ES2276795T3

ES2276795T3 - Mu-1, miembro de la familia del receptor de citoquina.

Info

Publication number: ES2276795T3
Application number: ES01937340T
Authority: ES
Inventors: Debra D. Donaldson; Michelle J. Unger; Deborah A. Young; Matthew J. Whitters; Leslie Lowe; Mary Collins
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 2000-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2007-07-01
Anticipated expiration: 2021-05-11
Also published as: EP1353953B1; DE60124954T2; JP2009019037A; AU2001263088C1; CY1107339T1; ATE346864T1; DK1353953T3; AU6308801A; AU2001263088B2; EP1787997A1; JP5763518B2; JP2012061009A; PT1353953E; DE60124954D1; EP1353953A2; JP2004500845A; WO2001085792A8; WO2001085792A2; WO2001085792A3

Abstract

Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno inmune que comprende ensayar la capacidad del compuesto para modular la interacción de Polipéptido MU-1 con una molécula STAT, identificando por lo tanto capaz de tratar un trastorno inmune en donde el polipéptido MU-1 es un miembro de la familia de proteína MU-1 que tiene una secuencia de aminoácido de al menos 65 % idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o 10.

Description

MU-1, miembro de la familia del receptor de citoquina.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con miembros nuevos de la familia del receptor de citoquina en mamíferos de proteínas (que incluyen sin limitación proteínas de receptor murino y humano), fragmentos de estos, polinucleótidos recombinantes y células útiles para expresar tales proteínas, y métodos para identificar compuestos capaces de tratar trastornos inmunes que comprenden ensayar la capacidad de los compuestos para modular la interacción de las proteínas con una molécula STAT.

Antecedente de la invención

Una variedad de moléculas reguladoras, conocidas como hematopoyetinas, se han identificado por estar involucradas en el desarrollo y proliferación de las varias poblaciones de células sanguíneas o hematopoyéticas. La mayoría de hematopoyetinas exhiben ciertas actividades biológicas al interactuar con un receptor sobre la superficie de las células objetivo. Los receptores de citoquina están comúnmente compuestos de uno, dos o tres cadenas. Muchos receptores de citoquina y algunas citoquinas, tal como IL-12 p40, son miembros de la superfamilia de receptores de hematopoyetina de proteínas. La identificación de nuevos miembros de la superficie familia de receptor de hematopoyetina puede ser útil en la regulación de hematopoyesis, en la regulación de respuestas inmunes y en la identificación de otros miembros de la superfamilia hematopoyetina que incluyen citoquinas y receptores.

Sería deseable identificar y determinar el ADN y la secuencia de proteína para miembros desconocidos de aquí en delante de la superfamilia del receptor de hematopoyetina.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se describe un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno inmune que comprende ensayar la capacidad del compuesto para modular la interacción del polipéptido MU-1 con una molécula STAT, identificando por lo tanto un compuesto capaz de tratar un trastorno inmune. La trayectoria de señalización STAT puede, por ejemplo ser una trayectoria de señalización STAT 3 o una trayectoria de señalización STAT 5 la invención también suministra un método para identificar un modulador de la actividad MU-1 que comprende poner en contacto una célula que expresa una proteína MU-1 de acuerdo con la SEQ ID: 2 o 10, o una porción de esta capaz de detener la interacción con las moléculas STAT, con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la interacción de dicha proteína MU-1 o dicha porción de esta, con una molécula STAT. Dicha molécula STAT puede, por ejemplo ser STAT 3 o STAT 5. Adicionalmente, en este método la proteína MU-1 puede, por ejemplo, estar de acuerdo con SEQ ID NO: 9, y se puede expresar en dicha célula como una función del dominio intracelular MU-1 y el dominio extracelular del receptor BPO humano.

También se describen polinucleótidos que codifican la cadena de superfamilia del receptor de hematopoyetina MU-1, que incluye sin limitación aquellas de las fuentes de murino y humano.

En ciertas modalidades, un polinucleótido aislado comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de:

(a) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 1;

(b) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO 1: del nucleótido 238 al nucleótido 1852

(c) la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO 1 del nucleido 301 al nucleótido 1852

(d) la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO 1 del nucleótido 301 al nucleótido 945

(e) una secuencia de nucleótido que varía de la secuencia del nucleótido especificada en cualquiera (a)-(d) como un resultado de una degeneración del código genético

(f) una secuencia de nucleótido capaz de hibridizar bajo condiciones estrictas al nucleótido especificado en cualquiera (a)-(d);

(g) una secuencia de nucleótido que codifica una especie homologa de la secuencia de SEQ ID NO 2; y

(h) Una variante alélica de la secuencia de nucleótido especificada en cualquiera de (a)-(d). preferiblemente la secuencia de nucleótido codifica una proteína que tiene una actividad biológica de la cadena de superfamilia del receptor hematopoyetina MU-1. La secuencia de nucleótido se puede ligar operablemente a una secuencia de control de expresión.

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También se describen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codificada una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de:

(a): secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 2;

(b): la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 2 de los aminoácidos 22 a 538;

(c): la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 2 de los aminoácidos 22 a 236;

(d): la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO 2 de los aminoácidos 1 a 236; y

(e): fragmentos de (a)-(d) que tienen una actividad biológica de la cadena de superfamilia del receptor de hematopoyetina MU-1.

Se suministra adicionalmente un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de:

(a): la secuencia del nucleótido de la SEQ ID NO 9;

(b): una secuencia del nucleótido que varía de la secuencia de la secuencia especifica del nucleótido en (a) como un resultado de la degeneración del código genético;

(c): una secuencia de nucleótido capaz de hibridizar bajo condiciones estrictas al nucleótido especificado en (a);

(d): una variante alélica de la secuencia de nucleótido especificada en (a).

Se describe adicionalmente polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica un péptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

(a): la secuencia de aminoácido SEQ ID NO 10:

(b): fragmentos de (a) que tienen una actividad biológica de la cadena de superfamilia del receptor de hematopoyetina MU-1.

También se suministran células huésped, preferiblemente células de mamífero, transformadas con los polinucleótidos.

En otras modalidades, la invención suministra un proceso para producir una proteína MU-1. El proceso comprende:

(a): hacer crecer un cultivo de la célula huésped de la presente invención en un medio de cultivo adecuado; y

(b): purificar la proteína; MU-1 humana del cultivo.

También se suministran proteínas producidas de acuerdo con estos métodos.

La presente invención también suministra una proteína MU-1 aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

(a): la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 2;

(b): la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 2 de los aminoácidos 22 a 538

(c): la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 2 de los aminoácidos 22 a 236;

(d): la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 2 de los aminoácidos 1 a 236: y

También se describe una proteína MU-1 aislada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

(a): la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10;

(b): fragmentos (a) que tienen una actividad biológica de la cadena de superfamilia del receptor de hematopoyetina MU-1.

La secuencia de aminoácido MU-1 de murino (SEQ ID NO: 10) de aproximadamente 65% idéntica a la secuencia de aminoácido del MU-1 humano.

En otras modalidades preferidas, la secuencia de aminoácido específica es parte de una proteína de fusión (con una secuencia de aminoácidos adicional no derivada de MU-1). Proteínas de fusión preferidas comprenden un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fc.

Composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína MU-1 y un portador farmacéuticamente aceptable también se suministra.

También se describen composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con una proteína de la presente invención.

Una molécula de ácido nucleico MU-1 como se describe aquí es de al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más idénticos a la secuencia de nucleótido (por ejemplo, a la longitud completa de la secuencia de nucleótido) mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 9.

Preferiblemente la molécula de ácido nucleico consiste de la secuencia de nucleótido, mostrada en la SEQ ID MO: 1 o 9. También se prefiere que la molécula de ácido nucleico incluya un fragmento de al menos 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, o más nucleótidos (por ejemplo nucleótidos contiguos) de la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO 1 o 9, o un complemento de estos.

Preferiblemente, el miembro de la familia de proteína MU-1 tiene una secuencia de aminoácido al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% O más idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 2 o 10.

También se describe fragmentos de la proteína que tienen la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 2 o 10, en donde el fragmento comprende al menos 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 aminoácidos (por ejemplo aminoácidos) contiguos de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO 2 o 10.

En otro aspecto, se suministra un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico MU-1, proteína o polipéptido en una muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar la molécula de ácido nucleico MU-1, proteína o polipéptido de tal forma que la presencia de una molécula de ácido nucleico MU-1, proteína o polipéptido se detecta en la muestra biológica.

En otro aspecto, se suministra un método para detectar la presencia de actividad MU-1 en una muestra biológica al poner en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de actividad MU-1 de tal forma que la presencia de la actividad MU-1 se detecta en la muestra biológica.

En otro aspecto, se describe un método para modular la actividad MU-1 que comprende poner en contacto una célula capaz de expresar MU-1 con un agente que modula la actividad MU-1 de tal forma que la actividad MU-1 en la célula. En una modalidad, el agente inhibe la actividad MU-1. En otra modalidad, el agente estimula la actividad MU-1. En una modalidad, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína MU-1. En otra modalidad, el agente modula la expresión del MU-1 al modular la trascripción de un gen MU-1 o traducción de un MU-1 mARN. En aún otra modalidad, el agente es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido que es antisentido a la hebra de codificación de un mARN MU-1 o un gen MU-1.

Los métodos descritos se pueden utilizar para tratar un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por actividad o expresión de ácido nucleico o proteína MU-1 no deseada (por ejemplo, un trastorno asociado con MU-1) al administrar un agente que es un modulador MU-1 al sujeto. En una modalidad, el modulador MU-1 es una proteína MU-1. En otra modalidad el modulador MU-1 es una molécula de ácido nucleico MU-1. En aún otra modalidad, el modulador MU-1 es un péptido, péptido mimético, anticuerpo, u otra molécula pequeña.

