ITUB20151014A1 - Ligandi del recettore b7h nel trattamento di osteopenia e osteoporosi - Google Patents
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo:
?Ligandi del recettore B7h nel trattamento di osteopenia e osteoporosi?
TESTO DELLA DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce un nuovo uso di ligandi del recettore B7h nel trattamento di osteopenia e osteoporosi.
SFONDO DELL?INVENZIONE
Gli osteoclasti sono cellule giganti formate per fusione tra cellule di precursori dei monociti-macrofagici e sono caratterizzati dalla presenza di pi? nuclei, numerosi vacuoli e lisosomi; essi ricoprono un ruolo chiave nello sviluppo e nel rimodellamento osseo, che coinvolge anche osteoblasti e osteociti. Gli osteoclasti si differenziano dai monociti per l?influenza del fattore di stimolazione delle colonie di macrofagi (M-CSF) e del ligando del recettore attivatore del fattore nucleare k-B (RANKL).
La funzione degli osteoclasti ? stimolata dall?attivazione del recettore attivatore del fattore nucleare-kappa B (RANK) espresso sulla membrana degli osteoclasti da RANKL. Nell?osso sano, la principale fonte di RANKL ? rappresentata dagli osteoblasti che lo esprimono come recettore di superficie in risposta a fattori di riassorbimento osseo e viene scisso in una molecola solubile (sRANKL) dalle metalloproteinasi (MMP). Inoltre, RANKL ? espresso anche da cellule stromali, linfociti e macrofagi i quali possono supportare la funzione degli osteoclasti durante l?infiammazione. L?osteoprotegerina (OPG) ? un recettore solubile di RANKL ed ? secreta dagli osteoblasti e dalle cellule stromali per inibire la stimolazione di RANK e l?osteoclastogenesi indotte da RANKL. Il legame di M-CSF al suo recettore del fattore 1 di stimolazione delle colonie (c-fms) sui progenitori degli osteoclasti sovraregola l?espressione di RANK in queste cellule e favorisce l?osteoclastogenesi. La differenziazione degli osteoclasti include la polarizzazione delle cellule con formazione di una membrana increspata e sigillatura degli osteoclasti all?osso con formazione di una zona di sigillatura, o zona chiara, che separa le lacune di riassorbimento dall?ambiente circostante. Questo ? il sito di secrezione di acido, fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP), catepsine, e MMP che portano alla demineralizzazione della componente inorganica dell?osso e all?idrolisi dei suoi componenti organici. Quindi, i meccanismi di accoppiamento favoriscono la differenziazione e il reclutamento degli osteoblasti nelle lacune di riassorbimento, in cui essi secernono la componente organica dell?osso che viene quindi mineralizzata dall?idrossiapatite. Alcuni osteoblasti intrappolati all?interno della matrice diventano osteociti e secernono sclerostina che inibisce la funzione degli osteoblasti e chiude quindi il ciclo di rimodellamento. L?espressione della sclerostina viene inibita quando gli osteociti sono esposti a forze meccaniche, il che focalizza il rimodellamento osseo nelle aree di massima sollecitazione.
Un eccesso di attivit? osteoclastica porta a una perdita ossea patologica e si pu? rivelare in condizioni come osteoporosi, artrite reumatoide e altre malattie autoimmuni, in cui un ruolo chiave ? stato attribuito alle citochine infiammatorie e all?immunit? adattativa. Inoltre, alcune neoplasie che coinvolgono le cellule immunitarie, come il mieloma multiplo, sono caratterizzate da intense erosioni ossee focali attribuite all?elevata espressione di RANKL da parte di cellule stromali e, forse, di cellule neoplastiche. Anche le metastasi ossee di tumori solidi possono essere osteolitiche e il cancro della prostata pu? favorire il riassorbimento osseo attraverso l?espressione di una forma solubile di RANKL.
Diverse citochine infiammatorie, come TNF-?, interleuchina (IL)-1, IL-6 e M-CSF sovraregolano l?espressione di RANKL e stimolano la funzione degli osteoclasti. Un ruolo chiave ? ricoperto dalle cellule T helper tipo 17 (Th17) che secernono IL-17 che induce l?espressione di RANKL negli osteoblasti e nelle cellule sinoviali. Inoltre, IL-17 supporta il reclutamento di diversi tipi di cellule immunitarie che contribuiscono al danneggiamento osseo e producono citochine e altre molecole proinfiammatorie che supportano la differenziazione e l?attivit? degli osteoclasti.
B7h (noto anche come CD275, B7H2, B7-RP1, ICOSL, GL50) appartiene alla famiglia B7 di recettori di superficie e si lega a ICOS (CD278), che appartiene alla famiglia CD28<1-5>. ICOS ? selettivamente espresso da cellule T attivate, mentre B7h ? espresso da una grande variet? di tipi di cellule, tra cui cellule B, macrofagi, cellule dendritiche e un sottogruppo di cellule T. Tuttavia, B7h ? espresso anche da cellule di origine non ematopoietica come cellule endoteliali vascolari, cellule epiteliali, e fibroblasti, e in molti tumori primari e linee cellulari tumorali. La principale funzione nota di B7h ? la stimolazione di ICOS, che agisce da molecola di costimolazione per cellule T attivate, modulando la loro secrezione di citochine e, soprattutto, aumentando la secrezione di Interferone (IFN)-? (nell?uomo), IL-4 (nei topi) e IL-10, IL-17 e IL-21 (in entrambe le specie). Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che l?interazione B7h:ICOS pu? innescare segnali bidirezionali in grado di modulare anche la risposta delle cellule che esprimono B7h. Nelle cellule dendritiche di topo questa ?segnalazione inversa? mediata da B7h ne induce la maturazione parziale con un aumento notevole della secrezione di IL-6. Nelle cellule dendritiche umane, si ? riscontrato che modula la secrezione di citochine, favorisce la capacit? di cross-presentare antigeni internalizzati per endocitosi in molecole MHC di classe I, e inibisce l?adesione alle cellule endoteliali e la migrazione. La stimolazione di B7h inibisce anche l?adesione e la migrazione di cellule endoteliali e di linee tumorali. Questi effetti sono accompagnati da una riduzione della fosforilazione di ERK e p38 in cellule endoteliali; una riduzione della fosforilazione di FAK e una sotto-modulazione di ?-Pix in cellule endoteliali e in cellule tumorali. Infine, l?attivazione di B7h inibisce lo sviluppo di metastasi del polmone in seguito all?iniezione di cellule CF-PAC1 in topi NOD-SCID-IL2R?null e di cellule B16-F10 in topi C57BL/6.
SCOPO E SINTESI DELL?INVENZIONE
La presente descrizione si riferisce all?espressione del recettore B7h negli osteoclasti e alla stimolazione del recettore B7h per ridurre e/o inibire la differenziazione, la maturazione e/o l?attivit? degli osteoclasti.
Lo scopo della presente invenzione ? quello di fornire nuovi composti per il trattamento di osteoporosi o osteopenia.
Secondo l?invenzione, il suddetto scopo viene raggiunto grazie al procedimento specificato nelle rivendicazioni che seguono, che si intendono quale parte integrante della presente descrizione.
In una forma di realizzazione, la presente descrizione descrive un nuovo uso di ligandi del recettore B7h nel trattamento di osteoporosi e osteopenia.
