JP2024503784A

JP2024503784A - Ｎｐｒ１アゴニストに結合する免疫グロブリンタンパク質

Info

Publication number: JP2024503784A
Application number: JP2023536859A
Authority: JP
Inventors: マイケル・ダン; ローリ・モートン; ニール・スタール; タミー・ファン; イシター・チャタジー; ヴィシャール・カマット; アシーク・ラフィーク
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2024-01-29
Also published as: KR20230132468A; CN116964101A; CO2023009498A2; IL303542A; US20220195058A1; EP4263616A1; MX2023007023A; AU2021401415A1; CA3202629A1; CL2023001680A1; WO2022133239A1

Abstract

本開示は、ヒトナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）アゴニスト、好ましくは抗ＮＰＲ１抗体に結合する新規免疫グロブリンタンパク質を提供する。ある種の実施形態において、本開示のタンパク質は、抗ＮＰＲ１抗体に結合する少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある種の実施形態において、本開示のタンパク質は、投与された抗ＮＰＲ１抗体の効果を遮断するおよび／または反転させるのに有用である。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトにおける血圧および血行動態の効果的な管理に有用である。

Description

本開示は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）アゴニストに特異的に結合する免疫グロブリンタンパク質、およびそれらのタンパク質を使用する治療方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ特許国際出願として２０２１年１２月１７日に出願されている。本出願は、２０２０年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１２７，９５９号に対する優先権を主張し、その全内容は参照によって本明細書に組み入れられる。

配列の陳述
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる配列表を含む。２０２１年１２月１３日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、４０８４８－０１０４ＷＯＵ１－ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前を付けられ、７１キロバイトのサイズである。

ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１；ＮＰＲ－Ａとしても知られている）は、サイクリックＧＭＰへのＧＴＰの変換を触媒する酵素であるグアニリルシクラーゼ受容体の細胞表面ファミリーに属する。ＮＰＲ１は、腎臓、肺、副腎、血管系、脳、肝臓、内皮組織および脂肪組織において高度に発現し、心臓では低レベルで発現する。これは、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）または脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）に結合することによって活性化される。ＮＰＲ１の活性化およびシグナル伝達は、多くの組織に関与する多くの生理学的反応を刺激する。ＡＮＰ－ＮＰＲ１系は、血管弛緩、ナトリウム利尿、利尿、内皮透過性、ならびに脂肪分解および免疫細胞機能のような非心臓血管機能における役割について十分に研究されている（非特許文献１）。ＮＰＲ１の活性化はナトリウム利尿（腎臓による塩分の排出）を引き起こし、血圧を低下させる。

ＮＰＲ１のアゴニズムを目的とした現在承認されている治療薬には、複数の臨床的課題がある。

ＮＰＲ１に対するモノクローナル抗体は、Ｋｉｔａｎｏら（非特許文献２）によって最初に記載された。活性化またはアゴニスト抗ＮＰＲ１抗体は、例えば、特許文献１および特許文献２および特許文献３に開示されている。高い親和性でＮＰＲ１タンパク質に特異的に結合し、それを活性化する完全ヒトアゴニスト抗体は、特許文献４に記載されている。Ｒ５３８１は、現在の標準治療と比較して全身血圧の低下において長期間の効果が示されているＮＰＲ１のアゴニストである。

ｉｎｖｉｖｏ研究により、Ｒ５３８１は、有害な低血圧（すなわち、失神、運動力の変化、死亡）の証拠を示さずに、全身血圧の大幅で持続的な低下を誘導することが示された。ある種の抗ＮＰＲ１抗体の主な作用機序は血行動態であることが見出されているため、その血行動態効果を阻止する反転剤が必要とされている。

米国特許第９０９０６９５号米国特許公開第２０１６０１６８２５１号ＷＯ２０１００６５２９３米国特許公開第２０２００１２３２６３号

Ｐｏｔｔｅｒ２０１１年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３０：７１～８２頁１９９５年ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ４７：２１５～２２頁

ＮＰＲ１アゴニスト（例えば、活性化またはアゴニスト抗ＮＰＲ１抗体）の使用に関して起こり得る懸念に対処する取り組みにおいて、本明細書に開示されているように、このようなＮＰＲ１アゴニストに特異的に結合する反転剤が開発された。

抗ＮＰＲ１抗体は、ＮＰＲ１に関連する疾患、障害もしくは状態の処置および／もしくは予防、ならびに／またはそのような疾患、障害もしくは状態に関連する少なくとも１つの症状を改善することに関して記載されている（例えば、ＷＯ２０２０／０８６４０６を参照）。抗ＮＰＲ１抗体の主な作用機序は血行動態である。血圧低下に関連する潜在的な有害事象には、持続性の症候性低血圧、代償性交感神経系反応による反射性頻脈（心筋梗塞、脳卒中、不整脈、心不全のリスクが増加する可能性がある）、ならびに正常（低い）静脈圧を有する対象における心拍出量および終末器官灌流の減少が含まれる。したがって、抗ＮＰＲ１抗体の血行動態効果を標的とし、安定化するか、または低減もしくは反転させることができる反転剤（または救済剤）が必要とされている。

したがって、本開示は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）アゴニストの血行動態効果を反転させる薬剤を提供する。この薬剤は、本明細書において反転剤または救済剤とも呼ばれる。

別の態様において、本開示は、対象におけるＮＰＲ１アゴニストの投与に関連する血圧の低下を反転させる薬剤を提供する。

一実施形態において、薬剤は、免疫グロブリンタンパク質、昇圧剤、アルファ－アドレナリン受容体アゴニスト、ステロイド、抗利尿ホルモン、血管新生阻害剤、および血圧を増加させる小分子薬剤からなる群から選択される。

一実施形態において、薬剤は、免疫グロブリンタンパク質である。一実施形態において、薬剤は、ＮＰＲ１アゴニストに特異的に結合する。一実施形態において、ＮＰＲ１アゴニストは、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；および配列番号５２を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体は、配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびに配列番号５３、５４および５５をそれぞれ含む３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のＨＣＶＲおよび配列番号５２のＬＣＶＲを含む。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体は、モノクローナル抗体である。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５６を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖を含む。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体は、Ｒ５３８１である。

一実施形態において、救済剤は、免疫グロブリンタンパク質である。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。別の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、２価抗体を含む。別の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、１価または「１アーム」抗体を含む。別の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、組換えモノクローナル抗体を含む。別の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、２価または１価である完全ヒトモノクローナル抗体を含む。別の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである完全ヒトモノクローナル抗体である。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、Ｆａｂフラグメントを含む。ある実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、２価モノクローナル抗体、１価モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖまたはｄＡｂを含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲおよびＬＣＶＲ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲを含む１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む多量体化成分をさらに含む。一実施形態において、多量体化成分は、第１のＦｃフラグメントおよび第２のＦｃフラグメントを含み、両方ではないが、第１のＦｃフラグメントまたは第２のＦｃフラグメントは、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む。一実施形態において、修飾は、Ｈ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む。

一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、１価抗体を含み、１価抗体は、重鎖定常領域およびＨＣＶＲを含む重鎖、ならびに軽鎖定常領域およびＬＣＶＲを含む軽鎖を含み、重鎖は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。一実施形態において、重鎖定常領域は、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む。一実施形態において、修飾は、Ｈ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、Ｆｃフラグメントを含む多量体化成分をさらに含む。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。

一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲおよびＬＣＶＲ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲを含む１つの免疫グロブリン可変ドメインを含むＦａｂフラグメントを含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、多量体化成分をさらに含む。一実施形態において、多量体化成分は、少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ４またはそれらの変異体のものである。一実施形態において、多量体化成分は、第１のＦｃフラグメントおよび第２のＦｃフラグメントを含み、両方ではないが、第１のＦｃフラグメントまたは第２のＦｃフラグメントは、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む。一実施形態において、修飾は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃフラグメントにおけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む。

表１に、典型的な免疫グロブリンタンパク質の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別名を記載する。表２に、典型的な免疫グロブリンタンパク質のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別名を記載する。

ＣＤＲの境界を同定するために用いられる典型的な慣例は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義を含む。一般的な用語において、Ｋａｂａｔ定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造上のループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間で妥協したものである。例えば、Ｋａｂａｔ、「ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ」、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７～９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８～９２７２（１９８９年）を参照。公的データベースも、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。

ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、前記ＨＣＶＲは、１２個以下のアミノ酸置換を有する表１に挙げられるアミノ酸配列を含み、および／または前記ＬＣＶＲは、１０個以下のアミノ酸置換を有する表１に挙げられるアミノ酸配列を含む。例えば、本開示は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記ＨＣＶＲが表１に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸置換を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。他の例では、本開示は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記ＬＣＶＲが、表１に記載のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸置換を有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、本開示は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む免疫グロブリンタンパク質またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記ＨＣＶＲは、表１に挙げられるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、および／または前記ＬＣＶＲは表１に挙げられるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。

ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントである。

ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントである。

本開示はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

本開示はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

本開示はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対形成される表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある種の実施形態によると、本開示は、表１に挙げられる典型的な免疫グロブリンタンパク質のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８／１６および２８／３６からなる群より選択される。

ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、本明細書に開示される核酸分子によってコードされる抗体またはその抗原結合フラグメントである。例えば、本開示は、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある実施形態において、不所望なグリコシル化部位を取り除くための修飾が有用であり得るか、またはフコース部分を欠く抗体は、オリゴ糖鎖上に示して、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）機能が増大される（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２年）ＪＢＣ２７７：２６７３３頁を参照）。他の適用において、ガラクトシル化という修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために成される。

一態様において、本開示は：（ｉ）ＨＣＶＲ内に含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、およびＬＣＶＲ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質を提供する。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質のＨＣＶＲは、表１のＨＣＶＲ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質のＬＣＶＲは、表１のＬＣＶＲ配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号８および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号１２および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号１４および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号１６および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３は、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４および１６；または（ｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、３４および３６から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、多量体化成分をさらに含み、多量体化成分は、少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。一実施形態において、多量体化成分は、第１のＦｃフラグメントおよび第２のＦｃフラグメントを含み、両方ではないが、第１のＦｃフラグメントまたは第２のＦｃフラグメントは、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む。一実施形態において、修飾は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃフラグメントにおけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む。一実施形態において、多量体化成分は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＦｃフラグメントおよび配列番号５８のアミノ酸配列を含むＦｃフラグメントを含む。
配列番号５８：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、２価抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、１価（「１アーム」）抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ＨＣＶＲを含む重鎖およびＬＣＶＲを含む軽鎖を含み、重鎖は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。一実施形態において、重鎖は、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む。一実施形態において、修飾は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖におけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む。一実施形態において、重鎖は、配列番号１８および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；軽鎖は、配列番号２０および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、Ｆｃフラグメントをさらに含む。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。一実施形態において、Ｆｃフラグメントは、配列番号４６を含むアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体は、Ｒ５３８１である。

一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ＲＥＧＮ９０３５である。一実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ＲＥＧＮ９０３７である。

一態様において、本開示は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。別の態様において、本開示は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。一態様において、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子を含むベクターを提供する。ある種の実施形態において、ベクターは、免疫グロブリンタンパク質の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含むポリヌクレオチドを発現することができる組換え発現ベクターである。例えば、本開示は、本明細書に開示される核酸分子、すなわち、表２に挙げられるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。別の態様において、本開示は、本明細書に開示されるベクターを発現する宿主細胞を提供する。例えば、本開示は、本明細書に開示されるように、免疫グロブリンタンパク質の重鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる第１の組換え発現ベクター；免疫グロブリンタンパク質の軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる第２の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、本開示は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む第１の単離されたポリヌクレオチド分子、および本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の単離されたポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を提供する。ある種の実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞または原核細胞を含む。ある種の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞である。

一態様において、本開示は、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントを産生する方法であって、抗体またはフラグメントの産生を可能にする条件下で本明細書に開示される宿主細胞を成長させること、およびこのように産生された免疫グロブリンタンパク質またはフラグメントを回収することを含む、方法を提供する。ある種の実施形態において、本開示は、本開示の免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントを産生する方法であって、宿主細胞に、プロモーターに作動可能に連結された本開示の免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントのＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲをコードする核酸配列を含む発現ベクターを導入すること；核酸配列の発現に好ましい条件下で宿主細胞を培養すること；ならびに培養培地および／または宿主細胞から免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントを単離することを含む、方法を提供する。単離された免疫グロブリンタンパク質またはそのフラグメントは、従来技術で公知の方法のいずれかを使用して精製することができる。一実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、本明細書の他の場所に開示されるように、プロテインＡへの異なる結合を利用した試薬および方法を使用して精製することができる。

一実施形態において、救済剤は、昇圧剤である。別の実施形態において、昇圧剤は、ミドドリンである。

一態様において、本開示は、本明細書に開示される救済剤および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、組成物は、救済剤および第２の治療剤の組合せを含む。一実施形態において、第２の治療剤は、救済剤と有利に組み合わされる任意の薬剤である。本開示の救済剤を含む追加の組合せ療法および共製剤は、本明細書の他の場所に開示される。

一態様において、本開示は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントの血行動態効果を反転させる方法であって、本明細書に開示される治療有効量の救済剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様において、本開示は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）タンパク質に特異的に結合するアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントの投与に関連する血圧の低下を反転させる方法であって、治療有効量の本明細書に開示される救済剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

ある種の実施形態において、医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、または経口で対象に投与される。

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象における抗ＮＰＲ１抗体の投与に関連する血行動態効果を反転させるための医薬の製造における本明細書に開示される救済剤の使用を提供する。

一実施形態において、対象は、ＮＰＲ１関連疾患または障害を有する。一実施形態において、疾患または障害は、高血圧、心不全および／または慢性腎疾患である。

一態様において、本開示は：（ｉ）本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質；および（ｉｉ）ＮＰＲ１アゴニストを含む組成物を提供する。一実施形態において、ＮＰＲ１アゴニストは、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）である。一実施形態において、組成物は、それを必要とする対象における血圧の効果的な調節のための方法で使用される。一実施形態において、対象は、ＮＰＲ１関連疾患または障害を有する。一実施形態において、疾患または障害は、高血圧、心不全および／または慢性腎不全である。

一態様において、本開示は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質との結合について競合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

別の態様において、本開示は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

他の実施形態は、以下の詳細な説明の検討から明らかになるであろう。

ｐＨ７．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ５．０のバッファにおける抗Ｒ５３８１抗体である、ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７の解離半減期（ｔ１／２）の比較を棒グラフ形式で提供する図である。ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおける抗Ｒ５３８１抗体である、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７、ＲＥＧＮ６５８０、およびＲＥＧＮ６５８１の薬物動態プロファイルを折れ線グラフ形式で提供する図である。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１誘導性収縮期血圧低下の反転に対する２価抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、収縮期血圧および体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表１８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１またはＰＢＳの皮下注射を与えた。次に、動物に、表１８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価ｍＡｂまたはＰＢＳの静脈内注射を与えた。全ての値は、－２～２０日目の２４時間にわたる平均圧力±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。統計－ダネットを用いた二元配置分散分析；^＊ｐ＜０．０５対アイソタイプ対照ｍＡｂ。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１誘導性拡張期血圧低下の反転に対する２価抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、収縮期血圧および体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表１８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１またはＰＢＳの皮下注射を与えた。次に、動物に、表１８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価ｍＡｂまたはＰＢＳの静脈内注射を与えた。全ての値は、－２～２０日目の２４時間にわたる平均圧力±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。統計－ダネットを用いた二元配置分散分析；^＊ｐ＜０．０５対アイソタイプ対照。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１ｍＡｂ誘導性心拍数作用の反転に対する２価抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、収縮期血圧および体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表１８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１またはＰＢＳの皮下注射を与えた。次に、動物に、表１８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価ｍＡｂまたはＰＢＳの静脈内注射を与えた。全ての値は、－２～２０日目の２４時間にわたる平均心拍数±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。統計－ダネットを用いた二元配置分散分析。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１ｍＡｂ誘導性平均動脈血圧低下の反転に対する２価抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、収縮期血圧および体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表１８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１またはＰＢＳの皮下注射を与えた。次に、動物に、表１８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価ｍＡｂまたはＰＢＳの静脈内注射を与えた。全ての値は、－２～２０日目の２４時間にわたる平均圧力±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。統計－ダネットを用いた二元配置分散分析；^＊ｐ＜０．０５対アイソタイプ対照ｍＡｂ。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１誘導性収縮期血圧低下の反転に対する２価抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、収縮期血圧および体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表２３に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１またはＰＢＳの皮下注射を与えた。次に、動物に、表２３に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂの皮下注射を与えた。全ての値は、－３～２１日目の２４時間にわたる平均圧力±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。統計－ダネットを用いた二元配置分散分析；^＊ｐ＜０．０５ＰＢＳ対アイソタイプ対照ｍＡｂ；^＊＊ｐ＜０．０１ＰＢＳ対アイソタイプ対照ｍＡｂ；！ｐ＜．０５ＲＥＧＮ６５８０対アイソタイプ対照ｍＡｂ；＃ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ６５８１対アイソタイプ対照。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１誘導性収縮期血圧低下の反転に対する１価抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表２８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＮＰＲ１アゴニストｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂの皮下注射を与えた。次に、動物に、表２８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価（ＲＥＧＮ６５８０）もしくは１価（ＲＥＧＮ９０３５またはＲＥＧＮ９０３７）のｍＡｂまたはＰＢＳの静脈内注射を与えた。全ての値は、平均±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。統計－ダネットを用いた二元配置分散分析；^＊ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ６５８０ｓ．ｃ．対アイソタイプ対照ｍＡｂ；^＃ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ９０３５ｓ．ｃ．対アイソタイプ対照ｍＡｂ；^！ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ９０３７ｓ．ｃ．対アイソタイプ対照ｍＡｂ；^＠ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ６５８０ｉ．ｖ．対アイソタイプ対照ｍＡｂ；^＆ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ９０３５ｉ．ｖ．対アイソタイプ対照ｍＡｂ；^＞ｐ＜０．０５ＲＥＧＮ９０３７ｉ．ｖ．対アイソタイプ対照ｍＡｂ。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１誘導性血圧低下の反転に対する１価および２価の抗Ｒ５３８１ｍＡｂの急性効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表２８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１またはＰＢＳ対照の皮下注射を与えた。次に、動物に、表２８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価（ＲＥＧＮ６５８０）もしくは１価（ＲＥＧＮ９０３５またはＲＥＧＮ９０３７）のｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂの静脈内注射を与えた。全ての値は、平均±ＳＥＭ、群当たりｎ＝４～５である。正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおけるＲ５３８１誘導性ｃＧＭＰ生成の反転に対する１価の抗Ｒ５３８１ｍＡｂの効果を折れ線グラフ形式で示す図である。遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを、体重に基づいて群に無作為化した。動物に、表２８に記載されるように、単回の５ｍｇ／ｋｇのＮＰＲ１アゴニストｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂの皮下注射を与えた。次に、動物に、表２８に記載されるように、単回の５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｒ５３８１の２価（ＲＥＧＮ６５８０）もしくは１価（ＲＥＧＮ９０３５またはＲＥＧＮ９０３７）のｍＡｂまたはＰＢＳの静脈内注射を与えた。尿を研究の２１日目から２２日目まで一晩採取した。全ての値は、平均±ＳＥＭ、群当たりｎ＝５～６である。統計－ダネットを用いた分散分析；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対ＰＢＳ＋ＰＢＳ；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１対Ｒ５３８１＋アイソタイプ対照ｍＡｂ。２５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１の単回投与の３日後に投与した２．５ｍｇ／ｋｇのミドドリンの３回の投与により、Ｒ５３８１の血圧低下効果が反転することを示す図である。体重３～５ｋｇのオスのカニクイザルに、無線遠隔測定送信機を外科的に埋め込んだ。０日目に、各動物に生理食塩水（ＰＢＳ；ｎ＝１０）または２５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１（ｎ＝１３）の単回ＩＶボーラスを与えた。３日目に、各動物に、ｘ軸上の点線で示されるように、各投与を３～４時間の間隔を空けて、強制経口投与によって投与した２．５ｍｇ／ｋｇ／用量のミドドリン（生理食塩水群ではｎ＝６；Ｒ５３８１群ではｎ＝７）または水／ビヒクル（生理食塩水群ではｎ＝４；Ｒ５３８１群ではｎ＝６）の３回の投与を与えた。血圧測定値は、各動物の投与前（ベースライン測定のため）および投与後４日間のモニタリング期間中に収集した。Ｒ５３８１投与後３５時間から７２時間の間の各処置群についてのベースライン収縮期血圧からの平均変化を示す。データは、群の平均±平均の標準誤差として表す。２５ｍｇ／ｋｇの単回投与の３日後に投与した２．５ｍｇ／ｋｇのミドドリンの３回の投与により、Ｒ５３８１誘導性心拍数作用が反転することを示す図である。体重３～５ｋｇの年齢のオスのカニクイザルに、無線遠隔測定送信機を外科的に埋め込んだ。０日目に、各動物に生理食塩水（ＰＢＳ；ｎ＝１０）または２５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１（ｎ＝１３）の単回ＩＶボーラスを与えた。３日目に、各動物に、ｘ軸上の点線で示されるように、各投与を３～４時間の間隔を空けて、強制経口投与によって投与した２．５ｍｇ／ｋｇ／用量のミドドリン（生理食塩水群ではｎ＝６；Ｒ５３８１群ではｎ＝７）または水／ビヒクル（生理食塩水群ではｎ＝４；Ｒ５３８１群ではｎ＝６）の３回の投与を与えた。心拍数測定値は、各動物の投与前（ベースライン測定のため）および投与後４日間のモニタリング期間中に収集した。Ｒ５３８１投与後３５時間から７２時間の間の各処置群についてのベースライン心拍数からの平均変化を示す。データは、群の平均±平均の標準誤差として表す。

