KR20010085838A - 사이토킨 리셉터 ｚａｌｐｈａ11 - Google Patents

Abstract

신규한 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드, 및 관련된 조성물 및 방법이 신규한 사이토킨 리셉터인 zalpha11에 대해 개시된다. 폴리펩티드는 시험관내 및 생체내에서 조혈, 림프 및 골수 세포의 증식 및/또는 분화를 자극하는 리간드를 검출하기 위한 방법 내에서 사용될수 있다. zalpha11을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 16 상에 위치하며, 사람의 질환 상태와 관련된 게놈의 영역을 확인하는데 사용될수 있다. 또한, 본 발명은 단백질 제조 방법, 그것들의 용도 및 그것들에 대한 항체를 포함한다.

Description

사이토킨 리셉터 ｚａｌｐｈａ11{CYTOKINE RECEPTOR ZALPHA11}

호르몬과 성장 인자들은 리셉터에 결합함으로써 세포 대사에 영향을 미친다. 리셉터는 세포내에 있는 신호화 경로에 결합된 통합 멤브레인단백질, 예컨대 2차 메신저 시스템일 수 있다. 다른 부류의 리셉터들은 가용성 분자, 예컨대 전사 인자들일 수 있다. 특히 관심이 가는 것은 사이토킨에 대한 리셉터, 즉 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진하는 분자들이다. 사이토킨의 실예로는 적혈구의 발생을 자극하는 에리트로포이에틴 (EPO); 거대핵세포 계통의 세포의 발생을 자극하는 트롬보포이에틴 (TPO); 및 호중구의 발생을 자극하는 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF)가 있다. 이들 사이토킨은 빈혈, 혈소판 감소증, 및 뉴트로페니아에 걸려있는 환자들또는 암 때문에 화학요법을 받고 있는 환자들에서 정상적인 혈구 수준을 회복시키는데 유용하다.

이들 사이토킨의 입증된 생체내 활성은 다른 사이토킨, 사이토킨 아고니스트, 및 사이토킨 길항체의 수많은 임상적인 가능성, 및 그것들에 대한 요구를 설명해준다. 본 발명은 새로운 조혈 사이토킨 리셉터와, 뿐만 아니라 관련된 조성물 및 방법을 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다.

본 발명은 본원에서 교시하는 것으로부터 당업자들에게 명백한 이들 및 다른 용도를 위해 그러한 폴리펩티드를 제공한다.

(발명의 요약)

한 측면으로, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)에 도시된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여, ktup=1, 갭 개방 페널티=10, 갭 확장 페널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62 와, 초기값으로서 설정된 다른 매개변수를 사용하는 FASTA 프로그램을 사용하여 아미노산 퍼센트 동일성을 측정하는 바, 최소한 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 구체예에서, 상술된 폴리뉴클레오티드는 (a) SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 1에서 뉴클레오티드 1614에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열; (b) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 126에서 뉴클레오티드 779에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열; (c) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 126에서 뉴클레오티드 833에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열; (d) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 834에서 뉴클레오티드 1682에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열; (e) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 126에서 뉴클레오티드 1682에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열; 및 (f) SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 69에서 뉴클레오티드 1682에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 폴리뉴클레오티드는 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)에 도시된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)에 도시된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에도시된 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열로 구성된다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 추가로 WSWSX 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 추가로 트랜스멤브레인 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 238 (Leu)에서 잔기 255 (Leu)로 이루어지는 트랜스멤브레인 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 추가로 세포내 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서는, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 256 (Lys)에서 538 (Ser)로 구성되는 세포내 도메인을 포함하고 있다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리뉴클레오티드는 추가로 폴리펩티드가 친화성 태그를 추가로 포함하고 있는 세포내 도메인을 포함하는 Box I 및 Box II 부위를 포함하는 세포내 도메인을 포함한다.

두 번째 측면으로, 본 발명은 다음의 작동가능하게 연결된 요소들: 전사 프로모터; SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열을 가지고 있는 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및 전사 터미네이터를 포함하고 있으며, 이 때 프로모터는 DNA 절편에 작동가능하게 연결되어 있고 DNA 절편은 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터를 제공한다. 한 구체예에서, 상술된 발현 벡터는 추가로 DNA 절편에 작동가능하게 연결되어 있는 분비 신호 서열을 포함한다.

세 번째 측면으로, 본 발명은 상술된 것과 같은 발현 벡터를 포함하는 배양 세포를 제공하며, 이 세포는 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현한다.

네 번째 측면으로, 본 발명은 전사 프로모터; SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지고 있는 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및 전사 터미네이터를 포함하며, 상기 프로모터, DNA 절편, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터를 제공한다. 한 구체예에서, 상술된 발현 벡터는 DNA 절편에 작동가능하게 연결되어 있는 분비 신호 서열을 추가로 포함한다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 추가로 SEQ ID NO:2의 잔기 238 (Leu)에서 255(Leu)로 구성되는 트랜스멤브레인 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 발현 벡터는 추가로 DNA 절편에 작동가능하게 연결되어 있는 세포내 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 발현 벡터는 SEQ ID NO:2의 잔기 256 (Lys)에서 538 (Ser)로 구성되는 세포내 도메인을 포함한다.

다른 측면으로, 본 발명은 본원의 청구항 15에 따르는 발현 벡터가 도입된 배양 세포를 제공하는데, 이 세포는 DNA 절편에 의해 코드화된 가용성 리셉터 폴리펩티드를 발현한다. 한 구체예에서, 상술된 배양 세포는 증식을 위하여 외인성 공급되는 조혈 성장 인자에 의존한다.

다른 측면으로, 본 발명은 융합 단백질을 코드화하는 DNA 구성물을 제공하는데, 이 DNA 구성물은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 1 (Met)에서 아미노산 번호 19 (Gly)의 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)의 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)의 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 238 (Lys)에서 아미노산 번호 255 (Ser)의 아미노산 서열; (e) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 238 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)의 아미노산 서열; (f) SEE ID NO:3의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)의 아미노산 서열; 및 (g) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 코드화하는 첫 번째 DNA 절편과; 추가의 폴리펩티드를 코드화하는 최소한 하나의 다른 DNA 절편을 포함하고 있으며, 이 때 첫 번째 및 다른 DNA 절편은 프레임내에서 연결되고, 융합 단백질을 코드화한다.

다른 측면으로, 본 발명은 다음의 작동가능하게 연결되는 요소들: 전사 프로모터; 상술된 바와 같이 융합 단백질을 코드화하는 DNA 구성물; 및 전사 터미네이터를 포함하고 있는 발현 벡터를 제공하며, 상기 프로모터는 DNA 구성물에 작동가능하게 연결되고, DNA 구성물은 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결된다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 상술된 바와 같은 발현 벡터를 포함하고 있는 배양 세포를 제공하는데, 이 세포는 DNA 구성물에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현한다.

다른 측면으로, 본 발명은 상술된 세포를 배양하는 단계; 그리고 세포에 의해 생성된 폴리펩티드를 단리하는 단계로 이루어지는 융합 단백질의 제조 방법을제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)에 도시된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여, ktup=1, 갭 개방 페널티=10, 갭 확장 페널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62 와, 초기값으로서 설정된 다른 매개변수를 사용하는 FASTA 프로그램을 사용하여 아미노산 퍼센트 동일성을 측정하는 바, 최소한 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하고 있는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 한 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)에 도시된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)에 도시된 아미노산 서열; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 255 (Leu)에 도시된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 256 (Lys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열; 및 (e) SEQ ID NO:2 의 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538 (Ser)에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기 서열로 구성된다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 추가로 WSXWS 모티프를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 트랜스멤브레인 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 238 (Leu)에서 255 (Leu)로 구성되는 트랜스멤브레인 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 추가로 세포내 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 잔기 256 (Lys)에서 538 (Ser)로 구성되는 세포내 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 추가로 BoxI 과 BoxII 부위를 포함하는 세포내 도메인을 추가로 포함한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 상술된 바와 같은 세포를 배양하는 단계; 그리고 세포에 의해 생성된 zalpha11 폴리펩티드를 단리하는 단계로 이루어지는 zalpha11 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His)의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 실질적으로 통상적으로 조혈 리셉터와 관련되어 있는 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인이 없는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 다른 구체예에서, 상술된 단리된 폴리펩티드는 친화성 태그를 포함한다.

다른 측면으로, 본 발명은 상술된 바와 같은 세포를 배양하는 단계; 그리고 그 세포에 의해 생성된 zalpha11 폴리펩티드를 단리하는 단계로 이루어지는, zalpha11 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 (a) 9 내지 519개의 아미노산으로 이루어지며, SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 538 (Ser) 까지의 연속되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드; (b) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 101 (Leu)에서 아미노산 번호 122 (Gly) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 141 (Asn)에서 아미노산 번호 174 (Ala) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (e) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 193 (Cys)에서 아미노산 번호 261 (Val) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (f) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 513 (Trp)에서 아미노산 번호 61 (Glu) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (g) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 136 (Ile)에서 아미노산 번호 143 (Glu) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (h) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 187 (Pro)에서 아미노산 번호 195 (Ser) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; (i) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 223 (Phe)에서 아미노산 번호 232 (Glu) 까지의아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; 및 (j) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 360 (Glu)에서 아미노산 번호 368 (Asp) 까지의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드로 동물을 접종하고, 그로써 폴리펩티드가 zalpha11 폴리펩티드에 대한 항체를 생성하도록 동물에게서 면역 반응을 유도하는 단계; 그리고 그 동물로부터 항체를 단리하는 것으로 이루어지는, zalpha11 폴리펩티드에 대한 항체의 제조 방법을 제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 상술된 방법에 의해 생성된 항체를 제공하는데, 이 항체는 zalpha11 폴리펩티드에 대하여 특이하게 결합한다. 한 구체예에서, 상술된 항체는 단클론성 항체이다.

다른 측면으로, 본 발명은 상술된 바와 같은 폴리펩티드에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 그 안으로 상술된 발현 벡터가 도입된 세포를 배양하여 세포가 시험 샘플의 존재 및 부재시에 DNA 절편에 의해 코드화된 zalpha11 단백질을 발현시키는 단계; 시험 샘플의 존재 및 부제시에 zalpha11의 활성 수준을 생물학적 또는 생화학적 분석법에 의하여 비교하는 단계; 그리고 그 비교로부터 시험 샘플중의 zalpha11 활성의 조절인자의 존재를 검출하는 단계로 이루어지는, 시험 샘플중의 zalpha11 단백질 활성의 조절인자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 시험 샘플을 SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)에서 아미노산 번호 237 (His) 까지의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 시험 샘플중의 리간드에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계로 이루어지는, 시험 샘플내에 있는 zalpha11 리셉터 리간드를 검출하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상술된 방법은 추가로 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 방법은 추가로 폴리펩티드가 배양된 세포내에서 멤브레인 결합되어 있는 폴리펩티드를 포함하며, 검출 단계는 배양 세포에서의 생물학적 반응을 측정하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 상술된 방법은 추가로 배양된 세포내에서 멤브레인 결합되어 있는 폴리펩티드를 포함하며, 검출 단계는 배양된 세포에서의 생물학적 반응을 측정하는 것을 포함하고, 이 생물학적 반응은 세포 증식 또는 리포터 유전자의 전사의 활성화이다. 다른 구체예에서, 상술된 방법은 추가로 고체 지지체위에 고정된 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 이들 및 다른 측면들은 다음의 상세한 설명을 참조로 명백해질 것이다.

다핵세포 유기체의 세포의 증식 및 분화는 호르몬 및 폴리펩티드 성장 인자들에 의하여 조절된다. 이들 확산성 분자들은 세포가 상호 소통하고 협력하여 세포 및 기관을 형성하고, 손상된 조직을 수복하는 것을 가능하게 한다. 그러한 호르몬 및 성장 인자들의 실예로는 스테로이드 호르몬 (예컨대 에스트로겐, 테스토스테론), 부갑상선 호르몬, 난포 자극 호르몬, 인터류킨, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴 (EPO) 및 칼시토닌이 있다.

도 1은 사람 zalpha11의 Hopp/Woods 친수성 도표이다.

도 2는 사람 zalpha11 (zalpha) (SEQ ID NO:2) 및 마우스 zalpha11 (muzalp) (SEQ ID NO:85)의 배열이다.

본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 다음의 용어들을 규정하는 것이 발명의 이해를 도와줄 것이다.

용어 "친화성 태그"는 본원에서 두 번째 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하기 위하여 또는 기질에 대한 두 번째 폴리펩티드의 부착 부위를 제공하기 위하여 두 번째 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 절편을 규정하기 위하여 사용된다. 원리적으로, 그것에 대한 항체 또는 다른 특이적인 결합제가 활용될 수 있는 모든 펩티드 또는 단백질이 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 친화성 태그로는 예를 들면, 폴리히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al.,EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al.,Methods Enzymol. 198:3, 1991), 글루타티온 S 트랜스페라제 (Smith and Johnso,Gene 67:31, 1988), Glu-Glu 친화성 태그 (Grussenmeyer et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-7954, 1985), 물질 P, Flag^TM펩티드 (Hopp et al.,Biotechnology 6:1204-1210, 1988), 스트렙트아비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이 있다. (일반적인 참조: Ford et al.,Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991). DNA 코드화 친화성 태그는 상업적인 공급자들 (예컨대 Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 이용할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대립성 변이체"는 동일한 염색체상 유전자좌를 차지하고 있는 유전자의 둘 또는 그 이상의 교대 형태중 어느 하나를 나타낸다. 대립성 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하며, 그 결과 그 집단내에서 표현형적 다형태를 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 사일런트성일 수 있거나 (코드화된 폴리펩티드에 변화가 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화할 수도 있다. 용어 대립성 변이체는 또한 본원에서 유전자의 대립성 변이체에 의해 코드화된 단백질을 나타내기 위해서도 사용된다.

용어 "아미노-말단" 및 "카르복시-말단"은 본원에서 폴리펩티드내에 있는 단백질을 표시하기 위해 사용된다. 내용이 허용되는 한, 이들 용어는 근접성 또는 상대적인 위치를 표시하기 위하여 폴리펩티드의 특정 서열 또는 부분과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩티드내에 있는 참조 서열에 대하여 카르복시-말단적으로 위치한 특정 서열은 참조 서열의 카르복시 말단에 근접하여 위치한 것이지만, 반드시 완전한 폴리펩티드의 카르복시 말단에 있는 것은 아니다.

용어 "보체/항-보체 쌍"은 적절한 조건하에서 비-공유적으로 결합된, 안정한 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분을 나타낸다. 예를 들어, 바이오틴과 아비딘 (또는 스트렙트아비딘)은 보체/항-보체 쌍의 원형적인 한 예이다. 다른 예시적인 보체/항-보체 쌍으로는 리셉터/리간드 쌍, 항체/항원 (또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등이 있다. 다음 단계로 보체/항-보체 쌍이 계속해서 분해되는 것이 바람직한 경우에는, 보체/항-보체 쌍의 결합 친화성이 바람직하게는 10⁹M^-1보다 작은 것이 좋다.

용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 보체"는 참조 서열과 비교하여 상보하는 염기 서열과 역 방향을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드 분자이다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3' 은 5' CCCGTGCAT 3'에 상보한다.

용어 "콘티그"는 다른 폴리뉴클레오티드에 대하여 동일한 또는 상보하는 서열의 연속되는 스트레치를 가지고 있는 폴리뉴클렐오티드를 나타낸다. 연속 서열은 전체적으로 또는 폴리뉴클레오티드의 부분적인 스트레치를 따라 폴리뉴클레오티드 서열의 주어진 서열을 "중첩한다"고 말할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 5'-ATGGCTTAGCTT-3'에 대한 대표적인 콘티그는 5'-TAGCTTgagtct-3' 및 3'-gtcgacTACCGA-5'이다.

용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 하나 또는 둘 이상의 축퇴성 코돈 (폴리펩티드를 코드화하는 참조 뉴클레오티드 분자에 비교하여)을 포함하는 뉴클레오티드?? 서열을 표시한다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 상이한 트리플렛을 함유하고는 있지만, 동일한 아미노산 잔기를 코드화한다 (즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 Asp를 코드화한다).

용어 "발현 벡터"는 본원에서 그것의 전사를 제공하는 추가의 절편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 절편을 포함하는, 선형 또는 원형의 DNA 분자를 나타낸다. 그러한 추가의 절편들로는 프로모터와 터미네이터 서열이 있으며, 또한 하나 또는 둘 이상의 복제 기원, 하나 또는 둘 이상의 선택성 마아커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도될 수 있으며, 또는 두가지의 요소를 모두 함유할 수 있다.

용어 "단리된"은, 폴리뉴클레오티드에 적용될 때는 폴리뉴클레오티드가 그것의 자연적인 유전적 환경으로부터 제거되었고 그로써 다른 외인성 또는 원하지 않는 코딩 서열이 없으며, 유전공학적으로 처리된 단백질 제조 시스템내에서 사용하기에 적당한 형태임을 나타낸다. 그러한 단리된 분자들은 그것의 천연 환경으로부터 분리되는 것들로 cDNA 및 게놈성 클론을 포함한다. 본 발명의 단리된 DNA 분자들은 그것들이 통상적으로 결합되는 다른 유전자들은 없지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연적으로 발생하는 5' 및 3' 미번역 영역을 포함할 수 있다. 결합된 영역의 확인은 당업자에게는 명백한 일일 것이다 (Dynan and Tijan,Nature 316:774-778, 1985).

"단리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 그것의 천연 환경 이외의 조건, 예컨대 혈액 및 동물 조직이외의 조건에서 발견되는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 형태의 단리된 폴리펩티드는 실질적으로는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없는 것이다. 고도로 정제된 형태, 즉 95 % 이상 순수한, 보다 바람직하게는 99 % 이상 순수한 폴리펩티드가 제공되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "단리된"은 선택적인 물리적 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재, 예컨대 이량체 또는 그렇지 않은 경우 글리코실화된 또는 유도체화된 형태를 배제하지 않는다.

용어 "작동가능하게 연결된"은, DNA 절편과 관련하여,절편들이 그것들의 의도된 목적과 일치하여 작용하도록, 예컨대 전사는 프로모터에서 개시되고 코딩 절편을 통하여 진행되어 터미네이터에 이르도록 배열된 것을 가리킨다.

용어 "오르토로그"는 상이한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 대응물인 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 가리킨다. 오르토로그들중의 서열 차이는 종 분화의 결과이다.

"파라로그"는 한 유기체에 의해 만들어진 구별되지만 구조적으로 관련된 단백질이다. 파라로그는 유전자 복제를 통하여 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 상호의 파라로그이다.

"폴리뉴클레오티드"는 5' 단부에서 3' 단부쪽으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 단일- 또는 이중-가닥 중합체이다. 폴리뉴클레오티드로는 RNA 및 DNA 가 있으며, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있고, 시험관내에서 합성될 수 있으며, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기쌍 ("bp"로 약칭됨), 뉴클레오티드 ("nt"), 또는 킬로염기 ("kb")로 표시된다. 내용이 허용되는 한, 후자의 두 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 이 용어가 이중 가닥의 분자에 적용되는 경우에는 그것은 전체 길이를 표시하기 위해 사용되고, 용어 "염기쌍"과 동등한 것으로 이해될 것이다. 당업자들은 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드의 두 가닥이 길이가 약간은 다르며, 그것의 단부가 효소적 절단의 결과로서 서로 엇갈릴 수 있고, 그로써 이중 가닥의 폴리뉴클레오티드 분자내에 있는 모든 뉴클레오티드들이 쌍을 이루지 않을 수도 있음을 인지할 것이다.

"폴리펩티드"는 그것이 자연적으로 생성된 것이든 또는 합성된 것이든 펩티드 결합에 의하여 결합된 아미노산 잔기들의 중합체이다. 약 10 아미노산 잔기 이하의 폴리펩티드는 통상 "펩티드"로도 언급된다.

용어 "프로모터"는 본원에서 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 함유하고 있는 유전자 부분을 표시하기 위해 기술분야에서 인지되는의미로 사용된다. 프로모터 서열은 통상, 그러나 항상 그렇지는 않지만, 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.

"단백질"은 하나 또는 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비-펩티드 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수도 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환체는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 다를 것이다. 단백질은 본원에서 그것들의 아미노산 골격 구조의 견지에서 규정되며; 탄수화물 기와 같은 치환체는 일반적으로 특정되어 있지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 것이다.

본원에서 용어 "리셉터"는 생체내에서 활성적인 분자 ("리간드")에 결합하여 세포에 미치는 리간드의 영향을 중재하는 세포-결합된 단백질, 또는 그러한 단백질의 폴리펩티드 하위단위체를 표시하기 위하여 사용된다. 리셉터에 대한 리간드의 결합의 결과로서 리셉터의 형태의 변화 (그리고 어떤 경우에는 리셉터 다중결합, 즉 동일한 또는 상이한 리셉터 하위단위체의 결합)가 일어나고, 그로써 세포의 이펙터 도메인(들)과 다른 분자(들) 사이의 상호작용이 유발된다. 이들 상호작용은 계속해서 세포의 대사의 변경을 유도한다. 리셉터-리간드 상효작용에 연결된 대사 사건으로는 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 세포 증식, 고리형 AMP 생성의 증가, 세포내 칼슘의 고정화, 막지질의 고정화, 세포 점착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해가 있다. 세포-표면 사이토킨 리셉터는 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 다중-도메인 구조를 특징으로 한다. 이들 리셉터는 보통 양으로 하전된 잔기들 (Lys 또는 Arg)이 양 옆에 있는 소수성 아미노산 잔기의 서열 (전형적으로 약 21 내지 25 개의 잔기)을 가지는 것을 특징으로 하는 트랜스멤브레인 도메인에 의해 세포막에 고착된다. 일반적으로, 리셉터는 막결합될 수 있고, 시토솔에 있거나 핵에 있을 수 있으며, 단량체 (예컨대 갑상선 자극 호르몬 리셉터, 베타-아드레날린성 리셉터)이거나 다량체 (예컨대 PDGF 리셉터, 성장 호르몬 리셉터, IL-3 리셉터, GM-CSF 리셉터, G-CSF 리셉터, 에리트로포이에틴 리셉터 및 IL-6 리셉터)일 수 있다. 용어 "리셉터 폴리펩티드"는 본원에서 완전한 리셉터 폴리펩티드 사슬 및 단리된 기능적 도메인 (예컨대 리간드-결합 도메인)을 포함한 그것의 부분들을 표시하기 위하여 사용된다.

"분비 신호 서열"은 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 보다 큰 폴리펩티드를 지정하는 폴리펩티드 ("분비 펩티드")를 코드화하는 DNA 서열이다. 보다 큰 펩티드는 통상적으로 분비 경로를 통한 전이중에 분비 펩티드를 제거하기 위하여 절단된다.

"가용성 리셉터"는 세포막에 결합되지 않는 리셉터 폴리펩티드이다. 가용성 리셉터는 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인이 없는 가장 통상적인 리간드-결합 리셉터 폴리펩티드이다. 가용성 리셉터는 추가의 아미노산 잔기, 예컨대 폴리펩티드의 정제를 제공하거나 또는 기질에 대한 폴리펩티드의 부착을 위한 부위를 제공하는 친화성 태그, 또는 면역글로불린 일정 영역 서열을 포함할 수 있다. 많은 세포-표면 리셉터들은 단백질 가수분해에 의해 생성된 자연 발생적인, 가용성 대응물을 가지고 있다. 가용성 리셉터 폴리펩티드는 그것들이 각각 멤브레인 고착 또는 신호 변환을 제공하기 위한 절편의 충분한 부분이 없는 경우 실질적으로 트랜스멤브레인및 세포내 폴리펩티드 절편이 없다고 말할 수 있다.

용어 "스플라이스 변이체"는 본원에서 유전자로부터 전사되는 RNA의 또 다른 형태를 나타낸다. 스플라이스 변이체는 전사된 RNA 분자내에 있는, 또는 흔하지는 않지만 별도로 전사된 RNA 분자들 사이에 있는 또 다른 스플라이싱 부위를 사용함으로써 자연적으로 발생하고, 그 결과 동일한 유전자로부터 전사된 여러개의 mRNA를 유발할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화한다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 본원에서 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 코드화된 단백질을 나타내기 위하여 사용된다.

부정확한 분석 방법 (예컨대 겔 전기영동)에 의해 측정된 중합체의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 인지될 것이다. 그러한 값이 "약" X 또는 "대략" Z로 표시되는 경우, 표시된 X의 값은 ±10 % 정도로 정확할 것으로 인정될 것이다.

본 발명은 부분적으로는 부류 I 사이토킨 리셉터의 구조를 가지고 있는 단백질을 코드화하는 신규한 DNA 서열의 발견에 기초한다. 추론된 아미노산 서열은 코드화된 리셉터가 IL-2 리셉터 β-하위단위체 및 β-통상 리셉터 (즉, IL3, IL-5 및 GM-CSF 리셉터 β-하위단위체)를 포함하는 리셉터 하위패밀리에 속하는 것을 나타냈다. 이러한 신규한 DNA 에 상응하는 mRNA의 조직 분포에 대한 분석은 림프절, 말초혈 백혈구 (PBLs), 비장, 및 흉선에서의 발현을 나타냈다. 더욱이, mRNA는 버키트 림프종 (Burkitt's lymphoma)로부터 유도된 Raji 셀라인 (ATCC No. CCL-86)에서풍부하였다. 폴리펩티드는 zalpha11로 표시되었다.

본 발명의 신규한 zalpha11 폴리펩티드는 초기에는 EST 데이터베이스에 의문을 가짐으로써 확인되었다. EST가 발견되었고 그것에 상응하는 cDNA가 서열화되었다. cDNA에 의해 코드화된 신규한 폴리펩티드는 제 I 부류의 사이토킨 리셉터와의 상동성을 나타냈다. zalpha11 폴리뉴클레오티드 서열은 예상된 단백질의 전체적인 코딩 서열을 코드화한다. zalpha11 은 아폽토시스성 세포 경로, 세포-세포 신호화 분자, 성장인자 리셉터, 또는 성장 인자 호르몬 활성을 가지는 세포외 매트릭스 결합 단백질 등에 포함될 수 있는 신규한 사이토킨 리셉터이다.

zalpha11 폴리펩티드의 서열은 그것의 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한 단일 클론으로부터 추론되었다. 이 클론은 척수 라이브러리로부터 얻어졌다. 그러한 서열을 또한 추론해낼 수 있는 다른 라이브러리로는 PBL, 흉선, 비장, 림프절, 사람 적백혈병 셀라인 (예컨대 TF-1), Raji 세포, 급성 단세포성 백혈병 셀라인, 다른 림프종 및 조혈 셀라인 등이 있다.

대표적인 zalpha11-코드화 DNA의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 표시되며 (뉴클레오티드 69부터 1682 까지), 그것의 추론된 538 개의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2에 표시된다. 전체적으로 볼 때 zalpha11 폴리펩티드 (SEQ ID NO:2)는 전-길이의 폴리펩티드 절편 (SEQ ID NO:2의 잔기 1 (Met)부터 잔기 538 (Ser)까지)을 나타낸다. zalpha11 폴리펩티드의 도메인 및 구조적 특징은 아래에서 더 설명된다.

SEQ ID NO:1의 DNA 서열에 의하여 코드화된 zalpha11 폴리펩티드에 대한 분석 결과, 19 개의 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 1 (Met)부터 잔기 19 (Gly)까지)로 된 예상하였던 분비 신호 펩티드와, 519 개의 아미노산 (SEQ ID NO:2의 잔기 20 (Cys)부터 538 (Ser)까지)으로 된 성숙한 폴리펩티드를 포함하는 538 개의 아미노산 (SEQ ID NO:2)을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 나타냈다. SEQ ID NO:2의 잔기 214부터 218 까지에 상응하는 WSXWS 모티프 (SEQ ID NO:3)외에, 리셉터는 대략 200 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:2의 잔기 20 (Cys)에서 237 (His)까지)로 이루어진 사이토킨-결합 도메인; 도메인 링커 (SEQ ID NO:2의 잔기 120 (Pro)에서 123 (Pro)까지); 페널티메이트 (penultimate) 스트란드 영역 (SEQ ID NO:2의 잔기 192 (Lys)에서 202 (Ala)까지); 트랜스멤브레인 도메인 (SEQ ID NO:2의 잔기 238 (Leu)에서 255 (Leu)까지); "Box I" 신호화 부위 (SEQ ID NO:2의 잔기 267 (Ile)에서 273 (Pro)까지), 및 "Box II" 신호화 부위 (SEQ ID NO:2의 잔기 301 (Leu)에서 304 (Gly)까지)를 함유하는 완전한 세포내 신호화 도메인 (SEQ ID NO:2의 잔기 256 (Lys)에서 538 (Ser)까지)을 포함한다. 당업자들은 이들 도메인 경계가 대략적인 것이며, 공지된 단백질과의 일렬 배열 및 단백질 접힘에 대한 예상을 기초로 한것임을 인지할 것이다. 이들 도메인외에, 코드화된 리셉터의 보존된 리셉터 특징은 (SEQ ID NO:2에 나타난 바와 같이) 위치 138에 있는 보존된 Trp 잔기 및 위치 201 에 있는 보존된 Arg 잔기를 포함한다. 상술된 zalpha11 폴리펩티드 영역, 도메인, 모티프, 잔기 및 서열을 코드화하는 상응하는 폴리뉴클레오티드들은 SEQ ID NO:1에 제시된다.

트랜스멤브레인 영역, 및 보존되고 가변성이 적은 모티프의 존재는 일반적으로 단백질의 중요한 구조적 영역과 상관이 있거나 그러한 영역을 규정한다. 가변성이 적은 영역 (예컨대 소수성 클러스터)은 일반적으로 구조적으로 중요한 영역에 존재한다 (Sheppard, P. et al. 상기 동일 문헌 참조). 그러한 가변성이 적은 영역은 때로 희귀한 또는 드물게 존재하는 아미노산, 예컨대 트립토판을 함유한다. 그런 보존되고 가변성이 적은 모티프 양 옆에 있고 그런 모티프들 사이에 있는 영역들은 보다 가변적일 수 있지만, 때로는 그것들이 결합 도메인, 생물학적 및 효소적 활성, 신호 변환, 세포-세포 상호작용, 조직 정위 도메인 등과 같은 중요한 구조 및 활성과 관련이 있거나 그것들을 규정하기 때문에 기능적으로 중요하다.

상술된 zalpha11의 보존된 아미노산 잔기의 영역은 새로운 패밀리 구성원을 확인하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)이 다양한 조직 공급원 또는 셀라인으로부터 얻어진 RNA로부터의 보존된 영역을 코드화하는 서열을 증폭시키기 위하여 사용될 수 있다. 특히, zalpha11 서열로부터 디자인된 고도의 축퇴성 프라이머가 이 목적에 유용하다. 그러한 축퇴성 프라이머를 디자인하고 사용하는 것은 당업자에 의해 쉽게 수행될 수 있다.

본 발명은 DNA 와 RNA 분자를 포함하여, 본원에서 설명된 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 당업자들은 유전자 코드의 축퇴성의 견지에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오티드 분자들간에 가능하다는 것을 인지할 것이다. SEQ ID NO:4는 SEQ ID NO:2의 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 모든 DNA를 포함하는 축퇴성 DNA 서열이다. 당업자들은 SEQ ID NO:4의 축퇴성 코돈이 또한 T 대신 U를 치환함으로써 SEQ ID NO:2를 코드화하는 모든 RNA 서열을 제공함을 인지할 것이다. 그러므로, SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 1부터 뉴클레오티드 1614를 포함하는 zalpha11 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 및 그것들의 RNA 동등물은 본 발명에 포함된다. 하기 표 1 은 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 표시하기 위하여 SEQ ID NO:4 내에서 사용된 한-문자 코드를 나타낸다. "레졸루션"은 코드 문자에 의해 표시된 뉴클레오티드이다. "보체"는 상보하는 뉴클레오티드(들)을 가리킨다. 예를 들어, 코드 Y는 C 또는 T를 나타내며, 그것의 보체 R은 A 또는 G를 나타내고, A는 T에 상보하며, G는 C에 상보한다.

SEQ ID NO:4에서 사용된 축퇴성 코돈은, 주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하여 하기 표 2에서 설명된다.