También se suministra ensayos diagnósticos para identificar la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos uno de (i) mutación o modificación aberrante de un gen que codifica una proteína MU-1,(ii) la seudo - regulación del gen MU-1; y (iii) modificación post-traduccional aberrante de una proteína MU-1, en donde una forma de tipo silvestre del gen codifica una proteína con una actividad MU-1.

En otro aspecto los métodos para identificar un compuesto que se une a o modula la actividad de una proteína MU-1 se suministran, al proporcionar una composición indicadora que comprende una proteína MU-1 que tiene actividad MU-1, que pone en contacto la composición indicadora con un compuesto de ensayo, y determinar el efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad MU-1 (por ejemplo modulación de fosforilación STAT, por ejemplo, fosforilación STAT 3 o STAT) en la composición indicadora para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína MU-1.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 describe una secuencia de cADN de longitud completa de MU-1 de murino. La secuencia de nucleótido corresponde a nucleótidos 1-2628 SEQ ID número 29.

La figura 2 describe la secuencia de aminoácido de MU-1 de murino (que corresponde a los aminoácidos 1-529 de la SEQ ID número 10). Existe una secuencia líder predicha en los aminoácidos 1-19, que se predice por SPScan con clasificación de 10.1 (tipo "negrilla"). Existe un dominio de transmembrana predicho en los aminoácidos 237-253 (subrayado). Los motivos de señalización predichos incluyen las siguientes regiones: casilla 1: aminoácido 265-274 y casilla número 2: aminoácidos 3-324 (negrilla y subrayado); se ubican seis tiroxinas en las posiciones de aminoácidos 281, 319, 361, 368, 397 y 510. El motivo WSXWS (SEQ ID número 8) se ubica en el residuo de aminoácido 214 al residuo de aminoácido 218 (en tipo "negrilla", grande). Sitios de acoplamiento STAT potenciales incluyen los aminoácidos 393-398 y los aminoácidos 510-513.

La figura 3 describe la comparación GAP de la secuencias de cADN MU-1 de murino y humano (que corresponde a los ácidos nucleicos 1-2665 de la SEQ ID número 1 y ácidos nucleicos 1-2628 de la SEQ ID número 9, respectivamente). HuMU-1 = MU-1 humano, mur MU-1 = MU-1 de murino. Parámetros GAP: peso GAP = 50, case promedio = 10.000, peso longitud E = 3, promedio de desfase = 0.000. Porcentaje identidad = 66.116.

La figura 4 describe una comparación GAP de la proteína MU-1 humana (que corresponde a los aminoácidos 1-538 de la SEQ ID número 2) y la proteína MU-1 de murino (que corresponde a los aminoácidos 1-529 de la SEQ ID número 10). Matriz de sustitución de aminoácido BLOSUM62. (Henikoff, S. y Henikoff, J.G. (1.992)). Las matrices de sustitución de aminoácido de bloques de proteína (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919). Parámetros GAP = peso GAP:8, case promedio = 2.912, peso longitud = 2, promedio desfase = -2.003. Porcentaje de identidad = 65.267.

La figura 5 describe una alineación múltiple de secuencia de aminoácidos del MU-1 humano (que corresponde a la SEQ ID número 2), MU-1 de murino (que corresponde a la SEQ ID número 10), y cadena IL2beta humana (número de acceso GENbank M26062). Se subrayan los dominios líder y transmembrana. Los motivos de módulo de receptor de citoquina conservados se indican por el tipo "negrilla". Se indican las regiones de señalización potencial al subrayar y escribir en "negrilla".

La figura 6 describe la señalización a través del MU-1. El MU-1 fosforila el STAT5 en la quimera de clon E7 EPO- MU-1. Bajo las condiciones especificadas en el ejemplo 3, la señalización a través de MU-1 resulta en la fosforilación del STAT en todos los puntos de tiempo ensayados. El tratamiento de controles o las células BAF-3 quiméricas con IL-3 resulta en la fosforilación del STAT3, pero no el STAT1 o 5.

Descripción detallada de la modalidad preferida

Los inventores de la presente solicitud han suministrado poli nucleótidos que codifican la cadena de superfamilia de receptor de hematopoyetina MU-1 (aquí en adelante "MU-1" o "proteína MU-1"), que incluyen sin limitación poli nucleótidos que codifican el MU-1 de murino y humano.

En una modalidad particularmente preferida, la proteína MU-1 y las moléculas de ácido nucleico son moléculas MU-1 humanas. Una región del aminoácido 70 del receptor IL5 humano (LMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSM
CREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWFVIVIMATICFILLIL, SEQ ID número 3) se utiliza para buscar en la base de datos EST GenBank utilizando el algoritmo TBLASTN. La secuencia dentro del clon BAC geonómico AC002303 del cromosoma humano 16P12 se identifica con homología a esta región, lo que sugiere que este segmento codificaría un gen para un receptor de hematopoyetina novedoso. Ejemplos de cuadros de lectura abierta dentro de 1000BP de nucleótido 40,886 revela un cuadro abierto 270BP que cuando se utiliza en la búsqueda BLASTP del GenPept identifica exclusivamente los miembros de la familia de receptor de citoquina. Un codón de parada presente al final de este cuadro de lectura se interpreta como indicio de transición sobre un límite de exón/intrón.

Se determina luego si el ARN se transcribe de un gen contenido dentro de este clon BAC del cromosoma 16P12. Se sintetizan los iniciadores PCR basados en el segmento ORF más grande que contienen la secuencia de péptido conservada dentro de la familia del receptor de citoquina. Los iniciadores GAGTCCGAGGAGAAAGCTGATCTCA (5p) (SEQ ID número 4) y GAAAGATGACCGGGTCACTCCATT (3p) (SEQ ID número 5) se utilizan en PCR para seleccionar las librerías fago a partir de varios tejidos humanos (Clontech). Los productos PCR del tamaño 164BP esperado que hibridizan específicamente a un oligonucleótido etiquetado 32-p de la secuencia ACTCGAGCTATGAGCTG
CAGGTGCGGGCA (SEQ ID número 6) se observa en fago de pulmón, riñón, placenta y corazón. Utilizando el oligonucleótido ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID número 7) un clon de cADN de longitud completa NN14-1b (MU-1) se identifica, se purifica, y se secuencia. La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácido predicha se muestran en la SEQ ID número 1 y SEQ ID número 2, respectivamente. La secuencia de aminoácido predicha de la cadena del receptor MU-1 humano incluye una secuencia de señal putativa de los aminoácidos 1921. El MU-1 humano maduro se cree que tiene la secuencia de los aminoácidos 24-538 de la SEQ ID número 2. Se encuentra un dominio de transmembrana en los aminoácidos 237-257.

En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico y de proteína MU-1 son moléculas MU-1 de murino. Para identificar la secuencia de poli nucleótido que codifica la proteína MU-1 de murino un fragmento parcial del homólogo de murino del receptor MU-1 se aísla mediante PCR a partir de cADN de ratón utilizando oligonucleótidos derivados de la secuencia humano como se describe en el ejemplo 1. La secuencia de ADN de este fragmento se determina y se derivan dos oligonucleótidos a partir de una porción interna de este fragmento con las siguientes secuencias:

	TTGAACGTGACTGTGGCCTT (5p)	(SEQ ID número 13)

	TGAATGAAGTGCCTGGCTGA (3p)	(SEQ ID número 14)

Se utilizan oligonucleótidos para amplificar un fragmento de nucleótido 262 interno del producto PCR original (que corresponde a los nucleótidos 781-1043 de la secuencia de cADN de murino de la Figura 1 y la SEQ ID número 9) para usar como una sonda de hibridización para seleccionar una librería de cADN aislada de la línea de célula T2D6. Se determina la secuencia de ADN a partir de dos clones independientes. El clon 6 se secuencia y se confirma por ser el homólogo de murino de longitud completa del MU-1 humano.

La secuencia de nucleótido de longitud completa del MU-1 de murino se muestra en la Figura 1 (que corresponde a los nucleótidos 1-2628 de la SEQ ID número 9). La secuencia de nucleótido tiene una secuencia líder predicha en los nucleótidos 407-464, que codifican la secuencia en los nucleótidos 407-1993 y un codón de terminación en los nucleótidos 1994-1997. Los nucleótidos 1-406 corresponden a la región no traducida 5' y los nucleótidos 1998-2628 corresponden a la región no traducida 3'. La secuencia de proteína predicha de MU-1 de murino se muestra en la Figura 2 (que corresponde a los aminoácidos 1-529 de la SEQ ID número 10).

La proteína MU-1 de murino contiene una secuencia líder predicha determinada SPScan (clasificación = 10.1) que corresponde a los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID número 10), y un dominio de transmembrana predicho (que corresponde a los aminoácidos 237-253 de la SEQ ID número 10). Los motivos de señalización predichos incluyen las siguientes regiones: casilla 1: aminoácidos 265-274 de la SEQ ID número 10, casilla número 2: aminoácidos 310-324 de la SEQ ID número 10, seis residuos de tirozina en las posiciones 281, 319, 319, 361, 368, 397 y 510 de la SEQ ID número 10. Los lípidos de acoplamiento del STAT potenciales incluyen pero no se limitan a: STAT5: EDDGYPA, STAT3: YLQR.

