TW201701903A - 抗人類ｇｄｆ８之抗體 - Google Patents

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特雷弗 斯蒂特
埃斯特 拉崔斯
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再生元醫藥公司
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Abstract

本發明提供一種單離的人類或人類化抗體或其片段，其特異性結合生長及分化因子-8(GDF8)並阻斷GDF8活性。該抗體或抗體片段可用於治療方法中，以供治療藉由抑制GDF8而改善或改進的病況或病症，諸如肌肉組織流失、與肌肉萎縮、肌肉萎縮症、肌肉消瘦症候群、肌肉減少症或惡病質；代謝障礙或第II型糖尿病相關的病況或病症，藉此改善葡萄糖恆定、降低脂肪質量、增加胰島素敏感性、改善腎臟功能及/或降低脂肪累積，或特徵在於骨質流失的病況，例如與骨質疏鬆症、骨量稀少、骨關節炎及/或骨折相關的病況。

Description

抗人類GDF8之抗體
本發明是有關對生長及分化因子-8(GDF8)具有特異性的抗體及其抗原-結合片段。
已知作為肌肉生長抑制素(myostatin)的生長及分化因子-8(GDF8)是生長因子TGF-β超家族的成員。GDF8是骨骼肌質量的負向調節子，在發育中與成人骨骼肌中高度表現。
GDF8在物種間是高度守恆的，且鼠與人類GDF8的胺基酸序列相同(人類GDF8核酸序列和胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：338-339)(McPherron et al.1977 Nature 387：83-90)。
一些人類疾病與肌肉組織的喪失或損傷有關，例如肌肉萎縮症(muscular dystrophy)、肌肉萎縮(muscle atrophy)、肌肉消瘦症候群(muscle wasting syndrome)、肌肉減少症(sarcopenia)與惡病質(cachexia)，且GDF8的抑制劑可應用於治療這些疾病或病症。
在例如US 6,096,506、US 7,320,789、US 7,807,159、WO 2007/047112、WO 2005/094446、US 2007/0087000、US 7,261,893與WO 2010/070094中揭示抗-GDF8的抗體以及治療方法。
發明摘述
本發明提供特異性結合人類生長及分化因子8(GDF8)的人類或人類化抗體及人類或人類化抗體之抗原-結合片段。這些抗體的特徵在於以高親和性結合至GDF8以及中和GDF8活性的能力。抗體可以是全長(例如IgG1或IgG4抗體)或可僅包含一抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可被修飾成影響功能性，例如消除殘餘效應子功能(Reddy et al.(2000)J.Immunol.164：1925-1933)。
在一個具體例中，本發明抗體包含選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組中的重鏈可變區(HCVR)胺基酸序列：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、360與376或其實質相同的序列。
在一個具體例中，本發明抗體包含選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組中的輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、322、368與384或其實質相同的序列。
在一個具體例中，本發明抗體包含有HCVR胺基酸序列以及LCVR胺基酸序列，其中HCVR/LCVR對序列是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、114/322、360/368以及376/384。
本發明亦載示一種人類或人類化抗體或抗體之抗原-結合片段，其包含一重鏈互補決定區3(HCDR3)胺基酸序列以及一輕鏈CDR3胺 NO所構成之群組：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、366及382或其實質相同的序列，而LCDR3胺基酸序列是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、328、374及390或其實質相同的序列。在另一個具體例中，抗體或其片段包含選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、120/328、366/374及382/390。
在一個相關具體例中，抗體或其片段進一步包含重鏈CDR1(HCDR1)與CDR2(HCDR2)胺基酸序列及輕鏈CDR1(LCDR1)與CDR2(LCDR2)胺基酸序列，其中HCDR1胺基酸序列是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、362及378或其實質相同的序列；HCDR2胺基酸序列是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、364及380或其實質相同的序列；LCDR1胺基酸序列是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、324、370及386或其實質相同的序列；而LCDR2胺基酸序列是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、326、372及388或其實質相同的序列。在另一個具體例中，HCDR1、 HCDR2與HCDR3是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：36/38/40、116/118/120、228/230/232、362/364/366以及378/380/382；而LCDR1、LCDR2與LCDR3是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：44/46/48、124/126/128、236/238/240、370/372/374與386/388/390。在又另一個具體例中，重鏈與輕鏈CDR是選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：36/38/40/44/46/48(例如21-E5)、116/118/120/124/126/128(例如8D12)、228/230/232/236/238/240(例如1A2)、362/364/366/370/372/374(例如H4H1657N2)以及378/380/382/386/388/390(例如H4H1669P)。
在一個相關具體例中，本發明包括特異性結合GDF8的抗體或抗體之抗原-結合片段，其中抗體或片段包含重鏈與輕鏈可變區序列中所含有的重鏈與輕鏈CDR區，其選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、114/322、360/368以及376/384。用於鑑定落在HCVR與LCVR胺基酸序列中的CDRs的方法及技術在該技藝中為已知的，且可用來鑑定本文中揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內之CDRs。可用於鑑定CDRs邊界的例示性習知技術包括，例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在通常術語中，Kabat界定法是以序列變異性為基礎，Chothia界定法是以結構環區的位置為基礎，而AbM界定法是一種介於Kabat與Chothia法之間的折衷法。參見，例如Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公開資料庫亦可用來鑑定抗體內的CDR序列。
本發明亦提供編碼本發明抗體或抗原-結合片段之核酸分子。帶有本發明之抗體編碼核酸的重組型表現載體與該等載體引入的宿主細胞，以及藉由培養本發明之宿主細胞來製造本發明抗體之方法亦被本發明所涵括。
在一個具體例中，本發明抗體包含由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼的HCVR：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、359與375，或其具有至少95%同源性之實質相似序列。
在一個具體例中，本發明抗體包含由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼的LCVR：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、321、367與383，或其具有至少95%同源性之實質相似序列。
在一個具體例中，本發明抗體包含HCVR胺基酸序列以及LCVR胺基酸序列，其中HCVR/LCVR對序列是由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核酸分子對所編碼：1/9、17/25、33/41、49/57、65/73、81/89、97/105、113/121、129/137、145/153、161/169、177/185、193/201、209/217、225/233、241/249、257/265、273/281、289/297、305/313、113/321、359/367與375/383。
本發明亦載示一種人類或人類化抗體或抗體片段，其包含由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼的HCDR3：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、365及381，或其具有至少95%同源性之實質上相似序列，以及由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼的LCDR3：15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、 319、327、373及389，或其具有至少95%同源性之實質上相似序列。在一個具體例中，HCDR3/LCDR3組是由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列對所編碼：7/15、23/31、39/47、55/63、71/79、87/95、103/111、119/127、135/143、151/159、167/175、183/191、199/207、215/223、231/239、247/255、263/271、279/287、295/303、311/319、119/327、365/373及381/389。
在一個相關具體例中，抗體或抗體片段進一步包含HCDR1與HCDR2，以及LCDR1與LCDR2，其中HCDR1是由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、361及377，或其具有至少95%同源性之實質相似序列，HCDR2是由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、363及379，或其具有至少95%同源性之實質相似序列，LCDR1是由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、323、369及385，或其具有至少95%同源性之實質相似序列，而LCDR2是由選自於下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、325、371及387，或其具有至少95%同源性之實質相似序列。在一個具體例中，該抗體或抗體片段包含由下列SEQ ID NO的核酸序列組所編碼的重鏈與輕鏈CDRs：35/37/39/43/45/47、115/117/119/123/125/127、227/229/231/235/237/239、361/363/365/369/371/373或377/379/381/385/387/389。
