CN105531370A - 治疗靶向特异性vnar结构域与icosl的分离 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了ICOSL特异性抗原结合分子，该分子是从免疫的和合成的板鳃亚纲衍生文库分离得到的。特别地，本发明涉及特异性结合且中和人可诱导共刺激配体(ICOSL)活性的鲨鱼可变新抗原受体(VNAR)结构域。中和的VNAR结构域从两个独立的来源分离；一个来源为免疫的护士鲨文库，一个来源为合成的角鲨框架融合文库。该分子可以被制备成药物组合物并在医药中使用。

Description

治疗靶向特异性VNAR结构域与ICOSL的分离
技术领域
本发明涉及从免疫的和合成的板鳃亚纲来源的文库分离的具有高亲和力的抗原特异性的天然和非天然的结合分子的分离和表征。特别地，本发明涉及特异性结合及中和可诱导共刺激配体(InducedCo-StimulatoryLigand，ICOSL)(作为免疫功能的重要调节子的分子)活性的鲨鱼可变的新抗原受体(VNAR)结构域。中和的VNAR结构域从两个独立的来源分离；一个来源为免疫的护士鲨文库，一个来源为合成的角鲨框架融合文库。
背景技术
基于生物制剂的单克隆抗体(mAb)相对于小分子而言具有多种优势，例如它们连续的临床成功以及随后给生物技术和生物制药公司带来的经济价值。与靶点特异性结合且干预疾病相关的生物学进程，同时降低位点外(off-site)毒性的固有能力，致使它们成为强有效的且目前已被证明的疗法种类。然而，它们的疗效具有局限性。它们的尺寸和复杂性可能限制其在某些疾病类型和人体内发病部位中的应用。与此相反地，已经开发了大量的所谓的来源于基于免疫球蛋白和非免疫球蛋白来源的替代支架(alternativescaffolds)，其目的在于解决较大的蛋白质疗法的一些公认的局限性。
鲨鱼免疫球蛋白新型或新抗原受体(IgNAR)是天然存在的已知在软骨鱼的适应性免疫系统中发挥作用的单链结合域(GreenbergA.S.,etal.,Nature,1995.374(6518):p.168-173；Dooley,H.,etal,Mol.Immunol,2003.40(1):p.25-33；Müller,M.R.,etal.,mAbs,2012.4(6):p.673-685)。该作用的一个重要方面为能够高亲和力地特异性结合到靶点上，这通过可变域(VNAR)内的四个不同区域实现；即CDR1、HV2、HV4和CDR3(Stanfield,R.L.,etalScience,2004.305(5691):p.1770-1773)。额外的非典型半胱氨酸残基构成了VNAR同种型谱系(repertoire)，这些同种型可以转化为具有能够与更多隐蔽的或隐藏的表位相结合的独特的互补位拓扑结构的不同结构的家族(Stanfield,R.L.,etalScience,2004.305(5691):p.1770-1773；Streltsov,V.A.,etal,ProteinSci.,2005.14(11):p.2901-2909；Stanfield,R.L.,etal.,JMol.Biol.,2007.367(2):p.358-372)。缺乏轻链伴侣与CDR2的结合使VNARs成为在脊椎动物领域中最小的天然存在结合域。除了它们对靶点的精确的选择性，这种固有的溶解度和稳定性使它们成为治疗药物和诊断开发的有吸引力的候选物(Barelle,C.J.,etal.,Adv.Ex.Med.Biol.,2009.655:p.49-62；Griffiths,K.,etal.,Antibodies,2012.2:p.66-81)。文献中的术语IgNARs指的是免疫球蛋白同种型新型抗原受体或免疫球蛋白同种型新抗原受体，并且这些术语是同义的。
在护士鲨中首次证明了能够提高软骨鱼的靶向特异性IgNAR应答(WO03/014161)。使用鸡蛋溶菌酶(HEL)作为模型免疫原，通过最初使用佐剂随后在缓冲液中反复提高对靶标进行免疫，获得了随时间变化的抗原特异性滴定度。在该研究以前，普遍认为次级免疫应答局限于进化更高级的脊椎动物(例如鸟类和哺乳动物)。因此，人们不曾预期可以在进化原始物种如板鳃亚纲中见到这种应答。鲨鱼对免疫原的应答也与在哺乳动物中见到的应答也有很大的区别，因为IgNAR应答具有令人难以置信的低抗原特异性血清滴定度(比啮齿类动物和其它哺乳动物表现出的抗原特异性血清滴定度低约两个数量级)。与被称为纳米抗体的骆驼单域抗体谱系(lineage)不同，IgNAR的结合域并未表现出从经典的免疫球蛋白抗体祖先进化了进化。
在一级序列中的差异是显而易见的，对于纳米抗体而言，约80-85％的框架区与人IgG重链相似，并且IgNAR与人轻链序列之间仅有25-30％的相似性(Dooley,H.andFlajnik,M.F.,Eur.J.Immunol.,2005.35(3):p.936-945)。在幼年护士鲨中进行的研究已经表明同种型谱系以及由此产生的提高对任何外部挑战(challenge)的IgNAR结构域的多样性局限于被称为III型的D区融合同种型。该理论认为这可能是对年轻幼仔在子宫内静止时可能暴露于的普通抗原的限制性应答。经过约六个月的发育，年轻的成年鲨鱼表现出完整的谱系以及对挑战的IgNAR应答，挑战包括多种不同的IgNAR同种型；I型(迄今为止仅在护士鲨中发现)、II型、IIb型、III型和IIIb型。同种型的非典型半胱氨酸残基的含量和位置不同，其转化为在结合域的互补位上的不同结构特征。
两个平台可用于VNARs的分离。第一个是基于IgNAR作为鲨鱼的适应性免疫系统的一部分的作用(WO03/014161)。目前，已经表明在至少三种不同种类的鲨鱼中，在抗原攻击应答中诱导IgNAR应答(Dooley,H.,etal,Mol.Immunol,2003.40(1):p.25-33；Müller,M.R.,etal.,mAbs,2012.4(6):p.673-685；Camacho-Villegas,T.,mAbs.,2013.5(1):p.80-85WO2011/056056)。由于VNAR结构域适用于噬菌体展示技术，所以在进行反复免疫处理后从这些动物获得简单的血液样品，随后进行增量、RNA提取和从该总信息生成的cDNA扩增得到VNAR谱系(Müller,M.R.,etal.,MethodsMol.Biol.2012.907:p.177-194,Flajnik,M.F.,andDooley,H.,MethodsMol.Biol.2009.562:p.71-82)。克隆成标准的噬菌粒载体和选择可以被用于寻找阳性结果的命中结果(hit)。分离VNAR结构域的第二种且公认的(complimentary)另一种方式为以通常包括CDR区构建过程中明显的额外多样性的单一天然VNAR框架为基础，构建天然的或半合成的噬菌体展示文库(Nuttall,S.D.,etal.,Mol.Biol.2001:38:p.313-326；Nuttall,S.D.,etal.,FEBSLetters,2002.516:p.80-86；Liu,J.L.,etal.,MolImmunol.,2007.44:p.1175-1783；Liu,J.L.,etal.,BMCBiotech.,2007.7:p.78-88)。通过共混或融合来自不同物种内部或之间的不同VNAR同种型的不同框架实现了相对于单一框架文库的明显改进。在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815,043优先权的共同待决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251中描述了从合成文库产生VNARs的新方法(通过参考并入)。
免疫文库和合成文库均具有优势和挑战。鲨鱼免疫系统的远位点进化促进对多种哺乳动物蛋白产生有利应答。因此，通过在体内成熟过程之后，免疫通常提供直接对靶抗原具有高亲和力的结构域。该过程略慢于在哺乳动物中见到的相关过程，因为其在动物体内发生，但是约4-8个月才可以达到IgNAR谱系的成熟。从合成文库中选择缩短了该时间范围，但是成功的水平(特异性和亲和力)依赖于被筛选文库的质量和规模，并且通常将产生可能需要通过体外成熟过程以进一步精制(refinement)的具有较低亲和力的结构域。在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815,043优先权处于共同待决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251中描述了从合成文库产生VNARs的一种新方法(通过参考并入)。
然而，已经成功地使用这两种方法分离出作用于多种靶标种类的大量VNAR结构域(Nuttall,S.D.etal.,Mol.Biol.2001:38:p.313-326；Dooley,H.,etal,Mol.Immunol,2003.40(1):p.25-33；Nuttall,S.,D.,Protein,2004.55:p.187-197；Liu,J.L.,etal.,MolImmunol.,2007.44:p.1175-1783；Liu,J.L.,etal.,BMCBiotech.,2007.7:p.78-88；Walsh,R.,Virology,2011.411(1):p.132-141；Müller,M.R.,etal.,mAbs,2012.4(6):p.673-685；Bojalil,R.,BMCImmunol.,2013:14(7):p.14-17)。
免疫调节生物制剂是可以被用于治疗多种不同治疗领域中免疫相关疾病的强有力的工具。它们可以被涉及为抑制(dampendown)超免疫应答，因此，可应用于器官移植以及慢性自身免疫性疾病和炎性病症，例如风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和银屑病。相反地，它们可以在癌症或慢性细菌或病毒感染中起到增强免疫应答的作用(Yao,S.,etal.,NatureReviews,2013.12:p.130-146)。可诱导的共刺激配体(ICOSL)也被称为B7相关蛋白(B7RP-1)、CD275和B7同源物(B7h)，是一种在抗原呈递细胞(APCs)如B细胞、活化的单核细胞和树突细胞上持续(constitutively)表达的细胞表面抗原，且是B7家族成员ICOS(CD278)的配体(Yoshinaga,S.,K.,etal.,Int.Immunol.,2000.12(10):p.1439-1447)。最初，人们认为它的作用局限于T细胞的活化，但是最近ICOSL在免疫调节中的核心作用分别通过其与CD28和CTLA4的相互作用已经被扩展至了T细胞刺激和抑制通路。具有谱系限制性(lineage-restricted)ICOSL表达的转基因小鼠的产生已经证明了ICOSL-ICOS相互作用在刺激T-细胞应答、T-细胞耐受和T-细胞依赖性B细胞应答中的作用，及其在抗体介导的疾病中的重要性已经在包括RA、SLE和葡萄膜炎的人疾病的临床前模型中得到了验证(Yoshinaga,S.,K.,etal.,Nature,1999.402(827):p.827-832；,Aicher,A.,etal.,J.Immunol.,2000.164(9):p.4689-4696；Larimore,K.,etal.,BMCImmunol.,2012.13(29)；p.1-17；Iwai,H.,etal.,J.Immunol,2002.169(8):p.4332-4339；Frey,O.,etal.,Ann.Rheum.Dis.,2010.69(8):p.1495-1501；Usui,Y.,etal.,EurJImmunol.,2006.36(11):p.3071-3081；Hu,Y.,L.,etal.,J.Immunol.,2009.182(3):p.1421-1428)。已经表明靶向的T细胞群是与生发中心B细胞(germinalcentreBcells)相互作用的滤泡辅助性T细胞(TFH)(Hu,Y.,L.,etal.,J.Immunol.,2009.182(3):p.1421-1428)。
最近，已经表明ICOSL-ICOS相互作用通过调节免疫抑制性肿瘤相关的T调节细胞(Treg)而影响肿瘤的发育(StraussL.,etal.,JImmunol.,2008.180:p.2967–2980；GobertM,etal.,CancerRes.,2009.69:p.2000–2009；Faget,J.,etal.,CancerResearch,2012.72(23):p.6130-6141)。已经在癌症患者体内鉴定出越来越多的且普遍的Tregs，并且已经从不同的肿瘤和肿瘤间质(tumourstroma)中被分离出，包括胰腺和乳腺癌、结肠直肠癌、胃和食管癌、白血病和淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和肝癌(Ménétrier-Caux,C.etal.,Targ.Oncol.,2012.7:p.15–28)。
ICOSL是一种B7相关的跨膜糖蛋白，具有两个细胞外免疫球蛋白样结构域：IgC和IgV。突变分析已经表明IgV结构域构形成受体与配体之间的界面，并且表现出人与啮齿类动物之间的低物种同源性(人与小鼠之间约为44％)。虽然要求蛋白复合体具有整体完整性，但是IgC结构域并不与ICOS形成任何接触界面，并且其相对于IgV结构域而言是近膜的(Chattopadhyay,K.,J.Immunol.,2006.177(6):p.3920-3929)。活性蛋白的组织(organization)被认为主要为非共价异源二聚体，并且已有证据表明这些蛋白的聚簇或低聚发生在细胞表面(Chattopadhyay,K.,J.Immunol.,2006.177(6):p.3920-3929)。当啮齿类动物与人的靶结构域之间的序列同源性很低时，用于临床前研发的小鼠或大鼠替代分子(surrogatemolecule)的分离和开发可能是有用的。之前已经表明了这种抗ICOSL的替代抗体的分离和表征(Iwai,H.,etal.,J.Immunol,2002.169(8):p.4332-4339；Hu,Y.,L.,etal.,J.Immunol.,2009.182(3):p.1421-1428)。
VNARs从抗与IgV区域结合的小鼠ICOSL的合成文库ELSS1中分离，并且在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815,043优先权的共同未决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251中描述了其亲和力的范围为40-400nM(通过引用并入)。分离的抗人ICOSL的VANR结构域(也被认为是IgV结构域)对靶标的亲和力相比于分离的抗小鼠VNAR结构域大至少一个数量级。对于治疗益处，关键的是分离的抗ICOSL的结构域进行拮抗(antagonize)，因此可以防止与ICOS的相互作用以及随后的下游信号以诱导免疫应答。T细胞增殖试验是一种检测ICOS-ICOSL之间相互作用的这种抑制作用的强有力手段，并且之前已经实施过该试验以举例说明体外先导分子的有效性。该研究期间分离的抗人ICOSL结构域在T细胞试验中表现出在效能上比相应的小鼠相对物(counterparts)增加了100倍以上。这很可能是由于与抗小鼠结构域相比，抗人结构域的亲和力增加导致的。因此，可预测的是这些结构在体内将表现出更大的效能。
发明内容
本发明涉及从天然和非天然来源分离的抗人ICOSL的VNAR结构域在中和试验中的非预期效能、对靶点的高亲和力和选择性及多样性。
根据本发明的第一方面，提供了一种ICOSL特异性抗原结合分子，该分子含有如式(I)所示的氨基酸序列
A-X-B-Y-C(I)
其中，
A-为SEQIDNO：1、SEQIDNO：4或SEQIDNO：7
X为6或7个氨基酸残基的CDR1区
B-为SEQIDNO：2、SEQIDNO：5或SEQIDNO：8
Y为具有7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的CDR3区
C-为SEQIDNO：3、SEQIDNO：6或SEQIDNO：9
或与它们至少具有50％同源性的序列，
其中，SEQIDNO：1为TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT，TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQIDNO：2为TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA或TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQIDNO：3为DGAGTVLTVN