In una ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione si riferisce all?utilizzo del recettore B7h come bersaglio per lo screening di agenti farmaceutici attivi utili nel trattamento di osteopenia e osteoporosi, in cui l?agente farmaceutico attivo interferisce con la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti, inibendo quindi l?osteoclastogenesi.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
L?invenzione verr? ora descritta, solo a titolo di esempio, con riferimento alle figure dei disegni allegate, in cui:
- Figura 1: Analisi morfologica ed espressione di CD14, B7h e Catepsina-K in osteoclasti derivati da monociti (MDOC). A) Le cellule sono state fotografate al giorno 0 (T0), al giorno 14 (T14) e al giorno 21 (T21) di coltura in presenza di M-CSF (25 ng/ml) e RANKL (30 ng/ml) al microscopio a contrasto di fase. B) L?espressione di CD14, B7h e Catepsina-K ? stata valutata mediante citometria a flusso in MDOC al T0, T14 e T21. I numeri in ogni riquadro indicano la % di cellule positive. I riquadri sono rappresentativi di 5 esperimenti.
- Figura 2: Effetto di ICOS-Fc sulla differenziazione degli osteoclasti. I monociti sono stati indotti a differenziarsi in MDOC in presenza e assenza di ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFc(1 ?g/ml) o F119SICOS-Fc (1 ?g/ml) aggiunti al giorno 0 (trattamento T0-21). A) Le cellule sono state fotografate al T10 e al T21 al microscopio a contrasto di fase. B) L?espressione di CD14 e di Catepsina-K ? stata valutata mediante citometria a flusso in MDOC al T10 e T21. I numeri in ogni riquadro indicano la % di cellule positive rispetto al controllo negativo interno. I riquadri sono rappresentativi di 5 esperimenti.
- Figura 3: Effetto di ICOS-Fc sulla differenziazione degli osteoclasti. I monociti sono stati indotti a differenziarsi in MDOC in presenza e assenza di ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFc (1 ?g/ml) o F119SICOS-Fc (1 ?g/ml) aggiunti dal giorno 14 (trattamento T14- 21). A) Le cellule sono state fotografate al T21 al microscopio a contrasto di fase. B) L?espressione di CD14 e Catepsina-K ? stata valutata mediante citometria a flusso in MDOC al T21. I numeri in ogni riquadro indicano la % di cellule positive rispetto al controllo negativo interno. I riquadri sono rappresentativi di 3 esperimenti. C) I grafici a barre mostrano il numero di nuclei contati in ogni campo al giorno 21 (media di 5 campi); i dati sono espressi come media ? errore standard della media (SEM) di 3 esperimenti indipendenti (*: p<0,01 rispetto al controllo).
- Figura 4: Effetto di ICOS-Fc sulla differenziazione degli osteoclasti. I monociti sono stati indotti a differenziarsi in MDOC in presenza e assenza di ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFc (1 ?g/ml) o F119SICOS-Fc (1 ?g/ml) aggiunti dal giorno 7 (trattamenti T7-21 e T7-14). A) Le cellule sono state fotografate al T21 al microscopio a contrasto di fase. B) L?espressione di CD14 e Catepsina-K ? stata valutata mediante citometria a flusso in MDOC al T21. I numeri in ogni riquadro indicano la % di cellule positive rispetto al controllo negativo interno. I riquadri sono rappresentativi di 3 esperimenti.
- Figura 5: Effetto di ICOS-Fc sugli osteoclasti differenziati. Dopo 21 giorni di coltura per la differenziazione, MDOC sono stati coltivati in presenza e assenza di ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFC (1 ?g/ml) o
F119SICOS-Fc (1 ?g/ml) per altri 3 giorni (trattamento T21-24), lavati e quindi coltivati per altri 4 giorni (T25-T28). A) Le cellule sono state fotografate al T24, T25 e T28 al microscopio a contrasto di fase. B) L?espressione di CD14 e Catepsina-K ? stata valutata mediante citometria a flusso in MDOC al T24, T25 e T28. I numeri in ogni riquadro indicano la % di cellule positive rispetto al controllo negativo interno. I riquadri sono rappresentativi di 3 esperimenti.
- Figura 6: Effetto di ICOS-Fc sulla colorazione per TRAP. MDOC differenziati da monociti sono stati trattati con o senza ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFC (1 ?g/ml) o
F119SICOS-Fc (1 ?g/ml), come descritto nella Figura 2 (trattamento T14-21) . Al giorno 21, lo strato di cellule ? stato colorato con Fast Garnet GBC Base Solution per valutare l?attivit? di TRAP. A) Microfotografie dell?area di colorazione sono state scattate per monitorare le cellule TRAP-positive (n=3). B) I grafici a barre mostrano la % di cellule TRAP+; i dati sono espressi come media ? SEM della percentuale di inibizione rispetto al controllo da 3 esperimenti indipendenti (*: p<0,01 rispetto al controllo).
- Figura 7: Effetto della stimolazione di B7h sul rimodellamento per effetto dell?actina. MDOC differenziati da monociti sono stati trattati con o senza ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFc (1 ?g/ml) o F119SICOS-Fc (1 ?g/ml), come descritto nella Figura 2 (trattamento T14-21). A) Le cellule sono state colorate con fluoresceina isotiocianato (FITC)-falloidina che marca l?actina e sono state fotografate con un microscopio a fluorescenza il Giorno 21. B) I grafici a barre mostrano la % delle cellule positive all?anello perinucleare di actina-F; i dati sono espressi come media ? SEM della percentuale di aumento rispetto al controllo da 3 esperimenti indipendenti (*: p<0,05 rispetto al controllo).
- Figura 8: Effetto della stimolazione di B7h sull?attivit? osteolitica degli osteoclasti. I monociti sono stati piastrati su piastre Osteo Surface e sono stati indotti a differenziarsi in osteoclasti in presenza e assenza di ICOS-Fc (1 ?g/ml), ICOS-msFc (1 ?g/ml) o
F119SICOS-Fc (1 ?g/ml), come descritto nella Figura 2 (trattamento T14-21). Al Giorno 21, i supernatanti della coltura sono stati raccolti ed esaminati per il rilascio di calcio. I dati rappresentano la media ? SEM della percentuale di inibizione rispetto al controllo da 4 esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato. (*: p <0,05 vs controllo).
- Figura 9: Effetti del trattamento con ICOS-Fc in un modello murino di osteoporosi. A topi femmina C57BL/6 di sette settimane ? stato iniettato per via intraperitoneale (i.p.) 1 mg/Kg di sRANKL, a intervalli di 24 ore (h) per 3 giorni insieme a 100 ?g/ml di ICOS-Fc murino (msICOS-huFc) (n=3), o 100 ?g/ml di F119SICOS-Fc umano (n=3) o tampone fosfato isotonico (PBS, gruppo di controllo, n=3). I topi sono stati sacrificati 4 h dopo l?ultima iniezione. A) Colorazione di sezioni non decalcificate di tibia e femore nei diversi gruppi di trattamento con iniezione. B) Istogramma che mostra la % media ? SEM di osso calcificato nella regione corticale (**: p<0,01 o ***: p <0,001 rispetto ai topi di controllo che non hanno ricevuto trattamenti).
- Figura 10: Sequenza amminoacidica del costrutto ICOS-Fc (SEQ ID No.: 1).
- Figura 11: Sequenza amminoacidica di ICOS umano (SEQ ID No.: 29); gli aminoacidi sottolineati corrispondono alla porzione extracellulare di ICOS (SEQ ID No: 2).
