BR112015022123B1

BR112015022123B1 - Anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à hepcidina ou um peptídeo de hepcidina, uso, meio contentor e kit

Info

Publication number: BR112015022123B1
Application number: BR112015022123-8A
Authority: BR
Inventors: Mark Westerman; Vaughn Ostland; Huiling Han; Patrick Gutschow; Keith Westerman; Gordana Olbina
Original assignee: Intrinsic Lifesciences, Llc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2022-08-09
Also published as: JP2019037236A; AU2014236677A1; KR102218494B1; US20160017032A1; CN105263514B; MX2015011772A; BR112015022123A2; JP2016513664A; AU2014236677B2; US9803011B2; IL241079A0; IL261547B; WO2014152006A3; CN105263514A; MX359794B; CA2904357C; CA2904357A1; CN110041427A; ES2695166T3; BR112015022123A8

Abstract

ANTICORPOS, FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DOS MESMOS QUE SE LIGAM ESPECIFICAMENTE À HEPCIDINA, USO, MEIO CONTENTOR E KIT PARA TRATAMENTO UTILIZANDO TAIS ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente à hepcidina e métodos de utilização dos anticorpos. Outro aspecto refere-se a anticorpos que se ligam à hepcidina e regulam a homeostase de ferro. Outro aspecto refere-se ao uso de anticorpos humanizados que se ligam à hepcidina para o tratamento de uma doença ou condição associada à hepcidina.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA

[0001] Este pedido reivindica o benefício de Pedido Provisório No. U.S. 61/791.953, depositado em 15 de março de 2013, cujo pedido está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 7 de março de 2014, é denominada 44546- 702.601_SL.txt e tem tamanho de 38.025 bytes.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O ferro é um elemento traço essencial exigido para o crescimento e desenvolvimento de organismos vivos. Em mamíferos, o teor de ferro é regulado ao controlar a absorção de ferro, reciclagem de ferro e liberação de ferro das células nas quais o mesmo é armazenado. O ferro é predominantemente absorvido no duodeno e jejuno superior por enterócitos. O ferro é reciclado a partir de glóbulos vermelhos degradados por macrófagos reticuloendoteliais na medula óssea, células hepáticas de Kupffer e baço. A liberação de ferro é controlada por ferroportina, uma proteína de exportação de ferro essencial localizada na superfície celular de enterócitos, macrófagos e hepatócitos, as células principais capazes de liberar ferro no plasma. A hepcidina se liga à ferroportina e reduz sua atividade funcional fazendo com que a mesma seja internalizada a partir da superfície celular e degradada. (Nemeth et al., Science, 306:2090-3, 2004).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina (Hep) ou um peptídeo hepcidina são fornecidos no presente documento. Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à terminação N de hepcidina ou um peptídeo hepcidina e neutraliza a atividade de hepcidina in vitro e/ou in vivo.

[0005] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina ou um peptídeo hepcidina, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve,

[0006] em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 55-57, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 58-60, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61-63; e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 64-66, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 67-69, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 70-72.

[0007] Em um aspecto, proporciona-se um anticorpo, ou fragment de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina ou um peptídeo de hepcidina, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve,

[0008] em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-3, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 4-6, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 7-9; e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 10-12, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 13-15, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 16-18.

[0009] Em um aspecto, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, fornecido no presente documento compreende IgG1 ou uma cadeia pesada variável e cadeia leve variável IgG4.

[0010] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina ou um peptídeo de hepcidina, que é preparado ao injetar em um roedor (isto é, camundongo, rato ou coelho) um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 19-27. Em outra modalidade, o peptídeo é conjugado com um carreador (por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH)) ou administrado com um adjuvante (adjuvante completo de Freund (CFA) ou adjuvante incompleto de Freund (IFA)). Em outra modalidade, o peptídeo é conjugado com um hapteno (por exemplo, dinitrofenol [DNP]) e um carreador.

[0011] Um peptídeo hepcidina ao qual um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga pode ter, em alguns casos, uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[0012] Proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre Hep-5, Hep-9, Hep-20, Hep 22 e Hep25.

[0013] Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos de Hep-20 (SEQ ID NO: 22), Hep 22 (SEQ ID NO: 23) e Hep25 (SEQ ID NO: 19).

[0014] Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a um epítopo que compreende Hep-5 (SEQ ID NO: 25) ou Hep-9 (SEQ ID NO: 24). Em outra modalidade, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epítopo que compreende resíduos de aminoácido 1 a 9 de hepcidina. Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 resíduos de aminoácido de um epítopo que compreende resíduos de aminoácido 1 a 9 de hepcidina.

[0015] Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada CDR1 codificada por SEQ ID NO: 55, uma cadeia pesada CDR2 codificada por SEQ ID NO: 58, uma cadeia pesada CDR3 codificada por SEQ ID NO: 61, uma cadeia leve CDR1 codificada por SEQ ID NO: 64, uma cadeia leve CDR2 codificada por SEQ ID NO: 67, e uma cadeia leve CDR3 codificada por SEQ ID NO: 70.

[0016] Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada CDR1 codificada por SEQ ID NO: 56, uma cadeia pesada CDR2 codificada por SEQ ID NO: 59, uma cadeia pesada CDR3 codificada por SEQ ID NO: 61, uma cadeia leve CDR1 codificada por SEQ ID NO: 65, uma cadeia leve CDR2 codificada por SEQ ID NO: 68, e uma cadeia leve CDR3 codificada por SEQ ID NO: 71.

[0017] Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada CDR1 codificada por SEQ ID NO: 57, uma cadeia pesada CDR2 codificada por SEQ ID NO: 60, uma cadeia pesada CDR3 codificada por SEQ ID NO: 63, uma cadeia leve CDR1 codificada por SEQ ID NO: 66, uma cadeia leve CDR2 codificada por SEQ ID NO: 69, e uma cadeia leve CDR3 codificada por SEQ ID NO: 72.

[0018] O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, ou um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, uma cadeia pesada variável humanizada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 40. Em outra modalidade, uma cadeia leve variável humanizada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 38.

[0019] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que compreende uma região de região de estrutura variável de cadeia pesada; e uma região de estrutura variável de cadeia leve framework apresentada na Listagem de Sequência abaixo em que as CDRs identificadas em qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-18 são inseridas na região de estrutura utilizando a numeração de Kabat.

[0020] O fragmento de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo,um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento scFv, um polipeptídeo de ligação de cadeia simples, um fragmento Fd, uma cadeia pesada variável, uma cadeia leve variável ou um fragmento dAb. Um fragmento de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, um AVIMER, um anticorpo bivalente, ou um dímero de cadeia pesada. Um dímero de cadeia pesada pode ser, por exemplo, um camelídeo ou uma construção de cadeia pesada de tubarão.

[0021] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode ter uma constante de dissociação (Kd) de cerca de 1 a cerca de 10 pM, a partir de cerca de 10 a cerca de 20 pM, a partir de cerca de 1 a cerca de 29 pM, a partir de cerca de 30 a cerca de 40 pM, a partir de cerca de 10 a cerca de 100 pM, ou a partir de cerca de 20 a cerca de 500 pM.

[0022] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode ter uma constante de dissociação (Kd) de menos que cerca de 500 pM, menos que cerca de 400 pM, menos que cerca de 300 pM, menos que cerca de 200 pM, menos que cerca de 100 pM, menos que cerca de 75 pM, menos que cerca de 50 pM, menos que cerca de 30 pM, menos que cerca de 25 pM, menos que cerca de 20 pM, menos que cerca de 18 pM, menos que cerca de 15 pM, menos que cerca de 10 pM, menos que cerca de 7.5 pM, menos que cerca de 5 pM, menos que cerca de 2,5 pM, ou menos que cerca de 1 pM.

[0023] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode ter uma afinidade com hepcidina ou um peptídeo de hepcidina a partir de cerca de 10-9 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-10 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-11 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-12 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-13 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-10 a cerca de 10-11, a partir de cerca de 10-11 a cerca de 10-12, a partir de cerca de 1012 a cerca de 10-13, ou 10-13 a cerca de 10-14.

[0024] Proporciona-se no presente documento uma composição, que compreende um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, descrito no presente documento, e um carreador ou excipiente aceitável.

[0025] Também proporciona-se no presente documento uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento. Também proporciona-se no presente documento um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico, ligada de maneira funcional a uma sequência de controle reguladora. Também proporciona-se no presente documento uma célula hospedeira que compreende um vetor ou uma molécula de ácido nucleico fornecida no presente documento. Também proporciona-se no presente documento um método de utilizar a célula hospedeira para produzir um anticorpo, que compreende cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas de modo que o ácido nucleico seja expresso para produzir o anticorpo.

[0026] Métodos terapêuticos que utilizam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descritos no presente documento são fornecidos no presente documento. Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar um distúrbio de homeostase do ferro em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de modular a atividade de hepcidina em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método para tratar um distúrbio de homeostase do ferro em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de hemocromatose em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Em ainda outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de um indivíduo com níveis de hepcidina patologicamente ou inapropriadamente elevados (inapropriadamente elevados em relação às reservas de ferro no corpo e plasma), que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de anemia em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento ou redução de inflamação em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Em uma modalidade, a inflamação que será tratada ou reduzida é inflamação crônica. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de uma infecção em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Uma infecção pode ser, por exemplo, uma infecção bacteriana, fúngica, ou viral. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de anemia refratária por deficiência de ferro (IRIDA). Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de Anemia da Inflamação (AI) e Anemia de Doença Crônica (ACD). Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de doença renal crônica (CKD). Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de câncer e Anemia Induzida por Quimioterapia (CCIA) que são associadas à hepcidina elevada. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratamento de doenças neuroinflamatórias que são associadas à hepcidina elevada.

[0027] Qualquer um desses métodos pode, em alguns casos, compreender adicionalmente administrar ao dito indivíduo um ou mais estimulantes de eritropoiese. Os estimulantes de eritropoiese incluem, mas não se limitam a, eritropoietina, um variante de eritropoietina, um agente estimulante de eritropoiese (ESA; como, por exemplo, Alfaepoetina [por exemplo, Procrit®, Epogen®, etc.], Betaepoetina [por exemplo, NeoRecormon, etc.], Alfadarbepoetina [por exemplo, Aranesp®, etc.], Metóxi polietileno glicol-betaepoetina [por exemplo, Mircera®, etc.], etc.), um fator induzível de hipóxia (HIF) inibidor de prolil hidroxilase, um fator eritroide derivado de medula óssea (por exemplo eritroferrona), um peptídeo mini-hepcidina (consulte, por exemplo, Publicação No. U.S. 20120040894, por Ganz et al., que está incorporado no presente documento a título de referência), um inibidor anti-senso de hepcidina (consulte, por exemplo, Publicação No. U.S. 20100136015, por Lin and Babitt., que está incorporada no presente documento a título de referência), um inibidor siRNA de hepcidina (Id.), inibidor miRNA de hepcidina (Id.), um anticorpo anti-BMP-2 (Id.), um anticorpo anti-BMP-4 (Id.), um anticorpo anti-BMP-6 (Id.), um inibidor de pequenas moléculas (Id.), um anticorpo anti-IL-6 (consulte, por exemplo, Publicação No. U.S. 20110059080, por Cornfeld et al., que está incorporado no presente documento a título de referência), um anticorpo anti-TNF-alfa, metotrexato, um agente anti-inflamatório (por exemplo, um esteroide [por exemplo, um corticosteroide, etc.]; um fármaco inflamatório não esteroidal [NSAID; por exemplo, aspirina, ibuprofeno, naproxeno, um inibidor de enzima ciclooxigenase (COX), etc.], um hormônio (por exemplo, testosterona), ou um derivado anti- inflamatório seletivo imune [ImSAID; por exemplo, tripeptídeo FEG (Phe-Glu-Gly) e seu isômero D feG]), hemojuvelina, um anticorpo que liga eritropoietina, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina e o estimulante de eritropoiese é administrado simultaneamente ou sequencialmente.

[0028] A administração de uma composição no presente documento pode ser qualquer meio adequado que inclui, mas não se limita a, injeção. Em uma modalidade, a injeção pode ser, por exemplo, injeção intravenosa, subcutânea, intramuscular ou espinhal no fluido cerebrospinal (CSF).

[0029] Proporciona-se no presente documento um meio contentor que compreende uma composição descrita no presente documento. O meio contentor pode ser qualquer contentor que pode alojar um líquido ou composição liofilizada que inclui, mas não se limita a, um conceptáculo, seringa, garrafa, uma bolsa intravenosa (IV) ou ampola. Uma seringa pode reter qualquer volume de líquido adequado para injeção em um indivíduo que inclui, mas não se limita a, 0,5 cc, 1 cc, 2 cc, 5 cc, 10 cc ou mais.

[0030] Kits que compreendem uma composição ou composições descritas no presente documento são fornecidos no presente documento. Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevados ou um distúrbio de homeostase de ferro, que compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento e um estimulante de eritropoiese. Poderia ser entendido, em alguns casos, que a hepcidina pode estar na faixa normal, porém inapropriadamente elevada em relação a reservas de ferro.

[0031] Em outro aspecto, proporciona-se no presente document um kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevadas ou um distúrbio de homeostase de ferro, que compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento, e uma identificação anexada ou embalada com o contentor, sendo que a identificação descreve o uso do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com um estimulante de eritropoiese.

[0032] Em outro aspecto, proporciona-se no presente document um kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevados, que compreende um estimulante de eritropoiese e uma identificação anexada ou embalada com o contentor, sendo que a identificação descreve o uso do estimulante de eritropoiese com um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento.

INCORPORAÇÃO A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[0033] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados nesse relatório descritivo estão incorporados no presente documento a título referência na mesma extensão como se cada publicação, patente, ou pedido de individual estivesse específica e individualmente indicada para ser incorporada a título de referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento das características e vantagens da presente invenção será obtido a título de referência à seguinte descrição detalhada que apresenta modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados e os desenhos anexos, nos quais:

[0035] Figura 1. Exemplos de sequências de antígeno de peptide hepcidina usadas para imunizar camundongos BALB/c para a produção de hibridoma e descoberta de MAbs H32, 583, e 1B1.

[0036] Figura 2. Exemplo de uma primeira fase de triagem de hibridomas isolados utilizando placas revestidas com neutravidina revestidascom K18-biotina hepcidina-25 e detectados por HRP conjugado com IgG (H+L) anti-camundongo. As densidades ópticas (OD) em 450 nm após o desenvolvimento de HRP e adição de solução de parada são exibidas. Nota-se sinais positivos (>2,0 OD) em Coluna 9 linhas D-F. Os poços de controle positivos e negativos são G12 e H12, respectivamente.

[0037] Figura 3. Exemplo de uma segunda fase de triagem de hibridomas isolados da primeira fase de triagem determinados como positivos (Figura 2) utilizando placas revestidas com Fc de coelho anti- camundongo para capturar IgG de camundongo de sobrenadantes de hibridoma. As IgGs de camundongo ligadas são, então, examinadas quanto à ligação à K18-biotina hepcidina-25 utilizando HRP conjugado com estreptavidina. As densidades ópticas (OD) em 450 nm após o desenvolvimento de HRP e adição de solução de parada são exibidas. Nota-se sinais positivos (>2,0 OD) na Coluna 9 linha D. Os poços de controle positivos e negativos são G12 e H12, respectivamente.

[0038] Figura 4. Triagem de atividade funcional de hibridomas positivos para ligação anti-hepcidina. Os poços são revestidos com anticorpos Fc anti-camundongo e bloqueados. Em poços duplicados, cada sobrenadante de hibridoma indicado foi adicionado ao tampão de ligação contendo 1 ng de traçador de NT -biotina hepcidina-25, com ou sem 100 ng de hepcidina-25 sintética. A ligação da NT-biotina hepcidina-25 foi detectada com SA-HRP como OD em 450 nm após a adição de solução de parada aos poços. O anticorpo 5A3 (como 4B1 e 5A4) mostrou excelente ligação em tampão sem hepcidina-25 e foi completamente bloqueado por hepcidina-25 no tampão de ligação indicando que o hibridoma 5A3 continha um anticorpo ligado tanto à NT- biotina hepcidina-25 como à hepcidina-25 sintética em solução. O clone essencialmente derivado de hibridoma 5A3 foi posteriormente renomeado MAb 583; assim, os dados para MAb 583 são mostados nos poços 5A3. Os clones 4B1 e 5A4, embora aparentemente positivos nessa análise, não conseguiram produzir anticorpos anti-hepcidina funcionais quando testados após a expansão, funcionalidade, e triagem de isotipo adicionais.

[0039] Figura 5. Características de MAbs 583, 1B1, e H32, inclusive antígenos, títulos de soro de camundongos BALB/c imunizados, sítios de injeção, frequência de injeção, tecido(s) usado(s) para produção de hibridoma, e taxas de sucesso através de cada fase de triagem resultaram nesses anticorpos monoclonais anti-hepcidina funcionais isolados.

[0040] Figura 6. Taxas de sucesso totais de MAbs anti-hepcidina- 25 funcionais através de campanhas de desenvolvimento de 8 MAb. Um total de 11.845 hibridomas foi classificado quanto à descoberta de MAbs H32, 583, e 1B1.

[0041] Figura 7. Análise SDS-PAGE redutora de purificação de MAb 583 em uma Coluna de Proteína A. Preparações cruas de sobrenadantes de hibridoma diluídos, frações de fluxo contínuo coletadas durante a lavagem de coluna, e MAb 583 altamente purificado (Lote de Purificação 003) e 1B1 (Lote de Purificação 003) analisado por coloração de Coomassie. As descrições de linha são fornecidas à direita do ensaio.

[0042] Figura 8. Análise ELISA de neutralização de MAb 583 em solução por hepcidina-25. Essa triagem baseada em solução testou a capacidade de 0,0, e 0,1-8,0 ng de hepcidina-25 sintética (eixo geométrico x) de bloquear (neutralizar) a ligação de 20 ng de MAb 583 em solução. A hepcidina sintética (0,1-8,0 ng) foi adicionada a 20 ng de MAb 583 durante duas horas em tampão de ligação. As soluções de MAb 583 tratadas com hepcidina-25 foram adicionadas a poços duplicados com hepcidina-25 (200 ng/poço) covalentemente ligada a placas de micropoços ativadas por anidrido maleico. A ligação à hepcidina-25 por MAb 583 foi detectada utilizando IgG (H+L) de coelho anti-camundongo conjugado em HRP com TMB como o substrato. A ligação de MAb 583 à hepcidina-25 ligada é quantificada por espectrofotometria após a adição de solução de parada ao medir a OD (densidade óptica) em 450 nm.

[0043] Figura 9. Gel SDS-PAGE de tricina não redutor (painel esquerdo) colorido com Coomassie e Western blot (painel direito) de hepcidina-25, hepcidina-22, hepcidina-20, e protegrina (1.5 μg/linha) sondado com MAb 583. As descrições de linha são fornecidas na legenda abaixo do gráfico.

[0044] Figura 10. SDS-PAGE redutor de coloração com Coomassie e Western blots de atividade de ligação de MAb 583 e MAb 1B1 contra hepcidina-25, hepcidina-20, K18-biotin hepcidina-25, K24-biotin hepcidina-25, e NT-biotina hepcidina-25. As descrições de linha são fornecidas na legenda abaixo do gráfico.

[0045] Figura 11. Análise Biacore de afinidades de ligação de MAb 583 em 24 μg/ml, para K18-biotina hepcidina-25, NT-biotina hepcidina- 25, e K24-biotina hepcidina-25 ligadas a um chip Biacore revestido com estreptavidina. Os dados mostram afinidade e constantes de dissociação picomolares altas para MAb 583 para NT-biotina hepcidina- 25, e aproximadamente constantes de afinidade reduzidas em um log para K18-biotina hepcidina-25 e K24-biotin hepcidina-25, respectivamente.

[0046] Figura 12. Análise Biacore de afinidades de ligação de MAb 583 em 5 μg/ml para K18-biotina hepcidina-25 e NT-biotina hepcidina- 25 ligadas a um chip Biacore revestido com estreptavidina. Há pouca alteração na inclinação do traço Biacore durante 1200 segundos (20 minutos) indicando baixas constantes de dissociação de MAb 583 para K18-biotina hepcidina-25 e NT-biotina hepcidina-25.

[0047] Figura 13. A afinidade de ligação resulta de experimentos Biacore mostrados na Figura 12. Os dados mostram afinidade maior e constantes de associação picomolar (KA) e dissociação (KD) menores para MAb 583 para K18-biotina hepcidina-25 do que NT-biotina hepcidina-25 quando avaliada em 24 μg/ml.

[0048] Figura 14. Dados Biacore que mostram a afinidade de ligação de MAb 1B1 em 24 μg/ml para K18-biotina hepcidina-25, NT- biotina hepcidina-25, e K24-biotina hepcidina-25. Esses dados mostram que MAb 1B1 tinha forte afinidade de ligação para K24-biotina hepcidina-25, afinidade menor para K18-biotina hepcidina-25, e nenhuma afinidade para NT-biotina hepcidina-25. Esse experimento foi conduzido durante 500 segundos e uma não dissociação de 1B1 foi observada ou calculável pelo instrumento Biacore após a ligação à K24- biotina hepcidina-25 e K18-biotina hepcidina-25 durante 500 segundos.

[0049] Figura 15. Dados Biacore que mostram afinidade de ligaçãode MAb 1B1 em 24 μg/ml para K24-biotina hepcidina-25. Esses dados mostram forte afinidade de 1B1 para K24-biotina hepcidina-25 e nenhuma dissociação de MAb 1B1 de K24-biotina hepcidina-25 durante 500 segundos sugerindo que uma baixa constante de dissociação picomolar para femtamolar de 1B1 parahepcidina-25 é possível.

[0050] Figura 16. Análise de curva padrão ELISA de ligação de hepcidina-25, hepcidina-22, e hepcidina-20 a anticorpo MAb 583 revestido em 100 ng/ml por poço. A ligação relativa do traçador de NT- biotina hepcidina-25 (1 ng/poço) em relação à hepcidina-25, hepcidina- 22, e hepcidina-20 foi medida por ELISA. Uma análise de regressão logística de quatro parâmetros foi conduzida utilizando o software GraphPad Prism para produzir as curvas mostradas. Um deslocamento para a direita na curva demonstra afinidade de MAb 583 para hepcidina- 22 e hepcidina-20 consecutivamente menor do que MAb 583 tem para hepcidina-25.

[0051] Figura 17. Análise ELISA de ligação à hepcidina-1 de murino (hepcidina-25 de camundongo), protegrina, e peptídeo hepcidina-(10- 25) para MAb 583 comparado com NT-biotina hepcidina-25. Esses dados mostram que não há ligação de MAb 583 à hepcidina-1 de murino, protegrina, ou um peptídeo hepcidina-(10-25) oxidado e redobrado contendo as ligações de cisteína apropriadas para essa região de hepcidina-25 em concentrações de até 2000 ng/ml.

[0052] Figura 18. Análise ELISA de ligação de peptídeo hepcidina- (10-25) a MAb 1B1. Os resultados indicam que MAb 1B1 não há afinidade de ligação para um peptídeo de hepcidina-(10-25) oxidado e redobrado contendo as ligações de cisteína apropriadas para essa região quando comparado com hepcidina-25. K18-biotina hepcidina-25 foi usada para a detecção. Nota-se que não há ligação de peptídeo hepcidina-(10-25) a MAb 1B1 em concentrações de até 2000 ng/ml.

[0053] Figura 19. Análise ELISA de ligação de hepcidina-(10-25) a MAb 1B1. Os resultados indicam que MAb 1B1 não tem afinidade de ligação para um peptídeo hepcidina-(10-25) oxidado e redobrado contendo as ligações de cisteína apropriadas para essa região quando comparado com hepcidina-25. NT-biotina hepcidina-25 foi usada para a detecção. Nota-se que não há ligação de hepcidina-(10-25) a MAb 1B1 em concentrações de até 2000 ng/ml do peptídeo hepcidina-(10-25).

[0054] Figura 20. Citometria de fluxo de células Fpn-GFP tratadas com MAb 583. As células foram induzidas de um dia para o outro com ponasterona para induzir a expressão de Fpn-GFP murino. No dia seguinte, a ponasterona foi removida por lavagem, e hepcidina-25 e anticorpos MAb 583 adicionados durante 24 horas. Hepcidina-25 foi usada em 100 ng/ml de concentração (37 nM). MAb 583 foi adicionado em 10 vezes, 2 vezes ou 1/3 de concentração de hepcidina (370 nM, 74 nM e 10 nM). O MAb de controle era um anticorpo monoclonal anti- hepcidina reprovado quando analisado in vitro por ELISA e foi usado na concentração mais alta (370 nM). Nota-se que 10 nM de MAb 583 neutralizaram completamente e 37 nM de hepcidina-25 e sua atividade biológica resultando na degradação de FPN-GFP.

[0055] Figura 21. Porcentagem (%) de alteração em fluorescência FPN-GFP em células HEK tratadas com MAb 583 em concentrações de 10 a 370 nM na presença de 37 nM de hepcidina-25.

[0056] Figura 22. Citometria de fluxo de células Fpn-GFP tratadas com MAb 583. As células foram induzidas de um dia para o outro com ponasterona para induzir a expressão de Fpn-GFP murino. No dia seguinte, a ponasterona foi removida por lavagem, e hepcidina-25 e anticorpos MAb 583 adicionados durante 24 horas. A hepcidina-25 foi usada em concentração de 100 ng/ml (37 nM). MAb 583 foi adicionado em 1/3, 1/6, 1/12, e 1/24 a concentração molar de hepcidina-25 nesses ensaios baseados em células de atividade biológica de MAb 583. O MAb de controle era um anticorpo monoclonal anti-hepcidina reprovado quando analisado in vitro por ELISA e foi usado na concentração mais alta (370 nM). Nota-se que 2,5 nM de MAb 583 neutralizaram significativamente (~23% de redução) 37 nM de hepcidina-25 e sua atividade biológica resultando na degradação de FPN-GFP em 1/12 da razão molar in vitro.

[0057] Figura 23. Porcentagem (%) de alteração em fluorescência FPN-GFP em células HEK tratadas com MAb 583 em concentrações a partir de 0,62-10 nM na presença de 37 nM de hepcidina-25 como descrito na Figura 22.

[0058] Figura 24. Ensaio de ferritina de células Fpn-GFP tratadas com MAb 583. As células HEK foram induzidas de um dia para o outro com ponasterona para induzir a expressão de Fpn-GFP murino e transporte de ferro para o meio. No dia seguinte, a ponasterona foi removida por lavagem, e hepcidina-25 e anticorpos MAb 583 adicionados durante 24 horas. A hepcidina-25 foi usada em 100 ng/ml de concentração (37 nM). MAb 583 foi adicionado em 10 vezes, 2 vezes ou 1/3 de concentração de hepcidina (370 nM, 74 nM e 10 nM). O MAb de controle era um anticorpo monoclonal anti-hepcidina reprovado quando analisado in vitro por ELISA e foi usado na concentração mais alta (370 nM). Nota-se que 10 nM de MAb 583 neutralizaram significativamente 37 nM de hepcidina-25 e sua atividade biológica resultando na degradação de FPN-GFP e retenção de ferro ligado à ferritina intracelular. As proteínas foram extraídas utilizando tampão RIPA e concentrações de ferritina intracelular determinadas utilizando ELISA de ferritina (Ramco).

[0059] Figura 25. Ensaio de ferritina de células Fpn-GFP tratadas com MAb 583. As células HEK foram induzidas de um dia para o outro com ponasterona para induzir a expressão de Fpn-GFP murino e transporte de ferro para o meio. No dia seguinte, a ponasterona foi removida por lavagem, e hepcidina-25 e anticorpos MAb 583 adicionados durante 24 horas. A hepcidina-25 foi usada em 100 ng/ml de concentração (37 nM) e anticorpo MAb 583 em 1/3, 1/6, 1/12, e 1/24 a concentração molar de hepcidina-25 nesse ensaio baseado em células de atividade biológica de MAb 583. O MAb de controle (sham MAb) era um anticorpo monoclonal anti-hepcidina reprovado quando analisado in vitro por ELISA e foi usado na concentração mais alta (370 nM). Nota-se que 2,5-5 nM de 583 neutralizaram significativamente 37 nM de hepcidina-25 e sua atividade biológica resultando na degradação de FPN-GFP e retenção de ferro ligado à ferritina intracelular. As proteínas foram extraídas utilizando tampão RIPA e concentrações de ferritina intracelular determinadas utilizando ELISA de ferritina (Ramco).

[0060] Figura 26. Porcentagem (%) de alteração de concentração de ferritina intracelular em células HEK tratadas com MAb 583 em concentrações a partir de 0,62-10 nM na presença de 37 nM de hepcidina-25 como descrito na Figura 25.

[0061] Figura 27. Efeito de injeção de MAb 583 e hepcidina-25 humana in vivo sobre a concentração de ferro no soro em camundongos C57Bl/6 machos. Cinco grupos de camundongos (n=8/grupo) foram injetados de maneira intraperitoneal com PBS (grupo 1, H-PBS e grupo 5, PBS), 1 mg de MAb 583 (grupo 2, H-Mab), 0,5 mg de MAb 583 (grupo 3, H-2Mab), ou 0,5 mg de Mab de controle (grupo 4, H-sham Mab). No dia seguinte, todos os camundongos no grupo 3 receberam um adicional de 0,5 mg de MAb 583 e 24 horas depois, os grupos 1 a 4 receberam uma única injeção de 50 μg de hepcidina-25 humana e o grupo 5 recebeu PBS. Todos os camundongos foram sacrificados 2 horas depois e o ferro no soro foi medido. Uma análise estatística (consulte a Figura 28 para detalhes) indicou uma diferença significativa entre PBS e PBS mais hepcidina-25 (H-PBS, P=0,001), e entre PBS mais hepcidina-25 (H-PBS) e os camundongos que receberam duas doses de 0,5 mg de MAb 583 e hepcidina-25 (H-2Mab, P=0,004).

[0062] Figura 28. Estatísticas descritivas (média, desvio padrão, SEM) e resultados de ANOVA unidirecional de concentrações de ferro no soro de cinco grupos de camundongos C57BL/6 machos do estudo in vivo de MAb 583 mostrado na Figura 27. Múltiplas Comparações versus Grupo de Controle (método de Holm-Sidak) com um nível de significância total de P= 0,05 geraram valores P não ajustados dependentes de comparação que variam a partir de 0,001 a 0,253.

[0063] Figura 29. Comparação da quimera MAb 583 com MAb 583 murino quanto à ligação a uma placa ELISA revestida com Hepcidina- 25. 100 ng de hepcidina-25 foram covalentemente ligados a poços de uma microplaca de 96 poços ativada por anidrido maleico. Quantidades crescentes de quimera MAb 583 (BAP070-01; 3650 ng/ml; quadrados abertos) e MAb 583 murino (MAb de controle positivo; triângulos abertos) foram adicionadas à placa de micropoço e deixadas se ligarem durante uma hora. A ligação de quimera MAb 583 foi detectada por IgG1 (H+L) HRP de coelho anti-humano. O anticorpo MAb 583 murino ligado foi detectado com IgG1 (H+L) anti-camundongo conjugado com HRP. As reações foram interrompidas com 1N de HCl 5 minutos após TMB ser adicionado aos poços e lido imediatamente. A ligação foi quantificada como OD em um espectrofotômetro em 450 nm após a adição de solução de parada. Eixo geométrico X: Concentração de anticorpo em ng/ml; e Eixo geométrico Y: valores de OD 450 nm.

[0064] Figura 30. Ligação de quimera MAb 583 a uma placa ELISA revestida com hepcidina-25. 100 ng de hepcidina-25 foram covalentemente ligados a poços de uma microplaca de 96 poços ativada por anidrido maleico. Quantidades crescentes de quimera MAb 583 (BAP070-01; 3650 ng/ml; círculos preenchidos) e sobrenadante de células transfectadas com vetor vazio (BAP070; quadrados preenchidos) foram adicionadas à placa de micropoçose deixada se ligar durante 2 horas. A ligação de quimera MAb 583 foi detectada por IgG1 (H+L) HRP de coelho anti-humano com TMB como substrato. A ligação foi quantificada em um espectrofotômetro em 450 nm após a adição de solução de parada.

