MXPA06014742A

MXPA06014742A - Nueva epo carbamilada y metodo para su produccion.

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Publication number: MXPA06014742A
Application number: MXPA06014742A
Authority: MX
Inventors: Soren Christensen; Lars Foldager; Jesper Valbjorn; Marianne Hallberg Thuesen; Anders Hjelholt Pedersen; Morten Munk
Original assignee: Lundbeck & Co As H
Priority date: 2004-07-07
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2007-02-16
Also published as: JP2008505133A; WO2006002646A2; EA011586B1; HRP20090343T1; EA200700255A1; DE602005014117D1; BRPI0513029A; PT1781697E; AU2005259689A1; EP1781697A2; ES2325034T3; HK1109631A1; NO20070687L; PL1781697T3; WO2006002646A3; SI1781697T1; CY1109232T1; IL180518A0; JP5025470B2; CA2572643A1

Abstract

La presente invencion describe un metodo para la produccion de nueva eritropoyetina carbamilada; composiciones que comprenden la nueva eritropoyetina carbamilada; sus composiciones farmaceuticas y sus usos.

Description

NUEVA EPO CARBAMILADA Y MÉTODO PARA SU PRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN La presente invención está dirigida a un nuevo compuesto, así como también a un método para la producción de dicho compuesto. El nuevo compuesto, eritropoyetina carbamilada (CEPO) , se caracteriza por estar carbamilado en todas o en la mayoría de las aminas primarias de usinas, y en el aminoácido N-terminal de la molécula; además, este compuesto posee bajo nivel de carbamilación de las aminas primarias de otros aminoácidos en la molécula. Adicionalmente, este nuevo compuesto está libre de polímeros y de proteínas agregadas, y es adecuado para el uso en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, en el sistema nervioso central o periférico y en otros tejidos que expresan el receptor de EPO central. Otra ventaja sorprendente del presente método de producción es que el método provee un producto que contiene menos proteína agregada y menos polímeros, que los productos logrados con otros métodos de carbamilación conocidos descritos para eritropoyetina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La alteración de la actividad hematopoyética biológica de la EPO carbamilada la han demostrado R. y col. (1990), Biochimi ca et Biophysica Acta ; 1038: 125-129; y Mun, K-C y Golper, T. A. (2000), Blood Purif . , 18: 13-17. Brines y col., 2003, Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2003 0072737, demostraron que la pérdida de la actividad hematopoyética no interfería con las propiedades protectoras de tejido de la EPO. La carbamilación de proteínas es ampliamente conocida como un efecto colateral del uso de urea en la purificación de proteínas, y como resultado de los altos niveles de urea en suero. Esto es provocado por la descomposición espontánea de urea hasta el cianato. El cianato es responsable de la carbamilación de las aminas primarias (grupos alfa-amino y grupos épsilon-amino) de la proteína; en consecuencia, el extremo N-terminal y las usinas de una proteína son susceptibles a la carbamilación (Figura 1) . Adicionalmente, otros residuos de aminoácidos potenciales susceptibles a la carbamilación son arginina, cisteína, tirosina, ácido aspártico, ácido glutámico e histidina; sin embargo, la reacción es dependiente del pH, y no procede tan fácilmente como con el residuo N-terminal y usina.

Las investigaciones para revelar si la carbamilación de proteínas podía mejorar o disminuir la actividad biológica de las proteínas han sido realizadas por Horkkd, S. y col. (1992), Kidney In terna ti onal , 41: 1175-1181; Plapp, B. V. y col., (1971), Jour. Biol . Chem . , 246 (4): 939-945; Satake, R. y col., (1990), Biochimi ca et Biophysica Acta , 1038: 125-129; y Mun, K-C y Golper, T. A. (2000), Blood Purif . , 18: 13-17. Todos ellos investigaron el efecto biológico de la carbamilación de proteínas empleando KCNO como fuente de cianato, y observaron una declinación o cambio en la actividad biológica como resultado de la mayor carbamilación. La evaluación del grado de carbamilación se basó en dos métodos analíticos: 1. Medición de la disminución de grupos amino libres usando un ensayo de ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) ; y 2. Análisis de aminoácidos por medio de la determinación de usinas convertidas en residuos de homocitrulina . Horkko, S. y col. (1992) carbamilaron una lipoproteína de baja densidad durante un máximo de 6 horas a 37°C con KCNO 2 M, aunque no obtuvieron una proteína completamente carbamilada, conforme a la medición con el ensayo de TNBS. Plapp, B. V. y col. (1971) investigaron el efecto del tiempo, y obtuvieron una desoxirribonucleasa A pancreática bovina casi completamente carbamilada, después de un tratamiento de 24 horas con KCNO 1 M a 37°C. Mun, K-C y Golper, T. A. (2000) investigaron el efecto del tiempo con un máximo de 6 horas de tiempo de reacción, usando KCNO 2 M. Además investigaron el efecto del aumento de la concentración de KCNO, con un tiempo de 6 horas, donde todas las reacciones estaban a una temperatura de 37°C. Mun, K-C y Golper, T. A. (2000) no pudieron verificar, a partir del diseño experimental, el grado exacto de carbamilación (referirse a la página 16, líneas 33-35) . Nosotros hallamos, en la presente invención, que la carbamilación de EPO producía polímeros y agregados, y que en consecuencia, no era adecuada como un producto biofarmacéutico . Además, hallamos que la formación de estos polímeros y agregados dependía de las condiciones del proceso para la carbamilación. Por lo tanto, fue necesaria la formulación de un proceso con óptimos parámetros en relación al pH, tiempo, concentración de cianato, temperatura, concentración de proteína y, principalmente, el grado de polimerización de proteína. La presente invención comprende un proceso óptimo para la carbamilación, que logra un producto con bajo grado de polimerización y agregación, y además, de manera sorprendente, hallamos que se obtenía una EPO completamente carbamilada, que apuntaba a los residuos N-terminales y a todas las usinas (esto último se produce en un intervalo de pH específico) . Se realizó una etapa posterior del método de la invención a fin de eliminar los polímeros y agregados formados. La EPO pura carbamilada resultante es un compuesto nuevo, y se reclama como tal en la presente solicitud, junto con composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto. Se ha descrito anteriormente que el grado de carbamilación depende de la concentración de cianato y del tiempo. Sin embargo, no se ha descrito la manera de obtener un proceso de carbamilación que pueda ser adaptado a escala, para la producción de un producto biofarmacéutico. La presencia de agregados mediante la producción subóptima se ha relacionado con la inducción de anticuerpos. Por lo tanto, la presencia de agregados logra un producto biofarmacéutico no adecuado para el uso en humanos. El proceso de carbamilación y purificación descrito en la presente invención conduce a una proteína caracterizada por estar completamente carbamilada, con la menor formación posible de polímeros y agregados, y con la mínima pérdida de producto final. De aquí que convierte a este proceso en una etapa viable y económica. El procesamiento adicional de la proteína carbamilada logra un producto útil como producto biofarmacéutico, que sólo tiene riesgo mínimo de generación de respuesta inmunológica a la proteína, debido a los agregados y polímeros. Los métodos analíticos para evaluar la carbamilación completa son, además del análisis de aminoácidos: TNBS para grupos amino primario libres, y finalmente, una caracterización del producto y producto digerido por MALDI-TOF. El nuevo compuesto de la invención, que es eritropoyetina completamente carbamilada en grupos amino libres en el extremo N-terminal y usinas de la molécula, y que además, no está agregada ni polimerizada hasta un contenido de más del 2.5%, y que contiene un mínimo de eritropoyetina sobre- o subcarbamilada, se puede usar para la producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades que responden a los efectos neuroprotectores de la eritropoyetina natural.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un procedimiento de carbamilación de proteína, que puede usarse en escala, para la producción de productos biofarmacéuticos. Además, se relaciona con el producto del proceso, con composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto, y con el uso de dichas composiciones. El proceso de carbamilación y purificación descrito en la presente solicitud conduce a una proteína caracterizada por estar completamente carbamilada, con la menor formación posible de polímeros y agregados, y con la mínima pérdida de producto final. El proceso de carbamilación se ha optimizado a fin de obtener una proteína carbamilada, con la menor cantidad de polímero y agregados, lo que lo convierte en un proceso viable y económico. El producto final adicionalmente contiene cantidades limitadas de isoformas de eritropoyetina sobre- o subcarbamilada (menos o más de 9 carbamilaciones por molécula) . La EPO subcarbamilada podría contener menos de 9 residuos de carbamilo, esto es, no todas las ocho usinas y extremo N están carbamilados . La EPO subcarbamilada puede tener tan pocos como 5 residuos carbamilo, e incluso no poseer actividad eritropoyética clásica, por lo que es adecuada para el uso en la presente invención. La EPO sobrecarbamilada tiene más de 9 residuos de carbamilo, y tendrá carbamilaciones en aminoácidos diferentes de los ocho residuos de lisina y el término N. La CEPO puede tener tanto como 15 residuos de carbamilo, y aun poseer el efecto deseado, es decir, no presentar actividad eritropoyética clásica. Por lo menos aproximadamente 90%, y más probablemente, 95% de las isoformas CEPO están carbamiladas sólo en los 8 residuos de lisina y extremo N. El procesamiento adicional de la proteína carbamilada elimina producto agregado y polimerizado hasta un nivel máximo de 3% ó 2.5%, y en consecuencia, logra un producto útil como producto biofarmacéutico, sólo con mínimo riesgo de generación de respuesta inmunológica a la proteína debido a agregados y polímeros. Los métodos analíticos para la evaluación de la carbamilación son, además del análisis de aminoácidos: TNBS para los grupos amino primario libres, y una caracterización del producto y producto digerido por MALDI-TOF y LC-MS/MS.' DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Método de elaboración El método de carbamilación de las proteínas consiste en seis etapas: 1. Concentración por ultrafiltración . 2. Modificación por carbamilación. 3. Desalación por filtración de gel. 4. Purificación por intercambio aniónico. 5. Concentración e intercambio de amortiguador por ultra-y diafiltración . 6. Filtración a través de 0.22 µm. El material inicial del presente proceso de carbamilación es EPO humana purificada de modo conveniente, aunque puede ser cualquier forma de EPO de tipo animal o humano; ejemplos, sin limitación, son EPO humana sintética o biotecnológica, o EPO humana biotecnológica modificada biológica o químicamente, tal como asialo-EPO; mutantes de EPO humana, es decir, una molécula donde se introducen cambios en la secuencia de aminoácidos; fragmentos de EPO; péptidos de EPO; otras proteínas; o una mezcla de proteínas, si se desea carbamilar varias proteínas. La primera etapa del proceso implica un ajuste de la concentración de proteína por ultrafiltración; la concentración de proteína se ajusta con el propósito de mantener un bajo volumen de proceso. La concentración de proteína es de 0.05-10 mg/ml, o de 0.05-8 mg/ml en una modalidad preferida. En una modalidad más preferida es de 0.05-7 mg/ml; y más preferentemente, 2-5 mg/ml. Si se aumenta la concentración, se forman agregados en mayor medida. La ultrafiltración se efectúa por medio de un instrumento BioMax (Millipore) con un MWCO (sigla en inglés de molecular weigh t cutoff (corte de peso molecular) ) de 5 kDa. Se pueden aplicar otros filtros. Además, la solubilidad de la proteína se puede ajustar agregando estabilizadores . Después de completarse la etapa de la concentración, la solución de proteína se mezcla con K-borato tetrahidratado, K-cianato, con un pH de 7-11, o un pH de 7-10. En una modalidad preferida, el pH es de 8 a 10, y más preferentemente de 9.0. Los intervalos de temperatura oscilan entre 0°C-60°C; 0°C-50°C; 0°C-40°C; ó 0°C-<37°C, si bien, en una modalidad preferida, el intervalo de temperatura es de 30°C-34°C, preferentemente, 32°C, para una ventana de tiempo de 10 minutos-30 días; 30 minutos-30 días; 1 hora-30 días; 1 hora-20 días; 1 hora-10 días; 1 hora-5 días; 1 hora-2 días; 1 hora-26 horas; 18-26 horas, o preferentemente, 22 horas-26 horas, y más preferentemente, 24 horas. Sin embargo, estos intervalos preferidos podrían cambiarse si se cambian otros parámetros del proceso, es decir, la temperatura, la concentración de cianato y la concentración de proteína. Si la temperatura es inferior a los límites, el rendimiento será bajo, ya que la carbamilación será lenta e ineficiente; si se exceden los límites de temperatura, el rendimiento será bajo debido a la mayor agregación. Otro parámetro crucial es el tiempo, ya que la carbamilación no se completará si se disminuye el tiempo; o si se aumenta el tiempo, se observará la formación de agregados, y se obtendrá menor rendimiento. Por lo tanto, se presenta un proceso con parámetros coherentes; esto es, si la temperatura se disminuye, la menor reacción de carbamilación podrá compensarse aumentando la concentración de cianato o el tiempo de la reacción. Adicionalmente, si se disminuye el tiempo de reacción, la menor reacción de carbamilación se podrá compensar aumentando la temperatura o la concentración de cianato. Finalmente, en un proceso con menor concentración de cianato, la menor reacción de carbamilación se podrá compensar aumentando el tiempo de reacción y/o la temperatura. Por lo tanto, en conclusión un cambio significativo de un parámetro crucial (tiempo, temperatura, concentración de cianato y concentración de proteína) implicará un cambio en uno o más de los otros parámetros cruciales, a fin de obtener una molécula completamente carbamilada, con baja formación de agregados y polímeros. La concentración de amortiguador de borato puede ser de 0.05-2 M, aunque en una modalidad preferida, es de 0.1-1 M, y más preferentemente de 0.5 M, ya que el cianato se hidroliza inherentemente y se polimeriza con la absorción de protones, y la falta de capacidad amortiguadora produce una desviación del pH de la solución.