本方法を説明する前に、本開示は記載された特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変化し得ることは理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであることも理解されるべきであり、本開示の範囲は、添付の請求項によってのみ制限されるため、制限であることは意図されない。

別段定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本開示が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または均等な任意の方法および材料は、本開示の実施または試験において用いられるが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書において述べられる全ての刊行物は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる。

定義
「ＮＰＲＡ」とも呼ばれる用語「ＮＰＲ１」は、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａとしても知られる）を指す。ＮＰＲ１はホモ二量体の膜貫通グアニル酸シクラーゼであり、ｃＧＭＰ合成を触媒する酵素である。このタンパク質は、細胞外リガンド結合ドメイン、単一膜貫通領域、細胞内プロテインキナーゼ様相同ドメイン、およびグアニリルシクラーゼ触媒ドメインを含む４つの異なる領域を有する。全長ＮＰＲ１タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｐ１６０６６．１（配列番号５９）としてＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔにおいて提供されるアミノ酸配列によって例示される：
１ｍｐｇｐｒｒｐａｇｓｒｌｒｌｌｌｌｌｌｌｐｐｌｌｌｌｌｒｇｓｈａｇｎｌｔｖａｖｖｌｐｌａｎｔｓｙｐｗｓｗａｒｖｇｐａｖｅ
６１ｌａｌａｑｖｋａｒｐｄｌｌｐｇｗｔｖｒｔｖｌｇｓｓｅｎａｌｇｖｃｓｄｔａａｐｌａａｖｄｌｋｗｅｈｎｐａｖｆｌｇｐｇｃｖｙ
１２１ａａａｐｖｇｒｆｔａｈｗｒｖｐｌｌｔａｇａｐａｌｇｆｇｖｋｄｅｙａｌｔｔｒａｇｐｓｙａｋｌｇｄｆｖａａｌｈｒｒｌｇｗｅｒ
１８１ｑａｌｍｌｙａｙｒｐｇｄｅｅｈｃｆｆｌｖｅｇｌｆｍｒｖｒｄｒｌｎｉｔｖｄｈｌｅｆａｅｄｄｌｓｈｙｔｒｌｌｒｔｍｐｒｋｇｒ
２４１ｖｉｙｉｃｓｓｐｄａｆｒｔｌｍｌｌａｌｅａｇｌｃｇｅｄｙｖｆｆｈｌｄｉｆｇｑｓｌｑｇｇｑｇｐａｐｒｒｐｗｅｒｇｄｇｑｄｖ
３０１ｓａｒｑａｆｑａａｋｉｉｔｙｋｄｐｄｎｐｅｙｌｅｆｌｋｑｌｋｈｌａｙｅｑｆｎｆｔｍｅｄｇｌｖｎｔｉｐａｓｆｈｄｇｌｌｌｙ
３６１ｉｑａｖｔｅｔｌａｈｇｇｔｖｔｄｇｅｎｉｔｑｒｍｗｎｒｓｆｑｇｖｔｇｙｌｋｉｄｓｓｇｄｒｅｔｄｆｓｌｗｄｍｄｐｅｎｇａｆ
４２１ｒｖｖｌｎｙｎｇｔｓｑｅｌｖａｖｓｇｒｋｌｎｗｐｌｇｙｐｐｐｄｉｐｋｃｇｆｄｎｅｄｐａｃｎｑｄｈｌｓｔｌｅｖｌａｌｖｇｓ
４８１ｌｓｌｌｇｉｌｉｖｓｆｆｉｙｒｋｍｑｌｅｋｅｌａｓｅｌｗｒｖｒｗｅｄｖｅｐｓｓｌｅｒｈｌｒｓａｇｓｒｌｔｌｓｇｒｇｓｎｙ
５４１ｇｓｌｌｔｔｅｇｑｆｑｖｆａｋｔａｙｙｋｇｎｌｖａｖｋｒｖｎｒｋｒｉｅｌｔｒｋｖｌｆｅｌｋｈｍｒｄｖｑｎｅｈｌｔｒｆｖｇ
６０１ａｃｔｄｐｐｎｉｃｉｌｔｅｙｃｐｒｇｓｌｑｄｉｌｅｎｅｓｉｔｌｄｗｍｆｒｙｓｌｔｎｄｉｖｋｇｍｌｆｌｈｎｇａｉｃｓｈｇｎ
６６１ｌｋｓｓｎｃｖｖｄｇｒｆｖｌｋｉｔｄｙｇｌｅｓｆｒｄｌｄｐｅｑｇｈｔｖｙａｋｋｌｗｔａｐｅｌｌｒｍａｓｐｐｖｒｇｓｑａｇ
７２１ｄｖｙｓｆｇｉｉｌｑｅｉａｌｒｓｇｖｆｈｖｅｇｌｄｌｓｐｋｅｉｉｅｒｖｔｒｇｅｑｐｐｆｒｐｓｌａｌｑｓｈｌｅｅｌｇｌｌｍ
７８１ｑｒｃｗａｅｄｐｑｅｒｐｐｆｑｑｉｒｌｔｌｒｋｆｎｒｅｎｓｓｎｉｌｄｎｌｌｓｒｍｅｑｙａｎｎｌｅｅｌｖｅｅｒｔｑａｙｌｅ
８４１ｅｋｒｋａｅａｌｌｙｑｉｌｐｈｓｖａｅｑｌｋｒｇｅｔｖｑａｅａｆｄｓｖｔｉｙｆｓｄｉｖｇｆｔａｌｓａｅｓｔｐｍｑｖｖｔｌ
９０１ｌｎｄｌｙｔｃｆｄａｖｉｄｎｆｄｖｙｋｖｅｔｉｇｄａｙｍｖｖｓｇｌｐｖｒｎｇｒｌｈａｃｅｖａｒｍａｌａｌｌｄａｖｒｓｆｒ
９６１ｉｒｈｒｐｑｅｑｌｒｌｒｉｇｉｈｔｇｐｖｃａｇｖｖｇｌｋｍｐｒｙｃｌｆｇｄｔｖｎｔａｓｒｍｅｓｎｇｅａｌｋｉｈｌｓｓｅｔ
１０２１ｋａｖｌｅｅｆｇｇｆｅｌｅｌｒｇｄｖｅｍｋｇｋｇｋｖｒｔｙｗｌｌｇｅｒｇｓｓｔｒｇ

用語「ＮＰＲ１」は、組換えＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントを含む。この用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトのＦｃ、またはシグナル配列に結合したＮＰＲ１タンパク質またはそのフラグメントも包含する。

本明細書で使用される場合、用語「ＮＰＲ１アゴニスト」は、ＮＰＲ１活性を活性化、増加もしくは増強するか、またはＮＰＲ１の活性化コンフォメーションを安定化する分子を指す。好ましい実施形態において、用語「ＮＰＲ１アゴニスト」は、ＮＰＲ１に特異的に結合し、ＮＰＲ１の少なくとも１つの生物学的活性を活性化または増加させる抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。このようなアゴニスト抗ＮＰＲ１抗体は、リガンド（例えば、ＡＮＰまたはＢＮＰ）の存在下または非存在下のいずれかでＮＰＲ１に結合することができる。ある種の実施形態において、生物学的活性には、アゴニスト抗ＮＰＲ１抗体の投与時の対象における血圧の減少または低下が含まれるが、これに限定されない。ある種の実施形態において、生物学的活性には、高血圧、心不全または慢性腎疾患などの疾患または障害を有する対象における血行動態変化（例えば、血圧の低下）が含まれる。この用語には、例えば、米国公開第２０２００１２３２６３号に開示されているアゴニスト抗ＮＰＲ１抗体が含まれる。特定の実施形態において、この用語は、配列番号４８のＨＣＶＲおよび配列番号５２のＬＣＶＲを含む抗ＮＰＲ１抗体を指す。別の特定の実施形態において、この用語は、Ｒ５３８１（ＲＥＧＮ５３８１としても知られる）を指す。Ｒ５３８１は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む完全ヒト抗ＮＰＲ１モノクローナル抗体である。

本明細書で使用される場合、「反転剤」または「救済剤」は、ＮＰＲ１アゴニストの血行動態効果を反転させる薬剤である。「反転剤」および「救済剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ある種の実施形態において、本明細書で言及される反転剤は、ＮＰＲ１に特異的に結合するアゴニスト抗体または抗原結合フラグメントの（対象への）投与に関連する血行動態変化を反転させる。「反転させる」という用語は、ＮＰＲ１アゴニストの投与の結果として血圧が低下している対象の血圧を増加させることを含む。血圧の増加は、当該技術分野で公知の任意の標準的な血圧評価手段（例えば、血圧計）を使用して測定することができる。この増加は、プレアゴニスト抗体の処置レベルまで、または十分な血行動態安定性をもたらすレベルまでであり得る。血行動態効果は、血圧降下に関連する効果である間接的な効果を含み得る。これらの効果も同様に、本明細書に開示される薬剤を使用して反転させることができる。本明細書で言及される血行動態効果には、血圧および心拍数などの生理学的パラメーター、またはめまい、立ちくらみ、かすみ目、吐き気、疲労などの臨床徴候が含まれる。ある種の実施形態において、反転剤は、ＮＰＲ１アゴニストに特異的に結合し、ＮＰＲ１アゴニストによって引き起こされる血行動態効果を反転させる。特定の実施形態において、反転剤は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質を含む。

本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリンタンパク質」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む抗原結合分子を指す。少なくとも１つの可変ドメインは抗原結合ドメインであり、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態において、可変ドメインは、本明細書の他の場所に開示されるように、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、または抗体の任意の他の抗原結合フラグメントに含まれる。ある実施形態において、可変ドメインは、１価または２価の抗体に含まれる。この用語には、抗体およびその抗原結合フラグメント、１価抗体、２価抗体およびその抗原結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。免疫グロブリンタンパク質はまた、可変ドメインに連結した多量体化成分を含んでもよい。本明細書の他の場所に開示されるように、多量体化成分は、抗体のＦｃフラグメントまたは抗体の切断された重鎖を含んでもよい。例えば、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、Ｆａｂ内に単一の可変ドメインを含んでもよく、Ｆａｂは少なくとも１つのＦｃフラグメントに連結している。ある種の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、（ｉ）重鎖定常領域および重鎖可変領域を含む重鎖、（ｉｉ）軽鎖定常領域および軽鎖可変領域を含む軽鎖、ならびに（ｉｉｉ）Ｆｃフラグメントまたは切断された重鎖を含むポリペプチドを含む。ある種の実施形態において、Ｆｃドメインポリペプチドは、抗原結合ドメインに連結していないＦｃドメインポリペプチドを指す「ダミーＦｃ」である。単一の可変ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質は、「１アーム」または「単一アーム」または「１価」抗体と呼ばれることがある。本開示の文脈において、この用語は、別の抗体の可変領域に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント（「抗イディオタイプ抗体」）を指す。特定の実施形態において、この用語は、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントに特異的に結合する単一可変ドメインを含む抗体（またはその抗原結合フラグメント）を指す。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは競合的結合剤である。本開示の１アーム抗体は、本明細書の表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含み得る。本明細書に開示される例示的な１アーム抗Ｒ５３８１抗体には、ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、別段具体的に示されない限り、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互結合された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合フラグメントを指すことが意図される。本開示の文脈において、用語「２価抗体」は、「完全抗体分子」、すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖を含むものを指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「Ｖ_Ｈ」）、ならびに重鎖定常領域（ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む）を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「Ｖ_Ｌ」）、および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、高頻度可変性の領域にさらに細分される。それぞれのＶ_ＨならびにＶ_Ｌは、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。本開示のある種の実施形態において、抗体（もしくはその抗原結合フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然または人工的に修飾される。アミノ酸連続配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲの隣り合った解析に基づき定義される。

ある種の実施形態において、用語「抗体」または「抗原結合分子」は、１価抗原結合分子を含む。１価抗原結合分子は、単一の重鎖および単一の軽鎖によって形成される単一の抗原結合ドメインを含む。一価抗原結合分子は、重鎖の少なくとも１つのＦｃドメインを含むポリペプチドをさらに含む。ある種の実施形態において、Ｆｃドメインポリペプチドは、「ダミーＦｃ」であり、これは、抗原結合ドメインに連結していないＦｃドメインポリペプチドを指す。ある種の実施形態において、１価抗体は、完全な重鎖、完全な軽鎖、および切断された重鎖を有する。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリンのフラグメントの結晶化可能な領域を指し、これは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系の一部のタンパク質と相互作用する抗体の尾部領域である。この特性により、抗体は免疫系を活性化することができる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域またはＦｃドメインは、抗体の重鎖の２番目および３番目の定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）に由来し；ＩｇＭおよびＩｇＥＦｃ領域は、ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈドメイン２～４）を含有する。本開示の文脈において、この用語は、別段具体的に示されない限り、ヒトＦｃドメインに由来するＦｃ領域を指す。ある種の実施形態において、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプに由来する。

本明細書で使用される場合、「多量体化成分」は、同じまたは類似の構造または構成の第２の巨大分子と会合する能力を有する任意の巨大分子を指す。例えば、多量体化成分は、免疫グロブリンＣ_Ｈ３ドメインを含むポリペプチドであり得る。多量体化成分の非限定的な例は、抗体のＦｃ部分（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含む）、例えば、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびに各アイソタイプ群内の任意のアロタイプから選択されるＩｇＧのＦｃドメインである。ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む多量体化成分を含む。ある種の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、２つのＦｃフラグメントを含む。第１および第２のＦｃフラグメントは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。あるいは、第１および第２のＦｃフラグメントは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプのものであってもよい。ある種の実施形態において、２つのＦｃフラグメントは、同一の配列を有する。ある種の実施形態において、２つのＦｃフラグメントは、１つまたはそれ以上のアミノ酸が互いに異なる。ある種の実施形態において、両方のＦｃフラグメントではないが、第１のＦｃフラグメントまたは第２のＦｃフラグメントは、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む。ある種の実施形態において、多量体化成分は、Ｆｃフラグメント、または少なくとも１つのシステイン残基を含有する１～約２００アミノ酸長のアミノ酸配列である。他の実施形態において、多量体化成分は、システイン残基、または短いシステイン含有ペプチドである。他の多量体化成分は、ロイシンジッパー、ヘリックスループモチーフ、またはコイルドコイルモチーフを含むか、またはそれらからなるペプチドまたはポリペプチドを含む。例えば、Ｆｃドメインを含む多量体化成分は、本明細書の他の場所に開示されるように、野生型の天然に存在する型のＦｃドメインと比較して、１つまたはそれ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失または置換）を含み得る。

１つもしくはそれ以上のＣＤＲ残基の置換、または１つもしくはそれ以上のＣＤＲの省略も可能である。１つまたは２つのＣＤＲを省いても結合する抗体が、科学文献において記載されている。Ｐａｄｌａｎら（１９９５年ＦＡＳＥＢＪ．９：１３３～１３９頁）は、公開された結晶構造に基づき、抗体とその抗原の間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約５分の１～３分の１のみが抗原と実際に接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触したアミノ酸を有していない、多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓら２００２年ＪＭｏｌＢｉｏｌ３２０：４１５～４２８頁も参照）。

