TW201438736A - 以ｄｌｌ４拮抗劑治療卵巢癌之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供治療癌症/腫瘤生長的方法，其是藉由投與Dll4拮抗劑，具體而言是特異地結合人類Dll4的Dll4抗體與其片段，視情況與VEGF拮抗劑以及化療劑一起。亦提供含有Dll4拮抗劑、VEGF拮抗劑以及化療劑的醫藥組成物與套組。

Description

以DLL4拮抗劑治療卵巢癌之方法
本發明是有關於以δ樣配體4(Dll4)拮抗劑、具體而言為特異地結合人類Dll4之人類抗體或其片段治療癌症或腫瘤的方法。該Dll4拮抗劑可與一或多種額外藥劑一起投與，額外藥劑為化療劑及/或VEGF拮抗劑。
Dll4是Notch配體δ家族的一個成員，其依據血管內皮展現高度選擇性表現(Shutter et al.(2000)Genes Develop.14：1313-1318)。Dll4是Notch受體(包括Notch1及Notch4)的一個配體。Dll4拮抗劑可在各種癌症中用於抑制腫瘤生長。人類Dll4(hDll4)的核酸與胺基酸序列分別顯示於SEQ ID NO：1與2中。對人類Dll4具有特異性的抗體以及使用Dll4抗體治療癌症/腫瘤揭示於國際專利申請公開案WO 2007/143689、WO 2008/042236以及WO 2007/070671中。
在第一個態樣中，本發明特徵為一種在有需要的個體中治療癌症(例如卵巢癌)的方法，該方法包含向該個體投與Dll4拮抗劑，其中該癌症受到治療。由本發明方法所治療的個體可包括任一種哺乳動物物種，但較佳為罹患癌症的人類。
本發明亦有關使用Dll4拮抗劑治療卵巢癌的方法以及降低或停止卵巢腫瘤生長的方法，該方法包含向該個體投與Dll4拮抗劑，其中該癌症受到治療及/或卵巢腫瘤生長被降低或停止，其包括投與採用VEGF拮抗劑及/或化療劑的組合療法。
在一個具體例中，該Dll4拮抗劑為以高親和力特異地結合Dll4並阻斷Dll4結合至Notch受體及/或中和Dll4活性的Dll4抗體或其片段(”Dll4 Ab”)。該抗體可以是多株、單株、嵌合、鼠、人類化或完全人類抗體。該抗體較佳為完全人類單株抗體或單株抗體片段。該抗體片段可以是單鏈抗體、Fab或(Fab’)2。
在另一個具體例中，該Dll4 Ab結合位於Dll4(SEQ ID NO：2)的N-端域(S27-R172)，或DSL域(V173-C217)，或N-端-DSL域(S27-C217)內的抗原決定位。本發明方法中所使用的該Dll4 Ab能夠以高親和力結合人類Dll4且其解離常數(KD)如藉由表面電漿共振所測為約500pM或更低，包括約300pM或更低，且包括約200pM或更低。舉例而言，Dll4 Ab具有包含三個重鏈CDR(H-CDR)的重鏈可變區(HCVR)以及包含三個輕鏈CDR(L-CDR)的輕鏈可變區(LCVR)，其中該三個重鏈CDR包含胺基酸序列SEQ ID NO：20的CDR1、CDR2以及CDR3，而三個輕鏈CDR包含胺基酸序列SEQ ID NO：28的CDR1、CDR2以及CDR3。在另一個具體例中，Dll4 Ab的 重鏈CDR1、CDR2以及CDR3分別包含SEQ ID NO：22、24及26的胺基酸序列。在另一個具體例中，Dll4 Ab的輕鏈CDR1、CDR2以及CDR3分別包含SEQ ID NO：30、32以及34的胺基酸序列。在又另一個具體例中，Dll4 Ab包含分別含有SEQ ID NO：22、24以及26的重鏈CDR1、CDR2以及CDR3，以及分別含有SEQ ID NO：30、32以及34的輕鏈CDR1、CDR2以及CDR3。在又另一個具體例中，Dll4 Ab包含含有SEQ ID NO：20或116之胺基酸序列的HCVR，或含有SEQ ID NO：28或118之胺基酸序列的LCVR。在又另一個具體例中，Dll4 Ab包含SEQ ID NO：20/28(REGN281)或116/118(REGN421)的HCVR/LCVR組合。
在另一個具體例中，Dll4 Ab包含選自下列的重鏈CDR1/CDR2/CDR3組合以及輕鏈CDR1/CDR2/CDR3組合：分別為SEQ ID NO：6/8/10與SEQ ID NO：14/16/18；分別為SEQ ID NO：38/40/42與SEQ ID NO：46/48/50；分別為SEQ ID NO：54/56/58與SEQ ID NO：62/64/66；分別為SEQ ID NO：70/72/74與SEQ ID NO：78/80/82；分別為SEQ ID NO：86/88/90與SEQ ID NO：94/96/98；以及分別為SEQ ID NO：102/104/106與SEQ ID NO：110/112/114。在另一個具體例中，Dll4 Abl包含含有SEQ ID NO：4、36、52、68、84或100之胺基酸序列的HCVR，或含有SEQ ID NO：12、44、60、76、92或108之胺基酸序列的LCVR。在又另一個具體例中，Dll4 Ab包含選自下列的HCVR/LCVR組合：SEQ ID NO：4/12(REGN279)；SEQ ID NO：36/44(REGN290)；SEQ ID NO：52/60(REGN306)；SEQ ID NO：68/76(REGN309)；SEQ ID NO：84/92(REGN310)；以及SEQ ID NO：100/108(REGN289)。
編碼胺基酸序列SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116以及118的核苷酸序列分別顯示為SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115以及117中。
在一個具體例中，本發明方法包括投與VEGF拮抗劑。在特定具體例中，該VEGF拮抗劑為VEGF抗體或其抗原-結合片段，其能阻斷VEGF結合至VEGF受體。在一個具體例中，該VEGF拮抗劑為VEGF-Trap，其包含SEQ ID NO：121的胺基酸序列。
在一個具體例中，該化療劑為抗-有絲分裂劑，諸如多西紫杉醇、太平洋紫杉醇與類似物；以鉑為主的化療化合物，諸如順鉑、卡鉑、異丙鉑，草酸鉑與類似物；或其他習知細胞毒性劑，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)、伊立替康(irinotecan)、白葉酸(leucovorin)、吉西他濱(gemcitabine)；受體酪胺酸激酶及/或血管新生的抑制劑，諸如ErbB抑制劑、RTK第III類抑制劑與類似物，而Dll4拮抗劑為如上所述的Dll4抗體或其片段。
在一個具體例中，本發明特徵亦為一種相較於單獨投與個別藥劑而降低達到所要治療效用所需之化療劑或Dll4拮抗劑之量的方法，該方法包含投與化療劑以及Dll4拮抗劑。在一個具體例 中，亦投與VEGF拮抗劑。在一個具體例中，於共投與Dll4拮抗劑的情況下，達到所要治療效用(諸如，例如停止或降低腫瘤生長)的化療劑之量為至少低10%、至少低20%、至少低30%、至少低40%，或至少低50%，或反之亦然。一般而言，樂見可降低化療劑或Dll4拮抗劑的量達約30%至約50%。因此，本發明方法藉由能夠降低有效劑量而尤其有益於癌症患者，該患者對於因為藥劑單獨治療所需之高劑量引起的副作用有低耐受性。
其他目的以及益處將從檢閱以下詳細說明而變得清楚。
詳細說明
在說明本方法之前，應理解本發明不限於特定方法以及所述實驗條件，因為這些方法以及條件可能會改變。亦要理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用，而不是限制性的，因為本發明的範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
如本說明書以及隨附申請專利範圍中所使用，除非在本文內另有清楚指明，否則單數形式”一”以及”該”包括複數指涉對象。因此，例如提及”一種方法”包括一或多種方法，及/或本文所述類型及/或對於習於技藝者來說在讀過本揭示內容之後將變得清楚的步驟。
除非另有定義，否則本文所使用的全部技術以及科學術語具有本發明所屬技術領域中具有通常技術者一般所理解的相同意思。儘管任何與本文所述方法以及材料相似或相同者可用於實施或測試本發明，現將說明較佳方法以及材料。
定義
”δ樣配體4”、”Dll4”、”hDll4”交互地使用來意指由核酸序列SEQ ID NO：1所編碼的蛋白質以及具有胺基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白質。
Dll4拮抗劑包括針對Dll4的抗體及其能阻斷Dll4結合至Notch受體(諸如Notch 1以及Notch4)的片段、包含融合至集合體分之Dll4胞外域的融合蛋白質或其片段(參見例如美國專利申請公開案第2006/0134121號與第2008/0107648號)，與肽和肽體(參見例如美國專利第7,138,370號)。
除非另有具體指明，否則術語”抗體”如本文所用，應理解為含括包含兩條免疫球蛋白重鏈以及兩條免疫球蛋白輕鏈的抗體分子(亦即”完整抗體分子”)和其抗原-結合片段。術語”抗體的”抗原-結合部分”、抗體的”抗原-結合片段”及類似用語如本文所用包括任何天然存在的、酵素上所得到的、合成的或經遺傳工程化的多肽或糖蛋白，其特異地結合抗原而形成複合體。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作並表現編碼抗體可變與視情況恆定域之DNA的重組遺傳工程技術)而衍生自例如完整抗體分子。這樣的DNA是已知的及/或易於從例如商業來源、DNA庫(包括，例如噬菌體-抗體庫)獲得或可被合成。DNA可以被定序且以化學的方式或藉由使用分子生物技術來操作，例如將一或多個可變及/或恆定域排成適當構型，或引入會產生半胱胺酸殘基的密碼子、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原-結合片段的非限制性實施例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；與(vii)由模擬抗體的超變異區之胺基酸殘基所構成的 最小辨識單元(例如單離的互補決定區(CDR))。其他經工程化的分子(諸如雙抗體、三抗體、四抗體與微抗體)亦含括在如本文所用詞句”抗原-結合片段”中。
抗體的抗原-結合片段典型含有至少1個可變域。可變域可以是任何大小與胺基酸組成，且通常含有至少一個鄰近一或多個骨架序列或在一或多個骨架序列中的CDR。在帶有與VL域締合之VH域的抗原-結合片段中，VH以及VL域可相對另一者位在適當排列處。舉例而言，可變區是二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些具體例中，抗體的抗原-結合片段可含有至少一個共價連結至少一個恆定域的可變域。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變域與恆定域的非限制例示性構型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變域與恆定域的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構型)，可變域與恆定域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相鄰可變域及/或恆定域間產生彈性或半彈性鍵聯。此外，本發明之抗體的抗原-結合片段可包含上列可變域與恆定域構型的任一者彼此及/或與一或多個單體VH或VL域以非共價締合(例如藉由雙硫鍵)所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完整抗體分子而言，抗原-結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原-結合片段典型包含有至少兩個不同可變域，其中各個可變域能夠特異地結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定位。任一種多特異性抗體形式，包括本文所揭示的例示性雙特異性抗體形式，可使用該技藝中可取得之慣用技術而改造成使用於本發明之抗體的抗原-結合片段中。