Además, se prefiere una concentración de cianato en el intervalo de 0.05-10 M; 0.05-8 M; 0.05-6 M; 0.05-4 M; o 0.05-2 M; en una modalidad preferida, es de 0.05-1 M y más preferentemente de 0.5 M. Es necesaria una concentración de amortiguador de borato de 0.5 M, a fin de controlar la desviación de pH causada por la absorción de protones de la concentración de cianato de 0.5 M utilizada. Se puede emplear un proceso que utilice otras sales de cianato y borato. Adicionalmente, se pueden emplear otros amortiguadores de la reacción diferentes del borato, por ejemplo, un amortiguador de carbonato o un amortiguador de fosfato. La desalación de la mezcla de reacción de proteína y cianato se lleva a cabo por medio de una filtración de gel cromatográfica. Se emplea la matriz G-25 Fine (Amersham Biosciences) . Se controla el tiempo de retención antes de la aplicación de la muestra a la columna, y no debe exceder las 2 horas; de lo contrario, se producirá carbamilación adicional y formación de polímero. La desalación y el cambio de amortiguador de las proteínas se pueden realizar mediante diálisis, diaultrafiltración, o por medio de una filtración de gel cromatográfica . Se pueden aplicar otras matrices de filtración de gel, tales como matrices de polisacáridos reticulados o polisacáridos mixtos reticulados, poliacrilamida, poliestireno, o matrices de naturaleza cerámica. Además, en esta etapa puede variarse la altura de la columna. La etapa de carbamilación se puede ajustar a fin de obtener un producto con menos de 30% de agregados y polímeros, o menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 12.5%, menos de 10%, menos de 8% o menos de 7%. La eliminación de agregados y polímeros se realiza por medio de una etapa de purificación usando intercambio aniónico. Se observa que se puede separar EPO carbamilada de los restos del material inicial y de los agregados y polímeros. El amortiguador del proceso A es: 0.3% Tris (25 mM) , 0.3% (50 mM) NaCl, pH 8.5 ± 0.2, y el amortiguador de elución B es: 0.3% Tris (25 mM) , 5.8% (1 M) NaCl, pH 8.5 ± 0.2. El gradiente se lleva a cabo con 0-30% en 20 volúmenes de columna, para obtener la separación deseada. La etapa de purificación puede lograr un producto con menos de 3% de agregados y polímeros; menos de 2.5%; menos de 2%; menos de 1.5%; menos de 1%; o menos de aproximadamente 0.5%. La elución, recolección y reunión del pico de EPO carbamilada influyen en la distribución de la heterogeneidad, esto es, las isoformas, de la proteína eluida. En otras palabras, las cantidades de CEPO sobre- y subcarbamilada variarán según el procedimiento de recolección y reunión. Una reunión estrecha conducirá a la disminución del contenido de eritropoyetina sobre- o subcarbamilada. El aumento de la longitud del gradiente permitirá la selección de un producto más definido, por ejemplo, descartando algunas especies. Una composición de EPO carbamilada con menos de aproximadamente 40% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI, constituye una modalidad de la invención. Una modalidad más preferida es una CEPO con menos de aproximadamente 35% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad aun más preferida es una CEPO con menos de aproximadamente 30% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad de mayor preferencia es una CEPO con menos de aproximadamente 25% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad incluso más preferida es una CEPO con menos de aproximadamente 20% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad aun más preferida es una CEPO con menos de aproximadamente 15% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad de mayor preferencia es una CEPO con menos de aproximadamente 10% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad aun más preferida es una CEPO con menos de aproximadamente 5% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Una modalidad incluso más preferida es una CEPO con menos de aproximadamente 2% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. La modalidad de mayor preferencia es una CEPO con menos de aproximadamente 1% de isoformas sobre- y subcarbamiladas en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Además de influir en el contenido general de las isoformas, la recolección y reunión del pico de EPO carbamilada influyen sobre la distribución de CEPO sobrecarbamilada . Se prefiere que la cantidad de isoformas de CEPO sobrecarbamilada sea inferior a aproximadamente 35% en peso, medida por espectrometría de masa ESI. Se prefiere aun más que la cantidad de CEPO sobrecarbamilada sea menos de aproximadamente 30% en peso, medida por espectrometría de masa ESI, y aun más preferentemente, se prefiere que la cantidad de CEPO sobrecarbamilada sea menos de aproximadamente 25% en peso, y aun más preferentemente, menos de alrededor de 20%, más preferentemente, menos de alrededor de 15%. Con mayor preferencia, la cantidad de EPO sobrecarbamilada no debería ser mayor que aproximadamente 10%, aproximadamente 5%, o aproximadamente 1% en peso de la CEPO total.

Se pueden emplear otros amortiguadores de proceso y de elución como otras matrices de intercambio aniónico, y se pueden utilizar filtros cargados. Ejemplos, sin limitación, de las matrices son polisacáridos reticulados o polisacáridos mixtos reticulados, poliacrilamida, poliestireno o matrices de naturaleza cerámica. Además, se pueden utilizar incluso intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión por tamaño, para la purificación. En la siguiente etapa para el ajuste de la concentración y amortiguador, se usa una unidad de filtración de flujo tangencial de dia/ultrafiltración. La EPO carbamilada se ajusta a una concentración de >0.5 mg/ml, y el amortiguador se cambia a un amortiguador de citrato 20 mM, NaCl 100 mM. El cambio de concentración y amortiguador se realiza por medio de un instrumento BioMax (Millipore) con un MWCO de 5 kDa. Pueden aplicarse otros filtros. Finalmente, la sustancia de fármaco, biofarmacéutica purificada se filtra a través de 0.22 µm usando un instrumento Millipak (Millipore) , para reducir los gérmenes. Se puede emplear cualquier filtro de 0.22 µm.

