KR20110021919A - 인터루킨-21 수용체의 결합 단백질을 사용하는 치료 방법 - Google Patents

인터루킨-21 수용체의 결합 단백질을 사용하는 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 인터루킨-21 수용체(IL-21R)에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편(인간 항체를 포함함) 및 이의 제조 방법을 제공한다. 상기 결합 단백질은 예를 들어, IL-21R 활성의 길항제로서 작용하여 일반적으로 면역 반응, 특히 IL-21R에 의해 매개되는 면역 반응을 조절할 수 있다. 개시된 조성물 및 방법은 예를 들어, IL-21R-관련 질환, 예를 들어, 염증 질환, 자가면역 질환, 알레르기, 이식편 거부 및 다른 면역 시스템 질환의 진단, 치료 및/또는 예방에서 사용될 수 있다.

Description

인터루킨-21 수용체의 결합 단백질을 사용하는 치료 방법{METHODS OF TREATMENT UTILIZING BINDING PROTEINS OF THE INTERLEUKIN-21 RECEPTOR}
본 발명은 인터루킨-21 수용체(IL-21R), 특히 인간 IL-21R에 결합하는 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편, 및 IL-21R-관련 활성, 예를 들어, IL-21 반응성 유전자의 발현 수준에 대한 IL-21 효과의 조절에 있어서 상기 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편의 용도에 관한 것이다. 본원에 개시된 결합 단백질은 IL-21R-관련 질환, 예를 들어, 염증 질환, 자가면역 질환, 알레르기, 이식편 거부, 혈액 과다증식성 질환 및 다른 면역 시스템 질환의 치료 및/또는 진단에 있어서 유용하다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체의 약력학적(PD) 성질 및 약동학적(PK) 성질을 측정하는 방법을 제공한다.
관련 출원
본원은 내용이 전체로써 본원에 참고로 도입되는 미국 가출원 제61/055,543호(2008년 5월 23일 출원) 및 제61/099,476호(2008년 9월 23일 출원)를 우선권 주장한다.
관련 배경기술
항원은 면역 반응을 개시하고 가장 큰 두 림프구 집단, 즉 T 세포 및 B 세포를 활성화시킨다. T 세포는 항원과 만난 후 증식하고 이펙터(effector) 세포로 분화하는 반면, B 세포는 항원과 만난 후 증식하고 항체-분비 혈장 세포로 분화한다. 상기 이펙터 세포는 림프구 및 다른 종류의 세포에 의해 분비되는 작은 단백질(약 30 kDa 미만)인 사이토카인을 분비하고/하거나 사이토카인에 반응한다.
인간 IL-21은 IL-2, IL-4 및 IL-15에 대한 서열 상동성을 보이는 사이토카인이다(Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408:57-63). 인터루킨 사이토카인들 사이에서의 낮은 서열 상동성에도 불구하고, 사이토카인은 그의 패밀리(family)를 대표하는 "4-나선-다발" 구조로의 공통된 폴딩을 공유한다. 대다수의 사이토카인은 클래스 I 또는 클래스 II 사이토카인 수용체에 결합한다. 클래스 II 사이토카인 수용체는 IL-10 및 인터페론에 대한 수용체를 포함하는 반면, 클래스 I 사이토카인 수용체는 IL-2 내지 IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13 및 IL-15에 대한 수용체뿐만 아니라 조혈 성장 인자, 렙틴(leptin) 및 성장 호르몬에 대한 수용체를 포함한다(Cosman (1993) Cytokine 5:95-106).
인간 IL-21R은 클래스 I 사이토카인 수용체이다. 인간 IL-21 및 이의 수용체(IL-21R)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 국제특허출원 공개 제WO 00/053761호 및 제WO 01/085792호; 상기 문헌(Parrish-Novak et al. (2000)); 및 문헌(Ozaki et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11439-44)에 기재되어 있다. IL-21R은 IL-2 수용체 β 쇄 및 IL-4 수용체 α 쇄에 대한 최대 서열 상동성을 나타낸다(상기 문헌(Ozaki et al. (2000)). 리간드 결합 시, IL-21R은 IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 및 IL-15에 대한 수용체 결합체(complex)에 의해 공유되는 공통된 γ 사이토카인 수용체 쇄(γc)와 회합한다(상기 문헌(Ozaki et al. (2000)); 및 문헌(Asao et al. (2001) J. Immunol. 167:1-5)).
IL-21R은 림프 조직, 특히 T 세포, B 세포, 천연 살해(NK) 세포, 수지상 세포(DC) 및 대식세포 상에서 발현되어(상기 문헌(Parrish-Novak et al. (2000)), 상기 세포들이 IL-21에 반응할 수 있게 한다(Leonard and Spolski (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:688-98). IL-21R의 넓은 림프 분포는 IL-21이 면역 조절에 있어서 중요한 역할을 수행함을 암시한다. 시험관내 연구는 IL-21이 B 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포, 및 NK 세포의 기능을 상당히 조절함을 보여준다(상기 문헌(Parrish-Novak et al. (2000)); 및 문헌(Kasaian et al. (2002) Immunity 16:559-69)). 최근 연구 결과는 IL-21-매개된 신호전달이 항-종양 활성을 나타낼 수 있고(Sivakumar et al. (2004) Immunology 112:177-82), IL-21이 마우스에서 항원-유도된 천식을 예방할 수 있음(Shang et al. (2006) Cell. Immunol. 241:66-74)을 암시한다.
자가면역에서, IL-21 유전자의 파괴 및 재조합 IL-21의 주입은 실험적 자가면역 중증근육무력증(EAMG) 및 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 진행을 조절하는 것으로 밝혀졌다(King et al. (2004) Cell 117:265-77; Ozaki et al. (2004) J. Immunol. 173:5361-71; Vollmer et al. (2005) J. Immunol. 174:2696-2701; Liu et al. (2006) J. Immunol. 176:5247-54). 이 실험 시스템들에서, IL-21-매개된 신호전달의 조작이 CD8+ 세포, B 세포, T 헬퍼 세포 및 NK 세포의 기능을 직접적으로 변경시킴이 암시되었다.
따라서, 본 발명은 IL-21 경로를 차단함으로써 예를 들어, 자가면역 질환을 치료하기 위한 신규 치료제, 즉 항-IL-21R 항체를 제공한다. 치료제, 예컨대, 항-IL-21R 항체가 생체 내에서 유효하기 위해서는, IL-21 반응을 조절하는 데 필요한 항-IL-21R 항체의 최소 혈청 농도가 측정되어야 하므로, 이러한 최소 혈청 농도를 정확하게 측정하는 방법이 요구된다.
본 발명은 인간 IL-21R 및 뮤린(murine) IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 예를 들어, 인간 항체 및 이의 단편의 단리 및 특징규명에 관한 것이다. 본원에 개시된 결합 단백질은 전체로써 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제7,495,085호에 개시된 항체 18A5로부터 유도된다. 본 발명의 결합 단백질은 인간 IL-21R 및/또는 뮤린 IL-21R에 대해 모 항체인 항체 18A5보다 훨씬 더 높은 친화성을 나타낸다.
본 발명은 적어도 부분적으로 높은 친화성 및 특이성으로 IL-21R, 특히 인간 IL-21R에 결합하는 IL-21R 결합제(예컨대, 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편)를 제공한다. 본 발명의 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편은 본원에서 각각 "항-IL-21R 결합 단백질" 및 "이의 단편"으로도 지칭된다. 한 실시양태에서, 상기 결합 단백질 또는 이의 단편은 IL-21R 활성을 감소시키거나, 억제하거나 길항한다. 이러한 결합 단백질은 IL-21R 활성을 길항함으로써 면역 반응 또는 IL-21R-관련 질환을 조절하는 데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-IL-21R 결합 단백질은 진단에서 사용될 수 있거나 치료제 또는 세포독성제를 IL-21R-발현 세포에 전달하는 표적 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-IL-21R 결합 단백질은 본원에 더 상세히 기재되는 바와 같이 IL-21R-관련 질환, 예를 들어, 염증 질환, 자가면역 질환, 알레르기, 이식편 거부, 혈액 과다증식성 질환 및 다른 면역 시스템 질환의 진단 및 치료에서 유용하다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-21R, 특히 인간 IL-21R에 결합하는 단리된 결합 단백질(예를 들어, 단리된 항체) 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 항-IL-21R 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 나타낼 수 있다: (1) 단일클론 또는 단일 특이성 결합 단백질인 특징; (2) 인간 결합 단백질인 특징; (3) 시험관 내에서 생성된 결합 단백질인 특징; (4) 생체 내에서 생성된(예를 들어, 형질전환 마우스 시스템에서 생성된) 결합 단백질인 특징; (5) IL-21과 IL-21R의 결합을 억제하는 특징; (6) IgG1인 특징; (7) 약 105 M-1s-1 이상의 결합 상수로 인간 IL-21R에 결합하는 특징; (8) 약 5 x 104 M-1s-1 이상의 결합 상수로 뮤린 IL-21R에 결합하는 특징; (9) 약 10-3 s-1 이하의 해리 상수로 인간 IL-21R에 결합하는 특징; (10) 약 10-2 s-1 이하의 해리 상수로 뮤린 IL-21R에 결합하는 특징; (11) 약 1.75 nM 이하의 IC50으로 인간 IL-21R-발현 BaF3 세포의 인간 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (12) 약 0.5 nM 이하의 IC50으로 뮤린 IL-21R-발현 BaF3 세포의 뮤린 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (13) 약 14.0 nM 이하의 IC50으로 인간 IL-21R-발현 TF1 세포의 인간 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (14) 약 1.9 nM 이하의 IC50으로 인간 일차 B 세포의 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (15) 약 1.5 nM 이하의 IC50으로 인간 일차 CD4+ T 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하는 특징; (16) 약 5.0 nM 이하의 IC50으로 뮤린 일차 CD4+ T 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하는 특징; (17) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에 정맥내 투여된 후 약 0.1 내지 7.5 ㎖/hr/kg의 평균 전신 제거율(mean total body clearance)을 나타내는 특징; (18) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여된 후 약 20 내지 700시간의 평균 제거 반감기를 나타내는 특징; (19) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에서 약 40 내지 1500 ㎖/kg의 평균 정상-상태 분포 용적을 나타내는 특징; (20) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 피하 투여된 후 약 35 내지 100%의 생체이용률을 나타내는 특징; (21) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여된 후 (1 mg/kg 투여량 당) 약 200 내지 10,000 ㎍*hr/㎖의 평균 투여량-표준화된 AUC를 나타내는 특징; (22) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여된 후 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖의 평균 투여량-표준화된 C최대(최대 혈청 농도)를 나타내는 특징; 및 (23) IL-21 반응성 사이토카인 또는 IL-21 반응성 유전자의 발현을 조절하는 특징.
본 발명의 결합 단백질(용어 "결합 단백질"은 적절한 경우 그의 항원-결합 단편을 포함하고 의미하기도 함)의 비제한적 예시적 실시양태는 본원에서 AbA 내지 AbZ로서 지칭되고, 이 용어들과 미국 가출원 제61/055,543호에서 사용된 용어들 사이의 상관관계는 하기 표 2A에 제시되어 있다. 본 발명의 결합 단백질의 다른 예시적 실시양태, 즉 단일-쇄 가변 단편(scFv)은 하기 표 2B에 상세히 기재된 바와 같이 본원에서 H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및 L23 내지 L25로서 지칭된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 항체이다. 추가 실시양태에서, 상기 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 단일특이적 항체, 다특이적 항체, 비특이적 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단일-쇄 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 혼성체 항체, 돌연변이된 항체, 이식된 항체, 시험관 내에서 생성된 항체 및/또는 다중특이적 항체(예를 들어, 둘 이상의 온전한 항체로부터 형성된 이중특이적 항체)이다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체(subject)에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 실시양태에서, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 항체, scFv, 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL) 및/또는 상보성 결정 영역(CDR)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 내지 195, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 194 및 195로 구성된 군으로붙 선택된 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열 또한 포함해야 한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 5, 7, 9 및 11로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열도 포함해야 한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 내지 195, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 194 및 195로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열도 포함해야 한다.
본 발명의 추가 실시양태는 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 서열번호 14, 16, 18, 20, 68, 70, 72, 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 및 242로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하고, 상기 VH 도메인은 서열번호 14, 16, 18 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214 내지 217, 220 내지 229, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하고, 상기 VL 도메인은 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 215, 217, 221, 223, 225, 227 및 229로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 중쇄는 서열번호 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 및 242로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214, 216, 220, 222, 224, 226, 228, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태는 AbA 내지 AbW, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및 L23 내지 L25로 구성된 군으로부터 선택된 결합 단백질에 의해 인식되는 인간 IL-21R 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 AbA 내지 AbW, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및 L23 내지 L25로 구성된 군으로부터 선택된 결합 단백질과 인간 IL-21R의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 경쇄 또는 Fv 단편을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 경쇄 또는 Fv 단편을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 결합 단백질은 AbO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, AbV 및/또는 AbW에 의해 인식되는 IL-21R 에피토프에 특이적으로 결합하고, AbO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, AbV 및/또는 AbW와 인간 IL-21R의 결합을 경쟁적으로 억제한다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, IL-21R-관련 질환은 자가면역 질환, 염증 증상, 알레르기, 이식편 거부 및 혈액 과다증식성 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, IL-21R-관련 질환은 면역 질환, 혈액 과다증식성 질환, 이식편 거부, 이식편-대-숙주 질환, 알레르기(아토피성 알레르기를 포함함), 당뇨병, 관절염 질환(류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염을 포함함), 척추관절병증, 다발성 경화증, 뇌척수염, 중증근육무력증, 전신 홍반 루푸스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 자가면역 갑상선염, 피부염(아토피성 피부염, 습진 피부염을 포함함), 건선, 쇼그렌 증후군, 염증성 장 질환(IBD)(크론병, 궤양성 대장염을 포함함), 천식(내인성 천식, 알레르기성 천식을 포함함), 공피증 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, IL-21R-관련 질환은 다발성 경화증, SLE, 건선, 이식편 거부, 류마티스성 관절염 및 다른 관절염 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IL-21R에 대해 105 M-1s-1 이상의 결합 상수를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 약 1.75 nM 이하의 IC50으로 IL-21-매개된 BaF3 세포 증식을 억제하고, 이때 상기 BaF3 세포는 인간 IL-21R을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 약 14 nM 이하의 IC50으로 TF1 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하고, 이때 상기 TF1 세포는 인간 IL-21R을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 약 1.9 nM 이하의 IC50으로 일차 인간 B 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하고, 이때 상기 B 세포는 인간 IL-21R을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 약 1.5 nM 이하의 IC50으로 일차 인간 CD4+ 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하고, 이때 상기 CD4+ 세포는 인간 IL-21R을 포함한다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 상기 파라미터들, 다른 PD 파라미터 및 다른 PK 파라미터에 대한 다른 범위 및 값이 본원에 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 항-IL-21R 항체가 치료 항-IL-21R 항체인지를 확인하는 방법으로서, 대상체로부터 수득된 제1 혈액 샘플을 IL-21 리간드와 접촉시키는 단계; IL-21 리간드와 접촉된 상기 제1 혈액 샘플에서 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 대상체로부터 수득된 제2 혈액 샘플을 항-IL-21R 항체의 존재 하에 IL-21 리간드와 접촉시키는 단계; 항-IL-21R 항체의 존재 하에 IL-21 리간드와 접촉된 상기 제2 혈액 샘플에서 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 이때 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준의 변화는 상기 항-IL-21R 항체가 치료 항체임을 표시한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 원숭이 또는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자는 TNF, IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSF1, GZMB, PRF1, IL-2Rα 및 IL-21R로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자는 IL-2Rα이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체의 혈액 샘플에서 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준의 조절을 검출하는 단계를 포함하는, 항-IL-21R 항체의 약력학적 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준의 조절의 검출은 항-IL-21R 항체를 항-IL-21R 항체로 치료받은 대상체에게 투여하는 단계; 항-IL-21R 항체로 치료받은 대상체로부터 수득된 혈액 샘플을 IL-21 리간드와 접촉시키는 단계; 항-IL-21R 항체로 치료받은 대상체로부터 수득되어 IL-21 리간드와 접촉된 혈액 샘플에서 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을, 항-IL-21R 항체로 치료받지 않은 대상체로부터 수득되어 IL-21 리간드와 접촉된 상이한 혈액 샘플에서 측정된 상기 1종 이상의 IL-21 반응성 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 원숭이 또는 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자는 TNF, IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSF1, GZMB, PRF1, IL-2Rα 및 IL-21R로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자는 CD19, GZMB, PRF1, IL-2Rα, IFNγ 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자는 IL-2Rα이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 급성 기 반응(acute phase response)을 감소시키거나, 억제하거나 경감시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 급성 기 반응을 감소시키거나, 억제하거나 경감시키는 방법을 제공하고, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 국소 투여된다.
본 발명의 한 실시양태는 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 면역화하는 데 사용된 백신 제제의 효능을 증가시키는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 면역화 전, 면역화 도중 및/또는 면역화 후에 투여된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편과 상기 샘플 사이의 결합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 상기 샘플 중의 IL-21R의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 이때 대조군 또는 기준 샘플과 비교할 때 상기 샘플에서 상기 결합체의 형성에서의 유의한 차이는 상기 샘플 중의 IL-21R의 존재를 표시하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시양태에서, 샘플은 혈청, 혈장 또는 조직이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 (a) 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 IL-21R과 결합할 수 있는 조건 하에 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계, 및 (b) 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편과 IL-21R 사이의 결합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 생체 내에서 IL-21R의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 이때 대조군 또는 기준 샘플과 비교할 때 상기 대상체에서 상기 결합체의 형성 또는 형성 수준의 유의한 차이는 IL-21R의 존재를 표시하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 결합된 항체 또는 비결합된 항체의 검출을 촉진하기 위해 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 추가 실시양태에서, 검출가능한 물질은 효소, 보결 기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질 또는 방사성 물질이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 사이토카인 억제제, 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제, 대사 억제제, 효소 억제제, 세포독성제 및 세포증식 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 또 다른 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 상기 치료제는 TNF 길항제, IL-12 길항제, IL-15 길항제, IL-17 길항제, IL-18 길항제, IL-19 길항제, IL-20 길항제, IL-21 길항제, IL-23 길항제, T 세포-소진제, B 세포-소진제, 메토트렉세이트(methotrexate), 레플루노마이드(leflunomide), 시롤리무스(sirolimus)(라파마이신) 또는 이의 유사체, cox2 억제제, cPLA2 억제제, NSAID 및 p38 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 다른 방법에서와 같이, 일부 실시양태에서 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 항-생성물 항체, 예를 들어, 항-IL-21R 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편에 대한 항-생성물 항체의 생성 수준의 측정, 확인 및/또는 평가 방법을 제공한다.
개시내용의 추가 양태는 부분적으로 상세한 설명에 기재될 것이고, 부분적으로 상세한 설명으로부터 자명하거나 본 발명의 실시에 의해 인식될 수 있다. 본 발명은 명세서에 기재되어 있고 특히 특허청구범위에 기술되어 있으며, 개시내용은 특허청구범위를 한정하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 하기 상세한 설명은 본 발명의 다양한 실시양태들의 예시적인 대표적 실시양태들을 포함하고, 이러한 대표적인 실시양태들은 청구된 본 발명을 한정하지 않는다. 첨부된 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 상세한 설명과 함께 실시양태들을 설명하기 위해 제공될 뿐, 본 발명을 한정하기 위해 제공되는 것은 아니다.
도 1(a 내지 c)은 scFv에 의한 인간 IL-21R-BaF3 세포의 증식의 중화를 보여준다. 세포를 표시된 scFv와 혼합한 후 100 pg/㎖의 인간 IL-21과 함께 항온처리하였다. 48시간 후 증식을 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)(등록상표)(프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 측정하였다.
도 2(a 내지 c)는 scFv에 의한 인간 IL-21R-TF1 세포의 증식의 중화를 보여준다. 세포를 표시된 scFv와 혼합한 후 100 pg/㎖의 인간 IL-21과 함께 항온처리하였다. 48시간 후 증식을 셀타이터-글로(등록상표)로 측정하였다.
도 3(a 내지 c)은 scFv에 의한 뮤린 IL-21R-BaF3 세포의 증식의 중화를 보여준다. 세포를 표시된 scFv와 혼합한 후 400 pg/㎖의 뮤린 IL-21과 함께 항온처리하였다. 48시간 후 증식을 셀타이터-글로(등록상표)로 측정하였다.
도 4(a 내지 c)는 뮤린 IL-21R과의 결합에 대해 scFv와 모 항체 18A5 IgG의 경쟁을 보여준다. scFv를 바이오틴-부착된 뮤린 IL-21R-His/FLAG(H/F)와 혼합하고, 혼합물을 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA) 플레이트 상에 고정된 항체 18A5에 첨가하였다. 뮤린 IL-21R(mIL-21R)의 포획을 호스라디쉬 퍼록시데이즈(HRP)-스트렙타비딘으로 검출하였고, mIL-21R과의 결합에 대한 경쟁을 A450 신호의 감소로 표시하였다.
도 5는 21개의 중쇄/경쇄 쌍에 의한 IL-21-의존성 증식의 중화를 보여준다. 도면에 표시된 항체를 세포에 첨가하였다. 이어서, IL-21을 첨가하고, 48시간 후 증식을 셀타이터-글로(등록상표)로 측정하였다. 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-BaF3 세포에 대한 분석을 수행하였고(도 5a 내지 5c), 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-TF1 세포에 대한 분석을 수행하였고(도 5d 내지 5f), 400 pg/㎖의 뮤린 IL-21을 사용하여 뮤린 IL-21R-BaF3 세포에 대한 분석을 수행하였다(도 5g 내지 5i).
도 6은 인간 IL-21R(도 6a 내지 6c), 래트 IL-21R(도 6d 내지 6f), 시아노몰구스 원숭이 IL-21R(도 6g 내지 6i) 및 인간 감마 공통 쇄(도 6j 내지 6l)를 일시적으로 발현하는 CHO 세포와 21개의 항-IL-21R IgG의 결합을 보여준다. CHO 세포를 IL-21R 또는 대조군 감마 공통 쇄로 일시적으로 형질감염시키고, 결합을 세포-기재 ELISA 분석에서 HRP-접합된 항-인간 IgG로 검출하였다.
도 7(a 내지 c)은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된, 특정한 항-IL-21R 항체(도 7a, AbS; 도 7b, AbQ, AbT 및 AbO; 도 7c, AbR, AbP 및 AbU)의 결합 특이성을 보여준다. 항-IL-21R 항체를 항-인간 IgG 상에 포획하고, 뮤린 IL-21R-H/F, 인간 IL-13-H/F, 인간 IL-2Rβ 또는 인간 가용성 IL-4R에의 후속 결합을 비아코어(BIACORE)(상표명) 장치(지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 측정하였다. 도 7d는 인간 IL-2Rβ 및 인간 가용성 IL-4R이 특이적 항-IL-2Rβ 및 항-IL-4R 항체 각각에 의해 포획됨을 보여준다(대조군).
도 8(a 내지 d)은 항-IL-21R 항체와 인간 IL-21R 및 뮤린 IL-21R의 결합을 보여준다. 표시된 인간 항-IL-21R 항체를 비아코어(상표명) 칩 상에 고정된 항-인간 IgG 상에 포획하였다. 다양한 농도의 인간 IL-21R-H/F(도 8a 및 8b) 및 뮤린 IL-21R-H/F(도 8c 및 8d)를 상기 칩 상에 유동시키고, 결합 및 해리를 모니터링하였다.
도 9는 항-IL-21R 항체와 인간 IL-21R 및 시아노몰구스 원숭이 IL-21R의 결합을 보여준다. 인간 항-IL-21R 항체 AbS 및 AbT를 비아코어(상표명) 칩 상에 고정된 항-인간 IgG 상에 포획하였다. 다양한 농도의 인간 IL-21R-H/F 및 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F를 상기 칩 상에 유동시키고, 결합 및 해리를 모니터링하였다. 도 9a는 AbS에 결합하는 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F를 보여준다. 도 9b는 AbS에 결합하는 인간 IL-21R-H/F를 보여준다. 도 9c는 AbT에 결합하는 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F를 보여준다. 도 9d는 AbT에 결합하는 인간 IL-21R-H/F를 보여준다.
도 10은 IL-21R 항체의 에피토프 평가를 보여준다. 도 10a에 도시된 실험에서(Y-축의 좌측에 있는 설명 또한 참조), 뮤린 IL-21R-H/F(His-FLAG 융합 단백질)를 비아코어(상표명) 칩 상에 고정된 항-IL-21R 항체 AbS로 포획하였다. 추가 항-IL-21R 항체(AbS, AbT, D5(D5-20, 중화 항-뮤린 IL-21R 항체) 및 7C2(비중화 항-뮤린 IL-21R 대조군 항체))를 상기 칩 상에 유동시키고, 포획된 IL-21R-H/F와 상기 항체들의 결합을 모니터링하였다. 도 10b에 도시된 실험에서, 인간 IL-21R-H/F를 비아코어(상표명) 칩 상에 고정된 항-IL-21R 항체 AbS로 포획하였다. 추가 항-IL-21R 항체(AbS, AbT 및 9D2(비중화 항-인간 IL-21R 대조군 항체))를 상기 칩 상에 유동시키고, 포획된 IL-21R-H/F와 상기 항체들의 결합을 모니터링하였다.
도 11은 표시된 항체들에 의한 인간 IL-21R-BaF3 세포 및 뮤린 IL-21R-BaF3 세포의 증식 중화를 보여준다. 항체를 세포에 첨가하였다. 이어서, IL-21을 첨가하고, 48시간 후 증식을 셀타이터-글로(등록상표)로 측정하였다. 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-BaF3 세포에 대한 분석을 수행하였고(도 11a), 200 pg/㎖의 뮤린 IL-21을 사용하여 뮤린 IL-21R-BaF3 세포에 대한 분석을 수행하였고(도 11b), 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-TF1 세포에 대한 분석을 수행하였다(도 11c).
도 12는 인간 일차 B 세포의 IL-21-의존성 증식 중화를 보여준다. 표시된 항체들을 항-CD40 항체 및 인간 IL-21과 함께 일차 인간 B 세포에 첨가하였다. 3일 후 3H-티미딘의 도입을 측정하였다. 도 12a는 AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, IL-13 삼중-돌연변이체 및 모 항체 18A5 사이의 비교를 보여주고, 도 12b는 AbT, AbV, AbW, AbU 및 인간 IgG1 대조군(hIg1) 사이의 비교를 보여준다.
도 13은 인간 일차 CD4+ T 세포의 IL-21-의존성 증식 중화를 보여준다. 표시된 항체들을 인간 IL-21과 함께 활성화된 일차 인간 CD4+ T 세포에 첨가하고, 3일 후 3H-티미딘의 도입을 측정하였다.
도 14는 뮤린 일차 CD8+ T 세포의 IL-21-의존성 증식 중화를 보여준다. 표시된 항체들을 인간 IL-21과 함께 활성화된 일차 뮤린 CD8+ T 세포에 첨가하고, 3일 후 3H-티미딘의 도입을 측정하였다.
도 15는 항-IL-21R 항체에 의해 유도된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)의 측정을 보여준다. 표시된 항-IL-21R 항체로 코팅된 CFSE-표지된 BJAB 세포의 PBMC-의존성 사멸을 프로피디움 요오다이드의 도입으로 측정하였다. 항-CD20 항체 리툭시마브(리툭산(RITUXAN(등록상표), 제넨테크 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재)를 양성 대조군으로서 포함시키고, 항-IL-13 항체를 음성 대조군으로서 포함시켰다.
도 16은 항-IL-21R 항체에 의한 보체 C1q 결합을 보여준다. 표시된 항-IL-21R 항체를 ELISA 플레이트 상에 고정시키고, 인간 혈청과 함께 항온처리한 후, C1q 결합을 닭 항-인간 C1q 및 HRP-접합된 항-닭 IgY 항체를 사용하여 측정하였다. 항-CD20 항체 리툭시마브(리툭산(등록상표))를 양성 대조군으로서 포함시키고, 항-IL-13 항체를 음성 대조군으로서 포함시켰다.
도 17(a 내지 c)은 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbQ에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 18(a 내지 c)은 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbR에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 19(a 내지 c)는 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbW에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 20(a 내지 c)은 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbS에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 21(a 내지 c)은 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbT에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 22(a 내지 c)는 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbO에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 23(a 내지 c)은 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbP에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 24(a 내지 c)는 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbU에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 25(a 내지 c)는 VH 도메인, VL 도메인, CDR(H1, H2, H3, L1, L2 및 L3), 및 불변 영역을 포함하는 AbV에 대한 아미노산 서열을 보여준다.
도 26(a 내지 g)은 (전술된) 도 5, 11, 12, 13 및 14에 나타낸 결과를 얻기 위해 수행된 연구와 유사하게 수행된 추가 연구로부터 얻은 결과를 보여준다.
도 27a는 뮤린 IL-21R(mIL-21R)과의 결합에 대한 IL-21 사이토카인과 항체 AbT의 경쟁을 보여준다. 비히클 또는 증가하는 양의 IL-21을 바이오틴-부착된 뮤린 IL-21R-H/F와 혼합하고, 혼합물을 ELISA 플레이트 상에 고정된 AbT에 첨가하였다. mIL-21R의 포획을 HRP-스트렙타비딘으로 검출하고, mIL-21R과의 결합에 대한 경쟁을 A450 신호의 감소로 표시하였다. 도 27b는 mIL-21R과의 결합에 대한 AbS와 IL-21의 경쟁을 보여준다. AbS와 mIL-21을 혼합하여 ELISA 플레이트 내의 고정된 mIL-21R-Fc에 도포하고, AbS(채워진 마름모형), 동형(isotype) 대조군 항체(빈 삼각형) 또는 mIL-21(사각형)의 결합을 모니터링하였다.
도 28은 항-IL-21R 항체 AbS, AbU, AbV 또는 AbW, 또는 동형 대조군 항체 hIgG1-TM의 존재 하에 래트 CD3 T 세포 내로의 IL-21-의존성 3H 티미딘 도입을 보여준다.
도 29는 토끼 IL-21을 함유하는 10% 컨디셔닝된(conditioned) 배지의 부재(도 29a) 또는 존재(도 29b) 하에 고정된 항-마우스 IgG 항체에 의해 제시된 토끼 IL-21R-Fc의 두 동종형(isoform) 중 어느 하나와 AbS의 결합을 보여준다.
도 30은 항-IL-21R 항체로 처리된 동물에서 NP-특이적 일차 항체 반응을 보여준다. 도 30a는 NP-특이적 IgG 반응을 보여주고, 도 30b는 NP-특이적 IgM 반응을 보여준다. 도 30c 내지 30f는 도 30a에서 나타낸 실험의 반복에서 NP-특이적 IgG 하위클래스 반응을 보여주고, 이때 ELISA 데이타는 개개의 동물들에 대해 표시되어 있다: 총 IgG(도 30c), IgG1(도 30d), IgG2a(도 30e) 및 IgG2c(도 30f). 도 30g는 2달 동안의 NP-특이적 IgG 반응을 보여준다. 도 30h는 2달 연구 기간의 말기에 골수에서 발견된 NP-특이적 IgG 항체-분비 세포(ASC)를 보여준다.
도 31은 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스에서 항-이중가닥 DNA(항-dsDNA) 항체를 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회)로 처리하고, 뮤린 IL-21에 대한 반응성을 나타내지 않는 항-인간 IL-13 인간 IgG1 A234 A235 A237 삼중-돌연변이체 항체(IL-13 TM)를 동형 대조군으로서 사용하였다. 2주마다 모은 혈청을 항-dsDNA의 존재에 대해 ELISA로 시험하였다. 도 31a는 처리 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31b는 출혈 전 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31c는 2주 동안의 투여 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31d는 4주 동안의 투여 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31e는 6주 동안의 투여 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31f는 8주 동안의 투여 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31g는 10주 동안의 투여 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 31a 및 도 31c 내지 31g에서, 별표는 식염수 및 IL-13 대조군과 비교할 때 유의한 차이를 표시한다(p<0.01). 도 31b에서, 별표는 다른 3개의 군과 비교할 때 유의한 차이를 표시한다(p<0.01). 도 31b 내지 도 31g에서 점선은 검출 수준을 표시한다.
도 32는 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스의 신장에서 IgG 침착물을 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하고(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회), 뮤린 IL-21에 대한 반응성을 나타내지 않는 항-인간 IL-13 인간 IgG1 A234 A235 A237 삼중-돌연변이체 항체를 동형 대조군으로서 사용하였다. 처리로부터 10주 후, 마우스를 희생시키고, 신장에서 IgG 침착물을 면역세포화학법(immunocytochemistry)으로 확인하였다(도 32b; 사구체는 점선 원으로 표시되어 있고, IgG 침착물의 예는 화살촉 모양으로 표시되어 있음). 염색 강도는 1 내지 5의 등급으로 점수가 매겨졌다(도 32a).
도 33은 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스의 신장에서 IgM 및 보체 C3 침착물을 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회). 처리로부터 10주 후, 마우스를 희생시키고, 신장에서 IgM(도 33a) 및 보체 C3(도 33b) 침착물을 면역세포화학법으로 확인하였다. 염색 강도를 1 내지 5의 등급으로 점수를 매겼다.
도 34는 항-IL-21R 항체로 처리된(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회) MRL-Faslpr 마우스의 뇌에서 IgG, IgM 및 보체 C3 침착물을 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다. 처리로부터 10주 후, 마우스를 희생시키고, 뇌에서 IgG(도 34a), IgM(도 34b) 및 보체 C3(도 34c) 침착물을 면역세포화학법으로 확인하였다. 염색 강도를 1 내지 5의 등급으로 점수를 매겼다.
도 35는 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스의 신장에서 림프구 침윤물을 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회). 처리로부터 10주 후, 마우스를 희생시키고 헤마톡실린/에오신(H/E)-염색된 절편을 3개 구역, 즉 피질 간질(사구체에 대한 지지 구조체)(도 35a), 피질 혈관주위(도 35b) 및 신우주위(요관의 기점 근처)(도 35c)에서 림프구 침윤물에 대해 조사하였다. 림프구의 수를 1 내지 5의 등급으로 점수를 매겼다.
도 36은 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스의 폐에서 림프구 침윤물을 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회). 처리로부터 10주 후, 마우스를 희생시키고, H/E-염색된 폐 절편을 림프구 침윤물에 대해 조사하였다. 림프구의 수를 1 내지 5의 등급으로 점수를 매겼다.
도 37a 및 37b는 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스에서 마우스 항-인간 항체(MAHA) 반응을 보여준다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다(10 mg/kg, 복강내 투여, 주 당 3회). 2주마다 모은 혈청을, 마우스에 처리된 항체와 동일한 인간 항체에 결합할 수 있는 뮤린 항체의 존재(도 37a), 또는 다른 항-IL-21 인간 항체에 결합할 수 있는 뮤린 항체의 존재(도 37b)에 대해 ELISA로 시험하였다. 도 37a에서, 별표는 항-IL-13-처리된 군과 비교할 때 유의한 차이를 표시한다(p<0.05).
도 38은 항-IL-21R 항체로 처리된 MRL-Faslpr 마우스에서 항-dsDNA 항체의 발생을 보여준다. 도 38a는 AbS로 처리된 마우스에 대한 항-dsDNA 항체 역가를 보여주고, 도 38b는 AbT로 처리된 마우스에 대한 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다. 도 38c 및 도 38d는 AbS 및 AbT로 처리된 MRL-Faslpr 마우스에서 신장 병리 및 신장 염증 병소를 보여준다.
도 39는 항-IL-21R 항체로 처리된 마우스 또는 래트에서 등 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 보여준다. 도 39a 내지 도 39e: 공기 주머니를 생성하기 위해 BALB/C 마우스의 등 피부 밑에 3 ㎖의 공기를 주입한 지 3일 후, 상기 주머니는 다시 팽창하였다. 2일 후, 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체를 복강내로 주사하였다. 100 ng의 뮤린 IL-21을 항체 주사로부터 24시간 후 상기 공기 주머니 내에 주입하였다. 6시간 후, 상기 주머니를 3 ㎖의 PBS로 세척하고, 총 세포수(도 39a), 단핵구(도 39b), 림프구(도 39c) 및 호중구(도 39d)를 측정하였다. 도 39e는 도 39a 내지 도 39d에서 도시된 실험의 재현에서 총 세포수를 보여준다. 도 39f 내지 도 39j는 마우스 IL-21 항체 및 항-IL-21R 항체로 처리한 후 래트에서 공기 주머니 내로의 총 세포 침윤을 보여준다. 도 39f는 AbS 또는 대조군 항체의 존재 또는 부재 하에 6시간 동안 20 ㎍의 mIL-21을 투여한 후 또는 20시간 동안 1 ㎍의 mIL-21을 투여한 후 세포 침윤을 보여준다. 도 39g 내지 도 39h는 20 ㎍의 mIL-21을 1, 3 또는 10 ㎍/kg AbS 또는 대조군의 존재 하에 6시간 동안 투여한 재현 실험에서 래트 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 보여준다. 도 39i에 도시된 실험에서, 래트를, 단독으로 사용되거나 조합 사용된 20 ㎍의 mIL-21 및 1 mg/kg의 항체(AbS 또는 동형 대조군)뿐만 아니라 20 ㎍ mIL-21과 10 mg/kg 항체의 조합물로 6시간 동안 처리하였다. 도 39j에서, 10, 20 또는 40 ㎍의 mIL-21을 1 또는 10 mg/kg의 AbS와 조합하여 시험하였다.
도 40은 정맥내로 또는 피하로 단회 투여 후 CD-1 마우스에서 AbS의 농도-시간 프로파일을 보여준다. 정량화 한계(LOQ) 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 데이타 점에 있어서 N은 4 내지 8이다.
도 41은 복강내로 단회 투여 후 DBA 마우스 및 MRL-Faslpr 마우스에서 AbS의 농도-시간 프로파일을 보여준다. LOQ 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 데이타 점에 있어서 N은 4 내지 8이다.
도 42a 및 도 42b는 10, 5 및 2.5 mg/kg 투여량으로 10주 동안 주 당 3회 복강내로 다회 투여한 후 MRL-Faslpr 마우스에서 관찰된 AbS 농도 및 예측된 AbS 농도를 보여준다. LOQ 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 데이타 점에 있어서 N은 7 내지 8이다.
도 43a 및 도 43b는 도시된 바와 같이 투여 후 시아노몰구스 원숭이에서 AbS의 농도-시간 프로파일을 보여준다. LOQ 미만의 농도(<30 ng/㎖)는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 데이타 점에 있어서 N은 3이다. 도 43a에서 SAN은 연구 동물 수이다.
도 44는 마우스에게 단회 투여한 후 AbS 및 AbT의 농도-시간 프로파일을 보여준다. 도 44a는 CD-1 마우스에서 10 mg/kg 정맥내 투여 후 프로파일을 보여준다. 도 44b는 MRL-Faslpr 마우스에서 10 mg/kg 복강내 투여 후 프로파일을 보여준다. 도 44c는 DBA 마우스에서 8 mg/kg 복강내 투여 후 프로파일을 보여준다. LOQ 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 데이타 점에 있어서 N은 4 내지 8이다.
도 45는 20 mg/kg 투여량으로 10주 동안 주 당 3회 복강내로 다회 투여한 후 MRL-Faslpr 마우스에서 관찰된 AbT 농도 및 예측된 AbT 농도를 나타낸다. LOQ 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 시점 당 N은 6 내지 8이다.
도 46a 및 도 46b는 도시된 바와 같이 투여 후 시아노몰구스 원숭이에서 AbT 및 AbS의 농도-시간 프로파일을 보여준다. LOQ 미만의 농도(<30 ng/㎖)는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 군에 있어서 N은 3이다.
도 47은 수컷 DBA 마우스에서 항-IL-21R 항체 AbS, AbT 및 125I-D5(8 mg/kg, 복강내)의 농도-시간 프로파일을 보여준다. 인간 항체 AbS 및 AbT를 항-인간 IgG ELISA로 정량하고, 125I-표지된 뮤린 항체 D5를 방사성표지를 모니터링하여 정량하였다.
도 48a는 10 mg/kg을 정맥내로 단회 투여한 후 스프라그-돌리(S-D) 래트에서 AbS, AbT 및 동형 대조군의 평균 혈청 농도(Y-축; ng/㎖)를 나타낸다. 도 48b는 S-D 래트에서 10 mg/kg을 S-D 래트에게 정맥내로 단회 투여한 후 항-IL-21R 항체 AbS 내지 AbW를 보여준다. LOQ(45 ng/㎖) 미만의 개개의 데이타 점은 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 평균 값이 LOQ 미만인 경우(예를 들어, 모든 동물이 LOQ 미만의 값을 나타내는 경우), 데이타 점은 표시되지 않는다.
도 49는 정맥내로, 복강내로 또는 피하로 단회 투여한 후 S-D 래트에서 AbS의 평균 혈청 농도(Y-축; ng/㎖)를 보여준다.
도 50은 2.5 mg/kg을 정맥내로 단회 투여한 후 IL-21R 넉아웃(knockout) 마우스 및 야생형 C57BL/6(대조군) 마우스에서 125I-AbS의 생체분포를 보여준다. 도 50a는 대조군 C57BL/6 마우스의 조직에서 125I-AbS의 농도를 보여준다. 도 50b는 IL-21R 넉아웃 마우스에서 125I-AbS의 농도를 보여준다. 도 50c는 대조군 C57BL/6 마우스 및 IL-21R 넉아웃 마우스에서 125I-AbS의 혈청 농도를 보여준다. 도 50d는 대조군 C57BL/6 마우스 및 IL-21R 넉아웃 마우스에서 125I-AbS의 누적 소변 카운트(count)를 보여준다. LOQ 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 혈청 또는 조직 데이타 점에 있어서 N은 9 내지 10이고, 각 소변 데이타 점에 있어서 N은 5 내지 10이다.
도 51은 2.5 mg/kg을 복강내로 단회 투여한 후 MRL-Faslpr 마우스에서 125I-AbS의 생체분포를 보여준다. 도 51a는 MRL-Faslpr 마우스에서 125I-AbS의 농도를 보여준다. 도 51b는 MRL-Faslpr 마우스에서 125I-AbS의 소변 카운트를 보여준다.
도 52는 2.5 mg/kg 및 10 mg/kg을 복강내로 단회 투여한 후 MRL-Faslpr 마우스에서 125I-AbS의 혈청 농도를 보여준다. LOQ 미만의 농도는 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리하였다. 각 데이타 점에 있어서 N은 4 내지 8이다.
도 53a는 인간 전혈 샘플에서 AbS의 농도가 증가함에 따라(X-축) IL-21-유도된 IL-2Rα(IL2RA), PRF1, IL-6 및 CD19 발현의 억제율(Y-축)(변화 배수로부터 계산됨)을 보여주고, 도 53b는 인간 전혈 샘플에서 증가하는 AbS 농도(X-축; 농도 Ab(nM))에 반응한, IL-6의 IL-21-유도된 상대적 발현 수준(RQ; Y-축)의 억제를 보여준다.
도 54는 분석을 위해 주문제작한 TLDA(택만(Taqman)(등록상표) 저밀도 어레이) 상에 포함된 유전자들을 보여주는데, 이때 내재성(엔도) 대조군이 표시되어 있다.
도 55는 2, 4, 6 또는 24시간에서 다양한 농도의 IL-21에서 6종의 조사된 유전자들(CD19, GZMB, IFNγ(IFNG), IL-2Rα(IL2RA), IL-6 및 PRF1)의 유전자 발현의 상대적 정량화(RQ; Y-축)를 보여준다.
도 56a는 IL-21 및 다양한 농도의 AbS 또는 IgG1 TM 대조군(X-축)과 함께 항온처리한 후 6종의 조사된 유전자들(CD19, GZMB, IFNγ, IL-2Rα, IL-6 및 PRF1)의 유전자 발현의 상대적 정량화(RQ; Y-축)를 보여준다. 도 56b 및 도 56c는 다양한 농도의 AbS 또는 대조군 IgG1 TM(X-축)으로 처리한 후 상기 유전자들의 IL-21 반응의 억제율(Y-축)을 보여준다.
도 57은 재조합 인간 IL-21을 사용한 생체외 자극 후 수컷 시아노몰구스 원숭이의 전혈에서 IL-2Rα 유전자 발현의 상대적 정량화(RQ) 값의 분포를 보여준다. 도 57a는 상기 RQ 값(X-축)에 대한 막대그래프 분석(Y-축)을 보여주고, 도 57b는 통계학적 소프트웨어 팩키지를 이용하여 수득한 로그2-변환된 RQ 값(X-축)에 대한 막대그래프 분석(Y-축)을 보여준다. 직선은 가우스 분포를 나타낸다. 점선은 하기 수학식을 이용하여 정의된, 생체내 연구로 등록될 컷오프 RQ를 나타낸다: 로그{RQ컷오프} = 로그-변환된 RQ 값의 평균 - 로그-변환된 RQ 값의 표준 편차. 도 57c는 개개의 동물을 비교하고 IL-21로만 자극된 전혈 분취액(원형)과 비교할 때 IL-21 및 AbT(삼각형) 또는 IL-21 및 대조군 IgG(사각형)로 자극된 전혈 분취액의 평균(직선) RQ 값(Y-축)을 비교한 것이다.
