ES2962777T3

ES2962777T3 - Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral

Info

Publication number: ES2962777T3
Application number: ES18167567T
Authority: ES
Inventors: Christopher Sloey; Jason Ko; Tiansheng Li
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-11-15
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2024-03-21
Anticipated expiration: 2028-11-13
Also published as: US8796206B2; US20100297117A1; US11433134B2; EP3381445A2; US20230126688A1; EP3381445A3; EP3381445B1; WO2009064838A1; US20140294859A1; EP2219602A1

Abstract

La presente invención se refiere a formulaciones proteicas acuosas estables. En particular, en el presente documento se describen formulaciones de proteínas terapéuticas adecuadas para administración parenteral que tienen uno o más antioxidantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación acuosa de anticuerpos estabilizada por antioxidantes para la administración parenteral

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas acuosas estables de anticuerpos IgG1. En particular, la presente invención se refiere a formulaciones farmacéuticas acuosas de anticuerpos IgG1 adecuadas para administración parenteral que comprenden un antioxidante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En ocasiones, durante el curso de la fabricación, manipulación, almacenamiento y administración, las proteínas terapéuticas pueden estar expuestas a luz visible y radiación ultravioleta. Proteger las proteínas de la exposición a la luz implica típicamente cubrir físicamente la muestra con papel de aluminio, o una caja u otro recipiente, o almacenarla en un refrigerador cerrado. Sin embargo, puede haber ocasiones en las que la exposición de la proteína a la luz sea inevitable y, como resultado de esta exposición, la proteína pueda degradarse. La degradación de proteínas inducida por la luz puede implicar la oxidación de varios aminoácidos, incluyendo triptófano, tirosina, metionina, histidina y cisteína. Si la oxidación altera las propiedades estructurales de la proteína, ésta puede perder actividad biológica. La oxidación de determinados residuos de aminoácidos también puede conducir a un amarilleamiento de la solución proteica. Además, la proteína oxidada puede agregarse mediante la rotura de enlaces disulfuro nativos o mediante la formación de enlaces ditirosina. La pérdida de actividad biológica, el cambio de color y/o claridad de la solución proteica y la formación de agregados son efectos comercialmente indeseables. En casos extremos, la oxidación o agregación podría provocar una respuesta inmunogénica en los pacientes con efectos secundarios posiblemente graves.

Además de los radicales libres generados por la exposición a la luz, las proteínas pueden formularse con excipientes que contengan pequeñas cantidades de impurezas que, aunque inofensivas en sí mismas, podrían generar radicales libres que aceleran la degradación y/u oxidación de las proteínas. Las formulaciones de proteínas en jeringas precargadas y otros dispositivos de administración de fármacos pueden contener componentes extraíbles o iones metálicos que podrían catalizar la generación de radicales libres y la oxidación de proteínas. Excipientes aprobados para su uso en la formulación de proteínas pueden tener una capacidad limitada para prevenir estos tipos de oxidación.

Se han utilizado diversos tipos de moléculas, tales como azúcares, tensioactivos, aminoácidos y ácidos grasos, en esfuerzos por estabilizar productos proteicos y peptídicos contra la degradación. Véase Wang y Hanson, J. Parenteral Science and Technology Suplemento, 1988, Informe Técnico N° 10 (que describe formulaciones parenterales de proteínas y péptidos); Manning et al., 6 Pharmaceutical Research, 1989. También se conocen en la técnica ejemplos de excipientes tales como tampones, conservantes, agentes isotónicos y tensioactivos. Véase la sección 21 C.F.R.

180.22 y siguientes. (que define los aditivos alimentarios reconocidos); Wang y Kowal, 34 J. Parenteral Drug Association 452, 1980 (que describe diversos excipientes); A.R. Gennaro et al., 17a "Pharmaceutical Sciences" de Remington. 1985; Avis et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Vol. 1, 1992, todos los cuales incluyen las definiciones de diversos excipientes útiles. Se describen ejemplos adicionales en los documentos WO 2002/103029 y WO 2007/037795.

Se entiende que el desarrollo de una formulación acuosa adecuada para administración a un sujeto es complejo. Existe una necesidad en la técnica de formulaciones acuosas de proteínas terapéuticas que tengan una degradación física y química mínima cuando se exponen a niveles variables de radiación UV u otra luz, o cuando se exponen a otras fuentes que generan radicales libres.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una formulación acuosa adecuada para la administración parenteral que comprende un anticuerpo IgG1 y una concentración estabilizante de un antioxidante, en donde el antioxidante:

(i) se selecciona del grupo que consiste en ácido vainílico, ácido gálico, una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo y mezclas de los mismos; y el antioxidante está presente en la formulación acuosa a una concentración de 0,1 mM a 20 mM; o

(ii) se selecciona del grupo que consiste en metil parabeno, m-cresol, fenol, una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo y mezclas de los mismos; y el antioxidante está presente en la formulación acuosa a una concentración de hasta 5 mM.

La invención también proporciona el uso de un antioxidante para estabilizar una formulación acuosa adecuada para administración parenteral que comprende un anticuerpo IgG1, en donde el antioxidante:

DIVULGACIÓN ADICIONAL

También se describen, pero no de acuerdo con la invención, formulaciones farmacéuticas acuosas de proteínas y antioxidantes farmacéuticamente activos que exhiben una estabilidad y/o resistencia superior a la oxidación o degradación inducida por radicales libres, métodos para preparar formulaciones de este tipo, métodos para seleccionar antioxidantes para su uso en formulaciones de este tipo, y métodos de utilizar formulaciones de este tipo. La oxidación o degradación debida a radicales libres puede ocurrir debido a una o más condiciones adversas, tales como la exposición a la luz, incluida la luz ultravioleta, visible y/o fluorescente, la exposición a radicales libres generados a partir de otras fuentes y/o la exposición a iones metálicos.

También se describen, pero no de acuerdo con la invención, formulaciones farmacéuticas acuosas que comprenden una proteína terapéutica y una cantidad o concentración estabilizante de uno, dos o más antioxidantes que protegen la proteína de la degradación oxidativa bajo una o más condiciones adversas. Opcionalmente, formulaciones de este tipo pueden comprender, además, uno o más osmolitos y/o uno o más agentes depuradores de peróxido. Opcionalmente, formulaciones de este tipo también pueden comprender otros diluyentes, excipientes, soportes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, incluyendo tensioactivos, sales, tampones o conservantes en una concentración conservante. Las formulaciones farmacéuticas pueden estar en forma lista para usar, concentrada o liofilizada que se reconstituye con una solución acuosa. Las formulaciones farmacéuticas pueden proporcionarse en recipientes, kits y/o sistemas de administración adecuados, incluyendo viales, ampollas, cartuchos o jeringas precargadas.

También se describen, pero no de acuerdo con la invención, métodos para preparar las formulaciones, que comprenden las etapas de proporcionar una proteína terapéutica purificada y mezclar la proteína con una cantidad o concentración estabilizante de uno, dos o más antioxidantes y/o uno o más diluyentes, excipientes, soportes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, y/o cualquiera de los componentes antes mencionados tales como osmolitos, agentes depuradores de peróxido, tensioactivos, sales, tampones o conservantes en una concentración conservante. También se describe, pero no de acuerdo con la invención, un método para estabilizar una proteína terapéutica en solución acuosa añadiendo una cantidad o concentración estabilizante de un antioxidante y una proteína terapéutica a una solución acuosa, que opcionalmente comprende, además, la etapa de liofilizar la solución acuosa. También se describen, pero no de acuerdo con la invención, otros métodos para preparar formulaciones acuosas, que comprenden la etapa de proporcionar un polvo liofilizado o una solución concentrada que contiene los componentes antes mencionados y reconstituir el polvo o la solución con una cantidad predeterminada de diluyente acuoso, tal como agua estéril para inyección, para producir una formulación.

Las formulaciones farmacéuticas acuosas descritas en esta memoria se pueden administrar a un paciente para administrar la proteína terapéutica en una dosis que sea parte de un régimen de dosificación terapéuticamente eficaz.

Las proteínas farmacéuticamente activas contempladas para uso en las formulaciones son proteínas de anticuerpos IgG1. La proteína terapéutica puede estar presente en una concentración de al menos 0,1 mg/mL y preferiblemente está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz para una afección de interés.

Entre las clases de compuestos antioxidantes contemplados para uso en las formulaciones descritas en esta memoria, pero no de acuerdo con la invención, se encuentran el ácido cinámico y derivados del mismo, o compuestos de la fórmula (I):

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-<8>, hidroxi, arilo y Oalquilo C<1>-<8>; R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; y n es un número entero de 0 a 5. Compuestos ejemplares de fórmula (I) incluyen, pero no se limitan a ácido cinámico, ácido cumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido sinápico y ácido clorogénico. Concentraciones estabilizadoras ejemplares de antioxidantes que son derivados del ácido cinámico incluyen 0,1 mM a 20 mM.

Otra clase de compuestos antioxidantes son ácido benzoico y derivados del mismo, o compuestos de la fórmula (II):

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-<8>, hidroxi, N(R5)<2>, arilo y OalquiloC<1>-<8>; R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; y m es un número entero de 0 a 5, con la condición opcional de que la fórmula (II) no sea ácido benzoico, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, butil parabeno, cloruro de benzalconio, cresol, fenol, alcohol bencílico u otro conservante conocido. Compuestos ejemplares que no son de acuerdo con la invención son el ácido benzoico, el ácido p-hidroxibenzoico, el ácido paminobenzoico, el ácido protocatéquico y el ácido sinápico. Concentraciones estabilizadoras ejemplares de antioxidantes que son derivados del ácido benzoico incluyen 0,1 mM a 20 mM.

Otra clase de antioxidantes son los compuestos aromáticos de fórmula (III):

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-<8>, hidroxi, N(R5)<2>, arilo, OalquiloC<1>-<8>; CO<2>R5, alquenilo C<2>-<8>, alquenil C<2>-<8>CO<2>R5, arilo, halo, ciano, nitro y sulfato; R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; y p es un número entero de 1 a 5, con la condición opcional de que la fórmula (III) no sea ácido benzoico, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, butil parabeno, cloruro de benzalconio, cresol, fenol, alcohol bencílico u otro conservante conocido. Las fórmulas (I) y (II) quedan abarcadas por la fórmula (III). Cuando el antioxidante es un conservante conocido, tal como ácido benzoico, etil parabeno, propil parabeno, butil parabeno, alcohol bencílico, fenoxietanol o cloruro de benzalconio, que no son de acuerdo con la invención, el antioxidante en la solución acuosa está presente en una cantidad no conservante. Cuando la formulación contiene conservantes conocidos en una concentración de conservante, contiene un antioxidante diferente que no actúa como conservante. Típicamente, cuando se utiliza un antioxidante que también tiene propiedades conservantes, éste se utiliza en una concentración inferior (p. ej., al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % menos que) su concentración inhibidora mínima (MIC, por sus siglas en inglés) conocida. En realizaciones en las que se utiliza un antioxidante que tiene propiedades conservantes, la concentración del antioxidante es 5 mM o menos. Las concentraciones inhibidoras mínimas (MICs) se definen como la concentración más baja de un agente antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo después de una incubación durante la noche (Andrews, J. Antimicrobial Chemotherapy, 48 (Supl. 1): 5-16 (2001)). MICs para conservantes conocidos incluyen las siguientes: ácido benzoico (1,6 mg/mL o 13 mM); metil parabeno (4 mg/mL o 26 mM); etil parabeno (2 mg/mL o 12 mM); m-cresol (1,5 mg/mL o 14 mM); alcohol bencílico (5 mg/mL o 46 mM); fenoxietanol (8,5 mg/mL o 62 mM); propil parabeno (1 mg/mL o 5,5 mM); fenol (0,6 mg/mL o 6,4 mM); butil parabeno (5 mg/mL o 26 mM); y cloruro de benzalconio (0,064 mg/mL o 0,1 mM) (véase Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000)).

Otras clases de compuestos antioxidantes (incluyendo una sal o un éster farmacéuticamente aceptable de los mismos) son vitaminas, tales como tiamina o piridoxina; aminoácidos, p. ej., N-acetil-triptófano y prolina; alfa hidroxiácidos, tales como ácido glicólico, ácido láctico o ácido cítrico; compuestos conjugados no aromáticos, tales como ácido fumárico o ácido shikímico; nucleobases, tales como adenina, timina, uracilo o guanina o sus correspondientes nucleósidos, nucleótidos o desoxinucleótidos; flavonoles u otros compuestos fitoquímicos que se encuentran en frutas o verduras, tales como catequina, epicatetina o furaneol; o antioxidantes utilizados en otras tecnologías de protección UV (p. ej., protectores solares) tales como sulisobenzona.

Opcionalmente se puede incluir un osmolito en la formulación de la invención. Los osimolitos incluyen aminoácidos, polioles, otros azúcares y poliaminas. Osmolitos ejemplares incluyen glicerol, sorbitol, prolina y sacarosa.

Agentes depuradores de peróxido ejemplares que pueden incluirse en las formulaciones de la divulgación incluyen metionina, N-acetilcisteína, ácido ascórbico o ácido pirúvico. Derivados del ácido benzoico u otros antioxidantes también pueden ser agentes depuradores de peróxido, además de tener actividad fotoestabilizante.

En una divulgación que no es de acuerdo con la invención, la relación de proteína (mg/mL) a antioxidante (mM) varía de 1:20 a aproximadamente 1:0,1, o de 200:0,001 a aproximadamente 100: 0.01. Otros intervalos contemplados incluyen 200:0,01 a 200: 1, 200:0,1 a aproximadamente 1:1, 100: 1 a aproximadamente 1:10 y 10:1 a aproximadamente 1:20.

En una divulgación adicional, no de acuerdo con la invención, se proporcionan métodos para seleccionar antioxidantes que estabilizan proteínas contra la oxidación inducida por radicales libres, que comprenden las etapas de proporcionar al menos dos formulaciones candidatas diferentes, cada una de las cuales contiene la misma concentración de proteína terapéutica pero una concentración diferente de antioxidante, exponer las formulaciones candidatas a una fuente que genera radicales libres durante un período de tiempo, y determinar la actividad biológica o la agregación o decoloración u oxidación de la proteína terapéutica dentro de las formulaciones candidatas. Fuentes que generan radicales libres incluyen la luz ultravioleta, la luz visible, la luz fluorescente, la luz diurna artificial (o combinaciones de diversos tipos de luz), peróxido, iones metálicos, contaminantes en excipientes, lixiviados de adhesivos o plásticos utilizados en jeringas y otros dispositivos o recipientes médicos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. muestra la unión del anticuerpo A, un anticuerpo IgG1, a su antígeno diana (parte superior) o proteína A (parte inferior) en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido clorogénico, ácido ferúlico o ácido cumárico 20 mM, después de una exposición a radiación UV de 0-24 horas; radiación;

la FIG. 2 muestra la unión de anticuerpo B, un anticuerpo IgG1, a proteína A en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido clorogénico, ácido ferúlico o metionina 20 mM, después de una exposición a radiación UV de 0-24 horas;

la FIG. 3 muestra la unión de eritropoyetina (EPO) a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido clorogénico, ácido ferúlico o ácido cumárico 20 mM, después de una exposición a radiación UV de 0 24 horas;

la FIG.4 muestra la degradación de EPO en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido clorogénico, ácido ferúlico o ácido cumárico 20 mM, después de una exposición a radiación UV de 24 horas;

la FIG. 5 muestra la degradación de anti-estreptavidina, un anticuerpo IgG2, en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido clorogénico, ácido ferúlico o ácido cumárico 20 mM, después de una exposición a radiación UV de 24 horas;

la FIG. 6 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido clorogénico, ácido ferúlico o ácido cumárico 20 mM, después de una exposición a radiación UV de 24 horas; la FIG 7 muestra la degradación de EPO en formulaciones que no contienen antioxidante o metionina o ácido ferúlico 0,1 mM, 1 mM o 10 mM, después de una exposición a radiación UV de 24 horas;

la FIG. 8 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido cumárico 0,1, 1 o 10 mM, después de una exposición a radiación UV de 0-24 horas;

la FIG. 9 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido cumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico o ácido sinápico 0,1 mM, después de una exposición a radiación UV de 0-4 horas; la FIG. 10 muestra la agregación de Anticuerpo A (1 mg/mL - parte superior; 30 mg/mL - parte inferior) en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido cumárico 0,001 mM, 0,01 mM, 0,05 mM, 0,1 mM o 1 mM;

la FIG. 11 muestra la agregación de anti-estreptavidina, un anticuerpo IgG2, después de 10 días a 52°C en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido ferúlico 10 mM o ácido cumárico 10 mM con y sin 5 % de glicerol;

la FIG. 12 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido ferúlico 5 mM después de la exposición a H<2>O<2>al 0,3 %, Fe-EDTA 0,2 mM y ácido ascórbico 1 mM durante 2 horas; la FIG. 13 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido siríngico, ácido vainílico, ácido gálico, ácido protocatéquico o ácido p-hidroxibenzoico 20 mM, después de exposición a radiación UV durante 3 horas;

la FIG. 14 muestra la agregación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido paminobenzoico 20 mM, después de exposición a radiación UV durante 1,2 y 3 horas;

la FIG. 15 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o galato de propilo 10 mM, después de exposición a radiación UV durante 3 horas;