抗原と接触していないＣＤＲ残基は、従前の研究に基づいて（例えば、ＣＤＲＨ２における残基Ｈ６０～Ｈ６５は、多くの場合、必要ではない）、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、および／または実験的に同定される。ＣＤＲまたはその残基が除外されるなら、それは、別のヒト抗体配列または共通のかかる配列における対応する位置を占めるアミノ酸で通常置換される。置換するためのＣＤＲおよびアミノ酸内の置換のための位置はまた、実験的に選択される。実験的置換は、保存的または非保存的置換である。

本明細書において開示される完全ヒト免疫グロブリンタンパク質（抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する）は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。かかる変異は、本明細書において開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより、容易に確かめられる。本開示は、本明細書において開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つもしくはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個またはそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異される（かかる配列変更は、本明細書において「生殖系列変異」としてまとめて言及される）。

当業者は、本明細書において開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つもしくはそれ以上の個々の生殖系列変異またはその組合せを含む、多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に作り出す。ある種の実施形態において、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌドメイン内のフレームワークならびに／またはＣＤＲ残基の全てを変異させて、抗体が由来する元の生殖系列配列において見出される残基に戻す。他の実施形態において、ある種の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内で見出される変異した残基、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内で見出される変異した残基のみを変異させて、元の本来の生殖系列配列に戻す。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の１つまたはそれ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列と異なる、生殖系列配列）の対応する残基に変異される。さらに、本開示の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つもしくはそれ以上の生殖系列変異の任意の組合せを含有し、例えば、ここで、ある種の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異され、一方、元の生殖系列配列と異なるある種の他の残基は、維持されるか、もしくは異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される。一旦得られると、１つまたはそれ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の好転、結合親和性の増大、アンタゴニスト生物学的特性の好転または増強、免疫原性の低減などのような１つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験される。この一般的な方法において得られる抗体および抗原結合フラグメントは、本開示に包含される。

本開示はまた、１つまたはそれ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト免疫グロブリンタンパク質（抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する）も含む。例えば、本開示は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個またはそれ以下、８個またはそれ以下、６個またはそれ以下、４個またはそれ以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する完全ヒト免疫グロブリンタンパク質（抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する）を含む。

本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、複合体を形成するために抗原に特異的に結合する、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」という用語は、抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含有するフラグメント、または単離されたＣＤＲを含む。ある種の実施形態において、用語「抗原結合フラグメント」は、多特異性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質消化、または抗体可変および（場合により）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子操作技術のような任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得ることができる。かかるＤＮＡは公知であり、および／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成される。ＤＮＡは、配列決定され、化学的に、または分子生物学技術を用いることにより操作されて、例えば、１つもしくはそれ以上の可変および／もしくは定常ドメインが適切な配置に配置されるか、またはコドンが導入されるか、システイン残基が作製されるか、アミノ酸が修飾されるか、付加されるか、もしくは欠損される。

抗原結合フラグメントの非限定的な例には：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が含まれる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメインが欠損した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲが移植された抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ（例えば、１価のナノボディ、２価のナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインのような他の操作された分子もまた、本明細書において用いられる、表現「抗原結合フラグメント」に包含される。

抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメインを典型的に含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり、少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含み、１つもしくはそれ以上のフレームワーク配列に隣接されるか、もしくはインフレームである。Ｖ_Ｌドメインと繋がったＶ_Ｈドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、任意の適切な配置で相対的に位置する。例えば、可変領域は、二量体であり、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、またはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを含有する。

ある種の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本開示の抗体の抗原結合フラグメント内に見出される可変および定常ドメインの非限定的な例示的な構成には：（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３；（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ；（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１；（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２；（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２；（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３；および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが含まれる。上で挙げられる典型的な配置のいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変ならびに定常ドメインは、互いに直接的に結合されるか、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域により結合されるか、のいずれかである。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個もしくはそれ以上）のアミノ酸からなり、単一のポリペプチド分子における隣接する可変および／または定常ドメイン間の可動性または半可動性の結合をもたらす。さらに、本開示の抗体の抗原結合フラグメントは、（例えば、ジスルフィド結合による）互いにおよび／もしくは１つもしくはそれ以上の単量体Ｖ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインと非共有結合的に会合した、上で挙げられた可変ならびに定常ドメイン配置のいずれかのホモ－二量体またはヘテロ－二量体（もしくは他の多量体）を含む。

本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」、または「完全ヒト抗体」、または「完全ヒト免疫グロブリンタンパク質」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含む。しかしながら、本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトＦＲ配列に移植されている、ｍＡｂを含むことは意図されない。用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え的に産生される抗体を含む。用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生じた抗体を含むことは意図されない。

本明細書において用いられる用語「組換え体」は、例えば、ＤＮＡスプライシングおよび遺伝子導入発現を含む、組換えＤＮＡ技術として当該技術分野において公知の技術もしくは方法により、作製されるか、発現されるか、単離されるか、もしくは得られる、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。用語は、非ヒト哺乳類（遺伝子導入非ヒト哺乳類、例えば、遺伝子導入マウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現されるか、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体を指す。

用語「特異的に結合する」、または「に特異的に結合する」などは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、例えば、生理的条件下で比較的安定である抗ＮＰＲ１抗体との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０^－８Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数により特徴付けられる（例えば、Ｋ_Ｄが小さいほど、より強固な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書に記載されるように、抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により同定され、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）に特異的に結合する。さらに、抗ＮＰＲ１抗体における１つのドメイン、および１つもしくはそれ以上のさらなる抗原に結合する多特異性抗体、または抗ＮＰＲ１抗体の２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず、本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」抗体とみなされる。

用語「高い親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡにより測定される、少なくとも１０^－８Ｍ；好ましくは、１０^－９Ｍ；より好ましくは、１０^－１０Ｍ、なおより好ましくは、１０^－１１ＭのＫ_Ｄとして表される、抗ＮＰＲ１抗体に対する結合親和性を有するそのｍＡｂを指す。

用語「スローオフレート」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により決定される、１×１０^－３ｓ^－１もしくはそれ以下、好ましくは、１×１０^－４ｓ^－１もしくはそれ以下の速度定数で抗ＮＰＲ１抗体から解離する抗体を意味する。

本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、任意の天然に生じる、酵素的に得られる、合成された、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書に記載される免疫グロブリンタンパク質の「抗原」は、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）またはその抗原結合フラグメント（すなわち、ＮＰＲ１に結合する抗体のフラグメント）である。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」は、抗ＮＰＲ１抗体に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指す。

特定の実施形態において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、リガンドまたは治療部分（「イムノコンジュゲート」）、第２の救済剤、または抗ＮＰＲ１抗体の血行動態効果を反転させるのに有用な任意の他の治療部分などの部分にコンジュゲートされる。

本明細書において用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）が実質的にない抗体（例えば、抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントは、抗ＮＰＲ１抗体以外の抗原に特異的に結合するＡｂが実質的にない）を指すことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎａｎｄＰｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いた、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体分子相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。

本明細書において用いられる用語「Ｋ_Ｄ」は、特定の抗体と抗原の相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。本開示の文脈において、免疫グロブリンタンパク質の「抗原」は、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）またはその抗原結合フラグメント（すなわち、ＮＰＲ１に結合する抗体のフラグメント）である。

用語「エピトープ」は、パラトープとしても公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定因子を指す。免疫グロブリンタンパク質の「抗原」は、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）またはその抗原結合フラグメント（すなわち、ＮＰＲ１に結合する抗体のフラグメント）である。単一の抗原が１つより多いエピトープを有する場合がある。したがって、異なる免疫グロブリンタンパク質（抗体）は、抗原上の異なる領域に結合する場合があり、異なる生物学的効果を有する場合がある。用語「エピトープ」はまた、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。それはまた、抗体により結合される抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的として定義される。機能的エピトープは、一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に関与するその残基を有する。エピトープはまた立体構造でもあり、すなわち、非直線状のアミノ酸を含む。ある種の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面基である決定因子を含み、ある種の実施形態において、特異的な３次元の構造的特徴、および／または特異的な変更特徴を有する。

本明細書において用いられる、用語「交差競合する」は、抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、抗原に結合し、別の抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合を阻害するか、または遮断することを意味する。免疫グロブリンタンパク質の「抗原」は、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）またはその抗原結合フラグメント（すなわち、ＮＰＲ１に結合する抗体のフラグメント）である。用語はまた、方向の両方、すなわち、第２の抗体に結合し、第２の抗体の結合を遮断する第１の抗体、および逆も真なり、における２つの抗体間の競合も含む。ある種の実施形態において、第１および第２の抗体は、同一のエピトープに結合する。あるいは、第１および第２の抗体は、異なるがオーバーラップするエピトープに結合することで、１つの結合が、第２の抗体の結合を、例えば立体障害を介して阻害するか、または遮断するようになる。抗体間の交差競合は、当該技術分野において公知の方法により、例えば、リアルタイム、ラベルフリーバイオレイヤーインターフェロメトリーアッセイにより測定される。２つの抗体間の交差競合は、自己と自己の結合（ここで、第１および第２の抗体は同一の抗体である）に起因するバックグラウンドシグナル未満である、第２の抗体の結合として表される。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースラインの自己と自己のバックグラウンド結合（ここで、第１および第２の抗体は同一の抗体である）未満である第２の抗体の％結合として表される。

核酸もしくはそのフラグメントに言及している場合、用語「実質的な同一性」または「実質的に同一の」は、適切なヌクレオチド挿入または欠損を伴うかたちで別の核酸（もしくはその相補鎖）と最適に整列されると、以下で考察される通り、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰのような、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムにより測定される、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対する実質的な同一性を有する核酸分子は、ある種の例において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同一または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。

ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似の」は、２つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、最適に整列されると、少なくとも９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、残基位置は、同一でなく、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合において、類似性の割合または程度は、置換の保存的性質を補正するよう上方調節される。この調節を成す手段は、当業者に周知である。例えば、参照によって本明細書に組み入れられる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１頁を参照。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン、およびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン、およびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩、およびグルタミン酸塩、ならびに７）硫黄含有側鎖：システイン、およびメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸塩－アスパラギン酸塩、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、参照によって本明細書に組み入れられる、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３～４５頁において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度の保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。

ポリペプチドについての配列類似性は、配列解析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠損、および他の修飾に割り当てられる類似性の測定を用いて、類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、生物の異なる種由来の相同な諸ポリペプチドの間、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間のような、密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターで用いられるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメーターを用いたＦＡＳＴＡ；ＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１におけるプログラムを用いても比較される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２、およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと検索配列の間の最適オーバーラップの領域の整列化およびパーセント配列同一性をもたらす（上記、Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年））。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する上での別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いた、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁、および（１９９７年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９～３４０２頁を参照されたく、これらの各々は、参照によって本明細書に組み入れられる。

語句「治療上有効量」によって、投与されるものに所望の作用を作り出す量が意味される。正確な量は、処置の目的に依存し、公知の技術（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９年）ＴｈｅＡｒｔ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照）を用いて当業者により解明可能だろう。例えば、本発明による救済剤の治療有効量は、一実施形態において、ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）アゴニストの血行動態効果のある程度の反転をもたらす量である。

本明細書で使用される場合、用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。本開示の特定の実施形態において、対象は、ＮＰＲ１に特異的に結合するアゴニスト抗体またはその抗原結合フラグメントの投与に関連する血圧の降下または他の血行動態パラメーターの変化を経験した、経験している、または経験する可能性がある。

本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」または「処置」は、本明細書に記載される免疫グロブリンタンパク質などの治療剤を、それを必要とする対象に投与することによる、疾患または障害の少なくとも１つの症状または徴候の重症度の軽減または改善を指す。この用語は、疾患の進行の阻害、または症状／徴候の悪化の阻害を含む。この用語はまた、疾患のポジティブな予後を含んでいてもよく、すなわち、対象は、本開示の抗体などの治療剤の投与時に、疾患から解放されるか、または疾患が軽減される。治療剤は、対象に治療的用量で投与される。

用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、治療剤の投与時の、疾患もしくは障害の発現またはそのような疾患もしくは障害の任意の症状もしくは徴候の阻害を指す。

ヒト免疫グロブリンタンパク質の調製
特定の抗原に特異的な免疫グロブリン可変（抗原結合）ドメインは、当該技術分野で公知の任意の抗体生成技術によって調製される。得られると、それらは、慣例的方法を使用して本開示の免疫グロブリンタンパク質分子を産生するように適切に配置される。（本開示の免疫グロブリンタンパク質分子を構築するために使用できる例示的な免疫グロブリンタンパク質成分およびフォーマットの説明は、本明細書の他の場所に提供される。）ある種の実施形態において、本開示のタンパク質の個々の成分（例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域）のうちの１つまたはそれ以上は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体に由来する。このような抗体を作製するための方法は当該技術分野で周知である。例えば、ヒト抗体はトランスジェニックマウスにおいて生成される。

任意のそのような公知の方法は、抗ＮＰＲ１抗体に特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の文脈において使用される。一実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体は、Ｒ５３８１である。

以下のいずれか１つを含む免疫原は、抗ＮＰＲ１抗体に対する抗体を生成するために使用される。ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質（抗体）は、全長抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）またはタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡで免疫化されたマウスから得られる。あるいは、タンパク質またはそのフラグメントは、標準的な生化学的技術を用いて産生されて改変され、免疫原として使用し得る。

ある実施形態において、免疫原は、大腸菌またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの他の任意の真核生物または哺乳動物細胞で発現させた組換え抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよい。

本開示の免疫グロブリンタンパク質の重鎖および／または軽鎖の１つまたはそれ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照）、またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して調製される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、抗ＮＰＲ１抗体（例えば、Ｒ５３８１）に対する高親和性キメラ抗体が、まず単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域部位に作動可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子導入マウスの作製に関与する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に結合される。次に、ＤＮＡは、完全ヒト抗体を発現する能力がある細胞において発現される。

以下の実験のセクションにあるように、抗体は、特徴付けられ、親和性、選択性、エピトープなどを含む、所望の特徴について選択される。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置き換えて、本開示の完全なヒト抗体、例えば、野生型、または修飾されたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を作製する。選択された定常領域が、特定の使用に従い変動する一方、高い親和性の抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。

生物学的等価物
本開示の免疫グロブリンタンパク質は、記載された抗体とは異なるアミノ酸配列を有するが、抗ＮＰＲ１抗体、例えば、Ｒ５３８１に結合する能力を維持するタンパク質を包含する。かかる変異体タンパク質は、親配列と比較された場合、アミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載されたタンパク質（例えば、抗体）のものと実質的に等価である生物学的活性を示す。同様に、免疫グロブリンタンパク質の（例えば、抗体をコードする）ＤＮＡ配列は、開示される配列と比較された場合、ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本開示の免疫グロブリンタンパク質（例えば、抗体または抗体フラグメント）と実質的に生物学的等価である抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。

２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば、吸収の速度および程度が、類似の実験条件下で同一のモル用量、単回用量もしくは複数回用量いずれかで投与される場合、有意な相違を示さない医薬等価物もしくは医薬代替物であるなら、生物学的等価物とみなされる。ある抗体は、その吸収の程度において等価物であるが、その吸収の速度において等価物でないなら、等価物または医薬代替物とみなされ、かかる吸収の速度における相違が意図的であり、標識において反映され、例えば、慢性的使用の際の有効な身体薬物濃度の到達に必須ではなく、研究される特定の薬物製品にとって医薬的に有意でないとみなされるので、生物学的等価物であると依然みなされる。

１つの実施形態において、２つの免疫グロブリンタンパク質の安全性、純度、または有効性において臨床上有意義な相違はないなら、２つの抗原結合タンパク質は生物学的等価物である。

１つの実施形態において、２つの免疫グロブリンタンパク質は、患者が、切り替えることなく継続される療法と比較して、免疫原性における臨床上有意な変化、もしくは損なわれた効能を含む副作用のリスクの増大を予期せずに、参照産物と生物学的産物の間で１回またはそれ以上切り替えられるなら、生物学的等価物である。

１つの実施形態において、２つの免疫グロブリンタンパク質は、それら両方が、使用の条件もしくは複数の条件についての作用の通常のメカニズムまたは複数のメカニズムにより、かかるメカニズムが公知である限り、作用するなら、生物学的等価物である。

生物学的等価物は、インビボおよび／またはインビトロの方法により実証される。生物学的等価物の測定は、例えば、（ａ）免疫グロブリンタンパク質もしくはその代謝産物の濃度が、血液、血漿、血清、もしくは他の生物学的体液において時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関し、それを十分に予測するインビトロ試験；（ｃ）免疫グロブリンタンパク質（例えば、抗体（もしくはその標的））の適切な急性薬理作用が、時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験；および（ｄ）免疫グロブリンタンパク質の安全性、効能（efficacy）、もしくはバイオアベイラビリティもしくは生物学的均等性を確立する、十分に制御された臨床試験、を含む。

本開示の免疫グロブリンタンパク質（例えば、抗体）の生物学的等価変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことによって、または生物学的活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築される。本開示の免疫グロブリンタンパク質（例えば、Ｒ５３８１に特異的に結合する抗体または抗体フラグメント）の「生物学的活性」には、抗原（例えば、抗ＮＰＲ１抗体Ｒ５３８１）に特異的に結合すること、抗ＮＰＲ１抗体の血行動態効果を反転させること、および抗ＮＰＲ１抗体の投与の結果として降下した血圧を増加させることが含まれるが、これらに限定されない。血流、心臓負荷、および／または心拍数も、ある種の実施形態では良い影響を受ける。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、欠損されるか、または他のアミノ酸で置換されて、再生の際に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成が防止される。他の文脈において、生物学的等価物免疫グロブリンタンパク質は、アミノ酸変更を含む抗体変異体を含み、抗体のグリコシル化特徴、例えば、グリコシル化を除去するか、または取り除く変異を修飾する。

Ｆｃ変異体を含む免疫グロブリンタンパク質
本開示のある種の実施形態によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体への抗体の結合を増強または減少させる１つまたはそれ以上の変異を含むＦｃドメインを含む免疫グロブリンタンパク質が提供される。例えば、本開示は、抗ＮＰＲ１抗体に結合し、ＦｃドメインのＣ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域に変異を含む免疫グロブリンタンパク質を含み、その変異は、酸性環境下（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲であるエンドソーム内）でＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。このような変異は、動物に投与された場合、免疫グロブリンタンパク質の血清半減期の増加をもたらす場合がある。このようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷもしくはＴ）、２５４位（例えば、ＳもしくはＴ）、ならびに２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤもしくはＴ）における修飾；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦもしくはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦもしくはＮ４３４Ｙ］）における修飾；または２５０位および／もしくは４２８位における修飾；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態において、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）の修飾を含む。