도 58은 10 mg/kg의 항-IL-21R 항체 AbS("A") 또는 AbT("B")를 수컷 시아노몰구스 원숭이에게 정맥내로 단회 투여한 후 혈청 농도(Y-축)를 보여주는데, 이때 상기 혈청은 AbS의 경우 148일째 날까지 모았고 AbT의 경우 36일째 날까지 모았다(X-축). 보다 낮은 LOQ(30 ng/㎖) 미만의 혈청 농도를 보이는 데이타 점은 표시되지 않았다.
도 59는 10 mg/kg의 항-IL-21R 항체 AbS를 수컷 시아노몰구스 원숭이에게 정맥내로 단회 투여한 후 투여 전 및 투여 후 다양한 시점(X-축; 시간(일))에서 측정된 항체 혈청 농도(제2 Y-축), 약력학적(PD) 활성("RQ"; 제1 Y-축), 및 중화 항-생성물 항체 반응("AN"으로 표시됨)을 포함하는 항-생성물 항체 반응("A"로 표시됨)의 상관관계를 보여준다. 도 59a 내지 도 59c는 동물 1 내지 3 각각에 대한 결과를 보여준다.
도 60은 AbT(10 mg/kg의 정맥내 단회 투여)의 경우 도 59에 나타낸 항체 혈청 농도, PD 활성 및 항-생성물 항체 반응과 유사한 상관관계를 보여준다. 도 60a 내지 60c는 동물 4 내지 6 각각에 대한 결과를 보여준다.
도 61은 정맥내 단회 투여 후 시아노몰구스 원숭이에서 AbS 내지 AbW의 농도-시간 프로파일을 보여준다. LOQ 미만의 농도(<30 ng/㎖)는 계산을 위해 0으로 처리하였다. AbS(채워진 원형, 연구 1; 빈 마름모형, 연구 2), AbT(빈 원형), AbV(채워진 마름모형) 및 AbU(빈 삼각형)의 경우 n은 3이고, 투여량은 10 mg/kg이다. AbW(빈 사각형)의 경우, n은 2이고, 투여량은 1 mg/kg이다.
도 62는 2 mg/kg(도 62a) 또는 10 mg/kg(도 62b)의 AbS를 파상풍 독소가 투여된 수컷 시아노몰구스 및 암컷 시아노몰구스에게 정맥내로 주 당 3회 투여한 후(화살표) AbS의 개별 농도(ng/㎖)를 보여준다.
도 63은 정맥내 투여 후 AbS PK 파라미터의 상대성장 스케일링(allometric scaling)을 나타낸다. 체중(W); 최대 수명 잠재력(년 단위; MLP).
도 63a는 체중(X-축)에 대해 작도된 CLㅇMLP(Y-축)를 나타내고, 도 63b는 체중(X-축)에 대해 작도된 분포 용적(Y-축)을 나타낸다. 직선은 마우스, 래트 및 시아노몰구스 원숭이로부터 수득된 데이타를 사용한 선형 회귀에 의거하여 작도된 곡선을 나타낸다. 점선은 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 64는 정맥내 투여 후 AbT PK 파라미터의 상대성장 스케일링을 나타낸다. 체중(W); 뇌 중량("BW"). 도 64a는 체중(X-축)에 대해 작도된 CL*BW(Y-축)를 나타내고, 도 64b는 체중(X-축)에 대해 작도된 분포 용적(Y-축)을 나타낸다.
도 65a 및 65b는 NZBWF1/J 마우스에서 단백뇨의 발달에 대한 AbS의 효과(도 65a) 및 항-dsDNA IgG 혈청 항체 역가(도 65b)를 보여준다. 암컷 26주령 NZBWF1/J 마우스에게 400 ㎍의 식염수, 항-에이메리아 테넬라(E. tenella) 항체, mCTLA-4Ig, hIgGTm 항체 또는 AbS 항체를 10주 동안 주 당 3회 투여하였다. 소변 단백질 농도 및 항-dsDNA IgG 혈청 항체 역가를 연구의 개시 시점에서 측정하고, 그 후 10주 동안 2주마다 측정하였다. CTLA4-Ig로 처리된 동물들은 4 내지 10주에서 항-dsDNA 역가의 유의한 감소(별표; p<0.05)를 보여주었다.
도 66은 류마티스성 관절염의 반-치료 CIA 마우스 모델에서 질환 발현에 대한 항-IL-21R 중화의 효과를 보여준다. 암컷 DBA/1 마우스를 면역화시키고 소 콜라겐 타입 II로 부스팅하였는데, 본 연구에서 10%의 동물들이 발 팽윤을 나타내었을 때, 마우스에게 8 mg/kg의 뮤린 IgG2a 동형 대조군 항체, 항-마우스 IL-21R 항체 D5(뮤린 IgG2a 항체) 또는 mTNFRII-Fc(양성 대조군, 뮤린 IgG2a 동형)(도 66a); 또는 항-IL-13TM 항체(인간 IgG1 동형 대조군 항체), AbT 또는 AbS(도 66b)를 30일 동안 주 당 3회 투여하였다. 30일 동안의 본 연구의 개별 동물 점수는 도 66c에 표시되어 있다.
도 67은 AbS의 존재 하에 시아노몰구스 원숭이에서 파상풍 독소에 대한 기억상실 파상풍-특이적 IgM 및 IgG 혈청 항체 반응의 발생을 보여준다. 9마리의 수컷 시아노몰구스 및 암컷 시아노몰구스를 파상풍 독소로 면역화시키고 43일 동안 쉬게 하였다. 43일 후, 수컷 원숭이 및 암컷 원숭이를 3개의 군으로 무작위적으로 배정하고 식염수(비히클), 2 mg/kg AbS 또는 10 mg/kg AbS로 3주 동안 주 당 1회 처리하였다. 비히클 또는 AbS의 제1 투여로부터 24시간 후(화살표), 원숭이들을 파상풍 독소로 다시 면역화시켰다. 원숭이들을 본 연구 기간 동안 관용적으로 사육하고 파상풍-특이적 IgM(도 67a) 및 IgG(도 67b) 혈청 항체 역가에 대해 조사하였다.
본 발명의 결합 단백질은 본래 모 항체 18A5로부터 유래되었지만 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3의 부분의 아미노산 서열에 있어서 모 항체 18A5와 상이하다. 추가로, 본 발명의 결합 단백질은 등가의 포맷(format)(예를 들어, scFv 또는 IgG)에서 모 항체 18A5와 비교할 때 인간 IL-21R 및 뮤린 IL-21R 둘다에 결합하여 중화시키는 면에서 개선된 효능을 보인다. 단일 결합 단백질에 의한, 두 종(인간 및 마우스)으로부터 유래된 IL-21R의 높은 중화 효능은 이전에 보고된 바가 없다. 그들의 모 항체보다 더 높은 중화 효능을 보이는 본 발명의 결합 단백질은 이미 공지된 약제와 비교할 때 더 높은 효율로 번역될 수 있다. 또한, VH 골격 영역 및 VL 골격 영역의 아미노산 서열을 인간 게놈 서열에 의해 코딩된 서열과 일치하도록 변경시킴으로써 본 발명의 결합 단백질로 치료받은 환자에서 인간 항-인간 항체 반응에 대한 잠재력을 감소시켰다.
정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 일부 용어들을 먼저 정의한다. 추가 정의는 상세한 설명 및 본 명세서의 다른 부분에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "결합 단백질"은 항원, 표적 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 단편에 결합하는 임의의 천연 발생 단백질, 재조합 단백질, 합성 단백질 또는 유전학적으로 개조된 단백질, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 본 발명의 결합 단백질은 항체를 포함할 수 있거나 하나 이상의 항체 단편으로부터 유래될 수 있다. 상기 결합 단백질은 천연 발생 단백질 및/또는 합성적으로 개조된 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 항원 또는 이의 단편에 결합하여 결합체를 형성할 수 있고 생물학적 반응(예를 들어, 특정한 생물학적 활성의 활성화 또는 길항)을 일으킬 수 있다. 결합 단백질은 단리된 항체 단편, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되어 있는 재조합 단일-쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변 영역과 유사한 아미노산 잔기들로 구성된 최소 인식 단위체(unit)를 포함할 수 있다. 또한, 결합 단백질 단편은 항체의 기능성 단편들, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv 및 항체의 단일 가변 도메인(dAb)을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 이중-쇄 또는 단일-쇄일 수 있고 단일 결합 도메인 또는 다수의 결합 도메인을 포함할 수 있다.
결합 단백질은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 하나 이상의 천연 또는 개조된 불변 영역 중 CH1 이외의 불변 영역, 예를 들어, IgG 및 IgA의 CH2 영역 및 CH3 영역 또는 IgE의 CH3 영역 및 CH4 영역을 포함하는 영역에 융합되거나 연결된 면역글로불린 힌지(hinge) 또는 힌지-작용 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질도 포함할 수 있다(예를 들어, 보다 완전한 설명을 위해서는 미국 특허 공개 제2005/0136049호(Ledbetter et al.) 참조). 상기 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 개조된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 구축물의 경우 CH3), 및 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 구축물의 경우 CH3)에 융합되거나 연결된 천연 또는 개조된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 구축물의 경우 CH4)를 포함하는 영역을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성, 보체 고정 및/또는 표적, 예를 들어, 표적 항원과의 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 면역학적 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 마우스, 래트, 인간, 카멜, 라마, 물고기, 상어, 염소, 토끼, 닭 및 소를 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 지정된 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 단편에 대한 반응성을 나타내는 면역글로불린을 의미한다. 적절한 항체는 인간 항체, 영장류화 항체, 키메라 항체, 단일클론 항체, 단일특이적 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체, 비특이적 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 혼성체 항체, 돌연변이된 항체, 이식된 접합된 항체(즉, 다른 단백질, 방사성표지 또는 세포독소에 접합되거나 융합된 항체) 및 시험관 내에서 생성된 항체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 클래스의 항체로부터 유래될 수 있고 상기 항체의 임의의 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 항체로부터 유래될 수 있다. 항체는 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 항체는 예를 들어, 카파(κ) 및 람다(λ)로부터 선택된 경쇄도 가질 수 있다. 본 발명의 항체는 마우스, 래트, 인간, 낙타, 라마, 물고기, 상어, 염소, 토끼, 닭 및 소를 포함하나 이들로 한정되지 않은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체의 불변 영역은 항체의 성질을 변화시키도록(예를 들어, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능 및 보체 기능 중 하나 이상의 성질을 증가시키거나 감소시키도록) 변경될, 예를 들어, 돌연변이될 수 있다. 전형적으로, 항체는 소정의 항원, 예를 들어, 질환, 예컨대, 염증 질환, 면역 질환, 자가면역 질환, 신경퇴행성 질환, 대사 질환 및/또는 악성 질환과 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용된 용어 "단일 도메인 결합 단백질"은 항원, 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 임의의 단일 도메인 결합 스카폴드(scaffold)를 포함한다. 단일 도메인 결합 단백질은 항원 또는 이의 단편에 결합하여 결합체를 형성하고 생물학적 반응(예를 들어, 특정한 생물학적 활성의 활성화 또는 길항)을 일으키는 임의의 천연 단백질 스카폴드, 재조합 단백질 스카폴드 또는 유전적으로 개조된 단백질 스카폴드, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 단일 도메인 결합 단백질은 천연 발생 단백질 또는 항체로부터 유래될 수 있거나, 재조합 기법에 의해 합성적으로 개조되거나 제조될 수 있다. 단일 도메인 결합 단백질은 당분야에서 공지된 또는 향후 공지될 임의의 단일 도메인 결합 단백질일 수 있고, 마우스, 인간, 낙타, 라마, 물고기, 상어, 염소, 토끼, 닭 및 소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 단일 도메인 결합 단백질 스카폴드는 물고기에서 발견되는 면역글로불린의 가변 영역, 예를 들어, 상어의 혈청에서 발견된 신규 항원 수용체(NAR)로서 공지된 면역글로불린 동형의 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR("IgNAR")의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 결합 스카폴드의 제조 방법은 국제특허출원 공개 제WO 03/014161호 및 문헌(Streltsov (2005) Protein Sci. 14(11):2901-09)에 기재되어 있다.
다른 실시양태에서, 단일 도메인 결합 단백질은 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체로서 당업계에 공지되어 있는 천연 발생 단일 도메인 결합 단백질이다. 이러한 단일 도메인 결합 단백질은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 94/004678호에 개시되어 있다. 명확하게 기재하기 위해, 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체로부터 유래된 가변 도메인 결합 단백질은 4개의 쇄로 구성된 면역글로불린의 보편적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 "나노바디(nanobody)"로서 기재된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 동물 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 단봉 낙타, 알파카 및 구아나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 동물 이외의 다른 패밀리도 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 중쇄 결합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. VHH 분자는 보편적인 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. VHH 분자는 단일 폴리펩티드이고 극도의 pH 및 온도 조건을 견딜 정도로 매우 안정하다. 뿐만 아니라, VHH 분자는 단백질분해효소의 작용에 대한 내성을 나타내나, 보편적인 항체들은 이러한 내성을 나타내지 못한다. 나아가, VHH 분자의 시험관내 발현은 적절하게 폴딩된 기능성 VHH를 고수율로 생성할 수 있다. 또한, 카멜리드(Camelid)에서 생성된 결합 단백질은 항체 라이브러리 또는 카멜리드 이외의 포유동물의 면역화를 통해 시험관 내에서 생성된 항체에 의해 인식되는 에피토프 이외의 에피토프를 인식할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원 공개 제WO 97/049805호 및 제WO 94/004678호 참조).
용어 "항원-결합 도메인" 및 "항원-결합 단편"은 결합 단백질과 항원의 특이적 결합을 담당하는 아미노산을 포함하는 결합 단백질의 부분을 의미한다. 결합 단백질이 특이적으로 인식하여 결합하는 항원의 부분은 "에피토프"로서 지칭된다. 항원-결합 도메인은 항체의 VL 및 VH를 포함할 수 있으나, 상기 영역 둘다를 반드시 포함해야 하는 것은 아니다. 예를 들어, Fd 단편은 2개의 VH 영역을 갖고 종종 온전한 항원-결합 도메인의 항원-결합 기능을 보유한다. 결합 단백질의 항원-결합 단편의 예로는 (1) VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 가진 일가 단편인 Fab 단편; (2) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 가진 이가 단편인 F(ab')2 단편; (3) 2개의 VH 도메인 및 1개의 CH1 도메인을 가진 Fd 단편; (4) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 도메인 및 VH 도메인을 가진 Fv 단편; (5) 1개의 VH 도메인을 가진 dAb 단편(예를 들어, 문헌(Ward et al. (1989) Nature 341:544-46) 참조); (6) 단리된 CDR; 및 (7) scFv가 있으나 이들로 한정되지 않는다. Fv 단편의 2개 도메인, 즉 VL 도메인 및 VH 도메인이 별개의 유전자에 의해 코딩되더라도, 상기 두 도메인들은 VL 영역 및 VH 영역 쌍이 일가 분자(scFv로서 공지됨)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 통해 연결될 수 있다(예를 들어, 문헌(Bird et al. (1988) Science 242:423-26); 및 문헌(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83) 참조). 이 결합 도메인 단편은 당업자에게 공지된 보편적인 기법을 이용하여 수득할 수 있고, 상기 단편은 예를 들어, 항체와 같은 온전한 결합 단백질과 동일한 방식으로 기능에 대해 평가된다.
용어 "중화"는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 항체)이 신호전달 경로 또는 항원, 예를 들어, IL-21/IL-21R 신호전달 경로 또는 IL-21R 항원의 활성을 감소시키거나 차단하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 "항-생성물 항체"는 외래 단백질, 예를 들어, 항-IL-21R 항체에 반응하여 형성된 항체를 의미한다. 본원에서 사용된 "중화 항-생성물 항체"는 외부로부터 도입된 단백질, 예를 들어, 항-IL-21R 항체의 생체내 활성을 차단하는 항-생성물 항체를 의미한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 중화 항-생성물 항체는 IL-21R 항체의 생체내 활성, 예를 들어, IL-21R 항체의 생체내 PD 활성(예컨대, IL-21-반응성 사이토카인 또는 유전자의 발현을 조절하는 항-IL-21R 항체의 능력)을 감소시킨다.
용어 "유효량"은 임상적 증상의 중증도의 완화 또는 경감, 또는 원하는 생물학적 효과, 예를 들어, 감소된 T 세포 및/또는 B 세포 활성, 자가면역의 억제, 이식편 거부의 억제를 달성하도록 IL-21R 활성을 조절하기에 충분한 투여량 또는 양을 의미한다.
용어 "인간 결합 단백질"은 예를 들어, 문헌(Kabat et al. (5th ed. 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 기재된 인간 생식세포주 면역글로불린 서열을 포함하는, 당업계에 공지된 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 실질적으로 상응하는 가변 영역 및 불변 영역을 가진 결합 단백질을 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어, CDR, 특히 CDR3에서 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 상기 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기로 치환된 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 위치를 가질 수 있다.
IL-21R 활성을 "억제", "길항", "차단" 또는 "중화"한다는 표현 및 이들의 동족 표현은 항-IL-21R 항체의 결합으로 인해 IL-21R의 1종 이상의 활성의 경감, 억제 또는 감소를 의미하고, 이때 상기 경감은 항-IL-21R 항체의 부재 하에서의 IL-21R의 활성을 기준으로 측정한다. IL-21R 활성은 당업계에 공지된 임의의 기법을 이용하여 측정할 수 있다. 억제 또는 길항작용이 반드시 IL-21R 생물학적 활성의 완전한 제거를 의미하지는 않는다. 활성 감소는 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상일 수 있다.
용어 "인터루킨-21R 수용체" 또는 "IL-21R"은 IL-21 리간드에 결합하는 클래스 I 사이토카인 패밀리 수용체[MU-1(예를 들어, 미국 특허출원 제09/569,384호; 및 미국 특허출원 공개 제2004/0265960호, 제2006/0159655호, 제2006/0024268호 및 제2008/0241098호 참조), NILR 또는 잘파11(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 01/085792호, 상기 문헌(Parrish-Novak et al. (2000)) 및 상기 문헌(Ozaki et al. (2000)) 참조)로도 공지되어 있음]를 의미한다. IL-21R은 IL-2 수용체, IL-15 수용체 및 IL-4α의 공유된 β 쇄에 대한 상동성을 나타낸다(상기 문헌(Ozaki et al. (2000))). 리간드와의 결합 시, IL-21R은 공통된 감마 사이토카인 수용체 쇄(γc)와 상호작용하여 STAT1 및 STAT3(상기 문헌(Asao et al. (2001))) 또는 STAT5(상기 문헌(Ozaki et al. (2000)))의 인산화를 유도할 수 있다. IL-21R은 넓은 림프 조직 분포를 보인다. 또한, 용어 "인터루킨-21 수용체" 또는 "IL-21R"은 폴리펩티드(바람직하게는 포유동물 유래의 폴리펩티드, 예를 들어, 뮤린 또는 인간 IL-21R)를 의미하거나, 문맥에 따라 IL-21(바람직하게는 포유동물 유래의 IL-21, 예를 들어, 뮤린 또는 인간 IL-21)과 상호작용하고 하기 특징들 중 1종 이상의 특징을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다: 천연 발생 포유동물 IL-21R 폴리펩티드 또는 이의 단편의 아미노산 서열, 예를 들어, 서열번호 2(인간 - 진뱅크(등록상표)(미국 보건성, 미국 매릴랜드주 베쎄스다 소재) 검색번호 NP_068570에 상응함) 또는 서열번호 4(뮤린 - 진뱅크(등록상표) 검색번호 NP_068687에 상응함)에 기재된 아미노산 서열 또는 이들의 단편; (2) 서열번호 2 또는 4에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편에 대한 실질적인 상동성, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열; (3) 천연 발생 포유동물 IL-21R 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편(예를 들어, 서열번호 1(인간 - 진뱅크(등록상표) 검색번호 NM_021798에 상응함) 또는 서열번호 3(뮤린 - 진뱅크(등록상표) 검색번호 NM_021887에 상응함), 또는 이들의 단편)에 의해 코딩되는 아미노산 서열; (4) 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편에 대한 실질적인 상동성, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열; (5) 천연 발생 IL-21R 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편, 예를 들어, 서열번호 1 또는 3 또는 이들의 단편에 대한 축퇴 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 및 (6) 엄격한 조건, 예를 들어, 고도로 엄격한 조건 하에 상기 뉴클레오티드 서열들 중 하나에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열. 추가로, 다른 비인간 IL-21R 및 비포유동물 IL-21R도 개시된 본 발명의 방법에서 유용한 것으로 고려된다.
용어 "인터루킨-21" 또는 "IL-21"은 IL-2, IL-4 및 IL-15에 대한 서열 상동성을 나타내고(상기 문헌(Parrish-Novak et al. (2000))) IL-21R에 결합하는 사이토카인을 의미한다. 이러한 사이토카인은 그 자신이 속한 패밀리를 대표하는 "4-나선-다발" 구조로의 공통된 폴딩을 공유한다. IL-21은 활성화된 CD4+ T 세포에서 주로 발현되고 NK 세포, B 세포 및 T 세포에 대해 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(상기 문헌(Parrish-Novak et al. (2000)) 및 상기 문헌(Kasaian et al. (2002))). IL-21과 IL-21R의 결합 시, IL-21R의 활성화는 예를 들어, STAT5 또는 STAT3 신호전달을 유도한다(상기 문헌(Ozaki et al. (2000))). 용어 "인터루킨-21" 또는 "IL-21"은 폴리펩티드(바람직하게는 포유동물 유래의 폴리펩티드, 예를 들어, 뮤린 또는 인간 IL-21)를 의미하거나, 문맥에 따라 IL-21R(바람직하게는 포유동물 유래의 IL-21R, 예를 들어, 뮤린 또는 인간 IL-21R)과 상호작용하고 하기 특징들 중 1종 이상의 특징을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다: (1) 천연 발생 포유동물 IL-21의 아미노산 서열 또는 이의 단편, 예를 들어, 서열번호 212(인간)에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편; (2) 서열번호 212에 기재된 아미노산 서열 또는 이의 단편에 대한 실질적인 상동성, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열, (3) 천연 발생 포유동물 IL-21 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편(예를 들어, 서열번호 211(인간) 또는 이의 단편)에 의해 코딩되는 아미노산 서열; (4) 서열번호 211에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편에 대한 실질적인 상동성, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; (5) 천연 발생 IL-21 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편에 대한 축퇴 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열; 및 (6) 엄격한 조건, 예를 들어, 고도로 엄격한 조건 하에 상기 뉴클레오티드 서열들 중 하나에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열.
용어 "IL-21R 활성" 등(예를 들어, "IL-21R의 활성", "IL-21/IL-21R 활성")은 IL-21R 결합의 결과로서 개시되거나 중단된 하나 이상의 세포 과정을 의미한다. IL-21R 활성은 하기 (1) 내지 (4)의 활성을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: (1) 리간드, 예를 들어, IL-21 폴리펩티드와의 상호작용 또는 결합; (2) 신호전달도입(특정한 자극에 반응하여 일어나는 세포내 캐스케이드를 의미하는 "신호전달"로도 지칭됨) 및 신호전달도입 분자(예를 들어, 감마 쇄(γc) 및 JAK1)와의 결합 또는 상기 신호전달도입 또는 신호전달도입 분자의 활성화, 및/또는 STAT 단백질, 예를 들어, STAT5 및/또는 STAT3의 인산화 및/또는 활성화의 자극; (3) 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, B 세포, 대식세포, 조절 T 세포(Tregs) 및 거대핵세포의 증식, 분화, 이펙터 세포 기능, 세포용해 활성, 사이토카인 분비 및/또는 생존의 조절; 및 (4) IL-21-반응성 유전자 또는 사이토카인의 발현 조절, 예를 들어, TNF, IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, ICAM-1, TBX21, CSF1, GZMB, PRF1, IL-2Rα, IL-21R 등의 발현 수준에 대한 IL-21 효과의 조절.
본원에서 사용된 용어 "시험관 내에서 생성된 항체"는 가변 도메인의 전부 또는 일부(예를 들어, 하나 이상의 CDR)가 비면역 세포 선별(예를 들어, 시험관내 파지 디스플레이, 단백질 칩, 또는 항원에 대한 후보 서열의 결합 능력을 시험할 수 있는 임의의 다른 방법)에서 생성된 항체를 의미한다.
용어 "단리된"은 실질적으로 그의 천연 환경으로부터 자유로운 분자를 의미한다. 예를 들어, 단리된 단백질은 이 단백질의 기원이 되는 세포 또는 조직 공급원으로부터 유래된 세포 물질 또는 다른 단백질들을 실질적으로 갖지 않는다. 또한, 상기 용어는 단리된 단백질이 약학 조성물용으로 충분히 순수한, 또는 70 내지 80%(중량/중량) 이상, 80 내지 90%(중량/중량) 이상, 90 내지 95%(중량/중량) 이상 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(중량/중량) 이상 순수한 제제를 의미한다.
"% 동일한" 또는 "% 동일성"은 2종 이상의 상이한 서열들 사이의 유사성을 의미한다. 이 % 동일성은 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, 문헌(Altshul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)에 기재된 기본 국소 정렬 검색 수단(BLAST); 문헌(Needleman et al., (1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)의 알고리즘; 또는 문헌(Meyers et al., (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)의 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 파라미터 세트는 갭 페널티가 12이고, 갭 연장 페널티가 4이고, 프레임변동(frameshift) 갭 페널티가 5인 블로섬(Blosum) 62 스코어링 매트릭스일 수 있다. 2종의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열들 사이의 % 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하여, ALIGN 프로그램(버젼 2.0) 내로 도입된 문헌(Meyers and Miller, (1989) CABIOS 4:11-17)의 알고리즘으로 측정할 수도 있다. % 동일성은 통상적으로 유사한 길이의 서열들을 비교함으로써 계산할 수 있다.
용어 "레파토리"는 1종 이상의 면역글로불린을 코딩하는 1종 이상의 서열로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 1종 이상의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 서열(들)은 중쇄의 V 분절, D 분절 및 J 분절과 경쇄의 V 분절 및 J 분절의 생체내 재배열에 의해 생성될 수 있다. 별법으로, 상기 서열(들)은 시험관내 자극에 반응하여 재배열이 일어나는 세포로부터 생성될 수 있다. 별법으로, 상기 서열(들)의 일부 또는 전부가 DNA 스플라이싱, 뉴클레오티드 합성, 돌연변이유발 또는 다른 방법(예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호 참조)에 의해 수득될 수 있다. 레파토리는 1종의 서열만을 포함할 수 있거나 유전적으로 상이한 집합체 내의 서열들을 포함하는 다수의 종의 서열들을 포함할 수 있다.
용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다" 등은 2종의 분자가 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정한 결합체를 형성함을 의미한다. 특이적 결합은 통상적으로 중등도 내지 고등도의 용량으로 낮은 친화성을 나타내는 비특이적 결합과 구별되는 높은 친화성 및 저등도 내지 중등도의 용량을 특징으로 한다. 전형적으로, 결합은 결합상수 Ka가 약 106 M-1s-1보다 높은 경우 특이적 결합으로 간주된다. 필요한 경우, 비특이적 결합은 결합 조건을 변경함에 의해 특이적 결합에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 감소될 수 있다. 당업자는 관용적인 기법을 이용하여 적절한 결합 조건, 예를 들어, 결합 단백질의 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합을 위해 주어진 시간, 차단제(예를 들어, 혈청 알부민 또는 우유 카세인)의 농도 등을 개선할 수 있다. 예시적인 조건이 본원에 기재되어 있지만, 당업자에게 공지된 다른 조건도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "엄격한", "엄격도" 등은 혼성화 및 세척을 위한 조건을 기술한다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산과 동일하거나 유사한 서열을 가진 핵산을 확인하고 단리하기 위한 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 따라서, 이 방식으로 단리된 폴리뉴클레오티드는 IL-21R에 대한 결합 단백질을 제조하거나 이러한 결합 단백질을 발현하는 세포를 확인하는 데 사용될 수 있다. 핵산을 확인하고 단리하는 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 서던 혼성화(Southern hybridization), 동일반응계 혼성화(in situ hybridization) 및 노던 혼성화(Northern hybridization)를 포함하고 당업자에게 잘 공지되어 있다.
혼성화 반응은 엄격도가 다양한 조건 하에 수행될 수 있다. 혼성화 반응의 엄격도는 임의의 2종의 핵산 분자가 서로 혼성화되기 어려운 정도 및 상기 2종의 핵산 분자가 혼성화된 상태로 유지될 수 있는 조건을 포함한다. 바람직하게는, 혼성화 폴리뉴클레오티드는 엄격도가 감소된 조건, 더 바람직하게는 엄격한 조건, 가장 바람직하게는 고도로 엄격한 조건 하에 그의 상응하는 폴리뉴클레오티드에 각각 혼성화된다. 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고 예를 들어, 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989) 6.3.1-6.3.6)에서 찾을 수 있다. 수성 방법 및 비수성 방법 둘다가 상기 문헌에 기재되어 있고 이용될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 일례는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC) 중에서 혼성화한 후 50℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것이다. 엄격한 혼성화 조건은 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 예를 들어, 0.2X SSC/0.1% SDS 중에서 세척함으로써 달성할 수도 있다. 고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 65℃에서 0.5 M 인산나트륨/7% SDS 중에서 혼성화한 후 65℃에서 0.2X SSC/1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것을 포함한다. 엄격한 조건의 추가 예는 하기 표 1에 기재되어 있다: 고도로 엄격한 조건은 적어도 예를 들어, 조건 A 내지 F만큼 엄격한 조건이고; 엄격한 조건은 적어도 예를 들어, 조건 G 내지 L만큼 엄격한 조건이고; 엄격도가 감소된 조건은 적어도 예를 들어, 조건 M 내지 R만큼 엄격한 조건이다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리뉴클레오티드의 대립유전자 변이체를 코딩하는 서열을 가진 DNA를 확인하고 단리하기 위한 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수 있다. 대립유전자 변이체는 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일하거나 상당히 유사한 폴리펩티드를 코딩하는, 개시된 폴리뉴클레오티드의 천연 발생 택일적 형태이다. 바람직하게는, 대립유전자 변이체는 개시된 폴리뉴클레오티드에 대해 약 90% 이상의 동일성(더 바람직하게는, 약 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 동일성)을 나타낸다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리뉴클레오티드에 대한 상동성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 가진 DNA를 확인하고 단리하기 위한 혼성화 프로브 및 프라이머로서 사용될 수도 있다. 이 상동체(homolog)는 개시된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 기원이 되는 종과 상이한 종으로부터 단리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이거나, 개시된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 기원이 되는 종과 동일한 종으로부터 단리되되 상기 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 상당한 서열 유사성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 상동체는 개시된 폴리뉴클레오티드에 대한 약 50% 이상의 서열 동일성(더 바람직하게는, 약 75% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성)을 나타내는 반면, 폴리펩티드 상동체는 개시된 결합 단백질/폴리펩티드에 대한 약 30% 이상의 서열 동일성(더 바람직하게는 약 45% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 60% 이상의 서열 동일성)을 나타낸다. 바람직하게는, 개시된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 상동체는 포유동물 종으로부터 단리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드이다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 결합 단백질이 발현되는 조건 하에 상기 결합 단백질을 발현하는 세포 및 조직을 확인하기 위한 혼성화 프로브 및 프라이머로서도 사용될 수 있다.
"실질적으로 기재된 바와 같은", "실질적으로 동일한" 및 "실질적인 상동성을 나타내는"은 기재된 서열과 비교할 때 관련 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CDR(들), VH 또는 VL 도메인(들))이 동일하거나 (예를 들어, 보존된 아미노산 치환을 통해) 실질적으로 상이하지 않음을 의미한다. 실질적으로 상이하지 않다는 것은 미미한 아미노산 변화, 예컨대, 특정된 영역의 5개 아미노산으로 구성된 서열에서의 1 또는 2개의 치환을 포함한다. 항체의 경우, 제2 항체는 제1 항체와 동일한 특이성을 나타내고 제1 항체의 친화성의 약 50% 이상의 친화성을 나타낸다.
본원에 개시된 서열과 실질적으로 동일한 서열 또는 본원에 개시된 서열에 대한 실질적인 상동성을 나타내는 서열도 본원의 일부이다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로, 실질적인 동일성 또는 상동성은 핵산 분절이 선별적 혼성화 조건(예를 들어, 고도로 엄격한 혼성화 조건) 하에 핵산 가닥의 상보체에 혼성화하는 경우 존재한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
용어 "치료제"는 의학적 질환 또는 이의 증상을 치료함에 있어서 치료하거나 보조하는 물질이다. 치료제는 항-IL-21R 결합 단백질의 사용을 보충하는 방식으로 면역 세포 또는 면역 반응을 조절하는 물질을 포함할 수 있으나 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 치료제는 치료 항체, 예를 들어, 항-IL-21R 항체이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 치료제는 치료 결합 단백질, 예를 들어, 항-IL-21R 나노바디이다. 치료제의 비제한적 예 및 사용이 본원에 기재된다.
본원에서 사용된 항-IL-21R 결합 단백질(예를 들어, 항체)의 "치료 유효량"은 대상체(예컨대, 인간 환자)에게 단회 또는 다회 투여된 경우 질환 또는 재발된 질환의 1종 이상의 증상의 치료, 예방, 치유, 지연, 중증도 경감 및/또는 완화에 효과적이거나 대상체의 생존을 이러한 치료의 부재 하에 예측된 생존보다 연장시키는 데 있어서 효과적인 결합 단백질의 양을 의미한다. 한 실시양태에서, 치료 유효량은 1종 이상의 IL-21-반응성 사이토카인 또는 유전자의 발현을 조절하기에 충분한 항-IL-21R 결합 단백질의 양일 수 있다.
용어 "치료"는 치료적 또는 예방적 조치를 의미한다. 치료는 질환 또는 재발된 질환의 1종 이상의 증상의 예방, 치유, 지연, 중증도 경감 및/또는 완화를 위해 또는 대상체의 생존을 이러한 치료의 부재 하에 예측된 생존보다 연장시키기 위해 의학적 질환을 앓거나 궁극적으로 상기 질환을 앓을 수 있는 대상체에게 제공된다.
항-IL-21R 결합 단백질
본원의 개시내용은 신규 항원-결합 단편을 포함하는 신규 항-IL-21R 결합 단백질을 제공한다. 당업자에게 공지된 다수의 방법들이 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 수득하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 항-IL-21R 결합 단백질은 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 이용하여 제조할 수 있다. 단일클론 항체 또한 공지된 방법에 따라 하이브리도마를 생성함으로써 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌(Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-99) 참조). 그 후, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 표준 방법, 예컨대, ELISA 및 표면 플라스몬 공명(비아코어(상표명)) 분석을 이용하여 검색함으로써 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인할 수 있다. 임의의 형태의 특정된 항원, 예를 들어, 재조합 항원, 천연 발생 형태의 항원, 이들의 임의의 변이체 또는 단편 및 이들의 항원성 펩티드가 면역원으로서 사용될 수 있다.
항체를 포함하는 결합 단백질의 한 예시적 제조 방법은 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어, 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리의 검색을 포함한다. 파지 디스플레이는 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 문헌(Smith (1985) Science 228:1315-17); 문헌(Clackson et al. (1991) Nature 352:624-28); 문헌(Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97); 및 국제특허출원 공개 제WO 92/018619호, 제WO 91/017271호, 제WO 92/020791호, 제WO 92/015679호, 제WO 93/001288호, 제WO 92/001047호, 제WO 92/009690호 및 제WO 90/002809호에 기재되어 있다.
디스플레이 라이브러리의 사용 이외에, 특정된 항원은 비인간 동물, 예를 들어, 시아노몰구스 원숭이, 닭 또는 설치류(예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 래트)를 면역화하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 비인간 동물은 인간 면역글로불린 유전자의 적어도 일부를 포함한다. 예를 들어, 인간 Ig 좌위의 큰 단편을 사용하여 마우스 항체를 생성하지 못하는 마우스 변종을 발생시킬 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여, 원하는 특이성을 나타내는 유전자로부터 유래된 항원-특이적 단일클론 결합 단백질, 예컨대, 항체를 제조하고 선별할 수 있다(예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)(상표명)(암젠 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 사우전드 오크스 소재); 문헌(Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21); 미국 특허 제7,064,244호; 및 국제특허출원 공개 제WO 96/034096호 및 제WO 96/033735호 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, 결합 단백질은 비인간 동물로부터 수득된 후 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법으로 변경된(예를 들어, 인간화된, 탈면역화된 또는 키메라) 단일클론 항체이다. 다양한 키메라 항체의 제조 기법이 공지되어 있다(예를 들어, 문헌(Morrison et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(21):6851-55); 문헌(Takeda et al. (1985) Nature 314(6010):452-54); 미국 특허 제4,816,567호 및 제4,816,397호; 유럽 특허출원 공개 제EP 0 171 496호 및 제EP 0 173 494호; 및 영국 특허 제GB 2 177 096호 참조). 인간화된 결합 단백질은 예를 들어, 인간 중쇄 유전자 및 인간 경쇄 유전자를 발현하되 내재하는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없는 형질전환 마우스를 이용하여 제조할 수도 있다. 미국 특허 제5,225,539호(Winter)에는 본원에 기재된 인간화된 결합 단백질의 제조에 이용될 수 있는 예시적 CDR-이식 방법이 기재되어 있다. 특정한 인간 결합 단백질의 CDR 전부가 비인간 CDR의 적어도 일부로 치환될 수 있거나 상기 CDR의 일부가 비인간 CDR로 치환될 수 있다. 인간화된 결합 단백질과 소정의 항원의 결합에 필요한 CDR의 수를 변경하는 것만이 필요하다.
인간화된 결합 단백질 또는 이의 단편은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않는 Fv 가변 도메인의 서열을 인간 Fv 가변 도메인으로부터 유래된 등가의 서열로 치환함으로써 생성할 수 있다. 인간화된 결합 단백질 또는 이의 단편의 예시적 생성 방법은 예를 들어, 문헌(Morrison (1985) Science 229:1202-07); 문헌(Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214); 및 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 제5,859,205;호 및 제6,407,213호에 제시되어 있다. 상기 방법은 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄로부터 유래된 면역글로불린 Fv 가변 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리하고 개조하고 발현하는 것을 포함한다. 이러한 핵산은 전술된 바와 같이 소정의 표적에 대한 항체를 생성하는 하이브리도마뿐만 아니라 다른 공급원으로부터 수득될 수 있다. 그 후, 인간화된 항체 분자를 코딩하는 재조합 DNA를 적절한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간화된 결합 단백질은 보존적 치환, 컨센서스(consensus) 서열 치환, 생식세포주 치환 및/또는 복귀돌연변이에 의해 개선된다. 이처럼 변경된 면역글로불린 분자는 당업게에 공지된 여러 기법들 중 임의의 기법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌(Teng et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-73); 문헌(Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:7279); 문헌(Olsson et al. (1982) Meth. Enzymol. 92:3-16); 국제특허출원 공개 제WO 92/006193호; 및 유럽 특허 제EP 0 239 400호 참조).
결합 단백질 또는 이의 단편은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 98/052976호 및 제WO 00/034317호에 개시된 방법에 의한 인간 T 세포 에피토프의 특이적 결실 또는 "탈면역화"에 의해 변경될 수도 있다. 요약하건대, 결합 단백질(예를 들어, 항체로부터 유래된 결합 단백질)의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드에 대해 조사할 수 있다(상기 펩티드는 (예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 98/052976호 및 제WO 00/034317호에 정의된 바와 같이) 잠재적 T 세포 에피토프를 나타냄). 잠재적 T 세포 에피토프의 검출을 위해, "펩티드 쓰레딩(threading)"으로 지칭되는 컴퓨터 모델링 방법을 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 국제특허출원 공개 제WO 98/052976호 및 제WO 00/034317호에 기재된 바와 같이 VH 서열 및 VL 서열에 존재하는 모티프에 대해 인간 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 데이타베이스를 검색할 수 있다. 상기 모티프는 18종의 주요 MHC 클래스 II DR 동종이형(allotype) 중 임의의 동종이형에 결합하여 잠재적 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재적 T 세포 에피토프는 가변 도메인에 존재하는 소수의 아미노산 잔기를 치환시키거나 단일 아미노산을 치환시켜 제거할 수 있다. 전형적으로 보존적 치환이 만들어진다. 종종, 인간 생식세포주 항체 서열 내의 한 위치에 공통적으로 존재하는 아미노산이 사용될 수 있으나, 반드시 그러한 것은 아니다. 인간 생식세포주 서열은 예를 들어, 문헌(Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-98); 문헌(Cook et al. (1995) Immunol. Today 16(5):237-42); 문헌(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817); 및 문헌(Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-38)에 개시되어 있다. VBASE 파일 목록은 인간 면역글로불린 가변 영역 서열(영국 캠브리지에 소재하는 엠알씨 단백질 공학 센터(MRC Centre for Protein Engineering)의 톰린슨(Tomlinson) 등에 의해 수집됨)의 포괄적인 파일 목록을 제공한다. 이 서열은 인간 서열, 예를 들어, 골격 영역 및 CDR의 공급원으로서 사용될 수 있다. 컨센서스 인간 골격 영역은 예를 들어, 미국 특허 제6,300,064호에 기재된 바와 같이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 변경된 면역글로불린 불변 영역 또는 Fc 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원의 교시에 따라 제조된 결합 단백질은 이 결합 단백질의 여러 면역 기능, 예컨대, 이펙터 세포 활성, 용해, 보체-매개된 활성, 결합 단백질 제거 및 결합 단백질 수명을 조절할 수 있는 이펙터 분자, 예컨대, 보체 및/또는 Fc 수용체에 더 강하게 또는 더 높은 특이성으로 결합할 수 있다. 결합 단백질(예를 들어, IgG 항체)의 Fc 영역에 결합하는 전형적인 Fc 수용체는 FcγRI, FcγRII 및 FcRn 하위클래스의 수용체(이 수용체들의 대립유전자 변이체 및 택일적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. Fc 수용체는 예를 들어, 문헌(Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-92; Capel et al. (1994) Immunomethods 4:25-34) 및 문헌(de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-41)에서 논의되어 있다. 추가적인 결합 단백질/항체 제조 기법에 대해서는 예를 들어, 문헌(Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Harlow et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory)을 참조한다. 본 발명은 결합 단백질 또는 항체의 임의의 특정한 공급원, 제조 방법 또는 다른 특별한 특징으로 반드시 한정되지 않는다.
항체(면역글로불린)를 포함하는 결합 단백질은 각각 약 25 kDa인 2개의 경쇄(L) 및 각각 약 50 kDa인 2개의 중쇄(H)로 구성된, 전형적으로 사량체 형태인 글리코실화된 단백질이다. 람다(λ) 및 카파(κ)로 지칭되는 두 종류의 경쇄가 항체에서 발견될 수 있다. 면역글로불린은 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 5종의 주요 클래스, 즉 A, D, E, G 및 M으로 분류될 수 있고, 이들 중 몇몇은 하위클래스(동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 경쇄는 N-말단 가변(V) 도메인(VL) 및 불변(C) 도메인(CL)을 각각 포함한다. 중쇄는 N-말단 V 도메인(VH), 3 또는 4개의 C 도메인(CH) 및 힌지 영역을 각각 포함한다. VH에 가장 인접한 CH 도메인은 CH1로서 명명된다. VH 도메인 및 VL 도메인은 CDR로 지칭되는 초가변 서열의 3개 영역에 대한 스카폴드를 형성하는 골격 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 지칭되는 비교적 보존된 서열의 4개 영역으로 구성된다. CDR은 항체와 항원의 특이적 상호작용을 담당하는 잔기들의 대다수를 함유한다. CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭된다. 중쇄 상의 CDR 구성요소들은 H1, H2 및 H3(본원에서 각각 CDR H1, CDR H2 및 CDR H3으로도 지칭됨)으로 지칭되는 반면, 경쇄 상의 CDR 구성요소들은 L1, L2 및 L3(본원에서 각각 CDR L1, CDR L2 및 CDR L3으로도 지칭됨)으로서 지칭된다.
CDR3은 전형적으로 항원-결합 부위 내에서 분자 다양성의 가장 큰 공급원이다. 예를 들어, CDR H3은 2개의 아미노산 잔기로 구성될 정도로 짧을 수 있거나 26개 초과의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 하위단위 구조체 및 3차원적 입체구조체는 당업계에 잘 공지되어 있다. 항체 구조의 검토를 위해서는 예를 들어, 상기 문헌(Harlow et al. (1988))을 참조한다. 당업자는 상기 하위단위 구조체, 예를 들어, CH, VH, CL, VL, CDR 및/또는 FR 구조체가 활성 단편, 예를 들어, 항원에 결합하는 VH, VL 또는 CDR 하위단위체의 일부, 즉 항원-결합 단편을 포함하거나, 예를 들어, Fc 수용체 및/또는 보체에 결합하고/하거나 상기 Fc 수용체 및/또는 보체를 활성화시키는 CH 하위단위체의 일부를 각각 포함함을 인식할 것이다. CDR은 전형적으로 (상기 문헌(Kabat et al. (1991))에 기재된 바와 같이) 카바트(Kabat) CDR을 의미한다. 항원-결합 부위를 특징규명하는 또 다른 표준은 예를 들어, 상기 문헌(Chothia et al. (1992)) 및 상기 문헌(Tomlinson et al. (1995))에 기재된 바와 같은 초가변 루프를 언급하는 것이다. 또 다른 표준은 옥스퍼드 분자 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된 "AbM" 정의이다(일반적으로, 예를 들어, 문헌(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains in: Antibody Engineering (2001) Duebel and Kontermann eds., Springer-Verlag, Heidelberg) 참조). 대안적으로, 카바트 CDR에 대해 기재된 실시양태는 초티아(Chothia) 초가변 루프 또는 AbM-정의된 루프에 대해 기재된 유사한 관계를 이용하여 실시될 수 있다.
