ES2386480T3 - Anticuerpos humanos para ligando 4 similar a delta humano - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a ligando 4 similar a delta humano(hD114), comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo una región variable de la cadenapesada/región variable de la cadena ligera (HCVR/LCVR) seleccionada de los pares de secuencias de aminoácidosde SEC ID Nº: 429/437 y 901/903.

Description

Anticuerpos humanos para ligando 4 similar a delta humano

Antecedentes

La ruta de señalización de Notch es un sistema para la comunicación célula a célula usada por una amplia gama de eucariotas para muchos procesos biológicos tales como diferenciación, proliferación y homeostasis. 4 similar a delta (DI4) o ligando 4 similar a delta (DII4) (denominado en lo sucesivo “DII4”) es un miembro de la familia delta de ligandos Notch que presenta expresión altamente selectiva por endotelio vascular (Shutter y col. (2000) Genes Develop. 14:1313-1318). DII4 es un ligando para receptores Notch, que incluyen Notch1 y Notch 4. Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para DII4 humano se muestran en SEC ID Nº: 1-2, respectivamente.

Los procedimientos para producir anticuerpos útiles como agentes terapéuticos humanos incluyen generación de anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, el documento U.S. 6.949.245). Véanse, por ejemplo, los documentos WO 94/02602 (Abgenix) y U.S. 6.596.541 (Regeneron Pharmaceuticals) que describen procedimientos de generación de ratones transgénicos no humanos que pueden producir anticuerpos humanos. Hainaud y col. (Cancer Research 2006 66 : (17)) desvelan la función de DLL4 en el remodelado de receptores de tumores.

La solicitud de patente japonesa 2003/047470A2 (Asahi Kasei Kogyo) describe anticuerpos para la porción extracelular de la proteína del ligando Notch humana.

Breve resumen de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona anticuerpos humanos, preferentemente anticuerpos humanos recombinantes, que se unen específicamente a ligando 4 similar a delta humano (hDII4). El anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a ligando 4 similar a delta humano (hDII4), comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo una región variable de la cadena pesada/región variable de la cadena ligera (HCVR/LCVR) seleccionada de los pares de secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 429/437 y 901/903. Estos anticuerpos se caracterizan por unirse a hDII4 con alta afinidad y por la capacidad para neutralizar la actividad de DII4. Los anticuerpos de la invención pueden bloquear la unión de DII4 a su(s) receptor(es) Notch, y por tanto, inhibir la señalización por DII4. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender sólo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para efectuar la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Glu que elimina funciones efectoras residuales (Reddy y col. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención y un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico.

La invención proporciona adicionalmente una célula huésped que comprende un vector de la invención. En un aspecto relacionado, la invención también proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo anti-DII4 humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende cultivar células huésped de la invención en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo y la recuperación del anticuerpo o fragmento así producido.

La invención proporciona además el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para tratar cáncer en un ser humano.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención para su uso en un procedimiento para tratar cáncer en un paciente humano.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 y 947 o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. En la invención, la HCVR es la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 429 ó 901.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 y 949 o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. En la invención, la LCVR es la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 437 ó 903.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo que comprende una HCVR seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 y 947 o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma, y una LCVR seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 y 949 o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. En una realización preferida de la invención, las HCVR/LCVR son los pares de secuencias de aminoácidos SEC ID Nº: 429/437 ó 901/903.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 1 (CDR1) seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711119, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 y 879, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR2 de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 y 881, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR3 de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 y 883, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 6, 22, 38, 54, 70, 86. 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711119, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 y 879, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma; una CDR2 de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 y 881, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma; y una CDR3 de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 y 883, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID Nº: 431/433/435; 374/376/378; 783/785/787; y 799/801/803.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 y 887, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR2 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N0:16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 y 889,

o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 y 891, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 y 887, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma; una CDR2 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 y 889, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma; y una CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 y 891, o una secuencia sustancialmente idéntica de la misma. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 439/441/443; 382/384/386; 791/793/795; y 807/809/811.

La invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno, de la invención. Vectores de expresión recombinantes que llevan los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de la invención, y células huésped en las que se han introducido tales vectores, también se describen en este documento, ya que son procedimientos de preparación de los anticuerpos de la invención cultivando las células huésped de la invención.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 y 946, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo que comprende una LCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 y 948, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 y 946, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma, y una LCVR codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 y 948, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 y 878, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR2 de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 y 880, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR3 de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 y 882, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 y 878, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma; una CDR2 de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 y 880, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma; y una CDR3 de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 y 882, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 430/432/434; 373/375/377; 782/784/786; y 798/800/802.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 y 886, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR2 de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872, y 888, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR3 de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 y 890, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende una CDR1 de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 y 886, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma; una CDR2 de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 y 888, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma; y una CDR3 de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 y 890,

o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 95% de homología con la misma. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede comprender la CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 438/440/442; 381/383/385; 790/792/794; y 806/808/810.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a hDII4, que comprende una CDR 1, 2 y 3 seleccionada del grupo que consiste en (a) una región CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEC ID Nº: 928) en la que X1 es Gly; X2 es Phe o Tyr; X3 es Thr; X4 es Phe; X5 es Ser, Thr o Asn; X6 es Ser, Asn o Tyr; X7 es Tyr o Phe; y X8 es Gly o Ala; (b) una región CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEC ID Nº: 929) en la que X1 es Ile o Leu; X2 es Trp o Ser; X3 es Tyr, Ala o Gly; X4 es Asp, Ser o Tyr; X5 es Gly o Asp; X6 es Ser, Gly, Thr o Val; X7 es Asn o Asp; y X8 es Lys o Arg; (c) una región CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 -X10 -X11 -X12 -X13 -X14 -X15 -X16 (SEC ID Nº: 930) en la que X1 es Ala o Ser; X2 es Arg o Lys; X3 es Asp o Tyr; X4 es Ser, Gly o His; X5 es Asp, Ala o Trp; X6 es Asn, o Phe; X7 es Tyr, Arg o Lys; X8 es His o Ser; X9 es Gly o Trp; X10 es Tyr o Phe; X11 es Glu o Asp; X12 es Gly, His o Pro; X13 es Tyr, Trp

o ausente; X14 es Phe o ausente; X15 es Asp o ausente; y X16 es Pro o ausente.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en este documento puede comprender CDR 1, 2 y 3 de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en (a) una región CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEC ID Nº: 928) en la que X1 es Gly; X2 es Phe; X3 es Thr; X4 es Phe; X5 es Ser o Asn; X6 es Ser o Asn; X7 es Tyr o Phe; y X8 es Gly o Ala; (b) una región CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEC ID Nº: 929) en la que X1 es Ile o Leu; X2 es Trp o Ser; X3 es Tyr o Gly; X4 es Asp o Ser; X5 es Gly; X6 es Ser, Thr o Val; X7 es Asn o Asp; y X8 es Lys o Arg; (c) una región CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos defórmula X1 -X2 -X3-X4-X5 -X6-X7-X8 -X9-X10-X11-X12 -X13-X14 -X15-X16 (SEC ID Nº: 930) en la que X1 es Ala o Ser; X2 es Arg o Lys; X3 es Asp; X4 es Gly o His; X5 es Asp o Ala; X6 es Phe; X7 es Tyr o Arg; X8 es Ser; X9 es Gly; X10 es Tyr; X11 es Glu; X12 es Gly o His; X13 es Tyr o Trp; X14 es Phe o ausente; X15 es Asp o ausente; y X16 es Pro o ausente.

El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo descrito en este documento puede comprender adicionalmente (d) una región CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEC ID Nº: 931) en la que X1 es Gln; X2 es Ser; X3 es Val; X4 es Arg, Ser o Thr; X5 es Ser o Gly; X6 es Ser

o Tyr; y X7 es Tyr o ausente; (e) una región CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 (SEC ID Nº: 932) en la que X1 es Gly o Asp; X2 es Ala o Thr; y X3 es Ser; y (f) una región CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 (SEC ID Nº: 933) en la que X1 es Gln; X2 es Gln o His; X3 es Tyr, Arg o Ser; X4 es Gly, Ser o Ala; X5 es Ser, Asn o Phe; X6 es Trp o Ser; X7 es Pro; X8 es Trp, Pro o Arg; y X9 es Thr.

El anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo descrito en este documento puede comprender adicionalmente (d) una región CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 (SEC ID Nº: 931) en la que X1 es Gln; X2 es Ser; X3 es Val; X4 es Arg o Ser; X5 es Ser; X6 es Ser o Tyr; y X7 es Tyr o ausente; (e) una región CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 (SEC ID Nº: 932) en la que X1 es Gly o Asp; X2 es Ala o Thr; y X3 es Ser; y (f) una región CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 -X9 (SEC ID Nº: 933) en la que X1 es Gln; X2 es Gln o His; X3 es Tyr o Arg; X4 es Gly o Ser; X5 es Ser o Asn; X6 es Trp o Ser; X7 es Pro; X8 es Pro o Arg; y X9 es Thr.

Por tanto, en este documento se describe un anticuerpo completamente humano o fragmento de anticuerpo que se une a hDII4 con una CI50 inferior a aproximadamente 10 nM, como se mide en ensayo in vitro o ensayo de bloqueo de DII4 basado en ELISA (descrito más adelante). Un anticuerpo tal puede presentar una CI50 de aproximadamente 500 pM o menos. Un anticuerpo tal puede presentar preferentemente una CI50 de aproximadamente 100 pM o menos.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo monoclonal completamente humano que se une específicamente a e inhibe DII4 humano y presenta una CI50 inferior a o igual a aproximadamente 150 pM, 100 pM, 75 pM o 50 pM, como se mide por el bioensayo de luciferasa inducible por Notch con hDII4-Fc. Como se muestra en la sección experimental más adelante, los anticuerpos anti-hDII4 de la invención no reaccionan de forma cruzada con proteínas delta estrechamente relacionadas tales como hDII1 y hDII3.

Adicionalmente, en este documento se describe un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a hDII4 con una KD inferior a aproximadamente 500 pM, preferentemente inferior a aproximadamente 300 pM, incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 50 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales (BIACORE™), por ejemplo, usando hDII4 dimérico (Tabla 2).

