JP2015517529A

JP2015517529A - Ｎｏｔｃｈ２／３抗体によって癌を治療するための方法

Info

Publication number: JP2015517529A
Application number: JP2015512830A
Authority: JP
Inventors: ティモシーチャールズヘイ; ジョンエイ．レビツキ; ワン−チンイェン; ジェイコブデュポン
Original assignee: オンコメッドファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2015-06-22
Also published as: WO2013173542A4; EP2849785A1; EP2849785A4; WO2013173542A1; US20130323266A1

Abstract

本発明は、癌を治療するための方法を提供する。より詳細には、本発明は、Notch2／3抗体を複数回投与する段階を含む、癌を治療するための方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年5月16日に提出された米国特許仮出願第61／647,742号、および2012年11月5日に提出された米国特許仮出願第61／722,340号の優先権の恩典を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の説明
発明の分野
本発明は、癌の治療の分野に関する。より詳細には、本発明は、Notch2／3抗体を複数回投与する段階を含む、癌を治療するための方法を提供する。

背景
癌は先進諸国における死亡の主因の1つであり、米国だけでも毎年、100万人以上が癌と診断され、500,000人以上が死亡している。全体として、人々の3人に1人以上が人生の間に何らかの型の癌を発症すると推定されている。癌には200種を上回る異なる種類があり、そのうち、乳癌、肺癌、結腸直腸癌および前立腺の4つが、癌の新規症例全体の過半数を占める（Jemal et al., 2010, CA: Cancer J, Clin., 60:277-300（非特許文献1））。

癌の治療は、次第に、全身作用性の細胞傷害性薬物の使用から、無秩序な細胞増殖および生存を可能にし、かつそれらを支える機序に照準を合わせた、より標的指向性の高い治療法を含めるように移行してきている。例えば、腫瘍が独立した血液供給を確立する過程である腫瘍血管新生は、腫瘍の成長にとって決定的に重要な段階である。このため、腫瘍血管新生を標的とする取り組みは、アバスチン（AVASTIN）などの新規癌治療薬の開発のための重要な戦略として浮上してきている。

正常な状態では、シグナル伝達経路は細胞外シグナルを核と結び付け、細胞増殖、細胞分化、細胞生存、および細胞死を直接的または間接的に制御する遺伝子の発現を導く。多種多様な癌では、シグナル伝達経路が調節不全の状態にあり、腫瘍イニシエーションおよび／または腫瘍進行につながっている可能性がある。ヒトの発癌と関連付けられているシグナル伝達経路には、Notch経路、Ras-Raf-MEK-ERK経路すなわちMAPK経路、PI3K-AKT経路、CDKN2A／CDK4経路、Bcl-2／TP53経路、およびWnt経路が非限定的に含まれる。

Notchシグナル伝達経路は、普遍的に保存されているシグナル伝達系である。これは、胚パターン形成および後胚期の組織維持を含む、発生期間中の細胞運命の決定に関与している。加えて、Notchシグナル伝達は、造血幹細胞の維持における決定的な因子としても同定されている。

Notch経路は、血液性および固形の腫瘍および癌のいずれの発生病理とも関連付けられている。細胞増殖、アポトーシス、接着および血管新生を含む、腫瘍発生と関連性のある数多くの細胞機能および微小環境因子（microenvironmental cue）が、Notch経路シグナル伝達によってモジュレートされることが示されている（Leong et al., 2006, Blood, 107:2223-2233（非特許文献2））。加えて、Notch受容体および／またはNotchリガンドは、急性骨髄性白血病、B細胞慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、脳悪性腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、および黒色腫を含む多数のヒト癌において、発癌の役割を果たす可能性があることも示されている（Leong et al., 2006, Blood, 107:2223-2233（非特許文献2）；Nickoloff et al., 2003, Oncogene, 22:6598-6608（非特許文献3））。このように、Notch経路は癌治療法の有望な標的として特定されている。

Jemal et al., 2010, CA: Cancer J, Clin., 60:277-300 Leong et al., 2006, Blood, 107:2223-2233 Nickoloff et al., 2003, Oncogene, 22:6598-6608

本発明は、Notch2／3抗体の治療的有効量をヒト対象に投与する段階を含む、癌を治療するための方法を提供する。1つの局面において、本発明は、ヒト患者における癌を治療するための方法であって、（a）患者に対してNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対してNotch2／3抗体の少なくとも1回の追加用量を投与する段階、を含む方法を提供する。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対してNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対してNotch2／3抗体の少なくとも2回の追加用量を第1の投薬頻度で投与する段階；および（c）患者に対してNotch2／3抗体の少なくとも1回のさらなる追加用量を第2の投薬頻度で投与する段階、を含む。ある態様において、第1の追加用量は初回用量の約1週間後に投与される。他の態様において、第1の追加用量は初回用量の約2週間後に投与される。他の態様において、第1の追加用量は初回用量の約3週間後に投与される。他の態様において、第1の追加用量は初回用量の約4週間後に投与される。いくつかの態様において、（b）における追加用量は、1週間またはそれ未満毎に約1回の投薬頻度で投与される。いくつかの態様において、（b）における追加用量は、2週間毎に約1回の投薬頻度で投与される。いくつかの態様において、（c）における追加用量は2週間毎に約1回の投薬頻度で投与される。いくつかの態様において、（c）における追加用量は3週間毎に約1回の投薬頻度で投与される。

もう1つの局面において、本発明は、ヒト患者における癌を治療するための方法であって、患者に対してNotch2／3抗体の有効用量を間欠的投薬レジメンに従って投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体の初回用量を患者に投与して、その後にNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に1回、3週間毎に1回、または4週間毎に1回を投与することを含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体を患者に2週間毎に1回投与することを含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体を患者に3週間毎に1回投与することを含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体を患者に4週間毎に1回投与することを含む。

いくつかの態様において、追加用量は初回用量とほぼ同じ量（すなわち、mg／kg）であるかまたはそれ未満である。他の態様において、追加用量は初回用量を上回る。いくつかの態様において、初回用量は約0.5mg／kg〜約20mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量は約5mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量は約7.5mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量は約10mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約5mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約7.5mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約10mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量および追加用量は約5mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量および追加用量は約7.5mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量および追加用量は約10mg／kgである。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体は固定用量として投与される。いくつかの態様において、用量は約2000mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約1500mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約1000mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約750mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約500mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約300mgまたはそれ未満である。

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与して、その後に約2.5mg／kgまたはそれ未満である1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与して、その後に約5mg／kgまたはそれ未満である1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与して、その後に約7.5mg／kgまたはそれ未満である1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約10mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与して、その後に約10mg／kgまたはそれ未満である1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階、を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階、を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階、を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を3週間毎に約1回投与する段階、を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を3週間毎に約1回投与する段階、を含む。

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を2週間毎に1回投与する段階、および、この投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を2週間毎に1回投与する段階、および、この投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を2週間毎に1回投与する段階、および、この投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を3週間毎に1回に投与する段階、および、この投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を3週間毎に1回投与する段階、および、この投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を3週間毎に1回投与する段階、および、この投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。

いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対してNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して、Notch2／3抗体の追加用量を、患者においてNotch2／3抗体の治療的有効レベルが達成されて維持されるのに十分な投薬頻度で投与する段階、を含む。

本発明のもう1つの局面においては、Notch2／3抗体の投与の結果として生じる1つまたは複数の副作用および／または毒性を軽減するための方法が提供される。

本発明のもう1つの局面においては、Notch2／3抗体の治療指数を高めるための方法が提供される。

本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、投与は静脈内注射によるか、または静脈内へのものであってよい。いくつかの態様において、投与は静脈内注入による。

本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、癌は、以下のものからなる群より選択される：肺癌、神経膠腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、多形性神経膠芽腫、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、腺様嚢胞癌、および頭頸部癌。いくつかの態様において、癌は膵臓癌である。いくつかの態様において、癌は結腸癌または結腸直腸癌である。いくつかの態様において、癌は卵巣癌である。いくつかの態様において、癌は肺癌である。

本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはNotch3と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2の細胞外ドメインと特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch2のEGFリピート10と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch2のEGFリピート10内の配列HKGAL（SEQ ID NO：23）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はさらに、ヒトNotch3と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch3のEGFリピート9と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch3のEGFリピート9内の配列HEDAI（SEQ ID NO：24）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch3の細胞外ドメインと特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch3のEGFリピート9と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch3のEGFリピート9内の配列HEDAI（SEQ ID NO：24）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はさらに、ヒトNotch2と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch2のEGFリピート10と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch2のEGFリピート10内の配列HKGAL（SEQ ID NO：23）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、約10nM〜約0.01nMの解離定数（K_D）でヒトNotch2と結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、約10nM〜約0.01nMの解離定数（K_D）でヒトNotch3と結合する。

ある態様において、Notch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む重鎖CDR2、およびSIFYTT（SEQ ID NO：12）またはGIFFAI（SEQ ID NO：13）を含む重鎖CDR3、ならびに

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6のアミノ酸を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、Notch2／3抗体はさらに、SEQ ID NO：9のアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はSEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：4を含む。いくつかの態様において、Notch2／3／抗体はSEQ ID NO：8を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、寄託番号PTA-10170またはPTA-9547を有する、ATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と同じ重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、ブダペスト条約の規定に基づいて2009年7月6日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110に寄託された、ATCC寄託番号PTA-10170を有するプラスミドによってコードされる。ある態様において、Notch2／3抗体は、ブダペスト条約の規定に基づいて2008年10月15日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110に寄託された、ATCC寄託番号PTA-9547を有するプラスミドによってコードされる。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2またはヒトNotch3に対する特異的結合をめぐって、寄託番号PTA-10170またはPTA-9547を有する、ATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と競合する。

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を3週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、少なくとも1つのさらなる治療薬を投与する段階をさらに含む。ある態様において、さらなる治療薬は化学療法薬である。

本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、本方法は、Notch2／3抗体の、単独での、または少なくとも1つのさらなる治療薬と組み合わせた投与の結果として生じる1つまたは複数の副作用を軽減しうる。本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、本方法は、Notch2／3抗体の、単独での、または少なくとも1つのさらなる治療薬と組み合わせた投与の結果として生じる1つまたは複数の毒性を軽減しうる。本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、本方法は、Notch2／3抗体の、単独での、または少なくとも1つのさらなる治療薬と組み合わせた治療指数を高めうる。

インビボ異種移植モデルにおけるOMP-59R5の間欠的投薬による膵臓腫瘍成長の阻害。A．PN8膵臓腫瘍細胞をNOD／SCIDマウスに皮下注射した。マウスには、対照抗体（-○-）、抗Notch2／3抗体59R5の2週間毎1回（-■-）、3週間毎1回（-Δ-）または4週間毎1回（-▼-）、ゲムシタビン（-●-）、ゲムシタビンと59R5の2週間毎1回（-◆-）、3週間毎1回（-x-）または4週間毎1回（-□-）との組み合わせを投与した。抗体は40mg／kgで2週間毎、3週間毎、または4週間毎に腹腔内投与し、対照抗体は週1回投与した。ゲムシタビンは10mg／kgで週1回腹腔内投与した。データは投与後の日数経過に伴う腫瘍体積（mm3）として示している。B．ゲムシタビン群およびゲムシタビン／59R5併用群における第62日時点の個々のマウスによる腫瘍体積。 OMP-59R5の間欠的投薬後のOMP-PN8膵臓腫瘍細胞における遺伝子発現。 OMP-59R5の投与後のOMP-PN8膵臓腫瘍細胞における遺伝子発現の動態。A．CD201、NANOG、OCT4およびID1。 OMP-59R5の投与後のOMP-PN8膵臓腫瘍細胞における遺伝子発現の動態。B．NOTCH3、マウスNotch3、マウスHeyLおよびマウスRgs5。 OMP-59R5の投与後のOMP-PN8膵臓腫瘍細胞における遺伝子発現の動態。C．SOX2、RARRES1、BMPR1B、およびNOTCH2。 OMP-59R5を投与された患者の8週間薬物動態試験。

発明の詳細な説明
I．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。

「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位または抗原結合部位を通じて、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、または前記のものの組み合わせなどの標的を認識してそれと特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いる場合、「抗体」という用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体断片（Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片など）、単鎖Fv（scFv）突然変異体、少なくとも2つの無傷の抗体から作製された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原認識部位を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の改変免疫グロブリン分子を、それらの抗体が所望の生物活性を示す限り、範囲に含む。抗体は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと称されるそれらの重鎖定常ドメインの実体に基づく、免疫グロブリンの5つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）の任意のものであってよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元立体配置を有する。抗体は裸（naked）であってもよく、または毒素および放射性同位体を非限定的に含む他の分子とコンジュゲートされていてもよい。

「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部分のことを指し、本明細書で用いる場合には、無傷の抗体の抗原決定可変領域または抗原結合部位のことを指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、線状抗体、単鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が非限定的に含まれる。

抗体の「可変領域」という用語は、単独であるかまたは組み合わされた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域のことを指す。重鎖および軽鎖の可変領域は一般に、4つのフレームワーク領域が3つの相補性決定領域（CDR）（超可変領域としても知られる）によって接続されたものからなる。各鎖におけるCDRは、フレームワーク領域によって互いに近接して保持され、他の鎖からのCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための手法には少なくとも2つがある：（1）異種間の配列多様性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda MD)；および（2）抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Al-Lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948）。加えて、これらの2つのアプローチの組み合わせも時折、CDRを決定するために当技術分野において用いられる。

