NO345593B1

NO345593B1 - Humane anti-B7RP1 nøytraliserende antistoffer

Info

Publication number: NO345593B1
Application number: NO20080302A
Authority: NO
Inventors: Haichun Huang; Gerald Siu; Wenyan Shen; Steven Kiyoshi Yoshinaga
Original assignee: Amgen Inc; Squibb & Sons Llc
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2021-05-03
Also published as: HRP20160875T1; US20080166352A1; CA2614972C; IL218888A0; EP2388277A2; PL1915398T3; HK1120049A1; WO2007011941A9; ZA200801137B; RS54984B1; AU2006270009A1; NO20080302L; CN101321783B; CN101321783A; UA102667C2; EP1915398A2; EP2388276A2; CA2854576A1; KR20080049014A; IL188642A0

Description

Humane anti-B7RP1 nøytraliserende antistoffer

Foreliggende søknad krever prioritet fra U.S. provisional patent application, Serial nr. 60/700,265, innlevert 18. juli, 2005, idet beskrivelsen i denne er uttrykkelig inntatt her ved referanse.

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Oppfinnelsen angår humane monoklonale antistoffer som binder B7-relatert protein-1 (B7RP1). Sammensetninger og fremgangsmåter for behandling av sykdommer og lidelser relatert til immunsuppresjon og immunaktivering er også beskrevet.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

T-celler initierer immunresponsen, medierer antigen-spesifikke effektorfunksjoner og regulerer aktiviteten av andre leukocytter ved å utskille cytokiner. For dannelse av en passende T-lymfocytt (T-celle) immunrespons, må to signaler gis til T-cellen ved antigenpresenterende celler (APC). Antigen må presenteres for T-cellereseptoren (TCR) gjennom et major histocompatibility complex (MHC), i en hendelse som bestemmer spesifisitet. T-celler kan kun gjenkjenne antigen presentert på en APC. I tillegg til antigereseptoren, krever riktig T-celleaktivering også interaksjon av andre celleoverflatemolekyler på både T-cellen og APC. Disse molekylene, referert til som kostimulerende molekyler, består av en reseptor på den responderende cellen og en ligand til stede på inducer-cellen. Dette antigen-uavhengige, kostimulerende signalet må leveres ved engasjement av medlemmer av B7-familien på APC med deres reseptorer på T-celler. En produktiv immunrespons fører til proliferasjon, differensiering, klonal ekspansjon og effektorfunksjon. I fravær av det andre, kostimulerende signalet, gjennomgår T-celler en tilstand av langvarig antigenspesifikk uimottagelighet, betegnet anergi. Fase II kliniske forsøk har vist at blokkering av én kostimuleringreaksjonsvei er effektiv ved behandling av psoriasis (Abrams et al., 2000, J Exp Med. 192:681-94; Abrams et al., 1999, J. Clin. Invest. 103:1243-52) og revmatoid artritt (Kremer et al., 2003, New England Journal of Medicine 349:1907-15), hvilket indikerer at denne generelle strategien er et godt mål for immunmodulerende behandling.

Et spesielt kostimulerende B7-molekyl, B7-relatert protein-1 (B7RP1), er et type 1 transmembranprotein med en signalsekvens og ekstracellulært domene ved den aminoterminale enden, et ekstracellulært domene omfattende to Igløkker, et transmembrandomene og et karboksyterminalt intracellulært domene (PCT-søknad publikasjon nr. WO 00/46240). B7RP1 binder foretrukket til ICOS (som står for “induserbar costimulator”; Yoshinga et al., 2000, Int. Immun.

12:1439-1447) uttrykt på celleoverflaten av T-celler. ICOS spiller en viktig rolle ved produksjon av både type 1 og type 2 cytokiner ved aktiverte T-celler (Coyle et al., 2000, Immunity 13:95-105).

WO 02/44364 beskriver to typer anti-B7RP1-antistoffer: kanin anti-mus B7RP1 polyklonale antistoffer og rotte anti-mus B7RP1 monoklonale antistoffer. Inhibering av T-celleproliferasjon in vitro ble rapport ved anvendelse av kaninpolyklonale antistoffer (se side 17 linje 11 av WO 02/44364). EP 1374902 beskriver antistoffer mot et molekyl identifisert deri som AILIM, som også er kalt for ICOS og 8F4. EP 1374902 uttaler at disse antistoffene ble oppdaget å signifikant undertrykke begynnelsen av inflammatoriske tarmsykdommer slik som Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.

B7RP1 er den eneste liganden uttrykt konstitutivt på APC’er (Yoshinaga et al., 1999, Nature. 402:827-32), mens ICOS blir uttrykt kun på aktiverte T-celler (McAdam et al., 2000, Journal of Immunology 165:5035-40). B7RP1-avhengig signalering er nødvendig for aktivering av effektor (dvs. fullstendig aktivert) T-cellen, så vel som dens modning fra dens naïve forløper (Dong et al., 2003, Journal of Autoimmunity. 21:255-60; Coyle et al., 2000, Immunity. 13:95-105). Følgelig er B7RP1/ICOS-interaksjonen nødvendig for riktige T-celle-avhengige hukommelses (”recall”) immunresponser (Dong et al., 2003, Journal of Autoimmunity. 21:255-60).

Aktuelle forsøk på å interferere med den kostimulerende T-celle reaksjonsveien har fokusert primært på kostimulerende polypeptider som blokkerer T-celleaktivering kun, men har ikke fokusert på aktivering og modning.

Følgelig gir disse behandlingene generell hemming av T-cellefunksjon. I motsetning gir blokkering av B7RP1/ICOS-interaksjonen en mer spesifikk hemming av T-cellefunksjon ved å påvirke kun modne effektor T-celler. Følgelig er blokkering av B7RP1/ICOS-interaksjonen i en klinisk setting svært ønskelig fordi det ville gi en mer begrenset bivirkningsprofil enn kostimulerings terapier som blokkerer kun naïv T-celleaktivering.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen tilveiebringer monoklonale antistoffer som binder til B7-relatert protein-1 (B7RP1). I én utførelsesform er de monoklonale antistoffene humane monoklonale antistoffer som nøytraliserer biologiske aktiviteter av B7RP1 og er spesielt anvendelige for å hemme delvis eller fullstendig den immun costimulerende aktiviteten av B7RP1. Oppfinnelsen tilveiebringer også celler, spesielt hybridomceller som produserer de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen. I bestemte aspekter binder antistoffene ifølge oppfinnelsen spesifikt til H eller D-regionen av B7RP1 som beskrevet her.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre fusjonsproteiner omfattende sekvensen av en antistoff Fc-region og én eller flere sekvenser identifisert som SEKV ID NR: 1 til og med SEKV ID NR. 40. Slike molekyler kan fremstilles ved anvendelse av metoder som beskrevet, for eksempel, i internasjonal patentsøknad, Publikasjon nr. WO 00/24782, som herved inntas ved referanse. Slike molekyler kan uttrykkes, for eksempel, i pattedyrceller (f.eks. ovarieceller fra kinesisk hamster) eller bakterieceller (f.eks. E. coli-celler).

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer omfattende en tung kjede og en lett kjede, hvor den tunge kjeden omfatter en tung kjede konstant region valgt fra IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA og IgE tung kjede konstante regioner eller hvilken som helst allelisk variasjon derav (som beskrevet i Kabat et al., 1991, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Femte Utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikasjon nr. 91-3242), inntatt her ved referanse, og den variable regionen av den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 7 til og med SEKV ID NR. 14 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav. Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter enten en aminosyresekvens av IgG2 tung kjede konstant region som angitt i SEKV ID NR: 41 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, eller en aminosyresekvens av IgG1 tung kjede konstant region som angitt i SEKV ID NR: 42 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav. I visse utførelsesformer er antistoffene monoklonale antistoffer, humane antistoffer eller foretrukket humane monoklonale antistoffer.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer omfattende en tung kjede og en lett kjede, hvor den lette kjeden omfatter en konstant region som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 43 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav, og den lette kjede variable regionen omfatter en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 1 til og med SEKV ID NR. 6 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav. I visse utførelsesformer er antistoffene monoklonale antistoffer, humane antistoffer eller foretrukket humane monoklonale antistoffer.

I visse aspekter omfatter antistoffer ifølge oppfinnelsen en tung kjede og en lett kjede, hvor den variable regionen av den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 7 eller SEKV ID NR: 8 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav. I andre aspekter omfatter den lette kjede variable regionen en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 1 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

I andre aspekter omfatter antistoffer ifølge oppfinnelsen en tung kjede og en lett kjede, hvor den variable regionen av den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 9 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav. I andre aspekter omfatter den lette kjede variable regionen en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 2 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

I ytterligere aspekter omfatter den tunge kjeden minst én komplementaritetsbestemmende region (CDR) som har en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 27 til og med SEKV ID NR.40 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav. I enda ytterligere aspekter omfatter den lette kjeden minst én CDR som har en aminosyresekvens som angitt i hvilken som helst av SEKV ID NR: 15 til og med SEKV ID NR. 26 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som binder spesifikt til B7RP1, hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 7 eller SEKV ID NR: 8 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav og den lette kjeden omfatter en variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 1 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer som binder spesifikt til B7RP1, hvor den tunge kjeden omfatter en variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 9 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav, og den lette kjeden omfatter en variabel region omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 2 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen også antistoffer, omfattende en tung kjede og en lett kjede, hvor den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og hvor den tunge kjede variable regionen omfatter en sekvens som har minst ca. 75%, minst ca. 80%, minst ca. 85%, minst ca.90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, eller minst ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i hvilke som helst av SEKV ID NR: 7 til og med SEKV ID NR.14 og hvor den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, og hvor den lette kjede variable regionen omfatter en sekvens som har minst ca.

80%, minst ca.85%, minst ca.90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller minst ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i hvilke som helst av SEKV ID NR: 1 til og med SEKV ID NR.6, hvor antistoffet binder spesifikt til B7RP1.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som binder spesifikt til B7RP1, hvor den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 44 eller SEKV ID NR: 46 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 45 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som binder spesifikt til B7RP1, hvor den tunge kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 47 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav og den lette kjeden omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 48 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

I visse aspekter tilveiebringer oppfinnelsen antistoffer, omfattende en tung kjede og en lett kjede, hvor den tunge kjeden omfatter en tung kjede variabel region, og hvor den tunge kjede variable regionen omfatter minst én CDR som har en sekvens som har minst ca. 75%, minst ca. 80%, minst ca. 85%, minst ca.

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller minst ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i hvilke som helst av SEKV ID NR: 27 til og med SEKV ID NR. 40, og hvor den lette kjeden omfatter en lett kjede variabel region, og hvor den lette kjede variable regionen omfatter minst én CDR som har en aminosyresekvens som har som misnt ca. 80%, minst ca. 85%, minst ca.

90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, eller minst ca. 99% identitet med aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 15 til og med SEKV ID NR.

26, hvor antistoffet binder spesifikt til B7RP1.

Oppfinnelsen tilveiebringer også enkeltkjede antistoffer, enkeltkjede Fvantistoffer, F(ab)-antistoffer, F(ab)’-antistoffer og (Fab’)2-antistoffer.

I bestemte aspekter tilveiebringer oppfinnelsen en lett kjede omfattende en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 15 til og med SEKV ID NR. 26 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en tung kjede omfattende en aminosyresekvens som angitt i hvilke som helst av SEKV ID NR: 27 til og med SEKV ID NR. 40 eller et antigen-bindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

Oppfinnelsen angår også isolerte humane antistoffer som spesifikt binder B7RP1, hvor antistoffet omfatter: (a) human tung kjede struktur (”framework”)-regioner, en human tung kjede CDR1-region, en human tung kjede CDR2-region og en human tung kjede CDR3-region; og (b) human lett kjede struktur (”framework”)-regioner, en human lett kjede CDR1-region, en human lett kjede CDR2-region og en human lett kjede CDR3-region. I visse aspekter kan den humane tung kjede CDR1-regionen være tung kjede CDR1-regionen som vist i hvilke som helst av SEKV ID NR: 27, 30 eller 35 og den humane lett kjede CDR1-regionen kan være lett kjede CDR1-regionen vist i hvilke som helst av SEKV ID NR: 15, 18 eller 24. I andre aspekter kan den humane tung kjede CDR2-regionen være tung kjede CDR2-regionen som vist i hvilke som helst av SEKV ID NR: 28, 31, 33, 36 eller 39 og den humane lett kjede CDR2-regionen kan være lett kjede CDR2 som vist i hvilke som helst av SEKV ID NR: 16, 19 eller 21. I enda andre aspekter er den humane tung kjede CDR3-regionen tung kjede CDR3-regionen som vist i hvilke som helst av SEKV ID NR: 29, 32, 34, 37, 38 eller 40 og den humane lett kjede CDR3-regionen er lette kjede CDR3-regionen som vist i hvilke som helst av SEKV ID NR: 17, 20, 22, 23, 25 eller 26.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er karakterisert ved evnen til å binde spesifikt til B7RP1. Videre har antistoffer ifølge oppfinnelsen evne til å antagonisere minst én in vitro og/eller in vivo-aktivitet forbundet med B7RP1 polypeptider. Oppfinnelsen tilveiebringer isolerte anti-humane B7RP1 humane antistoffer med høyaffinitets binding til B7RP1-polypeptider, hvor antistoffene binder til et humant B7RP1-polypeptid og dissosierer fra det humane B7RP1-polypeptidet med en dissosiasjonskonstant (KD) på ca.10<-6 >M, 10<-7 >M, 10<-8 >M, 10<-9 >M, 10<-10 >M, 10<-11 >M, 10<-12 >M eller mindre, som bestemt ved anvendelse av KinExA, eller som hemmer B7RP1-indusert overlevelse i et in vitro nøytraliseringsforsøk med en EC50 på ca. 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9M, 10-10 M, 10-11M, 10-12 M eller mindre.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte humane antistoffer eller et antigenbindende eller immunologisk funksjonelle immunglobulin-fragmenter derav som binder spesifikt til B7RP1, hvor antistoffene eller fragmentene omfatter en tung kjede variabel region omfattende en tung kjede CDR1, CDR2 og CDR3, hvor:

a) tung kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 27, den tunge kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 28 og tung kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 29;

b) den tunge kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 30, tung kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 31 og tung kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 32;

c) den tunge kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 27, tung kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 33 og tung kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 34;

d) tung kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 35, tung kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 36 og tung kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 37;

e) tung kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 27, tung kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 33 og tung kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 38; eller

f) tung kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 35, tung kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 39 og tung kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 40.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et isolert humant antistoff eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav som binder spesifikt til B7RP1, hvor antistoffet eller fragmentet omfatter en lett kjede variabel region omfattende en lett kjede CDR1, CDR2 og CDR3, hvor:

a) den lette kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 15, lett kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 16 og lett kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 17;

b) den lette kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 18, lett kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 19 og lett kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 20;

c) lett kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 15, lett kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 21 og lett kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 22;

d) lett kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 18, lett kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 19 og lett kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 23;

e) den lette kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 24, lett kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 16 og lett kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 25; eller

f) den lette kjede CDR1 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 24, lett kjede CDR2 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 16 og lett kjede CDR 3 har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 26.

Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer som konkurrerer med binding av antistoffene beskrevet her til B7RP1. I visse aspekter konkurrerer et kompetitivt antistoff ifølge oppfinnelsen med binding av et antistoff som omfatter hvilke som helst av SEKV ID NR: 1-40 til human B7RP1.

Også del av oppfinnelsen er polynukleotidsekvenser som koder for antihumane B7RP1 humane antistoffer, vektorer omfattende polynukleotidsekvensene som koder for anti-humane B7RP1 humane antistoffer, vertsceller transformert med vektorer som omfatter polynukleotider som koder for anti-humane B7RP1 humane antistoffer, formuleringer omfattende anti-humane B7RP1 humane antistoffer og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av de samme.

Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å detektere B7RP1 i en biologisk prøve, omfattende trinnet med å bringe prøven i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen eller antigen-bindende fragment derav. Et anti-B7RP1 antistoff ifølge oppfinnelsen kan anvendes i hvilken som helst kjent analysemetode, slik som kompetitiv bindings-analyse, direkte og indirekte sandwich-assays, immunpresipitering analyse og enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) (Se, Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, s. 147-158, CRC Press, Inc.) for deteksjonen og kvantifisering av B7RP1. Antistoffene kan binde B7RP1 med en affinitet som er passende for analysemetoden som anvendes.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for behandling av en sykdom forbundet med økt produksjon av B7RP1, økt sensitivitet for B7RP1 og/eller sykdommer relatert til kontroll av T-celle-responser, omfattende trinnet med å administrere en farmasøytisk effektiv mengde av en farmasøytisk sammensetning omfattende minst ett antistoff ifølge oppfinnelsen eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav til et individ med behov for dette.

Utførelsesformer ifølge oppfinnelsen vil tydelig fremgå fra den følgende detaljerte beskrivelsen og kravene.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1A viser sekvensen av 16H antistoff variabel region (SEKV ID NR: 7) og den korresponderende 16H variabel region kjønnscelle (16Hg)-sekvensen (SEKV ID NR: 8).

Figur 1B viser resultater av kostimulerings-forsøk ved anvendelse av anti-CD3 og hB7RP1-Fc fusjonsprotein som demonstrerer at 16Hg beholder dens biologiske aktiviteter sammenlignet med 16H.

Figur 2 viser resultatene av Biacore<® >bindingsforsøk med 16H, 16Hg og 5D antistoffer.

Figur 3 viser resultatene av KinExA bindingsforsøk med 5D antistoff.

Figur 4 viser resultatene av KinExA bindingsforsøk med 2H antistoff.

Figur 5 viser resultatene av KinExA bindingsforsøk med 2H kjønnscelle (2Hg) antistoff.

Figur 6 viser resultatene av bindings konkurranseforsøk som viser at 16H antistoff utkonkurrerer binding av ICOS-Fc på B7RP-1, analysert ved strømningscytometri.

Figur 7 viser en oppsummering av en B7RP-1 enkeltnukleotid polymorfisme (SNP) analyse.

Figur 8 viser en oppsummering av analysen av et sett av anti-humane B7RP-1 monoklonale antistoffer i ELISA konkurranseforsøk. Verdier vist er IC50s for hemming av binding av et ICOS-Fc-fusjonsprotein.

Figur 9A viser fluorescerende merking av B7RP1 ekstracellulært domene (ECD) med merkede 16H, 5D og ICOS antistoffer.

Figur 9B viser lignende bindingseffektivitet for 16H og 5D antistoffer til en B7RP1 SNP-variant.

Figur 9C viser resultatene av kostimulerings-forsøk med 16H eller 5D antistoffer og SNP-varianter.

Figur 10A viser resultater av plate kostimuleringsforsøk med 1B7v2 monoklonale antistoffer sammenlignet med flere forskjellige anti-murine B7RP-1 monoklonale antistoffer.

Figurene 10B, 10C og 10D viser resultatene av antigen provokasjon-forsøk, analysert for antigen-spesifikt serum IgM (Figur 10B), IgG2a (Figur 10C) og IgG1 (Figur 10D).

Figur 11 viser ELISA-resultater som viser at serum IL-5-nivåer blir undertrykt av 1B7v2-antistoffer.

Figur 12A viser at 16H antistoffer kan binde til cynomolgusape B7RP1 (høyre panel) og humane B7RP1 (venstre panel).

Figur 12B viser at 16H, 16Hg og 5D antistoffer kan hemme cynomolgusape B7RP1/ICOS-avhengig T-celleaktivering.

Figur 13A viser individuelle cynomolgusape og gruppe gjennomsnittlige titer-verdier ved dag 53 og dag 57 etter sekundær provokasjon med tetanustoksoid ved dag 42 i dyr behandlet med 16H antistoffer.

Figur 13B viser individuelle cynomolgusape og gruppe gjennomsnittlige titer-verdier ved dag 53 og dag 57 etter sekundær provokasjon med tetanustoksoid ved dag 42 i dyr behandlet med 5D antistoffer.

DETALJERT BESKRIVELSE AV VISSE UTFØRELSESFORMER

Overskriftene på avsnittene anvendt her er kun for organiseringsmessige formål og skal ikke oppfattes som begrensende for innholdet som er beskrevet. Alle referanser omtalt i foreliggende søknad er uttrykkelig inntatt ved referanse her for hvilket som helst formål.

Definisjoner

Konvensjonelle teknikker kan anvendes for rekombinant DNA, oligonukleotidsyntese og vevskultur og transformasjon (f.eks., elektroporering, lipofeksjon). Enzymatiske reaksjoner og renseteknikker kan utføres i henhold til produsenters spesifikasjoner eller som vanlig utført på området eller som beskrevet her. De foregående teknikkene og fremgangsmåtene kan generelt utføres i henhold til metoder velkjent på området og som beskrevet i forskjellige generelle og mer spesifikk referanser som er angitt og beskrevet gjennom hele foreliggende spesifikasjon. Se f.eks., Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., som er inntatt her ved referanse for hvilket som helst formål. Medmindre spesifikke definisjoner er gitt, er nomenklaturen anvendt i forbindelse med, og laboratorie-metodene og teknikkene for, analytisk kjemi, syntetisk organisk kjemi og medisinsk og farmasøytisk kjemi beskrevet her de som er velkjent og vanlig anvendt på området. Tilsvarende kan konvensjonelle teknikker anvendes for kjemiske synteser, kjemiske analyser, farmasøytisk fremstilling, formulering og levering og behandling av pasienter.