En este documento se describen anticuerpos anti-hDII4 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glicosilación no deseables, o un anticuerpo que carece de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield y col. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones puede hacerse la modificación de una galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Por tanto, en este documento se describen anticuerpos anti-hDII4 que se unen a epítopes específicos de hDII4 y pueden bloquear la actividad biológica de hDII4. El dominio extracelular de DII4 está compuesto por un dominio del extremo N, un dominio Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) y un tándem de ocho repeticiones similares a factor de crecimiento epidérmico (EGF). Generalmente, los dominios de EGF son reconocidos ya que se producen en aproximadamente los residuos de aminoácidos 218-251 (dominio 1), 252-282 (dominio 2), 284-322 (dominio 3), 324-360 (dominio 4) y 362-400 (dominio 5), con el dominio DSL en aproximadamente los residuos de aminoácidos 173-217 y el dominio del extremo N en aproximadamente los residuos de aminoácidos 27-172 de hDII4 (SEC ID Nº: 2).

Un anticuerpo bloqueante descrito en este documento puede unirse dentro de los residuos de aminoácidos 27 a 524 de SEC ID Nº: 2. En una realización más específica, un anticuerpo bloqueante descrito en este documento se une a un epítope dentro de los dominios del extremo N-DSL 27-217 de SEC ID Nº: 2; en una realización incluso más específica, el anticuerpo bloqueante se une a un epítope dentro de aproximadamente los residuos de aminoácidos 27-172 (dominio del extremo N) o 173-217 (dominio DSL). En otra realización, un anticuerpo bloqueante descrito en este documento se une al epítope de EGF-2 dentro de aproximadamente los residuos de aminoácidos 252-282 de SEC ID Nº: 2.

La invención caracteriza una composición que comprende un anticuerpo humano anti-DII4 humano recombinante de la invención y un vehículo aceptable. Adicionalmente, en este documento se describen vectores y células huésped que comprenden vectores que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo humano anti-DII4 de la invención, además de procedimientos de producción de estos anticuerpos novedosos que comprende cultivar una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-hDII4 de la invención o un fragmento de anticuerpo en condiciones que permitan la producción de la proteína y la recuperación de la proteína así producida.

Adicionalmente, en este documento se describen procedimientos para inhibir la actividad de hDII4 usando un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención. En una realización, el procedimiento descrito en este documento puede comprender poner en contacto hDII4 con el presente anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de forma que hDII4 inhibe la unión al receptor Notch, por ejemplo Notch-1. En otra realización, el procedimiento descrito en este documento comprende administrar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención a un sujeto humano que padece un trastorno que es mejorado por la inhibición de actividad de DII4. El trastorno tratado es una enfermedad o afección que es superada, mejorada, inhibida o prevenida por eliminación, inhibición o reducción de la actividad de DII4, por ejemplo, vascularización patológica asociada a angiogénesis tumoral y cáncer, enfermedades de inmunodeficiencia, rechazo de trasplante o inflamación; y afecciones neurodegenerativas, por ejemplo, asociadas a enfermedad de priones. Por tanto, en este documento se describe el uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, como se ha descrito anteriormente, en la preparación de un medicamento para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno mediado por DII4 en un ser humano.

Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.

Descripción detallada

Antes de describir los presentes procedimientos debe entenderse que la presente invención no se limita a procedimientos particulares y condiciones experimentales descritas, ya que tales procedimientos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de sólo describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención sólo se limitará por las reivindicaciones adjuntas.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referencias plurales, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, una referencia a “un procedimiento” incluye uno o más procedimientos y/o etapas del tipo descrito en este documento y/o que serán evidentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de esta divulgación.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a aquellos descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen procedimientos preferidos y materiales.

Definiciones

“Ligando 4 similar a delta”, “DII4”, “hDII4” se usan indistintamente para referirse a la proteína codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1 y la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:

2.

El término “anticuerpo”, como se usa en este documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) conectadas entre sí por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en este documento LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El término anticuerpo de “alta afinidad” se refiere a aquellos anticuerpos que tienen una afinidad de unión a hDII4 de al menos 10-8 M; preferentemente 10-9 M; incluso más preferentemente 10-10 M, como se mide por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad por disolución.

Por el término “constante de disociación lenta” o “Kdis” se indica un anticuerpo que se disocia de hDII4 con una tasa constante de 1 x 10-3 s-1 o menos, preferentemente 1 x 10-4 s-1 o menos, como se ha determinado por resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, BIACORE™.

Un anticuerpo “neutralizante” o “bloqueante” pretende referirse a un anticuerpo cuya unión a DII4 produce la inhibición de la actividad biológica de DII4. Esta inhibición de la actividad biológica de DII4 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de actividad de DII4 biológica. Estos indicadores de actividad de DII4 biológica pueden evaluarse por uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo convencionales conocidos en la técnica (véanse los ejemplos más adelante). Preferentemente, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad de DII4 se evalúa por la inhibición de la unión de DII4 a un receptor Notch.

El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo” o “fragmento de anticuerpo”), como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hDII4). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col. (1989) Nature 241:544-546) que consiste en un dominio VH; y (vi) una CDR aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, por un ligador sintético que les permite prepararse como una cadena de única proteína en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenaria (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también pretenden estar englobados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. También están englobadas otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena de polipéptidos, pero usando un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzándose así los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger y col. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak y col. (1994) Structure 2:1121-1123).

Todavía más, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mayor, formada por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o varias proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para preparar una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov y col. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido de marcador y una marca de polihistidina del extremo C para preparar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov y col. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse usando técnicas de ADN recombinante convencionales como se describen en este documento.

El término “anticuerpo humano”, como se usa en este documento, está previsto que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específicas para sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término “anticuerpo humano”, como se usa en este documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, han sido injertadas en secuencias de la región estructural humana.

El término “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en este documento, está previsto que incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrito adicionalmente más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante (descrita adicionalmente más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor y col. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que implican el corte y empalme de secuencias del gen de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, si se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se deriven de y estén relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Un “anticuerpo aislado”, como se usa en este documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hDII4 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de hDII4). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hDII4 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de hDII4 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

El término “resonancia de plasmones superficiales”, como se usa en este documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo, usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden y Piscataway, N.J.).

El término “KD”, como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término “epítope” incluye cualquier determinante, preferentemente un determinante de polipéptidos, que puede unirse específicamente con una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. En ciertas realizaciones, los determinantes de epítopes incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y en ciertas realizaciones pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítope es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. En ciertas realizaciones se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En realizaciones preferidas, un anticuerpo se dice que se une específicamente a antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio es inferior a o igual a 10-8 M, más preferentemente cuando la constante de disociación en equilibrio es inferior a o igual a 10-9 M, y lo más preferentemente cuando la constante de disociación es inferior a o igual a 10-10 M.

Una proteína o polipéptido es “sustancialmente puro”, “sustancialmente homogéneo” o “sustancialmente purificado” cuando al menos aproximadamente del 60 al 75% de una muestra presenta una única especie de polipéptido. El polipéptido o proteína puede ser monomérico o multimérico. Un polipéptido o proteína sustancialmente puro comprenderá normalmente aproximadamente el 50%, 60, 70%, 80% o el 90% en peso/peso de una muestra de proteína, más normalmente aproximadamente el 95%, y preferentemente será superior al 99% de pureza. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse por varios medios muy conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de visualización de una única banda de polipéptidos tras la tinción del gel con una tinción muy conocida en la técnica. Para ciertos fines puede proporcionarse mayor resolución usando HPLC u otros medios muy conocidos en la técnica para la purificación.

El término “análogo o variante de polipéptido” como se usa en este documento se refiere a un polipéptido que comprende un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una parte de una secuencia de aminoácidos y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a hDII4 bajo condiciones de unión adecuadas, o (2) capacidad para bloquear la unión de DII4 a un receptor Notch. Normalmente, los análogos o variantes de polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácidos conservativa (o inserción o deleción) con respecto a la secuencia que se produce naturalmente. Los análogos tienen normalmente al menos 20 aminoácidos de longitud, preferentemente al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud o más, y frecuentemente puede ser tan largo como un polipéptido que se produce naturalmente de longitud completa.

Sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas mutaciones de una secuencia distintas de la secuencia de péptidos que se produce naturalmente. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de un único o de múltiples aminoácidos (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia que se produce naturalmente (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del (de los) dominio(s) que forma(n) contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservativa no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de sustitución no debería tender a la rotura de una hélice que se produce en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia parental). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton 1984 W. H. Freeman and Company, New York; Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze, eds., 1991, Garland Publishing, NY); y Thornton y col. 1991 Nature 354:105.

Los análogos de no péptido se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se llaman “miméticos de péptidos” o “peptidomiméticos” (véase, por ejemplo, Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res. 15:29; y Evans y col. (1987) J. Med. Chem. 30:1229). La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un Daminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también puede usarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos constreñidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica pueden generarse mediante procedimientos conocidos en la técnica (Rizo y col. (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387), por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

El término “identidad de secuencias en porcentaje” en el contexto de secuencias de ácidos nucleicos se refiere a los residuos en dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencias puede ser sobre una extensión de al menos aproximadamente nueve nucleótidos o más, normalmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 24 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más normalmente al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferentemente al menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Hay varios algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en Wisconsin Package versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, proporciona alineamientos e identidad de secuencias en porcentaje de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (1990) Methods Enzymol. 183:63-98 y (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219). A menos que se especifique de otro modo se usan los parámetros por defecto para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, la identidad de secuencias en porcentaje entre secuencias de ácidos nucleicos pueden determinarse usando FASTA con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) o usando Gap con sus parámetros por defecto como se proporciona en GCG versión 6.1.

Una referencia a una secuencia de ácidos nucleicos engloba su complemento, a menos que se especifique de otro modo. Por tanto, una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular debería entenderse que engloba su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. Generalmente, la materia usa los términos “identidad de secuencias en porcentaje”, “similitud de secuencias en porcentaje” y “homología de secuencias en porcentaje”, indistintamente. En la presente solicitud, estos términos deben tener el mismo significado con respecto a secuencias de ácidos nucleicos.