Fab 단편은 불변 영역들 사이의 이황화 결합에 의해 공유결합된 VH-CH1 도메인 및 VL-CL 도메인으로 구성된다. Fv 단편은 보다 작고 비공유결합된 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된다. 비공유결합된 도메인들이 해리되는 경향을 극복하기 위해, scFv를 구축할 수 있다. scFv는 (1) VH의 C-말단을 VL의 N-말단에 연결시키거나 (2) VL의 C-말단을 VH의 N-말단에 연결시키는 유연한 폴리펩티드를 함유한다. 예를 들어, 15-머(Gly4Ser)3 펩티드가 링커로서 사용될 수 있지만 다른 링커들도 당업계에 공지되어 있다.
조립 및 체세포 돌연변이 후 항체 유전자의 서열은 고도로 변경되고, 이 변경된 유전자들은 1010종의 상이한 항체 분자들을 코딩하는 것으로 추정된다(Immunoglobulin Genes (2nd ed. 1995) Jonio et al. eds., Academic Press, San Diego, CA).
본 발명의 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 단일 도메인 결합 단백질이다. 단일 도메인 결합 단백질은 CDR이 단일 도메인 폴리펩티드의 일부인 결합 단백질을 포함한다. 그 예로는 중쇄 결합 단백질, 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 결합 단백질, 보편적인 4-쇄 항체로부터 유래된 단일 도메인 결합 단백질, 개조된 결합 단백질, 및 항체로부터 유래된 결합 단백질 이외의 단일 도메인 결합 스카폴드가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 단일 도메인 결합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 단일 도메인 결합 단백질 및 향후 확인될 또는 공지될 임의의 단일 도메인 결합 단백질을 포함한다.
단일 도메인 결합 단백질은 마우스, 인간, 낙타, 라마, 물고기, 상어, 염소, 토끼, 닭 및 소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 단일 도메인 결합 단백질은 물고기에서 발견된 면역글로불린의 가변 영역, 예를 들어, 상어의 혈청에서 발견되는 NAR로서 공지된 면역글로불린 동형의 가변 영역으로부터 유래될 수 있다. NAR(IgNAR)의 가변 영역으로부터 유래된 단일 도메인 결합 단백질의 제조 방법은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 03/014161호 및 문헌(Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-09)에 기재되어 있다. 단일 도메인 결합 단백질은 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체로서 당업계에 공지된 천연 발생 단일 도메인 결합 단백질도 포함한다. 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 중쇄 항체로부터 유래된 이 가변 도메인은 4-쇄 면역글로불린의 보편적인 VH와 구별하기 위해 본원에서 VHH 또는 나노바디로서 기재된다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 동물, 예를 들어, 낙타, 라마, 단봉 낙타, 알파카 및 구아나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있고 종종 카멜리드 또는 카멜리드화된 가변 도메인으로 지칭된다(예를 들어, 본원에 참고로 도입되는 문헌(Muyldermans (2001) J. Biotechnol. 74(4):277-302) 참조). 낙타과 패밀리에 속하는 종 이외의 다른 종도 천연적으로 경쇄를 갖지 않는 중쇄 결합 단백질을 생성할 수 있다. VHH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 더 작다. VHH 분자는 단일 폴리펩티드이고 극도의 pH 및 온도 조건을 견딜 정도로 매우 안정하다. 뿐만 아니라, VHH 분자는 단백질분해효소의 작용에 대한 내성을 나타내나, 보편적인 항체들은 이러한 내성을 나타내지 못한다. 나아가, VHH 분자의 시험관내 발현은 적절하게 폴딩된 기능성 VHH를 고수율로 생성할 수 있다. 또한, 카멜리드에서 생성된 결합 단백질은 항체 라이브러리 또는 카멜리드 이외의 포유동물의 면역화를 통해 시험관 내에서 생성된 항체에 의해 인식되는 에피토프 이외의 에피토프를 인식할 수 있다(예를 들어, 본원에 참고로 도입되는 국제특허출원 공개 제WO 97/049805호 및 제WO 94/004678호 참조).
"이중특이적" 또는 "이작용성" 결합 단백질은 2종의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2종의 상이한 결합 부위를 가진 인공 혼성체 결합 단백질이다. 이중특이적 결합 단백질은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 비롯한 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌(Songsivilai and Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-21); 및 문헌(Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-53) 참조). 한 실시양태에서, 이중특이적 결합 단백질은 면역글로불린 불변 영역을 통해 제2 결합 도메인 폴리펩티드에 연결된 제1 결합 도메인 폴리펩티드, 예컨대, Fab' 단편을 포함한다.
본 발명에 따른 또 다른 결합 단백질은 예를 들어, 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 하나 이상의 천연 또는 개조된 불변 영역 중 CH1 이외의 불변 영역, 예를 들어, IgG 및 IgA1의 CH2 영역 및 CH3 영역 또는 IgE의 CH3 영역 및 CH4 영역을 포함하는 영역에 융합되거나 연결된 면역글로불린 힌지 또는 힌지-작용 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 결합 도메인 폴리펩티드를 포함하는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질을 포함할 수 있다(예를 들어, 보다 상세한 설명을 위해서는 미국 특허 공개 제2005/0136049호 참조). 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되거나 연결된 천연 또는 개조된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 구축물의 경우 CH3), 및 CH2 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 구축물의 경우 CH3)에 융합되거나 연결된 천연 또는 개조된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 폴리펩티드(또는 IgE로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 구축물의 경우 CH4)를 포함하는 영역을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질은 ADCC, 보체 고정, 및/또는 표적, 예를 들어, 표적 항원, 예컨대, 인간 IL-21R과의 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 면역학적 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 펩티드 모사체(mimetic)도 포함할 수 있다. 펩티드 모사체는 단백질 2차 구조의 요소들을 모방하는 펩티드-함유 분자들이다(예를 들어, 전체로써 본원에 참고로 도입되는 문헌(Johnson et al. Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy (1993), Pezzuto et al. eds., Chapman and Hall, New York) 참조). 펩티드 모사체 사용의 기초가 되는 원리는 단백질의 펩티드 골격이 주로 분자 상호작용, 예컨대, 항체와 항원 사이의 분자 상호작용을 촉진하는 방식으로 아미노산 측쇄를 배향하도록 존재한다는 것이다. 펩티드 모사체는 천연 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용할 것으로 예측된다. 이 원리는 본원에 개시된 표적 펩티드의 천연 성질들 중 대다수를 나타내되 변경되고 잠재적으로 개선된 특징을 나타내는 제2 세대 분자를 개조하는 데 이용될 수 있다.
본 발명을 실시함에 있어서 유용한 결합 단백질의 다른 실시양태는 융합 단백질을 포함한다. 이 분자들은 일반적으로 N-말단 또는 C-말단에서 제2 폴리펩티드 또는 단백질의 전부 또는 일부에 연결된 표적 펩티드, 예를 들어, IL-21R 또는 항-IL21R 항체의 전부 또는 중요한 일부를 가진다. 예를 들어, 융합 단백질은 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하도록 다른 종으로부터 유래된 리더(또는 신호) 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 리더(또는 신호) 서열을 포함하는 본 발명의 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 87 내지 109 및 239 내지 248로부터 선택될 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 면역학적 활성 도메인, 예컨대, 결합 단백질 에피토프의 부가를 포함한다. 융합 연접부(junction)에 존재하거나 융합 연접부 근처에 존재하는 절단 부위의 포함은 정제 후 외래 폴리펩티드의 제거를 용이하게 할 것이다. 다른 유용한 융합은 기능성 도메인, 예컨대, 효소의 활성 부위, 글리코실화 도메인, 세포 표적화 신호 또는 경막 영역의 연결을 포함한다. 융합 단백질 내로 도입될 수 있는 단백질 또는 펩티드의 예는 세포증식억제 단백질, 세포파괴 단백질, 전구-아폽토시스 물질, 항-혈관신생 물질, 호르몬, 사이토카인, 성장 인자, 펩티드 약물, 항체, 항체의 Fab 단편, 항원, 수용체 단백질, 효소, 렉틴, MHC 단백질, 세포 부착 단백질 및 결합 단백질을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 융합 단백질의 제조 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 단백질은 예를 들어, 이작용성 가교-결합 시약을 사용한 화학적 부착, 완전한 융합 단백질의 드 노보(de novo) 합성, 또는 제2 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 서열에의 표적 펩티드 코딩 DNA 서열의 부착 후 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 펩티드, 예를 들어, IL-21R은 2개의 불변 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유하되 가변 영역을 갖지 않는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 예컨대, Fc 단편과 융합된다(예를 들어, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,018,026호 및 제5,750,375호 참조). Fc 영역은 천연 발생 Fc 영역일 수 있거나 특정한 질, 예를 들어, 치료적 질, 순환 시간, 감소된 응집을 개선시키도록 변경될 수 있다. Fc 영역에 융합된 펩티드 및 단백질은 전형적으로 융합되지 않은 펩티드 및 단백질을 투여한 경우보다 더 높은 생체내 반감기를 나타낸다. 또한, Fc 영역과의 융합은 융합 폴리펩티드의 2량체화/다량체화를 허용한다.
본 발명의 한 양태는 IL-21R에 결합하는 결합 단백질 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원의 개시내용은 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 유래된 신규 CDR을 제공한다. CDR을 보유하기 위해 일반적으로 사용되는 단백질 구조체는 항체 중쇄 또는 경쇄, 또는 이들의 일부이고, 이때 상기 CDR은 천연 발생 CDR과 관련된 영역에 국한된다. 가변 도메인의 구조 및 위치는 상기 문헌(Kabat et al., (1991))에 기재된 바와 같이 확인할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질(및 이의 항원-결합 단편)의 예시적 실시양태는 AbA 내지 AbU, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및 L23 내지 L25로서 확인된다. 본 발명의 항-IL-21R 결합 단백질의 비제한적 예시적 실시양태의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 서열번호 5 내지 195, 213 내지 229 및 239 내지 248에 기재되어 있다. scFv 단편, VH 도메인, VL 도메인 및 CDR을 포함하는 본 발명의 항-IL-21R 결합 단백질의 일부 예시적 실시양태의 DNA 서열 및 아미노산 서열뿐만 아니라 이들의 현재 코드 및 이전 명칭은 도 17 내지 25 및 하기 표 2A 및 2B에 기재되어 있다.
[표 2A]
Figure pct00003
[표 2B]
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 항-IL-21R 결합 단백질은 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C-말단에서 Cκ 또는 Cλ와 같은 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인 또는 이의 일부는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 이의 임의의 동형 하위클래스와 같은 중쇄의 전부 또는 일부에 부착될 수 있다. 불변 영역은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌(Kabat et al. (1991)) 참조). 따라서, 본 발명의 범위 내의 결합 단백질은 당업계에 공지된 불변 영역과 결합된 VH 도메인 및 VL 도메인, 및 이들의 일부를 포함한다.
일부 실시양태는 AbA 내지 AbZ, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및/또는 L23 내지 L25로부터 유래된 Fv 단편의 VH 도메인, VL 도메인 또는 이들의 조합물을 포함한다. 추가 실시양태는 VH 도메인 및 VL 도메인으로부터 유래된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다. CDR 서열이 서열번호 5 내지 195, 213 내지 229 및 239 내지 248에 기재된 서열 내에 존재하는 하나 이상의 CDR 서열과 동일하거나 유사한(즉, 실질적으로 상이하지 않은) 결합 단백질은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
일부 실시양태에서, VH 도메인 및/또는 VL 도메인은 생식세포주로부터 유래될 수 있다. 즉, 보편적인 분자생물학적 기법을 이용하여 상기 도메인들의 FR을 생식세포주에 의해 생성된 것과 일치하도록 돌연변이시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, FR 서열은 컨센서스 생식세포주 서열로부터 분기된 상태로 남아있다.
한 실시양태에서, 돌연변이유발은 하나 이상의 생식세포주 서열과 더 유사한 결합 단백질을 제조하는 데 사용된다. 이것은 돌연변이가 체세포 돌연변이유발 또는 오류 발생 PCR을 통해 결합 단백질(예를 들어, 항체)의 FR 내로 도입되는 경우 바람직할 수 있다. VH 도메인 및 VL 도메인에 대한 생식세포주 서열은 VBASE 데이타베이스에 대한 아미노산 서열 및 핵산 서열 정렬을 수행함으로써 확인할 수 있다(엠알씨 단백질 공학 센터, 영국 소재). VBASE는 진뱅크(등록상표) 및 EMBL 데이타 라이브러리의 현재 공개 자료 내의 공개된 서열을 포함하는 천 개 이상의 공개된 서열로부터 수집된 모든 인간 생식세포주 가변 영역 서열들의 포괄적인 파일 목록이다. 일부 실시양태에서, scFv의 FR은 VBASE 데이타베이스에서 가장 대등한 서열과 일치하도록 돌연변이되고, CDR 부분은 온전한 상태로 유지된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 이들이 AbA 내지 AbZ, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 또는 L23 내지 L25와 인간 IL-21R의 결합을 경쟁적으로 억제하도록 AbA 내지 AbZ, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 또는 L23 내지 L25에 의해 인식되는 에피토프와 동일한 에피토프와 특이적으로 반응한다. 이러한 결합 단백질은 경쟁 결합 분석에서 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 IL-21R에 대한 이 결합 단백질의 결합 상수(Ka)는 105 M-1s-1 이상이다. 결합 친화성은 본원에 기재된 기법을 포함하는 당업계에 공지된 기법, 예컨대, ELISA, 바이오센서 기술(예를 들어, 이중특이적 상호작용 분석) 또는 다른 기법을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 결합 단백질은 다른 단백질, 예를 들어, IL-21R의 전부 또는 일부를 포함하는 재조합 단백질에 결합될 수 있다.
당업자는 개시된 결합 단백질이 IL-21R과 다소 상이한 단백질의 검출, 측정 및/또는 억제에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 상기 단백질은 IL-21R의 상동체일 수 있다. 항-IL-21R 결합 단백질은 서열번호 2 또는 4에 기재된 서열에서 100, 80, 60, 40 또는 20개 이상의 인접한 아미노산으로 구성된 임의의 서열과 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 단백질에 결합할 것으로 예측된다.
서열 상동성 분석 이외에, 에피토프 맵핑(예를 들어, 문헌(Epitope Mapping Protocols (1996) Morris ed., Humana Press) 참조), 2차 구조 분석 및 3차 구조 분석을 수행하여, 본원에 개시된 결합 단백질 및 이 단백질과 항원의 결합체에 의해 추정되는 특정 3D 구조를 확인할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 결합 단백질을 사실상 대표하는 결합 단백질의 X-선 결정학(Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) 및 컴퓨터 모델링을 포함하나 이들로 한정되지 않는다(Fletterick et al. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
본원의 개시내용은 항-IL-21R 결합 단백질을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 개시된 서열로부터 변경된 VH 서열 및/또는 VL 서열을 가진 결합 단백질을 생성하는 단계를 포함한다. 이러한 결합 단백질은 당업계에 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 FR 영역 및/또는 CDR 영역 내에 도입할 수 있다. FR 변화는 통상적으로 결합 단백질의 안정성 및 면역원성을 개선시키도록 디자인되는 반면, CDR 변화는 전형적으로 항원에 대한 결합 단백질의 친화성을 증가시키도록 디자인된다. 친화성을 증가시키는 변화는 하나 이상의 CDR 서열을 변경하고 표적에 대한 결합 단백질의 친화성을 측정함으로써 시험할 수 있다(예를 들어, 문헌(Antibody Engineering (2nd ed. 1995) Borrebaeck ed., Oxford University Press) 참조).
CDR 서열이 서열번호 5 내지 195, 213 내지 229 및 239 내지 248에 기재된 서열 또는 이 서열 내에 포함되는 서열과 실질적으로 상이하지 않은 결합 단백질은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 전형적으로, 이러한 실질적으로 상이하지 않음은 소정의 아미노산을 유사한 전하, 소수성 또는 입체화학적 특징을 가진 아미노산으로 치환시키는 것을 포함한다. CDR 영역과 대조적으로, FR 영역에서의 보다 과감한 치환이 결합 단백질의 결합성에 악영향을 미치지 않는 한(예를 들어, 비치환된 결합 단백질에 비해 친화성을 50% 이상 감소시키지 않는 한) 상기 치환도 도입될 수 있다. 치환은 결합 단백질을 생식세포주 계열의 결합 단백질로 만들거나 상기 결합 단백질의 항원-결합 부위를 안정화시키기 위해 도입될 수도 있다.
보존적 변경은 이러한 변경이 도입된 분자들의 기능적 특징 및 화학적 특징과 유사한 기능적 특징 및 화학적 특징을 나타내는 분자를 생성할 수 있다. 대조적으로, 상기 분자의 기능적 특징 및/또는 화학적 특징에서의 실질적인 변경은 (1) 치환 영역에서 골격의 구조를 예를 들어, 시트(sheet) 또는 나선 입체구조로서 유지시키는 것, (2) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키는 것, 및/또는 (3) 상기 분자의 크기를 유지시키는 것에 대한 치환의 효과 면에서 유의하게 상이한 아미노산 서열 내의 치환을 선별함으로써 달성할 수 있다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 천연 아미노산 잔기를, 그 위치에서 상기 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 영향을 미치지 않거나 전혀 영향을 미치지 않는 비천연 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌(MacLennan et al. (1998) Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67); 및 문헌(Sasaki et al. (1998) Adv. Biophys. 35:1-24) 참조).
(보존적 치환이든 아니면 비보존적 치환이든 관계 없이) 원하는 아미노산 치환은 이러한 치환이 필요한 경우 당업자에에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 분자 서열의 중요한 잔기를 확인하거나 본원에 개시된 분자의 친화성을 증가시키거나 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 예시적인 아미노산 치환은 하기 표 3에 기재된 치환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
[표 3]
Figure pct00007
일부 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 도입되는 비천연 발생 아미노산 잔기도 포함한다.
한 실시양태에서, 변이체 VH 도메인의 제조 방법은 개시된 VH 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 부가하거나, 결실시키거나 치환시키는 단계, 또는 개시된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 IL-21R 결합 또는 IL-21R/IL-21 활성의 조절에 대해 변이체 VH 도메인을 시험하는 단계를 포함한다.
유사하게, 변이체 VL 도메인의 제조 방법은 개시된 VL 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 부가하거나, 결실시키거나 치환시키는 단계, 또는 개시된 VL 도메인을 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는 단계, 및 IL-21R 결합 또는 IL-21R 활성의 조절에 대해 변이체 VL 도메인을 시험하는 단계를 포함한다.
일부 대안적 실시양태에서, 항-IL-21R 결합 단백질은 화학적 가교결합 또는 재조합 방법에 의해 단백질(예를 들어, 알부민)에 연결될 수 있다. 개시된 결합 단백질은 미국 특허 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 및 제4,179,337호에 기재된 방식에 의해 다양한 비단백질성 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌)에 연결될 수도 있다. 결합 단백질은 예를 들어, 혈액 순환에서 상기 결합 단백질의 반감기를 증가시키기 위해 중합체와의 공유접합을 통해 화학적으로 변경시킬 수 있다. 예시적인 중합체 및 부착 방법은 미국 특허 제4,766,106호, 제4,179,337호, 제4,495,285호 및 제4,609,546호에 기재되어 있다.
개시된 결합 단백질은 그의 글리코실화가 변화되도록 변경될 수 있다. 즉, 하나 이상의 탄수화물 잔기가 상기 결합 단백질로부터 결실되거나 상기 결합 단백질에 부가될 수 있다. 글리코실화 부위의 결실 또는 부가는 당업자에게 잘 공지되어 있는 글리코실화 컨센서스 부위를 결실시키거나 형성하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성할 수 있다. 탄수화물 잔기를 부가하는 또 다른 수단은 글리코사이드와 결합 단백질, 예를 들어, 항체의 아미노산 잔기의 효소적 또는 화학적 커플링이다(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 87/05330호 및 문헌(Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22:259-306) 참조). 탄수화물 잔기의 제거도 효소적 또는 화학적으로 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌(Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52); 문헌(Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131); 및 문헌(Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350) 참조). 탄수화물 구조의 변경은 Fc 도메인에서의 아미노산 변화가 약학 조성물의 면역원성을 증가시킬 수 있기 때문에 바람직할 수 있다(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2008/052030호 참조). 면역글로불린 분자의 경우, CH2 도메인의 Asn-297과 N-결합된 탄수화물의 부착이 ADCC 활성에 있어서 매우 중요한 것으로 입증되었다. 효소 또는 돌연변이를 통한 N-결합된 컨센서스 부위의 제거는 ADCC 활성이 거의 또는 전혀 나타나지 않게 한다. 당단백질에서, 탄수화물은 트라이펩티드 모티프 Asn-X-Thr/Ser 내의 아스파라긴 측쇄에서 아마이드 질소 원자에 부착될 수 있다. N-결합된 글리코실화로 지칭되는 이러한 종류의 글리코실화는 모노사카라이드가 돌리콜(dolichol) 포스페이트에 부가되어 14-잔기 분지쇄 탄수화물 결합체가 형성되면서 소포체(endoplasmic reticulum; ER)에서 개시된다. 그 후, 상기 탄수화물 결합체는 올리고사카릴트랜스퍼레이즈(OST)에 의해 단백질로 전달된다. 당단백질이 ER의 루멘(lumen)을 떠나기 전에, 3개의 당 분자가 14-잔기 올리고사카라이드로부터 제거된다. ER 글루코시데이즈(glucosidase) I, ER 글루코시데이즈 II 및 ER 만노시데이즈(mannosidase) 효소가 ER 프로세싱(processing)에 관여한다. 그 후, 폴리펩티드가 골지체(Golgi complex)로 수송되고, 상기 골지체에서 N-결합된 당 쇄가 많은 상이한 방식으로 변경된다. 골지체의 시스(cis) 구역 및 중간 구역에서, 원래의 14-사카라이드 N-결합된 결합체가 만노스(Man) 잔기의 제거를 통해 다듬어지고 N-아세틸글루코스아민(GlcNac) 및/또는 푸코스(Fuc) 잔기의 부가를 통해 연장된다. N-결합된 탄수화물의 다양한 형태는 일반적으로 3개의 만노스 및 2개의 N-아세틸글로코스아민 잔기로 구성된 펜타사카라이드 코어(core)를 공통적으로 가진다. 마지막으로 트랜스(trans) 골지에서, 다른 GlcNac 잔기가 부가된 후 갈락토스(Gal) 및 말단 시알산(Sial)이 부가될 수 있다. 골지체에서의 탄수화물 프로세싱은 ER에서 일어나는 "코어 글리코실화"와 구별되기 위해 "말단 글리코실화"로 지칭된다. 최종 결합체 탄수화물 단위체는 많은 형태 및 구조를 취할 수 있고, 이들 중 일부는 2, 3 또는 4개의 분지(이안테나성(biantennary), 삼안테나성(triantennary) 또는 사안테나성(tetraantennary))를 가진다. 골지 만노시데이즈 IA, IB 및 IC, GlcNAc-트랜스퍼레이즈 I, 골지 만노시데이즈 II, GlcNAc-트랜스퍼레이즈 II, 갈락토실 트랜스퍼레이즈 및 시알릴 트랜스퍼레이즈를 포함하는 다수의 효소가 골지 프로세싱에 관여한다.
결합 단백질의 불변 영역(예컨대, 항체의 불변 영역)을 변경시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 변경된 기능(예를 들어, 세포 상의 FcR 또는 보체의 C1 성분과 같은 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화성)을 가진 결합 단백질은 불변 영역 내의 하나 이상이 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 치환시켜 제조할 수 있다(예를 들어, 유럽 특허출원 공개 제EP 0 388 151호; 및 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 참조). 뮤린 또는 다른 종의 결합 단백질에 적용되는 경우 유사한 기능을 감소시키거나 없앨 수 있는 유사한 종류의 변경이 기재될 수 있다.
예를 들어, FcR(예를 들어, FcγR1) 또는 C1q에 대한 결합 단백질(예를 들어, IgG, 예컨대, 인간 IgG)의 Fc 영역의 친화성을 변경시킬 수 있다. 상기 친화성은 하나 이상의 특정한 잔기를 측쇄 상에 적절한 작용기를 가진 하나 이상의 잔기로 치환시키거나, 또는 하전된 작용기, 예컨대, 글루타메이트 또는 아스파테이트, 또는 가능하게는 방향족 비극성 잔기, 예컨대, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 알라닌을 도입하여 변경시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조).
예를 들어, IgG 불변 영역에서 잔기 297(아스파라긴)을 알라닌으로 치환시키는 것은 이펙터 세포의 동원(recruitment)을 유의하게 억제하는 반면, C1q에 대한 친화성을 약하게(약 3배 더 약한 정도로)만 감소킨다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조). 중쇄의 잔기의 넘버링은 EU 지수(상기 문헌(Kabat et al. (1991)) 참조)의 넘버링이다. 이 변경은 글리코실화 부위를 파괴하고, 탄수화물의 존재는 Fc 수용체 결합에 필요한 것으로 추측된다. 글리코실화 부위를 파괴하는 상기 부위에서의 임의의 다른 치환은 용해 활성의 유사한 감소를 초래하는 것으로 추측된다. 다른 아미노산 치환, 예를 들어, 잔기 318(Glu), 320(Lys) 및 322(Lys) 중 어느 하나를 Ala으로 치환시키는 것도 C1q와 IgG 항체의 Fc 영역의 결합을 파괴하는 것으로 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조).
Fc 수용체와의 감소된 상호작용을 갖는 변경된 결합 단백질이 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간 FcγR1 수용체에 결합하는 인간 IgG3에서 Leu 235를 Glu로 치환시키는 것은 인간 IgG3과 상기 수용체의 상호작용을 파괴함이 밝혀졌다. 결합 단백질의 힌지 연결 영역에서 인접한 또는 가까운 부위 상의 돌연변이(예를 들어, 잔기 234, 235 및 237을 Ala으로 치환시키는 것) 또한 FcγR1 수용체에 대한 결합 단백질의 친화성에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 중쇄의 잔기의 넘버링은 EU 지수(상기 문헌(Kabat et al. (1991)) 참조)에 의거한 것이다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질의 Fc 영역은 하나 이상의 불변 영역 돌연변이, 예를 들어, 위치 234에서 Leu의 Ala으로의 치환(L234A), 위치 235에서 Leu의 Ala으로 치환(L235A) 및/또는 위치 237에서 Gly의 Ala으로의 치환(G237A)을 함유한다. 한 실시양태에서, 결합 단백질의 Fc 영역은 2개 이상의 불변 영역 돌연변이, 즉 L234A 및 G237A를 함유한다(즉, "이중-돌연변이체" 또는 "DM"). 또 다른 실시양태에서, 결합 단백질의 Fc 영역은 3개 이상의 불변 영역 돌연변이, L234A, L235A 및 G237A를 함유한다(즉, "삼중-돌연변이체" 또는 "TM"). 예를 들어, 인간 IgG 불변 영역 삼중-돌연변이체는 서열번호 196에 기재되어 있다.
예를 들어, CH2 도메인의 N-말단 영역에서 하나 이상의 아미노산을 변경시킴으로써 결합 단백질의 용해 활성을 변경시키는 다른 방법들은 국제 특허출원 공개 제WO 94/029351호 및 미국 특허 제5,624,821호에 기재되어 있다.
본 발명의 결합 단백질에 검출가능한 표지 또는 기능성 표지를 부착할 수 있다. 이 표지는 방사성표지(예를 들어, 131I 및 99Tc), 효소 표지(예를 들어, HRP 및 알칼리성 포스파테이즈) 및 다른 화학적 잔기(예를 들어, 바이오틴)를 포함한다.
또한, 본 발명은 IL-21R, 특히 인간 IL-21R에 결합하는 단리된 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-IL-21R 결합 단백질은 하기 특징들 중 하나 이상의 특징을 나타낼 수 있다: (1) 단일클론 또는 단일 특이성 결합 단백질인 특징; (2) 인간 결합 단백질인 특징; (3) 시험관 내에서 생성된 결합 단백질인 특징; (4) 생체 내에서 생성된(예를 들어, 형질전환 마우스 시스템에서 생성된) 결합 단백질인 특징; (5) IL-21과 IL-21R의 결합을 억제하는 특징; (6) IgG1인 특징; (7) 약 105 M-1s-1 이상의 결합 상수로 인간 IL-21R에 결합하는 특징; (8) 약 5 x 104 M-1s-1 이상의 결합 상수로 뮤린 IL-21R에 결합하는 특징; (9) 약 10-3 s-1 이하의 해리 상수로 인간 IL-21R에 결합하는 특징; (10) 약 10-2 s-1 이하의 해리 상수로 뮤린 IL-21R에 결합하는 특징; (11) 약 1.75 nM 이하의 IC50으로 인간 IL-21R-발현 BaF3 세포의 인간 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (12) 약 0.5 nM 이하의 IC50으로 뮤린 IL-21R-발현 BaF3 세포의 뮤린 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (13) 약 14.0 nM 이하의 IC50으로 인간 IL-21R-발현 TF1 세포의 인간 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (14) 약 1.9 nM 이하의 IC50으로 인간 일차 B 세포의 IL-21R-매개된 증식을 억제하는 특징; (15) 약 1.5 nM 이하의 IC50으로 인간 일차 CD4+ T 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하는 특징; (16) 약 5.0 nM 이하의 IC50으로 뮤린 일차 CD4+ T 세포의 IL-21-매개된 증식을 억제하는 특징; (17) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에 정맥내 투여된 후 약 0.1 내지 7.5 ㎖/hr/kg의 평균 전신 제거율(mean total body clearance)을 나타내는 특징; (18) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여된 후 약 20 내지 700시간의 평균 제거 반감기를 나타내는 특징; (19) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에서 약 40 내지 1500 ㎖/kg의 평균 정상-상태 분포 용적을 나타내는 특징; (20) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 피하 투여된 후 약 35 내지 100%의 생체이용률을 나타내는 특징; (21) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여된 후 (1 mg/kg 투여량 당) 약 200 내지 10,000 ㎍*hr/㎖의 평균 투여량-표준화된 AUC를 나타내는 특징; (22) 동물, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, 인간, 비인간 영장류, 설치류에, 예를 들어, 정맥내, 피하 또는 복강내 투여된 후 약 0.5 내지 30 ㎍/㎖의 평균 투여량-표준화된 C최대(최대 혈청 농도)를 나타내는 특징; 및 (23) IL-21 반응성 사이토카인 또는 IL-21 반응성 유전자의 발현을 조절하는 특징.
당업자라면 전술된 변경으로만 한정되지 않고 본 발명의 개시내용의 교시에 비추어 많은 다른 변경이 당업자에게 자명할 것임을 인식할 것이다.
핵산, 클로닝 및 발현 시스템
본 개시내용은 개시된 결합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, (전체적으로 또는 부분적으로) 합성된 핵산일 수 있거나 (전체적으로 또는 부분적으로) 재조합된 핵산일 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정한 서열을 가진 DNA 분자, 및 T가 U로 치환되어 있는 특정한 서열을 가진 RNA 분자를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 1, 2 또는 3개의 CDR, VH 도메인, VL 도메인 또는 이들의 조합물에 대한 코딩 서열, 또는 이와 실질적으로 동일한 서열(예를 들어, 상기 코딩 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열 또는 엄격한 조건 하에 상기 코딩 서열에 혼성화될 수 있는 서열)을 포함하는 핵산도 고려된다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열번호 163 내지 195의 아미노산 서열들로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-IL-21R 결합 단백질의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 기재된 서열들과 상이한 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산을 가진 CDR을 코딩하는 서열을 가진다.
핵산은 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역만을 코딩할 수 있거나, 또는 상응하는 가변 영역에 작동가능하게 연결된 결합 단백질의 경쇄 불변 영역 또는 중쇄 불변 영역을 코딩할 수 있다. 한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 κ 불변 영역 및 λ 불변 영역으로부터 선택된 불변 영역에 연결된다. 경쇄 불변 영역은 인간 κ 또는 λ 유형일 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD 및 IgE로부터 선택된 결합 단백질 동형의 중쇄 불변 영역에 연결될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG(예를 들어, IgG1) 동형일 수 있다.
본 발명의 핵산 조성물은 변경된 제한 부위 등을 제외하고 (cDNA 또는 게놈 DNA, 또는 이들의 혼합물의) 천연 서열에서 종종 표준 기법에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이 돌연변이는 원하는 경우 아미노산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 천연 V, D, J, 불변 및 스위치 서열, 및 본원에 기재된 다른 V, D, J, 불변 및 스위치 서열과 실질적으로 동일하거나 이들로부터 유래된 뉴클레오티드 서열이 고려된다(이때, "유래된"은 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또 다른 서열로부터 변경되어 있음을 의미함).
한 실시양태에서, 핵산은 제공된 서열과 (예를 들어, 1개 이상 내지 10, 20, 30 또는 40개 미만의 뉴클레오티드만큼; 본원 핵산 내의 뉴클레오티드의 1개 이상 내지 1%, 5%, 10% 또는 20% 미만만큼) 상이하다(예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상이함). 이 분석을 위해 필요한 경우, 최대 상동성을 위해 서열을 정렬해야 한다. 결실, 삽입 또는 불일치에 의해 "루프 형태로" 돌출된 서열들은 상이한 서열로서 간주된다. 상이함은 비필수 잔기(들)를 코딩하는 뉴클레오티드(들)에서의 상이함일 수 있거나 보존적 치환(들)일 수 있다.
본 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 및 전사 또는 발현 카세트의 형태의 핵산 구축물도 제공한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 핵산 구축물을 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
또한, 본원에 기재된 서열(들)을 포함하는 핵산(들)을 포함하는 핵산(들)으로부터 코딩된 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 숙주 세포가 상기 핵산으로부터 상기 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 발현 및 제조 후, VH 도메인, VL 도메인 또는 특정한 결합 구성원을 임의의 적절한 기법으로 단리하고/하거나 정제한 후 적절한 경우 사용할 수 있다. 상기 방법은 scFv를 코딩하는 핵산을, 결합 단백질의 Fc 부분을 코딩하는 핵산과 융합시키는 단계, 및 융합된 핵산을 세포 내에서 발현시키는 단계도 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 생식세포주화하는 단계도 포함할 수 있다.
항원-결합 단편, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는 실질적으로 순수한 또는 균질한 형태로, 또는 핵산의 경우 필요한 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 이외에 공급원의 다른 핵산 또는 유전자를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 형태로 그들의 천연 환경으로부터 단리될 수 있고/있거나 정제될 수 있다.
다양한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝하고 발현하기 위한 시스템은 당업계에 공지되어 있다. 결합 단백질의 제조에 적합한 세포는 예를 들어, 문헌(Fernandez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press)에 기재되어 있다. 요약하건대, 적절한 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 또는 원핵 세포, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)를 포함한다. 이종 폴리펩티드 발현을 위해 당업계에서 입수가능한 포유동물 세포는 림프구 세포주(예를 들어, NSO), HEK293 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, 난모 세포, 및 형질전환 동물로부터 유래된 세포, 예를 들어, 유방 상피 세포를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 조직-특이적 프로모터(예를 들어, 유방-특이적 프로모터)의 조절 하에 배치하고, 결합 단백질을 형질전환 동물에서 제조한다. 예를 들어, 결합 단백질은 형질전환 동물, 예컨대, 형질전환 소, 돼지, 말, 양, 염소 또는 설치류의 모유 내로 분비된다.
적절한 벡터는 프로모터 서열, 종결부위(terminator) 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 다른 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 포함하도록 선택될 수 있거나 구축될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 골격도 포함할 수 있다. 세부적 설명을 위해서는 예를 들어, 문헌(Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참조한다. DNA의 조작, 준비, 돌연변이유발, 서열 분석 및 형질감염을 포함하는, 벡터와 함께 이용되는 많은 확립된 기법들이 예를 들어, 문헌(Current Protocols in Molecular Biology (2nd ed. 1992) Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons)에 기재되어 있다.
본 개시내용의 추가 양태는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. 진핵 세포의 경우, 적절한 형질감염 기법은 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개된 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스(들), 예를 들어, 백시니아 또는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적절한 기법은 염화칼슘 형질전환, 전기천공, 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다. DNA 도입 후, 핵산을 함유하는 세포를 선별하기 위해 선별 방법(예를 들어, 약물 내성)을 수행할 수 있다.
항-IL-21R 결합 단백질의 사용
IL-21R에 대한 길항제로서 작용하는 항-IL-21R 결합 단백질(예를 들어, 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편)은 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 활액 세포의 1종 이상의 IL-21R-매개된 면역 반응, 예컨대, 세포 증식, 사이토카인 발현 또는 분비, 케모카인 분비 및 세포용해 활성 중 1종 이상을 조절하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 결합 단백질은 면역 또는 조혈 세포(예를 들어, 골수, 림프 또는 적혈구 계통의 세포 또는 이의 전구체 세포)의 활성(예를 들어, 증식, 분화 및/또는 생존)을 억제하는 데 사용될 수 있으므로 다양한 면역 질환 및 혈액 과다증식성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 IL-21R-관련 질환/면역 질환의 예는 이식편 거부, 이식편-대-숙주 질환(GVHD), 알레르기(예를 들어, 아토피성 알레르기) 및 자가면역 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 자가면역 질환은 당뇨병, 관절염 질환(류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선 관절염 및 강직성 척추염을 포함함), 척추관절병, 다발성 경화증, 뇌척수염, 중증근육무력증, SLE, 피부 홍반 루푸스, 자가면역 갑상선염, 피부염(아토피성 피부염, 습진 피부염을 포함함), 건선, 쇼그렌 증후군, 염증성 장 질환(IBD)(크론병, 궤양성 대장염을 포함함), 천식(내인성 천식, 알레르기성 천식을 포함함), 공피증 및 혈관염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 대상체, 예를 들어, 인간에서 IL-21R-관련 질환/면역 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
다발성 경화증은 염증 및 수초(신경을 절연시키고 적절한 신경 기능을 위해 필요한 지방 물질)의 상실을 특징으로 하는 중추신경계 질환이다. IL-21/IL-21R에 의존하는 면역 반응으로부터 발생되는 염증은 본 발명의 결합 단백질 및 조성물에 의해 치료될 수 있다. 다발성 경화증에 대한 실험적 자가면역 뇌염(EAE) 마우스 모델(예를 들어, 문헌(Tuohy et al. (1988) J. Immunol. 141:1126-30); 문헌(Sobel et al. (1984) J. Immunol. 132:2393-401); 및 문헌(Traugott (1989) Cell Immunol. 119:114-29) 참조)에서, EAE의 유도 전(및 후에 연속적으로) IL-21R 항체의 주사를 이용한 마우스의 치료는 질환의 발병 시점을 유의하게 지연시켰다. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 대상체, 예를 들어, 인간에서 다발성 경화증을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용될 수 있다.
관절염은 관절의 염증을 특징으로 하는 질환이다. 류마티스성 관절염(RA)은 결합 조직 및 활막(관절의 경계를 형성하는 막)의 염증을 수반하는 가장 흔한 형태의 관절염이다. 염증이 발생된 활막은 종종 관절을 침윤하여 관절 연골 및 뼈를 손상시킨다. 연구는 IL-21을 사용한 활액 세포 및 대식세포의 처리가, 상기 세포들이 염증과 관련된 사이토카인 및 케모카인을 분비하도록 유도함을 보여준다. RA 대한 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) 마우스 모델에서(예를 들어, 문헌(Courtenay et al. (1980) Nature 283:666-28); 및 문헌(Williams et al. (1995) Immunol. 84:433-39) 참조), CIA 유도 후(및 연속적으로) IL-21을 사용한 마우스의 처리는 상기 질환을 악화시킨다. 염증성 사이토카인 및 케모카인의 증가된 분비, 보다 중요하게는, IL-21에 의존하는 면역 반응으로부터 비롯된 질환의 증가된 수준은 본 발명의 결합 단백질로 치료될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 대상체, 예를 들어, 인간에서 RA 또는 다른 관절염을 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
이식편 거부는 공여자로부터 받은 조직이 숙주의 면역 세포에 의해 특이적으로 "공격받는" 면역학적 현상이다. 주된 "공격" 세포는 T 세포이고, 이 T세포의 수용체는 공여자의 MHC 분자를 "외래" 물질로서 인식한다. 이 현상은 T 세포를 활성화시키고, 상기 T 세포는 증식하여 궁극적으로 이식편을 파괴하는 다양한 사이토카인 및 세포용해 단백질을 분비한다. 이식편 거부의 시험관내 분석인 혼합된 림프구 반응(MLR)에서 T 세포는 IL-21로 보충될 때 보다 강하게 증식한다. MLR 및 이식 모델은 문헌(Current Protocols in Immunology (2nd ed. 1994) Coligan et al. eds., John Wiley & Sons)에 기재되어 있다(상기 문헌(Kasaian et al. (2002)); 문헌(Fulmer et al. (1963) Am. J. Anat. 113:273-85); 및 문헌(Lenschow et al. (1992) Science 257:789-92) 또한 참조). 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 대상체, 예를 들어, 인간에서 MLR을 경감하거나 예방하는 방법, 및/또는 IL-21에 의존하는 이식편 거부 및 관련 질환(예를 들어, GVHD)을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용될 수 있다.
전신 홍반 루프스(SLE)는 DNA, 핵 항원 및 리보핵단백질에 대한 항체를 포함하는 자가항체의 존재를 특징으로 하는 자가면역 질환이다. 상기 자가항체는 조직 및 기관 손상과 관련되어 있다. SLE의 원인은 알려져 있지 않으나 자가항체의 발생은 자가반응성 T 세포 또는 B 세포의 부적절한 억제를 암시한다. 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 자가반응성 T 세포 및 B 세포의 IL-21-매개된 활성을 억제하는 방법, 및/또는 대상체, 예를 들어, 인간 또는 MRL-Faslpr 마우스(SLE에 대한 마우스 모델)에서 SLE 또는 관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용될 수 있다(Immunologic Defects in Laboratory Animals (1981) Gershwin et al. eds., Plenum Press).
또한, 본 발명의 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 대상체, 예를 들어, 인간에서 IL-21-반응성 세포 및 IL-21R-반응성 세포의 비정상적인 활성과 관련되어 있는 혈액 과다증식성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 세포의 예로는 조혈 유래의 신생물 세포, 예를 들어, 골수, 림프 또는 적혈구 계통으로부터 유래된 세포 또는 이의 전구체 세포를 포함한다. 이러한 신생물 질환의 예는 백혈병성 암, 혈액의 종양, 골수의 종양(예를 들어, 골수종) 및 림프 조직의 종양(예를 들어, 림프종)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 급성 전구골수성 백혈병(APML), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 백혈병성 암의 치료에 대한 것이다(문헌(Vaickus (1991) Crit. Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97)에서 논의됨). 본 발명에 의해 치료될 수 있는 림프 악성종양의 예로는 급성 림프모구 백혈병(ALL)(B-계통 ALL 및 T-계통 ALL을 포함하는 ALL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 전구림프구 백혈병(PLL), 모발 세포 백혈병(HCL) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명에 의해 치료될 수 있는 악성 림프종의 추가 형태는 비-호지킨 림프종, 말초 T 세포 림프종, 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 경피 T 세포 림프종(CTCL), 대과립 림프구 백혈병(LGL), 호지킨 림프종 및 이들의 변이체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 급성 기 반응을 감소시키거나, 억제하거나, 또는 경감하는 방법을 특징으로 한다. 급성 기 반응은 급성 기 단백질(예를 들어, C-반응성 단백질 및 혈청 알부민)의 농도 조절을 포함하는, 염증에 대한 반응이다. 본 발명의 방법은 본원에 기재된 항-IL-21R 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 급성 기 반응을 감소시키거나, 억제하거나, 또는 경감하기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 포유동물, 예를 들어, 본원에 기재된 IL-21R-관련 질환, 예를 들어, 호흡기 질환, 염증 질환 및 자가면역 질환을 앓는 인간이다.
병용 요법
한 실시양태에서, 1종 이상의 항-IL-21R 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 치료제를 포함하는 약학 조성물은 병용 요법으로 투여된다. 상기 요법은 병리학적 상태 또는 질환, 예컨대, 면역 질환 및 염증 질환의 치료에 있어서 유용하다. 본 내용에서 용어 "병용되는"은 결합 단백질 조성물 및 치료제가 동시적으로 또는 순차적으로 실질적으로 동시에 투여됨을 의미한다. 순차적으로 투여되는 경우, 2종의 화합물들 중 제1 화합물은 제2 화합물의 투여 시점에서 치료 부위에서 유효한 농도로 여전히 검출될 수 있다.
예를 들어, 병용 요법은 1종 이상의 추가 치료제와 함께 동시제제화되고/되거나 동시투여되는 1종 이상의 항-IL-21R 결합 단백질, 예컨대, 항-IL-21R 항체를 포함할 수 있다. 상기 추가 치료제는 이하에 더 상세히 기재되는 바와 같이 1종 이상의 사이토카인 억제제, 성장 인자 억제제, 면역억제제, 소염제, 대사 억제제, 효소 억제제, 세포독성 물질 및/또는 세포증식 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 병용 요법은 보다 낮은 투여량의 투여되는 치료제를 사용할 수 있으므로 다양한 단독요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 뿐만 아니라, 본원에 개시된 치료제는 IL-21/IL-21R 경로와 상이한 경로에 대해 작용하므로 항-IL-21R 결합 단백질의 효과를 증가시키고/시키거나 상승시킬 것으로 예측된다.
