CN102149403A

CN102149403A - 利用白介素-21受体结合蛋白的治疗方法

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Publication number: CN102149403A
Application number: CN2009801289410A
Authority: CN
Inventors: 莱尔德·布卢姆; 达文德·吉尔; 尤利亚·武格梅斯特; 德博拉·A·扬; 马戈·奥图尔; 希思·M·瓜伊; 卡丽莎·K·阿德金斯; 埃米·A·韦弗; 萨达纳·贾因; 马亚·阿莱
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 2008-05-23
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2011-08-10
Also published as: MX2010012812A; AU2009248812A1; AR072136A1; RU2010152689A; WO2009143526A1; BRPI0912998A2; IL209455A0; KR20110021919A; US20090298081A1; CA2725154A1; JP2011520989A; US20120276102A1; EP2296689A1; US8178097B2

Abstract

本发明提供特异性结合人白介素-21受体(IL-21R)的结合蛋白及其抗原结合片段，包括人抗体，及使用它们的方法。该结合蛋白能起例如IL-21R活性拮抗剂的作用，由此调控一般而言的免疫应答，及具体而言的由IL-21R介导的免疫应答。所公开的组合物和方法可以例如在诊断、治疗、和/或预防IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥、和其它免疫系统病症中使用。

Description

利用白介素-21受体结合蛋白的治疗方法

相关申请

本申请要求2008年5月23日提交的美国临时专利申请No.61/055,543和2008年9月23日提交的美国临时专利申请No.61/099,476的优先权，通过述及将其内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及结合白介素-21受体(IL-21R)，特别是人IL-21R的结合蛋白及其抗原结合片段，及其在调节IL-21R相关活性(例如IL-21对IL-21响应性基因表达水平的影响)中的用途。本文中公开的结合蛋白在治疗和/或诊断IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应(allergies)、移植排斥、高增殖性血液病症、和其它免疫系统病症中有用。本发明进一步提供用于测定本发明抗体的药效学和药动学特性的方法。

发明背景

抗原激起免疫应答并激活最大的两群淋巴细胞：T细胞和B细胞。遭遇抗原后，T细胞增殖并分化成效应器细胞，而B细胞增殖并分化成抗体分泌浆细胞。这些效应器细胞分泌和/或响应细胞因子，细胞因子是由淋巴细胞和其它细胞类型分泌的小蛋白质(小于约30kDa)。

人IL-21是与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同源性的细胞因子(Parrish-Novak等(2000)Nature 408：57-63)。尽管白介素细胞因子间序列同源性低，但是细胞因子分享共同的折叠，折叠成该家族代表性的“四螺旋束”结构。大多数细胞因子结合I类或II类细胞因子受体。II类细胞因子受体包括IL-10和干扰素的受体，而I受细胞因子受体包括IL-2至IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、和IL-15以及造血生长因子、瘦蛋白、和生长激素的受体(Cosman(1993)Cytokine 5：95-106)。

人IL-21R是I类细胞因子受体。编码人IL-21及其受体(IL-21R)的核苷酸和氨基酸序列记载于国际申请公开号WO 00/053761和WO 01/085792；Parrish-Novak等(2000)出处同上；及Ozaki等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：11439-44。IL-21R与IL-2受体β链和IL-4受体α链具有最高的序列同源性(Ozaki等(2000)出处同上)。在配体结合时，IL-21R与IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15的受体复合物分享的共同伽马细胞因子受体链(γc)联合(Ozaki等(2000)出处同上；Asao等(2001)J.Immunol.167：1-5)。

IL-21R在淋巴样组织中，特别是在T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞(DC)和巨噬细胞上表达(Parrish-Novak等(2000)出处同上)，这容许这些细胞响应IL-21(Leonard and Spolski(2005)Nat.Rev.Immunol.5：688-98)。IL-21R的广泛淋巴样分布指示IL-21在免疫调节中发挥重要作用。体外研究显示了IL-21显著调控B细胞、CD4⁺和CD8⁺T细胞、及NK细胞的功能(Parrish-Novak等(2000)出处同上；Kasaian等(2002)Immunity 16：559-69)。最新的证据提示IL-21介导的信号传导可具有抗肿瘤活性(Sivakumar等(2004)Immunology 112：177-82)，而且IL-21能在小鼠中预防抗原诱导的消除(Shang等(2006)Cell.Immunol.241：66-74)。

在自身免疫中，破坏IL-21基因和注射重组IL-21显示出分别调控实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发展(King等(2004)Cell 117：265-77；Ozaki等(2004)J.Immunol.173：5361-71；Vollmer等(2005)J.Immunol.174：2696-2701；Liu等(2006)J.Immunol.176：5247-54)。在这些实验系统中，提示操纵IL-21介导的信号传导直接改变CD8⁺细胞、B细胞、T辅助细胞、和NK细胞的功能。

如此，本发明提供通过阻断IL-21信号传导途径来起作用，用于治疗例如自身免疫性疾病的新治疗剂，即抗IL-21R抗体。为了使治疗剂(诸如抗IL-21R抗体)在体内有效，应当测定调控IL-21应答所必需的抗IL-21R抗体最小血清浓度；因此，需要容许精确测定此类最小血清浓度的方法。

发明概述

本发明描述了特异性结合人和鼠IL-21R的结合蛋白例如人抗体及其片段的分离和表征。本文中描述的结合蛋白衍生自抗体18A5，其披露于美国专利No.7,495,085，通过述及将其全部收入本文。本发明的结合蛋白具有程度比亲本18A5抗体大得多的对人和/或鼠IL-21R的亲和力。

本发明至少部分提供以高亲和力和特异性结合IL-21R，特别是人IL-21R的IL-21R结合剂(诸如结合蛋白及其抗原结合片段)。本发明的结合蛋白及其抗原结合片段在本文中也分别称作“抗IL-21R结合蛋白”及“其片段”。在一个实施方案中，结合蛋白或其片段降低、抑制、或拮抗IL-21R活性。此类结合蛋白可用于通过拮抗IL-21R活性来调节免疫应答或IL-21R相关病症。在其它实施方案中，抗IL-21R结合蛋白可用于诊断，或作为靶向结合蛋白用于将治疗剂或细胞毒剂投递至IL-21R表达细胞。如此，本发明的抗IL-21R结合蛋白在诊断和治疗IL-21R相关病症例如炎性病症、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥、血液高增殖性病症、和其它免疫系统病症中有用，如本文中更完整描述的。

因而，在一个方面，本发明的结合蛋白特征为一种结合IL-21R，特别是人IL-21R的分离的结合蛋白(例如分离的抗体)或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗IL-21R结合蛋白(例如抗体)可具有一项或多项下述特征：(1)它是单克隆或单特异性结合蛋白；(2)它是人结合蛋白；(3)它是体外生成的结合蛋白；(4)它是体内(例如转基因小鼠系统)生成的结合蛋白；(5)它抑制IL-21结合IL-21R；(6)它是IgG1；(7)它以至少约10⁵M^-1s^-1的结合常数结合人IL-21R；(8)它以至少约5x10⁴M^-1s^-1的结合常数结合鼠IL-21R；(9)它以约10^-3s^-1或更少的解离常数结合人IL-21R；(10)它以约10^-2s^-1或更少的解离常数结合鼠IL-21R；(11)它以约1.75nM或更少的IC₅₀抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性BaF3细胞增殖；(12)它以约0.5nM或更少的IC₅₀抑制鼠IL-21R介导的鼠IL-21R表达性BaF3细胞增殖；(13)它以约14.0nM或更少的IC₅₀抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性TF1细胞增殖；(14)它以约1.9nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的人原代B细胞增殖；(15)它以约1.5nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的人原代CD4⁺T细胞增殖；(16)它以约5.0nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的鼠原代CD4⁺T细胞增殖；(17)它在例如静脉内(i.v.)施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约0.1-7.5ml/hr/kg的均值总身体清除；(18)它在例如i.v.、皮下(s.c.)、或腹膜内(i.p.)施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约20-700小时的均值消除半衰期；(19)它在动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)中具有约40-1500ml/kg的均值稳态分布体积；(20)它在例如s.c.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约35-100％的生物利用度；(21)它在例如i.v.、s.c.、或i.p.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约200-10,000μg*hr/ml(每1mg/kg剂量)的均值剂量标准化AUC；(22)它在例如i.v.、s.c.、或i.p.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约0.5-30μg/ml的均值剂量标准化C_max(最大血清浓度)；和(23)它调控IL-21响应性细胞因子或IL-21响应性基因的表达。

本发明的结合蛋白(术语“结合蛋白”根据需要还包括及指其抗原结合片段)的非限制性例示性实施方案在本文中称作AbA-AbZ，而且这些术语与美国临时专利申请No.61/055,543中使用的术语的关系呈现于表2A。本发明的结合蛋白的其它例示性实施方案，即scFv，在本文中称作H3-H6、L1-L6、L8-L21、和L23-L25，如表2B中详述的。

在一个实施方案中，本发明的结合蛋白是抗体。在进一步的实施方案中，抗体是多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的(grafted)、体外生成的和/或多特异性的(例如自至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)。

本发明的一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

在本发明的实施方案中，所述结合蛋白或抗原结合片段可以是例如抗体、scFv、V_H、V_L、和/或CDR。

本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247。

在本发明的一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和248，且其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，8，10，12，163，164，169，170，194，和195，那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247，且其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：5，7，9，和11，那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247。

在本发明的一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和248，其中，如果所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，8，10，12，163，164，169，170，194，和195，那么所述结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

本发明的又一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括对受试者施用特异性结合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链和重链，且其中该重链包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，68，70，72，88，90，92，94，213，218，219，240，和242。在一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含V_L域和V_H域，且该V_H域包含至少一种选自下组的序列：SEQ ID NO：14，16，18，和20。

本发明的另一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括对受试者施用特异性结合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链和重链，且其中该轻链包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，74，76，78，80，82，84，86，96，98，100，102，104，106，108，214-217，220-229，244，246，和248。

在一个实施方案中，结合蛋白或抗原结合片段包含V_L域和V_H域，且该V_L域包含至少一种选自下组的序列：SEQ ID NO：22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，215，217，221，223，225，227，和229。

在本发明方法的另一个实施方案中，重链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：88，90，92，94，213，218，219，240，和242，且轻链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：96，98，100，102，104，106，108，214，216，220，222，224，226，228，244，246，和248。

本发明的一个实施方案是在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合选自下组的结合蛋白识别的人IL-21R表位的结合蛋白或其抗原结合片段：AbA-AbW，H3-H6，L1-L6，L8-L21，和L23-L25，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或抗原结合片段竞争性抑制选自下组的结合蛋白结合人IL-21R：AbA-AbW，H3-H6，L1-L6，L8-L21，和L23-L25。在另一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片段，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。在又一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片段，其包含由选自下组的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247。在又一个实施方案中，结合蛋白特异性结合受AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV、和/或AbW识别的IL-21R表位，且其中所述结合蛋白竞争性抑制AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV、和/或AbW对人IL-21R的结合。

在本发明方法的一个实施方案中，IL-21R相关病症选自下组：自身免疫性病症、炎性状况、变态反应、移植排斥、和血液高增殖性病症。在另一个实施方案中，IL-21R相关病症选自下组：免疫性病症、血液高增殖性病症、移植排斥、移植物抗宿主病、变态反应(包括特应性变态反应)、糖尿病、关节炎病症(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎)、脊椎关节病、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎、湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦

氏综合症、IBD(包括克罗恩(Crohn)氏病、溃疡性结肠炎)、哮喘(包括内源性哮喘、变应性哮喘)、硬皮病和血管炎。在又一个实施方案中，IL-21R相关病症选自下组：多发性硬化、系统性红斑狼疮、银屑病、移植排斥、类风湿性关节炎、和其它关节炎病症。

在本发明方法的一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段对人IL-21R的结合常数为至少10⁵M^-1s^-1。在另一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约1.75nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的BAF3细胞增殖，其中所述BAF3细胞包含人IL-21受体。在另一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约14nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的TF1细胞增殖，其中所述TF1细胞包含人IL-21受体。在又一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约1.9nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的原代人B细胞增殖，其中所述B细胞包含人IL-21R。在又一个实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段以约1.5nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的原代人CD4⁺细胞增殖，其中所述CD4⁺细胞包含人IL-21R。在本发明的进一步实施方案中，在本文中提供这些参数和其它药动学和药效学参数的其它范围和数值。

在一个实施方案中，本发明提供一种确定抗IL-21R抗体是否是治疗性抗IL-21R抗体的方法，包括下述步骤：使来自受试者的第一血液样品与IL-21配体接触；测定与IL-21配体接触的第一血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；在抗IL-21R抗体存在下使来自受试者的第二血液样品与IL-21配体接触；测定在抗IL-21R抗体存在下与IL-21配体接触的第二血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；并比较上文测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平，其中至少一种IL-21响应性基因表达水平的变化指示该抗IL-21R抗体是治疗性抗体。在本发明的另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如猴或人。在另一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因选自下组：TNF，IFNγ，IL-6，IL-8，IL-10，CD19，STAT3，TBX21，CSF1，GZMB，PRF1，IL-2Rα，和IL-21R。在又一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Rα。

在一个实施方案中，本发明提供一种测定抗IL-21R抗体的药效活性的方法，包括检测受试者的血液样品中至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控。在一个进一步的实施方案中，检测至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控包括下述步骤：对受试者施用抗IL-21R抗体，其中所述受试者用所述抗IL-21R抗体处理；使来自用所述抗IL-21R抗体处理的所述受试者的血液样品与IL-21配体接触；测定来自用所述抗IL-21R抗体处理的所述受试者并与所述IL-21配体接触的所述血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；并比较上文测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平与与IL-21配体接触的不同血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平，其中所述不同血液样品来自未用所述抗IL-21R抗体处理的受试者。在本发明的另一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如猴或人。在另一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因选自下组：TNF，IFNγ，IL-6，IL-8，IL-10，CD19，STAT3，FBX21，CSF1，GZMB，PRF1，IL-2Rα，和IL-21R。在又一个实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因选自下组：CD19，GZMB，PRF1，IL-2Rα，IFNγ，和IL-6。在另一个进一步的实施方案中，所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Rα。

在一个实施方案中，本发明提供在受试者中降低、抑制、或减弱急性期应答的方法，包括以足以降低、抑制或减弱受试者中急性期应答的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。在一个进一步的实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段是局部施用的。

本发明的一个实施方案是提高用于免疫受试者的疫苗配制剂的功效的方法，包括对受试者施用治疗有效量的特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段是在免疫之前、期间和/或之后施用的。

本发明的另一个实施方案提供用于在体外检测样品中IL-21R的存在的方法，包括：(a)使样品与特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段接触；并(b)检测结合蛋白或其抗原结合片段与样品之间复合物的形成，其中样品中复合物形成相对于对照或参照样品或水平的显著差异指示该样品中存在IL-21R，且其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。在一个进一步的实施方案中，样品是血清、血浆、或组织。

本发明的又一个实施方案提供用于在体内检测IL-21R的存在的方法，包括：(a)在容许结合蛋白或其抗原结合片段结合IL-21R的条件下对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段；并(b)检测结合蛋白或其抗原结合片段与IL-21R之间复合物的形成，其中受试者中复合物形成相对于对照或参照样品或复合物形成水平的显著差异指示存在IL-21R，且其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。在一些实施方案中，结合蛋白或其抗原结合片段用可检测物质直接或间接标记以便于结合的或未结合的抗体的检测。在进一步的实施方案中，可检测物质是酶、辅基、荧光材料、发光材料、或放射性材料。

在一些实施方案中，本发明提供的方法进一步包括对受试者施用另一种选自下组的治疗剂：细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂、和细胞抑制剂。在进一步的实施方案中，治疗剂选自下组：TNF拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-19拮抗剂、IL-20拮抗剂、IL-21拮抗剂、IL-23拮抗剂、T细胞消减剂、B细胞消减剂、甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物、cox2抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAID、和p38抑制剂。如在本发明的其它方法中，在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。

本发明的另一个实施方案提供用于测量、测定、和/或评估抗产品抗体(例如针对抗IL-21R结合蛋白及其抗原结合片段的抗产品抗体)的生成水平的方法。

本公开的别的方面会在说明中部分列出，而且根据说明会部分显而易见，或者通过实践本发明可学会。本发明在权利要求中列出和具体指出，而且本公开不应解释为限制权利要求的范围。下面的详细说明包括本发明各种实施方案的例示性呈现，它们对于要求保护的发明不是限制性的。附图构成本说明书的一部分，而且与说明一起只用来例示实施方案，而非限制本发明。

附图简述

图1(a-c)描绘scFv对人IL-21R-BaF3细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混合，然后与100pg/ml人IL-21一起温育。48小时后通过CELLTITER GLO(Promega Corporation，Madison，WI)测量增殖。

图2(a-c)描绘scFv对人IL-21R-TF1细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混合，然后与100pg/ml人IL-21一起温育。48小时后通过CELLTITER-GLO

测量增殖。

图3(a-c)描绘scFv对鼠IL-21R-BaF3细胞增殖的中和。将细胞与所示scFv混合，然后与400pg/ml鼠IL-21一起温育。48小时后通过CELLTITER-GLO测量增殖。

图4(a-c)描绘scFv与亲本抗体18A5 IgG竞争对鼠IL-21R的结合。将scFv与生物素化的鼠IL-21R H/F混合，并将混合物添加至在ELISA板上固定化的抗体18A5。用HRP-链霉亲合素检测mIL-21R捕捉，并以A450信号的降低指示mIL-21R结合的竞争。

图5描绘21对重链/轻链对IL-21依赖性增殖的中和。将图中所示抗体添加至细胞。随后添加IL-21，并在48小时后用CELLTITER GLO

测量增殖。对人IL-21R-BaF3细胞用100pg/ml人IL-21(图5a-c)、对人IL-21R-TF1细胞用100pg/ml人IL-21(图5d-f)、或对鼠IL-21R-BaF3细胞用400pg/ml鼠IL-21(图5g-i)来进行测定。

图6描绘21种抗IL-21R IgG对瞬时表达人IL-21R(图6a-c)、大鼠IL-21R(图6d-f)、猕猴IL-21R(图6g-i)、和人伽马共同链(图6j-l)的CHO细胞的结合。用IL-21R或对照伽马共同链瞬时转染CHO细胞，并在基于细胞的ELISA中用HRP偶联的抗人IgG测量结合。

图7(a-c)描绘特定抗IL-21R抗体(图7a，AbS；图7b，AbQ、AbT、AbO；图7c，AbR、AbP、和AbU)的结合特异性，这是通过表面等离振子共振测量得出的。在抗人IgG上捕捉抗IL-21R抗体，并在BIACORE^TM仪器(GE Healthcare，Piscataway，NJ)中测量随后对鼠IL-21R-H/F、人IL-13-H/F、人IL-2Rβ、或人可溶性IL-4R任一的结合。图7d显示人IL-2Rβ和人可溶性IL-4R分别被特异性抗IL-2Rβ和抗IL-4R抗体所捕捉(对照)。

图8(a-d)描绘抗IL-21R抗体对人和鼠IL-21R的结合。在BIACORE^TM芯片上固定化的抗人IgG上捕捉所示人抗IL-21R抗体。让不同浓度的人IL-21R-His/FLAG(图8a-b)和鼠IL-21R-His/FLAG(图8c-d)流过芯片，并监测结合和解离。

图9描绘抗IL-21R抗体对人和猕猴IL-21R的结合。在BIACORE^TM芯片上固定化的抗人IgG上捕捉人抗IL-21R抗体AbS和AbT。让不同浓度的人和猕猴IL-21R-His/FLAG流过芯片，并监测结合和解离。图9a显示猕猴IL-21R-His/FLAG结合至AbS。图9b显示人IL-21R-His/FLAG结合至AbS。图9c显示猕猴IL-21R-His/FLAG结合至AbT。图9d显示人IL-21R-His/FLAG结合至AbT。

图10描绘IL-21R抗体的表位评估。在图10a所示实验中(还可见Y轴左边的图解)，通过BIACORE^TM芯片上固定化的抗IL-21R抗体AbS来捕捉鼠IL-21R-H/F(His-Flag融合蛋白)。使别的抗IL-21R抗体(AbS、AbT、D5(D5-20，一种中和性抗鼠IL-21R抗体)、和7C2(一种非中和性抗鼠IL-21R对照抗体))流过芯片，并监测它们对捕捉到的IL-21R-H/F的结合。在图10b所示实验中，通过BIACORE^TM芯片上固定化的抗IL-21R抗体AbS来捕捉人IL-21R-H/F。使别的抗IL-21R抗体(AbS、AbT、和9D2(一种非中和性抗人IL-21R对照抗体))流过芯片，并监测它们对捕捉到的IL-21R-H/F的结合。

图11描绘所示抗体对人IL-21R-BaF3细胞和鼠IL-21R-BaF3细胞增殖的中和。将抗体添加至细胞。随后添加IL-21，并在48小时后用CELLTITERGLO测量增殖。对人IL-21R-BaF3细胞用100pg/ml人IL-21(图11a)、对鼠IL-21R-BaF3细胞用200pg/ml鼠IL-21(图11b)、及对人IL-21R-TF1细胞用100pg/ml人IL-21(图11c)来进行测定。

图12描绘对人原代B细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与抗CD40抗体和人IL-21一起将所示抗体添加至原代人B细胞。3天后测量³H-胸苷掺入。图12a描绘AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、IL-13三重突变体、和18A5亲本抗体之间的比较；图12b描绘AbT、AbV、AbW、AbU、和人IgG1对照(hIg1)之间的比较。

图13描绘对人原代CD4⁺T细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与人IL-21一起将所示抗体添加至活化的原代人CD4⁺T细胞，并在3天后测量³H-胸苷掺入。

图14描绘对鼠原代CD8⁺T细胞的IL-21依赖性增殖的中和。与人IL-21一起将所示抗体添加至活化的原代鼠CD8⁺T细胞，并在3天后测量³H-胸苷掺入。

图15描绘由抗IL-21R抗体诱导的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测量。通过碘化丙啶掺入来测量经所示抗IL-21R抗体包被的CFSE标记的BJAB细胞的PBMC依赖性杀伤。包括抗CD20抗体利妥昔单抗(RITUXAN

Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)作为阳性对照，而且包括抗IL-13抗体作为阴性对照。

图16描绘抗IL-21R抗体的补体C1q结合。在ELISA板上固定化所示抗IL-21R抗体，并在与人血清一起温育后，用鸡抗人C1q和HRP偶联的抗鸡IgY抗体测量C1q结合。包括抗CD20抗体利妥昔单抗(RITUXAN

)作为阳性对照，并包括抗IL-13抗体作为阴性对照。

图17(a-c)描绘AbQ的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图18(a-c)描绘AbR的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图19(a-c)描绘AbW的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图20(a-c)描绘AbS的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图21(a-c)描绘AbT的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图22(a-c)描绘AbO的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图23(a-c)描绘AbP的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图24(a-c)描绘AbU的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图25(a-c)描绘AbV的氨基酸序列，包括V_H和V_L域、CDR(H1，H2，H3，L1，L2，和L3)、和恒定区。

图26(a-g)描绘与产生图5、11、12、13、和14(上文描述的)所示结果的研究类似实施的别的研究产生的结果。

图27a描绘IL-21细胞因子与抗体AbT竞争对鼠IL-21R的结合。将媒介或渐增量的IL-21与生物素化的鼠IL-21R-His/FLAG混合，并将混合物添加至在ELISA板上固定化的AbT。用HRP-链霉亲合素检测mIL-21R捕捉，并以A450信号的降低指示mIL-21R结合的竞争。图27b描绘AbS与IL-21竞争对鼠IL-21R的结合。将AbS和mIL-21混合，应用至ELISA板中固定化的mIL-21R-Fc，并监测AbS(实心菱形)、同种型对照抗体(空心三角形)、或mIL-21(方形)的结合。

图28描绘在抗IL-21R抗体AbS、AbU、AbV、或AbW或者同种型对照抗体hIgG1-TM存在下进入大鼠CD3T细胞的IL-21依赖性³H-胸苷掺入。

图29描绘在10％含有家兔IL-21的条件化培养基缺失(图29a)或存在(图29b)下AbS对由固定化抗小鼠IgG抗体呈递的两种家兔IL-21R同等型-Fc任一的结合。

图30描绘用抗IL-21R抗体处理的动物中的NP特异性一抗应答。图30a描绘NP特异性IgG应答，而图30b描绘NP特异性IgM应答。图30c-f描绘图30a所示实验的重复中的NP特异性IgG亚类应答，为各动物显示了ELISA数据：总IgG(图30c)，IgG1(图30d)，IgG2a(图30e)，和IgG2c(图30f)。图30g描绘两个月时期里的NP特异性IgG应答。图30h描绘两个月研究期结束时在骨髓中找到的NP特异性IgG抗体分泌细胞(ASC)。

图31描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠中的抗双链DNA(抗dsDNA)抗体。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠；对鼠IL-21没有反应性的抗人IL-13人IgG1 A234 A235 A237三重突变体抗体(IL-13 TM)用作同种型对照。通过ELISA对两周一次收集的血清测试抗dsDNA的存在。图31a显示处理后的抗dsDNA抗体滴度。图31b显示采血前的抗dsDNA抗体滴度。图31c显示服药2周后的抗dsDNA抗体滴度。图31d显示服药4周后的抗dsDNA抗体滴度。图31e显示服药6周后的抗dsDNA抗体滴度。图31f显示服药8周后的抗dsDNA抗体滴度。图31g显示服药10周后的抗dsDNA抗体滴度。在图31a和31c-g中，星号指示与盐水和IL-13对照二者相比的显著差异(p＜0.01)。在图31b中，星号指示与其它三组相比的显著差异(p＜0.01)。图31b-g中的虚线表示检测水平。

图32描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠的肾中的IgG沉积物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠；对鼠IL-21没有反应性的抗人IL-13人IgG1 A234 A235 A237三重突变体抗体用作同种型对照。处理10周后，处死小鼠并通过免疫细胞化学来鉴定肾中的IgG沉积物(图32b；肾小球以虚线圆圈标示；IgG沉积物的例子以箭头标示)。对染色强度在1-5的尺度上打分(图32a)。

图33描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠的肾中的IgM和补体C3沉积物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。处理10周后，处死小鼠并通过免疫细胞化学来鉴定肾中的IgM(图33a)和补体C3(图33b)。对染色强度在1-5的尺度上打分。

图34描绘用抗IL-21R抗体处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)的MRL-Fas^lpr小鼠的脑中的IgG、IgM和补体C3沉积物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。处理10周后，处死小鼠并通过免疫细胞化学来鉴定脑中的IgG(图34a)、IgM(图34b)、和补体C3(图34c)沉积物。对染色强度在1-5的尺度上打分。

图35描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠的肾中的淋巴细胞浸润物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。处理10周后，处死小鼠并对苏木精/曙红(H/E)染色的肾切片检查皮质-间质(肾小球的支持结构)(图35a)、皮质-血管周围区域(图35b)、和肾盂周围区域(输尿管起点附近)(图35c)这三个区带中的淋巴细胞浸润。对淋巴细胞数在1-5尺度上打分。

图36描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠的肺中的淋巴细胞浸润物。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。处理10周后，处死小鼠并对H/E染色的肺切片检查淋巴细胞浸润。对淋巴细胞数在1-5尺度上打分。

图37a-b描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠中的小鼠抗人抗体(MAHA)应答。用所示三重突变体抗体处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。通过ELISA对两周一次收集的血清测试能够结合用于处理小鼠的人抗体的鼠抗体的存在(图37a)或能够结合其它抗IL-21人抗体的鼠抗体的存在(图37b)。图37a中的星号指示与抗IL-13处理组相比的显著差异(p＜0.05)。

图38描绘用抗IL-21R抗体处理的MRL-Fas^lpr小鼠中抗dsDNA抗体的发生。图38a描绘用AbS处理的小鼠的抗dsDNA抗体滴度，而图38b描绘用AbT处理的小鼠的抗dsDNA抗体滴度。图38c-d呈现用AbS和AbT处理的MRL-Fas^lpr小鼠中的肾病理和肾炎症灶。

图39描绘用抗IL-21R抗体处理的小鼠或大鼠中进入背部气袋的细胞浸润。图39a-e：在BALB/C小鼠的背部皮肤下注射3ml空气以创建气袋后3天，给袋补气。2天后，i.p.注射盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一。抗体注射后24小时将100ng鼠IL-21注射入气袋。6小时后，用3ml PBS清洗袋，并测定总细胞计数(图39a)、单核细胞(图39b)、淋巴细胞(图39c)、和嗜中性粒细胞(图39d)。图39e描绘图39a-d所示实验的重复中的总细胞计数。图39f-j描绘用小鼠IL-21和抗IL-21R抗体处理后大鼠中进入气袋的总细胞浸润。图39f描绘在AbS或对照抗体存在或缺失下施用20μg mIL-21(6小时)或1μg mIL-21(20小时)任一后的细胞浸润。图39g-h描绘重复实验中进入大鼠气袋的细胞浸润，其中在1、3、或10μg/kg AbS或对照抗体存在下施用20μg mIL-21达6小时。在图39i所示实验中，将大鼠用单一的或组合的20μg mIL-21和1mg/kg抗体(AbS或同种型对照任一)，以及20μg mIL-21和10mg/kg抗体的组合处理6小时。在图39j中，测试与1或10mg/kg AbS组合的10、20、或40μgmIL-21。

图40描绘单次静脉内或皮下施用后CD-1小鼠中AbS的浓度-时间曲线。低于定量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个数据点N＝4-8。

图41描绘单次腹膜内施用后DBA和MRL-Fas^lpr小鼠中AbS的浓度-时间曲线。低于定量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个数据点N＝4-8。

图42a和b描绘以10、5、和2.5mg/kg剂量、每周三次、持续10周多次i.p.施用后MRL-Fas^lpr小鼠中的观察和预测AbS浓度。低于定量极限的浓度在计算均值和SD时作为零处理。每个时间点N＝7-8。

图43a和b描绘如所示施用后猕猴中AbS的浓度-时间曲线。低于定量极限的浓度(＜30ng/ml)在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个组N＝3。图43a中的SAN指研究动物编号。

图44描绘给小鼠单次施用后AbS和AbT的浓度-时间曲线。图44a显示CD-1小鼠中10mg/kg i.v.施用后的曲线。图44b显示MRL-Fas^lpr小鼠中10mg/kg i.p.施用后的曲线。图44c显示DBA小鼠中8mg/kg i.p.施用后的曲线。低于定量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个数据点N＝4-8。

图45描绘以20mg/kg、每周三次、持续10周多剂i.p.施用后MRL-Fas^lpr小鼠中的观察和预测AbT浓度。低于定量极限的浓度在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个时间点N＝6-8。

图46a和b描绘如所示施用后AbT和AbS在猕猴中的浓度-时间曲线。低于定量极限的浓度(＜30ng/ml)在计算均值和标准偏差时作为零处理。每个组N＝3。

图47描绘抗IL-21R抗体AbS、AbT、和¹²⁵I-D5(8mg/kg，i.p.)在雄性DBA小鼠中的浓度-时间曲线。通过抗人IgG ELISA来定量人抗体AbS和AbT，并通过监测放射性标记物来定量¹²⁵I标记的鼠抗体D5。

图48a描绘单剂10mg/kg i.v.后AbS、AbT、和同种型对照在Sprague-Dawley(S-D)大鼠中的均值血清浓度(Y轴；ng/ml)。图48b描绘S-D大鼠中单剂10mg/kg i.v.后的抗IL-21R抗体AbS-AbW。＜LOQ(45ng/mL)的各数据点在计算均值和SD时作为零处理。如果均值低于LOQ(例如当所有动物具有＜LOQ的值时)，那么不显示数据点。

图49描绘单剂i.v.、i.p.、或s.c.后S-D大鼠中的AbS均值血清浓度(Y轴；ng/ml)。

图50描绘单剂2.5mg/kg静脉内后¹²⁵I-AbS在IL-21R敲除和野生型C57BL/6(对照)小鼠中的生物分布。图50a显示对照C57BL/6小鼠中的组织中的¹²⁵I-AbS浓度。图50b显示IL-21R敲除小鼠中的¹²⁵I-AbS浓度。图50c显示对照C57BL/6和IL-21R敲除小鼠中的¹²⁵I-AbS血清浓度。图50d显示对照C57BL/6和IL-21R敲除小鼠中的¹²⁵I-AbS累积尿计数。低于LOQ的浓度在计算均值和SD时作为零处理。每个血清或组织时间点N＝9-10；每个尿时间点N＝5-10。

图51描绘单剂2.5mg/kg i.p后¹²⁵I-AbS在MRL-Fas^lpr小鼠中的生物分布。图51a显示MRL-Fas^lpr小鼠中的¹²⁵I-AbS组织浓度。图51b显示MRL-Fas^lpr小鼠中的¹²⁵I-AbS尿计数。

图52描绘单剂2.5和10mg/kg i.p.后MRL-Fas^lpr小鼠中的¹²⁵I-AbS血清浓度。低于LOQ的浓度在计算均值和SD时作为零处理。每个时间点N＝4-8。

图53a描绘人全血样品中渐增浓度的AbS(X轴)时对IL-21诱导的IL-2Rα(IL2RA)、PRF1、IL-6、和CD19表达的百分比抑制(Y轴)，自倍数变化计算得出；图53b描绘人全血样品中响应渐增的AbS浓度(X轴；Ab浓度(nM))时对IL-21诱导的IL-6相对表达水平的抑制(RQ；Y轴)。

图54描绘在用于测定的定制TLDA(Taqman

低密度阵列)上包括的基因；标示了内源对照。

图55展现不同浓度的IL-21时2、4、6、或24小时时间点(X轴)任一时六种检查的基因(CD19、GZMB、IFNγ(IFNG)、IL-2Rα(IL2RA)、IL-6、和PRF1)的基因表达的相对定量(RQ；Y轴)。