Som anvendt i henhold til foreliggende beskrivelse, skal de følgende betegnelsene, hvis ikke annet er angitt, forstås å ha de følgende betydningene. Uttrykkene “biologisk egenskap”, “biologisk trekk” og betegnelsen “aktivitet” i referanse til et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse blir anvendt om hverandre her og omfatter, men er ikke begrenset til, epitop-affinitet og spesifisitet (f.eks., anti-human B7RP1 humant antistoff binding til human B7RP1), evne til å antagonisere aktiviteten av det målrettede polypeptidet (f.eks., B7RP1-aktivitet), in vivo-stabiliteten av antistoffet og de immunogene egenskapene av antistoffet. Andre identifiserbare biologiske egenskaper eller karakteristika for et antistoff kjent på området omfatter for eksempel kryssreaktivitet, (dvs., med ikke-humane homologer av B7RP1 eller med andre proteiner eller vev, generelt) og evne til å opprettholde høye ekspresjonsnivåer av protein i mammalske celler. Ovennevnte egenskaper eller karakteristika kan observeres eller måles ved anvendelse av teknikker kjent på området omfattende, men ikke begrenset til ELISA, kompetitiv ELISA, overflate plasmon resonans-analyse, in vitro og in vivo nøytraliseringsanalyser (f.eks., Eksempel 2) og immunhistokjemi på vevssnitt fra forskjellige kilder omfattende human, primat eller hvilken som helst annen passende kilde. Spesielle aktiviteter og biologiske egenskaper av anti-humane B7RP1 humane antistoffer er beskrevet mer detaljert i eksemplene nedenfor.

Betegnelsen "isolert polynukleotid" som anvendt her skal bety et polynukleotid av genomisk DNA, cDNA, RNA eller syntetisk opprinnelse eller en eller annen kombinasjon derav, hvor, i kraft av dets opprinnelse, det isolerte poilypeptidet (1) ikke er forbundet med hele eller en del av et polynukleotid med hvilket det isolerte polynukleotidet er funnet i naturen, (2) er bundet til et polynukleotid til hvilket det ikke er bundet i naturen eller (3) ikke forekommer i naturen som del av en større sekvens.

Betegnelsen "polynukleotid" som referert til her betyr enkeltrådete eller dobbeltrådete nukleinsyre-polymerer med en lengde på minst 10 nukleotider. I visse utførelsesformer kan nukleotidene omfattende polynukleotidet være ribonukleotider eller deoksyribonukleotider eller en modifisert form av den ene eller andre typen av nukleotid. Nevnte modifikasjoner omfatter basemodifikasjoner slik som bromuridin, ribose-modifikasjoner slik som arabinosid og 2’,3’-dideoksyribose og internukleotid-binding-modifikasjoner slik som fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, phoshoraniladat og fosforoamidat. Betegnelsen "polynukleotid" omfatter spesifikt enkelt og dobbeltrådete former av DNA eller RNA.

Betegnelsen "oligonukleotid" referert til her omfatter naturlig forekommende og modifiserte nukleotider bundet sammen med naturlig forekommende og/eller ikke-naturlig forekommende oligonukleotid-bindinger. Oligonukleotider er en polynukleotid undergruppe omfattende medlemmer som generelt er enkeltrådete og har en lengde på 200 nukleotider eller færre. I visse utførelsesformer er oligonukleotider 10 til 60 nukleotider i lengde. I visse utførelsesformer er oligonukleotider 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 eller 20 til 40 nukleotider i lengde. Oligonukleotider kan være enkeltrådete eller dobbeltrådete, f.eks. for anvendelse ved konstruksjon av en genetisk mutant. Oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan være sense eller antisense oligonukleotider med referanse til en proteinkodende sekvens.

Betegnelsen "naturlig forekommende nukleotider" omfatter deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Betegnelsen "modifiserte nukleotider" omfatter nukleotider med modifiserte eller substituerte sukkergrupper og lignende. Betegnelsen "oligonukleotid-bindinger" omfatter oligonukleotid-bindinger slik som fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, phoshoraniladat, fosforoamidat og lignende. Se, f.eks., LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL

APPROACH, s. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., U.S. Pat. nr. 5,151,510; Uhlmann og Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, idet beskrivelsene i disse herved inntas ved referanse for hvilket som helst formål. Et oligonukleotid kan omfatte et detekterbart merke for å muliggjøre deteksjon av oligonukleotidet eller hybridisering derav.

Betegnelsen “isolert protein” referert til her betyr at et aktuelt protein (1) er fritt for minst noen andre proteiner med hvilke det ville bli funnet i naturen, (2) er hovedsakelig fritt for andre proteiner fra samme kilde, f.eks., fra samme art, (3) blir uttrykt av en celle fra en ulik art, (4) har blitt separert fra minst ca. 50 prosent av polynukleotider, lipider, karbohydrater eller andre materialer med hvilke det er forbundet i naturen, (5) ikke er forbundet (ved kovalent eller ikke-kovalent interaksjon) med deler av et protein med hvilket det “isolerte proteinet” er forbundet i naturen, (6) er operabelt forbundet (ved kovalent eller ikke-kovalent interaksjon) med et polypeptid med hvilket det ikke er forbundet i naturen eller (7) ikke forekommer i naturen. Et slikt isolert protein kan kodes for av genomisk DNA, cDNA, mRNA eller annet RNA, av syntetisk opprinnelse eller hvilken som helst kombinasjon derav. I én utførelsesform er det isolerte proteinet hovedsakelig fritt fra proteiner eller polypeptider eller andre forurensninger som er funnet i dens naturlige omgivelse som ville komme i konflikt med anvendelse derav (terapeutisk, diagnostisk, profylaktisk, forskning eller på annen måte).

Et “isolert” antistoff er ett som har blitt identifisert og separert og/eller utvunnet fra en komponent av dets naturlige omgivelse. Kontaminantkomponenter fra dets naturlige omgivelse er materialer som ville komme i konflikt med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser for antistoffet og kan omfatte enzymer, hormoner og andre proteinholdige eller ikke-proteinholdige substanser. I visse utførelsesformer blir antistoffet renset (1) til mer enn 95% eller mer enn 99 vekt% av antistoff som bestemt ved Lowry-metoden, (2) til en grad tilstrekkelig til å oppnå minst 15 rester av N-terminal eller indre aminosyresekvens ved anvendelse av en ”spinning cup” sekvenator eller (3) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av Coomassie blue eller sølvfarging. Isolert antistoff omfatter antistoffet in situ innenfor rekombinante celler siden minst én komponent av antistoffets naturlige omgivelse ikke vil være til stede.

Betegnelsene "polypeptid" eller “protein” betyr molekyler som har sekvensen av native proteiner, dvs. proteiner produsert av naturlig forekommende og spesifikt ikke-rekombinante celler eller genetisk konstruerte eller rekombinante celler, og omfatter molekyler som har aminosyresekvensen av det native proteinet eller molekyler som har delesjoner, addisjoner til og/eller substitusjoner av én eller flere aminosyrer av den native sekvensen. Betegnelsene “polypeptid” og “protein” omfatter spesifikt anti-B7RP1-antistoffer eller sekvenser som har delesjoner fra, addisjoner til og/eller substitusjoner av én eller flere aminosyrer av et anti- B7RP1-antistoff.

Betegnelsen "polypeptid-fragment" angir et polypeptid som har en aminoterminal delesjon, en karboksy-terminal delesjon og/eller en indre delesjon. I visse utførelsesformer er fragmenter minst 5 til ca.500 aminosyrer lange. Det vil forstås at i visse utførelsesformer, er fragmenter minst 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 eller 450 aminosyrer lange. Spesielt anvendelige polypeptid-fragmenter omfatter funksjonelle domener, inkludert bindingsdomener spesielt antigenbindende domener, spesielt hvor antigenet er en epitop av human B7RP1. I tilfellet av et anti-B7RP1-antistoff, omfatter anvendelige fragmenter men er ikke begrenset til en CDR-region, et variabelt domene av en tung eller lett kjede, en del av en antistoff-kjede eller kun dens variable region omfattende to CDR’er og lignende.

Betegnelsen “spesifikt bindende middel” refererer til et naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende molekyl som spesifikt binder til et mål. Eksempler på spesifikke bindemidler omfatter, men er ikke begrenset til, proteiner, peptider, nukleinsyrer, karbohydrater og lipider. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindemiddel et antistoff.

Betegnelsen “spesifikt bindende middel for B7RP1” refererer til et spesifikt bindemiddel som spesifikt binder hvilken som helst del av B7RP1. I visse utførelsesformer er et spesifikt bindemiddel for B7RP1 et antistoff som binder spesifikt til B7RP1.

Eksempelvis, et antistoff “binder spesifikt” til et mål dersom antistoffet, når merket, kan utkonkurreres fra dets mål av det tilsvarende ikke-merkede antistoffet.

Betegnelsen “immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment” som anvendt her angir et polypeptid-fragment som i det minste inneholder CDR’ene fra immunglobulin tunge og lette kjeder. Et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment ifølge oppfinnelsen er i stand til å binde til et antigen. I visse utførelsesformer er antigenet en ligand som spesifikt binder til en reseptor. I disse utførelsesformene forhindrer binding av et immunologisk funksjonelt immunoglobulin-fragment ifølge oppfinnelsen binding av liganden til dens reseptor, hvilket forstyrrer den biologiske responsen som følger av ligand-binding til reseptoren. I én utførelsesform binder et immunologisk funksjonelt immunoglobulin-fragment ifølge oppfinnelsen spesifikt til B7RP1. Foretrukket binder fragmentet spesifikt til human B7RP1.

Betegnelsen “naturlig forekommende” eller “nativ” som benyttet her og anvendt for et objekt refererer til det faktum at objektet kan finnes i naturen. For eksempel er et polypeptid eller polynukleotidsekvens som er til stede i en organisme (omfattende virus) som kan isoleres fra en kilde i naturen og som ikke med hensikt er modifisert av mennesker, naturlig forekommende. Betegnelsen “ikke-naturlig forekommende” eller “ikke-nativ” som anvendt her refererer til et materiale som ikke er funnet i naturen eller som er strukturelt modifisert eller syntetisert av mennesker. For eksempel kan “ikke-naturlig forekommende” referere til en variant, slik som en polynukleotid-variant som kan fremstilles ved anvendelse av mutageneseteknikker kjent på området eller en polypeptid-variant fremstilt av en slik polynukleotid-variant. Slike varianter omfatter for eksempel de fremstilt ved nukleotid-substitusjoner, delesjoner eller addisjoner som kan involvere én eller flere nukleotider. Polynukleotid-varianter kan endres i kodende eller ikke-kodende regioner eller begge. Endringer i de kodende regionene kan frembringe konservative eller ikke-konservative aminosyre-substitusjoner, delesjoner eller addisjoner. Spesielt er visse av disse stille substitusjoner, addisjoner, delesjoner og konservative substitusjoner, som ikke endrer egenskapene og aktivitetene av et B7RP1-antistoff ifølge oppfinnelsen. Fagfolk på området kan lett bestemme hvorledes en slik variant kan fremstilles ved anvendelse av metoder velkjent på området.

Betegnelsen "operabelt bundet" betyr at komponentene for hvilke betegnelsen blir anvendt er i en forbindelse som tillater dem å utføre deres iboende funksjoner under egnede betingelser. For eksempel er en kontrollsekvens "operabelt bundet" til en proteinkodende sekvens ligert dertil slik at ekspresjon av den proteinkodende sekvensen blir oppnådd under betingelser kompatible med den transkripsjonelle aktiviteten av kontrollsekvensene.

Betegnelsen "kontrollsekvens" som anvendt her refererer til polynukleotidsekvenser som kan bevirke ekspresjon, prosessering eller intracellulær lokalisering av de kodende sekvensene til hvilke de er operabelt bundet. Karakteren av slike kontrollsekvenser kan avhenge av vertsorganismen. I spesielle utførelsesformer kan kontrollsekvenser for prokaryoter omfatte en promoter, ribosomalt bindingssete og transkripsjonsterminering-sekvens. I andre spesielle utførelsesformer kan kontrollsekvenser for eukaryoter omfatte promotere omfattende ett eller en rekke gjenkjennelses seter for transkripsjonsfaktorer, transkripsjonsenhancer-sekvenser, transkripsjonsterminering-sekvenser og polyadenylering sekvenser. I visse utførelsesformer kan "kontrollsekvenser" omfatte ledersekvenser og/eller fusjonspartner-sekvenser.

Betegnelsen "vektor" omfatter et nukleinsyremolekyl som er i stand til å bære inn i en celle, en annen nukleinsyre til hvilken det har blitt bundet. En type vektor er et "plasmid", som refererer til en sirkulær dobbeltrådet DNA-løkke inn i hvilken ytterligere DNA-segmenter kan ligeres. En annen type vektor er en viral vektor, hvor ytterligere DNA-segmenter kan ligeres inn i det virale genomet. Visse vektorer er i stand til å replikere autonomt i en vertscelle inn i hvilken de blir innført (f.eks., bakterielle vektorer som har et bakterielt replikasjonsorigo og episomale mammalske vektorer). Andre vektorer (f.eks., ikke-episomale mammalske vektorer) kan integreres i genomet til en vertscelle ved innføring inn i vertscellen og blir derved replikert sammen med vertsgenomet. Videre kan visse vektorer styre ekspresjon av gener til hvilke de er operabelt bundet. Slike vektorer er referert til her som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller ganske enkelt, "ekspresjonsvektorer"). Generelt er ekspresjonsvektorer anvendelige ved utøvelse av rekombinant DNA-teknikker ofte i form av plasmider. I foreliggende spesifikasjon kan "plasmid" og "vektor" anvendes om hverandre ettersom plasmidet er den vanligst anvendte formen av vektor. Imidlertid skal oppfinnelsen omfatte slike andre former for ekspresjonsvektorer, slik som virale vektorer (f.eks., replikasjonsdefekt retrovirus, adenovirus og adeno-assosiert virus), som tjener ekvivalente funksjoner.

Uttrykket "rekombinant vertscelle" (eller ganske enkelt "vertscelle") omfatter en celle inn i hvilken en rekombinant ekspresjonsvektor har blitt innført. Det vil forstås av fagfolk på området at slike betegnelser skal referere ikke bare til den spesielle aktuelle cellen men til avkommet av en slik celle. Fordi visse modifikasjoner kan oppstå i etterfølgende generasjoner på grunn av enten mutasjon eller miljømessige påvirkninger, kan slikt avkom, faktisk, kanskje ikke være identisk med den parentale cellen, men er fortsatt omfattet innenfor omfanget av betegnelsen "vertscelle" som anvendt her. En rekke verts ekspresjonssystemer kan anvendes for å uttrykke antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse omfattende bakterielle, gjær, baculovirus og mammalske ekspresjonssystemer (så vel som fagdisplay ekspresjonssystemer). Et eksempel på en egnet bakteriell ekspresjonsvektor er pUC19. For å uttrykke et antistoff rekombinant, blir en vertscelle transfektert med én eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer DNA-fragmenter som koder for immunglobulin lette og tunge kjeder av antistoffet slik at de lette og tunge kjedene blir uttrykt i vertscellen og kan utskilles inn i mediet hvor vertscellene blir dyrket, fra hvilket medium antistoffene kan utvinnes. Standard rekombinant DNA-metoder blir anvendt for å oppnå antistoff tung og lett kjede gener, inkorporere disse genene inn i rekombinante ekspresjonsvektorer og innføre vektorene inn i vertsceller, slik som de beskrevet i Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY

MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel, F.M. et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates, (1989) og i U.S. Patent nr.4,816,397 ved Boss et al.

Betegnelsen “transduksjon” blir anvendt for å referere til overføring av gener fra én bakterie til en annen, vanligvis ved en fag. “Transduksjon” refererer også til ervervelse og overføring av eukaryote cellulære sekvenser ved retrovirus.

Betegnelsen “transfeksjon” blir anvendt for å referere til opptak av fremmed eller eksogent DNA ved en celle og en celle er “transfektert” når det eksogene DNA er innført innenfor cellemembranen. Flere transfeksjonsteknikker er velkjent på området og er beskrevet her. Se, f.eks., Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; og Chu et al., 1981, Gene 13: 197. Slike teknikker kan anvendes for å innføre én eller flere eksogene DNA-enheter inn i egnede vertsceller.

Betegnelsen “transformasjon” som anvendt her refererer til en endring i en celles genetiske karakteristika og en celle har blitt transformert når den har blitt modifisert til å inneholde et nytt DNA. For eksempel er en celle transformert når den er genetisk modifisert fra dens native tilstand. Etter transfeksjon eller transduksjon kan det transformerende DNA rekombinere med DNA fra cellen ved fysisk integrering inn i et kromosom av cellen eller kan opprettholdes transient som et episomalt element uten å bli replikert eller kan replikere uavhengig som et plasmid. En celle er antatt å ha blitt stabilt transformert når DNA blir replikert ved deling av cellen.

Betegnelsen “antigen” refererer til et molekyl eller en del av et molekyl som kan bli bundet av et selektivt bindemiddel, slik som et antistoff og som i tillegg kan anvendes i et dyr for å produsere antistoffer i stand til å binde til en epitop av dette antigenet. Et antigen kan ha én eller flere epitoper.

I visse utførelsesformer omfatter antistoffvarianter glykosyleringsvarianter hvor antallet og/eller type av glykosyleringssete har blitt endret sammenlignet med aminosyresekvensene av det parentale polypeptidet. I visse utførelsesformer omfatter proteinvarianter et større eller et mindre antall av N-bundne glykosyleringsseter enn det native proteinet. Et N-bundet glykosyleringssete er karakterisert ved sekvensen: Asn-Xaa-Ser eller Asn-Xaa-Thr, hvor aminosyreresten betegnet som Xaa kan være hvilken som helst aminosyrerest bortsett fra prolin. Substitusjon av aminosyrerester for å danne denne sekvensen gir et potensielt nytt sete for tilføyelse av en N-bundet karbohydratkjede. Alternativt vil substitusjoner som eliminerer denne sekvensen fjerne en eksisterende N-bundet karbohydratkjede. Også gitt er en rearrangering av N-bundne karbohydratkjeder hvor én eller flere N-bundne glykosyleringsseter (typisk de som er naturlig forekommende) blir fjernet og ett eller flere nye N-bundne seter blir dannet. Ytterligere antistoffvarianter omfatter cystein-varianter hvor én eller flere cysteinrester er deletert fra eller erstattet med en annen aminosyre (f.eks., serin) sammenlignet med den parentale aminosyresekvensen. Cystein-varianter kan være anvendelige når antistoffer må refoldes til en biologisk aktiv konformasjon slik som etter isolering av uløselige inklusjonslegemer. Cystein-varianter har generelt færre cysteinrester enn det native proteinet og finnes typisk i et partall for å minimalisere interaksjoner som følger av uparede cysteiner.

I ytterligere utførelsesformer kan antistoffvarianter omfatte antistoffer omfattende et modifisert Fc-fragment eller en modifisert tung kjede konstant region. Et Fc-fragment, som står for “fragment som krystalliserer,” eller en tung kjede konstant region kan modifiseres ved mutasjon til å gi et antistoff endrede bindingsegenskaper. Se, for eksempel, Burton og Woof, 1992, Advances in Immunology 51: 1-84; Ravetch og Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19: 275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem 276: 6591-6604; Telleman og Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; som alle er inntatt her ved referanse). Slike mutasjoner kan omfatte substitusjoner, addisjoner, delesjoner eller hvilken som helst kombinasjon derav og blir typisk fremstilt ved seterettet mutagenese ved anvendelse av ett eller flere mutagene oligonukleotider i henhold til metoder beskrevet her, så vel som i henhold til metoder kjent på området (se for eksempel, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y.og Berger og Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volum 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA., som er inntatt her ved referanse).

