JP2024505195A - 抗ｐｄｇｆ－ｂ抗体及び肺動脈高血圧症（ｐａｈ）を治療するための使用方法 - Google Patents

抗ｐｄｇｆ－ｂ抗体及び肺動脈高血圧症（ｐａｈ）を治療するための使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、抗血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－Ｂ）抗体及びその抗原結合断片、並びに肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を有する対象を治療するためのかかる抗体又はその抗原結合断片の使用方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２１年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／１４１，０３０号に対する優先権を主張し、その全体の内容は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１月２０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、１１８００３－００７２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３３，６２４バイトのサイズである。
本発明は、血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－Ｂ）に特異的に結合するヒト抗体及びその抗原結合断片、並びにかかる抗体及び断片を使用する治療及び診断方法に関する。
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、４つの異なるアイソフォームサブユニット：Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤからなる５つの異なる二量体形態として存在する強力なマイトジェンである。ＰＤＧＦの５つの二量体形態は、ＡＡ、ＢＢ、ＡＢ、ＣＣ、及びＤＤであり、これらは、対応する個々のＰＤＧＦ単量体のジスルフィド結合によって形成される。ＰＤＧＦリガンドは、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）との相互作用を通じて生物学的効果を発揮する。ＰＤＧＦＲは、アルファ（ａ）受容体鎖（ＰＤＧＦＲ－アルファ）及び／又はベータ（β）受容体鎖（ＰＤＧＦ－Ｂ）のヘテロ二量体又はホモ二量体会合からなる単一パス、膜貫通、チロシンキナーゼ受容体である。したがって、活性ＰＤＧＦＲは、αα、ββ、又はαβ受容体鎖対からなり得る。ＰＤＧＦＲは、５つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ループ、膜貫通ドメイン、及びスプリット細胞内チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインを含む共通のドメイン構造を共有する。二量体ＰＤＧＦリガンドとＰＤＧＦＲとの間の相互作用は、受容体鎖二量体化、受容体自己リン酸化、及び細胞内シグナル伝達をもたらす。ββ受容体は、ＰＤＧＦ－ＢＢ及び－ＤＤによって活性化され、一方、αβ受容体は、ＰＤＧＦ－ＢＢ、－ＣＣ、－ＤＤ、及び－ＡＢによって活性化され、αα受容体は、ＰＤＧＦ－ＡＡ、－ＢＢ、－ＣＣ、及び－ＡＢによって活性化されることが、インビトロで実証されている（Ａｎｄｒａｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２２（１０）：１２７６－１３１２を参照のこと）。
ＰＤＧＦシグナル伝達は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む様々なヒト疾患に関与している。肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、大きな肺動脈と小さな肺動脈の両方に損傷を与える肺動脈圧の持続的な増加を特徴とする進行性障害である。ＰＡＨは、血行動態的には、３０ｍｍＨｇ超の収縮期肺動脈圧、又は肺毛細血管を有する２５ｍｍＨｇ超の平均肺動脈圧、又は１５ｍｍＨｇ以下の左心房圧の評価として定義される。例えば、Ｚａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３３：４２５－３１（２００５）を参照のこと。ＰＡＨにおける持続的な血管収縮は、肺血管平滑筋細胞及び内皮細胞が、収縮性正常表現型から合成表現型への表現型の切り替えを受けて、細胞増殖及びマトリックス沈着をもたらす構造的リモデリングをもたらす。最も細い血管の壁が厚くなると、血液と肺の間で酸素及び二酸化炭素を正常に運ぶことができなくなり、やがて肺高血圧症は、肺動脈の肥厚及び血液が流れる通路の狭窄をもたらす。最終的に、血管平滑筋及び内皮細胞の増殖は、肺血管系の内腔の閉塞を伴う血管のリモデリングをもたらす。肺高血圧症患者からの組織試料の組織学的検査は、特に直径１００μｍ未満の血管について、血管内膜肥厚、及び平滑筋細胞肥大を示す。これは、血液が減少した管腔面積を通って送り出されるため、肺圧の進行性上昇を引き起こす。結果として、心臓の右側は補償するためにより懸命に働き、増加した努力は、右心室を肥大及び肥厚させる。血液が心室及び脚にプールする傾向があるため、右心室が肥大すると、肺塞栓症のリスクがある。プールした血液中に血栓が形成された場合、最終的には移動して肺に留まり得る。最終的には、右心室に置かれた追加の作業負荷は、これらの患者の心臓の機能不全を引き起こし、早期死亡につながる。
ＰＡＨを有する対象の治療のための標準療法は、主に血行動態であり、血管緊張に影響を及ぼし、例えば、プロスタシクリン類似体、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、及び可溶性グアニル酸シクラーゼアクチベーター／刺激剤を含み、これらは、症候的緩和を提供し、予後を改善する。しかしながら、これらの療法は、不十分であり、ＰＡＨを有する患者にハンディキャップのない長期生存を提供するために、肺血管系の構造的及び機能的統合性を再確立するものではない。
ＰＡＨの治療の全ての進歩にもかかわらず、この致命的な疾患の治癒の見込みは依然としてなく、大多数の患者は、右心室不全に進行し続けている。したがって、ＰＤＧＦシグナル伝達の新たな、非常に特異的で強力な阻害剤が当該技術分野で必要である。
Ａｎｄｒａｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２２（１０）：１２７６－１３１２ Ｚａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３３：４２５－３１（２００５）
本開示は、血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－Ｂ）に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びその抗原結合断片を提供する。そのような抗体は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を有する対象を治療するのに有用であり得る。
肺平滑筋細胞及び線維芽細胞のための強力なマイトジェンであるＰＤＧＦ－Ｂの循環及び肺発現は、特発性ＰＡＨを示す患者及び低酸素／ｓｕｇｅｎ ＰＡＨマウスモデルの両方で増加する。ＰＤＧＦ－ＢとＰＤＧＦＲββ、ＰＤＧＦＲαβ、及びＰＤＧＦＲααとの相互作用は、病理学的血管形成及び肺血管リモデリングの促進に関与する。したがって、ＰＤＧＦ－Ｂを標的とすることは、異常な血管リモデリングを促進するために協調するＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲαβ、及びＰＤＧＦＲββを介したシグナル伝達を標的とすることによって、ＰＤＧＦＲβを超えた強化された有効性を提供し得る。
したがって、一態様では、本開示は、ヒト血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－Ｂ）に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１．８４ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で、３７℃でヒトＰＤＧＦ－サブユニットＢホモ二量体（ＰＤＧＦ－ＢＢ）に結合すること、（ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１．３６ｐＭ未満のＫＤで、３７℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、（ｃ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１１５５分以上のｔ１／２で、３７℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、（ｄ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２．７９ｐＭ未満のＫＤで、２５℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、（ｅ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１１５５分以上のｔ１／２で、２５℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、（ｆ）２５℃での競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定されたとき、約１．９ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢに対してＰＤＧＦ－Ｂ活性化を阻害すること、（ｇ）２５℃での競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定されたとき、約８．８ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＰＤＧＦ－サブユニットＡ及びサブユニットＢヘテロ二量体（ＰＤＧＦ－ＡＢ）に対してＰＤＧＦ－Ｂ活性化を阻害すること、並びに（ｈ）ヒトＰＤＧＦ－ＢＢと、ヒトＰＤＧＦＲ－αα、ＰＤＧＦＲ－αβ、及びＰＤＧＦＲ－ββのうちの１つ以上との間の相互作用を遮断すること、からなる群から選択される１つ以上の特性を示す。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２及び２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、配列番号１０及び３０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む。
いくつかの実施形態では、単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２又は配列番号２２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号１０又は配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）配列番号２及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０及び３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、（ａ）配列番号４及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１ドメイン、（ｂ）配列番号６及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２ドメイン、（ｃ）配列番号８及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３ドメイン、（ｄ）配列番号１２及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１ドメイン、（ｅ）配列番号１４及び３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２ドメイン、並びに／又は（ｆ）配列番号１６及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２／１０及び２２／３０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、（ｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、並びに／又は（ｉｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリンを含む。
いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、又はｄＡｂ断片である。
別の態様では、本開示は、配列番号２及び２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、配列番号１０及び３０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む、抗体又は抗原結合断片と同じヒトＰＤＧＦ－Ｂ上のエピトープに結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様では、本開示は、配列番号２及び２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、配列番号１０及び３０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む抗体又は抗原結合断片と、ヒトＰＤＧＦ－Ｂへの結合について競合する、単離された抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様では、本発明は、抗ＰＤＧＦ抗体又はその断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、及びかかるベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で、宿主細胞を培養することによって、及び産生された抗体を回収することによって、抗体を産生する方法と同様に本発明に含まれる。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片を作製するための方法を提供し、本方法は、（ｉ）当該抗体又は断片の軽免疫グロブリン鎖及び当該抗体又は断片の重免疫グロブリン鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で、成長培地中で宿主細胞を培養することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、宿主細胞及び／又は宿主細胞が成長している培地から抗体又は断片を単離することと、を含む。
別の態様では、本開示は、本方法によって産生される抗体又は抗原結合断片を提供し、（ｉ）当該抗体又は断片の軽免疫グロブリン鎖及び当該抗体又は断片の重免疫グロブリン鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で、成長培地中で宿主細胞を培養することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、宿主細胞及び／又は宿主細胞が成長している培地から抗体又は断片を単離することと、を含む。
いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、配列番号２及び２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、配列番号１０及び３０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片を含む注射デバイス又は容器を提供する。
別の態様では、本開示は、上記又は本明細書に開示されるヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、任意選択的に、１つ以上の追加の治療剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療剤は、鉄サプリメントを含む。
別の態様では、本開示は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の予防又は治療を必要とする患者において肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を予防又は治療するための方法であって、有効量の、本明細書に開示されるヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書に開示されるヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する単離されたヒト抗体若しくはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を、患者に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、皮下、静脈内、真皮内、経口、又は筋肉内に投与される。
いくつかの実施形態では、ＰＡＨは、対象の肺動脈の肥厚、対象の一回拍出量の減少、対象の右心室心拍出量の減少、及び対象の生存時間の減少からなる群から選択される状態を生じさせ、抗体又は抗原結合断片の投与が、状態を治療するか、又は状態のうちの１つ以上の症状の重症度を低減する。
別の態様では、本開示は、ＰＡＨを有する患者の治療に使用するための、本明細書に開示されるヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様では、本開示は、ＰＡＨの治療に使用するための、本明細書に開示されるヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する１つ以上の抗体又は抗原結合断片を含む、組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、ＰＡＨを有する患者を治療するための医薬の製造における、本明細書に開示されるヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する単離された抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、及び／又はＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢを中和し、細胞内のＰＤＧＦ駆動のカルシウムフラックスを防止することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢを中和し、細胞内のＰＤＧＦ駆動のカルシウムフラックスを防止することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＡＢを中和し、細胞内のＰＤＧＦ駆動のカルシウムフラックスを防止することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体、又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢを中和し、細胞内のＰＤＧＦ駆動のカルシウムフラックスを防止することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、及び／又はＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢを中和し、ＰＤＧＦ駆動の細胞増殖を防止することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢを中和し、ＰＤＧＦ駆動の細胞増殖を防止することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＡＢを中和し、ＰＤＧＦ駆動の細胞増殖を防止することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢを中和し、ＰＤＧＦ駆動の細胞増殖を防止することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肺動脈平滑筋細胞及び一次ヒト肺線維芽細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのβシート領域の外縁に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢの鎖間ループに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、βシート領域の外縁及びＰＤＧＦ－ＢＢの鎖間ループに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、Ｗ４０、Ｒ７３、Ｋ８０、Ｋ８１、Ｐ８２、Ｆ８４、Ｋ８６、及びＲ５６からなる群から選択されるＰＤＧＦ－ＢＢの１つ以上の残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＷ４０残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＲ７３残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＫ８０残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＫ８１残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＰ８２残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＦ８４残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＫ８６残基に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ－ＢＢのＲ５６残基に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＧＦ受容体を介して、リガンド依存的な方法で細胞に内在化される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肺動脈平滑筋細胞及び一次ヒト肺線維芽細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、それを必要とする対象における右心室収縮期圧を低減することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、それを必要とする対象における右心室肥大を低減することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、それを必要とする対象における右心室収縮期圧及び右心室肥大を低減することができる。
他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。
ＶＩ－３マウス由来のモノクローナル抗ＰＤＧＦ抗体のスクリーニング結果を示すグラフである。 ２５℃及び３７℃で１７の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の結合反応速度を決定するために実施した研究を示す概略図である。 精製された抗ＰＤＧＦ－ＢＢモノクローナル抗体間の交差競合研究を示す概略図である。 第１の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体（ｍＡｂ－１）をヒトＰＤＧＦ－ＢＢでコーティングされたセンサーチップに適用し、続いて第２の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体（ｍＡｂ－２）で処理した抗体交差競合アッセイの結果を示すマトリックスである。試験した各抗体の組み合わせについての結合反応が、示される。 ７０％超遮断する５つの強力な抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を同定し、３つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．２３～１．８ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢの両方を遮断し、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．５５～０．６４ｎＭのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢのみ遮断し、６つの中等度の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、４５％超遮断し、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、２．８～１３ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢの両方を遮断し、４つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．６４～２．８ｎＭのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢのみ遮断し、６つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が非ブロッカーであった。 ７０％超遮断する５つの強力な抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を同定し、３つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．２３～１．８ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢの両方を遮断し、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．５５～０．６４ｎＭのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢのみ遮断し、６つの中等度の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、４５％超遮断し、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、２．８～１３ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢの両方を遮断し、４つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．６４～２．８ｎＭのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢのみ遮断し、６つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が非ブロッカーであった。 可溶性ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢ並びにプレート捕捉ＰＤＧＦＲ－ベータを用いたブロッキングＥＬＩＳＡにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の特徴を要約する表である。 図５Ａは、１７個の抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちの１３個が、５００ｐＭのｈＰＤＧＦ ＢＢを、ＩＣ５０値が８８ｐＭ～７．２ｎＭで、最大阻害率が４２～９９％で阻害したことを示すグラフである。 更に、図５Ｂに示されるように、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体がヒトＰＤＧＦ－ＢＢで活性化されたことを示すグラフである。 図５Ｃは、１７個の抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちの８個が、５ｎＭのヒトＰＤＧＦ－ＡＢを、ＩＣ５０値が９９ｐＭ～５０ｎＭで、最大阻害率が３２～９９％で阻害したことを示すグラフである。Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐは、ＩＣ５０値が８．８及び２．６ｎＭでベースラインまで遮断された。 最後に、図５Ｄは、１７個の抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちの１０個が、６００ｐＭのマウスＰＤＧＦ－ＢＢを、ＩＣ５０値が４５０ｐＭ～６．４ｎＭで、最大阻害率が３９～９８％で阻害したことを示すグラフである。 検出可能な高次複合体が観察されない、最も異なる２：２のｍＡｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ種を形成する試料からのクロマトグラムを示すグラフである。 検出可能な高次複合体が観察されない、最も異なる２：２のｍＡｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ種を形成する試料からのクロマトグラムを示すグラフである。 検出可能な高次複合体が観察されない、最も異なる２：２のｍＡｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ種を形成する試料からのクロマトグラムを示すグラフである。 Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐが、ヒト及びカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢタンパク質の両方に対してＨ４Ｈ１３１３２Ｐよりも更に強力であることを示すグラフである。 商業的なサルＰＤＧＦ－ＢＢが、抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂ Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐへの特異的結合を示したことを示す表である。 抗体結合エピトープのウエスタンブロット分析Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐが、ヒトｒＰＤＧＦ－ＢＢの線形エピトープに結合することを確認したことを示す。 抗ＰＤＧＦ－Ｂが、抗ＰＤＧＦＲ－βと直接比較した場合に、ＰＡＨの２つの臨床的に関連するエンドポイント（右心室圧及び肥大）において優れた有効性を提供したことを示すグラフのパネルである。 このＰＡＨのラットモデルにおいて、抗ＰＤＧＦ－Ｂによる予防的処置が血行動態エンドポイント（ＲＶＳＰ）及び右心室肥大の両方を低減させたことを示すグラフのパネルである。 抗ＰＤＧＦ－Ｂが、ＰＡＨの重症ＭＣＴラットモデルにおける生存時間を堅牢に改善したことを示すグラフのパネルである。 １ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃの低用量における抗ＰＤＧＦ－Ｂが、ＰＡＨの臨床的に関連するエンドポイント（右心室圧）において有効性を提供したことを示すグラフのパネルである。 抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与後４２日目のＨｙ／Ｓｕマウスにおける循環ＰＤＧＦ－Ｂレベル及び抗ＰＤＧＦ－Ｂ濃度を示すグラフのパネルである。 抗ＰＤＧＦ－Ｒβ抗体（２Ｃ５、ＲＥＧＮ７６４）の全身送達が周皮細胞を効果的に枯渇させたが、抗ＰＤＧＦ－ＢＢ抗体が、３ｍｇ／ｋｇで網膜血管形成（ＲＶＤ）モデルにおいて、明らかな効果を有さなかったことを示す周皮細胞の画像のパネルである。 より高い用量（２５ｍｇ／ｋｇ）のＨ４Ｈ１３１４５Ｐが、ＲＶＤモデルにおいて、周皮細胞枯渇に対して中程度の効果を有することを示す周皮細胞の画像のパネルである。 ０．１、１、又は１０ｍｇ／ｋｇの３回の単回皮下用量でのＣ５７ＢＬ／６野生型マウスにおける抗ＰＤＦＧ－Ｂ抗体の薬物動態プロファイルを示すグラフ及び表のパネルである。 胃腸（ＧＩ）、肺、又は脳血管透過性における高用量の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を有する健常Ｃ５７ＢＬ成体マウスの慢性処置の影響を評価する研究設計を示す概略図である。 抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の投与が、動物の体重増加に著しく干渉しなかったことを示すグラフのパネルである。 健常マウスにおけるアイソタイプ対照ＩｇＧ、抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体を用いた処置後に、小腸における胃腸（ＧＩ）水分貯留／浮腫に有意な変化がなかったことを示すグラフである。 マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって小腸における血管透過性に有意な変化がなかったことを示すグラフ及び画像のパネルである。 健常マウス及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、胃内のＧＩ水分貯留／浮腫において有意な変化がなかったことを示すグラフである。 マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって胃内の血管透過性に有意な変化がなかったことを示すグラフ及び画像のパネルである。 健常マウス及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、肺内のＧＩ水分貯留／浮腫において有意な変化がなかったことを示すグラフである。 健常及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、肺内の血管透過性において有意な変化がなかったことを示すグラフ及び画像のパネルである。 健常マウス及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、脳内のＧＩ水分貯留／浮腫において有意な変化がなかったことを示すグラフである。 健常及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、脳内の血管透過性に有意な変化がなかったことを示すグラフ及び画像のパネルである。 抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体によるヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）におけるＰＤＧＦ誘導カルシウムフラックスの阻害を示すグラフのパネルである。 抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体によるヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）におけるＰＤＧＦ誘導細胞増殖の阻害を示すグラフのパネルである。 抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体－リガンド複合体で前処理された肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）における蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）受容体内在化アッセイを示すグラフのパネルである。 アイソタイプ対照処置ラットと比較して、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置が右心室収縮期圧を低下させることを実証した、心臓右心室圧のカテーテルによる評価のためのモノクロタリン処置ラットにおける研究を示すグラフである。 抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体による予防的処置が、アイソタイプ対照処置ラットと比較して右心室肥大を減少させたことを示すグラフである。 エンドセリン受容体アンタゴニストマシテンタンと抗ＰＤＧＦ－Ｂ処置との組み合わせが、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体による単剤療法と比較して更なる生存利益を示さなかったことを示すグラフである。
本発明の方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法、及び実験条件に限定されず、かかる方法及び条件は変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料の例が、これより記載される。本明細書に言及されている全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
定義
