JP2015227381A - ヒトプロテアーゼ活性化受容体−２に対する高親和性ヒト抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒトプロテアーゼ活性化受容体−２に対する高親和性ヒト抗体の提供。
【解決手段】本発明は、プロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）に結合する抗体およびそれらの使用方法を提供する。本発明の一定の実施形態によると、これらの抗体は、ヒトＰＡＲ−２に結合する完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、とりわけ、疼痛状態、炎症性状態および胃腸の状態の処置をはじめとする、１つ以上のＰＡＲ−２生物活性に関連した疾患および障害の処置に有用である。本発明は、患者におけるＰＡＲ−２活性に関連したまたは起因する疾患または障害を処置するための薬物の製造における、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体の抗原結合部分の使用も含む。
【選択図】図５

Description

本発明は、プロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ−２）に特異性のある抗体およびそれらの抗原結合フラグメントに関する。

プロテアーゼ活性化受容体（「ＰＡＲ」）は、７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体（ｓｅｖｅｎ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の１ファミリーである。７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体の中でも、ＰＡＲは、ユニークな活性化様式を有する；すなわち、ＰＡＲは、「テザーリガンド」としての役割を果たす新たなＮ末端ドメインを生成するようなアミノ末端でのタンパク質分解的切断によって活性化される。前記テザーリガンドが前記受容体の細胞外ループ−２と相互作用し、その結果、受容体活性化が生ずることとなる。現在、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４と称するＰＡＲファミリーの４メンバーが公知である。

ＰＡＲ−２は、「Ｃ１４０」とも呼ばれている（特許文献１）。ヒトＰＡＲ−２とマウスＰＡＲ−２の両方がプロテアーゼ切断ドメインＳＫＧＲＳＬＩＧ（配列番号：８５２の残基６〜１３、および配列番号：８５６の残基８〜１５）を共有する。この配列は、トリプシンなどの様々なプロテアーゼによって、ならびに肥満細胞トリプターゼ、組織因子／第ＶＩＩａ因子複合体および第Ｘａ因子、好中球プロテイナーゼ３（ＰＲ−３）、ヒト白血球エラスターゼ、および病原性生物起源のプロテアーゼによってＲ残基とＳ残基の間で切断される。

ＰＡＲ−２活性は、炎症性疾患、疼痛、胃腸の状態、神経疾患および心血管障害をはじめとする幾つかの疾患および状態に関係づけられている、または該疾患および状態と関連づけられている（例えば、非特許文献１Ｌｉｎｄｅｒら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６５０４−６５１０；非特許文献２Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：８２１−８２６；非特許文献３Ｃｅｎａｃら、２００７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１７：６３６−６４７；非特許文献４Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ、２００４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４１：１２６４−１２７４；非特許文献５Ｋｎｉｇｈｔら、２００１、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：７９７−８０３；非特許文献６Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５３１５−５３２１参照）。ＰＡＲ−２に結合する抗体は、ＰＡＲ−２の活性にｉｎ ｖｉｖｏで拮抗する可能性を有する。従って、抗ＰＡＲ−２抗体は、様々な疾患状態の処置および／または改善に潜在的に有用である。

ＰＡＲ−２に結合する抗体、およびそれらの一定の治療目的使用は、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５において述べられている。それでもなお、ＰＡＲ−２媒介疾患および状態を処置するために使用することができる、抗ＰＡＲ−２抗体をはじめとする、新規ＰＡＲ−２調節剤が、当該技術分野において依然として必要とされている。

米国特許第５，８７４，４００号明細書 米国特許第５，８７４，４００号明細書 米国特許出願公開第２００７／０２３７７５９号明細書 国際公開第２００９／００５７２６号 米国特許出願公開第２０１０／０１１９５０６号明細書

Ｌｉｎｄｅｒら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６５０４−６５１０ Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：８２１−８２６ Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ、２００４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４１：１２６４−１２７４ Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ、２００４、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４１：１２６４−１２７４ Ｋｎｉｇｈｔら、２００１、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０８：７９７−８０３ Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら、２００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５３１５−５３２１

本発明は、ヒトＰＡＲ−２に結合するヒト抗体を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、ＰＡＲ−２媒介シグナリングの阻害に、ならびにＰＡＲ−２活性化に起因するまたは関連した疾患および障害の処置に有用である。

本発明は、ＰＡＲ−２のＮ末端領域と相互作用し、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位（本明細書中で定義するとおり）でのタンパク質分解的切断を遮断するが、１つ以上の非活性化性プロテアーゼ切断部位でのタンパク質分解的切断を遮断しない抗体を含む。一定の実施形態によると、そのようなタンパク質分解的切断遮断特性を呈示する抗ＰＡＲ−２抗体は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の近位の特定のアミノ酸と相互作用する。例えば、本発明は、プロテアーゼ切断遮断活性を有する抗ＰＡＲ−２抗体であって、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）のＶａｌ−４２およびＡｓｐ−４３と相互作用するものであり、ならびにＳｅｒ−３７、Ｌｅｕ−３８、Ｉｌｅ−３９、Ｇｌｙ−４０およびＧｌｙ−４４から成る群より選択される１つ以上のヒトＰＡＲ−２残基とさらに相互作用することができるものである抗ＰＡＲ−２抗体を提供する。

他の実施形態によると、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、ヒトＰＡＲ−２およびサルＰＡＲ−２に特異的に結合するが、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびブタＰＡＲ−２から成る群より選択される少なくとも１つのメンバーには結合しない。本発明は、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化を阻害または減弱することができるが、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的切断を遮断しない抗体も含む。ＰＡＲ−２切断またはタンパク質分解的活性化を遮断する抗体の能力を測定する／評価するための例示的方法は、本明細書の中で説明する。

本発明の抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４抗体）である場合があり、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２もしくはｓｃＦｖフラグメント）しか含まないことがあり、および機能性に影響を及ぼすように、例えば残留エフェクター機能をなくすように、修飾されることがある（Ｒｅｄｄｙら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５−１９３３）。

本発明は、配列番号：２、１８、２２、２６、４２、４６、５０、６６、７０、７４、９０、９４、９８、１１４、１１８、１２２、１３８、１４２、１４６、１６２、１６６、１７０、１８６、１９０、１９４、２１０、２１４、２１８、２３４、２３８、２４２、２５８、２６２、２６６、２８２、２８６、２９０、３０６、３１０、３１４、３３０、３３４、３３８、３５４、３５８、３６２、３７８、３８２、３８６、４０２、４０６、４１０、４２６、４３０、４３４、４５０、４５４、４５８、４７４、４７８、４８２、４９８、５０２、５０６、５２２、５２６、５３０、５４６、５５０、５５４、５７０、５７４、５７８、５９４、５９８、６０２、６１８、６２２、６２６、６４２、６４６、６５０、６６６、６７０、６７４、６９０、６９４、６９８、７１４、７１８、７２２、７３８、７４２、７４６、７６２、７６６、７７０、７８６、７９０、７９４、８１０、８１４、８１８、８３４および８３８から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントを提供する。一定の実施形態によると、前記抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号：９８、１４６、３３８および７１４から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。

本発明は、配列番号：１０、２０、２４、３４、４４、４８、５８、６８、７２、８２、９２、９６、１０６、１１６、１２０、１３０、１４０、１４４、１５４、１６４、１６８、１７８、１８８、１９２、２０２、２１２、２１６、２２６、２３６、２４０、２５０、２６０、２６４、２７４、２８４、２８８、２９８、３０８、３１２、３２２、３３２、３３６、３４６、３５６、３６０、３７０、３８０、３８４、３９４、４０４、４０８、４１８、４２８、４３２、４４２、４５２、４５６、４６６、４７６、４８０、４９０、５００、５０４、５１４、５２４、５２８、５３８、５４８、５５２、５６２、５７２、５７６、５８６、５９６、６００、６１０、６２０、６２４、６３４、６４４、６４８、６５８、６６８、６７２、６８２、６９２、６９６、７０６、７１６、７２０、７３０、７４０、７４４、７５４、７６４、７６８、７７８、７８８、７９２、８０２、８１２、８１６、８２６、８３６および８４０から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。一定の実施形態によると、前記抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号：１０６、１５４、３４６および６９２から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。

本発明は、配列番号：２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、５０２／５０４、５０６／５１４、５２２／５２４、５２６／５２８、５３０／５３８、５４６／５４８、５５０／５５２、５５４／５６２、５７０／５７２、５７４／５７６、５７８／５８６、５９４／５９６、５９８／６００、６０２／６１０、６１８／６２０、６２２／６２４、６２６／６３４、６４２／６４４、６４６／６４８、６５０／６５８、６６６／６６８、６７０／６７２、６７４／６８２、６９０／６９２、６９４／６９６、６９８／７０６、７１４／７１６、７１４／６９２、７１８／７２０、７２２／７３０、７３８／７４０、７４２／７４４、７４６／７５４、７６２／７６４、７６６／７６８、７７０／７７８、７８６／７８８、７９０／７９２、７９４／８０２、８１０／８１２、８１４／８１６、８１８／８２６、８３４／８３６および８３８／８４０から成る群より選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列ペアを含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。一定の実施形態によると、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号：９８／１０６、１４６／１５４、３３８／３４６および７１４／６９２のアミノ酸配列ペアから選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。

本発明は、配列番号：８、３２、５６、８０、１０４、１２８、１５２、１７６、２００、２２４、２４８、２７２、２９６、３２０、３４４、３６８、３９２、４１６、４４０、４６４、４８８、５１２、５３６、５６０、５８４、６０８、６３２、６５６、６８０、７０４、７２８、７５２、７７６、８００および８２４から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメインと；配列番号：１６、４０、６４、８８、１１２、１３６、１６０、１８４、２０８、２３２、２５６、２８０、３０４、３２８、３５２、３７６、４００、４２４、４４８、４７２、４９６、５２０、５４４、５６８、５９２、６１６、６４０、６６４、６８８、７１２、７３６、７６０、７８４、８０８および８３２から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインとを含む、抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。

一定の実施形態において、前記抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号：８／１６、３２／４０、５６／６４、８０／８８、１０４／１１２、１２８／１３６、１５２／１６０、１７６／１８４、２００／２０８、２２４／２３２、２４８／２５６、２７２／２８０、２９６／３０４、３２０／３２８、３４４／３５２、３６８／３７６、３９２／４００、４１６／４２４、４４０／４４８、４６４／４７２、４８８／４９６、５１２／５２０、５３６／５４４、５６０／５６８、５８４／５９２、６０８／６１６、６３２／６４０、６５６／６６４、６８０／６８８、７０４／７１２、７２８／７３６、７５２／７６０、７７６／７８４、８００／８０８および８２４／８３２から成る群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。一定の実施形態によると、前記抗体または抗体の抗原結合部分は、配列番号：１０４／１１２、１５２／１６０、３４４／３５２および７０４／７１２から成る群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む。これらのＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３ペアを有する抗ＰＡＲ−２抗体の非限定的な例は、それぞれＨ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１Ｎ、Ｈ４Ｈ６１８ＮおよびＨ４Ｈ５８１Ｐと称する抗体である。

本発明は、配列番号：４、２８、５２、７６、１００、１２４、１４８、１７２、１９６、２２０、２４４、２６８、２９２、３１６、３４０、３６４、３８８、４１２、４３６、４６０、４８４、５０８、５３２、５５６、５８０、６０４、６２８、６５２、６７６、７００、７２４、７４８、７７２、７９６および８２０から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメインと；配列番号：６、３０、５４、７８、１０２、１２６、１５０、１７４、１９８、２２２、２４６、２７０、２９４、３１８、３４２、３６６、３９０、４１４、４３８、４６２、４８６、５１０、５３４、５５８、５８２、６０６、６３０、６５４、６７８、７０２、７２６、７５０、７７４、７９８および８２２から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメインと；配列番号：１２、３６、６０、８４、１０８、１３２、１５６、１８０、２０４、２２８、２５２、２７６、３００、３２４、３４８、３７２、３９６、４２０、４４４、４６８、４９２、５１６、５４０、５６４、５８８、６１２、６３６、６６０、６８４、７０８、７３２、７５６、７８０、８０４および８２８から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメインと；配列番号：１４、３８、６２、８６、１１０、１３４、１５８、１８２、２０６、２３０、２５４、２７８、３０２、３２６、３５０、３７４、３９８、４２２、４４６、４７０、４９４、５１８、５４２、５６６、５９０、６１４、６３８、６６２、６８６、７１０、７３４、７５８、７８２、８０６および８３０から成る群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列、を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインとをさらに含む、抗体またはそのフラグメントも提供する。

本発明の一定の非限定的、例示的抗体および抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号：１００、１０２、１０４、１０８、１１０および１１２（例えば、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ）；（ｉｉ）配列番号：１４８、１５０、１５２、１５６、１５８および１６０（例えば、Ｈ４Ｈ５９１Ｎ）；（ｉｉｉ）配列番号：３４０、３４２、３４４、３４８、３５０および３５２（例えば、Ｈ４Ｈ６１８Ｎ）；ならびに（ｉｖ）配列番号：７００、７０２、７０４、７０８、７１０および７１２（例えば、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ）から成る群よりそれぞれ選択される、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ドメインを含む。これらの例示的ＣＤＲのアミノ酸配列を図２および３に描写する。

関連実施形態において、本発明は、ＰＡＲ−２を特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、配列番号：２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、５０２／５０４、５０６／５１４、５２２／５２４、５２６／５２８、５３０／５３８、５４６／５４８、５５０／５５２、５５４／５６２、５７０／５７２、５７４／５７６、５７８／５８６、５９４／５９６、５９８／６００、６０２／６１０、６１８／６２０、６２２／６２４、６２６／６３４、６４２／６４４、６４６／６４８、６５０／６５８、６６６／６６８、６７０／６７２、６７４／６８２、６９０／６９２、６９４／６９６、６９８／７０６、７１４／７１６、７１４／６９２、７１８／７２０、７２２／７３０、７３８／７４０、７４２／７４４、７４６／７５４、７６２／７６４、７６６／７６８、７７０／７７８、７８６／７８８、７９０／７９２、７９４／８０２、８１０／８１２、８１４／８１６、８１８／８２６、８３４／８３６および８３８／８４０から成る群より選択される重および軽鎖配列内に含有される重および軽鎖ＣＤＲドメインを含むものである抗体またはフラグメントを含む。一定の実施形態によると、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号：９８／１０６、１４６／１５４、３３８／３４６および７１４／６９２のアミノ酸配列ペアから選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ内に含有されるＣＤＲ配列を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は当該技術分野において周知であり、ならびに本明細書に開示する指定ＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するためにそれらを用いることができる。ＣＤＲの境界を同定するために用いることができる例示的規約としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般論として、Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づき、およびＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチの折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために公共データベースを利用することもできる。

もう１つの態様において、本発明は、抗ＰＡＲ−２抗体またはそれらのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を担持する組換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞も本発明に包含され、該抗体の生産を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、生産された抗体を回収することによる、該抗体の生産方法も包含される。