I henhold til visse utførelsesformer kan aminosyresubstitusjoner (1) redusere mottagelighet for proteolyse, (2) redusere mottagelighet for oksidasjon, (3) endre bindingsaffinitet og/eller (4) meddele eller modifisere andre fysiskkjemiske eller funksjonelle egenskaper til slike polypeptider. I henhold til visse utførelsesformer, kan enkelt eller multiple aminosyresubstitusjoner (i visse utførelsesformer, konservative aminosyresubstitusjoner) foretas i den naturlig forekommende sekvensen (i visse utførelsesformer, i delen av polypeptidet utenfor de domene(r)-dannende intermolekylære kontaktene). En konservativ aminosyresubstitusjon endrer typisk ikke hovedsakelig, i visse utførelsesformer, de strukturelle egenskapene av den parentale sekvensen (f.eks., en erstatningsaminosyre skulle forstyrre eller være tilbøyelig til å ødelegge sekundærstruktur som karakteriserer en parental sekvens, slik som en heliks). Eksempler på polypeptid sekundær og tertiærstrukturer kjent på området er beskrevet i

PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman og Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden og J. Tooze, eds.), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; og Thornton et al., 1991, Nature 354:105 som hver er inntatt her ved referanse.

"Antistoff" eller "antistoff-peptid(er)" refererer til et intakt antistoff eller et bindende fragment derav som konkurrerer med det intakte antistoffet om spesifikk binding. I visse utførelsesformer blir bindende fragmenter fremstilt ved rekombinant DNA-teknikker. I ytterligere utførelsesformer blir bindende fragmenter fremstilt ved enzymatisk eller kjemisk kløyving av intakte antistoffer. Bindingsfragmenter omfatter, men er ikke begrenset til, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv og enkelt-kjede antistoffer.

Oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer som omfatter en tung kjede og en lett kjede, hvor de tunge og lette kjedene sammen danner en antigenbindende struktur som er i stand til spesifikt å binde B7RP1. En fullengde tung kjede omfatter et variabel region domene, VH og tre konstant region domener, CH1, CH2 og CH3. VH-domenene er ved den aminoterminale enden av polypeptidet og CH3-domenet er ved den karboksyterminale enden. Betegnelsen “tung kjede”, som anvendt her, omfatter en fullengde tung kjede og fragmenter derav. En fullengde lett kjede omfatter et variabel region domene, VL og et konstant region domene, CL. På samme måte som for den tunge kjeden, er variabel region domenet av den lette kjeden ved den aminoterminale enden av polypeptidet. Betegnelsen “lett kjede”, som anvendt her, omfatter en fullengde lett kjede og fragmenter derav. Et F(ab)-fragment utgjøres av én lett kjede og CH1 og variable regioner av én tung kjede. Den tunge kjeden av et F(ab)-molekyl kan ikke danne en disulfidbinding med et annet tung kjede molekyl. Et F(ab’)-fragment inneholder én lett kjede og én tung kjede som inneholder mer av den konstante regionen, mellom CH1 og CH2-domenene, slik at en interkjede disulfidbinding kan dannes mellom to tunge kjeder for å danne et F(ab’)2 molekyl. Fv-regionen omfatter de variable regionene fra både de tunge og lette kjedene, men mangler de konstante regionene. Enkeltkjede antistoffer er Fv-molekyler hvor de tunge og lette kjede variable regionene er forbundet av en fleksibel linker for å danne en enkelt polypeptidkjede, som danner en antigenbindende region. Enkeltkjede antistoffer er beskrevet i detalj i internasjonal patentsøknad Publikasjon nr. WO 88/01649 og U.S. Patent nr.

4,946,778 og 5,260,203.

Et bivalent antistoff forskjellig fra et "multispesifikt" eller "multifunksjonelt" antistoff er, i visse utførelsesformer, forstått å omfatte bindingsseter som har identisk antigen spesifisitet.

Ved bedømmelse av antistoffbinding og spesifisitet ifølge oppfinnelsen, hemmer et antistoff hovedsakelig adhesjon av en ligand til en reseptor når et overskudd av antistoff reduserer mengden av ligand bundet til reseptor med minst ca. 20%, 40%, 60%, 80%, 85% eller mer (som målt, blant annet, ved anvendelse av et in vitro kompetitivt bindingsforsøk).

Med “nøytraliserende antistoff” menes et antistoffmolekyl som kan blokkere eller hovedsakelig redusere en effektorfunksjon av et mål-antigen til hvilket det binder. Følgelig er et “nøytraliserende” anti-B7RP1 antistoff i stand til å blokkere eller vesentlig redusere en effektorfunksjon, slik som reseptorbinding og/eller fremkalling av en cellulær respons, av B7RP1. “Hovedsakelig reduserer” skal bety minst ca.60%, minst ca.70%, minst ca.75%, minst ca. 80%, minst ca. 85% eller minst ca. 90% reduksjon av en effektorfunksjon av mål-antigenet (f.eks. human B7RP1).

Betegnelsen "epitop" omfatter hvilket som helst sete på et antigen som er i stand til å binde spesifikt til et immunglobulin eller T-celle-reseptor. I visse utførelsesformer omfatter epitop-determinanter kjemisk aktive overflate-grupper av molekyler slik som aminosyrer, sukker sidekjeder, fosforylgrupper eller sulfonylgrupper og, i visse utførelsesformer, kan ha spesifikke tredimensjonale strukturelle egenskaper og/eller spesifikke ladningsegenskaper. En epitop er en region av et antigen som blir bundet av et antistoff. I visse utførelsesformer sies et antistoff å spesifikt binde et antigen når det fortrinnsvis gjenkjenner dets målantigen i en kompleks blanding av proteiner og/eller makromolekyler. I visse utførelsesformer, sies et antistoff å spesifikt binde et antigen når likevekt dissosiasjonskonstanten er ca.10<-6 >M, 10<-7 >M, 10<-8 >M, 10<-9 >M, 10<-10 >M, 10<-11 >M, 10<-12 >M eller mindre enn ca.10<-12>M.

Et antistoff binder “hovedsakelig samme epitop” som et referanse-antistoff, når de to antistoffene gjenkjenner identiske eller sterisk overlappende epitoper. De mest vanlig anvendte og raskeste metodene for å bestemme hvorvidt to antistoffer binder til identiske eller sterisk overlappende epitoper er konkurranseforsøk, som kan bygges opp i en rekke forskjellige formater, ved anvendelse av enten merket antigen eller merket antistoff. Vanligvis er antigenet immobilisert på et substrat og evnen av umerkede antistoffer til å blokkere binding av merkede antistoffer blir målt ved anvendelse av radioaktive isotoper eller enzym-merker.

Betegnelsen "middel" blir anvendt her i betydningen en kjemisk forbindelse, en blanding av kjemiske forbindelser, et biologisk makromolekyl eller et ekstrakt fremstilt fra biologiske materialer.

Som anvendt her refererer betegnelsene "merke" eller "merket" til inkorporering av en detekterbar markør, f.eks., ved inkorporering av en radioaktivt merket aminosyre eller binding til et polypeptid av biotin-grupper som kan detekteres ved merket avidin (f.eks., streptavidin omfattende en detekterbar markør slik som en fluorescerende markør, en kjemiluminescent markør eller en enzymatisk aktivitet som kan detekteres ved optiske eller kolorimetriske metoder). I visse utførelsesformer kan merket også være terapeutisk. Forskjellige metoder for merking av polypeptider og glykoproteiner er kjent på området og kan anvendes fordelaktig ved fremgangsmåtene beskrevet her. Eksempler på merker for polypeptider omfatter, men er ikke begrenset til radioisotoper eller radionuklider slik som <3>H, <14>C, <15>N, <35>S, <90>Y, <99m>Tc, <111>In, <125>I og <131>I, fluorescerende merker (f.eks., fluorescein isotiocyanat eller FITC, rhodamin eller lanthanid fosfor), enzymatiske merker (f.eks., pepperrot peroksidase, β-galaktosidase, luciferase, alkalisk fosfatase), kjemiluminescent merker, hapten-merker slik som biotinylgrupper og forhåndsbestemte polypeptid-epitoper gjenkjent av en sekundær reporter (f.eks., leucin-glidelås par-sekvenser, bindingsseter for sekundære antistoffer, metallbindende domener eller epitop-merker). I visse utførelsesformer er merker forbundet ved spacer-armer (slik som (CH2)n, hvor n < ca. 20) med forskjellige lengder for å redusere potensiell sterisk hindring.

Betegnelsen “biologisk prøve”, som anvendt her, omfatter, men er ikke begrenset til, hvilken som helst mengde av en substans fra et levende objekt eller tidligere levende objekt. Slike levende objekter omfatter, men er ikke begrenset til, mennesker, mus, aper, rotter, kaniner og andre dyr. Slike substanser omfatter, men er ikke begrenset til, blod, serum, urin, celler, organer, vev, ben, benmarg, lymfeknuter og hud.

Betegnelsen "farmasøytisk middel eller medikament" som anvendt her angir en kjemisk forbindelse eller sammensetning som er i stand til å indusere en ønsket terapeutisk effekt når passende administrert til en pasient. Uttrykket “farmasøytisk effektiv mengde” i referanse til en farmasøytisk sammensetning omfattende ett eller en rekke av antistoffene ifølge oppfinnelsen er forstått i betydningen, ifølge oppfinnelsen, en mengde av den nevnte farmasøytiske sammensetningen som kan oppheve, hos en pasient, reduksjonen i sensitivitetsterskelen for ytre stimuli hvor denne sensitivitetsterskelen går tilbake til et nivå komparabelt med det observert hos friske subjekter.

En “lidelse” er hvilken som helst tilstand som ville ha fordel av behandling ifølge foreliggende oppfinnelse. “Lidelse” og “tilstand” blir anvendt om hverandre her og omfatter kroniske og akutte lidelser i immunsystemet eller sykdommer i immunsystemet forbundet med uhensiktsmessig immunrespons, omfattende de patologiske tilstandene som predisponerer pattedyret for den aktuelle lidelsen. Flere tilstander og lidelser som ville ha fordel av behandlingen ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet, for eksempel i internasjonal patentsøknad nr. PCT/US00/01871 (Publikasjon nr. WO 00/46240), idet beskrivelsen i denne er inntatt ved referanse i sin helhet.

Betegnelsene “sykdom i immunsystemet” og “lidelse i immunsystemet” omfatter hvilken som helst medisinsk tilstand eller lidelse forbundet med økte nivåer av B7RP1, økt sensitivitet for B7RP1 eller T-celle-medierte sykdommer, omfattende, men ikke begrenset til, autoimmun sykdom, graft overlevelse, benmarg og organtransplantasjon, allo sensibilisering på grunn av blodtransfusjoner, toksisk sjokksyndrom, T-celle avhengige B-celle-medierte sykdommer, kronisk inflammatoriske sykdommer forbundet med kronisk immuncelle dysfunksjon, lymfoproliferative lidelser (slik som multippelt myelom, Waldenstrøms makroglobulinemi og crioglobulinemi) og kreft. Ikke-begrensende eksempler på autoimmune sykdommer omfatter systemisk lupus erythematosus, revmatoid artritt, immunologisk trombocytopen purpura (ITP), multippel sklerose, diabetes og psoriasis. Ikke-begrensende eksempler på kronisk inflammatoriske sykdommer omfatter inflammatorisk tarmsykdom (slik som Crohns sykdom og colitis ulcerosa), Graves sykdom, Hashimotos thyreoiditt og diabetes mellitus.

Betegnelsene “sykdom i immunsystemet” og “lidelse i immunsystemet” omfatter også hvilken som helst klinisk tilstand som ville bli forbedret ved hemming av antistoffproduksjon, slik som hypersensitivitetsreaksjoner. Hypersensitivitetsreaksjoner kan være forårsaket, for eksempel av høyfeber, allergier, astma, atopi og akutt ødem. Ikke-begrensende eksempler på sykdommer som forårsaker antistoff-medierte hypersensitivitetsreaksjoner omfatter systemisk lupus erythematosus, artritt (slik som revmatoid artritt, reaktiv artritt, psoriatisk artritt), nefropatier (slik som glomerulonefritt, membranøs, mesangiokapillær, fokal segmental, fokal nekrotiserende, crescentic og proliferative nefropatier slik som tubulopatier), hudlidelser (slik som pemfigus og pemfigoid, erythema nodosum), endokrinopatier (slik som thyreoiditt, Graves sykdom, Hashimotos sykdom, insulinavhengig diabetes mellitus), forskjellige pneumopatier (slik som ekstrinsisk alveolitt), forskjellige vaskulopatier, cøliaki, sykdommer med avvikende produksjon av IgA, mange anemier og trombocytopeni, Guillain-Barré Syndrom og myasthenia gravis.

Som anvendt her angir betegnelsene “effektiv mengde” og “terapeutisk effektiv mengde” når anvendt med referanse til en konstituent- eller en farmasøytisk sammensetning omfattende ett eller flere anti-human B7RP1 humane antistoffer en mengde eller dose tilstrekkelig til å frembringe et ønsket resultat (dvs. der, for behandling med konstituent- eller anti-human B7RP1 humane antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, det ønskede resultatet er den ønskede moduleringen av T-celle-responser, for eksempel) eller til å opprettholde en observerbar reduksjon i nivået av én eller flere biologiske aktiviteter av B7RP1. Nærmere bestemt er en terapeutisk effektiv mengde en mengde av de(t) antihumane B7RP1 humane antistoffet(antistoffene) tilstrekkelig til å hemme, for en eller annen tidsperiode, én eller flere av de klinisk definerte patologiske prosessene forbundet med den aktuelle lidelsen, f.eks. immunlidelser og sykdommer, hos et subjekt behandlet in vivo med midlet. Ved foreliggende oppfinnelse kan en “effektiv mengde” av et anti-B7RP1-antistoff modulere T-celleresponser hos en pasient. Ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, blir betegnelsen “kontroll” og grammatikalske varianter derav, anvendt for å referere til forebygging, partiell eller fullstendig hemming, reduksjon, forsinkelse eller moderering av en uønsket hendelse, f.eks. immunrespons. Den effektive mengden kan variere avhengig av det spesifikke konstituent- eller anti-humane B7RP1 humane antistoffet(antistoffene) valgt og er også avhengig av en rekke faktorer og tilstander relatert til pasienten som skal behandles og alvorlighetsgraden av lidelsen. For eksempel dersom konstituent- eller det antihuman B7RP1 humane antistoffet(antistoffene) skal administreres in vivo, ville faktorer slik som alder, vekt og helse for pasienten så vel som doseresponskurver og toksisitetsdata oppnådd i preklinisk arbeid med dyr være blant de som tas i betraktning. Dersom midlet skal bringes i kontakt med cellene in vitro, ville en også utforme en rekke prekliniske in vitro-studier for å bedømme slike parametere som opptak, halveringstid, dose, toksisitet, osv. Bestemmelsen av en effektiv mengde eller en terapeutisk effektiv mengde for et gitt middel er innenfor fagfolks evne på området.

Som anvendt her er betegnelsene “B7-relatert protein-1” og “B7RP1” definert som alle mammalske typer av nativ sekvens B7RP1, som er beskrevet i internasjonal patentsøknad Publikasjon nr. WO 00/46240, som er inntatt her ved referanse.

Som anvendt her betyr "hovedsakelig ren" eller “hovedsakelig renset” en forbindelse eller spesie som er den dominerende spesien til stede (dvs., på en molar basis er den mer rikelig enn noen annen individuell spesie i sammensetningen). I visse utførelsesformer er en hovedsakelig renset fraksjon en sammensetning hvor spesien omfatter minst ca.50 prosent (på en molar basis) av alle makromolekylære spesier til stede. I visse utførelsesformer vil en hovedsakelig ren sammensetning omfatte mer enn ca.80%, 85%, 90%, 95% eller 99% av alle makromolare spesier til stede i sammensetningen. I visse utførelsesformer blir spesiene renset til vesentlig homogenitet (kontaminant spesier kan ikke detekteres i sammensetningen ved konvensjonelle deteksjonsmetoder) hvor sammensetningen består i det vesentlige av en enkelt makromolekylær spesie.

Betegnelsen “pasient” omfatter humane og animalske subjekter.

“Behandling” eller “behandle” refererer både til terapeutisk behandling og profylaktisk eller forebyggende mål. De som har behov for behandling omfatter de som allerede har lidelsen så vel som de som er tilbøyelige til å få lidelsen eller de hos hvilke lidelsen skal forebygges.

Medmindre det kreves på annen måte gjennom sammenhengen, skal entallsbetegnelser omfatte flertall og flertallsbetegnelser skal omfatte entallsbetegnelser.

I henhold til visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen kan antistoffer rettet mot B7RP1 anvendes for å behandle lidelser i immunsystemet og sykdommer i immunsystemet, omfattende men ikke begrenset til, de nevnt ovenfor.

I ett aspekt ifølge oppfinnelsen tilveiebringes fullstendig humane monoklonale antistoffer fremkalt mot og med biologisk og immunologisk spesifisitet for binding til human B7RP1. I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen nukleinsyrer omfattende nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvenser for tung og lett kjede immunglobulinmolekyler, spesielt sekvenser svarende til de variable regionene derav. Spesielle utførelsesformer av dette aspektet av oppfinnelsen er sekvenser svarende til komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er), spesifikt fra CDR1 til og med CDR3, av de tunge og lette kjedene gitt ved oppfinnelsen. Ved enda et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen hybridomceller og cellelinjer som uttrykker immunglobulinmolekylene og antistoffene, slik som monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen. Oppfinnelsen tilveiebringer også biologisk og immunologisk rensede preparater av antistoffer, slik som monoklonale antistoffer fremkalt mot og med biologisk og immunologisk spesifisitet for binding til human B7RP1.

Evnen til å klone og rekonstruere humane loci av megabase-størrelse i gjær kunstige kromosomer (YAC’er) og til å innføre dem inn i mus kjønnscelle tilveiebringer en fordelaktig fremgangsmåte for å forklare de funksjonelle komponentene av svært store eller grovt kartlagte loci så vel som fremstilling av anvendelige modeller av human sykdom. Videre gir utnyttelse av slik teknologi for substitusjon av muse loci med deres humane ekvivalenter unik innsikt i ekspresjon og regulering av humane genprodukter under utvikling, deres kommunikasjon med andre systemer og deres engasjement i induksjon og progresjon av sykdom.

En viktig praktisk anvendelse av en slik strategi er "humaniseringen” av det humorale immunsystemet hos mus. Innføring av humane immunglobulin (Ig) loci inn i mus hvor de endogene Ig-genene har blitt inaktivert gir anledning til å undersøke mekanismer som ligger til grunn for programmert ekspresjon og sammensetting av antistoffer så vel som deres rolle i B-celleutvikling. Videre gir en slik strategi en kilde for produksjon av fullstendig humane monoklonale antistoffer (MAbs).

Betegnelsen “humant antistoff” omfatter antistoffer som har variable og konstante regioner hovedsakelig svarende til human kjønnscelle immunglobulinsekvenser. I visse utførelsesformer blir humane antistoffer produsert i ikke-humane pattedyr, omfattende, men ikke begrenset til, gnagere, slik som mus og rotter og lagomorfer, slik som kaniner. I visse utførelsesformer blir humane antistoffer produsert i hybridomceller. I visse utførelsesformer blir humane antistoffer fremstilt rekombinant.

Betegnelsen “rekombinant” i referanse til et antistoff omfatter antistoffer som blir fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert ved rekombinante metoder. Representative eksempler omfatter antistoffer uttrykt ved anvendelse av en rekombinant ekspresjonsvektor transfektert inn i en vertscelle, antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk humant antistoff-bibliotek, antistoffer isolert fra et dyr (f.eks., en mus) som er transgen for humane immunglobulingener (se f.eks., Taylor, et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); eller antistoffer fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert ved hvilken som helst metode som omfatter spleising av humane immunglobulin gensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante humane antistoffer har variable og konstante regioner avledet fra human kjønnscelle immunglobulinsekvenser.

Humane antistoffer har minst tre fordeler fremfor ikke-humane og kimære antistoffer for anvendelse i human terapi:

1) fordi effektor-delen av antistoffet er human, kan den interagere bedre med de andre delene av det humane immunsystemet (f.eks. ødelegge målcellene mer effektivt ved komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) eller antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC));

2) det humane immunsystemet skulle ikke gjenkjenne det humane antistoffet som fremmed og, derfor skulle antistoffresponsen mot et slikt injisert antistoff være mindre enn mot et fullstendig fremmed ikke-humant antistoff eller et delvis fremmed kimært antistoff;

3) injiserte ikke-humane antistoffer er rapportert å ha en halveringstid i den humane sirkulasjonen mye kortere enn halveringstiden for humane antistoffer. Injiserte humane antistoffer vil ha en halveringstid hovedsakelig identisk med naturlig forekommende humane antistoffer, hvilket tillater at det gis lavere og mindre hyppige doser.

Følgelig er fullstendig humane antistoffer forventet å begrense de immunogene og allergiske reaksjonene intrinsisk for mus eller mus-avledede Mabs, og derved øke effektiviteten og sikkerheten av de administrerte antistoffene. Fullstendig humane antistoffer ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes ved behandling av sykdommer og lidelser forbundet med uhensiktsmessig immunrespons, hvor behandling derav krever gjentatt administrering av antistoff. Følgelig er én spesiell fordel ved anti-B7RP1 antistoffene ifølge oppfinnelsen at antistoffene er fullstendig humane og kan administreres til pasienter på en ikkeakutt måte mens de begrenser ugunstige reaksjoner vanligvis forbundet med humane anti-mus antistoffer eller andre tidligere beskrevne ikke fullstendig humane antistoffer fra ikke-humane arter.