例えば、本開示は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される変異の１つまたはそれ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む免疫グロブリンタンパク質を含む。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組合せが、本開示の範囲内に企図される。

本開示はまた、第１のＣ_Ｈ３ドメインおよび第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質を含み、第１および第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸だけ互いに異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違により、アミノ酸の相違を欠くタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合が減少する。一実施形態において、第１のＩｇＣ_Ｈ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインは、ＥＵナンバリングによるＨ３１５ＲなどのプロテインＡ結合を減少または消失させる変異を含む。第２のＣ_Ｈ３は、ＥＵナンバリングによるＹ３１６Ｆをさらに含むことができる。一実施形態において、第１のＩｇＣ_Ｈ３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによりＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を減少または消失させる変異を含む。第２のＣ_Ｈ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含むことができる。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照。第２のＣ_Ｈ３内で見出されるさらなる修飾は：ＩｇＧ１抗体の場合において、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵにより、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合において、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵにより、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合において、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵにより、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）を含む。

本開示はまた、抗ＮＰＲ１抗体に結合し、キメラ重鎖定常（Ｃ_Ｈ）領域を含む免疫グロブリンタンパク質を含み、ここで、キメラＣ_Ｈ領域は、１つより多い免疫グロブリンアイソタイプのＣ_Ｈ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣ_Ｈ３ドメインの一部または全てと組み合わせて、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣ_Ｈ２ドメインの一部または全てを含むキメラＣ_Ｈ領域を含むことができる。ある種の実施形態によれば、本開示の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣ_Ｈ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵナンバリングによる２２８位から２３６位のアミノ酸残基）と組み合わせて、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングによる２１６位から２２７位のアミノ酸残基）を含むことができる。ある種の実施形態によれば、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基、およびヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書に記載されるキメラＣ_Ｈ領域を含む抗体は、ある種の実施形態において、抗体の治療特性または薬物動態特性に悪影響を与えることなく、修飾されたＦｃエフェクター機能を示すことができる。（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号を参照されたく、その開示は全体が参照によって本明細書に組み入れられる）。

免疫グロブリンタンパク質の生物学的特徴
一般に、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、ＮＰＲ１アゴニスト（抗ＮＰＲ１抗体など）に結合し、その血行動態効果を反転させることによって機能する。例えば、本開示は、例えば、本明細書の実施例３で定義されるようなアッセイ形式を使用した、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、２５℃で約３ｎＭ未満、および３７℃で約７ｎｍ未満のＫ_Ｄで抗ＮＰＲ１抗体（の親ハイブリドーマ）に結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３で定義されるようなアッセイ形式、または実質的に同様のアッセイを使用した、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．７５ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＫ_Ｄで抗ＮＰＲ１抗体の親ハイブリドーマに結合する。

本開示はまた、ｐＨ感受性様式でＮＰＲ１アゴニストに結合する免疫グロブリンタンパク質およびそのフラグメントを含む。例えば、ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７のｋ_ｄおよび解離半減期（ｔ１／２）は、本明細書の実施例５に示されるように、ｐＨ７．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ５．０のバッファ中で変化する。ＲＥＧＮ９０３５の場合、解離半減期（ｔ１／２）は、ｐＨの減少に伴って、約１２分から約０．６分に大幅に減少し；ＲＥＧＮ９０３７の場合、解離半減期（ｔ１／２）は、ｐＨの減少に伴って、約１３分から約１７分の間でわずかに変化する。各々のｋ_ｄも同様に変化し、ＲＥＧＮ９０３５の場合、約９．９６Ｅ－０４から１．９７Ｅ－０２の間であり、ＲＥＧＮ９０３７の場合、約８．６７Ｅ－０４から約６．６４Ｅ－０４の間である。

本開示はまた、抗ＮＰＲ１抗体によって誘導されたｈＮＰＲ１の活性化を阻害する免疫グロブリンタンパク質およびそのフラグメントも含む。例えば、２価および１価の抗Ｒ５３８１抗体およびその抗原結合フラグメントは、内因性リガンド（例えば、ＡＮＰ、ＢＮＰ）の存在下および非存在下で、Ｒ５３８１誘導性のｈＮＰＲ１の活性化を遮断する。Ｒ５３８１誘導性のＮＰＲ１の活性化の最大阻害（約９７％～約１０６％）は、例えば、本明細書の実施例６に定義されるようなアッセイ形式、または実質的に同様のアッセイを使用して、ｃＧＭＰ蓄積によって測定した。ある種の実施形態において、本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、抗ＮＰＲ１抗体誘導性のｈＮＰＲ１の活性化を、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、少なくとも約１０１％、少なくとも約１０２％、少なくとも約１０３％、少なくとも約１０４％、または少なくとも約１０５％、少なくとも約１０６％阻害する。

本開示はまた、ｈＮＰＲ１への抗ＮＰＲ１抗体の結合を遮断する免疫グロブリンタンパク質およびそのフラグメントも含む。例えば、２価および１価の抗Ｒ５３８１抗体およびその抗原結合フラグメントは、実施例７に記載されるような、遮断ＥＬＩＳＡ、または実質的に同様のアッセイを使用して評価されるように、ビオチン－Ｒ５３８１がヒトＮＰＲ１へ結合することを遮断する。１価／１アームおよび２価の抗Ｒ５３８１抗体について、それぞれ約９９％および約１００％の遮断を評価した。ある種の実施形態において、本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、ｈＮＰＲ１への抗ＮＰＲ１抗体の結合を、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００遮断する。

本開示はまた、アゴニスト抗ＮＰＲ１抗体と循環免疫複合体（ＣＩＣ）を最小限だけ形成するか、全く形成しない免疫グロブリンタンパク質およびそのフラグメントも含む。例えば、２価および１価の抗Ｒ５３８１抗体およびその抗原結合フラグメントは、実施例８に記載されるような、Ｃｌｑ－ＣＩＣアッセイ、または実質的に同様のアッセイを使用して評価した場合、Ｒ５３８１と検出可能なＣＩＣを形成しない。ある種の実施形態において、本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、抗ＮＰＲ１抗体とＣＩＣを形成しない。循環中のＣＩＣの存在は、疾患活動性と統計的に相関する。

本開示はまた、抗ＮＰＲ１抗体の血行動態効果を反転させる免疫グロブリンタンパク質およびそのフラグメントも含む。例えば、２価の抗Ｒ５３８１抗体およびその抗原結合フラグメントは、実施例１０に記載されるような、イムノアッセイ、または実質的に同様のアッセイによって評価した場合、アイソタイプ対照よりも迅速、かつ、より効果的にマウスからＲ５３８１を除去することができた。Ｒ５３８１の血清濃度は７日目には著しく低下し、２２日目には検出できなくなった。別の例として、２価および１価の抗Ｒ５３８１抗体およびその抗原結合フラグメントは、実施例１１および１２に記載されるような、収縮期圧、拡張期圧、脈圧、および平均動脈圧、ならびに心拍数の収集、または実質的に同様のアッセイで評価した場合、Ｒ５３８１の血圧低下効果を迅速かつ持続的に反転させた。２価および１価の抗Ｒ５３８１抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、実施例１１および１２に記載されるような、ＥＬＩＳＡ、または実質的に同様のアッセイを使用して尿中で評価した場合、ＮＰＲ１誘導性のｃＧＭＰ産生も阻害した。ある種の実施形態において、本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、血圧をベースラインレベルまで戻すように増加させる（すなわち、抗ＮＰＲ１抗体の投与による血圧降下前のレベルまで戻す）。

一実施形態において、本開示は、抗ＮＰＲ１抗体（Ｒ５３８１など）に特異的に結合する単離された組換え免疫グロブリンタンパク質またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、免疫グロブリンタンパク質は、以下の特徴のうちの１つまたはそれ以上を示す：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体を含む；（ｂ）完全ヒト１価または１アーム抗体を含む；（ｃ）単一の免疫グロブリンドメインおよび少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む多量体化成分を含む；（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合、２５℃および３７℃において７ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_Ｄ）で抗ＮＰＲ１抗体に結合する；（ｅ）ｐＨ依存性の解離を示す；（ｆ）抗ＮＰＲ１抗体誘導性のＮＰＲ１の活性化を約９７％～約１０６％阻害する；（ｇ）少なくともいくつかのビオチン抗ＮＰＲ１アゴニスト抗体がヒトＮＰＲ１に結合することを遮断する；（ｈ）抗ＮＰＲ１抗体と検出可能なＣＩＣを形成しない；（ｉ）アイソタイプ対照よりも迅速に抗ＮＰＲ１抗体を血清から除去する；（ｊ）抗ＮＰＲ１抗体の血圧低下効果を反転させる；ならびに（ｋ）表１に挙げられるＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、および表１に挙げられるＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。

本開示の免疫グロブリンタンパク質は、上述の生物学的特徴、またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたはそれ以上を有し得る。本開示の免疫グロブリンタンパク質の他の生物学的特性は、当技術分野の当業者であれば、本明細書の実施例を含む本開示の検討から、明らかであろう。

エピトープマッピングおよび関連技術
本開示は、抗ＮＰＲ１抗体分子の１つまたはそれ以上の領域内に見出される１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する、免疫グロブリンタンパク質を含む。免疫グロブリンタンパク質が結合するエピトープは、抗ＮＰＲ１抗体分子の前述のドメインのいずれかに位置する、３個またはそれ以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個もしくはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなる（例えば、ドメインにおける直線エピトープ）。あるいは、エピトープは、抗体分子の前述のドメインのいずれかまたは両方に位置する、多数の非連続アミノ酸（もしくはアミノ酸配列）からなる（例えば、立体構造エピトープ）。

当業者に公知の種々の技術を用いて、抗体が、ポリペプチドもしくはタンパク質内の「１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかが決定される。典型的な技術は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ）において記載されるもののような、慣例的交差－遮断アッセイを含む。他の方法は、アラニンスキャンニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４年）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３～６３頁）、ペプチド切断解析結晶研究、およびＮＭＲ解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、および化学修飾のような方法が利用される（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７～４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いられる別の方法は、質量分析により検出される水素／ジュウテリウム交換である。一般的な用語において、水素／ジュウテリウム交換方法は、目的のタンパク質をジュウテリウム標識すること、続いて、抗体をジュウテリウムで標識されたタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移され、抗体複合体により保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、接触面の一部でないアミノ酸内の交換可能なプロトンより遅い速度でジュウテリウムから水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体接触面の部分を形成するアミノ酸は、ジュウテリウムを保持し、それ故、接触面に含まれないアミノ酸と比較して、比較的大きな質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質は、タンパク質分解酵素切断および質量分析の対象とされ、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応するジュウテリウムで標識された残基が明らかにされる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６７：２５２～２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ～２６５Ａ頁を参照。

用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。本開示の文脈において、抗原は抗ＮＰＲ１抗体である。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の３次フォールディングにより並べて置かれた連続アミノ酸または不連続アミノ酸両方から形成される。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露の際に典型的に保持され、他方、３次フォールディングにより形成されるエピトープは、変性溶媒での処理の際に典型的に失われる。エピトープは、固有の空間立体構造において少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を典型的に含む。

抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面へのそれぞれの抗体の結合プロファイルの類似性により、同一の抗原に対して向けられた多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０、参照によって全体として具体的に本明細書に組み入れられる）。それぞれのカテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープと明らかに異なるか、または部分的に重複するいずれかの固有のエピトープを反映する。この技術は、特徴が、遺伝子学的に明確な抗体に焦点を当てられるように、遺伝子学的に一致する抗体の迅速な選別を可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を促進する。ＭＡＰを用いて、本開示の抗体は異なるエピトープに結合する抗体の群に分類される。

ある種の実施形態において、本開示は、抗ＮＰＲ１抗体の細胞外ドメイン内に見出される１つまたはそれ以上のエピトープと相互作用する、免疫グロブリンタンパク質およびそのフラグメントを含む。エピトープは、抗ＮＰＲ１抗体の細胞外ドメイン内に見出される、３またはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）のアミノ酸の１つまたはそれ以上の連続した配列からなっていてもよい。あるいは、エピトープは、抗ＮＰＲ１抗体内に位置する複数の非連続的アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。

本開示は、表１において挙げられる特異的な代表的な免疫グロブリンタンパク質のいずれかと同一のエピトープ、またはエピトープの部分に結合する抗体を含む。同様に、本開示はまた、抗ＮＰＲ１抗体またはそのフラグメントへの結合について、表１において挙げられる特異的な代表的な免疫グロブリンタンパク質のいずれかと競合する抗体も含む。例えば、本開示は、抗ＮＰＲ１抗体またはそのフラグメントへの結合について、表１において挙げられる抗体の１つまたはそれ以上と交差競合する抗体を含む。

当該技術分野において公知の慣例的方法を用いることにより、抗体が、参照免疫グロブリンタンパク質と同一のエピトープに結合するか、または結合について参照免疫グロブリンタンパク質と競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本開示の参照免疫グロブリンタンパク質と同一のエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を飽和条件下で抗ＮＰＲ１抗体タンパク質またはペプチドに結合させることを可能にする。次に、抗ＮＰＲ１抗体タンパク質分子に結合する試験抗体の能力が評価される。試験抗体は、参照免疫グロブリンタンパク質との飽和結合後に抗ＮＰＲ１抗体に結合することができるなら、試験抗体は、参照抗免疫グロブリンタンパク質より異なるエピトープに結合すると結論付けられる。他方、試験抗体は、参照免疫グロブリンタンパク質との飽和結合後に抗ＮＰＲ１抗体タンパク質に結合することができないなら、次に、試験抗体は、本開示の参照免疫グロブリンタンパク質により結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する。

抗体が、結合について参照免疫グロブリンタンパク質と競合するかを決定するために、上で記載された結合方法論は、２つの方針で行われる。第１の方針において、参照抗体を、飽和条件下で抗ＮＰＲ１抗体タンパク質に結合させることを可能にし、続いて、試験抗体の抗ＮＰＲ１抗体分子への結合が評価される。第２の方針において、試験抗体を、飽和条件下で抗ＮＰＲ１抗体分子に結合させることを可能にし、続いて、参照抗体の抗ＮＰＲ１抗体分子への結合が評価される。両方の方針において、第１の（飽和）抗体のみが、抗ＮＰＲ１抗体分子に結合する能力があるなら、次に、試験抗体と参照抗体は、抗ＮＰＲ１抗体への結合について競合すると結論付けられる。当業者により理解される通り、結合について参照抗体と競合する抗体は、参照抗体と一致するエピトープに必ずしも結合しないが、重複または隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断する。

２つの抗体は、それぞれが、他方の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）するなら、同一または重複するエピトープに結合する。抗原は抗ＮＰＲ１抗体である。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗体が、他方の結合を、競合的結合アッセイにおいて測定される、少なくとも５０％だが、好ましくは、７５％、９０％、もしくは９９％でさえ阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９０年５０：１４９５～１５０２頁を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減するか、もしくは除去する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減するか、または除去するなら、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減するか、もしくは除去する、いくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減するか、または除去するなら、２つの抗体は重複するエピトープを有する。

次に、さらなる慣習的実験（例えば、ペプチド変異、および結合解析）を行い、試験抗体の結合の観察された欠如が、事実上、参照抗体と同一のエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体的遮断（もしくは別の現象）が、観察された結合の欠如に関与するかが確認される。この選別の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて行われる。

イムノコンジュゲート
本開示は、ＮＰＲ１関連疾患もしくは障害（例えば、高血圧）を処置するため、および／または抗ＮＰＲ１抗体の治療的使用に関連する血行動態効果を改善するための、治療部分にコンジュゲートさせたヒト免疫グロブリンタンパク質（「イムノコンジュゲート」）をさらに包含する。本明細書で使用される場合、用語「イムノコンジュゲート」は、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質、または治療剤に化学的または生物学的に結合される免疫グロブリンタンパク質を指す。上記タンパク質は、その標的、抗ＮＰＲ１抗体に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置において、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、ペプチド、または治療剤に結合される。免疫複合体の例は、抗体薬物複合体、および抗体と毒素の融合タンパク質を含む。１つの実施形態において、剤は、ＮＰＲ１タンパク質に対する第２の異なる抗体である。レスキュー剤に結合される治療部分のタイプは、処置されるべき条件、および達成されるべき所望の治療効果を考慮する。免疫複合体を形成させるのに適切な剤の例は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照。

治療投与および製剤
本開示は、本開示の免疫グロブリンタンパク質を含む治療用組成物を提供する。治療組成物は、本開示に従い、輸送、デリバリー、寛容の好転などをもたらすよう製剤に取り込まれる、適切な担体、賦形剤、および他の剤と共に投与される。多数の適切な製剤は、全ての医薬化学者に公知の処方書：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出される。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェル、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオンまたは陰イオン）含有ベシクル（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ジェル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓｆｏｒｐａｒｅｎｔｅｒａｌｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８年）ＪＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ５２：２３８～３１１頁も参照。

免疫グロブリンタンパク質の用量は、投与される対象の年齢および大きさ、状態、投与経路などに応じて変化し得る。本開示のタンパク質が、成人患者において抗ＮＰＲ１抗体の血行動態効果を反転させるため、またはこのような血行動態効果を予防するために使用される場合、本開示の免疫グロブリンタンパク質を、通常、体重１ｋｇ当たり約０．１～約１００ｍｇの単回用量で投与することが有利である。状態の重症度に依存して、処置の頻度および持続時間は調節される。ある種の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約６００ｍｇ、約５～約５００ｍｇ、または約１０～約４００ｍｇの開始用量として投与される。ある種の実施形態において、開始用量に続き、開始用量のものとおよそ同一であるか、またはそれ未満である量における第２または多数の続く用量の免疫グロブリンタンパク質またはその抗原結合フラグメントが投与され、ここで、続く用量は、少なくとも１日～３日；少なくとも１週；少なくとも２週；少なくとも３週；少なくとも４週；少なくとも５週；少なくとも６週；少なくとも７週；少なくとも８週；少なくとも９週；少なくとも１０週；少なくとも１２週；または少なくとも１４週により隔てられる。

種々のデリバリーシステムが公知であり、これを用いて、本開示の医薬組成物、例えば、リポソームにおけるカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現する能力がある組換え細胞、受容体により仲介されるエンドサイトーシスが投与される（例えば、Ｗｕら（１９８７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９～４４３２頁を参照）。導入の方法は、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜裏層（例えば、経口粘膜、直腸、および腸粘膜など）を通じた吸収により、投与され、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与される。投与は全身または局所である。医薬組成物はまた、ベシクル、特に、リポソームにおいてもデリバリーされる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７～１５３３頁を参照）。