La FIG. 16 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o tiamina 5, 10, 20 o 50 mM después de exposición a radiación UV durante 4 horas;

la FIG. 17 muestra la agregación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o piridoxina 5, 10, 20 o 50 mM, después de exposición a radiación UV durante 4 horas;

la FIG. 18 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o metil parabeno, m-cresol, fenol o alcohol bencílico 5 mM, después de exposición a radiación UV durante 3 horas;

la FIG. 19 muestra la agregación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o metil parabeno, m-cresol, fenol o alcohol bencílico 1 mM, después de exposición a radiación UV durante 1 hora;

la FIG. 20 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido fumárico o ácido shikímico 100 mM, después de exposición a radiación UV durante 3 horas;

la FIG. 21 muestra la agregación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o cistosina 25 mM, después de exposición a radiación UV durante 1,2 y 3 horas;

la FIG. 22 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o N-acetiltriptófano 20 mM, después de exposición a radiación UV durante 0-24 horas;

la FIG. 23 muestra la agregación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o prolina 200 mM, después de exposición a radiación UV durante 15 minutos;

la FIG. 24 muestra la degradación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o prolina 400 mM, después de exposición a una solución de H<2>O<2>al 1 % a 25 °C durante 2 semanas;

la FIG. 25 muestra la cantidad de oxidación con Met-54 del Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o metionina, ácido fólico o ácido ferúlico 10 mM, después de la exposición a una solución de H<2>O<2>al 0,06 % a temperatura ambiente durante 24 horas;

la FIG. 26 muestra la agregación de Anticuerpo A en formulaciones que no contienen antioxidante o ácido glicólico o ácido láctico 100 mM a pH 4,5 o ácido cítrico 100 mM a pH 5,00, después de exposición a radiación UV durante 1 hora;

la FIG. 27 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o catequina 20 mM, después de exposición a radiación UV durante 0-8 horas;

la FIG. 28 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o furaneol 100 mM, después de exposición a radiación UV durante 0-8 horas; y

la FIG. 29 muestra la unión de EPO a D11 en formulaciones que no contienen antioxidante o sulisobenzona 5 mM, después de exposición a radiación UV durante 0-8 horas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Formulaciones farmacéuticas de proteína terapéutica adecuadas para administración parenteral son preferiblemente de alta pureza y altamente estables bajo una diversidad de condiciones de almacenamiento y manipulación. Se ha descubierto que la adición de antioxidantes a una formulación acuosa adecuada para administración parenteral mitiga la degradación y/u oxidación de proteínas terapéuticas que surgen de la radiación UV y/o los radicales libres, ampliando así la gama de condiciones permitidas de almacenamiento y manipulación y, en muchos casos, eliminando la necesidad de un envasado especial para evitar la exposición a la luz, iones metálicos u otras fuentes que generen radicales libres. Esta reducción en la degradación y/u oxidación de proteínas terapéuticas puede demostrarse como una reducción de cambios indeseables en la proteína, tales como oxidación de proteínas, decoloración, agregación de proteínas, pérdida de actividad biológica, pérdida de la estructura terciaria de la proteína (p. ej., cambio en la conformación o despliegue), u otra degradación de proteínas. La estabilidad mejorada impartida por la inclusión de antioxidantes en las formulaciones de la divulgación puede exhibirse bajo un conjunto específico de condiciones o en una amplia gama de condiciones, incluyendo la temperatura, y durante un período de tiempo sustancial.

Tal como se utiliza en esta memoria, "formulación farmacéutica" es una composición de un fármaco farmacéuticamente activo, tal como una proteína biológicamente activa, que es adecuada para la administración parenteral a un paciente que lo necesita e incluye solo excipientes, diluyentes, soportes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables que son seguros para la administración parenteral a seres humanos en las concentraciones utilizadas, bajo patrones iguales o similares a los de los excipientes, diluyentes, soportes y adyuvantes considerados seguros por la Administración Federal de Medicamentos u otras autoridades nacionales o extranjeras. Una formulación farmacéutica puede estar en una forma de solución lista para usar, forma concentrada o preparación liofilizada que puede reconstituirse con una cantidad dirigida de diluyente adecuado para la inyección parenteral, tal como agua, solución salina o solución tampón.

Tal como se utiliza en esta memoria, la administración "parenteral" de un medicamento o formulación significa la administración a un sujeto por una vía distinta de la tópica u oral (es decir, una vía no tópica y no oral). Ejemplos de vías parenterales incluyen administración subcutánea, intramuscular, intravascular (incluyendo intraarterial o intravenosa), intraperitoneal, intraorbitaria, retrobulbar, peribulbar, intranasal, intrapulmonar, intratecal, intraventricular, intraespinal, intracisternal, intracapsular, intraesternal o intralesional. La administración parenteral puede ser, p. ej., mediante inyección en bolo o infusión continua, ya sea constante o intermitente y/o pulsátil, y puede realizarse mediante una aguja o mediante un catéter u otro tubo.

La presente divulgación, que no es de acuerdo con la invención, está dirigida a formulaciones farmacéuticas acuosas de proteínas y antioxidantes farmacéuticamente activos que exhiben una estabilidad y/o resistencia superior a la oxidación o degradación inducida por radicales libres, métodos para preparar formulaciones de este tipo, métodos para seleccionar antioxidantes para uso en formulaciones de este tipo, y métodos de utilizar formulaciones de este tipo. La oxidación o degradación debida a radicales libres puede ocurrir debido a una o más condiciones adversas, tales como la exposición a la luz, incluida la luz ultravioleta, visible y/o fluorescente, la exposición a radicales libres de otras fuentes, tales como peróxido de hidrógeno o los aniones superóxido, y/o la exposición a iones metálicos o componentes extraíbles o lixiviables de recipientes.

Lo ideal es que una formulación farmacéutica acuosa estable para administración parenteral permanezca dentro de sus especificaciones físicas, químicas, microbiológicas, terapéuticas y toxicológicas durante toda su vida útil. Por ejemplo, puede conservar su claridad, color y/u olor originales durante toda su vida útil, opcionalmente a lo largo de un intervalo de temperaturas relativamente amplio tal como de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 37 °C o de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 25 °C. Idealmente, las soluciones de ingredientes farmacéuticos activos deben poder soportar condiciones cíclicas de temperatura y un intervalo de exposición a la luz ambiental, incluida la radiación UV.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "concentración estabilizadora de antioxidante" significa una concentración de antioxidante que aumenta la estabilidad de una proteína en una formulación en comparación con la estabilidad de la proteína cuando el antioxidante está ausente de la formulación, como se determina en las mismas condiciones. Un ejemplo de concentración estabilizadora de antioxidante es una concentración de antioxidante que reduce la degradación de la proteína en la formulación en comparación con la degradación de la proteína cuando se calcula en las mismas condiciones.

Preferiblemente, la concentración estabilizante del antioxidante da como resultado una vida útil a 2-8 °C (temperatura del refrigerador) de al menos dos meses, o al menos 3, 6, 9, 12, 18 o 24 meses cuando se expone a condiciones de luz ambiente normal o fluorescente. En algunos aspectos de la divulgación, el efecto estabilizante también da como resultado una vida útil más larga a otras temperaturas, tales como 25-30 °C (temperatura ambiente). La estabilidad de una formulación se puede evaluar exponiendo la formulación a condiciones extremas, incluyendo una exposición prolongada a la radiación UV-B. Si bien es poco probable que se produzca exposición directa a la radiación UV-B durante el almacenamiento, la manipulación y la administración de un agente terapéutico proteico, a menudo está presente algo de radiación UV-B que conduciría a una degradación indeseable de la proteína. El efecto estabilizador de los antioxidantes en una formulación acuosa se evalúa exponiendo las formulaciones a UVB y/u otras fuentes de luz, incluyendo la iluminación fluorescente de la habitación, la luz diurna artificial y la luz UV cercana.

Tal como se utiliza en esta memoria, "vida útil" significa el período de almacenamiento durante el cual un ingrediente activo tal como una proteína terapéutica en una formulación farmacéutica tiene una degradación mínima (p. ej., no más de aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6%, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de degradación) y/o una reducción mínima de la actividad biológica (p. ej., menos del 10 % o menos del 20 %) cuando la formulación farmacéutica se almacena en condiciones de almacenamiento específicas, por ejemplo, 2-8 °C y exposición a una fuente de luz específica. La cantidad de degradación (% de degradación) se puede determinar fácilmente por un experto en la técnica relevante. Técnicas para evaluar la degradación varían dependiendo de la identidad de la proteína en la formulación farmacéutica. Técnicas ejemplares incluyen cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)-HPLC para detectar, p. ej., agregación, HPLC de fase inversa (RP, por sus siglas en inglés) para detectar, p. ej., la fragmentación de proteínas, HPLC de intercambio iónico para detectar, p. ej., cambios en la carga de la proteína. espectrometría de masas, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) y espectroscopia Raman para detectar cambios conformacionales de proteínas. Todas estas técnicas se pueden utilizar solas o en combinación para evaluar la degradación de la proteína en la formulación farmacéutica y determinar la vida útil de esa formulación. . Formulaciones farmacéuticas ejemplares de la presente divulgación pueden exhibir una degradación (p. ej., fragmentación, agregación, oxidación o despliegue) de no más de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 % a lo largo de 24 meses cuando se exponen a cualquier luz incidente encontrada durante el envío, la manipulación o administración del fármaco y se almacena a 2-8 °C.

En aspectos ejemplares de la divulgación, la formulación farmacéutica acuosa de la proteína terapéutica en presencia del antioxidante conserva al menos el 25 % o al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de su eficacia terapéutica tras la exposición a condiciones diseñadas para aumentar la generación de radicales libres, en comparación con la eficacia terapéutica de la misma formulación cuando no se somete a condiciones de este tipo. En otros aspectos de la divulgación, la formulación farmacéutica acuosa de la proteína terapéutica exhibe una mejora del 50 % o más en la estabilidad en presencia del antioxidante en comparación con su estabilidad en ausencia del antioxidante (en las mismas condiciones), cuando se expone a una o más condiciones de este tipo diseñadas para aumentar la generación de radicales libres. La evaluación de la fotoestabilidad o estabilidad tras la exposición a otras fuentes que generan radicales libres se describe con más detalle más adelante.

También se describen, pero no son de acuerdo con la invención, formulaciones farmacéuticas acuosas que comprenden una proteína terapéutica y una cantidad o concentración estabilizante de uno, dos o más antioxidantes que protegen la proteína de la degradación oxidativa bajo una o más condiciones adversas. En los casos en los que se utilizan múltiples antioxidantes en combinación, la cantidad o concentración estabilizante requerida de cada uno de los antioxidantes puede ser menor, como parte de la combinación, que si el antioxidante se utilizara solo. A continuación se describen con más detalle clases ejemplares de antioxidantes. Opcionalmente, formulaciones de este tipo pueden comprender, además, uno o más osmolitos y/o uno o más agentes depuradores de peróxido, que se describen con más detalle más adelante. Opcionalmente, formulaciones de este tipo también pueden comprender otros diluyentes, excipientes, soportes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, incluyendo tensioactivos, sales o tampones, o conservantes en una concentración de conservante. Cuando la formulación contiene conservantes conocidos en una concentración de conservante, contiene también un antioxidante diferente que no actúa como conservante.

Tal como se utiliza en esta memoria, un "conservante" es un agente que mata o inhibe el crecimiento de microbios, incluyendo bacterias o levaduras/hongos u otros microorganismos. Un conservante generalmente está presente en una "concentración de conservante" que retarda el crecimiento bacteriano o la contaminación de los productos farmacéuticos. Una "concentración no conservante" es una concentración menor que la concentración que previene eficazmente el crecimiento microbiano o bacteriano. Típicamente, cuando se utiliza un antioxidante que también tiene propiedades conservantes, éste se utiliza en una concentración inferior (p. ej., al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % menos que) su concentración inhibidora mínima (MIC) conocida. En los casos en los que el antioxidante también tiene propiedades conservantes, la concentración estabilizadora del antioxidante puede ser de 5 mM o menos, o de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 5 mM.

En otro aspecto relacionado, no de acuerdo con la invención, la divulgación proporciona métodos para preparar las formulaciones de la divulgación que comprenden las etapas de proporcionar una proteína terapéutica purificada y mezclar la proteína con una cantidad o concentración estabilizante de uno, dos o más antioxidantes. Etapas adicionales pueden incluir mezclar uno o más diluyentes, excipientes, soportes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables con la proteína, y etapas adicionales opcionales incluyen mezclar con otros componentes tales como osmolitos, agentes depuradores de peróxido, tensioactivos, sales, tampones o conservantes a una concentración conservante.

La divulgación, no de acuerdo con la invención, proporciona un método para estabilizar una proteína terapéutica en solución acuosa, que comprende la etapa de añadir una proteína terapéutica y una cantidad o concentración estabilizante de un antioxidante a una solución acuosa, que opcionalmente comprende, además, la etapa de liofilizar la solución acuosa. La divulgación, no de acuerdo con la invención, proporciona otros métodos para preparar formulaciones de este tipo, que comprenden la etapa de proporcionar un polvo liofilizado o una solución concentrada que contiene los componentes antes mencionados y reconstituir el polvo o la solución con una cantidad predeterminada de solución acuosa, tal como agua estéril para inyección, para producir una formulación de la divulgación.

También se describen con mayor detalle más adelante, pero no de acuerdo con la invención, métodos para seleccionar antioxidantes deseables para uso en formulaciones de la divulgación y concentraciones óptimas de los mismos.Proteínas terapéuticas

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria.

La divulgación descrita en esta memoria, pero no de acuerdo con la invención, se puede poner en práctica con una diversidad de proteínas como se describe en esta memoria. Entre las proteínas ejemplares a este respecto se encuentran las proteínas farmacéuticas para uso terapéutico veterinario y/o humano, particularmente proteínas para uso terapéutico humano. También entre las proteínas ejemplares se encuentran las proteínas que son solubles en soluciones acuosas, particularmente aquellas que son solubles en concentraciones relativamente altas y aquellas que son estables durante largos períodos de tiempo.

Entre la diversidad de proteínas farmacéuticamente activas contempladas para uso en las formulaciones y los métodos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, se encuentran anticuerpos, pepticuerpos, proteínas similares a inmunoglobulinas, proteínas que no son anticuerpos, proteínas que no son similares a inmunoglobulinas, proteínas de fusión. tales como pepticuerpos, proteínas de fusión Fc, avímeros, proteínas quiméricas y/o proteínas multicadena, ya sean que se producen de forma natural o no natural. Ejemplos no limitantes incluyen proteínas estructurales, enzimas, hormonas, factores hematopoyéticos, factores de crecimiento, citoquinas, quimioquinas, factores antiobesidad, factores tróficos, factores anti-inflamatorios y proteínas reguladoras, incluyendo, pero no limitadas a factor de células madre, leptina, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH, por sus siglas en inglés), hormona estimulante del tiroides (TSH, por sus siglas en inglés), hormona luteinizante (LH, por sus siglas en inglés), hormona estimulante del folículo (FSH, por sus siglas en inglés), gonadotropina coriónica humana (HCG, por sus siglas en inglés), motilina, interferón (alfa, beta, gamma), interleuquina (IL-1 a IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína de unión al factor de necrosis tumoral (TNF-bp, por sus siglas en inglés), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en inglés), factor neurotrófico derivado de la glial (GDNF, por sus siglas en inglés), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento neurotrófico (NGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento óseo, tal como la osteoprotegerina (OPG), factor de crecimiento similar a la insulina (IGF, por sus siglas en inglés), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento derivado de megacariocitos (MGDF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento simulador de colonias (CSF, por sus siglas en inglés), proteína morfogenética ósea (BMP, por sus siglas en inglés), superóxido dismutasa (SOD), tejido activador del plasminógeno (TPA, por sus siglas en inglés), uroquinasa, estreptoquinasa o calicreína. Se contempla el uso de análogos de proteínas que se producen de forma natural en formulaciones y métodos de la presente divulgación, pero no de acuerdo con la invención, incluyendo polipéptidos con glicosilación modificada o polipéptidos sin glicosilación (no glicosilados) y polipéptidos con otras modificaciones post-traduccionales que pueden ser elaborados mediante sistemas de modificación celular o mediante métodos enzimáticos y/o químicos.

