RU2448979C2 - Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека - Google Patents
Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2448979C2 RU2448979C2 RU2009126766/10A RU2009126766A RU2448979C2 RU 2448979 C2 RU2448979 C2 RU 2448979C2 RU 2009126766/10 A RU2009126766/10 A RU 2009126766/10A RU 2009126766 A RU2009126766 A RU 2009126766A RU 2448979 C2 RU2448979 C2 RU 2448979C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- human
- seq
- fragment
- hdll4
- Prior art date
Links
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 62
- 108700041286 delta Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 50
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 4
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims abstract 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 79
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 7
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 claims 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 101150109170 dll4 gene Proteins 0.000 abstract description 45
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 33
- 229950001752 enoticumab Drugs 0.000 description 33
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 7
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 108700037638 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100023181 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- -1 FR3 Proteins 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 108700005648 Dll4-Fc Proteins 0.000 description 3
- 101150092640 HES1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 101100387419 Mus musculus Dll4 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000001759 Notch1 Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010029755 Notch1 Receptor Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 2
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 101000872077 Homo sapiens Delta-like protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100496572 Rattus norvegicus C6 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012452 Xenomouse strains Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000914947 Bungarus multicinctus Long neurotoxin homolog TA-bm16 Proteins 0.000 description 1
- 101100510615 Caenorhabditis elegans lag-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 101100012887 Drosophila melanogaster btl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100012878 Drosophila melanogaster htl gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010055334 EphB2 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000978766 Homo sapiens Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 102000001753 Notch4 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010029741 Notch4 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035712 Serrate RNA effector molecule homolog Human genes 0.000 description 1
- 108010036039 Serrate-Jagged Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 229940127276 delta-like ligand 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044457 human DLL4 Human genes 0.000 description 1
- 102000045609 human NOTCH1 Human genes 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000009448 modified atmosphere packaging Methods 0.000 description 1
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное антитело человека или фрагмент антитела, которые специфическим образом связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDII4), указанное антитело человека или фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую три CDR легкой цепи, где указанные три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:901, а указанные три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:437 или SEQ ID NO:903, и где указанное антитело или его фрагмент связывается с эпитопом в пределах N-концевого-DSL домена hDII4. Описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая описанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Представлены вектор экспрессии, содержащий описанную молекулу нуклеиновой кислоты, и система «хозяин-вектор» для получения описанного антитела. Представлен способ получения описанного антитела против DII4 человека или его антиген-связывающего фрагмента. Описана композиция для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4, содержащая описанное антитело или его фрагмент. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 16 табл., 9 пр.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Notch-сигнальный путь представляет собой систему передачи информации между клетками, используемый широким спектром эукариот во многих биологических процессах, в том числе клеточной дифференциации, пролиферации и гомеостаза. Дельта-подобный 4 (Dl4) или дельта-подобный лиганд-4 (Dll4), далее именуемый “Dll4”) входит в дельта-семейство Notch-лигандов и с высокой селективностью экспрессируется сосудистым эндотелием (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4 выполняет функции лиганда для Notch-рецепторов, в том числе рецепторов Notch-1 и Notch-4. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для Dll4 человека приведены в последовательностях SEQ ID №: 1-2 соответственно.
Способы получения антител, полезных в качестве лекарственных препаратов для человека, включают производство химерных антител и гуманизированных антител (см., например, патент US 6949245). См., например, WO 94/02602 (Abgenix) и патент US 6596541 (Regeneron Pharmaceuticals), где описаны способы создания не относящихся к человеку трансгенных мышей, способных производить антитела человека.
В заявке на патент Японии 2003/047470A2 (Asahi Kasei Kogyo) описаны антитела к внеклеточной части белка Notch-лиганда человека.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящее изобретение относится к антителам человека, предпочтительно рекомбинантным антителам человека, которые специфически связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDll4). Для этих антител характерно связывание с hDll4 с высокой аффинностью и способность нейтрализовать активность Dll4. Антитела по изобретению способны блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором (рецепторами) и тем самым ингибировать передачу сигнала через Dll4. Антитела могут быть полноразмерными (например, антитела IgG1 или IgG4) или включать только антиген-связывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')2 или scFv) и могут быть модифицированы с целью воздействовать на функциональность, например удалять остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 и 947, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения HCVR является аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 429 или 901.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 и 949, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения LCVR является аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 437 или 903.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит HCVR, выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 и 947, или ее существенно идентичную последовательность, и LCVR, выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 и 949, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения HCVR/LCVR являются парами аминокислотной последовательности SEQ ID №: 429/437 или 901/903.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 1 (CDR1) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 и 879, или ее существенно идентичная последовательность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 2 (CDR2) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 и 881, или ее существенно идентичная последовательность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 3 (CDR3) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 и 883, или ее существенно идентичная последовательность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 и 879, или ее существенно идентичная последовательность; CDR2 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 и 881, или ее существенно идентичная последовательность; и CDR3 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 и 883, или ее существенно идентичная последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, выбранные из группы, содержащей SEQ ID №: 431/433/435; 374/376/378; 783/785/787 и 799/801/803.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 и 887, или ее существенно идентичная последовательность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 и 889, или ее существенно идентичная последовательность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 и 891, или ее существенно идентичная последовательность.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 и 887, или ее существенно идентичная последовательность; CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 и 889, или ее существенно идентичная последовательность; и CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 и 891, или ее существенно идентичная последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, выбранные из группы, содержащей SEQ ID №: 439/441/443; 382/384/386; 791/793/795 и 807/809/811.
Во втором аспекте настоящего изобретения приводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или антиген-связывающие области изобретения. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, которые кодируют антитела, и клетки-хозяева, в которые включаются такие векторы, а также способы приготовления антител настоящего изобретения путем культивирования клеток-хозяев изобретения.
В одном из осуществлений настоящего изобретения антитело содержит HCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 и 946, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит LCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 и 948, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит HCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 и 946, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%, и LCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 и 948, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 и 878, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, содержащий CDR2 тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 и 880, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 и 882, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 и 878, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; CDR2 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 и 880, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; и CDR3 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 и 882, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, содержащей SEQ ID №: 430/432/434; 373/375/377; 782/784/786 и 798/800/802.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, содержащий CDR1 легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 и 886, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR2 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 и 888, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 и 890, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 и 886, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; CDR2 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 и 888, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%, и CDR3 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 и 890, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, содержащей SEQ ID №: 438/440/442; 381/383/385; 790/792/794 и 806/808/810.
В третьем аспекте настоящего изобретения приводится выделенное антитело человека или фрагмент антитела, с которым специфическим образом связывается hDll4 человека, и в котором содержатся CDR 1, 2 и 3, выбранные из группы, включающей (a) область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID №: 928), где X1 - Gly; X2 - Phe или Tyr; X3 - Thr; X4 - Phe; X5 - Ser, Thr или Asn; X6 - Ser, Asn или Tyr; X7 - Tyr или Phe; и X8 - Gly или Ala; (b) область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID №: 929), где X1 - Ile или Leu; X2 - Trp или Ser; X3 - Tyr, Ala или Gly; X4 - Asp, Ser или Tyr; X5 - Gly или Asp; X6 - Ser, Gly, Thr или Val; X7 - Asn или Asp; и X8 - Lys или Arg; (c) область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16 (SEQ ID №: 930), где X1 - Ala или Ser; X2 - Arg или Lys; X3 - Asp или Tyr; X4 - Ser, Gly или His; X5 - Asp, Ala или Trp; X6 - Asn или Phe; X7 - Tyr, Arg или Lys; X8 - His или Ser; X9 - Gly или Trp; X10 - Tyr или Phe; X11 - Glu или Asp; X12 - Gly, His или Pro; X13 - Tyr, Trp или отсутствует; X14 - Phe или отсутствует; X15 - Asp или отсутствует; и X16 - Pro или отсутствует.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело человека или фрагмент антитела содержит последовательности CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи, выбранные из группы, включающей (a) область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID №: 928), где X1 - Gly; X2 - Phe; X3 - Thr; X4 - Phe; X5 - Ser или Asn; X6 - Ser или Asn; X7 - Tyr или Phe; и X8 - Gly или Ala; (b) область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID №: 929), где X1 - Ile или Leu; X2 - Trp или Ser; X3 - Tyr или Gly; X4 - Asp или Ser; X5 - Gly; X6 - Ser, Thr или Val; X7 - Asn или Asp; и X8 - Lys или Arg; (c) область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16 (SEQ ID №: 930), где X1 - Ala или Ser; X2 - Arg или Lys; X3 - Asp; X4 - Gly или His; X5 - Asp или Ala; X6 - Phe; X7 - Tyr или Arg; X8 - Ser; X9 - Gly; X10 - Tyr; X11 - Glu; X12 - Gly или His; X13 - Tyr или Trp; X14 - Phe или отсутствует; X15 - Asp или отсутствует; и X16 - Pro или отсутствует.
В еще одном варианте осуществления изобретения выделенное антитело человека или фрагмент антитела также содержит (d) область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID №: 931), где X1 - Gln; X2 - Ser; X3 - Val; X4 - Arg, Ser или Thr; X5 - Ser или Gly; X6 - Ser или Tyr; и X7 - Tyr или отсутствует; (e) область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3 (SEQ ID №: 932), где X1 - Gly или Asp; X2 - Ala или Thr; и X3 - Ser; и (f) область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID №: 933), где X1 - Gln; X2 - Gln или His; X3 - Tyr, Arg или Ser; X4 - Gly, Ser или Ala; X5 - Ser, Asn или Phe; X6 - Trp или Ser; X7 - Pro; X8 - Trp, Pro или Arg; и X9 - Thr.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенное антитело человека или фрагмент антитела также содержит (d) область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID №: 931), где X1 - Gln; X2 - Ser; X3 - Val; X4 - Arg или Ser; X5 - Ser; X6 - Ser или Tyr; и X7 - Tyr или отсутствует; (e) область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3 (SEQ ID №: 932), где X1 - Gly или Asp; X2 - Ala или Thr; и X3 - Ser; и (f) область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID №: 933), где X1 - Gln; X2 - Gln или His; X3 - Tyr или Arg; X4 - Gly или Ser; X5 - Ser или Asn; X6 - Trp или Ser; X7 - Pro; X8 - Pro или Arg; и X9 - Thr.
В четвертом аспекте настоящего изобретения приводится полностью человеческое антитело или фрагмент антитела, с которым связывается hDll4 с концентрацией IC50 менее 10 нМ, согласно результатам измерения in vitro или анализа блокирования Dll4 на основе ELISA (описано ниже). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IC50 антитела составляет приблизительно 500 пМ или менее. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IC50 антитела составляет приблизительно 100 пМ или менее.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения приводится полностью человеческое моноклональное антитело, которое специфическим образом связывает и ингибирует Dll4 человека и имеет IC50 менее или равное приблизительно 150 пМ, 100 пМ, 75 пМ или 50 пМ, согласно результатам измерения биологической активности индуцируемой Notch-рецептором люциферазы с hDll4-Fc. Как показано в разделе примеров ниже, антитела против hDll4 настоящего изобретения не вступают в перекрестную реакцию с близкородственными дельта-белками, такими как hDll1 и hDll3.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу человека или его антиген-связывающей области, которые связывают hDll4 с константой аффинности (KD) менее чем приблизительно 500 пМ, предпочтительнее менее чем приблизительно 300 пМ, еще предпочтительнее менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ, по данным поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE™), например, с применением димерного hDll4 (таблица 2).
Настоящее изобретение относится к антителу против hDll4 с модифицированной картиной гликозилирования. В некоторых случаях может оказаться полезным удалить нежелательные сайты гликозилирования или использовать антитело без фукозного фрагмента в олигосахаридной цепи, например для усиления функции антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других вариантах использования может осуществляться модификация галактозилирования, с тем чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).
Настоящее изобретение относится к антителам против hDll4, которые связывают конкретные эпитопы hDll4 и способны блокировать биологическую активность hDll4. Внеклеточный домен Dll4 состоит из N-терминального домена, домена Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) и восьми тандемных ЭФР (эпидермальный фактор роста) - подобных повторов. В общем, ЭФР домены находятся примерно в области аминокислотных остатков 218-251 (домен 1), 252-282 (домен 2), 284-322 (домен 3), 324-360 (домен 4) и 362-400 (домен 5), домен DSL - примерно в области аминокислотных остатков 173-217, а N-терминальный домен - примерно в области аминокислотных остатков 27-172 hDll4 (SEQ ID №: 2).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения блокирующее антитело по изобретению связывается с аминокислотными остатками с 27 по 524 последовательности SEQ ID №: 2. В более конкретном варианте осуществления блокирующее антитело по изобретению связывается с эпитопом в N-терминальном-DSL доменах 27-217 последовательности SEQ ID №: 2; в еще более конкретном варианте осуществления блокирующее антитело связывается с эпитопом примерно в области аминокислотных остатков 27-172 (N-терминальный домен) или 173-217 (домен DSL). В другом варианте осуществления блокирующее антитело по изобретению связывается с эпитопом ЭФР-2 примерно в области аминокислотных остатков 252-282 последовательности SEQ ID №: 2.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантное антитело против hDll4 человека и приемлемый носитель. Изобретение также включает векторы и состоящие из клеток-хозяев векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитело против hDll4 человека по настоящему изобретению, а также способы получения таких новых антител, заключающиеся в культивировании клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против hDll4 человека по настоящему изобретению или фрагмент такого антитела, в условиях, допускающих продукцию белка и выделение продуцированного таким образом белка.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности hDll4 с помощью приведенного в настоящем изобретении антитела или его антиген-связывающей области. В одном из вариантов осуществления способ включает взаимодействие hDll4 с антителом по настоящему изобретению или его антиген-связывающей областью таким образом, что при этом происходит ингибирование активности hDll4 в результате связи с Notch-рецептором, например рецептором Notch-1. В другом варианте осуществления способ включает введение антитела по настоящему изобретению или его антиген-связывающей области человеку, страдающему нарушением, состояние при котором улучшается при ингибировании активности Dll4. Такие нарушения включают болезни или патологические состояния, которые могут быть купированы, облегчены, ослаблены или предотвращены за счет блокирования, ингибирования или снижения активности Dll4, например патологическое развитие кровеносной сети, связанное с ангиогенезом в опухолях и раком, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантатов или воспаление, а также нейродегенеративные нарушения, например связанные с прионными заболеваниями. Настоящее изобретение также предусматривает использование антитела или антиген-связывающей области антитела в соответствии с приведенным выше описанием при производстве лекарственных препаратов, применяемых для смягчения или ингибирования заболеваний или нарушений в организме человека, опосредованных Dll4.
