EA011586B1

EA011586B1 - Новый карбамилированный еро и способ его получения

Info

Publication number: EA011586B1
Application number: EA200700255A
Authority: EA
Inventors: Серен Кристенсен; Ларс Фольдагер; Йеспер Вальбьерн; Марианне Халберг Туэсен; Андерс Ельхольт Педерсен; Мортен Мунк
Original assignee: Х. Лундбекк А/С
Priority date: 2004-07-07
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2009-04-28
Also published as: WO2006002646A2; DE602005014117D1; JP5025470B2; AU2005259689A1; IL180518A0; EP1781697B1; NO20070687L; HRP20090343T1; AU2005259689B2; HK1109631A1; JP2008505133A; BRPI0513029A; WO2006002646A3; CY1109232T1; SI1781697T1; MXPA06014742A; CA2572643A1; ES2325034T3; DK1781697T3; EP1781697A2

Abstract

В настоящем изобретении описан способ получения нового карбамилированного эритропоэтина и содержащих новый карбамилированный эритропоэтин композиций, и содержащих его фармацевтических композиций, и их применение.

Description

Настоящее изобретение относится к новому соединению, а также способу получения указанного соединения. Представляющее собой карбамилированный эритропоэтин (СЕРО) новое соединение карбамилировано по всем или большинству первичных аминов лизинов и по Ν-концевой аминокислоте молекулы, и, кроме того, данное соединение имеет низкий уровень карбамилирования первичных аминов других аминокислот в молекуле. Кроме того, данное новое соединение свободно от агрегированных белков и полимеров и приемлемо для применения в фармацевтических композициях для лечения заболеваний, например, центральной и периферической нервной системы и других тканей, экспрессирующих центральный рецептор ЕРО. Одним дополнительным неожиданным преимуществом данного способа получения является тот факт, что способ предоставляет продукт, содержащий меньшее количество агрегированного белка и меньшее количество полимеров, чем продукты, получаемые другими описанными для эритропоэтина известными способами карбамилирования.

Предпосылки изобретения

8а!аке, К. е! а1. (1990) ВюсЫшюа е! ВюрЬ.у81са Ас1а; 1038: 125-129 и Мип, К-С. апй Оо1рет, ТА. (2000) В1оой РипТ; 18: 13-17 показали снижение биологической гематопоэтической активности карбамилированным ЕРО. Втшек е! а1. 2003, патентная заявка США 20030072737 показали, что потеря гематопоэтической активности не препятствует тканевым защитным свойствам ЕРО.

Карбамилирование белков широко известно как побочный эффект применения мочевины в очистке белков и как результат высокого уровня мочевины в сыворотке. Карбамилирование вызвано спонтанным разложением мочевины до цианата. Цианат отвечает за карбамилирование первичных аминов белка в Νконцевой области и подверженных карбамилированию лизинах белка (фиг. 1). Кроме того, другие возможные подверженные карбамилированию аминокислотные остатки представляют собой аргинин, цистеин, тирозин, аспарагиновая кислота, глутаминовую кислоту и гистидин, однако реакция зависит от рН и не протекает так быстро, как с Ν-концевым остатком и остатком лизина.

Нбгккб 8. е! а1. (1992) К1йпеу 1п!етпайопа1.; 41: 1175-1181, Р1арр, В.У. е! а1. (1971) 1оит. Вю1. Сйеш.; 246(4): 939-945, 8а!аке, К. е! а1. (1990) ВюсЫшка е! Вюрйуыса Ас!а; 1038: 125-129 и Мип, К-С. апй Оо1рег, Т.А. (2000) В1оой РипТ; 18: 13-17 провели исследования для того, чтобы выяснить, способно ли карбамилирование белков улучшать или ухудшать биологическую активность белков. Они исследовали биологическое действие карбамилирования белков, используя ΚΟΝΟ в качестве источника цианата. В результате повышенного карбамилирования все они наблюдали снижение или изменение биологической активности. Оценка степени карбамилирования основана на двух аналитических способах:

1. Измерение снижения свободных аминогрупп с применением анализа с тринитробензолсульфоновой кислотой (ТNВ8) и

2. Аминокислотный анализ, определяющий преобразованные в остатки гомоцитруллина лизины. Нбгккб 8. е! а1. (1992) выполняли карбамилирование липопротеина низкой плотности максимум в течение 6 ч при 37°С 2М ΚΟΝΟ, но не получали полностью карбамилированный белок, применяя анализ с ТИВ8.

Р1арр, В. V. е! а1. (1971) изучали действие времени и получили почти полностью карбамилированную бычью панкреатическую дезоксирибонуклеазу А после 24-часовой обработки 1М ΚΟΝΟ при 37°С.

Мип, К-С. апй Оо1рет, Т.А. (2000) изучали зависимость от времени с максимальным временем реакции 6 ч с применением 2М ΚСNΟ. Они также изучали действие повышения концентрации ΚСNΟ в течение 6 ч, все реакции проводили при 37°С.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что карбамилирование ЕРО приводит к образованию полимеров и агрегатов, делая его, таким образом, биофармацевтически непригодным. Кроме того, авторы обнаружили, что образование таких полимеров и агрегатов зависит от условий процесса карбамилирования. Следовательно, необходима разработка процесса с оптимальными параметрами, рассматривая рН, время, концентрацию цианата, температуру, белковую концентрацию и наиболее важный параметр степень полимеризации белка. Настоящее изобретение включает в себя оптимальный процесс карбамилирования с образованием продукта с низкой степенью полимеризации и агрегации, и, кроме того, неожиданно авторы изобретения обнаружили, что получен полностью карбамилированный ЕРО, имея в виду Ν-концевую аминокислоту и все остатки лизина (последнее происходит в указанном диапазоне рН). Для удаления образовавшихся агрегатов и полимеров выполняли последующую стадию способа по изобретению. Полученный карбамилированный чистый ЕРО представляет собой новое соединение и в настоящей заявке заявлен как таковое, наряду с содержащими данное соединение фармацевтическими композициями.

Ранее проиллюстрировано, что степень карбамилирования зависит от концентрации цианата и времени. Однако не описано, как проводить процесс изменяемого карбамилирования для производства биофармацевтического продукта.

Присутствие агрегатов при недостаточно оптимальном получении связано с индукцией антител. И, следовательно, присутствие агрегатов приводит к неприемлемому для применения у людей биофармацевтическому продукту.

Описанный в настоящем изобретении способ карбамилирования и очистки приводит к получению

- 1 011586 белка, характеризуемого как полностью карбамилированный с наименьшей из возможного степенью образования полимеров или агрегатов и с минимальной потерей конечного продукта, что делает его, таким образом, экономически целесообразной стадией.

Кроме того, получение карбамилированного белка предоставляет биофармацевтически приемлемый продукт с исключительно минимальным риском развития иммунологической реакции к белку из-за агрегатов и полимеров.

Кроме аминокислотного анализа, аналитические способы оценки полного карбамилирования представляют собой измерение свободных первичных аминогрупп с применением ΤΝΒ8 и, наконец, определение продукта и расщепленного ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ продукта.

Для получения фармацевтических композиций для лечения чувствительных к нейропротективному действию нативного эритропоэтина заболеваний можно применять новое соединение по изобретению, представляющее собой эритропоэтин, полностью карбамилированный по свободным аминогруппам на Ν-концевой аминокислоте и лизинах молекулы, и, кроме того, не агрегированный и не полимеризованный в объеме свыше 2,5%, и содержащий минимальное количество избыточно или недостаточно карбамилированного эритропоэтина.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к масштабируемому способу карбамилирования белка для получения биофармацевтических продуктов. Кроме того, изобретение относится к продукту, полученному указанным способом, к содержащим соединение фармацевтическим композициям и к применению данных композиций.

Описанный в настоящей заявке способ карбамилирования и очистки приводит к получению белка, характеризуемого как полностью карбамилированный с наименьшей из возможного степенью образования полимеров или агрегатов и с минимальной потерей конечного продукта.

Способ карбамилирования оптимизировали к получению карбамилированного белка с наименьшим количеством полимера или агрегатов, что делает его экономически целесообразным способом. Кроме того, конечный продукт содержит ограниченные количества изоформ избыточно и/или недостаточно карбамилированного эритропоэтина (менее или более 9 карбамилирований на молекулу). Недостаточно карбамилированный ΕΡΟ содержит менее 9 карбамильных остатков, т.е. карбамилированы не все из 8 лизинов и Ν-концевая аминокислота. Недостаточно карбамилированный ΕΡΟ может иметь, например, около 5 карбамильных остатков и, тем не менее, не обладать классической активностью эритропоэтина, делая его приемлемым для применения по настоящему изобретению. Избыточно карбамилированный ΕΡΟ имеет более 9 карбамильных остатков и карбамилирован по аминокислотам, отличным от восьми лизиновых остатков и Ν-концевой аминокислоты. СЕРО может иметь также и 15 карбамильных остатков и, тем не менее, обладать желаемым действием, т. е., отсутствием классической активности эритропоэтина. По меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно 95% изоформ СЕРО карбамилированы только по 8 лизиновым остаткам и Ν-концевому остатку.

Кроме того, получение карбамилированного белка удаляет агрегированный и полимеризованный продукт до максимального уровня 3 или 2,5% и, таким образом, предоставляет биофармацевтически приемлемый продукт с исключительно минимальным риском развития иммунологической реакции к белку из-за агрегатов и полимеров.

Кроме аминокислотного анализа аналитические способы оценки карбамилирования представляют собой измерение свободных первичных аминогрупп с ΤΝΒ8 и определение продукта и расщепленного ΜΆΕΌΙ-ΤΟΕ и ЖХ-МС/МС продукта.

Подробное описание изобретения Способы получения

Способ карбамилирования белков состоит из 6 стадий:

1. Концентрирование ультрафильтрацией

2. Модифицирование карбамилированием.

3. Обессоливание гель-фильтрацией

4. Очистка анионообменом.

5. Концентрирование и замена буфера ультра- и диафильтрацией.

6. Фильтрация через фильтр с размером пор 0,22 мкм

По данному способу карбамилирования исходным веществом является эффективно очищенный человеческий ΕΡΟ, но может являться любая форма ΕΡΟ животного или человеческого типа, в качестве не ограничивающего примера ΕΡΟ представляет собой синтетический, рекомбинантный человеческий ΕΡΟ или биологически, или химически модифицированный человеческий ΕΡΟ, как, например, асиало-ЕРО, мутанты человеческого ΕΡΟ, т.е. молекула с включенными в аминокислотную последовательность заменами, фрагменты ΕΡΟ, пептиды ΕΡΟ, другие белки или смесь белков, если желательно карбамилирование нескольких белков.

Первая стадия способа включает в себя подбор концентрации белка ультрафильтрацией, где концентрацию белка подбирают с целью поддержания низкого объема в ходе производства. По предпочтительному варианту осуществления концентрация белка составляет от 0,05-10 или 0,05-8 мг/мл. Более

- 2 011586 предпочтительным вариантом осуществления является 0,05-7 мг/мл, а наиболее предпочтительны 2-5 мг/мл. Агрегаты формируются в большей степени, если концентрация увеличена. Ультрафильтрацию выполняют посредством ВюМах (МтШроге) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа. Можно применять другие фильтры. Кроме того, посредством добавления стабилизаторов можно подобрать растворимость белка.

После завершения стадии концентрирования белковый раствор смешивают с К-борат тетрагидратом, К-цианатом с рН 7-11 или рН 7-10. По предпочтительному варианту осуществления рН равно 8-10, а наиболее предпочтительно 9,0. Диапазоны температур от 0-60°С или 0 -50°С или от до 40°С или от 0 до менее чем 37°С, но предпочтительный вариант осуществления представляет собой температурный интервал 30-34°С, предпочтительно 32°С, в течение временного интервала 10 мин - 30 суток или 30 мин 30 суток или 1 ч - 30 суток или 1 ч - 20 суток или 1 ч - 10 суток или 1 ч - 5 суток или 1 ч -2 суток или 1-26 ч или 18-26 ч или предпочтительно 22-26 ч, наиболее предпочтительно 24 ч. Однако данные предпочтительные интервалы можно менять, если меняют другие параметры процесса, т. е. температуру, концентрацию цианата и концентрацию белка.

При понижении температуры ниже предельной выход низок из-за медленного и неэффективного карбамилирования. При превышении температурных пределов выход низок из-за повышенной агрегации. Еще один критический параметр представляет собой время, так как карбамилирование не будет завершенным, если время укорочено или наблюдают формирование агрегатов, если время увеличено, следовательно, приводя к более низкому выходу.

Следовательно, представляют процесс с согласованными параметрами, т.е., сниженную реакцию карбамилирования можно компенсировать посредством увеличения концентрации цианата и/или времени реакции, если температура понижена. Кроме того, если снижено время реакции, пониженную реакцию карбамилирования можно компенсировать посредством повышения температуры и/или концентрации цианата. Наконец, в способе со сниженной концентрацией цианата, пониженную реакцию карбамилирования можно компенсировать посредством повышения времени реакции и/или температуры.

Следовательно, в заключение необходимо отметить, что одно значимое изменение одного критического параметра (время, температура, концентрация цианата и белковая концентрация) предполагает изменение одного или нескольких из оставшихся критических параметров для того, чтобы получить полностью карбамилированную молекулу с низким образованием агрегатов и полимеров.

Концентрация боратного буфера может составлять 0,05-2М, но в предпочтительном варианте осуществления 0,1-1М, а наиболее предпочтительно 0,5М из-за существенного гидролиза и полимеризации цианата при поглощении протонов и потери буферной емкости, что приводит к сдвигу рН раствора.

Кроме того, концентрация цианата предпочтительно находится в интервале 0,05-10М, или 0,05-8М, или 0,05-6М, или 0,05-4М, или 0,05-2М, предпочтительным вариантом осуществления является 0,05-1М, а наиболее предпочтительно 0,5М.