[0065] Figura 31. Curva padrão de hepcidina-25 produzida utilizando a quimera BAP070-01 MAb 583. Os poços em placa de micropoços foram revestidos com 150ng/ml de Proteína G e bloqueadas. A quimera Mab 583 (BAP070-01) foi adicionada aos poços em 150ng/poço e deixada se ligar durante uma hora. As concentrações conhecidas de hepcidina-25 sintética foram adicionadas ao tampão de ensaio contendo NT-biotina hepcidina-25 (1ng/poço), misturadas, e adicionadas a 8 poços duplicados e deixadas competir durante duas horas. Os poços foram lavados e SA-HRP com substrato TMB foi usado para detectar a ligação do traçador NT-biotina hepcidina-25. A ligação foi quantificada em um espectrofotômetro em 450 nm após a adição de solução de parada. A curva padrão foi gerada utilizando o software Graphpad Prism (San Diego, CA) utilizando uma regressão logística de 4 parâmetros.

[0066] Figura 32. Ligação de quimera MAb 583 à NT-biotina hepcidina-25 em placas de micropoços revestidas com neutravidina. Os poços na placa de micropoços foram revestidos com 150ng/ml de neutravidina e bloqueados. O traçador de NT-biotina hepcidina-25 foi adicionado a poços em 1ng/poço e deixado se ligar durante uma hora. A quimera Mab 583 (BAP070-01) foi adicionada aos poços em150ng/poço juntamente com hepcidina-25 sintética em concentrações conhecida e deixada competir por ligação à NT-biotina hepcidina-25 durante uma hora. A ligação da quimera Mab 583 foi detectada utilizando (H+L) HRP de coelho anti-humano com TMB como substrato. A ligação foi quantificada por espectropscopia em 450 nm após a adição de solução de parada. Os pontos representam as duas duplicatas (losangos e quadrados preenchidos) e a média (triângulos preenchidos).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0067] De acordo com o presente pedido, técnicas de biologia molecular, microbiologia e DNA recombinante convencionais podem ser empregadas dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas de forma completa na literatura. Consulte, por exemplo, Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984), cada uma está especificamente incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

Terminologia de Anticorpos

[0068] Conforme usado no presente documento, o termo “anticorpo” se refere a uma imunoglobulina (Ig) seja natural ou parcial ou completamente produzida de maneira sintética. O termo também abrange qualquer polipeptídeo ou proteína tendo um domínio de ligação que é, ou é homólogo a, um domínio de ligação ao antígeno. O termo inclui adicionalmente “fragmentos de ligação ao antígeno” e outros termos intercambiáveis para fragmentos de ligação similares como descrito abaixo. Os anticorpos enxertados com região determinante de complementaridade (CDR) e outros anticorpos humanizados (inclusive modificações de CDR e modificações de região de estrutura) também são contempladas por esse termo.

[0069] Os anticorpos nativos e imunoglobulinas nativas são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 Dáltons, compostos de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). cada cadeia leve é tipicamente ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de isotipos de imunoglobulina diferentes. cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem uma extremidade e um domínio variável (“VH”) seguido por inúmeros domínios constantes (“CH”). Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (“VL”) e um domínio constante (“CL”) em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada.

[0070] Os termos “polinucleotídeo sintético”, “gene sintético” ou “polipeptídeo sintético”, como usado no presente documento, significam que a sequência de polinucleotideo correspondente ou porção da mesma, ou sequência de aminoácidos ou porção da mesma, é derivada, de uma sequência que foi desenhada, ou sintetizada de novo, ou modificada, comparado com uma sequência de ocorrência natural equivalente. Os polinucleotídeos sintéticos (anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno) ou genes sintéticos podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica, inclusive, mas não se limitam a, a síntese química de sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos. Os genes sintéticos são tipicamente diferentes de genes de ocorrência natural, no nível de aminoácido ou polinucleotídeo, (ou ambos) e ficam tipicamente localizados dentro do contexto de sequências de controle de expressão sintética. Por exemplo, as sequências de genes sintéticos podem incluir aminoácido, ou polinucleotídeo, sequências que foram alteradas, por exemplo, pela substituição, deleção ou adição de um ou mais, aminoácidos, ou nucleotídeos, fornecendo assim uma sequência de aminoácidos de anticorpo, ou uma sequência de codificação de polinucleotídeo que é diferente da sequência de origem. As sequências de polinucleotídeos de genes sintéticos, não podem necessariamente codificar proteínas com aminoácidos diferentes, comparado com o gene natural; por exemplo, os mesmos também podem incluir sequências de polinucleotídeos sintéticos que incorporam diferentes códons, porém que codificam o mesmo aminoácido (isto é, as alterações de nucleotídeo representam mutações silenciosas no nível de aminoácido).

[0071] Em relação a anticorpos, o termo “domínio variável” se refere aos domínios variáveis de anticorpos que são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular de seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Em vez disso, essa é concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis (também conhecidas como CDRs) tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas as “regiões de estrutura” ou “FRs”. Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves não modificadas contêm quatro FRs (FR1, FR2, FR3 e FR4), que adotam amplamente uma configuração de folha-β, combinadas com três CDRs, que formam alças de conexão, e em alguns casos formam parte da estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas unidas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (consulte Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), páginas 647-669).

[0072] Os termos “região hipervariável” e “CDR” quando usados no presente documento, se referem aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. As CDRs compreendem resíduos de aminoácido de três regiões de sequência que se ligam de maneira complementar a um antígeno e são conhecidas como CDR1, CDR2, e CDR3 para cada uma das cadeias VH e VL. No domínio variável de cadeia leve, as CDRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89-97 (CDRL3), e no domínio variável de cadeia pesada, as CDRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Entende-se que as CDRs de anticorpos diferentes podem conter inserções, assim, a numeração de aminoácido pode se diferir. O sistema de numeração de Kabat conta com tais inserções com um esquema de numeração que utiliza letras fixadas a resíduos específicos (por exemplo, 27A, 27B, 27C, 27D, 27E e 27F de CDRL1 na cadeia leve) para refletir quaisquer inserções nas numerações entre anticorpos diferentes. Alternativamente, no domínio variável de cadeia leve, as CDRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) e 91-96 (CDRL3), e no domínio variável de cadeia pesada, as CDRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 26-32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) e 96-101 (CDRH3) de acordo com Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)).

[0073] Conforme usado no presente documento, “região de estrutura” ou “FR” se refere a resíduos de aminoácido de estrutura que formam uma parte do bolso ou sulco de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, os resíduos de estrutura formam uma alça que é uma parte do bolso ou sulco de ligação ao antígeno e os resíduos de aminoácidos na alça podem ou não entrar em contato com o antígeno. As regiões de estrutura geralmente compreendem as regiões entre as CDRs. No domínio variável de cadeia leve, as FRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 0-23 (FRL1), 35-49 (FRL2), 57-88 (FRL3), e 98-109 e no domínio variável de cadeia pesada, as FRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 0-30 (FRH1), 36-49 (FRH2), 66-94 (FRH3), e 103-133 de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Como discutido acima com a numeração de Kabat da cadeia leve, a cadeia pesada também conta com as inserções de maneira similar (por exemplo, 35A, 35B de CDRH1 na cadeia pesada). Alternativamente, no domínio variável de cadeia leve, as FRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 0-25 (FRL1), 33-49 (FRL2) 53-90 (FRL3), e 97-109 (FRL4), e no domínio variável de cadeia pesada, as FRs tipicamente correspondem a aproximadamente resíduos 0-25 (FRH1), 33-52 (FRH2), 56-95 (FRH3), e 102-113 (FRH4) de acordo com Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)).

[0074] Os aminoácidos de alça de uma FR podem ser avaliados e determinados pela inspeção da estrutura tridimensional de uma cadeia pesada de anticorpo e/ou cadeia leve de anticorpo. A estrutura tridimensional pode ser analisada quanto a posições de aminoácido acessíveis por solvente visto que é provável que tais posições formem uma alça e/ou forneçam contato ao antígeno em um domínio variável de anticorpo. Algumas posições acessíveis por solvente podem tolerar diversidade de sequência de aminoácidos e outras (por exemplo, posições estruturais) são, geralmente menos diversificadas. A estrutura tridimensional do domínio variável de anticorpo pode ser derivada de uma estrutura cristalina ou modelagem de proteína.

[0075] Os domínios constantes (Fc) de anticorpos não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, porém, em vez disso, exibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo através de interações, por exemplo, com receptores Fc (FcR). Os domínios Fc também podem aumentar a biodisponibilidade de um anticorpo em circulação após a administração a um indivíduo.

[0076] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes diferentes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias dessas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada (Fc) que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0077] As “cadeias leves” de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrados podem ser atribuídas a um dos dois tipos claramente distintos, denominados kappa ou (“K”) e lambda ou (“À”), com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes.

[0078] Os termos “porção de ligação ao antígeno de um anticorpo”, “fragmento de ligação ao antígeno”, “domínio de ligação ao antígeno”, “fragmento de anticorpo” ou um “fragmento funcional de um anticorpo” são usados de maneira intercambiável no presente documento para se referirem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antígeno. Exemplos não limitativos de fragmentos de anticorpo incluídos dentro de tais termos incluem, mas não se limitam a, (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que contém dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que contém os domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544 546), que contém um domínio VH; e (vi) uma CDR isolada. Adicionalmente incluídos nessa definição estão “metade” de anticorpo que compreende uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como anticorpos bivalentes também são abrangidas no presente documento.

[0079] Porções de “F(ab')2” e “Fab'“ podem ser produzidas ao tartar um Ig com uma protease como pepsina e papaína, e incluem fragmentos de anticorpo gerados ao digerir imunoglobulina próximo às ligações de dissulfeto que existem entre as regiões de dobradiça em cada uma das duas cadeias pesadas. Por exemplo, a papaína cliva IgG a montante das ligações de dissulfeto que existem entre as regiões de dobradiça em cada uma das duas cadeias pesadas para gerar dois fragmentos de anticorpo homólogos em que uma cadeia leve composta de VL e CL (região constante de cadeia leve), e um fragmento de cadeia pesada composto de região VH e CHYI (Y1) na região constante da cadeia pesada) são conectados em suas regiões C terminal através de uma ligação de dissulfeto. Cada um desses dois fragmentos de anticorpo homólogos é denominado Fab'. A pepsina também cliva IgG a jusante das ligações de dissulfeto que existem entre as regiões de dobradiça em cada uma das duas cadeias pesadas para gerar um fragmento de anticorpo ligeiramente maior do que o fragmento no qual os dois Fab' mencionados acima são conectados na região de dobradiça. Esse fragmento de anticorpo é denominado F(ab')2.

[0080] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' se diferem de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carboxila do domínio de cadeia pesada CH1 que inclui uma ou mais cisteína(s) da região de dobradiça de anticorpo. Fab'- SH é a designação no presente documento para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre os mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são bem conhecidos.

[0081] “Fv” se refere a um fragmento de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno complete e sítio de ligação ao antígeno. Essa região consiste em um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associação não covalente ou covalente (os Fv’s ligados a dissulfeto foram descritos na técnica, Reiter et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1239-1245). É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, uma combinação de uma ou mais das CDRs de cada uma das cadeias VH e VL confere especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo. Por exemplo, poderia ser entendido que, por exemplo, a CDRH3 e CDRL3 poderiam ser suficientes para conferir especificidade de ligação ao antígeno a um anticorpo quando transferidas para cadeias VH e VL de um anticorpo receptor ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e essa combinação de CDRs pode ser testada quanto à ligação, afinidade, etc. utilizando qualquer uma das técnicas descritas no presente documento. Mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas de um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora provavelmente em uma afinidade menor que quando combinadas com um segundo domínio variável. Ademais, embora os dois domínios de um fragmento Fv (VL e VH), sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos utilizando métodos recombinantes por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam produzidos como uma única cadeia proteica na qual o par de regiões VL e VH forma moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia única (scFv); Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; e Osbourn et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16:778). Tais scFvs também pretendem ser incluídos dentro do termo “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo. Quaisquer sequências VH e VL de scFv específico podem ser ligadas a um cDNA de regi ou sequências genômicas, para gerar vetores de expressão que codificam moléculas de Ig completas (por exemplo, IgG) ou outros isotipos. VH e VL também podem ser usados na geração de Fab, Fv ou outros fragmentos de Igs utilizando química de proteína ou tecnologia de DNA recombinante.

[0082] “Fv de cadeia única” ou fragmentos de anticorpo “sFv” compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma análise de sFvs, consulte, por exemplo, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

[0083] O termo “AVIMER™” se refere a uma classe de proteínas terapêuticas de origem humana, que é não relacionada a anticorpos e fragmentos de anticorpo, e são compostas de vários domínios de ligação modulares e reutilizáveis, referidos como domínios A (também referidos como módulo classe A, repetição do tipo complemento, ou domínio de receptor LDL classe A). Os mesmos são desenvolvidos a partir de domínios receptores extracelulares humanos por embaralhamento de éxons e exibição de fagos in vitro (Silverman et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:1493-1494; Silverman et al., 2006, Nat. Biotechnol. 24:220). As proteínas resultantes podem conter múltiplos domínios de ligação independentes que podem exibir afinidade aprimorada (em alguns casos, sub-nanomolar) e especificidade comparada com proteínas de ligação a único epítopo. Consulte, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Nos. U.S. 2005/0221384,2005/0164301, 2005/0053973 e 2005/0089932, 2005/0048512, e 2004/0175756, cada uma está incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[0084] Cada um dos 217 domínios A humanos compreende ~35 aminoácidos (~4 kDa); e esses domínios são separados por ligantes que têm em média cinco aminoácidos de comprimento. Os domínios A nativos são dobrados de maneira rápida e eficiente em uma estrutura estável uniforme mediada principalmente por ligação de cálcio e formação de dissulfeto. Um motivo de arcabouço conservado de apenas 12 aminoácidos é exigido para essa estrutura comum. O resultado final é uma única cadeia proteica contendo múltiplos domínios, cada um representa uma função separada. Cada domínio das proteínas se liga independentemente e as contribuições energéticas de cada domínio são aditivas. Essas proteínas foram denominadas “AVIMERs™” a partir de multímeros de avidez.

[0085] O termo “anticorpos bivalentes” se refere a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação ao antígeno, tais fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Utilizando-se um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a se emparelharem com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação ao antígeno. Os anticorpos biespecíficos são descritos de forma mais completa, por exemplo, em EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993).

[0086] Os polipeptídeos de ligação ao antígeno também incluem dímeros de cadeia pesada como, por exemplo, anticorpos de camelídeos e tubarões. Os anticorpos de camelídeos e tubarões compreendem um par homodimérico de duas cadeias de domínios tipo V e tipo C (nenhum tem uma cadeia leve). Visto que a região VH de um Ig de dímero de cadeia pesada em um camelídeo não tem de fazer interações hidrofóbicas com uma cadeia leve, a região na cadeia pesada que normalmente entra em contato com uma cadeia leve é alterada para resíduos de aminoácido hidrofílicos em um camelídeo. Os domínios VH de IgGs de dímero de cadeia pesada são denominados domínios VHH. Os Ig-NARs de tubarão compreendem um homodímero de um domínio variável (denominado um domínio V-NAR) e cinco domínios constantes tipo C (domínios C-NAR). Em camelídeos, a diversidade de repertório de anticorpo é determinada pelas CDRs 1, 2 e 3 nas regiões VH ou VHH. A CDR3 na região VHH de camelo é caracterizada por seu comprimento relativamente longo, que tem em média 16 aminoácidos (Muyldermans et al., 1994, Protein Engineering 7(9): 1129). Isto está em contraste a regiões CDR3 de anticorpos de muitas outras espécies. Por exemplo, a CDR3 de VH de camundongo tem uma média de 9 aminoácidos. As bibliotecas de regiões variáveis de anticorpo derivadas de camelídeo, que mantêm a diversidade in vivo das regiões variáveis de um camelídeo, podem ser feitas, por exemplo, pelos métodos descritos no Pedido de Patente No. Ser. U.S. 20050037421.

[0087] As “formas humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinas) incluem anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de um Ig não humano. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são IgGs humanos (anticorpo receptor) em que uma ou mais das CDRs do receptor são substituídas por CDRs de um anticorpo de espécie não humana (anticorpo doador) como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tem a função de especificidade, afinidade e ligação desejada. Em alguns casos, um ou mais resíduos de aminoácido FR do Ig humano são substituídos por resíduos de aminoácido não humanos correspondentes. Ademais, os anticorpos humanizados podem conter resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. essas modificações podem ser feitas para aprimorar o desempenho de anticorpo, se necessário. Um anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos dentre pelo menos um e, em alguns casos dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todos, ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também pode incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes, consulte Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

[0088] Um anticorpo humanizado também inclui anticorpos em que parte, ou todas as CDRs da cadeia pesada e leve são derivadas de um anticorpo não humano monoclonal, substancialmente todas as porções restantes das regiões variáveis são derivadas de região variável humana (tanto cadeia pesada como leve), e as regiões constantes são derivadas de uma região constante humana. Em uma modalidade, as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 das cadeias pesadas e leves são derivadas de um anticorpo não humano. Ainda em outra modalidade, pelo menos uma CDR (por exemplo, uma CDR3) das cadeias pesadas e leves é derivada de um anticorpo não humano. Várias combinações de CDR1, CDR2 e CDR3 podem ser derivadas de um anticorpo não humano e são contempladas no presente documento. Em um exemplo não limitativo, uma ou mais das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cada uma das cadeias pesadas e leves são derivadas das sequências fornecidas no presente documento.

[0089] O termo “anticorpo monoclonal” como usado no presente documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Ademais, ao contrário de preparações de anticorpo convencionais (policlonais), os mesmos podem incluir anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante (consulte, por exemplo, Patente No. U.S. 4.816.567). Em determinadas modalidades, os anticorpos monoclonais podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.

[0090] Os anticorpos podem ser isolados e purificados do sobrenadante de cultura ou ascites mencionados acima por precipitação de sulfato de amônio saturado, método de precipitação de euglobulina, método de ácido caproico, método de ácido caprílico, cromatografia por troca iônica (DEAE ou DE52), ou cromatografia por afinidade utilizando a coluna anti-Ig ou uma coluna de proteína A, G ou L como descrito em mais detalhes abaixo.

[0091] Os anticorpos exemplificativos para uso nas composições e métodos descritos no presente documento são moléculas de imunoglobulina intactas, como, por exemplo, um anticorpo humanizado ou aquelas porções de uma molécula de Ig humanizada que contém o sítio de ligação ao antígeno (isto é, parátopo) ou uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve, que inclui aquelas porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab)', F(ab% Fd, scFv, um domínio pesado variável, um domínio leve variável, um domínio NAR variável, scFv biespecífico, um Fab2 biespecífico, um Fab3 triespecífico e polipeptídeos de ligação de cadeia única e outros também referidos como fragmentos de ligação ao antígeno. Quando se constrói uma molécula de imunoglobulina ou fragmentos da mesma, regiões variáveis ou porções das mesmas podem ser fundidas, conectadas, ou de outro modo unidas a uma ou mais regiões constantes ou porções das mesmas para produzir quaisquer anticorpos ou fragmentos dos mesmos descritos no presente documento. Isso pode ser realizado em uma variedade de maneiras conhecidas na técnica, inclusive, mas não se limitam a, técnicas de clonagem molecular ou síntese direta dos ácidos nucleicos que codificam as moléculas. Métodos não limitativos exemplificativos de construir essas moléculas também podem ser encontrados nos exemplos descritos no presente documento.

[0092] Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos ou outros multiespecíficos são conhecidos na técnica e incluem reticulação química, uso de zíperes de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992); tecnologia de anticorpo bivalente (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993); dímeros scFv [Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368, 1994], anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-62, 1995); e anticorpos recombinantes quelantes (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).

[0093] “Anticorpos lineares” compreendem um par de segmentos Fd em paralelo (VH-CH1-VH-CH1) que forma um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)).

[0094] Adicionalmente, os anticorpos anti-hepcidina descritos no presente documento também podem ser interpretados para se dobrarem em formas multivalentes, podendo aprimorar a afinidade de ligação, especificidade e/ou meia-vida aumentada no sangue. As formas multivalentes de anticorpos anti-hepcidina podem ser preparadas por técnicas conhecidas.

[0095] Os anticorpos biespecíficos ou monoespecíficos incluem anticorpos reticulados ou “heteroconjugados”. por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos utilizando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente No. U.S. 4.676.980, juntamente com inúmeras técnicas de reticulação. Outro método é desenhado para produzir tetrâmeros ao adicionar uma sequência de codificação de estreptavidina na terminação C do scFv. A estreptavidina é composta de quatro subunidades, então quando a estreptavidina de scFv é dobrada, quatro subunidades se associam para formarem um tetrâmero (Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995), cuja descrição está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade).

[0096] De acordo com outra abordagem para produzir anticorpos biespecíficos, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser elaborada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados de cultura celular recombinante. Uma interface compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Nesse método, uma ou mais cadeias de aminoácido pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As “cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo ao substituir as cadeias laterais de aminoácido grandes por menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados como homodímeros. Consulte WO 96/27011 publicado em 6 de setembro de 1996.

[0097] Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos de fragmentos de anticorpo são convencionalmente conhecida. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos ou triespecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol, arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e impedir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são, então, convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é, então, reconvertido no Fab'- tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecífico produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas. Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) descrevem a secreção de fragmentos de anticorpo funcionais de bactérias (consulte, por exemplo, Better et al., Skerra et al. Science 240: 1038-1041 (1988)). Por exemplo, os fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formarem anticorpos biespecíficos (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).

[0098] Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante são convencionalmente conhecidas. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos forma produzidos utilizando zíperes de leucina, por exemplo, GCN4. (Consulte geralmente Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992).) Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de genes. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobradiça para formarem monômeros e, então, reoxidados para formarem os heterodímeros de anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo.

[0099] Como usado no presente documento, um “minibody” se refere a um scFv fundido com CH3 através de um ligante de peptídeo (sem dobradiça) ou através de uma dobradiça de IgG descrita em Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. April 2004; 17(4):315-23.

[00100] Conforme usado no presente documento, um “maxibody” se refere a um scFv bivalente covalentemente ligado à região de Fc de uma imunoglobulina, consulte, por exemplo, Fredericks et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) and Powers et al., Journal of Immunological Methods, 251:123-135 (2001).

[00101] Conforme usado no presente documento, um “intrabody” se refere a um anticorpo de cadeia única que demonstra a expressão intraceular e pode manipular a função de proteína intracelular (Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21, 2004). Os “intrabodies”, que compreendem sequências de sinal celular que retêm a construção de anticorpo em regiões intracelulares, podem ser produzidos como descrito em Mhashilkar et al., (EMBO J 14:1542-51, 1995) e Wheeler et al. (FASEB J. 17:1733-5. 2003). Os “transbodies” são anticorpos permeáveis a células em que uma proteína de domínios de transdução (PTD) é fundida com anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv) Heng et al., (Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005).

[00102] Os anticorpos que são SMIPs ou proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação específicas para proteína alvo são adicionalmente contemplados no presente documento. Essas construções são polipeptídeos de cadeia única que compreendem domínios de ligação ao antígeno fundidos com domínios de imunoglobulina necessários para realizar funções efetoras de anticorpo. Consulte, por exemplo, WO 03/041600, a publicação de Patente U.S. 20030133939 e Publicação de Patente US 20030118592, que estão incorporados a título de referência.

[00103] A humanização de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos pode ser realizada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica e descrita no presente documento. Similarmente, a produção de anticorpos humanizados também pode ser realizada através de métodos conhecidos na técnica e descrita no presente documento.

[00104] Em uma modalidade exemplificativa, o pedido contempla um polipeptídeo de ligação de cadeia única que tem uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve que se liga a um epítopo descrito no presente documento e tem, opcionalmente, uma região Fc de imunoglobulina. Tal molécula é um fragmento variável de cadela única (scFv) que tem opcionalmente função efetora ou meia-vida aumentada através da presença da região de Fc de imunoglobulina. Os métodos de preparação de polipeptídeos de ligação de cadeia única são conhecidos na técnica (por exemplo, Pedido de Patente No. U.S. 2005/0238646).

[00105] Os termos “segmentos de gene de linha germinativa” ou “sequências germinativas” se referem aos genes da linha germinativa (os gametas haploides e aquelas células diploides a partir das quais esses são formados). O DNA de linha germinativa contém múltiplos segmentos de genes que codificam uma u nica cadeia pesada ou leve de Ig. Esses segmentos de genes são realizados nas células germinativas, porém não podem ser transcritos e traduzidos em cadeias pesadas e leves até a mesmas serem dispostas em genes funcionais. Durante a diferenciação de células B na medula óssea, esses segmentos de gene são aleatoriamente embaralhados por um sistema genético dinâmico capaz de gerar mais de 108 especificidades. A maioria desses segmentos de gene é publicada e coletada pelo banco de dados de linha germinativa.

[00106] A afinidade de ligação e/ou avidez de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser aprimoradas ao modificar as regiões de estrutura. Os métodos de modificações de regiões de estrutura são conhecidos na técnica e são contemplados no presente documento. A seleção de alteração de uma ou mais posições de aminoácido de estrutura relativas depende de uma variedade de critérios. Um critério para selecionar a alteração de aminoácidos de estrutura relativos pode ser as diferenças relativas em resíduos de estrutura de aminoácido entre as moléculas doadoras e aceitantes. A seleção de alteração de posições de estrutura relativas utilizando essa abordagem tem a vantagem de evitar qualquer tendência subjetiva em determinação de resíduos ou qualquer bias em contribuição de afinidade de ligação de CDR pelo resíduo.

[00107] Conforme usado no presente documento, “imunorreativo” se refere a anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que são específicos a uma sequencia de resíduos de aminoácido (“sítio de ligação” ou “epítopo”), ainda se apresentarem reação cruzada com outros peptídeos/proteínas, não são tóxicos nos níveis em que os mesmos são formulados para administração para uso humano. O termo “ligação” se refere a uma associação direta entre duas moléculas, devido, por exemplo, a interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iônicas /ou ligação de hidrogênio sob condições fisiológicas, e inclusive interações como pontes de sal e pontes de água e qualquer outro meio de ligação convencional. O termo “se liga preferencialmente” significa que o agente de ligação se liga ao sítio de ligação com afinidade maior do que o mesmo se liga a sequências de aminoácido não relacionadas. De preferência, tal afinidade é pelo menos 1 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, ou pelo menos 1000 vezes maior do que a afinidade do agente de ligação de sequências de aminoácido não relacionadas. Os termos “imunorreativo” e “se liga preferencialmente” são usados de maneira intercambiável no presente documento.

[00108] Conforme usado no presente documento, o termo “afinidade” se refere à constante de equilíbrio da ligação reversível de dois agentes e é expresso como Kd. Em uma modalidade, os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos exibem características desejadas como afinidade de ligação como medido por KD (constante de dissociação de equilíbrio) para hepcidina na faixa de 1xio-6 M ou menos, ou que varia até 10-16 M ou menos, (por exemplo, cerca de 107, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16 M ou menos). A constante de dissociação de equilíbrio pode ser determinada em ensaio de equilíbrio de solução utilizando BIAcore e/ou KinExA. Como usado no presente documento, o termo “avidez” se refere à resistência de um complexo de dois ou mais agentes para dissociação após a diluição. Afinidades aparentes podem ser determinadas por métodos como um ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA) ou qualquer outra técnica conhecida por um elemento versado na técnica. As avidezes podem ser determinadas por métodos como uma análise de Scatchard ou qualquer outra técnica conhecida por um elemento versado na técnica.

[00109] “Epítopo” se refere àquela porção de um antígeno ou outra macromolécula capaz de formar uma interação de ligação com o bolso de ligação de região variável de um anticorpo. Tais interações de ligação podem ser manifestadas como um contato intermolecular com um ou mais resíduos de aminoácido de uma ou mais CDRs. A ligação ao antígeno pode envolver, por exemplo, um CDR3 ou um par de CDR3 ou, em alguns casos, interações de até seis CDRs das cadeias VH e VL. Um epítopo pode ser uma sequência peptídica linear (isto é, “contínua”) ou pode ser composto de sequências de aminoácido não contíguas (isto é, “conformacionais” ou “descontínuas”). Um anticorpo pode reconhecer uma ou mais sequências de aminoácidos; portanto, um epítopo pode definir mais de uma sequência de aminoácidos distinta. Os epítopos reconhecidos por anticorpos podem ser determinados por mapeamento de peptídeos e técnicas de análise de sequência bem conhecidas por um elemento versado na técnica. As interações de ligação são manifestadas como contatos intermoleculares com um ou mais resíduos de aminoácido de uma CDR.

[00110] O termo “específico” se refere a uma situação na qual um anticorpo não irá mostrar qualquer ligação significativa a moléculas exceto o antígeno contendo o epítopo reconhecido pelo anticorpo. O termo também é aplicável em que, por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno é específico para um epítopo particular que é conduzido por inúmeros antígenos, em tal caso o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que conduz o domínio de ligação ao antígeno será capaz de se ligar aos vários antígenos que conduzem o epítopo. Os termos “se liga preferencialmente” ou “se liga especificamente” significam que os anticorpos ou fragmentos dos mesmos se ligam a um epítopo com afinidade maior que aqueles que se ligam a sequências de aminoácido não relacionadas, e, se apresentarem reação cruzada com outros polipeptídeos contendo o epítopo, não são tóxicos nos níveis em que os mesmos são formulados para administração para uso humano. Em um aspecto, tal afinidade é pelo menos 1 vez maior, pelo menos 2 vezes maior, pelo menos 3 vezes maior, pelo menos 4 vezes maior, pelo menos 5 vezes maior, pelo menos 6 vezes maior, pelo menos 7 vezes maior, pelo menos 8 vezes maior, pelo menos 9 vezes maior, 10 vezes maior, pelo menos 20 vezes maior, pelo menos 30 vezes maior, pelo menos 40 vezes maior, pelo menos 50 vezes maior, pelo menos 60 vezes maior, pelo menos 70 vezes maior, pelo menos 80 vezes maior, pelo menos 90 vezes maior, pelo menos 100 vezes maior, ou pelo menos 1000 vezes maior que a afinidade do anticorpo ou fragmento do mesmo para sequências de for aminoácido não relacionadas. Os termos “imunorreativo”, “se liga”, “se liga preferencialmente” e “se liga especificamente” são usados de maneira intercambiável no presente documento. O termo “ligação” se refere a uma associação direta entre duas moléculas, devido, por exemplo, a interações covalentes, eletrostáticas, hidrofóbicas e iônicas e/ou ligação de hidrogênio sob condições fisiológicas, e inclui interações como pontes de sal e pontes de água, bem como qualquer outro meio convencional de ligação.

[00111] Os anticorpos podem ser classificados quanto à afinidade de ligação por métodos conhecidos na técnica que incluem, mas não se limitam a, ensaios “gel-shift”, Western blots, ensaio de competição por radioidentificação, co-fracionamento por cromatografia, co-precipitação, reticulação, ELISA, e similares, que são descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology (1999) John Wiley & Sons, NY, que está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00112] Os anticorpos que se ligam ao epítopo desejado no antígeno alvo podem ser classificados em um ensaio de bloqueio cruzado convencional como descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), podem ser realizados. Os ensaios de ligação competitivos convencionais também podem ser usados, em que um anticorpo desconhecido é caracterizado por sua capacidade de inibir a ligação de alvo a um anticorpo específico alvo da invenção. O antígeno intacto, fragmentos dos mesmos como o domínio extracelular, ou epítopos lineares podem ser usados. O mapeamento de epítopo é descrito em Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995).

[00113] Os anticorpos que inibem ou neutralizam a atividade de hepcidina humana podem ser identificados ao contatar a hepcidina com um anticorpo, comparar a atividade de hepcidina na presença e ausência do anticorpo de teste, e determinar se a presença do anticorpo diminui a atividade da hepcidina. A atividade biológica de um anticorpo particular, ou combinação de anticorpos, pode ser avaliada in vivo utilizando um modelo animal adequado, inclusive qualquer um daqueles descritos no presente documento.