El cuadro de lectura abierto del MU-1 codifica una membrana de la familia del receptor de hematopoyetina. En una modalidad, el MU-1 tiene una secuencia líder pares de cisteína conservados, PP, y motivos WSXWS (SEQ ID número: 8) característicos de la familia, así como también un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico extensivo. El MU-1 también contiene un PXPP conservado así como también motivos de señalización de casilla i y casilla ii en el dominio citoplásmico (ver figura 5). Estos dominios se conservan entre MU-1 de murino y MU-1 de humano. La subsecuente alineación FASTA de la secuencia con el GenPept muestra mayor homología con el IL-2Rb de humano (ver figura 5).

Se deposita el cADN MU-1 de humano con el American Type Culture Collection en Marzo 10, 1998, con el número de acceso ATCC 98687.

Mediante análisis Northern, como se describe en el ejemplo 4, se detecta MU-1 de murino en tejido de bazo, pulmón y corazón en murino adulto. El MU-1 humano se detecta en tejidos linfoides humanos, PBL, timo, bazo y nodos linfáticos y en pulmón de feto.

Cualquier forma de las proteínas MU-1 de menos de longitud completa se abarca dentro de la presente invención y se refieren aquí colectivamente con longitud completa y formas maduras como "proteínas MU-1" o "MU-1". Las proteínas MU-1 de menos de longitud completa se pueden producir la expresar un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína MU-1 de longitud completa (SEQ ID No: 4 o SEQ ID No: 6). Estos fragmentos se polinucleótido correspondientes también se pueden utilizar. Los polinucleótidos modificados como se describió anteriormente se pueden hacer mediante técnicas de biológica molecular estándar, que incluyen la construcción de mutantes de eliminación deseada apropiados, métodos de mutagénesis dirigida al sitio o mediante reducción de cadena de polimerasa utilizando iniciadores de oligonucleótido apropiados.

Para los propósitos de la presente invención, una proteína tiene "una actividad biológica de la cadena de superfamilia del receptor de hematopoyetina MU-1" si esta posee una o más de las actividades biológicas de la proteína MU-1 madura correspondiente. La actividad MU-1 incluye la interacción con moléculas STAT (por ejemplo, STAT 5, STAT 3).

Fragmentos activos o MU-1 de estos (proteínas MU-1) se pueden fusionar a la moléculas portadoras tales como inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina. Por ejemplo, las formas solubles del MU-1 se pueden fusionar a través de secuencias "ligadoras" a la porción Fc de una inmunoglobulina. Otras proteínas de fusión, tal como aquellas con GST, Lex-A o MBP, también se pueden utilizar.

También se describen variantes alélicas de la secuencia de nucleótido como se establece en la SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 9 que son, formas alternativas de ocurrencia natural del polinucleótido aislado de la SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 9 que también codifican proteínas MU-1, preferiblemente aquellas proteínas que tienen unan actividad biológica de MU-1. También se incluye en la invención polinucleótidos aislados que hibridizan a la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 9 bajo condiciones altamente estrictas (por ejemplo, 0.1 x SSC a 65ºC). Los polinucleótidos aislados que codifican las proteínas MU-1 pero que difieren de la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No:1 y SEQ ID No: 9 por virtud de la degeneración del código genético también se abarcan por la presente invención. Variaciones en la secuencia de nucleótido como se establece en la SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 9 que se originan por mutaciones de punto o por modificaciones inducidas también se incluyen.

Como se utiliza aquí el término "hibridiza bajo condiciones estrictas" se pretende describir condiciones para la hibridización y lavado bajo la cual las secuencias de nucleótido al menos 60% idénticas la una a la otra típicamente permanecen hibridizadas la una a la otra. Preferiblemente, las condiciones son tales que la secuencias en al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, aún más preferiblemente al menos 85% o 90% idéntica la una a la otra típicamente permanecen hibridizadas la una a la otra. Tales condiciones estrictas son conocidas por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Jhon Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitativo, preferido de condiciones de hibridización estrictas es la hibridización en 6 X de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por una o más lavadas en 0.2 X SSC, 0.1% SDS a 50ºC, preferiblemente a 55ºC, más preferiblemente a 60ºC, y aún más preferiblemente a 65ºC. Se abarcan los rangos que atraviesan los valores descritos anteriormente, por ejemplo, 55-60ºC o 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislado que hibridiza bajo condiciones estrictas a la secuencia de la SEQ ID No: 1 o 9 corresponde a una molécula de ácido nucleico de ocurrencia natural. Como se utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico "de ocurrencia natural" se refiere a una molécula de ADN o ARN que tiene una secuencia de nucleótido que ocurre en la naturaleza (por ejemplo codifica una proteína natural).

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencia de ácido nucleico, se alinean las secuencias par propósito de comparación óptimo (por ejemplo, se pueden introducir espacios en uno o ambos de una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico o aminoácido para alineación óptima y se pueden independizar secuencias no idénticas para propósitos de comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósito de comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, aún más preferiblemente al menos 60%, y aún más preferiblemente al menos 70%, 80%, o 90% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en la posiciones de aminoácidos correspondientes o posiciones de nucleótidos se comparan luego. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza aquí la "idéntica" de ácido nucleico o aminoácido es equivalente a la "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que se necesitan introducir para alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y la determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden lograr utilizando un algoritmo matemático. En una modalidad preferida el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se determina utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando la matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En aún otra modalidad preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CPM y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otra modalidad, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Myers and Miller, 1988, Comput. Appl, Biosci. 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabal de residuo de peso PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4.

Las secuencias de proteína y ácido nucleico descritas aquí se pueden adicionalmente utilizar como una "secuencia de pregunta" para desarrollar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden desarrollar utilizando programa NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et. al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden desarrollar con el programa NBLAST, clasificación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácidos nucleicos Adhr-1 de la invención. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden desarrollar con el programa XBLAST, clasificación = 100 longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácido homologas a las moléculas de proteína Adhr-1 de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, se puede utilizar BLAST espaciado como se describe en Altschul et. al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST Espaciado los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo XBALST y NBLAST se pueden utilizar. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

También se describen polinucleótidos que codifican homólogos del MU-1 humano a partir de otras especies animales, particularmente otras especies de mamíferos. Las especies homólogas se pueden identificar y aislar a hacer sondas o iniciadores a partir de las secuencias de murino o humanas descritas aquí y que seleccionan una librería a partir de una especie apropiada, tal como por ejemplo librerías construidas a partir de PBMC, timo o testículos de especies importantes.

Los polinucleótidos aislados se pueden ligar operablemente a una secuencia de control de expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490(1991), con el fin de producir la proteína MU-recombinantemente. Se conocen muchas secuencias de control de expresión adecuadas en la técnica. Los métodos generales que expresan proteínas recombinantes también se conocen y se ejemplifican en R. Kaufman, Methods in Enzimology 185, 537-566(1990). Como se define aquí "ligado operablemente" significa ligado enzimático o químicamente para formar un enlace covalente entre el polinucleótido aislado y la secuencia de control de expresión, en tal una forma que la proteína MU-1 se expresa mediante una célula huésped que se ha transformado (transfectado) con un polinucleótido ligado/secuencia de control de expresión.

Un número de tipos de células pueden actuar como células huésped adecuadas para la expresión de la proteína MU-1. Cualquier tipo de célula capaz de expresar proteína MU-1 funcional se puede utilizar. Las células de huésped de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células de mono COS, células e ovario de Hámster Chino (CHO), células de riñón humano 293, células epidérmicas humana A431, células de colon humano 205, células 373, células CV-1, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivos in vitro de tejidos primarios, explantes primarios, células HeLa, células de ratón L BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x o células C2C12.

También se pueden producir proteínas MU-1 al ligar operablemente el polinucleótido aislado a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos, y emplear un sistema de expresión de insectos. Materiales y métodos para sistemas de expresión celular de vaculovirus/insectos están disponibles comercialmente en forma de kit, por ejemplo, invitrogen, San Diego, California, E.U.A (el kit MaxBac®), y tales métodos son bien conocidos en la técnica, como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987). Las formas solubles de la proteína MU-1 también se pueden producir en células de insecto utilizando polinucleótidos aislados como se describió anteriormente.

Alternativamente, la proteína MU-1 se puede producir en eucariotes inferiores tal como levadura o en procariotes tales como bacterias. Las cepas de levadura adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces cerevisiae, cepa de Schizosaccharomyces pombe, cepa de Kluyveromyces candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Cepas bacteriales adecuadas incluyen cepa de Escherichia coli, cepa de Bacillus subtilis, cepa de Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacterial capaz de expresar proteínas heterólogas.

La expresión en bacterias puede resultar en la formación de anticuerpos de inclusión que incorporan la proteína recombinante. Así, se puede requerir replegar la proteína recombinante con el fin de producir un material activo o más activo. Varios métodos para obtener proteínas heterólogas correctamente plegadas de cuerpos de inclusión bacterial se conocen en la técnica. Estos métodos involucran generalmente solubilizar la proteína a partir de la inclusión de cuerpos, luego desnaturalizar la proteína completamente utilizando un agente caotrópico. Cuando los residuos de cisteína están presentes en la secuencia de aminoácido primaria de la proteína, es a menudo necesario acompañar el repliegue en un ambiente que permita la formación correcta de enlaces de disulfuro (un sistema redox). Se describen métodos generales de repliegue en cono, Meth. Enzym., 185:187-195(1990). EP 0433225 y solicitud copendiente USSN 08/163,877 que describe otros métodos apropiados.

También se puede expresar la proteína MU-1 como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas transgénicas, cabras, cerdos u ovejas que se caracteriza por células germinales o somáticas que contienen una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína MU-1.

