PT1353953E

PT1353953E - Mu-1, membro da família dos receptores de citocina

Info

Publication number: PT1353953E
Application number: PT01937340T
Authority: PT
Inventors: Mary Collins; Debra D Donaldson; Michelle J Unger; Deborah A Young; Matthew J Whitters; Leslie Lowe
Original assignee: Genetics Inst Llc
Priority date: 2000-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2007-02-28
Also published as: EP1787997A1; DE60124954D1; EP1353953A2; EP1353953B1; WO2001085792A8; DK1353953T3; AU2001263088B2; JP5763518B2; JP2004500845A; WO2001085792A3; AU2001263088C1; CY1107339T1; ES2276795T3; AU6308801A; JP2012061009A; JP2009019037A; DE60124954T2; WO2001085792A2; ATE346864T1

Description

DESCRIÇÃO "MU-1, MEMBRO DA FAMÍLIA DOS RECEPTORES DE CITOCINA"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a novos membros da família dos receptores de citocina de mamífero de proteínas (incluindo, sem limitação, proteínas de receptores humanos e murinos), seus fragmentos, polinucleotídeos recombinantes e células úteis para a expressão de tais proteínas, e métodos para a identificação de compostos capazes de tratar distúrbios imunitários compreendendo a análise da capacidade dos compostos para modular a interacção das proteínas com uma molécula STAT.

Antecedentes da Invenção

Foi identificada uma variedade de moléculas reguladoras, conhecidas como hematopoetinas, que estão envolvidas no desenvolvimento e proliferação das diversas populações de células hematopoéticas ou sanguíneas. A maioria das hematopoetinas exibe determinadas actividades biológicas por interacção com um receptor na superfície de células alvo. Os receptores de citocina são compostos geralmente por uma, duas ou três cadeias. Muitos receptores de citocina e algumas citocinas, tais como IL-12 p40, são membros da superfamília dos receptores da hematopoetina de proteínas. A identificação de novos membros da superfamília dos receptores da hematopoetina pode ser útil na regulação da hematopoese, na regulação de respostas imunes e na 1 identificação de outros membros da superfamilia da hematopoetina, incluindo citocinas e receptores.

Seria desejável identificar e determinar a sequência de ADN e de proteina de membros, até agora, desconhecidos da superfamilia dos receptores da hematopoetina.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção é divulgado um método para a identificação de um composto capaz de tratar um distúrbio imunitário, compreendendo a análise da capacidade do composto para modular a interacção do polipeptideo MU-1 com uma molécula STAT identificando, desse modo, um composto capaz de tratar um distúrbio imunitário. A via de sinalização STAT pode ser, por exemplo, uma via de sinalização STAT 3 ou uma via de sinalização STAT 5. A invenção proporciona igualmente um método de identificação de um modulador da actividade de MU-1, compreendendo a colocação em contacto de uma célula expressando uma proteina MU-1 conforme a SEQ ID N°:2 ou 10, ou uma parte desta, capaz de interacção com moléculas STAT, com um composto de teste e a determinação da capacidade do referido composto de teste para modular a interacção da referida proteina MU-1, ou referida parte desta, com uma molécula STAT. A referida molécula STAT pode ser, por exemplo, STAT 3 ou STAT 5. Para além disso, neste método, a proteina MU-1 pode ser, por exemplo, conforme a SEQ ID N°: 9 e pode ser expressa na referida célula sob a forma de uma fusão do domínio intracelular de MU-1 e do domínio extracelular do receptor humano de BPO. 2 São igualmente divulgados polinucleotideos codificando a cadeia da superfamília dos receptores da hematopoetina de MU-1, incluindo sem limitação, aqueles de origens murinas e humanas.

Em determinadas formas de realização, um polinucleotideo isolado compreende uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) a sequência nucleotidica de SEQ ID N°:l; (b) a sequência nucleotidica de SEQ ID N°: 1 do nucleotideo 238 ao nucleotideo 1852; (c) a sequência nucleotidica de SEQ ID N°: 1 do nucleotideo 301 ao nucleotideo 1852; (d) a sequência nucleotidica de SEQ ID N°: 1 do nucleotideo 301 ao nucleotideo 945; (e) uma sequência nucleotidica variável a partir da sequência da sequência nucleotidica especificada em qualquer de (a)-(d) em consequência da degenerescência do código genético; (f) uma sequência nucleotidica capaz de hibridar sob condições de restringência ao nucleotideo especificado em qualquer de (a)-(d); (g) uma sequência nucleotidica codificando uma espécie homóloga da sequência de SEQ ID N°:2; e 3 (h) um variante alélico da sequência nucleotidica especificada em qualquer de (a)-(d). De um modo preferido, a sequência nucleotidica codifica uma proteina possuindo uma actividade biológica da cadeia da superfamilia dos receptores da hematopoetina de MU-1. A sequência nucleotidica pode ser ligada operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão. São igualmente divulgados polinucleotideos isolados compreendendo uma sequência nucleotidica codificando um peptideo ou proteina compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2; (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 de aminoácidos 22 a 538; (c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 de aminoácidos 22 a 236; (d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 de aminoácidos 1 a 236; e (e) fragmentos de (a)-(d) possuindo uma actividade biológica da cadeia da superfamilia dos receptores da hematopoetina de MU-1. 4

Proporciona-se adicionalmente um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) a sequência nucleotidica de SEQ ID N°:9; (b) uma sequência nucleotidica variável a partir da sequência da sequência nucleotidica especificada em (a) em consequência da degenerescência do código genético; (c) uma sequência nucleotidica capaz de hibridar sob condições de restringência ao nucleotideo especificado em (a) ; (d) um variante alélico da sequência nucleotidica especificada em (a). São adicionalmente divulgados polinucleotideos isolados compreendendo uma sequência nucleotidica codificando um peptideo ou proteina compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 10; (b) fragmentos de (a) possuindo uma actividade biológica da cadeia da superfamilia dos receptores da hematopoetina de MU-1. São igualmente proporcionadas células hospedeiras, de um modo preferido, células de mamifero, transformadas com os polinucleotideos. 5

Em outras formas de realização, a invenção proporciona um processo para a produção de uma proteína MU-1. 0 processo compreende: (a) crescer uma cultura da célula hospedeira da presente invenção num meio de cultura adequado; e (b) purificar a proteína humana MU-1 a partir da cultura. São igualmente proporcionadas proteínas produzidas de acordo com estes métodos. A presente invenção proporciona igualmente uma proteína UM-1 isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2; (b) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 de aminoácidos 22 a 538; (c) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 de aminoácidos 22 a 236; (d) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 de aminoácidos 1 a 236; e (e) fragmentos de (a)-(d) possuindo uma actividade biológica da cadeia da superfamília dos receptores da hematopoetina de MU-1. 6 É igualmente divulgada uma proteína MU-1 isolada compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo consistindo de: (a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 10/ (b) fragmentos de (a) possuindo uma actividade biológica da cadeia da superfamília dos receptores da hematopoetina de MU-1. A sequência de aminoácidos de MU-1 Murina (SEQ ID N°:10) é cerca de 65% idêntica à sequência de aminoácidos de MU-1 humana.

Em outras formas de realização preferidas, a sequência de aminoácidos especificada é parte de uma proteína de fusão (com uma sequência de aminoácidos adicional não derivada de MU-1). As proteínas de fusão preferidas compreendem um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fc. São igualmente proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo uma proteína MU-1 e um veículo farmaceuticamente aceitável. São igualmente divulgadas composições compreendendo um anticorpo que reage especificamente com uma proteína da presente invenção.

Uma molécula de ácido nucleico de MU-1 como aqui descrita é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais idêntica à sequência nucleotídica (e. g., ao tamanho total da sequência nucleotidica) apresentada em SEQ ID N°:l ou 9. 7

De um modo preferido, a molécula de ácido nucleico consiste na sequência nucleotidica apresentada em SEQ ID N°: 1 ou 9. É igualmente preferido que a molécula de ácido nucleico inclui um fragmento de pelo menos O LO 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, ou mais nucleotídeos (e. 9-r nucleotídeos contíguos) da sequência nucleotidica de SEQ ID N°:1 ou 9, ou uma sua complementar.

De um modo preferido, o membro da familia das proteinas UM-1 possui uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 2 ou 10. São igualmente divulgados fragmentos da proteína possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 ou 10, em que o fragmento compreende pelo menos 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100 aminoácidos (e. g., aminoácidos contíguos) da sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:2 ou 10.

Noutro aspecto, é proporcionado um método para a detecção da presença de uma molécula de ácido nucleico, proteína ou polipeptídeo de MU-1 numa amostra biológica colocando em contacto a amostra biológica com um agente capaz de detectar uma molécula de ácido nucleico, proteína ou polipeptídeo de MU-1, tal que a presença de uma molécula de ácido nucleico, proteína ou polipeptídeo de MU-1 é detectada na amostra biológica.

Noutro aspecto, é proporcionado um método para a detecção da presença de actividade de MU-1 numa amostra biológica colocando em contacto a amostra biológica com um agente capaz de detectar um indicador de actividade de MU-1, tal que a presença de actividade de MU-1 é detectada na amostra biológica.

Noutro aspecto, é divulgado um método para a modulação da actividade de MU-1 compreendendo a colocação em contacto de uma célula capaz de expressão de MU-1 com um agente que modula actividade de MU-1, tal que é modulada actividade de MU-1 na célula. Numa forma de realização, o agente inibe a actividade de MU-1. Noutra forma de realização, o agente esimula a actividade de MU-1. Numa forma de realização, o agente é um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína MU-1. Noutra forma de realização, o agente modula a expressão de MU-1 pela modulação da transcrição de um gene de MU-1 ou da tradução de um ARNm de MU-1. Ainda noutra forma de realização, o agente é uma molécula de ácido nucleico possuindo uma sequência nucleotídica que está em anti-sentido em relação à cadeia codificante de um ARNm de MU-1 ou um gene de MU-1.

Os métodos divulgados podem ser utilizados para tratar um indivíduo possuindo um distúrbio caracterizado por expressão ou actividade aberrante ou indesejada de proteína ou ácido nucleico de MU-1 (e. g., um distúrbio associado a MU-1) pela administração ao indivíduo de um agente que é um modulador de UM-1. Numa forma de realização, o modulador de MU-1 é uma proteína MU-1. Noutra forma de realização, o modulador de MU-1 é uma molécula de ácido nucleico de MU-1. Ainda noutra forma de realização, o modulador de MU-1 é um peptídeo, peptidomimético, anticorpo, ou outra molécula pequena. São igualmente proporcionados ensaios de diagnóstico para a identificação da presença ou ausência de uma alteração genética caracterizada por pelo menos uma de (i) modificação ou mutação 9 aberrante de um gene codificando uma proteína MU-1; (ii) desregulação do gene de MU-1; e (iii) modificação pós- traducional aberrante de uma proteina MU-1, em que uma f orma selvagem do gene codifica um proteina com uma actividade de UM-1.

Noutro aspecto, são proporcionados métodos para a identificação de um composto que se liga a ou modula a actividade de uma proteina MU-1, proporcionando uma composição indicadora compreendendo uma proteina MU-1 possuindo actividade de MU-1, contactando a composição indicadora com um composto de teste, e determinando o efeito do composto de teste sobre a actividade de MU-1 (e. g., modulação da fosforilação de STAT, e. g., fosforilação STAT 3 ou STAT 5) na composição indicadora para identificar um composto que modula a actividade de uma proteina MU-1.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 representa a sequência de tamanho total de ADNc de MU-1 murina. A sequência nucleotidica corresponde aos nucleotideos 1-2628 de SEQ ID N°:9. A Figura 2 representa a sequência de aminoácidos de MU-1 murina (correspondendo aos aminoácidos 1-529 de SEQ ID N°:10). Existe uma sequência lider prevista nos aminoácidos 1-19, a qual foi prevista por SPScan com pontuação de 10,1 (de tipo negrito). Existe um dominio transmembranar previsto nos aminoácidos 237-253 (sublinhado). Motivos de sinalização previstos incluem as seguintes regiões: Caixa 1: aminoácidos 265-274 e Caixa 2: aminoácidos 310-324 10 (negrito e sublinhado); Seis Tirosinas estão localizadas nas posições de aminoácidos 281, 319, 361, 368, 397 e 510. O motivo WSXWS (SEQ ID N°:8) está localizado desde o residuo de aminoácido 214 ao residuo de aminoácido 218 (em tipo negrito, grande). Sitios de potencial acoplagem STAT incluem aminoácidos 393-398 e aminoácidos 510-513. A Figura 3 representa a comparação GAP de sequências de ADNc de MU-1 humana e murina (correspondendo aos ácidos nucleicos 1-2665 de SEQ ID N°:1 e ácidos nucleicos 1-2628 de SEQ ID N°:9, respectivamente). HuMU-l= MU-1 humana, murMU-l= MU-1 murina. Parâmetros Gap: Ponderação de Lacuna= 50, Correspondência Média= 10,000, Ponderação de Comprimento= 3, Discrepância Média= 0,000. Percentagem de Identidade= 66,116. A Figura 4 representa uma comparação GAP da proteína MU-1 humana (correspondendo aos aminoácidos 1-538 de SEQ ID N°:2) e da proteína MU-1 murina (correspondendo aos aminoácidos 1-529 de SEQ ID N°:10). Matriz de substituição de aminoácidos BLOSUM62. (Henikoff, S. e Henikoff, J. G. (1992)). Matrizes de substituição de aminoácidos a partir de blocos de proteínas (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919). Parâmetros de Lacuna= Ponderação de Lacuna: 8, Correspondência Média= 2,912, Ponderação de Comprimento= 2, Discrepância Média= -2,003. Percentagem de Identidade= 65,267. A Figura 5 representa um alinhamento de múltiplas sequências dos aminoácidos de MU-1 humana (correspondendo a SEQ ID N°:2), MU-1 murina (correspondendo a SEQ ID N°:10), e cadeia IL2beta humana (Acesso GENbank N° M26062). Os 11 domínios líder e transmembranar estão sublinhados. Os motivos conservados do módulo do receptor de citocina estão indicados através de tipo negrito. Potenciais regiões de sinalização estão indicadas através de tipo negrito e sublinhado. A Figura 6 representa a sinalização através de MU-1. MU-1 fosforila STAT 5 na quimera EPO-MU-1 do Clone E7. Sob as condições especificadas no Exemplo 3, a sinalização através de MU-1 resulta na fosforilação de STAT 5 em todos os intervalos de tempo testados. 0 tratamento de controlos ou das células quiméricas BAF-3 com IL-3 resultou na fosforilação de STAT 3, mas não STAT 1 ou 5.