本發明亦載示一種特異性結合GDF8的單離抗體或抗體片段，其包含選自由下列所構成之群組的重鏈與輕鏈CDRs：(a)HCDR1，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO：329)之胺基酸序列，其中X1為Gly；X2為Phe；X3為Thr；X4為Phe；X5為Ser；X6為Ala或Ser；X7為Phe或Tyr；X8為Gly或Ala；(b)HCDR2，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(SEQ ID NO：330)之胺基酸序列，其中X1為Ile；X2為Gly或Ser；X3為Tyr或Gly；X4為Ser或Asp；X5為Gly；X6為Gly；X7為Ser或Asn；而X8為Ala或Glu；(c)HCDR3，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14(SEQ ID NO：331)之胺基酸序列，其中X1為Ser或Ala；X2為Thr或Lys；X3為Asp或Ile；X4為Gly或Ser；X5為Ala或His；X6為Trp或Tyr；X7為Lys或Asp；X8為Met或Ile；X9為Ser或Leu；X10為Gly或Ser；X11為Leu或Gly；X12為Asp或Met；X13為Val或Asp；X14為Val或不存在；(d)LCDR1，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO：332)之胺基酸序列，其中X1為Gln；X2為Asp或Gly；X3為Ile；X4為Ser；X5為Asp或Asn；而X6為Tyr或Trp；(e)LCDR2，含有式X1-X2-X3(SEQ ID NO：333)之胺基酸序列，其中X1為Thr或Ala；X2為Thr或Ala；而X3為Ser；以及(f)LCDR3區，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO：334)之胺基酸序列，其中X1為Gln；X2為Lys或Gln；X3為Ala或Tyr；X4為Asp或Asn；X5為Ser；X6為Ala或Phe；X7為Pro；X8為Leu；而X9為Thr。
本發明亦載示一種完整人類或人類化抗體或抗體片段，當藉由表面電漿共振分析(例如BIACORETM)來測定時，其以約1nM或更低的親和性(以解離常數「KD」表示)結合GDF8。在某些具體例中，本發明抗體展現出約700pM或更低、約500pM或更低、約320pM或更低、約160pM或更低、約100pM或更低、約50pM或更低、約10pM 或更低或約5pM或更低的KD。
在一個具體例中，本發明提供一種完整人類或人類化單株抗體(mAb)，其特異性結合並抑制人類GDF8，且當藉由GDF8誘發螢光素酶分析來測定時展現出低於或等於約10nM、約5nM或更低、約3nM或更低、約2nM或更低、約1nM或更低、約500pM或更低或約200pM或更低的IC50。如下面實驗節中所示，本發明的一些抗-GDF8抗體以遠高於GDF8在螢光素酶生物分析中的IC50阻斷極相關蛋白質(諸如GDF11)的活性。在一個具體例中，本發明提供一種抗體或抗體的抗原-結合片段，其就阻斷GDF11活性來說相對於GDF8展現出至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍、至少約1000倍或至少約1500倍高的IC50。
本發明涵括具有經修飾糖化型態的抗-GDF8抗體。在一些應用中，移除非所欲糖化位址的修飾可能是有用的，或缺乏存在於寡醣鏈上的海藻糖部分的抗體會增加例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，糖化修飾可能是為了修飾補體依賴性毒性(CDC)而做出。
本發明包括結合GDF8的特定抗原決定區且能夠阻斷GDF8生物活性的抗-GDF8抗體。在第一個具體例中，本發明抗體在從約1至約109、從約1至約54、從約1至約44、從約1至約34、從約1至約24以及從約1至約14胺基酸內結合成熟GDF8蛋白(SEQ ID NO：340)的一個抗原決定區。在第二個具體例中，本發明抗體在從約35至約109、從約45至約109、從約55至約109、從約65至約109、從約75至約109、從約85至約109、從約92至約109或從約95至約109胺基酸內結合成熟GDF8蛋白(SEQ ID NO：340)的一或多個抗原決定區。在第三個具體例中，該抗體或抗體的抗原-結合片段從約胺基酸殘基48至約72、從約48至約69、從約48至約65、從約52至約72、 從約52至約65或從約56至約65結合於成熟人類GDF8蛋白質的一個抗原決定區內。
在一個相關具體例中，本發明提供一種抗體或其抗原-結合片段，其與另一種抗體競爭特異性結合GDF8，該抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO：36/38/40/44/46/48、116/118/120/124/126/128、228/230/232/236/238/240、362/364/366/370/372/374或378/380/382/386/388/390的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3胺基酸序列組合。在一個具體例中，本發明的抗體或抗原-結合片段與另一種抗體競爭特異性結合GDF8，該抗體或抗原-結合片段包含SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、114/322、360/368或376/384的HCVR/LCVR胺基酸序列對。在又另一個相關具體例中，本發明提供辦識由另一種抗體所辨識之GDF8的抗原決定區之抗體或其抗原-結合片段，該抗體或其抗原-結合片段包含下列SEQ ID NO的HCDR/LCDR胺基酸序列組合：36/38/40/44/46/48、116/118/120/124/126/128、228/230/232/236/238/240、362/364/366/370/372/374或378/380/382/386/388/390。在一個具體例中，本發明的抗體或抗原-結合片段辨識由另一種抗體所辨識之GDF8的抗原決定區，其包含下列SEQ ID NO的HCVR/LCVR胺基酸序列對：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、114/322、360/368或376/384。
本發明亦載示一種包含重組型人類或人類化抗人類GDF8抗體及可接受載劑的組成物。本發明更包括載體及含有載體(具有編碼本發 明人類抗-GDF8抗體之核酸分子)的宿主細胞，以及製造這些新穎抗體的方法，該方法包含在允許生產蛋白質且回收所產蛋白質的條件下令含有編碼本發明抗-GDF8抗體或抗體片段之核酸的宿主細胞生長。
本發明亦載示使用本發明之抗體或其抗原結合部分抑制GDF8活性的方法。在一個具體例中，該方法包含將本發明之抗體或抗體片段投與罹患因為抑制GDF8活性而能被改善之病症的人類個體。在較佳具體例中，以本發明抗體或抗體片段治療的人類個體需要改善葡萄糖恆定、降低脂肪質量、增加胰島素敏感性、改善腎臟功能及/或降低脂肪累積。本發明抗體或抗體片段可用於治療、預防或抑制特徵在於骨質流失(bone loss)的疾病或病況(包括骨質疏鬆症、骨量減少(osteopenia)、骨關節炎與骨折)、治療代謝症候群、對抗因為持續投與糖皮質素和類固醇激素所致的肌肉消瘦，或與肌肉萎縮症、肌肉萎縮、肌肉消瘦症候群、肌肉減少症與惡病質相關的肌肉減少。
其他目的以及優點將因為檢閱下面詳細說明而變得清楚。
發明之詳細說明
在說明本發明方法之前，要理解本發明不限於所述特定方法以及實驗條件，因為這些方法以及條件可能會改變。亦要理解本文中所用術語僅供說明特定具體例之用，而不是限制性的，因為本發明的範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一」、「一種」與「該」包括複數指示對象(referent)，除非內文另有清楚指明。因此，例如參照「方法」包括一或多種方法，及/或本文所述類型的步驟及/或習於技藝者在閱讀過本揭示內容後將會變得清楚者。
除非另有定義，所有此處使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。如本文所用，術語 「約」，當使用在有關特定引用的數值時，表示該數值可自所引用的數值起改變達不超過1%。舉例而言，如本文所用，詞句「約100」包括99與101以及其間的所有數值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等等)。
儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可應用於實施或測試本發明，現將說明較佳的方法以及材料。
定義
「人類生長分化因子-8」、「GDF8」與「肌肉生長抑制素」交替使用來意指由SEQ ID NO：338的核酸序列所編碼的蛋白質以及具有SEQ ID NO：339(前肽)與340(成熟肽)的胺基酸序列的蛋白質。
術語「抗體」，如本文所用，包括免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈，以及其集合體(例如IgM)。各個重鏈含有1個重鏈可變區域(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區域。重鏈恆定區域含有3個區，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區域(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域含有1個區(CL1)。VH與VL區域可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區域(complementarity determining regions,CDRs))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區域(FR))。各個VH與VL由3個CDRs以及4個FRs所構成，以下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的不同具體例中，抗-GDF8抗體(或其抗原結合部分)的FR可能與人類生殖細胞序列相同，或可以經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可以依據並行分析兩個或多個CDRs來確定。
術語「抗體」，如本文所用，亦包括完整抗體分子的抗原-結合片段。如本文所用，術語抗體的「抗原結合部分」、抗體的「抗原-結合 片段」及類似者包括任何天然存在的、酵素上所得到的、合成的或經遺傳工程的多肽或糖蛋白，其特異性結合抗原而形成複合物。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作並表現編碼抗體可變與視情況恆定區之DNA的重組型遺傳工程技術)而衍生自例如完整抗體分子。這樣的DNA是已知的及/或易於從例如商業來源、DNA圖書館(包括，例如噬菌體抗體圖書館)獲得或可合成。DNA可以被定序且以化學的方式或使用分子生物技術來操作，例如以將一或多個可變及/或恆定區排入適當構型中，或引入會產生半胱胺酸殘基的密碼子、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原-結合片段的非限定實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；與(vii)由模擬抗體的超變異區域之胺基酸殘基所構成的最小辨認單元(例如單離的互補決定區域(CDR))。其他經工程化的分子(諸如雙鍵抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及微抗體)亦涵括在如本文所用「抗原-結合片段」的詞句中。
抗體的抗原-結合片段典型含有至少1個可變區。可變區可以是任何大小與胺基酸構成，且通常含有至少1個鄰近1或多個骨架序列或在1或多個骨架序列中的CDR。在帶有與VL區締合之VH區的抗原-結合片段中，VH以及VL區可相對另一者位在適當排列處。舉例而言，可變區是二聚物且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚物。另擇地，抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL區。