SEQIDNO：4为ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT
SEQIDNO：5为TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA或TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQIDNO：6为YGAGTVLTVN
SEQIDNO：7为ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDP或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDA或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDG或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRES
SEQIDNO：8为TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGA或
TCWSRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGL，
TCWTRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCAL，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGV，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGH，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRISDLTVEDGGTYRCGH，
SEQIDNO：9为CGGGTVVTVN，CGGGTAVTVN，CGDGTAVTVN，或CGDGTAVTVN。
由A、X、B、Y和/或C表示的氨基酸序列可以衍生自相同的或者不同的板鳃亚纲成员。由A、X、B、Y和/或C表示的氨基酸序列也可以衍生自相同的或者不同的VNAR序列的同种型，例如I型、II型和/或III型(包括Ib型、IIb型和IIIb型)。因此，源材料的任何常规的适当组合都是可能的。
在本发明的一些实施方式中，式(II)A-X-B-Y-C可以由序列组成，其中，元件A、B和C被表示为(i)SEQIDNO.s1、2和3；(ii)SEQIDNO.s1、2和6；(iii)SEQIDNO.s1、5和3；(iv)SEQIDNO:s1、5和6；(v)SEQIDNO.s4、5和6；(vi)SEQIDNO:s4、5和3；(vii)SEQIDNO:s4、2和6；(viii)SEQIDNO.s4、2和3；(ix)SEQIDNOs7、8和9。
CDR1区可以为如图10A或10B所示的任意CDR1区，或者至少与其具有50％同源性的序列。CDR3区可以为如图10A、10B或10C所示的任意CDR3区，或者至少与其具有50％同源性的序列。
ICOSL是一种B7相关跨膜糖蛋白，其具有两个细胞外免疫球蛋白样结构域：IgC和IgV。在GenBank中ICOSL的人和小鼠序列如下所示：
人：登录号：O75144.2；GI：19855066(302aa)
小鼠：登录号：Q9JHJ8.1；GI：15214053(322aa)
当对氨基酸序列进行比对时，总得分为43.38且同一性％为47.80。本发明的ICOSL特异性抗原结合分子可以为抗作为抗原的任意ICOSL序列。在合适的情况下，该ICOSL序列可以为人ICOSL(hICOSL)序列，或其同源序列，或来源于其它动物物种的ICOSL序列，使用本文描述的标准分子生物学技术经人源化后该序列可以以抗原的形式呈现。ICOSL的人序列的实例如图12所示。
在本发明的一种实施方式中，ICOSL特异性抗原结合分子可以为如图9A或图9C所示的序列，或者至少与其具有50％同源性的序列。
其中，CDR3区存在于来源合成文库的ICOSL特异性抗原结合分子中，所述区可以含有7-21个氨基酸残基，优选为7、9、10、11、12、13、14、16或21个氨基酸残基。
其中，CDR3区存在于来源免疫过程的ICOSL特异性抗原结合分子中，所述区可以含有13-21个氨基酸残基，优选为13、19、20或21个氨基酸残基。
因此，所述ICOSL特异性抗原结合分子也可以被描述为分离的VNAR结构域。
本发明的从非天然和天然来源分离得到的VNAR结构域序列与人ICOSL特异性结合，具有高亲和力并且中和ICOSL与ICOS之间的相互作用。
在本发明的一种实施方式中，该抗hICOSLVNAR结构域可以从合成文库分离得到，按照在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815,043优先权的共同未决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251的描述进行制备(通过引用并入)。该文库的一个示例为合成文库ELSS1，其为由以多种组合形式融合的两个连续肽结构域组成的框架融合合成文库。已经证明这种合成文库设计是一种功能强大的平台，从其中分离抗多种靶标类型的VNARs，部分原因是由于融合同种型和鲨鱼物种之间的不同框架的独特方法明显增加了该文库的结合分子多样性。该抗人ICOSL结构域进一步举例证明了这一点，因为它们除了独特的CDR3和CDR1序列以外还由不同的同种型框架残基组成。在该实施方式中，VNAR结构域可以通过对具有被固定在链霉亲合素磁珠上的生物素化的单体人ICOSL的文库进行筛选而分离得到。在一种可选的实施方式中，VNAR结构域可以通过对具有直接固定在固体表面如免疫管上的人ICOSL的文库进行筛选而分离得到。
在本发明的另一种实施方式中，抗人VNAR结构域可以从免疫的鲨鱼中分离得到。护士鲨可以经溶于弗氏完全佐剂的单体人ICOSL免疫，然后经溶于PBS中每月进行反复加强。监控抗靶标的IgNAR的血清滴定度，并且确定在进行了一次至三次可溶性抗原加强期间是否可以观察对人ICOSL的应答。第4次取血的滴定度可以被认为是在这种情况下典型受试动物可达到的最大响应，并且可以从外周血淋巴细胞(pbls)提取RNA。从这种样品中，可以产生cDNA和使用框架1和框架4特异性引物扩增的VNAR谱系。
扩增子可以被克隆至转化入大肠杆菌宿主细胞的噬菌体载体中，以构建约1×108个克隆的展示文库。在该实施方式中，VNAR结构域可以通过对具有被固定在链霉亲合素磁珠上的生物素化的单体人ICOSL的文库进行筛选而分离得到。在一种可选的实施方式中，VNAR结构域可以通过对具有直接被固定在固体表面如免疫管上的人ICOSL的文库进行筛选而分离得到。
本发明的重要优势在于证明了通过分离的VNAR结构域表现出的ICOS-ICOSL相互作用的强效中和作用。使ICOS与ICOSL之间的相互作用拮抗的效能可以在基于体外试验或者可选的方式如基于抗原试验的ELISA的细胞中得以证明。中和作用的效能可以在多种蛋白形式中得以证明，包括但不限于单体外周血浆表达的蛋白、作为纯化蛋白和作为哺乳动物细胞上清液的VNAR结构域-Fc融合体以及分子融合蛋白，如N-末端和/或C-末端通过连接肽与伴侣蛋白或蛋白相连接的抗hICOSLVNAR。
在本发明的一种实施方式中，可溶性外周血浆表达的单体抗人ICOSLVNAR结构域在多孔板ELISA形式中阻断细胞表面表达的ICOS与ICOSL-Fc融合蛋白之间的相互作用。
在本发明的进一步的实施方式中，哺乳动物表达的纯化的抗人ICOSLVNAR-Fc结构域可以以浓度依赖的方式阻断细胞表面表达的ICOS与ICOS-Fc融合蛋白之间的相互作用。
另一种实施方式为通过分子连接肽将单体抗人ICOSLVNAR结构域重构至N-末端或C-末端或二者均可、二聚体或三聚体或更多融合体中的灵活性。以三聚体的形式融合至抗人血清白蛋白VNAR结构域和抗小鼠ICOSLVNAR结构域的抗人ICOSVNAR结构域保持与hICOSL结合及阻断ICOS与ICOSL之间的相互作用的能力。在这种具有三种功能的形式中，全部三种VNAR结构域均保持与它们的特异性靶标结合的能力。
在本发明的进一步的实施方式中，纯化的抗人单体ICOSLVNAR结构域可以阻断原代人T细胞的增殖。在本发明的一种可选的实施方式中，该抗人ICOSLVNAR结构域可以被转化为Fc蛋白融合构建体，该构建体可以在哺乳动物宿主细胞中表达及纯化。这种纯化的材料可以在原代人T细胞试验中进行滴定，并且表现出对T细胞增殖的浓度依赖性抑制作用。
本发明的另一种优势在于由抗人ICOSL结构域表现出的高亲和力和选择性。
在本发明的一种实施方式中，抗人ICOSLVNAR结构域可以被表达为可溶性单体蛋白结构域并且穿过(passover)在BIAcore室中固定的hICOSL以测量结合相互作用的结合和分离动力学。
在本发明的另一种实施方式中，抗人ICOSLVNAR结构域可以被转化为可以在哺乳动物宿主细胞中表达和纯化的Fc蛋白融合构建体。然后，该材料可以流过BIAcore室中的固定的hICOSL以测量结合相互作用的结合和分离动力学。
在本发明的一种实施方式中，通过将抗人ICOSLVNAR结构域结合至表达ICOS和ICOSL的CHO细胞系，使用二次荧光染料标记的抗体进行检测并使用FACS分析进行结合测量，证明了抗人ICOSLVNAR结构域的选择性。进一步的实施方式通过ELISA证明了对不同蛋白的多种类型的选择性。
根据本发明的第二方面，提供了一种本发明的第一方面的ICOSL特异性抗原结合分子的药物组合物。
本发明的药物组合物可以含有任意合适的且药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲溶液。该组合物可以进一步含有药学上的活性剂。所述载体可以包括，但不限于，生理盐水、缓冲盐溶液、葡糖糖(dextrose)、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。
该组合物可以进一步含有如本文所述的药学上的活性剂。添加剂可以为治疗性化合物，如抗炎药、细胞毒性剂、细胞抑制剂或抗生素。该添加剂可以以适合对需要其的患者进行给药的形式存在，并且所述给药可以是同时给药、单独给药或顺序给药。成分可以制备成包括适当说明书的试剂盒的形式。
所述药物组合物可以以任意有效的且方便的方式进行给药，以有效地治疗患者的疾病，例如，包括口服给药、局部给药、静脉注射给药(intravenous)、肌内给药、鼻内给药、或皮下给药路径等。在治疗药或作为预防药的情况下，所述活性剂可以以可注射组合物的形式给药至个体，例如可以为无菌水性分散体，优选为等渗的。
对于给药至哺乳动物，特别是人，预期活性剂的日剂量为0.01mg/kg体重，通常约1mg/kg、2mg/kg或高达4mg/kg。在任何情况下，医生将确定最适合于个体的实际剂量，这将依赖于以下因素，包括年龄、体重、性别以及该个体的反应。上述剂量为平均情况的示例。当然，较高或较低剂量的例子也是理所当然的，并且这也在本发明的范围内。
本发明还提供了一种包括本文所述的药物组合物且带有使用说明的试剂盒。
根据本发明的第三方面，提供了第二方面所述的药物组合物在医药中的用途。该用途包括通过给药治疗有效剂量的如上所述的本发明的药物组合物进行疾病的治疗方法，所述疾病与ICOSL与其受体伴侣(包括但不限于ICOS、CD28和CTLA4)之间的相互作用有关，和/或涉及T细胞调控和/或抗体介导的疾病有关。该组合物可以含有本发明的至少一种ICOSL特异性抗原结合分子(VNAR结构域)，或者该分子和/或其人源化变异体的组合。
如本文所用的，术语“治疗”包括对人有益的任意方式。所述治疗可以是关于任何现存病症或失调的治疗性用药(therapeutictreatment)，或者可以为预防性的(预防性用药)。
可以使用本发明的组合物进行治疗的疾病包括由T细胞激活特别是涉及其亚型TFH细胞介导的自身免疫性疾病和炎性疾病。例如，该疾病的实例包括但不限于，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、牛皮癣Grave’s病、重症肌无力、大疱性类天疱疮、抗磷脂综合征、眼色素层炎、Devic’s病、Lambert-Eaton肌无力综合征、GuillainBarre/MiilerFisher、僵人综合征、自身免疫性脑炎、寻常性天疱疮。可以使用本发明的组合物进行治疗的其它疾病包括通过T调节(Treg)细胞的激活介导的癌症，其包括但不限于胰腺癌和乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌和食道癌、白血病和淋巴瘤、黑素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、和肝细胞癌。
根据本发明的这一方面，提供了本发明第一方面的组合物在制备用于治疗与ICOSL及其受体伴侣(包括但不限于ICOS、CD28和CTLA4)之间的相互作用相关的疾病，和/或与T细胞调控和/或抗体介导的疾病相关的疾病的药物中的用途。
本发明的ICOSL特异性抗原结合分子还可以被用于研究患者的病症的性质。该ICOSL特异性抗原结合分子可以被用于制备受试者体内发病部位的成像，通过使用成像技术如X射线、伽马射线、或PET扫描、或类似的成像技术。因此，本发明可以扩展为受试者发病部位成像的方法，该方法包括将合适的可检测的带有标记的ICOSL特异性抗原结合分子给药至受试者并随后扫描受试者的身体。可选地，将所述分子给药至受试者可以提供通过分析来自给药该分子后的受试者的样品的测试结果。所述实施方式可以包括受试者疾病或身体状况的诊断方法，该方法包括本发明的ICOSL特异性抗原结合分子的给药。
具体实施方式
在本发明的一种实施方式中，提供了一种抗原特异性抗原结合分子，该分子含有如式(I)所示的氨基酸序列
A-X-B-Y-C(I)
其中，
A-为SEQIDNO：1或SEQIDNO：4
X为5、6或7个氨基酸残基的CDR1区
B-为SEQIDNO：2或SEQIDNO：5
Y为具有8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸残基的CDR3区
C-为SEQIDNO：3或SEQIDNO：6
或与它们至少具有50％同源性的序列，
其中，SEQIDNO:1为TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT，TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQIDNO:2为TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA或TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQIDNO:3为DGAGTVLTVN
SEQIDNO:4为ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT
SEQIDNO:5为TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA或TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQIDNO:6为YGAGTVLTVN。
所述CDR1区可以为如图10A或10B所示的任意CDR1区。所述CDR3区可以为如图10A、10B或10C所示的任意CDR3区。
本发明的该实施方式的序列可以如图9A所示。
在本发明的另一种实施方式中，提供了一种抗原特异性抗原结合分子，该分子含有如式(I)所示的氨基酸序列
A-X-B-Y-C(I)
其中，
A-为SEQIDNO：7
X为6个氨基酸残基的CDR1区
B-为SEQIDNO：8
Y为14、20或22个氨基酸残基的CDR3区
C-为SEQIDNO：9
或与它们至少具有50％同源性的序列，
其中，SEQIDNO:7为ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDP或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDA或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDG或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRES
SEQIDNO:8为TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGA或
TCWSRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGL，
TCWTRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCAL，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGV，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGH，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRISDLTVEDGGTYRCGH，
SEQIDNO:9为CGGGTVVTVN，CGGGTAVTVN，CGDGTAVTVN或CGDGTAVTVN。
所述CDR1区可以为如图10B所示的任意CDR1区。所述CDR3区可以为如图10B所示的任意CDR3区。
本发明的该实施方式的序列可以如图9C所示。
定义
本发明的抗原特异性抗原结合分子含有源自可变新抗原受体(VNAR)分子的合成文库或源自VNAR分子的免疫文库的氨基酸序列。术语VNAR、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)和新抗原受体(NAR)也可以互换使用。
本文所示的氨基酸或者为单字母代码或者为三字母代码或者二者均可。
术语“亲和纯化”指的是分子的纯化，这基于所述分子与化学物质或结合伴侣之间的特异性吸附或结合以形成结合物或复合体，所述结合物或复合体允许该分子从杂质中分离，而保留结合或吸附至伴侣部分。
术语“互补决定区”或CDRs(即，CDR1和CDR3)指的是VNAR结构域的氨基酸残基，它的存在为抗原结合所必需的。每个VNAR通常具有三个CDR区域，被定义为CDR1和CDR3。每个互补决定区可以含有来自于“互补决定区”的氨基酸残基和/或来自于“高变区环”(HV)的那些残基。在某些情况下，互补决定区可以含有来自于CDR区和高变区环的氨基酸。根据VNAR分子通常可接受的命名法，不存在CDR2区。
“框架区”(Fw)为除了CDR残基以外的VNAR残基。每个VNAR通常具有五个框架区，被定义为FW1、FW2、FW3a、FW3b和FW4。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用(除非上下文另有说明)，并且这种命名包括细胞或细胞系的全部传代细胞。因此，例如，如“转化子”和“转化细胞”的术语包括原代受试细胞及其产生的培养物，而不考虑转化的数量。还应该理解的是所有传代细胞的DNA含量不可能精确地相同，因为存在特意的或偶然的突变。包括在初始的转化细胞中筛选出的具有相同功能或生物学活性的突变传代细胞。
当涉及表达时，“控制序列”指的是在特定宿主有机体中对于可操作连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地包括操纵子序列、核糖体结合位点等。真核细胞使用的控制序列，例如，启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
术语“衣壳蛋白”指的是一种蛋白质，其至少一部分存在于病毒颗粒的表面。从功能的角度来看，衣壳蛋白为在宿主细胞中病毒组装过程中与病毒颗粒相关的任意蛋白，并且保持与组装病毒相关直至其感染其它的宿主细胞。
在特定的试验中用于化学实体的“检测限”为对于该试验该实体超出背景水平的可以被检测到的最低浓度。例如，在噬菌体ELISA中，展示特定抗原结合片段的特定噬菌体的“检测限”为该特定噬菌体产生的ELISA信号超出由不展示该抗原结合片段的对照噬菌体产生的ELISA信号的噬菌体浓度。
“融合蛋白”和“融合多肽”指的是具有共价连接在一起的两个部分的多肽，其中，每个部分为具有不同特性的多肽。所述特性可以为生物学特性，例如体外或体内活性。所述特性还可以为简单的化学或物理特性，例如与靶抗原的结合、反应的催化作用等。这两部分可以通过单一肽键或含有一个或多个氨基酸残基的连接肽直接连接。一般情况下，这两部分和连接肽将彼此存在于阅读框中。优选地，多肽的这两部分从异源的或不同的多肽中获得。
一般而言，本文中的术语“融合蛋白”指的是通过化学方式(包括氢键或盐桥)或者通过肽键进行蛋白合成或者二者均可的方式结合在一起的一种或多种蛋白。
“异源DNA”为被导入宿主细胞的任意DNA。所述DNA可以源自多种来源，包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和这些的融合体或者组合。所述DNA可以包括来自于作为宿主细胞或受体细胞的相同细胞或细胞类型的DNA，或者来自于不同细胞类型的DNA，例如，来自于同种异体或异种来源。可选地，所述DNA可以包括标记物或选择基因，例如，抗生素抗性基因、耐热基因等。
“高度多样化位置”指的是位于轻链和重链的可变区的氨基酸的位置，当对已知的氨基酸序列和/或天然出现的抗体或抗原结合片段进行比较时，轻链和重链的可变区具有在该位置存在的多种不同氨基酸。高度多样化位置通常位于CDR区。
“同一性”描述了通过序列对比确定的两个或多个多肽序列或者两个或多个多核酸序列之间的关系。同一性还表示多肽或多核酸序列之间序列相关性(同源性)的程度，根据具体情况而定，通过这些序列的字符串(string)之间的匹配进行确定。虽然存在多种确定两种多肽或两种多核酸序列之间的同一性的方法，但是将通常采用的用于确定同一性的方法编成了计算机程序。优选的用于确定两种序列之间的同一性的计算机程序包括，但不限于，GCG程序包(Devereux,etal.,NucleicacidsResearch,12,387(1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschuletal.,J.Molec.Biol.(1990)215,403)。
优选地，使用由HGMP(人类基因组图谱制作计划)提供的BLAST计算机程序(Atschuletal.,J.Mol.Biol.(1990)215,403-410)的默认参数确定的蛋白的氨基酸序列与本文公开的氨基酸序列在氨基酸水平上具有至少50％的同一性。
更有选地，该蛋白序列在核酸或氨基酸水平上与本文所示的氨基酸序列具有至少55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％以及进一步优选95％以上(还更优选至少96％、97％、98％或99％)的同一性。
所述蛋白也可以含有与本文公开的序列具有至少50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，使用由HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数。
“文库”指的是多个VNARs或VNAR片段序列或编码这些序列的核酸所述文库的来源可以在性质上来自非天然来源或合成的，其中，多样性已经被设计成天然框架或天然框架的组合物，或者可以来自天然来源，例如从免疫动物提取的RNA中分离得到的VNAR结构域。
“连接(Ligation)”为两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。为了两个片段的连接，这两个片段的末端必须彼此兼容。在某些情况下，所述末端经核酸内切酶消化后将直接兼容。然而，可能有必要首先将经核酸内切酶消化后通常产生的粘端(staggeredend)转变成平末端以使它们对于连接是兼容的。对于使末端平端化，在存在四种脱氧核苷三磷酸的情况下使用约10单位的DNA聚合酶I或T4DNA聚合酶的Klenow片段，将DNA在合适的缓冲液中于15℃下处理至少15分钟。然后，该DNA通过苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀或者通过二氧化硅纯化进行纯化。将待连接在一起的DNA片段放入约等摩尔量的溶液中。该溶液也含有ATP、连接酶缓冲液和连接酶，如约10单位/0.5μgDNA的T4DNA连接酶。如果该DNA将被连接至载体中，该载体首先经合适的限制性内切核酸酶消化以线性化。然后，使用细菌碱性磷酸酶或牛小肠磷酸酶对该线性化片段进行处理以防止连接过程中发生自连接。
“突变”为相对于参照核酸序列如野生型序列，核苷酸的缺失、插入、或取代。
“天然的”或“天然发生的”VNARs，指的是从非合成来源确定的VNARs，例如，体外获得的组织来源，或者板鳃亚纲的动物血清。这些VNARs可以包括任何免疫应答的类型(或者天然的或其它诱导产生的)中生成的VNARs。天然的VNARs包括氨基酸序列，以及构建或编码这些抗体的核酸序列。如本文所用的，天然的VNARs不同于“合成的VNARs”，合成的VNARs指的是对来源或模板序列进行改变得到的VNAR序列，例如，使用不同的氨基酸在特定位置上进行一个氨基酸，或一个以上氨基酸的取代、缺失或添加，所述不同的氨基酸提供与源抗体序列不同的抗体序列。
术语“核酸构建体”通常指的是任意长度的核酸，其可以是通过克隆获得的或由化学合成产生的DNA、cDNA或RNA(如mRNA)。所述DNA可以是单链的或双链的。单链DNA可以是编码正义链，或者其可以是非编码链或反义链。对于治疗用途，所述核酸构建体优选为在待治疗的受试者中能够被表达的形式。
当涉及核酸时，“可操作地连接”指的是将所述核酸置入功能相关的另一核酸序列中。例如，将用于前序列或分泌性先导物的DNA可操作地连接至用于多肽的DNA，如果其被表达为参与多肽分泌的前蛋白；将启动子或增强子可操作地连接至编码序列，如果其影响该序列的转录；或者将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果将其置入有利于转录。通常情况下，“可操作地连接”指的是被连接的DNA序列是连续的，并且对于分泌性先导物应视情况而定且在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在合适的限制性位点上连接而实现的。如果这种位点不存在，合成的寡核苷酸接头或连接子按照常规用法使用。
“噬菌体展示”是一种技术，通过该技术多肽变异体以融合蛋白的形式被展示至至少噬菌体表面上的衣壳蛋白部分，如丝状噬菌体，颗粒。噬菌体展示技术允许制备随机蛋白变异体的大文库，其可以快速且有效的分选出与靶抗原以高亲和力进行结合的序列。噬菌体上的肽和蛋白质文库的展示可以被用于在数百万种多肽中筛选出一种具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经被用于展示小随机肽以及小蛋白，这通过将它们融合至编码丝状噬菌体的衣壳蛋白pIII、pVIII、pVI、pVII或pIX的基因中。
“噬菌粒”是一种具有细菌复制起点，如ColEl，以及细菌噬菌体的基因间隔区拷贝的质粒载体。该噬菌粒可以被用在任意已知的细菌噬菌体上，包括丝状细菌噬菌体和人字形细菌噬菌体。通常情况下，该质粒还将含有用于抗生素抗性的选择性标记物。克隆至这些载体的DNA片段可以作为质粒增殖。当携带这些载体的细胞被提供有用于产生噬菌体颗粒所需的所有基因时，质粒的复制模式转变为滚环复制，以生成质粒DNA一条链的拷贝并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可以生成感染性或非感染性噬菌体颗粒。该术语包括的噬菌粒含有连接至作为基因融合的异源多肽基因上的噬菌体衣壳蛋白基因或其片段，这样所述异源多肽被展示在噬菌体颗粒的表面。噬菌粒展示载体的实例为pWRIL-1。
术语“噬菌体载体”含有异源性基因并且能够复制的细菌噬菌体的双链复制形式。噬菌体载体具有允许噬菌体复制及噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。所述噬菌体优选为丝状细菌噬菌体，例如M13、fl、fd、Pf3噬菌体或者它们的衍生物，或人字形噬菌体，例如lambda21、phi80、phi81或它们的衍生物。
术语“蛋白质”在通用术语中指的是通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。它可以互换使用并且与肽、寡肽、寡聚物或多肽的意思相同，并包括糖蛋白及其衍生物。术语“蛋白质”还旨在包括蛋白质的片段、类似物、变异体及衍生物，其中，所述片段、类似物、变异体或衍生物保留了与参比蛋白质基本上相同的生物学活性。蛋白质类似物和衍生物的实例包括肽核酸和DARPins(设计的锚蛋白重复序列蛋白质(DesignedAnkyrinRepeatProteins))。“本发明的多肽”为如本文所定义的ICOSL特异性抗原结合分子。
蛋白质的片段、类似物、变异体或衍生物可以至少具有25优选为30或40，或者高达50或100，或60至120个氨基酸的长度，这依赖于其衍生自的起始蛋白序列的长度。在某些情况下，90至120，100至100的氨基酸的长度比较合适。
蛋白质的片段、衍生物、变异体或类似物可以为(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选为保守的氨基酸残基)取代并且该取代的氨基酸残基可以为或可以不为由遗传密码子编码的残基，或者(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团，或者(iii)其中额外的氨基酸被融合至成熟的多肽，如被用于多肽纯化的前导序列或辅助序列。该片段、衍生物、变异体和类似物被认为在本文所教导的本领域技术人员的范围内。
“寡核苷酸”为通过已知的方法(如使用固相技术的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酸胺化学法)经化学合成的长度较短的单链或双链多聚脱氧核苷酸。进一步的方法包括聚合酶链反应(PCR)，如果该基因的完整的核苷酸序列是已知的，或者与编码链互补的核酸的序列是可用的。可选地，如果靶氨基酸序列是已知的，使用用于每个氨基酸残基的已知的且优选的编码残基可以推测出可能的核酸序列。寡核苷酸可以在聚丙烯酰胺凝胶或分子尺寸柱(molecularsizingcolumns)上进行纯化或者通过沉淀进行纯化。当DNA与非核酸杂质(其可以为极性的、非极性的、离子型的，等)分离时DNA被“纯化”了。
本文所用的“来源”或“模板”VNAR指的是VNAR或VNAR抗原结合片段，其抗原结合序列作为模板序列，在该模板序列的基础上根据本文所述的标准实现多样性。抗原结合序列通常包括在VNAR内，优选为至少一个CDR，优选地包括框架区。
“转录调控元件”将包括以下一个或多个组件：增强子元件、启动子、操纵子序列、阻遏基因和转录终止序列。
“转化”指的是细胞摄取DNA并转变为“转化体”的过程。该DNA摄取过程可以是永久的或是瞬时的。“转化体”是已经摄取并保留DNA的细胞，其可以通过与所述DNA相关的表型的表达得到证明(例如由所述DNA编码的蛋白质提供的抗生素抗性)。
起始或参比多肽(如源VNAR或其CDR)的“变异体”或“突变体”，如融合蛋白(多肽)或异源多肽(与噬菌体异源)，是一种多肽，该多肽(1)具有不同于起始或参比多肽的氨基酸序列和(2)通过自然或人工诱变从起始或参比多肽衍生的。所述变异体包括，例如，目标多肽的氨基酸序列中残基的缺失，和/或插入和/或取代。例如，使用含有编码变异氨基酸(相对于在源VNAR或抗原结合片段中相应位置发现的氨基酸)的非随机密码子组的寡核苷酸生成的本发明的融合多肽将为相对于源VNAR或抗原结合片段的变异多肽。因此，变异CDR指的是含有相对于起始或参比多肽序列(例如源VNAR或抗原结合片段)的变异序列的CDR。变异氨基酸，在本文中，指的是在起始或参比多肽序列中相应位置(例如源VNAR或抗原结合片段的相应位置)上的氨基酸不同的氨基酸。缺失、插入和取代的任意组合均可以导致最终的变异或突变构建体，只要最终的构建体具有预期的功能特性。氨基酸的变化也可以改变多肽的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。
“野生型”或“参比”序列，或者“野生型”或“参比”蛋白/多肽(如衣壳蛋白)，或源VNAR的CDR的序列，可以为参比序列，通过引入突变从所述参比序列衍生变异多肽。通常情况下，特定蛋白的“野生型”序列为自然界中最常见的序列。相似地，“野生型”基因序列为自然界中最常见的基因的序列。通过自然进程或者通过人工诱变的方式可以在“野生型”基因(及其编码的蛋白)中引入突变。这种加工过程的产物为起始“野生型”蛋白或基因的“变异体”或“突变体”形式。