Descrição Detalhada de Forma de Realização Preferida

Os requerentes do presente pedido proporcionaram polinucleotídeos codificando a cadeia da superfamília dos receptores da hematopoetina de MU-1 (a seguir "MU-1" ou "proteína MU-1"), incluindo, sem limitação, polinucleotídeos codificando MU-1 humana e murina.

Numa forma de realização particularmente preferida, a proteína e moléculas de ácido nucleico de MU-1 são moléculas MU-1 humanas. Uma região de 70 aminoácidos do receptor humano IL 5 (LMTNAFISIIDDLSKY DVQVRAAVS SMCREAGLWSEWS QPIYVGND EHKPLREWFVIVIMATICFILLIL, SEQ ID N°:3) foi utilizada para pesquisar a base de dados EST do GenBank utilizando o algoritmo TBLASTN. A sequência dentro do clone genómico BAC AC002303 do cromossoma humano 16pl2 foi identificada com homologia para esta região, sugerindo que este segmento poderá codificar um gene 12 para um novo receptor da hematopoetina. A examinação de grelhas de leitura abertas em torno de lOOOpb do nucleotídeo 40886 revelou uma grelha aberta de 270 pb que, quando utilizada numa pesquisa BLASTP de GenPept, identificou exclusivamente membros da família dos receptores de citocina. Um codão de terminação presente na extremidade desta grelha de leitura foi interpretado como indicação de transição em torno da fronteira exão/intrão.

Em seguida, determinou-se se o ARN foi transcrito a partir de um gene contido dentro deste clone BAC do cromossoma 16pl2. Foram sintetizados iniciadores de PCR com base no maior segmento da ORF que continha a sequência peptídica conservada dentro da família dos receptores de citocina. Utilizaram-se iniciadores GAGTCCGAG GAGAAAG CTGATCTCA (5p) (SEQ ID N°:4) e GAAAGATGACCGGGTCACTCCATT (3p) (SEQ ID N°:5) em PCRs para pesquisar bibliotecas de fagos de diversos tecidos humanos (Clontech). Produtos de PCR do tamanho esperado de 164 pb que se hibridaram especificamente a um oligonucleotídeo marcado com 32-P da sequência ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID N°:6) foram observados no fago a partir do pulmão, rim, placenta e coração. Utilizando o oligonucleotídeo ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID N°:7) foi identificado, purificado e sequenciado um clone de ADNc de tamanho total NN14-lb (MU-1) . A sequência de ADN e a sequência de aminoácidos prevista são apresentadas em SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°:2, respectivamente. A sequência de aminoácidos prevista da cadeia do receptor MU-1 humano inclui uma sequência sinal putativa dos aminoácidos 1-21. Julga-se que a MU-1 humana madura possui a sequência de aminoácidos 24-538 de SEQ ID N°:2. Observa-se um domínio transmembranar nos aminoácidos 237-254.

Noutra forma de realização, a proteína e moléculas de ácido nucleico de MU-1 são moléculas MU-1 murinas. Para identificar a 13 sequência polinucleotídica codificando a proteína MU-1 murina, foi isolado por PCR um fragmento parcial do homólogo murino do receptor MU-1 a partir de ADNc de murganho utilizando oligonucleotídeos derivados da sequência humana, como descrito no Exemplo 1. Determinou-se a sequência de ADN deste fragmento e derivaram-se dois oligonucleotídeos a partir de uma parte interna deste fragmento com as sequências seguintes: TTGAACGTGACTGTGGCCTT (5p) (SEQ ID N°: 13) TGAATGAAGTGCCTGGCTGA (3p) (SEQ ID N°: 14).

Os oligonucleotídeos foram utilizados para amplificar um fragmento interno de 262 nucleotídeos do produto de PCR original (correspondendo aos nucleotídeos 781-1043 da sequência de ADNc murina da figura 1 e SEQ ID N°:9) para utilizar como uma sonda de hibridação para pesquisar um banco de ADNc isolado a partir da linha de células T 2D6. A sequência de ADN foi determinada a partir de dois clones independentes. O clone 6 foi sequenciado e confirmou ser o homólogo murino de tamanho total de MU-1 humana. A sequência nucleotídica de tamanho total de MU-1 murina é apresentada na figura 1 (correspondendo aos nucleotídeos 1-2628 de SEQ ID N°:9). A sequência nucleotídica possui uma sequência líder prevista nos nucleotídeos 407-464, sequência codificante nos nucleotídeos 407-1993 e um codão de terminação nos nucleotídeos 1994-1997. Os nucleotídeos 1-406 correspondem à região em 5' não traduzida e os nucleotídeos 1998-2628 correspondem à região em 3' não traduzida. A sequência proteica prevista de MU-1 murina é apresentada na figura 2 (correspondendo aos aminoácidos 1-529 de SEQ ID N°:10). 14 A proteína MU-1 murina contém uma sequência líder prevista determinada por SPScan (pontuação=l0, 1) (correspondendo aos aminoácidos 1-19 de SEQ ID N°:10) e um domínio transmembranar previsto (correspondendo aos aminoácidos 237-253 de SEQ ID N°:10). Motivos de sinalização previstos incluem as regiões seguintes: Caixa 1: aminoácidos 265-274 de SEQ ID N°:10, Caixa 2: aminoácidos 310-324 de SEQ ID N°:10, seis residuos de

tirosina nas posições 281, 319, 361, 368, 397 e 510 de SEQ ID N°: 10. Sítios de potencial acoplagem STAT incluem, mas não estão limitados a: STAT 5: EDDGYPA, STAT 3:YLQR. A fase de leitura aberta de MU-1 codifica um membro da família dos receptores da hematopoetina. Numa forma de realização, MU-1 possui uma sequência líder, pares de cisteína conservados, PP e motivos WSXWS (SEQ ID N°:8) característicos da família, bem como um domínio transmembranar e um extenso domínio citoplasmático. MU-1 contém igualmente um PXPP conservado bem como motivos de sinalização Caixa I e Caixa II no domínio citoplasmático (ver Figura 5). Estes domínios estão conservados entre a MU-1 murina e a MU-1 humana. Alinhamento FASTA subsequente de sequência MU-1 com GenPept mostrou maior homologia com IL-2Rb humana (ver figura 5). O ADNc de MU-1 humana foi depositado na American Type Culture Collection a 10 de Março de 1998, enquanto número de acesso ATCC 98687.

Por análise de Northern, como descrito no Exemplo 4, MU-1 murina foi detectada nos tecidos do baço, pulmão e coração de murino adulto. MU-1 humana foi detectada em tecidos linfóides humanos adultos, PBLs, timo, baço e nodo linfático, e no pulmão fetal. 15

Quaisquer formas de proteínas MU-1 com menos que o tamanho total estão abrangidas no seio da presente invenção e são aqui referidas colectivamente com formas de tamanho total e maduras como "MU-1" ou "proteínas MU-1". Proteínas MU-1 com menos do tamanho total podem ser produzidas pela expressão de um fragmento correspondente do polinucleotídeo codificando a proteína MU-1 de tamanho total (SEQ ID N°:4 ou SEQ ID N°:6) . Podem igualmente ser utilizados estes fragmentos polinucleotídicos correspondentes. Polinucleotídeos modificados, como acima descrito, podem ser preparados por técnicas correntes de biologia molecular, incluindo a construção de mutantes de deleção apropriados desejados, métodos de mutagénese dirigida pontual ou pela reacção de polimerização em cadeia utilizando iniciadores oligonucleotídicos apropriados.

Para os fins da presente invenção, uma proteína possui "uma actividade biológica da cadeia da superfamília dos receptores da hematopoetina de MU-1" se possuir uma ou mais das actividades biológicas da proteína MU-1 madura correspondente. Actividade de MU-1 inclui interacção com moléculas STAT (e. g., STAT 5, STAT 3). MU-1 ou seus fragmentos activos (proteínas MU-1) podem ser fundidas a moléculas veículo, tais como imunoglobulinas ou fragmento de imunoglobulina. Por exemplo, formas solúveis da MU-1 podem ser fundidas através de sequências "ligantes" à parte Fc de uma imunoglobulina. Podem ser igualmente utilizadas outras proteínas de fusão, tais como aquelas com GST, Lex-A ou MPB. São igualmente divulgados variantes alélicos da sequência nucleotídica como exposto em SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°:9, isto é, 16 formas alternativas ocorrendo naturalmente do polinucleotídeo isolado de SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 9 que codifica igualmente proteinas MU-1, de um modo preferido, aquelas proteínas possuindo uma actividade biológica de MU-1. São igualmente incluídos na invenção polinucleotídeos isolados que se hibridam à sequência nucleotídica exposta em SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 9 sob condições de elevada restringência (por exemplo, 0,lxSSC a 65 °C) . Polinucleotídeos isolados que codificam proteínas MU-1 mas que diferem da sequência nucleotídica exposta na SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 9, em virtude da degenerescência do código genético, estão igualmente abrangidos pela presente invenção. Estão igualmente incluídas variações na sequência nucleotídica como exposto na SEQ ID N°:1 ou SEQ ID N°:9 que são causadas por mutações pontuais ou por modificações induzidas.

Como aqui utilizado, o termo "híbrida sob condições de restringência" pretende descrever condições de hibridação e lavagem sob as quais, sequências nucleotídicas pelo menos 60% idênticas entre si permanecem tipicamente hibridadas entre si.

De um modo preferido, as condições são tais que sequências pelo menos cerca de 70%, de um modo mais preferido pelo menos 80%, de um modo ainda mais preferido pelo menos cerca de 85% ou 90% idênticas entre si permanecem tipicamente hibridadas entre si.

Tais condições de restringência são conhecidas dos especialistas na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Um exemplo preferido, não limitante, de condições de hibridação restringentes são hibridação em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50 °C, de um modo preferido a 55 °C, de um modo mais preferido a 60 °C e de um modo ainda mais preferido a 65 °C. Estão abrangidas gamas que abarcam os valores acima 17 expostos, e. g., 55-60 °C, ou 50-65 °C. De um modo preferido, uma molécula de ácido nucleico isolada que híbrida sob condições de restringência à sequência de SEQ ID N°: 1 ou 9 corresponde a uma molécula de ácido nucleico ocorrendo naturalmente. Como aqui utilizado, uma molécula de ácido nucleico "ocorrendo naturalmente" refere-se a uma molécula de ARN ou ADN possuindo uma sequência nucleotídica que ocorre na natureza (e. g., codifica uma proteína natural).

Para determinar a percentagem de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação óptima (e. g., podem ser introduzidas lacunas em uma ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para alinhamento óptimo e, para fins de comparação, sequências não idênticas podem ser postas de parte). Numa forma de realização preferida, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação é pelo menos 30%, de um modo preferido pelo menos 40%, de um modo mais preferido pelo menos 50%, de um modo ainda mais preferido pelo menos 60% e de um modo ainda mais preferido pelo menos 70%, 80%, ou 90% do comprimento da sequência de referência. Em seguida, comparam-se os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizado, "identidade" de aminoácido ou de ácido nucleico é equivalente a "homologia" de aminoácido ou de ácido nucleico). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhado pelas sequências, tomando em consideração o número de 18 lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que necessita de ser introduzido para alinhamento óptimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser efectuada utilizando um algoritmo matemático. Numa forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) o qual foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando quer uma matriz Blosum 62 ou uma matriz PAM250, e uma ponderação de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e uma ponderação de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. Ainda noutra forma de realização preferida, a percentagem de identidade entre duas sequências nucleotidicas é determinada utilizando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando uma matriz NWSgapdna. CMP e uma ponderação de lacuna de 40, 50, 60, 70, ou 8 0 e uma ponderação de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

Noutra forma de realização, a percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou de nucleotídeos é determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Myers e Miller,1988, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) o qual foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de ponderação de resíduos PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.

As sequências de ácidos nucleicos e proteínas aqui divulgadas podem ser adicionalmente utilizadas como uma "sequência de pesquisa" para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser 19 realizadas utilizando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pesquisas BLAST de nucleotídeos podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências nucleotidicas homólogas a moléculas de ácidos nucleicos Adhr-1 da invenção. Pesquisas BLAST de proteínas podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a moléculas de proteínas Adhr-1 da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, pode utilizar-se o Gapped BLAST como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Quando se utilizam os programas BLAST e Gapped BLAST, podem utilizar-se os parâmetros pré-definidos dos respectivos programas (e. g., XBLAST e NBLASI). Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. São igualmente divulgados polinucleotídeos codificando homólogos da MU-1 humana de outras espécies animais, particularmente outras espécies de mamíferos. Homólogos de espécie podem ser identificados e isolados pela preparação de sondas ou iniciadores a partir das sequências murinas ou humanas aqui divulgadas e pesquisando uma biblioteca de uma espécie apropriada, tal como por exemplo bibliotecas construídas a partir de PBMCs, timo ou testículo da espécie relevante.

Os polinucleotídeos isolados podem ser ligados operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão tais como os vectores de expressão pMT2 ou pED divulgados em Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 1_9, 4485-4490 (1991), para produzir a proteína MU-1 recombinantemente. Conhecem-se na técnica muitas sequências de controlo de expressão adequadas. Métodos genéricos de expressão de proteínas recombinantes são igualmente 20 conhecidos e estão exemplificados em R. Kaufman, Methods in

Enzymology 185, 537-566 (1990). Como aqui definido "ligado operacionalmente" significa ligado enzimaticamente ou quimicamente para formar uma ligação covalente entre o polinucleotideo isolado e a sequência de controlo de expressão, de tal maneira que a proteína MU-1 é expressa por uma célula hospedeira a qual foi transformada (transfectada) com a sequência polinucleotídeo/controlo de expressão ligada.