[00114] Em uma modalidade, ensaios de triagem de alto rendimento (HTS) para identificar anticorpos que interagem ou inibem a atividade biológica de hepcidina alvo são fornecidos no presente documento. Os ensaios HTS permitem a triagem de grandes números de compostos de maneira eficiente.

[00115] A frase “substituição de aminoácido conservadora” se refere ao agrupamento de aminoácidos com base em determinadas propriedades comuns. Uma maneira funcional para definir as propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as frequências normalizadas de alterações de aminoácido entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tais análises, os grupos de aminoácidos podem ser definidos em que aminoácidos dentro de um grupo trocam preferencialmente entre si, e, portanto, se assemelham na maior parte por seu impacto sobre a estrutura de proteína total (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Exemplos de grupos de aminoácidos definidos dessa maneira incluem: (i) um grupo carregado, que consiste em Glu e Asp, Lys, Arg e His, (ii) um grupo positivamente carregado, que consiste em Lys, Arg e His, (iii) um grupo negativamente carregado, que consiste em Glu e Asp, (iv) um grupo aromático, que consiste em Phe, Tyr e Trp, (v) um grupo de anel de nitrogênio, que consiste em His e Trp, (vi) um grupo não polar alifático grande, que consiste em Val, Leu e Ile, (vii) um grupo ligeiramente polar, que consiste em Met e Cys, (viii) um grupo de pequenos resíduos, que consiste em Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln e Pro, (ix) um grupo alifático que consiste em Val, Leu, Ile, Met e Cys, e (x) um grupo hidroxila pequeno que consiste em Ser e Thr.

[00116] Além dos grupos apresentados acima, cada resíduo de aminoácido pode formar seu próprio grupo, e o grupo formado por um aminoácido individual pode ser referido simplesmente pela abreviação de uma e/ou três letras daquele aminoácido comumente usado na técnica como descrito acima.

[00117] Um “resíduo conservado” é um aminoácido que é relativamente invariante através de uma faixa de proteínas similares. Geralmente os resíduos conservados irão variar somente por serem substituídos por um aminoácido similar, como descrito acima para “substituição de aminoácido conservadora”.

[00118] A letra “x” ou “xaa” como usado em sequências de aminoácidos no presente documento pretende indicar que qualquer um dentre os vinte aminoácidos padrão pode ser colocado nessa posição exceto onde especificamente observado em contrário.

[00119] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” se refere à similaridade de sequência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. Homologia e identidade podem ser determinadas ao comparar uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para propósitos de comparação. Quando uma posição equivalente nas sequências comparadas for ocupada pela mesma base ou aminoácido, então, as moléculas são idênticas naquela posição; quando o sítio equivalente ocupado pelo mesmo resíduo de aminoácido ou um similar (por exemplo, similar em natureza estérica e/ou eletrônica), então, as moléculas podem ser referidas como homólogas (similares) naquela posição. A expressão como uma porcentagem de homologia/similaridade ou identidade se refere a uma função do número de aminoácidos idênticos ou similares em posições compartilhadas pelas sequências comparadas. Uma sequência que é “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos de 40% de identidade, embora tenha preferencialmente menos de 25% de identidade com uma sequência da presente invenção. Ao comparar duas sequências, a ausência de resíduos (aminoácidos ou ácidos nucleicos) ou presença de resíduos adicionais também diminui a identidade e homologia/similaridade.

[00120] O termo “homologia” descreve uma comparação de base matemática de similaridades de sequência que é usada para identificar genes ou proteínas com funções ou motivos similares. As sequências de ácido nucleico (nucleotídeo, oligonucleotídeo) e aminoácido (proteína) da presente invenção podem ser usadas como uma “sequência de consulta” para realizar uma pesquisa em banco de dados público, por exemplo, para identificar outros membros da família, sequências relacionadas ou homólogos. Tais pesquisas podem ser realizadas utilizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação=100, comprimento de palavra =12 para obter sequências de nucleotídeo homólogas a moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de aminoácido BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação=50, comprimento de palavra=3 para obter sequências de aminoácido homólogas a moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos com gaps para propósitos de comparação, gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utiliza programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e BLAST) podem ser usados (consulte, www.ncbi.nlm.nih.gov).

[00121] Conforme usado no presente documento, “identidade” significa a porcentagem de resíduos de nucleotídeo ou aminoácido idênticos em posições correspondentes em duas ou mais sequências quando as sequências forem alinhadas para aumentar a correspondência de sequência, isto é, levando-se em consideração lacunas e inserções. A identidade pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos, inclusive, mas não se limitam àqueles descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos para determinar a identidade são desenhados para fornecer a maior correspondência entre as sequências testadas. Ademais, os métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não se limitam a, o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) e Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). O programa BLAST X está publicamente disponível a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar a identidade.

[00122] “Isolado” (usado de maneira intercambiável com “substancialmente puro” ou “purificado”) quando aplicado a polipeptídeos significa um polipeptídeo ou uma porção do mesmo que, devido à sua origem ou manipulação: (i) está presente em uma célula hospedeira como o produto de expressão de uma porção de um vetor de expressão; ou (ii) é ligado a uma proteína ou outra porção química exceto aquela à qual o mesmo é ligado em natureza; ou (iii) não ocorre na natureza, por exemplo, uma proteína que é quimicamente manipulada ao anexar, ou adicionar pelo menos uma porção hidrofóbica à proteína de modo que a proteína esteja sob uma forma não encontrada na natureza. Por “isolado” entende-se adicionalmente uma proteína que é: (i) quimicamente sintetizada; ou (ii) expressa em uma célula hospedeira e purificada de proteínas associadas e contaminantes. O termo geralmente significa um polipeptídeo que foi separado de outras proteínas e ácidos nucleicos com os quais isso ocorre naturalmente. De preferência, o polipeptídeo também é separado de substâncias como anticorpos ou matrizes de gel (poliacrilamida) que são usados para purificar o mesmo.

[00123] “Induzir uma resposta imune hospedeira” significa que um indivíduo sente alívio ou redução de sinais ou sintomas de doença, e especificamente inclui, sem limitação, prolongamento de sobrevivência.

[00124] As imunoglobulinas humanizadas, inclusive anticorpos humanizados, foram construídos por meio de engenharia genética. A maioria das imunoglobulinas humanizadas que foi anteriormente descrita compreende uma estrutura que é idêntica à estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humana particular (isto é, um aceitante ou receptor), e três CDRs de uma cadeia de imunoglobulina não humana (isto é, doador). Conforme descrito no presente documento, a humanização também pode incluir critérios pelos quais um número limitado de aminoácidos na estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humanizada é identificado e selecionado como o mesmo que os aminoácidos naquelas posições no doador em vez de no aceitante, para aumentar a afinidade de um anticorpo que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizada.

[00125] Quando a afinidade aumentada de um anticorpo humanizado é desejada, os resíduos dentro das CDRs de um anticorpo convertido podem ser adicionalmente substituídos por outros aminoácidos. Tipicamente, não mais que quatro resíduos de aminoácido em uma CDR são alterados, e no máximo tipicamente não m ais que dois resíduos na CDR serão alterados, exceto para CDR2 de cadeia pesada, em que tanto quanto 10 resíduos podem ser alterados. As alterações em afinidade podem ser medidas por métodos convencionais como aqueles descritos no presente documento (por exemplo, Biacore).

[00126] Métodos de “superhumanização” de anticorpos são descritos em mais detalhes na Patente No. US 6.881.557 que está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00127] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno humanizados podem ser construídos e produzidos utilizando técnicas convencionais conhecidas. Ademais, os anticorpos recombinantemente preparados podem ser geralmente produzidos em grandes quantidades, particularmente quando se utiliza vetores de expressão de alto nível.

[00128] Os anticorpos podem ser sequenciados utilizando técnicas convencionais conhecidas. Em um aspecto, as sequências de aminoácido de uma ou mais CDRs são inseridas em uma sequência sintética, por exemplo, de uma estrutura de anticorpo humano (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) para criar um anticorpo humano que poderia limitar as reações colaterais de tratamento de um indivíduo humano com um anticorpo não humano. As sequências de aminoácido de uma ou mais CDRs também podem ser inseridas em uma sequência sintética, por exemplo, em uma proteína de ligação como um AVIMER™ para criar uma construção para a administração a um indivíduo humano. Tais técnicas podem ser modificadas dependendo da espécie de animal que será tratada. Por exemplo, para usos em veterinária, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de ligação pode ser sintetizado para a administração de um não humano (por exemplo, um primata, uma vaca, um cavalo, etc.).

[00129] Em outro aspecto, utilizando-se técnicas reconhecidas como aquelas fornecidas e incorporadas no presente documento, sequências de aminoácidos de codificação de nucleotídeos de uma ou mais CDRs podem ser inseridas, por exemplo, por técnicas recombinantes em sítios de endonuclease de restrição de um polipeptídeo existente que codifica um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de ligação.

[00130] Para a expressão, um sistema de expressão é um que utiliza o sistema GS (Lonza) utilizando um gene de glutamina sintetase como o marcador selecionável. Brevemente, uma transfecção é realizada em células CHO por eletroporação (250V) utilizando o sistema GS (Lonza) utilizando o gene da glutamina sintetase como o marcador selecionável. As células CHO tipo selvagem são desenvolvidas em DMEM (Sigma) contendo 10% de Soro Fetal de Vitelo dialisado (FCS) com 2 mM de glutamina. As células 6x107 CHO são transfectadas com 300 μg de DNA linearizado por eletroporação. Após a eletroporação, as células são ressuspensas em DMEM com glutamina e semeadas em placas de 36x96 poços (50 μl/poço), e incubadas a 37° C. em 5% de CO2. No dia seguinte, 150 μl/poço de meio seletivo (DMEM sem glutamina) são adicionados. Após aproximadamente 3 semanas, as colônias são classificadas por ELISA (consulte abaixo) utilizando um anticorpo irrelevante como um controle negativo. Todas as colônias que produzem >20 μg/ml são expandidas em placas de 24 poços e, então, em frascos T25 duplicados.

[00131] Para produção de alto nível, o sistema de expressão de mamíferos mais amplamente usado é um que utiliza o procedimento de amplificação de genes oferecido por células ovarianas de hamster chinês com deficiência de deidrofolato redutase (“dhfr“). O sistema é bem conhecido pelos elementos versados na técnica. O sistema é baseado no gene “dhfr” de deidrofolato redutase, que codifica a enzima DHFR, que catalisa a conversão de deidrofolato em tetraidrofolato. Para obter uma alta produção, as células de dhfr- CHO são transfectadas com um vetor de expressão contendo um gene DHFR funcional, juntamente com um gene que codifica uma proteína desejada. Nesse caso, a proteína desejada em cadeia pesada e/ou cadeia leve de anticorpo recombinante.

[00132] Ao aumentar a quantidade do metotrexato (MTX) inibidor DHFR competitivo, as células recombinantes desenvolvem resistência ao amplificar o gene dhfr. Em casos padrão, a unidade de amplificação empregada é muito maior que o tamanho do gene dhfr, e como resultado a cadeia pesada de anticorpo é co-amplificada.

[00133] Quando a produção em larga escala da proteína, como a cadeia de anticorpo, é desejada, tanto o nível de expressão como a estabilidade das células que são empregadas são levados em consideração. Em cultura de longo prazo, as populações de células CHO recombinantes perdem a homogeneidade em relação à sua produtividade de anticorpo específica durante a amplificação, mesmo que as mesmas sejam derivadas de um único clone parental.

[00134] O presente pedido fornece um polinucleotídeo isolado (ácido nucleico) que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como descrito no presente documento, vetores contendo tais polinucleotídeos, e células hospedeiras e sistemas de expressão para transcrever e traduzir tais polinucleotídeos em polipeptídeos.

[00135] O presente pedido também fornece construções sob a forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

[00136] O presente pedido também fornece uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções como acima. Um ácido nucleico que codifica qualquer anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento como fornecido por si mesmo forma um aspecto do presente pedido, como um método de produção do anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento, tal método compreende a expressão a partir de codificação de ácido nucleico. A expressão pode ser convenientemente realizada por cultura sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes que contêm o ácido nucleico. Após a produção por expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, então, usada como apropriado.

[00137] Os anticorpos específicos, fragmentos de ligação ao antígeno, e moléculas de codificação de ácido nucleico e vetores descritos no presente documento podem ser fornecidos isolados e/ou purificados, por exemplo, a partir de seu ambiente natural, em forma substancialmente pura ou homogênea. No caso de ácido nucleico, isento ou substancialmente isento de ácido nucleico ou origem de genes exceto a sequência que codifica um polipeptídeo com a função exigida. O ácido nucleico pode compreender DNA ou RNA e pode ser total ou parcialmente sintético. Os métodos de purificação são bem conhecidos na técnica.

[00138] Os sistemas de clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem, mas não se limitam a, células bacterianas, células de mamíferos, células de levedura e sistemas de baculovírus. As linhagens celulares de mamífero disponíveis na técnica para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células ovarianas de hamster chinês, células HeLa, células de rim de filhote de hamster, células de mieloma de camundongo NS0 e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum é E. coli.

[00139] A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo em células procarióticas como E. coli é bem estabelecida na técnica. Para uma análise, consulte, por exemplo, Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura também está disponível para os elementos versados na técnica como uma opção para a produção dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento, consulte para análises recentes, por exemplo, Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560, cada um desses está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00140] Os vetores adequados podem ser selecionados ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, inclusive sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, genes marcadores e outras sequências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, ou fagomídeo, como apropriado. Para detalhes adicionais consulte, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão de gene, e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. As descrições de métodos de Sambrook et al. e Ausubel et al. estão incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade e são bem conhecidas na técnica.

[00141] Assim, um aspecto adicional fornece uma célula hospedeira que contém ácido nucleico como descrito no presente documento. Ainda um aspecto adicional fornece um método que compreende introduzir tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfecção de fosfato de cálcio, Dextrano DEAE, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma e transdução utilizando retrovírus ou outro vírus, por exemplo, vaccínia ou, para células de insetos, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção utilizando bacteriófagos.

[00142] A introdução pode ser seguida por causar ou permitir a expressão do ácido nucleico, por exemplo, ao cultivar as células hospedeiras sob condições para a expressão do gene.

[00143] Em uma modalidade, o ácido nucleico é integrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da células hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Otimizações de Ig podem ser inicializadas como necessário para maximizar a expressão.

[00144] O presente pedido também fornece um método que compreende utilizar uma construção como determinado acima em um sistema de expressão para expressar os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos como acima.

[00145] O presente pedido também se refere a ácidos nucleicos isolados, colmo moléculas de DNA recombinantes ou genes clonados, ou variantes degenerados dos mesmos, mutantes, análogos, ou fragmentos dos mesmos, que codificam um anticorpo ou sequências de ligação ao antígeno descrito no presente documento.

[00146] Em um aspecto, o presente pedido fornece um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como descrito no presente documento.

[00147] Em uma modalidade adicional, a sequência de DNA total da molécula de DNA recombinante ou gene clonado de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento pode ser ligado de maneira funcional a uma sequência de controle de expressão que pode ser introduzida em um hospedeiro apropriado. Consequentemente, o pedido se estende a hospedeiros unicelulares transformados com o gene clonado ou molécula de DNA recombinante que compreende uma sequência de DNA que codifica VH e/ou VL, ou porções dos mesmos, do anticorpo.

[00148] Outra característica é a expressão das sequências de DNA descritas no presente documento. Conforme é bem conhecido na técnica, as sequências de DNA podem ser expressas ao ligar as mesmas de maneira funcional a uma sequência de controle de expressão em um vetor de expressão apropriado e emprega aquele vetor de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.

[00149] Tal ligação operativa de uma sequência de DNA a uma sequência de controle de expressão, naturalmente, inclui, se não já parte da sequência de DNA, o fornecimento de um códon de iniciação, ATG, no quadro de leitura correto a montante da sequência de DNA.

[00150] Os polinucleotídeos e vetores podem ser fornecidos em uma forma isolada e/ou purificada (por exemplo, isenta ou substancialmente isenta de polinucleotídeos de origem exceto o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com a função exigida). Como usado no presente documento, “substancialmente puro”, e “substancialmente isento” se referem a uma solução ou suspensão contendo menos que, por exemplo, cerca de 20% ou menos material estranho, cerca de 10% ou menos material estranho, cerca de 5% ou menos material estranho, cerca de 4% ou menos material estranho, cerca de 3% ou menos material estranho, cerca de 2% ou menos material estranho, ou cerca de 1% ou menos material estranho.

[00151] Uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vetor de expressão pode ser empregada na expressão das sequências de DNA dessa invenção. Os vetores de expressão úteis, por exemplo, podem consistir em segmentos de sequências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas. Os vetores adequados incluem, mas não se limitam a, derivados de SV40 e plasmídeos bacteriano conhecidos, por exemplo, plasmídeos de E. coli col El, Pcr1, Pbr322, Pmb9 e seus derivados, plasmídeos como RP4; DNAs de fago, por exemplo, os inúmeros derivados de fago À, por exemplo, NM989, e outro DNA de fago, por exemplo, M13 e DNA de fago de cadeia simples filamentoso; plasmídeos de levedura como o plasmídeo 2u ou derivados do mesmo; vetores úteis em células eucarióticas, como vetores úteis em células de insetos ou mamíferos; vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNAs de fago, como plasmídeos que foram modificados para empregar DNA de fago ou outras sequências de controle de expressão; e similares.

[00152] Também proporciona-se no presente documento uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções de polinucleotídeo. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como fornecido no presente documento forma um aspecto do presente pedido, como um método de produção do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal método compreende a expressão do polinucleotídeo. A expressão pode ser realizada, por exemplo, ao cultivar células hospedeiras contendo o polinucleotídeo sob condições apropriadas. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser, então, isolado e/ou purificado utilizando qualquer técnica adequada, e usado como apropriado.

[00153] Qualquer uma dentre uma ampla variedade de sequências de controle de expressão - sequências que controlam a expressão de uma sequência de DNA ligada de maneira funcional às mesmas - pode ser usada nesses vetores para expressar as sequências de DNA. Tais sequências de controle de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces ou tardios de SV40, CMV, vaccínia, polioma ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, o operador principal e regiões promotoras de fago À, as regiões de controle de proteína capsidial fd, o promotor de 3- fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de fosfatase ácida (por exemplo, Pho5), os promotores dos fatores alfa- correspondentes ativos de levedura, e outras sequências conhecidas para controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e várias combinações das mesmas.

[00154] Os sistemas de clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de células hospedeiras diferentes são bem conhecidos. As células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, sistemas de levedura e baculovírus. As linhagens celulares de mamíferos disponíveis na técnica de expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células ovarianas de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de filhote de hamster, células de mieloma de camundongo NS0 e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano comum pode ser, por exemplo, E. coli.

[00155] A expressão de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno em células procarióticas, como E. coli, é bem estabelecida na técnica. Para uma análise, consulte, por exemplo, Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura também está disponível para os elementos versados na técnica (Raff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560).

[00156] Uma ampla variedade de células hospedeiras unicelulares também é útil para expressar as sequências de DNA. Essas hospedeiras incluem hospedeiros eucarióticos e procarióticos bem conhecidos, como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungos como leveduras, e células animais, como células CHO, YB/20, NS0, SP2/0, Rl.l, B-W e L-M, células de rins de macaco verde africano (por exemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, e BMT10),células de insetos (por exemplo, Sf9), e células de humanos e células vegetais em cultura de tecido.

[00157] Será entendido que nem todos os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros irão funcionar igualmente bem para expressar as sequências de DNA. Nem todos os hospedeiros funcionam igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Entretanto, um elemento versado na técnica poderá selecionar os vetores, sequências de controle de expressão e hospedeiros apropriados sem experimentação indevida para realizar a expressão desejada sem que se abandone o escopo deste pedido. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro deve ser considerado devido ao vetor poder funcionar no mesmo. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópias, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, como marcadores antibióticos, também serão consideradas. Um elemento versado na técnica pode selecionar os vetores, sequências de controle de expressão, e hospedeiros apropriados para realizar a expressão desejada sem que se abandone o escopo deste pedido. Por exemplo, ao selecionar um vetor, o hospedeiro é considerado devido ao vetor funcionar no mesmo. O número de cópias do vetor, a capacidade de controlar aquele número de cópias, e a expressão de quaisquer outras proteínas codificadas pelo vetor, como marcadores antibióticos, também podem ser consideradas.

[00158] O presente pedido também fornece construções sob a forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão como descrito em outro lugar no presente documento que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima. Os vetores adequados podem ser selecionados ou construídos, contendo sequências reguladoras apropriadas, inclusive sequências promotoras, sequências terminadoras, sequências de poliadenilação, sequências intensificadoras, marcadores selcionáveis e outras sequências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, fagemídeo, etc., como apropriado. Para detalhes adicionais consulte, por exemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA em células e expressão de gene, e análise de proteínas, são descritas em detalhes em Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Os métodos e descrições de Sambrook et al. e Ausubel et al. estão incorporados no presente documento a título de referência.

[00159] Ao selecionar uma sequência de controle de expressão, uma variedade de fatores será normalmente considerada. Esses incluem, por exemplo, a resistência relativa do sistema, sua controlabilidade, e sua compatibilidade com a sequência de DNA particular ou gene que será expresso, particularmente quanto a estruturas secundárias potenciais. Os hospedeiros unicelulares adequados serão selecionados por consideração, por exemplo, de sua compatibilidade com o vetor selecionado, suas características de secreção, sua capacidade de dobrar proteínas corretamente e suas exigências de fermentação, bem como a toxicidade ao hospedeiro do produto codificado pelas sequências de DNA que serão expressas, e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.

[00160] Um aspecto adicional fornece uma célula hospedeira que contém um ou mais polinucleotídeos como descrito no presente documento. Ainda um aspecto adicional fornece um método de introduzir tal um ou mais polinucleotídeos em uma célula hospedeira, qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transfecção de fosfato de cálcio, DEAEDextran, eletroporação, transfecção e transdução mediada por lipossoma utilizando retrovírus ou outro vírus (por exemplo, vaccínia) ou, para células de insetos, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir, por exemplo, transformação por cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção utilizando bacteriófagos.

[00161] A introdução pode ser seguida por causar ou permitir a expressão do um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, ao cultivar as células hospedeiras sob condições para a expressão de um ou mais polinucleotídeos a partir de um ou mais polinucleotídeos. Sistemas induzíveis podem ser usados e a expressão induzida pela adição de um ativador.

[00162] Em uma modalidade, os polinucleotídeos podem ser integrados no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Em outra modalidade, o ácido nucleico é mantido em um vetor epissomal na célula hospedeira.

[00163] Os métodos são fornecidos no presente documento, esses incluem utilizar uma construção como apresentado acima em um sistema de expressão para expressar um polipeptídeo específico.

[00164] Considerando-se esses e outros fatores, um elemento versado na técnica poderá construir uma variedade de combinações de vetor/ sequência de controle de expressão/hospedeiro que irão expressar as sequências de DNA durante a fermentação ou em cultura animal em larga escala.

[00165] Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou uma proteína de ligação pode ser preparado de maneira recombinante/sintética além de, ou em vez de, clonado. O polinucleotídeo pode ser desenhado com os códons apropriados do anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou uma proteína de ligação. Em geral, alguém irá selecionar os códons preferidos de um hospedeiro pretendido se a sequência for usada para expressão. O polinucleotídeo completo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados por métodos padrão e montados em uma sequência de codificação completa. Consulte, por exemplo, Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259:6311 (1984), cada um está incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00166] Um método geral para incorporação sítio-específica de aminoácidos não naturais em proteínas é descrito em Noren et al., Science, 244:182-188 (abril de 1989). Esse método pode ser usado para criar análogos com aminoácidos não naturais.

[00167] Conforme mencionado acima, uma sequência de DNA que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser preparada de maneira sintética em vez de clonada. A sequência de DNA pode ser desenhada com os códons apropriados do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno sequência de aminoácidos. Em geral, alguém irá selecionar códons preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência for usada para expressão. A sequência completa é montada a partir de oligonucleotídeos sobrepostos preparados por métodos padrão e montados em uma sequência de codificação completa.

[00168] Os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ser modificados utilizando técnicas conhecidas para vários propósitos como, por exemplo, pela adição de polietileno glicol (PEG). A modificação de PEG (PEGuilação) pode resultar em um ou mais dentre tempo de circulação aprimorado, solubilidade aprimorada, resistência aprimorada à proteólise, antigenicidade e imunogenicidade reduzida, biodisponibilidade aprimorada, toxicidade reduzida, estabilidade aprimorada, e formulação mais fácil (para uma análise consulte, Francis et al., International Journal of Hematology 68:1-18, 1998).

[00169] No caso de um fragmento de ligação ao antígeno que não contém uma porção Fc, um fragmento de porção Fc pode ser adicionado (por exemplo, de maneira recombinante), por exemplo, para aumentar a meia-vida do fragmento de ligação ao antígeno em circulação no sangue quando administrado a um indivíduo. A seleção de uma região Fc apropriada e métodos de incorporar tais fragmentos são conhecidos na técnica. A incorporação de uma região de Fc de uma IgG em um polipeptídeo de interesse para aumentar sua meia-vida circulatória, porém para não perder sua atividade biológica pode ser realizada utilizando técnicas convencionais conhecidas como, por exemplo, descrito na Patente No. U.S. 6.096.871, que está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. As porções de Fc de anticorpos podem ser adicionalmente modificadas para aumentar a meia-vida do fragmento de ligação ao antígeno em circulação no sangue quando administradas a um indivíduo. As modificações podem ser determinadas utilizando meios convencionais na técnica como, por exemplo, descrito na Patente No. U.S. 7.217.798, que está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00170] Outros métodos de aprimorar a meia-vida de proteínas de fusão à base de anticorpo na circulação também são conhecidos como, por exemplo, descrito na Patente Nos. U.S. 7.091.321 e 6.737.056, cada uma está incorporada no presente documento a título de referência. Adicionalmente, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser produzidos ou expressos de modo que não contenham fucose em suas cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexas. A remoção da fucose das cadeias de açúcar ligadas a N- glicosídeo complexas é conhecida por aumentar as funções efetoras dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno, inclusive, porém não se limitam a, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Similarmente, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que podem se ligar a um epítopo podem ser ligados em sua extremidade C-terminal a toda ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM e qualquer uma das subclasses de isotipos, particularmente IgG1, IgG2b, IgG2a, IgG3 e IgG4.

[00171] Adicionalmente, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento também podem ser modificados de modo que os mesmos possam cruzar a barreira hematoencefálica. Tal modificação dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno descritas no presente documento permite o tratamento de doenças cerebrais como glioblastoma multiforme (GBM). As modificações exemplificativas para permitir que as proteínas como anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno cruzem a barreira hematoencefálica são descritas na Publicação de Pedido de Patente US 2007/0082380 que está incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00172] A glicosilação de imunoglobulinas revelou ter efeitos significativos sobre suas funções efetoras, estabilidade estrutural e taxa de secreção de células produtoras de anticorpo (Leatherbarrow et al., Mol. Immunol. 22:407 (1985)). Os grupos de carboidratos responsáveis por essas propriedades são geralmente ligados às regiões constantes (C) dos anticorpos. Por exemplo, a glicosilação de IgG em asparagina 297 no domínio CH 2 é exigida para a capacidade total de IgG para ativar a via clássica de citólise dependente de complemento (Tao and Morrison, J. Immunol. 143:2595 (1989)). A glicosilação de IgM em asparagina 402 no domínio CH 3 é necessária para a montagem apropriada e atividade citolítica do anticorpo (Muraoka and Shulman, J. Immunol. 142:695 (1989)). A remoção de sítios de glicosilação como as posições 162 e 419 nos domínios CH 1 e CH3 de um anticorpo IgA resultou em degradação intracelular e pelo menos 90% de inibição de secreção (Taylor and Wall, Mol. Cell. Biol. 8:4197 (1988)). Adicionalmente, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser produzidos ou expressos de modo que os mesmos não contenham fucose em suas cadeias de açúcar ligadas a N- glicosídeo complexas. A remoção da fucose das cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexas é conhecida por aumentar as funções efetoras dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno, inclusive, porém não se limitam a, citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Esses anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno “desfucosilados” podem ser produzidos através de uma variedade de sistemas utilizando técnicas de clonagem molecular conhecidas, inclusive, mas não se limitam a, animais transgênicos, plantas transgênicas, ou linhagens celulares que foram geneticamente elaboradas de modo que as mesmas não contenham mais as enzimas e vias bioquímicas necessárias para a inclusão de uma fucose nas cadeias de açúcar ligadas a N-glicosídeo complexas (também conhecida como células nocaute fucosiltransferase de animais, plantas). Exemplos não limitativos de células que podem ser elaboradas para serem células nocaute fucosiltransferase incluem células CHO, células SP2/0, células NS0 e células YB2/0.

[00173] A glicosilação de imunoglobulinas na região variável (V) também foi observada. Sox e Hood relataram que cerca de 20% de anticorpos humanos são glicosilados na região V (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66:975 (1970)). Acredita-se que a glicosilação do domínio V surge de ocorrências fortuitas do sinal de glicosilação ligado a N Asn-Xaa- Ser/Thr na sequência de região V e não reconhecido na técnica como exercendo um papel na função de imunoglobulina.

[00174] A glicosilação em um resíduo de estrutura de domínio variável pode alterar a interação de ligação do anticorpo com o antígeno. A presente invenção incluir critérios por meio dos quais um número limitado de aminoácidos na estrutura ou CDRs de uma cadeia de imunoglobulina humanizada é selecionado para ser submetido à mutação (por exemplo, por substituição, deleção, ou adição de resíduos) para aumentar a afinidade de um anticorpo.

[00175] O(s) resíduo(s) de cisteína pode(m) ser removido(s) ou introduzido(s) na região Fc de um anticorpo ou polipeptídeo contendo Fc, assim, eliminando ou aumentando a formação de ligação de dissulfeto intercadeia nessa região. Um agente de ligação específico homodimérico ou anticorpo gerado utilizando tais métodos pode exibir capacidade de internalização aumentada e/ou morte celular mediada por complemento aumentada e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Consulte Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992).

[00176] Foi mostrado que as sequências dentro da CDR podem fazer com que um anticorpo se ligue a MHC Classe II e ative uma resposta de células T auxiliares indesejada. Uma substituição conservadora pode permitir que o anticorpo mantenha a atividade de ligação, ainda reduza sua capacidade de ativar uma reposta de células T indesejada. Em uma modalidade, um ou mais dentre os 20 aminoácidos N-terminal da cadeia pesada ou leve podem ser removidos.

[00177] Em algumas modalidades, as moléculas de anticorpo podem ser produzidas com estrutura de carboidrato alterada resultando em atividade efetora alterada, inclusive moléculas de anticorpo com fucosilação ausente ou reduzida que exibe atividade de ADCC aprimorada. Uma variedade de maneiras é conhecida na técnica para realizar isso. Por exemplo, a atividade efetora de ADCC é mediada pela ligação da molécula de anticorpo ao receptor FCYRIII, que se revelou dependente da estrutura de carboidrato da glicosilação ligada a N na Asn-297 do domínio CH2. Os anticorpos não-fucosilados se ligam a esse receptor com afinidade aumentada e ativam as funções efetoras mediadas por FCYRIII mais eficientemente do que os anticorpos nativos, fucosilados. Algumas dessas cepas de células hospedeiras, por exemplo, a linhagem celular Lec13 ou hibridoma de rato YB2/0 naturalmente produz anticorpos com níveis de fucosilação inferiores. Shields et al., J Biol Chem. Jul. 26, 2002;277(30):26733-40; Shinkawa et al., J Biol Chem. Jan. 31, 2003;278(5):3466-73. Um aumento no nível de carboidrato dividido, por exemplo, através de produção recombinante de anticorpo em células que superexpressam a enzima GnTIII, também foi determinado por aumentar a atividade de ADCC. Umana et al., Nat Biotechnol. Fevereiro de 1999;17(2):176-80. Foi previsto que a ausência de apenas um dos dois resíduos de fucose pode ser suficiente para aumentar a atividade de ADCC. (Ferrara et al., J Biol Chem. Dec. 5, 2005).