El término “similitud sustancial” o “similitud de secuencias sustancial”, cuando es con referencia a un ácido nucleico

o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay identidad de secuencias de nucleótidos en al menos aproximadamente el 90%, preferentemente al menos aproximadamente el 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% de las bases de nucleótidos, como se mide por cualquier algoritmo de identidad de secuencias muy conocido tal como FASTA, BLAST o Gap, como se trata anteriormente.

Como se aplica a polipéptidos, el término “identidad sustancial” o “sustancialmente idéntico” significa que dos secuencias de péptidos, cuando están óptimamente alineadas, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos el 80% de identidad de secuencias, preferentemente al menos el 90% o el 95% de identidad de secuencias, incluso más preferentemente al menos el 98% o el 99% de identidad de secuencias. Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas se diferencian por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácidos conservativa” es una en la que un residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos se diferencian entre sí por sustituciones conservativas, la identidad de secuencias en porcentaje o el grado de similitud pueden ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para preparar este ajuste son muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; y 6) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Alternativamente, una sustitución conservativa es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidades logarítmicas PAM250 desvelada en Gonnet y col. (1992) Science 256: 1443 45. Una sustitución “moderadamente conservativa” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidades logarítmicas PAM250.

La similitud de secuencias para polipéptidos, que también se denomina en lo sucesivo identidad de secuencias, se mide normalmente usando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas hace corresponder secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, que incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar homología de secuencias o identidad de secuencias entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína natural y una muteína del mismo. Véase, por ejemplo, GCG versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos de identidad de secuencias en porcentaje de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000), arriba). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros por defecto. Véanse, por ejemplo, Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

La longitud de secuencias de polipéptidos comparada para homología tendrá generalmente al menos aproximadamente 16 residuos de aminoácidos, normalmente al menos aproximadamente 20 residuos, más normalmente al menos aproximadamente 24 residuos, normalmente al menos aproximadamente 28 residuos, y preferentemente más de aproximadamente 35 residuos. Cuando se busca en una base de datos que contiene secuencias de un gran número de organismos diferentes es preferible comparar secuencias de aminoácidos.

Preparación de anticuerpos humanos

Los procedimientos para generar anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo, tecnología VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals), XENOMOUSE™ (Abgenix), el enfoque de “minilocus” y expresión en fago. La tecnología VELOCIMMUNE® (documento U.S. 6.596.541) engloba un procedimiento de generación de un anticuerpo completamente humano de alta especificidad para un antígeno seleccionado. Esta tecnología implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera humanas operativamente ligadas a loci de la región constante de ratón endógeno de forma que el ratón produzca un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se aísla y se liga operativamente a ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas. Entonces, el ADN se expresa en una célula que puede expresar el anticuerpo completamente humano. En una realización específica, la célula es una célula CHO.

La tecnología XENOMOUSE™ (Green y col. (1994) Nature Genetics 7:13-21) genera un ratón que tiene regiones tanto variables como constantes humanas de loci de tanto la cadena pesada como la cadena ligera kappa. En un enfoque alternativo, otros han utilizado un enfoque de 'minilocus” en el que un locus de Ig exógena se imita mediante la inclusión de genes individuales del locus de Ig (véase, por ejemplo, el documento U.S. 5.545.807). El ADN que codifica las regiones variables puede aislarse con o sin ligarse operativamente al ADN que codifica la región constante de la cadena pesada y ligera humana.

Se conocen otros procedimientos de generación de anticuerpos humanos, que incluyen aislamiento de un donante humano. Véase, por ejemplo, el documento U.S. 6.787.637.

Los anticuerpos pueden ser terapéuticamente útiles en el bloqueo de una interacción ligando-receptor o la inhibición de la interacción de componentes del receptor, en vez de en la destrucción de células mediante fijación de complemento y participación en CDC. La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y participar en CDC o destrucción de células directa mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en la deseabilidad del anticuerpo para fijar el complemento.

Las inmunoglobulinas humanas pueden existir en dos formas que están asociadas a la heterogeneidad bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un enlace disulfuro de cadenas pesadas entre las cadenas. En una segunda forma, los dímeros no están ligados por enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una única cadena ligera y pesada. Estas formas han sido difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intactos es debida a, pero no se limita a, diferencias estructurales asociadas al isotipo de región bisagra del anticuerpo. En realidad, una única sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal y col. 1993 Molecular Immunology 30:105) a niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención engloba anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción para mejorar el rendimiento, o modular funciones efectoras.

Los anticuerpos de la invención se preparan preferentemente usando tecnología VELOCIMMUNE®. Un ratón transgénico en el que las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina endógena se reemplazan por las regiones variables correspondientes humanas se expone al antígeno de interés, y células linfáticas (tales como linfocitos B) se recuperan de ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y tales líneas celulares de hibridoma se criban y se seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera pueden aislarse y ligarse a regiones constantes de la cadena pesada y cadena ligera isotípicas deseables. Una proteína de anticuerpo tal puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Alternativamente, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos para antígeno puede aislarse directamente de linfocitos específicos para antígeno. En diversas realizaciones, el ratón transgénico comprende 12 genes de la cadena pesada variable humana funcional y 11 genes de la cadena ligera kappa variable humana funcional; 25 a 30 genes de la cadena pesada variable humana y de 18 a 20 genes de la cadena ligera kappa variable humana; 43 a 48 genes de la cadena pesada variable humana y 20 a 22 genes de la cadena ligera kappa variable humana; o aproximadamente 80 genes de la cadena pesada variable humana y aproximadamente 40 genes de la cadena ligera kappa variable humana.

En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy altas, poseyendo normalmente KD de aproximadamente 10-9 a aproximadamente 10-11 M, cuando se mide por unión a antígeno tanto inmovilizado sobre fase sólida como en fase de disolución. Las regiones constantes de ratón se reemplazan por regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 naturales o modificadas (por ejemplo, SEC ID Nº: 950, 951 ó 952). Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad por diana residen en la región variable.

Cáncer, enfermedades infecciosas, autoinmunidad, inmunodeficiencia, trasplantes, inflamación, lesión y afecciones degenerativas pueden tratarse por modulación del sistema inmunitario. En casos de enfermedad debida a función o hiperactividad inapropiada del sistema inmunitario, tal como autoinmunidad o inflamación, puede mejorarse mediante inhibición de la función de células inmunitarias o reducción de los números de células inmunitarias. Esto puede llevarse a cabo por el bloqueo de señales positivas o la estimulación de señales negativas en poblaciones de células inmunitarias críticas para el proceso de enfermedad, tales como linfocitos T, B o NK, neutrófilos, macrófagos, células presentadoras de antígeno, mastocitos u otros tipos de células. La actividad en exceso también puede inhibirse mediante la eliminación de diversas poblaciones de células inmunitarias por estimulación de apoptosis, elección como diana de receptores de superficie específicos con anticuerpos de agotamiento o conjugados anticuerpo-fármaco, o el bloqueo o alteración de la diferenciación de linajes de células inmunitarias o tipos de células específicos. La función inmunitaria ineficiente o reducida puede producir o agravar trastornos tales como cáncer, enfermedad infecciosa y otras inmunodeficiencias. La hipoactividad del sistema inmunitario puede mejorarse mediante la activación de células inmunitarias por estimulación de señales positivas por reticulación o anticuerpos agonistas o bloqueo de señales negativas. Las poblaciones de células inmunitarias pueden aumentarse por estimulación del desarrollo de algunos o todos los linajes de células inmunitarias, prevención de apoptosis o eliminación de señales inhibidoras. En una aplicación específica, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento, inhibición o mejora de una afección o enfermedad tal como, por ejemplo, inmunodeficiencia al cáncer, rechazo de trasplante o inflamación.

Mapeo de epítopes y tecnologías relacionadas

Para cribar para anticuerpos que se unen a un epítope particular (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de IgE a su receptor de alta afinidad) puede realizarse un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Harlow y Lane (1990), arriba. Otros procedimientos incluyen mutantes de cribado de alanina, transferencias de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) o análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse procedimientos tales como escisión de epítope, extracción de epítopes y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).

El término “epítope” se refiere a un sitio sobre un antígeno al que responden los linfocitos B y/o T. Los epítopes de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos son normalmente retenidos con la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados por plegamiento terciario se pierden normalmente con el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítope normalmente incluye al menos 3, y más normalmente al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.

El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en estructura de antígenos (ASAP), es un procedimiento que clasifica grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígeno químicamente o enzimáticamente modificadas (publicación de patente de EE.UU. nº 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítope único tanto distintamente diferente de como parcialmente solapante con epítope representado por otra categoría. Esta tecnología permite el rápido filtrado de anticuerpos genéticamente idénticos, de forma que la caracterización puede basarse en anticuerpos genéticamente distintos. Si se aplica al cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen mAb que tienen las características deseadas. MAP puede usarse para clasificar los anticuerpos para hDII4 de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopes.

Agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado son enzimas tales como, por ejemplo, enzimas proteolíticas, por ejemplo, tripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Asp-N, quimotripsina, etc. Agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado también pueden ser agentes químicos tales como ésteres de succinimidilo y su derivado, compuestos que contienen aminas primarias, hidracinas y carbohidracinas, aminoácidos libres, etc.

La proteína de antígeno puede inmovilizarse sobre cualquier superficie de chip de biosensor o perlas de poliestireno. Estas últimas pueden procesarse con, por ejemplo, un ensayo tal como ensayo de detección LUMINEX™ de múltiplex (Luminex Corp., Austin, TX). Debido a la capacidad de LUMINEX™ para manipular análisis de múltiplex con hasta 100 tipos diferentes de perlas, LUMINEX™ proporciona superficies de antígeno casi ilimitadas con diversas modificaciones, produciendo resolución mejorada en el perfilado de epítopes de anticuerpos durante un ensayo de biosensor.