Uma quantidade de tipos de células podem funcionar como células hospedeiras adequadas para expressão da proteína MU-1. Pode ser utilizado qualquer tipo de célula capaz de expressão de proteína MU-1 funcional. Células hospedeiras de mamífero adequadas incluem, por exemplo, células COS de macaco, Células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) , células humanas 2 93 de rim, células humanas A431 epidérmicas, células humanas Colo205, células 3T3, células CV-1, outras linhas celulares de primata transformadas, células diplóides normais, estirpes celulares derivadas de cultura in vitro de tecido primário, explantes primários, células HeLa, células L de murganho, células BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, Mlx ou C2C12. A proteína MU-1 pode igualmente ser produzida ligando operacionalmente o polinucleotideo isolado a sequências de controlo adequadas em um ou mais vectores de expressão de insecto e empregando um sistema de expressão de insecto. Materiais e métodos para sistemas de expressão celulares de baculovírus/insecto estão disponíveis comercialmente em forma de kit a partir de, e. g., Invitrogen, San Diego, Califórnia, E.U.A. (kit MaxBac®) , e tais métodos são bem conhecidos na técnica, como descrito em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Formas solúveis da 21 proteína MU-1 podem igualmente ser produzidas em células de insectos utilizando polinucleotídeos isolados apropriados como acima descrito.

Alternativamente, a proteína MU-1 pode ser produzida em eucariotas inferiores tais como levedura ou em procariotas tais como bactérias. Estirpes de levedura adequadas incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, estirpes de Kluyveromyces, Candida, ou qualquer estirpe de levedura capaz de expressão de proteínas heterólogas. Estirpes bacterianas adequadas incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, ou qualquer estirpe bacteriana capaz de expressão de proteínas heterólogas. A expressão em bactérias pode resultar na formação de corpos de inclusão incorporando a proteína recombinante. Pode, deste modo, ser requerido o reenrolamento da proteína recombinante para produzir material activo ou mais activo. Conhecem-se na técnica vários métodos para a obtenção de proteínas heterólogas correctamente enroladas a partir de corpos de inclusão bacterianos. Estes métodos envolvem, geralmente, a solubilização da proteína a partir dos corpos de inclusão, depois a desnaturação completa da proteína utilizando um agente caotrópico. Quando estão presentes resíduos de cisteína na sequência primária de aminoácidos da proteína é frequentemente necessário realizar o reenrolamento num ambiente que permita a correcta formação de ligações persulfureto (um sistema redox). Métodos genéricos de reenrolamento são divulgados em Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990). O documento EP 0433225 e pedido co-pendente USSN 08/163877 descrevem outros métodos apropriados. 22 A proteína MU-1 pode igualmente ser expressa como um produto de animais transgénicos, e. g., como um componente do leite de vacas, cabras, porcos, ou ovelhas transgénicas que são caracterizadas por células somáticas ou germinais contendo uma sequência polinucleotídica codificando a proteína MU-1. A proteína MU-1 pode ser preparada pelo crescimento de uma cultura de células hospedeiras transformadas sob condições de cultivo necessárias para expressar a proteína desejada. A proteína expressa resultante pode ser, em seguida, purificada a partir do meio de cultura ou extractos celulares. Formas solúveis da proteína MU-1 podem ser purificadas a partir de meios condicionados. As formas associadas à membrana de proteína MU-1 podem purificar-se pela preparação de uma fracção de membrana total a partir da célula de expressão e extracção das membranas com um detergente não iónico tal como Triton X-100. A proteína MU-1 pode ser purificada utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Por exemplo, a proteína MU-1 pode ser concentrada utilizando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após a etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação tal como um meio de filtração em gel. Alternativamente, pode ser empregue uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato possuindo grupos dietilaminoetilo (DEAR) ou polietilenomina (PEI) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos geralmente empregues na purificação de proteínas. Alternativamente, pode empregar-se uma etapa de permuta catiónica. Permutadores catiónicos adequados incluem diversas matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou 23 carboximetilo. São preferidos grupos sulfopropilo (e. g., colunas de S-Sepharose®). A purificação da proteína MU-1 a partir do sobrenadante de cultura pode igualmente incluir uma ou mais etapas de coluna sobre resinas de afinidade tais como agarose-concanavalina A, heparina-toyopearl® ou Cibacrom blue 3GA Sepharose®; ou através de cromatografia de interacção hidrofóbica utilizando resinas tais como éter fenílico, éter butílico, ou éter propílico; ou através de cromatografia de imunoafinidade. Finalmente, podem ser empregues um ou mais passos de cromatografia líquida de alta resolução de fase reversa (RP-HPLC) empregando meios de RP-HPLC hidrofóbicos, e. g., sílica gel possuindo grupos metílicos ou outros grupos alifáticos pendentes para purificar adicionalmente a proteína MU-1. Na purificação, podem igualmente utilizar-se colunas de afinidade incluindo anticorpos para a proteína MU-1, de acordo com métodos conhecidos. Algumas ou a totalidade dos passos de purificação precedentes, em diversas combinações ou com outros métodos conhecidos, podem ser igualmente empregues para proporcionar uma proteína recombinante isolada substancialmente purificada. De um modo preferido, a proteína MU-1 isolada é purificada de modo que fique substancialmente isenta de outras proteínas de mamífero.

As proteínas MU-1 podem igualmente ser utilizadas para rastrear agentes que sejam capazes de se ligar a MU-1. Ensaios de ligação utilizando uma proteína de ligação desejada, imobilizada ou não, são bem conhecidos na técnica e podem ser utilizados para este fim utilizando a proteína MU-1 da invenção. Ensaios de selecção baseados em células ou baseados em proteínas (isentos de células purificadas) podem ser utilizados para identificar tais agentes. Por exemplo, a proteína MU-1 pode ser imobilizada na forma purificada num veículo ou ligação de 24 ligandos potenciais para purificação. A proteína MU-1 pode ser medida.

Proteínas MU-1, purificadas a partir de células ou produzidas recombinantemente, podem ser utilizadas como uma composição farmacêutica quando combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição pode conter, além de MU-1 ou inibidor e veículo, diversos diluentes, enchimentos, sais, tampões, estabilizadores, solubilizantes e outros materiais bem conhecidos na técnica. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da actividade biológica do(s) ingrediente(s) activo(s). As características do veículo dependerão da via de administração. A composição farmacêutica pode igualmente conter citocinas, linfocinas, ou outros factores hematopoéticos tais como M-CSF, OM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, factor de célula estaminal, e eritropoetina. A composição farmacêutica pode igualmente incluir anticorpos anti-citocina. A composição farmacêutica pode conter factores trombolíticos ou antitrombóticos tais como activador do plasminogénio e Factor VIII. A composição farmacêutica pode conter adicionalmente outros agentes anti-inflamatórios. Tais factores e/ou agentes adicionais podem ser incluídos na composição farmacêutica para produzir um efeito sinérgico com a proteína MU-1 isolada, ou para minimizar efeitos secundários causados pela proteína MU-1 isolada. De modo inverso, a proteína MU-1 isolada pode ser incluída em formulações da citocina particular, linfocina, outro factor hematopoético, factor trombolítico ou antitrombótico, ou agente anti-inflamatório para minimizar efeitos secundários da 25 citocina, linfocina, trombolítico ou antitrombótico, outro factor hematopoético factor ou agente anti-inflamatório. A composição farmacêutica pode ser na forma de um lipossoma no qual é combinada a proteína MU-1 isolada, além de outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfifílicos tais como lípidos que existem na forma agregada como micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, ou camadas lamelares. Lípidos adequados para formulação lipossomal incluem, sem limitação, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatídeos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares e afins. A preparação de tais formulações lipossomais está dentro do nível dos conhecimentos na técnica, como divulgado, por exemplo, na Patente U.S. N° 4235871; Patente U.S. N° 4501728; Patente U.S. N° 4837028; e Patente U.S. N° 4737323.

Como aqui utilizado, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa a quantidade total de cada componente activo da composição farmacêutica ou método que é suficiente para apresentar um benefício significativo ao doente, e. g., melhoramento de sintomas de, cura de, ou aumento na taxa de cura de tais estados. Quando aplicado a um ingrediente activo individual, administrado isolado, o termo refere-se apenas àquele ingrediente. Quando aplicado a uma combinação, o termo refere-se a quantidades combinadas dos ingredientes activos que resultam no efeito terapêutico, quer administradas em combinação, em série ou simultaneamente. A proteína MU-1 isolada pode ser administrada quer isolada quer em conjunto com outras terapias tais como tratamentos empregando citocinas, linfocinas ou outros factores hematopoéticos. Quando co-administrada com uma ou mais 26 citocinas, linfocinas ou outros factores hematopoéticos, a proteína MU-1 pode ser administrada quer simultaneamente com a(s) citocina(s), linfocina(s), outro(s) factore(s) hematopoético(s), trombolítico(s) ou factore(s) antitrombótico(s) , quer sequencialmente. Se administrada sequencialmente, o médico assistente decidirá sobre a sequência apropriada de administração da proteína MU-1 em conjunto com citocina(s), linfocina(s), outro(s) factore(s) hematopoético(s) , factores trombolíticos ou antitrombóticos. A administração de proteína MU-1 utilizada na composição farmacêutica ou para praticar o método da presente invenção pode ser efectuada numa variedade de maneiras convencionais, tais como ingestão oral, inalação, ou injecção cutânea, subcutânea, ou intravenosa. Prefere-se a administração intravenosa ao doente.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína MU-1 é administrada oralmente, a proteína MU-1 estará na forma de comprimido, cápsula, pó, solução ou elixir. Quando administrada na forma de comprimido, a composição farmacêutica da invenção pode conter adicionalmente um veículo sólido tal como uma gelatina ou um adjuvante. O comprimido, cápsula e pó contêm desde cerca de 5 a 95% de proteína MU-1 e, de um modo preferido, desde cerca de 25 a 90% de proteína MU-1. Quando administrada na forma líquida, pode ser adicionado um veículo líquido tal como agua, petróleo, óleos de origem animal ou vegetal tais como óleo de amendoim, óleo mineral, óleo de soja, ou óleo de sésamo, ou óleos sintéticos. A forma líquida da composição farmacêutica pode conter adicionalmente solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução sacárida, ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou 27 polietilenoglicol. Quando administrada na forma liquida, a composição farmacêutica contém desde cerca de 0,5 a 90% em peso de proteína MU-1 e, de um modo preferido, desde cerca de 1 a 50% de proteina MU-1.

Quando uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína MU-1 é administrada através de injecção intravenosa, cutânea ou subcutânea, a proteína MU-1 estará na forma de uma solução aquosa, apirogénica, parentericamente aceitável. A preparação de tais soluções de proteína parentericamente aceitáveis, tendo em consideração o pH, isotonicidade, estabilidade e semelhantes, está dentro dos conhecimentos na técnica. Uma composição farmacêutica preferida para injecção intravenosa, cutânea, ou subcutânea deve conter, além de proteína MU-1, um veículo isotónico tal como Injecção de Cloreto de Sódio, Injecção de Ringer, Injecção de Dextrose, Injecção de Dextrose e Cloreto de Sódio, Injecção de Ringer com Lactato, ou outro veículo como conhecido na técnica. A composição farmacêutica pode igualmente conter estabilizadores, conservantes, tampões, antioxidantes, ou outro aditivo conhecido dos especialistas na técnica. A quantidade de proteína MU-1 na composição farmacêutica dependerá da natureza e gravidade do estado a ser tratado e da natureza de tratamentos anteriores a que o doente se tenha submetido. Em última análise, o médico assistente decidirá a quantidade de proteína MU-1 com a qual tratar cada doente individual. Inicialmente, o médico assistente administrará doses baixas de proteína MU-1 e observará a resposta do doente. Doses maiores de proteína MU-1 podem ser administradas até ser obtido o efeito terapêutico óptimo para o doente e nesse momento a dosagem não é geralmente aumentada. Está contemplado que as diversas composições farmacêuticas utilizadas devem conter cerca 28 de 0,1 yg a cerca de 100 mg de proteína MU-1 por Kg de peso corporal. A duração da terapia intravenosa utilizando a composição farmacêutica variará, dependendo da gravidade da doença a ser tratada e do estado e potencial resposta idiossincrática de cada doente individual. Está contemplado que a duração de cada aplicação da proteína MU-1 será na gama de 12 a 24 horas de administração intravenosa contínua. Em última análise, o médico assistente decidirá sobre a duração apropriada da terapia intravenosa utilizando a composição farmacêutica.

Espera-se que o polinucleotídeo e proteínas exibam uma ou mais das utilizações ou actividades biológicas (incluindo aquelas associadas a ensaios aqui citados) abaixo identificadas. Utilizações ou actividades descritas para proteínas podem ser proporcionadas pela administração ou utilização de tais proteínas ou pela administração ou utilização de polinucleotídeos codificando tais proteínas (tais como, por exemplo, em terapias génicas ou vectores adequados para introdução de ADN).