En algunos aspectos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, la proteína terapéutica es una proteína estimulante de la eritropoyesis. Tal como se utiliza en esta memoria, "proteína estimulante de la eritropoyesis" significa una proteína que directa o indirectamente provoca la activación del receptor de eritropoyetina, por ejemplo, uniéndose al receptor y provocando la dimerización del receptor. Proteínas estimulantes de la eritropoyesis incluyen la eritropoyetina y sus variantes, análogos o derivados que se unen al receptor de eritropoyetina y lo activan; los anticuerpos que se unen al receptor de eritropoyetina y lo activan; o los péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina y lo activan. Proteínas estimulantes de la eritropoyesis incluyen, pero no se limitan a epoetina alfa, epoetina beta, epoetina delta, epoetina omega, epoetina iota, epoetina zeta y análogos de las mismas, eritropoyetina pegilada, eritropoyetina carbamilada, péptidos miméticos (incluyendo EMP1/hematida) y anticuerpos miméticos. Proteínas estimulantes de la eritropoyesis ejemplares incluyen eritropoyetina, darbepoetina, variantes agonistas de la eritropoyetina y péptidos o anticuerpos que se unen y activan el receptor de eritropoyetina (e incluyen compuestos reseñados en las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. N°s 2003/0215444 y 2006/0040858, así como moléculas o variantes de eritropoyetina) o análogos de los mismos como se describe en las siguientes patentes o solicitudes de patente: Patentes de EE.UU. N2s 4.703.008; 5.441.868; 5.547.933; 5.618.698; 5.621.080; 5.756.349; 5.767.078; 5.773.569; 5.955.422; 5.830.851; 5.856.298; 5.986.047; 6.030.086; 6.310.078; 6.391.633; 6.583.272; 6.586.398; 6.900.292; 6.750.369; 7.030.226; 7.084.245; 7.217.689; publicaciones PCT n°s WO 91/05867; WO 95/05465; WO 99/66054; WO 00/24893; WO 01/81405; WO 00/61637; WO 01/36489; WO 02/014356; WO 02/19963; WO 02/20034; WO 02/49673; WO 02/085940; WO 03/029291; WO 2003/055526; WO 2003/084477; WO 2003/094858; WO 2004/002417; WO 2004/002424; WO 2004/009627; WO 2004/024761; WO 2004/033651; WO 2004/035603; WO 2004/043382 WO 2004/101600 WO 2004/101606 WO 2004/101611 WO 2004/106373 WO 2004/018667 WO 2005/001025 WO 2005/001136 WO 2005/021579 WO 2005/025606 WO 2005/032460 WO 2005/051327 WO 2005/063808 WO 2005/063809 WO 2005/070451 WO 2005/081687 WO 2005/084711 WO 2005/103076 WO 2005/100403 WO 2005/092369; WO 2006/50959; WO 2006/02646; WO 2006/29094; y publicaciones de EE.UU. n°s US 2002/0155998 US 2003/0077753 US 2003/0082749 US 2003/0143202 US 2004/0009902 US 2004/0071694 US 2004/0091961 US 2004/0143857 US 2004/0157293 US 2004/0175379 US 2004/0175824 US 2004/0229318 US 2004/0248815 US 2004/0266690 US 2005/0019914 US 2005/0026834 US 2005/0096461 US 2005/0107297 US 2005/0107591 US 2005/0124045 US 2005/0124564 US 2005/0137329 US 2005/0142642 US 2005/0143292 US 2005/0153879 US 2005/0158822 US 2005/0158832 US 2005/0170457 US 2005/0181359 US 2005/0181482 US 2005/0192211 US 2005/0202538; US 2005/0227289; US 2005/0244409; US 2006/0088906; US 2006/0111279.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "análogos", cuando se utiliza con referencia a polipéptidos, se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a la secuencia original, al tiempo que aún mantiene sustancialmente la actividad biológica de la secuencia original, según se determina utilizando ensayos biológicos conocidos por un experto en la técnica. Las formulaciones y los métodos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, también pueden incluir "derivados" de polipéptidos que se producen de forma natural o análogos que han sido modificados químicamente, por ejemplo, para unir polímeros hidrosolubles (p. ej., pegilados), marcadores (p. ej., radionucleidos o diversas enzimas), u otros restos de diagnóstico o de fijación de objetivo o terapéuticos, o mediante inserción o sustitución de aminoácidos no naturales por medios químicos. Derivados de este tipo conservarán las propiedades de unión de las moléculas no derivatizadas de la divulgación.

Polipéptidos de este tipo pueden derivarse de una fuente natural, construirse mediante síntesis química de novo o semi-síntesis, o expresarse de forma recombinante, p. ej., mediante expresión de una construcción de expresión exógena, mediante activación de un gen endógeno (mediante recombinación homologa o no homologa, por ejemplo), mediante la expresión de un gen exógeno bajo el control de una región de control de la transcripción endógena, o cualesquiera otras técnicas conocidas en la técnica.

Además, entre las proteínas ejemplares para uso en las composiciones y los métodos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, se encuentran proteínas para formulaciones farmacéuticas que no inducen una respuesta antigénica altamente perjudicial después de la administración a un sujeto. A este respecto son ejemplares las proteínas para uso veterinario y/o médico humano, en particular, respecto a estas últimas, las proteínas humanizadas y humanas.

Además, entre las proteínas ejemplares de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, se encuentran proteínas que se unen selectivamente a dianas específicas, incluyendo proteínas de unión a ligandos y ligandos de proteínas. Las proteínas de unión a antígeno, las proteínas derivadas de las mismas y las proteínas relacionadas con las mismas se encuentran entre los aspectos particularmente ejemplares de la divulgación a este respecto.

Anticuerpos

El anticuerpo de la invención es el anticuerpo IgG1. Entre las proteínas particularmente ejemplares que se pueden utilizar en las composiciones y los métodos de la presente divulgación se encuentran los anticuerpos, pero no de acuerdo con la invención, se encuentran otros polipéptidos de anticuerpos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "anticuerpo" incluye cadenas pesadas o ligeras, anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales pesados (incluyendo anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a antígeno (p. ej., Fab', F'(ab)2, Fv , anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos) y polipéptidos que comprenden 1,2, 3, 4, 5 o las 6 regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de lo anterior, y proteínas de fusión o variantes o derivados de las mismas, siempre que exhiban la actividad de unión o biológica deseada. En las composiciones o los métodos de la presente divulgación se pueden utilizar anticuerpos de cualquier clase o subclase de isotipo, incluyendo IgG, IgM, IgD , IgA e IgE , IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, o cualquier alotipo. Anticuerpos se pueden producir mediante cualesquiera técnicas conocidas en la técnica, incluyendo tecnologías de hibridoma, mediante activación de un gen endógeno (mediante recombinación homóloga o no homóloga, por ejemplo), mediante expresión de un gen exógeno bajo el control de una región de control de la transcripción endógena, mediante expresión de una construcción de expresión exógena, por semi-síntesis y por síntesis de novo.

La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones que se producen de forma natural o modificaciones posttraduccionales alternativas que pueden estar presentes en menores cantidades, ya sea producidas a partir de hibridomas o técnicas de ADN recombinante. Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados o humanos, o variantes o derivados de los mismos. La humanización o modificación de la secuencia del anticuerpo para que sea más parecida a la humana se describe, p. ej., en Jones et al., Nature 321:522525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:6592 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3):169217 (1994); y Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994). Un método para aislar anticuerpos monoclonales humanos es el uso de tecnología de presentación en fagos. La presentación en fagos se describe, p. ej., en Dower et al., documento WO 91/17271,

McCafferty et al., documento WO 92/01047 y Caton y Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990). Otro método para aislar anticuerpos monoclonales humanos utiliza animales transgénicos que no tienen producción endógena de inmunoglobulinas y están modificados por ingeniería genética para contener loci de inmunoglobulinas humanas. Véase, p. ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); documentos<w>O 91/10741, WO 96/34096, WO 98/24893, o las publicaciones de solicitudes de patente de EE.UU. n°s 20030194404, 20030031667 o 20020199213.

Fragmentos de anticuerpos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto de longitud completa, preferiblemente la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto, e incluyen anticuerpos multiespecíficos (biespecíficos, triespecíficos , etc.) formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Ejemplos no limitantes de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv (región variable), anticuerpos de dominio (dAb, que contiene un dominio VH; Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), que contienen dominios VH y VL en una única cadena polipeptídica; Bird et al., Science 242:423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988, que incluye opcionalmente un enlazador polipeptídico y, opcionalmente, multiespecífico, Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)), fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos (dominios VH y VL) en una única cadena polipeptídica que se empareja con dominios de VL y VH complementarios de otra cadena; documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)), tricuerpos, tetracuerpos, minicuerpos (scFv condensado a CH3 mediante un enlazador peptídico (sin bisagras) o mediante una bisagra de IgG; Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. abril de 2004;17(4):315-23), anticuerpos lineales (segmentos Fd en tándem (VH -CH1-VH -CH1; Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)); anticuerpos recombinantes quelantes (crAb, que pueden unirse a dos epítopos adyacentes en el mismo antígeno; Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995), bicuerpos (Fab-scFv biespecífico) o tricuerpos (Fab-(scFv) triespecífico (2); Schoonjans et al., J Immunol. 165:7050-57, 2000; Willems et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161 -76, 2003), intracuerpos (Biocca, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:17616-21,2004) que también pueden comprender secuencias de señal celular que conservan el anticuerpo intracelularmente (Mhashilkar et al, EMBO J 14:1542-51, 1995; Wheeler et al., FASEB J. 17:1733-5, 2003), transcuerpos (anticuerpos permeables a las células que contienen un dominio de transducción de proteínas (PTD, por sus siglas en inglés) condensado a scFv; Heng et al., Med Hypotheses. 64:1105-8, 2005) nanocuerpos (dominio variable de aproximadamente 15 kDa de la cadena pesada; Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004, pequeños inmunofármacos modulares (SMIPs, por sus siglas en inglés; documento WO 03/041600, publicación de patente de EE.UU. 2003/0133939 y publicación de patente de EE.UU. 2003/0118592), una proteína de fusión de inmunoglobulina con dominio de unión a antígeno, un anticuerpo camelizado (en el que VH se recombina con una región constante que contiene dominios bisagra, CH1, CH2 y CH3; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001; Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002; Publicaciones de Patentes de EE.Uu . N°s 20050136049 y 20050037421), un anticuerpo que contiene VHH, anticuerpos de cadena pesada (HCAbs, por sus siglas en inglés, homodímeros de dos cadenas pesadas que tienen la estructura H2L2), o variantes o derivados de los mismos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión de antígeno específica al polipéptido, tal como una secuencia CDR, siempre que el anticuerpo conserve la actividad biológica deseada.

La expresión región "hipervariable" o "región determinante de complementariedad" (CDR) se refiere a los residuos 24 34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31 -35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como describen Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); o una definición alternativa de residuos de CDR de un "bucle" hipervariable se describe por Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987) como residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91 -96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96 101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada). Los residuos de "marco" son aquellos residuos de la región variable distintos de los residuos de la región hipervariable.

El término "variante" cuando se utiliza en relación con anticuerpos se refiere a la secuencia polipeptídica de un anticuerpo que contiene al menos una sustitución, deleción o inserción de un aminoácido en la región variable o la porción equivalente a la región variable, siempre que la variante conserve la afinidad de unión o actividad biológica deseada. Además, los anticuerpos de la divulgación pueden tener modificaciones de aminoácidos en la región constante para modificar la función efectora del anticuerpo, incluyendo la semivida o el aclaramiento, la actividad ADCC y/o CDC. Modificaciones de este tipo pueden potenciar la farmacocinética o potenciar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Véase Shields et al., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001).

El término "derivado", cuando se utiliza en relación con anticuerpos, se refiere a anticuerpos modificados covalentemente mediante conjugación con agentes terapéuticos o de diagnóstico, marcaje (p. ej., con radionucleidos o diversas enzimas), unión de polímero covalente tal como pegilación (derivatización con polietilenglicol) e inserción o sustitución por síntesis química de aminoácidos no naturales. Derivados de la divulgación conservarán las propiedades de unión de las moléculas no derivatizadas de la divulgación. La conjugación de anticuerpos que fijan como objetivo el cáncer con agentes citotóxicos, por ejemplo, isótopos radiactivos (p. ej., I131, I125, Y90 y Re186), agentes quimioterapéuticos o toxinas, puede potenciar la destrucción de células cancerosas.

Métodos para producir anticuerpos biespecíficos u otros anticuerpos multiespecíficos son conocidos en la técnica e incluyen reticulación química, uso de cremalleras de leucina (Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992)]; tecnología de diacuerpos (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993); dímeros de scFv (Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368, 1994), anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8:1057-62, 1995); y anticuerpos recombinantes quelantes (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995).

Proteínas de Unión a Diana

También entre las proteínas ejemplares de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, a este respecto se encuentran otros tipos de proteínas de unión a diana, y proteínas relacionadas con las mismas o derivadas de las mismas, y ligandos de proteínas, y proteínas derivadas de las mismas o relacionadas con las mismas, particularmente las que comprenden una región Fc de un anticuerpo o una variante o derivado de una región Fc. Entre las proteínas de unión a ligando ejemplares a este respecto se encuentran las proteínas que se unen a proteínas señalizadoras y efectoras, y proteínas relacionadas con las mismas o derivadas de las mismas.

Los pepticuerpos, moléculas que comprenden un dominio Fc de anticuerpo fijado a al menos un péptido de unión a antígeno, se describen generalmente en la publicación PCT WO 00/24782, publicada el 4 de mayo de 2000. Proteínas similares a inmunoglobulinas, miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, contienen uno o más dominios similares a inmunoglobulinas que se pliegan en estructuras similares a porciones de la región variable del anticuerpo.

También se contemplan con respecto a las composiciones y métodos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, formulaciones que contienen armazones de proteínas que pueden comprender una única cadena proteica o un complejo multipolipeptídico. Armazones de proteínas ejemplares son los avimeros, que son multímeros de avidez que contienen una única cadena proteica formada por múltiples dominios, cada uno de los cuales representa una función separada (Silverman et al., Nat Biotech 23(12): 1556-1561 (2005); Publicación de Patente de EE.UU. N° US 2005/0089932 A1 Se revisan otros armazones de proteínas en Razeghifard et al., Current Protein & Peptide Science.

8(1 ):3-18, 2007. Otros armazones de proteínas adecuados para presentar péptidos se revisan en Hosse et al . al., Protein Science 15:14-27, 2006 (revisando armazones tales como el dominio de fibronectina tipo III, una lipocalina, un nudo, el citocromo b562, un inhibidor de proteasa tipo kunitz, el dominio Z y el módulo de unión a hidratos de carbono CBM4-2). Véase también Gill et al., Current Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006)(anticuerpos de dominio único, pequeños inmunofármacos modulares, tetranectinas, adnectinas, proteínas de dominio A, lipocalinas, proteínas repetidas anquilinas) y Skerra , J. Mol. Recognit., 13:167-187 (2000) (dominios únicos de anticuerpos o de superfamilia de inmunoglobulinas, inhibidores de proteasas, proteínas de haz de hélice, péptidos anudados con disulfuro y lipocalinas).

Las proteínas de unión a diana, incluyendo anticuerpos, pepticuerpos, proteínas de fusión Fc, avímeros y otros armazones de proteínas, y análogos o variantes o derivados de los mismos, que se pueden utilizar en las composiciones y los métodos de la presente divulgación, pero no de acuerdo con la invención, incluyen las que se unen a uno o más de los siguientes, solos o en cualquier combinación:

(i) proteínas CD que incluyen, pero no se limitan a CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD30 y CD34; incluyendo las que interfieren con la unión al receptor.

(ii) proteínas de la familia de receptores HER, incluyendo, por ejemplo, HER2, HER3, HER4 y el receptor de EGF;

(iii) moléculas de adhesión celular, por ejemplo, LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina alfa v/beta 3;

(iv) factores de crecimiento, incluyendo, pero no limitados a, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF"), hormona del crecimiento, hormona estimulante de la tiroides, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, factor liberador de la hormona del crecimiento, hormona paratiroidea, sustancia inhibidora de Müller, proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-alfa), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés), factores de crecimiento de fibroblastos, incluyendo, por ejemplo, aFGF y bFGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés), factores de crecimiento transformantes (TGF, por sus siglas en inglés), incluyendo, entre otros, TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4 o TGF-beta5, factores de crecimiento similares a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II), des(1-3)-IGF-I (IGF-I del cerebro) y factores osteoinductivos;

(v) insulinas y proteínas relacionadas con la insulina, incluyendo, pero no limitadas a insulina, cadena A de insulina, cadena B de insulina, proinsulina y proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina;

(vi) proteínas de la coagulación y relacionadas con la coagulación, tales como, entre otras, factor VIII, factor tisular, factor von Willebrand, proteína C, alfa-1-antitripsina, activadores del plasminógeno, tales como uroquinasa y activador del plasminógeno tisular ("t-PA"), bombazina, trombina y trombopoyetina;

(vii) otras proteínas de la sangre y del suero, incluyendo, pero no limitadas a albúmina, IgE y antígenos de grupo sanguíneo;

(viii) factores estimulantes de colonias (CSFs) y receptores de los mismos, incluidos los siguientes, entre otros, M-CSF, GM-CSF y G-CSF, y receptores de los mismos, tales como el receptor de CSF-1 (c-fms);

(ix) receptores y proteínas asociadas a receptores, incluyendo, por ejemplo, receptor flk2/flt3, receptor de obesidad (OB), receptores de hormona del crecimiento, receptores de trombopoyetina ("TPO-R", "c-mpl"), receptores de glucagón, receptores de interleuquina, receptores de interferón, receptores de células T, receptores de factores de células madre (scfr's), tales como c-Kit, y otros receptores enumerados en esta memoria;

(x) ligandos de receptores, incluyendo, por ejemplo, OX40L, el ligando para el receptor OX40 expresado en células T, y otros ligandos enumerados en esta memoria;

(xi) factores neurotróficos, incluyendo, pero no limitados al factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF, por sus siglas en inglés) y la neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6);

(xii) cadena A de relaxina, cadena B de relaxina y pro-relaxina;

(xiii) interferones y receptores de interferones, incluyendo, por ejemplo, receptores de interferón alfa, beta y gamma y receptores de interferón alfa, beta y gamma;

(xiv) interleuquinas (IL) y receptores de interleuquina, incluyendo, pero no limitados a receptores de IL-1 a IL-15 e IL-1 a IL-15, tales como el receptor de IL-8, entre otros;

(xv) antígenos virales, que incluyen, pero no se limitan a un antígeno viral de la envoltura del SIDA;

(xvi) lipoproteínas, calcitonina, glucagón, factor natriurético auricular, tensioactivo pulmonar, factor de necrosis tumoral alfa y beta, encefalinasa, RANTES (siglas inglesas de regulado por activación normalmente expresado y secretado por células T), péptido asociado a gonadotropina de ratón, ADNasa, inhibina y activina;

(xvii) integrina, proteína A o D, factores reumatoides, inmunotoxinas, proteína morfogenética ósea (BMP, por sus siglas en inglés), superóxido dismutasa, proteínas de la superficie de membrana, factor acelerador de la descomposición (DAF, por sus siglas en inglés), envoltura del SIDA, proteínas de transporte, receptores de localización, adresinas, proteínas reguladoras, inmunoadhesinas, anticuerpos;

(xviii) miostatinas, proteínas TALL, incluyendo TALL-1, proteínas amiloides, incluyendo, pero no limitadas a proteínas beta-amiloides, linfopoyetinas del estroma tímico ("TSLP"), ligando RANK ("OPGL''), c-kit, receptores de TNF, incluyendo el receptor de TNF tipo 1, TRAII, -R2, angiopoyetinas y

(xix) fragmentos biológicamente activos o análogos o variantes de cualquiera de los anteriores.