Для контроля сдвига рН, вызванного протонным поглощением используемой 0,5М концентрации цианата, необходима 0,5М концентрация боратного буфера. Можно использовать способ с применением других солей цианата и бората. Кроме того, можно применять другие реакционные буферные растворы помимо боратного, например карбонатный буфер или фосфатный буфер.

Обессоливание реакционной смеси белка и цианата выполняют хроматографической гельфильтрацией. Применяют матрицу 0-25 Еше (Атетзйат Вюзаепсез). Время выдержки до нанесения образца на колонку контролируют, и оно не должно превышать 2 ч, поскольку это может вызвать дополнительное карбамилирование и образование полимера. Обессоливание и замену буфера белков можно выполнять диализом, диа-ультрафильтрацией или хроматографической гель-фильтрацией. Можно применять другие матрицы гель-фильтрации, такие как например, матрицы сшитых полисахаридов или сшитых смешанных полисахаридов, полиакриламид, полистирол или матрицы керамической природы. Кроме того, на этой стадии можно менять высоту колонки.

Для получения продукта с менее 40% агрегатов и полимеров или менее 30%, или менее 25%, или менее 20%, или менее 15%, или менее 12,5%, или менее 10%, или менее 8%, или менее 7% можно стандартизировать стадию карбамилирования.

Удаление агрегатов и полимеров выполняют посредством стадии очистки с применением анионного обмена. Отмечают, что можно отделить карбамилированный ЕРО от остатков исходного вещества и от агрегатов/полимеров. Разделяющий буфер А представляет собой: 0,3% Трис (25 мМ), 0,3% (50 мМ) ЫаС1, рН 8,5 ± 0,2, и элюирующий буфер В: 0,3% Трис (25 мМ), 5,8% (1М) ЫаС1, рН 8,5 ± 0,2. Градиент выполняют с 0-30% более 20 объемов колонки, приводя к желательному разделению. Стадия очистки может приводить к получению продукта с менее 3% агрегатов и полимеров или менее 2,5%, или менее 2%, или менее 1,5%, или менее 1%, или менее чем приблизительно 0,5%.

Элюирование и сбор, и объединение пика карбамилированного ЕРО влияет на распределение неоднородности, т.е. изоформ, элюированного белка. Другими словами, количества избыточно и недостаточно карбамилированного СЕРО варьируют в зависимости от способа сбора и объединения. Точное объединение приводит к снижению содержания избыточно и/или недостаточно карбамилированного эритропоэтина. Увеличение интервала градиента обеспечит выделение более определенного продукта посред

- 3 011586 ством исключения других продуктов.

Композиция карбамилированного ЕРО с менее чем приблизительно 40 мас.% определенных Ε8Ιмасс-спектрометрией избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ представляет собой один вариант осуществления изобретения. Более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 35 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее, чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 25 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 15 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее, чем приблизительно 10 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-массспектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 5 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Еще более предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее, чем приблизительно 2 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией. Наиболее предпочтительный вариант осуществления представляет собой СЕРО с менее чем приблизительно 1 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированных изоформ, определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией.

Кроме того, влияние суммарного содержания изоформ, сбор и объединение пика карбамилированного ΕΡΟ оказывает влияние на распределение избыточно карбамилированного СЕРО.

Предпочтительно, чтобы количество определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 35 мас.%. Еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 30 мас.%, а еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 25 мас.%, а еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ΕδΙ-массспектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 20 мас.%, а еще более предпочтительно, чтобы количество определенных ΕδΙ-масс-спектрометрией изоформ избыточно карбамилированного СЕРО составляло менее приблизительно 15 мас.%. Наиболее предпочтительно количество избыточно карбамилированного ΕΡΟ должно составлять не более чем приблизительно 10%, приблизительно 5% или приблизительно 1 мас.% от суммарного СЕРО.

Можно применять другие разделяющие и элюирующие буферы, а также другие анионообменные матрицы. В качестве не ограничивающего примера матрицы представляют собой сшитые полисахариды или сшитые смешанные полисахариды, полиакриламид, полистирол или матрицы керамической природы. Кроме того, для очистки можно равнозначно применять катионообменную, гидрофобную хроматографию, хроматографию с обращенными фазами, аффинную хроматографию и хроматографию с исключением по размеру.

В следующей стадии для подбора концентрации и буфера диа/ультрафильтрацией применяют установку с проточной фильтрацией вдоль потока. Концентрацию карбамилированного ΕΡΟ корректируют до > 0,5 мг/мл и меняют буфер на буферный раствор с 20 мМ цитрата, 100 мМ ЫаС1. Концентрирование и замену буфера выполняют посредством ВюМах (МтШроге) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа. Можно применять другие фильтры.

Наконец, для исключения роста патогенной среды очищенное биофармацевтическое лекарственное вещество фильтруют через фильт с размером пор 0,22 мкм с применением М1Шрак (М1Шроге). Можно применять любой фильтр с размером пор 0,22 мкм.

С применением способа полностью карбамилированного ΕΡΟ получают с менее 3% или предпочтительно менее 2,5% агрегатов, измеренных ВЭЖХ с исключением по размеру. Полное карбамилирование 8 лизиновых остатков подтверждают с применением аминокислотного анализа, определяющего превращенные в гомоцитруллин лизины. Кроме того, после карбамилирования применяют анализ ΤΝΒ8 для определения первичных аминов, доказывая, таким образом, полное карбамилирование лизинов и Νконца.

Кроме того, полное исследование с применением ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ определяет изменение в исходной массе обработанного ΡΝΟαδο белка и белка с Ν-гликанами. Кроме того, ΜΆΕΌΙ-ΤΟΕ анализ в области отпечатка пальцев пептидных масс/ЖХ-МС/МС анализ показывают, что все 8 лизинов и Ν-концевая аминокислота карбамилированы. Другие карбамилированные аминокислоты не определяют и не регистрируют модификации гликанов. Кроме того, в конечном продукте получают сниженное количество избыточно и недостаточно карбамилированных форм ΕΡΟ. Данный продукт является новым и заявленным.

- 4 011586

Один вариант осуществления изобретения представляет собой композицию, полученную после стадии карбамилирования, но до анионообменной очистки, включающей в себя карбамилированный ЕРО с менее приблизительно 40 мас.% агрегатов и полимеров, или менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 12,5%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 8%, или менее приблизительно 7% и количество цианата.

Кроме того, один вариант осуществления изобретения представляет собой композиция, полученная после анионообменной очистки, включающая в себя карбамилированный ЕРО с менее приблизительно 3 мас.% агрегатов и полимеров, или менее приблизительно 2,5%, или менее приблизительно 2%, или менее приблизительно 1,5%, или менее приблизительно 1%, или менее приблизительно 0,5%. Кроме того, данная композиция содержит изоформы, состоящие из избыточно или недостаточно карбамилированного ЕРО в количествах менее приблизительно 40 мас.% суммарного карбамилированного ЕРО, или более предпочтительно менее приблизительно 35%, или менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 7,5%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. Кроме того, количество избыточно карбамилированного ЕРО в композиции может составлять менее приблизительно 35 мас.% суммарного карбамилированного ЕРО, или более предпочтительно менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 7,5%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%.

Фармацевтические композиции по изобретению

Один аспект изобретения представляет собой применение соединений по изобретению для получения фармацевтических композиций для применения у людей или млекопитающих для лечения описанных ниже состояний.

Один вариант осуществления изобретения представляет собой фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество карбамилированного ЕРО с менее приблизительно 3 мас.% агрегатов и полимеров, или более предпочтительно менее приблизительно 2,5%, или менее приблизительно 2%, или менее приблизительно 1,5%, или менее приблизительно 1%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 0,5%, и, кроме того, данная композиция включает в себя изоформы, состоящие из избыточно или недостаточно карбамилированного ЕРО в количествах менее приблизительно 40 мас.% суммарного карбамилированного ЕРО, или более предпочтительно менее приблизительно 35%, или менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 7,5%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 3%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%. Кроме того, количество избыточно карбамилированного ЕРО в композиции может составлять менее приблизительно 35 мас.% суммарного карбамилированного ЕРО, или более предпочтительно менее приблизительно 30%, или менее приблизительно 25%, или менее приблизительно 20%, или менее приблизительно 15%, или менее приблизительно 10%, или менее приблизительно 5%, или менее приблизительно 3%, или менее приблизительно 2%, и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1%.

При осуществлении первого аспекта настоящего изобретения содержащую соединение по изобретению фармацевтическую композицию, как описано выше, можно вводить млекопитающему любым способом, обеспечивающим необходимый уровень соединения по изобретению в сосудистой системе для обеспечения прохождения сквозь эндотелиально-клеточный барьер и благоприятного действия на восприимчивые клетки. Аналогичные эффекты желательны при использовании с целью перфузии ткани или органа. В случае, когда клетки или ткань не васкуляризированы и/или введение представляет собой промывание клеток или ткани композицией по изобретению, фармацевтическая композиция обеспечивает эффективное для лечения клеток количество соединения по изобретению. Эндотелиально-клеточные барьеры, сквозь которые может проходить соединение по изобретению, включают в себя запирающие зоны, перфорированные соединения, фенестрированные соединения и любые другие представленные у млекопитающего типы эндотелиальных барьеров. В качестве не ограничивающего примера предпочтительным барьером является эндотелиально-клеточное плотное соединение.

Указанное выше соединение по изобретению, как правило, приемлемо для терапевтического или профилактического лечения человеческих заболеваний центральной нервной системы или периферической нервной системы, имеющих, главным образом, неврологические или психиатрические симптомы, глазных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, сердечно-легочных заболеваний, респираторных заболеваний, заболеваний почек, заболеваний мочевых путей и заболеваний репродуктивной системы, желудочно-кишечных заболеваний и эндокринных и метаболических нарушений. Конкретно, такие состояния и заболевания включают в себя гипоксические состояния, неблагоприятно воздействующие на возбудимые ткани, как, например, возбудимые ткани в ткани центральной нервной системы, ткани периферической нервной системы или сердечной ткани или ткани сетчатки, такие как, например, в головном

- 5 011586 мозге, сердце или сетчатке/глазу. Таким образом, соединение по изобретению можно применять для лечения или профилактики повреждения возбудимой ткани в результате гипоксических состояний в ряде условий и состояний. В качестве не ограничивающих примеров такие условия и состояния представлены здесь далее в таблице.

В примере защиты от поддающихся лечению по настоящему изобретению патологий нервной ткани, подобные патологии включают в себя состояния, полученные в результате сниженной оксигенации нервных тканей. Любое состояние, снижающее доступ кислорода к нервной ткани, приводящее к стрессу, повреждению и, наконец, гибели нервной клетки, можно лечить способами по настоящему изобретению. Как правило, определяемые как гипоксия и/или ишемия, данные состояния возникают в результате или включают в себя в качестве не ограничивающих примеров инсульт, сосудистую окклюзию, пренатальное или постнатальное кислородное голодание, удушье, удушение, удушье, утопление с угрозой жизни, отравление угарным газом, вдыхание дыма, травму, включая хирургическую и радиотерапию, асфиксию, эпилепсию, гипогликемию, хроническое обструктивное заболевание легких, эмфизему, синдром расстройства дыхания у взрослых, гипотензивный шок, септический шок, анафилактический шок, инсулиновый шок, серповидный кризис, остановку сердца, нарушение ритма, кессонную болезнь и неврологические расстройства, вызванные проведением искусственного кровообращения.

По одному из вариантов осуществления, например, конкретные фармацевтические композиции, содержащие композицию по изобретению, можно вводить для предотвращения травмы или повреждения ткани, возникающего в результате риска травмы или повреждения ткани во время хирургических процедур, таких как, например, резекция опухоли или лечение аневризмы. Другие патологии, вызванные или возникающие в результате гипогликемии, поддающиеся лечению описанными здесь способами, включают в себя передозировку инсулина, также называемую ятрогенной гиперинсулинемией, инсулиному, дефицит соматотропного гормона, гипокортицизм, передозировку лекарственным препаратом и определенные новообразования.

Другие патологии, являющиеся результатом повреждения возбудимой нервной ткани, включают в себя судорожные расстройства, как, например, эпилепсия, конвульсии или хронические судорожные расстройства. Другие поддающиеся лечению состояния и заболевания в качестве не ограничивающих примеров включают в себя заболевания, как, например, инсульт (ишемический инсульт, субарахноидальное кровоизлияние, внутримозговое кровоизлияние), рассеянный склероз, гипотензия, остановка сердца, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, церебральный паралич, травма головного или спинного мозга, СПИД-деменция, возрастная потеря когнитивной функции, потеря памяти, амиотрофический боковой склероз, судорожные расстройства, алкоголизм, ишемия сетчатки, обусловленное глаукомой повреждение зрительного нерва и потеря нейронов.

Конкретная композиция и способы по настоящему изобретению можно применять для лечения воспаления, обусловленного болезненными состояниями или различными травмами, как, например, физически или химически индуцированное воспаление. Такие травмы могут включать в себя ангиит, хронический бронхит, панкреатит, остеомиелит, ревматический артрит, гломерулонефрит, воспаление зрительного нерва, темпоральный артериит, энцефалит, менингит, поперечный миелит, дерматомиозит, полимиозит, некротический фасцилит, гепатит и некротический энтероколит.