Другие цели и преимущества станут очевидными при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Прежде чем переходить к описанию представляемых способов, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными способами и изложенными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут меняться. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не носит ограничительного характера, поскольку охват настоящего изобретения будет лимитироваться только прилагаемыми пунктами формулы изобретения.
Использование в данном описании и в прилагаемых пунктах формулы изобретения единственного числа подразумевает ссылку на множественное число, за исключением случаев, когда из контекста явно следует обратное. Так, например, упоминание «способа» подразумевает один или несколько способов и/или стадий описанного в тексте типа, и/или методов или стадий, которые будут очевидны специалистам в данной области при ознакомлении с описанием настоящего изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, ниже приводится описание предпочтительных способов и материалов.
Определения
Термины «дельта-подобный лиганд-4», «Dll4», «hDll4» являются взаимозаменяемыми при обозначении белка, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 1, и белка, содержащего последовательность аминокислоты SEQ ID №: 2.
Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе HCVR, или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе LCVR, или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми остовными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Используемый в настоящем документе термин «антитело высокой аффинности» относится к антителам, имеющим аффинность связывания с hDll4 не менее 10-8М; предпочтительно 10-9М; еще более предпочтительно 10-10М, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™, или результатам измерения аффинности в растворе методом иммуноферментного анализа (ELISA).
Под используемым в настоящем документе термином “медленно диссоциирующее” или “Koff” подразумевается антитело, комплекс которого с hDll4 диссоциирует с константой скорости 1×10-3 сек-1 или ниже, предпочтительно 1×10-4 сек-1 или ниже, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™.
Под используемым в настоящем документе термином «нейтрализующее», или «блокирующее» антитело понимается антитело, связывание которого с Dll4 приводит к ингибированию биологической активности Dll4. Такое ингибирование биологической активности Dll4 может оцениваться посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности Dll4. Данные показатели биологической активности Dll4 могут оцениваться при помощи одного или нескольких методов анализа in vitro или in vivo, известных специалистам (см. примеры ниже). Способность антитела нейтрализовать активность Dll4 предпочтительно должна оцениваться по ингибированию связывания Dll4 с Notch-рецептором.
Используемый в настоящем документе термин «антиген-связывающая область» антитела (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, hDll4). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами всей последовательности антитела. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антиген-связывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) изолированный CDR. Более того, несмотря на то что два домена во фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антиген-связывающая область» антитела. Сюда же входят и другие формы одноцепочечных антител, например диатела. Диатела представляют собой бивалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но длина соединяющего их линкера слишком мала для связывания двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены одной цепи связываться с комплементарными доменами другой цепи, создавая тем самым два сайта связывания антигена (см., например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Далее, антитело или его антиген-связывающая область могут быть частью более крупной иммуноадгезивной молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или части антитела и одной или несколькими другими белковыми молекулами или пептидами. Примеры таких иммуноадгезивных молекул включают использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), и использование остатка цистеина, маркера-пептида и C-терминальной полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')2, могут быть получены из цельных антител с помощью стандартных методик, таких как папаиновое и пепсиновое расщепление цельных антител соответственно. Кроме того, антитела, части антител и иммуноадгезивные молекулы могут быть получены с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, как описано в настоящем документе.
Используемый в настоящем документе термин «антитело человека» предназначен для обозначения антител с вариабельной и константной областями, полученных из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. Описываемые в данном изобретении антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевых линий человека (например, мутации, вызванные случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo), например, в областях CDR, особенно в области CDR3. Однако используемый в настоящем документе термин "антитело человека" не подразумевает включения антител, в которых на зародышевые последовательности человека привиты CDR последовательности, полученные из зародышевых линий другого вида млекопитающих, например мыши.
Используемый в настоящем документе термин "рекомбинантное антитело человека" подразумевает включение всех типов антител человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных технологий, в том числе антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина (как описано ниже), антител, выделенных из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (как описано ниже), антител, выделенных из животного (например, мыши), трансгенного по отношению к генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), а также антител, полученных, экспрессированных, созданных или выделенных с использованием любых других методов, использующих сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельную и константную области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. В ряде осуществлений, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (либо, при использовании животных, трансгенных по иммуноглобулину человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител оказываются последовательностями, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL областей зародышевых линий человека, а также связаны с ними, могут отсутствовать в естественно существующем in vivo наборе последовательностей зародышевых линий человека.
Используемый в настоящем документе термин "выделенное антитело" предназначен для обозначения антитела, существенно свободного от других антител, обладающих иной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфично связывает hDll4, существенно свободно от антител, которые специфично связывают антигены, отличные от hDll4). Выделенное антитело, которое специфично связывает hDll4, тем не менее может иметь перекрестную реактивность к другим антигенам, например молекулам hDll4 из других видов. Более того, выделенное антитело может быть существенно свободно от иных клеточных материалов и/или химических реагентов.
Используемый в настоящем документе термин «поверхностный плазмонный резонанс» относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени за счет детектирования изменений концентраций белка в биосенсорной матрице, например с помощью системы Biscoe™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).
Используемый в настоящем документе термин «KD» предназначен для обозначения константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Используемый в настоящем документе термин “эпитоп” включает любую детерминанту, предпочтительно полипептидную детерминанту, способную к специфичному связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. В ряде осуществлений эпитопные детерминанты включают химически активные группировки на поверхности молекул, таких как аминокислот, боковых цепей сахаров, фосфорильных групп или сульфонильных групп, и в ряде осуществлений могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические зарядовые характеристики. Эпитоп представляет собой область антигена, в которой происходит связывание с антителом. В ряде осуществлений считается, что антитело специфично связывается с антигеном, если оно предпочтительно опознает свою антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения считается, что антитело специфично связывается с антигеном, если равновесная константа диссоциации не превышает 10-8М, более предпочтительно, если равновесная константа диссоциации не превышает 10-9М, и наиболее предпочтительно, если равновесная константа диссоциации не превышает 10-10 М.
Белок или полипептид является "существенно чистым", "существенно однородным" или "существенно очищенным", если по крайней мере примерно от 60 до 75% образца содержит один вид полипептида. Полипептид или белок может быть мономерным или мультимерным. Существенно чистый полипептид или белок обычно составляет примерно 50, 60, 70, 80 или 90 весовых процентов образца белка, как правило примерно 95% и предпочтительно является чистым более чем на 99%. Чистота или однородность белка может быть доказана с помощью ряда хорошо известных в данной области методов, например электрофорезом образца белка в полиакриламидном геле с последующим получением одной полипептидной полосы при окрашивании геля одним из хорошо известных в данной области красителей. В ряде случаев для получения более высокого разрешения может использоваться ВЭЖХ или другие методы очистки, хорошо известные специалистам в данной области.
Используемый в настоящем документе термин "полипептидный аналог или вариант" относится к полипептиду, содержащему сегмент длиной не менее 25 аминокислотных остатков, который существенно совпадает с участком аминокислотной последовательности и обладает по крайней мере одним из следующих свойств: (1) специфично связывается с hDll4 в требуемых для связывания условиях, или (2) способен блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором. Как правило, полипептидные аналоги или варианты содержат консервативную замену (или вставку или удаление) аминокислот по сравнению с исходной естественной последовательностью. Аналоги, как правило, имеют длину не менее 20 аминокислотных остатков, предпочтительно не менее 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислотных остатков или больше, и часто могут иметь ту же длину, что и полноразмерный естественный полипептид.
Предпочтительными для замещения аминокислот являются группы, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания при образовании белковых комплексов, (4) изменяют аффинности связывания и (4) придают или изменяют другие физико-химические или функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут содержать различные мутации последовательности по сравнению с естественной пептидной последовательностью. Например, в исходной естественной последовательности (предпочтительно в области полипептида за пределами образующих межмолекулярные контакты доменов) могут быть сделаны одиночные или множественные замены аминокислот (предпочтительно консервативные замены аминокислот). Консервативная замена аминокислот не должна существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, заменяющая аминокислота не должна способствовать разрыву имеющейся в исходной последовательности спирали или иным образом нарушать составляющие элементы вторичной структуры, характерной для исходной последовательности). Примеры общепринятых в данной области элементов вторичной и третичной структуры полипептидов описаны в книгах «Proteins, Structures and Molecular Principles» (Creighton 1984 W. H. Freeman and Company, New York), «Introduction to Protein Structure» (Branden & Tooze, eds., 1991, Garland Publishing, NY), а также в Thornton et at. 1991 Nature 354:105.
Непептидные аналоги широко используются в фармацевтической отрасли в качестве лекарственных препаратов со свойствами, аналогичными свойствам исходного пептида-матрицы. Подобные непептидные соединения получили название "миметики пептидов" или "пептидомиметики" (см. например, Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res. 15:29; and Evans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229). Систематическая замена одной или более аминокислот согласованной последовательности на D-аминокислоту того же типа (например, на D-лизин вместо L-лизина) может также использоваться для получения более стабильных пептидов. Кроме того, известными в данной области методами (Rizo et al. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387) могут быть получены пептиды с дополнительными структурными ограничениями, содержащие согласованную последовательность или существенно идентичную вариацию согласованной последовательности, например путем введения дополнительных внутренних остатков цистеина, способных к образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков, которые приводят к циклизации пептида.
Термин "процентная степень идентичности последовательности" в контексте последовательностей нуклеиновых кислот относится к остаткам в двух последовательностях, которые оказываются одинаковым при сопоставлении двух последовательностей для достижения максимальной согласованности. Длина участка сравнения для установления степени идентичности последовательностей может составлять не менее 9 нуклеотидов или более, обычно по крайней мере 18 нуклеотидов, более обычно по крайней мере 24 нуклеотида, как правило не менее примерно 28 нуклеотидов, более типично по крайней мере 32 нуклеотида, и предпочтительнее не менее примерно 36, 48 или более нуклеотидов. Существует несколько известных в данной области различных алгоритмов, которые могут быть использованы для измерения степени идентичности последовательностей нуклеотидов. Например, полинуклеотидные последовательности могут сравниваться с использованием программ FASTA, Gap или Bestfit, входящих в пакет Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. Набор программ FASTA, включающий, например, программы FASTA2 и FASTA3, позволяет выполнить сопоставление и определить процентную степень идентичности последовательности областей наилучшего перекрывания между заданной и исследуемой последовательностями (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98 and (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219). Если не оговорено особо, для программ и алгоритмов используются стандартные параметры по умолчанию. Например, для определения процентной степени идентичности последовательности нуклеиновых кислот можно использовать программы FASTA со своими параметрами по умолчанию (размер слова 6 и опция NOPAM для построения матрицы оценки) или программы Gap со своими значениями по умолчанию, указанными в пакете GCG Version 6.1.
Ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты подразумевает одновременно и комплементарную последовательность, если иное не оговорено явно. Так, ссылка на молекулу нуклеиновой кислоты с конкретной последовательностью нуклеотидов должна пониматься также как ссылка и на комплементарную цепь с комплементарной последовательностью. В общем, в данной области термины "процентная степень идентичности последовательности", "процентное сходство последовательностей" и "процент гомологичности последовательностей" считаются взаимозаменяемыми. В настоящем документе эти термины будут иметь то же значение в отношении последовательностей нуклеиновых кислот.
Термин «существенная аналогичность» или «по существу аналогичны» в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента означает, что при оптимальном сопоставлении с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) с соответствующими добавлениями или делециями наблюдается идентичность нуклеотидной последовательности на уровне не менее приблизительно 90%, предпочтительно не менее приблизительно 95%, более предпочтительно не менее приблизительно 96%, 97%, 98% или 99% оснований нуклеотидов, что измеряется с помощью любого известного алгоритма идентичности последовательностей, например FASTA, BLAST или Gap, которые описывались выше.
Применяемый в отношении полипептидов термин «существенная идентичность» или «по существу идентичные» означает, что две пептидные последовательности при их оптимальном сопоставлении, например с помощью программ GAP или BESTFIT с учетом вклада пропусков, демонстрируют не менее 80% идентичности последовательностей, более предпочтительно не менее 90% или 95% идентичности последовательностей и еще более предпочтительно не менее 98% или 99% идентичности последовательностей. Предпочтительно положение неидентичных остатков отличается лишь консервативным замещением аминокислот. «Консервативное замещение аминокислот» - это такое замещение, при котором один аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) с аналогичными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В общем случае, консервативное замещение аминокислот не будет приводить к существенным изменениям функциональных свойств белка. В случае если две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативным замещением, процент идентичности последовательности или степень аналогичности может корректироваться в сторону увеличения, с тем чтобы учесть консервативный характер замещения. Способы такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. См. например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. К примерам групп аминокислот, имеющих боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, относятся 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксилированные боковые цепи: серин и треонин; 3) боковые цепи с амидной группой: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) боковые цепи со свойствами основания: лизин, аргинин и гистидин; и (6) серосодержащие боковые цепи - цистеин и метионин. Предпочтительными группами для консервативного замещения аминокислот являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В альтернативном варианте консервативное замещение представляет собой любое изменение, приводящее к положительному значению в логарифмической матрице вероятностей PAM250, описанной в работе Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. «Умеренно консервативным» замещением называется любое изменение, приводящее к неотрицательному значению в логарифмической матрице вероятностей PAM250.
Подобие последовательностей полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно определяют с помощью программного обеспечения для анализа последовательности. Программа для анализа белков сопоставляет подобные последовательности с использованием показателей аналогичности, задаваемых для различных замещений, делеций и других модификаций, в том числе для консервативного замещения аминокислот. Например, программное обеспечение GCG содержит такие программы, как Gap и Bestfit, которые могут использоваться с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательности или идентичности последовательности между близкородственными полипептидами, например гомологичными полипептидами различных видов организмов или между исходным белком и его мутантом. См., например, GCG Вер. 6.1. Полипептидные последовательности могут также сопоставляться с помощью FASTA - программы, включенной в GCG Вер. 6.1, - с использованием параметров по умолчанию или рекомендуемых параметров. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает сопоставление и определяет процент идентичности последовательностей в областях с наибольшим перекрыванием между заданной и исследуемой последовательностями (см. выше Pearson (2000)). Другим предпочтительным алгоритмом сопоставления последовательности настоящего изобретения с базой данных, содержащей большое число последовательностей различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN, которая использует параметры по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.