Actividade de Citocina e de Proliferação/Diferenciação Celular

Uma proteína MU-1 pode exibir actividade de citocina, de proliferação celular (quer induzindo quer inibindo) ou de diferenciação celular (quer induzindo quer inibindo) ou pode induzir a produção de outras citocinas em determinadas populações celulares. 29

Muitos factores proteicos descobertos até à data, incluindo todas as citocinas conhecidas, exibiram actividade em um ou mais ensaios de proliferação celular dependente de factor e, por este motivo, os ensaios servem como uma confirmação conveniente da actividade de citocina. A actividade de uma proteina MU-1 é demonstrada por qualquer um de um número de ensaios de rotina de proliferação celular dependente de factor para linhas celulares incluindo, sem limitação, 32D, DA2, DA1G, TIO, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+) , 2E8, RB5, DAI, 123, TI 165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e e CMK. Células BAF-3 expressando receptores quiméricos huEPOR -huMU proliferam em resposta a huEPO. A fim de testar a capacidade do receptor de MU para sinalizar através do seu domínio citoplasmático, manipularam-se células BAF-3 para expressar receptores quiméricos de EPOr/MU(cyto) e ensaiaram-se para incorporação de timidina 3H na presença de EPO. Células BAF-3 expressando moléculas EPOr intactas proliferaram em resposta a EPO enquanto células mãe BAF-3 não proliferam. O clone A5, possuindo o EPOr/MU(cyto) quimérico prolifera em resposta a EPO, demonstrando que a porção citoplasmática de MU-1 pode manter um sinal proliferativo. As células BAF-3 que expressam EPOr na sua superfície respondem igualmente a EPO. A actividade de uma proteína pode, entre outros meios, ser medida pelos métodos seguintes:

Ensaios para proliferação de célula T ou timócito incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates e Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for 30

Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:34 94-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990;

Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991;

Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994.

Ensaios para produção e/ou proliferação de citocina de células do baço, células do nodo linfático ou timócitos incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. e Shevach, E.M. In Current

Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.12.1- 3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto. 1994; e

Measurement of mouse and human Interferon y, Schreiber, R.D. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.8.1- 6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.

Ensaios para proliferação e diferenciação de células hematopoéticas e linfopoéticas incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. e Lipsky, P.E. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.3.1- 6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 - Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and

Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11

Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. e Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 31 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9 - Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. e Turner, K.J. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991.

Ensaios para respostas de clones de células T a antigénios (que identificarão, entre outras, proteínas que afectam interacções celulares APC-T bem como efeitos directos em células T através da medição da proliferação e produção de citocina) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Capítulo 6, Cytokines and their cellular receptors; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:6091-6095,1980; Weinberger et al., Eur. J. Immnn.11:405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500,1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.

Actividade de Estimulação ou Supressão Imunitária

Uma proteína MU-1 pode igualmente exibir actividade de estimulação imunitária ou de supressão imunitária incluindo, sem limitação, as actividades relativamente às quais os ensaios são aqui descritos. Uma proteína pode ser útil no tratamento de diversas deficiências e distúrbios imunitários (incluindo imunodeficiência combinada grave (SCID)), e. g., na regulação (positiva ou negativa) do crescimento e proliferação de linfócitos T e/ou B, bem como na efectuação da actividade 32 citolítica de células ofNK e outras populações celulares. Estas deficiências imunitárias podem ser genéticas ou ser causadas por infecções virais (e. g., HIV) bem como bacterianas ou fúngicas, ou podem resultar de distúrbios auto-imunes. Mais especificamente, doenças infecciosas causadas por infecção virai, bacteriana, fúngica ou outra podem ser tratáveis utilizando uma proteina da presente invenção, incluindo infecções por HIV, virus da hepatite, herpesvírus, micobactérias, Leishmania spp., malaria spp. e diversas infecções fúngicas tal como candidiase. Certamente, a este respeito, uma proteina divulgada pode igualmente ser útil onde um reforço para o sistema imunitário seja geralmente desejável, i. e., no tratamento do cancro.

Distúrbios auto-imunes que podem ser tratados utilizando uma proteina divulgada incluem, por exemplo, doença do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, artrite reumatóide, inflamação pulmonar auto-imune, sindroma de Guillain-Barre, tiroidite auto-imune, diabetes Mellitus dependente de insulina, miastenia grave, reacção enxerto versus hospedeiro e doença ocular inflamatória auto-imune. Uma tal proteina pode igualmente ser útil no tratamento de reacções alérgicas e estados, tais como, asma (particularmente asma alérgica) ou outros problemas respiratórios. Outros estados, nos quais é desejada a supressão de imunidade (incluindo, por exemplo, transplantação de órgãos), podem igualmente ser tratáveis utilizando uma proteina divulgada. 0 ADN de MU-1 mapeia igualmente para o lócus cromossomal para a doença de Crohn. Como resultado, proteínas MU-1 podem ser utilizadas para tratar a doença de Crohn e outras doenças inflamatórias intestinais. 33

Utilizando as proteínas MU-1 aqui divulgadas pode igualmente ser possivel regular respostas imunes, numa variedade de maneiras. A regulação negativa pode ser na forma de inibir ou bloquear uma resposta imune já em progresso ou pode envolver a prevenção da indução de uma resposta imune. As funções de células T activadas podem ser inibidas pela supressão de respostas de células T ou pela indução de tolerância especifica em células T, ou ambas. A imunossupressão de respostas de células T é geralmente um processo activo, não especifico de antigénio, que requer exposição continua das células T ao agente supressivo. Tolerância, que envolve a indução da não responsividade ou anergia em células T, é distinguível de imunossupressão visto que é geralmente específica de antigénio e persiste após a exposição ao agente tolerizante ter cessado. Operacionalmente, a tolerância pode ser demonstrada pela ausência de uma resposta de célula T após reexposição a antigénio específico na ausência do agente tolerizante. A regulação negativa ou o impedimento de uma ou mais funções antigénicas (incluindo, sem limitação, funções antigénicas de linfócito B (tais como, por exemplo, B7)), e. g., o impedimento da síntese de níveis elevados de linfocina por células T activadas, será útil em situações de transplantação de tecido, pele e órgão e em reacção enxerto versus hospedeiro (GVHD) . Por exemplo, o bloqueio de função de célula T deve resultar em destruição reduzida de tecido em transplantação de tecido. Tipicamente, em transplantes de tecido, a rejeição do transplante é iniciada através do seu reconhecimento como estranho por células T, seguida por uma reacção imunitária que destrói o transplante. A administração de uma molécula que inibe ou bloqueia a interacção de um antigénio de linfócito B7 com 34 o(s) seu(s) ligando (s) natural (is) em células imunitárias (tal como uma forma solúvel, monomérica, de um peptídeo possuindo apenas actividade de B7-2 ou em conjunto com uma forma monomérica de um peptideo possuindo uma actividade de outro antigénio de linfócito B (e. g., B7-1, B7-3) ou anticorpo de bloqueio) antes da transplantação, pode conduzir à ligação da molécula ao (s) ligando(s) natural (is) nas células imunitárias sem transmitir o correspondente sinal co-estimulatório. 0 bloqueio da função antigénica de linfócito B nesta questão, impede a sintese de citocina por células imunitárias, tais como células T e, deste modo, actua como um imunossupressor. Além disso, a ausência de co-estimulação pode igualmente ser suficiente para anergizar as células T induzindo, desse modo, a tolerância num individuo. A indução de tolerância de longo prazo por reagentes bloqueantes de antigénio de linfócito B pode evitar a necessidade de administração repetida destes agentes bloqueantes. Para alcançar imunossupressão ou tolerância suficiente num indivíduo, pode igualmente ser necessário bloquear a função de uma combinação de antigénios de linfócito B. A eficácia de reagentes bloqueantes específicos na prevenção da rejeição de transplante de órgãos ou GVHD pode ser avaliada utilizando modelos animais que são vaticínio de eficácia em humanos. Exemplos de sistemas apropriados que podem ser utilizados incluem enxertos cardíacos alógenos em ratos e enxertos xenógenos de células dos ilhéus pancreáticos em murganhos, ambos os quais foram utilizados para examinar os efeitos imunossupressivos de proteínas de fusão CTLA4Ig in vivo como descrito em Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992) e

Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89:11102-11105 (1992).

Adicionalmente, podem ser utilizados modelos murinos de GVHD 35 (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nova Iorque, 1989, pp. 846-847) para determinar o efeito do bloqueio da função antigénica de linfócito B in vivo no desenvolvimento daquela doença. 0 bloqueio da função antigénica pode igualmente ser terapeuticamente útil para o tratamento de doenças auto-imunes. Muitos distúrbios auto-imunes são o resultado de activação inapropriada de células T que são reactivas contra tecido próprio e que promovem a produção de citocinas e auto-anticorpos envolvidos na patologia das doenças. 0 impedimento da activação de células T auto-reactivas pode reduzir ou eliminar sintomas de doença. A administração de reagentes que bloqueiam a co-estimulação de células T, por perturbação de interacções receptor:ligando de antigénios de linfócito B, pode ser utilizada para inibir a activação de células T e impedir a produção de auto-anticorpos ou citocinas derivadas de células T que podem estar envolvidas no processo de doença. Adicionalmente, reagentes bloqueantes podem induzir tolerância especifica de antigénio de células T auto-reactivas que poderia conduzir a alivio duradouro da doença. A eficácia de reagentes bloqueantes na prevenção ou alivio de distúrbios auto-imunes pode ser determinada utilizando um número de modelos animais bem caracterizados de doenças auto-imunes humanas. Exemplos incluem encefalite auto-imune experimental murina, lúpus eritematoso sistémico em murganhos MRL/lpr/lpr ou murganhos híbridos NZB, artrite colagénica auto-imune murina, diabetes Mellitus em murganhos NOD e ratos BB, e miastenia grave experimental murina (ver Paul ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nova Iorque, 1989, pp. 840-856). 36 A regulação positiva de uma função antigénica (de um modo preferido, uma função antigénica de linfócito B) , como meio de regulação positiva de respostas imunes, pode igualmente ser útil na terapia. A regulação positiva de respostas imunes pode ser na forma de melhoramento de uma resposta imune existente ou de melhoria de uma resposta imune inicial. Por exemplo, melhorar uma resposta imune através da estimulação da função antigénica de linfócito B pode ser útil nos casos de infecção virai. Adicionalmente, doenças virais sistémicas tais como gripe, a constipação comum, e encefalite poderiam ser aliviadas pela administração de formas estimulatórias de antigénios de linfócito B sistemicamente.

Alternativamente, podem melhorar-se respostas imunes antivirais num doente infectado, pela remoção de células T do doente, co-estimulando as células T in vitro com APCs virais cadenciados por antigénios, quer expressando um peptídeo MU-1 quer juntamente com uma forma estimulatória de um peptídeo solúvel aqui divulgado, e reintroduzindo no doente as células T activadas in vitro. Outro método de melhoramento de respostas imunes antivirais seria isolar células infectadas de um doente, transfectá-las com um ácido nucleico codificando uma proteína como aqui descrito, visto que as células expressam a totalidade ou uma parte da proteína na sua superfície, e reintroduzir no doente as células transfectadas. As células infectadas seriam, agora, capazes de distribuir um sinal co-estimulatório a células T e, desse modo, activar células T in vivo.

Noutro pedido, regulação positiva ou melhoramento da função antigénica (de um modo preferido, função antigénica de linfócito B) pode ser útil na indução de imunidade tumoral. Células tumorais (e. g.r sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, 37 neuroblastoma, carcinoma) transfectadas com um ácido nucleico codificando, pelo menos um peptideo da presente invenção, podem ser administradas a um indivíduo para superar a tolerância especifica de tumor no indivíduo. Se desejado, a célula tumoral pode ser transfectada para expressar uma combinação de peptideos. Por exemplo, células tumorais obtidas de um doente podem ser transfectadas ex vivo com um vector de expressão direccionando a expressão de um peptideo possuindo apenas actividade semelhante a B7-2, ou em conjunto com um peptideo possuindo actividade semelhante a B7-1 e/ou actividade semelhante a B7-3. As células tumorais transfectadas são restituídas ao doente para resultar na expressão dos peptideos na superfície da célula transfectada. Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de terapia génica para marcar uma célula tumoral para transfecção in vivo. A presença do peptideo divulgado, possuindo a actividade de antigénio(s) de linfócito B na superfície da célula tumoral, proporciona o necessário sinal de co-estimulação a células T para induzir uma resposta imune mediada por célula T contra as células tumorais transfectadas. Adicionalmente, células tumorais que careçam de moléculas da classe I do MHC ou da classe II do MHC, ou que sejam incapazes de reexpressar quantidades suficientes de moléculas da classe I do MHC ou da classe II do MHC, podem ser transfectadas com ácido nucleico codificando a totalidade ou uma parte (e. g., uma parte truncada de dominio citoplasmático) de uma proteina de cadeia α da classe I do MHC e proteína microglobulina β2 ou uma proteína de cadeia α da classe II do MHC e uma proteína de cadeia β da classe II do MHC para expressar, desse modo, proteínas da classe I do MHC ou da classe II do MHC na superfície da célula. A expressão da classe I ou classe II do MHC apropriada, em conjunto com um peptideo 38 possuindo a actividade de um antigénio de linfócito B (e. g., B7-1, B7-2, B7-3), induz uma resposta imune mediada por células T contra a célula tumoral transfectada. Facultativamente, um gene codificando uma construção anti-sentido que bloqueia a expressão de uma proteína associada da classe II do MHC, tal como a cadeia invariante, pode igualmente ser co-transfectado com um ADN codificando um peptídeo possuindo a actividade de um antigénio de linfócito B para promover a apresentação de antigénios associados a tumores e induzir imunidade específica de tumor. Deste modo, a indução num indivíduo humano de uma resposta imune mediada por células T pode ser suficiente para superar a tolerância específica de tumor no indivíduo. A actividade de uma proteína divulgada pode, entre outros meios, ser medida pelos métodos seguintes:

Ensaios adequados para citotoxicidade de timócito ou esplenócito incluem, sem limitação, aqueles descritos em:

Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates e Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capitulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7 8:2488-2492,1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowmanet et al., J. Virology 61:1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 39 133:327-341, 1991/ Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994.

Ensaios para respostas de imunoglobulinas dependentes de células T e troca de classe de isótopo (que identificarão, entre outras, proteínas que modulam respostas de anticorpo dependentes de células T e que afectam perfis Thl/Th2) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990/ e Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J. e Brunswick, M. Em Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1- 3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.

Ensaios de reacções de linfócitos mistos (MLR) (que identificarão, entre outras, proteínas que geram predominantemente respostas Thl e CTL) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates e Wiley-Interscience (Captítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1- 3.19/ Captítulo 7, Immunologic studies in Humans)/ Takai et ai., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986/ Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988/ Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778- 3783, 1992.