文库构建
可以根据如上描述的任意合适的技术构建合成文库。在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815,043优先权的处于共同待决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251中描述了从合成文库形成VNARs的方法(通过参考并入)。
将选择的氨基酸替换进模板核酸的方法已在本领域充分建立。例如，使用Kunkel法(Kunkeletal.,MethodsEnzymol.(1987),154,367-382)通过靶向用于和变异氨基酸进行氨基酸替换的至少一个CDR区中的氨基酸位置进行构建文库。因此，可以按照预期构建特异性密码子组。
密码子组为被用于编码预期的变异氨基酸的不同核苷酸三联体序列组。密码子组可以使用符号来表示以指定下述根据IUB代码所示的特定核苷酸或核苷酸的等摩尔混合物。
IUB代码
G鸟嘌呤
A腺嘌呤
T胸腺嘧啶
C胞嘧啶
R(A或G)
Y(C或T)
M(A或C)
K(G或T)
S(C或G)
W(A或T)
H(A或C或T)
B(C或G或T)
V(A或C或G)
D(A或G或T)H
N(A或C或G或T)
寡核苷酸或引物组可以使用标准方法进行合成。例如，通过固相合成，可以合成寡核苷酸组，其含有代表由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组合的序列以及将编码预期氨基酸组的序列。
在特定位置具有选择的核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域所公知的。这种具有特定密码子组的核苷酸组可以使用商业化的核酸合成产品(例如，购自AppliedBiosystems，福斯特城，CA)进行合成，或者可通过商购获得(例如，购自GeneLink公司，HawthornNY，或LifeTechnologies，洛克维尔，MD)。因此，合成的具有特定密码子组的寡核苷酸组通常包括多个具有不同序列的寡核苷酸，该差异是通过在整体序列中的密码子组建立的。根据本发明所用的寡核苷酸具有允许杂交至可变结构域核酸模板的序列，并且还可以包括用于克隆目的的限制酶位点。
编码其它来源或模板分子的核酸是已知的或者可以被轻易地确定。通常情况下，使用长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。理想的寡核苷酸将具有与编码突变的核苷酸的任意一侧的模板完全互补的12至15个核苷酸。这保证了寡核苷酸将正确地杂交至单链DNA模板分子上。使用本领域技术人员公知的技术(如Creaetal.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,(1987)75:5765)能够轻易地合成所述寡核苷酸。
通过衍生自细菌噬菌体M13载体(商购的M13mpl8和M13mpl9载体是合适的)的载体，或者如Vieraetal.,MethodsEnzymol.,(1987)153,3)描述的含有单链噬菌体复制起点的那些载体可以形成DNA模板。因此，待突变的DNA可以被插入这些载体中的一个以产生单链模板。
为了改变天然的DNA序列，将寡核苷酸在合适的杂交条件下杂交至单链模板。然后，加入DNA聚合酶，通常为T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段以合成作为合成引物的寡核苷酸模板的互补链。因此，形成了异源双链分子，使得DNA的一条链编码编码序列1的突变形式，并且另一条链(起始模板)编码编码序列1的天然的、未改变的序列。然后，将该异源双链分子转化入合适的宿主细胞，通常为原核生物，如大肠杆菌JM101。细胞生长后，将其接种在琼脂糖平板上并使用带有32-磷酸盐放射性同位素标记的寡核苷酸引物进行筛选以鉴定含有突变DNA的细菌克隆。
可以对上述方法进行修改以构建同源双链分子，其中该质粒的两条链均含有突变。修改如下：将单链寡核苷酸退火至如上所述的单链模板。将三种脱氧核苷酸，即脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖鸟苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(deoxyribothymidine，dTT)的混合物与经修饰的被称为dCTP-(aS)的硫代脱氧核糖胞嘧啶(thiodeoxyribocytosine)(其可以从Amersham获得)相结合。将该混合物加入至模板寡核苷酸复合物中。一旦将DNA酶加入至该混合物，便生成了与模板相同的DNA链，除了突变碱基以外。另外，该DNA新链将含有dCTP-(aS)而不是dCTP，其作用是保护该DNA链免被限制性核酸内切酶消化。双链异源双链核酸分子的模板链经合适的限制内切酶切口后，该模板链可以被ExoIII核酸酶或其它合适的核酸酶消化，而越过含有诱变处理的位点的区域。然后，终止该反应以保留仅为部分单链的分子。然后，在全部四种脱氧核苷三磷酸、ATP和DNA连接酶存在的情况下，使用DNA聚合酶生成完整的双链DNA同源双链。然后，将该同源双链分子转化至合适的宿主细胞内。
如前所示的寡核苷酸组的序列具有杂交至模板核酸的足够长度，还可以，但不是必须的，含有限制性位点。通过衍生自细菌噬菌体M13载体的那些载体或者含有如Viera等(Meth.Enzymol.(1987),153,3)描述的单链噬菌体复制起点的载体可以生成DNA模板。因此，待突变的DNA必须被插入这些载体之一以生成单链模板。
寡核苷酸组可以被用在聚合酶链反应中，使用核酸模板序列作为构建核酸表达盒(cassettes)的模板。该核酸模板序列可以为VNAR分子的任意部分(即，编码以取代为目标的氨基酸的核酸序列)。该核酸模板序列为具有第一核酸链和互补的第二核酸链的双链DNA分子的一部分。核酸模板序列含有VNAR结构域的至少一部分并且具有至少一个CDR。在有些情况下，核酸模板序列含有一个以上的CDR。核酸模板序列的上游部分和下游部分可以被靶向用于与上游寡核苷酸组和下游寡核苷酸组的成员杂交。
上游引物组的第一寡核苷酸可以杂交至第一核酸链并且下游引物组的第二寡核苷酸可以杂交至第二核酸链。该寡核苷酸引物可以包括一个或多个密码子组并且被设计为与核酸模板序列的一部分进行杂交。这些寡核苷酸的使用可以引入两个或多个密码子组至PCR后的PCR产物中(即，核酸表达盒)。杂交至编码VNAR结构域的核酸序列区的寡核苷酸引物包括编码CDR残基的部分，CDR残基用于氨基酸取代。
还可以合成上游和下游寡核苷酸组以在寡核苷酸序列中包括限制性位点。这些限制性位点可以促进核酸表达盒(即，PCR反应产物)插入进具有额外VNAR序列的表达载体中。
蛋白表达
编码本发明的抗原特异性抗原结合分子的核酸序列可以存在于核苷酸构建体中。这种核酸构建体可以为载体的形式，例如，表达载体，并且也可以包括染色体、附加体(episomal)和病毒来源的载体，例如，来自细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒(papova-viruses)，如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒(fowlpoxviruses)、假性狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体，以及来自它们的组合的载体，如衍生自质粒和细菌噬菌体基因元件，例如粘粒和噬菌粒的那些载体。通常情况下，适用于维持、增殖或表达核酸以在宿主中表达多肽的任何载体均可以被用于该方面的表达。
核酸构建体可以适当地包括启动子或其它控制核酸表达的调控序列。启动子和其它控制核酸表达的调控序列已经被识别并且为本领域所公知的。本领域技术人员将注意到可能没有必要利用全部启动子或其它调控序列。仅需要最基本的调控元件，并且，实际上，这种元件可以被用于构建嵌合序列或其它启动子。当然，基本要求是保留组织和/或时间(temporal)特异性。所述启动子可以为任意合适的已知启动子，例如，人巨细胞病毒(CMV)启动子、CMV即早启动子(immediateearlypromoter)、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40启动子或逆转录病毒LTRs的启动子，例如劳斯氏肉瘤病毒的启动子和金属硫因启动子，如小鼠金属硫因I启动子。启动子可以包括用于启动子活性的最基本组成(例如TATA元件，可选地，无增强子元件)，例如，CMV启动子的最基本序列。优选地，所述启动子为连续的核酸序列。
如本文所述的，核酸构建体可以为载体的形式。载体通常包括一种或多种表达标志物，所述表达标志物使得选择经其转染(或转化)的细胞成为可能，并且优选地，使得选择含有引入异源DNA载体的细胞成为可能。通常存在合适的起始和终止信号。
所述载体可以为任意合适的表达载体，例如pET。所述载体可以包括预期的额外的这种控制序列，例如选择性标志物(例如，抗生素抗性、荧光性等)，转录控制序列和启动子，包括起始和终止序列。
启动子可以为用于诱导由本发明的核酸序列编码的蛋白的表达的任意合适的启动子，例如CMV启动子、人磷酸甘油酸激酶(hPGK)启动子。
所述载体可以存在于宿主细胞中。用于本发明的核酸构建体表达的合适的宿主细胞的代表性实例包括病毒包装细胞，其允许将核酸包封入病毒载体，细菌细胞，如链球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；单细胞，如酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和曲霉细胞(Aspergillus)；昆虫细胞，例如果蝇S2(DrosophilaS2)和草地夜蛾Sf9(SpodopteraSf9)细胞；动物细胞，如CHO、COS、C127、3T3、PHK.293，和Bowes黑色素瘤细胞以及其它合适的人细胞；以及植物细胞，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)。适当地，宿主细胞为真核细胞，如CHO细胞或HEK293细胞。
将表达载体导入至宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子-脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮痕(scrapeloading)、弹道导入、感染或其他方法来实现。这些方法在许多标准实验室手册有描述，如Sambrooketal,MolecularCloning,aLaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。
在合适的启动子的控制下，在宿主细胞中可以被表达的成熟蛋白包括哺乳动物细胞，如CHO细胞、酵母、细菌、或其它细胞。可以使用非细胞翻译系统以产生如使用源自本发明第三方面的所述核酸构建体的RNAs产生的该类蛋白质。用于原核宿主和真核宿主的合适的克隆和表达载体由Sambrooketal,MolecularCloning,aLaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)进行了描述。
本发明还提供了含有本文描述的本发明的任意多聚核苷酸和/或载体的宿主细胞。根据本发明，提供了用于生产本发明的抗原特异性抗原结合分子的方法，包括在本文所定义的合适的宿主细胞中表达编码所述分子的核酸序列的步骤。
通过标准方法可以从重组细胞培养物中回收和纯化蛋白质，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析(chromatography)、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、凝集素和/或肝素层析。对于治疗，例如以重组载体的形式的核酸构建体可以通过本领域公知的技术进行纯化，如通过柱层析的方式，在Sambrooketal,MolecularCloning,aLaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)中进行了描述。
因此，本发明的这一方面扩展至制备本发明的融合蛋白的方法，包括在宿主细胞中表达生产重组融合蛋白，通过肽键连接、氢键或盐键或化学交联的方式对表达的融合蛋白进行纯化。在本发明的该方面的某些实施方式中，可以使用氢键或盐键制备融合蛋白，其中肽能够多聚化，例如二聚或三聚。
作为文库的蛋白表达
以蛋白文库形式的蛋白表达可以通过任意合适的技术实现。在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815，043优先权的处于共同待决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251中描述了表达蛋白文库的方法(通过参考并入)。
举例来说，可以将核酸表达盒克隆入任何合适的载体中，以表达含有生成的靶氨基酸取代物的部分或整个VNAR的载体。可以将所述核酸表达盒可以克隆入载体，允许产生被融合至全部或部分病毒衣壳蛋白的部分或全部VNAR链序列(如构建融合蛋白)并在颗粒或细胞表面展示。虽然几种类型的载体可用并且可以用于本发明，但是噬菌粒载体为本文使用的优选载体，因为它们的构建相对容易，并且可以容易地扩增。噬菌粒载体通常包括多种组分，包括启动子、信号序列、表型选择基因、复制位点的起点以及其它必需组分。
在另一种实施方式中，其中，特定的变异氨基酸组合物被表达，核酸表达盒含有能够编码全部或部分VNAR序列，并且能够编码变异氨基酸组合物的序列。对于含有这些变异氨基酸或变异氨基酸的组合物的抗原特异性抗原结合分子的生产，核酸表达盒可以被插入含有额外VNAR序列的表达载体中，例如，多种CDR、框架区和/或高变区的全部或部分。这些额外的序列还可以被融合至其它的核酸序列，例如编码病毒衣壳蛋白组分的序列，因此，允许产生融合蛋白。
本发明的一方面包括含有编码基因融合的核酸序列的可复制的表达载体，其中，所述基因融合编码含有VNAR序列和第二VNAR序列的融合蛋白，被融合至全部或部分病毒衣壳蛋白。所述载体可以包括多种组件并且优选地被构建成允许在不同的载体之间运动的VNAR序列和/或以提供不同形式的融合蛋白的展示。
载体的实例包括噬菌体载体。所述噬菌体载体具有允许噬菌体复制及噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。优选地，所述噬菌体为丝状细菌噬菌体，例如，M13、fl、fd、Pf3噬菌体或它们的衍生物，或者人字形噬菌体，如lambda、21、phi80、phi81、82、424、434等，或它们的衍生物。
病毒衣壳蛋白的实例包括感染性蛋白PIII、主要衣壳蛋白PVIII、p3、Soc(T4)、Hoc(T4)、gpD(细菌噬菌体lambda的)、小细菌噬菌体衣壳蛋白6(pVI)(丝状噬菌体；Huftonetal,JImmunolMethods.(1999),231,(1-2):39-51)、M13细菌噬菌体主要衣壳蛋白(P8)的变异体(Weissetal,ProteinSci(2000)9(4):647-54)。所述融合蛋白可以在噬菌体的表面展示，并且合适的噬菌体系统包括M13K07辅助噬菌体、M13R408、M13-VCS和PhiX174、pJuFo噬菌体系统(PereboevetalJVirol.(2001)；75(15):7107-13)，以及超级噬菌体(RondotetalNatBiotechnol.(2001)；19(1):75-8)。优选的辅助噬菌体为M13K07，并且优选的衣壳蛋白为M13噬菌体基因III衣壳蛋白。优选的宿主为大肠杆菌以及并且大肠杆菌的蛋白酶缺陷菌株。载体，如fthl载体(Enshell-Seijffersetal.,NucleicAcidsRes.(2001)；29(10):E50-0)可以有助于融合蛋白的表达。
表达载体还可以具有融合至编码每个VNAR或其片段的DNA上的分泌信号序列。该序列通常直接位于编码融合蛋白的基因的5’端，因此，将在融合蛋白的氨基末端被转录。然而，在某些情况下，已经证明所述信号序列位于编码被分泌蛋白的基因的5’端以外的位置。该序列靶向跨细菌细胞内膜附着(attache)的蛋白质。编码信号序列的DNA可以作为来自编码具有信号序列的蛋白的任意基因的限制性内切核酸酶片段而获得。合适的原核信号序列可以从编码基因，例如，LamB或OmpF(Wongetal,Gene,(1983)68,1931)、MalE、PhoA和其它基因获得。