術語”人類抗體”，如本文所用，欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定位突變或藉由活體內體突變所引入的突變)，例如在CDR以及尤其在CDR3中。但是，術語”人類抗體”，如本文所用，不意欲要包括已被移植至人類FR序列上之衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列的mAb。
相較於對應生殖系序列，本文揭示的完整人類抗-Dll4抗體可在骨架及/或重鏈及輕鏈可變域的CDR區中含有一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等突變可透過將本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公用抗體序列資料庫的生殖系序列相比對而容易確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，其等是衍生自本文所揭示的任一胺基酸序列，其中一或多個骨架及/或CDR區中的一或多個胺基酸回復突變成對應生殖系殘基，或對應生殖系殘基的守恆性胺基酸置換(天然或非天然)(此等序列改變在本文中意指為”生殖系回復-突變”)。本技藝中具有通常技術者從本文揭示的重鏈與輕鏈可變區序列開始，可輕易製造出許多含有一或多個個別生殖系回復-突變或其組合的抗體及抗原-結合片段。在某些具體例中，VH及/或VL域 中的所有骨架及/或CDR殘基突變回復成生殖系序列。在其他具體例中，僅有某些殘基突變回復成生殖系序列，例如僅有在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基，或僅有CDR1、CDR2或CDR3中所發現的突變殘基。此外，本發明抗體可含有兩個或更多個骨架及/或CDR區中之生殖系回復-突變的任一組合，亦即其中某些個別殘基突變回復成生殖系序列，而不同於生殖系序列的某些其他殘基維持原狀。在得到後，含有一或多個生殖系回復-突變的抗體及抗原-結合片段可針對一或多種所要特性(諸如結合特異性增進、結合親和力增加、拮抗或促效生物特性增進或提高(視情況而定)、免疫原性降低等)來進行簡易測試。以此一般方式所得到的抗體及抗原-結合片段含括在本發明中。
本發明亦包括抗-Dll4抗體，該抗體含有本文揭示之具有一或多個守恆性置換的HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列任一者的變體。例如，本發明包括具有HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列的抗-Dll4抗體，該抗體相對於本文揭示之任一HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少、2個或1個守恆性胺基酸置換。在一個具體例中，HCVR包含其中有10個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：116。在另一個具體例中，HCVR包含其中有8個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：116。在另一個具體例中，HCVR包含其中有6個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：116。在另一個具體例中，HCVR包含其中有4個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：116。在又另一個具體例中，HCVR包含其中有2個或1個守恆性胺基酸置換的胺基 酸序列SEQ ID NO：116。在一個具體例中，LCVR包含其中有10個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：118。在另一個具體例中，LCVR包含其中有8個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：118。在另一個具體例中，LCVR包含其中有6個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：118。在另一個具體例中，LCVR包含其中有4個或更少個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：118。在又另一個具體例中，LCVR包含其中有2個或1個守恆性胺基酸置換的胺基酸序列SEQ ID NO：118。
”中和”或”阻斷”抗體欲意指一種抗體，其結合至Dll4會抑制Dll4的生物活性。Dll4生物活性的抑制作用可以藉由測量Dll4生物活性的一或多個指標而被評估。Dll4生物活性的這些指標可以藉由數種技藝中已知的標準活體外或活體內分析中的一或多者來評估。例如，抗體中和Dll4活性的能力是藉由抑制Dll4結合至Notch受體來評估。
本發明亦包括特異地結合至鼠Dll4的抗-Dll4抗體。舉例而言，本發明包括分別具有SEQ ID NO：122與123之LCVR與HCVR胺基酸序列的抗-Dll4抗體(mDll4Abl，亦已知為REGN1035)及其抗原-結合片段。在本發明的一個具體例中，特異地結合至鼠Dll4的抗-Dll4抗體不會明顯結合至人類Dll4。
術語”特異地結合”或類似用語表示與抗原形成在生理條件下相對穩定之複合體的抗體或其抗原-結合片段。特異性結合的特徵在於平衡解離常數為至少約1x 10-6M或更低(例如，較小的KD表示更緊密的結合)。用於測定兩個分子是否特異結合的方法為本技藝中已知，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。但是， 特異地結合hDll4的經單離抗體可能對其他抗原(諸如其他物種的Dll4分子)表現交叉反應性。此外，結合至hDll4以及一或多種其他抗原的多特異性抗體(例如雙特異性)仍被視為是如本文所用”特異地結合”hDll4的抗體。
術語”KD”，如本文所用，欲意指特定抗體-抗原交互作用的解離常數。
術語”高親和力”抗體意指彼等以少於約500pM、少於約400pM、少於約300pM，或少於約200pM的KD結合Dll4的抗體，如藉由表面電漿共振(例如BIACORETM或溶液-親和力ELISA)使用例如單體Dll4所測量；或彼等以少於約100pM、少於約50pM，或少於約20pM的KD結合Dll4的抗體，如藉由表面電漿共振使用二聚體Dll4所測量。
術語”表面電漿共振”，如本文所用，意指容許藉由偵測生物感測基質中的蛋白質濃度變化來分析即時生物特異性交互作用的光學現象，例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。
術語”抗原決定位(epitope)”意指抗原被抗體結合的一個區域。抗原決定位可以被界定為結構性或功能性。功能性抗原決定位通常是結構性抗原決定位的一個子群且具有與交互作用親和力直接相關的彼等殘基。抗原決定位也可以是構像性的，亦即由非線性胺基酸所組成。在某些具體例中，抗原決定位可包括本身為分子的化學活性表面基團的決定因子，諸如胺基酸、糖側鏈、磷氧基或磺醯基，且在某些具體例中，可具有特定三維結構特性，及/或特定電荷特性。
依據某些具體例，本發明方法包含對個體投與VEGF拮抗劑。如本文所述，用語”VEGF拮抗劑”表示任何阻斷、降低或干擾VEGF之正常生物活性的分子。VEGF拮抗劑包括干擾VEGF與天然VEGF受體之間交互作用的分子，例如結合至VEGF或VEGF受體且防止或以其他方法阻止VEGF與VEGF受體之間交互作用的分子。特定例示性VEGF拮抗劑包括抗-VEGF抗體、抗-VEGF受體抗體，以及以VEGF受體為主的嵌合分子(在本文中亦意指為”VEGF-Trap”)。VEGF-Trap的一個較佳具體例為VEGFR1R2-Fc△C1(a)(SEQ ID NO：121)(如WO 00/75319中所述)。
以VEGF受體為主的嵌合分子包括嵌合多肽，其含有VEGF受體的兩個或更多個免疫球蛋白(Ig)樣域，諸如VEGFR1(亦意指為Flt1)及/或VEGFR2(亦意指為Flk1或KDR)，且亦可含有集合域(例如促使兩個或更多個嵌合多肽集合(例如二聚化)的Fc域)。如上所提，以VEGF受體為主的例示性嵌合分子是意指為VEGFR1R2-Fc△C1(a)的分子，其由SEQ ID NO：119的核酸序列所編碼。VEGFR1R2-Fc△C1(a)包含三個組分：(1)含有SEQ ID NO：120之胺基酸27至129的VEGFR1組分；(2)含有SEQ ID NO：120之胺基酸130至231的VEGFR2組分；以及(3)含有SEQ ID NO：120之胺基酸232至457的集合組分(”Fc△C1(a)”)(SEQ ID NO：120的C端胺基酸[亦即K458]可被或可不被納入本發明方法中所用的VEGF拮抗劑中；參見例如美國專利7,396,664)。SEQ ID NO：120的胺基酸1-26為訊號序列。
化療劑為治療癌症中可使用的化學性化合物，且包括生長抑制劑或其他細胞毒性劑。本方法中可使用的化療劑實例包括 烷化劑，諸如塞替派(thiotepa)以及環磷醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN®)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulphan)、英丙舒凡(improsulfan)與呱泊舒凡(piposulfan)；吖丙啶(aziridine)，諸如苯佐替呱(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；二亞甲亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲蜜胺；氮芥類，比如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氮環磷醯胺、雌氮芥、異環磷醯胺、甲基二氯乙基胺、甲基二氯乙基胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀、氯乙環磷醯胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲類(nitrosurea)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯尿菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，卡奇黴素(calicheamicin)、放線菌素、嗜癌菌素、色黴素、博來黴素、放線菌素C(cactinomycin)、卡奇黴素、卡柔比星、洋紅黴素、嗜癌菌素、色黴素、放線菌素D、道諾黴素、地托比星、6-二氮雜-5-側氧基-L-正亮胺酸、阿黴素、表阿黴素、依索比星、依達比星、麻西羅黴素、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素、橄欖黴素、培洛黴素、泊非黴素、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲黴素、殺結核菌素、烏苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代謝物，諸如甲氨蝶呤和5-FU；葉酸類似物，諸如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱、阿紮胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙去氧尿苷 