Длина полипептидных последовательностей, сравниваемых для определения степени гомологии, как правило, составляет не менее примерно 16 аминокислотных остатков, обычно не менее примерно 20 остатков, чаще всего не менее примерно 24 остатков, в большинстве случаев не менее примерно 28 остатков и предпочтительно более 35 остатков. При поиске в базе данных, содержащих последовательности из большого количества различных организмов, предпочтительно сравнивать последовательности аминокислот.
Получение антител человека
К методам получения антител человека относятся, например, VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals), технология XENOMOUSE™ (Abgenix), «минилокусный» метод и фаговый дисплей. Технология VELOCIMMUNE® (патент US 6596541) включает метод получение полностью человеческих антител с высокой специфичностью по отношению к выбранному антигену. Данная технология предполагает получение трансгенных мышей с геномом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепи человека, которые функционально связаны с эндогенными локусами константной области мыши, так что в ответ на антигенную стимуляцию мышь продуцирует антитело, содержащее вариабельную область человека и константную область мыши. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей константные тяжелые и легкие цепи человека. Затем ДНК экспрессируют в клетке, которая в состоянии экспрессировать полностью человеческое антитело. В конкретном варианте осуществления такой клеткой является клетка СНО.
Технологией XENOMOUSE™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21) получают мышь, обладающую как вариабельной, так и константной областями человека из локусов тяжелой цепи и легкой цепи каппа. В другом варианте использовался подход «минилокус», в котором экзогенный локус Ig имитировался путем включения индивидуальных генов из локуса Ig (см., например, патент US 5545807). Выделенная ДНК, кодирующая вариабельные области, может иметь или не иметь функциональную связь с ДНК, кодирующей константные тяжелые и легкие цепи человека.
Известны также другие методы производства антител человека, в том числе путем получения от донора. См., например, GCG Вер. 6787637.
Антитела могут использоваться в терапевтических целях для блокирования лиганд-рецепторного взаимодействия или ингибирования взаимодействия рецепторных компонентов вместо уничтожения клеток за счет фиксации комплемента и участия в клеточно-обусловленной цитотоксичности (CDC). Константная область антитела важна для обеспечения способности антитела фиксировать комплемент и участвовать в CDC или непосредственном уничтожении клеток за счет антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC). Поэтому изотип антитела можно выбирать в зависимости от того, насколько желательно, чтобы антитело фиксировало комплемент.
Иммуноглобулины человека могут существовать в двух формах, что связано с гетерогенностью шарнирной области. В одной из форм молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию весом примерно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются связывающим тяжелые цепи дисульфидным мостиком. Во второй форме димеры не связаны межцепочечным дисульфидным мостиком, и образуется молекула с приблизительным весом 75-80 кДа, состоящая из одной легкой и тяжелой цепи. Разделение этих форм было сопряжено с трудностями, даже после аффинной очистки.
Частота проявлений второй формы в различных изотипах интактного IgG вызвана, кроме прочего, структурными различиями, связанными с изотипом шарнирной области антитела. Действительно, замена одной аминокислоты в шарнирной области человеческого IgG4 может существенно снизить долю второй формы (Angal et al. 1993, Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно характерных при использовании шарнирной области человеческого IgG1. В сферу охвата настоящего изобретения входят антитела, имеющие одну или несколько мутаций в шарнирной области, областях CH2 или CH3, которые могут быть желательны, например, при продуцировании антител для повышения выхода или для модулирования эффекторных функций.
Антитела по настоящему изобретению предпочтительно получаются с использованием технологии VELOCIMMUNE®. Трансгенные мыши, у которых вариабельные области тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина заменяются соответствующими вариабельными областями человека, стимулируются представляющим интерес антигеном, и у мыши, экспрессирующей антитела, берутся лимфатические клетки (например, В-клетки). Лимфатические клетки могут сливаться с линией миелоидных клеток для получения иммортализованных линий клеток гибридомы, и такие линии клеток гибридомы проходят скрининг и селекцию для идентификации тех линий клеток гибридомы, которые продуцируют антитела, специфические к представляющему интерес антигену. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела, можно выделить и связывать с нужными изотипическими константными областями тяжелой и легкой цепей. Такой белок антитела может продуцироваться в клетке, например в клетке СНО. В альтернативном варианте ДНК, кодирующую антигенспецифические химерные антитела, можно выделить непосредственно из антигенспецифических лимфоцитов. В различных вариантах осуществления трансгенная мышь содержит 12 функциональных вариабельных генов тяжелой цепи человека и 11 функциональных вариабельных генов каппа легкой цепи человека; от 25 до 30 вариабельных генов тяжелой цепи человека и от 18 до 20 вариабельных генов каппа легкой цепи человека; от 43 до 48 вариабельных генов тяжелой цепи человека и от 20 до 22 вариабельных генов каппа легкой цепи человека; или примерно 80 вариабельных генов тяжелой цепи человека и примерно 40 вариабельных генов каппа легкой цепи человека.
В общем случае антитела по настоящему изобретению обладают очень высокой аффинностью, как правило с KD от примерно 10-9 до примерно 10-11M, если измерять по связыванию с антигеном, иммобилизованным на твердой подложке или анализируемым в растворе. Константные области мыши заменяются желаемыми константными областями человека, с тем чтобы получить полностью человеческие антитела, описанные в настоящем изобретении, например исходный или модифицированный IgG1 или IgG4 (например, SEQ ID №: 950, 951, 952). Выбранная константная область может меняться в зависимости от конкретного осуществления, а свойства высокой аффинности антиген-связывания и необходимая специфичность определяются вариабельной областью.
Рак, инфекционные заболевания, аутоиммунные нарушения, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантатов, воспаления, травмы и дегенеративные нарушения можно лечить посредством модуляции иммунной системы. В случае болезней, связанных с неправильным функционированием или излишней активностью иммунной системы, таких как аутоиммунные нарушения и воспаления, положительный эффект может быть достигнут за счет подавления функций иммунных клеток или снижения их количества. Для этого можно использовать либо блокирование положительных сигналов, либо стимулирование отрицательных сигналов для популяций иммунных клеток, критически важных для протекания данного заболевания, например T-клеток, B-клеток, NK-клеток, нейтрофилов, макрофагов, антиген-представляющих клеток, мастоцитов или клеток других типов. Для подавления повышенной активности может также использоваться элиминация популяций различных иммунных клеток путем стимулирования апоптоза, направленного воздействия на специфические поверхностные рецепторы элиминирующими антителами или конъюгатами антитело-лекарство, а также блокирования или изменения дифференцировки линий иммунных клеток или конкретных типов клеток. Неэффективность или пониженная активность иммунной функции может приводить к возникновению или осложнению таких заболеваний, как рак, инфекционные болезни и другие иммунодефицитные состояния. С пониженной активностью иммунной системы можно бороться путем активирования иммунных клеток, стимулируя положительные сигналы с помощью кросс-сшивки или агонистические антитела, либо блокируя отрицательные сигналы. Повышение популяции иммунных клеток может быть достигнуто путем стимуляции развития некоторых или всех линий дифференцировки иммунных клеток, блокирования апоптоза или устранения ингибиторных сигналов. В конкретном приложении антитела по настоящему изобретению полезны для лечения, подавления или облегчения таких состояний или болезней, как, например, рак, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантата или воспаление.
Эпитопное картирование и связанные с ним технологии
Для скрининга антител, которые связываются с конкретным эпитопом (например, блокирующих связывание IgE с соответствующим рецептором, обладающим высокой аффинностью), можно проводить стандартный перекрестный конкурентный анализ (cross-blocking) подобно описанному в Harlow and Lane (1990) выше. К другим методам относятся мутанты сканирования аланина, пептидный блоттинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), и анализ расщепления пептидов. Кроме того, могут использоваться такие методы, как вырезание эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science: 487-496).
Используемый в настоящем документе термин "эпитоп" относится к сайту антигена, на который реагируют B- и/или T-клетки. Эпитопы B-клеток могут быть образованы как непрерывной последовательностью аминокислот, так и разрозненными аминокислотами, оказавшимися в требуемом взаимном положении в результате фолдинга белка в третичную структуру. Эпитопы, образованные непрерывной последовательностью аминокислот, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, возникшие в результате фолдинга белка в третичную структуру, разрушаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, формируется по крайней мере 3, а обычно по крайней мере 5 или 8-10 аминокислотами в уникальной пространственной конформации.
Определение профиля с помощью модификации (MAP), также известное как определение профиля антител на основе структуры антигена (ASAP), представляет собой метод классификации большого числа моноклональных антител (mAbs) к одному и тому же антигену в соответствии со сходствами профиля связывания каждого антитела с химически или энзиматически модифицированными антигенными поверхностями (публикация патента США No. 2004/0101920). Каждая категория может отражать уникальный эпитоп, который либо четко отличается от эпитопа, представленного в любой другой категории, либо частично перекрывается с ним. Подобная технология позволяет быстро отделять генетически идентичные антитела, так что их идентификация может быть сконцентрирована на генетически отличающихся антителах. В случае применения для скрининга гибридомы MAP может способствовать идентификации редких клонов гибридомы, производящих mAbs с нужными характеристиками. MAP может использоваться для сортировки антител hDll4 по настоящему изобретению в группы антител, связывающих различные эпитопы.
К агентам, используемым для изменения структуры иммобилизованных антигенов, относятся ферменты, например протеолитические ферменты, такие как трипсин, эндопротеиназа Glu-C, эндопротеиназа Asp-N, химотрипсин и т.п. К агентам, используемым для изменения структуры иммобилизованных антигенов, также могут относиться химические вещества, такие как сукцинимидные эфиры и их производные, первичные аминосодержащие соединения, гидразины и карбогидразины, свободные аминокислоты и т.п.
Антигенный белок может иммобилизироваться на поверхностях чипа биосенсора или полистирольных гранулах. Последние могут анализироваться, например, с использованием метода мультиплексного анализа LUMINEX™ (Luminex Corp., Austin, TX). Поскольку LUMINEX™ позволяет проводить мультиплексный анализ до 100 различных типов гранул, он обеспечивает почти бесконечную антигенную поверхность с различными модификациями, что гарантирует более высокое разрешение профилирования эпитопов антител по сравнению с анализом на биосенсорах.
Терапевтическое применение и составы препаратов
Введение терапевтических препаратов в соответствии с настоящим изобретением осуществляется в подходящих носителях, наполнителях и прочих веществах, которые включаются в состав препаратов, чтобы обеспечить более эффективное распространение, доставку, переносимость и т.п. Множество соответствующих составов можно найти в формулярах, известных всем специалистам в области фармацевтической химии: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). К таким препаратам, например, относятся порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (например, LIPOFECTIN™), конъюгаты ДНК, безводные абсорбционные пасты, эмульсии масло-в-воде и вода-в-масле, эмульсии карбовакса (полиэтиленгликоли различного молекулярного веса), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Любая из приведенных выше смесей может подходить для лечения и проведения терапии в соответствии с настоящим изобретением при условии, что активный ингредиент состава не инактивируется компонентами препарата и что состав является физиологически совместимым и приемлемым для способа введения. См. также в Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 и в цитируемой там литературе дополнительную информацию, касающуюся наполнителей и носителей, хорошо известных специалистам в области фармацевтической химии.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение антител человека к рецептору человека Dll4.
Мыши могут быть иммунизированы с помощью любого метода, известного специалистам в области (см., например, Harlow and Lane выше). В одном из вариантов осуществления изобретения мышам, полученным при помощи VELOCIMMUNE®, вводится непосредственно антиген hDll4, который содержит локусы ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи человеческого Ig и вариабельные области легкой цепи каппа, в адъюванте для стимулирования иммунного ответа. Такой адъювант включает полный и неполный адъювант Фрейнда, систему адъюванта MPL+TDM (Sigma) или RIBI (мурамил-дипептид) (см. O'Hagan (2000) Vaccine Adjuvant, by Human Press, Totawa, NJ). Выработка антител в качестве иммунного ответа контролируется стандартными методами антиген-специфичного иммуноанализа. После получения нужного иммунного ответа антитело-экспрессирующие В-клетки собирали и объединяли с клетками миеломы мыши для сохранения их жизнеспособности, с образованием линий клеток гибридомы. Такие линии клеток гибридомы проходят скрининг и селекцию для идентификации тех линий клеток, которые продуцируют антитела к представляющему интерес антигену, используя анализы, описанные ниже.
Альтернативным методом является выделение клеток гибридомы для представляющего интерес антигена способом проточной цитометрии. После объединения с клетками миеломы собранные вместе клетки гибридомы выращивали в течение 10 дней в гипоксантин-аминоптеринтимидиновой среде. Затем клетки собирали и окрашивали меченым биотином Dll4 при концентрации 2 мг/мл в течение 1 часа, с последующим добавлением фикоэритрин-стрептавидина. Флуоресцентно-меченые клетки сортировали методом проточной цитометрии (одна клетка на лунку в 96-луночном планшете со средой для выращивания клеток гибридомы), культивировали 8-10 дней, затем проводили скрининг в кондиционированной среде на наличие функционально желательных моноклональных антител, как описано ниже.
Антитела против hDll4 получали прямым выделением спленоцитов. Антиген-специфичные антитела можно также выделять напрямую из антиген-иммунизированных B-клеток без объединения с клетками миеломы, как описано в патенте США 2007/0280945 A1. Из выделенных рекомбинантов получали стабильные CHO клеточные линии с экспрессией рекомбинантных антител.
Пример 2. Определение антиген-связывающей аффинности антигена.
Константы диссоциации (величины KD) комплексов антигена с рядом описанных выше антител определяли поверхностной кинетикой методом плазмонного резонанса на поверхности биосенсора в реальном времени (BIACORE™ 2000). Антитело удерживали на поверхности поликлонального антимышиного антитела козы IgG, образованной посредством прямого химического связывания с чипом BIACORE™ для формирования поверхности связанного антитела. На поверхность захваченных антител наносили мономерные hDll4 или димерные hDll4-hFc в различных концентрациях, и связывание и диссоциация комплекса антигена - антитела контролировали в реальном времени. Расчет KD, констант скорости диссоциации и полупериода диссоциации комплекса антиген/антитело осуществляли при помощи кинетического анализа (таблица 1). Аналогичный метод использовали и для определения характеристик полученных из одиночных моноклональных антител B-клеток, модифицированных введением константного домена IgG человека. Антитела вводили в контакт с содержащим анти-hFc поликлональные тела козы реагентом (Jackson Immuno Research Lab), иммобилизованным на поверхности чипа BIACORE™, и обрабатывали димерным белком Dll4-mFc или мономерным белком Dll4 (таблица 2).