[00178] As modificações covalentes de um anticorpo também são incluídas no presente documento. As mesmas podem ser feitas por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes podem ser introduzidos ao reagir os resíduos de aminoácido alvejados com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com as cadeias laterais selecionadas ou os resíduos N- ou C-terminal.

[00179] Os resíduos de cisteinil são comumente reagidos com alfa- haloacetatos (e aminas correspondentes), como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para gerar derivados de carboximetila ou carboxiamidometila. Os resíduos de cisteinil também são derivados por reação com bromotrifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiônico, fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila, dissulfeto de metil 2-piridila, p- cloromercuribenzoato, 2-cloromercúrioi-4-nitrofenol, ou cloro-7- nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

[00180] Os resíduos de histidil podem ser derivados por reação com dietilpirocarbonato em pH 5,5-7,0, pois esse agente é relativamente específico para a cadeia lateral de histidil. Brometo de para- bromofenacila também é útil; a reação pode ser realizada em 0,1 M de cacodilato de sódio em pH 6,0.

[00181] Os resíduos de lisinil e amino-terminal podem ser reagidos com anidridos de ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A derivação com esses agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos de lisinil. Outros reagentes adequados para derivar os resíduos contendo alfa-amino incluem imidoésteres como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroboroidreto, ácido trinitrobenzenossulfônico, O-metilisoureia, 2,4-pentanodiona, e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

[00182] Os resíduos de arginil podem ser modificados por reação com um ou vários reagentes convencionais, como fenilglioxal, 2,3- butanodiona, 1,2-cicloexanediona, e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina exige que a reação seja realizada em condições alcalinas devido à alta pKa do grupo funcional guanidina. Ademais, esses reagentes podem reagir com os grupos de lisina bem como o grupo épsilon-amino arginina.

[00183] A modificação específica de resíduos de tirosil pode ser feita, com interesse particular ao introduzir identificações espectrais em resíduos de tirosil por reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais comumente, N-acetilimidizol e tetranitrometano podem ser usados para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os resíduos de tirosil são iodados utilizando 125I ou 131I para preparar as proteínas identificadas para uso em radioimunoensaio.

[00184] Os grupos laterais de carboxila (aspartil ou glutamil) são seletivamente modificados por reação com carbodiimidas (R—N=C=N—R‘), em que R e R' são grupos alquila diferentes, como 1- cicloexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1-etil-3-(4-azonia-4,4- dimetilpentil)carbodiimida. Ademais, os resíduos aspartil e vglutamil são convertidos em resíduos de asparaginil e glutaminil por reação com íons de amônio.

[00185] Os resíduos de glutaminil e asparaginil podem ser desamidados com os resíduos de glutamil e aspartil correspondentes, respectivamente. Esses resíduos são desamidados sob condições neutras ou básicas.

[00186] Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila, metilação dos grupos alfa-amino de cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

[00187] Outro tipo de modificação covalente envolve acoplar química ou enzimaticamente glicosídeos ao agente de ligação específico ou anticorpo. Esses procedimentos são vantajosos, pois os mesmos não exigem a produção do polipeptídeo ou anticorpo em uma célula hospedeira que tem capacidade de glicosilação para glicosilação ligada a N ou O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser ligado(s) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) grupos sulfidrila livres como aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila livres como aqueles de serina, treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos como aqueles de fenilalanina, tirosina, ou triptofano, ou (f) o grupo amida de glutamina. Esses métodos são descritos em WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

[00188] A remoção de quaisquer porções de carboidrato presentes no polipeptídeo ou anticorpo pode ser realizada de maneira química ou enzimática. A deglicosilação química envolve a exposição do anticorpo ao composto ácido trifluorometanossulfônico, ou um composto equivalente. Esse tratamento resulta na clivagem de maioria ou todos os açúcares exceto o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N- acetilgalactosamina), enquanto deixa o anticorpo intacto. A deglicosilação química é descrita por Hakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) e por Edge et al. Anal. Biochem., 118: 131 (1981). A clivagem enzimática de porções de carboidrato sobre um anticorpo pode ser realizada pelo uso de uma variedade de endo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).

[00189] Outro tipo de modificação covalente de atividade de hepcidina compreende ligar um anticorpo a um dentre uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileo glicol, polióis polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, ou polímeros de polissacarídeo como dextrano. Tais métodos são conhecidos na técnica, consulte, por exemplo, Patente Nos. U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192. 4.179.337. 4.766.106. 4.179.337.4.495.285. 4.609.546 ou EP 315 456.

[00190] A afinidade de ligação de um antígeno de polipeptídeo pré- determinado pode, geralmente, ser modulada ao introduzir uma ou mais mutações na estrutura de região V, tipicamente em áreas adjacentes a uma ou mais CDRs e/ou em uma ou mais regiões de estrutura. Tipicamente, tais mutações envolvem a introdução de substituições de aminoácido conservadoras que tanto destroem como criam as sequências de sítio de glicosilação, porém não afetam substancialmente as propriedades estruturais hidropáticas do polipeptídeo. Tipicamente, as mutações que introduzem um resíduo de prolina são evitadas. A glicosilação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos é adicionalmente descrita na Patente No. U.S. 6.350.861, que está incorporada a título de referência no presente documento em relação à glicosilação.

Anticorpos Anti-Hepcidina

[00191] Anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina são fornecidos no presente documento.

[00192] Hepcidina está envolvida na regulação de homeostase de ferro. Hepcidina se liga à ferroportina e diminui sua atividade funcional ao fazer com que a mesma seja internalizada a partir da superfície celular e degradada.

[00193] Altos níveis de hepcidina humana podem resultar em níveis de ferro reduzidos e vice-versa. Mutações no gene de hepcidina que resultam na falta de atividade de hepcidina estão associadas à hemocromatose juvenil, uma doença de sobrecarga de ferro grave. Estudos em camundongos demonstraram uma função de hepcidina no controle de homeostase de ferro normal.

[00194] A hepcidina também pode estar envolvida no sequestro de ferro durante a inflamação. A expressão de gene da hepcidina foi observada como fortemente superrregulada após estímulos inflamatórios, como infecções, que induzem a resposta de fase aguda dos sistemas imunes inatos de vertebrados. A expressão do gene da hepcidina pode ser superrregulada por lipopolissacarídeo (LPS), turpentina, adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, infecções adenovirais e a interleucina-6 (IL-6) de citocina inflamatória. Uma forte correlação entre a expressão de hepcidina e anemia de inflamação também foi encontrada em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, inclusive infecções bacterianas, fúngicas e virais.

[00195] A hepcidina humana é um peptídeo de 25 aminoácidos com atividade antimicrobiana e reguladora de ferro. Também foi referido como LEAP-1 (peptídeo antimicrobiano expresso no fígado). Um cDNA de hepcidina que codifica um pré-propeptídeo de 83 aminoácidos em camundongos e um pré-propeptídeo de 84 aminoácidos em ratos e humanos foi subsequentemente identificado em uma busca de genes específicos de fígado que foram regulados por ferro. O peptídeo de sinal N-terminal de 24 resíduos é primeiramente clivado para produzir pró- hepcidina, que é, então, processada para produzir hepcidina madura, encontrada tanto no sangue como urina. Na urina humana, a forma predominante contém 25 aminoácidos, embora peptídeos mais curtos de 22 e 20 aminoácidos também estejam presentes em concentrações indetectáveis ou muito baixas em determinadas doenças.

[00196] Os anticorpos monoclonais (MAbs) foram elevados contra hepcidina que modulam a atividade de hepcidina e, desse modo, regulam a homeostase de ferro. A seguir, uma referência aos termos “anticorpo” e “anticorpos” será considerada inclusiva de qualquer um dos fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento e dos termos que serão intercambiáveis onde aplicável.

[00197] Esses anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são úteis para o diagnóstico e tratamento de várias condições e doenças bem como para a purificação e detecção de hepcidina.

[00198] A ligação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno à hepcidina pode modular hepcidina parcialmente (por exemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou qualquer número neste) ou completamente. A atividade de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser determinada utilizando um ensaio in vitro e/ou in vivo utilizando ensaios reconhecidos na técnica como aqueles descritos no presente documento ou de outro modo conhecidos na técnica.

[00199] Em um aspecto, o fragmento de ligação ao antígeno de qualquer um dos anticorpos descritos acima é um Fab, um Fab’, um Fd, um F(ab’)2, um Fv, um scFv, um polipeptídeo de ligação de cadeia simples (por exemplo, um scFv com a porção Fc) ou qualquer outro fragmento funcional do mesmo como descrito no presente documento.

[00200] Os anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, descritos no presente documento podem ser adicionalmente modificados para alterar as propriedades específicas do anticorpo enquanto mantêm a funcionalidade desejada, se necessário. Por exemplo, em uma modalidade, o composto pode ser modificado para alterar uma propriedade fármacocinética do composto, como estabilidade, solubilidade, biodisponibilidade ou meia-vida in vivo.

[00201] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ser formulados para qualquer via de administração adequada a um indivíduo que inclui, mas não se limita a, injeção. A injeção inclui, por exemplo, injeção subcutânea, peritoneal, ou intravenosa. A administração pode ser em um, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais sítios de injeção. Em uma modalidade, a administração é através de seis sítios de injeção.

[00202] Os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e proteínas de ligação que se ligam à hepcidina gerados utilizando tais métodos podem ser testados quanto a uma ou mais dentre sua afinidade de ligação, avidez e capacidades de modulação. Os anticorpos úteis e fragmentos de ligação ao antígeno, podem ser administrados a um indivíduo para prevenir, inibir, gerenciar ou tratar uma doença ou distúrbio como descrito em mais detalhes abaixo.

[00203] Métodos convencionais podem ser utilizados para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno podem ser avaliados quanto a uma ou mais dentre afinidade de ligação, taxas de associação, taxas de dissociação e avidez. Em um aspecto, os anticorpos podem ser avaliados quanto à sua capacidade de modular a atividade de hepcidina ou um polipeptídeo no qual a sequência de ligação à hepcidina (epítopo) está presente. A afinidade de ligação de medição, taxa de associação, taxas de dissociação e avidez podem ser realizadas utilizando ensaios reconhecidos na técnica que incluem (Ressonância de Plásmon de Superfíci), mas não se limitam a, um ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA), Análise de Scatchard, análise BIACORE, etc., bem como outros ensaios comumente usados e conhecidos pelos elementos versados na técnica.

[00204] A medição de ligação de anticorpos à hepcidina e/ou a capacidade dos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ser determinadas utilizando, por exemplo, um ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA), um ensaio de ligação competitivo, um ensaio ELISPOT, ou qualquer outro ensaio útil conhecido na técnica. Esses ensaios são comumente usados e bem conhecidos pelos elementos versados na técnica.

[00205] Em uma modalidade não limitativa, um ensaio ELISA pode ser usado para medir a capacidade de ligação de anticorpos específicos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam à hepcidina.

[00206] Ensaios, como um ELISA, também podem ser usados para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que exibem especificidade aumentada para hepcidina em comparação com outros anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Ensaios, como um ELISA, também podem ser usados para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos com ligação a epítopos em um ou mais polipeptídeos e em uma ou mais espécies de hepcidina. O ensaio de especificidade pode ser conduzido ao executar ELISAs paralelos em que os anticorpos de teste ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são examinados simultaneamente em câmaras de ensaio separadas quanto à capacidade de .ligação a um ou mais epítopos em espécies diferentes do polipeptídeo contendo os epítopos de hepcidina para identificar anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina. Outra técnica para medir a afinidade de ligação aparente conhecida pelos elementos versados na técnica é uma técnica de ressonância de plásmon de superfície (analisada em um sistema BIACORE 2000) (Liljeblad, et al., Glyco. J. 2000, 17:323-329). As medições padrão e ensaios de ligação tradicionais são descritos por Heeley, R. P., Endocr. Res. 2002, 28:217-229.

[00207] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser testados quanto a uma variedade de funções utilizando uma variedade de métodos in vitro e in vivo que incluem, mas não se limitam àquelas conhecidas na técnica e àquelas descritas no presente documento.

[00208] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina são fornecidos no presente documento. Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve,

[00209] em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 55-57, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 58-60, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 61-63;

[00210] e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 64-66, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 67-69, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 70-72.

[00211] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina ou um peptídeo de hepcidina, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve,

[00212] em que a dita região variável de cadeia pesada compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 1-3, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 4-6, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 7-9;

[00213] e a dita região variável de cadeia leve compreende: (i) uma CDR1 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 10-12, (ii) uma CDR2 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 13-15, e (iii) uma CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos codificada por qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 16-18. Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compreende uma região de estrutura de região variável de cadeia pesada; e uma região de estrutura de região variável de cadeia leve como apresentado na Listagem de Sequência abaixo onde as CDRs identificadas em qualquer uma dentre as SEQ ID NOS: 1-18 ou 55-72 são inseridas na região de estrutura utilizando a numeração de Kabat.

[00214] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina, preparado ao injetar em um roedor (isto é, camundongo, rato ou coelho) um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NOS: 19-27. Em outra modalidade, o peptídeo é conjugado com um carreador (por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH)) ou administrado com um adjuvante (adjuvante completo de Freund (CFA) ou adjuvante incompleto de Freund (IFA)). Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a 1 a 9 resíduos de aminoácidos de hepcidina. Em outra modalidade, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a 1 a 7 resíduos de aminoácido de hepcidina.

[00215] Um peptídeo hepcidina ao qual um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

[00216] Proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre Hep-5, Hep-9, Hep-20, Hep-22 e Hep-25, onde as sequências dos peptídeos são fornecidas na listagem de sequência.

[00217] Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a um epítopo que compreende uma sequência de aminoácidos de Hep-20 (SEQ ID NO: 22), Hep-22 (SEQ ID NO: 23) e Hep-25 (SEQ ID NO: 19).

[00218] Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a um epítopo que compreende Hep-5 (SEQ ID NO: 25) ou Hep-9 (SEQ ID NO: 24). Em outra modalidade, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a um epítopo que compreende 1 a 9 resíduos de aminoácido de hepcidina. Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 resíduos de aminoácido de um epítopo que compreende 1 a 9 resíduos de aminoácido.

[00219] Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é anticorpo monoclonal que compreende uma CDR1 de cadeia pesada codificada por SEQ ID NO: 55, uma cadeia pesada CDR2 codificada por SEQ ID NO: 58, uma cadeia pesada CDR3 codificada por SEQ ID NO: 61, uma cadeia leve CDR1 codificada por SEQ ID NO: 64, uma cadeia leve CDR2 codificada por SEQ ID NO: 67, e uma cadeia leve CDR3 codificada por SEQ ID NO: 70.

[00220] Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada CDR1 codificada por SEQ ID NO: 56, uma cadeia pesada CDR2 codificada por SEQ ID NO: 59, uma cadeia pesada CDR3 codificada por SEQ ID NO: 61, uma cadeia leve CDR1 codificada por SEQ ID NO: 65, uma cadeia leve CDR2 codificada por SEQ ID NO: 68, e uma cadeia leve CDR3 codificada por SEQ ID NO: 71.

[00221] Em outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada CDR1 codificada por SEQ ID NO: 57, uma cadeia pesada CDR2 codificada por SEQ ID NO: 60, uma cadeia pesada CDR3 codificada por SEQ ID NO: 63, uma cadeia leve CDR1 codificada por SEQ ID NO: 66, uma cadeia leve CDR2 codificada por SEQ ID NO: 69, e uma cadeia leve CDR3 codificada por SEQ ID NO: 72.

[00222] O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, ou um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, uma cadeia pesada variável humanizada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 40. Em outra modalidade, uma cadeia leve variável humanizada compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 38.

[00223] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região de estrutura de região variável de cadeia pesada; e uma região de estrutura de região variável de cadeia leve como apresentado na Listagem de Sequência abaixo onde as CDRs identificadas em qualquer uma dentre a SEQ ID NOS: 1-18 de 55 a 72 são inseridas na região de estrutura utilizando a numeração de Kabat.

[00224] O fragmento de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento scFv, um polipeptídeo de ligação de cadeia simples, um fragmento Fd, uma cadeia pesada variável, uma cadeia leve variável, um fragmento dAb ou qualquer outro tipo de fragmento descrito no presente documento. Um fragmento de ligação ao antígeno pode ser, por exemplo, um AVIMER, um anticorpo bivalente, ou um dímero de cadeia pesada. Um dímero de cadeia pesada pode ser, por exemplo, um camelídeo ou uma construção de cadeia pesada de tubarão.

[00225] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode ter uma constante de dissociação (Kd) de cerca de 1 a cerca de 10 pM, a partir de cerca de 10 a cerca de 20 pM, a partir de cerca de 1 a cerca de 29 pM, a partir de cerca de 30 a cerca de 40 pM, a partir de cerca de 10 a cerca de 100 pM, ou a partir de cerca de 20 a cerca de 500 pM.

[00226] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode ter uma constante de dissociação (Kd) de menos que cerca de 500 pM, menos que cerca de 400 pM, menos que cerca de 300 pM, menos que cerca de 200 pM, menos que cerca de 100 pM, menos que cerca de 75 pM, menos que cerca de 50 pM, menos que cerca de 30 pM, menos que cerca de 25 pM, menos que cerca de 20 pM, menos que cerca de 18 pM, menos que cerca de 15 pM, menos que cerca de 10 pM, menos que cerca de 75. pM, menos que cerca de 5 pM, menos que cerca de 2.5 pM, ou menos que cerca de 1 pM.

[00227] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode ter uma afinidade com hepcidina ou um peptídeo de hepcidina a partir de cerca de 10-9 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-10 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-11 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-12 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-13 a cerca de 10-14, a partir de cerca de 10-10 a cerca de 10-11, a partir de cerca de 10-11 a cerca de 10-12, a partir de cerca de 1012 a cerca de 10-13, ou 10-13 a cerca de 10-14.

[00228] Proporciona-se no presente documento uma composição, que compreende um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, e um carreador ou excipiente aceitável. As composições são descritas em mais detalhes abaixo.

[00229] Também proporciona-se no presente documento uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento. Também proporciona-se no presente documento um vetor de expressão que compreende a molécula de ácido nucleico, ligada de maneira funcional a uma sequência de controle reguladora. Também proporciona-se no presente documento uma célula hospedeira que compreende um vetor ou a molécula de ácido nucleico fornecido no presente documento. Também proporciona-se no presente documento um método que utiliza a célula hospedeira para produzir um anticorpo, que compreende cultivar a célula hospedeira sob condições adequadas de modo que o ácido nucleico seja expresso para produzir o anticorpo.

Composições

[00230] Cada um dos compostos descritos no presente documento pode ser usado como uma composição quando combinado com um carreador ou excipiente aceitável. Tais composições são úteis para análise in vitro ou in vivo ou para administração a um indivíduo in vivo ou ex vivo para tratar um indivíduo com os compostos descritos.

[00231] Assim, as composições farmacêuticas podem incluir, além do ingrediente ativo, um excipiente, carreador, tampão, estabilizante farmaceuticamente aceitável ou outros materiais bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do carreador ou outro material irá depender da via de administração.

[00232] As formulações farmacêuticas que compreendem uma proteína de interesse, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, identificado pelos métodos descritos no presente documento podem ser preparadas para armazenamento ao misturar a proteína que tem o grau de pureza desejado com carreadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carreadores, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são aqueles que são não tóxicas a receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões como fosfato, citrato, e outros ácido orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos como metil ou propil parabeno; catechol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos que incluem glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons de formação de sal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

[00233] Os carreadores aceitáveis são fisiologicamente aceitáveis pelo indivíduo administrado e mantêm as propriedades terapêuticas dos compostos com /onde os mesmos são administrados. Os carreadores aceitáveis e suas formulações são geralmente descritos, por exemplo, em Remington’ pharmaceutical Sciences (18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990). Um carreador exemplificativo é salina fisiológica. A frase “carreador farmaceuticamente aceitável” como usado no presente documento significa um a material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, como um líquido ou carga sólida, diluente, excipiente, solvente ou material encapsulante, envolvido na condução ou transporte dos compostos em questão a partir do sítio de administração de um órgão, ou parte do corpo, a outro órgão, ou parte do corpo, ou em um sistema de ensaio in vitro. Cada carreador é aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial a um indivíduo para o qual o mesmo é administrado. Um carreador aceitável não deve alterar a cavidade específica dos compostos em questão.

[00234] Em um aspecto, as composições farmaceuticamente aceitáveis ou fisiologicamente aceitáveis que incluem solventes (aquosos ou não aquosos), soluções, emulsões, meios de dispersão, revestimentos, agentes de promoção ou retardo de absorção isotônicos, compatíveis com a administração farmacêutica. Portanto, as composições farmacêuticas ou formulações farmacêuticas se referem a uma composição adequada para uso farmacêutico em um indivíduo. As composições e formulações farmacêuticas incluem uma quantidade de um composto descrito no presente documento e um carreador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável.

[00235] As composições podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via de administração particular (isto é, sistêmica ou local). Assim, as composições incluem carreadores, diluentes, ou excipientes adequados para administração por várias vias.

[00236] Em outra modalidade, as composições podem compreender adicionalmente, se necessário, um aditivo aceitável para aprimorar a estabilidade dos compostos na composição e/ou controlar a taxa de liberação da composição. Os aditivos aceitáveis não alteram a atividade específica dos compostos em questão. Os aditivos aceitáveis exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um açúcar como manitol, sorbitol, glicose, xilitol, trealose, sorbose, sacarose, galactose, dextrano, dextrose, frutose, lactose e misturas dos mesmos. Os aditivos aceitáveis podem ser combinados com carreadores e/ou excipientes aceitáveis como dextrose. Alternativamente, os aditivos aceitáveis exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um tensoativo como polissorbato 20 ou polissorbato 80 para aumentar a estabilidade do peptídeo e diminuir a gelificação da solução. O tensoativo pode ser adicionado à composição em uma quantidade de 0,01% a 5% da solução. A adição de tais aditivos aceitáveis aumenta a estabilidade e a meia-vida da composição em armazenamento.

[00237] Em uma modalidade, uma composição pode conter um tampão isotônico como um fosfato, acetato, ou tampão TRIS em combinação com um agente de tonicidade como um poliol., Sorbitol, sacarose ou cloreto de sódio, que se tonifica e estabiliza. Um agente de tonicidade pode estar presente na composição em uma quantidade de cerca de 5%.

[00238] Em outra modalidade, a composição pode incluir um tensoativo como para prevenir a agregação e estabilização em 0,01 a 0,02% p/vol.

[00239] Em outra modalidade, o pH da composição pode variar a parti de 4,5-6,5 ou 4,5-5,5.

[00240] Outras descrições exemplificativas de composições farmacêuticas para anticorpos podem ser encontradas, por exemplo, em US 2003/0113316 e Patente No. U.S. 6.171.586, cada um incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00241] Uma composição no presente documento também pode conter mais de um composto ativo como necessário para a indicação particular que é tratada, como aquelas com aditivos complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Por exemplo, um método de tratamento pode fornecer adicionalmente um agente imunossupressor. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[00242] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipsosomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[00243] As suspensões e formas cristalinas de anticorpos também são contempladas no presente documento; métodos para produzir suspensões e formas cristalinas são conhecidos pelos elementos versados na técnica.

[00244] Uma composição que será usada para administração in vivo deve ser estéril. Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização bem conhecidas. Por exemplo, a esterilização pode ser prontamente realizada por filtração através de membranas de filtração estéreis. As soluções resultantes podem ser embaladas para uso ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo que a preparação liofilizada é combinada com uma solução estéril antes da administração.

[00245] A secagem por congelamento pode ser empregada para estabilizar polipeptídeos para armazenamento em longo prazo, como quando um polipeptídeo é relativamente instável em composições líquidas. Um ciclo de liofilização é geralmente composto de três etapas: congelamento, secagem primária, e secagem secundária; Williams e Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, Volume 38, Número 2, páginas 48-59 (1984). Na etapa de congelamento, a solução é resfriada até a mesma ser adequadamente congelada. A massa de água na solução forma gelo nesse estágio. O gelo é sublimado no estágio de secagem primário, que é conduzido ao reduzir a pressão de câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, utilizando-se um vácuo. Por fim, a água sorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundário sob pressão de câmara reduzida e uma temperatura de prateleira elevada. O processo produz um material conhecido como um bolo liofilizado. Portanto, o bolo pode ser reconstituído antes do uso. A prática de reconstituição padrão de material liofilizado é adicionar novamente um volume de água pura (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam às vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para administração parenteral; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 18, Números 11 e 12, páginas 1311-1354 (1992).

[00246] Alguns excipientes como, por exemplo, polióis (inclusive manitol, sorbitol e glicerol); açúcares (inclusive glicose e sacarose); e aminoácidos (inclusive alanina, glicina e ácido glutâmico), podem atuar como estabilizantes para produtos secos por congelamento; consulte, por exemplo, Carpenter et al., Developments in Biological Standardization, Volume 74, páginas 225-239 (1991). Os polióis e açúcares também podem ser usados para proteger polipeptídeos contra danos induzidos por congelamento e secagem e para aumentar a estabilidade durante o armazenamento no estado seco. Os açúcares podem ser eficazes tanto no processo de secagem por congelamento como durante o armazenamento. Outras classes de moléculas, inclusive mono- e dissacarídeos e polímeros como PVP, foram relatadas como estabilizantes de produtos liofilizados.

[00247] Para injeção, uma composição e/ou medicamento pode ser um pó adequado para reconstituição com uma solução apropriada como descrito acima. Exemplos desses incluem, mas não se limitam a, pós secos por congelamento, secos por rotação ou secos por pulverização, pós amorfos, grânulos, precipitados ou particulados. Para injeção, as composições podem conter opcionalmente estabilizantes, modificadores de pH, tensoativos, modificadores de biodisponibilidade e combinações dos mesmos.

[00248] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada adequadas incluem matrizes semipermeáveis de ditos polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, tais matrizes estão sob a forma de artigos conformados, por exemplo, filmes, ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (consulte, por exemplo, Patente No. U.S. 3.773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradável como Lupron Depot™ (imicroesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros como acetato de etileno-vinil e ácido láctico-ácido glicólico permita a liberação de moléculas durante mais de 100 dias, determinados hidrogéis liberam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Embora os anticorpos encapsulados permaneçam no corpo durante um longo tempo, os mesmos podem se desnaturar ou agregar como resultado de exposição à umidade a 37 °C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser desenvolvidas quanto à estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for constatado que o mecanismo de agregação é a formação de ligação intermolecular S—S através de intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização pode ser realizada ao modificar os resíduos de sulfidrila, liofilizar soluções ácidas, controlar o teor de umidade, utilizar aditivos apropriados e desenvolver composições de matriz polimérica específicas.

[00249] Uma composição descrita no presente documento pode ser desenhada como de curta ação, liberação rápida, longa ação, ou liberação sustentada como descrito no presente documento. Em uma modalidade, a composição pode ser formulada para liberação controlada ou para liberação lenta.

[00250] A composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, por injeção, inclusive, mas não se limita a, injeção subcutânea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebroespinhal, ou intramuscular. Excipientes e carreadores para uso na formulação de composições para cada tipo de injeção são contemplados no presente documento. As seguintes descrições são somente a título de exemplo e não pretendem limitar o escopo das composições. As composições para injeção incluem, mas não se limitam a, soluções aquosas (onde solúveis em água) ou dispersões, bem como pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Para administração intravenosa, os carreadores adequados incluem salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ou salina tamponada com fosfato (PBS). O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas adequados dos mesmos. A fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Os agentes antibacterianos e antifúngicos incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e timerosal. Agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol, e cloreto de sódio podem ser incluídos na composição. As soluções resultantes podem ser embaladas para uso como estão, ou liofilizadas; a preparação liofilizada pode ser posteriormente combinada com uma solução estéril antes da administração. Para injeção intravenosa, ou injeção no local de aflição, o ingrediente ativo estará sob a forma de uma solução parenteralmente aceitável que é isenta de pirógeno e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os elementos versados na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactado. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, como necessário. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas ao incorporar um ingrediente ativo na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como exigido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas ao incorporar o ingrediente ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento que rendem um pó do ingrediente ativo além de qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada anteriormente estéril do mesmo.

[00251] As composições podem ser convencionalmente administradas de maneira intravítrea, subcutânea, ou através de implante intravítreo.

[00252] As composições podem ser convencionalmente administradas de maneira intravenosa, como por injeção de uma dose unitária, por exemplo. Para injeção, um ingrediente ativo pode estar sob a forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é substancialmente isenta de pirógeno e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Uma pessoa pode preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotônicos como Injeção de Cloreto de Sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer Lactado. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, como necessário. Adicionalmente, as composições podem ser administradas através de aerossolização (Lahn et al., Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allergy Immuno., 134: 49-55 (2004)).

[00253] Em uma modalidade, a composição é liofilizada, por exemplo, para aumentar a vida de prateleira em armazenamento. Quando as composições forem consideradas para uso em medicamentos ou qualquer um dos métodos fornecidos no presente documento, é contemplado que a composição pode ser substancialmente isenta de pirógenos de modo que a composição não irá causar uma reação inflamatória ou uma reação alérgica não segura quando administrada a um indivíduo humano. O teste de composições para pirógenos e preparação de composições substancialmente isentas de pirógenos são bem entendidos por um elemento versado na técnica e podem ser realizados utilizando kit comercialmente disponíveis.

[00254] Os carreadores aceitáveis podem conter um composto que estabiliza, aumenta ou retarda a absorção ou liberação. Tais compostos incluem, por exemplo, carboidratos, como glicose, sacarose, ou dextranos; proteínas de baixo peso molecular; composições que reduzem a liberação ou hidrólise de peptídeos; ou excipientes ou outros estabilizantes e/ou tampões. Os agentes que retardam a absorção incluem, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. Detergentes também podem ser usados para estabilizar ou aumentar ou reduzir a absorção da composição farmacêutica, inclusive carreadores lipossômicos. Para proteção contra a digestão, o composto pode ser complexado com uma composição para tornar a mesma resistente à hidrólise ácida e enzimática, ou o composto pode ser complexado em um carreador apropriadamente resistente como um lipossoma. Meios de proteção de compostos contra digestão são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760 1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119 135; e Patente No. U.S. 5.391.377, que descreve composições lipídicas para entrega oral de agentes terapêuticos).

[00255] A frase “farmaceuticamente aceitável” se refere a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente uma reação alérgica ou adversa similar, como distúrbio gástrico, tontura e similares, quando administradas a um humano.

[00256] O termo “dose unitária” quando usado em referência a uma composição terapêutica se refere a unidades fisicamente distintas adequadas como dosagem unitária para humanos, sendo que cada unidade contém uma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente desejado; isto é, carreador, ou veículo.

[00257] As composições podem ser administradas de maneira compatível com a formulação de dosagem, e em uma quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade que será administrada depende do indivíduo que será tratado, capacidade do sistema imune do indivíduo para utilizar o ingrediente ativo, e grau de capacidade de ligação desejado. Quantidades precisas de ingrediente ativo que serão administradas dependem do julgamento do profissional e são peculiares para cada individual. Os regimes adequados para administração inicial e doses de reforço também são variáveis, porém são tipificados por uma administração inicial seguida por doses repetidas em intervalos de uma ou mais horas por uma injeção subsequente ou outra administração. Alternativamente, a infusão intravenosa contínua que é suficiente para manter concentrações no sangue é contemplada.

[00258] Uma modalidade contempla o uso das composições descritas no presente documento para produzir um medicamento para tratar uma condição, doença ou distúrbio descrito no presente documento. Os medicamentos podem ser formulados com base nas características físicas do indivíduo em necessidade de tratamento, e podem ser formulados em formulações únicas ou múltiplas com base no estágio da condição, doença ou distúrbio. Os medicamentos podem ser embalados em uma embalagem adequada com identificações apropriadas para a distribuição para hospitais e clínicas em que a identificação serve para a indicação de tratamento de um indivíduo que tem uma doença descrita no presente documento. Os medicamentos podem ser embalados como uma unidade única ou múltipla. As instruções da dosagem e administração das composições podem ser incluídas com as embalagens como descrito abaixo. A invenção é adicionalmente dirigida a medicamentos de um anticorpo anti-hepcidina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento acima e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00259] As composições de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina e incluem aqueles como descrito em outro lugar no presente documento são fornecidas aqui. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam à hepcidina como descrito no presente documento podem ser usados para o tratamento de várias doenças e condições associadas à homeostase de ferro.