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，比如卡魯睪酮、屈他雄酮丙酸鹽、環硫雄醇、美雄酮、睪內酯；抗腎上腺類(antl-adrenals)，諸如胺魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，諸如醛葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶；貝塔布希(bestrabucil)；比生群；依達曲沙(edatraxate)；磷胺氮芥(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鳥胺酸；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他丁；苯丙氨酸；批柔比星；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK®；雷佐生；西佐糖；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴仁(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(arabinoside)("Ara-C")；環磷醯胺；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇或紫杉醇家族的成員，諸如太平洋紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、多西紫杉醇(TAXOTERE®；Aventis Antony,France)與其類似物；氯芥苯丁酸(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑與卡鉑；長春花鹼(vinblastine)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C(mitomycin C)；雙羥恩(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；維諾本(navelbine)；諾肖林(novantrone)；坦尼坡賽(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺蝶呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸 (ibandronate)；CPT-11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；維甲酸(retinoic acid)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；受體酪胺酸激酶及/或血管新生的抑制劑，包括索拉菲尼(sorafenib)(Bayer Pharmaceuticals Corp.的Nexavar®)、舒尼替尼(sunitinib)(Pfizer的Sutent®)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline的VotrientTM)、托西尼布(toceranib)(Pfizer的PalladiaTM)、凡德他尼(vandetanib)(AstraZeneca的ZactimaTM)、西地尼布(cediranib)(AstraZeneca的Recentin®)、瑞格菲尼(regorafenib)(Bayer的BAY 73-4506)、阿西替尼(axitinib)(Pfizer的AG013736)、來他替尼(lestaurtinib)(Cephalon的CEP-701)、厄洛替尼(erlotinib)(Genentech的Tarceva®)、吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca的IressaTM)、BIBW 2992(Boehringer Ingelheim的TovokTM)、拉帕替尼(lapatinib)(GlaxoSmithKline的Tykerb®)、來那替尼(neratinib)(Wyeth/Pfizer的HKI-272)，與類似物，及上述任一者的醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。調節或抑制激素對腫瘤作用的抗激素藥劑亦含括在這個定義中，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)與托瑞米芬(toremifene)(Fareston®)；以及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比鲁卡胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)與戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一者之可接受之鹽、酸或上述任一者的衍生物。其他如Wiemann et al.,1985,in Medical Oncology(Calabresi et al.,eds.),Chapter 10,McMillan Publishing中所揭示的習知細胞毒性化學化合物亦可應用 於本發明方法中。
術語”生長抑制劑”意指在活體外或活體內抑制細胞，特別是癌細胞生長的化合物或組成物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞週期進展(在S期以外之處)的藥劑，諸如誘導G1遏止與M期遏止的藥劑。典型M期阻斷劑包括長春花(長春新鹼與長春花鹼)、紫杉烷家族成員(包括，但不限於太平洋紫杉醇(TAXOL®)、多西紫杉醇(TAXOTERE®)與其類似物(例如，XRP9881和XRP6258：參見Ojima et al.,Curr Opin Investig Drugs 4：737(2003))，以及拓樸異構酶抑制劑，諸如伊立替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、片螺素D(lamellarin D)、阿黴素、表阿黴素(epirubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)與博來黴素(bleomycin)。遏止G1的彼等藥劑也適用於S期遏止，例如DNA烷化劑，諸如他莫昔芬、強體松、達卡巴仁、甲基二氯乙基胺、順鉑、甲氨蝶呤、5-FU以及ara-C。
一般性說明
本發明是基於以下發現：投與Dll4拮抗劑(例如特異地結合Dll4並阻斷Dll4活性的Dll4抗體或其片段)可以抑制卵巢腫瘤的生長。關於完整人類Dll4 Ab(包括重組人類Dll4 Ab)的說明，參見國際專利申請公開案第WO 2008/076379號。
製備Dll4 Ab的方法
用於製備抗體的方法為技藝中熟知的。參見，例如Kohler & Milstein(1975)Nature 256：495-497；Harlow & Lane(1988)Antibodies：a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,NY)。由人類以外的生物體(諸如小鼠、大鼠、兔、牛) 分離的抗體可透過嵌合或人類化而變得更像人類。
”人類化”或嵌合形式的非人類(例如鼠)抗體為免疫球蛋白，其免疫球蛋白鏈或片段(諸如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原-結合次序列)，含有抗原結合所需之衍生自非人類免疫球蛋白的最小序列。它們與鼠或其他非人類抗體具有相同或相似的結合特異性以及親和力，而鼠或其他非人類抗體提供構築嵌合或人類化抗體的起始材料。嵌合抗體為其輕鏈與重鏈基因已經過通常是藉由遺傳工程由屬於不同物種之免疫球蛋白基因節段構築而成的抗體。舉例而言，鼠單株抗體基因的可變(V)節段可接合至人類恆定(C)節段，諸如IgG1與IgG4。因此，典型的嵌合抗體是一種由小鼠抗體的V或抗原-結合域與人類抗體的C或效應子域所組成的雜交蛋白質。人類化抗體具有基本上來自人類抗體的可變區骨架殘基(稱為接受者抗體)以及基本上來自小鼠抗體的互補決定區(CDR)(意指為給予者免疫球蛋白)。參見Queen et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA 86：10029-10033(1989)與國際專利申請公開案第WO 90/07861號及U.S.專利5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101以及5,225,539。恆定區(若有的話)也基本上或完全是來自人類免疫球蛋白。人類可變域通常是選自其骨架序列表現與CDR衍生之鼠可變區域具有高度序列同一性的人類抗體。重鏈與輕鏈可變區骨架殘基可以衍生自相同或不同的人類抗體序列。人類抗體序列可以是天然的人類抗體序列或者可以是數種人類抗體的一致序列。參見國際專利申請公開案第WO 92/22653號。就基於置換對CDR構型及/或結合至抗原的可能影響來選擇人類可變區骨架殘基的某些胺基酸。這些可能影響的研究是藉由建造模型、檢驗特定位置處的胺基酸的特性，或按照經驗 觀察特定胺基酸的置換或突變影響來實施。例如，當鼠可變區骨架殘基與選定人類可變區骨架殘基之間有一個胺基酸差異，若那個胺基酸被合理預期為(1)非共價直接結合抗原；(2)與CDR區相鄰；(3)以其他方式與CDR區交互作用(意即在CDR區的約6Å內)，或(4)參與VL-VH介面，則人類骨架胺基酸通常被鼠抗體的相同骨架胺基酸所置換。其他置換用的候選者為對於人類免疫球蛋白來說在那個位置不常見的接受者人類骨架胺基酸。這些胺基酸可以經相同位置的鼠給予者抗體或相同位置的更典型人類免疫球蛋白之胺基酸置換。其他置換用的候選者為那個位置對人類免疫球蛋白來說不常見的接受者人類骨架胺基酸。人類化免疫球蛋白的可變區骨架通常顯示與人類可變區骨架序列或此等一致序列有至少85%序列一致性。
生成人類抗體的方法包括，例如VelocImmuneTM(Regeneron Pharmaceuticals)、XenoMouseTM技術(Abgenix)、“小區(minilocus)”方法，以及噬菌體展示。VelocImmuneTM技術(US專利6,596,541)含括生成高親和力完整人類抗體以篩選抗原的方法。這個技術涉及生成轉殖小鼠，該轉殖小鼠具有一包含人類重鏈與輕鏈可變區的基因組，該人類重鏈與輕鏈可變區的基因組可操作地連結至內源性小鼠恆定區基因座，使得小鼠生產對抗原性刺激反應之包含人類可變區與小鼠恆定區的抗體。編碼該抗體之重鏈與輕鏈可變區的DNA經分離並且被連結至編碼人類重鏈與輕鏈恆定區的DNA。接著在能夠表現完整人類抗體的細胞中表現該DNA。在一個具體例中，該細胞為CHO細胞。
XenoMouseTM技術(Green et al.,1994,Nature Genetics 7：13-21)生成帶有來自重鏈及κ輕鏈基因座之人類可變區與恆定區的 小鼠。在一個替代方法中，他者採用”小區”方法，其中透過納入Ig基因座的個別基因來模擬外源性Ig基因座(參見，例如US專利5,545,807)。在有或沒有可操作地連結至編碼人類重鏈與輕鏈恆定區的情況下，可以分離編碼可變區的DNA。
或者，噬菌體展示或相關展示技術可用來鑑定特異地結合至Dll4的抗體、抗體片段(諸如可變域)，以及異質Fab片段。(參見，例如US專利第7,138,370號)。
可藉由技藝中熟知的各種方法來篩選與選擇較佳免疫球蛋白(抗體)。關於存在對Dll4具有特異性之單株抗體的第一次篩選是透過使用例如以ELISA為主的方法或噬菌體展示來執行。較佳地進行第二次篩選來鑑定並選擇所要的單株抗體。第二次篩選可以使用技藝中熟知的任何適當方法來進行。一個較佳方法稱為”生物感測器修飾輔助的概況分析”(”BiaMAP”)，描述於美國專利申請公開案第2004/0101920號中。BiaMAP容許快速鑑定生產帶有所要特性之單株抗體的融合瘤純系。更具體而言，基於評估抗體：抗原交互作用而將單株抗體分選至獨特抗原決定位相關群組中。或者，以ELISA為主、以珠粒為主，或以Biacore®為主的競爭分析可用來鑑別結合Dll4之不同抗原決定位的結合對，並因而能夠配合以高親和力結合配體。