항-IL-21R 결합 단백질과 병용되는 치료제는 자가면역 반응 및 후속 염증 반응의 여러 상이한 단계에서 관여하는 물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 1종 이상의 항-IL-21R 결합 단백질은 1종 이상의 사이토카인 및/또는 성장 인자 길항제와 함께 동시제제화되고/되거나 동시투여될 수 있다. 상기 길항제는 가용성 수용체, 펩티드 억제제, 소분자, 리간드 융합체, (사이토카인 또는 성장 인자, 또는 이들의 수용체 또는 다른 세포 표면 분자에 결합하는) 항체, 및 "소염성 사이토카인" 및 이들의 작용제를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항-IL-21R 결합 단백질과 병용될 수 있는 물질의 예로는 1종 이상의 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 및 IL-22), 사이토카인(예를 들어, TNF-α, LT, EMAP-II 및 GM-CSF) 또는 성장 인자(예를 들어, FGF 및 PDGF)가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 상기 물질은 인터루킨, 사이토카인 또는 성장 인자에 대한 1종 이상의 수용체의 길항제도 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 항-IL-21R 결합 단백질은 세포 표면 분자, 예컨대, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD90, 또는 이들의 리간드(예를 들어, CD154(gp39, CD40L)), LFA-1/ICAM-1 또는 VLA-4/VCAM-1(문헌(Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med. Res. Rev. 22(2): 146-67) 참조)에 대한 억제제(예를 들어, 항체)와 병용될 수도 있다. 본원에 기재된 항-IL-21R 결합 단백질과 병용될 수 있는 길항제는 IL-1, IL-12, TNF-α, IL-15, IL-17, IL-18, IL-22 및 이들의 수용체의 길항제를 포함할 수 있다.
IL-12 길항제의 예로는 IL-12에 결합하는 항체(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 00/056772호 참조), IL-12 수용체 억제제(예를 들어, IL-12 수용체에 대한 항체), 및 가용성 IL-12 수용체 및 이의 단편이 있다. IL-15 길항제의 예로는 IL-15 또는 이의 수용체에 대한 항체, IL-15 수용체의 가용성 단편, 및 IL-15 결합 단백질이 있다. IL-18 길항제의 예로는 IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체의 가용성 단편 및 IL-18 결합 단백질(IL-18BP, 문헌(Mallet et al. (2001) Circ. Res. 28))이 있다. IL-1 길항제의 예로는 인터루킨-1 전환 효소(ICE) 억제제(예컨대, Vx740), IL-1 길항제(예를 들어, IL-1RA(아나킨라(anakinra), 암젠)), sIL-1RII(이뮤넥스) 및 항-IL-1 수용체 항체가 있다.
TNF 길항제의 예로는 TNF(예를 들어, 인간 TNF-α)에 대한 항체, 예컨대, D2E7(인간 항-TNF-α 항체, 미국 특허 제6,258,562호, 휴미라(HUMIRA)(상표명), 바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니 소재), CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(인간화된 항-TNF-α 항체, 셀텍(Celltech)/파마샤(Pharmacia)), cA2(키메라 항-TNF-α 항체, 레미캐이드(REMICADE)(상표명), 센토코르(Centocor)), 및 항-TNF 항체 단편(예를 들어, CPD870)이 있다. 다른 예로는 가용성 TNF 수용체(예를 들어, 인간 p55 또는 p75) 단편 및 유도체, 예컨대, p55 kd TNFR-IgG(55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 레네르셉트(LENERCEPT)(상표명) 및 75 kd TNFR-IgG(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 엔브렐(ENBREL)(상표명), 이뮤넥스; 예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1994) 37:S295 and J. Invest. Med. (1996) 44:235A) 참조)가 있다. 추가 예로는 효소 길항제[예를 들어, TNF-α 전환 효소 억제제(TACE), 예컨대, 알파-설포닐 하이드록삼산 유도체(국제특허출원 공개 제WO 01/055112호) 또는 N-하이드록시포름아마이드 억제제(GW 3333, -005 또는 -022)] 및 TNF-bp/s-TNFR[가용성 TNF 결합 단백질; 예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S284) 및 문헌(Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) 268:37-42) 참조]이 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 항-IL-21R 결합 단백질은 하기 물질들 중 1종 이상의 물질과 병용 투여될 수 있다: IL-13 길항제, 예컨대, 가용성 IL-13 수용체 및/또는 항-IL-13 항체; 및 IL-2 길항제, 예컨대, IL-2 융합 단백질[예를 들어, DAB 486-IL-2 및/또는 DAB 389-IL-2, 세라겐(Seragen)(예를 들어, 문헌(Rheumatism (1993) 36:1223) 참조) 및 항-IL-2R 항체(예를 들어, 항-Tac(인간화된 항체, 프로테인 디자인 랩스(Protein Design Labs)(문헌(Cancer Res. (1990) 50(5): 1495-502) 참조))]. 또 다른 병용은 비소진 항-CD4 억제제, 예컨대, IDEC-CE9.1/SB 210396(항-CD4 항체, IDEC/스미스클라인)과 병용되는 항-IL-21R 결합 단백질을 포함한다. 또한, 다른 병용은 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2) 공자극(costimulatory) 경로 길항제(예컨대, 항체, 가용성 수용체 또는 길항제성 리간드), P-셀렉틴(selectin) 당단백질 리간드(PSGL), 및/또는 소염성 사이토카인 및 이들의 작용제(예를 들어, 항체)와 병용되는 항-IL-21R 결합 단백질을 포함한다. 소염성 사이토카인은 IL-4(DNAX/쉐링, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), IL-10(SCH 52000, 재조합 IL-10, DNAX/쉐링), IL-13 및 TGF를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 1종 이상의 항-IL-21R 결합 단백질은 1종 이상의 소염제, 면역억제제, 대사 억제제 및 효소 억제제와 동시제제화될 수 있고/있거나 동시투여될 수 있다. 본원에 기재된 IL-21R 결합 단백질과 병용될 수 있는 약제 또는 억제제의 비제한적 예는 하기 물질들 중 1종 이상을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 비스테로이드성 소염제(NSAID)(예컨대, 이부프로펜(ibuprofen), 테니댑(tenidap)(예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S280) 참조), 나프록센(naproxen)(예를 들어, 문헌(NeuroReport (1996) 7:1209-13) 참조), 멜록시캠(meloxicam), 피록시캠(piroxicam), 디클로페낙(diclofenac) 및 인도메타신(indomethacin)); 설파살라진(sulfasalazine)(예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S281) 참조); 코르티코스테로이드(예컨대, 프레드니솔론(prednisolone)); 사이토카인 억제 소염제(CSAID); 및 뉴클레오티드 생합성 억제제(예컨대, 퓨린 생합성 억제제(예를 들어, 메토트렉세이트와 같은 폴레이트 길항제) 및 피리미딘 생합성 억제제(예를 들어, 다이하이드로오로테이트 데하이드로게네이즈(DHODH) 억제제, 예컨대, 레플루노마이드(leflunomide)(예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S131) 및 문헌(Inflammation Research (1996) 45:103-7) 참조).
추가 억제제의 예는 하기 물질들 중 1종 이상을 포함한다: 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사); 면역억제제(예컨대, 사이클로스포린 및 타크롤리무스(tacrolimus)(FK-506)); mTOR 억제제(예컨대, 시롤리무스(sirolimus)(라파마이신(rapamycin)) 또는 라파마이신 유도체(예를 들어, 에스터 라파마이신 유도체, 예컨대, CCI-779(문헌(Elit (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(8): 1249-53) 및 문헌(Huang et al. (2002) Current Opinion Investig. Drugs 3(2):295-304) 참조); 전구염증성 사이토카인, 예컨대, TNF-α 및 IL-1의 신호전달을 방해하는 물질(예를 들어, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 카이네이즈(kinase) 억제제); cox2 억제제(예를 들어, 셀레콕시브(celecoxib) 및 이의 변이체(MK-966); 예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S81) 참조); 포스포다이에스터레이즈(phosphodiesterase) 억제제(예컨대, R973401; 예를 들어, 문헌(Arthritis Rheumatism (1996) 39(9):S282) 참조); 포스포라이페이즈(phospholipase) 억제제(예를 들어, 세포질성 포스포라이페이즈 2(쳬LA2) 억제제, 예컨대, 트라이플루오로메틸 케톤 유사체; 미국 특허 제6,350,892호 참조); 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 억제제; VEGF 수용체 억제제; 및 혈관신생 억제제.
본원에 개시된 항-IL-21R 결합 단백질은 다른 치료제와 병용되어 이하에서 더 상세히 논의되는 특정한 면역 질환을 치료할 수 있다.
항-IL-21R 결합 단백질과 병용될 수 있는 관절염 질환(예를 들어, 류마티스성 관절염, 염증성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염 및 건선 관절염) 치료제의 비제한적 예는 하기 물질들 중 1종 이상의 물질을 포함한다: TNF 길항제(예컨대, 항-TNF 항체); TNF 수용체의 가용성 단편(예를 들어, 인간 p55 및 p75) 및 이들의 유도체(예컨대, p55 kd TNFR-IgG(55 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 레네르셉트(상표명)) 및 75 kd TNFR-IgG(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 엔브렐(상표명)); TNF 효소 길항제(예컨대, TACE 억제제); IL-12, IL-15, IL-17, IL-18 및 IL-22의 길항제; T 세포-소진제 및 B 세포-소진제(예컨대, 항-CD4 또는 항-CD22 항체); 소분자 억제제(예컨대, 메톡트렉세이트 및 레플루노마이드); 시롤리무스(라파마이신) 및 이의 유사체(예를 들어, CCI-779); cox2 및 cPLA2 억제제; NSAID; p38, TPL-2, Mk-2 및 NFκB 억제제; RAGE 또는 가용성 RAGE; P-셀렉틴 또는 PSGL-1 억제제(예컨대, P-셀렉틴 또는 PSGL-1에 대한 항체 및 소분자 억제제); 에스트로겐 수용체 β(ERB) 작용제; 및 ERB-NFκB 길항제. 1종 이상의 IL-21/IL-21R 길항제와 동시투여될 수 있고/있거나 동시제제화될 수 있는 치료제는 하기 물질들 중 1종 이상을 포함할 수 있다: TNF 수용체(예를 들어, 인간 p55 또는 p75), 예컨대, 75 kd TNFR-IgG(75 kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, 엔브렐(상표명)); 메토트렉세이트; 레플루노마이드; 및 시롤리무스(라파마이신) 또는 이의 유사체(예를 들어, CCI-779).
항-IL-21R 결합 단백질과 병용될 수 있는 다발성 경화증 치료제의 비제한적 예는 인터페론-β(예를 들어, IFNβ-1a 및 IFNβ-1b), 코팍손(Copaxone), 코르티코스테로이드, IL-1 억제제, TNF 억제제, CD40 리간드에 대한 항체, CD80에 대한 항체, 및 IL-12 길항제를 포함한다.
항-IL-21R 결합 단백질과 병용될 수 있는 염증성 장 질환 또는 크론병 치료제의 비제한적 예는 하기 물질들 중 1종 이상을 포함한다: 부데노사이드(budenoside); 표피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캡토퓨린; 아자티오프린(azathioprine); 메트로니다졸(metronidazole); 리폭시게네이즈(lipoxygenase) 억제제; 메살아민(mesalamine); 올살라진(olsalazine); 발살라자이드(balsalazide); 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1 단일클론 항체; 항-IL-6 단일클론 항체; 성장 인자; 엘라스테이즈(elastase) 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; 본원에 기재된 TNF 길항제; IL-4, IL-10, IL-13 및/또는 TGFβ 또는 이의 작용제(예를 들어, 작용제성 항체); IL-11; 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 또는 부데소나이드(budesonide)의 글루큐로나이드(glucuronide)- 또는 덱스트란-접합된 전구약물; ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드(ISIS 2302; 아이시스 파마슈티칼스 인코포레이티드(Isis Pharmaceuticals, Inc.)); 가용성 보체 수용체 1(TP10; 티 셀 사이언시스 인코포레이티드(T Cell Sciences, Inc.)); 서방출 메살라진(mesalazine); 메토트렉세이트; 혈소판 활성화 인자(PAF)의 길항제; 시프로플록사신(ciprofloxacin); 및 리그노케인(lignocaine).
다른 실시양태에서, 항-IL-21R 결합 단백질은 면역 반응, 예를 들어, 이식편 거부 또는 GVHD에 관여하는 다른 표적에 대한 1종 이상의 항체와 병용될 수 있다. IL-21/IL-21R 길항제와 병용될 수 있는 면역 반응 치료제의 비제한적 예는 세포 표면 분자(예를 들어, CD25(IL-2 수용체 α), CD11a(LFA-1), CD54(ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80(B7-1), CD86(B7-2), 또는 이들의 조합물)에 대한 하기 항체들을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항-IL-21R 결합 단백질은 1종 이상의 일반적인 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린 A 또는 FK506과 병용된다.
본 발명의 또 다른 양태는 다른 치료제와 항-IL-21R 결합 단백질의 병용 투여를 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 키트는 약학적 담체 중에 제제화된 1종 이상의 항-IL-21R 결합 단백질, 및 적절한 경우 하나 이상의 별도의 약학 제제 중에 제제화된 1종 이상의 치료제를 포함한다.
진단 용도
본 발명의 결합 단백질은 생물학적 샘플에서 IL-21R의 존재를 검출하는 데 사용될 수도 있다. 당업자라면 상기 단백질의 존재 또는 농도를 의학적 상태와 상호관련시킴으로써 관련된 의학적 상태를 진단할 수 있다. 예를 들어, 자극된 T 세포는 그의 IL-21R의 발현을 증가시키고, 관절에서 비정상적으로 높은 농도의 IL-21R을 발현하는 T 세포는 관절 염증 및 가능한 관절염을 표시할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질에 의해 진단될 수 있는 예시적 의학적 상태는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염 및 이식편 거부를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
결합 단백질-기재 검출 방법, 예컨대, 항체에 대해 통상적으로 이용되는 검출 방법이 당업계에 잘 공지되어 있고, ELISA, 방사성면역분석, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 유세포분류, 면역형광, 면역침전 및 다른 관련된 기법을 포함한다. 본 발명의 결합 단백질은 IL-21R을 검출하기 위해 상기 방법들 중 1종 이상의 방법을 도입하는 진단 키트 내에 구비될 수 있다. 상기 키트는 다른 성분들, 포장재, 설명서, 시약, 및/또는 상기 단백질의 검출 및 상기 키트의 사용을 보조하는 다른 물질을 함유할 수 있다.
결합 단백질은 리간드 기(예를 들어, 바이오틴), 형광단, 발색단, 방사성 동위원소, 전자 밀도가 높은 시약 또는 효소를 포함하는 검출가능한 마커로 변경될 수 있다. 효소는 그의 활성에 의해 검출된다. 예를 들어, HRP는 테트라메틸벤지딘(TMB)을 분광계로 정량될 수 있는 청색 색소로 전환시킬 수 있는 그의 능력에 의해 검출된다. 다른 적절한 결합 파트너는 바이오틴과 아비딘, IgG와 단백질 A, 및 당업계에 공지된 다른 수용체-리간드 쌍을 포함한다.
또한, 결합 단백질은 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유결합 또는 다른 수단에 의해) 1종 이상의 다른 분자 물질, 예컨대, 또 다른 결합 단백질(예를 들어, 이중특이적 또는 다중특이적 결합 단백질), 독소, 방사성 동위원소, 세포독성 물질 또는 세포증식 억제제에 기능적으로 연결될 수 있다. 다른 변경 및 가능성은 당업자에게 자명하고 본 발명의 범위 내에 포함되는 균등물로서 간주된다.
약학 조성물 및 투여 방법
본 발명의 일부 실시양태는 개시된 결합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 환자에게 약학적으로 사용하고 투여하기에 적합할 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 결합 단백질 및 약학 부형제를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학 부형제"는 약학적 투여에 적합할 수 있는 용매, 분산 매질, 코팅물, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡수지연제 등을 포함한다. 약학 활성 물질을 위한 상기 약학 부형제들의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 약학 조성물은 보충 치료 기능, 추가 치료 기능 또는 증가된 치료 기능을 제공하는 다른 활성 화합물도 함유할 수 있다. 상기 약학 조성물은 투여를 위한 설명서와 함께 용기, 팩 또는 분배기 내에 포함될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 투여를 달성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 약학 조성물은 국소 투여될 수 있거나, 경구 투여될 수 있거나, 또는 점막을 가로질러 투과될 수 있다. 약학 조성물의 투여 예는 경구 섭취 또는 흡입을 포함한다. 또한, 투여는 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 강내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 경피 투여일 수 있다.
피내 또는 피하 투여를 위한 용액 또는 현탁액은 하기 성분들 중 1종 이상의 성분을 포함한다: 멸균 희석제, 예컨대, 물, 식염수 용액, 고정된 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 삼투성 조절제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 당업계에 공지된 방법에 의해 산 또는 염기로 조정될 수 있다. 이러한 제제는 앰플, 1회용 주사기 또는 다회 투여분 바이알 내에 봉입될 수 있다.
정맥내 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 담체, 예컨대, 생리식염수, 살균수, 크레모포 엘(CREMOPHOR EL)(등록상표)(바스프 코포레이션(BASF Corp.), 독일 루드빅샤펜 소재), 에탄올 또는 폴리올을 포함한다. 모든 경우, 조성물은 용이한 주사 투여를 위해 멸균된 유체이어야 한다. 적절한 유동성은 종종 레시틴 또는 계면활성제를 사용하여 수득할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 한다. 미생물의 방지는 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 사용하여 달성할 수 있다. 많은 경우, 등장화제(당), 폴리알코올(예를 들어, 만니톨 및 소르비톨) 또는 염화나트륨이 상기 조성물에 포함될 수 있다. 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 첨가하여 달성할 수 있다.
경구 조성물은 불활성 희석제 또는 식용가능한 담체를 포함한다. 경구 투여를 위해, 결합 단백질은 부형제와 함께 도입되어 예를 들어, 정제, 트로치, 캡슐 또는 젤라틴 내에 배치된다. 약학적으로 적합한 결합제 또는 보조제 물질이 상기 조성물에 포함될 수 있다. 상기 조성물은 (1) 결합제, 예컨대, 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸쓰 또는 젤라틴; (2) 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스; (3) 붕해제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; (4) 윤활제, 예컨대, 스테아르산마그네슘; (5) 활택제, 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 및/또는 (6) 감미제 또는 풍미제를 함유할 수 있다.
또한, 조성물은 경점막 또는 경피 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, Fc 부분을 포함하는 결합 단백질(예를 들어, 항체)은 장, 구강 또는 폐에서 (Fc 수용체를 통해) 점막을 통과할 수 있다. 경점막 투여는 로젠지, 비강 분무기, 흡입기 또는 좌약제에 의해 달성될 수 있다. 경피 투여는 당업계에 공지된 연고, 고약, 겔 또는 크림을 함유하는 조성물에 의해 달성될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 막에 적합한 침투제가 사용될 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 결합 단백질은 추진제(예를 들어, 액체 또는 기체)를 함유하는 가압된 용기 또는 분배기, 또는 분사기로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 체내로부터의 급속한 제거로부터 상기 결합 단백질을 보호하는 담체를 사용하여 제제화된다. 생분해성 중합체(예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스터 및 폴리락트산)가 종종 사용된다. 이러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 리포좀 현탁액도 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 리포좀은 당업계에 공지된 확립된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호 참조).
본 발명의 결합 단백질 또는 결합 단백질 조성물은 기재된 치료 유효량으로 투여된다. 치료 유효량은 대상체의 연령, 상태, 성별 및 의학적 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량은 임상적 상태에 의거하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 상기 결합 단백질 또는 조성물은 최대한 긴 시간 동안 결합 단백질의 순환 농도를 최대화하기 위해 볼루스 투여로서 제공될 수 있다. 연속적인 관주도 이용될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 대상체는 IL-21R을 발현하는 세포, 예를 들어, 암세포 또는 면역세포를 특징으로 하는 질환을 앓는 인간 환자를 포함할 수 있다. 용어 본 발명의 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예컨대, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
대상체에게 투여될 수 있는 투여량 범위의 예는 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg, 1 ㎍/kg 내지 10 mg/kg, 1 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 10 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 10 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg, 100 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 250 ㎍/kg 내지 2 mg/kg, 250 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 500 ㎍/kg 내지 2 mg/kg, 500 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 1 mg/kg 내지 2 mg/kg, 1 mg/kg 내지 5 mg/kg, 5 mg/kg 내지 10 mg/kg, 10 mg/kg 내지 20 mg/kg, 15 mg/kg 내지 20 mg/kg, 10 mg/kg 내지 25 mg/kg, 15 mg/kg 내지 25 mg/kg, 20 mg/kg 내지 25 mg/kg 및 20 mg/kg 내지 30 mg/kg(또는 그 이상)으로부터 선택될 수 있다. 상기 투여량 범위는 투여량, 투여 방법, 치료될 질환 또는 증상(들) 및 개개의 대상체의 특징에 따라 1일마다, 1주마다, 2주마다, 1개월마다 또는 덜 빈번하게, 예를 들어, 1년마다 투여될 수 있다.
일부 경우, 투여의 용이함 및 투여량 균일성을 위해 조성물을 투여량 단위 제형으로 제제화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 사용된 투여량 단위 제형은 환자에게 적합한 물리적으로 분리된 단위 제형을 의미한다. 각각의 투여량 단위 제형은 치료 효과를 달성하기 위해 계산된 예정된 양의 결합 단백질을 담체와 함께 함유한다. 투여량 단위 제형은 결합 단백질의 특징 및 달성될 구체적인 치료 효과에 달려 있다.
조성물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 방법, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 투여량)을 측정함으로써 측정할 수 있다. 독성과 치료 효능 사이의 투여량 비는 치료 지수이고 비 LD50/ED50으로서 표시될 수 있다. 큰 치료 지수를 보이는 결합 단백질은 보다 낮은 독성 및/또는 보다 높은 치료 효과를 나타낼 수 있다.
세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 인간에서 투여량 범위를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 화합물들의 투여량은 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는, 순환하는 결합 단백질의 혈중 농도 범위 내에 있을 수 있다. 투여량은 사용되는 투여 조성물 형태 및 투여 경로에 의해 좌우되는 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용되는 임의의 결합 단백질의 경우, 치료 유효량은 세포 배양물 분석을 이용하여 먼저 평가할 수 있다. IC50을 포함하는 순환하는 혈장 농도 범위(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 결합 단백질의 농도)를 달성하는 투여량을 동물 모델에서 결정할 수 있다. 임의의 구체적인 투여량의 효과는 적절한 생물분석에 의해 모니터링될 수 있다. 적절한 생물분석의 예로는 DNA 복제 분석, 전사-기재 분석, 유전자 발현 분석, IL-21/IL-21R 결합 분석 및 다른 면역학적 분석이 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 투여량은 생체외 전혈 세포 분석에서 결정될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 구체적인 투여량을 결정하고 모니터링하기에 적합한 생물분석은 IL-21R 활성의 억제 또는 경감, 예컨대, IL-21-반응성 유전자의 발현 조절에 필요한 항-IL-21R 결합 단백질의 최소 혈청 농도를 측정하는 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, IL-21-반응성 유전자는 하기 비제한적인 목록으로부터 선택된다: TNF, IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSF1, GZMB, PRF1, IL-2Rα 및 IL-21R. 바람직한 실시양태에서, IL-21-반응성 유전자는 CD19, GZMB, IFNγ, IL-2Rα, IL-6 및 PRF1로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시양태에서, IL-21-반응성 유전자는 IL-2Rα이다. 따라서, IL-21R 활성의 억제 또는 경감에 필요한 항-IL-21R 항체의 최소 혈청 농도를 측정하는 방법은 1종 초과의 IL-21-반응성 유전자, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6종의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
본원 전체에서 인용된 모든 참고자료, 특허출원 및 특허의 전체 내용은 본원에 참고로 도입된다.
[실시예]
본 발명은 하기 비제한적 실시예에서 더 설명될 것이다. 이 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 기재되는 것이고 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실시예는 당업자에게 잘 공지된 통상적인 방법들의 상세한 설명을 포함하지 않는다.
실시예 1: 파지 디스플레이에 의한 결합 단백질의 생성
미국 특허 제7,495,085호(본원에 참고로 도입됨)에 기재된 scFv 모 클론 18A5는 1 순환 및 3 순환에서 표적으로서 인간 IL-21R 발현 BaF3 세포를 사용하고 2 순환에서 표적으로서 바이오틴-부착된 IL-21R-Fc 융합 단백질을 사용하는 표준 파지 디스플레이 방법으로 CS 인간 scFv 라이브러리로부터 수득하였다.
실시예 2: 라이브러리 구축
파지 디스플레이 라이브러리는 scFv가 그의 3' 말단에서 온전한 유전자에 융합되어 있는 pCANTAB6 벡터를 사용하여 모 클론 18A5 scFv에 의거하여 구축하였다. 다양한 CDR3 서열을 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 유도하였다.
6개의 연속적인 코돈으로 구성된 2개의 중첩 블록을 VH 및 VL의 CDR3 내에 무작위적으로 배치하여 총 4개의 라이브러리, 즉 H3B1, H3B2, L3B1 및 L3B2를 제조하였다. 하기 서열번호는 각각 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 확인시켜준다: IL-21R: 18A5 VH CDR3[서열번호 199 및 200]; H3B1(라이브러리 크기 1.40x109)[서열번호 201 및 202]; H3B2(라이브러리 크기 1.00x109)[서열번호 203 및 204]; IL-21R: 18A5 VL CDR3[서열번호 205 및 206]; L3B1(라이브러리 크기 9.00x109)[서열번호 207 및 208]; L3B2(라이브러리 크기 6.40x109)[서열번호 209 및 210].
실시예 3: 파지 선별
18A5의 모든 유도체는 용액 상(phase)에서 바이오틴-부착된 인간 IL-21R 세포외 도메인 His-FLAG 융합 단백질("바이오틴-hIL-21R-H/F") 및 바이오틴-부착된 뮤린 IL-21R 세포외 도메인 His-FLAG 융합 단백질("바이오틴-mIL-21R-H/F")에 결합할 수 있는 파지를 선별함으로써 상기 scFv 라이브러리로부터 단리하였고, 선별과 관련된 모든 방법 및 기법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 총 27종의 항-IL-21R scFv를 파지 선별 방법으로 단리하였다.
실시예 4: 라이브러리 검색
scFv 포맷에서 생성된 결합 단백질은 인간 IgG1 포맷에서 바이오틴-hIL-21R-H/F 및 바이오틴-mIL-21R-H/F와의 결합에 대해 모 항체 18A5와 경쟁함으로써 인간 IL-21R을 발현하는 유전적으로 개조된 세포주의 hIL-21-의존적 증식 및 뮤린 IL-21R을 발현하는 유전적으로 개조된 세포주의 mIL-21-의존적 증식을 방해하는 상기 결합 단백질의 능력에 의거하여 선택하였다.
실시예 4.1: 검색 분석에서 사용될 조질의 원형질막주위 물질 제제("원형질막주위-제제")
사용되는 생장 조건에 따라, scFv는 박테리아 원형질막주위 공간 내의 용액 중에서 발현될 수 있다. 원형질막주위 공간 내로의 scFv의 방출을 유도하기 위해, 0.1% 글루코스/100 ㎍/㎖ 앰피실린과 함께 990 ㎕ 2xTY 배지를 함유하는 96-깊은 웰 플레이트를, QPix2 콜로니 픽커(picker)(제네틱스(Genetix), 잉글랜드 뉴 밀톤 소재)를 이용하여 해동된 글리세롤 저장액으로 접종하고(웰 당 1종의 클론) 37℃에서 (999 rpm으로) 약 4시간 동안 생장시켰다. 배양물을 최종 농도 0.02 mM에서 IPTG로 유도하고 30℃에서 (999 rpm으로) 밤새 생장시켰다. 박테리아 원형질막주위 공간의 내용물(원형질막주위-제제)을 삼투압 쇼크를 통해 방출하였다. 요약하건대, 플레이트를 원심분리하고, 펠렛을 150 ㎕ TES 원형질막주위 완충제(50 mM 트리스/HCl(pH 8.0)/1 mM EDTA(pH 8.0)/20% 수크로스) 중에 재현탁시킨 후, 150 ㎕의 1:5 TES:물을 첨가하고, 얼음 상에서 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 원심분리하고, scFv-함유 상청액을 수거하였다.
실시예 4.2: 라이브러리 검색을 위한 에피토프 경쟁 분석
인간 또는 뮤린 IL-21R에 결합하는 능력에 대해 모 항체 18A5와 경쟁하는 scFv는 균질한 시간-해상 형광(HTRF(등록상표)) 분석에 의해 선별된 파지로부터 확인될 수 있다. 정제된 모 항체 18A5를, HTRF(등록상표) 크립테이트(Cryptate) 표지 키트(시스바이오(Cisbio), 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)의 설명서에 따라 유로퓸의 유도체인 크립테이트와 공유접합시켰다. scFv의 원형질막주위-제제는 전술한 바와 같이 제조하여 PBS/0.4 M 칼륨 플루오라이드/0.1% BSA(HTRF(등록상표) 완충제)로 0.25%까지 희석한 후, 10 ㎕의 혼합물을 흑색 384-얕은 웰 플레이트(넌크(Nunc), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)의 웰로 옮겼다. 그 다음, 5 ㎕의 크립테이트-접합된 18A5 항체를 웰 각각에 첨가한 후, 1:800 비율로 희석된 스트렙타비딘-XL665 접합체(시스바이오)와 4.8 nM 바이오틴-hIL-21R-H/F 또는 40 nM 바이오틴-mIL-21R-H/F의 혼합물 5 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 항온처리하고, 시간-해상 형광도 측정을 수행하였다(340 nm 여기, 615 nm 및 665 nm 방출). 18A5 항체와의 경쟁은 615 nm에서의 방출에 대한 665 nm에서의 방출의 배경-보정된 비의 감소로 표시되었다.
독립적으로 총 8280종의 단리된 scFv가 인간 IL-21R-H/F를 사용한 HTRF(등록상표) 분석에서 검색되었고, 바이오틴-hIL-21R-H/F와의 결합에 대해 모 항체 18A5와 경쟁할 수 있는 376종의 클론이 추가 분석을 위해 선택되었다.
실시예 5: 서열 분석을 위한 scFv 영역의 라이브러리-유래된 scFv-PCR 증폭의 DNA 서열 분석
모 항체 18A5 scFv 분자의 서열에 비해 개선된 IL-21R 결합을 나타내는 287종의 18A5-유래된 scFv 변이체의 서열을 결정하고, 위치 각각에서 확인된 아미노산의 빈도를 측정하였다. VH 클론들 중에서 2종의 클론만(1.7%)이 (VH CDR3의 C-말단에서) 예를 들어, 서열번호 169의 마지막 6개 아미노산을 돌연변이시킨 라이브러리로부터 유래되었고, 나머지 클론들은 예를 들어, 서열번호 169의 처음 6개 아미노산을 돌연변이시킨 라이브러리로부터 유래되었다. VL 클론들 중에서 1종의 클론만이(0.6%) (VL CDR3의 C-말단에서) 예를 들어, 서열번호 170의 마지막 6개 아미노산을 돌연변이시킨 라이브러리로부터 유래되었고, 대다수의 클론들은 (VL CDR3)의 N-말단에서) 예를 들어, 서열번호 170의 처음 6개 아미노산을 돌연변이시킨 라이브러리로부터 유래되었다.
scFv의 PCR 증폭은 제조자의 설명서에 따라 HN 완충제(에피센터 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 중에서 VENT(등록상표) DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 이스프위치 소재)를 사용하여 수행하였다. 5 ㎕의 정지상 박테리아 배양물 1:10 희석물을 20 ㎕의 최종 반응 부피에 대한 기질로서 사용하였다. 이용된 주기 조건은 94℃에서 2분 고온 개시; 94℃에서 (1분) 변성, 55℃에서 (2분) 프라이머 어닐링 및 72℃에서 (1분) 연장으로 구성된 30주기; 및 이어서 72℃에서 (5분) 최종 연장이었다. PCR 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로 검증하고 M13rev 프라이머를 사용하여 서열을 분석하기 전에 ExoI/SAP(작은 새우 알칼리성 포스파테이즈)로 처리하였다.
27종의 scFv의 CDR3 서열에 대한 서열번호는 하기 표 4에 기재되어 있다. 이 scFv들은 실시예 6에 기재된 분석에 의거한 추가 분석을 위해 선택되었다.
[표 4]
Figure pct00008
실시예 6: 라이브러리-유래된 scFv의 특징규명
실시예 6.1: 정량 분석을 위한 정제된 scFv의 준비
개개의 scFv 클론들을 파이팁(PHYTIP)(등록상표) 컬럼(파이넥서스 인코포레이티드(PhyNexus, Inc.), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재) 상의 Ni-NTA 정제로 소규모로 정제하였다. 단일 콜로니를 250 rpm에서 교반하면서 37℃에서 50-㎖ 원뿔 튜브 내의 0.1% 글루코스/100 ㎍/㎖ 앰피실린이 함유된 20 ㎖ 2xTY 배지 중에서 중간-대수기까지 생장시켰다. scFv의 발현은 최종 농도 0.02 mM에서 IPTG로 유도하고, 배양물을 30℃에서 밤새 생장시켰다. 세포를 원심분리하여 수거하고 1 ㎖ TES 원형질막주위 완충제에 재현탁한 후, 1 ㎖ 1:5 TES:물을 첨가하고 얼음 상에서 30분 동안 항온처리하였다. 용해물을 4℃ 및 3200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 2 mM MgCl2로 옮겼다. 퍼킨 엘머(미국 매사추세츠주 왈쌈 소재) 미니트랙(MINITRAK)(상표명) IX 액체 조작 로봇 상의 파이팁(등록상표) 상에서 상청액의 반복된 통과를 통해 scFv를 Ni-NTA 파이팁(등록상표)(파이넥서스) 상에 포획시킨 후, IMAC 세척 완충제 중에서 세척하고 200 nM 이미다졸, 50 mM 트리스 및 300 mM NaCl(pH 9.0)으로 용출시켰다. PBS로의 1:10 희석을 3회 수행함으로써 완충제를 PBS로 교체한 후, 10,000 분자량 컷오프 필터 플레이트(밀리포어 멀티스크린(MULTISCREEN)(등록상표) 울트라셀(ULTRACEL)(상표명) 96-웰 한외여과 플레이트, 밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재) 상에서 농축하였다. 마이크로 BCA(상표명) 키트(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Fisher Scientific Inc.), 미국 일리노이주 록포드 소재) 및 제조자의 소 혈청 알부민 표준물을 사용하여 샘플을 정량하였다.
실시예 6.2: 인간 IL-21R 또는 뮤린 IL-21R을 과발현하는 세포의 IL-21-의존적 증식에 대한 분석
인간 또는 뮤린 IL-21R로 형질감염된 세포주의 IL-21-의존적 증식을 억제하는 18A5-유래된 결합 단백질(scFv 및 IgG)의 능력을 측정하기 위해 상기 결합 단백질을 사용하여 억제 분석을 수행하였다. 뮤린 전구-B 세포주인 BaF3 세포 및 인간 적혈구 세포주인 TF1 세포를 레트로바이러스를 사용하여 IL-21R 및 녹색 형광 단백질(GFP)로 형질도입시켰다. 세포를 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 0.00036% β-머캡토에탄올을 함유하는 RPMI 1640 중에서 통상적으로 생장시켰다. 인간 IL-21R-BaF3 세포 배양물을 50 ng/㎖의 인간 IL-21로 보충하고, 뮤린 IL-21R-BaF3 세포 배양물을 10 U/㎖의 IL-3으로 보충하고, TF1 세포 배양물을 50 ng/㎖의 GM-CSF로 보충하였다. 분석 전, 세포를 보충 성장 인자가 결여된 분석 배지 중에서 3회 세척하고, 분석 배지에 재현탁시키고, 37℃/5% CO2에서 6시간 동안 항온처리하였다. 분석 플레이트를 준비하기 위해, 5000개의 세포를 55 ㎕/웰의 부피로 96-웰 평저 백색 조직 배양 플레이트(써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 왈쌈 소재)의 중앙 60개 웰에 첨가하였다. 저장액 샘플을 분석 배지로 희석하고 연속적으로 3배 희석함으로써 시험 scFv 또는 IgG 샘플을 준비하였다. 25 ㎕의 결합 단백질 샘플을 상기 세포에 첨가하고 37℃/5% CO2에서 30분 동안 항온처리하였다. 100 내지 400 pg/㎖의 인간 또는 뮤린 IL-21을 함유하는 20 ㎕의 분석 배지를 웰 각각에 첨가하고, 세포를 추가 48시간 동안 항온처리하였다. 플레이트의 온도가 실온에 도달되게 하고, 15 ㎕/웰 셀타이터-글로(등록상표)를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 항온처리하고, 퍼킨 엘머 엔비젼(ENVISION)(상표명) 플레이트 판독기로 발광을 측정함으로써 증식을 측정하였다. 파이넥서스 IMAC 팁으로 정제한 후, 108종의 scFv를 3종의 세포주 모두의 IL-21-의존적 증식의 중화에 대해 시험하였다. 모든 세포주가 모 항체 18A5 scFv의 IC50 이하의 IC50을 보이면서 인간 IL-21R-BaF3 세포의 중화를 보였다. 하위세트는 뮤린 IL-21R-BaF3 세포 및 인간 IL-21R-TF1 세포의 증식의 강한 중화를 보였다. 27종의 가장 강한 클론들로부터 수득된 데이타가 도 1 내지 3에 도시되어 있고 표 5에 요약되어 있다.
도 1 내지 3은 인간 IL-21R-BaF3 세포(도 1a 내지 1c); 인간 IL-21R-TF1 세포(도 2a 내지 2c); 및 뮤린 IL-21R-BaF3 세포(도 3a 내지 3c)의 scFv에 의한 증식의 중화를 보였다. 세포는 표시된 scFv와 혼합되었고 100 pg/㎖(도 1 및 2) 또는 400 pg/㎖(도 3)의 인간 IL-21과 함께 항온처리되었다.
실시예 6.3: 정량적 에피토프 경쟁 분석
정제된 scFv는 ELISA에서 뮤린 IL-21R과의 결합에 대해 모 항체 18A5와 경쟁하는 그의 능력에 대해 정량적으로 분석되었다. 모 항체 18A5 항체를 4℃에서 96-웰 넌크 맥시소프(MAXISORP)(등록상표) 플레이트 상에서 PBS 중의 0.75 ㎍/㎖의 농도로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한 후, 실온에서 PBS/1% BSA/0.05% 트윈-20 중에서 3시간 동안 차단하였다. scFv를 36 nM 바이오틴-부착된 mIL-21R-H/F와 혼합하고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 차단된 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 50 ㎕/웰의 scFv/IL-21R 혼합물을 적절한 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 5회 세척한 후, HRP-접합된 스트렙타비딘(서던 바이오텍(Southern Biotech), 미국 알라바마주 버밍햄 소재) 2차 항체의 1:6000 희석물을 첨가하여 결합된 바이오틴-부착된 mIL-21R-H/F를 검출하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 PBS로 7회 세척하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 신호를 발생시키고, H2SO4를 사용하여 반응을 중지시키고, 엔비젼(상표명) 플레이트 판독기(퍼킨 엘머) 상에서 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 파이넥서스 IMAC 팁에 의해 정제된 108종의 scFv는 이 분석에서 시험되었고 모 항체 18A5 scFv의 IC50보다 더 낮은 IC50으로 바이오틴-부착된 뮤린 IL-21R-H/F와의 결합에 대해 모 항체 18A5와 가장 잘 경쟁하였다. 세포-기재 중화 분석에서 가장 높은 효능을 보인 27종의 클론들에 대한 에피토프 경쟁 데이타는 도 4a 내지 4c에 도시되어 있고 표 5에 요약되어 있다.
[표 5]
Figure pct00009
실시예 7: 모 항체 18A5 IgG의 생식세포주 서열로의 전환
생식세포주 유래의 모 항체 18A5의 VL(하기 참조)과 함께 변경된 VL 영역을 가진 하기 15종의 scFv를 전장 인간 IgG 람다로의 전환을 위해 선택하였다: L2, L3, L6, L9, L11, L13, L14, L16, L17, L18, L19, L20, L23, L24 및 L25. 생식세포주 유래의 모 항체 18A5의 VH(하기 참조)와 함께 변경된 VH 영역을 가진 4종의 scFv(H3, H4, H5 및 H6)를 전장 인간 IgG1로의 전환을 위해 선택하였다.
CDR 영역 외부의 서열들이 가장 유사한 인간 생식세포주 서열(VH의 경우 DP67/VH4B+(VBASE_AA:WAP00CEAZ_1) 및 JH1/JH4/JH5, 및 VL의 경우 DPL16/VL3.1(VBASE_AA:WAP00CEMI_1))과 일치하도록 모 항체 18A5의 VH 아미노산 서열 및 VL 아미노산 서열을 변경시켰다. 진아트(GENEART)(독일 레젠스버그 소재)에서 유전자 합성의 조합을 이용하여 변경을 수행하고, 부위-지정 변이를 PCR로 도입하였다. 또한, 진아트는 그가 독점 소유하는 방법을 이용하여 포유동물 세포에서의 발현에 대해 서열을 코돈-최적화하였다. 모 항체 18A5 서열과 생식세포주-수정된 18A5 서열의 정렬은 다음과 같다:
18A5 중쇄 비교
Figure pct00010
Figure pct00011
18A5 경쇄 비교
Figure pct00012
Figure pct00013
생식세포주-수정된 VH 서열(모 서열로부터의 변화는 밑줄친 굵은 글자체로 기재됨)
Figure pct00014
생식세포주-수정된 VL 서열(모 서열로부터의 변화는 밑줄친 굵은 글자체로 기재됨)
Figure pct00015
실시예 8: 라이브러리-유래된 scFv의 IgG로의 전환
개선된 18A5 scFv 유도체의 VL 도메인 및 VH 도메인의 CDR3 영역을 PCR로 증폭하고 하기 방법을 이용하여 모 항체 18A5의 생식세포주-수정된 VL 및 VH 골격 내로 서브클로닝하였다. 생식세포주 18A5 VH 유전자의 5' 부분을 포함하는 PCR 단편은 플라스미드 pSMED2_OP18A5G_huIgG1을 프라이머 BssHII_II_VH_F(5'-GCTTGGCGCGCACTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3')[서열번호 230] 및 GVH_R_for_BssHII(5'-TCAGGGAGAACTGGTTCTTGG-3')[서열번호 231]로 증폭시켜 생성하였다. 개선된 scFv 클론 VH3으로부터 유래된 VH 유전자의 3' 부분을 포함하는 PCR 단편은 하기 프라이머로 증폭하였다: G_VH_F_for_SalI(5'-TCCAAGAACCAGTTCTCCCTG-3')[서열번호 232] 및 scFv_SalI_VH_R(5'-GCGACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3')[서열번호 233]. 단편을 겔-정제한 후, 2종의 단편을 혼합하고 외부 프라이머 세트 BssHII_G_VH_F 및 SalI_VH_R로 증폭시켜 완전한 VH 유전자 단편을 생성하였다. 이 단편을 BssHII 및 SalI로 분해하고 삼중-돌연변이체 힌지 영역을 가진 인간 IgG1의 불변 영역을 함유하는 벡터 내로 결찰시켰다. 삽입체를 BssHII_II_VH_F 및 새로운 프라이머(Sal_VH_R_RJ(5' -GCGACGTCGACAGGACTCACCACTCGAGACGG-3'))[서열번호 234]로 재증폭시켜 VHJ 분절의 코딩 서열을 JH1 생식세포주 서열에 일치하도록 변경시키고, 인간 IgG1-삼중-돌연변이체 불변 영역 벡터 내로 결찰시켰다.
개선된 scFv로부터 유래된 VL 유전자를 유사한 방법으로 서브클로닝하였다. 18A5 VL 유전자의 5' 부분을 포함하는 PCR 단편은 플라스미드 pSMEN2_OP18A5G_hu 람다를 프라이머 BssHII_II_VL_F(5'-GCTTGGCGCGCACTCTTCCTCTGAGCTGACCCAG-3')[서열번호 235] 및 scFv_VL_R_for_BssFII(5'-GCCTGAGCCCCAGTGATGGTCA-3')[서열번호 236]로 증폭시켜 생성하였다. 개선된 scFv 클론으로부터 유래된 VL 유전자의 3' 부분을 포함하는 PCR 단편은 프라이머 GVL_F_for_XbaI(5'-ACCGCCTCCCTGACCATCAC-3')[서열번호 237] 및 scFv_XbaI_VL_R(5'-GCGCCGTCTAGAGTTATTCTACTCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCCTC-3')[서열번호 238]로 증폭시켰다. 단편을 겔-정제한 후, 유전자 각각의 5' 부분 및 3' 부분에 상응하는 단편을 혼합하고 외부 프라이머 세트 BssHII_II_VL_F 및 scFv_XbaI_VL_R로 증폭시켜 완전한 VL 유전자 단편을 생성하였다. 이 단편을 BssHII 및 XbaI로 분해하고 인간 람다 유전자의 불변 영역을 함유하는 벡터 내로 결찰시켰다.