图56a展现与IL-21和不同浓度的AbS或IgG1TM对照任一一起温育(X轴)后六种检查的基因(CD19、GZMB、IFNγ、IL-2Rα、IL-6、和PRF1)的基因表达的相对定量(RQ；Y轴)。图56b-c描绘用不同浓度的AbS或对照IgG1 TM任一处理(X轴)后对相同基因的IL-21响应的百分比抑制(Y轴)。

图57描绘用重组人IL-21离体刺激后雄性猕猴的全血中IL-2Rα基因表达的相对定量(RQ)值的分布。图57a展现RQ值(X轴)的柱状图分析(Y轴)，而图57b展现经log2换算的RQ值(X轴)的柱状图分析(Y轴)，它们是使用统计软件包获得的。实线表示高斯(Gaussian)分布。虚线表示登入体内研究的截留RQ，其是使用如下公式定义的：log{RQ_截留}＝经log换算的RQ值的均值-经log换算的RQ值的SD。图57c比较各动物和用IL-21和AbT(三角形)或者IL-21和对照IgG(正方形)刺激的全血等分试样的中值(实线)RQ值(Y轴)，与仅用IL-21刺激(圆形)比较。

图58描绘给雄性猕猴单次10mg/kg i.v.施用抗IL-21R抗体AbS(“A”)或AbT(“B”)后的血清浓度(Y轴)，AbS收集至第148天而AbT收集至第36天(X轴)。血清浓度低于下限LOQ(30ng/mL)的数据点未显示。

图59显示给雄性猕猴单次10mg/kg i.v.施用抗IL-21R抗体AbS后抗体血清浓度(第二Y轴)、药效学(PD)活性(“RQ”；第一Y轴)、和抗产品抗体应答(以“A”表示)(包括中和性抗产品抗体应答(以“AN”表示))的相关性，如在剂量施用前和后各时间(X轴；时间(天))测量的。图59a-c分别描绘动物1-3。

图60显示相关性，与图59中关于AbT(单次10mg/kg i.v.施用)的相似。图60a-c分别描绘动物4-6的结果。

图61描绘单次i.v.施用后AbS-AbW在猕猴中的浓度-时间曲线。低于定量极限的浓度(＜30ng/ml)在计算时作为零处理。对于AbS(实心圆圈，研究1；空心菱形，研究2)、AbT(空心圆圈)、AbV(实心菱形)、和AbU(空心三角)，n＝3；10mg/kg剂量。对于AbW(孔心方框)，n＝2；1mg/kg剂量。

图62描绘给经破伤风类毒素攻击的雄性和雌性猕猴三次每周一次i.v.施用(箭号)2(图62a)或10mg/kg(图62b)后AbS的各浓度(ng/ml)。

图63描绘i.v.施用后AbS PK参数的异计缩放(allometric scaling)。体重(W)；最大跨度潜力(以年计；MLP)。图63a呈现针对体重(X轴)绘图的CLMLP(Y轴)；图63b呈现针对体重(X轴)绘图的分布体积(Y轴)。实线表示使用来自小鼠、大鼠、和猕猴的数据基于线性回归拟合的曲线。虚线表示95％置信区间。

图64呈现i.v.施用后AbT PK参数的异计缩放。脑重(“BW”)。图64a呈现针对体重(X轴)绘图的CL*BW(Y轴)；图64b呈现针对体重(X轴)绘图的分布体积(Y轴)。

图65(a-b)描绘NZBWF1/J小鼠中AbS对蛋白尿发生(图65a)和抗dsDNAIgG血清抗体滴度(图65b)的影响。给雌性26周龄NZBWF1/J小鼠施用400μg盐水、抗艾美尔球虫(E.tenella)抗体、mCTLA-4Ig、hIgGTm抗体或AbS抗体任一，每周三次，持续10周。在研究开始时及此后10周每两周测量尿蛋白质水平和抗dsDNA IgG血清抗体滴度。用CTLA4-Ig处理的动物在第4-10周显示出抗dsDNA滴度显著降低(星号；p＜.05)。

图66描绘类风湿性关节炎的半治疗性CIA小鼠模型中抗IL-21R中和对疾病结局的影响。对雌性DBA/1小鼠用牛II型胶原免疫接种和强化；当研究中10％的动物展现出爪肿胀时，给小鼠服用(每周三次，持续30天)8mg/kg鼠IgG2a同种型对照抗体、抗小鼠IL-21R抗体D5(鼠IgG2a抗体)、mTNFRII-Fc(阳性对照，鼠IgG2a同种型)(图66a)；或抗IL-13TM抗体(人IgG1同种型对照抗体)、AbT、或AbS任一(图66b)。各动物在研究第30天的得分描绘于图66c。

图67描绘在AbS存在下猕猴中针对破伤风类毒素的遗忘性(amnestic)破伤风特异性IgM和IgG血清抗体应答的形成。给9只雄性和9只雌性猕猴免疫接种破伤风类毒素并休息43天。43天后，将雄性和雌性猴随机分派入三组，并用盐水(媒介)、2mg/kg AbS、或10mg/kg AbS任一处理，每周一次，持续三周。第一剂媒介或AbS任一后24小时(箭号)，第二次给猴免疫接种破伤风类毒素。贯穿研究过程对猴例行采血，并检查破伤风特异性IgM(图67a)和IgG(图67b)血清抗体滴度。

发明详述

本发明的结合蛋白最初衍生自亲本抗体18A5，但是在重链和/或轻链互补决定区3(CDR3)部分氨基酸序列方面不同于18A5。另外，本发明的结合蛋白显示结合和中和人和鼠IL-21R二者方面与等同形式(例如scFv或IgG)的18A5相比改良的效力。先前没有报告单一结合蛋白对来自这两个物种(人和小鼠)的IL-21R的高效力中和。具有比它们的亲本抗体更大的中和效力的本发明结合蛋白可转化为与先前记载的药剂相比更高的功效。另外，已经改变了V_H和V_L框架区的氨基酸序列以匹配由人基因组序列编码的序列，由此降低用本发明结合蛋白处理的患者中人抗人抗体应答的潜力。

定义

为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。别的定义遍及详述和说明书中的其它地方列出。

术语“结合蛋白”如本文中使用的包括如下的任何天然发生的、重组的、合成的、或遗传工程的蛋白质或其组合，其结合抗原、靶蛋白质、或肽，或其片段。本发明的结合蛋白可包括抗体，或衍生自至少一种抗体片段。结合蛋白可包括天然发生的蛋白质和/或合成工程的蛋白质。本发明的结合蛋白可结合抗原或其片段以形成复合物，并引发生物学应答(例如激动或拮抗特定生物学活性)。结合蛋白可包括分离的抗体片段。由抗体重和轻链的可变区组成的“Fv”片段、其中轻和重链可变区经肽接头相连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白质”)、和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。结合蛋白片段还可包括功能性抗体片段，诸如例如Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fc、Fd、Fd’、Fv、和单抗体可变域(dAb)。结合蛋白抗原是双链或单链，而且可包含单个结合域或多个结合域。

结合蛋白还可包括结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽融合或以其它方式连接至免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽，后者继而融合或以其它方式连接至包含来自免疫球蛋白重链的一个或多个天然或工程化恒定区的区域，所述恒定区不同于C_H1，例如IgG和IgA的C_H2和C_H3区或者IgE的C_H3和C_H4区(更完整的说明参见例如Ledbetter等，美国专利公开文本2005/0136049)。结合域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括如下的区域，其包括融合或以其它方式连接至铰链区多肽的天然或工程化免疫球蛋白重链C_H2恒定区多肽(或C_H3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)和融合或以其它方式连接至C_H2恒定区多肽(或C_H3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)的天然或工程化免疫球蛋白重链C_H3恒定区多肽(或C_H4，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)。通常，此类结合域-免疫球蛋白融合蛋白具有至少一项选自下组的免疫学活性：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、补体结合、和/或对靶物(例如靶抗原)的结合。本发明的结合蛋白可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。

术语“抗体”如本文中使用的指对指定蛋白质或肽或其片段有反应性的免疫球蛋白。此类抗体包括但不限于人抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变型抗体、嫁接偶联抗体(即偶联或融合至其它蛋白质、放射性标记物、细胞毒素的抗体)、和体外生成的抗体。抗体可来自任何类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE，及来自任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如卡帕(κ)或拉姆达(λ)的轻链。本发明的抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、大鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。抗体的恒定区可进行改变，例如突变，以修饰抗体的特性(例如以提高或降低下述一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应器细胞功能、或补体功能)。通常，抗体特异性结合预定抗原，例如与病症有关的抗原，病症例如炎性的、免疫性的、自身免疫性的、神经变性性的、代谢的、和/或恶性的病症。

术语“单域结合蛋白”如本文中使用的包括结合抗原、蛋白质、或多肽的任何单域结合支架。单域结合蛋白可包括如下的任何天然的、重组的、合成的、或遗传工程的蛋白质支架或其组合，其结合抗原或其片段以形成复合物，并引发生物学应答(例如激动或拮抗特定生物学活性)。单域结合蛋白可衍生自天然发生的蛋白质或抗体，或者它们可以合成工程化或通过重组技术来生成。单域结合蛋白可以是任何现有技术的单域结合蛋白或任何未来的单域结合蛋白，而且可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。在本发明的一些实施方案中，单域结合蛋白支架可衍生自在鱼中找到的免疫球蛋白的可变区，诸如例如衍生自在鲨鱼血清中找到的称作新型抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型的可变区。生成衍生自NAR可变区(“IgNAR”)的单域结合支架的方法记载于国际申请公开号No.WO 03/014161及Streltsov(2005)Protein Sci.14(11)：2901-09。

在其它实施方案中，单域结合蛋白是现有技术中描述为不含轻链的重链抗体的天然发生的单域结合蛋白。此类单域结合蛋白披露于例如国际申请公开号WO 94/004678。出于清楚原因，衍生自天然不含轻链的重链抗体的可变域结合蛋白在本文中称作VHH或“纳米抗体”(nanobody)以将它与常规四链免疫球蛋白的V_H区分开。此类VHH分子可衍生自在骆驼科(Camelidae)物种中产生的抗体，例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼、和原驼中。骆驼科以外的其它科也可用于生成天然不含轻链的重链结合蛋白。VHH分子比传统的IgG分子小大约10倍。它们是单一多肽，而且非常稳定，对极端pH和温度条件有抗性。此外，它们对蛋白酶的作用有抗性，常规抗体则不然。此外，体外表达VHH能生成高产量的、正确折叠的功能性VHH。另外，在camelids中生成的结合蛋白能识别经抗体文库或经免疫camelids以外的哺乳动物在体外生成的抗体识别的表位以外的表位(参见例如国际申请公开号WO 97/049805和WO 94/004678，通过述及将二者收入本文)。

术语“抗原结合域”和“抗原结合片段”指结合蛋白的一部分，其包负责含结合蛋白和抗原之间特异性结合的氨基酸。抗原中受到结合蛋白特异性识别和结合的部分称作“表位”。抗原结合域可包含抗体的轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)；然而，它不必包含二者。例如，Fd片段具有两个V_H区，而且常常保留完整抗原结合域的抗原结合功能。结合蛋白的抗原结合片段的例子包括但不限于：(1)Fab片段，即具有V_L、V_H、C_L和C_H1域的单价片段；(2)F(ab′)₂片段，即具有通过铰链区处的二硫桥相连接的两个Fab片段的二价片段；(3)Fd片段，其具有两个V_H和一个C_H1域；(4)Fv片段，其具有抗体单臂的V_L和V_H域；(5)dAb片段(参见例如Ward等(1989)Nature 341：544-46)，其具有V_H域；(6)分离的CDR；和(7)单链可变片段(scFv)。虽然Fv片段的两个域(即V_L和V_H)由分开的基因编码，但是它们能接合在一起，这使用重组方法，通过合成的接头，使得它们能够作为单一蛋白质链生成，其中V_L和V_H区配对以形成单价分子(称作scFv)(参见例如Bird等(1988)Science 242：423-26；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83)。这些结合域片段可使用本领域技术人员知道的常规技术来获得，而且可以以与完整结合蛋白诸如例如抗体相同的方式对片段评估功能。

术语“中和”指结合蛋白或其抗原结合片段(例如抗体)降低或阻断信号传导途径或抗原，例如IL-21/IL-21R信号传导途径或IL-21R抗原的活性。如本文中使用的，“抗产品抗体”指响应外源蛋白质(例如抗IL-21R抗体)而形成的抗体。如本文中使用的，“中和性抗产品抗体”指阻断外源导入蛋白质(例如抗IL-21R抗体)的体内活性的抗产品抗体。在本发明的一些实施方案中，中和性抗产品抗体降低IL-21R抗体的体内活性，例如IL-21R抗体的体内药效(PD)活性(诸如抗IL-21R抗体调控IL-21响应性细胞因子或基因表达的能力)。

术语“有效量”指足以调节IL-21R活性以改善或减轻临床症状的严重程度或实现期望的生物学结果，例如降低T细胞和/或B细胞活性、遏制自身免疫、遏制移植排斥的剂量或量。

术语“人结合蛋白”包括具有基本上与本领域已知的人种系免疫球蛋白序列(包括例如Kabat等(5th ed.1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91 3242记载的)对应的可变和恒定区的结合蛋白。本发明的人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3在。人抗体中可以有至少一个、两个、三个、四个、五个、或更多个位置被不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基替换。

短语“抑制”、“拮抗”、“阻断”、或“中和”IL-21R活性及其类似短语指IL-21R的至少一种活性由于结合抗IL-21R抗体而降低、抑制、或以其它方式减弱，其中降低是相对于IL-21R在该抗体缺失下的活性。IL-21R活性可使用本领域已知的任何技术来测量。抑制或拮抗不必指示完全消除IL-21R生物学活性。活性的降低可以是约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，或更多。

术语“白介素-21受体”或“IL-21R”等等指结合IL-21配体的I类细胞因子家族受体，也称作MU-1(参见例如美国专利申请No.09/569,384和美国申请公开文本No.2004/0265960；2006/0159655；2006/0024268；和2008/0241098)、NILR或zalphall(参见例如国际申请公开号WO 01/085792；Parrish Novak等(2000)出处同上；Ozaki等(2000)出处同上)。IL-21R与IL-2和IL-15受体分享的β链、和IL-4α同源(Ozaki等(2000)出处同上)。在配体结合时，IL-21R能够与共同伽马细胞因子受体链(γc)相互作用并诱导STAT1和STAT3(Asao等(2001)出处同上)或STAT5(Ozaki等(2000)出处同上)磷酸化。IL-21R显示广泛的淋巴样组织分布。术语“白介素-21受体”或“IL-21R”等等还指能够与IL-21(优选哺乳动物起源的IL-21，例如鼠或人IL-21)相互作用且具有至少一项下述特征的多肽(优选哺乳动物起源的，例如鼠或人IL-21R)或(在上下文需要时)编码此类多肽的多核苷酸：(1)天然发生的哺乳动物IL-21R多肽的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：2(人-对应于GENBANK

(U.S.Dept.of Health and Human Services，Bethesda，MD)登录号NP_068570)或SEQ ID NO：4(鼠-对应于GENBANK

登录号NP_068687)所列氨基酸序列或其片段；(2)与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所列氨基酸序列或其片段基本上同源例如至少85％，90％，95％，98％，或99％同源的氨基酸序列；(3)由天然发生的哺乳动物IL-21R核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：1(人-对应于GENBANK

登录号NM_021798)或SEQ ID NO：3(鼠-对应于GENBANK

登录号NM_021887)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所列核苷酸序列或其片段基本上同源例如至少85％，90％，95％，98％，或99％同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(5)由与天然发生的IL-21R核苷酸序列或其片段例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或其片段简并的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(6)在严格条件(例如高严格条件)下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。另外，涵盖在所公开的方法中有用的其它非人和非哺乳动物IL-21R。

术语“白介素-21”或“IL-21”指与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同源性(Parrish-Novak等(2000)出处同上)且结合IL-21R的细胞因子。此类细胞因子分享共同的折叠，折叠成该家族特征性的“四螺旋束”结构。IL-21主要在活化的CD4⁺T细胞中表达，而且据报告对NK、B和T细胞有效果(Parrish Novak等(2000)出处同上；Kasaian等(2002)出处同上)。在IL-21结合至IL-21R时，IL-21R的活化引起例如STAT5或STAT3信号传导(Ozaki等(2000)出处同上)。术语“白介素-21”或“IL-21”还指能够与IL-21R(优选哺乳动物起源的，例如鼠或人IL-21R)相互作用且具有至少一项下述特征的多肽(优选哺乳动物起源的，例如鼠或人IL-21)或(在上下文需要时)编码此类多肽的多核苷酸：(1)天然发生的哺乳动物IL-21的氨基酸序列或其片段，例如SEQ ID NO：212(人)所列氨基酸序列或其片段；(2)与SEQ ID NO：212所列氨基酸序列或其片段基本上同源例如至少85％，90％，95％，98％，或99％同源的氨基酸序列；(3)由天然发生的哺乳动物IL-21核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：211(人)或其片段)编码的氨基酸序列；(4)由与SEQ ID NO：211所列核苷酸序列或其片段基本上同源例如至少85％，90％，95％，98％，或99％同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(5)由与天然发生的IL-21核苷酸序列或其片段简并的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(6)在严格条件(例如高严格条件)下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。

术语“IL-21R活性”等等(例如“IL-21R的活性”、“IL-21/IL-21R活性”)指因IL-21R结合而发起或中断的至少一种细胞过程。IL-21R活性包括但不限于：(1)与配体(例如IL-21多肽)相互作用(例如结合)；(2)联合或活化信号转导(也称作“信号传导”，指响应特定刺激发生的细胞内级联)和信号转导分子(例如伽马链(γc)和JAK1)，和/或刺激STAT蛋白质(例如STAT5和/或STAT3)的磷酸化和/或活化；(3)调控免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、调节性T细胞(Treg)和巨核细胞)的增殖、分化、效应器细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌、和/或存活；及(4)调控IL-21响应性基因或细胞因子的表达，例如调控IL-21对例如TNF，IFNγ，IL-6，IL-8，IL-10，CD19，STAT3，ICAM-1，TBX21，CSF1，GZMB，PRF1，IL-2Rα，IL-21R，等的表达水平的影响。

如本文中使用的，“体外生成的抗体”指如下的抗体，其中整个或部分可变区(例如至少一个CDR)是在非免疫细胞选择(例如体外噬菌体展示、蛋白质芯片、或能对候选序列测试它们结合抗原的能力的任何其它方法)中生成的。

术语“分离的”指基本上不含其天然环境的分子。例如，分离的蛋白质基本上不含细胞材料或来自衍生它的细胞或组织来源的其它蛋白质。该术语还指如下的制备物，其中分离的蛋白质对于药物组合物是足够纯的，或者至少70-80％(w/w)纯的、至少80-90％(w/w)纯的、至少90-95％(w/w)纯的、或至少95％，96％，97％，98％，99％，或100％(w/w)纯的。

短语“百分比相同”或“百分比同一性”指至少两种不同序列之间的相似性。此百分比同一性可通过标准算法来确定，例如Altshul等((1990)J.Mol.Biol.215：403-10)记载的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)；Needleman等((1970)J.Mol.Biol.48：444-53)的算法；或Meyers等((1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)的算法。一组参数可以是Blosum 62评分矩阵及缺口罚分12、缺口延伸罚分4、和移码缺口罚分5。两种氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性还可以使用Meyers和Miller((1989)CABIOS 4：11-17)的算法来确定，该算法已经掺入ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12、和缺口罚分4。百分比同一性通常通过比较相似长度的序列来计算。

术语“全集(repertoire)”指完全或部分地自编码至少一种免疫球蛋白的至少一种序列衍生的至少一种核苷酸序列。可以通过在体内重排重链的V、D、和J区段及轻链的V和J区段来生成序列。或者，可以自响应例如体外刺激而发生重排的细胞生成序列。或者，可以通过DNA剪接、核苷酸合成、诱变、或其它方法来获得部分或整个/所有序列(参见例如美国专利No.5,565,332)。全集可以只包括一种序列，或者可以包括多种序列，包括遗传上多样的集合中的多种序列。

术语“特异性结合”等等指两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合以高的亲和力和低至中的能力来表征，与通常具有低的亲和力和中至高的能力的非特异性结合区分开。通常，当结合常数Ka高于约10⁶M^-1s^-1时，认为结合是特异性的。如果必要，通过改变结合条件，能降低非特异性结合且基本上不影响特异性结合。熟练技术人员能使用常规技术来改进适宜的结合条件，诸如结合蛋白的浓度、溶液的离子强度、温度、容许结合进行的时间、封闭剂(例如血清清蛋白或乳酪蛋白)的浓度、等。本文中列出了例示性的条件，但是本领域普通技术人员知道的其它条件落在本发明的范围内。

如本文中使用的，术语“严格”、“严格性”、等等描述用于杂交和清洗的条件。本发明的分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物来鉴定和分离具有如下序列的核酸，该序列与编码所公开的多核苷酸的序列相同或相似。因此，以此方式分离得到的多核苷酸可用于生成针对IL-21R的结合蛋白或鉴定表达此类结合蛋白的细胞。用于鉴定和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、Southern杂交、原位杂交和Northern杂交，而且是本领域技术人员公知的。

可以在具有不同严格性的条件下实施杂交反应。杂交反应的严格性包括任意两个核酸分子会彼此杂交的难度和它们会保持杂交的条件。优选的是，在低严格性条件、更优选严格条件、和最优选高严格条件下，每个杂交的多核苷酸杂交至其对应多核苷酸。严格条件是本领域技术人员知道的，而且可见于例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6。含水的和不含水的方法均在此文献中有记载，而且均可使用。严格杂交条件的一个例子是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃杂交，接着在0.2X SSC/0.1％SDS中于50℃清洗至少一次。严格杂交条件还可用在例如0.2X SSC/0.1％SDS中于55℃、60℃、或65℃清洗来实现。高严格条件包括例如在0.5M磷酸钠/7％SDS中于65℃杂交，接着在0.2X SSC/1％SDS中于65℃清洗至少一次。严格条件的其它例子显示于下文表1：高严格条件指至少像例如条件A-F那样严格的条件；严格条件指至少像例如条件G-L那样严格的条件；而低严格条件指至少像例如条件M-R那样严格的条件。

表1：杂交条件

¹杂合物长度是对杂交多核苷酸的杂交区预期的长度。当将一多核苷酸杂交至序列未知的靶多核苷酸时，杂合物长度假设为杂交多核苷酸的长度。当序列已知的多核苷酸杂交时，杂合物长度可通过比对多核苷酸的序列并鉴定具有最佳序列互补性的区域来确定。

²SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl，10mM NaH₂PO₄，和1.25mM EDTA，pH 7.4)可替代杂交和清洗缓冲液中的SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；清洗在杂交完全后实施15分钟。

T_B ^*-T_R ^*：用于长度预期小于50个碱基对的杂合物的杂交温度应当比杂合物的解链温度(T_m)低5-10℃，其中T_m依照下述方程来确定。对于长度小于18个碱基对的杂合物，T_m(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度介于18和49个碱基对的杂合物，T_m(℃)＝81.5+16.6(log₁₀Na⁺)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂合物中的碱基数，而Na⁺为杂交缓冲液中的钠离子浓度(1X SSC的Na⁺＝0.165M)。

用于多核苷酸杂交的严格性条件的别的例子见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第9章和第11章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，及Ausubel等eds.，Current Protocols in Molecular Biology，2.10节和6.3-6.4节，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，通过述及收入本文。

本发明的分离的多核苷酸可用作杂交探针和引物来鉴定和分离具有如下序列的DNA，该序列编码所公开的多核苷酸的等位基因变体。等位基因变体指所公开的多核苷酸的天然发生的可变形式，其编码与所公开的多核苷酸编码的多肽相同或具有显著相似性的多肽。优选的是，等位基因变体与所公开的多核苷酸具有至少约90％序列同一性(更优选至少约95％同一性；最优选至少约99％同一性)。本发明的分离的多核苷酸还可用作杂交探针和引物来鉴定和分离具有如下序列的DNA，该序列编码与所公开的多核苷酸同源的多肽。这些同系物是自与所公开的多肽和多核苷酸的物种不同或相同的物种分离，但是与所公开的多核苷酸和多肽具有显著序列相似性的多核苷酸和多肽。优选的是，多核苷酸同系物与所公开的多核苷酸具有至少约50％序列同一性(更优选至少约75％同一性；最优选至少约90％同一性)，而多肽同系物与所公开的结合蛋白/多肽具有至少约30％序列同一性(更优选至少约45％同一性；最优选至少约60％同一性)。优选的是，所公开的多核苷酸和多肽的同系物是自哺乳动物物种分离的。本发明的分离的多核苷酸可另外用作杂交探针和引物来鉴定表达本发明结合蛋白的细胞和组织及表达它们的条件。

短语“基本上如…所列”、“基本上相同”、和“基本上同源”意味着有关氨基酸或核苷酸序列(例如CDR、V_H、或V_L域)与所列序列会相同或具有非基本差异(例如经由保守氨基酸替代)。非基本差异包括次要氨基酸变化，诸如规定区域的五个氨基酸的序列中的一处或两处替代。在抗体的情况中，第二抗体具有与第一抗体相同的特异性，而且具有第一抗体的至少约50％的亲和力。

与本文中公开的序列基本上相同或同源的序列也是本申请的一部分。在一些实施方案中，序列同一性可以是约85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如高严格杂交条件)下会杂交至该链的互补物时，存在基本同一性或同源性。核酸可以存在于完整细胞中、细胞溶胞物中、或部分纯化的或基本上纯化的形式。

术语“治疗剂”等等指治疗或有助于治疗医学病症或其症状的物质。治疗剂可包括但不限于以补充抗IL-21R结合蛋白使用的方式调控免疫细胞或免疫应答的物质。在本发明的一个实施方案中，治疗剂是治疗性抗体，例如抗IL-21R抗体。在本发明的另一个实施方案中，治疗剂是治疗性结合蛋白，例如抗IL-21R抗体。本文中描述了治疗剂的非限制性例子和用途。

如本文中使用的，抗IL-21R结合蛋白(例如抗体)的“治疗有效量”指结合蛋白的如下量，其在单剂或多剂施用于受试者(诸如人类患者)时有效治疗、预防、治愈、延迟、降低严重程度、和/或改善病症或复发病症的至少一种症状或延长受试者的存活超出没有此类处理的情况中的预期。在一个实施方案中，治疗有效量可以是抗IL-21R结合蛋白足以调控至少一种IL-21响应性细胞因子或基因表达的量。

术语“治疗”或“处理”指治疗或预防措施。治疗或处理可以施用于具有医学病症的受试者或最终会获得病症的受试者，用以预防、治愈、延迟、减低严重程度、和/或改善病症或复发病症的一种或多种症状或者用以延长受试者的存活超出没有此类处理的情况中的预期。

抗IL-21R结合蛋白

本申请的公开提供新的抗IL-21R结合蛋白，其包含新的抗原结合片段。本领域技术人员知道的众多方法可用于获得结合蛋白或其抗原结合片段。例如，抗IL-21R结合蛋白(包括抗体)可使用重组DNA法来生成(参见例如美国专利No.4,816,567)。单克隆抗体也可通过依照已知方法生成杂交瘤来生成(参见例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495-99)。然后使用标准方法诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和表面等离振子共振(BIACORE^TM)分析筛选以这种方式形成的杂交瘤，以鉴定生成特异性结合特定抗原的抗体的一个或多个杂交瘤。可以使用任何形式的规定抗原作为免疫原，例如其天然存在形式、任何变体或片段，及其抗原性肽。

生成结合蛋白(包括抗体)的一种例示性方法包括筛选蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示记载于例如美国专利No.5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-17；Clackson等(1991)Nature 352：624-28；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222：581-97；和国际申请公开号WO 92/018619；WO 91/017271；WO 92/020791；WO 92/015679；WO 93/001288；WO 92/001047；WO 92/009690；和WO 90/002809。

在使用展示文库之外，可以使用规定抗原来免疫非人动物，例如猕猴、鸡、或啮齿类动物(例如小鼠、仓鼠、或大鼠)。在一个实施方案中，非人动物至少包括人免疫球蛋白基因的一部分。例如，有可能用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体生成缺陷的小鼠品系。使用杂交瘤技术，可生成和选择自具有期望特异性的基因衍生的抗原特异性单克隆结合蛋白(诸如抗体)(参见例如XENOMOUSE^TM(Amgen，Inc.，Thous和Oaks，CA)；Green等(1994)Nat.Genet.7：13 21；美国专利No.7,064,244；和国际申请公开号WO 96/034096和WO 96/033735)。

在本发明的一个实施方案中，结合蛋白是自非人动物获得，然后使用本领域已知的重组DNA技术修饰(例如人源化、去免疫、或嵌合)的单克隆抗体。已经记载了用于生成嵌合抗体的多种办法(参见例如Morrison等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(21)：6851-55；Takeda等(1985)Nature 314(6010)：452-54；美国专利No.4,816,567和4,816,397；欧洲申请公开号EP 0 171 496和EP 0 173 494；和英国专利No.GB 2 177 096)。也可例如使用表达人重和轻链基因但不能表达内源小鼠免疫球蛋白重和轻链基因的转基因小鼠来生成人源化结合蛋白。Winter(美国专利No.5,225,539)描述了一种例示性CDR嫁接法，其可用于制备本文所述人源化结合蛋白。可将特定人结合蛋白的所有CDR用非人CDR的至少一部分替换，或者可仅将一些CDR用非人CDR替换。仅必须替换人源化结合蛋白结合预定抗原所需数目的CDR。

人源化结合蛋白或其片段可通过将不直接牵涉抗原结合的Fv可变域用来自人Fv可变域的等价序列替换来生成。用于生成人源化结合蛋白或其片段的例示方法提供于例如Morrison(1985)Science 229：1202-07；Oi等(1986)BioTechniques 4：214；和美国专利No.5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205；和6,407,213。那些方法包括分离、操作、和表达编码来自重或轻链至少之一的整个或部分免疫球蛋白Fv可变域的核酸序列。此类核酸可得自如上所述生成针对预定靶物的抗体的杂交瘤，以及其它来源。然后可以将编码人源化抗体分子的重组DNA克隆入适宜的表达载体。

在某些实施方案中，通过引入保守替代、共有序列替代、种系替代和/或回复突变来改进人源化结合蛋白。此类改变的免疫球蛋白分子可通过本领域已知的数种技术任一来生成(参见例如Teng等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：7308-73；Kozbor等(1983)Immunol.Today 4：7279；Olsson等(1982)Meth.Enzymol.92：3-16)；国际申请公开号WO 92/006193；和欧洲专利No.EP 0 239 400)。

结合蛋白或其片段还可通过例如国际申请公开号WO 98/052976和WO 00/034317中披露的方法特异性删除人T细胞表位或“去免疫”来修饰。简言之，可以对结合蛋白(诸如例如自抗体衍生的结合蛋白)的重和轻链可变域分析结合II类MHC的肽；这些肽代表潜在的T细胞表位(如例如国际申请公开号WO 98/052976和WO 00/034317中限定的)。为了检测潜在的T细胞表位，可应用称作“肽穿带”(peptide threading)的一种计算机建模办法，而且另外，可对人II类MHC结合肽的数据库搜索V_H和V_L序列中存在的基序，如国际申请公开号WO 98/052976和WO 00/034317中记载的。这些基序结合18种主要II类MHC DR同种异型任一，并如此构成潜在T细胞表位。检测到的潜在的T细胞表位可通过替代可变域中的少数氨基酸残基或通过单一氨基酸替代来消除。典型地，进行保守替代。通常，但非排他地，可使用人种系抗体序列中的某位置共同的氨基酸。人种系序列披露于例如Tomlinson等(1992)J.Mol.Biol.227：776-98；Cook等(1995)Immunol.Today 16(5)：237-42；Chothia等(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；和Tomlinson等(1995)EMBO J.14：4628-38。V BASE目录提供人免疫球蛋白可变区序列的综合目录(由Tomlinson等，MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK编辑)。这些序列可用作人序列的来源，例如框架区和CDR的。也可使用共有人框架区，如例如美国专利No.6,300,064中记载的。

在某些实施方案中，结合蛋白可含有改变的免疫球蛋白恒定或Fc区。例如，依照本文中的教导生成的结合蛋白可更强地或以更高的特异性结合效应器分子，诸如补体和/或Fc受体，其能控制结合蛋白的数项免疫功能，诸如效应细胞活性、溶胞、补体介导的活性、结合蛋白清除、和结合蛋白半衰期。结合结合蛋白(例如IgG抗体)Fc区的典型Fc受体包括但不限于FcγRI、FcγRII、和FcRn亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。Fc受体的综述见例如Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9：457-92；Capel等(1994)Immunomethods 4：25-34；和de Haas等(1995)J.Lab.Clin.Med.126：330-41。关于别的结合蛋白/抗体生产技术，参见例如Antibody：A Laboratory Manual(1988)Harlow等编，Cold Spring Harbor Laboratory。本发明不必限于结合蛋白或抗体的任何具体来源、生成方法、或其它特殊特征。

结合蛋白(包括抗体(免疫球蛋白))通常是四聚体糖基化蛋白质，由两条轻(L)链(每条大约25kDa)和两条重(H)链(每条大约50kDa)构成。在抗体中可找到两种轻链型，称作拉姆达(λ)和卡帕(κ)。根据重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可指派至五大类：A、D、E、G、和M，而且这些中的数个可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、lgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。每条轻链包括一个N端可变(V)域(V_L)和一个恒定(C)域(C_L)。每条重链包括一个N端V域(V_H)、三个或四个C域(C_H)、和一个铰链区。最接近V_H的C_H域称作C_H1。V_H和V_L域由序列相对保守的称作框架区的四个区域(FR1、FR2、FR3、和FR4)和序列高变的称作CDR的三个区域组成，框架区为CDR形成支架。CDR含有负责抗体与抗原的特异性相互作用的大多数残基。CDR称作CDR1、CDR2、和CDR3。重链上的CDR成分称作H1、H2、和H3(在本文中也分别称作CDRH1、CDR H2、和CDR H3)，而轻链上的CDR成分称作L1、L2、和L3(在本文中也分别称作CDR L1、CDR L2、和CDR L3)。