「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定基またはエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する均一な抗体集団のことを指す。これは、種々の異なる抗原決定基を対象とするさまざまな抗体の混合物を典型的に含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷および完全長のモノクローナル抗体に加えて、抗体断片（Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片など）、単鎖Fv（scFv）突然変異体、抗体の一部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の改変免疫グロブリン分子も範囲に含む。その上、「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ作製、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物を非限定的に含む、いくつかの様式の任意のもので作製されたそのような抗体のことも指す。

「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト（例えば、マウス）配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片である、非ヒト型（例えば、マウス）抗体のことを指す。

「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当技術分野において公知の任意の手法を用いて作製された、ヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体のことを意味する。ヒト抗体のこの定義には、無傷または完全長の抗体、およびそれらの断片が含まれる。

「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれを上回る種に由来する抗体のことを指す。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する1つの哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域は、その種における免疫応答を誘発することを避けるために、別の種（通常はヒト）に由来する抗体における配列と相同である。

「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特定の抗体によって認識されて特異的な結合を受けることのできる抗原の部分のことを指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸（しばしば「線状エピトープ」と称される）、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される非連続的アミノ酸（しばしば「立体配置エピトープ」と称される）のいずれによっても形成されうる。連続したアミノ酸によって形成されるエピトープは、典型的にはタンパク質が変性しても保たれるが、一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的にはタンパク質が変性すると失われる。エピトープは典型的には、特有の空間立体配置にある少なくとも3個、より一般的には少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。

「特異的に結合する」または「特異的結合」という用語は、結合性物質または抗体が、非関連タンパク質を含む代替的な物質との場合よりも、より頻繁に、より急速に、より長い持続時間にわたり、より高い親和性で、または上記のいくつかの組み合わせで、反応または結合することを意味する。ある態様において、「特異的に結合する」とは、抗体がタンパク質と、約0.1mMもしくはそれ未満の、しかしより通常には約1μM未満のK_Dで結合することを意味する。ある態様において、「特異的に結合する」とは、抗体がタンパク質と、ある時には少なくとも約0.1μMもしくはそれ未満の、そして別の時には少なくとも約0.01μMもしくはそれ未満のK_Dで結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性が理由で、特異的結合には、複数の種におけるNotch2（例えば、マウスNotch2およびヒトNotch2）を認識する抗体が含まれうる。第1の標的と特異的に結合する抗体または結合モイエティーは第2の標的と特異的に結合してもよく、またはしなくてもよいことが理解されよう。このため、「特異的結合」は、排他的な結合、すなわち単一の標的との結合を（含むことはできるものの）必ずしも必要としない。したがって、抗体は、ある態様において、複数の標的と特異的に結合しうる。ある態様において、複数の標的が抗体上の同一の抗原結合部位による結合を受けてもよい。例えば、抗体が、場合によっては、それぞれが2種またはそれを上回るタンパク質上の同一のエピトープ（例えば、ヒトNotch2およびヒトNotch3）と特異的に結合する、2つの同一な抗原結合部位を含んでもよい。ある代替的な態様において、抗体が二重特異性であって、異なる特異性を有する少なくとも2つの抗原結合部位を含んでもよい。非限定的な一例として、二重特異性抗体は、Notchタンパク質上のエピトープを認識する1つの抗原結合部位を含むことができ、かつ、DLL4などの第2のタンパク質上の異なるエピトープを認識する第2の異なる抗原結合部位をさらに含む。一般に、ただし必ずではないが、「結合」への言及は特異的結合を意味する。

「ポリペプチド」または「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸重合体のことを指す。重合体は線状または分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸が介在してもよい。これらの用語はまた、天然に、または介入によって；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の任意の操作もしくは修飾、例えば標識用構成要素とのコンジュゲーションなどによって修飾されたアミノ酸重合体も範囲に含む。また、例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸など）、ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体を基にしているため、ある態様において、ポリペプチドが単鎖または会合鎖として存在しうることは理解されよう。

「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチド重合体のことを指し、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによって重合体に組み込まれうる任意の基質であってよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などを含みうる。ヌクレオチド構造への修飾は、存在するのであれば、重合体の集合の前に付与されてもよく、その後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド構成要素が介在してもよい。ポリヌクレオチドが、重合後に、例えば標識用構成要素とのコンジュゲーションなどによってさらに修飾されてもよい。他の種類の修飾には、例えば、「キャップ」；天然ヌクレオチドの1つまたは複数の、類似体による置換；ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート（cabamate）など）および荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）；ペンダントモイエティー、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）；インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）；キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）；アルキル化剤；修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）；ならびに非修飾型のポリヌクレオチドが含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えばホスホン酸基、リン酸基によって置き換えられてもよく、標準的な保護基によって保護されてもよく、またはさらなるヌクレオチドに対するさらなる結合を用意するために活性化されてもよく、または固体支持体とコンジュゲートされてもよい。5'末端OHおよび3'末端OHはリン酸化されてもよく、またはアミンもしくは炭素原子1〜20個の有機キャッピング基モイエティーによって置換されてもよい。他のヒドロキシルを標準的な保護基へと誘導体化してもよい。また、ポリヌクレオチドが、例えば、2'-O-メチル-、2'-O-アリル、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースもしくはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、ヘプツロース、非環式類似体、および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなどを含む、当技術分野において一般に公知のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似型を含有してもよい。1つまたは複数のホスホジエステル結合を代替的な連結基によって置き換えてもよい。これらの代替的な連結基には、リン酸基がP(O)S（「チオエート」）、P(S)S（「ジチオエート」）、(O)NR2（「アミデート」）、P(O)R、P(O)OR'、COまたはCH2（「ホルムアセタール」）によって置き換えられる態様が非限定的に含まれ、式中、各RまたはR'は独立に、H、またはエーテル（-O-）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキル（araldyl）を含有してもよい置換アルキルもしくは非置換アルキル（1〜20 C）である。ポリヌクレオチド中の結合のすべてが同一である必要はない。

「高ストリンジェンシーの条件」は、（1）洗浄のために低イオン強度および高温を使用するもの、例えば、50℃で、15mM塩化ナトリウム／1.5mMクエン酸ナトリウム（1×SSC）を、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムとともに；（2）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤を使用するもの、例えば、42℃で、50％（v／v）ホルムアミドを、0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％）Ficoll／0.1％ポリビニルピロリドン／50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5と、5×SSC（0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）とともに；または（3）42℃で、50％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理済みサケ精子DNA（50μg／ml）、0.1％ SDS、および10％デキストラン硫酸を使用し、42℃で0.2×SSC（30mM塩化ナトリウム／3mMクエン酸ナトリウム）中および55℃で50％ホルムアミド中で洗浄し、その後にEDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を55℃で行うもの、によって特定することができる。

2つまたはそれを上回る核酸またはポリペプチドの文脈における「同一の」または「一致」度（percent "identity"）という用語は、配列同一性の要素としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、対応が最大になるように（必要であれば、ギャップを導入して）比較およびアラインメントを行った場合に、同じであるか、または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指定のパーセンテージで有する、2つまたはそれを上回る配列または部分配列のことを指す。一致度は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために用いうる、さまざまなアルゴリズムおよびソフトウェアが、当技術分野において公知である。これらには、BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、およびそれらの変形物が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、このことは、対応が最大になるように比較およびアラインメントを行って、配列比較アルゴリズムを用いるかまたは目視検査によって測定した場合に、それらが、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、および、いくつかの態様においては、少なくとも95％、96％、97％、98％、99％のヌクレオチド同一性またはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。いくつかの態様において、同一性は、長さが少なくとも約10残基、少なくとも約20残基、少なくとも約40〜60残基、またはそれらの間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、60〜80残基よりも長い領域、例えば少なくとも約90〜100残基にわたって存在し、いくつかの態様においては、配列は、ヌクレオチド配列のコード領域というような、比較される配列の完全長にわたって実質的に同一である。

「保存的アミノ酸置換」とは、1つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置き換えられることをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されており、これには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。例えば、チロシンのフェニルアラニンへの置換は保存的置換である。好ましくは、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体の、そのポリペプチドまたは抗体が結合する抗原、すなわちNotchタンパク質との結合を無効にしない。抗原結合を消失させないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野において周知である。

「ベクター」という用語は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達することができ、好ましくは発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随しているDNAまたはRNA発現ベクター、およびリポソーム内に封入されたDNAまたはRNA発現ベクターが非限定的に含まれる。

「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物とは、天然には見られない形態にあるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物のことである。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞もしくは組成物には、それらがもはや天然に見られる形態ではない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。

本明細書で用いる場合、「実質的に純粋な」とは、純度が少なくとも50％（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは純度が少なくとも90％、より好ましくは純度が少なくとも95％、より好ましくは純度が少なくとも98％、より好ましくは純度が少なくとも99％である材料のことを指す。

「腫瘍」および「新生物」という用語は、過度の細胞成長または増殖に起因する、良性（非癌性）であるか、または前癌病変を含む悪性（癌性）であるかのいずれかである、あらゆる組織塊のことを指す。

「癌幹細胞」または「CSC」または「腫瘍幹細胞」または「腫瘍始原細胞」または「固形腫瘍幹細胞」または「腫瘍形成性幹細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、（1）高度の増殖能を有し；2）非対称細胞分裂を行って、増殖能力または発生能力の低下した1つまたは複数の種類の分化した子孫を生じることができ；かつ（3）自己複製または自己維持のために対称細胞分裂を行うことができる、固形腫瘍由来の細胞の集団のことを指す。これらの特性は「癌幹細胞」または「腫瘍始原細胞」に対して、免疫低下宿主（例えば、マウス）に累代移植された時に、腫瘍を形成できない大部分の腫瘍細胞と比べ、腫瘍触知可能な腫瘍を形成する能力を付与する。癌幹細胞は、無秩序な様式で自己複製と分化とを行い、突然変異が起こるにつれて経時的に変化しうる異常な細胞型を伴う腫瘍を形成する。

「癌細胞」または「腫瘍細胞」という用語、および文法的同等物は、腫瘍細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞、および腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、腫瘍または前癌病変に由来する細胞の全集団のことを指す。本明細書で用いる場合、「腫瘍細胞」という用語は、複製および分化する能力がない腫瘍細胞のみを指す場合には、そのような腫瘍細胞を癌幹細胞と区別するために「非腫瘍形成性」という用語で修飾される。

「腫瘍形成性の」という用語は、固形腫瘍幹細胞が腫瘍を形成することを可能にする、自己複製（さらなる腫瘍形成性癌幹細胞を生じる）および他のすべての腫瘍細胞を生じさせる増殖（分化した、それ故に非腫瘍形成性である腫瘍細胞を生じる）の特性を含む、固形腫瘍幹細胞の機能的特徴のことを指す。自己複製、および他のすべての腫瘍細胞を生じさせる増殖というこれらの特性は、癌幹細胞に対して、累代移植を行っても腫瘍を形成できない非腫瘍形成性腫瘍細胞と比べて、免疫低下宿主（例えば、マウス）に累代移植された時に触知可能な腫瘍を形成する能力を付与する。非腫瘍形成性腫瘍細胞は、固形腫瘍から腫瘍細胞を得た後に免疫低下宿主への初代移植を行うと腫瘍を形成しうることが観察されているが、そのような非腫瘍形成性腫瘍細胞は累代移植を行っても腫瘍を生じない。

「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントになる予定の、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物などを非限定的に含む、あらゆる動物（例えば、哺乳動物）のことを指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に言及して本明細書において互換的に用いられる。

「薬学的に許容される塩」という語句は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理学的活性を保有する、化合物の塩のことを指す。

「薬学的に許容される添加剤、担体または補助剤」という語句は、本開示の抗体の少なくとも1つとともに対象に投与することができ、かつ、その薬理学的活性および／または生物活性を消失させず、治療量の抗体を送達するのに十分な用量で投与された時に無毒性である、添加剤、担体または補助剤のことを指す。

「薬学的に許容される媒体」という語句は、本開示の抗体の少なくとも1つとともに投与される希釈剤、補助剤、添加剤または担体のことを指す。

「治療的有効量」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「治療する」のに有効な、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機小分子または他の薬物の量のことを指す。癌の場合には、薬物（例えば、抗体）の治療的有効量は、癌細胞数を減少させること；腫瘍サイズを縮小させること；例えば、軟部組織および骨の中への癌の波及を含む、末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害または停止させること；癌に関連した症状の1つもしくは複数をある程度軽減すること；罹病率および死亡率を低下させること；生活の質を向上させること；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能を低下させること；腫瘍内の癌幹細胞の数もしくは頻度を減少させること；腫瘍形成細胞を非腫瘍形成状態に分化させること；またはそのような効果の組み合わせが可能である。薬物が既存の癌細胞の増殖を防止し、かつ／またはこれを死滅させる限りにおいて、それは細胞分裂抑制性および／または細胞傷害性であると称することができる。

「治療する」または「治療」または「治療すること」または「緩和する」または「緩和すること」などの用語は、1）診断された病的状態または障害を治癒させる、緩徐化する、その症状を和らげる、および／またはその進行を停止させる治療的手段、ならびに2）標的とする病的状態または障害の発症を予防および／または緩徐化する予防処置的または予防的手段の両方を指す。したがって、治療を必要とする者には、既に障害を有する者；障害を有しやすい者；および障害を予防すべきである者が含まれる。ある態様において、患者が以下のうち1つまたは複数を示すならば、対象は本発明の方法によって癌が首尾よく「治療されている」：癌細胞または腫瘍細胞の数の減少または完全な欠如；腫瘍サイズの縮小；例えば軟部組織および骨の中への癌の波及を含む、末梢臓器への癌細胞の浸潤の阻害もしくは欠如；腫瘍転移の阻害もしくは欠如；腫瘍成長の阻害もしくは欠如；特定の癌に関連した1つもしくは複数の症状の緩和；罹病率および死亡率の低下；生活の質の向上；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能の低下；腫瘍内の癌幹細胞の数もしくは頻度の減少；腫瘍形成細胞の非腫瘍形成状態への分化；またはこれらの効果の何らかの組み合わせ。