在某些具體例中，抗體的抗原-結合片段可含有至少1個共價連結至少1個恆定區的可變區。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定區的非限定例示性構型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi) VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變與恆定區的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構型)，可變與恆定區可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區域是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相鄰可變和/或恆定區間產生彈性或半彈性鍵聯。此外，本發明之抗體的抗原-結合片段可包含有上列可變與恆定區構型的任一者彼此和/或與一或多個單體VH或VL區以非共價締合(例如藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完整抗體分子而言，抗原-結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原-結合片段典型包含有至少2個不同可變區，其中各個可變區能夠特異性結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定區。任一種多特異性抗體形式，包括此處所揭示的例示性雙特異性抗體形式，可使用該技藝中可取得之慣用技術而改造成使用於本發明之抗體的抗原-結合片段中。
本發明抗體可透過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)而作用。「補體依賴性細胞毒性」(CDC)意指藉由本發明抗體在補體存在下溶解抗原表現細胞。「抗體依賴性細胞媒介細胞毒性」(ADCC)意指細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcRs)的非特異性細胞毒殺細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球與巨噬細胞)會辨識結合在標的細胞上的抗體並因此造成標的細胞溶解。CDC與ADCC可以使用該技藝中熟知且可取得的分析來測定(參見，例如美國專利第5,500,362號與第5,821,337號，以及Clynes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656(1998))。
術語「特異性結合」或類似者意指抗體或其抗原-結合片段與抗原形成一個在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合的特徵可以 是約1x10-6M或更低的解離常數。用於決定2個分子是否特異性結合的方法在該技藝中為習知的並包括，例如，平衡透析、表面電漿共振以及類似者。舉例而言，「特異性結合」人類GDF8的抗體，當使用在本發明的上下文時，包括結合人類GDF8或其部分(例如，含有SEQ ID NO：340的至少6個連續胺基酸之肽)的抗體，其中當以表面電漿共振分析來測定時，KD低於約1000nM，低於約500nM，低於約300nM，低於約200nM，低於約100nM，低於約90nM，低於約80nM，低於約70nM，低於約60nM，低於約50nM，低於約40nM，低於約30nM，低於約20nM，低於約10nM，低於約5nM，低於約4nM，低於約3nM，低於約2nM，低於約1nM或低於約0.5nM(參見例如本文的實施例3)。但是，特異性結合人類GDF8的單離抗體可能具有與其他抗原(諸如來自於其他物種的GDF8分子)有交叉反應性。
術語「高親和性」抗體意指當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM或溶液-親和性ELISA)來測量時，能夠以約10-8M或更低、約10-9M或更低、約10-10M或更低、約10-11M或更低，或約10-12M的解離常數(KD)結合GDF8的抗體。
依據術語「低解離速率」或「Koff」表示當藉由表面電漿共振(例如BIACORETM)來測量時，以1x10-3s-1或更低，較佳地1x10-4s-1的速率常數自GDF8解離的抗體。
「中和」或「阻斷」抗體欲意指一種結合至GDF8而抑制GDF8之生物活性的抗體。抑制GDF8的生物活性可藉由測定GDF8生物活性的一或多個指標來評估。GDF8生物活性的這些指標可以藉由該技藝中已知的數種標準活體外或活體內分析中的一或多者來評估。
與對應的生殖細胞序列相較之下，本文所揭示的完整-人類抗-GDF8抗體在骨架和/或重鏈以及輕鏈可變區的CDR區域處可包含有一或多個胺基酸置換、插入和/或刪除。此等突變可易於藉由將此處所 揭示的胺基酸序列與可得自於例如公開抗體序列資料庫的生殖細胞序列相比對而確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，它們是自此處所揭示的任一胺基酸序列衍生而來，其中在一或多個骨架和/或CDR區域內的一或多個胺基酸回復突變成對應的生殖細胞殘基(等)或回復突變成對應生殖細胞殘基(等)的守恆性胺基酸置換(天然或非天然)(這樣的序列改變於此意指為「生殖細胞回復突變」)。該技藝中具有通常知識者可容易地由此處所揭示的重鏈以及輕鏈可變區域序列製造出眾多抗體以及抗原-結合片段，它們包含有一或多個獨立的生殖細胞回復突變或其組合。在某些具體例中，所有在VH和/或VL區中的骨架和/或CDR殘基突變回復成生殖細胞序列。在其他具體例中，僅有某些殘基突變回復成生殖細胞序列，例如僅僅在FR1的前8個胺基酸或FR4的最後8個胺基酸中被發現到有突變殘基，或僅僅在CDR1、CDR2或CDR3中發現到有突變殘基。再者，本發明的抗體在骨架和/或CDR區域內可含有2或多個生殖細胞回復突變的組合，亦即，其中某些單獨殘基突變回復成生殖細胞序列，而某些其他不同於生殖細胞序列的殘基仍保留著。在得到之後，含有一或多個生殖細胞回復突變的抗體以及抗原-結合片段可易於測試一或多個所欲特性，諸如增進的結合特異性、增高的結合親和性、增進或增高的拮抗或促效生物特性(視情況)、降低的免疫原性等。以這樣一般的方式所得到的抗體以及抗原-結合片段涵括在本發明中。
本發明亦包括抗-GDF8抗體，其包含有本文所揭示之具有一或多個守恆性置換的HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列任一者的變異體。舉例來說，相對於此處所揭示的任一HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列，本發明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少個等守恆性胺基酸置換的抗-GDF8抗體。在一個具體例中，該抗體包含有一選 自SEQ ID NO：360與376(有8個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在另一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：360與376(有6個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在另一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：360與376(有4個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在另一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：360與376(有2個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：368與384(有8個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。在另一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：368與384(有6個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。在另一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：368與384(有4個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。在另一個具體例中，該抗體包含有一選自SEQ ID NO：368與384(有2個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。
在某些具體例中，本發明的抗體或抗體片段可接合至一個治療部分(「免疫接合物」)，諸如細胞毒素、化學治療藥物以及免疫抑制劑或放射線同位素。
如本文所用，就本發明而言，「單離的抗體」意指已被鑑定且自其天然環境的至少一組份中被分離及/或回收的抗體。舉例而言，已自生物、組織或細胞(抗體天然存在或天然被製造出)的至少一組份中被分離或移除的抗體是「單離的抗體」。單離的抗體亦包括在重組型細胞中原位的抗體，以及已進行至少一種純化或分離步驟的抗體。依據某些具體例，分離抗體可能實質上沒有其他細胞物質和/或化學品。
如本文所用，術語「表面電漿共振」意指一種在生物偵測器矩陣中藉由偵測蛋白質濃度變化而容許分析即時交互作用的光學現象(例 如使用BIAcoreTM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.))。
如本文所用，術語「KD」，欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。
術語「抗原決定區」包括任何能夠特異性結合免疫球蛋白或T細胞受體的決定位，較佳地多肽決定位。在某些具體例中，抗原決定區決定位包括分子在化學上有活性的表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷酸基團或磺醯基，而在某些具體例中，可具有特定三維結構特性，及/或特定電荷特性。抗原決定區是一個被抗體所結合的抗原區域。在某些具體例中，抗體被認為會偏好在蛋白質及/或巨分子的複合混合物中辨識其標的抗原而特異性結合抗原。舉例而言，當KD低於或等於10-8M，低於或等於10-9M，或低於或等於10-10M時，抗體被認為特異性結合抗原。
當至少約60%至75%的樣品表現出單一類型的多肽時，蛋白質或多肽為「實質純的」、「實質同源的」或「實質純化的」。多肽或蛋白質可能是單體或集合體。實質純的多肽或蛋白質典型地含有約50%、60%、70%、80%或90% w/w的蛋白質樣品，通常約95%，且較佳地超過99%是純的。蛋白質純度或同源性可以藉由一些該技藝中已知的方式來表示，諸如蛋白質樣品的聚丙烯醯胺凝膠電泳，接著以該技藝中熟知的染料來對凝膠染色之後視觀單一多肽帶。為某些目的起見，可藉由使用HPLC或其他該技藝中已知用於純化的方式提供較高分辨率。
如本文所用，術語「多肽類似物或變異體」意指含有至少25個胺基酸片段(實質與胺基酸序列的一部分相同)且具有下列特性的至少一者的多肽：(1)在適當的結合條件下特異性結合GDF8，或(2)阻斷GDF8生物活性的能力。典型地，多肽類似物或變異體含有關於天然 存在序列的守恆性胺基酸置換(或插入或刪除)。類似物典型地有至少20個胺基酸長，至少50、60、70、80、90、100、150或200個胺基酸長或更長，且經常與天然存在的多肽一樣長。
較佳的胺基酸置換為下列：(1)降低對蛋白水解的感受性、(2)降低對氧化的感受性、(3)改變結合親和性以形成蛋白質複合物、(4)改變結合親和性，以及(4)賦予或修飾該等類似物其他生理化學或功能性特性。類似物可包括各種天然存在肽序列以外的突變序列。舉例而言，單一或多個胺基酸置換(較佳地守恆性胺基酸置換)可以在天然存在序列中做出(較佳地在形成分子間接觸之區域以外的多肽部分)。守恆性胺基酸置換實質上不會改變親代序列的結構特性(例如取代胺基酸應不會易於破壞出現在親代序列中的螺旋，或分裂載示母結構之其他類型的二級結構)。該技藝中已被辨別的多肽二級與三級結構實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton 1984 W.H.Freeman and Company,New York；Introduction to Protein Structure(Branden & Tooze,eds.,1991,Garland Publishing,NY)；與Thornton et at.1991 Nature 354：105。
非肽類似物在醫藥產業中一般作為藥物，其具有與模版肽類似的特性。這些類型的非肽化合物命名為「肽模擬物」或「擬肽(peptidomimetics)」(參見，例如Fauchere(1986)J.Adv.Drug Res.15：29；and Evans et al.(1987)J.Med.Chem.30：1229)。以相同類型的D-胺基酸(例如，以D-離胺酸代替L-離胺酸)有系統地置換共有序列的一或多個胺基酸也可用來產生更為穩定的肽。此外，含有一致序列或實質相同一致序列變異之有限的肽可藉由該技藝中已知的方法生成(Rizo et al.(1992)Ann.Rev.Biochem.61：387)，例如藉由添加能夠形成分子內雙硫橋而將肽環化的內部半胱胺酸殘基。