１つの実施形態において、本発明は、配列番号：１、１７、２１、２５、４１、４５、４９、６５、６９、７３、８９、９３、９７、１１３、１１７、１２１、１３７、１４１、１４５、１６１、１６５、１６９、１８５、１８９、１９３、２０９、２１３、２１７、２３３、２３７、２４１、２５７、２６１、２６５、２８１、２８５、２８９、３０５、３０９、３１３、３２９、３３３、３３７、３５３、３５７、３６１、３７７、３８１、３８５、４０１、４０５、４０９、４２５、４２９、４３３、４４９、４５３、４５７、４７３、４７７、４８１、４９７、５０１、５０５、５２１、５２５、５２９、５４５、５４９、５５３、５６９、５７３、５７７、５９３、５９７、６０１、６１７、６２１、６２５、６４１、６４５、６４９、６６５、６６９、６７３、６８９、６９３、６９７、７１３、７１７、７２１、７３７、７４１、７４５、７６１、７６５、７６９、７８５、７８９、７９３、８０９、８１３、８１７、８３３および８３７から成る群より選択される核酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＨＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。一定の実施形態によると、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号：９７、１４５、３３７および７１３から成る群より選択される核酸によってコードされたＨＣＶＲを含む。

本発明は、配列番号：９、１９、２３、３３、４３、４７、５７、６７、７１、８１、９１、９５、１０５、１１５、１１９、１２９、１３９、１４３、１５３、１６３、１６７、１７７、１８７、１９１、２０１、２１１、２１５、２２５、２３５、２３９、２４９、２５９、２６３、２７３、２８３、２８７、２９７、３０７、３１１、３２１、３３１、３３５、３４５、３５５、３５９、３６９、３７９、３８３、３９３、４０３、４０７、４１７、４２７、４３１、４４１、４５１、４５５、４６５、４７５、４７９、４８９、４９９、５０３、５１３、５２３、５２７、５３７、５４７、５５１、５６１、５７１、５７５、５８５、５９５、５９９、６０９、６１９、６２３、６３３、６４３、６４７、６５７、６６７、６７１、６８１、６９１、６９５、７０５、７１５、７１９、７２９、７３９、７４３、７５３、７６３、７６７、７７７、７８７、７９１、８０１、８１１、８１５、８２５、８３５および８３９から成る群より選択される核酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＬＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントも提供する。一定の実施形態によると、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号：１０５、１５３、３４５および７１５から成る群より選択される核酸によってコードされたＬＣＶＲを含む。

本発明は、配列番号：７、３１、５５、７９、１０３、１２７、１５１、１７５、１９９、２２３、２４７、２７１、２９５、３１９、３４３、３６７、３９１、４１５、４３９、４６３、４８７、５１１、５３５、５５９、５８３、６０７、６３１、６５５、６７９、７０３、７２７、７５１、７７５、７９９および８２３から成る群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＨＣＤＲ３ドメインと；配列番号：１５、３９、６３、８７、１１１、１３５、１５９、１８３、２０７、２３１、２５５、２７９、３０３、３２７、３５１、３７５、３９９、４２３、４４７、４７１、４９５、５１９、５４３、５６７、５９１、６１５、６３９、６６３、６８７、７１１、７３５、７５９、７８３、８０７および８３１から成る群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＬＣＤＲ３ドメインとを含む抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。一定の実施形態によると、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号：１０３／１１１、１５１／１５９、３４３／３５１および７０３／７１１から成る群より選択される核酸配列ペアによってコードされたＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３配列を含む。

本発明は、配列番号：３、２７、５１、７５、９９、１２３、１４７、１７１、１９５、２１９、２４３、２６７、２９１、３１５、３３９、３６３、３８７、４１１、４３５、４５９、４８３、５０７、５３１、５５５、５７９、６０３、６２７、６５１、６７５、６９９、７２３、７４７、７７１、７９５および８１９から成る群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＨＣＤＲ１ドメインと；配列番号：５、２９、５３、７７、１０１、１２５、１４９、１７３、１９７、２２１、２４５、２６９、２９３、３１７、３４１、３６５、３８９、４１３、４３７、４６１、４８５、５０９、５３３、５５７、５８１、６０５、６２９、６５３、６７７、７０１、７２５、７４９、７７３、７９７および８２１から成る群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＨＣＤＲ２ドメインと；配列番号：１１、３５、５９、８３、１０７、１３１、１５５、１７９、２０３、２２７、２５１、２７５、２９９、３２３、３４７、３７１、３９５、４１９、４４３、４６７、４９１、５１５、５３９、５６３、５８７、６１１、６３５、６５９、６８３、７０７、７３１、７５５、７７９、８０３および８２７から成る群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＬＣＤＲ１ドメインと；配列番号：１３、３７、６１、８５、１０９、１３３、１５７、１８１、２０５、２２９、２５３、２７７、３０１、３２５、３４９、３７３、３９７、４２１、４４５、４６９、４９３、５１７、５４１、５６５、５８９、６１３、６３７、６６１、６８５、７０９、７３３、７５７、７８１、８０５、８２９から成る群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列、によってコードされたＬＣＤＲ２ドメインとをさらに含む、抗体またはそのフラグメントも提供する。

一定の実施形態によると、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号：９７および１０５；配列番号：１４５および１５３；配列番号：３３７および３４５；または配列番号：７１３および７１５の核酸配列によってコードされた重および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

本発明は、ＰＡＲ−２を特異的に結合する単離された抗体または抗体の抗原結合フラグメントであって、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３を含み、該ＨＣＤＲ３が、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９−Ｘ^１０−Ｘ^１１−Ｘ^１２のアミノ酸配列（配列番号：８４３）（この式中、Ｘ^１は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘ^２は、Ｌｙｓであり、Ｘ^３は、ＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ^４は、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｘ^５は、ＰｈｅまたはＡｓｐであり、Ｘ^６は、ＴｒｐまたはＳｅｒ、Ｘ^７は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり、Ｘ^８は、ＧｌｙまたはＴｙｒであり、Ｘ^９は、ＴｙｒまたはＡｓｐであり、Ｘ^１０は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ^１１は、ＡｓｐまたはＡｌａであり、Ｘ^１２は、Ｔｙｒである）を含み；およびに該ＬＣＤＲ３が、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９のアミノ酸配列（配列番号：８４６）（この式中、Ｘ^１は、ＭｅｔまたはＧｌｎであり、Ｘ^２は、Ｇｌｎであり、Ｘ^３は、ＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ^４は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘ^５は、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＩｌｅであり、Ｘ^６は、ＰｈｅまたはＳｅｒであり、Ｘ^７は、Ｐｒｏであり、Ｘ^８は、ＴｈｒまたはＬｅｕであり、およびＸ^９は、Ｔｈｒであるか不在である）を含むものである、単離された抗体または抗体の抗原結合フラグメントも提供する。

より特定的な実施形態において、本発明は、ＰＡＲ−２を特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントであって、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８のＨＣＤＲ１配列（配列番号：８４１）（この式中、Ｘ^１は、Ｇｌｙであり、Ｘ^２は、Ｐｈｅであり、Ｘ^３は、Ｔｈｒであり、Ｘ^４は、Ｐｈｅであり、Ｘ^５は、ＳｅｒまたはＡｒｇであり、Ｘ^６は、ＳｅｒまたはＡｒｇであり、Ｘ^７は、Ｔｙｒであり、およびＸ^８は、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒである）と、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８のＨＣＤＲ２配列（配列番号：８４２）（この式中、Ｘ^１は、Ｉｌｅであり、Ｘ^２は、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、Ｘ^３は、Ｔｙｒ、ＧｌｙまたはＡｓｐであり、Ｘ^４は、Ａｓｐ、ＧｌｙまたはＳｅｒであり、Ｘ^５は、ＧｌｙまたはＡｒｇであり、Ｘ^６は、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＡｌａであり、Ｘ^７は、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙであり、およびＸ^８は、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＴｈｒである）と、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９−Ｘ^１０−Ｘ^１１−Ｘ^１２のＨＣＤＲ３配列（配列番号：８４３）（この式中、Ｘ^１は、ＡｌａまたはＶａｌであり、Ｘ^２は、Ｌｙｓであり、Ｘ^３は、ＧｌｙまたはＧｌｕであり、Ｘ^４は、ＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｘ^５は、ＰｈｅまたはＡｓｐであり、Ｘ^６は、ＴｒｐまたはＳｅｒであり、Ｘ^７は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり、Ｘ^８は、ＧｌｙまたはＴｙｒであり、Ｘ^９は、ＴｙｒまたはＡｓｐであり、Ｘ^１０は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘ^１１は、ＡｓｐまたはＡｌａ、およびＸ^１２は、Ｔｙｒである）と、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９−Ｘ^１０−Ｘ^１１のＬＣＤＲ１配列（配列番号：８４４）（この式中、Ｘ^１は、Ｇｌｎであり、Ｘ^２は、ＳｅｒまたはＧｌｙであり、Ｘ^３は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｘ^４は、ＶａｌまたはＳｅｒであり、Ｘ^５は、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＴｈｒであり、Ｘ^６は、Ｓｅｒ、ＡｓｎまたはＴｙｒであり、Ｘ^７は、Ａｓｐであるか不在であり；Ｘ^８は、Ｇｌｙであるか不在であり、Ｘ^９は、Ａｓｎであるか不在であり、Ｘ^１０は、Ｔｈｒであるか不在であり、およびＸ^１１は、Ｔｙｒであるか不在である）と、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３のＬＣＤＲ２配列（配列番号：８４５）（この式中、Ｘ^１は、ＬｙｓまたはＡｌａであり、Ｘ^２は、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＴｈｒであり、およびＸ^３は、Ｓｅｒである）とを含み；ならびにＬＣＤＲ３が、式Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−Ｘ^５−Ｘ^６−Ｘ^７−Ｘ^８−Ｘ^９のアミノ酸配列（配列番号：８４６）（この式中、Ｘ^１は、ＭｅｔまたはＧｌｎであり、Ｘ^２は、Ｇｌｎであり、Ｘ^３は、ＡｌａまたはＴｙｒであり、Ｘ^４は、ＴｈｒまたはＬｙｓであり、Ｘ^５は、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＩｌｅであり、Ｘ^６は、ＰｈｅまたはＳｅｒであり、Ｘ^７は、Ｐｒｏであり、Ｘ^８は、ＴｈｒまたはＬｅｕであり、およびＸ^９は、Ｔｈｒであるか不在である）を含むものである、単離された抗体またはそのフラグメントを特徴とする。

本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＰＡＲ−２抗体を包含する。一部の用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾は有用であり得る、つまり、例えば抗体依存性細胞傷害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）機能を増加させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠く抗体は有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２）ＪＢＣ
２７７：２６７３３参照）。他の用途では、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を修飾するためにガラクトシル化の修飾を行う場合がある。

もう１つの態様において、本発明は、ＰＡＲ−２を特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントと薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を提供する。関連態様において、本発明は、ＰＡＲ−２阻害剤と第二の治療薬との組み合わせである組成物を特徴とする。１つの実施形態において、前記ＰＡＲ−２阻害剤は、抗体またはそのフラグメントである。１つの実施形態において、前記第二の治療薬は、ＰＡＲ−２阻害剤と有利に併用される任意の薬剤である。ＰＡＲ−２阻害剤と有利に併用することができる例示的薬剤としては、限定ではないが、ＰＡＲ−２活性を阻害する他の薬剤（他の抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニストなど）、および／またはＰＡＲ−２上流もしくは下流シグナリングに干渉する薬剤が挙げられる。

さらにもう１つの態様において、本発明は、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体の抗原結合部分を使用してＰＡＲ−２活性を阻害する方法であって、本発明の抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含むものである治療方法を提供する。処置される障害は、ＰＡＲ−２抗体の除去、阻害または低減によって向上、改善、阻害または予防される任意の疾患または状態である。本発明の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体フラグメントは、ＰＡＲ−２とプロテアーゼ（例えば、トリプシンもしくはトリプシン様セリンプロテアーゼ）との相互作用を遮断するように、でなければＰＡＲ−２のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するように、作用することができる。あるいは、または加えて、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、ＰＡＲ−２テザーリガンドと１つ以上のＰＡＲ−２細胞外ループとの相互作用に干渉することができる（ＰＡＲ−２タンパク質分解的切断および活性化の一般的な論考については、例えばＭａｃＦａｒｌａｎｅら、２００１、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５３：２４５−２８２を参照のこと）。前記抗体または抗体フラグメントは、単独で使用することができ、または１つ以上の追加の治療薬と併用することができる。

本発明は、患者におけるＰＡＲ−２活性に関連したまたは起因する疾患または障害を処置するための薬物の製造における、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体の抗原結合部分の使用も含む。

他の実施形態は、後続の詳細な説明の再考から明らかになるであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）に特異的に結合し、ヒトＰＡＲ−２のＶａｌ−４２およびＡｓｐ−４３と相互作用する、単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
ヒトＰＡＲ−２のＳｅｒ−３７、Ｌｅｕ−３８、Ｉｌｅ−３９、Ｇｌｙ−４０およびＧｌｙ−４４から成る群より選択される１つ以上の残基とも相互作用する、項目１に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目３）
ヒトＰＡＲ−２のＬｙｓ−４１と相互作用しない、項目１または２に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目４）
ヒトＰＡＲ−２のＳｅｒ−３７、Ｌｅｕ−３８、Ｉｌｅ−３９、Ｇｌｙ−４０、Ｖａｌ−４２及びＡｓｐ−４３と相互作用するが、ヒトＰＡＲ−２のＬｙｓ−４１とは相互作用しない、項目１〜３のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目５）
配列番号：９８／１０６および配列番号：７１４／６９２から成る群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目６）
（ａ）配列番号：１００−１０２−１０４／１０８−１１０−１１２；および（ｂ）配列番号：７００−７０２−７０４／７０８−７１０−７１２から成る群より選択されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、項目５に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目７）
ヒトＰＡＲ−２の残基Ａｒｇ−３６およびＳｅｒ−３７の接合点に位置する活性化性切断部位でのヒトＰＡＲ−２のトリプシン切断を遮断する、項目１〜６のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目８）
ヒトＰＡＲ−２の残基Ａｒｇ−３１およびＳｅｒ−３２の接合点に位置する非活性化性切断部位ならびにヒトＰＡＲ−２の残基Ｌｙｓ−３４およびＧｌｙ−３５の接合点に位置する非活性化性切断部位から選択される１つ以上の非活性化性切断部位でのヒトＰＡＲ−２のトリプシン切断を遮断しない、項目７に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目９）
ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）に特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＰＡＲ−２のＳｅｒ−３７、Ｌｅｕ−３８、Ｉｌｅ−３９、Ｇｌｙ−４０、Ｖａｌ−４２およびＡｓｐ−４３と相互作用するが、ヒトＰＡＲ−２のＬｙｓ−４１とは相互作用しないものであり、そしてヒトＰＡＲ−２の残基Ａｒｇ−３６およびＳｅｒ−３７の接合点に位置する活性化性切断部位でのヒトＰＡＲ−２のトリプシン切断を遮断するが、ヒトＰＡＲ−２の残基Ａｒｇ−３１およびＳｅｒ−３２の接合点に位置する非活性化性切断部位でのヒトＰＡＲ−２のトリプシン切断を遮断しないものである、単離されたヒト抗体または抗原結合フラグメント。
（項目１０）
（ａ）配列番号：７１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号：６９２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含む抗体；および（ｂ）配列番号：９８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、配列番号：１０６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む抗体から成る群より選択される基準抗体と、ヒトＰＡＲ−２上の同じエピトープに結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントと薬学的に許容され得る担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
（項目１２）
ＰＡＲ−２活性に起因する疾患または障害の１つ以上の症状または徴候を呈示する患者に項目１１に記載の医薬組成物を投与することを含む治療方法。
（項目１３）
ＰＡＲ−２活性に起因する上記疾患または障害が、疼痛、そう痒、喘息、関節リウマチ、線維症、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、潰瘍、クローン病、癌およびネザートン病から成る群より選択される、項目１２に記載の治療方法。
（項目１４）
ＩＬ−１阻害剤、ＩＬ−１８阻害剤、ＩＬ−４阻害剤、ＩＬ−４受容体阻害剤、ＩＬ−６阻害剤、ＩＬ−６受容体阻害剤、神経成長因子（ＮＧＦ）阻害剤、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害剤、ＴＮＦ受容体阻害剤、尿酸合成阻害剤およびコルチコステロイドから成る群より選択される少なくとも１つのさらなる治療活性成分を上記患者に投与することをさらに含む、項目１２または１３に記載の治療方法。
（項目１５）
疼痛、そう痒、喘息、関節リウマチ、線維症、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、潰瘍、クローン病、癌およびネザートン病から成る群より選択される疾患または障害である、ＰＡＲ−２活性に起因する疾患または障害のうちの１つ以上の症状または徴候を呈示する患者の処置に使用するための、項目１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体もしくは抗原結合フラグメント、または項目１１に記載の医薬組成物。
（項目１６）
疼痛、そう痒、喘息、関節リウマチ、線維症、アトピー性皮膚炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、膵炎、潰瘍、クローン病、癌およびネザートン病から成る群より選択される疾患または障害である、ＰＡＲ−２活性に起因する疾患または障害のうちの１つ以上の症状または徴候を呈示する患者の処置に使用するための薬物の製造における、項目１〜１０のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または項目１１に記載の医薬組成物の使用。