本開示および特許請求の範囲において用いられる場合、「1つの（a）」「1つの（an）」および「その（the）」という単数形は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数形も含む。

本明細書において態様が「含む」という言葉で記述されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」によって記述される他の類似の態様も提供されることは了解されよう。同じく、本明細書において態様が「から本質的になる」という言葉で記述されている場合は常に、「からなる」によって記述される他の類似の態様も提供されることも了解されよう。

本明細書において「Aおよび／またはB」のような語句に用いられる「および／または」という用語は、AおよびBも、AまたはBも、A（のみ）およびB（のみ）も含むものとする。同様に、「A、B、および／またはC」のような語句に用いられる「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを範囲に含むものとする：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（のみ）；B（のみ）；ならびにC（のみ）。

II．Notch2／3抗体
本発明は、癌を治療するための方法に用いるためのNotch2／3抗体を提供する。

ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2の細胞外ドメインおよび／またはヒトNotch3の細胞外ドメインと特異的に結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2のEGFリピート10と特異的に結合する。ある態様において、Notch 2／3抗体は、Notch3のEGFリピート9と特異的に結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2のEGFリピート10と特異的に結合し、かつNotch3のEGFリピート9と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch2 EGFリピート10内の配列HKGAL（SEQ ID NO：23）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch3 EGFリピート9内の配列HEDAI（SEQ ID NO：24）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、Notch2 EGFリピート10内の配列HKGAL（SEQ ID NO：23）の少なくとも一部と特異的に結合し、かつNotch3 EGFリピート9内の配列HEDAI（SEQ ID NO：24）の少なくとも一部と特異的に結合する。

ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2と、約1μMもしくはそれ未満、約100nMもしくはそれ未満、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、約1nMもしくはそれ未満、約0.5nMもしくはそれ未満、または約0.1nMもしくはそれ未満の解離定数（K_D）で結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch3と、約1μMもしくはそれ未満、約100nMもしくはそれ未満、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、約1nMもしくはそれ未満、約0.5nMもしくはそれ未満、または約0.1nMもしくはそれ未満の解離定数（K_D）で結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2およびNotch3と、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、約1nMもしくはそれ未満、または約0.5nMもしくはそれ未満のK_Dで結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約1nMまたはそれ未満のK_Dで結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約0.8nMまたはそれ未満のK_Dで結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約0.6nMまたはそれ未満のK_Dで結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約0.5nMまたはそれ未満のK_Dで結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約0.4nMまたはそれ未満のK_Dで結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約0.3nMまたはそれ未満のK_Dで結合する。いくつかの態様において、K_Dは表面プラズモン共鳴によって測定される。いくつかの態様において、抗体のNotch2および／またはNotch3に対する解離定数は、Biacoreチップ上に固定化されたNotch2またはNotch3の細胞外ドメインを含むNotch融合タンパク質（例えば、Notch ECD-Fc融合タンパク質）を用いて決定される解離定数である。

ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約1μMもしくはそれ未満、約100nMもしくはそれ未満、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、または約1nMもしくはそれ未満の半値有効濃度（EC₅₀）で結合する。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはNotch3と、約40nMもしくはそれ未満、約20nMもしくはそれ未満、約10nMもしくはそれ未満、または約1nMもしくはそれ未満のEC₅₀で結合する。

ある態様において、Notch2／3抗体はIgG抗体である。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はIgG1抗体である。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はIgG2抗体である。ある態様において、Notch2／3抗体はモノクローナル抗体である。ある態様において、Notch2／3抗体はヒト化抗体である。ある態様において、Notch2／3抗体はヒト抗体である。ある態様において、Notch2／3抗体は、抗原結合部位を含む抗体断片である。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、任意の公知の方法によって調製することができる。いくつかの態様において、ポリクローナル抗体は、関連抗原（例えば、精製ペプチド断片、完全長組換えタンパク質、融合タンパク質など）の複数回の皮下注射または腹腔内注射により、動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバなど）に免疫処置を行うことによって調製される。抗原を任意で、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または血清アルブミンなどの担体タンパク質とコンジュゲートさせてもよい。抗原（担体タンパク質を伴うかまたは伴わない）を滅菌食塩水中に希釈し、通常はアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント）と組み合わせて安定な乳濁液を形成させる。十分な期間の後に、免疫処置した動物の血液、腹水などからポリクローナル抗体を回収する。ポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を非限定的に含む、当技術分野において標準的な方法に従って、血清または腹水から精製することができる。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、当業者に公知のハイブリドーマ法を用いて調製される（例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495を参照）。ハイブリドーマ法を用いる場合は、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物に対して上記のように免疫処置を行い、免疫抗原と特異的に結合すると考えられる抗体を産生するようにリンパ球を誘発する。いくつかの態様においては、リンパ球にインビトロで免疫処置を行う。いくつかの態様において、免疫抗原（例えば、Notchタンパク質）はヒトタンパク質またはその一部分である。いくつかの態様において、免疫抗原（例えば、Notchタンパク質）はマウスタンパク質またはその一部分である。いくつかの態様において、免疫抗原はヒトNotchタンパク質の細胞外ドメインである。いくつかの態様において、免疫抗原はマウスNotchタンパク質の細胞外ドメインである。いくつかの態様において、マウスはヒト抗原による免疫処置を受ける。いくつかの態様において、マウスはマウス抗原による免疫処置を受ける。

免疫処置の後に、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを用いて、適した骨髄腫細胞株と融合させる。当技術分野において公知の特殊な培地を用いてハイブリドーマ細胞を選別するが、融合していないリンパ球および骨髄腫細胞はこの選別過程を生き延びることができない。標的抗原を対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫沈降法、イムノブロット法、およびインビトロ結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、またはラジオイムノアッセイ（RIA））を非限定的に含む、種々の手法によって同定することができる。ハイブリドーマは、インビトロの組織培養下で標準的な方法を用いて（J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA）、またはインビボで宿主動物における腹水として増やすことができる。モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を非限定的に含む、当技術分野において標準的な方法に従って、培養培地または腹水から精製することができる。

いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、当業者に公知の組換えDNA手法を用いて作製することができる。いくつかの態様においては、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるRT-PCRによって単離し、それらの配列を従来の手順を用いて決定する。重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、通常であれば免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌（E. coli）細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトされた時にモノクローナル抗体を産生する、適した発現ベクター中にクローニングする。ある態様において、組換えモノクローナル抗体またはその断片は、所望の種の可変ドメイン領域またはCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（例えば、McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554；Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628；およびMarks et al., 1991, J, Mol. Biol., 222:581-597を参照）。

モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、例えば、代替的な抗体を作製するために組換えDNA技術を用いることによって、改変することができる。いくつかの態様においては、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインによって、例えばヒト抗体のものを置換してキメラ抗体を作製すること、または非免疫グロブリンポリペプチドを置換して融合タンパク質を作製することができる。いくつかの態様においては、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を作製するために、定常領域を短縮または除去する。いくつかの態様においては、可変領域の部位指定突然変異誘発または高密度突然変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性、および／または他の生物学的特性を最適化することができる。いくつかの態様において、いくつかの態様においては、CDRの部位指定突然変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性、および／または他の生物学的特性を最適化することができる。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体はヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（CDR）由来の残基が、当業者に公知の方法によって、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のCDR由来の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリンである。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基は、所望の特異性、親和性、および／または能力を有する非ヒト免疫グロブリン由来の対応するフレームワーク領域残基によって置き換えられる。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、および／または能力を改良および最適化するために、Fvフレームワーク領域および／または置き換えられた非ヒト残基のいずれかにおけるさらなる残基の置換によって、さらに改変される。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRのすべてまたは実質的にすべてを含む、少なくとも1つ、典型的には2つまたは3つの可変ドメインのすべてまたは実質的にすべてを含むが、一方、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。いくつかの態様において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分も含みうる。ある態様において、そのようなヒト化抗体は治療的に用いられるが、これは、それらはヒト対象に投与された時に抗原性が低いはずであり、HAMA（ヒト抗マウス抗体）反応が低下する可能性があるためである。当業者は、公知の手法に従って、免疫原性の低下した機能的なヒト化抗体を得ることができるであろう（例えば、米国特許第5,225,539号；第5,585,089号；第5,693,761号；および第5,693,762号を参照）。

ある態様において、Notch2／3抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知のさまざまな手法を用いて直接調製することができる。いくつかの態様において、ヒト抗体は、インビトロで免疫処置を受けた不死化ヒトBリンパ球から、または免疫処置を受けた個体から単離したリンパ球から作製することができる。いずれの場合にも、標的抗原を対象とする抗体を産生する細胞を作製して単離することができる（例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77；Boemer et al., 1991, J Immunol, 147:86-95；ならびに米国特許第5,750,373号；第5,567,610号；および第5,229,275号を参照）。

いくつかの態様において、ヒト抗体はファージライブラリーから選択することができ、ここでこのファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314；Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162；Hoogenboom and Winter, 1991, J, Mol. Biol, 227:381；Marks et al., 1991, J Mol Biol, 222:581）。ファージディスプレイ技術を用いることで、免疫処置を受けていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体断片をインビトロで生成させることができる。抗体ファージライブラリーの作製および使用のためのさまざまな手法は、米国特許第5,969,108号；第6,172,197号；第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号；第6,593,081号；第6,300,064号；第6,653,068号；第6,706,484号；および第7,264,963号；Rothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376:1182-1200、ならびに当業者に公知の他の刊行物に記載されている。

抗体がひとたび同定されれば、鎖シャッフリング（Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783）および部位指定突然変異誘発を非限定的に含む、当技術分野において公知の親和性成熟戦略を、高親和性ヒト抗体を作製するために利用することができる。

いくつかの態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスにおいて作り出すことができる。免疫処置を受けると、これらのマウスは内因性免疫グロブリン産生を伴わずにヒト抗体の全レパートリーを産生することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；および第5,661,016号に記載されている。

ある態様において、Notch2／3抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも2種類の異なるエピトープを特異的に認識して、それと結合することができる。異なるエピトープは同じ分子内にあってもよく、または異なる分子上にあってもよい。いくつかの態様において、抗体は、第1の抗原標的を発現する細胞に細胞防御機構を集中させるために、第1の抗原標的（例えば、Notch2および／またはNotch3）に加えて、白血球上のエフェクター分子（例えば、CD2、CD3、CD28、もしくはB7）またはFc受容体（例えば、CD64、CD32、もしくはCD16）といった第2の抗原標的も特異的に認識して結合することができる。いくつかの態様において、これらの抗体を用いて、特定の標的抗原、例えばNotchタンパク質などを発現する細胞に細胞傷害性物質を向かわせることができる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害性物質または放射性核種キレート剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、もしくはTETAなどと結合するアームとを保有する。ある態様において、抗体は、血管新生に影響を与えるために使用しうる。ある態様において、二重特異性抗体は、Notch2および／またはNotch3ならびにVEGFと特異的に結合する。ある態様において、二重特異性抗体は、Notch2および／またはNotch3、ならびにNotchリガンド（例えば、DLL4、Jagged1もしくはJagged2）、またはNotch1、Notch2、Notch3、およびNotch4からなる群より選択される少なくとも1つの他のNotch受容体と特異的に結合する。

二重特異性抗体を作り出すための技法は当業者に公知であり、例えば、Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539；Brennan et al., 1985, Science, 229:81；Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol, 121:120；Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659；Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225；Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553；Gruber et al., 1994, J. Immunol, 152:5368；米国特許第5,731,168号、および米国特許出願公開第2011／0123532号を参照されたい。二重特異性抗体は無傷の抗体であってもよく、または抗体断片であってもよい。三価以上の結合価を有する抗体も想定している。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60）。したがって、ある態様において、Notch2および／またはNotch3に対する抗体は多重特異性である。

ある態様において、本明細書に記載のNotch2／3抗体（例えば、抗体または他のポリペプチド）は、単一特異性であってよい。例えば、ある態様において、抗体が含む1つまたは複数の抗原結合部位のそれぞれは、Notch2および／またはNotch3上の相同なエピトープと結合することができる（または結合する）。

ある態様において、Notch2／3抗体は抗体断片である。抗体断片は無傷の抗体とは異なる機能または能力を有してもよく；例えば、抗体断片の腫瘍浸透性が増大していてもよい。無傷の抗体のタンパク質分解消化を非限定的に含む、抗体断片の生成のためのさまざまな手法が公知である。いくつかの態様において、抗体断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生されるF(ab')2断片が含まれる。いくつかの態様において、抗体断片には、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片が含まれる。他の態様において、抗体断片には、パパインおよび還元剤による抗体分子の処理によって作製されるFab断片が含まれる。ある態様において、抗体断片は組換え法によって生産される。いくつかの態様において、抗体断片にはFvまたは単鎖Fv（scFv）断片が含まれる。Fab、FvおよびscFv抗体断片は大腸菌または他の宿主細胞内で発現させて、それらから分泌させることができることから、これらの断片の大量生産が可能である。いくつかの態様において、抗体断片は、本明細書で考察したような抗体ファージライブラリから単離される。例えば、Fab発現ライブラリの構築のための方法（Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281）を用いて、Notch2および／またはNotch3、またはそれらの誘導体、断片、類似体またはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ効果的な同定を可能にすることができる。いくつかの態様において、抗体断片は、線状の抗体断片である。ある態様において、抗体断片は単一特異性または二重特異性である。ある態様において、Notch2／3抗体はscFvである。さまざまな手法を、Notch2／3に対して特異的な単鎖抗体の生産のために用いることができる。