[00260] Uma composição (um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno descrito no presente documento) pode ser administrada individualmente ou em combinação com uma segunda composição tanto de maneira simultânea como sequencial dependendo da condição que será tratada. Em uma modalidade, um segundo tratamento terapêutico é um estimulante de eritropoiese. Quando duas ou mais composições forem administradas, as composições podem ser administradas em combinação (tanto de maneira sequencial como simultânea). Uma composição pode ser administrada em uma única dose ou múltiplas doses.

[00261] Quando formuladas para administração a indivíduos humanos, as composições podem ser formuladas para serem isentas de pirógenos. O teste de composições para pirógenos e preparação de composições isentas de pirógenos são bem entendidos por um elemento versado na técnica.

[00262] Uma modalidade contempla o uso por qualquer uma das composições da presente invenção para produzir um medicamento para tratar um distúrbio da presente invenção. Os medicamentos podem ser formulados com base nas características físicas do indivíduo em necessidade de tratamento, e podem ser formulados em formulações únicas ou múltiplas com base no distúrbio. Os medicamentos da presente invenção podem ser embalados em uma embalagem farmacêutica adequada com identificações apropriadas para a distribuição para hospitais e clínicas em que a identificação serve para a indicação de tratamento de um distúrbio como descrito no presente documento em um indivíduo. Os medicamentos podem ser embalados como uma unidade única ou múltipla. As instruções da dosagem e administração das composições farmacêuticas da presente invenção podem ser incluídas com as embalagens farmacêuticas.

Diagnósticos

[00263] Proporciona-se no presente documento um método de diagnosticar um distúrbio relacionado á hepcidina, que compreende: (a) colocar uma amostra biológica de um indivíduo suspeito de ter o dito distúrbio em contato com um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento sob condições que permitam a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, à hepcidina; e (b) detectar e/ou quantificar a hepcidina ligada ao anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que a quantidade de hepcidina na amostra, como quantificado em (b), acima de um nível limiar indica a presença de distúrbio relacionado à hepcidina e abaixo do nível limiar indica a ausência de distúrbio relacionado à hepcidina.

[00264] Um método De diferenciar uma doença inflamatória de uma doença não inflamatória, que compreende: (a) colocar uma amostra biológica de um indivíduo suspeito de ter o dito distúrbio em contato com um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento sob condições que permitam a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, à hepcidina; e (b) detectar e/ou quantificar a hepcidina ligada ao anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que a quantidade de hepcidina na amostra, como quantificado em (b), acima de um nível limiar indica a presença de doença inflamatória e abaixo do nível limiar indica a ausência de doença inflamatória.

[00265] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende adicionalmente uma porção detectável. A detecção pode ocorrer in vitro, in vivo ou ex vivo. Os ensaios in vitro para a detecção e/ou determinação (quantificação, qualificação, etc.) de hepcidina com os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos m esmos incluem, mas não se limitam a, por exemplo, ELISAs, RIAs e western blots. A detecção, diagnóstico ou monitoramento in vitro de hepcidina pode ocorrer ao obter uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue) de um indivíduo e testar a amostra, por exemplo, em um ensaio ELISA padrão. Por exemplo, uma placa de microtitulação de 96 poços pode ser revestida com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito no presente documento, lavada e revestimento com PBS-Tween/BSA para inibir a ligação não específica. A amostra de sangue pode ser serialmente diluída e colocada em poços únicos ou duplos comparado com uma curva padrão serialmente diluída de hepcidina. Após incubar e lavar os poços, um anticorpo anti-hepcidina marcado com biotina pode ser adicionado, seguido pela adição de estreptavidina-fosfatase alcalina. Os poços podem ser lavados e um substrato (peroxidase de rábano) adicionado para desenvolver a placa. A placa pode ser lida utilizando um leitor de placa convencional e software.

[00266] Quando ocorre a detecção in vivo, o contato ocorre através da administração do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno utilizando qualquer meio convencional como aqueles descritos em outro lugar no presente documento. Em tais métodos, a detecção de hepcidina em uma amostra ou um indivíduo pode ser usada para diagnosticar uma doença ou distúrbio associado, ou correlacionada à atividade daquelas doenças e distúrbios descritos no presente documento.

[00267] Na detecção in vivo, o diagnóstico ou monitoramento de hepcidina, um indivíduo é administrado com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga à hepcidina, tal anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é ligado a uma porção detectável. A porção detectável pode ser visualizada utilizando métodos reconhecidos na técnica como, mas não se limitam a, imagem de ressonância magnética (MRI), fluorescência, radioimagem, fontes de luz fornecidas por endoscópios, laparoscópios, ou cateter intravascular (isto é, através de detecção de agentes fotoativos), fotovarredura, varredura de tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética nuclear de corpo inteiro (NMR), radiocintilografia, tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), varredura de região de infravermelho próximo (NIR), raio X, ultrassom, etc. como descrito, por exemplo, na Patente No. U.S. 6.096.289, Patente No. U.S. 7.115.716, Patente No. U.S. 7.112.412, Pedido de Patente No. U.S. 20030003048 e Pedido de Patente No. U.S. 20060147379, cada um incorporado no presente documento em sua totalidade a título de referência. As identificações para detectar compostos utilizando tais métodos também são conhecidas na técnica e descritas em tais patentes e pedidos e estão incorporadas no presente documento a título de referência. A visualização da porção detectável pode permitir a detecção, diagnóstico e/ou monitoramento de uma condição ou doença associada à hepcidina.

[00268] Ensaios diagnósticos adicionais que utilizam anticorpos específicos para a proteína alvo desejada, isto é, hepcidina, são conhecidos na técnica e também são contemplados no presente documento.

[00269] Para métodos de detecção in vitro, as amostras que serão obtidas de um indivíduo incluem, mas não se limitam a, amostras de sangue, biópsia de tecido e fluido das mesmas.

[00270] Assim, a presente invenção fornece anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos contra hepcidina que são úteis para detectar ou diagnosticar níveis de hepcidina associados a uma doença ou distúrbio, indicando potencialmente a necessidade de tratamento terapêutico. Em determinadas modalidades, os anticorpos compreendem um anticorpo anti-hepcidina humanizado descrito no presente documento. Em outras modalidades, o anticorpo compreende adicionalmente um segundo agente. Tal agente pode ser uma molécula ou porção como, por exemplo, uma molécula repórter ou uma identificação detectável. As identificações/porções detectáveis para tais métodos de detecção são conhecidas na técnica e são descritas em mais detalhes abaixo. As moléculas repórter são qualquer porção que pode ser detectada utilizando um ensaio. Exemplos não limitativos de moléculas repórter que foram conjugadas com polipeptídeos incluem enzimas, radioidentificações, haptenos, identificações fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimiluminescentes, cromóforos, moléculas luminescentes, moléculas de fotoafinidade, partículas coloridas ou ligantes, como biotina. As identificações detectáveis incluem compostos e/ou elementos que podem ser detectados devido às suas propriedades funcionais específicas e/ou características químicas, cujo uso permite que o polipeptídeo ao qual os mesmos são ligados seja detectado e/ou adicionalmente quantificado se desejado. Muitos agentes detectáveis apropriados (imagem) são conhecidos na técnica, como os métodos para sua ligação a polipeptídeos (consulte, por exemplo, Patente Nos. U.S. 5.021.236; 4.938.948; e 4.472.509, cada uma está incorporada no presente documento a título de referência).

[00271] Os métodos de ligação de polipeptídeos como anticorpos com porções detectáveis são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, tecnologia de DNA recombinante para formar proteínas de fusão e conjugação (por exemplo, conjugação química). Os métodos de preparação de proteínas de fusão por conjugação química ou engenharia recombinante são bem conhecidos na técnica. Os métodos de ligação de maneira covalente e não covalente também são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787 1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404414; and Kroll (1993) DNA Cell. Biol. 12: 441-453.

[00272] Pode ser necessário, em alguns casos, introduzir uma região ligante de polipeptídeo não estruturada entre uma identificação ou uma porção e uma ou mais porções dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno ou proteínas de ligação descritos no presente documento. Um ligante pode facilitar a flexibilidade aumentada e/ou reduzir o impedimento estérico entre quaisquer dois fragmentos. O ligante também pode facilitar a dobra apropriada de cada fragmento. O ligante pode ser de origem natural, como uma sequência determinada para exigir em espiral aleatória entre dois domínios de uma proteína. Uma sequência ligante é o ligante encontrado enter os domínios C-terminal e N-terminal da subunidade a de RNA polimerase. Outros exemplos de ligantes de ocorrência natural incluem ligantes encontrados nas proteínas 1CI e LexA.

[00273] Dentro de um ligante, uma sequência de aminoácidos pode ser variada com base nas características do ligante como determinado de maneira empírica ou como revelado por modelagem. Considerações ao selecionar um ligante incluem a flexibilidade do ligante, carga do ligante e presença de alguns aminoácidos do ligante nas subunidades de ocorrência natural. O ligante também pode ser desenhado de modo que os resíduos no ligante entrem em contato com o ácido desoxirribonucleico (DNA), desse modo, influenciando a afinidade de ligação ou especificidade, ou interajam com outras proteínas. Em alguns casos, como quando é necessário expandir a uma distância mais longa entre as subunidades ou quando os domínios deverem ser mantidos em uma configuração particular, o ligante pode, opcionalmente, conter um domínio dobrado adicional. Em algumas modalidades, o desenho de um ligante pode envolver uma disposição de domínios que exige que o ligante se expanda a uma distância relativamente curta, por exemplo, menor que cerca de 10 Angstroms (A). Entretanto, em determinadas modalidades, os ligantes se expandem a uma distância de até cerca de 50 Angstroms.

[00274] Dentro do ligante, a sequência de aminoácidos pode ser variada com base nas características do ligante como determinado empiricamente ou como revelado por modelagem. Considerações ao selecionar um ligante incluem a flexibilidade do ligante, carga do ligante e presença de alguns aminoácidos do ligante nas subunidades de ocorrência natural. O ligante também pode ser desenhado de modo que os resíduos no ligante entrem em contato com o DNA, desse modo, influenciando a afinidade de ligação ou especificidade, ou interajam com outras proteínas. Em alguns casos, quando for necessário se expandir a uma distância mais longa entre as subunidades ou quando os domínios deverem ser mantidos em uma configuração particular, o ligante pode, opcionalmente, conter um domínio dobrado adicional.

[00275] Os métodos de acoplamento de polipeptídeos (livres ou ligados a células) a esferas são conhecidos na técnica. Os métodos para selecionar polipeptídeos acoplados ou células que exibem um polipeptídeo também são conhecidos na técnica. Brevemente, as micropartículas de poliestireno paramagnéticas que estão comercialmente disponíveis (Spherotech, Inc., Libertyville, IL; Invitrogen, Carlsbad, CA) acoplam os peptídeos a superfícies de micropartículas que foram modificadas com grupos funcionais ou revestidas com vários anticorpos ou ligantes como, por exemplo, avidina, estreptavidina ou biotina.

[00276] A propriedade paramagnética de micropartículas permite que as mesmas sejam separadas da solução utilizando um ímã. As micropartículas podem ser facilmente ressuspensas quando removidas do ímã. Os polipeptídeos podem ser acoplados a micropartículas de poliestireno paramagnéticas revestidas com uma camada de poliuretano em um tubo. Os grupos hidróxi sobre a superfície de micropartícula são ativados por reação com cloreto de p-toluensulfonila (Nilsson K and Mosbach K. “p-Toluenesulfonyl chloride as an activating agent of agarose for the preparation of immobilized affinity ligands and proteins.” Eur. J. Biochem. 1980:112: 397-402). Alternativamente, as micropartículas de poliestireno paramagnéticas contendo ácido carboxílico na superfície podem ser ativadas com uma carbodiimida seguido por acoplamento a um polipeptídeo, resultando em uma ligação de amida estável entre um grupo amino primário do polipeptídeo e os grupos de ácido carboxílico sobre a superfície das micropartículas (Nakajima N and Ikade Y, Mechanism of amide formation by carbodiimide for bioconjugation in aqueous media, Bioconjugate Chem. 1995, 6(1): 123-130; Gilles MA, Hudson AQ and Borders CL Jr, Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution, Anal Biochem. 1990 Feb 1;184(2):244-248; Sehgal D and Vijay IK, a method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation, Anal Biochem. 1994 Apr; 218(1):87-91; Szajani B et al, Effects of carbodiimide structure on the immobilization of enzymes, Appl Biochem Biotechnol. 1991 Aug; 30(2): 225-231). Outra opção é acoplar os polipeptídeos biotinilados a micropartículas de poliestireno paramagnéticas cujas superfícies foram covalentemente ligadas a uma monocamada de estreptavidina. (Argarana CE, Kuntz ID, Birken S, Axel R, Cantor CR. Molecular cloning and nucleotide sequence of the streptavidin gene. Nucleic Acids Res. 1986;14(4):1871-82; Pahler A, Hendrickson WA, Gawinowicz Kolks MA, Aragana CE, Cantor CR. Characterization and crystallization of core streptavidin. J Biol Chem 1987:262(29):13933-13937).

[00277] Os polipeptídeos podem ser conjugados com uma ampla variedade de corantes fluorescentes, supressores e haptenos como fluoresceína, R-ficoeritrina, e biotina. A conjugação pode ocorrer tanto durante a síntese de polipeptídeo como após o polipeptídeo ser sintetizado e purificado. Biotina é uma pequena vitamina (244 quilodaltons) que se liga com alta afinidade às proteínas avidina e estreptavidina e podem ser conjugadas com a maioria dos peptídeos sem alterar suas atividades biológicas. Os polipeptídeos marcados com biotina são facilmente purificados a partir de polipeptídeos não marcados utilizando géis com afinidade de estreptavidina e avidina imobilizados, e sondas conjugadas com estreptavidina ou avidina podem ser usadas para detectar polipeptídeos biotinilados, por exemplo, em ELISA, aplicações de dot blot ou Western blot. Ésteres de N-hidroxisuccinimida de biotina são o tipo mais comumente usado de agente de biotinilação. As biotinas ativadas por N-hidroxisuccinimida reagem eficientemente com grupos amino primário em tampões fisiológicos para formarem ligações de amida estáveis. Os polipeptídeos têm aminas primárias na terminação N e também podem ter várias aminas primárias na cadeia lateral de resíduos de lisina que estão disponíveis como alvos para identificação com reagentes de biotina ativada por N-hidroxisuccinimida. Vários ésteres de N- hidroxisuccinimida de biotina diferentes estão disponíveis, com várias propriedades e comprimento de braço espaçador (Pierce, Rockford, IL). Os reagentes de sulfo-N-hidroxisuccinimida éster são solúveis em água, permitindo que as reações sejam realizadas na ausência de solventes orgânicos.

[00278] A razão mole para mole de biotina para polipeptídeo pode ser estimada utilizando um ensaio de 2-(ácido 4’-Hidroxiazobenzeno-2- carboxílico) utilizando técnicas reconhecidas (Green, NM, (1975) “Avidin. In Advances in Protein Chemistry.” Academic Press, New York. 29, 85-133; Green, NM, (1971) “The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin.” Biochem J. 125, 781-791; Green, NM., (1965) “A spectrophotometric assay for avidin and biotin based on binding of dyes by avidin.” Biochem. J. 94: 23c-24c). Várias moléculas de biotina podem ser conjugadas com um polipeptídeo e cada molécula de biotina pode ligar uma molécula de avidina. A formação de ligação biotina-avidina é muito rápida e estável em solventes orgânicos, pH extremo e reagentes desnaturantes. Para quantificar a biotinilação, uma solução contendo o polipeptídeo biotinilado é adicionada a uma mistura de 2-(ácido 4’- Hidroxiazobenzeno-2-carboxílico) e avidina. Devido ao fato de a biotina ter uma afinidade maior com avidina, a mesma desloca o 2-(ácido 4’- hidroxiazobenzeno-2-carboxílico) e a absorbância em 500 nanômetros diminui proporcionalmente. A quantidade de biotina em uma solução pode ser quantificada em uma única cuveta ao medir a absorbância da solução de 2-(ácido 4’-Hudroxiazobenzeno-2-carboxílico)-avidina antes e após a adição do peptídeo contendo biotina. A alteração em absorbância se refere á quantidade de biotina na amostra pelo coeficiente de extinção do complexo 2-(ácido 4’-Hidroxiazobenzeno-2- carboxílico)-avidina.

[00279] Alternativamente, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno ou proteína de ligação pode ser conjugado com uma porção fluorescente. A conjugação de polipeptídeos com porções fluorescentes (por exemplo, R-Ficoeritrina, isotiocianato de fluoresceína (FITC), etc.) pode ser realizada utilizando técnicas reconhecidas descritas, por exemplo, em Glazer, AN and Stryer L. (1984). Trends Biochem. Sci. 9:423-7; Kronick, MN and Grossman, PD (1983) Clin. Chem. 29:15826; Lanier, LL and Loken, MR (1984) J. Immunol., 132:151-156; Parks, DR et al. (1984) Cytometry 5:159-68; Hardy, RR et al. (1983) Nature 306:270-2; Hardy RR et al. (1984) J. Exp. Med. 159:1169-88; Kronick, MN (1986) J. Immuno. Meth. 92:1-13; Der-Balian G, Kameda, N and Rowley, G. (1988) Anal. Biochem. 173:59-63.

[00280] Em uma modalidade não limitativa, um anticorpo fragmento de ligação ao antígeno pode estar associado a (conjugado) uma identificação detectável, como um radionuclídeo, composto relacionado a ferro, um corante, um agente de formação de imagens ou um agente fluorescente para imunodetecção de hepcidina que pode ser usada para visualizar a ligação dos anticorpos à hepcidina in vitro e/ou in vivo.

[00281] Exemplos não limitativos de radioidentificadores incluem, por exemplo, 32P, 33P, 43K, 52Fe, 57Co, 64Cu, 67Ga, 67Cu, 68Ga, 71Ge, 75Br, 76Br, 77Br, 77As, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 90Y, 97Ru, 99Tc, 100Pd, 101Rh, 103Pb, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 111In, 113In, 119Sb, 121Sn, 123I, 125I, 127Cs, 128Ba, 129Cs, 131I, 131Cs, 143Pr, 153Sm, 161Tb, 166Ho, 169Eu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 191Os, 193Pt, 194Ir, 197Hg, 199Au, 203Pb, 211At, 212Pb, 212Bi e 213Bi. Os radioidentificadores podem ser anexados a compostos utilizando química convencional conhecida na técnica de formação de imagens de anticorpo. Os compostos radioidentificados são úteis em técnicas de diagnóstico in vitro e em técnicas de radioimagem in vivo e em radioimunoterapia.

[00282] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser conjugado com uma porção terapêutica e uma porção detectável. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser conjugado, ou recombinantemente elaborado com, uma etiqueta de afinidade (por exemplo, uma etiqueta de purificação). As etiquetas de afinidade como, por exemplo, etiquetas His6 (SEQ ID NO: 28) são convencionais na técnica.

[00283] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos fornecidos no presente documento são tais que os mesmos podem ser conjugado ou ligados a uma porção terapêutica e/ou uma porção de formação de imagens ou uma porção detectável e/ou uma etiqueta de afinidade. Os métodos para conjugar ou ligar polipeptídeos são bem conhecidos na técnica. As associações (ligação) entre os compostos e identificações incluem quaisquer meios conhecidos na técnica que incluem, mas não se limitam a, interações covalentes e não covalentes, conjugação química bem como técnicas recombinantes.

Métodos de Tratamento

[00284] Proporciona-se no presente documento um método de induzir uma resposta em um indivíduo (humano ou não humano) ao administrar ao indivíduo uma composição de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga à hepcidina. O sítio de ligação ao qual o anticorpo se liga pode ser um epítopo contínuo ou conformacional/descontínuo. Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a um epítopo que compreende 1 a 9 resíduos de aminoácido de hepcidina. Em outra modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 resíduos de aminoácido de um epítopo que compreende 1 a 9 resíduos de aminoácido de hepcidina. Ainda em outra modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a Hep-20, Hep-22, e Hep-25.

[00285] Hepcidina pode ter uma sequência de aminoácidos, por exemplo, de SEQ ID NO: 19. Um peptídeo de hepcidina pode ter uma sequência de aminoácidos, por exemplo, de qualquer uma dentre a SEQ ID NOS: 20-25. Ainda em outra modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga a uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS de peptídeo descritas no presente documento inclusive, por exemplo, SEQ ID NOS: 19-27.

[00286] Uma resposta eficaz da presente invenção é obtida quando o indivíduo experimenta alívio parcial ou total ou redução de sinais ou sintomas de doença, e especificamente inclui, sem limitação, prolongamento de sobrevivência. Os tempos de sobrevivência isenta de progressão esperados podem ser medidos em meses a anos, dependendo de fatores prognósticos que incluem o número de recidiva, estágio de doença, e outros fatores. O prolongamento de sobrevivência inclui, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês (mes.), cerca de pelo menos 2 meses., cerca de pelo menos 3 meses., cerca de pelo menos 4 meses., cerca de pelo menos 6 meses., cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos, etc. A sobrevivência total também pode ser medida em meses a anos. Alternativamente, uma resposta eficaz pode ser que os sintomas de um indivíduo permanecem estáticos. Indicações adicionais de tratamento de indicações são descritas em mais detalhes abaixo.

[00287] As composições de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritas no presente documento podem ser usadas como agentes não terapêuticos (por exemplo, como agentes de purificação por afinidade). Geralmente, em uma modalidade, uma proteína de interesse é imobilizada em uma fase sólida como resina Sephadex ou papel filtro, utilizando métodos convencionais conhecidos na técnica. A proteína imobilizada é contatada com uma amostra contendo o alvo de interesse (ou fragmento do mesmo) que será purificado, e, então, o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra exceto a proteína alvo, que é ligada ao anticorpo imobilizado. Por fim, o suporte é lavado com outro solvente adequado, como tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar a proteína alvo. Além da purificação, as composições podem ser usadas para detecção, diagnóstico e terapia de doenças e distúrbios descritos no presente documento.

[00288] O termo “contatar” como usado no presente documento se refere à adição a uma solução ou composição de um composto com um meio líquido que lava os polipeptídeos, células, tecido ou órgão de um organismo. Alternativamente, “contatar” se refere a misturar uma solução ou composição de um composto com um líquido como sangue, soro, ou plasma derivado de um organismo. Para aplicações in vitro, uma composição também pode compreender outro componente, como sulfóxido de dimetila (DMSO). DMSO facilita a absorção dos compostos ou solubilidade dos compostos. A solução que compreende o composto de teste pode ser adicionada ao meio que lava as células, tecidos ou órgãos, ou misturada com outro líquido como sangue, utilizando um aparelho de entrega, como um dispositivo à base de pipeta ou dispositivo à base de seringa. Para aplicações in vivo, o contato pode ocorrer, por exemplo, através de administração de uma composição a um indivíduo por qualquer meio adequado; composições com excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis foram descritos em mais detalhes abaixo.

[00289] Um “indivíduo” (por exemplo, um mamífero como um humano ou um animal não humano como um primata, roedor, vaca, cavalo, porco, ovelha, etc.) de acordo com uma modalidade do presente pedido, é um mamífero que exibe uma ou mais manifestações e/ou sintomas clínicos de uma doença ou distúrbio descrito no presente documento.

[00290] Uma composição descrita no presente documento pode ser administrada a um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado ao inibir uma doença ou distúrbio como descrito no presente documento que pode estar associada à hepcidina, em uma razão risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Para a administração das presentes composições a indivíduos humanos, as composições podem ser formuladas por metodologia conhecida por um elemento versado na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que obtém pelo menos parcialmente um efeito terapêutico ou profilático desejado em um órgão ou tecido. A quantidade de um anticorpo anti-hepcidina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo necessária para causar a prevenção e/ou tratamento terapêutico de uma doença ou distúrbio não é fixa per se. A quantidade de anticorpo anti-hepcidina ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo administrada pode variar com o tipo de doença, extensão da doença, e tamanho do mamífero que sofre da doença ou distúrbio. Em uma modalidade, dois ou mais anticorpos anti-hepcidina descritos no presente documento são administrados a um indivíduo em combinação. A combinação incluir a administração concomitante ou subsequente dos anticorpos.

[00291] “Administrar” é definido no presente documento como um meio que fornece a composição ao indivíduo de maneira que resulte na composição estando dentro do corpo do indivíduo. Tal administração pode ser por qualquer via que inclui, sem limitação, local, regional ou sistêmica por administração subcutânea, intravítrea, intradérmica, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebreoespinhal, ou intramuscular (por exemplo, injeção). “Administração concomitante” significa administração dentro de um período de tempo relativamente curto entre a mesma; tal período de tempo pode ser menos que 2 semanas, menos que 7 dias, menos que 1 dia e poderia ainda ser administrada simultaneamente.

[00292] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições podem ser variados para obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um indivíduo, composição e modo de administração particular, sem ser tóxica ao indivíduo. O nível de dosagem selecionado irá depender de uma variedade de fatores que incluem a atividade do composto particular empregado, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com a composição particular empregada, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do indivíduo que está sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos na área médica.

[00293] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno descritos no presente documento podem ser administrados a um indivíduo em quantidades de dosagem variadas e intervalos de tempo variados. Doses não limitativas incluem cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 100 mg/kg, cerca de 125 mg/kg, cerca de 150 mg/kg, cerca de 175 mg/kg, cerca de 200 mg/kg, ou qualquer número inteiro entre esses. Adicionalmente, a(s) dose(s) de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode(m) ser administrada(s) duas vezes por semana, semanalmente, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada 4 semanas, a cada 6 semanas, a cada 8 semanas, a cada 12 semanas, ou qualquer combinação de semanas. Os ciclos de dosagem também são contemplados como, por exemplo, administrar anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos uma vez ou duas vezes por semana durante 4 semanas, seguido por duas semanas sem terapia. Os ciclos de dosagem adicionais que incluem, por exemplo, combinações diferentes das doses e ciclos semanais descritos no presente documento também são contemplados dentro da invenção.

[00294] As quantidades terapeuticamente eficazes de uma composição podem variar e dependem da gravidade da doença e do peso e estado geral do individuo que está sendo tratado, porém geralmente variam a partir de cerca de 1,0 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 10 μg/kg a cerca de 30 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg por aplicação. A administração pode ser diariamente, em dias alternados, semanalmente, duas vezes por mês, mensalmente ou mais ou menos frequentemente, como necessário dependendo da resposta ao distúrbio ou condição e da tolerância do indivíduo à terapia. As dosagens de manutenção durante um período de tempo mais longo, como 4, 5, 6, 7, 8, 10 ou 12 semanas ou mais podem ser necessárias até ocorrer uma supressão desejada de sintomas de distúrbio, e as dosagens podem ser ajustadas como necessário. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[00295] As dosagens específicas podem ser ajustadas dependendo das condições de doença, da idade, peso corporal, condições de saúde geral, sexo, e dieta do indivíduo, intervalos de dose, vias de administração, taxa de excreção e combinações de fármacos. Qualquer uma das formas de dosagem acima contendo quantidades eficazes está dentro dos limites da experimentação rotineira e, portanto, bem dentro do escopo da presente invenção.

[00296] Em algumas modalidades, o agente de ligação específico ou anticorpo da invenção é administrado de maneira intravenosa em uma solução fisiológica em uma dose que varia entre 0,01 mg/kg a 100 mg/kg em uma frequência que varia a partir de diariamente a semanalmente (por exemplo, todos os dias, em dias alternados, a cada três dias, ou 2, 3, 4, 5, ou 6 vezes por semana), de preferência, uma dose que varia a partir de 0,1 a 45 mg/kg, 0,1 a 15 mg/kg ou 0,1 a 10 mg/kg em uma frequência de 2 ou 3 vezes por semana, ou até 45 mg/kg uma vez por mês.

[00297] “Contatar” é definido no presente documento como um meio de ligar uma composição como fornecido no presente documento em proximidade física com uma célula, órgão, tecido ou fluido como descrito no presente documento. O contato inclui administração sistêmica ou local de qualquer uma das composições fornecidas no presente documento e inclui, sem limitação, procedimentos in vitro, in vivo e/ou ex vivo e métodos. “Combinar” e “contatar” são usados de maneira intercambiável no presente documento e se destinam a ser definidos da mesma maneira.

[00298] Um anticorpo descrito no presente documento pode ser administrado por qualquer meio adequado, tanto de maneira sistêmica como local, inclusive através de administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intracerebroespinhal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As vias parenterais incluem administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, epidural, intratecal. Ademais, o agente de ligação específico ou anticorpo é adequadamente administrado por infusão de pulso, particularmente com doses decrescentes do agente de ligação específico ou anticorpo. Em uma modalidade, as composições podem ser administradas por injeção dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Outros modos de métodos de administração são contemplados, inclusive administração tópica, particularmente transdérmica, transmucosal, retal, oral ou local, por exemplo, através de um cateter posicionado próximo ao local desejado.

[00299] Uma resposta é obtida quando o indivíduo sente alívio parcial ou total, ou redução de sinais ou sintomas de doença, e especificamente inclui, sem limitação, prolongamento de sobrevivência. Os tempos de sobrevivência isenta de progressão esperados podem ser medidos em meses a anos, dependendo de fatores prognósticos que incluem o número de recidivas, estágio de doença, e outros fatores. O prolongamento de sobrevivência inclui, sem limitação, tempos de pelo menos 1 mês (mes.), cerca de pelo menos 2 meses (mes.), cerca de pelo menos 3 meses., cerca de pelo menos 4 meses., cerca de pelo menos 6 meses., cerca de pelo menos 1 ano, cerca de pelo menos 2 anos, cerca de pelo menos 3 anos, ou mais. A sobrevivência total também pode ser medida em meses a anos. Os sintomas do indivíduo podem permanecer estáticos ou podem diminuir.

[00300] Um médico ou veterinário com habilidade na técnica pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz (ED50) da composição exigida. Por exemplo, o médico ou veterinário poderia começar as doses dos compostos empregados na composição em níveis inferiores ao exigido para obter o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até o efeito desejado ser obtido. Alternativamente, uma dose pode permanecer constante.

[00301] As composições podem ser administradas a um indivíduo por qualquer via conveniente como descrito acima. Independente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratada adequada e/ou as composições, são formulados em formas de dosagem aceitáveis como descrito abaixo ou por outros métodos convencionais conhecidos pelos elementos versados na técnica.

[00302] Os anticorpos e/ou outros agentes podem ser combinados em composições separadas para administração simultânea ou sequencial. Em uma modalidade, a administração simultânea compreende uma ou mais composições que são administradas ao mesmo tempo, ou dentro de 30 minutos entre as mesmas. A administração pode ocorrer nos locais ou em locais diferentes.

[00303] A toxicidade e eficácia terapêutica de tal ingrediente podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal a 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e o mesmo pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Embora compostos que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usados, deve-se tomar cuidado ao desenhar um sistema de entrega que alveja tais compostos ao local de tecido afetado para reduzir danos potenciais a células saudáveis e, assim, reduzir efeitos colaterais.

[00304] Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados para formular uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de tais compostos está, de preferência, dentro da faixa de concentrações circulantes que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para obter uma disposição de concentração de plasma circulante que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que obtém a metade da inibição máxima) como determinado em cultura celular. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho. Tais informações podem ser usadas para determinar mais precisamente as doses úteis em humanos.

[00305] Conforme usado no presente documento, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser um antagonista de atividade de hepcidina, significando uma substância que inibe a atividade reguladora de ferro da hepcidina.