La proteína MU-1 se puede preparar al hacer crecer un cultivo transformado de células huésped bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína deseada. La proteína expresada resultante puede luego ser purificada a partir del medio de cultivo o los extractos celulares. Las formas solubles de la proteína MU-1 se pueden purificar a partir del medio condicionado. Las formas de unión de membrana de la proteína MU-1 se pueden purificar al preparar una fracción de la membrana total a partir de células de expresión y extraer las membranas con un detergente no iónico tal como tritón X-100.

La proteína MU-1 se puede purificar utilizando los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, la proteína MU-1 se puede concentrar utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Pellicon o Millipore. Luego de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación de tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio de aniño por ejemplo, una a matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoatilo (DEAR) o poloetilenoamina (PEI) pendientes. Las matrices pueden ser de tipo acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio de catión. Intercambiadores de Catión adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden sulfopropilo o grupos carboximetilos. Grupos sulfopropilos se prefieren (por ejemplo columnas S-Sefarose®). La purificación de la proteína MU-1 del supernandante del cultivo también puede incluir una o más etapas de columna sobre tales resinas de afinidad como concanavalin A-agarosa heparin-topopearl® o Cibacrom azul 3GA Sepharose®; o mediante cromatografía de interacción hidrófoba utilizando tales resinas como felinéter, gulieter, o propileter; o mediante cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, una o mas o etapas de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medio RP-HPLC hidrófobo por ejemplo gel de sílice que tiene grupos metilo pendientes u otros grupos alifáticos, se puede emplear adicionalmente para purificar la proteína MU-1 las columnas de afinidad que incluyen anticuerpos para la proteína MU- 1 también se pueden utilizar en la purificación de acuerdo con métodos conocidos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones o con otros métodos conocidos, también se pueden emplear para suministrar una proteína recombinarte aislada sustancialmente purificada. Preferiblemente, la proteína MU-1 aislada se purifica de tal forma que es sustancialmente libre de otras proteínas de mamíferos.

Las proteínas MU-1 también se pueden utilizar para selección de agentes que son capaces de unirse al MU-1. Los ensayos de unión que utilizan una proteína de unión deseada, inmovilizada o no, son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar para este propósito utilizando la proteína MU-1 de la invención. Ensayos de selección (libre de células) basados en proteínas o basados en células purificadas se pueden utilizar para identificar tales agentes. Por ejemplo, se puede inmovilizar la proteína MU-1 en forma purificada sobre un portador y unirse aligado potenciales para purificación. La proteína MU-1 se puede medir.

Las proteicas MU-1, purificadas de células o producidas recombinantemente se pueden utilizar como una composición farmacéutica cuando se combinaba con un portador farmacéuticamente aceptable. Tal una composición puede contener, en adición a MU-1 o inhibidor y portador, varios diluyentes, llenadotes, sales, amortiguadores, estabilizadores, solubilizadores, y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo. Las características del portador dependerán de la ruta de administración.

La composición farmacéutica también puede contener citoquinas, linfoquinas, u otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, OM-CSF,IL-1,IL-.2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, factor de célula madre y eritropoyetina. La composición farmacéutica también puede incluir anticuerpos anti-citoquina. La composición farmacéutica puede contener factores trombolíticos o antitrombóticos tales como activador de plasminógeno y factor VIII. La composición farmacéutica puede contener adicionalmente otros agentes antiinflamatorios. Tales factores adicionales y/o agentes se pueden incluir en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergístico con la proteína MU-1 aislada o para minimizar efectos colaterales originados por la proteína MU-1 aislada. Por el contrario, la proteína MU-1 aislada se puede incluir en las formulaciones de la citoquina particular, linfoquina, otro factor hematopoyético, trombolítico o factor antitrombótico, o agente antiinflamatorio para minimizar efectos colaterales de la citoquina, linfoquina u otro factor hematopoyético, factor trombolítico o factor antitrombótico, o agente antiinflamatorio.

La composición farmacéutica puede estar en la forma de una liposoma en la que se combina la proteína MU-1 aislada, en adición a otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, o capas lamelares. Lípidos adecuados para formulación de liposoma incluye sin limitación monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos de bilis, y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales esta dentro del nivel del experto en la técnica, como se describe, como por ejemplo, en la patente estadounidense No 4,235,871; Patente estadounidense 4,501,728; patente estadounidense No 4,839,028; y patente estadounidense No, 4737,323.

Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método que es suficiente para mostrar un beneficio al paciente significativo, por ejemplo, mejoramiento de los síntomas de, curación de, o un incremento en el índice de curación de tales condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, se administra solo, el término se refiere a un ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapéutico si se administran combinación, en forma serial o simultáneamente.

La proteína MU-1 aislada se puede administrar sola o en combinación con otras terapias tal como tratamientos que emplean cito quimas, linfoquinas u otros factores hematopoyéticos. Cuando se coadministra con una o mas citoquinas, linfoquinas u otro factores hematopoyéticos, la proteína MU-1 se puede administrar simultáneamente con las citoquinas, linfoquinas, otros factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos, o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico que atiende decidirá sobre la secuencia apropiada de administración de proteína MU-1 en combinación con factores de citoquina, linfoquinas, u otros factores hematopoyéticos, factores trombo líticos o antitrombóticos.

La administración de la proteína MU-1 utilizada en la composición farmacéutica o para practicar el método de la presente invención se puede llevar a cabo en una variedad de formas convencionales, tal como ingestión oral, inhalación, o inyección cutánea, subcutánea o intravenosa, se prefiere la administración intravenosa del paciente.

Cuando se administra oralmente una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína MU-1, la proteína MU-1 estará en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elíxir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un portador solidó tal como una gelatina o una adyuvante. La tableta, cápsula y polvo contiene aproximadamente 5 a 95% de proteína MU-1, y preferiblemente de aproximadamente 25 a 90% de proteína MU-1. Cuando se administra en forma líquida, un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal aceite de origen plantas tal como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soya o aceite de sésamo o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener adicionalmente solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacarosa o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximada-
mente 0.5 a 90% en peso de proteína MU-1, y preferiblemente de aproximadamente 1 a 50% proteína MU-1.

Cuando se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína MU-1 post inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea, la proteína de MU-1 estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógenos la preparación de tales soluciones de proteína parenteralmente aceptables que tienen con respecto al PH y su tonicidad, estabilidad y similares, que están dentro de la habilidad del experto en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, en adición a la proteína MU-1 un vehiculo isotónico tal como inyección de Cloruro de Sodio inyección de solución de Ringer inyección de dextrosa, inyección de cloruro de Sodio y inyección de dextrosa, inyección de Cloruro de Sodio y dextrosa, inyección de solución de Ringer lactosada u otro vehiculo conocido en la técnica. La composición farmacéutica también puede contener estabilizantes, preservativos, amortiguadores, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por aquellos expertos en la técnica.

La cantidad de proteínas MU-1 en la composición farmacéutica dependerá de la naturaleza y serenidad de la condición hacer tratada, y sobre la naturaleza de tratamientos anteriores que el paciente haya experimentado. Finalmente, el médico que atiende decidirá la cantidad de proteína MU-1 con la que tratar cada paciente individual inicialmente, el médico que atiende administrará bajas dosis de proteína MU-1 y observa la respuesta de paciente. Dosis mayores de proteína MU-1 se pueden administrar hasta que el efecto terapéutico óptimo se obtenga por el paciente, y en ese punto la dosis no se incrementa adicionalmente. Se contempla que las varias composiciones farmacéuticas utilizadas deben contener aproximadamente 0.1 \mug a aproximadamente 100 mg de proteína MU-1 por kg de peso corporal.

La duración de la terapia intravenosa que utiliza la composición farmacéutica variará, dependiendo de la severidad de la enfermedad a ser tratada y la condición y respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la proteína MU-1 estará en el rango de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente el médico que atiende decidirá la duración apropiada de la terapia intravenosa que utiliza la composición farmacéutica.

Se espera que las proteínas y polinucleótidos exhiban uno o más de los usos o actividades biológicas (que incluyen aquellas asociadas con ensayos citados aquí) identificados adelante. Los usos o actividades descritas para las proteínas se pueden suministrar por administración o uso de tales proteínas o por administración o uso polinucleótidos que codifican tales proteínas (tal como, por ejemplo, en terapia de genes o vectores adecuados para introducción de ADN).

Citoquina y actividad de proliferación/diferenciación celular

Una proteína MU-1 puede exhibir citoquina, la proliferación celular (que induce o inhibe) o la diferenciación celular (que induce o inhibe) la actividad o puede inducir producción de otras citoquinas en ciertas poblaciones celulares.

Muchos factores de proteína descubiertos a la fecha que incluyen todas las citoquinas han exhibido actividad en uno o más ensayos de proliferación celular dependiente de factor, y por lo tanto los ensayos sirven como una confirmación conveniente de la actividad de citoquina. La actividad de la proteína MU-1 se evidencia por uno cualquiera de un numero de factores de rutina dependientes de ensayos de proliferación celular para líneas celulares que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G,M+ (pre B M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1 165, HT2,CTLL2, Th-1. Mo7e y CMK.

Las células BAF-3 que expresan receptores quiméricos huEPOR-huMU que proliferan en respuesta al huEPO. Con el fin de ensayar la capacidad para el receptor MU para señal a través de su dominio citoplásmico, se construyen con ingeniería células BAF-3 para expresar receptores quiméricos EPOr/MU (cito) y se ensayan para incorporación de ^{3}H timidina en la presencia de EPO. Las células BAF-3 que expresan proliferación de moléculas EPOr en respuesta al EPo mientras que las células BAF-3 parientes no lo hacen. El clon A5, que posee el EPOr/MU(cito) quimérico prolifera en respuesta al EPOr que demuestra que la porción citoplásmica de MU-1 puede sostener una señal proliferativa. Las células BAF-3 que expresan EPOr sobre su superficie también responden al EPO.