「ＰＤＧＦ－Ｂ」、「ＰＤＧＦＢ」、及び「血小板由来成長因子Ｂ」という用語は、同義的に、配列番号４１のアミノ酸配列を有するヒトＰＤＧＦ－Ｂタンパク質を指す（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ０１１２７も参照のこと）。本明細書におけるタンパク質、ポリペプチド、及びタンパク質断片への全ての言及は、非ヒト種（例えば、「マウスＰＤＧＦ－Ｂ」、「サルＰＤＧＦ－Ｂ」など）由来であると明確に特定されない限り、ヒトバージョンのそれぞれのタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質断片を指すことが意図されている。肺平滑筋細胞及び線維芽細胞のための強力なマイトジェンであるＰＤＧＦ－Ｂの循環及び肺発現は、特発性ＰＡＨを示す患者及び低酸素／ｓｕｇｅｎ ＰＡＨマウスモデルの両方で増加する。ＰＤＧＦ－ＢとＰＤＧＦＲββ、ＰＤＧＦＲαβ、及びＰＤＧＦＲααとの相互作用は、病理学的血管形成及び肺血管リモデリングの促進に関与する。機構的には、ＰＤＧＦ－Ｂを標的とすることは、異常な血管リモデリングを促進するために協調するＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲαβ、及びＰＤＧＦＲββを介したシグナル伝達を標的とすることによって、ＰＤＧＦＲβを超えた強化された有効性を提供し得る。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）又はその抗原結合断片を指すよう意図されている。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域へと更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ある特定の実施形態では、抗体（又はその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列配列と同一であり得るか、又は天然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
１つ以上のＣＤＲ残基の置換、又は１つ以上のＣＤＲの排除もまた、可能である。科学文献では、結合のために１つ又は２つのＣＤＲを取り除くことができる抗体が記載されている。Ｐａｄｌａｎら（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５，９：１３３－１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて、抗体とそれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約５分の１から３分の１のみが実際に抗原に接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つ又は２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を持たない多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照のこと）。
抗原に接触していないＣＤＲ残基は、分子モデリングにより及び／又は経験的に、先行研究に基づいて同定することができる。ＣＤＲ又はその残基が脱落している場合、それは通常、別のヒト抗体配列又はかかる配列のコンセンサス中で対応する位置を占有するアミノ酸で置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置及び置換するアミノ酸は、経験的に選択することもできる。経験的置換は、保存的置換又は非保存的置換であってよい。
本明細書に開示される完全ヒトＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体は、対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域において、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含み得る。かかる変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって、容易に確認され得る。本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体及びその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖細胞系列配列の対応する残基に変異するか、又は別のヒト生殖細胞系列配列の対応する残基に変異するか、又は対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（かかる配列変化は、本明細書で集合的に「生殖細胞系列変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖細胞系列変異又はそれらの組み合わせを含む多くの抗体及び抗原結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の全てが、変異して、抗体が由来した元の生殖細胞系列配列において見出される残基に戻る。他の実施形態では、ある特定の残基のみが変異して、元の生殖細胞系列配列に戻り、例えば、変異した残基のみが、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、若しくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見出されるか、又は変異した残基のみが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３内に見出される。他の実施形態では、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のうちの１つ以上が、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基に変異する。更に、本開示の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含んでもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基に変異するのに対し、元の生殖細胞系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、又は異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異する。一旦得られると、１つ以上の生殖細胞系列変異を含む抗体及び抗原結合断片は、改善された結合特異性、増大する結合親和性、改善又は強化されたアンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性（場合による）、低減した免疫原性などの１つ以上の所望の特性について、容易に試験され得る。この一般的な様式で得られた抗体及び抗原結合断片は、本開示に包含される。
本開示はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含む完全ヒト抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体も含む。例えば、本開示は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下又は４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を含む。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲにおける、具体的には、ＣＤＲ３における、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へとグラフト接合されたｍＡｂを含むことを意図するものではない。
「肺高血圧症」（「ＰＨ」）という用語は、任意の原因からの肺における高血圧を説明するために使用される用語である。一方、「高血圧症」又は「高血圧」という用語は、全身の動脈における高血圧を指す。
「肺動脈高血圧症」（「ＰＡＨ」）という用語は、肺動脈圧の持続的な上昇を特徴とする進行性肺疾患を指す。ＰＡＨを有する患者は、典型的には、２５ｍｍＨｇ以上の肺動脈圧を有し、１５ｍｍＨｇ以下の肺毛細血管又は左房圧を有する。これらの圧力は、典型的には、右心カテーテル法を使用して、安静時の対象において測定される。ＰＡＨは、未治療の場合、診断後２．８年以内に（平均して）死亡する。
世界保健機関（ＷＨＯ）は、ＰＡＨの５つの群の臨床的分類を提供する（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１３；６２（２５＿Ｓ）に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）：
１．肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）
１．１．特発性
１．２．遺伝性
１．２．１．ＢＭＰＲ２
１．２．２．ＡＬＫ１、ＥＮＧ、ＳＭＡＤ９、ＣＡＶ１、ＫＣＮＫ３
１．２．３．不明
１．３．薬物及び毒素誘発
１．４．以下に関連付けられている：
１．４．１．結合組織疾患
１．４．２．ＨＩＶ感染
１．４．３．門脈圧高進症
１．４．４．先天性心疾患
１．４．５．住血吸虫症
１’．肺静脈閉塞性疾患（ＰＶＯＤ）及び／又は肺毛細血管腫症（ＰＣＨ）
１’’．新生児持続性肺高血圧症（ＰＰＨＮ）
２．左心疾患による肺高血圧症
２．１．左心室の収縮機能不全
２．２．左心室の拡張機能不全
２．３．弁膜症
２．４．先天性／後天性左心流入／流出路閉塞及び先天性心筋症
３．肺疾患及び／又は低酸素症による肺高血圧症
３．１．慢性閉塞性肺疾患
３．２．間質性肺疾患
３．３．拘束性パターンと閉塞性パターンが混在するその他の肺疾患
３．４．睡眠呼吸障害
３．５．肺胞低換気障害
３．６．高地への慢性的な曝露
３．７．発育異常
４．慢性血栓塞栓性肺高血圧症（ＣＴＥＰＨ）
５．多因子性機序が不明な肺高血圧症
５．１．血液障害：慢性溶血性貧血、骨髄増殖性障害、脾臓摘出術
５．２．全身性疾患：サルコイドーシス、肺組織球増殖症、リンパ脈管筋腫症
５．３．代謝障害：グリコーゲン蓄積症、ゴーシェ病、甲状腺障害
５．４．その他：腫瘍閉塞、線維性縦隔炎、透析による慢性腎不全、区域性ＰＨ。
一実施形態では、本開示の方法から利益を享受し得る対象は、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨを有する対象である。
ベースライン時（例えば、診断されたとき）のＰＡＨは、例えば、ＰＡＨを有する患者における疾患重症度の尺度であるＷＨＯ機能クラスによって測定されるように、軽度、中等度、又は重度であり得る。ＷＨＯの機能分類は、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）システムの適応であり、例えば、疾患の進行及び治療への応答を監視する際に、活動耐性を定性的に評価するために日常的に使用される（Ｒｕｂｉｎ（２００４）Ｃｈｅｓｔ １２６：７－１０）。ＷＨＯシステムで認識される４つの機能クラスがある：
クラスＩ：身体活動に制限が生じない肺高血圧症；
通常の身体活動は、過度の呼吸困難又は疲労、胸痛又は目まいを引き起こさない；
クラスＩＩ：身体活動にわずかな制限をもたらす肺高血圧症；
患者が安静時に快適である；通常の身体活動が過度の呼吸困難又は疲労、胸痛又は目まいを引き起こす；
クラスＩＩＩ：身体活動の著しく制限をもたらす肺高血圧症；患者が安静時に快適である；通常よりも少ない活動が過度の呼吸困難又は疲労、胸痛又は目まいを引き起こす、並びに
クラスＩＶ：症状なしに任意の身体活動を行うことができない肺高血圧症；患者は右心不全の兆候を示す；呼吸困難及び／又は疲労は、安静時でも存在し得る；不快感は、任意の身体活動によって増加する。
一実施形態では、本開示の方法から利益を享受し得る対象は、ベースライン時で、ＷＨＯクラスＩのＰＡＨ、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨ）を有する対象である。別の実施形態では、本開示の方法から利益を享受し得る対象は、ベースライン時で、ＷＨＯクラスＩＩのＰＡＨ（例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨ）を有する対象である。別の実施形態では、本開示の方法から利益を享受し得る対象は、ベースライン時で、ＷＨＯクラスＩＩＩのＰＡＨ、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨ）を有する対象である。
本明細書で使用される場合、「対象」は、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、及びクジラなど）、哺乳動物などの動物である。
一実施形態では、対象は、本明細書に記載されるように、ＰＡＨについて治療又は評価されるヒト、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨ；ＰＡＨについてリスクのあるヒト、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨ；ＰＡＨを有するヒト、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨ；及び／又はＰＡＨについて治療されるヒト、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡ）などのヒトである。
本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療」という用語は、ＰＡＨ、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨに関連する１つ以上の症状の緩和又は改善を含むが、これらに限定されない有益又は所望の結果を指す。「治療」はまた、治療の非存在下で、予想される生存と比較して、疾患の経過を遅らせる、又は疾患の症状の発症を低減させる、後期発症疾患の重症度を低減させる、又は生存を延長することを意味し得る。例えば、そのような疾患、障害、又は状態に関連する症状の発症の低減（例えば、その疾患又は障害の臨床的に許容される尺度で少なくとも約１０％）、又は遅延した症状の発現（例えば、数日、数週間、数カ月、又は数年）は、有効な治療とみなされる。
「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔｏ）」などの用語は、抗体又はその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数によって特徴付けることができる（例えば、より小さいＫＤは、より強い結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書に記載されるように、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって特定されている。更に、本明細書で使用される場合、ＰＤＧＦ－Ｂの１つのドメイン及び１つ以上の追加の抗原に結合する多特異性抗体、又はＰＤＧＦ－Ｂの２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）又は溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、少なくとも１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ、より好ましくは１０－９Ｍ、更により好ましくは１０－１０Ｍ、更により好ましくは１０－１１ＭのＫＤとして表されるＰＤＧＦ－Ｂに対して結合親和性を有するそれらのｍＡｂを指す。
「遅い解離速度」、「Ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定されるように、１×１０－３ｓ－１以下、好ましくは１×１０－４ｓ－１以下の速度定数でＰＤＧＦ－Ｂから解離する抗体を記載することを意味する。
抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」及び同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素的に入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」又は「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＤＧＦ－Ｂに結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。
特定の実施形態では、本開示の抗体又は抗体断片は、抗生物質などの治療部分（「免疫コンジュゲート」）、第２の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体、又はＩＬ－１、ＩＬ－６、若しくはＴＧＦ－βなどのサイトカインに対する抗体、又は肺動脈高血圧症の治療に有用な任意の他の治療部分にコンジュゲートされ得る。
「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体（例えば、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する単離された抗体又はその断片は、ＰＤＧＦ－Ｂ以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）を指すことを意図する。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によるリアルタイム生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すよう意図されている。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つを超えるエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。それはまた、抗体が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、構造的又は機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体構造的であり得、すなわち、非線状アミノ酸からなり得る。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、ある特定の実施形態では、特異的三次元構造特徴及び／又は比電荷特徴を有し得る。
「実質的な同一性」又は「実質的に同一である」という用語は、核酸又はその断片を指す場合、別の核酸（又はその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入又は欠失と最適にアラインメントされるとき、以下で論じられるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、又はＧＡＰなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定したときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、場合によっては、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じ又は実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」又は「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用して、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによってなど最適にアラインメントした場合、少なくとも９０％の配列同一性、更により好ましくは、少なくとも９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似性の割合又は程度は、置換の保存的性質について補正するために上向きに調整することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたく、これは、本明細書に参照により組み込まれる。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。代替的に、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の測定を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、ＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有し、これらは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の、配列相同性又は配列同一性を決定するためのデフォルトパラメータとともに使用することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムである、デフォルト又は推奨パラメータを用いたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー及び探索配列との間の最良の重複部分の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及び（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照されたく、これらの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための抗体又は抗体断片は、単一特異性、二重特異性、又は多特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、又は１つより多い標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含んでよい。
「治療有効量」という語句は、本明細書で使用される場合、ＰＡＨ、例えば、グループＩ（ＷＨＯ）のＰＡＨを有する対象に投与される場合、疾患の治療（例えば、既存の疾患又は疾患の１つ以上の症状を軽減、改善、又は維持することによって）を達成するか、又は疾患を管理するのに十分である抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の量を含むことを意図する。「治療有効量」は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与方法、疾患及びその重症度、並びに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、ＰＡＨの病期、先行又は併用治療の種類（ある場合）、並びに治療される患者の他の個々の特徴に応じて異なり得る。
「治療有効量」はまた、対象に投与されたときに疾患又は疾患の１つ以上の症状を改善するのに十分である抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の量を含むことも意図する。疾患を改善することは、疾患の経過を遅らせること、又は後期発症疾患の重症度を低減させることを含む。
「治療有効量」はまた、いずれの治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でいくつかの所望の局所又は全身効果をもたらす抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の量を含む。本開示の方法で使用される抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、かかる治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。
概要
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、４つの異なるアイソフォームサブユニット：Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤからなる５つの異なる二量体形態として存在する強力なマイトジェンである。ＰＤＧＦの５つの二量体形態は、ＡＡ、ＢＢ、ＡＢ、ＣＣ、及びＤＤであり、これらは、対応する個々のＰＤＧＦ単量体のジスルフィド結合によって形成される。ＰＤＧＦリガンドは、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）との相互作用を通じて生物学的効果を発揮する。ＰＤＧＦＲは、アルファ（ａ）受容体鎖（ＰＤＧＦＲ－アルファ）及び／又はベータ（β）受容体鎖（ＰＤＧＦ－Ｂ）のヘテロ二量体又はホモ二量体会合からなる単一パス、膜貫通、チロシンキナーゼ受容体である。したがって、活性ＰＤＧＦＲは、αα、ββ、又はαβ受容体鎖対からなり得る。ＰＤＧＦＲは、５つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ループ、膜貫通ドメイン、及びスプリット細胞内チロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインを含む共通のドメイン構造を共有する。二量体ＰＤＧＦリガンドとＰＤＧＦＲとの間の相互作用は、受容体鎖二量体化、受容体自己リン酸化、及び細胞内シグナル伝達をもたらす。ββ受容体は、ＰＤＧＦ－ＢＢ及び－ＤＤによって活性化され、一方、αβ受容体は、ＰＤＧＦ－ＢＢ、－ＣＣ、－ＤＤ、及び－ＡＢによって活性化され、αα受容体は、ＰＤＧＦ－ＡＡ、－ＢＢ、－ＣＣ、及び－ＡＢによって活性化されることが、インビトロで実証されている（Ａｎｄｒａｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２２（１０）：１２７６－１３１２を参照のこと）。
本明細書に記載される抗体は、ＰＤＧＦ－Ｂへの特異的結合を示し、いくつかの実施形態では、肺動脈高血圧症に罹患している患者を治療するのに有用であり得る。これらは、単独で、又は、鉄サプリメントによる鉄の補給、血清鉄を促進するための食事の変更、及び／又は鉄の静脈内送達、輸血、及び鉄促進薬などであるが、これらに限定されない、肺動脈高血圧症を治療するための当該技術分野で既知の他の治療部位又は様式との補助療法として使用され得る。これらは、ＰＤＧＦ－Ｂ以外の抗原に特異的な追加の抗体と併せて使用され得るか、又は他のタイプの治療と併せて使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、肺動脈高血圧症の予防、治療、又は管理に有用であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、天然の完全長ヒトＰＤＧＦ－Ｂ（配列番号４１）又はＰＤＧＦ－Ｂ断片などの一次免疫原で免疫化されたマウスから得られ、続いて二次免疫原又はＰＤＧＦ－Ｂの免疫原的に活性な断片で免疫化される。
免疫原は、ＰＤＧＦ－Ｂの免疫原性断片又はその断片をコードするＤＮＡであり得る。免疫原は、抗体のヒスチジンタグ及び／又はＦｃ領域の断片に結合したＰＤＧＦ－Ｂであり得る。
完全長ヒトＰＤＧＦ－Ｂのアミノ酸配列を、配列番号４１として示す。
ある特定の実施形態では、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する抗体は、上記領域の断片又は指定された領域を超えて、本明細書に記載される領域のＮ末端又はＣ末端の一方又は両方から、約５～約２０アミノ酸残基だけ伸長するペプチドを使用して調製され得る。ある特定の実施形態では、上記領域又はその断片の任意の組み合わせは、ＰＤＧＦ－Ｂ特異的抗体の調製に使用され得る。ある特定の実施形態では、ＰＤＧＦ－Ｂの上記領域のうちのいずれか１つ以上、又はその断片を、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性抗体の調製に使用され得る。
抗体の抗原結合断片
特に明記しない限り、本明細書で使用される「抗体」という用語は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）、並びにその抗原結合断片を包含するものと理解されるべきである。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」及び同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素的に入手可能な、合成の、又は遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」又は「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含む断片、又は単離されたＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメイン及び（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関与するタンパク質分解技術又は組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を使用して、完全抗体分子に由来し得る。かかるＤＮＡは既知であり、及び／又は例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。ＤＮＡは、配列決定され、化学的又は分子生物学技術を使用することによって操作され、例えば、１つ以上の可変及び／又は定常ドメインを適当な配置に並べるか、あるいはコドンを導入するか、システイン残基を創出するか、アミノ酸を修飾するか、付加するか、若しくは欠損させてもよい。
抗原結合断片の非限定的な例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、又は拘束性ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位を含む。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子はまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさ又はアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、又はそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含むだろう。ＶＬドメインと関連するＶＨドメインを有する抗原結合断片では、ＶＨ及びＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、又はＶＬ－ＶＬ二量体を含有してもよい。代替的に、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨ又はＶＬドメインを含有してもよい。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有してもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変及び定常ドメインの非限定的な例示的な配置は、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬを含む。上で列挙された例示的な配置のうちのいずれかを含む、可変及び定常ドメインの任意の配置において、可変及び定常ドメインは、互いに直接結合し得るか、あるいは完全若しくは部分的ヒンジ又はリンカー領域により結合され得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変及び／又は定常ドメイン間で可動性又は半可動性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上の）アミノ酸からなってもよい。更に、本開示の抗体の抗原結合断片は、互いとの及び／又は１つ以上の単量体のＶＨ若しくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合による）非共有結合性会合での上で列挙された可変及び定常ドメイン配置のうちのいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性又は多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体形式を含む任意の多特異性抗体形式は、当該技術分野で利用可能な通常の技術を使用して、本開示の抗体の抗原結合断片の文脈での使用に適合され得る。
本開示は、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖を有する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び抗原結合断片、並びに細胞及び／又はインビトロ翻訳後修飾を有するバリアントを含む。例えば、本開示は、本明細書に記載される重鎖及び／又は軽鎖アミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及び／又はＣＤＲ－Ｌ３）を含むＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片、並びに１つ以上のアミノ酸残基がグリコシル化されている、１つ以上のＡｓｎ残基が脱アミド化されている、１つ以上の残基（例えば、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、及び／又はＨｉｓ）が酸化されている、Ｎ末端Ｇｌｎがピログルタメート（ｐｙｒｏＥ）である、並びに／又はＣ末端リジンが欠けている、抗体及び断片を含む。
本開示は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片、又はその免疫グロブリン鎖を作製するための組換え方法を含み、例えば、ポリヌクレオチドがベクター内にあり、かつ／又はプロモーターに作動可能に連結されている、（ｉ）当該抗体又は抗原結合断片（例えば、重鎖又はそのＶＨ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン、並びに／又は軽鎖又はそのＶＬ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン）の軽鎖及び／又は重鎖免疫グロブリン鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを導入することと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で、宿主細胞（例えば、チャイニチャーハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＰｉｃｈｉａ細胞又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞）を培養することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、宿主細胞及び／又は宿主細胞が成長している培地から抗体又は断片若しくは鎖を単離することと、を含む。１つ超の免疫グロブリン鎖を含む抗体又は抗原結合断片、例えば、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を作製する場合、単一の宿主細胞において鎖を共発現することは、例えば、抗体又は抗原結合断片分子を形成するために、かかる鎖が分泌される場合、細胞内又は細胞表面上又は細胞外において鎖の会合をもたらす。方法は、免疫グロブリン重鎖のみ又は免疫グロブリン軽鎖のみ（例えば、成熟断片及び／又はその可変ドメインを含む本明細書で論じられたもののうちのいずれか）が発現されるものを含む。かかる鎖は、例えば、このような鎖を含む抗体又は抗原結合断片の発現において中間体として有用である。本開示は、かかる発現方法の生成物（例えば、抗体、抗原結合断片、ＶＨ、又はＶＬ）を含む。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で既知である。任意のかかる既知の方法は、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の文脈下で使用され得る。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照のこと）又はモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ＰＤＧＦ－Ｂに対する高親和性キメラ抗体が、最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を生成するように、内在性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。次いで、ＤＮＡは、完全ヒト抗体を発現することができる細胞において発現させる。
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、対象の抗原でチャレンジされ、リンパ細胞（Ｂ細胞など）が、抗体を発現するマウスから回収される。不死化ハイブリドーマ細胞株を調製するためにリンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、かかるハイブリドーマ細胞株は、対象となる抗原に特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を同定するためにスクリーニング及び選択される。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが、単離され、重鎖及び軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結させ得る。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において生成され得る。代替的に、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接単離され得る。