投與方法
本發明提供治療方法，其包含向個體投與有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含Dll4拮抗劑(諸如Dll4 Ab)，視情況加上VEGF拮抗劑(例如VEGF-Trap或抗-VEGF抗體)，及或化療劑，諸如抗有絲分裂劑，例如多西紫杉醇、太平洋紫杉醇與類似物(紫杉 烷)；以鉑為主的化療化合物，諸如順鉑、卡鉑、異丙鉑、草酸鉑與類似物；嘧啶類似物，諸如5-Fu、卡培他濱(Xeloda®,Roche)與類似物；拓撲異構酶抑制劑，諸如伊立替康、拓撲替康、喜樹鹼、片螺素D與類似物；及/或佐劑，諸如白葉酸(醛葉酸)，與類似物(詳情參見上面定義段)。
Dll4拮抗劑、VEGF拮抗劑及/或化療劑可以一起或分開共投與。若使用個別劑量調配物，則Dll4拮抗劑、VEGF拮抗劑及/或化療劑可同時或在交錯時間分開(例如依序)投與。
已知有各種不同的投遞系統並且可用於投與本發明的醫藥組成物，例如囊封在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組細胞、受體媒介的胞吞作用(參見，例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、眼內、硬膜上以及口服途徑。組成物可以藉由任何習知途徑來投與，例如藉由輸注或團注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收，並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投與。投藥可以是全身性或局部的。投與可以是急性或慢性(例如每天、每週、每月等)或與其他藥劑組合。也可以採用肺投與，例如藉由使用吸入器或噴霧器，且與氣溶膠劑一起調配。
就皮下投遞而言，筆型投遞裝置很容易應用於投遞本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆型投遞裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆型投遞裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投與且卡匣空了，空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼就可以重 複使用筆型投遞裝置。就拋棄式筆型投遞裝置來說，沒有可換式卡匣。更確切地來說，拋棄式筆型投遞裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物，整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆型投遞裝置在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面具實用性。實例包括，但不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面具實用性的拋棄式筆型投遞裝置的實例包括，但絕對不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)。
在另一個具體例中，活性劑可以呈囊泡，或脂質體形式被投遞(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533)。在又另一個具體例中，可以在控制釋放系統中投遞活性劑。在一個具體例中，可使用泵(參見Langer，上文)。在另一個具體例中，可使用聚合材料(參見Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71：105)。在本發明活性劑為編碼蛋白質之核酸的另一個具體例中，該核酸可藉由將其構築為適當核酸表現載體的一部分並將其投與(例如使用逆轉錄病毒載體)(參 見，例如美國專利第4,980,286號)或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic,Dupont)，或使用脂質或細胞表面受體或轉染劑塗佈，或藉由將其連結至已知會進入細胞核之同位序列樣(homeobox-like)肽來投與(參見，例如Joliot et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等以使其變成細胞內的，而在活體內被投與以促使其編碼蛋白質表現。或者，核酸可以被引入細胞內並且藉由同源重組併入至宿主細胞DNA以供表現。
在一個特定具體例中，希望將本發明醫藥組成物局部投與至需要治療的區域；這可以例如(但不限於)在外科手術期間藉由局部輸注、局部施用(例如藉由注射、藉由導管的方式，或藉由植入物的方式)達致，該植入物是有孔的、無孔的，或凝膠狀材料，包括膜，諸如矽塑膜、纖維或商業皮膚代用品。
有效治療癌症/腫瘤之本發明活性劑的數量可基於本說明書遵從標準臨床技術來決定。另外，可視情況採用活體外分析來幫助鑑定最佳劑量範圍。調配物中採用的確切劑量也取決於投與路徑，及病況嚴重程度，且應依據臨床醫師判斷與每一個體的情況來決定。但是，靜脈內投與的適當劑量範圍通常為約0.2至30mg活性化合物/公斤體重。鼻內投與的適當劑量範圍通常為約0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。有效劑量可以由衍生自活體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線來外推。
投與方案
依據本發明的某些具體例，多劑量Dll4拮抗劑(例如抗-Dll4抗體)可在一段限定時間裡被投與給個體。依據本發明此態樣的方法包含依序將多劑量之抗-Dll4抗體投與給個體。如本文所用，” 依序投與”表示各劑量的抗-Dll4抗體在不同時間點被投與給個體，例如在由預定間隔(例如數小時、數天、數週或數月)所分開的不同天。本發明包括含有將單一起始劑量之抗-Dll4抗體，接而為一或多個第二劑量的抗-Dll4抗體，以及視情況一或多個第三劑量的抗-Dll4抗體依序投與給患者的方法。
術語”起始劑量”、”第二劑量”及”第三劑量”意指投與抗-Dll4抗體的時間順序。因此，”起始劑量”是在治療方案開始時被投與的劑量(亦意指為”基線劑量”)；”第二劑量”為在起始劑量之後被投與的劑量；而”第三劑量”為在第二劑量之後被投與的劑量。起始劑量、第二劑量與第三劑量可全都含有等量之抗-Dll4抗體，但通常會在投與頻率方面有所不同。但是，在某些具體例中，起始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含有之抗-Dll4抗體之量將會在治療期間彼此改變(例如調高或調低，若需要的話)。在某些具體例中，兩個或更多個(例如2、3、4或5)劑量在治療方案開始被投與作為”加載劑量”，接著以較不頻繁的方式投與後續劑量(例如”維持劑量”)。
在本發明的一個例示性具體例中，各個第二劑量及/或第三劑量在緊接先前劑量之後1至26(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½或更多)週被投與。詞組”緊接先前劑量”，如本文所用，表示以多次投與的順序，抗-Dll4抗體劑量在順序上於下一個劑量投與之前沒有任何插入的劑量被投與給患者。
依據本發明此態樣的方法可含有將任一數目的第二 劑量及/或第三劑量抗-Dll4抗體投與給患者。例如，在某些具體例中，僅有單一個第二劑量被投與給患者。在其他具體例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量被投與給患者。同樣地，在某些具體例中，僅有單一個第三劑量被投與給患者。在其他具體例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量被投與給患者。
在涉及多個第二劑量的具體例中，各個第二劑量可以與其他第二劑量相同的頻率被投與。例如，各個第二劑量可在緊接先前劑量之後1至2週被投與給患者。同樣地，在涉及多個第三劑量的具體例中，各個第三劑量可以與其他第三劑量相同的頻率被投與。例如，各個第三劑量可在緊接先前劑量之後2至4週被投與給患者。或者，第二劑量及/或第三劑量投與給患者的頻率可能隨著治療方案過程而改變。投與頻率也可在治療過程期間由臨床醫師依據個別患者的需要遵循臨床檢驗來予以調整。
在本發明的一些具體例中，以與上述類似的方式投與呈多劑量的其他治療劑(例如VEGF拮抗劑及/或化療劑)。
就全身性投與而言，治療有效劑量最初可以由活體外分析估算。舉例而言，可以在動物模型中調配某個劑量以達到包括如在細胞培養物中測得之IC50的循環濃度範圍。此等資訊可用來更為準確地決定在人類中的可用劑量。起始劑量也可以由活體內數據(例如動物模型)使用技藝中熟知的技術估算。具有一般技術者可基於動物數據容易地將對人類的投與最佳化。
劑量將隨著要被投與的個體的年齡與身材(例如體重或體表面積)、目標疾病、病況、投與路徑以及類似因素而改變。就 全身性投與Dll4拮抗劑而言，特別是就Dll4抗體而言，用於靜脈內投與的一般劑量範圍為約0.01至約100mg/kg、約0.1至約50mg/kg或約0.2至約10mg/kg體重的日劑量。就皮下投與而言，以約10mg至約500mg、約20mg至約400mg、約30mg至約300mg，或約50mg至約200mg，以約至少25mg/ml、約50mg/ml、約75mg/ml、約100mg/ml、約125mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml或約250mg/ml的抗體濃度，每天1至5次、每週1至5次或每月1至5次投與抗體。或者，最先經由靜脈內注射投與抗體，接著為依序皮下投與。
就全身性投與VEGF拮抗劑而言，特別是就VEGF-Trap而言，用於靜脈內投與的一般劑量範圍為約0.01至約100mg/kg、約0.1至約50mg/kg或約0.2至約10mg/kg體重的日劑量。就皮下投與而言，以約10mg至約500mg、約20mg至約400mg、約30mg至約300mg，或約50mg至約200mg，以約至少25mg/ml、約50mg/ml、約75mg/ml、約100mg/ml、約125mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml或約250mg/ml的抗體濃度，每天1至5次、每週1至5次或每月1至5次投與VEGF拮抗劑。或者，最先經由靜脈內注射投與VEGF拮抗劑，接著為依序皮下投與。
一般而言，以靜脈內或經口的方式在介於每週50mg/m2與500mg/m2的劑量範圍使用化療劑，但劑量範圍取決於各種因素而定，包括待治療個體、個體的體重與年齡、疾病的嚴重性、投與方式、使用化療劑的類型、臨床醫師的判斷與類似因素。儘管可偵測到症狀或甚至無法偵測到症狀，療法可能間斷地重複。治療的持續時間也取決於待治療病況的嚴重性以及個體對可能不良效應 的耐受程度(若有的話)而定，且只要有需要就可以繼續或只要益處勝過任何不良效應就繼續。
若相較於單獨投與各個藥劑(參見實例1及2，下文)，各個藥劑要達到所要治療效用所需的數量(亦即展現協同效用)降低，則可進一步在組合療法中進一步調整各個藥劑的劑量。
可用於本發明組合療法中的化療劑亦包括彼等於已知化療方案中所採用者。舉例而言，FOLFOX是一種用於治療結腸直腸癌(CRC)的化療方案且為5-FU、醛葉酸以及草酸鉑的一種組合。FOLFIRI是另一種用於CRC的化療方案且為5-FU、醛葉酸與伊立替康的一種組合。XELOX是CRC的第二線化療方案且為卡培他濱與草酸鉑的一種組合。
此外，使用Dll4拮抗劑(例如，抗-Dll4抗體)、VEGF拮抗劑(例如，VEGF-Trap)，及/或化療劑之組合的療法可以單獨提供或與其他藥物組合一起提供，其他藥物為諸如其他抗血管新生劑，例如其他VEGF拮抗劑，包括抗-VEGF抗體(例如Genentch的AVASTIN®)與類似物；以及其他化療劑，諸如止痛劑、消炎劑，包括非類固醇消炎藥物(NSAID)，諸如Cox-2抑制劑與類似物，俾以改善及/或降低伴隨著原本癌症/腫瘤的症狀。