당업자는 각각의 아미노산을 코드화하는 모든 가능한 코돈을 대표하는 축퇴성 코돈을 결정하는데 약간의 불명확함이 포함된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 세린에 대한 축퇴성 코돈 (WSN)은 어떤 경우에는 아르기닌 (AGR)을 코드화하고, 아르기닌에 대한 축퇴성 코돈 (MGN)은 어떤 경우에는 세린 (AGY)을 코드화한다. 유사한 관계가 페닐알라닌과 로이신을 코드화하는 코돈들 사이에도 존재한다. 그러므로, 축퇴성 서열에 의해 포함되는 일부의 폴리뉴클레오티드는 변이 아미노산 서열을 코드화할 수 있지만, 당업자는 그러한 변이체 서열을 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 참조하여 쉽게 확인할 수 있다. 변이 서열은 본원에서 설명되는 바와 같이 기능성에 대해 쉽게 시험될 수 있다.

당업자는 또한 상이한 종이 "우선적인 코돈 용도"를 나타낼 수 있음을 인지할 것이다 (일반적인 참조: Grantham, et al.,Nuc. Acids Res. 8:1893-1912, 1980; Haas, et al.,Curr. Biol. 6:315-324, 1996; Wain-Hobson, et al.,Gene 13:355-364, 1981; GrosJean and Fiers,Gene 18:199-209, 1982; Holm,Nuc. Acids Res. 14:3075-3087, 1986; Ikemura,J. Mol. Biol.158:573-597, 1982). 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "우선적인 코돈 용도" 또는 "우선적인 코돈"은 특정한 종의 세포에서 가장 흔하게 사용되는, 그로써 각각의 아미노산을 코드화하는 가능한 코돈을 대표하는 하나 또는 소수를 선호하게 되는 단백질 번역 코돈에 관한 분야의 용어이다 (표 2 참조). 예를 들어, 아미노산 트레오닌 (Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의해 코드화될 수 있지만, 포유동물 세포에서는 ACC가 가장 흔하게 사용되는 코돈이고; 다른 종, 예컨대 곤충 세포, 효모, 바이러스 또는 박테리아에서는 다른 Thr 코돈이 바람직할 수 있다. 특정 종에 대한 우선적인 코돈이 당업계에 공지되어 있는 다양한 방법에 의하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 안으로의 우선적인 코돈 서열의 도입은 단백질 번역을 특정한 세포 유형 또는 종내에서 보다 효과적으로 만듦으로써 단백질 생성을증가시킬 수 있다. 그러므로, SEQ ID NO:4에 나타낸 축퇴성 코돈 서열은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되고 본원에서 설명되는 다양한 세포 유형 및 종에서의 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로서 작용한다. 우선적인 코돈을 함유하고 있는 서열은 본원에서 설명되는 바와 같이 다양한 종에서의 발현을 위해 시험되고 최적화될 수 있으며, 기능성에 대해 시험될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예내에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1의 유사한 크기의 영역, 또는 그것에 상보하는 서열에, 엄격한 조건하에서 혼성화할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이한 서열에 대한 열 용융점 (T_m)보다 약 5 ℃ 낮게 선택된다. T_m은 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서) 표적 서열의 50 %가 완전하게 매치되는 프로브에 혼성화하게 되는 온도이다. Tm을 계산하기 위한 많은 방정식이 당업계에 공지되어 있으며, DNA, RNA 및 DNA-RNA 혼성체 및 다양한 길이의 폴리뉴클레오티드 프로브 서열에 따라 특이하다 (Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, 1987); Berger and Kimmel (eds.),Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press, Inc. 1987); Wetmur,Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.26:227 (1990)). OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) 및 프라이머 프레이머 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)와 같은 서열 분석 소프트웨어 뿐만 아니라 인터넷상의 사이트들이, 사용자가 규정한 기준을 토대로 주어진 서열을 분석하고 T_m을 계산하기 위해 활용될 수 있는 도구들이다. 그러한 프로그램들은 또한 규정된 조건하에서 주어진 서열을 분석하고 적당한 프로브 서열을 확인할 수 있다. 전형적으로, 보다 긴 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대 50 염기쌍 이상)의 혼성화는 계산된 T_m보다 약 20 내지 25 ℃ 낮은 온도에서 수행된다. 보다 작은 프로브 (예컨대 50 염기쌍 미만)에 대해서는, 혼성화는 T_m에서 또는 그것보다 5 내지 10 ℃ 낮은 온도에서 수행되는 것이 전형적이다. 이런 조건이 DNA-DNA 및 DNA-RNA 혼성체에 대한 혼성화의 최대 속도를 가능하게 한다. 보다 낮은 온도에서의 보다 더 높은 엄격도는 포름아미드를 첨가함으로써 이루어질 수 있으며, 포름아미드는 완충액중의 각 1 % 포름아미드에 대하여 혼성체의 T_m을 약 1 ℃ 감소시킨다. 적당히 엄격한 혼성화 조건은 약 40 내지 50 % 의 포름아미드, 약 6×까지의 SSC, 약 5×의 덴하르드트 용액, 0 내지 약 10 %의 덱스트란 술페이트, 및 약 10 내지 20 ㎍/ml의 변성된 상업적으로 이용가능한 담체 DNA를 포함하는 용액중에서 약 42 ℃에서 약 5 시간 내지 하룻밤 배양하는 것과 동등하다. 일반적으로, 그러한 엄격한 조건은 20 내지 70℃의 온도와 약 6×까지의 SSC 및 0 내지 50 %의 포름아미드를 함유하는 혼성화 완충액을 포함하며; 혼성화에 이어서 약 2×까지의 SSC에서 필터가 세척된다. 예를 들어, 적당한 세척 강도는 55 내지 65 ℃에서 0.1×SSC 내지 2×SSC, 0.1 % SDS와 동등하다. 표적 서열에 대한 최대의 특이한 결합을 이루기 위하여 혼성화 및 세척 중에 다양한 엄격도가 사용될 수 있다. 전형적으로, 혼성화에 이어지는 세척은 혼성화된 복합체로부터 혼성화되지 않은 폴리뉴클레오티드 프로브를 제거하기 위하여 엄격도를 증가시켜가면서 수행된다. 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 T_m에 반영된 프로브의 길이, 사용되는 혼성화 및 세척 용액에 따라 좌우되며, 기본적으로는 당업자에 의해 실험적으로 결정된다.

상기에서 주지되는 바와 같이, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는 DNA와 RNA를 포함한다. DNA와 RNA를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, RNA는 다량의 zalpha11 RNA를 생성하는 조직 또는 세포로부터 단리된다. 그러한 조직 및 세포는 노던 블롯팅에 의해 확인되며 (Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980), 그러한 것으로는 PBL, 비장, 흉선, 및 림프 조직, Raji 세포, 사람 적백혈병 셀라인 (예컨대 TF-1), 급성 단세포성 백혈병 셀라인, 다른 림프종 및 조혈 셀라인 등이 있다. 총 RNA는 구아니디움 이소시아네이트 추출을 사용하고, 이어서 CsCl 구배에서의 원심분리에 의한 분리에 의해 제조될 수 있다 (Chirgwin et al.,Biochemistry 18:52-94, 1979). 폴리(A)⁺RNA는 총 RNA로부터 Aviv와 Leder 방법을 사용하여 제조된다 (Aviv and Leder,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). 상보하는 DNA (cDNA)는 공지의 방법을 사용하여 폴리(A)⁺RNA로부터 제조된다. 또는 달리, 게놈 DNA가 단리될 수도 있다. zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 그런 다음, 예컨대 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)(Mullis, 미국 특허 제 4,683,202 호)에 의하여 확인되며 단리된다.

zalpha11을 코드화하는 전-길이의 클론은 종래의 클로닝 과정에 의하여 얻어질 수 있다. 어떤 경우에는 (예컨대 트랜스제닉 동물에서의 발현) 게놈 클론을 사용하거나 또는 최소한 하나의 게놈 인트론을 포함하도록 cDNA 클론을 변형시키는 것이 바람직할 수도 있지만, 상보하는 DNA (cDNA) 클론이 바람직하다. cDNA와 게놈 클론을 제조하는 방법은 공지이며 당업자의 기술 수준내에 있고, 라이브러리를 프로빙하거나 또는 프라이밍하기 위하여 본원에서 개시되는 서열, 또는 그것의 일부를 사용하는 것을 포함한다. 발현 라이브러리는 zalpha11, 리셉터 단편, 또는 다른 특이한 결합 도메인에 대한 항체를 사용하여 프로브될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 현재 선택되는 방법은 포스포라미디트 방법이다. 만약 화학적으로 합성된 이중 가닥의 DNA가 유전자 또는 유전자 단편의 합성과 같은 적용을 위해 필요하다면, 각각의 상보하는 가닥이 별도로 만들어진다. 짧은 폴리뉴클레오티드 (60 내지 80 bp)의 제조는 기술적으로 진보되어 있으며, 상보하는 가닥을 합성한 후 그것들을 아닐링함으로써 이루어질 수 있다. 그러나, 보다 긴 폴리뉴클레오티드 (300 bp 이상)를 제조하기 위해서는 화학적 DNA 합성중의 각 사이클의 커플링 효율이 거의 100 % 가 되지 않기 때문에 통상 특수한 스트래티지가 사용된다. 이 문제를 극복하기 위하여, 길이가 20 내지 100 뉴클레오티드인 단일-가닥의 단편들로부터 합성 유전자 (이중-가닥)가 분자 형태로 조립된다.

합성 유전자를 만들기 위한 한가지 방법은 각각이 20 내지 60 뉴클레오티드 길이를 가지는 중첩하고, 상보하는 올리고뉴클레오티드의 세트를 먼저 제조하는 것을 필요로 한다. 유전자의 각각의 내부 부분은 인접한 부분과 정확하게 염기쌍을 이루도록 디자인된 상보하는 3' 및 5' 말단 연장부를 갖는다. 그러므로, 유전자가조립된 후, 두 가닥의 골격을 따라 T4 DNA 리가제를 사용하여 틈을 실링함으로써 프로세싱이 완료된다. 단백질 코딩 서열이외에, 합성 유전자는 클로닝 벡터의 제한 엔도뉴클레아제 부위안으로의 삽입을 용이하게 하는 말단 서열을 가지도록 디자인될 수 있다. 더욱이, 적절한 개시 및 전사 및 번역의 종결을 위한 신호를 함유하는 다른 서열이 첨가되어야 한다.

전-길이의 유전자를 제조하기 위한 또 다른 방법은 중첩하는 올리고뉴클레오티드 (40 내지 100 뉴클레오티드)의 특정 세트를 합성하는 것이다. 3' 및 5' 짧은 중첩하는 상보 영역 (6 내지 10 뉴클레오티드)이 아닐링된 후, 큰 갭이 여전히 남아 있지만, 짧은 염기쌍의 영역들은 구조체를 함께 유지하기에 충분히 긴 길이이고 안정하다. 갭은 채워지고 DNA 듀플렉스는 대장균 DNA 중합효소 I에 의한 효소적 DNA 합성을 통해 완성된다. 효소적 합성이 완료된 후에, 틈은 T4 DNA 리가제를 사용하여 실링된다. 이중 가닥의 구성물은 상호간에 차례대로 연결되어 DNA 서열 분석에 의해 증명된 전체 유전자 서열을 형성하게 된다 (Glick and Pasternak,Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C.1994); Itakura et al.,Annu. Rev. Biochem. 53:323-356, 1984 및 Climie et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-637, 1990).

본 발명은 추가로 다른 종으로부터 얻어지는 대응하는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 (오르토로그)를 제공한다. 이들 종으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 포유류, 조류, 양서류, 파충류, 어류, 곤충 및 다른 척추동물 및 무척추동물 종이 있다. 특히 관심있는 것은 쥐과, 돼지, 양, 소, 개, 고양이, 말, 및 다른영장류 폴리펩티드를 포함한 다른 포유류 종으로부터 얻어지는 zalpha11 폴리펩티드이다. 사람 zalpha11의 오르토로그는 본 발명에 의해 제공되는 정보 및 조성물을 종래의 클로닝 기법과 조합하여 사용함으로써 클론될 수 있다. 예를 들면, cDNA는 본원에서 설명되는 바와 같이 zalpha11을 발현하는 조직 또는 세포 유형으로부터 얻어진 mRNA를 사용하여 클론될 수 있다. mRNA의 적당한 공급원은 본원에 개시된 서열로부터 디자인된 프로브를 사용하여 노던 블롯을 프로빙함으로써 확인될 수 있다. 그런 다음 양성의 조직 또는 셀라인의 mRNA로부터 라이브러리가 제조된다. 그런 다음 zalpha11-코드화하는 cDNA가 다양한 방법, 예컨대 완전한 또는 부분적인 사람 cDNA 또는 개시된 서열을 토대로 한 하나 또는 둘 이상의 축퇴성 프로브 세트를 사용하여 프로빙함으로써 단리될 수 있다. cDNA는 또한 PCR (Mullis, 상기 동일)을 사용하여, 본원에 개시된 대표적인 사람 zalpha11 서열로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 클론될 수 있다. 추가의 방법에서, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 사용될 수 있으며, 관심의 cDNA의 발현은 zalpha11 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 유사한 기법들이 게놈 클론의 단리에도 적용될 수 있다.

사이토킨 리셉터 하위단위체들은 세포외 도메인, 세포막에 있는 폴리펩티드에 고착하는 트랜스멤브레인 도메인, 및 세포내 도메인을 포함하고 있는 다중-도메인 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 세포외 도메인은 리간드-결합 도메인일 수 있으며, 비록 리간드-결합 및 이펙터 기능이 다중체 리셉터의 별도의 하위단위체상에 존재할 수도 있지만, 세포내 도메인은 신호 변환에 포함된 이펙터 도메인일 수있다. 리간드-결합 도메인은 그 자체가 다중-도메인 구조일 수 있다. 다중체 리셉터는 단일이중체 (예컨대 PDGF 리셉터 αα 및 ββ 이성형태, 에리트로포이에틴 리셉터, MPL, 및 G-CSF 리셉터), 그것들의 하위단위체 각각이 리간드-결합 및 이펙터 도메인을 가지는 헤테로이중체 (예컨대 PDGF 리셉터 αβ 이성형태), 및 이종 (disparate) 기능을 가지고 있는 하위단위체를 가지는 다중체 (예컨대 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 및 GM-CSF 리셉터)를 포함한다. 일부의 리셉터 하위단위체들은 다수의 리셉터에 공통적이다. 예를 들면, 그 자체로서는 리간드에 결합할 수 없지만 세포내 신호 변환 도메인을 포함하고 있는 AIC2B 하위단위체는 IL-3 및 GM-CSF 리셉터의 성분이다. 많은 사이토킨 리셉터들이 구조 및 기능을 토대로 4개의 관련된 패밀리중 하나로 분류될 수 있다. 예를 들어 조혈 리셉터는 보존된 시스테인 잔기와 WSXWS 모티프 (SEQ ID NO:3)를 함유하고 있는 도메인이 존재하는 것을 특징으로 한다. 사이토킨 리셉터 구조는 문헌에서 검토되었다 (Urdal,Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991; Cosman,Cytokine 5:95-106, 1993). 유기체가 새로운 생물학적 기능을 얻기 위해 선택된 압력하에서, 새로운 리셉터 패밀리 구성원은 다중-유전자 패밀리의 존재를 유도하는 기존의 리셉터 유전자들의 복제로부터 발생하는 것 같다. 그러므로 패밀리 구성원들은 선구 유전자의 흔적을 함유하고 있으며, 이들 특징적인 특징은 추가의 패밀리 구성원의 단리 및 확인시에 찾아볼 수 있다. 그러므로, 사이토킨 리셉터 슈퍼패밀리 (superfamily)는 여러개의 패밀리, 예컨대 면역글로불린 패밀리 (CSF-1, MGF, IL-1, 및 PDGF 리셉터 포함); 헤마토포이에틴 패밀리 (IL-2 리셉터 β-하위단위체, GM-CSF 리셉터 α-하위단위체,GM-CSF 리셉터 β-하위단위체; 및 G-CSF, EPO, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 및 IL-9 리셉터 포함); TNF 리셉터 패밀리 (TNF(p80) TNF(p60) 리셉터, CD27, CD30, CD40, Fas, 및 NGF 리셉터 포함)로 다시 나누어진다.

zalpha11 서열의 분석은 그것이 IL-2 리셉터 β-하위단위체, IL-3, IL-4, 및 IL-6 리셉터와 같은 리셉터 하위패밀리의 한 구성원임을 시사한다. 이 하위패밀리의 특정 리셉터 (예컨대 G-CSF)는 신호를 변환시키는 단일이중체를 형성하기 위하여 결합한다. 하위패밀리의 다른 구성원들 (예컨대 IL-6, IL-11, 및 LIF 리셉터)은 리간드에 결합하여 신호를 변환시키기 위하여 두 번째 하위단위체 (β-하위단위체라 명명함)와 결합한다. 특이한 β-하위단위체는 다수의 특이한 사이토킨 리셉터 하위단위체들과 결합한다. 예를 들면, β-하위단위체 gp130 (Hibi et al., Cell 63:1149-1157, 1990)은 IL-6, IL-11 및 LIF 에 특이한 리셉터 하위단위체와 결합한다 (Gearing et al., EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., 미국 특허 제 5,284,755 호). 온코스타틴 M은 LIF 리셉터와 gp130의 이종이중체에 결합한다. CNTF는 CNTF 리셉터, LIF 리셉터, 및 gp130 하위단위체를 포함하는 사합체 리셉터이다.

사람 zalpha11의 마우스 오르토로그에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 확인되었고 SEQ ID NO:84에 표시되며, 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:85에 나타낸다. SEQ ID NO:84의 DNA 서열에 의해 코드화된 마우스의 zalpha11 폴리펩티드에 대한 분석 결과, 19 개의 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:85의 잔기 1 (Met)부터 잔기 19 (Ser)까지)로 된 예상하였던 분비 신호 펩티드와, 510 개의 아미노산 (SEQ ID NO:2의 잔기 20 (Cys)부터 529 (Ser)까지)으로 된 성숙한 폴리펩티드를 포함하는 529 개의 아미노산 (SEQ ID NO:85)을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 나타냈다. SEQ ID NO:85의 잔기 214부터 218 까지에 상응하는 WSXWS 모티프 (SEQ ID NO:3)외에, 리셉터는 대략 200 아미노산 잔기 (SEQ ID NO:85의 잔기 20 (Cys)에서 237 (His)까지)로 이루어진 사이토킨-결합 도메인; 도메인 링커 (SEQ ID NO:85의 잔기 120 (Pro)에서 123 (Pro)까지); 페널티메이트 스트란드 영역 (SEQ ID NO:85의 잔기 192 (Lys)에서 202 (Ala)까지); 트랜스멤브레인 도메인 (SEQ ID NO:85의 잔기 238 (Met)에서 254 (Leu)까지); "Box I" 신호화 부위 (SEQ ID NO:85의 잔기 266 (Ile)에서 273 (Pro)까지), 및 "Box II" 신호화 부위 (SEQ ID NO:2의 잔기 266 (Ile)에서 304 (Val)까지)를 함유하는 완전한 세포내 신호화 도메인 (SEQ ID NO:85의 잔기 255 (Lys)에서 529 (Ser)까지)을 포함한다. 사람과 마우스의 아미노산 서열의 비교는 사람 및 오르토로그성 폴리펩티드 둘 다 상술된 상응하는 구조적 특징을 함유하고 있음을 나타낸다 (도 2 참조). 마우스의 zalpha11에 대한 성숙한 서열은 Cys₂₀에서 시작되며 (SEQ ID NO:85에 도시된 바대로), 이것은 사람 서열의 Cys₂₀에 상응한다 (SEQ ID NO:2에 도시된 바와 같다). SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:85 에 상응하는 전체 아미노산 서열에 대해서는 마우스와 사람 서열 사이에 약 63 %의 동일성이 있다. SEQ ID NO:2의 잔기 20 (Cys)에서 237 (His) 및 SEQ ID NO:85의 잔기 20 (Cys)에서 237 (His)에 상응하는 세포외 사이토킨 결합 도메인에 대해서는 마우스와 사람 zalpha11 서열 사이에 약 69 %의 동일성이 있다. SEQ ID NO:2의 잔기 256 (Lys)에서 538 (Ser), 및 SEQ ID NO:85의 잔기 255 (Lys)에서 529 (Ser)에 상응하는 세포내 신호화 도메인에 대해서는 마우스와 사람 zalpha11 서열 사이에 약 60 %의 동일성이 있다. 상기 % 동일성은 ktup=1, 갭 개방 페널티=12, 갭 확장 페널티=2, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62, 초기값으로서 설정된 다른 매개변수를 가지는 FASTA 프로그램을 사용하여 측정하였다. 상술된 마우스의 zalpha11 폴리펩티드 영역, 도메인, 모티프, 잔기 및 서열을 코드화하는 상응하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:84에 나타낸다.

당업자들은 SEQ ID NO:1에 개시된 서열이 사람 zalpha11의 단일한 대립형질을 나타내며, 대립성 변이 및 또는 다르게는 스플라이싱이 일어날 것으로 예상됨을 인지할 것이다. 이 서열의 대립성 변이체는 표준 과정에 따라 상이한 개체로부터 얻어지는 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다. SEQ ID NO:1에 나타낸 DNA 서열의 대립성 변이체는, 사일런트 돌연변이를 함유하는 것들 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 것들을 포함하여, SEQ ID NO:2의 대립성 변이체인 단백질과 같이 본 발명의 범주내에 있다. 또는 달리 스플라이스된 mRNA 로부터 생성되고, zalpha11 폴리펩티드의 성질을 보유하고 있는 cDNA는 그러한 cDNA 및 mRNA에 의해 코드화된 폴리펩티드들이 그러한 것처럼 본 발명의 범주안에 포함된다. 이들 서열의 대립성 변이체 및 스플라이스 변이체들은 당업계에 공지되어 있는 표준 과정을 따라 상이한 개체 또는 조직으로부터 얻어지는 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브함으로써 클론될 수 있다.

본 발명은 또한 실질적으로 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드 및 그것들의 오르토로그에 유사한 단리된 zalpha11 폴리펩티드를 제공한다. 용어 "실질적으로 유사한"은 본원에서 SEQ ID NO:2에 도시된 서열 또는 그것들의 오르토로그에 대하여 최소한 70 %, 보다 바람직하게는 최소한 80 %의 서열 동일성을 가지고 있는 폴리펩티드를 표시하기 위하여 사용된다. 그러한 폴리펩티드는 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:2 또는 그것의 오르토로그에 대하여 최소한 90 %, 가장 바람직하게는 95 % 이상 동일할 것이다. % 서열 동일성은 종래의 방법에 의하여 측정된다 (예컨대 Altschul et al.,Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986; Henikoff and Henikoff,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992). 간단히 설명하면, 두 개의 아미노산 서열이 10의 갭 개방 페널티, 1 의 갭 확장 페널티, 및 표 3 에 나타낸 바와 같은 헨니코프와 헨니코프의 "블로섬 62" 스코어링 매트릭스를 사용하여 배열 스코어를 최적화기키기 위하여 배열된다 (아미노산은 표준 한-문자 코드로 표시된다). 그런 다음 % 동일성이 다음과 같이 계산된다:

폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성은 상술된 것과 같은 비율을 사용하여 유사한 방법에 의해 측정된다.

당업자들은 두 개의 아미노산 서열을 배열하기 위하여 활용될 수 있는 많은 알고리듬이 수립되어 있음을 인지할 것이다. 피어슨과 리프만의 "FASTA" 유사성 조사 알고리듬은 본원에 개시된 아미노산 서열 및 잠재적인 변이체 asig57의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성 수준을 조사하기에 적당한 단백질 배열 방법이다. FASTA 알고리듬은 피어슨과 리프만에 의해 설명되었다 (Pearson and Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), Pearson,Meth. Enzymol. 183:63 (1990)).

간단하게 설명하면, FASTA는 먼저 의문 서열과 보존적인 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 고려함이 없이 가장 높은 밀도의 동일성을 가지거나 (ktup 변수가 1 인 경우) 또는 동일성 쌍을 가진 (ktup=2) 시험 서열에 의해 공유된 영역을 확인함으로써 서열 유사성을 특징짓는다. 그런 다음 10 개의 가장 높은 밀도의 동일성을 가지는 영역이 모든 쌍을 이룬 아미노산의 유사성을 아미노산 치환 매트릭스를 사용하여 비교함으로써 기록되고, 영역의 끝은 단지 가장 높은 스코어에 기여하는 잔기들만을 포함하도록 "트리밍"된다. 만약 "컷오프" 값보다 더 큰 스코어를 가지는 영역이 여러개 있다면 (서열의 길이 및 ktup 값을 토대로 예정된 식에 의해 계산됨), 그 때에는 트리밍된 초기 영역이 조사되어 영역들이 갭을 가지는 대략적인 배열을 형성하기 위하여 결합될 수 있는 지의 여부가 측정된다. 마지막으로, 두 아미노산 서열중 가장 높은 스코어를 가지는 영역이, 아미노산 삽입 및 결실을 가능하게 하는 니들만-분쉬-셀러스 알고리듬을 변형 사용하여 배열된다 (Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers,SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)). FASTA 분석에 바람직한 매개변수는 다음과 같다: ktup=1, 갭 개방 페널티=10, 갭 확장 페널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62, 설정된 다른 매개변수는 초기값이다. 이들 매개변수는 FASTA 프로그램에 스코어링 매트릭스 파일 ("SMATRIX")을, 피어슨 문헌에서 설명된 바와 같이 변형시킴으로써 도입될 수 있다 (Appendix 2 of Pearson,Meth. Enzymol. 183:63 (1990)).

FASTA는 또한 상술된 바와 같은 비율을 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위해서는, ktup 값이 0에서 6 까지, 바람직하게는 3에서 6 까지 변할 수 있으며, 가장 바람직하게는 3이고, 다른 매개변수들은 초기값으로서 설정된다.

BLOSUM62 표 (표 3)는 관련된 단백질의 500 그룹 이상의 고도로 보존된 영역을 나타내는, 단백질 서열 절편의 약 2,000 개의 국소적인 다중 배열로부터 유도된 아미노산 치환 매트릭스이다 (Henikoff and Henikoff,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). 따라서, BLOSUM62 치환 빈도는 본 발명의 아미노산 서열에 도입될 수 있는 보존성 아미노산 치환을 규정하는 데 사용될 수 있다. 화학적 성질만을 토대로 하여 (하기에서 논의되는 바와 같이) 아미노산 치환을 디자인하는 것이 가능하긴 하지만, "보존성 아미노산 치환"이라는 용어는 바람직하게는 -1 이상의 BLOSUM62 값에 의해 표시되는 치환을 의미한다. 예를 들어, 만약 치환이 0, 1, 2, 또는 3 의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다면 그 아미노산 치환은 보존적이다. 이 시스템에 따라서, 바람직한 보존성 아미노산 치환은 최소한 1 의 BLOSUM62 값 (예컨대 1, 2, 또는 3)을 특징으로 하는 한편, 보다 바람직한 보존성 아미노산 치환은 최소한 2 (예컨대 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다.

변이체 zalpha11 폴리펩티드 또는 실질적으로 상동하는 zalpha11 폴리펩티드는 하나 또는 둘 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 바람직하게는 미미한 성질의 것, 즉 본존성 아미노산 치환 (표 4 참조) 및 폴리펩티드의 접힘 또는 활성에 유의할만한 영향을 주지 않는 다른 치환; 작은 결실, 전형적으로는 1 내지 약 30 아미노산의 결실; 및 작은 아미노- 또는 카르복시-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25 잔기의 작은 링커 펩티드, 또는 친화성 태그이다. 본 발명은 그러므로 SEQ ID NO:2의 상응하는 영역에 대하여 최소한 80 %, 바람직하게는 최소한 90 %, 보다 바람직하게는 95 % 이상 동일한 서열을 포함하는 약 489 내지 약 568 개의 아미노산 잔기로 된 폴리펩티드를 포함한다. 친화성 태그를 포함하는 폴리펩티드는 추가로 zalpha11 폴리펩티드와 친화성 태그 사이에 단백질 가수분해성 절단 부위를 포함할 수 있다. 적당한 부위로는 트롬빈 절단 부위 및 제 Xa 인자 절단 부위가 있다.

본 발명은 추가로 다양한 다른 폴리펩티드 융합 및 하나 또는 둘 이상의 폴리펩티드 융합을 포함하는 관련된 다량체 단백질을 제공한다. 예를 들어, zalpha11 폴리펩티드는 미국 특허 제 5,155,027 호 및 5,567,584 호에 개시되어 있는 바와 같이 이량체화하는 단백질에 대한 융합물로서 제조될 수 있다. 이런 견지에서 바람직한 이량체화 단백질은 면역글로불린 불변 영역 도메인을 포함한다.면역글로불린-zalpha11 폴리펩티드 융합물은 유전공학적으로 처리된 세포에서 다양한 다량체 zalpha11 유사체를 생성하도록 발현될 수 있다. 보조 도메인이 zalpha11 폴리펩티드를 특정 세포, 조직, 또는 거대분자 (예컨대 콜라겐)에 대하여 표적화하기 위하여 zalpha11 폴리펩티드에 융합될 수 있다. zalpha11 폴리펩티드는 둘 또는 그 이상의 부분, 예컨대 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합물은 또한 하나 또는 둘 이상의 절단 부위, 특히 도메인 사이에 있는 그런 부위들을 포함할 수 있다 (Tuan et al.,Connective Tissue Research 34:1-9, 1996).

본 발명의 단백질은 또한 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비-자연 발생적인 아미노산 잔기들로는 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-로이신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌이 있으며, 제한은 없다. 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 단백질안에 통합시키는 여러 가지 방법에 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 넌센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA를 사용하여 억제되는 시험관내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하는 방법 및 tRNA를 아미노아실화하는 방법은 당업계에 공지이다. 넌센스 돌연변이를 함유하고 있는 플라스미드의 전사 및 번역은 대장균 S30 추출물 및상업적으로 이용할 수 있는 효소 및 다른 시약을 포함하고 있는 세포-유리 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. (예컨대 Robertson et al.,J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al.,Methods enzymol. 202:301, 1991; Chung et al.,Science259:806-809, 1993; Chung et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-10149, 1993 참조). 두 번째 방법으로, 번역은 돌연변이된 mRNA 와 화학적으로 아미노아실화된 억제제 tRNA의 미소 주입에 의하여 제노푸스 난모세포에서 수행된다 (Turcatti et al.,J. Biol. Chem. 271:19991-19998, 1996). 세 번째 방법으로, 대장균 세포가 있어야 할 천연 아미노산 (예컨대 페닐알라닌) 없이 및 원하는 비-자연 발생적인 아미노산(들) (예컨대 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재하에 배양된다. 비-자연 발생적인 아미노산은 그것의 천연 대응물 대신에 단백질안에 통합된다 (Koide et al.,Biochem. 33:7470-7476, 1994). 자연 발생적인 아미노산 잔기들은 시험관내 화학적 변형에 의하여 비-자연 발생적인 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 치환의 범위를 추가로 확대시키기 위하여 부위-특정 돌연변이 생성과 조합될 수 있다 (Wynn and Richards,Protein Sci. 2:395-403, 1993).

제한된 수의 비-보존성 아미노산, 유전자 코드에 의하여 코드화되지 않은 아미노산들, 비-자연 발생적인 아미노산들, 및 비천연 아미노산들이 zalpha11 아미노산 잔기대신 치환될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 필수 아미노산들은 당업계에 공지되어 있는 과정, 예컨대 부위-특정 돌연변이생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 생성법을 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085, 1989; Bass et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-4502, 1991). 후자의 기법에서, 단일한 알라닌 돌연변이가 분자내의 매 잔기마다 도입되고, 그 결과의 돌연변이 분자는 하기에서 설명되는 바와 같이, 분자의 활성에 임계적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성 (예컨대 리간드 결합 및 신호 변환)에 대하여 시험된다 (Hilton et al.,J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996). 리간드-리셉터, 단백질-단백질 또는 다른 생물학적 상호작용의 부위들이 또한 구조의 물리적 분석에 의해, 예컨대 핵자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기법을 추정되는 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 사용함에 의해 측정되는 바와 같이 측정될 수 있다 (de Vos et al.,Science 255:306-312, 1992; Smith et al.,J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al.,FEBS Lett. 309:59-64, 1992). 필수 아미노산의 동일성은 또한 관련된 리셉터와의 상동성의 분석으로부터 추론될 수 있다.