CDR3通常是抗原结合位点内分子多样性的最大来源。例如，CDR H3可短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是本领域公知的。关于抗体结构的综述参见例如Harlow等(1988)见上文。本领域技术人员会认识到每种亚基结构(例如C_H、V_H、C_L、V_L、CDR、和/或FR结构)包含活性片段，例如V_H、V_L、或CDR亚基结合抗原的部分，即抗原结合片段，或例如C_H亚基结合和/或活化例如Fc受体和/或补体的部分。CDR通常指Kabat CDR(如Kabat等(1991)见上文中记载的)。用于表征抗原结合位点的另一项标准是指高变环，如例如Chothia等(1992)见上文和Tomlinson等(1995)见上文中记载的。还有一项标准是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的“AbM”定义(一般参见例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains in：Antibody Engineering(2001)Duebel和Kontermann编，Springer-Verlag，Heidelberg)。关于Kabat CDR描述的实施方案可使用关于Chothia高变环或AbM定义环类似描述的联系来转换实施。

Fab片段由通过恒定区之间的二硫键共价相连接的V_H-C_H1和V_L-C_L域组成。Fv片段较小，而且由非共价相连接的V_H和V_L域组成。为了克服非共价连接的域解离的倾向，可构建scFv。scFv含有连接(1)V_H的C端至V_L的N端，或(2)V_L的C端至V_H的N端的柔性多肽。例如，15聚物(Gly₄Ser)₃肽可用作接头，但是其它接头是本领域已知的。

装配以及体细胞突变后的抗体基因的序列是差异很大的，而且这些差异化的基因估计编码10¹⁰种不同抗体分子(Immunoglobulin Genes(第2版，1995)Jonio等编，Academic Press，San Diego，CA)。

在本发明的某些实施方案中，结合蛋白是单域结合蛋白。单域结合蛋白包括如下的结合蛋白，其中CDR是单域多肽的一部分。例子包括但不限于重链结合蛋白、天然没有轻链的结合蛋白、自常规四链抗体衍生的单域结合蛋白、工程化结合蛋白、和与自抗体衍生的那些不同的单域蛋白支架。单域结合蛋白包括任何本领域已知的，以及任何未来确定的或学会的单域结合蛋白。

单域结合蛋白可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼(llama)、鱼、鲨鱼、山羊、家兔、鸡、和牛。在本发明的一个方面，单域结合蛋白可衍生自在鱼中找到的免疫球蛋白的可变区，诸如例如自在鲨鱼血清中找到的称作新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型衍生的。生成自NAR(IgNAR)可变区衍生的单域结合蛋白的方法加载于例如国际申请公开号WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14：2901-09。单域结合蛋白还包括本领域中已知是没有轻链的重链抗体的天然存在的单域结合蛋白。这种自天然没有轻链的重链抗体衍生的可变域在本文中称作VHH，或纳米抗体，以将它与四链免疫球蛋白的常规V_H区分开。此类VHH分子可衍生自在骆驼科物种中产生的抗体，例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼、和原驼中，而且有时称作camelid或骆驼化可变域(参见例如Muyldermans(2001)J.Biotechnol.74(4)：277-302，通过述及收入本文)。骆驼科物种以外的其它物种也可生成天然没有轻链的重链结合蛋白。VHH分子比IgG分子小约10倍。它们是单一多肽，而且非常稳定，对极端pH和温度条件有抗性。此外，它们对蛋白酶的作用有抗性，常规抗体则不然。此外，体外表达VHH能生成高产量的、正确折叠的功能性VHH。另外，在camelids中生成的结合蛋白会识别经抗体文库或经免疫camelids以外的哺乳动物在体外生成的抗体识别的表位以外的表位(参见例如国际申请公开号WO 97/049805和WO 94/004678，通过述及收入本文)。

“双特异性”或“双功能”结合蛋白指具有两对不同重/轻链和两个不同结合位点的人造杂合结合蛋白。双特异性结合蛋白可通过多种方法来生成，包括融合杂交瘤或连接Fab’片段(参见例如Songsivilai和Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-21；Kostelny等(1992)J.Immunol.148：1547-53)。在一个实施方案中，双特异性结合蛋白包含经免疫球蛋白恒定区相连接的第一结合域多肽(诸如Fab’片段)和第二结合域多肽。

另一种依据本发明的结合蛋白可包括例如结合域-免疫球蛋白融合蛋白，其中结合域多肽融合或以其它方式连接至免疫球蛋白铰链或铰链作用区多肽，其继而融合或以其它方式连接至包含一个或多个来自免疫球蛋白重链、C_H1以外的天然或工程化恒定区(例如IgG和IgA1的C_H2和C_H3区或IgE的C_H3和C_H4区)的区域(更完整的描述参见例如美国申请公开文本No.2005/0136049，通过述及收入本文)。结合域-免疫球蛋白融合蛋白可进一步包括如下的区域，其中天然或工程化免疫球蛋白重链C_H2恒定区多肽(或C_H3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)融合或以其它方式连接至铰链区多肽和天然或工程化免疫球蛋白重链C_H3恒定区多肽(或C_H4，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)，其融合或以其它方式连接至C_H2恒定区多肽(或C_H3，在构建物完全或部分衍生自IgE的情况中)。通常，此类结合域-免疫球蛋白融合蛋白能够进行至少一项选自下组的免疫学活性：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体结合、和/或结合靶物(例如靶抗原，诸如人IL-21R)。

本发明的结合蛋白还可包括肽模拟物。肽模拟物指含肽分子，其模拟蛋白质二级结构元件(参见例如Johnson等，Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy(1993)Pezzuto等编，Chapman and Hall，New York，通过述及完整收入本文)。肽模拟物使用背后的潜在原理是蛋白质的肽主链的存在主要是为了使氨基酸侧链以如下的方式取向，即推动分子相互作用，诸如抗体与抗原之间的分子相互作用。肽模拟物预期容许与天然分子相似的分子相互作用。这些原理可用于改造具有本文中公开的靶向肽的许多天然特性但具有改变的和可能改良的特征的第二代分子。

对于实践本发明有用的结合蛋白的其它实施方案包括融合蛋白。在这些分子中，一般靶向肽(例如IL-21R或抗IL-21R抗体)的整个或实质部分在N或C端连接至第二多肽或蛋白质的整个或部分。例如，融合蛋白可采用来自其它物种的前导(或信号)序列以容许蛋白质在异源宿主中的重组表达。例如，包含前导(或信号)序列的本发明结合蛋白及其抗原结合片段的氨基酸序列或编码氨基酸序列的核酸序列可选自SEQ ID NO：87-109和239-248。另一种有用的融合包括添加免疫学活性域，诸如结合蛋白表位，以便于融合蛋白的纯化。在融合接合处或附近包括切割位点会便于在纯化后除去外来的多肽。其它有用的融合包括连接功能域诸如来自酶的活性位点、糖基化域、细胞靶向信号、或跨膜区。可掺入融合蛋白的蛋白质或肽的例子包括但不限于抑制细胞性蛋白质、杀细胞性蛋白质、促凋亡剂、抗血管发生剂、激素、细胞因子、生长因子、肽药物、抗体、Fab抗体片段、抗原、受体蛋白、酶、凝集素、MHC蛋白、细胞粘附蛋白、和结合蛋白。生成融合蛋白的方法是本领域技术人员公知的。此类蛋白质可例如通过使用双功能交联试剂的化学附着、通过完整融合蛋白的从头合成、或通过将编码靶向肽的DNA序列附着至编码第二肽或蛋白质的DNA序列，接着表达完整融合蛋白来生成。

在一个实施方案中，将靶向肽(例如IL-21R)与免疫球蛋白重链恒定区(诸如含有两个恒定区结构域和铰链区但缺少可变区的Fc片段)融合(参见例如美国专利No.6,018,026和5,750,375，通过述及收入本文)。Fc区可以是天然存在Fc区，或者可以改变以改进某些性质，例如治疗性质、循环时间、降低的聚集。融合至Fc区的肽和蛋白质通常展现比未融合的对应物长的体内半衰期。另外，与Fc区的融合容许融合多肽二聚化/多聚化。

本发明的一个方面包含结合IL-21R的结合蛋白及其抗原结合片段。本公开提供自人免疫球蛋白基因文库衍生的新CDR。一般用于携带CDR的蛋白质结构是抗体重或轻链或其部分，其中CDR位于与天然存在CDR有关的区域。可变域的结构和位置可以如Kabat等((1991)见上文)中所述来确定。

本发明的结合蛋白(及其抗原结合片段)的例示性实施方案鉴定为AbA-AbU、H3-H6、L1-L6、L8-L21、和L23-L25。本发明抗IL-21R结合蛋白的非限制性例示性实施方案的DNA和氨基酸序列列于SEQ ID NO：5-195，213-229，和239-248。本发明抗IL-21R结合蛋白的一些例示性实施方案的DNA和氨基酸序列，包括它们的scFv片段、V_H和V_L域、和CDR，以及它们现在的代码和先前的名称列于图17-25及表2A和2B。

表2A：现在的抗体代码与先前的名称的关系

现在的代码	先前的名称
		AbA	VHP/VL2
AbB	VHP/VL3
		AbC	VHP/VL11
AbD	VHP/VL13
		AbE	VHP/VL14
AbF	VHP/VL17
		AbG	VHP/VL18

AbH	VHP/VL19
		AbI	VHP/VL24
AbJ	VH3/VLP
		AbK	VH3/VL3
AbL	VH3/VL13
		AbM	VH6/VL13
AbN	VH6/VL24
		AbO	VHP/VL16；VHPTM/VL16
AbP	VHP/VL20；VHPTM/VL20
		AbQ	VH3/VL2；VH3DM/VL2
AbR	VH3/VL18；VH3DM/VL18
		AbS	VHP/VL6；VHPTM/VL6；VL6
AbT	VHP/VL9；VHPTM/VL9；VL9
		AbU	VHP/VL25；VHPTM/VL25
AbV	VH3TM/VL2
		AbW	VH3TM/VL18
AbX	VHPDM/VL9
		AbY	VHPg4/VL9
AbZ	VHPWT/VL9

表2B：本发明例示性结合蛋白的V_H和V_L域、scFv、和CDR的氨基酸和核苷酸序列

表2B(续)

表2B(续)

CDR L3

AA

NO：177

NO：178

NO：179

NO：180

NO：181

V_H

DNA

NO：5

V_L

DNA

NO：33

NO：35

NO：37

NO：39

NO：41

scFv

DNA

NO：129

NO：131

NO：133

NO：135

NO：137

表2B(续)

表2B(续)

表2B(续)

CDR H1	AA	NO：163	NO：163
				CDR H2	AA	NO：164	NO：164
CDR H3	AA	NO：169	NO：169
				CDR L1	AA	NO：194	NO：194
CDR L2	AA	NO：195	NO：195
				CDR L3	AA	NO：192	NO：193
V_H	DNA	NO：5	NO：5
				V_L	DNA	NO：63	NO：65
scFv	DNA	NO：159	NO：161

本发明的抗IL-21R结合蛋白可包含抗体恒定区或其部分。例如，V_L域可在其C端附着至轻链恒定域，像Cκ或Cλ。类似地，V_H域或其部分可附着至重链的整个或部分，像IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，和任何同种型亚类。恒定区是本领域已知的(参见例如Kabat等(1991)见上文)。因此，本发明范围内的结合蛋白包括与本领域已知的恒定区组合的V_H和V_L域或其部分。

某些实施方案包含来自AbA-AbZ、H3-H6、L1-L6、L8-L21、和/或L23-L25的Fv片段的V_H域、V_L域、或其组合。其它实施方案包含来自V_H和V_L域的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。其CDR序列与SEQ ID NO：5-195，213-229，和239-248所列序列内存在的一种或多种CDR序列相同或相似(即非实质性地不同)的结合蛋白涵盖在本发明的范围内。

在某些实施方案中，V_H和/或V_L域可以种系化(germlined)，即使用常规分子生物学技术突变这些域的FR以匹配由种系细胞生成的那些。在其它实施方案中，FR序列保持与共有种系序列不同。

在一个实施方案中，使用诱变来生成与一种或多种种系序列更加相似的结合蛋白。在经由体细胞诱变或经由易错PCR将突变引入结合蛋白(例如抗体)的FR时可能想要这样。V_H和V_L域的种系序列可通过针对VBASE数据库(MRC Center for Protein Engineering，UK)实施氨基酸和核酸序列比对来鉴定。VBASE是自超过1000种已发表序列(包括最新版的GENBANK

和EMBL数据文库中的那些)编辑的所有人种系可变区序列综合目录。在一些实施方案中，将scFv的FR突变成与VBASE数据库中最接近的匹配一致，而CDR部分保持不变。

在某些实施方案中，本发明的结合蛋白特异性地与由AbA-AbZ、H3-H6、L1-L6、L8-L21、或L23-L25所识别的表位相同的表位起反应，使得它们竞争性抑制AbA-AbZ、H3-H6、L1-L6、L8-L21、或L23-L25对人IL-21R的结合。此类结合蛋白可以在竞争性结合测定法中来确定。在一个实施方案中，这些结合蛋白对人IL-21R的结合常数(K_A)是至少10⁵M^-1s^-1。结合亲和力可使用本领域已知的技术来测定，诸如ELISA、生物传感器技术(诸如生物特异性相互作用分析)或其它技术，包括本申请中描述的那些。

本发明的结合蛋白可结合其它蛋白质，诸如例如包含整个或部分IL-21R的重组蛋白。

本领域普通技术人员会认识到所公开的结合蛋白可用于检测、测量、和/或抑制与IL-21R有点不同的蛋白质。例如，这些蛋白质可以是IL-21R的同系物。抗IL-21R结合蛋白预期结合包含与SEQ ID NO：2或4所列序列中至少100，80，60，40，或20个连续氨基酸的任何序列至少约60％，70％，80％，90％，95％，或更多相同的序列的蛋白质。

在序列同源性分析之外，可进行表位作图(参见例如Epitope Mapping Protocols(1996)Morris编，Humana Press)及二级和三级结构分析来鉴定当前公开的结合蛋白及其与抗原的复合物采取的特定3D结构。此类方法包括但不限于x射线晶体学(Engstom(1974)Biochem.Exp.Biol.11：7-13)和当前结合蛋白的实际表象的计算机建模(Fletterick等(1986)Computer Graphics and Molecular Modeling，于Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。

本公开提供一种用于获得抗IL-21R结合蛋白的方法。该方法包括创建具有自本文中公开的V_H和/或V_L序列改变得到的V_H和/或V_L序列的结合蛋白。此类结合蛋白可以由技术人员使用本领域已知技术来衍生。例如，可以在FR和/或CDR区中引入氨基酸替代、删除、或添加。FR改变通常设计成改进结合蛋白的稳定性和免疫原性，而CDR改变通常设计成提高结合蛋白对其抗原的亲和力。提高亲和力的改变可通过改变一个或多个CDR序列并测量结合蛋白对其靶物的亲和力来测试(参见例如Antibody Engineering(第2版，1995)Borrebaeck编，Oxford University Press)。

其CDR序列非实质性不同于序列SEQ ID NO：5-195，213-229，和239-248所列或所含CDR序列的结合蛋白涵盖在本发明的范围内。典型地，此类非实质性差异涉及氨基酸用具有相似电荷、疏水性、或立体化学特征的氨基酸替代。与CDR区不同，FR区中还可进行更激烈的替代，只要它们对结合蛋白的结合特性没有不利影响(例如亲和力与未替代的结合蛋白相比降低超过50％)。还可以进行替代以使结合蛋白种系化或使其抗原结合位点稳定。

保守修饰会生成具有与进行此类修饰的分子的功能和化学特征相似的功能和化学特征的分子。相反，分子的功能和/或特征的实质修饰可通过选择在对维持下述各项的影响方面显著不同的氨基酸序列替代来实现：(1)替代区域的分子主链的结构，例如片层或螺旋构象；(2)分子在靶位点处的电荷或疏水性；和/或(3)分子的大小。

例如，“保守氨基酸替代”可涉及天然氨基酸残基用标准残基替代，使得对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷影响很小或没有影响(参见例如MacLennan等(1998)Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67；Sasaki等(1998)Adv.Biophys.35：1-24)。

期望的氨基酸替代(保守的或非保守的)可以在想要进行此类替代时由本领域技术人员来确定。例如，氨基酸替代可用于鉴定分子序列的重要残基，或用于提高或降低本文所述分子的亲和力。例示性氨基酸替代包括但不限于表3所列的那些。

表3：例示性氨基酸替代

初始残基	例示替代	更保守的替代
			Ala(A)	Val，Leu，Ile	Val
Arg(R)	Lys，Gln，Asn	Lys
			Asn(N)	Gln	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser，Ala	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Gly(G)	Pro，Ala	Ala
His(H)	Asn，Gln，Lys，Arg	Arg
			Ile(I)	Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸	Leu
Leu(L)	正亮氨酸，Ile，Val，Met，Ala，Phe	Ile
			Lys(K)	Arg，1，4-二氨基丁酸，Gln，Asn	Arg
Met(M)	Leu，Phe，Ile	Leu
			Phe(F)	Leu，Val，Ile，Ala，Tyr	Leu
Pro(P)	Ala，Gly	Gly
			Ser(S)	Thr，Ala，Cys	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr，Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp，Phe，Thr，Ser	Phe
			Val(V)	Ile，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸	Leu

在某些实施方案中，保守氨基酸替代还涵盖非天然存在氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过生物学系统中的合成来掺入。

在一个实施方案中，用于生成变异V_H域的方法包括添加、删除、或替代公开的V_H域中的至少一个氨基酸，或组合公开的V_H域与至少一种V_L域，并对变异V_H域测试IL-21R结合或IL-21R/IL-21活性调控。

一种用于生成变异V_L域的类似方法包括在公开的V_L域中添加、删除、或替代至少一个氨基酸，或组合公开的V_L域与至少一种V_H域，并对变异V_L域测试IL-21R结合或IL-21R活性调控。

在一些备选实施方案中，可通过化学交联或重组方法将抗IL-21R结合蛋白连接至某蛋白质(例如清蛋白)。还可以以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337中所列方式将公开的结合蛋白连接至多种非蛋白质的聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯)。可以通过共价偶联至聚合物(例如为了延长它们在血液循环中的半衰期)来化学修饰结合蛋白。例示性的聚合物和附着方法显示于美国专利No.4,766,106；4,179,337；4,495,285；和4,609,546。

可以修饰公开的结合蛋白以改变它们的糖基化；就是说，至少一个碳水化合物模块(moiety)可以删除或添加至结合蛋白。糖基化位点的删除或添加可通过改变氨基酸序列以删除或创建本领域公知的糖基化共有位点来实现。另一种添加碳水化合物模块的手段是化学或酶促偶联糖苷至结合蛋白(例如抗体)的氨基酸残基(参见例如国际申请公开号WO 87/05330和Aplin等(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.22：259-306)。碳水化合物模块的消除也可化学地或酶促地来实现(参见例如Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem.Biophys.259：52；Edge等(1981)Anal.Biochem.118：131；及Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.138：350)。对碳水化合物结构的修饰可能是优选的，因为Fc域中的氨基酸变化可增强药物组合物的免疫原性(参见例如国际申请公开号WO 2008/052030)。对于免疫球蛋白分子，已经证明N连接碳水化合物附着至C_H2域的Asn 297对于ADCC活性是至关重要的。其酶促的或经由N连接共有位点突变的消除导致ADCC活性很小乃至没有。在糖蛋白中，碳水化合物可附着至三肽基序Asn-X-Thr/Ser中天冬酰胺的侧链中的酰胺氮原子。这种类型的糖基化(称作N连接糖基化)在内质网(ER)中以将多个单糖添加至多萜醇磷酸酯以形成14个残基的分支碳水化合物复合物开始。然后此碳水化合物复合物被寡糖基转移酶(OST)复合体转移至蛋白质。在糖蛋白离开ER内腔之前，自14个残基的寡糖消除三个葡萄糖分子。酶ER葡萄糖苷酶I、ER葡萄糖苷酶II和ER甘露糖苷酶涉及ER加工。随后，多肽被转运至高尔基复合体，在那里N连接糖链以多种不同方式进行修饰。在高尔基复合体的顺式和中间室中，最初的14个糖的N连接复合物可以经由消除甘露糖(Man)残基进行修剪及经由添加N-乙酰基葡糖胺(GlcNac)和/或果糖(Fuc)残基进行延长。各种形式的N连接碳水化合物一般具有共同的五糖核心，其由三个甘露糖和两个N-乙酰基葡糖胺残基组成。最后，在反式高尔基中，可添加其它GlcNac残基，接着是半乳糖(Gal)和终末唾液酸(Sial)。高尔基复合体中的碳水化合物加工称作“终末糖基化”以将其与ER中发生的“核心糖基化“区分开。最终的复合碳水化合物单元可采取多种形式和结构，其中一些具有两个、三个或四个分支(称作二分支的、三分支的或四分支的)。多种酶涉及高尔基加工，包括高尔基甘露糖苷酶IA、IB和IC，GlcNAc转移酶I、高尔基甘露糖苷酶II、GlcNAc转移酶II、半乳糖转移酶和唾液酸转移酶。

用于改变结合蛋白的恒定区(诸如例如抗体的恒定区)的方法是本领域已知的。功能改变(例如对效应器配体诸如细胞上的FcR或补体的C1成分的亲和力改变)的结合蛋白可通过将恒定部分中的至少一个氨基酸残基用不同残基替换来生成(参见例如欧洲申请公开号EP 0 388 151及美国专利No.5,624,821和5,648,260)。可以描述如果应用于鼠或其它物种的结合蛋白，会降低或消除相似功能的相似类型改变。

例如，有可能改变结合蛋白(例如IgG，诸如人IgG)的Fc区对FcR(例如Fc伽马R1)或C1q的亲和力。亲和力可以通过将至少一个规定残基用至少一种在其侧链上具有适宜官能度的残基替换或通过引入带电荷的官能团(诸如谷氨酸或天冬氨酸)或可能芳香族非极性残基(诸如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)来改变(参见例如美国专利No.5,624,821)。

例如，将IgG恒定区中的残基297(天冬酰胺)用丙氨酸替换显著抑制效应细胞的募集，同时只略微降低(弱约3倍)对CIq的亲和力(参见例如美国专利No.5,624,821)。重链中残基的编号方式是EU索引的编号方式(参见Kabat等(1991)见上文)。这种改变破坏糖基化位点，而且认为碳水化合物的存在是Fc受体结合所需要的。认为此位点处破坏糖基化位点的任何其它替代引起相似的溶胞活性降低。已知其它氨基酸替代，例如残基318(Glu)、320(Lys)和322(Lys)任一变成Ala，也消除C1q结合IgG抗体Fc区(参见例如美国专利No.5,624,821)。

可生成与Fc受体的相互作用降低的经修饰结合蛋白。例如，显示了在结合人Fc伽马R1受体的人IgG3中，将Leu 235变成Glu破坏其与受体的相互作用。结合蛋白铰链区中毗邻或附近位点的突变(例如将残基234、235和237用Ala替换)也可用于改变结合蛋白对Fc伽马R1受体的亲和力。重链中残基的编号方式基于EU索引(参见Kabat等(1991)见上文)。如此，在本发明的一些实施方案中，本发明的结合蛋白的Fc区含有至少一处恒定区突变，诸如例如第234位Leu变成Ala(L234A)、第235位Leu变成Ala(L235A)、和/或第237位Gly变成Ala(G237A)。在一个实施方案中，结合蛋白的Fc区含有两处恒定区突变，即L234A和G237A(即“双重突变体”或“DM”)。在另一个实施方案中，结合蛋白的Fc区含有三处恒定区突变，即L234A、L235A、和G237A(即“三重突变体”或“TM”)。例如，一种人IgG恒定区三重突变体列于SEQ ID NO：196。

别的用于改变结合蛋白的溶胞活性的方法，例如通过改变C_H2域N端区域中的至少一个氨基酸，记载于国际申请公开号WO 94/029351及美国专利No.5,624,821。

本发明的结合蛋白可以用可检测或功能性标记物来标记。这些标记物包括放射性标记物(例如¹³¹I和⁹⁹Tc)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、和其它活性模块(例如生物素)。

本发明的特征还有一种结合IL-21R(特别是人IL-21R)的分离的结合蛋白或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗IL-21R结合蛋白可具有至少一项下述特征：(1)它是单克隆或单特异性结合蛋白；(2)它是人结合蛋白；(3)它是体外生成的结合蛋白；(4)它是体内生成的结合蛋白(例如转基因小鼠系统)；(5)它抑制IL-21结合IL-21R；(6)它是IgG1；(7)它以至少约10⁵M^-1s^-1的结合常数结合人IL-21R；(8)它以至少约5x10⁴M^-1s^-1的结合常数结合鼠IL-21R；(9)它以约10^-3(1/s)或更小的解离常数结合人IL-21R；(10)它以约10^-2(1/s)或更小的解离常数结合鼠IL-21R；(11)它以约1.75nM或更小的IC₅₀抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性BaF3细胞增殖；(12)它以约0.5nM或更小的IC₅₀抑制鼠IL-21R介导的鼠IL-21R表达性BaF3细胞增殖；(13)它以约14.0nM或更小的IC₅₀抑制人IL-21R介导的人IL-21R表达性TF1细胞增殖；(14)它以约1.9nM或更小的的IC₅₀抑制IL-21介导的人原代B细胞增殖；(15)它以约1.5nM或更小的的IC₅₀抑制IL-21介导的人原代CD4⁺T细胞增殖；(16)它以约5.0nM或更小的IC₅₀抑制IL-21介导的鼠原代CD4⁺T细胞增殖；(17)它在例如i.v.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约0.1-7.5ml/hr/kg的均值总身体清除；(18)它在例如i.v.、s.c.、或i.p.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约20-700小时的均值消除半衰期；(19)它在动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)中具有约40-1500ml/kg的均值稳态分布体积；(20)它在例如s.c.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约35-100％的生物利用度；(21)它在例如i.v.、s.c.、或i.p.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约200-10,000μg*hr/ml(每1mg/kg剂量)的均值剂量标准化AUC；(22)它在例如i.v.、s.c.、或i.p.施用于动物(例如哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物)后具有约0.5-30μg/ml的均值剂量标准化C_max(最大血清浓度)；和(23)它调控IL-21响应性细胞因子或IL-21响应性基因的表达

本领域技术人员会领会，上文所述修饰不是穷举的，而且许多其它修饰根据本公开的教导对于技术人员会是显而易见的。

核酸、克隆和表达系统

本公开提供编码公开的结合蛋白的分离的核酸。核酸可包括DNA或RNA，而且它们可以是合成的(完全地或部分地)或重组的(完全地或部分地)。提到本文中所列核苷酸序列涵盖具有规定序列的DNA分子，而且涵盖具有规定序列的RNA分子，其中U替代T。

还涵盖包含如本文中公开的一种、两种、或三种CDR，V_H域，V_L域，或其组合的编码序列，或与其基本上相同的序列(例如与其至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高相同的序列，或能够在严格条件下与这些序列杂交的序列)的核酸。

在一个实施方案中，分离的核酸具有编码抗IL-21R结合蛋白重链和轻链可变区的核苷酸序列，该可变区包含至少一个选自氨基酸序列SEQ ID NO：163-195的CDR，或编码CDR的序列，该CDR因一个或两个或三个或四个氨基酸而与本文所述序列不同。

核酸可以只编码轻链或重链可变区，或者可以编码结合蛋白轻或重链恒定区，其任选连接至相应的可变区。在一个实施方案中，轻链可变区连接至选自卡帕或拉姆达恒定区的恒定区。轻链恒定区也可以是人卡帕或拉姆达型。在另一个实施方案中，重链可变区连接至选自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD、和IgE的结合蛋白同种型的重链恒定区。重链恒定区可以是IgG(例如IgG1)同种型。

虽然除经修饰限制性位点等等外常常是天然序列(cDNA或基因组DNA或其混合物的)，但是本发明的核酸组合物可以依照标准技术进行突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可根据需要来改变氨基酸序列。具体而言，涵盖与天然V、D、J、恒定、转换和本文所述其它此类序列基本上相同或自其衍生的核苷酸序列(其中“衍生”指示某序列与另一序列相同或是自其修饰得到的)。

在一个实施方案中，核酸不同(例如因替代、插入、或删除而不同)于所提供序列的合适(例如因至少一个但少于10，20，30，或40个核苷酸；至少一个但少于受试核酸中核苷酸的1％，5％，10％或20％)。如果对于此分析是必需的，那么应当为最大同源性来比对序列。为删除或插入或者错配而以“环”弄出的序列被认为是差异。差异可以是编码非关键残基的核苷酸，或者差异可以是保守替代。

本公开还提供质粒、载体、和转录或表达盒形式的核酸构建物，其包含至少一种本文所述核酸。

本公开进一步提供宿主细胞，其包含至少一种本文所述核酸构建物。

还提供自包含本文所述序列的核酸制备所编码蛋白质的方法。该方法包括在适宜条件下培养宿主细胞使得它们自核酸表达蛋白质。表达和生成后，可以使用任何合适技术分离和/或纯化V_H或V_L域、或特定结合成员，然后适当使用。该方法还可包括如下步骤，即将编码scFv的核酸与编码结合蛋白Fc部分的核酸融合，并在细胞中表达融合的核酸。该方法还可包括种系化的步骤。

抗原结合片段、V_H和/或V_L域、及编码核酸分子和载体可以是自它们的天然环境分离和/或纯化的，处于基本上纯的或均质的形式，或在核酸的情况中，不含或基本上不含除编码具有所需功能之多肽的序列以外的来源的核酸或基因。

用于在多种宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域已知的。适合于生成结合蛋白的细胞记载于例如Fernandez等(1999)Gene Expression Systems，Academic Press。简言之，合适的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞、或原核细胞，例如大肠杆菌。本领域可用于异源多肽表达的哺乳动物细胞包括淋巴细胞细胞系(例如NSO)、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、卵母细胞、和来自转基因动物的细胞，例如乳房上皮细胞。在其它实施方案中，编码本发明结合蛋白的核酸被置于组织特异性启动子(例如乳房特异性启动子)的控制下，而且在转基因动物中生成结合蛋白。例如，将结合蛋白分泌入转基因动物(诸如转基因母牛、猪、马、绵羊、山羊、或啮齿类动物)的乳汁。

可以选择或构建合适的载体以含有适宜的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多聚腺苷酸化信号、增强子序列、标志基因、和其它序列。载体还可含有质粒或病毒骨架。关于详情参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press。许多与载体一起使用的已建立技术(包括DNA的操作、制备、诱变、测序、和转染)记载于例如Current Protocols in Molecular Biology(第2版，1992)Ausubel等编，John Wiley & Sons。

本公开的又一个方面提供将核酸导入宿主细胞的方法。对于真核细胞，合适的转染技术可包括磷酸钙、DEAE右旋糖苷、电穿孔、脂质体介导的转染、和使用逆转录病毒或其它病毒(例如牛痘或杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔、和使用噬菌体的转染。DNA导入之后可以是选择方法(例如药物抗性)以选择含有核酸的细胞。

抗IL-21R结合蛋白的用途

起IL-21R拮抗剂作用的抗IL-21R结合蛋白(例如本发明的结合蛋白或其抗原结合片段)可用于降低至少一种由IL-21R介导的免疫应答，诸如细胞增殖、细胞因子表达或分泌、趋化因子分泌、及T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、或滑膜细胞的溶胞活性中的一项或多项。因而，本发明的结合蛋白可用于抑制免疫或造血细胞(例如髓、淋巴、或红细胞谱系的细胞或其前体细胞)的活性(例如增殖、分化、和/或存活)，并因此可用于治疗多种免疫性病症和血液高增殖性病症。IL-21R相关病症/能治疗的免疫性病症的例子包括但不限于移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、变态反应(例如特应性变态反应)、和自身免疫性疾病。自身免疫性疾病包括但不限于糖尿病、关节炎病症(包括类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、和强直性脊柱炎)、脊椎关节病、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、皮肤红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、银屑病、斯耶格伦

氏综合症、IBD(包括克罗恩(Crohn)氏病和溃疡性结肠炎)、哮喘(包括内源性哮喘和变应性哮喘)、硬皮病和血管炎。本发明的结合蛋白或其抗原结合片段可以在在受试者中(例如在人中)治疗或预防IL-21R相关病症/免疫性病症的方法中使用。

多发性硬化是一种中枢神经系统疾病，其特征在于炎症和髓鞘(隔离神经且为适当神经功能所需要的脂肪材料)的丢失。源自IL-21/IL-21R依赖性免疫应答的炎症可以用本发明的结合蛋白和组合物来治疗。在多发性硬化的实验性自身免疫性脑炎(EAE)小鼠模型(参见例如Tuohy等(1988)J.Immunol.141：1126-30；Sobel等(1984)J.Immunol.132：2393-401；及Traugott(1989)Cell Immunol.119：114-29)中，在EAE诱导之前(及之后持续地)用IL-21R抗体注射处理小鼠显著延迟疾病的发作。本发明的结合蛋白或其抗原结合片段可以在在受试者中(例如在人中)治疗或预防多发性硬化的方法中使用。