Administración terapéutica y formulaciones

La administración de entidades terapéuticas según la invención se administrará con vehículos, excipientes adecuados y otros agentes que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, administración, tolerancia mejorada y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todo los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15ª ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones carbocera (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbocera. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en los tratamientos y terapias según la presente invención, siempre que el principio activo en la formulación no esté inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Powell y col. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52:238-311 y las citas en su interior para información adicional relacionada con excipientes y vehículos muy conocidos para los químicos farmacéuticos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos para DII4 humano.

Pueden inmunizarse ratones mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, arriba). En una realización, el antígeno de hDII4 se administra directamente a ratones VELOCIMMUNE® que comprenden loci de ADN que codifican regiones variables de la cadena pesada y regiones variables de la cadena ligera kappa de Ig humana, con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Un adyuvante tal incluye adyuvante completo e incompleto de Freund, sistema de adyuvantes MPL+TDM (Sigma) o RIBI (muramildipéptidos) (véase O'Hagan 2000 Vaccine Adjuvant, de Human Press, Totawa, NJ). La respuesta inmunitaria del anticuerpo se monitoriza por inmunoensayo específico para antígeno convencional. Cuando se logra una respuesta inmunitaria deseada, los linfocitos B que expresan anticuerpo se recogen y se fusionan con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad, formando líneas celulares de hibridoma. Tales líneas celulares de hibridoma se criban y se seleccionan para identificar líneas celulares que producen anticuerpos específicos para antígeno usando ensayos como se describen más adelante.

Alternativamente, células de hibridoma específicas para antígeno pueden aislarse por citometría de flujo. Brevemente, después de la fusión con células de mieloma, las células de hibridoma recogidas se cultivaron durante 10 días en medio HAT. Entonces, las células se recogieron y se tiñeron con DII4 marcado con biotina a 2 mg/ml durante una hora, seguido de la adición de ficoeritrina-estreptavidina. Las células marcadas con fluorescencia se clasificaron por citometría de flujo (una única célula por pocillo en placas de 96 pocillos que contenían medio de crecimiento de hibridomas), se cultivaron durante 8-10 días y los medios acondicionados se cribaron para la presencia de anticuerpos monoclonales funcionalmente deseables, como se describe más adelante.

Anticuerpos anti-hDII4 generados por aislamiento directo de esplenocitos. Anticuerpos específicos para antígeno también pueden aislarse directamente a partir de linfocitos B inmunizados con antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en la publicación de patente de EE.UU. 2007/0280945A1. Líneas celulares CHO que expresan anticuerpos recombinantes estables se establecieron a partir de los recombinantes apropiados aislados.

Ejemplo 2. Determinación de la afinidad de unión a antígeno.

Las constantes de disociación en equilibrio (valores de KD) para la unión de antígeno a los anticuerpos seleccionados anteriormente descritos se determinaron por la superficie cinética en un ensayo de resonancia de 5 plasmones superficiales en biosensores en tiempo real (BIACORE™ 2000). El anticuerpo se capturó en una superficie de anticuerpo policlonal de cabra dirigido contra IgG de ratón creada mediante acoplamiento químico directo a un chip BIACORE™ para formar una superficie de anticuerpo capturado. Concentraciones variables de hDII4 monomérico o hDII4-hFc dimérico se inyectaron sobre las superficies de anticuerpo capturado, y la unión antígeno-anticuerpo y la disociación se monitorizaron en tiempo real. El análisis cinético se realizó para calcular KD,

10 constantes de velocidad de disociación y la semivida de la disociación del complejo antígeno /anticuerpo (Tabla 1). Un procedimiento similar se aplicó para medir anticuerpos monoclonales derivados de un único linfocito B modificado para contener un dominio constante de IgG humana. Lo anticuerpos se presentaron por reactivo de anticuerpo policlonal de cabra anti-hFc (Jackson Immuno Research Lab) inmovilizado sobre el chip BIACORE™ y se expusieron tanto a proteína DII4-mFc dimérica como a DII4 monomérica (Tabla 2).

15 La afinidad de unión a antígeno del anticuerpo también puede evaluarse usando un ensayo de competencia en disolución basado en ELISA. Brevemente, sobre una placa de microtitulación de 96 pocillos, los anticuerpos (proteínas purificadas o en medio acondicionado) se mezclaron previamente con diluciones seriadas de proteína de antígeno (monomérica o dimérica) que oscila de 0 a 10 µg/ml con una concentración constante de anticuerpo.

20 Después de una incubación de 2 h del antígeno con el anticuerpo, la disoluciones se transfirieron a una placa de microtitulación previamente recubierta con antígeno para la medición de anticuerpo libre (MAXISORB™, VWR, West Chester, PA). La placa se recubrió con 1 µg/ml de proteína hDII4-hFc en disolución de PBS durante la noche a 4ºC y los sitios de unión no específica se bloquearon con BSA durante 2 h. Después de una incubación de 1 h tras la transferencia, la placa se lavó y los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un reactivo de anticuerpo

25 policlonal de cabra dirigido contra IgG de ratón conjugada con HRP (Jackson Immuno Laboratory) y se revelaron usando sustratos colorimétricos (OPTEIA™; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). La reacción enzimática se detuvo con ácido fosfórico 1 M, las absorciones ópticas a 450 nm se registraron y los datos se analizaron usando un modelo de respuesta a dosis sigmoide y se informaron los valores de CI50 (Tabla 1).

30 TABLA 1

Anticuerpo

KD de DII4 (nM) KD de DII4-Fc (nM) CI50 de DII4-Fc (nM)

13B6

2,79 0,188 0,06

15E10

0,55 0,023 0,58

22G12

1,29 0,076 0,03

24C8

0,52 0,047 0,01

VAV 2H4-19

1,51 0,611 0,10

VAV 4H10-9

13,70 0,662 0,30

VAV 7B9-9

0,88 0,021 0,27

VAW 10E4-9

89,00 0,468 0,06

VAW 10G11-2

31,30 1,430 1,66

VAW 1C6-1

45,80 0,092 0,25

VAW 1G2-4

83,80 0,035 0,40

VAW 1H2-2

67,00 0,148 0,30

VAW 2H3-2

0,30 0,150 0,26

VAW 3A7-2

1,64 0,162 0,02

VAW 3A9-5

NA 2,510 16,00

VAW 3F12-8

8,12 0,648 0,07

VAW 6B8-12

0,89 0,060 0,43

VAW 6C6-2

91,70 0,092 0,50

VAW 6G12-10

3,74 0,527 0,19

VAW 7C10-11

17,10 0,853 0,28

VAW 8A10-14

1,41 0,648 0,08

VAW 8G1-12

6,09 8,300 8,60

Anticuerpo

KD de DII4 (nM) KD de DII4-Fc (nM) CI50 de DII4-Fc (nM)

VAW 9B11-2

62,20 0,048 0,00

VAW 9F12-6

16,00 1,350 0,02

VAW 9G10-1

56,10 0,555 0,10

TABLA 2

Anticuerpo

KD de DII4 (nM) KD de DII4-Fc (nM)

314266-06F12-B7

2,17 0,075

318518-01A04-D5

0,237 0,244

318518-01A10-D8

0,399 0,018

318518-01B09-C3

0,833 0,180

318518-01B11-D4

0,382 0,088

318518-01E07-H2

0,165 0,238

318518-01G04-F3

0,501 0,107

318518-01G05-B5

1,06 0,196

318518-02A07-B3

0,208 0,148

318518-02B06-E2

2,15 0,193

318518-02B08-F7

N/A N/A

318518-02C04-D1

0,478 0,331

318518-02F05-D10

1,28 0,035

318518-02G03-F2

1,31 0,042

318518-02G04-B11

0,813 0,048

318518-02G08-F11

N/A N/A

318518-03A03-B2

0,136 0,124

318518-03C10-F2

1,18 0,131

318518-03D04-B5

0,904 0,136

318518-03D07-G11

3,74 0,163

318518-03F04-A6

0,501 0,088

318518-03F06-A3

0,556 0,037

318518-03H03-F3

8,89 0,084

318518-14A06-E7

4,54 0,282

318518-14A07-C4

0,235 0,035

318518-14D08-G1

0,541 0,046

318518-14H08-A2

6,67 0,128

318518-1H08-E9

0,225 0,050

Ejemplo 3. Inhibición de DII4 e interacción de Notch

5 La capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de D114 a Notch se evaluó con un inmunoensayo basado en ELISA. Brevemente, la proteína recombinante Notch-hFc se recubrió sobre una placa de 96 pocillos en tampón PBS durante la noche a 4ºC a 1 mg/ml, y los sitios de unión no específica se bloquearon con BSA. Esta placa se usó para medir biotina-DII4-hFc libre de las disoluciones de muestras de valoración de anticuerpo. Para preparar las muestras

10 de valoración de anticuerpo, una cantidad constante de biotina-DII4-hFc a 25 pM se mezcló previamente con cantidades variadas de anticuerpo, tanto en medio de acondicionamiento de hibridomas brutos como en proteína de anticuerpo purificada, que oscila de 0 a -50 nM en diluciones seriadas, seguido de incubación de 2 h a temperatura ambiente para permitir la unión anticuerpo-antígeno para alcanzar el equilibrio. Entonces, las disoluciones de muestra equilibrada se transfirieron a las placas recubiertas con Notch-hFc para la medición de biotina-DII4-hFc libre. Después de 1 hora de unión, la placa se lavó y la biotina-DII4-hFc unida se detectó usando estreptavidina conjugada con HRP (estreptavidina Poly HRP, Pierce Endogen) y se reveló usando sustrato TMB (BD Pharmigen). Los datos se analizaron usando el software GraphPad Prism y los valores de CI50 se determinaron como la cantidad de anticuerpo requerida para lograr el 50% de reducción de biotina-DII4-hFc unida a Notch-Fc recubierta sobre la placa (Tabla 3)

TABLA 3

Anticuerpo

CI50 (nM)