Fagfolk på området kan konstruere musestammer defisitte med hensyn til mus antistoffproduksjon med store fragmenter av de humane Ig loci slik at slike mus produserer humane antistoffer i fravær av mus antistoffer. Store human Igfragmenter kan bevare den store variable gendiversiteten så vel som riktig regulering av antistoffproduksjon og ekspresjon. Ved å utnytte musens cellulære maskineri for antistoff diversifisering og seleksjon og mangelen på immunologisk toleranse for humane proteiner, gir det reproduserte humane antistoff-repertoaret i disse musestammene høyaffinitets antistoffer mot hvilket som helst antigen av interesse, inkludert humane antigener. Ved anvendelse av hybridom-teknologien, kan antigen-spesifikke humane MAbs med ønsket spesifisitet produseres og selekteres.

Transgene dyr (f.eks. mus) kan også anvendes for å produsere humane antistoffer i fravær av endogen immunoglobulinproduksjon. For eksempel vil overføring av den humane kjønnscelle immunoglobulin gen array i slike kjønnscelle mutante mus resultere i produksjon av humane antistoffer ved antigen provokasjon (se f.eks., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; Bruggemann et al., 1993, Year in Immun. 7:33, 1994, Nature 148:1547-1553) og, 1996, Nature Biotechnology 14:826; Gross et al., 2000, Nature 404:995-999; og U.S. Patenter nr. 5,877,397, 5,874,299, 5,814,318, 5,789,650, 5,770,429, 5,661,016, 5,633,425, 5,625,126, 5,569,825 og 5,545,806, (som alle er inntatt her ved referanse i sin helhet for alle formål)). Humane antistoffer kan også produseres i fagdisplay biblioteker (Hoogenboom og Winter, 1992, J. Mol. Biol 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). Teknikkene ved Cole et al. og Boerner et al. er også tilgjengelig for fremstilling av human monoklonale antistoffer (Cole et al., 1985, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY Alan R. Liss, s. 77; og Boerner et al., 1991, J. Immunol.147:86-95).

Rekombinante humane antistoffer kan også underlegges in vitro mutagenese (eller, når et dyr transgent for humane Ig-sekvenser blir anvendt, in vivo somatisk mutagenese) og, følgelig er aminosyresekvensene av VH og VL-regionene av de rekombinante antistoffene sekvenser som, selv om de er avledet fra de relatert til human kjønnscelle VH og VL-sekvenser, kanskje ikke eksisterer naturlig innenfor det humane antistoff kjønnscelle-repertoaret in vivo.

I visse utførelsesformer kan fagfolk anvende konstante regioner fra arter forskjellig fra mennesket sammen med de(n) humane variable regionen(e) i slike mus for fremstilling av kimære antistoffer.

Et bispesifikt eller bifunksjonelt antistoff er typisk et kunstig hybrid antistoff som har to forskjellige tung kjede/lett kjede par og to forskjellige bindingsseter. Bispesifikke antistoffer kan fremstilles ved en rekke metoder omfattende, men ikke begrenset til, fusjon av hybridomer eller binding av F(ab')-fragmenter. Se f.eks., Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148:1547-1553.

Oppfinnelsen tilveiebringer antistoffer som binder til human B7RP1. Disse antistoffene kan fremstilles ved immunisering med fullengde B7RP1 eller fragmenter derav. Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan være polyklonale eller monoklonale og/eller kan være rekombinante antistoffer. I foretrukne utførelsesformer er antistoffer ifølge oppfinnelsen humane antistoffer fremstilt, for eksempel ved immunisering av transgene dyr som er i stand til å produsere humane antistoffer (se for eksempel internasjonal patentsøknad, Publikasjon W0 93/12227).

De komplementaritetsbestemmende regionene (CDR’ene) av de lett kjede og tung kjede variable regionene av anti-B7RP1 antistoffer ifølge oppfinnelsen kan bindes til struktur (”framework”)-regioner (FR’er) fra samme, eller en annen, art. I visse utførelsesformer kan CDR’ene av de lette kjede og tunge kjede variable regionene av anti-B7RP1 antistoff bindes til konsensus humane FR’er. For å danne konsensus humane FR’er, blir FR’er fra mange humane tung kjede eller lett kjede aminosyresekvenser sammenstilt for å identifisere en konsensus aminosyresekvens. FR’ene av anti-B7RP1 antistoff tung kjede eller lett kjede kan erstattes med FR’ene fra en ulik tung kjede eller lett kjede. Sjeldne aminosyrer i FR’ene av de tunge og lette kjedene av anti-B7RP1-antistoff blir typisk ikke erstattet, mens resten av FR aminosyrene kan erstattes. Sjeldne aminosyrer er spesifikke aminosyrer som er i posisjoner hvor de ikke vanligvis er funnet i FR’er. De bundne variable regionene fra anti-B7RP1 antistoffer ifølge oppfinnelsen kan anvendes sammen med en konstant region som er forskjellig fra den konstante region av anti-B7RP1 antistoff. Alternativt er de bundne variable regionene del av et enkeltkjede Fv-antistoff. CDR-binding er beskrevet, f.eks., i U.S. Patenter nr.

6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 og 5,530,101, som herved inntas ved referanse for hvilket som helst formål.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved anvendelse av transgene mus som har en vesentlig del av de humane antistoffproduserende locus insertert i antistoff-produserende celler av musen og som videre er konstruert til å være defisitte med hensyn til produksjon av endogene, murine, antistoffer. Slike mus kan produsere humane immunglobulinmolekyler og antistoffer og produserer ikke eller produserer vesentlig reduserte mengder av murine immunglobulinmolekyler og antistoffer. Teknologier anvendt for å oppnå dette resultatet er beskrevet i patentene, søknadene og referansene beskrevet i beskrivelsen her. I visse utførelsesformer kan fagfolk anvende metoder som beskrevet i internasjonal patentsøknad Publikasjon nr. WO 98/24893, som herved inntas ved referanse for hvilket som helst formål. Se også Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156, som herved inntas ved referanse for hvilket som helst formål.

De monoklonale antistoffene (mAbs) ifølge oppfinnelsen kan fremstills ved en rekke teknikker, omfattende konvensjonell monoklonal antistoff-metodikk, f.eks., standard somatisk celle hybridiseringsteknikk ved Kohler og Milstein (1975, Nature 256:495). Andre teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer kan anvendes, f.eks., viral eller oncogen transformasjon av B-lymfocytter.

Et eksempel på dyresystem for fremstilling av hybridomer er mus. Hybridom produksjon i mus er kjent på området og immuniseringsmetoder og teknikker for isolering av immuniserte splenocytter for fusjon er også kjent på området. Fusjonspartnere (f.eks., murine myelomceller) og metoder for fusjon er også kjent.

I en bestemt utførelsesform kan humane monoklonale antistoffer rettet mot B7RP1 dannes ved anvendelse av transgen mus som bærer deler av det humane immunsystemet heller enn systemet fra mus. Disse transgene musene, referert til her som “HuMab” mus, inneholder et humant immunglobulingen minilocus som koder for ikke-rearrangerte humane tung (μ og γ) og κ lett kjede immunglobulinsekvenser, sammen med målrettede mutasjoner som inaktiverer de endogene μ og κ kjede loci (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Følgelig viser musene redusert ekspresjon av mus IgM eller κ og som respons på immunisering, gjennomgår de innførte humane tung kjede og lett kjede transgenene klasseswitching og somatisk mutasjon for å danne høyaffinitets humane IgG κ monoklonale antistoffer (Lonberg et al., supra.; Lonberg og Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding og Lonberg, 1995, Ann.N.Y.Acad.Sci. 764:536-546). Fremstilling av HuMab mus er beskrevet i detalj i Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:29122920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg & Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-851, idet innholdet i disse herved inntas her ved referanse i sin helhet. Se videre U.S. Patenter nr. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; og 5,770,429; alle ved Lonberg og Kay, så vel som U.S. Patent nr. 5,545,807 ved Surani et al.; internasjonale patentsøknader Publikasjoner nr. WO 93/1227, publisert 24. juni, 1993; WO 92/22646, publisert 23. desember, 1992; og WO 92/03918, publisert 19. mars, 1992, idet beskrivelsene i disse herved inntas ved referanse heri i sin helhet. Alternativt kan transgene musestammer beskrevet i eksemplene nedenfor anvendes for å fremstille humane anti-B7RP1-antistoffer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer humane monoklonale antistoffer som er spesifikke for og nøytraliserer bioaktive humane B7RP1-polypeptider. Også gitt er antistoff tung og lett kjede aminosyresekvenser som er svært spesifikke for og nøytraliserer B7RP1-polypeptider når de er bundet til dem. Denne høye spesifisiteten setter de anti-human B7RP1 humane antistoffene og humane monoklonale antistoffer med lik spesifisitet, i stand til å være effektiv immunoterapi for B7RP1-assosierte sykdommer.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen isolerte humane antistoffer som binder samme eller i det vesentlige samme epitop som 16H antistoffet gitt her.

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen isolerte humane antistoffer omfattende minst én av aminosyresekvensene vist i SEKV ID NR: 1-40 eller 44-58 som binder en B7RP1 polypeptid-epitop med høy affinitet og har evne til å antagonisere B7RP1 polypeptid-aktivitet. Disse antistoffene kan binde samme eller i hovedsakelig samme epitop som anti-B7RP1 antistoffene vist i eksemplene her.

I visse utførelsesformer binder de isolerte antistoffene til B7RP1-polypeptid med en dissosiasjonskonstant (KD) på ca. 10<-6 >M, 10<-7 >M, 10<-8 >M, 10<-9 >M, 10<-10 >M, 10<-11 >M eller mindre og hemmer B7RP1-indusert overlevelse i et in vitro nøytraliseringsforsøk med en EC50 på ca. 10<-6 >M, 10<-7 >M, 10<-8 >M, 10<-9 >M eller mindre. Eksempler på anti-humane B7RP1 humane antistoffer som oppfyller ovennevnte bindings- og nøytraliseringskriterier er gitt her.

I visse utførelsesformer er anti-humane B7RP1 humane antistoffer ifølge oppfinnelsen referert til her som 16H, 16Hg (kjønnscelle), 5D, 2H, 2Hg (kjønnscelle), 15H, 41H og 43H. Antistoff 16H omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 7 og SEKV ID NR: 1, henholdsvis. Antistoff 16Hg omfatter en variabel lett kjede (VL) og variabel tung kjede (VH) polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 1 og SEKV ID NR: 8, henholdsvis. Antistoff 5D omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 2 og SEKV ID NR: 9, henholdsvis. Antistoff 2H omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 3 og SEKV ID NR: 10, henholdsvis. Antistoff 2Hg omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 3 og SEKV ID NR: 11, henholdsvis. Antistoff 15H omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 4 og SEKV ID NR: 12, henholdsvis. Antistoff 41H omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 5 og SEKV ID NR: 13, henholdsvis. Antistoff 43H omfatter VL og VH polypeptidsekvenser som vist i SEKV ID NR: 6 og SEKV ID NR: 14, henholdsvis. Egenskapene til de anti-humane B7RP1 humane antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesifikt beskrevet i eksemplene. Spesielt bemerkelsesverdig er den høye affiniteten for B7RP1-polypeptid og høy kapasitet til å antagonisere B7RP1-polypeptidaktivitet vist her.

Dissosiasjonskonstanten (KD) for et anti-humant B7RP1 humant antistoff kan bestemmes ved overflate plasmon resonans som generelt beskrevet i eksemplene nedenfor. Generelt måler overflate plasmon resonans-analyse sanntid bindings-interaksjoner mellom ligand (rekombinant B7RP1-polypeptid immobilisert på en biosensor matriks) og analytt (antistoffer i løsning) ved overflate plasmon resonans (SPR) ved anvendelse av BIAcore<®>-systemet (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Overflate plasmon-analyse kan også utføres ved å immobilisere analytten (antistoffer på en biosensor matriks) og presentere liganden (rekombinant V i løsning). Dissosiasjonskonstanten (KD) for et antihumant B7RP1 humant antistoff kan også bestemmes ved anvendelse av KinExA metodikk. I visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen, binder antistoffene til B7RP1 med en KD på omtrent 10<-5 >M, 10<-6 >M, 10<-7 >M, 10<-8 >M, 10<-9 >M, 10<-10 >M, 10<-11 >M eller 10<-12 >M. Betegnelsen “KD”, som anvendt her, skal referere til dissosiasjonskonstanten for en spesiell antistoff-antigen-interaksjon. For formål ifølge foreliggende oppfinnelse ble KD bestemt som vist i eksemplene nedenfor.

I visse utførelsesformer er antistoffene ifølge oppfinnelsen av IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4-isotypen. Antistoffene kan være av IgG2 eller IgG1-isotypen. I andre utførelsesformer kan antistoffene ifølge oppfinnelsen være av IgM, IgA, IgE eller IgD-isotypen. I visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen omfatter antistoffene en human kappa lett kjede og en human IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4 tung kjede. Ekspresjon av antistoffer ifølge oppfinnelsen omfattende en IgG1 eller en IgG2 tung kjede konstant region er beskrevet i eksemplene nedenfor. I spesielle utførelsesformer er de variable regionene av antistoffene ligert til en konstant region forskjellig fra den konstante regionen av IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4-isotypen. I visse utførelsesformer har antistoffene ifølge oppfinnelsen blitt klonet for ekspresjon i pattedyrceller.

I visse utførelsesformer vil konservative modifikasjoner av de tunge kjedene og lette kjedene av anti-B7RP1-antistoffer (og tilsvarende modifikasjoner av de kodende nukleotidene) produsere anti-B7RP1 antistoffer som har funksjonelle og kjemiske egenskaper lik de for anti-B7RP1 antistoffene beskrevet her. På den annen side, kan vesentlige modifikasjoner i de funksjonelle og/eller kjemiske egenskapene av anti-B7RP1-antistoffer oppnås ved seleksjon av substitusjoner i aminosyresekvensen av de tunge og lette kjedene som avviker betydelig i deres effekt på opprettholdelse av (a) strukturen av den molekylære ryggraden i området for substitusjonen, for eksempel som en ”sheet” eller heliks-konformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten av molekylet ved mål-setet eller (c) omfanget av sidekjeden.

For eksempel kan en "konservativ aminosyresubstitusjon" omfatte en substitusjon av en nativ aminosyrerest med en ikke nativ rest slik at det er liten eller ingen effekt på polariteten eller ladningen av aminosyreresten ved denne posisjonen. Videre kan hvilken som helst nativ rest i polypeptidet også substitueres med alanin, som tidligere har blitt beskrevet for "alanin scanning mutagenese."

Aminosyresubstitusjoner (hva enten de er konservative eller ikkekonservative) kan bestemmes av fagfolk på området ved det tidspunktet hvor slike substitusjoner er ønsket. I visse utførelsesformer kan aminosyresubstitusjoner anvendes for å identifisere de aminosyrerestene av et anti-B7RP1 antistoff som er involvert i bindingsspesifisitet og/eller affinitet av antistoffet for B7RP1 (f.eks. rester som er involvert i binding av antistoffet til en bestemt epitop), slik som aminosyrerester i CDR1, CDR2 og/eller CDR3-regioner av de lette eller tunge kjedene som beskrevet her. Slike aminosyresubstitusjoner kan øke eller redusere affiniteten til anti-B7RP1-antistoffene beskrevet her.

Mindre endringer i en aminosyresekvens slik som delesjon, addisjon eller substitusjon av én, noen få eller til og med mange aminosyrer kan føre til en allelisk form av det opprinnelige proteinet som har hovedsakelig identiske egenskaper. Derfor kan, i tillegg til antistoffene spesifikt beskrevet her, andre "hovedsakelig homologe" antistoffer lett utformes og fremstilles ved anvendelse av forskjellige rekombinant DNA-teknikker velkjent for fagfolk på området. Generelt kan modifikasjoner av genene lett oppnås ved en rekke velkjente teknikker, slik som seterettet mutagenese. Derfor omfatter foreliggende oppfinnelse “variant” eller “mutante” anti-B7RP1 humane antistoffer som har hovedsakelig like egenskaper som de anti-B7RP1 human antistoffene beskrevet her (se for eksempel WO 00/56772, idet denne herved er omfattet her i sin helhet ved referanse). Med betegnelsen "variant” eller “mutant” med referanse til et anti-B7RP1 humant antistoff menes det følgelig hvilket som helst bindingsmolekyl (molekyl X) (i) hvor de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 av den tunge kjeden eller de hypervariable regionene CDR1, CDR2 og CDR3 av den lette kjeden tatt under ett er minst ca. 80% homologe, minst ca. 90% homologe eller minst ca.95% homologe med de hypervariable regionene som vist i SEKV ID NR: 15 til og med SEKV ID NR. 26 eller SEKV ID NR: 27 til og med SEKV ID NR: 40, henholdsvis og (ii) hvor varianten eller mutanten kan hemme aktiviteten av human B7RP1 i samme grad som et referanse anti-B7RP1 humant antistoff som har struktur (”framework”)-regioner identiske med de for molekyl X. Slike antistoffer kan binde til human B7RP1 eller til mus B7RP1 eller begge. Mus B7RP1-sekvensen er beskrevet i WO 00/46240, som er omfattet ved referanse.

Vanligvis vil en anti-B7RP1 humant antistoff-variant ha lett og/eller tung kjede CDR’er, når tatt under ett, som har minst ca. 80% aminosyresekvensidentitet, minst ca. 85% sekvensidentitet, minst ca. 90% sekvensidentitet, minst ca. 91% sekvensidentitet, minst ca. 92% sekvensidentitet, minst ca. 93% sekvensidentitet, minst ca. 94% sekvensidentitet, minst ca. 95% sekvensidentitet, minst ca. 96% sekvensidentitet, minst ca. 97% sekvensidentitet, minst ca. 98% sekvensidentitet eller minst ca. 99% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen som vist i SEKV ID NR: 15 til og med SEKV ID NR.26 og/eller SEKV ID NR: 27 til og med SEKV ID NR. 40, henholdsvis. Slike antistoffer kan binde til human B7RP1 eller til mus B7RP1 eller til begge.

En anti-B7RP1 human antistoff-variant vil ha en lett kjede variabel region, når tatt under ett, som har minst ca. 80% aminosyresekvensidentitet, minst ca.

81% sekvensidentitet, minst ca. 82% sekvensidentitet, minst ca. 83% sekvensidentitet, minst ca. 84% sekvensidentitet, minst ca. 85% sekvensidentitet, minst ca. 86% sekvensidentitet, minst ca. 87% sekvensidentitet, minst ca. 88% sekvensidentitet, minst ca. 89% sekvensidentitet, minst ca. 90% sekvensidentitet, minst ca. 91% sekvensidentitet, minst ca. 92% sekvensidentitet, minst ca. 93% sekvensidentitet, minst ca. 94% sekvensidentitet, minst ca. 95% sekvensidentitet, minst ca. 96% sekvensidentitet, minst ca. 97% sekvensidentitet, minst ca. 98% sekvensidentitet, minst ca. 99% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen som vist i SEKV ID NR: 1 til og med SEKV ID NR.6 og/eller en tung kjede variabel region, når tatt under ett, som har minst ca. 70% aminosyresekvensidentitet, minst ca. 75% sekvensidentitet, minst ca. 80% sekvensidentitet, minst ca. 81% sekvensidentitet, minst ca. 82% sekvensidentitet, minst ca. 83% sekvensidentitet, minst ca. 84% sekvensidentitet, minst ca. 85% sekvensidentitet, minst ca. 86% sekvensidentitet, minst ca. 87% sekvensidentitet, minst ca. 88% sekvensidentitet, minst ca. 89% sekvensidentitet, minst ca. 90% sekvensidentitet, minst ca. 91% sekvensidentitet, minst ca. 92% sekvensidentitet, minst ca. 93% sekvensidentitet, minst ca. 94% sekvensidentitet, minst ca. 95% sekvensidentitet, minst ca. 96% sekvensidentitet, minst ca. 97% sekvensidentitet, minst ca. 98% sekvensidentitet eller minst ca. 99% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen som vist i SEKV ID NR: 7 til og med SEKV ID NR. 14. Slike antistoffer kan binde til human B7RP1 og/eller mus B7RP1.