いくつかの態様においては、特に抗体断片の場合には、その血清中半減期を変更するため（例えば、延長または短縮するため）に、抗体を改変することが望ましいことがある。これは例えば、抗体断片内の適切な領域の突然変異による、抗体断片へのサルベージ受容体結合エピトープの組み入れによって、またはペプチドタグにエピトープを組み入れ、それを続いて抗体断片のいずれかの端もしくは中央部に融合させること（例えば、DNA合成またはペプチド合成による）によって達成することができる。

本発明においては、改変抗体、またはそれらの断片が、抗体とヒトNotch2および／またはヒトNotch3との会合をもたらすあらゆる種類の可変領域を含みうることが理解されるべきである。この点に関して、可変領域は、体液性応答を開始して所望の抗原（例えば、Notchタンパク質）に対する免疫グロブリンを生成するように誘導しうる、あらゆる種類の哺乳動物に由来してよい。そのため、改変抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル、マカクザルなど）またはウサギ由来であってよい。いくつかの態様において、改変された免疫グロブリンの可変領域および定常領域は両方ともヒトのものである。他の態様において、適合性のある抗体（通常は、ヒトでない源に由来）の可変領域を、分子の結合特性を改善するため、または分子の免疫原性を低下させるために操作すること、または特異的に適応させることができる。この点に関して、移入アミノ酸配列を含めることにより、本発明において有用な可変領域をヒト化すること、または他の様式で変更することができる。

ある態様において、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、1つもしくは複数のCDRの少なくとも部分的な置き換えによって、または必要な場合には、部分的なフレームワーク領域の置き換えおよび配列改変によって変更される。CDRは、フレームワーク領域の由来となった抗体と同じクラス、またはさらには同じサブクラスに由来してもよいが、CDRが、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種からの抗体に由来することも想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移行させるために、CDRのすべてをドナー可変領域由来のCDRのすべてによって置き換えることは必要でない場合がある。より正確に言えば、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移行させることだけが必要な場合がある。

可変領域の変更にかかわらず、当業者は、本発明の改変抗体に、ネイティブ性定常領域または変更されていない定常領域を含む免疫原性がほぼ同じ抗体と比較して腫瘍局在性の増大、腫瘍浸透性の増大、血清中半減期の短縮または血清中半減期の延長といった所望の生化学的特性が得られるように、定常領域ドメインのうち1つまたは複数の少なくとも一部分が欠失しているか、または他の様式で変更されている抗体（例えば、完全長抗体またはそれらの抗原結合性断片）が含まれると考えられることを理解するであろう。いくつかの態様において、改変抗体の定常領域はヒト定常領域を含む。定常領域の改変には、1つまたは複数のドメインにおける1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれる。本明細書に開示された改変抗体は、3つの重鎖定常ドメイン（CH1、CH2またはCH3）の1つもしくは複数、および／または軽鎖定常ドメイン（CL）に対する変更または改変を含みうる。いくつかの態様においては、1つまたは複数のドメインが、改変抗体の定常領域から部分的または完全に欠失している。いくつかの態様においては、CH2ドメイン全体が除去されている（ΔCH2構築物）。いくつかの態様において、取り除かれた定常領域ドメインは、存在しない定常領域によって典型的には付与される分子柔軟性の一部を与える、短いアミノ酸スペーサー（例えば、10アミノ酸残基）によって置き換えられる。

ある態様において、改変抗体は、CH3ドメインが抗体のヒンジ領域と直接融合するように操作される。他の態様においては、ペプチドスペーサーが、ヒンジ領域と改変されたCH2および／またはCH3ドメインとの間に挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失しており、残りのCH3ドメイン（改変されているか、または改変されていない）が5〜20アミノ酸のスペーサーによってヒンジ領域と接続している構築物を発現させることができる。そのようなスペーサーを付加することにより、確実に、定常ドメインの調節エレメントを障害物のないアクセス可能な状態に保つこと、またはヒンジ領域を柔軟なままに保つことができる。しかし、アミノ酸スペーサーが、場合によっては、免疫原性であって、構築物に対する望まれない免疫応答を誘発することが判明する恐れがあることに留意すべきである。したがって、ある態様において、構築物に付加されるあらゆるスペーサーは、改変抗体の所望の生化学的特質を維持するように、比較的非免疫原性であると考えられる。

いくつかの態様において、改変抗体は、定常ドメインの部分的欠失、または少数もしくは単一のアミノ酸の置換のみを有しうる。例えば、CH2ドメインの選択された区域における単一のアミノ酸の突然変異だけで、Fc結合を大幅に低下させ、それによって腫瘍局在性および／または腫瘍浸透性を増大させるのに十分な場合がある。同様に、調節しようとする特定のエフェクタ機能（例えば、補体C1q結合）を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの部分を単に欠失させることが望ましい場合もある。定常領域のそのような部分的欠失により、当該定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしておく一方で、抗体の選択された特性（血清中半減期）が改善される可能性がある。さらに、上に示唆したように、開示された抗体の定常領域は、結果として得られる構築物のプロファイルを向上させる、1つまたは複数のアミノ酸の突然変異または置換によって改変されてもよい。この点に関して、改変抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持する一方で、保存された結合部位（例えば、Fc結合性）によってもたらされる活性を妨害することが可能な場合がある。ある態様において、改変抗体は、エフェクター機能の低下もしくは増大といった望ましい特徴を強化するように、またはさらに多くのサイトトキシンもしくは糖質の結び付きをもたらすように、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含む。

定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することは、当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と（抗原と結合した）IgGまたはIgM抗体のFc領域との結合により、補体系が活性化される。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体活性化は炎症反応も刺激し、自己免疫性過敏症にも関与する場合がある。加えて、抗体のFc領域は、Fc受容体（FcR）を発現する細胞と結合することもできる。IgG（γ受容体）、IgE（ε受容体）、IgA（α受容体）およびIgM（μ受容体）を含む、種々のクラスの抗体に対して特異的な、いくつかのFc受容体がある。抗体と細胞表面上のFc受容体との結合により、抗体でコーティングされた粒子の貪食および破壊、免疫複合体の排除、抗体でコーティングされた標的細胞のキラー細胞による溶解、炎症メディエーターの放出、胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を含む、いくつかの重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。

ある態様において、Notch2／3抗体はエフェクター機能の変更をもたらし、これが続いて、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段を通じての）欠失または不活性化は、流血中改変抗体（例えば、Notch2／3抗体）のFc受容体との結合を減少させ、それによって腫瘍局在性および／または浸透性を増大させることができる。他の態様において、定常領域の改変は、抗体の血清中半減期を延長させるか、または短縮させる。いくつかの態様において、定常領域は、腫瘍局在性および／または浸透性の強化が可能になるように、ジスルフィド結合またはオリゴ糖モイエティーを除去するように改変される。

ある態様において、Notch2／3抗体は、1つまたは複数のエフェクター機能を有しない。いくつかの態様において、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性を有しない、かつ／または補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有しない。ある態様において、抗体は、Fc受容体および／または補体因子と結合しない。ある態様において、抗体はエフェクター機能を有しない。

本発明は、本明細書に記載されるキメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、またはそれらの抗体断片と実質的に相同である変種および同等物をさらに包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含みうる。

いくつかの態様において、本発明は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9と特異的に結合する抗体であって、抗体59R1または59R5のCDRのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および／または6つを含む抗体を提供する。これらの抗体および／または類似の抗体は、米国特許出願公開第2010／0111958号に記載されている。

ある態様において、本発明は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9と特異的に結合するNotch2／3抗体であって、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む重鎖CDR2、およびSIFYTT（SEQ ID NO：12）またはGIFFAI（SEQ ID NO：13）を含む重鎖CDR3、ならびにRASQSVRNYLA（SEQ ID NO：14）を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む抗体を提供する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は以下のものを含む：SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む重鎖CDR2、およびSIFYTT（SEQ ID NO：12）を含む重鎖CDR3、ならびに

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3。

ある態様において、本発明は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9と特異的に結合する抗体であって、SEQ ID NO：5もしくはSEQ ID NO：6に対して少なくとも約80％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO：9に対して少なくとも80％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。ある態様において、抗体は、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗体は、SEQ ID NO：9に対して少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある態様において、抗体は、SEQ ID NO：5もしくはSEQ ID NO：6に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO：9に対して少なくとも約95％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある態様において、抗体は、SEQ ID NO：5もしくはSEQ ID NO：6を含む重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様において、抗体は、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様において、抗体は、SEQ ID NO：5を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域を含む。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：4を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はSEQ ID NO：8を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：8を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：4およびSEQ ID NO：8を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：17によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：18によってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：17によってコードされるポリペプチドおよびSEQ ID NO：18によってコードされるポリペプチドを含む。

ある態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6を含む重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域を含む抗体が結合するのと同じエピトープと結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、抗体59R5と同じエピトープと結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は抗体59R1と同じエピトープと結合する。

ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9に対する特異的結合をめぐって抗体と競合し、ここでその抗体は、SEQ ID NO：5もしくはSEQ ID NO：6を含む重鎖可変領域、および／またはSEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9に対する特異的結合をめぐって、寄託番号PTA-9547を有するATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と競合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9に対する特異的結合をめぐって、寄託番号PTA-10170を有するATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と競合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、競合結合アッセイにおいて、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9に対する特異的結合をめぐって競合する。

本発明のNotch2／3抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって、特異的結合に関してアッセイすることができる。用いうるイムノアッセイには、例えば、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、ELISA法、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインAイムノアッセイなどの手法を用いる、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が非限定的に含まれる。そのようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野において周知である（例えば、Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照）。

例えば、Notch2／3抗体とヒトNotch2および／またはヒトNotch3との特異的結合は、ELISAを用いて判定しうる。ELISAアッセイには、抗原を調製する段階、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする段階、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物とコンジュゲートさせた抗体をウェルに添加する段階、一定時間にわたってインキュベートする段階、および結合性物質または抗体の存在を検出する段階が含まれる。いくつかの態様において、抗体は検出可能な化合物とコンジュゲートされず、その代わりに、抗体を認識する第2の結合抗体がウェルに添加される。いくつかの態様において、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよく、コーティングされたウェルに抗原を添加した後に、検出可能な化合物をコンジュゲートさせた第2の抗体を添加する。当業者は、検出されるシグナルを増強するために改変および／または最適化しうるパラメータ、ならびに用いうるELISAの他の変形物に精通しているであろう（例えば、Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照）。

もう1つの例では、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3に対するNotch2／3抗体の特異的結合を、FACSを用いて決定しうる。FACSスクリーニングアッセイは、融合タンパク質として抗原を発現するcDNA構築物を作製する段階、構築物を細胞にトランスフェクトする段階、抗原を細胞の表面上に発現させる段階、Notch2／3抗体をトランスフェクトされた細胞と混合する段階、およびある時間にわたってインキュベートする段階を含みうる。抗体による結合を受けた細胞は、検出可能な化合物とコンジュゲートさせた二次抗体（例えば、PE結合抗Fc抗体）およびフローサイトメーターを用いることによって同定しうる。当業者は、検出されるシグナルを最適化するために改変しうるパラメーター、ならびにスクリーニング（例えば、遮断抗体に関するスクリーニング）を強化しうるFACSの他の変法について精通しているであろう。

Notch2／3抗体の結合親和性および抗体-抗原相互作用の結合-解離速度（on-off rate）は、競合結合アッセイによって決定することができる。いくつかの態様において、競合結合アッセイは、漸増量の非標識抗原の存在下における、標識抗原（例えば、³Hまたは¹²⁵I）またはその断片もしくは変異体と関心対象の抗体とのインキュベーションと、それに続く、標識抗原と結合した抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。抗原に対する抗体の親和性および結合-解離速度は、データからスキャッチャードプロット分析によって決定することができる。いくつかの態様においては、Biacore速度論的分析を用いて、抗体、またはNotch2および／またはNotch3と結合する抗体の結合親和性および結合-解離速度を決定する。Biacore速度論的分析は、Biacoreチップの表面上に固定化した抗原（例えば、Notchタンパク質）に対する抗原の結合およびそれからの解離を分析する段階を含む。いくつかの態様において、Biacore速度論的分析は、定性的エピトープ競合結合アッセイにおいて種々の抗体の結合を決定するために用いられる。

したがって、本発明は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9と結合する抗体を作製するための方法を提供する。いくつかの態様において、Notch2および／またはNotch3と結合する抗体を作製する方法は、ハイブリドーマ手法を用いる段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、マウスNotch2、マウスNotch3、ヒトNotch2、またはヒトNotch3の細胞外ドメインを免疫抗原として用いる段階を含む。いくつかの態様において、Notch2および／またはNotch3と結合する抗体を作製する方法は、ヒトファージライブラリーをスクリーニングする段階を含む。本発明はさらに、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と結合する抗体を同定する方法を提供する。いくつかの態様において、抗体は、フローサイトメトリー（FACS）による、Notch2および／またはNotch3に対する結合に関するスクリーニングによって同定される。いくつかの態様において、抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3に対する結合に関してスクリーニングされる。いくつかの態様において、抗体は、マウスNotch2および／またはマウスNotch3に対する結合に関してスクリーニングされる。いくつかの態様において、抗体は、Notch活性化の阻害または遮断に関するスクリーニングによって同定される。