VAV 2H4-19

0,01

VAW 3A7-2

0,017

VAW 9G10-1

0,019

VAW 10E4-9

0,032

VAW 8A10-11

0,04

VAW 9F12-6

0,059

VAW 3F12-8

0,066

VAW 1C6-1

0,086

VAW 1G2-4

0,11

VAW 6C6-2

0,119

VAV 7B9-4

0,123

VAW 1H2-2

0,154

VAW 2H3-2

0,168

VAW 6B8-12

0,255

VAW 6G12-10

0,257

VAW 7C10-11

0,273

VAV 4H10-9

0,599

VAW 10G11-2

0,931

VAW 3A9-5

3,8

VAW 8G1-12

10,7

VAW 9B11-2

0,069

15E10*

0,04

22G12

0,10

13B6

0,11

24C8

0,031

314266-06F12-B7

0,07

318518-01A04-D5

0,11

318518-01A10-D8

0,05

318518-01B09-C3

0,03

318518-01B11-D4

0,03

318518-01E07-H2

1,17

318518-01G04-F3

0,02

318518-01G05-B5

1,08

318518-02A07-B3

0,03

318518-02B06-E2

0,09

318518-02B08-F7

N/A

318518-02C04-D1

0,60

Anticuerpo

CI50 (nM)

318518-02F05-D10

0,16

318518-02G03-F2

0,07

318518-02G04-B11

1,09

318518-02G08-F11

N/A

318518-03A03-B2

0,57

318518-03C10-F2

0,12

318518-03D04-B5

0,04

318518-03D07-G11

0,45

318518-03F04-A6

0,01

318518-03F06-A3

0,02

318518-03H03-F3

0,17

318518-14A06-E7

0,04

318518-14A07-C4

0,02

318518-14D08-G1

0,14

318518-14H08-A2

0,25

318518-1H08-E9

0,03

La capacidad de anticuerpos anti-hDll4 purificados seleccionados para bloquear la unión de DII4 a Notch también se evaluó con el inmunoensayo basado en ELISA descrito anteriormente, modificado reemplazando 25 pM de biotinaDII4-hFc con 30 pM de biotina-DII4-hFc, y reduciendo la duración de la incubación de anticuerpo-antígeno de 2 h a 1

5 h. Por comodidad, el anticuerpo 318518-01A10-D8 se renombró “REGN281” (HCVR/LCVR de SEC ID Nº: 429/437 y hlgG1 de SEC ID Nº: 950). Los anticuerpos derivados probados incluyeron REGN421 (HCVR/LCVR de SEC ID Nº: 901/903, hlgG1 de SEC ID Nº: 950); y REGN422 (HCVR/LCVR de SEC ID Nº: 901/903, con hlgG4 modificada de SEC ID Nº: 952). Los resultados se muestran en la Tabla 4.

10 TABLA 4

Anticuerpo

CI50 (nM)

REGN281

0,042

REGN421

0,045

REGN422

0,039

La capacidad del anticuerpo para neutralizar la función celular mediada por DII4 también se probó in vitro usando DII4 que expresa células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). La inhibición de la expresión génica de hHes1 y EphB2 mediada por Notch en HUVEC con los anticuerpos derivados se monitorizó del siguiente modo: se 15 cultivaron HUVEC de bajo pase en medio MCDB-131 (Vec Technologies). Un día antes del análisis, las células HUVEC se sembraron a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en placas de 24 pocillos en 1 ml de volumen de medio total. El anticuerpo de prueba u otro inhibidor se añadió directamente a los pocillos de muestra individuales por triplicado seguido de cultivo de 5 horas a 37ºC. Al final del periodo de cultivo, el medio se eliminó y el ARN total se aisló usando QIAZOL™ y el kit de tejidos de lípido RNEASY™ (Qiagen). La cuantificación del nivel de ARNm se 20 realizó usando PCR y el ensayo de nucleasa fluorogénica en 5' (ensayo TAQMAN®, Applied Biosystems). Para cada muestra, el ADNc se sintetizó a partir de 1-2 mg de ARN total. El ADNc generado a partir de una cantidad equivalente de ARN de partida (normalmente 25 ng) se cargó por triplicado sobre placas de reacción óptica ABI PRISM™. Para cada muestra de ARN también se ejecutó un control de “no RT” en el que no se añadió transcriptasa inversa para permitir la resta de cualquier contribución de ADN genómico posible a la señal. Se añadió 2x Mastermix 25 (TAQMAN® 2x PCR Mastermix; ABI) a cada reacción para una concentración final de 1x. Adicionalmente, a cada reacción se añadieron la sonda TASMAN® y cebadores para el gen de interés. Cada cebador se usó a una concentración final de 900 nM y la sonda se añadió a una concentración final de 200 nM. Se usó ADN genómico humano como patrón. Los ensayos se realizaron bajo condiciones de TASMAN® convencionales en un instrumento ABI 7900HT. Los niveles de Hes1 y efrina B2 se midieron y se normalizaron a un gen de control endógeno 30 (ciclofilina) (Tabla 5). Sondas y cebadores: sonda Hes1 humana (SEC ID Nº: 387); oligonucleótidos: hHes1-869F (SEC ID Nº: 388); hHes1-940R (SEC ID Nº: 389), sonda efrina B2 humana: hEphB2-773T (SEC ID Nº: 390); oligonucleótidos: hEphB2-752F (SEC ID Nº: 391), hEphB2-812R (SEC ID Nº: 392); ciclofilina humana: sonda: hCiclofilina-343T (SEC ID Nº: 393); oligonucleótidos: hCiclofilina-323F (SEC ID Nº: 394); hCiclofilina-389R (SEC ID

Nº: 395).

TABLA 5

Anticuerpo

CI50 de expresión de efrina B2 (nM) CI50 de expresión de Hes1 (nM)

22G12

0,379 0,381

15E10

2,56 4,49

VAW 3A7-2

0,409 0,533

314266-06F12-B7

0,239 0,405

318518-01A10-D8

0,305 0,329

318518-01G04-F3

0,088 0,172

318518-01H08-E9

0,413 0,548

318518-02A07-B3

0,398 0,128

318518-03F04-A6

0,158 0,115

318518-03F06-A3

0,304 0,692

318518-014A07-C4

0,175 0,312

318518-014 D08-G1

0,510 0,568

hDII4-hFc

0,843 0,974

5 Ensayo de proliferación de HUVEC. La capacidad del anticuerpo para bloquear la inhibición mediada por DII4 del crecimiento de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se probó en un ensayo de proliferación celular in vitro. Se obtuvieron células HUVEC de bajo pase y se cultivaron en medio MCDB-131 (Vec Technologies). Un día antes del análisis, placas de cultivo de tejido de 12 pocillos se recubrieron con hDII4-hFc en PBS a 4ºC durante la noche (0,2 µg/ml; 0,5 ml de PBS/pocillo). Las placas se lavaron 1x con PBS y se sembraron células

10 HUVEC a una densidad de 4x103 células/pocillo en 1,0 ml de volumen de medio total. Inmediatamente tras la adición de las células, los anticuerpos anti-hDII4 se añadieron en 0,5 ml de volumen total durante un intervalo de concentraciones para generar una curva de inhibición. Las células se cultivaron durante 96 horas a 37ºC. El número de células se cuantificó usando el reactivo CCK-8 (Dojindo). Todos los ensayos se ejecutaron por triplicado (Tabla 6, SB, sin bloqueo).

TABLA 6

Anticuerpo

CI50 (nM)

15E10

0,284

VAW9B11-2

1,868

VAW8D8-12

NB

13B6

5,01

VAW2H4-19

SB

VAW3A7-2

0,198

VAW8A10-14

0,214

22G12

0,888

318518-06F12-B7

2,067

318518-01A10-D8

0,096

318518-01G04-F3

0,106

318518-01H08-E9

0,188

318518-02A07-B3

0,200

318518-03F04-A6

0,184

318518-03F06-A3

0,188

318518-014A07-C4

0,159

318518-014D08-G1

0,165

Ensayo de luciferasa inducible por Notch. Se desarrolló un bioensayo para determinar la capacidad de anticuerpos purificados seleccionados para neutralizar la función celular mediada por DII4 in vitro usando una línea celular HEK293 manipulada (ATCC) que expresa constitutivamente Notch 1 humano y contiene una luciferasa de acción promotora sensible a Notch. La inhibición de la actividad de luciferasa inducible por Notch se determinó del siguiente

5 modo: 1 día antes del ensayo, cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos opaca se recubrió con 100 µl de hDII4-hFc tanto 1 nM como 1,5 nM en PBS durante la noche a 4ºC. Las células se sembraron sobre las placas recubiertas a 2 x104 células/pocillo en medio. La proteína de anticuerpo purificada, en diluciones seriadas empezando en 2 nM en medio de células, se incubó con las células a 37ºC durante 24 h. La actividad de luciferasa se determinó añadiendo un volumen de pocillo igual de sustrato STEADY-GLO® (Promega) (Tabla 7).

TABLA 7

Anticuerpo

CI50 (pM)

hDII4-hFc 1 nM

hDII4-hFc 1,5 nM

REGN281

50,5 78,7

REGN421

54,4 87,3

REGN422

88,2 131,1

Ejemplo 4. Inhibición de la escisión de Notch1

15 La capacidad de los anticuerpos anti-hDII4 seleccionados para inhibir la escisión de Notch1 se probó por examen de proteína Notch1 escindida total por SDS-PAGE/transferencia Western. Se cultivaron células HUVEC de pase bajo como se ha descrito anteriormente. Un día antes del análisis, placas de 6 pocillos se recubrieron con hDII4-hFc en PBS a 4ºC durante la noche (0,2 µg/ml; 1,0 ml de PBS/pocillo). Las placas se lavaron 1x con PBS y las células HUVEC se sembraron a 7,5 x 105 células/pocillo en 2,0 ml de volumen de medio total. Inmediatamente tras la

20 siembra de las células, el anticuerpo anti-hDII4 se añadió a cada pocillo a concentración final 10 nM. Las células se cultivaron durante 24 horas a 37ºC, tras lo cual se prepararon extractos de células completas y se analizaron por SDS-PAGE. Los niveles de Notch1 escindido se determinaron usando un anticuerpo anti-Notch1 escindido (Va11744) (Cell Signaling) y técnicas de transferencia Western convencionales. Los anticuerpos anti-hDII4 pudieron bloquear enteramente la escisión de Notch1 inducida por placa recubierta con hDII4-hFc (datos no mostrados).