- Figura 12: Sequenza amminoacidica del recettore B7h umano (SEQ ID No.:27).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE L?invenzione verr? ora descritta dettagliatamente, a titolo di esempio non limitativo, con riferimento ad un nuovo uso di ICOS, ligando naturale del recettore B7h, per il trattamento di osteoporosi e osteopenia.
? evidente che lo scopo della presente descrizione non ? in alcun modo limitato all?uso di ICOS soltanto; altri ligandi del recettore B7h possono venire utilizzati nel trattamento di osteoporosi e osteopenia, in cui tali ligandi sono in grado di ridurre/inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti inibendo cos? la perdita ossea indotta dagli osteoclasti in quanto in grado di stimolare l?attivit? del recettore B7h negli osteoclasti.
Nella seguente descrizione, numerosi dettagli specifici sono riportati al fine di permettere una comprensione approfondita delle forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono venire messe in pratica senza uno o pi? dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non sono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
In tutta la presente descrizione, il riferimento a ?una sola forma di realizzazione? o ?una forma di realizzazione? indica che una particolare funzione, struttura o caratteristica descritta in relazione alla forma di realizzazione ? inclusa in almeno una sola forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni ?in una sola forma di realizzazione? o ?in una forma di realizzazione? in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferiscono necessariamente tutte alla stessa realizzazione. Inoltre, le particolari funzioni, strutture o caratteristiche possono venire combinate in qualsiasi modo in una o pi? forme di realizzazione.
I titoli forniti in questa sede sono solo per convenienza e non interpretano lo scopo o il significato delle forme di realizzazione.
La presente descrizione si riferisce a un nuovo uso di ligandi del recettore B7h nel trattamento di osteoporosi e osteopenia.
In una forma di realizzazione, il ligando del recettori B7h utile nel trattamento di osteoporosi e osteopenia viene scelto tra:
a) una proteina ICOS umana avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29;
b) un omologo della proteina ICOS umana avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29;
c) una porzione della sequenza amminoacidica di ICOS umano riportata in SEQ ID No.: 29 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e di inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della proteina ICOS nativa;
d) un dominio extracellulare di ICOS umano avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2;
e) una porzione del dominio extracellulare di ICOS umano della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2; oppure
f) un omologo del dominio extracellulare di ICOS umano avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 ed avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2.
In una forma di realizzazione, la presente descrizione si riferisce all?utilizzo del recettore B7h come bersaglio per lo screening di agenti farmaceutici attivi utili nel trattamento di osteopenia e osteoporosi, in cui l?agente farmaceutico attivo interferisce con la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti e si lega al recettore B7h e stimola l?attivit? di recettore B7h.
In una ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione fornisce una composizione farmaceutica per l?uso nel trattamento di osteoporosi e osteopenia, comprendente almeno un ligando del recettore B7h e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
In una forma di realizzazione, la composizione farmaceutica comprende almeno un ligando del recettore B7h scelto tra:
a) una proteina ICOS umana avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29;
b) un omologo della proteina ICOS umana avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29;
c) una porzione della sequenza amminoacidica di ICOS umano riportata in SEQ ID No.: 29 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e di inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della proteina ICOS nativa;
d) un dominio extracellulare di ICOS umano avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2;
e) una porzione del dominio extracellulare di ICOS umano della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2; oppure
f) un omologo del dominio extracellulare di ICOS umano avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 ed avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2.
In ancora una ulteriore forma di realizzazione, la presente descrizione fornisce un procedimento di identificazione di un agente farmaceutico attivo adatto per l?uso nel trattamento di osteopenia e osteoporosi, comprendente le fasi di: a) fornire un agente di prova, b) portare a contatto l?agente di prova con osteoclasti che esprimono il recettore B7h, c) testare la capacit? dell?agente di prova di ridurre la maturazione, la differenziazione e/o la funzione degli osteoclasti, d) selezionare l?agente di prova che riduce la maturazione, la differenziazione e/o la funzione degli osteoclasti come agente attivo utile nel trattamento di osteopenia e osteoporosi, in cui l?agente attivo si lega al recettore B7h e stimola l?attivit? di recettore B7h. Preferibilmente il procedimento prevede la misurazione della secrezione di fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) da parte degli osteoclasti, l?organizzazione dell?actina nel citoscheletro cellulare negli osteoclasti e/o il rilascio di calcio da parte degli osteoclasti.
In una diversa forma di realizzazione, la presente descrizione si riferisce a un procedimento di trattamento dell?osteoporosi o dell?osteopenia comprendente le fasi di: provvedere un paziente affetto da osteoporosi o osteopenia, somministrare al paziente un medicamento comprendente un ligando del recettore B7h, ridurre quindi l?osteoporosi o l?osteopenia nel paziente.
Il rimodellamento osseo ? un processo complesso gestito da osteoblasti e osteoclasti e il sistema immunitario ? coinvolto nella regolazione della funzione di queste cellule attraverso l?attivit? di citochine e recettori di superficie.
La presente descrizione descrive un nuovo percorso implicato nelle interazioni linfociti/cellule ossee dimostrando che il legame di ICOS, espresso dalle cellule T attivate, con il suo ligando B7h, espresso dagli osteoclasti, inibisce la maturazione e la funzione degli osteoclasti. Questi effetti sono stati rivelati utilizzando ICOS-Fc, una forma solubile ricombinante di ICOS, ed erano specifici in quanto non sono stati mostrati da <F119S>ICOS-Fc, una forma mutata di ICOS-Fc incapace di legarsi con B7h.
L?effetto sulla differenziazione degli osteoclasti ? stato rivelato trattando le cellule con ICOS-Fc durante la differenziazione in vitro di monociti ad osteoclasti guidata da M-CSF e RANKL. ICOS-Fc ha bloccato quasi completamente la differenziazione quando il trattamento ? stato iniziato all?inizio delle tre settimane di coltura per la differenziazione, tuttavia ha arrestato la differenziazione anche quando il trattamento ? stato iniziato nell?ultima settimana, come mostrato dalla diminuita multinuclearit? delle cellule e dall?arresto dell?acquisizione delle caratteristiche morfologiche e fenotipiche degli osteoclasti indotti dal trattamento con ICOS-Fc. Questo effetto non ? dovuto alla tossicit? cellulare in quanto la sopravvivenza delle cellule era normale anche quando le colture sono state prolungate fino alla quarta settimana.
Inoltre l?effetto era reversibile poich? l?interruzione del trattamento nell?ultima settimana di coltura ha permesso alle cellule di riavviare il percorso di differenziazione degli osteoclasti. L?arresto della differenziazione ? stato accompagnato da una alterata organizzazione dell?actina nel citoscheletro in cui, in cellule trattate con ICOS-Fc, ? stata rivelata una distribuzione perinucleare in un anello di actina F senza i segni di polarizzazione tipici della zona sigillante che delimita la lacuna erosiva rivelata sugli osteoclasti. In linea con questi dati, le cellule trattate con ICOS-Fc hanno mostrato una diminuita espressione di TRAP e una ridotta attivit? osteolitica in vitro.
Un secondo punto chiave ? stato l?effetto di ICOS-Fc sugli osteoclasti gi? differenziati, in cui il trattamento con ICOS-Fc ha indotto una riduzione notevole delle dimensioni di cellule e nuclei, senza effetti sostanziali sulla vitalit? cellulare. Anche in questo caso l?effetto ? stato reversibile poich? le cellule si sono nuovamente ingrandite e hanno nuovamente assunto il fenotipo di osteoclasti dopo l?interruzione del trattamento.