En cuanto a todo lo anterior, son particularmente ejemplares, pero no de acuerdo con la invención, aquellos que son agentes terapéuticos eficaces, particularmente aquellos que ejercen un efecto terapéutico uniéndose a una diana, particularmente una diana entre las enumeradas anteriormente, incluyendo las dianas derivadas de la misma, dianas relacionadas con los mismos, y modificaciones de los mismos.

Proteínas

Polipéptidos terapéuticos ejemplares adecuados para su uso en las formulaciones y los métodos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, incluyen eritropoyetina humana (SEQ ID NO: 1) o variantes, derivados o análogos biológicamente activos de la misma, incluyendo derivados químicamente modificados. Una proteína ejemplar es la darbepoetina (SEQ ID NO: 2). La darbepoetina es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilado que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de la EPO humana recombinante que proporcionan dos cadenas de hidratos de carbono con enlaces N adicionales en los residuos de aminoácidos 30 y 88. Los cinco cambios en la secuencia de aminoácidos de la EPO humana recombinante que se encuentran dentro la secuencia de aminoácidos de darbepoetina son Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn y Pro90Thr (de acuerdo con la numeración de posiciones de aminoácidos de EPO (SEQ iD NO: 1); Egrie et al., British J Cancer 84 (Suplemento 1): 3-10 (2001)).

Entre las proteínas se encuentran las proteínas específicas que se exponen a continuación, incluyendo fusiones, fragmentos, análogos, variantes o derivados de las mismas:

anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos para OPGL, y similares (a los que también se alude como anticuerpos, pepticuerpos y similares específicos para RANKL), incluyendo anticuerpos específicos para OPGL completamente humanizados y humanos, particularmente anticuerpos monoclonales completamente humanizados, que incluyen, pero no se limitan a los anticuerpos descritos en la Publicación Internacional Número WO 03/002713, relacionada con anticuerpos específicos para OPGL y proteínas relacionadas con anticuerpos, particularmente los que tienen las secuencias expuestas en el mismo, particularmente, pero no limitadas a aquellas indicadas en la misma: 9H7; 18B2; 2D8; 2E11; 16E1; y 22B3, incluyendo los anticuerpos específicos para OPGL que tienen la cadena ligera de SEQ ID NO: 2 como se recoge en la Figura 2 y/o la cadena pesada de SEQ ID NO: 4, como se recoge en la Figura 4.

Proteínas de unión a miostatina, pepticuerpos y proteínas relacionadas, y similares, incluyendo pepticuerpos específicos para miostatina, en particular los descritos en la Publicación de Solicitud de EE.UU. número 2004/0181033 y la Publicación Internacional Número WO 2004/058988, particularmente en partes pertinentes a pepticuerpos específicos para miostatina, incluyendo, pero no limitados a pepticuerpos de la familia mTN8-19, incluyendos los de SEQ ID NOS: 305-351, incluyendo TN8-19-1 a TN8-19-40, TN8-19 con1 y TN8-19 con2; pepticuerpos de la familia mL2 de SEQ ID NOS: 357-383; la familia mL15 de SEQ ID NOS: 384-409; la familia mL17 de SEQ ID NOS: 410-438; la familia mL20 de SEQ ID NOS: 439-446; la familia mL21 de SEQ ID NOS: 447-452; la familia mL24 de SEQ ID NOS: 453-454; y las de SEQ ID NOS: 615-631.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos del receptor de IL-4, y similares, particularmente los que inhiben las actividades mediadas por la unión de IL-4 y/o IL-13 al receptor, incluyendo los descritos en la Publicación Internacional N° WO 2005/047331 de la Solicitud Internacional Número PCT/US2004/03742 y en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. número 2005/112694, particularmente en partes pertinentes a anticuerpos específicos del receptor de IL-4, particularmente los anticuerpos que se describen en el mismo, en particular, y sin limitación, los designados en la misma: L1H1; L1H2; L1H3; L1 h4; L1H5; L1H6; L1H7; L1H8; L1H9; L1H10; L1H11; L2H1; L2H2; L2H3; L2H4; L2H5; L2H6; L2H7; L2H8; L2H9; L2H10; L2H11; L2H12; L2H13; L2H14; L3H1; L4H1; L5H1;L6H1.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos del receptor 1 de interleuquina 1 ("IL1 -R1"), y similares, incluyendos, pero no limitados a los descritos en la Publicación de Solicitud de EE.UU. Número US2004/097712A1 en partes pertinentes a las proteínas de unión específicas de IL1-R1, anticuerpos monoclonales en particular, especialmente, sin limitación, los designados en la misma: 15CA, 26F5, 27F2, 24E12 y 10H7.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de Ang2, y similares, incluyendo, pero no limitados a los descritos en la Publicación Internacional Número WO 03/057134 y la Publicación de Solicitud de EE.UU. Número US2003/0229023, particularmente en partes pertinentes a anticuerpos y pepticuerpos específicos de Ang2 y similares, especialmente los de secuencias descritas en la misma y que incluyen pero no se limitan a: L1 (N); L1 (N) WT; L1 (N) 1K WT; 2xL1 (N); 2xL1 (N) WT; Con4 (N), Con4 (N) 1K WT, 2xCon4 (N) 1K; L1C; L1C 1K; 2xL1 C; Con4C; Con4C 1K; 2xCon4C 1K; Con4-L1 (N); Con4-L1C; TN-12-9 (N); C17 (N); TN8-8(N); TN8-14 (N); Con 1 (N), incluyendo también anticuerpos anti-Ang 2 y formulaciones tales como las descritas en la Publicación Internacional Número WO 2003/030833, particularmente Ab526; Ab528; Ab531; Ab533; Ab535; Ab536; Ab537; Ab540; Ab543; Ab544; Ab545; Ab546; A551; Ab553; Ab555; Ab558; Ab559; Ab565; AbF1AbFD; AbFE; AbFJ; AbFK; AbG1 D4; AbGC1 E8; AbH1C12; AblA1; AblF; AblK, AblP; y AblP, en sus diversas permutaciones como se describe allí.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de NGF, y similares, incluyendo, en particular, pero no limitados a los descritos en la Publicación de Solicitud de EE.UU. Número US2005/0074821 y la Patente de EE.UU. Número 6.919.426, particularmente en lo que respecta a anticuerpos específicos de NGF y proteínas relacionadas a este respecto, incluyendo en particular, pero no limitadas a los anticuerpos específicos de NGF designados en el mismo 4D4, 4G6, 6H9, 7H2, 14D10 y 14D11.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de CD22, y similares, tales como los descritos en el documento US 5.789.554 en cuanto a anticuerpos específicos de CD22 y proteínas relacionadas, particularmente anticuerpos específicos de CD22 humanos, tales como, pero no limitados a anticuerpos humanizados y totalmente humanos, incluyendo, pero no limitados a anticuerpos monoclonales humanizados y completamente humanos, incluyendo particularmente pero no limitado a anticuerpos IgG específicos de CD22 humano, tales como, por ejemplo, un dímero de un disulfuro de cadena gamma de hLL2 monoclonal humano-ratón enlazado a una cadena kappa de hLL2 monoclonal humano-ratón, que incluye, pero no se limita, por ejemplo, el anticuerpo específico de CD22 humano completamente humanizado en Epratuzumab, número de registro CAS 501423-23-0.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos del receptor de IGF-1, y similares, tales como los descritos en la Solicitud de Patente Internacional Número PCT/US2005/046493, en cuanto a anticuerpos específicos del receptor de IGF-1 y proteínas relacionadas, incluyendo, pero no limitados a los anticuerpos específicos de IGF-1 allí designados L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, L23H23, L24H24, L25H25, L26H26, L27H27, L28H28, L29H29, L30H30, L31H31, L32H32, L33H33, L34H34, L35H35, L36H36, L37H37, L38H38, L39H39, L40H40, L41H41, L42H42, L43H43, L44H44, L45H45, L46H46, L47H47, L48H48, L49H49, L50H50, L51H51, L52H52, y fragmentos de unión a IGF-1 R y derivados de los mismos.

También entre ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-IGF-1 R para uso en los métodos y las composiciones de la presente divulgación, pero no de acuerdo con la invención, 2 son todos y cada uno de los descritos en

la Pub. de Sol. de Pat de EE.UU. N° 06/0040358 (publicada el 23 de febrero de 2006), 05/0008642 (publicada el 13 de enero de 2005), 04/0228859 (publicada el 18 de noviembre de 2004), incluyendo, pero no limitados, por ejemplo, al anticuerpo 1A (DSMZ Depósito N° DSM ACC 2586), anticuerpo 8 (DSMZ Depósito N° DSM ACC 2589), anticuerpo 23 (DSMZ Depósito N° DSM ACC 2588) y anticuerpo 18 como se describe en las mismas;

Pub. PCT N° WO 06/138729 (publicada el 28 de diciembre de 2006), WO 05/016970 (publicada el 24 de febrero de 2005) y Lu et al., 2004, J Biol Chem. 279:2856-65, incluidos, pero no limitados a los anticuerpos 2F8, A12 e IMC-A12 como se describen en las mismas;

Pub. PCT N° WO 07/012614 (publicada el 1 de febrero de 2007), WO 07/000328 (publicada el 4 de enero de 2007), WO 06/013472 (publicada el 9 de febrero de 2006) y 05/058967 (publicada el 30 de junio de 2005), 03/059951 (publicada el 24 de julio de 2003);

la Pub. de Sol. de Pat de EE.UU. N° 05/0084906 (publicada el 21 de abril de 2005), incluyendo, pero no limitados al anticuerpo 7C10, anticuerpo quimérico C7C10, anticuerpo h7C10, anticuerpo 7H2M, anticuerpo quimérico *7C10, anticuerpo GM 607, anticuerpo humanizado 7C10 versión 1, anticuerpo humanizado 7C10 versión 2, anticuerpo humanizado 7C10 versión 3 y anticuerpo 7H2HM, como se describe en las mismas;

la Pub. de Sol. de Pat de EE.UU. N° 05/0249728 (publicada el 10 de noviembre de 2005), 05/0186203 (publicada el 25 de agosto de 2005), 04/0265307 (publicada el 30 de diciembre de 2004), 03/0235582 (publicada el 25 de diciembre de 2003) y Maloney et al., 2003, Cancer Res. 63:5073-83, incluyendo, pero no limitados a los anticuerpos EM164, EM164 revestido, EM164 humanizado, huEM164 v1.0, huEM164 v1.1, huEM164 v1.2 y huEM164 v1.3 como se describe en las mismas;

la Pat. de EE.UU. N° 7.037.498 (expedida el 2 de mayo de 2006), la Sol. de Pat. de EE.UU . N° 05/0244408 (publicada el 30 de noviembre de 2005), 04/0086503 (publicada el 6 de mayo de 2004), Cohen, et al., 2005, Clinical Cancer Res. 11:2063-73, p. ej., anticuerpo CP-751.871, que incluye, pero no se limita a cada uno de los anticuerpos producidos por los hibridomas que tienen los números de acceso de la ATCC PTA-2792, PTA-2788, PTA-2790, PTA-2791, PTA-2789, PTA-2793 y anticuerpos 2.12.1, 2.13.2, 2.14.3, 3.1.1, 4.9.2 y 4.17.3, como se describe en las mismas;

la Sol. Pat. de EE.UU. . N° 05/0136063 (publicada el 23 de junio de 2005), 04/0018191 (publicada el 29 de enero de 2004), que incluyen, pero no se limitan al anticuerpo 19D12 y un anticuerpo que comprende una cadena pesada codificada por un polinucleótido en el plásmido 15H12/19D12 HCA (y4), depositada en la ATCC bajo el número PTA-5214, y una cadena ligera codificada por un polinucleótido en el plásmido 15H12/19D12 LCF (k), depositada en la ATCC bajo el número PTA-5220, como se describe en las mismas;

la Sol. Pat. de EE.UU. .04/0202655 (publicada el 14 de octubre de 2004), que incluye, pero no se limita a anticuerpos PINT-6A1, PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1, PINT-9A2, PINT-11A1. , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1, PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, como se describe en la misma; particularmente en cuanto a los anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas y similares antes mencionados que fijan como objetivo los receptores de IGF-1.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos para la proteína 1 relacionada con B-7 ("B7RP-1", a los que también se alude en la bibliografía como B7H2, ICOSL, B7h y CD275), particularmente anticuerpos IgG2 monoclonales completamente humanos específicos para B7RP, particularmente anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano que se une a un epítopo en el primer dominio similar a inmunoglobulina de B7RP-1, especialmente los que inhiben la interacción de B7RP-1 con su receptor natural, ICOS, en células T activadas en particular, especialmente, en todo lo anterior con respecto a los descritos en la Solicitud Provisional de EE.UU. Número 60/700.265, presentada el 18 de julio de 2005 y la Publicación Internacional Número WO07/011941, en cuanto a anticuerpos y proteínas relacionadas de este tipo, incluyendo, pero no limitados a los siguientes: 16H (que tienen secuencias variables de la cadena ligera y variables de la cadena pesada SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:7 respectivamente); 5D (que tiene secuencias variables de la cadena ligera y variable de la cadena pesada SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:9, respectivamente); 2H (que tiene secuencias variables de la cadena ligera y variable de la cadena pesada SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:10, respectivamente); 43H (que tiene secuencias variables de la cadena ligera y variables de la cadena pesada SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:14, respectivamente); 41H (que tiene secuencias variables de la cadena ligera y variables de la cadena pesada SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:13, respectivamente); y 15H (que tienen las secuencias variables de la cadena ligera y variables de la cadena pesada SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:12, respectivamente).

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de IL-15, y similares, tales como, en particular, anticuerpos monoclonales humanizados, particularmente anticuerpos tales como los descritos en las Publicaciones de Solicitudes de EE.UU. Números: US2003/0138421; US2003/023586; US2004/0071702; y la Patente de EE.UU. Número 7.153.507 en cuanto a anticuerpos específicos de IL-15 y proteínas relacionadas, incluyendo pepticuerpos, que incluyen particularmente, por ejemplo, pero no limitados a anticuerpos HuMax IL-15 y proteínas relacionadas, tales como, por ejemplo, 146B7.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de IFN gamma y similares, especialmente anticuerpos específicos de IFN gamma humano, particularmente anticuerpos anti-IFN gamma totalmente humanos, tales como, por ejemplo, los descritos en la Publicación de Solicitud de EE.UU. Número US 2005/0004353, en cuanto a anticuerpos específicos de IFN gamma, particularmente, por ejemplo, los anticuerpos allí designados 1118; 1118*; 1119; 1121; y 1121*. Las secuencias completas de las cadenas pesada y ligera de cada uno de estos anticuerpos, así como las secuencias de sus regiones variables de la cadena pesada y ligera y regiones determinantes de complementariedad, se describen en la Publicación de Solicitud de EE.Uu . anterior US 2005/0004353 y en Thakur et al., Mol. Immunol.

36: 1107-1115 (1999). Además, la descripción de las propiedades de estos anticuerpos proporcionada en la Solicitud de Patente de EE.UU. N° US 2005/0004353. Anticuerpos específicos incluyen los que tienen la cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 18; los que tienen la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:6 y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:8; los que tienen la cadena pesada de SEQ ID NO:19 y la cadena ligera de SEQ ID NO:20; los que tienen la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:10 y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:12; aquellos que tienen la cadena pesada de SEQ ID NO:32 y la cadena ligera de SEQ ID NO:20; aquellos que tienen la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:30 y la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:12; los que tienen la secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:21 y la secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:22; los que tienen la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:14 y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:16; los que tienen la cadena pesada de SEQ ID NO:21 y la cadena ligera de SEQ ID NO:33; y los que tienen la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. N° 2005/0004353. Un anticuerpo específico es el anticuerpo 1119 como se describe en la Pub. de Patente de EE.UU. N° 2005/0004353 y que tiene una cadena pesada completa de SEQ ID NO:17 como se describe en la misma y que tiene una cadena ligera completa de SEQ ID NO:18 como se describe en la misma.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de TALL-1, y similares, y otras proteínas de unión específicas de TALL, tales como las descritas en las Publicaciones de Solicitud de EE.UU. Números 2003/0195156 y 2006/135431 en cuanto a proteínas de unión de TALL-1, particularmente las moléculas de las Tablas 4 y 5B.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos de la hormona paratiroidea ("PTH") , y similares, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. Número 6.756.480, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a PTH.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos del receptor de trombopoyetina ("TPO-R") y similares, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. Número 6.835.809, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a TPO-R.

Anticuerpos, pepticuerpos y proteínas relacionadas específicos del factor de crecimiento de hepatocitos ("HGF") , y similares, incluyendo los que fijan como objetivo el eje HGF/SF:cMet (HGF/SF:c-Met ), tales como los anticuerpos monoclonales completamente humanos que neutralizar el factor de crecimiento/factor de dispersión de hepatocitos (HGF/SF) descrito en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número US2005/0118643 y la Publicación Internacional Número WO2005/017107, huL2G7 descrito en la Patente de EE.UU. Número 7.220.410 y OA-5d5 descrito en las Patentes de EE.UU. Números 5.686.292, 6.468.529, y en la Publicación Internacional Número WO 96/38557, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a HGF.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos de TRAIL-R2, tales como los descritos en las Solicitudes Provisionales de EE.UU. 60/713.433 presentada el 31 de agosto de 2005 y 60/713.478 presentada el 31 de agosto de 2005, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a TRAIL-R2.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos de activina A, incluyendo, pero no limitados a los descritos en la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Número 60/843.430 presentada el 8 de septiembre de 2006, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a activina A.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos de TGF-beta, incluyendo, pero no limitados a los descritos en la Patente de EE.UU. Número 6.803.453 y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. Número 2007/110747, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a TGF-beta.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos de- la proteína amiloide-beta, incluyendo, pero no limitados a los descritos en la Publicación Internacional Número WO 2006/081171, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a proteínas amiloide-beta. Un anticuerpo contemplado es un anticuerpo que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 8 y una región variable de la cadena ligera que tiene la SEQ ID NO: 6 como se describe en el documento WO 2006/081171.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos de c-Kit, incluyendo, pero no limitados a los descritos en la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Número 60/794.771, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a c-Kit y/u otros receptores del factor de células madre.