Por medio de este método, se obtiene una EPO completamente carbamilada, con menos de 3%, o preferentemente, menos de 2.5% de agregados, medido por SEC-HPLC. La carbamilación completa de los 8 residuos de lisina se verificó usando análisis de aminoácidos, por medio de la determinación de las usinas convertidas en homocitrulina . Además, se siguió la carbamilación mediante el ensayo de TNBS para la determinación de aminas primarias, que mostró así la carbamilación completa de usinas y extremo N-terminal. Adicionalmente, una caracterización completa usando MALDI-TOF determinó el cambio en la masa intacta, tanto de la proteína tratada con PNGasa, como de la proteína con los N-glicanos. Además de MALDI-TOF, el análisis de huella de masa peptídica/análisis LC-MS/MS mostraron que las ocho usinas y el extremo N-terminal estaban carbamilados . No se detectaron otros aminoácidos carbamilados , ni modificaciones de los glicanos. Aún más, se obtuvo un menor contenido de formas sobre- y subcarbamiladas de EPO, en el producto final. Este producto es novedoso, y se reclama. Una modalidad de la invención consiste en la composición obtenida después de la etapa de carbamilación, pero antes de la purificación de intercambio aniónico, que comprende EPO completamente carbamilada, con menos de aproximadamente 40% en peso de agregados y polímeros, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 12.5%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 8%, o menos de aproximadamente 7%, y una cantidad de cianato. Otra modalidad de la invención consiste en la composición obtenida después de la purificación de intercambio aniónico, que comprende una EPO carbamilada, con menos de aproximadamente 3% en peso de agregados y polímeros, o menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1.5%, o menos de aproximadamente 1%, o menos de aproximadamente 0.5%. Además, esta composición comprende isoformas que consisten en EPO sobre- o subcarbamilada en cantidades menores que aproximadamente 40% en peso de la EPO carbamilada total, o más preferentemente, en menos de aproximadamente 35%, o menos de aproximadamente 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 7.5%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 2%, y con mayor preferencia, menos de aproximadamente 1%. Además, la cantidad de EPO sobrecarbamilada en la composición puede ser inferior a aproximadamente 35% en peso de la EPO carbamilada total, o más preferentemente, inferior a aproximadamente 30%, o inferior a aproximadamente 25%, o inferior a aproximadamente 20%, o inferior a aproximadamente 15%, o inferior a aproximadamente 10%, o inferior a aproximadamente 7.5%, o inferior a aproximadamente 5%, o inferior a aproximadamente 2%, y con mayor preferencia, inferior a aproximadamente 1%.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención comprende el uso de los compuestos de la invención para la producción de composiciones farmacéuticas, que van a ser utilizadas en humanos o mamíferos, para el tratamiento de las afecciones que se describen más adelante. Una modalidad de la invención consiste en una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de EPO carbamilada, con menos de aproximadamente 3% en peso de agregados y polímeros, o más preferentemente menos de aproximadamente 2.5%, o menos de aproximadamente 2%, o menos de aproximadamente 1.5%, o menos de aproximadamente 1% y con mayor preferencia, menos de aproximadamente 0.5%, y además, esta composición comprende isoformas que consisten en EPO sobre- o subcarbamilada en cantidades inferiores a aproximadamente 40% en peso de EPO carbamilada total, o más preferentemente, en menos de alrededor de 35%, o menos de alrededor de 30%, o menos de aproximadamente 25%, o menos de aproximadamente 20%, o menos de aproximadamente 15%, o menos de aproximadamente 10%, o menos de aproximadamente 5%, o menos de aproximadamente 3%, o menos de aproximadamente 2%, y con mayor preferencia, menos de aproximadamente 1%. Además, la cantidad de EPO sobrecarbamilada en la composición puede ser inferior a aproximadamente 35% en peso de la EPO carbamilada total, o más preferentemente, inferior a aproximadamente 30%, o inferior a aproximadamente 25%, o inferior a aproximadamente 20%, o inferior a aproximadamente 15%, o inferior a aproximadamente 10%, o inferior a aproximadamente 5%, o inferior a aproximadamente 3%, o inferior a aproximadamente 2%, y con mayor preferencia, inferior a aproximadamente 1%. En la práctica de un aspecto de la presente invención, una composición farmacéutica como se describe con anterioridad, que contiene el compuesto de la invención, se puede administrar a un mamífero por cualquier vía que proporcione un nivel suficiente del compuesto de la invención en la vasculatura, a fin de permitir la traslocación a través de una barrera celular endotelial y efectos beneficiosos en las células receptoras. Cuando se emplea con propósitos de perfusión de un tejido u órgano, se desean resultados similares. En el caso donde las células o el tejido no están vascularizados, o la administración es por medio del baño de las células o el tejido con la composición de la invención, la composición farmacéutica provee una cantidad eficaz, sensible, beneficiosa para la célula, de un compuesto de la invención. Las barreras celulares endoteliales a través de las cuales el compuesto de la invención puede traslocarse incluyen uniones estrechas, uniones perforadas, uniones fenestradas y cualquier otro tipo de barreras endoteliales presentes en un mamífero. Una barrera preferida es una unión estrecha de célula endotelial, si bien la invención no se limita a ella. El compuesto mencionado de la invención es útil, en general, para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades humanas del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico, que tienen principalmente síntomas neurológicos o psiquiátricos; enfermedades oftálmicas; enfermedades cardiovasculares; enfermedades cardiopulmonares; enfermedades respiratorias; enfermedades renales, urinarias y reproductivas; enfermedades gastrointestinales; y anormalidades endocrinas y metabólicas. En particular, dichas afecciones y enfermedades incluyen afecciones hipóxicas que afectan de manera adversa los tejidos excitables, tales como los tejidos excitables en el tejido del sistema nervioso central, en tejido del sistema nervioso periférico, o tejido cardíaco o retiniano, tal como por ejemplo el cerebro, corazón o retina/ojo. Por lo tanto, el compuesto de la invención se puede utilizar para tratar o prevenir el daño a tejido excitable, resultante de afecciones hipóxicas en una variedad de afecciones y circunstancias. Ejemplos, sin limitación, de dichas afecciones y circunstancias se proveen en la tabla que se presenta más adelante. En el ejemplo de la protección de patologías de tejido neuronal que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención, dichas patologías incluyen aquellas resultantes de la menor oxigenación de tejidos neuronales. Cualquier afección que reduzca la disponibilidad de oxígeno en el tejido neuronal, que produzca estrés, daño, y finalmente, muerte celular neuronal, puede tratarse con los métodos de la presente invención. Referidas en general como hipoxia y/o isquemia, estas afecciones abarcan, sin restricción, accidente cerebrovascular, oclusión vascular, privación de oxígeno prenatal o posnatal, sofocación, ahogo, ahogo por llenado pulmonar con líquidos, envenenamiento con monóxido de carbono, inhalación de humo, traumatismo, incluso por cirugía y radioterapia, asfixia, epilepsia, hipoglucemia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, choque hipotensivo, choque séptico, choque anafiláctico, choque insulínico, crisis drepanocítica, paro cardíaco, arritmia, narcosis nitrógena y déficits neurológicos causados por procedimientos de derivación o bypass de corazón-pulmón. En una modalidad, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas específicas que comprenden la composición de la invención se pueden administrar a fin de prevenir lesiones o daños de tejidos contra el riesgo de lesión o daño de tejido en procedimientos quirúrgicos, tales como por ejemplo resecciones de tumores o reparación de aneurismas. Otras patologías causadas por la hipoglucemia, o resultantes de ella, que pueden tratarse con los métodos que se describen en esta solicitud abarcan sobredosis insulínica, también denominada hiperinsulinemia iatrogénica, insulinoma, deficiencia de hormona de crecimiento, hipocortisolismo, sobredosis por fármacos y ciertos tumores. Otras patologías resultantes del daño de tejido neuronal excitable incluyen trastornos de aparición repentina tales como epilepsia, convulsiones o trastornos de aparición repentina crónicos. Otras enfermedades y afecciones que pueden tratarse comprenden, sin limitación, enfermedades tales como accidente cerebrovascular (ACV isquémico, hemorragia subaracnoidea, hemorragia intracerebral) , esclerosis múltiple, hipotensión, paro cardíaco, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, parálisis cerebral, traumatismo cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad, pérdida de la memoria, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos de aparición repentina, alcoholismo, isquemia retiniana, daño del nervio óptico como consecuencia de glaucoma, y pérdida neuronal. La composición específica y los métodos de la presente invención se pueden usar para tratar inflamación como consecuencia de estados patológicos o diversos traumatismos, tales como la inflamación inducida física o químicamente. Dichos traumatismos podrían incluir vasculitis, bronquitis crónica, pancreatitis, osteomielitis, artritis reumatoide, glomerulonefritis, neuritis óptica, arteritis temporal, encefalitis, meningitis, mielitis transversal, dermatomiositis, polimiositis, fascitis necrosante, hepatitis y enterocolitis necrosante. Las pruebas han demostrado que los astrocitos activados pueden ejercer una función citotóxica hacia las neuronas, produciendo neurotoxinas . Se liberan óxido nítrico, especies reactivas con oxígeno y citocinas desde los neurogliocitos en respuesta a la isquemia cerebral (ver Becker, K. J. , 2001, "Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke". Curr. Opinión Neurol . , 14: 349-353, y Mattson, M. P., Culmsee, C. y Yu, Z. F., 2000, "Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke". Cell Tissue Res . , 301, 173-187). Los estudios han demostrado además que en modelos de neurodegeneración, la activación neuroglial y posterior producción de citocinas inflamatorias dependen del daño neuronal primario (ver Viviani, B., Corsini, E., Galli, C. L., Padovani, A., Ciusani, E. y Marinovich, M., 2000, "Dying neural cells actívate glia through the reléase of a protease product". Glia , 32: 84-90, y Rabuffetti, M., Scioratti, C, Tarozzo, G., Clementi, E., Manfredi, A. A. y Beltramo, M., 2000, "Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines". J. Neurosci . , 20: 4398-4404). La activación y la inflamación neuroglial son comunes a diferentes formas de trastornos neurodegenerativos, entre ellos, isquemia cerebral, traumatismo cerebral y encefalomielitis alérgica experimental, trastornos en los cuales la eritropoyetina ejerce un efecto neuroprotector . La inhibición de la producción de citocinas por la eritropoyetina podría, al menos en parte, mediar su efecto protector. Sin embargo, a diferencia de las citocinas antiinflamatorias "clásicas" tales como IL-10 e IL-13, que inhiben la producción de factor de necrosis tumoral directamente, la eritropoyetina parece ser activa sólo en presencia de muerte neuronal. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría particular, pareciera que esta actividad antiinflamatoria puede explicarse hipotéticamente por varias teorías no limitantes. En primer lugar, debido a que la eritropoyetina previene la apoptosis, se evitarían los sucesos inflamatorios disparados por la apoptosis. Además, la eritropoyetina puede prevenir la liberación de señales moleculares desde neuronas moribundas que estimulan los neurogliocitos, o podría actuar directamente en los neurogliocitos, reduciendo su reacción con estos productos. Otra posibilidad es que la eritropoyetina apunte a miembros más próximos de la cascada inflamatoria (por ejemplo, caspasa 1, intermediarios reactivos con oxígeno o nitrógeno) , que disparan tanto la apoptosis como la inflamación. Adicionalmente, la eritropoyetina parece proporcionar protección antiinflamatoria, sin el efecto de rebote asociado típicamente con otros compuestos antiinflamatorios, tales como dexametasona . Una vez más, sin deseos de limitarse a ninguna teoría particular, pareciera que esto pudiera deberse al efecto de la eritropoyetina sobre neurotoxinas de múltiples propósitos, tales como óxido nítrico (NO, por sus siglas en inglés) . Si bien los astrocitos activados y microneuroglia producen cantidades neurotóxicas de NO en respuesta a varios traumatismos, el NO cumple muchas funciones dentro del organismo, entre ellas, la modulación de funciones fisiológicas esenciales. Por lo tanto, aunque el uso de un antiinflamatorio puede aliviar la inflamación suprimiendo NO u otras neurotoxinas, si el antiinflamatorio tiene vida media demasiado larga, también puede interferir con las funciones de estos agentes químicos en la reparación del daño resultante del traumatismo que condujo a la inflamación. Se expone la hipótesis de que el compuesto de la presente invención puede aliviar la inflamación, sin interferir con las capacidades restauradoras de las neurotoxinas, tales como NO. Las composiciones específicas y los métodos de la invención se pueden usar para tratar afecciones y daños del tejido retiniano. Dichos trastornos incluyen, sin limitación, isquemia retiniana, degeneración macular, desprendimiento de retina, retinitis pigmentosa, retinopatía arteriosclerótica, retinopatía hipertensiva, bloqueo de la arteria retiniana, bloqueo de la vena retiniana, hipotensión y retinopatía diabética.

En otra modalidad, los métodos y principios de la invención se pueden usar para proteger o tratar lesiones resultantes del daño por radiación o daño inducido por quimioterapia, al tejido excitable. En un ejemplo no limitante, para proteger de los daños provocados por compuestos como taxanos, cisplatino y otros productos quimioterapéuticos con el potencial para inducir neuropatías periféricas. Otra utilidad de los métodos de la presente invención es en el tratamiento de envenenamiento por neurotoxinas, tal como intoxicación por mariscos con ácido domoico, neurolatirismo y enfermedad de Guam, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Parkinson. Como se menciona con anterioridad, la presente invención también está dirigida a un método para mejorar la función de tejidos excitables en un mamífero, mediante la administración periférica de un compuesto de la invención, como se describe anteriormente. Con este método, pueden tratarse varias enfermedades y afecciones; además, este método es útil para mejorar la función cognitiva en ausencia de cualquier enfermedad o afección. Estos usos de la presente invención se describen en mayor detalle a continuación, e incluyen la mejoría del aprendizaje y el entrenamiento, tanto en humanos como en mamíferos no humanos.