Som del vil være forstått av fagfolk på området, er mange av de potensielle CDR-kontakt-restene mottagelige for substitusjon ved andre aminosyrer og tillater fortsatt antistoffet å beholde vesentlig affinitet for antigenet. Likeledes kan mange av struktur (”framework”)-restene som ikke er i kontakt med CDR’ene i de tunge og lette kjedene romme substitusjoner av aminosyrer fra de korresponderende posisjonene fra andre humane antistoffer, ved humane konsensus aminosyrer eller fra andre mus antistoffer, uten betydelig tap av affiniteten eller ikkeimmunogenisitet av det humane antistoffet. Valg av forskjellige alternative aminosyrer kan anvendes for å fremstille versjoner av de beskrevne anti-B7RP1 antistoffene og fragmenter derav som har varierende kombinasjoner av affinitet, spesifisitet, ikke-immunogenisitet, enkel fremstilling og andre ønskelige egenskaper.

En “variant” med referanse til et polynukleotid er ment å referere til et nukleinsyremolekyl som har minst ca. 75% nukleinsyresekvensidentitet med en polynukleotidsekvens ifølge foreliggende oppfinnelse. Vanligvis vil en polynukleotid-variant ha minst ca.75% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca.80% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 81% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca.

82% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 83% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 84% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 85% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 86% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca.

87% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 88% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 89% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 90% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 91% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca.

92% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 93% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 94% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 95% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 96% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca.

97% nukleinsyresekvensidentitet, minst ca. 98% nukleinsyresekvensidentitet eller minst ca. 99% nukleinsyresekvensidentitet med en ny nukleinsyresekvens beskrevet her.

I alternative utførelsesformer kan antistoffer ifølge oppfinnelsen uttrykkes i cellelinjer forskjellig fra hybridom cellelinjer. I disse utførelsesformene kan sekvenser som koder for spesielle antistoffer anvendes for transformasjon av en egnet mammalsk vertscelle. I henhold til disse utførelsesformene kan transformasjon oppnås ved anvendelse av hvilken som helst kjent metode for innføring av polynukleotider inn i en vertscelle, inkludert for eksempel pakking av polynukleotidet i et virus (eller inn i en viral vektor) og transduksjon av en vertscelle med viruset (eller vektoren) eller ved transfeksjonsmetoder kjent på området, som eksemplifisert ved U.S. Patenter nr. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 og 4,959,455 (idet alle disse herved inntas her ved referanse for hvilket som helst formål). Generelt kan transformasjonsmetoden anvendt avhenge av verten som skal transformeres. Metoder for innføring av heterologe polynukleotider inn i pattedyrceller er velkjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, dekstran-mediert transfeksjon, kalsiumfosfat presipitering, polybrenmediert transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, innkapsling av polynukleotidet(polynukleotidene) i liposomer og direkte mikroinjeksjon av DNA inn i kjerner.

Et nukleinsyremolekyl som koder for aminosyresekvensen av en tung kjede konstant region, en tung kjede variabel region, en lett kjede konstant region eller en lett kjede variabel region av et anti-B7RP1-antistoff ifølge oppfinnelsen blir insertert i en passende ekspresjonsvektor ved anvendelse av standard ligeringsteknikker. I én utførelsesform er den anti-B7RP1 antistoff tung kjede eller lett kjede konstante regionen tilføyd til den C-terminale enden av den passende variable regionen og er ligert inn i en ekspresjonsvektor. Vektoren blir typisk valgt å være funksjonell i den bestemte vertscellen anvendt (dvs., vektoren er kompatibel med vertscellens maskineri slik at amplifisering av genet og/eller ekspresjon av genet kan finne sted). For en oversikt over ekspresjonsvektorer, se

METHODS IN ENZYMOLOGY 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press.

Typisk vil ekspresjonsvektorer anvendt i hvilke som helst av vertscellene inneholde sekvenser for opprettholdelse av plasmid og for kloning og ekspresjon av eksogene nukleotidsekvenser. Slike sekvenser, samlet referert til som “flankerende sekvenser” vil i visse utførelsesformer typisk omfatte én eller flere av de følgende nukleotidsekvensene: en promoter, én eller flere enhancer-sekvenser, et replikasjonsorigo, en transkripsjonsterminering-sekvens, en fullstendig intronsekvens inneholdende et donor og akseptor splice-sete, en sekvens som koder for en ledersekvens for sekresjon av polypeptid, et ribosombindingssete, en polyadenyleringssekvens, en polylinker-region for å insertere nukleinsyren som koder for polypeptidet som skal uttrykkes og et selekterbart markør-element. Hver av disse sekvensene er beskrevet nedenfor.

Eventuelt kan vektoren inneholde en “merke”-kodende sekvens, dvs., et oligonukleotidmolekyl lokalisert ved 5’ eller 3’-enden av den anti-B7RP1 antistoff polypeptid-kodende sekvensen; oligonukleotidsekvensen koder for polyHis (slik som heksaHis) eller et annet “merke” slik som FLAG, HA (hemaglutinin influensavirus) eller myc for hvilke det finnes kommersielt tilgjengelige antistoffer. Dette merket blir typisk fusjonert til polypeptidet ved ekspresjon av polypeptidet og kan tjene som et middel for affinitetsrensing eller deteksjon av anti-B7RP1-antistoffet fra vertscellen. Affinitetsrensing kan gjennomføres, for eksempel ved kolonnekromatografi ved anvendelse av antistoffer mot merket som en affinitetsmatriks. Eventuelt kan merket deretter fjernes fra det rensede anti-B7RP1 antistoff-polypeptidet ved forskjellige metoder slik som ved anvendelse av visse peptidaser for kløyving.

Flankerende sekvenser kan være homologe (dvs., fra samme art og/eller stamme som vertscellen), heterologe (dvs., fra en art forskjellig fra vertscelle-arten eller stammen), hybride (dvs., en kombinasjon av flankerende sekvenser fra mer enn én kilde), syntetiske eller native. Som sådan kan kilden for en flankerende sekvens være hvilken som helst prokaryot eller eukaryot organisme, hvilket som helst virveldyr eller invertebrat organisme eller hvilken som helst plante, forutsatt at den flankerende sekvensen er funksjonell i og kan aktiveres av, vertscellens maskineri.

Flankerende sekvenser anvendelige i vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan oppnås ved hvilken som helst av mange metoder velkjent på området. Typisk vil flankerende sekvenser anvendelige ha blitt tidligere identifisert ved kartlegging og/eller ved kløyving ved restriksjonsendonuklease og kan følgelig isoleres fra den passende vevskilden ved anvendelse av passende restriksjonsendonukleaser. I noen tilfeller kan den fullstendige nukleotidsekvensen av en flankerende sekvens være kjent. Her kan den flankerende sekvensen syntetiseres ved anvendelse av metodene beskrevet her for nukleinsyresyntese eller kloning.

Hva enten hele eller kun en del av den flankerende sekvensen er kjent, kan den oppnås ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR) og/eller ved screening av et genomisk bibliotek med en egnet probe slik som et oligonukleotid og/eller flankerende sekvens-fragment fra samme eller en annen art. Når den flankerende sekvensen ikke er kjent, kan et fragment av DNA inneholdende en flankerende sekvens isoleres fra en større del av DNA som for eksempel kan inneholde en kodende sekvens eller til og med et annet gen eller gener. Isolering kan oppnås ved kløyving med restriksjonsendonuklease for å fremstille det passende DNA-fragmentet etterfulgt av isolering ved anvendelse av rensing på agarosegel, Qiagen<® >kolonnekromatografi (Chatsworth, CA) eller andre metoder kjent for fagfolk. Valg av egnede enzymer for å oppnå dette formålet vil være opplagt for fagfolk på området.

Et replikasjonsorigo er typisk en del av de prokaryote ekspresjonsvektorene som erverves kommersielt og origo bidrar ved amplifiseringen av vektoren i en vertscelle. Hvis den valgte vektoren ikke inneholder et replikasjonsorigo-sete, kan det syntetiseres kjemisk basert på en kjent sekvens og ligeres inn i vektoren. For eksempel er replikasjonsorigo fra plasmidet pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) egnet for de fleste gram-negative bakterier og forskjellige virale origo (f.eks., SV40, polyoma, adenovirus, vesikulært stomatittvirus (VSV) eller papillomavirus slik som HPV eller BPV) er anvendelige for kloningsvektorer for pattedyrceller. Generelt er ikke replikasjonsorigo-komponenten nødvendig for mammalske ekspresjonsvektorer (for eksempel blir SV40 origo ofte anvendt kun fordi det også inneholder virus early promoteren).

En transkripsjonsterminering-sekvens er typisk lokalisert 3’ for enden av en polypeptidkodende region og tjener til terminering av transkripsjon. Vanligvis er en transkripsjonsterminering-sekvens i prokaryote celler et G-C-rikt fragment etterfulgt av en poly-T-sekvens. Selv om sekvensen lett blir klonet fra et bibliotek eller til og med innkjøpt kommersielt som del av en vektor, kan den også lett syntetiseres ved anvendelse av metoder for nukleinsyresyntese slik som de beskrevet her.

Et selekterbart markørgen koder for et protein nødvendig for overlevelse og vekst av en vertscelle dyrket i et selektivt dyrkningsmedium. Typisk koder seleksjonsmarkør-gener for proteiner som (a) gir resistens mot antibiotika eller andre toksiner, f.eks., ampicillin, tetracyklin eller kanamycin for prokaryote vertsceller; (b) komplementerer auxotrofe mangler for cellen; eller (c) leverer kritiske næringsstoffer ikke tilgjengelige fra komplekse eller definerte media. Eksempler på selekterbare markører er kanamycinresistensgenet, ampicillinresistens genet og tetracyklinresistens genet. Fordelaktig kan et neomycinresistens gen også anvendes for seleksjon i både prokaryote og eukaryote vertsceller.

Andre selekterbare gener kan anvendes for å amplifisere genet som vil bli uttrykt. Amplifisering er prosessen hvor gener som er nødvendige for produksjon av et protein kritisk for vekst eller celleoverlevelse blir gjentatt etter hverandre i kromosomene i suksessive generasjoner av rekombinante celler. Eksempler på egnede selekterbare markører for pattedyrceller omfatter dihydrofolat reduktase (DHFR) og promoterfri thymidin kinase-gener. Pattedyrcelle transformanter blir plassert under seleksjonstrykk hvor kun de transformantene som er unikt tilpasset overlever i kraft av det selekterbare genet til stede i vektoren. Seleksjonstrykk blir pålagt ved dyrking av de transformerte cellene under betingelser hvor konsentrasjonen av seleksjonsmiddel i mediet blir suksessivt øket, hvilket derved fører til amplifisering av både det selekterbare genet og DNA som koder for et annet gen, slik som et antistoff som binder til B7RP1-polypeptid. Som et resultat blir økte mengder av et polypeptid slik som et anti-B7RP1-antistoff syntetisert fra det amplifiserte DNA.

Et ribosombindingssete er vanligvis nødvendig for translasjonsinitiering av mRNA og er karakterisert ved en Shine-Dalgarno-sekvens (prokaryoter) eller en Kozak-sekvens (eukaryoter). Elementet er typisk lokalisert 3’ for promoteren og 5’ for den kodende sekvensen av polypeptidet som skal uttrykkes.

I noen tilfeller, for eksempel hvor glykosylering er ønsket i et eukaryot vertscelle ekspresjonssystem, kan en manipulere de forskjellige pre- eller prosekvensene for å forbedre glykosylering eller utbytte. For eksempel kan en endre peptidase kløyvingssetet for et bestemt signalpeptid eller tilføye prosekvenser, som også kan påvirke glykosylering. Det endelige proteinproduktet kan ha, i -1-posisjonen (relativt til den første aminosyren av det modne proteinet) én eller flere ytterligere aminosyrer som følger med ekspresjon, som kanskje ikke har blitt fullstendig fjernet. For eksempel kan det endelige proteinproduktet ha én eller to aminosyrerester funnet i peptidase kløyvingsetet, bundet til den aminoterminale enden. Alternativt kan anvendelse av noen enzym kløyvingsseter resultere i en litt trunkert form av det ønskede polypeptidet, dersom enzymet kløyver ved et slikt område innenfor det modne polypeptidet.

Ekspresjons og kloningsvektorer ifølge oppfinnelsen vil typisk inneholde en promoter som blir gjenkjent av vertsorganismen og operabelt bundet til molekylet som koder for anti-B7RP1-antistoffet. Promotere er ikke-transkriberte sekvenser lokalisert oppstrøms (dvs., 5’) for startkodonet av et strukturelt gen (generelt innenfor ca. 100 til 1000 bp) som kontrollerer transkripsjon av det strukturelle genet. Promotere blir konvensjonelt gruppert inn i én av to klasser: induserbare promotere og konstitutive promotere. Induserbare promotere initierer forhøyede nivåer av transkripsjon fra DNA under deres kontroll som respons på en eller annen forandring i kulturbetingelser, slik som nærvær eller fravær av et næringsmiddel eller en endring i temperatur. Konstitutive promotere, på den annen side, transkriberer enhetlig gener til hvilke de er operabelt bundet, dvs. med liten eller ingen kontroll over genekspresjon. Et stort antall av promotere, gjenkjent av en rekke potensielle vertsceller, er velkjente. En egnet promoter blir operabelt bundet til DNA som koder for tung kjede eller lett kjede omfattende et anti-B7RP1-antistoff ifølge oppfinnelsen ved å fjerne promoteren fra DNA-kilden ved kløyving med restriksjonsenzym og insertering av den ønskede promotersekvensen inn i vektoren.

Egnede promotere for anvendelse med gjærverter er også velkjent på området. Gjær-enhancere blir fordelaktig anvendt med gjærpromotere. Egnede promotere for anvendelse med mammalske vertsceller er velkjente og omfatter, men er ikke begrenset til, de oppnådd fra genomene fra virus slik som polyomavirus, fowlpox virus, adenovirus (slik som Adenovirus 2), bovint papillomavirus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitt-B virus og Simian Virus 40 (SV40). Andre egnede mammalske promotere omfatter heterologe mammalske promotere, for eksempel varmesjokk-promotere og aktin promoteren.

Ytterligere promotere som kan være av interesse omfatter, men er ikke begrenset til: SV40 tidlig promoter (Bernoist og Chambon, 1981, Nature 290:304-10); CMV-promoter (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:659-663); promoteren inneholdt i 3’ long terminal repeat fra Rous sarkomavirus (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-97); herpes thymidin kinase-promoteren (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); promoter og regulatorsekvenser fra metallotionein-genet (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); og prokaryote promotere slik som beta-laktamase-promoteren (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 75:3727-31); eller tac-promoteren (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 80:21-25). Også av interesse er de følgende animalske transkripsjonskontroll-regionene, som fremviser vevsspesifisitet og har blitt anvendt i transgene dyr: elastase I gen kontrollregionen som er aktiv i pankreatiske acinarceller (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); insulingen kontroll-regionen som er aktiv i pankreas beta-celler (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); immunglobulingen kontroll-regionen som er aktiv i lymfoide celler (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); mus brysttumor virus kontrollregionen som er aktiv i testikkel-, bryst, lymfoide og mastceller (Leder et al., 1986, Cell 45:485-95); albumin gen kontroll-regionen som er aktiv i lever (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-76); alfa-feto-protein-gen kontroll-regionen som er aktiv i lever (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); alfa 1-antitrypsin gen kontroll-regionen som er aktiv i lever (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-71); beta-globingen kontroll-regionen som er aktiv i myeloide celler (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); myelin basisk protein-gen kontroll-regionen som er aktiv i oligodendrocytt-celler i hjernen (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); myosin lett kjede-2 gen kontroll-regionen som er aktiv i skjelettmuskel (Sani, 1985, Nature 314:283-86); og gonadotropinfrigjørende hormon gen kontroll-regionen som er aktiv i hypothalamus (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78).

En enhancer-sekvens kan inserteres i vektoren for å øke transkripsjon av DNA som koder for lett kjede eller tung kjede omfattende et anti-B7RP1 antistoff ifølge oppfinnelsen ved høyere eukaryoter. Enhancere er cis-virkende elementer av DNA, vanligvis ca. 10-300 bp i lengde, som virker på promoteren for å øke transkripsjon. Enhancere er relativt orienterings- og posisjonsuavhengige, og har blitt funnet i posisjoner både 5’ og 3’ for transkripsjonensenheten. Mange enhancer-sekvenser tilgjengelige fra pattedyrgener er kjent (f.eks., globin, elastase, albumin, alfa-feto-protein og insulin). Typisk blir imidlertid en enhancer fra et virus anvendt. SV40-enhanceren, cytomegalovirus tidlig promoterenhanceren, polyoma-enhanceren og adenovirus-enhancere kjent på området er eksempler på forsterkende elementer for aktivering av eukaryote promotere. Selv om en enhancer kan være plassert i vektoren enten 5’ eller 3’ for en kodende sekvens, er den typisk lokalisert ved et sete 5’ fra promoteren.

Ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen kan konstrueres fra en utgangsvektor slik som en kommersielt tilgjengelig vektor. Slike vektorer kan, eller kan ikke, inneholde alle de ønskede flankerende sekvensene. Når én eller flere av de flankerende sekvensene beskrevet her ikke allerede er til stede i vektoren, kan de oppnås individuelt og ligeres inn i vektoren. Metoder anvendt for å oppnå hver av de flankerende sekvensene er velkjent for fagfolk på området.

Etter at vektoren er konstruert og et nukleinsyremolekyl som koder for lett kjede, en tung kjede eller en lett kjede og en tung kjede omfattende et anti-B7RP1-antistoff har blitt insertert i det passende setet av vektoren, kan den ferdige vektoren inserteres i en egnet vertscelle for amplifisering og/eller ekspresjon av polypeptid. Transformasjon av en ekspresjonsvektor for et anti-B7RP1-antistoff inn i en valgt vertscelle kan oppnås ved velkjente metoder omfattende transfeksjon, infeksjon, kalsiumfosfat kopresipitering, elektroporering, mikroinjeksjon, lipofeksjon, DEAE-dekstran-mediert transfeksjon eller andre kjente teknikker. Den valgte metoden vil delvis være en funksjon av typen av vertscelle som skal anvendes. Disse metodene og andre egnede metoder er velkjent for fagfolk og er angitt, for eksempel i Sambrook et al., supra.

En vertscelle syntetiserer, når dyrket under passende betingelser, et anti-B7RP1 antistoff som deretter kan oppsamles fra dyrkningsmediet (dersom vertscellen utskiller det inn i mediet) eller direkte fra vertscellen som produserer det (dersom det ikke blir utskilt). Valg av en passende vertscelle vil avhenge av forskjellige faktorer, slik som ønskede ekspresjonsnivåer, polypeptidmodifikasjoner som er ønskelige eller nødvendige for aktivitet (slik som glykosylering eller fosforylering) og enkel folding til et biologisk aktivt molekyl

Mammalske cellelinjer tilgjengelige som verter for ekspresjon er velkjent på området og omfatter, men er ikke begrenset til, immortaliserte cellelinjer tilgjengelige fra American Type Culture Collection (ATCC), omfattende men ikke begrenset til ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), HeLa-celler, babyhamster nyre (BHK)-celler, apenyre-celler (COS), humant hepatocellulært karsinom-celler (f.eks., Hep G2) og flere andre cellelinjer. I visse utførelsesformer kan cellelinjer velges gjennom bestemmelse av hvilke cellelinjer som har høye ekspresjonsnivåer og konstitutivt produserer antistoffer med B7RP1 bindingsegenskaper. I en annen utførelsesform kan en cellelinje fra B-cellelinjen som ikke fremstiller sitt eget antistoff men har en evne til å fremstille og sekretere et heterologt antistoff velges.

Antistoffer ifølge oppfinnelsen er anvendelige for detektering av B7RP1 i biologiske prøver og identifikasjon av celler eller vev som produserer B7RP1-protein. Antistoffer ifølge oppfinnelsen som spesifikt binder til B7RP1 kan være anvendelige ved behandling av B7RP1-medierte sykdommer. Nevnte antistoffer kan anvendes i bindingsforsøk for å detektere B7RP1 og til å hemme B7RP1 fra å danne et kompleks med B7RP1-reseptorer. Nevnte antistoffer som binder til B7RP1 og blokkerer interaksjon med andre bindende forbindelser kan ha terapeutisk anvendelse ved modulering av B7RP1-medierte sykdommer. I visse utførelsesformer kan antistoffer mot B7RP1 blokkere B7RP1-binding til dens reseptor, hvilket kan føre til forstyrrelse av den B7RP1-induserte signaltransduksjonskaskaden.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av ett eller flere av antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ved fremstilling av et medikament for behandling av en lidelse eller tilstand forårsaket av økt ekspresjon av B7RP1 eller økt sensitivitet for B7RP1 hos en pasient slik som hvilke som helst av lidelsene eller tilstandene beskrevet her.

I visse utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen farmasøytiske sammensetninger omfattende en terapeutisk effektiv mengde av ett eller en rekke av antistoffene ifølge oppfinnelsen sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer, solubiliseringsmiddel, emulgeringsmiddel, konserveringsmiddel og/eller adjuvans. Akseptable materialer for formulering er ikke toksiske for mottagere ved de anvendte dosene og konsentrasjonene. I foretrukne utførelsesformer er farmasøytiske sammensetninger omfattende en terapeutisk effektiv mengde av anti-B7RP1 antistoffer gitt.