Ejemplo 5. Ensayos de ADCC y CDC

La citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) inducida por los dos anticuerpos de prueba (REGN421, REGN422) se evaluó usando un panel de ocho líneas celulares diana con niveles de expresión de hDll4 30 variables. Las ocho líneas celulares diana fueron (1) HUVEC; (2) HUVEC estimuladas con VEGF 10 nM durante 24 horas; (3) Colo205; (4) células de glioma de rata C6 manipuladas que expresan eGFP; (5) células de glioma de rata C6 manipuladas que expresan hDll4; (6) células HT1080 manipuladas que expresan eGFP; (7) células HT1080 manipuladas que expresan hDll4; y (8) HT29. DII4 o eGFP humano se integraron en la célula C6 o genoma de HT1080 mediante transfección retrovírica. Brevemente, células de cada línea celular diana (10.000 células/pocillo en 35 50 µl) se mezclaron primero con un volumen igual de REGN421 o REGN422 seriadamente diluido, produciendo una concentración de anticuerpo final que oscila de 0,169 pM a 10 nM, y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente en un formato de placa de 96 pocillos (control = pocillos sin anticuerpo). Por separado, células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC, células efectoras) se prepararon siguiendo un procedimiento de enriquecimiento por centrifugación en gradiente Ficoll-Hypaque convencional. Aproximadamente 300.000 PBMC 40 se añadieron a cada mezcla de anticuerpo y células diana para dar una relación final de células efectoras con respecto a diana de aproximadamente 30:1. Entonces, las placas de 96 pocillos se incubaron durante 4 h a 37ºC, 5% de CO2 seguido de centrifugación a 250 x g. Los sobrenadantes se recogieron y se ensayaron para actividad de lactato-deshidrogenasa (LDH) usando el sistema de ensayo de citotoxicidad no radiactivo CYTOTOX 96® (Promega). Los resultados se muestran en la Tabla 8. La lisis de células dependiente de dosis inducida por REGN421 sólo se

45 observó en células C6 que expresan hDll4 (col. 5), que presentaron la mayor expresión de hDll4 entre todas las líneas celulares (como se determina por inmunoprecipitación/transferencia Western y citometría de flujo). La máxima citotoxicidad de células en la línea celular C6-hDll4 osciló del 20% al 60%. No se observó lisis de células inducida por REGN421 en las siete líneas celulares diana restantes. REGN422 no indujo lisis de células en ninguna de las líneas celulares diana.

TABLA 8

Ab

% de citotoxicidad máxima

1

2 3 4 5 6 7 8

REGN421

0 0 0 0 20-60 0 0 0

REGN422

0 0 0 0 0 0 0 0

La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) inducida por REGN421 se evaluó usando el mismo panel de líneas celulares descrito anteriormente. Brevemente, células de cada una de las líneas celulares diana (50.000 células/pocillo en 50 µl) se mezclaron primero con un volumen igual de REGN421seriadamente diluido, produciendo una concentración de anticuerpo final que oscilaba de 0,169 pM a 10 nM, y se incubó durante 10 min a temperatura 5 ambiente en un formato de placa de 96 pocillos. A cada pocillo se añadió suero humano normal, con componentes de complemento (Quidel Corp., San Diego, CA) para dar una concentración de suero final del 5%. Entonces, las placas se incubaron a 37ºC, 5% de CO2 durante 2 horas, seguido de adición de reactivo CELLTITER-BLUE® (Promega) (controles = pocillos sin anticuerpo y pocillos con anticuerpo pero no suero). Las placas se incubaron durante la noche y se ensayó la supervivencia de células (niveles de CDC). Como control positivo, células Daudi se

10 trataron con rituximab. REGN421 no presentó CDC hacia ninguna de las líneas celulares diana probadas (datos no mostrados).

Ejemplo 6. Mapeo de epítopes y especificidad

15 Con el fin de determinar la especificidad de unión de los epítopes se generó una serie de siete proteínas D114 quiméricas en las que los dominios D114 humanos específicos se sustituyeron en una proteína D114 de ratón del siguiente modo: nº 1 contuvo dominios del extremo N humano y DSL (S27-Q218); nº 2 contuvo dominios del extremo N humano, DSL y EGF-1 (S27-N252); nº 3 contuvo dominios del extremo N humano, DSL, EGF-1 y EGF-2 (S27-Q283); nº 4 contuvo el extremo N humano, DSL, EGF-1, EGF-2, EGF-3, EGF-4 y EGF-5; nº 5 contuvo el dominio del

20 extremo N humano (S27-R172); nº 6 contuvo el dominio DSL humano (V173-Q218); y nº 7 contuvo el dominio EGF2 humano (E252-D282). Las proteínas quiméricas se fusionaron con un fragmento IgG2a-Fc de ratón y se expresaron en célula CHO-K1. Se recogieron los medios acondicionados y la expresión de proteínas se confirmó por transferencia Western.

25 La especificidad de unión de anticuerpos de prueba para hDII4, mDII4, y las proteínas quiméricas nº 1, nº 2, nº 3 y nº 4, se probaron del siguiente modo: anticuerpos 22G12, VAW3A7-2 y 15E10 purificados se acoplaron a amina entre 5000-6000 UR sobre el chip CM5. Los medios acondicionados de células CHO K1 que contienen las proteínas DII4 quiméricas, hDII4-mFc, y mDII4-mFc se inyectaron secuencialmente, seguido de regeneración superficial sobre superficies acopladas a anticuerpo. Se usó una superficie de celda de flujo acoplada a amina de blanco como control

30 para la unión no específica de los medios acondicionados. Los resultados se resumen en la Tabla 9. 22G12 se unió a un epítope entre S27-Q218 de hDll4; VAW3A7-2 se unió a un epítope entre Q283-E400 hDll4; y 15E10 se unió a un epítope entre E252-D282 de hDII4.

TABLA 9

Anticuerpo

hDII4-mFc mDII4-mFc Proteínas quiméricas

Nº 1

Nº 2 Nº 3 Nº 4

22G12

+ - + + + +

VAW3A7-2

+ - - - - +

15E10

+ - - - + +

35 Se determinó la especificidad de unión de mAb de prueba purificados por hDII4, mDII4 y las proteínas quiméricas (descritas anteriormente) (REGN279 = 314266-6F12-B7; REGN287= 318518-1 G04-F3; REGN289= 318518-1H08-E9; REGN290=318518-2A07-B3; REGN306= 318518-3F06-A3). Brevemente, cada proteína DII4 se capturó (70-130 UR) sobre superficies de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón, seguido de inyección de mAb de prueba a

40 una concentración de 100 µg/ml. Un anticuerpo que se unió a mDII4-mFc se usó como control positivo (control positivo= 6C10). Los resultados (Tabla 10) muestran que REGN279 se unió a un epítope entre S27-Q218 de hDII4; REGN287 se unió entre Q283-E400 de hDII4; REGN289, REGN290 y REGN306 se unieron entre S27-E400 de hDII4.

45 TABLA 10

Anticuerpo

hDII4-mFc mDII4-mFc Proteínas de fusión quiméricas de DII4 humano-de ratón

nº 1

nº 2 nº 3 nº 4 nº 5 nº 6 nº 7

REGN279

+ - + + + + + - -

REGN287

+ - - - - + - - -

REGN289

+ - + + + + - + -

REGN290

+ - + + + + - + -

REGN306

+ - + + + + - + -

Control

+ + + + + + + + +

Se realizaron otras determinaciones de especificidad de unión por epítope como se ha descrito anteriormente con los siguientes anticuerpos de prueba purificados: REGN281=318518-1A10-D8; REGN305=318518-3F04-A6; REGN309=318518-14A07-C4; REGN310=318518-14D08-G1; REGN421 y REGN422. Brevemente, cada una de las proteínas DII4 se capturó (240-470 UR) sobre superficies de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón, seguido de inyección del anticuerpo de prueba a una concentración de 100 µg/ml (Tabla 11).

TABLA 11

Anticuerpo

hDII4-mFc mDII4-mFc Proteínas de fusión quiméricas de DII4 humano-de ratón

nº 1

nº 2 nº 3 nº 4 nº 5 nº 6 nº 7

REGN281

+ - + + + + + + -

REGN305

+ - - - - + - - -

REGN309

+ - + + + - + + -

REGN310

+ - - - + + - + +

REGN421

+ - + + + + + + -

REGN422

+ - + + + + + + -

Análisis de transferencia Western. La especificidad de unión de anticuerpos seleccionados por DII4 quimérico, de

10 ratón y humano se determinó por transferencia Western. Brevemente, hDII4-mFc (200 ng por carril), mDII4-mFc (200 ng por carril) y proteínas quiméricas nº 1 -nº 7 (aproximado 150 ng por carril) se sometieron a electroforesis sobre geles de SDS-PAGE duplicados usando tampón no reductor de muestra. Entonces, cada gel se transfirió a una membrana PVDF. Las transferencias se expusieron primero a REGN421 a 0,2 µg/ml y luego a anticuerpo dirigido contra hIgG conjugada con HRP (Pierce). Las transferencias de control se expusieron a anticuerpo anti-mFc

15 conjugado con HRP (Pierce). Resultados: REGN421 reconoció hDII4-mFc y proteínas quiméricas que contienen el dominio del extremo N humano (nº 5), un dominio DSL humano (nº 6), o ambos (nº 1, nº 2, nº 3 y nº 4). REGN421 no reconoció una proteína quimérica que contenía un dominio de EGF-2 humano (nº 7).