关节炎是以关节中的炎症为特征的一种疾病。类风湿性关节炎(RA)是最常见的关节炎形式，涉及结缔组织和滑膜(关节衬里的膜)的炎症。发炎的滑膜常常渗透关节并破坏关节软骨和骨。研究显示用IL-21处理滑膜细胞和巨噬细胞诱导这些细胞分泌与炎症有关的细胞因子和趋化因子。在类风湿性关节炎的胶原诱发关节炎(CIA)小鼠模型(参见例如Courtenay等(1980)Nature 283：666-28；及Williams等(1995)Immunol.84：433-39)中，CIA诱导后(及持续地)用IL-21处理小鼠使疾病加剧。升高的炎性细胞因子和趋化因子分泌和更重要的升高的源自IL-21依赖性免疫应答的疾病水平可以用本发明的结合蛋白来治疗。类似地，本发明的结合蛋白或其抗原结合片段可以在在受试者中(例如在人中)治疗或预防RA或其它关节炎疾病的方法中使用。

移植排斥指如下的免疫学现象，其中来自供体的组织受到宿主免疫细胞的特异性“攻击”。主要的“攻击”细胞是T细胞，其T细胞受体将供体的MHC分子识别为“外来的”。这种识别活化T细胞，其增殖并分泌多种细胞因子和溶胞性蛋白质，它们最终消灭移植物。混合淋巴细胞反应(MLR)(移植排斥的一种体外测定法)中的T细胞在补充有IL-21时更加强烈地增殖。MLR和移植模型记载于Current Protocols in Immunology(第2版，1994)Coligan等编，John Wiley & Sons(还可参见Kasaian等(2002)见上文；Fulmer等(1963)Am.J.Anat.113：273-85；及Lenschow等(1992)Science 257：789-92)。本发明的结合蛋白或其抗原结合片段可以在在受试者中(例如在人中)降低或预防MLR和/或治疗或预防移植排斥及依赖于IL-21的相关疾病(例如GVHD)的方法中使用。

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，其特征在于存在自身抗体，包括针对DNA、核抗原、和核糖核蛋白的抗体。这些自身抗体与组织和器官损伤有关。SLE的起因未知，但是自身抗体的出现提示对自身反应性细胞或B细胞的不当抑制。本发明的结合蛋白或其抗原结合片段可以在在受试者中例如在人中或在MRL-Fas^lpr小鼠(SLE的一种小鼠模型)(Immunologic Defects in Laboratory Animals(1981)Gershwin等编，Plenum Press)中抑制IL-21介导的自身反应性T细胞和B细胞活性和/或治疗或预防SLE或相关疾病的方法中使用。

本发明的结合蛋白或其抗原结合片段还可用于在受试者中(例如在人中)治疗或预防与IL-21响应性细胞和IL-21R响应性细胞的异常活性有关的血液高增殖性病症。此类细胞的例子包括造血起源的赘生性细胞，例如源自髓、淋巴或红细胞谱系或其前体细胞的细胞。此类赘生性病症/肿瘤性病症的例子包括白血病癌症及血液、骨髓(例如骨髓瘤)、和淋巴组织(例如淋巴瘤)的肿瘤。在某些实施方案中，本发明致力于各种白血病癌症的治疗，包括但不限于急性前髓细胞性白血病(APML)、急性髓细胞性白血病(AML)和慢性髓细胞性白血病(CML)(综述见Vaickus(1991)Crit.Rev.Oncol./Hemotol.11：267-97)。可通过本发明方法治疗的淋巴恶性肿瘤的例子包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL，包括B谱系ALL和T谱系ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HCL)、和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症(WM)。可通过本发明治疗的别的恶性淋巴瘤形式包括但不限于非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、成年T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)、何杰金氏淋巴瘤、及其变体。

在另一个方面，本发明的特征是一种在受试者中降低、抑制或减弱急性期应答的方法。急性期应答指对炎症的应答，包括调控急性期蛋白质(例如C-反应性蛋白质和血清清蛋白)的水平。该方法包括以足以降低、抑制或减弱受试者中急性期应答的量对受试者施用本文所述抗IL-21R结合蛋白或其抗原结合片段。在一个实施方案中，受试者是罹患本文所述IL-21R相关病症(包括例如呼吸病症、炎性病症和自身免疫性病症)的哺乳动物，例如人。

组合疗法

在一个实施方案中，在组合疗法中施用包含至少一种抗IL-21R结合蛋白或其抗原结合片段和至少一种治疗剂的药物组合物。该疗法对于治疗病理状况或病症，诸如免疫性和炎性病症是有用的。术语“组合”在此上下文中意味着结合蛋白组合物和治疗剂是基本上同时给予的，或是同时的或是序贯的。如果序贯给予，那么在开始施用第二化合物时，在处理部位仍能检测到有效浓度的两种化合物中的第一化合物。

例如，组合疗法可包括与至少一种别的治疗剂共配制和/或共施用的至少一种抗IL-21R结合蛋白，诸如例如抗IL-21R抗体。别的药剂可包括至少一种细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂、和/或细胞抑制剂，如下文更详细描述的。此类组合疗法可有利地利用较低剂量的所施用治疗剂，如此避免可能的与各种单一疗法有关的毒性或并发症。此外，本文中公开的治疗剂作用于与IL-21/IL-21R途径不同的途径，并因此预期增强和/或协同抗IL-21R结合蛋白的效果。

与抗IL-21R结合蛋白组合使用的治疗剂可以是那些干扰自身免疫和后续炎症应答的不同阶段的药剂。在一个实施方案中，可以将本文中描述的至少一种抗IL-21R结合蛋白与至少一种细胞因子和/或生长因子拮抗剂一起共配制和/或共施用。拮抗剂可包括可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物，(结合细胞因子或生长因子、或它们的受体或其它细胞表面分子的)抗体，和“抗炎性细胞因子”及其激动剂。

可以与本文中描述的抗IL-21R结合蛋白组合使用的药剂的例子包括但不限于至少一种白介素(例如IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-18，和IL-22)、细胞因子(例如TNFα，LT，EMAP-II，和GM-CSF)、或生长因子(例如FGF和PDGF)的拮抗剂。药剂还可包括但不限于白介素、细胞因子、或生长因子的至少一种受体的拮抗剂。抗IL-21R结合蛋白还可以与细胞表面分子(诸如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD90)、或它们的配体(例如CD154(gp39，CD40L))、或LFA-1/ICAM-1或VLA-4/VCAM-1(参见Yusuf-Makagiansar等(2002)Med.Res.Rev.22(2)：14667))的抑制剂(例如抗体)组合。可以与本文中所描述的抗IL-21R结合蛋白组合使用的拮抗剂可包括IL-1，IL-12，TNF-α，IL-15，IL-17，IL-18，IL-22，及它们的受体的拮抗剂。

IL-12拮抗剂的例子包括结合IL-12的抗体(参见例如国际申请公开号WO 00/056772)；IL-12受体抑制剂(例如IL-12受体的抗体)、和可溶性IL-12受体及其片段。IL-15拮抗剂的例子包括针对IL-15或其受体的抗体、IL-15受体的可溶性片段、和IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的例子包括针对IL-18的抗体、IL-18受体的可溶性片段、和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallet等(2001)Circ.Res.28)。IL-1拮抗剂的例子包括白介素-1转化酶(ICE)抑制剂(诸如Vx740)、IL-1拮抗剂(例如IL-1RA(anakinra，Amgen))、sIL-1RII(Immunex)、和抗IL-1受体抗体。

FNF拮抗剂的例子包括针对TNF(例如人TNFα)的抗体，诸如D2E7(人抗TNFα抗体；美国专利No.6,258,562，HUMIRA^TM，BASF，Parsippany，NJ)，CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化的抗TNF-α抗体，Celltech/Pharmacia)，cA2(嵌合的抗TNF-α抗体，REMICADE^TM，Centocor)，和抗TNF抗体片段(例如CPD870)。其它例子包括可溶性TNF受体(例如人p55或p75)片段及其衍生物，诸如p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LENERCEPT^TM)和75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM；Immunex；参见例如Arthritis Rheumatism(1994)37：S295及J.Invest.Med.(1996)44：235A)。别的例子包括酶拮抗剂(例如TNFα转化酶抑制剂(TACE)诸如α-磺酰基羟氨基酸衍生物(WO 01/055112)或N-羟基甲酰胺抑制剂(GW 3333，-005，或-022))和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见例如Arthritis Rheumatism(1996)39(9)：S284及Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.(1995)268：37-42)。

在其它实施方案中，本文中描述的抗IL-21R结合蛋白可以下述至少一项一起组合施用：IL-13拮抗剂，例如可溶性IL-13受体和/或抗IL-13的抗体；IL-2拮抗剂，诸如IL-2融合蛋白(例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2，Seragen(参见例如Arthritis Rheumatism(1993)36：1223))和抗IL-2R抗体(例如抗Tac(人源化抗体，Protein Design Labs(参见Cancer Res.(1990)50(5)：1495-502)))。另一种组合包括与非消减性抗CD4抑制剂诸如DEC-CE9.1/SB 210396(抗CD4抗体；IDEC/SmithKline)组合的抗IL-21R结合蛋白。还有其它的组合包括抗IL-21R结合蛋白及CD80(B7.1)和CD86(B7.2)共刺激途径拮抗剂(诸如抗体、可溶性受体、或拮抗性配体)、p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、和/或抗炎性细胞因子及其激动剂(例如抗体)。抗炎性细胞因子可包括IL-4(DNAX/Schering，Palo Alto，CA)、IL-10(SCH 52000；重组IL-10 DNAX/Schering)、IL-13、和TGF。

在其它实施方案中，至少一种抗IL-21R结合蛋白可以与至少一种抗炎性药物、免疫抑制剂、代谢抑制剂、和酶抑制剂一起共配制和/或共施用。可以与本文中描述的IL-21R结合蛋白组合使用的药物或抑制剂的非限制性例子包括但不限于下述至少一项：非类固醇抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAID)(诸如布洛芬(ibuprofen)、替尼达普(tenidap)(参见例如Arthritis Rheumatism(1996)39(9)：S280)、萘普生(naproxen)(参见例如NeuroReport(1996)7：1209-13)、美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、双氯芬酸(diclofenac)、和吲哚美辛(indomethacin))；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)(参见例如Arthritis Rheumatism(1996)39(9)：S281)；皮质类固醇(corticosteroid)(诸如泼尼松龙(prednisolone))；和核苷酸生物合成抑制剂(诸如嘌呤生物合成抑制剂(例如叶酸拮抗剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate))和嘧啶生物合成抑制剂(例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂，诸如来氟米特(leflunomide)(参见例如Arthritis Rheumatism(1996)39(9)：S131及Infammation Research(1996)45：103-7))。

别的抑制剂的例子包括下述至少一项：皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制剂(诸如环孢菌素(cyclosporin)和他克莫司(tacrolimus)(FK-506))；mTOR抑制剂(诸如西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))或雷帕霉素衍生物(例如酯雷帕霉素衍生物诸如CCI-779(参见Elit(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)：1249 53及Huang等(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)：295304)))；干扰由促炎性细胞因子诸如TNFα和IL-1进行的信号传导的药剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38、或MAP激酶抑制剂)；cox2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)及其变体(MK 966)；参见例如Arthritis Rheumatism(1996)39(9)：S81)；磷酸二酯酶抑制剂(诸如R973401；参见例如Arthritis Rheumatism(1996)39(9)：S282)；磷脂酶抑制剂(例如细胞溶质磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂诸如三氟甲基酮类似物；参见美国专利No.6,350,892)；血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抑制剂；和血管发生抑制剂。

本文中公开的抗IL-21R结合蛋白可以与其它治疗剂组合使用，以治疗特定免疫性病症，如下文更详细讨论的。

可以与抗IL-21R结合蛋白组合、用于治疗关节炎病症(例如类风湿性关节炎、炎性关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎和银屑病关节炎)的药剂的非限制性例子包括下述至少一项：TNF拮抗剂(诸如抗FNF抗体)；TNF受体的可溶性片段(例如人p55和p75)及其衍生物(诸如p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白，LENERCEPT^TM)和75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM))；TNF酶拮抗剂(诸如TACE抑制剂)；IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-22的拮抗剂；T细胞和B细胞消减剂(诸如抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂(诸如甲氨蝶呤和来氟米特)；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物(例如CCI-779)；cox2和cPLA2抑制剂；NSAID；p38、TPL-2、Mk-2、和NFκb抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(诸如其抗体和小分子抑制剂)；雌激素受体贝塔(ERB)激动剂；和ERB-NFκb拮抗剂。可以与至少一种IL-21/IL-21R拮抗剂一起共施用和/或共配制的治疗剂可包括下述至少一项：TNF受体的可溶性片段(例如人p55或p75)，诸如75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM)；甲氨蝶呤；来氟米特；和西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物(例如CCI-779)。

可以与抗IL-21R结合蛋白组合、用于治疗多发性硬化的药剂的非限制性例子包括干扰素-β，例如IFNβ-1a和IFNβ-1b；Copaxone，皮质类固醇，IL-1抑制剂，TNF抑制剂，针对CD40配体的抗体，针对CD80的抗体，和IL-12拮抗剂。

可以与抗IL-21R结合蛋白组合、用于治疗炎性肠病或克罗恩氏病的药剂的非限制性例子包括下述至少一项：布地奈德(budenoside)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢霉素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑(metronidazole)；脂氧化酶抑制剂；美沙拉秦(mesalamine)；奥沙拉秦；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化剂；血栓素抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；TNF拮抗剂，如本文中描述的；IL-4、IL-10、IL-13、和/或TGFβ或其激动剂(例如激动性抗体)；IL-11；葡糖苷酸或右旋糖苷偶联的泼尼松龙、地塞米松或布地奈德前体药物；ICAM-1反义磷硫酰寡聚脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；缓释美沙拉秦；甲氨蝶呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星(ciprofloxacin)；和利多卡因(lignocaine)。

在其它实施方案中，抗IL-21R结合蛋白可以与至少一种针对其它涉及调节免疫应答(例如移植排斥或GVHD)的靶物的抗体组合使用。可以与IL-21/IL-21R拮抗剂组合、用于治疗免疫应答的药剂的非限制性例子包括下述针对细胞表面分子(例如CD25(IL-2受体α)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、或其组合)的抗体。在另一个实施方案中，抗IL-21R结合蛋白与至少一种一般性免疫抑制剂诸如环孢菌素A或FK506组合使用。

本发明的另一个方面涉及用于进行抗IL-21R结合蛋白与其它治疗剂的组合施用的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒包含至少一种在制药载体中配制的抗IL-21R结合蛋白和至少一种治疗剂，它们适当地配制成一种或多种分开的药物制剂。

诊断用途

本发明的结合蛋白还可用于检测生物学样品中IL-21R的存在。通过关联这些蛋白质的存在或水平与医学状况，本领域技术人员能诊断有关的医学状况。例如，受到刺激的T细胞提高它们的IL-21R表达，而且通常关节中高浓度的IL-21R表达T细胞可指示关节炎症和可能的关节炎。可通过本发明的结合蛋白来诊断的例示性医学状况包括但不限于多发性硬化、类风湿性关节炎、和移植排斥。

基于结合蛋白的检测方法(诸如那些对抗体普遍使用的)是本领域公知的，而且包括ELISA、放射性免疫测定法、免疫印迹、Western印迹、流式细胞术、免疫荧光、免疫沉淀、和其它相关技术。可以在掺入至少一种这些规程的诊断试剂盒中提供结合蛋白以检测IL-21R。该试剂盒可含有其它成分、包装、指令、试剂、和/或其它材料以帮助检测蛋白质和使用试剂盒。

结合蛋白可以用可检测标志物修饰，包括配体基团(例如生物素)、荧光团、生色团、放射性同位素、电子致密试剂、或酶。酶通过它们的活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通过其将四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色色素(其可用分光光度计量化)的能力来检测。其它合适的结合配偶包括生物素和亲合素、IgG和蛋白A、及本领域已知的其它受体-配体对。

结合蛋白还可以在功能上连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价关联、或其它方式)至至少一种其它分子实体，诸如另一种结合蛋白(例如双特异性或多特异性结合蛋白)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞抑制剂、等等。其它改变和可能性对于本领域普通技术人员是显而易见的，而且它们被认为是本发明范围内的等同方案。

药物组合物和施用方法

本发明的某些实施方案包括包含所公开的结合蛋白的组合物。组合物可适合于制药用途和施用于患者。组合物包含本发明的结合蛋白和制药赋形剂。如本文中使用的，“制药赋形剂”包括与药物施用相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、等。这些药剂用于药学活性物质的用途是本领域公知的。组合物还可含有其它活性化合物，提供补充的、另外的、或增强的治疗功能。药物组合物还可与施用指令一起包括在容器、包、或分配器中。

本发明药物组合物配制成与其预定施用路径相容。实现施用的方法是本领域普通技术人员知道的。药物组合物可以表面或口服施用，或者能够穿越粘膜。药物组合物的施用的例子包括口服摄入或吸入。施用还可以是静脉内、腹膜内、肌肉内、腔内、皮下、皮肤、或经皮。

用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括至少一种下述成分：无菌稀释剂，诸如水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其它合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；及张度剂，诸如氯化钠或右旋糖。可以提供本领域已知方法用酸或碱来调节pH。此类制剂制备物可封装在安瓿、一次性注射器、或多剂管形瓶中。

用于静脉内施用的溶液或悬浮液包括载体，诸如生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR EL

(BASF Corp.，Ludwigshafen，Germany)、乙醇、或多元醇。在所有情况中，组合物必须是无菌的且流动的，以易于注射。恰当的流动性常常可以使用卵磷脂或表面活性剂来获得。组合物还必须在制造和贮存的条件下是稳定的。针对微生物的防护可以用抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞、等。在许多情况中，可以在组合物中包括等张剂(糖)、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)、氯化钠。组合物的延迟吸收可通过添加延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

口服组合物包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服施用的目的，结合蛋白可以与赋形剂一起掺入，并置于例如片剂、锭剂、胶囊剂、或明胶。药学相容粘合剂或辅佐材料可包括在组合物中。组合物可含有(1)粘合剂，诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；(2)赋形剂，诸如淀粉或乳糖；(3)崩解剂，诸如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；(4)滑润剂，诸如硬脂酸镁；(5)助流剂，诸如胶体二氧化硅；和/或(6)甜味或芳香剂。

组合物还可通过经粘膜或经皮路径来施用。例如，包含F区的结合蛋白(例如抗体)可能能够穿过肠、口、或肺中的粘膜(经Fc受体)。经粘膜经粘膜施用可通过锭剂、鼻喷雾剂、吸入剂、或栓剂来实现。经皮施用可以用本领域已知的含有组合物的软膏剂、油膏剂、凝胶剂、或乳膏剂来实现。对于经粘膜或经皮施用，使用对于要渗透的屏障适宜的渗透剂。对于通过吸入的施用，结合蛋白可以自含有推进剂(例如液体或气体)的加压容器或分配器、或喷雾器的以气溶胶喷雾剂投递。

在某些实施方案中，与载体一起制备本发明的结合蛋白以保护结合蛋白免于自身体快速清除。常常使用生物可降解聚合物(例如乙烯-乙酸乙烯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚正酯、和聚乳酸)。用于制备此类配制剂的方法是本领域技术人员已知的。脂质体悬浮液也可用作药学可接受载体。脂质体可依照本领域已知的已建立方法来制备(参见例如美国专利No.4,522,811)。

本发明的结合蛋白或结合蛋白组合物如所述的以治疗有效量施用。治疗有效量可随受试者的年龄、状况、性别、和药学状况的严重性而变化。内科医师能基于临床适应证来确定适宜的剂量。结合蛋白或组合物可作为推注剂量(bolus dose)来给予以使结合蛋白的循环水平最大化，持续最长的时间。也可使用连续输注。

如本文中使用的，术语“受试者”意图包括人和非人动物。受试者可包括具有以表达IL-21R的细胞(例如癌细胞或免疫细胞)为特征的病症的人患者。本发明的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、犬、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物、等。

能对受试者施用的剂量范围的例子可以选自：1μg/kg至20mg/kg，1μg/kg至10mg/kg，1μg/kg至1mg/kg，10μg/kg至1mg/kg，10μg/kg至100μg/kg，100μg/kg至1mg/kg，250μg/kg至2mg/kg，250μg/kg至1mg/kg，500μg/kg至2mg/kg，500μg/kg至1mg/kg，1mg/kg至2mg/kg，1mg/kg至5mg/kg，5mg/kg至10mg/kg，10mg/kg至20mg/kg，15mg/kg至20mg/kg，10mg/kg至25mg/kg，15mg/kg至25mg/kg，20mg/kg至25mg/kg，和20mg/kg至30mg/kg(或更高)。这些剂量可每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、或更不频繁地施用，例如每年两次，这取决于剂量、施用方法、要治疗的病症或症状、及各受试者的特征。

在某些情况中，以剂量单位形式配制组合物以方便施用和剂量一致可能是有利的。如本文中使用的，剂量单位形式指适合于患者的物理离散单元。每个剂量单位含有与载体联合的预定数量的结合蛋白，其根据计算，产生治疗效果。剂量单位取决于结合蛋白的特征和要实现的具体治疗效果。

组合物的毒性和治疗功效可通过标准药学规程在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD₅₀(对群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。有毒和治疗效果之间的剂量比即治疗指数，而且它可表述为比LD₅₀/ED₅₀。展现大治疗指数的结合蛋白可以是毒性低和/或治疗功效高。

自细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可用于阐明在人中的剂量范围。这些化合物的剂量可位于血液中循环结合蛋白浓度的范围内，这包括有很小毒性或没有毒性的ED₅₀。剂量可以在此范围内变化，取决于采用的剂量组合物形式和施用路径。对于本发明中使用的任何结合蛋白，治疗有效剂量最初可使用细胞培养物测定法来估算。可以在动物模型中阐明实现包括IC₅₀(即实现的对症状的半最大抑制的结合蛋白浓度)的循环血浆浓度范围的剂量。任何特定剂量的效果可以通过合适的生物测定法来监测。合适生物测定法的例子包括DNA复制测定法、基于转录的测定法、基因表达测定法、IL-21/IL-21R结合测定法、和其它免疫学测定法。

在本发明的一个实施方案中，可以在离体全血细胞测定法中阐明剂量。在此类实施方案中，一种适合于测定和监测特定剂量的生物测定法包括一种测定抑制或降低IL-21R活性诸如调控IL-21响应性基因表达所必需的抗IL-21R结合蛋白最小血清浓度的方法。在本发明的一个实施方案中，IL-21响应性基因选自下面的非限制性列表：TNF，IFNγ，IL-6，IL-8，IL-10，CD19，STAT3，TBX21，CSF1，GZMB，PRF1，IL-2Rα，和IL-21R。在一个优选的实施方案中，IL-21响应性基因选自CD19，GZMB，IFNγ，IL-2Rα，IL6，和PRF-1。在一个最优选的实施方案中，IL-21响应性基因是IL-2Rα。如此，测定抑制或降低IL-21R活性所必需的抗IL-21R抗体最小血清浓度的方法可包括测定超过一种IL-21响应性基因例如两种、三种、四种、五种、或六种IL-21响应性基因的表达水平。

通过述及将贯穿本申请引用的所有参考文献、专利申请、和专利的整个内容收入本文。

实施例

在下面的非限制性实施例中会进一步例示本发明。列出这些实施例是为了帮助理解本发明，而不是意图也不应解释为以任何方式限制其范围。实施例不包括本领域普通技术人员会熟知的常规方法的详细描述。

实施例1：通过噬菌体展示生成结合蛋白

美国专利No.7,495,085(通过述及收入本文)中记载的scFv亲本克隆18A5是通过标准噬菌体展示法自CS人scFv文库获得的，其中使用表达人IL-21R的BaF3细胞作为第1轮和第3轮中的靶物，及生物素化IL-21R-Fc融合蛋白作为第2轮中的靶物。

实施例2：文库构建

噬菌体展示文库基于亲本18A5 scFv，使用pCANTAB6载体，其中scFv以其3′端融合至完整基因III。使用本领域公知的技术衍生了多种CDR3序列。

在V_H和V_L的CDR3中随机化六个连续密码子的两个交叠块，生成总共四个文库：H3B1，H3B2，L3B1，和L3B2。下面分别鉴别了核苷酸和氨基酸序列：IL-21R：18A5 V_HCDR3[SEQ ID NO：199和200]；H3B1(文库容量1.40x10⁹)[SEQ ID NO：201和202]；H3B2(文库容量1.00x10⁹)[SEQ ID NO：203和204]；IL-21R：18A5 V_LCDR3[SEQ ID NO：205和206]；L3B1(文库容量9.00x10⁹)[SEQ ID NO：207和208]；L3B2(文库容量6.40x10⁹)[SEQ ID NO：209和210]。

实施例3：噬菌体选择

通过选择能够在溶液相中结合生物素化人IL-21R胞外域His-Flag融合蛋白(“生物素-hIL-21R-H/F”)和生物素化鼠IL-21R胞外域His-Flag融合蛋白(“生物素-mIL-21R-H/F”)的噬菌体，自上文scFv文库分离18A5的所有衍生物；所有涉及选择的规程和技术是本领域技术人员熟知的。通过噬菌体选择规程分离到总共27种抗IL-21R scFv。

实施例4：文库筛选

所得scFv格式的结合蛋白是基于它们与人IgG1格式的亲本18A5竞争结合生物素-hIL-21R-H/F和生物素-mIL-21R-H/F以阻止表达人IL-21R的遗传工程细胞系的hIL-21依赖性增殖和表达鼠IL-21R的遗传工程细胞系的mIL-21依赖性增殖的能力而选择的。

实施例4.1：制备粗制周质材料(“周质制备物”)供筛选测定法中使用

根据所使用的生长条件，可以在细菌周质空间中在溶液中表达scFv。为了诱导scFv释放入周质，使用QPix2菌落采集器(Genetix，New Milton，England)给装有990μl含0.1％葡萄糖/100μg/ml氨苄青霉素的2xTY培养基的96孔深孔板接种融化的甘油原种(每个孔一个克隆)，并于37℃(999rpm)培养约4小时。将培养物用终浓度0.02mM的IPTG诱导，并于30℃(999rpm)培养过夜。通过渗压震扰来释放细菌周质的内含物(周质制备物)。简言之，将板离心，并将团粒在150μl TES周质缓冲液(50mM Tris/HCl(pH 8.0)/1mM EDTA(pH 8.0)/20％蔗糖)中重悬浮，接着添加150μl 1∶5 TES∶水，并在冰上温育30分钟。将板离心，并收获含有scFv的上清液。

实施例4.2：用于文库筛选的表位竞争测定法

那些能够与亲本18A5抗体竞争结合人或鼠IL-21R的scFv是通过均质时间解析荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF

)测定法自选定的噬菌体鉴定的。依照HTRF

Cryptate标记试剂盒(Cisbio，Bedford，MA)中的指令将经过纯化的亲本18A5抗体用Cryptate(铕的一种衍生物)共价修饰。如上所述制备scFv的周质制备物，并在PBS/0.4M氟化钾/0.1％BSA(HTRF缓冲液)中稀释至0.25％；然后将10μl混合物转移至黑色384孔浅孔板(Nunc，Rochester，NY)的孔。然后将5μl Cryptate偶联的18A5抗体添加至每个孔，接着是1∶800稀释的链霉亲合素-XL665偶联物(Cisbio)与4.8nM生物素-hIL-21R-H/F或40nM生物素-mIL-21R-H/F任一的5μl混合物。将混合物于室温温育2小时，并进行时间解析荧光测量(340nm激发，615nm和665nm发射)。与18A5抗体的竞争通过665nm处发射对615nm处发射的经过背景修正的比的降低来指示。

在HTRF

测定法中使用人IL-21R-H/F筛选了总共8280个独立分离的scFv，而且选择376个能够与亲本18A5抗体竞争结合生物素-hIL-21R-H/F的克隆用于进一步分析。

实施例5：文库衍生的scFv的DNA序列分析-PCR扩增scFv区域供测序分析用

测定了287个较之亲本18A5具有改进的IL-21R结合的18A5衍生scFv变体的序列，并测定了每个位置处的氨基酸频率。在V_H克隆中，只有两个(1.7％)衍生自突变例如SEQ ID NO：169的最后六个氨基酸(在V_H CDR3的C端)的文库，而剩余衍生自例如SEQ ID NO：169的头六个氨基酸的文库。在V_L克隆中，只有一个克隆(0.6％)衍生自突变例如SEQ ID NO：170的最后六个氨基酸(在V_LCDR3的C端)的文库，而大多数衍生自例如SEQ ID NO：170的头六个氨基酸(在V_L CDR3的N端)的改变。

使用VENT

DNA聚合酶(New England Biolabs，Ispwich，MA)在HN缓冲液(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)中依照制造商的指令进行scFv的PCR扩增。将5μl 1∶10稀释的稳定期细菌培养物作为模板用于20μl的反应终体积。所使用的循环条件为94℃2分钟热启动，30个循环的94℃变性(1分钟)、55℃引物退火(2分钟)和72℃延伸(1分钟)，接着是72℃最终延伸(5分钟)。通过琼脂糖凝胶电泳来检验PCR产物，并用ExoI/SAP(虾碱性磷酸酶)清洁，之后用M13rev引物测序。

27个scFv的CDR3序列的SEQ ID NO列于表4。选择这些scFv来基于实施例6中所描述的测定法进行进一步分析。

表4：改良的18A5衍生的scFv的CDR3 SEQ ID NO

scFv

重CDR3

轻CDR3

H3	165	170
			H4	166	170
H5	167	170
			H6	168	170
L1	169	171
			L2	169	172
L3	169	173
			L4	169	174
L5	169	175
			L6	169	176
L8	169	177
			L9	169	178
L10	169	179
			L11	169	180
L12	169	181
			L13	169	182
L14	169	183
			L15	169	184
L16	169	185
			L17	169	186
L18	169	187
			L19	169	188
L20	169	189
			L21	169	190

L23	169	191
			L24	169	192
L25	169	193

实施例6：文库衍生scFv的表征

实施例6.1：制备经过纯化的scFv供定量分析用

在PHYTIP

柱(PhyNexus，Inc.，San Jose，CA)上通过Ni-NTA纯化小规模纯化各scFv克隆。将单菌落在50ml锥形管中在20ml含0.1％葡萄糖/100μg/ml氨苄青霉素的2xTY培养基中于37℃以250rpm摇动培养至对数中期。用终浓度0.02mM的IPTG诱导scFv表达，并将培养物于30℃培养过夜。通过离心收获细胞，并在1ml TES周质缓冲液中重悬浮，接着添加1ml 1∶5 TES∶水，并在冰上温育30分钟。将溶胞物于4℃以3200rpm离心10分钟，并将上清液调至2mM MgCl₂。在Ni-NTA PHYTIPs

(PhyNexus)上通过让上清液反复通过Perkin Elmer(Waltham，MA)MINITRAK^TM IX液体操作机器人上的PHYTIPs

来捕捉scFv，接着在IMAC清洗缓冲液中清洗，并用200mM咪唑，50mM Tris，300mM NaCl(pH 8.0)洗脱。通过三轮1∶10稀释入PBS来将缓冲液交换成PBS，接着在10,000分子量截留滤板(Millipore MULTISCREENULTRACEL^TM 96孔超滤板，Millipore，Billerica，MA)上浓缩。使用Micro BCA^TM试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.，Rockford，IL)使用制造商的牛血清清蛋白标准品对样品定量。

实施例6.2：用于过表达人或鼠IL-21R的细胞的IL-21依赖性增殖的测定法

用18A5衍生结合蛋白(scFv和IgG)实施抑制测定法以测量它们对经人或鼠IL-21R转染的细胞系的IL-21依赖性增殖的阻断。将BaF3细胞(一种鼠前B细胞系)和TF1细胞(一种人红细胞细胞系)经逆转录病毒用IL-21R和绿色荧光蛋白(GFP)转导。在含10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，和0.00036％β-巯基乙醇的RPMI 1640中例行培养细胞。给人IL-21R-BaF3细胞培养物补充50ng/ml人IL-21；给鼠IL-21R-BaF3细胞培养物补充10U/ml IL-3；给TF1细胞培养物补充50ng/ml GM-CSF。在测定之前，将细胞在缺少补充生长因子的测定培养基中清洗3次，在测定培养基中重悬浮，并于37℃/5％CO₂温育6小时。为了准备测定板，将5000个细胞以55μl/孔的体积添加至96孔平底白色组织培养板(Thermo Scientific，Waltham，MA)的中央60个孔。通过将贮存样品在测定培养基中稀释并连续三倍稀释来准备测试scFv或IgG样品。将25μl结合蛋白样品添加至细胞，并于37℃/5％CO₂温育30分钟。将20μl含有100-400pg/ml人或鼠IL-21的测定培养基添加至每个孔，并将细胞再温育48小时。如下测量增殖，即使板达到室温，添加15μl/孔CELLTITER-GLO

与室温温育10分钟，并用Perkin Elmer ENVISION^TM读板仪测量发光。用PhyNexus IMAC tips纯化后，对108个scFv测试对所有三种细胞系的IL-21依赖性增殖的中和。所有都显示对人IL-21R-BaF3细胞的中和，其中IC₅₀低于或等于亲本18A5 scFv的。一个子集显示出对鼠IL-21R-BaF3细胞和人IL-21R-TF1细胞的增殖的强烈中和。来自27个最有力的克隆的数据显示于图1-3，而且汇总于表5。

图1-3显示scFv对人IL-21R-BaF3细胞(图1a-c)、人IL-21R-TF1细胞(图2a-c)、和鼠IL-21R-BaF3细胞(图3a-c)增殖的中和。将细胞与所示scFv混合，并与100pg/ml(图1-2)或400pg/ml(图3)人IL-21一起温育。