本開示の免疫グロブリンタンパク質をデリバリーするためのナノ粒子の使用も本明細書において考えられる。抗体結合ナノ粒子は、治療上および診断上の適用両方のため用いられる。抗体コンジュゲートナノ粒子、ならびに調製および使用方法は、参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．ら、２００９年（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ、２００９巻、論文番号４３９３８９、２４頁、ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）により詳細に記載される。ナノ粒子が開発され、細胞を標的化するための医薬組成物において含有される抗体にコンジュゲートされる。薬物デリバリー用ナノ粒子はまた、例えば、ＵＳ８２５７７４０、またはＵＳ８２４６９９５においても記載され、各々はその全体が本明細書に組み入れられる。

ある種の状況において、医薬組成物は、制御放出システムにおいてデリバリーされる。１つの実施形態において、ポンプが用いられる。別の実施形態において、ポリマー材料が用いられる。なお別の実施形態において、制御放出システムは、組成物の標的の近くに置かれ、したがって、少量の全身性用量のみが必要とされる。

注射可能な調製物は、静脈内、皮下、頭蓋内、腹腔内および筋内注射用形態、点滴注入用形態などを含む。これらの注射可能な調製物は、公的に公知の方法により調製される。

本開示の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジで皮下または静脈内にデリバリーされる。加えて、皮下デリバリーに関して、ペンデリバリー装置は、本開示の医薬組成物のデリバリーにおいて容易に適用される。かかるペンデリバリー装置は、再利用可能であるか、または使い捨てである。再利用可能なペンデリバリー装置は、医薬組成物を含有する置換可能なカートリッジを一般に利用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与されると、カートリッジは空になり、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジで置き換えられる。次に、ペンデリバリー装置は再利用される。使い捨てのペンデリバリー装置において、置き換え可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てのペンデリバリー装置は、装置内のリザーバーにおいて保持される医薬組成物で予め充填される。リザーバーは、医薬組成物が空になると、全体の装置は廃棄される。

有利には、上で記載された経口または非経口使用用医薬組成物は、有効成分の用量に適合するよう適した単位用量における投薬形態に調製される。単位用量におけるかかる投薬形態は、例えば、錠剤、ピル、カプセル剤、注射（アンプル剤）、坐剤などを含む。含有される免疫グロブリンタンパク質の量は、一般に、単位用量において；特に、注射の形態において１つの投薬形態当たり約５～約５００ｍｇ、他の投薬形態のため約５～約３００ｍｇ、および約１０～約３００ｍｇの免疫グロブリンタンパク質が含有されることが好ましい。

免疫グロブリンタンパク質の治療上の使用
本開示は、免疫グロブリンタンパク質を含む治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質のいずれか、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含むことができる。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、ＮＰＲ１アゴニストの投与による血圧の増加または効果の反転から利益を受けるであろうヒトまたは非ヒト動物を意味する。

本開示の免疫グロブリンタンパク質（およびそれを含む治療組成物）は、とりわけ、血圧の増加が有益である任意の疾患または障害の処置に有用である。特に、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、ＮＰＲ１の発現もしくは活性に関連するか、またはそれらによって媒介される任意の疾患または障害の処置、予防、および／または改善のために使用される。本開示の治療方法が達成される作用機構は、アゴニスト抗ＮＰＲ１抗体への結合およびアゴニスト抗体の除去／クリアランスを含む。アゴニストである抗ＮＰＲ１抗体の除去は、血圧の増加をもたらす。

本開示の免疫グロブリンタンパク質は、例えば、ＮＰＲ１アゴニストを投与された対象における任意のＮＰＲ１関連疾患または障害を処置するために使用され、ＮＰＲ１アゴニストの血行動態効果の反転が望まれる。ＮＰＲ１関連疾患または障害の例には、高血圧、心不全、肥満、腎不全、慢性腎疾患、黄斑浮腫、緑内障、脳卒中、肺障害、肺線維症、炎症、喘息、骨格成長障害、骨折、糖尿病、およびがんが含まれるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンタンパク質を含む治療組成物の投与は、血圧低下に関連する１つまたはそれ以上の有害事象の予防につながり得る。血圧低下に関連する潜在的な有害事象には、持続性の症候性低血圧、代償性交感神経系反応による反射性頻脈（心筋梗塞、脳卒中、不整脈、心不全のリスクが増加する可能性がある）、ならびに正常（低い）静脈圧を有する対象における心拍出量および終末器官灌流の減少が含まれる。

一実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、抗ＮＰＲ１抗体の投与の結果として低血圧を有する患者を処置するための医薬組成物または医薬の製造のために使用される。別の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、血圧を増加させる、および／または血圧降下に関連する症状に対処するのに有用な、任意の他の薬剤、または当業者に公知の任意の他の治療との補助療法として使用される。

本開示はまた：（ｉ）治療量の本明細書に開示される免疫グロブリンタンパク質；および（ｉｉ）ＮＰＲ１関連疾患または障害を患っている対象における血圧および／または血行動態変化の効果的な調節のための方法で使用するための、アゴニスト抗ＮＰＲ１抗体を含む組成物を提供する。

非免疫グロブリンタンパク質反転剤
本開示のある種の実施形態において、抗ＮＰＲ１抗体またはその抗原結合フラグメントの血行動態効果を反転させるのに使用するための薬剤（すなわち、反転剤）は、昇圧剤、アルファ－アドレナリン受容体アゴニスト、ステロイド、抗利尿ホルモン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト／血管新生阻害剤、および血圧を増加させる小分子薬剤からなる群から選択される。

昇圧剤は、血管を収縮させて血圧を増加させる薬剤である。アルファ－アドレナリン受容体アゴニスト（α－アゴニスト）は、血管平滑筋上のα－受容体に結合し、平滑な収縮および血管収縮を誘導し、血圧を増加させる。抗利尿ホルモンは、下垂体後葉から放出されるホルモンであり、腎臓に作用して水分の再吸収を増加させ、心血管系の血管収縮を引き起こす。昇圧剤および抗利尿ホルモンは当該技術分野で公知である。

別の実施形態において、反転剤は、ミドドリン、レボフェド、ノルエピネフリン、フェニレフリン、フルドロコルチゾン、オルバテン（Ｏｒｖａｔｅｎ）、ノーテラ（Ｎｏｒｔｈｅｒａ）、エフェドリン、バズクレプ（Ｖａｚｃｕｌｅｐ）、ドロキシドパ、アコバズ（Ａｋｏｖａｚ）、ビオルフェン（Ｂｉｏｒｐｈｅｎ）、コルフェドラ（Ｃｏｒｐｈｅｄｒａ）、およびエメルフェド（Ｅｍｅｒｐｈｅｄ）からなる群から選択されるが、これらに限定されない、抗ＮＰＲ１抗体誘導性の血行動態効果を処置するための薬物である。

したがって、本開示は、抗ＮＰＲ１抗体療法の血行動態効果を反転させることができる、免疫グロブリンタンパク質（抗体を含む）以外の反転剤を含む。例えば、α１－アドレナリン受容体アゴニストであるミドドリンは、本明細書の実施例１４に記載されるように、Ｒ５３８１の血圧および心拍数作用を反転させることができる。

併用療法
ある種の実施形態において、対象の血圧を管理するために、１つまたはそれ以上の他の公知の降圧療法と組み合わせて本開示の免疫グロブリンタンパク質および他の反転剤を使用することが企図される。特定の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、ＮＰＲ１アゴニスト、好ましくは抗ＮＰＲ１抗体と組み合わせて使用される。１つの特定の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、それを必要とする対象における血圧の効果的な管理のために、Ｒ５３８１と組み合わせて使用される。

併用療法は、本開示の免疫グロブリンタンパク質、および本開示の免疫グロブリンタンパク質、または本開示の免疫グロブリンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントと有利に組み合わせることができる任意の追加の治療剤を含むことができる。本開示の免疫グロブリンタンパク質は、血圧を増加させるため、または血圧降下に関連する効果に対処するために使用される１つまたはそれ以上の薬物または療法と相乗的に組み合わせることができる。

本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という用語は、本開示の免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤の投与前、投与と同時、または投与後に追加の治療活性成分を投与できることを意味する。「と組み合わせて」という用語はまた、免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤、および第２の治療剤の連続投与または同時投与も含む。

特定の実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質は、ＮＰＲ１アゴニスト、例えば、Ｒ５３８１と組み合わせて対象に投与される。さらなる実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質およびＮＰＲ１アゴニスト、例えば、Ｒ５３８１は、１つの組成物中で一緒に、または１つより多い組成物中で別個に、同時に（同じ時点で）対象に投与される。なおさらなる実施形態において、本開示の免疫グロブリンタンパク質およびＮＰＲ１アゴニスト、例えば、Ｒ５３８１は、ＮＰＲ１アゴニスト、例えば、Ｒ５３８１の後に本開示の免疫グロブリンタンパク質を連続的に対象に投与される。

追加の治療活性成分は、本開示の免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤の投与前に対象に投与される。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、または３０分未満前に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与されるとみなされる。他の実施形態において、追加の治療活性成分は、本開示の免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤の投与後に対象に投与される。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与から３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後、またはそれ以上後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後」に投与されるとみなされる。さらに他の実施形態において、追加の治療活性成分は、本開示の免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤の投与と同時に対象に投与される。

本開示の目的のために、「同時」投与は、例えば、互いに約３０分以内に対象に投与される単一の剤形、または別個の剤形での対象への免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤および追加の治療活性成分の投与を含む。別個の剤形で投与される場合、各剤形は同じ経路を介して投与され（例えば、免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤および追加の治療活性成分の両方が静脈内投与されるなど）；あるいは、各剤形は異なる経路を介して投与される（例えば、免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤は静脈内投与され、追加の治療活性成分は経口投与される）。いずれにせよ、同じ経路によって単一の剤形、もしくは別個の剤形、または異なる経路によって別個の剤形で成分を投与することは、本開示の目的では全て「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与の「前」、「同時」、または「後」（これらの用語は本明細書上記に定義されている通りである）の免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤の投与は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤の投与とみなされる。

本開示は、本開示の免疫グロブリンタンパク質または他の反転剤が、本明細書の他の場所に記載されるような追加の治療活性成分の１つまたはそれ以上と共製剤化される医薬組成物を含む。

免疫グロブリンタンパク質の診断的使用
本開示の救済剤は、例えば、診断目的のために、試料中の抗ＮＰＲ１抗体を検出および／または測定するために使用される。抗ＮＰＲ１抗体についての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本開示の救済剤と接触させることを含むことができ、ここで、救済剤は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料から抗ＮＰＲ１抗体を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。あるいは、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、未標識の救済剤を診断用途に使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、もしくは^１２５Ｉなどの放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの酵素であってもよい。試料中の抗ＮＰＲ１抗体を検出または測定するために使用することができる具体的な例示的なアッセイには、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。

本開示による抗ＮＰＲ１抗体診断アッセイで使用することができる試料は、患者から入手可能な任意の組織または流体試料を含み、これは、抗ＮＰＲ１抗体タンパク質またはそのフラグメントのいずれかを対象に投与した後の検出可能な量のそれらを含有する。一般に、健康な患者（例えば、抗ＮＰＲ１抗体を受けていない患者）から得られた特定の試料中の抗ＮＰＲ１抗体タンパク質のレベルを測定して、最初に抗ＮＰＲ１抗体のベースラインまたは標準レベルを確立する。次いでこの抗ＮＰＲ１抗体のベースラインレベルを、抗ＮＰＲ１抗体を投与された疑いのある個体から得られた試料中で測定された抗ＮＰＲ１抗体のレベルと比較することができる。

抗ＮＰＲ１抗体タンパク質に特異的な免疫グロブリンタンパク質は、追加の標識もしくは部分を含有しなくてもよいか、またはそれらは、Ｎ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有してもよい。一実施形態において、標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（存在する場合）の位置によって、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定することができる。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。

以下の実施例は、当技術分野の当業者に、本開示の方法および組成物の作成方法および使用方法に関する完全な開示および記載を提供するために記載されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。用いた数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するよう試みられたが、実験上の誤差および自差がある程度あることは考慮されるべきである。別段示されなければ、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏におけるものであり、室温は約２５℃であり、圧力は雰囲気においてであるか、または雰囲気に近い。

実施例１：ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）に特異的に結合するアゴニスト抗体に対するヒト抗体の作製
抗Ｒ５３８１抗体の作製
ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む、抗ＮＰＲ１抗体タンパク質に対するヒト抗体は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて作製した。このマウスを、抗ＮＰＲ１抗体Ｒ５３８１によって免疫化した（本明細書の他の場所に記載される）。

抗Ｒ５３８１特異的イムノアッセイにより、抗体免疫応答をモニターした。所望の免疫応答を達成したら、脾細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と融合させて生存能を保持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、抗Ｒ５３８１特異的抗体を産生する細胞株を同定した。細胞株を用いて、いくつかの抗Ｒ５３８１キメラ抗体（例えば、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。

抗Ｒ５３８１抗体はまた、全体が参照によって本明細書に具体的に組み入れられる米国特許第７，５８２，２９８号に記載されているように、骨髄腫細胞と融合させずに、抗原陽性マウスＢ細胞から直接単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗Ｒ５３８１抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を取得した。

上記で開示されたように作製された例示的な抗体をｍＡｂ３６３１２およびｍＡｂ３６３１３とした。

「１アーム」抗Ｒ５３８１抗体の作製
上記で作製した選択された抗体を使用して、１価または「１アーム」抗体または抗原結合分子を作製した。このような１価の抗原結合分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む単一のＲ５３８１結合部分を含む。全長重鎖、全長軽鎖および追加のＦｃドメインポリペプチドを含む１価の抗体は、標準的な方法論（ＷＯ２０１０１５１７９２を参照）を用いて構築したが、重鎖定常領域はＦｃドメインポリペプチドとは少なくとも２つのアミノ酸が異なっている。このような修飾は、１価の抗体の精製に有用である（ＷＯ２０１０１５１７９２を参照）。

ＩｇＧ４Ｆｃドメインを有する例示的な１アーム抗体を製造し、ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７とした。

この実施例の方法に従って作製された例示的な抗体の生物学的特性は、以下に示す実施例に詳細に記載される。

実施例２：重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列およびヌクレオチド配列
表１は、本開示の選択された抗Ｒ５３８１抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を記載する。

対応する核酸配列識別子を表２に示す。

本明細書で言及する抗体は、典型的には、完全にヒトの可変領域を有するが、ヒトまたはマウスの定常領域を有していてもよい。当業者が理解する通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体を、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４を有する抗体などに変換することができる）が、いずれの場合も、表２において示した数字で表した識別名により示した可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同一のままであり、抗原の結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず、一致または実質的に類似であると予測した。ある種の実施形態において、マウスＩｇＧ１Ｆｃを有する選択された抗体をヒトＩｇＧ４Ｆｃを有する抗体に変換した。一実施形態において、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、ＵＳ２０１００３３１５２７に開示されているように、２つまたはそれ以上のアミノ酸変化を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ４Ｆｃは、二量体安定化を促進するためにヒンジ領域（Ｓ１０８Ｐ）においてセリンからプロリンへの変異を含む。別段示されなければ、以下の実施例で使用される全ての抗体はヒトＩｇＧ４アイソタイプを含む。

配列番号２／１０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む例示的な２価の抗体は、ＲＥＧＮ６５８０である。ＲＥＧＮ６５８０は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

配列番号２２／３０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む例示的な２価の抗体は、ＲＥＧＮ６５８１である。ＲＥＧＮ６５８１は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

選択された抗Ｒ５３８１抗体を、抗Ｒ５３８１結合アームおよび追加のＦｃポリペプチド（または切断された重鎖）を含む１アーム抗体の構築に使用した。ある種の実施形態において、抗Ｒ５３８１結合アームは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプまたはそれらの変異体の重鎖定常領域を含む。一実施形態において、追加のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１アイソタイプまたはその変異体のものである。一実施形態において、追加のＦｃポリペプチドは、その変異体のＩｇＧ４アイソタイプのものである。

表３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、選択された１アーム抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＣＤＲ、ならびに重鎖および軽鎖配列識別子を挙げている。

別段示されなければ、以下の実施例で使用される全ての抗体は、ヒトＩｇＧ４アイソタイプを含む。

実施例３：選択された抗体のＢｉａｃｏｒｅ結合動態
Ｈ２ａＭ２２０３３Ｎ（Ｒ５３８１の親ハイブリドーマ）への選択された抗Ｒ５３８１抗体（ｍＡｂ）の結合に対する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのＢｉａｃｏｒｅＴ２００バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合研究を、２５℃および３７℃で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＴ）ランニングバッファ中で実施した。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ表面を、Ｈ２ａＭ２２０３３Ｎを捕捉するために、抗マウスＦｃ特異的抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ１００８３８）とのアミンカップリングによって最初に誘導体化した。ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファ中で調製した異なる濃度のｍＡｂ（１００ｎＭ～３．７ｎＭ、３倍連続希釈）を、流速５０μＬ／分で３分間注入した。Ｈ２ａＭ２２０３３Ｎに結合した異なるｍＡｂの解離を、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファ中で１０分間モニタリングした。各サイクルの終わりに、１０ｍＭのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５の６０秒間の注入を使用して、Ｈ２ａＭ２２０３３Ｎ捕捉表面を再生した。会合速度（ｋ_ａ）および解離速度（ｋ_ｄ）は、リアルタイム結合センサグラムを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して質量輸送制限のある１：１結合モデルに適合させることにより決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）および解離半減期（ｔ１／２）は速度論的速度から次のように算出した：