術語「序列同一性百分比」在核酸序列的背景中意指在兩個相同 的序列中當就最大對應性來排列的殘基。序列同一性比對的長度可以超過一段至少約9個或更多核苷酸，通常至少約18個核苷酸，更長至少約24個核苷酸，典型地至少約28個核苷酸，更典型地至少約32個核苷酸，以及較佳地至少約36、48或更多個核苷酸。在該技藝中有一些不同的演算法，其可用來測定核苷酸序列同一性。例如，多核苷酸序列可以使用FASTA、Gap或Bestfit來比對，這些是Wisconsin Package Version 10.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wis.FASTA的程式，包括例如程式FASTA2與FASTA3，提供查詢序列與研究序列之間最佳重複區域的排列和序列同一性百分比(Pearson(1990)Methods Enzymol.183：63-98 and(2000)Methods Mol.Biol.132：185-219)。除非另有指明，使用針對特定程式或演算法的內定參數。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可以如GCG第6.1版中使用FASTA以其內定參數(6個字大小且計分矩陣的NOPAM因子)或使用GAP以其內定參數來測定。
除非另有指明，核酸序列的指示對象涵括其互補序列。因此，具有特定序列之核酸分子的指示對象應理解為涵括其互補股，其互補序列。一般來說，該技藝中交替地使用術語「序列同一性百分比」、「序列相似性百分比」以及「序列同源性百分比」。在本件申請案中，這些術語就核酸序列來說具有相同意思。
當意指核酸或其片段時，「實質相似性」或「實質序列相似性」表示若藉由任何序列同一性的已知演算法(諸如FAST、BLAST或Gap，如上所述)來測定時，當在有適當核苷酸插入或刪除的情況下與另一核酸(或其互補股)最佳排列時，在至少約90%，至少約95%，至少約96%，至少約97%，至少約98%或至少約99%核苷酸鹼基中有核苷酸序列同一性。
當應用於多肽時，術語「實質同一性」或「實質同一」表示當兩 個肽序列最佳地排列時(諸如按照演算法GAP或BESTFIT使用內定空位權重)，共有至少約80%序列同一性，至少約90%，至少約95%，至少約98%或至少約99%序列同一性。較佳地，不相同的殘基位置因為守恆性胺基酸置換而有所差異。「守恆性胺基酸置換」是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說，守恆性胺基酸置換實質不會改變蛋白質的官能性質。在2或多個胺基酸序列彼此因為守恆性置換而有所不同的情況下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上調整而校正置換的守恆性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的基團實例包括1)脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；3)含醯胺的側鏈：天門冬醯胺酸與麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸與組胺酸；以及6)含硫側鏈為半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的守恆性胺基酸置換基團為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸，以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。另擇地，守恆性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-45的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的改變。「適度守恆」置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。
有關多肽的序列相似性，其亦可意指為序列同一性，典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括守恆性胺基酸置換)的相似性的測量法來配對相似序列。例如，GCG含有諸如「Gap」與「Bestfit’」的程式，它們可以與內定參數一起用來決定關係相近之多肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或 序列同一性。參見，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用採內定或建議參數的FASTA(一種在GCG第6.1版中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最多重複區域的排列以及百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時，另一個較佳的演算法是電腦程式BLAST，特別是blastp或blastn，使用內定參數。參見，例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410以及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。
針對同源性來比較的多肽序列長度通常為至少約16個胺基酸殘基，至少約20個殘基，至少約24個殘基，至少約28個殘基或至少約35個殘基。當搜尋含有大量來自不同生物之序列的資料庫時，較佳地是比對胺基酸序列。
術語「有效量」是抗體或抗體的抗原-結合片段達到特定所述目的之濃度或數量。「有效量」的抗-GDF8抗體或其抗體的抗原-結合片段可憑經驗來決定。此外，「治療有效量」是抗-GDF8抗體或其抗原-結合片段的濃度或數量，其能有效達到所述目的之治療效用。這個數量亦可憑經驗來決定。
人類抗體的製備
用於生成包括完整人類單株抗體之單株抗體的方法在該技藝中是已知的。任何此種已知方法可用於本發明的上下文內以製造出特異性結合GDF8的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他用於生成單株抗體的已知方法，首先分離出帶有人類可變區域以及小鼠恆定區域之對GDF8具高親和性的嵌合抗體。如同在下面實驗節中，鑑定抗體的特徵並且篩選所欲的特性，包括親和性、選擇性、抗原決定區等。小鼠恆定區 域取代成所欲的人類恆定區域以生成本發明的完整人類抗體，例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4。儘管篩選出的恆定區域可能會依據特定用途、可變區域中的高親和性抗原-結合以及標的特異性特性而改變。
一般而言，當藉由結合至抗原(固定於固相或在溶液相中)來測量時，本發明的抗體具有非常高的親和性，典型具有約10-12至約10-9M的KD。小鼠恆定區域是以所欲人類恆定區域來取代以產生本發明的完全人類抗體，例如野生型IgG1(SEQ ID NO：335)或IgG4(SEQ ID NO：336)，或經修飾的IgG1或IgG4(例如SEQ ID NO：337)。儘管篩選出的恆定區域可能會依據特定用途、可變區域中的高親和性抗原-結合以及標的特異性特性而改變。
生物等效性
本發明的抗-GDF8抗體以及抗體片段涵括帶有由那些所述抗體變化而來，但仍保有結合人類GDF8能力之胺基酸序列的蛋白質。當與親代序列相較之下，此等變異抗體以及抗體片段包含有一或多個胺基酸加入、刪除或置換，但仍展現出基本上與所述抗體等效的生物活性。同樣地，當與所揭示的序列相較之下，本發明之抗-GDF8抗體編碼DNA序列涵括具有一或多個核苷酸加入、刪除或置換，但仍編碼基本上與本發明之抗-GDF8抗體或抗體片段生物等效的抗-GDF8抗體或抗體片段的序列。上面詳述此等變異胺基酸以及DNA序列的實例。
舉例而言，若2個抗原-結合蛋白或抗體是藥學等效物或藥學代用品，當它們以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投與的吸收速率或程度未顯示出明顯差異(不論是單一劑量或多劑量)，它們被視為生物等效的。若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上沒 有，它們將會被視為等效物，因為此等在吸收速率上的差異是有目的並且在歸類時被反映，對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的，並且就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中，若2個抗原-結合蛋白在臨床上就其安全性、純度以及效力而言並無有意義的差異，它們是生物等效的。
在一個具體例中，若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期增高不良反應的風險(包括與持續治療而沒有這樣切換的情況下，在免疫原性上的臨床顯著變化，或減低有效性)時，它們是生物等效的。
在一個具體例中，若2個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均是藉由共同的機制或作用機制而作用達致此等機制已知的程度，它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內或活體內方法證實。生物等效性測量法包括，例如(a)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度；(b)已使用人類活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測的活體外測試；(c)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體(或其標的)之適當急性藥理學效用；以及(d)在已證實抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明之抗-GDF8抗體的生物等效變異體可以藉由例如，製造各種殘基或序列置換，或刪除不是生物活性所必需的末端或內部殘基或序列而建構。舉例而言，對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或取代為其他會在再復性之後防止形成不必要或不正確分子間雙硫橋的胺基酸。在其他上下文中，生物等效性抗體可包括抗 -GDF8抗體變異體，其含有會修飾抗體之糖化特性的胺基酸改變(例如消除或移除糖化的突變)。
抗原決定區拼圖以及相關技術
為了篩選結合特定抗原決定區的抗體(例如那些會阻斷IgE結合其高親和性受體的抗體)，可施行諸如在Harlow and Lane的「Antibodies」上文中所述的慣用交叉-阻斷分析。其他方法包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)，或肽切割分析。此外，可以採用諸如抗原決定區切除、抗原決定區抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)。
術語「抗原決定區」意指一個B和/或T細胞在抗原上反應的位址。B細胞抗原決定區可以由連續胺基酸或透過蛋白質的三級摺疊並排的非連續胺基酸而形成。由連續胺基酸所形成的抗原決定區在暴露於變性溶劑時典型會維持著，而由三級摺疊所形成的抗原決定區在以變性溶劑處理時會消失。抗原決定區在獨特的空間構形中典型包括至少3個，以及更常見至少5個或8-10個胺基酸。
修飾輔助的剖析(modification-assisted profiling,MAP)，亦已知為以抗原結構為基礎的抗體剖析(ASAP)，是一種將大量單株抗體(mAbs)針對相同抗原而依據各抗體對化學或酵素修飾之抗原表面的結合圖譜相似性來分類的方法(US 2004/0101920)。各個分類可以反映出清楚不同於另一分類所呈現之抗原決定區或與另一分類所呈現之抗原決定區部分重疊的獨特抗原決定區。這個技術提供快速過濾遺傳上相同的抗體，以使得特徵鑑定可以集中在遺傳上明顯不同的抗體。當應用於融合瘤篩選時，MAP有助於鑑定生產帶有所欲特質之mAbs的罕見融合瘤細胞株。MAP也可以用來將本發明的抗-GDF8抗體分成結合不同抗原決定區的抗體群。
本發明包括抗-GDF8抗體及抗體的抗原-結合片段，其結合人類GDF8的特異性抗原決定區(SEQ ID NO：340)的特定抗原決定區且能夠阻斷GDF8的生物活性。在一個具體例中，抗體或其抗原-結合片段結合在含有胺基酸殘基1至109；1至54；1至44；1至34；1至24；以及1至14的抗原決定區內。在另一個具體例中，抗體或其抗原-結合片段結合在含有胺基酸殘基65至72；35至109；45至109；55至109；65至109；75至109；85至109；92至109；或95至109的抗原決定區內。在另一個具體例中，抗體或其抗原-結合片段結合在含有胺基酸殘基48至72；48至69；48至65；52至72；52至65；或56至65的抗原決定區內。在特定具體例中，抗體或其抗原-結合片段可結合在2個或更多個抗原決定區內。