Данные демонстрируют, что активированные астроциты могут проявлять цитостатическую роль по отношению к нейронам, продуцируя нейротоксины. Оксид азота, активные формы кислорода и цитокины синтезируются глиальными клетками в ответ на церебральную ишемию (см. Вескег, К. 1. 2001. Тагдейид 111е сеп1га1 иетуоиз зуз1ет шПашша!огу гезроизе ίη 1зсйеш1с з1токе. Сигг Θρίηίοη №ито1 14:349-353 и Майзои, Μ. Р., Си1шзее, С, аий Уи, Ζ. Р. 2000. Арор1ойс и Ап11арор(о(1с шесйашзшз ίη з1токе. Се11 Т1ззиеРез 301: 173-187.). Кроме того, исследования демонстрируют, что в моделях нейродегенерации активация глии и последующая продукция воспалительных цитокинов зависит от первичного нейронного повреждения (см. УМага, В., Сотзш1, Е., ОаШ, СЬ. , Райоуаш, А., Сшзаш, Е., аий Мапиоукй, М. 2000. Оушд иеига1 се11з асйуа1е д11а Штоидй 1йе ге1еазе оГ а рто1еазе ртойис!. Ойа 32: 84-90 и КаЬиГГеЮ, М., 8сютай1, С, Таго/хо, О., С1етеий, Е., МаиГгей1, А.А., аий ВеЙташо, М. 2000. 1ий1Ьйюи оГ сазразе-1-11ке асОуйу Ьу АсТуг-Уа1-А1а-Азр-сЫогоше1йу1 ке1оие шс1ийез 1оид 1аз11ид иеигорго1ес11ои ш сегеЬга1 1зсйеш1а ΙΙιΐΌΐίβΙι арор1оз1з тейисйои и йесгеазе оГ ргошПаттаЮгу суЮкшез. 1 №игозс1 20: 4398-4404). Воспаление и активация глии присущи различным формам нейродегенеративных расстройств, включающих в себя церебральную ишемию, травму головного мозга и экспериментальный аллергический энцефаломиелит, расстройства, при которых эритропоэтин оказывает нейропротективное действие.

Ингибирование продукции цитокинов эритропоэтином может, по меньшей мере, частично, опосредовать свое защитное действие. Однако в отличие от классических противовоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-10 и ИЛ-13, ингибирующих непосредственно фактор некроза опухоли, эритропоэтин оказывается активным только при наличии гибели нейрона.

Не желая быть ограниченными любой конкретной теорией, очевидно, что данную противовоспалительную активность можно гипотетически в качестве неограничивающих примеров объяснить несколькими теориями. Во-первых, так как эритропоэтин предотвращает апоптоз, были бы предотвращены вызванные апоптозом воспалительные события. Кроме того, эритропоэтин может предотвращать высвобо- 6 011586 ждение молекулярных сигналов от гибнущих нейронов, стимулирующих клетки глии или способные действовать непосредственно на клетки глии, снижающие их взаимодействие с данными продуктами. Еще одна возможность состоит в том, что эритропоэтин выявляет более проксимальных участников воспалительного каскада (например, каспаза 1, реакционно-способный кислород или промежуточные соединения азота), запускающих апоптоз и воспаление.

Кроме того, очевидно, что эритропоэтин обеспечивает противовоспалительную защиту без обратного действия, обычно связанного с другими противовоспалительными соединениями, как, например, дексаметазон. Опять не желая быть связанными любой конкретной теорией, однако, очевидно, что это может быть обусловлено действием эритропоэтина на нейротоксины с широким спектром действия, как, например, оксид азота (N0). Хотя в ответ на различные травмы активированные астроциты и микроглия продуцируют нейротоксические количества N0, N0 служит для многих целей в организме, включающих в себя модулирование необходимых физиологических функций. Таким образом, хотя применение противовоспалительного средства может ослабить воспаление посредством супрессии N0 или других нейротоксинов, если противовоспалительное средство обладает слишком долгим периодом полувыведения, оно также может перекрещиваться с задачами данных химических реагентов в восстановлении повреждения, вызванного приводящей к воспалению травмой. Предполагают, что соединение по настоящему изобретению способно ослаблять воспаление без перекреста с репаративными возможностями нейротоксинов, таких как N0.

Конкретные композиции и способы по изобретению можно применять для лечения состояний и повреждений ткани сетчатки. Такие заболевания в качестве не ограничивающих примеров включают в себя ишемию сетчатки, дистрофию желтого пятна, отслоение сетчатки, пигментную дегенерацию сетчатки, артериосклеротическую ретинопатию, гипертензивную ретинопатию, закупорку артерии сетчатки, закупорку вены сетчатки, гипотензию и диабетическую ретинопатию.

По еще одному из вариантов осуществления способы и принципы по изобретению можно применять для профилактики или лечения повреждений, вызванных лучевым поражением или индуцированного химиотерапией повреждения возбудимой ткани. В качестве не ограничивающего примера для защиты от повреждений, вызванных соединениями, такими как таксаны, цисплатин и другие химиотерапевтические средства, способные индуцировать периферическую нейропатию. Дополнительная польза способов по настоящему изобретению состоит в лечении нейротоксического отравления, как, например, отравление домоевой кислотой моллюска, нейролатиризм и болезнь Гуама, амиотрофический боковой склероз и болезнь Паркинсона.

Как указано выше, настоящее изобретение также относится к способу усиления функции возбудимости ткани у млекопитающего посредством периферического введения соединения по изобретению, как описано выше. Различные заболевания и расстройства поддаются лечению с применением данного способа, и, кроме того, данный способ приемлем для усиления когнитивной функции при отсутствии какого-либо расстройства или заболевания. Такие применения настоящего изобретения описаны в дополнительной части далее и включают в себя улучшение познания и обучаемости у человека и не относящихся к человеку приматов.

Расстройства и заболевания, поддающиеся лечению посредством способов по данному аспекту настоящего изобретения, направленные на центральную нервную систему в качестве не ограничивающих примеров, включают в себя расстройства настроения, тревожные расстройства, депрессию, аутизм, синдром дефицита внимания с гиперактивностью и когнитивную дисфункцию. При данных расстройствах характерно усиление нейронной функции. Другие расстройства, поддающиеся лечению в соответствии с замыслом настоящего изобретения, включают в себя, например, расстройство сна, апноэ во сне и связанные с путешествиями расстройства; субарахноидальные и аневризматические кровотечения, гипотензивный шок, ударное повреждение, септический шок, анафилактический шок и осложнения различных энцефалитов и менингитов, например связанные с заболеванием соединительной ткани энцефалиты, как, например, туберкулез кожи.

Другие применения включают в себя профилактику или защиту от отравления нейротоксинами, как например, отравление домоевой кислотой моллюска, нейролатиризм и болезнь Гуама, амиотрофический боковой склероз, болезнь Паркинсона; послеоперативное лечение эмболии или ишемического повреждения; тотальное облучение головного мозга; серповидный кризис и эклампсия.

Дополнительная группа поддающихся лечению способами по настоящему изобретению расстройств включает в себя митохондриальную дисфункцию наследственной или приобретенной природы, являющуюся причиной ряда неврологических заболеваний, являющихся типичным примером нейронального повреждения и гибели. Например, болезнь Ли (подострая некротическая энцефалопатия) характеризуется прогрессивной потерей зрения и энцефалопатией из-за резкого снижения нейронной функции и миопатии. В этих случаях, дефектный митохондриальный метаболизм не в состоянии восполнять достаточно высокие энергетические субстраты для поддержания метаболизма возбудимых клеток. Модулятор активности рецептора эритропоэтина оптимизирует недостаточную функцию в ряде митохондриальных заболеваний. Как указано выше, гипоксические состояния неблагоприятно действуют на возбудимые ткани. Возбудимые ткани включают в качестве не ограничивающих примеров в себя ткань цен

- 7 011586 тральной нервной системы, ткань периферической нервной системы и сердечную ткань. Кроме описанных выше состояний, способы по настоящему изобретению приемлемы для лечения отравления вдыханием, например, угарного газа и вдыхания дыма, тяжелой астмы, синдрома расстройства дыхания у взрослых, удушья и близкого к смерти от утопления состояния. Дополнительные состояния, создающие гипоксические условия или индуцирующие повреждение возбудимой ткани другими способами, включают в себя гипогликемию, которая может произойти при неадекватном дозировании инсулина или при инсулин-продуцирующих новообразованиях (инсулинома).

Различные нейрофизиологические расстройства, как полагают, возникающие из-за повреждения возбудимой ткани, поддаются лечению посредством срочных процедур. Хронические расстройства, в которые вовлечено нейрональное повреждение и лечение которых обеспечивается по настоящему изобретению, включают в себя связанные с центральной нервной системой и/или периферической нервной системой расстройства, включающие в себя возрастную потерю когнитивной функции и старческое слабоумие, хронические судорожные расстройства, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, деменцию, потерю памяти, амиотрофический латеральный склероз, рассеянный склероз, туберозный склероз, болезнь Вильсона, церебральный и прогрессивный надъядерный паралич, болезнь Гуама, деменцию с тельцами Леви, прионные заболевания, как, например, спонгиозная энцефалопатия, например, болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Гентингтона, миотоническую дистрофию, болезнь Шарко-Мари-Тута, атаксию Фридриха и другие атаксии, а также синдром Жилля де ла Туретта, судорожные расстройства, как, например, эпилепсия и хронические судорожные расстройства, инсульт, травму головного или спинного мозга, СПИД-деменцию, алкоголизм, аутизм, ишемию сетчатки, глаукому, расстройства автоматической функции, такие как гипертензия и расстройства сна, и нейропсихиатрические расстройства, в качестве не ограничивающих примеров включающие в себя шизофрению, шизоаффективное расстройство, синдром нарушения внимания с гиперактивностью, дистимическое расстройство, большое депрессивное расстройство, мания, обсессивно-компульсивное расстройство, связанные с применением психоактивных веществ расстройства, беспокойство, паническое расстройство, а также униполярные и биполярные аффективные расстройства. Дополнительные нейропсихиатрические и нейродегенеративные расстройства включают в себя, например, расстройства, указанные в Атепсап Р8усЫа1пс А^оаабопк Όίαβηοδίίο и 81аЙ8Йса1 Мапиа1 οί Меп1а1 Экогбеге (Ό8Μ), самая последняя версия IV, полностью включенная сюда в качестве ссылки.

По еще одному из вариантов осуществления можно применять содержащие соединение по изобретению рекомбинантные химерные молекулы токсинов для терапевтического применения токсинов для лечения пролиферативного заболевания, как, например, злокачественная опухоль, или вирусного заболевания, как например, подострый склерозирующий панэнцефалит.

В табл. 1 в качестве не ограничивающих перечислены дополнительные примеры в отношении различных состояний и заболеваний, поддающихся лечению указанными выше соединениями по изобретению.

- 8 011586

Таблица 1

Клетка, ткань или орган	Дисфункция или патология	Расстройство или заболевание	Тип
Сердце	Ишемия	Сердечнососудистое заболевание	Острое, хроническое стабильное, нестабильное
Инфаркт миокарда	Синдром Дресслера
Стенокардия
Врожденный порок сердца	Клапанная кардиомиопатия
Стенокардия Принцметала
Разрыв сердца	Аневризматическое отверстие перегородки
Ангиит
Аритмия	Тахи-, брадиаритмия, патологии наджелудочковой, внутрижелудочковой проводимости	Стабильная, нестабильная гиперчувствительность каротидного синуса

	Застойная сердечная недостаточность	Левосторонняя, правосторонняя, бивентрикулярная, систолическая, диастолическая	Кардиомиопатии, как например, идиопатическая семейная, инф е кци окна я, метаболическая, болезнь накопления, пороки, заболевание соединительной ткани, инфильтрация и гранулемы, нейрососудистая
Миокардиты	Аутоиммунный, инфекционный, идиопатический
Легочное сердце
Грубая и пенетрирующая травма
Токсины	Кокаиновая токсичность
Сосудистая	Гипертензия	Первичная, вторичная
Декомпрессионная болезнь
Фиброзномышечная гиперплазия
Аневризма	Расслаивающая, разрывающая, ра сширяюща я
Легкие	Обструктивная	Астма, хронический бронхит, эмфизема и дыхательная обструкция
Ишемическая болезнь легких	Легочная эмболия, легочный тромбоз, жировая эмболия

- 9 011586

	Вызываемые загрязнением окружающей среды заболевания легких
Ишемическая болезнь легких	Легочная эмболия, легочный тромбоз
Интерстициальное заболевание легких	Идиопатический легочный фиброз
Наследственная	Кистозный фиброз
Легочное сердце
Травма
Пневмония и · пневмониты	Инфекционная, паразитарная, токсическая, травматическая, ожоговая, аспирационная
Саркоидоз
Поджелудочная железа	Эндокринная	Сахарный диабет, тип I и II	Отсутствие, дисфункция бета клеток, диабетическая нейропатия
Другое поражение эндокринных клеток поджелудочной железы
Экзокринная	Поражение экзокринной поджелудочной железы	Панкреатит

- 10 011586

Костная	Остеопения	Первичная, Вторичнная	Гипогонадизм, иммобилизация, постклимактерический, возрастной, гиперпаратиреоидизм, гипертиреоидизм, дефицит кальция, магния, фосфора и/или витамина й
Остеомиелит
Аваскулярный некроз
Травма
Болезнь Пагета
Кожа	Алопеция	Локальная, тотальная	Первичная, вторичная, мужчина мужское облысение
Витилиго	Локальное, генерализованное	Первичное, вторичное
Диабетическое изъязвление
Болезнь периферических сосудов
Ожоговые повреждения
Аут оиммунные расстройства	Красная волчанка, болезнь Шегрена, ревматоидный артрит, гломерулонефрит, ангиит
Гистиоцитоз клеток Лангерганса
Глаз	Воспаление зрительного нерва

- 11 011586

	Грубые и пенетрирующие по врежде ния, инфекции, саркоид, серповидноклеточное заболевание, отслоение сетчатки, темпоральный артериит
Ишемия сетчатки, дистрофия желтого пятна, пигментная дегенерация сетчатки, атеросклеротическая ретинопатия, гипертензивная ретинопатия, закупорка артерии с е т ч а т ки, закупорка вены сетчатки, гипотензия, диабетическая ретинопатия и макулярный отек
Эмбриональные и зародышевые расстройства	Асфиксия
Ишемия
цнс	Синдром хронической усталости, острый и хронический гипоосмолярный и гиперосмолярный синдромы, СПРЩ-деменция, смертельная электротравма
	Энцефалит	Бешенство, герпес
Менингит