Ensaios dependentes de células dendríticas (que identificarão, entre outras, proteínas expressas por células dendríticas que activam células T naive) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995/ Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991/ Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071- 5079, 1995/ Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 40 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-12 64, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinicai Investigation 94:797-807, 1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990.

Ensaios para sobrevivência/apoptose de linfócitos (que identificarão, entre outras, proteínas que previnem a apoptose após indução de superantigénio e proteínas que regulam a homeostasia de linfócitos) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670,1993; Gorczyca et al., Câncer Research 53:1945-1951,1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045,1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1:639-648,1992.

Ensaios para proteínas que influenciam etapas iniciais de comprometimento e desenvolvimento de células T incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Antica et al, Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122,1994; Galy et al., Blood 85:277 0-2778,1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad Sei. USA 88:7548-7551, 1991.

As moléculas de MCT-1 da presente invenção estão igualmente envolvidas na modulação de actividade STAT, e. g., sinalização (e. g., através de interaeção com moléculas STAT, e. g., STAT 3 e/ou STAT 5, e modulação da fosforilação de STAT) . Moduladores de sinalização STAT e moduladores de interaeção de MU-1 com moléculas STAT podem ser identificados através de ensaios de selecção como aqui descrito. 41

Ensaios que podem ser utilizados para identificar moduladores de actividade de MU-1 incluem ensaios para actividade STAT, e. g., sinalização STAT, tal como ensaios conhecidos na técnica e ensaios aqui descritos. Ensaios para actividade STAT estão igualmente descritos em, por exemplo, Friedrich K, et al. (2001) Biol Chem 382(2):343-51. Outros ensaios para actividade STAT incluem ensaios para proliferação celular e fosforilação STAT.

Num aspecto da invenção, um ensaio para um modulador de actividade de MU-1 consiste num ensaio de base celular no qual uma célula que expressa uma proteína MU-1, ou sua parte biologicamente activa, é colocada em contacto com um composto de teste e é determinada a capacidade do composto de teste para modular a actividade de MU-1 (e. g., interacção com moléculas STAT ou modulação de sinalização STAT). A determinação da capacidade do composto de teste para modular a actividade de MU-1 pode ser realizada pela monitorização, por exemplo, da sinalização STAT, fosforilação de moléculas STAT, proliferação celular, diferenciação celular, ou produção de citocinas. A célula, por exemplo, pode ser de origem mamífera, e. g., uma célula T activada.

Actividade de Regulação da Hematopoese

Uma proteína MU-1 pode ser útil na regulação da hematopoese e, consequentemente, no tratamento de deficiências de células mielóides ou linfóides. Até mesmo a actividade biológica marginal em favor de células de formação de colónia ou linhas celulares dependentes de factor, indicam envolvimento na 42 regulação da hematopoese, e. g., apenas no suporte do crescimento e proliferação de células eritróides progenitoras ou em combinação com outras citocinas indicando, desse modo, utilidade, por exemplo, no tratamento de diversas anemias ou para utilização em conjunto com irradiação/quimioterapia para estimular a produção de precursores eritróides e/ou células eritróides; no suporte do crescimento e proliferação de células mielóides tais como granulócitos e monócitos/macrófagos (i. e., actividade de CSF tradicional) útil, por exemplo, em conjunto com quimioterapia para prevenir ou tratar a consequente mielo-supressão; no suporte do crescimento e proliferação de megacariócitos e consequentemente de plaquetas permitindo, desse modo, a prevenção ou tratamento de diversos distúrbios plaquetários tais como trombocitopenia, e geralmente para utilização em lugar de, ou complementarmente a, transfusões plaquetárias; e/ou no suporte do crescimento e proliferação de células estaminais hematopoéticas que são capazes de maturação para toda e qualquer das células hematopoéticas supramencionadas e, por conseguinte, encontrar utilidade terapêutica em diversos distúrbios de células estaminais (tais como aqueles tratados habitualmente com transplantação incluindo, sem limitação, anemia aplástica e hemoglobinúria paroxística nocturna), bem como na repopulação do compartimento de células estaminais pós irradiação/quimioterapia, quer in vivo quer ex vivo (i. e., em conjunto com transplantação de medula óssea ou com transplantação de células progenitoras periféricas (homóloga ou heteróloga)) como células normais ou manipuladas geneticamente para terapia génica. A actividade de uma proteína MU-1 pode, entre outros meios, ser medida pelos métodos seguintes: 43

Ensaios adequados para proliferação e diferenciação de diversas linhas hematopoéticas estão citados acima.

Ensaios para diferenciação de células estaminais embriónicas (que identificarão, entre outras, proteínas que influenciam a hematopoese de diferenciação embriónica) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Johansson et al. Cellular Biology 15:141-151,1995; Keller et al., Molecular and Cellular Blology 13:473-486,1993; McClanahan et al., Blood 81:2903-2915, 1993.

Ensaios para sobrevivência de células estaminais e diferenciação (que identificarão, entre outras, proteínas que regulam a linfo-hematopoese) incluem, sem limitação, aqueles descritos em: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. Em Culture of Hematopoletic Cells. RI. Freshney, et al. eds. Vol pp. 265-268, Wiley-Liss, Inc., Nova Iorque, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad: Sei. USA 8 9:5907-5911,1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. e Briddell, R.A. Em Culture of Hematopoietic Cells. RI. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc., Nova Iorque, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. Em Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc., Nova Iorque, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. e Allen, T. Em Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., Nova Iorque, NY. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, HJ. Em Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc., Nova Iorque, NY. 1994. 44

Utilizações de Investigação e Utilidades

Os polinucleotídeos aqui divulgados podem ser utilizados pela comunidade de investigação para diversos fins. Os polinucleotídeos podem ser utilizados para expressar proteína recombinante para análise, caracterização ou utilização terapêutica; como marcadores para tecidos nos quais a proteína correspondente é expressa preferencialmente (quer constitutivamente quer numa fase particular de diferenciação tecidular ou desenvolvimento ou em estados de doença); como marcadores de peso molecular em géis de Southern; como marcadores cromossomais ou marcas (quando marcados) para identificar cromossomas ou para mapear posições de genes relacionados; para comparar com sequências de ADN endógeno em doentes para identificar potenciais distúrbios genéticos; como sondas para hibridizar e, deste modo, descobrir novas sequências de ADN relacionadas; como fonte de informação para obter iniciadores de PCR para impressão digital genética; como sonda para "retirar por subtração" sequências conhecidas no processo de descoberta de outros novos polinucleotídeos; para seleccionar e preparar oligómeros para ligação a um "chip génico" ou outro suporte, incluindo para examinação de padrões de expressão; para produzir anticorpos anti-proteína utilizando técnicas de imunização de ADN; e como antigénio para produzir anticorpos anti-ADN ou deduzir outra resposta imune. Onde o polinucleotídeo codifica uma proteína que se liga ou liga potencialmente a outra proteína (tal como, por exemplo, numa interacção receptor-ligando), o polinucleotídeo pode igualmente ser utilizado em ensaios de interacção armadilhados (tal como, por exemplo, aquele descrito em Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)) para 45 identificar polinucleotídeos codificando a outra proteína com a qual a ligação ocorre ou para identificar inibidores da interacção de ligação.

As proteínas aqui divulgadas podem analogamente ser utilizadas em ensaios para determinar actividade biológica, incluindo num painel de múltiplas proteínas para selecção de elevado débito; para produzir anticorpos ou para deduzir outra resposta imune; como reagente (incluindo o reagente marcado) em ensaios concebidos para determinar quantitativamente níveis da proteína (ou seu receptor) em fluidos biológicos; como marcadores para tecidos nos quais a proteína correspondente é expressa preferencialmente (quer constitutivamente quer numa fase particular de diferenciação tecidular ou desenvolvimento ou num estado de doença); e, claro, para isolar receptores ou ligandos correlativos. Onde a proteína se liga ou liga potencialmente a outra proteína (tal como, por exemplo, numa interacção receptor-ligando) , a proteína pode ser utilizada para identificar a outra proteína com a qual a ligação ocorre ou para identificar inibidores da interacção de ligação. Proteínas envolvidas nestas interacções de ligação podem igualmente ser utilizadas para pesquisar inibidores de peptídeos ou de moléculas pequenas ou agonistas da interacção de ligação.

Alguma ou a totalidade destas utilidades de investigação são capazes de ser desenvolvidas para reagentes de grau analítico ou formato de kit para comercialização como produtos de investigação. Métodos para a execução das utilizações acima listadas são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Referências divulgando tais métodos incluem, sem limitação, "Molecular 46

Cloning: A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis eds., 1989, e "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. e A.R Kimmel eds., 1987.

Utilizações Nutricionais

Os polinucleotideos e proteínas aqui divulgados podem igualmente ser utilizados como fontes nutricionais ou suplementos. Tais utilizações incluem, sem limitação, utilização como suplemento de proteína ou aminoácido, utilização como fonte de carbono, utilização como fonte de azoto e utilização como fonte de hidrato de carbono. Em tais casos a proteína ou polinucleotídeo da invenção podem ser adicionados à alimentação de um organismo particular ou podem ser administrados como uma preparação sólida ou líquida separada, tal como na forma de pó, comprimidos, soluções, suspensões ou cápsulas. No caso de microorganismos, a proteína ou o polinucleotídeo podem ser adicionados ao meio dentro ou sobre o qual o microorganismo é cultivado.

Proteínas MU-1 podem igualmente ser utilizadas para imunizar animais para a obtenção de anticorpos policlonais ou monoclonais que reagem especificamente com a proteína MU-1 e que podem inibir a ligação de ligandos ao receptor. Tais anticorpos podem ser obtidos utilizando a totalidade de MU-1 como imunogénio, ou pela utilização de fragmentos de MU-1. Para a imunização de animais podem igualmente ser utilizados fragmentos menores de MU-1. Os imunogénios peptídicos podem conter adicionalmente um resíduo de cisteína na extremidade 47 carboxilica, e são conjugados a um hapteno tal como hemocianina do caramujo (KLH). Imunogénios peptídicos adicionais podem ser gerados pela substituição de residuos de tirosina por residuos de tirosina sulfatados. Métodos para a sintese de tais peptideos são conhecidos na técnica, por exemplo, como em RP. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 8_5, 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).

Anticorpos neutralizantes ou não neutralizantes (de um modo preferido anticorpos monoclonais) que se ligam à proteina MU-1 podem igualmente ser terapia útil para determinados tumores e também no tratamento de estados acima descritos. Estes anticorpos monoclonais neutralizantes podem ser capazes de bloquear a ligação do ligando à cadeia do receptor de MU-1.

Esta invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos seguintes, os quais não devem ser interpretados como restritivos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Isolamento e Caracterização de ADNcs de MU-1 Murina:

Foi isolado por PCR um fragmento parcial do homólogo murino do receptor de MU-1 utilizando oligonucleotideos derivados da sequência humana. Foi preparado ADNc de ARN isolado de timos murinos com 17 dias de idade e a partir da linha celular T 2D6 murina. Foi amplificado um fragmento de ADN de aproximadamente 300 nucleotideos a partir do ADNc por PCR com os oligonucleotideos seguintes, correspondendo a regiões 584-603 e 48 876-896, respectivamente, da sequência humana de ADNc na figura 1 (correspondendo a SEQ ID N°:l): AGCATCAAGC CGGCTCCCCC (5p) (SEQ ID N°:ll) CTCCATTCAC TCCAGGTCCC (3p) (SEQ ID N°:12) A amplificação foi efectuada utilizando Taq polimerase em tampão 1 x Taq contendo cloreto de magnésio a 1,5 mM durante 30 ciclos a 94 °C durante um minuto, 50 °C durante 1 minuto e 72 °C durante um minuto. Determinou-se a sequência de ADN deste fragmento, e foram derivados dois oligonucleotideos a partir de uma parte interna deste fragmento com as sequências seguintes: TTGAACGTGACTGTGGCCTT (5p) (SEQ ID N°:13) TGAATGAAGTGCCTGGCTGA (3p) (SEQ ID N°:14)

Os oligonucleotideos foram utilizados para amplificar um fragmento interno de 262 nucleotideos do produto de PCR original (correspondendo aos nucleotideos 781-1043 da sequência de ADNc murina da figura 1 e SEQ ID N°:9) para utilizar como uma sonda de hibridação para pesquisar uma biblioteca de ADNc isolado a partir da linha celular T 2D6. As membranas foram hibridadas a 65 °C utilizando condições de hibridação 5 X SSC padrão e lavadas em SSC a 65 °C. Foram isolados vinte clones que se hibridaram à sonda numa selecção de 426000 clones. A sequência de ADN foi determinada a partir de dois clones independentes. A sequência de tamanho total do clone #6 confirmou ser o homólogo murino de tamanho total de MU-1 humana (SEQ ID N°:9). 49 A sequência nucleotídica de tamanho total de MU-1 murina é apresentada na figura 1 (correspondendo a SEQ ID N°:9). A sequência nucleotidica possui uma sequência lider prevista nos nucleotideos 407-464, sequência codificante nos nucleotideos 407-1993, codão de terminação nos nucleotideos 1994-1997. Os nucleotideos 1-406 correspondem à região em 5' não traduzida e os nucleotideos 1998-2628 correspondem à região em 3' não traduzida. A sequência proteica prevista de MU-1 murina é apresentada na figura 2 (correspondendo a SEQ ID N°:10) . A proteína MU-1 murina contém uma sequência líder prevista determinada por SPScan (pontuação=10,1) (correspondendo aos aminoácidos 1-19 de SEQ ID N°:10), e um domínio transmembranar previsto (correspondendo aos aminoácidos 237-253 de SEQ ID N°:10). Motivos de sinalização previstos incluem as regiões seguintes: Caixa 1: aminoácidos 265-274 de SEQ ID N°:10, Caixa 2: aminoácidos 310-324 de SEQ ID N°:10, seis resíduos de tirosinas nas posições 281, 319, 361, 368, 397 e 510 de SEQ ID N°:10. Sítios de potencial acoplagem STAT incluem: STATS: EDDGYPA, STAT 3:YLQR.