실시예 9: 시험관 내에서 개선된 IgG의 특징규명
실시예 9.1: 결합 단백질의 일시적 소규모 발현
클론을 cos-7 세포에서 일시적으로 발현시킨 후 전장 IgG 포맷에서의 기능에 대해 시험하였다. 16종의 시험 서열 세트(생식세포주로부터 유래된 모 항체 18A5 VL 및 L2, L3, L6, L9, L11, L13, L14, L16, L17, L18, L19, L20, L23, L24 및 L25)의 경쇄 각각을 5종의 시험 서열 세트(생식세포주로부터 유래된 모 항체 18A5 VH 도메인인 VH_P와 함께 H3, H4, H5 및 H6)의 중쇄 각각과 쌍을 이루게 하였다. 쌍을 이룬 형태의 플라스미드 각각(1.4 ㎍)을 제조자의 설명서에 따라 트랜지트(TRANSIT)(등록상표) 형질감염 시약(미니스(Minis), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)과 조합하고, DNA:트랜지트(등록상표) 시약 결합체를, 6-웰 조직 배양 플레이트 내의 둘베코스 개질 이글 배지(DMEM)/10% 열-불활성화된 태아소 혈청/페니실린/스트렙토마이신/2 mM L-글루타민 중에서 생장하는 cos-7 세포의 단일층에 첨가하였다. 24시간 후, 배지를 무혈청 배지(R1CD1)로 교체한 다음 48시간 후 수거하였다. 전장 항체를 포함하는 결합 단백질을 항-인간 IgG ELISA로 정량하였다.
실시예 9.2: 세포 증식의 중화에서 항-IL-21R IgG의 활성
무혈청 컨디셔닝된 배지 중의 80쌍의 일시적으로 발현된 IgG를 상기 3종의 세포주, 즉 (1) 인간 IL-21R-BaF3 세포, (2) 뮤린 IL-21R-BaF3 세포 및 (3) 인간 IL-21R-TF1 세포에서 IL-21-의존적 증식 분석에서의 활성에 대해 시험하였다. 80쌍의 모든 IgG가 인간 IL-21R-발현 BaF3 세포의 증식 중화를 보였고, VH4를 포함하는 IgG를 제외한 모든 IgG 쌍이 인간 IL-21R-발현 TF1 세포의 중화를 보였다(데이타는 나타내지 않음). 또한, 80쌍의 IgG 모두가 뮤린 IL-21R-발현 BaF3 세포의 증식 중화를 보였는데, 이때 가장 강한 중화는 일반적으로 모 항체의 중쇄와 쌍을 이룬 경쇄와 관련되어 있고, 가장 약한 중화는 일반적으로 VH4 중쇄와 관련되어 있다(데이타는 나타내지 않음). 가장 강력한 21쌍의 IgG 조합물(AbA 내지 AbU)로부터 수득된 중화 데이타는 도 5에 도시되어 있고, IC50 데이타는 표 6에 요약되어 있다.
100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-BaF3 세포에 대해 분석을 수행하였고(도 5a 내지 5c), 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-TF1 세포에 대해 분석을 수행하였고(도 5d 내지 5f), 400 pg/㎖의 뮤린 IL-21을 사용하여 뮤린 IL-21R-BaF3 세포에 대해 분석을 수행하였다(도 5g 내지 5i). IL-21을 표시된 항체 다음에 세포에 첨가하고, 48시간 후, 셀타이터-글로(등록상표명)로 증식을 측정하였다. 도 26a 내지 26c는 상기 3종의 세포주에서 유사한 억제를 입증하는 추가 연구를 보여준다.
실시예 9.3: 일시적으로 발현된 래트 IL-21R 및 시아노몰구스 원숭이 IL-21R에 결합하는 항-IL-21R IgG
결합 단백질 하위세트를 CHO-PA-Dukx 세포의 표면 상에서 일시적으로 발현된 래트 IL-21R, 시아노몰구스 원숭이 IL-21R, 인간 IL-21R 또는 인간 IL-2R-γ 공통 하위단위체에 결합하는 능력에 대해 시험하였다. 분석 48시간 전, 세포를 형질감염시켰다. 분석 당일, 세포를 자동 플레이트 세척기(타이터텍(Titertek), 미국 알라바마주 헌츠빌 소재) 상에서 0.9 mM CaCl2 및 0.45 mM MgCl2가 함유된 PBS(PBS/CaMg)로 약하게 5회 세척하고, 실온에서 PBS/CaMg/5% 탈지 분유 중에서 2시간 동안 차단하였다. 일시적으로 발현된 항-IL-21R IgG로부터의 컨디셔닝된 배지를 차단 완충제로 연속적으로 희석하고, 실온에서 차단된 플레이트 내의 세포에 1시간 동안 첨가하였다. 세포를 PBS/CaMg로 5회 세척한 후, 실온에서 HRP-접합된 항-인간 IgG와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 PBS/CaMg로 10회 세척하고, 세척 완충제 전부를 제거하였다. 색채 반응이 포화상태에 도달될 때까지 세포를 100 ㎕의 TMB와 항온처리하고, 100 ㎕의 0.18 M H2SO4로 중단시키고, 퍼킨 엘머 엔비젼(상표명) 플레이트 판독기 상에서 A450에서 판독하였다.
21종의 IgG 전부가 인간 IL-21R을 일시적으로 발현하는 CHO 세포(도 6a 내지 6c), 래트 IL-21R을 일시적으로 발현하는 CHO 세포(도 6d 내지 6f) 또는 시아노몰구스 원숭이 IL-21R을 일시적으로 발현하는 CHO 세포(도 6g 내지 6i)에 결합되었다. 대다수는 CHO 세포 상에서 일시적으로 발현된 대조군 단백질(인간 감마(γ) 공통 쇄)에 대한 배경보다 더 높은 수준의 결합을 보이지 않았지만, IgG의 하위세트(AbD, AbE, AbF, AbH, AbL 및 AbM)는 13 nM 이상에서 배경보다 더 높은 수준으로 결합되었다(도 6j 내지 6l). 데이타는 표 6에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure pct00016
실시예 9.4: 인간 IL-21R에 결합하는 항-IL-21R IgG의 선별성의 비아코어(상표명) 분석
일시적으로 발현된 항-IL-21R 결합 단백질(여기서, 항체)의 하위세트의 결합 특이성을 비아코어(상표명) 2000 표면 플라스몬 공명 장치 상에서 시험하였다. 항-인간-IgG, 항-뮤린 면역글로불린 항체 및 뮤린 IL-21R-H/F를, 표준 아민 커플링을 이용하여 연구 등급의 카복시메틸-덱스트란 칩(CM5) 상에 고정시켰다. 센서 칩 표면을 20 ㎕/분의 유속으로 EDC/NHS로 7분 동안 활성화시켰다. 제1 유동 셀을 용적 굴절 지수, 매트릭스 효과 및 비특이적 결합에 대한 보정을 위한 기준 표면으로서 사용하였다. 포획 항체(유동 셀 2 상의 7,150 공명 유니트(RU)의 항-인간-Fc 항체(인비트로겐 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재), 및 유동 셀 3 상의 7,500 RU의 항-뮤린-Fc 항체)를 아세트산나트륨 완충제(pH 5.0)로 10 ㎍/㎖로 희석하고 상기 활성화된 표면 상에 주입하였다. 남은 활성화된 기는 1.0 M 에탄올아민(pH 8.0)으로 차단하였다. 항-인간 IgG 및 항-뮤린 IgG의 분자량은 둘다 150 kD이고, IL-21R 단량체의 분자량은 27 kD이었다.
항-21R 항체 및 항체 대조군(뮤린 항-인간 IL-2Rβ 및 뮤린 항-인간 IL-4R(알앤디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재); 인간 항-인간 IL-13(와이어쓰(Wyeth), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)을 함유하는 컨디셔닝된 배지를 0.2% 소 혈청으로 보충된 HBS/EP 완충제로 희석하고, 종에 적합한 포획 항체 상에 500 내지 700 RU의 항체를 포획하는 비아코어(상표명) 칩의 4개의 모든 유동 셀 상에 주사하였다. 5초 세척 기간 후, 양성 대조군 단백질(뮤린 IL-21R-H/F), IL-21R과 관련된 2종의 인간 단백질(인간 IL-2Rβ 및 인간 sIL-4R(알앤디 시스템스)) 또는 관련되지 않은 H/F-부착된 단백질(인간 IL-13-H/F)을 함유하는 50 nM 용액을 상기 칩 상의 포획된 항체 상에 주사하였다. 결합 주기 및 해리 주기를 각각 120초 및 180초 동안 모니터링한 후 5 ㎕의 글리신(pH 1.5)을 2회 주사하여 완전 활성 포획 표면을 재생시켰다. 모든 결합 실험은 25℃에서 HBS/EP 완충제 중에서 수행하였다. 이중 기준을 사용하여 감지그래프 각각에 대해 블랭크 효과 및 완충제 효과를 차감하였다.
시험된 모든 항-IL-21R 항체(18A5 항체 및 AbA 내지 AbU)는 뮤린 IL-21R과의 분명한 결합을 보였으나, IL-21R-관련된 단백질 인간 IL-2Rβ 및 인간 가용성 IL-4R 또는 관련되지 않은 H/F-부착된 단백질 인간 IL-13-H/F와의 결합은 보이지 않았다(도 7a 내지 7c). 대조군은 IL-2Rβ 및 인간 가용성 IL-4R이 특이적 항-IL-2Rβ 및 항-IL-4R 항체에 의해 포획될 수 있음을 보여주었다(도 7d).
실시예 9.5: 일시적으로 발현된 항체의 정제
7종의 항체(인간 IgG1 삼중-돌연변이체 버전: AbS, AbT, AbO, AbP 및 AbU; 및 이중-돌연변이체 버전: AbQ 및 AbR)를 cos-7 세포에서 일시적으로 발현시키고 추가 분석을 위해 정제하였다. 추가로, 상이한 Fc 수용체 결합 수준을 나타낼 것으로 예측된, 인간 IgG 꼬리(tail)를 가진 3종의 AbT 버전(야생형 IgG1, IgG4 및 IgG1 이중-돌연변이체)도 제조하였다. 25 ㎍의 플라스미드를 각각 사용하여 8개의 T-175 플라스크 각각에서 세포를 형질감염시킨 점을 제외하고 전술된 트랜지트(등록상표) 프로토콜을 수행하였다. 먼저 컨디셔닝된 배지를 수거한 후, 새로운 R1CD1을 첨가한 다음 추가 72시간 후 수거하였다. 컨디셔닝된 배지를 모아 0.22 ㎛ 필터 상에서 여과하였다. 항체를 단백질 A 수지 상에 적재하고, 20 mM 시트르산/150 mM 염화나트륨(pH 2.5)으로 용출하고 트리스(pH 8.5)로 중화시키고 PBS 내로 투석하였다.
실시예 9.6: 인간 IL-21R 및 뮤린 IL-21R에 결합하는 항체의 비아코어(상표명) 분석
항-IL-21R 항체와 인간 IL-21R-H/F 및 뮤린 IL-21R-H/F의 결합의 동역학을 비아코어(상표명) 표면 플라스몬 공명 장치 상에서 시험하였다. 항-인간 IgG 항체(인비트로겐 코포레이션)를 표준 아민 커플링을 이용하여 연구-등급의 카복시-메틸-덱스트란 칩(CM5) 상에 고정시켰다. 상기 표면을 20 ㎕/분의 유속으로 EDC/NHS로 7분 동안 활성화시켰다. 제1 유동 셀을 용적 굴절 지수, 매트릭스 효과 및 비특이적 결합을 보정하기 위한 기준 표면으로서 사용하였다. 항-인간-Fc 항체를 10 mM 아세트산나트륨 완충제(pH 5.0)로 20 ㎍/㎖으로 희석하고, 2950 내지 3405 RU의 항체를 4개의 유동 셀 각각에 포획하였다. 남은 활성화된 기를 1.0 M 에탄올아민-HCl(pH 8.5)로 차단하였다.
항-IL-21R 항체를 0.2% 소 혈청 알부민으로 보충된 HBS/EP 완충제로 0.1 내지 0.2 ㎍/㎖로 희석하고 비아코어(상표명) 칩 상에 적재하였다. 짧게 세척한 후, 0 내지 100 nM의 인간 IL-21R-H/F 또는 10 내지 500 nM의 뮤린 IL-21R-H/F를 함유하는 용액을 50 ㎕/분의 유속으로 상기 칩 상에 주사하였다. 결합 주기를 hIL-21R 동역학 및 mIL-21R 동역학에 대해 3분 동안 실행하고, 해리 주기를 hIL-21R에 대해 15분 동안 모니터링하고 mIL-21R에 대해 5분 동안 모니터링한 후, 10 ㎕의 글리신(pH 1.5)을 2회 주사하고 30 ㎕의 글리신(pH 1.5)을 1회 주사하여 완전 활성 포획 표면을 재생시켰다. 모든 결합 실험은 25℃에서 HBS/EP 완충제 중에서 수행하였고, 샘플 선반을 15℃에서 보관하였다. 이중 기준을 사용하여 감지그래프 각각에 대해 블랭크 효과 및 완충제 효과를 차감하였다. 감지그래프는 도 8a 및 8b(인간 IL-21R-H/F) 및 도 8c 및 8d(뮤린 IL-21R-H/F)에 도시되어 있다. 결합 동역학적 파라미터는 표 7A에 기재되어 있고, 반복 실험으로부터 수득된 추가 동역학적 데이타는 표 7B에 기재되어 있다.
추가로, 전술된 프로토콜을 이용하여 AbS 및 AbT를 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F에 대한 결합 동역학에 대해 시험하였다. 인간 IL-21R-H/F 및 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F에 대한 결합 프로파일은 AbS 및 AbT 둘다의 경우 유사하였다(도 9). 도 9는 AbS에 결합하는 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F(도 9a); AbT에 결합하는 시아노몰구스 원숭이 IL-21R-H/F(도 9c); AbS에 결합하는 인간 IL-21R-H/F(도 9b); 및 AbT에 결합하는 인간 IL-21R-H/F(도 9d)를 보여준다.
[표 7A]
Figure pct00017
[표 7B]
Figure pct00018
실시예 9.7: 비아코어(상표명) 에피토프 경쟁 분석
항체 AbS, 항체 AbT 및 모 항체 18A5를 CM5 비아코어(상표명) 칩 상에 직접 고정시켰다. 뮤린 IL-21R-H/F(100 nM)를 상기 칩 상에 300초 동안 유동시킨 후, 세척하고(100초), 이어서 AbS, AbT, D5 또는 비중화 항-mIL-21R 항체(7C2)의 5 ㎍/㎖ 용액을 상기 표면 상에 유동시켰다. AbS, AbT 및 D5의 경우에는 추가 결합이 관찰되지 않았는데, 이것은 mIL-21R-H/F 상의 결합 부위가 AbS, AbT 또는 18A5 항체와의 동시적인 결합에 의해 차단됨을 암시한다(도 10a). 대조적으로, 비중화 대조군 항-IL-21R 항체 7C2는 AbS, AbT 또는 18A5 상에 포획된 mIL-21R-H/F에 결합할 수 있었는데, 이것은 이 대조군 항체가 포획 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에서 결합함을 암시한다.
유사하게, AbS 및 AbT는 CM5 비아코어(상표명) 칩 상에 고정된 AbS 또는 AbT에 의해 포획된 인간 IL-21R-H/F에 결합하지 못하였지만, 대조군 항-인간 IL-21R 항체(9D2)는 AbS 또는 AbT에 의해 포획된 인간 IL-21R-H/F에 결합할 수 있었다(도 10b). 이 관찰결과는 AbS에 대한 결합 부위가 AbT에 의한 동시적인 결합에 의해 차단되고, 역으로 AbT에 대한 결합 부위가 AbS에 의한 동시적인 결합에 의해 차단됨을 암시한다.
실시예 9.8: 세포-기재 증식 분석
정제된 IgG는 전술된 바와 같이 3종의 세포주, 즉 인간 IL-21R-BaF3 세포, 뮤린 IL-21R-BaF3 세포 및 인간 IL-21R-TF-1 세포에서 IL-21-의존적 증식 분석에서의 활성에 대해 시험하였다. 모든 세포주가 모 항체 18A5 IgG보다 더 높은 효능으로 인간 IL-21R-의존적 증식 및 뮤린 IL-21R-의존적 증식 둘다의 강한 억제를 보였다(도 11, 표 8). 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-BaF3 세포에 대해 분석을 수행하였고(도 11a), 200 pg/㎖의 뮤린 IL-21을 사용하여 뮤린 IL-21R-BaF3 세포에 대해 분석을 수행하였고(도 11b), 100 pg/㎖의 인간 IL-21을 사용하여 인간 IL-21R-TF-1 세포에 대해 분석을 수행하였다(도 11c). 도 26d는 인간 IL-21R-BaF3 세포에 대한 상기 항체들의 효과의 추가 연구의 결과를 보여준다.
[표 8]
Figure pct00019
실시예 9.9: 일차 인간 B 세포 증식 분석
일차 인간 B 세포의 IL-21-의존적 증식을 억제하는 항-IL-21R 항체의 능력을 시험하였다. 건강한 인간 공여자로부터 유래된 연막 세포를 매사추세츠 제너럴 호스피탈(Massachusetts General Hospital, 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)로부터 입수하였다. 상기 세포를 로셋테셉(ROSETTESEP)(상표명) B 세포 풍부 칵테일(스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies), 캐나다 밴쿠버 소재), 및 제조자의 설명서에 따라 단리된 B 세포와 함께 항온처리하였다. 생성된 집단(60 내지 80% CD19+ B 세포)을 96-웰 평저 플레이트 내에서 10% FBS, 50 U/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 함유된 RPMI 중에서 1x105/웰의 밀도로 배양하였다. 5% CO2로 조정된 37℃ 항온처리기 내에서 B 세포를 연속적으로 희석된 항-인간 IL-21R 항체로 30분 동안 전처리하였다. 그 후, 5% CO2로 조정된 37℃ 항온처리기 내에서 상기 처리된 B 세포를 0.5 ㎍/㎖의 항-CD40 mAb(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 산 호세 소재) 및 10 ng/㎖의 IL-21 사이토카인으로 3일 동안 자극하였다. 3일째 날, 0.5 μCi/웰의 3H-티미딘(퍼킨 엘머(NEN))을 배양물에 펄스로 첨가하고, 5시간 후 유리 섬유 필터 매트 상으로 수거하였다. 3H-티미딘 도입을 액체 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. 개선된 모든 항체가 모 항체 18A5보다 더 높은 효능으로 IL-21-의존적 증식을 중화시켰다(도 12a 및 12b, 표 9; 도 26e 또한 참조).
[표 9]
Figure pct00020
실시예 9.10: 일차 인간 T 세포 증식 분석
일차 인간 CD4+ T 세포의 IL-21-의존적 증식을 억제하는 항-IL-21R 항체의 능력을 시험하였다. 건강한 인간 공여자로부터 유래된 연막 세포를 매사추세츠 제너럴 호스피탈로부터 입수하였다. CD4+ T 세포를 로셋테셉(상표명) CD4+ T 세포 풍부 칵테일(스템셀 테크놀로지스)을 사용하여 제조자의 설명서에 따라 음성 선별함으로써 단리하였다. 생성된 집단은 약 80 내지 90% CD4+/CD3+ T 세포이었다. 풍부한 인간 CD4+ T 세포를, 5% CO2로 조정된 37℃ 항온처리기 내에서 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 HEPES가 함유된 RPMI 중에서 항-CD3/항-CD28-코팅된 미소구로 3일 동안 활성화시켰다. 활성화 후, 미소구를 제거하고, 세포를 세척하고 배양 배지 중에서 약 1x106 세포/㎖의 농도로 밤새 정치시켰다. 이어서, 정치된 세포를 다시 세척한 후 분석 플레이트에 첨가하였다. 항-인간 IL-21 수용체 항체의 연속 희석물을 평저 96-웰 플레이트에서 배양 배지로 제조한 후, 인간 IL-21(20 ng/㎖ 최종 농도) 및 활성화되고 정치된 CD4+ T 세포(105 세포/웰)를 순차적으로 첨가하였다. 이어서, 상기 플레이트를 추가 3일 동안 항온처리하고, 분석의 최종 6시간 동안 1 μCi/웰의 3H-티미딘(퍼킨 엘머(NEN))을 상기 플레이트에 펄스 첨가하였다. 세포를 유리 섬유 필터 매트 상으로 수거하고, 3H-티미딘 도입을 액체 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. 개선된 모든 항체가 모 항체 18A5보다 더 높은 효능으로 IL-21-의존적 증식을 중화시켰다(도 13, 표 10A; 도 26f 또한 참조).
[표 10A]
Figure pct00021
실시예 9.11: 일차 뮤린 T 세포 증식 분석
일차 뮤린 CD8+ T 세포의 IL-21-의존적 증식을 억제하는 항-IL-21R 항체의 능력을 시험하였다. 12주령 암컷 BALB/C 마우스로부터 오금, 겨드랑이, 상완 및 샅굴 림프절, 및 비장을 채취하였다. 0.017 M 트리스(pH 7.4) 중의 0.16 M NH4Cl을 사용하여 비장 세포의 단일-세포 현탁액으로부터 적혈구 세포를 제거하였다. 비장 및 림프절 세포를 모으고 뮤린 T 세포 CD8 하위세트 컬럼 키트(알앤디 시스템스)를 사용하여 CD8+ 세포를 풍부하게 하였다. 뮤린 CD8+ 세포(3x104; 10% 태아소 혈청을 함유하고 0.05 mM β-머캡토에탄올, 2 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 나트륨 피루베이트, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신으로 보충된 DMEM 중에 현탁됨)를 96-웰 항-mCD3 활성화 플레이트(비디 바이오사이언시스)에 플레이팅하고, mIL-21(50 ng/㎖)을 모든 웰에 첨가하였다. 시험 항체의 역가를 20 ㎍/㎖부터 시작되는 3회 반복실험에서 측정하였다. 세포를 37℃/10% CO2 배양기 내에서 3일 동안 생장시켰다. 배양 기간 중 마지막 5시간 동안 세포를 0.5 μCi의 메틸-3H-티미딘/웰(지이 헬쓰케어)로 표지하였다. 세포를 마치(Mach) III 세포 수거기(톰텍(TomTec), 미국 코넥티컷주 햄덴 소재)를 이용하여 수거하고 트릴룩스 마이크로베타 카운터(Trilux microbeta counter)(퍼킨 엘머)를 이용하여 카운팅하였다. AbP와는 별개로, 개선된 모든 항체가 모 항체 18A5보다 더 높은 효능으로 IL-21-의존적 증식을 중화시켰다(도 14, 표 10B; 도 26g 또한 참조).
[표 10B]
Figure pct00022
실시예 9.12: ADCC 분석
표적 세포에 결합된 경우 ADCC를 유도하는 항-IL-21R 항체의 능력을 시험하였다. 실험 전날, 연막을 PBS 중에 1:1로 희석하여 피콜(FICOLL)(등록상표)(지이 헬쓰케어) 상에 적층시키고 1200 g에서 20분 동안 원심분리함으로써 연막으로부터 PBMC를 단리하였다. PBMC를 피콜(등록상표) 층의 상부로부터 제거하고 세척하고 10 ng/㎖의 IL-2 및 10 ng/㎖의 IL-12(알앤디 시스템스)로 밤새 자극하였다. 실험 당일, 자극된 PBMC를 원심분리하여 수거하고 배지에 1x108 세포/㎖의 농도로 재현탁하였다. BJAB 세포를 37℃에서 0.5 μM CFSE(몰레큘라 프로브스(MOLECULAR PROBES)(등록상표), 인비트로겐 코포레이션)로 10분 동안 표지한 후 태아 소 혈청으로 1회 세척하고 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 100 ㎕ 배지 중의 2x105 세포/웰의 밀도로 96-웰 평저 플레이트에 플레이팅하였다. 4x 항체 50 ㎕를 BJAB 세포에 첨가한 후, 50 ㎕ 중의 5x106 PBMC를 첨가하여 최종 1:25의 표적:이펙터 세포 비를 제공하였다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 항온처리하고 프로피디움 요오다이드(PI)로 염색하여 사멸 세포 및 사멸하는 세포를 표지하였다. 표적 세포의 사멸(CFSE+)은 팩스칼리버(FACSCALIBUR)(상표명) 유세포분류기(비디 바이오사이언시스)에서 PI 염색을 측정함으로써 평가하였다. 1종의 항-IL-21R 항체, 즉 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 가진 AbZ만이 표적 세포에 결합하지 못하는 대조군 항-IL-13 항체에 의해 표시되는 배경 수준보다 높은 ADCC를 보였다. AbZ와 동일한 가변 도메인을 가진 모든 항체(인간 IgG4를 가진 형태(AbY), 및 인간 IgG1의 이중-돌연변이체 형태(AbX) 및 삼중-돌연변이체 형태(AbT)를 포함함)가 배경 수준의 ADCC만을 보였다(도 15). 시험된 다른 모든 항-IL-21R 항체는 인간 IgG1의 삼중-돌연변이체 형태를 함유하였고 배경 ADCC를 보였다. 양성 대조군 항체인 리툭시마브(리툭산(등록상표))는 모든 실험에서 ADCC를 유도하였다.
실시예 9.13: C1q ELISA
항-IL-21R 항체에 의한 세포-표면 결합이 보체-의존적 세포독성(CDC)을 일으킬 수 있는지를 확인하기 위해, ELISA에서 보체 성분 C1q에 결합하는 항체의 능력을 시험하였다. IL-21R 항체 및 리툭시마브(리툭산(등록상표))를 PBS로 5 ㎍/㎖로 희석하였다. 4℃에서 코스타(COSTAR)(등록상표) 고-결합 ELISA 플레이트(코닝 라이프 사이언시스, 미국 매사추세츠주 로웰 소재)를 상기 희석된 항체(100 ㎕)로 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈-20으로 3회 세척하고 실온에서 200 ㎕의 차단 완충제(0.1 M NaPO4, 0.1 M NaCl, 0.1% 젤라틴, 0.01% 트윈)로 1시간 동안 차단하였다. C1q를 함유하는 것으로 이미 확인된 인간 혈청(퀴델(Quidel), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)을 PBS로 1:50으로 희석하였다. 1시간 동안 차단한 후, 플레이트를 세척하고, 100 ㎕의 희석된 혈청을 웰 각각에 첨가하고 실온에서 진탕기 상에서 2시간 동안 항온처리하였다. 3회 세척 후, 100 ㎕의 0.1 ㎍/㎖ 닭 다중클론 항-인간 C1q 항체(에이비캠(AbCam), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)를 웰 각각에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 닭 Ig-Y-HRP 희석된 1:4000(에이비캠)에 대한 100 ㎕의 토끼 다중클론 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 TMB로 5분 동안 현상한 후, 50 ㎕의 1 M H2SO4로 반응을 중지시킨 다음, 450 nm에서 판독하였다. 1종의 항-IL-21R 항체, 즉 야생형 인간 IgG1 불변 영역을 가진 AbZ만이 C1q 결합을 결여하는 것으로 이미 확인된 삼중-돌연변이체 인간 IgG1 불변 영역을 가진 대조군 항체에 의해 나타난 배경 수준보다 더 높은 C1q 결합을 보였다. AbZ와 동일한 가변 도메인을 가진 모든 항체(인간 IgG4를 가진 형태(AbY), 및 인간 IgG1의 이중-돌연변이체 형태(AbX) 및 삼중-돌연변이체 형태(AbT)를 포함함)는 C1q 결합의 배경 수준만을 보였다(도 16). 시험된 다른 모든 항-IL-21R 항체는 인간 IgG1의 삼중-돌연변이체 형태를 함유하였고 배경 수준의 C1q 결합을 보였다.
실시예 9.14: 사이토카인 경쟁 분석
항체 AbT가 IL-21 사이토카인과 경쟁하는 방식으로 뮤린 IL-21R에 결합하는지를 확인하기 위해, 사이토카인 경쟁 분석을 수행하였다. ELISA 플레이트를 1 ㎍/㎖의 항체 AbT로 코팅하고, 상기 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 중의 1% BSA로 차단하였다. 바이오틴-부착된 뮤린 IL-21R-H/F(1.5 ng/㎖)를 단독으로 또는 증가하는 농도의 뮤린 IL-21의 존재 하에 웰에 첨가하고, 수용체와 고정된 항체의 결합을 HRP-접합된 스트렙타비딘의 첨가 및 TMB 검출 시약과의 후속 항온처리를 이용하여 검출하였다. 마우스 IL-21은 4 ng/㎖를 초과하는 농도에서 mIL-21R과 AbT의 결합을 거의 완전히 차단할 수 있었는데, 이것은 상기 항체와 사이토카인이 뮤린 IL-21R과의 결합에 대해 경쟁함을 암시한다(도 27a).
항체 AbS가 IL-21 사이토카인과 경쟁하는 방식으로 뮤린 IL-21R에 결합함을 입증하기 위해 제2 분석을 수행하였다. 뮤린 IL-21R-Fc를 항-마우스 IgG2a 항체로 코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획시켰다. 플레이트를 PBS 중의 1% BSA로 차단하고 세척하고, 다양한 농도의 AbS를 10 ㎍/㎖ mIL-21의 존재 하에 상기 플레이트에 첨가하였다. mIL-21과 수용체의 결합을 HRP-접합된 항-His6 항체로 검출하고, AbS와 수용체의 결합을 항-인간 Ig 항체로 검출하였다. 약 2 ㎍/㎖를 초과하는 AbS의 농도는 mIL-21과 mIL-21R-Fc의 결합을 완전히 방해하였는데, 이것은 상기 항체와 사이토카인이 뮤린 IL-21R과의 결합에 대해 경쟁함을 암시한다(도 27b).
실시예 9.15: 항-IL-21R 항체에 의한 래트 T 세포 증식의 억제
제조자의 설명서에 따라 래트 T 세포 풍부 컬럼(RTCC-25; 알앤디 시스템스)을 사용하여 루이스 암컷 래트 비장 T 세포를 95% CD3+ 순도로 정제하였다. 항-인간 IL-21R 항체 및 동형 대조군 단백질의 연속 희석물을, 1 ㎍의 항-래트 CD3 항체(비디 파민겐(BD Pharmingen) 카달로그 번호554829)로 미리 코팅된 평저 96-웰 조직 배양 플레이트 내에서 배양 배지(10% FCS, L-글루타민, β-머캡토에탄올, 비필수 아미노산, 나트륨 피루베이트, 페니실린, 스트렙토마이신 및 젠타마이신을 함유하는 DMEM)로 제조하고, 웰 당 5 ng/㎖ 래트 IL-21 및 20,000 CD3 T 세포를 첨가하였다. 세포를 10% CO2 및 37℃의 가습 항온처리기 내에서 3일 동안 생장시켰다. 배양 기간 중 마지막 5시간 동안, 세포를 0.5 μC의 3H-티미딘(지이 아머샴 카달로그 번호TRA-120)으로 표지하였다. 플레이트를 톰텍 마치 III 플레이트 수거기를 이용하여 유리 섬유 필터 매트 상으로 수거하고 퍼킨 엘머 1450 마이크로베타 카운터 상에서 카운팅하였다.
5 ng/㎖ 래트 IL-21에 대한 래트 T 세포의 반응은 1 ㎍의 항-CD3 단독에 대한 배경 반응보다 6배 더 높았다. 항체 AbS, AbU, AbV 및 AbW는 5 ng/㎖ 래트 IL-21에 의해 자극된 3H 티미딘 도입을 억제할 수 있었다(항체 처리의 부재 하에 57,000 cpm; 도 28). 2회의 독립적인 실험에서 중화에 대한 IC50 값은 표 11에 기재되어 있다.
[표 11]
Figure pct00023
실시예 9.16: AbS와 토끼 IL-21R의 결합
항체 AbS가 토끼 IL-21R에 결합함을 입증하기 위해, 토끼 IL-21R의 2종의 동형 세포외 도메인을 Fc 융합체로서 서브클로닝하고 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 토끼 IL-21R-Fc(동형 1 또는 동형 2)는 컨디셔닝된 배지로부터 항-마우스 IgG2a로 코팅된 ELISA 플레이트 상으로 포획되었다. 다양한 농도의 AbS를 첨가하고, 플레이트를 세척하고, 항체 결합을 HRP-접합된 항-인간 IgG 항체로 검출하였다. AbS는 토끼 IL-21R Fc의 동형 둘다와의 분명한 결합을 보였다(도 29a). AbS와 토끼 IL-21R-Fc의 결합이 토끼 IL-21을 함유하는 10% 컨디셔닝된 배지의 존재 하에 수행되는 경우, AbS와 수용체 동형들 중 어느 하나의 결합은 약 10배까지 감소하였는데, 이것은 AbS가 토끼 IL-21R과의 결합에 대해 토끼 IL-21과 경쟁함을 암시한다(도 29b).
실시예 10: 생체 내에서 개선된 IgG 의 특징규명
실시예 10.1: 항-IL-21R 항체 AbS 및 AbT를 사용한 IL-21R의 중화는 생체 내에서 T 세포-의존적 항원에 대한 IgG 항체 반응의 발생을 억제한다.
IL-21은 IgG의 일부 하위클래스로의 B 세포 동형 전환 및 혈장 세포로의 분화에 있어서 중요하다. 따라서, 항-IL-21R 항체 AbS 및 AbT의 생체내 효능을 측정하기 위해서, T 세포-의존적 항원인 NP-닭 감마 글로불린(NP-CGG)에 대한 IgM 및 IgG 항체 반응을 억제하는 상기 항체들의 능력을 C57BL/6 마우스에서 시험하였다. NP-CGG를 사용한 면역화 1일 전날부터 시작하여 마우스를 10 mg/kg 항-IL-21R 항체 또는 동형 대조군으로 주 당 3회 처리하였다. NP-특이적 IgG 및 IgM을 ELISA로 검출하였다. NP-특이적 IgM 및 IgG 항체는 면역화 후 7일 이내에 동형 대조군-처리된 동물의 혈청에서 용이하게 검출되었고, 이 반응은 14일째 날까지 유의하게 증가하였다(도 30b). AbS 또는 AbT를 사용한 처리는 본 연구에서 IgM 반응의 크기에 영향을 미치지 않았다. 7일째 날 동형 대조군에 비해 감소된 반응에 의해 입증되는 바와 같이, NP-특이적 IgG 항체 반응은 AbS- 또는 AbT-처리된 세포에서 지연되었다. NP-특이적 IgG 항체 반응은 14일째 날 동형 대조군-처리된 마우스, AbS-처리된 마우스 및 AbT-처리된 마우스에서 유사하였다(도 30a). 이 데이타는 AbS 또는 AbT를 사용한 생체내 IL-21R의 중화가 T 세포-의존적 항원에 대한 초기 IgG 항체 반응의 유도를 일시적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
AbS 및 AbT를 시험하는 제2 연구 또한 유사한 결과를 보여주었다(도 30c 내지 30f). NP-특이적 IgG 반응은 AbS 또는 AbT로 처리된 마우스에서 면역화로부터 7일째 날에 일시적으로 감소되었지만 더 늦은 시점에서 동형 대조군-처리된 마우스와 유사하였다. 동형-특이적 ELISA는 IgG2b 및 IgG2c가 7일째 날에 대조군에 비해 AbS 및 AbT에 의해 유의하게 감소됨을 보여주었다(도 30e 및 30f). 이 데이타는 AbS 또는 AbT를 사용한 생체내 IL-21R의 중화가 T 세포-의존적 항원에 대한 초기 IgG 항체 반응의 유도를 일시적으로 억제할 수 있음을 보여준다.
확립된 장기 체액성 면역의 유지에 대한 IL-21R 중화의 효과를 시험하기 위해, C57BL/6 마우스를 NP-CGG로 면역화시키고 1개월 이상의 기간 동안 휴식을 취하게 하여 상기 마우스가 기억 B 세포 및 장기-생존 혈장 세포(장기 IgG 혈청 항체 역가를 발생시킴)를 생성할 수 있게 하였다. 면역화로부터 약 1개월 후, 마우스를 식염수, 10 mg/kg의 AbS 또는 AbT, 또는 동형 대조군 항체로 2개월 동안 복강내로 주 당 3회 처리하였다. NP-특이적 IgG 혈청 항체 역가를 ELISA로 2주마다 모니터링하였다. C57BL/6 마우스는 비-처리된 C57BL/6 마우스에 비해 면역화로부터 1개월 후 높은 역가의 NP-특이적 IgG 혈청 항체를 가졌는데, 이것은 NP에 대한 장기 체액성 면역의 형성과 일치한다. NP-특이적 IgG 혈청 항체 역가는 동형 대조군 항체로 처리된 마우스 둘다에서 본 연구의 기간에 걸쳐 안정한 상태로 유지되었고, AbS 또는 AbT를 사용한 처리는 상기 항체 역가에 영향을 미치지 않았다(도 30g). 면역화 후, B 세포는 장기 혈청 항체 역가를 발생시키는 혈장 세포를 (골수에서) 생성한다. 본 연구의 말기에서, 마우스의 골수에 존재하는 NP-특이적 IgG 혈장 세포의 수를 측정하였는데, 상기 세포 수는 AbS 또는 AbT를 사용한 처리에 의해 영향을 받지 않았다(도 30h). 이 데이타는 본 치료 섭생법에서 AbS 및 AbT를 사용한 IL-21R의 중화가 확립된 장기 혈청 항체 역가의 유지에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
실시예 10.2: SLE의 모델에서 항-IL-21R 항체 기능
항-IL-21R 항체 AbS 및 AbT를 SLE의 MRL-Faslpr 뮤린 모델에서 질환의 완화 능력에 대해 시험하였다. MRL-Faslpr 마우스는 순환하는 항-이중-가닥 DNA(항-dsDNA) 자가 항체의 높은 역가, 사구체에 존재하는 면역글로불린 및 보체 C3 침착물, 및 신장 및 폐에서의 림프구 침윤물의 존재, 및 중증 질환, 단백뇨, 림프절병증 및 피부 병소를 포함하는, 인간 루푸스 환자에서 관찰되는 증상과 유사한 증상을 자연적으로 발생시킨다. 수컷 MRL-Faslpr 마우스는 잭슨 레이보레이토리(미국 메인주 바 하버 소재)로부터 입수되었고, 12주령부터 시작하여 복강내 주사를 통해 400 ㎍/마우스(10 mg/kg)의 투여량의 AbS, AbT, 식염수, 또는 동일한 삼중-돌연변이체 인간 IgG1 불변 영역을 가진 대조군 항-인간 IL-13 항체를 10주에 걸쳐 주 당 3회 투여받았다. 혈청 샘플을 2주마다 채취하여 ELISA로 항-dsDNA 항체에 대해 조사하였다. 소변을 2주마다 채취하여 (단백질 시험 스트립을 사용하여) 단백질에 대해 시험하였는데, 대조군 동물 및 처리된 동물 둘다 유의한 단백뇨를 발생시키지 않았다. 확장된 림프절 및 피부 병소에 대해서도 동물들을 모니터링하였는데, 대조군 동물 및 처리된 동물 둘다 비정상적인 현상을 보이지 않았다. 10주간의 처리 후, 동물들을 희생시키고, 신장 및 뇌 절편을 면역조직화학법으로 Ig 및 C3 침착물에 대해 조사하였다. 신장 및 폐 내로의 세포 침윤물은 H/E-염색된 조직 절편의 조사로 측정하였다.
IL-21R 차단 항체 AbS를 사용한 MRL-Faslpr 마우스의 처리는 식염수 또는 대조군 항-인간 IL-13 항체로 처리된 동물과 비교할 때 처리 후 2주부터 시작하여 처리 후 10주까지 항-dsDNA IgG 혈청 항체 수준을 유의하게 감소시켰다(도 31). 항-dsDNA 항체는 식염수 및 IL-13 대조군 항체-처리된 동물(모든 대조군 마우스는 검출가능한 항-dsDNA 항체 역가를 보였음)과 비교할 때 4주에서 10마리 마우스 중 8마리 마우스에서 AbS 처리에 의해 검출불가능한 수준까지 감소하였고(도 31d), 6주에서 10마리 마우스 중 5마리 마우스에서 AbS 처리에 의해 검출불가능한 수준까지 감소하였고(도 31e), 8주에서 10마리 마우스 중 7마리 마우스에서 AbS 처리에 의해 검출불가능한 수준까지 감소하였다(도 31f). IL-21R 차단 항체 AbT를 사용한 처리는 항-dsDNA IgG 혈청 항체 수준에 유의하게 영향을 미치지 않았다.
도 31a는 처리 후 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다(AbS-처리군은 식염수-처리군 및 항-IL-13-처리군과 유의하게 상이함(p<0.01)). 도 31b는 출혈 전 항-dsDNA 항체 역가를 보여준다(식염수-처리군은 AbS-처리군, AbT-처리군 및 항-IL-13-처리군과 유의하게 상이함(p<0.01)). AbS-처리군은 2주간의 투여 후(도 31c), 4주간의 투여 후(도 31d), 6주간의 투여 후(도 31e), 8주간의 투여 후(도 31f) 및 10주간의 투여 후(도 31g) 식염수-처리군 및 항-IL-13-처리군과 유의하게 상이하다(p <0.01).
AbS를 사용한 처리는 항-IL-13 항체-처리 대조군과 비교할 때 Ig 및 C3 면역 결합체 침착 및 신장 병리도 유의하게 감소시켰다(p<0.01)(도 32 및 33). 12주령 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체(뮤린 IL-21에 대한 반응성을 보이지 않는 항-인간 IL-13 인간 IgG1 A234 A235 A237 돌연변이체 항체가 동형 대조군으로서 사용됨)로 처리하였다(10 mg/kg 복강내, 주 당 3회). 10주간의 처리 후, 마우스를 희생시키고, 신장에 존재하는 Ig 및 C3 침착물을 면역조직화학법으로 확인하였다. 도 32는 표시된 바와 같이 처리된 MRL-Faslpr 마우스의 신장에 존재하는 IgG 침착물을 보여준다(도 32b에서, 사구체는 점선 원으로 표시되어 있고, IgG 침착물을 표시하는 확산 염색의 예는 백색 화살촉으로 표시되어 있음). 염색 강도를 1 내지 5의 등급으로 점수 매겼다(도 32a). AbS로 처리된 동물에서 신장 IgG 침착물은 IL-13 삼중-돌연변이체-처리 대조군의 동물보다 유의하게 더 적었다(p<0.01). 도 33은 표시된 바와 같이 처리된 MRL-Faslpr 마우스의 신장에서 IgM(도 33a) 및 보체 C3(도 33b) 침착물을 보여준다. 염색 강도를 1 내지 5의 등급으로 점수 매겼다. 신장에서의 IgM 및 보체 C3 침착은 항-IL-13 대조군 항체와 비교할 때 AbS에 의해 유의하게 감소되었다(p<0.05)(도 33). 도 34는 처리된 마우스의 뇌에서 IgG의 침착(도 34a), IgM의 침착(도 34b) 및 C3의 침착(도 34c)을 보여준다. IgG(p<0.05; 도 34a) 침착물은 항-IL-13 항체-처리 대조군과 비교할 때 AbS-처리된 마우스의 뇌에서 감소되었지만 IgM(도 34b) 또는 C3(도 34c) 침착물은 감소되지 않았다. 염색 강도를 1 내지 5의 등급으로 점수 매겼다. AbT를 사용한 처리는 MRL-Faslpr 마우스의 신장 또는 뇌에서 면역 결합체 침착을 감소시키지 않았다(도 32 내지 34).
MRL-Faslpr 마우스의 신장 및 폐 내로의 림프구의 침윤도 조직학적으로 조사되었다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 식염수(대조군) 또는 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다(10 mg/kg 복강내, 주 당 3회). 10주간의 처리 후, 마우스를 희생시키고, H/E-염색된 신장 및 폐 절편을 림프구 침윤에 대해 조사하였다. 림프구 수를 1 내지 5의 등급으로 점수 매겼다. 신장에서, AbS는 3개의 영역, 즉 피질-간질(사구체에 대한 지지 구조체)(도 35a), 피질-혈관주위 영역(도 35b) 및 신우주위 영역(요관의 기원에 인접함)(도 35c)에서 림프구 침윤을 유의하게 감소시켰지만 AbT는 그러하지 못하였다(p<0.01). AbS 및 AbT 처리 둘다 식염수-처리된 대조군 및 항-IL-13 항체-처리된 대조군 둘다와 비교할 때 MRL-Faslpr 마우스의 폐에서 측정된 림프구의 수를 유의하게 감소시켰다(각각 p<0.01 및 p<0.05; 도 36).
또한, 이 데이타는 AbS를 사용한 처리가 MRL-Faslpr 마우스에서 루푸스-유사 질환을 완화시키는 반면, AbT를 사용한 처리는 이 SLE 모델에서 덜 효과적일 것임을 보여준다. MRL-Faslpr 마우스의 AbS 처리의 효능과 AbT 처리의 효능의 차이를 조사하기 위해, 상기 마우스로부터 수득된 혈청을 ELISA로 항-생성물 항체 반응에 대해 조사하였다. 12주령의 수컷 MRL-Faslpr 마우스를 표시된 삼중-돌연변이체 항체로 처리하였다(10 mg/kg 복강내, 주 당 3회). 2주마다 채취한 혈청을, 상기 마우스에 처리된 항체와 동일한 인간 항체에 결합할 수 있는 뮤린 항체의 존재에 대해 ELISA로 시험하였다. MRL-Faslpr 마우스는 처리 후 2주만큼 빠른 시간 이내에 시험된 모든 3종의 항체에 대한 항-인간 항체(MAHA)를 발생시켰다(도 37a). 그러나, AbT 또는 대조군 항체에 대한 항-생성물 IgG 항체 반응은 AbS에 대한 항-생성물 IgG 항체 반응보다 10배 이상 더 높았다(AbS 대 IL-13 대조군에 대해 p<0.05). AbS 및 AbT 둘다의 경우 항-생성물 항체의 대다수가 상기 두 분자에 공통적으로 존재하는 에피토프를 인식하였기 때문에 AbS의 CDR 서열이 AbT의 CDR 서열보다 더 강한 면역원성을 나타낼 것 같지는 않다(도 37b).