節拍器式(Metronomic)化療
節拍器式化療是以改善投與化學療法的方式嶄露頭角。傳統化學療法以不會造成危及生命之毒性程度的單一劑量投與或短期療法的最高劑量來投與，例如呈最大耐受劑量(MTD)。MTD療法在連續療法週期之間需要2-3週的延長暫停。儘管此等化療劑數目且已進行大量臨床試驗來測試它們，在治癒或顯著延長癌症患者 壽命方面仍無長足進展(Kerbel et al.,2004,Nature Reviews Cancer 4：423-436)。
節拍器式化療意指為以明顯低於MTD的劑量而沒有延長無藥物暫停來頻繁(甚至是每天)投與化療劑。除了降低急性毒性之外，當與特定抗血管新生藥物(諸如VEGF拮抗劑)組合時會增加節拍器式化療的效用(Kerbel et al.,2004，上文)。
因此，本發明特徵為用於在有需要的個體中治療癌症的節拍器式化療，其包含向該個體投與和化療劑組合之Dll4拮抗劑，其中該癌症受到治療。在一個特定具體例中，Dll4拮抗劑與化療劑可以一起投與或依序投與持續一段相對短的時間期間(例如1-12週)，接著為節拍器式投與化療劑達一段長時間期間(例如6-24個月)。
醫藥組成物
本發明提供包含Dll4拮抗劑、化療劑以及醫藥上可接受載劑的醫藥組成物。術語”醫藥上可接受”表示經聯邦或州政府的管理機關核准或美國藥典或其他一般認可藥典中所列使用於動物(更具體而言為人類)者。術語”載劑”意指與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑、賦形劑，或媒劑。此等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水與油，包括彼等石油醚、動物、植物或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似物。適當的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、乾燥脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇與類似物。若需要的話，該組成物亦可含有微量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組成物可呈溶液、懸浮液、乳液、 錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續釋放調配物與類似形式。該組成物可調配成如栓劑，具有習知黏結劑與載劑(諸如三酸甘油酯)。經口調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適當醫藥載劑的實例描述於E.W.Martin的”Remington’s Pharmaceutical Sciences”中。
在一個較佳具體例中，該組成物是依據如靜脈內投與給人類之醫藥組成物的慣常程序來調配。若需要的話，該組成物亦可包括增溶劑與局部止痛劑(諸如利多卡因)以減輕注射處的疼痛。若組成物是藉由輸注投與，則其可使用含有無菌醫藥級水或食鹽水的輸注瓶來懸浮。若組成物是藉由注射投與，則可提供一安瓿的無菌注射用水或食鹽水以使得成分可在投與之前被混合。
本發明活性劑也可調配成如中性或鹽形式。醫藥上可接受鹽包括彼等與游離胺基所形成者，游離胺基為諸如衍生自氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等者；以及彼等與游離羧基形成者，游離羧基為諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、二乙胺乙醇、組胺酸、普魯卡因等。
用於實施本發明方法的組成物可為呈溶液、呈懸浮液或兩者的液體，其含有藥劑。術語”溶液/懸浮液”意指一種液體組成物，其中第一部份的活性劑以溶液形式存在而第二部分的活性劑以顆粒形式、以在液體基質中的懸浮液存在。該液體組成物可為水性且亦可包括凝膠與軟膏形式。
可用於實施本發明方法的水性懸浮液或溶液/懸浮液可含有一或多種聚合物作為懸浮劑。可供使用的聚合物包括水溶性聚合物，諸如交聯含羧基聚合物。本發明水性懸浮液或溶液/懸浮液 較佳具黏性或黏液性，或甚至更佳是具有黏性與黏液性兩者。
套組
本發明進一步提供一種製造物品或套組，其含有包裝材料、容器以及包含在容器內的藥劑，其中該藥劑包含至少一種Dll4拮抗劑(諸如Dll4抗體)，且其中該包裝材料包括標籤或包裝插入頁，其指明Dll4拮抗劑可用於治療癌症或降低或停止腫瘤生長。在一個具體例中，該製造物品或套組包含包裝材料、容器以及包含在容器內的藥劑，其中該藥劑包含至少一種VEGF拮抗劑，且其中該包裝材料包括標籤或包裝插入頁，其指明Dll4拮抗劑與VEGF拮抗劑可用於治療癌症或降低或停止腫瘤生長。在一個具體例中，該製造物品或套組包含包裝材料、容器以及包含在容器內的藥劑，其中該藥劑包含至少一種化療劑，且其中該包裝材料包括標籤或包裝插入頁，其指明Dll4拮抗劑與化療劑可用於治療癌症或降低或停止腫瘤生長。在一個具體例中，Dll4拮抗劑、VEGF拮抗劑及/或化療劑可包含在分開的容器內；因此，本發明提供包含容器的套組，該容器其中含有特異地結合hDll4之抗體或其抗原-結合片段，以及一或多個其中含有至少一種VEGF拮抗劑及/或化療劑的額外容器。
圖1顯示Dll4 Ab與順鉑組合對於植入表現人類化Dll4蛋白質之嚴重合併性免疫不全病(SCID)小鼠(人類化Dll4 SCID小鼠)的人類VMCub1腫瘤(膀胱癌)生長的效用(實例1)。人類Fc對照(◆與實線)；REGN421(Dll4 Ab)2mg/kg/注射(◆與虛線)；順鉑0.5mg/kg/注射(□)；順鉑2mg/kg/注射(■)；REGN421 2mg/kg/注射+順鉑0.5 mg/kg/注射(○)；以及REGN421 2mg/kg/注射+順鉑2mg/kg/注射(●)。
圖2顯示Dll4 Ab與順鉑組合對於植入人類化Dll4 SCID小鼠的人類A549腫瘤(非小細胞肺癌)生長的效用(實例2)。人類Fc對照(●)；REGN421 6mg/kg總劑量(○)；順鉑5mg/kg總劑量(△)；順鉑9mg/kg總劑量(▲)；REGN421 6mg/kg+順鉑5mg/kg總劑量(◇)；以及REGN421 6mg/kg+順鉑9mg/kg總劑量(◆)。
圖3顯示Dll4 Ab與5-FU組合對於植入人類化Dll4 SCID小鼠的人類HCT116(結腸直腸癌)生長的效用(實例5)。人類Fc對照(●)；REGN421 6mg/kg總劑量(○)；5-FU 45mg/kg總劑量(△)；5-FU 75mg/kg總劑量(▲)；REGN421 6mg/kg+5-FU 45mg/kg總劑量(◇)；以及REGN421 6mg/kg+5-FU 75mg/kg總劑量(◆)。
圖4顯示Dll4 Ab與伊立替康組合對於植入人類化Dll4 SCID小鼠的人類HCT116腫瘤生長的效用(實例6)。人類Fc對照(●)；REGN421 6mg/kg總劑量(○)；伊立替康22.5mg/kg總劑量(△)；伊立替康75mg/kg總劑量(▲)；REGN421 6mg/kg+伊立替康22.5mg/kg總劑量(◇)；以及REGN421 6mg/kg+伊立替康75mg/kg總劑量(◆)。
圖5顯示在單一劑量REGN421為0.5、5或15mg/kg的情況下，Hey1基因在植入人類化Dll4 SCID小鼠的Colo205人類結腸直腸腫瘤細胞中相較於15mg/kg hFc在給藥後第5、10、24與72小時以及7天後的平均變化倍數(4隻小鼠/組)。
提出下列實施例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及說明提供給那些在技藝中具有通常技 術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字的正確性(例如數量、溫度等)，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份為以重量計的份，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或近乎大氣壓(圖式誤差槓=平均值±SEM)。
實例1：抗-hDll4抗體與順鉑組合的效用
對植入嚴重合併性免疫不全病(SCID)小鼠的腫瘤評估抗-Dll4抗體(REGN421)與順鉑(platinol，順-二胺二氯鉑)對於腫瘤生長的效用，該小鼠表現人類化Dll4蛋白(人類化Dll4 SCID小鼠)。人類化Dll4 SCID小鼠是藉由將小鼠Dll4基因的整個細胞外域取代成胚幹(ES)細胞中之人類Dll4基因的對應細胞外區域(7kb)而做成。產生同型合子hDll4小鼠並繁育成SCID背景。
每隻小鼠皮下(sc)植入1x106人類VM-Cub1腫瘤細胞(膀胱癌細胞)加上MATRIGELTM(BD Biosciences,#354234)。在腫瘤於小鼠中建立之後(腫瘤尺寸為150-200mm3，植入後約14天)，測量腫瘤、隨機分組並以hFc、REGN421、順鉑或REGN421加上順鉑的組合處理。總共45隻小鼠被分成九組(每群n=5)。第一組以2mg/kg的hFc皮下(sc)處理；第二組與第三組分別以0.5與2mg/kg的REGN421 sc處理；第四組與第五組分別以0.5與2mg/kg順鉑腹膜內(ip)處理；第六組以0.5mg/kg的REGN421 sc處理與0.5mg/kg的順鉑ip處理；第七組以0.5mg/kg的REGN421 sc處理與2mg/kg的順鉑ip處理；第八組以2mg/kg的REGN421 sc處理與0.5mg/kg的順鉑ip處理；以及第九組以2mg/kg的REGN421 sc處理與2mg/kg的順鉑ip處理。在第14天起每3-4天投與REGN421，而小鼠總共接受三種劑量。在第14天起每24小時投與順鉑；小鼠總共接受四種劑量。
為了評估REGN421與順鉑作為單一藥劑或組合治療的效用，紀錄腫瘤尺寸的變化。在最初REGN421治療之前三天、在每一次REGN421治療當天(第14、17與21天)，以及之後每3-4天測量腫瘤生長直到腫瘤大小達到~600mm3。活體內腫瘤尺寸是使用等式(長度×寬度2)/2來計算(圖1與表1)。
腫瘤生長抑制TGI是藉由計算經處理(T)對媒劑對照(C)腫瘤在對照群被安樂死當天(亦即在第32天)的腫瘤大小差異而決定；TGI=[1-(T最後-T最初)/(C最終-C最初)]x 100。
腫瘤生長延遲TGD是評估為當每一群達到指定腫瘤尺寸時，經處理(T)對對照(C)腫瘤在天數上的差異。這個實驗的預定腫瘤尺寸為600mm3。
結果顯示，單獨以REGN421處理使得腫瘤生長降低54%。單獨以順鉑處理使得腫瘤生長降低(就劑量0.5mg/kg/注射為降 低61%；而就劑量2mg/kg/注射為降低54%)。組合治療在腫瘤生長方面比單一藥劑處理有降低更多(就0.5mg/kg/注射順鉑加上2mg/kg/注射REGN421為降低104%；而就2mg/kg/注射順鉑加上2mg/kg/注射REGN421為降低58%)。
這些結果顯示，使用Dll4阻斷劑與順鉑在Dll4阻斷劑為2mg/kg/注射且順鉑為0.5mg/kg/注射時的腫瘤治療可比單一藥劑有更高的腫瘤生長抑制。
實例2：抗-hDll4抗體與順鉑組合的效用
對植入人類化Dll4 SCID小鼠的腫瘤評估REGN421與順鉑組合對於腫瘤生長的效用。每隻小鼠皮下(sc)植入5 x 106人類A549腫瘤細胞(非小細胞肺癌或”NSCLC”)。在腫瘤於小鼠中建立之後(腫瘤尺寸為100-150mm3，植入後約29天)，測量腫瘤、隨機分組並以hFc、REGN421、順鉑或REGN421加上順鉑的組合處理。總共36隻小鼠被分成6組(每群n=6)。第一組以2mg/kg的hFc sc處理；第二組以2mg/kg的REGN421 sc處理；第三組與第四組分別以2.5與4.5mg/kg的順鉑ip處理；第五組以2mg/kg的REGN421 sc處理與2.5mg/kg的順鉑ip處理；以及第六組以2mg/kg的REGN421 sc與4.5mg/kg的順鉑ip處理。在第29天起每3-4天投與REGN421，而小鼠總共接受三種劑量。在第29天起每24小時投與順鉑，且小鼠總共接受兩種劑量。