図１は、抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮおよびＨ４Ｈ６１８Ｎの重鎖可変領域およびＣＤＲの配列比較表である。 図２は、抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮおよびＨ４Ｈ６１８Ｎの軽鎖可変領域およびＣＤＲの配列比較表である。 図３における上のパネル（Ａ）は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を取り囲む配列（ＧＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬＩＧＫＶＤＧＴ；配列番号：８５２）に対応するＣおよびＮ末端ビオチン標識ペプチドを示す。これらのプロテアーゼ切断部位を番号１（上流、非活性化性プロテアーゼ切断部位）および番号２（ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位）によって表す。非切断および切断フラグメントの予想サイズを上の表に示す。下のパネル（Ｂ）は、抗ＰＡＲ−２抗体または陰性対照の存在下での０、５および１５分のトリプシン処理後に観察されたフラグメントサイズを示す。 図４における上のパネル（Ａ）は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を取り囲む配列（それぞれ、配列番号：８８３、８５８および８５２）に対応するマウス、ラットおよびヒトペプチドを示す。これらのプロテアーゼ切断部位を番号１および２（上流、非活性化性プロテアーゼ切断部位）ならびに番号３（ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位）によって表す。非切断および切断フラグメントの予想サイズを上の表に示す。下のパネル（Ｂ）は、抗ＰＡＲ−２抗体または陰性対照の存在下での０および５分のトリプシン処理後に観察されたフラグメントサイズを示す。 図５は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を取り囲む配列（配列番号：８５２）に結合する抗体についてのアラニン・スキャニング・エピトープ・マッピング結果の描写である。白三角は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の上流に位置するプロテアーゼ切断部位を表す。ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を黒三角によって示す。括弧内の数字は、完全長ヒトＰＡＲ−２配列（配列番号：８５１）内のアミノ酸番号付けを示す。アミノ酸残基の下の丸の中の番号は、表２４〜２６および２８に示すとおりの、野生型ペプチドへの抗体結合のＴ１／２に対するアラニンスキャン突然変異体ペプチドへの抗体結合のＴ１／２のパーセントを示す。二重反復実験を行った場合、平均Ｔ１／２百分率を丸の中に示す。白い数字を伴う黒丸は、アラニンに変えたときに抗体結合のＴ１／２を野生型ペプチドへの抗体結合のＴ１／２の３０％以下に低下させるアミノ酸を示す。そのようなアミノ酸を、本明細書では、抗体が相互作用する残基と定義する。

本発明を説明する前に、本発明が、記載する特定の方法および実験条件に限定されないことを理解しなければならない。そのような方法および条件は様々であり得るからである。本明細書において用いる専門用語が、特定の実施形態の説明のみを目的とするものであること、および本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるので、限定を意図したものでないことも理解しなければならない。

別の定義がない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において用いる場合、用語「約」は、個々に列挙する数値に関して用いるとき、その数値が列挙されている値から１％以下変動することがあることを意味する。例えば、本明細書において用いる場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびに間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書に記載するものに類似したまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験の際に用いることができるが、好ましい方法および材料を、今般、説明する。

定義
本明細書において用いる場合、用語「プロテイナーゼ活性化受容体−２」、「プロテアーゼ活性化受容体−２」および「ＰＡＲ−２」は、完全長ＰＡＲ−２タンパク質を指す。ヒトＰＡＲ−２は、配列番号：８５０に示す核酸配列によってコードされ、配列番号：８５１のアミノ酸配列を有する。非ヒト種（例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、ブタなど）からのＰＡＲ−２分子のアミノ酸配列もパブリックソースから入手できる。

用語「ＰＡＲ−２フラグメント」は、本明細書において用いる場合、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位（下で定義するとおり）の上流（すなわち、Ｎ末端側）に位置する４、５、６、７、８、９、１０以上の隣接アミノ酸および／またはＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流（すなわち、Ｃ末端側）に位置する４、５、６、７、８、９、１０以上の隣接アミノ酸を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。例示的ＰＡＲ−２フラグメント（Ｐｅｐｔｉｄｅ「Ａ」から「Ｊ」と呼ぶ、すなわち、それぞれ配列番号：８５２から８６１）は、実施例２、表２において例証する。

「ＰＡＲ−２」および「ＰＡＲ−２フラグメント」という表現は、本明細書において用いる場合、非ヒト種からである（例えば、「マウスＰＡＲ−２」、「マウスＰＡＲ−２フラグメント」、「サルＰＡＲ−２」、「サルＰＡＲ−２フラグメント」など）と指定されていない限り、ヒトＰＡＲ−２タンパク質またはフラグメントを指す。

本開示の文脈の中で用いる場合、「ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位」という表現は、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）の残基Ａｒｇ−３６およびＳｅｒ−３７の接合点を意味する。ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位は、切断されたとき、天然に産生されるタンパク質中のＰＡＲ−２テザーリガンドが形成される結果となる部位である。

用語「ＰＡＲ−２プロテアーゼ」は、本明細書において用いる場合、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位でＰＡＲ−２またはＰＡＲ−２フラグメントを切断することができる酵素を意味する。例示的ＰＡＲ−２プロテアーゼとしては、トリプシン、カテプシンＧ、アクロシン、組織第ＶＩＩａ因子、組織第Ｘａ因子、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ、トリプターゼ、膜結合型セリンプロテアーゼ１（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ−１）（ＭＴ−ＳＰ１）、ＴＭＰＲＳＳ２、プロテアーゼ−３、エラスターゼ、カリクレイン−５、カリクレイン−６、カリクレイン−１４、活性化プロテインＣ、デュオデナーゼ、ギンギパイン−Ｒ、Ｄｅｒ ｐ１、Ｄｅｒ ｐ３、Ｄｅｒ ｐ９、サーモライシン、セラリシン、およびＴ．ｄｅｎｔｉｃｌａプロテアーゼが挙げられる。

用語「抗体」は、本明細書において用いる場合、ジスルフィド結合によって相互に連結されている４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖、を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を指すことを意図したものである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、より保存される領域［フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる］が散在する超可変性領域［相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる］にさらに細分することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の種々の実施形態において、抗Ａｎｇ−２抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であることがあり、または天然にもしくは人工的に修飾されていることがある。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイド・バイ・サイド分析に基づいて定義することができる。

用語「抗体」は、本明細書において用いる場合、完全抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合」フラグメント、およびこれらに類する用語は、本明細書において用いる場合、抗原を特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に産生される、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質分解的消化、または抗体可変および場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術などの、任意の適する標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは、公知であり、および／または例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手することができ、または合成することができる。前記ＤＮＡをシークエンシングし、化学的にまたは分子生物学技術を用いて操作して、例えば、１つ以上の可変および／もしくは定常ドメインを適する配置に配列すること、またはコドンを導入すること、またはシステイン残基を作ること、アミノ酸を修飾する、付加させるもしくは欠失させることなどができる。

抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が挙げられる。遺伝子工学で作られる他の分子、例えば、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーも、本明細書において用いる「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。

抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメインを概して含むであろう。前記可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってよく、１つ以上のフレームワーク配列に隣接する、または１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである、少なくとも１つのＣＤＲを一般に含む。Ｖ_Ｌドメインと会合したＶ_Ｈドメインを有する抗原結合フラグメントの場合、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、互いに対していずれの適する布置に置かれていてもよい。例えば、可変領域は、二量体であり、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｌ二量体を含有することがある。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを含有することがある。

一定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有することがある。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見いだすことができる可変および定常ドメインの非限定的、例示的配置としては、（ｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１；（ｉｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ２；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ３；（ｉｖ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２；（ｖ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；（ｖｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ−Ｃ_Ｌ；（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ１；（ｉｘ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ２；（ｘ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ３；（ｘｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２；（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３；および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ−Ｃ_Ｌが挙げられる。上に列挙した例示的配置のいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変および定常ドメインは、互いに直接連結していることがあり、または完全もしくは部分ヒンジもしくはリンカー領域によって連結されていることがある。ヒンジ領域は、少なくとも２（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上）のアミノ酸から成り得、これらのアミノ酸が、単一ポリペプチド分子内の隣接する可変および／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結を生じさせる結果となる。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いにおよび／または１つ以上の単量体Ｖ_ＨもしくはＶ_Ｌドメインと（例えば、ジスルフィド結合（単数または複数）により）の非共有結合的に会合している状態で、上に列挙した可変および定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことがある。

完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性であることがあり、または多重特異性（例えば、二重特異性）であることもある。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、各ドメインが別の抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる、少なくとも２つの異なる可変ドメインを概して含むだろう。本明細書に開示する例示的二重特異性抗体フォーマットを含めて、任意の多重特異性抗体フォーマットが、当該技術分野において利用可能な常例的な技術を用いて本発明の抗体の抗原結合フラグメントに関連して使用することに適しているだろう。

抗体の定常領域は、補体を固定するおよび細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力に重要である。従って、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて、抗体のアイソタイプを選択することができる。

用語「ヒト抗体」は、本明細書において用いる場合、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図したものである。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでランダムまたは部位特異的突然変異誘発によりまたはｉｎ
ｖｉｖｏで体性突然変異により導入される突然変異）を、例えばＣＤＲ内におよび特定のＣＤＲ３内に、含むことがある。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において用いる場合、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列にグラフトさせた抗体を含むことを意図したものではない。

用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において用いる場合、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（下でさらに説明する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（下でさらに説明する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の技術によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体を含むことを意図したものである。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、一定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物を使用するときにはｉｎ ｖｉｖｏ体性突然変異誘発）に付されるので、それらの組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連している配列であるが、ｉｎ ｖｉｖｏヒト抗体生殖細胞系レパートリーの中に天然に存在し得ない配列である。

ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連づけられる２つの形態で存在する場合がある。一方の形態での免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている、おおよそ１５０〜１６０ｋＤａの安定した４本鎖構築物を含む。第二の形態では、二量体が鎖間ジスルフィド結合によって連結されず、共有結合によりカップリングされた軽および重鎖から成る約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、アフィニティー精製後でさえ、分離することが極めて難しい。

様々なインタクトＩｇＧアイソタイプにおける前記第二の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連した構造の相違によるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、前記第二の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルへと、有意に低減することができる（Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０：１０５）。本発明は、例えば、生産の際、所望の抗体形態の収率を向上させるために望ましいことがあるヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１つ以上の突然変異を有する抗体を包含する。

「単離された抗体」は、本明細書において用いる場合、その天然の環境の少なくとも１つの成分から同定された、および分離された、および／または回収された抗体を意味する。例えば、その抗体が天然に存在するまたは天然に生産される生物、組織または細胞の少なくとも１つの成分から分離または除去された抗体は、本発明のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞の中のｉｎ ｓｉｔｕでの抗体、ならびに少なくとも１つの精製または単離工程に付された抗体も含む。一定の実施形態によると、単離された抗体には他の細胞物質および／または化学物質が実質的にないことがある。

用語「特異的に結合する」またはこれに類するものは、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生理条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、１×１０^−６Ｍ以下の解離定数によって特徴づけることができる。２つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析法、表面プラズモン共鳴およびこれらに類するものを含む。例えば、ヒトＰＡＲ−２を「特異的に結合する」抗体は、本発明に関連して用いる場合、表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、ヒトＰＡＲ−２またはその一部分（例えば、活性化性プロテアーゼ切断部位を含むＰＡＲ−２フラグメント）を約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満のＫ_Ｄで結合する抗体を含む。（例えば、本明細書の実施例４参照）。しかし、ヒトＰＡＲ−２を特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＰＡＲ−２分子などの、他の抗原への交差反応性を有することがある。

「中和」または「遮断」抗体は、本明細書において用いる場合、ＰＡＲ−２への結合が、（ｉ）ＰＡＲ−２もしくはＰＡＲ−２フラグメントと１つ以上のプロテアーゼとの相互作用に干渉する、（ｉｉ）ＰＡＲ−２プロテアーゼによるＰＡＲ−２もしくはＰＡＲ−２フラグメントの切断を防止する；（ｉｉｉ）ＰＡＲ−２テザーリガンドとＰＡＲ−２細胞外ループとの相互作用を阻害する、および／または（ｉｖ）結果としてＰＡＲ−２の少なくとも１つの生物学的機能の阻害を生じさせる抗体を指すことを意図したものである。ＰＡＲ−２中和または遮断抗体に起因する阻害は、適切なアッセイを用いて検出できるのであれば完全である必要はない。ＰＡＲ−２阻害を検出するための例示的アッセイは、本明細書の中で説明する。

本明細書に開示する完全ヒト抗ＰＡＲ−２抗体は、重および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に、対応する生殖細胞系配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含むことがある。そのような突然変異は、本明細書に開示するアミノ酸配列と例えば公共抗体配列データベースから入手できる生殖細胞系配列とを比較することにより、容易に突きとめることができる。本発明は、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸が、対応する生殖細胞系残基（単数もしくは複数）にまたは対応する生殖細胞系残基（単数もしくは複数）の保存的アミノ酸置換（天然もしくは非天然）に復帰突然変異する（そのような配列変化を本明細書では「生殖細胞系復帰突然変異」と呼ぶ）、本明細書に開示する任意のアミノ酸配列に由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。当業者は、本明細書に開示する重および軽鎖可変領域配列で出発して、１つ以上の個々の生殖細胞系復帰突然変異またはそれらの組み合わせを含む非常に多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に生産することができる。一定の実施形態では、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のすべてが突然変異して生殖細胞系配列に戻る。他の実施形態では、一定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸の中もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸の中に見いだされる突然変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の中に見いだされる突然変異残基のみ、が突然変異して生殖細胞系配列に戻る。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖細胞系復帰突然変異の任意の組み合わせを含有することがある、すなわち、この場合、一定の個々の残基は突然変異して生殖細胞系配列に戻り、その一方で生殖細胞系配列とは異なる一定の他の残基は維持される。得られたら、一定の１つ以上の生殖細胞系復帰突然変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントを、１つ以上の所望の特性、例えば、結合特異性向上、結合親和性増大、（場合次第で）拮抗的または作動的生物学的特性向上または強化、免疫原性低減などについて容易に試験することができる。この一般的な手法で得られる抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。