구조적 통합성을 유지하는데 중요한 영역 또는 도메인안에 있는 아미노산 잔기들의 측정이 이루어질 수 있다. 이들 영역내에서 당업자는 변화를 다소간에 허용할 특이한 잔기들을 측정할 수 있고 분자의 전체적인 3차 구조를 유지할 수 있다. 서열 구조를 분석하는 방법으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 다중 서열을 높은 아미노산 또는 뉴클레오티드 동일성 및 활용가능한 소프트웨어 (예컨대 Insight II^??viewer 및 상동성 모델링 툴스; MSI, San Diego, CA)를 사용하는 컴퓨터 분석을 이용하여 배열하는 방법, 2차 구조 경향, 쌍성 (binary) 패턴, 상보성팩킹 및 숨겨져 있는 극성 상호작용이 있다 (Barton,Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995; Cordes et al.,Current Opin. Struct.Biol. 6:3-10, 1996). 일반적으로, 분자에 대한 변형을 디자인할 때 또는 특이한 단편을 확인할 때, 변형된 분자의 활성을 평가함에 의해 구조의 측정이 수반될 것이다.

아미노산 서열 변화는 생물학적 활성에 필수적인 보다 더 질서정연한 구조의 파괴를 최소화하기 위하여 zalpha11 폴리펩티드에서 이루어진다. 예를 들어, zalpha11 폴리펩티드가 하나 또는 둘 이상의 나선을 포함할 때, 아미노산 잔기의 변화는 형태의 변화가 일부의 중요한 기능, 예컨대 분자의 그것의 결합 파트너에 대한 결합을 완화시키는 분자의 다른 성분들 및 나선 기하학을 파괴하지 않도록 만들어질 것이다. 아미노산 서열 변화의 영향은 예를 들면 상술된 바와 같은 컴퓨터 모델링에 의해 예측될 수 있거나, 또는 결정 구조에 의해 측정될 수 있다 (Lapthorn et al.,Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995). 당업계에 잘 알려져 있는 다른 기법들은 표준 분자 (예컨대 천연 단백질)에 대한 변이체 단백질의 접힘을 비교한다. 예를 들어, 변이체와 표준 분자들의 시스테인 패턴의 비교가 이루어질 수 있다. 질량 분광측광법, 및 환원 및 알킬화를 사용하는 화학적 변형은 이황화 결합으로 결합되어 있거나 또는 그러한 결합이 없는 시스테인 잔기를 측정하는 방법을 제공한다 (Bean et al.,Anal. Biochem.201:216-226, 1992; Gray,Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; Patterson et al.,Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). 일반적으로 만약 변형된 분자가 표준 분자와 동일한 이황화 결합 패턴을 가지고 있지 않다면 접힘이 영향을 받았을 것으로 여겨진다. 다른 잘 알려져 있고 수용되고 있는 접힘 측정 방법은 원형 이색성 (CD)이다. 변형된 분자와 표준 분자에 의해 생성된 CD 스펙트럼을 측정하고 비교하는 것은 기본적인 일이다 (Johnson,Protein 7:205-214, 1990). 접힘 및 구조를 분석하기 위해 잘 알려져 있는 다른 방법은 결정학이다. 핵자기 공명 (NMR), 소화 펩티드 지도화 및 에피토프 지도화도 또한 단백질과 폴리펩티드 사이의 접힘 및 구조적 유사성을 분석하기 위한 공지된 방법들이다 (Schaanan et al.,Science 257:961-964, 1992).

SEQ ID NO:2에 도시된 바와 같은 zalpha11 단백질 서열의 Hopp/Woods 친수성 프로필은 만들어질 수 있다 (Hopp et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828, 1981; Hopp,J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986; Triquier et al.,Protein Engineering 11:153-169, 1998) (도 1 참조). 이 프로필은 미끄러지는 6-잔기 윈도우를 토대로 한다. 감추어져 있는 G, S, 및 T 잔기와 노출되어 있는 H, Y 및 W 잔기는 무시되었다. 예를 들어, zalpha11에서, 친수성 영역은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 55부터 60 까지, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 56부터 61 까지, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 139부터 144 까지, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 227부터 232 까지, 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 364부터 369 까지를 포함한다.

당업자들은 zalpha11 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형을 디자인할 때 전체적인 구조적 및 생물학적 프로필을 파괴하지 않기 위하여 친수성 또는 소수성이 고려될 것임을 인지할 것이다. 대체의 경우 특히 관심있는 것은 Val, Leu 및 Ile 로 이루어지는 군 또는 Met, Gly, Ser, Ala, Tyr 및 Trp로 이루어지는 군으로부터 선택되는 소수성 잔기이다. 예를 들어, 치환을 허용하는 잔기는 SEQ ID NO:2에 도시된 바와 같은 그러한 잔기들이다. 그러나, 시스테인 잔기는 상대적으로 치환되지 않을 수도 있다.

필수 아미노산의 동일성은 또한 제 I 부류 사이토킨 리셉터 패밀리 구성원과 zalpha11 사이의 서열 유사성의 분석으로부터 추론될 수 있다. 전술한 "FASTA" 분석법과 같은 방법을 사용하여 유사성이 높은 영역들이 단백질 패밀리내에서 확인되고 보존된 영역에 대한 아미노산 서열을 분석하기 위하여 사용된다. 구조를 토대로 하여 변이 zalpha11 폴리뉴클레오티드를 확인하기 위한 또 다른 접근법은 추정되는 변이 zalpha11 폴리뉴클레오티드를 코드화하는 핵산 분자가 상기에서 논의된 바와 같이, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 핵산 분자에 혼성화할 수 있는 지의 여부를 측정하는 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 필수 아미노산을 확인하는 다른 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 부위-특정 돌연변이 생성 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 생성이 있다 (Cunningham and Wells,Science 244:1081 (1989), Bass et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, "부위-특정 돌연변이 생성 및 단백질 공학", inProteins:Analysis and Design, Angeletti Ied.O, pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). 후자의 기법에서 단일한 알라닌 돌연변이가 분자내에 있는 매 잔기마다 도입되고, 그 결과의 돌연변이 분자들은 하기에서 논의되는 바와 같이, 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성에 대하여 시험된다 (Hilton et al.,J. Biol. Chem. 271:4699 (1996)).

본 발명은 또한 zalpha11 폴리펩티드의 기능성 단편 및 그러한 기능성 단편을 코드화하는 핵산 분자를 포함한다. 본원에서 규정된 "기능성" zalpha11 또는 그것의 단편은 그것의 증식 또는 분화 활성, 특수화된 세포 기능을 유도 또는 억제하는 능력, 또는 항-zalpha11 항체 또는 zalpha11 리간드 (가용성 또는 고정화된)에 대한 특이적인 결합 능력을 가지는 것을 특징으로 한다. 전술한 바와 같이, zalpha11는 제 I 부류의 사이토킨 리셉터 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 그러므로, 본 발명은 추가로 (a) 본원에서 설명되는 세포외 또는 세포내 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자; 및 (b) 이들 도메인의 하나 또는 둘 이상을 포함하는 기능성 단편들을 포함하고 있는 융합 단백질을 제공한다. 융합 단백질의 다른 폴리펩티드 부분은 제 I 부류의 다른 사이토킨 리셉터, 예를 들면 IL-2 리셉터 α-하위단위체 및 β-공통 리셉터 (즉, IL-3, IL-5, 및 GM-CSF 리셉터 β-하위단위체), 또는 융합 단백질의 분비를 용이하게 해주는 비-천연 및/또는 관련이 없는 분비 신호 펩티드에 의해 제공될 수 있다.

Zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 분자의 기능성 단편들을 얻기 위하여 핵산 분자에 대한 기본적인 결실 분석이 수행될 수 있다. 간단히 예를 들면, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 DNA 분자 또는 그것의 단편들은 일련의 차곡차곡 포개어진 결실을 얻기 위하여Bal31 뉴클레아제로 소화될 수 있다. 그런 다음 이들 DNA 단편들은 적절한 리딩 프레임으로 발현 벡터안에 삽입되고, 발현된 폴리펩티드들은 단리되어 zalpha11 활성에 대해서, 또는 항-zalpha11 항체 또는 zalpha11 리간드에 결합하는 능력에 대하여 시험된다. 또 다른 엑소뉴클레아제 소화 한 가지는 올리고뉴클레오티드-특정 돌연변이생성을 사용하여 원하는 zalpha11 단편의 생성을 구체화하기 위하여 결실 또는 중지 코돈을 도입하는 것이다. 또는 달리, zalpha11 폴리뉴클레오티드의 특정 단편이 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 합성될 수 있다.

기능성 도메인을 확인하기 위한 표준 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 인터페론의 양 단부 중 하나 또는 양 단부에 대한 연구가 문헌에 요약되어 있다 (Horisberger and Di Narco,Pharmac. Ther. 66:507 91995)). 더욱이, 단백질의 기능적 분석에 대한 표준 기법은 문헌에 설명되어 있다 (Treuter et al.,Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Content et al., "사람 인터페론에 의해 유도된 42 kDa 2-5A 합성효소의 발현 및 예비 결실 분석", inBiological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), pages 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," inControl of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al.,J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al.,J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al.,Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); Meisel et al.,Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)).

다중 아미노산 치환은 공지되어 있는 돌연변이 생성 및 스크리닝 방법, 예를 들면 라이트하르-올슨 및 사우어에 의해 또는 보위와 사우어에 의해 설명된 것과 같은 방법들에 의해 이루어지고 시험될 수 있다 (Reidhaar-Olson and Sauer,Science 241:53-57, 1988; Bowie and Sauer,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). 간단하게 설명하면, 이들 저자는 폴리펩티드안의 둘 또는 그 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능성 폴리펩티드를 선택한 후, 각각의 위치에서 허용될 수 있는 치환의 스펙트럼을 결정하기 위하여 돌연변이된 폴리펩티드를 서열화하는 방법을 개시하였다. 사용될 수 있는 다른 방법으로는 파지 디스플레이 (Lowman et al.,Biochem. 30:10832-10837, 1991; Ladner et al., 미국 특허 제 5,223,409 호; Huse, WIPO 공보 WO 92/062045), 및 영역-특정 돌연변이 생성 (Derbyshire et al.,Gene 46:1986; Ner et al.,DNA 7:127, 1988)이 있다.

개시된 zalpha11 DNA와 폴리펩티드 서열의 변이체들은 문헌에 개시된 바와 같이 DNA 셔플링을 통하여 생성될 수 있다 (Stemmer,Nature 370:389-391, 1994; Stemmer,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994; WIPO 공보 WO 97/20078). 간단히 설명하면, 변이 DNA는 모 DNA의 무작위 단편화와 이어지는 PCR을 사용한 어젬블리에 의하여 동종 재조합되고, 그 결과 무작위로 도입된 점 돌연변이가 일어남으로써 생성될 수 있다. 이 기법은 과정에 추가의 가변성을 도입시키기 위하여 모 DNA의 패밀리, 예를 들면 대립성 변이체 또는 다른 종으로부터의 DNA를 사용함으로써 변형될 수 있다. 원하는 활성에 대한 선택 또는 스크리닝과, 이어지는 돌연변이 생성 및 분석의 추가의 반복은, 바람직한 돌연변이를 선택하는 한편 동시에 불리한 변화에 대하여 선택함으로써 서열의 신속한 "진화"를 제공한다.

본원에서 개시되는 것과 같은 돌연변이 생성법은 고-출력의 자동화된 스크리닝 방법과 조합되어 숙주 세포에서의 클론되고 돌연변이된 zalpha11 리셉터 폴리펩티드의 활성을 검출할 수 있다. 이런 견지에서 바람직한 분석법으로는 세포 증식분석법 및 바이오센서-기초 리간드-결합 분석법이 있으며, 이것들에 대해서는 하기에서 설명된다. 활성 리셉터 또는 그것의 부분들 (예컨대 리간드-결합 단편, 신호화 도메인 등)을 코드화하는 돌연변이된 DNA 분자들은 현대적인 장비를 사용하여 숙주 세포로부터 회수되어 신속하게 서열화될 수 있다. 이들 방법은 관심의 폴리펩티드의 개별적인 아미노산 잔기의 중요성에 대한 신속한 측정을 가능하게 하며, 미지의 구조를 가지는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 (또는 그것의 폴리펩티드 단편)은 다른 생체활성 분자, 특히 다른 사이토킨과 결합하여 다중-기능성 분자를 제공할 수 있다. 예를 들면, zalpha11로부터의 하나 또는 둘 이상의 나선이 그것들의 생물학적 성질 또는 생성 효율을 증강시키기 위하여 다른 사이토킨과 결합될 수 있다.

본 발명은 그러므로 zalpha11의 하나 또는 둘 이상의 나선을 포함하고 있는 절편이 다른 폴리펩티드에 융합되어 있는 일련의 신규한 혼성 분자를 제공한다. 융합은 바람직하게는 DNA 수준에서 재조합 제조 시스템에서의 키메릭 분자의 발현을 가능하게 하는 스플라이싱에 의해 이루어진다. 다음 단계로 그 결과 생성된 분자는 개선된 용해도, 개선된 안정성, 연장된 제거 반감기, 개선된 발현 및 분비 수준, 및 약력학과 같은 성질에 대해 분석된다. 그러한 혼성 분자는 추가로 성분 단백질들 또는 폴리펩티드들 사이에 추가의 아미노산 잔기 (예컨대 폴리펩티드 링커)를 포함할 수 있다.

본원에서 논의되는 방법들을 사용하여, 당업자는 신호 변환 또는 리간드 결합 활성을 보유하는 SEQ ID NO:2의 다양한 폴리펩티드 단편 또는 변이체들을 확인및/또는 제조할 수 있다. 예를 들면, 당업자는 실질적으로 사이토킨-결합 도메인 (SEQ ID NO:2의 잔기 20 (Cys)에서 237 (His)까지 또는 그것의 대립성 변이체 또는 종 오르토로그)에 상동하며, 야생형 zalpha11 단백질의 리간드-결합 활성을 보유하고 있는 다양한 폴리펩티드를 제조함으로써 zalpha11 "가용성 리셉터"를 제조할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 예컨대 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인의 일부 또는 전부로부터 얻어지는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 또한 표지, 친화성 태그, 등과 같은 본원에서 보편적으로 개시되는 추가의 폴리펩티드 절편들을 포함할 수 있다.

변이체, 가용성 리셉터, 및 융합 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하여 어떠한 zalpha11 폴리펩티드에 대해서든지, 당업자는 상기 표 1 및 표 2에 나타낸 정보를 사용하여 그 변이체를 코드화하는 완전히 축퇴성인 폴리뉴클레오티드 서열을 쉽게 생성할 수 있다.

본 발명의 zalpha11 폴리펩티드는 전-길이의 폴리펩티드, 생물학적으로 활성인 단편, 및 융합 폴리펩티드를 포함하여, 종래의 기법에 따라 유전공학적으로 제조된 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질전환될 수 있고 배양중에 성장할 수 있는 그러한 세포 유형으로, 박테리아, 진균 세포, 및 배양된 고등 진핵 세포가 포함된다. 진핵 세포, 특히 다핵 유기체의 배양 세포가 바람직하다. 클론된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA를 다양한 숙주 세포안에 도입시키는 방법들은 문헌에 개시되어 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, 1989; Ausubel et al., eds.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987).

일반적으로, zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열은 발현 벡터내에서 그것의 발현을 위해 필요한 다른 유전적 요소, 일반적으로는 전사 프로모터 및 터미네이터에 작동가능하게 연결된다. 비록 당업자가 특정 시스템내에서 선택가능한 마아커가 별도의 벡터상에 제공되고, 외인성 DNA의 복제가 숙주 세포 게놈안으로의 통합에 의하여 제공될 수 있음을 인지하게 되더라도, 벡터는 또한 통상적으로 하나 또는 둘 이상의 선택가능한 마아커 및 하나 또는 둘 이상의 복제 기원을 함유할 것이다. 프로모터, 터미네이터, 선택가능한 마아커, 벡터 및 다른 요소들의 선택은 당업자의 기술 수준내에 있는 기본적인 디자인의 문제이다. 그러한 많은 요소들이 문헌에 설명되어 있으며, 상업적인 공급체들로부터 이용가능하다.

숙주 세포의 분비 경로안에 zalpha11 폴리펩티드를 지정하기 위해서, 분비 신호 서열 (또는 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열로도 공지됨)이 발현 벡터안에 제공된다. 분비 신호 서열은 zalpha11의 것일 수도 있고, 또는 다른 분비된 단백질 (예컨대 t-PA)로부터 유도될 수도 있고 또는 새롭게 합성될 수도 있다. 분비 신호 서열은 zalpha11 DNA 서열에 작동가능하게 연결된다. 즉 두 서열은 정확한 리딩 프레임으로 결합되어 숙주 세포의 분비 경로 안으로 새롭게 합성된 폴리펩티드를 지정하도록 자리를 잡는다. 분비 신호 서열은 통상적으로 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열의 5'쪽에 위치하지만, 어떤 분비 신호 서열은 관심의 DNA 서열의 그 밖의 어느 곳에든지 위치할 수 있다 (Welch et al., 미국 특허 제5,037,743 호; Holland et al., 미국 특허 제 5,143,830 호).

또는 달리, 본 발명의 폴리펩티드에 함유된 분비 신호 서열은 분비 경로안에 다른 폴리펩티드를 지정하기 위하여 사용된다. 본 발명은 그러한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 신호 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 1 (Met)로부터 아미노산 19 (Gly)에서 유도된 분비 신호 서열이 당업계에 공지되고 본원에 개시된 방법들을 사용하여 다른 폴리펩티드에 작동가능하게 연결되도록 만들어질 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드에 함유된 분비 신호 서열은 바람직하게는 아미노-말단쪽으로 추가의 펩티드에 융합되어 추가의 펩티드를 분비 경로안에 지정한다. 그러한 구성물은 당업계에 공지된 많은 적용 분야를 갖는다. 예를 들어, 이들 새로운 분비 신호 서열 융합 구성물은 정상적으로 분비되지 않는 단백질의 활성 성분의 분비를 지정할 수 있다. 그러한 융합물은 분비 경로를 통하여 펩티드를 지정하기 위하여 생체내에서 또는 생체외에서 사용될 수 있다.

배양된 포유류 세포가 본 발명내에서 적당한 숙주이다. 외인성 DNA를 포유류 숙주 세포안에 도입시키기 위한 방법으로는 인산 칼슘-중재된 형질전환 (Wigler et al.,Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson,Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb,Virology 52:456, 1973), 전기천공(Neumann et al.,EMBO J. 1:841-845, 1982), DEAE-덱스트란 중재 형질전환 (Ausubel et al., 상기 동일), 및 리포솜-중재 형질전환 (Hawley-Nelson et al.,Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al.,Focus 15:80, 1993), 및 바이러스 벡터 (Miller and Rosman,BioTechniques 7:980-990, 1989; Wang and Finer,Nature Med. 2:714-716, 1996)가있다. 배양된 포유류 세포에서의 재조합 폴리펩티드의 생성은 문헌에 개시되어 있다 (Levinson et al., 미국 특허 제 4,713,339 호; Hagen et al., 미국 특허 제 4,784,950 호; Palmiter et al., 미국 특허 제 4,579,821 호; 및 Ringold, 미국 특허 제 4,656,134 호). 적당한 배양 포유류 세포로는 COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al.,J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) 및 차이니즈 햄스터 난소 (예컨대 CHO-K1; ATCC No. CCL 61) 셀라인이 있다. 추가의 적당한 셀라인이 당업계에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (Rockville, Maryland)과 같은 공공 기탁기관으로부터 이용가능하다. 일반적으로, 강한 전사 프로모터, 예컨대 SV-40 또는 사이토메갈로바이러스로부터 유도된 프로모터들이 바람직하다 (미국 특허 제 4,956,288 호). 다른 적당한 프로모터로는 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 것들 (미국 특허 제 4,579,821 호 및 4,601,978 호)과 아데노바이러스 주요 후기 프로모터가 있다.

약물 선택은 일반적으로 외래 DNA가 삽입된 배양 포유류 세포를 선택하기 위하여 사용된다. 그러한 세포는 통상적으로 "형질전환체"로 언급된다. 선택제제의 존재하에 배양되고 유전자가 그것들의 자손으로 계대될 수 있는 세포들은 "안정한 형질전환체"로 언급된다. 바람직한 선택가능한 마아커는 항생물질 네오마이신에 대한 내성을 코드화하는 유전자이다. 선택은 네오마이신-유사 약물, 예컨대 G-418 등의 존재하에 수행된다. 선택 시스템은 또한 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위하여 사용될 수 있으며, 그 과정을 "증폭"으로 언급한다. 증폭은 형질전환체를 낮은 수준의 선택 제제의 존재하에 배양한 후, 도입된 유전자의 생성물을 높은 수준으로 생성하는 세포들에 대하여 선택하기 위하여 선택 제제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 바람직한 증폭성 선택가능한 마아커는 디하이드로폴레이트 환원효소이며, 이것은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 다른 약물 내성 유전자 (예컨대 하이그로마이신 내성, 다중-약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제)도 사용될 수 있다. 변경된 표현형을 도입시키는 또 다른 마아커, 예컨대 녹색 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질, 예컨대 CD4, CD8, 제 I 부류 MHC, 태반 알칼리성 포스파타제가 FACS 분류법 또는 자기 비드 분리 기법과 같은 수단에 의해 형질전환되지 않은 세포로부터 형질전환된 세포를 분류하기 위하여 사용될 수 있다.

식물 세포, 곤충 세포 및 조류 세포를 포함하여 다른 고등 진핵 세포들이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포에서의 유전자 발현을 위한 벡터로서 아그로박테리움 리조게네스를 사용하는 것에 대해서는 문헌에서 검토된 바 있다 (Sinker et al.,J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987). 곤충 세포의 형질전환 및 그 안에서의 외래 폴리펩티드의 생성에 대해서도 문헌에 개시되어 있다 (Guarino et al., 미국 특허 제 5,162,222 호 및 WIPO 공보 WO 94/06463). 곤충 세포는 오토그라파 캘리포니카 뉴클레어폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)로부터 통상적으로 유도된 재조합 배큘로바이러스로 감염될 수 있다 (King, L.A. and Possee, R.D.,The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al.,Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; Richardson, C.D., Ed.,Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995). 재조합 zalpha11 배큘로바이러스를 만드는 두 번째 방법은 루코프에 의해 설명된 트랜스포존-기초 시스템을 활용한다 (Luckow, V.A. et al.,J. Virol. 67:4566-4579, 1993). 수송 벡터를 사용하는 이 시스템은 Bac-to-Bac^TM키트로 시판된다 (Life Technologies, Rockville, MD). 이 시스템은 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 "백미드"로 불리는 큰 플라스미드로서 대장균안에 유지되는 배큘로바이러스 게놈안에 이동시키기 위하여 Tn7 트랜스포존을 함유하고 있는 수송 벡터, pFastBacl^TM(Life Technologies)을 활용한다 (Hill-Perkins, M.S. and Possee, R.D.,J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning, B.C. et al.,J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; Chazenbalk, G.D. and Rapoport, B.,J Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995). 또한, 수송 벡터는 발현된 zalpha11 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에 있는 에피토프 태그, 예를 들면 Glu-Glu 에피토프 태그 (Grussenmeyer, T. et al,.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-7954, 1985)를 코드화하는 DNA와의 프레임-내 융합물을 포함할 수 있다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 기법을 사용하여, zalpha11을 함유하고 있는 수송 벡터는 대장균에 형질전환되고, 재조합 배큘로바이러스를 나타내는 차단된 lacZ 유전자를 함유하고 있는 백미드에 대해 스크리닝된다. 재조합 배큘로바이러스 게놈을 함유하고 있는 백미드 DNA는 통상적인 기법을 사용하여 단리되고, 스포돕테라 프루기페르다 세포, 예컨대 Sf9 세포를 형질전환시키기 위하여 사용된다. zalpha11을 발현하는 재조합 바이러스는 계속해서 제조된다. 재조합 바이러스 스톡은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법들에 의하여 만들어진다.

재조합 바이러스는 숙주 세포, 전형적으로 가을 유충, 스포돕테라 프루기페르다로부터 유도된 셀라인을 감염시키기 위하여 사용된다 (Glick and Pasternak,Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994). 다른 적당한 셀라인은 트리코플루시아 니 (Trichoplucia ni)로부터 유도된 High FiveO^TM셀라인 (Invitrogen)이다 (미국 특허 제 5,300,435 호). 상업적으로 활용가능한 혈청-유리 배지가 세포를 성장시키고 유지시키기 위하여 사용된다. 적당한 배지는 Sf9 세포에 대해서는 Sf900II^TM(Life Technologies) 또는 ESF 921^TM(발현 시스템);T.ni세포에 대해서는 Ex-cellO405^TM(JRH Bioscience, Lenexa, KS) 또는 Express FiveO^TM(Life Technologies)이다. 사용된 과정은 일반적으로 이용가능한 실험실 매뉴얼에 기재되어 있다 (King, L.A. and Possee, R.D., 상기 동일; O'Reilly, D.R., 상기 동일; Richardson, C.D., 상기 동일). 상층액으로부터 얻어지는 zalpha11 폴리펩티드의 후속되는 정제는 본원에서 설명되는 방법들을 사용하여 이루어질 수 있다.

효모 세포를 포함하여, 진균 세포들이 또한 본 발명내에서 사용될 수 있다. 본원의 견지에서 특히 관심이 있는 효모 종은 사카로마이세스 세레비시아에, 피치아 파스토리스, 및 피치아 메타놀리카이다. 사카로마이세스 세레비시아에 세포를외래 DNA로 형질전환하고, 그것으로부터 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법들은 문헌에 개시되어 있다 (Kawasaki, 미국 특허 제 4,599,311 호; Kawasaki et al., 미국 특허 제 4,931,373 호; Brake, 미국 특허 제 4,870,008 호; Welch et al., 미국 특허 제 5,037,743 호; Murray et al., 미국 특허 제 4,845,075 호). 형질전환된 세포들은 선택가능한 마아커, 통상적으로는 약물 내성 또는 특정 영양분 (예컨대 로이신)이 없을 때 성장하는 능력에 의해 결정된 표현형에 의하여 선택된다. 사카로마이세스 세레비시아에에서 사용하기에 바람직한 벡터 시스템은 형질전환된 세포들이 글루코오스-함유 배지에서의 성장에 의해 선택되는 것을 가능하게 하는, 가와사키 등에 의해 개시된 (미국 특허 제 4,931, 373 호)POT1벡터 시스템이다. 효모에서 사용하기에 적당한 프로모터 및 터미네이터로는 당분해 효소 유전자로부터 유도된 것들 (Kawasaki, 미국 특허 제 4,599,311 호; Kingsman et al., 미국 특허 제 4,615,974 호; Bitter, 미국 특허 제 4,977,092 호) 및 알코올 데히드로게나제 유전자로부터 유도된 것들이 있다 (미국 특허 제 4,990,446 호; 5,063,154 호; 5,139,936 호 및 4,661,454 호 참조). 다른 효모, 예컨대Hansenula polymorpha,Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis,Kluyveromyces fragilis,Ustilago maydis,Pichia pastoris,Pichia methanolica,Pichia guillermondii및Candida maltosa를 위한 형질전환 시스템들이 당업계에 알려져 있다 (Gleeson et al.,J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 및 Cregg, 미국 특허 제 4,882,279 호) 아스페르길루스 세포들은 맥나이트 등의 방법에 따라 사용될 수 있다 (McKnight et al., 미국 특허 제 4,935,349 호).Acremonium chrysogenum을 형질전환시키는 방법은 스미노 등의 미국 특허 제 5,162,228 호 (Sumino et al.)에 설명되어 있다.Neurospora를 형질전환시키는 방법은 람보비츠의 미국 특허 제 4,486,533 호 (Lambowitz)에 개시되어 있다.

재조합 단백질의 제조를 위한 숙주로서의 피치아 메타놀리카의 사용은 WIPO 공보 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/01536 및 WO 98/02565에 개시되어 있다. 피치아 메타놀리카를 형질전환하는데 사용하기 위한 DNA 분자는 통상적으로 이중-가닥의 원형 플라스미드로서 제조될 것이고, 바람직하게는 형질전환전에 선형화될 것이다. 피치아 메타놀리카에서의 폴리펩티드 제조를 위해서는, 플라스미드의 프로모터 및 터미네이터가 피치아 메타놀리카 유전자의 프로모터 및 터미네이터, 예컨대 피치아 메타놀리카 알코올 활용 유전자 (AUG1또는AUG2)의 프로모터 및 터미네이터인 것이 바람직하다. 다른 유용한 프로모터로는 디히드록시아세톤 합성효소 유전자의 프로모터 (DHAS), 포름산염 데히드로게나제 유전자의 프로모터(FMD), 및 카탈라제 유전자의 프로모터 (CAT)가 있다. 숙주 염색체안으로의 DNA의 통합을 촉진하기 위해서는, 숙주 DNA 서열의 양 단부 옆에 플라스미드의 전체 발현 절편이 있는 것이 바람직하다. 피치아 메타놀리카에서 사용하기에 바람직한 선택가능한 마아커는 피치아 메타놀리카 ADE2 유전자로, 이것은 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제 (AIRC; EC 4.1.1.21)를 코드화하며,ade2숙주 세포가 아데닌 없이 성장하는 것을 가능하게 한다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모의 산업적 과정을 위해서는, 두가지 메탄올 활용 유전자 (AUG1및AUG2)가 결실되어 있는 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 분비된 단백질의 제조를 위해서는,공포의 (vacuolar) 프로테아제 유전자 (PEP4및PRB1)가 없는 숙주 세포가 바람직하다. 피치아 메타놀리카 세포안에 관심의 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 함유하고 있는 플라스미드를 도입하는 것을 용이하게 하기 위하여 전기천공이 사용된다. 피치아 메타놀리카 세포를 2.5에서 4.5 kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm의 자기장 세기와, 1 내지 40 밀리초, 가장 바람직하게는 약 20 밀리초의 시간 상수 (t)를 가지는, 지수적으로 감쇠하는 맥동 전기장을 사용하여 전기천공에 의해 형질전환하는 것이 바람직하다.

박테리아 대장균, 바실루스 및 다른 속의 스트레인들을 포함하여 원핵 숙주 세포들이 또한 본 발명내에서 유용한 숙주 세포들이다. 이들 숙주를 형질전환시키고 그 안에 클론된 외래 DNA 서열을 발현시키는 기법들은 당해 기술분야에 공지이다 (Sambrook et al., 상기 동일). 대장균과 같은 박테리아에서 zalpha11 폴리펩티드가 발현될 때, 폴리펩티드는 원형질에, 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유되거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의해 말초 공간을 향해 지정될 수도 있다. 전자의 경우에, 세포는 용해되고, 과립이 회수되어, 예를 들면 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 변성된다. 변성된 폴리펩티드는 그런 다음 다시 접혀지고, 예컨대 우레아 용액 및 환원되고 산화된 글루타티온의 조합에 대한 투석과, 계속해서 완충 식염 용액에 대한 투석에 의해서와 같은, 변성제의 희석에 의하여 이량체화된다. 후자의 경우에는, 폴리펩티드는 말초 공간의 내용물을 방출시키기 위하여 세포를 파괴하고 (예컨대 초음파처리 또는 삼투 쇼크에 의해), 단백질을 회수함으로써 가용성이고 기능적인 형태로 말초 공간으로부터 회수될 수 있고, 그로써 변성 및 재접힘에 대한 요구가 제거된다.

형질전환된 세포들은 종래 과정에 따라 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양분 및 다른 성분들을 함유하고 있는 배양 배지에서 배양된다. 규정된 배지 및 복합 배지를 포함한 다양한 적당한 배지가 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 탄소 공급원, 질소 공급원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함항다. 배지는 또한 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분들을 필요에 따라 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 외래적으로 첨가된 DNA를 함유하고 있는 세포를, 예를 들면 약물 선택 또는 발현 벡터상에 운반된 또는 숙주 세포안에 함께 형질전환된 선택가능함 마아커에 의해 상쇄되는 필수 영양분의 결핍에 의해 선택한다. 피치아 메타놀리카 세포는 적당한 탄소, 질소 공급원 및 미량의 영양분을 포함하고 있는 배지에서 약 25 ℃ 내지 35 ℃의 온도에서 배양된다. 액체 배양액에는 종래 수단, 예컨대 작은 플라스크의 진동 또는 발효기의 스파아징에 의해 충분한 공기가 통풍된다. 피치아 메타놀리카에 대한 바람직한 배양 배지는 YEPD (2 %의 D-글루코오스, 2 %의 Bacto^TM펩톤 (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1 %의 Bacto^TM효모 추출물 (Difco Laboratories), 0.004 %의 아데닌 및 0.006 %의 L-로이신)이다.