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が、単離される。抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴について特徴付けられ、選択される。マウス定常領域は、本開示の完全ヒト抗体、例えば、野生型又は修飾ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４を生成するために、所望のヒト定常領域で置換される。選択される定常領域が、特定の用途に応じて異なり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
一般に、本開示の抗体は、固相又は溶液相のいずれかに固定された抗原への結合によって測定されるとき、非常に高い親和性を有し、典型的には、約１０－１２～約１０－７ＭのＫＤを有する。マウス定常領域は、本開示の完全ヒト抗体を生成するために、所望のヒト定常領域で置換される。選択される定常領域が、特定の用途に応じて異なり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
生物学的同等性
本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び抗体断片は、記載される抗体のものとは異なるが、ＰＤＧＦ－Ｂに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。かかるバリアント抗体及び抗体断片は、親配列と比較して、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載される抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本開示の抗体をコードしているＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本開示の抗体又は抗体断片と本質的に生物学的に同等である抗体又は抗体断片をコードする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質又は抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で、同じモル用量で、単回用量又は複数回用量のいずれかで投与されたときに、吸収の速度及び程度が著しい差異を示さない薬学的等価物又は薬学的代替物である場合、生物学的等価物であるとみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は同等であるが、これらの吸収速度は同等ではない場合、等価物又は薬学的代替物であるとみなされ、更に、吸収の速度のこのような差異が、意図的であり、標識に反映されており、例えば、慢性使用において有効身体薬物濃度の獲得に不可欠ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされるため、生物学的等価物であるとみなされ得る。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、又は有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品の間での一回以上の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの予想される上昇又は有効性の減退が生じずに、患者がそのような切り替えを行うことができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件又は使用条件について、共通の機序又は作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、インビボ及び／又はインビトロの方法によって実証され得る。生物学的同等性測定方法には、例えば、（ａ）抗体又はその代謝物の濃度が血液、血漿、血清、又は他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒトのインビボでの生物学的利用能データと相関し、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験、及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又は生物学的利用能若しくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
本開示の抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基若しくは配列の様々な置換を生じること、又は生物活性に必要とされない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失又は他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈では、生物学的に等価の抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除又は除去する変異を含む、抗体バリアントを含み得る。
Ｆｃバリアントを含む抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体
本開示のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強又は減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、提供される。例えば、本開示は、ＦｃドメインのＣＨ２領域又はＣＨ３領域に変異を含む抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を含み、変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲であるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる。かかる変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。
前述のＦｃドメイン変異、及び本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本開示の範囲内で企図される。
本開示はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体も含み、キメラＣＨ領域は、１つ超の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部又は全てと組み合わせて、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、又はヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部又は全てを含むキメラＣＨ領域を含み得る。ある特定の実施形態によると、本開示の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基）と組み合わせて、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基）を含み得る。ある特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４の上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２の下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態では、抗体の治療特性又は薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Ｆｃエフェクター機能を呈し得る。（例えば、２０１３年２月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５９，５７８号（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
抗体の生物学的特性
一般に、本開示の抗体は、ＰＤＧＦ－Ｂに結合することによって機能し得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、別の抗原（交差反応性抗体）に結合し得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本開示の二重特異性抗体は、１つのドメイン内の１つのエピトープに結合し得、ＰＤＧＦ－Ｂの第２のドメイン内の１つのエピトープにも結合し得る。ある特定の実施形態では、本開示の二重特異性抗体は、同じドメイン内の２つの異なるエピトープに結合し得る。
一実施形態では、本開示は、ＰＤＧＦ－Ｂに結合する完全ヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその断片は、以下の特徴のうちの１つ以上を示す：（ｉ）配列番号２及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＶＲを含み、（ｉｉ）配列番号１０及び３０からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＶＲを含み、（ｉｉｉ）配列番号８及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１６及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含み、（ｉｖ）配列番号４及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号６及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号１２及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号１４及び３４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、を含み、（ｖ）１０－７以下のＫＤでＰＤＧＦ－Ｂに結合する。
本開示のある特定の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、インビトロ又はインビボアッセイによって決定されるように、ＰＤＧＦ－Ｂの活性に結合し、中和することができる。抗体がＰＤＧＦ－Ｂの活性に結合し、その活性を中和する能力は、本明細書に記載される結合アッセイ又は活性アッセイを含む、当業者に既知の任意の標準的な方法を使用して測定され得る。
ペプチドは、タグ付けのため、又はＫＬＨなどの担体分子へのコンジュゲーションの目的で、ある特定の残基の添加又は置換を含むように修飾され得る。例えば、システインは、ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに付加されてもよく、又はリンカー配列を付加して、例えば、免疫化のためのＫＬＨへのコンジュゲーションのためのペプチドを調製してもよい。
ＰＤＧＦ－Ｂに特異的な抗体は、追加の標識又は部分を含有していなくてもよく、又は、それらが、Ｎ末端又はＣ末端の標識又は部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識又は部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識の位置は（もしあれば）、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。一実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光染料又はＭＲＩ検出可能標識であり得る。ある特定の実施形態では、かかる標識抗体は、イメージングアッセイを含む診断アッセイで使用され得る。
エピトープマッピング及び関連技術
本開示は、ＰＤＧＦ－Ｂの１つ以上の領域内に見出される１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＰＤＧＦ－Ｂ分子の上述領域のいずれか内に位置する３つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列（例えば、ドメイン中の直鎖状エピトープ）からなり得る。代替的に、エピトープは、ＰＤＧＦ－Ｂ分子（例えば、コンフォメーションエピトープ）の前述の領域のいずれか、又は両方に位置する複数の非連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなり得る。
抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用するかどうか」を決定するために、当業者に既知の様々な技術を使用することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されるルーチンクロスブロッキングアッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析、結晶学的研究、及びＮＭＲ分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学改変などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析法によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、対象となるタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で、重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得るため、界面に含まれないアミノ酸と比較して、比較的高い質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質に対してプロテアーゼ切断及び質量分光分析を行い、それにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸を含有する、重水素標識された残基を含有するペプチドを明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸又はタンパク質の三次折り畳みによって並列された連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、独自の空間コンフォメーション中に、少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個、又は８～１０個のアミノ酸を含む。
修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）、別名、抗原構造ベース抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）は、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原を対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０を参照のこと、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）。各カテゴリは、別のカテゴリによって表されるエピトープとは明らかに異なるか、又は部分的に重複する固有のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴付けが遺伝的に異なる抗体に焦点を当てられ得るように、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを生成する希少なハイブリドーマクローンの同定を促進し得る。ＭＡＰを使用して、本開示の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別することができる。
ある特定の実施形態では、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１に例示されるように、ヒトＰＤＧＦ－Ｂに例示される領域のうちのいずれか１つ以上内のエピトープ、又はその断片に結合する。
本開示は、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと同じエピトープ又はエピトープの一部に結合するヒト抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体、又は本明細書に記載される例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。同様に、本開示はまた、ＰＤＧＦ－Ｂ又はＰＤＧＦ－Ｂ断片への結合について、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと競合する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体、又は本明細書に記載される例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。
当該技術分野で既知の常法を使用して、抗体が、参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体と同一のエピトープに結合するか、又はそれと結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本開示の参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を、飽和条件下で、ＰＤＧＦ－Ｂタンパク質又はペプチドに結合させることができる。次に、試験抗体がＰＤＧＦ－Ｂ分子に結合する能力が、評価される。試験抗体が、参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体との飽和結合の後にＰＤＧＦ－Ｂに結合することができる場合、その試験抗体は、参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体との飽和結合の後にＰＤＧＦ－Ｂ鎖に結合することができない場合、その試験抗体は、本開示の参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
抗体が、参照抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上に記載の結合方法を、２つの配向から実施する。第１の配向では、参照抗体を、飽和条件下で、ＰＤＧＦ－Ｂタンパク質に結合させ、その後、試験抗体のＰＤＧＦ－Ｂ分子への結合を評価する。第２の配向では、試験抗体を、飽和条件下で、ＰＤＧＦ－Ｂ分子に結合させ、その後、参照抗体のＰＤＧＦ－Ｂ分子への結合を評価する。両方の配向では、第１の（飽和）抗体のみがＰＤＧＦ－Ｂ分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体は、ＰＤＧＦ－Ｂへの結合について競合すると結論付けられる。当業者によって認識されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
２つの抗体が各々、抗原に対して他方の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、その２つの抗体は、同じ又は重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、又は１００倍過剰量の一方の抗体が、競合結合アッセイで測定した場合、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％、又は更に９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照のこと）。代替的に、一方の抗体の結合を減少又は排除する抗原において本質的に全てのアミノ酸変異がもう一方の結合を減少又は除外する場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少又は除外するいくつかのアミノ酸変異が、もう一方の結合を減少又は除外する場合、２つの抗体は、重複エピトープを有する。
次いで、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープに対する結合に起因するものであるか、又は立体ブロッキング（又は別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、更なる通常の実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
免疫コンジュゲート
本開示は、肺動脈高血圧症の重症度を軽減することができる薬剤、又は肺動脈高血圧症に関連する少なくとも１つの症状を改善することができる薬剤などの治療部分（「免疫コンジュゲート」）にコンジュゲートされたヒト抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用される場合、「免疫コンジュゲート」という用語は、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的若しくはレポーター部分、酵素、毒素、又は治療剤に化学的又は生物学的に連結されている抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的若しくはレポーター部分、酵素、毒素、又は治療剤に連結され得る。免疫コンジュゲートの例は、抗体薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＰＤＧＦ－Ｂ、又はＩＬ－１、ＩＬ－６などのサイトカイン、又はＴＧＦ－βなどのケモカインに対する第２の異なる抗体であり得る。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体にコンジュゲートされてもよい治療部分の種類は、治療されるべき状態及び達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れる。免疫コンジュゲートを形成するために好適な薬剤の例は、当該技術分野で既知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと）。免疫コンジュゲート及び免疫毒素の調製は、概して、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４３４０５３５号を参照のこと）。免疫コンジュゲートは、例えば、ＵＳ７２５０４９２、ＵＳ７４２００４０、及びＵＳ７４１１０４６に詳細に記載されており、これらの各々は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
多重特異性抗体
本開示の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、又は１つより多い標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照のこと。本開示の抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に連結させ得るか、又はそれと同時発現させ得る。例えば、抗体又はその断片は、別の抗体又は抗体断片などの１つ以上の他の分子的実体に（例えば、化学的結合、遺伝的融合、非共有結合性会合などによって）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本開示は、免疫グロブリンの一方のアームが、ＰＤＧＦ－Ｂ若しくはその断片のＮ末端領域に対して特異的であり、かつ免疫グロブリンの他方のアームが、ＰＤＧＦ－Ｂ若しくは第２の治療標的のＣ末端領域に対して特異的であるか、又は治療部分にコンジュゲートされた、二重特異性抗体を含む。本開示の文脈で使用され得る例示的な二重特異性抗体のフォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、第１及び第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸によって互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二重特異性抗体と比較して、二重特異性抗体のＰＤＧＦ－Ｂへの結合を低減させる。上述の二重特異性抗体のフォーマットの変形は、本開示の範囲内で意図されている。
本開示の文脈で使用することができる他の例示的な二重特異性のフォーマットとしては、例えば、ｓｃＦｖベース又はダイアボディ二重特異性のフォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用性Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異性フォーマット（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、及びそこで引用されている参考文献を、上記のフォーマットの考察のために参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性抗体はまた、例えば、直交化学反応性を持つ非天然アミノ酸を使用して、その後画定された組成物、原子価、及び形状によって多量体へと自己組織化する部位特異的抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成する、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築され得る。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照のこと）。
治療用投与及び製剤
本開示は、本明細書に論じられる抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片を含む治療組成物を提供する。本開示に従う治療組成物は、好適な担体、賦形剤、及び改善された移送、送達、耐性能などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤とともに投与され得る。数多くの適切な製剤が、全ての薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出され得る。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油及び油中水エマルション、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、並びにカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照のこと。
抗体の用量は、投与される対象の年齢及びサイズ、標的疾患、病態、投与経路などに応じて異なり得る。本開示の抗体が肺動脈高血圧症を予防又は治療するために使用される場合、本開示の抗体を通常は体重１ｋｇ当たり約０．１～約１００ｍｇの単回投与で、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約５～約１００、約１０～約９０、又は約２０～約７０ｍｇの単回投与で静脈内投与することが有利である。病態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約５００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、又は約１０～約２００ｍｇ、約１０～約１００ｍｇ、若しくは約１０～約５０ｍｇの初期用量として投与することができる。ある特定の実施形態では、初期用量に続いて、初期用量とほぼ同じか、又はそれ未満であり得る量で、抗体又はその抗原結合断片の２回目又は複数の後続用量の投与が行われ得、後続用量は、少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、又は少なくとも１４週間離れている。
様々な送達系が知られており、例えば、リポソームへの封入、マイクロ粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスの本開示の薬学的組成物を投与するために使用され得る（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。導入方法には、真皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、及び経口が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入若しくはボーラス注射による、上皮若しくは粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）を介した吸収による、任意の好都合な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、全身又は局所であり得る。薬学的組成物はまた、ベシクル、具体的にはリポソーム中で送達され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照のこと）。
本開示の抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた、本明細書に企図される。抗体結合ナノ粒子は、治療用途及び診断用途の両方に使用され得る。抗体結合ナノ粒子並びに調製及び使用方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）（参照により本明細書に組み込まれる）によって詳述される。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、ＵＳ８２７７８１２、ＵＳ８２５８２５６、ＵＳ８２５７７４０、ＵＳ８２４６９９５、ＵＳ８２３６３３０にも記載され、各々が、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の状況において、薬学的組成物は、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを、使用することができる。別の実施形態では、高分子材料を、使用することができる。更に別の実施形態では、放出制御システムは、組成物の標的の近傍に配置することができるため、全身投与量のほんの一部しか必要としない。
注入可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、及び筋肉内注射、点滴などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調製物は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に上述の抗体又はその塩を溶解、懸濁、又は乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、及び他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
本開示の薬学的組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下に又は静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本開示の薬学的組成物の送達において、容易に用途を見出す。そのようなペン型送達デバイスは、再利用可能であるか、又は使い捨てであり得る。再利用可能なペン型送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。次いで、ペン型送達デバイスは、再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは、存在しない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が予め充填されている。貯蔵器から薬学的組成物が空になると、デバイス全体が、廃棄される。
数多くの再利用可能なペン型送達デバイス及び自己注射器型送達デバイスが、本開示の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（登録商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（登録商標）Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）ＰＲＯ、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）ＳＴＡＲＬＥＴ、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、決してこれらに限定されない。本開示の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（登録商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（登録商標）（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（登録商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（ＰＥＮＬＥＴ（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（登録商標）（Ｍｙｌａｎ（登録商標）及びＨＵＭＩＲＡ（登録商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）などが挙げられるが、決してこれらに限定されない。
有益なことに、上記の経口又は非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態に調製される。単位用量におけるかかる剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。含有される前述の抗体の量は、概して、単位用量で剤形当たり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、上記の抗体は、約５～約１００ｍｇに含有されることが好ましく、及びその他の剤形に対しては約１０～約２５０ｍｇに含有されることが好ましい。本開示は、薬学的に許容される担体を含む本開示の抗体又は抗原結合断片又はその薬学的組成物を含む注射デバイス（例えば、予め充填されたシリンジ若しくは予め充填された自動注射器）又はバイアル（例えば、ガラス若しくはプラスチックバイアル）を含む。
抗体の治療的使用
本開示のある特定の実施形態では、本抗体は、肺動脈高血圧症、又は肺動脈高血圧症に関連する少なくとも１つの症状を治療するのに有用である。本開示の抗体はまた、肺動脈高血圧症を発症するリスクがある患者における予防的使用のためにも企図される。これらの患者には、疾患若しくは免疫抑制療法による治療に起因する免疫不全の高齢者又は患者が含まれる。本開示の抗体は、肺動脈高血圧症を治療するため、又は肺動脈高血圧症に関連する少なくとも１つの症状若しくは合併症を緩和するために、単独で、又は第２の薬剤若しくは第３の薬剤と併用され得ることが企図される。第２又は第３の薬剤は、本開示の抗体と同時に送達され得るか、又はそれらは、本開示の抗体の前又は後のいずれかで別々に投与され得る。本開示の抗体若しくは抗原結合断片又はその薬学的組成物を受け得る患者は、例えば、ヒト（例えば、高齢者、例えば、６５歳以上）、ウサギ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、霊長類、ウマ、又はヒツジなどの哺乳動物などの動物を含む。
本開示の更なる実施形態では、本抗体は、肺動脈高血圧症に罹患している患者を治療するための薬学的組成物の調製のために使用される。
併用療法
本開示は、１つ以上の追加の治療活性成分と組み合わせて本明細書に記載される抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちのいずれかを含む組成物及び治療用製剤、並びにそのような組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を含む。