用于实施本发明的优选的原核信号序列为如Changetal(Gene55.189(1987))描述的大肠杆菌热稳定肠毒素II(STII)信号序列和malE。
所述载体通常也包括用于促进融合蛋白表达的启动子。在原核载体中最常用的启动子包括lacZ启动子系统、碱性磷酸酶pho启动子(AP)，细菌噬菌体XPL启动子(温敏启动子)，tac启动子(受lac阻遏子调节的杂合trp-lac启动子)、色氨酸启动子和噬菌体T7启动子。对于启动子的常规描述，请参见Sambrooketal第17章。虽然这些是最常用的启动子，但是也可以使用其它合适的微生物启动子。
所述载体还可以包括其它核酸序列，例如，编码gD标签、c-Myc表位、聚-组氨酸标签、荧光蛋白(如GFP)、或β-半乳糖苷蛋白的序列，它们对噬菌体或细胞表面上表达的融合蛋白的检测或纯化是有用的。
编码如gD标签的核酸序列还提供了表达融合蛋白的细胞或病毒的阳性或阴性选择。在一些实施方式中，所述gD标签优选地被融合至未与病毒衣壳蛋白组分融合的VNAR序列上。编码如多组氨酸的核酸序列有利于通过使用免疫组织化学方法鉴定包括结合至特异抗原的VNAR序列的融合蛋白。有利于抗原结合检测的标签可以被融合至未与病毒衣壳蛋白组分融合的VNAR序列或者与病毒衣壳蛋白组分融合的VNAR序列上。
用于实施本发明的另一种有用的载体组分为表型选择基因。典型的表型选择基因为那些编码赋予宿主细胞抗生素抗性的编码蛋白的基因。举例来说，氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)很容易被用于该目的。
所述载体还可以包括含有特殊限制性位点和可抑制的终止密码子的核酸序列。该特殊限制性位点有利于VNAR序列在不同载体和表达系统之间移动。所述可抑制的终止密码子有利于控制融合蛋白的表达水平以及促进可溶性VNAR片段的纯化。例如，琥珀终止密码子(amberstopcodon)可以被读为supE宿主中的Gln以使噬菌体展示成为可能，虽然在非supE宿主中其被读为终止密码子以产生未融合至噬菌体衣壳蛋白的可溶性VNAR片段。这些合成序列可以被融合至载体中的一个或多个VNAR序列上。
可以方便地使用载体系统，其允许编码兴趣序列如具有变异氨基酸的CDR的核酸轻易地从载体系统中移除并置入另一载体系统中。例如，可以在载体系统中设计合适的限制性位点以促进编码VNAR的核酸序列的移除。所述限制性序列通常选择为在载体中是特殊的，以促进有效地切除和连接入新载体中。然后，可以从无外源融合序列(例如病毒衣壳蛋白或其它序列标签)的载体表达VNAR序列。
在编码VNAR序列(基因1)与病毒衣壳蛋白组分(基因2)的核酸之间，可以插入编码终止(termination)或停止(stop)密码子的DNA，例如所述终止密码子包括UAG(琥珀，(amber))、UAA(赭石(ocher))和UGA(蛋白石(opel))(Microbiology,Davisetal.,Harper&Row,NewYork,1980,pp.237,245-47and374)。在野生型宿主细胞中表达的终止或停止密码子引起基因1蛋白产物的合成，而未附带基因2蛋白。然而，在抑制性宿主细胞中生长可以引起可检测量的融合蛋白的合成。所述抑制性宿主细胞是公知的且已有描述，例如大肠杆菌抑制性菌株(Bullocketal.,BioTechniques5:376-379(1987))。任意可接受的方法均可以被用于将这种终止密码子置入编码融合多肽的mRNA中。
可以在编码VNAR序列的第一基因与编码至少部分噬菌体衣壳蛋白的第二基因之间插入抑制性密码子。可选地，通过替换VNAR序列中的最后一个氨基酸三联体或噬菌体衣壳蛋白中第一个氨基酸，将所述抑制性终止密码子可以插入融合位点附近。所述抑制性终止密码子可以位于二聚化结构域的C-末端上或者之后。当含有抑制性密码子的质粒在抑制性宿主细胞中生长时，其导致产生可检测量的含有多肽和衣壳蛋白的融合多肽。当所述质粒在非抑制性宿主细胞中生长时，VNAR序列被大量合成，而未融合至噬菌体衣壳蛋白上，这是由于在插入的抑制性三联体UAG、UAA或UGA处的终止。在非抑制性细胞中抗体可变结构域被合成并且从宿主细胞分泌，这是由于缺少融合的噬菌体衣壳蛋白，否则其可以将抗体可变结构域锚定至宿主细胞膜上。
本发明的抗原特异性抗原结合分子
在本发明的某些实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子具有选自如图9所示的组中的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子为如图9所示的氨基酸序列，或其任意变异体、类似物、衍生物或片段，包括使用由HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数的与它们具有50％同一性的序列，或者具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性。在本发明的一种实施方式中，所述抗原特异性抗原结合分子是人源化的。它可以方便地提供本发明的约20％至约85％人源化(例如约25％至约60％人源化)的人源化结合分子。VNAR结构域的人源化之前已经进行过(WO2013/167883；Kovalenka,O.V.,etal.,J.Biol.Chem.,2012.288(24):p.17408-17419)，其例证了增加氨基酸残基与人抗体框架的氨基酸残基的同一性百分比且具有最小功能损失的能力。来源于白斑角鲨的抗人白蛋白结合VNARE06已经被人源化((E06patentreference；Kovalenka,O.V.,etal.,J.Biol.Chem.,2012.288(24):p.17408-17419)，并且保留了结合靶标的能力。来自于ELSS1文库(已知为2V和5V)的融合的同种型框架也来源于白斑角鲨，并且同样地，来自图9A(1D12)的实例的框架残基与E06框架之间具有92％的同一性。可以预测的是可以使用相同的方法人源化合成的抗人ICOSL结构域。相同的是作为护士鲨I型结构域的免疫的抗人ICOSL结构域确实与也已经被人源化的抗HEL结构域5A7相似((WO2013/167883；Kovalenka,O.V.,etal.,J.Biol.Chem.,2012.288(24):p.17408-17419)。
所述抗原特异性抗原结合分子可以包括使用前被剪切的额外的N-末端或C-末端序列，这有助于如本文描述分子的生产过程中的纯化和/或分离。例如，在分子C-末端的(Ala)3(His)6。
本发明还包括具有蛋白质的氨基酸序列的变异体、类似物、衍生物和片段，其中任意组合的数个如5至10个、或1至5个、或1至3个、2个、1个或无氨基酸残基被取代、缺失或添加。其中，特别优选的是沉默取代、添加和缺失，其不改变本发明的蛋白的特性和活性。另外，在这方面特别优选的是保守性取代，其中，相对于原始形式，本发明的蛋白的特性以变异形式被保留。变异体还包括含有根据本发明的抗原特异性抗原结合分子的融合蛋白。
如上述所讨论的，本发明的变异体的实例包括一个或多个氨基酸被其它一个或多个氨基酸替换的蛋白质。本领域技术人员意识到多种氨基酸具有类似的特性。物质的一个或多个这种氨基酸通常可以被一个或多个其它这种氨基酸替换而不影响或消除该物质的预期活性。这种替换可以被称为“非保守的”氨基酸替换。
因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸通常可以相互替换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。在这些可能的替换中，优选甘氨酸和丙氨酸用于相互替换(因为它们具有相对短的侧链)以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸用于相互替换(因为它们具有较大的疏水性脂肪族侧链)。其它通常可相互替换的氨基酸包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(氨基酸具有酰胺侧链)；以及半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。这种性质的替换通常被称为“保守的”或“半保守的”氨基酸替换。
相对于如上所述的融合蛋白的氨基酸序列，也可以进行氨基酸缺失或插入。因此，例如，可以缺失对多肽的活性没有实质影响，或者至少不会消除该活性的氨基酸。所述缺失可能是有益的，因为可以减少多肽的整体长度和分子量而仍然保留其活性。这可以使得用于特定目的所需的多肽的量被减少-例如，剂量水平可以被降低。
相对于如上融合蛋白序列，也可以进行氨基酸插入。这可以改变本发明的物质的性质(例如，有助于鉴定、纯化或表达，如上关于融合蛋白的解释)。
相对于本发明的融合蛋白的序列，可以使用任意合适的技术，例如通过使用定点诱变来进行氨基酸的变化。
应该理解的是，在本发明范围内的氨基酸取代或插入可以通过使用天然存在的或非天然存在的氨基酸进行。无论使用的是否为天然的或合成的氨基酸，优选为仅存在L-氨基酸。
根据本发明的蛋白质可以具有额外的N-末端和/或C-末端氨基酸序列。这种序列可以因为多种原因被提供，例如，糖基化。
融合蛋白可以包括本发明的抗原特异性抗原结合分子，其被融合至为融合蛋白提供结构元件的异源肽或蛋白序列上。在其它的实施方式中，所述融合蛋白可以包括本发明所述的抗原特异性抗原结合分子，其与具有生物学活性的分子相融合，即，具有药理学上有用的活性的治疗蛋白。所述分子可以为肽或蛋白序列，或者其它生物学活性分子。
例如，抗原特异性抗原结合分子可以被融合至异源肽序列上，该序列可以为聚氨基酸序列，例如，多个组氨酸残基或多个赖氨酸残基(适当情况下为2、3、4、5或6个残基)，或免疫球蛋白结构域(例如Fc结构域)。
异源肽序列的参照包括来源于其它哺乳动物物种的序列，例如小鼠和人以及来源于其它VNAR结构域的任意异源肽序列。
其中，融合蛋白包含本发明的与具有生物学活性的分子相融合的抗原特异性抗原结合分子，生物学活性部分可以为具有生物学活性的肽或蛋白质，例如酶、免疫球蛋白、细胞因子或其片段。可选地，所述生物学活性分子可以为抗生素、抗癌药、NSAID、类固醇、镇痛剂、毒素或其它药学活性剂。抗癌药可以包括细胞毒性药物或细胞生长抑制剂。
在一些实施方式中，所述融合蛋白可以包括本发明的抗原特异性抗原结合分子，该分子被融合至另一种免疫球蛋白的可变区或恒定区，或本发明的另一种抗原特异性抗原结合分子。换句话说，本发明所述的抗原特异性抗原结合分子的融合体的长度可以是可变的，例如，二聚体、三聚体、四聚体或更多聚体(即，五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体，或更多)。在特定的实施方式中，这可以表示为单体VNAR亚基的多聚体。
例如，其中，将VNARCDRs融合至额外的肽序列，该额外的肽序列可以提供病毒颗粒或细胞表面的一种或多种融合多肽的相互作用。因此，这些肽序列可以被称为“二聚化结构域”。二聚化结构域可以包括至少一种或多种二聚化序列，或者至少一种含有半胱氨酸残基的序列或者包括这二者。合适的二聚化序列包括那些具有两亲性α螺旋的蛋白质，其中，疏水性残基被有规律地间隔开，并且通过每种蛋白质的疏水性残基的相互作用允许二聚体的形成；所述蛋白质及部分蛋白质包括，例如，亮氨酸拉链区。
二聚化结构域还可以包括一个或多个半胱氨酸残基(例如，通过在二聚化结构域内包括抗体铰链序列提供)。该半胱氨酸残基通过形成一个或多个二硫键提供二聚化。在一种实施方式中，其中，在二聚化结构域的后面存在停止密码子，该二聚化结构域包含至少一个半胱氨酸残基。该二聚化结构域优选位于抗体可变区或恒定区与病毒衣壳蛋白组分之间。
在本发明的融合蛋白中，抗原特异性抗原结合分子可以通过结合体部分直接融合至或连接至该融合蛋白的其它元件上。所述结合体可以为肽、肽核苷酸或聚酰胺结合体。合适的肽结合体可以包含多个氨基酸残基，例如，4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个氨基酸，如(Gly)4、(Gly)5、(Gly)4Ser、(Gly)4(Ser)(Gly)4或其组合或其多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体或更多)。例如，合适的结合体可以为(GGGGS)3。可选的结合体包括(Ala)3(His)6或其多聚体。还包括使用由HGMP提供的BLAST计算机程序的默认参数的至少具有50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的序列。
在某些情况下，载体编码融合至衣壳蛋白的单一VNAR噬菌体多肽。在这些情况下，该载体被认为是“单顺反子”，在确定的启动子的控制下表达一种转录物。
这种载体的示例性实例使用了碱性磷酸酶(AP)或Tac启动子以促进编码VNAR区的单顺反子序列的表达，在两个结构域之间具有连接肽。该顺反子序列可以在5’-端被连接至大肠杆菌malE或热稳定性肠毒素II(STII)信号序列上并且在其3’端被连接至全部或部分病毒衣壳蛋白(例如，pIII蛋白)上。该载体可以进一步包括在其3’-末端，第二可变结构域序列与病毒衣壳蛋白序列之间编码二聚化结构域(如亮氨酸拉链)的序列。含有二聚化结构域的融合多肽能够发生二聚化以形成两个多肽的复合体。
在其它情况下，VNAR序列(多个VNAR序列或片段)可以被表达为单独的多肽，因此，该载体为“双顺反子”，其允许单独的转录本的表达。在这些载体中，合适的启动子，如Ptac或PhoA启动子，可以被用于促进双顺反子信息的表达。例如，编码第一VNAR序列的第一顺反子可以在5’-端可以被连接至大肠杆菌malE或热稳定的肠毒素II(STII)信号序列上以及在3’-端被连接至编码gD标签的核酸序列上。例如，编码第二VNAR序列的第二顺反子可以在5’-端被连接至大肠杆菌malE或热稳定的肠毒素II(STII)信号序列上以及在3’-末端被连接至全部或部分病毒衣壳蛋白上。
示例性载体可以包括合适的启动子，例如Ptac或PhoA(AP)启动子，它们可以促进编码在5’-端被可操作地连接至大肠杆菌malE或热稳定肠毒素II(STII)信号序列上且在3’-端被连接至编码gD标签的核酸序列上的VNAR序列的第一顺反子的表达。例如，第二顺反子编码另一VNAR序列，该序列在5’-端被可操作地连接至大肠杆菌malE或热稳定肠毒素II(STII)信号序列上且在3’-端具有含有IgG铰链序列和亮氨酸拉链序列以及跟随的至少部分病毒衣壳蛋白的二聚化结构域。
VNAR序列的融合多肽可以在细胞、病毒、或噬菌粒颗粒的表面以多种形式被展示。这些形式包括单链片段和这些片段的多价形式。所述多价形式可以为二聚体，或更高的多聚体。展示的所述多价形式是方便的，因为它们具有一个以上的抗原结合位点，这通常导致较低亲和力克隆的识别，还允许在筛选过程中稀有克隆的更有效分类。
将根据本发明的描述构建的载体导入宿主细胞进行扩增和/或表达。使用标准转化方法可以将载体导入宿主细胞，所述方法包括电穿孔、磷酸钙沉淀和类似方法。如果载体为感染性颗粒如病毒，那么该载体本身提供对宿主细胞的进入。含有编码基因融合体的可复制表达载体宿主细胞的转染以及根据标准操作流程生产噬菌体颗粒可以提供噬菌体颗粒，在其中，在噬菌体颗粒表面展示融合蛋白。
通过使用多种方法将可复制表达载体导入宿主细胞。在一种实施方式中，可以通过使用将载体导入细胞。细胞在标准培养液的培养中生长，可选地，在约37℃下生长约6-48小时(或者生长至OD600＝0.6-0.8)，然后将培养液进行离心并移除上清液(如轻轻倒出)。优选地，通过将细胞沉淀在缓冲液(如1.0mMHEPESpH7.4)中重悬，之后再离心并移除上清液进行初步纯化。将得到的细胞沉淀重悬于被稀释的甘油中(如5-20％v/v)，再次离心以形成细胞沉淀并移除上清液。通过将上述细胞沉淀重悬于水中或稀释的甘油中至预期浓度以获得最终的细胞浓度。
在电穿孔(约10x)期间较高的DNA浓度的使用可以提高转化效率并增加转化入宿主细胞的DNA的量。使用高细胞浓度还可以提高效能(约10x)。较大量的转化的DNA可以产生更大的文库，该文库具有更大的多样性并且呈现出组合文库更大数量的特殊成员。通常通过在含有抗生素的培养基中生长以选择转化细胞。