实施例6.3：定量表位竞争测定法

在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中对经过纯化的scFv定量分析它们与亲本18A5抗体竞争结合鼠IL-21R的能力。将亲本18A5抗体在PBS中以0.75μg/ml的浓度在96孔Nunc MAXISORP板上于4℃包被过夜。将板使用PBS清洗3次，然后在PBS/1％BSA/0.05％Tween 20中于室温封闭3小时。将scFv与36nM生物素化mIL-21R-H/F混合，并于室温温育10分钟。将经过封闭的板用PBS清洗3次，并将50μl/孔scFv/IL-21R混合物转移至适宜的板，并于室温温育1小时。将板用PBS清洗5次，之后添加1∶6000稀释的辣根过氧化物酶偶联的链霉亲合素(Southern Biotech，Birmingham，AL)二抗以检测结合的生物素化mIL-21R-H/F。然后将板于室温温育1小时，并用PBS清洗7次。使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)发展信号，用H₂SO₄终止反应，并在ENVISION^TM读板仪(Perkin Elmer)上于450nm读取吸光度。在此测定法中测试了108个通过PhyNexus IMAC tips纯化的scFv，而且大多数与亲本18A5抗体竞争结合生物素化鼠IL-21R-H/F，其IC₅₀低于亲本18A5 scFv的。27个在基于细胞的中和测定法中具有最高效力的克隆的表位竞争数据显示于图4a-c，而且汇总于表5。

表5：基于细胞的测定法中对人和鼠IL-21R的中和及与18A5抗体对鼠IL-21R结合的竞争

实施例7：亲本18A5 IgG转变成种系序列

选择下面15种具有改良V_L区域的scFv，连同种系化亲本18A5 V_L(见下文)用于转变成全长人IgG拉姆达：L2，L3，L6，L9，L11，L13，L14，L16，L17，L18，L19，L20，L23，L24，和L25。选择4种具有改良V_H区域(H3、H4、H5、和H6)的scFv，连同种系化亲本18A5V_H(见下文)用于转变成全长人IgG1。

修饰亲本18A5抗体的V_H和V_L氨基酸序列，使得CDR区域以外的序列匹配最接近的人种系序列：V_H情况中的DP67/VH4B+(VBASE_AA：WAP00CEAZ_1)和JH1/JH4/JH5，及V_L情况中的DPL16/V_L3.1(VBASE_AA：WAP00CEMI_1)。修饰是通过GENEART(Regensburg，Germany)处的基因合成和通过PCR引入的定点变化组合进行的。另外，为哺乳动物细胞中的表达由GENEART使用他们专有的方法对序列进行密码子优化。下面显示亲本18A5序列和经过种系修正的18A5序列的比对：

18A5重链比较

亲本18A5 V _H

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGACTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTTACTCCATCAGCAGTGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGTTGGAGTGGATTGGGAGTATCTCTCATACTGGGAACACCTACTACAACCCGCCCCTCAAGAGTCGCGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGCGAGGTGGGGGAATTAGCAGGCCGGAGTACTGGGGCAAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGT(SEQ ID NO：5)

种系化18A5 V _H

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCTCTGACCTGTGCCGTGTCCGGCTACTCCATCTCCTCCGGCTACTACTGGGGCTGGATCAGACAGCCTCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTCCATCTCTCACACCGGCAACACCTACTACAACCCCCCTCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCGTGGACACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTCCTCTGTGACCGCTGCCGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCGGCGGAATCTCCAGACCTGAGTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCT(SEQ ID NO：7)

种系化18A5 V _H x亲本18A5 V _H

18A5轻链比较

亲本18A5 V _L

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTCCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCACGCTCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAACCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGTCAGGACAGGCCCCTATACTTCTCCTCTATGGTAAACACAAACGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGCTTCTCTGGCTCCACCTCAGGAGACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGACGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACTCCAGTGGCAACCCCCATGTTCTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTTTTA(SEQ ID NO：9)

种系化18A5V _L

TCCTCTGAGCTGACCCAGGATCCTGCTGTGTCTGTGGCCCTGGGCCAGACCGTCAGGATCACCTGCCAGGGCGATAGCCTGAGAACCTACTACGCCTCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTGTGCTGGTGATCTACGGCAAGCACAAGAGGCCATCCGGCATCCCTGACAGATTCTCCGGCTCCTCCTCTGGCAATACCGCCTCCCTGACCATCACCGGCGCTCAGGCCGAGGACGAGGCCGACTACTACTGTAACTCCCGGGACTCTTCCGGCAACCCTCACGTGCTGTTTGGCGGCGGAACCCAGCTGACCGTGCTA(SEQ ID NO：11)

种系化18A5 V _L x亲本18A5V _L

经过种系修正的V_H序列(相对于亲本序列的变化为粗体和下划线)：

亲本的(SEQ ID NO：6) QVQLQESGPGLVKTSETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKG

种系化的(SEQ ID NO：8) QVQLQESGPGLVK

SETLSLTCAVSGYSISSGYYWGWIRQPPGKG

亲本的 LEWIGSISHTGNTYYNPPLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGISRP

种系化的 LEWIGSISHTGNTYYNPPLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGGISRP

亲本的 EYWGKGTLVTVSS

种系化的 EYWG

GTLVTVSS

经过种系修正的V_L序列(相对于亲本序列的变化为粗体和下划线)：

亲本的(SEQ ID NO：10) SSELTQDPPVSVALGQTVTLTCQGDSLRTYYASWYQQKSGQAPIL

种系化的(SEQ ID NO：12) SSELTQDP

VSVALGQTVTCQGDSLRTYYASWYQQK

GQAP

L

亲本的 LLYGKHKRPSGIPDRFSGSTSGDTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNPHVLFGGGTQ

种系化的

YGKHKRPSGIPDRFSGSSG

TASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNPHVLFGGGTQ

亲本的 LTVL

种系化的 LTVL

实施例8：文库衍生的scFv转变成IgG

通过PCR扩增改良18A5 scFv衍生物的V_L和V_H域CDR3区，并通过下面的方法亚克隆入经过种系修正的亲本18A5 V_L和V_H框架。通过用引物BssHII_II_V_H_F(5’-GCTTGGCGCGCACTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3’)[SEQ ID NO：230]和GV_H_R_for_BssHII(5’-TCAGGGAGAACTGGTTCTTGG-3’)[SEQ ID NO：231]扩增质粒pSMED2_OP18A5G_huIgG1生成涵盖种系化18A5 V_H基因5’部分的PCR片段。用引物G_V_H_F_for_SalI(5’-TCCAAGAACCAGTTCTCCCTG-3’)[SEQ ID NO：232]和scFv_SalI_V_H_R(5’-GCGACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’)[SEQ ID NO：233]扩增涵盖来自改良scFv克隆VH3的V_H基因3’部分的PCR片段。将片段凝胶纯化，然后将二者混合，并用外部引物集BssHII_G_V_H_F和SalI_V_H_R扩增以生成完整V_H基因片段。将这用BssHII和SalI消化，并连接入含有人IgG1恒定区及三重突变铰链区的载体。用BssHII_II_V_H_F和新引物(Sal_V_H_R_RJ(5’-GCGACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGG-3’))[SEQ ID NO：234]再扩增插入物以改变V_H J区段的编码序列以符合JH1种系序列，并连接入人IgG1-三重突变恒定区载体。

通过相似的方法来亚克隆来自改良scFv的V_L基因。通过用引物BssHII_II_V_L_F(5’-GCTTGGCGCGCACTCTTCCTCTGAGCTGACCCAG-3’)[SEQ ID NO：235]和scFv_V_L_R_for_BssHII(5’-GCCTGAGCCCCAGTGATGGTCA-3’)[SEQ ID NO：236]扩增质粒pSMEN2_OP18A5G_hu Lambda生成涵盖18A5 V_L基因5’部分的PCR片段。用引物GV_L_F_for_XbaI(5’-ACCGCCTCCCTGACCATCAC-3’)[SEQ ID NO：237]和scFv_XbaI_V_L_R(5’-GCGCCGTCTAGAGTTATTCTACTCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCCTC-3’)[SEQ ID NO：238]扩增涵盖来自改良scFv克隆的V_L基因3’部分的PCR片段。将片段凝胶纯化，然后与每一种基因的5’和3’部分对应的片段混合，并用外部引物集BssHII_II_V_L_F和scFv_XbaI_V_L_R扩增以生成完整V_L基因片段。将这些用BssHII和XbaI消化，并连接入含有人拉姆达基因恒定区的载体。

实施例9：改良IgG的体外表征

实施例9.1：结合蛋白的瞬时小规模表达

对克隆测试完整IgG格式在cos7细胞中瞬时表达后的功能。将16种测试序列(种系化亲本18A5 V_L及L2、L3、L6、L9、L11、L13、L14、L16、L17、L18、L19、L20、L23、L24和L25)的集合中的每种轻链与5种测试序列(H3、H4、H5、和H6连同V_H_P，即种系化亲本18A5 V_H域)的集合中的每种重链配对。将配对的每种质粒(1.4μg)与TRANSIT

转染试剂(Mirus，Madison，WI)依照制造商的指令组合，并将DNA:TRANSIT

试剂复合物添加至在6孔组织培养板中在Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)/10％热灭活的胎牛血清/青霉素/链霉素/2mM L-谷氨酰胺中生长的cos7细胞单层。24小时后，将培养液更换成无血清培养基(R1CD1)，然后在48小时后收集。通过抗人IgG ELISA对结合蛋白(现在包括全长抗体)定量。

实施例9.2：抗IL-21R IgG在细胞增殖中和中的活性

如上所述对无血清条件化培养基中的80种瞬时表达IgG测试在IL-21依赖性增殖测定法中在三种细胞系中的活性：(1)人IL-21R-BaF3细胞，(2)鼠IL-21R-BaF3细胞，和(3)人IL-21R-TF1细胞。所有80对显示出对人IL-21R表达性BaF3细胞增殖的中和，而且除涉及VH4外的所有对显示出对人IL-21R表达TF1细胞的中和(数据未显示)。所有80对还显示出对鼠IL-21R表达性BaF3细胞增殖的中和，其中最强的中和一般与同亲本重链配对的轻链有关，而最弱的中和一般与VH4重链有关(数据未显示)。来自最有力的21种IgG组合(AbA-AbU)的中和数据显示于图5，而且IC₅₀数据汇总于表6。

对人IL-21R-BaF3细胞用100pg/ml人IL-21(图5a-c)、对人IL-21R-TF1细胞用100pg/ml人IL-21(图5d-f)、或对鼠IL-21R-BaF3细胞用400pg/ml鼠IL-21(图5g-i)进行测定。在所示抗体之后将IL-21添加至细胞；48小时后用CELLTITER-GLO

测量增殖。图26a-c显示别的研究，它们证明了相同三种细胞系中的相似抑制。

实施例9.3：结合瞬时表达的大鼠和猕猴IL-21R的抗IL-21R IgG

对一个子集的结合蛋白测试对在CHO PA Dukx细胞表面上瞬时表达的大鼠、猕猴、人IL-21R、或人IL-2R-γ共同亚基的结合。在测定前48小时转染细胞。在测定那天，将细胞在自动化洗板仪(Titertek，Huntsville，AL)上在含有0.9mM CaCl₂和0.45mM MgCl₂的PBS(PBS/CaMg)中温和清洗5次，并在PBS/CaMg/5％脱脂奶粉中于室温封闭1小时。将来自瞬时表达抗IL-21RIgG的条件化培养基在封闭缓冲液中连续稀释，并添加至经过封闭的板中的细胞，室温1小时。将细胞用PBS/CaMg清洗5次，然后与辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG一起于室温温育1小时。然后将细胞在PBS/CaMg中清洗10次，并除去所有清洗缓冲液。将细胞与100μl TMB一起温育，直至颜色反应达到饱和，用100μl 0.18M H₂SO₄终止，并在Perkin Elmer ENVISION^TM读板仪上于A450读数。

所有21种IgG结合瞬时表达人(图6a-c)、大鼠(图6d-f)、或猕猴(图6g-i)IL-21R的CHO细胞。大多数不显示超出背景的对在CHO细胞上瞬时表达的对照蛋白质(人伽马(γ)共同链)的结合，但是一个子集的IgG(AbD、AbE、AbF、AbH、AbL、和AbM)的结合超出背景，为13nM或更大(图6j-l)。数据汇总于表6。

表6：对细胞增殖测定法中人和鼠IL-21R活性的中和及对在CHO细胞上表达的人、大鼠、和猕猴IL-21R的结合的汇总

AbI	1.00	3.80	0.224	1.237	1.088	1.209	0.107
								AbJ	0.65	4.60	0.4	1.217	1.261	1.273	0.126
AbK	0.98	4.00	0.079	1.364	1.175	1.338	0.108
								AbL	0.68	4.25	0.227	1.454	1.257	1.514	0.219
AbM	1.08	4.22	0.125	1.197	0.78	1.45	0.224
								AbN	0.50	1.59	0.435	1.214	0.702	1.497	0.136
AbO	0.52	2.91	0.065	1.107	1.101	1.358	0.108
								AbP	0.75	3.48	0.03	1.308	1.03	1.313	0.112
AbQ	0.68	4.62	0.153	1.255	1.161	1.31	0.125
								AbR	0.87	3.94	0.302	1.334	1.108	1.35	0.109
AbS	1.53	5.00	0.04	1.017	1.166	1.224	0.118
								AbT	0.67	3.26	0.093	1.078	0.994	1.219	0.102
AbU	0.73	3.13	0.184	1.289	0.927	1.314	0.104

实施例9.4：抗IL-21R IgG结合人IL-21R的选择性的BIACORE ^TM 分析

在BIACORE^TM 2000表面等离振子共振仪器上测试一个子集的瞬时表达抗IL-21R结合蛋白(这里是抗体)的结合特异性。使用标准胺偶联将抗人IgG、抗鼠免疫球蛋白抗体、和鼠IL-21R-H/F固定化到研究级羧甲基右旋糖苷芯片(CM5)上。将传感器芯片表面用EDC/NHS活化7分钟，流速20μl/min。使用第一流动室作为参照表面来校正体折光率(bulk refractive index)、基体效应(matrix effect)、和非特异性结合。捕捉抗体(流动室2上7,150个共振单位(RU)的抗人Fc抗体(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)和流动室3上7,500个RU的抗鼠Fc抗体)在乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中稀释至10μg/ml，并注射到活化的表面上。用1.0M乙醇胺(pH 8.0)封闭剩余的活化的基团。抗人IgG和抗鼠IgG的分子量均为150kD，而IL-21R单体的分子量为27kD。

含有抗IL-21R抗体和抗体对照(鼠抗人IL-2Rβ和鼠抗人IL-4R(R&D Systems，Minneapolis，MN)；人抗人IL-13(Wyeth，Cambridge，MA))的条件化培养基在补充有0.2％牛血清的HBS/EP缓冲液中稀释，并注射到BIACORE^TM芯片的所有四个流动室上，在物种适宜的捕捉抗体上捕捉500-700(RU)的抗体。5秒清洗期后，将一种阳性对照蛋白质(鼠IL-21R-H/F)、两种与IL-21R有关的人蛋白质(人IL-2Rβ和人sIL-4R(R&D Systems))、或一种无关的带His/FLAG标签的蛋白质(人IL-13-H/F)的50nM溶液注射到芯片上捕捉的抗体上。结合和解离期分别监测120和180秒，接着两次注射5μl甘氨酸(pH 1.5)以再生完全有活性的捕捉表面。所有结合实验是于25℃在HBS/EP缓冲液中进行的。使用双重参照为每幅传感图减去空白和缓冲液效应。

所有测试的抗IL-21R抗体(18A5抗体和AbA-AbU)显示出清楚的对鼠IL-21R的结合，但是对IL-21R相关蛋白质人IL-2Rβ和人可溶性IL-4R或对无关的带His/FLAG标签的蛋白质人IL-13-His/FLAG没有结合(图7a-c)。对照指示IL-2Rβ和人可溶性IL-4R能被特异性抗IL-2Rβ和抗IL-4R抗体捕捉(图7d)。

实施例9.5：瞬时表达的抗体的纯化

将7种抗体(人IgG1三重突变体型式：AbS，AbT，AbO，AbP，和AbU；及双重突变体型式：AbQ和AbR)在cos7细胞中瞬时表达，并纯化，供进一步分析用。另外，还制备了预期具有不同水平Fc受体结合的带人IgG尾的三种AbT型式(野生型IgG1、IgG4、和IgG1双重突变体)。遵循上文所述TRANSIT

方案，只是使用25μg每种质粒来转染8个T 175烧瓶每个中的细胞。第一次收获条件化培养基后，添加新鲜的R1CD1，然后在再过72小时后收集。合并条件化培养基，并在0.22μm滤器上过滤。将抗体加载到蛋白A树脂上，用20mM柠檬酸/150mM氯化钠(pH 2.5)洗脱，用Tris(pH 8.5)中和，并透析入PBS。

实施例9.6：抗体结合人和鼠IL-21R的BIACORE ^TM 分析

在BIACORE^TM表面等离振子共振仪器上测试抗IL-21R抗体结合人和鼠IL-21R-H/F的动力学。使用标准胺偶联将抗人IgG抗体(Invitrogen Corporation)固定化到研究级羧甲基右旋糖苷芯片(CM5)上。将表面用EDC/NHS活化7分钟，流速20μl/min。使用第一流动室作为参照表面来校正体折光率、基体效应、和非特异性结合。将抗人Fc抗体在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中稀释至20μg/ml，并在四个流动室每个上捕捉2950-3405个共振单位(RU)。用1.0M乙醇胺HCl(pH 8.5)封闭剩余的活化的基团。

将抗IL-21R抗体在补充有0.2％牛血清清蛋白的HBS/EP缓冲液中稀释至0.1-0.2μg/ml，并加载到BIACORE^TM芯片上。简短的清洗期后，将0-100nM人IL-21R-H/F或10-500nM鼠IL-21R-H/F的溶液注射到芯片上，流速50μl/min。为人和鼠IL-21R动力学运行结合期3分钟，并为hIL-21R监测解离期15分钟，为mIL-21R监测解离期5分钟，接着两次注射10μl和一次注射30μl甘氨酸(pH 1.5)以再生完全有活性的捕捉表面。所有结合实验是于25℃在HBS/EP缓冲液中进行的，而且样品架(sample rack)保持于15℃。使用双重参照为每幅传感图减去空白和缓冲液效应。传感图显示于图8a-b(人IL-21R-His/FLAG)和图8c-d(鼠IL-21R-His/FLAG)。结合动力学参数显示于表7A，而且来自一项重复实验的别的动力学数据显示于表7B。

另外，通过上文所述方案对AbS和AbT测试对猕猴IL-21R-His/FLAG的结合动力学。人和猕猴IL-21R-H/F的结合特性对于AbS和AbT二者是相似的(图9)。图9显示猕猴IL-21R-His/FLAG结合AbS(9a)；和AbT(9c)；及人IL-21R-His/FLAG结合AbS(9b)；和AbT(9d)。

表7A：抗IL-21R抗体结合人和鼠IL-21R-His/FLAG的动力学参数

表7B：抗IL-21R抗体结合人IL-21R-His/FLAG的动力学参数

实施例9.7：BIACORE ^TM 表位竞争测定法

将抗体AbS和AbT及亲本抗体18A5直接固定化到CM5BIACORE^TM芯片上。容许鼠IL-21R-H/F(100nM)流过芯片300秒，接着清洗(100sec)，然后容许AbS、AbT、D5、或一种非中和性抗mIL-21R抗体(7C2)任一的5μg/ml溶液流过表面。对AbS、AbT、和D5没有观察到另外的结合，指示它们在mIL-21R-H/F上的结合位点被AbS、AbT、或18A5抗体的并行结合所阻断(图10a)。相反，中和性对照抗IL-21R抗体7C2能够结合AbS、AbT、或18A5抗体上捕捉的mIL-21R-H/F，指示此对照抗体在与捕捉抗体所结合的表位不同的表位处结合。

类似地，AbS和AbT不结合被CM5 BIACORE^TM芯片上固定化的AbS或AbT捕捉的人IL-21R-H/F，而对照抗人IL-21R抗体(9D2)能够结合被AbS或AbT捕捉的人IL-21R-H/F(图10b)。此观察结果提示AbS的结合位点被AbT的并行结合所阻断，反之亦然。

实施例9.8：基于细胞的增殖测定法

如上所述对经过纯化的IgG测试在IL-21依赖性增殖中在三种细胞系中的活性：人IL-21R-BaF3细胞，鼠IL-21R-BaF3细胞，和人IL-21R-TF-1细胞。所有都显示出对人和鼠IL-21R依赖性增殖二者的强烈抑制，效力比亲本18A5IgG大(图11，表8)。对人IL-21R-BaF3细胞用100pg/ml人IL-21(图11a)、对鼠IL-21R-BaF3细胞用200pg/ml鼠IL-21(图11b)、及对人IL-21R-TF-1细胞用100pg/ml人IL-21(图11c)进行测定。图26d描绘关于这些抗体对人IL-21R-BaF3细胞的影响的另一项研究的结果。

表8：对人IL-21R-BaF3细胞、鼠IL-21R-BaF3细胞、和人IL-21R-TF-1细胞增殖的中和

实施例9.9：原代人B细胞增殖测定法

对抗IL-21R抗体测试它们抑制原代人B细胞的IL-21依赖性增殖的能力。来自健康人供体的血沉棕黄层细胞得自Massachusetts General Hospital(Boston，MA)。将细胞与ROSETTESEP^TM B细胞富集混合物(StemCell Technologies，Vancouver，Canada)一起温育，并依照制造商的指令分离B细胞。将所得群体(60-80％CD19⁺B细胞)在96孔平底板中以1x10⁵/孔在含有10％FBS，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，和2mM L-谷氨酰胺的RPMI中培养。将B细胞用连续稀释的抗人IL-21R抗体在调至5％CO₂的37℃温箱中预处理30分钟。然后将经过处理的B细胞用0.5μg/ml抗CD40单抗(BD Biosciences，San Jose，CA)和10ng/ml IL-21细胞因子在调至5％CO₂的37℃温箱中刺激3天。在第3天，将培养物用0.5μCi/孔³H-胸苷(Perkin Elmer(NEN))脉冲，并在5小时后收获到玻璃纤维滤垫上。通过液体闪烁计数来测定³H-胸苷掺入。所有改良的抗体中和IL-21依赖性增殖，效力比亲本18A5抗体大(图12a-b，表9；还可见图26e)。

表9：对人原代B细胞增殖的中和

抗体	对B细胞增殖的中和IC₅₀(nM)
		AbQ	0.16
AbR	0.22
		AbS	0.44

AbT	0.14
		AbU	0.13
18A5抗体	1.86

实施例9.10：原代人T细胞增殖测定法

对抗IL-21R抗体测试它们抑制原代人CD4⁺T细胞的IL-21依赖性增殖的能力。来自健康人供体的血沉棕黄层细胞得自Massachusetts General Hospital。使用ROSETTESEP^TM CD4⁺T细胞富集混合物(StemCell Technologies)依照制造商的指令通过负选择来分离CD4⁺T细胞。所得群体为约80-90％CD4⁺/CD3⁺T细胞。将经过富集的人CD4⁺T细胞在调至5％CO₂的37℃温箱中在含有10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺，和HEPES的RPMI中用经抗CD3/抗CD28包被的微球体活化3天。活化后，除去微球体，清洗细胞，并在培养基中以大约1x10⁶个细胞/ml休息过夜。然后再次清洗经过休息的细胞，之后添加至测定板。在平底96孔板中在培养基中制备连续稀释的抗人IL-21受体抗体，接着序贯添加人IL-21(20ng/ml终浓度)和经过活化和休息的CD4⁺T细胞(10⁵个细胞/孔)。然后将板再温育3天，并在测定的最后6小时期间用1μCi/孔³H-胸苷(Perkin Elmer(NEN))脉冲。将细胞收获到玻璃纤维滤垫上，并通过液体闪烁计数来测定³H-胸苷掺入。所有改良的抗体中和IL-21依赖性增殖，效力比亲本18A5抗体大(图13，表10A；还可见图26f)。

表10A：对人原代T细胞增殖的中和

抗体	对T细胞增殖的中和IC₅₀(nM)
		AbO	0.06
AbP	0.02
		AbQ	0.08
AbR	0.04
		AbS	0.06
AbT	0.03
		AbU	0.03
18A5抗体	1.42

实施例9.11：原代鼠T细胞增殖测定法

对抗IL-21R抗体测试它们抑制原代鼠CD8⁺T细胞的IL-21依赖性增殖的能力。自12周龄雌性BALB/C小鼠收集腘、腋窝、臂、和腹股沟淋巴结及脾。使用0.017M Tris(pH 7.4)中的0.16M NH₄Cl对脾细胞的单细胞悬浮液消减红血球。合并脾和淋巴结细胞，并使用鼠T细胞CD8子集柱试剂盒(R&D Systems)富集CD8⁺细胞。将鼠CD8⁺细胞(3x10⁴；在含有10％胎牛血清且补充有0.05mMβ-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和50μg/ml庆大霉素的DMEM中悬浮)分配入96孔抗mCD3活化板(BD Biosciences)；将mIL-21(50ng/ml)添加至所有孔。一式三份地滴定测试抗体，以20μg/ml开始。将细胞在37℃/10％CO₂温箱中培养3天。在培养的最后5小时期间，用0.5μCi甲基-³H-胸苷/孔(GE Healthcare)标记细胞。使用Mach III细胞收集器(TomTec，Hamden，CT)收获细胞，并使用Trilux microbeta计数器(Perkin Elmer)计数。除AbP以外，所有改良的抗体中和IL-21依赖性增殖，效力比亲本18A5抗体大(图14，表10B；还可见图26g)。

表10B：对鼠原代T细胞增殖的中和

抗体	对T细胞增殖的中和IC₅₀(nM)
		AbO	4.92
AbP	无抑制
		AbQ	0.85
AbR	0.13
		AbS	0.02
AbT	0.61
		AbU	1.79
18A5抗体	＞85

实施例9.12：ADCC测定法

对抗IL-21R抗体测试它们在结合靶细胞时诱导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力。实验前那天，如下自血沉棕黄层分离PBMC，即将血沉棕黄层在PBS中1∶1稀释，将其在FICOLL

(GE Healthcare)上铺层，并以1200g离心20分钟。自FICOLL

层的顶部取出PBMC，清洗，并用10ng/ml IL-2和10ng/mlIL-12(R&D Systems)刺激过夜。实验那天，通过离心来收集经过刺激的PBMC，并在培养基中以1x10⁸个细胞/ml重悬浮。将BJAB细胞用0.5μM CFSE(MOLECULAR PROBESInvitrogen Corporation)于37℃标记10分钟，然后用胎牛血清清洗一次，用PBS清洗两次。然后将细胞在100μl培养基中以2x10⁵个细胞/孔分配入96孔平底板。将50μl 4x抗体添加至BJAB细胞，接着是50μl中的5x10⁶个PBMC，给出最终1∶25靶∶效应细胞比。将细胞于37℃温育6小时，并用碘化丙啶(PI)染色以标记死亡的和正在死亡的细胞。通过在FACSCALIBUR^TM流式细胞仪(BD Biosciences)在测量PI染色来评估靶细胞(CFSE+)杀伤。只有一种抗IL-21R抗体，即AbZ，其具有野生型人IgG1恒定区，显示出超出由不结合靶细胞的对照抗IL-13抗体展现的背景水平的ADCC。所有与AbZ具有相同可变域的抗体，包括具有人IgG4的各形式(AbY)，及具有人IgG1的双重突变体(AbX)和三重突变体(AbT)形式的抗体，只显示出背景水平的ADCC(图15)。所有其它测试的抗IL-21R抗体含有人IgG1的三重突变体形式，而且显示出背景ADCC。一种阳性对照抗体，即利妥昔单抗(rituximab，RITUXAN

)，在所有实验中诱导ADCC。

实施例9.13：C1q ELISA

为了确定抗IL-21R抗体的细胞表面结合是否有可能导致补体依赖性细胞毒性(CDC)，在ELISA中对抗体测试它们结合补体成分C1q的能力。将IL-21R抗体和利妥昔单抗(RITUXAN

)在PBS中稀释至5μg/ml。将经过稀释的抗体(100μl)包被到COSTAR

高结合ELISA板(Corning Life Sciences，Lowell，MA)上，于4℃过夜。将板用PBS/Tween 20清洗3次，并用200μl封闭缓冲液(0.1M NaPO₄，0.1M NaCl，0.1％明胶，0.01％Tween)于室温封闭1小时。将先前确定含有C1q的人血清(Quidel，San Diego，CA)在PBS中1∶50稀释。封闭1小时后，清洗板，将100μl经过稀释的血清添加至每个孔，并在摇床上于室温温育2小时。清洗3次后，将100μl 0.1μg/ml鸡多克隆抗人C1q抗体(AbCam，Cambridge，MA)添加至每个孔，并于室温温育1小时。再次清洗板，并与100μl 1∶4000稀释的家兔抗鸡Ig-Y多克隆抗体-HRP(AbCam)一起于室温温育1小时。清洗板，并用TMB显色5分钟，接着用50μl 1M H2SO₄终止反应，然后于450nm读数。只有一种抗IL-21R抗体，即AbZ，其具有野生型人IgG1恒定区，显示出超出由对照抗体展示的背景水平的C1q结合，该对照抗体具有三重突变体人IgG1恒定区，而且先前显示出缺乏C1q结合。所有与AbZ具有相同可变域的抗体，包括具有人IgG4的各形式(AbY)，及具有人IgG1的双重突变体(AbX)和三重突变体(AbT)形式的抗体，只显示出背景水平的C1q结合(图16)。所有其它测试的抗IL-21R抗体含有人IgG1的三重突变体形式，而且显示出背景C1q结合。

实施例9.14：细胞因子竞争测定法

为了证明抗体AbT以与IL-21细胞因子竞争的方式结合鼠IL-21R，实施了细胞因子竞争测定法。将抗体AbT以1μg/ml包被到ELISA板上，然后用PBS/.05％Tween中的1％BSA封闭。将生物素化鼠IL-21R-His/FLAG(1.5ng/ml)添加至各孔，或是单独的或是存在浓度渐增的鼠IL-21，并用HRP偶联的链霉亲合素及随后与TMB检测试剂一起的温育来检测受体对固定化抗体的结合。小鼠IL-21在4ng/ml以上能够近乎完全阻断mIL-21R结合AbT，指示该抗体和该细胞因子竞争结合鼠IL-21R(图27a)。

实施了第二项测定法来证明抗体AbS以与IL-21细胞因子竞争的方式结合鼠IL-21R。在经抗小鼠IgG2a抗体包被的ELISA板上捕捉鼠IL-21R-Fc。将板用PBS中的1％BSA封闭，清洗，并在10μg/ml mIL-21存在下将不同浓度的AbS添加至板。通过HRP偶联的抗His6抗体来检测mIL-21对受体的结合，并通过抗人Ig抗体来检测AbS对受体的结合。大约2μg/ml以上的AbS浓度完全阻止mIL-21结合mIL-21R-Fc，指示该抗体和该细胞因子竞争结合鼠IL-21R(图27b)。

实施例9.15：抗IL-21R抗体对大鼠T细胞增殖的抑制

使用大鼠T细胞富集柱(RTCC-25；R&D Systems)依照制造商的指令将Lewis雌性大鼠脾T细胞纯化至95％CD3⁺。在经1μg抗大鼠CD3抗体(BD Pharmingen Cat# 554829)预包被的平底96孔组织培养板中在培养基(含有10％FCS，L-谷氨酰胺，β-巯基乙醇，非必需氨基酸，丙酮酸钠，青霉素，链霉素，和庆大霉素的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基)中制备连续稀释的抗人IL-21R抗体和同种型对照蛋白质的度，接着添加5ng/ml大鼠IL-21和20,000个CD3T细胞每孔。将细胞在10％CO₂，37℃，增湿的温箱中培养3天。对于培养的最后5小时，用0.5μCi ³H-胸苷(GE Amersham Cat# TRA-120)标记细胞。通过Tomtec Mach III板收集器将板收获到玻璃纤维滤垫上，并在Perkin Elmer 1450 Microbeta计数器上计数。

大鼠T细胞对5ng/ml大鼠IL-21的响应对单独的1μg抗CD3的背景响应6倍。抗体AbS、AbU、AbV、和AbW能够抑制由5ng/ml大鼠IL-21刺激的³H-胸苷掺入(在没有抗体处理的情况中为57,000cpm；图28)。两项独立实验中的中和IC₅₀值显示于表11。

表11：抗IL-21R抗体对IL-21依赖性大鼠T细胞增殖的阻断。

实施例9.16：AbS对家兔IL-21R的结合

为了证明抗体AbS结合家兔IL-21R，将家兔IL-21R的两种同等型的胞外域亚克隆成Fc融合物，并在HEK293细胞中瞬时表达。将家兔IL-21R-Fc(同等型1或同等型2任一)自条件化培养基捕捉到经抗小鼠IgG2a包被的ELISA板上。添加不同浓度的AbS，清洗板，并用HRP偶联的抗人IgG抗体检测抗体结合。AbS显示出清楚的对两种同等型家兔IL-21R-Fc的结合(图29a)。当在10％含有家兔IL-21的条件化培养基存在下进行AbS对家兔IL-21R-Fc的结合时，AbS对任一受体同等型的结合降低了大约10倍，指示AbS与家兔IL-21竞争结合家兔IL-21R(图29b)。

实施例10：改良IgG的体内表征

实施例10.1：在体内用抗IL-21R抗体AbS和AbT中和IL-21R抑制针对T细胞依赖性抗原的IgG抗体应答的生成

IL-21对于B细胞同种型转换成IgG的某些亚类及分化成浆细胞是重要的。如此，为了测定抗IL-21R抗体AbS和AbT的体内功效，在C57BL/6小鼠中测试这些抗体抑制针对T细胞依赖性抗原NP-鸡伽马球蛋白(NP-CGG)的IgM和IgG抗体应答的能力。在用NP-CGG免疫接种前一天开始，每周三次用10mg/kg抗IL-21R抗体或同种型对照处理小鼠。通过ELISA来检测NP特异性IgG和IgM。免疫接种后7天内在用同种型对照处理的动物的血清中易于检测到NP特异性IgM和IgG抗体，而且这些应答的程度升高至第14天(图30b)。在此研究中用AbS或AbT任一处理不影响IgM应答的程度。NP特异性IgG抗体应答在用AbS或AbT处理的细胞中延迟，如第7天与同种型对照相比降低的应答所证明的。第14天NP特异性IgG抗体应答在用同种型对照、AbS和AbT处理的小鼠中是相似的(图30a)。这些数据显示使用AbS或AbT任一进行的体内IL-21R中和能瞬时抑制对针对T细胞依赖性抗原的早期IgG抗体应答的诱导。