Questi effetti in vitro sulla differenziazione e sulla funzione degli osteoclasti sono supportati dai risultati in vivo che dimostrano come il trattamento con ICOS-Fc inibisce in modo molto evidente il riassorbimento osseo sistemico indotto nei topi mediante trattamento con alte dosi di RANKL solubile, che ? un modello murino di osteoporosi paragonabile al modello di ovariectomia in termini di diminuzione della densit? ossea.
Il sistema immunitario ? in grado di modulare l?ossificazione, e la perdita ossea ? una caratteristica comune di diverse malattie autoimmuni e infiammatorie croniche. Infatti, il rischio di osteoporosi ? maggiore nei pazienti con artrite reumatoide, malattia infiammatoria dell?intestino o lupus eritematoso sistemico, e una distruzione ossea aggressiva localizzata pu? essere una caratteristica di certe malattie autoimmuni, cancri e infezioni.
I pazienti affetti da artrite reumatoide presentano tre tipi di implicazione ossea: osteoporosi, perdita ossea periarticolare, ed erosioni articolari. Le citochine infiammatorie come IL-1, IL-6 e TNF-? sono abbondanti nella membrana sinoviale e nel liquido sinoviale e possono indurre RANKL sui fibroblasti sinoviali e sulle cellule stromali. Inoltre, RANKL ? espresso dalle cellule T e B nel tessuto e nel liquido sinoviale di pazienti con artrite reumatoide e pu? essere implicato nell?attivazione degli osteoclasti, e anticorpi contro proteine citrullinate, che sono un marcatore dell?artrite reumatoide, possono avere un effetto stimolante sugli osteoclasti.
La deficienza di estrogeni durante la menopausa pu? comportare un aumento dell?attivit? degli osteoclasti a causa dell?eliminazione di un effetto inibitorio degli estrogeni sulla differenziazione e sulla funzione degli osteoclasti, ma anche a causa di un aumento della produzione di citochine infiammatorie come TNF-? e IL-17 e di un aumento dell?espressione di RANKL di cellule B e T.
Nel controllo immunitario dell?ossificazione, un ruolo chiave ? stato attribuito alle cellule T helper. Le cellule Th1 e Th2 secernono rispettivamente IFN-? e IL-4, che sono citochine anti-osteoclastogeniche. Di contro, le cellule Th17 esprimono alti livelli di RANKL e secernono IL-17 indicendo l?espressione di RANKL sulle cellule mesenchimali e il reclutamento di cellule infiammatorie. Inoltre le cellule Th17 secernono anche IL-22 che pu? indurre la differenziazione degli osteoblasti migliorando l?ossificazione nei siti di infiammazione. Le cellule possono anche agire usando recettori di superficie in quanto il loro CD40L pu? stimolare CD40 sulle cellule stromali, inducendo queste cellule ad esprimere RANKL e sopprimendo l?espressione di OPG, sottoregolando l?attivit? dell?asse RANKL/RANK. Inoltre l?osteoclastogenesi pu? essere inibita anche da cellule T regolatrici (Treg) attraverso il rilascio del fattore di crescita trasformante ? (TGF?) e l?espressione superficiale dell?antigene 4 dei linfociti T citotossici (CTLA4), che ? in grado di inibire la formazione di osteoclasti legandosi ai suoi ligandi B7.1 e B7.2, espressi sui monociti e prevenendo la loro differenziazione ad osteoclasti. Questo risultato ? interessante in quanto CTLA4 e ICOS appartengono alla famiglia di recettori co-stimolatori CD28 e si legano a recettori di superficie appartenenti alla famiglia B7. Inoltre, anche ICOS ? coinvolto nella funzione di Treg in quanto, in condizioni adatte, la stimolazione di ICOS pu? indurre la differenziazione di Treg e la secrezione di TGF? da parte di cellule Th na?ve, e sottotipi di cellule Treg esprimono alti livelli di ICOS. L?effetto mostrato dalla stimolazione di B7h sugli osteoclasti sembra essere pi? ampio di quello mostrato dallo stimolo di B7.1/B7.2 in quanto inibisce anche reversibilmente la funzione di osteoclasti differenziati.
Il recettore B7h umano ha la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 27.
La proteina ICOS umana, il ligando naturale del recettore B7h, ha la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29.
I ligandi del recettore B7h utili per il trattamento di osteoporosi e osteopenia possono venire scelti tra ligandi di origine naturale, sintetica o ricombinante del recettore B7h come, per esempio, ICOS o sue porzioni, composti a molecole piccole, aptameri, anticorpi, peptidi, dominanti positivi del recettore B7h, in cui tali ligandi si legano al recettore B7h e sono in grado di stimolare l?attivit? di recettore B7h.
I ligandi del recettore B7h possono essere fusi o coniugati ad una o pi? molecole stabilizzanti al fine di ridurre o prevenire la degradazione, per aumentare l?emivita e/o la solubilit?, per ridurre la tossicit? e/o l?immunogenicit?.
L?uso di molecole in grado di stabilizzare una proteina per la sua somministrazione ad un mammifero ? una tecnica ampiamente nota nel settore.
I ligandi del recettore B7h possono essere coniugati ad un anticorpo per aumentare la specificit?, la farmacocinetica, e/o la biodistribuzione, sfruttando le propriet? degli anticorpi di legarsi specificamente a un osteoclasto o ad un altro componente osseo.
Molecole stabilizzanti che possono essere coniugate ad un ligando del recettore B7h possono essere selezionate tra:
- Polietilenglicoli (PEG) o loro derivati. Derivati di PEG in grado di legarsi ai gruppi amminici presenti sui ligandi del recettore B7h sono i.a. epossido PEG, aldeide PEG, nitrofenile carbonato PEG e succinimidilestere PEG; derivati di PEG in grado di legarsi ai gruppi tiolo presenti sui ligandi del recettore B7h sono i.a. composti di ortopiridildisolfuro PEG; derivati di PEG in grado di legarsi ai gruppi ossidrile presenti sui ligandi del recettore B7h sono i.a. PEG-COOH attivato con N-idrossisuccinimmide o idrossibenzotriazolo. Altri derivati di PEG sono rappresentati da PEG-poliacetale con idrolisi pH-dipendente, e PEG-destrina (terapia con proteina non mascherata-mascherata con polimero, PUMPT).
- poli-L-lisina citrammide (tramite uno spaziatore di lisina o di etilcarbammato), anidride di acido stirenmaleico e poli-idrossipropilmetacrilammide.
Al fine di aumentare l?indirizzamento del ligando del recettore B7h nel sito di trattamento, ovvero gli osteoclasti che esprimono il recettore B7h, i ligandi del recettore B7h possono anche venire iperglicosilati o coniugati a residui di mannosio.
L?iperglicosilazione pu? venire eseguita mediante reazioni chimiche in situ o mediante mutagenesi sitodiretta con conseguente glicosilazione della proteina N-legata od O-legata. Nella glicosilazione N-legata la catena di saccaride ? legata all?asparagina della sequenza tripeptidica Asn-X-Ser/Thr, in cui X rappresenta un amminoacido diverso da una prolina. L?acido polisialico (PSA) viene spesso usato per l?iperglicosilazione. PSA ad alto molecolare sono adatti per l?indirizzamento di farmaci e peptidi a basso peso molecolare, mentre PSA con peso molecolare inferiore possono venire usati per proteine grandi cos? come per sistemi di indirizzamento di farmaci particolati.