噬菌体展示在识别靶抗原结合体中的应用已经在本领域建立，其具有多种置换(permutations)和变异(variations)的方法。一种方法包括构建含有被可操作地连接至编码融合多肽的基因融合体上的转录调控元件的多种(variant)可复制载体家族，转化合适的宿主细胞，培养转化的细胞以形成在噬菌体颗粒表面展示融合多肽的噬菌体颗粒，之后需要通过将重组噬菌体颗粒与靶抗原接触以进行选择或分选，使得至少部分颗粒群与靶标结合，其目的是为了提高并丰富在选择过程中结合颗粒相对于未结合颗粒的颗粒子集。选择池可以通过感染宿主细胞进行扩大，以为了另一轮在不同或相同严格度下在同一靶标上进行分选。然后，将得到的变异体池进行抗靶抗原的筛选以识别新型具有高亲和力的结合蛋白。
这些新型具有高亲和力的结合蛋白作为治疗剂、作为拮抗剂或激动剂，和/或诊断和研究试剂是有用的。
融合多肽如含有变异氨基酸的抗体可变域可以在噬菌体、噬菌粒颗粒或细胞的表面上表达，然后，选择和/或筛选出具有结合至通常为目标抗原的靶抗原的融合多肽组的成员的能力。
这种融合蛋白可以通过任意合适的途径进行制备，包括通过在宿主细胞或非细胞系统中表达的重组技术，以及通过化学合成途径。
ICOSL特异性文库成员的选择
靶标的结合体的选择方法也可以包括在通用蛋白上进行分选，该通用蛋白对抗体可变区如蛋白L或结合至抗体的标签特异性抗体或在噬菌体上展示的抗体片段具有亲和力，该方法可以被用于丰富展示正确折叠抗体片段(融合多肽)的文库成员。
靶ICOSL蛋白可以从天然来源分离得到或者通过本领域公知步骤的重组方法制备得到。用于亲和力选择(selection)(分选(sorting))的两种主要策略可以为(i)固体载体法(solid-supportmethod)或平板分选法或固定靶标分选法；和(ii)溶液结合法。
对于固体载体法，靶蛋白可以被吸附于合适的本领域所公知的固体或半固体基质上，例如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸羟烷基凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体等。
将靶抗原吸附至基质上以后，固定的靶标与表达融合多肽的文库在适合将噬菌体颗粒群的至少一个子集与固定的靶抗原结合的条件下进行接触。正常情况下，所述包括pH值、离子强度、温度等的条件将模拟生理条件。结合至固定的靶标上的颗粒(“结合体”)通过洗涤从未结合至靶标上的颗粒中分离出来。可以调整洗涤条件以导致脱除全部但除了高亲和力的结合体。结合体可以通过多种方法从固定的靶标分离。这些方法包括使用野生型配体(如过量的靶抗原)的竞争性分离，改变pH值和/或离子强度，以及本领域所公知的方法。结合体的选择通常包括从具有合适洗脱材料如0.1MHCl等的酸或配体的亲和基质中洗脱。伴有提高配体浓度的洗脱可以洗脱显示出亲和力升高的分子。
结合体可以被分离并且之后通过使用作为结合体(以及如果必要的话为辅助噬菌粒，例如当病毒颗粒为噬菌粒颗粒时)的病毒颗粒感染细胞以在合适的宿主细胞中进行再扩增，并且在适用于展示预期融合多肽的颗粒的扩增条件下培养宿主细胞。然后，收集噬菌体颗粒并且重复一次或更多次该选择过程，直至靶抗原的结合体在某种程度上被富集。可以使用任意数量的选择或分选轮数。一种选择或分选过程可以包括分离结合至通用亲和蛋白如蛋白L的结合体或结合至存在于展示多肽中的多肽标签的抗体，例如结合至gD蛋白或聚组氨酸标签的抗体。
另一种选择方法为“溶液-结合方法”，该方法允许溶液相分选，且具有超过常规的溶液分选方法的提高的效率。该溶液结合方法已经被用于从随机文库中发现起始结合体或者从指定改善特定结合克隆或克隆组的亲和力的文库中发现改善的结合体。该方法包括与多个多肽接触，例如在具有标记的或与标签分子融合的靶抗原的噬菌体或噬菌粒颗粒(文库)上展示的多肽。所述标签可以为生物素或其它可用的特异性结合体的基团。溶液相的严格度可以通过使用降低浓度的第一溶液结合相中带有标记的靶抗原进行变化。
为了进一步提高严格度，第一溶液结合相之后可以为第二溶液相，该第二溶液相在第一溶液相中与带有标记的的靶标发生初始结合后具有高浓度的未标记的靶抗原。通常情况下，在第二相中(如果包括)使用的未带有标记的靶标超过带有标记的靶标100至1000倍。第一溶液相的孵育时间长度可以从几分钟变化为一到两个小时或者更长时间以达到平衡。在该第一相中使用较短的结合时间可能偏向于(bias)或选择出具有快结合速率的结合体。可以改变在第二相中孵育的时间长度和温度以增加严格度。这提供了选择具有低速率脱离靶点(脱离速率)的结合体的偏向。
多个多肽(在噬菌体/噬菌粒颗粒上展示的)与靶抗原接触后，将结合至带有标记的靶标的噬菌体或噬菌粒颗粒与未结合的噬菌体相分离。从结合的溶液相中分离颗粒-靶标混合物，这通过将其与带有标记的靶标部分相接触并允许其与结合有带有标记的靶标部分的分子结合一段较短的时间(如2-5分钟)。标记的靶抗原的初始浓度的范围为约0.1nM至约1000nM。结合的颗粒被洗脱并且可以进行增殖以用于下一轮分选。多轮分选优选每轮分选使用较低浓度的标记的靶抗原。
例如，使用约100至250nM标记的靶抗原进行初始分选或选择应该足够获得大范围的亲和力，虽然该因素可凭经验确定和/或符合工作者的预期。在第二轮选择中，可以使用约25至100nM的标记的靶抗原。在第三轮选择中，可以使用约0.1至25nM的标记的靶抗原。例如，为了改善100nM结合体的亲和力，预期开始于20nM，然后逐步变为5和1nM的标记的靶点，然后，甚至为更低浓度例如约0.1nM的标记的靶抗原。
如本文所述的，固体载体法语溶液分选法的结合在用于分离具有预期特性的结合体方面是有利的。对靶抗原选择/分选数轮以后，通常从已选的池中筛选单克隆以识别具有预期性能/特性的特异性结合体。优选地，筛选过程通过自动系统进行以允许文库候选者的高通量筛选。
以下描述了两种主要的筛选方法。然而，也可以使用其它方法。第一种筛选方法包括使用固定靶抗原进行的噬菌体ELISA试验，该方法提供了从非结合克隆中对特异性结合克隆的识别。通过对靶包被孔和BSA或其它非靶蛋白包被孔上的克隆的同时测定确定特异性。该测定法是自动的，可用于高通量筛选。
一个实例包括通过生成含有大量多肽的可复制表达载体文库以选择抗体可变区的方法，所述抗体可变区结合来自抗体可变区的库的特异性靶抗原，该方法包括；在适用于结合的条件下将该文库与靶抗原和至少一种非靶抗原进行接触；在该文库中将多肽结合体与非结合体相分离；识别结合至靶抗原和未结合至非靶抗原的结合体；从靶抗原上洗脱所述结合体；并扩增含有结合至特异性抗原的多肽结合体的可复制表达载体。
另一实例包括亲和筛选试验，该试验提供了以高通量的方法从具有低亲和力的克隆中筛选出具有高亲和力的克隆。在该试验中，应用于靶包被孔之前较短时间内(如5-15分钟)，在与特定浓度的靶抗原进行和未进行一段时间(如30-60分钟)的第一次孵育的情况下对每个克隆进行试验。然后，通过常规的噬菌体ELISA法检测结合的噬菌体，例如，使用抗-M13HRP结合物(conjugates)。两个孔的结合信号的比率表明亲和力，其中一个孔已经与靶标预孵育，另一个孔未与靶抗原预孵育。用于第一次孵育的靶标的浓度的选择依赖于目的亲和力的范围。例如，如果预期结合体的亲和力高于10nM，在第一次孵育中通常使用1000nM的靶标。一旦从特定一轮分选(选择)中发现结合体，可以使用亲和力筛选试验对这些克隆进行筛选以识别出具有高亲和力的结合体。
可以方便地采用任意上述分选/选择方法的组合。例如，在一种实施方式中，首先选择结合至固定靶抗原的多肽结合体。
然后，将结合至固定靶抗原的多肽结合体进行扩增并且筛选出结合至靶抗原和未结合至非靶抗原的结合体。扩增特异性结合至靶抗原的多肽结合体。然后，通过将这些多肽结合体与一定浓度的标记的靶抗原接触以形成复合物，从而对这些多肽结合体进行较高亲和力的筛选，其中标记的靶抗原的浓度范围为从约0.1nM至约1000nM，所述复合物通过与结合至靶抗原上的标记的制剂相接触而被分离。然后，将多肽结合体从标记的靶抗原洗脱下来，可选地，重复进行数轮选择，每次使用更低浓度的标记的靶抗原。然后，使用该筛选方法分离出的具有高亲和力的多肽结合体可以使用例如，使用溶液相ELISA试验或点竞争ELISA试验以用于高亲和力筛选。
通过结合至靶抗原识别出结合体之后，可以提取核酸。然后，提取的DNA可以被直接用于转化入大肠杆菌宿主细胞或者，可选地，扩增编码序列，例如使用具有合适引物的PCR，并且通过常规的测序法进行测序。结合体的DNA可变域可以经限制性内切酶消化，然后被插入用于蛋白表达的载体中。
其它合适的选择方法可以包括生成多个具有一个或多个多样化CDR区的多肽，通过在适用于结合的条件下将多个多肽与靶抗原相接触分选出对于靶抗原为结合体的多个多肽；从那些未结合的结合体中分离出与靶抗原结合的结合体；分离上述结合体；并且鉴定具有高亲和力的结合体。结合至靶抗原的结合体的亲和力可以使用如本文描述的竞争ELISA法进行确定。可选地，所述多肽可以被融合至多肽标签如gD、poly-his或FLAG，其可以被用于分选与分选用靶抗原相结合的结合体。
另一实例包括从VNARs文库中选择结合至靶抗原的抗原特异性抗原结合分子，其包括：a)生成含有本发明的多个多肽的可复制表达载体的文库；b)通过在适用于结合的条件下将所述文库与固定靶抗原相接触，从该文库中分离相对于靶抗原的多肽结合体；c)将文库中的多肽结合体与非结合体相分离并且从靶抗原洗脱结合体；d)扩增具有多肽结合体的可复制表达载体；以及e)可选地，至少重复两次步骤a-d。
所述方法可以进一步包括：f)将经扩增的含有多肽结合体的可重复表达载体与浓度在0.1nM至1000nM范围内的带有标记的靶抗原在适用于结合的条件下进行孵育以形成混合物；g)将上述混合物与结合至靶抗原上标签的固定剂相接触；h)分离结合至带有标记的靶抗原上的多肽结合体并且将该多肽结合体从带有标记的靶抗原上洗脱下来；i)扩增含有多肽结合体的可复制的表达载体；以及j)可选地，至少重复两次步骤f)至i)，每次使用更低浓度的带有标记的靶抗原。可选地，所述方法可以包括添加过量的不带标签的靶抗原至混合物中并且孵育一定时间以足够使得具有低亲和力的结合体从带有标记的靶抗原洗脱下来。
另一实例包括从可复制的表达载体文库中分离或选择出对靶抗原具有高亲和力的结合体，其包括：a)生成含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库；b)将上述文库与浓度至少为约0.1nM至1000nM的靶抗原相接触以分离靶抗原的多肽结合体；c)从靶抗原中分离多肽结合体并且扩增含有该多肽结合体的可重复的表达载体；d)可选地，至少重复两次步骤a-c，每次使用更低浓度的靶抗原以分离出结合至最低浓度靶抗原的多肽结合体；e)通过将上述多肽结合体与数种不同的靶抗原稀释液共孵育并确定该多肽结合体的IC50值，选择出具有高亲和力的结合至最低浓度靶抗原的多肽结合体；以及f)鉴定出与浓度为约0.1nM至200nM的靶抗原具有亲和力的多肽结合体。
另一实例包括从含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库中选择多肽结合体的试验，其包括：a)将上述文库与浓度在0.1nM至1000nM范围内的带有标记的靶抗原在适用于结合的条件下相接触以形成多肽结合体与带有标记的靶抗原的复合物；b)分离该复合物并从带有标记的靶抗原中分离出多肽结合体；c)扩增含有多肽结合体的可复制的表达载体；d)可选地，至少重复两次步骤a-c，每次使用更低浓度的靶抗原。
可选地，该方法可以进一步包括添加过量的不带标签的靶抗原至多肽结合体与靶抗原的复合物中。在一种优选的实施方式中，重复两次该方法的上述步骤并且在第一轮选择中靶标的浓度约为100nM至250nM，并且在第二轮选择中靶标的浓度约为25nM至100nM，并且在第三轮选择中靶标的浓度约为0.1nM至25nM。
其它识别目的结合蛋白的可能途径包括对含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库进行筛选的方法，其包括：a)将第一文库样本与一定浓度的靶抗原在适用于多肽结合至靶抗原的条件下进行孵育；b)将第二文库样本在无靶抗原的条件下孵育；c)将每第一样本和第二样本均与固定靶抗原在适用于多肽结合至固定靶抗原的条件下进行接触；d)检测每个样本对固定靶抗原的结合多肽的量；e)通过计算第一样本中结合多肽的量超出第二样本中结合多肽的量的比率，以确定多肽对靶抗原的亲和力。
所述文库也可以被用于与特异靶标结合和不与非靶抗原结合的筛选。一方法，另一种实施方式提供了用于从VNARs文库中筛选结合至特异靶抗原的抗体可变域的方法，其包括：a)生成含有本发明的多个多肽的可复制的表达载体文库；b)将上述文库与靶抗原和至少一种非靶抗原在适用于结合的条件下相接触；c)将文库中的多肽结合体与非结合体相分离；d)鉴定结合至靶抗原和未结合至非靶抗原的结合体；e)从靶抗原上洗脱结合体；f)扩增含有结合至特异抗原的多肽结合体的可复制的表达载体。
上述任意分选/选择方法的组合可以与筛选方法相结合。例如，在一种实施方式中，首先选择出结合至固定靶抗原的多肽结合体。
然后，扩增结合至固定靶抗原上的多肽结合体，并且进行与靶抗原结合和不与非靶抗原结合的筛选。扩增特异性结合至靶抗原的多肽结合体。然后，通过将这些多肽结合体与一定浓度的带有标记的靶抗原相接触以形成复合物选择出具有较高亲和力的多肽结合体，其中，所述带有标记的抗原的浓度范围为从约0.1nM至约1000nM。通过将上述复合物与结合至靶抗原上的标签的制剂相接触分离所述复合物。然后，将上述多肽结合体从带有标记的抗原上洗脱下来，可选地，重复进行选择数轮，每次使用更低浓度的带有标记的靶抗原。然后，使用该选择方法分离得到的具有高亲和力的多肽结合体可以使用例如，溶液相ELISA试验或点竞争ELISA试验进行高亲和力筛选。
药物组合物及用途
根据本发明，提供了本发明的抗原特异性抗原结合分子的药物组合物。这种组合物包括含有所述抗原特异性抗原结合分子的融合蛋白。
该药物组合物还可以含有融合至治疗性蛋白的本发明的抗原特异性抗原结合分子，或其片段。所述治疗性蛋白可以是激素、生长因子(如TGFβ、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、集落刺激因子(CSF)、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、胎盘生长因子)；分化因子；凝血因子(例如，因子VIIa、因子VIII、因子IX、VonWillebrand因子或蛋白C)，或者来自凝血级联系统的的其它蛋白(例如，抗凝血酶)；细胞因子如白介素(例如，IL1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32或IL-33)或干扰素(例如，IFN-α、IFN-β和IFN-γ)，肿瘤坏死因子(TNF)，IFN-γ诱导因子(IGIF)，骨形态发生蛋白(BMP，例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP10、BMP-11、BMP-12、BMP-13)；白细胞介素受体拮抗剂(例如，IL-1ra，IL-1RII)；趋化因子(例如MIPs(巨噬细胞炎性蛋白)，例如，MIP1α和MIP1β；MCPs(单核细胞趋化蛋白)例如，MCP1、2或3；RANTES(正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白))；营养因子；细胞因子抑制剂；细胞因子受体；酶，例如自由基清除酶，例如超氧化物歧化酶或过氧化氢酶或前药转化酶(例如，血管紧张素转换酶、脱氨酶、脱氢酶、还原酶、激酶和磷酸酶)；肽模拟物；蛋白酶抑制剂；金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs，例如TIMP1、TIMP2、TIMP3或TIMP4)或丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶的抑制剂)。
在本发明的其它实施方式中，融合蛋白中的治疗性蛋白可以为抗体，或其改造的片段，包括Fab、Fc、F(ab’)2(包括化学连接的F(ab’)2链)、Fab’、scFv(包括其多聚体形式，即，二聚scFv或三聚scFv)、sdAb或BiTE(二聚特异性T细胞衔接子(bi-specificT-cellengager))。抗体片段还包括可变区及其片段，以及其它VNAR型片段(IgNAR分子)。本发明的抗原特异性结合分子可以是单体、二聚体或三聚体或多聚体，并且可以是能够结合相同或不同靶标和/或相同靶标上相同或不同表位的同源的或异源的。换句话说，所述抗原特异性结合分子可以是单一特异性的、双特异性的、三特异性的或多特异性的。本发明涉及的异源抗原特异性结合分子指的是与相同靶标上的不同表位相结合。改造的片段还包括本发明的抗原特异性结合分子的Fc融合体以及抗体的Fc片段。
所述药物组合物可以由多种本发明的抗原特异性抗原结合分子组成，例如，被融合至治疗性蛋白上的二聚体、三聚体或更高数量级的多聚体，即2、3、4、5、6、7或8聚体(mers)。