본 발명의 한 측면으로, zalpha11 사이토킨 리셉터 (트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 포함하여)는 배양된 세포에 의해 생성되고, 세포는 천연 리간드, 및 천연 리간드의 길항체 및 아고니스트를 포함하여 리셉터에 대한 리간드를 스크린하기 위해 사용된다. 이 접근법을 요약하면, cDNA 또는 리셉터를 코드화하는 유전자는 그것의 발현에 필요한 다른 유전자 요소들 (예컨대 전사 프로모터)과 조합되고, 그 결과의 발현 벡터는 숙주 세포안에 삽입된다. DNA를 발현하고 기능성 리셉터를 생성하는 세포들이 선택되고 다양한 스크리닝 시스템안에서 사용된다.

본 발명의 신규한 리셉터를 발현하고 리셉터-중재된 신호를 변환시키는데 사용하기에 적당한 포유류 세포로는 β-하위단위체, 예컨대 gp130을 발현하는 세포, 및 gp130과 LIF 리셉터를 함께 발현하는 세포들이 있다 (Gearing et al., EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing et al., 미국 특허 제 5,284,755 호). 이런 관점에서 동일한 하위패밀리에 속하는 리셉터에 결합하는 다른 사이토킨들, 예컨대 IL-6 또는 LIF에 반응하는 세포를 사용하는 것이 대체로 바람직한데, 왜냐하면 그러한 세포들이 필요한 신호 변환 경로(들)을 함유하고 있을 것이기 때문이다. 이런 유형의 바람직한 세포로는 사람 TF-1 셀라인 (ATCC No. CRL-2003) 및 DA-1 셀라인 (Branch et al.,Blood 69:1782, 1987; Broudy et al.,Blood 75:1622-1626, 1990)이 있다. 또는 달리, 적당한 숙주 세포는 원하는 세포 반응에 필요한 β-하위단위체 또는 다른 세포 성분을 제조하기 위하여 공학적으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 쥐과의 셀라인인 BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986), 어린 햄스터 신장 (BHK) 셀라인, 또는 CTLL-2 셀라인 (ATCC TIB-214)이 zalpha11외에 마우스 gp130 하위단위체, 또는 마우스 gp130 및 LIF 리셉터를 발현하기 위하여 형질전환될 수 있다. 동일 종으로부터 얻어지는 숙주 세포 및 리셉터(들)을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하긴 하지만, 이 접근법은 공학적으로 처리될 셀라인이 어떠한 종으로부터 얻어지는 다중 리셉터 하위단위체를 발현하고, 그로써 종 특이성으로부터 발생하는 잠재적인 한계점들을 극복하는 것을 가능하게 한다. 또는 다르게는, 사람 리셉터 cDNA의 종 상동체가 클론되어 동일 종으로부터 얻어지는 셀라인내에서, 예컨대 BaF3 셀라인에서 마우스 cDNA와 같이, 사용될 수 있다. 따라서 하나의 조혈 성장 인자, 예컨대 IL-3에 좌우되는 셀라인이 공학적으로 처리되어 zalpha11 리간드에 따라 좌우되게 된다.

기능적인 zalpha11를 발현하는 세포들이 스크리닝 분석법에서 사용된다. 다양한 적당한 분석법들이 당해 기술분야에 알려져 있다. 이들 분석법은 표적 세포에서의 생물학적 반응의 검출을 토대로 한다. 그러한 한가지 분석법은 세포 증식 분석법이다. 세포는 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 배양되고, 세포 증식은, 예컨대 3중 수소로 처리된 티미딘의 통합을 측정함에 의해, 또는 Alymar BlueTM (AccuMed, Chicago, IL) 또는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드 (MTT)의 대사 브레이크다운을 토대로 한 비색 분석법에 의해 검출된다 (Mosman,J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). 다른 분석법 포맷은 리포터 유전자를 발현하기 위하여 추가로 공학 처리되는 세포들을 사용한다. 리포터 유전자는 리셉터-결합된 경로에 반응하는 프로모터 요소에 결합되며, 그러면 분석법으로 리포터 유전자의 전사의 활성화가 검출된다. 이 관점에서 바람직한 프로모터 요소는 혈청 반응 요소, 또는 SRE이다 (Shaw et al.,Cell 56:563-572, 1989). 바람직한 그런 리포터 유전자는 루시페라제 유전자이다 (de Wet et al.,Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987). 루시페라제 유전자의 발현은 당업계에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 발광에 의해 검출된다 (Baumgartner et al.,J. Biol. Chem. 269:19094-29101, 1994; Schenborn and Goiffin,Promega Notes 41:11, 1993). 루시페라제 분석 키트는 상업적으로 활용가능하며, 예컨대 Promega Corp. (Madison, WI)로부터 구입할 수 있다. 이런 유형의 표적 셀라인은 호학약품의 라이브러리, 세포-조절 배양 배지, 진균 육즙, 토양 샘플, 물 샘플, 등을 스크린하기 위하여 사용된다. 예를 들면, 세포- 또는 조직-조절 배지 샘플은 리간드를 생성하는 세포들을 확인하기 위하여 표적 세포상에서 분석될 수 있다. 그런 다음 양성의 세포들이 포유류 세포 발현 벡터에서 cDNA를 생성하기 위하여 사용되고, 그것은 풀(pool)로 나누어지고, 숙주 세포로 형질전환된 후 발현된다. 그런 다음 형질전환된 세포로부터 배지 샘플이 분석되고, 계속해서 풀로 나누어지며, 다시 형질전환되고, 다시 배양되고, 리간드를 발현하는 클론 셀라인을 단리하기 위하여 양성 세포들이 다시 분석된다. 신장, 간, 비장, 흉선, 다른 림프 조직, 또는 T-세포에 의해 조건화된 배지 샘플들이 스크리닝 과정에 사용하기에 바람직한 리간드 공급원이다.

Zalpha11에 대한 천연 리간드는 또한 zalpha11을 발현하는 사이토킨-의존성 셀라인을 돌연변이시키고, 그것을 오토크린 성장을 선택하는 조건하에서 배양함으로써 확인될 수 있다 (WIPO 공보 WO 95/21930 참조). 전형적인 과정에서, zalpha11을 발현하는 세포들이 예컨대 EMS로 돌연변이된다. 그런 다음 세포는 필요한 사이토킨의 존재하에 회수된 다음, 사이토킨이 없는 배지에 형질전환된다. 살아남은 세포는 zalpha11에 대한 리간드의 생성에 대하여, 예컨대 배양 배지에 가용성 (리간드-결합) 리셉터 폴리펩티드를 첨가함에 의해 또는 야생형 세포 및 zalpha11를 발현하는 형질전환된 세포에 대하여 컨디셔닝 배지를 분석함에 의해 스크린된다. 이 방법에 사용하기에 바람직한 셀라인은 gp130 또는 LIF 리셉터와 결합된 gp130을 발현하도록 형질전환된 세포들이다. 바람직한 그러한 숙주 셀라인은 형질전환된 CTLL-2 세포 (Gillis and Smith,Nature 268:154-156, 1977) 및 형질전환된 BaF3 세포이다.

더욱이, zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드를 사용하는 분비 트랩 방법은 zalpha11 리간드를 단리하기 위해 사용될 수 있다 (Aldrich, et al., Cell 87:1161-1169, 1996). 공지의 또는 추정되는 리간드 공급원으로부터 제조된 cDNA 발현 라이브러리는 COS-7 세포안에 형질전환된다. cDNA 라이브러리 벡터는 일반적으로 COS-7 세포에서의 증폭을 위해 SV40 기원을 가지며, 높은 수준의 발현을 위해서 CMV 프로모터를 가진다. 형질전환된 COS-7 세포는 단층에서 성장된 후 고정되고 투과된다. 그런 다음 본원에서 설명된, 태그가 달렸거나 바이오틴-표지된 zalpha11 가용성 리셉터가 세포 층과 접촉하게 되고, 항-상보 분자, 즉 zalpha11 리간드를 발현하는 단층에 있는 세포와 결합하게 된다. 그로써 리간드를 발현하는 세포는 리셉터 분자와 결합하게 된다. 양고추냉이 과산화효소 (HRP)와 콘쥬게이트되는 항-태그 항체 (Ig 융합에 대해서는 항-Ig, M2 또는 FLAG-태그달린 융합, 스트렙트아비딘, 등에 대해서는 항-FLAG)가 태그달린 또는 바이오틴-표지된 zalpha11 가용성 리셉터가 결합된 이들 세포를 가시화하기 위하여 사용된다. HRP는 티라미드 시약, 예컨대 티라미드-FITC의 침착을 촉매한다. 이 검출을 위하여 상업적으로 이용가능한키트가 사용될 수 있다 (예를 들면, Renaissance TSA-Direct^TM키트; NEN Life Science Products, Boston, MA). zalpha11 리셉터 리간드를 발현하는 세포는 형광 현미경하에서 녹색 세포로서 확인될 것이고, 리간드의 계속되는 클로닝을 위해 문헌 (Aldrich, et al., 상기 동일)에서 개략적으로 설명된 바와 같은 플라스미드 해방을 위한 과정을 사용하여 선택되며, 이어서 단일한 클론이 확인될 때까지 분비 트랩 분석이 여러번 수행된다.

리셉터로서, zalpha11 폴리펩티드의 활성은 세포외 산성화 비율 또는 리셉터 결합과 관련된 양자 배출 및 이어지는 생리학적 세포 반응을 측정하는 실리콘-기초 바이오센서 마이크로피지오미터에 의해 측정될 수 있다. 예시적인 한 장치는 Molecular Devices (Sunnyvale, CA)에 의해 제조된 Cytosensor^TM마이크로피지오미터이다. 다양한 세포 반응, 예컨대 세포 증식, 이온 수송, 에너지 생성, 염증 반응, 조절 및 리셉터 활성화 등이 이 방법에 의해 측정될 수 있다 (McConnell, H.M. et al.,Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al.,Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al.,J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al.,Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998). 마이크로피지오미터는 진핵, 원핵, 고착 또는 비-고착 세포를 분석하는데 사용될 수 있다. 시간에 따른 세포 배지에서의 세포외 산성화 변화를 측정함으로써, 마이크로피지오미터는 zalpha11 폴리펩티드의 아고니스트, 리간드, 또는 길항체를 포함한 다양한 자극에 대한 세포 반응을 직접적으로 측정한다. 바람직하게도, 마이크로피지오미터는zalpha11 폴리펩티드를 발현하지 않는 대조 진핵 세포와 비교하여, zalpha11-발현 진핵 세포의 반응을 측정하는데 사용된다. zalpha11-발현 진핵 세포는 본원에서 설명된 바와 같이, zalpha11-조절 자극에 대하여 반응하는 세포를 생성하는, zalpha11가 형질전환되어 들어간 세포를 포함하거나, 또는 림프계, 비장, 흉선 또는 PBL로부터 유도된 zalpha11-발현 세포와 같이 자연적으로 zalpha11을 발현하는 세포이다. zalpha11을 발현하는 세포의 반응에서 세포외 산성화의 증가 또는 감소에 의해 측정된, 대조표준에 비교한 차이는 zalpha11-조절된 세포 반응의 직접적인 척도이다. 더욱이, 그러한 zalpha11-조절된 반응은 다양한 자극하에서 분석될 수 있다. 또한 마이크로피지오미터를 사용하여, zalpha11 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제공하는 단계, 그 세포의 첫 번째 부분은 시험 화합물의 부재하에 배양하는 단계, 세포의 두 번째 부분을 시험 화합물의 존재하에 배양하는 단계, 그리고 세포의 첫 번째 부분과 비교하여 세포의 두 번째 부분의 세포 반응의 증가 또는 감소를 검출하는 단계로 이루어진, zalpha11 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항체를 확인하는 방법이 제공된다. zalpha11 폴리펩티드의 천연 리간드를 포함하여, 길항체 및 아고니스트는 이 방법을 사용하여 신속하게 확인될 수 있다.

본 발명에 의해 추가로 제공되는 분석법들은 혼성체 리셉터 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함한다. 이들 혼성체 폴리펩티드는 2 개의 일반적인 부류로 분류된다. 첫 번째 부류에서, SEQ ID NO:2의 대략 잔기 256 (Lys)에서부터 528 (Ser)까지를 포함하는 zalpha11의 세포내 도메인은 두 번째 리셉터의 리간드-결합 도메인에 결합된다. 두 번째 리셉터는 조혈 사이토킨 리셉터, 예컨대 mpl 리셉터인 것이 바람직하다 (Souyri et al.,Cell 63:1137-1147, 1990). 혼성체 리셉터는 추가로 어느 하나의 리셉터로부터 유도될 수 있는 트랜스멤브레인 도메인을 포함할 것이다. 그런 다음 혼성체 리셉터를 코드화하는 DNA 구성물이 숙주 세포안에 삽입된다. 혼성체 리셉터를 발현하는 세포들은 결합 도메인에 대한 리간드의 존재하에 배양되고, 반응에 대하여 분석된다. 이 시스템은 쉽게 이용할 수 있는 리간드를 사용하는 한편 zalpha11에 의해 중재된 신호 변환을 분석하기 위한 수단을 제공한다. 이 시스템은 또한 특정 셀라인이 zalpha11에 의해 변환된 신호에 대해 반응할 수 있는 지를 측정하기 위해서도 사용될 수 있다. 두 번째 부류의 혼성체 리셉터 폴리펩티드는 두 번째 리셉터의 세포질 도메인, 바람직하게는 사이토킨 리셉터, 및 트랜스멤브레인 도메인을 가지고 있는 zalpha11의 세포외 (리간드-결합하는) 도메인 (SEQ ID NO:2의 대략적인 잔기 20 (Cys)부터 237 (His)까지)을 포함한다. 이 두 번째 부류의 혼성체 리셉터는 두 번째 리셉터에 의해 변환된 신호에 대해 반응할 수 있는 것으로 알려진 세포들에서 발현된다. 이들 두 부류의 혼성체 리셉터는 리셉터-기초 분석 시스템내에서 광범위한 스펙트럼의 세포 유형의 사용을 가능하게 한다.

그런 다음 zalpha11에 대한 리간드를 발현하는 것으로 밝혀진 세포들이, 그것으로부터 리간드-코드화 cDNA가 상술된 바와 같이 단리될 수 있는 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여 사용된다. 그러므로 본 발명은 신규한 리셉터 폴리펩티드 외에 리셉터에 대한 폴리펩티드 리간드를 클로닝하는 방법을 제공한다.

Zalpha11 발현의 조직 특이성은 초기 흉선세포 발생 및 면역 반응 조절에서의 역할을 시사한다. 이들 과정은 세포 증식 및 그것들의 동족 리셉터에 대한 하나또는 둘 이상의 사이토킨의 결합에 대한 반응의 차이를 자극하는 것을 포함한다. 이 리셉터에 대하여 관찰된 조직 분포의 견지에서, 아고니스트 (천연 리간드를 포함하여) 및 길항체들은 시험관내 및 생체내 적용시에 많은 잠재력을 갖는다. 리셉터 아고니스트로서 확인된 화합물들은 시험관내 및 생체내에서 표적 세포의 증식 및 발생을 자극하는데 유용하다. 예를 들면, 아고니스트 화합물들은 규정된 세포 배양 배지의 성분으로서 유용하고, 세포 배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 대신하기 위하여 단독으로 또는 다른 사이토킨 및 호르몬들과 결합하여 사용될 수 있다. 그러므로 아고니스트는 림프 및 척수성 계통의 T-세포, B-세포, 및 다른 세포, 및 배양중의 조혈 세포의 성장 및/또는 발생을 특이적으로 촉진시키는데 유용하다.

Zalpha11에 대한 아고니스트 리간드는, 예를 들면 특정 바이러스 감염을 포함하여 면역억제를 포함하는 감염의 처리에서와 같이, 세포-중재된 면역성을 자극하는데 및 림프구 증식을 자극하는데 유용할 수 있다. 추가의 용도로는 종양 억제가 있으며, 이 때 악성 형질전환이 항원성인 종양 세포를 초래한다. 아고니스트 리간드는 세포독성을 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 세포독성은 T-세포, NK (천연 킬러) 세포, 또는 LAK (림프 활성화된 킬러) 세포와 같은 이펙터 세포의 활성화를 통하여 중재되거나, 또는 직접 아폽토시스 경로를 통하여 유도될 수 있다. 아고니스트 리간드는 또한 영향을 받은 세포 유형의 수준을 증가시킴으로써 백혈구 감소증을 치료하는데, 및 골수 이식후에 T-세포 전체를 재생하는 것을 증가시키는데 유용할 수 있다.

길항체 리간드 또는 화합물은 면역 시스템의 억제, 예를 들면 자가면역 질병의 치료, 예컨대 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 염증성 장 질병, 크론병 등의 치료에도 사용될 수 있다. 면역억제는 또한 조직 또는 기관 이식 및 이식편의 거부를 감소시키기 위하여 및 영향을 받은 세포 유형의 증식을 억제함으로써 T-세포 특이적인 백혈병 또는 림프종을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

Zalpha11는 또한 리간드의 순환 수준을 검출하기 위하여 진단 시스템내에서 사용될 수 있다. 관련된 구체예에서, zalpha11 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 제제가 순환하는 리셉터 폴리펩티드를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 리간드 또는 리셉터 폴리펩티드의 상승된 또는 억제된 수준은 암을 포함하여 병리학적 상태를 표시하는 것일 수 있다. 가용성 리셉터 폴리펩티드는 병리학적 과정에 기여할 수 있으며 숨겨져 있는 질병의 간접적인 마아커일 수 있다. 예를 들어, 사람 혈청중의 가용성 IL-2 리셉터의 상승된 수준은 광범위한 염증성 및 신생물 형성 질환, 예컨대 심근 경색, 천식, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 급성 T-세포 백혈병, B-세포 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 결장암, 유방암, 및 난소암과 관련이 있다 (Heaney et al.,Blood 87:847-867, 1996).

Zalpha11 리셉터의 리간드-결합하는 폴리펩티드, 또는 "가용성 리셉터"는 zalpha11 사이토킨 결합 도메인 (사람 리셉터 (SEQ ID NO:2)의 대략적인 잔기 20 (Cys)부터 잔기 237 (His)까지) 또는 비-사람 리셉터의 상응하는 영역을 코드화하는 절단된 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 세포외 도메인은 트랜스멤브레인 절편과 세포내 폴리펩티드 도메인이 실질적으로 없는 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 더욱이, 상술된 바와 같이, zalpha11 사이토킨 결합 도메인내에 있는리간드-결합 폴리펩티드 단편은 또한 본원에서 설명된 용도에 대하여 zalpha11 가용성 리셉터로서 작용할 수 있다. 숙주 세포로부터의 리셉터 폴리펩티드의 수출을 지정하기 위하여, 리셉터 DNA는 분비 펩티드, 예컨대 t-PA 분비 펩티드 또는 zalpha11 분비 펩티드를 코드화하는 두 번째의 DNA 절편에 결합된다. 분비된 리셉터 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위하여, C-말단 연장부, 예컨대 폴리-히스티딘 태그, 물질 P, FlagTM 펩티드 (Hopp et al.,Bio/Technology 6:1204-1210, 1988; Eastman Kodak Co., New Haven, CT로부터 구입할 수 있음) 또는 그것에 대한 항체 또는 다른 특이한 결합제가 이용가능한 다른 폴리펩티드 또는 단백질이 리셉터 폴리펩티드에 융합될 수 있다.

또 다른 접근법에서, 리셉터 세포외 도메인은 두 개의 불변 영역 도메인을 함유하고 가변 영역이 없는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 전형적으로 F_c단편과의 융합물로서 발현될 수 있다. 그러한 융합물은 전형적으로 다량체 분자로서 분비되는데, 이 경우 F_c부분은 상호간에 이황화 결합되어 있고 두 개의 리셉터 폴리펩티드는 상호간에 밀접하게 배열되어 있다. 이런 유형의 융합물은 리간드를 특이적으로 적정해냄으로써 시험관내에서 신호를 차단하기 위한 시험관내 분석 도구로서, 및 순환하는 리간드에 결합하여 리간드를 순환계로부터 제거하기 위하여 그것들을 비경구적으로 투여함에 의한 생체내 길항체로서, 용액으로부터 동족 리간드를 친화적으로 정제하는 데 사용될 수 있다. 리간드를 정제하기 위하여, 리셉터-리간드 결합을 용이하게 하는 조건 (전형적으로 거의-생리적인 온도, pH, 및 이온 강도)하에서 리간드를 함유하고 있는 샘플 (예컨대 세포-조절된 배양 배지 또는 조직 추출물)에 zalpha11-Ig 키메라가 첨가된다. 그런 다음 키메라-리간드 복합체가 고체 지지체 (예컨대 불용성 수지 비드)상에 고정된 단백질 A를 사용한 혼합에 의해 분리된다. 다음 단계로 리간드는 종래의 화학적 기법, 예를 들면 염 또는 pH 구배를 사용하여 용출된다. 또는 다르게는, 키메라 자체가 고체 지지체에 결합되고, 상술된 바와 같이 결합 및 용출이 수행된다. 수집된 분획들은 원하는 수준의 순도에 이를 때까지 재-분획화된다.

더욱이, zalpha11 가용성 리셉터들은 리간드의 존재가 바람직하지 않은 경우의 다른 용도 또는 치료 용도에서 생체내에서 또는 시험관내에서 리간드에 결합하기 위하여 "리간드 싱크", 즉 길항체로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 다량의 생체내 활성 zalpha11 리간드를 발현하는 암에서, zalpha11 가용성 리셉터는 생체내 리간드의 직접적인 길항체로서 사용될 수 있으며, 병의 진전 및 질병과 관련된 증상을 감소시키는 것을 보조할 수 있다. 더욱이, zalpha11 가용성 리셉터는 zalpha11 리셉터를 과잉-발현하는 암의 진전을, 그렇지 않으면 그 암의 증식을 증강시킬 수도 있을 리간드와 생체내에서 결합함으로써 둔화시키는데 사용될 수 있다. zalpha11 가용성 리셉터에 대한 유사한 시험관내 적용이, 예를 들면 zalpha11 리간드의 부재하에 성장하는 셀라인을 선택하기 위한 네가티브 선택으로서 사용될 수 있다.

더욱이, zalpha11 가용성 리셉터는 생체내에서 또는 진단 적용시에 생체내의 또는 조직 샘플중의 zalpha11 리간드-발현 암을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, zalpha11 가용성 리셉터는 본원에서 설명되는 바와 같이 방사성-표지 또는 형광 표지와 콘쥬게이트되어 조직 샘플중의 리간드의 존재를 시험관내 리간드-리셉터 타입 결합 분석, 또는 형광 영상화 분석법을 사용하여 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 방사성-표지된 zalpha11 가용성 리셉터는 당업계에 공지되어 있는 방사성-영상화 방법을 통하여 리간드-발현 고체 종양을 검출하기 위하여 생체내로 투여될 수 있었다.

이러한 신규한 DNA에 상응하는 mRNA의 조직 분포를 분석한 결과, 그것이 흉선, 비장, 림프절, 및 말초혈 백혈구를 포함한 림프 조직에서 발현된 것으로 타나났다. 이들 데이터는 면역 세포의 증식, 분화, 및/또는 활성화에서의 zalpha11 리셉터의 역할을 가리키며, 면역 반응의 발생 및 조절에서의 역할을 시사한다. 이 데이터는 또한 zalpha11과 그것의 리간드와의 상호작용이 골수 세포의 증식 및 발샹을 자극할 수 있고, IL-2, IL-6, LIF, IL-11 및 OSM (Baumann et al.,J. Biol. Chem. 268:8414-8417, 1993)과 같이 간세포에서 급성-단계 단백질 합성을 유도할 수 있음을 시사한다.

본 발명의 폴리펩티드는 거대분자 오염, 특히 다른 단백질 및 핵산과 관련하여, 및 감염성 및 발열성 제제가 없이 80 % 이상의 순도로, 보다 바람직하게는 90 % 이상의 순도로, 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 순도로 정제되는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 약학적으로 순수한 상태로, 즉 99.9 % 이상의 순도로 정제되는 것이 바람직하다. 바람직하게도, 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 없다.

발현된 재조합 zalpha11 폴리펩티드 (또는 zalpha11 키메릭 또는 융합 폴리펩티드)는 분획화 및/또는 종래의 정제 방법 및 배지를 사용하여 정제될 수 있다. 암모늄 술페이트 침전 및 산 또는 케이오트로프 추출인 샘플의 분획화를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 정제 단계로는 히드록시아파타이트, 크기 축출, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피가 있다. 적당한 크로마토그래피 배지로는 유도된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카 등이 있다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하다. 예시적인 크로마토그래피 배지로는 페닐, 부틸, 또는 옥틸기, 예컨대 페닐-세파로스 FF (Pharmacia), Toyopearl 부틸 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로스 (Pharmacia)등으로 유도되는 배지; 또는 폴리아크릴계 수지, 예컨대 암버크롬 CG71 (Toso Haas) 등으로 유도된 배지가 있다. 적당한 고체 지지체는 그것들이 사용되는 조건하에서 불용성인 유리 비드, 실리카-기초 비드, 셀룰로스 수지, 아가로스 비드, 교차-결합된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차-결합된 폴리아크릴아미드 수지 등이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록시기 및/또는 탄수화물 부분에 의해 단백질이 부착되는 것을 허용하는 반응성기로 변형될 수 있다. 커플링 화학의 실예로는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체가 있다. 이들 및 다른 고체 배지는 잘 알려져 있으며 당업계에서 널리 사용되고 있고, 상업적 공급체들로부터 구할 수 있다. 리셉터 폴리펩티드를 지지체 배지에 결합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 방법의 선택은 기본적인 디자인 문제이고, 부분적으로는 선택된 지지체의 성질에 의해 결정된다 (Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988).

본 발명의 폴리펩티드는 그것들의 생화학적, 구조적, 및 생물학적 성질의 개발에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 고정된 금속 이온 흡착 (IMAC) 크로마토그래피는 폴리히스티딘 태그를 포함하여, 히스티딘이 풍부한 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 간단하게 설명하면, 겔이 먼저 2가의 금속 이온으로 하전되어 킬레이트가 형성된다 (Sulkowski,Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). 히스티딘이 풍부한 단백질은 사용된 금속 이온에 따라 친화력을 달리하면서 이 매트릭스에 흡착될 것이고, 경합 용출, pH 의 강하, 또는 강력한 킬레이트제의 사용에 의해 용출될 것이다. 다른 정제 방법으로는 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제가 있다 (Methods in Enzymol., Vol. 182, "단백질 정제에 대한 안내", M. Deutsher, (ed.), Acad. Press. San Diego, 1990, pp.529-539). 본 발명의 추가의 구체예에서, 관심의 폴리펩티드와 친화성 태그 (예컨대 말토오스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)와의 융합이 정제를 용이하게 하기 위하여 구성될 수 있다.

더욱이, 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 폴리펩티드 융합, 또는 혼성체 zalpha11 단백질이, 본 발명의 zalpha11의 영역 또는 도메인을, 다른 사람 사이토킨 리셉터 패밀리 단백질, 또는 이종 단백질의 영역 또는 도메인과 함께 사용함으로써 구성된다 (Sambrook et al., 상기 동일; Altschul et al., 상기 동일;Picard,Cur. Opin. Biology, 5:511-515, 1994, 및 기타 본원에 인용된 문헌). 이들 방법으로 관심의 폴리펩티드의 보다 큰 도메인 또는 영역의 생물학적 중요성에 대한 측정이 가능해진다. 그러한 혼성체는 반응 역학, 결합을 변경시킬 수 있고, 기징 특이성을 제한 또는 확대시킬 수 있으며, 또는 폴리펩티드의 조직 및 세포 정위를 변경시킬 수 있고, 미지의 구조를 가지는 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

융합 폴리펩티드 또는 단백질은 당업자들에 의해, 융합 단백질의 각각의 성분을 제조한 후 그것들을 화학적으로 결합시킴으로써 제조될 수 있다. 또는 달리, 적절한 리딩 프레임에 있는 융합 단백질의 하나 또는 둘 이상의 성분들을 코드화하는 폴리뉴클레오티드가 공지의 기법을 사용하여 생성될 수 있고, 본원에 기술된 방법에 의하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 기능을 부여하는 일부 또는 전부가 본 발명의 zalpha11과 다른 사이토킨 패밀리 구성원으로부터 얻어지는 기능적으로 동등한 도메인(들) 사이에서 교환될 수 있다. 그러한 도메인으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 본원에서 설명된 바와 같은 분비 신호 서열, 세포외 사이토킨 결합 도메인, 트랜스멤브레인 도메인, 및 세포내 신호화 도메인, Box I 및 Box II 부위가 있다. 그러한 융합 단백질은 구성된 융합물에 따라 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 공지의 패밀리 단백질과 동일한 또는 유사한 생물학적 기능 프로필을 가질 것으로 예상될 수 있다. 더욱이, 그러한 융합 단백질은 본원에 설명된 바와 같은 다른 성질을 나타낼 수 있다.

zalpha11 폴리펩티드와 그것들이 융합하게 되는 폴리펩티드 사이에 동등한 도메인들을 교환하기 위하여 표준 분자 생물학 및 클로닝 기법들이 사용될 수 있다. 일반적으로, 관심의 도메인, 예컨대 본원에서 기술된 zalpha11 도메인을 코드화하는 DNA 서열은 추가의 폴리펩티드를 코드화하는 최소한 하나의 다른 DNA 절편 (예를 들면 다른 사이토킨 리셉터로부터의 도메인 또는 영역, 예컨대 IL-2, 리셉터)에 프레임내에서 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 DNA 구성물은 폴리펩티드의 상응하는 영역을 코드화하는 여러 가지 DNA 절편들이 전체 융합 단백질, 또는 그것의 기능적인 부분을 코드화하는 단일한 구성물을 만들기 위하여 프레임내에서 작동가능하게 연결되도록 만들어진다. 예를 들어, DNA 구성물은 신호 폴리펩티드와 이어지는 사이토킨 결합 도메인을 포함하고 있는 융합 단백질의 N-말단에서부터 C-말단까지, 이어서 트랜스멤브레인 도메인, 계속해서 세포내 신호화 도메인을 코드화할 것이다. 그러한 융합 단백질은 본원에서 설명되는 바와 같이 발현되고, 단리되며, 활성에 대해 분석될 것이다.

zalpha11 폴리펩티드 또는 그것의 단편들은 또한 화학적 합성을 통하여 제조될 수 있다. zalpha11 폴리펩티드는 단량체이거나 다량체일 수 있고; 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있으며; 페길화되거나 그렇지 않을 수 있고; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 독점적인 고체상 합성, 부분적인 고체상 방법, 단편 축합 또는 고전적인 용액 합성에 의하여 합성될 수 있다. 폴리펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다 (Merrifield,J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Kaiser et al.,Anal. Biochem. 34:595, 1970). 고체 지지체위에 원하는 펩티드가 전체적으로 합성된 후에, 펩티드-수지는 수지로부터 폴리펩티드를 절단하고대부분의 측쇄 보호기를 제거하는 시약과 접촉된다. 그러한 방법은 당업계에 잘 수립되어 있다.

본 발명의 분자들의 활성은 세포 분화 및 증식을 측정하는 다양한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 그러한 분석법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.

본 발명의 단백질은 예를 들면, 림프, 면역, 염증, 비장, 혈액 또는 뼈 장애의 치료에 유용하며, 시험관내에서 배양된 세포를 사용하여, 또는 생체내에서 본 발명에서 주장하는 분자를 적절한 동물 모델에 투여함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포들은 알긴산염 환경에 포함되어 리셉터 동물에 주입 (이식)될 수 있다. 알긴산염-폴리-L-라이신 마이크로 캡슐화, 투과 선택성 막 캡슐화 및 확산 챔버가 형질전환된 포유류 세포 또는 일차 포유류 세포를 붙잡기 위한 수단이다. 이들 유형의 비-면역원성 "캡슐화"는 포획된 세포에 의해 분비된 또는 방출된 단백질 또는 다른 거대분자의 리셉터 동물로의 확산을 가능하게 한다. 가장 중요한 것은, 캡슐이 리셉터 동물의 면역 반응으로부터 외래의 삽입된 세포를 차단하고 보호한다는 것이다. 그러한 캡슐화는 주입된 세포의 수명을 수시간 또는 수일로부터 (무방비 세포) 여러 주까지 (삽입된 세포)로 연장시킬 수 있다. 알긴산염 스레드 (thread)는 삽입된 세포를 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공한다.