La coniugazione a residui di mannosio induce il legame del coniugato ai recettori del mannosio, di cui si riporta che sono espressi su cellule di Kupffer, macrofagi, alveolari, cellule dendritiche derivate da monociti e sottogruppi di cellule endoteliali vascolari e linfatiche. Le proteine mannosilate possono venire riconosciute da lectine mannosio-specifiche, vale a dire, recettori del mannosio ed MBP.
L?indirizzamento del ligando del recettore B7h pu? anche venire aumentato sfruttando sistemi di indirizzamento di farmaci colloidali noti nella tecnica, in cui i vettori colloidali possono venire selezionati i.a. tra microparticelle, nanoparticelle e liposomi. Le microparticelle sono generalmente formate da polimeri biodegradabili come, per esempio, amido, alginato, collagene, poli(lattide-co-glicolide) (PLGA), policaprolattoni (PCL). Le nanoparticelle vengono solitamente prodotte con polimeri naturali o sintetici, come chitosano, alginato, PCL, acido polilattico (PLA), poli(glicolide), PLGA. I liposomi possono anche venire modificati in superficie con PEG al fine di interferire con il riconoscimento e l?assorbimento da parte del sistema reticolo-endoteliale e di prolungare il tempo di circolazione. Inoltre, gli idrogel termosensibili in situ subiscono la transizione di fase sol-gel in risposta a variazioni di temperatura.
Materiali e Metodi
Cellule
Cellule Mononucleate di Sangue Periferico (PBMC) sono state ottenute, mediante centrifugazione in gradiente di densit?, da campioni di sangue umano di donatori sani che hanno sottoscritto il loro consenso informato. Gli osteoclasti sono stati preparati da monociti CD14+, isolati da PBMC con EasySepTM Human CD14 Negative Selection Kit (cod. 19059, StemCells Techologies, Vancouver, BC, Canada). In particolare, 0,5?106 monociti sono stati piastrati in una piastra da 24 pozzetti (cod. 662160, Greiner Bio-One, Capital DriveMonroe, NC, USA) e coltivati per 21 giorni in un mezzo di differenziazione, composto da DMEM (cod. 41966-029 Invitrogen, Burlington, ON, Canada, USA), e dal 10% di Siero Fetale Bovino (FBS, cod. 10270, Invitrogen), integrato con M-CSF umano ricombinante (25 ng/ml, cod. 216-MC, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) e RANKL (30 ng/ml, cod. 390-TN, R&D Systems). Il mezzo di differenziazione ? stato sostituito ogni 3 giorni. A tempi diversi, le cellule sono state trattate con 1 ?g/ml di ICOS-Fc (SEQ ID No.: 1 -una proteina di fusione contenente la porzione extracellulare di ICOS umano (SEQ ID No.: 2)) fusa con l?Fc di IgG1 umana (SEQ ID No.: 3)) o ICOS-msFc (SEQ ID No.: 4 -una molecola chimerica contenente la porzione extracellulare di ICOS umano (SEQ ID No.: 2) fusa con l?Fc di IgG1 murina (ID SEQ No.: 5)). I controlli sono stati eseguiti utilizzando F119SICOS-Fc (SEQ ID No.: 6 - in cui la forma mutata della porzione extracellulare di ICOS umano (SEQ ID No.: 7) che presenta la sostituzione F119S ? fusa con l?Fc di IgG1 umana (SEQ ID No.: 3)) e msICOShuFc (SEQ ID No.: 24 - una proteina di fusione contenente la porzione extracellulare di ICOS murino (SEQ ID No.: 28)) fusa con l?Fc di IgG1 umana (SEQ ID No.: 3)).
Clonazione e produzione di ICOS
La porzione extracellulare di ICOS umano o murino ? stata clonata in un vettore di espressione eucariotico modificato derivato dal plasmide pcDNA3.1/Hygro(+) (cod. V870-20, Invitrogen) e riportata come p-Minibody (pMB-SV5) da Di Niro R. et al.6, PubMed ID: 17678525. Questo vettore differisce da quello originale per: la sequenza di Kozak (5? CCACATGG 3? - SEQ ID No.: 8) che ? necessaria per l?inizio della traduzione in cellule eucariotiche; la sequenza leader secretoria (5? GCTGGAGCCTGATCCTCCTGTTCCTCGTCGCTGTGGCTACA 3? - SEQ ID No.: 9) che ? stata introdotta per consentire il rilascio della proteina nei supernatanti di coltura; la mini-sequenza intronica (5? GTAAGGGGCTCACAGTAGCAGGCTTGAGGTCTGGACATATATATGGGTGACAATGACAT CCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG 3? - SEQ ID No.: 10) per aumentare il livello di espressione della proteina. ? stata introdotta una sequenza marcatore il cui bersaglio ? la proteina prodotta e deriva dal Virus della Scimmia 5 (marcatore SV5) (5? GGCAAACCAATCCCAAACCCACTGCTGGGCCTGGATAGTACT 3? - SEQ ID No.: 11) ed ? utile per il riconoscimento della proteina da parte di un anticorpo monoclonale. Questo vettore ha permesso di clonare i frammenti di interesse in frame con la sequenza codificante del frammento costante umano o murino del dominio dell?immunoglobulina IgG1 (Fc), le cui sequenze nucleotidiche sono riportate, rispettivamente, in SEQ ID No.: 30 e 31.
Per generare il costrutto ICOS-Fc (SEQ ID No.: 1), la sequenza nucleotidica codificante la porzione extracellulare di ICOS umano (SEQ ID No.: 12) ? stata amplificata con primer specifici: primer BsshII diretto per ICOS (5? GGCGCGCATGCCGAAATCAATGGTTCTGCC 3? - SEQ ID No.: 13, Sigma-Genosys, The Woodlands, TX, USA) e primer NheI inverso per ICOS (5? GCTAGCAAGTTGTGATTCATAAATATGC 3? - SEQ ID No.: 14, Sigma-Genosys). I frammenti amplificati sono stati digeriti con gli enzimi BssHII (cod. R0199S, New England Biolabs inc, Ipswich, MA, USA) e NheI (cod. R0131S, New England Biolabs inc). I frammenti doppiamente digeriti sono stati clonati nel plasmide pMB-SV5 precedentemente descritto. La sequenza nucleotidica ? stata determinata mediante sequenziamento.
La sequenza nucleotidica del vettore di espressione codificante per ICOS-Fc ? riportata in SEQ ID No: 21.
Nel caso del clonazione di ICOS-msFc (SEQ ID No.: 4), ? stato seguito lo stesso protocollo precedentemente descritto, ad eccezione del fatto che il vettore pMB-SV5 conteneva la sequenza codificante per il dominio Fc murino (SEQ ID No.: 31).
La sequenza nucleotidica del vettore di espressione codificante per ICOS-msFC ? riportata in SEQ ID No.: 22.
Per generare il costrutto F119SICOS-Fc umano mutato (SEQ ID No.: 6), ? stata introdotta la mutazione F119S nella porzione extracellulare di ICOS umano con un primer diretto (5? TCAATTTTTGATCCTCCTCCTTCTAAAGTAACTCTTACAGG 3? ? SEQ ID No.: 15, Sigma- Genosys), che si ibrida in corrispondenza del sito di digestione di BseRI e con il primer NheI inverso per ICOS umano (5? GCTAGCAAGTTGTGATTCATAAATATGC 3? - SEQ ID No.: 14, Sigma-Genosys). La sequenza nucleotidica della porzione extracellulare di F119SICOS umano mutato ? riportata in SEQ ID No.: 26. I frammenti mutati sono stati clonati nel plasmide pMB-SV5 con la sequenza codificante del dominio Fc umano, dopo la digestione con gli enzimi BseRI (cod. R0581, New England Biolabs inc) e NheI.