Anticuerpos, pepticuerpos, proteínas relacionadas y similares específicos de OX40L, incluyendo, pero no limitados a los descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. Número 11/068.289, particularmente en partes pertinentes a proteínas que se unen a OX40L y/u otros ligandos del receptor de OXO40.

Otras proteínas ejemplares incluyen Activase® (Alteplasa, tPA); Aranesp® (Darbepoetina-alfa), Epogen® (Epoetina alfa o eritropoyetina); Avonex® (Interferón beta-1a); Bexxar® (Tositumomab, anticuerpo monoclonal anti-CD22); Betaseron® (Interferón-beta); Campath® (Alemtuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD52); Dynepo® (Epoetina delta); Velcade® (bortezomib); MLN0002 (mAb anti-a4p7); MLN1202 (mAb del receptor de quimioquina anti-CCR2); Enbrel® (etanercept, receptor de TNF/proteína de fusión Fc, bloqueador de TNF); Eprex® (Epoetina alfa); Erbitux® (Cetuximab, anti-EGFR / HER1 / c-ErbB-1); Genotropin® (Somatropina, Hormona del Crecimiento Humana); Herceptin® (Trastuzumab, mAb del receptor anti-HER2/neu (erbB2)); Humatrope® (Somatropina, Hormona del Crecimiento Humana); Humira® (Adalimumab); Insulina en Solución; Infergen® (Interferón Alfacon-1); Natrecor® (nesiritida; péptido natriurético tipo B humano recombinante (hBNP); Kineret® (Anakinra), Leukine® (Sargamostim, rhuGM-CSF); LymphoCide® (Epratuzumab, mAb anti-CD22); Lymphostat B® (Belimumab, mAb anti-BlyS); Metalyse® (Tenecteplasa, análogo de t-PA); Mircera® (metoxi polietilenglicol-epoetina beta); Mylotarg® (Gemtuzumab ozogamicina); Raptiva® (efalizumab); Cimzia® (certolizumab pegol, CDP 870); Soliris™ (Eculizumab); Pexelizumab (Complemento Anti-C5); MEDI-524 (Numax®); Lucentis® (Ranibizumab); 17-1A (Edrecolomab, Panorex®); Trabio® (lerdelimumab); TheraCim hR3 (Nimotuzumab); Omnitarg (Pertuzumab, 2C4); Osidem® (IDM-1); OvaRex® (B43.13); Nuvion® (visilizumab); Cantuzumab mertansina (huC242-DM1); NeoRecormon® (Epoetina beta); Neumega® (Oprelvekina, Interleuquina-11 Humana); Neulasta® (filgastrim pegilado, G-CSF pegilado, hu-Met-G-CSF pegilado); Neupogen® (Filgrastim, G-CSF, hu-MetG-CSF); Orthoclone OKT3® (Muromonab-CD3, anticuerpo monoclonal anti-CD3), Procrit® (Epoetina alfa); Remicade® (Infliximab, anticuerpo monoclonal anti-TNFa), Reopro® (Abciximab, anticuerpo monoclonal del receptor lIb/Ilia anti-GP), Actemra® (mAb del recpetor anti-II,6), Avastin® (Bevacizumab), HuMax-CD4 (zanolimumab), Rituxan® (Rituximab, mAb anti-CD20); Tarceva® (Erlotinib); Roferon-A®-(Interferón alfa-2a); Simulect® (Basiliximab); Prexige® (lumiracoxib); Synagis® (Palivizumab); 146B7-CHO (anticuerpo anti-IL15, véase U.S.P.N. 7.153.507), Tysabri® (Natalizumab, mAB anti-a4integrina); Valortim® (MDX-1303, mAb del Antígeno Protector antracis anti-B); ABthrax™; Vectibix® (Panitumumab); Xolair® (Omalizumab), ETI211 (mAb anti-MRSA), IL-1 Trap (la porción Fc de IgG1 humana y los dominios extracelulares de los dos componentes del receptor IL-1 (el receptor de Tipo I y la proteína accesoria del receptor)), VEGF Trap (dominios Ig de VEGFR1 condensados a IgG1 Fc), Zenapax® (Daclizumab); Zenapax® (Daclizumab, mAb anti-IL-2Ra), Zevalin® (Ibritumomab tiuxetan), Zetia (ezetimiba), Atacicept (TACI-Ig), anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD80 (galiximab), mAb anti-CD23 (lumiliximab), BR2-Fc (proteína de fusión huBR3 / huFc, antagonist de BAFF soluble); CNTO 148 (Golimumab, mAb anti-TNFa); HGS-ETR1 (Mapatumumab; mAb del Receptor-1 anti-TRAIL humano); HuMax-CD20 (Ocrelizumab, mAb anti-CD20 humano); HuMax-EGFR (zalutumumab); M200 (Volociximab, mAb de integrina anti-a5p1); MDX-010 (Ipilimumab, mAb anti-CTLA-4 y VEGFR-1 (IMC-18F1); mAb anti-BR3; mAbs Toxina A y Toxina B C anti-C. difficile MdX-066 (CDA-1) y MDX-1388); conjugados de dsFv-PE38 anti-CD22 (CAT-3888 y CAT-8015); mAb anti-CD25 (HuMax-TAC); mAb anti-CD3 (NI-0401); Adecatumumab; mAb anti-CD30 (MDX-060); MDX-1333 (anti-IFNAR); mAb anti-CD38 (HuMax CD38); mAb anti-CD40L; mAb anti-Cripto; anti-CTGF Fibrosis Pulmonar Idiopática Fase I de Fibrogen (FG-3019); mAb anti-CTLA4; mAb anti-eotaxina1 (cAt -213); mAb anti-FGF8; mAb GD2 anti-gangliósido; mAb GM2 anti-gangliósido; mAb humano anti-GDF-8 (MYO-029); mAb del Receptor anti-GM-CSF (CAM-3001); mAb anti-HepC (HuMax HepC); mAb anti-IFNa (MEDI-545, MDX-1103); mAb anti-IGF1 R; mAb anti-IGF-1 R (HuMax-Inflam); mAb anti-IL12 (ABT-874); mAb anti-IL12/IL23 (CNTO 1275); mAb anti-IL13 (CAT-354); mAb anti-IL2Ra (HuMax-TAC); mAb del Receptor anti-IL5; mAb de receptores anti-integrina (MDX-018, CNTO 95); mAb de Colitis Ulcerativa anti-IP10 (MDX-1100); anticuerpo anti-LLY; b Ms -66513; mAb del Receptor/hCGp anti-Manosa (MDX-1307); conjugado dsFv-PE38 anti-mesotelina (CAT-5001); mAb anti-PD1 (MDX-1106 (ONO-4538)); anticuerpo anti-PDGFRa (IMC-3G3); mAb anti-TGFp (GC-1008); mAb humano del Receptor-2 anti-TRAIL (HGS-ETR2); mAb anti-TWEAK; mAb anti-vEGFR/Flt-1; mAb anti-ZP3 (HuMax-ZP3); Anticuerpo NVS n° 1; y Anticuerpo NVS n° 2.

Variación de la Secuencia

Proteínas particularmente ejemplares con respecto a todo lo anterior y lo siguiente, pero no de acuerdo con la invención, incluyen las que comprenden una región que es 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 98 % o más o 99 % o más idéntica en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos de referencia de una proteína de unión, como se ilustra arriba, particularmente una proteína de unión farmacéutica, tal como una de GenBank u otra secuencia de referencia de una proteína de referencia.

La identidad a este respecto se puede determinar utilizando una diversidad de software de análisis de secuencias de aminoácidos bien conocidos y fácilmente disponibles. Software ejemplar incluye los que implementan los algoritmos de Smith-Waterman, considerados una solución satisfactoria al problema de buscar y alinear secuencias. También se pueden emplear otros algoritmos, particularmente cuando la velocidad es una consideración importante. Programas comúnmente empleados para el alineamiento y la coincidencia de homología de ADNs, ARNs y polipéptidos que se pueden utilizar a este respecto incluyen FASTA, TFASTA, BLASTN, BLASTP, BLASTX, Tb LASTN, PROSRCH, BLAZE y MPSRCH, siendo este último una implementación del algoritmo de Smith-Waterman para ejecución en procesadores masivamente paralelos fabricados por MasPar.

Los programas BLASTN, BLASTX y BLASTP se encuentran entre programas ejemplares para determinaciones de este tipo, el primero para comparaciones de secuencias de polinucleótidos y los dos últimos para comparaciones de secuencias de polipéptidos; particularmente BLASTX para comparar las secuencias polipeptídicas de los tres marcos de lectura de la secuencia polinucleotídica y BLASTP para una única secuencia polipeptídica.

BLAST proporciona una diversidad de parámetros definibles por el usuario que se configuran antes de implementar una comparación. Algunos de ellos son más fácilmente evidentes que otros en las interfaces gráficas de usuario, como las proporcionadas por NCBI BLAST y otros programas de alineamiento de secuencias a los que se puede acceder en Internet. Las configuraciones y sus valores se establecen y explican en los sitios web de servicios y se explican y establecen con particular detalle en una diversidad de textos fácilmente disponibles, que incluyen, pero no se limitan a BIOINFORMATICS: SEQUENCE AND GENOME ANALYSIS, 2a Ed., David W. Mount, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2004), especialmente los Capítulos 3, 4, 5 y 6 en cuanto a la comparación de secuencias de proteínas y ácidos nucleicos en general y en cuanto a las comparaciones y búsquedas de BLAST en particular; SEQUENCE ANALYSIS IN A NUTSHELL: A GUIDE TO COMMON TOOLS AND DATABASES, Scott Markel y Darryl León, O'Reilly & Associates, Sebastopol, California (2003), especialmente el Capítulo 7 en cuanto a BLAST en particular, particularmente en las partes pertinentes a la comparación de secuencias nucleotídicas y polipeptídicas y para determinar su grado de identidad, similitud, homología y/o similares, especialmente en cuanto a la comparación de una secuencia de ensayo y una secuencia de referencia para calcular un grado (porcentaje) de identidad entre ellas.

La divulgación a este respecto, la relación de secuencias se define como la puntuación de identidad en porcentaje devuelta por una cualquiera de las búsquedas de comparación BLAST antes mencionadas con e = 10 y todos los demás parámetros establecidos en sus valores por defecto en el servidor web del NCBI como se establece. en SEQUENCE ANALYSIS IN A NUTSHELL: A GUIDE TO COMMON TOOLS AND DATABASES, Scott Markel y Darryl León, O'Reilly & Associates, Sebastopol, California (2003), páginas 47-51 que son configuraciones ejemplares de parámetros para comparar secuencias usando BLAST, como los de NCBI BLAST.

Las siguientes referencias proporcionan información adicional sobre comparaciones de secuencias a este respecto y a otros. GUIDE TO HUMAN GENOME COMPUTING, Ed. Martin J. Bishop, Academic Press, Harcourt Brace & Company Publishers, Nueva York (1994), particularmente en las partes pertinentes para determinar la identidad y/o homología de secuencias de aminoácidos o polinucleótidos, especialmente el Capítulo 7. Los programas BLAST se describen en Altschul et al., "Basic Local Alignment Research Tool," J Mol Biol 215: 403-410 (1990). Se proporciona información adicional sobre el análisis de secuencia y las determinaciones de homología e identidad, entre muchas otras referencias bien conocidas y fácilmente disponibles para los expertos en la técnica: NUCLEIC ACID AND PROTEIN SEQUENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH, Eds. M. J. Bishop y C. J. Rawings, IRL Press, Oxford, Reino Unido (1987); PROTEIN STRUCTURE: A PRACTICAL APPROACH, Ed. T. E. Creighton, IRL Press, Oxford, Reino Unido (1989); Doolittle, R. F.: T. E. Creighton, IRL Press, Oxford, Reino Unido (1989); Doolittle, R. F.: 183: 99 110 (1990); Meyers y Miller: "Optimal alignments in linear space" Comput. Applica. in Biosci 4: 11-17 (1988); Needleman y Wunsch: "A general method applicable to the search for similarities in amino acid sequence of two proteins," J Mol Biol 48: 443-453 (1970) y Smith y Waterman "Identification of common molecular subsequences," J Mol Biol 147: 1950 et seq. (1981), particularmente en las partes pertinentes a la comparación de secuencias y determinaciones de identidad y homología.

Aspectos particularmente ejemplares de la divulgación a este respecto, pero no de acuerdo con la invención, tienen del 50 % al 150 % de la actividad de la proteína de referencia antes mencionada, aspectos particularmente muy ejemplares a este respecto tienen del 60 % al 125 % de la actividad de la proteína de referencia, aspectos aún más ejemplares tienen del 75 % al 110 % de la actividad de la proteína de referencia, aspectos todavía más ejemplares tienen del 85 % al 125 % de la actividad de la referencia, aspectos aún más ejemplares tienen del 90 % al 110 % de la actividad de la referencia.

En las formulaciones de la divulgación, la proteína terapéutica puede estar presente en una concentración de al menos 0,1 mg/mL y preferiblemente está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz para una afección de interés. Concentraciones de proteína ejemplares en la formulación pueden variar desde aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 180 mg/mL o desde aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 50 mg/mL, o desde aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 25 mg/mL o, alternativamente, desde aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 10 mg/ mL. La concentración de proteína dependerá del uso final de la formulación acuosa y puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. Concentraciones de proteína particularmente contempladas son al menos aproximadamente 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30.0, 35,0 o 40,0, o hasta aproximadamente 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 80.0, 85,0, 90,0, 95,0, 100,0, 105,0, 110,0, 115,0, 120,0, 125,0, 130,0, 140,0 o 150,0 mg/ mL.

Antioxidantes

"Antioxidantes" son moléculas ricas en electrones que (a) contienen un sistema conjugado de dobles enlaces, (b) comprenden al menos dos dobles enlaces del mismo o diferente tipo (por ejemplo, un doble enlace carbono-carbono o carbono-nitrógeno), (c) no contienen más de 3 anillos (p. ej., 0, 1,2 o 3 anillos) y/o (d) inhiben el daño a una proteína causado por radicales libres. De este modo, los antioxidantes retardan o previenen la oxidación de una proteína terapéutica en una formulación acuosa debido a la exposición a la luz, incluida la luz ultravioleta, visible y/o fluorescente, y/o la exposición a radicales libres generados a partir de otras fuentes, tales como peróxidos, aniones superóxido o iones de metales. Los antioxidantes incluyen moléculas tanto aromáticas como conjugadas. Sin estar sujeto a una teoría de la divulgación, se cree que un mecanismo de acción de los antioxidantes implica la estabilización por resonancia de radicales libres mediante el sistema conjugado de dobles enlaces. La absorción de radiación UV o la reacción con especies reactivas de oxígeno da como resultado la abstracción de un protón del antioxidante y la generación de una especie radical estabilizada. Debido al menor estado de energía libre de esta especie radical en comparación con la que implica especies de oxígeno o aminoácidos proteicos, la reacción posterior se vuelve energéticamente desfavorable y el radical permanece atrapado dentro del anti-oxidante. Como resultado, se pueden inhibir daños tales como la oxidación de proteínas por radicales libres. Los compuestos fenólicos y cualquier compuesto que contenga sistemas conjugados de dobles enlaces permiten la estabilización por resonancia de especies radicales y son antioxidantes eficaces.

Clases ejemplares de antioxidantes de la divulgación incluyen ácido cinámico y derivados del mismo, o ácido benzoico y derivados del mismo, ejemplificados por los compuestos de fórmula (I) o (II), respectivamente:

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en que R1 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-<8>, hidroxi, arilo y Oalquilo C<1>-<8>; R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; y n es un número entero de 0 a 5; y en donde R4 se selecciona del grupo que consiste en alquilo C<1>-<8>, hidroxi, N(R5)<2>, arilo y Oalquilo C<1>-8; R3 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; y m es un número entero de 0 a 5. Los antioxidantes de la invención se seleccionan del grupo que consiste en ácido vainílico, ácido gálico, metil parabeno, m-cresol o fenol y sales o ésteres farmacéuticamente aceptables de los mismos. Con la excepción del ácido vainílico y el ácido gálico, los siguientes antioxidantes no están de acuerdo con la invención. Estos compuestos, adecuados como antioxidantes en las formulaciones descritas en esta memoria incluyen, pero no se limitan a

(ácido cafeico)

(ácido sinápico) y

(acido vainilico) y

Otra clase de antioxidantes son los compuestos aromáticos de fórmula (III):

o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en alquilo C<1>-<8>, hidroxi, N(R5)<2>, arilo, OalquiloC<1>-<8>; CO<2>R5, alquenilo C<2>-<8>, alquenil C<2>-<8>CO<2>R5, arilo, halo, ciano, nitro y sulfato; R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C<1>-<8>; y p es un número entero de 0 a 5. Las fórmulas (I) y (II) quedan abarcadas por la fórmula (III).