测试AbS和AbT的第二项研究也产生相似的结果(图30c-f)。在用AbS或AbT任一处理的小鼠中NP特异性IgG应答在免疫接种的第7天瞬时降低，但是与稍晚时间点用同种型对照处理的小鼠相似。同种型特异性ELISA指示第7天与对照相比AbS和AbT显著降低IgG2b和IgG2c(图30e-f)。这些数据显示使用AbS或AbT任一进行的体内IL-21R中和能瞬时抑制对针对T细胞依赖性抗原的早期IgG抗体应答的诱导。

为了测试IL-21R中和对维持已建立的长期体液免疫的影响，给C57BL/6小鼠免疫接种NP-CGG并休息至少一个月以容许它们生成记忆B细胞和长命浆细胞，它们产生长期IgG血清抗体滴度。免疫接种后大约1个月，每周三次用盐水、或10mg/kg AbS或AbT任一、或同种型对照抗体i.p.处理小鼠，持续两个月。每两周通过ELISA来监测NP特异性IgG血清抗体滴度。免疫接种后1个月，与未接触抗原的C57BL/6小鼠相比，C57BL/6小鼠具有高滴度的NP特异性IgG血清抗体，这与针对NP的长期体液免疫的形成一致。在用同种型对照抗体处理的小鼠中NP特异性IgG血清抗体滴度在研究过程里都维持稳定，而且用AbS或AbT任一处理不影响这些抗体滴度(图30g)。免疫接种后，B细胞生成浆细胞(在骨髓中)，它们产生长期血清抗体滴度。在研究结束时，测量小鼠的骨髓中NP特异性IgG浆细胞的数目，而且细胞数不受AbS或AbT处理的影响(图30h)。这些数据指示在此处理方案中用AbS和AbT中和IL-21R不影响已建立的长期血清抗体滴度的维持。

实施例10.2：抗IL-21R抗体在SLE模型中的功能

在系统性红斑狼疮(SLE)的MRL-Fas^lpr鼠模型中对抗IL-21R抗体AbS和AbT测试它们改善疾病的能力。MRL-Fas^lpr小鼠自发发生类似在人狼疮中观察到的症状，包括循环中高滴度的抗双链DNA(抗dsDNA)自身抗体、肾小球中的免疫球蛋白和补体C3沉积物、肾和肺中淋巴细胞浸润物的存在、及严重疾病中蛋白尿、淋巴结病、和皮肤损伤。雄性MRL-Fas^lpr小鼠得自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，而且自12周龄开始经i.p.注射给予AbS、AbT、盐水、或具有相同三重突变体人IgG1恒定区的对照抗人IL-13抗体，剂量400μg/小鼠(10mg/kg)，每周三次，持续10周。两周一次采集血清样品并通过ELISA来检查抗抗dsDNA抗体。两周一次收集尿液并测试蛋白质(使用蛋白质测试条)；对照动物和处理动物无一发生显著的蛋白尿。还对动物监测淋巴结肿大和皮肤损伤；对照动物和处理动物无一显示异常。处理10周后，处死动物，并通过免疫组织化学对肾和脑切片检查Ig和C3沉积物。通过检查H/E染色的组织切片来测量进入肾和肺的细胞浸润。

自处理后2周开始及持续直至处理后10周，与用盐水或对照抗人IL-13抗体处理的动物相比，用IL-21R阻断性抗体AbS处理MRL-Fas^lpr小鼠显著降低抗dsDNA IgG血清抗体水平(图31)。与用盐水和IL-13对照抗体处理的动物相比(所有对照小鼠具有检测得到的抗dsDNA抗体滴度)，第4周8/10只小鼠中(图31d)、第6周5/10只小鼠中(图31e)、和第8周7/10只小鼠中(图31f)，AbS处理将抗dsDNA抗体降低至检测不到的水平。用IL-21R阻断性抗体AbT处理没有显著影响抗dsDNA IgG血清抗体水平。

图31a显示处理后的抗dsDNA抗体滴度(AbS处理组显著不同于盐水和抗IL-13处理组二者(p＜0.01))。图31b显示预采血抗dsDNA抗体滴度(盐水处理组显著不同于AbS、AbT、和抗IL-13处理组(p＜0.01))。服药2周(图31c)；4周(图31d)；6周(图31e)；8周(图31f)；和10周(图31g)后，AbS处理组显著不同于盐水和抗IL-13处理组二者(p＜0.01)。

与用抗IL-13抗体处理的对照相比，用AbS处理也显著降低Ig和C3免疫复合物沉积和肾病理(p＜0.01)(图32，33)。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体(使用对鼠IL-21没有反应性的抗人IL-13人IgG1 A234 A235 A237突变体抗体作为同种型对照)任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。处理10周后，处死小鼠，并通过免疫细胞化学来鉴定肾中的Ig和C3沉积物。图32描绘如所示处理的MRL-Fas^lpr小鼠的肾中的IgG沉积物(在图32b中，肾小球以虚线圆圈表示，而指示IgG沉积物的扩散染色的例子以白色箭头指示)。对染色强度在1-5的尺度上打分(图32a)。用AbS处理的动物中的肾IgG沉积物显著比用IL-13三重突变体处理的对照中的低(p＜0.01)。图33描绘如所示处理的MRL-Fas^lpr小鼠的肾中的IgM(图33a)和补体C3(图33b)沉积物。对染色强度在1-5的尺度上打分。与抗IL-13对照抗体相比，AbS显著降低肾中的IgM和补体C3沉积(p＜0.05)(图33)。图34描绘处理小鼠的脑中的IgG(图34a)、IgM(图34b)、和C3(图34c)沉积。与用抗IL-13抗体处理的对照相比，用AbS处理的小鼠的脑中的IgG(p＜0.05；图34a)沉积物降低，但是IgM(图34b)或C3(图34c)不然。对染色强度在1-5的尺度上打分。用AbT处理不降低MRL-Fas^lpr小鼠的肾或脑中的免疫复合物沉积(图32-34)。

还在组织学上检查了淋巴细胞进入MRL-Fas^lpr小鼠的肾和肺的浸润。用盐水(对照)或所示三重突变体抗体任一处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。处理10周后，处死小鼠，并对H/E染色的肾和肺切片检查淋巴细胞浸润。在1-5的尺度上对淋巴细胞数打分。在肾中，AbS显著降低皮质-间质(肾小球的支持结构)(图35a)、皮质-血管周围区域(图35b)、和肾盂周围区域(输尿管起点附近)(图35c)这三个区带中的淋巴细胞浸润，但是AbT不然(p＜0.01)。与用盐水处理的和用抗IL-13抗体处理的对照相比，AbS和AbT处理二者显著降低在MRL-Fas^lpr小鼠的肺中测量得到的淋巴细胞数(分别为p＜0.01和p＜0.05，图36)。

总之，这些数据显示在MRL-Fas^lpr小鼠中用AbS处理改善狼疮样疾病，而在此SLE模型中用AbT处理似乎不太有效。为了检查AbS和AbT处理对MRL-Fas^lpr小鼠的功效的差异，通过ELISA对来自这些小鼠的血清检查抗产品抗体应答。用所示三重突变体抗体处理(10mg/kg，i.p.，每周三次)12周龄雄性MRL-Fas^lpr小鼠。通过ELISA对两周一次收集的血清测试能够结合用于处理小鼠的相同人抗体的鼠抗体的存在。MRL-Fas^lpr小鼠早在处理后2周就对所有三种测试抗体生成抗人抗体(MAHA)应答(图37a)。然而，针对AbT或对照抗体的抗产品IgG抗体应答比针对AbS的高超过10倍(对于AbS对IL-13对照，p＜0.05)。不太可能的是AbS CDR序列的免疫原性比AbT的高，因为对于AbS和AbT二者，大多数抗产品抗体识别这两种分子共同的表位(图37b)。

为了检查MRL-Fas^lpr模型中IL-21R中和对疾病发生的剂量依赖性，给8周龄雌性小鼠i.p.施用AbS(10，5或2.5mg/kg剂量)、AbT(20mg/kg剂量)或同种型对照抗体(20，10，5，或2.5mg/kg剂量)任一，每周三次，持续10周。对小鼠测试抗dsDNA血清抗体，并检查蛋白尿、淋巴结病、和皮肤损伤，每两周进行。服药10周后，处死动物，通过免疫组织化学对肾切片检查免疫球蛋白沉积物，并通过检查H&E染色的肾切片来测量免疫细胞浸润物。

在研究开始时MRL-Fas^lpr小鼠具有可检测水平的抗dsDNA IgG抗体，而且这些抗体的滴度在所有处理组中在研究过程里升高。然而，与同种型对照处理的小鼠血清相比，在所有测试剂量(10，5和2.5mg/kg)用AbS处理以剂量依赖性方式显著降低MRL-Fas^lpr小鼠中的抗体滴度(图38a)。AbT(20mg/kg)也降低这些小鼠中的抗dsDNA抗体滴度，但是只在一个时间点(服药第2周)(图38b)。

为了进一步评估MRL-Fas^lpr小鼠中IL-21R中和对疾病发展的影响，对小鼠检查疾病的临床征候。此研究中使用的MRL-Fas^lpr小鼠很少发生皮肤损伤或临床显著的蛋白尿，所以不能评估AbS和AbT处理对疾病这些方面的影响。在所有测试剂量用AbS和AbT处理不影响研究中淋巴结病的发生。然而，在来自用同种型对照处理的小鼠的肾中易于观察到IgG沉积物和免疫细胞浸润物，这与这些小鼠中狼疮肾炎的发生一致。用10mg/kg AbS处理显著降低免疫细胞浸润物的均值数目和肾中的IgG沉积物，而用5和2.5mg/kg AbS处理在此研究中对这些参数没有影响(图38c-d)。在此研究中在以20mg/kg剂量用AbT处理提高免疫细胞浸润物的均值数目，而且不影响MRL-Fas^lpr小鼠的肾中的IgG沉积物(图38c-d)。

实施例10.3：在鼠气袋测定法中IL-21R抗体阻断细胞浸润

在短期鼠气袋测定法中测试了AbS和AbT在体内中和IL-21R功能的能力。通过在背部皮肤下给8-10周龄BALB/C小鼠注射3ml空气来创建气袋。3天后，给袋补气。补气后2天，以所示剂量i.p.注射盐水(对照)或所示抗体任一。抗体注射后24小时将鼠IL-21(100ng)注射入气袋。6小时后，将袋用3mlPBS清洗，并用CELL-DYN

(Abbott，Abbott Park，IL)测定总细胞计数(图39a)、单核细胞(图39b)、淋巴细胞(图39c)、和嗜中性粒细胞(图39d)。

将鼠IL-21注射入气袋导致6小时后气袋中的总细胞(p＝0.0002)、单核细胞(p＝0.0137)、淋巴细胞(p＝0.0035)、和嗜中性粒细胞(p＝0.0004)与盐水相比显著增多(图39a)。用AbS或AbT任一处理导致进入气袋的细胞浸润与用对照IgG1(抗IL-13)处理相比显著减少。与对照IgG相比，AbS(10mg/kg，p＝0.0031；1mg/kg，p＝0.00426)和AbT(10mg/kg，p＝0.0198)二者显著降低总细胞浸润(图39a)。单核细胞浸润显著降低：AbS(5mg/kg，p＝0.0031；2mg/kg，p＝0.0239；1mg/kg，p＝0.0008)和AbT(10mg/kg，p＝0.0002；5mg/kg，p＝0.0066；1mg/kg，p＝0.0009)(图39b)。淋巴细胞浸润也显著降低：AbS(1mg/kg，p＝0.0049)和AbT(10mg/kg，p＝0.0222)(图39c)。AbS(10mg/kg，p＝0.0032)显著降低嗜中性粒细胞浸润，但是AbT不然。

在为了检查AbS和AbT在鼠气袋模型中的能力而进行的第二项研究中获得了相似的结果。在以10(p＝0.0113)、5(p＝0.0027)、和2mg/kg(p＝0.029)施用AbS和以10mg/kg(p＝0.0007)施用AbT时，进入气袋的总细胞浸润显著降低(图39e)。

还检查了AbS对大鼠气袋模型中响应IL-21的细胞浸润的影响以确定这些抗体是否能在大鼠中中和IL-21R。通过给8周龄雌性S-D大鼠将20ml空气注射入背部的皮肤组织来创建袋。3天后，通过另外将10mL空气注射入袋来给袋补气。2天后，给大鼠注射所示量的同种型对照或AbS抗体。次日，将盐水或1-20μg鼠IL-21任一注射入袋，并在6小时后洗出袋内容物并使用CellDyne机器对总细胞计数。

将1μg鼠IL-21注射入气袋不导致显著的进入袋的细胞浸润。然而，施用20μg鼠IL-21导致6小时后与盐水相比气袋中的总细胞增多，而且用10mg/kgAbS处理在这些条件下显著降低IL-21介导的进入袋的细胞浸润(图39f)。为了确定AbS在此大鼠模型中能抑制进入气袋的细胞浸润的最小剂量，实施了别的研究，其中给大鼠施用20μg鼠IL-21及10mg/kg同种型对照或10，3或1mg/kg AbS任一。施用10mg/kg AbS显著减低进入大鼠气袋的细胞浸润(p＜0.05)。在用3mg/kg AbS处理的大鼠中观察到进入气袋的细胞浸润的非显著升高。与用同种型对照处理的大鼠相比，用1mg/kg AbS处理显著增加进入袋的细胞浸润(p＜0.05)(图39g)。这些观察结果在第二项研究中得到重复，其中用10mg/kg处理显著降低由20μg鼠IL-21诱导的进入气袋的细胞浸润(p＜0.05)；在此研究中，用3和1mg/kg AbS二者处理显著增加进入袋的细胞浸润(p＜0.05)(图39h)。

当以低剂量(例如1mg/kg)施用AbS时，用AbS处理显著增加响应IL-21而进入袋的细胞浸润。为了确定以低浓度(1mg/kg)单独施用抗体入袋是否引发进入袋的细胞浸润，实施了另一项研究，其中在没有IL-21处理的情况中用1mg/kg AbS或同种型对照抗体处理大鼠。正如在先前的研究中观察到的，以10mg/kg施用AbS显著降低进入袋的IL-21驱动的细胞浸润(p＝0.0075)，而以1mg/kg施用AbS显著提高进入袋的IL-21诱导的细胞浸润(p＝0.0257)。在没有IL-21处理的情况中以1mg/kg用AbS或同种型对照抗体任一处理不提高进入袋的细胞浸润，指示在此模型中以1mg/kg用AbS处理引发的进入袋的细胞浸润增多依赖于施用鼠IL-21和抗IL-21R抗体二者(图39i)。

为了确定大鼠气袋模型中的细胞增多是否依赖于鼠IL-21剂量(20μg)的施用，进行了一项实验，其中用10，20或40μg鼠IL-21任一及1或10mg/kg AbS任一处理大鼠。用10mg/kg AbS观察到对响应10(p＝0.003)和20μg(p＝0.003)鼠IL-21二者进入袋的细胞浸润的显著抑制。在此研究中用10mg/kg AbS处理不影响响应40μg鼠IL-21的细胞浸润。用1mg/kg AbS处理显著提高响应20μg鼠IL-21进入气袋的细胞浸润(p＝0.0454)，正如先前观察到的。然而，用1mg/kg AbS处理不影响响应10或40μg鼠IL-21任一进入大鼠气袋的细胞浸润，指示在此模型中进入大鼠气袋的细胞浸润增多对于1mg/kg Abs和20μg鼠IL-21的剂量是非常特异性的(图39j)。这些数据指示AbS能影响响应鼠IL-21进入大鼠气袋的细胞浸润，其中在10mg/kg AbS的剂量实现对此响应的抑制。

实施例10.4：静脉内或皮下施用AbS后在CD-1小鼠中的药动学

通过如表13中描述的那样限条件的(qualified)ELISA来测定人抗IL-21R抗体的血清浓度。抗IL-21R ELISA使用单体带His标签的IL-21R作为捕捉试剂，并使用抗人Fc(偶联至辣根过氧化物酶(HRP))作为检测试剂。使用酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)来产生有色终产物以显现结合的测试物。在405或450nm波长处以比色法测量光密度(OD)。通过自使用四参数方程拟合的标准曲线插值来确定样品浓度。

基于均值浓度来计算药动学参数。对于均值和SD的计算，低于IOQ的各浓度值作为零来处理。使用PK软件包WinNonlin(4.1版；Pharsight，Mountain View，CA)的无隔室分析模块(用于i.p.和s.c.服药的模型200及用于i.v.服药的模型201)来确定PK参数。该程序应用一种不依赖模型的办法及Gibaldi和Perrier(Pharmacokinetics(第2版，1982)Marcel-Dekker，Inc.，New York)记载的标准方法。使用线性梯形法来计算血清浓度对时间曲线下面积(AUC)。通过使用至少三个时间点的log线性回归来估算表观末期的斜率，并自斜率推导终末速率常数(λ)。作为AUC_0-t(其中t是最后一个可测量浓度的时间)与C_t/λ的和来估算AUC_0-∞。作为0.693/λ来计算表观清除半衰期(t_1/2)。使用WinNonlin软件通过非参数重叠来进行多剂方案后的浓度预测。

对雄性CD-1小鼠静脉内施用10mg/kg AbS后，AbS的暴露(AUC_0-∞)为7272μg*hr/ml。静脉内施用后的第一个采样时间点的均值浓度(C_5min)为113μg/ml。AbS在CD-1小鼠中的清除是相对较慢的，如约1.4ml/hr/kg的低总身体清除(CL)和162小时(约6.8天)的长清除半衰期(t_1/2)所证明的。稳态分布体积(Vd_SS)为306ml/kg，提示AbS主要局限于血管系统(图40；表14)。

AbS在CD-1小鼠中的药动学在10-100mg/kg剂量范围中表现为线性。给雄性CD-1小鼠静脉内施用100mg/kg AbS后，AUC_0-∞为75792μg*hr/ml，C_5min为1160μg/ml，CL为约1.3ml/hr/kg，Vd_SS为473ml/kg，而清除半衰期为约391hr(约16.2天)(图40；表14)。

给CD-1小鼠s.c.施用10mg/kg AbS后，AbS吸收是较慢的(T_max为48小时)，而皮下生物利用度为81％。皮下施用后的均值t_1/2值为约195hr(约8.1天)，而且与10mg/kg静脉内施用后观察到的相似。

在给CD-1小鼠(n＝8每个时间点每组)i.v.或s.c.施用10mg/kg AbS后576小时(24天)和672小时(28天)使用限条件的免疫测定法来评估抗AbS抗体的存在。使用一种电化学发光顺磁珠测定法来检测抗AbS抗体。在此测定法中，将样品与生物素化AbS一起共温育过夜。将经链霉亲合素包被的顺磁珠与混合物一起温育。与珠一起温育后，将板放置在Bio Veris M系列384分析仪中。施加磁场来将顺磁珠捕捉到表面电极上，并洗去未结合的反应物。通过施加电压电激发珠上捕捉的钌化AbS，导致光的产生。通过光检测器来测量光，其中读出以响应单位(RU)表述。

还使用阳性和阴性对照来确定割点RU，其定义为阴性对照的均值RU的两倍。最初在1∶25和1∶75的稀释度以筛选格式来测试样品。产生的RU大于或等于割点RU的样品认定为阳性，并以完整稀释度系列再分析以确认阳性结果和测定滴度(产生的RU会等于割点RU的稀释度的倒数)。对于阳性样品，报告滴度的对数。最低要求稀释度为1∶25，而检测极限为1.40(25的对数)。因此，阴性样品指派为＜1.40。

在i.v.和s.c.处理组二者中，每组每个时间点(8只中)5或6只小鼠测试呈抗AbS抗体阳性(表15)。大多数具有可检测抗AbS抗体的小鼠具有比在没有抗AbS抗体的动物中观察到的要低的AbS浓度；要注意，一些样品中高水平的AbS会干扰抗AbS抗体的检测。各时间间和各动物物种间抗AbS抗体应答发生及品系/模型的汇总显示于表23。

还在给CD-1小鼠(n＝3每个时间点)i.v.施用100mg/kg AbS后648小时(27天)、984小时(41天)、和1320小时(55天)测试抗AbS抗体的存在。测试的小鼠在这些时间点无一呈抗AbS抗体阳性。

实施例10.5：腹膜内施用AbS后在DBA和MRL-Fas ^lpr 小鼠中的药动学

通过如表13中描述的那样限条件的ELISA来测定人抗IL-21R抗体的血清浓度。抗IL-21R ELISA使用抗人Fc作为捕捉试剂，并使用生物素化抗人Fc作为检测试剂。使用亲合素-HRP和酶底物TMB或2，2’-连氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸酯(ABTS)来产生有色终产物。在405或450nm波长处以比色法测量OD。通过自使用四参数方程拟合的标准曲线插值来确定样品浓度。如实施例10.4中所述来计算PK参数。假设2.5-10mg/kg剂量范围(单剂)中MRL-Fas^lpr和DBA小鼠中的动力学是线性的并使用WinNonlin软件通过非参数重叠来进行多剂方案后的浓度预测。

对雄性DBA小鼠施用单剂i.p.8mg/kg AbS后，AbS的最大血清浓度(C_max)和暴露(AUC_0-∞)分别为62μg/ml和7229μg*hr/ml。AbS的T_max和清除半衰期(t_1/2)分别为6小时和140小时(约5.8天)(图41)。在测试的8只动物中，3只在672小时时发生抗AbS抗体应答，这是使用实施例10.4中描述的顺磁珠测定法确定的(表12)。各时间和物种/品系间抗AbS抗体发生的汇总显示于表23。

表12：给DBA小鼠i.p.施用单剂8mg/kg后的抗AbS抗体形成

发生(hr)	408hr	504hr	576hr	672hr
					阳性	8中0	8中0	8中0	8中3

给雌性12周龄MRL-Fas^lpr小鼠单剂腹膜内10mg/kg后，AbS的最大血清浓度(C_max)和暴露(AUC_0-∞)分别为51μg/ml和2798μg*hr/ml。AbS的T_max和清除半衰期(t_1/2)分别为3小时和46小时(约1.9天)(图41)。

与DBA和CD-1小鼠相比，AbS的剂量标准化暴露表现出在MRL-Fas^lpr小鼠中较低(表14)。这并非完全出乎意料，因为已经报告了正常IgG在MRL-Fas^lpr小鼠中(尤其是具有疾病症状的)和在SLE患者中具有较快的清除(参见Zhou等(2005)Lupus 4(6)：458-66；Newkirk等(1996)Clin.Exp.Immunol.106(2)：259-64；Wochner(1970)J.Clin.Invest.49(3)：454-64)。已经提出小鼠IgG在MRL-Fas^lpr小鼠中的分解代谢过度是由于调节IgG稳态的受体FcRn功能发生疾病诱导的受损(Zhou等(2005)见上文)。由于AbS是人IgG，因此AbS在不同小鼠品系间末期时的清除差异也可以由差异MAHA应答来至少部分解释。

当以2.5，5，或10mg/kg每剂，每周3次，持续10周给MRL-Fas^lpr小鼠i.p.施用AbS时(实施例10.2)，所有剂量组具有与同种型对照(抗人IL-13人IgG1三重突变体)相比显著降低的抗dsDNA抗体滴度。对于2.5和10mg/kg剂量组，通过ELISA来测定AbS的稳态波谷水平。在2和4周时间点，来自2.5mg/kg组的几乎所有测试的样品在血清中具有检测不到的AbS水平(＜34ng/ml)；一份样品具有很低的水平(57ng/ml)。对于10mg/kg组，AbS血清浓度有较高的动物间差异；然而，中值稳态波谷水平比使用来自MRL-Fas^lpr小鼠中单剂研究的PK数据通过模拟而预测的高约3-10倍(图42)。当使用在DBA小鼠品系中获得的单剂i p.数据进行预测时，表现出10mg/kg/剂组中的观察和预测AbS浓度之间的相关性有改进(图42)。并非意图受理论束缚，低剂量组中检测不到AbS水平的一种可能解释是由以低剂量水平多次施用AbS触发的显著的MAHA产生，因为对来自2.5mg/kg/剂组的第2周血清样品测定了抗AbS抗体，而且所有样品具有很高的滴度，超出4.74log滴度单位的定量上限。然而，代替AbS延迟和/或降低IgG应答的预期药理学作用，有可能的是多剂方案下更高剂量的AbS会降低针对其自身的MAHA应答，导致与仅仅基于单剂PK数据预期的相比更高的观察血清AbS浓度。事实上，在MRL-Fas^lpr小鼠中，针对AbS的MAHA应答比经相同多剂方案(10mg/kg，每周三次，持续10周)施用的同种型对照人IgG低约10倍(图37a)。

实施例10.6：AbS在雌性猕猴中的PK

在单次10mg/kg i.v.或s.c.施用后测定AbS在雌性猴中的PK。来自此研究的各动物和均值浓度-时间曲线分别显示于图43a和43b，而且均值PK参数汇总于表14。

通过如表12中描述的那样限条件的ELISA来测定人抗IL-21R抗体的血清浓度。抗IL-21R ELISA使用单体带His标签的IL-21R作为捕捉试剂，并使用偶联有HRP的抗人-Fc作为检测试剂，如实施例10.4中关于CD-1小鼠所描述的。还通过ELISA来测量猴中同种型对照抗体(抗IL-13抗体)的血清浓度。在此测定法中，通过抗FLAG单克隆抗体来捕捉含有FLAG八肽融合标签的重组人IL-13配体。用抗人Fc-HRP来检测含有抗IL-13抗体的血清样品。使用酶底物ABTS来产生有色终产物以显现结合的测试物。使用非隔室方法为各动物计算PK参数。

所有六只以10mg/kg(n＝3，i.v.和s.c.施用路径二者)施用AbS的雌性猴在末期(服药后约408小时)具有AbS水平的急剧下降，提示可能形成抗产品抗体。在有和无观察到急剧下降的时间点的情况中计算10mg/kg组中的消除半衰期值。

给雌性猕猴单次10mg/kg i.v.施用AbS后，均值血清清除(CL)为1.03ml/hr/kg，而均值清除半衰期(t_1/2)为74hr(约3天)。当观察到急剧浓度下降的时间点被排除在计算之外时，均值t_1/2估值为约7.9天。均值稳态分布体积(Vd_SS)较低(约125ml/kg)，提示AbS主要局限于血管系统。AbS的均值暴露(AUC_0-∞)为9728μg*hr/ml。

给猕猴单次100mg/kg i.v.施用AbS后，CL为约1.08ml/hr/kg，t_1/2为279hr(约11.6天)，AUC_0-∞为约92867μg*hr/ml，而Vd_SS为约211ml/kg。如此，一般而言，AbS的PK在10-100mg/kg剂量范围中是大致线性的。

给雌性猴10mg/kg s.c.施用AbS后，AbS的吸收较慢(均值T_max为约34hr)，而均值s.c.生物利用度为约43％。给猴10mg/kg s.c.施用后的均值t_1/2值为52hr(约2.2天)，而且与10mg/kg i.v.施用后观察到的相似。当观察到急剧浓度下降的时间点被排除在计算之外时，均值t_1/2为258hr(约10.8天)。

根据使用实施例10.4中描述的顺磁珠测定法的测定，所有六只以10mg/kg施用AbS的雌性猴自服药后504小时(3周)开始具有可检测的抗AbS抗体(表16)。这些数据与观察到的AbS血清水平急剧下降一致。抗AbS应答在所有后续时间点(直至27周)得到持续。如此，抗AbS抗体应答表现出影响单次10mg/kg i.v.或s.c.施用后AbS在猴中的PK。对于100mg/kg i.v.剂量组，3只猴中的1只在第6周和第8周呈抗AbS抗体阳性，其中log滴度分别为1.8和4.6。

表13：小鼠和雌性猴血清中AbS的ELISA汇总

表14：AbS在小鼠和雌性猴中的均值PK参数

^a为i v路径计算C_5min，或者为i.p.和s.c.路径确定C_max。

^b在排除具有急剧浓度下降的数据点的情况中计算终末半衰期。

NA＝不适用

ND＝未测定

表15：单剂IV或SC 10mg/kg后雄性CD-1小鼠中抗AbS抗体的形成(Log滴度)

^a＜1.40表示阴性结果。

SAN＝研究动物编号

表16：单剂IV或SC 10mg/kg后雌性猕猴中抗AbS抗体的形成(Log滴度)

^a＜1.40表示阴性结果。

SAN＝研究动物编号

实施例10.7：AbT在小鼠中的PK

通过如表17中描述的那样限条件的ELISA来测定人抗IL-21R抗体的血清浓度。对于CD-1小鼠，抗IL-21R ELISA使用单体带His标签的IL-21R作为捕捉试剂，并使用抗人Fc(偶联至辣根过氧化物酶(HRP))作为检测试剂，对于DBA和MRL-Fas^lpr小鼠，使用抗人Fc作为捕捉试剂，并使用生物素化抗人Fc作为检测试剂。如实施例10.4中所述来计算PK参数。假设AbS的2.5-10mg/kg剂量范围(单剂)和AbT的8-20mg/kg剂量范围(单剂)中MRL-Fas^lpr和DBA小鼠中的动力学是线性的并使用WinNonlin软件通过非参数重叠来进行多剂方案后的浓度预测。

对雄性CD-1小鼠i.v.施用10mg/kg AbT后，AbT的暴露(AUC_0-∞)为4551μg*hr/ml(图44a；表18)。i.v.施用后第一个采样时间点的均值浓度(C_5min)为约70μg/ml。AbT在CD-1小鼠中的清除相对较慢，如约2.2ml/hr/kg的低的总身体清除(CL)和210hr(约8.8天)的长的清除半衰期(t_1/2)所证明的。稳态分布体积(Vd_SS)为572ml/kg。对小鼠10mg/kg i.v.施用后，AbT表现出具有与AbS的相应值相比较高的CL(升高约60％)、较低的AUC_0-∞(降低约37％)和较大的Vd_SS(升高约87％)。

对雄性DBA小鼠施用单剂i.p.8mg/kg后，AbT的最大血清浓度(C_max)和暴露(AUC_0-∞)分别为21μg/ml和3320μg*hr/ml(图44c；表18)。AbT的T_max和清除半衰期(t_1/2)分别为1小时和80小时(约3.3天)。对DBA小鼠i.p.施用后，AbT暴露和半衰期与AbS的相应PK参数相比分别降低约54％和43％。

对雌性12周龄MRL-Fas^lpr小鼠施用单剂i.p.10mg/kg后，AbT的最大血清浓度(C_max)和暴露(AUC_0-∞)分别为23μg/ml和957μg*hr/ml(图44b；表18)。AbT的T_max和清除半衰期(t_1/2)分别为6小时和21小时。对MRL-Fas^lpr小鼠i.p.施用后，AbT暴露和半衰期与AbS的相应PK参数相比分别降低约66％和约54％。2周(对AbT观察到抗dsDNA滴度降低的唯一时间点)时，中值AbT水平比使用来自MRL-Fas^lpr小鼠中单剂研究的PK数据通过模拟而预测的高4-5倍，而且与用自DBA小鼠获得的单剂数据通过模拟而预测的相似(图45)。此观察结果与来自AbS 10mg/kg组的一致。并非意图受理论束缚，2周时间点时相对较低的AbT水平(与AbS相比)和稍后时间点时检测不到的AbT水平的一种可能解释是由多次施用AbT触发的显著的MAHA产生及AbT没有能力遏制针对它自身的MAHA应答。

与对AbT描述的结果一致，AbT在MRL-Fas^lpr小鼠中的剂量标准化暴露表现为比DBA和CD-1小鼠中的低(表18)。

与AbS不同，当以10mg/kg或20mg/kg每剂，每周三次，持续10周对MRL-Fas^lpr小鼠i.p.施用AbT时，只观察到有限的对MRL-Fas^lpr小鼠中疾病发生的影响(实施例10.2)。施用AbT(10mg/kg)在所有评估的时间点没有导致显著的抗dsDNA滴度降低。施用20mg/kg AbT导致2周时抗dsDNA滴度的瞬时降低；然而，稍后时间点(4，6，8，和10周)的抗dsDNA滴度与对照没有差异(表19)。对于20mg/kg AbT组，通过ELISA来测定AbT的稳态波谷水平。AbT血清浓度中有较高的动物间差异；然而，一般而言，AbT的中值稳态波谷水平表现出与对中值抗dsDNA滴度的影响具有逆相关(表19)。2周时，中值AbT水平比4周时高约8倍(但是仍然比10mg/kg组2周时的中值AbS水平低)。在稍后的时间点(4，6，8，和10周)，中值AbT波谷水平低于检测极限(约66ng/ml)。2周(对AbT观察到抗dsDNA滴度降低的唯一时间点)时，中值AbT水平比使用来自MRL-Fas^lpr小鼠中单剂研究的PK数据通过模拟而预测的高4-5倍，而且与用自DBA小鼠获得的单剂数据通过模拟而预测的相似(图45)。此观察结果与来自AbS 10mg/kg组的一致。并非意图受理论束缚，2周时间点时相对较低的AbT水平(与AbS相比)和稍后时间点时检测不到的AbT水平的的一种可能解释是由多次施用AbT触发的显著的MAHA产生及AbT没有能力遏制针对它自身的MAHA应答。