- 12 011586

	Субдуральная гематома
Пристрастие к никотину
Пристрастие к наркотическим веществам и синдром отмены	Кокаин, героин, крэк, марихуана, ЛСД, фенциклидин, полинаркомания, экстази, опиоиды, седативные/ успокоительные средства, амфетамины, кофеин
Обсессивнокомпульсивные расстройства
Спинальный стеноз, поперечный миелит, синдром Гийена—Баре, травма, сдавление корешка нерва, опухолевое сдавление, тепловой удар
лор	Шум в ушах, синдром Меньера, потеря слуха
Травматическое повреждение, баротравмы

- 13 011586

Почка	Почечная недостаточность	Острая, хроническая	Сосудистая/ ишемическая, коллагеновая болезнь, диабетическое заболевание почек, нефротические синдромы, инфекции, повреждение, контрастиндуцированная, индуцированная химиотерапией, индуцированная экстракорпоральным кровообращением или профилактическая
Болезнь Шенлейн-Геноха
Поперечнополосатая мышца	Аутоиммунные расстройства	Миастения гравис, дерматомиозит, полимиозит
Миопатии	Наследственная, метаболическая, эндокринная и токсическая
Тепловой удар
Повреждение с размозжением тканей
Рабдомилоз
Митохондриальное заболевание
Инфекция	Некротический фасциит
Половая дисфункция	Центральная и периферическая (например, эректильная дисфункция)	Вторичная импотенция в результате лечения, (диабет)
Печень	Гепатит	Вирусный, бактериаль ный, паразитический

- 14 011586

	Ишемическая болезнь
Цирроз, жировая инфильграция печени
Инфиль трирующие/метаболиче ские заболевания
жкт	Ишемическая болезнь пищеварительного тракта
Воспалительное заболевание пищеварительного тракта
Некротический энтероколит
Трансплантация органа	Лечение донора и реципиента
Половые пути	Бесплодие	Сосудистое, аутоиммунное, патологии матки, имплантационные нарушения
Эндокринная	Гландулярная гипер- и гипофункция

Как указано выше, данные заболевания, расстройства или состояния являются только иллюстрациями ряда преимуществ, обеспечиваемых соединением по изобретению. Соответственно, данное изобретение в целом обеспечивает терапевтическое или профилактическое лечение последствий механической травмы или человеческих заболеваний. Предпочтительно терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний ЦНС и/или периферической нервной системы. Представлено терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний с психиатрическим компонентом. Представленное терапевтическое или профилактическое лечение заболеваний, расстройств или состояний в качестве не ограничивающих примеров включает в себя заболевания с глазным, сердечно-сосудистым, сердечно-легочным, респираторным, почечным, мочевым, репродуктивным, желудочно-кишечным, эндокринным или метаболическим компонентом.

В одном из вариантов осуществления такую содержащую соединение по изобретению фармацевтическую композицию можно вводить системно для защиты или улучшения состояния клеток-мишеней, ткани или органа. Такое введение может представлять собой парентерально, посредством ингаляции, через слизистую оболочку, например перорально, назально, ректально, интравагинально, сублингвально, подслизистым введением или чрескожно. Предпочтительно парентеральное введение представляет собой, например, внутривенную или интраперитонеальную инъекцию, а также в качестве не ограничивающих примеров включает в себя внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение.

Для других путей введения, которыми вводят фармацевтическую композицию, как, например, посредством перфузируемой жидкости, инъекции в орган, или другого местного введения, приводит к результату в соответствующих концентрациях соединения по изобретению, как описано выше. Предпочтительная концентрация составляет приблизительно 0,01 пМ - 30 нМ.

Фармацевтические композиции по изобретению могут включать в себя терапевтически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления термин фармацевтически приемлемый означает средства, одобренные Федеральным регулирующим органом или правительством штата или перечисленные в американской Фармакопее или другой общепризнанной иностранной фармакопее для применения у животных, а более конкретно, у людей. Термин носитель относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или носителю, с которым вводят лекарство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, как, например, солевые растворы в воде и маслах, включающие в себя масла из нефтепродуктов, животного, растительного или синтетического происхождения, как например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и т.п. Предпочтительным носителем является физиологический раствор, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей, конкретно для инъекционных растворов также можно применять солевые растворы и водный раствор глюкозы, и растворы глицерина. Фармацевтически приемлемые наполнители включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Если жела

- 15 011586 тельно, композиция также может содержать небольшие количества увлажнителей или эмульгирующих веществ или рН буферных веществ. Данные композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Композицию можно формулировать как суппозиторий с обычными связывающими веществами и носителями, как, например, триглицериды. Соединения по изобретению можно формулировать как нейтральные или солевые формы. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли, образованные свободными аминогруппами, как, например, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот группы и т.д., и группы, образованные свободными карбоксильными группами, как, например, группы, полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д. Примеры приемлемых фармацевтических носителей описаны в Кеш1пд!ои'8 Рйагтасеийса1 Заеисек у Е.^. Магйи. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, вместе с приемлемым количеством носителя для обеспечения формы для соответствующего введения пациенту. Формулировка должна удовлетворять способу введения.

Приспособленные для перорального введения фармацевтические композиции можно принимать в виде капсул или таблеток; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропа или суспензий (в водных или неводных жидкостях); в виде съедобных пленок или кремов; или в виде эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или их производные, стеарат магния, сахаросодержащий натрий, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислота или их соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы и сахара.

Предназначенное для перорального введения активное вещество можно покрывать или смешивать с веществом, задерживающим распад и/или абсорбцию активного вещества в желудочно-кишечном тракте (например, можно применять глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат). Таким образом, можно достичь продолжительного высвобождения активного вещества в течение многих часов, и, если необходимо, активное вещество можно защищать от деградации в желудке. Для облегчения высвобождения активного вещества в конкретном участке желудочно-кишечного тракта фармацевтические композиции для перорального введения можно формулировать с помощью определенного рН или ферментативных условий.

Приспособленные для трансдермального введения фармацевтические композиции можно вводить в виде дискретных частей, предназначенных для сохранения в непосредственном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного промежутка времени. Приспособленные для местного введения фармацевтические композиции можно вводить в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Для местного применения на коже, рту, глазу или других внешних тканях предпочтительно применять местно мазь или крем. При формулировании в виде мази активный ингредиент можно применять с парафиновой или водорастворимой мазевой основой. В качестве альтернативы, активный ингредиент можно формулировать в крем с основой масло-в-воде или основой вода-в-масле. Приспособленные к местному введению в глазу фармацевтические композиции включают в себя глазные капли. В данных композициях активный ингредиент можно растворять или суспендировать в приемлемом носителе, например в водном растворителе. Приспособленные к местному введению в ротовой полости фармацевтические композиции включают в себя таблетки, пастилки и жидкости для полоскания рта.

Приспособленные для назального и легочного введения фармацевтические композиции могут содержать твердые носители, как, например, порошки (предпочтительно с размером частиц в диапазоне от 20 до 500 мкм). Порошки можно вводить сопровождающимся вдохом способом, т.е. посредством быстрого вдыхания носом из поднесенного близко к носу контейнера с порошком. В качестве альтернативы, приспособленные для назального введения композиции могут содержать жидкие носители, например спреи для носа или капли для носа. В качестве альтернативы, ингаляцию непосредственно в легкие можно выполнять посредством глубокой ингаляции или установки загубника в ротоглотку. Данные композиции могут содержать водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции для введения ингаляцией можно поставлять в специально приспособленных устройствах, в качестве не ограничивающих примеров включающих в себя аэрозоли под давлением, распылители или порошковдуватели, которые можно конструировать для введения определенных заранее дозировок активного ингредиента. По предпочтительному варианту осуществления, фармацевтические композиции по изобретению вводят прямо в носовую полость или легкие через носовую полость или ротоглотку.

Приспособленные для ректального введения фармацевтические композиции можно вводить в виде суппозиториев или клизм. Приспособленные для вагинального введения фармацевтические композиции можно вводить в виде вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или аэрозольных препаратов.

Приспособленные для парентерального введения фармацевтические композиции включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы или суспензии, которые могут содержать антиоксиданты, буферные растворы, бактериостатические вещества и растворы с кровью предполагаемого

- 16 011586 реципиента, превращающие композиции, главным образом, в изотонические. Другие компоненты, которые могут присутствовать в таких композициях, включают в себя, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Приспособленные для парентерального введения фармацевтические композиции можно выпускать в однократной дозировке или содержащих многократные дозировки контейнерах, например герметично закрытых ампулах и флаконах, и можно хранить в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением, например, стерильного физиологического раствора для инъекций. Предназначенные для немедленного приема инъекционные растворы и суспензии можно получать из порошков, гранул и таблеток. По одному из вариантов осуществления содержащий инъекционный раствор соединения по изобретению автоинжектор можно использовать для неотложного применения в машинах скорой помощи, пунктах медицинской помощи и в условиях боевых действий, а также для самостоятельного введения в домашних условиях, особенно в случаях возможной травматической ампутации, как, например, неосторожное обращение с газонокосилкой. Вероятность выживания после реплантации клеток и тканей в отрезанной ноге или пальце ноги можно увеличить введением соединения по изобретению в несколько участков в отрезанную часть, как только осуществление этого станет возможным, даже до прибытия медицинского персонала на участок, или доставки пострадавшего индивидуума с отрезанным пальцем ноги в отделение неотложной хирургии.

По предпочтительному варианту осуществления композицию формулируют в соответствии с общепринятыми способами, например, приспособленную для внутривенного введения людям фармацевтическую композицию. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буферном растворе. Если необходимо, композиция также может включать в себя растворитель и местный анестетик для снятия боли в участке инъекции, как например, лидокаин. Как правило, ингредиенты комплектуют отдельно или смешивают вместе в стандартную лекарственную форму, например в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, как например, ампула или пакет-саше с указанием количества активного вещества. При инфузионном введении композицию можно дозировать с помощью содержащего фармацевтически стерильную воду или физиологический раствор инфузионного сосуда. При введении композиции посредством инъекции ампулу со стерильным физиологическим раствором можно приготовить таким образом, чтобы можно было смешать ингредиенты непосредственно перед введением.

Как правило, суппозитории содержат активное вещество в диапазоне от 0,5 до 10 мас.%; пероральные препараты предпочтительно содержат от 10 до 95% активного вещества.

Перфузируемую композицию можно готовить для применения в сосудах для пересаженных органов, для перфузии ίη кйи или для введения в сосудистую систему донорского органа перед забором органа. Такие фармацевтические композиции могут содержать не приемлемые для острого или хронического, местного или системного введения индивидууму концентрации соединения по изобретению, но удовлетворяющие функциям, определенным здесь в трупе, сосуде для органа, перфузате для органа, или перфузии ίη кйи до удаления или снижения содержавшихся там концентраций соединения по изобретению до выделения или возвращения обработанного органа или ткани в системную циркуляцию.

Изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по изобретению контейнеров. Такой контейнер(ы) необязательно сопровождаются уведомлением в форме, установленной государственными органами, контролирующими производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, в таком уведомлении отражено одобрение организации производства, применения или продажи для введения людям.

По еще одному из вариантов осуществления, например, соединение по изобретению можно выпускать в системе с контролируемым высвобождением. Например, полипептид можно вводить с применением внутривенной инфузии, имплантируемой осмотической помпы, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. По одному из вариантов осуществления можно применять помпу (см. Ьапдег, выше; 8ейоп, 1987, СКС Сгб. К.еГ. Вютеб. Епд. 14: 201; Висйта1б е! а1., 1980, 8шдегу 88: 507; 8аибек е! а1., 1989, N. Епд1. I. Меб. 321: 574). По еще одному из вариантов осуществления соединение можно выпускать в везикуле, конкретно липосоме (см. Ьапдег, 8с1епсе 249: 1527-1533 (1990); Тгеа! е! а1., ίη Ь1рокотек ш 1Не Тйетару οί 1пГесйоик Ищеаке и Сапсег, Ьоре/-Вегек1еш и Е1б1ет (ебк.), Ыкк, №\ν Уогк, рр. 353-365 (1989); \УО 91/04014; патент США № 4704355; Ьорех-Ветейеш, 1Ь1б., рр. 317-327; кее депега11у 1Ь1б.). По еще одному из вариантов осуществления можно применять полимерные материалы (см. Меб1са1 АррНсаПопк оГ Соп1го11еб К.е1еаке, Ьапдег и СТке (ебк.), СКС Ргекк: Воса Ка1оп. Р1ойба, 1974; Соп1го11еб Эгид ВюауайаЬййу, Эгид Ртобис!: Иеыдп апб РегГогтапсе, 8шо1еп апб Ва11 (ебк.), \УПеу: №\ν Уогк (1984); Капдег апб Реррак, ί. Масгото1. 8ст Кеу. Масгото1. Сйет. 23: 61, 1953; также см. Ьеуу е! а1., 1985, 8с1епсе 228: 190; Иитшд е! а1., 1989, Апп. №ито1. 25: 351; Но\\шб е! а1, 1989, I. №игокигд. 71: 105).

По еще одному из вариантов осуществления систему с контролируемым высвобождением можно помещать близко от терапевтической мишени, т. е. целевых клеток, ткани или органа, требуя, таким образом, только части системной дозы (см., например, Сообкоп, рр. 115-138 ш Меб1са1 Аррйсайопк оГ Соп1го11еб К.е1еаке, уо1. 2, кирга, 1984). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждают в

- 17 011586 обзоре у Ьапдег (1990, 8аепсе 249: 1527-1533).