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "alquilo" incluye grupos hidrocarbonados de cadena lineal y ramificados que contienen el número indicado de átomos de carbono, tales como metilo, etilo y grupos propilo y butilo de cadena lineal y ramificados. El grupo hidrocarbonado puede contener hasta 8 átomos de carbono. El término "alquilo" también abarca grupos alquilo que están opcionalmente sustituidos con, p. ej., uno o más átomos de halógeno, uno o más grupos hidroxilo, uno o más grupos tiol o uno o más grupos de ácido carboxílico. También quedan abarcados por el término "alquilo" los grupos cicloalquilo. "Cicloalquilo" se define como un grupo hidrocarbonado C<3>-C<8>cíclico, p. ej., ciclopropilo, ciclobutilo, ciclohexilo y ciclopentilo. "Heterocicloalquilo" se define de manera similar a cicloalquilo, excepto que al menos un heteroátomo está presente en la estructura cíclica. Heteroátomos adecuados incluyen N, S y O. El término "alquenilo" se define de manera idéntica a "alquilo", excepto que contiene un doble enlace carbonocarbono.

El término "halo" o "halógeno" se define en esta memoria para incluir flúor, bromo, cloro y yodo.

El término "arilo", solo o en combinación, se define en esta memoria como un grupo aromático monocíclico o policíclico, preferiblemente un grupo aromático monocíclico o bicíclico, p. ej., fenilo o naftilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo "arilo" puede estar sin sustituir o sustituido, por ejemplo, con uno o más y, en particular, uno a tres, halo, alquilo, hidroxi, C(=O)OR, hidroxialquilo, alcoxi, alcoxialquilo, haloalquilo, haloalcoxi, ciano, nitro, amino, alquilamino, acilamino, alquiltio, alquilsulfinilo y alquilsulfonilo. Grupos arilo ejemplares incluyen fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, 2-clorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2-metilfenilo, 4-metoxifenilo, 3-trifluorometilfenilo, 4-nitrofenilo y similares. Los términos "arilalquilo C<1-3>" y "heteroarilalquilo C<1-3>" se definen como un grupo arilo o heteroarilo que tiene un sustituyente alquilo C<1-3>.

El término "heteroarilo" se define en esta memoria como un sistema de anillos monocíclico o bicíclico que contiene uno o dos anillos aromáticos y que contiene al menos un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre en un anillo aromático, y que puede estar sin sustituir o sustituido, por ejemplo, con uno o más y, en particular, uno a tres sustituyentes, tales como halo, alquilo, hidroxi, hidroxialquilo, alcoxi, alcoxialquilo, haloalquilo, nitro, amino, alquilamino, acilamino, alquiltio, alquilsulfinilo y alquilsulfonilo. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen tienilo, furilo, piridilo, oxazolilo, quinolilo, isoquinolilo, indolilo, triazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, imidizolilo, benzotiazolilo, pirazinilo, pirimidinilo, tiazolilo y tiadiazolilo.

El término "hidroxi" se define como -OH.

El término "alcoxi" se define como -OR, en donde R es alquilo.

El término "ciano" se define como -CN.

El término "nitro" se define como -NO<2>.

El término "sulfato" se define como -SO<3>H.

Otras clases de compuestos antioxidantes (incluyendo una sal o éster farmacéuticamente aceptable de los mismos) contemplados para uso en las formulaciones de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, son vitaminas, tales como tiamina o piridoxina.

Aminoácidos o derivados de aminoácidos, p. ej., N-acetil-triptófano y prolina y alfa hidroxiácidos, tales como ácido glicólico, ácido láctico o ácido cítrico, también son antioxidantes adecuados para uso de acuerdo con la divulgación, pero no de acuerdo con la invención. 2.

Compuestos conjugados no aromáticos, tales como el ácido fumárico o el ácido shikímico, también son antioxidantes adecuados para uso de acuerdo con la divulgación, pero no de acuerdo con la invención.

Las nucleobases o análogos químicos o derivados de las mismas, tales como citosina, adenina, timina, uracilo, guanina o sus correspondientes nucleósidos, nucleótidos o desoxinucleótidos son una clase adecuada de antioxidantes para uso de acuerdo con la divulgación, pero no de acuerdo con la invención.

Una gran clase de antioxidantes incluye flavonoles u otros compuestos fitoquímicos que se encuentran en frutas o verduras, tales como catequina, epicatetina o furaneol. Otras categorías de compuestos fitoquímicos incluyen flavonas, flavonoles, flavanoides, flavanonas, isoflavonas y antocianidinas. Compuestos específicos adicionales contemplados incluyen, pero no se limitan a quercetina, galato de epicatequina y galato de epigalocatequina.

Aún otra clase de antioxidantes incluye los utilizados en otras tecnologías de protección contra los rayos UV (p. ej., protectores solares), como sulisobenzona. Otros compuestos de esta clase de antioxidantes incluyen todos los ingredientes activos de protección solar aprobados por la FDA u otras autoridades reguladoras nacionales o regionales, tales como ácido amniobenzoico, avobenzona, cinoxato, dioxibenzona, homosalato, antranilato de mentilo, octocrileno, metoxicinamato de octilo, salicilato de octilo, oxibenzona, padimato, ácido fenilbencimidazol sulfónico, dióxido de titanio, salicilato de trolamina y óxido de zinc.

El antioxidante está presente en las cantidades de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 5.

En aspectos de la divulgación que no están de acuerdo con la invención, en que el antioxidante también puede ser un conservante conocido, tal como, p. ej., ácido benzoico, alcohol bencílico o etilparabeno, la concentración de antioxidante es una concentración no conservante. Con el fin de que los conservantes protejan eficazmente contra el crecimiento microbiano o bacteriano, deben estar presentes en una concentración suficiente. En algunos aspectos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, cuando los compuestos que se han utilizado como conservantes forman parte de las formulaciones acuosas descritas, están presentes en una cantidad inferior a 10 mM; menos de 7 mM; o 5 mM o menos. En algunos aspectos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, cuando el antioxidante es un conservante conocido, la concentración del antioxidante es una concentración no conservante de 0,1 mM a 5 mM. En algunos aspectos específicos de la divulgación, pero no de acuerdo con la invención, el antioxidante comprende alcohol bencílico y/o etil parabeno y tiene una concentración de 0,1 mM a 5 mM.

Típicamente, cuando se utiliza un antioxidante que también tiene propiedades conservantes, éste se utiliza en una concentración inferior (p. ej., al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % menos que) su concentración inhibidora mínima (MIC) conocida. Concentraciones inhibidoras mínimas (MICs) se definen como la concentración más baja de un agente antimicrobiano que inhibirá el crecimiento visible de un microorganismo después de una incubación durante la noche (Andrews, J. Antimicrobial Chemotherapy, 48 (Supl. 1): 5-16 (2001)). Concentraciones bactericidas mínimas (MBCs, por sus siglas en inglés) son la concentración más baja de agente antimicrobiano que impedirá el crecimiento de un organismo después del subcultivo en medios libres de antibióticos. Los laboratorios de diagnóstico utilizan las MICs principalmente para confirmar la resistencia, pero más a menudo como herramienta de investigación para determinar la actividad in vitro de nuevos agentes antimicrobianos, y los datos de estudios de este tipo se han utilizado para determinar los puntos de corte de las MIC. Las determinaciones de MBC se realizan con menos frecuencia y su uso principal se ha reservado para componentes aislados de la sangre de pacientes con endocarditis. Los métodos estandarizados para determinar las MICs y MBCs se describen en Andrews, J. Antimicrobian Chemotherapy, 48 (Supl.

1): 5-16 (2001). El método proporciona información sobre el almacenamiento de polvo antibiótico estándar, preparación de soluciones antibióticas madre, medios, preparación de inóculos, condiciones de incubación y lectura e interpretación de los resultados.

Los valores de MIC son específicos para microorganismos específicos. Por lo tanto, existe una diversidad de MICs para un conservante determinado, dependiendo del microorganismo que se considere. Sin embargo, los conservantes a menudo se añaden en una cantidad que está en una concentración de una de sus MICs más altas, para que sean eficaces contra una amplia diversidad de microorganismos. MICs para conservantes conocidos incluyen las siguientes: ácido benzoico (1,6 mg/mL o 13 mM); metil parabeno (4 mg/mL o 26 mM); etil parabeno (2 mg/mL o 12 mM); m-cresol (1,5 mg/mL o 14 mM); alcohol bencílico (5 mg/mL o 46 mM); fenoxietanol (8,5 mg/mL o 62 mM); propil parabeno (1 mg/mL o 5,5 mM); fenol (0,6 mg/mL o 6,4 mM); butil parabeno (5 mg/mL o 26 mM); y cloruro de benzalconio (0,064 mg/mL o 0,1 mM) (véase Kibbe (ed.),Handbook of Pharmaceutical Excipients,American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000)).

Osmolitos

Formulaciones de la divulgación pueden incluir un osmolito y/o un agente depurador de peróxido. Tal como se utiliza en esta memoria, los "osmolitos" son compuestos orgánicos pequeños sin carga neta. Estos incluyen compuestos de iones híbridos (compuestos que contienen especies cargadas, pero cuya carga total es cero debido a números iguales de cargas positivas y negativas). Ejemplos de osmolitos contemplados para uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a azúcares (p. ej., sacarosa, glucosa, trehalosa, fructosa, xilosa, manitosa, fucosa), polioles (p. ej., glicerol, manitol, sorbitol, glicol, inositol), aminoácidos, incluyendo aminoácidos libres y derivados de los mismos (p. ej., glicina, prolina, valina, leucina, alanina, glutamina, glicina betaína), poliamina o amina y trimetilamino N-óxido (TMAO). Otros osmolitos contemplados incluyen colina, betaína, fosforilcolina, glicerofosforilcolina, creatina, fosfato de creatina, glutamato, aspartato y taurina.

Intervalos ejemplares de concentraciones de osmolitos en una formulación acuosa adecuada para la administración parenteral de la presente divulgación están entre aproximadamente 0,05 M y aproximadamente 3,5 M, aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 3,0 M, o aproximadamente 0,2 M y aproximadamente 2,0 M. También se contemplan concentraciones de osmolitos de aproximadamente 0,35, aproximadamente 0,4, aproximadamente 0,45, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,55, aproximadamente 0,6, aproximadamente 0,65, aproximadamente 0,7, aproximadamente 0,75, aproximadamente 0,8, aproximadamente 0,85, aproximadamente 0,9, aproximadamente 0,95, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,05, aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,15, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,25, aproximadamente 1,3, aproximadamente 1,35, aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,45, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,55, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,65, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,75, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,85, aproximadamente 1,9 y aproximadamente 1,95 M.

Agentes depuradores de peróxido

La expresión "agente depurador de peróxido", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un compuesto capaz de reaccionar con, para eliminar o reducir, radicales peróxido, alquilo, peróxido de alquilo o hidrógeno o mezclas de los mismos. Agentes depuradores de peróxido ejemplares que pueden incluirse en las formulaciones de la divulgación incluyen metionina, N-acetilcisteína, ácido ascórbico, ácido pirúvico o cualquier tiol éter o compuesto de tiol, y otros compuestos de este tipo. Ácido benzoico y sus derivados u otros antioxidantes también pueden funcionar como agentes depuradores de peróxido, además de sus efectos fotoestabilizantes.

intervalos ejemplares de concentraciones de agentes depuradores de peróxido incluyen aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 40 mM, o aproximadamente 1 mM a aproximadamente 30 mM. En algunos casos, el agente depurador de peróxido puede ser superior a 50 mM hasta aproximadamente 250 mM. También se contemplan concentraciones de agentes depuradores de peróxido de aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10, aproximadamente 10,5, aproximadamente 11, aproximadamente 11,5, aproximadamente 12, aproximadamente 12,5, aproximadamente 13, aproximadamente 13,5, aproximadamente 14, aproximadamente 14,5, aproximadamente 15, aproximadamente 15,5, aproximadamente 16, aproximadamente 16,5, aproximadamente 17, aproximadamente 17,5, aproximadamente 18, aproximadamente 18,5, aproximadamente 19, aproximadamente 19,5, aproximadamente 20, aproximadamente 20,5, aproximadamente 21, aproximadamente 21,5, aproximadamente 22, aproximadamente 22,5, aproximadamente 23, aproximadamente 23,5, aproximadamente 24, aproximadamente 24,5, aproximadamente 25, aproximadamente 25,5, aproximadamente 26, aproximadamente 26,5, aproximadamente 27, aproximadamente 27,5, aproximadamente 28, aproximadamente 28,5, aproximadamente 29, aproximadamente 29,5, aproximadamente 30, aproximadamente 30,5, aproximadamente 31, aproximadamente 31,5, aproximadamente 32, aproximadamente 32,5, aproximadamente 33, aproximadamente 33,5, aproximadamente 34, aproximadamente 34,5, aproximadamente 35, aproximadamente 36, aproximadamente 37, aproximadamente 38, aproximadamente 39, aproximadamente 40, aproximadamente 41, aproximadamente 42, aproximadamente 43, aproximadamente 44, aproximadamente 45, aproximadamente 46, aproximadamente 47, aproximadamente 48 y aproximadamente 49 mM.

Evaluación de la estabilidad, incluida la fotoestabilidad

La estabilidad de una formulación farmacéutica a la exposición a la luz u otras fuentes que generen radicales libres se puede evaluar utilizando cualquier medio y cualquier condición de ensayo conocidos en la técnica. Generalmente, un lote de una formulación farmacéutica se prepara y almacena bajo un conjunto específico de condiciones. Las condiciones pueden diseñarse para imitar las condiciones de almacenamiento normales o, alternativamente, pueden ser condiciones de almacenamiento exageradas diseñadas para aumentar la tasa de degradación u oxidación química 0 física de la sustancia farmacológica, también denominadas ensayo acelerado o ensayo de estrés. Luego se analizan muestras de cada uno de los lotes de formulación en diferentes momentos para determinar su estabilidad. Por ejemplo, en condiciones normales de almacenamiento, momentos ejemplares incluyen el tiempo cero, 2 semanas, 1 mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 1 año, 18 meses y/o 2 años. Dependiendo de las condiciones de almacenamiento exageradas, momentos ejemplares podrían incluir la evaluación en el tiempo cero, 0,5 horas, 2 horas y/o 24 horas, o 1 día, 2 días, 7 días y/o 2 semanas. Estudios sobre productos farmacológicos se llevan a cabo de manera secuencial, empezando por testar el producto completamente expuesto y luego progresar según sea necesario hasta el producto en el paquete inmediato y luego al paquete de comercialización.

Condiciones extremas diseñadas para aumentar en gran medida la generación de radicales libres incluyen la exposición a la luz UVA y/o UVB de 4 °C a 25 °C durante 0,5 a 24 horas, o la exposición a una solución de peróxido de hidrógeno al 1 % a 25 °C durante 2 semanas, o la exposición a Fe-EDTA 0,2 mM, H<2>O<2>al 0,3 % y ascorbato 1 mM durante 2 horas o más a 37°C. Alternativamente, las muestras pueden exponerse a una luz que proporcione una iluminación general de no menos de 1,2 millones de lux hora y una energía ultravioleta cercana integrada de no menos de 200 vatios hora/metro cuadrado.

Las directrices de la International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) para el ensayo de fotoestabilidad de una nueva sustancia farmacológica dan recomendaciones sobre las fuentes de luz y los tiempos de exposición que deben ensayarse para garantizar que dicha exposición no resulte en un cambio indeseable. Esta directriz ofrece dos opciones para fuentes de luz. Incluyen (1) cualquier fuente de luz que esté diseñada para producir una salida similar al patrón de emisión D65/ID65, tal como una lámpara fluorescente de luz diurna artificial que combine salidas visibles y ultravioleta, xenón o lámpara de haluro metálico; o (2) la muestra se expone a una lámpara fluorescente blanca fría y a una lámpara ultravioleta cercana. La lámpara fluorescente de color blanco frío está configurada para producir una salida similar a la especificada en la Norma ISO 10977. La lámpara fluorescente cercana a UV tiene una distribución espectral de 320 nm a 400 nm con una emisión de energía máxima entre 350 nm y 370 nm. Una proporción significativa de UV se encuentra en ambas bandas de 320 nm a 360 nm y de 360 nm a 400 nm.

La estabilidad de una proteína terapéutica en una formulación acuosa se puede evaluar de diversas maneras, que incluyen midiendo la degradación, agregación, actividad de la proteína terapéutica en comparación con un patrón, decoloración y/u oxidación de proteínas. A modo de comparación, se puede controlar la misma concentración de proteína en dos formulaciones en presencia y ausencia de antioxidante (u otros componentes) para determinar el efecto beneficioso sobre la estabilidad y la vida útil.

Técnicas para evaluar la degradación varían dependiendo de la identidad de la proteína en la formulación farmacéutica. Técnicas ejemplares incluyen cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)-HPLC para detectar, p. ej., agregación, HPLC de fase inversa (RP, por sus siglas en inglés) para detectar, p. ej., la fragmentación de proteínas, HPLC de intercambio iónico para detectar, p. ej., cambios en la carga de la proteína. espectrometría de masas, espectroscopia de fluorescencia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD, por sus siglas en inglés), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) y espectroscopia Raman para detectar cambios conformacionales de proteínas. La estabilidad se puede evaluar de muchas maneras, incluyendo el seguimiento del cambio conformacional en un intervalo de temperaturas (termoestabilidad) y/o períodos de tiempo (vida útil) y/o después de la exposición a situaciones de manipulación estresantes (p. ej., agitación física). La cantidad de agregación de proteínas se puede medir mediante observación visual de la turbidez, midiendo la absorbancia en una longitud de onda específica, mediante cromatografía de exclusión por tamaño (en la que los agregados de una proteína eluirán en fracciones diferentes en comparación con la proteína en su estado activo nativo), HPLC u otros métodos cromatográficos. Se pueden utilizar otros métodos para medir el cambio conformacional, incluyendo el uso de calorimetría diferencial de barrido (DSC), p. ej., para determinar la temperatura de desnaturalización, o dicroísmo circular (CD), que mide la elipticidad molar de la proteína. También se puede utilizar la fluorescencia para analizar la composición. La fluorescencia abarca la liberación o absorción de energía en forma de luz o calor y cambios en las propiedades polares de la luz. La emisión de fluorescencia puede ser intrínseca a una proteína o puede deberse a una molécula indicadora de fluorescencia. Por ejemplo, ANS es una sonda fluorescente que se une a las bolsas hidrófobas de proteínas parcialmente desplegadas. A medida que aumenta la concentración de proteína desplegada, aumenta el número de bolsas hidrófobas y, posteriormente, aumenta la concentración de ANS que puede unirse. Este aumento en la unión de ANS se puede controlar mediante la detección de la señal de fluorescencia de una muestra de proteína.