本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１に記載のアフリベルセプト又は他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質などの「ＶＥＧＦトラップ」、抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片（例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、若しくはパゾパニブ）、又は抗ＶＥＧＦ受容体抗体とともに製剤化され得、及び／又は組み合わせて投与され得る。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体はまた、ＰＤＧＦリガンドアンタゴニスト（例えば、抗ＰＤＧＦ－ＢＢ抗体、抗ＰＤＧＦ－ＤＤ抗体、抗ＰＤＧＦ－ＣＣ抗体、抗ＰＤＧＦ－ＡＢ抗体、又はアプタマー［例えば、Ｆｏｖｉｓｔａ（商標）、Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪなどの抗ＰＤＧＦ－Ｂアプタマー］、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ＰＤＧＦリガンドに対して指向されるナノボディ若しくは抗体断片などの他のＰＤＧＦリガンドアンタゴニスト）と組み合わせられ得る。他の実施形態では、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブ若しくはパニツムマブ］又はＥＧＦＲの低分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブ若しくはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２、抗ＥｒｂＢ３、若しくは抗ＥｒｂＢ４抗体、又はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、若しくはＥｒｂＢ４活性の低分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖｌｌｌに特異的なアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖｌｌｌに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアナゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１ Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１ Ｒ抗体）、又はＢ－ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ－０８７９、ＰＬＸ－４７２０）とともに製剤化され得、及び／又は組み合わせて投与され得る。場合によっては、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、ＰＤＧＦＲ－アルファ阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－アルファ抗体）、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１などのＵＳ２００９／０１４２３５４に開示される抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１ Ｈ６８５ＰなどのＵＳ２０１１／００２７２８６に開示される抗Ａｎｇ２抗体）などと組み合わせられ、共製剤化され、及び／又は組み合わせて投与される。本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤には、小分子サイトカイン阻害剤及びＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８などのサイトカイン又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤が含まれる。
本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体はまた、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、金属キレート剤、ＩＦＮ－ガンマ、及び／又はＮＳＡＩＤとともに投与され得、及び／又は組み合わせて共製剤化され得る。本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体はまた、（例えば、がんを治療するか、又は腫瘍成長を阻害する方法の文脈で）放射線治療及び／又は従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与され得る。
前述の追加の治療活性成分のうちのいずれかは、例えば、本明細書で言及される眼疾患、線維性疾患、血管疾患、及び／又はがんのうちのいずれかを含む、抗ＰＤＧＦＲ－ベータ抗体の投与が有益である任意の疾患又は障害の治療のために、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちのいずれかと組み合わせて投与され得る。例えば、眼疾患（例えば、湿性ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、ＣＲＶＯ、又は本明細書に記載される他の眼疾患のうちのいずれか）の治療の文脈において、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１に記載のアフリベルセプト又は他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質などの「ＶＥＧＦトラップ」、又は抗ＶＥＧＦ抗体若しくはその抗原結合断片（例えば、ベバシズマブ、又はラニビズマブ）とともに製剤化され得、及び／又は組み合わせて投与され得る。
本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及びＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤の投与を含む、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦトラップ）と組み合わせて投与される例示的な実施形態では、個々の成分は、様々な投与量の組み合わせを使用して対象に投与され得、及び／又は共製剤化され得る。例えば、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、及び５．５ｍｇからなる群から選択される量で、対象に投与され得、及び／又は共製剤に含有され得、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦトラップ）は、１．０ｍｇ、１．１ｍｇ、１．２ｍｇ、１．３ｍｇ、１．４ｍｇ、１．５ｍｇ、１．６ｍｇ、１．７ｍｇ、１．８ｍｇ、１．９ｍｇ、２．０ｍｇ、２．１ｍｇ、２．２ｍｇ、２．３ｍｇ、２．４ｍｇ、２．５ｍｇ、２．６ｍｇ、２．７ｍｇ、２．８ｍｇ、２．９ｍｇ、及び３．０ｍｇからなる群から選択される量で、対象に投与され得、及び／又は共製剤に含有され得る。本開示の例示的な抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体／アフリベルセプト投与量の組み合わせとしては、例えば、（ｉ）０．２ｍｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体＋２ｍｇのアフリベルセプト、（ｉｉ）０．５ｍｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体＋２ｍｇのアフリベルセプト、（ｉｉｉ）１ｍｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体＋２ｍｇのアフリベルセプト、（ｉｖ）３ｍｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体＋２ｍｇのアフリベルセプト、及び（ｖ）４ｍｇの抗ＰＤＧＦＲ－ベータ抗体＋２ｍｇのアフリベルセプトが挙げられる。この組み合わせ／共製剤は、例えば、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、４カ月毎に１回、５カ月毎に１回、６カ月毎に１回などを含む、本明細書の他の場所に開示される投与レジメンのうちのいずれかに従って、対象に投与され得る。
追加の治療活性成分は、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与の前に、対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、又は１分未満前に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性成分は、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与後に、対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与から１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。更に他の実施形態では、追加の治療活性成分は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与と同時に、対象に投与され得る。
本開示の目的のための「同時」投与には、例えば、（例えば、共製剤化された）単一の剤形での、又は互いに約３０分以内に対象に投与される別個の剤形での、対象への抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び追加の治療活性成分の投与が含まれる。別々の剤形で投与する場合、各剤形は、同じ経路で投与することができ（例えば、抗ＰＤＧＦＲ－ベータ抗体及び追加の治療活性成分の両方が、硝子体内、皮下などに投与することができ）、代替的に、各剤形は、異なる経路で投与することができる（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、硝子体内投与し、追加の治療活性成分が、全身投与することができる）。いずれの事象においても、単回剤形で、同じ経路による別個の剤形で、又は異なる経路による別個の剤形でこの成分を投与することは全て、本開示の目的のために、「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「の前の」、「と同時の」、又は「の後の」抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与と考えられる）。
本開示は、本開示の抗ＰＤＧＦＲ－ベータ抗体が、本明細書の別の箇所に記載される追加の治療上活性な成分のうちの１つ以上と共製剤化される薬学的組成物を含む。
本開示はまた、ＰＤＧＦアンタゴニスト及びＶＥＧＦアンタゴニストの組み合わせを含む追加の治療用組成物も含む。本開示のこの態様によるＰＤＧＦアンタゴニストとしては、ＰＤＧＦリガンドアンタゴニストと同様に、ＰＤＧＦ受容体アンタゴニストが挙げられる。同様に、本開示のこの態様によるＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦリガンドアンタゴニストと同様に、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニストを含む。
追加の治療的に活性な成分は、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与前に、それと同時に、又はその投与後に投与され得る。本開示の目的のために、かかる投与レジメンは、１つ以上の追加の治療活性成分と「組み合わせた」抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与とみなされる。
抗体の診断的使用
本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体はまた、例えば、診断目的のために、試料中のＰＤＧＦ－Ｂを検出及び／又は測定するためにも使用され得る。ＰＤＧＦ－Ｂについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体と接触させることを含み得、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、検出可能な標識若しくはレポーター分子で標識されるか、又は患者試料由来のＰＤＧＦ－Ｂを選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。代替的に、標識されていない抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、それ自体が検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断用途において使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナート若しくはローダミンなどの蛍光部分若しくは化学発光部分、又はアルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＰＤＧＦ－Ｂを検出又は測定するために使用することができる特定の例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本開示によるＰＤＧＦ－Ｂ診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常条件又は病理学的条件下で、検出可能な量のＰＤＧＦ－Ｂ又はその断片を含有する、患者から得ることのできる任意の組織又は体液試料が含まれる。一般に、健常な患者（例えば、肺動脈高血圧症に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＰＤＧＦ－Ｂのレベルを測定して、ＰＤＧＦ－Ｂのベースラインレベル又は標準レベルを最初に確立する。次いで、ＰＤＧＦ－Ｂのこのベースラインレベルを、肺動脈高血圧症に関連する病態又はかかる病態に関連する症状を有することが疑われる個体から得られた試料中に測定されたＰＤＧＦ－Ｂのレベルと比較することができる。
ＰＤＧＦ－Ｂに特異的な抗体は、追加の標識又は部分を含有していなくてもよく、又は、それらが、Ｎ末端又はＣ末端の標識又は部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識又は部分は、ビオチンである。結合アッセイでは、標識の位置は（もしあれば）、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。いくつかの実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光染料、又はＭＲＩ検出可能標識などの検出可能な標識であり得る。検出可能な標識は、かかる抗体がイメージングアッセイで使用され得る抗体に連結され得る。
治療方法
本開示は、肺動脈高血圧症を有する対象を治療するための方法を提供する。方法は、一般に、治療有効量の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体、又はその抗原結合断片を対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与は、対象における肺動脈の肥厚を阻害し、例えば、ベースラインから、例えば、診断時に、対象における肺動脈の更なる肥厚を阻害する。肺動脈の肥厚は、例えば、胸部ＣＴ（例えば、強化されていない軸方向の１０ｍｍ ＣＴ切片など）によって決定され得、主肺動脈の直径（ｍＰＡ）を計算するために使用され得る。正常対象の主肺動脈の直径は、約２．４ｃｍ～約３．０ｃｍである。肺動脈高血圧症の対象における主肺動脈の直径は、約３．１ｃｍ～約３．８ｃｍ以上である。例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ ７１（８５０）：１０１８－２０を参照のこと。
他の態様では、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与は、対象における一回拍出量及び／又は一回拍出量対収縮末期容積比（「ＳＶ／ＥＳＶ」）を増加させる。「一回拍出量」（「ＳＶ」）は、１回の拍動当たり右心室又は左心室から送り出される血液量である。一回拍出量は、心エコー図から心室容積を測定し、拍動終了時の心室内の血液量（「収縮末期容積」、「ＥＤＶ」と呼ばれる）から拍動直前の血液量（「拡張末期容積」、「ＥＳＶ」と呼ばれる）を減算することによって算出することができる。一回拍出量はまた、例えば、右心カテーテル検査中に熱希釈によって測定された心拍出量を心拍数で割った値、又はＥＤＶからＥＳＶを引いた値として、体表面積を指数として算出することもできる。一回拍出量という用語は、心臓の２つの心室の各々に適用され得る。各脳室の一回拍出量は、概して、等しく、両方とも健常対象では、約７０ｍＬである。健常対象のＳＶ／ＥＳＶは、約０．９～約２．２であり、ＰＡＨを有する対象のＳＶ／ＥＳＶは、約０．２～約０．９である。例えば、Ｂｒｅｗｉｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ２１８：２０６－２１１を参照のこと。
更に他の態様では、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与は、対象における右心室心拍出量及び／又は心指数（ＣＩ）を増加させる。「心拍出量」（「ＣＯ」）は、単位時間で心室によって送り出された血液の量として定義される。「心臓指数」（「ＣＩ」）は、１分間の左心室からの心拍出量（ＣＯ）を「体表面積」（「ＢＳＡ」）に関連付ける血行動態パラメータであり、したがって、個体のサイズに対する心臓のパフォーマンスを関連付ける。心エコー技法及び放射性核種イメージング技法を使用して、心室寸法のリアルタイム変化を推定し、それにより一回拍出量を計算することができ、これは、心拍数を乗じると心拍出量が得られ、ＢＳＡは、例えば、Ｄｕ Ｂｏｉｓ式（Ｖｅｒｂｒａｅｃｋｅｎ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ－Ｃｌｉｎ Ｅｘｐｅｒ ５５（４）：５１５－２４）又はＭｏｓｔｅｌｌｅｒ式（Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒ（１９８７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３１７：１０９８）を含む当業者に既知の式のうちのいずれか１つを使用して、計算することができる。ＰＡＨを有しない対象は、約４．０～８．０Ｌ／分の範囲の心拍出量及び１平方メートル当たり約２．６～約４．２Ｌ／分の心臓指数を有する。ＰＡＨを有する対象は、１平方メートル当たり約１．９～約２．３Ｌ／分の心臓指数を有する（Ｒｙａｎ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ（２０１６）Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １１５：１７６－１８８）。
本開示の方法におけるＰＡＨを有する対象への抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与は、例えば、右心房圧、肺動脈圧、末端呼気圧、全身動脈圧、心拍、肺血管抵抗、及び／又は全身血管抵抗の存在下での肺毛細血管くさび入圧など、ＰＡＨを有する対象における他の血行動態測定値を改善し得る。右心房圧、肺動脈圧、末端呼気圧、全身動脈圧、心拍、肺血管抵抗、及び／又は全身血管抵抗の存在下での肺毛細血管くさび入圧を測定するための方法及びデバイスは、当業者に既知である。
ＰＡＨを有さない対象は、約１ｍｍＨｇ～約５ｍｍＨｇの右心房圧を有し、ＰＡＨを有する対象は、約１１ｍｍＨｇ～約１３ｍｍＨｇの右心房圧を有する。
ＰＡＨを有さない対象は、約９ｍｍＨｇ～約２０ｍｍＨｇの肺動脈圧を有し、ＰＡＨを有する対象は、約５７ｍｍＨｇ～約６１ｍｍＨｇの肺動脈圧を有する。
ＰＡＨを有さない対象は、約４ｍｍＨｇ～約１２ｍｍＨｇの末端呼気圧の存在下で肺毛細血管くさび入圧を有し、ＰＡＨを有する対象は、約９ｍｍＨｇ～約１１ｍｍＨｇの末端呼気圧の存在下で肺毛細血管くさび入圧を有する。
ＰＡＨを有さない対象は、約９０ｍｍＨｇ～約９６ｍｍＨｇの全身動脈圧を有し、ＰＡＨを有する対象は、約８７ｍｍＨｇ～約９１ｍｍＨｇの全身動脈圧を有する。
ＰＡＨを有さない対象は、約６０ビート／分（ｂｐｍ）～約９０ｂｐｍの心拍を有し、ＰＡＨを有する対象は、約８４ｂｐｍ～８８ｂｐｍの全身動脈圧を有する。
ＰＡＨを有さない対象は、約２０ダイン秒／ｃｍ５～約１３０ダイン秒／ｃｍ５（又は約０．２５～約１．６２５木材単位）の肺血管抵抗を有し、ＰＡＨを有する対象は、約１２００ダイン秒／ｃｍ５～約１３６０ダイン秒／ｃｍ５（又は約１５～約１７木材単位）の肺血管抵抗を有する。
ＰＡＨを有しない対象は、約７００ダイン秒／ｃｍ５～約１６００ダイン秒／ｃｍ５（又は約９～約２０木材単位）の全身血管抵抗を有し、ＰＡＨを有する対象は、約１８４０ダイン秒／ｃｍ５～約２０００ダイン秒／ｃｍ５（又は約２３～約２５木材単位）の全身血管抵抗を有する。
本開示の方法はまた、治療される対象における肺機能などの他の臨床パラメータを改善し得る。例えば、治療期間中又は治療期間後に、対象は、例えば、６分間の歩行距離（６ＭＷＤ）のテスト又は活動の尺度によって測定されるように、増加した運動能力若しくは活動、又は低減したＢｏｒｇ呼吸困難指数（ＢＤＩ）を有し得る。
本開示の方法はまた、ベースラインと比較して、１つ以上の生活の質パラメータ、例えば、ＳＦ－３６（登録商標）健康調査機能尺度の少なくとも１つにおけるスコアの増加、例えば、より低いＷＨＯ機能クラスへの移動による、病態の重症度のベースラインと比較した改善、及び／又は寿命の延長を改善し得る。
運動能力の任意の適切な測定は、対象が増加した運動能力又は活動を有するかどうかを決定するために使用することができる。１つの適切な測定は、６分間の歩行試験（６ＭＷＴ）であり、これは、対象が６分間でどれだけの距離を歩くことができるか、すなわち、６分間の歩行距離（６ＭＷＤ）を測定する。別の適切な測定は、Ｂｏｒｇ呼吸困難指数（ＢＤＩ）であり、これは、知覚される呼吸困難（呼吸不快感）を評価するための数値尺度である。６分間の歩行試験（６ＭＷＴ）の完了後の息切れの程度を測定し、ＢＤＩが０の場合、息切れはなく、１０の場合、最大の息切れを示す。一実施形態では、本開示の方法は、対象に、６ＭＷＤにおけるベースラインから少なくとも約１０分間、例えば、約１０分、１５分、２０分、又は約３０分間の増加を提供する。別の実施形態では、６ＭＷＴに続いて、本開示の方法は、対象に、ベースラインＢＤＩから少なくとも約０．５～約１．０の指数ポイントの低下を提供する。
任意の好適な測定の生活の質が、使用され得る。例えば、ＳＦ－３６（登録商標）健康調査は、８つの健康パラメータ：身体機能、身体的健康問題による役割の制限、身体の痛み、一般的な健康、活力（エネルギー及び倦怠感）、社会的機能、感情的問題による役割の制限、及び精神的健康（心理的苦痛及び心理的幸福）、を測定する自己報告の複数項目の尺度を提供する。この調査はまた、身体的構成要素の要約及び精神的構成要素の要約も提供される。一実施形態では、本開示の方法は、ＳＦ－３６の身体的健康関連パラメータ（身体的健康、役割－身体的、身体の痛み及び／又は一般的な健康）のうちの少なくとも１つ、及び／又はＳＦ－３６の精神的健康関連パラメータ（活力、社会的機能、役割－感情的及び／又は精神的健康）のうちの少なくとも１つにおけるベースラインに対する改善を対象に提供する。そのような改善は、任意の１つ以上のパラメータについて、尺度上の少なくとも１、例えば、少なくとも２又は少なくとも３ポイントの増加の形をとることができる。
本開示の方法はまた、治療される対象の予後を改善し得る。例えば、本開示の方法は、治療期間中の臨床的悪化事象の確率の低下、及び／又は血清脳性利尿ペプチド（ＢＮＰ）若しくはＮＴ ｐｒｏ－ＢＮＰ若しくはそのＮ末端プロホルモン、ＮＴ－ｐｒｏ－ＢＮＰ濃度のベースラインからの低下を、対象に提供し得、ベースラインでは、対象における状態の最初の診断からの時間は、約２年以下である。
様々な態様では、最初の診断からの時間は、例えば、約１．５年以下、約１年以下、約０．７５年以下、又は約０．５年以下であり得る。臨床的悪化事象（ＣＷＥ）は、死亡、肺移植、ＰＡＨのための入院、心房中隔切除術、追加の肺高血圧療法の開始、又はそれらの組み合わせを含む。ＰＡＨの臨床的悪化までの時間は、治療の開始からＣＷＥの最初の発生までの時間として定義される。
一実施形態では、本開示の方法は、ＢＮＰ又はＮＴ－ｐｒｏ－ＢＮＰ濃度において、ベースラインから少なくとも約１５％、例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％の減少を提供する。
一実施形態では、本開示の方法は、治療期間中の死亡、肺移植、肺動脈高血圧症のための入院、心房中隔切除術、及び／又は追加の肺高血圧療法の開始の確率において、少なくとも約２５％、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％未満、又は少なくとも約８０％の減少を提供する。
本開示の方法はまた、処置の開始時から、例えば、少なくとも約３０日までに、ＰＡＨを有する対象の寿命（生存時間の延長）を延長し得る。
本開示の方法で使用するための抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の治療有効量は、約０．０５ｍｇ～約６００ｍｇ、例えば、抗体のそれぞれの、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６１０ｍｇ、約６２０ｍｇ、約６３０ｍｇ、約６４０ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６６０ｍｇ、約６７０ｍｇ、約６８０ｍｇ、約６９０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７１０ｍｇ、約７２０ｍｇ、約７３０ｍｇ、約７４０ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７６０ｍｇ、約７７０ｍｇ、約７８０ｍｇ、約７９０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８１０ｍｇ、約８２０ｍｇ、約８３０ｍｇ、約８４０ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８６０ｍｇ、約８７０ｍｇ、約８８０ｍｇ、約８９０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９１０ｍｇ、約９２０ｍｇ、約９３０ｍｇ、約９４０ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９６０ｍｇ、約９７０ｍｇ、約９８０ｍｇ、約９９０ｍｇ、又は約１０００ｍｇであり得る。
個々の用量に含有される抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の量は、患者の体重キログラム当たりの抗体のミリグラム単位（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）で表すことができる。例えば、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、約０．０００１～約５０ｍｇ／ｋｇの患者体重（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、１５．５ｍｇ／ｋｇ、１６．０ｍｇ／ｋｇ、１６．５ｍｇ／ｋｇ、１７．０ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、１８．０ｍｇ／ｋｇ、１８．５ｍｇ／ｋｇ、１９．０ｍｇ／ｋｇ、１９．５ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇなど）の用量で患者に投与され得る。
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体若しくはその抗原結合断片、又は抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体若しくはその抗原結合断片を含む薬学的組成物の複数回用量は、既定されるタイムコースにわたって対象に投与され得る。本開示のこの態様による方法は、本開示の活性成分の複数回用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「順次投与すること」とは、活性成分の各用量が、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週、又は月）を隔てた異なる時点、例えば、異なる日に対象に投与されることを意味する。本開示には、活性成分の単回初期用量、続いて活性成分の１回以上の二次用量、続いて任意選択的に活性成分の１回以上の三次用量を患者に連続的に投与することを含む方法が含まれる。
「初回用量」、「二次用量」、及び「三次用量」という用語は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体若しくはその抗原結合断片又は本開示の併用療法の投与に関する時系列を指す。したがって、「初回用量」は、治療レジメンの開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」とも称される）、「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量、及び三次用量は全て、同じ量の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片を含有し得るが、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、初回用量、二次用量、及び／又は三次用量の含有する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の量は、治療経過中に（例えば、必要に応じて上下に調整されて）互いに異なっている。ある特定の実施形態では、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つ）の用量が、治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、その後の用量は、より少ない頻度ベース（例えば、「維持用量」）で投与される。
本開示のある特定の例示的な実施形態では、各二次用量及び／又は三次用量は、直前の投与から１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、又はそれ以上）週間後に投与する。「直前の投与」という句は、本明細書で使用される場合、一連の複数回投与において、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の用量を意味し、これは、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者に投与される。
本開示のこの態様による方法は、任意の数の二次及び／又は三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単回の二次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又はそれ以上）の二次用量が、患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単回の三次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、又はそれ以上）の三次用量が、患者に投与される。
複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の投与から１～２週間後又は１～２カ月後に、患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の投与から２～１２週間後に、患者に投与され得る。本開示のある特定の実施形態では、二次用量及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過中に調整され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）投与され得る。他の実施形態では、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片、及び少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することを含む併用方法では、抗体及び追加の治療剤は、対象に、例えば、単一の治療用量で、又は互いに同時に、又は約５分未満以内に投与される２つの別々の用量で、同時に、又は実質的に同時に、対象に投与され得る。代替的に、抗体及び追加の治療剤は、例えば、約５分を超えて時間的に互いに分離された別個の治療用量で、連続的に対象に投与され得る。
したがって、一実施形態では、この方法は、治療有効量の、抗凝固剤、利尿剤、心臓グリコシド、カルシウムチャネル遮断剤、血管拡張剤、プロスタシクリン類似体、内皮アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エンドペプチダーゼ阻害剤、脂質低下剤、及びトロンボキサン阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの治療剤を投与することを更に含む。一実施形態では、本開示の方法は、治療有効量の少なくとも１つ以上の追加の治療用抗体又は抗体、又は抗原結合断片若しくはその断片を投与することを更に含む。一実施形態では、１つ以上の追加の抗体又は抗体は、抗Ｇｒｅｍ １抗体又は抗体、抗ＰＤＧＦＲβ抗体又は抗体、抗ＴＬＲ４抗体又は抗体、抗ＴＬＲ２抗体又は抗体、抗ＥＤＮ１抗体又は抗体、及び抗ＡＳＩＣ１抗体又は抗体からなる群から選択される。
適切な抗凝固剤の例としては、例えば、血栓症及び血栓塞栓症の増大するリスクを有する肺高血圧症患者の治療に有用なワルファリンが挙げられるが、これに限定されない。
好適なカルシウムチャネル遮断薬の例には、ジルチアゼム、フェロジピン、アムロジピン、及びニフェジピンが含まれるが、これらに限定されない。
好適な血管拡張剤には、例えば、プロスタシクリン、エポプロステノール、トレプロスチニル、及び一酸化窒素（ＮＯ）が含まれるが、これらに限定されない。
好適な例示的なホスホジエステラーゼ阻害剤には、特に、例えば、タダラフィル、シルデナフィル、及びバルデナフィルなどのホスホジエステラーゼＶ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。
好適なエンドセリンアンタゴニストの例には、例えば、ボセンタン及びシタキセンタンが含まれるが、これらに限定されない。
好適なプロスタシクリン類似体には、例えば、イロメジン、トレプロスチニル、及びエポプロステノールが含まれるが、これらに限定されない。
好適な脂質低下剤としては、例えば、シンバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、ロバスタチン、イタバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン、ＺＤ－４５２２、及びセリバスタチンなどのＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の併用療法での使用に適した利尿剤には、例えば、クロロタリドン、インダパミド、ベンドロ－フルメチアジド、メトラゾン、シクロペンチアジド、ポリチアジド、メフルシド、キマピド、クロロチアジド、及びヒドロクロロチアジドが含まれるが、これらに限定されない。
他の治療薬の例としては、例えば、エナラプリル、ラミプリル、カプトプリル、シラザプリル、トランドラプリル、フォシノプリル、キナプリル、モキシプリル、リシノプリル及びペリンドプリルなどのＡＣＥ阻害剤、又はロサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、エンブサルタン、バルサルタン及びテルミサルタンなどのＡＴＩＩ阻害剤、又はイロプロスト、ベタプロスト、Ｌ－アルギニン、オマパトリラト、酸素、及び／又はジゴキシンが挙げられるが、これらに限定されない。
本方法はまた、キナーゼ阻害剤（例えば、ＢＭＳ－３５４８２５、カネルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウチニブ、ロナファルニブ、ペガプタニブ、ペリチニブ、セマキサニブ、タンデュチニブ、チピファルニブ、バタラニブ、ロニダミン、ファスジル、レフルノミド、ボルテゾミブ、イマチニブ、エルロチニブ、及びグリベック）並びに／又はエラスターゼ阻害剤の併用を含み得る。
追加の治療活性成分は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与の前に、対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、又は１分未満前に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性成分は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与後に、対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与から１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。
更に他の実施形態では、追加の治療活性成分は、本開示の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与と同時に、対象に投与され得る。本開示の目的のための「同時」投与には、例えば、単一の剤形での、又は互いに約３０分以内に対象に投与される別個の剤形での、対象への抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び追加の治療活性成分の投与が含まれる。別々の剤形で投与する場合、各剤形は、同じ経路で投与することができ（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び追加の治療活性成分の両方が、静脈内、皮下、硝子体内などに投与することができ）、代替的に、各剤形は、異なる経路で投与することができる（例えば、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、局所（例えば、硝子体内）投与することができ、追加の治療活性成分が、全身投与することができる）。いずれの事象においても、単回剤形で、同じ経路による別個の剤形で、又は異なる経路による別個の剤形でこの成分を投与することは全て、本開示の目的のために、「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「の前の」、「と同時の」、又は「の後の」抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の投与は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はその抗原結合断片の投与と考えられる）。