MRL-Faslpr 마우스 모델에서 질환 발달에 대한 IL-21R 중화의 투여량-의존성을 조사하기 위해, 8주령의 암컷 마우스에게 AbS(10, 5 또는 2.5 mg/kg 투여량)를 10주 동안 주 당 3회 복강내 투여하였다. 마우스를 항-dsDNA 혈청 항체에 대해 시험하고, 단백뇨, 림프절병증 및 피부 병소에 대해 2주마다 조사하였다. 10주간의 투여 후, 동물을 희생시키고, 신장 절편을 면역조직화학법으로 면역글로불린 침착물에 대해 조사하고, 면역 세포 침윤물을 H/E-염색된 신장 절편의 조사로 측정하였다.
MRL-Faslpr 마우스는 본 연구의 개시 시점에서 검출가능한 수준의 항-dsDNA IgG 항체를 보였고, 이 항체의 역가는 모든 처리군에서 본 연구의 기간에 걸쳐 증가되었다. 그러나, 시험된 모든 투여량(10, 5 및 2.5 mg/kg)에서 AbS를 사용한 처리는 동형 대조군-처리된 마우스 혈청과 비교할 때 투여량-의존적 방식으로 MRL-Faslpr 마우스에서 항체 역가를 유의하게 감소시켰다(도 38a). AbT(20 mg/kg) 또한 상기 마우스에서 한 시점에서만(투여 2주) 항-dsDNA 항체 역가를 감소시켰다(도 38b).
MRL-Faslpr 마우스에서 질환 진행에 대한 IL-21R 중화의 효과를 더 평가하기 위해, 상기 마우스를 질환의 임상적 징후에 대해 조사하였다. 본 연구에서 사용된 MRL-Faslpr 마우스 중 극소수의 마우스는 피부 병소 또는 임상적으로 유의한 단백뇨를 발생시켰기 때문에, 질환의 이러한 양태에 대한 AbS 및 AbT 처리의 효과는 평가될 수 없었다. 시험된 모든 투여량에서 AbS 및 AbT를 사용한 처리는 본 연구에서 림프절병증의 발달에 영향을 미치지 않았다. 그러나, IgG 침착물 및 면역 세포 침윤물은 동형 대조군-처리된 마우스로부터 수득된 신장에서 용이하게 관찰되었는데, 이것은 상기 마우스에서 루푸스 신장염의 발생과 일치한다. 10 mg/kg AbS를 사용한 처리는 상기 신장에서 면역 세포 침윤물 및 IgG 침착물의 평균 수를 유의하게 감소시킨 반면, 5 mg/kg AbS 및 2.5 mg/kg AbS를 사용한 처리는 본 연구에서 이 파라미터들에 영향을 미치지 않았다(도 38c 및 38d). 20 mg/kg AbT를 사용한 처리는 면역 세포 침윤물의 평균 수를 증가시켰고 본 연구에서 MRL-Faslpr 마우스의 신장에서 IgG 침착물에 영향을 미치지 않았다(도 38c 및 38d).
실시예 10.3: IL -21R 항체는 뮤린 공기 주머니 분석에서 세포 침윤을 차단한다.
생체 내에서 IL-21R 기능을 중화시키는 AbS 및 AbT의 능력을 단기 뮤린 공기 주머니 분석에서 시험하였다. 3 ml의 공기를 8 내지 10주령의 BALB/C 마우스의 등 피부 아래에 주사하여 공기 주머니를 생성하였다. 3일 후, 공기 주머니를 재평윤시켰다. 재팽윤으로부터 2일 후, 식염수(대조군) 또는 표시된 항체들을 표시된 투여량으로 복강 내로 주사하였다. 뮤린 IL-21(100 ng)을 항체 주사로부터 24시간 후 상기 공기 주머니 내로 주사하였다. 6시간 후, 공기 주머니를 3 ml의 PBS로 세척하고, 셀-다인(CELL-DYN)(등록상표)(애보트, 미국 일리노이주 애보트 파크 소재)을 이용하여 총 세포 수(도 38a), 단핵구(도 39b), 림프구(도 39c) 및 호중구(도 39d)를 측정하였다.
공기 주머니 내로의 뮤린 IL-21의 주사는 식염수와 비교할 때 6시간 후 상기 공기 주머니에서 총 세포(p=0.0002), 단핵구(p=0.0137), 림프구(p=0.0035) 및 호중구(=0.0004)를 유의하게 증가시켰다(도 39a). AbS 또는 AbT를 사용한 처리는 대조군 IgG1(항-IL-13)을 사용한 처리와 비교할 때 상기 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 감소시켰다. 총 세포 침윤은 AbS(10 mg/kg, p=0.0031; 1 mg/kg, p=0.00426) 및 AbT(10 mg/kg, p=0.0198) 둘다에 의해 대조군 IgG에 비해 유의하게 감소되었다(도 39a). 단핵구 침윤은 유의하게 감소되었다: AbS(5 mg/kg, p=0.0031; 2 mg/kg, p=0.0239; 1 mg/kg, p=0.0008) 및 AbT (10 mg/kg, p=0.0002; 5 mg/kg, p=0.0066; 1 mg/kg, p=0.0009)(도 39b). 림프구 침윤 또한 유의하게 감소되었다: AbS(1 mg/kg, p=0.0049) 및 AbT(10 mg/kg, p=0.0222)(도 39c). 호중구 침윤은 AbS(10 mg/kg, p=0.0032)에 의해 유의하게 감소되었지만 AbT에 의해서는 유의하게 감소되지 않았다.
유사한 결과가 뮤린 공기 주머니 모델에서 AbS 및 AbT의 능력을 조사하기 위해 수행된 제2 연구에서 수득되었다. 상기 공기 주머니 내로의 총 세포 침윤은 10 mg/kg(p=0.0113), 5 mg/kg(p=0.0027) 및 2 mg/kg(p=0.029)의 양으로 투여된 AbS에 의해 유의하게 감소되었고 10 mg/kg(p=0.0007)의 양으로 투여된 AbT에 의해서도 유의하게 감소되었다(도 39e).
래트 공기 주머니 모델에서 IL-21에 반응하여 발생된 세포 침윤에 대한 AbS의 효과도 상기 항체가 래트에서 IL-21R을 중화시킬 수 있는지를 확인하기 위해 조사되었다. 20 ml의 공기를 8주령의 암컷 S-D 래트의 등의 피하 조직 내로 주사하여 주머니를 생성하였다. 3일 후, 10 ml의 공기를 상기 주머니 내로 추가로 주사하여 주머니를 재팽윤시켰다. 2일 후, 상기 래트에게 표시된 양의 동형 대조군 또는 AbS 항체를 주사하였다. 그 다음 날, 식염수 또는 1 내지 20 ㎍의 뮤린 IL-21을 상기 주머니 내로 주사하고, 6시간 후, 상기 주머니 내용물을 세척하고, 셀-다인 기계를 이용하여 총 세포 수를 카운팅하였다.
공기 주머니 내로의 1 ㎍ 뮤린 IL-21의 주사는 상기 주머니 내로의 유의한 세포 침윤을 초래하지 않았다. 그러나, 20 ㎍의 뮤린 IL-21의 투여는 식염수와 비교할 때 6시간 후 상기 공기 주머니의 총 세포를 증가시켰고, 10 mg/kg AbS를 사용한 처리는 이 조건 하에 상기 주머니 내로의 IL-21-매개된 세포 침윤을 유의하게 감소시켰다(p<0.05)(도 39f). 이 래트 모델에서 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 억제할 수 있는 AbS의 최소 투여량을 측정하기 위해, 20 ㎍의 뮤린 IL-21 및 10 mg/kg 동형 대조군 또는 10, 3 또는 1 mg/kg AbS를 래트에게 투여한 추가 연구를 수행하였다. 10 mg/kg AbS의 투여는 래트의 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 감소시켰다(p<0.05). 공기 주머니 내로의 세포 침윤의 유의하지 않은 증가는 3 mg/kg의 AbS로 처리된 래트에서 관찰되었다. 1 mg/kg AbS를 사용한 처리는 동형 대조군으로 처리된 래트와 비교할 때 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 증가시켰다(p<0.05)(도 39g). 이 결과는 10 mg/kg을 사용한 처리가 20 ㎍ 뮤린 IL-21에 의해 유도된 래트 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 감소시킨(p<0.05) 제2 연구에서도 관찰되었는데, 이 연구에서 3 mg/kg AbS를 사용한 처리 및 1 mg/kg AbS를 사용한 처리는 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 증가시켰다(p<0.05)(도 39h).
AbS를 사용한 처리는 AbS가 낮은 투여량(예를 들어, 1 mg/kg)으로 투여된 경우 IL-21에 반응하여 발생되는 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 증가시켰다. 낮은 농도(1 mg/kg)의 항체만을 공기 주머니 내로 투여하는 것이 상기 공기 주머니 내로의 세포 이동을 유발하는지를 확인하기 위해, 래트를 IL-21 처리의 부재 하에 1 mg/kg AbS 또는 동형 대조군 항체로 처리한 추가 연구를 수행하였다. 선행 연구에서 관찰된 바와 같이, 10 mg/kg의 AbS의 투여는 공기 주머니 내로의 IL-21-유도된 세포 침윤을 유의하게 감소시킨 반면(p=0.0075), 1 mg/kg의 AbS의 투여는 공기 주머니 내로의 IL-21-유도된 세포 침윤을 유의하게 증가시켰다(p=0.0257). IL-21 처리의 부재 하에 1 mg/kg의 AbS 또는 동형 대조군 항체를 사용한 처리는 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 증가시키지 않았는데, 이것은 1 mg/kg의 AbS를 사용한 처리에 의해 유발된 공기 주머니 내로의 증가된 세포 침윤이 이 모델에서 뮤린 IL-21 및 항-IL-21R 항체의 투여에 의존함을 암시한다(도 39i).
래트 공기 주머니 모델에서 세포의 증가가 상기 투여량(20 ㎍)의 뮤린 IL-21의 투여에 의존하는지를 확인하기 위해, 래트를 10, 20 또는 40 ㎍ 뮤린 IL-21 및 1 또는 10 mg/kg AbS로 처리한 실험을 수행하였다. 10 ㎍(p=0.003) 및 20 ㎍(p=0.003) 뮤린 IL-21에 반응하여 발생된 공기 주머니 내로의 세포 침윤의 유의한 억제가 10 mg/kg AbS의 투여에서 관찰되었다. 본 연구에서 10 mg/kg AbS를 사용한 처리는 40 ㎍ 뮤린 IL-21에 반응하여 발생된 세포 침윤에는 영향을 미치지 않았다. 이미 관찰된 바와 같이, 1 mg/kg AbS를 사용한 처리는 20 ㎍ 뮤린 IL-21에 반응하여 발생된 공기 주머니 내로의 세포 침윤을 유의하게 증가시켰다. 그러나, 1 mg/kg AbS를 사용한 처리는 10 또는 40 ㎍ 뮤린 IL-21에 반응하여 발생된 래트 공기 주머니 내로의 세포 침윤에 영향을 미치지 않았는데, 이것은 래트 공기 주머니 내로의 증가된 세포 침윤이 이 모델에서 1 mg/kg AbS 및 20 ㎍ 뮤린 IL-21의 투여량에 매우 의존함을 암시한다(도 39j). 이 데이타는 AbS가 뮤린 IL-21에 반응하여 발생되는 래트 공기 주머니 내로의 세포 침윤에 영향을 미칠 수 있고 이 반응의 억제가 10 mg/kg 투여량의 AbS에서 달성됨을 보여준다.
실시예 10.4: AbS 의 정맥내 또는 피하 투여 후 CD -1 마우스에서의 PK
표 13에 기재된 바와 같이, 인간 항-IL-21R 항체의 혈청 농도를 최적화된 ELISA로 측정하였다. 항-IL-21R ELISA는 단량체 His-부착된 IL-21R을 포획 시약으로서 사용하였고 항-인간-Fc(HRP에 접합됨)를 검출 시약으로서 사용하였다. 효소 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 사용하여 착색된 최종 생성물을 생성함으로써 결합된 시험 대상을 가시화하였다. 405 또는 450 nm의 파장에서 광학 밀도(OD)를 비색계로 측정하였다. 4-파라미터 방정식을 사용하여 피팅한 표준 곡선으로부터의 내삽법을 이용하여 샘플 농도를 측정하였다.
평균 농도에 의거하여 PK 파라미터를 계산하였다. LOQ 미만의 개개의 농도 값은 평균 및 표준 편차의 계산을 위해 0으로 처리되었다. PK 파라미터는 PK 소프트웨어 팩키지 윈놀린(WinNonlin)(버젼 4.1; 파사이트(Pharsight); 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)의 비-구획화 분석 모듈(복강내 투여 및 피하 투여의 경우 모듈 200; 정맥내 투여의 경우 모듈 201)을 이용하여 측정하였다. 상기 프로그램은 모델-독립적 방법 및 문헌(Gibaldi and Perrier, Pharmacokinetics (2nd ed. 1982) Marcel-Dekker, Inc., New York)에 기재된 표준 방법에 적용된다. 혈청 농도 대 시간 곡선 하의 면적(AUC)을 선형 사다리꼴 방법을 이용하여 계산하였다. 겉보기 말기의 기울기는 3개 이상의 데이타 점을 사용하여 로그-선형 회귀로 평가하였고, 말기 속도 상수(λ)는 상기 기울기로부터 유도하였다. AUC0 -∞는 AUC0 -t(이때, t는 마지막으로 농도를 측정할 수 있는 시간임)와 Ct/λ의 합계로서 평가되었다. 겉보기 제거 반감기(t1/2)는 0.693/λ로서 계산되었다. 다회 투여 섭생법 후 농도의 예측은 윈놀린 소프트웨어를 사용한 비-파라미터 중첩을 이용하여 수행하였다.
10 mg/kg의 AbS를 수컷 CD-1 마우스에게 정맥내 투여한 후, AbS의 노출(AUC0-t)은 7272 ㎍*hr/ml이었다. 정맥내 투여 후 제1 샘플링 시점에서의 평균 농도(C5분)는 113 ㎍/ml이었다. CD-1 마우스에서 AbS의 제거는 약 1.4 mg/hr/kg의 낮은 전신 제거율(CL) 및 162시간(약 6.8일)의 긴 제거 반감기(t1/2)에 의해 입증되는 바와 같이 비교적 느렸다. 정지-상태 분포 용적(Vdss)은 306 mg/kg이었는데, 이것은 AbS가 혈관계에 주로 국한되어 있음을 암시한다(도 40; 표 14).
CD-1 마우스에서 AbS의 PK는 10 내지 100 mg/kg 투여량 범위 내에서 선형으로 나타났다. 100 mg/kg의 AbS를 수컷 CD-1 마우스에게 정맥 내로 투여한 후, AUC0-∞는 75792 ㎍*hr/ml이었고, C5분은 1160 ㎍/ml이었고, CL은 약 1.3 ml/hr/kg이었고, Vdss는 473 mg/kg이었고, 제거 반감기는 약 391시간(약 16.2일)이었다(도 40; 표 14).
10 mg/kg의 AbS를 CD-1 마우스에게 피하 투여한 후, AbS의 흡수는 느렸고(48시간의 T최대), 피하 생체이용률은 81%이었다. 피하 투여 후 평균 t1/2 값은 약 195시간(약 8.1일)이었고 10 mg/kg 정맥내 투여 후 관찰된 값과 유사하였다.
10 mg/kg의 AbS를 CD-1 마우스에게 정맥내 또는 피하 투여한 후 576시간(24일) 및 672시간(28일)에서 최적화된 면역분석을 이용하여 항-AbS 항체의 존재를 평가하였다(군 당 시점 당 n=8). 전기화학발광 상자성 비드 분석을 이용하여 항-AbS 항체를 검출하였다. 본 분석에서, 샘플을 바이오틴-부착된 AbS와 함께 밤새 항온처리하였다. 스트렙타비딘으로 코팅된 상자성 비드를 상기 혼합물과 함께 항온처리하였다. 비드와의 항온처리 후, 플레이트를 바이오베리스 엠-시리즈(BioVeris M-Series) 384 분석기 내에 배치하였다. 자기를 인가하여 상자성 비드를 표면 전극 상으로 포획하고, 결합되지 않은 반응물을 세척하여 제거하였다. 전압을 인가하여, 상기 비드 상에 포획된 루테늄-부착된 AbS를 전기적으로 여기시킴으로써 광을 발생시켰다. 상기 광을 반응 유니트(RU)로 판독하면서 광 검출기로 측정하였다.
또한, 양성 대조군 및 음성 대조군을 사용하여 음성 대조군의 평균 RU의 2배로서 정의되는 컷포인트(cutpoint) RU를 측정하였다. 먼저, 1:25의 희석비 및 1:75의 희석비에서 검색 포맷으로 샘플을 시험하였다. 컷포인트 RU 이상의 RU를 발생시키는 샘플은 양성으로 간주되었고 전부-희석 시리즈에서 재분석하여 양성 결과를 확인하고 역가(컷포인트 RU와 동일한 RU를 발생시키는 희석비의 역수)를 측정하였다. 양성 샘플의 경우, 역가의 로그를 기재하였다. 필요한 최소 희석비는 1:25이었고, 검출 한계는 1.40(25의 로그)이었다. 따라서, 음성 샘플은 <1.40으로서 표시되었다.
정맥내 처리군 및 피하 처리군 둘다에서, 군 당 시점 당 (8마리 중) 5 또는 6마리의 마우스가 항-AbS 항체에 대해 양성인 것으로 시험되었다(표 15). 검출가능한 항-AbS 항체를 가진 대다수의 마우스는 항-AbS 항체를 갖지 않은 동물에서 관찰되는 AbS 농도보다 더 낮은 AbS 농도를 가졌는데, 상기 마우스 중 일부 마우스의 샘플에서 고농도의 AbS는 항-AbS 항체의 검출을 방해할 수 있음을 인지해야 한다. 다양한 시점, 및 동물 종 및 품종/모델에서 항-AbS 항체 반응의 발생 시점이 표 23에 요약되어 있다.
항-AbS 항체의 존재는 100 mg/kg의 AbS를 CD-1 마우스(시점 당 n=3)에게 정맥내 투여한 후 648시간(27일), 984시간(41일) 및 1320시간(55일)에서도 시험되었다. 시험된 마우스들 중 어떠한 마우스도 이 시점들에서 항-AbS 항체에 대해 양성으로 확인되지 않았다.
실시예 10.5: AbS의 복강내 투여 후 DBA 마우스 및 MRL-Fas lpr 마우스에서의 PK
표 13에 기재된 바와 같은 최적화된 ELISA를 이용하여 인간 항-IL-21R 항체의 혈청 농도를 측정하였다. 항-IL-21R ELISA는 항-인간-Fc를 포획 시약으로서 사용하였고, 바이오틴-부착된 항-인간-Fc를 검출 시약으로서 사용하였다. 아비딘-HRP 및 효소 기질 TMB 또는 2,2'-아지노 다이(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설포네이트)(ABTS)를 사용하여 착색된 최종 생성물을 생성하였다. 405 또는 450 nm의 파장에서 OD를 비색계로 측정하였다. 4-파라미터 방정식을 이용하여 피팅한 표준 곡선으로부터의 내삽법을 이용하여 혈청 농도를 측정하였다. PK 파라미터는 실시예 10.4에 기재된 바와 같이 계산되었다. 다회 투여 섭생법 후 농도의 예측은 MRL-Faslpr 마우스 및 DBA 마우스에서 2.5 내지 10 mg/kg의 투여량(단회 투여) 범위 내에서 선형 속도를 가정하면서 윈놀린 소프트웨어를 사용한 비-파라미터 중첩을 이용하여 수행하였다.
8 mg/kg의 AbS를 수컷 DBA 마우스에게 복강 내로 단회 투여한 후, AbS의 최대 혈청 농도(C최대) 및 노출(AUC0-∞)은 각각 62 ㎍/ml 및 7229 ㎍*hr/ml이었다. AbS의 T최대 및 제거 반감기(t1/2)는 각각 6시간 및 140시간(약 5.8일)이었다(도 41). 시험된 8마리의 동물들 중 3마리의 동물이 실시예 10.4에 기재된 상자성 비드 분석을 이용하여 측정할 때 672시간에서 항-AbS 항체 반응을 발생시켰다(표 12). 다양한 시간 및 종/품종에서 항-AbS 항체의 발생 시점은 표 23에 요약되어 있다.
[표 12]
Figure pct00024
10 mg/kg을 12-주령의 암컷 MRL-Faslpr 마우스에게 복강 내로 단회 투여한 후, AbS의 최대 혈청 농도(C최대) 및 노출(AUC0-∞)은 각각 51 ㎍/ml 및 2798 ㎍*hr/ml이었다. AbS의 T최대 및 제거 반감기(t1/2)는 각각 3시간 및 46시간(약 1.9일)이었다(도 41).
DBA 마우스 및 CD-1 마우스와 비교할 때, AbS의 투여량-표준화된 노출은 MRL-Faslpr 마우스에서 더 낮은 듯하였다(표 14). 이것은 MRL-Faslpr 마우스(특히, 질환 증상을 가진 MRL-Faslpr 마우스) 및 SLE 환자에서 정상 IgG의 빠른 제거가 이미 보고되어 있었기 때문에[문헌(Zhou et al. (2005) Lupus 4(6):458-66); 문헌(Newkirk et al. (1996) Clin. Exp. Immunol. 106(2):259-64); 및 문헌(Wochner (1970) J. Clin. Invest. 49(3):454-64)] 전혀 예측되지 않는 것은 아니었다. MRL-Faslpr 마우스에서 마우스 IgG의 과다이화(hypercatabolism)는 IgG의 항상성을 조절하는 수용체 FcRn의 기능의 질환-유도된 손상으로 인한 것으로 제안되었다(상기 문헌(Zhou et al. (2005)). AbS가 인간 IgG이기 때문에, 다양한 품종의 마우스들 사이에서 말기에서의 AbS의 제거 차이 또한 설명될 수 있고, 상기 제거 차이는 적어도 부분적으로 차등적 MAHA 반응에 의한 것일 수 있다.
AbS가 2.5, 5 또는 10 mg/kg의 투여량으로 10주 동안 주 당 3회 MRL-Faslpr 마우스에게 투여된 경우(실시예 10.2), 모든 투여군이 동형 대조군(항-인간 IL-13 인간 IgG1 삼중-돌연변이체)과 비교할 때 항-dsDNA 항체의 역가에서 상당한 감소를 보였다. 2.5 mg/kg이 투여된 군 및 10 mg/kg이 투여된 군의 경우, AbS의 정지-상태 최저 농도를 ELISA로 분석하였다. 2주 및 4주 시점에서, 2.5 mg/kg 투여군으로부터 시험된 거의 모든 샘플들이 검출불가능한 AbS 혈청 농도(<34 ng/ml)를 보였고, 하나의 샘플이 매우 낮은 수준(57 ng/ml)의 AbS를 보였다. 10 mg/kg 투여군의 경우, AbS 혈청 농도에서의 높은 동물간 변동성이 있었지만, 평균 정지-상태 최저 농도는 MRL-Faslpr 마우스에서 단회 투여 연구로부터 수득된 PK 데이타를 사용한 시뮬레이션에 의해 예측된 평균 정지-상태 최저 농도와 비교할 때 약 3 내지 10배 더 높았다(도 42). DBA 마우스 품종에서 수득된 단회 복강내 투여 데이타가 예측에 사용되는 경우, 10 mg/kg 투여군에서 관측된 AbS 농도와 예측된 AbS 농도 사이에 개선된 상관관계가 있는 듯하다(도 42). 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 저-투여량 군에서 AbS의 검출불가능한 수준에 대한 가능한 설명은 비교적 낮은 투여량 수준에서 AbS의 다회 투여에 의해 유발된 현저한 MAHA 생성인데, 이는 2.5 mg/kg 투여군으로부터 수득된 2-주 혈청 샘플을 항-AbS 항체에 대해 분석하였을 때 모든 샘플이 정량 상한인 4.74 로그 역가 유니트를 초과하는 매우 높은 역가를 보였기 때문이다. 그러나, IgG 반응을 지연시키고/시키거나 감소시키는 AbS의 예측된 약리학적 작용 대신에, 다회 투여 섭생법에서 보다 높은 투여량의 AbS가 그 자체에 대한 MAHA 반응을 감소시켜 단회 투여 PK 데이타에만 의거하여 예측된 AbS 혈청 농도보다 더 높은 관측된 AbS 혈청 농도를 야기할 수 있다. 사실상, MRL-Faslpr 마우스에서, AbS에 대한 MAHA 반응은 다회 투여 섭생법을 통해 10 mg/kg의 양으로 10주 동안 주 당 3회 투여된 동형 대조군 인간 IgG에 비해 약 10배 더 낮았다(도 37a).
실시예 10.6: 암컷 시아노몰구스 원숭이에서 AbS의 PK
10 mg/kg의 단회 정맥내 또는 피하 투여 후 암컷 원숭이에서 AbS의 PK를 측정하였다. 개개의 동물, 및 본 연구로부터 수득된 평균 농도-시간 프로파일은 각각 도 43a 및 43b에 도시되어 있고, 평균 PK 파라미터는 표 14에 요약되어 있다.
표 12에 기재된 바와 같은 최적화된 ELISA를 이용하여 인간 항-IL-21R 항체의 혈청 농도를 측정하였다. 항-IL-21R ELISA는 실시예 10.4에서 CD-1 마우스에 대해 기재된 바와 같이 단량체 His-부착된 IL-21R을 포획 시약으로서 사용하였고 HRP에 접합된 항-인간-Fc를 검출 시약으로서 사용하였다. 원숭이에서 동형 대조군 항체(항-IL-13 항체)의 혈청 농도 또한 ELISA로 측정하였다. 이 분석에서, FLAG 옥타펩티드 융합 태그를 함유하는 재조합 인간 IL-13 리간드가 항-FLAG 단일클론 항체에 의해 포획되었다. 항-IL-13 항체를 함유하는 혈청 샘플을 항-인간-Fc-HRP로 검출하였다. 효소 기질 ABTS를 사용하여 착색된 최종 생성물을 생성함으로써 결합된 시험 대상을 가시화하였다. PK 파라미터를 비-구획화 방법을 이용하여 개개의 동물 각각에 대해 계산하였다.
10 mg/kg의 AbS가 투여된 6마리 암컷 원숭이 모두(정맥내 투여 경로에 대해 n=3, 피하 투여 경로에 대해 n=3)가 말기(투여 후 약 408시간)에서 AbS 농도의 급격한 강하를 보였는데, 이것은 항-생성물 항체의 가능한 형성을 암시한다. 10 mg/kg 군에서 제거 반감기 값은 급격한 농도 강하가 관찰된 시점을 사용하여 계산하였고 상기 관찰된 시점을 사용하지 않고도 계산하였다.
10 mg/kg의 AbS를 암컷 시아노몰구스 원숭이에게 정맥 내로 단회 투여한 후, 평균 혈청 제거율(CL)은 1.03 ml/hr/k이었고, 평균 제거 반감기(t1/2)는 74시간(약 3일)이었다. 급격한 농도 강하가 관찰된 시점이 계산으로부터 배제된 경우, 평균 t1/2 추정치는 약 7.9일이었다. 평균 정지-상태 분포 용적(Vdss)은 낮았는데(약 125 ml/kg), 이것은 AbS가 혈관계에 주로 국한되어 있음을 암시한다. AbS의 평균 노출(AUC0-∞)은 9728 ㎍*hr/ml이었다.
100 mg/kg의 AbS를 시아노몰구스 원숭이에게 정맥 내로 단회 투여한 후, CL은 약 1.08 ml/hr/kg이었고, t1/2는 279시간(약 11.6일)이었고, AUC0-∞는 약 92867 ㎍*hr/ml이었고, Vdss는 약 211 ml/kg이었다. 따라서, 일반적으로 AbS의 PK는 10 내지 100 mg/kg 투여량 범위에서 거의 선형이었다.
10 mg/kg의 AbS를 암컷 원숭이에게 피하 투여한 후, AbS의 흡수는 느렸고(약 34시간의 평균 T최대), 평균 피하 생체이용률은 약 43%이었다. 10 mg/kg을 원숭이에게 피하 투여한 후 평균 t1/2 값은 52시간(약 2.2일)이었고 10 mg/kg을 정맥 내로 투여한 후 관측된 값과 유사하였다. 급격한 농도 강하가 관찰된 시점이 계산으로부터 배제된 경우, 평균 t1/2는 258시간(약 10.8일)이었다.
실시예 10.4에 기재된 상자성 비드 분석을 이용하여 측정하였을 때, 10 mg/kg의 AbS가 투여된 6마리 암컷 원숭이 모두가 투여 후 504시간(3주)이 경과된 시점부터 시작하여 검출가능한 항-AbS 항체를 보였다(표 16). 이 데이타는 AbS 혈청 농도에서 관측된 급격한 강하와 일치한다. 항-AbS 반응은 모든 후속 시점(27주까지)에서 지속되었다. 따라서, 항-AbS 항체 반응은 10 mg/kg 단회 정맥내 또는 피하 투여 후 원숭이에서 AbS의 PK에 영향을 미치는 듯하다. 100 mg/kg 정맥내 투여군의 경우, 3마리의 원숭이들 중 1마리의 원숭이는 각각 1.8 및 4.6의 로그 역가로 6주 및 8주에서 항-AbS 항체에 대해 양성을 보였다.
[표 13]
Figure pct00025
[표 14]
Figure pct00026
[표 15]
Figure pct00027
[표 16]
Figure pct00028
실시예 10.7: 마우스에서 AbT의 PK
표 17에 기재된 바와 같은 최적화된 ELISA를 이용하여 인간 항-IL-21R 항체의 혈청 농도를 측정하였다. 항-IL-21R ELISA는 CD-1 마우스의 경우 단량체 His-부착된 IL-21R을 포획 시약으로서 사용하였고 (HRP에 접합된) 항-인간-Fc를 검출 시약으로서 사용하고, DBA 마우스 및 MRL-Faslpr 마우스의 경우 항-인간 Fc를 포획 시약으로서 사용하였고 바이오틴-부착된 항-인간 Fc를 검출 시약으로서 사용하였다. PK 파라미터는 실시예 10.4에 기재된 바와 같이 계산하였다. 다회 투여 섭생법 후 농도의 예측은 MRL-Faslpr 마우스 및 DBA 마우스에서 AbS의 경우 2.5 내지 10 mg/kg의 투여량(단회 투여) 범위 내에서 그리고 AbT의 경우 8 내지 20 mg/kg 투여량(단회 투여) 범위 내에서 선형 속도를 가정하면서 윈놀린 소프트웨어를 사용한 비-파라미터 중첩을 이용하여 수행하였다.
10 mg/kg의 AbT가 수컷 CD-1 마우스에게 정맥 내로 투여된 후, AbT의 노출(AUC0-∞)은 4551 ㎍*hr/ml(도 44a; 표 18)이었다. 정맥내 투여 후 제1 샘플링 시점에서의 평균 농도(C5 분)는 약 70 ㎍/ml이었다. 약 2.2 ml/hr/kg의 낮은 전신 제거율(CL) 및 210시간(약 8.8일)의 긴 제거 반감기(t1 /2)에 의해 입증되는 바와 같이 CD-1 마우스에서 AbT의 제거는 비교적 느렸다. 정지-상태 분포 용적(Vdss)은 572 ml/kg이었다. 10 mg/kg을 마우스에게 정맥 내로 투여한 후, AbT는 AbS에 대한 상응하는 값과 비교할 때 보다 높은 CL(약 60% 증가), 보다 낮은 AUC0-∞(약 37% 감소) 및 보다 큰 Vdss(약 87%)를 나타내는 듯하였다.
8 mg/kg의 AbT가 수컷 DBA 마우스에게 복강 내로 단회 투여된 후, AbT의 최대 혈청 농도(C최대) 및 노출(AUC0 -∞)은 각각 21 ㎍/ml 및 3320 ㎍*hr/ml이었다(도 44c; 표 18). AbT의 T최대 및 제거 반감기(t1 /2)는 각각 1시간 및 80시간(약 3.3일)이었다. AbT가 DBA 마우스에게 복강 내로 투여된 후, AbT 노출 및 반감기는 AbS의 상응하는 PK 파라미터와 비교할 때 각각 약 54% 및 약 43% 감소되었다.
10 mg/kg의 AbT가 12주령의 암컷 MRL-Faslpr 마우스에게 복강 내로 단회 투여된 후, AbT의 최대 혈청 농도(C최대) 및 노출(AUC0 -∞)은 각각 23 ㎍/ml 및 957 ㎍*hr/ml이었다(도 44b; 표 18). AbT의 T최대 및 제거 반감기(t1/2)는 각각 6시간 및 21시간이었다. AbT가 MRL-Faslpr 마우스에게 복강 내로 투여된 후, AbT 노출 및 반감기는 AbS의 상응하는 PK 파라미터와 비교할 때 각각 약 66% 및 약 54% 감소되었다. AbT에 대해 항-dsDNA 역가의 감소가 관측되는 유일한 시점인 2주 시점에서, 평균 AbT 농도는 MRL-Faslpr 마우스에서 단회 투여 연구로부터 수득된 PK 데이타를 사용한 시뮬레이션에 의해 예측된 농도와 비교할 때 4 내지 5배 더 높았고 DBA 마우스로부터 수득된 단회 투여 데이타를 사용한 시뮬레이션에 의해 예측된 농도와 비교할 때 유사하였다(도 45). 이 결과는 10 mg/kg의 AbS 투여군에서 관찰된 결과와 일치한다. 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, (AbS의 농도와 비교할 때) 상기 2주 시점에서 AbT의 비교적 낮은 농도 및 그 후 시점에서의 AbT의 검출불가능한 농도에 대한 가능한 설명은 AbT의 다회 투여에 의해 유발된 현저한 MAHA 생성 및 그 자체에 대한 MAHA 반응을 억제하는 AbT의 능력의 부재이다.
AbT에 대해 기재된 결과와 일치하여, AbT의 투여량-표준화된 노출은 DBA 마우스 및 CD-1 마우스에 비해 MRL-Faslpr 마우스에서 더 낮은 것으로 보였다(표 18).
AbS와 달리, AbT가 MRL-Faslpr 마우스에게 10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 투여량으로 10주 동안 주 당 3회 복강내 투여되는 경우, MRL-Faslpr 마우스에서 질환 발달에 대한 유일한 한정된 효과가 관찰되었다(실시예 10.2). AbT(10 mg/kg)의 투여는 평가된 모든 시점에서 항-dsDNA 역가의 유의한 감소를 초래하지 않았다. 20 mg/kg의 AbT의 투여는 2주 시점에서 항-dsDNA 역가의 일시적인 감소를 초래하였으나, 항-dsDNA 역가는 상기 시점 이후의 시점(4주, 6주, 8주 및 10주 시점)에서 대조군과 상이하지 않았다(표 19). 20 mg/kg AbT 투여군의 경우, AbT의 정지-상태 최저 농도를 ELISA로 분석하였다. AbT 혈청 농도에서의 높은 동물간 변동성이 있었으나, 일반적으로, 평균 정지-상태 최저 AbT 농도는 평균 항-dsDNA 역가에 대한 효과와 역의 상관관계를 갖는 것으로 보인다(표 19). 2주 시점에서, 평균 AbT 농도는 4주 시점에서의 농도보다 약 8배 더 높았다(그러나, 10 mg/kg 투여군에서 2주 시점에서의 평균 AbS 농도보다 여전히 낮음). 2주 이후의 시점(4주, 6주, 8주 및 10주 시점)에서, 평균 AbT 최저 농도는 검출 한계(약 66 ng/ml) 미만이었다. AbT에 대해 항-dsDNA 역가의 감소가 관찰된 유일한 시점인 2주 시점에서, 평균 AbT 농도는 MRL-Faslpr 마우스에서 단회 투여 연구로부터 수득된 PK 데이타를 사용한 시뮬레이션에 의해 예측된 농도보다 4 내지 5배 더 높았고, DBA 마우스로부터 수득된 단회 투여 데이타를 사용한 시뮬레이션에 의해 예측된 농도와 비교할 때 유사하였다(도 45). 이 결과는 10 mg/kg AbS 투여군에 대한 결과와 일치한다. 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, (AbS와 비교할 때) 2주 시점에서 AbT의 비교적 낮은 농도 및 그 이후의 시점에서 AbT의 검출불가능한 농도에 대한 가능한 설명은 AbT의 다회 투여에 의해 유발된 현저한 MAHA 생성 및 그 자체에 대한 MAHA 반응을 억제하는 AbT의 능력의 부재이다.
실시예 10.8: 시아노몰구스 원숭이에서 AbT의 PK
암컷 원숭이에서 AbT의 PK를 단회 정맥내(10 mg/kg 또는 100 mg/kg) 또는 피하(10 mg/kg) 투여 후 측정하였다. 본 연구로부터 수득된 평균 농도-시간 프로파일을 AbS에 대해 수득된 것과 비교하였고(도 46a 및 46b), 평균 PK 파라미터는 표 18에 요약되어 있다.
표 17에 기재된 바와 같은 최적화된 ELISA를 이용하여 인간 항-IL-21R 항체의 혈청 농도를 측정하였다. 항-IL-21R ELISA는 실시예 10.6에 기재된 바와 같이 단량체 His-부착된 IL-21R을 포획 시약으로서 사용하였고 HRP에 접합된 항-인간-Fc를 검출 시약으로서 사용하였다. TMB를 사용하여 착색된 최종 생성물을 생성함으로써 결합된 시험 대상을 가시화하였다. 원숭이에서 동형 대조군 항체(항-IL-13 항체)의 혈청 농도 또한 실시예 10.6에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였다. PK 파라미터를 실시예 10.6에 기재된 바와 같이 계산하였다.
10 mg/kg의 AbT를 암컷 시아노몰구스 원숭이에게 정맥 내로 단회 투여한 후, 평균 혈청 제거율(CL)은 7.01 ml/hr/kg이었고, 평균 제거 반감기(t1/2)는 약 2.6일이었다. 평균 정지-상태 분포 용적(Vdss)은 약 202 ml/kg이었고, AbT의 평균 노출(AUC0-∞)은 1476 ㎍*hr/ml이었다(표 18).
100 mg/kg의 AbT를 시아노몰구스 원숭이에게 정맥 내로 단회 투여한 후, CL은 약 4.87 ml/hr/kg이었고, t1/2는 약 3.7일이었고, AUC0-∞는 약 20955 ㎍*hr/ml이었고, Vdss는 약 146 ml/kg이었다(표 18). 10 mg/kg의 단회 정맥내 투여 후 AbT의 평균 PK 파라미터와 100 mg/kg의 단회 정맥내 투여 후 AbT의 평균 PK 파라미터 사이에서 유의한 차이점은 없었으므로, AbT의 PK는 10 내지 100 mg/kg 투여량 범위에서 거의 선형이었다.
10 mg/kg의 AbT를 원숭이에게 피하 투여한 후, 평균 T최대는 약 6시간이었고, 평균 피하 생체이용률은 약 43%이었다. 10 mg/kg을 원숭이에게 피하 투여한 후 평균 t1/2 값은 63시간(약 2.6일)이었고 10 또는 100 mg/kg 정맥내 투여 후 관찰된 값과 유사하였다(표 18).
[표 17]
Figure pct00029
[표 18]
Figure pct00030
[표 19]
Figure pct00031
실시예 10.9: DBA 마우스에서 125 I-D5의 PK
125I-항-뮤린 IL-21R 항체 D5-20("D5)을 8 mg/kg의 투여량으로 금식하지 않은 수컷 DBA 마우스 내로 단회 복강내 주사하였다. 1 내지 576시간의 시점에서 혈청 샘플을 채취하고, 트라이클로로아세트산(TCA)-침전가능한 방사성을 측정하여 D5 농도를 정량하였다. DBA 마우스에게로의 복강내 투여 후 D5 항체의 PK 프로파일은 일반적으로 인간 항-IL-21R 항체의 PK 프로파일과 유사하였다(표 20, 도 47; 표 14 및 18 또한 참조).
[표 20]
Figure pct00032
실시예 10.10: 항-IL-21R 항체의 정맥내, 피하 또는 복강내 투여 후 스프라그-돌리 래트에서의 PK
AbS, AbT, AbV, AbU 및 AbW의 PK뿐만 아니라 동형 대조군 항체의 PK를 10 mg/kg의 상기 항체들을 S-D 래트에게 정맥 내로 단회 투여한 후 조사하였다. 시험 대상 혈청 농도의 정량화를 위한 생체분석학적 분석, 래트 혈청 중의 항-AbS 항체의 검출을 위한 분석 및 PK 계산을 하기 변경을 이용하되 원숭이에 대한 AbS 및 AbT에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다(실시예 10.6 및 10.8): S-D 혈청을 분석 희석제로서 사용하였고, 시험 대상 혈청 농도 분석에 대한 LOQ는 45 ng/ml이었다. 동형 대조군에 대해 이용된 ELISA 방법의 경우, 항-인간 Fc 항체는 포획 시약 및 검출 시약 둘다로서 사용되었다.
10 mg/kg을 S-D 래트에게 정맥 내로 단회 투여한 후, 항체 AbS는 서서히 제거되었음에도 불구하고(약 1.6 ml/hr/kg의 CL), 동형 대조군 IgG(약 0.4 ml/hr/kg의 CL)보다 유의하게 더 빨리 제거되었다(p<0.05)(표 21 및 도 48a). 모든 래트(n=6)가 투여 후 15일 및 그 이후의 시점에서 검출가능한 AbS가 없을 정도로 AbS 혈청 농도에서의 급격한 강하를 보였다. AbS 혈청 농도에서의 상기 강하는 6마리 동물 모두에서 15일 및 그 후의 모든 시점에서 검출된 항-AbS 항체의 존재와 관련되어 있을 가능성이 높았다. AbS와 대조군 IgG 사이에서 래트의 농도-시간 프로파일의 차이는 오로지 항-생성물 반응에 의해 설명될 수 있을 것 같지 않음을 인지해야 하는데, 이는 평균 혈청 농도가 투여 후 24시간만큼 빠른 시점에서 분기하기 시작하여 1주 시점에서 4배 이상만큼 상이하였기 때문이다. AbV의 농도-시간 프로파일 및 PK 파라미터는 래트에서 AbS의 농도-시간 프로파일 및 PK 파라미터와 매우 유사하였다.
10 mg/kg을 래트에게 정맥 내로 단회 투여한 후, AbT의 제거는 AbS보다 빨랐고(약 2.1 ml/hr/kg의 CL) 수득된 AUC0 -∞는 AbS보다 약 2배 더 낮았다. AbT가 투여된 6마리 래트 모두 말기에서 혈청 농도의 급격한 강하를 보였다. 레트에서 AbU 및 AbW의 농도-시간 프로파일 및 PK 파라미터(예컨대, AUC0 -∞, AUC0 -240시간 및 CL)는 AbS의 농도-시간 프로파일 및 PK 파라미터와 AbT의 농도-시간 프로파일 및 PK 파라미터의 중간이었다(도 48b).
[표 21]
Figure pct00033
AbS의 경우, 래트의 PK 또한 10 mg/kg의 피하 투여 및 복강내 투여 후뿐만 아니라 1 mg/mg 및 10 mg/mg의 정맥내 투여 후에도 조사되었다.
래트에게로의 단회 정맥내, 피하 또는 복강내 투여 후 168시간 내지 504시간에서 모든 동물에서 AbS 농도의 급격한 강하가 있었다(도 49). 정맥내 투여군 및 피하 투여군에서, AbS 농도는 360시간부터 본 연구의 말기 시점(840시간)까지 분석에 대한 LOQ(45.0 ng/ml) 미만이었다. 복강내 투여군에서, 576시간부터 시작하여 본 연구의 말기 시점까지 검출가능한 AbS가 없었다. 실시예 10.4 및 11에 기재된 상자성 비드 분석을 이용하여, 모든 투여군에 대한 모든 동물에서 투여 후 360시간만큼 빠른 시점(항-AbS 항체 평가를 위해 선택된 제1 샘플링 시점)에서 항-AbS 항체를 검출하였고 상기 항체는 본 연구의 말기 시점(840시간)까지 지속되었다. 시험된 모든 샘플의 경우 본 연구의 말기 시점까지 항-AbS 반응의 로그 역가가 4.01 내지 4.74 초과 유니트에 도달하였다. 따라서, AbS의 급격한 강하는 항-AbS 항체의 형성과 관련되어 있을 가능성이 높았다.