[00306] Em um aspecto, o antagonista de atividade de hepcidina pode ser uma substância que inibe a função de hepcidina, por exemplo, ao inibir a ligação entre a hepcidina e ferroportina, ao inibir a retenção de ferro celular controlada por hepcidina, ou ao facilitar o transporte de ferro dependente de ferroportina. Os antagonistas de atividade de hepcidina incluem anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam à hepcidina e inibem sua atividade. Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em alguns casos, pode se ligar à ferroportina, porém não ativar o transporte de ferro de ferroportina.

[00307] Ainda em outras modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode inibir (ou neutralizar) a atividade reguladora de ferro de hepcidina, in vitro e/ou também in vivo. Tais anticorpos neutralizantes de hepcidina são terapeuticamente úteis para distúrbios relacionados à hepcidina ou distúrbios de homeostase de ferro. A atividade neutralizante de hepcidina pode ser medida, por exemplo, através de inúmeros marcadores como níveis de ferritina/ferro, contagem de hemácias, características de hemácias (teor de hemoglobina e/ou volume celular), características de hemácias iniciais (números de reticulócitos, teor de hemoglobina ou volume celular), internalização de ferroportina, ou transporte de ferro. Em uma modalidade não limitativa, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento diminui a concentração de ferro intracelular em uma EC50 de cerca de 10-8 M ou menos e/ou aumenta a concentração de ferro circulante.

[00308] Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento pode antagonizar o efeito de hepcidina humana ou inibir a atividade reguladora de ferro de hepcidina. Em algumas modalidades, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento exerce um efeito em uma EC50 de cerca de 1xio-8 M ou menos, ou cerca de ixio-7 M ou menos. Por exemplo, um anticorpo pode reduzir o nível de ferro intracelular em uma célula em uma EC5Q de cerca de 1x1Q-8 M ou menos, ou pode reduzir a expressão de ferritina em uma EC5Q de cerca de 1x1Q-8 M ou menos, como determinado por um ensaio de ferritina. Em outras modalidades, um anticorpo como descrito no presente documento pode reduzir os níveis séricos livres de hepcidina em pelo menos cerca de 2Q%, em pelo menos cerca de 3Q%, em pelo menos cerca de 4Q%, em pelo menos cerca de 5Q%, em pelo menos cerca de 6Q%, em pelo menos cerca de 7Q%, em pelo menos cerca de 8Q%, ou em pelo menos cerca de 9Q% comparado com um anticorpo de controle ou comparado com um placebo. Em outras modalidades, um anticorpo como descrito no presente documento pode aumentar a contagem de hemácias (número), o volume celular médio de hemácias ou teor de hemoglobina de hemácias, aumentar a hemoglobina, aumentar o hematócrito, aumentar a % de Tsat, aumentar os níveis de ferro circulantes (ou séricos), e/ou aumentar ou normalizar a contagem de reticulócitos, volume celular médio de reticulócitos, teor de hemoglobina de reticulócitos ou números de reticulócitos.

[00309] Os métodos diagnósticos que utilizam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento são fornecidos no presente documento. Um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento, também pode ser usado para propósitos de purificação.

[00310] Os métodos terapêuticos que utilizam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento também são fornecidos no presente documento. Tais anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ser usados para tratar um distúrbio relacionado à hepcidina. Os distúrbios relacionados à hepcidina, doenças inflamatórias, e doenças ou distúrbio de homeostase de ferro aos quais os métodos podem ser aplicados incluem, mas não se limitam a, sobrecarga de ferro, alfa talassemia, doença de Alzheimer, anemia, anemia de câncer, anemia de doença crônica, anemia de inflamação, arteriosclerose ou aterosclerose (inclusive doença arterial coronariana, doença cerebrovascular ou doença arterial oclusiva periférica), ataxias, ataxias relacionadas a ferro, atransferrinemia, câncer, deficiência de ceruloplasmina, anemia induzida por quimioterapia, doença renal crônica/doença renal (estágio I, II, III, IV ou V), inclusive doença renal em estágio terminal ou insuficiência renal crônica/renal, lesão renal aguda (AKI), cirrose de fígado, hemocromatose clássica, artrite induzida por colágeno (CIA), condições com excesso de hepcidina (hepcidina elevada), anemia congênita diseritropoiética, insuficiência cardíaca congestiva, doença de Crohn, doença celíaca, doença inflamatória intestinal (IBD), diabetes, distúrbios de biodistribuição de ferro, distúrbios de homeostase de ferro, distúrbios de metabolismo de ferro, doença relacionada à ferroportina, hemocromatose por mutação de ferroportina, deficiência de folato, ataxia de Friedrich, mielose funicular, síndrome grácil, infecção por H. pylori ou outras infecções bacterianas, doença de Hallervordan Spatz disease, hemocromatose, hemocromatose resultante de mutações em receptor 2 de transferrina, hemoglobinopatias, hepatite, hepatite (Brock), hepatite C, carcinoma hepatocelular, deficiência de hepcidina, hemocromatose hereditária, HIV ou outras doenças virais, doença de Huntington, hiperferritinemia, anemia microcítica hipocrômica, hipoferremia, resistência à insulina, anemia por deficiência de ferro, distúrbios de deficiência de ferro, deficiência de sobrecarga de ferro, condições de deficiência de ferro com excesso de hepcidina, hemocromatose juvenil (HFE2), esclerose múltipla, mutação em receptor 2 de transferrina, HFE, hemojuvelina, ferroportina, TMPRSS6 (IRIDA), ou outros genes de metabolismo de ferro, hemocromatose neonatal, doenças neurodegenerativas relacionadas a ferro, osteopenia, osteoporose, pancreatite, neurodegeneração associada à Pantotenato quinase, doença de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutânea tardia, pseudoencefalite, hemosiderose pulmonar, distúrbios relacionados a hemácias, artrite reumatoide, sepse, anemia sideroblástica, lúpus sistêmico eritematoso, talassemia, talassemia intermédia, sobrecarga de ferro transfusional, tumores, vasculite, deficiência de vitamina B6, deficiência de vitamina B12, e/ou doença de Wilson.

[00311] Conforme usado no presente documento, “tratamento” ou “tratar” se refere tanto a tratamento profilático de um indivíduo em risco de, ou que tem uma predisposição a, uma doença ou distúrbio, como a tratamento terapêutico de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio.

[00312] A administração de um agente terapêutico em um método profilático pode ocorrer antes da manifestação de sintomas de uma doença ou distúrbio não desejado, de modo que a doença ou distúrbio seja prevenido ou, alternativamente, retardado em seu progresso. Assim, quando usado em conjunto com métodos profiláticos, o termo “terapeuticamente eficaz” significa que, após o tratamento, um número menor de indivíduos (em média) desenvolve a doença ou distúrbio indesejado ou progresso na gravidade de sintomas.

[00313] Quando usado em conjunto com métodos terapêuticos que envolvem a administração de um agente terapêutico após o indivíduo manifestar os sintomas de uma doença ou distúrbio, o termo “terapeuticamente eficaz” significa que, após o tratamento, um ou mais sinais ou sintomas da doença ou distúrbio são melhorados ou eliminados.

[00314] Conforme usado no presente documento, um “distúrbio relacionado à hepcidina” se refere a uma condição causada ou associada a um nível anormal de hepcidina (por exemplo, excesso de hepcidina ou deficiência de hepcidina relativa ao grau de anemia ou ferro armazenado) que atrapalha a homeostase de ferro. Um distúrbio em homeostase de ferro pode por sua vez resultar em doenças secundárias como anemia. As condições inflamatórias agudas ou crônicas podem resultar em superregulação de expressão de hepcidina, isso pode resultar em níveis de ferro circulantes reduzidos, isso pode causar anemia ou piorar a anemia existente. As doenças inflamatórias relacionadas à hepcidina exemplificativas incluem anemia de câncer, anemia de doença crônica, anemia de inflamação, anemia induzida por quimioterapia, doença renal crônica (estágio I, II, III, IV ou V), doença renal em estágio terminal, insuficiência renal crônica, insuficiência cardíaca congestiva, câncer, artrite reumatoide, lúpus sistêmicos eritematoso, doença de Crohn, infecção por H. pylori ou outras infecções bacterianas, hepatite C, HIV, e outras doenças virais, arteriosclerose, aterosclerose, cirrose do fígado, pancreatite, sepse, vasculite, deficiência de ferro, anemia microcítica hipocrômica e condições com excesso de hepcidina.

[00315] Conforme usado no presente documento, a frase “doença (ou distúrbio) de homeostase de ferro” se refere a uma condição na qual os níveis de ferro do indivíduo exigem modulação. Isso inclui distúrbios relacionados à hepcidina; condições não associadas a níveis elevados de hepcidina que, contudo, poderiam se beneficiar da inibição de atividade de hepcidina, como um distúrbio na homeostase de ferro não causada por hepcidina; doenças em que a absorção, reciclagem, metabolismo ou excreção de ferro aberrante causa um distúrbio nos níveis de ferro normais no sangue ou distribuição de tecido; doenças em que a desregulação de ferro é uma consequência de outra doença ou condição, como inflamação, câncer ou quimioterapia; doenças ou distúrbios resultantes de níveis de ferro no sangue ou distribuição de tecido anormais; e doenças ou distúrbios que podem ser tratados ao modular os níveis ou distribuição de ferro. Exemplos não limitativos de tais doenças ou distúrbios de homeostase de ferro, distúrbios relacionados à hepcidina e condições inflamatórias que resultam em excesso de hepcidina incluem sobrecarga de ferro, anemia refratária por deficiência de ferro (IRIDA), alfa talassemia, doença de Alzheimer, anemia, anemia de câncer, anemia de doença crônica, anemia de inflamação, arteriosclerose ou aterosclerose (inclusive doença arterial coronariana, doença cerebrovascular ou doença arterial oclusiva periférica), ataxias, ataxias relacionadas a ferro, atransferrinemia, câncer, deficiência de ceruloplasmina, anemia induzida por quimioterapia, doença renal crônica/doença renal (estágio I, II, III, IV ou V), inclusive doença renal em estágio terminal ou insuficiência renal crônica/renal, lesão renal aguda (AKI), cirrose de fígado, hemocromatose clássica, artrite induzida por colágeno (CIA), condições com excesso de hepcidina (hepcidina elevada), anemia congênita diseritropoiética, insuficiência cardíaca congestiva, doença de Crohn, doença celíaca, doença inflamatória intestinal (IBD), diabetes, distúrbios de biodistribuição de ferro, distúrbios de homeostase de ferro, distúrbios de metabolismo de ferro, doença relacionada à ferroportina, hemocromatose por mutação de ferroportina, deficiência de folato, ataxia de Friedrich, mielose funicular, síndrome grácil, infecção por H. pylori ou outras infecções bacterianas, doença de Hallervordan Spatz disease, hemocromatose hereditária, hemochromatose adquirida, hemocromatose resultante de mutações em receptor 2 de transferrina, hemoglobinopatias, hepatite, hepatite (Brock), hepatite C, carcinoma hepatocelular, HIV ou outras doenças virais, doença de Huntington, hiperferritinemia, anemia microcítica hipocrômica, hipoferremia, resistência à insulina, anemia por deficiência de ferro, distúrbios de deficiência de ferro, deficiência de sobrecarga de ferro, condições de deficiência de ferro com excesso de hepcidina, hemocromatose juvenil (HFE2), esclerose múltipla, mutação em receptor 2 de transferrina, HFE, hemojuvelina, ferroportina ou outros genes de metabolismo de ferro, hemocromatose neonatal, doenças neurodegenerativas relacionadas a ferro, osteopenia, osteoporose, pancreatite, neurodegeneração associada à Pantotenato quinase, doença de Parkinson, pelagra, pica, porfiria, porfiria cutânea tardia, pseudoencefalite, hemosiderose pulmonar, distúrbios relacionados a hemácias, artrite reumatoide, sepse, anemia sideroblástica, lúpus sistêmico eritematoso, talassemia, talassemia intermédia, sobrecarga de ferro transfusional, tumores, vasculite, deficiência de vitamina B6, deficiência de vitamina B12, e/ou doença de Wilson.

[00316] Condições não inflamatórias que são implicadas em um distúrbio de regulação de ferro incluem, mas não se limitam a, deficiência de vitamina B6, deficiência de vitamina B12, deficiência de folato, pelagra, mielose funicular, pseudoencefalite, doença de Parkinson (Fasano et al., J. Neurochem. 96:909 (2006) and Kaur et al., Ageing Res. Rev., 3:327 (2004)), doença de Alzheimer, doença cardíaca coronariana, osteopenia e osteoporose (Guggenbuhl et al., Osteoporos. Int. 16:1809 (2005)), hemoglobinopatias e distúrbios de metabolismo de glóbulos vermelhos (Papanikolaou et al., Blood 105:4103 (2005)), e doença arterial oclusiva periférica.

[00317] Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar um distúrbio de homeostase de ferro em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de modular a atividade de hepcidina em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método para tratar um distúrbio de homeostase de ferro em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar hemocromatose em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar um indivíduo com um nível elevado de hepcidina, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição farmacêutica descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar anemia em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar uma doença inflamatória em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Ainda em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um método de tratar uma infecção em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar ao dito indivíduo uma composição descrita no presente documento. Uma infecção pode ser, por exemplo, uma infecção bacteriana, fúngica ou viral.

[00318] Qualquer um dos métodos pode, em alguns casos, compreender adicionalmente administrar ao dito indivíduo um estimulante de eritropoiese, em que o dito estimulante de eritropoiese é selecionado a partir do grupo que consiste em eritropoietina, um variante de eritropoietina e um anticorpo que se liga à eritropoietina. Em uma modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina e o dito estimulante de eritropoiese são administrados simultaneamente ou sequencialmente. Conforme usado no presente documento, o termo “atividade eritropoiética” significa atividade para estimular a eritropoiese como demonstrado em um ensaio in vivo, por exemplo, o ensaio de camundongo de policitemia exipóxia. Consulte, por exemplo, Cotes and Bangham, Nature 191:1065 (1961).

[00319] Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento e um estimulante de eritropoiese pode ser usado para aprimorar o tratamento de um paciente com anemia. Em outra modalidade, pacientes que são hiporresponsivos, inclusive não responsivos a, terapia com estimulante de eritropoiese, como eritropoietina ou análogos da mesma (Alfaepoetina, Betaepoetina, alfadarbepoetina), entre outras, podem se beneficiar de co-tratamento com um antagonista de atividade de hepcidina ou inibidor de expressão de hepcidina. Em outra modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento e um estimulante de eritropoiese podem ser usados para aprimorar o tratamento de um paciente com um distúrbio de carga de ferro secundário à sobrecarga de ferro dependente de transfusão, ou têm um distúrbio de má distribuição como ataxia de Friedreich.

[00320] Conforme usado no presente documento, “estimulante de eritropoiese” se refere a um composto químico que causa direta ou indiretamente a ativação do receptor de eritropoietina, por exemplo, mediante ligação e causa a dimerização do receptor ou mediante estímulo de expressão de eritropoietina endógena. Os estimulantes de eritropoiese incluem eritropoietina e variantes, análogos, ou derivados dos mesmos que se ligam e ativam o receptor de eritropoietina; anticorpos que se ligam ao receptor de eritropoietina e ativam o receptor; ou peptídeos que se ligam e ativam o receptor de eritropoietina; ou pequenos compostos químicos orgânicos, opcionalmente menos que cerca de 1000 Dáltons em peso molecular, que se ligam e ativam o receptor de eritropoietina. Os estimulantes de eritropoiese incluem, mas não se limitam a, alfaepoetina, betaepoetina, deltaepoetina, ômega epoetina, iota epoetina, zeta epoetina, e análogos das mesmas, eritropoietina peguilada, eritropoietina carbamilada, peptídeos miméticos (inclusive EMP1/hematita), anticorpos miméticos e inibidores de HIF (consulte Publicação de Patente No. U.S. 2005/0020487, cuja descrição está incorporada a título de referência em sua totalidade). Os estimulantes de eritropoiese exemplificativos incluem eritropoietina, darbepoetina, variantes de agonista de eritropoietina, e peptídeos ou anticorpos que se ligam e ativam o receptor de eritropoietina (e incluem compostos relatados na Publicação de Pedido de Patente Nos. U.S. 2003/0215444 e 2006/0040858, cujas descrições estão incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade) bem como moléculas de eritropoietina ou variantes ou análogos das mesmas como descrito nas seguintes patentes ou pedidos de patente, que estão incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade: Patente Nos. U.S. 4.703.008; 5.441.868; 5.547.933; 5.618.698; 5.621.080; 5.756.349; 5.767.078; 5.773.569; 5.955.422; 5.830.851; 5.856.298; 5.986.047; 6.030.086; 6.310.078; 6.391.633; 6.583.272; 6.586.398; 6.900.292; 6.750.369; 7.030.226; 7.084.245; 7.217.689; publicação PCT nos. WO 91/05867; WO 95/05465; WO 99/66054; WO 00/24893; WO 01/81405; WO 00/61637; WO 01/36489; WO 02/014356; WO 02/19963; WO 02/20034; WO 02/49673; WO 02/085940; WO 03/029291; WO 2003/055526; WO 2003/084477; WO 2003/094858; WO 2004/002417; WO 2004/002424; WO 2004/009627; WO 2004/024761; WO 2004/033651; WO 2004/035603; WO 2004/043382; WO 2004/101600; WO 2004/101606; WO 2004/101611; WO 2004/106373; WO 2004/018667; WO 2005/001025; WO 2005/001136; WO 2005/021579; WO 2005/025606; WO 2005/032460; WO 2005/051327; WO 2005/063808; WO 2005/063809; WO 2005/070451; WO 2005/081687; WO 2005/084711; WO 2005/103076; WO 2005/100403; WO 2005/092369; WO 2006/50959; WO 2006/02646; WO 2006/29094; e publicação US nos. US 2002/0155998; US 2003/0077753; US 2003/0082749; US 2003/0143202; US 2004/0009902; US 2004/0071694; US 2004/0091961; US 2004/0143857; US 2004/0157293; US 2004/0175379; US 2004/0175824; US 2004/0229318; US 2004/0248815; US 2004/0266690; US 2005/0019914; US 2005/0026834; US 2005/0096461; US 2005/0107297; US 2005/0107591; US 2005/0124045; US 2005/0124564; US 2005/0137329; US 2005/0142642; US 2005/0143292; US 2005/0153879; US 2005/0158822; US 2005/0158832; US 2005/0170457; US 2005/0181359; US 2005/0181482; US 2005/0192211; US 2005/0202538; US 2005/0227289; US 2005/0244409; US 2006/0088906; US 2006/0111279.

[00321] Em uma modalidade, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, descrito no presente documento e um quelante de ferro para redistribuir as reservas de ferro no corpo também é contemplado. Um quelante de ferro é um agente capaz de se ligar ao ferro e remover o mesmo de um tecido ou da circulação. Exemplos incluem deferoxamina (Desferal®) e deferasirox (Exjade®), e deferiprona (1,2-dimetil-3-hidroxipiridin-4-ona).

[00322] A administração de uma composição no presente documento pode ser qualquer meio adequado que inclui, mas não se limita a, injeção. Em uma modalidade, a injeção pode ser, por exemplo, injeção intravenosa, subcutânea ou intramuscular.

Embalagens, Kits e Contentores Pré-Carregados

[00323] Os kits contendo um ou mais compostos descritos acima também são fornecidos no presente documento. O kit pode compreender um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à hepcidina em meios contentores adequados.

[00324] Os meios contentores dos kits irão incluir geralmente pelo menos um conceptáculo, tubo de teste, frasco, garrafa, ampola, seringa, uma bolsa intravenosa (IV) e/ou outros meios contentores, nos quais o pelo menos um polipeptídeo pode ser colocado, e/ou, de preferência, adequadamente aliquotadas. Proporciona-se no presente documento um meio contentor que compreende uma composição descrita no presente documento.

[00325] Os kits podem incluir um meio para conter pelo menos uma proteína de fusão, porção detectável, molécula repórter e/ou qualquer outro contentor reagente em estreito confinamento para venda comercial. Tais contentores podem incluir injeção e/ou contentores de plástico moldados por sopro dentro dos quais os conceptáculos desejados ficam retidos. Os kits também podem incluir material impresso para uso dos materiais no kit.

[00326] As embalagens e kits podem incluir adicionalmente um agente de tamponamento, um conservante e/ou um agente estabilizante em uma formulação farmacêutica. Cada componente do kit pode ser confinado dentro de um contentor individual e todos os vários contentores podem estar dentro de uma única embalagem. Os kits da invenção podem ser desenhados para armazenamento frio ou armazenamento à temperatura ambiente.

[00327] Adicionalmente, as preparações podem conter estabilizantes para aumentar a vida de prateleira dos kits e incluem, por exemplo, albumina do soro bovino (BSA). Em que as composições são liofilizadas, o kit pode conter preparações adicionais de soluções para reconstituir as preparações liofilizadas. As soluções de reconstituição aceitáveis são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, salina tamponada com fosfato farmaceuticamente aceitável (PBS).

[00328] As embalagens e kits podem incluir adicionalmente um ou mais componentes para um ensaio, como, por exemplo, um ensaio ELISA. As amostras que serão testadas nesse pedido incluem, por exemplo, sangue, plasma, e seções de tecido e secreções, urina, linfa, e produtos das mesmas. As embalagens e kits podem incluir adicionalmente um ou mais componentes para a coleta de uma amostra (por exemplo, uma seringa, um copo, um cotonete, etc.).

[00329] As embalagens e kits podem incluir adicionalmente uma identificação que especifica, por exemplo, uma descrição de produto, modo de administração e/ou indicação de tratamento. As embalagens fornecidas no presente documento podem incluir qualquer uma das composições como descrito no presente documento. Uma doença (por exemplo, IBD), artrite reumatoide, osteoartrite, uma forma de câncer e suas metástases.

[00330] O termo “material de embalagem” se refere a uma estrutura física que aloja os componentes do kit. O material de embalagem pode manter os componentes de maneira estéril e pode ser feito de material comumente usado para tais propósitos (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, folha metálica, ampolas, etc.). A identificação ou folheto informativo pode incluir instruções escritas apropriadas. Portanto, os kits podem incluir adicionalmente identificações ou instruções para utilizar os componentes do kit em qualquer método da invenção. Um kit pode incluir um composto em uma embalagem, ou dispensador juntamente com instruções para administrar o composto em um método descrito no presente documento.

[00331] Ainda em outras modalidades, um kit pode compreender adicionalmente um meio contentor para um estimulante de eritropoiese.

[00332] As instruções podem incluir instruções para praticar qualquer um dos métodos descritos no presente documento que incluem métodos de tratamento. As instruções podem incluir adicionalmente indicações de um critério de avaliação clínico satisfatório ou quaisquer sintomas adversos que podem ocorrer, ou informações adicionais exigidas por agências reguladoras como a Food and Drug Administration para uso em um indivíduo humano.

[00333] As instruções podem ser em “impressas”, por exemplo, em papel ou papelão dentro ou fixado ao kit, ou em uma identificação anexada ao kit ou material de embalagem, ou fixada a um conceptáculo ou tubo contendo um componente do kit. As instruções podem ser adicionalmente incluídas em um meio legível de computador, como uma unidade flash/nuvem, disco (disquete ou disco rígido), CD óptico como CD- ou DVD-ROM/RAM, fita magnética, meio de armazenamento elétrico como RAM e ROM, IC tip e híbridos dos mesmos como meio de armazenamento magnético/óptico.

[00334] Proporciona-se no presente documento um meio contentor que compreende uma composição descrita no presente documento. O meio contentor pode ser qualquer contentor adequado que possa alojar uma composição líquida ou liofilizada que inclui, mas não se limita a, um conceptáculo, seringa, garrafa, uma bolsa intravenosa (IV) ou ampola. Uma seringa pode ser capaz de reter qualquer volume de líquido adequados para injeção em um indivíduo que inclui, mas não se limita a, 0,5 cc, 1 cc, 2 cc, 5 cc, 10 cc ou mais.

[00335] Kits que compreendem uma composição descrita no presente documento são fornecidos no presente documento. Em um aspecto, proporciona-se no presente documento um kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevados ou um distúrbio de homeostase de ferro, que compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento e um estimulante de eritropoiese.

[00336] Em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevados ou um distúrbio de homeostase de ferro, que compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento, e uma identificação fixada ou embalada com o contentor, sendo que a identificação descreve o uso do anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com um estimulante de eritropoiese.

[00337] Em outro aspecto, proporciona-se no presente documento um kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevados, que compreende um estimulante de eritropoiese e uma identificação fixada ou embalada com o contentor, sendo que a identificação descreve o uso do estimulante de eritropoiese com um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como descrito no presente documento.

EXEMPLOS

[00338] O pedido pode ser mais bem entendido a título de referência aos seguintes exemplos não limitativos, esses são fornecidos como modalidades exemplificativas do pedido. Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar mais completamente as modalidades e, entretanto, não devem ser interpretados de forma alguma como limitativos do amplo escopo do pedido.

Exemplo 1. Desenvolvimento de anticorpo monoclonal e desenho de antígeno em Hepcidina Humana Antecedentes

[00339] A hepcidina é um hormônio peptídico de 25 aminoácidos que regula a homeostase de ferro. A deficiência ou excesso de hepcidina genética ou adquirida é a causa principal ou determinante das principais doenças de regulação de ferro. Em outras doenças em que a homeostase de ferro é alterada pela deficiência ou excesso primário de reservas de ferro no corpo, as concentrações de hepcidina no sangue refletem as respostas fisiológicas ao distúrbio primário. Apesar da importância potencial de terapias dirigidas Àhepcidina-25 em medicina clínica, somente um anticorpo humanizado monoclonal foi inserido em estudos clínicos iniciais de Fase 1.

[00340] A sequência de aminoácidos de hepcidinas maduras é altamente conservada entre mamíferos, particularmente a terminação N. As hepcidinas de camundongo e rato são 76% e 64% idênticas à hepcidina humana respectivamente. A estrutura distinta de hepcidina é altamente conservada de maneira evolutiva, e os 5 aminoácidos N- terminal são absolutamente exigidos para bioatividade in vitro visto que os aminoácidos N-terminal estão diretamente envolvidos na ligação e Fpn e resultam na internalização e degradação em lisossomas (Nemeth et al., 2006).

[00341] No nível molecular, isso ocorre pelo fato de a hepcidina causar a degradação de seu receptor, ferroportina, o único canal de ferro humano, e aprisionar o ferro dentro de células hepáticas, macrófagos, e células que revestem o intestino onde a ferroportina é expressa. À medida que os níveis de ferro no plasma diminuem, os níveis de hepcidina diminuem e a ferroportina é produzida e traficada para a membrana celular. Isso permite que a absorção e reciclagem de ferro normais ocorram e forneçam o ferro exigido para a produção de sangue. O eixo geométrico regulador de ferro hepcidina-ferroportina é o alvo de esforços de desenvolvimento de vários fármacos terapêuticos inovadores atualmente em testes pré-clínicos e Fase I. Entretanto, somente um MAb humanizado dirigido contra hepcidina está sendo atualmente avaliado em estudos iniciais de Fase I.

[00342] As células renais embrionárias humanas (HEK 293) foram estavelmente transfectadas com um promotor induzível de ponesterona que promove altos níveis de expressão de uma proteína de fusão de ferroportina murina-GFP (designada Ec:R50-GFP) para estudar o ensaio baseado em célula in vitro de biologia de ferroportina.

[00343] A dificuldade bem conhecida para produzir anticorpos para hepcidina-25 se deve a seu formato compacto e alto grau de conservação evolutiva, particularmente na região N-terminal do peptídeo em mamíferos, inclusive aqueles em uso para esforços de desenvolvimento de MAb.

[00344] Outras empresas dirigiram seus anticorpos contra peptídeos lineares da região C-terminal madura de hepcidina-25 (hepcidina (1025)) [SEQ ID NO: 27], que não é útil para detecção ELISA de hepcidina- 25 biologicamente ativa e não espera-se que seja eficaz em aplicações terapêuticas (consulte, por exemplo, Geacintov et al., US2004/0096990 A1).

Anticorpos desenvolvidos pelos presentes inventores

[00345] Utilizando-se o conhecimento sobre a importância da terminação amino de hepcidina-25 e sua imunogenicidade insatisfatória, projetou-se um conjunto de antígenos e grupos imunizados de camundongos BALB/c para produzir anticorpos monoclonais para hepcidina-25 biologicamente ativa.

[00346] O presente desenho de antígeno se concentrou na produção de MAbs na terminação N de hepcidina-25 e o peptídeo de hepcidina- 25 oxidado de comprimento total. Exemplos de antígenos que foram desenhados resultando em três MAbs funcionais descritos no presente documento são mostrados nas Figuras 1 e 6.

[00347] Inúmeros antígenos peptídicos foram testados in vivo em camundongos BALB/c quanto à imunogenicidade e produção de MAbs específicos para hepcidina-25 utilizando inúmeros métodos sintéticos para adicionar haptenos (por exemplo, DNP, PamCys) e proteínas carreadoras imunogênicas (por exemplo, KLH, mKLH, albumina, ou Proteína Carreadora) e alguns se revelaram antígenos adequados (Figura 5 e 6).

Exemplo 2: Protocolo de Hibridoma

[00348] Após o cálculo de titulação de anticorpo, os hibridomas são preparados utilizando um kit de fusão comercialmente disponível (Hy- Clone) ou pelos métodos convencionais descritos por Kohler e Milstein (Id.).

[00349] O propósito desse exemplo é descrever a produção de anticorpos monoclonais por isolamento de linfócitos, linfonodos (LN) e/ou baço (S) de camundongos após a imunização, a produção de células de hibridoma, e a produção e seleção de clones positivos que secretam anticorpos específicos de antígeno.

Procedimento Preparação de Células do Mieloma.

[00350] Duas semanas antes da fusão, uma linhagem celular de mieloma Sp2/0 é propagada em meio DEME, com 10% de FCS, 8- Azaguanina e Pen-Strep. Uma semana antes da fusão celular, as células são cultivadas sem 8-azaguanina e dividiram as células em dias alternados. A densidade celular de fusão é 2*105/ml e 100 ml dessas células são exigidos. As células foram divididas no dia anterior à fusão e a viabilidade celular determinada; espera-se que a viabilidade seja maior que 95%.

[00351] As células SP2/0 foram colhidas por centrifugação em 300xg durante 10 minutos e lavadas 3 vezes ao adicionar 30 ml de Meio de Fusão B ClonaCell-HY-. Os péletes celulares foram ressuspensos em 25 ml de Meio B para conter 2 x107 células viáveis. Após a ressuspensão, as células foram mantidas à temperatura ambiente (RT). Essa etapa pode ser realizada simultaneamente, ou após, a preparação de linfócitos.

Isolamento de Linfonodos, Baço e Linfócitos de Camundongos

[00352] PEG e meios (Meio A, B, C,) foram preparados para fusão por pré-aquecimento a 37 °C.

[00353] Somente camundongos que responderam à imunização como determinado por análise de titulação de soro padrão utilizando-se hepcidina-25 como o antígeno são selecionados para fusão de hibridoma. A fusão de hibridoma foi realizada 3 dias após o último reforço com o antígeno selecionado.

[00354] Cada camundongo foi sacrificado utilizando asfixia e deslocamento cervical e pulverizado com 75% de etanol. O camundongo foi colocado com sua superfície ventral voltada para cima em uma placa de dissecação e todos os membros presos à placa de dissecação. Todas as técnicas de dissecação foram realizadas utilizando técnicas assépticas e diferentes conjuntos de instrumentos estéreis (tesouras, pinças) foram usados para cada etapa da dissecação para remover o baço e linfonodos (LN).

[00355] O LN (e/ou baço) foi colocado em um poço de placa de 6 poços contendo 2 ml de Meio A e a gordura e tecido conjuntivo foram aparados. Um filtro celular descartável foi colocado sobre um tubo centrífugo cônico de 50 ml e transferiu o LN (ou baço) para dentro do filtro e cortou o LN (ou baço) em pequenos pedaços com tesouras estéreis e triturou o tecido utilizando o êmbolo de uma seringa estéril de 3 ml e passou 5 a 10 ml de Meio B através do filtro. O tecido foi triturado uma ou mais vezes e enxaguado com 10 ml de Meio B (somente a membrana deve permanecer na peneira). Os linfócitos foram gentilmente pipetados e misturados por inversão e centrifugados em 400xg durante 7 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 10 ml de Meio B. As diluições apropriadas das células foram, então, contadas utilizando um hemocitômetro.