Las afecciones y enfermedades que pueden tratarse con los métodos de este aspecto de la presente invención dirigidos al sistema nervioso central comprenden, sin limitación, trastornos del ánimo, trastornos de ansiedad, depresión, autismo, trastornos de hiperactividad y déficit de atención y disfunción cognitiva. Estas afecciones se benefician con el aumento de la función neuronal. Otros trastornos que se pueden tratar de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen, por ejemplo, alteraciones del sueño, apnea del sueño y trastornos relacionados con el viaje; sangrados subaracnoideos y aneurísmicos, choque hipotensivo, lesión por conmoción, choque séptico, choque anafiláctico y secuelas de varias encefalitis y meningitis bacterianas, por ejemplo, cerebritis bacteriana relacionada con enfermedad de tejido conectivo, tal como lupus. Otros usos incluyen la prevención o protección contra el envenenamiento por neurotoxinas, tales como la intoxicación por mariscos con ácido domoico, neurolatirismo, y enfermedad de Guam, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson; tratamiento posoperatorio para lesión embólica o isquémica; radiación cerebral total; crisis drepanocítica; y eclampsia . Otro grupo de afecciones que pueden tratarse con los métodos de la presente invención abarcan disfunción mitocondrial de naturaleza hereditaria o adquirida, que es la causa de una variedad de enfermedades neurológicas tipificadas por la lesión y muerte neuronal. Por ejemplo, la enfermedad de Leigh (encefalopatía necrosante subaguda) se caracteriza por la pérdida visual progresiva y encefalopatía, debida a la caída neuronal, y miopatía. En estos casos, el defectuoso metabolismo mitocondrial no provee suficientes sustratos de alta energía para abastecer el metabolismo de células excitables. Un modulador de la actividad del receptor de eritropoyetina optimiza la función de fracaso en la provisión, en una diversidad de enfermedades mitocondriales . Como se mencionó con anterioridad, las afecciones hipóxicas afectan de manera adversa los tejidos excitables. Los tejidos excitables incluyen, sin limitación, el tejido del sistema nervioso central, el tejido del sistema nervioso periférico, y tejido cardíaco. Además de las afecciones que se describen anteriormente, los métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de la intoxicación por inhalación, tal como la inhalación de monóxido de carbono y humo; asma grave; síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto; ahogo; y ahogo por llenado pulmonar con líquidos. Otras afecciones que crean afecciones hipóxicas, o inducen de otro modo el daño de los tejidos excitables, abarcan hipoglucemia que puede aparecer con la inapropiada dosificación de insulina, o con neoplasmas productores de insulina (insulinoma) . Se cree que varios trastornos neuropsicológicos que se originan del daño de tejido excitable pueden tratarse con los presentes métodos. Los trastornos crónicos en los cuales se compromete el daño neuronal, y para los cuales se proporciona el tratamiento de la presente invención, incluyen trastornos relacionados con el sistema nervioso central y/o el sistema nervioso periférico, entre ellos, pérdida de la función cognitiva relacionada con la edad y demencia senil, trastornos de aparición repentina crónicos, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia, pérdida de la memoria, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, esclerosis tuberosa, enfermedad de Wilson, parálisis supranuclear progresiva y cerebral, enfermedad de Guam, demencia de cuerpos de Lewy, enfermedades priónicas tales como encefalopatías espongiformes, por ejemplo enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington, distrofia miotónica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, ataxia de Freidrich y otras ataxias, así como también, síndrome de Gilíes de la Tourette, trastornos de aparición repentina tales como epilepsia y trastorno de aparición repentina crónico, ACV, traumatismo cerebral o de la médula espinal, demencia por SIDA, alcoholismo, autismo, isquemia retiniana, glaucoma, trastornos de la función autónoma tales como hipertensión y trastornos del sueño, y trastornos neuropsiquiátricos que comprenden, sin limitación, esquizofrenia, trastorno esquizoafectivo, trastorno de hiperactividad y déficit de atención, trastorno distímico, trastorno depresivo mayor, manía, trastorno obsesivo-compulsivo, trastornos de uso de sustancias psicoactivas, ansiedad, trastorno de pánico, así como también, trastornos afectivos unipolares y bipolares. Otros trastornos neuropsiquiátricos y neurodegenerativos comprenden, por ejemplo, los que se citan en el Diagnosti c and Sta ti stica l Manual of Men tal Disorders (DMS, por sus siglas en inglés) de la American Psychia tric Associa tion (Asociación Psiquiátrica Norteamericana) , en su versión más actual, IV, incorporado a la presente solicitud a modo de referencia, en su totalidad. En otra modalidad, se pueden usar moléculas de toxinas quiméricas biotecnológicas que comprenden un compuesto de la invención, para el suministro terapéutico de toxinas que tienen la finalidad de tratar un trastorno proliferativo, tal como cáncer, o trastorno viral, tal como panencefalitis esclerosante subaguda. La Tabla 1 cita otras indicaciones ejemplares, sin limitación, en relación a varias afecciones y enfermedades que pueden tratarse con los compuestos de la invención, mencionados Tabla 1 Enfermedad pulmonar Embolia pulmonar, trombosis isquémica pulmonar, embolia grasa Enfermedades pulmonares ambientales Enfermedad pulmonar Embolia pulmonar isquémica Trombosis pulmonar Enfermedad pulmonar Fibrosis pulmonar idiopática intersticial Congénita Fibrosis quística Neumonía central {Cor pulmonale) Traumatismo Neumonía y neumonía Infecciosa, parasitaria, tóxica, bacteriana traumática, quemadura, aspiración Sarcoidosis Páncreas Endocrina Diabetes mellitus, tipo I y II Insuficiencia de células beta, disfunción, neuropatía diabética Otra insuficiencia de células endocrinas del páncreas Exocrina Insuficiencia exocrina del pancreatitis páncreas Como ya se mencionó, estas enfermedades, trastornos o afecciones son sólo ilustrativos del abanico de beneficios provistos por el compuesto de la invención. En consecuencia, esta invención proporciona, en general, el tratamiento terapéutico o profiláctico de las consecuencias del traumatismo mecánico o de enfermedades humanas. Se prefiere el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades, trastornos o afecciones del SNC o del sistema nervioso periférico. Se provee el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades, trastornos o afecciones que tienen un componente psiquiátrico. Se provee también el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades, trastornos o afecciones que abarcan, sin limitación, aquellas que tienen un componente oftálmico, cardiovascular, cardiopulmonar, respiratorio, renal, urinario, reproductivo, gastrointestinal, endocrino o metabólico. En una modalidad, dicha composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención se puede administrar de manera generalizada a fin de proteger o mejorar las células, tejidos u órganos propuestos. Dicha administración puede efectuarse por vía parenteral, mediante inhalación, o por vía transmucosal, por ejemplo, oral, nasal, rectal, intravaginal, sublingual, submucosal o transdérmica. Preferentemente, la administración es parenteral, por ejemplo, por medio de la inyección intravenosa o intraperitoneal, y que también comprende, sin limitación, la administración intraarterial, intramuscular, intradérmica y subcutánea. Para otras vías de administración, tales como mediante perfusión, inyección en un órgano, u otra administración local, se proveerá una composición farmacéutica que logre niveles del compuesto de la invención similares a los descritos anteriormente. Se prefiere un nivel de aproximadamente 0.01 pM-30 nM. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que dicho compuesto está aprobado por una agencia reguladora del gobierno nacional o estatal, o está citado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea extranjera generalmente reconocida, para uso en animales, y más en particular, en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua y aceites, entre ellos, aquellos de origen animal, vegetal, sintético o de hidrocarburos, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa es una solución salina. Las soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosas también se pueden emplear como portadores líquidos, en particular, para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados comprenden almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio con aglutinantes y portadores tradicionales, tales como triglicéridos. Los compuestos de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres, tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres, tales como aquellas derivadas de hidróxidos férricos, de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington ' s Pharma ceuti cal Sciences , de E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador, a fin de proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración . Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración oral pueden proveerse como cápsulas o comprimidos; como polvos o granulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos) ; como batidos o espumas comestibles; o como emulsiones. Los comprimidos o cápsulas de gelatina dura pueden comprender lactosa, almidón o sus derivados, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, ácido esteárico o sus sales. Las cápsulas de gelatina blanda pueden comprender aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc. Las soluciones y jarabes pueden comprender agua, polioles y azúcares. Un agente activo propuesto para administración oral puede revestirse o mezclarse con un material que demore la desintegración o absorción del agente activo en el tracto gastrointestinal (por ejemplo, se pueden emplear monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol). Por lo tanto, puede lograrse la liberación sostenida de un agente activo durante muchas horas, y si es necesario, el agente activo se puede proteger contra la degradación en el estómago. Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular a fin de facilitar la liberación de un agente activo en una región gastrointestinal particular, debido a las condiciones enzimáticas o de pH específicas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden proveerse como parches separados, propuestos para permanecer en íntimo contacto con la epidermis del receptor, durante un período prolongado. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica pueden proveerse como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Para administración tópica a la piel, boca, ojos u otros tejidos externos, se usa preferentemente un ungüento o crema tópico. Cuando se formula en un ungüento, el ingrediente activo se puede emplear o bien con una base de ungüento parafínica, o miscible con agua. Alternativamente, el ingrediente activo se puede formular en una crema, con una base de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica al ojo comprenden gotas oculares. En estas composiciones, el ingrediente activo puede estar disuelto o suspendido en un portador adecuado, por ejemplo, en un solvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica a la boca incluyen comprimidos para disolución bucal, pastillas y lavados bucales. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal y pulmonar pueden comprender portadores sólidos, tales como polvos (preferentemente con un tamaño de partícula en el intervalo de 20 a 500 micrones) . Los polvos se pueden administrar de manera de aspirar una bocanada, esto es, mediante la rápida inhalación a través de la nariz, desde un recipiente de polvo que se mantiene cerca de la nariz. Alternativamente, las composiciones adoptadas para administración nasal pueden comprender portadores líquidos, por ejemplo, pulverizaciones nasales o gotas nasales. De manera alternativa, la inhalación directamente hacia los pulmones puede realizarse por inhalación profunda, o instalación a través de una boquilla en la orofaringe. Estas composiciones pueden comprender soluciones acuosas u oleosas del ingrediente activo. Las composiciones para administración por inhalación pueden proveerse en dispositivos especialmente adaptados, entre ellos, sin limitación, aerosoles presurizados, nebulizadores o insufladores, que pueden construirse de manera de proveer dosificaciones predeterminadas del ingrediente activo. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en la cavidad nasal directamente, o en los pulmones mediante la cavidad nasal u orofaringe. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden proveerse como supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden proveerse como óvulos, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverización . Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen suspensiones o soluciones inyectables acuosas y no acuosas estériles, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, agentes bacteriostáticos y solutos que sirven para que las composiciones sean sustancialmente isotónicas con la sangre del receptor propuesto. Otros componentes que pueden presentarse en dichas composiciones incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. Las composiciones adaptadas para administración parenteral pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y frascos sellados, y pueden almacenarse en forma secada por congelamiento (liofilizada), que solo requiere la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo, solución salina estéril para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las suspensiones y soluciones para inyección improvisada pueden prepararse a partir de polvos estériles, granulos y comprimidos. En una modalidad, puede proveerse un autoinyector que comprende una solución inyectable de un compuesto de la invención para uso de emergencia en ambulancias, salas de emergencias y situaciones de campo, y aun para autoadministración en un establecimiento doméstico, en particular, donde puede existir la posibilidad de amputación traumática, tal como con el uso imprudente de una cortadora de césped. Puede aumentar la probabilidad de que, luego del restablecimiento, las células y tejidos en el pie o dedo del pie seccionados sobrevivan, administrando un compuesto de la invención en múltiples sitios en la parte seccionada tan pronto como sea posible, aun antes de la llegada del personal médico al lugar, o de la llegada del individuo afectado con el dedo del pie seccionado, a la sala de emergencias. En una modalidad preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina, como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. En general, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente de solubilización y un anestésico local, tal como lidocaína, a fin de aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se proveen o bien por separado, o en mezcla en formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolla o saquillo que indica la cantidad de ingrediente activo. Cuando la composición debe administrarse por infusión, puede ser preparada en una botella de infusión que contiene solución salina o agua de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición debe administrarse por inyección, puede proveerse una ampolla de solución salina estéril, de manera que los ingredientes puedan ser mezclados antes de la administración. Los supositorios en general contienen ingrediente activo en el intervalo de 0.5% a 10% en peso; las formulaciones orales preferentemente contienen de 10% a 95% de ingrediente activo. Puede proveerse una composición de perfusión para uso en baños de órganos trasplantados, para perfusión in si tu, o para administración a la vasculatura de un donante de órgano, antes de la ablación del órgano. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender niveles del compuesto de la invención inadecuados para la administración aguda o crónica, local o generalizada, a un individuo, aunque cumplirán las funciones propuestas en esta solicitud en un cadáver, baño de órgano, perfusión de órgano, o perfusión in si tu antes de eliminar o reducir los niveles del compuesto de la invención allí contenidos, previamente a la exposición o devolución del tejido u órgano tratado a la circulación regular. La invención además provee un equipo o paquete farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente, junto con el recipiente o con los recipientes puede presentarse un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la elaboración, uso o venta de productos biológicos o farmacéuticos; dicho aviso refleja la aprobación de la agencia, para la elaboración, uso o venta con fines de administración a seres humanos. En otra modalidad, por ejemplo, el compuesto de la invención puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el polipéptido se puede administrar por medio de infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, puede emplearse una bomba (ver Langer, supra ; Sefton, 1987, CRC Cri t . Ref. Biomed. Eng. , 14: 201; Buchwald y col., 1980, Surgery, 88: 507; Saudek y col., 1989, N. Engl . J. Med. , 321: 574). En otra modalidad, el compuesto se puede administrar en una vesícula, en particular, un liposoma (ver Langer, Science, 249: 1527- 1533 (1990); Treat y col., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss New York, págs . 353-365 (1989); WO 91/04014; Patente de los Estados Unidos No. 4,704,355; Lopez-Berestein, ibid. , págs. 317-327; ver generalmente ibid. ) . En otra modalidad, se pueden emplear materiales poliméricos (ver Medi cal Appli ca tions of Con trol led Reléase, Langer y Wise (eds.), CRC Press: Boca Ratón, Florida, 1974; Con trolled Drug Bioavailabili ty, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley; New York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol . Sci . Rev. Macromol . Chem . , 23: 61, 1953; ver además Levy y col., 1985, Science, 228: 190; During y col., 1989, Ann . Neurol . , 25: 351; Howard y col., 1989, J. Neurosurg. 71: 105). En otra modalidad más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades del blanco terapéutico, esto es, las células, tejido u órgano blanco, y por lo tanto, sólo se necesitará una fracción de la dosis general (ver, por ejemplo, Goodson, págs. 115-138, en Medical Applica tions of Con trolled Reléase, vol. 2, supra , 1984). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la reseña de Langer (1990, Science, 249: 1527-1533). En otra modalidad, el compuesto de la invención, apropiadamente formulado, puede administrarse por vía nasal, oral, rectal, vaginal o sublingual. En una modalidad específica, puede ser conveniente administrar las composiciones de la invención en forma local a la zona que necesita tratamiento; esto puede efectuarse, por ejemplo, y no a modo de limitación, mediante infusión local durante la cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, junto con un vendaje para heridas luego de la cirugía; por inyección; por medio de un catéter; por medio de un supositorio; o por medio de un implante; dicho implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, por ejemplo, membranas, tales como membranas silásticas, o fibras. La selección de la dosis eficaz preferida será determinada por el experto en la técnica, sobre la base de diversos factores conocidos en la técnica. Dichos factores incluyen la forma particular de compuesto de la invención y sus parámetros farmacocinéticos, tales como biodisponibilidad, metabolismo, vida media, etc., que se habrán establecido en los procedimientos de desarrollo de rutina empleados habitualmente para obtener la aprobación de las agencias reguladoras para un compuesto farmacéutico. Otros factores que deben considerarse al establecer la dosis incluyen la afección o enfermedad por tratar o el beneficio por lograr en un individuo normal, la masa corporal del paciente, la vía de administración, si la administración es crónica o aguda, las medicaciones concomitantes, y otros factores bien conocidos que se sabe afectan la eficacia de los agentes farmacéuticos administrados. Por lo tanto, la dosificación precisa debe decidirse conforme al juicio del médico y las circunstancias de cada paciente, por ejemplo, según la afección y el estado inmunológico del paciente, y de acuerdo con técnicas clínicas convencionales. En otro aspecto de la invención, se provee una solución de perfusión o perfundido para la perfusión y almacenamiento de órganos para trasplante. La solución de perfusión comprende una cantidad del compuesto de la invención, eficaz para proteger las células sensibles y células, tejidos u órganos asociados. El trasplante abarca, sin limitación, xenotrasplante, donde un órgano (incluso células, tejido u otra parte corporal) es extirpado de un donante y trasplantado en un receptor diferente; y autotrasplante, donde se toma el órgano de una parte del cuerpo y se reemplaza con éste otra parte, lo que abarca procedimientos quirúrgicos en mesa de trabajo, en los cuales puede extirparse un órgano, y ex vi vo, puede reseccionarse, repararse o manipularse de otro modo, tal como para la extirpación de tumores, y luego retornarse a la ubicación original. En una modalidad, la solución de perfusión es la solución de la Universidad de Wisconsin (UW) (Patente de los Estados Unidos No. 4,798,824), que contiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 U/ml de eritropoyetina, hidroxietil-almidón al 5% (con un peso molecular desde aproximadamente 200,000 hasta aproximadamente 300,000, y sustancialmente libre de etilenglicol, etilenclorhidrina, cloruro _ de sodio y acetona) ; KH2P04 25 mM; glutatión 3 mM; adenosina 5 mM; glucosa 10 mM; amortiguador HEPES 10 mM; gluconato de magnesio 5 mM; CaCl2 1.5 mM; gluconato de sodio 105 mM; 200,000 unidades de penicilina; 40 unidades de insulina; 16 mg de dexametasona; 12 mg de rojo de fenol; y con un pH de 7.4-7.5, y una osmolaridad de aproximadamente 320 mOSm/1. La solución se emplea a fin de mantener los ríñones y páncreas cadavéricos antes del trasplante. Con el uso de la solución, la conservación puede extenderse más allá del límite de 30 horas recomendado para la conservación de riñon cadavérico. Esta perfusión particular es solo ilustrativa de una cantidad de dichas soluciones que pueden adaptarse para el presente uso, agregando una cantidad eficaz del compuesto de la invención. En otra modalidad, la solución de perfusión contiene desde aproximadamente 0.01 pg/ml hasta aproximadamente 400 ng/ml del compuesto de la invención, o desde aproximadamente 40 hasta aproximadamente 300 ng/ml del compuesto de la invención. Si bien el receptor preferido de un compuesto de la invención para los propósitos de toda esta solicitud es un humano, los presentes métodos se aplican igualmente a otros mamíferos, en particular, animales domesticados, ganado, animales de compañía y de zoológico. Sin embargo, la invención no se limita a éstos, y pueden obtenerse los beneficios en cualquier animal.