래트에서 1 또는 10 mg/kg AbS의 정맥내 단회 투여 후, 평균 노출(AUC0 -∞)은 각각 470 ± 45 또는 6361 ± 845 ㎍*hr/ml이었다(표 22). 10 mg/kg AbS의 정맥내 단회 투여 후 평균 정지-상태 분포 용적(Vdss)은 낮았는데(각각 101 ± 24 또는 191 ± 33 mL/kg), 이것은 AbS가 정맥내 투여 후 혈관 공간 전체에 주로 분포되어 있고 한정된 세포외 유체 내에 분포되어 있음을 암시한다. AbS의 평균 제거율(CL)은 1 mg/kg 정맥내 투여 및 10 mg/kg 정맥내 투여의 경우 각각 2.14 ± 0.21 및 1.60 ± 0.21 mL/hr/kg이었다. AbS PK 파라미터는 래트에게의 정맥내 투여 후 1 내지 10 mg/kg 투여량 범위에서 투여량에 비례하지 않았는데, 이는 평균 투여량-표준화된 노출(AUC0 -∞/투여량), CL 및 t1 /2가 1 mg/kg 투여량 군과 10 mg/kg 투여량 군 사이에 유의하게 상이하였기 때문이다(p<0.01, 비대응 t-검정).
10 mg/kg의 AbS가 래트에게 복강 내로 단회 투여된 후, 평균 혈청 AUC0 -∞는 3929 ± 979 ㎍*hr/ml이었고, 평균 추정된 생체이용률(BA)은 62 ± 15%이었다(10 mg/kg 정맥내 투여군으로부터 수득된 AUC0-∞ 데이타가 BA 계산을 위해 사용됨)(표 22). 평균 혈청 C최대는 31 ± 14 ㎍/mL이었고 20 ± 9시간의 T최대에서 도달되었다. 10 mg/kg이 래트에게 복강 내로 투여된 후, 평균 값이 78 ± 70시간이면서 겉보기 말기 t1 /2에서의 유의한 동물간 변동성이 존재하였다.
10 mg/kg의 AbS가 래트에게 피하 투여된 후, 평균 혈청 AUC0 -∞는 1595 ± 456 ㎍*hr/mL이었고, 평균 추정된 BA는 비교적 낮은 25 ± 7%이었다(10 mg/kg 정맥내 투여군으로부터 수득된 AUC0-∞ 데이타가 BA 계산을 위해 사용됨)(표 22). 평균 혈청 C최대는 8 ± 1 ㎍/mL이었고 77 ± 26시간의 T최대에서 도달되었다. 10 mg/kg이 래트에게 피하 투여된 후, 평균 값이 88 ± 78시간이면서 겉보기 말기 t1 /2에서의 유의한 동물간 변동성이 존재하였다.
[표 22]
Figure pct00034
S-D 래트를 포함하는 모든 동물에서 항-AbS 항체 반응의 발생 시점이 표 23에 요약되어 있다.
[표 23]
Figure pct00035
실시예 11: 야생형 대조군 마우스(C57BL/6), IL-21R 넉아웃 마우스 및 MRL-Fas lpr 마우스의 PK 및 생체분포
실시예 11.1: 125 I 표지 부착
제조자의 설명서에 따라 요오도-비즈(IODO-BEADS) 방법(피어스, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 이용하여 요오드화를 수행하고 여과하여 정제하였다. 요약하건대, 약 100 내지 200 ㎍의 시험 대상을 1 내지 2 mCi의 125I(퍼킨엘머), 3개의 요오도-비즈 및 약 100 내지 200 ㎕의 PBS와 25분 동안 항온처리하였다. 반응 혼합물을 요오도-비즈로부터 분리하여 센트리콘 여과 장치(10 kD 컷-오프, 밀리포어)로 옮겼다. 약 5 내지 10 ml의 PBS(1 내지 2 ml의 분취액 형태)를 첨가하고 여과 장치의 상부 챔버 내의 용적이 약 200 내지 500 ㎕로 감소될 때까지 2,000 x g에서 원심분리함으로써 정제를 수행하였다.
표지가 부착되지 않은 시험 대상의 저장 용액, 제제화 완충제 및 125I 트레이서(tracer)를 조합하여 투여 용액을 제조하였다. 상기 투여 용액의 순도는 환원 SDS-PAGE 및 비-환원 SDS-PAGE로 분석하였다. 상기 투여 용액은 제1 동물군의 투여 1일 전 한 번에 제조하였다.
실시예 11.2: 혈청 중의 방사능 당량 농도의 측정
50 내지 100 ㎕ 혈청 샘플(중복 샘플) 중의 총 방사능(분 당 카운트(cpm) 단위)을 감마-카운팅(1480 위자드(WIZARD), 왈락 인코포레이티드(Wallac Inc.), 미국 매릴랜드주 케이터스버그 소재)으로 측정하였다. 동일한 부피의 20% TCA(트라이클로로아세트산)를 각각의 분취액에 첨가하고, 샘플을 약 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액(총 방사능 카운트를 위해 이용된 샘플 부피와 동일한 부피의 상청액) 중의 TCA-가용성 방사능을 감마-카운팅으로 측정하였다. 소정의 샘플 중의 TCA-침전가능한 방사능[총 cpm - 2 x TCA - 가용성 cpm], 투여 용액의 비활성(cpm/ng), 샘플 측정일(ts(일)) 및 투여 용액 측정일(tD(일))이 하기 화학식을 이용하여 소정의 샘플에서 방사능 당량 농도(ng eq/ml)를 계산하는 데 사용되었다: [평균 TCA - 침전가능한 cpm/EXP(-0.693/60.2 x (ts - tD)]/[비활성 x 샘플 부피].
실시예 11.3: 소변에서 누적 총 카운트(투여량 카운트의 백분율) 및 자유 125 I 분율의 측정
총 카운트는 하기 화학식을 이용하여 채취 기간 각각에 대한 소변 분비(% 투여량으로서 분비된 cpm)를 계산하는 데 사용되었다: [100% x 소변 cpm/EXP(-0.693/60.2 x (ts - tD))]/[비활성 x 투여량]. 소변에서의 누적 방사능(% 투여량으로서 누적 분비된 cpm)은 0시간부터 표시된 시점까지 소변 분비의 합계(cpm, % 투여량)로서 정의되었다.
TCA-가용성 방사능의 분율을 측정하기 위해, 50 ㎕의 소변 분취액을 50 ㎕의 정상 마우스 혈청과 혼합하여(100 ㎕의 샘플을 생성함) 감마-카운팅으로 분석하였다. 20% TCA의 100 ㎕ 분취액을 100 ㎕ 샘플 각각에 첨가하고, 200 ㎕ 샘플을 약 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 100 ㎕ 상청액 중의 TCA-가용성 방사능을 감마-카운팅으로 측정하였다. 자유 요오딘의 분율은 하기 화학식을 이용하여 수득하였다: [2 x 100% x TCA-100 ㎕ 상청액 중의 가용성 cpm/50 ㎕ 소변 중의 총 cpm].
실시예 11.4: 생체분포 분석
조직 샘플을 미리 중량이 측정된 튜브 내에 넣고 조직 중량을 g 단위로 측정하고 총 방사능(cpm)을 카운팅하였다. 방사능 당량 조직 농도(ng eq/g)의 정량은 하기 화학식을 사용한 125I의 반감기의 보정 후 조직에서의 총 방사능 및 투여 용액의 비활성(cpm/ng)에 의거하였다: [샘플 cpm/EXP(-0.693/60.2 x (ts - tD)]/[비활성 x 샘플 중량].
소정의 시점에서 소정의 조직에 대한 조직 대 혈청 농도 비(T/S)는 혈청의 방사능 당량 농도(㎍ eq/ml)에 대한 조직의 방사능 당량 농도(㎍ eq/g)의 비를 이용하여 계산하였다. % 투여량으로서의 총 조직 카운트는 하기 화학식을 이용하여 계산하였다: [100% x 샘플 cpm/EXP(-0.693/60.2 x (ts - tD)]/[비활성 x 투여량].
실시예 11.5: 2.5 mg / kg 정맥내 투여 후 대조군 마우스 및 IL -21R 넉아웃 마우스에서 PK 및 생체분포
야생형 C57BL/6(대조군) 마우스에서, 2.5 mg/kg 125I-AbS의 정맥내 단회 투여 후 10 내지 14일째 날부터 시작하여 IL-21R 넉아웃 마우스에서의 평균 AbS 혈청 농도에 비해 평균 AbS 혈청 농도의 강하가 있었다(도 50c). 14일째 날(336시간)에서, 대조군(n=40)의 60% 및 IL-21R 넉아웃 마우스(n=10)의 0%가 검출불가능한 또는 매우 낮은 농도의 AbS를 보였다. 20일째 날(480시간) 후, 모든 대조군 마우스의 혈청에서 검출가능한 AbS 농도는 없었다. IL-21R 넉아웃 마우스에서, AbS는 마지막 샘플링 시점인 투여 후 36일째 날(864시간)만큼 늦게 혈청 중에서 검출되었다. 대조군에서의 125I-AbS 대 IL-21R 넉아웃에서의 125I-AbS의 농도-시간 프로파일의 차이는 이들 두 마우스 품종 사이의 항-AbS 반응의 가능한 차이에 기인한 것으로 보인다. 5주 시점에서, 야생형 혈청 샘플의 약 55%(9마리 중 5마리)가 항-AbS 항체 분석에서 양성으로 시험되었고, IL-21R 넉아웃 혈청 샘플 중 어떠한 혈청 샘플도 항-AbS 항체 분석에서 양성으로 시험되지 않았다.
대조군 마우스에서, 전신 제거율(CL)은 약 1.3 ml/hr/kg이고, 제거 반감기(t1/2)는 120시간(약 5.0일)이었다. IL-21R 넉아웃 마우스에서, CL은 약 0.7 ml/hr/kg이었고, t1/2는 256시간(10.7일)이었다(표 14). 따라서, 2.5 mg/kg의 정맥내 투여 후, IL-21R 넉아웃 마우스는 대조군보다 더 높은 혈청 노출(AUC0-∞)을 보였다(표 14).
일반적으로, 대조군 및 IL-21R 넉아웃 마우스 둘다의 경우, 조사된 다른 조직들과 비교할 때 혈청에서 125I-AbS의 최대 농도가 관찰되었다(도 50a 및 50b; 표 24 및 25). 그러나, 마지막 조직 샘플링 시점(864시간)에서, 검출가능한 125I-AbS 농도는 대조군 마우스의 조직에서는 관찰되었지만 혈청에서는 관찰되지 않았다.
대조군 마우스와 IL-21R 넉아웃 마우스 사이의 AbS 혈청 농도의 차이에 따르면, 조직에서의 AbS의 방사능 당량 농도는 투여 후 약 2주째 시점부터 IL-21R 넉아웃 마우스보다 대조군 마우스에서 더 낮았다(도 50). 마찬가지로, 조직 제거 반감기(t1 /2)는 IL-21R 넉아웃 마우스의 조직에서(약 230 내지 270시간)보다 대조군 마우스에서(약 90 내지 165시간) 더 짧았다. 따라서, 조직 노출(AUC0 -∞)은 IL-21R 넉아웃 마우스보다 대조군 마우스에서 더 낮았다(표 26). 그러므로, 2.5 mg/kg의 125I가 IL-21R 넉아웃 마우스에게 정맥내 투여된 후, 혈청 및 조직 둘다에서의 노출은 대조군보다 더 높았다.
[표 24]
Figure pct00036
[표 25]
Figure pct00037
[표 26]
Figure pct00038
실시예 11.6: 2.5 mg/kg의 복강내 투여 후 MRL-Fas lpr 마우스에서 PK 및 생체분포
2.5 mg/kg의 125I가 암컷 MRL-Faslpr 마우스(약 10 내지 12주령)에게 단회 복강내 투여된 후, 혈청 농도-시간 프로파일은 투여 후 제1주 동안 AbS 농도의 비교적 느린 강하(t1 /2는 약 54시간) 투여 후 5일 이후부터 비교적 빠른 강하(t1 /2 약 12시간)를 보이는 이중상(biphasic) 프로파일이었는데, 이것은 항-AbS 항체의 형성을 암시한다(도 51a 및 52). 사실상, 312시간째 시점에서 4마리 마우스 중 4마리 모두가 항-생성물 항체에 대해 양성으로 시험되었고(약 4.01 로그 역가 유니트의 상대적 배지 역가), 408시간째 시점에서 4마리 마우스 중 4마리 모두가 항-생성물 항체에 대해 양성으로 시험되었다(약 4.43 로그 역가 유니트의 상대적 배지 역가). 2.5 mg/kg 125I의 복강내 투여 후, AbS의 최대 혈청 농도(C최대) 및 노출(AUC0-∞)은 각각 12 ㎍ eq/ml 및 823 ㎍ eq*hr/ml이었다. 따라서, MRL-Faslpr 마우스에게의 단회 복강내 투여 후, PK는 2.5 내지 10 mg/kg 투여량 범위에서 거의 선형이었다(도 52; 표 14)(실시예 104 또한 참조). MRL-Faslpr 마우스에서 125I-AbS의 소변 카운트는 10일째 시점까지 평가되었다(도 51b).
2.5 mg/kg 단회 복강내 투여 후 제1주 동안(아마도 항-생성물 항체의 형성 전), 조사된 모든 조직 중 혈청에서 AbS의 최대 농도가 관찰되었다. 상기 제1주 후, 혈청 농도는 조직 중의 AbS의 강하와 비교할 때 더 빨리 감소됨으로써, T/S 농도 비는 1보다 유의하게 더 높았고(표 27), 조직 중의 AUC0 -∞는 약 90 내지 300 ㎍eq*hr/ml이었다(표 28). 조직에서, 겉보기 제거 반감기(24 내지 312시간 데이타 세트에 의거하여 계산함)는 약 40 내지 55시간이었다. 본 연구의 말기까지(투여 후 7주) 비교적 낮은(그러나 여전히 검출가능한) 수준의 방사능이 조직에서 지속되었다(도 51a).
[표 27]
Figure pct00039
[표 28]
Figure pct00040
실시예 12: 인간 혈액 중의 항-IL-21R 항체의 억제성
실시예 12.1: IL-21에 대한 인간 전혈의 작용제 반응은 항-IL-21R 항체의 생체외 처리에 의해 중화된다.
인간 전혈을 인간 혈액 공여 프로그램(미국 매사추세츠주 캠프리지 소재)에 의해 수득하였다. 모든 인간 혈액 샘플을 비디(BD) 바큐테이너(Vacutainer)(상표명) 씨피티(CPT)(상표명) 세포 준비 튜브 내에 채취하였다. 채취 튜브는 나트륨 헤파린을 함유하였다. 샘플을 주위 온도에서 유지하고 즉시 처리하였다. 혈액을 냉동바이알 내의 1 내지 2 ml 분취액으로 나누고, IL-21, AbS 또는 대조군 단백질로 처리하였다. 샘플을 항체 및 IL-21 둘다로 처리하는 경우, 상기 항체는 IL-21 직전에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 포르마 사이언티픽 리치-인 항온처리기(Forma Scientific Reach-In Incubator) 모델 번호 3956 내에서 37℃에서 4시간 동안 항온처리하고, 이 항온처리 동안에 어프로프리에이트 테크니칼 리소시스 인코포레이티드(Appropriate Technical Resources Inc.; ATR) 로타믹스(Rotamix)(카달로그 번호 RKVS) 회전 혼합기(일련 번호 0995-52 및 0695-36)를 이용하거나 랩쿠아크(Labquake)(등록상표) 튜브 진탕기/회전기(카달로그 번호 400110)를 이용하여 샘플을 15 rpm에서 계속 혼합하였다. ART 1000E 팁(카달로그 번호 72830-042)이 장착된 길슨 P1000 피펫을 이용하여 분취액(0.5 ml)을 분리하여, 인간 리보퓨어(RiboPure)(상표명)-블러드 키트(앰비온, 미국 텍사스주 오스틴 소재; 카달로그 번호 AM1928)에 구비된 알엔에이레이터(RNAlater)(등록상표) 1.3 ml가 함유된 2.0 ml 마이크로튜브(악시겐 사이언티픽, 카달로그 번호 10011-744)에 첨가하고, 5회의 완전한 역위(inversion)를 통해 철저히 혼합하였다. 샘플을 주위 온도에서 밤새 저장한 후, RNA 정제를 위해 -80℃에서 동결시켰다.
인간 리보퓨어(상표명)-블러드 프로토콜(앰비온, 카달로그 번호 AM1928)을 이용하여 RNA를 단리하였다. 인간 리보퓨어(상표명) RNA 단리 절차는 구아니디늄-기재 용액 중에서의 세포 용해, 페놀/클로로포름 추출에 의한 RNA의 초기 정제, 및 유리-섬유 필터 상에서의 고체상 추출에 의한 최종 RNA 정제로 구성된다. 잔류 게놈 DNA는 상기 키트에 구비된 DNA-프리(free)(상표명) 시약을 사용하여 DNAse 처리를 위한 제조자의 설명서에 따라 제거하였다. 모든 샘플에서, RNA 양은 나노드롭(NanoDrop) 1000(나노드롭, 미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)을 사용하여 260 nm에서 흡광도를 판독함으로써 측정하였다. RNA 질은 2100 바이오어날라이저(아질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 이용하여 점-조사하였다. cDNA 합성이 수행될 때까지 샘플을 -80℃에서 저장하였다.
제조자의 설명서에 따라, 샘플 당 50 U의 추가 RNase 억제제(에이비아이(ABI), 카달로그 번호 N808-0119)를 사용하는 고성능 cDNA 역전사 키트(에이비아이, 카달로그 번호 4368814)를 이용하여 총 RNA로부터 cDNA를 역전사하였다. RT-PCR(실시간 PCR)이 수행될 때까지 cDNA 샘플을 -20℃에서 저장하였다. 택만(Taqman)(등록상표) 저밀도 어레이 카드 상에 적재된 cDNA의 양은 실험에서 수득된 가장 낮은 RNA 수율을 이용하여 측정하였다. cDNA 샘플을 에이비아이 프리즘 7900 서열 검출기(서열 검출기 소프트웨어 v2.2.2, 어플라이드 바이오시스템스) 상에서 통상적인 열적 순환 조건(50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 및 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분으로 구성된 40주기)을 이용하여 분석하였다.
IL-21의 생체외 효과를 조사하기 위해, 인간 전혈이 유전자 발현 수준에서의 검출가능한 변화와 함께 IL-21에 반응하는지를 시험하기 위한 실험을 수행하였다. 인간 공여자로부터 수득된 전혈을 IL-21의 존재 및 부재 하에 항온처리하고, RNA 수준을 TLDA 카드로 측정하였다. 2종의 상이한 TLDA를 사용하여 RNA 발현 수준을 측정하였다. 먼저, 인간 면역 TLDA(에이비아이, 카달로그 번호 4370573)는 96종의 유전자를 시험하였고, 이들 중 91종의 유전자가 자극된 인간 혈액에서 검출될 수 있었다. 인간 공여자의 전혈로부터 수득된 LPS 또는 PHA에 의해 자극받은 PBMC는 양성 대조군으로서 사용되었다. IL-21 자극에 반응한 IL-21R의 상향조절을 시험하기 위해, IL-21R 유전자를 함유하는 주문제작 디자인된 TLDA를 사용하여 결과를 수득하였다.
선택된 분석 조건 하에 시험된 4명의 인간의 전혈 샘플들에서 관찰된, 가장 일관된 7개의 IL-21-의존적 유전자 발현 변화에 대한 데이타가 표 29에 기재되어 있다. IL-21에 대한 유의한 반응은 IL-6, IFNγ, CD19, PRF1, IL-10, IL-2Rα 및 GNLY의 경우에 관찰되었다. 흥미롭게도, 30 ng/ml, 100 ng/ml 및 500 ng/ml 농도에서의 IL-21 처리는 유사한 결과를 보였다(표 29).
[표 29]
Figure pct00041
AbS가 인간 세포의 IL-21/IL-21R-의존적 활성화의 원하는 차단 활성을 나타내는지를 확인하기 위해, 전혈에서 IL-21-의존적 활성화를 차단하는 상기 항체의 능력을 인간 공여자들 중 한 공여자에 대해 시험하였다. 도 53a 및 53b는 상기 항체에 의한 IL-21-반응성 유전자의 IL-21-의존적 활성화의 효과적인 억제(인간 IgG1 대조군과 비교할 때)를 보인다.
이 결과는 인간 전혈 샘플에서 IL-21에 대한 반응을 측정하는 방법을 정의하므로, 이 분석은 실험적 또는 임상적 셋팅에서 항-IL-21R 항체의 IL-21-의존적 활성화의 억제를 검출하는 데 이용될 수 있는데, 이는 상기 분석이 관용적으로 채혈될 수 있는 혈액보다 더 많은 혈액을 필요로 하지 않고 최소한의 생체외 조작을 포함하기 때문이다.
실시예 12.2: 인간 전혈에서 AbS의 PD 활성을 측정하는 분석
총 5명의 건강한 인간 공여자들을 본 연구에 참여시켰다. 모든 인간 전혈 샘플을 나트륨 헤파린을 함유하는 비디 바큐테이너(상표명) 씨피티(상표명) 세포 준비 튜브(카달로그 번호 362753) 내에 채취하였다. 인간 전혈을 인간 혈액 공여 프로그램(미국 매사추세츠주 캠프리지 소재)으로 수득하였다. 샘플을 주위 온도에서 유지하고 달리 명시하지 않은 한 채취한 지 1시간 이내에 처리하였다. 샘플을 면역글로불린 시약 및 IL-21 둘다로 처리하는 경우, 상기 면역글로불린 시약은 IL-21의 첨가 직전에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 포르마 사이언티픽 리치-인 항온처리기 모델 번호 3956 내에서 37℃에서 표시된 시간 동안 항온처리하고, 이 항온처리 동안에 어프로프리에이트 테크니칼 리소시스 인코포레이티드 로타믹스(카달로그 번호 RKVS) 회전 혼합기(일련 번호 0995-52 및 0695-36)를 이용하거나 랩쿠아크(등록상표) 튜브 진탕기/회전기(카달로그 번호 400110)를 이용하여 샘플을 약 7 rpm에서 계속 혼합하였다. 이어서, 0.5 ml의 샘플을 각각 분리하여, 인간 리보퓨어(상표명)-블러드 키트(앰비온; 카달로그 번호 AM1928)에 구비된 알엔에이레이터(등록상표) 1.3 ml가 함유된 2.0 ml 마이크로튜브(악시겐 사이언티픽, 카달로그 번호 10011-744)에 첨가하고, 5회의 완전한 역위를 통해 철저히 혼합하였다. 실시예 12.1에 기재된 절차 후, 샘플을 단리하고 RNA 수율을 정량하고, cDNA를 합성하고, 200 ng의 cDNA를 도 54에 도시된 바와 같은 24종의 유전자(이들 중 19종의 시험 유전자는 IL-21로 자극받은 경우 인간 전혈에서의 변화를 보이는 것으로 관찰되었고, 5종의 유전자는 내재 대조군 유전자임)가 포함된 주문제작 TLDA 플레이트 상에 적재하였다
RNA 발현 수준의 정량을 위해, 여러 종의 내재 대조군 유전자(도 54에서 (GAPDH, GUSB, ZNF592 및 PGK1)로부터 얻은 평균 실시간 PCR 역치 사이클(Ct) 값은 "표준치(normalizer)"로서 사용되었는데, 이는 상기 유전자들의 발현이 처리에 따라 변화지 않았고, 상기 유전자들이 모든 샘플에서 가장 일관된 Ct 값을 보였기 때문이다. 실험 대조군들(AbS 및 IL-21 둘다가 첨가되지 않음)의 평균 Ct 값은 "보정치(calibrator)"로서 사용되었다. 소정의 샘플에서 한 유전자의 발현은 유전자의 Ct - 그 샘플에 대한 내재 대조군의 평균 Ct(샘플의 ΔCt)로서 계산되었다. 유전자 발현 값(ΔΔCt)은 샘플의 ΔCt - "보정치"의 ΔCt이다. 상대적 정량화(RQ) 또는 변화 배수는 2-ΔΔCt로서 계산되었다.
최대 신호의 발생을 위한 IL-21 처리의 최적 시간 및 투여량을 측정하기 위해, 5명의 건강한 공여자로부터 수득된 전혈 샘플을 3.3, 10 또는 30 ng/ml의 IL-21의 존재 하에 2, 4, 6 또는 24시간 동안 항온처리하였다. RNA를 단리하고, 유전자 발현 수준을 측정하였다. 유의한 IL-21-의존적 신호 및 강한 IL-21-의존적 신호가 6종의 하기 유전자들에 대해 수득되었다: IL-6, IFNγ, IL-2Rα, GZMB, PRF1 및 CD19. 상기 유전자들 중 CD19를 제외한 모든 유전자에 대한 최적 신호는 2시간째 시점에서 수득되었다(도 55). 3.3, 10 또는 30 ng/ml의 IL-21에서 수득된 반응에서 차이는 거의 없었다. 생체외 IL-21 처리에 대한 반응은 5명의 공여자 모두에서 일치하였다(데이타는 나타내지 않음). 이 5명의 공여자들에서 수득된 결과에 의거하여, IL-21에 대한 생체외 반응에 대한 AbS의 억제 효과를 적정하기 위해 선택된 분석 조건은 10 ng/ml의 IL-21을 사용한 2시간 동안의 자극이었다. 가장 신뢰할만한 IL-21-반응성 유전자들은 GZMB, IFNγ, IL-21RA, IL-6 및 PRF1이었다.
IL-21의 효과를 최적으로 차단하는 AbS의 투여량을 측정하기 위해, 4명의 공여자들로부터 수득된 샘플을 PBS로 희석된, 표시된 농도의 AbS 및 IgG1TM과 함께 2시간 동안 예비항온처리한 후 10 ng/ml의 IL-21을 첨가하였다. IL-21의 첨가 후, 샘플을 2시간 동안 더 항온처리하였다.
0.1 ㎍/ml의 AbS를 첨가하면 완전히 억제되었으므로, 0.003 ㎍/ml의 AbS가 후속 실험에서 사용되었다. 도 56a 내지 56c에 나타낸 바와 같이, AbS는 4명의 모든 공여자들에서 시험된 6종의 유전자들 모두의 반응을 억제하였지만 IgG1TM은 그러하지 못하였다. 상기 6종의 유전자들 모두에 대한 IC50은 표 30에 기재되어 있다.
[표 30]
Figure pct00042
도 56에 나타낸 바와 같이, 0.03 ㎍/ml(200 pM 또는 6x104 분자/세포)만큼 낮은 농도의 AbS는 유전자 발현에 대한 10 ng/ml의 IL-21의 효과를 성공적으로 차단하였다. 이 억제는 AbS의 농도가 0.003 ㎍/ml(20 pM) 이하로 낮아질 때 감소되었다. GZMB, IFNγ, IL-2Rα, IL-6 및 PRF1은 IL-21R/IL-21의 신뢰할만한 혈액 생체마커이고, 2시간째 시점에서 항체 활성을 나타내지만, 6종의 유전자(GZMB, IFNγ, IL-2Rα, IL-6, PRF1 및 CD19) 모두가 IL-21R/IL-21 활성에 대한 유용한 인간 혈액 생체마커로서 확인되었다. 뿐만 아니라, 10 ng/ml의 IL-21은 동일한 분석에서 TBX-21 유전자의 유전자 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌고, 이 감소는 0.03 ㎍/ml의 AbS에 의해 완전히 회복되었다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 13: 수컷 시아노몰구스 원숭이에서 AbS 및 AbT 의 PK 및 PD
실시예 13.1: AbS 및 AbT 연구에 대한 동물 선별
본 연구에서 사용된 동물들은 단백질을 투여받은 경험이 없고 투여 전 전혈 생체외 분석에서 재조합 인간 IL-21 자극을 이용하여 수득한 결과를 기초로 하여 연구 참여에 대해 선별되었다.
구체적으로, 수컷 원숭이의 경우, 전혈 샘플(0.5 내지 1.5 ㎖)을 멸균된 뉴클레이즈-무함유 2 ㎖ 마이크로-원심분리 튜브(악시젠(Axygen), 카달로그 번호1011-744)에 넣고 37℃의 플랫폼 진탕기 상에서 비히클(10 mM L-히스티딘, 5% 수크로스), 50 ng/㎖ 재조합 인간 IL-21(rhuIL-21), 30 nM IgG 대조군 항체와 함께 50 ng/㎖ rhuIL-21, 또는 30 nM 항-IL-21R 항체와 함께 50 ng/㎖ rhuIL-21로 4시간 동안 처리하였다. 암컷 원숭이의 경우, 전혈 샘플(0.5 ㎖)을 비히클 또는 20 ng/㎖의 rhuIL-21로 처리하였다. 전혈 샘플에서 말초혈 단핵 세포를 제조자의 설명서(지이 헬쓰케어, 피콜-파크(상표명) 플러스)에 따라 피콜 방법으로 단리하고 PBS로 1회 세척하였다.
리보퓨어(상표명)-블러드 키트(암비온, 카달로그 번호AM1928; 수컷) 또는 알엔이지(RNeasy) 키트(퀴아젠; 암컷)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 RNA 단리를 수행하였다. RNA 수율은 나노드롭(NanoDrop) 1000 A 분광계(나노드롭, 미국 델라웨어주 윌밍톤 소재)를 이용하여 측정하고, RNA 질은 2100 생물분석기(Bioanalyzer)(아질런트, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)를 이용하여 평가하였다. RNA 농도는 28 ng/㎖(수컷) 또는 20 ng/㎕(암컷)로 조절하였다.
수컷 원숭이의 경우, 고성능 cDNA 역 전사 키트(어플라이드 바이오시스템스, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 카달로그 번호4368814)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 700 ng의 RNA로 cDNA 합성을 수행하고, 시아노몰구스 원숭이 유전자의 검출을 위해 디자인된 와이어쓰 주문제작 TLDA 카드(어플라이드 바이오시스템스, 파트 # 4342249)를 이용하여 유전자 발현 분석을 수행하였다. cDNA 합성 반응물을 택만(TaqMan)(등록상표) 2x PCR 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템스, 카달로그 번호 4304437)와 각각 혼합하고, 100 ㎕를 TLDA 카드 상에 적재하였다. TLDA 카드를 제조자의 설명서에 따라 처리하고, ABI 프리즘(Prism)(등록상표) 7900HT 서열 검출 시스템을 이용하여 증폭을 수행하였다. 실행 각각에 대해 이용된 주기 파라미터는 다음과 같다: 50℃, 2분; 95℃, 10분; 및 95℃, 15초에 이어서 60℃, 1분으로 구성된 40주기. 주기 역치(CT)는 서열 검출 소프트웨어(버젼 2.3, 어플라이드 바이오시스템스)를 이용하여 계산하였다.
암컷 원숭이의 경우, IL-2Rα만에 대한 택만 정량 RT-PCR을, IL-2Rα에 대한 미리정량된 프라이머 및 프로브(어플라이드 바이오시스템스; 수컷 원숭이의 경우 주문제작 TLDA에서 사용된 프라이머 및 프로브와 동일한 IL-2Rα 프라이머 및 프로브)를 사용하여 수행하였다.
이어서, 수컷 및 암컷 둘다에서 델타 델타 Ct(ΔΔCt) 방법을 이용하여 유전자 발현의 상대적 정량(RQ)을 계산하였다(이때, RQ = 2-ΔΔCt). 징크 핑커 단백질 592(ZNF592, 수컷) 또는 단백질 카이네이즈 G-1(PKG1, 암컷)을 내재성 대조군으로 사용하고, 비히클 대조군 샘플을 RQ 계산을 위한 보정자(calibrator)로서 사용하였다. RQ 값이 1.5 이상인 샘플은 상응하는 비히클 대조군 샘플보다 더 높은 유전자 발현을 나타내는 것으로 간주되었다.
혈액이 생체 외에서 IL-21로 자극된 경우 비히클에 비해 여러 면역 기능-관련 유전자들의 보다 높은 발현을 보이는(RQ>1.5) 수컷 원숭이를 선별하여 본 연구에 포함시켰다. 동물 수(동물 #)로 표시되는, 하기 추가 연구를 위해 선별된 9마리의 원숭이에 대한 5종의 유전자(IL-2Rα, IL-21R, PRFl, GZMB 및 IL-6)의 RQ 값은 표 31에 기재되어 있다. 군 번호(A 내지 C)는 선별된 동물들이 후속 실험에서 AbS(군 A), AbT(군 B) 또는 IgG 대조군(군 C)으로 처리되었는지를 나타낸다. 동물 10 내지 13은 추가 연구를 위해 선별되지 않았다.
[표 31]
Figure pct00043
IL-2Rα는 평가된 유전자의 IL-21-유도된 유전자 발현에서 가장 큰 규모(가장 높은 RQ)를 및 가장 일관된 변화(RQ가 1.5보다 큰 동물의 최대 백분율)를 나타내는 것으로 확인되었으므로, 항-IL-21R 항체의 PD 활성을 평가하기 위한 최적의 단일 유전자인 것으로 간주되었다. 생체내 연구에 포함된 모든 원숭이들로부터 수득된 전혈 샘플은 생체에서 IL-21로 자극된 후 1.5보다 더 높은 IL-2Rα RQ 값을 나타내었다. 그러나, IL-2Rα RQ 값에서 유의한 동물간 변동성(variability)이 2.8 내지 6.3의 값으로 관찰되었다.
생체외 분석에서 rhuIL-21에 대한 IL-2Rα의 분포의 특징규명을 위한 최대수의 샘플을 수득하기 위해, 혈액 샘플을 24마리의 추가 암컷 시아노몰구스 원숭이로부터 수득하고, 생체외에서 rhuIL-21로 자극시키고 정량 RT-PCR 방법을 이용하여 IL-2Rα 유전자 발현에 대해 분석하였다(IL-21R, PRFl, GZMB 및 IL-6 발현은 상기 원숭이들에 대해 분석되지 않았음). 수컷 원숭이와 암컷 원숭이 사이에 IL-2Rα RQ 분포의 주목할 만한 차이는 없었고(평균 ± SD RQ 값이 각각 3.8 ± 1.7 및 3.0 ± 1.9임), IL-2Rα RQ 분포의 후속 분석을 n이 37인 조합된 데이타 세트를 사용하여 수행하였다. 시험된 모든 시아노몰구스 원숭이는 생체외에서 rhuIL-21로 자극된 후 1.5 이상의 IL-2Rα RQ 값을 보였다. 평균 IL-2Rα RQ 값(n=37)은 3.2이고 범위는 1.5 내지 8.1이었다. 37마리의 원숭이로부터 기준치에서 수득된 IL-2Rα 발현에 대한 RQ 값을 로그-변환하였고, RQ 및 로그{RQ} 값의 분포를 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 및 다고스티노 앤드 피어슨(D'Agostino & Pearson) 정규성 검정에서 검정하였다(그래프패드 프리즘(GraphPad Prizm) 5, 그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드). 정규성 가설은 RQ 분포에 대해서는 거부되었지만 로그{RQ} 분포에 대해서는 거부되지 않았다(샤피로-윌크 검정의 경우 p=0.16, 다고스티노 앤드 피어슨 검정의 경우 p=0.48). 로그-변환된 RQ 값은 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 이용하여 정규 분포(R2=0.69)로 피팅하였다. 모든 37마리의 원숭이(수컷 n=13, 암컷 n=24)에 대해 생체외 분석에서 수득된 IL-2Rα RQ 값 및 상기 RQ 값의 로그-변환(로그2)의 분포는 각각 도 57a 및 57b에 나타나 있다. IL-2Rα RQ 값의 분포는 대략적으로 로그-정규로 나타났고 정규성 검정을 통과하였다. 시아노몰구스 원숭이에서 항-IL-21R 항체를 사용한 향후 PD 연구의 포함 기준은 하기 수학식에 의거할 때 2.3으로서 정의되었다: 로그{RQ기준값} = 로그-변환된 RQ 값의 평균 - 로그-변환된 RQ 값의 표준 편차. 따라서, IL-2Rα RQ 값의 분포가 2.3보다 더 큰 동물들은 IL-21 자극에 대한 우수한 반응자들로서 간주되었다. RQ 값이 2.3보다 더 큰 동물들(약 81%; 37마리 중 30마리)은 우수한 반응자로서 정의되었고 항-IL-21R 항체의 PD 연구를 위한 포함 기준을 충족시키는 것으로 간주되었다.
IL-21-유도된 유전발 발현이 시아노몰구스 원숭이 IL-21R의 사용에 의존하는지를 확인하기 위해, RNA 단리 및 유전 발현 분석 전에 원숭이 전혈 샘플을 IL-21 및 항-IL-21R 항체(AbT; 30 nM)와 동시에 항온처리하였다. 예측된 바와 같이, IL-21과 동시에 AbT의 생체외 첨가는 전혈 분석에서 IL-21-유도된 유전자 발현 변화를 강하게 억제하였다(즉, RQ 값<1.5; 도 57c).
실시예 13.2: 생체내 실험을 위한 연구 디자인
(실시예 12.1에 기재된) 생체외 PD 전혈 분석에서 IL-21 자극에 대한 반응자로서 확인된 9마리의 수컷 단백질-투여 무경험 시아노몰구스 원숭이에게 10 mg/kg의 AbS(군 A), AbT(군 B) 또는 IgG 대조군 항체(군 C)(군 당 3마리)를 투여하였다. 투여량은 2.5 ㎖/kg의 투여량 부피로 복재 동맥 내로 정맥내 투여되었다(관주 속도 약 4 ㎖/분).
PD 활성의 측정(3개 군 모두)을 위한 혈액 샘플(약 7.0 ㎖)을 항응고제로서 시트르산나트륨이 함유된 튜브 내로 모았다. 혈청 AbS 또는 AbT 농도의 측정 및 항-생성물 항체의 평가를 위한 혈액 샘플(약 3.0 ㎖)을 항응고제가 없는 튜브 내로 모아 실온에서 약 15분 동안 응고시키고 원심분리에 의한 혈청 수거를 위해 처리하였다. 샘플 수거 스캐쥴은 표 32에 기재되어 있다. 50일째 날 후, 추가 샘플링 시점을 AbS 군에서 동물 1 및 3에 대해 추가하여 PD 활성의 가역성을 입증하였다. "투여량 투여"로도 지칭되는 1일째 날은 항체가 원숭이에게 투여되는 날이다. "전-투여"는 투여량 투여 전 샘플 수거 시점을 의미하고, "후-투여"는 투여량 투여 후 샘플 수거 시점을 의미한다.
[표 32]
Figure pct00044
실시예 13.3: AbS 및 AbT 혈청 농도
AbS 혈청 농도 및 AbT 혈청 농도를 측정하기 위해, 실시예 10에 기재된 ELISA를 이용하였다. 실시예 10에 기재된 시아노몰구스 원숭이에서 PK 연구는 단회 정맥내 투여 후, AbS가 AbT에 비해 현저히 더 빨리 제거됨을 보여준다. 본 연구에서, PK 파라미터의 완전한 세트를 결정하는 데 필요한 광범위한 혈청 샘플링은 PD 분석에 요구되는 비교적 큰 샘플 부피 및 개개의 시아노몰구스 원숭이로부터 수거될 수 있는 혈액 부피에 대한 한계로 인해 수행되지 않았다. 항-IL-21R 혈청 농도의 측정을 위한 샘플은 개개의 동물들 각각에 대한 혈청 농도와 PD 활성을 상호관련시킬 수 있도록 PD 활성이 평가되는 시점에서만 채취되었다. 따라서, 제거 반감기(t1/2)만이 혈청 농도-시간 프로파일의 말기에 의거하여 평가되었다. 겉보기 t1/2는 실시예 10에 기재된 바와 같이 측정되었다.
10 mg/kg의 단회 정맥내 투여 후, AbS는 약 10.6 ± 3.92일의 평균 겉보기 말단 반감기(t1 /2)를 보이면서 수컷 시아노몰구스 원숭이로부터 서서히 제거되었다(표 33). 22일째 날까지, AbS 혈청 농도는 AbS가 투여된 3마리 동물 모두에서 매우 유사하였다(도 58). 그러나, 36일째 날 및 그 이후의 시점에서, 동물 2의 AbS 혈청 농도는 동물 1 및 3의 AbS 혈청 농도(약 2 ㎍/㎖)에 비해 급속히(약 0.6 ㎍/㎖까지) 감소하였다. 50일째 날, 동물 2는 혈청에서 검출가능한 AbS를 보이지 않았지만(30 ng/㎖의 LOQ 미만), 동물 1 및 3은 약 0.9 내지 1 ㎍/㎖의 AbS 혈청 농도를 보였다. 따라서, AbS의 추정된 t1/2는 동물 1 및 3(각각 약 12일 및 14일)에 비해 동물 2(약 6.2일)의 경우 더 짧았다.
초기 PK 연구에 의거하여 예측된 바와 같이, 10 mg/kg의 단회 정맥내 투여 후, AbT의 혈청 농도는 AbS에 비해 현저히 더 빨리 감소하였다(도 58). AbS가 투여된 원숭이 3마리 모두 유사한 혈청 시간-프로파일 및 겉보기 t1/2 값을 보였고(표 33), 혈청 농도는 15일째 날에 비교적 낮은 수준으로 감소하였고(<0.4 ㎍/㎖) 22일째 날에 LOQ 미만의 수준으로 감소하였다. AbT의 추정된 평균 t1 /2는 2.3 ± 0.16일이었다. AbS 농도 및 AbT 농도는 투여 후 24시간만큼 빠른 시점에서 분기하기 시작하여 1주가 되는 시점에서 10배보다 더 높은 수준만큼 상이하였다. 이 데이타는 AbT가 AbS에 비해 약 5 내지 7배 더 빠른 전신 제거율(CL)을 나타냄을 입증하는 초기 PK 연구의 결과를 확인시켜주었다(예를 들어, 실시예 10 참조).
[표 33]
Figure pct00045
실시예 13.4: 수컷 시아노몰구스 원숭이에서 AbS 및 AbT PD 반응
항-IL-21R 항체에 의한 IL-21-유도된 발현의 억제 검출을 위한 생체외 전혈 분석은 실시예 12.1에 기재되어 있다. 본 연구에 등록된 9마리 원숭이 모두의 경우, 전-투여 전혈 샘플 및 후-투여 전혈 샘플을 4개의 1.5 ㎖ 분취액으로 각각 나누었다. 제1 분취액 및 제2 분취액을 재조합 인간 IL-21 또는 비히클(RQ 계산을 위한 보정자)로 처리하고, 순환 시험 대상이 생체외 IL-21-유도된 IL-2Rα 유전자 발현(즉, PD 활성)에 영향을 미치는지를 평가하는 데 사용하였다. 제3 분취액을 IL-21 및 항-IL-21R 항체(30 nM)로 처리하고, 제4 분취액을 IL-21 및 IgG 대조군 항체(항-IL-21R 항체에 대한 음성 대조군)로 처리하였다. 제3 분취액 및 제4 분취액을 사용하여, 주어진 후-투여 샘플 중의 순환 시험 대상에 의한 IL-21-유도된 IL-2Rα 유전자 발현이 완전한지(PD 활성이 관찰되는 시점에 대해), 및 IL-21-유도된 유전자 발현의 복귀가 IL-21R을 통해 매개되는지(PD 활성이 추후 상실되는 시점에 대해)를 평가하고, 중화 항-생성물 항체의 존재를 모니터링하였다.
AbS의 경우, 혈청 AbS 농도가 3마리 원숭이 모두에 있어서 6 nM(0.9 ㎍/㎖) 이상일 때 IL-21-유도된 IL-2Rα 유전자 발현의 완전한 억제(IL-2Rα RQ<1.5)는 투여량 투여 직후 관찰되었고 동물 2의 경우 22일 이상까지 지속되었고 동물 1 및 3의 경우 50일 이상까지 지속되었다(도 59a 내지 59c 및 표 33). 생체외 IL-21-유도된 IL-2Rα 발현은 동물 1 및 3의 경우 92일째 날 전-투여 값으로 복귀되었고(즉, PD 활성이 상실되었고), 상기 시점은 혈청 농도가 LOQ 미만인 시점과 일치하였다(도 59a 내지 59c). 동물 2의 경우, PD 활성은 혈청 AbS 농도가 약 4 nM(0.6 ㎍/㎖)의 비교적 낮은 수준으로 감소하는 시점인 36일째 날에 상실되었다. 본 연구에서 조사된 모든 시점의 경우, AbS의 PD 활성은 모든 시점에서 나타났거나 모든 시점에서 나타나지 않았는데, 이것은 전형적으로 IL-21-유도된 IL-2Rα 유전자 발현의 완전한 억제(RQ<1.5) 또는 억제의 결여(상응하는 전-투여 샘플에서의 RQ와 유사한 RQ)가 있음을 의미한다. 부분적 PD 반응은 IL-2Rα RQ 값에서 관찰된 동물내 변동성으로 인해 식별되기 어려웠다. AbS에 대한 부분적 PD 반응을 보이는 데이타 점은 추가 샘플링 시점이 말기에서 모아지는 경우 관찰될 가능성이 있다. AbS의 최소 PD 활성(C최소)을 유지하는 데 필요한 최소 농도는 정확히 평가될 수 없지만 약 4 내지 6 nM일 것이다.
AbT의 경우, PD 활성은 혈청 AbT 농도가 1.3 ㎍/㎖ 이상인 경우 투여량 투여 직후 관찰되었고 적어도 8일째 날까지 지속되었다(도 60a 내지 60c 및 표 33). 3마리 원숭이 모두의 경우 PD 활성은 15일째 날에 상실되었다(RQ>1.5). 15일째 날에서 동물 5 및 6로부터 수득된 혈액 샘플에서, IL-2Rα RQ 값은 상응하는 전-투여 값과 유사하였고(즉, PD 활성의 완전한 상실), 혈청 AbT 농도는 1.8 nM 미만이었다. 2.7의 관찰된 IL-2Rα RQ 값은 전-투여 시점에서의 IL-2Rα RQ 값(RQ = 4.8) 및 투여 후 22일째 날에서의 IL-2Rα RQ(RQ = 5.3; 도 60a) 미만이기 때문에 15일째 날 동물 4로부터 수득된 혈액 샘플에서 부분적인 PD 반응이 있었다. 또한, 동물 4는 동물 5 및 6에 비해 15일째 날에서 약간 더 긴 평가된 t1/2 및 다소 더 높은 AbT 혈청 농도(약 2.5 nM)를 보였다(도 60a 내지 60c). 이 데이타는 PD 활성의 유지에 필요한 AbT의 C최소가 약 2.5 nM임을 암시한다.