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法及び組成物の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図しない。特に指定しない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は℃であり、圧力は、大気圧又はその付近である。
ＲＥＧＮ１３３３５及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐという用語は、本明細書において交換可能に使用される。更に、ＲＥＧＮ１５１７１及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐという用語は、本明細書において交換可能に使用される。
実施例１．抗ＰＤＧＦ抗体のスクリーニング及びインビトロ特性決定
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の単離及び一次スクリーニングのために、Ａｄａｍ６／ＶＩ－３、ＵＬＣ１６３３、及びＵＬＣ１６３５マウスを利用した。考慮すべき事項には、サルとの交配、及びマウスとの交配が必要であり、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢシグナル伝達の遮断が必要であった。ＤＤへの交差は、起こりにくいと考えられ、ＰＤＧＦ ＡＡへの交差反応は、予想されなかった。ＡＦ－２２０－ＮＡヤギａ－ヒトＰＤＧＦＢＢポリクローナル中和抗体を、対照／比較抗体として使用した。
ＰＥＳで選別されたＢ細胞は、１２匹のマウスから単離した。Ａｄａｍ６／ＶＩ－３、ＵＬＣ１６３３、及びＵＬＣ１６３５マウスを使用して、抗原ビオチン－ｈＰＤＧＦＢＢ又はｍＰＤＧＦＢＢを選別し、６３８７個のＢ細胞を収集した。Ｂ細胞の１１個のプレートを処理し（３６１４個のＢ細胞）、ＶＨをＵＬＣマウスについてのみ増幅した。合計１０５６個のＰＣＲ対を、ｈＩｇＧ１ ＢＳＴプラスミドにクローニングした。Ａｇ＋試料の一次スクリーニングを、ＥＬＩＳＡによって実施した。合計８５４個のＡｇ＋（８１％）試料が、同定された（１０００個超のＭＦＩからｈＰＤＦＧＢＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））。ブロッキングＥＬＩＳＡ、ブロッキングＬｕｍｉｎｅｘ、Ｂｉａｃｏｒｅ、及びバイオアッセイを使用して、Ａｇ＋試料に対して、二次スクリーニングを行った。マウスとの交配を、マウスＢｉａｃｏｒｅ及びＢｉｏａｓｓａｙを使用して分析した。ＶＩ－３マウス由来のモノクローナル抗体のスクリーニング結果を、以下の図１及び表１に要約する。
本開示の精製された抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体に結合するヒト及びマウスＰＤＧＦ－Ｂの平衡解離定数（ＫＤ値）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー機器、ＭＡＳＳ－１を使用して決定された。全ての結合研究を、２５℃及び３７℃で、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのヘパリン、及び０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－Ｔ）泳動緩衝液中で実施した（図２）。ＨＣＡセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ１００８３９）をカップリングするアミンによって最初に誘導体化し、抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体を個別に捕捉した。ＨＢＳ－ＥＨＴ泳動緩衝液中で調製された異なる濃度のヒトＰＤＧＦ－Ｂ（ｈＰＤＧＦ－Ｂ；５０ｎＭ、１２．５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）又はマウスＰＤＧＦ－Ｂ（ｍＰＤＧＦ－Ｂ；５０ｎＭ、１２．５ｎＭ、３．１２５ｎＭ）を、捕捉された抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体上に、５０μＬ／分の流速で４分間注入し、捕捉された抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体に結合したＰＤＧＦ－Ｂ試薬の解離を、ＨＢＳ－Ｔ泳動緩衝液中で１０分間モニタリングした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、質量輸送制限を伴う１：１結合モデルに適合させることによって、速度論的結合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数を決定した。異なる抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体の結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
２５℃及び３７℃での本開示の異なる抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体に結合するｈＰＤＧＦ－Ｂ又はｍＰＤＧＦ－Ｂの結合反応速度パラメータを、表２～４に示す。
３７℃での本開示の例示的な抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体に結合するｈＰＤＧＦ－Ｂ又はｍＰＤＧＦ－Ｂの結合反応速度パラメータを、表５～６に示す。
これらの結合データは、抗ＰＤＧＦ－Ｂ－ｍＡｂ（例えば、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐ）が、ｐＭ濃度でヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスＰＤＧＦ－ＢＢに特異的に結合することができることを実証する。
実施例２．重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表７は、ＰＤＧＦ－Ｂに特異的な選択された抗体及びそれらの対応する抗体識別子の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列対を記載する。抗体は、典型的には、以下の命名法に従って本明細書で参照される：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ４Ｈ」）、続いて数値識別子（例えば、表７に示すように「３１３２」）、続いて「Ｐ」接尾辞。したがって、この命名法によれば、抗体は、例えば、「Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ」と称され得る。本明細書に使用される抗体名のＨ４Ｈ接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。
実施例３．精製された抗ＰＤＧＦ－ＢＢモノクローナル抗体間の交差競合
精製された抗ＰＤＧＦ－ＢＢモノクローナル抗体（ｍＡｂ）間の交差競合を決定するために、約１．２～１．６ｎＭの抗ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂを、５０μｇ／ｍＬの抗ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂを含有するウェルにα－ｈＦｃコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーを３分間浸漬することによって捕捉する（図３Ａ）。Ｈ４Ｈ ｈＦｃ（アイソタイプ対照）を、陰性対照として使用した。未占有のα－ｈＦｃ Ｏｃｔｅｔセンサーを、ブロッキングｍＡｂ溶液（２００μｇ／ｍＬのＨ４ＨヒトＦｃ（アイソタイプ対照）１）を含有するウェルに４分間浸漬することによって飽和させ、１００ｎＭのヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ）を、１ｕＭの抗ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂで少なくとも２時間プレインキュベートした。ブロッキングｍＡｂ飽和Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを、抗ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂ及びヒトＰＤＧＦ－ＢＢの事前混合物を含有するウェルに４分間浸した。各サイクルの終わりに、α－ｈＦｃ Ｏｃｔｅｔセンサーを、１０ｍＭ ＨＣｌ中で再生した。解析中、捕捉表面へのｍＡｂへの結合に起因して引き起こされる自己バックグラウンド結合シグナルは、カラム全体から差し引かれる。ｍＡｂ－１の結合応答を比較し、競合ｍＡｂ及び非競合ｍＡｂを、それぞれのｍＡｂ－１結合応答に基づいてビニングした。
交差競合試験は、ＨＢＳＴ＋０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの泳動緩衝液を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器で、２５℃で行った。センサータイプは、抗Ｈｉｓ、捕捉流量／時間は、３分間、１０００ｒｐｍであり、試料注入流量／時間は、様々な時間で、１０００ｒｐｍであった。図３Ｂは、抗体交差競合アッセイの結合応答の結果を示すマトリックスを示す。精製された抗体の親和性は、０．００２ｎＭ～２ｎＭの範囲である。
実施例４．ＥＬＩＳＡの使用による抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の特性決定
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を、２つのブロッキングＥＬＩＳＡフォーマット：プレート捕捉ＰＤＧＦＲ－Ｂに結合するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢをブロッキングすることで特徴付けた。研究を実施するために、１ｕｇ／ｍｌのヒトＰＤＧＦＲ－ベータ－ｍｍＨ（ＲＥＧＮ９７９ロット番号０１－１００３２６）を、４℃で一晩プレート上にコーティングした。
事前結合：１００ｎＭ＋１００ｐＭの最終濃度ＰＤＧＦ－ＡＢ（Ｒ＆Ｄ、２２２－ＡＢ）又は６０ｐＭの最終濃度ＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ、２２０－ＢＢ）からのＡｂｓの１２点の３倍連続希釈液。室温で１時間。検出：：１：１０，０００ ＳＡ－ＨＲＰ。
図４Ａ～Ｃに示されるように、７０％超遮断する５つの強力な抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体を同定し、３つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．２３～１．８ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢの両方を遮断し、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．５５～０．６４ｎＭのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢのみ遮断し、６つの中等度の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、４５％超遮断し、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、２．８～１３ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢの両方を遮断し、４つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、０．６４～２．８ｎＭのＩＣ５０値範囲を有するＰＤＧＦ－ＢＢのみ遮断し、６つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が非ブロッカーであった。
実施例５．抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢを阻害する
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の活性を決定するために、ＰＤＧＦ－ＢＢを使用して、バイオアッセイを行った。バイオアッセイを実施するために、２０，０００個のＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＰＤＧＦＲβ単一細胞選別細胞／ウェルを、０．１％ ＦＣＳ Ｏｐｔｉｍｅｍに一晩播種した。用量反応は、ヒトＰＤＧＦ ＢＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００－１４Ｂ、ロット番号１１１００４、大腸菌由来）について、１：３の連続希釈を１００ｎＭで開始して決定された。阻害は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ、抗ＰＤＧＦＲｂ（ＲＥＧＮ２１７６、０８－Ｒ１２０７３１）、及び精製抗体（１：３の連続希釈を１００ｎＭで開始する）を、５００ｐＭのヒトＰＤＧＦ－ＢＢを有する細胞に添加して、決定された。プレートを、３７℃で５．５時間インキュベートし、発光を、Ｏｎｅ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。
図５Ａに示されるように、１７個の抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうち１３個が、５００ｐＭのｈＰＤＧＦ ＢＢを、ＩＣ５０値が８８ｐＭ～７．２ｎＭで、最大阻害率が４２～９９％で阻害した。更に、図５Ｂに示されるように、２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢで活性化された。図５Ｃは、１７個の抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちの８個が、５ｎＭのヒトＰＤＧＦ－ＡＢを、ＩＣ５０値が９９ｐＭ～５０ｎＭで、最大阻害率が３２～９９％で阻害したことを示す。Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐは、ＩＣ５０値が８．８及び２．６ｎＭでベースラインまで遮断された。最後に、図５Ｄは、１７個の抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体のうちの１０個が、６００ｐＭのマウスＰＤＧＦ－ＢＢを、ＩＣ５０値が４５０ｐＭ～６．４ｎＭで、最大阻害率が３９～９８％で阻害したことを示す。これらの結果は、６つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、ＩＣ５０値が３１０ｐＭ～２ｎＭのヒトＰＤＧＦ－ＢＢの完全な阻害を示すことを実証する。具体的には、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ｈＰＤＧＦ ＢＢ、ｈＰＤＧＦ ＡＢ、及びｍＰＤＧＦ ＢＢの３つ全てのリガンドをベースラインまで阻害する。ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－ｌｕｃ／ｈＰＤＧＦＲβ細胞における例示的な抗ｈＰＤＧＦ－Ｂ抗体の使用によるＰＤＧＦ－Ｂ活性化の阻害を、以下の表８～９に要約する。
Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐは、ｈＰＤＧＦ－ＢＢ、ｈＰＤＧＦ－ＡＢ、ｍＰＤＧＦ－ＢＢ、及びｃｙｎｏＰＤＧＦ－ＢＢに対してＩＣ５０値が１．９～９．０ｎＭで８７％超の阻害を示す。
Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ｈＰＤＧＦ－ＢＢ、ｈＰＤＧＦ－ＡＢ、ｍＰＤＧＦ－ＢＢ、及びｃｙｎｏＰＤＧＦ－ＢＢに対してＩＣ５０値が０．５～３ｎＭの完全な阻害を示す。
実施例６．組換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢと抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体（ｍＡｂ）との間で形成された複合体の分析
多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）に結合したサイズ排除クロマトグラフィーを、組換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）といくつかの抗ＰＤＧＦリードｍＡｂとの間に形成された複合体の相対サイズ分布を評価するために使用した。５ｍＭのＰＤＧＦ－ＢＢ＋５ｍＭのｍＡｂ（等モル比）を、試験した各抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂについてｐＨ７．４の１×ＰＢＳで調製し、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる総タンパク質の分画の前に、室温で３時間インキュベートした。ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ条件下で、１００ｍｇ（総タンパク質）の各試料を、１注入当たり９０分の実行時間で、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４（移動相）のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラムに二重に注入した。
Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ（ピーク１）は、２：２のｍＡｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ種と一致する、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢと異なる複合体（ピーク２）を大きく形成した（図６Ａ）。更に、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ（ピーク１）は、２：２のｍＡｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ種と一致するヒトＰＤＧＦ－ＢＢと異なる複合体（ピーク２）を大きく形成した（図６Ｂ）。図６Ｃは、検出可能な高次複合体が観察されない、最も異なる２：２のｍＡｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ種を形成する試料からのオーバーレイされたクロマトグラムを示す。
概して、ほとんどの抗ＰＤＧＦ ｍＡｂは、２：２のｍＡｂ：ｈＰＤＧＦ－ＢＢ種と一致して、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢと大きく異なる複合体を形成するように思われ、高次複合体（「紙人形」）はほとんど又はまったく観察されなかった。２：２のｍＡｂ：ｈＰＤＧＦ－ＢＢ種よりも大きいわずかな量の高次複合体が、試料Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ、及びＨ４Ｈ１３１６２Ｐで観察されたが、これらの複合体が、ｈＰＤＧＦ－ＢＢと、各ｍＡｂ試料中に様々な量で存在した抗体の単量体形態又は抗体多量体（ＨＭＷ種）との相互作用の結果として形成されたかどうかは不明である。代替的に、これらの試料中の高次複合体は、単量体抗体と、検出された少量の多量体ｈＰＤＧＦ－ＢＢとの相互作用に起因し得る。試料Ｈ４Ｈ１３１４８Ｐ及びＨ４Ｈ１３１６９Ｐは、検出可能な高次複合体が存在しない、最も異なる２：２のｍＡｂ：ｈＰＤＧＦ－ＢＢ種を形成するように思われた。興味深いことに、これらの２つの試料によって形成された複合体は、類似の計算されたモル質量を有したが、Ｈ４Ｈ１３１４８Ｐによって形成された複合体は、Ｈ４Ｈ１３１４８Ｐによって形成された複合体の分子形状（流体力学的半径）が本質的によりコンパクトであることを示唆する、同等のＨ４Ｈ１３１６９Ｐ複合体よりも後に著しく溶出した。２：２のｍＡｂ：ｈＰＤＧＦ－ＢＢ複合体の推定モル質量の複合体の広範な分布が、Ｈ４Ｈ１３１５５Ｐ試料中で観察され、これは、溶液中でｈＰＤＧＦ－ＢＢにより形成された複合体が、分画プロセス中に解離していたこと、又は試験された実験条件下で試料が平衡に達しなかったことを示し得る。
実施例７．抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５ＰのカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢタンパク質バイオアッセイの検証
カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢを、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ及びＳｉｎｏ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌからＦｃ融合物として得た。ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｍｆＰＤＧＦＢＢ－ｅｃｔｏ／ｈＰＤＧＦＲｂ－ｃｙｔｏ細胞ｐ２を、９６ウェルプレートに播種し、細胞を、２．５×１０５細胞／ｍｌ（２０，０００細胞／ウェル）の８０ｕｌ／ウェルで３７℃、５％ ＣＯ２で一晩添加した。ＰＤＧＦ－ＢＢの用量反応を、２０ｎＭから開始する１～３希釈で決定した。阻害を決定する（ｄｅｔｒｍｅｎｉｎｇ）ために、１：３の連続的に希釈したＡｂを、５００ｐＭのＰＤＧＦ－ＢＢを定数として５００ｎＭから開始して分析した。プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で５．５時間インキュベートした。プレートを、インキュベーターから取り出し、室温（ＲＴ）で約３０分間平衡化した。１００ｕｌのＯｎｅ－ｇｌｏ基質（ＲＴに平衡化された）を、プレートの全てのウェルに添加し、プレートシェーカー上で、ＲＴで１０分間混合した。発光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３Ｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（商標））を使用して測定した。図７に示されるように、このアッセイシステムにおいて、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ヒト及びカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢタンパク質の両方に対してＨ４Ｈ１３１３２Ｐよりも更に強力であるように同定された。
以下のアッセイは、サルＰＤＧＦＲβの細胞外ドメインの発現を伴う細胞におけるカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢ誘導型シグナル伝達を遮断する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の効力を決定するために使用した。
ルシフェラーゼバイオアッセイ
操作された細胞株、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｍｆＰＤＧＦＲβ－ｅｃｔｏ／ｈＰＤＧＦＲｂ－ｃｙｔｏ細胞（ＡＣＬ７８０４）は、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐが、カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢによって駆動されるルシフェラーゼ発現を中和する能力をアッセイするために使用した。細胞を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ培地中の０．５％ウシ血清アルブミン、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－グルタミン）を使用して９６ウェルプレートに播種し、血清を、一晩飢餓させた（３７℃、５．０％ ＣＯ２）。
用量反応曲線の生成
カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢの用量反応曲線は、アッセイ培地中で希釈されたリガンドを、３ｐＭ～２０ｎＭの範囲の濃度でＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｍｆＰＤＧＦＲβ－ｅｃｔｏ／ｈＰＤＧＦＲｂ－ｃｙｔｏ細胞に添加することによって決定された。各濃度を、二重に試験し、リガンドを添加しないウェルを陰性対照として機能させた。カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢの添加後、細胞を、３７℃、５．０％ ＣＯ２で５．５時間インキュベートし、次いで３０分間室温に平衡化した。等体積のＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を、各ウェルに添加し、プレートを、室温で更に５分間インキュベートした。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３Ｘプレートリーダーで測定し、値を、１０点の用量反応曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）上の４パラメータロジスティック方程式によって分析した。
阻害曲線の生成
Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐを、ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｍｆＰＤＧＦＲβ－ｅｃｔｏ／ｈＰＤＧＦＲｂ－ｃｙｔｏ細胞株におけるカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢ媒介ｍｆＰＤＧＦＲβシグナル伝達の阻害について試験した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ、又は陰性対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を、２２８ｐＭ～５００ｎＭの範囲の濃度で細胞に二重に添加し、続いて５００ｐＭでカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢを添加した。プレートを、３７℃、５．０％ ＣＯ２で５．５時間インキュベートし、３０分間室温に平衡化した。等体積のＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を、各ウェルに添加し、プレートを、室温で更に５分間インキュベートした。相対光単位（ＲＬＵ）を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３Ｘプレートリーダーで測定し、値を、１０点の用量反応曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）上の４パラメータロジスティック方程式によって分析した。
結果
リガンド媒介性カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢ媒介性ｍｆＰＤＧＦＲβシグナル伝達の遮断
ＨＥＫ２９３／ＳＲＥ－Ｌｕｃ／ｍｆＰＤＧＦＲβ－ｅｃｔｏ／ｈＰＤＧＦＲｂ－ｃｙｔｏ細胞株における最大活性レベルの５０％（ＥＣ５０）までのｍｆＰＤＧＦＲβシグナル伝達を刺激するのに必要なＳｉｎｏ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢ Ｆｃタグの濃度は、１６７ｐＭであった（図７）カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢの固定濃度の存在下で、最大活性の５０％（ＩＣ５０）までのＰＤＧＦ－ＢＢシグナル伝達を低減するのに必要な抗体の濃度は、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ、Ｈ４ｈ１３１４５Ｐ、及びアイソタイプ対照抗体であるＲＥＧＮ１９４５（ネコＦｅｌ ｄ １に対して提起され、ｍｆＰＤＧＦＲβへの結合はない抗体）について決定された。図７に示されるように、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐは、それぞれ、ＩＣ５０値が７８１ｐＭ及び１６ｐＭで、５００ｐＭの固定濃度のカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢによって誘導されるカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢシグナル伝達を効果的に遮断した。対照的に、ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体であるＲＥＧＮ１９４５は、カニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢによって誘導されるカニクイザルＰＤＧＦ－ＢＢシグナル伝達を遮断するのに効果がなかった。
実施例８．抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐに対する市販のサルＰＤＧＦ－ＢＢ試薬のＢｉａｃｏｒｅ結合の検証
抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂ Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐに対する市販のサルＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）の結合速度論を決定するために、約２５０～３５０ＲＵの抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂを、２５℃でのＭＡＳＳ－２の抗ｈＦｃ ＨＣＡチップ上の陰性対照（ＲＥＧＮ１９４５）で捕捉した。９０ｎＭのヒト及びサルＰＤＧＦ－ＢＢを調製し、連続的に３倍に希釈した。試料を、２５ｕＬ／分で３分間注入し、解離を、１０分間モニタリングした。反応速度論パラメータは、質量輸送制限を伴う１：１の結合モデルを使用してリアルタイムデータを適合させることによって評価した。図８に示されるように、商業的なサルＰＤＧＦ－ＢＢは、抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂ Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐへの特異的結合を示した。
実施例９．ＰＤＧＦ－ＢＢ上のｍＡｂ結合エピトープのウエスタンブロット検出
抗体の様々な性能を理解するための鍵は、それらが認識する結合部位又はエピトープを決定することである。エピトープは、概して、連続的なアミノ酸のストレッチが結合に十分である線形エピトープと、主要なアミノ酸残基がタンパク質折り畳みによって一緒になるコンフォメーションエピトープとの２つの分類に分けられる。線形エピトープは、タンパク質標的が、ウエスタンブロット（ＷＢ）などの免疫アッセイの前の試料調製中に完全に又は部分的に変性される用途に好ましくあり得る。したがって、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２ＰによるＰＤＧＦ－ＢＢのウエスタンブロット分析は、これらのｍＡｂが線形エピトープに結合するかどうかを判定するために実施した。
Ｒ＆Ｄシステム１μｇからのヒト組換えＰＤＧＦ－ＢＢ二量体タンパク質（ＣＦ）は、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下で、ＳＤＳ ＰＡＧＥ ５～２０％の勾配ゲルで分解された。以下のステップを、ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂ Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及び市販の抗ＰＤＧＦ－ＢＢ ａｂ（Ｒ＆Ｄ抗ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ ａｂ：ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ抗体ＡＦ－２２０－ＮＡ）によるＲ及びＮＲの両方の条件下で、ＰＤＧＦ－ＢＢバンドを検出するために使用した。非特異的なブロッキングの場合：ＰＶＤＦ膜を、５％ ＢＳＡ中で、室温で１時間ブロッキングした。一次Ａｂブロッティングの場合：ＰＶＤＦ膜（１）ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂ Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ又は（２）１．０ｕｇ／ｍｌでのＲ＆Ｄ抗ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂを５％ ＢＳＡ ＴＢＳＴ中の４Ｃで一晩希釈。膜を、ＴＢＳＴ洗浄緩衝液中で、室温で１０分間（３回）洗浄した。二次抗体インキュベーションは、５％ ＢＳＡ ＴＢＳＴ中のＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次Ａｂ中の膜を、室温で１時間インキュベーションすることを含んだ。膜洗浄は、室温で１０分間（３回）のＴＢＳＴ緩衝液の使用を含んだ。シグナルは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ウエスタンブロットシグナルエンハンサーを用いて発現させた。
１μｇ／レーンの組換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢは、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分解され、銀染色によって可視化され、それぞれ、１３ｋＤａ及び２８ｋＤａで単一のバンドを示した。図９は、抗体結合エピトープのウエスタンブロット分析が、Ｈ４Ｈ１３１４５ＰがヒトｒＰＤＧＦ－ＢＢの線形エピトープに結合することを確認したことを示す。
実施例１０．Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐの前臨床実験ＰＡＨ有効性評価
リードｍＡｂを介したＰＤＧＦ－Ｂ遮断（Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ）は、ＰＡＨの複数のモデル（マウス＋ラット）において堅牢な治療上の利益をもたらした。これらの効果は、ＳＯＣを含むこれまでの任意の治療又はベンチマークよりも印象的であった。これらの結果は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体が、効果的な非血管拡張剤ＰＡＨ療法を提供することを実証する。
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐの肺動脈高血圧症における効果を評価するために、慢性低酸素誘発性肺動脈高血圧症マウスモデル及びモノクロタリンラットモデルを使用して、別々の研究を実施した。
ＰＡＨモデルを、以下の表１０に要約する。
これらの研究では、以下の材料及び方法が、使用された。
材料及び方法
マウス
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、血管抵抗の進行性の増加につながる肺血管リモデリングを特徴とする。肺動脈圧の上昇は、代償性右心室肥大及び最終的な不全を誘発する。血小板由来成長因子－Ｂ（ＰＤＧＦ－Ｂ）は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーである強力なマイトジェンである。ＰＤＧＦ－Ｂ／ＰＤＧＦＲβシグナル伝達は、病理学的な肺動脈血管リモデリングを調節する中心的なシグナル伝達経路であることが示されている。この研究は、治療的に投与されたときの、低酸素症／ｓｕｇｅｎ ＰＡＨマウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の有効性を比較することである。
第１の研究では、１４～１６週齢の雄ヒト化ＰＤＧＦＲβ ｈｕ－ｈｕマウス（ＭＡＩＤ＃１６３９）を使用した。開始体重が異なる群間で同様であるように、マウスを、重量別に処置群に分けた。ケージは、約２１％ Ｏ２（正常圧正常酸素）に留まるか、又は室内空気の安定した吸入にＮ２流量を調整して、低Ｏ２レベルを維持した１０％ Ｏ２（正常圧低酸素）チャンバ（修飾した６’半剛体アイソレータユニット、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に配置されるかのいずれかを選択した。低酸素室内のマウスに、週に１回、６週間、２０ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦ受容体阻害剤Ｓｕｇｅｎ５１４６を皮下投与した。マウスに、表１１に概説されるように、２１日目に開始して３週間、抗体を投与した。６週目の終わりまでに、右心カテーテル法によって右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定し、ＲＶと（ＬＶ＋隔壁）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によってＲＶ肥大を計算した。