Fusão

[00356] Os linfócitos e células de mieloma foram misturados em uma razão 4:1 (aproximadamente 8 x 107 linfócitos com 2x107 células do mieloma) em um tubo de 50 ml. A razão de linfócitos para células de mieloma pode estar na faixa a partir de 10:1 a 1:1. As células fundidas foram centrifugadas durante 10 minutos em 400xg uma vez e a mistura celular ressuspensa em 30 ml de Meio B e centrifugada em 800g x 5 min para obter aderência satisfatória e promover a fusão das células.

[00357] O meio foi completamente aspirado do pélete celular e a parte inferior do tubo gentilmente batido visto que o pélete pode ser interrompido para fusão ideal. Um ml de solução PEG foi lentamente adicionado ao pélete por gotejamento utilizando uma pipeta de um ml durante um período de um minuto sem agitação. A parte inferior do tubo foi continuamente batido gentilmente durante o próximo minuto.

[00358] 4 ml de Meio B foram lentamente adicionados à mistura de fusão com batidas contínuas como antes, durante um período de 4 minutos.

[00359] 10 ml de Meio B foram lentamente adicionados às células, incubados durante 15 minutos em banho de água ajustado a 37°C.

[00360] 30 ml de Meio A foram lentamente adicionados e as células centrifugadas em 400xg durante 7 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células lavadas com 40 ml de Meio A para garantir que todo o PEG fosse removido.

[00361] O pélete celular foi lentamente ressuspenso em 10 ml de Meio de Recuperação de Hibridoma Clonacell-HY (Meio C) e transferido para um frasco de cultura de tecido T-75 cm2 contendo 20 ml de Meio C (volume total =30 ml). As células foram incubadas de um dia para o outro em um incubador umidificado a 37°C em 5% de atmosfera de CO2.

Seleção e Clonagem

[00362] No dia anterior à fusão, o Meio de Seleção de Hibridoma ClonaCell-Hy (Meio D) foi colocado a 2 a 8°C e descongelado de um dia para o outro. No dia da fusão, o Meio D foi agitado vigorosamente para misturar bem os conteúdos e deixar aquecerem à temperatura ambiente.

[00363] A suspensão celular fundida foi, então, transferida para um tubo cônico de 50 ml e centrifugada durante 10 minutos em 400xg à RT e o sobrenadante foi removido e descartado. As células foram ressuspensas em Meio C a um volume total de 10 ml.

[00364] 10 ml da suspensão celular foram transferidos para 90 ml de Meio D e bem misturados ao inverter gentilmente a garrafa várias vezes. A suspensão celular de hibridoma foi, então, transferida para um reservatório de reagente descartável e deixada descansar durante 15 minutos à RT para deixar algumas bolhas subirem e se dispersarem.

[00365] Utilizando-se uma pipeta multicanal e pontas de pipeta estéreis, o Meio D ClonaCell®-HY contendo as células de hibridoma foi dispensado em 60 a 80 μL volumes por poço em placas de 96 poços. Isso rendeu tipicamente entre 10 a 16 placas dependendo do volume semeado. As placas foram incubadas a 37°C em um incubador umidificado com 5% de CO2. Após 8 dias de incubação não interrompida, os poços foram examinados quanto à presença de colônias e suavemente sobrepostos com 150 μL de Meio E pré- aquecido ClonaCell®-HY no meio semissólido de cada poço, independente da presença de colônias e análise realizada em todos os poços.

[00366] As placas foram incubadas durante mais 2 a 4 dias a 37°C em um incubador umidificado com 5% de CO2. O tempo de incubação por sobreposição pode ser ainda mais aumentado para garantir a detecção de hibridomas de baixa expressão.

[00367] 100 μL do Meio E ClonaCell®-HY sobreposto foram cuidadosamente removidos sem prejudicar as colônias no meio semissólido. Os sobrenadantes foram testados quanto a anticorpos específicos utilizando um sistema de ensaio apropriado para o antígeno envolvido, por exemplo, Neutravidin ELISA, Mouse Mab Isotipagem, etc.

[00368] Os conteúdos de poços que tiveram resultado positivo para anticorpos foram suavemente ressuspensos e transferidos para poços de uma placa de 24 poços contendo um ml de Meio E ClonaCell®-HY para expandir os hibridomas. Quando um poço positivo contém mais de uma única colônia, os clones são coletados separadamente e transferidos para poços individuais para expansão e reteste para determinar qual clone produz o anticorpo de interesse.

Congelamento de Hibridomas

[00369] As células foram criopreservadas em uma concentração de 2x106 células por conceptáculo.

[00370] Uma solução de 20% de DMSO em Soro Fetal Bovino (FBS) foi colocada em um tubo cônico de 50 ml e deixada resfriar em gelo. O volume apropriado de DMSO foi lentamente adicionado e bem misturado e o filtro esterilizado utilizando um filtro de 0,2 μm e mantido em gelo.

[00371] As células foram coletadas e ressuspensas em FBS frio em duas vezes a concentração celular final desejada (por exemplo, suspensas em 4x106 células/ml de células criopreservadas em2x106 células por crioconceptáculo).

[00372] Para a criopreservação, a solução FBS/20% de DMSO foi lentamente adicionada em uma razão de 1:1 para o tubo contendo as células com mistura contínua durante a adição. Um ml de células em meio de congelamento foi transferido para cada crioconceptáculo. A suspensão celular final foi calculada para ser 90% de FBS contendo 10% de DMSO.

[00373] Os crioconceptáculo foram colocados imediatamente em contentores de congelamento e, então, movidos para o congelador a - 80°C freezer de um dia para o outro. No dia seguinte, remove-se os conceptáculos congelados do contentor de congelamento e os armazena em nitrogênio líquido.

Exemplo 3: Triagem de Hibridomas para Anticorpos Anti-Hepcidina

[00374] Após oito dias de incubação sem interrupção seguinte à fusão, todos os poços foram analisados para identificar os hibridomas murinos que secretaram anticorpos de hepcidina anti-humanos. Brevemente, no dia anterior à triagem, 100 μl de neutravidina (200 ng/poço) preparados em tampão de revestimento de carbonato (pH 9,6) foram colocados em cada poço de uma placa de ensaio imunoenzimático (EIA) e incubados de um dia para o outro a 4oC. No dia seguinte, a placa foi lavada, bloqueada com 1% de BSA em tampão, e 1 ng de traçador de hepcidina-25 K18-Biotin foi adicionado a cada poço. Após uma hora de incubação, a placa foi lavada, 100 μl de sobrenadante de cultura de tecido de hibridoma foram combinados com 50 μl de 1%de BSA/TBST em cada poço e a placa incubada em um agitador rotativo (240 rpm) durante 1,5 h. A placa foi lavada e um anticorpo de detecção de cadeia (H+L) de IgG de cabra anti- camundongo identificado por HRP foi adicionado e a incubação continuou durante mais hora. A placa foi lavada, o substrato aplicado, a reação desenvolvida durante 10 min. antes de parar com 1N de H2SO4 e a absorbância lida em 450 nM. Um exemplo dessa primeira fase de triagem rendeu uma matriz 8x12 de valores OD como mostrado na Figura 2. Os hibridomas que produziram uma OD >2,0 foram identificados e adicionalmente propagados antes da segunda fase de triagem.

[00375] A segunda fase de triagem envolveu o teste da especificidade de cada hibridoma para hepcidina-25. Brevemente, as placas EIA de 96 poços são revestidas de um dia para o outro com anticorpo específico de Fc de IgG de cabra anti-camundongo (1/2,500 diluição), e no dia seguinte a placa foi lavada, bloqueada e 100 μl de sobrenadante de cultura de tecido foram colocados em cada poço e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. A capacidade dos anticorpos murinos presentes no sobrenadante de cultura de tecido que foram capturados pela região de Fc foi testada pela adição de 1 ng de traçador de Hepcidina-25 K18-Biotin a cada poço e incubação durante 1,5 hora em um agitador de placa rotativo. Após a lavagem, a estreptavidina identificada por HRP (SA-HRP) foi adicionada aos poços, incubada durante uma hora, lavada e a presença de traçador capturado por anticorpo foi detectada pela adição de substrato TMB durante 10 min. A reação foi interrompida pela adição de ácido e a absorbância lida em 450 nM. Como mostrado na Figura 3, os hibridomas que produzem uma OD>0,4 foram identificados e subclonados para caracterização adicional. A presente experiência revelou que os hibridomas que produzem uma OD que excede 2,0 nessa segunda fase de triagem são fortes candidatos à caracterização adicional.

[00376] Para testar a atividade funcional dos hibridomas, os clones identificados na segunda fase de triagem foram subclonados, desenvolvidos para aproximadamente 70% de confluência e classificados como descrito na segunda fase de triagem. Brevemente, as placas de 96 poços são revestidas com anticorpo específico de Fc de IgG de cabra anti-camungondo e no dia seguinte as placas foram lavadas e bloqueadas e o sobrenadante de cultura de tecido foi colocado em cada poço e incubado durante 1 hora.

[00377] Para preparar uma solução de estoque de hepcidina, pesa- se aproximadamente 1 mg de Hepcidina liofilizada e a reconstitui em 0,5 ml de 0,016% de HCl (preparado em água de grau de cultura de tecido estéril) para obter uma concentração final de 2 mg/ml.

[00378] Para determinar precisamente a concentração de hepcidina na solução, mede-se a absorbância em 215 nm e 225 nm em um espectrofotômetro.

[00379] Para a medição de amostra, realiza-se uma diluição 1:20 da solução (10 μl da solução de estoque em 190 μl de água estéril). Apagar o espectrofotômetro com 10% de 0,016% de HCl. (10 μl de 0,016% de HCl a 190 μl de água estéril). A medição da absorbância em 215 nm e 225 nm e cálculo da concentração de hepcidina são realizados utilizando a seguinte fórmula de concentração peptídica:

[00380] O cálculo de concentração de hepcidina-25 em mg/ml é [hepcidina-25 mg/ml] = (A215-A225) x 0,144 x 20 (20 é o fator de diluição).

[00381] Para armazenar hepcidina-25, as soluções de estoque realizam a alíquota da solução em volumes de 100 μl em tubos microcentrífugos estéreis de 0,5 ml e armazenados a -80°C. Para diluir ainda mais o estoque de hepcidina para uma solução de trabalho conveniente, dilui-se o estoque concentrado em 500 μg/ml (solução de trabalho) com água de grau de cultura de tecido estéril.

[00382] Para confirmar a concentração peptídica na solução preparada, mede-se a absorbância em 215 nm e 225 nm. Para a medição, prepara-se uma diluição 1:10 da solução. Uma alíquota em volumes de 25 μl em 0,5 ml de tubos microcentrífugos estéreis com a tampa de rosca.

[00383] A capacidade de hepcidina-25 humana sintética para competir contra o traçador de Hepcidina-25 K18-Biotin por sítios de ligação MAb foi testada pela adição de 100 ng de hepcidina-25 preparada como acima para a solução de traçador e 100 μl dessa foram adicionados a cada poço e incubados durante 1,5 h. Após a lavagem, estreptavidina identificada por HRP foi adicionada, incubada durante uma hora, lavada e a presença de traçador ligado foi detectada pela adição de substrato TMB. A reação foi interrompida pela adição de ácido e a absorbância lida em 450 nM. Um exemplo de triagem de atividade funcional de sobrenadante de hibridoma é mostrado na Figura 4. Os hibridomas que exibem atividade funcional foram identificados por uma redução na OD nos poços de Traçador + Hepcidina-25, comparado com a OD produzida somente pelo Traçador (por exemplo, hibridoma 5A3; a designação 5A3 foi posteriormente alterada para “MAb 583”).

[00384] Um exemplo da dificuldade para produzir MAbs murinos é mostrado na Figura 5. Uma variedade de antígenos e abordagens de imunização típicos pode render números variados de camundongos que respondem à imunização (com base em título de soro), e os tecidos que rendem fusões bem-sucedidas. Independente do antígeno empregado, a porcentagem de MAbs murinos específicos de hepcidina-25 funcionais é essencialmente menor que 0,06% (Figura 5).Similarmente, como um exemplo do esforço exigido para a descoberta de 3 MAbs murinos específicos para hepcidina-25, foram testados oito antígenos e classificados 11.845 hibridomas com uma taxa de sucesso de 0,025% (Figura 6).

Exemplo 4: Purificação de MAbs Murinos

[00385] Grandes quantidades de MAb 583 e MAb 1B1 foram produzidas ao semear biorreatores de fibras ocas individuais comercialmente disponíveis CellMax (10,000 cm2 de área de superfície (Spectrum Labs, Inc.) que foram, então, incubados a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. Aproximadamente 2 a 3 litros de sobrenadante de cultura celular total de cada MAb foram coletados em aproximadamente 100 ml lotes. Cada lote foi centrifugado e congelado a -20°C até a purificação.

[00386] Para a purificação, o sobrenadante foi congelado, re- centrifugado e a imunoglobulina foi purificada por cromatografia por afinidade utilizando uma coluna de proteína G de 5 ml HiTrap (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) como por instruções do fabricante. A purificação foi realizada utilizando um sistema de cromatografia de pressão média BioRad Biologic DuoFlow equipado com um detector BioLogic Maximizer, QuadTec UV-VIS e um coletor de fração BioFrac. Para análise SDS-PAGE. Frações de fluxo contínuo de duas purificações anteriores de MAb 583 e MAb 1B1 contendo imunoglobulina foram agrupadas e a troca de tampão foi realizada utilizando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (GE Healthcare). A concentração proteica foi determinada utilizando ácido bicinconínico (BCA, Thermo Scientific) e alíquotas foram armazenadas congeladas a -20°C.

[00387] Um exemplo da purificação de MAb 581 e MAb 1B1 (lote 3) foi confirmado utilizando géis SDS-PAGE corados com Coomassie (12% de acrilamida) executados sob condições redutoras padrão (Figura 7). Conforme mostrado na Figura 7, as preparações purificadas de MAbs 583 e 1B1 IgG (linhas 8, 9) foram obtidas a partir de seus respectivos sobrenadantes de cultura de hibridoma (linhas 2-5) como evidenciado pela presença de proteínas de cadeia pesada e leve da massa molecular correta (aproximadamente 50 e 25 kDa, respectivamente). Ademais, os MAbs murinos purificados eram eletroforeticamente equivalentes ao controle de IgG de camundongo (linha 10). O meio de cultura de tecido isento de soro (linha 6) serviu como um controle negativo. Esse método poderia render consistentemente um MAb purificado que fosse adequado para afinidade de ligação adicional (por exemplo, Biacore) e estudos de especificidade.

[00388] Para avaliar a consistência de produção de biorreator e o rendimento de purificação, um método de caracterização de atividade de MAb foi desenvolvido para avaliar a atividade de ligação de cada Lote de purificação sucessiva de anticorpo MAb 583 que foi avaliado por eletroforese em gel como mostrado na Figura 7. Esse mesmo método foi aplicado a purificações de MAb 1B1 (dados não mostrados).

[00389] Utilizou-se uma placa de micropoços ELISA para avaliar a atividade de anticorpo. Várias diluições de MAb 583 purificadas de cada Lote de purificação sucessiva de sobrenadantes de biorreator (aprox. 100 ml por Lote) foram revestidas em placas (0-100 ng) e bloqueadas. O traçador de hepcidina-25 de NT-biotina foi adicionado através da placa em 1 ng/poço em TBST, pH 8) contendo 0,25% de Blotto. O traçador foi deixado se ligar durante 2 horas e os poços foram lavados em TBST, pH 8 sem Blotto. SA-HRP foi adicionado em 1:2500 durante 30 minutos, os poços lavados em TBST, e o substrato TMB foi adicionado durante 10 minutos. O tampão de Stop buffer foi adicionado e a OD quantificada em um espectrofotômetro em 450 nm. Um OD de 4 indica que a absorbância está além da faixa analítica do espectrofotômro.

[00390] A tabela abaixo é um exemplo do método ELISA estabelecido para determinar as características de atividade de ligação para 5 purificações sucessivas de MAb 583.

[00391] Os dados mostram que a ai tividade de ligação d e lotes de MAb 583 purificado aumentou após o Lote 3 e era compatível com Lotes 4-7 após o protocolo de purificação ser otimizado durante as primeiras quatro purificações realizadas. Os poços revestidos com 6,25 ng de MAb 583 purificado demonstraram que a densidade óptica em 450 nm variou a partir de 2,7-4 em Lotes 4-7 e na próxima diluição (3,12 ng/poço), os ODs variaram a partir de 1,5-2,3. Esse exemplo demonstra que um protocolo estabelecido e validado para purificação do anticorpo MAb 583 de sobrenadantes de biorreator é estabelecido e mostrado para ser compatível com dezenas de Lotes de purificação tanto de MAb 583 como 1B1.

Exemplo 5: Caracterização de especificidade de MAb a peptídeos de hepcidina-25 e hepcidina

[00392] MAb 583 demonstra especificidade ótima e excelente para hepcidina-25 em um ensaio de especificidade baseado em solução. Por exemplo, hepcidina-25 foi revestida em uma placa de anidrido maleico e os sítios de ligação não ocupados foram arrefecidos utilizando métodos padrão. Em paralelo, 20 ng de MAb 583 são misturados com concentrações crescentes de hepcidina-25 (0 a 8 ng/poço) em uma placa de 96 poços de baixa ligação de proteína e deixados reagir durante uma hora. Essa mistura MAb é, então transferida para a placa de anidrido maleico e deixada reagir durante 2 horas, após isso, a mesma é lavada e a presença de MAb 583 ligado à hepcidina-25 covalentemente ligada à placa é determinada utilizando o anticorpo secundário de IgG de cabra HRP anti-camundongo. Após incubação e lavagem adicionais, o substrato é adicionado, o desenvolvimento é interrompido utilizando ácido e a OD 450 nM é determinada. A Figura 8 demonstra que a hepcidina-25 pode bloquear os sítios de ligação em MAb 583 em solução de maneira dependente de dose.

[00393] Outro exemplo da especificidade de MAb 583 para hepcidina-20, hepcidina-22 e hepcidina-25 e protegrina foi demonstrado utilizando ensaios baseados em membrana como, mas não se limitam a, análise SDS-PAGE de tricina não redutor (10 a 20% de acrilamida) utilizando eletroforese padrão e condições de immunoblot (Figura 9). Como mostrado na imagem corada com Coomassie, hepcidina-20, -22 e -25 (linha 2, 3, 4) e protegrina (linha 5) têm uma massa molecular similar de aproximadamente 3 kDa. Em contrapartida, o Western blot sondado com MAb 583 indicou que MAb 583 reconheceu especificamente a hepcidina-20, hepcidina-22 e hepcidina-25, porém não reconheceu a protegrina.

[00394] Para exemplificar adicionalmente a especificidade de MAb 583 e MAb 1B1 para hepcidina-22 e hepcidina-25 e traçador de hepcidina-25 por NT-biotina, traçador de hepcidina-25 por K18-biotina e traçador de hepcidina-25 por K24-biotina, uma análise SDS-PAGE redutora (12% de acrilamida) e Western immunoblots foram realizados sob eletroforese padrão e métodos de immunoblotting (Figura 10). A análise SDS-PAGE corada com Coomassie indica que tanto a hepcidina-20 como a hepcidina-25 (linhas 2, 3) e as três formas de traçador identificado por biotina (linhas 4, 5, 6) têm uma massamolecular idêntica. Western blots sondados com MAb 583 ou MAb 1B1 indicaram que esses MAbs reconheceram especificamente a hepcidina- 20, hepcidina-25 e as três formas de peptídeos de traçador de hepcidina-25 identificada por biotina. Considerados coletivamente, os presentes estudos baseados em solução e baseados em membrana demonstram que MAb 583 e MAb 1B1 têm especificidade exclusiva para todas as três formas das moléculas de traçador de hepcidina-25 humanas biotiniladas.

Exemplo 6: Análise de Ressonância de Plásmon de Superfície BIAcore (SPR) de MAbs 583 e 1B1

[00395] Esse exemplo descreve a análise da afinidade de ligação e constantes de dissociação de interação de MAbs 583 e 1B1 com hepcidina-25 utilizando SPR.

[00396] A SPR foi realizada em um Sistema Biacore 3000 (BIAcore, Piscataway, NJ) utilizando o chip CM5 sensor. A matriz de chip CM5 consiste em um dextrano carboximetilado covalentemente ligado a uma superfície de ouro. Todas as medições foram realizadas a 25°C.

[00397] Neutravidina (Sigma, St. Louis, MO) foi imobilizada em um chip CM5 sensor (células de fluxo 1 a 4) pelo protocolo de acoplamento de amina, em um nível de 5000-10000 unidades de resposta (RUs). O protocolo de acoplamento de amina inclui a ativação da matriz de dextrano sobre a superfície de chip sensor com uma mistura 1:1 de 0,4 M de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil carbodiimida (EDC) e 0,1 M de N- hidroxisuccinimida (NHS), seguido por injeção de neutravidina em10 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4.

[00398] Após a imobilização de neutravidina, as etapas subsequentes foram realizadas em tampão HBS-EP (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, e 0,005% de tensoativo P20).

[00399] Os peptídeos de hepcidina biotinilados (NT-biotina- hepcidina-25, K18-biotina-hepcidina-25 e K24-biotina-hepcidina-25) foram imobilizados em células de fluxo 2-4 (uma espécie de peptídeo por célula de fluxo) ao injetar peptídeos individuais em uma concentração de 200 μg/ml em uma taxa de fluxo de 5 μl/min, por 20 min.

[00400] Após os análogos de biotina-hepcidina-25 serem capturados no chip, MAb 583 ou 1B1 anti-hepcidina foi injetado em células de fluxo 1-4 na concentração de 24 μg/ml em tampão HBS-EP na taxa de fluxo de 50 μl/min, durante 3 min. Após 3 minutos, a injeção foi interrompida e a dissociação foi seguida por 6 min. A regeneração foi realizada ao injetar 10 mM de glicina HCl, pH 1,5 em uma taxa de fluxo de 10 μl/min por 1 min.

[00401] Os sinais de ressonância foram corrigidos para ligação não específica ao subtrair o sinal da célula de fluxo de controle (célula 1) e analisados utilizando o software BIAevaluation 4.1 (Biacore).

[00402] No primeiro experimento de SPR, MAb 583 foi aplicado ao chip Biacore preparado como descrito acima em uma concentração de 24 μg/ml e ligação rápida e uma taxa de dissociação muito baixa de MAb 583 para os três análogos de biotina-hepcidina-25 foi observada (Figura 11). Os dados dos experimentos SPR mostrados na Figura 11 são mostrados na tabela abaixo. Afinidade de ligação (Ka) e constantes de dissociação (Kd) excelente foram observadas para MAb 583 com a NT- biotina hepcidina-25, e aproximadamente 1 log de afinidade inferior e constantes de dissociação para K18-biotin hepcidina-25 e K24-biotina hepcidina-25, respectivamente.

[00403] O experimento Biacore mostrado na Figura 11 foi mostrado com uma concentração de MAb 583 aproximadamente 5 vezes menor (5 μg/ml) para avaliar MAb 583 em uma razão molar muito mais baixa de anticorpo para os dois melhores antígenos de hepcidina-25 biotinilados, NT-biotina hepcidina-25 e K18-biotina hepcidina-25 (Figura12). O gráfico de Biacore mostra que MAb583 tem excelente afinidade de ligação e dissociação muito baixa tanto de peptídeos de K18-biotina hepcidina-25 como de NT-biotina hepcidina-25 avaliados nesse experimento Biacore. Os resultados de Biacore da Figura 12 são mostrados na Figura 13.

[00404] Os dados Biacore indicam que MAb 583 se liga à K18-biotina hepcidina-25 com alta afinidade e uma baixa constante de dissociação picomolar (Kd) = aprox. 7,5 pM). MAb 583 tem afinidade de ligação alta, porém ligeiramente inferior e baixas constantes de dissociação picomolares para NT-biotina-hepcidina-25, com uma Kd = aprox. 18 pM.

[00405] Esses experimentos e resultados Biacore confirmam que MAb 583 se liga à hepcidina-25 rapidamente com alta afinidade e se dissocia de hepcidina-25 lentamente com baixas constantes de dissociação pM. O epítopo de MAb 583 consiste nos 9 aminoácidos N- terminal cujos primeiros 5 aminoácidos N-terminal (SEQ 25) são essenciais para a ligação de hepcidina-25 ao transportador e receptor de ferro, ferroportina, e sua capacidade de internalizar e degradar ferroportina. A excelente especificidade, afinidade, avidez, e Kd de pM de MAb 583 para a terminação N de hepcidina-25 indica que o mesmo será um anticorpo neutralizante in vitro e in vivo, e adequado para a humanização para aplicações terapêuticas. Exemplos de experimentos Biacore com MAb 1B1 são mostrados nas Figuras 14-15. Duas tentativas foram feitas utilizando as mesmas condições descritas para MAb 583 para conduzir a análise de SPR com MAb 1B1 e em cada caso, a taxa de dissociação de 1B1 dos antígenos de hepcidina-25 era tão lenta que o instrumento Biacore 3000 que o software BIAevaluation 4.1 usou não poderia detectar qualquer dissociação de 1B1 dos antígenos de hepcidina-25 durante os 20 minutos de experimento. Por esse motivo, os experimentos não conseguiram produzir informações estatísticas como mostrado para MAb 583 na Figura 13 para os experimentos Biacore mostrados nas Figuras 14-15.

[00406] A análise SPR sob essas condições experimentais indica que o MAb 1B1 murino tem afinidade extraordinária para peptídeos de hepcidina-25 e podem ter uma constante de afinidade (KD) de < 10-1210-13 M) e com essas características pode ser adequado para a humanização e avaliação pré-clínica como um MAb específico de hepcidina-25.

Exemplo 7: Experimentos de especificidade e ligação de hepcidina com MAbs 583 e 1B1

[00407] A especificidade e afinidades de ligação relativas do 583 e 1B1 foram avaliadas em uma série de experimentos de competição de placa de microtitulação. Os ensaios foram realizados em duplicata ou triplicata utilizando placas de microtitulação de 96 poços revestidas com MAb 583 ou MAb 1B1.

[00408] MAb 583 foi diluído 1:4000 em salina tamponada com Tris (TBS) contendo 40 mM de Tris-HCl (pH 7,3), 100 mM de NaCl, foram pipetados dentro das placas de microtitulação.

[00409] Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente (RT), as placas de microtitulação foram lavadas com TBST (TBS com 0,05% de TWEEN® 20) e 100 ml de amostras padrão contendo várias quantidades de peptídeos sintéticos e análogos de biotina hepcidina-25 (1-2 ng/poço) foram adicionados a cada poço e incubados durante 1 hora à RT.

[00410] A competição foi detectada por estreptavidina-HRP com o substrato de tetrametilbenzidina; a reação de cor foi interrompida com 0,5 N de H2SO4 e a densidade óptica da solução lida em 450 nm de comprimento de onda.

[00411] Análise de ligação de hepcidina-25, hepcidina-22, e hepcidina-20 a anticorpos MAb 583 revestidos em uma placa de microtitulação. A ligação de análogos de hepcidina-25 biotinilados e a detecção de NT-biotina hepcidina-25 ligada foi usada para detectar o grau de ligação relativo de cada um dos peptídeos de hepcidina em relação à hepcidina-25 (Figura 16). As curvas de competição com a NT- biotina hepcidina-25 com os isômeros de peptídeo de hepcidina, hepcidina-22 e hepcidina-20, eram similares indicando que os isômeros de hepcidina se ligam a MAb 583, porém com valores EC50 decrescentes (afinidade) com redução de tamanho do isômero de hepcidina como demonstrado pelo deslocamento para a direita na curva de regressão a partir de hepcidina-25 para hepcidina-22 para hepcidina- 20.

[00412] Utilizou-se o mesmo nome acima para investigar as afinidades de ligação relativas de MAbs 583 e 1B1 contra um peptídeo C-terminal oxidado, para avaliar os epítopos de ligação em hepcidina para cada MAb. Os peptídeos carbóxi terminais como hepcidina (10-25) são descritos na Patente Nos. US 7.320.894 e 7.411.048, cada uma dessas patentes está incorporada no presente documento a título de referência em relação aos peptídeos.

[00413] Como mostrado na Figura 17 e Figura 18, não houve ligação do peptídeo de hepcidina (10-25) a cada MAb 583 ou 1B1, respectivamente, em qualquer concentração testada até 2000 ng/ml com a NT-biotina hepcidina-25. Não houve ligação observada entre MAb 583 e hepcidina-25 de camundongo (hepcidina-1 murina) ou protegrina como comparado com a excelente ligação competitiva por hepcidina-25 sintética nesse experimento ELISA (Figura 17). Esses experimentos mostram claramente que MAbs 583 e 1B1 não ligam quaisquer epítopos encontrados nos 16 aminoácidos C-terminal de hepcidina-25 (hepcidina (10-15) e, desse modo, ligam os epítopos N- terminal.

[00414] O peptídeo antimicrobiano catiônico, protegrina,e hepcidina- 25 de camundongo, (hepcidina-1 de murino) são estruturalmente similares, com hepcidina-1 de murino compartilhando 76% de identidade de aminoácido à hepcidina-25 humana. Os peptídeos foram usados para testar a reatividade cruzada de MAb 583 com peptídeos similares no mesmo ensaio com MAb 583. Como claramente mostrado em um experimento ELISA, não foi encontrada ligação aparente de 583 a esses peptídeos estruturalmente similares (Figura 17).

[00415] Em um experimento similar como mostrado na Figura 18, não observou-se ligação de hepcidina (10-25) a MAb 1B1 em um experimento similar conduzido com K18-biotina hepcidina-25 usado como o traçador no experimento ELISA (Figura 19) confirmando adicionalmente os 9 aminoácidos N-terminal como o epítopo essencial para 1B1. De maneira importante, esses dados mostram que tanto MAbs 583 como 1B1 têm afinidade e especificidade excelente para a terminação N de hepcidina-25. Ambos poderiam ser previstos como anticorpos neutralizantes para bioatividade de hepcidina contra o receptor de ferroportina e canal de ferro in vitro e in vivo e uma vez humanizados, candidatos para desenvolvimento terapêutico

Exemplo 8: Análise de MAb 583 quanto à atividade neutralizante contra hepcidina-25 in vitro em ensaios baseados em células por análise de fluorescência de ferroportina-GFP Ensaios baseados em células in vitro

[00416] A atividade neutralizante de MAb 583 foi analisada in vitro em um ensaio de fluorescência baseado em célula utilizando o protocolo de citometria de fluxo como descrito em Nemeth et al. (2006) para avaliar a atividade neutralizante de MAb 583 contra hepcidina-25 humana (SEQ ID NO. 19). Os cinco aminoácidos N-terminal [SEQ ID NO. 25] de hepcidina interagem com ferroportina e são exigidos para a atividade biológica de hepcidina, com isso cada deleção de único aminoácido da terminação N reduz a atividade biológica da hepcidina como definido por atividade de degradação de ferroportina (Figuras 20-23).

[00417] As células HEK humanas contendo uma construção de ferroportina de camundongo induzível por ponasterona (Fpn-GFP) foram incubadas com ou sem 10 mM de ponasterona durante 24 horas. Após três lavagens com 1x PBS de Dulbecco, as células foram tratadas sequencialmente com quantidades conhecidas de anticorpo MAb 583 purificado por afinidade de Proteína A e concentrações conhecidas de hepcidina-25 umana sintética biologicamente ativa, ou tampão de controle durante mais 24 horas.

[00418] As células foram separadas utilizando TrypLE Express (Invitrogen) e ressuspensas em meio em uma concentração de 1 x 106 células/ml. A intensidade de fluorescência verde foi medida utilizando a citometria de fluxo.