本発明は、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示する任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列の変異体を含む抗ＰＡＲ−２抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示する任意のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列に比べて例えば１０以下、８以下、６以下、４以下などの保存的アミノ酸置換を伴うＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＡＲ−２抗体を含む。１つの実施形態において、前記抗体は、８以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：６９８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。もう１つの実施形態において、前記抗体は、６以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：６９８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。もう１つの実施形態において、前記抗体は、４以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：６９８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。もう１つの実施形態において、前記抗体は、２以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：６９８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。１つの実施形態において、前記抗体は、８以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：７０６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。もう１つの実施形態において、前記抗体は、６以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：７０６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。もう１つの実施形態において、前記抗体は、４以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：７０６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。もう１つの実施形態において、前記抗体は、２以下の保存的アミノ酸置換を伴う配列番号：７０６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。

用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書において用いる場合、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（ニュージャージー州ピスカタウェイのＢｉａｃｏｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより実時間相互作用分析を可能にする光学現象を指す。

用語「Ｋ_Ｄ」は、本明細書において用いる場合、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図したものである。

用語「エピトープ」は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有することがある。従って、異なる抗体が、抗原の異なるエリアに結合することがあり、異なる生物学的作用を及ぼすことがある。エピトープは、高次構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であることもあり、または一次構造（ｌｉｎｅａｒ）であることもある。高次構造エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並べられたアミノ酸によって作り出される。一次構造エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。一定の状況では、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基またはスルホニル基の部分を含むことがある。

核酸またはそのフラグメントに言及するときの用語「実質的同一性」または「実質的に同一な」は、適切なヌクレオチド挿入または欠失があるが別の核酸（またはその相補鎖）と最適にアラインしたとき、下で説明するような任意の周知の配列同一性アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ、によって測定して、それらのヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、およびさらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％にヌクレオチド配列同一異性があることを示す。基準核酸分子との実質的同一性を有する核酸分子は、一定の場合、その基準核酸分子によってコードされたポリペプチドと同じまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。

ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似した」は、２つのペプチド配列が、例えばデフォルト・ギャップ・ウェイトを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアラインされたとき、少なくとも９５％配列同一性、さらにいっそう好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換の点で異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が、互いに保存的置換の点で異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似度を上方調整して、置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行う手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１参照。類似した化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルタートおよびグルタマート、ならびに（７）硫黄含有側鎖（システインおよびメチオニンである）が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタマート−アスパルタート、およびアスパラギン−グルアミンである。あるいは、保存的置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列で正の値を有する任意の変化である。「中等度保存的」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列で負でない値を有する任意の変化である。

配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドの配列類似性は、概して、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めて、様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を用いて類似した配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、デフォルトパラメータで用いて、密接な関係があるポリペプチド、例えば生物の異なる種からの相同ポリペプチド、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を判定することができるプログラム、例えばＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔ、を含有する。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１参照。ＦＡＳＴＡを用い、デフォルトまたは推奨パラメータを用いてポリペプチド配列を比較することもでき、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１．ＦＡＳＴＡの中のプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列とサーチ配列の間の最高重複領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上記）。本発明の配列と異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースとを比較するときのもう１つの好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、とりわけＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮ、である。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２参照。

ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体をはじめとするモノクローナル抗体の産生方法は、当該技術分野において公知である。任意のそのような公知の方法を本発明に関連して用いて、ヒトＰＡＲ−２に特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。

モノクローナル抗体を産生させるためのＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術または任意の他の方法を用いて、ＰＡＲ−２に対する、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、高親和性キメラ抗体を最初に単離する。下の実験の部でのように、それらの抗体を特性づけし、親和性、選択性、エピトープなどをはじめとする所望の特性について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、を産生させる。選択される定常領域は、具体的な用途によって様々であるが、高親和性抗原結合特性およびターゲット特異特性は、可変領域に存する。

生物学的等価物
本発明の抗ＰＡＲ−２抗体および抗体フラグメントは、記載する抗体のものとは異なるアミノ酸配列であるがヒトＰＡＲ−２を結合する能力を保持するものであるアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのような変異抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較したときにアミノ酸の１つ以上の付加、欠失または置換を含むが、記載する抗体のものと本質的に等価である生物活性を提示する。同様に、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示する配列と比較したときにヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失または置換を含む配列であるが本発明の抗ＰＡＲ−２抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に等価である抗ＰＡＲ−２抗体または抗体フラグメントをコードするものである配列を包含する。そのような変異アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上で論じている。

２つの抗原結合性タンパク質、すなわち抗体、は、例えばそれらが、単回投薬または反復投薬のいずれかの類似した実験条件下、同じモル用量で投与されたとき吸収速度および量に有意差を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、生物学的等価と見なされる。一部の抗体は、それらが、吸収量の点では等価であるが吸収速度の点では等価でなく、それにもかかわらず、そのような吸収速度の差が、意図的なものであり、標識づけに反映され、例えば慢性使用時に有効体内薬物濃度の達成に必須でなく、特定の医薬品研究にとって医学的に意味のないものと見なされるため、生物学的等価と見なすことができる場合には、等価物または薬学的代替物と見なされるだろう。

１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度および作用強度に臨床的に意義のある差がない場合、生物学的等価である。

１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、基準製品と生物学的製剤の１回以上の切り替えを、そのような切り替えを伴わない継続治療と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性減少をはじめとする有害作用のリスクの予想される増加なしに、患者に施すことができる場合、生物学的等価である。

１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それら両方が、使用条件（単数または複数）に対して共通の作用メカニズム（単数または複数）によって作用する場合、そのようなメカニズムがわかる範囲内で生物学的等価である。

生物学的等価性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって実証することができる。生物等価性測定法としては、例えば、（ａ）血液、血漿、血清または他の生体液中の抗体またはその代謝産物の濃度を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトｉｎ ｖｉｖｏバイオアベイラビリティーデータとの相関関係が立証されており該データを合理的に予示する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）抗体（またはそのターゲット）の適切な急性薬理作用を時間の関数として測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）抗体の安全性、効力またはバイオアベイラビリティーまたは生物学的等価性を確証する十分に管理された臨床試験が挙げられる。

本発明の抗ＰＡＲ−２抗体の生物学的等価変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必要ない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることによって構築することができる。例えば、生物活性に必須でないシステイン残基を欠失させてまたは他のアミノ酸と置き換えて、復元時に不必要なまたは不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の状況では、生物学的等価抗体は、抗体のグルコシル化特性を修飾するアミノ酸変化、例えばグリコシル化をなくすまたは除去する突然変異、を含む抗ＰＡＲ−２抗体変異体を含むことがある。

抗体の生物学的特徴
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）によって作用することができる。「補体依存性細胞傷害性」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現性細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）がターゲット細胞上の結合抗体を認識し、それによってそのターゲット細胞の溶解をもたらす、細胞媒介反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当該技術分野において周知であり利用できるアッセイを用いて、測定することができる（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号、ならびにＣｌｙｎｅｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６参照）。

あるいは、または加えて、本発明の抗体は、ＰＡＲ−２相互作用を遮断するまたは受容体成分相互作用を阻害する点で治療的上有用であり得る。本発明のＰＡＲ−２抗体の場合、抗体は、とりわけ、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を遮断するかまたは覆い隠すことによって作用することができる。あるいは、本発明の抗体は、テザーリガンドと１つ以上の細胞外ループ（例えば、ループ−１、ループ−２および／またはループ−３）との相互作用に干渉することによって作用することができる。

より具体的には、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、次の特徴のうちの１つ以上を呈示することができる：（１）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに、および非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−２またはＰＡＲ−２フラグメントに結合できること；（２）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに結合できるが、非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−２およびＰＡＲ−２フラグメントに結合できないこと；（３）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに、およびサルＰＡＲ−２またはサルＰＡＲ−２フラグメントに結合できるが、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたはブタＰＡＲ−２ならびにＰＡＲ−２フラグメントに結合できないこと；（４）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに、およびヒトＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４またはそれらのフラグメントに結合できること；（５）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに結合できるが、ヒトＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４ならびにそれらのフラグメントに結合できないこと；（６）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに、および非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４またはそれらのフラグメントに結合できること；（７）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントに結合できるが、非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４ならびにそれらのフラグメントに結合できないこと；（８）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できること；（９）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントおよび非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−２またはＰＡＲ−２フラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できること；（１０）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できるが、非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−２またはＰＡＲ−２フラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できないこと；（１１）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントおよびヒトＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４またはそれらのフラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できること；（１２）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できるが、ヒトＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４またはそれらのフラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できないこと；（１３）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントおよび非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４またはそれらのフラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できること；および／または（１４）ヒトＰＡＲ−２またはヒトＰＡＲ−２フラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できるが、非ヒト（例えば、マウス、サル、ラット、ウサギ、イヌ、ブタなど）ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４またはそれらのフラグメントのタンパク質分解的切断を遮断できないこと。

上の項目（８）〜（１４）で用いているような用語「タンパク質分解的切断」は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位でＰＡＲ−２を切断することができるＰＡＲ−２プロテアーゼまたは他の酵素によるＰＡＲ分子（ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３もしくはＰＡＲ−４）またはそれらのフラグメントの切断を意味する。

ヒトＰＡＲ−２のＮ末端領域は、少なくとも２つの「非活性化性」プロテアーゼ切断部位、すなわち、トリプシンによって切断され得るがその結果としてその受容体の活性化が生じることとならない部位を有する。これらのＮ末端非活性化性プロテアーゼ切断部位は、（ａ）ＰＡＲ−２（配列番号：８５１）の前記Ａｒｇ−３１およびＳｅｒ−３２の接合点に；ならびに（ｂ）ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）の残基Ｌｙｓ−３４およびＧｌｙ３５の接合点に位置する。ＰＡＲ−２のＮ末端の活性化性および非活性化性切断部位を図５（白三角は、非活性化性プロテアーゼ切断部位を示し、および黒三角は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を示す）に図示する；図４も参照のこと。本発明は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を遮断するが、非活性化性プロテアーゼ切断部位の一方または両方を遮断しない、抗ＰＡＲ−２抗体を含む。候補抗体が、特定のプロテアーゼ切断部位を遮断するか遮断しないかを、当業者は、本明細書の実施例８において述べる例示的ｉｎ ｖｉｔｒｏ遮断アッセイなどの任意の適するアッセイを用いて判定することができる。実施例８において例証するように、例示的抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐは、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位でのならびにヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）の残基Ｌｙｓ−３４およびＧｌｙ３５の接合点に位置する非活性化性プロテアーゼ切断部位でのトリプシン切断を遮断することが証明されたが、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）の残基Ａｒｇ−３１およびＳｅｒ−３２の接合点に位置する非活性化性プロテアーゼ切断部位での切断を遮断しなかった。対照的に、実施例８において用いたコンパレーター抗体は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位および両方の非活性化性部位での切断を遮断した。これらの例示的抗ＰＡＲ−２抗体の示差遮断能力は、これらの抗体が結合するＰＡＲ−２分子の特定の領域の違いを反映する可能性が最も高い（例えば、本明細書の実施例９参照）。

本明細書において用いる場合、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて２５℃でターゲット分子への結合について試験したときに５００ｎＭより大きいＫ_Ｄを示す場合、または酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）において２５℃でターゲット分子への結合について試験した場合に５０ｎＭより大きいＥＣ_５０を示す場合、またはいずれのタイプのアッセイもしくはそれらの等価のものにおいても一切結合を示すことができない場合、指定ターゲット分子（例えば、マウスＰＡＲ−２、ラットＰＡＲ−２、ウサギＰＡＲ−２、イヌＰＡＲ−２、ブタＰＡＲ−２、またはそれらのフラグメント）に「結合しない」。

本発明の一定の抗ＰＡＲ−２抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイにおいてＰＡＲ−２活性化を阻害または減弱することができる。ＰＡＲ−２活性化についての非限定的な例示的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイを本明細書に実施例６において例証する。この実施例では、ＰＡＲ−２を発現する細胞であって、レポーター分子（例えば、ルシフェラーゼ）に融合したＮＦ−κＢを含む構築物を保有するものである細胞を使用する。簡単に言うと、そのような細胞を抗ＰＡＲ−２抗体と併せ、その後、ＰＡＲ−２プロテアーゼで処理する。阻害性抗ＰＡＲ−２抗体の存在下で前記プロテアーゼで処理される細胞は、阻害性抗ＰＡＲ−２抗体の不在下で前記プロテアーゼで処理される細胞と比較して、有意に少ないレポーターシグナルを呈示するまたはレポーターシグナルをまったく呈示しないであろう。レポーターシグナルの半最大阻害を達成するために必要な抗体の濃度（ＩＣ_５０）を、そのようなアッセイを用いて計算することができる。本発明は、上で説明したようなｉｎ
ｖｉｔｒｏ細胞アッセイにおいてＰＡＲ−２活性化について試験したときに３００ｎＭ未満のＩＣ_５０を示す阻害性抗ＰＡＲ−２抗体を含む。例えば、本発明は、細胞を抗体と共に１時間、３７℃でインキュベートし、その後、２０ｎＭのトリプシン（または他のＰＡＲ−２プロテアーゼ）で５時間、３７℃で処理する、上で説明したようなｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイにおいてＰＡＲ−２活性について試験したときに、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ未満のＩＣ_５０を有する抗ＰＡＲ−２抗体を含む。

本発明は、次のペプチドのうちの１つ以上に結合する抗ＰＡＲ−２抗体およびそれらの抗原結合フラグメントを含む：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ（ＧＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬＩＧＫＶＤＧＴ、配列番号：８５２）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂ（ＳＬＩＧＫＶＤＧＴＳＨＶＴＧ、配列番号：８５３）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ（ＳＬＩＧＫＶ、配列番号：８５４）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄ（ヒトＰＡＲ−２のＮ末端ドメイン−マウスＩｇＧ、配列番号：８５５）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅ（ＬＡＰＧＲＮＮＳＫＧＲＳＬＩＧＲＬＥＴＱ、配列番号：８５６）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆ（ＧＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬＩＧＲＶＤＧＴ、配列番号：８５７）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇ（ＧＰＮＳＫＧＲＳＬＩＧＲＬＤＴＰ、配列番号：８５８）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈ（ＧＴＮＫＴＳＫＧＲＳＬＩＧＲＮＴＧＳ、配列番号：８５９）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉ（ＧＴＮＲＴＳＫＧＲＳＬＩＧＫＴＤＳＳ、配列番号：８６０）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｊ（ＧＴＳＲＰＳＫＧＲＳＬＩＧＫＡＤＮＴ、配列番号：８６１）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｋ（ＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤ、配列番号：８６２）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌ（ＤＴＮＮＬＡＫＰＴＬＰＩＫＴＦＲＧＡ、配列番号：８６３）；またはＰｅｐｔｉｄｅ Ｍ（ＥＳＧＳＴＧＧＧＤＤＳＴＰＳＩＬＰＡＰ、配列番号：８６４）。これらのペプチドに関する追加の情報は、本明細書の実施例３において見つけることができる。これらのペプチドは、追加の標識および部分をまったく含有しないことがあり、またはＮ末端もしくはＣ末端標識もしくは部分を含有することがある。１つの実施形態において、前記標識または部分はビオチンである。結合アッセイでは、標識（もしあれば）の位置が、ペプチドが結合する表面に対するそのペプチドの配向を決めることがある。例えば、表面をアビジンで被覆する場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、そのペプチドのＣ末端部分がその表面の遠位になるように配向されるであろう。