ある態様において、本明細書に記載の抗体は単離される。ある態様において、本明細書に記載の抗体は実質的に純粋である。

ある種の抗Notch2／3抗体は、例えば、米国特許出願公開第2010／0111958号に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明のいくつかの態様において、Notch2／3抗体はポリペプチドである。ポリペプチドは、Notch2のEGFリピート10および／またはNotch3のEGFリピート9と結合する組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであってよい。当業者は、タンパク質の構造または機能に大きな影響を与えずにポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列を変化させうることを認識しているであろう。したがって、本ポリペプチドには、ヒトNotch2および／またはNotch3タンパク質のエピトープに対して実質的な結合活性を示す、ポリペプチドの変形物がさらに含まれる。いくつかの態様において、ポリペプチドのアミノ酸配列の変形物には、欠失、挿入、逆位、反復、および／または型置換が含まれる。

ポリペプチドおよびそれらの変異体は、通常はそのポリペプチドの部分ではない、さらなる化学的モイエティーを含有するようにさらに改変することができる。誘導体化されたモイエティーは、ポリペプチドの溶解性、生物学的半減期または吸収を向上させることができる。モイエティーはまた、ポリペプチドおよび変異体の何らかの望ましくない副作用を軽減するか、または消失させることもできる。そのような化学的モイエティーに関する概説は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PAに見いだすことができる。

本明細書に記載の単離されたポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適した方法によって生産することができる。そのような方法は、直接的なタンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードするDNA配列を構築して、そのような配列を適した宿主において発現させることまでの範囲にわたる。いくつかの態様において、DNA配列は、組換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、配列に、その機能的変異体を得るために部位特異的突然変異誘発によって突然変異を誘発させることもできる。

いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いる化学合成によって構築することができる。オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、組換え関心対象のポリペプチドが産生されると考えられる宿主細胞において好まれるコドンを選択することによって設計することができる。標準的な方法を適用して、関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することもできる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、続いて連結させることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的アセンブリのための5'および／または3'突出部を含有する。

ひとたびアセンブリが行われれば（合成、部位指定突然変異誘発、または別の方法によって）、関心対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、所望の宿主におけるポリペプチドの発現のために適切な発現制御配列と機能的に連結することができる。アセンブリの正しさは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および／または適した宿主における生物活性ポリペプチドの発現によって確認することができる。当技術分野において周知のように、宿主におけるトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るためには、遺伝子を、選択された発現宿主において機能する転写発現制御配列および翻訳発現制御配列と機能的に連結させなければならない。

ある態様においては、Notch2／3抗体またはその断片をコードするDNAの増幅および発現のために、組換え発現ベクターが用いられる。例えば、組換え発現ベクターは、抗Notch2／3抗体またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNA由来DNA断片が、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、または昆虫遺伝子に由来する適した転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントと機能的に連結されたものを有する、複製可能なDNA構築物であってよい。転写単位は一般に、（1）遺伝子発現において役割を果たす1つまたは複数の調節エレメント、例えば、転写プロモーターおよび／またはエンハンサー、（2）mRNAへと転写され、タンパク質へと翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに（3）適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列、のアセンブリを含む。調節エレメントには、転写を制御するためのオペレーター配列が含まれうる。複製起点によって通常付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子も組み入れることができる。DNA領域は、それらが互いに機能的に関連している場合に、「機能的に連結」されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてそれが発現されるならば、ポリペプチドのDNAと機能的に連結されており；プロモーターは、コード配列の転写を制御するならば、それと機能的に連結されており；またはリボソーム結合部位は、翻訳が可能となるように配置されているならば、コード配列と機能的に連結されている。酵母発現系における使用を目的とする構造エレメントには、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。または、組換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列も伴わずに発現される場合には、それはN末端メチオニン残基を含みうる。この残基は、任意で、最終産物を得るために、発現された組換えタンパク質から後に切り離されてもよい。

発現ベクターおよび制御エレメントの選択は宿主の選択に応じて決まる。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを利用することができる。真核生物宿主において有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主において有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えばpCR1、pBR322、pMB9およびそれらの誘導体などを含む大腸菌由来のプラスミド、ならびにより宿主範囲の広いプラスミド、例えばM13など、ならびに他の繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。

Notch2／3抗体（または抗原として用いるためのNotchタンパク質）の発現のために適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌が含まれる。高等真核細胞には、下記のような哺乳動物由来の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系を使用することもできる。

組換えタンパク質を発現させるために、さまざまな哺乳動物培養系または昆虫細胞培養系が用いられる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、そのようなタンパク質が一般に正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ生物学的に機能することから好まれることがある。適した哺乳動物宿主細胞株の例には、COS-7（サル腎臓由来）細胞株、L-929（マウス線維芽細胞由来）細胞株、C127（マウス乳腺腫瘍由来）細胞株、3T3（マウス線維芽細胞由来）細胞株、CHO（チャイニーズハムスター卵巣由来）細胞株、HeLa（ヒト子宮頸癌由来）細胞株、BHK（ハムスター腎臓線維芽細胞由来）細胞株、およびHEK-293（ヒト胚性腎臓由来）細胞株、ならびにそれらの変種が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適したプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、ならびに転写終結配列といった非転写性エレメントを含みうる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、当業者に周知である（例えば、Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47を参照）。

形質転換宿主によって産生されたタンパク質（例えば抗体）は、任意の適した方法に従って精製することができる。そのような方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性の差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な手法が含まれる。適切なアフィニティーカラムの通過による容易な精製を可能にするために、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼといったアフィニティータグをタンパク質に結び付けることができる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、核磁気共鳴（NMR）、およびX線結晶解析のような手法を用いて、物理的に特徴付けることができる。

例えば、組換えタンパク質を培地中に分泌する系からの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて、まず濃縮することができる。濃縮段階の後に、濃縮物を適した精製マトリックスに適用することができる。いくつかの態様においては、陰イオン交換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（DEAE）ペンダント基を有するマトリックスまたは基質を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に一般に使用される他の種類のものであってよい。いくつかの態様においては、陽イオン交換の段階を使用することができる。適した陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリックスが含まれる。いくつかの態様においては、セラミックハイドロキシアパタイト（CHT）を非限定的に含むハイドロキシアパタイト媒質が使用される。いくつかの態様においては、タンパク質をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒質（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する1つまたは複数の逆相HPLC段階が使用される。前述の精製段階のいくつかまたはすべてをさまざまな組み合わせで使用することにより、均質な組換えタンパク質を得ることができる。

いくつかの態様において、細菌培養で産生された組換えタンパク質は、例えば、まず細胞ペレットから抽出し、その後に1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィーの段階を行うことによって単離することができる。ある態様において、最後の精製段階にはHPLCが使用される。組換えタンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来の方法によって破壊することができる。

抗体および他のタンパク質の精製のための当技術分野において公知の方法には、例えば、米国特許出願公開第2008／0312425号；第2008／0177048号；および第2009／0187005号に記載されたものも含まれる。

タンパク質標的と高い親和性で結合する、抗体でないポリペプチドの同定および生産のための種々の方法が、当技術分野において公知である。例えば、Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304；Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27；Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol, 17:653-658；Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76；およびSkerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83を参照。ある態様においては、ファージディスプレイ技術を用いて、Notch2／3結合性ポリペプチドを生産および／または同定することができる。ある態様において、Notch2／3結合性ポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択される種類のタンパク質スカフォールドを含む。

ある態様において、Notch2／3抗体は、いくつかの結合形態（例えば、免疫結合体もしくは放射性結合体）または非結合形態のいずれか1つとして用いることができる。ある態様において、抗体は、CDCおよび／またはADCCを含む対象の天然の防御機構を利用して悪性細胞または癌細胞を排除するために、非結合形態で用いられる。

ある態様において、Notch2／3抗体は細胞傷害性物質とコンジュゲートされる。いくつかの態様において、細胞傷害性物質は、メトトレキサート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレート剤を非限定的に含む化学療法薬である。いくつかの態様において、細胞傷害性物質は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ニガウリ（Momordica charantia）インヒビター、クルシン、クロチン、サボンソウ（Sapaonaria officinalis）インヒビター、ゲロニン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを非限定的に含む、細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素活性を有する毒素、またはその断片である。ある態様において、細胞傷害性物質は、放射線結合体または放射線結合抗体を生成させるための放射性同位体である。放射性結合抗体の生成のためには、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹³¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Reおよび²¹²Biを非限定的に含む、種々の放射性核種を利用することができる。抗体と1つまたは複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテン、およびCC1065、ならびにこれらの毒素の毒素活性を有する誘導体との結合体を用いることもできる。抗体と細胞傷害性物質との結合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルチオール（pyridyidithiol）)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能基誘導体（ジメチルアジプイミダートHCLなど）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス-アジド化合物（ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン2,6-ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなど）といった、種々の二官能基性タンパク質カップリング剤を用いて作り出される。

ヘテロ結合体抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロ結合体抗体は、共有結合性に接続された2つの抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化する目的で提案されている（米国特許第4,676,980号）。この抗体は、架橋剤を必要とする方法を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を用いて、インビトロで調製しうると想定している。

III. ポリヌクレオチド
ある態様において、本発明は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／もしくはヒトNotch3のEGFリピート11と特異的に結合するポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを範囲に含む。「あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列だけを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを範囲に含む。例えば、本発明は、ヒトNotch2および／もしくはヒトNotch3に対する抗体をコードするか、またはそのような抗体の断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態にあってもよく、DNAの形態にあってもよい。DNAにはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれ、これらは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖である場合はコード鎖でも非コード（アンチセンス）鎖でもよい。

ある態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）と同じリーディングフレームで融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、宿主細胞によって切断されて成熟型ポリペプチドを生じるリーダー配列を有しうる。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質にさらなる5'アミノ酸残基が付加されたプロタンパク質をコードすることもできる。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、不活性型のタンパク質である。プロ配列がひとたび切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。

ある態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの精製および／または同定を可能にするマーカー配列と同じリーディングフレームで融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、細菌宿主の場合、マーカー配列は、マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するための、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであってもよく、または哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が用いられる場合、マーカー配列はインフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素（HA）タグであってもよい。いくつかの態様において、マーカー配列はFLAGタグ、すなわち配列DYKDDDDK（SEQ ID NO：25）のペプチドであり、これを他のアフィニティータグとともに用いてもよい。

本発明はさらに、例えば、断片、類似体および／または誘導体をコードする、上記のポリヌクレオチドの変異体にも関する。

ある態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8およびSEQ ID NO：9からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：18からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プラスミドは、SEQ ID NO：17を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、プラスミドは、SEQ ID NO：18を含むポリヌクレオチドを含む。

ある態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：18からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも80％同一な、少なくとも85％同一な、少なくとも90％同一な、少なくとも95％同一な、さらにいくつかの態様においては、少なくとも96％、97％、98％または99％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。また、SEQ ID NO：17またはSEQ ID NO：18とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある態様において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシーの条件下である。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：18を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

ある態様において、本明細書は、本明細書に記載の抗体、またはその断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも80％同一な、少なくとも85％同一な、少なくとも90％同一な、少なくとも95％同一な、さらにいくつかの態様においては、少なくとも96％、97％、98％または99％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。

本明細書で用いる場合、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95％「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという語句は、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチド毎に最大5個までの点突然変異をポリヌクレオチド配列が含みうることを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味するものとする。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列のヌクレオチドの最大5％までが欠失するか、もしくは別のヌクレオチドで置換されてもよく、または参照配列における全ヌクレオチドの最大5％までのいくつかのヌクレオチドが参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端の位置または末端位置間の任意の場所に存在してもよく、参照配列の中のヌクレオチドの間に個々に、または参照配列内の1つもしくは複数の連続した群として分散してもよい。

ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方に変化を含有しうる。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるものの、コードされるポリペプチドの性質または活性を変えない変化を含有する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変異体は、遺伝暗号の縮重による「サイレントな」置換を含有する。ポリヌクレオチド変異体は、さまざまな理由で、例えば、特定の宿主に向けてコドン発現を最適化するように作製することができる（例えば、ヒトmRNAのコドンを、大腸菌などの細菌宿主に好まれるコドンに変える）。

ある態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは単離される。ある態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは実質的に純粋である。

本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターおよび細胞も提供される。

IV．使用方法および薬学的組成物
本発明は、ヒト患者における癌を、本明細書に記載のNotch2／3抗体を用いて治療するための方法を提供する。本発明の1つの局面は、ヒト患者における癌を治療するための方法であって、（a）患者に対してNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対してNotch2／3抗体の少なくとも1回の追加用量を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対してNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対してNotch2／3抗体の少なくとも2回の追加用量を第1の投薬頻度で投与する段階；および（c）患者に対してNotch2／3抗体の少なくとも1回のさらなる追加用量を第2の投薬頻度で投与する段階を含む。Notch2／3抗体のより高い血中レベルをより早い時点で達成することは、疾患安定、部分寛解または完全寛解の患者を増やすことにつながる可能性がある。これを可能にするレジメンには、より高い初回用量に続いて、追加用量を低下したレベルで用いること；初期の時点でより高い初回用量および高い投薬頻度を用いること；ならびに／または初回用量を高い投薬頻度で用いることが含まれる。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対してNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対してNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含む。

本発明によれば、1回または複数回の初回用量に続いて、同量またはより少量のNotch2／3抗体という追加用量を、抗体を有効な標的レベルまたはそれを上回って維持するのに十分な間隔で投与する。いくつかの態様において、初回用量は「初回負荷用量」と称してもよい。いくつかの態様において、追加用量は「維持用量」と称してもよい。用量間の間隔は、1週間またはそれ未満、約2週間、約3週間、または約4週間であってよいが、それらには限定されない。いくつかの態様において、治療の初期の週における初回用量が高いか、または投薬頻度が多いことには、治療中のより早期に目標血清中薬物濃度に到達することによって有効性が高まるという利点がある。