I visse utførelsesformer er akseptable materialer for formulering ikke toksiske for mottagere ved de anvendte dosene og konsentrasjonene.

I visse utførelsesformer kan den farmasøytiske sammensetningen inneholde materialer for formulering for modifisering, opprettholdelse eller bevaring, for eksempel av pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, isotonisitet, lukt, sterilitet, stabilitet, hastighet av oppløsning eller frigjøring, adsorpsjon eller penetrering av sammensetningen. I slike utførelsesformer omfatter egnede materialer for formulering, men er ikke begrenset til, aminosyrer (slik som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin); antimikrobielle midler, antioksidanter (slik som askorbinsyre, natriumsulfitt eller natriumhydrogen-sulfitt); buffere (slik som borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrater, fosfater eller andre organiske syrer); fyllmidler (slik som mannitol eller glysin); chelaterende midler (slik som etylendiamin tetraeddiksyre (EDTA)); komplekserende midler (slik som koffein, polyvinylpyrrolidon, beta-cyklodekstrin eller hydroksypropyl-beta-cyklodekstrin); fyllmidler; monosakkarider; disakkarider; og andre karbohydrater (slik som glukose, mannose eller dekstriner); proteiner (slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner); fargemidler, smaksstoffer og fortynningsmidler; emulgeringsmidler; hydrofile polymerer (slik som polyvinylpyrrolidon); lavmolekylvekt polypeptider; saltdannende motioner (slik som natrium); konserveringsmidler (slik som benzalkoniumklorid, benzosyre, salicylsyre, timerosal, fenetylalkohol, metylparaben, propylparaben, klorheksidin, sorbinsyre eller hydrogenperoksid); løsningsmidler (slik som glyserin, propylenglykol eller polyetylenglykol); sukkeralkoholer (slik som mannitol eller sorbitol); suspenderingsmidler; surfaktanter eller fuktemidler (slik som pluronics, PEG, sorbiten-estere, polysorbater slik som polysorbat 20, polysorbat 80, triton, trometamin, lecitin, kolesterol, tyloksapal); stabilitetsfremmende midler (slik som sukrose eller sorbitol); tonisitetsfremmende midler (slik som alkalimetallhalogenider, for eksempel natrium eller kaliumklorid, mannitol sorbitol); leverings-konstituenter; fortynningsmidler; tilsetningsmidler og/eller farmasøytiske adjuvantia. Se REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18<th >Utgave, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

I visse utførelsesformer vil den optimale farmasøytiske sammensetningen bestemmes av fagfolk på området avhengig av, for eksempel den tilsiktede administreringsveien, leveringsformatet og ønsket dose. Se for eksempel,

REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. I visse utførelsesformer kan slike sammensetninger innvirke på den fysiske tilstanden, stabiliteten, hastigheten av in vivo-frigjøring og hastigheten av in vivo utskilling av antistoffene ifølge oppfinnelsen.

I visse utførelsesformer kan den primære konstituenten eller bæreren i en farmasøytisk sammensetning være enten vandig eller ikke-vandig av karakter. For eksempel kan en egnet konstituent eller bærer være vann for injeksjon, fysiologisk saltoppløsning eller kunstig cerebrospinalvæske, muligens supplert med andre materialer vanlige i sammensetninger for parenteral administrering. Nøytral bufret saltoppløsning eller saltoppløsning blandet med serumalbumin er ytterligere eksempler på konstituenter. I visse utførelsesformer omfatter farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse Tris-buffer med ca. pH 7,0-8,5 eller acetat-buffer med ca. pH 4,0-5,5 og kan videre omfatte sorbitol, sukrose, Tween-20 og/eller en egnet erstatning derfor. I visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen kan anti-B7RP1-antistoff- sammensetninger fremstilles for lagring ved å blande den valgte sammensetningen som har den ønskede graden av renhet med valgfrie midler for formulering (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) i form av en lyofilisert kake eller en vandig løsning. Videre kan i visse utførelsesformer, anti-B7RP1 antistoff-produktet formuleres som et lyofilisat ved anvendelse av passende tilsetningsmidler slik som sukrose.

De farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan velges for parenteral levering. Alternativt kan sammensetningene velges for inhalasjon eller for levering gjennom fordøyelseskanalen, for eksempel oralt. Fremstilling av slike farmasøytisk akseptable sammensetninger er kjent teknikk på området.

Formulerings-komponentene er til stede i konsentrasjoner som er akseptable for administreringsstedet. I visse utførelsesformer blir buffere anvendt for å opprettholde sammensetningen ved fysiologisk pH eller ved en litt lavere pH, typisk innenfor et pH-område på fra ca.5 til ca.8.

Når det gjelder parenteral administrering, kan de terapeutiske sammensetningene for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse gis i form av en pyrogenfri, parenteralt akseptabel vandig løsning omfattende det ønskede anti-B7RP1 antistoffet i en farmasøytisk akseptabel konstituent. En spesielt egnet konstituent for parenteral injeksjon er sterilt, destillert vann hvor anti-B7RP1-antistoffet er formulert som en steril, isotonisk løsning, riktig opprettholdt. I visse utførelsesformer kan fremstillingen omfatte formulering av det ønskede molekylet med et middel, slik som injiserbare mikrokuler, bioeroderbare partikler, polymere forbindelser (slik som polymelkesyre eller polyglykolsyre), kuler eller liposomer, som kan gi kontrollert eller forlenget frigjøring av produktet som kan leveres gjennom depotinjeksjon. I visse utførelsesformer kan hyaluronsyre også anvendes, som har effekten av å fremme forlenget varighet i sirkulasjonen. I visse utførelsesformer kan implanterbare medikament leveringsanordninger anvendes for å innføre det ønskede antistoffmolekylet.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan formuleres for inhalasjon. I disse utførelsesformene blir anti-B7RP1 antistoffer fordelaktig formulert som et tørt, inhalerbart pulver. I visse utførelsesformer kan anti-B7RP1-antistoff inhalasjonsløsninger også formuleres med et drivmiddel for aerosol levering. I visse utførelsesformer, kan løsninger nebuliseres. Pulmonal administrering og formuleringsmetoder derfor er ytterligere beskrevet i internasjonal patentsøknad nr. PCT/US94/001875, som er inntatt ved referanse og beskriver pulmonal levering av kjemisk modifiserte proteiner.

Det er også antatt at formuleringer kan administreres oralt. Anti-B7RP1-antistoffer som blir administrert på denne måten kan formuleres med eller uten bærere som vanligvis anvendes ved blanding av faste doseringsformer slik som tabletter og kapsler. I visse utførelsesformer kan en kapsel utformes til å frigjøre den aktive delen av formuleringen ved det stedet i mage-tarm-kanalen hvor biotilgjengelighet er maksimert og pre-systemisk nedbrytning er minimalisert. Ytterligere midler kan inkluderes for å lette absorpsjon av anti-B7RP1-antistoffet. Fortynningsmidler, smaksmidler, vokser med lavt smeltepunkt, vegetabilske oljer, glattemidler, suspenderingsmidler, tablett desintegrasjonsmidler og bindemidler kan også anvendes.

En farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen tilveiebringes til å omfatte en effektiv mengde av ett eller en rekke anti-B7RP1-antistoffer i en blanding med ikke-toksiske tilsetningsmidler som er egnet for fremstilling av tabletter. Ved oppløsning av tablettene i sterilt vann eller en annen passende konstituent, kan løsninger fremstilles i enhetsdoseform. Egnede tilsetningsmidler omfatter, men er ikke begrenset til, inerte fortynningsmidler, slik som kalsiumkarbonat, natriumkarbonat eller bikarbonat, laktose eller kalsiumfosfat; eller bindemidler, slik som stivelse, gelatin eller akasie; eller glattemidler slik som magnesiumstearat, stearinsyre eller talkum.

Ytterligere farmasøytiske sammesetninger vil være åpenbare for fagfolk på området, inkludert formuleringer som omfatter anti-B7RP1 antistoffer i formuleringer med forlenget eller kontrollert levering. Teknikker for formulering av en rekke andre midler med forlenget eller kontrollert levering, slik som liposombærere, bioeroderbare mikropartikler eller porøse kuler og depotinjeksjoner, er også kjent for fagfolk på området. Se, for eksempel, internasjonal patentsøknad nr. PCT/US93/00829, som er inntatt ved referanse og beskriver kontrollert frigjøring av porøse polymere mikropartikler for levering av farmasøytiske sammensetninger. Preparater med forlenget frigjøring kan omfatte semipermeable polymer-matrikser i form av formede produkter, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Matrikser med forlenget frigjøring kan omfatte polyestere, hydrogeler, polylaktider (som beskrevet i U.S. Patent nr. 3,773,919 og europeisk patentsøknad Publikasjon nr. EP 058481 som hver er inntatt ved referanse), kopolymerer av L-glutaminsyre og gamma etyl-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), poly (2-hydroksyetyl-metakrylat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 og Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etylen vinylacetat (Langer et al., supra) eller poly-D(-)-3-hydroksysmørsyre (europeisk patentsøknad Publikasjon nr. EP 133,988). Sammensetninger med forlenget frigjøring kan også omfatte liposomer som kan fremstilles ved hvilken som helst av mange metoder kjent på området. Se f.eks., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; europeisk patentsøknad Publikasjoner nr. EP 036,676; EP 088,046 og EP 143,949, inntatt ved referanse.

Farmasøytiske sammensetninger anvendt for in vivo administrering blir typisk gitt som sterile preparater. Sterilisering kan gjennomføres ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner. Når sammensetningen er lyofilisert, kan sterilisering ved anvendelse av denne metoden utføres enten før eller etter lyofilisering og rekonstituering. Sammensetninger for parenteral administrering kan lagres i lyofilisert form eller i en løsning. Parenterale sammensetninger blir generelt plassert i en beholder som har en steril tilgangsåpning, for eksempel en intravenøs løsnings-pose eller ampulle som har en kork gjennomtrengelig for en hypodermisk injeksjonsnål.

Når den farmasøytiske sammensetningen først er formulert, kan den lagres i sterile medisinglass som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, fast stoff eller som et dehydratisert eller lyofilisert pulver. Slike formuleringer kan lagres enten i en form klar til bruk eller i en form (f.eks., lyofilisert) som blir rekonstituert før administrering.

Oppfinnelsen tilveiebringer også sett for fremstilling av en enkeltdose administreringsenhet. Settene ifølge oppfinnelsen kan hvert inneholde både en første beholder som har et tørket protein og en andre beholder som har en vandig formulering. I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes sett inneholdende enkelt og flerkammer forhåndsfylte sprøyter (f.eks., væske sprøyter og ”lyosyringes”).

Den effektive mengden av en anti-B7RP1-antistoff-inneholdende farmasøytisk sammensetning som skal anvendes terapeutisk vil avhenge, for eksempel av den terapeutiske sammenhengen og formålene. Fagfolk på området vil forstå at de passende dosenivåene for behandling vil variere avhengig, delvis, av molekylet som leveres, indikasjonen for hvilken anti-B7RP1 antistoffet anvendes, administreringsveien og størrelsen (kroppsvekt, kroppsoverflate eller organstørrelse) og/eller tilstanden (alderen og generell helse) for pasienten. I visse utførelsesformer kan klinikeren titrere dosen og modifisere administreringsveien for å oppnå den optimale terapeutisk effekten. En typisk dose kan være i området fra ca. 0,1 µg/kg til opptil ca. 30 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene nevnt ovenfor. I visse utførelsesformer kan dosen være i området fra 0,1 µg/kg opptil ca.

30 mg/kg; fra 1 µg/kg opptil ca.30 mg/kg; eller fra 5 µg/kg opptil ca.30 mg/kg.

Doseringshyppigheten vil avhenge av de farmakokinetiske parametrene for det spesielle anti-B7RP1-antistoffet i den anvendte formuleringen. En kliniker administrerer typisk sammensetningen inntil det oppnås en dose som oppnår den ønskede effekten. Sammensetningen kan derfor administreres som en enkelt dose eller som to eller flere doser (som kan, eller kan ikke, inneholde samme mengde av det ønskede molekylet) over tid eller som en kontinuerlig infusjon gjennom en implantasjonsanordning eller kateter. Ytterligere forbedring av den passende dosen blir rutinemessig utført av fagfolk på området og er innenfor omfanget av oppgaver rutinemessig utført av dem. Passende doser kan bestemmes gjennom anvendelse av passende dose-respons data. I visse utførelsesformer kan antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres til pasienter gjennom en lengre tidsperiode. Kronisk administrering av et antistoff ifølge oppfinnelsen begrenser den ugunstige immun eller allergiske responsen vanligvis forbundet med antistoffer som er fremkalt mot et humant antigen i et ikke-humant dyr, for eksempel et ikke-fullstendig humant antistoff produsert i en ikke-human art.

Administreringsveien for den farmasøytiske sammensetningen er i overensstemmelse med kjente metoder, f.eks. oral, gjennom injeksjon ved intravenøs, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenchymal), intracerebroventrikulær, intramuskulær, intra-okulær, intraarteriell, intraportal eller intralesjonale administreringsveier; ved systemer for forlenget frigjøring eller ved implantasjonsanordninger. I visse utførelsesformer kan sammensetningene administreres ved bolusinjeksjon eller kontinuerlig ved infusjon eller ved implantasjonsanordning.

Sammensetningen også kan administreres lokalt gjennom implantasjon av en membran, svamp eller et annet passende materiale på hvilket det ønskede molekylet er absorbert eller innkapslet. I visse utførelsesformer, hvor en implantasjonsanordning blir anvendt, kan anordningen implanteres inn i hvilket som helst egnet vev eller organ og levering av det ønskede molekylet kan finne sted gjennom diffusjon, bolus med styrt frigjøring eller kontinuerlig administrering.

Det også kan være ønskelig å anvende anti-B7RP1-antistoff farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen ex vivo. I slike tilfeller blir celler, vev eller organer som er fjernet fra pasienten eksponert for anti-B7RP1-antistoff farmasøytiske sammensetninger hvoretter cellene, vevene og/eller organene deretter blir implantert tilbake i pasienten.

Spesielt kan anti-B7RP1-antistoffer leveres ved implantering av visse celler som har blitt genetisk konstruert, ved anvendelse av metoder slik som de beskrevet her, for å uttrykke og utskille polypeptidet. I visse utførelsesformer kan slike celler være dyre- eller humane celler og kan være autologe, heterologe eller xenogene. I visse utførelsesformer kan cellene være immortaliserte. I andre utførelsesformer kan cellene, for å redusere sjansen for en immunologisk respons, innkapsles for å unngå infiltrering av omgivende vev. I ytterligere utførelsesformer er innkapslingsmaterialene typisk biokompatible, semipermeable polymere kapslinger eller membraner som tillater frigjøring av proteinproduktet(-produktene) men forhindrer ødeleggelse av cellene ved pasientens immunsystem eller ved andre skadelige faktorer fra de omgivende vevene.

EKSEMPLER

De følgende eksemplene, omfattende forsøkene utført og resultater oppnådd er gitt kun for illustrative formål og skal ikke oppfattes som begrensende for oppfinnelsen.

Eksempel 1

Produksjon av humane monoklonale antistoffer mot B7-relatert protein-1 (B7RP1)

Antigen

Renset rekombinant human B7RP-1 (hB7RP-1) fremstilt som beskrevet i internasjonal patentsøknad Publikasjon nr. WO 00/46240, som er inntatt her ved referanse eller CHO-celler transfektert til å uttrykke hB7RP-1 ble anvendt som antigenet. Moden human B7RP-1 har aminosyresekvensen av restene X til 302 i sekvensen vist i WO 00/46240 som SEKV ID NR: 17, hvor X kan være 19, 20, 21, 22, 24 eller 28.

Transgene HuMab mus

Fullstendig humane monoklonale antistoffer mot B7RP-1 ble fremstilt ved anvendelse av HCo7 og HCo12-stammer av HuMab transgene mus, som begge uttrykker humane antistoffgener. I begge disse musestammene, er det endogene mus kappa lett kjede-genet blitt homozygot forstyrret som beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 og det endogene mus tung kjede genet har blitt homozygot forstyrret som beskrevet i Eksempel 1 i PCT Publikasjon WO 01/09187. Hver av disse musestammene bærer et humant kappa lett kjede transgen, KCo5, som beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. HCo7-stammen bærer HCo7 human tung kjede transgenet som beskrevet i U.S. Patenter nr. 5,545,806; 5,625,825; og 5,545,807. HCo12-stammen bærer HCo12 human tung kjede transgenet som beskrevet i Eksempel 2 i PCT Publikasjon WO 01/09187.

HuMab Immuniseringer:

For å danne fullstendig humane monoklonale antistoffer mot B7RP-1, ble HuMab-mus av HCo7 eller HCo12-stammen immunisert med renset rekombinant B7RP-1 eller CHO-celler transfektert til å uttrykke B7RP-1. Generelle immuniseringsplaner for HuMab-mus er beskrevet i Lonberg et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 og PCT Publikasjon WO 98/24884. Musene var 6-16 uker gamle ved den første infusjonen av antigen. Et renset rekombinant preparat av B7RP-1-antigen (50 µg) eller en fremstilling av transfekterte CHO-celler (3,5 x 10<6 >– 1 x 10<7 >celler) ble anvendt for å immunisere HuMab-musene intraperitonealt.

Transgene mus ble immunisert to ganger med renset antigen i complete Freund’s adjuvans intraperitonealt, fulgt av 2-4 uker med IP immuniseringer (opptil totalt 8 immuniseringer) med det rensede antigenet i incomplete Freund’s adjuvans. Immunisering med CHO-celler transfektert til å uttrykke B7RP-1 var lik bortsett fra at complete Freund’s adjuvans og incomplete Freund’s adjuvans ikke ble anvendt sammen med cellene. Immunresponsen ble overvåket ved retroorbitale tappinger. Plasmaet ble screenet ved ELISA (som beskrevet nedenfor) og mus med tilstrekkelig titere av anti-B7RP-1 humant immungolobulin ble anvendt for fusjoner. Mus ble boostret intravenøst med antigen 3 og 2 dager før avliving og fjerning av milten. Typisk ble 10-20 fusjoner for hvert antigen utført. Mange dusin mus ble immunisert for hvert antigen. Totalt 28 mus fra HCo7 og HCo12-musestammene ble immunisert med B7RP-1.

Seleksjon av HuMab-mus som produserer anti-B7RP-1-antistoffer:

For å selektere HuMab-mus som produserer antistoffer som binder B7RP-1, ble sera fra immuniserte mus testet ved ELISA som beskrevet av Fishwild et al. (1996). I korthet ble mikrotiterplater belagt med renset rekombinant B7RP-1 ved 1-2 µg /ml i PBS, 50 µl/brønner inkubert 4 °C natten over deretter blokkert med 200 µl/brønn av 5% kyllingserum i PBS/Tween (0,05%). Fortynninger av plasma fra B7RP-1-immuniserte mus ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 1-2 timer ved omgivelsestemperatur. Platene ble vasket med PBS/Tween og deretter inkubert med et geit-anti-humant IgG Fc polyklonalt antistoff konjugert med pepperrot peroksidase (HRP) i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking ble platene utviklet med ABTS substrat (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) og analysert med spektrofotometer ved OD 415-495. Mus som utviklet de høyeste titere av anti-B7RP-1 antistoffer ble anvendt for fusjoner. Fusjoner ble utført som beskrevet nedenfor og hybridom supernatanter ble testet for anti-B7RP-1-aktivitet ved ELISA.

Fremstilling av hybridomer som produserer humane monoklonale antistoffer mot B7RP-1:

Mus splenocyttene, isolert fra HuMab-mus, ble fusjonert med PEG til en mus myelomcellelinje basert på standardmetoder. De resulterende hybridomene ble deretter screenet for fremstilling av antigen-spesifikke antistoffer. Enkelt cellesuspensjoner av milt lymfocytter fra immuniserte mus ble fusjonert til én fjerdedel av antallet SP2/0 ikke sekreterende mus myelomceller (ATCC, CRL 1581) med 50% PEG (Sigma). Celler ble platet ut ved omtrent 1x10 <5>/brønn i flatbunnet mikrotiterplate, fulgt av ca. to ukers inkubering i selektivt medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) kondisjonert medium, 3-5% origen (IGEN) i DMEM (Mediatech, CRL 10013, med høy glukose, L-glutamin og natriumpyruvat) pluss 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamycin og 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Etter 1-2 uker ble celler dyrket i medium hvor HAT var erstattet med HT. Individuelle brønner ble deretter screenet ved ELISA (beskrevet ovenfor) for humane anti-B7RP-1 monoklonale IgG-antistoffer. Straks omfattende hybridomvekst oppsto, ble medium overvåket vanligvis etter 10-14 dager. De antistoff-sekreterende hybridomene ble platet ut på nytt, screenet igjen og, dersom fortsatt positive for human IgG, ble anti-B7RP-1 monoklonale antistoffer subklonet minst to ganger ved begrensende fortynning (”limiting dilution”). De stabile subklonene ble deretter dyrket in vitro for å danne små mengder av antistoff i vevskultur medium for videre karakterisering.