上述のＰｅｐｔｉｄｅに関して、本発明は、次の結合プロフィールのうちの１つ以上を有する抗ＰＡＲ−２抗体を含む：（１）Ｐｅｐｔｉｄｅ ＡおよびＢに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃには結合しない；（２）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、ＢおよびＤに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃには結合しない；（３）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｂ、ＤおよびＦに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃには結合しない；（４）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｂ、ＤおよびＦに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ ＣまたはＥのいずれかに結合しない；（５）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、ＢおよびＤに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｋ、ＬおよびＭのいずれにも結合しない；（６）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、ＢおよびＦに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｋ、ＬおよびＭのいずれにも結合しない；（７）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｂ、ＤおよびＦに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｋ、ＬおよびＭのいずれにも結合しない；ならびに／または（８）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＩおよびＪのうちの少なくとも３つに結合するが、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｈには結合しない。本発明の抗体の他の結合プロフィールは、本明細書の実施例から明らかに分かるだろう。

エピトープマッピングおよび関連技術
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥのその高親和性受容体への結合を遮断するもの）をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．、ＮＹ）に記載されているものなどの常例的交差遮断アッセイを行うことができる。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３−４６３）、またはペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学修飾を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７−４９６）。

用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、隣接アミノ酸で構成される場合もあり、またはタンパク質の三次フォールディングによって並べられた非隣接アミノ酸で構成される場合もある。隣接アミノ酸で構成されたエピトープは、変性溶媒に曝露しても概して保持されるが、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、変性溶媒で処理すると概して失われる。エピトープは、概して、少なくとも３、およびさらに通常は少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を独特の空間的高次構造で含む。

抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＡＳＡＰ）としても公知の修飾援用プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロフィールの類似性に従って同じ抗原に対して作られた多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリー分けする方法である（米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープと明確に異なるまたは部分的に重複するユニークエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝学的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にするので、特性づけの焦点を遺伝学的に異なる抗体に絞ることができる。ハイブリドーマスクリーニングに応用した場合、ＭＡＰは、望ましい特性を有するｍＡｂを生産する珍しいハイブリドーマクローンの同定を助長することができる。ＭＡＰを用いて、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体を異なるエピトープに結合する抗体の群に分類することができる。

本発明は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位のまたは付近の（例えば、５、１０、１５もしくは２０アミノ酸以内の）エピトープに結合する抗ＰＡＲ−２抗体を含む。一定の実施形態において、前記抗ＰＡＲ−２抗体は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の上流（すなわち、Ｎ末端側）に位置するエピトープに結合する。本発明の一定の他の実施形態において、前記抗ＰＡＲ−２抗体は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流（すなわち、Ｃ末端側）に位置するエピトープに結合する。さらに他の実施形態において、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の上流に位置するアミノ酸配列とＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流に位置するアミノ酸配列の両方を含むエピトープに結合することができる。

あるいは、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、一定の実施形態では、ＰＡＲ−２タンパク質の１つ以上の細胞外ループ（例えば、細胞外ループ１、細胞外ループ２および／または細胞外ループ３）上に位置するエピトープに結合することができる。

本発明は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流に位置する一定のアミノ酸残基と相互作用する、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明は、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）のＶａｌ−４２およびＡｓｐ−４３と相互作用する、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。これらの２つの残基に加えて、前記単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流に位置する次の残基のうちの１つ以上とも相互作用することができる：ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）のＳｅｒ−３７、Ｌｅｕ−３８、Ｉｌｅ−３９、Ｇｌｙ−４０またはＧｌｙ−４４。一定の実施形態において、前記単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）のＬｙｓ−４１と相互作用しない。例えば、本発明は、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）のＳｅｒ−３７、Ｌｅｕ−３８、Ｉｌｅ−３９、Ｇｌｙ−４０、Ｖａｌ−４２およびＡｓｐ−４３と相互作用するが、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）のＬｙｓ−４１とは相互作用しない、単離されたヒト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含む。実施例９において例証する実験手順を用いて、候補抗ＰＡＲ−２抗体がＰＡＲ−２の特定のアミノ酸残基「と相互作用する」のか、「と相互作用しない」のかを判定することができる。例えば、候補抗体を、実施例９の手順を用いて配列番号：８７９を有するペプチド（ＰＡＲ−２のＶａｌ−４２がアラニンに突然変異される、ＰＡＲ−２のＮ末端領域に対応する、例えば、表２４〜２８参照）への結合について試験し、その抗体のＴ_１／２が、該候補抗体を野生型ペプチド（配列番号：８７１）への結合について試験したときに観察されるＴ_１／２の３０％未満であった場合には、本開示のために、該候補抗体は、アラニンに突然変異したアミノ酸（この場合、Ｖａｌ−４２）「と相互作用する」と考える；すなわち、該候補抗体の結合は、Ｖａｌ−４２に対応するアミノ酸がアラニンに突然変異されたときに実質的に低減される（そのような残基を図５に黒丸によって描写する）。一方、候補抗体を、実施例９の手順を用いて配列番号：８７８を有するペプチド（ＰＡＲ−２のＬｙｓ−４１がアラニンに突然変異される、ＰＡＲ−２のＮ末端領域に対応する、例えば、表２４〜２８参照）への結合について試験し、その抗体のＴ_１／２が、該候補抗体を野生型ペプチド（配列番号：８７１）への結合について試験したときに観察されるＴ_１／２の３０％以上であった場合には、本開示のために、該候補抗体は、アラニンに突然変異したアミノ酸（この場合、Ｌｙｓ−４１）「と相互作用しない」と考える；すなわち、該候補抗体の結合は、Ｌｙｓ−４１に対応するアミノ酸がアラニンに突然変異されたときに実質的に低減されない（そのような残基を図５に白丸によって描写する）。

本発明は、本明細書に記載する任意の特定の例示的抗体（例えば、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮまたはＨ４Ｈ６１８Ｎ）と同じエピトープに結合する抗ＰＡＲ−２抗体を含む。同様に、本発明は、ＰＡＲ−２またはＰＡＲ−２フラグメントへの結合について本明細書に記載する任意の特定の例示的抗体（例えば、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮまたはＨ４Ｈ６１８Ｎ）と交差競合する抗ＰＡＲ−２抗体も含む。

ある抗体が、基準抗ＰＡＲ−２抗体と同じエピトープに結合するのか、または基準抗ＰＡＲ−２抗体と結合について競合するのかは、当該技術分野において公知の常例的方法を用いることによって容易に判定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の基準抗ＰＡＲ−２抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定するために、該基準抗体を飽和条件下でＰＡＲ−２タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、そのＰＡＲ−２分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、基準抗ＰＡＲ−２抗体との飽和結合後にＰＡＲ−２に結合することができる場合、該試験抗体は、該基準抗ＰＡＲ−２抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。一方、試験抗体が、基準抗ＰＡＲ−２抗体との飽和結合後にＰＡＲ−２分子に結合することができない場合には、該試験抗体は、本発明の基準抗ＰＡＲ−２抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合することができる。その後、さらなる常例的実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を行って、試験抗体の観察された結合喪失が、実際、基準抗体と同じエピトープへの結合に起因するのか、または立体的遮断（もしくは別の現象）がその観察された結合喪失原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、または当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて行うことができる。本発明の一定の実施形態によると、２つの抗体は、例えば、１、５、１０、２０または１００倍過剰な一方の抗体が、他方の結合を、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２参照）で測定して少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％またはさらに９９％阻害する場合、同じ（または重複）エピトープに結合する。あるいは、２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減するまたはなくす抗原の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が、他方の結合を低減するまたはなくす場合、同じエピトープに結合すると考えられる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を低減するまたはなくすアミノ酸突然変異のサブセットのみが、他方の結合を低減するまたはなくす場合、「重複エピトープ」を有すると考えられる。

ある抗体が、基準抗ＰＡＲ−２抗体と結合について競合するかどうかを判定するために、上で説明した結合方法論を２つの方針で行う：第一の方針では、基準抗体を飽和条件下でＰＡＲ−２分子に結合させ、その後、そのＰＡＲ−２分子への試験抗体の結合を評価する。第二の方針では、試験抗体を飽和条件下でＰＡＲ−２分子に結合させ、その後、そのＰＡＲ−２分子への基準抗体の結合を評価する。両方の方針において、第一の（飽和）抗体のみがＰＡＲ−２分子に結合できる場合には、試験抗体と基準抗体は、ＰＡＲ−２への結合について競合すると結論づけられる。当業者には理解されるであろうが、基準抗体と結合について競合する抗体は、その基準抗体と同じエピトープに必ずしも結合できるとは限らないが、重複または隣接エピトープを結合することによりその基準配列の結合を立体的に遮断することがある。

種選択性および種交差反応性
本発明の一定の実施形態によると、抗ＰＡＲ−２抗体は、ヒトＰＡＲ−２に結合するが、他の種からのＰＡＲ−２には結合しない。あるいは、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、一定の実施形態において、ヒトＰＡＲ−２に、および１種以上の非ヒト種からのＰＡＲ−２に結合する。例えば、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、ヒトＰＡＲ−２に結合することができ、場合次第で、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーＰＡＲ−２のうちの１つ以上に結合することができ、または結合することができない。

イムノコンジュゲート
本発明は、細胞毒、化学療法薬、免疫抑制剤または放射性同位体などの治療用部分にコンジュゲートした抗ＰＡＲ−２モノクローナル抗体（「イムノコンジュゲート」）を包含する。細胞傷害剤は、細胞に有害である任意の作用因子を含む。イムノコンジュゲートの形成に適する細胞傷害剤および化学療法薬の例は、当該技術分野において公知である（例えば、国際公開第０５／１０３０８１号参照）。

多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であることがある。多重特異性抗体は、１つのターゲットポリペプチドの異なるエピトープに特異的であることがあり、または１つより多くのターゲットポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有することがある。例えばＴｕｔｔら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒら、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４参照。本発明の抗ＰＡＲ−２抗体を別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質、に連結させることができ、または該分子と共発現させることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを１つ以上の他の分子エンティティー、例えば別の抗体または抗体フラグメント、に（例えば、化学的カップリングにより、遺伝子融合により、非共有結合性会合により、または別の方法で）機能的に連結させて、第二の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を生産することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトＰＡＲ−２またはそのフラグメントに特異的であり、その免疫グロブリンの他のアームが第二の治療用ターゲットに特異的である、またはトリプシン阻害剤などの治療用部分にコンジュゲートしている、二重特異性抗体を含む。

本発明に関連して用いることができる例示的二重特異性抗体フォーマットは、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ_Ｈ３ドメインおよび第二のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインの使用を含み、この場合、該第一および第二のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、この少なくとも１つのアミノ酸の違いは、アミノ酸の違いのない二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの該二重特異性抗体の結合を低減する。１つの実施形態において、前記第一のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、プロテインＡを結合し、および前記第二のＩｇ Ｃ_Ｈ３ドメインは、プロテインＡ結合を低減するまたは消失させる突然変異、例えばＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソン番号付けによる；ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）を含有する。前記第二のＣ_Ｈ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含むことがある。前記第二のＣ_Ｈ３内で見いだすことができるさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上で説明した二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲に包含される。

治療用製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物の投与は、適する担体、賦形剤、ならびに向上された移入、送達、許容度およびこれらに類するものをもたらすために製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与される。すべての薬剤師に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡの中で沢山の適切な製剤を見つけることができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカルボワックスの半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８−３１１も参照のこと。

抗体の用量は、投与される被験者の年齢およびサイズ、ターゲット疾患、状態、投与経路およびこれらに類するものに依存して様々であり得る。好ましい用量は、体重または体表面積に従って概して計算される。本発明の抗体を成人患者におけるＰＡＲ−２活性に関連した状態または疾患の処置に使用するとき、本発明の抗体を、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の一回量で静脈内投与するのが有利であり得る。状態の重症度に依存して、処置の頻度および継続期間を調整することができる。ＰＡＲ−２抗体の投与に有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決めることができ；例えば、患者の経過を定期評価によりモニターし、相応じて用量を調整することができる。さらに、当該技術分野において周知の方法を用いて投薬量の種間スケーリングを行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。

様々な送達システム、例えばリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの封入、突然変異体ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス、が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる（例えば、Ｗｕら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）。導入方法は、内皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含むが、これらに限定されない。前記組成物は、任意の適弁な経路によって、例えば注入もしくはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を通した吸収によって、投与することができ、および他の生物活性薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身的である場合もあり、または局所的である場合もある。

本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器で皮下または静脈内投与することができる。加えて、皮下送達に関しては、ペン型送達システムが本発明の医薬組成物の送達に利用される。そのようなペン型送達装置は、再使用可能である場合もあり、または使い捨てである場合もある。再使用可能なペン送達装置は、一般に、医薬組成物を収容する交換可能なカートリッジを用いる。カートリッジ内のすべての医薬組成物を投与し、そのカートリッジが空になったら、空のカートリッジを廃棄して医薬組成物が収容されている新しいカートリッジと交換することが容易にできる。その後、そのペン型送達装置を再使用することができる。使い捨てペン型送達装置には交換可能なカートリッジがない。もちろん、使い捨てペン型装置は、その装置内のレザバーの中に保持された医薬組成物が既に充填された状態になっている。レザバーに医薬組成物が空になったら、装置全体を廃棄する。

非常に多数の再使用可能ペン型および自己注射器型送達装置が本発明の医薬組成物の皮下送達に利用される。例としては、ほんの少し名を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（英国、ウッドストックのＯｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（スイス、バーグドーフのＤｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（インディアナ州インディアナポリスのＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（デンマーク、コペンハーゲンのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（デンマーク、コペンハーゲンのＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、ＢＤ（商標）ペン（ニュージャージー州フランクリンレークのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ドイツ、フランクフルトのｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下送達に利用される使い捨てペン型送達装置の例としては、ほんの少し名を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標） Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（カリフォルニア州サウザンドオークスのＡｍｇｅｎ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（ドイツ、シュトゥットガルトのＨａｓｅｌｍｅｉｅｒ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標） Ｐｅｎ（イリノイ州アボットパークのＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

一定の状況では、前記医薬組成物を制御放出システムで送達することができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１参照）。もう１つの実施形態では、高分子材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（編集）、１９７４、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ参照。もう１つの実施形態では、制御放出システムを前記組成物のターゲットの近くに配置することができ、それ故、全身用量の数分の一しか必要としない（例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、第２巻、１１５−１３８頁のＧｏｏｄｓｏｎ、１９８４参照）。他の制御放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３による総説において論じられている。

注射用調製品としては、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射剤、点滴などを挙げることができる。これらの注射用調製品は、公知の方法によって調製することができる。例えば、注射用調製品は、例えば、上で説明した抗体またはその塩を注射剤に従来使用されている滅菌水性媒体または油性媒体に溶解、懸濁または乳化させることによって、調製することができる。注射剤用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の助剤を含有する等張溶液、などがあり、これらは、適切な可溶化剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加体）］など、と併用されることがある。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが利用されており、これらは、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用されることがある。このようにして調製した注射剤を、好ましくは、適切なアンプルに充填する。

有利には、上で説明した経口または非経口用の医薬組成物を、活性成分の用量に合わせるのに適した単位用量の剤形に調製する。単位用量のそのような剤形としては、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射剤（例えば、アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される前述の抗体の量は、一般に、単位用量の剤形１つにつき約５〜約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態の場合は上述の抗体を約５〜約１００ｍｇ、および他の剤形については約１０〜約２５０ｍｇで含有することが好ましい。