USOS TERAPÉUTICOS Y PREVENTIVOS DE LOS COMPUESTOS DE LA INVENCIÓN Como se observa en el Ejemplo 1 a continuación, la presencia de receptores de eritropoyetina en el endotelio humano capilar cerebral, indica la presencia de los blancos de los compuestos de la invención en el cerebro humano, y que los estudios en animales sobre estos compuestos de la invención se pueden aplicar directamente al tratamiento o profilaxis de seres humanos. En otro aspecto de la invención, se proveen métodos y composiciones para mejorar la viabilidad de células, tejidos u órganos no aislados de la vasculatura por una barrera celular endotelial, mediante la exposición de las células, tejido u órganos directamente a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, o la administración o el contacto de una composición farmacéutica que contiene el compuesto de la invención a la vasculatura del tejido u órgano. La mayor actividad de las células sensibles en el órgano o tejido tratado, es responsable de los efectos positivos ejercidos. Como se describe con anterioridad, la invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las moléculas de eritropoyetina pueden transportarse desde la superficie luminal hasta la superficie de la membrana basal de las células endoteliales de los capilares de órganos con uniones estrechas de células endoteliales, entre ellos, por ejemplo, el cerebro, la retina y los testículos. Por lo tanto, las células sensibles a través de la barrera son blancos susceptibles para los efectos beneficiosos de un compuesto de la invención, y otros tipos celulares, tejidos u órganos que contienen células sensibles, y dependen en su totalidad o en parte de ellas, son blancos para los métodos de la invención. Si bien no se desea limitarse a ninguna teoría particular, luego de la transcitosis de un compuesto de la invención, el compuesto puede interactuar con un receptor de eritropoyetina en una célula sensible, por ejemplo, una célula neuronal, retiniana, muscular, cardiaca, pulmonar, hepática, renal, del intestino delgado, de la corteza suprarrenal, médula suprarrenal, capilar endotelial, testicular, ovárica, pancreática, ósea, dérmica o endometrial, y la unión al receptor puede iniciar una cascada de transducción de señal que provoca la activación de un programa de expresión genética dentro del tejido o célula sensible, lo que brinda protección de la célula, tejido u órgano contra el daño, tal como el daño por toxinas, agentes quimioterapéuticos, tratamiento de radiación, hipoxia, etc. En consecuencia, se describen en detalle más adelante los métodos para la protección de tejido que contiene células sensibles, contra la lesión o estrés hipóxico, y para el aumento de la función de dicho tejido. Como ya se mencionó, los métodos de la invención son igualmente aplicables a humanos como a otros animales. En la práctica de una modalidad de la invención, un paciente mamífero se somete a quimioterapia generalizada para el tratamiento de cáncer, que abarca tratamiento de radiación, que comúnmente posee efectos adversos tales como daño nervioso, pulmonar, cardíaco, ovárico o testicular. La administración de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención como se describe con anterioridad, se realiza antes de la quimioterapia y/o tratamiento de radiación y durante dichos tratamientos, a fin de proteger diversos tejidos y órganos contra el daño del agente quimioterapéutico, por ejemplo, para proteger los testículos. El tratamiento puede continuar hasta que los niveles circulantes del agente quimioterapéutico han descendido por debajo de un nivel de potencial peligro para el organismo del mamífero. En la práctica de otra modalidad de la invención, se planeó realizar ablación multiorgánica de una víctima de accidente automovilístico, para trasplante a diversos receptores; para algunos de estos órganos se necesitó el transporte de largas distancias y durante períodos prolongados. Antes de la ablación de los órganos, la víctima fue infundida con una composición farmacéutica que comprendía un compuesto de la invención, como se describe en esta solicitud. Los órganos extirpados para embarque se perfundieron con una perfusión que contenía un compuesto de la invención, como se describe en esta solicitud, y se almacenaron en un baño que comprendía un compuesto de la invención. Ciertos órganos se perfundieron de manera continua con un dispositivo de perfusión pulsátil, utilizando una perfusión que contenía un compuesto de la invención, de acuerdo con esta invención. Se produjo mínimo deterioro de la función orgánica durante el transporte y con el implante y reperfusión de los órganos in si tu . En otra modalidad de la invención, fueron necesarias la cardioplejía temporal y oclusión arterial para un procedimiento quirúrgico, con el fin de reparar una válvula cardiaca. Antes de la cirugía, se infundió el paciente con 4 µg de un compuesto de la invención por kg de peso corporal. Dicho tratamiento previno el daño celular isquémico hipóxico, en particular, después de la reperfusión. En otra modalidad de la invención, en cualquier procedimiento quirúrgico, tal como en una cirugía de derivación cardiopulmonar, se puede usar un compuesto de la invención. En una modalidad, la administración de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, como se describe con anterioridad, se realiza antes, durante y/o después del procedimiento de derivación o circulación extracorporal, a fin de proteger la función del cerebro, del corazón y de otros órganos. En los ejemplos anteriores donde se usa un compuesto de la invención para aplicaciones ex vivo, o para tratar células sensibles, tales como tejido neuronal, tejido retiniano, células o tejido cardíaco, pulmonar, hepático, renal, del intestino delgado, de la corteza suprarrenal, de la médula suprarrenal, capilar endotelial, testicular, ovárico o endometrial, la invención provee una composición farmacéutica en una forma farmacéutica unitaria, adaptada para la protección o mejoría de células, tejidos u órganos sensibles, distales a la vasculatura, que comprende, por unidad de dosificación, una cantidad eficaz, no tóxica, dentro del intervalo de aproximadamente 0.01 pg a 5 mg; 1 pg a 5 mg; 500 pg a 5 mg; 1 ng a 5 mg; 500 ng a 5 mg; 1 µg a 5 mg; 500 µg a 5 mg; ó 1 mg a 5 mg de compuesto de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, la cantidad de un compuesto de la invención se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 1 ng a 5 mg. En otro aspecto de la invención, se halló que la administración de EPO restauró la función cognitiva en animales que habían sufrido traumatismo cerebral. Se espera que los compuestos de la invención tengan los mismos efectos protectores celulares que la EPO. Después de una demora de 5 días ó 30 días, la EPO aún pudo restaurar la función, en comparación con animales tratados con un sustituto, lo que indica la capacidad de una EPO para regenerar o restaurar la actividad cerebral. Por lo tanto, la invención también se dirige al uso de un compuesto de la invención para preparar una composición farmacéutica, para el tratamiento de traumatismo cerebral y otras disfunciones cognitivas, incluso el tratamiento tiempo después de la lesión (por ejemplo, tres días, cinco días, una semana, un mes o más) . La invención además se dirige a un método para el tratamiento de disfunción cognitiva después de la lesión, mediante la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de la invención. Puede emplearse cualquier compuesto de la invención como se describe en esta solicitud, para este aspecto de la invención. Además, este aspecto restaurador de la invención se dirige al uso de cualquiera de los compuestos de la invención para la preparación de una composición farmacéutica, para la restauración de la disfunción celular, tisular u orgánica, donde el tratamiento se inicia después, y bastante después del ataque inicial responsable de la disfunción. Aun más, el tratamiento con un compuesto de la invención puede extenderse a lo largo del curso de la enfermedad o afección en la fase aguda, como también, en la fase crónica. En el caso donde un compuesto tiene actividad eritropoyética, el compuesto puede administrarse en forma generalizada, en una dosificación entre aproximadamente 1 µg y aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal; preferentemente, alrededor de 5-50 µg/kg de peso corporal; con mayor preferencia aproximadamente 10-30 µg/kg de peso corporal, por administración. Esta dosis eficaz debe ser suficiente para lograr niveles séricos del compuesto mayores que aproximadamente 10,000, 15,000, ó 20,000 mU/ml de suero, luego de la administración del compuesto. Estos niveles séricos pueden alcanzarse en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 horas después de la administración. Dichas dosificaciones se pueden repetir según lo necesario. Por ejemplo, la administración puede repetirse a diario, siempre que sea clínicamente necesario, o después de un intervalo apropiado, por ejemplo, cada 1 a 12 semanas, aunque preferentemente, cada 1 a 3 semanas. La cantidad eficaz de compuesto y portador farmacéuticamente aceptable pueden envasarse en un frasco de dosis única u otro recipiente. Sin embargo, el compuesto de la invención es no eritropoyético, esto es, puede ejercer las actividades aquí descritas sin provocar un aumento en la concentración de hemoglobina, o hematocrito. Dicho compuesto no eritropoyético se prefiere especialmente en los casos donde los métodos de la presente invención tienen la intención de administración crónica. En otra modalidad, un compuesto de la invención se suministra en una dosis superior a una dosis correspondiente (p/p) de eritropoyetina natural que sería necesaria para estimular al máximo la eritropoyesis . Como ya se observó, un compuesto de la invención no tiene actividad eritropoyética, y por lo tanto, las dosificaciones mencionadas, expresadas en unidades son solo ejemplares para cantidades correspondientes de eritropoyetina natural; en la presente solicitud, se proveen los equivalentes molares superiores para las dosificaciones, que son aplicables a cualquier compuesto de la invención.

EJEMPLOS La presente invención puede comprenderse mejor por referencia a los siguientes ejemplos no restrictivos, que se proveen como ejemplares de la invención. Los ejemplos que siguen se presentan a fin de ilustrar en mayor detalle las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, no deben interpretarse de modo alguno como un límite al amplio alcance de la invención.

Ejemplo 1 Producción de eritropoyetina carbamilada El material inicial del proceso en este ejemplo fue EPO humana biotecnológica purificada. En primer lugar, se ajustó la concentración de proteína por ultrafiltración, para los propósitos de mantener un bajo volumen de proceso. Se ajustó la concentración de proteína a 3 mg/ml. La ultrafiltración se efectuó por medio de un instrumento BioMax (Millipore) con un MWCO de 5 kDa. Después de completarse la etapa de concentración, se mezcló la solución de EPO con K-borato tetrahidratado 0.5 M, K-cianato 0.5 M, a pH 9.0; la solución se incubó a 32°C durante 24 horas. Se realizó la desalación de la mezcla de reacción de EPO y cianato por medio de filtración de gel. La proteína se desaló con un amortiguador de Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 8.5. Se empleó una resina G-25 Fine (Amersham Biosciences) . Usando un caudal de 90 cm/h en una columna de aproximadamente 15 cm de alto, se aplicó una carga de la muestra de aproximadamente 20% del volumen de la columna. La EPO carbamilada desalada se recogió para procesamiento adicional.