Eksempel 2

Kloning av anti-B7RP1 antistoff tunge og lette kjeder

Hybridomer som uttrykker det B7RP1-bindende monoklonale antistoffet 16H ble anvendt som en kilde for å isolere totalt RNA ved anvendelse av TRIzol® reagens (Invitrogen). Et 5’ RACE (rask amplifisering av cDNA-ender) oligonukleotid (5’- CGA CUG GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3’; SEKV ID NR: 69) ble ligert til RNA ved anvendelse av GeneRacer ™ Kit (Invitrogen) komponenter og fremgangsmåte. Første tråd cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en tilfeldig primer med en forlengelse adapter (5’-_ GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3’) (SEKV ID NR: 59) og en 5’ RACE (rask amplifisering av cDNA-ender) preparativ analyse ble utført ved anvendelse av GeneRacer ™ Kit’et (Invitrogen) i henhold til instruksjoner fra produsenten. For fremstilling av fullstendig lett kjede-kodende cDNA, var foroverprimeren GeneRacer ™ nested primer og revers-primeren var (5’- GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3’) (SEKV ID NR: 60). For fremstilling av cDNA som koder for den variable regionen av den tunge kjeden, var foroverprimeren GeneRacer ™ nested primer og revers-primeren var (5’- TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3’) (SEKV ID NR: 61). RACE-produkter ble klonet inn i pCR4-TOPO (Invitrogen) og sekvensene bestemt. Konsensus-sekvenser ble anvendt for å utforme primere for fullengde antistoffkjede PCR-amplifisering.

For fremstilling av cDNA som koder for anti-B7RP1 16H kappa lett kjede, kodet 5’ PCR primeren for den aminoterminale enden av signalsekvensen, et XbaI restriksjonsenzymsete og en optimalisert Kozak-sekvens (5’-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCT CGC TCA GCT CCT GGG-3’) (SEKV ID NR: 62). 3’-primeren kodet for den karboksyterminale enden og termineringskodon, så vel som et SalI restriksjonssete (5’-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3’) (SEKV ID NR: 63). Det resulterende PCR-produkt-fragmentet ble renset, kløyvet med XbaI og SalI og deretter gelisolert og ligert inn i mammalsk ekspresjonsvektor pDSRα20 (se internasjonal søknad, publikasjon nr. WO 90/14363, som inntas her ved referanse for hvilket som helst formål. pDSRα20 ble fremstilt ved å endre nukleotid 2563 i pDSRa19 fra et “Guanosin” til et “Adenosin” ved seterettet mutagenese.).

For fremstilling av cDNA som koder for anti-B7RP116H tung kjede kodet 5’ PCR-primeren for den aminoterminale enden av signalsekvensen, et XbaI restriksjonsenzymsete og en optimalisert Kozak-sekvens (5’-ACA ACA AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GAA CTG G-3’) (SEKV ID NR: 64).3’-primeren kodet for den karboksyterminale enden av den variable regionen, inkludert et naturlig forekommende sense-tråd BsmBI-sete (5’- GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGG ATT CC -3’; SEKV ID NR: 65). Det resulterende produktet ble renset, kløyvet med XbaI og BsmBI, isolert på gel og ligert inn i pDSRα20-vektoren inneholdende den humane IgG1 konstante regionen og også inn i pDSRα20-vektoren inneholdende den humane IgG2 konstante regionen. Alle hybridom-avledete anti-B7RP1 tung kjede variable regionene, uavhengig av den native konstante regionen forbundet, ble klonet som beskrevet ovenfor både inn i pDSRα20-vektorene inneholdende de humane IgG1 og de humane IgG2 konstante regionene.

Eksempel 3

Ekspresjon av anti-B7RP1-antistoffer i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler)

Stabil ekspresjon av 16H anti-B7RP1 mAb ble oppnådd ved kotransfeksjon av 16H-tung kjede/pDSRα19 IgG2 B7RP1-kappa/pDSRα19-plasmider inn i dihydrofolat reduktase defisitte (DHFR-) serum-fri tilpassede ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler) ved anvendelse av en kalsiumfosfat-metode (fullengde 16H tung kjede-sekvensen er vist i SEKV ID NR: 44; 16H kappa-kjede sekvensen er vist i SEKV ID NR: 45). Transfekterte celler ble selektert i medium inneholdende dialysert serum men ikke inneholdende hypoksantin-tymidin for å sikre vekst av celler som uttrykker DHFR-enzymet. Transfektert kloner ble screenet ved anvendelse av analyser slik som ELISA for å detektere ekspresjon av 16H anti-B7RP1 mAb i det kondisjonerte mediet. De høyest uttrykkende klonene ble underlagt økende konsentrasjoner av metotrexat (MTX) for DHFR-amplifisering. MTX-amplifiserte kloner ble screenet ved anvendelse av analyser slik som ELISA for å detektere høyere ekspresjon av 16H anti-B7RP1 mAb i det kondisjonerte mediet. De høyest uttrykkende klonene ble underlagt subkloning for å oppnå en homogen populasjon og dannelse av cellebanker.

Andre rekombinante anti-B7RP1 antistoffer ifølge oppfinnelsen kan dannes i ovarieceller fra kinesisk hamster defisitte for DHFR ved anvendelse av samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor for det anti-B7RP1 monoklonale antistoffet. DNA-sekvensene som koder for den fullstendige tunge kjeden eller lette kjeden av hvert anti-B7RP1 antistoff ifølge oppfinnelsen blir klonet inn i ekspresjonsvektorer. CHOd-celler blir kotransfektert med en ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke en fullstendig tung kjede og en ekspresjonsvektor som uttrykker den fullstendige lette kjeden av det passende anti-B7RP1-antistoffet. For eksempel, for å danne et 5D anti-B7RP1-antistoff, blir celler koransfektert med en vektor som er i stand til å uttrykke en fullstendig tung kjede omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 47 og en vektor som er i stand til å uttrykke en fullstendig lett kjede omfattende aminosyresekvensen angitt i SEKV ID NR: 48. Tabell 2 oppsummerer eksempler på fullstendige lette kjeder og eksempler på fullstendige tunge kjeder for anti-B7RP1 antistoffer som har human IgG tung kjede konstante regioner. Fagfolk på området vil forstå at IgG1 eller IgG2 kunne settes i stedet for hverandre (dvs. der IgG1 er listet opp i tabellen, kunne IgG2 være til stede og omvendt). Alternativt kunne hvilket som helst annet immunglobulin (f.eks. IgM, IgA, IgE eller IgH) anvendes for å danne antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Tabell 2

Eksempel 4

Produksjon av anti-B7RP1-antistoff

Anti-B7RP1 antistoff blir fremstilt ved ekspresjon i en klonal linje av CHO-celler. For hver produksjon kjørt, blir celler fra en enkelt ampulle tint opp i serumfrie celledyrkningsmedier. Cellene blir dyrket initielt i en T-kolbe fulgt av spinnerflasker og deretter dyrket i reaktorer av rustfritt stål med økende målestokk opptil en 2000L bioreaktor. Produksjon blir utført i en 2000L bioreaktor ved anvendelse av en fed-batch-kultur, hvor et nærende fôr inneholdende konsentrerte medium-komponenter blir tilsatt for å opprettholde cellevekst og kultur viabilitet. Produksjon varer i omtrent to uker under hvilket tidsrom anti-B7RP1 antistoff blir konstitutivt produsert av cellene og utskilt inn i celledyrkningsmediet.

Produksjonsreaktoren blir kontrollert ved en forutbestemt pH, temperatur og oppløst oksygennivå: pH blir kontrollert ved karbondioksidgass og natriumkarbonat-tilsetning; oppløst oksygen blir kontrollert ved luft, nitrogen og oksygengass strømninger.

Ved slutten av produksjon, blir cellemediet fylt inn i en disk stack sentrifuge og kultursupernatanten blir separert fra cellene. Konsentratet blir ytterligere renset gjennom et dybdefilter fulgt av et 0,2 μm filter. De rensede kondisjonerte media blir deretter konsentrert ved tangential flow ultrafiltrering. De kondisjonerte media blir konsentrert 15 til 30 ganger. Det resulterende konsentrerte kondisjonerte mediet blir deretter enten prosessert gjennom rensing eller frosset for rensing ved et senere tidspunkt.

Eksempel 5

Omdanning av 16H mAb til kjønnscelle-sekvensen (”germlining”)

Sekvenssammenstilling av 16H-antistoffet med humane kjønnscelle (”germline”)-sekvenser viste at struktur (”framework”)-sekvensen i den variable regionen av 16H antistoffet var mest identisk med VH 3-07 og JH4 kjønnscellesekvenser, med kun tre aminosyrers forskjell (Figur 1A). Struktur (”framework”)-sekvensen for VK-regionen av 16H antistoffet ble funnet å være identisk med VK1-L15 kjønnscellesekvensen. Det er teoretisk mulig at somatiske hypermutasjoner blir gjenkjent som fremmede ved immunresponsen hos en pasient; i hvilket tilfelle pasienten ville generere en anti-idiotype respons som kunne nøytralisere det terapeutiske midlet. For å redusere denne muligheten ble de tre aminosyreendringene i VH struktur (”framework”)-regionen omformet tilbake til VH 3-07 og JH4 kjønnscellesekvensene (Figur 1A). Siden kjønnscelle VH og JH gensegmentene er til stede i hvert humant genom, er det ikke sannsynlig at kjønnscelle-versjonen av 16H blir gjenkjent som fremmed ved immunresponsen hos en dosert pasient. Plate kostimulering bioassays ble utført for å bestemme om de ”germlined” antistoffene kunne indusere T-celleproliferasjon med en IC50 lik IC50 for de ikke-omformede antistoffene. Kostimulerings-forsøket ble utført som beskrevet nedenfor ved anvendelse av anti-CD3 og hB7RP-1-Fc fusjonsprotein bekreftet at dette ”germlined” antistoffet, referert til som 16Hkjønnscelle eller 16Hg, beholder sine biologiske aktiviteter (Figur 1B).

Eksempel 6

Affinitetsmåling av monoklonale antistoffer ved Biacore<® >og KinExA

Tre antistoffer (5D og 16H, fremstilt som beskrevet i Eksempel 1 og 16H kjønnscelle, fremstilt som beskrevet i Eksempel 5) ble renset og underlagt bindingsaffinitets-analyse. B7RP1-Fc ble immobilisert ved en høy tetthet på en CM5 sensor-chip ved anvendelse av standard amin koblingskjemi. En fastsatt konsentrasjon av mAb ble deretter inkubert med varierende konsentrasjoner av B7RP-1 eller B7RP1-Fc i minst åtte timer ved romtemperatur for å tillate dem å nå likevekt. Prøvene ble deretter injisert over B7RP1-Fc-overflaten og bindingssignalet observert representerte fritt antistoff som er igjen i løsning ved likevekt. Ved anvendelse av to forskjellige antistoffkonsentrasjoner (0,2nM og 1nM), ble KD for interaksjonen mellom en bestemt mAb og ligand beregnet fra ikke-lineær regresjonsanalyse av konkurranse kurvene ved anvendelse av en dual-curve one-site homogen bindingsmodell (Adamczyk et al., 1999, Bioconjugate Chem. 10:1032-37; Adamczyk et al., 2000, Methods 20:319-28). Som vist i Figur 2 og Tabell 3, bandt 16H, 16Hg og 5D mAbs både oppløselige B7RP-1 og B7RP-1-Fc-proteiner ved høye affiniteter. I tillegg indikerte resultatene at 16H (ikke-kjønnscelle) og 16Hg (kjønnscelle) reagerte tilsvarende, hvilket demonstrerer at ”germlining” ikke påvirket binding mellom antistoff og ligand i betydelig grad.

Tabell 3

Binding av 5D, 2H og 2H kjønnscelle-antistoffer ble også testet ved anvendelse av KinExA (kinetisk eksklusjon analyse)-teknologi. I dette forsøket ble hB7RP-1 koblet til agarosekuler. Kulene ble anvendt til å danne en kule-kolonne. Prøver inneholdende antistoff ved en fastsatt konsentrasjon, som fikk komme til likevekt med varierende konsentrasjoner av hB7RP-1, ble deretter passert over kule-kolonnen. Antistoff ikke kompleksert med ligand bandt til de belagte kulene.

Et fluorescerende merket anti-humant Fc sekundært antistoff ble anvendt for å detektere bundet test-antistoff. Signalet oppnådd var proporsjonalt med fritt antistoff i løsning ved en gitt ligand-konsentrasjon. Ved anvendelse av to forskjellige antistoffkonsentrasjoner, ble KD for interaksjonen beregnet fra ikkelineær regresjonsanalyse av konkurranse kurvene ved anvendelse av en dualcurve one-site homogen bindingsmodell (Adamczyk et al., 1999, Bioconjugate Chem. 10:1032-37; Adamczyk et al., 2000, Methods 20:319-28). Figurene 3, 4 og 5 viser dual-kurve tilpasningene for antistoffene 5D, 2H og 2H(kjønnscelle). Ved anvendelse av denne teknikken, ble en ca. 10 ganger forskjell sett i KD for antistoffene 5D og 2H.

Resultatene av Biacore<® >og KinExA-analysene viste at antistoff 5D har en høyere affinitet for hB7RP-1 enn både 2H eller 16H. Kjønnscelle-versjonen av antistoff 2H viser dessuten ikke en signifikant forskjell fra ikke-kjønnscellekonstruksjonen.

Eksempel 7

Funksjonelle egenskaper av anti-B7RP1-antistoffer

De funksjonelle egenskapene av B7RP-1-antistoffer ifølge oppfinnelsen ble evaluert ved anvendelse av bindingskonkurranse forsøk, in vitro kostimuleringsforsøk og in vitro tetanustoksoid forsøk.

Bindingskonkurranse-studier

Bindingskonkurranse studier ble utført med 16H mAbs for å demonstrere at de kan konkurrere om ICOS-binding for B7RP-1. CHO-celler transfektert med et gen som koder for fullengde human B7RP-1 ble først inkubert med avtagende mengder av umerket 16H mAb og deretter merket med et fluorescerende-merket ICOS-Fc fusjonsprotein. Cellene ble deretter analysert ved anvendelse av strømningscytometri. Som vist i Figur 6, merket ICOS-Fc de B7RP-1-transfekterte CHO-cellene; 0,4μg/ml 16H mAb påvirket ikke ICOS-Fc-binding. 6 og 25 μg/ml 16H utkonkurrerte imidlertid effektivt ICOS-Fc-binding, hvilket indikerer at 16H mAb faktisk konkurrerte om ICOS-binding på B7RP-1.

Kostimulerings forsøk

Cellekulturplater (Falcon, Kat nr. 353077, U bunn) ble belagt med 1 μg/ml anti-humane CD3-antistoffer (PharMingen Kat nr.555336) og 10ug/ml anti-human IgG (Fc-spesifikk, Sigma Kat nr. I3391). Anti-CD3 antistoffene og anti-humant immunglobulin i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) ble tilsatt til hver brønn (100μl/brønn). De belagte platene ble inkubert ved 4<o>C natten over eller ved romtemperatur i 2 timer. Platene ble deretter vasket med PBS to ganger. Etter vasking ble 1μg/ml human B7-2Fc (R&D System, Kat Nr. 141-B2) eller 5μg/ml hB7RP1Fc, hver fortynnet i PBS, tilsatt til hver brønn (100μl pr. brønn). Platene ble deretter inkubert ved romtemperatur i 3 timer og vasket to ganger med PBS deretter. Rensede humane T-celler ble tilsatt (1x10<5 >pr. brønn) i 200μl volum av media (RPMI 1640 supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), penicillinstreptomycin-L-glutamin (PSG), β-mercpatoetanol (2-ME), N-acetyl aspartat (NAA) og Napyruvat) og inkubert ved 37<o>C, 5% CO2 i 48 timer. <3->H tymidin (ICN Kat nr.

2404205) ble tilsatt ved 1μCi/brønn og cellene ble inkubert natten over ved 37<o>C, 5% CO2. Cellene ble deretter høstet og tellet.

Cellekulturplater (Falcon, Kat nr.353077, U bunn) ble belagt med 0,1 μg/ml anti-human CD3 som ovenfor. hB7RP1-transfekterte CHO-celler (5000RAD bestrålet) ble tilsatt ved 2x10<4 >pr. brønn fulgt av rensede humane T-celler ved 1x10<5 >pr. brønn i 200μl volum. Plater ble inkubert ved 37<o>C, 5% CO2 i 48 timer som ovenfor.<3->H tymidin ble tilsatt ved 1μCi/brønn. Celler ble inkubert natten over, høstet og tellet som ovenfor.

Tetanustoksoid analyser

PBMC ble renset fra humant blod ved anvendelse av en Ficoll-Paque (Amersham Biosciences)-gradient som følger. Blod ble fortynnet 1:2 med PBS, fortynnet blod ble lagt på toppen av Ficoll (1/3 romtemp Ficoll 2/3 fortynnet blod), sentrifugert ved 2500 rpm i 30 minutter ved romtemperatur, det øverste laget (plasma & blodplater) ble aspirert av og mononukleær celle-laget ble overført til et nytt 50 ml rør. De isolerte PBMC ble vasket med PBS (3x volumet av mononukleær celle-lag) og sentrifugert i 10 minutter ved 1300 rpm ved romtemperatur og vasket som ovenfor. PBMC ble resuspendert i media (RPMI 1640 10% varme-inaktivert FBS 1X PSG 1X NEAA 55 µM 2-ME) og cellene ble tellet.

PMBC ble tilsatt til brønner i en 96-brønns rundbunnet plate ved 100 µl PBMC/brønn (3x10<6>/ml). Tetanustoksoid (20 µg/ml; University of Massachusetts) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 5 µg/ml. Cellene ble inkubert i 3 dager ved 37°C; 100 µl supernatant ble oppsamlet og inkubert for en tilsetning 6 til 8 timer i nærvær av 1 µCi/brønn <3>H-tymidin (MP Biomedicals). Cellene ble deretter høstet og tellet.

Tabell 4 oppsummerer de funksjonelle egenskapene av visse antistoffer ifølge oppfinnelsen som bestemt ved anvendelse av forsøkene beskrevet ovenfor.

Tabell 4

*EC50/KD-verdier i pM

Eksempel 8

Epitop-kartlegging

Forsøk ble utført for å identifisere regionen av B7RP-1 til hvilken de monoklonale antistoffene 16H/16Hg og 5D binder. For å gjøre dette ble et nytt Fluorescens-aktivert celle sorterer (FACS) bindingsforsøk utviklet. Det humane ekstracellulær domenet (ECD) av B7RP1 (SEKV ID NR: 66) så vel som forkortede former av B7RP-1 inneholdende enten Ig1 (IgV-lignende; SEKV ID NR: 67) eller Ig2 (IgC-lignende; SEKV ID NR: 68) ble uttrykt som N-terminale fusjoner i leseramme med kylling avidin.

SEKV ID NR: 66 (ECD):

Ekspresjonsvektorer inneholdende gener som koder for disse fusjonsproteinene ble individuelt transient transfektert inn i 293T-celler og de kondisjonerte media fra disse cellelinjene ble anvendt som kilden for fusjonsprotein. Avidin-merket ble anvendt for å oppfange B7RP1-fusjonsproteinene fra løsning ved anvendelse av en biotin-belagt kule. Fusjonsproteiner ble inkubert med enten fluorescerende merket 16H eller 5D mAbs eller et fluorescerende merket ICOS-Fc fusjonsprotein og inkubert med biotinbelagte kuler. Kulene ble gjenvunnet og analysert ved anvendelse av strømningscytometri i en Becton-Dickinson Bioscience FACScan (BD, Franklin Lakes, NJ). Som vist i Figur 9A ble fluorescerende merking av kulene detektert med 16H, 5D og ICOS reagensene når den fullstendige ECD av B7RP-1 ble bundet, hvilket indikerer at alle tre av disse reagensene kunne binde til ECD av B7RP-1. Tilsvarende bandt alle tre reagensene til avidin fusjonsproteinet inneholdende kun Ig1-domenet, hvilket indikerer at både ICOS og de blokkerende anti-B7RP-1 mAbs kunne binde til denne regionen. Derimot kunne hverken ICOS eller anti-B7RP-1 mAbs binde til fusjonsproteinet inneholdende kun det membranproksimale Ig2-domenet. Følgelig var ICOS, 16H og 5D bindingsregionene på B7RP-1 lokalisert i Ig1-domenet.