Аффинность связывания комплекса антиген-антитело также может быть определена путем конкурентного анализа в растворе на основе ELISA. Вкратце: антитела (в виде очищенных белков или в кондиционированной среде) предварительно смешивали на 96-ячеечном титрационном микропланшете с последовательным разбавлением антигенного белка (мономерного или димерного) в пределах от 0 до 10 мкг/мл, при постоянной концентрации антитела. После 2 часов инкубирования антигена с антителом растворы переносили на титрационный микропланшет с предварительно нанесенным антигеном для определения свободного антитела (MAXISORB™, VWR, West Chester, PA). На планшет наносили раствор 1 мкг/мл белка hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере, планшет выдерживали в течение ночи при температуре 4°C, неспецифичные сайты связывания блокировали обработкой БСА в течение двух часов. После переноса и инкубации в течение часа планшет промывали, и связанные с поверхностью планшета антитела определяли с помощью реагента, содержащего конъюгат пероксидазы хрена и поликлонального антимышиного IgG антитела козы (Jackson Immuno Laboratory), и проявляли с помощью колориметрических субстратов (OPTEIA™; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Ферментативную реакцию останавливали 1М раствором фосфорной кислоты, измеряли оптическое поглощение на 450 нм, полученные данные анализировали в модели сигмоидальной зависимости отклика от дозы, определенные таким образом концентрации IC50 приведены ниже (таблица 1).
| ТАБЛИЦА 1 | |||
| Антитело | KD Dll4 (нМ) | KD Dll4-Fc (нМ) | IC50 Dll4-Fc (нМ) |
| 13B6 | 2,79 | 0,188 | 0,06 |
| 15E10 | 0,55 | 0,023 | 0,58 |
| 22G12 | 1,29 | 0,076 | 0,03 |
| 24C8 | 0,52 | 0,047 | 0,01 |
| VAV 2H4-19 | 1,51 | 0,611 | 0,10 |
| VAV 4H10-9 | 13,70 | 0,662 | 0,30 |
| VAV 7B9-9 | 0,88 | 0,021 | 0,27 |
| VAW 10E4-9 | 89,00 | 0,468 | 0,06 |
| VAW 10G11-2 | 31,30 | 1,430 | 1,66 |
| VAW 1C6-1 | 45,80 | 0,092 | 0,25 |
| VAW 1G2-4 | 83,80 | 0,035 | 0,40 |
| VAW 1H2-2 | 67,00 | 0,148 | 0,30 |
| VAW 2H3-2 | 0,30 | 0,150 | 0,26 |
| VAW 3A7-2 | 1,64 | 0,162 | 0,02 |
| VAW 3A9-5 | н.д. | 2,510 | 16,00 |
| VAW 3F12-8 | 8,12 | 0,648 | 0,07 |
| VAW 6B8-12 | 0,89 | 0,060 | 0,43 |
| VAW 6C6-2 | 91,70 | 0,092 | 0,50 |
| VAW 6G12-10 | 3,74 | 0,527 | 0,19 |
| VAW 7C10-11 | 17,10 | 0,853 | 0,28 |
| VAW 8A10-14 | 1,41 | 0,648 | 0,08 |
| VAW 8G1-12 | 6,09 | 8,300 | 8,60 |
| VAW 9B11-2 | 62,20 | 0,048 | 0,00 |
| VAW 9F12-6 | 16,00 | 1,350 | 0,02 |
| VAW 9G10-1 | 56,10 | 0,555 | 0,10 |
| ТАБЛИЦА 2 | ||
| Антитело | KD Dll4 (нМ) | KD Dll4-Fc (нМ) |
| 314266-06F12-B7 | 2,17 | 0,075 |
| 318518-01A04-D5 | 0,237 | 0,244 |
| 318518-01A10-D8 | 0,399 | 0,018 |
| 318518-01B09-C3 | 0,833 | 0,180 |
| 318518-01B11-D4 | 0,382 | 0,088 |
| 318518-01E07-H2 | 0,165 | 0,238 |
| 318518-01G04-F3 | 0,501 | 0,107 |
| 318518-01G05-B5 | 1,06 | 0,196 |
| 318518-02A07-B3 | 0,208 | 0,148 |
| 318518-02B06-E2 | 2,15 | 0,193 |
| 318518-02B08-F7 | н.д. | н.д. |
| 318518-02C04-D1 | 0,478 | 0,331 |
| 318518-02F05-D10 | 1,28 | 0,035 |
| 318518-02G03-F2 | 1,31 | 0,042 |
| 318518-02G04-B11 | 0,813 | 0,048 |
| 318518-02G08-F11 | н.д. | н.д. |
| 318518-03A03-B2 | 0,136 | 0,124 |
| 318518-03C10-F2 | 1,18 | 0,131 |
| 318518-03D04-B5 | 0,904 | 0,136 |
| 318518-03D07-G11 | 3,74 | 0,163 |
| 318518-03F04-A6 | 0,501 | 0,088 |
| 318518-03F06-A3 | 0,556 | 0,037 |
| 318518-03H03-F3 | 8,89 | 0,084 |
| 318518-14A06-E7 | 4,54 | 0,282 |
| 318518-14A07-C4 | 0,235 | 0,035 |
| 318518-14D08-G1 | 0,541 | 0,046 |
| 318518-14H08-A2 | 6,67 | 0,128 |
| 318518-1H08-E9 | 0,225 | 0,050 |
Пример 3. Ингибирование взаимодействия Dll4 с Notch-рецептором
Способность антител блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором оценивали методом иммуноферментного анализа на твердом носителе (ELISA). Раствор 1 мг/мл рекомбинантного белка Notch-hFc в фосфатно-солевом буфере наносили на 96-луночный планшет и выдерживали в течение ночи при температуре 4°C, неспецифичные сайты связывания блокировали обработкой БСА. Приготовленный таким образом планшет использовали для измерения свободного биотин-Dll4-hFc в растворах образцов для титрования антител. Для приготовления образцов для титрования антител одинаковое количество биотин-Dll4-hFc при концентрации 25 пМ смешивали с разными количествами антитела, либо в виде исходной неочищенной среды для кондиционирования гибридомы, либо в виде очищенного белка антитела, в диапазоне концентраций от 0 до ~50 нМ в последовательных разбавлениях, затем проводили двухчасовое инкубирование при комнатной температуре для достижения равновесия связывания антиген-антитело. После достижения равновесия растворы переносили на покрытые Notch-hFc планшеты для измерения свободного биотин-Dll4-hFc. После часовой инкубации для связывания планшет промывали, связанный биотин-Dll4-hFc определяли с помощью конъюгата перксидазы хрена и стрептавидина (Poly HRP streptavidin, Pierce Endogen) и проявляли с помощью содержащего тетраметилбензидин субстрата (BD Pharmigen). Полученные данные анализировали в программном пакете GraphPad Prism, и концентрации IC50 определяли как количества антитела, требуемые для 50% снижения биотин-Dll4-hFc, связанного с нанесенным на планшет Notch-Fc (таблица 3) (*кондиционированная среда).
| ТАБЛИЦА 3 | |
| Антитело | IC50 (нМ) |
| VAV 2H4-19 | 0,01 |
| VAW 3A7-2 | 0,017 |
| VAW 9G10-1 | 0,019 |
| VAW 10E4-9 | 0,032 |
| VAW 8A10-11 | 0,04 |
| VAW 9F12-6 | 0,059 |
| VAW 3F12-8 | 0,066 |
| VAW 1C6-1 | 0,086 |
| VAW 1G2-4 | 0,11 |
| VAW 6C6-2 | 0,119 |
| VAV 7B9-4 | 0,123 |
| VAW 1H2-2 | 0,154 |
| VAW 2H3-2 | 0,168 |
| VAW 6B8-12 | 0,255 |
| VAW 6G12-10 | 0,257 |
| VAW 7C10-11 | 0,273 |
| VAV 4H10-9 | 0,599 |
| VAW 10G11-2 | 0,931 |
| VAW 3A9-5 | 3,8 |
| VAW 8G1-12 | 10,7 |
| VAW 9B11-2 | 0,069 |
| 15E10* | 0,04 |
| 22G12 | 0,10 |
| 13B6 | 0,11 |
| 24C8 | 0,031 |
| 314266-06F12-B7 | 0,07 |
| 318518-01A04-D5 | 0,11 |
| 318518-01A10-D8 | 0,05 |
| 318518-01B09-C3 | 0,03 |
| 318518-01B11-D4 | 0,03 |
| 318518-01E07-H2 | 1,17 |
| 318518-01G04-F3 | 0,02 |
| 318518-01G05-B5 | 1,08 |
| 318518-02A07-B3 | 0,03 |
| 318518-02B06-E2 | 0,09 |
| 318518-02B08-F7 | н.д. |
| 318518-02C04-D1 | 0,60 |
| 318518-02F05-D10 | 0,16 |
| 318518-02G03-F2 | 0,07 |
| 318518-02G04-B11 | 1,09 |
| 318518-02G08-F11 | н.д. |
| 318518-03A03-B2 | 0,57 |
| 318518-03C10-F2 | 0,12 |
| 318518-03D04-B5 | 0,04 |
| 318518-03D07-G11 | 0,45 |
| 318518-03F04-A6 | 0,01 |
| 318518-03F06-A3 | 0,02 |
| 318518-03H03-F3 | 0,17 |
| 318518-14A06-E7 | 0,04 |
| 318518-14A07-C4 | 0,02 |
| 318518-14D08-G1 | 0,14 |
| 318518-14H08-A2 | 0,25 |
| 318518-1H08-E9 | 0,03 |
Способность выбранных очищенных антител против hDll4 блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором также оценивали описанным выше методом иммуноферментного анализа (ELISA), модифицированного заменой 25 пМ биотин-Dll4-hFc на 30 пМ биотин-Dll4-hFc и сокращением продолжительности инкубации антиген-антитело от двух до одного часа. Для удобства пользования антитело 318518-01A10-D8 переименовали в «REGN281» (HCVR/LCVR SEQ ID №№: 429/437 и hIgG1 SEQ ID №: 950). Протестированные производные антитела включали REGN421 (HCVR/LCVR SEQ ID №: 901/903, hIgG1 SEQ ID №: 950) и REGN422 (HCVR/LCVR SEQ ID №: 901/903 с модифицированным hIgG4 SEQ ID №: 952). Результаты приведены в таблице 4.
| ТАБЛИЦА 4 | |
| Антитело | IC50 (нМ) |
| REGN281 | 0,042 |
| REGN421 | 0,045 |
| REGN422 | 0,039 |
Способность антитела нейтрализовать опосредуемую Dll4 клеточную функцию также проверяли in vitro на экспрессирующих Dll4 эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Ингибирование опосредуемой Notch-системой экспрессии генов hHes1 и EphB2 в клетках HUVEC производными антителами контролировали следующим образом: клетки HUVEC с малым числом пересевов культивировали в среде MCDB-131 (Vec Technologies). За день до анализа клетки HUVEC высевали с плотностью 2×105 клеток на лунку на 24-луночных планшетах с общим объемом среды 1 мл. Проверяемое антитело или иной ингибитор вводили непосредственно в отдельные лунки планшета, используя по три лунки на образец, затем следовало культивирование в течение 5 часов при 37°C. По окончании периода культивирования среду удаляли и суммарную РНК выделяли с использованием лизирующего реагента QIAZOL™ и набора RNEASY™ для извлечения РНК из тканей с высоким содержанием липидов (Qiagen). Количественное определение мРНК проводили с использованием ПЦР и флуорогенного 5' нуклеазного анализа (TAQMAN® assay, Appied Biosystems). Для каждого образца синтезировали кДНК из 1-2 мг суммарной РНК. кДНК, полученная из эквивалентного количества исходной РНК (как правило 25 нг), помещали на оптические реакционные планшеты ABI PRISM™ (также с тройным повтором). Для каждого образца РНК также готовили контрольный образец без добавления обратной транскриптазы “no RT” для вычитания возможного вклада геномной ДНК в сигнал. В каждую реакцию вводили 2x Mastermix (TAQMAN® 2x PCR Mastermix; ABI) до конечной концентрации 1x. Кроме того, в каждую реакцию также вводили зонд TAQMAN® и праймеры для контролируемого гена. Каждый праймер использовали при конечной концентрации 900 нМ, зонд вводили до конечной концентрации 200 нМ. В качестве стандарта использовали геномную ДНК человека. Анализ проводили в стандартных условиях методики TAQMAN® на анализаторе ABI 7900HT. Измеренные уровни экспрессии Hes1 и EphrinB2 нормировали на эндогенный контрольный ген (циклофилин) (таблица 5). Использованные зонды и праймеры: зонд на Hes1 человека (SEQ ID №: 387); олигонуклеотиды: hHes1-869F (SEQ ID №: 388); hHes1-940R (SEQ ID №: 389), зонд на ephrinB2 человека: hEphB2-773T (SEQ ID №: 390); олигонуклеотиды: hEphB2-752F (SEQ ID №: 391); hEphB2-812R (SEQ ID №: 392); циклофилин человека: зонд: hCyclophilin-343T (SEQ ID №: 393); олигонуклеотиды: hCyclophilin-323F (SEQ ID №: 394); hCyclophilin-389R (SEQ ID №: 395).
| ТАБЛИЦА 5 | ||
| Антитело | IC50 экспрессии EphrinB2 (нМ) | IC50 экспрессии Hes1 (нМ) |
| 22G12 | 0,379 | 0,381 |
| 15E10 | 2,56 | 4,49 |
| VAW 3A7-2 | 0,409 | 0,533 |
| 314266-06F12-B7 | 0,239 | 0,405 |
| 318518-01A10-D8 | 0,305 | 0,329 |
| 318518-01G04-F3 | 0,088 | 0,172 |
| 318518-01H08-E9 | 0,413 | 0,548 |
| 318518-02A07-B3 | 0,398 | 0,128 |
| 318518-03F04-A6 | 0,158 | 0,115 |
| 318518-03F06-A3 | 0,304 | 0,692 |
| 318518-014A07-C4 | 0,175 | 0,312 |
| 318518-014D08-G1 | 0,510 | 0,568 |
| hDll4-hFc | 0,843 | 0,974 |
Тест на размножение клеток HUVEC.
Способность антител блокировать опосредуемое Dll4 ингибирование роста эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) проверяли в in vitro тесте на размножение клеток. Полученные клетки HUVEC с малым числом пересевов культивировали в среде MCDB-131 (Vec Technologies). За день до анализа на 12-луночные культуральные планшеты наносили раствор hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере (0,2 мкг/мл; 0,5 мл ФСБ/лунку). Планшеты выдерживали ночь при температуре 4°C и однократно промывали фосфатно-солевым буфером. На планшеты высевали клетки HUVEC с плотностью 4×103 клеток на лунку с общим объемом среды 1,0 мл.