ある態様において、第1の追加用量は初回用量の約1週間後に投与される。他の態様において、第1の追加用量は初回用量の約2週間後に投与される。他の態様において、第1の追加用量は初回用量の約3週間後に投与される。他の態様において、第1の追加用量は初回用量の約4週間後に投与される。いくつかの態様において、（b）における追加用量は、1週間またはそれ未満に約1回の投薬頻度で投与される。いくつかの態様において、（b）における追加用量は、2週間毎に約1回の投薬頻度で投与される。いくつかの態様において、（c）における追加用量は、2週間毎に約1回の投薬頻度で投与される。いくつかの態様において、（c）における追加用量は、3週間毎に約1回の投薬頻度で投与される。

いくつかの態様において、追加用量は、初回用量とほぼ同量またはそれ未満である。他の態様において、追加用量は初回用量よりも上回る量である。当業者には公知であるように、用いられる用量は、達成しようとする臨床的目標に依存すると考えられる。いくつかの態様において、初回用量は約1mg／kg〜約20mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量は約2、3、4、5、6、7、8、9、10、1 1、12、13、14、15、16、17、18、19、または20mg／kgである。ある態様において、初回用量は約2.5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約7.5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約10mg／kgである。ある態様において、初回用量は約12.5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約15mg／kgである。ある態様において、初回用量は約20mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約2mg／kg〜約15mg／kgである。ある態様において、追加用量は約2、3、4、5、6、7、8、9、10、1 1、12、13、14、または15mg／kgである。ある態様において、追加用量は約2.5mg／kgである。ある態様において、追加用量は約5mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約7.5mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約10mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約12.5mg／kgである。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体の初回用量は、2.5mg／kg、5mg／kg、7.5mg／ml、または10mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は、2.5mg／kg、5mg／kg、7.5mg／ml、または10mg／kgであり、週1回投与される。いくつかの態様において、追加用量は、2.5mg／kg、5mg／kg、7.5mg／ml、または10mg／kgであり、2週間毎に1回投与される。いくつかの態様において、追加用量は、2.5mg／kg、5mg／kg、7.5mg／ml、または10mg／kgであり、3週間毎に1回投与される。

いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約10mg／kgまたはそれ未満であるNotch2／3抗体の初回用量を投与し、続いて約10mg／kgまたはそれ未満という1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約7.5mg／kgまたはそれ未満であるNotch2／3抗体の初回用量を投与し、続いて約7.5mg／kgまたはそれ未満という1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約5mg／kgまたはそれ未満であるNotch2／3抗体の初回用量を投与し、続いて約5mg／kgまたはそれ未満という1回または複数回の追加用量を投与する段階を含む。

いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の2回の追加用量を週に約1回投与する段階；および（c）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体のさらなる追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含む。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体は固定用量として投与される。いくつかの態様において、用量は約2000mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約1500mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は約1000mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は600mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は300mgまたはそれ未満である。いくつかの態様において、用量は150mgまたはそれ未満である。

当業者には公知であるように、いかなる治療薬の投与も、副作用および／または毒性をもたらすことがある。場合によっては、副作用および／または毒性は、治療的有効用量での特定の薬剤の投与を不可能にするほど重篤である。場合によっては、薬物治療を中断しなければならず、他の薬剤を試すことになる。しかし、同じ治療クラスの多くの薬剤は類似の副作用および／または毒性を示すことが多く、このことは、患者が治療法を中止しなければならないか、または可能であったとしても、その治療薬に関連した不快な副作用に悩まされることを意味する。

治療薬による副作用には、蕁麻疹、皮疹、掻痒感、悪心、嘔吐、食欲減退、下痢、悪寒、発熱、疲労、筋痛および筋肉痛、頭痛、低血圧、高血圧、低カリウム血症、血球数減少、出血、ならびに心臓障害が非限定的に含まれる。

したがって、本発明の1つの局面は、患者における癌を治療する方法であって、Notch2／3抗体の投与に関連した副作用および／または毒性を軽減しうる間欠的投薬レジメンを用いてNotch2／3抗体を投与する段階を含む方法を対象とする。本明細書で用いる場合、「間欠的投薬」とは、週1回を上回る間隔での投薬、例えば、2週間毎に1回、3週間毎に1回、4週間毎に1回といった投薬を用いる投薬レジメンのことを指す。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体の有効用量を間欠的投薬レジメンに従って投与する段階を含む。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体の有効用量を間欠的投薬レジメンに従って投与する段階、およびNotch2／3抗体の治療指数を高める段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体の初回用量を患者に投与する段階、およびNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体の初回用量を患者に投与する段階、およびNotch2／3抗体の追加用量を3週間毎に約1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、Notch2／3抗体の初回用量を患者に投与する段階、およびNotch2／3抗体の追加用量を4週間毎に約1回投与する段階を含む。

いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンにおける追加用量は、初回用量とほぼ同量またはそれ未満である。他の態様において、追加用量は初回用量よりも上回る量である。当業者には公知であるように、用いられる用量は、達成しようとする臨床的目標に依存すると考えられる。いくつかの態様において、初回用量は約1mg／kg〜約20mg／kgである。いくつかの態様において、初回用量は約2、3、4、5、6、7、8、9、10、1 1、12、13、14、15、16、17、18、19、または20mg／kgである。ある態様において、初回用量は約2.5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約7.5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約10mg／kgである。ある態様において、初回用量は約12.5mg／kgである。ある態様において、初回用量は約15mg／kgである。ある態様において、初回用量は約20mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約2mg／kg〜約15mg／kgである。ある態様において、追加用量は約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15mg／kgである。ある態様において、追加用量は約2.5mg／kgである。ある態様において、追加用量は約5mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約7.5mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約10mg／kgである。いくつかの態様において、追加用量は約12.5mg／kgである。

いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約2.5mg／kgである追加用量を2週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約5mg／kgである追加用量を2週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約7.5mg／kgである追加用量を2週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約2.5mg／kgである追加用量を3週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約5mg／kgである追加用量を3週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約7.5mg／kgである追加用量を3週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約2.5mg／kgである追加用量を4週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約5mg／kgである追加用量を4週間毎に1回投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠的投薬レジメンは、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階、および（b）約7.5mg／kgである追加用量を4週間毎に1回投与する段階を含む。ある態様において、初回用量と維持用量は異なり、例えば、初回用量は約5mg／kgであり、追加用量は約2.5mg／kgである。ある態様において、間欠的投薬レジメンは初回負荷用量を含んでよく、例えば、初回用量は約20mg／kgであり、追加用量は約2.5mg／kgまたは約5mg／kgであって、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または4週間毎に1回投与される。

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を2週間毎に1回投与する段階、およびこの投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を2週間毎に1回投与する段階、およびこの投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を2週間毎に1回投与する段階、およびこの投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を3週間毎に1回投与する段階、およびこの投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を3週間毎に1回投与する段階、およびこの投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の用量を3週間毎に1回投与する段階、およびこの投与を合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって繰り返す段階を含む。いくつかの態様において、投与は4サイクルにわたって繰り返される。いくつかの態様において、投与は5サイクルにわたって繰り返される。いくつかの態様において、投与は6サイクルにわたって繰り返される。いくつかの態様において、投与は7サイクルにわたって繰り返される。いくつかの態様において、投与は8サイクルにわたって繰り返される。

本発明のもう1つの局面は、ヒト患者におけるNotch2／3抗体の毒性を軽減するための方法であって、患者に対してNotch2／3抗体を間欠的投薬レジメンを用いて投与する段階を含む方法を対象とする。本発明のもう1つの局面は、ヒト患者におけるNotch2／3抗体の副作用を軽減するための方法であって、患者に対してNotch2／3抗体を間欠的投薬レジメンを用いて投与する段階を含む方法を対象とする。本発明のもう1つの局面は、ヒト患者におけるNotch2／3抗体の治療指数を高めるための方法であって、患者に対してNotch2／3抗体を間欠的投薬レジメンを用いて投与する段階を含む方法を対象とする。

いくつかの態様において、Notch2／3抗体の毒性を軽減するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体を約2.5mg／kgの用量で2週間毎に1回投与する段階を含み、ここで下痢が軽減される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体の毒性を軽減するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体を約5mg／kgの用量で2週間毎に1回投与する段階を含み、ここで下痢が軽減される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体の毒性を軽減するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体を約7.5mg／kgの用量で2週間毎に1回投与する段階を含み、ここで下痢が軽減される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体の毒性を軽減するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体を約2.5mg／kgの用量で3週間毎に1回投与する段階を含み、ここで下痢が軽減される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体の毒性を軽減するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体を約5mg／kgの用量で3週間毎に1回投与する段階を含み、ここで下痢が軽減される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体の毒性を軽減するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体を約7.5mg／kgの用量で3週間毎に1回投与する段階を含み、ここで下痢が軽減される。

初回用量および追加用量に関する送達方法の選択は、動物またはヒト患者が体内へのNotch2／3抗体の導入に耐える能力に応じて行われる。したがって、本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、Notch2／3抗体の投与は静脈内注射によるか、または静脈内へのものであってよい。いくつかの態様において、投与は静脈内注入による。本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいて、Notch2／3抗体の投与は非静脈内経路によるものでよい。

本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいては、癌を治療するための方法であって、癌が以下のものからなる群より選択される方法が提供される：肺癌、神経膠腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、多形性神経膠芽腫、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、腺様嚢胞癌、肝癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、および頭頸部癌。いくつかの態様において、癌は膵臓癌である。いくつかの態様において、癌は結腸癌または結腸直腸癌である。いくつかの態様において、癌は卵巣癌である。いくつかの態様において、癌は肺癌である。

本明細書に記載の局面および／または態様の任意のものにおいては、患者に対してNotch2／3抗体を投与することによって癌を治療するための方法が提供される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2のEGFリピート10および／またはヒトNotch3のEGFリピート9と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、配列HKGAL（SEQ ID NO：23）の少なくとも一部と特異的に結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は配列HEDAI（SEQ ID NO：24）の少なくとも一部と結合する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2および／またはヒトNotch3と、約10nM〜約0.1nMまたはそれ未満の解離定数（K_D）で結合する。

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、SEQ ID NO：5を含む重鎖可変領域およびSEQ ID NO：9を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はSEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：3を含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はSEQ ID NO：8をさらに含む。いくつかの態様において、Notch2／3抗体はSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：8を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、寄託番号PTA-9547またはPTA-10170を有する、ATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と同じ重鎖アミノ酸配列および軽鎖アミノ酸配列を含む。ある態様において、Notch2／3抗体は、ブダペスト条約の規定に基づいて2008年10月15日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110に寄託された、ATCC寄託番号PTA-9547を有するプラスミドによってコードされる。ある態様において、Notch2／3抗体は、ブダペスト条約の規定に基づいて2009年7月6日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）, 10801 University Boulevard，Manassas，VA，20110に寄託された、ATCC寄託番号PTA-10170を有するプラスミドによってコードされる。ある態様において、Notch2／3抗体は、ヒトNotch2／3に対する特異的結合をめぐって、寄託番号PTA-10170またはPTA-9547を有する、ATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と競合する。

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；（b）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体の2回の追加用量を週に約1回投与する段階；および（c）患者に対して約2.5mg／kgであるNotch2／3抗体のさらなる追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体の有効用量を間欠的投薬レジメンに従って投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、患者に対してNotch2／3抗体の有効用量を間欠的投薬レジメンに従って投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約10mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約10mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約10mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約10mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を2週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して少なくとも約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を3週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む。ある態様において、ヒト患者における癌を治療するための方法は、（a）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の初回用量を投与する段階；および（b）患者に対して約7.5mg／kgであるNotch2／3抗体の追加用量を3週間毎に約1回投与する段階を含み、ここでNotch2／3抗体は、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

いくつかの態様において、癌を治療する方法は、約2.5mg／kg、約5mg／kgまたは約10mg／kgであるNotch2／3抗体の用量の投与を含む。例えば、抗体OMP-59R5を、5％デキストロースを含む水（USP）に希釈して総容積を250mLとする。OMP-59R5を0.22ミクロンフィルターに通して、静脈内注入として30分間かけて送達する。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または4週間毎に1回投与される。

本発明のもう1つの局面において、本明細書に記載の方法は、少なくとも1つのさらなる治療薬を投与する段階をさらに含みうる。さらなる治療薬は、Notch2／3抗体の投与の前、それと同時、および／またはその後に投与することができる。Notch2／3抗体とさらなる治療薬とを含む薬学的組成物も提供される。いくつかの態様において、少なくとも1つのさらなる治療薬は、1種、2種、3種またはそれを上回るさらなる治療薬を含む。

少なくとも2つの治療薬との併用療法では、必須ではないものの、異なる作用機序によって働く薬剤を用いることが多い。異なる作用機序を有する薬剤を用いる併用療法は、相加効果または相乗効果をもたらしうる。併用療法は、単剤療法において用いられるよりも各薬剤の用量を低くすることを可能にし、それによって副作用および／または毒性を軽減することができる。併用療法は、耐性癌細胞が生じる可能性を減らすことができる。いくつかの態様において、併用療法は、非腫瘍形成性細胞に主として影響を及ぼす（例えば、阻害する、または死滅させる）治療薬、および腫瘍形成性CSCに主として影響を及ぼす（例えば、阻害する、または死滅させる）治療薬で構成される。