Antistoffene fremstilt som beskrevet ovenfor i Eksempel 1 og testet for binding ved anvendelse av avidin fusjon-bindingsforsøket, kunne deles opp i to epitop-klasser, H og D, som vist i Tabell 5. Av de 100 antistoffene initielt selektert basert på deres evne til å binde B7RP1, mislyktes 15 i å binde i avidin fusjonbindingsforsøket, mest sannsynlig på grunn av nedbrytning.

Tabell 5

Eksempel 9

SNP identifikasjon og funksjonell analyse

En hoved enkeltnukleotid-polymorfisme (SNP)-variant ble identifisert i B7RP-1 som er til stede i populasjonen med en allelfrekvens på 28,4% (Figur 7). Varianten ble identifisert innenfor den modne proteinkodende sekvensen. Et søk ved National Center for Biotechnology Information (NCBI) databank avslørte en andre potensiell SNP-variant; den andre varianten ble identifisert i en 1,5 individuell (tre kromosom) analyse. Den første SNP-varianten (V128I) var lokalisert i det første IgV-lignende domenet, mens NCBI SNP-varianten (L221F) var lokalisert i det andre IgC-lignende domenet.

Som beskrevet ovenfor, binder begge de monoklonale antistoffene 16H og 5D til det første IgV-lignende domenet, således er det usannsynlig at den sistnevnte L221F-varianten påvirker hverken 16H eller 5D mAb-binding eller funksjon. Ikke desto mindre, for å bestemme hvorvidt det ene eller det andre av disse SNP-variantene påvirker 16H eller 5D-binding og/eller funksjon, ble to forskjellige forsøk utført. I det første settet av forsøk, ble avidin fusjonsproteiner konstruert med de to SNP-variantene og testet for binding til 16H eller 5D-antistoffer i den strømningscytometriske analysen som beskrevet ovenfor. Disse representative mAbs fra H og D epitop-klassene bandt til SNP-variantene med lignende effektivitet som villtype B7RP-1 (Figur 9B). Disse data antydet at antistoffer fra både H og D epitop-klassene binder til B7RP-1 SNP-variantene.

Ved den andre metoden ble Fc-fusjonsproteiner konstruert ved anvendelse av B7RP-1 SNP variant-sekvensene og sammenlignet med hensyn til evnen av disse proteinene til å stimulere T-celler i plate kostimulerings-forsøket (Figur 9C). Både 16H og 5D antistoff hemmet kostimulering mediert av SNP-variant Fc fusjonsproteinene med lignende EC50s som villtype fusjonsproteinet. Tatt under ett indikerte disse data at de to potensielle B7RP-1 SNP-variantene ble gjenkjent av antistoffene ifølge oppfinnelsen. Følgelig kan antistoffene ifølge oppfinnelsen binde til mål i pasienter inneholdende disse SNP-variantene.

Eksempel 10

In vivo dyre- effektivitetsmodeller

Evnen av B7RP-1-antistoffer til å hemme immunrespons ble analysert ved anvendelse av et ”murinisert” (”murinized”) rotte anti-murint B7RP-1 monoklonalt antistoff (1B7v2) og provokasjon av BALB/c-mus med keyhole-limpet hemocyanin (KLH).

Fremstilling av det muriniserte rotte anti-murine B7RP-1 monoklonale antistoffet 1B7v2

En ovariecellelinje fra kinesisk hamster som overuttrykte en fullengde murin B7RP-1 ble injisert inn i rotter som en primær immunisering, og deretter med et murint B7RP-1-Fc fusjonsprotein for å boostre immunresponsen. Milter ble høstet 3 eller 4 dager etter intravenøs boost og milt B-cellene fusjonert med Y3-Ag1.2.3 rotte myelomlinjen (ATCC CRL-1631). Celler ble deretter selektert i media supplert med hypoksantin-aminopterin-tymidin (HAT) i 2 uker og deretter enkeltcelle subklonet ved begrensende fortynning. Disse metodene er beskrevet i "Practical Immunology, 2nd ed." Leslie Hudson og Frank C. Hay; Blackwell Scientific Publications 1980.

Gener som koder for 1B7 immunglobulinet ble klonet fra 1B7 cellelinjen ved anvendelse av standardmetoder (Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Isotype switchingen av de humane anti-huB7RP1 MAbs ble oppnådd ved kloning av variabel region-fragmentene inneholdende XbaI og BsmBI restriksjonssete kohesive ender inn i pDSRa-vektoren med den humane IgG1 eller huIgG2 konstante regionen som også hadde XbaI og BsmBI-ender. For 1B7 rotte anti-muB7RP1 ble kimærene dannet ved en tretrinns overlappende PCR-prosess.

Rotte variabel region ble PCR-amplifisert med en 3'-primer som inneholdt en del, ~25-35 nukleotider, av den murine konstante regionen. Den murine konstante regionen ble amplifisert med en 5'-primer som inneholdt en del, ~25-35 nukleotider, av rotte variabel region. De to fragmentene ble deretter anvendt som templat og 5' rotte variabel region (XbaI inneholdende) og murin 3' konstant region (SalI inneholdende)-primere ble anvendt for å danne en fullstendig lett kjede eller tung kjede. Lett kjede og tung kjede PCR-produktene ble deretter kløyvet med XbaI og SalI og klonet inn i pDSRa19. Totalt 25µg av linearisert DNA (12,5 µg pDC323B LC 12,5 µg pDC324 HC) ble transfektert inn i CS-9-celler ved anvendelse av elektroporering og selektert på DHFR-supplert medium.

For å test effektiviteten av 1B7v2 mAb, ble plate kostimulerings forsøk utført med dette mAb. Resultatene ble sammenlignet med andre anti-murine B7RP-1 mAbs (Figur 10A). Som beskrevet ovenfor er 1B7 den opprinnelige hybridomproduserte mAb; to forskjellige preparater (merket 1,33 og 7,4) ble testet. 5E1 og 11G10 var andre anti-mB7RP-1 monoklonale antistoffer dannet i fusjonene beskrevet ovenfor. Endelig var HK5,3 et kommersielt tilgjengelig anti-mB7RP-1 (ebiosciences # 16-5985-85).

1B7v2 mAb blokkerte T-celleaktivering i dette forsøket på høyde med eller bedre enn noen av de andre mAbs og ble følgelig valgt som surrogat terapeutisk middel for videre studier.

Antigen provokasjon i mus

Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) ble anskaffet fra Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois). Doseringsløsning nr. 1 (KLH 5 mg/kg i 1 mg/mus ALUM) ble fremstilt med like deler av 2x ALUM (500 mg av ALUM pluss 50 ml PBS (fosfatbufret saltoppløsning)) og 2x KLH (2,0 ml dH20 (RNAse-Fri) blandet med 20 mg av lyofilisert KLH, bragt til 20 ml med 1x PBS). Doseringsløsning nr.2 (KLH 1 mg/kg i 1 mg/mus ALUM) ble fremstilt med 1 del 2x KLH blandet med 4 deler 1x fosfatbufret saltoppløsning.

BALB/c hunnmus ble primet enten med 1 mg/kg av KLH/alum og reimmunisert ved dag 21 med 5 mg/kg KLH kun, innført ved intraperitoneal injeksjon. Mus ble behandlet ved intraperitoneal injeksjon med 1B7v.2, isotype kontroll-antistoffet (anti-AGP3 PB) eller konstituenten (PBS) alene, ved start på dag 1 (én dag før priming med KLH/alum) i et endelig volum på 200μl hver 5. dag.

Musen ble tappet hver 7. dag retro-orbitalt (omtrent 200μl) for å oppnå omtrent 50-100μl serum for analyse av antigen-spesifikt serum IgM (Figur 10B), IgG2a (Figur 10C) og IgG1 (Figur 10D). Både isotype-kontroll og konstituentbehandlede mus fremviste signifikante primære og sekundære immunresponser. IgM-responsen ble ikke påvirket ved behandling, mens blokkering av B7RP-1-ICOS med 1B7v2 reduserte både primære og sekundære IgG2a og IgG1-responser på en statistisk signifikant måte.

IL-5 er et cytokin frigjort av T-celler som respons på antigenstimulering som induserer B-celle-differensiering og funksjon. Ettersom B7RP-1/ICOS-interaksjonen er antatt å være kritisk for T-celle-avhengig B-cellefunksjon, ble måling av serum IL-5-nivåer anvendt for å bestemme hvorvidt umyndiggjøring av B7RP-1/ICOS aksen faktisk påvirket T-cellefunksjon. Blokkering av B7RP-1 hemmet også, som forventet, antigen-induserte serum IL-5-nivåer. Sera ble høstet fra musene fra antigen provokasjon-forsøket beskrevet ovenfor 24 timer etter antigen provokasjon ved dag 21 og serum IL-5-nivåer ble bestemt ved ELISA. Som vist i Figur 11 ble forhøyede IL-5-nivåer detektert i test-musene så tidlig som 9 timer etter provokasjon; nivåer begynte å gå tilbake ved 48 timer og gikk tilbake til baselinje ved 72 timer. Behandling av musene med 1B7v2 mAb fører til en statistisk signifikant repressjon av IL-5-nivåer ved 24-timers tidspunktet.

Eksempel 11

Binding til cynomolgusape B7RP-1

For å bestemme hvorvidt anti-hB7RP-1 mAbs også binder til cynomolgusape B7RP-1, ble strømningscytometrisk merking-forsøket utført med 16H mAb og B-celler renset fra cynomolgusaper og mennesker. Tilsetning av fluorescerende merket 16H til cyno B-celler fører til merking, som vist i Figur 12A, hvilket indikerer at 16H faktisk ble bundet til cyno B7RP-1 (høyre panel). Som forventet merket 16H også humane B-celler (venstre panel). I tillegg ble 16H, 16Hg og 5D testet i plate kostimulerings forsøk ved anvendelse av cyno T-celler, cyno B7RP-1-Fc og anti-CD3 mAb. Som vist i Figur 12B, hemmet alle tre mAbs cyno B7RP-1-avhengig cyno T-celleaktivering, hvilket indikerer at disse mAbs funksjonelt blokkerer cyno ICOS-B7RP-1-interaksjonen.

Eksempel 12

T-celleavhengige antigenresponser i Cynomolgusape etter administrering av anti-B7RP-1-antistoffene

Et cynomolgusape-studie ble utført med to anti-B7RP-1 monoklonale antistoffer, 16H og 5D, for å bedømme evnen av disse antistoffene til å hemme en T-celle-avhengig B-celle antigenrespons som bestemt ved serumnivåer av antigen-spesifikt antistoff. I korthet ble anti-keyhole limpet hemocyanin (KLH) og anti-tetanustoksoid antistoff-responser undersøkt etter antigen provokasjon i nærvær av B7RP-1 antistoffer i cynomolgusapen.

Test-produkt 1 var 16H og test-produkt 2 var 5D. Kontroll-produkt var konstituenten for B7RP-1-antistoff (0,01 natriumacetat, pH 5,0, 5% sorbitol, 0,004% Tween 20). Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) ble anskaffet fra Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois).

KLH ble fremstilt ved rekonstituering med sterilt vann, hvilket gir en 10 mg/ml stockløsning. Stockløsningen ble fortynnet med sterilt vann, hvilket gir en 1 mg/ml doseringsløsning. Tetanustoksoid anvendt for disse forsøkene var Super-Tet<® >Tetanus Toxoid w/Havlogen<®>, anskaffet fra Intervet<TM >Inc. (Milsboro, Delaware). Dosenivået for disse forsøkene var 75 IU (0,5 ml 150 IU/ml).

Tabell 6 viser behandlingsgruppe-fordelingen for 28 cynomolgusaper.

Tabell 6

Test-produkt-doser ble administrert via intravenøs injeksjon til alle dyrene ved dagene 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 og 50. Dyr registrert for nekropsi i Gruppene 1-4 (1/kjønn/gruppe) mottok en ytterligere dose ved dag 57. Evaluering av immunrespons ble utført på alle dyr gjennom immunisering med KLH og tetanustoksoid-antigener fulgt av blodprøvetaking for antigenspesifikke immunglobuliner (IgM og IgG).

Titer-verdier var til stede etter primær administrering av både KLH og tetanus-antigenene. For KLH varierte primære titer-verdier fra 0 til 900 for både IgM og IgG. Ettersom den primære KLH provokasjonen ble administrert før testprodukt-administrering, ble ingen effekt av B7RP-1 antistoffene evaluert. For tetanustoksoid varierte primære titer-verdier fra 0 til 50 for IgM og fra 0 til 4050 for IgG. Det var ingen forskjeller i den primære responsen på tetanustoksoid mellom B7RP-1 antistoff-gruppene og kontrollgruppen.

Som forventet ble titer-verdier for IgG økt etter sekundær administrering av både KLH og tetanus-antigenene, når sammenlignet med de primære titerverdiene. For KLH varierte sekundære titer-verdier fra 0 til 300 for IgM og fra 0 til 8100 for IgG. Imidlertid var det ingen bevis for hemming av KLH sekundær respons tilskrevet administrering av B7RP-1-antistoffene.

For tetanustoksoid var sekundære titer-verdier under 50 for IgM og varierte fra 1350 til 36450 for IgG. Resultater for individuelle dyr og gruppe gjenomsnittlige verdier er presentert i figur 13A (16H antistoff) og Figur 13B (5D antistoff) for dagene 53 og 57 etter den sekundære provokasjonen med tetanustoksoid ved dag 42.

Ved dag 53 var antallet dyr som nådde topp respons 3/4, 1/4 og 1/4 ved dosenivåene på 0,1, 1 og 8 mg/kg av 16H, henholdsvis og 1/4, 1/4 og 1/4 ved dosenivåene på 0,1, 1 og 8 mg/kg av 5D henholdsvis, sammenlignet med 2/4 kontrolldyr. Følgelig var, generelt, antall dyr som nådde en høy titer ved dag 53 redusert i de B7RP-1-antistoff-behandlede gruppene. Ved dag 57 var titer-verdier opprettholdt i kontrolldyrene, mens titer-verdier for mange av de B7RP-1-antistoffbehandlede dyrene avtok fra verdiene ved dag 53. Antall dyr med høye titere ved dag 57 var 0/4, 0/4 og 1/4 ved dosenivåene på 0,1, 1 og 8 mg/kg av 16H, henholdsvis og 0/4, 0/4 og 0/4 ved dosenivåene på 0,1, 1 og 8 mg/kg av 5D henholdsvis, sammenlignet med 2/4 kontrolldyr.

Disse resultatene viste at de to B7RP-1-antistoffene 16H og 5D hemmet en T-celle-avhengig B-celle antigen-respons i cynomolgusaper, som bestemt ved serumnivåer av tetanustoksoid-spesifikt antistoff. I tillegg var tilstedeværelsen av B7RP-1 antistoffene viktig for blokkering av B7RP-1-ICOS-interaksjonen under den primære responsen for å detektere en effekt etter den sekundære provokasjonen.

Disse resultatene og resultatene fra Eksempel 10 viste at både det surrogat terapeutiske midlet og de terapeutiske kandidatene blokkerte T og B celleavhengige immunresponser i murine og ape-modellsystemer, hvilket indikerte at blokkering av denne kostimulerende aksen kan være effektiv ved behandling av B-celle-medierte sykdommer slik som systemisk lupus erythematosus (SLE), astma og revmatoid artritt (RA).

Det skal forstås at foregående beskrivelse fremhever visse spesifikke utførelsesformer ifølge oppfinnelsen og at alle modifikasjoner eller alternativer ekvivalente dertil er innenfor idéen og omfanget av oppfinnelsen som angitt i de tilhørende kravene.

Claims

PATENTKRAV

1. Isolert antistoff som binder spesifikt til B7RP1, hvor antistoffet omfatter en tung kjede omfattende en CDR1 som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 27, en CDR2 som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 28, og en CDR3 som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 29, eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav, og en lett kjede omfattende en CDR1 som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 15, en CDR2 som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 16, og en CDR3 som har en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 17, eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav, og hvor antistoffet hemmer B7RP1-aktivitet.

2. Antistoff ifølge krav 1, hvor den tunge kjede variable regionen omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 7 eller 8, eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav.

3. Antistoff ifølge krav 1, hvor den lette kjede variable regionen omfatter en aminosyresekvens som angitt i SEKV ID NR: 1, eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

4. Polypeptid omfattende aminosyresekvensene som angitt i SEKV ID NR:

15, 16, 17, 27, 28, 29, og hvor polypeptidet binder spesifikt til B7RP1 og hemmer B7RP1-aktivitet.

5. Isolert antistoff eller fragment ifølge krav 1 som binder spesifikt til B7RP1, hvor antistoffet binder til SEKV ID NR: 67, men ikke til SEKV ID NR: 68 av det ekstracellulære domenet til B7RP1 og hemmer B7RP1-aktivitet.

6. Antistoff ifølge krav 1, som omfatter en aminosyresekvens som angitt i hvilket som helst av SEKV ID NR: 45 eller 46, eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav.

7. Antistoff ifølge krav 1 eller 5, hvor den tunge kjeden og den lette kjeden omfatter et enkeltkjede antistoff.

8. Antistoff ifølge krav 7, som er et enkeltkjede Fv-antistoff.

9. Antistoff ifølge krav 1 eller 5, som er et Fab-antistoff.

10. Antistoff ifølge krav 1 eller 5, som er et Fab’-antistoff.

11. Antistoff ifølge krav 1 eller 5, som er et (Fab’)2-antistoff.

12. Antistoff ifølge krav 1 eller 5, hvor antistoffet er et fullstendig humant antistoff.

13. Farmasøytisk sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer: og

en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 6 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav; eller

en terapeutisk effektiv mengde av polypeptidet ifølge krav 4.

14. Antistoff eller fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 5 til anvendelse som et medikament.

15. Polypeptid ifølge krav 4 til anvendelse som et medikament.

16. Antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 5 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulinfragment derav til anvendelse i behandling av en autoimmun sykdom eller inflammatorisk respons hos en pasient.

17. Polypeptid ifølge krav 4 til anvendelse i behandling av en autoimmun sykdom eller inflammatorisk respons hos en pasient.

18. Anvendelse av en farmasøytisk effektiv menge av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 5 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav, for preparering av en sammensetning for behandling av en B7RP1-mediert autoimmun sykdom eller inflammatorisk respons hos en pasient.

19. Anvendelse av en farmasøytisk effektiv mengde av polypeptidet ifølge krav 4 for preparering av en sammensetning for behandling av en B7RP1-mediert autoimmun sykdom eller inflammatorisk respons hos en pasient.

20. Anvendelse ifølge krav 18 eller 19, hvor den autoimmune sykdommen eller den inflammatoriske responsen er revmatoid artritt, astma, immunologisk trombocytopen purpura, multippel sklerose, diabetes, psoriasis, inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom, colitis ulcerosa, Graves sykdom, Hashimotos thyreoiditt eller systemisk lupus erythematosus.

21. Anvendelse av en farmasøytisk effektiv mengde av antistoffet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 5 eller et antigenbindende eller et immunologisk funksjonelt immunglobulin-fragment derav for preparering av en sammensetning for å hemme kostimulerende signal T-celleaktivering hos en pasient.

22. Fremgangsmåte for å detektere B7RP1 i en biologisk prøve, omfattende:

a) å bringe prøven i kontakt med antistoffet ifølge krav 1 eller 5 eller polypeptidet ifølge krav 4 under betingelser som tillater binding av antistoffet eller polypeptidet til B7RP1; og

b) å måle nivået av bundet antistoff eller polypeptid i prøven.

23. Nukleinsyremolekyl som koder for:

antistoffet ifølge krav 1 eller 5;

polypeptidet ifølge krav 4; eller

et polypeptid omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

(a) SEKV ID NR: 1 og 7,

(b) SEKV ID NR: 1 og 8,

(c) SEKV ID NR: 15, 16, 17, 27, 28 og 29,

(d) SEKV ID NR: 45 og 7,

(e) SEKV ID NR: 45 og 8, og

(f) SEKV ID NR: 1 og 46.

24. Vertscelle omfattende nukleinsyremolekylet ifølge krav 23.

25. Isolert cellelinje som produserer et antistoff ifølge hvilke som helst av kravene 1 eller 5, eller polypeptidet ifølge krav 4.

26. Ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyremolekylet ifølge krav 23.

27. Fremgangsmåte for å fremstille et antistoff eller et polypeptid omfattende å dyrke vertscellen ifølge krav 24 eller cellelinjen ifølge krav 25 og å samle antistoffet eller polypeptidet fra kulturmediet eller fra vertscellen.

28. Antistoff ifølge krav 1, hvor den lette kjede variable regionen omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 1 og den tunge kjede variable regionen omfatter aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 8.

29. Antistoff ifølge krav 28, hvor den lette kjeden videre omfatter en lett kjede konstant region omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 43; og hvor den tunge kjeden videre omfatter en tung kjede konstant region omfattende aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 41.

30. Antistoff ifølge krav 29, hvor den lette kjeden består av aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 45 og den tunge kjeden består av aminosyresekvensen som angitt i SEKV ID NR: 46.