第２の研究（研究２）では、１２～１４週齢の雄Ｃ５７／ＢＬマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）を、研究のために使用した。開始体重が異なる群間で同様であるように、マウスを、重量別に処置群に分けた。ケージは、約２１％ Ｏ２（正常圧正常酸素）に留まるか、又は室内空気の安定した吸入にＮ２流量を調整して、低Ｏ２レベルを維持した１０％ Ｏ２（正常圧低酸素）チャンバ（修飾した６’半剛体アイソレータユニット、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に配置されるかのいずれかを選択した。低酸素室内のマウスに、週に１回、６週間、２０ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦ受容体阻害剤Ｓｕｇｅｎ５１４６を皮下投与した。マウスに、表１２に概説されるように、２１日目に開始して３週間、抗体を投与した。６週目の終わりまでに、右心カテーテル法によって右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定し、ＲＶと（ＬＶ＋隔壁）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によってＲＶ肥大を計算した。マウス血清を、ヒト抗体ＩｇＧ評価のために４２日目に収集した。
右心カテーテル法及び右室収縮期圧
マウスを、イソフルランで麻酔し、加熱プラットフォーム（Ｈｅａｔｅｄ Ｈａｒｄ Ｐａｄ １、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び循環加熱水ポンプ（Ｔ／Ｐｕｍｐ Ｃｌａｓｓｉｃ、Ｇａｙｍａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して、約３７℃で維持した。各マウスの頸部領域は、右総頸動脈及び右頸静脈を脱毛することによって手術のために準備した。切開を行い、頸動脈及び／又は迷走神経を損傷しないように注意して右頸静脈を単離した。５－０の絹縫合糸の一部を、単離した頸静脈の下に配置して、血管を頭側に後退させた後、３０ゲージの針で頸静脈に穴を開けた。圧力カテーテル（マイクロチップカテーテル変換器ＳＰＲ－１０００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を頸静脈の開口部に挿入し、右心房を通過して右心室に進めた。カテーテルは、心拍数並びに拡張期及び収縮期の右心室圧の両方を測定した圧力／容積計器（ＭＰＶＳ－３００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）に接続した。これらのパラメータは、データ取得システム（ＰｏｗｅｒＬａｂ ４／３５、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデジタル取得された。ＬａｂＣｈａｒｔ Ｐｒｏ ７．０ソフトウェア（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、右心室圧力を分析した。測定値は、圧力トレーシングの６０秒間隔から定量化した（圧力安定化を可能にするために２分間の記録後）。分析したパラメータは、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）、心拍数（ＨＲ）、及び右心室圧上昇率（ｄＰ／ｄｔ ｍａｘ）であった。
右心肥大評価
インビボ血行動態測定の後、動物を麻酔下で放血によって安楽死させ、次いで、ＲＶ自由壁、左心室（ＬＶ）及び中隔組織を採取し、重み付けした。ＲＶ肥大は、ＲＶと（ＬＶ＋中隔）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によって計算された。次いで、生化学的分析のために、ＲＶ組織を凍結保存した（－８０℃）。安楽死直後に、各マウスについてヘマトクリットを取得した。
血清ヒトＩｇＧ評価
血清ＰＤＧＦ－Ｂ抗体ヒトＩｇＧは、グリセロール中で希釈されたビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ４モノクローナル抗体（ＲＥＧＮ２５６７）によってＧｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ（商標）２００ ＣＤ上に捕捉され、グリセロール中で希釈されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－コンジュゲートマウス抗ヒトカッパ抗体によって検出される。血清試料を、以下に記載されるように処理する：１）血清試料を希釈緩衝液で１：５０に希釈し、合計８点の標準物質に対して希釈緩衝液を使用して標準物質を２μｇ／ｍＬの開始濃度になるまで希釈する。２）洗浄中に、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ４を１００ｕｇ／ｍＬになるまで希釈する。３）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－コンジュゲートマウス抗ヒトカッパ抗体を、洗浄緩衝液中で１０ｕｇ／ｍＬになるまで希釈する。４）捕捉及び検出抗体を、１５，０００ＲＣＦで５分間遠心分離する。５）検出緩衝液中で０．５ｕｇ／ｍＬの最終濃度になるまで検出抗体を更に希釈する（遠心分離した検出抗体の最上層のみを使用する）。６）ＧＹＲＯＳが生成したプレートマップを使用して、試料、標準物質、洗浄緩衝液を充填し、９６ウェルＰＣＲプレート上で抗体を捕捉し、検出する。
統計分析
定量的データを、平均±標準偏差として表す。２つの群間で実施された統計分析は、ｔ検定によって分析された。時間経過の比較を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。複数の薬物治療群の治療効果の比較を、一元ＡＮＯＶＡによって分析した。ＰＲＩＳＭソフトウェアを、全ての統計分析に使用した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
研究１の投与スケジュールを、表１１に示す。
研究２の投与スケジュールを、表１２に示す。
超音波評価及び分析
各研究の最終日に、高周波超音波システム（Ｖｅｖｏ ２１００、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を使用して、各マウスの肺動脈のサイズ並びに右心室の機能及び寸法を評価した。評価のために、マウスを、（医療用グレードの空気の１．０ｃｃ／ｍＬの速度で、１．５％イソフルランで）麻酔し、その温度を、直腸体温プローブでモニタリングし、加熱プラットフォーム（ＭｏｕｓｅＭｏｎｉｔｏｒＳ、Ｉｎｄｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び加温ランプを用いて約３７℃で保持した。明るさモード（Ｂモード）及び動きモード（Ｍモード）の両方のイメージングを使用した。断面におけるマウス心臓のＢモードイメージングを、肺動脈弁のレベルで肺動脈断面積（ＰＡ ＣＳＡ）を決定するために使用した。Ｍモードイメージングを、肺動脈を通る血流の代表的なドップラー追跡の曲線下の面積に由来するパルス波速度時間積分（ＶＴＩ）を決定するために使用した。右心室の一回拍出量（ＲＶ ＳＶ）を、ＰＡ ＣＳＡ及びＶＴＩの積から計算した。右心室の心拍出量（ＲＶ ＣＯ）を、ＳＶ及び心拍数（ＨＲ）の積から計算した。Ｍモードイメージングを、拡張期及び収縮期中の右心室自由壁（ＲＶＦＷ）厚さを決定するために使用した。右心室圧力評価の前に、動物を、元のケージに戻した。
右室圧力評価
その後、全ての治療群について右心室圧力を評価した。マウスを、イソフルランで麻酔し、加熱プラットフォーム（Ｈｅａｔｅｄ Ｈａｒｄ Ｐａｄ １、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び循環加熱水ポンプ（Ｔ／Ｐｕｍｐ Ｃｌａｓｓｉｃ、Ｇａｙｍａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して、約３７℃で維持した。各マウスの頸部領域は、右総頸動脈及び右頸静脈を脱毛することによって手術のために準備した。切開を行い、頸動脈及び／又は迷走神経を損傷しないように注意して右頸静脈を単離した。５－０の絹縫合糸の一部を、単離した頸静脈の下に配置して、血管を頭側に後退させた後、３０ゲージの針で頸静脈に穴を開けた。圧力カテーテル（マイクロチップカテーテル変換器ＳＰＲ－１０００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を頸静脈の開口部に挿入し、右心房を通過して右心室に進めた。カテーテルは、心拍数並びに拡張期及び収縮期の右心室圧の両方を測定した圧力／容積計器（ＭＰＶＳ－３００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）に接続した。これらのパラメータは、データ取得システム（ＰｏｗｅｒＬａｂ ４／３５、ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデジタル取得された。ＬａｂＣｈａｒｔ Ｐｒｏ ７．０ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、右心室圧力を分析した。測定値は、圧力トレーシングの６０秒間隔から定量化した（圧力安定化を可能にするために２分間の記録後）。分析したパラメータは、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）、心拍数（ＨＲ）、及び右心室圧上昇率（ｄＰ／ｄｔ ｍａｘ）であった。血清／組織の収集及び右室肥大の評価
右心室圧測定の完了後、カテーテルを除去し、各動物を殺処分した。腹部を開き、ヘマトクリット評価及び血清収集のために大静脈から血液を採取した。次いで、胸腔を開き、右肺の中葉を５－０絹縫合糸で結紮して切除し、後でＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ０９０１）に入れ、２４時間後に－８０℃で凍結した。各動物から心臓を切除し、右心室（ＲＶ）を左心室及び中隔（ＬＶ＋Ｓ）から慎重に切除した。両方の心臓組織をマイクロ天秤（ＡＪ０００、Ｍｅｔｔｌｅｒ）で別々に秤量し、ＲＶ肥大指数［ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）；Ｆｕｌｔｏｎ指数］を算出した。
各処置群の動物の半数は、肺を２０～２５ｍｍＨｇでリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で灌流し、次いで１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で固定した。肺は、１０％ ＮＢＦに２４時間浸した後、７０％エタノール中に少なくとも４８時間浸し、組織処理及びパラフィン包埋を行った。肺の灌流固定を受けなかった動物については、右下葉を５－０絹縫合糸で結紮してから切除し、秤量して、液体Ｎ２中で凍結した。
ラット
６～７週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。体重が異なる群間で同様であるように、ラットを、処置群に分けた。研究１において、モノクロタリン注射の１日前に、抗体処置群のラットに、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はアイソタイプ対照ＩｇＧのいずれかを、２８日間、週２回、皮下投与した。標準治療群には、３０ｍｇ／ｋｇのマシテンタンを、２８日間、毎日経口投与した。１日目に、ラットに、４０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリン又は５ｍＬ／ｋｇの生理食塩水のいずれかを、皮下投与した。２８日目の終わりまでに、右心カテーテル法によって右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定し、ＲＶと（ＬＶ＋隔壁）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によってＲＶ肥大を計算した。研究２では、ラットに、６０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリン又は５ｍＬ／ｋｇの生理食塩水のいずれかを、皮下投与した。１４日目に開始して、抗体処置群のラットに、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はアイソタイプ対照ＩｇＧのいずれかを、２１日間、週２回、皮下投与した。０日目～３５日目の体重変化を、一般毒性評価のために使用し、動物死亡率を３５日目まで計算した。
研究１の投与スケジュールを、表１３に示す。
研究２の投与スケジュールを、表１４に示す。
右心カテーテル法及び右室収縮期圧
ラットを、イソフルランで麻酔し、加熱プラットフォーム（Ｈｅａｔｅｄ Ｈａｒｄ Ｐａｄ １、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び循環加熱水ポンプ（Ｔ／Ｐｕｍｐ Ｃｌａｓｓｉｃ、Ｇａｙｍａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して、約３７℃で維持した。各ラットの頸部領域は、右総頸動脈及び右頸静脈を脱毛することによって手術のために準備した。切開を行い、頸動脈及び／又は迷走神経を損傷しないように注意して右頸静脈を単離した。５－０の絹縫合糸の一部を、単離した頸静脈の下に配置して、血管を頭側に後退させた後、２３ゲージの針で頸静脈に穴を開けた。圧力カテーテル（マイクロチップカテーテル変換器ＳＰＲ－１０００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を頸静脈の開口部に挿入し、右心房を通過して右心室に進めた。カテーテルは、心拍数並びに拡張期及び収縮期の右心室圧の両方を測定した圧力／容積計器（ＭＰＶＳ－３００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）に接続した。これらのパラメータは、データ取得システム（ＰｏｗｅｒＬａｂ ４／３５、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデジタル取得された。ＬａｂＣｈａｒｔ Ｐｒｏ ７．０ソフトウェア（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、右心室圧力を分析した。測定値は、圧力トレーシングの６０秒間隔から定量化した（圧力安定化を可能にするために２分間の記録後）。分析したパラメータは、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）、心拍数（ＨＲ）、及び右心室圧上昇率（ｄＰ／ｄｔ ｍａｘ）であった。
右心肥大評価
インビボ血行動態測定の後、動物を麻酔下で放血によって安楽死させ、次いで、ＲＶ自由壁、左心室（ＬＶ）及び中隔組織を採取し、重み付けした。ＲＶ肥大は、ＲＶと（ＬＶ＋中隔）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によって計算された。次いで、生化学的分析のために、ＲＶ組織を凍結保存した（－８０℃）。
統計分析
定量的データを、平均±標準偏差として表す。２つの群間で実施された統計分析は、ｔ検定によって分析された。時間経過の比較を、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析した。複数の薬物治療群の治療効果の比較を、一元ＡＮＯＶＡによって分析した。ＰＲＩＳＭソフトウェアを、全ての統計分析に使用した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。
結果
抗ＰＤＧＦ－Ｂは、抗ＰＤＧＦＲβと直接比較した場合に、ＰＡＨの２つの臨床的に関連するエンドポイントにおいて優れた有効性を提供した
低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスにおける体重変化
低酸素症に曝露したマウスは、正常酸素症下の動物と比較して、６週間で体重増加が遅いことを示した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置は、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ４処置群と比較して、体重減少を有意に弱毒化した。抗ＰＤＧＦＲβ抗体処置は、低酸素症曝露によって引き起こされる体重変化へのいかなる影響も示さなかった（図１０）。Ｈｙ／Ｓｕ＋アイソタイプ対照ＩｇＧとＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦ－Ｂとの間でのみ、４２日目の時点で有意差が認められた（＊＊ｐ＜０．０１）。
低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスで誘導された右心室圧の上昇
心臓の右心室圧力のカテーテルベースの評価は、６週目の低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスのアイソタイプ抗体処置群で右心室収縮期圧力の有意な上昇を明らかにした。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置は、右心室収縮期圧の上昇を有意に９ｍｍＨｇ低下させたが、抗ＰＤＧＦＲβ抗体はまた、右心室収縮期圧を少ない程度まで低下させた（図１０）。Ｈｙ／Ｓｕ＋アイソタイプ対照ＩｇＧとＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）とＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦＲβ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）との間に有意差が認められた。Ｈｙ／Ｓｕ＋ＰＤＧＦＲβとＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊ｐ＜０．０５）との間にも有意差が認められた。
低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスに誘導された右心室肥大
マウスの右心重量の死後分析は、低酸素症／ｓｕｇｅｎ曝露マウスに有意な変化が認められた（図１０）。右心室重量対左心室＋中隔重量の比率は、右心室肥大の指数（すなわち、Ｆｕｌｔｏｎ指数）を提供し、低酸素症／ｓｕｇｅｎにおける６週間の群は、正常酸素動物と比較してより大きな比率を示し、このことは、右心室肥大の存在を示した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の治療的処置は、低酸素症／ｓｕｇｅｎアイソタイプ対照処置マウスと比較して、右心室肥大を約３５％減少させた。抗ＰＤＧＦＲβ抗体の使用は、低酸素症／ｓｕｇｅｎ曝露動物における右心室肥大を減少させることができなかった。Ｈｙ／Ｓｕ＋アイソタイプ対照ＩｇＧとＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）とＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦＲβ（＊ｐ＜０．０５）との間に有意差が認められた。Ｈｙ／Ｓｕ＋ＰＤＧＦＲβとＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊ｐ＜０．０５）との間にも有意差が認められた。
要約すると、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスモードにおける抗ＰＤＧＦＲβと直接比較した場合、ＰＡＨの２つの臨床的に関連するエンドポイント（右心室圧及び肥大）において優れた有効性を提供した。
抗ＰＤＧＦ－Ｂの予防的処置は、ＭＣＴラットにおける動物を強力に保護し、抗ＰＤＧＦ－Ｂの治療的処置は、高用量ＭＣＴラットにおける生存を改善する
モノクロタリンラットで誘発された右心室圧の上昇
研究１では、心臓の右心室圧力のカテーテルベースの評価は、４週目のモノクロタリンラットのアイソタイプ抗体処置群で右心室収縮期圧力の有意な上昇を明らかにした。血管拡張剤マシテンタン及び抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置の両方が、右心室収縮期圧の上昇を有意に低下させた。モノクロタリン＋アイソタイプ対照ＩｇＧとモノクロタリン＋マシテンタン（＊＊＊ｐ＜０．００１）とモノクロタリン＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊ｐ＜０．０５）との間に有意差が認められた（図１１）。
モノクロタリンラットに誘導された右心室肥大
ラットの右心重量の死後分析は、アイソタイプ対照ＩｇＧ処置を受けたモノクロタリンラットにおいて有意な変化が認められた。右心室重量対左心室＋中隔重量の比率は、右心室肥大の指数（すなわち、Ｆｕｌｔｏｎ指数）を提供し、モノクロタリン処置ラットにおける４週間の群は、生理食塩水処置動物と比較してより大きな比率を示し、このことは、右心室肥大の存在を示した。（抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の予防的処置は、アイソタイプ対照処置ラットを用いたモノクロタリンと比較して、右心室肥大を約４０％減少させた（図１１）。血管拡張剤マシテンタンの使用は、モノクロタリンラットにおける右心室肥大を減少させることができなかった。モノクロタリン＋アイソタイプ対照ＩｇＧとモノクロタリン＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊ｐ＜０．０５）との間に有意差が認められた。
モノクロタリンラットにおける動物生存率
研究２では、６０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを注射したラットは、重度の肺高血圧症状を発症し、高い死亡率を示した。特に、アイソタイプ対照ＩｇＧ処置群を有するモノクロタリン中の動物の９０％が、３５日目までに死亡した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置は、モノクロタリン注射の１４後に開始され、動物の体重減少を有意に軽減した。モノクロタリン＋アイソタイプ対照ＩｇＧとモノクロタリン＋抗ＰＤＧＦ－Ｂとの間に、２８日目（＊ｐ＜０．０５）及び３５日目（＊＊＊ｐ＜０．００１）の有意差が認められた。ＰＤＧＦ－Ｂ抗体治療はまた、３５日目までにラットの５８％を死から救出した。モノクロタリン＋アイソタイプ対照ＩｇＧとモノクロタリン＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ（＊ｐ＜０．０５）との間に有意差が認められ、ラットの５８％を、３５日目までに死亡から救出した（図１２）。
要約すると、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体による予防的治療は、モノクロタリンモデルにおける血行動態エンドポイント（右心室収縮期圧）及び右心室肥大の両方を低下させた。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の治療的処置は、モノクロタリンラットの重篤なＰＡＨにおける動物生存を有意に改善した。
抗ＰＤＧＦ－Ｂは、低用量治療的処置における有効性を実証した
低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスで誘導された右心室圧の上昇
心臓右心室圧力のカテーテルベースの評価では、６週目までに低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスのアイソタイプ抗体処置群で右心室収縮期圧力の有意な上昇を明らかにした。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置は、１、３、１０及び２５ｍｇ／ｋｇ用量で右心室収縮期圧の上昇を有意に低下させた。１ｍｇ／ｋｇ（＊ｐ＜０．０５）、３ｍｇ／ｋｇ（＊＜０．０１）、１０ｍｇ／ｋｇ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）、及び２５ｍｇ／ｋｇ（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）におけるＨｙ／Ｓｕ＋アイソタイプ対照ＩｇＧ群とＨｙ／Ｓｕ＋抗ＰＤＧＦ－Ｂ群との間に有意差が認められた。異なる用量のＰＤＧＦ－Ｂ処置間で統計的に有意な差はなかった（図１３Ａ）。
低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスに誘導された右心室肥大
マウスの右心重量の死後分析は、低酸素症／ｓｕｇｅｎ曝露マウスに有意な変化が認められた（図１３Ａ）。右心室重量対左心室＋中隔重量の比率は、右心室肥大の指数（すなわち、Ｆｕｌｔｏｎ指数）を提供し、低酸素症／ｓｕｇｅｎにおける６週間の群は、正常酸素動物と比較してより大きな比率を示し、このことは、右心室肥大の存在を示した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の治療的処置は、低酸素症／ｓｕｇｅｎアイソタイプ対照処置マウスと比較して、右心室肥大を変化させなかった。Ｎｏｒｍｏｘｉａ群と全てのＨｙ／Ｓｕ群との間に有意差が認められた（＃＃＃＃ｐ＜０．０００１）。
低酸素症／Ｓｕｇｅｎマウスにおける血清ＰＤＧＦ－Ｂタンパク質及び抗体レベル
６週目までに、循環ＰＤＧＦ－Ｂタンパク質及びヒト抗体分析のために血清を収集した。ＰＤＧＦ－Ｂの循環レベルは、低酸素症／ｓｕｇｅｎマウス群で有意に上昇した（図１３Ｂ）。マウス血清中のヒトＩｇＧの測定は、１～２５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ処置群における抗体レベルが用量依存的に増加したことを確認した。１～２５ｍｇ／ｋｇの反復皮下投与は、循環ＰＤＧＦ－Ｂの数千倍であるｎＭレベルの血清抗体レベルを達成した（図１３Ｂ）。
要約すると、循環ＰＤＧＦ－ＢＢは、Ｈｙ／Ｓｕ ＰＡＨマウスにおいて上昇した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体は、低酸素症／ｓｕｇｅｎマウスモードで１ｍｇ／ｋｇの投与量まで肺血行動態（右心室圧）を改善する有効性を示した。
ＰＤＧＦ－Ｂシグナル伝達を標的とするためのインビボ有効性を、以下の表１５に要約する。
リードｍＡｂ（Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ）を介したＰＤＧＦ－Ｂの標的化は、齧歯類モデルにおいて、臨床的に関連するＰＡＨエンドポイント（右心室収縮期圧－ＲＶＳＰ；右心室肥大－ＲＶ）にわたって一貫した堅牢な有効性を実証した。これらの効果は、標準治療薬、比較臨床試験薬、及び社内ＰＤＧＦＲｂ遮断を含むこれまでの任意の治療又はベンチマークよりも印象的であった。ＰＤＧＦ－Ｂブロッカーは、効果的な非血管拡張剤ＰＡＨ療法を提供し得る。
実施例１１．ＰＤＧＦＲ－βの遮断の安全性評価
ＰＤＧＦ－Ｂ／ＰＤＧＦＲｂシグナル伝達は、周皮細胞の増殖、遊走、生存及び付着に関与している。発芽内皮細胞は、周皮細胞特異的受容体ＰＤＧＦＲｂに結合するＰＤＧＦ－Ｂを分泌し、周皮細胞の動員及び付着をもたらす。ＰＤＧＦ－Ｂ／ＰＤＧＦＲｂシグナル伝達の障害は、周皮細胞の動員の失敗及び微小血管周皮細胞の被覆の減少をもたらし、最終的には内皮過形成、異常な血管形態形成、及び微小動脈瘤の形成をもたらす。内皮由来ＰＤＧＦ－Ｂをアブレーションしたマウスは、毛細血管及び静脈の直径を可変させる５２％未満の正常な周皮細胞密度を示し、毛細血管枝を後退させた。光受容体細胞におけるＰＤＧＦ－Ｂの特異的な過剰発現は、周皮細胞の増殖の増加をもたらしたが、星状細胞及び内皮細胞も増加した。ＰＤＧＦ－Ｂ対ＰＤＧＦ－Ｒｂアンタゴニストの長期治療は、潜在的に、ヒトにおける周皮細胞喪失／血管損傷及びその後の浮腫及び出血を引き起こし得る。更に、抗ＰＤＧＦＲβペグ化ジＦａｂ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）の全身毒性は、ヒトにおいて報告されており（がん患者における末梢浮腫）、長期抗ＰＤＧＦ－Ｂ療法の安全性は、不明である。
本発明者らは、特異的なＰＤＧＦ－Ｂリガンド遮断が、残りのＰＤＧＦリガンドを通じた受容体シグナル伝達の継続を可能にし、周皮細胞ホメオスタシスへの悪影響が少ないという仮説を立てた。３ｍｇ／ｋｇのｓ．ｃでの抗ＰＤＧＦ－Ｂ ａｂの系統的投与は、新生児マウスにおいて網膜血管周皮細胞の損失を引き起こさなかったが、抗ＰＤＧＦＲｂ ａｂは、網膜血管周皮細胞を完全に枯渇させたことが見出された。成体齧歯類は、高用量の抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲｂ処置に耐性であることが観察された。更に、成体マウスにおける８カ月間の高用量の抗ＰＤＧＦＲｂ処置は、いかなる血管損傷、出血、又は明らかな浮腫も誘発しなかった。
Ｐ２野生型マウスの網膜血管系に対する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の効果を分析すると、３ｍｇ／ｋｇの投与量での抗ＰＤＧＦ ＢＢ処置網膜における周皮細胞被覆に対する効果は観察されなかった。抗ＰＤＧＦ－Ｒβ抗体（２Ｃ５、ＲＥＧＮ７６４）の全身送達が周皮細胞を効果的に枯渇させたが、抗ＰＤＧＦ－ＢＢ抗体（Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐ）が、３ｍｇ／ｋｇで網膜血管形成（ＲＶＤ）モデルにおいて、明らかな効果を有さなかった（図１４）。
Ｐ２ ＷＴマウスの網膜血管系に対する抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の効果を決定するために、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体をＰ２で注射し、組織をＰ５で収集した。全ての網膜を、抗ＮＧ２抗体とともにインキュベートして、血管周皮細胞を検出した。より高い用量の抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体（Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ）が、ＲＶＤモデルにおいて、周皮細胞枯渇に対して中程度の効果を示すことが観察された（図１５）。
したがって、この研究は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の使用が、抗ＰＤＧＦＲ－β抗体の使用と比較してより良好な安全性プロファイルを提供し、特異的なＰＤＧＦ－Ｂリガンド遮断が、周皮細胞機能を維持するために、残りのＰＤＧＦリガンドを通じた受容体シグナル伝達の継続を可能にし得ることを実証する。
実施例１２．抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の薬物動態プロファイル
抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の薬物動態（ＰＫ）プロファイルは、Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスにおいて、３つの異なる用量で決定された。この研究で使用される両方の抗ＰＤＧＦ－Ｂモノクローナル抗体は、３７℃でサブナノモル親和性を有するマウスＰＤＧＦ－ＢＢを交差させる。２６週齢の雌マウス（合計＝３６匹のマウス；１００％ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでのＷＴ）に、０．１、１、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与を行い、６時間、１日目、２日目、３日目、４日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、及び３０日目の出血時点で分析した。総ヒトＩｇＧは、Ｇｙｒｏｓ：マウス抗ヒトカッパ軽鎖定数（ＲＥＧＮ６５４＊ビオチン）ｍＡｂ捕捉／マウス抗ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ４（ＲＥＧＮ２５６７＊Ａｌｅｘａ６４７）ｍＡｂ Ｄｅｔｅｃｔによって決定した。機能的結合は、Ｇｙｒｏｓ：マウスＰＤＧＦ－ＢＢ＊ビオチン捕捉／マウス抗ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ４（ＲＥＧＮ２５６７＊Ａｌｅｘａ６４７）ｍＡｂ Ｄｅｔｅｃｔによって決定した。
薬物動態研究で使用される抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体及びｈＩｇＧ４アイソタイプ対照の用量を、表１６に記載する。
全体として、Ｈ４Ｈ１３１４５ＰとＨ４Ｈ１３１３２Ｐとの間に差異が観察された（図１６）。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照よりも速いクリアランスを示し、１０ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照と同様のＰＫプロファイルを有する。Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐは、全ての用量でアイソタイプ対照と同様のＰＫプロファイルを示す。薬物曝露（ＡＵＣｌａｓｔ）の最大の差異が、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐと比較した場合、１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇで観察される。試験された全てのモノクローナル抗体は、それぞれの用量で同様のＣｍａｘに達した。しかしながら、０．１ｍｇ／ｋｇで投与された３つ全てのモノクローナル抗体で予想よりも低いＣｍａｘが、観察された。
１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇでＨ４Ｈ１３１４５Ｐで観察されたクリアランスは、ｍＰＤＧＦ－ＢＢに対するサブピコモル親和性によって駆動され得る標的媒介クリアランスを示唆する。各分子のｈＰＤＧＦ－ＢＢに対する親和性は非常に類似しているが、ｍＰＤＧＦ－ＢＢに対する分子間の親和性には違いがあることに留意することが重要である。
機能的（マウスＰＤＧＦ－ＢＢ）結合アッセイは、総ｈＩｇＧ濃度と比較して、非結合抗体濃度を調べるために実施され得る。
抗ＰＤＧＦ抗体のＰＫプロファイルを評価するために、カニクイザルで同様の研究が実施される。カニクイザル（合計＝２７）に、０．１、１、又は１０ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量を投与し、６時間、１日目、２日目、３日目、４日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、及び３０日目の出血時点で分析する。抗体の標的レベル（総結合及び非結合ＰＤＧＦ－Ｂ）、ｈＦｃレベル（総）、及び遊離標的レベル（遊離ＰＤＧＦ－Ｂ）のエンドポイントを決定するために、ＰＫ分析のために血漿を収集する。
実施例１３．抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の血管透過性研究
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤療法（カプトプリル）に関する血管浮腫の病態生物学的機序は、カリクレイン－キニン血漿エフェクターシステムに関連すると考えられる（Ｃｒａｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１６５（２）：１１９－２７を参照されたく、これが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。血管浮腫は、ブラジキニン（ＢＫ）の不十分な分解に起因して生じ得る。ＢＫは、ＡＣＥなどの様々なメタロプロテイナーゼによって急速に代謝されるため、１７秒という非常に短い半減期を有する。ＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルは、ブラジキニンの分解を遮断することによって、ブラジキニンレベルを増加させ、血管拡張及び血管透過性の増加をもたらす。
高用量のＰＤＧＦ－ＢＢ抗体を有する健常Ｃ５７成体マウスの慢性治療が、胃腸（ＧＩ）、肺、又は脳血管透過性において任意の付加的な影響を有するかどうかを評価するために、研究を実施した。１１～１６週齢のタコニックＣ５７ＢＬ雄マウスに、図１７に記載されるように、週に２回、４週間、２５ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ、抗ＰＤＧＦ－Ｂ、及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の皮下用量を投与した。エバンスブルー（ＥＢ）アッセイは、ベースライン及びＡＣＥ ＩＩ阻害剤誘発性ＧＩ血管透過性における抗ＰＤＧＦ－Ｂ及びＰＤＧＦＲβ抗体の４週間処置の影響を評価するために使用した。エバンスブルー（ＥＢ）染料は、中程度の親和性で血清アルブミンに可逆的に結合し、長い血液半減期を有する。ＥＢのアルブミンへの結合は、増加した血管透過性の指標としてタンパク質漏出を定量化するために利用されている。生理学的条件下では、内皮は、アルブミンに不透過性であるため、エバンスブルー結合アルブミンは、血管内に制限されたままである。増加した血管透過性を促進する病理学的条件下では、内皮細胞は、密接な接触を部分的に失い、内皮は、アルブミンなどの小さなタンパク質に対して透過性になる。透過性が増加した臓器は、無傷の内皮を有する臓器と比較して、有意に増加した青色着色を示すであろう。血管透過性のレベルは、単純な視覚化によって、又は組織のミリグラム当たりに組み込まれた染料の定量的測定によって評価され得る。