Exemplo 2: Comparação de MU-1 Humana e Murina:

Utilizou-se o algoritmo GAP para comparar os aminoácidos de MU-1 humana e murina. Uma comparação das sequências proteicas murinas e humanas previstas é apresentada na figura 4. Utilizando o algoritmo GAP os aminoácidos foram 65,267% idênticos. O alinhamento foi gerado pela matriz de substituição de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff, S. e Henikoff, J. G. (1992)). Matrizes de substituição de aminoácidos a partir de blocos de 50 proteínas (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919). Parâmetros de Lacuna= Ponderação de Lacuna: 8, Correspondência Média= 2,912, Ponderação de Comprimento= 2, Discrepância Média= -2,003. Percentagem de Semelhança= 69,466.

Uma comparação das sequências nucleotídicas humanas e murinas de ADNc é apresentada na figura 3. As sequências de ADN são 66,116% idênticas quando alinhadas utilizando o algoritmo GAP. Parâmetros de Lacuna: Ponderação de Lacuna: 50, Correspondência Média= 10,000, Ponderação de Comprimento= 3, Discrepância Média= 0,000. Percentagem de Semelhança= 66,198.

Ambas as proteínas MU-1 humanas e murinas são membros da superfamília dos receptores de citocina de Tipo 1. A avaliação da sequência de MU-1 murina e humana revela a presença de potenciais motivos de sinalização Caixa-1 e Caixa-2. Estão presentes seis resíduos de tirosina no domínio citoplasmático e poderiam igualmente ser importantes em funções de sinalização de MU-1. A comparação das sequências de MU-1 com outros membros da família sugeriu a presença de sítios de potencial acoplagem para STAT 5 e STAT 3.

Exemplo 3: Determinação de vias de sinalização STAT utilizadas por MU-1 Humana:

Manipularam-se células BAF-3 para expressar um receptor quimérico de citocina consistindo no domínio extracelular do receptor humano de EPO e no domínio intracelular do receptor de MU-1. Células BAF-3 que expressaram receptores quiméricos huEPOR/MU-1(cyto) proliferaram em resposta a EPO humana solúvel. Estas células foram analisadas para determinar que moléculas 51 STAT foram fosforiladas em resposta a sinalização EPO. Resumidamente, células de controlo BAF-3 parentais não modificadas e células quiméricas BAF-3 EPOR/MU foram retiradas de meio de crescimento contendo IL-3 e reestimuladas quer com IL-3 ou EPO durante 0, 15, 30 e 60 minutos. As células foram sedimentadas e ressuspensas em tampão de lise frio contendo ortovanadato, para preservar tirosinas fosforiladas. Resolveram-se em electroforese de SDS-PAGE quantidades iguais de lisado celular e transferiram-se para membranas de nitrocelulose para análise de Western. Transferências duplicadas foram coradas para formas fosforiladas e não fosforiladas de STAT 1, 3, 5 e 6 pela utilização de anticorpos específicos para cada forma da molécula STAT. Células HELA, não activadas e activadas com interferão alfa, foram utilizadas como controlos positivos.

Estes resultados indicaram que, sob estas condições específicas, a sinalização através de MU-1 resulta na fosforilação de STAT 5 em todos os intervalos de tempo testados (T=0, T=15', T=30', T=60')· O tratamento de controlos ou das células quiméricas BAF-3 com IL-3 resultou na fosforilação de STAT 3, mas não de STAT 1 ou 5.

Exemplo 4: Expressão Tecidular de MU-1 Murina e Humana

Análise de Northern

As transferências Northern de ARN polyA+ de vários tecidos (Clonetech, Paio Alto, CA) foram realizadas como recomendado pelo fabricante. Para as transferências murinas, foi utilizado para hibridação um fragmento de 262 nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos 781-1043 da Fig. 1 e SEQ ID N°:9. 52

Foi detectado um único transcrito de MU-1 murina nos tecidos do baço, pulmão e coração de murino adulto. 0 transcrito maior observado em tecidos humanos não foi observado em tecidos de murganho.

Detectaram-se dois transcritos de MU-1 humana em tecidos linfóides humanos adultos, PBLs, timo, baço e nodo linfático, e no pulmão fetal.

Hibridação In Situ

Estudos de hibridação in situ foram realizados por Phylogency Inc. de Columbus, OH (de acordo com o método de Lyons et al., 1990, J. Cell. Biol: 111:2427-2436). Resumidamente, secções em série de parafina de 5-7 micrones foram desparafinadas, fixas, digeridas com proteinase K, tratadas com tri-etanolamina e desidratadas. Prepararam-se ARNcs a partir de moldes linearizados de ADNc para gerar sondas anti-sentido e sentido. Os transcritos de ARNc foram sintetizados de acordo com as condições do fabricante (Ambion) e foram marcados com 35S-UTP. Hibridaram-se secções de um dia para o outro, lavaram-se com restringência e trataram-se com ARNase A e mergulharam-se em emulsão ionográfica e foram expostas durante 2-3 semanas. Hibridaram-se secções de controlo com sondas sentido para indicar o nivel de ruido de fundo do processo. A sonda murina consistiu num fragmento de 186pb correspondendo aos nucleotideos 860-1064 (SEQ ID N°:9). A sonda humana era um produto de PCR de 231pb gerado a partir de ADN humano de MU-1. 53 A expressão de MU-1 murina foi observada nos nodos linfáticos do intestino delgado do adulto nos centros germinativos e muscularis externa. Nodos linfáticos especializados e placas de Peyer exibiram igualmente expressão de MU-1 murina.

Expressão de MU-1 humana foi detectada nos centros germinativos dos nodos linfáticos no córtex. A medula, a qual contém macrófagos, foi negativa para MU-1 humana. No baço humano, a expressão de MU-1 humana foi detectada nas regiões de polpa branca mas não polpa vermelha.

Exemplo 5: Expressão de MU-1 Humana em células e linhas celulares:

A análise de protecção de ARNase foi realizada em células T humanas em repouso e activadas e nas linhas celulares B, Raj i e RPMI 8866, e na linha celular T Jurkat. As células T humanas foram activadas com anti-CD3 e anti-CD28. As linhas celulares foram activadas por éster de Forbol e ionomicina. 0 plasmídeo MU-1 produtor de ribosonda foi construído pela inserção de um produto de PCR de 231pb (o PCR foi realizado pela utilização do iniciador 5' CACAAAGCTTCAGTATGAGCTGCAGTACAGGAACCGGGGA (SEQ ID N°: 15) e iniciador 3' CACAGGATCCCT T TAAC TCCTCTGAC TGGGTC TGAAAGAT (SEQ ID N°:16)) nos sítios da BamHl e HindIII do vector pGEM3zf(-) (Promega, Madison, WI). Para preparar a ribosonda, o plasmídeo produtor de ribosonda foi linearizado com HindIII. 0 ADN resultante foi extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. A T7 ARN polimerase foi utilizada para preparar a ribosonda de acordo com o protocolo sugerido pelo vendedor (PharMingen, San Diego, CA) . 0 ensaio de protecção de ARNase foi 54 realizado pela utilização do sistema da PharMingen RiboQuant Multi-Probe Ribonuclease Protection Assay. Incluiram-se 2,0 ug de ARN total em cada reacção de RPA, após digestão de ARN, as ribosondas protegidas foram corridas num sistema de separação rápida de ácido nucleico QuickPoint (Novex, San Diego, CA) . Os géis foram secos e expostos conforme a indicação do vendedor. ARN de MU-1 humana é regulado positivamente em células humanas purificadas CD3+ estimuladas com anti-CD3 +anti-CD28 quando comparado com populações não estimuladas. MU-1 é igualmente regulada positivamente após reestimulação em populações de células T Th e Th2 assimétricas. As linhas celulares B, RPMI 8866 e Raji, expressam MU-1 constitutivamente ao passo que a linha celular T Jurkat não o faz.

Exemplo 6: Ligação de MU-1 humana a Citocinas Conhecidas

Tanto as proteinas de fusão Ig humanas como murinas foram construídas e imobilizadas em chips Biacore num esforço para identificar o ligando de MU-1. Avaliaram-se uma variedade de meios condicionados de cultura celular bem como um painel de citocinas conhecidas para ligação a MU-1. Algumas citocinas foram igualmente testadas em combinação com outras cadeias de receptores na familia para considerar a possibilidade que MU-1 pode requerer um segunda cadeia de receptor para ligação do ligando. Testaram-se as citocinas seguintes e verificou-se serem negativas para ligação a MU-1: mIL-2, hIL-2, hIL-15, mIL-7, TSLP, TSLP+IL7, TSLP+IL7R, TSLP+IL7g, TSLP+ IL-2, TSLP + IL2 + IL2Rbeta, IL2Rbeta, IL2Rgama, IL7R, IL2+2Rbeta, IL2+2Rgama, ILl5+IL2Rbeta, IL15+2Rgama, IL7+2Rgama, IL2+IL7R, IL15+IL7R, IL7+IL7R. Imobilizaram-se igualmente receptores conhecidos e 55 testaram-se para ligação a MUFc com resultados negativos. IL-15 irá ligar-se a IL2Rb mas não a IL2Rg ou MUFc. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genetics Institute, Inc., et al.

<120> MU-1, MEMBRO DA FAMÍLIA DOS RECEPTORES DE CITOCINA

<130> GFN-5230CPPC <140> <141> <150> 09/569,384 <151> 2000-05-11 <160> 16

<170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2665 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 56 gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg 60 tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat 120 ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc 180 acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagcatgcc 240 gcgtggctgg gccgccccct tgctcctgct gctgctccag ggaggctggg gctgccccga 300 cctcgtctgc tacaccgatt acctccagac ggtcatctgc atcctggaaa tgtggaacct 360 ccaccccagc acgctcaccc ttacctggca agaccagtat gaagagctga aggacgaggc 420 cacctcctgc agcctccaca ggtcggccca caatgccacg catgccacct acacctgcca 480 catggatgta ttccacttca tggccgacga cattttcagt gtcaacatca cagaccagtc 540 tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct gagagcatca agccggctcc 600 ccctttcaac gtgactgtga ccttctcagg acagtataat atctcctggc gctcagatta 660 cgaagaccct gccttctaca tgctgaaggg caagcttcag tatgagctgc agtacaggaa 720 ccggggagac ccctgggctg tgagtccgag gagaaagctg atctcagtgg actcaagaag 780 tgtctccctc ctccccctgg agttccgcaa agactcgagc tatgagctgc aggtgcgggc 840 agggcccatg cctggctcct cctaccaggg gacctggagt gaatggagtg acccggtcat 900 ctttcagacc cagtcagagg agttaaagga aggctggaac cctcacctgc tgcttctcct 960 cctgcttgtc atagtcttca ttcctgcctt ctggagcctg aagacccatc cattgtggag 1020 gctatggaag aagatatggg ccgtccccag ccctgagcgg ttcttcatgc ccctgtacaa 1080 gggctgcagc ggagacttca agaaatgggt gggtgcaccc ttcactggct ccagcctgga 1140 gctgggaccc tggagcccag aggtgccctc caccctggag gtgtacagct gccacccacc 1200 acggagcccg gccaagaggc tgcagctcac ggagctacaa gaaccagcag agctggtgga 1260 gtctgacggt gtgcccaagc ccagcttctg gccgacagcc cagaactcgg ggggctcagc 1320 ttacagtgag gagagggatc ggccatacgg cctggtgtcc attgacacag tgactgtgct 1380 agatgcagag gggccatgca cctggccctg cagctgtgag gatgacggct acccagccct 1440 ggacctggat gctggcctgg agcccagccc aggcctagag gacccactct tggatgcagg 1500 gaccacagtc ctgtcctgtg gctgtgtctc agctggcagc cctgggctag gagggcccct 1560 gggaagcctc ctggacagac taaagccacc ccttgcagat ggggaggact gggctggggg 1620 actgccctgg ggtggccggt cacctggagg ggtctcagag agtgaggcgg gctcacccct 1680 ggccggcctg gatatggaca cgtttgacag tggctttgtg ggctctgact gcagcagccc 1740 tgtggagtgt gacttcacca gccccgggga cgaaggaccc ccccggagct acctccgcca 1800 gtgggtggtc attcctccgc cactttcgag ccctggaccc caggccagct aatgaggctg 1860 actggatgtc cagagctggc caggccactg ggccctgagc cagagacaag gtcacctggg 1920 ctgtgatgtg aagacacctg cagcctttgg tctcctggat gggcctttga gcctgatgtt 1980 tacàgtgtct gtgtgtgtgt gtgcatatgt gtgtgtgtgc atatgcatgt gtgtgtgtgt 2040 gtgtgtctta ggtgcgcagt ggcatgtcca cgtgtgtgtg tgattgcacg tgcctgtggg 2100 cctgggataa tgcccatggt actccatgca ttcacctgcc ctgtgcatgt ctggactcac 2160 ggagctcacc catgtgcaca agtgtgcaca gtaaacgtgt ttgtggtcaa cagatgacaa 2220 cagccgtcct ccctcctagg gtcttgtgtt gcaagttggt ccacagcatc tccggggctt 2280 tgtgggatca gggcattgcc tgtgactgag gcggagccca gccctccagc gtctgcctcc 2340 aggagctgca agaagtccat attgttcctt atcacctgcc aacaggaagc gaaaggggat 2400 ggagtgagcc catggtgacc tcgggaatgg caattttttg ggcggcccct ggacgaaggt 2460 ctgaatcccg actctgatac cttctggctg tgctacctga gccaagtcgc ctcccctctc 2520 tgggctagag tttccttatc cagacagtgg ggaaggcatg acacacctgg gggaaattgg 2580 cgatgtcacc cgtgtacggt acgcagccca gagcagaccc tcaataaacg tcagcttcct 2640 tcaaaaaaaa aaaaaaaaat ctaga 2665 <210> 2 <211> 538 57