本發明亦包括抗體及其抗原-結合片段，其結合野生型成熟GDF8(SEQ ID NO：340)但不會結合具有要比SEQ ID NO：340的完整胺基酸序列還要少的肽。舉例而言，本發明包括結合野生型成熟GDF8(SEQ ID NO：340)但不會結合由SEQ ID NO：340的10至40個連續胺基酸構成之肽的抗-GDF8抗體。在本發明的某些具體例中，抗-GDF8抗體結合含有SEQ ID NO：340的野生型成熟人類GDF8，但不會結合一或多個具有選自於由下列胺基酸構成之群組的胺基酸序列的GDF8肽：SEQ ID NO：340的1-14、1-18、7-42、48-65、48-69、48-72、52-65、52-72、56-65、56-72、65-72、73-90、75-105以及91-105。在某些具體例中，抗-GDF8抗體不會結合任何前述GDF8肽。用以決定某抗體是否能夠結合特定GDF8肽的方法對習於該技藝者來說是已知的。其他例示性方法於本文實施例7中例示說明，其中GDF8肽連接於微球，抗體添加至接合有該肽的微球，且在洗滌步驟之後偵測接合抗體的微球。接合抗體不存在表示抗體不會連結至要測試的特定肽。
本發明亦包括單離的人類抗體或其抗原-結合片段，其特異性結 合野生型成熟人類GDF8(例如含有SEQ ID NO：340的蛋白質或多肽)，但不會結合嵌合GDF8建構物(其中GDF8的某些胺基酸以不相同但相關蛋白質(諸如TGFβ-1)之對應胺基酸序列來取代)。在一個實例中，嵌合建構物是GDF8/TGFβ-1嵌合體，其中成熟GDF8的胺基酸48-72經TGFβ-1的對應胺基酸序列(例如TGFβ-1的胺基酸49-76)取代。一個這樣的嵌合體實例是以SEQ ID NO：352作為代表(參見本文中的實施例4與6)。因此，在某些具體例中，本發明之抗體特異性結合野生型成熟人類GDF8(SEQ ID NO：340)，但不會結合至SEQ ID NO：352的嵌合GDF8/TGFβ-1建構物，這表示該等抗體所結合的抗原決定區包括或涵括位在SEQ ID NO：340之殘基48至72內的胺基酸。阻斷生物分析，諸如本文實施例4中所提及者，亦可用來間接確認抗體是否結合野生型成熟人類GDF8(SEQ ID NO：340)但不會結合嵌合GDF8/TGFβ-1建構物，例如SEQ ID NO：352的建構物。舉例而言，阻斷野生型成熟人類GDF8的生物活性但不會阻斷嵌合GDF8/TGFβ-1的生物活性的抗體被視為會結合GDF8被嵌合建構物中對應的TGFβ-1序列所取代的部分。
相同地，本發明亦包括單離的人類抗體或其抗原-結合片段，其在生物分析中阻斷野生型成熟GDF8-媒介的活性但不會阻斷嵌合GDF8建構物(例如GDF8/TGFβ-1嵌合物，其中成熟GDF8的胺基酸48-72經TGFβ-1的對應胺基酸序列(例如SEQ ID NO：352)取代)的活性。一個可在於本發明的這個態樣之上下文的例示性GDF8生物分析於本文實施例4中提出，儘管其他能夠測定GDF8細胞活性的類似生物分析是可思及的。
本發明包括結合與本文中所述任一特定例示性抗體所結合的抗原決定區相同之抗-GDF8抗體。相同地，本發明亦包括與本文中所述任一特定例示性抗體交叉競爭結合GDF8或GDF8片段的抗-GDF8抗 體。
藉由使用該技藝中所熟知的慣用方法，吾人可易於決定抗體是否如同指示對象抗-GDF8抗體般結合至相同抗原決定區，或與參考抗-GDF8抗體競爭結合。舉例而言，為決定測試抗體是否如同本發明的參考抗-GDF8抗體般結合至相同抗原決定區，容許參考抗體在飽和條件下結合GDF8蛋白質或肽。接著，評估測試抗體結合至GDF8分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗-GDF8抗體飽和結合之後結合至GDF8，可以推斷測試抗體結合至參考抗-GDF8抗體以外的不同抗原決定區。另一方面，若測試抗體無法在參考抗-GDF8抗體飽和結合之後結合至GDF8分子，那麼測試抗體可能結合至與本發明之參考抗-GDF8抗體所結合之抗原決定區相同的抗原決定區。接而可以實行額外的慣用實驗(例如肽突變以及結合分析)以確認觀察到測試抗體沒有結合事實上是因為結合至與參考抗體相同的抗原決定區或若空間阻斷(或另一種現象)是被觀察到沒有結合的原因。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流動式細胞測量術或任何其他在該技藝中可供使用之定量或定性抗體-結合分析來執行這類的實驗。依照本發明的某些具體例，當在競爭性結合分析中測量(參見，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990：50：1495-1502)時，2個抗體結合至相同(或重疊)抗原決定區，若例如一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體會抑制另一者結合達到至少50%，但較佳地75%、90%或甚至是99%。另擇地，若基本上在抗原中所有會減低或消除一抗體結合的胺基酸突變也會減低或消除另一者結合，2個抗體被視為是結合至相同抗原決定區。若僅有一部分會減低或消除一抗體結合的胺基酸突變會減低或消除另一者結合，2個抗體被視為是具有「重疊的抗原決定區」。
為決定抗體是否會與參考抗-GDF8抗體競爭結合，從2個方面實施上述結合方法學：就第1個方面，容許參考抗體在飽和條件下結合 GDF8分子，接而評估測試抗體結合GDF8分子。就第2個方面，容許測試抗體在飽和條件下結合GDF8分子，接而評估參考抗體結合至GDF8分子。若在2個方面中，僅有第一(飽和)抗體能夠結合GDF8分子，那麼推斷測試抗體會與參考抗體競爭結合至GDF8。如同在該技藝中具有通常知識者所知悉的，與參考抗體競爭結合的抗體不必然會結合至與參考抗體相同的抗原決定區，但可能是因為結合重疊或相鄰抗原決定區而在空間上阻斷參考抗體的結合。
物種選擇性以及物種交叉反應性
依據本發明的某些具體例，抗-GDF8抗體結合至人類GDF8而不會結合至其他物種的GDF8。另擇地，在某些具體例中，本發明的抗-GDF8抗體結合至人類GDF8以及一或多個非人類物種的GDF8。舉例而言，本發明的抗-GDF8抗體可以結合至人類GDF8並且視情況結合或不結合小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、馬來猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩GDF8的一或多者。
免疫接合物(immunoconjugates)
本發明涵括接合至一治療部分(「免疫接合物」)(諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素)的人類或人類化抗-GDF8單株抗體。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。用於形成免疫接合物的適當細胞毒性劑以及化學治療劑的實例在該技藝中是已知的，參見例如WO 05/103081。
多特異性抗體
本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性 抗體可以是對一個標的多肽的不同抗原決定區具有特異性或者可能含有對超過一個標的多肽具有特異性的抗原-結合區。參見例如Tutt et al.(1999)J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明的抗-GDF8抗體或其部分可以連結至另一個功能性分子(例如另一個肽或蛋白質)或與該另一個功能性分子一起表現。舉例而言，抗體或其片段在功能上可以連結(例如，藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他)至一或多個其他分子實體，諸如另一個抗體或抗體片段，以產生帶有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白的一臂對於人類GDF8或其片段具有特異性，而免疫球蛋白的另一臂對第二治療標的具有特異性或接合至一個治療部分。
可以使用於本發明的例示性雙特異性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3區以及第二Ig CH3區，其中第一與第二Ig CH3區因為至少1個胺基酸而彼此不同，以及其中與缺乏該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下，至少1個胺基酸差異會減低該雙特異性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中，該第一Ig CH3區結合蛋白質A而該第二Ig CH3區含有1個會減低或消除蛋白質A結合的突變，諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號；按照EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT；按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括：在IgG1抗體的情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗體的情況下，N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU為N384S、K392V以及V422I)；以及在IgG4抗體的情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU為Q355R、N384S、K392V、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異 性抗體形式方面的變異在本發明範圍中是可預想的。
治療投藥以及配方
本發明提供包含有本發明之抗體或其抗原-結合片段的治療組成物。依據本發明的治療組成物的投藥可進一步與適當載劑、賦形劑以及其他併入配方中以提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者的藥劑一起投藥。可以在對於藥學化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當的配方：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些配方包括，例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水中油與油中水乳劑、乳化卡波蠟(具有各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。只要配方中的活性成分不會因為配製而不具活性，且配方與投藥途徑是生理學上可相容的且可耐受的，任一前述混合物在依據本發明的治療與療法中是適當的。亦參見Powell et al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
劑量可以視要被投藥的個體的年齡與身材、標的疾病、病況、投藥途徑以及類似者來決定。當本發明的抗體用於在成人患者體內治療與GDF8有關的病況和疾病(例如肌肉萎縮症、肌肉萎縮、肌肉消瘦症候群、肌肉減少症與惡病質)時，通常以約0.01至約20mg/kg體重、約0.1至約10mg/kg體重或約0.1至約5mg/kg體重的單一劑量靜脈內投與本發明抗體是有益的。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。在其他非經口投藥或經口投藥中，抗體可以一個與上述預定劑量對應的劑量來投與。當病況特別嚴重時，劑量可以根據病況增高至會造成明顯負作用的數量(若有需要的話)。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投與本發明的醫藥組成物，例如封裝在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見，例如Wu et al.1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服途徑。組成物可以藉由任何習知途徑來投與，例如藉由輸液或食團注射、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收，並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投與。投藥可以是全身性或局部的。