알긴산염 스레드를 생성하기 위하여 필요한 재료들은 당해 기술분야에 알려져 있다. 실험적인 과정에서, 3 % 의 알긴산염 멸균수용액이 제조되고, 멸균되고 여과된다. 알긴산염 스레드의 제조 직전에, 용액은 다시 여과된다. 대략 50 % 의세포 현탁액 (약 5×10⁵에서 약 5×10⁷세포/ml)이 3 % 의 알긴산염 용액과 혼합된다. 1 ml의 알긴산염/세포 현탁액이 약 15 분에 걸쳐 100 mM의 멸균 여과된 CaCl₂용액에 성형되어, "스레드"가 형성된다. 성형된 스레드는 그런 다음 50 mM의 CaCl₂용액에 전달된 후, 25 mM 의 CaCl₂용액에 전달된다. 다음 단계로 스레드는 탈이온수로 세정된 후에 0.01 % 의 폴리-L-라이신 용액중에서 배양됨으로써 코팅된다. 마지막으로, 스레드는 락테이트 처리된 링거 용액으로 세정된 다음 용액으로부터 주사기 몸통 (바늘은 없음)에 주입된다. 그런 다음 구멍이 큰 바늘이 주사기에 부착되고, 스레드는 최소 부피의 락테이트 처리된 링거 용액으로 리셉터에게 복강내로 주입된다.

본 발명의 단백질을 분석하는 생체내 접근법은 바이러스 전달 시스템을 포함한다. 이런 목적을 위해 예시적인 바이러스로는 아데노바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-관련 바이러스 (AAV)이다. 이중-가닥의 DNA 바이러스인 아데노바이러스가 현재 이종 핵산의 전달을 위한 유전자 전달 벡터로서 가장 잘 연구가 되어 있다 (T.C.Becker et al.,Meth. Cell Biol. 43:161-189, 1994; J.T.Douglas and D.T. Curiel,Science & Medicine 4:44-53, 1997). 아데노바이러스 시스템은 여러 가지 장점을 제공한다: (i) 아데노바이러스는 상대적으로 큰 DNA 삽입물을 수용할 수 있다; (ii) 아데노바이러스는 고-역가로 성장할 수 있다; (iii) 아데노바이러스는 광범위한 포유류 세포 유형을 감염시킬 수 있다; 그리고 (iv) 아데노바이러스는 편재하는 조직 특이적이고 조절가능한 프로모터를 포함하여 다수의 상이한 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 또한, 아데노바이러스는 혈류내에서 안정하기 때문에, 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.

아데노바이러스 게놈의 일부가 결실되어 있는 아데노바이러스 벡터를 사용하여, 삽입물은 직접 결찰에 의해 또는 함께 형질전환된 플라스미드와의 동종 재조합에 의해 바이러스 DNA 안으로 통합된다. 예시적인 시스템에서, 필수 E1 유전자가 바이러스 벡터로부터 결실되었고, 바이러스는 E1 유전자가 숙주 세포에 의해 제공되지 않는 한 복제되지 않을 것이다 (사람 293 셀라인이 예시적이다). 아데노바이러스는 무상 동물에 정맥내로 투여될 때, 일차적으로는 간을 표적으로 한다. 만약 아데노바이러스 전달 시스템이 E1 유전자가 결실된 것이라면, 바이러스는 숙주 세포에서 복제될 수 없다. 그러나, 숙주의 조직 (예컨대 간)은 이종 단백질을 발현하고 프로세스할 것이다 (그리고 만약 분비 신호 서열이 존재한다면 분비한다). 분비된 단백질은 고도로 혈관신생된 간에서 순환계에 들어갈 것이며, 감염된 동물에 미치는 효과는 측정될 수 있다.

더욱이, 바이러스 유전자의 다양한 결실을 함유하고 있는 아데노바이러스 벡터는 벡터에 대한 면역 반응을 감소 또는 제거하기 위한 시도에서 사용될 수 있다. 그러한 아데노바이러스는 E1이 결실되어 있고, 또한 E2A 또는 E4 의 결실을 함유하고 있다 (Lusky, M. et al.,J. Virol. 72:2022-2032, 1998; Raper, S.E. et al.,Human Gene Therapy 9:671-679, 1998). 또한, E2b 의 결실이 면역 반응을 감소시킨다고 보고되었다 (Amalfitano, A. et al.,J. Virol. 72:926-933, 1998). 더욱이, 전체 아데노바이러스 게놈을 결실시킴으로써, 이종성 DNA의 매우 큰 삽입물이 수용될 수 있다. 모든 바이러스 유전자가 결실된 소위 "거트리스 (gutless)" 아데노바이러스의 생성은 특히 이종성 DNA의 큰 삽입물의 삽입에 유익하다 (Yeh, P. and Perricaudet, M.,FASEB J. 11:615-623, 1997).

아데노바이러스 시스템은 또한 시험관내에서 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 아데노바이러스-감염된 비-293 세포를 세포가 신속하게 분할하지 못하는 조건하에서 배양함으로써, 세포는 연장된 기간동안 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들면, BHK 세포는 세포 공장에서 집밀도에 이를 때까지 성장된 후, 관심의 분비된 단백질을 코드화하는 아데노바이러스 벡터에 노출된다. 그런 다음 세포는 감염된 세포가 유의할만한 세포 분할 없이 여러 주동안 생존하는 것이 가능한 혈청-유리 조건하에서 성장된다. 또는 달리, 아데노바이러스 벡터로 감염된 293 세포가 고착 세포로서 또는 현탁 배양액에서 상대적으로 높은 세포 밀도에서 상당한 양의 단백질을 생성하도록 성장될 수 있다 (Garnier et al.,Cytotechnol. 15:145-155, 1994). 어떤 프로토콜을 사용하든지, 발현되고 분비된 이종성 단백질은 세포내의 발현된 단백질의 배치에 따라 배양 상층액, 용해물, 또는 멤브레인 분획으로부터 반복적으로 단리될 수 있다. 감염된 293 세포 생성 프로토콜내에서 분비되지 않은 단백질 또한 효과적으로 얻어질 수 있다.

zalpha11에 대해 관찰된 조직 분포의 관점에서, 아고니스트 (천연 리간드/기질/보조인자/등을 포함하여) 및 길항체는 시험관내 및 생체내 적용에서 모두 많은 잠재력을 가지고 있다. zalpha11 아고니스트로서 확인된 화합물들은 시험관내 및 생체내에서 면역 및 조혈 세포의 성장을 자극하는데 유용하다. 예를 들어,zalpha11 및 아고니스트 화합물들은 규정된 세포 배양 배지의 성분으로서 유용하며, 세포 배양시에 통상적으로 사용되는 혈청을 대신하기 위하여 단독으로 또는 다른 사이토킨 및 호르몬과 결합하여 사용될 수 있다. 그러므로 아고니스트는 배양중의 T-세포, B-세포, 및 다른 림프 및 골수 계통의 세포들의 성장 및/또는 발생을 특이적으로 촉진하는데 유용하다. 더욱이, zalpha11 가용성 리셉터, 아고니스트, 또는 길항체는 시험관내에서 단리된 일차 골수 배양물로부터의 콜로니 형성의 자극을 측정하기 위한 분석에서 사용될 수 있다. 그러한 분석법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.

길항체는 또한 리간드-리셉터 상호작용의 부위를 특성확인하기 위한 연구 시약으로서 유용하다. zalpha11 활성의 억제제 (zalpha11 길항체)로는 항-zalpha11 항체 및 가용성 zalpha11 리셉터, 및 다른 펩티드성 및 비-펩티드성 항원 (리보자임을 포함함)이 있다.

Zalpha11은 또한 그것의 활성의 조절인자 (예컨대 길항체)를 확인하기 위해 사용될 수 있다. zalpha11의 활성을 억제하는 화합물들을 확인하기 위하여 본원에 개시된 분석법에 시험 화합물이 첨가된다. 본원에 개시된 분석법외에, 샘플은 zalpha11 결합, 올리고머화, 또는 zalpha11-의존성 세포 반응의 자극/억제를 측정하기 위해 디자인된 다양한 분석법내에서 zalpha11 활성의 억제에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, zalpha11-발현 셀라인이 zalpha11-자극된 세포 경로에 대해 반응하는 리셉터 유전자 구성물로 형질전환될 수 있다. 이런 유형의 리셉터 유전자 구성물은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 일반적으로 분석 검출가능한 단백질을 코드화하는 유전자, 예컨대 루시페라제에 작동가능하게 결합된 zalpha11 -DNA 반응 요소를 포함할 것이다. DNA 반응 요소로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 고리형 AMP 반응 요소 (CRE), 호르몬 반응 요소 (HRE), 인슐린 반응 요소 (IRE)(Nasrin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-5277, 1990) 및 혈청 반응 요소 (SRE)(Shaw et al.,Cell 56:563-572, 1989)가 있다. 고리형 AMP 반응 요소는 문헌에서 검토되었다 (Roestler et al.,J. Biol. Chem. 263(19):9063-9066, 1988; Habener,Molec. Endocrinol. 4(8):1087-1094, 1990). 호르몬 반응 요소도 문헌에서 검토되었다 (Beato,Cell 56:335-344, 1989). 다양한 세포 유형으로부터 얻어지는 후보 화합물, 용액, 혼합물 또는 추출물 또는 조절 배지는 리셉터 유전자 발현의 zalpha11 자극의 증가에 의해 증명되는 것처럼 zalpha11 리셉터의 활성을 증가시키는 능력에 대해 시험된다. 이런 유형의 분석은 리셉터 결합을 통하여 또는 그렇지 않으면 신호 캐스케이드의 일부를 자극함으로써 zalpha11 신호 변환 활성을 직접적으로 자극하는 화합물들을 검출할 것이다. 그것으로서, zalpha11 폴리펩티드에 반응하는 세포를 제공하는 단계, 세포의 첫 번째 부분을 시험 화합물의 부재하에 배양하는 단계, 세포의 두 번째 부분을 시험 화합물의 존재하에 배양하는 단계, 그리고 세포의 첫 번째 부분과 비교하여 세포의 두 번째 부분의 세포 반응의 증가를 검출하는 단계로 이루어지는, zalpha11 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법이 제공된다. 더욱이 상술된 리셉터 유전자 구성물을 함유하지만, zalpha11 리셉터는 발현하지 않는 세 번째 세포가 리포터의 비-특이적, 또는 비-zalpha11-중재된 자극을 평가하기 위한 대조 세포로서 사용될 수 있다. 그러므로, 천연 리간드를 포함하여 아고니스트는 zalpha11 폴리펩티드 기능을 자극 또는 증가시키는 데 유용하다.

본원에 개시된 사이토킨 결합 도메인과 같은 zalpha11 리간드-결합 폴리펩티드는 또한 리간드의 정제를 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 고체 지지체, 예컨대 아가로스 비드, 교차-결합된 아가로스 비드, 유리 비드, 셀룰로스 수지, 실리카-기초 수지, 폴리스티렌, 교차-결합된 폴리아크릴아미드, 또는 사용 조건하에서 안정한 유사 물질위에 고정된다. 폴리펩티드를 고체 지지체위에 결합시키는 방법은 당업계에 공지이며, 예를 들면 아민 화학, 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 밑 히드라지드 활성화가 있다. 그 결과의 배지는 일반적으로 컬럼의 형태로 형성될 것이며, 리간드를 함유하고 있는 액은 1 회 또는 여러번 컬럼을 통과하여 리간드가 리셉터 폴리펩티드에 결합하는 것을 가능하게 할 것이다. 그런 다음 리간드는 리간드-리셉터 결합을 파괴하는 염 농도의 변화, 케이오트로픽 제제 (구아니딘 HCl), 또는 pH 를 사용하여 용출된다.

리간드-결합 리셉터 (또는 항체, 보체/항-보체 쌍의 한 구성원) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 활용할 수 있는 바이오센서 기구를 사용하는 분석 시스템이 유리하게 사용될 수 있다 (예컨대 BIAcore^TM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ; 또는 SELDI^TMtechnology, Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA). 그러한 리셉터, 항체, 보체/항-보체 쌍의 구성원 또는 단편은 리셉터 칩의 표면위에 고정된다. 이 기구의 사용은 문헌에 설명되어 있다 (Karlsson,J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991; Cunningham and Wells,J. Mol. Biol. 234:554-563, 1993). 리셉터, 항체, 구성원 또는 단편은 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 플로우 셀 내에 있는 골드 필름에 부착된 덱스트란 섬유에 공유방식으로 부착된다. 시험 샘플은 셀을 통과한다. 만약 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체 쌍의 반대 구성원이 샘플중에 있다면, 그것은 각각 고정된 리셉터, 항체 또는 구성원에 결합할 것이며, 그 결과 배지의 굴절 지수에 변화가 발생하고, 그것은 골드 필름의 표면 플래즈몬 공명의 변화로서 검출된다. 이 시스템으로, 그것으로부터 결합 친화력이 계산될 수 있는 온- 및 오프-레이트 (on- and off-rate)의 측정, 및 결합의 입체화학의 평가가 가능해진다.

리간드-결합 리셉터 폴리펩티드는 또한 당업계에 공지되어 있는 다른 분석 시스템내에서 사용될 수 있다. 그러한 시스템으로는 결합 친화력의 측정을 위한 스캐쳐드 분석 (Scatchard,Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949) 및 열량 측정 분석 (Cunningham et al.,Science 253:545-548, 1991; Cunningham et al.,Science 245:821-825, 1991)이 있다.

Zalpha11 폴리펩티드는 또한 zalpha11 에피토프, 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. zalpha11 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 동물을 접종하고 면역 반응을 유도하기 위한 항원 (면역원)으로서 작용한다. 당업자는 항원 또는 면역원성 에피토프가 폴리펩티드에 따라 약 10 아미노산으로부터 폴리펩티드의 전체 길이까지 또는 더 긴 폴리펩티드내에 있는 아미노산스트레치로 구성될 수 있음을 인지할 것이다. 적당한 항원이 SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 20 (Cys)부터 아미노산 번호 538 (Ser), 또는 그것의 9부터 519 AA 아미노산 까지의 연속되는 단편에 의해 코드화된 zalpha11 폴리펩티드를 포함한다. 항원으로서 사용하기에 바람직한 펩티드로는 본원에 개시된 사이토킨 결합 도메인, 세포내 신호화 도메인, Box I 및 Box II 부위, 및 zalpha11 친수성 펩티드, 예컨대 숨겨져 있는 G,S, 및 T 잔기와 무시된 노출된 H, Y, 및 W 잔기를 포함한, 미끄러지는 6-잔기 윈도우를 기초로 한 Hopp/Woods 친수성 프로필로부터 측정된, 소수성 플롯으로부터 당업자에 의해 예상되는 친수성 펩티드가 있다 (도 1 참조). Zalpha11 친수성 펩티드로는 (1) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 51 (Trp)에서 아미노산 번호 61 (Glu)까지; (2) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 136 (Ile)에서 아미노산 번호 143 (Glu)까지; (3) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 187 (Pro)에서 아미노산 번호 195 (Ser)까지; (4) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 223 (Phe)에서 아미노산 번호 232 (Glu)까지; 및 (5) SEQ ID NO:2의 아미노산 번호 360 (Glu)에서 아미노산 번호 368 (Asp)까지로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 있다. 또한, zalpha11의 보존된 모티프, 및 zalpha11의 보존된 모티프들 사이의 가변 영역이 적당한 항원이다. 더욱이, 마우스 zalpha11 폴리펩티드 (SEQ ID NO:85)의 상응하는 영역은 마우스 zalpha11에 대한 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이 면역반응으로부터 생성된 항체는 본원에서 설명된 것과 같이 단리될 수 있고 정제될 수 있다. 다클론성 및 단클론성 항체를 제조하고 단리하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Current Protocols in Immunology, Cooligan et al.,(eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Hurrell, J.G.R., Ed.,Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982).

당업자에게 명백한 바와 같이, 다클론성 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 토끼, 마우스, 및 쥐와 같은 다양한 온혈동물을 zalpha11 폴리펩티드 또는 그것의 단편으로 접종함으로써 생성될 수 있다. zalpha11 폴리펩티드의 면역원성은 보조제, 예컨대 알루미늄 (수산화 알루미늄) 또는 프로인트 완전 또는 불완전 보조제를 사용함으로써 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드로는 또한 융합 폴리펩티드, 예컨대 zalpha11 또는 그것의 일부와 면역글로불린 폴리펩티드와의 또는 말토오스 결합 단백질과의 융합물이 있다. 폴리펩티드 면역원은 전-길이의 분자 또는 그것의 일부일 수 있다. 만약 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사"한 것이라면, 그러한 부분은 유익하게도 면역화를 위해 거대분자 담체 (예컨대 키호울 림페트 헤모시아닌 (KLH), 우혈청 알부민 (BSA) 또는 파상풍 독소)에 결합 또는 연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 다클론성 항체, 친화성-정제된 다클론성 항체, 단클론성 항체, 및 항원-결합 단편, 예컨대 F(ab')₂및 Fab 단백질 분해성 단편을 포함한다. 일반적으로 공학제조된 무상 항체 또는 단편, 예컨대 키메릭 항체, Fv 단편, 단일 사슬 항체등과, 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드들이 또한 포함된다. 비-사람 항체는 비-사람 CDR을 사람 프레임워크 및 불변 영역위에 이식하거나, 또는 전체 비-사람 가변 도메인을 통합시킴으로써 (노출된 잔기의 대체에 의해 사람-유사 표면으로 그것들을 임의로 "클로킹"하고, 그 결과는 "겉치레" 항체임) 인간화될 수 있다. 어떤 경우에, 인간화된 항체는 적절한 결합 특성을 증강시키기 위하여 사람 가변 영역 프레임워크내에서 비-사람 잔기를 보유할 수도 있다. 항체의 인간화를 통해서 생물학적 반감기가 증가될 수 있고, 사람에게 투여했을 때 역면역 반응에 대한 가능성이 감소된다.

본원에 유용한 항체를 생성하거나 또는 선택하는 또 다른 기법으로는 zalpha11 단백질 또는 펩티드에 대한 림프구의 시험관내 노출, 및 파지 또는 유사한 벡터에서의 항체 디스플레이 라이브러리의 선택 (예컨대 고정된 또는 표지된 zalpha11 단백질 또는 펩티드의 사용을 통하여)이 있다. 잠재적인 zalpha11 폴리펩티드 결합 도메인을 가지고 있는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자는 파지상에 디스플레이된 (파지 디스플레이) 또는 대장균과 같은 박테리아상에 디스플레이된 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함에 의해 얻어질 수 있다. 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열은 많은 방법, 예컨대 무작위 돌연변이생성 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통하여 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 리간드 또는 리셉터, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 기관의 유기 또는 무기 물질일 수 있는 공지의 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크린하는데 사용될 수 있다. 그러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 기법들은 당업계에 공지이고 (Ladner et al.,미국 특허 제 5,223,409 호; Ladner et al., 미국 특허 제 4,946,778 호; Ladner et al., 미국 특허 제 5,403,484 호; Ladner et al., 미국 특허 제 5,571,698 호), 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로, 예를 들면 Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)로부터 구입할 수 있다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 zalpha11에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 본원에 개시된 zalpha11 서열을 사용하여 스크린될 수 있다. zalpha11 폴리펩티드와 상호작용하는 이들 "결합 펩티드"는 세포에 태그를 붙일 때; 친화성 정제에 의하여 상동성 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있으며; 그것들은 직접 또는 간접적으로 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 콘쥬게이트될 수 있다. 이들 결합 펩티드들은 또한 발현 라이브러리를 스크리닝하고 활성을 중성화하기 위한 것과 같은 분석 방법에 사용될 수 있다. 결합 펩티드는 또한 zalpha11 폴리펩티드의 순환 수준을 측정하기 위한 진단 분석에; 숨어있는 병리학 또는 질병의 마아커로서 가용성 zalpha11 폴리펩티드를 검출 또는 정량하는데 사용될 수 있다. 이들 결합 펩티드는 또한 zalpha11 결합 및 시험관내 및 생체내에서의 신호 변환을 차단하기 위한 zalpha11 "길항체"로서 작용할 수 있다. 이들 항-zalpha11 결합 펩티드는 zalpha11과 결합하는 리간드의 작용을 억제하는데 유용할 것이다.

항체는 만약 1) 그것들이 결합 활성의 역치 수준을 나타내거나, 및/또는 2) 그것들이 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차-반응하지 않는다면 특이적으로 결합하는 것이라고 측정된다. 먼저, 항체는 만약 그것들이 zalpha11 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 대하여, 대조 (비-zalpha11) 폴리펩티드에 대한 결합 친화력보다 최소한 10 배 더 큰 친화력으로 결합한다면 본원에서는 특이적으로 결합하는 것이다. 항체는 10⁶M^-1이상, 바람직하게는 10⁷M^-1이상, 보다 바람직하게는 10⁸M^-1이상, 가장 바람직하게는 10⁹M^-1이상의 결합 친화력 (K_a)을 나타내는 것이 바람직하다. 항체의 결합 친화력은 당업자에 의해, 예컨대 스캐쳐드 분석 (Scatchard, G.,Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

두 번째로, 항체는 그것들이 관련된 폴리펩티드와 유의할만하게 교차-반응하지 않으면 특이적으로 결합된다고 측정된다. 항체들은 예컨대 그것들이 표준 웨스턴 블롯 분석 (Ausubel et al., 상기 동일)을 사용하여 zalpha11은 검출하지만 공지의 관련된 폴리펩티드는 검출하지 못한다면 관련된 폴리펩티드 분자와 유의할만하게 교차-반응하지 않는 것이다. 공지의 관련된 폴리펩티드의 실예는 단백질 패밀리의 구성원인 동일종으로부터의 단백질인 오르토로그 (예컨대 IL-6), zalpha11 폴리펩티드, 및 비-사람 zalpha11이다. 더욱이, 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 집단을 단리하기 위하여 공지의 관련된 폴리펩티드에 "대하여 스크린"될 수 있다. 예를 들어, zalpha11에 대하여 발생된 항체들은 불용성 매트릭스에 고착된 관련 폴리펩티드에 대하여 흡착되고; zalpha11에 대하여 특이적인 항체들은 적절한 완충 조건하에서 매트릭스를 통과하여 흐를 것이다. 그러한 스크리닝은 밀접하게관련된 폴리펩티드에 대하여 교차반응하지 않는 다클론성 및 단클론성 항체를 단리하는 것을 가능하게 한다 (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988;Current Protocols in Immunolgy, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). 특이한 항체의 스크리닝 및 단리는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (Fundamental Immunology, Paul (des.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988;Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Goding J.W.(eds.),Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al.,Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984).

당업자들에게 알려져 있는 다양한 분석법들이 zalpha11 단백질 또는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체들을 검출하기 위하여 활용될 수 있다. 예시적인 분석법들은 문헌에 상세하게 설명되어 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). 그러한 분석법의 대표적인 실예로는 다음과 같은 것들이 있다: 동시발생적인 면역 전기영동, 방사성 면역 분석, 방사성 면역 침전, 효소-결합된 면역 흡착 분석 (ELISA), 돗트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석, 억제 또는 경합 분석, 및 샌드위치 분석. 또한, 항체는 야생형 대 돌연변이 zalpha11 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 결합에 대해 스크린될 수 있다.

zalpha11에 대한 항체는 zalpha11을 발현하는 세포에 태그를 붙이기 위하여; 친화성 정제에 의하여 zalpha11을 단리하기 위하여; zalpha11 폴리펩티드의 순환하는 수준을 측정하기 위한 진단용 분석을 위하여; 숨겨져 있는 병리학 또는 질병의 마아커로서의 가용성 zalpha11을 검출 또는 정량하기 위하여; FACS를 사용하는 분석 방법에서; 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위하여; 항-이디오타입 항체를 생성하기 위하여; 그리고 중화 항체로서 또는 시험관내 및 생체내에서 zalpha11 활성을 차단하기 위한 길항체로서 사용될 수 있다. 적당한 직접 태그 또는 표지로는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마아커, 화학발광 마아커, 자기 입자 등이 있으며; 간접 태그 또는 표지는 중간체로서 바이오틴-아비딘 또는 다른 보체/항-보체 쌍을 사용하는 것을 특징으로 한다. 본원에서의 항체는 또한 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단용으로 또는 치료 용도로 사용된다. 더욱이, zalpha11 또는 그것의 단편에 대한 항체는 시험관내에서 분석, 예컨대 웨스턴 블롯 또는 다른 당업계에 공지되어 있는 분석중의 변성된 zalpha11 또는 그것의 단편을 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

Zalpha11에 대한 항체는 리셉터를 발현하는 세포에 태그를 달고, 형광-활성화된 세포 분류를 사용하는 분석 방법인 가용성 리셉터 폴리펩티드의 순환 수준을 측정하기 위한 진단용 분석법내에서 친화성 정제를 위하여 zalpha11 발현 수준을 분석하는데 유용하다. 2가의 항체는 zalpha11 리간드의 효과를 모방하는 아고니스트로서 사용될 수 있다.

항체는 또한 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단용으로 또는 치료 용도로 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 zalpha11을 인지하는 항체 또는 결합 폴리펩티드는 상응하는 항-보체 분자 (즉 zalpha11 리셉터)를 발현하는 조직 또는 기관을 확인 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 보다 특이하게, 항-zalpha11 항체, 또는 그것의 생체내 활성 단편 또는 부분들은 검출가능한 또는 세포독성 분자에 결합되어 zalpha11 분자를 발현하는 세포, 조직 또는 기관을 가지고 있는 포유류에 투여될 수 있다.

적당한 검출가능한 분자는 zalpha11에 결합하는 폴리펩티드 (상술된 결합 펩티드를 포함하는 "결합 폴리펩티드"), 항체, 또는 그것의 생체내 활성 단편 또는 부분들에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 적당한 검출가능한 분자로는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마아커, 화학발광 마아커, 자기 입자 등이 있다. 적당한 세포독성 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 예컨대 박테리아 또는 식물 독소 (예를 들면 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린 등), 뿐만 아니라 치료용 방사성 핵종, 예를 들면 요오드-131, 레늄-188 또는 이트륨-90이 있다 (어느 것이든지 직접적으로 폴리펩티드 또는 항체에 부착되든지, 또는 예컨대 킬레이트화 부분의 수단을 통하여 간접적으로 부착된다). 결합 폴리펩티드 또는 항체는 또한 세포독성 약물, 예컨대 아드리아마이신에 콘쥬게이트될 수 있다. 검출가능한 또는 세포독성 분자의 간접적인 부착을 위해서는, 검출가능한 또는 세포독성 분자는 보체/항-보체 쌍의 한 구성원과 콘쥬게이트될 수 있으며, 이때 다른 구성원은 결합 폴리펩티드 또는 항체 부분에 결합된다. 이 목적에 대해, 예시적인 보체/항-보체 쌍은 바이오틴/스트렙트아비딘이다.

다른 구체예에서, 결합 폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질은 표적화된 세포 또는 조직 억제 또는 제거 (예컨대 암세포 또는 조직을 치료하기 위하여)에 사용될 수 있다. 또는 달리, 만약 결합 폴리펩티드가 다중 기능 도메인 (즉 활성화 도메인 또는 리간드 결합 도메인과, 표적화 도메인)을 가지고 있다면, 단지 표적화 도메인만을 포함하고 있는 융합 단백질이 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 보체 분자를 관심의 세포 또는 조직 타입에 지정하는데 적당할 것이다. 단지 하나의 도메인만을 포함하고 있는 융합 단백질이 보체 분자를 포함하는 경우에, 항-보체 분자는 검출가능한 또는 세포독성 분자에 콘쥬게이트될 수 있다. 그러므로 그러한 도메인-보체 분자 융합 단백질은 일반적인 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 콘쥬게이트의 세포/조직-특이적 전달을 위한 일반적인 표적화 비히클을 대표한다.

다른 구체예에서, zalpha11 결합 폴리펩티드-사이토킨 또는 항체-사이토킨 융합 단백질은, 만약 결합 폴리펩티드-사이토킨 또는 항-zalpha11 항체가 과증식성 세포를 표적으로 한다면, 표적 조직 (예컨대 혈액, 림프, 결장, 및 골수 암)의 생체내 죽음을 증가시키는데 사용될 수 있다 (Hornick et al.,Blood 89:4437-4447, 1997). 상기 저자들은 융합 단백질이 원하는 작용 부위로 사이토킨이 표적화하는 것을 가능하게 하며, 그로써 사이토킨의 상승된 국부적인 농도를 제공한다고 설명하였다. 적당한 항-zalpha11 항체는 원하지 않는 세포 또는 조직 (즉 종양 또는 백혈병)을 표적으로 하며, 융합된 사이토킨은 이펙터 세포에 의한 개선된 표적 세포용해를 중재한다. 이 목적에 적당한 사이토킨은 예를 들면 인터류킨 2 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)이다.

또는 달리, 본원에서 설명된 zalpha11 결합 폴리펩티드 또는 항체 융합 단백질은 zalpha11-조절된 아폽토시스 경로를 직접적으로 자극함으로써 표적 세포의 생체내 죽음을 증가시키고, 그 결과 zalpha11을 발현하는 과증식성 세포의 죽음을 증가시키는데 사용될 수 있다.

본원에서 설명된 생체내활성 결합 폴리펩티드 또는 항체 콘쥬게이트는 경구적으로, 정맥내로, 동맥내로 또는 혈관내로 투여될 수 있으며, 또는 의도된 작용 부위로 국부적으로 도입될 수 있다.

활성화된 림프구에 의해 생성된 다른 단백질 뿐만 아니라 사이토킨 리셉터에 결합하는 4-나선 번들 사이토킨은 신체 전체를 통한 세포의 세포 분화, 활성화, 점증 (recruitment) 및 항상성에서 중요한 생물학적 역할을 한다. 치료적 용도로는 자가면역 질병을 포함하여 면역 조절을 필요로 하는 질병, 예컨대 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창 및 당뇨병의 치료를 포함한다. 가용성 리셉터와 천연 리간드를 포함하여, zalpha11 길항체 또는 아고니스트는 염증의 조절에 중요할 것이고, 따라서 류마티스성 관절염, 천식, 궤양성 대장염, 염증성 장내 질병, 크론병, 및 패혈증을 치료하는데 유용할 것이다. 가용성 리셉터와 천연 리간드를 포함하여 zalpha11 길항체 또는 아고니스트는 종양 생성을 중재하는데 역할을 할 것이며, 따라서 암의 치료에 유용할 것이다. 가용성 리셉터와 천연 리간드를 포함하여 zalpha11 길항체 또는 아고니스트는 이식 거부를 감소시키는데 중요한 면역 시스템의 억제에 잠재적인 치료효과를 가질 수 있다. Zalpha11 리간드는 대숙주성 이식편병의 예방에 유용할 것이다.

또는 달리, 가용성 리셉터와 천연 리간드를 포함하여 zalpha11 길항체 또는 아고니스트는 감염성 질병에 대한 면역성을 추가로 상승시키고, HIV+ 환자와 같은 면역손상된 환자를 치료하거나, 또는 백신을 개선시키는데 중요한 면역 시스템을 활성화시킬 수 있다. 특히, 가용성 리셉터와 천연 리간드를 포함하여 zalpha11 길항체 또는 아고니스트는 NK 세포 또는 그것들의 선구체를 조절, 자극 또는 확장시킬 수 있으며, 바이러스 감염의 치료에서, 및 항-신생물 형성 인자로서 치료적 가치를 제공할 것이다. NK 세포는 전이성 종양 세포의 제거, 및 전이와 고체 종양 두가지가 NK 세포 활성의 수준을 감소시킨 환자에게서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다 (Whiteside et al.,Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998).

Zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 zalpha11 활성을 증가 또는 억제하는 것이 바람직한 유전자 치료 적용에서 유용하다. 만약 포유류가 돌연변이된 또는 빈 zalpha11 유전자를 가지고 있다면, zalpha11 유전자는 포유류의 세포안에 도입될 수 있다. 한 구체예에서, zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 유전자가 생체내에서 바이러스 벡터안에 도입된다. 그러한 벡터로는 감쇠된 또는 결핍성 DNA 바이러스, 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 단순 포진 바이러스 (HSV), 유두종 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스 (EBV), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 등이 있다. 전체적으로 또는 거의 전체적으로 바이러스 유전자가 결핍되어 있는 결핍성 바이러스가 바람직하다. 결핍성 바이러스는 세포안에 도입된 후에는 감염성이 아니다. 결핍성 바이러스 벡터의 사용으로 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있다는 염려없이 특이하고 국부적인 영역에 있는 세포에 투여하는 것이 가능해진다. 그러한 특수한 벡터의 실예로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 결핍성 단순 포진 바이러스 1 (HSV1) 벡터 (Kaplitt et al.,Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330, 1991); 감쇠된 아데노바이러스 벡터, 예컨대 스트래트포드-페리카우뎃 등에 의해 설명된 벡터 (Stratford-Perricaudet et al.,J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992); 및 결핍성 아데노-관련 바이러스 벡터 (Samulski et al.,J. Virol. 61:3096-3101, 1987; Samulski et al.,J. Virol. 63:3822-3828, 1989)가 있다.