為了評估REGN421與順鉑作為單一藥劑或組合治療的效用，吾等從最初REGN421治療之前三天、在每一次藥劑治療當天(第29、30、33、36天)，以及之後每3-4天測量腫瘤尺寸(體積)直到腫瘤達到~600mm3大小。活體內腫瘤尺寸是使用等式(長度×寬度 2)/2來計算。對腫瘤生長的效用表示於圖2與表2中。
結果顯示，單獨以REGN421處理使得腫瘤生長降低54%。單獨以順鉑處理使得腫瘤生長降低(就劑量2.5mg/kg/注射為降低35%；而就劑量4.5mg/kg/注射為降低22%)。組合治療在腫瘤生長方面比單一藥劑處理降低更多(就2.5mg/kg/注射順鉑加上2mg/kg/注射REGN421為降低69%；而就4.5mg/kg/注射順鉑加上2mg/kg/注射REGN421為降低80%)。相較於對照與單一藥劑，組合治療明顯延遲腫瘤生長(就2.5mg/kg/注射順鉑加上2mg/kg/注射REGN421為21天；而就4.5mg/kg/注射順鉑加上2mg/kg/注射REGN421為26天)(p<0.01)。
這些結果顯示，使用Dll4阻斷劑與順鉑在Dll4阻斷劑為2mg/kg/注射且順鉑為2.5-4.5mg/kg/注射時的腫瘤治療可比單一藥劑有高的腫瘤生長抑制。
實例3：抗-hDll4抗體與多西紫杉醇組合的效用
對植入嚴重合併性免疫不全病(SCID)小鼠的腫瘤評估抗-Dll4抗體與多西紫杉醇(TAXOTERE®)組合對於腫瘤生長的效用。每隻小鼠皮下(sc)植入1 x 106大鼠C6腫瘤細胞(神經膠母細胞瘤細胞)。在腫瘤建立之後(腫瘤尺寸為100-150mm3，植入後約13天)，以hFc、多西紫杉醇、Dll4抗體或多西紫杉醇加上Dll4抗體的組合處理小鼠。因為這些小鼠表現小鼠Dll4，在這個實驗中使用的Dll4 Ab係根據公開序列(WO 2007/143689)自行製備，並且被命名為REGN 577。REGN 577結合至人類與小鼠Dll4，但無法偵測到結合人類Dll4與JAG1。總共30隻帶有腫瘤的雄性小鼠被隨機分成六組(每群N=5)。第一組以hFc(25mg/kg)皮下處理與以媒劑靜脈內(iv)處理；第二組以5mg/kg的REGN577 sc處理；第三組4.5mg/kg的多西紫杉醇iv處理；第四組以6mg/kg多西紫杉醇iv處理；第五組以4.5mg/kg多西紫杉醇iv處理加上5mg/kg的REGN577 sc處理；第六組以6mg/kg的多西紫杉醇iv處理加上5mg/kg的REGN577 sc處理。在同一天投與多西紫杉醇及/或Dll4抗體。每週處理動物2次且總共接受3種劑量。從最初治療當天起，一週測量體重與腫瘤兩次，直到當腫瘤達到大小為~600mm3時小鼠被安樂死。腫瘤尺寸是使用等式(長度×寬度2)/2來計算。
對照腫瘤在第25天達到~600mm3的大小並收取。在第25天，結果顯示單獨以Dll4抗體處理在腫瘤生長方面降低不少(達到約44%)。單獨以多西紫杉醇處理會降低腫瘤生長(就劑量4.5mg/kg為降低62%；而就劑量6mg/kg為降低70%)。組合治療在腫瘤生長方面比對照或單一藥劑處理降低更多(就4.5mg/kg多西紫杉醇加上Dll4 Ab為降低75%；而就6mg/kg多西紫杉醇加上Dll4 Ab為降低 81%)。測定TGI以及TGD(表3)。
結果顯示，以Dll4阻斷劑與不同劑量的多西紫杉醇組合處理腫瘤可延遲腫瘤生長達至少兩倍長且腫瘤生長抑制比單一藥劑還高。
實例4：抗-hDll4抗體與多西紫杉醇組合的效用
對植入嚴重合併性免疫不全病(SCID)小鼠的腫瘤評估抗-Dll4抗體與多西紫杉醇(TAXOTERE®，sanofi-aventis)組合對腫瘤生長的效用。每隻小鼠”偽-正位地”植入(皮下至乳腺#3)5 x 106人類MDA-MB-231乳癌細胞以及MATRIGELTM(BD Biosciences lot # 84540)。在腫瘤於小鼠中建立之後(腫瘤尺寸為150-200mm3，植入後約45天)，以hFc、多西紫杉醇、Dll4抗體或多西紫杉醇加上Dll4抗體的組合處理小鼠。總共25隻帶有腫瘤的雄性小鼠被隨機分成五組(每群N=5隻小鼠)。第一組以hFc(25mg/kg)皮下處理與媒劑靜脈 內(iv)處理；第二組以5mg/kg的Dll4抗體REGN577 sc處理；第三組以4.5mg/kg的多西紫杉醇iv處理；第四組以6mg/kg的多西紫杉醇iv處理；及第五組以6mg/kg的多西紫杉醇iv處理加上5mg/kg的REGN577 sc處理。在同一天投與多西紫杉醇及/或Dll4抗體。每週處理動物2次且總共接受3種劑量。從最初治療當天起，一週測量體重與腫瘤兩次，直到小鼠被安樂死。腫瘤尺寸是使用等式(長度×寬度2)/2來計算。
對照腫瘤在第63天達到~600mm3並收取。在第63天，結果顯示單獨以多西紫杉醇處理在腫瘤生長方面降低不少(就劑量4.5mg/kg為降低37%；而就劑量6mg/kg為降低52%)。單獨以Dll4抗體處理會明顯降低腫瘤生長(大約降低85%)；同時組合治療造成腫瘤退行(就6mg/kg多西紫杉醇加上Dll4 Ab為105%)。測定TGI以及TGD(表4)。
單獨多西紫杉醇處理在腫瘤生長方面產生最小延遲(就劑量4.5mg/kg為4天；而就劑量6mg/kg為4天)。單獨以Dll4抗體處理腫瘤會延遲腫瘤生長達21天。相較於對照與單一藥劑處理，組 合治療更為延遲腫瘤生長(就6mg/kg多西紫杉醇加上Dll4 Ab為28天；p<0.5)。
結果顯示，MDA-MB-231腫瘤對單獨多西紫杉醇處理反應不大，但是對於以抗-Dll4抗體處理非常敏感。相較於單一藥劑，Dll4阻斷劑與多西紫杉醇的組合可進一步延遲腫瘤生長並略為增進腫瘤生長抑制(腫瘤退行)。
實例5：抗-hDll4抗體與5-FU組合的效用
對植入人類化Dll4 SCID小鼠的腫瘤評估抗-Dll4 Ab(REGN421)與5-FU組合對於腫瘤生長的效用。每隻小鼠皮下(sc)植入5 x 106人類HCT116腫瘤細胞(CRC)。在腫瘤於小鼠中建立之後(腫瘤尺寸為~150mm3，植入後約22天)，測量腫瘤並隨機分組。以hFc、REGN421、5-FU，或REGN421與5-FU的組合處理小鼠。總共30隻小鼠被分成6組(每群n=5)。第一組以2mg/kg的hFc sc處理；第二組以2mg/kg的REGN421 sc處理；第三組與第四組分別以15與25mg/kg的5-FU ip處理；第五組以2mg/kg的REGN421 sc處理與15mg/kg的5-FU ip處理；以及第六組以2mg/kg的REGN421 sc處理與25mg/kg的5-FU ip處理。在第22天起每3-4天投與REGN421，且小鼠總共接受三種劑量。在第22天起每3-4天投與5-FU，且小鼠總共接受三種劑量。
為了評估REGN421與5-FU作為單一藥劑或組合的效用，從最初REGN421治療之前三天，與之後在每一次藥劑治療當天(第22、26、29天)，以及之後每3-4天測量腫瘤尺寸(體積)直到腫瘤達到~600mm3大小。活體內腫瘤尺寸是使用等式(長度×寬度2)/2來計算(圖3與表5)。
單獨5-FU處理在腫瘤生長方面產生最小延遲(就總劑量45mg/kg為4天；而就總劑量75mg/kg為2天)。單獨以Dll4抗體處理的腫瘤延遲腫瘤生長達6天。相較於對照，組合治療更為延遲腫瘤生長(p<0.043)。
實例6：抗-hDll4抗體與伊立替康組合的效用
對植入人類化Dll4 SCID小鼠的腫瘤評估抗-Dll4 Ab(REGN421)與伊立替康(伊立替康氫氯酸)組合對於腫瘤生長的效用。
每隻小鼠皮下(sc)植入5 x 106人類HCT116腫瘤細胞。在腫瘤於小鼠中建立之後(腫瘤尺寸為~150mm3，植入後約15天)，測量腫瘤並隨機分組。接著以hFc、REGN421、伊立替康或REGN421與伊立替康的組合處理小鼠。總共30隻小鼠被分成6組(每群n=5)。第一組以2mg/kg的hFc sc處理；第二組以2mg/kg的REGN421 sc處理；第三組與第四組分別以7.5與25mg/kg的伊立替康ip處理；第五組以2mg/kg的REGN421 sc處理與7.5mg/kg的伊立替康ip處理；以及第六組以2mg/kg的REGN421 sc處理與25mg/kg的伊立 替康ip處理。在第15天起每3-4天投與REGN421且小鼠總共接受三種劑量。在第15天起每3-4天投與伊立替康，且小鼠總共接受三種劑量。
為了評估REGN421與伊立替康作為單一藥劑或組合治療的效用，從最初REGN421治療之前三天，與之後在每一次藥劑治療當天(第15、19、22天)，以及之後每3-4天測量腫瘤尺寸(體積)直到達到~600mm3大小。活體內腫瘤尺寸是使用等式(長度×寬度2)/2來計算。結果顯示於圖4與表6。
單獨伊立替康處理在腫瘤生長方面產生延遲(就總劑量22.5mg/kg為8天；而就總劑量75mg/kg為16天)。單獨以Dll4抗體處理腫瘤延遲腫瘤生長達9天。相較於單一藥劑處理，組合治療明顯增進抗-腫瘤效力且更為延遲腫瘤生長(就75mg/kg伊立替康加上Dll4 Ab為19天；p<0.0001)。
實例7：抗-hDll4抗體在Colo205腫瘤中對於Hey1基因的效用
在植入人類Colo205結腸直腸腫瘤細胞的人類化Dll4 SCID小鼠中研究抗-hDll4抗體在腫瘤中對差異性基因表現的效用。簡言之，將雄性與雌性人類化Dll4 SCID小鼠皮下植入每隻小鼠2 x 106 Colo205細胞。當腫瘤達到~150mm3，以0.5、5或15mg/kg的單一劑量REGN421或15mg/kg的hFc對照處理小鼠(每組4隻小鼠)。在處理後5小時、10小時、24小時、72小時以及7天切下腫瘤並且儲存於RNA later穩定劑(Qiagen)中。使用RNeasy® Midi Kit(Qiagen)純化腫瘤RNA。於混合研磨器中在含有β-巰基乙醇的溶解緩衝液中均質化組織、加載至管柱並洗去未結合的汙染物。在管柱上進行DNaseI消化並且在無RNase的水中沖提RNA。青色素3(Cy3)-CTP使用Quick AmpTM RNA Amplification Kit(Agilent Technologies)而被併入來自500ng總RNA的經擴增cRNA。各樣品之經Cy3標定的cRNA接著與含括小鼠與人類轉錄體的訂製陣列雜交。陣列的雜交與洗滌是依據製造商的程序來進行且在Agilent微陣列掃描器上掃描陣列。由掃描陣列影像使用Agilent Feature Extraction軟體9.5取得數據。
為了鑑定出在對照與處理組之間有差異性表現的基因，按照晶片中位數集中(per-chip median centering)應用於各個樣品的完整基因體概況。接著，使用隨機變異數模型t-檢定比較兩組間的基因表現值(Simon,R.A.et al.,2007,“Analysis of Gene Expression Data Using BRB-Array Tools”,Cancer Inform 3：11-7)。那些在兩個組之間帶有平均差異超過1.5倍且p-值<0.05的基因被選出並且按照倍數變化遞減排列。亦進行總體檢定，其中個別樣品標定互換至多1000次且重複基因篩選程序。這會決定為在兩個組別之間被鑑定表現有差異的基因數目是否會高出單獨碰巧所預期者。
Hey1是Hey家族的一個成員，其已被鑑定為Notch活化 的立即下游標的且在小鼠研究中已顯示於抑制活體內腫瘤的Dll4-Notch路徑訊號傳遞會降低Hey-1 RNA含量(Noguera-Troise,I et al.,2006,Nature 444(7122)：1032-7)。如圖5中所示，在使用微陣列的本研究中分析Hey1 mRNA含量揭示，相較於對照經hFc處理的小鼠，從處理後10小時之時起在經REGN421處理的小鼠中Hey1 mRNA降低，但在處理後72小時與7天之時降低最為明顯。在0.5mg/kg(亦即REGN421的最低劑量)下沒有觀察到明顯降低。這些結果指出，REGN421有效地阻斷Notch訊號傳遞路徑，且Hey1可能是一個有關於Dll4抗體抑制Notch訊號傳遞的有效藥效學標的。