По еще одному из вариантов осуществления соединение по изобретению в виде соответствующей формулировки можно вводить посредством назального, перорального, ректального, вагинального или сублингвального введения.

В конкретном варианте осуществления может быть желательно введение композиций по изобретению местно в нуждающуюся в лечении область; этого можно достичь, в качестве не ограничивающего примера, локальной инфузией во время хирургической операции, местной аппликацией, например в сочетании с обработкой раны после хирургической операции, инъекцией, посредством катетера, при помощи суппозитория или при помощи имплантата, указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включающий в себя мембраны, как, например, силиконовые мембраны или нити.

Выбор предпочтительной эффективной дозы квалифицированный специалист производит на основании рассмотрения нескольких факторов, известных любому специалисту в данной области. Такие факторы включают в себя конкретную форму соединения по изобретению и его фармакокинетические параметры, как, например, биодоступность, метаболизм, период полувыведения и т.д., устанавливаемые во время стандартных процедур разработки, обычно используемых при получении разрешения контролирующего органа для фармацевтического соединения. Дополнительные факторы в обсуждении дозы включают в себя подвергаемое лечению состояние или заболевание, или достижение пользы у нормального индивидуума, массу тела пациента, путь введения, если введение является острым или хроническим, сопутствующие назначения лекарственных средств и другие факторы, хорошо известные для достижения эффекта от введенных фармацевтических веществ. Таким образом, точную дозу следует определять согласно заключению практикующего врача и обстоятельств каждого пациента, например, в зависимости от состояния и иммунного статуса отдельного пациента и в соответствии со стандартными клиническими способами.

По еще одному аспекту настоящего изобретения перфузат или перфузионный раствор предоставляют для перфузии и хранения органов для трансплантации, перфузионный раствор, включающий в себя количество соединения по изобретению, эффективен для защиты чувствительных клеток и ассоциированных клеток, тканей или органов. Трансплантация в качестве не ограничивающего примера включает в себя ксенотрансплантацию, где орган (включая клетки, ткань или другую часть тела) забирают от одного донора и пересаживают в отличающегося реципиента; и аутотрансплантацию, при которой орган забирают из одной части тела и помещают в другую, включая хирургические процедуры на столе, при которых орган можно удалить, и во время его положения ех у1уо резецировать, восстановить или обработать иначе, как, например, удаление опухоли, а затем возвратить в исходное положение. По одному из вариантов осуществления перфузионный раствор представляет собой раствор 111е Итуегайу о£ ХУйсопйп (И^) §о1и!юп (патент США № 4798824), содержащий от приблизительно 1 до приблизительно 25 Ед/мл эритропоэтина, 5% гидроксиэтилкрахмала (с молекулярным весом от приблизительно 200000 до приблизительно 300000 и в значительной степени свободный от этиленгликоля, этиленхлоргидрина, хлорида натрия и ацетона) ; 25 мМ КН₂РО₄; 3 мМ глутатиона; 5 мМ аденозина; 10 мМ глюкозы; 10 мМ буферного раствора НЕРЕ8; 5 мМ глюконата магния; 1,5 мМ СаС1₂; 105 мМ глюконата натрия; 200000 единиц пенициллина; 40 единиц инсулина; 16 мг дексаметазона; 12 мг фенолового красного; с рН 7,4-7,5 и осмолярностью приблизительно 320 мОсм/л. Раствор применяют для поддержания трупных почек и поджелудочных желез до трансплантации. С применением раствора консервирование можно продолжать свыше 30-часового ограничения, рекомендованного для консервирования трупных почек. Данный конкретный перфузат является всего лишь иллюстративным ряда подобных растворов, которые можно приспособить для настоящего применения включением эффективного количества соединения по изобретению. По дополнительному варианту осуществления перфузионный раствор содержит от приблизительно 0,01 пг/мл до приблизительно 400 нг/мл соединения по изобретению, или приблизительно от 40 приблизительно до 300 нг/мл соединения по изобретению.

Тогда как предпочтительным реципиентом соединения по изобретению во всех целях здесь является человек, применяемые здесь способы одинаковы для всех млекопитающих, конкретно одомашненных животных, домашнего скота, домашних животных и животных зоопарка. Однако изобретение не ограничено таким образом, и преимущества можно применять к любому млекопитающему.

Терапевтические и профилактические применения соединений по изобретению

Как отмечено далее в примере 1, присутствие рецепторов эритропоэтина в эндотелии капилляров головного мозга человека указывает, что мишени соединений по изобретению присутствуют в головном мозге человека, и что исследования на животных данных соединений по изобретению непосредственно переносятся на лечение или профилактику людей.

По еще одному аспекту изобретения способы и композиции для улучшения жизнеспособности клеток, тканей или органов, не отделенных от сосудистой системы эндотелиально-клеточным барьером, обеспечивают экспонированием клеток, ткани или органов непосредственно с фармацевтической композицией, содержащей соединение по изобретению, или введением, или взаимодействием соединения по изобретению - взаимодействием фармацевтической композиции с сосудистой системой ткани или орга

- 18 011586 на. Усиленная активность восприимчивых клеток в обработанной ткани или органе содействует оказанным положительным эффектам.

Как описано выше, изобретение отчасти основано на открытии, что молекулы эритропоэтина можно транспортировать от люминальной поверхности к поверхности базальной мембраны эндотелиальных клеток капилляров органов с эндотелиально-клеточными плотными контактами, включающими в себя, например, головной мозг, сетчатку и яички. Таким образом, чувствительные клетки поперек барьера являются восприимчивыми мишенями для лечебных воздействий соединения по изобретению, а другие типы клеток или тканей, или органов, содержащих и зависящих полностью или частично от восприимчивых клеток, представляют собой здесь мишени для способов по изобретению. Не желая связываться с любой конкретной теорией, после трансцитоза соединения по изобретению, соединение по изобретению может взаимодействовать с рецептором эритропоэтина на чувствительной клетке, например нервной, ретинальной, мышечной, сердечной, легочной, печеночной, почечной, клетке тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечника, капиллярного эндотелия, яичек, яичников, поджелудочной железы, костной, клетке кожи или эндодермальной клетке, а связывание рецептора может инициировать сигнальную передачу по каскаду, приводя к активации программы генной экспрессии в чувствительной клетке или ткани, приводя к защите клетки или ткани, или органа от повреждения, как, например, токсинами, химиотерапевтическими веществами, лучевой терапией, гипоксией и т. д. Таким образом, способы защиты содержащей чувствительные клетки ткани от повреждения или гипоксического стресса, и усиление функции такой ткани описаны в подробном описании здесь далее. Как указано выше, способы по изобретению одинаково применимы к людям, а также к другим животным.

По одному из способов одного варианта осуществления изобретения, млекопитающего больного для лечения злокачественной опухоли подвергают системной химиотерапии, включающей в себя лучевую терапию, обычно обладающей побочными эффектами, как, например, поражение нервов, легких, сердца, яичников или яичек. Введение содержащей соединение по изобретению фармацевтической композиции, как описано выше, выполняют перед или во время химиотерапии и/или лучевой терапии для защиты различных тканей и органов от повреждения химиотерапевтическим веществом, например для защиты яичек. Лечение можно продолжать до тех пор, пока циркулирующие концентрации химиотерапевтического вещества снизятся ниже уровня потенциальной опасности в организме млекопитающего.

По одному из способов еще одного варианта осуществления изобретения, различные органы, запланированные для забора от жертвы автомобильной аварии для трансплантации нескольким реципиентам, несколько из которых необходимо транспортировать на продолжительные расстояния и период времени. Перед забором органа жертве вводят содержащую соединение по изобретению фармацевтическую композицию, как здесь описано. Для транспортировки забранные органы перфузируют содержащей соединение по изобретению перфузионной жидкостью, как здесь описано, и хранят в содержащей соединение по изобретению емкости. Определенные органы непрерывно перфузируют пульсирующей перфузией дважды, используя перфузат по настоящему изобретению, содержащий соединение по изобретению. При транспортировке и при имплантации и реперфузии органов ίη 8Йи происходит минимальное повреждение функции органа.

По еще одному из вариантов осуществления изобретения, хирургическое вмешательство для восстановления сердечного клапана требует временной остановки сердца и артериальной окклюзии. Перед хирургической операцией пациенту вводят 4 мкг соединения по изобретению на кг массы тела. Такая обработка предотвращает гипоксическое ишемическое клеточное повреждение, конкретно после реперфузии.

По еще одному из вариантов осуществления изобретения, соединение по изобретению можно применять при любом хирургическом вмешательстве, как, например, операция в условиях искусственного кровообращения. По одному из вариантов осуществления, для защиты головного мозга, сердца и других органов введение содержащей соединение по изобретению фармацевтической композиции, как описано выше, выполняют перед, во время и/или после процедуры искусственного кровообращения.

В указанных выше примерах, в которых соединение по изобретению применяют для аппликаций ех νίνο, или для обработки чувствительных клеток, как например нервной ткани, ткани сетчатки, сердца, легких, печени, почек, тонкого кишечника, коры надпочечников, мозгового вещества надпочечников, капиллярного эндотелия, яичек, яичников или клеток, или ткани эндометрия, изобретение относится к фармацевтической композиции в стандартной лекарственной форме, приспособленной для защиты или активации чувствительных клеток, тканей или органов, отдаленных от сосудистой системы, содержащей в стандартной дозировке эффективное нетоксичное количество соединения по изобретению и фармацевтически приемлемого носителя в диапазоне от приблизительно 0,01 пг до 5 мг, 1 пг до 5 мг, 500 пг до 5 мг, 1 нг до 5 мг, 500 нг до 5 мг, 1 мкг до 5 мг, 500 мкг до 5 мг, или 1 мг до 5 мг. По предпочтительному варианту осуществления, количество соединения по изобретению находится в диапазоне от приблизительно 1 нг до 5 мг.

По дополнительному аспекту изобретения обнаружили, что введение ЕРО восстанавливает когнитивную функцию у подверженных травме головного мозга животных. Можно предположить, что соединения по изобретению обладают такими же защитными эффектами для клеток, как ЕРО. После 5

- 19 011586 суточной или 30-суточной выдержки ΕΡΟ все еще способен к восстановлению функционирования по сравнению с ложно-обработанными животными, показывая способность ΕΡΟ восстанавливать или воспроизводить активность головного мозга. Таким образом, изобретение также относится к применению соединения по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения травмы головного мозга и других когнитивных дисфункций, включая в себя лечение значительно позже повреждения (например, трех суток, пяти суток, недели, месяца или дольше). Изобретение также относится к способу лечения когнитивной дисфункции после повреждения посредством введения эффективного количества соединения по изобретению. Для данного аспекта изобретения можно применять любое соединение по изобретению, как здесь описано.

Кроме того, данный восстановительный аспект изобретения относится здесь к применению любого из соединений по изобретению для получения фармацевтической композиции для восстановления клеточной, тканевой или органной дисфункции, где лечение начинают после и значительно позже ответственного за дисфункцию исходного повреждения. Кроме того, лечение с применением соединения по изобретению может перекрывать развитие заболевания или состояния во время острой фазы, а также хронической фазы.

В примере, где соединение обладает эритропоэтической активностью, соединение можно вводить системно в дозировке на введение между приблизительно 1 мкг и приблизительно 100 мкг/кг массы тела, предпочтительно приблизительно 5-50 мкг/кг массы тела, наиболее предпочтительно 10-30 мкг/кг массы тела. Данная эффективная доза должна быть достаточной для достижения сывороточных концентраций соединения более чем приблизительно 10000, 15000 или 20000 мЕд/мл сыворотки после введения соединения. Таких сывороточных концентраций можно достичь в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ч после введения. Такие дозировки можно повторять по мере необходимости. Например, введение можно повторять ежедневно, так длительно, насколько это клинически необходимо, или после соответствующего интервала, например каждые от 1 до 12 недель, но предпочтительно каждые от 1 до 3 недель. Эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель можно фасовать в сосуд с однократной дозой или другой контейнер. Однако, соединение по изобретению не является эритропоэтическим, т. е. оно способно проявлять описанную здесь активность без увеличения концентрации гемоглобина или гематокрита. Такое неэритропоэтическое соединение особенно предпочтительно в примерах, где способы по настоящему изобретению направлены на хроническое применение. По еще одному из вариантов осуществления, соединение по изобретению дают в дозе, большей, чем соответствующая необходимая для максимальной стимуляции эритропоэза доза (мас./мас.) природного эритропоэтина. Как указано выше, соединение по изобретению не обладает эритропоэтической активностью, и следовательно указанные выше дозировки выражают в единицах, только приблизительно соответствующих количествам природного эритропоэтина; здесь выше представлены молярные эквиваленты для дозировок, применимые к любому соединению по изобретению.

Примеры

Настоящее изобретение можно лучше понять со ссылкой на следующие далее не ограничивающие примеры, представленные в качестве иллюстрации изобретения. Следующие далее примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты осуществлений изобретения. Однако их не следует интерпретировать в качестве ограничивающих полноту изобретения.

Пример 1. Получение карбамилированного эритропоэтина

Исходное вещество способа в данном примере представляет собой очищенный рекомбинантный человеческий ΕΡΟ.

Первую белковую концентрацию корректируют ультрафильтрацией с целью сохранения небольшого объема реакции.

Белковую концентрацию доводят до 3 мг/мл. Ультрафильтрацию выполняют посредством ВюМах (М1Шроге) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа.

После завершения стадии концентрирования раствор ΕΡΟ смешивают с 0,5М К-борат тетрагидратом, 0,5М К-цианатом при рН 9,0, раствор инкубируют при 32°С в течение 24 ч.

Обессоливание реакционной смеси ΕΡΟ и цианата выполняют гель-фильтрацией. Белок обессоливают с буферным раствором 25 мМ Трис, 50 мМ ЫаС1 рН 8,5. Применяют смолу 0-25 Рте (Атегкйат Вю8с1епсе8).