抗体の治療目的使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＰＡＲ−２のタンパク質分解的活性化に関連した疾患または障害をはじめとするＰＡＲ−２活性に関連した任意の疾患または障害の処置、予防および／または改善に有用である。本発明の抗ＰＡＲ−２抗体で処置することができる例示的疾患および障害としては、疼痛状態、例えば侵害受容性疼痛および内臓痛、ならびに炎症、手術切開後、ニューロパチー、骨折、火傷、骨粗しょう症性骨折、骨癌、痛風、偏頭痛、線維筋痛症などの状態に随伴する疼痛が挙げられる。本発明の抗体は、炎症性状態、例えば、関節の炎症、気道の炎症（喘息）、皮膚の炎症、皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎など）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、腎炎、間質性膀胱炎、膀胱の炎症、痛覚過敏症、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節炎、多発性硬化症、抗リン脂質症候群、アルファ−１−アンチトリプシン欠損症などを処置、予防および／または改善するためにも使用することができる。本発明の抗体は、例えば、強皮症、胆汁性肝硬変、移植後線維症、腎線維症、肺線維症、肝線維症、膵線維症、精巣線維症、肥厚性瘢痕および皮膚ケロイドをはじめとする線維症状態を処置するために使用することができる。一定の実施形態において、本発明の抗体は、胃腸の状態（例えば、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、特発性胃不全麻痺、膵炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および潰瘍（胃および十二指腸潰瘍を含む））；急性肺損傷；急性腎損傷；および敗血症の処置に有用である。本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、そう痒、例えば、皮膚／そう痒受容性（ｐｒｕｒｉｔｏｃｅｐｔｉｖｅ）、神経障害性、神経性および心因性痒み、ならびにアトピー性皮膚炎、乾癬、火傷瘢痕（火傷に関する痒み）、肥厚性瘢痕、ケロイド、腎不全および肝機能不全に随伴するそう痒の処置にも有用である。本発明の抗ＰＡＲ−２抗体の他の治療目的使用としては、アルツハイマー病、ネザートン病、病的血管新生、慢性蕁麻疹、血管浮腫、肥満細胞症、子宮内膜症、不妊症（例えば、精巣線維症に関連した男性不妊症）、肥満細胞媒介疾患、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素Ａ誘導腸炎、および癌（例えば、血液細胞癌、脳癌、乳癌、大腸癌、頭頸部癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌など）の処置、予防および／または改善が挙げられる。

併用療法
本発明は、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体を少なくとも１つの追加の治療活性成分と併用で投与することを含む、治療的投与レジメンを含む。そのような追加の治療活性成分の非限定的な例としては、他のＰＡＲ−２アンタゴニスト（例えば、抗ＰＡＲ−２抗体またはＰＡＲ−２の小分子阻害剤（例えば、Ｎ１−３−メチルブチリル−Ｎ４−６−アミノヘキサノイル−ピペラジン；ＥＮＭＤ−１０６８））、サイトカイン阻害剤（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害剤（例えば、リロナセプトまたはアナキンラ、小分子ＩＬ−１アンタゴニスト、または抗−ＩＬ−１抗体）；ＩＬ−１８阻害剤（例えば、小分子ＩＬ−１８アンタゴニストまたは抗−ＩＬ−１８抗体）；ＩＬ−４阻害剤（例えば、小分子ＩＬ−４アンタゴニスト、抗−ＩＬ−４抗体または抗−ＩＬ−４受容体抗体）；ＩＬ−６阻害剤（例えば、小分子ＩＬ−６アンタゴニスト、抗−ＩＬ−６抗体または抗−ＩＬ−６受容体抗体）；抗てんかん薬（例えば、ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔａｉｎ））；神経成長因子（ＮＧＦ）阻害剤（例えば、小分子ＮＧＦアンタゴニストまたは抗ＮＧＦ抗体）；低用量コルヒチン；アスピリン；ＮＳＡＩＤ；ステロイド（例えば、プレドニゾン、メトトレキサートなど）；低用量シクロスポリンＡ；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはＴＮＦ受容体阻害剤（例えば、小分子ＴＮＦもしくはＴＮＦＲアンタゴニストまたは抗−ＴＮＦもしくはＴＮＦＲ抗体）；尿酸合成阻害剤（例えば、アロプリノール）；尿酸排泄促進剤（例えば、プロベネシド、スルフィンピラゾン、ベンズブロマロンなど）；他の炎症性因子阻害剤（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）（例えば、カスパーゼ−１、ｐ３８、ＩＫＫ１／２、ＣＴＬＡ−４Ｉｇなどの阻害剤）；および／またはコルチコステロイドが挙げられる。前記追加の治療活性成分（単数または複数）を、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体の投与の前に、該投与と同時に、又は該投与の後に、投与することができる。

抗体の診断目的使用
本発明の抗ＰＡＲ−２抗体は、例えば診断を目的として、サンプル中のＰＡＲ−２を検出および／または測定するためにも使用することができる。例えば、抗ＰＡＲ−２抗体またはそのフラグメントは、ＰＡＲ−２の異常発現（例えば、過剰発現、過少発現、発現欠如など）を特徴とする状態または疾患を診断するために使用することができる。ＰＡＲ−２についての例示的診断アッセイは、例えば、患者から得たサンプルを本発明の抗ＰＡＲ−２抗体と接触させることを含むことがあり、この場合の抗ＰＡＲ−２抗体は、検出可能標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、未標識抗ＰＡＲ−２抗体とそれ自体が検出可能に標識されている二次抗体とを診断用途で併用することができる。前記検出可能標識またはレポーター分子は、放射性同位体、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓもしくは^１２５Ｉ；蛍光性もしくは化学発光性部分、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミン；または酵素、例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼであり得る。サンプル中のＰＡＲ−２を検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイとしては、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）および蛍光励起細胞分別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。

本発明によるＰＡＲ−２診断アッセイにおいて使用することができるサンプルとしては、正常または病的状態下の検出可能な量のＰＡＲ−２タンパク質またはそのフラグメントを有する患者から得ることができる任意の組織または流体サンプルが挙げられる。一般に、健常患者（例えば、異常ＰＡＲ−２レベルまたは活性に関連した疾患または状態に罹患していない患者）から得た特定のサンプル中のＰＡＲ−２のレベルを測定して、最初にＰＡＲ−２のベースライン、または基準、レベルを確立する。その後、このＰＡＲ−２ベースラインレベルを、ＰＡＲ−２関連疾患または状態を有すると推測される個体から得たサンプルで測定したＰＡＲ−２レベルと比較することができる。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物の製造および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示すものであり、本発明者らが本発明者らの発明と考える範囲を限定することを意図したものではない。用いる数値（例えば、量、温度など）に関しては正確を期すように努めたが、多少の実験誤差および偏差は考えられるだろう。別の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度でのものであり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

（実施例１）
ヒトＰＡＲ−２に対するヒト抗体の産生
アミノ酸配列ＧＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬＩＧＫＶＤＧＴ（配列番号：８５２）を有するヒトＰＡＲ−２ペプチドを含む免疫原を、免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリン重およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、直接投与した。ＰＡＲ−２特異的イムノアッセイによって、抗体免疫応答をモニターした。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を回収し、マウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存度を保ち、ハイブリドーマ細胞系を形成した。それらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択して、ＰＡＲ−２特異的抗体を生産する細胞系を同定した。この技術を用いて、幾つかの抗ＰＡＲ−２キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを保有する抗体）を得た；この要領で産生させた例示的抗体を次のように呼んだ：Ｈ２Ｍ５８８、Ｈ２Ｍ５８９、Ｈ１Ｍ５９０、Ｈ２Ｍ５９１、Ｈ１Ｍ５９２、Ｈ１Ｍ５９５、Ｈ２Ｍ６０９、Ｈ２Ｍ６１０、Ｈ２Ｍ６１１、Ｈ１Ｍ６１２、Ｈ１Ｍ６１３、Ｈ２Ｍ６１４、Ｈ１Ｍ６１５、Ｈ１Ｍ６１６、Ｈ３Ｍ６１７、Ｈ２Ｍ６１８、Ｈ１Ｍ６１９、およびＨ３Ｍ６２０。

抗ＰＡＲ−２抗体を、米国特許出願公開第２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されているように、骨髄腫細胞と融合させずに抗原陽性Ｂ細胞から直接単離もした。この方法を用いて、幾つかの完全ヒト抗ＰＡＲ−２抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを保有する抗体）を得た；この要領で産生させた例示的抗体を次のように呼んだ：Ｈ１Ｈ５７１、Ｈ１Ｈ５７２、Ｈ１Ｈ５７３、Ｈ１Ｈ５７４、Ｈ１Ｈ５７５、Ｈ１Ｈ５７６、Ｈ１Ｈ５７７、Ｈ１Ｈ５７８、Ｈ１Ｈ５７９、Ｈ１Ｈ５８０、Ｈ１Ｈ５８１、Ｈ１Ｈ５８３、Ｈ１Ｈ５８４、Ｈ１Ｈ５８５、Ｈ１Ｈ５８６、およびＨ１Ｈ５８７。

本実施例の方法に従って産生させた例示的抗ＰＡＲ−２抗体の生物学的特性を下の実施例で詳細に説明する。

（実施例２）
重および軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１は、選択した抗ＰＡＲ−２抗体の重および軽鎖可変領域アミノ酸配列ペアおよびそれらの対応する抗体識別子を示すものである。Ｎ、ＰおよびＧ記号は、同一のＣＤＲ配列を有するが該ＣＤＲ配列の範囲外になる領域に（すなわち、フレームワーク領域に）配列変動がある重および軽鎖を有する抗体を指す。従って、特定の抗体のＮ、ＰおよびＧ変異体は、それらの重および軽鎖可変領域内に同一のＣＤＲ配列を有するが、それらのフレームワーク領域内では互いに異なる。

表１

（実施例３）
ＰＡＲ−２ペプチドへの抗体結合
ＰＡＲ−２およびＰＡＲ−２関連配列の合成ペプチド（テネシー州ナッシュヴィルのＣｅｌｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を生成して、抗ＰＡＲ−２抗体の結合プロフィールを特性づけした。様々なペプチドのビオチン化形態と非ビオチン化形態の両方を、下に示す実施例のために生成した。ビオチン化形態については、ペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれかにＧ_４Ｓリンカーによって共有結合でビオチン部分を付けた。表２は、これらのペプチドの配列および由来を示すものである。

表２

抗ＰＡＲ−２抗体をＰＡＲ−２ペプチドに結合するそれらの能力について試験した。様々なＰＡＲ−２ Ｐｅｐｔｉｄｅ（表３）を９６ウエルプレート上に２μｇ／ｍＬの濃度で被覆し、一晩インキュベートし、その後、適するブロッキング剤で１時間ブロッキングした。同様に、ビオチン化ペプチド（Ｎ−Ｔｅｒｍ：Ｎ末端ビオチン化されたもの：Ｃ−ｔｅｒｍ：Ｃ末端ビオチン化されたもの）については、アビジンをプレートに２μｇ／ｍＬで被覆し、その後、０．２μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化ＰＡＲ−２ペプチドと共にインキュベートし、１時間インキュベートした。ＰＡＲ−２ペプチドで被覆されたプレートに精製抗ＰＡＲ−２抗体を０．２〜２．０μｇ／ｍＬにわたる範囲の最終濃度まで添加し、１時間、室温でインキュベートした。結合抗体の検出をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗マウスまたはヒトＩｇＧ（ペンシルバニア州ウェストグローブのＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）で判定し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用して標準的な比色応答により発色させた。吸収を０．１秒間、ＯＤ_４５０で読み取った。

観察されたＯＤ_４５０値（それぞれ、１．０〜４．０、０．５０〜０．９９、０．１〜０．４９、０．０〜０．０９）に従って試験した各抗ＰＡＲ−２抗体についての結合なし（−）と比較したときの非ビオチン化（Ｎｏ Ｂｉｏｔｉｎ）またはビオチン化Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、ＢおよびＣへの相対結合（＋＋＋、＋＋、＋）を表３に示す。対照：「Ｓａｍ１１」、ヒトＰＡＲ−２を結合する市販マウスモノクローナル抗体（カリフォルニア州サンタクルーズのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

表３

類似した実験で、突然変異体ヒトＩｇＧ４（配列番号：８４９）にクローニングした選択抗ＰＡＲ−２抗体を、非ビオチン化およびビオチン化形態のヒトＰＡＲ−２ペプチド（上で説明したとおり）を結合するそれらの能力について試験した。結果を表４に示す。

表４

もう１つの実験では、選択抗ＰＡＲ−２抗体を非ビオチン化Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄ、Ｋ、ＬおよびＭ（上で説明したとおり）への結合について試験した。キメラ抗体（例えば、Ｈ２Ｍ５８８Ｎ）および完全ヒト抗体（例えば、Ｈ４Ｈ５７２Ｐ）についての結果をそれぞれ表５および６に示す。Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄについては、結合抗体の検出をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗マウスκ（アラバマ州バーミングハムのＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で判定した。

表５

表６

もう１つの実験では、選択抗ＰＡＲ−２抗体をＮ末端ビオチン化マウス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅ Ｎ−Ｔｅｒｍ）およびサル（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆ Ｎ−Ｔｅｒｍ）ＰＡＲ−２ペプチド（上で説明したとおり）への結合について試験した。

表７

もう１つの実験では、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択抗ＰＡＲ−２抗体を非ビオチン化およびビオチン化形態のＰｅｐｔｉｄｅ ＥからＪ（上で説明したとおり）への結合について試験した。結果を表８に示す。

表８

もう１つの実験では、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択抗ＰＡＲ−２抗体を非ビオチン化およびビオチン化形態のＰＡＲ−２ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｅ、ＦおよびＧ；上で説明したとおり）への結合について試験した。この実験では、１３．３ｎＭから０．２２ｐＭまでの３倍系列希釈した抗ＰＡＲ−２抗体を前記ペプチド被覆プレート上で１時間、室温でインキュベートした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（カリフォルニア州ラホーヤのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）のシグモイド型用量反応モデルを使用して４５０ｎｍでの吸収値を分析し、ＥＣ_５０値を報告した（表９）。ＥＣ_５０値は、ＰＡＲ−２ペプチドへの最大結合の５０％を達成するために必要とされる抗体濃度と定義する。

表９

前の実験によって示されるように、抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮまたはＨ４Ｈ６１８Ｎすべてが、配列ＳＬＩＧＫＶＤＧＴ（配列番号：８５２のアミノ酸１０〜１８）を含むヒトＰｅｐｔｉｄｅ Ａ、ＢおよびＤへの、ならびに配列ＳＬＩＧＲＶＤＧＴ（配列番号：８５７のアミノ酸１０〜１８）を含むサルＰｅｐｔｉｄｅＦへの実質的結合を示す。抗体Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮおよびＨ４Ｈ６１８Ｎについては、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流に位置する配列ＶＤＧＴは、この配列を変えるとこれらの抗体による結合が実質的に低減するまたはなくなるので、結合に特に重要であるようである（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅ（マウス）、Ｇ（ラット）、Ｈ（ウサギ）、Ｉ（イヌ）およびＪ（ブタ）についての結合データを参照のこと）。