Для получения кривой ингибирования сразу же после высевания клеток в лунки вводили антитела против hDll4 в суммарном объеме 0,5 мл с варьируемой концентрацией. Клетки инкубировали в течение 96 часов при 37°C. Для определения численности клеток использовали реагент CCK-8 (Dojindo). Все тесты были проведены по три раза. (Таблица 6, «н.б.» - «не блокирует»)
| ТАБЛИЦА 6 | |
| Антитело | IC50 (нМ) |
| 15E10 | 0,284 |
| VAW9B11-2 | 1,868 |
| VAW8D8-12 | н.б. |
| 13B6 | 5,01 |
| VAW2H4-19 | н.б. |
| VAW3A7-2 | 0,198 |
| VAW8A10-14 | 0,214 |
| 22G12 | 0,888 |
| 318518-06F12-B7 | 2,067 |
| 318518-01A10-D8 | 0,096 |
| 318518-01G04-F3 | 0,106 |
| 318518-01H08-E9 | 0,188 |
| 318518-02A07-B3 | 0,200 |
| 318518-03F04-A6 | 0,184 |
| 318518-03F06-A3 | 0,188 |
| 318518-014A07-C4 | 0,159 |
| 318518-014D08-G1 | 0,165 |
Тест на Notch-индуцируемую активность люциферазы.
Для определения способности выбранных очищенных антител нейтрализовать опосредуемую Dll4 клеточную функцию был разработан in vitro тест на основе рекомбинантной клеточной линии HEK293 (ATCC), постоянно экспрессирующей Notch-1 человека и содержащей Notch-реактивный промотер, стимулирующий активность люциферазы. Степень ингибирования Notch-индуцируемой активности люциферазы определяли следующим образом: за день до анализа в каждую лунку непрозрачного 96-луночного культурального планшета пипетировали по 100 мкл 1 нМ или 1,5 нМ раствора hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере, планшет выдерживали ночь при температуре 4°C. Клетки высевали на планшет в среде в количестве 2×104 клеток/лунку. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C с очищенным белком антитела в последовательных разбавлениях в клеточной среде, начиная с 2 нМ. Активность люциферазы определяли путем добавления субстрата STEADY-GLO® (Promega) до полного заполнения лунки (таблица 7).
| ТАБЛИЦА 7 | ||
| Антитело | IC50 (пМ) | |
| 1 нМ hDll4-hFc | 1,5 нМ hDll4-hFc | |
| REGN281 | 50,5 | 78,7 |
| REGN421 | 54,4 | 87,3 |
| REGN422 | 88,2 | 131,1 |
Пример 4. Ингибирование расщепления Notch-1
Способность выбранных антител против hDll4 ингибировать расщепление Notch-1 проверяли анализом полного количества отщепленного белка Notch-1 методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)/вестерн-блоттингом. Клетки HUVEC с малым числом пересевов культивировали, как описано выше. За день до анализа на 6-луночные планшеты наносили раствор hDll4-hFc в фосфатно-солевом буфере (0,2 мкг/мл; 1,0 мл ФСБ/лунку). Планшеты выдерживали ночь при температуре 4°C и однократно промывали фосфатно-солевым буфером. На планшеты высевали клетки HUVEC с плотностью 7,5×105 клеток на лунку с общим объемом среды 2,0 мл. Сразу же после высевания клеток в лунки вводили антитела против hDll4 до конечной концентрации 10 нМ. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C, затем готовили экстракты из цельных клеток, которые анализировали методом SDS-PAGE. Уровни расщепленного Notch-1 определяли с помощью анти-расщепленного Notch-1 (Val1744) антитела (Cell Signaling) и стандартных методик вестерн-блоттинга. Антитела против hDll4 проявили способность полностью блокировать расщепление Notch-1, индуцируемое нанесенным на планшет hDll4-hFc (данные не приводятся).
Пример 5. Тесты ADCC и CDC
Антителозависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity/ADCC), индуцируемую двумя тестируемыми антителами (REGN421, REGN422), проверяли на наборе восьми линий клеток-мишеней с разными уровнями экспрессии hDll4. Использовали следующие 8 линий клеток-мишеней: (1) клетки HUVEC; (2) клетки HUVEC, стимулированные 10 нМ ФРЭС в течение 24 часов; (3) клетки Colo205; (4) рекомбинантные клетки C6 глиомы крысы, экспрессирующие eGFP; (5) рекомбинантные клетки C6 глиомы крысы, экспрессирующие hDll4; (6) рекомбинантные клетки HT1080, экспрессирующие eGFP; (7) рекомбинантные клетки HT1080, экспрессирующие hDll4; и (8) клетки HT29. Dll4 или eGFP человека встраивали в геном клетки C6 или HT1080 путем ретровирусной трансфекции. Для этого клетки каждой линии клеток-мишеней (10000 клеток/лунку в 50 мкл) сначала смешивали с равным объемом последовательно разбавленных антител REGN421 или REGN422 с получением конечной концентрации антител в диапазоне от 0,169 пМ до 10 нм и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре на 96-луночных планшетах (в качестве контроля использовали лунки без антитела). Отдельно готовили мононуклеарные клетки периферической крови человеке (PBMC, клетки-эффекторы), следуя стандартной процедуре градиентного центрифугирующего обогащения Ficoll-Hypaque. К каждой смеси антитела и клеток-мишеней добавляли примерно по 300000 клеток PBMC, создавая в результате конечное соотношение клеток-эффекторов к клеткам-мишеням примерно 30:1. Приготовленные таким образом 96-луночные планшеты затем инкубировали в течение 4 часов при 37°C, в атмосфере 5% CO2, с последующим центрифугированием при 250g. Супернатанты собирали и тестировали на активность лактатдегидрогеназы (LDH), используя тестирующую систему для нерадиоактивного контроля цитотоксичности CYTOTOX 96® (Promega). Результаты приведены в таблице 8. Индуцированный REGN421 зависящий от дозы лизис клеток наблюдался только в клетках C6, экспрессирующих hDll4 (колонка 5), которые демонстрировали самую высокую экспрессию hDll4 из всех исследованных линий клеток (по результатам анализа методом иммуноосаждения с последующим вестерн блотом и проточной цитометрии). Максимальная цитотоксичность клеток в линии C6-hDll4 колебалась от 20% до 60%. В остальных семи линиях клеток-мишеней индуцированный REGN421 лизис клеток не наблюдался. Антитело REGN422 не индуцировало лизиса клеток ни в одной из исследованных линий клеток-мишеней.
| ТАБЛИЦА 8 | ||||||||
| Ab | Максимальная цитотоксичность, % | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| REGN421 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20-60 | 0 | 0 | 0 |
| REGN422 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Индуцированная REGN421 комплементарно-зависимая цитотоксичность (Complement-dependent cytotoxicity/CDC) проверялась на том же наборе клеточных линий, описанном выше. Для этого клетки каждой линии клеток-мишеней (50000 клеток/лунку в 50 мкл) сначала смешивали с равным объемом последовательно разбавленных антител REGN421 с получением конечной концентрации антител в диапазоне от 0,169 пМ до 10 нм и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре на 96-луночных планшетах. Затем в каждую лунку добавляли нормальную сыворотку крови человека с комплементарными компонентами (Quidel Corp., San Diego, CA) до получения конечной концентрации сыворотки 5%. Приготовленные таким образом 96-луночные планшеты затем инкубировали в течение 2 часов при 37°C, в атмосфере 5% CO2, с последующим добавлением реагента CELLTITER-BLUE® (Promega) (в качестве контроля использовали лунки без антитела и лунки с антителом, но без сыворотки). Планшеты инкубировали в течение ночи, после чего определяли степень выживания клеток (уровни цитотоксичности CDC). В качестве положительного контроля использовали клетки Daudi, обработанные ритуксимабом. Антитело REGN421 не показало цитотоксичности CDC по отношению ни к одной из исследованных клеточных линий (данные не приводятся).
Пример 6. Эпитопное картирование и специфичность
Для определения специфичности связывания с эпитопом приготовили группу из семи химерных белков Dll4, в которых специфичные домены белка Dll4 человека были следующим образом встроены в белок Dll4 мыши: №1 содержал N-терминальный и DSL домены человека (S27-Q218); №2 содержал N-терминальный, DSL и ЭФР-1 домены человека (S27-N252); №3 содержал N-терминальный, DSL, ЭФР-1 и ЭФР-2 домены человека (S27-Q283); №4 содержал N-терминальный, DSL, ЭФР-1, ЭФР-2, ЭФР-3, ЭФР-4 и ЭФР-5 домены человека; №5 содержал N-терминальный домен человека (S27-R172); №6 содержал DSL домен человека (V173-Q218); и №7 содержал ЭФР-2 домен человека (E252-D282). Химерные белки объединяли с фрагментом IgG2a-Fc мыши и экспрессировали в клетках CHO-K1. Вестерн-блоттинг собранной кондиционированной среды подтвердил экспрессию белка.
Специфичность связывания проверяемых антител с hDll4, mDll4 и химерными белками №1, №2, №3 и №4 проверяли следующим образом: очищенные антитела 22G12, VAW3A7-2 и 15E10 связывали через аминогруппу в количестве 5000-6000 RU на чипе CM5. Кондиционированную среду клеток CHO K1, содержащих химерные белки Dll4, hDll4-mFc и mDll4-mFc, последовательно наносили на чип с последующей регенерацией поверхности над покрытой антителом поверхностью. В качестве контроля на неспецифическое связывание кондиционированной среды использовали свободную аминно-связанную поверхность проточной ячейки. Результаты приводятся в таблице 9. Антитело 22G12 связывалось с эпитопом между S27-Q218 hDll4; антитело VAW3A7-2 связывалось с эпитопом между Q283-E400 hDll4; и антитело 15E10 связывалось с эпитопом между E252-D282 hDll4.
| ТАБЛИЦА 9 | ||||||
| Антитело | hDll4-mFc | mDll4-mFc | Химерные белки | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |||
| 22G12 | + | - | + | + | + | + |
| VAW3A7-2 | + | - | - | - | - | + |
| 15E10 | + | - | - | - | + | + |
Определяли специфичность связывания очищенного испытуемого mAb к hDll4, mDll4 и описанных выше химерных белков (REGN279=314266-6F12-B7; REGN287=318518-1G04-F3; REGN289=318518-1H08-E9; REGN290=318518-2A07-B3; REGN306=318518-3F06-A3). Для этого каждый белок Dll4 связывали (70-130 RU) на поверхности антимышиного IgG антитела козы с последующим введением испытуемого mAb в концентрации 100 мкг/мл. В качестве положительного контроля использовали антитело, связывающее mDll4-mFc (положительный контроль=6C10). Результаты (таблица 10) показали, что антитело REGN279 связывалось с эпитопом между S27-Q218 hDll4; антитело REGN287 связывалось между Q283-E400 hDll4; антитела REGN289, REGN290 и REGN306 связывались между S27-E400 hDll4.
| ТАБЛИЦА 10 | |||||||||
| Антитело | hDll4-mFc | mDll4-mFc | Химерные белки Dll4 человека-мыши | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |||
| REGN279 | + | - | + | + | + | + | + | - | - |
| REGN287 | + | - | - | - | - | + | - | - | - |
| REGN289 | + | - | + | + | + | + | - | + | - |
| REGN290 | + | - | + | + | + | + | - | + | - |
| REGN306 | + | - | + | + | + | + | - | + | - |
| Контроль | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Описанным выше образом также проводили определения специфичности эпитопного связывания для следующих очищенных испытуемых антител: REGN281=318518-1A10-D8; REGN305=318518-3F04-A6; REGN309=318518-14A07-C4; REGN310=318518-14D08-G1; REGN421 и REGN422. Для этого каждый белок Dll4 связывали (240-470 RU) на поверхности антимышиного IgG антитела козы с последующим введением испытуемого mAb в концентрации 100 мкг/мл (таблица 11).
| ТАБЛИЦА 11 | |||||||||
| Антитело | hDll4-mFc | mDll4-mFc | Химерные белки Dll4 человека-мыши | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |||
| REGN281 | + | - | + | + | + | + | + | + | - |
| REGN305 | + | - | - | - | - | + | - | - | - |
| REGN309 | + | - | + | + | + | - | + | + | - |
| REGN310 | + | - | - | - | + | + | - | + | + |
| REGN421 | + | - | + | + | + | + | + | + | - |
| REGN422 | + | - | + | + | + | + | + | + | - |
Вестерн-блоттинг. Специфичность связывания выбранных антител с химерными белками Dll4, белками Dll4 человека и мыши определяли вестерн-блоттингом. Для этого выполняли электрофорез hDll4-mFc (200 нг на дорожку), mDll4-mFc (200 нг на дорожку) и химерных белков №1-№7 (примерно 150 нг на дорожку) на двойных гелях (SDS-PAGE) с использованием невосстанавливающего буфера. Каждый гель затем переносили на мембрану (PVDF). Блоты сначала обрабатывали антителом REGN421 в концентрации 0,2 мкг/мл и затем конъюгатом пероксидазы хрена и антитела анти-hIgG (Pierce). Контрольные блоты обрабатывали конъюгатом перксидазы хрена и антитела анти-mFc (Pierce). Результаты: антитело REGN421 опознало hDll4-mFc и химерные белки, содержащие N-терминальный домен человека (№5), DSL домен человека (№6), или оба этих домена (№1, №2, №3 и №4). Антитело REGN421 не опознало химерный протеин, содержащий домен ЭФР-2 человека (№7).