２５℃および３７℃における本開示のＨ２ａＭ２２０３３Ｎに対する異なるｍＡｂの結合に関する結合動態パラメーターをそれぞれ以下の表４および表５に示す。

実施例４：異なる抗Ｒ５３８１抗体間の交差競合
抗Ｒ５３８１抗体（ｍＡｂ）間の結合競合は、ＯｃｔｅｔＨＴＸバイオセンサープラットフォーム（ＰａｌｌＦｏｒｔｅＢｉｏＣｏｒｐ．）上のリアルタイム、ラベルフリーバイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）アッセイを使用して決定した。実験全体は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＴ）バッファ中で、１０００ｒｐｍの速度でプレートを振盪しながら２５℃で実施した。２つのｍＡｂがＲ５３８１上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合できるかどうかを評価するために、最初に約０．４７ｎｍのＲ５３８１を、Ｒ５３８１溶液１．７μｇ／ｍＬを含有するウェルにバイオセンサーチップを１分間浸漬することにより、抗ヒト抗体（ＡＨＣ）でコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（ＦｏｒｔｅｂｉｏＩｎｃ、＃１８－５０６４）上に捕捉した。次に、Ｒ５３８１捕捉バイオセンサーチップを、ｍＡｂ－１の溶液５０μｇ／ｍＬを含有するウェルに４分間浸漬することにより第１の抗Ｒ５３８１ｍＡｂ（以降、ｍＡｂ－１と呼ばれる）で飽和させた。次に、バイオセンサーチップを、続いて、第２の抗Ｒ５３８１ｍＡｂ（以降、ｍＡｂ－２と呼ばれる）の溶液５０μｇ／ｍＬを含有するウェルに３分間浸漬した。バイオセンサーチップは、実験の各工程の間にＨＢＳ－ＥＴＢバッファで洗浄した。リアルタイムの結合応答を実験の全過程の間にモニタリングし、各工程の終わりに結合応答を記録した。ｍＡｂ－１と予め複合体化したＲ５３８１へのｍＡｂ－２結合の応答を比較し、異なる抗Ｒ５３８１ｍＡｂの競合／非競合挙動を決定した。抗Ｒ５３８１ｍＡｂ間には交差競合があった。

実施例５：Ｒ５３８１に結合する抗Ｒ５３８１抗体のｐＨ感受性
ｐＨ７．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ５．０のバッファ中の異なる抗Ｒ５３８１ｍＡｂに対する解離速度定数（ｋ_ｄ）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのＢｉａｃｏｒｅ４０００バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合研究は、４つのランニングバッファ、（ｉ）ＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ７．４）、（ｉｉ）ＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．５（ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ６．５）、（ｉｉｉ）ＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０（ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ６．０）、および（ｉｖ）ＰＢＳ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ５．０（ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ５．０）を使用して３７℃で実施した。ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ表面を、Ｈ２ａＭ２２０３３Ｎ（Ｒ５３８１の親ハイブリドーマ）を捕捉するために、抗マウスＦｃ特異的抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＢＲ１００８３８）とのアミンカップリングにより最初に誘導体化した。ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ７．４バッファで調製した異なる濃度の抗Ｒ５３８１ｍＡｂ（１００ｎＭ～１１．１１ｎＭ、３倍連続希釈）を流速３０μＬ／分で３分間注入し、続いて、結合した抗Ｒ５３８１ｍＡｂを、ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ７．４、ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ６．５、ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ６．０またはＰＢＳ－ＴＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ５．０ランニングバッファ中で１０分間解離させた。

４つのｐＨランニングバッファ中での解離速度定数（ｋ_ｄ）は、リアルタイム結合センサグラムを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを使用して１：１結合モデルに適合させることにより決定した。解離半減期（ｔ１／２）はＫ_ｄ値から次のように算出した：

ＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．４中でＨ２ａＭ２２０３３Ｎに結合する選択された抗Ｒ５３８１ｍＡｂに対するｋ_ｄおよびｔ１／２値、その後の３７℃での本開示のＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ７．４、ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ６．５、ＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ６．０またはＰＢＳ－Ｔ－ｐＨ５．０中での解離を、それぞれ、表６、表７、表８、および表９に示す。

ｐＨ７．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、およびｐＨ５．０のバッファ中のＲ５３８１抗イディオタイプモノクローナル抗体ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７の解離半減期（ｔ１／２）の比較を図１に示す。

実施例６：Ｒ５３８１誘導性ＮＰＲ１活性化の阻害
ヒトＮＰＲ１（ｈＮＰＲ１）の調節を評価するために、Ｃ末端ｍｙｃおよびＦＬＡＧタグを有するｈＮＰＲ１を安定して発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株を開発した。この細胞株を、ｈＮＰＲ１、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１．ＭｙｃＤＤＫＨＳまたはＨＥＫ２９／ｈＮＰＲ１と略称されるものの高発現について選別し、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔ、およびＧ４１８硫酸塩５００μｇ／ｍＬを含有するＤＭＥＭ中に維持した。ＮＰＲ１へのリガンドの結合は、受容体のグアニル酸シクラーゼドメインを活性化し、これは、ＧＴＰからのｃＧＭＰの生成を触媒する（Ｚｏｉｓら、２０１４年Ｎａｔｕｒｅ１１（７）：４０３～４１２頁）。ｃＧＭＰレベルを測定する均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して、ＮＰＲ１活性を評価した。

ｃＧＭＰアッセイでは、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１細胞を、完全増殖培地５０μｌを含む９６ウェルハーフエリアプレートに２０，０００細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。翌日、培地を希釈バッファ１０μｌ（０．１％ＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ）と交換し、続いて、希釈バッファ中で作製されたアゴニスト（以下の表１０を参照）を含まない試料を含む様々な濃度の２×アゴニスト１０μｌを添加することによって、ｈＮＰＲ１の活性化を誘導した。Ｒ５３８１誘導性ｈＮＰＲ１活性化の反転を評価するために、細胞を、希釈バッファ中で作製した様々な濃度（表１０を参照）の２×抗Ｒ５３８１１０μｌで処理し、続いて、希釈バッファ単独で、または４０ｐＭのＡＮＰもしくは８０ｐＭのＢＮＰを含有する希釈バッファ中で作製した７０ｎＭのＲ５３８１１０μｌを添加した。処理した細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。ＨＴＲＦアッセイは、製造業者のプロトコール（＃６２ＧＭ２ＰＥＨ）に従ってＣｉｓｂｉｏ製のｃＧＭＰＨＴＲＦキットを使用して実施した。簡潔に説明すると、１×ｃＧＭＰ連続希釈液２０μｌを、ｃＧＭＰ標準曲線のために空のウェルに添加した。試験物を含む試料中のｃＧＭＰ濃度を測定するために、ｃＧＭＰ－ｄ２１０μｌおよび溶解バッファ中で希釈したクリプテートとコンジュゲートさせた抗ｃＧＭＰ抗体１０μｌを、暗所、室温で６０分間、順番に各ウェルに添加した。ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（励起＝３２０ｎｍ、発光＝６２０ｎｍ／６６５ｎｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して蛍光強度を検出し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）比を以下に記載される式を使用して算出した：

ＦＲＥＴ比を、ｃＧＭＰ標準曲線に従ってｃＧＭＰ濃度に変換し、１１点の用量応答曲線にわたって４パラメーターロジスティック方程式を使用して解析して、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８を使用して、試験したアゴニストの半数効果濃度（ＥＣ_５０）値および試験したアンタゴニストの半数阻害濃度（ＩＣ_５０）値を得た。最大阻害は、以下に記載される式で算出した：

この式において、［ｃＧＭＰ，ｎＭ］_{ベースライン}、［ｃＧＭＰ，ｎＭ］_試験抗体、および［ｃＧＭＰ，ｎＭ］_{７０ｎＭＲ５３８１}は、それぞれ、希釈バッファ、最も高い濃度の抗Ｒ５３８１抗体、および４０ｐＭのＡＮＰまたは８０ｐＭのＢＮＰを伴うまたは伴わない７０ｎＭのＲ５３８１で処理した細胞からのｃＧＭＰ濃度値である。

結果
Ｒ５３８１は、ＨＥＫ２９３／ｈＮＰＲ１細胞において発現されたｈＮＰＲ１を活性化して、ＡＮＰまたはＢＮＰの存在下または非存在下で１．７８～３１．２ｎＭのＥＣ５０値でｃＧＭＰ蓄積を刺激し、抗体なしのｃＧＭＰの基礎レベルは、一定量のＡＮＰまたはＢＮＰにより増加した。（以下の表１１）。アイソタイプ対照であるＲＥＧＮ１９４５は、希釈バッファ中で測定可能な活性化を示さなかった。このアッセイではｃＧＭＰ標準曲線と比較して高濃度での定量限界のため、ＡＮＰおよびＢＮＰのＥＣ５０値は算出されなかった。

全ての１アームおよび２価の抗Ｒ５３８１抗体は、４０ｐＭのＡＮＰまたは８０ｐＭのＢＮＰの存在下または非存在下で７０ｎＭのＲ５３８１誘導性ｈＮＰＲ１活性化を遮断し、１５．５～５７．５ｎＭのＩＣ５０値および９７％～１０６％の最大阻害率を有した（表１１）。アイソタイプ対照であるＲＥＧＮ１９４５は、ＡＮＰまたはＢＮＰの存在下または非存在下で、７０ｎＭのＲ５３８１誘導性ｈＮＰＲ１活性化の有意な阻害を示さなかった（表１１）。

まとめると、全ての抗Ｒ５３８１抗体は、ｃＧＭＰ蓄積によって測定されるように、内因性リガンドの存在下または非存在下でＲ５３８１誘導性ｈＮＰＲ１活性化の有意な阻害を示した。

抗Ｒ５３８１抗体は、内因性リガンドの非存在下、または４０ｐＭのＡＮＰ、もしくは８０ｐＭのＢＮＰの存在下でＲ５３８１誘導性ｈＮＰＲ１活性化を阻害することが見出された。細胞を、一定濃度のＡＮＰまたはＢＮＰの存在下または非存在下で、濃度を増加させたＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｒ５３８１もしくはアイソタイプ対照（ＲＥＧＮ１９４５）単独、または７０ｎＭのＲ５３８１とインキュベートした。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（励起＝３２０ｎｍ、発光＝６２０ｎｍ／６６５ｎｍ）を使用して蛍光強度を検出し、実験手順に記載されているようにＦＲＥＴ比およびｃＧＭＰ濃度を算出した。

実施例７：遮断ＥＬＩＳＡアッセイ
ＰＢＳ中の１．０μｇ／ｍＬのｈＮＰＲ１．ｅｃｔｏ．ｍｍｈ（そのうち、アミノ酸１～４４１：ＮＭ＿０００９０６．３の翻訳からのヒトＮＰＲ１アミノ酸Ｇ３２～Ｅ４７３、およびアミノ酸４４２～４６９：Ｍｙｃ－Ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグ；配列番号４７）を９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。続いて、非特異的結合部位を、ＰＢＳ（アッセイバッファ）中のＢＳＡの０．５％（ｗ／ｖ）溶液を使用して遮断した。抗Ｒ５３８１ｍＡｂおよびアイソタイプ対照ｍＡｂを、アッセイバッファ中で５００ｎＭから８．４６ｐＭまで３倍連続希釈した。９６ウェル希釈プレート内で、２８５ｐＭのビオチン－Ｒ５３８１を３倍段階希釈した抗体と混合し、室温（ＲＴ）で１時間事前結合させた。抗Ｒ５３８１およびアイソタイプ対照ｍＡｂの最終濃度は、３３３．３３ｎＭ～５．６４ｐＭの範囲であり、ビオチン－Ｒ５３８１の最終濃度は９５ｐＭであった。室温で１時間インキュベートした後、事前結合反応混合物を、ｈＮＰＲ１．ｅｃｔｏ．ｍｍｈでコーティングしたマイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートを室温で１時間インキュベートし、次いでプレート洗浄溶液で洗浄した。ビオチン－Ｒ５３８１の結合を、ポリ－ＨＲＰストレプトアビジンタンパク質を使用して検出した。プレートを検出タンパク質とともに室温で１時間インキュベートし、次いでプレート洗浄溶液で洗浄した。アッセイプレートは、製造業者の推奨手順に従ってＴＭＢ比色基質を用いて開発した。

各ウェルについて４５０ｎｍでの吸光度を記録し、抗体濃度の関数としてプロットした。データを、１１点の用量応答曲線にわたる４パラメーターロジスティック方程式を使用してＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアで解析し、ＩＣ_５０値を算出した。固定化されたｈＮＰＲ１．ｅｃｔｏ．ｍｍｈへのビオチン－Ｒ５３８１の結合を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度として定義される、算出したＩＣ_５０値を、遮断効力の指標として使用した。最も高い抗Ｒ５３８１濃度での遮断パーセントを、アッセイのベースラインと比較したＮＰＲ１へのビオチン－Ｒ５３８１の結合を遮断する抗体の能力の指標として算出した。ビオチン－Ｒ５３８１の０％の結合として定義される、アッセイのベースラインシグナルは、アッセイバッファのみを含むウェル内のポリ－ＨＲＰストレプトアビジン結合からのＯＤ４５０ｎｍ読み取り値から決定した。抗Ｒ５３８１の非存在下での９５ｐＭのビオチン－Ｒ５３８１の結合シグナルを、１００％の結合または０％の遮断として定義した。

結果
ヒトＮＰＲ１へのビオチン－Ｒ５３８１の結合を遮断する抗Ｒ５３８１抗体の能力を、遮断ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。遮断結果を以下の表１２に要約する。試験した最も高い抗体濃度（３３３．３３ｎＭ）で算出した遮断パーセントが、全ての抗体について報告された。ＲＥＧＮ９０３５は、２．０４ｎＭのＩＣ_５０［Ｍ］で９５ｐＭのビオチン－Ｒ５３８１の結合を遮断し、試験した最も高い濃度で９９．２９％の遮断を実証した。ＲＥＧＮ９０３７は、２．４０ｎＭのＩＣ_５０［Ｍ］で９５ｐＭのビオチン－Ｒ５３８１の結合を遮断し、試験した最も高い濃度で９９．０５％の遮断を実証した。

抗Ｒ５３８１の２価の抗体ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１は、それぞれ３８１ｐＭおよび５４３ｐＭのＩＣ_５０［Ｍ］値で９５ｐＭのビオチン－Ｒ５３８１の結合を遮断し、両方のｍＡｂは、最も高い濃度で１００％の遮断を実証した。アイソタイプ対照ｍＡｂ（ＲＥＧＮ１９４５）は、同一のアッセイ条件下でビオチン－Ｒ５３８１の遮断を示さなかった。

ＥＬＩＳＡベースの方法を使用して、様々な濃度の１アーム抗Ｒ５３８１ｍＡｂ、ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７の存在下で、ＥＬＩＳＡプレートでコーティングされたｈＮＰＲ１．ｅｃｔｏ．ｍｍｈ（配列番号４７）へのビオチン－Ｒ５３８１の結合の遮断を評価した。対照として、それぞれの２価のｍＡｂＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１、ならびにアイソタイプ対照ｍＡｂも試験した。最も高いｍＡｂ濃度（３３３．３３ｎＭ）での遮断パーセントおよびｍＡｂの遮断ＩＣ_５０［Ｍ］値を上記の表１２にまとめている。モル濃度［Ｍ］は、ｍＡｂの抗体濃度を示す。

実施例８：Ｒ５３８１と抗Ｒ５３８１との間の循環免疫複合体形成
Ｒ５３８１と抗Ｒ５３８１抗体との間で循環免疫複合体（ＣＩＣ）を形成する可能性を、Ｑｕｉｄｅｌによって開発されたＭｉｃｒｏｖｕｅＣ１ｑ－ＣＩＣキットを使用して試験した。このアッセイは製造業者の使用説明書に従って実施した。抗原および抗体試料を１：１または１：１０の比で合わせ、３７℃で３０分間インキュベートして複合体の形成を開始した。次いで抗体－抗原試料、ならびに陽性および陰性の熱凝集ガンマグロビン（ＨＡＧＧ）対照を、Ｃ１ｑでコーティングされた試験プレートにおいて１：５０に希釈した。キット基準物を、Ｃ１ｑでコーティングされた試験プレートに直接添加した。次いで試験プレートを室温で１時間インキュベートした。未結合の抗体、抗原または複合体を、１×洗浄バッファを使用してプレートから洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート検出抗体を試験プレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした後、未結合のＨＲＰコンジュゲート検出抗体を、１×洗浄バッファを使用してプレートから洗浄した。ＨＲＰ基質を試験プレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで酸性停止溶液を適用して、ＨＲＰ酵素を不活性化した。次いでプレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＶｉｃｔｏｒＸ５プレートリーダーで４０５ｎＭにて読み取った。

生データからバックグラウンドを差し引き、ＭｉｃｒｏＶｕｅＣ１ｑ－ＣＩＣキット基準物を使用して線形標準曲線をプロットし、これを線形回帰によって解析した。次いで線形回帰式を使用して試料およびＨＡＧＧ標準値（μｇＥｑ／ｍＬ）を算出した。

結果
ＨＡＧＧ高および低対照を各プレートに含んだ。製造業者の使用説明書に従って、４．０μｇＥｑ／ｍＬ未満の値を有する全ての試料を陰性とみなした。Ｒ５３８１が抗Ｒ５３８１抗体とＣＩＣを形成する可能性を、ＭｉｃｒｏＶｕｅＣ１ｑ－ＣＩＣキットを使用して調べた。結果を以下の表１３Ａおよび１３Ｂに要約する。ＣＩＣの最終値および存在が示される。実験的に試験した条件のいずれにおいてもＣＩＣは検出されなかった。

実施例９：ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおける抗Ｒ５３８１抗体の薬物動態評価
２つの１アーム抗Ｒ５３８１抗体、ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７、ならびにそれらのそれぞれの２価の親対応物であるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の薬物動態の評価を、ヒト化ＮＰＲ１マウス（ヒト化ＮＰＲ１対立遺伝子についてホモ接合性のマウス、ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}）において行った。コホートは、試験した抗体ごとに５匹のマウスを含んだ。ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１を投与したマウスには、１ｍｇ／ｋｇの用量を単回の皮下（ＳＣ）により与えた。ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７を投与したマウスには、親対応物に対するモル当量（０．６７ｍｇ／ｋｇ）に基づいて単回の正規化したＳＣ用量を与えた。血液試料を、投与後６時間、ならびに１、２、３、７、１０、１４、２１および３０日目に採取した。血液を血清に処理し、解析するまで－８０℃で凍結した。ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７、ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の全てのｈＩｇＧ血清濃度および機能的ｈＩｇＧ血清濃度を、ＧｙｒｏＬａｂｘＰｌｏｒｅプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ）を使用して測定した。

Ｇｙｒｏｓ技術は、レーザー誘起蛍光検出による自動イムノアッセイのためにアフィニティーフロースルーフォーマットを使用する。試料を、放射状に配置された複数のナノリットルスケールのアフィニティーキャプチャーカラムを含むコンパクトディスク（ＣＤ）に充填した。液体の流れは、遠心力及び毛細管力によって制御された。