La actividad de una proteína puede, entre otras significar, ser medido por los siguientes métodos:

Ensayos para profileración de célula T o timosito incluye sin limitación aquellas descritas en: Current Protocols in immunologic, Ed cy J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E.M: Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associatrs y Wiley-Interscience (capitulo 3 In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte 3.1-3.19: Capitulo 7,immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol 137:3494-3500, 1986; Beryagnolli et al., J Immunol 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli, et al., J.Ommunil. 146:3778-3783, 1992: Bowman et al., J. Ommunol. 152:1756-1761 m 1994.

Ensayos para la producción y/ proliferación de citoquina en células de bazo, células de nodo linfático o timocitos incluyen, sin limitación aquellas descritas en: Policlonal T CEll stimulation, Kruisbeek, A.M. y Shevach, E.M. in Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.12.1-3.12.14, Jhon Wiley and Sons, Toronto. 1994; y mención de interferón gama de ratón y humano, Schreiber, R:D. In Current Protocols in Inmunology. J:E: e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.8.1-6.8.8, Jhon Wiley and Sons, Toronto. 1.994.

Ensayos p proteína de microglobulina \beta_{2} ara proliferación y diferenciación de células ematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen, sin limitación aquellas descritas en: Measurement of Human and murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S and Lipsky, P.E. In current Protocols in Inmunology. J:E:e.a Coligan eds. Vol 1 pp. 6.3.1-6.3.12, Jhon Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991: Moreau et al., Nature 336:690-692, 1998; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of Mouse and Human Interleukin 6- Nordan 11- Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. and Turner, K. J. In current Protocols in immunology. J:E. e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 6.15.1 Jhon Wiley and sons, Toronto. 1991; Measurement of Mouse and Human Interleuking 9- Ciarletta, A., Jhon Wiley and sons, Toronto. 1991.

Ensayos de respuestas de clon de células T antígenos (que identificarán, entre otras, las proteínas que afectan las interacciones celulares APC-T así como también efectos de célula T directos al medir la proliferación y producción de citoquina) incluye, sin limitación, aquellas descritas en: Current Protocols in Inmunology, Ed by J:E: Coligan, A:M. Kruisbeek, D.H: Margulies, E.M. Shevach, WW Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley- interscience (Capítulo 3, in vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Capítulo 6; Cytokinesand their cellular receptors; Capítulo 7 Inmunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immnn. 11:405-411, 1981; Takai et al,. J. Immunol. 140:508512. 1998.

Actividad Estimuladora o Supresora de Inmunización

Una proteína MU-1 también puede exhibir actividad supresora de inmunización o estimuladora de inmunización que incluye sin limitación las actividades para las que se describen ensayos aquí. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de varias deficiencias inmunes y trastornes (que incluyen inmunodeficiencia severa combinada (SCID)), por ejemplo, en la regulación (hacia arriba o hacia abajo) el crecimiento y proliferación de linfocitos T y/o B, así como también afectar la actividad cito lítica de las células NK y otras poblaciones celulares. Estas deficiencias inmunes pueden ser genéticas o se pueden originar por virus (por ejemplo HIV) así como también infecciones por bacterias u hongos, o puede resultar de trastornos autoinmunes. Más específicamente, las enfermedades infecciosas originadas por virus, bacterias, hongos u otras infecciones se pueden tratar utilizando una proteína de la invención, que incluyen infección por HIV, virus de la hepatitis, virus del herpes, mico bacteria, leishmania SPP; malaria FPP. y varias infecciones por hongos tales como candidiasis. Por supuesto, a este respecto, también puede ser útil una proteína descrita en donde un propulsor para el sistema inmune generalmente puede ser deseable, es decir, en el tratamiento del cáncer.

Trastornos autoinmunes que se pueden tratar utilizando una proteína descrita incluyen, por ejemplo enfermedad del tejido conector, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome Guillen Barre, tiroiditis autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, miastenia gravis, enfermedad del huésped vs. Injerto y enfermedad inflamatoria del ojo autoinmune. Tal una proteína también puede ser útil en el tratamiento de reacciones alérgicas y condiciones, tales como asma (particularmente asma alérgica) hubo otros problemas respiratorios. Otras condiciones, en las que se desea una supresión inmune (que incluye, por ejemplo, trasplante de órgano), también puede ser tratable utilizando una proteína descrita.

También el ADN de MU-1 mapea el lugar cromosómico para la enfermedad de Crohn. Como un resultado, las proteínas MU-1 Se pueden utilizar para tratar la enfermedad de Crohn y otras enfermedades inflamatorias del intestino.

Utilizando las proteínas MU-1 descritas aquí también puede ser posible regular respuestas inmunes en un número de formas. La subregulación puede ser de la forma de inhibición o bloqueo de una respuesta inmune ya en progreso o puede involucrar evitar la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de células T activadas se pueden inhibir al suprimir las respuestas de célula T o al inducir tolerancia específica en células T, o ambos. La inmuno supresión de respuestas de célula T es generalmente un proceso específico- no antígeno, activo que requiere exposición continua de las células T al agente supresor. La tolerancia, que involucra inducir no receptividad o anergia en células T, es distinguible de inmuno supresión en que este generalmente es antígeno específico y persiste después que ha cesado la exposición al agente tolerizante. La tolerancia operacional se puede demostrar por la falta de una respuesta de célula T luego de reexposición a antígeno específico en la ausencia de un agente tolerante.

La subregulación o prevención de una o más funciones de antígeno (que incluye sin limitación funciones de antígeno de linfocito B (tal como, por ejemplo, B7)), por ejemplo, evitar la síntesis de lifnoquina de alto nivel por células T activadas, será útil en situaciones de transplante de tejido, piel y órgano y enfermedad de huésped vs. injerto (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo de la función de célula T debe resultar en reducción de tejido en transplante de tejido. Típicamente, en transplantes de tejido, el rechazo del transplante se inicia a través de su reconocimiento como extraño para las células T, seguido por una reacción inmune que destruye el transplante. La administración de una molécula que exhibe o bloquea la interacción de un antígeno de linfocito B7 con sus ligandos naturales sobre células inmunes (tal como una forma monomérica soluble de un péptido que tiene actividad D7-2 sola o en conjunto con una formo monomérica de péptido que tiene una actividad de otro antígeno de linfocito B (por ejemplo, B7-1, B7-3) o anticuerpo de bloqueo), antes que el transplante puede conducir a la unión de la molécula a los ligandos naturales sobre las células inmunes sin transmitir la correspondiente señal coestimuladora. El bloqueo de la función de antígeno de linfocito B en esta materia evita la síntesis de citoquina por células inmunes, tal como células T, y actúa así como un inmuno supresor. Más aún, la falta de coestimulación también puede ser suficiente para energizar las células T, induciendo por lo tanto tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo por reactivos que bloquean antígeno de linfocito B puede evitar la necesidad de administración repetida de estos reactivos de bloqueo. Para alcanzar inmuno supresión o tolerancia suficiente en un sujeto, también puede ser necesario bloquear la función de una combinación de antígeno de linfocito B.

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La eficacia de reactivos de bloque particular en prevenir el rechazo de transplante de órgano o GVHD se puede evaluar utilizando modelos animales que son predictivos de la eficacia en humanos. Ejemplos de sistemas apropiados que se pueden utilizar incluyen injertos cardiacos halogénicos en ratas e injertos de células islote pancreáticas xenogénicas en ratones, ambas de las cuales se han utilizado para examinar los efectos inmuno supresores de proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo como se describe en Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992) and Turka et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89-11102-11105 (1992). Adicionalmente, los modelos de murino de GVHD (ver Paul Ed., Fundamental Inmunology, Raven Press, New York, 1989, pp.846-847) se puede utilizar para determinar el efecto de bloque de la función de antígeno de linfocito de in vivo sobre el desarrollo de esa enfermedad.

La función de antígeno de bloqueo también puede ser terapéuticamente útil para tratar enfermedades autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de una activación inapropiada de células T que son reactivas contra el propio tejido y que promueven la producción de citoquinas y auto anticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de las células T autoreactivas puede reducir o eliminar síntomas de la enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la coestimulación de células T al interrumpir las interacciones del receptor: ligando de antígenos de linfocito B se pueden utilizar para inhibir la activación de células T y evitar la producción la producción de anticuerpos o citoquinas derivadas de células T que pueden estar involucradas en el proceso de la enfermedad. Adicionalmente, bloquear reactivos puede inducir la tolerancia específica de antígeno de células T auto reactivas que puede conducir a alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de reactivas de reactivos de bloqueo en la prevención o mejora de trastornos autoinmunes se puede determinar utilizando un número de modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Ejemplos incluyen encefalitis autoinmune experimenta. De murino, lupus heritematoso sistémico en ratones MRL/IPR/IPR o ratones en el ZB híbridos, artritis colágeno autoinmune de murino, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia gravis experimental en murino (ver Paul Ed., Fundamental Inmunology, Raven Press, New York, 1989, pp.841-856).

La sobre regulación de una función de antígeno (preferiblemente una función de antígeno de linfocito B), como un medio de sobre regulación de respuesta inmune, también puede ser útil en terapia. La sobre regulación de respuesta inmune puede estar en la forma de mejoramiento de una respuesta inmune existente o elicitar una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, mejorar una respuesta inmune a través de estimular la función de antígeno de linfocito B que puede ser útil en casos de infección viral. Adicionalmente, las enfermedades virales sistémicas tal como influenza, el resfriado común y la encefalitis se puede aliviar mediante la administración de formas estimuladoras de sistémicamente antígenos de linfocito B.