La sequenza nucleotidica del vettore di espressione codificante per F119SICOS-Fc ? riportata in SEQ ID No: 23.
Per generare il costrutto di ICOS murino fuso con l?Fc umano (msICOS-huFc) (SEQ ID No.: 24), la sequenza nucleotidica che codifica per la porzione extracellulare di ICOS murino (SEQ ID No.: 16) ? stata amplificata con primer specifici: primer BsshII diretto per ICOS murino (5? TTGGCGCGCATGCCGAAATCAATGGCTCGGCCGATC 3? - SEQ ID No.: 17, Sigma-Genosys) e primer NheI inverso per ICOS murino (5? CTAGCTAGCTAGCCAGAGCTTCAGCTGGC 3? - SEQ ID No.: 18, Sigma-Genosys). Il vettore utilizzato in questa clonazione ? stato pMB-SV5 contenente la sequenza codificante del dominio Fc murino.
La sequenza nucleotidica del vettore di espressione che codifica per msICOS-huFc ? riportata in SEQ ID No: 25.
Il DNA plasmidico ? stato trasformato in cellule batteriche chimicamente competenti di Escherichia Coli One Shot? TOP10 (E. coli; cod. C4040-03, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Le colonie risultanti sono state sottoposte a screening utilizzando primer specifici: P-Hygro diretto (5? CTGCTTACTGGCTTATCG 3? - SEQ ID No.: 19, Sigma-Genosys) e P-Hygro inverso (5? CAGATGGCTGGCAACTAG 3? - SEQ ID No.: 20, Sigma-Genosys) e il costrutto ? stato confermato mediante sequenziamento. Infine, il DNA plasmidico ? stato transfettato utilizzando FreeStyleTM MAX Reagent (cod. 16447100, Life Technologies) nella linea cellulare in sospensione di Ovaio di Criceto Cinese (CHO-s) (cod. R8/00-07, Invitrogen). I cloni stabili sono stati ottenuti grazie alla presenza della resistenza all?Igromicina nel vettore; a tal fine i cloni sono stati coltivati in condizioni di selezione con Igromicina-B (cod.
10687-010, Invitrogen) alla concentrazione di 0,2 mg/ml, che permette una totale selezione delle cellule transfettate. Le cellule sono state coltivate nel mezzo di coltura IMDM senza siero (cod. BE12-915F01, Lonza, Basilea, Svizzera) e i supernatanti della coltura senza siero sono stati purificati mediante colonne di Proteina G-SepharoseTM 4 Fast Flow (cod. 17-0618-01, GE Healthcare, Piscataway Township, NJ, USA).
Immunofluorescenza
Il fenotipo degli osteoclasti ? stato valutato mediante immunofluorescenza e citometria a flusso (BD, Bioscience, San Diego, CA, USA) usando gli appropriati anticorpi monoclonali (mAb) coniugati con FITC, PE, e APC per CD14 (cod. 21270146, Immunotools, Friesoythe, Germania), Catepsina-K (cod. BS1611R-FITC, Bioss Inc., Woburn, MA, USA), e B7h (cod. FAB165P, R&D Systems). I livelli di Catepsina-K sono stati valutati dopo la permeabilizzazione delle cellule utilizzando il kit FIX and PERM (cod. GAS003, Invitrogen) seguendo le istruzioni del produttore.
La colorazione dell?actina ? stata eseguita su cellule fissate su vetrino con paraformaldeide al 4% (cod. 76240, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA), lavate e quindi permeabilizzate con una soluzione contenente il 5% di FBS, l?1% di sieroalbumina bovina (BSA, cod. 05479-250G, Sigma-Aldrich) e lo 0,1% di Triton X-100 (cod. T9284, Sigma-Aldrich) per 1 h a temperatura ambiente. Quindi, i vetrini sono stati colorati con falloidina coniugata con FITC (cod. F432, Invitrogen) in una soluzione di 0,1% di Triton X-100, 1% di BSA e 2% di FBS. Dopo 2 h, le cellule sono state lavate con PBS pi? 0,1% di Triton X-100 per 10 minuti e osservate con un microscopio a contrasto di fase Axiovert 40 CFL (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania), fotografate con una fotocamera digitale Retiga 200R (QImaging, Surrey, BC, Canada) e analizzate con Image Pro Plus Software per microimmagini (Media Cybernetics, versione 5.0, Bethesda, MD, USA).
Saggio per la fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP)
L?attivit? di TRAP ? stata valutata, su cellule fissate su vetrini, mediante un kit commerciale (cod. 387A-1KT, Sigma-Aldrich) composto per il 25% da una soluzione di citrato (acido citrico 18 mmol/l, citrato di sodio 9 mmol/l, cloruro di sodio 12 mmol/l, pH 3,6), per il 65% da acetone e per il 10% da formaldeide al 37%, per circa 30 secondi. Quindi, i vetrini sono stati lavati con acqua deionizzata, colorati con Fast Garnet GBC Base Solution (7 mg/ml, Sigma-Aldrich) e osservati al microscopio a contrasto di fase. La positivit? per TRAP ? stata analizzata con un sistema di imaging (Image-Pro Plus).
Saggio di rilascio del calcio
I monociti (0,5?106) sono stati piastrati su piastre di coltura da 24 pozzetti Osteo Assay Surface (cod. CLS3987, Corning Inc., Corning, NY, USA) e differenziati in MDOC come precedentemente descritto aggiungendo i reagenti ICOS al giorno 14. Al giorno 21 di coltura, le cellule sono state lavate e incubate per altre 24 h con mezzo fresco. I supernatanti sono quindi stati raccolti e il livello di calcio ? stato valutato con un kit per saggio colorimetrico del calcio (cod. MAK022-1KT, Sigma-Aldrich).
Analisi in vivo
RANKL solubile (cod. GWB-P0945I, GenWay Biotech. Inc, San Diego, CA, USA, 1 mg/kg) ? stato iniettato i.p. giornalmente per 3 giorni in topi femmina C57BL/6 di 7 settimane di et? (cod. 057, Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA), come riportato da Tomimori Y. et al.7, da solo o in combinazione con 100 ?g di msICOS-huFc (una proteina di fusione contenente la porzione extracellulare di ICOS murino (SEQ ID No.: 28)) fusa con Fc di IgG1 umana (SEQ ID No.: 3), o F119SICOS-Fc. Ai topi di controllo sono stati iniettati PBS o con 100 ?g di ICOS-msFc, o F119SICOS-Fc, ma non RANKL. I topi sono stati sacrificati 4 h dopo l?ultima iniezione e campioni di sangue, tibie e femori sono stati raccolti per l?analisi. I topi sono stati allevati nello stabulario del Dipartimento di Scienze della Salute, in condizioni esenti da organismi patogeni e sono stati trattati in accordo con il Comitato Etico dell?Universit?.