図１８は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の投与が、動物の体重増加を著しく干渉しなかったことを示す。更に、動物の行動に変化は観察されなかった。
更に、図１９に示されるように、健常マウスにおいて、アイソタイプ対照ＩｇＧ、抗ＰＤＧＦ－Ｂ、及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体を用いた処置後に、小腸におけるＧＩ水分貯留／浮腫に有意な変化がなかった。カプトプリルは、小腸において軽度で統計的に有意でない湿重量の増加を引き起こした。アイソタイプ対照ＩｇＧ、抗ＰＤＧＦ－Ｂ、及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置は、カプトプリルによって引き起こされる小腸における組織浮腫を有意に変化させなかった。同様に、図２０は、マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって小腸における血管透過性に有意な変化がなかったことを示す。抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置は、カプトプリルを悪化させず、小腸における急性血管透過性増大を引き起こした。
更に、図２１に示されるように、健常マウス及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、胃内のＧＩ水分貯留／浮腫において有意な変化がなかった。カプトプリルは、胃において統計的に有意な湿潤体重の増加を引き起こさなかった。同様に、図２２は、マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって胃における血管透過性に有意な変化がなかったことを示す。抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置は、カプトプリルを悪化させず、胃における急性血管透過性増大を引き起こした。
図２３は、健常及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、肺内のＧＩ水分貯留／浮腫において有意な変化がなかったことを示す結果を表す。カプトプリルは、肺において有意な体重の増加を引き起こさなかった。同様に、図２４によって示されるように、健常及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、肺内の血管透過性に有意な変化がなかった。カプトプリル急性治療は、肺内の血管過透過性を引き起こさなかった。
更に、図２５は、健常及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、脳内のＧＩ水分貯留／浮腫において有意な変化がなかったことを示す結果を表す。カプトプリルは、脳において有意な体重の増加を引き起こさなかった。同様に、図２６によって示されるように、健常及びカプトプリル処置マウスにおける抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置によって、脳内の血管透過性に有意な変化はなかった。カプトプリル急性治療は、脳内の血管透過性を引き起こさなかった。
全体として、抗ＰＤＧＦ－Ｂ及び抗ＰＤＧＦＲβ抗体の処置は、マウスにおいて、いかなる有意な組織浮腫もＧＩ血管透過性の変化も引き起こさなかった。したがって、成体マウスのＧＩ血管透過性において、ＰＤＧＦ－Ｂ及びＰＤＧＦＲβ中和抗体の負の影響はない。更に、この研究は、ＰＤＧＦ－Ｂシグナルが、マウスの血管系周皮細胞の完全性を維持することにおいて不必要であり得ることを示唆する。
実施例１４．２５℃でのヒトＰＤＧＦ－ＢＢ、サルＰＤＧＦ－ＢＢ、及びラットＰＤＧＦ－ＢＢへのＰＤＧＦ－ＢＢモノクローナル抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合速度論
異なるＰＤＧＦ－ＢＢモノクローナル抗体（ｍＡｂ）へのＰＤＧＦ－ＢＢ結合の平衡解離定数（ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００又はＭＡＳＳ－２機器を使用するリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定された。全ての結合研究は、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－Ｐ）の泳動緩衝液中で行われた。センサーチップの表面を、ヒトＦｃ特異的マウスｍＡｂ（ＲＥＧＮ２５６７）とのアミンカップリングによって最初に誘導体化して、異なるＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂを捕捉した。ＨＢＳ－Ｐ泳動緩衝液中で調製されたヒトＰＤＧＦ－ＢＢ、サル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＤＧＦ－ＢＢ、又はラットＰＤＧＦ－ＢＢの異なる濃度（９０～１．１１ｎＭ、３倍の連続希釈法）を、抗ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂ捕捉表面上に、２５～５０μＬ／分の流速で１～３分間注入し、ＨＢＳ－Ｐ泳動緩衝液中でのそれらの解離を５～１０分間モニタリングした。各サイクルの終わりに、ＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂが捕捉した表面を、２０ｍＭのリン酸を１０～１２秒間注入を用いて再生した。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、質量輸送制限を伴う１：１結合モデルに適合させることによって、会合速度（ｋａ）及び解離速度（ｋｄ）を決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度から以下のように計算した：
２５℃での本発明の異なるＰＤＧＦ－ＢＢ ｍＡｂに結合するＰＤＧＦ－ＢＢの結合動態パラメータを、表１７～１９に記載する。
結果
実施例１５．一次ヒト肺動脈平滑筋細胞及び一次ヒト肺線維芽細胞を用いたＦＬＩＰＲを使用して、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、又はＰＤＧＦ－ＢＢ／ＡＢによって誘導されたカルシウムフラックスの組み合わせの抗体阻害試験。
カルシウムフラックスアッセイのために、一次ヒト肺平滑筋細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＣＣ－２５８１）及びヒト肺線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号２５１２）を、１０ｋ／ウェルの細胞密度で９６ウェルアッセイプレート上に播種した。平滑筋細胞を、供給業者が推奨する平滑筋培地（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３１８２）で培養し、線維芽細胞を、５％ ＣＯ２の３７℃で加湿インキュベーター内で、ＤＭＥＭ－１０％ ＦＢＳ－１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンで培養した。
ウェル内で１００％コンフルエンシーに達すると、ＰＤＧＦ駆動カルシウムフラックスを、製造業者のプロトコルに従って、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上のＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８１８５）を用いて評価した。簡言すれば、完全な培地を、５０μＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ－０．１％ ＢＳＡ－１×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン）に置き換えた。次いで、カルシウム５染料を、プロベネシドの存在下で供給された緩衝液中で再構成した（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ３６４００）。次いで、５０μＬの再構成カルシウム５染料を細胞に添加し、５％ ＣＯ２中の３７℃で１時間インキュベートした後に、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａシステムに配置した。ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２０－ＧＭＰ）、ヒトＰＤＧＦ－ＡＢ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２２－ＡＢ）、及びＰＤＧＦ－ＡＢ／ＰＤＧＦ－ＢＢを、３：１の比率で使用して、個々の投薬プレートを生成した。抗体阻害を評価するために、１ｎＭ濃度のＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、及び併用処置ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢを、定数として選択した。１ｎＭのＰＤＧＦタンパク質Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ又はＨ４Ｈ１３１３２Ｐの存在下で、５００ｎＭ～０．０６ｎＭ（１：６段階希釈）の範囲で試験した。抗体を、ＰＤＧＦタンパク質で３０分間プレインキュベートした後、ＦＬＩＰＲ ｔｅｔｒａシステムを介して細胞に添加した。カルシウムフラックスのトレースを、６０秒及び５分のフルタイムコースの両方で評価した。これらのカルシウムのトレースを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、それらの最大最小値について分析した。
表２０に示されるように、両方の抗体、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐは、ヒト肺平滑筋細胞にカルシウムフラックスを６０秒間記録した場合に、１ｎＭのＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、及びＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ（３：１）の完全な阻害を実証した。両方の抗体は、０．１８ｎＭ～４．５ｎＭの範囲のＩＣ５０値で、１ｎＭのＰＤＧＦ処置の阻害を実証した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、それぞれ、０．１８ｎＭ及び０．６４ｎＭのＩＣ５０で、ＰＤＧＦ－ＢＢに対してＨ４Ｈ１３１３２Ｐよりも大きな効力を実証した。これらの抗体は、ＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ（３：１）の組み合わせよりも、ＰＤＧＦ－ＢＢ単独のより強力な阻害剤である。
５分間のフルタイムコースにわたるカルシウムフラックスを記録する場合に、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐと比較して、ＰＤＧＦ－ＢＢを中和し、ＰＤＧＦ駆動のカルシウムフラックスを防止するより高い能力を実証した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ＰＤＧＦ－ＢＢの阻害については０．３６ｎＭ、ＰＤＧＦ－ＡＢの阻害については１６ｎＭ、及びＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ（３：１）の組み合わせについては５．７ｎＭのＩＣ５０で、全てのＰＤＧＦ処置の強力な阻害を維持した。アイソタイプ対照抗体は、ＰＤＧＦ媒介カルシウムフラックスの阻害を実証しなかった。
ヒト肺線維芽細胞で試験した場合、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐは、６０秒にわたってカルシウムフラックスを記録した場合に、全てのＰＤＧＦ処置の完全な阻害を実証した。両方の抗体は、０．５９ｎＭ～１．６ｎＭの範囲のＩＣ５０値で、１ｎＭのＰＤＧＦ処置の阻害を実証した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、それぞれ、０．５９ｎＭ及び０．９９ｎＭのＩＣ５０を有するＨ４Ｈ１３１３２Ｐと比較して、ＰＤＧＦ－ＢＢの中和においてわずかに高い効力を実証した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐはまた、それぞれ、０．１６ｎＭ及び０．５４ｎＭのＩＣ５０値を有するＨ４Ｈ１３１３２Ｐよりも、ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ処置の組み合わせを中和することにおいてわずかにより強力であった。これらの抗体は、ＰＤＧＦ－ＡＢ及びＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ処置の組み合わせよりも、ＰＤＧＦ－ＢＢ単独のより強力な阻害剤である。
５分間のフルタイムコースにわたるカルシウムフラックスを記録する場合に、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐと比較して、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、及び併用処置ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢを中和する有意により高い能力を実証した。Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐは、全てのＰＤＧＦ処置の１ｎＭ定数を最大限に阻害するより低い能力を実証した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、それぞれ、０．６３ｎＭ及び３．８ｎＭのＩＣ５０を有するＨ４Ｈ１３１３２Ｐと比較して、ＰＤＧＦ－ＢＢ駆動カルシウムフラックスの阻害においてより大きな効力を示した。アイソタイプ対照抗体は、ヒト肺線維芽細胞におけるＰＤＧＦ媒介性カルシウムフラックスの阻害を実証しなかった。
実施例１６：低温電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）による抗体－ ＰＤＧＦ－ＢＢ複合体の構造分析
方法
Ｆａｂ断片の調製
Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ、及びＨ４Ｈ１３１２７Ｐ ＩｇＧを、製造業者の標準プロトコルに従って、Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒ酵素（Ｇｅｎｏｖｉｓ）を使用して、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｃ断片に切断した。Ｆ（ａｂ’）２を、２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＦａｂに還元し、続いて、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－Ｆｃ（ｍｓ）親和性樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＦｃ断片を除去した。Ｆａｂ断片を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する実行緩衝液を含む、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア）に接続されたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １５／３００ ＧＬ、ＧＥヘルスケア）に注射することによって更に精製した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）中に濃縮して、その後、複合体調製に使用した。
複合体調製
組換えヒトＰＤＧＦ－ＢＢタンパク質（Ｒ＆Ｄ）を、１：２．２のモル比でＨ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ又はＨ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂと混合した。過剰な非競合Ｈ４Ｈ１３１２７Ｐ Ｆａｂを、２つの試料に更に添加して、２つの複合体のサイズを増加させ、それらをＥＭ特性評価のためのより適切な標的にした。この追加のＦａｂはまた、ＥＭグリッド上の複雑な粒子の配向分布を改善することができる。試料を４℃で３０分間インキュベートした後、Ｎａｎｏｄｒｏｐ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定した２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるまで３０ｋＤａのカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）中に濃縮した。
Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製及びデータ収集
新たに作製したＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体又はＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体を、３．５μＬの混合物をＵｌｔｒＡｕｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３、３００メッシュグリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ）上にピペットする直前に、約０．１５％のアンフィポールＰＭＡＬ－Ｃ８（Ａｎａｔｒａｃｅ）と混合した。濾紙を使用して余分な液体を吸い取り、４℃、湿度１００％で操作されたＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して液体窒素によって冷却された液体エタンに急速凍結した。次いで、グリッドを、Ｋ３カメラ（Ｇａｔａｎ）を装備したＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ Ｇ３ｉ顕微鏡（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にロードした。ＥＰＵソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、両方の複合体について、１０５，０００×（０．８６Åピクセルサイズ）の公称倍率のカウントモードで、約７，０００本の動画を収集した。各動画は、２秒間の曝露にわたって４６の用量画分を含み、Å２当たりの総獲得用量は、約４０電子であった。
Ｃｒｙｏ－ＥＭデータ処理及びマップ生成
Ｃｒｙｏ－ＥＭデータは、Ｃｒｙｏｓｐａｒｃ ｖ２．１４．２を使用して処理された。動画は、パッチモーション補正により動き補正され、ＣＴＦパラメータは、パッチＣＴＦ推定により推定された。粒子は、最初にＢｌｏｂピッカーを使用してピッキングされ、その後のテンプレートピッキングのテンプレートとして使用される２Ｄクラス平均を生成した。ジャンク粒子を除去するための２Ｄ分類の複数ラウンド後、ＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体及びＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体に、それぞれ、２４９，８３２及び４２９，９４８個の粒子を残した。Ａｂ最初の再構築、均質な精製、及び不均一な精製により、ＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体に対応する１１０，２６１個の粒子、及びＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体に対応する１５９，３７２個の粒子が、同定された。不均一な精製を使用して、これらの粒子を、２つの複合体について、それぞれ、３．４Å及び３．５Å分解能の再構築に更に精製した。
モデル構築及び精製
手動モデル構築は、Ｃｏｏｔバージョン０．８．９を使用して実行され、実空間の改良は、Ｐｈｅｎｉｘバージョン１．１７で実行された。ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（ＰＤＢ：１ＰＤＧ）の結晶構造を、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａのフィットインマップを使用して、ＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体及びＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体のｃｒｙｏ－ＥＭ密度マップにドッキングした。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ、及びＨ４Ｈ１３１２７ＰのＦａｂ断片の相同性モデルは、以前に決定されたＲＥＧＮ Ｆａｂ構造から作製した。Ｆａｂモデルをそれらのそれぞれの密度に明確にドッキングすることは、それらの異なるＣＤＲ配列に対応する明らかに解釈可能な側鎖密度によって支援された。ドッキング後、モデルを、Ｃｏｏｔで手動で調整し、続いてＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体又はＰＤＧＦＢＢ－Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂ－Ｈ４Ｈ１３１２７ Ｆａｂ複合体全体の実空間の改良をＰｈｅｎｉｘで行った。
結果
ＰＤＧＦＢＢリガンドは、３つの鎖間ループ（残基２５～３８によって形成されるＬ１、残基５３～５８によって形成されるＬ２、及び残基７８～８１によって形成されるＬ３）、続いてＣ末端セグメントによって形成される２つのクランプ領域を含有するホモ二量体である。
ｃｒｙｏ－ＥＭ研究によると、各ＰＤＧＦＢＢホモ二量体は、２つのＨ４Ｈ１３１４５Ｐ又はＨ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂ分子、及び２つのＨ４Ｈ１３１２７Ｐ Ｆａｂ分子に結合する。２つの複合体は、両方とも、βシート領域の外縁に結合する２つのＨ４Ｈ１３１２７Ｐ Ｆａｂ分子との２倍対称性を有する。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ Ｆａｂ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐ Ｆａｂは、両方とも、同様の結合部位を有する、ＰＤＧＦＢＢ－ＰＤＧＦＲβシグナル伝達複合体（ＰＤＢ：３ＭＪＧ）中のＰＤＧＦＲβとも係合する３つの鎖間ループに結合する。データは、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ抗体及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐ抗体がＰＤＧＦＢＢ二量体の末端で結合し、単一のＦａｂが二量体中の両方の単量体と接触する、すなわち、抗体が二量体界面にわたって結合することを示唆する。
Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ：Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐの重鎖及び軽鎖の両方が、３つの鎖間ループでＰＤＧＦＢＢ二量体と相互作用する。
二量体相互作用に対する抗体：重鎖中のＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３（残基Ａ３１、Ｙ３２、Ｗ５０、Ｙ５４、Ｎ５７、Ｗ１００）は、ＰＤＧＦＢＢホモ二量体の両方の鎖との相互作用に関与している。軽鎖のＣＤＲ Ｌ３（残基Ｙ９１、Ｙ９２、Ｎ９３、Ｌ９４、及びＦ９６）は、ＰＤＧＦＢＢ二量体の鎖１との相互作用に関与している。
二量体対抗体相互作用：ＰＤＧＦＢＢの鎖１（残基Ｆ３７、Ｗ４０、Ｒ７３、Ｋ８０、Ｋ８１、Ｐ８２、Ｆ８４、及びＫ８６）は、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐの両方の鎖と相互作用する。ＰＤＧＦＢＢの鎖２の残基Ｉ１３及びＲ５６は、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐの重鎖との相互作用に関与している。鎖１のループ１及びループ３は、相互作用において主要な役割を果たす。
Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐ：Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐの重鎖及び軽鎖の両方が、３つの鎖間ループでＰＤＧＦＢＢ二量体と相互作用する。
二量体相互作用に対する抗体：重鎖中のＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３（残基Ｓ３１、Ａ３３、Ｉ５２、Ｉ５４、Ｆ５５、Ｄ１０３、Ｙ１０４、Ｙ１０５）は、ＰＤＧＦＢＢ二量体の両方の鎖との相互作用に関与している。軽鎖のＣＤＲ Ｌ１及びＬ３（残基Ｙ３１、Ｔ９７、及びＷ９９）は、ＰＤＧＦＢＢ二量体の鎖１との相互作用に関与している。
二量体対抗体相互作用：ＰＤＧＦＢＢの鎖１（残基Ｌ３８、Ｗ４０、Ｒ７３、Ｉ７５、Ｋ８０、Ｋ８１、Ｐ８２、Ｉ８３、Ｆ８４、及びＫ８６）は、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐの両方の鎖と相互作用する。ＰＤＧＦＢＢの鎖２の残基Ｒ５６は、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐの重鎖との相互作用に関与している。鎖１のループ１及びループ３は、相互作用において主要な役割を果たす。
考察
Ｃｒｙｏ－ＥＭデータは、２つの抗体、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐが、ＰＤＧＦＢＢ二量体上でほぼ同一の結合部位を有することを示す。ＰＤＧＦＢＢの鎖１内の複数の残基は、両方の抗体（Ｗ４０、Ｒ７３、Ｋ８０、Ｋ８１、Ｐ８２、Ｆ８４、及びＫ８６）と相互作用する。ＰＤＧＦＢＢの鎖２と抗体との間の相互作用は、より少ない（Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐの場合は２つ、Ｈ４Ｈ１３１３２Ｐの場合は１つ）が、両方の相互作用は、共通のＲ５６残基を有する。
実施例１７：一次ヒト肺動脈平滑筋細胞におけるＦＬＩＰＲ又は細胞増殖を使用して、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、又はＰＤＧＦ－ＤＤによって誘導されたカルシウムフラックスの抗体又は小分子阻害の試験。
試薬
一次ヒト肺動脈平滑筋細胞におけるＦＬＩＰＲ又は細胞増殖を使用して、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、又はＰＤＧＦ－ＤＤによって誘導されたカルシウムフラックスの抗体又は小分子阻害の試験のために使用された試薬には、以下が含まれる：ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）、Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ－２５８１ロット番号００００５５９４９５；平滑筋細胞培地、Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３１８２；ＤＭＥＭ培地、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１９６５０９２；ウシ血清アルブミン溶液、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９５７６；ＰＤＧＦ－ＢＢ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２０－ＧＭＰ；ＰＤＧＦ－ＡＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２１－ＡＡ；ＰＤＧＦ－ＤＤ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１１５９－ＳＢ；Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８１８５；プロベネシド、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ３６４００；セラルチニブ（ＧＢ００２）、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号ＨＹ－１０９１９０；及びイマチニブメシラート、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、カタログ番号ＨＹ－５０９４６。
実験手順
カルシウムフラックスアッセイ及び増殖アッセイのために、一次ヒト肺平滑筋細胞を、それぞれ、１０，０００／ウェル及び２，０００／ウェルの細胞密度で９６ウェルアッセイプレート上に播種した。平滑筋細胞を、５％ ＣＯ２の３７℃で加湿インキュベーター内で、供給業者が推奨する平滑筋培地で培養した。
各ウェル内で１００％コンフルエンシーに達すると、ＰＤＧＦ駆動カルシウムフラックスを、製造業者のプロトコルに従って、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上のＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価した。簡言すれば、完全な培地を、５０μＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ－０．１％ ＢＳＡ－１×ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン）に置き換えた。次いで、カルシウム５染料を、プロベネシドの存在下で供給された緩衝液中で再構成した。次いで、５０μＬの再構成カルシウム５染料を細胞に添加し、５％ ＣＯ２中の３７℃で１時間インキュベートした後に、ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａシステムに配置した。ヒトＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、及びＰＤＧＦ－ＤＤの連続希釈及び阻害定数を、別々の投薬プレート上で生成した。０．５ｎＭ濃度のＰＤＧＦ－ＢＢ、１ｎＭ濃度のＰＤＧＦ－ＤＤ、及び３ｎＭ濃度のＰＤＧＦ－ＡＡを、抗体及び小分子阻害を評価するための定数として選択した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ（抗ＰＤＧＦｂ）及びＨ４Ｈ１２３８Ｎ（アイソタイプ対照）（２５０ｎＭ～０．２ｎＭ、１：６の希釈）の連続希釈を、ＰＤＧＦ定数の存在下で試験した。抗体を、ＰＤＧＦタンパク質で３０分間プレインキュベートした後、ＦＬＩＰＲ ｔｅｔｒａシステムを介して細胞に添加した。小分子セラルチニブ及びイマチニブを、アッセイ培地中の細胞及びカルシウム染料を用いて、１０，０００ｎＭ～８ｎＭの濃度範囲（１：６の連続希釈）で３０分間プレインキュベートした。これらのカルシウムのトレースを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、それらの最大最小値について分析した。
増殖は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて評価した。一晩播種した後、完全な培地を、０．１％ ＢＳＡを補充した無血清平滑筋培地に置き換えた。抗体を、ＰＤＧＦ定数で３０分間プレインキュベートし、一方、細胞を、ＰＤＧＦの添加前に、小分子化合物のイマチニブ及びセラルチニブを用いて前処理した。プレートを、７日間にわたって３時間毎に撮像し、増殖を、ＩｎｃｕＣｙｔｅベース解析ソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、６日目のウェルにおける細胞コンフルエンスを測定することによって決定した。
結果
ＰＤＧＦ成長因子ファミリーは、肺動脈高血圧症において対象となる強力な一連のマイトジェンである。セラルチニブ及びイマチニブと呼ばれる小分子受容体キナーゼ阻害剤を含む複数の治療法は、ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路を標的とする。本研究では、抗ＰＤＧＦ－ＢＢ分子Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐを、２つのインビトロ細胞アッセイにおいてこれらの小分子ＰＤＧＦＲ阻害剤と直接比較した。
セラルチニブ及びイマチニブの両方は、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＤＤ、及びＰＤＦＤ－ＢＢ駆動カルシウムフラックス及び増殖を完全に阻害した。ＰＤＧＦＲａを介したＰＤＧＦ－ＡＡシグナル、ＰＤＧＦＲｂを介したＰＤＧＦ－ＤＤシグナル、及び両方の二量体受容体を介したＰＤＧＦ－ＢＢシグナル。表２２に示されるように、セラルチニブは、６～２７ｎＭの範囲のＩＣ５０値を有するこの細胞ベースのアッセイにおいて、イマチニブと比較して、より強力である。イマチニブは、ＩＣ５０値が、１１０～６５０ｎＭの範囲である、ＰＤＧＦシグナル伝達を完全に阻害することができた。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ＩＣ５０が、それぞれ、０．１１ｎＭ及び０．１４ｎＭである、ＰＤＧＦ－ＢＢ駆動カルシウムフラックス及び増殖を完全に阻害することができた。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、小分子ＰＤＧＦＲ阻害剤、セラルチニブ及びイマチニブと比較して、ＰＤＧＦ－ＢＢに対してより強力である（表２２及び図２７～２８）。
実施例１８：一次ヒト肺動脈平滑筋細胞及び一次ヒト肺線維芽細胞における受容体媒介抗体内在化の試験。
試薬
一次ヒト肺動脈平滑筋細胞及び一次ヒト肺線維芽細胞における受容体媒介抗体内在化の試験のために使用される試薬には、以下が含まれる：ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）、Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ－２５８１ロット番号００００５５９４９５；正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）Ｌｏｎｚａカタログ番号ＣＣ－２５１２ロット番号００００４９４６０９；ＤＭＥＭ培地、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１９６５０９２；ウシ血清アルブミン溶液、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ９５７６；平滑筋細胞培地、Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３１８２；ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙラベリングキットカタログ番号Ｐ３５３５５ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；ＣｅｌｌＴｒｋｒ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キットカタログ番号Ｃ３４５７１ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；ＰＤＧＦ－ＢＢ－Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２０－ＧＭＰ；ＰＤＧＦ－ＡＢ－Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２２２－ＡＢ；Ｃａｌｃｉｕｍ ５ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８１８５；プロベネシド、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ３６４００；ＰＤＧＦＲａ－ＡＰＣ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ＡＢ１１９８３８；ＰＤＧＦＲｂ－ＡＰＣ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＡＢ１２６３Ａ；アイソタイプ抗体－ＡＰＣ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ＡＢ３７３９１；ＤＡＰＩ生存性染料、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６２２４８；及びＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１２６０４０１３。