다른 구체예에서, zalpha11 유전자는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 문헌에 소개된 바와 같은 벡터들에 도입될 수 있다 (Anderson et al., 미국 특허 제 5,399,346 호; Mann et al.,Cell 33:153, 1983; Temin et al., 미국 특허 제 4,650,764 호; Temin et al., 미국 특허 제 4,980,289 호; Markowitz et al.,J. Virol. 62:1120, 1988; Temin et al., 미국 특허 제 5,124,263 호; 국제 특허 공보 WO 95/07358, 1995 년 3 월 16 일 공개, Dougherty et al.; Kuo et al.,Blood 82:845, 1993). 또는 달리, 벡터는 리포솜을 사용하여 생체내 리포펙션에 의해 도입될 수 있다. 합성 양이온 지질이 마아커를 코드화하는 유전자의 생체내 형질전환을 위하여 리포솜을 제조하기 위해 사용될 수 있다 (Felgner et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1987; Mackey et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-8031, 1988). 외래 유전자를 특이한 기관안으로 생체내 도입시키기 위한리포펙션의 사용은 실제적인 장점을 갖는다. 리포솜의 특이한 세포를 향한 분자 표적화는 한 가지 장점을 나타낸다. 보다 구체적으로, 특정 세포로의 형질전환을 지정하는 것은 한 가지 장점이다. 예를 들어, 특정한 세포 유형으로 형질전환을 지정하는 것은 세포 이종성을 가지고 있는 조직, 예컨대 췌장, 간, 신장, 및 뇌에서 특히 유리할 것이다. 지질은 표적화 목적을 위해 다른 분자들과 화학적으로 결합될 수 있다. 표적화된 펩티드 (예컨대 호르몬 또는 신경 전달 물질), 단백질, 예컨대 항체, 또는 비-펩티드 분자들은 리포솜에 화학적으로 결합될 수 있다.

표적 세포를 신체로부터 제거하는 것; 벡터를 노출된 (naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것; 그런 다음 형질전환된 세포를 신체안에 재-이식하는 것이 가능하다. 유전자 치료를 위한 노출된 DNA 벡터는 당업계에 공지되어 있는 방법, 예컨대 형질전환, 전기천공, 미소주입, 트랜스덕션, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산 칼슘 침전화, 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용에 의해 원하는 숙주 세포안에 도입될 수 있다 (Wu et al.,J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992; Wu et al.,J. Biol. Chem. 263:14621-14624, 1988).

Zalpha11 유전자 전사를 억제하기 위하여, 예컨대 생체내에서 세포 증식을 억제하기 위하여 안티센스 방법론이 사용될 수 있다. Zalpha11-코드화 폴리펩티드의 한 절편에 상보하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대 SEQ ID NO:4에 나타낸 폴리뉴클레오티드)가 zalpha11-코드화 mRNA에 결합하여 그러한 mRNA의 번역을 억제하기 위하여 디자인된다. 그러한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 세포 배양중에 또는 환자에서 zalpha11 폴리펩티드-코드화하는 유전자의 발현을 억제하기 위하여 사용된다.

또한, 세포 표면 분자로서, zalpha11 폴리펩티드는 세포안에 유전자 치료법을 도입시키기 위한 표적으로서 사용될 수 있다. 이 적용은 치료 유전자를 정상적으로 zalpha11가 발현되는 세포, 예컨대 림프 조직 및 PBL, 또는 zalpha11 폴리펩티드를 발현하는 암세포안에 도입시키는데 특히 적절할 것이다. 예를 들어, 상술된 바와 같은 바이러스 유전자 치료법은 세포 리셉터, 예컨대 바이러스 리셉터보다는 zalpha11 폴리펩티드를 발현하는 특이한 세포 유형에 표적화될 수 있다. 항체, 또는 표적 세포 표면상에서 zalpha11 분자를 인지하는 다른 분자들이, 표적 세포를 감염시키기 위하여 바이러스를 지정하고 그 표적 세포에 유전자 치료 물질을 투여하기 위해 사용될 수 있다 (Woo, S.L.C.,Nature Biotech. 14:1538, 1996; Wickham, T.J. et al.,Nature Biotech. 14:1570-1573, 1996; Douglas, J.T. et al.,Nature Biotech. 14:1574-1578, 1996; Rihova, B.,Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169, 1997; Vile, R.G. et al.,Mol. Med. Today 4:84-92, 1998). 예를 들어, zalpha11-특이적인 항체에 결합된 바이러스-중화 Fab 단편을 함유하고 있는 이중 특이적 항체가 zalpha11 리셉터를 발현하는 세포에 대하여 바이러스를 지정하고 유전자 요소를 함유하고 있는 바이러스가 세포안에 효율적으로 도입되는 것을 가능하게 하는데 사용될 수 있다 (Wickham, T.J. et al.,J. Virol. 71:7663-7669, 1997; Wickham, T.J. et al.,J. Virol. 70:6831-6838, 1996).

본 발명은 또한 진단 적용시 사용될 시약을 제공한다. 예를 들면, zalpha11 유전자, zalpha11 DNA 또는 RNA 또는 그것의 하위서열을 포함하고 있는 프로브가, zalpha11 유전자가 염색체 16 상에 있는지 또는 돌연변이가 일어났는지의 여부를측정하기 위하여 사용될 수 있다. Zalpha11은 염색체 16의 16p11.1 영역에 위치한다 (실시예 3 참조). Zalpha11 유전자 유전자좌에 있는 검출가능한 염색체 변형으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 이수체, 유전자 복사수 변화, 삽입, 결실, 제한 부위 변화 및 재배열이 있다. 그러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용함으로써, 분자 유전학 기법, 예컨대 제한 단편 길이 다형태 (RFLP) 분석, 형광 제자리 혼성화 방법, PCR 기법을 사용한 짧은 탠덤 반복부 (STR) 분석, 및 다른 공지의 유전자 결합 분석 (Sambrook et al., 상기 동일; Ausubel et al., 상기 동일; Marian,Chest0:255-265, 1995)을 사용하여 검출될 수 있다.

유전자 위치에 대한 정확한 지식은 많은 목적, 예를 들어 1) 서열이 기존의 콘티그의 일부인지를 측정하고 추가의 주변 유전자 서열을 다양한 형태, 예컨대 YAC, BAC 또는 cDNA 클론으로 얻기 위하여; 2) 동일한 염색체 영역에 대한 결합을 보이는 유전적 질병에 대한 가능한 후보 유전자를 제공하기 위하여; 및 3) 특정 유전자가 어떤 기능을 가질 것인지를 측정하는 것을 도와주는 교차-참조 모델 유기체, 예컨대 마우스에 대하여 유용할 수 있다.

Zalpha11 유전자는 염색체 16의 16p11.1 영역에 위치한다. 기능이 공지되어 있는 여러 유전자들이 이 영역에 모여 있다. 예를 들어, 조혈 리셉터 패밀리의 한 구성원인 인터류킨 4 (IL-4) 사이토킨 리셉터 알파-하위단위체는 16p12.1-p11.2에 지도화된다. 이 하위단위체는 zalpha11과 이종이량체를 형성할 수 있다. 더욱이, zalpha11 폴리뉴클레오티드 프로브는 IL-4 리셉터의 결함과 관련된 비정상 또는 유전형, 예컨대 일종의 알레르기성 염증성 질환 및 천식에 포함된 것과 같은 것들을검출하기 위하여 사용될 수 있다 (Deichman, K.A. et al.,Exp. Allergy 28:151-155, 1998; Mitsuyasu, H. et al.,Nature Genet. 19:119-120, 1998). 또한, zalpha11 폴리펩티드 프로브는 염증성 장내 질환과 관련된 비정상 또는 유전형을 검출하기 위하여 사용될 수 있고, 이 때 민감성 마아커는 16p12-q13에 지도화된다 (Cho, J.H. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7502-7507, 1998). 나아가, zalpha11 폴리뉴클레오티드 프로브는 16pter-p13.3에 위치한 헤모글로빈 유전자좌와 관련된 비정상 또는 유전형, 및 특히 수증 피탈리스 (hydrops fetalis)와 같이 알파-지중해 빈혈 증후군과 관련된 헤모글로빈-알파 결핍을 검출하기 위하여 사용될 수 있다 (Chui, M.P. and Waye, J.S.,Blood 91:2213-2222, 1998). 더욱이, 다른 유전자 유전자좌들중에서도, 빌름스 종양, 타입 III (16q), 루벤스타인-타이비 증후군 (16p13.3), 심각한 유년기 다태 신장 질병 (16p13.3)에 대한 유전자좌들은 모두 그 자체가 사람 질병 상태에서 나타나며, 뿐만 아니라 사람 게놈이 이 영역으로 지도화된다. (공개적으로 활용될 수 있는 WWW 서버 (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin- post/Omim/getmap?chromosome=16p11.1)상의 염색체 16의 이 영역에 대하여 Online Mendellian Inheritance of Man (OMIM) 유전자 지도, 및 거기에 삽입된 참조문헌 참조). 이것들 모두는 zalpha11 유전자와 동일한 염색체상의 영역에 대한 연합을 나타내는 유전적인 질병에 대한 가능한 후보 유저자들로서 작용한다.

유사하게, zalpha11 유전자좌 자체의 결함이 유전적인 사람 질병 상태를 초래할 수 있다. 본 발명의 분자, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드, 길항체, 아고니스트, 폴리뉴클레오티드 및 항체들은 zalpha11 유전적 결함과 관련된 검출, 진단 예방, 및 치료에 도움을 줄 것이다.

"트랜스제닉 마우스"로 언급되는, zalpha11 유전자를 발현하도록 공학처리된 마우스들, 및 "녹아웃 마우스"로 언급되는, zalpha11 유전자 기능이 완전히 없는 마우스들이 또한 생성될 수 있다 (Snouwaert et al.,Science 257:1083, 1992; Lowell et al.,Nature 366:740-742, 1993; Capecchi, M.R.,Science 244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al.,Annu. Rev. Genet. 20:465-499, 1986). 예를 들어, zalpha11를 과잉-발현하는 트랜스제닉 마우스들은 편재하게 또는 조직-특이적인 또는 조직-제한된 프로모터하에서, 과잉-발현이 표현형을 유발하는지를 알아보기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 zalpha11 폴리펩티드, 그것의 폴리펩티드 단편 또는 돌연변이체의 과잉-발현은 정상적인 세포 과정을 변경시킬 수 있고, 그 결과 zalpha11 발현이 기능적으로 관련되고 zalpha11, 그것의 아고니스트 또는 길항체에 대한 치료적 표적을 가리킬 수 있는 조직을 확인하는 표현형을 초래한다. 예를 들면, 엔지니어에게 바람직한 트랜스제닉 마우스는 "우성 유전질-음성" 표현형을 발현하는 것, 예컨대 트랜스멤브레인 도메인 (대략 SEQ ID NO:2의 아미노산 20 (Cys)부터 255 (Leu)까지)이 부착되어 있는 zalpha11 세포외 사이토킨 결합 도메인을 과잉-발현하는 마우스이다. 더욱이, 그러한 과잉-발현은 사람 질병과 유사성을 나타내는 표현형을 초래할 것이다. 마찬가지로, 녹아웃 zalpha11 마우스는 zalpha11이 생체내에서 절대적으로 필요한지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 녹아웃 마우스의 표현형은 본원에서 설명된 것들과 같은, zalpha11 길항체가 가질 수도 있는 생체내 효과의 징조이다. 마우스 또는 사람 zalpha11 cDNA는 쥐과의 zalpha11 mRNA, cDNA 및 게놈 DNA를 단리하기 위하여 사용될 수 있고, 그것들은 계속해서 녹아웃 마우스를 생성하기 위하여 사용된다. 이들 마우스는 zalpha11 유전자 및 그로써 생체내 시스템에 코드화된 단백질을 연구하기 위하여 사용될 수 있고, 상응하는 사람 질병에 대한 생체 모델로서 사용될 수 있다. 더욱이, 본원에서 설명된, zalpha11 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 zalpha11에 대해 지정된 리보솜의 트랜스제닉 마우스 발현은 상술된 트랜스제닉 마우스와 유사하게 사용될 수 있다.

약학적 사용을 위하여, 본 발명의 가용성 리셉터 폴리펩티드는 비경구용으로, 특히 정맥내 또는 피하 투여를 위하여 종래 방법에 따라 제형된다. 정맥내 투여는 1 내지 여러 시간의 전형적인 기간에 걸친 거환 주사 또는 주입에 의해 이루어질 것이다. 일반적으로, 약학적 제형은 약학적으로 허용되는 비히클, 예컨대 식염수, 완충 식염수, 물중의 5 % 덱스트로오스 등과 함께 zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드를 포함할 것이다. 제형은 또한 하나 또는 둘 이상의 부형제, 보존제, 용해제, 완충제, 바이알 표면상에서의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 포함할 수 있다. 제형 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 문헌에 개시되어 있다 (Remington:The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995). 치료적 용량은 일반적으로 환자 체중 kg 당 1일에 0.1 내지 100 ㎍, 바람직하게는 0.5 내지 20 mg/kg/일의 범위이며, 정확한 용량은 허용된 표준에 따라, 치료해야 할 질환의 성질 및 심각성, 환자 특징 등을 고려하여 임상의에 의해 결정된다. 용량의 결정은 당업자의 수준내에 있다.

단백질은 일주 또는 그 이하에 걸쳐, 주로 1일 내지 3일의 기간에 걸쳐 급성 치료를 위해 투여될수 있거나, 또는 몇달 또는 몇년에 걸쳐 만성 치료를 위해 사용될수 있다. 일반적으로, zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드의 치료적인 유효량은 임상적으로 현저한 효과를 생성하기에 충분한 양이다.

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예들에 의해 더 설명된다.

실시예 1

사람 zalpha11의 확인

전-길이 zalpha11을 얻기 위한 EST 서열의 사용

번역된 DNA 데이타베이스의 스캐닝으로 제 I 부류 사이토킨 리셉터 패밀리의 구성원으로 밝혀진 발현 서열 태그(EST) 서열을 확인하고, 이것을 zalpha11로 표시했다.

EST가 발생한 cDNA의 서열 분석에 의해 EST 서열을 확정했다. 이 cDNA 클론을 얻었고, 다음 프라이머를 사용하여 서열화했다:

2945bp가 삽입되었고, 전-길이였다.

실시예 2

조직 분포

노던 블롯 분석을 Human Multiple Tissue Northern^TMBlots(MTN I, MTN II, 및 MTN III)(Clontech)를 사용하여 수행했다. 실시예 1에 기재된 cDNA를 프라이머로서 올리고스 ZC19,181(SEQ ID NO:18) 및 ZC19,182(SEQ ID NO:19)를 사용하는 PCR 반응에 사용했다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃ 1.5분; 94℃ 15초, 이어서 68℃ 30초 35 사이클; 72℃ 10분; 4℃ 하룻밤. PCR 반응 생성물 샘플을 1.5% 아가로스 겔 상에서 처리했다. 175bp의 예상 크기의 밴드가 보였다. 175bp PCR 단편을 상업적으로 입수가능한 키트(QiaexII^TM; Qiagen)를 사용하여 겔 정제한 후, 제조자의 지시에 따라 무작위 프라임 표지화 시스템인 RediprimeII^TM(Amersham)을 사용하여³²P-dCTP로 방사성 표지화했다. 다음에, 프로브를 제조자의 지시에 따라 Nuc-Trap^TM컬럼(Stratagene)을 사용하여 정제했다. ExpressHyb^TM(Clontech) 용액을 예비혼성화 및, 혼성화 용액으로서 노던 블롯에 사용했다. 혼성화를 표지된 프로브 1-2×10⁶cpm/ml를 사용하여 65℃에서 하룻밤 동안 실행했다. 다음에, 블롯을 25℃, 2×SSC/1% SDS에서 15분 동안 4회 세척했고, 이어서 50℃, 0.1×SSC/0.1% SDS에서 세척했다. 대략 3kb 및 5kb의 전사가 림프절, 말초혈 백혈구, 및 흉선에서 검출됐다.

또한, 도트 블롯을 Human RNA Master Blots^TM(Clontech)를 사용하여 수행했다. 도트 블롯에 대한 방법 및 조건은 상기 기재된 Multiple Tissue Blots과 동일하다. 도트 블롯은 흉선, 림프절, 및 비장에서 가장 강한 신호를 가졌다.

또한, 노던 분석을 Human Cancer Cell Line MTN^TM(Clontech)를 사용하여 수행했다. 실시예 1에 기재된 cDNA를 프라이머로서 올리고스 ZC19,907(SEQ ID NO:20) 및 ZC19,908(SEQ ID NO:21)을 사용하는 PCR 반응에 사용했다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃ 1분, 다음에 60℃ 1분 35 사이클; 72℃ 1.5분; 72℃ 10분;4℃ 하룻밤. PCR 반응 생성물 샘플을 1.5% 아가로스 겔 상에서 처리했다. 1.2kb의 예상 크기의 밴드가 보였다. 1.2kb PCR 단편을 상업적으로 입수가능한 키트(QiaQuick^TM겔 추출 키트; Qiagen)을 사용하여 겔 정제한 후, 제조자의 지시에 따라 무작위 프라임 표지화 시스템인 Prime-ItII^TM(Stratagene)를 사용하는³²P-dCTP로 방사성 표지화했다. 다음에, 프로브를 제조자의 지시에 따라 Nuc-Trap^TM컬럼(Stratagene)를 사용하여 정제했다. ExpressHyb^TM(Clontech) 용액을 예비혼성화 및, 혼성화 용액으로서 노던 블롯에 사용했다. 혼성화를 표지된 프로브 1-2×10⁶cpm/ml를 사용하여 65℃에서 2시간 동안 실행했다. 다음에, 블롯을 25℃, 2×SSC/1% SDS에서 15분 동안 4회 세척하고, 이어서 50℃, 0.1×SSC/0.1% SDS에서 2회 30분 세척했다. 강한 신호가버키트 임파종으로부터 유도된 Raji 셀라인에서 보였다.

실시예 3

zalpha11 유전자의 PCR-기제 염색체 지도화

zalpha11을 상업적으로 입수가능한 "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel"(Research Genetics Inc., Huntsville, AL)을 사용하여 염색체 16에 지도화했다. GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel은 두개의 대조표준 DNA(HFL 도너 및 A23 레시피언트)가 더해진, 각각의 93 방사선 혼성 클론으로부터의 PCR성 DNA를 함유한다. 공개적으로 입수가능한 WWW 서버(http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin /contig/rhma-pper.pl)가 GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel로 구성되는, Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research의 사람 게놈에 대한 방사선 혼성 지도("WICGR" 방사선 혼성 지도)와 관련된 지도화를 허가한다.

"GeneBridge 4 RH Panel"로 zalpha11을 지도화하기 위해, 반응물 20㎕을 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Stratagene, La Jolla, CA)에 셋업하고, "RoboCycler Gradient 96" 열 순환기(Stratagene)에서 사용했다. 각각의 95 PCR 반응물은 2㎕ 10×PCR 반응 완충액(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1.6㎕ dNTPs 혼합물(각 2.5mM, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1㎕ 센스 프라이머 ZC19,954(SEQ ID NO:22), 1㎕ 안티센스 프라이머 ZC19,955(SEQ ID NO:23), 2㎕ "RediLoad"(Research Genetics Inc., Huntsvills, Al), 0.4㎕ 50×Advantage KlenTaq Polymerase Mix(Clontech), 개개의 혼성 클론 또는 대조표준으로부터의DNA 25ng 및 ddH₂O로 구성된다(총부피 20㎕). 반응물을 동일한 양의 미네랄 오일로 덮고 밀봉했다. PCR 순환기 조건은 다음과 같았다: 94℃ 4분 변성 처음 1 사이클; 94℃ 45초, 68℃ 45초, 그리고 72℃ 1분 35 사이클; 이어서 72℃ 7분. 반응물을 2% 아가로스 겔(Life Technologies) 상에서 전기영동에 의해 분리했다.

결과는 zalpha11이 염색체 16 WICGR 방사선 혼성 지도 상에서 프레임워크 마아커로부터 9.54 cR_3000으로 지도화한다는 것을 나타냈다. 기부 및 원위 프레임워크 마아커는 각각 WI-3768 및 TIGR-A002K05였다. 주변 마아커의 사용은 통합된 LDB 염색체 16 지도 상의 16p11.1 영역에 zalpha11을 위치시킨다(The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics. soton.ac.uk/public_html /).

실시예 4

사람 MPL-zalpha11 폴리펩티드 키메라의 구성: zalpha11 세포내 신호화 도메인에 융합된 MPL 세포외 및 TM 도메인

MPL 리셉터의 세포외 및 트랜스멤브레인 도메인을 프라이머 ZC17,212(SEQ ID NO:24) 및 ZC19,914(SEQ ID NO:25)를 사용하는 PCR을 사용하여 MPL 리셉터를 함유하는 플라스미드(PHZ1/MPL 플라스미드)로부터 단리했다. 반응 조건은 다음과 같았다: 95℃ 1분; 95℃ 분, 45℃ 1분, 72℃ 2분 35 사이클; 이어서 72℃ 10분; 다음에 10℃ 소킹. PCR 생성물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN) 상에서 처리했고, 대략 1.5kb MPL 리셉터 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)을 사용하여 단리했다.

zalpha11의 세포내 도메인을 프라이머 ZC19,913(SEQ ID NO:26) 및 ZC20,097 (SEQ ID NO:27)을 사용하는 PCR을 사용하여 zalpha11 리셉터 cDNA를 함유하는 플라스미드로부터 단리했다. zalpha11 리셉터 코딩 서열에 해당하는 폴리뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 69-1682로 나타냈다. 반응 조건은 상기와 같았다. PCR 생성물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim) 상에서 처리했고, 대략 900bp zalpha11 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 단리했다.

상기 기재된 각각의 단리된 단편을 1:1 부피비로 혼합하고, ZC17,212(SEQ ID NO:24) 및 ZC20,097(SEQ ID NO:27)을 사용하는 PCR 반응에 사용하여 MPL-zalpha11 키메라를 만들었다. 반응 조건은 다음과 같았다: 95℃ 1분; 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 2분 35 사이클; 이어서 72℃ 1분; 다음에 10℃ 소킹. 전체 PCR 생성물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim) 상에서 처리했고, 대략 2.4kb MPL-zalpha11 키메라 단편을 제조자의 지시에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 단리했다. MPL-zalpha11 키메라 단편을 제조자의 지시에 따라 EcoRI(BRL) 및 XbaI(Boerhinger Mannheim)로 분해했다. 전체 분해물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim)에서 처리했고, 절단된 MPL-zalpha11 키메라를 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)을 사용하여 단리했다. 결과의 절단된 MPL-zalpha11 키메라를 아래 기재된 바대로 발현 벡터에 삽입했다.

레시피언트 발현 벡터 pZP-5N을 제조자의 지시에 따라 EcoRI(BRL) 및 HindIII(BRL)으로 분해하고, 상기 기재된 바대로 겔 정제했다. 이 벡터 단편을 상기 단리된 EcoRI 및 XbaI 절단 MPL-zalpha11 키메라 및 결합 반응의 XbaI/HindIII 링커 단편과 조합했다. 결합을 15℃에서 하룻밤 동안, T4 Ligase(BRL)를 사용하여 수행했다. 결합 샘플을 DH10B ElectroMAX^TM전기수용성(electrocompetent) 대장균 세포로 전기천공했다(25μF, 200Ω, 2.3V). 형질전환체를 LB+암피실린 플레이트 상에 플레이트했고, 단일 콜로니를 ZC17,212(SEQ ID NO:24) 및 ZC20,097(SEQ ID NO:27)와 상기 기재된 PCR 조건을 사용하는 PCR에 의해 스크린하여 MPL-zalpha11 키메라에 대해 조사했다.

다음 프라이머를 사용한 서열 분석에 의해 MPL-zalpha11 키메라 서열을 확정했다.

대략 2.4bp가 삽입되었고, 전-길이였다.

실시예 5

Alamar Blue를 사용하는 BAF3 분석에서 MPL-zalpha11 키메라를 기제로 하는 증식

A. MPL-zalpha11 키메라를 발현하는 BaF3 세포의 구성

마우스 골수로부터 유도된 인터류킨-3(IL-3) 종속 프레-림프계 셀라인인BaF3(Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986)를 완전 배지(10% 열 비활성화된 태아 소 혈청, 2ng/ml 뮤린 IL-3(mIL-3)(R & D, Minneapolis, MN), 2mM L-glutaMax-1^TM(Gibco BRL), 1mM 나트륨 피루베이트(Gibco BRL), 및 PSN 항생물질(Gibco BRL)로 보충된 RPMI 배지(JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS))에 보존했다. 전기천공 전에, pZP-5N/MPL-zalpha11 DNA(실시예 4)를 제조했고, 제조자의 지시에 따라 Qiagen Maxi Prep 키트(Qiagen)를 사용하여 정제했다. 전기천공용 BaF3 세포를 RPMI 배지로 1회 세척한 후, 10⁷세포/ml의 세포 밀도로 RPMI 배지에 재현탁했다. 재현탁된 BaF3 세포 1ml를 pZP-5N/MPL-zalpha11 플라스미드 DNA 30㎍과 혼합하고, 분리된 일회용 전기천공 챔버(Gibco BRL)로 옮겼다. 실온에서 15분 배양한 후, 세포에 전기천공 장치(CELL-PORATOR^TM; Gibco BRL)에 의해 가해지는 2회 연속 쇼크(800 lFad/300V.; 1180 lFad/300V.)를 가했다. 5분의 회복 시간 후, 전기천공된 세포를 50ml의 완전 배지로 옮겼고, 15-24시간 동안 배양기에 두었다(37℃, 5% CO₂). 다음에, 세포를 스핀다운시켰고, T-162 플라스크에서 Geneticin^TM(Gibco) 선택(500㎍/ml G418)을 함유하는 완전 배지 50ml에 재현탁하여 G418-내성 풀(pool)을 단리했다. 감염된 BaF3 세포의 풀(이후, BaF3/MPL-zalpha11 세포로 명명)을 아래에 기재된 바대로 신호화 능력에 대해 분석했다.

B. Alamar Blue 증식 분석을 사용한 BaF3/MPL-zalpha11 세포의 신호화 능력시험

BaF3/MPL-zalpha11 세포를 스핀다운시켰고, mIL-3가 없는 상기 기재된 완전 배지(이후, "mIL-3 미함유 배지"로 간주)에서 세척했다. 세포를 회전시켰고, 3회 세척하여 mIL-3의 제거를 확실하게 했다. 다음에, 세포를 헤마시토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 미함유 배지를 사용하여 웰 당 100㎕ 부피 및 5000 세포로 96-웰 포멧에 플레이트했다.

BaF3/MPL-zalpha11 세포의 증식을 500ng/ml, 250ng/ml, 125ng/ml, 62ng/ml, 30ng/ml, 15ng/ml, 7.5ng/ml, 3.75ng/ml, 1.8ng/ml, 0.9ng/ml, 0.5ng/ml 및 0.25ng/ml 농도로 mIL-3 미함유 배지로 희석된 트롬보포이에틴(TPO)을 사용하여 평가했다. 희석된 TPO 100㎕를 BaF3/MPL-zalpha11 세포에 가했다. 총 분석 부피는 200㎕이다. 음성 대조표준을 TPO의 첨가 없이 mIL-3 미함유 배지만를 사용하여 동시에 제조했다. Alamar Blue(Accumed, Chicago, IL)가 20㎕/웰로 가해지는 때로부터, 분석 플레이트를 3일 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. Alamar Blue는 살아있는 세포의 수에 기준한 형광광도적 해독을 제공하며, 따라서 음성 대조표준과 비교하여 세포 증식을 직접 측정한다. 플레이트를 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. 플레이트를 파장 544(들뜸) 및 590(방출)에서, SoftMax^TM프로 프로그램을 사용하여 Fmax^TM플레이트 리더(Molecular Devices, Sunneyvale, CA) 상에서 판독했다.

결과는 트롬보포이에틴이 62ng/ml 및 그 이상으로 바탕값에 대해 대략 10배의 증식을 유도함에 따라, zalpha11 리셉터 세포내 부분의 신호화 능력을 확인했다.

실시예 6

전-길이 zalpha11을 발현하는 발현 벡터의 구성

전체 zalpha11 리셉터를 프라이머 ZC19,905(SEQ ID NO:36) 및 ZC19,906(SEQ ID NO:37)을 사용하는 PCR을 사용하여 zalpha11 리셉터 cDNA를 함유하는 플라스미드로부터 단리했다. 반응 조건은 다음과 같았다: 95℃ 1분; 95℃ 분, 55℃ 1분, 72℃ 2분 35 사이클; 이어서 72℃ 10분; 다음에 10℃ 소킹. PCR 생성물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim) 상에서 처리했고, 대략 1.5kb zalpha11 cDNA를 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 단리했다.

정제된 zalpha11 cDNA를 제조자의 지시에 따라 BamHI(Boerhinger Mannheim) 및 EcoRI(BRL)로 분해했다. 전체 분해물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim) 상에서 처리했고, 제조자의 지시에 따라 Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 절단된 zalpha11 단편을 정제했다. 결과의 절단된 zalpha11 키메라를 아래 기재된 바대로 발현 벡터에 삽입했다.

레시피언트 발현 벡터 pZP-5N을 제조자의 지시에 따라 BamHI(Boerhinger Mannheim) 및 EcoRI(BRL)로 분해했고, 상기 기재된 바대로 겔 정제했다. 이 벡터 단편을 결합 반응에서 상기 단리된 BamHI 및 EcoRI 절단 zalpha11 단편과 조합했다. 결합을 하룻밤 동안 15℃에서 T4 Ligase(BRL)을 사용하여 수행했다. 결합 샘플을 DH10B electroMAX^TM전기수용성 대장균 세포로 전기천공했다(25μF, 200Ω, 2.3V). 형질전환체를 LB+암피실린 플레이트 상에 플레이트했고, 단일 콜로니를 ZC19,905 (SEQ ID NO:36) 및 ZC19,906(SEQ ID NO:37)와 상기 기재된 PCR 조건을 사용하는 PCR에 의해 스크린하여 zalpha11 서열에 대해 조사했다.

다음 프라이머를 사용한 서열 분석에 의해 MPL-zalpha11 서열을 확정했다.

대략 1.6kb가 삽입되었고, 전-길이였다.

실시예 7

Alamar Blue를 사용한 BAF3 분석에서 zalpha11을 기제로 하는 증식

A. zalpha11 리셉터를 발현하는 BaF3 세포의 구성

전-길이 zalpha11 리셉터를 발현하는 BaF3 세포를 상기 실시예 6에 기재된 zalpha11 발현 벡터 30㎍을 사용하여 상기 실시예 5A에 따라 구성했다. zalpha11 리셉터 mRNA를 발현하는 BaF3 세포를 BaF3/zalpha11로 표시했다. 이들 세포를 실시예 8 및 실시예 12에서 아래 기재된 바대로 zalpha11 활성에 대한 스크린에 사용했다.

실시예 8

Alamar Blue 증식 분석을 사용한 BaF3/zalpha11 세포를 사용한 zalpha11 활성에 대한 스크리닝

A. zalpha11 활성의 존재에 대한 시험에 사용되는 원숭이 일차 공급원

일차 원숭이 비장 세포로부터의 컨디셔닝 배지를 아래에 기재된 바대로 활성의 존재에 대한 시험에 사용했다. 원숭이 비장 세포를 72시간 동안 5ng/ml Phorblo-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)(Calbiochem, San Diego, CA) 및 0.5㎍/ml Ionomycin^TM(Calbiochem)을 사용하여 활성화시켰다. 자극된 원숭이 비장 세포로부터의 상층액을 아래 기재된 바대로 BaF3/zalpha11 세포의 증식을 분석하는데 사용했다.