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gin Gly 1 5 10 15 Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Vai Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gin Thr 20 25 30 Vai Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr 35 40 45 Leu Thr Trp Gin Asp Gin Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser 50 55 60 Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Cys His Met Asp Vai Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Vai 85 90 95 Asn Ile Thr Asp Gin Ser Gly Asn Tyr Ser Gin Glu Cys Gly Ser Phe 100 105 11Ò Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Vai Thr Vai 115 120 125 Thr Phe Ser Gly Gin Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp 130 135 140 Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gin Tyr Glu Leu Gin Tyr 145 150 155 160 Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Vai Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile 165 170 175 Ser Vai Asp Ser Arg Ser Vai Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys 180 185 190 Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gin Vai Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser 195 200 205 Ser Tyr Gin Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Vai Ile Phe Gin 210 215 220 Thr Gin Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu 225 230 235 240 Leu Leu Leu Leu Vai Ile Vai Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys 58 245 250 255

Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Vai Pro Ser 260 265 270 Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe 275 280 285 Lys Lys Trp Vai Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly 290 295 300 Pro Trp Ser Pro Glu Vai Pro Ser Thr Leu Glu Vai Tyr Ser Cys His 305 310 315 320 Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gin Leu Thr Glu Leu Gin Glu 325 330 335 Pro Ala Glu Leu Vai Glu Ser Asp Gly Vai Pro Lys Pro Ser Phe Trp 340 345 350 Pro Thr Ala Gin Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp 355 360 365 Arg Pro Tyr Gly Leu Vai Ser Ile Asp Thr Vai Thr Vai Leu Asp Ala 370 375 380 Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro 385 390 395 400 Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp 405 410 415 Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Vai Leu Ser Cys Gly Cys Vai Ser 420 425 430 Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro 450 455 460 Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Vai Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser 4 65 470 475 480 Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Vai Gly 485 490 495 Ser Asp Cys Ser Ser Pro Vai Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp 500 505 510 Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Trp Vai Vai Ile Pro Pro 515 520 525 Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gin Ala Ser 530 535 59 <210> 3

<211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Leu Met Thr Asn Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Vai Gin Vai Arg Ala Ala Vai Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly 20 25 30 Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gin Pro Ile Tyr Vai Gly Asn Asp Glu His 35 40 45 Lys Pro Leu Arg Glu Trp Phe Vai Ile Vai Ile Met Ala Thr Ile Cys 50 55 60 Phe Ile Leu Leu Ile Leu 65 70

210 > 4 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 gagtccgagg agaaagctga tctca 25

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 60 24 gaaagatgac cgggtcactc catt <2 A o \—1 6 <2 11> 29 <2 12> ADN <2 13> Homo sapiens <4 Λ o o 6 actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca 29 <210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 7 actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca 29

<210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Xaa na posição 3 pode ser qualquer aminoácido <400> 8

Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5 61 210 > 9 <211> 2628

<212> ADN <213> Mus musculus <4 Ο Ο> 9 gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt 60 gcttgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc 120 caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc 180 tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt 240 ctggacttgc acctgactga actcctgccc acctcaaacc ttcacctccc accaccacca 300 ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga 360 atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagcatgc cccggggccc 420 agtggctgcc ttactcctgc tgattctcca tggagcttgg agctgcctgg acctcacttg 480 ctacactgac tacctctgga ccatcacctg tgtcctggag acacggagcc ccaaccccag 540 catactcagt ctcacctggc aagatgaata tgaggaactt caggaccaag agaccttctg 600 cagcctacac aggtctggcc acaacaccac acatatatgg tacacgtgcc atatgcgctt 660 gtctcaattc ctgtccgatg aagttttcat tgtcaatgtg acggaccagt ctggcaacaa 720 ctcccaagag tgtggcagct ttgtcctggc tgagagcatc aaaccagctc cccccttgaa 780 cgtgactgtg gccttctcag gacgctatga tatctcctgg gactcagctt atgacgaacc 840 ctccaactac gtgctgaggg gcaagctaca atatgagctg cagtatcgga acctcagaga 900 cccctatgct gtgaggccgg tgaccaagct gatctcagtg gactcaagaa acgtctctct 960 tctccctgaa gagttccaca aagattctag ctaccagctg caggtgcggg cagcgcctca 1020 gccaggcact tcattcaggg ggacctggag tgagtggagt gaccccgtca tctttcagac 1080 ccaggctggg gagcccgagg caggctggga ccctcacatg ctgctgctcc tggctgtctt 1140 gatcattgtc ctggttttca tgggtctgaa gatccacctg ccttggaggc tatggaaaaa 1200 gatatgggca ccagtgccca cccctgagag tttcttccag cccctgtaca gggagcacag 1260 cgggaacttc aagaaatggg ttaatacccc tttcacggcc tccagcatag agttggtgcc 1320 acagagttcc acaacaacat cagccttaca tctgtcattg tatccagcca aggagaagaa 1380 gttcccgggg ctgccgggtc tggaagagca actggagtgt gatggaatgt ctgagcctgg 1440 tcactggtgc ataatcccct tggcagctgg ccaagcggtc tcagcctaca gtgaggagag 1500 agaccggcca tatggtctgg tgtccattga cacagtgact gtgggagatg cagagggcct 1560 gtgtgtctgg ccctgtagct gtgaggatga tggctatcca gccatgaacc tggatgctgg 1620 ccgagagtct ggccctaatt cagaggatct gctcttggtc acagaccctg cttttctgtc 1680 ttgcggctgt gtctcaggta gtggtctcag gcttggaggc tccccaggca gcctactgga 1740 caggttgagg ctgtcatttg caaaggaagg ggactggaca gcagacccaa cctggagaac 1800 tgggtcccca ggagggggct ctgagagtga agcaggttcc ccccctggtc tggacatgga 1860 cacatttgac agtggctttg caggttcaga ctgtggcagc cccgtggaga ctgatgaagg 1920 accccctcga agctatctcc gccagtgggt ggtcaggacc cctccacctg tggacagtgg 1980 agcccagagc agctagcata taataaccag ctatagtgag aagaggcctc tgagcctggc 2040 atttacagtg tgaacatgta ggggtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2100 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtcttgggt tgtgtgttag cacatccatg ttgggatttg 2160 gtctgttgct atgtattgta atgctaaatt ctctacccaa agttctaggc ctacgagtga 2220 attctcatgt ttacaaactt gctgtgtaaa ccttgttcct taatttaata ccattggtta 2280 aataaaattg gctgcaacca attactggag ggattagagg tagggggctt ttgagttacc 2340 tgtttggaga tggagaagga gagaggagag accaagagga gaaggaggaa ggagaggaga 2400 ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggctgccgtg 2460 aggggagagg gaccatgagc ctgtggccag gagaaacagc aagtatctgg ggtacactgg 2520 tgaggaggtg gccaggccag cagttagaag agtagattag gggtgacctc cagtatttgt 2580 caaagccaat taaaataaca aaaaaaaaaa aaaagcggcc gctctaga 2628 62 <210> 10

<211> 529 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 10

His Gly 15

Met Pro Arg Gly Pro Vai Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu 15 10 63

Ala Trp Ser Cys 20 Leu Asp Leu Thr Ile Thr Cys 35 Vai Leu Glu Thr Arg '40 Leu Thr Trp 50 Gin Asp Glu Tyr 55 Glu Cys 65 Ser Leu His Arg Ser 70 Gly His Cys His Met Arg Leu 85 Ser Gin Phe Asn Vai Thr Asp 100 Gin Ser Gly Asn Vai Leu Ala 115 Glu Ser Ile Lys Pro 120 Ala Phe 130 Ser Gly Arg Tyr Asp 135 Ile Pro 145 Ser Asn Tyr Vai Leu 150 Arg Gly Arg Asn Leu Arg Asp 165 Pro Tyr Ala Ser Vai Asp Ser 180 Arg Asn Vai Ser Asp Ser Ser 195 Tyr Gin Leu Gin Vai 200 Ser Phe 210 Arg Gly Thr Trp Ser 215 Glu Thr 225 Gin Ala Gly Glu Pro 230 Glu Ala Leu Leu Ala Vai Leu 245 Ile Ile Vai His Leu Pro Trp 260 Arg Leu Trp Lys Pro 1 Glu Ser 275 Phe Phe Gin Pro Leu 280 Lys Lys 290 Trp Vai Asn Thr Pro 295 Phe Pro 305 Gin Ser Ser Thr Thr 310 Thr Ser Ala Lys Glu Lys Lys 325 Phe Pro Gly

Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr 25 30 Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser 45 Glu Leu Gin Asp Gin Glu Thr Phe 60 Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr 75 80 Leu Ser Asp Glu Vai Phe Ile Vai 90 95 Asn Ser Gin Glu Cys Gly Ser Phe 105 110 Ala Pro Pro Leu Asn Vai Thr Vai 125 Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu 140 Lys Leu Gin Tyr Glu Leu Gin Tyr 155 160 Vai Arg Pro Vai Thr Lys Leu Ile 170 175 Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys 185 190 Arg Ala Ala Pro Gin Pro Gly Thr 205 Trp Ser Asp Pro Vai Ile Phe Gin 220 Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu 235 24 0 Leu Vai Phe Met Gly Leu Lys Ile 250 255 Lys Ile Trp Ala Pro Vai Pro Thr 265 270 Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe 285 Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Vai 300 Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro 315 320 Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gin Leu 330 335 64

Glu Cys Asp Gly Met 340 Ser Glu Pro Gly 345 Hls Trp Cys Ile Ile 350 Pro Leu Ala Ala Gly 355 Gin Ala Vai Ser Ala 360 Tyr Ser Glu Glu Arg 365 Asp Arg Pro Tyr Gly 370 Leu Vai Ser Ile Asp Thr 375 Vai Thr Vai Gly Asp 380 Ala Glu Gly Leu 385 Cys Vai Trp Pro Cys 390 Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr 395 Pro Ala Met 400 Asn Leu Asp Ala Gly 405 Arg Glu Ser Gly Pro 410 Asn Ser Glu Asp Leu Leu 415 Leu Vai Thr Asp Pro 420 Ala Phe Leu Ser 425 Cys Gly Cys Vai Ser 430 Gly Ser Gly Leu Arg 435 Leu Gly Gly Ser Pro 440 Gly Ser Leu Leu Asp 445 Arg Leu Arg Leu Ser 450 Phe Ala Lys Glu Gly Asp 455 Trp Thr Ala Asp Pro 4 60 Thr Trp Arg Thr 455 Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser 470 Glu Ser Glu Ala Gly 475 Ser Pro Pro 480 Gly Leu Asp Met Asp 485 Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly 490 Ser Asp Cys 495 Gly Ser Pro Vai Glu 500 Thr Asp Glu Gly 505 Pro Pro Arg Ser Tyr 510 Leu Arg Gin Ser Trp Vai 515 Vai Arg Thr Pro Pro 520 Pro Vai Asp Ser Gly 525 Ala Gin Ser <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 11 agcatcaagc cggctccccc 20 65 <210> 12

<211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 12 ctccattcac tccaggtccc 20 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> iii <4 0 0> 13 ttgaacgtga ctgtggcctt 20

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 14 tgaatgaagt gcctggctga 20 cacaaagctt cagtatgagc tgcagtacag gaaccgggga 40 <210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 15 66 <210> 16

<211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 16 cacaggatcc ctttaactcc tctgactggg tctgaaagat 40 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0127] <110> Genetics Institute, Inc., et al.

<120> MU-1, MEMBRO DA FAMÍLIA DOS RECEPTORES DE CITOCINA

<130> GFN-5230CPPC <140> <141> <150> 09/569,384 <151> 2000-05-11 <160> 16

<170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2665 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 1 67 gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg 60 tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat 120 ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc 180 acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagcatgcc 240 gcgtggctgg gccgccccct tgctcctgct gctgctccag ggaggctggg gctgccccga 300 cctcgtctgc tacaccgatt acctccagac ggtcatctgc atcctggaaa tgtggaacct 360 ccaccccagc acgctcaccc ttacctggca agaccagtat gaagagctga aggacgaggc 420 cacctcctgc agcctccaca ggtcggccca caatgccacg catgccacct acacctgcca 480 catggatgta ttccacttca tggccgacga cattttcagt gtcaacatca cagaccagtc 540 tggcaactac tcccaggagt gtggcagctt tctcctggct gagagcatca agccggctcc 600 ccctttcaac gtgactgtga ccttctcagg acagtataat atctcctggc gctcagatta 660 cgaagaccct gccttctaca tgctgaaggg caagcttcag tatgagctgc agtacaggaa 720 ccggggagac ccctgggctg tgagtccgag gagaaagctg atctcagtgg actcaagaag 780 tgtctccctc ctccccctgg agttccgcaa agactcgagc tatgagctgc aggtgcgggc 840 agggcccatg cctggctcct cctaccaggg gacctggagt gaatggagtg acccggtcat 900 ctttcagacc cagtcagagg agttaaagga aggctggaac cctcacctgc tgcttctcct 960 cctgcttgtc atagtcttca ttcctgcctt ctggagcctg aagacccatc cattgtggag 1020 gctatggaag aagatatggg ccgtccccag ccctgagcgg ttcttcatgc ccctgtacaa 1080 gggctgcagc ggagacttca agaaatgggt gggtgcaccc ttcactggct ccagcctgga 1140 gctgggaccc tggagcccag aggtgccctc caccctggag gtgtacagct gccacccacc 1200 acggagcccg gccaagaggc tgcagctcac ggagctacaa gaaccagcag agctggtgga 1260 gtctgacggt gtgcccaagc ccagcttctg gccgacagcc cagaactcgg ggggctcagc 1320 ttacagtgag gagagggatc ggccatacgg cctggtgtcc attgacacag tgactgtgct 1380 agatgcagag gggccatgca cctggccctg cagctgtgag gatgacggct acccagccct 1440 ggacctggat gctggcctgg agcccagccc aggcctagag gacccactct tggatgcagg 1500 gaccacagtc ctgtcctgtg gctgtgtctc agctggcagc cctgggctag gagggcccct 1560 gggaagcctc ctggacagac taaagccacc ccttgcagat ggggaggact gggctggggg 1620 actgccctgg ggtggccggt cacctggagg ggtctcagag agtgaggcgg gctcacccct 1680 ggccgçcctg gatatggaca cgtttgacag tggctttgtg ggctctgact gcagcagccc 1740 tgtggagtgt gacttcacca gccccgggga cgaaggaccc ccccggagct acctccgcca 1800 gtgggtggtc attcctccgc cactttcgag ccctggaccc caggccagct aatgaggctg 1860 actggatgtc cagagctggc caggccactg ggccctgagc cagagacaag gtcacctggg 1920 ctgtgatgtg aagacacctg cagcctttgg tctcctggat gggcctttga gcctgatgtt 1980 tacagtgtct gtgtgtgtgt gtgcatatgt gtgtgtgtgc atatgcatgt gtgtgtgtgt 2040 gtgtgtctta ggtgcgcagt ggcatgtcca cgtgtgtgtg tgattgcacg tgcctgtggg 2100 cctgggataa tgcccatggt actccatgca ttcacctgcc ctgtgcatgt ctggactcac 2160 ggagctcacc catgtgcaca agtgtgcaca gtaaacgtgt ttgtggtcaa cagatgacaa 2220 cagccgtcct ccctcctagg gtcttgtgtt gcaagttggt ccacagcatc tccggggctt 2280 tgtgggatca gggcattgcc tgtgactgag gcggagccca gccctccagc gtctgcctcc 2340 aggagctgca agaagtccat attgttcctt atcacctgcc aacaggaagc gaaaggggat 2400 ggagtgagcc catggtgacc tcgggaatgg caattttttg ggcggcccct ggacgaaggt 2460 ctgaatcccg actctgatac cttctggctg tgctacctga gccaagtcgc ctcccctctc 2520 tgggctagag tttccttatc cagacagtgg ggaaggcatg acacacctgg gggaaattgg 2580 cgatgtcacc cgtgtacggt acgcagccca gagcagaccc tcaataaacg tcagcttcct 2640 tcaaaaaaaa aaaaaaaaat ctaga 2665 <210> 2 <211> 538 68