實例8：第I期初步藥動學研究
現在於首次應用於人類的試驗中研究REGN421。這個研究的主要目標是要確定REGN421用於將來效力試驗的建議劑量。次要目標是要特徵鑑定藥物安全性概況、其藥動學、免疫原性以及藥效學，還有效力的初步證據。在這個研究中，抗-hDll4抗體REGN421每3週被靜脈內投與給患者，其癌症在習知療法時仍有進展。研究設計遵循著劑量遞增的標準方法學以及劑量限制毒性的定義。到目前為止，以每三週0.25mg/kg/劑量處理7名患者，並以每三週0.50mg/kg/劑量處理6名患者。就藥動學研究而言，在週期1的給藥前、0小時，以及第一天給藥後1、2、4與8小時，接著是第2、3、4、8與15天；以及週期≧2的第1天第0小時，與處理後追蹤在第15、30和60天取得血液樣品。樣品中的REGN421血漿/血清含量是藉由ELISA測量，在未經稀釋血清樣品中的定量上限為2.5μg/mL而定量下限為0.039μg/mL。研究是以希望能夠投與更高劑量來繼續進行，如在程序中定義為1、2、4及7mg/kg/劑量。
顯示在以0.25mg/kg(7名患者)以及0.5mg/kg(2名患者)單一30分鐘IV輸注REGN421之血漿藥動學參數的現有數據顯示於表7中。Cmax：藥物的最大血清濃度；Tlast：藥物最後可定量濃度的時間；Clast：藥物最後可定量濃度；AUClast：至多到藥物最後濃度之曲線下面積；AUC：曲線下總面積(亦即藥物暴露)；t1/2Z：最終半衰期；Vss：穩態時的分布體積；CL：藥物廓清率。數值為：平均值、(CV%)，以及[範圍](a：中位數[範圍])。
如表7中所示，REGN421的峰血清濃度平均值為6.27μg/mL(於0.25mg/kg劑量位準)，以及9.88μg/mL(於0.50mg/kg劑量位準)。這些數值在與動物異種移植模型的抗-腫瘤活性相關的REGN421濃度範圍內。
對在REGN421投與之前以及之後24小時取得之患者血清樣品使用微陣列技術分析REGN421對於Dll4-notch訊號傳遞路徑的藥效學效用。結果顯示於表8中。
如表8中所示，在REGN421投與之後，於所有樣品中的Hey-1基因表現較預處理樣品降低。如在人類化Dll4 SCID小鼠的異種移植腫瘤模型中所觀察到(參見上文實例7)，研究發現暗示RGN421確實在人類中抑制Dll4的生物活性。
實例9：針對第I期患者的Dll4 Ab與吉西他濱組合
在患有晚期或轉移性癌症的成年患者中進行本研究，晚期或轉移性癌症對於標準療法來說為難治性或無核准的治療選擇。被診斷的患者在患有晚期或轉移性癌症的成年患者中進行本研究，晚期或轉移性癌症對於標準療法來說為難治性或無核准的治療選擇。利用ECOG(東岸癌症臨床研究合作組織)體能狀態計分為0-2(0-5標尺)，以及適當腎臟、肝臟與血液學實驗室參數，依據病理學、物理與放射檢驗被診斷帶有晚期實體惡性腫瘤的患者適格參 與本研究。容許患者在研究期間接受同時支持照護，諸如輸血以及止痛劑。患者先前已接受轉移性疾病的化療或生物療法。以3+3設計依序將患者分派至劑量群。在一個劑量位準將會有三名患者，若無劑量限制毒性(DLT)的話，則劑量遞增至次一個劑量位準。若前3名患者中有1者經歷DLT，則另外3名患者可參加那個劑量位準。若前3名患者中有2者經歷DLT，則那個劑量位準將被認為具有過量毒性，而另外3名患者將加入先前一個劑量位準。患者將接受第1天：在30分鐘內0.25至10mg/kg IV的抗-Dll4抗體(例如REGN421或REGN281)加上在30分鐘內吉西他濱1250mg/m2 IV輸注，以及第8天：在30分鐘內吉西他濱1250mg/m2 IV輸注。每3週重複組合方案直到發生腫瘤進展或無法耐受的毒性。
主要評估指標是在帶有晚期實體惡性腫瘤的患者中評估抗-Dll4抗體與吉西他濱組合的安全性、耐受性與劑量限制毒性並且鑑定抗-Dll4抗體與吉西他濱組合的最大耐受劑量(MTD)。次要評估指標包括當與吉西他濱組合提供時，評估抗-Dll4抗體之藥動學(PK)概況來依據RECIST準則(參照Eisenhauer et al.,2009,Eur J Cancer 4 5：228-247)描述抗腫瘤活性並且決定對抗-Dll4抗體的免疫原性。使用物理檢驗、放射學方法(X射線、電腦斷層掃描或核磁共振成像)來評估疾病緩解。使用國家癌症委員會關於不良事件的術語準則來評估不良事件(CTCAE v 4.0，可在國家癌症委員會網址的Cancer Therapy Evaluation Program或CTEP找到)。從患者取得血清樣品來測量抗-Dll4抗體濃度以及對抗抗-Dll4抗體的可能抗體的存在。
實例10：對CRC患者投與Dll4 Ab與FOLFOX
簡言之，利用ECOG(東岸癌症臨床研究合作組織)體能狀態計分為0-2(0-5標尺)，以及適當腎臟、肝臟與血液學實驗室參數，依據病理學、物理與放射檢驗被診斷帶有局部晚期或轉移性結腸直腸癌的成年患者適格參與研究。容許患者在研究期間接受同時支持照護，諸如輸血以及止痛劑。患者先前未曾針對轉移性疾病接受化療(或抗血管新生劑，或抗EGFR療法)；容許針對其疾病進行輔助治療的療法，但是必須是已在參與本研究之前至少12個月時完成。以1：1比率將患者隨機分派成每2週接受靜脈內FOLFOX化療(第1天：草酸鉑85mg/m2 IV輸注與白葉酸(醛葉酸)200mg/m2 IV輸注，接著在2-4分鐘內給予5-FU 400mg/m2 IV團注，然後5-FU 600mg/m2 IV作為22-小時連續輸注。第2天：白葉酸200mg/m2 IV輸注，接著在2-4分鐘內給予5-FU 400mg/m2 IV團注，然後5-FU 600mg/m2 IV輸注作為22-小時連續輸注)以及貝伐單抗(AVASTIN®：人類化單株Ab對抗血管內皮生長因子(VEGF)，Genentech)(第1天：10mg/kg IV)，或在第1天呈0.25至10mg/kg IV的抗-Dll4抗體(REGN21)與先前提及的治療組合。每2週重複治療直到發生癌症進展或無法耐受的毒性。
主要評估指標是依據RECIST準則(參照Eisenhauer et al.,2009，上文)達到至少一部份緩解(已鑑定之腫瘤病灶直徑總數降低30%或更多)的患者比率，而次要評估指標包括腫瘤進展時間，以及整體存活率。使用物理檢驗、放射學方法(X射線、電腦斷層掃描或核磁共振成像)與在血清中測得的癌胚抗原(CEA)位準來評估疾病緩解。亦使用國家癌症委員會關於不良事件的術語準則(CTCAE v 4.0，上文)評估其他臨床參數，諸如不良事件。從取得患者血清樣 品以測量抗-Dll4抗體的血清濃度以及對抗抗-Dll4抗體的可能抗體的存在。
實例11：Dll4 Ab與多西紫杉醇組合的第II期
在患有晚期無法動手術或轉移性乳癌的成年患者中進行本研究。他們先前的輔助療法已經失敗。利用ECOG(東岸癌症臨床研究合作組織)體能狀態計分為0-2(0-5標尺)，以及適當腎臟、肝臟與血液學實驗室參數，依據病理學、物理與放射檢驗被診斷帶有乳癌的患者適格參與本研究。容許患者在研究期間接受同時支持照護，諸如輸血以及止痛劑。患者先前未曾接受轉移性疾病的化療或生物療法。在順利通過篩選程序以確認患者適格性之後，至多100名患者的依序群組受到處理。患者將接受第1天：在30分鐘內0.25至10mg/kg IV的抗-Dll4抗體(REGN421)加上在30分鐘內多西紫杉醇75mg/m2 IV輸注。每3週重複組合方案直到發生腫瘤進展或無法耐受的毒性。
主要評估指標是根據RECIST準則(遵循Eisenhauer et al.,2009,Eur J Cancer 4 5：228-247)基於腫瘤反應速率以及疾病進展時間評估治療效力。次要評估指標將包括當與多西紫杉醇組合提供時，抗-Dll4抗體之安全性與藥動學(PK)概況並且決定對抗-Dll4抗體的免疫原性。使用物理檢驗、放射學方法(X射線、電腦斷層掃描或核磁共振成像)來評估疾病緩解。使用國家癌症委員會關於不良事件的術語準則(CTCAE v 4.0，可在國家癌症委員會網址的Cancer Therapy Evaluation Program或CTEP找到)來評估不良事件。從患者取得血清樣品來測量抗-Dll4抗體濃度以及對抗抗-Dll4抗體的可能抗體的存在。
實例12：Dll4 Ab與順鉑/吉西他濱的第II期研究
在患有晚期無法動手術或轉移性膀胱癌的成年患者中進行本研究。利用ECOG(東岸癌症臨床研究合作組織)體能狀態計分為0-2(0-5標尺)，以及適當腎臟、肝臟與血液學實驗室參數，依據病理學、物理與放射檢驗被診斷帶有侵襲性膀胱癌的患者適格參與本研究。容許患者在研究期間接受同時支持照護，諸如輸血以及止痛劑。患者先前未曾接受轉移性疾病的化療或生物療法。在順利通過篩選程序以確認患者適格性之後，至多100名患者的依序群組受到處理。患者將在第1天於30分鐘內接受0.25至10mg/kg IV的抗-Dll4抗體(REGN421)加上在第1、8與15天於30至60分鐘內吉西他濱1,000mg/m2，加上在第2天順鉑70mg/m2。每4週重複組合方案直到發生腫瘤進展或無法耐受的毒性。
主要評估指標是根據RECIST準則(遵循Eisenhauer et al.,2009,Eur J Cancer 4 5：228-247)基於腫瘤反應速率以及疾病進展時間評估治療效力。次要評估指標將包括當與多西紫杉醇組合提供時，抗-Dll4抗體之安全性改況與藥動學(PK)概況說明並且決定對抗-Dll4抗體的免疫原性。使用物理檢驗、放射學方法(X射線、電腦斷層掃描或核磁共振成像)來評估疾病緩解。使用國家癌症委員會關於不良事件的術語準則(CTCAE v 4.0，可在國家癌症委員會網址的Cancer Therapy Evaluation Program或CTEP找到)來評估不良事件。從患者取得血清樣品來測量抗-Dll4抗體濃度以及對抗抗-Dll4抗體的可能抗體的存在。
實例13：抗-hDll4抗體在卵巢異種移植模型中的效用
如上所提，以人類抗-Dll4抗體REGN421處理會產生有 效且劑量依賴性抑制生長在免疫不全小鼠特定區域中的一些人類腫瘤異種移植(例如非小細胞肺癌、結腸直腸癌等)，該小鼠經工程化表現人類Dll4。亦實行研究來檢驗Dll4阻斷對於卵巢腫瘤異種移植的效用。此外，相對於靶定腫瘤表現之Dll4，檢驗在腫瘤基質中靶定Dll4的Dll4阻斷的效用，以及Dll4阻斷與VEGF抑制的組合療法的效用。
將卵巢腫瘤異種移植細胞植入人類化Dll4 SCID小鼠或廠商SCID小鼠(例如表現天然鼠Dll4的SCID小鼠)。移植之後，以REGN421(抗-人類Dll4抗體，結合至人類Dll4)、mDll4Abl(抗-鼠Dll4抗體，結合至鼠Dll4)，或人類Fc域對照蛋白處理小鼠。在一個研究中，以VEGF-Trap、mDll4Abl或VEGF-Trap加上mDll4Abl處理小鼠。將TOV-112D細胞(5x106)皮下植入人類化Dll4(n=4)或廠商SCID小鼠(n=7)的右脅中。在腫瘤細胞移植之後一週開始使用REGN421(2.5mg/kg，1x/週)或mDll4Abl(5mg/kg，1x/週)對hFc對照的處理。處理動物歷時2至3週。將A2780細胞(2x106)腹膜內植入人類化Dll4或廠商SCID小鼠(n=4-5)。在腫瘤細胞移植之後一週開始使用REGN421(2.5mg/kg，1x/週)或mDll4Abl(5mg/kg，1x/週)對hFc對照處理。關於A2780組合研究，在腫瘤細胞移植之後一週開始使用mDll4Abl(5mg/kg，1x/週)與VEGF-Trap(10mg/kg，2x/週)的同時處理。VEGF-Trap單一治療組被納入這個研究中。處理帶有A2780腫瘤的動物歷時4-5週。基質膠中的SKOV-3細胞(5x106)被皮下植入而帶有腫瘤的動物(n=10)每週被給與REGN421(2.5mg/kg)以及mDll4Abl(5mg/kg)一次。將OVCAR-3細胞(1x107)皮下植入至廠商SCID小鼠(n=7)的右脅。在腫瘤細胞移植之後66天開始使用mDll4Abl(5mg/kg 1x/週)對hFc對照的處理。處理動物總計5週。如上文詳述般測量腫瘤生長抑制(TGI)。