B. Alamar Blue 증식 분석을 사용한 BaF3/zalpha11 세포를 사용한 zalpha11 활성에 대한 스크리닝

BaF3/zalpha11 세포를 스핀다운시켰고, mIL-3 미함유 배지에서 세척했다. 세포를 회전시켰고, 3회 세척하여 mIL-3의 제거를 확실하게 했다. 다음에, 세포를 헤마시토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 미함유 배지를 사용하여 웰 당 100㎕ 부피 및 5000 세포로 96-웰 포멧에 플레이트했다.

BaF3/zalpha11 세포의 증식을 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도로 mIL-3 미함유 배지로 희석된 활성화된 원숭이 비장으로부터의 컨디셔닝 배지(상기 실시예 8A 참조)를 사용하여 평가했다. 희석된 컨디셔닝 배지 100㎕를 BaF3/zalpha11 세포에 가했다. 총 분석 부피는 200㎕이다. Alamar Blue(Accumed, Chicago, IL)가 20㎕/웰로 가해지는 때로부터, 분석 플레이트를 3일동안 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. 플레이트를 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. 플레이트를 상기 기재된 바대로 Fmax^TM플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 판독했다(실시예 5).

결과는 활성화 원숭이 비장 컨디셔닝 배지에 존재하는 인자에서 BaF3/zalpha11 세포의 증식 반응을 확인했다. 측정된 바, 반응은 50% 농도에서 바탕값에 대해 대략 4배였다. BaF3 야생형 세포는 이 인자에 반응하여 증식하지 않았다. 이것은 이 인자가 zalpha11 리셉터에 대해 특이적임을 나타낸다.

C. zalpha11 활성을 단리하는데 사용되는 사람 일차 공급원

혈액 100ml를 6명의 도너로부터 각각 취했다. 혈액을 헤파린을 함유하는 10×10ml 배큐테이너(vacutainer) 튜브를 사용하여 뽑았다. 도너 6명의 혈액을 모으고 (600ml), PBS로 1:1 희석하고, Ficoll-PaquePLUS(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용하여 분리했다. Ficoll 구배 상에서 분리 후, 단리된 일차 사람 세포는 1.2×10⁹세포였다.

세포를 9.6ml MACS 완충액(PBS, 0.5% EDTA, 2mM EDTA)에 현탁했다. 세포 현탁액 1.6ml를 제거하고, 0.4ml CD3 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 가했다. 혼합물을 4℃에서 15분 동안 배양했다. CD3 비드로 표지된 이들 세포를 30ml MACS 완충액으로 세척한 후, MACS 완충액 2ml에 재현탁했다.

VS+ 컬럼(Miltenyi)을 제조자의 지시에 따라 제조했다. 다음에, VS+ 컬럼을VarioMACS^TM자기장(Miltenyi)에 두었다. 컬럼을 5ml MACS 완충액으로 평형화시켰다. 다음에, 단리된 일차 사람 세포를 컬럼에 적용했다. CD3 음성 세포는 통과시켰다. 컬럼을 9ml(3×3ml) MACS 완충액으로 헹궜다. 다음에, 컬럼을 자석으로부터 제거했고, 15ml 팔콘 튜브 위에 두었다. CD3+ 세포를 컬럼에 5ml MACS 완충액을 가하여 용리했고, 결합된 세포를 제조자에 의해 제공된 플런저를 사용하여 내뿜었다. 상기 CD3 자기 비드를 사용한 세포 배양, 세척, 및 VS+ 컬럼 단계(용리를 통한 배양)을 5회 이상 반복했다. 6개의 컬럼 분리로부터 결과의 CD3+ 분획을 모았다. CD3+ 선택된 사람 T-세포의 수율은 3×10⁸총 세포였다.

모아진 CD3+ 선택된 사람 T-세포 샘플을 형광 항체 세포 정렬기(FACS) 상에서의 염색 및 정렬을 위해 제거하여, 그것들의 순도를 평가했다. CD3+ 선택된 사람 T-세포는 91% CD3+ 세포였다.

CD3+ 선택된 사람 T-세포를 13시간 동안 37℃, RPMI+5% FBS+PMA 10ng/ml 및 Ionomycin 0.5㎍/ml(Calbiochem)에서 배양함에 의해 활성화시켰다. 이들 활성화된 CD3+ 선택된 사람 T-세포로부터의 상층액을 아래 설명된 바대로 zalpha11 활성에 대해 시험했다.

D. BaF3/zalpha11 세포 및 Alamar Blue 증식 분석을 사용한 zalpha11 활성에 대한 활성화된 CD3+ 선택된 사람 T-세포로부터의 상층액 시험

BaF3/zalpha11 세포를 스핀다운시켰고, mIL-3 미함유 배지로 세척했다. 세포를 회전시키고, 3회 세척하여 mIL-3의 제거를 확실하게 했다. 다음에, 세포를 헤마시토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 미함유 배지를 사용하여 웰 당 100㎕ 부피 및 5000 세포로 96-웰 포멧에 플레이트했다.

BaF3/zalpha11 세포의 증식을 mIL-3 미함유 배지를 사용하여 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도로 희석된 활성화된 CD3+ 선택된 사람 T-세포로부터의 컨디셔닝 배지를 사용하여 평가했다. 희석된 컨디셔닝 배지 100㎕를 BaF3/zalpha11 세포에 가했다. 총 분석 부피는 200㎕이다. 분석 플레이트를 배양하고, 상기 실시예 8B에 기재된 바대로 분석했다.

결과는 활성화된 CD3+ 선택된 사람 T-세포 컨디셔닝 배지에 존재하는 인자에서 BaF3/zalpha11 세포의 증식 반응을 확인했다. 측정된 바의 반응은 50% 농도에서 바탕값에 대해 대략 10배였다. BaF3 야생형 세포는 이 인자에 반응하여 증식하지 않았다. 이 인자는 zalpha11 리셉터에 대해 특이성을 나타냈다.

실시예 9

zalpha11 가용성 리셉터를 발현하는 포유류 발현 벡터의 구성: zalpha11CEE, zalpha11CFLG, zalpha11CHIS 및 zalpha11-Fc4

A. zalpha11CEE, zalpha11CFLG 및 zalpha11CHIS를 함유하는 zalpha11 포유류 발현 벡터의 구성

발현 벡터를 zalpha11 폴리펩티드의 가용성, 세포외 도메인 pC4zalpha11CEE의 발현을 위해 제조했다. 여기에서, 구성물은 예상 초기화 메티오닌으로 이루어지고, 예상 트랜스멤브레인 도메인에 이웃하여 절단된 zalpha11 폴리펩티드가 C-말단 Glu-Glu 태그(SEQ ID NO:41)을 가지면서 발현하도록 지정된다.

700bp PCR 발생 zalpha11 DNA 단편을 Asp718 및 BamHI 제한 부위를 첨가하기 위해 프라이머로서 ZC19,931(SEQ ID NO:42) 및 ZC19,932(SEQ ID NO:43)을 사용하여 만들었다. zalpha11 리셉터 cDNA를 함유하는 플라스미드를 템플레이트로서 사용했다. zalpha11 단편의 PCR 증폭을 다음과 같이 수행했다: 0.5분 동안 94℃에서 25 사이클; 10초 동안 94℃, 30초 동안 50℃, 45총 동안 68℃, 이어서 4℃에 고정 5 사이클. 반응물을 클로로포름/페놀 추출 및 이소프로판올 침전에 의해 정제하고, 제조자의 프로토콜에 따라 Asp718 및 BamHI(Gibco BRL)로 분해했다. 700bp의 예상 크기의 밴드가 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타났고, 절제하고, DNA를 제조자의 지시에 따라 QiaexII^TM정제 시스템(Qiagen)을 사용하여 정제했다.

절제된 DNA를 BamHI 및 Asp718로 절단된 플라스미드 pC4EE에 하위클론했다. pC4zalpha11CEE 발현 벡터는 음성 zalpha11 신호 펩티드를 사용하고, zalpha11 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 서열의 C-말단에 Glu-Glu 태그(SEQ ID NO:41)을 부착시킨다. 플라스미드 pC4EE는 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터, 코팅 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위, 중지 코돈 및 사람 성장 호르몬 터미테이터를 가지는 발현 카세트를 함유하는 포유류 발현 벡터이다. 또한, 플라스미드는 대장균 기원의 복제, SV40 프로모터를 가지는 포유류 선택성 마아커 발현 단위, 복제 증강제 및 기원, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가진다.

약 30ng의 제한 분해된 zalpha11 삽입체와 약 12ng의 분해된 벡터를 16℃에서 하룻밤 동안 결합시켰다. 각 결합 반응물 1㎕를 제조자의 지시에 따라 독립적으로 DH10B 수용성 세포(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)로 전기천공하고, 50mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이트하고, 하룻밤 동안 배양했다. 콜로니들을 각 콜로니의 2ml 액상 배양물로부터 제조된 DNA의 제한 분석에 의해 스크린했다. 양성 콜로니의 삽입 서열을 서열 분석에 의해 증명했다. 대규모 플라스미드 제조를 제조자의 지시에 따라 QIAGENMaxi prep 키트(Qiagen)을 사용하여 행했다.

동일한 과정을 한줄의 6 His 잔기로 구성된 C-말단 His 태그; 및 C-말단 플래그(SEQ ID NO:49) 태그 zalpha11 CFLAG를 가지는 zalpha11 가용성 리셉터를 제조하기 위해 사용했다. 이들 구성물을 구성하기 위해, 상술된 벡터는 Glu-Glu 태그(SEQ ID NO:41)에 위치한 HIS 또는 FLAG태그 중 하나를 가진다.

B. 가용성 zalpha11 리셉터 zalpha11-Fc4의 포유류 발현 구성

zalpha11을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 모두 또는 일부 함유하는 발현 플라스미드를 상동성 재조합에 의해 구성했다. zalpha11 cDNA의 단편을 zalpha11 리셉터의 세포외 도메인으로부터의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 PCR을 사용하여 분리했다. zalpha11 단편의 제조에 사용된 두개의 프라이머는: (1) 5'-3' 단부; 40bp의 벡터 측면 서열(삽입의 5') 및 zalpha11 세포외 도메인(SEQ ID NO:44)의 5' 단부에 해당하는 17bp를 포함하는 각 PCR에 대한 프라이머; 그리고 (2) 40bp의 Fc4 폴리뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:45)의 5' 단부 및 zalpha11 세포외 도메인(SEQ ID NO:46)의 3' 단부에 해당하는 17bp이다. zalpha11과의 융합을 위한 Fc-4의 단편은 유사한 융합의 PCR에 의해 발생했다. Fc4 단편의 제조에 사용된 두개의 프라이머는: (1) 40bp의 zalpha11 세포외 도메인의 3' 단부으로부터의 서열 및17bp의 Fc4(SEQ ID NO:47)의 5' 단부으로 구성된 5' 프라이머; 그리고 (2) 40bp의 벡터 서열(삽입의 3') 및 17bp의 Fc4(SEQ ID NO:48)의 3' 단부으로 구성된 3' 프라이머이다.

상기 기재된 각 반응에 대한 PCR 증폭을 다음과 같이 수행했다: 2분 동안 94℃에서 1 사이클; 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 1분 동안 72℃에서 25 사이클; 5분 동안 72℃에서 1 사이클; 이어서 4℃에 고정. 100㎕ PCR 반응물 중 10㎕를 분석을 위해 1×TBE 완충액을 가지는 0.8% LMP 아가로스 겔(Seaplaque GTG) 상에 두었다. 남아있는 90㎕의 PCR 반응물을 1M NaCl 5㎕ 및 순수한 에탄올 250㎕를 첨가하여 침전시켰다. 사용된 발현 벡터를 플라스미드 pCZR199(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209에 기탁, No. 98668로 지정)로부터 유도하고, SmaI(BRL)로 절단했다. 발현 벡터를 플라스미드 pCZR199로부터 유도했다. 이것은 CMV 아주 초기 프로모터, 다양한 영역의 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌로부터의 교감 인트론, 코딩 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위, 중지 코돈 및 사람 성장 호르몬 터미네이터를 가지는 발현 카세트를 함유하는 포유류 발현 벡터이다. 또한, 발현 벡터는 대장균 기원의 복제, SV40 프로모터를 가지는 포유류 선택성 마아커 발현 단위, 복제에 대한 증강제 및 기원, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가진다. 사용된 발현 벡터를 CMV 아주 초기 프로모터로 메탈로티오네인 프로모터를 대체함에 의해 pCZR199로부터 구성했다.

수용성 이스트 세포(S. cerevisiae) 100㎕를 각각의 zalpha11 및 Fc4 삽입을 각각 대략 1㎍을 함유하는 10㎕, 및 SmaI(BRL) 분해된 발현 벡터와 조합하고,0.2cm 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 이스트/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), "무한" Ω, 25μF에서 전기펄스했다. 각 큐벳에 1.2M 소르비톨 600㎕을 가하고, 이스트를 두개의 URA-D 플레이트 상에 두개의 300㎕ 분취액으로 플레이트하고, 30℃에서 배양했다.

약 48 시간 후, 한 플레이트로부터의 Ura+ 이스트 형질전환체를 1ml H₂O에 재현탁하고, 간단히 회전시켜 이스트 세포를 펠렛화했다. 세포 펠렛을 1ml 리시스 완충액(2% 트리톤 X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁했다. 리시스 혼합물 500㎕를 300㎕ 산 세척 유리 비드 및 200㎕ 페놀-클로로포름을 함유하는 에펜드로프 튜브에 가하고, 1분 간격으로 2 또는 3회 와동시킨 후, 이어서 5분 동안 최대 속도로 에펜드로프 원심분리기에서 회전시켰다. 수성상 300㎕를 신선한 튜브로 옮기고, DNA를 600㎕ 에탄올(EtOH)을 사용하여 침전시키고, 이어서, 4℃에서 10분 동안 원심분리했다. DNA 펠렛을 100㎕ H₂O에 재현탁했다.

전기수용성 대장균 세포(DH10B, Gibco BRL)의 형질전환을 0.5-2ml 이스트 DNA prep 및 DH10B 세포 40ul을 사용하여 행했다. 세포를 2.0kV, 25mF 및 400Ω에서 전기펄스했다. 전기천공 후, 1ml SOC(2% Bactoe 트립톤(Difco, Detriot, MI), 0.5% 이스트 추출물(Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 글루코스)을 4개의 LB AMP 플레이트(LB 육즙(Lennox), 1.8% Bacto 아가(Difco), 100mg/L 암피실린) 상에 250㎕ 분취액으로 플레이트했다.

zalpha11-Fc4에 대한 정확한 발현 구성을 하보링하는 각각의 클론을 제한 분해에 의해 확인하여 zalpha11-Fc4 삽입체의 존재를 증명하고, 다양한 DNA 서열이 서로 정확하게 결합함을 확인했다. 양성 클론의 삽입을 서열 분석으로 행했다. 대규모 플라스미드 DNA를 제조자의 지시에 따라 Qiagen Maxi 키트(Qiagen)을 사용하여 분리했다.

실시예 10

zalpha11 가용성 리셉터 폴리펩티드의 감염 및 발현

BHK 570 세포(ATCC No. CRL-10314)(패시지 27)를 800㎕의 혈청 미함유(SF) DMEM 배지(DMEM, Gibco/BRL 고 글루코스)에 1.2X106세포/웰(6-웰 플레이트)로 플레이트했다(Gibco BRL, Gaithersburg, MD). 세포를 혈청 미함유(SF) DMEM에서 Lipofectin^TM(Gibco BRL)을 사용하여 상기 기재된(실시예 9 참조) zalpha11CEE /CFLG/CHIS를 함유하는 발현 플라스미드로 감염시켰다. 3㎍의 zalpha11CEE/CFLG/ CHIS 각각을 1.5ml 튜브에서 총 최종 부피 100㎕ SF DMEM으로 각각 희석시켰다. 분리된 튜브에서, 1.5㎕의 Lipofectin^TM(Gibco BRL)을 100㎕의 SF DMEM과 혼합했다. Lipofectin^TM혼합물을 실온에서 30-45분 동안 배양한 후, DNA 혼합물을 가하고, 대략 10-15분 동안 실온에서 배양했다.

전체 DNA:Lipofectin^TM혼합물을 플레이트된 세포에 가하고, 그것들에 대해 균일하게 분포시켰다. 세포를 37℃에서 대략 5분 동안 배양한 후, 3ml DMEM/5% 태아 송아지 혈청(FBS)(Hyclone, Logan, UT) 최종 부피로 각각의 150mm MAXI 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양하고, DNA:Lipofectin^TM혼합물을 다음 날 선택 배지(1μM 메토트렉세이트(MTX)를 가지는 5% FBS/DMEM)로 대체했다.

대략 1-12 일 후-감염 후, 플레이트를 10ml SF DMEM으로 세척했다. 세척 배지를 감압 여과하고, 7.25ml 혈청 미함유 DMEM으로 대체했다. 다음에, SF DMEM에서 미리-소킹된 스테릴 테플론 메시(Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA)를 클론성 세포 콜로니 위에 두었다. 다음에, SF DMEM에서 미리-소킹된 스테릴 니트로셀룰로스 필터를 메시 위에 두었다. 니트로셀룰로스 상의 정위 표시를 배지 디시로 옮겼다. 다음에, 플레이트를 37℃, 5% CO₂배양기에서 5-6시간 동안 배양했다.

배양한 후, 필터/메시를 제거하고, 배지를 흡입 여과하고, 1μM MTX를 가지는 5% FBS/DMEM으로 대체했다. 다음에, 필터를 회전 교반기 상에서 실온에서 15분 동안 10% 비지방 건조 우유/Western A 완충액(Western A: 50mM 트리스 pH 7.4, 5mM EDTA, 0.05% NP-40, 150mM NaCl 및 0.25% 겔라틴)으로 차단했다. 다음에 필터를 회전 교반기 상에서 2.5% 비지방 건조 우유/western A 완충액에서 실온에서 1시간 동안 항-Glu-Glu, 항-FLA, 또는 항-HIS 항체-HRP 콘쥬게이트를 사용하여 각각 배양했다. 다음에, 필터를 실온에서 Western A로 1회 당 5-10분 동안 3회 세척했다. 필터를 제조자의 지시에 따라 울트라 ECL 시약(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)을 사용하여 전개시키고, Lumi-Imager(Roche Corp.) 상에 가시화했다.

양성 발현 클론성 콜로니를 기계적으로 5μM MTX를 가지는 1ml의 5%FCS/DMEM의 12-웰 플레이트에서 가려낸 후, 합류점에서 성장시켰다. 다음에, 컨디셔닝 배지 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석에 의해 발현 수준에 대해 시험했다. 각 구성물에 대해 3개 최고 발현 클론을 가려냈다; 3개 중 2개를 백업용으로 냉동시키고, 1개를 미코플라스마 시험 및 대 규모 공장 시딩을 위해 증대시켰다.

B. 가용성 zalpha11 리셉터 zalpha11-Fc4의 포유류 발현

BHK 570 세포(ATCC NO: CRL-10314)를 10cm 조직 배양 디시에 플레이트하고, 하룻밤 동안 DMEM/FBS 배지(DMEM, Gibco/BRL 고 글루코스, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% 태아 송아지 혈청(Hyclone, Logan, UT), 1mM L-글루타민 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1mM 나트륨 피루베이트(Gibco BRL)), 37℃, 5% CO₂에서 대략 50-70% 융합도로 성장시켰다. 다음에, 세포를 혈청 미함유(SF) 배지 조제물(DMEM, 10mg/ml 트랜스페린, 5mg/ml 인슐린, 2mg/ml 페투인, 1% L-글루타민 및 1% 나트륨 피루베이트)에서 Lipofectamine^TM(Gibco BRL)을 사용하여, zalpha11-Fc4를 함유하는 플라스미드(실시예 9 참조)로 감염시켰다. zalpha11-Fc-4 함유 플라스미드를 640ml의 총 최종 부피로 SF 배지를 사용하여 15ml 튜브에서 희석시켰다. Lipofectamine^TM(Gibco BRL) 35ml를 SF 배지 605ml와 혼합했다. Lipofectamine^TM혼합물을 DNA 혼합물에 가하고, 실온에서 대략 30분 동안 배양했다. SF 배지 5ml를 DNA:Lipofectamine^TM혼합물에 가했다. 세포를 SF 배지 5ml로 1회 세척하고, 흡입 여과하고, DNA:Lipofectamine^TM혼합물을 가했다. 세포를 37℃에서 5시간 동안 배양한 후, 6.4ml의 DMEM/10% FBS, 1% PSN 배지를 각 플레이트에 가했다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하고, DNA:LipofectamineTM 혼합물을 다음날 신선한 5% FBS/DMEM 배지로 대체했다. 2일 후-감염 후, 세포를 선택 배지(1mM 메토트렉세이트 (Sigma Chemical, Co., St.. Louis, MO)가 첨가된 상기 DMEM/FBS 배지)에서 1:10, 1:20 및 1:50으로 150mm 플레이트에서 분리했다. 대략 10 일의 후-감염 후, 각 감염으로부터의 메토트렉세이트 내성 콜로니의 150mm 배양 디시를 트립신화하고, 세포를 모으고, T-162 플라스크에 플레이트하고, 대규모 배양기로 옮겼다.

실시예 11

BHK 570 세포로부터 zalpha11 가용성 리셉터의 정제

A. BHK 570으로부터 zalpha11CEE 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업을 4℃에서 수행했다. 다음 과정을 C-말단 GluGlu(EE) 태그를 함유하는 zalpha11 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용했다. 30l의 세포 팩토리 컨디셔닝 배지를 ProFlux A30 상에서 Amicon S10Y3 원형 카트리지를 사용하여 1.6l로 농축했다. 프로테아제 억제제 용액을 2.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Sigma Chemical, Co., St., Louis, MO), 0.003mM 뢰펩틴 (Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001mM 펩스타틴(Boerhinger Mannheim) 및 0.4mM Pefabloc(Boerhinger Mannheim)의 최종 농도로 감염된 BHK 570 세포(실시예 10 참조)로부터 농축된 1.6l의 세포 팩토리 컨디셔닝 배지에 가했다. 샘플을 분석을 위해 제거하고, 벌크 부피를 정제가 시작될 때까지 -80℃에서 냉각했다. 총 목표 단백질 농도의 농축된 세포 팩토리 컨디셔닝 배지를 SDS-PAGE 및항-EE HRP 콘쥬게이트된 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정했다.

항-EE G-세파로스의 100ml 컬럼(아래에 기재된 바대로 제조)을 Waters AP-5, 5cm×10cm 유리 컬럼에 부었다. 컬럼을 흐름 충전하고, 포스페이트 완충 살린(PBS) pH 7.4를 가지는 BioCad Sprint(PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 평형화시켰다. 농축된 세포 팩토리 컨디셔닝 배지를 해동히고, 0.2 마이크론 스테릴 여과하고, pH를 7.4로 조정한 후, 하룻밤 동안 1ml/분 흐름 속도로 컬럼에 로딩했다. 컬럼을 10 컬럼 부피(CVs)의 포스페이트 완충 살린(PBS, pH 7.4)로 세척한 후, 플러그를 0.5mg/ml EE 펩티드(Anaspec, San Jose, CA)를 함유하는 PBS(pH 6.0) 200ml를 사용하여 5ml/분으로 용리했다. 사용된 EE 펩티드는 서열 EYMPME(SEQ ID NO:41)을 가진다. 컬럼을 PBS를 가지는 10CVs로 세척한 후, 5CVs의 0.2M 글리신, pH 3.0을 사용하여 용리했다. 글리신-용리 컬럼의 pH를 2CVs의 5X PBS를 사용하여 7.0으로 조정한 후, PBS(pH 7.4)로 평형화시켰다. 5ml 분획을 용리 크로마토그래피 전체에 걸쳐 수집하고, 280 및 215nm에서의 흡광도를 모니터했다; 또한, 통과 및 워시풀을 저장하고, 분석했다. 관심있는 EE-폴리펩티드 용리 분획을 모으고, 제조자의 지시에 따라 10,000달톤 분자량 컷오프 막 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 60ml-5.0ml로 농축했다.

다른 공-정제 단백질로부터 zalpha11CEE를 단리하기 위해, 농축된 폴리펩티드 용리 수집 분획을 pH 8.0에서 POROS HQ-50(강 이온 교환 수지, PerSeptive, BioSystems, Framingham, MA)를 행했다. 1.0×6.0cm 컬럼을 붓고, BioCad Sprint 상에서 흐름 충전시켰다. 컬럼을 반대 이온으로 하전시킨 후, 20mM 트리스 pH 8.0(트리스(히드록시메틸 아미노메탄))으로 평형화시켰다. 샘플을 1:13으로 희석한 후(PBS의 이온 강도를 감소시키기 위해), 5ml/분으로 Poros HQ 컬럼 상에 로딩했다. 컬럼을 20mM 트리스 pH 8.0을 사용하여 10CVs 동안 세척한 후, 40CV 구배의 20mM 트리스/1M 염화나트륨(NaCl)을 사용하여 10ml/분으로 용리했다. 1.5ml 분획을 전체 크로마토그래피에 걸쳐 수집하고, 280-215nm에서의 흡광도를 모니터했다. 용출 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색에 의해 분석했다. 관심의 분획을 모으고, 제조자의 지시에 따라 10,000 달톤 분자량 컷오프 막 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 1.5-2ml로 농축했다.

유리 EE 펩티드 및 어떤 오염된 공-정제 단백질로부터 zalpha11CEE 폴리펩티드를 분리하기 위해서, 모인 농축된 분획을 BioCad Sprint를 사용하여 PBS로 평형화된 1.5X90cm 세파덱스 S200(Pharmacia, Pistacaway, NJ) 컬럼 상에서 1.0ml/분의 흐름 속도로 크로마토그래피했다. 1.5ml 분획을 전체 크로마토그래피를 가로질러 수집하고, 280 및 215nm에서의 흡광도를 모니터했다. 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색에 의해 특성화하고, 가장 순수한 분획만을 모았다. 이 물질을 정제된 zalpha11CEE 폴리펩티드로 표시한다.

이 정제된 물질을 최종적으로 4ml ActiClean Etox(Sterogene) 컬럼하여, 어떤 남아있는 엔도톡신을 제거했다. 샘플을 4회 PBS 평형화된 중력 컬럼 상에 통과시킨 후, 컬럼을 3ml PBS로 1회 세척하고, 이것을 "깨끗한" 샘플로 모았다. 다음에, 물질을 0.2 마이크론 스테릴 여과하고, 그것이 분취될때까지 -80℃에서 저장했다.

Coomassie Blue 및 Silver 염색된 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯에 있어서, zalpha11CEE 폴리펩티드는 50,000 달톤의 분명한 분자량의 1개 주요 밴드였다. 이 밴드의 이동도는 감소 및 비-감소 겔에서 동일했다.

정제된 물질의 단백질 농축을 BCA 분석(Pierce, Lockford, IL)에 의해 수행하고, 단백질을 분취하고, 표준 과정에 따라 -80℃에서 저장했다. IEF(이소일렉트릭 포커싱) 겔 상에서, 단백질을 4.5 이하의 PI를 가지도록 했다. zalpha11CEE 폴리펩티드의 농도는 1.0mg/ml였다.

정제된 zalpha11CEE 폴리펩티드를 토끼에 주입하기 위해 제조하고, 생성된 항체를 R & R Research and Development(Stanwood, WC)로 보냈다. 토끼에게 주입하여 항-huzalpha11-CEE-BHK 혈청을 생성했다(아래 실시예 15)

항-EE 세파로스를 제조하기 위해, 100ml 베드 부피의 단백질 G-세파로스 (Pharmacia, Pistacaway, NJ)를 500ml Nalgene 0.45 마이크론 필터 단위를 사용하여 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS 100ml로 3회 세척했다. 겔을 6.0 부피의 200mM 트리에탄올아민 pH 8.2(TEA, Sigma, St., Louis, MO)으로 세척하고, 900mg 항체를 함유하는 EE 항체 용액을 동일한 부피로 가했다. 4℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 미결합 항체를 상기 기재된 바대로 5 부피의 200mM TEA로 수지를 세척함에 의해 제거했다. 수지를 2 부피의 TEA에 재현탁하고, 적합한 용기로 옮기고, TEA에 용해된 디메틸피밀리미데이트-2HCl(Pierce, Lockford, IL)을 36mg/ml 단백질 G-세파로스 겔의 최종 농도로 가했다. 겔을 실온에서 45분 동안 굳히고, 액체를 상기 기재된 바대로 여과 단위를 사용하여 제거했다. 다음에, 겔상의 비특이 부위를200mM TEA 중 5 부피의 20mM 에탄올아민을 사용하여 실온에서 10분 동안 배양함에 의해 차단했다. 다음에, 겔을 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 5 부피의 PBS로 세척하고, 이 용액을 4℃에 저장했다.

B. BHK 570으로부터 zalpha11CFLAG 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업은 4℃에서 수행했다. 다음 과정을 C-말단 FLAG(FLG)(Sigma-Aldrich Co.) 태그를 함유하는 zalpha11 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용했다. 30l의 세포 팩토리 컨디셔닝 배지를 ProFlux A30 상에서 Amicon S10Y3 원형 카트리지를 사용하여 1.7l로 농축했다. 프로테아제 억제제 용액을 2.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Sigma Chemical Co., St., Louis, MO), 0.003mM 뢰펩틴(Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001mM 펩스타틴 (Boerhinger Mannheim) 및 0.4mM Pefabloc(Boerhinger Mannheim)의 최종 농도로 감염된 BHK 570 세포(실시예 10 참조)로부터 1.7l의 농축된 세포 팩토리 컨디셔닝 배지에 가했다. 샘플을 분석을 위해 제거하고, 벌크 부피를 정제가 시작될 때까지 -80℃에서 냉각했다. 총 목표 단백질 농도의 농축된 세포 팩토리 컨디셔닝 배지를 SDS-PAGE 및 항-FLAG(Kodak) HRP 콘쥬게이트 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정했다. 항-FLAGM2-아가로스 친화 겔(Sigma-Aldrich Co.)의 125ml 컬럼을 Waters AP-5, 5cm×10cm 유리 컬럼에 부었다. 컬럼을 흐름 충전하고, 포스페이트 완충 살린(PBS) pH 7.4를 가지는 BioCad Sprint(PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 평형화시켰다. 농축된 세포 팩토리 컨디셔닝 배지를 해동하고, 0.2 마이크론 스테릴 여과하고, pH를 7.4로 조정한 후, 하룻밤 동안 1ml/분 흐름 속도로 컬럼에 로딩했다. 컬럼을 10 컬럼 부피(CVs)의 포스페이트 완충 살린(PBS, pH 7.4)로 세척한 후, 플러그를 0.5mg/ml FLAG(Sigma-Aldrich Co.)를 함유하는 PBS(pH 6.0) 250ml를 사용하여 5ml/분으로 용리했다. 사용된 FLAG펩티드는 서열 DYKDDDDK(SEQ ID NO:49)을 가진다. 컬럼을 PBS를 가지는 10CVs로 세척한 후, 5CVs의 0.2M 글리신, pH 3.0을 사용하여 용리했다. 글리신-용리 컬럼의 pH를 2CVs의 5X PBS를 사용하여 7.0으로 조정한 후, PBS(pH 7.4)로 평형화시켰다. 5ml 분획을 용리 크로마토그래피 전체에 걸쳐 수집하고, 280 및 215nm에서의 흡광도를 모니터했다; 또한, 통과 및 워시풀을 저장하고, 분석했다. FLAG-폴리펩티드 용리 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색 및 항-FLAG HRP 콘쥬게이트 항체를 가지는 웨스턴 블롯팅에 의해 목표 단백질에 대해 분석했다. 관심의 폴리펩티드 용리 분획을 모으고, 제조자의 지시에 따라 10,000달톤 분자량 컷오프 막 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 80ml-12ml로 농축했다.

다른 공-정제 단백질로부터 zalpha11CFLG를 분리하기 위해, 농축된 폴리펩티드 용리 수집 분획을 pH 8.0에서 POROS HQ-50(강 이온 교환 수지, PerSeptive, BioSystems, Framingham, MA)를 행했다. 1.0×6.0cm 컬럼을 붓고, BioCad Sprint 상에서 흐름 충전시켰다. 컬름을 반대 이온으로 하전시킨 후, 20mM 트리스 pH 8.0(트리스(히드록시메틸 아미노메탄))으로 평형화시켰다. 샘플을 1:13으로 희석한 후(PBS의 이온 강도를 감소시키기 위해), 5ml/분으로 Poros HQ 컬럼 상에 로딩했다. 컬럼을 20mM 트리스 pH 8.0을 사용하여 10CVs 동안 세척한 후, 40CV 구배의 20mM 트리스/1M 염화나트륨(NaCl)을 사용하여 10ml/분으로 용리했다. 1.5ml 분획을 전체 크로마토그래피에 걸쳐 수집하고, 280-215nm에서의 흡광도를 모니터했다. 용출 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색에 의해 분석했다. 관심의 분획을 모으고, 제조자의 지시에 따라 10,000 달톤 분자량 컷오프 막 스핀 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 1.5-2ml로 농축했다.