Notch2／3抗体とさらなる治療薬との組み合わせが、任意の順序で、または並行して投与されうることは理解されるであろう。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、第2の治療薬による治療を以前に受けたことがある患者に投与される。他のある態様において、Notch2／3抗体および第2の治療薬は、実質的に同時に、または並行して投与される。例えば、対象は、第2の治療薬による治療過程（例えば、化学療法）を受けると同時に、Notch2／3抗体の投与を受けてもよい。ある態様において、Notch2／3抗体は、第2の治療薬による治療から1年以内に投与される。ある代替的な態様において、Notch2／3抗体は、第2の治療薬による何らかの治療から10カ月以内、8カ月以内、6カ月以内、4カ月以内、または2カ月以内に投与される。他のある態様において、Notch2／3抗体は、第2の治療薬による何らかの治療から4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内に投与される。いくつかの態様において、Notch2／3抗体は、第2の治療薬による何らかの治療から5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内に投与される。さらに、2種（またはそれを上回る）薬剤または治療を、数時間以内または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）対象に投与しうることは理解されるであろう。

有用なクラスの治療薬には、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害薬、アルキル化剤（例えば、白金錯体、例えばシスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）、および三核白金錯体、ならびにカルボプラチンなど）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害薬、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある態様において、第2の治療薬は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害薬、または血管新生阻害薬である。いくつかの態様において、第2の治療薬は、カルボプラチンまたはシスプラチンなどの白金錯体である。いくつかの態様において、さらなる治療薬は、白金錯体とタキサンとの組み合わせである。ある態様において、さらなる治療薬は降圧薬である。ある態様において、さらなる治療薬は、ゲムシタビンなどの代謝拮抗薬である。

Notch2／3抗体と組み合わせて投与しうる治療薬には、化学療法薬が含まれる。したがって、いくつかの態様において、前記の方法または治療は、本発明のNotch2／3抗体と、化学療法薬または複数の異なる化学療法薬のカクテルとの併用投与を伴う。Notch2／3抗体による治療は、化学療法の投与の前に、それと同時に、またはその後に行うことができる。併用投与には、単一の薬学的製剤の形での、もしくは別個の製剤を用いるかのいずれかによる同時投与、またはいずれの順番でもよいが一般に、活性薬剤のすべてがそれらの生物活性を同時に発揮しうる期間内での連続投与が含まれうる。そのような化学療法薬の調製および投薬スケジュールは、製造元の説明書に従って、または当業者によって経験的に決定されるように用いることができる。そのような化学療法に関する調製および投薬スケジュールは、The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PAにも記載されている。

本発明において有用な化学療法薬には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（シトキサン（CYTOXAN））など；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）など；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン（trimethylolomelamime）を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（methylamelamine）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FUなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補給剤、例えば、フォリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK；ラゾキサン；シゾフィラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポプロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；タキソイド、例えば、パクリタキセル（タキソール（TAXOL））およびドセタキセル（タキソテール（TAXOTERE））；クロランブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸；CPT11；トポイソメラーゼ阻害薬RFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン（XELODA）；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が非限定的に含まれる。化学療法薬にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン薬、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン（FARESTON））を含む抗エストロゲン薬；ならびに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。ある態様において、さらなる治療薬はゲムシタビンである。ある態様において、さらなる治療薬はシスプラチンである。ある態様において、さらなる治療薬はカルボプラチンである。ある態様において、さらなる治療薬はパクリタキセルである。

ある態様において、化学療法薬はトポイソメラーゼ阻害薬である。トポイソメラーゼ阻害薬は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼIまたはII）の作用を妨害する化学療法薬である。トポイソメラーゼ阻害薬には、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド（VM-26）、およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が非限定的に含まれる。ある態様において、さらなる治療薬はイリノテカンである。いくつかの態様において、さらなる治療薬はエトポシドである。

ある態様において、化学療法薬は代謝拮抗薬である。代謝拮抗薬は、正常な生化学反応に必要な代謝産物に類似しているものの、細胞の1つまたは複数の正常機能、例えば細胞分裂を妨害するには十分な程度に異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗薬には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が非限定的に含まれる。ある態様において、さらなる治療薬はゲムシタビンである。いくつかの態様において、さらなる治療薬はペメトレキセドである。ある態様において、Notch2／3抗体と組み合わせて投与される化学療法薬がゲムシタビンである場合、治療される癌または腫瘍は膵臓癌または膵臓腫瘍である。ある態様において、Notch2／3抗体と組み合わせて投与される化学療法薬がペメトレキセドである場合、治療される癌または腫瘍は肺癌または肺腫瘍である。

ある態様において、化学療法薬は、チューブリンと結合する薬剤を非限定的に含む有糸分裂阻害薬である。いくつかの態様において、薬剤はタキサンである。ある態様において、薬剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体である。ある態様において、薬剤は、パクリタキセル（タキソール（TAXOL））、ドセタキセル（タキソテール（TAXOTERE））、アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン（ABRAXANE））、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。ある代替的な態様において、有糸分裂阻害薬には、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシンなど、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体が含まれる。いくつかの態様において、有糸分裂阻害薬は、キネシンEg5の阻害薬、またはAuroraAもしくはPlk1といった分裂期キナーゼの阻害薬である。ある態様において、Notch2／3抗体と組み合わせて投与される化学療法薬が有糸分裂阻害薬である場合、治療される癌または腫瘍は乳癌または乳房腫瘍である。いくつかの態様において、Notch2／3抗体と組み合わせて投与される化学療法薬がパクリタキセルである場合、治療される癌または腫瘍は卵巣癌または卵巣腫瘍である。

いくつかの態様において、さらなる治療薬は、2種またはそれを上回る化学療法薬を含む。いくつかの態様において、さらなる治療薬はゲムシタビンおよびアルブミン結合パクリタキセルを含む。いくつかの態様において、さらなる治療薬はエトポシドおよびシスプラチンを含む。いくつかの態様において、さらなる治療薬は、エトポシド、シスプラチンおよびアルブミン結合パクリタキセルを含む。

いくつかの態様において、さらなる治療薬は、小分子などの薬剤を含む。例えば、治療は、本発明のNotch2／3抗体と、EGFR、ErbB2、HER2、および／またはVEGFを非限定的に含む、さらなる腫瘍関連タンパク質に対する阻害薬として作用する小分子との併用投与を伴うことができる。ある態様において、さらなる治療薬は、癌幹細胞経路を阻害する小分子である。いくつかの態様において、さらなる治療薬はNotch経路の小分子阻害薬である。いくつかの態様において、さらなる治療薬はWnt経路の小分子阻害薬である。いくつかの態様において、さらなる治療薬はBMP経路の小分子阻害薬である。いくつかの態様において、さらなる治療薬は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する小分子である。

いくつかの態様において、さらなる治療薬は、抗体などの生体分子を含む。例えば、治療は、本発明のNotch2／3抗体と、EGFR、ErbB2、HER2、および／またはVEGFと結合する抗体を非限定的に含む、さらなる腫瘍関連タンパク質に対する他の抗体との併用投与を伴うことができる。ある態様において、さらなる治療薬は、抗癌幹細胞マーカー抗体である抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療薬は、Notch経路のさらなる構成要素と結合する抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療薬は、Wnt経路の構成要素と結合する抗体である。ある態様において、さらなる治療薬は、癌幹細胞経路を阻害する抗体である。いくつかの態様において、さらなる治療薬はNotch経路の抗体阻害薬である。いくつかの態様において、さらなる治療薬はWnt経路の抗体阻害薬である。いくつかの態様において、さらなる治療薬はBMP経路の抗体阻害薬である。いくつかの態様において、さらなる治療薬は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する抗体である。ある態様において、さらなる治療薬は、血管新生の阻害薬またはモジュレーターである抗体（例えば、抗VEGF抗体または抗VEGF受容体抗体）である。ある態様において、さらなる治療薬は、ベバシズマブ（アバスチン（AVASTIN））、トラスツズマブ（ハーセプチン（HERCEPTIN））、パニツムマブ（ベクチビックス（VECTIBIX））、またはセツキシマブ（アービタックス（ERBITUX））である。併用投与は、単一の薬学的製剤の形での、もしくは別個の製剤を用いるかのいずれかによる同時投与、またはいずれの順番でもよいが一般に、活性薬剤のすべてがそれらの生物活性を同時に発揮しうる期間内での連続投与が含まれうる。

その上、本明細書に記載のNotch2／3抗体による治療は、1つもしくは複数のサイトカイン（例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および／または増殖因子）といった他の生体分子との併用治療も含むことができ、または、腫瘍、癌細胞の外科的除去、もしくは治療に当たる医師によって必要と判断される他の任意の治療法を伴うこともできる。

ある態様において、治療は、放射線療法と組み合わせた本発明のNotch2／3抗体の投与を伴う。Notch2／3抗体による治療は、放射線療法の施行の前に、それと同時に、またはその後に行うことができる。医療の当業者は、そのような放射線療法の施行スケジュールを決定することができる。

本開示の態様の範囲を、癌の治療のためのNotch2／3抗体の使用について説明している以下の非限定的な実施例を参照することによって、さらに定めることができる。本開示の範囲から逸脱することなく、材料および方法の両方に対して多くの変更を加えうることは当業者には明白であろう。

実施例1
膵臓異種移植モデルにおける抗Notch2／3抗体OMP-59R5の間欠的投薬および腫瘍成長に対する効果
OMP-PN8膵臓腫瘍細胞（50,000個）を、6〜8週齢のNOD／SCIDマウスに皮下注射した。マウスを複数の群にランダム化した上で（各群当たりn＝10匹）、抗Notch2／3抗体OMP-59R5、ゲムシタビン、OMP-59R5とゲムシタビンの組み合わせ、または対照抗体を投与した。OMP-59R5は40mg／kgの用量で、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または4週間毎に1回投与した。ゲムシタビンは毎週10mg／kgの用量で投与し、対照抗体は40mg／kgの用量で週1回投与した。薬剤は腹腔内に投与した。腫瘍体積は指定された日に電子キャリパーを用いて測定した。

図1に示されているように、単剤として投与した場合、OMP-59R5は、2週間毎に1回または3週間毎に1回のいずれかとして投薬した時に単剤活性を示した。ゲムシタビンと組み合わせた2週間毎または3週間毎のOMP-59R5の投薬も有効であり、個のモデルにおける腫瘍成長を完全に阻害したように思われた（図1Aおよび図1B）。これらの結果は、抗Notch2／3抗体治療の有効性が、特にゲムシタビンなどの化学療法薬と組み合わせた場合に、間欠的投薬レジメンによって維持されることを実証している。OMP-59R5の半減期が短いことを考慮すれば、2週間毎に1回または3週間毎に1回といった、より長い間隔での間欠的投薬がそのように有効であると考えられることは、驚くべきことであり、かつ予想外のことである。

実施例2
膵臓異種移植モデルにおける抗Notch2／3抗体OMP-59R5の間欠的投薬および遺伝子発現に対する効果
実施例1に記載した試験によるOMP-PN8膵臓腫瘍を、対照抗体およびOMP-59R5を投与したマウスから採取した。OMP-PN8異種移植腫瘍から得た全RNAに対して、定量的リアルタイムRT-PCRを行った。腫瘍標本を採取し、直ちに急速凍結した上で、RNA単離を行うまで-80℃で貯蔵した。製造元のプロトコールに従って、RNeasy Fibrous Mini Kit（Qiagen, Valencia CA, PN# 74704）をTissueLyzerホモジナイゼーションおよびDNアーゼI処理とともに用いて、全RNAを抽出した。RNAをBioanalyzer 2100（Agilent, Santa Clara, CA）で描出し、RIN値が6.0を上回ることによって無傷であることを確かめた。RNAはすべて、A260／A280比が1.8を上回った。

リアルタイムRT-PCRは二段階様式で行った。まず、Applied Biosystems User Bulletin 2に記載されたようにランダムヘキサマーを用いて、全RNAからcDNAを合成した。TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems, Foster City, CA. カタログ番号4304437および4326708）を、製造元のプロトコールに従って、その後のリアルタイムRT-PCR反応に用いた。遺伝子発現の相対量は、相対的標準曲線、または3回ずつ行った反応による閾値比較法を用いて決定した。遺伝子発現の変化は18Sに対して標準化した。マウス遺伝子特異的なプライマーおよびプローブは、Primer Express v2ソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて設計した。

結果を、2種のヒト腫瘍遺伝子CD201およびNANOG、ならびに2種のマウス間質遺伝子Rgs5およびHeyLに関して示している。図2に示されているように、59R5を2週間毎に1回および3週間毎に1回投与した腫瘍では、対照抗体を週1回投与した腫瘍と比較して、CD201およびNANOGの遺伝子発現が大きく低下した。59R5を4週間毎に1回投与した腫瘍においても遺伝子発現は低下したが、その程度はより小さかった。59R5を2週間毎に1回および3週間毎に1回投与した腫瘍では、マウス遺伝子Rgs5およびHeyLの遺伝子発現も大きく低下したが、59R5を4週間毎に1回投与した腫瘍では遺伝子発現が低下しなかった。これらの結果は、2週間毎、3週間毎、または4週間毎という間欠的投薬の長期間にわたる薬力学的効果を示唆している。OMP-59R5の流血中での半減期は比較的短いことから、これは驚くべきこと、および／または予想外のことである。