醫藥組成物亦可在囊泡中投藥，特別是在脂質體中(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
本發明的醫藥組成物可以，例如使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆式遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆式遞送裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆式遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投藥且卡匣是空的，空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼就可以重複使用筆式遞送裝置。就拋棄式筆式遞送裝置來說，沒有可換式卡匣。更確切地來說，拋棄式筆式遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物，整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆式以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組成物方面有實用性。實例包括，但不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapois,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk, Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面有實用性的拋棄式筆式遞送裝置的實例包括，但不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、the SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅舉幾個為例。
在某些情況下，醫藥組成物可以控制釋放系統的方式投遞，例如使用泵或聚合材料。在另一個具體例中，控制釋放系統可以被置放在鄰近組成物之標的處，因而僅需要全身性劑量的一部分。
用於經口投藥的組成物實例包括固體或液體劑型，特別是錠劑(包括糖衣錠以及經薄膜包覆的錠劑)、丸劑、顆粒、散劑製劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳液、懸浮液等。這樣一個組成物是藉由公眾所知悉的方法來製造且含有醫藥製備領域中所習用的載劑、稀釋劑或賦形劑。用於錠劑的載劑或賦形劑的實例為乳糖、澱粉、蔗糖、硬脂酸鎂及類似物。
可注射的製劑可包括用於靜脈內、皮下、皮內以及肌肉內注射、點滴式灌注等的劑型。這些可注射的製劑可以藉由公眾知悉的方法來製備。舉例而言，可注射的製劑可以藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化在習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。作為用於注射的水性介質，有例如生理食鹽水、含有葡萄糖和其他可以與適當助溶劑(諸如醇，(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑(例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物))一起使用之輔助劑等的等張溶液可供使用。作 為油性介質，有例如芝麻油、黃豆油(它們可以與諸如苯甲酸苄酯、苄醇等的助溶劑一起使用)等可供使用。由此所製備的注射劑較佳地填充在適當的安瓿內。
有利地，上述用於經口或非經口使用的醫藥組成物被製備成適於活性成分1次投藥之單位劑量的劑型。這種呈1單位劑量的劑型包括，例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。所含的前述抗體數量通常是1單位劑量中每劑型約5至約500mg；特別是注射劑形式，偏好所述抗體含有約5至約100mg以及在其他劑型約10至約250mg。
抗體的治療用途
本發明的抗體尤其可應用於治療、預防和/或改善任何與GFD8活性相關的疾病或病症。更特別地，本發明的抗體可應用於藉由因為阻斷GDF8活性來增加個體之肌肉強度/力量及/或肌肉質量及/或肌肉功能，或改變偏好代謝(醣類、脂質以及蛋白質處理)而改善的任何病況或疾病。可使用本發明抗-GDF8抗體來治療的例示性疾病、病症或病況包括，但不限於肌肉減少症、惡病質(原發性或對於其他病況來說是次發性，例如癌症、慢性腎衰竭或慢性阻塞性肺病)、肌肉消瘦與肌肉萎縮症，例如因為不用、固定、臥床、損傷、醫學治療或外科手術干預(例如髖關節骨折、髖關節置換、踝關節置換等)或者因為需要換氣所致或相關的肌肉萎縮症或消瘦。本發明的抗-GDF8抗體亦可用來治療、預防或改善諸如癌症、肥胖症、糖尿病、關節炎、多發性硬化症、肌肉萎縮、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、帕金森氏症、骨質疏鬆症、骨關節炎、骨量減少、代謝症候群(包括，但不限於糖尿病、肥胖症、營養異常、器官萎縮、慢性阻塞性肺病與厭食)。
本發明包括治療投藥攝生法，其含有將本發明抗-GDF8抗體組合至少一種額外的治療有效成分來投藥。此等額外治療有效成分的非限 定實例包括其他GDF8拮抗劑(例如GDF8的小分子抑制劑或其他GDF8抗體或結合分子)、生長因子抑制劑、免疫抑制劑、消炎劑、代謝抑制劑、酵素抑制劑以及細胞毒性/細胞生長抑制劑。額外的治療有效成分(等)可以在本發明之抗-GDF8抗體投與之前、同時或之後投與。
抗體的診斷用途
本發明的抗-GDF8抗體也可以用來偵測和/或測量樣品中的GDF8，例如供診斷之用。舉例而言，抗-GDF8抗體或其片段可以用來診斷特徵在於異常表現GDF8(例如過度表現、不足表現、缺乏表現等)的病況或疾病。有關GDF8的例示性診斷分析可包含，例如令得自於一患者的樣品與本發明之抗-GDF8抗體接觸，其中抗-GDF8抗體標定有可偵測到的標記或報導分子。另擇地，未標定的抗-GDF8抗體可以組合本身可被偵測到標定之二次抗體一起使用於診斷應用。可偵測到的標記或報導分子可以是放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光部分，諸如螢光素異氰酸鹽或玫瑰紅；或諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶，或螢光素酶的酵素。可用來偵測或測量樣品中的GDF8的特定例示性分析包括酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)以及螢光-活化細胞選別(FACS)。
依據本發明，可用於GDF8診斷分析中的樣品包括任何得自於患者的組織或體液樣品，其在正常或病理狀態下含有可偵測數量的GDF8蛋白或其片段。一般來說，測量GDF8在自健康患者(例如未罹患與異常GDF8位準或活性有關之疾病或病況的患者)所得到之特定樣品中的位準以在開始時建立基線，或標準GDF8位準。GDF8的這個基線位準接而可以與得自於被懷疑帶有GDF8相關疾病或病況之個體的樣品中所測得的GDF8位準來比對。
第1圖是人類GDF8以蛋白酶K限制蛋白水解的免疫墨點圖。凝膠是具有0.2μg GDF8加載至各徑中以及2μg/ml的抗體對照I(A)、1A2(B)或21-E9(C)的非還原18% SDS-PAGE。徑1：消化時間10分鐘，1μg GDF8，0μg蛋白酶K；徑2：消化時間10分鐘，GDF8 1μg，1μg蛋白酶K；徑3：消化時間10分鐘，1μg GDF8，6μg蛋白酶K；徑4：消化時間45分鐘，1μg GDF8，0μg蛋白酶K；徑5：消化時間45分鐘，GDF8 1μg，1μg蛋白酶K；徑6：消化時間45分鐘，1μg GDF8，6μg蛋白酶K。
第2圖是人類GDF8以高劑量蛋白酶K限制蛋白水解的免疫墨點圖。凝膠是具有0或4μg GDF8加載至各徑中以及2μg/ml的抗體對照I(A)或1A2(B)的非還原18% SDS-PAGE。徑1：消化時間16小時，0μg GDF8，96μg蛋白酶K；徑2：消化時間16小時GDF8 4μg，0μg蛋白酶K；徑3：消化時間16小時，4μg GDF8，24μg蛋白酶K；徑4：消化時間16小時，4μg GDF8，96μg蛋白酶K；徑5：消化時間1小時，GDF8 4μg，24μg蛋白酶K；徑6：消化時間1小時，4μg GDF8，96μg蛋白酶K；徑7：消化時間10分鐘，GDF8 4μg，0μg蛋白酶K；徑8：消化時間10分鐘，4μg GDF8，24μg蛋白酶K。
第3A與3B圖是說明於抗體處理之前(第3A圖)與之後(第3B圖)，在接受胰島素耐受性試驗之小鼠個體體內隨著時間的起始葡萄糖濃度百分比。
實施例 實施例1. 製造抗人類GDF8的人類抗體
以該技藝中已知的任何方法(參見，例如Harlow and Lane，上文)來免疫小鼠。在一個具體例中，直接對VELOCIMMUNE®小鼠(含有編碼人類Ig重鏈及κ輕鏈可變區域的DNA)投與GDF8抗原與佐劑以刺激免疫反應。適當的佐劑包括完全以及不完全佛氏佐劑、MPL+TDM佐劑系統(Sigma)或RIBI(胞壁醯二肽)(參見O’Hagan 2000 Vaccine Adjuvant,by Human Press,Totawa,NJ)。藉由標準抗原-特異性免疫分析來監測抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時，在一個具體例中，收取表現抗體的B細胞並且與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力並形成融合瘤細胞株。篩選並挑選融合瘤細胞株而鑑定出會生產抗原-特異性抗體的細胞株。
另擇地，抗原-特異性融合瘤細胞可以藉由流式細胞儀來分離。簡言之，在融合至骨髓瘤細胞之後，匯集的融合瘤細胞在HAT培養基中生長10天。接而收取細胞並且以2μg/ml經生物素標定的GDF8染色1小時，繼而添加藻紅素-鏈黴親和素。經螢光標定的細胞是藉由流式細胞儀來分選(以每孔單個細胞的方式分選至含有融合瘤生長培養基的96孔培養盤中)，培養8-10小時，並且篩選條件培養基是否存在具功能性的所欲單株抗體。
在另一個具體例中，經由直接分離脾臟細胞而產生抗-GDF8抗體。如同U.S.2007/0280945A1中所述，抗原-特異性抗體直接自經抗原免疫之B細胞分離出來而不融合至骨髓瘤細胞。由單離出的適當重組型細胞建立表現抗體的穩定重組型CHO細胞株。
實施例2. 基因應用分析
為了分析所生產出之抗體的結構，選殖並定序編碼抗體可變區域的核酸。從抗體的核酸序列以及預測的胺基酸序列，針對各個抗體鏈 鑑定基因利用率(gene usage)。表1顯示依據本發明之選定抗體的基因利用率。抗體標識符號(HCVR/LCVR)：21-E5(SEQ ID NO：34/42)；21-B9(SEQ ID NO：18/26)；21-E9(SEQ ID NO：98/106)；21-A2(SEQ ID NO：2/10)；22-D3(SEQ ID NO：50/58)；22-E6(SEQ ID NO：66/74)；22-G10(SEQ ID NO：82/90)；1A2(SEQ ID NO：226/234)；20B12(SEQ ID NO：274/282)；58C8(SEQ ID NO：242/250)；19F2(SEQ ID NO：258/266)：8D12-1(SEQ ID NO：114/122)；4E3-7(SEQ ID NO：194/202)；；9B11-12(SEQ ID NO：162/170)；4B9(SEQ ID NO：226/234)；1H4-5(SEQ ID NO：210/218)；9B4-3(SEQ ID NO：178/186)；3E2-1(SEQ ID NO：290/298)；4G3-25(SEQ ID NO：306/314)；4B6-6(SEQ ID NO：130/138)；H4H1657N2(SEQ ID NO：360/368)；H4H1669P(SEQ ID NO：376/384)。
使用於下列實施例的對照建構物
下列實驗中包括不同對照建構物(抗-GDF8抗體以及其他GDF8拮抗物)以供比對之用。對照建構物定名如下：對照I：人類抗-GDF8抗體，帶有包含「Myo29」之對應區的胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：16以及18)的重鏈以及輕鏈可變區域，如US 7,261,893中所提及；對照II：人類抗-GDF8抗體，帶有包含「2_112_K」之對應區的胺基酸序列的重鏈以及輕鏈可變區域(亦即SEQ ID NO：118以及120)，如US 2006/0263354中所提及；對照III：ActRIIB-Fc融合建構物，帶有SEQ ID NO：391的胺基酸序列；以及對照IV：變異ActRIIB-Fc融合建構物，與對照III相同，除了SEQ ID NO：391的位置64處的丙胺酸取代為精胺酸[R64]。(並非所有的對照建構物均使用於每一個實施例中)