Alternativamente, una respuesta inmune anti viral se puede mejorar en un paciente infectado al remover células T del paciente, coestimular las células T in Vitro con APC impulsado por antígeno viral ya sea expresando un péptido MU-1 o junto con una forma estimuladora de un péptido soluble descrito aquí y reintroducir las células T activadas in Vitro en el paciente. Otro método de mejorar la respuesta inmune anti viral podría ser aislar células infectadas de un paciente, transfectarlas con un ácido nucleico que codifica una proteína como se describe aquí de tal forma que las células expresan todo o una porción de la proteína sobre su superficie y reintroducir las células transfectadas en el paciente. Las células infectadas serían ahora capaces de suministrar una señal coestimuladora A, y por lo tanto activar, células T in vivo.

En otra aplicación la sobre regulación o mejora de la función de antígeno (preferiblemente función de antígeno de linfocito B) puede ser útil en la inducción de inmunizante tumor. Las células de tumos (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que codifica al menos péptido de la presente invención se puede administrar a un sujeto para superar la tolerancia específica de tumor en el sujeto. Si se desea, la célula de tumor se puede transfectar para expresar una combinación de péptidos. Por ejemplo, las células de tumor obtenidas de un paciente se pueden transfectar ex vivo con un vector que dirige la expresión de un péptido que tiene solo actividad similar a B7-2, o en conjunto con un péptido que tiene actividad similar a B7-1 y/o actividad similar B7-3. Las células de tumor transfectadas se regresan al paciente para resultar en la expresión del péptido sobre la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, las técnicas de terapia de gen se pueden utilizar para objetivar una célula de tumor para transfección in vivo.

La presencia del péptido descrito que tiene la actividad de un antígeno linfocito B sobre la superficie de la célula de tumor suministra la señal de coestimulación necesaria para las células T para inducir una respuesta inmune mediada por célula T contra las células de tumor transfecta. Adicionalmente, las células de tumor que les falta las moléculas MHC clase 1 o MHC clase ii, o que les falta reexpresar cantidades suficientes de moléculas MHC clase i o MHC clase ii, se pueden transfectar con ácidos nucleicos que codifican todo o una porción de (por ejemplo, una porción truncada del dominio citoplásmico) de una proteína de cadena \alpha MHC clase i, y proteína de micro globulina \beta_{2} o una proteína de cadena MHC clase ii \alpha y una proteína de \beta MHC clase ii para expresar por lo tanto las proteínas MHC clase i o MHC clase ii de la superficie celular. La expresión de la clase i apropiada o clase ii MHC en conjunto con un péptido que tiene la actividad de un antígeno de linfocito B (por ejemplo B7-1, B7-2, B7-3) induce una respuesta inmune mediada por célula T contra la célula de tumor transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica una construcción anti sentido que bloquea la expresión de una proteína asociada con MHC clase ii, tal como la cadena invariante, también cotransfectada con ADN que codifica un péptido que tiene la actividad de un antígeno linfocito B para promover la presentación de antígenos asociados con tumores e inducir la inmunidad específica de tumor. Así, la inducción con una respuesta inmune mediada por célula T en un sujeto humano ser suficiente para superar la tolerancia específica de tumor en el sujeto.

La actividad de una proteína descrita puede, entre otras significar, ser medida por los siguientes métodos:

Ensayos adecuados para citotoxicidad de timosito o esplenocito que incluye, sin limitación, aquellas descritas en: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowman et al., J. Virology 61:1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994.

Ensayos para respuestas de inmunoglobulina dependientes de célula T y conmutación de isotipos (que identificarán entre otras proteínas que modulan las respuestas de anticuerpos dependientes de células dependientes de T y que afectan los perfiles Th1/Th2) incluyen, sin limitación aquellas descritas en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; and Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J. J. and Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.

Los ensayos de reacción de linfocitos mezclados (MLR) (que identificarán, entre otros las proteínas que generan predominantemente las respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992.

Los ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otros proteínas expresadas por células dendríticas que activan células T naive) incluyen, sin limitación aquellas descritas en: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544,1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079,1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069,1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; y Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990.

Ensayos para supervivencia de linfocitos/apoptosis (que identificarán, entre otros, proteínas que evitan la apoptosis después de inducción de superantígeno y proteínas que regulan la homeostasis de linfocitos) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1:639-648, 1992.

Ensayos para proteínas que influencian etapas anteriores que incluyen desarrollo y compromiso de célula T sin limitación, aquellas descritas en: Antica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88:7548-7551, 1991.

Las moléculas MU-1 de la presente invención también están involucradas en la modulación de la actividad STAT, por ejemplo, señalización (por ejemplo, a través de la interacción con moléculas STAT, por ejemplo, STAT 3 y/o STAT 5, y modulación de fosforilación de STAT). Los moduladores de la señalización STAT y los moduladores de de interacción MU-1 con las moléculas STAT se pueden identificar a través de ensayos de selección como se describe aquí.

Los ensayos que se pueden utilizar para identificar moduladores de la actividad MU-1 incluyen ensayos para la actividad STAT, por ejemplo, señalización STAT, tal como ensayos conocidos en la técnica y ensayos descritos aquí. Ensayos para la actividad STAT también se describen en, por ejemplo, Friedrich K, et al. (2001) Biol Chem 382 (2):343-51. Otros ensayos para la actividad STAT incluyen ensayos para proliferación celular y fosforilación STAT.

En un aspecto de la invención, se determina un ensayo para un modulador de actividad MU-1 es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa una proteína MU-1 o porción biológicamente activa de esta se conecta con un compuesto de ensayo y la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad MU-1 (por ejemplo, interacción con moléculas STAT o modulación de señalización STAT). Determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad MU-1 se puede lograr al monitorear, por ejemplo, la señalización STAT, la fosforilación de las moléculas STAT, proliferación celular, diferenciación celular o producción de citoquinas. La célula, por ejemplo, puede ser de origen de mamífero, por ejemplo, una célula T activada.

Actividad de Regulación de Hematopoyesis

Una proteína MU-1 puede ser útil en la regulación de hematopoyesis y, posteriormente, en el tratamiento de deficiencia celular mieloide o linfoide. Aún la actividad biológica marginal en apoyo de las células formadoras de colonia o líneas celulares dependientes de factor indican el involucramiento en la regulación de la hematopoyesis, por ejemplo en apoyar el crecimiento y proliferación de células progenitoras eritroides solas o en combinación con otras citoquinas, indicando por lo tanto la utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de varias anemias o para uso en conjunto con una irradiación/quimioterapia para estimular la producción de precursores eritroides y/o células eritroides; en apoyar el crecimiento y proliferación de células mieloides tales como granulocitos y monocitos/mácrofagos (es decir, actividad CSF tradicional) útil, por ejemplo, en conjunto con quimioterapia para evitar o tratar posterior mielo-supresión; en apoyar el crecimiento y proliferación de megacariocitos y posteriormente de plaquetas permitiendo por lo tanto la prevención y tratamiento de varios trastornos de plaquetas tal como trombocitopenia, y generalmente para uso en lugar de o complementariamente con transfusión de plaquetas; y/o en apoyar el crecimiento y proliferación de células madre hematopoyéticas que son capaces de madurar para cualquiera y todas la células hematopoyéticas mencionadas anteriormente y por lo tanto hallar la utilidad terapéutica en varios trastornos de células madre (tal como aquellos usualmente tratados con transplante, que incluyen, sin limitación anemia aplasica y hemonoglobinuria nocturna paroximal), así como también en repoblar el compartimiento de célula madre post irradiación/quimioterapia, ya sea in vivo o ex-vivo (es decir, en conjunto con transplante de medula ósea o con transplante de célula de progenitor periférico (homologa o Heteróloga)) como células normales o manipuladas genéticamente para terapia de gen.

La actividad de la proteína MU-1 puede, entre otras significar, ser medido por los siguientes métodos:

Ensayos adecuados para proliferación y diferenciación de varias líneas hematopoyéticas se cita anteriormente.

Ensayos de diferenciación de células de tallo embriónico (que identificarán, entre otros, proteínas que influencian la hematopoyesis de diferenciación embrionica) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Johansson et al. Cellular Biology 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81:2903-2915, 1993.

Ensayos para supervivencia y diferenciación de célula madre (que identificarán, entre otros, proteínas que regulan la linfo-hematopoyesis) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M. G. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. and Briddell, R. A. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E. In Culture of hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Allen, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H. J. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994.

Usos y Utilidades de la Investigación

Los polinucleótidos descritos aquí se pueden utilizar por la comunidad investigadora para varios propósitos. Los polinucleótidos se pueden utilizar para expresar proteínas recombinantes para análisis, caracterización o uso terapéutico; como marcadores para tejidos en el que la proteína correspondiente se expresa preferencialmente (sea constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación de tejidos o desarrollo en estados de la enfermedad); como marcadores de peso molecular en geles Southern; como marcadores de cromosomas o etiquetas (cuando se marca) para identificar cromosomas o mapear posiciones de gen relacionados; para comparar con secuencias de ADN endógeno en pacientes para identificar los trastornos genéticos potenciales; como sondas para hibridizar y así descubrir secuencias de ADN relacionadas; como una fuente de información para derivar iniciadores PRC para huellas genéticas; como una sonda para "sustraer" secuencias conocidas en el proceso de descubrir otros polinucleótidos novedosos; para seleccionar y hacer oligómeros para unir a un "chip de gen" u otro soporte, que incluye examen de patrones de expresión; elevar anticuerpos anti-proteína utilizando técnicas de inmunización de ADN; y como un antígeno para elevar anticuerpos anti-ADN o elicitar otra respuesta inmune. En donde el polinucleótido codifica una proteína que une o une potencialmente a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción ligando-receptor), el polinucleótido también se puede utilizar en ensayo de trampa de interacción (tal como, por ejemplo, aquella descrita Gyuris et al., Cell 75:791-803 (1993)) para identificar polinucleótidos que codifican la otra proteína con la que la unión ocurre o para identificar inhibidores de a interacción de unión.