实施例10.8：AbT在猕猴中的PK

在单次i.v.(10mg/kg或100mg/kg)或s.c.(10mg/kg)施用后测定AbT在雌性猴中的PK。将来自此研究的均值浓度-时间曲线与AbS的相比(图46a-b)，而且均值PK参数汇总于表18。

通过如表17中描述的那样限条件的ELISA来测定人抗IL-21R抗体的血清浓度。抗IL-21R ELISA使用单体带His标签的IL-21R作为捕捉试剂，并使用偶联有HRP的抗人Fc作为检测试剂，如实施例10.6中描述的。使用TMB来产生有色终产物以显现结合的测试物。如实施例10.6中所描述的，还通过ELISA来测量猴中同种型对照抗体(抗IL-13抗体)的血清浓度。如实施例10.6中所述来计算PK参数。

给雌性猕猴单次10mg/kg静脉内施用AbT后，均值血清清除(CL)为7.01ml/hr/kg，而均值清除半衰期(t_1/2)为约2.6天。AbT的均值稳态分布体积(Vd_SS)为约202ml/kg，而均值暴露(AUC_0-∞)为1476μg*hr/ml(表18)。

给猕猴单次100mg/kg i.v.施用AbT后，CL为约4.87ml/hr/kg，t_1/2为约3.7天，AUC_0-∞为约20955μg*hr/ml，而Vd_SS为约146ml/kg(表18)。10与100mg/kg单剂i.v.后猴中AbT的均值PK参数之间没有显著差异；如此，AbT的PK在10-100mg/kg剂量范围中是大致线性的。

给猴10mg/kg s.c.施用AbT后，均值T_max为约6hr，而均值皮下生物利用度为约43％。给猴10mg/kg s.c.施用后的均值t_1/2值为63hr(约2.6天)，而且与10或100mg/kg i.v.施用后观察到的相似(表18)。

表17：小鼠和雌性猴血清中AbT的ELISA汇总

表18：AbT在小鼠和雌性猴中的均值PK参数

表19：给MRL^lpr小鼠多剂后中值AbS和AbT浓度

抗体(剂量)	2周	4周	6周	8周	10周
						AbS(2.5mg/kg)	0^*	0^*	ND^*	ND	ND

AbS(10mg/kg)	137940^*	196887^*	198707^*	68363	49563
						AbT(20mg/kg)	94456^*	12765	0	0	0

实施例10.9： ¹²⁵ I-D5在DBA小鼠中的药动学

以单剂8mg/kg将¹²⁵I-抗鼠IL-21R抗体D5-20(“D5”)腹膜内注射入未禁食的雄性DBA大鼠。在1-576小时的时间点采集血清样品，并通过测量三氯乙酸(TCA)可沉淀的放射性来定量D5水平。给DBA小鼠i.p.剂量后D5抗体的PK概况与人抗IL-21R抗体的大体相似(表20，图47；还可见表14和18)。

表20：¹²⁵I-D5在雄性DBA小鼠中的药动学参数

	t_1/2(hr)	T_max(hr)	C_max(μg/mL)	AUC_0-∞(μg*hr/ml)
					¹²⁵I-D5	143.9	6	36	5422

实施例10.10：静脉内、皮下、或腹膜内施用抗IL-21R抗体后 Sprague-Dawley大鼠中的药动学

检查给S-D大鼠单剂10mg/kg i.v.后AbS、AbT、AbV、AbU、和AbW以及同种型对照抗体的PK。如关于猴中AbS和AbT所述(实施例10.6和10.8)实施用于测试物血清浓度定量的生物分析测定法、用于检测大鼠血清中抗AbS抗体的测定法、和药动学计算，其中有下述修改：使用S-D血清作为测定稀释剂，而且测试物血清浓度测定法的LOQ为45ng/mL。对于用于同种型对照的ELISA方法，使用抗人Fc抗体作为捕捉和检测试剂二者。

给S-D大鼠单剂10mg/kg i.v.后，抗体AbS缓慢清除(CL约1.6mL/hr/kg)；尽管显著比同种型对照IgG(约0.4mL/hr/kg)快(p＜0.05)。(表21和图48a)。所有大鼠(n＝6)具有AbS血清浓度的急剧下降，使得服药后第15天时及之后检测不到AbS。AbS血清浓度的此下降有可能与所有六只动物中第15天和所有后续时间点检测到的抗AbS抗体的存在有关。应当注意AbS和对照IgG之间大鼠中浓度-时间曲线中的差异不太可能完全由抗产品应答来解释，因为均值血清浓度早至服药后24小时就开始不同，而且在1周时间点差异超过4倍。AbVD的浓度-时间曲线和PK参数紧密类似AbS在大鼠中的。

给大鼠单剂10mg/kg i.v.后，AbT清除比AbS快(CL约2.1mL/hr/kg)，且所得AUC_0-∞低约2倍。所有六只服用AbT的大鼠在末期还具有血清浓度的急剧下降。大鼠中AbU和AbW的浓度-时间曲线及PK参数(诸如AUC_0-∞、AUC_0-240hr、和CL)介于AbS和AbT的之间(图48b)。

表21：10mg/kg i.v.施用后S-D大鼠中抗IL-21R抗体的药动学特性

CL＝血清清除。Vd_SS＝稳态时的分布体积。AUC＝曲线下面积。

a.5分钟(IV施用后第一个采样时间点)时的浓度。

b.所有大鼠中240小时时间点后AbS水平＜LOQ。

c.所有剂量组中的所有动物在168-504小时时期期间具有测试物水平的急剧下降。如此，末期没有很好地限定，而且所得表观t_1/2值是由此浓度下降的发生的差异推动的。因此，t_1/2值没有用于构建物间的PK比较，而且没有显示。

对于AbS，还检查了10mg/kg s.c.和i.p.施用后以及两个剂量水平(1和10mg/mg)i.v.施用后大鼠中的PK。

在给大鼠单次i.v.、s.c.、或i.p.施用后168-504小时，所有动物中的AbS水平有急剧下降(图49)。在i.v.和s.c.组中，360小时直至研究结束(840小时)AbS水平低于测定法的LOQ(45.0ng/mL)。在i.p.组中，自576小时开始直至研究结束检测不到AbS。使用实施例10.4和11中描述的顺磁珠测定法，早至服药后360小时(为抗AbS抗体评估采集的第一个采样时间点)对于所有剂量组在所有动物中检测到抗AbS抗体，并持续直至研究结束(840小时)。到研究结束时，对于所有测试的样品，抗AbS应答的Log滴度达到4.01至＞4.74个单位。如此，AbS的急剧下降有可能与抗AbS抗体的形成有关。

在大鼠中单剂1或10mg/kg i.v.AbS后，平均暴露(AUC_0-∞)分别为470±45或6361±845μg·hr/mL(表22)。单剂1或10mg/kg i.v.AbS后的平均稳态分布体积(Vd_SS)较低(分别为101±24或191±33mL/kg)，提示AbS在i.v.施用用主要分布遍及血管空间并进入有限的细胞外液。1mg/kg和10mg/kg i.v.剂量的AbS的平均清除(CL)分别为2.14±0.21和1.60±0.21mL/hr/kg。1mg/kg和10mg/kg i.v.剂量的平均清除半衰期(t_1/2)分别为40±10和113±24hr。AbS PK参数在i.v.施用于大鼠后在1-10mg/kg剂量范围中与剂量不成比例，因为1和10mg/kg剂量组之间平均剂量标准化暴露(AUC_0-∞/剂量)、CL、和t_1/2显著不同(p＜0.01，不配对t检验)。

给大鼠单剂10mg/kg i.p.AbS后，平均血清AUC_0-∞为3929±979μg·hr/mL，而平均估算生物利用度(BA)为62±15％(其中AUC_0-∞数据来自用于BA计算的10mg/kg i.v.组)(表22)。平均血清C_max为31±14μg/mL，而且在20±9hr的T_max时达到。给大鼠10mg/kg i.p.剂量后，表观终末t_1/2有显著的动物间差异，其中平均值为78±70hr。

给大鼠单剂10mg/kg s.c.AbS后，平均血清AUC_0-∞为1595±456μg·hr/mL，而平均估算BA相对较低，为25±7％(其中AUC_0-∞数据来自用于BA计算的10mg/kg i.v.组)(表22)。平均血清C_max为8±1μg/mL，而且在77±26hr的T_max时达到。给大鼠10mg/kg s.c.剂量后，表观终末t_1/2也有显著的动物间差异，其中平均值为88±78hr。

表22：单个i.v.、i.p.、或s.c.剂量后S-D大鼠中AbS的均值(±SD)药动学参数

NA＝不适用。

注意：为每只动物计算PK参数。

a.为第1组和第2组显示了C_5min，i.v.施用后第一个采样时间点时的浓度。为第3组和第4组显示了C_max。

b.为第1组(10mg/kg，IV)使用AUCtion计算BA，i.p.或s.c.施用后的生物利用度。

c.来自第1组的统计学显著差异(p＜0.01)。

所有动物(包括S-D大鼠)中抗AbS抗体应答发生的汇总汇总于表23。

表23：给小鼠、大鼠、和猴单剂AbS后抗AbS抗体应答的发生

实施例11： ¹²⁵ I-AbS在野生型对照(C57BL/6)、IL-21R敲除、和MRL-Fas ^lpr 小鼠中的药动学和生物分布

实施例11.1： ¹²⁵ I标记

使用IODO-BEADS法(Pierce，Rockford，IL)依照制造商的指令实施碘化，并通过过滤来纯化。简言之，将约100-200μg测试物与1-2mCi ¹²⁵I(PerkinElmer)、3颗IODO-BEADS、和约100-200μl PBS一起温育25分钟。将反应混合物与IODO-BEADS分开，并转移至Centricon过滤装置(10kD截留，Millipore)。如下实施纯化，即添加约5-10ml PBS(以1-2mL等分)并以2,000Xg旋转直至过滤装置上室中的体积降至约200-500μl。

如下制备剂量给药溶液，即组合未标记测试物的储存液、配制缓冲液、和¹²⁵I示踪剂。使用还原和非还原SDS-PAGE来分析剂量给药溶液的纯度。在给第一分组的动物剂量给药前一天一次制备剂量给药溶液。

实施例11.2：血清中放射性当量浓度的测定

通过伽马计数(1480 WIZARD^TM，Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)来测定50-100μl血清样品(一式两份)中的总放射性(以计数每分(counts per min，cpm)来表述)。将等体积的20％TCA(三氯乙酸)添加至每个等分试样，并将样品以约12,000rpm旋转10分钟。通过伽马计数来测定上清液(体积等于用于总放射性计数的样品体积)中的TCA可溶性放射性。使用下述公式使用给定样品中的TCA可沉淀放射性[总cpm-2x TCA-可溶性cpm]、剂量给药溶液的比活性(cpm/ng)、以及样品(t_S(天))和剂量给药溶液(t_D(天))的日期测量来计算给定样品中的放射性当量浓度(ng eq/ml)：[平均TCA-可沉淀cpm/EXP(-0.693/60.2x(t_S-t_D)]/[比活性x样品体积]。

实施例11.3：尿液中累积总计数(作为剂量计数的百分比)和游离 ¹²⁵ 碘分数的确定

使用下述公式使用总计数来计算每个收集期的尿排泄(作为％剂量的排泄cpm)：[100％x尿cpm/EXP(-0.693/60.2x(t_S-t_D))]/[比活性x剂量]。尿中的累积放射性(作为％剂量的累积排泄cpm)定义为自时间0至所示时间点的尿排泄(cpm，作为％剂量)之和。

为了确定TCA可溶性放射性的分数，将50μl尿等分试样与50μl正常小鼠血清混合(得到100μl样品)，并通过伽马计数来分析。将100μl等分试样的20％TCA添加至每份100μl样品，并将200μl样品以约12,000rpm旋转10分钟。通过伽马计数来测定100μl上清液中的TCA可溶性放射性。使用下述公式来获得游离碘的分数：[2x 100％x 100μl上清液中的TCA可溶性/50μl尿中的总cpm]。

实施例11.4：生物分布分析

将组织样品放置入预称重的管，称重以测定以克计的组织重量，并对总放射性(cpm)计数。对放射性当量组织浓度(ng eq/g)的定量使用下述公式基于组织中的总放射性和¹²⁵I半衰期修正后剂量给药溶液的比活性(cpm/ng)：[样品cpm/EXP(-0.693/60.2x(t_S-t_D)]/[比活性x样品重量]。

使用组织中放射性当量浓度(μg eq/g)对血清中放射性当量浓度(μg eq/ml)之比来计算给定时间点时给定组织的组织对血清浓度比(T/S)。使用下述公式来计算作为％剂量的总组织计数：[100％x样品cpm/EXP(-0.693/60.2x(t_S-t_D)]/[比活性x剂量]。

实施例11.5：2.5mg/kg静脉内剂量后对照和IL-21R敲除小鼠中的药动学和生物分布

自单剂2.5mg/kg i.v.¹²⁵I-AbS后10-14天开始，野生型C57BL/6(对照)小鼠中的均值AbS血清水平相对于IL-21R敲除小鼠中的有下降(图50c)。在第14天(336小时)，60％的对照(n＝10)和0％的IL-21R敲除小鼠(n＝10)具有检测不到的或很低水平的AbS。第20天(480小时)后，所有对照小鼠的血清中没有可检测的AbS水平。在IL-21R敲除小鼠中，晚至服药后第36天(864小时)即最后一个采样时间点血清中检测到AbS。对照与IL-21R敲除中¹²⁵I-AbS浓度-时间曲线的差异表现为是由于这些两种小鼠品系中抗AbS应答的可能差异。在5周时间点，约55％的(9份中的5份)野生型血清样品和无一IL-21R敲除血清样品在抗AbS抗体测定法中测试呈阳性。

在对照小鼠中，总身体清除(CL)为约1.3ml/hr/kg，而且清除半衰期(t_1/2)为120hr(约5.0天)。在IL-21R敲除小鼠中，CL为约0.7ml/hr/kg，而t_1/2为256hr(10.7天)(表14)。因而，在2.5mg/kg i.v.剂量后，IL-21R敲除小鼠具有比对照高的血清暴露(AUC_0-∞)(表14)。

一般而言，对于对照和IL-21R敲除小鼠二者，与其它检查的组织相比，最高的¹²⁵I-AbS浓度见于血清(图50a和50b；表24和25)。然而，在最后一个组织采样时间点(864hr)，可检测的¹²⁵I-AbS水平见于对照小鼠的组织，血清则不然。

根据对照与IL-21R敲除小鼠之间AbS血清水平的差异，自服药后约2周开始，对照中的组织AbS放射性当量浓度比IL-21敲除的低(图50)。同样，对照小鼠(约90-165小时)中的组织清除半衰期(t_1/2)比IL-21R敲除小鼠(约230-270小时)的组织中的短。因而，对照小鼠中的组织暴露(AUC_0-∞)比IL-21R敲除小鼠中的低(表26)。。如此，给IL-21R敲除小鼠2.5mg/kg i.v.剂量的¹²⁵I后，血清和组织二者中的暴露比对照的高。

表24：给C57BL/6小鼠单剂静脉内2.5mg/kg ¹²⁵I-AbS后均值(±SD)组织对血清(T/S)放射性当量浓度比

	1hr	48hr	168hr	336hr
					脂肪	0.0099±0.0062	0.0849±0.0289	0.0619±0.0144	0.2316±0.2619
股骨	0.0360±0.0126	0.1203±0.0124	0.1108±0.0140	0.6979±1.0550
					心	0.0776±0.0109	0.1588±0.0143	0.1122±0.0123	0.3837±0.4993
肾	0.1293±0.0311	0.2497±0.2105	0.0957±0.0215	0.6350±0.8669
					大肠	0.0122±0.0056	0.0760±0.0127	0.0466±0.0078	0.2102±0.2544
肝	0.1600±0.0770	0.1342±0.0679	0.1206±0.0717	1.1834±1.4455
					肺	0.1968±0.0863	0.2522±0.0714	0.1462±0.0776	1.3408±2.4852
淋巴结	0.0314±0.0163	0.1554±0.0333	0.1504±0.0542	3.7491±5.7164
					骨骼肌	0.0099±0.0048	0.0789±0.0108	0.0724±0.0064	0.2461±0.3171
皮肤	0.0243±0.0195	0.3125±0.0327	0.3145±0.1155	1.4147±1.6123
					脾	0.2450±0.0289	0.2043±0.0403	0.1470±0.0232	2.2414±3.4892
胃	0.0471±0.0530	0.0791±0.0249	0.0674±0.014	0.4292±0.5801
					胸腺	0.0215±0.0117	0.0842±0.0174	0.0590±0.0125	0.2794±0.3901

低于定量极限(LOQ，定义为背景cpm的3倍)的各数值在计算均值和标准偏差(SD)时作为“0”处理。

没有为336小时后的时间点(480和864小时)计算T/S，因为血清浓度低于检测极限。

表25：给IL-21R敲除小鼠单剂静脉内2.5mg/kg ¹²⁵I-AbS后均值(±SD)组织对血清(T/S)放射性当量浓度比

	1hr	48hr	168hr	336hr
					脂肪	0.0063±0.0022	0.0718±0.0353	0.0856±0.0475	0.0885±0.0381
股骨	0.0327±0.0069	0.1283±0.0555	0.1169±0.0104	0.1238±0.0217
					心	0.0733±0.0152	0.1569±0.0172	0.1526±0.0213	0.1681±0.0315
肾	0.1491±0.0417	0.1570±0.0218	0.1588±0.0347	0.1687±0.0417
					大肠	0.0112±0.0034	0.0666±0.0133	0.0612±0.0111	0.0568±0.0122
肝	0.1550±0.0466	0.1434±0.0706	0.1190±0.0549	0.0784±0.0282
					肺	0.3495±0.1671	0.2722±0.0529	0.1178±0.0707	0.2510±0.1016
淋巴结	0.0224±0.0096	0.1337±0.0369	0.1215±0.0345	0.1118±0.0384
					骨骼肌	0.0068±0.0016	0.0663±0.0077	0.0761±0.0115	0.1227±0.1479
皮肤	0.0185±0.0029	0.2716±0.0315	0.3244±0.0607	0.3593±0.1247
					脾	0.2682±0.0425	0.1943±0.0304	0.1809±0.0322	0.1846±0.0483
胃	0.0318±0.0151	0.0617±0.0165	0.0689±0.0237	0.0724±0.0174
					胸腺	0.0206±0.0099	0.0929±0.0178	0.0979±0.0127	0.1049±0.0233

表26：单剂静脉内2.5mg/kg后C57BL/6和IL-21R敲除小鼠的组织中¹²⁵I-AbS暴露

脂肪	0.66	48	120	0.64	48	236
							股骨	0.93	48	213	1.17	48	370
心	1.79	1	258	1.97	1	501

肾	3.06	1	352	4.07	1	573
							大肠	0.59	48	105	0.61	48	181
肝	3.77	1	317	4.24	1	419
							淋巴结	1.21	48	303	9.88	1	882
肺	4.84	1	447	1.21	48	357
							骨骼肌	0.61	48	128	0.60	48	238
皮肤	2.44	48	567	2.48	48	939
							脾	5.77	1	454	7.20	1	706
胃	0.78	1	163	0.81	1	222
							胸腺	0.65	48	141	0.85	48	320
血清	29	NA	1927	32	NA	3415

^a为血清显示C_5min，即第一个采样时间点时的浓度。组织采样时间点为：1，48，168，336，480，和864hr。

实施例11.6：2.5mg/kg腹膜内剂量后MRL-Fas ^lpr 小鼠中的药动学和生物分布

给雌性MRL-Fas^lpr小鼠(约10-12周龄)单剂i.p.2.5mg/kg ¹²⁵I后，血清浓度-时间曲线是两阶段的，显示服药后第一周期间相对较慢的AbS水平下降(t_1/2约54hr)和服药后5天后较快的下降(t_1/2约12hr)，提示抗AbS抗体的形成(图51a和52)。事实上，处于312小时时间点的4只小鼠中的4只和处于408小时时间点的4只小鼠中的4只测试呈抗产品抗体阳性(其中相对中值滴度分别为约4.01和约4.43个log滴度单位)。一剂2.5mg/kg i.p.¹²⁵I后，AbS的最大血清浓度(C_max)和暴露(AUC_0-∞)分别为12mg eq/ml和823mg eq·hr/ml。如此，给MRL-Fas^lpr小鼠单剂i.p.后，PK在2.5-10mg/kg剂量范围中是大致线性的(图52；表14)(还可见实施例10.4)。对10天时间点评估MRL-Fas^lpr小鼠中的¹²⁵I-AbS尿计数(图51b)。

单剂2.5mg/kg i.p.后第一周期间(有可能在抗产品抗体形成之前)，所有检查的组织中的最高AbS浓度见于血清。第一周后，血清浓度下降比组织中的AbS下降更快速，所以T/S浓度比显著高于1(表27)，而且组织中的AUC_0-∞为约90-300mg eq·hr/ml(表28)。在组织中，表观清除半衰期(基于24-312小时数据集计算得出的)为约40-55hr。组织中保持相对较低的(但是仍然可检测的)放射性水平直至研究结束(服药后7周(图51a)。

表27：给MRL-Fas^lpr小鼠单剂IP 2.5mg/kg ¹²⁵I-AbS后均值(±SD)组织对血清(T/S)放射性当量浓度比

	24hr	72hr	168hr	240hr
					脂肪	0.321±0.073	0.233±0.070	41.125±69.735	71.500±131.496
肾	0.195±0.026	0.202±0.036	9.831±6.787	56.205±25.079
					肝	0.104±0.028	0.091±0.032	8.067±5.587	16.820±6.892
肺	0.177±0.074	0.159±0.070	7.621±6.512	20.127±12.783
					淋巴结	0.197±0.055	0.141±0.020	5.490±3.707	22.497±16.812
皮肤	0.318±0.023	0.305±0.056	12.237±8.734	50.869±59.413
					脾	0.166±0.022	0.105±0.020	9.648±6.834	50.418±33.424

没有为240小时后的时间点计算T/S，因为大多数小鼠中的血清浓度低于检测极限。

表28：单剂2.5mg/kg IP后MRL-Fad^lpr小鼠的组织中¹²⁵I-AbS暴露

组织采样时间点为：24，72，168，240，312，528，864，和1176hr。

实施例12：抗IL-21R抗体在人血中的抑制特性

实施例12.1：人全血对IL-21的激动性响应被抗IL-21R抗体离体处理中和

人全血采自人血液捐献计划(Cambridge，MA)。在BD Vacutainer^TM CPT^TM细胞制备管中收集所有人血液样品。收集管装有肝素钠。将样品维持于环境温度并立即加工。将血液在冷冻管中分成1至2mL等分试样，用IL-21、AbS、或对照蛋白质处理。当用抗体和IL-21二者处理样品时，在抗体之后立即添加IL-21。然后将样品在Forma Scientific Reach In Incubator Model #3956中于37℃温育4小时，同时温育期间使用Appropriate Technical Resources Inc(ATR)Rotamix(产品目录号RKVS)旋转混合仪(serial #0995 52和#0695 36)或使用LabquakeTube Shaker/Rotator(产品目录号400110)以15RPM持续混合。使用带ART 1000E尖头(产品目录号72830-042)的Gilson P1000移液器取出等分试样(0.5mL)，并添加至装有1.3mL与Human RiboPure^TM-血液试剂盒(Ambion，Austin，TX；产品目录号AM1928)一起提供的RNAlater

的2.0mL微量管(Axygen Scientific，产品目录号10011-744)，并通过五次完全倒置来彻底混合。将样品于环境温度保存过夜，然后于-80℃冷冻未完的RNA纯化。

使用Human RiboPure^TM血液方案(Ambion，产品目录号AM1928)分离RNA。Human RiboPure^TM RNA分离规程包括在基于胍的溶液中裂解细胞，通过酚/氯仿提取来初步纯化RNA，及通过玻璃纤维滤器上的固相提取来最终纯化RNA。使用试剂盒中提供的DNA free^TM试剂依照制造商关于DNA酶处理的指令除去残余的基因组DNA。对于所有样品，用NanoDrop 1000(NanoDrop，Wilmington，DE)通过260nm处的吸光度来测定RNA数量。使用2100 Bioanalyzer(Agilent，Palo Alto，CA)点查RNA质量。将样品保存于-80℃直至实施cDNA合成。

依照制造商的指令，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI，产品目录号4368814)及每份样品50U另外的RNA酶抑制剂(ABI，产品目录号N808-0119)自总RNA逆转录cDNA。将cDNA样品保存于-20℃直至实施RT-PCR(实时PCR)。使用一项实验内获得的最低RNA产量来确定在Taqman

低密度阵列卡上加载的cDNA量。在ABI PRISM 7900序列检测仪(序列检测仪软件v2.2.2，Applied Biosystems)上使用通用热循环条件50℃2min，95℃10min，然后40个循环的95℃15sec和60℃1min来测定cDNA样品。

为了检查IL-21的离体效果，进行实验来测试人全血是否以基因表达水平的可检测变化来响应IL-21。在有和无IL-21的情况中温育来自人供体的全血，并使用TLDA卡测定RNA水平。使用两种不同的TLDA来测量RNA表达水平。第一种，人免疫TLDA(ABI，产品目录号4370573)测试96种基因，其中91种在经过刺激的人血中可检测到。使用来自人供体全血、经LPS或PHA刺激的PBMC作为阳性对照。为了测试IL-21R响应IL-21刺激的上调，使用含有IL-21R基因的定制设计TLDA来获得结果。

在选定测定条件下测试的四个人的全血样品中观察到的7项最一致的IL-21依赖性基因表达变化的数据显示于表29。对IL6、IFNγ、CD19、PRF1、IL10、IL2Rα、和GNLY观察到显著的对IL-21的响应。有趣的是，30ng/mL、100ng/mL和500ng/mL浓度的IL-21处理产生相似的结果(表29)。

表29：人全血样品中的IL-21依赖性基因表达变化

倍数变化是通过处理组的RQ除以对照组的RQ来计算的。成对T检验值是使用RQ值并将来自每个人的对照和处理值配对来计算的。

为了确定AbS是否对人细胞的IL-21/IL-21R依赖性活化具有期望的阻断活性，以人供体之一测试了此抗体阻断全血中IL-21依赖性活化的能力。图53a-b显示该抗体对IL-21响应性基因的IL-21依赖性活化的有效抑制(与Hu IgG1对照相比)。

这些结果限定了用于测量人全血样品中对IL-21的响应的方法；如此，此测定法可用于检测实验或临床设置中抗IL-21R抗体对IL-21依赖性活化的抑制，因为该测定法需要的血不超过例行采血，而且涉及最低限度的离体操作。

实施例12.2：测量AbS在人全血中的PD活性的测定法

这些研究中使用了总共5名健康人供体。在装有肝素钠(产品目录号362753)的BD Vacutainer^TM CPT^TM细胞制备管中收集所有人全血样品。人全血采自人血液捐献计划(Cambridge，MA)。将样品维持于环境温度，而且除非另有说明，在收集后1小时内加工。当用免疫球蛋白试剂和IL-21处理样品时，在免疫球蛋白试剂之后添加添加IL-21。将样品在Forma Scientific Reach-In Incubator Model #3956中于37℃温育所述持续时间，同时温育期间使用Appropriate Technical Resources Inc(ATR)Rotamix(产品目录号RKVS)旋转混合仪(serial #0995-52和#0695-36)或使用Labquake

Tube Shaker/Rotator(产品目录号400110)以约7RPM持续混合。随后，取出0.5mL每份样品并添加至装有1.3ml与Human RiboPure^TM-血液试剂盒(Ambion，产品目录号AM1928)一起提供的RNAlater

的2.0mL微量管(Axygen Scientific，产品目录号10011-744)，并通过五次完全倒置来彻底混合。遵循实施例12.1中描述的规程，加工样品以分离和定量RNA产量，并合成cDNA；并将200ng cDNA加载到包含图54所示24种基因(19种测试基因和5种内源对照基因，测试基因的RNA表达水平已经观察到在用IL-21刺激后在人全血中有变化)的定制TLDA板上。

为了定量RNA表达水平，使用来自数种内源对照(图54中的GAPDH、GUSB、ZNF592、和PGK1)的平均实时PCR阈循环(Ct)值作为“标准化物”，因为这些基因的表达在处理时没有变化，而且基因在所有样品间产生最一致的Ct值。使用实验对照(不添加AbS和不添加IL-21)的平均Ct值作为“修正物”。基因在给定样品中的表达以该样品的基因Ct-内源对照平均Ct(样品ΔCt)来计算。基因表达值(ΔΔCt)以样品ΔCt-修正物ΔCt来计算。相对定量(RQ)或倍数变化以2^-ΔΔCt来计算。

为了确定产生最大信号的IL-21处理最佳时间和剂量，在3.3、10或30ng/ml IL-21存在下将来自5名健康供体的全血样品温育2、4、6或24小时。分离RNA并测量基因表达水平。对六种基因观察到显著且有力的IL-21依赖性信号：IL6、IFNγ、IL2Rα、GZMB、PRF1、CD19。除CD19外，最佳信号都是在2小时时获得的(图55)。以3.3、10或30ng/ml IL-21获得的响应中有少许差异。对离体IL-21处理的响应在所有5名供体间是一致的(数据未显示)。基于对这5名供体获得的结果，选择用来滴定AbS对离体IL-21响应的抑制效果的测定条件为：用10ng/ml IL-21刺激2小时。最可靠的IL-21响应性基因是GZMB、IFNγ、IL-21RA、IL-6、和PRF1。

为了确定最佳阻断IL-21效果的AbS剂量，将来自4名供体的样品以所示浓度的AbS和IgGTM(二者在PBS中稀释)预温育2小时，之后添加10ng/mlIL-21。添加IL-21后，将样品再温育2小时。

添加0.1μg/mL AbS导致完全抑制，所以将0.003μg/mL AbS用于后续实验。AbS抑制所有4名供体中所有6种测试基因的响应，但是IgG1TM不然，如图56a-c中展现的。所有6种基因的IC₅₀呈现于表30。

表30：AbS对全血中IL-21响应信号的抑制活性

CD19

GZMB

IFNG

IL2Rα

IL6

PRF1

IC₅₀(μg/mL)

0.007

＜0.003

0.015

0.002

0.005

0.007

如图56中展现的，浓度低至0.03μg/mL(200pM或6x10⁴分子/细胞)的AbS成功阻断10ng/mL IL-21对基因表达的影响。此抑制在AbS的浓度降低至≤0.003μg/mL(20pM)时减低。GZMB、IFNγ、IL-2Rα、IL-6、和PRF1是2小时时IL-21R/IL-21和抗体活性的可靠血液生物标志物；然而，所有6种基因(GZMB、IFNγ、IL-2Rα、IL-6、PRF1、和CD19)被鉴定为IL-21R/IL-21活性的有用人血液生物标志物。此外，10ng/mL IL-21在该测定法中显示出降低TBX-21基因的基因表达，而且此降低被0.03μg/mL AbS完全逆转(数据未显示)。

实施例13：AbS和AbT在雄性猕猴中的PK和PD

实施例13.1：AbS和AbT研究的动物选择

该研究中使用的动物未接触过蛋白质，而且基于剂量给药前在全血离体测定法中用重组人IL-21刺激获得的结果被选择来包括在研究中。

具体而言，对于雄性猴，将全血样品(0.5-1.5mL)放置在无菌、无核酸酶的2mL微量离心管(Axygen，产品目录号1011-744)中，并在平台摇动器上用媒介(10mM L-组氨酸，5％蔗糖)、50ng/mL重组人IL-21(rhuIL-21)、50ng/mL rhuIL-21及30nM IgG对照抗体、或50ng/mL rhuIL-21及30nM抗IL-21R抗体于37℃处理4小时。对于雌性猴，将全血样品(0.5mL)用媒介或20ng/mL rhuIL-21任一处理。通过Ficoll法依照制造商的指令(GE Healthcare，Ficoll-PaqueTM plus)分离血液样品中的外周血单个核细胞并在PBS中清洗一次。

使用RiboPure^TM-血液试剂盒(Ambion，产品目录号AM1928；雄性)或RNeasy试剂盒(Qiagen，雌性)依照制造商的指令实施RNA分离。使用NanoDrop 1000A分光光度计(NanoDrop，Wilmington，DE)测定RNA产量，并使用2100 Bioanalyzer(Agilent，Santa Clara，CA)评估RNA质量。将RNA浓度调整至28ng/mL(雄性)或20ng/μL(雌性)。

对于雄性猴，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，产品目录号4368814)依照制造商的指令用700ng RNA实施cDNA合成，并使用为检测猕猴基因而设计的Wyeth定制TLDA卡(Applied Biosystems，part #4342249)。将每份cDNA合成反应与TaqMan2x PCRMaster混合物(Applied Biosystems，产品目录号4304437)混合，并将100μL加载到TLDA卡上。依照制造商的指令加工TLDA卡，并使用ABI Prism7900HT序列检测系统实施扩增。用于每次运行的循环参数如下：50℃2min，95℃10min，和40个循环的95℃15sec接60℃1min。循环阈(C_T)使用序列检测软件(2.3版，Applied Biosystems)来计算。

对于雌性猴，只使用经预先验证的针对IL-2Rα的引物和探针实施了IL-2Rα的TaqMan定量RT-PCR(Applied Biosystems；IL-2Rα引物和探针与用于雄性猴的定制TLDA中的相同)。

对于雄性和雌性二者，然后使用德尔塔德尔塔Ct(ΔΔCt)法来计算基因表达的相对定量(RQ)，其中RQ＝2^-ΔΔCt。锌指蛋白592(ZNF592，雄性)或蛋白激酶G-1(PKG1，雌性)用作内源对照，而媒介对照样品用作RQ计算的修正物。RQ值大于或等于1.5的样品认定为具有比相应媒介对照样品高的基因表达。