将本发明的抗原特异性抗原结合分子融合至治疗性蛋白可以在该蛋白上的任意合适的位点，可以为N-、C-和/或N-/C-末端融合。在本发明的一种实施方式中，本发所述的抗原特异性抗原结合分子的融合在治疗性蛋白的N-和C-端。
本发明的药物组合物可以含有任意合适的且药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲液。该组合物可以进一步含有药学上的活性制剂。这种载体可以包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖(dextrose)、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合物。
这种组合物可以进一步含有如本文所述的药学上的活性制剂。额外的制剂可以为治疗性化合物，例如，抗炎药、细胞毒剂、细胞生长抑制剂或抗生素。这种额外的制剂可以以适用于给药至有需要的患者的形式存在，并且所述给药可以是同时的、单独的或顺序的。所述组分可以被制备成试剂盒的形式，该试剂盒可以适当地包括说明书。
所述药物组合物可以以任意有效的、方便的方式给药以有效治疗患者的疾病，包括例如，口服给药、局部给药、静脉注射给药、肌内注射给药、鼻腔给药、或皮下注射途径给药。在治疗或作为预防给药中，活性剂可以作为可注射的组合物给药至个体，例如，作为无菌水分散体的形式，优选为等渗的。
对于给药至哺乳动物，特别是人，预期活性剂的日剂量将至少(from)为0.01mg/kg体重，通常为约1mg/kg、2mg/kg或高达4mg/kg。无论如何，医师将决定最适合于个体的实际剂量，这将依赖于以下因素，包括个体的年龄、体重、性别以及反应。上述剂量为平均情况的示例。当然，可以有更高或更低剂量的示例，这均在本发明的范围内。
根据本发明，提供了本发明的抗原特异性抗原结合分子在医药中的用途。因此，本发明的该方面扩展至本发明的抗原特异性抗原结合分子在制备用于治疗需要其的患者的疾病药物中的用途。本发明的抗原特异性抗原结合分子还可以被用于制备含有如上定义的涉及本发明的药物组合物的特异性结合分子的融合蛋白。
所述用途还包括有需要的患者中疾病的治疗方法，其包括给药至患者含有本发明的抗原特异性抗原结合分子的如本文所定义的治疗有效剂量的药物组合物。
如本文所用的，术语“治疗”包括有益于人或非人的动物的任意方案。在兽药中“非人动物”的治疗可以扩展至家畜的治疗，包括马和宠物(如猫和狗)和农场/农业动物，包括绵羊、山羊、猪、牛和马家族中的成员。所述治疗可以为关于任意当前病症或病情的治疗性治疗，或者可以为预防性的(预防性治疗)。所述治疗可以为对遗传性疾病或后天获得性疾病的治疗。所述治疗可以是对急性或慢性病症的治疗。所述治疗可以是对和炎症和/或癌症相关的病症/病情的治疗。本发明的抗原特异性抗原结合分子可以被用于病情的治疗，包括，但不限于骨关节炎、硬皮病、肾疾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、多发性硬化、动脉粥样硬化、或任意炎性疾病。
本发明的抗原特异性抗原结合分子还可以被用于研究患者疾病病症的性质。该抗原特异性抗原结合分子可以被用于通过使用成像技术，例如X射线、伽玛射线、或PET扫描、或类似技术以制备受试者体内发病部位的成像。因此，本发明可以扩展至受试者发病部位成像的方法，包括将合适的可检测的带有标记的抗原特异性抗原结合分子给药至受试者，随后扫描受试者的身体。可选地，将所述分子给药至受试者可以通过分析来自所述分子给药后受试者的样本以提供测试结果。
可选地，所述抗原特异性抗原结合分子可以被用于测定体外样本中或患者体内靶分析物的存在情况。该样本可以为来自身体的任意生物学样本材料，例如，细胞、组织、血液、血浆、唾液、泪液、精液、脑脊髓液(CSF)和/或乳汁。该方法可以包括添加合适的带有标记的抗原特异性抗原结合分子至目的样本中。然后，可以通过任意合适的方法检测该带有标记的抗原特异性抗原结合分子与靶分析物的结合，例如按照标准的酶联免疫吸附试验(ELISA)和/或放射免疫试验(RIA)技术检测荧光性、放射性等。
这种实施方式可以包括诊断受试者的疾病或病情的方法，其包括将本发明的抗原特异性抗原结合分子给药至受试者，或者将所述抗原特异性抗原结合分子加入至样本中。
进一步发现该抗原特异性抗原结合分子可以用在目的分子的免疫亲和纯化中。适当的，本发明的抗原特异性抗原结合分子可以与底物结合，在该底物的上方通过或引入含有含有目的分子的样本，使得目的分子以可释放的方式结合至抗原特异性抗原结合分子上。发现所述免疫亲和纯化方法可以用在生物来源或化学反应得到的物质的生物加工中，否则很难制备出具有足够纯度的形式，例如治疗物质。
抗原特异性抗原结合分子可以结合的底物可以为柱状物，其包括珠状或粉末状形式的聚合物、平板(如多孔板)、微流体系统。所述底物可以以任意合适的惰性材料组成，例如，硅、玻璃或塑料材料，可选地，以薄片(chip)的形式。在一些情况下，这可以便于将具有相同或不同抗原特异性的多个抗原特异性抗原结合分子定位于该底物上。底物与抗原特异性抗原结合分子结合后，清洗该底物以去除未结合的材料，然后通过合适的方法洗脱已被纯化的物质。
附图说明
在本申请中提供了数个附图以供参考，其中：
图1显示了来自免疫鲨鱼的血清的人ICOSL特异性滴定度，用于说明在护士鲨中提高对该蛋白免疫原的免疫应答的能力。阴性对照为乳汁。
图2显示了在来自阳性选择命中结果(hit)的单克隆可溶性周质表达蛋白质上进行的基于细胞的中和试验。低信号表明与hICOSL发生阳性结合并且受体配体的相互作用的生成抑制(resultantinhibition)。阳性中和克隆在灰色椭圆形中被突出显示。在仅对靶标进行一轮选择以后，hICOSL特异性阳性命中结果的富集明显，其中，约60％表现出阻断配体(ICOSL)与受体(ICOS)结合的能力并且可进行进一步的分析。已知的中和150kDamAb克隆以黑色(black)显示并且在本文中被用作试验的阳性对照。
图3表明了从合成文库ELSS1中分离的抗hICOSLVNAR结构域的结合。作为纯化的Fc融合体，评价了VNAR结构域与hICOSL表达CHO细胞的结合。还包括阴性(未结合)VNAR-Fc被称为2V。
图4表明了从抗表达hICOSL或mICOSL的CHO细胞或亲本CHO细胞的合成文库和免疫文库中分离的命中结果的选择性。阳性克隆被表达为可溶性蛋白质且被用于与表达靶标的细胞表面的结合的测试，通过使用基于FACS试验与亲本细胞相比较。包括阳性抗hICOSL和抗mICOSLmAbs作为阳性对照以显示检测到阳性细胞结合时的预期变化。野生型对照为VNAR2V，其为天然的未结合的对照结构域。图4A显示的是结构域1-16，其为从实施例1所述的hICOSL免疫文库分离的阳性命中结果。图4B显示的是从抗hICOSL的ELSS1分离的合成库衍生的命中结果的选择性。
图5显示的数据举例说明了通过可溶性蛋白结合ELISA法得到的抗多个不同抗原(hICOSL、HSA、TNF-α、KLH、MPBS、TG、HEL和BSA)的抗hICOSLVNAR命中结果的选择性。黑色区表示的是高水平结合；背景结合显示为灰色。如图所示的阳性对照抗HSA和抗hICOSL结合克隆被并入ELISAs中。
图6显示了在T-100BIAcore上分析分离的主要克隆的亲和力。图6A显示了作为表达和纯化Fc构建体的七个主要免疫抗hICOSLVNAR克隆各自的传感图和结合动力学。图6B列出了主要合成文库和免疫文库来源克隆的计算KD值。
图7表明了从合成文库和免疫文库分离的抗ICOSLVNAR结构域抑制可溶性ICOS与表达ICOSL的细胞之间的相互作用的能力。纯化的Fc融合VNAR结构域被表达和纯化，并且在基于细胞的试验中被滴定。吸光度水平降低表明阳性中和作用。阴性对照为VNAR结构域，2V-Fc。图7A显示了来自于免疫文库的主要抗hICOSLVNAR结构域的结果，图7B为合成文库的结果。
图8显示了当抗hICOSLVNARs被合并入原代人T细胞增殖试验中时测量的IC50值。1C8、1C4、1G5、1A1、2D4、1H2和1D12为从ELSS1分离的全部VNAR结构域，它们被重构至Fc结构并进行纯化。商购可用的抗hICOSL抗体，mAb165为阳性对照。显示了来自两个独立的供体，已知为供体450和供体452的结果。
图9列出了从合成文库(克隆1A9、1C8、1D12、2B6、2D3、2D4、2E8、1G5、1H02、1A1、1C04、1A6、1B2、2C10、2C7、2G6、3E8、3G11、4B5、4G1、5A12、5B10、5B9、5C1、5E6、5F3、5F6和5G1)和免疫文库(克隆1、2、8、11、12、13和17)分离的所有阳性抗hICOSLVNAR克隆的氨基酸和核酸序列。图9A列出了来自抗hICOSLVNAR结构域的合成文库的氨基酸序列，图9B列出了其核酸序列。图9C列出来来自抗hICOSLVNAR结构域的免疫文库的氨基酸序列，图9D列出了其核酸序列。
图10列出了从合成文库和免疫文库分离的所有阳性抗hICOSLVNAR克隆的CDR1和CDR3氨基酸序列。图10A列出了从合成文库分离的克隆的CDR1和CDR3氨基酸序列，图10B列出了从免疫文库分离的克隆的CDR1和CDR3氨基酸序列。图10C显示了从ELSS2合成VNAR文库分离的ICOSL阳性VNAR克隆的序列。阳性命中结果为所示的所有交叉(all-cross)物种和交叉同种型(cross-isotype)框架融合体。
图11表明了抗ICOSLVNAR结构域与当靶标被重构作为融合至白蛋白结合VNAR结构域(E06)的分子的靶标的结合。图11A显示了三聚VNAR结构域融合蛋白的结合，其由抗小鼠ICOSLVNAR结构域、通过(GGGS)4氨基酸连接的延伸至抗人ICOSLVNAR结构域的CC3、通过(GGGS)4氨基酸连接的延伸至抗人血清白蛋白VNAR结构域E06的2D4组成。通过ELISA测试了表达的三聚融合蛋白与mICOSL、hICOSL和HSA的结合。浓度依赖性曲线表明实现了与每个靶标的结合，因此，该蛋白融合体具有三功能性。图11B显示了三聚变异体，其中，分子融合体的顺序被改变，从而导致了E06，其N和C末端在抗mICOSL与抗hICOSL之间均被融合了。在该方向下(Inthisorientation)，还表明了所有VNAR结构域与它们特异性靶标的结合。
图12显示了hICOSL的GenBank数据库序列，记录在登录号为O75144下的16-APR-2014(VersionO75144.2GI:19855066；DBSOURCEUniProtKB:locusICOSL_HUMAN,accessionO75144)。
还将通过参考以下实施例的方式进一步对本发明进行描述，其示出仅为了解释说明的目的并不用于构成对本发明的限制。
使用的缩略语：VNAR，可变新抗原受体；scFv，单链抗体片段；FW，框架；HV，高变环(Hypervariableloop)；CDR，互补决定区；SOE-PCR，重叠延伸剪接聚合酶链反应(splice-by-overlapextensionpolymerasechainreaction)。
实施例1：通过ELSS1合成VNAR文库的生物筛选分离抗hICOSLVNAR结构域
为了分离抗hICOSL结构域，使用固态和基于预包被磁珠的方法针对单体人ICOSL对ELSS1合成文库(如在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815，043优先权的处于共同待决状态的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251(通过参考并入)中描述的进行制备)进行筛选。使用这两种方法均获得了阳性命中结果。简单来说，固态选择的实施如下所示：使用含有预期浓度靶抗原的4mlPBS包被免疫管。然后，将该管密封并于4℃下旋转孵育O/N。使用PBS清洗3x之后，使用2％(w/v)M-PBS封闭该管1h。在M-PBS(2％(w/v)终浓度)中旋转封闭0.5-1ml投入的噬菌体1h。然后，将已封闭的噬菌体加入至该管中，使用2％(w/v)M-PBS补充至4ml，并且在20rpm的条件下旋转孵育1h，之后进一步静止孵育1h。丢弃未结合的噬菌体，并且使用PBST清洗该管5-10x，之后使用PBS清洗5-10x。通过添加1ml的100mM三乙胺在20rpm下旋转达10min以洗脱噬菌体。产出的噬菌体溶液通过加入0.5ml1M的pH值为7.5的Tris-HCl进行中和。洗脱的噬菌体被加入至10mlmid-logER2738细胞，在37℃不搅拌的条件下混合并孵育30min，之后以2,500×g离心15min。将沉淀重悬于1ml的2×TY-G中并且涂布在含有TYE-GA琼脂的Bio-assay盘中，并于30℃O/N下孵育O/N。
对于预包被磁珠试验，按照每个操作说明将抗原生物素化。生物素化材料与30μlDynabeadsM-280Streptavidin(Invitrogen)在R/T20rpm下孵育30分钟。使用如上描述的基本与固态选择相同的方法实施使用预修饰珠进行文库选择，其中，使用4％(w/v)M-PBS在R/T旋转条件下将产出的噬菌体和Dynabeads预封闭1小时。然后，通过加入封闭的磁珠在R/T旋转条件下1h，之后加入抗原包被的磁珠在R/T20rpm下1小时对噬菌体进行去选择。经PBST清洗5x后，通过在400μl100mM的TEA中旋转8分钟洗脱结合的噬菌体，并且通过加入200μl1M的pH为7.5的Tris-HCl进行中和。按照固态选择描述的方法实施洗脱的噬菌体的大肠杆菌感染。
可溶性VNAR蛋白的周质表达按照下述方式进行；接种经过夜培养的已选克隆并于37℃和250rpm条件下在深孔培养板(Greiner,Bio-One)中生长5小时，该培养板中含有1ml/well的2xTY、0.1％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素。通过加入1mMIPTG诱导转录，并且在28℃和250rpm条件下孵育过夜。深孔培养板在3200rpm下离心10分钟，并且将产生的沉淀重悬于200μl冰冷的TES缓冲液，然后是200μl冰冷的1:5TES缓冲液。冰上孵育30分钟后，重复离心，可溶性VNAR存在于得到的上清液中。通过标准结合ELISA，使用包被在免疫板(Nunc，ThermoScientific)上的1μg/ml抗原以及抗c-myc-HRP(Invitrogen)作为检测抗体以评价表达。在基于96孔板的细胞中和试验中，评价可溶性表达单克隆与靶标特异性结合的能力和阻断靶标与受体ICOS结合的能力。配体-受体中和试验按照如下方式进行：表达人ICOS受体的CHO细胞在含有DMEM/F12+5％FBS培养基的96孔细胞培养板(Greiner,Bio-One)中生长至汇合。hICOSL-hFc(20μl，450ng/ml)与40μl溶于DMEM/F12+2％FBS的抗hICOSL-VNAR结构域预孵育1h，然后将其加入细胞。在16℃下孵育1小时后，使用DMEM/F12+2％FBS轻柔地清洗细胞3次，并且在16℃下与使用在相同培养基中稀释1:10000倍的山羊抗人Fc-HRP(SIGMA)另外再孵育40分钟。之后，使用DMEM/F12+2％FBS培养基再清洗细胞3次和使用PBS清洗一次，并在存在TMB底物下成熟(developedwithTMBsubstrate)。
实施例2：从免疫hICOSL的护士鲨构建噬菌体展示文库
皮下注射250μg溶于完全弗氏佐剂的全蛋白(totalprotein)以对护士鲨(Ginglymostomacirratum)进行免疫，然后，每三个月静脉注射250μg溶于PBS的全蛋白进行加强。使用抗护士鲨IgNAR单克隆抗体GA8分析对人ICOSL应答的血清滴定度。检测到的应答如图1所示。从血样4(bleed4)中分离外周血淋巴细胞，并按照每个SIGMA扩增级DNaseI的方案纯化总RNA。按照生产商提供的说明书(Invitrogen，SuperScriptIII)合成cDNA，并且按照生产商提供的方案使用下述护士鲨特异性引物组合扩增VNARDNA(NEBPhusionHFPCRMasterMix)：
FW15’-GAGGAGGAGGAGAGGCCCAGGCGGCCGCTCGAGTGGACCAAACACCG-3’以及或者
FW4r15’-GAGGAGGAGGAGGAGGCCCCTGAGGCCGCATTCACAGTCACGACAGTGCCACCTC-3’或者
FW4r25’-GAGGAGGAGGAGGAGGCCCCTGAGGCCGCATTCACAGTCACGGCAGTGCCATCTC-3’.