• En este punto, el contenido de polímero/agregado era del 7.3%. La siguiente etapa fue la eliminación de agregados y polímeros, efectuada por medio de una etapa de purificación usando intercambio aniónico. Se empleó una resina SOURCE 30Q (Amersham Biosciences) para la purificación. Se aplicaron aproximadamente 4.5 mg/ml de EPO carbamilada a la columna. El amortiguador A del proceso fue: Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 8.5; y el amortiguador de elución B fue: Tris 25 mM, NaCl 1 M, pH 8.5. El gradiente se efectuó con 0-30%, en 20 volúmenes de columna; se recogió el pico mayor de EPO carbamilada y se reunió . La reunión de la etapa de purificación se ajustó a una concentración de >0.5 mg/ml, y se cambió el amortiguador a un amortiguador de citrato 20 mM, NaCl 100 mM, usando una unidad de filtración de flujo tangencial de dia/ultrafiltración. Se realizaron la concentración y el cambio de amortiguador en un instrumento BioMax de 0.1 m2 (Millipore) con un MWCO de 5 kDa. Finalmente, la sustancia de fármaco, biofarmacéutica purificada se filtró a través de 0.22 µm usando un filtro Millipak (Millipore) , para reducir los gérmenes . El proceso logró EPO carbamilada con propiedades útiles para usar como un producto biofarmacéutico: • El contenido de polímero/agregado fue del 0.5%, determinado por SEC-HPLC • El 100% de las usinas carbamiladas fueron determinadas por análisis de aminoácidos • La concentración fue >0.5 mg/ml. Se efectuó la caracterización usando MALDI-TOF para la determinación del cambio en la masa intacta, tanto para la proteína tratada con PNGasa como para la proteína con los N-glicanos. Además de MALDI-TOF, se efectuó análisis de huella de masa peptídica/análisis LC-MS/MS, de la siguiente manera: 1. Se purificaron CEPO y EPO en una columna POROS Rl (material de columna de fase inversa POROS Rl, PerSeptive Biosystems (1-1259-06). El material de columna se almacenó en 50% de HiPerSolv para HPLC VWR 152525R antes del uso. Se equilibró la columna Rl y se lavó con ácido fórmico al 5% (33015, Riedl de Haén) . La muestra se eluyó de la columna con solución de matriz de calidad Agilent MALDI HCCA (G2037A) . La masa intacta se determinó por análisis en un instrumento Bruker Reflex IV MALDI-TOF. 2. Se trataron 0.3 pmol de CEPO y/o EPO durante la noche, con 1 unidad de PNGasa F y PNGasa F/O-glicosidasa. Se determinó la masa total usando MALDI-TOF. 3. Se redujeron CEPO y EPO (1.5 pmol) en solución con 50 µl de DTT 10 mM, NH4C03 50 mM, y posteriormente, se alquilaron en 50 µl de yodoacetamida 55 mM, NH4C03 50 mM. Las muestras se purificaron en una columna POROS Rl antes de la digestión de tripsina. Se purificó una fracción de la muestra digerida en una columna POROS R2, antes del análisis MALDI-TOF, POROS 50 R2 PerSeptive Biosystems (1-1159-05) . La columna R2 se equilibró y se lavó con ácido trifluoracético al 0.1% (grado espectrométrico 99+%, Aldrich 302031-100 mi) . La muestra se eluyó de la columna con solución de matriz de calidad Agilent MALDI HCCA (G2037A) . La reunión de péptidos obtenidos por la digestión tríptica se trató con PNGasa F, se purificó en columnas POROS R2, y se caracterizó por MALDI-TOF. 4. Se redujeron CEPO y EPO en solución con DTT y se alquilaron con yodoacetamida. Las muestras se purificaron en columna POROS Rl antes de la digestión con Glu-C. Se purificó una fracción de la muestra digerida en columnas POROS R2, antes del análisis MALDI-TOF. La reunión de péptidos obtenidos por la digestión de Glu-C se trató con PNGasa F y se purificó en columnas POROS R2. 5. Para excluir la posibilidad de CEPO parcialmente carbamilada, se digirieron CEPO y EPO intactas con Lys-C. Las muestras se analizaron usando MALDI-TOF. Como conclusión puede extraerse que las 8 usinas y el extremo N se carbamilaron. No se detectaron ningún otro aminoácido carbamilado ni modificaciones de los glicanos .

Referencias : Identificación de proteina general por MS : Mann, M., Hojrup, P., Roepstorff, P. (1993), "Use of mass spectrometric molecular weight Informa tion to identif y proteins in sequence da tabases" , Biol. Mass Spectrom., 22, 338-345. Yates, J. R., Speicher, S., Griffin, P. R., Hunkapiller, T. (1993), " Peptide mass maps : a highly informa tive approach to protein iden tif ica t ion" , Anal. Biochem., 214, 397-408.

Masa intacta Laugesen, S., Roepstorff, P. (2003), "Co/nJin tion of two ma trices resul ts in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis", J. Am. Soc. Mass Spectrom., 14 (9), 992-1002.

Digestión/Grafi o Larsen, M. R., Hojrup, P., Roepstorff, P. (2005), "Characteri za tion of gel -separa ted glycoproteins using two- step proteolyti c digestión combined wi th sequen tial microcolumns and mass spectrometry" , Mol. Cell Proteomics, 4 (2) , 107-19.

Se realizaron estudios adicionales a fin de determinar el grado de homogeneidad de la carbamilación de EPO, la especificidad de la carbamilación y la identidad de los sitios de carbamilación, y la presencia de potenciales modificaciones inespecíficas debidas a reacciones colaterales del proceso de carbamilación y purificación. Las muestras se analizaron por análisis de masa total de muestras de proteínas desglicosiladas, y por cartografía peptídica usando endoproteasas LysC y tripsina para la digestión, y análisis LC/MS para la evaluación de péptidos.

Ejemplo 2 Análisis de masa total El análisis se efectuó en tres muestras de EPO carbamiladas usando el método del Ejemplo 1. Las tres muestras se purificaron luego de la reacción de carbamilación, empleando intercambio aniónico, como se describe en el Ejemplo 1. Una de las muestras de CEPO (designada CEPO-CMC) se preparó por CMC Biotech, a partir de una escala de producción de 1 gramo (concentración: 0.82 mg/ml; amortiguador: Na-citrato 20 mM, ácido cítrico 0.3 mM, NaCl 0.1 M, pH 6.9-7.3). Las dos muestras restantes, designadas CEPO-1 y CEPO-2, se prepararon a partir de una escala de producción de laboratorio de 70 mg (concentración: 1.1 mg/ml; amortiguador: Tris 25 mM, NaCl 0.2 mM, pH 8.3-8.7). Estas muestras de CEPO se compararon con EPO no modificada o inicial (concentración: 0.82 mg/ml; amortiguador: Na-citrato 2 mM, ácido cítrico 0.3 mM, NaCl 0.1 M, pH 6.9-7.3) y CEPO de imitación (EPO que se ha sometido al proceso de carbamilación, sin la adición de K-cianato) (concentración: 0.38 mg/ml; amortiguador: Na-citrato 20 mM, ácido cítrico 0.3 mM, NaCl 0.1 M, pH 6.9-7.3) .

Espectrometría de masa ESI Antes del análisis de masa total, las muestras se desglicosilaron enzimáticamente. Cada muestra se incubó durante la noche con 50 µg de N-glicosidasa F (Prozyme de Glyko) , neuraminidasa biotecnológica de A . ureafaciens y 0-glicosidasa, en una concentración de proteína de 0.5 mg/ml. La finalización de la reacción de desglicosilación se controló por SDS-PAGE, cargando 3 µg de cada muestra en geles de Tris 12%-glicina. El material restante de cada muestra se usó para análisis de masa.

Las muestras desglicosiladas se llevaron a una concentración de 4-5 M de clorhidrato de guanidinio, agregando el volumen apropiado de solución de carga de clorhidrato de guanidinio, y luego se desalaron en un amortiguador que contenía ácido fórmico al 2% y acenitrilo al 40%. El clorhidrato de guanidinio se agregó a fin de garantizar la alta recuperación de CEPO y EPO desglicosiladas, para el análisis de espectrometría de masa. La medición de masa se efectuó con un espectrómetro de masa Waters ESI-Q-Tof o Waters ESI-LCT, provisto con una fuente de ionización de ESI-nanopulverización. La evaluación de la información se llevó a cabo por desenrollamiento automático y por evaluación manual de picos de interés específicos, con un programa informático Mass Lynx 4.0. La cuantificación de las proporciones relativas de las especies de CEPO carbamiladas de manera diferente se realizó mediante el cálculo de las proporciones relativas sobre la base de las intensidades de señal registradas en el espectro m/z. La desglicosilación de las muestras logró la completa eliminación de los azúcares N-ligados. Sin embargo, la liberación de azúcares O-ligados fue incompleta, en especial, para las muestras de CEPO. Como era esperado, debido a la carbamilación, las muestras de CEPO mostraron diferentes espectros de masa, en comparación con las muestras de EPO y CEPO de imitación. Como se expone en la Tabla 2, el desenrollamiento de los espectros produjo masas para los picos mayores, como se esperaba teóricamente para las varias muestras. En todas las muestras de CEPO, solo se hallaron moléculas de CEPO altamente carbamiladas, donde la isoforma principal era la isoforma completamente carbamilada, con la carbamilación completa de las 8 usinas y el extremo N, esto es, 9 residuos carbamilo. Las muestras de CEPO mostraron heterogeneidad en relación al contenido de isoformas adicionales correspondientes a 8, 10 y 11 residuos carbamilo unidos a la CEPO. La especie que contenía 8 residuos carbamilo se designa como subcarbamilada, que carece de por lo menos un residuo carbamilo. Las especies con 10 y 11 residuos carbamilo se designan como sobrecarbamiladas, donde los residuos carbamilo adicionales unidos estarán unidos en una manera no específica a un aminoácido diferente de una lisina. Hubo algunas señales menores en los espectros de todas las muestras, pero ninguna se consideró una especie modificada de manera no específica. Algunas de las señales menores se hallaron en ambas muestras, EPO y CEPO, y se consideraron contaminantes ya presentes en la EPO inicial.

Tabla 2 Masas desenrolladas de muestras de CEPO y EPO desglicosiladas obtenidas en el análisis de masa total La Tabla 3 muestra las proporciones relativas de las varias isoformas. La CEPO subcarbamilada varía desde aproximadamente 1.5 hasta 5.5% de la CEPO total, según la muestra, y la CEPO sobrecarbamilada varía desde aproximadamente 11 hasta 22%, según la muestra. CEPO-1 y CEPO-2 tienen distribución similar de las isoformas, mientras que la CEPO-CMC tiene menos especies subcarbamiladas, en comparación con las otras dos muestras. Las diferentes escalas de producción lograron productos con diferente distribución, si bien, como lo muestra la Tabla 3, para la escala de producción de laboratorio, la producción puede repetirse con resultado similar. Tal como se describe en este documento, a una escala de producción determinada, la distribución puede adaptarse ajustando la reunión de la columna de intercambio aniónico. Los números en la Tabla 3 representan la proporción mínima de CEPO sub- y sobrecarbamilada. La razón para esto es que el grado de carbamilación (8 a 11 veces) no puede especificar el grado exacto de CEPO sub-, completa- y sobrecarbamilada. Por ejemplo, una molécula de CEPO que contiene 8 residuos carbamilo, según lo determinado por el análisis de masa, puede tener solo 7 grupos carbamilo unidos específicamente a usinas, y el residuo carbamilo restante estaría unido de manera no específica a otro aminoácido. Esta situación se consideraría sólo como subcarbamilada, aun cuando haya grupos carbamilo unidos de forma no específica. De manera inversa, una molécula de CEPO que contiene 10 residuos carbamilo puede tener unidos solo 8 residuos de manera específica, y dos unidos de manera no específica. En esta situación, la isoforma de CEPO se considera solo sobrecarbamilada, aun cuando todas las usinas no estén carbamiladas .