實施例3. 抗原結合親和性測定
藉由使用即時生物偵測器表面電漿共振分析(BIACORETM 2000)的表面動力學，測定有關所選抗體之抗原結合的平衡解離常數(KD值)。在山羊抗-小鼠IgG多株抗體表面或山羊抗-hFc多株抗體(Jackson Immuno Research Lab)表面上(透過直接化學偶合至BIACORETM晶片上以形成捕獲抗體表面)捕獲各選定抗體。將25nM的人類GDF8同型二聚體、hGDF11同型二聚體或hGDF5同型二聚體注射通過捕獲抗 體表面，且在室溫下即時監測抗原-抗體結合與解離。進行動力學分析以計算出抗原/抗體複合物解離的KD、解離速率常數(kd)、締合速率常數(ka)以及半衰期(表2)。
前述實驗也可以將GDF8施用於候選抗體H4H1669P或H4H1657N2的捕獲抗體表面來進行。初步數據顯示2種抗體的解離速率非常慢，暗示著KD為1-2pM或更小。
亦在不含有BSA之修改工作緩衝液中如所述般來測定選定抗體 對於抗原結合的KD值。
進行額外的抗原結合實驗，其中在25℃與37℃下將GDF8以及GDF11施用於選定抗-GDF8抗體以及對照抗體的表面。藉由表面動力學使用即時生物偵測器表面電漿共振分析(BIACORETM T100)來測定抗原結合至選定抗體的平衡解離常數(KD值)。各選定抗體或對照抗體捕獲在山羊抗-hFc多株抗體(Jackson Immuno Research Lab Cat# 109-005-098)表面(透過直接化學偶合至BIACORETM CM5偵測晶片上以形成捕獲抗體表面)。將不同濃度(2.5-0.625nM，2倍稀釋)的hGDF8同型二聚體或hGDF11同型二聚體(或者在一些實驗中，活化素A)注射通過捕獲抗體表面，並且即時監測抗原-抗體結合與解離。進行動力學分析以計算抗原/抗體複合物解離的KD，解離速率常數(kd)、締合速率常數(ka)以及半衰期。結果歸納於表4中。(NB=沒有觀察到結合)
如上所示，本發明抗體H4H1669P、H4H1657N2以及1A2-hIgG1全對GDF8展現出強烈結合但不會結合GDF11。相對地，對照分子顯示會結合GDF8以及GDF11。
實施例4. 抗體阻斷Smad2/螢光素酶反應
GDF8誘發的螢光素酶分析使用經工程化的A204細胞株(人類橫紋肌肉瘤細胞，ATCC，其含有會驅動螢光素酶表現的GDF8或GDF11反應性啟動子)而發展一種生物分析來決定所選抗-GDF8抗體活體外中和GDF8媒介或GDF11媒介之細胞功能的能力。如下測定GDF8或GDF11抑制誘發螢光素酶活性：以2x104細胞/孔將細胞種至96孔培養盤的培養基中並在37℃、5% CO2下培育過夜。以三重複將抗體蛋白(自25nM起在細胞培養基中連續稀釋)添加至兩個培養盤的A204/Smad2細胞的孔中；將GDF8或GDF11(0.8nM)加入各孔中。在37℃、5% CO2下培育培養盤6小時。藉由加入BRIGHT-GLO® Substrate(Promega)來測定螢光素酶活性並且測定IC50值(表5)。
所選抗-GDF8抗體中和GDF8媒介或GDF11媒介細胞功能的能力更進一步如上所述使用不同濃度的GDF8或GDF11來分析(表6)。(nd=未測定；NB=無結合)
使用GDF8/TGFβ-1嵌合建構物作為活化肽來重複上述生物分析。特別地，帶有胺基酸48-72經TGFβ-1的對應胺基酸取代之成熟GDF8構成的嵌合體使用於本實驗中(SEQ ID NO：352，在此亦稱為「GDF8/TGFβ[48-72]」)。這是由編碼帶有人類TGFβ-1序列(取代對應GDF8序列)之完整人類GDF8前驅物的表現建構物所製造。在藉著將GDF8/TGFβ[48-72]建構物暫時轉染至CHO細胞中而產生的條件培養基中分析生物活性。藉由西方墨點法來分析表現以及處理。將條件培養基濃縮20倍，加熱至80℃ 5分鐘以使得結合的GDF8前導肽失活，並且在生物分析中以連續稀釋來評估活性。儘管未測定確切的嵌合蛋白濃度，在實驗中於濃縮前濃度典型是落在1-10μg/ml的範圍內。如上所數，含有會驅動螢光素酶表現之GDF反應性啟動子的細胞被加種到96孔培養盤中。將選定抗體(自100nM起算於細胞培養基中連續稀釋)加入預計會產生最大反應之某個數量的GDF8/TGFβ[48-72]嵌合蛋白條件培養基。將這個混合物預培育45分鐘並且添加至報導細胞。測定螢光素酶活性並計算出大約的IC50值(如下表7所示)(NB=無阻斷)。
GDF8/TGFβ[48-72]嵌合建構物在這個分析中能夠活化螢光素酶活性，而1A2-hFc以及對照I能夠阻斷這個建構物的生物活性。但是，抗體H2M1657N2與H1H1669P無法阻斷GDF8/TGFβ[48-72]嵌合建構物的生物活性。因為這2個抗體在本分析系統中顯示會阻斷野生型GDF8的生物活性(參見表8)，可推斷H2M1657N2與H1H1669P最有可能藉由以不活化GDF8的胺基酸48-72內的抗原決定區而表現其生物效用。
實施例5. 以免疫墨點法來處理由蛋白酶K消化所產生的hGDF8片段
西方墨點分析被用來測定經蛋白酶K蛋白水解消化之測試與對照mAbs人類GDF。在消化緩衝液中培育含有1μg人類GDF8以及0、1或6μg蛋白酶K的酵素反應物10或45分鐘。含有存在於反應混合物中之GDF8的20%等量物(200ng)被加載至3個分開的18% SES-PAGE非還原凝膠並電漬到PVDF膜上。以2μg/ml的一級抗體繼而適當的二次抗體(接合至HRP)培育各膜。顯示於第1A-C圖的是分別針對對照mAb I、1A2 mAb以及21-E9 mAb來進行偵測而得到的免疫反應性。結果顯示針對徑3與6的對照mAb(A)喪失GDF8反應性。明顯不同的是，抗體1A2對分子量約17-19kD的較小GDF8片段仍保有免疫反應性(第1B圖)。
在消化時間高至10分鐘、1小時或16小時，有0或4μg GDF8與0、24或96μg蛋白酶K存在的情況下重複這個實驗。結果(第2A-B圖)顯示，在蛋白酶K不存在的情況下，對照以及1A2 mAb對全長成熟(未經消化的)GDF8有免疫反應性(參見第2A-B圖，徑2及7)。在蛋白酶K存在的情況下，對照I mAb在所有時間點失去免疫反應性。明顯不同的是，1A2 mAb對於經消化的人類GDF8片段仍維持著免疫 反應性(第2B圖，徑3-6與8)。這些結果指出，1A2 mAb對於GDF8的較小片段(在蛋白酶K存在下仍維持完整)有免疫反應性，而對照mAb對較小片段(17-19kD)失去免疫反應性。
使用經修改的西方墨點分析來進一步測定所選抗-hGDF8抗體的hGDF8抗原決定區。修改為在hGDF8特異性一級抗體與膜培育之前，各抗-hGDF8抗體預先與1000倍或50倍莫耳過量的hGDF8肽片段(1-14胺基酸、17-42胺基酸、48-72胺基酸或75-105胺基酸)培育。結果顯示，與肽片段48-72胺基酸在50倍莫耳過量的情況下預先培育能夠阻斷抗體8D12結合hGDF8。
實施例6. 抗體結合GDF8嵌合體
作出12種嵌合GDF8蛋白原(proprotein)。表8顯示成熟嵌合GDF8蛋白結構。嵌合GDF8蛋白含有兩部分：一個部分具有GDF8序列經BMP2序列的各種置換，另一部分具有GDF8序列經TGFβ1序列的各種置換。這些嵌合蛋白用來測試並定位抗體結合。
將不同的嵌合GDF8蛋白原暫時轉染至經工程化的穩定CHO hFurin細胞株中。如上所述的類似西方墨點分析用來偵測不同抗-hGDF8抗體對各個嵌合GDF8的結合。簡言之，將10μg CHO上清液加載至SDS-PAGE(非還原性或還原性)凝膠的各徑上並電漬到PVDF膜上。以2μg/ml的抗-GDF8抗體培育膜繼而暴露於適當的二次抗體(接合至HRP)。如表9中所示，抗體8D12無法結合B48或T48。結果顯示，成熟GDF8的胺基酸48至72參予抗體8D12結合GDF8。
實施例7. 抗體結合hGDF8肽
由成熟hGDF8(SEQ ID NO：340)製備14種肽(表10)。未經修飾的肽、N-端經生物素化的肽(N-term)或C-端經生物素化的肽(C-term)用來測試並定位抗體結合。全長hGDF8、hGDF11與未經修飾的肽各自獨立地經胺偶合至MAP® Multi-Analyte COOH微球(或珠粒)。各個經生物素化的肽結合至xMAP® Multi-Analyte LumAvidin微球。結合 肽的珠粒懸浮液接而與等體積阻斷緩衝液(PBS，1% BSA、0.05% Tween 20、0.05%疊氮化鈉)混合，然後被分配至96孔過濾培養盤(Millipore,MULTISCREEN® BV)中。接著將2.5μg/ml對照與測試抗-hGDF8抗體加入至結合肽的珠粒懸浮液中並在室溫下容許結合至珠粒過夜。然後，以PBST(PBS+0.05% Tween 20)洗滌經抗體培育的珠粒2次並在室溫下以接合藻紅素(PE)的抗-hFC抗體或接合藻紅素的抗-mFC抗體培育45分鐘。再次洗滌珠粒並針對不同肽的抗體結合訊號使用LUMINEX® 100TM或200TM儀器來進行偵測。如表10中所示，抗-hGDF8抗體8D12能夠結合肽4、5、6、7、8與9。相反地，抗-hGDF8抗體H4H1657N2未結合至任何肽。
實施例8. 人類抗-GDF8抗體對於GDF8結合至活化素RIIB的影響
成熟hGDF8首先經胺偶合至Luminex®珠粒。經hGDF8包覆的Luminex®珠粒接而在室溫下與1.25μg/ml的各種抗-hGDF8抗體培育2小時。接著，將人類活化素RIIB-mFc加入至珠粒-抗體混合物中並在室溫下培育又2小時。繼而洗滌珠粒並以接合R-藻紅素(R-PE)的抗-mFc多株抗體染色且測量平均螢光強度(MFI)。如表11中所示，儘管對照mAb I與抗體21-E5都能夠阻斷hGDF8與h活化素RIIB之間的結合，但對照mAb II僅能部份阻斷結合。抗體1A2不能阻斷hGDF8結合其受體(活化素RIIB)(表11，n=3)。
實施例9. 抗體8D12變異體
抗體8D12變異體帶有經修飾的LCVR，其是藉由修飾8D12的LCVR的下列一或多個胺基酸而產生：A7S或T、A8P、9PL、S18P、V19A、M21I、K27Q、F41Y、V42L、R44K、R55L或T、M56G或L、N58Y、L59R、A75D、R79K、A105G、L109V以及L111I。
有關hGDF8之抗體變異體的結合親和性(KD)是使用上述即時生物偵測器表面電漿共振分析(BIAcoreTM3000)在修改的工作緩衝液(不含BSA)中測定(表12)。
抗體變異體與hGDF8肽之間的結合亦如上面實施例7中所述來測試。抗體變異體8D12-v2與8D12-v3顯示強烈結合至C-端經生物素化的肽4、5、7與10。
實施例10. 抗-GDF8抗體對於骨骼肌質量的影響
活體內測定所選抗-GDF8 mAbs對於誘發骨骼肌肥大的效力。簡言之，20隻雄性CB17 SCID小鼠，約9週大，依據體重平均分成4組。以3個漸增的劑量(2.5mg/kg/劑量、5mg/kg/劑量以及10mg/kg/劑量)注射選定mAb(對照I、1A2、21-E5、8D12、1A2-hIgG或對照II)。人類IgG的Fc片段用作為陰性對照。在第1週腹膜內投與抗體2次，之後3週每週1次。在第28天，將小鼠安樂死並秤重，並取下且秤重脛骨前(TA)肌、腓腸(GA)肌以及四頭(Quad)肌、心臟、脾臟與腎臟。將組織常規化以開始秤量體重，且計算相對於陰性對照的百分 比變化(以重量計)。使用下列抗體重複6次分別實驗：對照I、1A2、21-E5、8D12、1A2-hIgG以及對照II(表13-18)。此外，亦以較高漸增劑量的對照I抗體(10mg/kg/劑量、30mg/kg/劑量以及50mg/kg/劑量)重複實驗(表19)。結果以相對於陰性對照的百分比增加±標準偏差來表示。
使用抗體H4H1657N2以及H4H1669P與對照投與給SCID小鼠來進行類似實驗。特別地，10週大雄性SCID小鼠依據下列給藥時間表皮下投與10mg/kg抗體：第1週2x以及第2與3週1x/週。總處理時間為28天。關於這個實驗，5隻小鼠投與同型陰性對照抗體；5隻小鼠投與對照I(Myo29)；6隻小鼠投與H4H1657N2；而6隻小鼠投與H4H1669P。結果歸納於表20中並且以相對於陰性對照的百分比增加±標準偏差來表示。
使用抗體H4H1657N2以及H4H1669P與對照投與給C57小鼠來 進行類似實驗。特別地，10週大雄性C57小鼠依據下列給藥時間表，皮下投與10mg/kg抗體：每週2x連續2週。關於這個實驗，5隻小鼠投與同型陰性對照抗體；5隻小鼠投與對照I(Myo29)；5隻小鼠投與H4H1657N2；而6隻小鼠投與H4H1669P。結果歸納於表21中並且以相對於陰性對照的百分比增加±標準偏差來表示。