扩增的PCR产物经SfiI消化过夜并克隆进入经SfiI消化的噬菌粒展示载体。按照生产商提供的方案，将连接的样本转化至电感受态(electrocompetent)TG1细胞(Lucigen)。预计文库大小为1×108个克隆。在文库的单克隆上使用载体特异性引物1082(5’-TGTGTGGAATTGTGAGCG-3’)和1059(5’-GGCGACATTCAACCGATTGAG-3’)通过PCR法进行文库QC。
文库单克隆在800μl2×TY，2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素中于37℃和285rpm条件下生长2小时。培养物被109M13K07辅助噬菌体(NEB)在37℃下感染30分钟，之后在37℃且150rpm条件下振荡孵育1小时。培养物于3200rpm下离心10分钟。沉淀重悬于2×TY，100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素中，并在25℃且280rpm条件下孵育过夜。培养板在32000rpm下离心20分钟，转移600μl上清液至150μl冰冷的20％PEG/2.5MNaCl中，并在冰上孵育30分钟。通过在3200rpm下离心20分钟收集噬菌体并将沉淀重悬于200μl4％(w/v)的MPBS中。
实施例3：从免疫文库中筛选阳性抗hICOSLVNAR命中结果(hits)
使用生物素化的hICOSL进行预包被磁珠选择，并使用相同的方法进行实施例1中描述的合成文库筛选。评价阳性噬菌体命中结果作为周质表达的可溶性蛋白的结合和中和作用，用于实施例中合成文库筛选。图2显示的阳性命中结果表明了在基于细胞的试验中ICOSL与ICOS的阻断。选取椭圆形阴影中突出的克隆并进行测序。
实施例4：合成文库衍生的和免疫文库衍生的抗hICOSL的VNAR命中结果的体外结 合力和选择性
阳性结合和中和特定结构域被转化成Fc结构以用于下述进一步的分析：使用引物对已选择的阳性单体VNAR结构域进行PCR扩增，引入限制性位点和侧翼序列，其对于克隆入所有(proprietary)Fc哺乳动物表达载体是相兼容的，这有利于在HEK293悬浮培养物中PEI介导的瞬时表达后表达的蛋白的蛋白质A的亲和纯化。使用无血清培养基，VNARFc融合蛋白的表达水平通常在50-70mg/L的范围内。基本上，通过离心和0.2μm过滤从条件培养基中去除后表达细胞碎片，然后按照如上所述的亲和色谱法，通过经过经PBS平衡的Superdex20026/60尺寸排阻柱对蛋白质进行最终的纯化(polishing)步骤。使用Amicon超滤单元浓缩SEC洗脱峰，并使用紫外光谱法确定蛋白浓度。然后，评价纯化的Fc蛋白的与表达hICOSL的细胞表面的结合，如图3所示。
使用FACS试验评价抗hICOSLVNAR结构域的选择性，其按照下述方式实施：通过加入PBS和5％EDTA，在37℃下于PBS中清洗亲本CHO细胞、表达mICOSL和hICOSL配体的CHO细胞10-15min，并从烧瓶中移出。通过上下抽吸烧瓶的表面分散细胞，旋转减慢至1200rpm并重悬于DMEM加5％FCS中。将细胞以0.5–1x106个细胞/孔的密度分份至96孔U-底部板中。细胞在含有HEK293VNAR-hFc表达蛋白的100μl组织培养上清液中于16℃下孵育30分钟，之后使用PBS加2％FCS清洗3x。然后，细胞与100μl的1μg/ml抗hFc-生物素(eBioscience)于16℃下孵育30分钟。经PBS加2％FCS清洗3x以后，加入1μg/ml的链霉亲合素-APC(eBioscience)于16℃下保持30分钟。经PBS加2％FCS清洗1x以后，细胞重悬于400μl的PBS加2％FCS中并将其转移至FACS管以用于FACS-Canto-2分析。图4a显示了合成文库衍生的抗hICOSLVNAR结构域的FACS分析结果，图4b显示了免疫文库衍生的结构域。合并后的数据通过示值读数的左移变化清楚地表明了与表达人ICOSL的CHO细胞的结合。
通过抗多个不相关蛋白的结合ELISA也可以清楚地显示合成文库衍生的抗hICOSLVNAR结构域的选择性，如图5所示。所有阳性抗hICOSL克隆的结合通过左侧的加黑阴影可见。未结合的抗包括靶标的其它物质；人血清白蛋白(HSA)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、匙孔戚血蓝蛋白(KLH)、乳汁磷酸盐缓冲盐水(MPBS)、甲状腺球蛋白(TG)、鸡卵溶菌酶(HEL)或牛血清白蛋白(BSA)是可检测的。包括抗HSA的阳性对照并且可以从表示阳性结合的加黑区清晰可见。
在单体和Fc结构的阳性先导物上进行命中结果的亲和检测(图6)：所有的BIAcore分析均使用T-100生物传感器SCM5系列芯片，胺偶联试剂盒，pH值为4、4.5、5.0和5.5的10mM醋酸钠固定缓冲液，10×HBS-P电泳缓冲液以及50mMNaOH(GEHealthcare)进行。已确定了试验条件，以最小化传质、亲和力和重新结合事件的影响。设定靶配体固定程序以在pH值为4的情况下在流动细胞(Fc)2&3上分别固定约1000应答单位(RU)的纯化的hICOSL-Fc(R&D系统)和hICOSL单体。将纯化的VNAR蛋白稀释在HBS-P电泳缓冲液稀释中至终浓度范围(从600-37.5nM开始以2倍稀释，使用整体拟合分析(globalfitanalysis)计算动力学常数)。每个浓度在快速流速30ml/min下注射3分钟，并且允许解离5min，之后使用50mMNaOH再生脉冲5sec。使用BIAcoreT100评价软件(1.1.1)分析每个浓度的参照减去传感图的结果。
实施例5：抗hICOSL命中结果的体外功能验证
通过两种基于细胞的试验测量抗hICOSL-Fc靶标的体外有效性。第一种为如实施例1描述的配体-受体中和试验。从合成和免疫文库得到的纯化的抗hICOSL-FcVNAR结构域被滴定至中和试验中，以表明其特异性阻断ICOSL-ICOS相互作用的能力(图7A和B)。第二种实施的基于细胞的功能试验为使用从正常健康供体分离得到的原代人T细胞的T细胞增殖试验。简单来说，该方法如下所述：对于初始培养板包被，加入溶于PBS的1μg/ml抗huCD3克隆OKT3(eBiosciencecat.#16-5889aCD3)加10μg/ml抗hIgG(JacksonImmunoResearchcat.#109-006-098)，总体积为100μl/well。4℃下静置过夜，然后从孔中去除溶液并使用PBS清洗孔2x。对于第二次包被，加入溶于PBS的4μg/ml的hB7-2.Ig(R&DSystemscat.#141-B2-100)添加500ng/ml的hICOSL.Ig(R&DSystemscat.#165-B7-100)，100μl/孔。室温下静置3小时，然后使用PBS清洗2x。在测定板的所有孔中加入50μl培养基。将CD4+T细胞稀释至2×106细胞/ml，并且将测试抗体稀释至3x预期终浓度。向每孔的50μl培养基中加入50μl抗体溶液和50μl细胞悬液，至最终体积为150μl/空，终浓度为1×105细胞/孔。将样本静置3天，然后在第3天脉冲1μCi/孔的3H胸腺嘧啶核苷6-8小时并计数。图8显示了使用从两个独立供体分离的T细胞进行的从合成文库得到的抗hICOSLVNAR结构域的计算效能(IC50值)。
实施例5：作为分子融合蛋白的重构抗ICOSLVNAR结构域
来自合成文库ELSS1的抗ICOSL结构域可以被串联克隆以形成与(GGGS)4氨基酸延伸(aminoacidstretches)连接的三聚融合产物，其可以被表达，纯化，并通过ELISA表明与所有三个单独命中结果结合。图11举例说明了使用抗小鼠ICOSLVNAR结构域CC3(按照在2014年4月23日提交的要求2013年4月23日提交的US61/815，043优先权的处于共同待决状态并的国际专利申请no.PCT/EP2014/058251(通过参考并入)中描述的方法进行制备)三聚体构建体的两个不同方向，其被融合至抗人ICOSLVNAR结构域，2D4，和抗HSA特异性VNAR结构域，E06(按照WO2013/167883中描述的制备)上。当被连接作为单一分子融合蛋白时，所有的三个VNAR结构域均保持结合靶标的能力。

Claims (18)

1.一种ICOSL特异性抗原结合分子，该分子含有如式(I)所示的氨基酸序列
A-X-B-Y-C(I)
其中，
A-为SEQIDNO：1、SEQIDNO：4或SEQIDNO：7
X为6或7个氨基酸残基的CDR1区
B-为SEQIDNO：2、SEQIDNO：5或SEQIDNO：8
Y为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸残基的CDR3区
C-为SEQIDNO：3、SEQIDNO：6或SEQIDNO：9
或与它们至少具有50％同源性的序列，
其中，SEQIDNO：1为TRVDQTPRTATKETGESLTINCVLTDT，TRVDQTPRTATKETGESLTINCVVTGA
SEQIDNO：2为TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYYCKA或TSWFRKNPGTTDWERMSIGGRYVESVNKGAKSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQIDNO：3为DGAGTVLTVN
SEQIDNO:4为ASVNQTPRTATKETGESLTINCVLTDT
SEQIDNO：5为TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYYCKA或TYWYRKNPGSSNQERISISGRYVESVNKRTMSFSLRIKDLTVADSATYICRA
SEQIDNO：6为YGAGTVLTVN
SEQIDNO：7为ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDP或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDA或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRDG或ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLRES
SEQIDNO：8为TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGA或
TCWSRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGL，
TCWTRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCAL，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGV，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRINDLTVEDGGTYRCGH，
TCWYRKKSGSTNEESISKGGRYVETVNSGSKSFSLRISDLTVEDGGTYRCGH，
SEQIDNO：9为CGGGTVVTVN，CGGGTAVTVN，CGDGTAVTVN，或CGDGTAVTVN。
2.根据权利要求6所述的ICOSL特异性抗原结合分子，其中，所述CDR3区为如图10A、图10B或图10C所示的CDR3区。
3.根据权利要求6所述的ICOSL特异性抗原结合分子，其中，所述CDR1区为如图10A或图10B所示的CDR1区。
4.根据权利要求6所述的ICOSL特异性抗原结合分子，其中，所述抗原特异性抗原结合分子具有如图9A或9C任意一个中所示的序列。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子，其中，该分子为人源化的。
6.包括权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中，将所述ICOSL特异性抗原结合分子融合到生物学活性蛋白上。
8.编码权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子，或权利要求6或7所述的融合蛋白的核酸。
9.含有权利要求8所述的核酸的核酸构建体。
10.含有权利要求9所述的载体的宿主细胞。
11.一种用于权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白的制备方法，该方法包括：在宿主细胞中表达编码所述分子的核酸序列的步骤。
12.权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白的药物组合物。
13.权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白在医药中的用途。
14.权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白在制备用于治疗需要它们的患者中的疾病的药物中的用途。
15.一种用于治疗需要治疗的患者中的疾病的方法，该方法包括：给药至所述患者治疗有效剂量的权利要求12所述的药物组合物。
16.一种测定样品中存在靶分析物的方法，该方法包括：将权利要求1-5中任意一项所述的可检测的带有标记的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白加入至样品中，并检测所述分子与靶分析物的结合。
17.一种用于受试者发病部位成像的方法，该方法包括：给药至受试者可检测的带有标记的权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白。
18.一种受试者中疾病或身体状况的诊断方法，该方法包括：给药至受试者权利要求1-5中任意一项所述的ICOSL特异性抗原结合分子或权利要求6或7所述的融合蛋白。
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