Análisis de la digestión con proteasa. La unión entre REGN281 y hDll4 se evaluó adicionalmente por digestión con

20 proteasa protectora y cromatografía líquida/espectrometría de masas (EM/CL) usando un HPLC1100 (Agilent) y espectrómetro de masas de trampa iónica clásico LCQ (Thermo). Brevemente, una mezcla de hDII4 y REGN281, en una relación molar de 1:5, o hDII4 solo, se incubó con proteasa durante la noche a tanto 25ºC (para la proteasa GluC) como 37ºC (para tripsina). Entonces, cada una de las mezclas de digestión proteolíticas resultantes se sometió a EM/CL. Los picos de péptidos únicos presentes en digestos proteolíticos realizados en ausencia de

25 REGN281, que tanto disminuyeron como desaparecieron en digestos proteolíticos realizados en presencia de REGN281, indican posibles sitios de unión de REGN281 sobre hDII4 que se protegieron de la digestión con proteasa por la unión de REGN281 a hDII4. Estos picos de péptidos únicos se analizaron por espectrometría de masas. La masa observada, masa predicha y las secuencias del extremo N de los péptidos se muestran en la Tabla

12. 30

TABLA 12

Pico

Masa observada Masa predicha Péptido hDII4 (SEC ID Nº: 2) Proteasa Dominio

G1

521 521,5 Phe37-Glu40 GluC Extremo N

G2

1362,8 1363,4 Ala121-Glu132 Gluc Extremo N

T1

758 760,8 Pro49-Arg55 Tripsina Extremo N

T2

587,1 587,2 Tyr169-Arg172 Tripsina Extremo N

T3

1607,4 1607,6 Va1173-Arg186 Tripsina DSL

T4

1399 1400,7 Gly42-Arg55 Tripsina Extremo N

T5

569,2 569,3 Thr56-Arg59 Tripsina Extremo N

T7

2615 2613,4 Ile143-Arg166 Tripsina Extremo N

T8

1807,2 1806,9 Ser27-Arg41 Tripsina Extremo N

Ejemplo 7. Afinidad de unión de anticuerpos purificados por DII4 humano y de mono.

35 Las afinidades de unión de anticuerpos purificados seleccionados por monómeros de hDII4, DII4 de M. facscicularis (mfDll4, SEC ID nº: 956) y DII4 de M. mulatta (mmDII4, SEC ID Nº: 957) se determinaron usando BIACORE™ 2000 & 3000. Se usó reactivo de anticuerpo policlonal de cabra anti-hFc inmovilizado sobre un chip BIACORE™ para presentar REGN281, REGN421 y REGN422. Se usaron concentraciones variables de cada proteína, hDII4 (de 12,5 nM a 100 nM), mfDII4 (de 3,13 nM a 100 nM) o mmDII4 (de 12,5 nM a 100 nM) como analito, y se inyectaron sobre las superficies del anticuerpo. La unión antígeno-anticuerpo y la disociación del complejo unido se monitorizaron en tiempo real (Tabla 13).

TABLA 13

ka (M-1s-1)

kd (s-1) KD (nM)

hDII4

mfDII4 mmDII4 hDII4 mfDII4 mmDII4 hDII4 mfDII4 mmDII4

REGN281

1,56 x 105 6,64 x104 9,27 x 104 2,30 x 10-5 2,04 x 10-5 3,05 x 10-5 0,148 0,307 0,329

REGN421

1,63 x 105 7,28 x 104 9,70x 104 2,17 x 10-5 2,02 x 10-5 3,23 x -10-5 0,133 0,278 0,333

REGN422

1,64 x 105 8,01 x 104 9,27 x 104 2,36 x 10-5 2,88 x 10-5 3,41 x 10-5 0,144 0,360 0,375

Las afinidades de unión de anticuerpos anti-hDII4 hacia dímeros de hDll4 y mmDll4 también se determinaron usando BIACORE™ 2000 y el procedimiento descrito anteriormente, excepto que hDll4 se sustituyó con hDI14-mFc (de 3,13 nM a 100 nM), o mmDII4 con mmDII4-mFc (de 0,78 nM a 25 nM) como analito (Tabla 14).

TABLA 14

ka (M-1 s-1)

kd (s-1) KD (nM)

hDII4-mFc

mmDII4-mFc hDII4-mFc mmDII4-mFc hDII4-mFc mmDII4-mFc

REGN281

3,02 x 105 3,16 x 105 4,96 x 10-6 4,64 x 10-6 0,0163 0,0147

REGN421

3,43 x 105 3,35 x 105 4,70 x 10-6 3,80 x 10-6 0,0137 0,013

REGN422

3,46 x 105 4,23 x 106 4,60 x 10-6 4,15 x 10-6 0,0133 0,0098

Ejemplo 8. Reactividad cruzada de anticuerpos con hDII1, hDII3, mDI14 o mfDII4

15 Se determinó la reactividad cruzada de los anticuerpos para proteínas de ligando 1 similar a delta humano (SEC ID Nº: 953) y ligando 3 similar a delta humano (SEC ID Nº: 954). REGN281, REGN421 y REGN422 se presentaron por un reactivo de anticuerpo policlonal de cabra anti-kappa humana (hK) (Southern Biotech) inmovilizado sobre un chip BIACORE™, y tanto la proteína hDII4-hFc como hDII1-hFc a 100 µg/ml se usaron como analito inyectado sobre las superficies del anticuerpo. Los tres anticuerpos anti-hDll4 sólo se unieron a hDII4-hFc, y no se unieron a hDII1-hFc.

20 Se usó un formato de BIACORE™ alternativo para evaluar la reactividad cruzada entre el anticuerpo anti-hDII4 y tanto hDII1-hFc como hDII3-hFc. Brevemente, los ligandos de hDII4-hFc, hDII1-hFc y hDII3-hFc se ligaron cada uno covalentemente a un chip CM-5, mediante acoplamiento de amina, a un intervalo de UR de aproximadamente 8.000 a 10.000. REGN421, a 300 µg/ml; se inyectó sobre la superficie de cada chip. REGN421 sólo se unió a hDII4-hFc;

25 no se observó unión a tanto hDII1-hFc como a hDII3-hFc. El mismo resultado se observó para REGN422 en lugar de REGN421.

Los ensayos de unión basados en OCTET™ se emplearon para determinar la unión entre anticuerpos anti-hDll4 purificados seleccionados y hDI1I4-hFc, hDII3-hFc, hDII1-hFc, mfDII4-mmh o mDII4-mFc. Brevemente, biosensores

30 FA de alta unión a estreptavidina (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA) se incubaron primero con biotina-anti-hK a 5 µg/ml durante 10 min a 30ºC para lograr la saturación. Entonces, los biosensores unidos a biotina-anti-hK-se incubaron con anticuerpos REGN281, REGN421 o REGN422, a 20 µg/ml durante 10 min a 30ºC, para lograr la saturación. Entonces, los biosensores unidos a anticuerpo se incubaron con tanto hDII4-hFc hDII3-hFc, hDII1-hFc como con mDII4-mFc, a 200 nM, o mfDll4-mmh a 100 nM, durante 10 min a 30ºC. Se midieron los cambios en el espesor de la

35 capa biológica después de cada incubación. DII4 humano-hFc y mfDII4-mmh se unió a biosensores unidos a anticuerpo anti-hDII4, mientras que hDII3-hFc, hDII1-hFc y mDII4-mFc no se unieron a biosensores unidos a anticuerpo anti-hDll4.

Ejemplo 9. Efecto del anticuerpo anti-hDII4 sobre el crecimiento tumoral

40 El efecto de REGN421 sobre el crecimiento tumoral se evaluó sobre tumores implantados en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) que expresan una proteína DII4 humanizada (SCIDxhDII4). Brevemente, el ratón con DII4 humanizado se produjo reemplazando el dominio extracelular completo del gen DII4 de ratón con la región extracelular correspondiente del gen DII4 humano (7kb) en citoblastos embrionarios (ES). Ratones con hDII4

45 homocigóticos se generaron y se reprodujeron en población de referencia de SCID. Entonces, a cada ratón se le implantó subcutáneamente (SC) 2,5 x 106 células tumorales HT1080 humanas. Después de establecerse los tumores en los ratones (~ 100-150 mm3, 18 días después de la implantación), los ratones se midieron y se trataron con hFc, hDII4-Fc o REGN421. Un total de 7 ratones se dividieron en tres grupos. El primer grupo (n=3) se trató subcutáneamente con hFc a 25 mg/kg; el segundo grupo (n=1) se trató con hDll4-Fc a 25 mg/kg; y el tercer grupo

50 (n=3) se trató con REGN421 a 10 mg/kg. Los tratamientos se repitieron cada 48 horas empezando en el día 18. Las mediciones de tumores in vivo se obtuvieron tres días antes del tratamiento inicial (día 15), en el mismo día de cada tratamiento (días 18, 20 y 22) y en el día 25. El tamaño del tumor se calculó usando la fórmula I x w2/2. Los resultados se muestran en la Tabla 15. En el día 25, los ratones se sacrificaron y cada tumor se extirpó y se midió ex vivo y se calculó (longitud x ancho x profundidad) (Tabla 16).

Además, un grupo de ratones con SCID que expresa mDII4 endógeno (n=2) se implantó con células tumorales y se trató con hDII4-Fc (25 mg/kg) siguiendo el mismo programa de dosificación.

TABLA 15

Ratón

Tratamiento Tamaño del tumor (mm3)

Día 15

Día 18 Día 20 Día 22 Día 25

SCID

hDII4-hFc 162,0 232,8 320,0 336,0 253,1

SCID

hDII4-hFc 22,5 117,0 117,0 108,0 68,8

SCIDxhDI14

hDII4-h Fc 288,0 320,0 352,0 446,0 320,0

SCIDxhDII4

hFc 162,0 288,0 320,0 500,0 550,0

SCIDxhDII4

hFc 162,0 220,5 352,0 662:0 661,5

SCIDxhDII4

hFc 93,8 135,0 179,6 352,0 726,0

SCIDxhDII4

REGN421 144,0 245,0 320,0 162,0 144,0

SCIDxhDII4

REGN421 87,5 162,0 153,0 225,0 135,0

SCIDxhDII4

REGN421 144,0 196,0 272,0 162,0 152,5

TABLA 16

Ratón

Tratamiento Tamaño del tumor (mm3)

SCID

hDII4-hFc 308,0

SCID

hDII4-hFc 105,0

SCIDxhDII4

hDII4-hFc 480,0

SCIDxhDII4

hFc 924,0

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SCIDxhDII4

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SCIDxhDII4

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SCIDxhDII4

REGN421 189,0

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> Anticuerpos humanos para ligando 4 similar a delta humano