Анализ протеазного расщепления. Связывание между антителом REGN281 и hDll4 также оценивали методом анализа защиты от протеазного расщепления с использованием жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ/МС) на хроматомасс-спектрометре HPLC1100 (Agilent) и масс-спектрометре LCQ Classical Ion Trap Mass Spectrometer (Thermo). Для этого смесь hDll4 и REGN281 в мольном соотношении 1:5, либо только hDll4, инкубировали в течение ночи с протеазой при 25°C (для GluC протеазы) или 37°C (для трипсина). Затем каждую из полученных протеолитических смесей анализировали методом ЖХ/МС. Характерные пептидные пики, присутствующие для протеолитических смесей, выработанных в отсутствие антитела REGN281, которые уменьшались либо исчезали для протеолитических смесей, выработанных в присутствии REGN281, указывали потенциальные места связывания REGN281 с hDll4, которые защищались от протеазного расщепления при связывании REGN281 с hDll4. Эти характерные пики анализировали масс-спектроскопически. Полученные массы, ожидаемые массы и N-терминальные последовательности пептидов приведены в таблице 12.
| ТАБЛИЦА 12 | |||||
| Пик | Полученная масса | Ожидаемая масса | Пептид hDll4 (SEQ ID №: 2) | Протеаза | Домен |
| G1 | 521 | 521,5 | Phe37-Glu40 | GluC | N-терминал |
| G2 | 1362,8 | 1363,4 | Ala121-Glu132 | GluC | N-терминал |
| T1 | 758 | 760,8 | Pro49-Arg55 | Трипсин | N-терминал |
| T2 | 587,1 | 587,2 | Tyr169-Arg172 | Трипсин | N-терминал |
| T3 | 1607,4 | 1607,6 | Val173-Arg186 | Трипсин | DSL |
| T4 | 1399 | 1400,7 | Gly42-Arg55 | Трипсин | N-терминал |
| T5 | 569,2 | 569,3 | Thr56-Arg59 | Трипсин | N-терминал |
| T7 | 2615 | 2613,4 | Ile143-Arg166 | Трипсин | N-терминал |
| T8 | 1807,2 | 1806,9 | Ser27-Arg41 | Трипсин | N-терминал |
Пример 7. Аффинность связывания очищенных антител Dll4 человека и обезьяны.
Аффинность связывания некоторых очищенных антител с мономерами Dll4, Dll4 M. facscicularis (mfDll4, SEQ IN №: 956) и Dll4 M. mulatta (mmDll4, SEQ ID №: 957) определяли при помощи BIACORE™ 2000 и 3000. Для фиксации антител REGN281, REGN421 и REGN422 использовали поликлональные анти-hFc антитела козы, иммобилизованные на поверхности чипа BIACORE™. В качестве вводимого на покрытую антителами поверхность анализируемого материала использовали различные концентрации каждого белка, hDll4 (от 12,5 нМ до 100 нМ), mfDll4 (от 3,13 нМ до 100 нМ) и mmDll4 (от 12,5 нМ до 100 нМ). Связывание антиген-антитело и диссоциация связанных комплексов наблюдали в реальном времени (таблица 13).
| ТАБЛИЦА 13 | |||||||||
| ka (M-1s-1) | kd (s-1) | KD (нМ) | |||||||
| hDll4 | mfDll4 | mmDll4 | hDll4 | mfDll4 | mmDll4 | hDll4 | mfDll4 | mmDll4 | |
| REGN281 | 1,56×105 | 6,64×104 | 9,27×104 | 2,30×10-5 | 2,04×10-5 | 3,05×10-5 | 0,148 | 0,307 | 0,329 |
| REGN421 | 1,63×105 | 7,28×104 | 9,70×104 | 2,17×10-5 | 2,02×10-5 | 3,23×10-5 | 0,133 | 0,278 | 0,333 |
| REGN422 | 1,64×105 | 8,01×104 | 9,27×104 | 2,36×10-5 | 2,88×10-5 | 3,41×10-5 | 0,144 | 0,360 | 0,375 |
Аффинность связывания антител против hDll4 по отношению к димерам hDll4 и mmDll4 также определяли при помощи BIACORE™ 2000 и метода, описанного выше, с тем отличием, что hDll4 заменяли на hDll4-mFc (с 3,13 нМ до 100 нМ) или mmDll4 с mmDll4-mFc (с 0,78 нМ до 25 нМ) в качестве анализируемого материала (таблица 14).
| ТАБЛИЦА 14 | ||||||
| ka (M-1s-1) | kd (s-1) | KD (нМ) | ||||
| hDll4-mFc | mmDll4-mFc | hDll4-mFc | mmDll4-mFc | hDll4-mFc | mmDll4-mFc | |
| REGN281 | 3,02×105 | 3,16×105 | 4,96×10-6 | 4,64×10-6 | 0,0163 | 0,0147 |
| REGN421 | 3,43×105 | 3,35×105 | 4,70×10-6 | 3,80×10-6 | 0,0137 | 0,013 |
| REGN422 | 3,46×105 | 4,23×105 | 4,60×10-6 | 4,15×10-6 | 0,0133 | 0,0098 |
Пример 8. Перекрестная реактивность антител с hDll1, hDll3, mDll4 и mfDll4.
Также определяли перекрестную реактивность антител к белку дельта-подобного лиганда 1 человека (SEQ ID №: 953) и белку дельта-подобного лиганда 3 человека (SEQ ID №: 954). Антитела REGN281, REGN421 и REGN422 приводили в контакт с содержащим поликлональные антитела анти-каппа человека (hK) козы реагентом (Southern Biotech), иммобилизованным на поверхности чипа BIACORE™, в качестве анализируемого материала, вводимого на покрытую антителом поверхность, использовали белок hDll4-hFc или hDll1-hFc в концентрации 100 мкг/мл. Все три антитела против hDll4 связывались только с hDll4-hFc и не связывались с hDll1-hFc.
Другой формат BIACORE™ использовали для оценки перекрестной реактивности между антителом против hDll4 и лигандами hDll1-hFc и hDll3-hFc. Для этого каждый из лигандов hDll4-hFc, hDll1-hFc и hDll3-hFc ковалентно связывали через аминогруппу с поверхностью чипа CM-5 в диапазоне RU примерно от 8000 до 10000. Затем антитело REGN421 в концентрации 300 мкг/мл вводили на поверхность каждого чипа. Антитело REGN421 связывалось только с hDll4-hFc; связывания с hDll1-hFc и hDll3-hFc не наблюдалось. Те же результаты получили и при замене REGN421 на REGN422.
Для определения связывания между выбранными очищенными антителами против hDll4 и hDll4-hFc, hDll3-hFc, hDll1-hFc, mfDll4-mmh или mDll4-mFc использовали тест на связывание на основе системы OCTETTM. Для этого стрептавидиновые FA биосенсоры с высокой связывающей способностью (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) сначала инкубировали с биотин-анти-hK при концентрации 5 мкг/мл в течение 10 минут при 30°C для достижения насыщения. Затем связанные с биотин-анти-hK биосенсоры инкубировались с антителами REGN281, REGN421 или REGN422 при концентрации 20 мкг/мл в течение 10 минут при 30°C для достижения насыщения. Связанные с антителом биосенсоры затем инкубировали либо с hDll4-hFc, либо с hDll3-hFc, hDll1-hFc или mDll4-mFc при 200 нМ, или mfDll4-mmh при 100 нМ в течение 10 минут при 30°C. После каждой инкубации измеряли изменение вязкости биологического слоя. Обнаружили, что Dll4-hFc человека и mfDll4-mmh связывались с биосенсором, связанным с антителом против hDll4, тогда как hDll3-hFc, hDll1-hFc и mDll4-mFc не связывались с биосенсором, связанным с антителом против hDll4.
Пример 9. Влияние антитела против hDll4 на рост опухоли
Эффект антитела REGN421 на рост опухоли проверяли на опухолях, имплантированных мышам с тяжелой комбинированной иммунонедостаточностью (Severe Combined Immunodeficiency/SCID), которые экспрессировали гуманизированный белок Dll4 (SCIDxhDll4). Для этого готовили гуманизированные по Dll4 мыши путем замены всего внеклеточного домена гена Dll4 мыши на соответствующий внеклеточный участок гена Dll4 человека (7kb) в зародышевых стволовых клетках (ЗСК). Подготовленные таким образом гомозиготные по hDll4 мыши доводили до требуемого состояния (SCID). Затем каждой мыши подкожно вводили 2,5×106 опухолевых клеток человека HT1080. После фиксации опухолей в мышах (~100-150 мм3 на 18 день после имплантации) мышей обследовали и вводили hFc, hDLL4-Fc или REGN421. 7 мышей разделили на три группы. Мыши первой группы (n=3) получали подкожно hFc (25 мг/кг); мыши второй группы (n=1) получали hDll4-Fc (25 мг/кг); и мыши третьей группы (n=3) получали REGN421 (10 мг/кг). Препарат вводили каждые 48 часов, начиная с 18 дня. Результаты измерения опухоли in vivo получали за три дня до первого введения препарата (15 день), в день каждого введения (18, 20 и 22 дни) и на 25 день. Размер опухоли рассчитывали по формуле l×w2/2. Результаты приведены в таблице 15. На 25 день мышей умерщвляли, каждую опухоль извлекали, измеряли ex vivo и рассчитывали (длина × ширина × глубина) (таблица 16).
Кроме того, группе SCID мышей, экспрессирующих эндогенный mDll4 (n=2), также имплантировали опухолевые клетки и проводили курс hDll4-Fc (25 мг/кг) по тому же графику.
| ТАБЛИЦА 15 | ||||||
| Мышь | Процесс | Размер опухоли (мм3) | ||||
| День 15 | День 18 | День 20 | День 22 | День 25 | ||
| SCID | hDll4-hFc | 162,0 | 232,8 | 320,0 | 336,0 | 253,1 |
| SCID | hDll4-hFc | 22,5 | 117,0 | 117,0 | 108,0 | 68,8 |
| SCIDxhDll4 | hDll4-hFc | 288,0 | 320,0 | 352,0 | 446,0 | 320,0 |
| SCIDxhDll4 | hFc | 162,0 | 288,0 | 320,0 | 500,0 | 550,0 |
| SCIDxhDll4 | hFc | 162,0 | 220,5 | 352,0 | 662,0 | 661,5 |
| SCIDxhDll4 | hFc | 93,8 | 135,0 | 179,6 | 352,0 | 726,0 |
| SCIDxhDll4 | REGN421 | 144,0 | 245,0 | 320,0 | 162,0 | 144,0 |
| SCIDxhDll4 | REGN421 | 87,5 | 162,0 | 153,0 | 225,0 | 135,0 |
| SCIDxhDll4 | REGN421 | 144,0 | 196,0 | 272,0 | 162,0 | 152,5 |
| ТАБЛИЦА 16 | ||
| Мышь | Процесс | Размер опухоли (мм3) |
| SCID | hDll4-hFc | 308,0 |
| SCID | hDll4-hFc | 105,0 |
| SCIDxhDll4 | hDll4-hFc | 480,0 |
| SCIDxhDll4 | hFc | 924,0 |
| SCIDxhDll4 | hFc | 1020,0 |
| SCIDxhDll4 | hFc | 792,0 |
| SCIDxhDll4 | REGN421 | 168,0 |
| SCIDxhDll4 | REGN421 | 84,0 |
| SCIDxhDll4 | REGN421 | 189,0 |
Claims (22)
1. Антитело человека или фрагмент антитела, которые специфическим образом связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDII4), указанное антитело человека или фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую три определяющих комплементарность области (CDR) тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую три CDR легкой цепи, где указанные три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:901, а указанные три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:437 или SEQ ID NO:903, и где указанное антитело или фрагмент антитела связывается с эпитопом в пределах N-концевого-DSL домена hDII4.
2. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, которые связывают hDII4 с константой аффинности (КD), измеренной с помощью поверхностного плазменного резонанса, менее чем примерно 500 пМ или менее примерно 300 пМ.
3. Антитело человека или фрагмент антитела по п.2, где КD для димерного hDII4 меньше 50 пМ.
4. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ ID NO:431, 433 и 435 соответственно.
5. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ ID NO:439, 441 и 443 соответственно.
6. Антитело человека или фрагмент антитела по п.1, где антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ ID NO:431, 433 и 435 соответственно; и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащие SEQ ID NO:439, 441 и 443 соответственно.
7. Антитело человека или фрагмент антитела по п.6, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из SEQ ID NO:429 и SEQ ID NO:901.
8. Антитело человека или фрагмент антитела по п.6, содержащие вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из SEQ ID NO:437 и SEQ ID NO:903.
9. Антитело человека или фрагмент антитела по п.6, где HCVR/LCVR выбраны из SEQ ID NO:429/437 и 901/903.
10. Антитело человека или фрагмент антитела по п.9, дополнительно содержащие константную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:950, 951 и 952.
11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из предшествующих пунктов.
12. Вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность по п.11.
13. Система «хозяин-вектор» для получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, который специфически связывает DII4 человека, содержащая вектор по п.12, в подходящей клетке-хозяине.
14. Система «хозяин-вектор» по п.13, где клетка-хозяин является прокариотической или эукариотической клеткой, выбранной из Е.coli или клетки СНО.
15. Способ получения антитела против DII4 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий выращивание клеток системы «хозяин-вектор» по п.13 в условиях, допускающих получение антитела или его фрагмента, и выделение антитела или фрагмента, полученных таким образом.
16. Применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из пп.1-10 для получения лекарственного средства, используемого для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4.
17. Применение по п.16, где связанное с DII4 заболевание или расстройство представляет собой патологический ангиогенез, рак, недостаточность иммунной системы, реакцию отторжения трансплантата или воспалительный процесс.
18. Антитело или фрагмент антитела по пп.1-10, используемые для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4.
19. Антитело или фрагмент антитела по п.18, используемые для облегчения течения или ингибирования заболевания, выбранного из патологического ангиогенеза, рака, иммунной недостаточности, реакции отторжения трансплантата или воспалительного процесса.
20. Композиция для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4, содержащая эффективное количество антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-10 и приемлемый носитель.
21. Антитело или фрагмент антитела по любому из пп.1-10, используемые в способе лечения заболевания или расстройства, опосредованного DII4, благодаря облегчению течения или ингибированию активности DII4, который включает введение человеку указанного антитела или фрагмента антитела.