동형 대조군의 경우, 생체외-첨추가된 재조합 인간 IL-21은 모든 시점에서 3마리 원숭이 모두로부터 수득된 전혈 샘플에서 IL-2Rα RQ 값의 현저한 동물내 변동성을 보이면서 IL-2Rα 유전자 발현을 유도하였다(데이타는 나타내지 않음).
초기 PK 연구와 일치하여(실시예 10 참조), AbT는 AbS에 비해 원숭이에서 보다 빠른 제거를 보였고, 이때 평균 겉보기 t1/2는 AbS의 경우 10.6일이고 AbT의 경우 2.3일이었다. 15일째 날, PD 활성은 3마리 AbT-투여된 원숭이 모두에서 완전히 또는 부분적으로 상실되었지만, AbS 투여 군에서 3마리 원숭이 모두 비교적 높은 혈청 AbS 농도(약 6.0 내지 7.4 ㎍/㎖) 및 최대 PD 활성을 보였다. 따라서, 시아노몰구스 원숭이에서 AbS의 PD 활성 지속 기간 및 AbS의 t1/2는 보다 더 길었다.
실시예 13.5: 항-생성물 항체 반응
PD 활성의 상실이 관찰되는 제1 시점에서, rhuIL-21과 함께 항-IL-21R 항체의 생체외 첨가는 모든 AbS-투여된 원숭이 및 AbT-투여된 원숭이에서 IL-2Rα 유전자 발현의 유도를 억제하였는데(RQ<1.5), 이것은 rhuIL-21-유도된 유전자 발현의 복귀가 IL-21R을 통해 매개되고 중화 항-IL-21R 항체가 존재하지 않음을 암시한다(도 59 및 60). AbS의 생체외 첨가는 동물 1 및 3으로부터 모아진 후속 시점에서 억제 활성을 계속 입증하였다. 그러나, AbS는 50일째 날 동물 2에서 생체외 억제 활성을 나타내지 않았다(도 59). 유사하게, AbT는 22일째 날 및/또는 36일째 날 AbT-투여된 군의 모든 동물에서 생체외 억제 활성을 나타내지 않았다(도 60). 이 데이타는 AbS 군에서 동물 2 및 AbT 군에서 3마리 동물 모두(동물 4 내지 6)가 중화 항-생성물 항체를 발생시킴을 암시한다.
AbT-투여된 동물들에서 중화 항-AbT 항체의 존재는 직교 유세포분류(FACS)-기재 분석을 이용하여 확인하였다. TF-1 및 TF-1/rhuIL-21R(rhuIL-21R로 형질감염된 TF-1 세포)이 25 ng/㎖ huGMCSF(알앤디 시스템스)가 함유된 RPMI 배지에서 생장시켰다. 전면생장 세포 배양물을 300 g에서 10분 동안 원심분리하고, 옵티멤(OptiMEM) 무혈청 배지(인비트로겐 코포레이션)에 106 세포/㎖로 재현탁시키고 37℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 세포를 냉각된 PBS/0.5% BSA로 세척하고 빙냉 PBS 완충제에 재현탁시키고 염색될 때까지 얼음 상에 놓았다. TF-1/rhuIL-21R 세포에 결합하는 AbS-바이오틴 및 AbT-바이오틴에 대한 EC50을 측정하기 위해, 모 TF-1 세포 및 TF-1/rhuIL-21R 세포(시험 당 105개 세포)를 AbT-바이오틴 또는 IgG-바이오틴 대조군(연속 3배 희석물)(범위 16 내지 0.0002 ㎍/㎖)과 함께 얼음 상에서 30분 동안 항온처리하고, PBS/0.5% BSA로 세척한 후, 스트렙타비딘-알로파이코시아닌(APC; 인비트로겐 코포레이션)과 함께 항온처리하였다. APC 채널 피크의 기하 평균 형광 강도("GMFI")를 LSRII 유세포분류기(비디 바이오사이언시스) 상에서 모아 플루조(Flowjo) 8.3.3 소프트웨어(트리스타)를 이용하여 분석하였다. 도표의 선형 회귀 분석은 매킨토시 v4.0b(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드)에 대한 프리즘 4를 이용하여 수행하였다.
본 분석에서 혈청 샘플을 시험하기 위한 최소 요구 희석비(MRD)는 PBS/0.5% BSA 중의 1:6인 것으로 확인되었다. TF-1/rhuIL-21R 세포에 대한 AbT-바이오틴의 억제(즉, 중화 활성의 존재)를 시험하기 위해, TF-1/rhuIL-21R 세포를 항-IL-21R-투여된 원숭이로부터 수득된 혈청(MRD에서 시작하는 3배 연속 희석물을 사용함)과 함께 예비항온처리하고, (추정된 EC50 농도에서) 항-IL-21R-바이오틴으로 염색하고, PBS/0.5% BSA로 세척하고, 스트렙타비딘-APC로 염색하고 전술한 바와 같이 GMFI에 대해 분석하였다. 혈청 샘플 각각을 2종의 개별 실험에서 중복 사용하고, 4개의 재현물에 대한 평균 GMFI 값을 희석 점 각각에 대해 수득하였다. 희석 점 각각에 대한 혈청 샘플 각각의 상대적 GMFI 값은 수학식 [100%*평균 GMFI/투여 전 평균 GMFI]을 이용하여 계산하였다. 상대적 GMFI 값이 MRD에서 80% 이하인 경우 샘플은 양성으로 간주되었다. 양성 샘플의 경우, 로그 역가는 로그[80%보다 높은 상대적 GMFI을 야기할 희석비의 역수]로서 계산되었다. MRD에 의거할 때, 음성 샘플에 대한 로그 역가는 0.78(로그 6)보다 작은 것으로 보고되었다.
3마리의 AbT-투여된 동물 모두 22일째 날 및 36일째 날 2.2 내지 4.1의 로그 역가를 보이면서 FACS-기재 중화 항체 분석에서 양성으로 시험되었다(표 34).
[표 34]
Figure pct00046
AbS-투여된 동물들 중 1마리의 동물만이 생체외 IL-2Rα 유전자 발현 분석에서 중화 항-AbS 항체의 증거를 보였기 때문에, AbS-투여된 원숭이로부터 수득된 혈청 샘플은 중화 항-AbS 항체 및 비중화 항-AbS 항체 둘다를 검출하는 실시예 11.5에 기재된 전기화학발광 상자성 비드-기재 분석에서 시험되었다. 이 분석에서, 혈청 샘플을 바이오틴-부착된 AbS 및 루테늄-부착된 AbS와 함께 동시항온처리하고, 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드를 혼합물에 첨가하고, 방출된 광을 바이오베리스(BioVeris) 기술을 이용하여 검출하였다. 3마리의 AbS-투여된 원숭이들 모두 본 분석에서 1.86 내지 3.43의 로그 역가를 나타내면서 항-AbS 항체에 대해 양성을 나타내었다(표 35). 항-AbS 생성의 겉보기 발생 시점에서 유의한 동물간 변동성이 존재하였다. 바이오베리스-기재 분석에서 항-AbS 항체에 대해 양성을 나타내는 제1 혈청 샘플은 동물 1, 2 및 3의 경우 각각 134일째 날, 36일째 날 및 92일째 날에 수득되었다. 따라서, 3마리의 AbS-투여된 동물들 중에서 동물 2는 항-AbS 항체 반응의 가장 짧은 t1/2, 가장 빠른 발생 시점 및 최대 역가를 보였다. 또한, 동물 2는 생체외 IL-2Rα 유전자 발현 분석에서 3마리의 AbS-투여된 원숭이들 모두와 유사한 중화 항-AbS 항체 반응의 증거를 보인 유일한 AbS-투여된 원숭이였다.
[표 35]
Figure pct00047
실시예 14: 시아노몰구스 원숭이에서 추가 항- IL -21R 항체의 PK 및 PD
단백질-투여 무경험 시아노몰구스 원숭이에게 단회 정맥내 투여한 후(각각 10, 10 및 1 mg/kg), AbV, AbU 및 AbW의 PK를 조사하고, PK 파라미터를 AbS 및 AbT에서 수득된 PK 데이타와 비교하였다(표 36 및 도 61). 생체분석적 분석 및 PK 계산을 실시예 13에서 AbS 및 AbT에 대해 기재된 바와 같이 수행하였다.
모든 화합물들에서, 항-생성물 항체의 상이한 형성 개시 시점과 관련되어 있는 듯한, 말기에서의 유의한 동물간 변동성이 존재하였다. 10 mg/kg이 원숭이에게 단회 정맥내 투여된 후, AbV 및 AbS는 유사한 평균 혈청 농도 및 PK 파라미터를 보이는 듯하였다. 원숭이에게 단회 정맥내 투여된 후, AbV 및 AbS는 시험된 모든 인간 항-IL-21R 항체들에서 가장 느린 평균 CL, 가장 긴 평균 t1 /2 및 가장 높은 (투여량-표준화된) 평균 혈청 농도를 나타내는 듯하였다. AbT는 시험된 모든 인간 항-IL-21R 항체들에서 가장 빠른 평균 CL, 가장 짧은 평균 t1/2 및 가장 낮은 (투여량-표준화된) 평균 혈청 농도를 나타내었다. 시아노몰구스 원숭이에게의 단회 정맥내 투여 후 평균 혈청 프로파일 및 PK 파라미터의 비교는 PK 프로파일에 의거한 인간 항-IL-21R Ab 항체의 등급이 S-D 래트와 시아노몰구스 원숭이 간에 유사함을 암시하였다(실시예 10.10 또한 참조).
[표 36]
Figure pct00048
동일한 연구에서, 원숭이에서 AbU 내지 AbW(AbU, AbV 및 AbW)의 PD 활성을 생체외 rhuIL-21-유도된 유전자 발현 분석(실시예 13에 기재됨)을 이용하여 조사하였다.
제1 샘플링 시점인 5분에서, AbU 내지 AbW는 모든 원숭이들에서 PD 활성을, 즉 생체외 전혈 분석에서 rhuIL-21-유도된 유전자 발현의 완전한 억제를 나타내었는데, 이것은 AbS 및 AbT에 대해 수득된 데이타와 유사하였다. PD 활성은 혈청으로부터 AbU 내지 AbW를 세척하였을 때 상실되었다.
실시예 15: 파상풍 독소-감염된 수컷 시아노몰구스 원숭이 및 암컷 시아노몰구스 원숭이에게 정맥내 투여된 후 AbS의 PK
2 또는 10 mg/kg의 AbS를 파상풍 독소-감염된 시아노몰구스 원숭이에게 주마다 3회 정맥내 투여한 후 AbS의 PK를 조사하였다. 예를 들어, 실시예 13에 기재된 바와 같이, AbS 혈청 농도 및 항-AbS 항체를 특이적 ELISA로 모니터링하고, PK 파라미터를 비-구획화 분석으로 계산하였다.
2 또는 10 mg/kg이 원숭이에게 주마다 3회 정맥내 투여된 후, AbS 농도-시간 프로파일 및 PK 파라미터는 동일한 투여군(군 당 성별 당 n=3)에서 수컷 원숭이와 암컷 원숭이 사이에 일반적으로 유사하였다. 제1 투여 후 5분에서의 평균 농도(C5 분) 및 제3 투여 후 5분에서의 평균 농도(C14 일,5분)뿐만 아니라 제3 투여 후 평균 노출(AUC14일-21일)은 투여량 수준에 따라 증가하였다. 2 mg/kg 투여군에서, 평균 C5 분은 28.4 ± 2.50 ㎍/ml이었고, 평균 C14 일,5분은 35.7 ± 11.0 ㎍/ml이었고, 평균 AUC14 일-21일은 1279 ± 592 ㎍*hr/ml이었다. 10 mg/kg 투여군에서, 평균 C5 분은 120 ± 59.9 ㎍/ml이었고, 평균 C14 일,5분은 152 ± 21.9 ㎍/ml이었고, 평균 AUC14 일-21일은 7700 ± 782 ㎍*hr/ml이었다. AbS의 제3 정맥내 투여 후 제거 반감기(t1 /2)는 2 mg/kg 투여군 및 10 mg/kg 투여군에서 각각 25.6 ± 22.7 및 168 ± 56.5시간이었다(p=0.0002)(도 62).
2 mg/kg 투여군에서, AbS 농도는 제3 정맥내 투여 후 급속히 감소하였고, 6마리 원숭이 모두가 28일째 날(제3 투여 후 2주)부터 연구의 말기 시점까지 항-AbS 항체에 대해 양성으로 시험되었는데, 이것은 비교적 짧은 t1/2와 일치하였다(도 62a). 10 mg/kg 투여군에서, 6마리 원숭이들 중 2마리의 원숭이(SAN 7 및 SAN 8)가 (42일째 또는 49일째 날에서) 항-AbS 항체에 대해 양성으로 시험되었고, 이 원숭이들은 상기 투여군에서 가장 짧은 t1/2 값을 보였는데, 이것은 항-AbS 항체의 형성이 AbS의 t1/2와 상호관련되어 있음을 암시한다(도 62b).
실시예 16: 단회 투여 후 인간에서 AbS 및 AbT의 PK의 예측
인간에서 AbS 및 AbT의 PK를 예측하기 위해, 두 방법을 이용하였다. 제1 방법의 경우, 인간에서 항-IL-21R Ab의 PK 파라미터(예컨대, CL 및 분포 용적)는 시아노몰구스 원숭이들의 PK 파라미터와 유사할 것으로 가정하였다. 제2 방법의 경우, 상대성장 스케일링을 이용하여, 항-IL-21R 항체의 단회 정맥내 투여 후 마우스, 래트 및 시아노몰구스 원숭이로부터 수득된 동물 데이타에 의거하여 인간 PK 파라미터를 평가하였다. 문헌(Mahmood (1996) Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 21:275-78), 문헌(Mahmood and Balian (1996) Xenobiotica 26:887-95), 문헌(Sacher, "Relation of lifespan to brain weight and body weight in mammals" in CIBA Foundation Symposium - The Lifespan of Animals (Colloquia on Aging), 115-33 (Wolstenholme GEW, O'Connor M, eds, 1959)) 및 문헌(Hahn ME, Haber SB. (1978) Behav Genet., 8:251-260)에 이미 기재된 방법에 따라 AbS의 경우 최대 수명 잠재력(MLP)의 조절 및 AbT의 경우 뇌 중량의 조절을 이용하여 CL의 상대성장 스케일링을 수행하였다. AbS 및 AbT에 대한 상대성장 스케일링 데이타는 각각 도 63a 및 63b 및 도 64a 및 64b에 도시되어 있다.
요약하건대, 상기 두 방법은 인간에서 AbS의 낮은 제거율(CL) 및 작은 정지-상태 분포 용적(Vdss)을 암시한다. AbS의 예측된 CL은 약 0.72 내지 1.3 ml/hr/kg이고, 추정된 Vdss는 약 92.4 내지 125 ml/kg이었다. 1 mg/kg의 AbS를 체중 60 kg의 인간에게 정맥내 투여한 후, 상대성장 스케일링 방법에 의해 수득된 CL 값에 의거하여 추정된 노출(AUC0-∞)은 1393 ㎍*hr/ml이다. AbT의 경우, 이 두 방법들은 약 5 내지 8.5 ml/hr/kg의 보다 높은 CL 및 약 115 내지 202 ml/hr/kg의 Vdss를 암시하였다.
실시예 17: AbS 를 사용한 처리는 NZBWF1 /J 뮤린 루푸스 신장염 모델에서 질환에 영향을 미치지 않는다.
NZBWF1/J 마우스를 이용하여 뮤린 루푸스 모델에서 질환을 감소시키는 항-IL-21R 항체 AbS의 능력을 시험하였다. 암컷 NZBWF1/J 마우스는 순환하는 IgG 항-핵 자가 항체 및 항-dsDNA 자가 항체의 높은 역가, 사구체에 존재하는 IgG 침착물, 및 단백뇨를 포함하는, 인간 루푸스 신장염에서 관찰된 증상과 유사한 증상을 자연적으로 발달시킨다. 소변 중의 단백질의 존재에 의해 측정되는 신장 질환의 발병은 암컷 NZBWF1/J 마우스에서 약 26주령에서 일어난다. AbS를 사용한 IL-21R 차단의 효과를 조사하기 위해, 26주령의 암컷 NZBWF1/J 마우스에게 식염수(비히클 대조군), CTLA-4Ig(뮤린 IgG2a, 양성 대조군), 항-에이메리아 테넬라 항체(뮤린 IgG2a 동형 대조군), AbS 또는 인간 항체 동형 대조군(삼중 돌연변이를 가진 인간 IgG1 항체)을 400 ㎍/마우스의 투여량으로 10주에 걸쳐 주 당 3회씩 복강내 주사하였다. 혈청 샘플을 2주마다 채취하여 ELISA로 IgG 항-dsDNA 항체에 대해 분석하였다. 소변을 채취하고 알부스틱스(Albustix)(바이엘 헬쓰케어(Bayer HealthCare), 미국 뉴욕주 태리타운 소재)를 이용하여 단백질 농도에 대해 2주마다 조사하였다. 모든 동물 군들은 연구의 개시 시점에서 유사한 수준의 단백뇨를 보였고, 단백뇨의 정도는 식염수, 항-에이메리아 테넬라 및 hIgG1TM 대조군에서 연구 기간에 걸쳐 상승하였다(도 65a). 이 모델에서 질환을 완화시키는 것으로 이미 확인된 CTLA-4Ig 단백질을 사용한 처리는 상기 마우스들에서 증가된 단백뇨의 발생을 방지하였다. 대조적으로, AbS를 사용한 처리는 대조군 마우스와 비교할 때 NZBWF1/J 마우스에서 단백뇨의 발달에 영향을 미치지 못하였다(도 65a). 유사하게, CTLA-4Ig를 사용한 처리는 NZBWF1/J 마우스에서 항-dsDNA IgG 혈청 항체를 유의하게 감소시키는 반면, AbS를 사용한 처리는 이 마우스에서 항-dsDNA 항체의 생성에 영향을 미치지 못하였다(도 65b).
실시예 18: 반-치료적 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 마우스 모델에서 항-IL-21R 항체를 사용한 처리의 효과
뮤린 콜라겐-유도된 류마티스 관절염 모델에서 질환을 감소시키는 항체 AbS 및 AbT의 능력을 시험하였다. 완전 프로인트 보강제 중에 에멀젼화된 소 콜라겐 타입 II 100 mg을 암컷 DBA/1 마우스의 꼬리에 피내 투여한 다음, 21일 후 불완전 프로인트 보강제 중에 에멀젼화된 소 콜라겐 타입 II 100 mg을 동일한 부위에 투여하여 부스팅함으로써 상기 마우스를 면역화시시켰다. 소 콜라겐 타입 II를 사용한 제2 면역화 후, 팽윤에 대해 발을 조사하여 0 내지 16의 등급으로 중증도를 기록하였는데, 이때 0은 팽윤이 없음을 표시하고, 16은 중증 질환을 표시한다. 연구에서 동물들의 10%가 질환의 징후를 보이면, 동물들을 비-처리된 상태로 방치하거나, 8 mg/kg의 뮤린 IgG2a 동형 대조군 항체, 항-마우스 IL-21R 항체 D5(뮤린 IgG2a 항체), mTNFRII-Fc(양성 대조군, 뮤린 IgG2a 동형), 항-IL-13TM 항체(인간 IgG1 동형 대조군 항체), AbT 또는 AbS로 30일 동안 주 당 3회 처리하였다. 본 연구에서 전체 질환 중증도는 이 모델에서 통상적으로 관찰되는 정도만큼 심각한 것으로 관찰되지 않았다. 연구 마지막 날, 비-처리된 마우스 및 동형 대조군으로 처리된 마우스에서 평균 질환 중증도는 0 내지 16의 등급에서 4 미만이었다(도 66c). 또한, mTNFRII-Fc 양성 대조군을 사용한 처리가 본 연구에서 질환을 경감시키지만, 질환 중증도에서의 통계학적으로 유의한 차이는 투여 후 22일째 날에 이 처리군의 질환과 동형 대조군 처리군의 질환 사이에서만 관찰되었다. 항-마우스 IL-21R 항체(D5) 또는 항-인간 IL-21R 항체(AbS 및 AbT)를 사용한 처리도 본 연구에서 질환 중증도에 영향을 미치지 않았다(도 66a 및 66b).
실시예 19: 시아노몰구스 원숭이에서 파상풍 면역화에 대한 기억상실 항체 반응의 형성에 대한 항체 효과의 시험
시아노몰구스 원숭이에서 파상풍 면역화에 대한 기억상실 항체 반응의 발달에 대한 항-IL-21R 항체 AbS의 효과를 조사하였다. 9마리의 암컷 시아노몰구스 원숭이 및 9마리의 수컷 시아노몰구스 원숭이를 파상풍 독소에 대한 혈청 항체 역가에 대해 시험하여 파상풍-무경험 동물을 확인하였다. 이어서, 상기 동물들에게 2회 균등 분할(0.25 ml) 투여량으로 0.5 ml의 파상풍 독소를 근육내 투여하고, 혈액을 35일 동안 7일마다 채취하여 ELISA로 항-파상풍 IgM 및 IgG 혈청 항체에 대해 조사하였다. 제1 면역화로부터 43일 후, 3마리의 수컷 시아노몰구스 원숭이 및 3마리의 암컷 시아노몰구스 원숭이로 구성된 군을 무작위로 배정하고, 식염수(비히클), 2 mg/kg AbS 또는 10 mg/kg AbS를 상박/두부 또는 두렁 정맥 내로의 정맥내 느린 볼루스로서 1 ml/kg의 투여 부피(2 ml 비히클로 부피를 조정함)로 3주 동안 주 당 1회 투여하였다. AbS 또는 비히클의 제1 투여량을 투여한 지 24시간 후, 2회 균등 분할(0.25 ml) 투여량으로 0.5 ml의 파상풍 독소를 근육내로 투여함으로써 원숭이들을 다시 면역화시키고, 혈액을 관용적으로 채취하고, ELISA로 항-파상풍 IgM 및 IgG 항체에 대해 조사하였다. 파상풍 독소를 사용한 제1 면역화 후 14일 이내에 IgM 및 IgG 파상풍 혈청 항체가 수컷 시아노몰구스 원숭이 및 암컷 시아노몰구스 원숭이 둘다에서 검출될 수 있었다(도 67a). 파상풍 특이적 혈청 IgM 역가는 임의의 처리군에서 파상풍 독소를 사용한 제2 면역화 후 변화지 않았다. 파상풍 특이적 IgG 혈청 역가는 약 10 내지 20배 더 높았고 제2 면역화 후 식염수 처리된 동물에서 더 신속히 생성되었는데, 이것은 기억상실 항체 반응의 속도와 일치한다(도 67b). 2 mg/kg 또는 10 mg/kg AbS를 사용한 처리는 제2 면역화 후 시아노몰구스 원숭이에서 파상풍 특이적 IgG 혈청 항체 반응의 발생에 영향을 미치지 않았는데, 이것은 AbS를 사용한 처리가 이 처리 프로토콜을 이용하여 파상풍 독소에 대한 기억상실 항체 반응의 형성에 영향을 미치지 않음을 암시한다(도 67b).
등가물
당업자는 과도한 실험을 수행하지 않고 본 명세서에 개시된 본 발명의 구체적인 실시양태들의 많은 등가물을 인식하거나 달성할 수 있다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Wyeth LLC <120> METHODS OF TREATMENT UTILIZING BINDING PROTEINS OF THE INTERLEUKIN-21 RECEPTOR <130> 01997.069001 <140> PCT/US2009/045188 <141> 2009-05-26 <150> US 61/055,543 <151> 2008-05-23 <150> US 61/099,476 <151> 2008-09-23 <160> 248 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2665 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (236)..(1849) <400> 1 gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg 60 tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat 120 ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc 180 acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagc atg 238 Met 1 ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg ctg ctc cag gga ggc 286 Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly Gly 5 10 15 tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc cag acg gtc 334 Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val 20 25 30 atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc acc ctt 382 Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu 35 40 45 acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc tcc tgc 430 Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys 50 55 60 65 agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc tgc 478 Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys 70 75 80 cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc aac 526 His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn 85 90 95 atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc agc ttt ctc 574 Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu 100 105 110 ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg act gtg acc 622 Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr 115 120 125 ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa gac cct 670 Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro 130 135 140 145 gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac agg 718 Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg 150 155 160 aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg atc tca 766 Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser 165 170 175 gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc aaa gac 814 Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp 180 185 190 tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc tcc tcc 862 Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser 195 200 205 tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt cag acc 910 Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr 210 215 220 225 cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cct cac ctg ctg ctt ctc 958 Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu 230 235 240 ctc ctg ctt gtc ata gtc ttc att cct gcc ttc tgg agc ctg aag acc 1006 Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys Thr 245 250 255 cat cca ttg tgg agg cta tgg aag aag ata tgg gcc gtc ccc agc cct 1054 His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser Pro 260 265 270 gag cgg ttc ttc atg ccc ctg tac aag ggc tgc agc gga gac ttc aag 1102 Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe Lys 275 280 285 aaa tgg gtg ggt gca ccc ttc act ggc tcc agc ctg gag ctg gga ccc 1150 Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly Pro 290 295 300 305 tgg agc cca gag gtg ccc tcc acc ctg gag gtg tac agc tgc cac cca 1198 Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His Pro 310 315 320 cca cgg agc ccg gcc aag agg ctg cag ctc acg gag cta caa gaa cca 1246 Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu Pro 325 330 335 gca gag ctg gtg gag tct gac ggt gtg ccc aag ccc agc ttc tgg ccg 1294 Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp Pro 340 345 350 aca gcc cag aac tcg ggg ggc tca gct tac agt gag gag agg gat cgg 1342 Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg 355 360 365 cca tac ggc ctg gtg tcc att gac aca gtg act gtg cta gat gca gag 1390 Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala Glu 370 375 380 385 ggg cca tgc acc tgg ccc tgc agc tgt gag gat gac ggc tac cca gcc 1438 Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala 390 395 400 ctg gac ctg gat gct ggc ctg gag ccc agc cca ggc cta gag gac cca 1486 Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp Pro 405 410 415 ctc ttg gat gca ggg acc aca gtc ctg tcc tgt ggc tgt gtc tca gct 1534 Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Ala 420 425 430 ggc agc cct ggg cta gga ggg ccc ctg gga agc ctc ctg gac aga cta 1582 Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu 435 440 445 aag cca ccc ctt gca gat ggg gag gac tgg gct ggg gga ctg ccc tgg 1630 Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro Trp 450 455 460 465 ggt ggc cgg tca cct gga ggg gtc tca gag agt gag gcg ggc tca ccc 1678 Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro 470 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Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe 100 105 110 Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val 115 120 125 Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp 130 135 140 Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr 145 150 155 160 Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile 165 170 175 Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys 180 185 190 Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser 195 200 205 Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln 210 215 220 Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu 225 230 235 240 Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys 245 250 255 Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser 260 265 270 Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe 275 280 285 Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly 290 295 300 Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His 305 310 315 320 Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu 325 330 335 Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp 340 345 350 Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp 355 360 365 Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala 370 375 380 Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro 385 390 395 400 Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp 405 410 415 Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser 420 425 430 Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro 450 455 460 Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser 465 470 475 480 Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly 485 490 495 Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp 500 505 510 Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro 515 520 525 Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser 530 535 <210> 3 <211> 2628 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (407)..(1993) <400> 3 gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt 60 gcttgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc 120 caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc 180 tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt 240 ctggacttgc acctgactga actcctgccc acctcaaacc ttcacctccc accaccacca 300 ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga 360 atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagc atg ccc cgg 415 Met Pro Arg 1 ggc cca gtg gct gcc tta ctc ctg ctg att ctc cat gga gct tgg agc 463 Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly Ala Trp Ser 5 10 15 tgc ctg gac ctc act tgc tac act gac tac ctc tgg acc atc acc tgt 511 Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys 20 25 30 35 gtc ctg gag aca cgg agc ccc aac ccc agc ata ctc agt ctc acc tgg 559 Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp 40 45 50 caa gat gaa tat gag gaa ctt cag gac caa gag acc ttc tgc agc cta 607 Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe Cys Ser Leu 55 60 65 cac agg tct ggc cac aac acc aca cat ata tgg tac acg tgc cat atg 655 His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr Cys His Met 70 75 80 cgc ttg tct caa ttc ctg tcc gat gaa gtt ttc att gtc aat gtg acg 703 Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val Asn Val Thr 85 90 95 gac cag tct ggc aac aac tcc caa gag tgt ggc agc ttt gtc ctg gct 751 Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Val Leu Ala 100 105 110 115 gag agc atc aaa cca gct ccc ccc ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca 799 Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val Ala Phe Ser 120 125 130 gga cgc tat gat atc tcc tgg gac tca gct tat gac gaa ccc tcc aac 847 Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn 135 140 145 tac gtg 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Arg Pro Tyr Gly Leu 360 365 370 gtg tcc att gac aca gtg act gtg gga gat gca gag ggc ctg tgt gtc 1567 Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys Val 375 380 385 tgg ccc tgt agc tgt gag gat gat ggc tat cca gcc atg aac ctg gat 1615 Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp 390 395 400 gct ggc cga gag tct ggc cct aat tca gag gat ctg ctc ttg gtc aca 1663 Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu Val Thr 405 410 415 gac cct gct ttt ctg tct tgc ggc tgt gtc tca ggt agt ggt ctc agg 1711 Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly Leu Arg 420 425 430 435 ctt gga ggc tcc cca ggc agc cta ctg gac agg ttg agg ctg tca ttt 1759 Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe 440 445 450 gca aag gaa ggg gac tgg aca gca gac cca acc tgg aga act ggg tcc 1807 Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser 455 460 465 cca gga ggg ggc tct gag agt gaa gca ggt tcc ccc cct ggt ctg gac 1855 Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp 470 475 480 atg gac aca ttt gac agt ggc ttt gca ggt tca gac tgt ggc agc ccc 1903 Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro 485 490 495 gtg gag act gat gaa gga ccc cct cga agc tat ctc cgc cag tgg gtg 1951 Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val 500 505 510 515 gtc agg acc cct cca cct gtg gac agt gga gcc cag agc agc 1993 Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser 520 525 tagcatataa taaccagcta tagtgagaag aggcctctga gcctggcatt tacagtgtga 2053 acatgtaggg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 2113 gtgtgtgtgt cttgggttgt gtgttagcac atccatgttg ggatttggtc tgttgctatg 2173 tattgtaatg ctaaattctc tacccaaagt tctaggccta cgagtgaatt ctcatgttta 2233 caaacttgct gtgtaaacct tgttccttaa tttaatacca ttggttaaat aaaattggct 2293 gcaaccaatt actggaggga ttagaggtag ggggcttttg agttacctgt ttggagatgg 2353 agaaggagag aggagagacc aagaggagaa ggaggaagga gaggagagga gaggagagga 2413 gaggagagga gaggagagga gaggagagga gaggagaggc tgccgtgagg ggagagggac 2473 catgagcctg tggccaggag aaacagcaag tatctggggt acactggtga ggaggtggcc 2533 aggccagcag ttagaagagt agattagggg tgacctccag tatttgtcaa agccaattaa 2593 aataacaaaa aaaaaaaaaa agcggccgct ctaga 2628 <210> 4 <211> 529 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr 20 25 30 Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser 35 40 45 Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe 50 55 60 Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr 65 70 75 80 Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val 85 90 95 Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe 100 105 110 Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val 115 120 125 Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu 130 135 140 Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr 145 150 155 160 Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile 165 170 175 Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys 180 185 190 Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr 195 200 205 Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln 210 215 220 Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu 225 230 235 240 Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile 245 250 255 His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr 260 265 270 Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe 275 280 285 Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val 290 295 300 Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro 305 310 315 320 Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu 325 330 335 Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu 340 345 350 Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg 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aggggttgga gtggattggg agtatctctc atactgggaa cacctactac 180 aacccgcccc tcaagagtcg cgtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaaactga gctctgtgac cgccgcagac acggccgtgt attactgtgc gcgaggtggg 300 ggaattagca ggccggagta ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagt 354 <210> 6 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Thr Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Ser Ile Ser His Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Pro Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Ile Ser Arg Pro Glu Tyr Trp Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 caggtgcagc tgcaggagtc tggccctggc ctggtgaagc cttccgagac cctgtctctg 60 acctgtgccg 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His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His 20 25 30 35 atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat 199 Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn 40 45 50 tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta 247 Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val 55 60 65 gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgc ttt cag aag gcc caa 295 Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln 70 75 80 cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata atc aat gta tca 343 Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser 85 90 95 att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat gca ggg aga aga 391 Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg 100 105 110 115 cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct tat gag aaa aaa 439 Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys 120 125 130 cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt ctc caa aag atg 487 Pro Pro Lys Glu Phe 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<211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer G_VH_F_for_SalI <400> 232 tccaagaacc agttctccct g 21 <210> 233 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer scFv_SalI_VH_R <400> 233 gcgacgtcga caggactcac cactcgagac ggtgaccagg gtgcc 45 <210> 234 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sal_VH_R_RJ <400> 234 gcgacgtcga caggactcac cactcgagac gg 32 <210> 235 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BssHII_II_VL_F <400> 235 gcttggcgcg cactcttcct ctgagctgac ccag 34 <210> 236 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer scFv_VL_R_for_BssHII <400> 236 gcctgagccc cagtgatggt ca 22 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GVL_F_for_XbaI <400> 237 accgcctccc tgaccatcac 20 <210> 238 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer scFv_XbaI_VL_R <400> 238 gcgccgtcta gagttattct actcacctaa aacggtgagc tgggtccctc 50 <210> 239 <211> 1401 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VHPTM heavy chain with signal sequence <400> 239 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggcaacag ctacaggcgt gcactctcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg ccctggcctg gtgaagcctt ccgagaccct gtctctgacc 120 tgtgccgtgt ccggctactc catctcctcc ggctactact ggggctggat cagacagcct 180 cctggcaagg gcctggagtg gatcggctcc atctctcaca ccggcaacac ctactacaac 240 ccccctctga agtccagagt gaccatctcc gtggacacct ccaagaacca gttctccctg 300 aagctgtcct ctgtgaccgc tgccgatacc gccgtgtact actgtgccag aggcggcgga 360 atctccagac ctgagtactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc tgcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggc accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggtcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa a 1401 <210> 240 <211> 467 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VHPTM heavy chain with signal sequence <400> 240 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser His Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Pro Pro Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ile Ser Arg Pro Glu Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 245 250 255 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 241 <211> 1401 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VH3TM heavy chain with signal sequence <400> 241 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggcaacag ctacaggcgt gcactctcag 60 gtgcagctgc aggagtctgg ccctggcctg gtgaagcctt ccgagaccct gtctctgacc 120 tgtgccgtgt ccggctactc catctcctcc ggctactact ggggctggat cagacagcct 180 cctggcaagg gcctggagtg gatcggctcc atctctcaca ccggcaacac ctactacaac 240 ccccctctga agtccagagt gaccatctcc gtggacacct ccaagaacca gttctccctg 300 aagctgtcct ctgtgaccgc tgccgatacc gccgtgtact actgtgccag attcatgggg 360 ttcggccgcc cggagtactg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc tgcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ccgcgggggc accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggtcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ccccgggtaa a 1401 <210> 242 <211> 467 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH3TM heavy chain with signal sequence <400> 242 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile 35 40 45 Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser His Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Pro Pro Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Met Gly Phe Gly Arg Pro Glu Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 245 250 255 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 243 <211> 703 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL2 light chain with signal sequence <400> 243 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggcaacag ctacaggcgt gcactcttcc 60 tctgagctga cccaggatcc tgctgtgtct gtggccctgg gccagaccgt caggatcacc 120 tgccagggcg atagcctgag aacctactac gcctcctggt atcagcagaa gcctggacag 180 gcccctgtgc tggtgatcta cggcaagcac aagaggccat ccggcatccc tgacagattc 240 tccggctcct cctctggcaa taccgcctcc ctgaccatca ctggggctca ggcggaagac 300 gaggctgact attactgtgt cgcccggtcg gtggtgggca acccccatgt tctgttcggc 360 ggagggaccc agctcaccgt tttaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 420 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 480 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 540 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 600 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 660 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt cat 703 <210> 244 <211> 234 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL2 light chain with signal sequence <400> 244 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Gly Lys His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ala Arg Ser Val Val 100 105 110 Gly Asn Pro His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 115 120 125 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 165 170 175 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 180 185 190 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 195 200 205 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 210 215 220 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 245 <211> 703 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL18 light chain with signal sequence <400> 245 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggcaacag ctacaggcgt gcactcttcc 60 tctgagctga cccaggatcc tgctgtgtct gtggccctgg gccagaccgt caggatcacc 120 tgccagggcg atagcctgag aacctactac gcctcctggt atcagcagaa gcctggacag 180 gcccctgtgc tggtgatcta cggcaagcac aagaggccat ccggcatccc tgacagattc 240 tccggctcct cctctggcaa taccgcctcc ctgaccatca ctggggctca ggcggaagac 300 gaggctgact attactgtgt cacgaggagc gtgaagggca acccccatgt tctgttcggc 360 ggagggaccc agctcaccgt tttaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 420 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 480 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 540 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 600 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 660 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt cat 703 <210> 246 <211> 234 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL18 light chain with signal sequence <400> 246 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Gly Lys His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Thr Arg Ser Val Lys 100 105 110 Gly Asn Pro His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 115 120 125 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 165 170 175 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 180 185 190 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 195 200 205 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 210 215 220 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 <210> 247 <211> 703 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL25 light chain with signal sequence <400> 247 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtggcaacag ctacaggcgt gcactcttcc 60 tctgagctga cccaggatcc tgctgtgtct gtggccctgg gccagaccgt caggatcacc 120 tgccagggcg atagcctgag aacctactac gcctcctggt atcagcagaa gcctggacag 180 gcccctgtgc tggtgatcta cggcaagcac aagaggccat ccggcatccc tgacagattc 240 tccggctcct cctctggcaa taccgcctcc ctgaccatca ctggggctca ggcggaagac 300 gaggctgact attactgtac gacgcggagc aacaagggca acccccatgt tctgttcggc 360 ggagggaccc agctcaccgt tttaggtcag cccaaggctg ccccctcggt cactctgttc 420 ccgccctcct ctgaggagct tcaagccaac aaggccacac tggtgtgtct cataagtgac 480 ttctacccgg gagccgtgac agtggcctgg aaggcagata gcagccccgt caaggcggga 540 gtggagacca ccacaccctc caaacaaagc aacaacaagt acgcggccag cagctatctg 600 agcctgacgc ctgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 660 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt cat 703 <210> 248 <211> 234 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VL25 light chain with signal sequence <400> 248 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala 20 25 30 Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Thr 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 50 55 60 Val Ile Tyr Gly Lys His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala 85 90 95 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Arg Ser Asn Lys 100 105 110 Gly Asn Pro His Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 115 120 125 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 165 170 175 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 180 185 190 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 195 200 205 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 210 215 220 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230

Claims (35)

  1. 인간 인터루킨-21 수용체(IL-21R)에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 항체인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 단일-쇄 가변 단편(scFv)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 중쇄 가변 영역(VH)인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 경쇄 가변 영역(VL)인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 상보성 결정 영역(CDR)인, 방법.
  7. 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  9. 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 내지 195, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편이 서열번호 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 194 및 195로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열도 포함해야 하는, 방법.
  10. 인간 IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 5, 7, 9 및 11로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 약 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 하나 이상의 아미노산 서열도 포함해야 하는, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 내지 195, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 6, 8, 10, 12, 163, 164, 169, 170, 194 및 195로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 95% 이상 동일한 하나 이상의 아미노산 서열도 포함해야 하는, 방법.
  12. IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄가 서열번호 14, 16, 18, 20, 68, 70, 72, 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 및 242로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  13. IL-21R에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214 내지 217, 220 내지 229, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하고, 이때 상기 VH 도메인이 서열번호 14, 16, 18 및 20으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하고, 이때 상기 VL 도메인이 서열번호 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 215, 217, 221, 223, 225, 227 및 229로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, 방법.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    중쇄가 서열번호 88, 90, 92, 94, 213, 218, 219, 240 및 242로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄가 서열번호 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 214, 216, 220, 222, 224, 226, 228, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  17. AbA 내지 AbW, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및 L23 내지 L25로 구성된 군으로부터 선택된 결합 단백질에 의해 인식되는 인간 IL-21R 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편을, 대상체에서 면역 세포 활성을 억제하거나 감소시키기에 충분한 양으로 상기 대상체에게 투여하여 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 IL-21R-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 이때 상기 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 AbA 내지 AbW, H3 내지 H6, L1 내지 L6, L8 내지 L21 및 L23 내지 L25로 구성된 군으로부터 선택된 결합 단백질과 인간 IL-21R의 결합을 경쟁적으로 억제하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 165 내지 168, 171 내지 193, 213 내지 229, 240, 242, 244, 246 및 248로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 경쇄 또는 Fv 단편을 포함하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 239, 241, 243, 245 및 247로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 경쇄 또는 Fv 단편을 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서,
    결합 단백질이 AbO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, AbV 및/또는 AbW에 의해 인식되는 IL-21R 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이때 상기 결합 단백질이 AbO, AbP, AbQ, AbR, AbS, AbT, AbU, AbV 및/또는 AbW와 인간 IL-21R의 결합을 경쟁적으로 억제하는, 방법.
  21. 제1항, 제9항, 제12항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-21R-관련 질환이 자가면역 질환, 염증 상태, 알레르기, 이식편 거부 및 혈액 과다증식성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    IL-21R-관련 질환이 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스, 건선, 이식편 거부, 류마티스성 관절염 및 다른 관절염 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제1항, 제9항, 제12항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 인간 IL-21R에 대하여 105 M-1s-1 이상의 결합 상수를 나타내는, 방법.
  24. 제1항, 제9항, 제12항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 약 1.75 nM 이하의 IC50으로 IL-21-매개된 BaF3 세포 증식을 억제하고, 상기 BaF3 세포가 인간 IL-21R을 포함하는, 방법.
  25. 제1항, 제9항, 제12항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 약 14 nM 이하의 IC50으로 IL-21-매개된 TF1 세포 증식을 억제하고, 상기 TF1 세포가 인간 IL-21R을 포함하는, 방법.
  26. 제1항, 제9항, 제12항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 약 1.9 nM 이하의 IC50으로 IL-21-매개된 일차 인간 B 세포 증식을 억제하고, 상기 B 세포가 인간 IL-21R을 포함하는, 방법.
  27. 제1항, 제9항, 제12항, 제13항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편이 약 1.5 nM 이하의 IC50으로 IL-21-매개된 일차 인간 CD4+ 세포 증식을 억제하고, 상기 CD4+ 세포가 인간 IL-21R을 포함하는, 방법.
  28. (a) 대상체로부터 수득된 제1 혈액 샘플을 IL-21 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) IL-21 리간드와 접촉된 제1 혈액 샘플에서 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 대상체로부터 수득된 제2 혈액 샘플을 항-IL-21R 항체의 존재 하에 IL-21 리간드와 접촉시키는 단계;
    (d) 항-IL-21R 항체의 존재 하에 IL-21 리간드와 접촉된 제2 혈액 샘플에서 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (e) 단계 (b)에서 측정된 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을, 단계 (d)에서 측정된 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 항-IL-21R 항체가 치료 항-IL-21R 항체인지를 확인하는 방법으로서, 이때 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준의 변화가 상기 항-IL-21R 항체가 치료 항체임을 표시하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    1종 이상의 IL-21-반응성 유전자가 TNF, IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSF1, GZMB, PRF1, IL-2Rα 및 IL-21R로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    1종 이상의 IL-21-반응성 유전자가 IL-2Rα인, 방법.
  31. 대상체의 혈액 샘플에서 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준의 조절을 검출함을 포함하는, 항-IL-21R 항체의 약력학적 활성을 측정하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준의 조절을 검출함이
    (a) 항-IL-21R 항체를 대상체에게 투여하여 상기 대상체를 상기 항-IL-21R 항체로 치료하는 단계;
    (b) 항-IL-21R 항체로 치료받은 대상체로부터 수득된 혈액 샘플을 IL-21 리간드와 접촉시키는 단계;
    (c) 항-IL-21R 항체로 치료받은 대상체로부터 수득되고 IL-21R 리간드와 접촉된 혈액 샘플에서 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 측정된 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준을, 항-IL-21R 항체로 치료받지 않은 대상체로부터 수득되어 IL-21 리간드와 접촉된 상이한 혈액 샘플에서 측정된 상기 1종 이상의 IL-21-반응성 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    1종 이상의 IL-21-반응성 유전자가 TNF, IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, CD19, STAT3, TBX21, CSF1, GZMB, PRF1, IL-2Rα 및 IL-21R로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    1종 이상의 IL-21-반응성 유전자가 CD19, GZMB, PRF1, IL-2Rα, IFNγ 및 IL-6으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    1종 이상의 IL-21-반응성 유전자가 IL-2Rα인, 방법.
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