<130> 6040A-WO

<140> Para asignar

<141>

<150> 60/874.922

<151>

<150> 60/916.415

<151>

<150> 60/985.323

<151>

<160> 957

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

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21

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<210> 115

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 115

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintético 10

<400> 116

<210> 123

<211> 325

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<220>

<223> Sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 124

<400> 128

<210> 131

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

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15

<210> 117 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

20

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25 30

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35

<400> 118

40

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15

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25

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36

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35

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10

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15

<220> <223> Sintético

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21

20

<210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

25

<220> <223> Sintético

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30

35

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40

<400> 127 ggtgcatcc 9

45

<210> 128 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial

50

<220> <223> Sintético

5

<210> 129 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

10

<220> <223> Sintético

15 20

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25

<400> 130

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358 30 <212> ADN

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Sintético

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 136

<210>

137

<210>

139

<211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Sintético

10 15

<400> 137 gcgaggtata gctggaactt tcactggttc gacccc <210> 138 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético 36

20

<400> 138

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<220>

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<400> 139

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<213> Secuencia artificial

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24

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5

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20

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27

10

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20

25

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27

10

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22

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18

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<220>

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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15

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ADN

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ADN

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404 45 <211> 336

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20

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<223> Sintético

<400> 446 ggtggctcca tcagcagtgg taattactac 30

<210> 447

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 447

<210> 448

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 448 atcaagaaca gtggaagcgc c 21

<210> 449

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 449 25 <210> 452

5

<210> 450 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintético

10

<400> 450 gcgagagatg aaaatatagc agttcgtcat gcttttgata tc 42

15

<210> 451 <211> 14 <212> PRT <213> Secuencia artificial

20

<220> <223> Sintético <400> 451

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintético

<400> 452

<210> 453

<211> 108

<212> PRT 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

45 <400> 453 <210> 454

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 455

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 457

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Sintético

<400> 459 10

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintético

<400> 461

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<211> 30

<212>

ADN 40 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 463

<210> 464

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 464 atcaaataca ctgggggcat c 21

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 465

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 467

<210> 468

<211> 324

<212>

ADN 5 <213> Secuencia artificial

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15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

20

<400> 460

<220>

<223> Sintético

10 <400> 468

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintético

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25 30

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35

<400> 470 cagagtgtta gcagtaacta c 21

40

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<220> <223> Sintético

45

<400> 471

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<220>

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<220>

<223> Sintético

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<211> 27

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 475

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<211> 357

<212> ADN

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<220>

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<213> Secuencia artificial

<220>

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15

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20

<220> <223> Sintético

25 30

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35

<400> 479

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<212> ADN

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<220> <223> Sintético

5

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15

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35 <220>

<223> Sintético

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<220>

<223> Sintético

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<220>

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10

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15

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30 35

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50

<400> 489

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<220>

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<400> 495

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<212> ADN

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<220>

<223> Sintético

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<223> Sintético

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15

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20

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30 <220>

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<210> 501

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<220>

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<220>

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15

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30 <220>

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<400> 516

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<210>

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20

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<220>

<223> Sintético

<400> 526 gatggctcca tcaacagtgt tgaatcctac 30

<210> 527

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<220>

<223> Sintético

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<220>

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530

<210>

532

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20

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<400> 532

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<210>

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20

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15

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15

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<400> 572

35

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40

<220>

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<220>

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<400> 575

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<220>

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30 <220>

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<220>

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<220>

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586

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588

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10 15

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20

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15

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35

<210> 605

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<212> ADN

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<220>

<223> Sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

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<220>

5 <223> Sintético

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15 <220>

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<211> 24

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<400> 653

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20

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<220>

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15

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25

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30

<220>

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35

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<220>

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 671

<210> 672

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 674 gcgagagcac ctggaagtca cacttttgat atc 33

<210> 675 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Sintético

<400> 675

25

<210> 676

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30

<220>

<223> Sintético

<400> 676

35

<210> 677

<211> 108 40 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintético 45

<400> 677

<210> 678

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 678 cagagtgtta gcaacaacta c 21

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 679

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<220>

<223> Sintético

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 681

<210>

682

<210>

684

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintético 30

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5

<220> <223> Sintético

10 15

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20

<400> 683

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360 25 <212> ADN

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<212> PRT

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40 <220>

<223> Sintético

<400> 685

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<220>

<223> Sintético

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<220>

<223> Sintético

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5

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10

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15

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20

<220> <223> Sintético <400> 691

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

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<400> 692

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<220>

<223> Sintético

45 <400> 693 <210> 694

<211> 21

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<213> Secuencia artificial

<220>

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<220>

<223> Sintético

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15

<210> 699 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintético

20

<400> 699

<210>

700 25 <211> 363

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintético

<400> 700

35

<210> 701

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

40

<220>

<223> Sintético

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<210> 702

<211> 24

<212> ADN

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<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> Sintético

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<210> 704

<211> 24

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<220>

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<211> 8

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<220>

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15

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20

<220> <223> Sintético

<400> 707

25

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<211> 318

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30

<220>

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35

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<213> Secuencia artificial

<220>

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<400> 709

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<220>

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<220>

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<220>

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

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<210>

714

<210>

716

<211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Sintético

10 15

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20

<400> 715

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<220>

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<400> 716

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<220>

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<220>

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<210> 721

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

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<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

10 <400> 722 gcgagagcac ctggaagtca taactttgac ate 33

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<211> 11 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 20

<400> 723

25 <210> 724

<211> 324

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<220>

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<220>

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<220>

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730

<210>

732

<211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial

5

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10 15

<400> 730 cagcaatata gtaggtcacc gatcacc <210> 731 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético 27

20

<400> 731

<211> 357 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 30

<400> 732

35 <210> 733

<211> 119

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<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Sintético

<400> 733

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<223> Sintético

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<220>

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33

15

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20

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<213> Secuencia artificial

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20

<400> 747

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24

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<213> Secuencia artificial

40

<220>

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<400> 765

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<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

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<210> 767

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

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10 15

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20

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<220>

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20

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<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Sintético

<400> 893

<210> 894

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 894

15 <210> 895

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintético

<400> 895

<210> 896

<211> 369

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Sintético

<400> 896

10

<210> 897

<211> 123 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 20

<400> 897

25 <210> 898

<211> 321

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Sintético

<400> 898

<210> 899

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 899

<210> 900

<211> 369

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

20 <400> 900

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintético

<400> 901

<210> 902

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 902

15

<210> 903

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20

<220>

<223> Sintético

<400> 903

25

<210> 904

<211> 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 904

10 <210> 905

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintético

<400> 905

<210> 906

<211> 324

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

30 <400> 906

<210> 907

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 907

10 <210> 908

<211> 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintético

<400> 908

<210> 909

<211> 121

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

30 <400> 909

<210> 910

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 910

15 <210> 911

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintético

<400> 911

<210> 912

<211> 363

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 912

10

<210> 913

<211> 121

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintético

<400> 913

20

<210> 914

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 30

<400> 914

<210> 915

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 915

10 <210> 916

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintético

<400> 916

<210> 917

<211> 119

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

30 <400> 917

<210> 918

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 918

15 <210> 919

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintético

<400> 919

<210> 920

<211> 360

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 920

10

<210> 921

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15

<220>

<223> Sintético

<400> 921

20

<210> 922

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 30

<400> 922

<210> 923

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 923

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Sintético

<400> 924

20

<210> 925

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25

<220>

<223> Sintético

<400> 925

30

<210> 926

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 926

15 <210> 927

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintético

<400> 927

<210> 928

<211> 8

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial <220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)... (8)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido o ausente

<400> 928

<210> 929

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)... (8)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido o ausente

<400> 929

<210> 930

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)...(16)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido o ausente

<400> 930

<210> 931

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> VARIANTE

<222> (1)...(7)

<223> Xaa = Cualquier aminoácido o ausente

<400> 931

5

<210> 932 <211> 3 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Sintético

15

<220> <221> VARIANTE <222> (1)...(3) <223> Xaa = Cualquier aminoácido o ausente

<400> 932

25

<210> 933 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintético

<220> <221> VARIANTE <222> (1)...(9) <223> Xaa = Cualquier aminoácido o ausente

35

<400> 933

<210> 934

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 934

<210> 935

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<223> Sintético

<400> 935

5

<210> 936

<211> 324

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> Sintético

<400> 936

15

<210> 937

<211> 108 20 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 25

<400> 937

<210> 938

<211> 360

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 938

<210> 939

<211> 120

<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

20 <400> 939

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Sintético

<400> 940

<210> 941

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 941

10 <210> 942

<211> 357

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Sintético

<400> 942

<210> 943

<211> 119

<212> PRT 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

30 <400> 943

<210> 944

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético 10

<400> 944

15 <210> 945

<211> 108

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Sintético

<400> 945

<210> 946

<211> 361

<212> ADN 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 945

5 <210> 947

<211> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> Sintético

<400> 947

<210> 948

<211> 325

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Sintético

25 <400> 948

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Sintético

<400> 949

<210> 950

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintético 10

<400> 950

<210> 951

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintético 10

<400> 951

<210> 952

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Sintético 10

<400> 952

<210> 953

<211> 544

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 953

<210> 954

<211> 490

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 954

<210> 955

<211> 527

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 955

<210> 956

<211> 498

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 956

<210> 957

<211> 498

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 957

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a ligando 4 similar a delta humano (hD114), comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo una región variable de la cadena pesada/región variable de la cadena ligera (HCVR/LCVR) seleccionada de los pares de secuencias de aminoácidos de SEC ID Nº: 429/437 y 901/903.

2. 2.

   Un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende además una región constante seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 950, 951 y 952.

3. 3.

   Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según la reivindicación 1 ó 2.

4. 4.

   Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. 5.

   Una célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 4.

6. 6.

   Una célula huésped según la reivindicación 5 que es una célula procariota o eucariota seleccionada de una de una célula de E. coli o CHO.

7. 7.

   Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-D114 humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende cultivar células huésped según la reivindicación 5 ó 6 en condiciones que permitan la producción del anticuerpo o fragmento del mismo y recuperar el anticuerpo o fragmento así producido.

8. 8.

   Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de un medicamento para tratar cáncer en un ser humano.

9. 9.

   Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2 para su uso en un procedimiento para tratar cáncer en un paciente humano.

10. 10.

    Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 1 ó 2 y un vehículo aceptable.