Las proteínas descritas aquí se pueden utilizar similarmente en ensayos para determinar la actividad biológica, que incluye en un panel de múltiples proteínas para selección de alto rendimiento; elevar anticuerpos o elicitar otra respuesta inmune; como un reactivo (que incluye un reactivo marcado) en ensayos diseñados para determinar cuantitativamente niveles de la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en los que la proteína correspondiente se expresa preferencialmente (sea constitutivamente o en una etapa particular de diferenciación de tejido o desarrollo o en un estado de enfermedad); y, por supuesto, aislar receptores correlacionados o ligandos. En donde la proteína une o une potencialmente a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción ligando-receptor), la proteína se puede utilizar para identificar la otra proteína con la que ocurre la unión o para identificar inhibidores de interacción de unión. Las proteínas involucradas en estas interacciones de unión también se pueden utilizar para seleccionar péptidos o inhibidores de moléculas pequeñas o agonistas de la interacción de unión.

Cualquiera o todas estas utilidades de investigación son capaces de ser desarrolladas en grado reactivo o formato de kit para comercialización como productos de investigación.

Los métodos para desarrollar los usos listados anteriormente son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las referencias que describen tales métodos incluyen sin limitación "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis eds., 1989, and "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S'L. and A. R. Kimmel eds., 1987.

Usos nutricionales

Los polinucleótidos y proteínas descritos aquí también se pueden utilizar como fuentes o suplementos nutricionales. Tales usos incluyen sin limitación uso como una proteína o suplemento de aminoácido, uso como una fuente de carbono, uso como una fuente de nitrógeno y uso como una fuente de carbohidratos. En tales casos la proteína o poli nucleótido de la invención se puede agregar a la alimentación de un organismo particular o se puede administrar como un sólido separado o preparación líquida, tal como en la forma de polvos, píldoras, soluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de microorganismos, la proteína o poli nucleótido se puede agregar al medio en o sobre lo que se cultiva el microorganismo.

Las proteínas MU-1 también se pueden utilizar para inmunizar animales para obtener anticuerpos poli clonales y monoclonales que reaccionan específicamente con la proteína MU-1 y que pueden inhibir la unión de ligandos al receptor. Tales anti cuerpos se pueden obtener utilizando MU-1 completo como un inmunógeno, o al utilizar fragmentos de MU-1. Los fragmentos más pequeños del MU-1 también se pueden utilizar para inmunizar animales. Los inmunógenos de péptido adicionalmente pueden contener un residuo cisteína en el terminal carboxilo y se conjugan con un hapteno tal como hemocianina de lapa de ojo de cerradura (kLH). Inmunógenos de péptidos adicionales se pueden generar al reemplazar los residuos de tiroxina con residuos de tiroxina sulfatados. Métodos para sintetizar tales péptidos se conocen en la técnica, por ejemplo, como en RP. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J. L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211,10 (1987).

La unión de anticuerpos neutralizantes o no neutralizantes (preferiblemente anticuerpo monoclonales) a la proteína MU-1 también pueden ser terapéuticos útiles para ciertos tumores y también en el tratamiento de condiciones descritas anteriormente. Estos anti cuerpos mono clonales neutralizantes pueden ser capaces de bloquear uniones de ligando a la cadena del receptor MU-1.

Esta invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no se deben constituir como limitan-
tes.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y caracterización de cADN MU-1 de murino

Un fragmento parcial del homólogo de murino del receptor MU-1 se aísla por PCR utilizando oligonucleótidos derivados de la secuencia humana. El cADN se prepara a partir de ARN aislado de 17 días de timo de murino y de línea de células T 2D6 de murino. Un fragmento de ADN de aproximadamente 300 nucleótidos se amplifica a partir de cADN por PCR con los siguientes oligonucleótidos, que corresponden a las regiones 584-603 y 876-896, respectivamente, de la secuencia de cADN humana en la figura 1 (que corresponde a la SEQ ID número 1):

	AGCATCAAGC CGGCTCCCCC (5p)	(SEQ ID NO: 11)

	CTCCATTCAC TCCAGGTCCC (3p)	(SEQ ID NO: 12)

La amplificación se lleva a cabo utilizando polimeriaza Taq en amortiguador 1 x Taq que contiene 1.5 mM de cloruro de magnesio durante 30 ciclos a 94°C durante un minuto, 50°C durante 1 minuto, y 72°C durante un minuto. La secuencia de ADN de este fragmento se determina y se derivan dos oligonucleótidos a partir de una porción interna de este fragmento con las siguientes secuencias:

	TTGAACGTGACTGTGGCCTT (5p)	(SEQ ID NO: 13)

	TGAATGAAGTGCCTGGCTGA (3p)	(SEQ ID NO: 14)

Se utilizan oligonucleótidos para amplificar un fragmento de nucleótido interno 262 de producto PCR original (que corresponde a los nucleótidos 781-1043 en la secuencia de cADN de murino de la figura 1 y la SEQ ID número 9) para usar como la sonda de hibridización para seleccionar una librería de cADN aislada de la línea de célula T 2D6. Los filtros se hibridizan a 65°C utilizando condiciones de hibridización 5 X SSC y se lavan en SSC a 65°C. Se aíslan 20 clones que hibridizan la sonda en una selección de 426,000 clones. Se determina la secuencia de ADN de dos clones independientes. La secuencia de longitud completa del clon #6 confirma que este es el homólogo de murino de longitud completa del MU-1 (SEQ ID NO: 9).

La secuencia de nucleótido de longitud completa de MU-1 de murino se muestra en la figura 1 (que corresponde a la SEQ ID número 9). La secuencia de nucleótido tiene una secuencia líder predicha en los nucleótidos 407-464, que codifican la secuencia en los nucleótidos 407-1993, codón de terminación en los nucleótidos 1994 y 1997. Los nucleótidos 1-406 corresponden a la región 5' no traducida y los nucleótidos 1998-2628 corresponden a la región 3' no traducida.

La secuencia de proteína predicha de MU-1 de murino se muestra en la figura 2 (que corresponde SEQ ID NO: 10). Esta proteína MU-1 de murino contiene una secuencia líder predicha determinada por SP scan (clasificación = 10.1) que corresponde a los aminoácidos 1-19 de la SEQ ID número 10), y el dominio de transmembrana predicho (que corresponde a los aminoácidos 237-253 de la SEQ ID NO: 10). Los motivos de señalización predichos incluyen las siguientes regiones: casilla 1: aminoácidos 265-274 de la SEQ ID NO: 10, casilla 2: aminoácidos 310-324 de la SEQ ID NO: 10, seis residuos de tiroxina en las posiciones 281,319,361,368,397, y 510 de la SEQ ID NO: 10. Sitios de acoplamiento STAT potenciales incluyen: STAT5 : EDDGYPA, STAT 3: YLQR.

Ejemplo 2 Comparación del MU-1 de murino y humano

El algoritmo GAP se utiliza para comparar los aminoácidos MU-1 de murino y humano. Se muestra en la figura 4 una comparación de las secuencias de proteína predichas humana y de murino. Los aminoácidos son 65.267% idéntico utilizando el algoritmo GAP. La alineación se genera mediante la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992)). Matrices de sustitución de aminoácidos de bloques de proteína (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919). Parámetros Gap = peso Gap: 8, promedio de case = 2.912, Peso Longitud = 2, promedio desfase = -2.003. Porcentaje de similitud = 69.466.

Se muestra en la figura 3 una comparación de las secuencias de nucleótido cADN de murino y humano. Las secuencias de ADN son 66.116% idénticas cuando se alinean utilizando el algoritmo GAP. Parámetros GAP: peso GAP = 50, promedio de case = 10. 000, peso longitud = 3, promedio desfase = 0.000. Porcentaje de similitud = 66.198.

Las proteínas MU-1 humanas y de ratón son miembros de la súper familia del receptor de citoquina tipo 1. La evaluación de la secuencia del MU-1 humano y de murino revela la presencia de los motivos de señalización de casilla -1 y casilla -2 potenciales. Se presentan seis residuos de tiroxina en el dominio citoplásmico, y también puede ser importante en funciones de señalización de MU-1. Comparación de las secuencias MU-1 con otros miembros de la familia sugiere la presencia de sitios de acoplamiento potenciales para STAT5 y STAT3.