其血液显示出数种免疫功能相关基因的表达在用IL-21离体刺激时比媒介高(RQ≥1.5)的雄性猴被选择来包括在此项研究中。表31显示了被选择来进行下文所述进一步研究的9只猴(以动物编号代表)的5种基因(IL-2Rα、IL-21R、PRF1、GZMB、和IL-6)的RQ值。分组编号(A-C)代表选定动物在后续实验中是用AbS(A组)、AbT(B组)、或IgG对照(C组)中哪项处理的。动物10-13没有被选择来进行进一步研究。

表31：向自雄性猕猴获得的全血离体添加IL-21诱导的基因表达的相对定量(RQ)

组；动物编号	IL-2Rα	IL-21R	PRF1	GZMB	IL-6
						A；1	2.8	2.5	2.8	2.0	4.2
A；2	3.4	2.3	1.2	1.1	1.7
						A；3	5.5	2.9	2.5	1.4	3.6
B；4	4.1	2.1	2.5	1.1	4.9
						B；5	5.3	3.2	2.1	2.1	4.1
B；6	2.8	1.8	1.8	2.0	0.5
						C；7	6.3	1.9	2.4	1.9	2.6
C；8	2.2	1.8	1.6	1.6	6.7
						C；9	3.8	2.0	1.9	2.2	1.2

10	2.9	1.8	0.7	1.0	0.9
						11	7.7	3.4	2.6	2.2	2.8
12	4.5	3.6	1.4	1.5	1.1
						13	2.1	1.5	1.1	1.2	1.4

测定出IL-2Rα在所评估基因的IL-21诱导基因表达中具有最大程度(RQ最高)且最一致的变化(RQ＞1.5的动物百分比最高)，并因此认定为用于评估抗IL-21R抗体的药效学(PD)活性的最佳单基因。来自体内研究中包括的所有猴的全血样品在用IL-21离体刺激后具有大于1.5的IL-2RαRQ值。然而，观察到IL-2RαRQ值的显著动物间差异，其中该值的范围为2.8至6.3。

为了获得更大数目的样品来表征离体测定法中对rhuIL-21的IL-2Rα响应的分布，自另外24只雌性猕猴获得血液样品，用rhuIL-21离体刺激，并通过使用定量RT-PCR法来分析IL-2Rα基因表达对这些猴没有分析IL-21R、PRF1、GZMB、和IL-6表达)。雄性与雌性猴之间IL-2RαRQ分布没有显而易见的差异(均值±SD RQ值分别为3.8±1.7和3.0±1.9)，并使用n＝37的组合数据集实施了后续IL-2RαRQ分布分析。所有测试的猕猴在用rhuIL-21离体刺激后具有大于或等于1.5的IL-2RαRQ值。中值IL-2RαRQ值(n＝37)为3.2，而范围为1.5-8.1。

对在基线时自37只猴获得的IL-2Rα表达RQ值进行log换算，并在Shapiro-Wilk和D′Agostino & Pearson正态检验(GraphPad Prizm 5，GraphPad Software Inc)中检验RQ和log{RQ}值的分布。RQ分布的正态假设被否决(p＜0.05)，但是log{RQ}分布不然(Shapiro-Wilk检验p＝0.16；而D′Agostino & Pearson检验p＝0.48)。使用GraphPad Prizm 5软件将经log换算的RQ值拟合入正态分布(R²＝0.69)。所有37只猴(n＝13只雄性；n＝24只雌性)在离体测定法中获得的IL-2RαRQ值和RQ值的log换算(log2)的分布分别显示于图57a和57b。IL-2RαRQ值的分布表现出是大致log正态的，而且通过了正态检验。猕猴中用抗IL-21R抗体进行的进一步药效学(PD)研究的准入标准限定为2.3，其基于以下公式：log{RQ_割点}＝经log换算的RQ值的均值-经log换算的RQ值的标准偏差。如此，IL-2RαRQ值分布大于2.3的动物认定为对IL-21刺激的好响应者。RQ值大于2.3的动物(～81％；37只中的30只)定义为好响应者，而且认定为满足抗IL-21R抗体的PD研究的准入标准。

为了确认IL-21诱导的基因表达依赖于猕猴IL-21R的卷入，将猴血样品与IL-21和抗IL-21R抗体(AbT；30nM)同时温育，之后进行RNA分离和基因表达分析。正如预期的，在全血测定法中与IL-21同时离体添加AbT强烈抑制IL-21诱导的基因表达变化(即RQ值＜1.5；图57c)。

实施例13.2：体内实验的研究设计

给在离体药效学(PD)全血测定法(实施例12.1中描述的)中鉴定为IL-21刺激响应者的9只雄性未接触蛋白质的猕猴服用10mg/kg AbS(A组)、AbT(B组)、或IgG对照抗体(C组)，每组3只动物。将剂量i.v.施用(输注速率为约4mL/min)入隐静脉，剂量体积2.5mL/kg。

将用于测定PD活性的血液样品(约7.0mL)(所有三组)收集入装有肝素钠作为抗凝血剂的管。将用于测定血清AbS或AbT浓度和用于评估抗产品抗体的血液样品(约3.0mL)收集入没有抗凝血剂的管。容许于室温凝血大约15分钟，并为通过离心来收集血清而加工。样品收集进度表显示于表32。第50天后，为AbS组(A组)中的动物1和3增加另外的采样时间点以证明PD活性的可逆性。第1天(也称作“剂量施用”)即给猴施用抗体的那天。“服药前”指在剂量施用之前的样品收集时间，而“服药后”指剂量施用之后的样品采集时间。

表32：雄性猕猴中的体内研究设计和样品收集

a.对于A组和B组，收集血清来测定测试物浓度和抗产品抗体，并收集全血来进行立体PD测定法。对于C组，只收集全血样品。

b.对于动物1，没有收集服药前第1天样品。

c.第50天PD分析后，包括了另外的采样时间点来证明PD活性的可能性。

实施例13.3：AbS和AbT血清浓度

为了测定AbS和AbT血清浓度，使用实施例10中描述的ELISA。实施例10中描述的猕猴中的PK研究指示单次i.v.施用后，AbS比AbT显著更快地清除。在此研究中，没有实施测定完整PK参数集所需要的广泛血清采样，因为PD测定法所需要的样品体积相对较大及自每只猕猴能收集的血液体积有限。只在PD活性评估为能够确定每只动物的血清浓度和PD活性之间相关性的那些时间点采集用于测定抗IL-21R血清浓度的样品。如此，只基于血清浓度-时间曲线的末期来评估清除半衰期(t_1/2)。如实施例10中所述来确定表观t_1/2。

单剂10mg/kg i.v.后，AbS自雄性猕猴缓慢清除，均值表观终末半衰期(t_1/2)为约10.6±3.92天(表33)。直至第22天，AbS血清浓度在所有三只服用AbS的动物之间非常相似(图58)。然而，在第36天和稍后的时间点，与动物1和3(下降至约2μg/mL)相比，动物2中的AbS血清浓度迅速下降(至约0.6μg/mL)。在第50天，动物2在血清中检测不到AbS(小于LOQ 30ng/mL)，而动物1和3具有约0.9-1μg/mL的AbS血清浓度。如此，动物2的AbS的估算t_1/2(约6.2天)比动物1和3(分别为约12和14天)短。

正如基于初始PK研究所预期的，单剂10mg/kg i.v.施用后，AbT的血清浓度比AbS显著更快地下降(图58)。所有三只服用AbS的猴具有相似的浓度-时间曲线和表观t_1/2值(表33)，其中血清浓度在第15天下降至相对较低的水平(＜0.4μg/mL)，而且在第22天下降至低于LOQ。AbT的估算均值t_1/2为2.3±0.16天。AbS和AbT浓度早至服药后24小时开始不同，而且在1周时间点时相差超过10倍。这些数据确认了来自较早的PK研究的观察结果，其中AbT具有比AbS快约5-7倍的总身体清除(CL)(见例如实施例10)。

表33：给雄性猕猴10mg/kg IV施用AbS和AbT后峰和最后可检测浓度和清除半衰期

C_峰 i.v.施用后第一个采样时间点即5分钟的浓度(也称作C_5min)

t_1/2 清除半衰期

T_最后测试物浓度在检测低限(LOQ＝30.0ng/mL)以上的最后时间点

C_最后 T_最后时的浓度

实施例13.4：雄性猕猴中的AbS和AbT PD响应

实施例12.1中描述了用于检测抗IL-21R抗体对IL-21诱导表达的抑制的离体全血测定法。对于登入此研究的所有9只猴，将每份服药前和服药后全血样品分成四份1.5mL等分试样。第一和第二等分试样用重组人IL-21或媒介(RQ计算的修正物)任一处理，并用于评估循环中的测试物是否影响离体IL-21诱导的IL-2Rα基因表达(即PD活性)。第三等分试样用IL-21和抗IL-21R抗体(30nM)处理，而第四等分试样用IL-21和IgG对照抗体(抗IL-21R抗体的阴性对照)处理。第三和第四等分试样用于评估给定的服药后样品中循环中的测试物对IL-21诱导IL-2Rα基因表达的抑制是否是完全的(对于观察到PD活性的时间点)，评估IL-21诱导基因表达的恢复是否是经由IL-21R介导的(对于稍后丧失PD活性的时间点)，及监测中和性抗产品抗体的存在。

对于AbS，在剂量施用后立即观察到对IL-21诱导的IL-2Rα基因表达的完全抑制(IL-2RαRQ＜1.5)，而且持续直至至少第22天(动物2)和至少第50天(动物1和3)，此时所有三只猴的血清AbS浓度处于或超出6nM(0.9μg/mL)(图59a-c和表33)。对于动物1和3，在第92天离体IL-21诱导IL-2Rα表达恢复至服药前值(即PD活性丧失)，与血清浓度＜LOQ的时间点一致(图59a和c)。对于动物2，PD活性在第36天丧失，此时血清AbS浓度下降至相对较低的水平，约4nM(0.6μg/mL)。对于在此研究中检查的所有时间点，AbS的PD活性表现为全有或全无，使得通常是完全抑制IL-21诱导的IL-2Rα基因表达(RQ＜1.5)或没有抑制(RQ与相应服药前样品中的相似)。部分PD响应难以区分，因为观察到IL-2RαRQ值的动物内差异。有可能的是，如果在末期收集另外的采样时间点，那么会观察到具有AbS的部分PD响应的数据点。无法精确估算维持AbS的最低PD活性所需要的最低浓度(C_min)，但是有可能是约4-6nM。

对于AbT，也在剂量给药后立即观察到PD活性，而且持续直至至少第8天(RQ＜1.5)，此时血清AbT浓度处于或超出1.3μg/mL(图60a-c和表33)。对于所有三只猴，PD活性在第15天丧失(RQ＞1.5)。在第15天自动物5和6获得的血液样品中，IL-2RαRQ值表现为与相应的服药前值相似(即完全丧失PD活性)，而且血清AbT浓度低于1.8nM。在第15天自动物4获得血液样品中有部分PD响应，因为观察到的IL-2RαRQ值2.7小于服药前的(RQ＝4.8)和随后第22天时间点的(RQ＝5.3；图60a)。与动物5和6相比，动物4还具有略微更长的估算t_1/2和稍微更高的第15天AbT血清浓度(约2.5nM)(图60a-c)。这些数据提示维持PD活性所需要的AbT C_min为大约2.5nM。

对于同种型对照组，离体添加重组人IL-21在所有时间点来自所有三只猴的全血样品中诱导IL-2Rα基因表达，其中IL-2RαRQ值有显而易见的动物内差异(数据未显示)。

与较早的PK研究(见实施例10)一致，在猴中，AbT具有比AbS快的消除，AbS和AbT的均值表观t_1/2分别为10.6和2.3天。在第15天时间点，所有三只服用AbT的猴中PD活性完全或部分丧失，而AbS服药组中的所有三只猴具有相对较高的血清AbS浓度(约6.0-7.4μg/mL)和完全的PD活性。如此，AbS在猕猴中具有更长的PD活性持续时间和更长的t_1/2。

实施例13.5：抗产品抗体应答

在观察到PD活性丧失的第一个时间点，与rhuIL-21同时离体添加抗IL-21R抗体在所有服用AbS和AbT的猴中抑制IL-2Rα基因表达的诱导(RQ＜1.5)，指示rhuIL-21诱导的基因表达的恢复是经由IL-21R介导的，而且不存在中和性抗IL-21R抗体(图59和60)。离体添加AbS在自动物1和3收集的后续时间点继续展现出抑制活性。然而，AbS在来自动物2的第50天时间点没有离体抑制活性(图59)。类似地，AbT在自服用AbT的组中所有动物收集的第22天和/或第36天没有离体抑制活性(图60)。这些数据提示AbS组中的动物2和AbT组中的所有三只动物(4-6)发生了中和性抗产品抗体。

使用正交基于流式细胞术(FACS)的测定法证实了服用AbT的动物中中和性抗AbT抗体的存在。在含有25ng/ml huGMCSF(R&D Systems)的RPMI培养基中培养TF-1和TF-1/rhuIL-21R(经rhuIL-21R转染的TF-1细胞)。将汇合的细胞培养物以300g离心10分钟，在OptiMEM无血清培养基(Invitrogen Corporation)中以10⁶个细胞/mL重悬浮，并于37℃温育2小时。然后将细胞在冷的PBS/0.5％BSA中清洗，在冰冷的PBS缓冲液中重悬浮，并保持在冰上直至染色。为了测定AbS-生物素和AbT-生物素结合TF-1/rhuIL-21R细胞的EC₅₀，将亲本TF-1和TF-1/rhuIL-21R细胞二者(10⁵个细胞每项测试)与AbT-生物素或IgG-生物素对照(使用连续3倍稀释，范围为16-0.0002μg/mL)任一一起在冰上温育30分钟，在PBS/0.5％BSA中清洗，然后与链霉亲合素-别藻蓝蛋白(APC；Invitrogen Corporation)一起温育。在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上收集APC通道峰的几何均值荧光强度(“GMFI”)，并使用Flowjo 8.3.3软件(Treestar)分析。使用Prism 4 for Macintosh v4.0b(GraphPad Software，Inc.)实施曲线的线性回归分析。

在此测定法中测试血清样品的最低要求稀释度(MRD)据测定是在PBS/0.5％BSA中1∶6。为了测试AbT-生物素对TF-1/rhuIL-21R细胞的抑制(即中和活性的存在)，将TF-1/rhuIL-21R细胞与来自服用抗IL-21R的猴的血清一起预温育(使用3倍稀释系列，自MRD开始)，用抗IL-21R-生物素(在估算EC₅₀浓度)染色，在PBS/0.5％BSA中清洗，用链霉亲合素-APC染色，并如上所述分析GMFI。每份血清样品在两项单独的实验中运行一式两份，并对每个稀释点获得四份重复的平均GMFI值。使用公式[100％*平均GMFI/服药前平均GMFI]来计算每个稀释点的每份血清样品的相对GMFI值。若MRD处的相对GMFI值小于或等于80％，则该样品认定为阳性。对于阳性样品，作为log[会生成相对GMFI＞80％的稀释度倒数]来计算log滴度。基于MRD，阴性样品的log滴度报告为＜0.78(log 6)。

所有三只服用AbT的动物在第22天和第36天在基于FACS的中和性抗体测定法中测试呈阳性，log滴度范围为2.2-4.1(表34)。

表34：对雄性猕猴i.v.施用10mg/kg AbT后中和性抗AbT抗体的形成(log滴度)

时间(天)	动物4	动物5	动物6
				服药前	阴性	阴性	阴性
15	阴性	阴性	阴性
				22	4.12	2.7	2.2
36	2.2	2.7	2.7

因为只有一只服用AbS的动物在离体IL-2Rα基因表达测定法中显示出中和性抗AbS抗体的证据，所以在实施例11.5中描述的检测中和性和非中和性抗AbS抗体二者的基于电化学发光顺磁珠测定法中测试来自服用AbS的猴的血清样品。在此测定法中，将血清样品与生物素化AbS和钌化(ruthenylated)AbS一起共温育，将经链霉亲合素包被的顺磁珠添加至混合物，并使用BioVeris技术来检测发射的光。所有三只服用AbS的猴在此测定法中呈抗AbS抗体阳性，log滴度范围为1.86至3.43(表35)。抗AbS生成的表观发生有显著的动物间差异。对于动物1、动物2、和动物3，分别在第134天、第36天、和第92天在基于BioVeris的测定法中第一次观察到血清样品呈抗AbS抗体阳性。如此，在这三只服用AbS的动物中，动物2具有最短的t_1/2和最快的发作和最高的抗AbS抗体应答滴度。动物2还是服用AbS的猴中唯一在离体IL-2Rα基因表达测定法中显示中和性抗AbS抗体应答的证据的，与所有三只服用AbS的猴相似。

表35：对雄性猕猴i.v.施用10mg/kg AbS后抗AbS抗体的形成(log滴度)

时间(天)	动物1	动物2	动物3
				服药前	阴性	阴性	阴性

15	阴性	阴性	阴性
				22	阴性	阴性	阴性
36	阴性	2.13	阴性
				50	阴性	3.43	阴性
71	ND	ND	阴性
				92	阴性	ND	2.27
106	ND	ND	2.79
				113	阴性	ND	ND
134	1.86	ND	ND
				148	2.4	ND	ND

“ND”＝未测定

实施例14：别的抗IL-21R抗体在猕猴中的PK和PD

在给未接触蛋白质的猕猴单剂i.v.(分别为10，10，和1mg/kg)后检查AbV、AbU、和AbW的药动学，并将PK参数与更早用AbS和AbT获得的PK数据比较(表36和图61)。如实施例13中关于AbS和AbT所述实施生物分析测定法和PK计算。

对于所有化合物，在末期有显著的动物间差异，可能涉及抗产品抗体形成的不同发作。在给猴单剂10mg/kg i.v.后，AbV和AbS表现出具有相似的均值血清浓度和PK参数。在给猴单剂i.v.后，AbV和AbS表现出在所有测试的人抗IL-21R抗体中具有最慢的均值CL、最长的均值t_1/2、和最高的(经剂量标准化)均值血清浓度。AbT在所有测试的人抗IL-21R抗体中具有最快的均值CL、最慢的均值t_1/2和最低的(经剂量标准化)均值血清浓度。给猕猴单剂i.v.后均值浓度概况和PK参数的比较提示基于PK概况对人抗IL-21R Ab抗体的排序在S-D大鼠与猕猴之间是相似的(还可见实施例10.10)。

表36：给猕猴单次i.v.施用人抗IL-21R抗体后的PK参数

所有研究在未接触蛋白质的猴中进行，n＝3每个剂量组，除非另有说明

a.C_5min＝IV施用后第一个时间点，5分钟时的浓度

b.来自一项分开的PK-PD研究的PK数据

NA＝不适用(n＝2)

ND＝未测定；采样时间点不足

在同一研究中，使用离体rhuIL-21诱导的基因表达测定法(实施例13中描述的)检查了AbU-AbW(AbU、AbV、和AbW)在猴中的PD活性。

在第一采样时间点5分钟时，AbU-AbW在所有猴中具有PD活性，即在离体全血测定法中展示对rhuIL-21诱导的基因表达的完全抑制，与对AbS和AbT获得的数据相似。PD活性在自血清洗掉AbU-AbW时丧失。

实施例15：AbS在静脉内施用于经破伤风类毒素攻击的雄性和雌性猕猴后的药动学

在给经破伤风类毒素攻击的猕猴单次三次每周一次i.v.施用2或10mg/kgAbS后检查AbS的PK。通过特异性ELISA来监测AbS血清浓度和抗AbS抗体，并如例如实施例13中所述通过无隔室分析来计算PK参数。

给猴三次每周一次i.v.施用2或10mg/kg后，AbS浓度-时间概况和PK参数同一剂量组(n＝3只每种性别每组)。中的雄性和雌性猴之间是大体相似的。第1剂(C_5min)和第3剂(C_day14，5min)后5分钟时的均值浓度，以及第3剂后的均值暴露(AUC_day14-day21)随剂量水平而升高。在2mg/kg组中，均值C_5min为28.4±2.50μg/mL，均值C_day14，5min为35.7±11.0μg/mL，而均值AUC_day14-day21为1279±592μg·hr/mL。在10mg/kg组中，均值C_5min为120±59.9，均值C_day14，5min为152±21.9μg/mL，而均值AUC_day14-day21为7700±782μg·hr/mL。在2和10mg/kg组中，第三次IV施用AbS后的消除半衰期(t_1/2)分别为25.6±22.7和168±56.5(p＝0.0002)(图62)。

在2mg/kg组中，AbS浓度在第三次i.v.施用后快速下降，而且所有六只猴在第28天(第三剂后两周)直至研究结束测试为抗AbS抗体阳性，符合相对较短的t_1/2(图62a)。在10mg/kg组中，六只猴中的两只(SAN 7和SAN 8)测试为抗AbS抗体阳性(第42天或第49天)，而且这些猴具有服药组中最短的t_1/2值，提示抗AbS抗体的形成与AbS的t_1/2有关联(图62b)。

实施例16：单次施用后AbS和AbT在人中的药动学的预测

为了预测AbS和AbT在人中的PK，使用了两种办法。对于第一种办法，假设抗IL-21R抗体在人中的PK参数(诸如CL和分布体积)会与在猕猴中的PK参数相似。对于第二种办法，使用异计缩放基于单次i.v.施用抗IL-21R抗体后自小鼠、大鼠、和猕猴获得的动物数据来估算人PK参数。依照Mahmood(1996)Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.21：275-78；Mahmood和Balian(1996)Xenobiotica 26：887-95；Sacher，“Relation of lifespan to brain weight and body weight in mammals”于CIBA Foundation Symposium-The Lifespan of Animals(Colloquia on Aging)，115-33(Wolstenholme GEW，O’Connor M编，1959)；及Hahn ME，Haber SB.(1978)Behav Genet.，8：251-260中先前记载的方法，使用对AbS的最长寿命潜力(MLP)和AbT的脑重量的调整，实施了CL的异计缩放。AbS和AbT的异计缩放数据分布展现于图63a-b和64a-b。

总之，这两种办法提示AbS在人中有低的清除(CL)和小的稳态分布体积(Vd_SS)。AbS的预测CL会是约0.72-1.3mL/hr/kg，而估算Vd_SS会是约92.4-125mL/kg。基于通过异计缩放法获得的CL值，给60kg人受试者一剂i.v.1mg/kgAbS后，暴露估值(AUC_0-∞)为1393μg·hr/mL。对于AbT，这两种办法提示更高的约5-8.5mL/hr/kg的CL和约115-202mL/hr/kg的Vd_ss。

实施例17：在NZBWF1/J鼠狼疮肾炎模型中用AbS处理不影响疾病

使用NZBWF/1J小鼠在鼠狼疮模型对抗IL-21R抗体AbS测试其减轻疾病的能力。雌性NZBWF1/J小鼠自发发生类似在人狼疮肾炎中观察到的症状，包括高滴度的循环IgG抗核和抗双链DNA自身抗体、肾小球中的IgG沉积物、和蛋白尿。在雌性NZBWF1/J小鼠中，如通过尿中蛋白质的存在所测量的，肾病的发作发生于大约26周龄。为了检查用AbS阻断IL-21R的影响，以400μg/小鼠的剂量给26周龄雌性NZBWF1/J小鼠经i.p.注射施用盐水(媒介对照)、CTLA-4Ig(鼠IgG2a，阳性对照)、抗艾美尔球虫抗体(鼠IgG2a同等型对照)、AbS、或人抗体同等型对照(具有三重突变的人IgG1抗体)任一，每周三次，持续10周。每两周采集血清样品，并通过ELISA测定IgG抗dsDNA抗体。每两周收集尿，并使用Albustix(Bayer HealthCare，Tarrytown，NY)检查蛋白质水平。所有动物组在研究开始时具有相似水平的蛋白尿，而且蛋白尿程度在研究过程中在盐水、抗艾美尔球虫、和hIgG1TM对照中逐步升高(图65a)。用CTLA-4Ig蛋白质(其在此模型中先前显示出改善疾病)处理在这些小鼠中阻止升高的蛋白尿发生。相反，与对照小鼠相比时，用AbS处理不影响NZBWF1/J小鼠中蛋白酶的发生(图65a)。类似地，用CTLA-4Ig处理显著降低NZBWF1/J小鼠中的抗dsDNA IgG血清抗体滴度，而用AbS处理不影响这些小鼠中抗dsDNA抗体的发生(图65b)。

实施例18：用抗IL-21R抗体处理在半治疗性胶原诱发的关节炎(CIA)小鼠模型中的影响

在类风湿性关节炎的鼠胶原诱发关节炎模型中对抗体AbS和AbT测试它们减轻疾病的能力。给雌性DBA/1小鼠在尾部皮内免疫接种100mg在完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原，然后在21天后在同一部位用100mg在不完全弗氏佐剂中乳化的牛II型胶原强化。第二次免疫接种牛II型胶原后，对爪检查肿胀并在0-16的尺度上对严重性打分，其中0代表无肿胀，而16指示严重的疾病。一旦研究中10％的动物显示出疾病的征候，就不再处理动物，或服用8mg/kg鼠IgG2a同等型对照抗体、抗小鼠IL-21R抗体D5(鼠IgG2a抗体)、mTNFRII-Fc(阳性对照，鼠IgG2a同等型)、抗IL-13TM抗体(人IgG1同等型对照抗体)、AbT、或AbS任一，每周三次，持续30天。在此项研究中没有观察到像在此模型中正常观察到的一样严重的总体疾病严重性。研究的最后一天时，未处理的和同等型对照处理的小鼠中的均值疾病严重性小于0-16尺度上的4(图66c)。另外，尽管在此项研究中用mTNFRII-Fc阳性对照处理减轻疾病，但是只在服药后第22天在此处理组与同种型对照处理组疾病之间观察到疾病严重性的统计学显著差异。在此项研究中用抗小鼠IL-21R抗体(D5)或抗人IL-21R抗体(AbS和AbT)处理也不影响疾病严重性(图66a-b)。

实施例19：在猕猴中测试抗体对针对破伤风免疫接种的遗忘性抗体应答形成的影响

在猕猴中对抗IL-21R抗体AbS检查其对针对破伤风免疫接种的遗忘性抗体应答发生的影响。对9只雌性和9只雄性猕猴测试针对破伤风类毒素的血清抗体滴度以鉴定未接触破伤风的动物。然后以两个等分(0.25ml)剂量给这些动物肌肉内施用0.5ml破伤风类毒素，每7天收集血液，持续35天，并通过ELISA检查抗破伤风IgM和IgG血清抗体。初次免疫接种后43天，随机指派3只雄性和3只雌性猕猴的各组，并以剂量体积1ml/kg(与2ml媒介齐平(flushed with))作为i.v.缓慢推注将盐水(媒介)、2mg/kg AbS、或10mg/kg AbS任一施用入臂/头或隐静脉，，每周一次，持续3周。施用第一剂AbS或媒介后24小时，第二次以两个等分(0.25ml)剂量给猴肌肉内免疫接种0.5ml破伤风类毒素，例行收集血液，并通过ELISA检查抗破伤风IgM和IgG抗体滴度。在第一次免疫接种破伤风类毒素后14天内在雄性和雌性猕猴中都能检测到IgM和IgG破伤风血清抗体(图67a)。在任何处理组中破伤风特异性血清IgM滴度在第二次免疫接种破伤风类毒素后没有变化。在第二次免疫接种后，破伤风特异性IgG血清滴度高大约10-20倍，而且在盐水处理动物中更加快速地生成，与遗忘性抗体应答的动力学一致(图67b)。在猕猴中在第二次免疫接种后用2mg/kg或10mg/kg AbS处理不影响破伤风特异性IgG血清抗体应答的发生，指示使用此治疗方案用AbS处理不影响针对破伤风类毒素的遗忘性抗体应答的形成(图67b)。

等同方案

仅仅使用例行实验，本领域技术人员就会认识或能够确定本文所述发明之具体实施方案的许多等同方案。所附权利要求书意图涵盖此类等同方案。

Claims

1.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

2.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是抗体。

3.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是scFv。

4.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是V_H。

5.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是V_L。

6.权利要求1的结合蛋白或抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段是CDR。

7.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中该结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247。

8.权利要求1的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

9.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO ：6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和248，且

其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种与选自下组的序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，8，10，12，163，164，169，170，194，和195，那么该结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种与选自下组的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

10.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合人IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，由此治疗或预防所述病症，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247，且

其中，如果该结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种由与选自下组的序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：5，7，9，和11，那么该结合蛋白或抗原结合片段必须还包含至少一种由与选自下组的核苷酸序列至少约95％相同的核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247。

11.权利要求9的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162-195，213-229，240，242，244，246，和248，

12.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括对受试者施用特异性结合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链和重链，且其中该重链包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，68，70，72，88，90，92，94，213，218，219，240，和242。

13.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括对受试者施用特异性结合IL-21R的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含轻链和重链，且其中该轻链包含至少一种选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，74，76，78，80，82，84，86，96，98，100，102，104，106，108，214-217，220-229，244，246，和248。

14.权利要求12的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含V_L域和V_H域，且其中该V_H域包含至少一种选自下组的序列：SEQ ID NO：14，16，18，和20。

15.权利要求13的方法，其中所述结合蛋白或抗原结合片段包含V_L域和V_H域，且其中该V_L域包含至少一种选自下组的序列：SEQ ID NO：22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，215，217，221，223，225，227，和229。

16.权利要求12或13的方法，其中所述重链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：88，90，92，94，213，218，219，240，和242，且所述轻链包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：96，98，100，102，104，106，108，214，216，220，222，224，226，228，244，246，和248。

17.一种在受试者中治疗或预防IL-21R相关病症的方法，包括以足以抑制或降低受试者中免疫细胞活性的量对受试者施用特异性结合受选自下组的结合蛋白识别的人IL-21R表位的结合蛋白或其抗原结合片段：AbA-AbW，H 3-H6，L1-L6，L8-L21，和L23-L25，其中所述结合蛋白或抗原结合片段竞争性抑制选自下组的结合蛋白对人IL-21R的结合：AbA-AbW，H3-H6，L1-L6，L8-L21，和L23-L25，由此治疗或预防所述病症。

18.权利要求17的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片段，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，165-168，171-193，213-229，240，242，244，246，和248。

19.权利要求17的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段包含重链、轻链、或Fv片段，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，239，241，243，245，和247。

20.权利要求17的方法，其中所述结合蛋白特异性结合受AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV、和/或AbW识别的IL-21R表位，且其中所述结合蛋白竞争性抑制AbO、AbP、AbQ、AbR、AbS、AbT、AbU、AbV、和/或AbW对人IL-21R的结合。

21.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法，其中所述IL-21R相关病症选自下组：自身免疫性病症、炎性状况、变态反应、移植排斥、和血液高增殖性病症。

22.权利要求21的方法，其中所述IL-21R相关病症选自下组：多发性硬化、系统性红斑狼疮、银屑病、移植排斥、类风湿性关节炎、和其它关节炎病症。

23.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段对人IL-21R的结合常数为至少约10⁵M^-1s^-1。

24.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段以约1.75nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的BAF3细胞增殖，且其中所述BAF3细胞包含人IL-21受体。

25.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段以约14.0nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的TF1细胞增殖，且其中所述TF1细胞包含人IL-21受体。

26.权利要求1，9，12，13，和17任一项的方法，其中所述结合蛋白或其抗原结合片段以约1.9nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的原代人B细胞增殖，且其中所述B细胞包含人IL-21R。

27.权利要求1，9，12，13，和17任一项的结合蛋白或其抗原结合片段，其中所述结合蛋白或抗原结合片段以约1.5nM或更少的IC₅₀抑制IL-21介导的原代人CD4⁺细胞增殖，且其中所述CD4⁺细胞包含人IL-21R。

28.一种确定抗IL-21R抗体是否是治疗性抗IL-21R抗体的方法，包括下述步骤：

(a)使来自受试者的第一血液样品与IL-21配体接触；

(b)测定与IL-21配体接触的第一血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；

(c)在抗IL-21R抗体存在下使来自该受试者的第二血液样品与IL-21配体接触；

(d)测定在该抗IL-21R抗体存在下与IL-21配体接触的第二血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；并

(e)比较步骤(b)和(d)中测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平，

其中至少一种IL-21响应性基因表达水平的变化指示该抗IL-21R抗体是治疗性抗体。

29.权利要求28的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因选自下组：TNF，IFNγ，IL-6，IL-8，IL-10，CD19，STAT3，TBX21，CSF1，GZMB，PRF1，IL-2Rα，和IL-21R。

30.权利要求29的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Rα。

31.一种测定抗IL-21R抗体的药效活性的方法，包括检测受试者的血液样品中至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控。

32.权利要求31的方法，其中检测至少一种IL-21响应性基因表达水平的调控包括下述步骤：

(a)对受试者施用抗IL-21R抗体，其中所述受试者用所述抗IL-21R抗体处理；

(b)使来自用所述抗IL-21R抗体处理的所述受试者的血液样品与IL-21配体接触；

(c)测定来自用所述抗IL-21R抗体处理的所述受试者，并与所述IL-21配体接触的所述血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平；并

(d)比较步骤(c)中测定的至少一种IL-21响应性基因的表达水平与与IL-21配体接触的另一种血液样品中至少一种IL-21响应性基因的表达水平，其中所述另一种血液样品来自未用所述抗IL-21R抗体处理的受试者。

33.权利要求32的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因选自下组：TNF，IFNγ，IL-6，IL-8，IL-10，CD19，STAT3，TBX21，CSF1，GZMB，PRF1，IL-2Rα，和IL-21R。

34.权利要求33的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因选自下组：CD19，GZMB，PRF1，IL-2Rα，IFNγ，和IL-6。

35.权利要求34的方法，其中所述至少一种IL-21响应性基因是IL-2Rα。