[00419] As células que não expressam Fpn-GFP (sem ponasterona) foram usadas para estabelecer uma porta (linha de base) para excluir a fluorescência de fundo. Os resultados foram representados como uma função da intensidade de GFP de células não tratadas, de acordo com a fórmula (Fx - Fhep) / (Funtreated - Fhep), onde F representa a média da fluorescência verde gated.

Citometria de Fluxo de células Fpn-GFP tratadas com MAb 583.

[00420] No primeiro experimento, as células foram induzidas de um dia para o outro com ponasterona para induzir a expressão de Fpn-GFP de murino. No dia seguinte, a ponasterona foi removida por lavagem, e hepcidina-25 e 583 anticorpos adicionados durante 24 horas (Figura 20 e Figura 21).

[00421] A hepcidina-25 foi usada em 100 ng/ml de concentração (37 nM). MAb 583 foi adicionado em 10 vezes, 2 vezes ou 1/3 da concentração molar relativa de concentração de hepcidina (370 nM, 74 nM e 10 nM).

[00422] O MAb de controle era um anticorpo monoclonal anti- hepcidina reprovado quando analisado in vitro por ELISA e foi usado na concentração mais alta (370 nM). Nesse experimento, 10 nM de MAb 583 neutralizaram completamente 37 nM de hepcidina-25 e suprimiram a degradação de hepcidina-25 de FPN-GFP.

[00423] O experimento foi repetido com MAb 583 adicionado em 1/3, 1/6, 1/12, e 1/24 a concentração molar de hepcidina-25 nesse ensaio baseado em células de atividade biológica de MAb 583 (Figura 22 e Figura 23).

[00424] Nesse experimento, 2,5 nM de MAb 583 neutralizaram significativamente (~23% de redução) 37 nM de hepcidina-25 e sua atividade biológica para FPN-GFP em 1/12 da razão molar de hepcidina- 25 biologicamente ativa (Figura 22, 23).

[00425] Também foi avaliada a atividade neutralizante de MAb 583 ao obter medições de ferritina intracelular de células Fpn-GFP de controle e células tratadas com concentrações variadas de MAb 583 e hepcidina em dois experimentos adicionais utilizando os protocolos idênticos, inclusive a concentração do anticorpo MAb 583 e peptídeos de hepcidina-25 biotinilados, como nos ensaios de fluorescência baseados em células (Figuras 24-26).

[00426] Para obter concentrações de ferritina intracelular, a proteína celular total foi extraída utilizando tampão RIPA (Boston BioProducts, Ashland, MA) com a adição de um coquetel inibidor de protease de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Indianapolis, IN).

[00427] Os níveis de ferritina foram determinados utilizando um ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA; Ramco Laboratories, Stafford, TX) de acordo com as instruções do fabricante com concentrações proteicas totais normalizadas em cada amostra. A concentração proteica total foi determinada utilizando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL).

[00428] As Figuras 24-26 mostram os resultados desses ensaios desenhados para avaliar a capacidade de MAb 583 neutralizar a atividade biológica de hepcidina-25 contra ferroportina.

[00429] Similar aos resultados observados em ensaios de fluorescência descritos no presente documento, 2,5-10 nM de MAb 583 neutralizaram significativamente 37 nM de hepcidina-25 e sua atividade biológica in vitro, resultando em degradação reduzida de FPN-GFP e retenção de ferro ligado à ferritina intracelular (Figura 24-26).

Exemplo 9. Atividade neutralizante in vivo de MAb 583 em camundongos C57BL/6

[00430] Para avaliar as características neutralizantes in vivo de MAb 583, foi realizado um estudo animal simples, porém aprofundado em que foram examinados dois regimes de dosagem com anticorpos MAb 583 purificados por afinidade quanto à capacidade de 583 anticorpos bloquearem a hepcidina-25 biologicamente ativa in vivo. Testou-se uma dose única de MAb 583 e duas doses de 50% de MAb 583 aplicada sequencialmente 24 horas de intervalo através de injeção intraperitoneal.

[00431] Para iniciar o experimento de MAb 583 in vivo, quarenta camundongos machos C57BL/6 (6 semanas de idade) foram alojados em um viveiro comercial e alimentados com uma dieta com baixo teor de ferro (20 ppm de ferro total, Teklad Custom Research Diet, Harlan Laboratories) durante 17 dias. No dia 1, quarenta camundongos foram randomizados em cinco grupos experimentais de 8 e cada grupo foi testado como descrito abaixo. O grupo um recebeu somente PBS, os grupos 2 e 3 receberam 1,0 mg e 0,5 mg de MAb 583 respectivamente, o grupo 4 recebeu o Mab de controle (MAb anti-hepcidina inadequado para ELISA) e o grupo 5 recebeu PBS. Vinte e quatro horas depois, cada camundongo no grupo 3 recebeu mais 0,5 mg de MAb 583. Após um período de incubação adicional de 20 horas, os grupos 1 a 4 receberam 50 μg de hepcidina-25 em PBS e os camundongos no grupo 5 (grupo de controle) receberam sua segunda dose de PBS (Figura 27)

[00432] Os camundongos foram sangrados através de punção cardíaca 2 horas após o tratamento, o sangue foi deixado coagular durante 30 minutos e seus níveis séricos de ferro avaliados utilizando um método espectrofotométrico comercial (Iron-SL Assay, Genzyme Diagnostics).

[00433] A análise estatística dos dados mostra que os dados foram normalmente distribuídos pelo Teste de Normalidade Shapiro-Wilk (P = 0,216).

[00434] O Teste de Variância Igual dos dados mostrou variâncias equivalentes nos grupos (P = 0,360).

[00435] ANOVA foi realizado e indicou que houve uma diferença estatisticamente significativa (P = 0,008) nos valores médios de concentrações de ferro no soro entre os grupos de tratamento (Figura 28). A Figura 27 mostra esses resultados graficamente e as diferenças significativas entre os controles PBS e camundongos tratados com hepcidina-25 in PBS individualmente ou em combinação com duas doses de 0,5 mg de MAb 583 em PBS (Figura 28).

[00436] Potência de teste realizado com alfa = 0,050: 0,748.

[00437] Múltiplas Comparações versus Grupo de Controle (método Holm-Sidak) renderam um nível de significância total = 0,05.

[00438] Diferenças significativas foram observadas em concentrações de ferro no plasma entre o grupo de controle PBS e o grupo de camundongos administrado com 50 μg dehepcidina-25 em PBS ou duas doses de 0,5 mg de MAb 583 durante 24 horas. O grupo administrado com 50 μg de hepcidina-25 em PBS seguido por 1,0 mg do MAb anti-hepcidina de controle (sham MAb) aproximou uma diferença significativa com a PBS mais grupo de controle de hepcidina- 25 (P = 0,054; Figura 28).

[00439] Esses resultados são promissores e indicam que MAb 583 tem atividade neutralizante in vivo que suprime a atividade biológica de hepcidina-25 quando ambos forem injetados sequencialmente IP em camundongos C57BL/6 machos. A dose 50 μg de hepcidina-25 humana usada nesse experimento in vivo foi anteriormente mostrada para induzir hipoferrimia severa durante até 72 horas em camundongos C57BL\6 e, portanto, a dose representa um teste rigoroso da atividade neutralizante de MAb 583 (Rivera et al. 2005).

Exemplo 10. Anticorpo quimérico humano-camundongo

[00440] Os domínios variáveis de cadeia leve e pesada de MAB 583 anti-hepcidina murino foram sintetizados e clonados em um vetor de expressão de mamíferos proprietário sem quaisquer modificações. O domínio variável de cadeia leve foi clonado de acordo com um sinal de secreção e um domínio constante de cadeia leve kappa humano. O domínio variável de cadeia pesada foi clonado de acordo com um sinal de secreção e um domínio constante de IgG1 humano. A sequência de clones resultante, BAP070-01 foi verificada. Nota-se que a sequência de sinal está sublinhada abaixo.

[00441] Sequência de DNA de Cadeia Leve BAP070-01 ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCT CTGGCTCCCAGGTGCCAAGTGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCC AGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTG CAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCAC TGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTAT CGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAG GCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATC TGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTG GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAA TCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGA CAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAG ACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO: 37)

[00442] Sequência de aminoácido de Proteína de Cadeia Leve BAP070-01 MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS ESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRT DFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG EC (SEQ ID NO: 38)

[00443] Sequência de DNA de Cadeia Pesada BAP070-01 ATGGCCACAACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTG GCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGATCCAGTTGGTGCAGTCTG GACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCA AGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAA GCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACAC CTACACTGGAGAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTT TGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATC AACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACAACGT ACGCTACTAGCTGGTACTGGGGCCAGGGAACGCTGGTCACCGTC AGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACC CTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACT CAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTC CTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCA GCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO: 39)

[00444] Sequência de aminoácidos de Proteína de Cadeia Pesada BAP070-01 MATTMEFGLSWLFLVAILKGVQCQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS GYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAF SLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTTYATSWYWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 40)

[00445] Sequência de Região Variável de Cadeia Pesada de mAb 583 Murino: CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGA GAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAA ACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAA AGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATG CTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGC CAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACG GCTACATATTTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGCC AAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 53)

[00446] Sequência de Região Variável de Cadeia Leve de mAb 583 Murino GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAG GGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATA GTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACA GCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGG GATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCAC CCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTAC TGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGTGGAGGCACCAAG CTGGAAATCAAAC (SEQ ID NO: 54)

[00447] As células CHO foram semeadas em placas de 6 poços, transfectadas com BAP070-01 (quimera recombinante) ou somente vetor vazio (BAP070) utilizando um protocolo de transfecção proprietário e cultivadas a 37°C em DMEM com 10% de soro. Os sobrenadantes foram coletados 48 horas após a transfecção. A concentração de IgG no sobrenadante foi determinada utilizando ELISA quantitativa BioAtla. A concentração do BAP070-01 recombinante foi determinada por ELISA quantitativa que é 3650 ng/ml.

[00448] O primeiro experimento no presente documento com a quimera de MAb 583 BAP070-01 foi desenhado para comparar a quimera de MAb 583 com o MAb 583 murino quanto à atividade de ligação à hepcidina-25. Séries de diluição de duas vezes e, então, três vezes de sobrenadante celular de BAP070-1 CHO ou MAb 583 murino (Lote 10, 0,5 mg/ml) começando em 600 ng/ml foi incubado em placas de micropoços com 100 ng de hepcidina-25 covalentemente ligada aos poços ativados de anidrido maleico. A ligação de anticorpo foi detectada com IgG anti-humana (H+L) conjugada com HRP (1:2500) para sobrenadante BAP070-01. A ligação de anticorpo pelo controle MAb 583 purificado foi detectada utilizando IgG de coelho anti-camundongo (H+L) na mesma diluição. As reações foram interrompidas com 1N de HCl 5 minutos após TMB ser adicionado aos poços e lido imediatamente. O valor de OD 450 nm das reações foi medido com Dispositivo Molecular SPECTRAmax Plus (Figura 29). Os resultados de OD mostrados na tabela abaixo e na Figura 29 demonstram excelente ligação pelo MAb 583 quimérico BAP070-01 e o controle de MAb 583 purificado indicando que o clone de quimera BAP070-01 foi corretamente construído e que as CDRs de cadeia pesada e cadeia leve de murino funcionaram corretamente no contexto da estrutura de IgG humana. Esses dados confirmam que a clonagem, expressão de BAP070-01 em cultura celular CHO, e a atividade de ligação de quimera são suficientemente fortes para continuar o protocolo de humanização. Experimentos adicionais foram conduzidos para confirmar a observação inicial.

[00449] Os valores OD 450 nm são os seguintes:

[00450] A quimera MAb 583, BAP070-01, claramente ligada à hepcidina-25 a um grau maior que o MAb 583 murino purificado serialmente diluído nesse experimento, confirmando que a especificidade e funcionalidade de anticorpos quiméricos são comparáveis com o MAb 583 murino parental (Figura 29).

[00451] Esse ensaio de ligação inicial foi uma avaliação semi- quantitativa da quimera BAP070-01 visto que a comparação envolve um sobrenadante de cultura celular de um MAb 583 quimérico humano- camundongo com um MAb 583 murino purificado. A quantificação de concentração de anticorpo quimérico em sobrenadantes de cultura celular foi realizada utilizando um método imunológico proprietário e MAb 583 purificado utilizando BCA. O ensaio diferente pode resultar potencialmente em quantidades desiguais de anticorpo, e, assim, o sinal, em uma comparação ELISA. Apesar dessas ressalvas, tanto MAb 583 como a quimera BAP070-01 mostram o sinal crescente com anticorpo crescente como previsto para essa comparação.

Titulação de Quimera 583 por placa revestida com hepcidina-25.

[00452] Para comparar a atividade de ligação de BAP070-01 e o vetor vazio, BAP070 foi determinado por ELISA. Brevemente, hepcidina-25 humana (100 ng/poço) foi covalentemente ligada a placas de micropoços ativadas por anidrido maleico de um dia para o outro e os sítios ativados não ligados restantes foram bloqueados como por instruções do fabricante. Os sobrenadantes de cultura serialmente diluídos contendo a quimera de MAb 583, BAP070-01, ou para o vetor vazio, BAP070, foram adicionados à placa de micropoço e incubadas à temperatura ambiente (RT) durante 2 horas. O anticorpo MAb 583 quimérico ligado foi detectado utilizando IgG-HRP anti-humana com TMB como substrato. Os resultados são mostrados na Figura 30.

[00453] Os dados indicam claramente que o MAb quimérico humano- camundongo BAP070-01 reconhece especificamente a hepcidina-25 humana com excelente afinidade enquanto não há ligação à hepcidina- 25 por sobrenadante CHO BAP070 nesse ensaio (Figura 30). Os dados mostrados nas Figuras 29 e 30 demonstram uma comparação muito positiva de MAb 583 purificado e MAb 583 quimérico BAP070-01 e a ligação específica de hepcidina-25 da quimera BAP070-01. Os resultados de ELISA esperados que comparam os sobrenadantes da quimera BAP070-01 com o vetor vazio BAP070 de controle negativo foram demonstrados utilizando placas revestidas com hepcidina-25 para capturar anticorpos IgG humanos funcionais e anticorpos IgG anti- humanos (H+L) para detecção (Figura 30).

C-ELISA revestido com Proteína G para Quimera BAP070-01 583

[00454] Para avaliar a ligação da quimera BAP070-01 à Proteína G e o grau de neutralização do MAb 583 BAP070-01 por hepcidina-25 sintética, foi realizado um ensaio C-ELISA utilizando NT-biotina hepcidina-25 como o traçador (Figura 31). Esse formato C-ELISA também foi útil para testar a ligação de traçador de NT-biotina hepcidina- 25 à quimera BAP070-01 e competir com hepcidina-25 pela ligação ao MAb 583 quimérico. Para capturar os anticorpos quiméricos BAP070- 01, placas de micropoços foram revestidas com Proteína G (150 ng/poço) de um dia para o outro em tampão de revestimento de carbonato.

[00455] A placa foi lavada com TBST e o sobrenadante celular CHO contendo a quimera de MAb 583 BAP070-01 (150 ng/poço) foi adicionado e deixado se ligar à Proteína G à RT durante 1 hora.

[00456] A placa foi lavada com TBST e um (1) ng/poço de NT-biotina hepcidina-25 foi misturada com quantidades diferentes (0-100ng) de padrão de hepcidina-25 sintética em TBST, 0,25% de BLOTTO foi adicionado sobre a placa para se ligar competitivamente. A placa foi lavada com TBST e SA-HRP (1:2500) adicionado e deixado se ligar durante 1 hora.

[00457] A placa foi lavada com TBST e substrato TBS adicionado e a reação foi interrompida após 10 minutos com solução de parada. A absorbância em 450 nm foi medida em um espectrofotômetro.

[00458] A absorbância (OD450) para C-ELISA de BAP070-01 é mostrada na Tabela abaixo.

[00459] Os resultados na tabela abaixo e nas Figuras 31 demonstram que a hepcidina-25 sintética compete com sítios de ligação de quimera BAP070-10 competitivamente e que os anticorpos MAb 583 quiméricos são específicos para hepcidina-25 e NT-biotina hepcidina- 25. A curva padrão mostrada na Figura 31 foi gerada utilizando uma regressão logística de quatro parâmetros (Graphpad Prism; San Diego, CA). Prism foi usado para calcular a EC50 da ligação de hepcidina-25 a BAP070-01 e determinou EC50=54 ng/ml (Figura 31). Essa EC50 é excelente considerando que a mesma é derivada de um sobrenadante bruto e não um MAb 583 purificado onde a EC50 é < 5,0 ng/ml (Figura 16).

C-ELISA de Neutravidina para Quimera BAP070-01 583

[00460] Outra avaliação de MAb 583 quimérico BAP070-01 foi realizada ao revestir placas de micropoços com neutravidina (150 ng/poço) de um dia para o outro em tampão de revestimento de carbonato. A placa foi lavada com TBST. O traçador NT-biotina hepcidina-25 foi adicionado em 1 ng/poço com concentrações diferentes de hepcidina-25 (0-100 ng/poço) e deixada se ligar à RT durante 1 hora. IgG anti-humana (H+L)-HRP foi usada para detectar a quimera de MAb 583 BAP070-01 ligada nessa análise C-ELISA.

[00461] A tabela abaixo mostra valores duplicados e OD450 médio em relação a concentrações de hepcidina-25. Os resultados mostram que a hepcidina-25 humana neutraliza claramente os sítios de ligação na quimera BAP070-01 e que o traçador NT-biotina hepcidina-25 (análogo de hepcidina) se liga eficientemente.

[00462] A Figura 3 2 fornece dados gráficos que ilustram os resultados apresentados na tabela acima para ligação competitiva da quimera BAP070-01 para NT-biotina hepcidina-25. Como esperado em qualquer ensaio competitivo, um sinal inferior é observado com o aumento da concentração de antígeno não identificado (por exemplo, hepcidina-25). A Figura 32 mostra as duas duplicatas OD450 e o valor de OD450 médio para cada concentração crescente de hepcidina-25.

[00463] Cumulativamente, os dados que foram apresentados no Exemplo 10 demonstram que o Mab 583 quimérico BAP070-01 mantém as características de alta afinidade e especificidade como o anticorpo MAb 583 murino parental e que a humanização completa do anticorpo MAb 583 murino nativo irá render um anticorpo terapêutico candidato adequado para teste pré-clínico e clínico em humanos.

[00464] Embora determinadas modalidades das presentes modalidades tenham sido mostradas e descritas no presente documento, será evidente para os elementos versados na técnica que tais modalidades são fornecidas somente a título de exemplo. Inúmeras variações, alterações e substituições irão ocorrer agora para os elementos versados na técnica sem que se abandone as modalidades. Deve ser entendido que várias alternativas para as modalidades das modalidades descritas no presente documento podem ser empregadas para praticar as modalidades. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam o escopo das modalidades e que os métodos e estruturas dentro do escopo dessas reivindicações e seus equivalentes sejam abrangidos pelas mesmas.

SEQUÊNCIAS

[00465] Alinhamentos de Nucleotídeos de Regiões CDR-1, CDR-2, e CDR-3 de Cadeias Pesadas e Leves Variáveis de MAbs H32, 583 e 1B1 de Hepcidina. As CDRs estão sublinhadas. As regiões de estrutura não estão sublinhadas.

Cadeia Pesada Variável

[00466] CDR-1

[00467] SEQ ID NO: 1 H32 GGTTCTGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCAC

[00468] SEQ ID NO: 2 583 GCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAAC

[00469] SEQ ID NO: 3 1B1 GTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAAC

[00470] CDR-2

[00471] SEQ ID NO: 4 H32 GGAGTTATTAGTTCTTACTATGGTGATGCTAGCTAC

[00472] SEQ ID NO: 5 583 GGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATAT

[00473] SEQ ID NO: 6 1B1 GGCTACATAAGCTACAGTAGTATCACTAACTAC

[00474] CDR-3

[00475] SEQ ID NO: 7 H32 TACTGTGCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTCTG GGGC

[00476] SEQ ID NO: 8 583 TTCTGTACAACGTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGC

[00477] SEQ ID NO: 9 1B1 TACTGTGCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCACTGGGGT

Cadeia Leve Variável

[00478] CDR-1

[00479] SEQ ID NO: 10 H32 TCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTG TAT

[00480] SEQ ID NO: 11 583 GCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCAC

[00481] SEQ ID NO: 12 1B1 GCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTAC

[00482] CDR-2

[00483] SEQ ID NO: 13 H32 GTATATCGGATGTCCAACCTT

[00484] SEQ ID NO: 14 583 ATCTATCGTGCATCCAACCTA

[00485] SEQ ID NO: 15 1B1 ATTTATCTCACATCCAACCTG

[00486] CDR-3

[00487] SEQ ID NO: 16 H32 TATTGTATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACGTTCGGT

[00488] SEQ ID NO: 17 583 TACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCTGACGTTCGGT

[00489] SEQ ID NO: 18 1B1 TACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACGTTCGGC

[00490] Peptídeo de hepcidina humano (hepcidina-25, hep-25, Hep-25, hHepcidin-25): SEQ ID NO: 19 (25aa) DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

[00491] Peptídeo de hepcidina-1 de camundongo (mhepcidin-1, mhep-1, mHep-1, mHepcidin-1): SEQ ID NO: 20: (25aa) DTNFPICIFCCKCCNNSQCGICCKT

[00492] Peptídeo de hepcidina de rato (rhepcidina, rhep, rHep, rHepcidin): SEQ ID NO: 21: (25aa) DTNFPICLFCCKCCKNSSCGLCCIT

[00493] Peptídeo de hepcidina-20 humano (hepcidina-20, hep-20, Hep-25, hHepcidin-20): SEQ ID NO: 22: (20aa) ICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

[00494] Peptídeo de hepcidina 22 humano (hepcidina-22, hep-22, Hep-22, hHepcidin-22): SEQ ID NO: 23: (23aa) HFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT

[00495] Peptídeo de hepcidina-9 humano (hepcidina-9, hep-9, Hep- 9, hHepcidin-9): SEQ ID NO: 24 (9aa) DTHFPICIF

[00496] Peptídeo de hepcidina-5 humano (hepcidina-5, hep-5, Hep- 5, hHepcidin-5): SEQ ID NO: 25 (5aa) DTHFP

[00497] Peptídeo de hepcidina 10-25 humano (hepcidina 10-25, hep 10-25, Hep 10-25, hHepcidina 10-25): SEQ ID NO: 26 (16aa) CCGCCHRSKCGMCCKT

[00498] Peptídeo de hepcidina -9 KLH DNP-humano (DNP-hepcidina -9-KLH, DNP-hep-9-KLH , DNP-Hep-9-KLH, DNP-hHepcidin-9-KLH): SEQ ID NO: 27 DNP-DTHFPIC(KLH-SMCC)-IF

[00499] Região variável de cadeia pesada IgG1 [Homo sapiens] GenBank: AAK62671.1

[00500] LLESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSMINYYWSWIRQPPGE RPQWLGHIIYGGTTKYNPSLESRITISRDISKSQFSLRLNSVTAADTAIY YCARVAIGVSGFLNYYYYMDVWGSGTAVTVSS (SEQ ID NO: 29)

[00501] Região variável de cadeia pesada IgG1 [Homo sapiens] GenBank: AAK19936.1

[00502] QVQLQQWGAGLLKPSETLSRTCAVYGGSFSDDYWSWIR QPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSEKQFSLKLSSVT AADTAVYYCARRNDWYPFDYWDEGILVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW (SEQ ID NO: 30)

[00503] IgG1 [Mus musculus] GenBank: BAA23565.1

[00504] QVQLQQSGAELMKPGASVNISCKASGYIFSSYWIEWVKQ RPGHGLEWIGEILPGSGNIKYNEKFKGKAIFTVETSSNTAYMQLSSLT SEDSAVYFCAKTDYYASGYGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 31)

[00505] Região variável de cadeia leve kappa de imunoglobulina [Mus musculus] GenBank: ABE03823.1

[00506] DIVMTQSPASLDVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMNW YQQKPGQPPKLLIYLASSLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEED AATYYCQHSREPPPTFGGGTKLEIKRAD (SEQ ID NO: 32)

[00507] Região variável de cadeia leve kappa de imunoglobulina [Mus musculus] GenBank: ABE03821.1

[00508] DVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLANNGRTYLNW LLQRPGQSPKRLIYLVSTLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDL GVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLELKRAD (SEQ ID NO: 33)

[00509] Região variável de cadeia leve de imunoglobulina IgG1 [Homo sapiens] GenBank: AAK62672.1

[00510] LTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGRNLGWYQQKPG QAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQ QRSDWPRTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 34)

[00511] Mouse_VK

[00512] QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKP GSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYY CQQWSSNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 35)

[00513] Mouse_VH

[00514] EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVR QSPEKGLEWVAEIRSKASNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQM NSLRAEDTGIYYCTRWRRFFDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 36) Sequências de Ácidos Nucleicos e Aminoácidos de Cadeia Pesada e Cadeia Leve de MAbs H32, 583 e 1B1 de Hepcidina.

[00515] H32 VH

[00516] GGTTCTGGCTACACATTCACTGATTATGCTATGCACGG AGTTATTAGTTCTTACTATGGTGATGCTAGCTACTACTGTGCAAGA TATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTCTGGGGC (SEQ ID NO: 41)

[00517] H32 VH

[00518] Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His Gly Val Ile Ser Ser Tyr Tyr Gly Asp Ala Ser Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Arg Gly Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly (SEQ ID NO: 42)

[00519] 583 VH

[00520] GCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACGG CTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATTTCTGTACAAC GTACGCTACTAGCTGGTACTGGGGC (SEQ ID NO: 43)

[00521] 583 VH

[00522] Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Phe Cys Thr Thr Tyr Ala Thr Ser Trp Tyr Trp Gly (SEQ ID NO: 44)

[00523] 1B1 VH

[00524] GTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAA CGGCTACATAAGCTACAGTAGTATCACTAACTACTACTGTGCTGGT CTTTACTATGTTATGGACCACTGGGGT (SEQ ID NO: 45)

[00525] 1B1 VH

[00526] Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Ser Ile Thr Asn Tyr Tyr Cys Ala Gly Leu Tyr Tyr Val Met Asp His Trp Gly (SEQ ID NO: 46)

[00527] H32 VL

[00528] TCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTAC TTGTATGTATATCGGATGTCCAACCTTTATTGTATGCAACATCTAG AATATCCTTTCACGTTCGGT (SEQ ID NO: 47)

[00529] H32 VL

[00530] Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Val Tyr Arg Met Ser Asn Leu Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly (SEQ ID NO: 48)

[00531] 583 VL

[00532] GCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATG CACATCTATCGTGCATCCAACCTATACTGTCAGCAAAGTAATGAGG ATCTGACGTTCGGT (SEQ ID NO: 49)

[00533] 583 VL

[00534] Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Leu Thr Phe Gly (SEQ ID NO: 50)

[00535] 1B1 VL

[00536] GCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACATTTATCTCACA TCCAACCTGTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACGTTC GGC (SEQ ID NO: 51)

[00537] 1B1 VL

[00538] Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Pro Phe Thr Phe Gly (SEQ ID NO: 52)

[00539] Sequências de polinucleotídeos CDR-1, CDR-2, e CDR-3 de Cadeias Pesadas e Leves Variáveis de MAbs H32, 583 e 1B1 de Hepcidina.

[00540] Cadeia Pesada Variável

[00541] CDR-1

[00542] SEQ ID NO: 55 H32 GGCTACACATTCACTGATTATGCT

[00543] SEQ ID NO: 56 583 GGGTATACCTTCACAAACTATGGA

[00544] SEQ ID NO: 57 1B1 GGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCC

[00545] CDR-2

[00546] SEQ ID NO: 58 H32 ATTAGTTCTTACTATGGTGATGCT

[00547] SEQ ID NO: 59 583 ATAAACACCTACACTGGAGAGCCA

[00548] SEQ ID NO: 60 1B1 ATAAGCTACAGTAGTATCACT

[00549] CDR-3

[00550] SEQ ID NO: 61 H32 GCAAGATATAGGGGGCTCTGGTACTTCGATGTC

[00551] SEQ ID NO: 62 583 ACAACGTACGCTACTAGCTGGTAC

[00552] SEQ ID NO: 63 1B1 GCTGGTCTTTACTATGTTATGGACCAC

[00553] Cadeia Leve Variável

[00554] CDR-1

[00555] SEQ ID NO: 64 H32 AAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTAC

[00556] SEQ ID NO: 65 583 GAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTT

[00557] SEQ ID NO: 66 1B1 TCAAGTGTAAGTTAC

[00558] CDR-2

[00559] SEQ ID NO: 67 H32 CGGATGTCC

[00560] SEQ ID NO: 68 583 CGTGCATCC

[00561] SEQ ID NO: 69 1B1 CTCACATCC

[00562] CDR-3

[00563] SEQ ID NO: 70 H32 ATGCAACATCTAGAATATCCTTTCACG

[00564] SEQ ID NO: 71 583 CAGCAAAGTAATGAGGATCTGACG

[00565] SEQ ID NO: 72 1B1 CAGCAGTGGAGTAGTGACCCTTTCACG Referências Hunter et al., J. Biol. Chem., 277:37597-37603 (2002) Kemna et al., Blood, 106:1864-1866, 2005 Kilpatrick KE, Wring SA, Walker DH, et al. 1997. Rapid Development of Monoclonal Antibodies Using Repetitive Immunization, Multiple Sites. Krause et al., FEBS Lett. 480:147 (2000) Lauth et al., J. Biol. Chem., 280:9272-9282 (2005) Nemeth et al., J. Clin. Invest., 113:1271-1276, 2004 Nemeth et al., Blood, 101:2461-2463, 2003 Nicolas et al., Nat. Genet., 34:97-101, 2003 Nicolas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:4596-4601, 2002 Nicolas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:8780-8785, 2001. Nicolas et al., J. Clin. Invest., 110:1037-1044, 2002 Park et al., J. Biol. Chem. 276:7806 (2001) Pigeon et al., J. Biol. Chem. 276:7811 (2001) Rivera et al., Blood, 105:1797-1802, 2005 Roetto et al., Nat. Genet., 33:21-22, 2003 Weinstein et al., Blood, 100:3776-36781, 2002 The N- terminus of hepcidin is essential for its interaction with ferroportin: Nemeth et al., Blood, 107(1):328-333, 2006.

Claims

1. Anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina (Hep) ou um peptídeo de hepcidina, caracterizado por compreender uma constante de dissociação (Kd) é menos que 500 pM, dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácido SEQ ID NO: 44 e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácido SEQ ID NO: 50.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente à hepcidina (Hep) ou um peptídeo de hepicidina, caracterizado por compreender uma constante de dissociação (Kd ) de menos de 500 pM, dito anticorpo, ou fragmento de ligação do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 46, e uma região variável cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 52.

3. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo bivalente, um anticorpo multiespecífico, um maxibody, um nanocorpo ou um anticorpo humanizado.

4. Fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, um fragmento Fab’, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento scFv ou um polipeptídeo de ligação de cadeia única.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga especificamente a um epítopo em hepcidina-20, hepcidina-22, e hepcidina-25.

6. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato ser na produção de um medicamento para tratamento de distúrbios de homeostase de ferro, modulação de atividade de hepicidina, hemocramatose, indivíduo com elevado nível de hepicidina, anemia refratária por deficiência de ferro (IRIDA), anemia, anemia de inflamação, ou doença inflamatória, ou infecção em um indivíduo em necessidade do mesmo.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de dito medicamento adicionalmente compreender um estimulante de eritropoiese, dito estimulante de eritropoiese selecionado do grupo que consiste em eritropoietina, uma variante de eritropoietina e um anticorpo que se liga à eritropoietina.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita infecção é infecção bacteriana, fúngica ou viral.

9. Uso, de acordo coma reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dito medicamento é formulado para injeção.

10. Meio contentor compreendendo anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tal meio contentor é um receptáculo, uma seringa, uma garrafa ou uma ampola.

11. Kit para tratar um distúrbio associado a níveis de hepcidina elevados ou um distúrbio de homeostase de ferro, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um estimulante de eritropoiese.