22. Антитело или фрагмент антитела по п.21, где заболевание или расстройство, опосредованное DII4, представляет собой патологический ангиогенез, рак, иммунную недостаточность, реакцию отторжения трансплантата или воспалительный процесс.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87492206P | 2006-12-14 | 2006-12-14 | |
| US60/874,922 | 2006-12-14 | ||
| US91641507P | 2007-05-07 | 2007-05-07 | |
| US60/916,415 | 2007-05-07 | ||
| US98532307P | 2007-11-05 | 2007-11-05 | |
| US60/985,323 | 2007-11-05 | ||
| PCT/US2007/025653 WO2008076379A2 (en) | 2006-12-14 | 2007-12-14 | Human antibodies to human delta like ligand 4 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009126766A RU2009126766A (ru) | 2011-01-20 |
| RU2448979C2 true RU2448979C2 (ru) | 2012-04-27 |
Family
ID=39491524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009126766/10A RU2448979C2 (ru) | 2006-12-14 | 2007-12-13 | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека |
Country Status (34)
| Country | Link |
|---|---|
| US (9) | US7919593B2 (ru) |
| EP (2) | EP2423227A1 (ru) |
| JP (2) | JP5677744B2 (ru) |
| KR (1) | KR101516569B1 (ru) |
| CN (1) | CN101611055B (ru) |
| AU (1) | AU2007334366B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0720021A2 (ru) |
| CA (1) | CA2672622C (ru) |
| CR (1) | CR10863A (ru) |
| CY (1) | CY1113087T1 (ru) |
| DK (1) | DK2115003T3 (ru) |
| DO (1) | DOP2009000140A (ru) |
| EC (1) | ECSP099404A (ru) |
| ES (1) | ES2386480T3 (ru) |
| GT (1) | GT200900167A (ru) |
| HK (1) | HK1138019A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20120536T1 (ru) |
| IL (1) | IL198612A (ru) |
| MA (1) | MA31092B1 (ru) |
| ME (1) | ME00812B (ru) |
| MX (2) | MX358410B (ru) |
| MY (1) | MY164461A (ru) |
| NI (1) | NI200900115A (ru) |
| NO (1) | NO347649B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ577616A (ru) |
| PL (1) | PL2115003T3 (ru) |
| PT (1) | PT2115003E (ru) |
| RS (1) | RS52439B (ru) |
| RU (1) | RU2448979C2 (ru) |
| SG (2) | SG177189A1 (ru) |
| SI (1) | SI2115003T1 (ru) |
| SV (1) | SV2009003296A (ru) |
| TN (1) | TN2009000245A1 (ru) |
| WO (1) | WO2008076379A2 (ru) |
Families Citing this family (148)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6984522B2 (en) | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| USRE47770E1 (en) | 2002-07-18 | 2019-12-17 | Merus N.V. | Recombinant production of mixtures of antibodies |
| ES2368733T3 (es) | 2002-07-18 | 2011-11-21 | Merus B.V. | Producción recombinante de mezclas de anticuerpos. |
| CA2527694C (en) | 2003-05-30 | 2015-07-14 | Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom | Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs |
| US20100069614A1 (en) | 2008-06-27 | 2010-03-18 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
| US7906116B2 (en) * | 2005-09-01 | 2011-03-15 | Parkash Gill | Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4 |
| PL2066694T3 (pl) * | 2006-09-29 | 2016-04-29 | Oncomed Pharm Inc | Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu |
| RU2448979C2 (ru) | 2006-12-14 | 2012-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека |
| WO2008092002A2 (en) | 2007-01-24 | 2008-07-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing pancreatic cancer |
| GB0709333D0 (en) * | 2007-05-15 | 2007-06-20 | Smart Targeting Ltd | Binding protein |
| WO2009111889A1 (en) * | 2008-03-13 | 2009-09-17 | The Hospital For Sick Children | Lymphocyte control of obesity and insulin resistance |
| EP2147594B1 (en) | 2008-06-27 | 2013-11-13 | Merus B.V. | Antibody producing non-human mammals |
| MY155603A (en) | 2008-07-08 | 2015-11-13 | Oncomed Pharm Inc | Notch-binding agents and antagonists and methods of use thereof |
| US8834875B2 (en) | 2010-01-13 | 2014-09-16 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Notch1 binding agents and methods of use thereof |
| PE20141433A1 (es) * | 2008-07-16 | 2014-10-19 | Inst Research In Biomedicine | Anticuerpos neutralizantes de citomegalovirus humano |
| US8871207B2 (en) | 2008-07-25 | 2014-10-28 | Humabs, LLC | Neutralizing anti-influenza A virus antibodies and uses thereof |
| WO2010010466A2 (en) * | 2008-07-25 | 2010-01-28 | Institute For Research In Biomedicine | Neutralizing anti-influenza a virus antibodies and uses thereof |
| CL2009001735A1 (es) * | 2008-08-19 | 2010-02-19 | Regeneron Pharma | Anticuerpo humano o fragmento de union a antigeno del mismo que une e inhibe actividad de ligando del activador del receptor de nf-kb (rankl); adn codificante; vector de expresion; metodo para producir dicho anticuerpo; composicion farmaceutica que lo comprende; uso para atenuar o inhibir enfermedad o condicion mediada por rankl |
| EP2927244A1 (en) * | 2008-09-19 | 2015-10-07 | MedImmune, LLC | Antibodies directed to DLL4 and uses thereof |
| DK2356270T3 (da) | 2008-11-07 | 2016-12-12 | Fabrus Llc | Kombinatoriske antistofbiblioteker og anvendelser deraf |
| CN102459346B (zh) | 2009-04-27 | 2016-10-26 | 昂考梅德药品有限公司 | 制造异源多聚体分子的方法 |
| TWI513465B (zh) * | 2009-06-25 | 2015-12-21 | Regeneron Pharma | 以ｄｌｌ４拮抗劑與化學治療劑治療癌症之方法 |
| EP2564695B1 (en) * | 2009-07-08 | 2015-04-15 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US20120204278A1 (en) * | 2009-07-08 | 2012-08-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| JO3182B1 (ar) | 2009-07-29 | 2018-03-08 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2 |
| EP3029070A1 (en) * | 2009-08-29 | 2016-06-08 | AbbVie Inc. | Therapeutic dll4 binding proteins |
| UY32917A (es) * | 2009-10-02 | 2011-04-29 | Boehringer Ingelheim Int | Moléculas de unión a dll-4 |
| UY32920A (es) | 2009-10-02 | 2011-04-29 | Boehringer Ingelheim Int | Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis |
| PL3072526T3 (pl) | 2009-10-16 | 2019-04-30 | Oncomed Pharm Inc | Kombinacja terapeutyczna i zastosowanie przeciwciał antagonistycznych względem DLL4 i środków antyhipertensyjnych |
| CA2782299A1 (en) * | 2009-12-01 | 2011-06-09 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancers comprising k-ras mutations |
| JO3274B1 (ar) | 2009-12-24 | 2018-09-16 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية للبروتين 4 المشابه لأجيوبيوتين البشري |
| TWI535445B (zh) | 2010-01-12 | 2016-06-01 | 安可美德藥物股份有限公司 | Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法 |
| JO3183B1 (ar) * | 2010-01-29 | 2018-03-08 | Regeneron Pharma | طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4 |
| EP3095871B1 (en) | 2010-02-08 | 2019-04-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Common light chain mouse |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| EP2542582A4 (en) | 2010-03-02 | 2013-12-04 | Abbvie Inc | THERAPEUTIC PROTEINS LINKING TO DLL4 |
| US20110256135A1 (en) * | 2010-03-17 | 2011-10-20 | Wolfgang Fraunhofer | Anti-nerve growth factor (ngf) antibody compositions |
| RU2635999C2 (ru) * | 2010-06-17 | 2017-11-17 | ТРЕЛЛИС БАЙОСАЙЕНС, ЭлЭлСи | Антитела, подходящие для пассивной иммунизации против гриппа |
| NZ707327A (en) | 2010-08-02 | 2017-01-27 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| US8551479B2 (en) | 2010-09-10 | 2013-10-08 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating melanoma |
| JP6000959B2 (ja) * | 2010-10-19 | 2016-10-05 | メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ | ヒト抗体ならびに神経疾患の処置のためのその診断的および治療的使用 |
| WO2012092539A2 (en) * | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Antibodies to dll4 and uses thereof |
| US9527925B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
| US20130078247A1 (en) | 2011-04-01 | 2013-03-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2 |
| JO3283B1 (ar) | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
| SG10201902706VA (en) * | 2011-06-03 | 2019-04-29 | Xoma Technology Ltd | Antibodies specific for tgf-beta |
| JO3412B1 (ar) | 2011-06-17 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها |
| ES2841899T3 (es) | 2011-07-18 | 2021-07-12 | Inst Res Biomedicine | Anticuerpos neutralizantes del virus de la influenza A y usos de los mismos |
| MY172718A (en) | 2011-08-05 | 2019-12-11 | Regeneron Pharma | Humanized universal light chain mice |
| US9017670B2 (en) | 2011-08-19 | 2015-04-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-Tie2 antibodies and uses thereof |
| WO2013041844A2 (en) * | 2011-09-19 | 2013-03-28 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains & chains tailored for human use |
| LT3485903T (lt) | 2011-09-23 | 2023-02-27 | Mereo Biopharma 5, Inc. | Vegf/ dll4 surišantys agentai ir jų panaudojimas |
| CA2791109C (en) | 2011-09-26 | 2021-02-16 | Merus B.V. | Generation of binding molecules |
| WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
| JP6271432B2 (ja) | 2011-09-30 | 2018-01-31 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 抗ＥｒｂＢ３抗体およびその使用 |
| LT3590332T (lt) | 2011-10-28 | 2022-08-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetiškai modifikuotos pelės, ekspresuojančios chimerines pagrindinio audinių dermės komplekso (mhc) ii molekules |
| GB201122047D0 (en) * | 2011-12-21 | 2012-02-01 | Kymab Ltd | Transgenic animals |
| US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| CA2892992A1 (en) | 2011-12-02 | 2013-06-06 | Aimm Therapeutics B.V. | Influenza a virus specific antibodies |
| KR101924805B1 (ko) | 2011-12-20 | 2018-12-04 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 경쇄 마우스 |
| DK3453723T3 (da) | 2012-01-31 | 2021-09-13 | Regeneron Pharma | Anti-ASIC1-antistoffer og anvendelser deraf |
| TWI613215B (zh) | 2012-02-22 | 2018-02-01 | 再生元醫藥公司 | 抗－大－內皮素－１（ｂｉｇ－ｅｔ－１）抗體及其用途 |
| US20140013456A1 (en) | 2012-03-16 | 2014-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same |
| SI2825037T1 (sl) | 2012-03-16 | 2019-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Glodavci, ki izražajo PH občutljiva zaporedja imunoglobulina |
| CN107827979A (zh) | 2012-03-16 | 2018-03-23 | 瑞泽恩制药公司 | 组氨酸工程改造的轻链抗体和用于生成所述抗体的经基因修饰的非人动物 |
| RU2014141536A (ru) | 2012-03-16 | 2016-05-10 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Мыши, которые продуцируют антигенсвязывающие белки с зависимыми от величины ph характеристиками связывания |
| US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
| GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
| MX360109B (es) | 2012-04-20 | 2018-10-23 | Merus Nv | Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig. |
| JO3820B1 (ar) | 2012-05-03 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها |
| CN104603151A (zh) * | 2012-05-31 | 2015-05-06 | 索伦托治疗有限公司 | 与dll-4结合的抗原结合蛋白 |
| AR092325A1 (es) * | 2012-05-31 | 2015-04-15 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-dll4 y kit |
| TW201843172A (zh) | 2012-06-25 | 2018-12-16 | 美商再生元醫藥公司 | 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途 |
| KR101535341B1 (ko) | 2012-07-02 | 2015-07-13 | 한화케미칼 주식회사 | Dll4에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도 |
| JOP20200236A1 (ar) * | 2012-09-21 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها |
| JP2015532272A (ja) | 2012-09-28 | 2015-11-09 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 二重アンジオポエチン−２／Ｄｌｌ４結合剤および抗ＶＥＧＦ−Ｒ剤を含む薬学的組み合わせ |
| US9599620B2 (en) | 2012-10-31 | 2017-03-21 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods and monitoring of treatment with a DLL4 antagonist |
| WO2014078306A1 (en) | 2012-11-13 | 2014-05-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-prokineticin receptor (prokr) antibodies and uses thereof |
| TW201438736A (zh) | 2012-11-14 | 2014-10-16 | Regeneron Pharma | 以ｄｌｌ４拮抗劑治療卵巢癌之方法 |
| JO3405B1 (ar) | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
| CN105164154B (zh) | 2013-02-22 | 2019-06-07 | 瑞泽恩制药公司 | 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠 |
| US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
| US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
| US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
| US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
| JP6283411B2 (ja) * | 2013-07-09 | 2018-02-21 | エービーエルバイオ | Ｄｌｌ４とｖｅｇｆに特異的に結合する新規二重標的タンパク質とこれの用途 |
| US10208125B2 (en) * | 2013-07-15 | 2019-02-19 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof |
| EP3564671B1 (en) | 2013-08-23 | 2021-09-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Diagnostic tests and methods for assessing safety, efficacy or outcome of allergen-specific immunotherapy (sit) |
| DE112014004537T5 (de) | 2013-10-01 | 2016-07-21 | Kymab Limited | Tiermodelle und therapeutische Moleküle |
| KR102501920B1 (ko) | 2013-10-02 | 2023-02-20 | 메디뮨 엘엘씨 | 중화 항-인플루엔자 a 항체 및 이의 용도 |
| EA037890B1 (ru) | 2013-10-18 | 2021-06-01 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Способы и композиции, включающие комбинацию антагониста vegf и анти-ctla-4 антитела |
| CN103804497A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-05-21 | 中国药科大学 | 一种抗人Delta like4单克隆抗体 |
| PL3126388T3 (pl) | 2014-03-11 | 2019-10-31 | Regeneron Pharma | Przeciwciała anty-egfrviii i ich zastosowania |
| TWI701042B (zh) | 2014-03-19 | 2020-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
| SG11201607015VA (en) | 2014-03-21 | 2016-09-29 | Regeneron Pharma | V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS |
| SG11201607203XA (en) | 2014-03-21 | 2016-09-29 | Regeneron Pharma | Non-human animals that make single domain binding proteins |
| CN113563462A (zh) | 2014-07-15 | 2021-10-29 | 免疫医疗有限责任公司 | 中和抗乙型流感抗体及其用途 |
| KR102486321B1 (ko) | 2014-07-18 | 2023-01-09 | 사노피 | 암을 앓고 있는 것으로 의심되는 환자를 아플리베르셉트로 치료한 결과를 예측하는 방법 |
| AU2015338974B2 (en) | 2014-10-31 | 2021-08-26 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy for treatment of disease |
| WO2016081490A1 (en) | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody |
| KR20170105609A (ko) | 2015-01-28 | 2017-09-19 | 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 | 신생혈관형성에 특이적인 신규한 단백질 |
| CA2979702A1 (en) | 2015-03-19 | 2016-09-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen |
| EA034950B1 (ru) | 2015-03-27 | 2020-04-09 | Регенерон Фармасьютикалз, Инк. | Производные майтанзиноида, их конъюгаты и способы использования |
| BR112017021250A2 (pt) | 2015-04-06 | 2018-06-26 | Regeneron Pharma | respostas imunes mediadas por células t humanizadas em animais não humanos |
| CA2987410A1 (en) | 2015-05-29 | 2016-12-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibodies against ox40 and uses thereof |
| HUE056407T2 (hu) | 2015-06-01 | 2022-02-28 | Medimmune Llc | Neutralizáló influenzaellenes kötõmolekulák és alkalmazásaik |
| EP3328994A4 (en) | 2015-07-31 | 2019-04-17 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | CD56 TARGETING ANTIGEN BINDING PROTEINS AND USES THEREOF |
| JOP20160154B1 (ar) | 2015-07-31 | 2021-08-17 | Regeneron Pharma | أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها |
| IL258036B (en) | 2015-09-23 | 2022-09-01 | Regeneron Pharma | Optimized bispecific antibodies against class 3 determinants and their uses |
| EP3353204B1 (en) | 2015-09-23 | 2023-10-18 | Mereo BioPharma 5, Inc. | Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer |
| WO2017100642A1 (en) | 2015-12-11 | 2017-06-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to egfr and/or erbb3 blockade |
| KR20180101436A (ko) | 2016-01-13 | 2018-09-12 | 메디뮨 엘엘씨 | 인플루엔자 a의 치료 방법 |
| CN114478801A (zh) | 2016-01-25 | 2022-05-13 | 里珍纳龙药品有限公司 | 美登素类化合物衍生物、其偶联物和使用方法 |
| WO2017205651A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Human notch1 based fusion proteins as decoy inhibitors of jagged-notch signaling and dll-notch signaling |
| AU2017278193B9 (en) | 2016-06-10 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-GITR antibodies and uses thereof |
| WO2018067331A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-04-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Bi specific anti-muc16-cd3 antibodies and nti-muc16 drug conjugates |
| KR102520731B1 (ko) | 2016-09-23 | 2023-04-14 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-steap2 항체, 항체-약물 컨쥬게이트, 및 steap2 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자, 및 이의 용도 |
| TWI782930B (zh) | 2016-11-16 | 2022-11-11 | 美商再生元醫藥公司 | 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法 |
| CA3044534A1 (en) | 2016-11-29 | 2018-06-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating prlr positive breast cancer |
| WO2018118713A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating an allergy with allergen-specific monoclonal antibodies |
| LT3638698T (lt) * | 2018-01-26 | 2021-04-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Antikūnai prieš tmprss2 ir antigeną surišantys fragmentai |
| EP3774866A1 (en) | 2018-04-13 | 2021-02-17 | Ludwig Institute for Cancer Research Ltd | Heterodimeric inactivatable chimeric antigen receptors |
| CN112074538A (zh) | 2018-04-30 | 2020-12-11 | 瑞泽恩制药公司 | 结合her2和/或aplp2的抗体和双特异性抗原结合分子、其缀合物和用途 |
| CN108752473B (zh) * | 2018-05-03 | 2021-08-31 | 陕西师范大学 | 一种抗c5全人源单链抗体c5b3及其应用 |
| EP3844189A1 (en) | 2018-08-31 | 2021-07-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Dosing strategy that mitigates cytokine release syndrome for cd3/c20 bispecific antibodies |
| CN113727757A (zh) | 2019-02-21 | 2021-11-30 | 瑞泽恩制药公司 | 使用结合met的抗-met抗体和双特异性抗原结合分子治疗眼癌的方法 |
| US20220119502A1 (en) * | 2019-02-28 | 2022-04-21 | Ann And Robert H. Lurie Children's Hospital Of Chicago | Kawasaki disease antibodies identify hepacivirus peptides |
| EP3986934A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of bispecific antigen-binding molecules that bind muc16 and cd3 in combination with 4-1bb co-stimulation |
| MA56515A (fr) | 2019-06-21 | 2022-04-27 | Regeneron Pharma | Utilisation de molécules de liaison à l'antigène bispécifiques se liant à psma et cd3 en combinaison avec une co-stimulation de 4-1bb |
| US11896682B2 (en) | 2019-09-16 | 2024-02-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Radiolabeled MET binding proteins for immuno-PET imaging and methods of use thereof |
| US11814428B2 (en) | 2019-09-19 | 2023-11-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof |
| US20230141511A1 (en) | 2019-12-20 | 2023-05-11 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd | Car-t cell therapy targeting ngcgm3 |
| CN111234003B (zh) * | 2020-02-07 | 2022-02-01 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种用于癌症靶向治疗的短肽及基于其的超声响应纳米载药微泡和应用 |
| IL295312A (en) | 2020-02-28 | 2022-10-01 | Regeneron Pharma | Bispecific antigen binding molecules that bind her2 and methods of using them |
| BR112022017156A2 (pt) | 2020-03-06 | 2022-11-08 | Regeneron Pharma | Anticorpo isolado ou fragmento de ligação, molécula polinucleotídica isolada, vetor, célula hospedeira isolada, composição farmacêutica, método de tratamento de câncer, e, uso de um anticorpo |
| WO2021195326A1 (en) * | 2020-03-26 | 2021-09-30 | Vanderbilt University | Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) |
| JP2023534437A (ja) | 2020-07-13 | 2023-08-09 | リジェネロン ファーマシューティカルズ，インク． | タンパク質中のグルタミン残基にコンジュゲートされたカンプトテシンアナログおよびその使用 |
| US11866502B2 (en) | 2020-10-22 | 2024-01-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-FGFR2 antibodies and methods of use thereof |
| JP2023548975A (ja) | 2020-11-10 | 2023-11-21 | レジェネロン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | セレン抗体複合体 |
| WO2022159875A1 (en) | 2021-01-25 | 2022-07-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-pdgf-b antibodies and mehods of use for treating pulmonary arterial hypertension (pah) |
| CA3212850A1 (en) | 2021-06-22 | 2022-12-29 | Frank DELFINO | Anti-egfrviii antibody drug conjugates and uses thereof |
| WO2023137026A1 (en) | 2022-01-12 | 2023-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use |
| WO2023196903A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific antigen-binding molecules that bind and cd3 and tumor associated antigens (taas) and uses thereof |
| WO2023240109A1 (en) | 2022-06-07 | 2023-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| IL101728A (en) * | 1991-05-03 | 2007-08-19 | Univ Yale | Human Abandonment and Delta, Restrictive Areas of Effect in Tophoric Proteins, and Methods Based on Them |
| ATE381614T1 (de) | 1992-07-24 | 2008-01-15 | Amgen Fremont Inc | Bildung von xenogenen antikörpern |
| ES2334953T3 (es) * | 1995-06-28 | 2010-03-17 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Secuencias de nucleotidos y proteinas de genes delta de vertebrados y metodos basados en los mismos. |
| AU718138B2 (en) * | 1995-08-29 | 2000-04-06 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Chimeric animal and method for constructing the same |
| JP4283891B2 (ja) | 1995-11-17 | 2009-06-24 | 旭化成株式会社 | 分化抑制ポリペプチド |
| US6121045A (en) * | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Human Delta3 nucleic acid molecules |
| EP0972041B2 (en) | 1997-04-04 | 2017-01-18 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel human delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor |
| US20030180784A1 (en) * | 1997-04-04 | 2003-09-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor |
| JP4171528B2 (ja) * | 1997-05-14 | 2008-10-22 | 旭化成株式会社 | 新規な分化抑制剤 |
| JP2002523018A (ja) | 1998-07-27 | 2002-07-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | デルタ関連ポリペプチド |
| US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
| US6949245B1 (en) | 1999-06-25 | 2005-09-27 | Genentech, Inc. | Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies |
| US6541225B1 (en) | 2000-01-26 | 2003-04-01 | Raven Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| JP2003047470A (ja) | 2001-08-01 | 2003-02-18 | Asahi Kasei Corp | 新規な抗体及びその用途 |
| PT1517921E (pt) * | 2002-06-28 | 2006-09-29 | Domantis Ltd | Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada |
| JP2006515177A (ja) * | 2002-09-10 | 2006-05-25 | ロランティス リミテッド | Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質を含む医薬組成物及び医学的処置 |
| US20040101920A1 (en) | 2002-11-01 | 2004-05-27 | Czeslaw Radziejewski | Modification assisted profiling (MAP) methodology |
| US20060134121A1 (en) * | 2004-10-29 | 2006-06-22 | Gavin Thurston | DII4 antagonists, assays, and therapeutic methods thereof |
| US20060175847A1 (en) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Davis Blair C | Magnetic doorknob with interchangeable design discs |
| CA2621226A1 (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Methods for using and identifying modulators of delta-like 4 |
| CA2630839C (en) * | 2005-12-16 | 2017-01-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists |
| MX2008014804A (es) | 2006-06-02 | 2009-01-27 | Regeneron Pharma | Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano. |
| CA2654304A1 (en) * | 2006-06-06 | 2007-12-13 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for modulating vascular development |
| AU2007319672B2 (en) * | 2006-06-06 | 2011-06-30 | Genentech, Inc. | Anti-DLL4 antibodies and methods using same |
| PL2066694T3 (pl) | 2006-09-29 | 2016-04-29 | Oncomed Pharm Inc | Kompozycje i sposoby diagnozowania i leczenia nowotworu |
| RU2448979C2 (ru) | 2006-12-14 | 2012-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека |
| TWI513465B (zh) * | 2009-06-25 | 2015-12-21 | Regeneron Pharma | 以ｄｌｌ４拮抗劑與化學治療劑治療癌症之方法 |
| JO3183B1 (ar) * | 2010-01-29 | 2018-03-08 | Regeneron Pharma | طرق لمعالجة أمراض المناعة الذاتية مضادات dll4 |
| TW201438736A (zh) * | 2012-11-14 | 2014-10-16 | Regeneron Pharma | 以ｄｌｌ４拮抗劑治療卵巢癌之方法 |
-
2007
- 2007-12-13 RU RU2009126766/10A patent/RU2448979C2/ru active
- 2007-12-13 NO NO20092596A patent/NO347649B1/no unknown
- 2007-12-14 EP EP11190612A patent/EP2423227A1/en not_active Withdrawn
- 2007-12-14 US US12/002,245 patent/US7919593B2/en active Active
- 2007-12-14 SG SG2011090172A patent/SG177189A1/en unknown
- 2007-12-14 MX MX2011006348A patent/MX358410B/es unknown
- 2007-12-14 WO PCT/US2007/025653 patent/WO2008076379A2/en active Application Filing
- 2007-12-14 ME MEP-2009-224A patent/ME00812B/me unknown
- 2007-12-14 ES ES07862940T patent/ES2386480T3/es active Active
- 2007-12-14 NZ NZ577616A patent/NZ577616A/en unknown
- 2007-12-14 AU AU2007334366A patent/AU2007334366B2/en active Active
- 2007-12-14 BR BRPI0720021A patent/BRPI0720021A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-12-14 CA CA2672622A patent/CA2672622C/en active Active
- 2007-12-14 PL PL07862940T patent/PL2115003T3/pl unknown
- 2007-12-14 RS RS20120366A patent/RS52439B/en unknown
- 2007-12-14 EP EP07862940A patent/EP2115003B1/en active Active
- 2007-12-14 MX MX2009005963A patent/MX2009005963A/es active IP Right Grant
- 2007-12-14 DK DK07862940.9T patent/DK2115003T3/da active
- 2007-12-14 SI SI200730966T patent/SI2115003T1/sl unknown
- 2007-12-14 PT PT07862940T patent/PT2115003E/pt unknown
- 2007-12-14 CN CN2007800460304A patent/CN101611055B/zh active Active
- 2007-12-14 SG SG2011090719A patent/SG177193A1/en unknown
- 2007-12-14 MY MYPI20092051A patent/MY164461A/en unknown
- 2007-12-14 JP JP2009541401A patent/JP5677744B2/ja active Active
- 2007-12-14 KR KR1020097013986A patent/KR101516569B1/ko active IP Right Grant
-
2008
- 2008-10-03 US US12/245,392 patent/US7488806B2/en active Active
-
2009
- 2009-02-13 US US12/371,159 patent/US7534868B1/en active Active
- 2009-05-06 IL IL198612A patent/IL198612A/en active IP Right Grant
- 2009-06-11 EC EC2009009404A patent/ECSP099404A/es unknown
- 2009-06-11 CR CR10863A patent/CR10863A/es unknown
- 2009-06-11 SV SV2009003296A patent/SV2009003296A/es unknown
- 2009-06-12 TN TNP2009000245A patent/TN2009000245A1/fr unknown
- 2009-06-12 NI NI200900115A patent/NI200900115A/es unknown
- 2009-06-12 GT GT200900167A patent/GT200900167A/es unknown
- 2009-06-12 DO DO2009000140A patent/DOP2009000140A/es unknown
- 2009-07-09 MA MA32084A patent/MA31092B1/fr unknown
-
2010
- 2010-05-11 HK HK10104569.1A patent/HK1138019A1/xx unknown
-
2011
- 2011-02-25 US US13/034,761 patent/US20110150905A1/en not_active Abandoned
-
2012
- 2012-06-28 HR HRP20120536TT patent/HRP20120536T1/hr unknown
- 2012-09-04 CY CY20121100786T patent/CY1113087T1/el unknown
-
2014
- 2014-02-10 US US14/176,523 patent/US20150232545A1/en not_active Abandoned
- 2014-08-15 JP JP2014165475A patent/JP2014240412A/ja not_active Withdrawn
- 2014-10-27 US US14/524,164 patent/US20150191534A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-06-03 US US14/729,218 patent/US20150376267A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-10-14 US US15/293,508 patent/US20170029492A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-06-04 US US16/892,336 patent/US11820815B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| РЫБАЛЬСКИЙ Н.Г., СЕРОВА М.А., ИГНАТЬЕВА Г.А., СТАРЧЕУС А.П. Моноклональные антитела и гибридомы. - М.: ВАСХНИЛ, 1989. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2448979C2 (ru) | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека | |
| RU2663106C2 (ru) | Человеческие антитела с высокой аффинностью к рецепторам il-4 человека | |
| JP6140777B2 (ja) | ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体 | |
| WO2017071625A1 (zh) | 一种抗pd-1单克隆抗体、其药物组合物及其用途 | |
| AU2007314522B8 (en) | High affinity human antibodies to human IL-4 receptor | |
| US20090252746A1 (en) | Erythropoietin receptor binding antibodies | |
| KR20200061320A (ko) | 세포독성 t-림프구-관련 단백질 4 (ctla-4)에 대한 신규의 단일클론 항체 | |
| KR20170110681A (ko) | Pcsk9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도 | |
| EP4070816A1 (en) | Anti-gdf15 antibody | |
| WO2021018114A1 (zh) | 抗人p40蛋白域抗体及其用途 | |
| CN116635418A (zh) | 抗igsf1抗体及其用途 | |
| CN116082513A (zh) | 分离的抗原结合蛋白及其用途 |