（実施例４）
抗原結合親和性判定
選択、精製ＰＡＲ−２抗体への抗原結合について平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）を、実時間表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて表面反応速度により決定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ＣＭ５センサーチップへの直接アミン化学的カップリングによって作られたウサギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）表面またはヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（ペンシルバニア州ウェストグローブのＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）表面のいずれかに抗体を捕捉して、抗体捕捉表面を形成した。様々な濃度（１５．６〜２５０ｎＭにわたる範囲）の単量体ヒトＰＡＲ−２ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ ＡおよびＢ）を１００μＬ／分の速度でその抗体捕捉表面に９０秒間注入した。抗原−抗体結合および解離を室温で実時間でモニターした。反応速度分析を行って、抗原／抗体複合体解離のＫ_Ｄおよび半減期を計算した（表１０）。Ｔ_１／２値を示さない抗体については、定常状態分析を用いてＫ_Ｄ値を計算した。ＮＢ：本実験条件下で観察される結合なし。ＮＤ：決定できない。

表１０

類似した実験で、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択抗体の非ビオチン化単量体マウス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅ）およびＮ末端ビオチン化サル（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆ Ｎ−Ｔｅｒｍ）ＰＡＲ−２ペプチドへの結合についてのＫ_Ｄ値を（上で説明したとおり）決定した（表１１）。抗体Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮおよびＨ４Ｈ６１８Ｎは、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅを結合しなかったが、対照抗体は、ＰｅｐｔｉｄｅＥにもＦにも結合しなかった。

表１１

もう一系列の実験で、選択したビオチン化および非ビオチン化形態のＰＡＲ−２ペプチドへの精製抗体結合についての平行解離定数（Ｋ_Ｄ値）を、実時間表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて表面反応速度により決定した。アミンカップリングケミストリーを用いてＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ）をＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｃ１チップまたはＣＭ５チップの表面に共有結合でカップリングさせた。ビオチン化（Ｎ−ＴｅｒｍまたはＣ−Ｔｅｒｍ）ＰＡＲ−２ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ ＡおよびＢ）をその表面にビオチンとアミンカップリングＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎとの高親和性結合相互作用により固定化した。

このフォーマットを用いる第一の実験では、固定化ペプチドを低密度（＜１ＲＵ）で被覆した表面に、様々な濃度（５〜１００μｇ／ｍＬにわたる範囲）の精製抗体を、５０μＬ／分の速度で３００秒間注入した。抗体−ペプチド結合および解離を実時間２５℃でモニターした（表１２）。

表１２

もう１つの類似した実験で、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択抗体のビオチン化形態のＰｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦおよびＧの低密度表面（＜１ＲＵ）への結合についてのＫ_Ｄ値を（上で説明したように）決定した。Ｃ末端およびＮ末端ビオチン化ＰＡＲ−２ペプチドへの結合についての結果をそれぞれ表１３〜１４に示す。この実験では、抗体Ｈ４Ｈ５８１ＰだけはＮ末端ビオチン化Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃに対する親和性（＞１００ｎＭのＫ_Ｄ）を明示したが、対照を含めて試験したすべての他の抗体は、このペプチドへの結合を示さなかった。

表１３

表１４

類似した実験で、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択抗体の単量体ビオチン化および非ビオチン化形態のＰＡＲ−２ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、Ｂ、Ｅ〜Ｍ）への結合についてのＫ_Ｄ値を（上で抗体捕捉表面について説明したように）決定した。結果を表１５〜１６に示す。試験したいずれの抗体もＰｅｐｔｉｄｅ Ｋ、ＬまたはＭへの結合を示さなかった。

表１５

表１６

（実施例５）
ＰＡＲ−２を発現するように（遺伝子）操作された細胞への抗体結合
抗ＰＡＲ−２抗体をさらに特性づけするために、ヒト胎児由来腎臓２９３細胞系（ＨＥＫ２９３）の細胞を、完全長ヒト（配列番号：８５１）またはマウス（配列番号：８６６）ＰＡＲ−２のいずれかを過剰発現するように遺伝子操作した。

ＨＥＫ２９３細胞にＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞の安定性を、ｅＧＦＰ発現によりフローサイトメトリーおよびルシフェラーゼ活性によって検出されるようなＩＬ−１βに対する応答によって立証した。ＩＬ−１βで誘導したときに低バックグラウンドレベルのルシフェラーゼ活性および高レベルのｅＧＦＰを有する、Ｄ９という名の、クローナル細胞系を、フローサイトメトリーを用いる細胞集団の一連の逐次選別によって作製した。その後、Ｔ２９３／Ｄ９細胞系にヒトＰＡＲ−２またはマウスＰＡＲ−２を個別にトランスフェクトして、安定した細胞系２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃおよび２９３／Ｄ９／ｍＰＡＲ−２ｒｅｃをそれぞれ生じさせた。

２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃ細胞への抗ＰＡＲ−２抗体の結合をＥＬＩＳＡによって判定した。２９３／Ｄ９および２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃ細胞を培地中５×１０^４細胞／ウエルの密度でプレーティングし、３７℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。精製細胞を細胞に１０μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、細胞を固定し、洗浄した後、ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧで結合抗体を検出し、ＴＭＢ基質を使用して標準的な比色応答により発色させた。吸光度をＯＤ_４５０で０．１秒間読み取った。２９３／Ｄ９細胞と比較した２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃへの抗体結合のＡ_４５０比を表１７に示す。

表１７

類似した実験で、電気化学発光技術（メリーランド州ゲーサーズバーグのＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて、抗ＰＡＲ−２抗体を２９３／Ｄ９、２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃおよび２９３／Ｄ９／ｍＰＡＲ−２ｒｅｃ細胞への結合について試験した。細胞をＭＳＤ高結合型９６ウエルプレートにＰＢＳ中４×１０^４細胞／ウエルの密度でプレーティングし、１時間、室温でインキュベートした。その後、２％ＢＳＡを伴うＰＢＳで細胞をブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。０．５％ＢＳＡを伴うＰＢＳで抗ＰＡＲ−２抗体（１００ｎＭ〜０．０９８ｎＭにわたる範囲）を二倍系列希釈し、それらの細胞を１時間、室温でインキュベートし、その後、０．５％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中で洗浄した。その後、０．１μｇ／ｍＬの濃度のＳｕｌｆｏ−ＴＡＧ標識（Ｓｕｌｆｏ−ｔａｇｇｅｄ）抗ヒトＩｇＧ抗体（ＭＳＤ）を細胞／抗体混合物に添加し、室温でさらに１時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、１×界面活性剤不含読み取り用緩衝液（ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、電気化学発光シグナルをＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒで読み取った。２９３／Ｄ９細胞への抗体結合のシグナルを２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃまたは２９３／Ｄ９／ｍＰＡＲ−２ｒｅｃ細胞へのシグナルから減算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのシグモイド型用量反応モデルを用いて減算データを分析し、ＥＣ_５０およびＢ_ｍａｘ値を報告した（表１８）。ＥＣ_５０値は、細胞への最大結合（Ｂ_ｍａｘ）の５０％を達成するために必要とされる抗体濃度と定義した。

表１８

（実施例６）
抗ＰＡＲ−２抗体によるヒトＰＡＲ−２活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ遮断
２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃ細胞への選択、精製抗ＰＡＲ−２抗体の結合（実施例５参照）によるＰＡＲ−２活性化（シグナリング）の遮断をルシフェラーゼアッセイによって判定した。２９３／Ｄ９／ｈＰＡＲ−２ｒｅｃ細胞を低血清培地中５×１０^４〜１０^５細胞／ウエルにわたる範囲の濃度で９６ウエルプレートにプレーティングし、５％ＣＯ_２での３７℃で一晩インキュベートした。培地を除去し、精製抗ＰＡＲ−２抗体を様々な濃度（５１ｐＭ〜１μＭにわたる範囲）でそれらの細胞に添加し、５％ＣＯ_２での３７℃で１時間インキュベートした。その後、様々な濃度の異なるセリンプロテアーゼ（トリプシン、ヒトトリプシン１、第Ｘａ因子および肺トリプターゼ）をその細胞／抗体混合物に個別に添加し、５％ＣＯ_２での３７℃で５時間インキュベートした。このアッセイにおけるＰＡＲ−２のタンパク質分解的切断は、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーター構築物の発現をもたらすが、低減されたまたは減弱されたルシフェラーゼシグナルレベルは、ＰＡＲ−２切断の阻害を示す。ＩＣ_５０値を表１９に示す。ＮＤ：決定できない。

表１９

表２０に示すように、抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮおよびＨ４Ｈ６１８Ｎは、レポーター細胞におけるＰＡＲ−２のプロテアーゼ活性化を有意に遮断することができた。対照的に、抗ＰＡＲ−２抗体Ｈ４Ｈ５９２Ｎ、Ｈ４Ｈ５９５Ｎ、Ｈ４Ｈ６１１Ｎ、Ｈ４Ｈ６１３Ｎ、Ｈ４Ｈ６１４Ｎ、Ｈ４Ｈ６１５Ｎ、Ｈ４Ｈ６１６Ｎ、Ｈ４Ｈ６１７ＮおよびＨ４Ｈ６１９Ｎは、このアッセイにおいてＰＡＲ−２切断／活性化の測定可能な遮断を一切明示しなかった（データを示さない）。

表２０

この実施例において用いた実験条件下で、抗体Ｈ４Ｈ５７２Ｐ、Ｈ４Ｈ５７３Ｐ、Ｈ４Ｈ５７６Ｐ、Ｈ４Ｈ５７８ＰおよびＨ４Ｈ５８７Ｐについて観察されたＰＡＲ−２シグナリングの遮断はなかったが、抗体Ｈ４Ｈ５７９Ｐ、Ｈ４Ｈ５８０Ｐ、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８３Ｐ、Ｈ４Ｈ５８４Ｐ、Ｈ４Ｈ５８５Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、Ｈ４Ｈ５９１ＮおよびＨ４Ｈ６１８Ｎでの有意な遮断が（様々な程度に）観察された。

もう１つの類似した実験では、ヒトトリプシン１、第Ｘａ因子および肺トリプターゼによって媒介されるＰＡＲ−２シグナリングの抗体遮断を、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択、精製抗ＰＡＲ−２抗体（上で説明したとおり）について判定した。結果を表２１に示す。

表２１．ＩＣ_５０（ｎＭ）

ヒト、サル、マウスまたはラットＰＡＲ−２を発現するＨＥＫ２９３／ＮＦκＢ−ルシフェラーゼ細胞を、漸増量の抗ＰＡＲ−２抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐとのプレインキュベーション後、様々なプロテアーゼで処理し、ＩＣ_５０を決定した。結果を表２２にまとめる。

表２２

用いた特定の実験条件下で、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ抗体は、ヒトおよびサルＰＡＲ−２のプロテアーゼ活性化を有効に阻害したが、マウスまたはラットＰＡＲ−２についてはしなかった。

（実施例７）
ヒトＰＡＲ−２依存性カルシウム動員のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体遮断
カルシウム動員ＦＬＩＰＲアッセイ（カリフォルニア州サニーヴェールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択、精製抗ＰＡＲ−２抗体でのＨＥＫ２９３細胞の処理により、トリプシン刺激ＰＡＲ−２活性化（シグナリング）の遮断を判定した。このアッセイにおいて非ＰＡＲ−２特異的対照抗体も試験した。

簡単に言うと、低血清培地（０．５％ＦＢＳを伴うＤＭＥ）中の８×１０^４ＨＥＫ２９３細胞をＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅプレート（カリフォルニア州サンホゼのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にプレーティングし、５％ＣＯ_２での３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を様々な濃度（０〜１μＭにわたる範囲）の選択抗ＰＡＲ−２抗体、または対照抗体、と共にインキュベートし、その後、トリプシンを添加した。ＰＡＲ−２のトリプシン媒介活性化は、カルシウム動員によって示される。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３（カリフォルニア州サニーヴェールのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でＦｌｕｏ−４ ＮＷ Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してカルシウムシグナリングの細胞内測定値を測定した。トリプシン媒介カルシウムシグナリングの半最大阻害を生じさせるために必要な抗体濃度（ＩＣ_５０）を各実験および対照抗体について測定した。結果をＩＣ_５０（ｎＭ）として表２３に示す。

表２３

この実施例で証明されるように、抗体Ｈ４Ｈ５８１ＰおよびＨ４Ｈ５８８Ｎそれぞれが、対照抗体と比較して有意な程度にトリプシン刺激カルシウムシグナリングを阻害した。

（実施例８）
ＰＡＲ−２ペプチドのトリプシン媒介切断のｉｎ ｖｉｔｒｏ遮断
マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）アッセイを展開して、ヒトＰＡＲ−２ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａ、配列番号：８５２）のトリプシン媒介切断を遮断する選択、精製抗ＰＡＲ−２抗体の能力を判定した。（Ｃ末端またはＮ末端ビオチンを含有する）ビオチン化バージョンのＰｅｐｔｉｄｅ Ａを抗ＰＡＲ−２抗体と混合して３：１の抗体対ペプチドモル比を獲得し、その後、トリプシンをそのペプチド−抗体混合物に添加した。モノ−アビジンによる免疫沈降（ＩＰ）によってビオチン化ペプチドを回収し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。

代表的な実験では、ヒトＩｇＧ４にクローニングした選択、精製抗ＰＡＲ−２抗体（Ｈ４Ｈ５８１ＰおよびＨ４Ｈ５８８Ｎ）を、ビオチン化ＰＡＲ−２ペプチドのトリプシン媒介切断を遮断するそれらの能力について試験した。同じアイソタイプの非ＰＡＲ−２特異的抗体を陰性対照（図３における「Ｎｅｇ Ｃｔｒｌ」）として使用した。Ｈ４Ｈ５８１Ｐおよび陰性対照抗体については、ビオチン化ペプチドを４．７５μＭの最終濃度で使用し、抗体を１４．２５μＭで使用した。Ｈ４Ｈ５８８Ｎについては、ビオチン化ペプチドを２．４５μＭの最終濃度で使用し、抗体を７．３５μＭで使用した。ペプチドおよび抗体をＰＢＳ中で混合し、平衡になるように１時間、室温で放置した。その後、トリプシン（９６ｎｇ）を添加し、その混合物を３７℃で０、５、１０および１５分間インキュベートした。各時点で、ビオチン化ペプチドの１００ｎｇに等しいアリコートを除去し、１０μＬの単量体アビジン樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）と１分間混合した。結合ペプチドを２００μＬのＰＢＳで３回すすぎ、その後、２０μＬの１００ｍＭグリシンｐＨ２．５で溶離した。ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してその溶離ペプチド混合物から塩を除去した。トリプシン切断後に生じた主要ビオチン化ＰＡＲ−２ペプチドの分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によって明らかにして、図３にまとめる。

これらの実験において使用したＰＡＲ−２ペプチドは、２つのＲ／Ｓプロテアーゼ切断部位を含有する。（図３において部位「（１）」で示す）第一の部位は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位のＮ末端側に位置する「上流」切断部位である。（図３において「（２）」で示す）ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位は、切断されたとき、自然に産生するタンパク質においてＰＡＲ−２テザーリガンドを形成する結果となる部位である。異なる部位での切断後に検出されるペプチドのサイズを図３の上の部分（パネルＡ）に示す。

図３（パネルＢ）に示すように、Ｃ末端ビオチンＰＡＲ−２ペプチドは、アイソタイプをマッチさせた対照抗体で処理し、その後、トリプシンインキュベーションを行ったとき、１５５８Ｄａの切断フラグメント（配列番号：８５２の残基１０〜１８を含有）を生じさせた。この１５５８Ｄａフラグメントは、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位（２）での切断の結果である。この切断パターンは、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ抗ＰＡＲ−２抗体を使用する実験においても観察された。それ故、このアッセイによると、対照抗体もＨ４Ｈ５８８Ｎ抗体もＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位（２）でのトリプシン切断を阻害しない。