接下來，在SCID小鼠中使用抗體H4H1657N2以及H4H1669P進行劑量反應實驗。特別地，依據下列給藥時間表對10週大雄性SCID小鼠皮下投與30mg/kg對照抗體，以及2.5、10或30mg/kg的H4H1657N2與H4H1669P：在第1週每週2x而之後每週1x。結果歸納於表22與23中並且以相對於陰性對照的百分比增加±標準偏差來表示。
在一個不同的實驗中，依據下列給藥時間表，5組的6隻10週大雄性SCID小鼠以10mg/kg皮下投與同型陰性對照抗體，而以0.1、0.75、2.5或10mg/kg皮下投與H4H1657N2：在第1週每週2x而之後每週1x，總共處理28天。結果歸納於表24中，以相對於陰性對照的百分比增加±標準偏差來表示。
表24
如同這個實驗中所示，當投與小鼠一個範圍的劑量時，抗體H4H1657N2以及H4H1669P在肌肉質量方面產生明顯增加。
實施例11. 抗-GDF8抗體對於葡萄糖恆定的影響
針對本發明抗-GDF8抗體在膳食誘發肥胖症(DIO)小鼠模型中測試其對於葡萄糖恆定以及胰島素敏感性的影響。在這個實驗中，藉由自9週大時開始餵食C57BL6小鼠高脂膳食(45% kcal脂質)7週而獲得DIO小鼠。自第8週起，以30mg/kg投與抗體1週2次，歷時又2週，並且在1週後(處理後21天)中止研究。本實驗中所使用的抗體為H4H1669P以及H4H1657N2，還有同型陰性對照抗體與對照I(對應於myo29的抗-GDF8抗體)。在抗體處理之前以及之後進行胰島素耐受性試驗。在4小時禁食之後藉由腹膜內注射投與胰島素(2IU/kg)並且測量葡萄糖位準。結果圖示於第3A圖(在抗體處理之前)以及第3B圖(在抗體處理之後)中。
如同這個實驗中所證實的，因為投與抗-GDF8抗體而抑制肌肉生長抑制素會增進DIO小鼠體內的葡萄糖恆定。在抗-GDF8抗體組 (H4H1669P、H4H1657N2或對照I)與同型對照抗體組之間注意到對胰島素食團有反應而在降低葡萄糖方面有明顯差異。
實施例12. 藉由投與H4H1657N2活體內阻斷肌肉萎縮
使用C57小鼠來測定H4H1657N2在預防因為打石膏/固定以及地塞米松投藥而誘發的肌肉萎縮的活體內特性。
在打石膏的例子中，3組的8隻C57小鼠被麻醉，且踝關節以90°角打石膏固定14天。第4組是未受干擾且用作為未固定對照。在固定的14天期間，投與小鼠同型陰性對照抗體；對照I(Myo29)；或H4H1657N2。3組皮下注射30mg/kg的抗體，每週2x，歷時2週，從固定時開始。結果歸納於表25中，以相對於陰性對照的百分比變化±標準偏差來表示。結果顯示在固定14天之後，接受H4H1657N2抗體處理的組別相對於同型對照組在骨骼肌流失方面顯示有明顯降低。
在地塞米松的例子中，2組的5隻C57小鼠被麻醉並且被皮下植入遞送1μg地塞米松/g/天的滲透泵。2個額外的組別植入遞送食鹽水的滲透泵並啟用作為對照。在14天處理的期間，2組小鼠(1組食鹽水以及1組地塞米松)投與同型陰性對照抗體；而2組小鼠(1組食鹽水以及1組地塞米松)投與H4H1657N2抗體。以30mg/kg，每週2x皮下注射抗體歷時2週。自泵植入之時開始抗體處理。結果歸納在表26中，以相對於陰性對照的百分比變化±標準偏差來表示。接受 H4H1657N2抗體的地塞米松組相對於接受同型對照的組別顯示，以H4H1657N2抗體處理能預防地塞米松治療誘發的肌肉重量流失。
實施例13. H4H1657N2在活體內的特異性
為了檢驗H4H1657N2在活體內的特異性，注射C57BL6小鼠藥物，並且從經處理小鼠所取得的血清被拿來進行以質譜法為基礎的配位子釣魚實驗(mass spectrometry based ligand "fishing" experiment)。簡言之，在14天期間內將藥物(H4H1657N2、對照IV或同型陰性對照)注射至C57BL6小鼠體內數次(第0、3、7、10天)。在第14天犧牲動物並將血清與與抗人類Fc珠粒一起培育。洗滌珠粒且以SDS-PAGE加載緩衝液洗提連結的材料。洗出的材料被拿來進行SDS-PAGE，而對應於5-20kDa的分子量範圍割下凝膠片。使用標準還原、烷基化以及胰蛋白酶化條件來處理樣品以供用於質譜法。消化物在奈米C18管柱中被分離並且自動點漬在Bruker Anchor Target上。使用LC-WARP(Bruker Daltonics)以自動化方式進行MALDI-MS(MS/MS)分析(Bruker Ultraflextreme)。使用MASCOT(Matrix Science)來搜尋質譜，並且相對於同型對照來評估結果。洗出的蛋白質列示於表27中。
如表27中所示，依據這個實驗，僅有小鼠GDF8被鑑定為H4H1657N2的結合夥伴。(小鼠與人類GDF8的序列相同)。相對地，除了GDF8以外，對照IV結合TGFβ配位子家族的其他數個成員，包括，尤其是GDF11。這個實驗確認H4H1657N2在活體內對於GDF8的特異性。
本發明就範圍來說並不受到此處所述的特定具體例囿限。更確切地說，除了此處所述者以外，本發明的各種修飾對於那些習於技藝者來說由前面描述以及圖式來說是清楚的。此等修飾意欲落在隨附申請專利範圍的範疇內。
<110> 再生元醫藥公司 REGENERON PHARMACEUTICALS,INC.
<120> 抗人類GDF8之抗體 ANTIBODIES TO HUMAN GDF8
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<220>
<223> 合成
<400> 390
<210> 391
<211> 340
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 391

Claims (16)

  1. 一種單離人類抗體或其抗原-結合片段，其特異性與含SEQ ID NO：340之野生型成熟人類GDF8結合或阻斷其生物活性，但不與嵌合GDF8/TGFβ1建構物結合或阻斷其生物活性，該嵌合GDF8/TGFβ1建構物具有經TGFβ1之對應胺基酸序列所取代的成熟人類GDF8的胺基酸48-72。
  2. 如申請專利範圍第1項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該嵌合GDF8/TGFβ1建構物包含SEQ ID NO：352的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含：(a)重鏈CDR(HCDR1、HCDR2與HCDR3)，其係來自具有選自由SEQ ID NO：114、360以及376所構成之群組的胺基酸序列的重鏈可變區域；以及(b)輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2與LCDR3)，其係來自具有選自由SEQ ID NO：122、368以及384所構成之群組的胺基酸序列的輕鏈可變區域。
  4. 如申請專利範圍第3項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含：(a)HCDR1/HCDR2/HCDR3胺基酸序列，選自於由SEQ ID NO：116/118/120、362/364/366與376/380/382所構成之群組；以及(b)LCDR1/LCDR2/LCDR3胺基酸序列，選 自於由SEQ ID NO：124/126/128、370/372/374與386/388/390所構成之群組。
  5. 如申請專利範圍第4項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含選自於由SEQ ID NO：116/118/120/124/126/128、362/364/366/370/372/374與376/380/382/386/388/390所構成之群組的重鏈及輕鏈CDR胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第5項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含選自於由SEQ ID NO：114/122、360/368與376/384所構成之群組的重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列對(HCVR/LCVR)。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該抗體或抗原-結合片段包含HDCR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2與LCDR3胺基酸序列，其中：(a)HCDR1，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的胺基酸序列(SEQ ID NO：329)，其中X1為Gly；X2為Phe；X3為Thr；X4為Phe；X5為Ser；X6為Ala或Ser；X7為Phe或Tyr；X8為Gly或Ala；(b)HCDR2，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的胺基酸序列(SEQ ID NO：330)，其中X1為Ile；X2為Gly或Ser；X3為Tyr或Gly；X4為Ser或Asp；X5為Gly；X6為Gly；X7為Ser或Asn；而X8為Ala或 Glu；(c)HCDR3，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14的胺基酸序列(SEQ ID NO：331)，其中X1為Ser或Ala；X2為Thr或Lys；X3為Asp或Ile；X4為Gly或Ser；X5為Ala或His；X6為Trp或Tyr；X7為Lys或Asp；X8為Met或Ile；X9為Ser或Leu；X10為Gly或Ser；X11為Leu或Gly；X12為Asp或Met；X13為Val或Asp；X14為Val或不存在；(d)LCDR1，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6的胺基酸序列(SEQ ID NO：332)，其中X1為Gln；X2為Asp或Gly；X3為Ile；X4為Ser；X5為Asp或Asn；而X6為Tyr或Trp；(e)LCDR2，含有式X1-X2-X3的胺基酸序列(SEQ ID NO：333)，其中X1為Thr或Ala；X2為Thr或Ala；而X3為Ser；以及(f)LCDR3，含有式X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的胺基酸序列(SEQ ID NO：334)，其中X1為Gln；X2為Lys或Gln；X3為Ala或Tyr；X4為Asp或Asn；X5為Ser；X6為Ala或Phe；X7為Pro；X8為Leu；且X9為Thr。
  8. 一種單離人類抗體或其抗原-結合片段，結合至如申請專利範圍第1至7項中任一項的單離抗體或其抗原-結合片段之野生型成熟人類GDF8(SEQ ID NO：340)上的相同抗原決定區。
  9. 一種單離人類抗體或其抗原-結合片段，其與如申請專利範圍第1至7項中任一項的單離抗體或其抗原-結合片段競爭結合野生型成熟人類GDF8(SEQ ID NO：340)。
  10. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原-結合片段及醫藥學上可接受的載劑或稀釋劑。
  11. 如申請專利範圍第1至9項中任一項的單離抗體或抗原-結合片段，或如申請專利範圍第10項的醫藥組成物，其係用於治療罹患、經診斷為罹患可藉由抑制GDF8活性而治療之疾病或病症或處於罹患風險下的病患。
  12. 如申請專利範圍第11項的單離抗體或其抗原-結合片段，其中該可藉由抑制GDF8活性而治療之疾病或病症是選自於由下列所構成之群組的疾病或病症：肌肉減少症、惡病質以及因為不用或固定所致的肌肉萎縮症。
  13. 如申請專利範圍第1至9項中任一項的單離抗體或其抗原-結合片段，或如申請專利範圍第10項的醫藥組成物於製造醫藥品之用途，該醫藥品供治療罹患、診斷為罹患可藉由抑制GDF8活性而治療之疾病或病症或處於罹患風險下的病患。
  14. 如申請專利範圍第13項的用途，其中該可藉由抑制 GDF8活性而治療之疾病或病症是選自於由下列所構成之群組的疾病或病症：肌肉減少症、惡病質以及因為不用或固定所致的肌肉萎縮症。
  15. 一種在患者體內抑制GDF8活性的治療方法，該方法包含對有需要的患者投與如申請專利範圍第1至9項中任一項的單離抗體或其抗原-結合片段，或如申請專利範圍第10項的醫藥組成物。
  16. 如申請專利範圍第15項的方法，其中該患者罹患、經診斷為罹患選自於由下列所構成之群組的疾病或病症或處於罹患的風險下：肌肉減少症、惡病質以及因為不用或固定所致的肌肉萎縮症。
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