I campioni di tibia e femore sono stati fissati a temperatura ambiente per 2 giorni in formalina tamponata neutra concentrata, diluita al 4% in PBS pH 6,9 (cod. F0033, Diapth, Martinengo, BG Italia) e disidratati in concentrazioni crescenti di etanolo (cod. 02860-2.5L, Sigma-Aldrich) per una notte, prima di eseguire una impregnazione in tre fasi in monomero di metilmetacrilato (MMA) (cod. 8005902500, Merck, Darmstadt, Germania) per almeno 3 giorni. Per l?inclusione, i blocchi dei campioni sono stati impregnati in 80% (volume/volume) di MMA stabilizzato, 20% (volume/volume) di Plastoid N (cod. 5866, Rohm Pharma, Germania) per 2 h in boccette non tappate sotto vuoto e inclusi in boccette di vetro tappate da 10 mL (bagno d?acqua, cod. BR778012, Sigma-Aldrich) a 37?C per una notte. Dopo la polimerizzazione, le boccette di vetro sono state rimosse e sezioni inumidite (50 mm) sono state tagliate con un Microtomo a Sega Leica SP 1600 con lama diamantata rotante, per la preparazione di campioni di alta qualit? di materiali duri per l?analisi microscopica e montate su vetrini di polietilene. Il taglio ? stato eseguito sull?asse lungo dell?osso e le sezioni sono state colorate, per la valutazione istologica, utilizzando verde chiaro (cod. 1159410025, Merck) e fucsina basica (cod.
47860, Sigma-Aldrich). Le sezioni sono state quindi esaminate dal punto di vista istomorfologico e morfometrico, in cieco riguardo all?identit? del materiale, da un tecnico analista. Queste misurazioni sono state eseguite utilizzando un microscopio ottico e analizzate con il software di imaging Leica (fotocamera digitale Leica DFC320 e software Leica QWin Plusv2.6). Tutte le misurazioni sono state eseguite con un ingrandimento 20?. La morfologia dell?osso corticale includeva volume del tessuto, volume del midollo (Me.v) e volume dell?osso (Bv = volume del tessuto - Me.v). ? stata misurata anche la superficie dell?osso endocorticale e periostale.
Analisi dei dati
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando ANOVA con test di Dunnett. p < 0,05 ? stato considerato significativo. Le analisi statistiche sono state eseguite con il software GraphPad Instat (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Risultati
Espressione di B7h in osteoclasti
Osteoclasti derivati da monociti (MDOC) sono stati ottenuti coltivando monociti CD14+ per 21 giorni in un mezzo di differenziazione contenente M-CSF e RANKL. Per valutare la differenziazione di MDOC e monitorare l?espressione di B7h, i presenti inventori hanno valutato la morfologia delle cellule mediante microscopia ottica ed espressione CD14 superficiale, monociti marcati, Catepsina K intracellulare, osteoclasti marcati, e B7h, mediante immunofluorescenza a tre colori e citometria di flusso, eseguite all?inizio (giorno 0, T0) e alla fine (giorno 21, T21) della coltura di differenziazione di MDOC e nel giorno intermedio 14 (T14) (Figura 1).
Effetti della stimolazione di B7h sugli osteoclasti in corso di differenziazione
Poich? B7h viene espresso durante la coltura di differenziazione di MDOC, i presenti inventori hanno valutato l?effetto della stimolazione di B7h su MDOC in corso di differenziazione utilizzando ICOS-Fc. Per valutare la specificit? dell?effetto di ICOS, le cellule sono state anche trattate con F119SICOS-Fc, che ? una forma mutata di ICOS incapace di legare B7h, o con ICOS-msFc, in cui ICOS umano ? fuso con una porzione di Fc? murino per minimizzare l?interazione con i recettori Fc? umani. Il trattamento di MDOC in corso di differenziazione ? stato iniziato a T0 o T14 della coltura aggiungendo i reagenti ICOS al mezzo di differenziazione. La coltura ? stata continuata fino a T21 per effettuare i trattamenti T0-21 e T14-21.
I risultati hanno dimostrato che il trattamento T0-21 con ICOS-Fc o ICOS-msFc ha fortemente inibito la differenziazione di MDOC. Al giorno 10 (T10) le cellule hanno mostrato una forma tondeggiate e a T21 hanno acquisito una morfologia fusiforme; inoltre, hanno mostrato una difettiva sottoregolazione di CD14 e sovraregolazione di catepsina-K, che caratterizzano la differenziazione degli osteoclasti. Di contro, le cellule trattate con F119SICOS-Fc non hanno presentano differenze rispetto alle cellule non trattate mostrando la tipica progressione verso la morfologia e il fenotipo di MDOC (Figura 2).
Il trattamento T14-21 con ICOS-Fc o ICOS-msFc ha mostrato un rallentamento sostanziale della differenziazione di MDOC in quanto, a T21, le cellule hanno mostrato una riduzione delle dimensioni cellulari e picnosi dei nuclei; una diminuita capacit? di aderire ai pozzetti di coltura; un aumento del numero di cellule con un solo nucleo e una riduzione del numero di cellule con >3 nuclei rispetto alle cellule non trattate; e una difettiva sovraregolazione di catepsina-K e, soprattutto, sottoregolazione di CD14. Inoltre, diverse cellule mostravano una morfologia a stella che non ? stata rivelata nelle cellule non trattate. Di contro, le cellule trattate con F119SICOS-Fc erano simili alle cellule non trattate (Figura 3).
Per valutare la reversibilit? dell?effetto di ICOS-Fc, le cellule sono state trattate con ICOS-Fc, ICOS-msFC o F119SICOS-Fc al giorno 7 (T7), lavate a T14 e quindi incubate fino a T21 in presenza (trattamento T7-21) o assenza (trattamento T7-14) di ICOS-Fc, ICOS-msFC o F119SICOS-Fc. I risultati hanno mostrato che il trattamento T7-21 con ICOS-Fc o ICOS-msFc ha indotto una morfologia e un fenotipo simili a quelli descritti precedentemente per il trattamento T14-21. Le cellule trattate con F119SICOS-Fc non hanno mostrato alcuna differenza rispetto alle cellule non trattate. Al contrario, il trattamento T7-14 ha indotto una morfologia e un fenotipo che convergono verso quelli mostrati da cellule non trattate (Figura 4).
Effetti della stimolazione di B7h su osteoclasti differenziati
Il trattamento di MDOC gi? differenziati ? stato eseguito mediante trattamento delle cellule a T21 con i reagenti ICOS e loro analisi dopo 3 giorni (T24) per eseguire il trattamento T21-24. I risultati hanno mostrato che il trattamento T21-24 con ICOS-Fc o ICOS-msFc ha indotto una notevole riduzione delle dimensioni delle cellule e dei nuclei, e una diminuita espressione della catepsina-K, rispetto alle cellule non trattate. L?analisi della vitalit? cellulare mediante test di esclusione con tripan blu ha dimostrato che le cellule erano vitali. Di contro, il trattamento T21-24 con F119SICOS-Fc non ha mostrato alcun effetto (Figura 5).
Per valutare la reversibilit? dell?effetto di ICOS, cellule T21-24-trattate sono state lavate a T24 e incubate per 1 (T25) o 4 giorni (T28) in un mezzo di differenziazione in assenza di ICOS-Fc. I risultati hanno mostrato che le cellule trattate con ICOS-Fc o ICOS-msFc e quindi coltivate in assenza di ICOS-Fc hanno iniziato ad aumentare le loro dimensioni e sovraregolavano la catepsina-K a T25, e mostravano una morfologia MDOC-simile, convergendo verso quella mostrata da cellule non trattate a T28 (Figura 5). L?analisi della vitalit? cellulare mediante test di esclusione con tripan blu ha dimostrato che le cellule erano vitali. Di contro, le cellule che non sono state trattate o sono state trattate con F119SICOS-Fc hanno mantenuto la loro morfologia e il loro fenotipo a T25 e T28.