Выполняют загрузку образца приблизительно 20% объема колонки, применяя поток 90 см/ч на колонку высотой приблизительно 15 см.

Обессоленный карбамилированный ΕΡΟ собирают дополнительной обработкой.

На данном этапе содержание полимер/агрегат составляет 7,3%.

Следующая стадия представляет собой удаление агрегатов и полимеров, выполняя стадию очистки с применением анионного обмена. Для очистки применят смолу БОИКСЕ 300 (Атегкйат Вюкшепсек). На колонку используют приблизительно 4,5 мг/мл карбамилированного ΕΡΟ. Разделяющий буфер А представляет собой: 25 мМ Трис, 50 мМ №101. рН 8,5, и элюирующий буфер В: 25 мМ Трис, 1 М ЫаС1, рН 8,5. Градиент выполняют с 0-30% более 20 объемов колонки, собирают и объединяют основной пик карбамилированного ΕΡΟ.

- 20 011586

Объединенную фракцию после стадии очистки корректируют до концентрации > 0,5 мг/мл, и меняют буфер на буферный раствор с 20 мМ цитрата, 100 мМ ЫаС1 с применением диа/ультрафильтрации с проточной фильтрацией вдоль потока. Концентрирование и замену буфера выполняют на 0,1 м² ВюМах (М1Шроге) с нижним пределом молекулярной массы от 5 кДа.

Наконец, очищенное биофармацевтическое лекарственное вещество фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм с применением Мбйрак (Мбйроге) для исключения пророста.

Полученный в результате обработки карбамилированный ЕРО обладает свойствами, определяющими его как приемлемый в качестве биофармацевтического.

Определенное 8ЕС-НРЬС содержание полимер/агрегат составляет 0,5%.

Определенные аминокислотным анализом карбамилированные лизины составляют 100%.

Концентрация составляет > 0,5 мг/мл.

Для определения изменения в исходной массе обработанного РЫСаке белка и белка с Ν-гликанами выполняют исследование с применением МАЬИ1-ТОР. Кроме того, выполняют МАЬЭ1-ТОЕ анализ отпечатка пальцев пептидных масс/ЖХ-МС/МС, как указано далее:

1. СЕРО и ЕРО очищают на колонке РОКО8 К1 (РОКО8 К1 геуегке рйаке со1итп та1епаР Рег8ербуе Вюкук1етк (1-1259-06)). До применения колоночный материал хранят в 50% Н1Рег8о1у для НРЬС У\УК. 152525К. Колонку К1 уравновешивают и промывают 5% муравьиной кислотой (33015, К1еб1 бе Наёп). Образцы элюируют из колонки качественным матричным раствором Адбеп! МАЬЭ1 НССА (С2037А). Исходную массу определяют посредством анализа на приборе Вгикег КеДех IV МАЬИ1-ТОР.

2. В течение ночи 0,3 пмоль СЕРО и/или ЕРО подвергают обработке 1 единицей РЫСаке Р и РЫСаке Р/О-гликозидазы. Общую массу определяют с применением МАЬИ1-ТОР.

3. СЕРО и ЕРО (1,5 пмоль) восстанавливают в растворе 50 мкл 10 мМ ИТТ, 50 мМ ЫН₄СО₃ с последующим алкилированием в 50 мкл 55 мМ иодацетамида, 50 мМ ЫН₄СО₃. Перед расщеплением трипсином образцы очищают на колонке РОКО8 К1. Фракцию расщепленного образца очищают на колонке РОКО8 К2 перед анализом МАЬИ1-ТОР (РОКО8 50 К2 Рег8ерДуе Вюкук1етк (1-1159-05)). Колонку К2 уравновешивают и промывают 0,1% трифторуксусной кислотой (99+% крес!готе!г1с дгабе, А1бпс11 302031-100т1). Образцы элюируют из колонки качественным матричным раствором Адбеп! МАЬИ1 НССА (С2037А). Полученную посредством трипсинового расщепления группу пептидов обрабатывают РЫСаке Р и очищают на колонках РОКО8 К2, и исследуют посредством МАЬИ1-ТОР.

4. СЕРО и ЕРО восстанавливают в растворе ЭТТ и алкилируют иодацетамидом. Перед расщеплением С1и-С образцы очищают на колонке РОКО8 К1. Перед анализом МАЬИ1-ТОР фракцию расщепленного образца очищают на колонках РОКО8 К2. Полученную посредством С1и-С расщепления группу пептидов обрабатывают РЫСаке Р и очищают на колонках РОКО8 К2.

5. Для исключения возможности присутствия частично карбамилированного СЕРО, исходный ЕРО и СЕРО расщепляют Ьук-С. Образцы анализируют с применением МАЬИ1-ТОР.

Заключение состоит в том, что 8 лизинов и Ы-концевая аминокислота являются карбамилированными. Другие карбамилированные аминокислоты не определены, и не обнаружено никаких модификаций гликанов.

Ссылки:

Обычная идентификация белков посредством М8:

Мапп М., Но)гир Р., КоеркЮгГГ Р. (1993) Ике о£ такк крес!готе1пс то1еси1аг \\Όίβ1ιΙ тГогтайоп 1о 1беп1Ну рго!етк т кециепсе ба!айакек, Вю1 Макк 8рес!гот 22, 338-345.

Уа!ек, I. К., 8реюйег 8, СпГПп Р. К., НипкарШег Т. (1993) РерНбе такк тарк: а Ыдй1у 1пГогтаНуе арргоасй 1о рго!ет 1беп(1Пса11оп, Апа1 Вюсйет 214, 397-408.

Исходная масса:

Ьаидекеп 8, КоеркЮгГГ Р. (2003) СотЫпаНоп оГ 1\\ό тайсек гекиНк ίπ ипрго+еб регГогтапсе оГ МАЬИ1 М8 Гог рерббе такк тарртд и рго!ет апа1ук1к. I. Ат 8ос. Макк 8рес1гот. 14(9), 992-1002.

Расщепление/соединение:

Ьагкеп МК, Но_)гир Р, КоеркЮгГГ Р. (2005) С11агас1епха1юп о£ де1-керага!еб §1усорго1етк иктд 1\\ю-к1ер рго!ео1убс бщекбоп сотЫпеб \νίΐ1ι кециепба! тюгосо1итпк апб такк крес!готе!гу. Мо1 Се11 Рго1еоткк. 4(2), 107-19.

Дополнительные исследования позволили определить степень и гомогенность карбамилирования ЕРО, специфичность карбамилирования и идентичность сайтов карбамилирования,и присутствие потенциальных неспецифичных модификаций в результате побочных реакций карбамилирования и процесса очистки. Образцы анализировали посредством анализа общей массы образцов дегликозилированных белков и пептидного картирования с применением эндопротеаз ЬукС и трипсина для расщепления, и анализ ЬС/М8 для определения пептидов.

Пример 2. Анализ общей массы

Анализ выполняют с тремя образцами ЕРО, карбамилированными с применением способа по примеру 1. Все три образца очищают после реакции карбамилирования с применением анионного обмена, как описано в примере 1. Один из образцов СЕРО (обозначенный СЕРО-СМС) получают посредством

- 21 011586

СМС Βίοίοοίι. масштаб производства из 1 г (концентрация: 0,82 мг/мл; буферный раствор: 20 мМ цитрат N3, 0,3 мМ лимонная кислота, 0,1М №С1, рН 6,9-7,3). Оставшиеся два образца, обозначенные СЕР0-1 и СЕРО-2, получают из лабораторного масштаба производства 70 мг (концентрация: 1,1 мг/мл; буферный раствор: 25 мМ Трис, 0,2 М №С1, рН 8,3-8,7). Данные образцы СЕРО сравнивают с не модифицированным или исходным ЕР0 (концентрация: 0,82 мг/мл; буферный раствор: 2 мМ цитрат N3, 0,3 мМ лимонная кислота, 0,1 №С1, рН 6,9-7,3) и ложным СЕРО (полученный посредством способа карбамилиорвания без добавления цианата К ЕР0) (концентрация: 0,38 мг/мл; буферный раствор: 20 мМ цитрат N3, 0,3 мМ лимонная кислота, 0,1М №С1, рН 6,9-7,3).

Е81-масс-спектрометрия

До проведения анализа общей массы образцы подвергают ферментативному дегликозилированию. Каждый образец инкубируют в течение ночи с 50 мкг ^гликозидазы Е (Ргохуте Ггот С1уко) , рекомбинантной нейраминидазы А. игеаГас1еи8 и О-гликозидазы при белковой концентрации 0,5 мг/мл. Полноту реакции дегликозилирования проверяют посредством способа 8Ό 8-РАСЕ при введении 3 мкг каждого образца в 12% Трис-глициновые гели. Оставшееся вещество из каждого образца используют для анализа по массе.

Добавлением соответствующего объема матричного раствора гуанидина гидрохлорида дегликозилированные образцы вносят к гуанидину гидрохлориду с концентрацией 4-5М, а затем обессоливают в содержащем 2% муравьиную кислоту и 40% ацетнитрил буферном растворе. Гуанидин гидрохлорид добавляют для того, чтобы обеспечить полное восстановление дегликозилированного ЕР0 и СЕРО для масс-спектрометрического анализа. Определение массы выполняют с применением \Уа1ег8 Е81-О-ТоГили \Уа1ег5 Е81-ЬСТ-масс-спектрометра, обеспечивающего Е81-наноспрей источник ионизации. Оценку данных проводят автоматической деконволюцией и ручным определением конкретных представляющих интерес пиков посредством программного обеспечения Ма88 Ьуих 4.0. Количественное определение относительных отношений карбамилированных разными способами образцов СЕРО выполняют вычислением относительных отношений на основании регистрируемых в области масса/заряд интенсивностей сигналов.

Дегликозилирование приводит к образованию полностью удаляемых ^связанных сахаров. Однако высвобождение О-связанных Сахаров является не полным, особенно для образцов СЕРО.

Как предполагалось, в результате карбамилирования образцы СЕРО показали различные спектры масс по сравнению с ЕР0 и образцами ложного СЕРО. Как показано в табл. 2, деконволюция спектров дала в результате массы для основных пиков для различных образцов, как ожидалось теоретически. Во всех образцах СЕРО обнаружили только в значительной степени карбамилированные молекулы СЕРО, с основной изоформой, представляющей собой полностью карбамилированную изоформу с полным карбамилированием 8 лизинов и ^концевой аминокислоты, т.е. 9 карбамильными остатками. Образцы СЕРО демонстрируют гетерогенность в содержании дополнительных изоформ, соответствующих 8, 10 и 11 карбамильным остаткам, присоединенных к СЕРО. Содержащие 8 карбамильных остатков образцы обозначены как недостаточно карбамилированные, с отсутствием по меньшей мере одного карбамильного остатка. Образцы с 10 и 11 карбамильными остатками обозначены как избыточно карбамилированные, где избыточные присоединенные карбамильные остатки могут связываться в неспецифичных условиях с отличными от лизина аминокислотами. В спектрах всех образцов определяют несколько минорных сигналов, но, как полагают, ни один не представляет собой неспецифично модифицированный образец. В образцах ЕР0 и СЕРО обнаружили несколько минорных сигналов, и, как полагают, примеси уже присутствовали в исходном ЕР0.

- 22 011586

Таблица 2. Полученные при анализе по общей массе деконволюционные массы дегликозилированных образцов СЕРО и ЕРО

ОБРАЗЕЦ	Теоретически ожидаемая масса	Полученная масса	Интвлретация
Исходный ЕРО	18239	18237	Соответствует
Ложный-СЕРО	18239	18239	Соответствует
СЕРО-СМС	18626 (Эх карб)	18583 18626 18669 18711 18991	8х карб Эх карб 10х карб Их карб 9х карб + 0сахар
СЕРО-1	18626 (Эх карб)	18583 18626 18669 18711 18989	8х карб Эх карб 10х карб Их карб 9х карб + 0сахар
СЕРО-2	18626 (Эх карб)	18584 18626 18669 18712 18992	8х карб Эх карб 10х карб Их карб 9х карб + 0сахар

В табл. 3 показаны относительные соотношения различных изоформ. Диапазоны недостаточно карбамилированного СЕРО приблизительно от 1,5 до 5,5% общего СЕРО в зависимости от образца, а диапазоны избыточно карбамилированного СЕРО приблизительно от 11 до 22% в зависимости от образца. СЕРО-1 и СЕРО-2 имеют одинаковое распределение изоформ, тогда как СЕРО-СМС имеет меньше недостаточно карбамилированных образцов по сравнению с двумя другими образцами. Различные масштабы производства дают выход продуктов с различным распределением, но как показано в табл. 3 для лабораторного масштаба производства, производство с подобным результатом можно повторять. Как обсуждали ранее, в любом выполненном масштабе производства распределение можно приспособить посредством корректировки объединения из анионообменной колонки.

Цифры в табл. 3 представляют собой минимальное соотношение недостаточно и избыточно карбамилированного СЕРО. Причиной этого является степень карбамилирования (от 8-кратной до 11кратной), возможно, не точно определенная степень недостаточно, полностью и избыточно карбамилированного СЕРО. Например, молекула СЕРО, содержащая 8 карбамильных остатков, определенных анализом по массе, может иметь только 7 карбамильных групп, специфично связанных с лизинами, а оставшийся карбамильный остаток может представлять собой неспецифично связанный с другой аминокислотой. Данную ситуацию можно рассматривать только как недостаточно карбамилированный СЕРО, даже если существуют неспецифически связанные карбамильные группы. Наоборот, содержащая 10 карбамильных остатков молекула СЕРО, возможно, имеет только 8 специфично связанных остатков и два связанных неспецифично. В данной ситуации изоформу СЕРО рассматривают только избыточно карбамилированную, даже если все лизины не карбамилированы.