実験手順
抗体ラベリング：ｐＨｒｏｄｏ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙラベリングは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙラベリングキット（カタログ番号Ｐ３５３５５及びＰ３５３５６）によって提供されるユーザーガイドに従って完了した。抗体内在化アッセイは、以下の手順を使用して実施した：
抗体内在化アッセイ１：（１）９６ウェルプレートのウェル当たり２０，０００ ＰＡＳＭＣを播種し、細胞を３７℃で、５％ ＣＯ２の完全な培地中で一晩インキュベートし、（２）完全な培地を除去し、ＰＢＳで一度洗浄し、次いで、ＣｅｌｌＴｒｋｒ Ｖｉｏｌｅｔ染料を用いて細胞を１５分間標識し、（３）ＣｅｌｌＴｒｋｒ溶液を除去し、（４）細胞の処理前に、室温で３０分間、ＰＤＧＦ－ＢＢ又はＰＤＧＦ－ＡＢを用いて標識化した（ｐＨｒｏｄｏ）抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂを事前結合し、（５）抗体リガンド溶液を細胞に添加する。対照として事前結合はせず、（６）生細胞イメージングは、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで１時間毎に最大２１時間取得され、（７）Ｈａｒｍｏｎｙ ４．９ソフトウェアによるデータの分析。
抗体内在化アッセイ２（受容体ブロッキングを伴う）：（１）９６ウェルプレートのウェル当たり２０，０００ ＰＡＳＭＣを播種し、細胞を３７℃で、５％ ＣＯ２の完全な培地中で一晩インキュベートし、（２）完全な培地を除去し、ＰＢＳで一度洗浄し、次いで、ＣｅｌｌＴｒｋｒ Ｖｉｏｌｅｔ染料を用いて細胞を１５分間標識し、（３）ＣｅｌｌＴｒｋｒ溶液を除去し、（４）抗ＰＤＧＦＲα（ＲＥＧＮ１５７４）、抗ＰＤＧＦＲβ（ＲＥＧＮ７６４）をそれぞれ５００ｎＭで、又は細胞と組み合わせて３０分間添加し、（５）細胞の処理前に、室温で３０分間、ＰＤＧＦ－ＢＢ又はＰＤＧＦ－ＡＢを用いて、それぞれ、標識化した（ｐＨｒｏｄｏ）抗ＰＤＧＦ－Ｂ ｍＡｂを事前結合し、（６）抗体リガンド溶液を細胞に添加し、（７）生細胞イメージングは、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで１時間毎に最大７２時間取得され、（８）Ｈａｒｍｏｎｙ ４．９ソフトウェアによるデータの分析。
ＦＬＩＰＲ（蛍光イメージングプレートリーダー）抗体内在化アッセイ：（１）９６ウェルプレートのウェル当たり１０，０００ ＰＡＳＭＣを播種し、３７℃で５％ＣＯ２で完全な培地中で細胞を一晩インキュベートし、（２）ＰＤＧＦ－ＢＢに対する抗体の混合物を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ－０．１％ ＢＳＡ－１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン）中で１０分間、１０－１ｎＭの比でプレインキュベートし、（３）完全な培地を、ＰＤＧＦ－ＢＢに対するＲＥＧＮ１９４５及びＨ４Ｈ１３１４５Ｐの１０－１ｎＭの比で置き換え、（４）細胞を、抗体－リガンド混合物で３、２４、及び４８時間処理し、（５）細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、（６）５０ｕＬのアッセイ培地及び５０ｕＬのカルシウム５染料を添加し、（７）ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａイメージャーを用いてプレートを読み取る前に、染料を添加した後、１時間、プレートをインキュベートし、（８）ＰＤＧＦ－ＢＢ（２５－０．０４ｎＭ、１：６の希釈）の連続希釈を用いて細胞を処理するために、処理プレートを組み立て、ＦＬＩＰＲシステムに挿入し、（９）ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した最大最小値についてのカルシウムトレースを分析する。
フローサイトメトリー抗体内在化アッセイ：（１）６ウェルプレートのウェル当たり３００，０００ ＰＡＳＭＣを播種し、３７℃で、５％ＣＯ２で完全な培地中で細胞を一晩インキュベートし、（２）ＰＤＧＦ－ＢＢに対する抗体の混合物を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ－０．１％ ＢＳＡ－１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン）中で１０分間、１０－１ｎＭの比でプレインキュベートし、（３）完全な培地を、ＰＤＧＦ－ＢＢに対する抗体の１０－１ｎＭの比で置き換え、（４）細胞を、抗体－リガンド混合物で２４時間処理し、（５）細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、（６）ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅを使用して６ウェルプレートから細胞を解離し、（７）沈降させ、細胞染色緩衝液（１０％ ＤＭＥＭ、５％ ＦＢＳ）中で再懸濁し、（８）製造業者のプロトコルに従って、ＰＤＧＦＲａ及びＰＤＧＦＲｂに対してＡＰＣコンジュゲートした抗体を用いて氷上の細胞を１時間染色し、（９）細胞を回転させ、３回洗浄し、（１０）ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターに挿入する前に、ＤＡＰＩ生存性染料を１μｇ／ｍＬの最終濃度で細胞に添加し、（１１）ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター上に１０，０００個の細胞を記録し、生体単一細胞のゲーティングを行い、（１２）ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメーターデータを分析する。
結果
複数の別々のアッセイにわたって、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐが、ＰＤＧＦ受容体を介してリガンド依存的な方法で様々な細胞株に内在化され得ることが示された。
抗体内在化：抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体をｐＨｒｏｄｏ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄで標識化することにより、ヒト一次ＰＡＳＭＣアッセイにおける抗体内在化の評価が可能になった。ｐＨｒｏｄｏ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄは、後期エンドソーム又はリソソームにおいて引き起こされるｐＨレベルで光を放出する。通常のｐＨでは、光は放出されない。これにより、共焦点イメージングを使用した時間依存性内在化の評価が可能になる。表２３～２４に示されるように、標識化されたＨ４Ｈ１３１４５Ｐ－ＰＤＧＦＢＢの共処置は、ＰＡＳＭＣ及びＮＨＬＦの両方において、標識化されたアイソタイプ対照ＲＥＧＮ１９４５と比較して、蛍光シグナルにおいて１０８～１２７倍の変化の増加を有した。ＰＤＧＦ－ＡＢについては、より低い大きさで同様の傾向が観察される。標識化された抗体が細胞に内在化されるときにのみ放出される蛍光シグナルのこの増加は、細胞がＰＤＧＦＲａ及びＰＤＧＦＲｂ受容体の両方を阻害する２つの抗体で事前処理されたときに減少する。このデータは、Ｈ４Ｈ１３１４５ＰがＰＤＧＦ受容体を介してリガンド依存的な方法で細胞に内在化されることを示唆している。
ＦＬＩＰＲデータ：このアッセイでは、ＰＤＧＦ－ＢＢは、ＰＤＧＦ受容体に結合し、その後のＰＤＧＦ－ＢＢ処置に対する細胞の急速な受容体内在化及び脱感作を引き起こす。表２５及び図２９に示されるように、ＲＥＧＮ１９４５－ＰＤＧＦＢＢ（１０：１ｎＭ）で事前処理したＰＡＳＭＣを、その後のＰＤＧＦ－ＢＢで誘導したカルシウムフラックスに対して脱感作した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ＰＤＧＦ－ＢＢを中和することができ、ＰＤＧＦ－ＢＢに対する応答性の観察された損失を制限することができた。培地対照と比較して、Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ群は、ＰＤＧＦ－ＢＢ脱感作を完全に防止することができなかった。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ－ＰＤＧＦＢＢ処置は、ＰＤＧＦ－ＢＢ処置の５ｎＭにおいて、効力のわずかに右方向のシフト及び最大最小カルシウムフラックス応答のわずかな低下を有した。これは、非結合ＰＤＧＦ－ＢＢよりも著しく遅い速度及び大きさではあるが、ＰＤＧＦＲ受容体に結合し、受容体の内在化を引き起こす抗体－リガンド複合体によって説明され得る。
フローサイトメトリー：ＰＡＳＭＣは、ＰＤＧＦＲａ及びＰＤＧＦＲｂの両方を発現する。ＲＥＧＮ１９４５リガンド処理群では、ＰＤＧＦＲａ及びＰＤＧＦＲｂの両方について蛍光シグナルは、検出されなかった。この所見は、ＰＤＧＦ－ＢＢに応答する受容体の急速なリガンド依存性内在化を確認する。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、ＰＤＧＦＲｂ蛍光シグナルにおける観察された損失を防止した。Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ処理群では、非結合ＰＤＧＦ－ＢＢと比較して減少した速度及び大きさではあるが、受容体内在化を示す培地対照と比較して、ＰＤＧＦＲ細胞表面発現のわずかなシフト及び損失があった。
実施例１９：肺動脈高血圧症のラットモノクロタリンモデルにおける２つの阻害性抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の効果の評価。
試薬
肺動脈高血圧症のラットモノクロタリンモデルにおける２つの阻害性抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の効果の評価のために使用される試薬には、以下が含まれる：モノクロタリン（クロタリン）シグマカタログ番号ＰＨＬ８９２５１－ＣＡＳ番号：３１５－２２－０、ＭＤＬ：ＭＦＣＤ０００８４６５６、式：Ｃ１６Ｈ２３ＮＯ６、式重量：３２５．３６ｇ／ｍｏｌ、保存温度：２～８℃、純度：９８％、マシテンタンＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓカタログ番号ＨＹ－１４１８４－経口活性エンドセリン受容体アンタゴニスト、ＣＡＳ番号：４４１７９８－３３－０、式：Ｃ１９Ｈ２０Ｂｒ２Ｎ６Ｏ４Ｓ、式重量：５８８．２７ｇ／ｍｏｌ、ロット番号：１０６７３、保存温度：３年間－２０℃、純度：９８％；及びＰＥＧ－４００（５０：５０ｖ／ｖ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．、＃１９９５７）。
実験手順
肺動脈高血圧症のラットモノクロタリンモデルにおける２つの阻害性抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の効果を評価するために、２つの研究が、実施された：研究番号１は、予防薬物治療を伴う４週間のモノクロタリンＰＡＨラットで実施され、研究番号２は、治療薬物治療を伴う５週間のモノクロタリン重度ＰＡＨラットの生存で実施された（表２６～２７）。
６～７週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。体重が異なる群間で同様であるように、ラットを、処置群に分けた。研究番号１では、モノクロタリン注射の１日前に、抗体処置群のラットに、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はアイソタイプ対照ＩｇＧのいずれかを１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与し、投与を週に２回の割合で、２８日間継続した。１日目に、ラットに、４０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリン又は対照として５ｍＬ／ｋｇの生理食塩水のいずれかを、皮下投与した。２８日目に、右心カテーテル法によって右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定し、ＲＶと（ＬＶ＋隔壁）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によってＲＶ肥大を計算した。研究番号２では、ラットに、６０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリン又は５ｍＬ／ｋｇの生理食塩水のいずれかを、皮下投与した。１４日目に開始して、抗体処置群のラットに、２５ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体又はアイソタイプ対照ＩｇＧのいずれかを、週２回、皮下投与した。低分子群には、１日３０ｍｇ／ｋｇのマシテンタンを、経口投与した。０～３５日目からの体重変化を、一般毒性評価のために使用し、動物死亡率及び生存期間中央値を３５日目までに計算した。
右心カテーテル法及び右室収縮期圧：ラットを、イソフルランで麻酔し、加熱プラットフォーム（Ｈｅａｔｅｄ Ｈａｒｄ Ｐａｄ １、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び循環加熱水ポンプ（Ｔ／Ｐｕｍｐ Ｃｌａｓｓｉｃ、Ｇａｙｍａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して、約３７℃で維持した。各ラットの頸部領域は、右総頸動脈及び右頸静脈を脱毛することによって手術のために準備した。切開を行い、頸動脈及び／又は迷走神経を損傷しないように注意して右頸静脈を単離した。５－０の絹縫合糸の一部を、単離した頸静脈の下に配置して、血管を頭側に後退させた後、２３ゲージの針で頸静脈に穴を開けた。圧力カテーテル（マイクロチップカテーテル変換器ＳＰＲ－１０００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を頸静脈の開口部に挿入し、右心房を通過して右心室に進めた。カテーテルは、心拍数並びに拡張期及び収縮期の右心室圧の両方を測定した圧力／容積計器（ＭＰＶＳ－３００、Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）に接続した。これらのパラメータは、データ取得システム（ＰｏｗｅｒＬａｂ ４／３５、ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してデジタル取得された。ＬａｂＣｈａｒｔ Ｐｒｏ ７．０ソフトウェア（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、右心室圧力を分析した。測定値は、圧力トレーシングの６０秒間隔から定量化した（圧力安定化を可能にするために２分間の記録後）。分析したパラメータは、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）及び心拍数（ＨＲ）であった。
右心肥大評価：インビボ血行動態測定の後、動物を麻酔下で放血によって安楽死させ、次いで、ＲＶ自由壁、左心室（ＬＶ）及び中隔組織を採取し、重み付けした。ＲＶ肥大は、ＲＶ対（ＬＶ＋中隔）の重量比としてＦｕｌｔｏｎ指数によって計算した。
結果
モノクロタリンラットで誘発された右心室圧の上昇：モノクロタリン処置ラットの研究番号１では、心臓の右心室圧力のカテーテルベースの評価は、４週目にアイソタイプ抗体処置群で右心室収縮期圧力の有意な上昇を明らかにした。２つの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体処置は、右心室収縮期圧を有意に低下させた（図３０及び表２８）。
モノクロタリンラットに誘導された右心室肥大：アイソタイプ対照ＩｇＧ処置群のモノクロタリンラットでは、右心室の心臓重量の増加が観察された。右心室重量対左心室＋中隔重量の比率は、右心室肥大の指数（すなわち、Ｆｕｌｔｏｎ指数）を提供する。生理食塩水で処置した対照と比較して、モノクロタリンで処置したラットで増加したｆｕｔｏｎ指数が観察され、これにより、右心室肥大の存在を示した。１０ｍｇ／ｋｇでの抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ及びＨ４Ｈ１３１３２Ｐによる予防的処置は、アイソタイプ対照で処置したラットと比較して、それぞれ、右心室肥大を３６％及び３０％減少させた（図３１及び表２８）。
モノクロタリンラットにおける動物生存率：研究番号２では、６０ｍｇ／ｋｇのモノクロタリンを注射したラットは、重度の肺高血圧症状を発症し、高い死亡率を示した。特に、アイソタイプ対照ＩｇＧ処置群を有するモノクロタリン中の１６匹のラットのうち１５匹が、３５日目までに死亡した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、モノクロタリン注射から１４日後に開始し、生存時間を有意に延長し、死亡率を改善した。標準治療薬であるエンドセリン受容体アンタゴニストマシテンタンは、生存期間を延ばすことができなかった。マシテンタンと抗ＰＤＧＦ－Ｂ処置との組み合わせは、抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体による単剤療法と比較して更なる生存利益を示さなかった（図３２及び表２９）。
要約すると、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体による予防的処置は、ＰＡＨのモノクロタリンラットモデルにおける血行動態エンドポイント（右心室収縮期圧）及び右心室肥大の両方を低下させた。Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体の治療的処置は、重度のモノクロタリンラットＰＡＨモデルにおける血管拡張薬エンドセリン受容体アンタゴニストマシテンタンよりも優れた生存利益を示した。抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐは、動物の死亡率及び生存時間の延長を有意に救済した。
等価物
当業者であれば、通常範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載される特定の実施形態及び方法に対する多くの均等物を認識するか、又は確定することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
非公式な配列表
Ｈ４Ｈ１３１４５Ｐ
配列番号１；ＨＣＶＲ
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＧＧＧＣＣＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２；ＨＣＶＲ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＴＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＹＧＡＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＦＱＤＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＮＴＡＹＭＥＬＲＧＬＫＳＤＤＴＡＶＹＦＣＡＲＡＷＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３；ＨＣＤＲ１
ＧＧＴ ＴＡＴ ＡＣＴ ＴＡＴ ＧＧＴ ＧＣＣ ＴＡＴ ＧＣＡ
配列番号４；ＨＣＤＲ１
Ｇ Ｙ Ｔ Ｙ Ｇ Ａ Ｙ Ａ
配列番号５；ＨＣＤＲ２
ＡＴＣ ＡＧＣ ＧＣＴ ＴＡＣ ＡＡＴ ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＣＡ
配列番号６；ＨＣＤＲ２
Ｉ Ｓ Ａ Ｙ Ｎ Ｇ Ｎ Ｔ
配列番号７；ＨＣＤＲ３
ＧＣＧ ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＡＣ ＴＡＣ
配列番号８；ＨＣＤＲ３
Ａ Ｒ Ａ Ｗ Ｎ Ｓ Ｆ Ｄ Ｙ
配列番号９；ＬＣＶＲ
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡ
配列番号１０；ＬＣＶＲ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＲＫＮＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＳＤＡＳＴＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＫＹＹＣＱＱＹＹＮＬＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号１１；ＬＣＤＲ１
ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＴＴ ＡＧＧ ＡＡＡ ＡＡＴ
配列番号１２；ＬＣＤＲ１
Ｑ Ｄ Ｉ Ｒ Ｋ Ｎ
配列番号１３；ＬＣＤＲ２
ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＣＣ
配列番号１４；ＬＣＤＲ２
Ｄ Ａ Ｓ
配列番号１５；ＬＣＤＲ３
ＣＡＡ ＣＡＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＡＴ ＣＴＣ ＣＣＡ ＴＴＣ ＡＣＴ
配列番号１６；ＬＣＤＲ３
Ｑ Ｑ Ｙ Ｙ Ｎ Ｌ Ｐ Ｆ Ｔ
配列番号１７；ＨＣ
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配列番号１８；ＨＣ
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配列番号１９；ＬＣ
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配列番号２０；ＬＣ
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配列番号２１；ＨＣＶＲ
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配列番号２２；ＨＣＶＲ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＴＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＹＧＤＹＹＦＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２３；ＨＣＤＲ１
ＧＧＡ ＧＧＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＣＴ
配列番号２４；ＨＣＤＲ１
Ｇ Ｇ Ｔ Ｆ Ｓ Ｓ Ｙ Ａ
配列番号２５；ＨＣＤＲ２
ＡＴＣ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＣＡ
配列番号２６；ＨＣＤＲ２
Ｉ Ｉ Ｐ Ｉ Ｆ Ｇ Ｔ Ａ
配列番号２７；ＨＣＤＲ３
ＧＣＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＴＧ ＧＡＣ ＧＴＣ
配列番号２８；ＨＣＤＲ３
Ａ Ｒ Ｅ Ｇ Ｙ Ｇ Ｄ Ｙ Ｙ Ｆ Ｇ Ｍ Ｄ Ｖ
配列番号２９；ＬＣＶＲ
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＡＡＧＣＣＴＣＧＴＡＴＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ
配列番号３０；ＬＣＶＲ
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配列番号３１；ＬＣＤＲ１
ＣＡＡ ＡＧＣ ＣＴＣ ＧＴＡ ＴＡＣ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ
配列番号３２；ＬＣＤＲ１
Ｑ Ｓ Ｌ Ｖ Ｙ Ｓ Ｄ Ｇ Ｎ Ｔ Ｙ
配列番号３３；ＬＣＤＲ２
ＡＡＧ ＡＴＴ ＴＣＴ
配列番号３４；ＬＣＤＲ２
Ｋ Ｉ Ｓ
配列番号３５；ＬＣＤＲ３
ＡＴＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＡＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＣＴ
配列番号３６；ＬＣＤＲ３
Ｍ Ｑ Ｇ Ｔ Ｈ Ｗ Ｐ Ｐ Ｔ
配列番号３７；ＨＣ
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＣＡＣＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＧＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＴＣＧＧＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ
配列番号３８；ＨＣ
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配列番号３９；ＬＣ
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配列番号４０；ＬＣ
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＹＳＤＧＮＴＹＬＮＷＦＱＱＲＰＤＱＳＰＲＲＬＩＹＫＩＳＮＲＤＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＨＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ＊
ｈＰＤＧＦ－Ｂ
配列番号４１；Ｐ０１１２７｜ＰＤＧＦＢ＿ヒト血小板由来成長因子サブユニットＢＯＳ＝ホモサピエンスＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＰＤＧＦＢ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＭＮＲＣＷＡＬＦＬＳＬＣＣＹＬＲＬＶＳＡＥＧＤＰＩＰＥＥＬＹＥＭＬＳＤＨＳＩＲＳＦＤＤＬＱＲＬＬＨＧＤＰＧＥＥＤＧＡＥＬＤＬＮＭＴＲＳＨＳＧＧＥＬＥＳＬＡＲＧＲＲＳＬＧＳＬＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩＤＲＴＮＡＮＦＬＶＷＰＰＣＶＥＶＱＲＣＳＧＣＣＮＮＲＮＶＱＣＲＰＴＱＶＱＬＲＰＶＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶＴＬＥＤＨＬＡＣＫＣＥＴＶＡＡＡＲＰＶＴＲＳＰＧＧＳＱＥＱＲＡＫＴＰＱＴＲＶＴＩＲＴＶＲＶＲＲＰＰＫＧＫＨＲＫＦＫＨＴＨＤＫＴＡＬＫＥＴＬＧＡ

Claims (22)

  1. ヒト血小板由来成長因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦ－Ｂ）に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片が、
    （ａ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１．８４ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で、３７℃でヒトＰＤＧＦ－サブユニットＢホモ二量体（ＰＤＧＦ－ＢＢ）に結合すること、
    （ｂ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１．３６ｐＭ未満のＫＤで、３７℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、
    （ｃ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１１５５分以上のｔ１／２で、３７℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、
    （ｄ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約２．７９ｐＭ未満のＫＤで、２５℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、
    （ｅ）表面プラズモン共鳴によって測定されたとき、約１１５５分以上のｔ１／２で、２５℃でヒトＰＤＧＦ－ＢＢに結合すること、
    （ｆ）２５℃での競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定されたとき、約１．９ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＰＤＧＦ－ＢＢに対してＰＤＧＦ－Ｂ活性化を阻害すること、
    （ｇ）２５℃での競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定されたとき、約８．８ｎＭ未満のＩＣ５０で、ヒトＰＤＧＦ－サブユニットＡ及びサブユニットＢヘテロ二量体（ＰＤＧＦ－ＡＢ）に対してＰＤＧＦ－Ｂ活性化を阻害すること、並びに
    （ｈ）ヒトＰＤＧＦ－ＢＢと、ヒトＰＤＧＦＲ－αα、ＰＤＧＦＲ－αβ、及びＰＤＧＦＲ－ββのうちの１つ以上との間の相互作用を遮断すること、からなる群から選択される１つ以上の特性を示す、単離されたヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
  2. ヒトＰＤＧＦ－Ｂに特異的に結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２及び２２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）と、配列番号１０及び３０からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）と、を含む、単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２又は配列番号２２の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項１又は２に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片。
  4. 前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号１０又は配列番号３０の配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記抗体又は抗原結合断片が、（ａ）配列番号２及び２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号１０及び３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片。
  6. 前記抗体又は抗原結合断片が、
    （ａ）配列番号４及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１ドメイン、
    （ｂ）配列番号６及び２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２ドメイン、
    （ｃ）配列番号８及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３ドメイン、
    （ｄ）配列番号１２及び３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１ドメイン、
    （ｅ）配列番号１４及び３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２ドメイン、並びに／又は
    （ｆ）配列番号１６及び３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３ドメイン、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片。
  7. 前記抗体又は抗原結合断片が、配列番号２／１０及び２２／３０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体又は抗原結合断片。
  8. 前記抗体又は抗原結合断片が、
    （ｉ）配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、及び
    配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、並びに／又は
    （ｉｉ）配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、及び
    配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体又は抗原結合断片。
  9. 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、又はｄＡｂ断片である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と同じヒトＰＤＧＦ－Ｂ上のエピトープに結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
  11. 請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と、ヒトＰＤＧＦ－Ｂへの結合を競合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を作製するための方法であって、
    （ｉ）前記抗体又は断片の軽免疫グロブリン鎖及び前記抗体又は断片の重免疫グロブリン鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、
    （ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で、前記宿主細胞を成長培地中で培養することと、
    （ｉｉｉ）任意選択的に、前記宿主細胞及び／又は前記宿主細胞が成長している培地から前記抗体又は断片を単離することと、を含む、方法。
  13. 請求項１２に記載の方法によって産生される、抗体又は抗原結合断片。
  14. 請求項１～１１及び１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片を含む、注射デバイス又は容器。
  15. 請求項１～１１及び１３のいずれか一項に記載のヒトＰＤＧＦ－Ｂに結合する単離されたヒト抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、任意選択的に、１つ以上の追加の治療剤と、を含む、薬学的組成物。
  16. 前記１つ以上の追加の治療剤が、鉄サプリメントを含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  17. 肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）の予防又は治療を必要とする患者において肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を予防又は治療するための方法であって、有効量の請求項１～１１及び１３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項１５若しくは１６に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
  18. 前記抗体又はその抗原結合断片が、皮下、静脈内、真皮内、経口、又は筋肉内に投与される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＰＡＨが、対象の肺動脈の肥厚、前記対象の一回拍出量の減少、前記対象の右心室心拍出量の減少、及び前記対象の生存時間の減少からなる群から選択される状態を生じさせ、
    前記抗体又は抗原結合断片の投与が、前記状態を治療するか、又は前記状態のうちの１つ以上の症状の重症度を低減する、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. ＰＡＨを有する患者の治療に使用するための、請求項１～１１及び１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  21. ＰＡＨの治療に使用するための、請求項１～１１及び１３のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体又はその抗原結合断片を含む、組成物。
  22. ＰＡＨを有する患者を治療するための医薬の製造における、請求項１～１１及び１３のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合断片の使用。
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