Tabla 3 Grado de heterogeneidad de carbamilación: proporciones relativas de especies de CEPO carbamiladas de manera diferente n = 2; **n = Ejemplo 3 Cartografía de péptidos LysC Se efectuó el análisis de cartografía de péptidos de las muestras de EPO y CEPO, usando endoproteasas LysC y tripsina para la fragmentación. Todos los análisis de cartografía de péptidos se llevaron a cabo con péptidos desglicosilados . La desglicosilación enzimática de los péptidos se efectuó simultáneamente con la digestión con la endoproteasa . Las muestras de EPO y CEPO (de aproximadamente 150 µg cada una) se desnaturalizaron y se redujeron por incubación con clorhidrato de guanidinio y DTT. Los grupos sulfhidrilo libres se alquilaron con ácido yodoacético. Las muestras alquiladas se desalaron, y el amortiguador se cambió por el amortiguador apropiado, usando columnas de filtración de gel de un solo uso. Se agregaron la endoproteasa, N-glicosidasa y neuraminidasa simultáneamente a las muestras de EPO y CEPO alquiladas. Las muestras se incubaron durante la noche a 37°C. Después de la incubación, se aplicaron alrededor de 5 µg de cada digestión a análisis RP-HPLC/MS usando una columna Júpiter, C18 RP, de Phenomenix, acoplada a un instrumento ESI-LCT de Waters. Se registraron la señal de UV a 220 nM y las cuentas iónicas totales (TIC, por sus siglas en inglés) en el espectrómetro de masa. Para la identificación y cuantificación de los péptidos obtenidos, se evaluó la TIC. Debido a que LysC no pudo disociar usinas carbamiladas, se esperaría que no se formaran fragmentos por digestión con LysC, si todas las lisinas estaban carbamiladas, lo que indica especificidad de carbamilación. En el caso de subcarbamilación, deben formarse fragmentos específicos de CEPO. La Tabla 4 cita los fragmentos formados teóricamente a partir de la digestión de LysC para EPO, CEPO completa- y sobrecarbamilada y CEPO subcarbamilada .

Tabla 4 Cartografía de péptidos LysC: listas de péptido/fragmentos formados teóricamente a partir de la digestión de LysC de EPO, CEPO completa- o sobrecarbamilada y CEPO subcarbamilada EPO CEPO (completamente carbamilada y sobrecarbamilada; CEPO subcarbamilada (8x carbamilación; Como se esperaba, el patrón de péptido LysC obtenido para las muestras de EPO y CEPO digeridas con LysC fue completamente diferente. La digestión de EPO inicial y CEPO de imitación con LysC produjo el patrón de péptido esperado. En ambas muestras, se pudieron identificar todos los péptidos Kl a K9. Los péptidos K5 y Kl se disociaron en forma parcial de manera no específica, tanto en EPO como en CEPO de imitación. No se pudieron identificar picos adicionales significativos ni picos faltantes en el mapa LysC de CEPO de imitación, en comparación con EPO inicial. A partir de esta información, puede concluirse que no se produjeron modificaciones covalentes no específicas, significativas de la proteína EPO durante el proceso de carbamilación y purificación. Los mapas peptídicos de las muestras de CEPO tuvieron un patrón peptídico diferente de la EPO inicial. Hubo un solo pico mayor y algunos picos menores. Como se muestra en la Tabla 5, las masas obtenidas de los picos se correlacionaron bien con las masas esperadas, o bien para la CEPO disociada, o para los fragmentos de la escisión LysC de CEPO subcarbamilada. El pico mayor (A) contenía CEPO intacta, desglicosilada, completamente carbamilada (9x carbamilos) y CEPO sobrecarbamilada (lOx carbamilos) (Tabla 5) . Los cuatro picos menores (B-E) contenían CEPO subcarbamilada (8x carbamilos) ; los diferentes picos que contenían CEPO subcarbamilada no estaban carbamilados en ciertas usinas. Los picos B y C contenían CEPO subcarbami'lada que carecía específicamente de carbamilación en Lys45, mientras que los picos D y E contenían CEPO subcarbamilada que carecía específicamente de carbamilación en Lys97 (Tabla 5) .

Tabla 5 Cartografía de péptido LysC: asignación de masas experimentalmente obtenidas a fragmentos de CEPO que derivan teóricamente de CEPO subcarbamilada Hubo algunas diferencias en las proporciones relativas de los picos para las diferentes muestras de CEPO. Las muestras de CEPO 1 y 2 tuvieron picos más prominentes D y E que CEPO-CMC, lo que indica que contenían más especies de CEPO subcarbamilada. Fue difícil cuantificar los picos menores en relación al pico mayor, debido a limitaciones técnicas. Sin embargo, usando las áreas pico de la detección de UV como una indicación en bruto de las proporciones relativas de las varias especies, se pudo calcular que la CEPO subcarbamilada puede representar menos del 10% de las isoformas de CEPO en las muestras, y que la CEPO-1 y CEPO-2 tienen el doble de isoformas subcarbamiladas que la CEPO-CMC. Empleando el mismo procedimiento que el utilizado para el análisis de masa total, la cuantificación de las especies sobrecarbamiladas ubicadas en el pico A fue aproximadamente 21% para CEPO-CMC y 12% para CEPO-1 y CEPO-2. En general, la información de la cartografía de péptido LysC concuerda en gran medida con el análisis de masa total descrito en el Ejemplo 2. CEPO-CMC contenía menos isoformas CEPO subcarbamiladas, mientras que CEPO-1 y CEPO-2 contenían más isoformas CEPO sobrecarbamiladas. Esta cartografía de péptido también indicó que la lisina 45 y la lisina 97 pueden representar sitios de subcarbamilación .

Ejemplo 4 Cartografía de péptido de tripsina La digestión de la muestra utilizando tripsina se describe en el Ejemplo 3. La digestión de EPO y CEPO de imitación con tripsina produjo un patrón peptídico como se esperaba. En ambas muestras, se pudo identificar la mayoría de los péptidos (TI a T21) esperados para la digestión de tripsina, excepto algunos di- y tri-péptidos pequeños (tales como T21) . Ver Tabla 6. Como fue el caso con la digestión de LysC, no hubo picos adicionales significativos ni picos faltantes de la CEPO de imitación, en comparación con EPO inicial. A partir de esta información, se concluyó que no hubo modificaciones covalentes no específicas de la proteína EPO durante el proceso de carbamilación y purificación. Los patrones peptídicos de las muestras de CEPO fueron diferentes de la EPO no modificada. La tripsina normalmente se escinde en lisina y arginina; por lo tanto, se esperaría que en el caso de la EPO completamente carbamilada, solo se produjera la fragmentación por escisión de las argininas. En consecuencia, después de obtener el patrón peptídico con tripsina, se pudieron identificar los sitios de carbamilación específicos y los péptidos carbamilados no específicamente. Los péptidos esperados de una digestión tríptica de moléculas de CEPO, dando por hecho la escisión en las argininas (R) solamente, se exponen en la Tabla 6.

Tabla 6 Lista de péptidos esperados para EPO y CEPO digeridas con tripsina EPO CEPO (asumiendo la escisión solo en Arg (R) debido a la carbamilación com leta; Se identificaron todos los péptidos esperados de la escisión de tripsina como picos mayores en todas las muestras de CEPO, excepto el péptido R13 C-terminal. Este péptido tampoco se halló en la EPO inicial ni en la CEPO de imitación. Los picos de Rl a R12 resultantes de la escisión específica solo de argininas representaron la gran mayoría de péptidos detectados en las muestras de CEPO. Además, todos los péptidos que contenían lisina se detectaron casi exclusivamente en la forma carbamilada por completo. Esta información indica un alto grado de carbamilación específica en las usinas y N-terminal. Además del péptido mayor, se detectaron también seis péptidos menores en todas las muestras de CEPO. Se identificaron tres de los péptidos menores por análisis de masa como el resultado de la escisión tríptica de CEPO sobrecarbamilada, y los tres restantes fueron el resultado de la CEPO subcarbamilada. La Tabla 7 cita todos los péptidos identificados en los mapas trípticos de las tres muestras de CEPO analizadas. Los péptidos abundantes altos, Rl a R12, formados a partir de EPO completa y específicamente carbamilada, están en letras normales; se presenta también la EPO correctamente carbamilada, en negrita. Los péptidos que más probablemente se formaron por la escisión de CEPO subcarbamilada se presentan en letra itálica, y los péptidos formados por escisión de CEPO sobrecarbamilada se presentan en letras subrayadas Tabla 7 Mapa de péptido tríptico: lista de péptidos identificados en el mapa de péptidos tríptico de CEPO *- intensidad relativa al número total de cuentas en TIC. 1- hallado por evaluación manual; señal confirmada como específica .

En relación a la Tabla 7, los picos menores T9 y TÍO que contenían los péptidos R6_al y R6_bl, respectivamente, derivaron con mayor probabilidad de la escisión de moléculas de CEPO subcarbamilada, que no estaban carbamiladas en Lys97. El péptido R4_bl+lxcarb se forma si el aminoácido Lys45 no está carbamilado. El péptido R6_al (pico T9) fue más abundante en las muestras de CEPO-1 y CEPO-2 que en la CEPO-CMC, lo que indica que las primeras pueden tener el doble de la cantidad de CEPO subcarbamilada. Los péptidos R6_bl y R4_bl+lxcarb estaban presentes en cantidades iguales en todas las muestras de CEPO. El cálculo del contenido relativo de CEPO subcarbamilada a partir de esta información fue difícil debido a limitaciones técnicas. Sin embargo, tomando todas las observaciones en conjunto, se calculó que la especie de subcarbamilación fue aproximadamente el 10%, deducida del análisis de masa total y de la cartografía de péptido LysC. Se interpretó en masa que otros tres péptidos menores que se coeluyeron con otros péptidos contenían un residuo carbamilo adicional, es decir, CEPO sobrecarbamilada. Se detectaron los péptidos R10_2xcarb y R7_lxcarb en cantidades mínimas, donde se halló que R12_3xcarb tenía intensidades de señal significativas. La CEPO-CMC tuvo un contenido dos veces superior de especie CEPO sobrecarbamilada, en comparación con CEPO-1 y CEPO-2. Esto concuerda con los resultados del análisis de masa total. Además se pudo concluir a partir de esta información que la secuencia de aminoácidos de 151-62 de EPO es un sitio para carbamilación no específica. Nuevamente, por las mismas razones que para la cuantificación de la subcarbamilación, la cuantificación de especies sobrecarbamiladas fue difícil. Sin embargo, dando por hecho que la eficacia de ionización de los péptidos que solo difieren en el grado de carbamilación es similar, se calculó por las cuentas iónicas relativas de los derivados de R12 que aproximadamente 3-7% de la CEPO era especie sobrecarbamilada. Esto fue inferior a la cantidad de isoformas sobrecarbamiladas calculada por análisis de masa total. En general, puede concluirse lo siguiente a partir del análisis de masa total y de la información de cartografía peptídica de la EPO y CEPO. Del análisis de masa total, las muestras de CEPO parecieron carbamilarse a un grado bastante alto. Aproximadamente el 95-98% de todas las moléculas estaban carbamiladas por completo y contenían por lo menos 9 residuos carbamilo (ver Tabla 3) . La cartografía tríptica y de LysC confirmaron el alto grado de carbamilación en sitios específicos, y que más probablemente, más del 95% de las moléculas de CEPO estaban carbamiladas por completo en las 8 lisinas y el extremo N. La información además mostró cuatro isoformas de CEPO halladas. Se detectaron especies con 8, 9, 10 y 11 residuos carbamilo en las muestras de CEPO analizadas, donde la isoforma con 9 carbamilos fue la especie dominante. Una porción menor de las moléculas de CEPO contuvo 8 residuos carbamilo en lugar de 9, y se consideraron subcarbamiladas. Para CEPO-1 y CEPO-2, estas isoformas fueron aproximadamente el 5% del total, y para la CEPO-CMC, esta isoforma conformaba aproximadamente el 1.5% de las moléculas de CEPO totales. Una porción más significativa de las moléculas de CEPO estaba sobrecarbamilada, esto es, contenían 10 u 11 residuos carbamilo. La CEPO sobrecarbamilada varió de aproximadamente 11% para CEPO-1 y CEPO-2 a aproximadamente 22% en CEPO-CMC. La información de la cartografía de péptido mostró un alto grado de especificidad de carbamilación en las 8 lisinas y en el extremo N. Además, la cartografía de péptido confirmó generalmente los resultados del análisis de masa total. Por lo menos aproximadamente el 90-95% de las moléculas de CEPO parecieron estar específicamente modificadas por residuos carbamilo en todas las lisinas y en el extremo N. Sin embargo, esta información también mostró la sub- y sobrecarbamilación de especies de CEPO. Debido a algunas limitaciones técnicas, la relación exacta de especies subcarbamiladas fue difícil de establecer, aunque se calculó que se hallaba en el intervalo de hasta alrededor del 10%, lo que concuerda con los números hallados en el análisis de masa total. Aun más, se identificaron dos posiciones distintas en la EPO, Lys45 y Lys97, como aquellas donde se pudo producir con mayor probabilidad la falta de carbamilación. En ambos grupos cartográficos peptídicos, se halló también especie sobrecarbamilada. Nuevamente, debido a limitaciones técnicas, la cantidad exacta de especie sobrecarbamilada fue difícil de cuantificar. De la información obtenida, se pudo calcular la detección de muy poca especie sobrecarbamilada en la cartografía de péptido. Se identificó solo un tercio a la mitad de la cantidad de especie sobrecabamilada por la cartografía de péptido, en comparación con el análisis de masa total. Una explicación razonable de esta discrepancia es que no se identificaron todos los péptidos sobrecarbamilados, o no se identificaron en la cantidad correcta. En el mapa de LysC, una especie de CEPO no disociada que contenía 10 residuos carbamilo se detectó en cantidades significativas, y en la cartografía tríptica, se detectaron tres péptidos que contenían un residuo carbamilo adicional. Dos de estos fragmentos se detectaron solo en cantidades mínimas. El tercer péptido, péptido CEPO aminoácidos 152-162, cerca del término C, parece representar un tercio de la sobrecarbamilación, y puede ser un sitio para la carbamilación no específica en EPO. No se detectaron cantidades significativas de otras modificaciones no específicas (no relacionadas con carbamilo) en las muestras de CEPO o en las muestras de CEPO de imitación, por ningún análisis efectuado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la producción de una proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 40% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI, donde dicho método comprende poner en contacto una cantidad de eritropoyetina con una cantidad de cianato, a una temperatura, un pH y durante un tiempo suficientes para que los grupos amina en las lisinas y los aminoácidos N-terminales de la eritropoyetina se carbamilen por lo menos en 90%.

2. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana.

3. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% de proteína agregada.

4. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% de proteína agregada.

5. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% de proteína agregada.

6. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

7. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

8. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

9. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobrecarbamilada.

10. Método según la reivindicación 1, donde la eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobrecarbamilada.

11. Método según la reivindicación 1, donde la eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobrecarbamilada.

12. Método según la reivindicación 1, donde la concentración de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0.05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml.

13. Método según la reivindicación 1, donde la concentración de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es de aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml.

14. Método según la reivindicación 1, donde la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 10 M.

15. Método según la reivindicación 1, donde la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 2 M.

16. Método según la reivindicación 1, donde la temperatura varía desde aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 60°C.

17. Método según la reivindicación 1, donde la temperatura varía desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 34°C.

18. Método según la reivindicación 1, donde el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11.

19. Método según la reivindicación 1, donde el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10.

20. Método según la reivindicación 1, donde el lapso de tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 30 días.

21. Método según la reivindicación 1, donde el lapso de tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 5 días.

22. Método según la reivindicación 1, donde la proteína de eritropoyetina se pone en contacto con el cianato en presencia de un amortiguador.

23. Método según la reivindicación 22, donde el amortiguador es borato.

24. Método según la reivindicación 22, donde la concentración del amortiguador es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 2 M.

25. Método según la reivindicación 22, donde la concentración del amortiguador es desde aproximadamente 0.1 M hasta aproximadamente 1 M.

26. Método según la reivindicación 22, donde la concentración del amortiguador es de aproximadamente 0.5 M.

27. Método según la reivindicación 1, donde la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0.05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml; la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 10 M; la temperatura varía desde aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 60°C; el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11; y el tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta treinta días .

28. Método según la reivindicación 1, donde la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml; la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 2 M; la temperatura varía desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 34 °C; el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10; y el tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta 5 días.

29. Método según la reivindicación 1, donde la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es de aproximadamente 3 mg/ml; la concentración del cianato es de aproximadamente 0.5 M; la temperatura es de aproximadamente 32 °C; el pH es de aproximadamente 9.0; y el tiempo es de aproximadamente 24 horas .

30. Método para la producción de una proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 3% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI, que comprende purificar la eritropoyetina carbamilada usando intercambio aniónico, intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño .

31. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana .

32. Método según la reivindicación 30, donde por lo menos 90% de los residuos amina en las lisinas y el aminoácido N-terminal de la eritropoyetina están carbamilados .

33. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 2.5% de proteína agregada.

34. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene aproximadamente 0.5% o menos de proteína agregada.

35. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

36. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

37. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

38. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobrecarbamilada.

39. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobrecarbamilada.

40. Método según la reivindicación 30, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobrecarbamilada.

41. Método para la producción de una proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene menos de aproximadamente 3% de proteína agregada y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI, donde dicho método comprende: (a) el contacto de una cantidad de una proteína de eritropoyetina con una cantidad de cianato, a una temperatura, un pH y durante un tiempo suficientes para que por lo menos 90% de los residuos amina en la lisina y los aminoácidos N-terminales de la eritropoyetina se carbamilen; y (b) la purificación de la proteína de eritropoyetina carbamilada usando intercambio aniónico, intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño.

42. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana .

43. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 2.5% de proteína agregada.

44. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene aproximadamente 0.5% o menos de proteína agregada.

45. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

46. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

47. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada .

48. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobrecarbamilada.

49. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobrecarbamilada.

50. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobrecarbamilada.

51. Método según la reivindicación 41, donde la concentración de proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0.05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml.

52. Método según la reivindicación 41, donde la concentración de proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml.

53. Método según la reivindicación 41, donde la concentración de proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es de aproximadamente 3 mg/ml.

54. Método según la reivindicación 41, donde la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 10 M.

55. Método según la reivindicación 41, donde la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 2 M.

56. Método según la reivindicación 41, donde la concentración del cianato es de aproximadamente 0.5 M.

57. Método según la reivindicación 41, donde la temperatura varía desde aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 60°C.

58. Método según la reivindicación 41, donde la temperatura varía desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 34 °C.

59. Método según la reivindicación 41, donde la temperatura es de aproximadamente 32°C.

60. Método según la reivindicación 41, donde el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11.

61. Método según la reivindicación 41, donde el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10.

62. Método según la reivindicación 41, donde el pH es de aproximadamente 9.

63. Método según la reivindicación 41, donde el lapso de tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 30 días.

64. Método según la reivindicación 41, donde el lapso de tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 5 días.

65. Método según la reivindicación 41, donde el lapso de tiempo es de aproximadamente 24 horas.

66. Método según la reivindicación 41, donde la proteína de eritropoyetina se pone en contacto con el cianato en presencia de un amortiguador.

67. Método según la reivindicación 66, donde el amortiguador es borato.

68. Método según la reivindicación 66, donde la concentración del amortiguador es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 2 M.

69. Método según la reivindicación 66, donde la concentración del amortiguador es desde aproximadamente 0.1 M hasta aproximadamente 1 M.

70. Método según la reivindicación 66, donde la concentración del amortiguador es de aproximadamente 0.5 M.

71. Método según la reivindicación 41, donde la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 0.05 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml; la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 10 M; la temperatura varía desde aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 60°C; el pH es desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 11; y el tiempo es desde aproximadamente 10 minutos hasta treinta días.

72. Método según la reivindicación 41, donde la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml; la concentración del cianato es desde aproximadamente 0.05 M hasta aproximadamente 2 M; la temperatura varía desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 34 °C; el pH es desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 10; y el tiempo es desde aproximadamente 1 hora hasta 5 días.

73. Método según la reivindicación 34, donde la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es de aproximadamente 3 mg/ml; la concentración del cianato es de aproximadamente 0.5 M; la temperatura es de aproximadamente 32°C; el pH es de aproximadamente 9.0; y el tiempo es de aproximadamente 24 horas .

74. Proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene por lo menos 90% de carbamilación de las aminas primarias de la lisina y los aminoácidos amino terminales; menos de aproximadamente 3% de proteína agregada; y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI.

75. Proteína de eritropoyetina carbamilada de la reivindicación 74, donde la proteína de eritropoyetina es eritropoyetina humana.

76. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 2.5% de proteína agregada.

77. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene aproximadamente 0.5% o menos de proteína agregada.

78. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, donde la cantidad de proteína agregada se mide por SEC-HPLC.

79. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

80. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

81. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

82. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 30% de proteína sobrecarbamilada.

83. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 20% de proteína sobrecarbamilada.

84. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 74, que tiene menos de aproximadamente 10% de proteína sobrecarbamilada.

85. Compuesto que comprende una proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene por lo menos 90% de carbamilación de las aminas primarias de la lisina y los aminoácidos amino terminales; menos de aproximadamente 40% de proteína agregada; y una cantidad de cianato.

86. Compuesto según la reivindicación 85, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana .

87. Compuesto según la reivindicación 85, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% de proteína agregada.

88. Compuesto según la reivindicación 85, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% de proteína agregada.

89. Compuesto según la reivindicación 85, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 15% de proteína agregada.

90. Compuesto según la reivindicación 85, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% de proteína agregada.

91. Compuesto según la reivindicación 85, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 7% de proteína agregada.

92. Compuesto según la reivindicación 85, donde la cantidad de proteína agregada se mide por SEC-HPLC.

93. Proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene por lo menos 90% de carbamilación de las aminas primarias de la lisina y los aminoácidos amino terminales; menos de aproximadamente 3% de proteína agregada; y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada, medida por espectrometría de masa ESI; que es el producto del proceso que comprende las etapas de: (a) el contacto de una cantidad de una proteína de eritropoyetina con una cantidad de cianato, a una temperatura, un pH y durante un tiempo suficientes para que por lo menos aproximadamente 90% de los residuos amina en las lisinas y el aminoácido N-terminal de la proteína de eritropoyetina se carbamilen; y (b) la purificación de la proteína de eritropoyetina carbamilada usando intercambio aniónico, intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño.

94. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, donde la proteína de eritropoyetina es eritropoyetina humana.

95. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 2.5% de proteína agregada.

96. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene aproximadamente 0.5% o menos de proteína agregada.

97. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, donde la cantidad de proteína agregada se mide por SEC-HPLC.

98. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

99. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

100. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

101. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobrecarbamilada.

102. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobrecarbamilada.

103. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, que tiene menos de aproximadamente 5% en peso de proteína sobrecarbamilada.

104. Proteína de eritropoyetina carbamilada según la reivindicación 93, donde el proceso comprende la concentración de la proteína de eritropoyetina que se pone en contacto con el cianato es de aproximadamente 3 mg/ml; la concentración del cianato es de aproximadamente 0.5 M; la temperatura es de aproximadamente 32 °C; el pH es de aproximadamente 9.0; y el tiempo es de aproximadamente 24 horas .

105. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de eritropoyetina carbamilada que tiene por lo menos aproximadamente 90% de carbamilación de las aminas primarias de la lisina y los aminoácidos amino terminales; menos de aproximadamente 3% de proteína agregada; y menos de aproximadamente 40% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada, y un portador farmacéuticamente aceptable.

106. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada es eritropoyetina humana.

107. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 2.5% de proteína agregada .

108. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene aproximadamente 0.5% o menos de proteína agregada .

109. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

110. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

111. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% en peso de proteína sobre- y subcarbamilada.

112. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 30% en peso de proteína sobrecarbamilada.

113. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 20% en peso de proteína sobrecarbamilada.

114. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 10% de proteína sobrecarbamilada .

115. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde la proteína de eritropoyetina carbamilada tiene menos de aproximadamente 5% de proteína sobrecarbamilada .

116. Composición farmacéutica según la reivindicación 105, donde el portador es un diluyente, un adyuvante, o un excipiente.

117. Método para el tratamiento de una enfermedad o afección crónica, que comprende la administración de la composición farmacéutica según la reivindicación 105.

118. Método para el tratamiento de una enfermedad o afección subcrónica, que comprende la administración de la composición farmacéutica según la reivindicación 105.

119. Método para el tratamiento de una enfermedad o afección aguda, que comprende la administración de la composición farmacéutica según la reivindicación 105.

120. Método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico, que comprende la administración de la composición farmacéutica según la reivindicación 105.

121. Método según la reivindicación 120, donde la enfermedad es un accidente cerebrovascular, un evento isquémico, una lesión de la médula espinal, una lesión cerebral traumática, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, o neuropatía inducida por quimioterapia.

122. Uso de un compuesto según la reivindicación 74 para la producción de una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para el tratamiento de una enfermedad o afección crónica.

123. Uso de un compuesto según la reivindicación 74 para la producción de una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para el tratamiento de una enfermedad o afección subcrónica.

124. Uso de un compuesto según la reivindicación 74 para la producción de una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para el tratamiento de una enfermedad o afección aguda.

125. Uso de un compuesto según la reivindicación 74 para la producción de una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso central o del sistema nervioso periférico.

126. Uso según la reivindicación 125, donde la enfermedad es un accidente cerebrovascular, un evento isquémico, una lesión de la médula espinal, una lesión cerebral traumática, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, o neuropatía inducida por quimioterapia.