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro 1 5

Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Vai 20

Vai Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp 35 40

Leu Thr Trp Gin Asp Gin Tyr Glu 50 55

Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His 65 70

Cys His Met Asp Vai Phe His Phe 85

Asn Ile Thr Asp Gin Ser Gly Asn 100

Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro 115 120

Thr Phe Ser Gly Gin Tyr Asn Ile 130 135

Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly 145 150

Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala 165

Ser Vai Asp Ser Arg Ser Vai Ser 180

Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gin Vai 195 200

Ser Tyr Gin Gly Thr Trp Ser Glu 210 215

Thr Gin Ser Glu Glu Leu Lys Glu 225 230

Leu Leu Leu Leu Vai Ile Vai Phe

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gin Gly 10 15

Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gin Thr 25 30

Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr 4 5

Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser 60

Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr 75 80

Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Vai 90 95

Tyr Ser Gin Glu Cys Gly Ser Phe 105 110

Ala Pro Pro Phe Asn Vai Thr Vai 125

Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp 140

Lys Leu Gin Tyr Glu Leu Gin Tyr 155 160

Vai Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile 170 175

Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys 185 190

Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser 205

Trp Ser Asp Pro Vai Ile Phe Gin 220

Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu 235 240

Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys 69 245 250 255

Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Vai Pro Ser 260 265 270

Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe 275 280 285

Lys Lys Trp Vai Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly 290 295 300

Pro Trp Ser Pro Glu Vai Pro Ser Thr Leu Glu Vai Tyr Ser Cys His 305 310 315 320

Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gin Leu Thr Glu Leu Gin Glu 325 330 335

Pro Ala Glu Leu Vai Glu Ser Asp Gly Vai Pro Lys Pro Ser Phe Trp 340 345 350

Pro Thr Ala Gin Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp 355 360 365

Arg Pro Tyr Gly Leu Vai Ser Ile Asp Thr Vai Thr Vai Leu Asp Ala 370 375 380

Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro 385 390 395 400

Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp 405 410 415

Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Vai Leu Ser Cys Gly Cys Vai Ser 420 425 430

Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg 435 440 445

Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro 450 455 460

Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Vai Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser 465 470 475 480

Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Vai Gly 485 490 495

Ser Asp Cys Ser Ser Pro Vai Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp 500 505 510

Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Trp Vai Vai Ile Pro Pro 515 520 525

Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gin Ala Ser 530 535 70

<210> 3 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Leu Met Thr Asn Ala Phe Ile Ser 1 5 Asp Vai Gin Vai Arg Ala Ala Vai 20 Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gin Pro 35 40 Lys Pro Leu Arg Glu Trp Phe Vai 50 55 Phe lie Leu Leu Ile Leu 65 70

Ile Ile Asp Asp 10 Leu Ser Lys 15 Tyr Ser 25 Ser Met Cys Arg Glu 30 Ala Gly Ile Tyr Vai Gly Asn 45 Asp Glu His Ile Vai Ile Met 60 Ala Thr Ile Cys <210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 25 24 gagtccgagg agaaagctga tctca

<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 gaaagatgac cgggtcactc catt 71 29

<210> 6 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 6 actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca <2 A o \—1 7 <2 11> 29 <2 12> ADN <2 13> Homo <4 A o o 7 sapiens 29 actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <223> Xaa na posição <4 0 0> 8 3 pode ser qualquer aminoácido

Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5 72 <210> 9

<211> 2628 <212> ADN <213> Mus musculus <4 Ο Ο> 9 gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt 60 gcttgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc 120 caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc 180 tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt 240 ctggacttgc acctgactga actcctgccc acctcaaacc ttcacctccc accaccacca 300 ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga 360 atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagcatgc cccggggccc 420 agtggctgcc ttactcctgc tgattctcca tggagcttgg agctgccfgg acctcacttg 480 ctacactgac tacctctgga ccatcacctg tgtcctggag acacggagcc ccaaccccag 540 catactcagt ctcacctggc aagatgaata tgaggaactt caggaccaag agaccttctg 600 cagcctacac aggtctggcc acaacaccac acatatatgg tacacgtgcc atatgcgctt 660 gtctcaattc ctgtccgatg aagttttcat tgtcaatgtg acggaccagt ctggcaacaa 720 ctcccaagag tgtggcagct ttgtcctggc tgagagcatc aaaccagctc cccccttgaa 780 cgtgactgtg gccttctcag gacgctatga tatctcctgg gactcagctt atgacgaacc 840 ctccaactac gtgctgaggg gcaagctaca atatgagctg cagtatcgga acctcagaga 900 cccctatgct gtgaggccgg tgaccaagct gatctcagtg gactcaagaa acgtctctct 960 tctccctgaa gagttccaca aagattctag ctaccagctg caggtgcggg cagcgcctca 1020 gccaggcact tcattcaggg ggacctggag tgagtggagt gaccccgtca tctttcagac 1080 ccaggctggg gagcccgagg caggctggga ccctcacatg ctgctgctcc tggctgtctt 1140 gatcattgtc ctggttttca tgggtctgaa gatccacctg ccttggaggc tatggaaaaa 1200 gatatgggca ccagtgccca cccctgagag tttcttccag cccctgtaca gggagcacag 1260 cgggaacttc aagaaatggg ttaatacccc tttcacggcc tccagcatag agttggtgcc 1320 acagagttcc acaacaacat cagccttaca tctgtcattg tatccagcca aggagaagaa 1380 gttcccgggg ctgccgggtc tggaagagca actggagtgt gatggaatgt ctgagcctgg 1440 tcactggtgc ataatcccct tggcagctgg ccaagcggtc tcagcctaca gtgaggagag 1500 agaccggcca tatggtctgg tgtccattga cacagtgact gtgggagatg cagagggcct 1560 gtgtgtctgg ccctgtagct gtgaggatga tggctatcca gccatgaacc tggatgctgg 1620 ccgagagtct ggccctaatt cagaçgatct gctcttggtc acagaccctg cttttctgtc 1680 ttgcggctgt gtctcaggta gtggtctcag gcttggaggc tccccaggca gcctactgga 1740 caggttgagg ctgtcatttg caaaggaagg ggactggaca gcagacccaa cctggagaac 1800 tgggtcccca ggagggggct ctgagagtga agcaggttcc ccccctggtc tggacatgga 1860 cacatttgac agtggctttg caggttcaga ctgtggcagc cccgtggaga ctgatgaagg 1920 accccctcga agctatctcc gccagtgggt ggtcaggacc cctccacctg tggacagtgg 1980 agcccagagc agctagcata taataaccag ctatagtgag aagaggcctc tgagcctggc 2040 atttacagtg tgaacatgta ggggtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2100 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtcttgggt tgtgtgttag cacatccatg ttgggatttg 2160 gtctgttgct atgtattgta atgctaaatt ctctacccaa agttctaggc ctacgagtga 2220 attctcatgt ttacaaactt gctgtgtaaa ccttgttcct taatttaata ccattggtta 2280 aataaaattg gctgcaacca attactggag ggattagagg tagggggctt ttgagttacc 2340 tgtttggaga tggagaagga gagaggagag accaagagga gaaggaggaa ggagaggaga 2400 ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggagaggaga ggctgccgtg 2460 aggggagagg gaccatgagc ctgtggccag gagaaacagc aagtatctgg ggtacactgg 2520 tgaggaggtg gccaggccag cagttagaag agtagattag gggtgacctc cagtatttgt 2580 caaagccaat taaaataaca aaaaaaaaaa aaaagcggcc gctctaga 2628 73 <210> 10

<211> 529 <212> PRT <213> Mus musculus <4 0 0> 10

Met Pro Arg Gly Pro Vai Ala Ala Leu 1 5

Leu Leu Leu Ile Leu His 10 15

Gly 74

Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr 20 Ile Thr Cys Vai Leu Glu Thr Arg 35 40 Leu Thr Trp Gin Asp Glu Tyr Glu 50 55 Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His 65 70 Cys His Met Arg Leu Ser Gin Phe 85 Asn Vai Thr Asp Gin Ser Gly Asn 100 Vai Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro 115 120 Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile 130 135 Pro Ser Asn Tyr Vai Leu Arg Gly 145 150 Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala 165 Ser Vai Asp Ser Arg Asn Vai Ser 180 Asp Ser Ser Tyr Gin Leu Gin Vai 195 200 Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu 210 215 Thr Gin Ala Gly Glu Pro Glu Ala 225 230 Leu Leu Ala Vai Leu Ile Ile Vai 245 His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys 260 Pro Glu Ser Phe Phe Gin Pro Leu 275 280 Lys Lys Trp Vai Asn Thr Pro Phe 290 295 Pro Gin Ser Ser Thr Thr Thr Ser 305 310 Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly 325

Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr 25 30

Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser 45

Glu Leu Gin Asp Gin Glu Thr Phe 60

Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr 75 80

Leu Ser Asp Glu Vai Phe Ile Vai 90 95

Asn Ser Gin Glu Cys Gly Ser Phe 105 110

Ala Pro Pro Leu Asn Vai Thr Vai 125

Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu 140

Lys Leu Gin Tyr Glu Leu Gin Tyr 155 160

Vai Arg Pro Vai Thr Lys Leu Ile 170 175

Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys 185 190

Arg Ala Ala Pro Gin Pro Gly Thr 205

Trp Ser Asp Pro Vai Ile Phe Gin 220

Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu 235 240

Leu Vai Phe Met Gly Leu Lys Ile 250 255

Lys Ile Trp Ala Pro Vai Pro Thr 265 270

Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe 285

Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Vai 300

Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro 315 320

Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gin Leu 330 335 75

Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu 340 345 350

Ala Ala Gly Gin Ala Vai Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro 355 360 365

Tyr Gly Leu Vai Ser Ile Asp Thr Vai Thr Vai Gly Asp Ala Glu Gly 370 375 380

Leu Cys Vai Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met 385 390 395 400

Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu 405 410 415

Leu Vai Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Vai Ser Gly Ser 420 425 430

Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg 435 440 445

Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg 450 455 460

Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro 465 470 475 480

Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys 485 490 495

Gly Ser Pro Vai Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg 500 505 510

Gin Trp Vai Vai Arg Thr Pro Pro Pro Vai Asp Ser Gly Ala Gin Ser 515 520 525

Ser

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 11 agcatcaagc cggctccccc 20 <210> 12 76

<211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 12 ctccattcac tccaggtccc 20 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 13 ttgaai agtga . ctgtggcctt <210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Mus musculus <4 0 0> 14 tgaatgaagt gcctggctga 20 <210> 15 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 15 cacaaagctt cagtatgagc tgcagtacag gaaccgggga 40 <210> 16 77

<211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 16 cacaggatcc ctttaactcc tctgactggg tctgaaagat 40

Lisboa, 30 de Janeiro de 2007 78

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a identificação de um composto capaz de tratar um distúrbio imunitário, compreendendo a análise da capacidade do composto para modular a interacção do polipeptídeo MU-1 com uma molécula STAT, identificando, desse modo, um composto capaz de tratar um distúrbio imunitário, em que o polipeptideo MU-1 é um membro da familia das proteinas MU-1 possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 65% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2 ou 10.
2. Método da Reivindicação 1, em que a molécula STAT é STAT 3 ou STAT 5.
3. Método de identificação de um modulador da actividade de MU-1, compreendendo a colocação em contacto de uma célula expressando uma proteína MU-1 de acordo com a SEQ ID N°:2 ou 10, ou uma sua porção capaz de interacção com moléculas STAT, com um composto de teste e a determinação da capacidade do referido composto de teste para modular a interacção da referida proteína MU-1, ou sua referida porção, com uma molécula STAT. Método da reivindicação 3, em que a referida molécula STAT é STAT 3 ou STAT 5.
4 .
5. Método da reivindicação 3 ou 4, em que a proteína MU-1 está de acordo com a SEQ ID N°:2 e é expressa na referida célula sob a forma de uma fusão do domínio intracelular de MCT-1 e do domínio extracelular do receptor humano de EPO. Lisboa, 30 de Janeiro de 2007 2