- 23 011586

Таблица 3. Степень и гетерогенность карбамилирования: относительные соотношения различно карбамилированных образцов СЕРО

		ОТНОСИТЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ
	Степень карб аминирования	СЕРО-СМС*	СЕРО- 1*	СЕРО- 2**
1	8х карб	1,5%	5,1%	5, 5%
2	Эх карб	77%	83,3%	83,6%
3	10х карб	19, 8%	10,9%	10,2%
4	Их карб	1,7%	0,7%	0,7%
5	Σ № 2-4 {>9х>	98,5%	94, 9%	94,5%
6	Σ № 3+4 (избыточнокарб.)	21,5%	11,6%	10,9%

*п=2 **п=1

Пример 3. ЬукС пептидное картирование

С применением эндопротеаз ЬукС и трипсина для расщепления выполняют исследование пептидной карты образцов ЕРО и СЕРО. Исследования всех пептидных карт проводили с дегликозилированными пептидами. Ферментативное дегликозилирование пептидов выполняют одновременно с эндопротеазным расщеплением.

Образцы ЕРО и СЕРО (приблизительно 150 мкг каждого) денатурируют и восстанавливают посредством инкубации с гуанидином гидрохлоридом и ΌΤΤ. Свободные сульфгидрильные группы алкилируют иодуксусной кислотой. Алкилированные образцы обессоливают и выполняют замену буфера на соответствующий буфер с применением колонок для гель-фильтрации одноразового использования.

Эндопротеазу, Ν-гликозидазу и нейраминидазу, одновременно добавляют к образцам алкилированных ЕРО и СЕРО. Образцы в течение ночи инкубируют при 37°С. После инкубации приблизительно 5 мкг каждой смеси используют для анализа КР-НРЬС/М§ с применением Лир11сг, С18 КР-колонок из Р11епотешх, соединенных с ΕδΙ-ЬСТ из \Уа1сг5. В масс-спектрометре регистрируют УФ-сигнал при 220 нм и общее количество ионов (Т1С). Для идентификации и количественного анализа полученных пептидов оценивают Т1С. Так как ЬукС не способен к расщеплению карбамилированных лизинов, предполагалось, что если карбамилированы все лизины, указывая на специфичность карбамилирования, при расщеплении ЬукС фрагменты не образуются. В случае неполного карбамилирования должны образоваться конкретные фрагменты СЕРО. В табл. 4 перечислены теоретически образующиеся при расщеплении ЬукС фрагменты ЕРО, полностью и избыточно карбамилированных СЕРО и недостаточно карбамилированного СЕРО.

Таблица 4. ЬукС пептидное картирование: списки теоретически образующихся при расщеплении ЬукС пептидных фрагментов ЕРО, полностью или избыточно карбамилированного СЕРО и недостаточно карбамилированных СЕРО и ЕРО

- 24 011586

Обозначение пептида	Аминокислоты от - до	Масса	Аминокислотная последовательность
К1	1-20	2399,3	АРРК ЬШЗК ΥΕΕΚ,ΥΕΕΕΑΚ
К2	21-45	2804,2	ЕАКТГТОСАЕНСЗ ΕΝΕΝΕΙΤνΡϋΟΤΚ
КЗ .	46-52	926,5	νΝΡΥΑΨΚ
К4	53-97	5022,7	КМЕУОООАУЕУ ХУрСЬАЬЬЙЕАУЬ К<ЗфАЫ,У№5(}Р У/ЕН^ЕНУОК
К5	98-116	1954,2	АУЗОЬК. 81ЛТШ?. АЬОАОК
Кб (+О-сахар)	117-140	2863,3	ΕΑΙ8ΡΡΟΑΑ8ΑΑΡ ЕК. ТГГАПТРК. К
К7	141-152	1498,8	ЬРЕ νΥδΝΡΕΚ. ОК
К8	153-154	259,2	ЬК
К9	155-165	1242,5	ЬУТОЕАСКТСЮ

СЕРО (полностью карбамилированный и избыточно карбамилированный)

Обозначение фрагмента	Аминокислоты от - до	Масса
СЕРО (9х карб)	1-165	19227
СЕРО (Юх карб)	1-165	19270
СЕРО (Их карб)	1-165	19313

Недостаточно карбамилированный СЕРО (8х карбамилирование)

I Не карбамилированная аминогруппа	Ожидаемая для Νконцевого фрагмента масса	Ожидаемая для Сконцевого фрагмента масса
Ни одной (9* карбамилированный)	19227
Ы-конец	19184	-
Ьуз20	2443,9	16755,9
Ъуз45	5274,9	13924,8
Ьуз52	6227,0	12972,7
Ьуз97	11276,8	7923,0
Ьуз116	13257,1	5942,6
Ьуз140	16147,2	3052,4
Ьуз152	17672,0	1527,5
Ьуз154	17956,4	1244,3

Как ожидали, полученный для расщепленных ЬукС образцов ЕРО и СЕРО ЬукС пептидный профиль полностью отличается. Расщепление ЬукС исходного ЕРО и ложного СЕРО привело к образованию ожидаемого пептидного профиля. В обоих образцах можно определить все пептиды от К1 до К9. В ЕРО и ложном СЕРО пептиды К5 и К1 являются частично расщепленными в неспецифических условиях. Не определяют никаких значимых дополнительных пиков и не определяют пики, отсутствующие в ЬукС карте ложного СЕРО по сравнению с исходным ЕРО. Исходя из этих данных, можно заключить, что при карбамилировании и процессе очистки не возникает значимых неспецифических ковалентных модификаций белка ЕРО.

Пептидные карты образцов СЕРО имеют различные пептидные профили с исходным ЕРО. Присутствует один основной пик и несколько незначительных пиков. Как показано в табл. 5, полученные из пиков массы хорошо коррелируют с массами, ожидаемыми для не расщепленного СЕРО, или для фрагментов при расщеплении ЬукС недостаточно карбамилированного СЕРО. Основной пик (А) включает в себя исходный, дегликозилированный, полностью карбамилированный СЕРО (9х карбамилов) и избыточно карбамилированный СЕРО (10х карбамилов) (табл. 5). Четыре незначительных пика (В-Е) включают в себя недостаточно карбамилированный СЕРО (8х карбамилов), с различными пиками, включающими в себя недостаточно карбамилированный СЕРО, не карбамилированный по конкретным лизинам. Пики В и С содержат недостаточно карбамилированный СЕРО, в котором отсутствует специфическое карбамилирование по Ьу845, тогда как пики Ό и Е содержат недостаточно карбамилированный СЕРО, в котором отсутствует специфическое карбамилирование по Ьу897 (табл. 5).

Таблица 5. ЬукС пептидное картирование: распределение экспериментально полученных масс с теоретически полученными фрагментами СЕРО из недостаточно карбамилированного СЕРО

- 25 011586

№ пика	Полученная масса	Интерпретация	Ожидаемая масса
А	19228 19271	СЕРО (9х карб + 0сахар) СЕРО (10х карб + 0сахар)	19227 19270
В	18867 13926	СЕРО (9х карб и/о 0сахар) СЕРО-фрагмент (аа46165)	18862 13924,3
С	5276	СЕРО-фрагмент (аа1-45)	5274,8
ϋ	7924	СЕРО-фрагмент (аа98- 165)	7922,4
Е	11279	СЕРО-фрагмент (аа1-97)	11276,6

В относительных соотношениях пиков для различных образцов СЕРО существует несколько различий. Образцы СЕРО 1 и 2 имеют более рельефные пики Ό и Ε, чем у ΟΕΡΟ-СМС, показывая, что они содержат больше образцов недостаточно карбамилированного СЕРО.

Из-за технических ограничений трудно количественно оценить минорные пики, так как они связаны с основным пиком. Однако с применением областей пиков по УФ-детекции в качестве грубого определения относительных отношений различных образцов можно определить, что недостаточно карбамилированный СЕРО может составлять менее 10% изоформ СЕРО в образцах и, что СΕΡΟ-1 и СЕРО-2 имеют двойное количество недостаточно карбамилированных изоформ по сравнению с СΕΡΟ-СΜС.

В целом, данные ЬукС пептидного картирования хорошо согласуются с описанным в примере 2 анализом по общей массе. СΕΡΟ-СΜС содержит меньше недостаточно карбамилированных изоформ СЕРО, тогда как СΕΡΟ-1 и СЕРО-2 содержат больше избыточно карбамилированных изоформ СЕРО. Данное пептидное картирование также показывает, что лизин 45 и лизин 97 могут представлять собой области неполного карбамилирования.

Пример 4. Пептидное картирование посредством трипсина

Расщепление образца с применением трипсина описано в примере 3.

Расщепление ΕΡΟ и ложного СЕРО трипсином приводит к образованию ожидаемого пептидного профиля. Как ожидали, при расщеплении трипсином в обоих образцах можно определить большинство пептидов (от Τ1 до Т21), за исключением некоторых небольших ди- и трипептидов (как например Т21). Смотри табл. 6. Как и в случае с расщеплением ЬукС, не выявляют значимых дополнительных пиков и не выявляют пиков, отсутствующих у ложного СЕРО по сравнению с исходным ΕΡΟ. Исходя из этих данных, заключают, что при карбамилировании и процессе очистки не образуется неспецифических ковалентных модификаций белка ΕΡΟ.

Пептидные профили образцов СЕРО отличаются от не модифицированного ΕΡΟ. Обычно трипсин расщепляет по лизину и аргинину, таким образом, можно предположить, что в случае полностью карбамилированного ΕΡΟ может произойти фрагментирование только посредством расщепления аргининов. Таким образом, после получения пептидного профиля с использованием трипсина можно определить области специфического карбамилирования и неспецифически карбамилированные пептиды. Ожидаемые при расщеплении трипсином молекул СЕРО пептиды допускают расщепление по аргининам (В) только, как указано в табл. 6.

Таблица 6. Список ожидаемых для ΕΡΟ и СЕРО расщепленных трипсином пептидов ΕΡΟ

Обозначение пептида	Аминокислоты от - до	Масса (МН)	Аминокислотная последовательность
Т1	1-4	439, 3	АРРЕ.
Т2	5-10	763,4	испзв.
ТЗ	11-14	513, 3	УЬЕК
Т4	15-20	735,4	УЕЬЕАК
Т5	21-45	2806,2	ЕАКЧТТОСАЕНСЗ ΕΝΕΝΙΤνΡϋϋΤΚ
Тб	46-52	926,5	νΝΡΥΑΨΚ
Т7	53-53	174,1	В

- 26 011586

Т8	54-76	2525,3	МЕУСффАУЕУУ/ фОЬАЬЬбЕАУЬВ.
Т9	77-97	2359,2	ΟφΑΙΧνΝ880ΡΨ ЕРЬфЬНУРК
тю	99-103	601,4	АУЗОЬК
Т11	104-110	802,5	ЗЬТТЬЬК
Т11	111-116	586,3	АЬОАОК
Т13 (+0- сахар)	117-131	1829,8	ΕΑΙ8ΡΡΟΑΑ8ΑΑΡ ьк
Т14	132-139	923,5	ΤΙΤΑΟΤΡΚ
Т15	140-140	146,1	К
Т16	141-143	434,3	ΙΤΚ
Т17	144-150	897, 5	νΥδΝΡΕΚ
Т18	151-152	203,1	ОК
Т19	153-154	259,2	ьк
Т20	155-162	969, 4	ЬУТОЕАСК
Т21	163-165	291,1	тор

результате полного карбамилирования)

СЕРО (предполагаемое расщепление только по Агд (К) в

Обозначение пептида	Аминокислоты от - до	Масса (МН)	Аминокислотная последовательность
К1 (1х карб)	1-4	482,3	АРРК.
К2	5-10	7 63,4	исок
КЗ	11-14	515,3	УЬЕК
К4 (Зх карб)	15-53	4717,2	ΥΙΧΕΑΚΕΑΝΪΤΤ ОСАЕНСЗЬНЕРЛТ νΡΏΡΤΚνΝΡΥΑ та
К5	54-76	2525,3	ΜΕνΟφΑνΕνν/φ ОЬАЬЬЗЕАУЬК.
Кб (1х карб)	77-103	2985,3	ОфАЬЬУЫ88фР1У ЕРЬфЬНУРКАУЗ оьк
К7	104-110	802,5	8ЬТ1Ю
К8 (1х карб) (+О-сахар)	111-131	2441,1	ΑΕΟΑφΚΕΑΊδΡΡϋ ААЗААРЬЕ
Р9	132-139	923,5	ΤΙΤΑΡΤΡΚ.
К10 (1х карб)	140-143	605,4	КЬГК
К11	144-150	897,5	νΥ8ΝΓΕΚ
К12 (2х карб)	151-162	1481,7	ОКЬКЬУТОЕАСК
К13	163-165	291,1	ТОР

Все ожидаемые для расщепления трипсином пептиды определяли в виде основных пиков во всех образцах СЕРО, за исключением С-концевого пептида К13. Данный пептид также не обнаружили в исходном ЕРО или ложном СЕРО. Полученные при специфическом расщеплении только по аргининам пики от К1 до К12 рассматривают как подавляющее большинство определенных в образцах СЕРО пептидов. Кроме того, все содержащие лизин пептиды определяют почти исключительно в полностью карбамилированной форме. Эти данные показывают высокую степень специфичного карбамилирования по лизинам и Ν-концевой аминокислоте.

Кроме основного пептида во всех образцах СЕРО также определяют шесть минорных пептидов. Анализом по массе определяют три из минорных пептидов как результат расщепления трипсином избыточно карбамилированного СЕРО, а оставшиеся три образуются в результате расщепления недостаточно карбамилированного СЕРО.

В табл. 7 перечислены все пептиды, определенные в картах с расщеплением трипсином трех проанализированных образцов СЕРО. Высоко распространенные пептиды от К1 до К12, образованные из полностью и специфически карбамилированного ЕРО, указаны обычным шрифтом, правильно карбамилированный ЕРО дополнительно обозначен жирным шрифтом. Наиболее вероятно образованные расщеплением недостаточно карбамилированного СЕРО пептиды обозначены курсивом, а образованные расщеплением избыточно карбамилированного СЕРО пептиды обозначены подчеркнутым шрифтом.