如表9中所示，Dll4抗體處理卵巢異種移植模型產生有效的抗腫瘤效用，相對於靶定腫瘤細胞表現的Dll4，該效用是依賴靶定腫瘤基質中的Dll4。具體而言，REGN421處理(2.5mg/kg，每週一次)帶有已建立皮下TOV-112D、皮下SKOV-3或腹膜內A2780人類腫瘤異種移植物的人類化Dll4小鼠會分別抑制生長86%、83%以及61%。藉由以小鼠Dll4-特異性代用抗體mDll4Abl在帶有OVCAR3或SKOV-3腫瘤的SCID小鼠(亦即表現hDll4的人類卵巢腫瘤細胞)中精確靶定基質Dll4，觀察到類似的抗腫瘤效用。相對地，特異阻斷腫瘤細胞表現的人類Dll4(亦即阻斷植入廠商SCID小鼠中之人類卵巢腫瘤異種移植細胞表現的Dll4)不會表現能夠觀察到的抗腫瘤活性，指明在這些模型中缺少腫瘤生長促進自泌Dll4-Notch腫瘤細胞訊號傳遞(參見，例如表9中於SCID小鼠體內REGN421處理皮下TOV-112D或腹膜內A2780腫瘤的數據)。最後，Dll4抗體與抗-VEGF藥劑zif-阿柏西普(VEGF-Trap)的組合治療會增強抗-腫瘤效用且實際上完全壓抑腹膜內A2780腫瘤生長，證明VEGF與Dll4的組合阻斷在卵巢癌中的臨床優勢。
以免疫組織化學的方式使用CD31染色來評估腫瘤微血管密度的定量。以抗-鼠Dll4抗體mDll4Abl或hFc(對照)處理帶有TOV-112D以及SKOV-3卵巢腫瘤異種移植的天然Dll4 SCID小鼠。如表10中所示，使用mDll4Abl處理與腫瘤血管結構顯著增加相關聯，強調Dll4作為芽生性血管新生調節者的功能。也可以看到腫瘤灌注降低(數據未示出)。
這些研究證實，治療性靶定Dll4作為單一藥劑或與抗-VEGF劑組合在卵巢癌中作為一種以血管新生為主的新穎抗癌策略。
<110> 庫納特 法蘭克(Frank Kuhnert) 瑟斯頓 奧林(Olin Gavin Thurston)
<120> 以DLL4拮抗劑治療卵巢癌之方法
<130> 9750A-WO
<140> 待分派
<141> 隨附申請
<150> 61/726,125
<151> 2012-11-14
<150> 61/805,361
<151> 2013-03-26
<160> 123
<170> 第4.0版的FastSEQ
<210> 1
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<220>
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<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
<210> 102
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
<210> 105
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
<210> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
<210> 110
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
<210> 111
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
<210> 112
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
<210> 113
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
<210> 115
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
<210> 116
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
<210> 117
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
<210> 119
<211> 1377
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
<210> 120
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
<210> 121
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
<210> 122
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
<210> 123
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123

Claims (31)

  1. 一種在個體中治療卵巢癌或降低或停止卵巢腫瘤生長的方法，該方法包含向該個體投與Dll4拮抗劑，以使得該癌症受到治療。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該Dll4拮抗劑為特異地結合人類Dll4(hDll4)的抗體或其片段。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該抗體結合人類Dll4的N端域或DSL域、或兩者中的抗原決定位。
  4. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該抗體或其片段包含分別含有SEQ ID NO：22、24及26之重鏈CDR1、CDR2與CDR3序列的重鏈可變區(HCVR)，以及分別含有SEQ ID NO：30、32及34之輕鏈CDR1、CDR2與CDR3序列的輕鏈可變區(LCVR)。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：116的HCVR序列。
  6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：118的LCVR序列。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該抗體包含SEQ ID NO：20/28或116/118的HCVR/LCVR組合。
  8. 如申請專利範圍第4項之方法，其進一步包含向該個體投與VEGF拮抗劑。
  9. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該VEGF拮抗劑為能夠阻斷VEGF結合至VEGF受體的VEGF抗體或其抗原-結合片段。
  10. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該VEGF拮抗劑為包含SEQ ID NO：121的VEGF-Trap。
  11. 如申請專利範圍第8項之方法，其進一步包含投與化療劑。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該化療劑是選自下列組成之群的至少一者：抗有絲分裂劑、以鉑為主的化療劑、嘧啶類似物、拓撲異構酶抑制劑、受體酪胺酸激酶抑制劑，以及佐劑。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該抗有絲分裂劑為多西紫杉醇或太平洋紫杉醇，或其醫藥上可接受之類似物或鹽。
  14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該以鉑為主的化療劑為順鉑、卡鉑、異丙鉑或草酸鉑，或其醫藥上可接受之鹽。
  15. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該受體酪胺酸激酶抑制劑為索拉菲尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)或帕唑帕尼(pazopanib)，或其醫藥上可接受之鹽。
  16. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該嘧啶類似物為吉西他濱(gemcitabine)、5-FU或卡培他濱(capecitabine)，或其醫藥上可接受之鹽。
  17. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該拓撲異構酶抑制劑為伊立替康(irinotecan)、拓撲替康(topotecan)、喜樹鹼或片螺素D(lamellarin D)，或其醫藥上可接受之鹽。
  18. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該佐劑為醛葉酸(folinic acid)或其醫藥上可接受之鹽。
  19. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該化療劑為5-FU、醛葉酸與草酸鉑的組合；5-FU、醛葉酸與伊立替康的組合；卡培他濱與草酸鉑的組合；或順鉑與吉西他濱的組合。
  20. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該Dll4拮抗劑與VEGF拮抗劑被同時投與。
  21. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該Dll4拮抗劑與該化療劑被同時投與。
  22. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該Dll4拮抗劑與該化療劑被依序投與。
  23. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該Dll4拮抗劑與該化療劑被依序投與。
  24. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該個體為人類個體。
  25. 一種在帶有卵巢癌或腫瘤的個體中降低達到所要治療效用所需之化療劑的量的方法，其包含向該個體投與化療劑與特異地結合至hDll4的抗體或其抗原-結合片段和VEGF抑制劑，其中該抗體或抗原-結合片段包含分別含有SEQ ID NO：22、24及26之重鏈CDR1、CDR2與CDR3序列的HCVR，以及分別含有SEQ ID NO：30、32及34之輕鏈CDR1、CDR2與CDR3序列的LCVR，且其中相較於在抗體或抗原-結合片段不存在下相同治療效用所需的量，該化療劑之量被降低。
  26. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該VEGF拮抗劑為能夠阻斷VEGF結合至VEGF受體的VEGF抗體或其抗體片段。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該VEGF拮抗劑為包含SEQ ID NO：121的VEGF-Trap。
  28. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該抗體或抗原-結合片段包含SEQ ID NO：20/28或116/118的HCVR/LCVR組合。
  29. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該化療劑是選自下列組成之群的至少一者：多西紫杉醇、太平洋紫杉醇、索拉菲尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、吉西他濱、順鉑、5-FU、醛葉酸、草酸鉑、伊立替康、卡鉑、卡培他濱、拓撲替康、異丙鉑、喜樹鹼、片螺素D，及其醫 藥上可接受之鹽。
  30. 如申請專利範圍第25項之方法，其中達到所要治療效用需要的化療劑之量降低至少20%。
  31. 如申請專利範圍第30項之方法，其中達到所要治療效用需要的化療劑之量降低約30至約50%。
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