Effetto della stimolazione di B7h sulla funzione degli osteoclasti
Poich? l?attivit? litica dell?osso da parte degli osteoclasti ? correlata alla loro capacit? di secernere il contenuto di granuli intracitoplasmatici contenenti diversi enzimi litici, tra cui TRAP, i presenti inventori hanno valutato l?effetto del trattamento T14-21 con i reagenti ICOS sull?espressione di TRAP, valutata mediante saggio enzimatico per TRAP. I risultati hanno evidenziato che i MDOC trattati con ICOS-Fc o ICOS-msFc mostrano un?attivit? inferiore di TRAP in termini di numero di cellule TRAP+ e della loro intensit? di colorazione rispetto alle cellule non trattate o alle cellule trattate con F119SICOS-Fc. Questo risultato era soprattutto evidente nelle cellule con >3 nuclei (Figura 6).
Poich? un aspetto fondamentale della funzione degli osteoclasti ? l?organizzazione del citoscheletro per formare il bordo increspato nell?area di erosione delimitata dalla zona sigillante, i presenti inventori hanno analizzato l?effetto dei reagenti ICOS sull?organizzazione dell?actina cellulare mediante colorazione intracellulare con falloidina-FITC di cellule MDOC T14-21-trattatte. I risultati hanno mostrato che, in MDOC non trattati, l?actina era polarizzata con un modello tipico della zona sigillante che delimita la lacuna erosiva degli osteoclasti. Di contro, nelle cellule trattate con ICOS-Fc o ICOS-msFc, l?actina mostrava una distribuzione perinucleare in un tipico anello di actina F senza segni di polarizzazione. Le cellule trattate con F119SICOS-Fc hanno mostrato un modello simile a quello delle cellule non trattate (Figura 7).
Per valutare l?effetto di ICOS sull?attivit? osteolitica di MDOC, i presenti inventori hanno valutato la loro capacit? di favorire il rilascio di calcio da fosfato di calcio cristallino in vitro. La differenziazione di MDOC ? stata indotta in pozzetti rivestiti con una superficie sintetica di fosfato di calcio cristallino inorganico che imita il materiale osseo vivente, in presenza e in assenza dei reagenti ICOS utilizzando un protocollo T14-21. A T21 le cellule sono state lavate e coltivate per altre 24 h in un mezzo fresco, e il rilascio di calcio ? stato quindi valutato nei supernatanti della coltura mediante un saggio colorimetrico. I risultati hanno mostrato che il trattamento T14-21 con ICOS-Fc o ICOS-msFc ha ridotto sensibilmente il rilascio di calcio rispetto ai MDOC non trattati, mentre F119SICOS-Fc non ha mostrato alcun effetto (Figura 8).
Infine, i presenti inventori hanno valutato l?effetto della stimolazione di B7h in vivo utilizzando un modello di osteoporosi indotta mediante trattamento di topi con alte dosi di RANKL solubile. A topi C57BL/6 di sesso femminile (7 settimane di et?) ? stato iniettato i.p. giornalmente per 3 giorni RANKL (1 mg/kg) da solo o in combinazione con msICOS-huFc (formato da ICOS murino e Fc umano) o F119SICOS-Fc (100 ?g/topo). I topi sono stati sacrificati 4 ore dopo l?ultima iniezione. L?analisi istologica delle tibie colorate con fucsina e verde chiaro ha mostrato una perdita ossea marcata nei topi a cui sono state praticate iniezioni di RANKL, che ? stata notevolmente inibita mediante cotrattamento con msICOS-huFc ma non con F119SICOS-Fc (Figura 9).
Naturalmente, sebbene il principio dell?invenzione rimanga lo stesso, i particolari di costruzione e le forme di realizzazione potranno venire ampiamente variati rispetto a quanto ? stato descritto e illustrato a puro titolo di esempio, senza allontanarsi dall?ambito della presente invenzione.
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Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Ligando del recettore B7h per l?uso nel trattamento di un paziente affetto da osteopenia o osteoporosi.
- 2. Ligando del recettore B7h per l?uso secondo la rivendicazione 1, in cui il ligando viene scelto tra: a) una proteina ICOS umana avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29; b) un omologo della proteina ICOS umana avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29; c) una porzione della sequenza amminoacidica di ICOS umana riportata in SEQ ID No.: 29 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e di inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti; d) un dominio extracellulare di ICOS umana avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2; e) una porzione del dominio extracellulare di ICOS umana della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2; oppure f) un omologo del dominio extracellulare di ICOS umano avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 ed avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2.
- 3. Ligando del recettore B7h per l?uso secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il ligando ? in forma solubile.
- 4. Ligandi del recettore B7h per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui il ligando deve venire somministrato per iniezione, infusione.
- 5. Ligando del recettore B7h per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui il ligando ? fuso o coniugato ad una molecola stabilizzante.
- 6. Ligando del recettore B7h per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui il ligando ? iperglicosilato o coniugato a residui di mannosio.
- 7. Uso del recettore B7h come bersaglio per lo screening di agenti farmaceutici attivi utili nel trattamento di osteopenia o osteoporosi.
- 8. Uso secondo la rivendicazione 7, in cui l?agente farmaceuticamente attivo interferisce con la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti.
- 9. Uso secondo la rivendicazione 7 o la rivendicazione 8, in cui l?agente farmaceuticamente attivo si lega al recettore B7h.
- 10. Composizione farmaceutica comprendente almeno un ligando del recettore B7h e un veicolo farmaceuticamente accettabile per l?uso nel trattamento di osteoporosi e osteopenia.
- 11. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 10, in cui l?almeno un ligando del recettore B7h viene selezionato tra: a) una proteina ICOS umana avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29; b) un omologo della proteina ICOS umana avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 29; c) una porzione della sequenza amminoacidica di ICOS umana riportata in SEQ ID No.: 29 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e di inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti; d) un dominio extracellulare di ICOS umano avente la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2; e) una porzione del dominio extracellulare di ICOS umana della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2; oppure f) un omologo del dominio extracellulare di ICOS umana avente almeno l?80%, preferibilmente almeno il 90%, di omologia di sequenza con la sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2 ed avente la capacit? di legarsi al recettore B7h e inibire la differenziazione, la maturazione e/o la funzione degli osteoclasti della sequenza amminoacidica riportata in SEQ ID No.: 2.
- 12. Procedimento di identificazione di un agente farmaceutico attivo adatto per l?uso nel trattamento di osteopenia o osteoporosi, comprendente le fasi di: a) fornire un agente di prova, b) portare a contatto l?agente di prova con osteoclasti che esprimono il recettore B7h, c) testare la capacit? dell?agente di prova di ridurre la maturazione, la differenziazione e/o la funzione degli osteoclasti, d) selezionare l?agente di prova che riduce la maturazione, la differenziazione e/o la funzione degli osteoclasti come agente attivo utile nel trattamento di osteopenia e osteoporosi, in cui l?agente attivo si lega al recettore B7h.
- 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui la fase di prova c) comprende la misurazione della secrezione della fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) da parte degli osteoclasti, l?organizzazione dell?actina cellulare negli osteoclasti, e/o il rilascio di calcio da parte degli osteoclasti.
- 14. Procedimento di trattamento di osteoporosi o osteopenia, comprendente le fasi di: provvedere un paziente affetto da osteoporosi o osteopenia, somministrare al paziente un medicamento comprendente un ligando del recettore B7h, ridurre quindi l?osteoporosi o l?osteopenia nel paziente.
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