対照的に、Ｃ末端ビオチンＰＡＲ−２ペプチドは、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ抗体で処理し、その後トリプシンインキュベーションを行ったとき、２０７３Ｄａの切断フラグメント（配列番号：８５２の残基５〜１８を含有）を生じさせた。この２０７３Ｄａフラグメントは、上流切断部位（１）のみでの切断によって生じたフラグメントである。それ故、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位（２）での切断は、明らかにＨ４Ｈ５８１Ｐ抗体によって遮断された。

Ｎ末端ビオチンＰＡＲ−２ペプチドでの実験は、試験したすべての抗体の存在下で、上流切断部位（１）でのトリプシン切断を示し、そのようにして９８８Ｄａ Ｎビオチン化フラグメント（配列番号：８５２の残基１〜４を含有）を生じさせた。従って、試験したいずれの抗体も、これらの実験条件下で上流切断部位（１）での切断を遮断しなかった。

上の実施例６および７に示したように、Ｈ４Ｈ５８１ＰとＨ４Ｈ５８８Ｎの両方が細胞ベースのアッセイにおいてトリプシンによるＰＡＲ−２活性化を遮断した。しかし、本実施例では、Ｈ４Ｈ５８１ＰのみがＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位でのトリプシン切断を遮断した。いずれの機構的理論による拘束も受けないが、従って、Ｈ４Ｈ５８８ＮはＰＡＲ−２のテザーリガンドと１つ以上の細胞外ループ（例えば、ループ１、ループ２および／またはループ３）との相互作用に干渉することによりその阻害作用（単数または複数）を発揮し得るようである。一方、Ｈ４Ｈ５８１Ｐは、主としてプロテアーゼ切断を遮断することによってＰＡＲ−２活性を阻害することができるが、テザーリガンド相互作用にもまた干渉することもできる。

抗ＰＡＲ−２抗体のプロテアーゼ切断遮断特性をさらに調査するために、Ｃ末端ビオチン化マウス、ラットおよびヒトＰＡＲ−２ペプチドを使用して追加のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験を行った。（図４参照）。これらの実験において試験した抗体は、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ、国際公開第２００９／００５７２６号において「１Ａ１」と呼ばれている抗体の重および軽鎖可変領域を有するコンパレーター抗体（図５において「Ｃｏｍｐ．Ａｂ」と呼ぶ）、ならびに陰性対照抗体（図４において「Ｎｅｇ Ｃｔｒｌ」と呼ぶ）であった。（上で説明した）前のＭＡＬＤ−ＴＯＦ実験で用いたのと同じ実験手順をこの実験でも用いた。

これらの実験において使用したペプチドは、それぞれ、トリプシンによって切断され得る多数の部位を（図５において「（１）」、「（２）」および「（３）」で示す）を保有する。各ペプチドについての部位（３）が活性化性プロテアーゼ切断部位である。異なる部位での切断後に生じるペプチドのサイズを図４の上の部分（パネルＡ）に示す。

図４にまとめたように、ビオチン化ヒトＰＡＲ−２ペプチドは、Ｈ４Ｈ５８１Ｐでの処理の後、およびトリプシンインキュベーション後、２０７４ｋＤａペプチドを生じさせた。これは部位（１）のみでの切断に対応する。それ故、Ｈ４Ｈ５８１Ｐは、部位（２）での切断も部位（３）での切断も遮断する。対照的に、ヒトＰＡＲ−２ペプチドは、コンパレーター抗体で処理した後、およびトリプシンインキュベーション後、２５０２ｋＤａで維持された。これは切断がないことを意味する。それ故、コンパレーター抗体は、このアッセイにおいて、最Ｎ末端部位（１）を含む３つすべてのプロテアーゼ切断部位を遮断する。抗体Ｈ４Ｈ５８８Ｎで前処理したとき、ヒトＰＡＲ−２ペプチドは、トリプシン切断後に１７７２ｋＤａフラグメントと１５５８ｋＤａフラグメントの両方を生じさせた。この切断パターンは、Ｈ４Ｈ５８８Ｎが活性化性部位（３）での切断を部分的に遮断するが、中間部位（２）を完全に遮断することを示唆する。

この実験を、Ｓａｍ−１１と呼ばれている抗体（Ｍｏｌｉｎｏら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：８２５−８３２（１９９８））の重および軽鎖可変領域を有するコンパレーター抗体を使用することによっても行った。予想どおり、この特定のコンパレーター抗体は、いずれのプロテアーゼ切断部位における切断も遮断しなかった（データを示さない）。

（実施例９）
ＰＡＲ−２ペプチドのアラニンスキャニング突然変異誘発によるエピトープマッピング
ＰＡＲ−２抗体が相互作用するＰＡＲ−２のアミノ酸をさらに詳細に同定するために、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位を含むペプチドを使用してアラニンスキャニング研究を行った。これらの実験については、ヒトＰＡＲ−２（配列番号：８５１）の位置３５から４５の各アミノ酸を個々にアラニンに置き換えることで１１の別個のＣ末端ビオチン化ペプチド（配列番号：８７１〜８８２）を合成した。ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の直ぐＣ末端側に位置する１４のアミノ酸を含む追加のＣ末端ビオチン化ペプチドセットも使用し、Ｖａｌ−４２および／またはＡｓｐ−４３をアラニンに変えた（配列番号：８８４〜８８７）。

ＰＡＲ−２抗体に結合する各ペプチド突然変異体の能力を、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ；ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて測定した。各ペプチド（２．５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン被覆バイオセンサーチップ（Ｏｃｔｅｔ ＳＡセンサー）上に１０秒間、捕捉した。各ペプチドとＰＡＲ−２抗体との結合および解離を測定するために、それらのペプチド被覆バイオセンサーをＰＡＲ−２抗体の２００ｎＭ溶液と５分間接触させ（結合）、その後、１０分間、抗体を伴わない緩衝液に移した（解離）。個々の抗体結合シグナルをそのペプチドについて観察された原ペプチド負荷シグナルで割って個々のバイオセンサー上のペプチド負荷量のわずかな変動を修正した後のネイティブ・シグナル・パーセントとして、各ペプチドへのＰＡＲ−２抗体の結合を表示した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒバージョン２．０ａ曲線当てはめソフトウェアを使用して解離曲線から解離半減期（Ｔ_１／２）を計算し、個々のペプチドについて観察された半減期を天然ペプチドの半減期で割ることによって相対半減期を計算した。結果をＷＴペプチドに対する結合パーセントおよびＴ_１／２パーセントとして表示する（表２４〜２８）。［コンパレーター１＝国際公開第２００９／００５７２６号において「１Ａ１」と呼ばれている抗体の重および軽鎖可変領域を有する抗体：コンパレーター２＝Ｓａｍ−１１と呼ばれている抗体（Ｍｏｌｉｎｏら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１８：８２５−８３２（１９９８））の重および軽鎖可変領域を有する抗体；ならびにコンパレーター３＝米国特許出願公開第２０１０／０１１９５０６号において「ＰＡＲ−Ｂ」と呼ばれている抗体の重および軽鎖可変領域を有する抗体］。一定の場合、結合実験を反復した（縦列見出し実験１および実験２で示す）。ＮＢ＝観察される結合なし。

表２４：Ｈ４Ｈ５８１Ｐ

表２５：Ｈ４Ｈ５８８Ｎ

表２６：コンパレーター１

表２７：コンパレーター２

表２８：コンパレーター３

アラニンスキャニング実験の結果を図５にまとめる。この図中の黒丸は、アラニンに変えられたとき、対応する抗体による結合を実質的に低減する（すなわち、突然変異ペプチドに結合する抗体Ｔ１／２が、野生型ペプチドに結合する抗体のＴ１／２の３０％未満である）ＰＡＲ−２のアミノ酸を示す。（図５中の白三角は、非活性化性上流プロテアーゼ切断部位を示し、および黒三角は、活性化性プロテアーゼ切断部位を示す）。図５に図示するように、コンパレーター１および３は、活性化性プロテアーゼ切断部位の両側の残基での突然変異に対して感受性であった。対照的に、抗体Ｈ４Ｈ５８１ＰおよびＨ４Ｈ５８８Ｎは、活性化性プロテアーゼ切断部位のＣ末端側において見いだされる残基での突然変異に対してしか感受性でない。それ故、ＰＡＲ−２上のＨ４Ｈ５８１Ｐ結合部位は、コンパレーター１および３抗体の結合部位に対してＣ末端方向に約２〜４アミノ酸シフトされたように見え、Ｈ４Ｈ５８８Ｎ結合部位は、Ｈ４Ｈ５８１Ｐ結合部位からＣ末端方向に約２〜４アミノ酸シフトされる。コンパレーター２抗体は、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位の下流の１４のアミノ酸を含むペプチド、すなわちＳＬＩＧＫＶＤＧＴＳＨＶＴＧ（配列番号：８８４の残基１〜１４）、のみに結合し、アスパラギン酸残基（配列番号：８５１のＡｓｐ−４３）での突然変異に対して感受性であったが、バリン残基（配列番号：８５１のＶａｌ−４２）での突然変異に対しては感受性でなかった。

有意なことに、この実験は、抗体Ｈ４Ｈ５８１ＰおよびＨ４Ｈ５８８Ｎ両方が、ＰＡＲ−２活性化性プロテアーゼ切断部位のＣ末端側に位置する最初のＶおよびＤ残基（すなわち、配列番号：８５１のＶａｌ−４２およびＡｓｐ−４３）と相互作用するが、コンパレーター１および３抗体は、これらの残基のいずれとも相互作用せず、コンパレーター２抗体は、Ａｓｐ−４３と相互作用するがＶａｌ−４２とはしないことを示している。コンパレーター抗体と比較したときのＰＡＲ−２上のＨ４Ｈ５８１Ｐの結合シフトは、以下のｉｎ ｖｉｖｏ実施例において実証されるように、コンパレーターに対するＨ４Ｈ５８１Ｐの機能的優位性の説明となり得る。

（実施例１０）
そう痒モデルにおける抗ＰＡＲ−２抗体の用量反応
この実施例では、２つの異なるプロテアーゼ誘導そう痒モデルにおいて痒みを減弱する抗ＰＡＲ−２抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐの能力を評価した。ヒトＰＡＲ−２（ｈＰＡＲ２^＋／＋）を発現するトランスジェニックマウスをこの実験におけるすべてのコホートに使用した。マウスの別個のコホートに１５０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のアイソタイプ対照ｍＡｂまたは１０、２５、５０、７５、１００および１５０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のＨ４Ｈ５８１Ｐを施した。抗体投薬の２４時間後、すべてのコホートに１５０μｇのブタトリプシン、または１０μｇの組換えヒトベータトリプターゼを施し（ｓ．ｃ．、肩甲骨間）、３０から６０分間のひっかき行動の発作を生じさせた。トリプシン注射前にＨ４Ｈ５８１Ｐを施したマウスにおいて、２５ｍｇ／ｋｇの推定ＥＤ_５０で、用量反応関係が観察された。これらの実験結果を、トリプシン投与後３０分間にわたってまたはトリプターゼ投与後６０分間にわたって記録したひっかき発作の総数の変化パーセントによって表示し、表２９に示す（すべてのデータは、平均±ＳＥＭとして表す；ＮＤ＝決定できない；^＊＝アイソタイプ対照群と比較してｐ＜０．０５）。

表２９

この実施例において証明されるように、ｍＡｂ Ｈ４Ｈ５８１Ｐは、２つの異なるプロテアーゼ誘導痒みモデルを使用して用量依存的にプロテアーゼ誘導そう痒行動を遮断できた。

（実施例１１）
ハプテン誘導慢性皮膚炎モデルにおける抗ＰＡＲ−２抗体の投与によるそう痒行動の低減
生理学的に意義のある疾病状態においてそう痒行動を低減する抗ＰＡＲ−２抗体Ｈ４Ｈ５８１Ｐの能力をさらに評価するために、慢性皮膚炎のマウスモデルを使用した。このモデルでは、ハプテン化剤、オキサゾロン、の反復皮膚適用をマウスに施した。この慢性オキサゾロン誘導皮膚炎モデルは、ヒトにおけるアトピー性皮膚炎の多くの臨床的、組織学的および免疫学的ホールマークを再現することが証明されている（Ｍａｎら、２００８、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２８（１）：７９−８６）。

マウスを左耳への１％オキサゾロンまたはビヒクル（１００ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の単回皮膚適用で感作した。その後、その感作適用の７日後に始めて肩甲骨間への０．６％オキサゾロンの合計９回の皮膚適用をマウスに施した。Ｈ４Ｈ５８１Ｐ抗ＰＡＲ−２抗体の週１回の投薬（合計３回）を、初回オキサゾロン攻撃（１００ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の２４時間前に開始した。この投薬パラダイムは、最終オキサゾロン攻撃によって惹起されたひっかき発作の減少数によって測定したとき、そう痒行動を有意に低減した。すべてのデータを、ｎ＝６マウス／群についてのひっかき発作の平均数±ＳＥＭとして表す（^＊＝オキサゾロン＋ＩｇＧ対照群と比較したときテューキー（Ｔｕｋｅｙ）ポストホック検定によりｐ＜０．０５；＃＝ビヒクル＋ＩｇＧ対照群と比較したときテューキー・ポスト・ホック検定によりｐ＜０．０５）。

表３０

組織学的分析により、オキサゾロン攻撃動物において表皮過形成および免疫細胞浸潤の有意な増加が証明された。（データは示さない）。Ｈ４Ｈ５８１Ｐ抗ＰＡＲ−２抗体とアイソタイプ対照の間にこれらのパラメータの有意差は一切観察されなかった。

（実施例１２）
ｍＡｂ Ｈ４Ｈ５８１Ｐのそう痒抑制活性の比較
この実施例では、マウスそう痒モデルにおいて痒み発作を減弱するｍＡｂ Ｈ４Ｈ５８１Ｐの能力をコンパレーター抗ＰＡＲ−２ ｍＡｂ（国際公開第２００９／００５７２６号に記載されているコンパレーター「１Ａ１」）のものと比較した。

ヒトＰＡＲ−２（ｈＰＡＲ２^＋／＋）を発現するトランスジェニックマウスを３コホートに分けた。コホートＡには５０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のアイソタイプ対照ｍＡｂを施し、コホートＢには５０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のＨ４Ｈ５８１Ｐを施し、コホートＣには５０ｍｇ／ｋｇ（ｓ．ｃ．）のコンパレーター抗ＰＡＲ−２抗体を施した。抗体投薬の２４時間後、すべてのコホートに１５０μｇのトリプシン（ｓ．ｃ．、肩甲骨間）を施し、３０分間、ひっかき行動の発作を生じさせた。対照処置マウスと比較したときの処置マウスについて観察されたひっかき発作数の変化パーセントを表２９に示す（すべてのデータを平均±ＳＥＭとして表す）。

表３１

この実施例において証明されるように、ここで用いたトリプシン誘導痒みモデルにおいて、ｍＡｂ Ｈ４Ｈ５８１Ｐは、そう痒行動を低減する点でコンパレーターｍＡｂより実質的に有効であった。

本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載したものに加えて本発明の様々な変形が上の説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変形は添付の請求項の範囲に入ると解釈される。

Claims (1)

1. 明細書に記載された発明。

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