血清中のＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７、ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の全ての濃度および機能的濃度を測定するために、試験物特異的ビオチン化捕捉試薬（以下の表１４）を、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）を予め充填したアフィニティーカラムを含むＧｙｒｏｌａｂＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに添加した。キャリブレーションに使用した基準物（表１４）を、０．４８８～２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で実行した。血清試料の連続希釈を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製した。基準物の連続希釈を、２％の正常マウス血清（ＮＭＳ）を含有するＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中で調製した。１：５０に希釈した血清試料の一重項および基準物の複製を、捕捉試薬でコーティングされたアフィニティーカラムに室温で加えた。捕捉されたヒトＩｇＧを、ＲｅｘｘｉｐＦバッファ（Ｇｙｒｏｓ）で希釈したＡｌｅｘａ－６４７コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ１／ｈＩｇＧ４モノクローナル抗体（０．５μｇ／ｍＬにおける）を使用して検出した；得られた蛍光シグナルを、ＧｙｒｏＬａｂｘＰｌｏｒｅ機器によって応答単位（ＲＵ）で記録した。それぞれのアッセイの０．０５μｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）を、品質管理（ＱＣ）試料が、予測濃度から一貫して２５％未満逸脱すると判定された標準曲線上の最も低い濃度として定義した（表１４）。試料濃度を、ＧｙｒｏｌａｂＥｖａｌｕａｔｏｒＳｏｆｔｗａｒｅにおける４パラメーターロジスティック曲線適合を使用して構築した標準曲線から補間によって決定した。２回の反復実験からの平均濃度を使用して、最終濃度を算出した。

ＰＫパラメーターを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアバージョン６．３（Ｃｅｒｔａｒａ、Ｌ．Ｐ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）および血管外投与モデルを使用したノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）によって決定した。各抗体についてそれぞれの平均濃度値（全てのｈＩｇＧ）を使用して、観察された血清中最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、観察された推定半減期（ｔ_１／２）、最後の測定可能な濃度までの時間に対する濃度曲線下面積（ＡＵＣ_ｌａｓｔ）、および抗体クリアランス率（Ｃｌ）を含む全てのＰＫパラメーターを、線形補間および均一な重み付けを伴う線形台形則を使用して決定した。

結果
ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおける抗Ｒ５３８１Ａｂの１ｍｇ／ｋｇ（または用量当量）のＳＣ投与後、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７、ＲＥＧＮ６５８０、およびＲＥＧＮ６５８１は、同様の用量で正規化した血清中の全てのｈＩｇＧの最大濃度（それぞれ、Ｃ_{ｍａｘ／Ｄ}＝１０．３、９．２３、９．３、および１１．４ｍｇ／ｍＬ）を示した。さらに、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７、ＲＥＧＮ６５８０、およびＲＥＧＮ６５８１はまた、同様の半減期値（それぞれ、Ｔ_１／２＝１８．１、１７．１、１６．１、および１５．４日）、用量正規化薬物曝露値（それぞれ、ＡＵＣ_{ｌａｓｔ／Ｄ}＝２０４、１７４、１６５、および２０５（ｄ^＊ｍｇ／ｍＬ）／（ｍｇ／ｋｇ））、およびクリアランス率（それぞれ、Ｃｌ＝５．０、６．１、４．９、および３．７ｍＬ／日／ｋｇ）を示した。さらに、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７、ＲＥＧＮ６５８０、およびＲＥＧＮ６５８１の全てのヒトＩｇＧ濃度および機能的ヒトＩｇＧ濃度は、全ての測定した時点にわたって同等であった。ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおいて２価の対応物であるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１と比較して、１アーム抗体ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７のＰＫプロファイルには、測定可能な差異は見られなかった。

全ての抗体濃度および機能的抗体濃度についてのデータの概要を以下の表１５に要約し、平均ＰＫパラメーターを以下の表１６に記載し、時間に対する平均全抗体濃度を図２に示す。

実施例１０：抗Ｒ５３８１抗体による救済後の全てのＲ５３８１（抗ＮＰＲ１ｍＡｂ）の血清濃度解析
Ｒ５３８１の血圧低下効果を反転させる際の、アイソタイプ対照抗体であるＲＥＧＮ１９４５と比較した、２価の抗Ｒ５３８１ｍＡｂであるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の有効性を評価するｉｎｖｉｖｏ研究からの血清の試料濃度解析。この研究は、遠隔測定した正常血圧ヒト化ＮＰＲ１（ヒト化ＮＰＲ１対立遺伝子についてホモ接合性のマウス、ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}）マウスにおいて実施した。簡潔に述べると、コホートは、試験抗体ごとに５匹のマウスを含んだ。全てのマウスに、５ｍｇ／ｋｇ用量のＲ５３８１を単回の皮下（ＳＣ）により投与した。３日後、マウスに、ＲＥＧＮ６５８０、ＲＥＧＮ６５８１またはアイソタイプ対照であるＲＥＧＮ１９４５の５０ｍｇ／ｋｇ用量を単回の静脈内（ＩＶ）により与えた。血液試料を、最初のＲ５３８１投与後７日目および２２日目に採取した。血液を血清に処理し、解析するまで－８０℃で凍結した。全てのＲ５３８１の血清濃度を、ＧｙｒｏＬａｂｘＰｌｏｒｅプラットフォーム（Ｇｙｒｏｓ）を使用して測定した。

血清中の全てのＲ５３８１を測定するために、イムノアッセイを実行した。Ｒ５３８１を投与され、続いて抗Ｒ５３８１ｍＡｂを投与されたマウスは、血清中で抗体：抗イディオタイプ複合体を形成すると推定される。（Ｒ５３８１：ＲＥＧＮ６５８０またはＲ５３８１：ＲＥＧＮ６５８１）。これらの試料の全てのＲ５３８１抗体濃度を正確に測定するために、アッセイの開始時に解離工程を実行した。簡潔に述べると、全てのＲ５３８１を測定するために、試験物に特異的なビオチン化捕捉試薬である７５μｇ／ｍＬの濃度のＲＥＧＮ６７１２を、１：２５０に希釈した血清試料または０．２４４～１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度に希釈した基準物と３７℃で４時間プレインキュベートした。血清試料の希釈物を、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（＋捕捉試薬）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製し、基準物（Ｒ５３８１）の連続希釈物を、０．４％の正常マウス血清（ＮＭＳ）（＋捕捉試薬）を含むＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中で調製した。捕捉試薬を試料または基準物と３７℃で４時間プレインキュベートした後、血清試料（＋捕捉試薬）の希釈した一重項および基準物（＋捕捉試薬）の希釈した複製を、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）を予め充填したアフィニティーカラムを含むＧｙｒｏｌａｂＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに添加した。捕捉したヒトＩｇＧを、ＲｅｘｘｉｐＦバッファ（Ｇｙｒｏｓ）中で希釈した０．５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ－６４７コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ１／ｈＩｇＧ４モノクローナル抗体を使用して検出した；得られた蛍光シグナルを、ＧｙｒｏＬａｂｘＰｌｏｒｅ機器によって応答単位（ＲＵ）で記録した。それぞれのアッセイの０．１μｇ／ｍＬの定量下限（ＬＬＯＱ）を、予め複合体化された品質管理（ＱＣ）（Ｒ５３８１：ＲＥＧＮ６５８０、Ｒ５３８１：ＲＥＧＮ６５８１）試料が、予測濃度から一貫して２５％未満逸脱すると判定された標準曲線上の最も低い濃度として定義した。

Ｒ５３８１に続いて未結合対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５）を投与したマウスからの血清中の全てのＲ５３８１濃度の測定のために、解離工程は必要ではなかった。全てのＲ５３８１濃度を次のように測定した。簡潔に述べると、試験物に特異的なビオチン化捕捉試薬であるｍＡｂ３６３１３を５０μｇ／ｍＬで、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）が予め充填されたアフィニティーカラムを含むＧｙｒｏｌａｂＢｉｏａｆｆｙ２００ＣＤに室温で添加した。このアッセイでのキャリブレーションのために使用した基準物（Ｒ５３８１）を、０．４８８～２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で希釈した。基準物の連続希釈物を、１％の正常マウス血清（ＮＭＳ）を含むＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中で調製した。１：１００に希釈した血清試料の一重項および基準物の複製を、捕捉試薬でコーティングされたアフィニティーカラムに室温で添加した。捕捉したヒトＩｇＧを、ＲｅｘｘｉｐＦバッファ（Ｇｙｒｏｓ）中で希釈した０．５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ－６４７コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ１／ｈＩｇＧ４モノクローナル抗体を使用して検出した；得られた蛍光シグナルを、ＧｙｒｏＬａｂｘＰｌｏｒｅ機器によってＲＵで記録した。それぞれのアッセイの０．０５μｇ／ｍＬのＬＬＯＱを、ＱＣ試料が、予測濃度から一貫して２５％未満逸脱すると判定された標準曲線上の最も低い濃度として定義した。

試料濃度を、ＧｙｒｏｌａｂＥｖａｌｕａｔｏｒＳｏｆｔｗａｒｅにおける４パラメーターロジスティック曲線適合を使用して構築した標準曲線から補間によって決定した。２回の反復実験からの平均濃度を使用して、最終濃度を算出した。

平均濃度の算出
ＬＬＯＱ未満（＜ＬＬＯＱ）の個々の濃度および平均濃度を、定量限界（ＢＬＱ）未満として報告した。個々の値の５０％超がＢＬＱである場合、その時点の平均値をＢＬＱとして報告した。ＢＬＱ値としてゼロを使用して、処置群内の個々の値の５０％以下がＢＬＱであり、平均値が算術的にＢＬＱである場合、平均値をＢＬＱとして報告した。ＢＬＱ値としてゼロを使用して、処置群内の個々の値の５０％以下がＢＬＱであり、平均値が算術的にＬＬＯＱ以上である場合、この算術値を報告した。

結果
ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにＲ５３８１を５ｍｇ／ｋｇ投与してから７日後、続いて３日後に救済試薬ＲＥＧＮ６５８０、ＲＥＧＮ６５８１、またはアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＲＥＧＮ１９４５）を５０ｍｇ／ｋｇ投与した結果、アイソタイプ対照の投与を受けたマウスと比較して抗イディオタイプ抗体を受けたマウスにおいて全てのＲ５３８１のより低い平均血清濃度が生じた。これは、抗イディオタイプ抗体ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１が、アイソタイプ対照を投与したマウスと比較して、これらの抗イディオタイプｍＡｂを与えられた場合、マウスにおいて見られるＲ５３８１のより速いクリアランスに関与していることを示す。

Ｒ５３８１を投与し、続いて３日後（最初のＲ５３８１投与から７日後）にＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１の用量を投与したマウスは、それぞれ３．６または７．４μｇ／ｍＬの全てのＲ５３８１濃度を有した。比較すると、３日後にアイソタイプ対照を投与したマウスは、３０．５μｇ／ｍＬの全てのＲ５３８１濃度を生じた。Ｒ５３８１投与、続いて抗イディオタイプ抗体を投与してから２２日後に採取した血清を解析すると、検出できない濃度の全てのＲ５３８１を生じ、一方、アイソタイプ対照を投与した群における全てのＲ５３８１の血清濃度は依然として約６μｇ／ｍＬであった。

ＲＥＧＮ６５８０、ＲＥＧＮ６５８１、またはアイソタイプ対照であるＲＥＧＮ１９４５のＩＶ投与によって救出されたマウスにおける全てのＲ５３８１血清濃度についてのデータの概要は以下の表１７に見出される。

実施例１１：正常血圧ＮＰＲ１ｈｕ／ｈｕマウスにおける２価の抗Ｒ５３８１ｍＡｂの単回の５０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量を使用したＲ５３８１誘導性血圧低下の反転の評価
遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおいてＲ５３８１によって誘導される血圧低下を反転させる際の２価の抗Ｒ５３８１抗体の効果を評価するために、約１８～２０週齢のオスのＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウス（ｎ＝２０）にＰＡ－Ｃ１０遠隔測定器（ＤＳＩ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を埋め込み、少なくとも７日間回復させた。動物を、研究前の収縮期血圧および体重に基づいて群（群１～４）に階層化した。動物を、標準的な条件（６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８℃～２９℃）の温度；３０％～７０％の相対湿度）下で個別に収容し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。食物（研究食標準ペレット飼料）および水を自由に与えた。

試験タンパク質を、０日目に単回の皮下注射によって適切な動物に投与した。救済剤を、３日目に単回の静脈内注射によって適切な動物に投与した。各動物の用量体積は、最新の体重の測定値に基づいた。

収縮期圧、拡張期圧、脈圧、平均動脈圧および心拍数を、試験期間の間、１０分ごとに１０秒間収集した。データをビニングし、Ｒ５３８１誘導性血圧低下の急性（１時間ごとのビニング）および慢性（２４時間のビニング）の反転についてそれに応じて評価した。２１／２２日目の尿中のサイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。総絶対心臓重量および相対的心臓重量を剖検時に収集した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして提示する。

結果
２価の抗Ｒ５３８１抗体であるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１のｉｎｖｉｖｏスクリーニングにより、Ｒ５３８１の血圧低下効果の迅速かつ持続的な反転が実証された（図３）。ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の両方は、Ｒ５３８１の初回投与から３日後に静脈内投与した場合、圧力をベースラインレベルまで戻して増加させることができた。時間を一致させた対照と比較した６～８ｍｍＨｇの初期圧力降下（以下の表１９）は、ＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１のいずれかの投与後３日以内に反転した（図３）。

反転の持続性は２２日間の研究期間中に維持され、Ｒ５３８１およびアイソタイプ対照ｍＡｂを投与した動物と比較した場合、ＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１を投与した動物について全ての血行動態パラメーターに統計的に有意な差があった（以下の表２０）。

ＰＢＳ対照動物と比較した場合、ＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１のいずれかの投与後に統計的に有意な差は認められず（表２０、図３～６）、Ｒ５３８１誘導性血圧低下効果の完全で持続的な反転を示している。

２価の抗Ｒ５３８１抗体であるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の両方は、ＰＢＳ投与動物と比較して、いずれかの反転剤を投与した群において脛骨重量に対する心臓重量に統計的に有意な差がないことによって示されるように、相対的心臓重量の減少を弱めた（以下の表２１）。

送達された試験物または救済物のいずれでも、尿量に対する効果は認められなかった（以下の表２２）。

２２日目に尿中で評価した場合、ｃＧＭＰ産生は、反転剤の投与による影響を受けなかった（表２２）。

２価の抗Ｒ５３８１抗体であるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の両方は、Ｒ５３８１の単回投与を受けた正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスに対する研究３日目の単回の静脈内注射後、研究２１日目までを通してＲ５３８１の血圧低下効果を迅速かつ持続的に反転させた。

実施例１２：正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおける２価の抗Ｒ５３８１ｍＡｂの単回の５０ｍｇ／ｋｇの皮下用量を使用したＲ５３８１誘導性血圧低下の反転の評価
遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおいてＲ５３８１によって誘導される血圧低下を反転させる際の２価の抗Ｒ５３８１抗体の効果を評価するために、約１０～１２週齢のオスのＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}（ｎ＝２０）マウスにＰＡ－Ｃ１０遠隔測定器（ＤＳＩ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を埋め込み、少なくとも７日間回復させた。動物を、研究前の収縮期血圧および体重に基づいて群（群１～４）に階層化した。動物を、標準的な条件（６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８℃～２９℃）の温度；３０％～７０％の相対湿度）下で個別に収容し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。食物（研究食標準ペレット飼料）および水を自由に与えた。

試験タンパク質を、０日目に単回の皮下注射によって適切な動物に投与した。救済剤を、３日目に単回の皮下注射によって適切な動物に投与した。各動物の用量体積は、最新の体重の測定値に基づいた。

収縮期圧、拡張期圧、脈圧、平均動脈圧および心拍数を、試験期間の間、１０分ごとに１０秒間収集した。データをビニングし、Ｒ５３８１誘導性血圧低下の急性（１時間ごとのビニング）および慢性（２４時間のビニング）の反転についてそれに応じて評価した。２１／２２日目の尿中のサイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）濃度をＥＬＩＳＡによって評価した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして提示する。

結果
２価の抗Ｒ５３８１抗体のｉｎｖｉｖｏスクリーニングにより、Ｒ５３８１の血圧低下効果の持続的な反転が実証された（図７および以下の表２４）。

ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の両方は、Ｒ５３８１の初回投与から３日後に皮下投与した場合、圧力をベースラインレベルまで戻して増加させることができた（図７および以下の表２５）。

反転の持続性は２２日間の研究期間中に維持され、Ｒ５３８１およびアイソタイプ対照ｍＡｂを投与した動物と比較した場合、ＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１を投与した動物について全ての血行動態パラメーターに統計的に有意な差があった（図７および以下の表２５）。ＰＢＳ対照動物と比較した場合、ＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１のいずれかの投与後に統計的に有意な差は認められず（表２５、図７）、Ｒ５３８１誘導性血圧低下効果の完全で持続的な反転を示している。

ＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の両方は、２２日後のＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１のいずれかの皮下投与後の尿中のｃＧＭＰレベルの統計的に有意な減少によって示されるようにＮＰＲ１シグナル伝達の減衰を実証した（以下の表２６）。

Ｒ５３８１およびアイソタイプ対照の投与により、絶対心臓重量および相対的心臓重量の非統計的に有意な減少の傾向が観察された（以下の表２７）。

この変化は、Ｒ５３８１の血行動態効果に起因する可能性が高い。有意ではないが、Ｒ５３８１に続いてＲＥＧＮ６５８０またはＲＥＧＮ６５８１のいずれかを与えられた動物は、Ｒ５３８１誘導性血行動態効果の軽減と一致して、対照動物に近い絶対心臓重量および相対的心臓重量を有した。

研究３日目の単回の皮下注射後、２価の抗Ｒ５３８１抗体であるＲＥＧＮ６５８０およびＲＥＧＮ６５８１の両方は、遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおいて評価した場合、Ｒ５３８１の血圧低下効果を迅速かつ持続的に反転させた。両方の薬剤は、研究２２日目までを通してＮＰＲ１誘導性ｃＧＭＰ産生を阻害する機能も果たした。

実施例１３：正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおける１価の抗Ｒ５３８１ｍＡｂの単回の５０ｍｇ／ｋｇの用量を使用したＲ５３８１誘導性血圧低下の反転の評価
遠隔測定した正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスにおいてＲ５３８１によって誘導される血圧低下を反転させる際の１価の抗Ｒ５３８１抗体の効果を評価しようとして、約１３～１４週齢のオスのＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}（ｎ＝４８）マウスにＰＡ－Ｃ１０遠隔測定器（ＤＳＩ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を埋め込み、少なくとも７日間回復させた。動物を、研究前の収縮期血圧および体重（以下の表２９）に基づいて群（以下の表２８）（群１～８）に階層化した。