La evaluación de la actividad biológica de la proteína terapéutica depende de la proteína y puede medirse mediante ensayos adecuados que los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente. Por ejemplo, para los anticuerpos, la retención de la afinidad o avidez de unión (medida, p. ej., mediante ensayos BIAcore) al antígeno diana específico del anticuerpo es una medida relevante de la actividad biológica. Para proteínas que no son anticuerpos, la retención de la conformación terciaria se puede evaluar mediante la capacidad de unirse a su ligando natural o su receptor natural, o por la capacidad de unirse a anticuerpos que reconocen epítopos importantes para la actividad biológica, o mediante ensayos de actividad biológicos adecuadosin vitrooin vivo.

La decoloración se puede evaluar visualmente o midiendo la absorbancia en una longitud de onda específica. La oxidación de proteínas se puede evaluar mediante mapeo de péptidos.

Un ensayo ejemplar para determinar la estabilidad de una formulación como se describe en esta memoria es exponer la formulación proteica durante 3 horas a luz UVB, utilizando, por ejemplo, una lámpara UV media de 8 vatios que tiene una distribución espectral de 270 nm a 360 nm con una emisión de energía máxima de aproximadamente 302 nm. Otro ejemplo para determinar la estabilidad de una formulación incluye exponer una formulación a luz UV utilizando una lámpara fluorescente a UV cercana que tiene una distribución espectral de 320 nm a 400 nm, con una emisión de energía máxima entre 350 nm y 370 nm. La iluminación global de la formulación debe ser de al menos 1,2 millones de lux hora y una energía UV cercana integrada de al menos 200 vatios hora/m2. Luego, la formulación se somete a cromatografía SEC para determinar el porcentaje de proteína que queda en la formulación. Las formulaciones descritas en esta memoria exhiben típicamente menos del 10 % de degradación después de la exposición a la luz UVB y/o UV, preferiblemente exhiben menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %.

Un protocolo ejemplar para el ensayo de oxidación y peróxido de Met-54 es el siguiente. Se añade peróxido de hidrógeno al 0,6 % a una solución de fosfato de sodio 20 mM que contiene 0,336 m/mL de eritropoyetina (EPO). Después de 24 horas de incubación a temperatura ambiente, se añade 1 gg de la enzima catalasa para inactivar el exceso de peróxido de hidrógeno. Se añaden 10 gL de solución de Tris 1 M, pH 8,0, a 90 gL de solución de EPO, seguido de la adición de 2 gL de una solución de tripsina de 1 mg/mL. Las muestras se incuban durante la noche a temperatura ambiente. Los péptidos se separan utilizando HPLC de fase inversa (RP-HPLC). Los péptidos se identifican mediante espectrometría de masas (LC-MS). El % de oxidación de Met-54 se calcula utilizando las áreas de los picos determinadas mediante la integración del cromatograma UV de RP-HPLC.

Se pueden utilizar otros medios para medir la estabilidad y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Todas estas técnicas se pueden utilizar solas o en combinación para evaluar la degradación de la proteína en la formulación farmacéutica y determinar la estabilidad de la formulación acuosa.

La divulgación también proporciona métodos para seleccionar antioxidantes que estabilizan proteínas contra la oxidación inducida por radicales libres, que comprenden las etapas de proporcionar al menos dos formulaciones candidatas diferentes, cada una de las cuales contiene la misma concentración de proteína terapéutica pero una concentración diferente de antioxidante, exponer las formulaciones candidatas a una fuente que genera radicales libres durante un período de tiempo, y determinar la actividad biológica o la agregación o decoloración u oxidación de la proteína terapéutica dentro de las formulaciones candidatas. Fuentes que generan radicales libres incluyen la luz ultravioleta, la luz visible, la luz fluorescente, la luz diurna artificial (o combinaciones de diversos tipos de luz), peróxido, iones metálicos o contaminantes o lixiviados en excipientes en recipientes de almacenamiento o dispositivos médicos tales como jeringas y similares.

La selección de un antioxidante para uso en una formulación proteica acuosa de la divulgación puede implicar testar antioxidantes candidatos para determinar su solubilidad, compatibilidad y eficacia. Para una proteína o anticuerpo dado, se selecciona una formulación con un valor de pH óptimo que maximice la estabilidad a largo plazo de la proteína. El pH elegido impacta en la selección posterior de antioxidantes eficaces para su inclusión en la formulación. Antioxidantes, tales como los derivados del ácido cinámico y los derivados del ácido benzoico contienen un grupo ácido carboxílico ionizable con un pKa de aproximadamente 4,5. Como resultado, la solubilidad de estos compuestos disminuye a medida que el pH se acerca a 4,5. El pH y la presencia de diferentes relaciones de formas ácidas y básicas del antioxidante también pueden afectar la actividad estabilizadora del antioxidante, así como el color y la apariencia del antioxidante en solución. La concentración de proteína, la sensibilidad de la proteína a la oxidación y la posibilidad de que la proteína tope con luz u otra fuente de radicales libres se consideran para determinar la concentración y potencia de los antioxidantes necesarios para una protección adecuada. A su vez, se pueden hacer ajustes al pH de la formulación para acomodar concentraciones más altas de un antioxidante particular. Los antioxidantes con suficiente solubilidad y falta de color a un pH determinado se testan en un intervalo de concentraciones para determinar el nivel de efectividad así como el efecto sobre la estabilidad de almacenamiento de la proteína.

Recipientes y kits

Las formulaciones farmacéuticas pueden proporcionarse en recipientes, kits y/o sistemas de administración adecuados. Recipientes ejemplares incluyen viales para inyección, ampollas, cartuchos, jeringas precargadas u otros recipientes conocidos en la técnica. Los viales pueden comprender un sello elastomérico perforable para el acceso mediante una aguja, o pueden comprender una tapa o válvula especial adaptada para el acceso sin aguja al contenido mediante una jeringa u otro tubo. Además se describen en esta memoria recipientes de un solo uso que comprenden formulaciones acuosas de la divulgación. Formulaciones acuosas en envases de un solo uso no contienen conservantes, ya que la formulación solo se usa una vez, por lo que no es necesario protegerse contra el crecimiento microbiano o bacteriano. Por lo tanto, para las formulaciones acuosas de un solo uso de la divulgación, se pueden incluir específicamente conservantes conocidos en las clases de antioxidantes utilizados de acuerdo con la divulgación.

Los kits pueden contener un recipiente e instrucciones. Los kits pueden contener dos recipientes, uno de los cuales contiene polvo liofilizado o solución concentrada y el otro contiene una cantidad deseada de agua para inyección u otra solución acuosa para la reconstitución del polvo liofilizado.

Los sistemas de administración incluyen depósitos implantables que contienen formulación farmacológica, cartuchos, jeringas, bombas de infusión u otros sistemas de administración conocidos en la técnica.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, pueden considerarse modos preferidos para su práctica.

EJEMPLOS

Los ejemplos descritos en esta memoria fueron preparados y estudiados para determinar su estabilidad. Se prepararon muestras de diferentes proteínas terapéuticas: eritropoyetina humana recombinante (EPO) (SEQ ID NO: 1), anticuerpo A (un anticuerpo monoclonal IgG1), anticuerpo B (otro anticuerpo monoclonal IgG1, que se une específicamente al interferón<y>humano), y antiestreptavidina (un anticuerpo monoclonal IgG2) - con diferentes antioxidantes y sin antioxidante como control. Los ejemplos relacionados con EPO y antiestreptavidina son solo como referencia.

Para los ejemplos que figuran más adelante, que implican la exposición a radiación UVB, cada una de las muestras se expuso a luz UVB (A = 302 nm) durante tiempos variables, utilizando una lámpara UVP de 8 W modelo UVLMS-38 a 4 °C. Luego, las formulaciones se analizaron utilizando cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía líquida de alta presión (SEC-HPLC). Se midieron la agregación (medida mediante análisis SEC-HPLC) y la unión (medida utilizando chips sensores de oro CM5) para determinar el efecto del antioxidante sobre la agregación y la bioactividad de la proteína terapéutica.

Las condiciones de SEC-HPLC fueron las siguientes: se utilizó una columna TOSOH SWXL G3000 y el caudal se ajustó a 0,5 mL/min. Para la EPO, la fase móvil fue fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 6,9, y cada una de las muestras se analizó durante 80 minutos. Tanto para IgG1 como para IgG2, la fase móvil fue fosfato de sodio 80 mM, perclorato de sodio 300 mM, isopropanol al 10 %, pH 7,2, y cada una de las muestras se analizó durante 45 minutos.

La actividad de unión de la proteína terapéutica a un ligando (p. ej., a un anticuerpo o participante en la unión o, en los casos en los que el componente terapéutico era un anticuerpo, la actividad de unión al antígeno diana específico o a la proteína A) se determinó de la siguiente manera. Cadenas de carboximetil-dextrano en un chip sensor de oro CM5 se activaron con 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida HCl (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) a un caudal de 5 gL/min. Se inyectó el ligando terapéutico de unión a proteínas de interés hasta que se alcanzó el nivel de inmovilización deseado (por encima de 5000 unidades de respuesta). Se midieron tres ligandos de unión a proteínas terapéuticas diferentes - el antígeno diana del anticuerpo A, la proteína A y D11 (un anticuerpo que se une a la eritropoyetina). Para la introducción del antígeno diana del Anticuerpo A en la columna, se introdujo una inyección de 80 gg del antígeno, diluido en acetato de Na 10 mM, pH 4,0; para la Proteína A, se introdujo una inyección de 4 gg de Proteína A, diluida en acetato de Na 10 mM, pH 4,5; para D11, se introdujo una inyección de 1 g de D11, diluido en acetato de Na 10 mM, pH 5,0. Los grupos activados restantes se bloquearon con etanolamina-HCl 1,0 M, pH 8,5.

Se preparó una curva patrón utilizando formas nativas de la proteína terapéutica de interés. Las formas nativas de la proteína terapéutica se diluyeron en tampón HBS-EP (pH 7,4) hasta concentraciones entre 1 y 5 gg/mL y luego se inyectaron en la columna, preparada como se describió anteriormente para obtener una curva patrón. Al final de cada análisis de muestra, se utilizó tampón de regeneración para eliminar por lavado cualquier proteína terapéutica unida en preparación para inyecciones posteriores.

También se diluyeron diversas formulaciones de anticuerpos estresados por UV en tampón HBS-EP (pH 7,4) hasta una concentración dentro de la región de la curva patrón y se inyectaron para cuantificar la pérdida de bioactividad en su respectivo participante de unión al ligando.

EJEMPLO 1: EFECTO DEL DERIVADO DEL ÁCIDO CINÁMICO SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

La actividad de unión de diversas proteínas terapéuticas en formulaciones acuosas que contienen un antioxidante se evaluó como se describe a continuación.

La FIG. 1 muestra la unión del Anticuerpo A, un anticuerpo monoclonal IgG1, a su antígeno diana y a la proteína A. El Anticuerpo A se formuló a pH 5,20 en tampón acetato. La exposición del anticuerpo A a la luz UV de 302 nm provocó una disminución en la unión a ambos ligandos en el transcurso de 24 horas. Esta unión se conservó mediante la adición de antioxidantes ácido clorogénico, ferúlico o cumárico en una concentración de 20 mM.

La FIG. 2 muestra el efecto de la exposición a UV-B sobre otro anticuerpo monoclonal IgG 1, el Anticuerpo B. El Anticuerpo B es el anticuerpo 1119 de la Solicitud de Patente de EE.UU. N° US 2005/0004353, que se une específicamente al interferón gamma humano. La secuencia y las propiedades del anticuerpo 1119 se describen completamente en la Solicitud de Patente de EE.UU. N° US 2005/0004353. El anticuerpo B se formuló a pH 6,90 en tampón fosfato. La pérdida de unión a la proteína A del Anticuerpo B se produjo en la formulación sin antioxidante, pero la adición de ácido clorogénico o ferúlico 20 mM evitó la degradación inducida por UV-B. Sin embargo, la adición de metionina 20 mM (un aditivo no aromático) no pudo evitar esta degradación inducida por UV-B.

La FIG. 3 muestra los resultados de las formulaciones de EPO tras la exposición a la radiación UV-B. La proteína fue expuesta a las mismas condiciones que el Anticuerpo A y el Anticuerpo B durante hasta 24 horas. La integridad de la proteína se evaluó por su capacidad para unirse a un anticuerpo monoclonal inmovilizado que reconoce una parte de su sitio activo. La unión de EPO al mAb D11 se eliminó por completo después de 24 horas de exposición a la luz UV, en ausencia de cualquier antioxidante. Los derivados del ácido cinámico - ácidos ferúlico, clorogénico y cumárico -formulados a 20 mM fueron capaces de preservar significativamente la capacidad del anticuerpo para unirse a D11. La protección proporcionada por estos antioxidantes se extiende a proteínas de menor peso molecular, así como a anticuerpos monoclonales.

EJEMPLO 2: EFECTO DEL DERIVADO DEL ÁCIDO CINÁMICO SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

La agregación de diversas formulaciones de proteínas terapéuticas se evaluó de la manera que se describe a continuación.

La FIG. 4 (EPO), la FIG. 5 (anti-estreptavidina) y la FIG. 6 (Anticuerpo A) muestra cromatogramas SEC-HPLC de cada una de las proteínas después de la exposición a luz UV-B de 302 nm durante 24 horas. Para la FIG. 4, se preparó la formulación de EPO que tenía las siguientes características: 1 mg/mL de EPO, fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM y pH 6,90. Para la FIG. 5, se preparó la formulación anti-estreptavidina que tenía las siguientes características: 1 mg/mL de mAb anti-estreptavidina (IgG2), acetato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 % y pH 5,00. Para la FIG. 6, se preparó la formulación de Anticuerpo A que tenía las siguientes características: 1 mg/mL de Anticuerpo A (IgG1), acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9 % y pH 5,20.

Estas cifras demuestran que la cantidad de agregado para cada formulación de proteína se reduce drásticamente cuando la formulación contiene 20 mM de un derivado del ácido cinámico (ácido clorogénico, ferúlico o cumárico). La agregación de proteínas expuestas a la luz UV ocurre típicamente como resultado de la formación de radicales tirosina que conducen a la reticulación de ditirosina. Varios otros mecanismos de foto-oxidación también pueden conducir a la agregación de proteínas durante la exposición a UV y estas cifras demuestran que los derivados del ácido cinámico pueden inhibir completamente estos mecanismos de agregación. Las tres cifras demuestran que los derivados del ácido cinámico son capaces de inhibir la agregación de una proteína del haz helicoidal glicosilada (EPO, FIG. 4), un anticuerpo monoclonal IgG2 (anti-estreptavidina, FIG. 5) y un anticuerpo monoclonal IgG1 (Anticuerpo A, FIG. 6). Las tres cifras abarcan el intervalo de pH de 5,00-6,90 y la adición de excipientes: cloruro de sodio 125 mM, sorbitol al 5 % y sacarosa al 9 %.

EJEMPLO 3: EFECTO DE CANTIDADES VARIABLES DE DERIVADOS DEL ÁCIDO CINÁMICO SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNIÓN Y LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

La eficacia de cantidades variables de diferentes antioxidantes se evaluó de la manera que se describe a continuación.

La FIG. 7 muestra resultados de SEC-HPLC para formulaciones de EPO con las siguientes características: 0,336 mg/mL de EPO, fosfato de sodio 20 mM y pH 6,90. Se añadieron a la formulación metionina o ácido ferúlico 0,1, 10 y 20 mM. Luego, cada una de las formulaciones se expuso a luz UV-B de 302 nm durante 24 horas. Luego se analizó la formulación de proteínas utilizando SEC-HPLC. Los resultados demostraron que el ácido ferúlico en concentraciones tan bajas como 0,1 mM fue capaz de reducir la cantidad de dímero y agregado de EPO provocado por la exposición a la luz UV. Incluso el ácido ferúlico 0,1 mM fue capaz de prevenir la degradación de la EPO de forma más eficaz que metionina 10 mM.

La FIG. 8 muestra los resultados de unión de anticuerpos para formulaciones de EPO que tienen ácido cumárico 0, 0,10 mM, 10 mM o 20 mM entre 0 y 24 horas de exposición a radiación UV-B. Estos resultados demostraron que el ácido cumárico 0,1 mM fue capaz de preservar la unión de EPO al anticuerpo monoclonal D11 durante al menos 4 horas de exposición a la radiación UV-B.

La FIG. 9 muestra la eficacia de una cantidad de 0,1 mM de antioxidantes para proteger la actividad de unión de EPO a D11. Se prepararon formulaciones que contenían 40 kU/mg de EPO sin antioxidante o con ácido cumárico, ferulílico, sinápico o cafeico 0,1 mM y se expusieron a radiación UV-B durante hasta 24 horas. La actividad de unión de EPO en cada una de las formulaciones se midió en diversos momentos. La FIG. 9 muestra que cada uno de los antioxidantes a 0,1 mM fueron capaces de proteger la EPO de la degradación y preservar su actividad de unión durante la exposición a UV-B.