Ejemplo 3 Determinación de trayectorias de señalización STAT utilizadas por el MU-1 humano

Se construyen con ingeniería células BAF-3 para expresar un receptor de citoquina quimérico que consiste del dominio extra celular del receptor EPO humano y el dominio intracelular del receptor MU-1. Las células BAF-3 que expresan los receptores quiméricos HUEPOR/MU-1 (cito) quiméricos proliferan es respuesta al EPO soluble humano. Estas células se analizan para determinar que las moléculas STAT se fosforilan en respuesta a la señalización EPO. En resumen, las células BAF-3 parientes no modificadas de control y las células BAF-3 quiméricas EPOR/MU están en descanso a partir del medio de crecimiento que contiene IL-3, y se reestimulan con IL-3 o EPO durante 0.15, 30 y 60 minutos. Las células se agrupan y resuspenden en amortiguador de lisis de hielo frío que contiene ortovanadato, para preservar las pirosinas fosforiladas. Cantidades iguales de lisato celular se electroforan mediante SDS-PAG, y se marcan en membranas de nitro celulosa para análisis western. Los blot duplicados se tiñen para fosforilado y las formas no fosforiladas de STAT 1, 3, 5, y 6 al utilizar anticuerpos específicos para forma de la molécula STAT. Las células HELA, activadas y no activadas con interferón alfa se utilizan como controles positivos

Estos resultados indican que bajo estas condiciones específicas, la señalización a través MU- 1 resulta en la fosforilación del STAT 5 en todos los puntos de tiempo ensayados (T = 0, T = 15', T = 30', T = 60'). Los tratamientos de controles de las células BAF-3 quiméricas con IL-3 resultan en la fosforilación del STAT 3, pero no en STAT 1 o 5.

Ejemplo 4 Expresión de tejido de MU-1 humano y de murino Análisis Northern

Se desarrollan Northern blots de polyA+ ARN de varios tejidos (Clonetech, Palo Alto, CA) según se recomienda por el fabricante. Para los blots de murino, un fragmento de nucleótido 262 que corresponde a los nucleótidos 781-1043 de la Figura. 1 y SEQ ID NO: 9 se utiliza para hibridización.

Una trascripción única de MU-1 de murino se detecta en tejidos de bazo, pulmón, y corazón de murino adulto. La mayor trascripción se observa en tejidos humanos que no se observa en tejidos de ratón.

Dos transcripciones de MU-1 humano se detectan en tejidos linfoides de humano adulto, PBL, timo, bazo y nodo linfático, en pulmón fetal.

Hibridización in situ

Los estudios de hibridización in situ se desarrollan por Phylogency Inc. de Columbus, OH (de acuerdo con el método de Lyons et. al., 1990, J. Cell. Biol: 111:2427-2436.). En resumen, se desparafinizan secciones de 5-7 micrones de parafina, se fijan y se digieren con proteínaza K, se tratan con tri-etalonamina y se deshidratan. El cARN se prepara a partir de plantillas de cADN linearizado para generar sondas anti sentido y sentido. Se sintetizan transcripciones de cRNA de acuerdo con las condiciones del fabricante (Ambion) y se etiquetan con 35S-UTP. La secciones se hibridizan durante la noche, se lavan en forma estricta y se tratan con ARNasa A y se sumerge en emulsión de rastro nuclear y se expone durante 2-3 semanas. Las secciones de control se hibridizan con sondas de sentido e indican el nivel de fondo del procedimiento. La sonda de murino consiste de un fragmento de 186bp que corresponde a 860-1064 nucleótidos (SEQ ID NO: 9). La sonda humana es un producto PCR 231bp generado de ADN MU-1 humano.

Se observa expresión MU-1 de murino en nodos linfáticos de intestino delgado de adulto en centros germinales y externos musculares. Modos linfáticos especializados y parches de Peyers también exhiben expresión MU-1 de murino.

Se detecta la expresión MU-1 humano en centros germinales de los módulos linfáticos en la corteza. La medula que contiene macrófagos, es negativa para MU-1 en el bazo se detecta la expresión MU-1 humano en las regiones de pulpa blanca pero no pulpa roja.

Ejemplo 5 Expresión de U-1 humano en células y líneas celulares

Se desarrolla análisis de protección RNAsa en células T humanas activas y en descanso las líneas de células B, y RPMI 8866, y las líneas celular T Jurkat. Se activan células T humanas con anti-CD3 y anti-CD28. Las líneas celulares se activan por éster de forbol e ionomizina. Se construye el plásmido que produce el MU-10 ribosonda al insertar un producto PCR 231bp (PCR se desarrollo al utilizar el inicializador 5' CACAAAGCTTCAGTATGAGCTGCAG
TACAGGAACCGGGGA (SEQ TD NO: 15) y el iniciador 3' CACAGGATCCCTTTAACTCCTCTGACTGGGTCT
GAAAGAT (SEQ ID NO: 16) en los sitios BamH1 y Hindi del pGEM3zf (-) (promega, Madison, WI) vector. Para hacer la ribosonda, el plásmido que produce ribosonda se linealiza con Hindi III el ADN resultante se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Se utiliza polimerasa de ARN T7 para hacer la ribosonda de acuerdo con el protocolo sugerido por el vendedor (PharMingen, San Diego, CA). Se desarrolla el ensayo de protección RNsa al utilizar en el sistema de ensayo de protección de Ribonucleasa Multi-sonda RiboQuant de PharMingen 2.0 ug del ARN total se incluye en cada reacción RTA, después de digestión de ANA, las ribosondas protegidas se corren en un sistema de separación de ácido nucleico rápido Quick Point (Novex, San Diego, Ca).los geles se secan y se exponen de acuerdo con la sugerencia del vendedor.

El ARN MU-1 humano se sobre regula en células CD3 purificadas humanas estimuladas anti- CD3+anti-CD28 cuando se comparan con poblaciones no estimuladas. El MU-1 también se sobre regula sobre la reestipulación en poblaciones de células T TH y Th2 skewed. Las líneas de células B, RPMI 8866 y Raji, expresan consecutivamente MU-1 mientras que las líneas de células de Jurkat no lo hacen.

Ejemplo 6 Uniones de MU-1 humano acetoquitas conocidas

Se construyen proteínas de fusión Og de murino y humano y se simbolizan en Chips Biacore en un esfuerzo por identificar el ligando para el MU-1. Una variedad de medios condicionados de cultivos celular así como también un panel de citoquinas conocidas se evalúa para unir al MU-1. Algunas citoquinas también se ensayan en combinación con otras cadenas de receptor en la familia para considerar la posibilidad que el MU-1 pueda requerir una segunda cadena de receptor para unir el ligando. Las siguientes citoquinas se ensayan y se encuentran que son negativas para la unión MU-1: mIL-2, hIL-2, Hil-12, Mil-7, TSLP, TSLP+IL7, TSLP+IL7R, TSLP+IL7g, TSLP+IL-2, TSLP +IL2+IL2Rbeta, IL2Rgamma, IL7R, IL2+2Rbeta, IL2+2Rgamma, IL15+IL+2Rbeta, IL15+2Rgamma, IL7+2Rgamma, IL2+IL7R,
IL15+IL7R, IL7+IL7R. Receptores conocidos han sido inmovilizados así como también ensayados para unión MUFc con resultados negativos. IL-15 se une al IL2Rb pero no al IL2Rg o MUFC.

<110> Genetics, Institute, Inc., et al.

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<120> MU-1, MIEMBRO DE LA FAMILIA DEL RECEPTOR DE CITOQUINA

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<130> GFN-5230 CPPC

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<140>

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<141>

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<150> 09/569,384

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<151> 2000-05-11

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<160> 16

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2665

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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1

100

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<210> 2

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<211> 538

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 25

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtccgagg agaaagctga tctca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaagatgac cgggtcactc catt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa EN LA POSICIÓN 3 PUEDE SER CUALQUIER AMINO ÁCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ser Xaa Trp Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2628

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 529

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcatcaagc cggctccccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccattcac tccaggtccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgaacgtga ctgtggcctt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaatgaagt gcctggctga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 15

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaaagctt cagtatgagc tgcagtacag gaaccgggga

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaggatcc ctttaactcc tctgactggg tctgaaagat

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Listado de secuencias

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Genetics, Institute, Inc., et al.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MU-1, MIEMBRO DE LA FAMILIA DEL RECEPTOR DE CITOQUINA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> GFN-5230 CPPC

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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<150> 09/569,384

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<151> 2000-05-11

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<160> 16

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2665

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 538

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

11

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<210> 4

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<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtccgagg agaaagctga tctca

\hfill

25

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<210> 5

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<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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gaaagatgac cgggtcactc catt

\hfill

24

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<210> 6

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca

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29

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<210> 7

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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actcgagcta tgagctgcag gtgcgggca

\hfill

29

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<210> 8

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa EN LA POSICIÓN 3 PUEDE SER CUALQUIER AMINO ÁCIDO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Trp Ser Xaa Trp Ser}

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<210> 9

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<211> 2628

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 9

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12

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<210> 10

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<211> 529

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcatcaagc cggctccccc

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccattcac tccaggtccc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgaacgtga ctgtggcctt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaatgaagt gcctggctga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaaagctt cagtattgagc tgcagtacag gaaccgggga

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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\hskip-.1em\dddseqskip

cacaggatcc ctttaactcc tctgactggg tctgaaagat

\hfill

40

Claims

1. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno inmune que comprende ensayar la capacidad del compuesto para modular la interacción de Polipéptido MU-1 con una molécula STAT, identificando por lo tanto capaz de tratar un trastorno inmune en donde el polipéptido MU-1 es un miembro de la familia de proteína MU-1 que tiene una secuencia de aminoácido de al menos 65% idéntica a la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o 10.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula STAT es STAT 3 o STAT 5.

3. Un método para identificar un modulador de la actividad MU-1 que comprende poner en contacto una célula que expresa una proteína MU-1 de acuerdo con la SEQ ID NO 2 o 10, o una porción de esta capaz de interacción con las moléculas STAT, con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad de dicho compuesto de ensayo para modular la interacción de dicha proteína MU-1, o dicha proteína de este, con una molécula STAT.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha molécula es STAT es STAT 3 o STAT 5.

5. El método de la reivindicación 3 o 4 en donde la proteína MU-1 esta de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y se expresa en dicha célula como una fusión del dominio intracelular MCT-1y el dominio extracelular del receptor EPO humano.