実施例3
膵臓腫瘍における抗Notch2／3抗体OMP-59R5による遺伝子発現の動態
OMP-PN8膵臓腫瘍細胞を、6〜8週齢のNOD／SCIDマウスに皮下注射した。179mm³という平均体積が達成されるまで腫瘍を成長させた。マウスを2群（各群当たりn＝25匹）にランダム化して、抗Notch2／3抗体OMP-59R5または対照抗体を投与した。マウスには、OMP-59R5または対照抗体のいずれかを40mg／kgの単回用量として腹腔内投与した。1日、3日、7日、14日および21日の時点で、マウス（n＝5）から腫瘍を採取した。腫瘍標本を採取し、直ちに急速凍結した上で、RNA単離を行うまで-80℃で貯蔵した。リアルタイムRT-PCRを上記の通りに行った。

ヒト腫瘍遺伝子CD201、NANOG、OCT4、ID1、NOTCH3、SOX2、RARRES1、BMPR1B、およびNOTCH2、ならびにマウス間質遺伝子Rgs5、HeyL、およびNotch3に関する結果を図3A〜3Cに示している。ヒトCD201遺伝子、NANOG遺伝子、OCT1遺伝子、ID1遺伝子およびNOTCH3遺伝子の発現は、第21日の時点までに大きく減少した。マウスRgs5遺伝子、HeyL遺伝子およびNotch3遺伝子の発現も、第21日の時点までに大きく減少した。これらのデータは、OMP-59R5治療が投薬後最長で3週間持続する長期間にわたる薬力学的効果を有することを示しているとともに、間欠的投薬レジメンの有効性の原因となる機序を提示している。

実施例4
第1相試験
進行期固形腫瘍に対する治療を以前に受けた患者における抗Notch2／3抗体OMP-59R5のオープンラベル第1相用量漸増試験を実施した。試験登録の時点で、これらの患者には、標準的な治癒療法も延命効果が実証されている治療法も残されていなかった。試験エンドポイントには、安全性プロフィール、薬物動態（PK）、免疫原性、薬力学（PD）、予備的有効性、および最大耐量（MTD）の判定を含めた。登録の前に、患者は試験への適格性を判定するためのスクリーニングを受けた。表1に患者背景をまとめている。

試験の初期段階では、OMP-59R5の最大耐量を決定するための用量漸増を行った。薬物は、疾患の進行を認めるか、または忍容性が許容されなくなるまで、0.5、1.0、2.5および5mg／kgの用量レベルで週1回；5、7.5および10mg／kgの用量レベルで2週間毎に1回；ならびに7.5mg／kgの用量レベルで3週間毎に1回静脈内投与した。個々の用量コホート内では用量の漸増も減少も行わないこととした。用量規定毒性（DLT）が観察されなければ、各用量レベルで患者3人ずつに投与を行った。患者3人のうち1人がDLTをきたした場合には、その用量レベルの範囲を患者6人に拡張した。2人またはそれを上回る患者がDLTをきたした場合には、そのレベルではそれ以上の患者には投薬を行わず、その用量レベルで患者6人に投与していない限り、さらに3人の患者を前の用量コホートに加えた。OMP-59R5の1回目の用量の投与後28日間にわたって患者をDLTに関して評価した。MTDは、被験者6人のうち2人未満でDLTが認められた最大用量レベルと定義した。DLTは、24時間以内に解消したグレード3の注入反応、標準的な内科療法に48時間以内に反応したグレード3の下痢、悪心、および／または嘔吐、ならびに24時間以内に補正に反応したグレード3の電解質障害を除く、グレード3またはそれを上回るあらゆる有害事象と定義した。

2012年11月17日のデータカットオフ日の時点で、試験中に4件のDLTが観察された。週1回、5mg／kgの用量レベルでは、患者2人がDLTをきたした（1人はグレード3の下痢を背景にしたグレード3の低カリウム血症であり、1人はグレード3の下痢であった）；隔週1回、10mg／kgの用量レベルでは、2件のDLT（いずれもグレード3の下痢）が起こった。グレード4の治療関連有害事象は報告されなかった。2012年11月17日のデータカットオフ日の時点での治療関連有害事象を表2にまとめ、グレード3〜5を含むすべての関連有害事象を表3にまとめている。

*ALT＝アラニンアミノトランスフェラーゼ

*ALT＝アラニンアミノトランスフェラーゼ

MTDは、週1回の投薬では2.5mg／kg、2週間毎の投薬では7.5mg／kg、および3週間毎の投薬では7.5mg／kgであると確定された。これらの結果は、間欠的投薬により、OMP-59R5のより高い用量での投与を、高い忍容性で行えることを示している。

この試験により、OMP-59R5が進行期固形腫瘍を有する患者において十分な忍容性があることが示された。用量規定毒性は下痢であったが、杯細胞におけるNotchシグナル伝達については明確な証拠があることから、これはオンターゲット（on-target）毒性と考えられる。重要なこととして、このデータにより、投薬の用量／スケジュールと下痢のグレードとの間に有意な相関が示された（p値＝0.01022）。このことは、特定の投薬スケジュールによって、OMP-59R5毒性の抑制および／または低下が可能であることを示唆している。

薬物動態
第1相治験に参加した患者においてOMP-59R5の薬物動態を評価した。0.5mg／kg、1mg／kg、2.5mg／kgおよび5mg／kgを週1回投与した各患者からの試料を週1回の間隔で収集し、5mg／kgおよび10mg／kgを隔週1回投与した各患者からの試料を週1回の間隔で収集し、3週間毎に7.5mg／kgを投与した各患者からの試料を週1回の間隔で収集した。試料を、hNotch2 EGF1-12-Fc融合タンパク質を捕捉分子として用い、ビオチン化ウサギ抗ヒトIgGを検出用試薬として用いる抗原特異的ELISAアッセイにより、OMP-59R5濃度に関して分析した。アッセイの定量下限は2μg／mlであった。

薬物動態試験について図4に示している。ノンコンパートメント分析（NCA）によって推定した平均薬物動態パラメーターを表4に示している。

a．著しい外挿であるため、値を算出せず
b．試料数の乏しさに起因する検出限界を超える低値

OMP-59R5は、ヒト体循環から迅速に非線形的に排出されるように思われ、用量依存的な終末相半減期は、投与された用量に応じて12〜47時間であった（例えば、7.5mg／kgではT_1/2は47±24時間であった）。この半減期の結果として、多回投与後に用量蓄積は認められなかった。3週間毎の投薬により、薬物ウォッシュアウトの期間が得られる。クリアランス（CL）は用量が増えるにつれて減少するように思われ、このことは可飽和性の排出機序を示唆しており、これはその標的である、平滑筋を含む多くの末梢組織で発現されるNotch2およびNotch3との結合に起因する可能性が高い。加えて、抗薬物抗体の形成（患者28人中５人（18％））も、59R5の薬物動態には影響を及ぼさないと思われた。

本明細書に記載された実施例および態様が例示のみを目的とすること、ならびに、それらに鑑みてさまざまな修正または変更が当業者には想起されるであろうが、それらは本出願の趣旨および範囲内に含まれることは理解されるであろう。

本明細書に引用された刊行物、特許、および特許出願はすべて、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別的に示されるのと同じ程度に、目的を問わず、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

配列
59R5重鎖（予想されるシグナル配列には下線を付している）（SEQ ID NO：1）

予想されるシグナル配列を伴わない59R5重鎖（SEQ ID NO：2）

59R1重鎖（予想されるシグナル配列には下線を付している）（SEQ ID NO：3）

予想されるシグナル配列を伴わない59R1重鎖（SEQ ID NO：4）

59R5重鎖可変領域（SEQ ID NO：5）

59R1重鎖可変領域（SEQ ID NO：6）

59R5軽鎖（予想されるシグナル配列には下線を付している）（SEQ ID NO：7）

予想されるシグナル配列を伴わない59R5軽鎖（SEQ ID NO：8）

59R5軽鎖可変領域（SEQ ID NO：9）

59R5重鎖CDR1（SEQ ID NO：10）
SSSGMS
59R5重鎖CDR2（SEQ ID NO：11）

59R5重鎖CDR3（SEQ ID NO：12）
SIFYTT
59R1重鎖CDR3（SEQ ID NO：13）
GIFFAI
59R5軽鎖CDR1（SEQ ID NO：14）

59R5軽鎖CDR2（SEQ ID NO：15）
GASSRAT
59R5軽鎖CDR3（SEQ ID NO：16）
QQYSNFPI
59R5重鎖ヌクレオチド配列（予想されるシグナル配列を伴わない）（SEQ ID NO：17）

59R5軽鎖ヌクレオチド配列（予想されるシグナル配列を伴わない）（SEQ ID NO：18）

ヒトNotch2細胞外ドメイン（予想されるシグナル配列には下線を付している）（SEQ ID NO：19）

ヒトNotch3細胞外ドメイン（予想されるシグナル配列には下線を付している）（SEQ ID NO：20）

ヒトNotch2 EGF10（SEQ ID NO：21）

ヒトNotch3 EGF9（SEQ ID NO：22）

ヒトNotch2のEGF10内の配列（SEQ ID NO：23）
HKGAL
ヒトNotch 3のEGF9内の配列（SEQ ID NO：24）
HEDAI
FLAGペプチド（SEQ ID NO：25）
DYKDDDDK

Claims

以下の段階を含む、ヒト患者における癌を治療するための方法：
（a）Notch2／3抗体の初回用量を患者に投与する段階であって、Notch2／3抗体の初回用量が約2mg／kg〜約15mg／kgである、段階；ならびに
（b）Notch2／3抗体の追加用量を毎週1回、2週間毎に1回、3週間毎に1回、または4週間毎に1回投与する段階であって、Notch2／3抗体の追加用量が約2mg／kg〜約15mg／kgであり、Notch2／3抗体が、ヒトNotch2の細胞外ドメインおよび／またはヒトNotch 3の細胞外ドメインと特異的に結合し、かつ、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、VIASSGSNTYYADSVKG（SEQ ID NO：11）を含む重鎖CDR2、およびSIFYTT（SEQ ID NO：12）またはGIFFAI（SEQ ID NO：13）を含む重鎖CDR3、ならびにRASQSVRSNYLA（SEQ ID NO：14）を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む、段階。
Notch2／3抗体の追加用量が毎週1回投与される、請求項1記載の方法。
Notch2／3抗体の追加用量が2週間毎に1回投与される、請求項1記載の方法。
Notch2／3抗体の追加用量が3週毎に1回投与される、請求項1記載の方法。
Notch2／3抗体が、患者に対して合計3、4、5、6、7、8サイクル、またはそれを上回るサイクルにわたって投与される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
Notch2／3抗体の初回用量が、約2.5mg／kg、約5mg／kg、約7.5mg／kg、約10mg／kg、約12.5mg／kg、または約15mg／kgである、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
Notch2／3抗体の追加用量が、約2.5mg／kg、約5mg／kg、約7.5mg／kg、約10mg／kg、約12.5mg／kg、または約15mg／kgである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
癌が以下のものからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法：膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、神経膠腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、子宮内膜癌、腺様嚢胞癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、多形性神経膠芽腫、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、および頭頸部癌。
癌が膵臓癌である、請求項8記載の方法。
癌が肺癌である、請求項8記載の方法。
癌が結腸直腸癌または結腸癌である、請求項8記載の方法。
Notch2／3抗体が、SEQ ID NO：5またはSEQ ID NO：6のアミノ酸を含む重鎖可変領域、およびSEQ ID NO：9のアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
Notch2／3抗体が、寄託番号PTA-10170またはPTA-9547を有する、ATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる抗体と同じ重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
Notch2／3抗体が、ATCC寄託番号PTA-10170またはPTA-9547を有するプラスミドによってコードされる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
Notch2／3抗体が、少なくとも1つのさらなる治療薬との併用療法の形で投与される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
さらなる治療薬が化学療法薬である、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がアルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン（ABRAXANE））である、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がゲムシタビンである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がゲムシタビンおよびアブラキサンである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がエトポシドである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がシスプラチンである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がエトポシドおよびシスプラチンである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がカルボプラチンである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がペメトレキセドである、請求項15記載の方法。
さらなる治療薬がカルボプラチンおよびペメトレキセドである、請求項15記載の方法。
以下の段階を含む、ヒト患者における膵臓癌を治療するための方法：
患者に対してNotch2／3抗体を約5mg／kg〜約15mg／kgの用量で2週間毎に1回投与する段階であって、Notch2／3抗体が、ヒトNotch2の細胞外ドメインおよび／またはヒトNotch3の細胞外ドメインと特異的に結合し、かつ、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む重鎖CDR2、およびSIFYTT（SEQ ID NO：12）またはGIFFAI（SEQ ID NO：13）を含む重鎖CDR3、ならびに

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む、段階。
Notch2／3抗体が、ゲムシタビンおよびアルブミン結合パクリタキセルとの併用療法の形で投与される、請求項26記載の方法。
以下の段階を含む、ヒト患者における肺癌を治療するための方法：
患者に対してNotch2／3抗体を約5mg／kg〜約15mg／kgの用量で3週間毎に1回投与する段階であって、Notch2／3抗体が、ヒトNotch2の細胞外ドメインおよび／またはヒトNotch3の細胞外ドメインと特異的に結合し、かつ、SSSGMS（SEQ ID NO：10）を含む重鎖CDR1、

を含む重鎖CDR2、およびSIFYTT（SEQ ID NO：12）またはGIFFAI（SEQ ID NO：13）を含む重鎖CDR3、ならびに

を含む軽鎖CDR1、GASSRAT（SEQ ID NO：15）を含む軽鎖CDR2、およびQQYSNFPI（SEQ ID NO：16）を含む軽鎖CDR3を含む、段階。
Notch2／3抗体が、エトポシドおよびシスプラチンとの併用療法の形で投与される、請求項28記載の方法。