La FIG. 10 muestra formulaciones de proteínas de 1 mg/mL (FIG. 10, parte superior). El anticuerpo A que tiene concentraciones de ácido cumárico tan bajas como 0,001 mM (1 pM) es eficaz para reducir la cantidad de agregado formado cuando se expone a UV-B durante 30 minutos. La FIG. 10 también muestra que se necesitan concentraciones más altas de ácido cumári

0,01 mM todavía previene la agregación del Anticuerpo A mejor que ningún antioxidante (es decir, control). Las formulaciones que contienen concentraciones más bajas de antioxidantes hidrófobos son ventajosas porque es menos probable que concentraciones más bajas provoquen la desnaturalización de las proteínas, lo que podría conducir a agregación y precipitación a temperaturas más altas.

EJEMPLO 4: EFECTO DE COMBINACIONES DE ANTIOXIDANTE Y OSMOLITO SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Se prepararon las siguientes formulaciones para evaluar la combinación de antioxidante y osmolito para aumentar la estabilidad de una formulación de proteína terapéutica. Trabajos anteriores han demostrado que los osmolitos protegen a las proteínas de la desnaturalización térmica y la agregación provocada por conservantes que son similares en estructura y efecto a los derivados del ácido cinámico.

La FIG. 11 muestra que el glicerol redujo el efecto de los ácidos ferúlico y p-cumárico sobre la agregación de un anticuerpo IgG2 a 52 °C durante 10 días. La anti-estreptavidina se formuló en acetato de sodio 50 mM a pH 5,00. Estas formulaciones no se expusieron a radiación UV, pero se evaluó su estabilidad térmica. Según se observa en la FIG. 11, el ácido ferúlico y el ácido cumárico contribuyeron a la agregación de anti-estreptavidina después de 10 días a 52 °C; la adición de 5 % de glicerol contrarrestó esa agregación térmica.

EJEMPLO 5: EFECTO DEL ANTIOXIDANTE SOBRE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS EXPUESTAS A RADICALES LIBRES GENERADOS A PARTIR DE IONES METÁLICOS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Las proteínas pueden oxidarse mediante una diversidad de otros mecanismos además de la exposición a la luz ultravioleta, incluyendo la generación de radicales hidroxilo mediados por iones metálicos. Con el fin de evaluar la capacidad de los antioxidantes de proteger las proteínas de este tipo de oxidación, se expusieron formulaciones de EPO (336 pg/mL), con y sin ácido ferúlico 5 mM, en HBS a pH 7,0 a oxidación a partir de una solución de 0,2 mM. Fe-EDTA, H<2>O<2>al 0,3 % y ascorbato 1 mM durante 2 horas a 37 °C. La FIG. 12 muestra que el ácido ferúlico fue capaz de proteger a la EPO de este tipo de oxidación catalizada por metales y conservó el 100 % de la actividad de unión de la EPO en comparación con una muestra sin antioxidante que retuvo menos del 20 % de su actividad en las mismas condiciones.

EJEMPLO 6: EFECTO DEL ANTIOXIDANTE SOBRE LA DECOLORACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Las proteínas también pueden volverse de color amarillo después de la exposición a la luz UV. Este amarilleamiento probablemente se debe a la oxidación de los residuos de triptófano en la proteína. Para evaluar la capacidad de diversos antioxidantes para proteger contra este amarilleamiento, se prepararon formulaciones de Anticuerpo A sin antioxidante, metionina 10 mM, ácido ferúlico 10 mM (solo o en presencia de metionina 10 mM), ácido cumárico 10 mM (solo o en presencia de metionina 10 mM) y ácido cumárico 5 mM en presencia de metionina 10 mM. La formulación de control mostró un amarilleamiento significativo después de la exposición a la luz UV-B durante 24 horas, al igual que la formulación de metionina 10 mM. Sin embargo, el resto de las formulaciones, cada una de las cuales contenía un antioxidante, no mostraron un amarilleamiento apreciable después de la exposición a 24 horas de luz UV-B.

EJEMPLO 7: EFECTO DE DERIVADOS DEL ÁCIDO BENZOICO SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

Se evaluaron derivados del ácido benzoico como posibles antioxidantes para formulaciones de proteínas terapéuticas. La FIG. 13 muestra los agregados de SEC-HPLC de diversas formulaciones de Anticuerpo A (5 mg/mL) en acetato de sodio 20 mM a pH 5,00 solo o en presencia de ácido siríngico, vainílico, gálico, protocatéquico o p-hidroxibenzoico 20 mM, tras exposición a radiación UV-B a 4 °C durante 3 horas. Cada uno de los derivados del ácido benzoico fue capaz de disminuir significativamente la cantidad de agregación debida a la radiación, en comparación con la formulación de control. Los ácidos distintos del ácido vanílico y el ácido gálico son solo como referencia.

El ácido P-aminobenzoico (PABA) tiene un efecto antioxidante relativamente potente. El PABA, al igual que la piridoxina, cambia a un color pardo-anaranjado con la luz. El PABA se utiliza comúnmente como aditivo de protección solar, pero se descubrió que provoca una irritación de la piel en algunas personas y desde entonces se ha descontinuado. Sin embargo, su uso en formulaciones parenterales puede ser seguro y ha sido testado en ensayos clínicos para una diversidad de dolencias y, a menudo, se administra a seres humanos en dosis de hasta 12 gramos por día sin toxicidad significativa. Se expusieron formulaciones de Anticuerpo A (1 mg/mL) a pH 5,00 con y sin PABA 20 mM a radiación UV durante 1, 2 o 3 horas y se midió la agregación utilizando SEC-HPLC. PABA pudo reducir significativamente la cantidad de agregación del Anticuerpo A en los tres momentos (FIG. 14).

También se evaluó el efecto del galato de propilo como un antioxidante. Se expusieron formulaciones de Anticuerpo A a pH 5,00 en presencia o ausencia de galato de propilo 10 mM a radiación UV durante 3 horas. Luego se midió la agregación del Anticuerpo A utilizando SEC-HPLC. El galato de propilo fue capaz de reducir significativamente la cantidad de agregación del Anticuerpo A debido a la radiación (FIG. 15). El galato de propilo se utiliza comúnmente como aditivo alimentario y cosmético y figura como ingrediente en la formulación multidosis de terramicina para inyección intramuscular. Su concentración en terramicina figura como 0,02 %, lo que corresponde a una concentración de aproximadamente 1 mM.

EJEMPLO 8: EFECTO DE VITAMINAS SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Se evalúan otros compuestos aromáticos como posibles antioxidantes para formulaciones de proteínas. La FIG. 16 muestra el efecto de añadir tiamina-HCl (5, 10, 20 o 50 mM) a formulaciones de Anticuerpo A (3 mg/mL) expuestas a radiación UV-B durante 4 horas. Concentraciones de tiamina tan bajas como 5 mM fueron capaces de inhibir significativamente la agregación del Anticuerpo A medida por SEC-HPLC. La tiamina también se conoce como vitamina B1 y funciona en los seres humanos como cofactor de las enzimas implicadas en el metabolismo de los hidratos de carbono. Se encuentra en las carnes, así como en el trigo, el salvado de arroz y el pan enriquecido y los cereales. Es menos potente en sus efectos protectores contra UV que los ácidos cinámicos, pero es más soluble que los ácidos cinámicos o los derivados del ácido benzoico y puede tener un efecto menos desnaturalizante sobre la estabilidad térmica de las proteínas. No tiene toxicidad conocida y, aunque no se ha utilizado en formulaciones de proteínas, se utiliza habitualmente mediante inyección intravenosa para tratar la deficiencia de tiamina.

La piridoxina es otra vitamina B (B6) hidrosoluble que se estudió como un posible antioxidante para prevenir la agregación de proteínas provocada por la exposición a UV-B. La FIG. 17 muestra el efecto de la piridoxina añadida (5, 10, 20 o 50 mM) sobre la prevención de la agregación de anticuerpos (Anticuerpo A 30 mg/mL) después de 4 horas de exposición a UV-B. Tanto la piridoxina 20 mM como la piridoxina 50 mM protegieron la proteína de la oxidación y la agregación, pero también provocaron que la formulación pareciera amarilla tras la exposición a la radiación UV. La piridoxina puede ser útil en la formulación de proteínas a pesar de este amarilleamiento. Es muy soluble y comúnmente se administran inyecciones de piridoxina a los seres humanos para corregir las deficiencias, por lo que se espera que no sea tóxico.

EJEMPLO 9: EFECTO DE CONSERVANTES ANTIOXIDANTES SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

Los conservantes se utilizan de forma rutinaria en formulaciones de proteínas parenterales para prevenir el crecimiento microbiano en formulaciones multidosis. Sin embargo, muchos conservantes son aromáticos y pueden actuar como antioxidantes en concentraciones muy inferiores a las que son eficaces para los conservantes. Se prepararon varias formulaciones de Anticuerpo A (1 mg/mL) a pH 5,00 en presencia de alcohol bencílico 5 mM o 1 mM (ejemplo de referencia), metil parabeno, m-cresol o fenol. Las formulaciones se expusieron a radiación UV durante 3 horas y se midió la cantidad de agregación de Anticuerpo A mediante SEC-HPLC. Los resultados se muestran en la FIG. 18 (5 mM) y la FIG. 19 (1 mM). Tanto 1 mM como 5 mM están por debajo de las cantidades de conservante eficaces de cada uno de estos compuestos para actuar como un conservante. Esta concentración está por debajo de la que típicamente se utiliza para todos los conservantes arriba mostrados. Tanto cresol como fenol fueron capaces de disminuir significativamente la cantidad de agregación del anticuerpo A tras la radiación UV.

EJEMPLO 10: EFECTO DE COMPUESTOS CONJUGADOS NO AROMÁTICOS SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Los compuestos que tienen enlaces dobles o triples conjugados pueden ser antioxidantes eficaces. Para testar esto, se prepararon formulaciones de Anticuerpo A (1 mg/mL) a pH 5,00 en presencia y ausencia de ácido fumárico o ácido shikímico 100 mM. Luego, cada una de las formulaciones se expuso a 3 horas de radiación UV y se midió la cantidad de agregación de Anticuerpo A mediante SEC-HPLC. Tanto el ácido fumárico como el ácido shikímico fueron capaces de proteger al Anticuerpo A de la agregación (FIG. 20). Estos compuestos también tienen capacidad tampón en el intervalo de pHs de 4-6 y pueden utilizarse como tampones antioxidantes en formulaciones de proteínas en este intervalo.

EJEMPLO 11: EFECTO DE NUCELOBASES SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Citosina es una base de pirimidina y es uno de los cuatro componentes principales del ADN. La FIG. 21 muestra que es capaz de prevenir la agregación de formulaciones de Anticuerpo A (1 mg/mL) a pH 5,00 tras exposición a 1,2 o 3 horas de radiación UV.

También se ensayan otras bases de pirimidina o purina, tales como adenina, timina, uracilo o guanina o sus correspondientes nucleósidos y nucleótidos y desoxinucleótidos.

EJEMPLO 12: EFECTO DE LOS AMINOÁCIDOS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

También se midió la capacidad protectora de diversos aminoácidos.

Se prepararon formulaciones de triptófano, prolina o metionina. La FIG. 22 muestra la actividad de formulaciones de 40 kU/mL de EPO a pH 6,90 con o sin N-acetil-triptófano racémico 20 mM después de la exposición a radiación UV de 0 a 24 horas. La actividad de EPO se preservó de la degradación por UV-B en presencia de N-acetil-triptófano. El N-acetil triptófano es más soluble que el triptófano libre y se utiliza en formulaciones parenterales de albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés).

La prolina es un aminoácido que se sabe que posee oxígeno singlete y capacidad de depuración de radicales libres debido a las propiedades de su anillo de pirrolidina. La agregación de formulaciones de Anticuerpo A (1 mg/mL) a pH 5,00 en presencia o ausencia de prolina 200 mM después de la exposición a radiación UV durante 15 minutos demostró que la prolina tenía un efecto débil en la protección de un anticuerpo monoclonal de la degradación inducida por UV-B (FIG. 23). Sin embargo, se observó un efecto más fuerte en la prevención de la agregación de anticuerpos provocada por la exposición al peróxido cuando se midió la agregación de Anticuerpo A después de la exposición a H<2>O<2>al 1 % después de 2 semanas en presencia o ausencia de prolina 400 mM (FIG. 24).

La metionina ha sido estudiada previamente y es bien conocida por sus efectos protectores en la prevención de la oxidación de proteínas bajo diversas condiciones, no se había informado previamente sobre su inclusión en formulaciones de proteínas en combinación con antioxidantes. Las formulaciones que contienen metionina y un antioxidante protegen la proteína terapéutica tanto frente a la oxidación del peróxido como a la oxidación por radiación UV. Formulaciones de EPO con metionina 10 mM, ácido fólico o ácido ferúlico se expusieron a H<2>O<2>al 0,06 % durante 24 horas a temperatura ambiente. Se midió la cantidad de oxidación de Met-54 y se encontró que metionina 10 mM fue capaz de reducir la cantidad de oxidación de EPO frente a la del control o cualquiera de las otras dos formulaciones (FIG. 25)

EJEMPLO 13: EFECTO DE ALFA-HIDROXIÁCIDOS SOBRE LA AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Los alfa-hidroxiácidos también han sido identificados como antioxidantes. Se prepararon formulaciones de Anticuerpo A (1 mg/mL) a pH 4,50 en presencia de ácido glicólico o ácido láctico 100 mM o a pH 5,00 con ácido cítrico. Las formulaciones se expusieron luego a radiación UV durante 1 h y se midió la agregación de Anticuerpo A utilizando SEC-HPLC (FIG. 26). Estos compuestos son altamente solubles a pH 4-5, lo que no ocurre con muchos de los ácidos fenólicos. El ácido glicólico es el más eficaz en la protección contra UV-B, mientras que el ácido cítrico es bastante débil.

EJEMPLO 14: EFECTO DE FLAVONOLES Y OTROS PRODUCTOS FITOQUÍMICOS SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

La catequina y la epicatequina son estereoisómeros que se encuentran en el té verde. Se cree que son en gran medida responsables de la alta capacidad antioxidante del té verde. Son miembros de la clase de compuestos denominados flavonoles que se distribuyen ampliamente en las plantas y son conocidos por sus propiedades antioxidantes. Su desventaja para la formulación de proteínas es la solubilidad limitada. Se midió su capacidad para preservar la unión de EPO-D11 tras la exposición a la radiación UV. Se prepararon formulaciones de EPO (40 kU/mL), fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM y Tween-80 al 0,005 % a pH 6,90 en presencia o ausencia de catequina 20 mM. Después de exposición a radiación UV de 0-8 horas, se midió el porcentaje de unión de EPO a D11 (FIG. 27) y la catequina fue capaz de preservar la unión de EPO.

Furaneol es el compuesto que da sabor y aroma a las fresas. Está presente en otras frutas, así como en cantidades más bajas y se añade a alimentos y bebidas como saborizante natural y artificial. La FIG. 28 muestra que una formulación de furaneol 100 mM en una formulación de EPO 40 kU/mL, fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM y Tween-80 al 0,005 % a pH 6,90 es capaz de proteger la unión de EPO a D11 después de la exposición durante 0-8 horas de radiación UV a 4 °C.

EJEMPLO 15: EFECTO DE SULISOBENZONA SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS (UN EJEMPLO DE REFERENCIA)

Sulisobenzona es un componente de muchos protectores solares. La FIG. 29 muestra que una formulación de sulisobenzona 5 mM con 40 kU/mL de EPO, fosfato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 125 mM y Tween-80 al 0,005 % a pH 6,90 es capaz de proteger la unión de EPO a D11 después de la exposición durante 0-8 horas de radiación UV a 4 °C.

El uso de los términos "un" y "una" y "el/la", y referencias similares, en el contexto de describir la descripción (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique aquí de otro modo o se contradiga claramente por el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye, pero no se limita a"), a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en esta memoria simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada uno de los valores separados que caen dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en esta memoria, y cada uno de los valores separados se incorpora en la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en esta memoria. Todos los métodos descritos en esta memoria se pueden realizar en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario aquí o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") que se proporciona en esta memoria, tiene como intención ilustrar mejor la descripción, y no representa una limitación en el alcance de la descripción, a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como una indicación de cualquier elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la divulgación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación acuosa adecuada para la administración parenteral que comprende un anticuerpo IgG1 y una concentración estabilizante de un antioxidante, en donde el antioxidante:

2. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde cuando el antioxidante es metil parabeno, m-cresol o fenol, y la concentración del antioxidante es de 0,0001 a 0,005 mM, de 0,0005 a 0,002 mM, de 0,001 a 0,01 mM o de 0,001 a 0,1 mM.

3. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el antioxidante es ácido vainílico o ácido gálico, una sal o éster farmacéuticamente aceptable de los mismos o una mezcla de los mismos, y el antioxidante está presente en la formulación acuosa a una concentración de 0,1 mM a 20 mM.

4. La formulación acuosa de la reivindicación 1, que comprende, además, un osmolito.

5. Uso de un antioxidante para estabilizar una formulación acuosa adecuada para administración parenteral que comprende un anticuerpo IgG1, en donde el antioxidante:

6. El uso de la reivindicación 5, en donde cuando el antioxidante es metil parabeno, m-cresol o fenol, y la concentración estabilizante del antioxidante es de 0,0001 a 0,005 mM, de 0,0005 a 0,002 mM, de 0,001 a 0,01 mM o de 0,001 a 0,1 mM.

7. El uso de la reivindicación 5, en donde el antioxidante es ácido vainílico o ácido gálico, una sal o éster farmacéuticamente aceptable de los mismos o una mezcla de los mismos, y el antioxidante está presente en la formulación acuosa a una concentración de 0,1 mM a 20 mM.

8. El uso de la reivindicación 5, en el que la formulación comprende, además, un osmolito.