- 27 011586

Таблица 7. Пептидная карта при расщеплении трипсином: список пептидов, определенных в пептидной карте СЕРО с расщеплением трипсином

Пептид	Масса	Относительное количество ионов (%)* СЕРО-1	Относительное количество ионов (%)* СЕРО-2	Относительное количество ионов (%)* СЕРО-СМС
К1_1х карб	482,25	1,28	1,09	1,15
К2	763,35	7, 87	8, 49	8,15
ВЗ	515,31	2,78	2, 58	2, 66
Р4_Ы._1х карб (Тб+Т7__1х карб)	1125,6	0,17	0,2	0,15
К4__3х карб	4717,2	1,5	0,80	1,32
В5	2525,34	11,44	9,56	9, 54
В. 5 ох	2541,34	' 0,15	0,15	0,21
Р.5 На	2547,32	. 0,15	0,13	0,14
К5 а1	1869,97	0,17	0,17	0,16
В5 Ы	673,38	0,29	0,27	0,25
Т9=К6 а!	2359,24	0, 62	0,54	0,26
Т10-К6 Ы	602,35	0,95	0,8	0,65
Кб_1х карб	2985,60	15,36	14,48	15,78
К7	802,49	7, 16	7,28	7,05
К7 1х карб	845,49	Ц	£	£
К8_1х карб	2076,10	0,16	0,15	0,16
К8 1х карб	2076,10	0,5	0,44	0, 63
К8_ЗА0_1х карб	2441,1	9,19	9,34	9,20
Н9	923,47	9,85	11,11	10, 58
К10_1х карб	605,37	5,17	5,40	5,43
К10 2х карб	643,37	0,02	0, 03	0,03
ΚΪ1	897,47	9,82	10, 70	10, 30
К12_а1_2х карб	806,46	0,20	0,22	0,17
К12_2х карб	1481,73	7,91	7,90	7,84
К12 Зх карб	1524,74	0,28	0,26	0,59
К13	291,11	-	-	-

*- интенсивность по отношению к общему количеству импульсов в ΤΙΟ

1- обнаружен посредством ручного определения; сигнал подтвержден как специфический

Со ссылкой на табл. 7, минорные пики Τ9 и Τ10, содержащие соответственно К6_а1 и К6_Ы пептиды, наиболее вероятно получены при расщеплении молекул недостаточно карбамилированного СЕРО, не карбамилированного по Ьуз97. Пептид К4_Ы+1хкарб. образуется, если не карбамилирована аминокислота Ьу845. Пептид К6_а1 (пик Т9) более выражен в образцах СΕΡΟ-1 и СΕΡΟ-2, по сравнению с СΕΡΟСМС, показывая, что образующая его молекула может иметь двойное количество недостаточно карбамилированного СЕРО. Пептиды К6_Ы и К4_Ы + 1хкарб. представлены в равных количествах во всех образцах СЕРО.

Выполнить вычисление относительного содержания недостаточно карбамилирванного СЕРО из этих данных представляет трудности из-за технических ограничений. Однако, собрав все наблюдения вместе, приблизительно определили, что количество недостаточно карбамилированных образцов составляет приблизительно 10%, так как это заключили из анализа по общей массе и ЬузС пептидного картирования.

Три других минорных пептида, элюированных с остальными пептидами, интерпретировали по массе как содержащие один избыточный карбамильный остаток, т. е. избыточно карбамилированный СЕРО. Пептиды К10_2хкарб. и К7_1хкарб. определяют в незначительных количествах, причем обнаружили, что К12_3хкарб. имеет значимую интенсивность сигнала. СΕΡΟ-СΜС имеет в два раза большее содержание избыточно карбамилированных образцов СЕРО по сравнению с СΕΡΟ-1 и СЕРО-2. Это согласуется с результатами анализа по общей массе. Из этих данных также следует заключить, что аминокислотная

- 28 011586 последовательность 151-62 ЕРО представляет собой область для неспецифического карбамилирования.

Кроме того, по тем же причинам, что и для количественной оценки неполного карбамилирования, количественная оценка избыточно карбамилированных образцов представляет трудности. Однако, предположив, что одинаковая эффективность ионизации пептидов, отличающаяся только по степени карбамилирования, по относительному количеству ионов производных К12 вычислили, что приблизительно 37% СЕРО представляют собой избыточно карбамилированные образцы. Это представляет собой меньшее количество избыточно карбамилированных изоформ, вычисленных анализом по общей массе.

В целом, из анализа по общей массе и данных пептидного картирования ЕРО и СЕРО можно заключить следующее.

Образцы СЕРО, являющиеся в достаточно высокой степени карбамилированными, исходя из анализа по общей массе. Приблизительно 95-98% всех молекул полностью карбамилированы и содержат по меньшей мере 9 карбамильных остатков (см. табл. 3). Картирование с применением ЬукС и трипсина подтверждает высокую степень карбамилирования по специфическим сайтам, и что наиболее вероятно более 95% молекул СЕРО являются полностью карбамилированными по 8 лизинам и Ν-концевой аминокислоте.

Данные также показывают четыре обнаруженных изоформы СЕРО. В проанализированных образцах СЕРО определяют образцы с 8, 9, 10 и 11 карбамильными остатками, изоформа с 9 карбамильными остатками представляет собой доминирующие образцы. Предполагают, что содержащая 8 карбамильных остатков вместо 9 небольшая часть молекул СЕРО является неполностью карбамилированной. Для СЕРО-1 и СЕРО-2 данные изоформы составляют приблизительно 5% от общего, а для СЕРО-СМС данная изоформа образуется приблизительно у 1,5% из общего количества молекул СЕРО.

Более значительная часть молекул СЕРО является избыточно карбамилированной, т.е. содержит 10 или 11 карбамильных остатков. Интервалы избыточно карбамилированного СЕРО составляют приблизительно от 11% для СЕРО-1 и СЕРО-2 до приблизительно 22% в СЕРО-СМС.

Данные пептидного картирования показывают высокую степень специфичности карбамилирования по 8 лизинам и Ν-концу. Кроме того, в целом пептидное картирование подтверждает результаты анализа по общей массе. По меньшей мере приблизительно 90-95% молекул СЕРО являются специфически модифицированными карбамильными остатками по всем лизинам и Ν-концу. Однако эти данные также показывают неполное и избыточное карбамилирование образцов СЕРО. Из-за некоторых технических ограничений тяжело определить точное соотношение недостаточно карбамилированных образцов, но приблизительно определили, что оно составляет приблизительно до 10%, что согласуется с обнаруженным по анализу общей массы количеством. Кроме того, на молекуле ЕРО определили два различных положения Ьу§45 и Ьу§97, как положения, где наиболее вероятно происходит отсутствие карбамилирования.

В обеих сериях пептидного картирования также обнаружили избыточно карбамилированные образцы. Более того, из-за технических ограничений тяжело количественно оценить точное количество избыточно карбамилированных образцов. Исходя из полученных данных, можно спекулировать, что при пептидном картировании определяют слишком малые количества избыточно карбамилированных образцов. Пептидным картированием определяют только от одной трети до одной второй количества избыточно карбамилированных образцов по сравнению с анализом по общей массе.

Разумное объяснение для данного противоречия состоит в том, что идентифицируют вообще не все из избыточно карбамилированных пептидов или в неправильном количестве. На карте ЬукС в значительных количествах определяют нерасщепленные содержащие 10 карбамильных остатков образцы СЕРО, а в картировании с применением трипсина определяют три пептида с содержанием одного избыточного карбамильного остатка. Два из этих фрагментов определяют только в следовых количествах. Третий пептид, пептид СЕРО из 152-162 аминокислот, граничит с С-концом и является причиной одной третьей части избыточного карбамилирования, и может представлять собой сайт для неспецифического карбамилирования в ЕРО.

Посредством любого выполненного анализа не определили значительных количеств других неспецифических (не связанных карбамилом) модификаций в образцах СЕРО или в образцах ложного СЕРО.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного ЕБ1-масс-спектрометрией, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и Νконцевой аминокислоте эритропоэтина.
2. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.
3. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно

- 29 011586

30% агрегированного белка.
4. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20% агрегированного белка.
5. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10% агрегированного белка.
6. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
7. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
8. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
9. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка.
10. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка.
11. Способ по п.1, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка.
12. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл.
13. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл.
14. Способ по п.1, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10М.
15. Способ по п.1, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2М.
16. Способ по п.1, где температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60°С.
17. Способ по п.1, где температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34°С.
18. Способ по п.1, где рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11.
19. Способ по п.1, где рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10.
20. Способ по п.1, где период времени составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток.
21. Способ по п.1, где период времени составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
22. Способ по п.1, где белок эритропоэтина взаимодействует с цианатом в присутствии буферного раствора.
23. Способ по п.22, где буферным раствором является борат.
24. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2М.
25. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,1 приблизительно до 1М.
26. Способ по п.22, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно 0,5М.
27. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10М, температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60°С, рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11, а время составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до тридцати суток.
28. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2М, температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34°С, рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10, а время составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
29. Способ по п.1, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно 3 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно 0,5М, температура составляет приблизительно 32°С, рН составляет приблизительно 9, а период времени составляет приблизительно 24 ч.
30. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 3% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного Е31-масс-спектрометрией, включающий в себя очистку карбамилированного эритропоэтина с применением анионообменной, катионообменной, гидрофобной хроматографии, хроматографии с обращенными фазами, аффинной хроматографии или хроматографии с исключением по размеру.
31. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий

- 30 011586 эритропоэтин.
32. Способ по п.30, где по меньшей мере 90% аминовых остатков на лизинах и Ν-концевой аминокислоте эритропоэтина карбамилированы.
33. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 2,5% агрегированного белка.
34. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет приблизительно 0,5% или менее агрегированного белка.
35. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
36. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
37. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
38. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка.
39. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка.
40. Способ по п.30, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка.
41. Способ получения белка карбамилированного эритропоэтина с менее чем приблизительно 3% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, определенного Е81-масс-спектрометрией, при этом способ включает в себя:

(a) взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминовых остатков на лизинах и Ν-концевой аминокислоте эритропоэтина; и (b) очистку белка карбамилированного эритропоэтина с применением анионообменной, катионообменной, гидрофобной хроматографии, хроматографии с обращенными фазами, аффинной хроматографии или размерно-эксклюзионной хроматографии.
42. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.
43. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 2,5% агрегированного белка.
44. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет приблизительно 0,5% или менее агрегированного белка.
45. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
46. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
47. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка.
48. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 30 мас.% избыточно карбамилированного белка.
49. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 20 мас.% избыточно карбамилированного белка.
50. Способ по п.41, где белок карбамилированного эритропоэтина имеет менее чем приблизительно 10 мас.% избыточно карбамилированного белка.
51. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего ставляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл.
52. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего ставляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл.
53. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего ставляет приблизительно 3 мг/мл.
54. Способ по п.41, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10М.
55. Способ по п.41, где концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2М.
56. Способ по п.41, где концентрация цианата составляет приблизительно 0,5М.
57. Способ по п.41, где температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60°С.
58. Способ по п.41, где температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34°С.
59. Способ по п.41, где температура составляет приблизительно 32°С.
60. Способ по п.41, где рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11.
61. Способ по п.41, где рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10.

цианатом цианатом цианатом белка белка белка эритропоэтина эритропоэтина эритропоэтина сососо- 31 011586
62. Способ по п.41, где рН составляет приблизительно 9.
63. Способ по п.41, где период времени составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток.
64. Способ по п.41, где период времени составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
65. Способ по п.41, где период времени составляет приблизительно 24 ч.
66. Способ по п.41, где белок эритропоэтина взаимодействует с цианатом в присутствии буферного раствора.
67. Способ по п.66, где буферным раствором является борат.
68. Способ по п.66, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2М.
69. Способ по п.66, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно от 0,1 приблизительно до 1М.
70. Способ по п.66, где концентрация буферного раствора составляет приблизительно 0,5М.
71. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 10М, температурные диапазоны приблизительно от 0 приблизительно до 60°С, рН находится приблизительно от 7 приблизительно до 11, а время составляет приблизительно от 10 мин приблизительно до 30 суток.
72. Способ по п.41, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно от 2 приблизительно до 5 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно от 0,05 приблизительно до 2М, температурные диапазоны приблизительно от 30 приблизительно до 34°С, рН находится приблизительно от 8 приблизительно до 10, а время составляет приблизительно от 1 ч приблизительно до 5 суток.
73. Способ по п.34, где концентрация взаимодействующего с цианатом белка эритропоэтина составляет приблизительно 3 мг/мл, концентрация цианата составляет приблизительно 0,5М, температура составляет приблизительно 32°С, рН составляет приблизительно 9, а период времени составляет приблизительно 24 ч.
74. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимыми для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и Ν-концевой аминокислоте эритропоэтина, причем эритропоэтин взаимодействует с цианатом в присутствии бората калия.
75. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре от 30 до 34°С, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и Ν-концевой аминокислоте эритропоэтина.
76. Способ получения карбамилированного белка эритропоэтина с менее чем приблизительно 40% агрегированного белка и менее чем приблизительно 40 мас.% избыточно и недостаточно карбамилированного белка, при этом способ включает в себя взаимодействие количества эритропоэтина с количеством цианата при температуре, рН и в течение периода времени, необходимых для по меньшей мере приблизительно 90% карбамилирования аминогрупп в лизинах и Ν-концевой аминокислоте эритропоэтина, причем карбамилированный белок эритропоэтина очищается с применением анионообменной хроматографии при поддержании рН 8,5±0,2 как разделяющего, так и элюирующего буферов.