動物を、標準的な条件（６４°Ｆ～８４°Ｆ（１８℃～２９℃）の温度；３０％～７０％の相対湿度）下で個別に収容し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルを維持した。食物（研究食標準ペレット飼料）および水を自由に与えた。

試験タンパク質を、０日目に単回の皮下注射によって適切な動物に投与した。救済剤を、３日目に単回の皮下または静脈内注射によって適切な動物に投与した。各動物の用量体積は、最新の体重の測定値に基づいた。一晩の尿の採取を研究２０日目および２１日目に実施した。

結果
１価の抗Ｒ５３８１抗体のｉｎｖｉｖｏスクリーニングにより、Ｒ５３８１の血圧低下効果の迅速かつ持続的な反転が実証された（以下の表３０；図８および図９）。

ＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７の両方は、Ｒ５３８１の初回投与の３日後に静脈内または皮下に投与した場合、圧力をベースラインレベルまで戻して増加させることができた（表３０；図８および図９）。時間を一致させた対照と比較した３～６ｍｍＨｇの絶対圧（表２９）および約１０ｍｍＨｇの相対圧（図８）の初期の降下は、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７またはＲＥＧＮ６５８０の静脈内投与後数時間以内に反転した（図９）。ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７またはＲＥＧＮ６５８０の皮下送達は、反転剤投与後２４時間以内に完全な反転を達成した（図９）。反転の持続性は２０日間の研究期間中に維持され、Ｒ５３８１およびアイソタイプ対照ｍＡｂを投与した動物と比較した場合、ＲＥＧＮ９０３５またはＲＥＧＮ９０３７を投与した動物についての全ての血行動態パラメーターに統計的に有意な差があった（表３０、図８）。ＰＢＳ対照動物と比較した場合、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７またはＲＥＧＮ６５８０のいずれかの投与後に統計的に有意な差は認められず（表３０、図８）、Ｒ５３８１誘導性血圧低下効果の完全かつ持続的な反転を示している。Ｒ５３８１によって誘導された圧力の低下により、心臓重量が少なくなったが（以下の表３１）、ＮＰＲ１アゴニズムによって誘導された左心室後負荷の減少の結果である可能性が高い。

心筋構造の変化は、反転剤、ＲＥＧＮ９０３５、ＲＥＧＮ９０３７またはＲＥＧＮ６５８０のいずれかの投与後に改善された（表３１）。最終的に、全ての抗Ｒ５３８１ｍＡｂは、２２日後の皮下または静脈内投与によるｃＧＭＰの統計的に有意な減少によって示されるように、ＮＰＲ１シグナル伝達の減衰を実証した（図１０）。

２価および１価の両方の抗Ｒ５３８１抗体であるＲＥＧＮ６５８０、ならびにＲＥＧＮ９０３５およびＲＥＧＮ９０３７は、それぞれ、Ｒ５３８１の血圧低下効果を迅速かつ持続的に反転させ、単回用量のＲ５３８１を受けた正常血圧ＮＰＲ１^{ｈｕ／ｈｕ}マウスへの研究３日目の単回の皮下または静脈内注射後、研究２１日目までを通してＮＰＲ１誘導性ｃＧＭＰ産生を阻害した。

実施例１４：遠隔測定したカニクイザルにおけるＲ５３８１の単回の静脈内投与後のミドドリン救済
カニクイザルにおけるＲ５３８１の血圧低下効果を一時的に反転させる有効な薬剤としてアルファ－アドレナリン受容体アゴニストであるミドドリンを評価するために、ｉｎｖｉｖｏ研究を実施した。動物に２５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１の単回のＩＶボーラスを与え、３日後に２．５ｍｇ／ｋｇのミドドリンを各投与間隔３～４時間の強制経口投与により３回の用量を投与した。動物を、ミドドリン投与後１日を含む、Ｒ５３８１投与後４日間モニタリングして血行動態の変化を評価した；投与前の測定値は、各動物についてのベースラインとしての役割を果たした。ミドドリンは、Ｒ５３８１誘導性の平均収縮期血圧の低下を、時間的に一致させた対照レベルまで一時的に反転させた。ミドドリンはまた、Ｒ５３８１誘導性の平均心拍数の上昇を一時的に反転させ、Ｒ５３８１を投与した動物においてベースライン心拍数からの平均低下をもたらした。

具体的には、正常血圧の遠隔測定したオスのカニクイザルにおけるＲ５３８１の血圧効果を一時的に反転させる薬剤としての昇圧剤の投与の有用性の評価は、Ｒ５３８１を受けた患者が血圧を増加させる必要があり得る臨床環境（例えば、衝撃誘発性低血圧）に特に関連している。用量を投与する前に、各動物に無線遠隔測定送信機を外科的に埋め込んだ。０日目に、各動物に生理食塩水（ＰＢＳ；ｎ＝１０）または２５ｍｇ／ｋｇのＲ５３８１（ｎ＝１３）の単回のＩＶボーラスを与えた。３日目に、各動物に２．５ｍｇ／ｋｇの用量のアルファ－アドレナリン受容体アゴニストであるミドドリン（生理食塩水群ではｎ＝６；Ｒ５３８１群ではｎ＝７）、または水／ビヒクル（生理食塩水群ではｎ＝４；Ｒ５３８１群ではｎ＝６）を３回与え、各用量を３～４時間の間隔を空けて強制経口投与により投与した。動物を４８時間モニタリングして心血管の血行動態変化について評価した。血圧および心拍数の測定値をＲ５３８１投与前の－３日目からＲ５３８１投与後の４日目までを通して各動物について収集した。投与前の測定値は、各動物についてのベースラインとしての役割を果たした。

結果
ミドドリンは、カニクイザルにおけるＲ５３８１の血圧および心拍数の降下を反転させた。ミドドリンを３回投与すると、Ｒ５３８１誘導性の平均収縮期血圧の低下が一時的に反転し、ミドドリンを受けたＲ５３８１を投与された動物は、ミドドリンを受けなかった生理食塩水を投与された動物において観察されたものと比較して、ベースライン収縮期血圧からの同様の平均変化を示した（図１１）。

さらに、ミドドリンの３回の投与は、Ｒ５３８１誘導性の平均心拍数の上昇を反転させた。ミドドリンの投与により、Ｒ５３８１を投与した動物においてベースライン心拍数から平均低下が生じた；同様の効果が、ミドドリンを投与した生理食塩水を投与した動物において観察された（図１２）。

本開示は、本明細書に記載される具体的な実施形態により、範囲において制限されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加え種々の修飾は、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる修飾は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。

Claims

ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）アゴニストの血行動態効果を反転させる薬剤。
ナトリウム利尿ペプチド受容体１（ＮＰＲ１）アゴニストの投与に関連する血圧の低下を反転させる薬剤。
免疫グロブリンタンパク質、昇圧剤、アルファ－アドレナリン受容体アゴニスト、ステロイド、抗利尿ホルモン、血管新生阻害剤、および血圧を増加させる小分子薬剤からなる群から選択される、請求項１または２に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬剤。
ＮＰＲ１アゴニストに特異的に結合する、請求項１～４のいずれか１項に記載の薬剤。
ＮＰＲ１アゴニストは、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬剤。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；および配列番号５２を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項６に記載の薬剤。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４９、５０および５１をそれぞれ含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；ならびに配列番号５３、５４および５５をそれぞれ含む３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項６または７に記載の薬剤。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のＨＣＶＲおよび配列番号５２のＬＣＶＲを含む、請求項８に記載の薬剤。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体である、請求項６～９のいずれか１項に記載の薬剤。
抗体は、ＩｇＧ１抗体である、請求項１０に記載の薬剤。
抗体は、ＩｇＧ４抗体である、請求項１０に記載の薬剤。
抗体は、配列番号５６を含む重鎖、および配列番号５７を含む軽鎖を含む、請求項１０に記載の薬剤。
ＮＰＲ１アゴニストは、Ｒ５３８１である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆｄフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、２価モノクローナル抗体または１価モノクローナル抗体を含む、請求項４～１４のいずれか１項に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項１５に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質は、配列番号４、６、８、１２、１４および１６；または配列番号２４、２６、２８、３２、３４および３６から選択されるアミノ酸配列を含む、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項１５または１６に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、場合により９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の薬剤。
ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、場合により９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７または１８に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含むヒトモノクローナル抗体を含む、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の薬剤。
ヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項２３に記載の薬剤。
ヒトモノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖を含み、重鎖は、配列番号１８および３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３または２４に記載の薬剤。
ヒトモノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖を含み、軽鎖は、配列番号２０および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質は、１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項４～１５のいずれか１項に記載の薬剤。
１つの免疫グロブリン可変ドメインは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１は、配列番号４および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２は、配列番号６および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３は、配列番号８および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１は、配列番号１２および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２は、配列番号１４および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ３は、配列番号１６および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の薬剤。
ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３は、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４および１６；ならびに（ｉｉ）配列番号２４、２６、２８、３２、３４および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、場合により９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８または２９に記載の薬剤。
ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、場合により９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の薬剤。
ＨＣＶＲは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の薬剤。
１つの免疫グロブリン可変ドメインは、Ｆａｂフラグメント内に含まれる、請求項２６～３４のいずれか１項に記載の薬剤。
多量体化成分をさらに含む、請求項２６～３５のいずれか１項に記載の薬剤。
多量体化成分は、少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む、請求項３６に記載の薬剤。
Ｆｃフラグメントは、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ４またはその変異体のものである、請求項３７に記載の薬剤。
Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項３８に記載の薬剤。
Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項３８に記載の薬剤。
第１のＦｃフラグメントおよび第２のＦｃフラグメントを含み、両方のＦｃフラグメントではないが、第１のＦｃフラグメントまたは第２のＦｃフラグメントは、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む、請求項３７～４０のいずれか１項に記載の薬剤。
修飾は、ＦｃフラグメントにおけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項４１に記載の薬剤。
多量体化成分は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＦｃフラグメントおよび配列番号５８のアミノ酸配列を含むＦｃフラグメントを含む、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の薬剤。
免疫グロブリン可変ドメインは、１価モノクローナル抗体に含まれる、請求項１６～２２または２６～３４のいずれか１項に記載の薬剤。
１価モノクローナル抗体は、重鎖定常領域およびＨＣＶＲを含む重鎖、ならびにＬＣＶＲを含む軽鎖を含む、請求項４４に記載の薬剤。
重鎖定常領域は、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む、請求項４５に記載の薬剤。
修飾は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域におけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項４６に記載の薬剤。
重鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の薬剤。
重鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の薬剤。
免疫グロブリンタンパク質は、Ｆｃフラグメントをさらに含む、請求項４４～４９のいずれか１項に記載の薬剤。
Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項５０に記載の薬剤。
Ｆｃフラグメントは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項５０または５１に記載の薬剤。
ＲＥＧＮ９０３５またはＲＥＧＮ９０３７である、請求項１～５２のいずれか１項に記載の薬剤。
請求項１５～５３のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
請求項１５～５３のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
請求項５４に記載のポリヌクレオチド分子および／または請求項５５に記載のポリヌクレオチド分子を含むベクター。
請求項５６に記載のベクターを発現する宿主細胞。
ＣＨＯ細胞である、請求項５７に記載の宿主細胞。
免疫グロブリンタンパク質を産生する方法であって、タンパク質の産生を可能にする条件下で請求項５７に記載の宿主細胞を成長させること、およびこのように産生されたタンパク質を回収することを含む、方法。
宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項５９に記載の方法。
昇圧剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬剤。
昇圧剤は、ミドドリンである、請求項６１に記載の薬剤。
請求項１～５３のいずれか１項に記載の薬剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
ＮＰＲ１アゴニストの血行動態効果を反転させる方法であって、治療有効量の請求項１～５３のいずれか１項に記載の薬剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
ＮＰＲ１アゴニストの投与に関連する血行動態変化を反転させる方法であって、治療有効量の請求項１～５３のいずれか１項に記載の薬剤を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、または経口で対象に投与される、請求項６４または６５に記載の方法。
ＮＰＲ１アゴニストは、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項６４～６６のいずれか１項に記載の方法。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；および配列番号５２を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項６７に記載の方法。
ＮＰＲ１アゴニストは、Ｒ５３８１である、請求項６４～６８のいずれか１項に記載の方法。
対象は、高血圧、心不全および慢性腎疾患からなる群から選択される疾患または障害を有する、請求項６４～６９のいずれか１項に記載の方法。
請求項１５～５３のいずれか１項に記載の薬剤との結合について競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
請求項１５～５３のいずれか１項に記載の薬剤と同じエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（ａ）配列番号２および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに配列番号１０および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、単一の免疫グロブリン可変ドメイン
を含む、免疫グロブリンタンパク質。
（ａ）ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３が、配列番号４、６および８、ならびに２４、２６および２８からなる群から選択される、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、ならびにＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３が、配列番号１２、１４および１６、ならびに３２、３４および３６からなる群から選択される、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、単一の免疫グロブリン可変ドメイン
を含む、免疫グロブリンタンパク質。
（ｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、場合により９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４または７５に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、場合により９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４～７６のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＨＣＶＲは、配列番号２および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７４～７７のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
（１）ＨＣＶＲは、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または
（２）ＨＣＶＲは、配列番号２２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項７３～７８のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
多量体化成分をさらに含む、請求項７３～７９のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
多量体化成分は、少なくとも１つのＦｃフラグメントを含む、請求項８０に記載の免疫グロブリンタンパク質。
Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項８１に記載の免疫グロブリンタンパク質。
第１のＦｃフラグメントおよび第２のＦｃフラグメントを含み、両方のＦｃフラグメントではないが、第１のＦｃフラグメントまたは第２のＦｃフラグメントは、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む、請求項８１または８２に記載の免疫グロブリンタンパク質。
修飾は、ＦｃフラグメントにおけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項８３に記載の免疫グロブリンタンパク質。
配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１のＦｃフラグメント、および配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃフラグメントを含む、請求項８０～８４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
配列番号２のＨＣＶＲ、配列番号１０のＬＣＶＲおよび多量体化成分を含み、多量体化成分は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１のＦｃフラグメントおよび配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃフラグメントを含む、請求項７３～８５のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
配列番号２２のＨＣＶＲ、配列番号３０のＬＣＶＲおよび多量体化成分を含み、多量体化成分は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１のＦｃフラグメントおよび配列番号５８のアミノ酸配列を含む第２のＦｃフラグメントを含む、請求項７３～８５のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
免疫グロブリンタンパク質は、ＨＣＶＲおよび重鎖定常領域を含む重鎖、ならびにＬＣＶＲおよび軽鎖定常領域を含む軽鎖を含み、重鎖は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項７３～７９のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
重鎖定常領域は、修飾を欠く免疫グロブリンタンパク質と比較してプロテインＡへの免疫グロブリンタンパク質の結合を減少させるＣＨ３ドメインの修飾を含む、請求項８８に記載の免疫グロブリンタンパク質。
修飾は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの重鎖定常領域におけるＨ３１５Ｒ置換およびＹ３１６Ｆ置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項８９に記載の免疫グロブリンタンパク質。
重鎖は、配列番号４２および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８８～９０のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
軽鎖は、配列番号２０および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８８～９１のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
（ｉ）重鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉ）重鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む、請求項８８～９２のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
多量体化成分をさらに含む、請求項８８～９３のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
多量体化成分は、Ｆｃフラグメントを含む、請求項９４に記載の免疫グロブリンタンパク質。
Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項９６に記載の免疫グロブリンタンパク質。
Ｆｃフラグメントは、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項９５または９６に記載の免疫グロブリンタンパク質。
配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号４６のアミノ酸配列を含むＦｃフラグメントを含む、請求項８８～９７のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号４０のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号４６のアミノ酸配列を含むＦｃフラグメントを含む、請求項８８～９７のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＮＰＲ１アゴニストに特異的に結合する、請求項７３～９９のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＮＰＲ１アゴニストは、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１００に記載の免疫グロブリンタンパク質。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび配列番号５２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１０１に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＮＰＲ１アゴニストは、Ｒ５３８１である、請求項１００～１０２のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
ＲＥＧＮ９０３５またはＲＥＧＮ９０３７である、請求項７３～１０３のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質。
請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
請求項１０５に記載のポリヌクレオチド分子および／または請求項１０６に記載のポリヌクレオチド分子を含むベクター。
請求項１０７に記載のベクターを発現する宿主細胞。
ＣＨＯ細胞である、請求項１０８に記載の宿主細胞。
免疫グロブリンタンパク質を産生する方法であって、タンパク質の産生を可能にする条件下で請求項１０８に記載の宿主細胞を成長させること、およびこのように産生されたタンパク質を回収することを含む、方法。
宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１１０に記載の方法。
請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
ＮＰＲ１アゴニストの血行動態効果を反転させる方法であって、治療有効量の請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
ＮＰＲ１アゴニストの投与に関連する血行動態変化を反転させる方法であって、治療有効量の請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、筋肉内、または経口で対象に投与される、請求項１１３または１１４に記載の方法。
ＮＰＲ１アゴニストは、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１１３～１１５のいずれか１項に記載の方法。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび配列番号５２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１１６に記載の方法。
ＮＰＲ１アゴニストは、Ｒ５３８１である、請求項１１３～１１７のいずれか１項に記載の方法。
対象は、高血圧、心不全および慢性腎疾患からなる群から選択される疾患または障害を有する、請求項１１３～１１８のいずれか１項に記載の方法。
請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質との結合について競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質と同じエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
（ｉ）請求項７３～１０４のいずれか１項に記載の免疫グロブリンタンパク質；および（ｉｉ）ＮＰＲ１アゴニストを含む、組成物。
ＮＰＲ１アゴニストは、ＮＰＲ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１２２に記載の組成物。
抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲおよび配列番号５２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１２３に記載の組成物。
ＮＰＲ１アゴニストは、Ｒ５３８１である、請求項１２２～１２４のいずれか１項に記載の組成物。
それを必要とする対象における血圧の効果的な調節のための方法で使用するための、請求項１２２～１２５のいずれか１項に記載の組成物。
対象は、ＮＰＲ１関連疾患または障害を有する、請求項１２６に記載の組成物。
疾患または障害は、高血圧、心不全および慢性腎疾患からなる群から選択される、請求項１２７に記載の組成物。