유리 FLAG펩티드 및 어떤 오염된 공-정제 단백질로부터 zalpha11CFLG 폴리펩티드를 분리하기 위해서, 모인 농축된 분획을 BioCad Sprint를 사용하여 PBS로 평형화 및 로딩된 1.5×90cm 세파크릴 S200(Pharmacia, Piscataway, NJ) 컬럼 상에서 1.0ml/분의 흐름 속도로 크로마토그래피했다. 1.5ml 분획을 전체 크로마토그래피를 가로질러 수집하고, 280 및 215nm에서의 흡광도를 모니터했다. 피크 분획을 SDS-PAGE Silver 염색에 의해 특성화하고, 가장 순수한 분획만을 모았다. 이 물질을 정제된 zalpha11CFLG 폴리펩티드로 표시한다.

이 정제된 물질을 최종적으로 4ml ActiClean Etox(Sterogene) 컬럼하여, 어떤 남아있는 엔도톡신을 제거했다. 샘플을 4회 PBS 평형화된 중력 컬럼 상에 통과시킨 후, 컬럼을 3ml PBS로 1회 세척하고, 이것을 "깨끗한" 샘플로 모았다. 다음에, 물질을 0.2 마이크론 스테릴 여과하고, 그것이 분취될때까지 -80℃에서 저장했다.

Coomassie Blue 및 Silver 염색된 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯에 있어서, zalpha11CFLG 폴리펩티드는 50,000 달톤의 분명한 분자량의 1개 주요 밴드였다. 이밴드의 이동도는 감소 및 비-감소 겔에서 동일했다.

정제된 물질의 단백질 농축을 BCA 분석(Pierce, Lockford, IL)에 의해 수행하고, 단백질을 분취하고, 표준 과정에 따라 -80℃에서 저장했다. IEF(이소일렉트릭 포커싱) 겔 상에서, 단백질을 4.5 이하의 PI를 가지도록 했다. zalpha11CFLG 폴리펩티드의 농도는 1.2mg/ml였다.

C. 감염된 BHK 570 세포로부터 zalpha11-Fc4 폴리펩티드의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업은 4℃에서 수행했다. 다음 과정을 사람 IgG/Fc에 융합한 C-말단을 함유하는 zalpha11 폴리펩티드(zalpha11-Fc4; 실시예 8 및 9)를 정제하기 위해 사용했다. zalpha11-Fc4(실시예 10)로 감염된 BHK 570 세포로부터 12,000l의 컨디셔닝 배지를 0.2mm 스테릴화 필터를 통해 여과한 후, 0.001mM 뢰펩틴(Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001mM 펩스타틴 (Boerhinger Mannheim) 및 0.4mM Pefabloc(Boerhinger Mannheim)의 최종 농도로, 프로테아제 억제제 용액으로 보충했다. 단백질 G 세파로스(6ml 베드 부피, Pharmacia Biotec)를 충전하고, 500ml PBS(Gibco/BRL)로 세척했다. 보충된 컨디셔닝 배지를 10ml/분의 흐름 속도로 컬럼을 통과시키고, 이어서, 1000ml PBS(BRL/Gibco)로 세척했다. zalpha11-Fc4를 0.1M 글리신 pH 3.5를 사용하여 용리하고, 2ml 분획을 0.2ml 2M 트리스 pH 8.0으로 직접 수집하고, 분획을 최종 pH 7.0으로 조정했다.

용리된 분획을 SDS-PAGE 및 항-사람 Fc(Amersham) 항체를 가지는 웨스턴 블롯팅에 의해 특성화했다. 감소한 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯 분석은 분획 2-10에서80,000KDa의 면역 반응성 단백질을 나타냈다. 또한, Silver 염색된 SDS-PAGE 겔이 분획 2-10에서 80,000KDa zalpha11:Fc 폴리펩티드를 나타냈다. 분획 2-10을 모았다.

모아진 분획의 단백질 농축을 BCA 분석(Pierce, Lockford, IL)에 의해 수행하고, 물질을 분취하고, 표준 과정에 따라 -80℃에서 저장했다. 모아진 분획의 농도는 0.26mg/ml였다.

실시예 12

zalpha11 가용성 리셉터 zalpha11CEE, zalpha11CFLG 및 zalpha11-Fc4를 사용한 분석

경쟁적 억제 분석에 있어서 (돌연변이) 가용성 리셉터

BaF3/zalpha11 세포를 스핀다운시켰고, mIL-3 미함유 배지로 세척했다. 세포를 회전시켰고, 3회 세척하여 mIL-3의 제거를 확실하게 했다. 다음에, 세포를 헤마시토미터로 계수했다. 세포를 mIL-3 미함유 배지를 사용하여 웰 당 100㎕ 부피 및 5000 세포로 96-웰 포멧에 플레이트했다.

실시예 8에 기재된, 원숭이 비장 세포 활성화 및 CD3+ 선택된 세포로부터의 배지 모두를 10㎍/ml로 zalpha11 가용성 리셉터를 가지거나 또는 가지지 않고, 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125%, 1.5%, 0.75% 및 0.375% 농도로 분리된 실험에 가했다(CEE, C-플래그, 및 Fc4 구성; 실시예 10 및 11 참조). 총 분석 부피는 200㎕이다.

Alamar Blue(Accumed)가 20㎕/웰로 가해지는 때로부터, 분석 플레이트를 3일동안 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. 플레이트를 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양했다. 플레이트를 상기 기재된 바대로(실시예 5) Fmax^TM플레이트 리더 (Molecular Devices) 상에서 판독했다. 결과는 10㎍/ml의 각각의 상이한 zalpha11 가용성 리셉터 구성물로부터 세포 성장의 완벽한 억제를 증명했고, 각 샘플의 인자가 zalpha11 리셉터에 대해 특이성임을 확인했다.

또한, 가용성 리셉터로 희석한 적정 곡선을 상기 기술된 분석을 사용하여 수행했다. zalpha11CEE 및 zalpha11CFLG 가용성 zalpha11 리셉터는 모두 20ng/ml 만큼 낮게 성장을 완벽하게 억제할수 있었다. 돌연변이 zalpha11-Fc4 가용성 리셉터는 1.5㎍/ml에서만 효과적이었다.

실시예 13

대장균에서의 사람 zalpha11의 발현

A. huzalpha11/MBP-6H 융합 폴리펩티드를 발현하는 발현 벡터 pCZR225의 구성

말토스 결합 단백질(MBP)에 C-말단적으로 융합된 사람 zalpha11 가용성 리셉터를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 플라스미드를 상동성 재조합에 의해 구성했다. MBP-zalpha11 가용성 리셉터 융합 폴리펩티드에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:51에 나타낸 해당 단백질 서열과 함께, SEQ ID NO:50으로 나타낸다. 실시예 14에서, huzalpha11/MBP-6H로 지정된 융합 폴리펩티드는 사람 zalpha11 가용성 리셉터(SEQ ID NO:51의 아미노산 389(Cys)-아미노산 606(His))에융합된 MBP 부분(SEQ ID NO:51의 아미노산 1(Met)-아미노산 388(Ser))을 함유한다. 사람 zalpha11 cDNA(SEQ ID NO:52)의 단편을 PCR을 사용하여 분리했다. 두개의 프라이머를 PCR 반응에서 사람 zalpha11 단편의 제조에 사용했다: (1) 40bp의 벡터 플랭킹 서열 및 사람 zalpha11의 아미노 말단에 해당하는 25bp를 함유하는 프라이머 ZC20,187(SEQ ID NO:53), 그리고 (2) 플랭킹 벡터 서열에 해당하는 40bp의 3' 단부 및 사람 zalpha11의 카르복실 말단에 해당하는 25bp를 함유하는 프라이머 ZC20,185(SEQ ID NO:54). PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 30초 동안 94℃, 30초 동안 50℃, 1분 동안 72℃ 25 사이클; 이어서 4℃에서 소킹, 2회 실시. 100㎕ PCR 반응물 중 2㎕를 분석을 위해 1X TBE 완충액을 가지는 1.0% 아가로스 겔 상에 두었고, 예상한 대략 660bp 단편을 보였다. 남아있는 90㎕의 PCR 반응물을 순수한 에탄올 400㎕로 침전된 2차 PCR 튜브와 조합했다. SmaI로의 재조합을 위해 사용된 침전된 DNA를 수용체 벡터 pTAP98로 절단하여, 아래 설명된 바, MBP-zalpha11 융합을 인코딩하는 구성물을 제조했다.

플라스미드 pTAP98을 플라스미드 pRS316 및 pMAL-c2로부터 유도했다. 플라스미드 pRS316은Saccharomyces cerevisiae셔틀 벡터이다(Hieter P. and Sikorski R., Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-C2(NEB)는 대장균 발현 플라스미드이다. 그것은MalE(MBP를 인코딩하는 유전자)를 드라이빙하는 택 프로모터, His 태그, 트롬빈 절단 부위, 클로닝 부위, 및rrnB터미네이터를 가진다. 벡터 pTAP98을 이스트 상동성 재조합을 사용하여 구성했다. EcoR1 절단 pMAL-c2 100ng을 1㎍ Pvul 절단 pRS316, 1㎍ 링커, 및 1㎍ Scal/EcoR1 절단 pRS316을 사용하여 재조합했다. 올리고스 ZC19,372(SEQ ID NO:55)(100pmol): ZC19,351(SEQ ID NO:56)(1pmol): ZC19,352(SEQ ID NO:57)(1pmol), 및 ZC19.371(SEQ ID NO:58)(100pmol)로 구성된 링커를 PCR 반응에 조합했다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 30초 동안 94℃, 30초 동안 50℃, 30초 동안 72℃ 10 사이클; 이어서 4℃ 소킹. PCR 생성물을 100% 에탄올 침전에 의해 농축했다.

수용성 이스트 세포(S. cerevisiae) 100㎕를 상기 사람 zalpha11 리셉터 PCR 생성물 대략 1㎍, 및 SmaI 분해된 pTAP98 벡터를 함유하는 혼합물 10㎕과 조합하고, 0.2cm 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 이스트/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), 무한 Ω, 25μF에서 전기천공했다. 각 큐벳에 1.2M 소르비톨 600㎕를 가한 후, 이스트를 두개의 URA D 플레이트 상의 300㎕ 분취액에 플레이트하고 30℃에서 배양했다.

약 48 시간 후, 1개 플레이트로부터 Ura+ 이스트 형질전환체를 1ml H₂O에 재현탁하고, 간단히 회전시켜 이스트 세포를 펠렛화했다. 세포 펠렛을 1ml 리시스 완충액(2% 트리톤 X-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA)에 재현탁했다. 리시스 혼합물 500㎕를 300㎕ 산 세척 유리 비드 및 200㎕ 페놀-클로로포름을 함유하는 에펜드로프 튜브에 가하고, 1분 간격으로 2 또는 3회 와동시키고,이어서 5분 동안 최대 속도로 에펜드로프 원심분리기에서 회전시켰다. 수성상 300㎕를 신선한 튜브로 옮기고, DNA를 600㎕ 에탄올(EDTA)로 침전시키고, 이어서 4℃에서 10분 동안 원심분리했다. DNA 펠렛을 100㎕ H₂O에 재현탁했다.

전기수용성 대장균 세포의 형질전환(MC1061, Casadaban et al., J. Mol.Biol. 138, 179-207)을 1㎕ 이스트 DNA prep 및 40㎕ MC1061 세포를 사용하여 행했다. 세포를 2.0kV, 25μF, 400Ω에서 전기천공했다. 전기천공 후, 0.6ml SOC(2% Bacto^TM트립톤(Difco, Detroit, MI), 0.5% 이스트 추출물(Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 글루코스)를 MM/CA+AMP 100mg/l 플레이트 상의 1개 분취액에 플레이트했다(Pryor and Leiting, Protein Expression and Purification, 10:309-319, 1997)

사람 zalpha11 리셉터에 대한 정확한 발현 구성을 하보링하는 세포를 발현에 의해 확인했다. 세포를 37℃에서 교반하면서, 100㎍/ml 암피실린을 가지는 MM/CA에서 2시간 동안 성장시켰다. 배양물 1ml를 1mM IPTG를 사용하여 유도했다. 2-4시간 후, 각 배양물 250㎕를 250㎕ 산 세척 유리 비드 및 5% βME 및 염료를 가지는 250㎕ 토너 완충액(8M 우레아, 100mM 트리스 pH 7.0, 10% 글리세롤, 2mM EDTA, 5% SDS)와 혼합했다. 샘플을 1분 동안 와동시키고, 10분 동안 65℃까지 가열했다. 20㎕를 4%-12% PAGE 겔(NOVEX) 상에 레인 당 로딩했다. 겔을 1×MES 완충액에 두었다. 양성 클론을 pCZR225로 지정하여, 서열 분석을 행했다. MBP-zalpha11 융합의 폴리뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO:50으로 나타낸다.

B. 사람 huzalpha11/MBP-6H 융합 폴리펩티드의 박테리아 발현

서열화한 DNA 1㎕를 균주 BL21을 형질전환하는데 사용했다. 세포를 2.0kV, 25μF 및 400Ω에서 전기천공했다. 전기천공 후, 100mg/L 암피실린을 가지는 0.6ml MM/CA.

세포를 37℃에서 교반하면서, 2시간 동안 100㎍/ml 암피실린을 가지는 MM/CA에서 성장시켰다. 배양물 1ml를 1mM IPTG를 사용하여 유도했다. 2-4시간 후, 각 배양물 250㎕를 250㎕ 산 세척 유리 비드 및 5% βME 및 염료를 가지는 250㎕ 토너 완충액(8M 우레아, 100mM 트리스 pH 7.0, 10% 글리세롤, 2mM EDTA, 5% SDS)와 혼합했다. 샘플을 1분 동안 와동시키고, 10분 동안 65℃까지 가열했다. 20㎕를 4%-12% PAGE 겔(NOVEX) 상에 레인 당 로딩했다. 겔을 1×MES 완충액에 두었다. 양성 클론을 huzalpha11/MBP-6H 융합 단백질의 단백질 증식을 위한 성장에 사용했다(아래 실시예 14).

실시예 14

대장균 발효로부터의 huzalpha11/MBP-6H 가용성 리셉터의 정제

다른 언급이 없다면, 모든 작업은 4℃에서 수행했다. 다음 과정을 huzalpha11/MBP-6H 가용성 리셉터 폴리펩티드를 정제하기 위해 사용했다. pCZR225 구성물을 함유하고 huzalpha11/MBP-6H 가용성 리셉터(실시예 13)를 발현하는 대장균 세포를 SuperBrothII(12g/L 카지엔, 24g/L 이스트 추출물, 11.4g/L 디-칼륨 포스페이트, 1.7g/L 모노-칼륨 포스페이트; Becton Dickenson, Cockeysville, MD)에서 성장시키고, 0.5% 글리세롤에서 냉동시켰다. SuperBrothII + 글리세롤의 냉동된 세포 20g을 단백질을 정제하기 위해 사용했다. 냉동된 세포를 해동하고, 세포를 용균시키고 huzalpha11/MBP-6H 가용성 리셉터 단백질을 유리하기 전, 프로테아제 억제제 용액(추출 완충액)에 1:10으로 희석했다. 희석된 세포는 20mM 트리스(JT Baker, Philipsburg, NJ), 100mM 염화나트륨(NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY),0.5mM 불화페닐메틸술포닐(PMSF, Sigma Chemical Co., St., Louis, MO), 2㎍/ml 뢰펩틴(Fluka, Switzerland), 2㎍/ml 아프로티닌(Sigma)의 최종 농도를 함유했다. -7~-10℃의 온도 및 30K PSI를 가지는 French Press 세포 파괴 시스템(Constant Systems, Ltd., Warwick, UK)를 사용하여 세포를 용균시켰다. 희석된 세포를 French Press 전후 A₆₀₀리딩하여 파괴에 대해 조사했다. 용균된 세포를 45분 동안 @ 18,000G 원심분리하여, 파괴된 세포 부스러기를 제거하고, 상층액을 사용하여 단백질을 정제했다. 상층액의 총 목표 단백질 농도를 제조자의 지시에 따라 BCA 단백질 분석(Pierce, Lockford, IL)에 의해 결정했다.

탈론 금속 친화성 수지(Clontech, Palo Alto, CA)의 25ml 컬럼(아래 기재된 바대로 제조된)을 Bio-Rad, 2.5cm D×10cm H 유리 컬럼에 부었다. 컬럼을 충전하여, 10 컬럼 부피의 탈론 평형 완충액(20mM 트리스, 100mM NaCl, pH 8.0)을 사용하여 중력에 의해 평형화시켰다. 상층액을 탈론 금속 친화성 수지에 뱃치 로딩하고, 하룻밤 동안 굳혔다. 수지를 컬럼에 도로 붓고, 10CVs의 탈론 평형 완충액을 사용하여 중력에 의해 세척한 후, 중력을 용리 완충액(탈론 평형 완충액 + 200mM 이미다졸-Fluka Chemical)을 사용하여 용리했다. 탈론 컬럼을 5CVs의 20mM 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 pH 5.0(MES, sigma), 5CVs의 희석된 H₂O를 사용하여 청소한 후, 20% 에탄올/0.1% 나트륨 아지드에 저장했다. 14ml 분획을 용리 크로마토그래피 전체에 걸쳐 수집하고, 분획을 280 및 320nm에서의 흡광도 및 BCA 단백질 분석을 사용하여 판독했다; 또한, 통과 및 워시풀을 저장하고 분석했다. 관심의 단백질 용리분획을 모으고, 아밀로스 수지(New England Biolabs, Beverly, MA)에 바로 로딩했다.

더 순수한 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드를 얻기 위해, 탈론 친화성 용리 수집 분획을 pH 7.4의 아밀로스 수지(22mls)에 행했다. 2.5cm D×10cm H Bio-Rad 컬럼을 붓고, 충전하고, 10CVs의 아미로스 평형 완충액-20mM 트리스(JT Baker), 100mM NaCl(Malinkrodt), 1mM PMSF(Sigma), 10mM β-메르캅토에탄올(BME, ICN Biomedical Inc., Aurora, OH) pH 7.4로 평형화시켰다. 샘플을 0.5ml/분의 중력 흐름 속도로 로딩했다. 컬럼을 아밀로스 평형 완충액을 사용하여 10CVs 동안 세척한 후, 중력에 의해 ~2CV의 아밀로스 평형 완충액 + 10mM 말토스(Fluka Biochemical, Switzerland)를 사용하여 용리했다. 5ml 분획을 전체 크로마토그래피에 걸쳐 수집하고, 280 및 320nm에서의 흡광도를 판독했다. 아밀로스 컬럼을 1CV의 희석된 H₂O, 5CVs의 0.1%(w/v)SDS(Sigma), 5CVs의 희석된 H₂O, 및 다음에 5CVs의 아밀로스 평형 완충액으로 재발생시켰다.

관심의 분획을 모으고, 4 x 4L PBS pH 7.4(Sigma)를 사용하는 Slide-A-Lyzer(Pierce)에서 투석하여 저분자량 오염물을 제거하고, 완충액을 교환하고, 탈염했다. PBS의 교체 후, 수확된 물질을 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드로 표시했다. 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드를 SDS-PAGE 코오마시에 염색 및 항-토끼 HRP 콘쥬게이트 항체(Lockland, Gilbertsville, PA)를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드의 농도는 BCA 분석에 의해 결정된 바대로 1.92mg/ml였다.

정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드를 토끼에 주입하기 위해 제조하고, 항체 제조를 위해 R & R Research and Development(Stanwood, WC)로 보냈다. 토끼에 주입하여 항 항-huzalpha11/MBP-6H 혈청을 제조했다(아래 실시예 15).

실시예 15

zalpha11 단클론성 항체

단클론성 항체를 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드(실시예 14), 또는 정제된 재조합 zalpha11CEE 가용성 리셉터(실시예 11A)를 사용하여, 두개의 여성 뉴질랜드 흰토끼를 면역화하여 제조했다. 해당 단클론성 항체를 토끼 항-huzalpha11/ MBP-6H 및 토끼 항-huzalpha11CEE-BHK로 각각 지정했다. 토끼에게 매주 Complete Freund's Adjuvant(Pierce, Lockford, IL)의 정제된 단백질 200mg의 초기 복내강(IP) 주사를 각각 제공하고, 이어서 Incomplete Freund's Adjuvant의 정제된 단백질 100mg의 효능촉진제를 IP 주사했다. 삼차 효능촉진제 주사의 투여 7-10일 후, 동물에서 채혈하고, 혈청을 수집했다. 다음에 토끼를 부스터하고, 3주 마다 채혈했다.

zalpha11-특이 단클론성 항체를 CNBr-SEPHAROSE 그램 당 정제된 huzalpha11/MBP-6H 폴리펩티드(실시예 14) 10mg을 사용하여 제조된 CNBr-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼(Pharmacia LKB)를 사용하여 토끼 혈청으로부터 친화성 정제하고, 이어서 하룻밤 동안 PBS에서 20× 투석했다. zalpha11-특이 항체를 항체 목표로서 적합한 단백질 항원 1mg/ml를 사용하여 ELISA 타이터 조사에 의해 특성화했다. 토끼 항-huzalpha11/MBP-6H 친화성 정제된 항체의 낮은 검출 한계(LLD)는 500pg/ml의 희석물이다. 토끼 항-huzalpha11CEE-BHK 친화성 정제된 항체의 LLD는 50pg/ml의 희석물이다.

실시예 16

RT-PCR을 사용한 zalpha11 리셉터 발현 세포의 확인

특이 사람 세포형을 분리하고, RT-PCR에 의해 zalpha11 발현에 대해 스크린했다. B-세포를 100㎛ 나일론 세포 스트레이너(FalconTM; Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ)를 통해 기계적으로 분열시켜 신선한 사람 편도선으로부터 분리했다. B-세포 현탁액을 VarioMACS VS+ 자기 컬럼을 사용한 양성 선택에 의해 CD19+ B-세포 및 제조자의 지시에 따라 CD19 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)로 부화했다. T-세포 및 단핵세포를 사람 어피어스드 혈액 샘플로부터 분리했다. CD3+ T-세포를 CD3 마이크로비드 VarioMACS 양성 선택에 의해 정제하고, 단핵세포를 제조자의 지시에 따라 VarioMACS 음성 선택 컬럼(Miltenyi)에 의해 정제했다. 각 개체군으로부터의 샘플을 염색하고, 형광 항체 세포 정렬화(FACS)(Bectin Dickenson, San Jose, CA) 분석에 의해 분석하여 부화 퍼센트 및 결과의 수율을 결정했다. CD19+ B-세포는 대략 96%, CD3+ T-세포는 대략 95%, 단핵세포는 대략 96% 정제되었다.

휴면 또는 활성인 모든 3개 세포형으로부터 당업계의 표준 방법을 사용하여 RNA를 제조했다. RNA를 상기 컬럼 조제품으로부터 직접적으로 휴면 세포로부터 분리했다. CD19+ 및 CD3+ 세포를 4 및 24시간 동안 PMA 5ng/ml(Calbiochem, LaJolla, CA) 및 Ionomycin 0.5ug/ml(Calbiochem)을 함유하는RPMI+10%FBS 중에서 500,000세포/ml로 배양함에 의해 활성화했다. 단핵세포를 24시간 동안 LPS 10ng/ml(Sigma St., Louis, MO) 및 rhIFN-g 10ng/ml(R&D, Minneapolis, MN)를 함유하는 RPMI+10%FBS에서 배양함에 의해 활성화했다. 세포를 수득하고, PBS로 세척했다. RNA를 RNeasy MidiprepTM 키트(Qiagen, Balencia, CA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 세포 펠렛으로부터 제조하고, 일차 스트랜드 cDNA 합성을 제조자의 프로토콜에 따라 SuperscriptIITM 키트(Gibco BRL, Grand Island, NY)을 사용하여 발생시켰다.

올리고스 ZC19907(SEQ ID NO:20) 및 ZC19908(SEQ ID NO:21)을 PCR 반응에 사용하여 zalpha11 메세지에 해당하는 1.2kb 단편에 대해 상기 기재된 샘플을 스크린했다. PCR 증폭을 Taq 폴리머라제(BRL Grand Island, NY)을 사용하여 수행했다. 조건은 다음과 같았다: 1분 동안 95℃, 1분 동안 60℃, 30초 동안 72℃ 35 사이클; 10분 동안 72℃ 1 사이클; 4℃ 소킹. 각 50㎕ 반응물 부피 중 10ul을 2% 아가로스 1XTAE 겔 상에 두어 결과의 생성물을 확있했다. PCR 생성물을 생성물 없음에 대해 (-)로, 밴드 보임에 대해 (+)로, 증가된 밴드 존재에 대해 (++)로, 가장 지배적인 밴드에 대해 (+++)로 기록하고, 아래 표 5에 결과를 나타냈다.

이들 결과는 zalpha11 메세지가 휴면 사람 CD19+ B-세포에 존재하고 미토젠 활성이 증가한다는 것을 나타냈다. 또한, 4시간 활성화 후, 사람 CD3+ T-세포에 의해서만 발현된다는 것이 나타났다. 휴면 또는 활성 사람 단핵세포에서 메세지는 나타나지 않았다.

실시예 17

zalpha 11 면역조직화학

A. 세포 및 조직 제조

양성 대조표준 조직을 HSD(Harlan Spraque Dawley, Indianapolis, IN)로부터 제공받은 마우스 림프절, 비장 및 흉선, Resigonal Primate Research Center(University of Washington, Seattle, WC)로부터 제공받은 원숭이 림프절 및 비장, CHTN(Cleveland, OH)으로부터 제공받은 사람 림프절 및 비장을 포함하는, zalpha11을 발현하는 것으로 알려진 zalpha11(실시예 7)로 감염된 BaF3 세포 및 임파 조직으로 구성했다. 각 조직 샘플 상에서 수행된 음성 대조표준은 (1) 비감염BaF3 세포, (2) zalpha 11을 발현하지 않는다고 알려진 마우스 및 사람으로부터의 간 및 뇌, (3) 일차 항체의 부존재하의 항체 희석 완충액(Ventann Biotek Systems, Tucson, AZ)을 사용한 염색, 및 (4) 경쟁 실험에서 zalpha11 가용성 단백질의 사용을 포함한다.

다른 세포 샘플을 시험했다. 비-자극 및 자극 HL60 세포를 모두 분석했다. HL60 세포는 전골수구 셀라인이며, 이것은 상이한 시약을 사용하여 골수 또는 과립백혈구 계통으로 분화될수 있다. 자극 HL60 샘플을 다음과 같이 제조했다: (1) HL60 세포를 48시간 동안 10ng/ml의 포르볼-미리스테이트-아세테이트(PMA)(Sigma, St. Louis, MO)로 처리하여 단핵세포 계통 세포로 분화시키고; (2) 4일 동안 1.25% DMSO(Sigma)로 HL60 세포를 처리하여 중성백혈구-모양 세포로 분화시켰다. 이에 더하여, 신선한 사람 혈액으로부터의 사람 다형핵(PMN) 세포, 사람 과립백혈구, 사람 말초 혈액 림프구(PBL) 및 사람 단핵세포를 시험했다(당업계의 관습적인 방법을 사용하여 하우스에서 제조됨). 상기 기재된 세포 및 조직을 10% NBF(Surgipath, Richmond, IL)에 하룻밤 동안 고정시키고, 파라팔스트 X-tra(Oxford Scientific, St. Louis, MO)에서 포매시키고, Reichart-Jung 2050 마이크롬(Leica Instruments GmbH, Nussloch, Germany)을 사용하여 5㎛로 구획했다.

B. 면역조직화학

조직 슬라이드를 탈파라핀화하고, 완충액(물)으로 수화시키고, Antigen Retrieval Citra 완충액(BioGeneX, San Roman, CA)에서 20분 동안 증기 HIER 처리했다. 5% 정상 염소 혈청(Vector, Burlingame, CA)을 사용하여 10분 동안 비-특이결합을 차단했다. 면역조직화학성 스크리닝 분석을 각각 1:200 및 1:400으로 희석하여 일차 항체로서 zalpha11 가용성 리셉터 단백질(토끼 항-huzalpha11-MBP-6H 및 토끼 항-huzalpha11-CEE-BHK; 실시예 15 참조)에서 단클론성 항체를 사용하여 수행했다. 바이오틴 콘쥬게이트 염소 항-토끼 IgG(벡터; Cat. No. BA-1000, 1.5mg/ml)를 1:200으로 희석하여 이차 항체로서 사용했다. 분리된 샘플에서, 단백질 경쟁을 일차 항체에서 추가 zalpha11CEE 가용성 리셉터 단백질(10×배 과량)(실시예 11A)를 사용하여 수행하여 일차 항체 면역반응을 미리 차단했다. 이 경쟁을 zalpha11에서 토끼 단클론성 항체 특이성에 대한 대조표준으로서 사용했다. 검출을 제조자의 지시에 따라 ChemMate DAB 키트(스트렙트아비딘-겨자무 과산화효소 콘쥬게이트 및 DAB 기질을 사용하는 표지된 스트렙트아비딘-바이오틴 키트) 및 30초 동안 제조자의 헤마토크실린 대조염색(Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ)을 사용하는 Ventana ChemMate 500 기계 상에서 수행했다.

zalpha11의 높은 발현이 PMA-활성 HL60 세포에서 관찰되었다. 낮은 수준의 발현이 비자극 PBL 및 HL60 세포에서 관찰되었다. 마우스 비장, 흉선 및 림프절에서 세포의 부속조는 양성 염색을 나타냈다. 사람과 원숭이의 림프절 및 비장, 그리고 DMSO 자극된 HL60 세포는 최소한의 염색을 나타내거나, 또는 염색을 나타내지 않았다. 신호가 세포에서 나타났고, 조직이 과량의 zalpha11 가용성 리셉터 단백질을 사용함에 의해 대부분 경쟁하여 사라졌다. 뇌 및 간의 음성 대조표준 조직은 염색을 나타내지 않았다.

실시예 18

zalpha11 가용성 리셉터에서 단클론성 토끼 항-세라를 사용하는 zalpha11 리셉터를 발현하는 말초 혈액 단핵 세포(PBMNC's)의 확인

200ml 신선한 헤파린화 혈액을 정상 공여자로부터 얻었다. 혈액을 PBS로 1:1 희석하고, Ficoll-Paque PLUS 구배(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용하여 분리하고, 림프구 계면을 수집했다. 세포를 PBS로 2× 세척하고, 2×10⁶세포/ml의 농도로 RPMI+5% FBS 배지에 재현탁했다.

zalpha11 리셉터의 발현이 림프구 세포의 활성 상태(즉, 휴면와 활성 세포 사이)에 의해 영향 받는지 아닌지를 결정하기 위해, 몇가지 자극 조건을 사용했다: 1) 비-자극, 즉 배지 단독(RPMI+5% FBS 배지); 2) PMA 10ng/ml+Ionomycin 0.5㎍/ml (모두 Calbiochem)으로 자극; 3) PHA 활성화(피토헤마글루티닌-P, Difco/VWR). 세포를 37℃에서 17시간 동안 배양한 후, 염색을 수집하여 zalpha11 리셉터의 발현을 검출했다.

간접적인 염색 프로토콜을 사용했다. 간단히, 사람 림프구 세포를 염색 완충액(PBS+0.02% NaN₃+BSA 1% 정상 사람 혈청 2%)에 재현탁하고, 96 웰 플레이트에서 50㎕/웰 중에 2×10⁵세포로 플레이트했다. zalpha11CEE 가용성 리셉터(실시예 15)에 대한 항체를 그것들이 분리된 사람 림프구 상에서 B-세포(CD-19), T-세포(CD-3) 또는 단핵세포 마아커(CD-14)를 사용하여 공-염색되는지 아닌지를 결정하기 위해 사용했다. 10㎍/ml로 zalpha11 가용성 리셉터(Rb 항-huzalpha11-CEE-BHK)(실시예 15)에 대한 토끼 단클론성 세라를 항체로 사용하여 림프구상의 zalpha11을 확인했다. 이차 항체인 염소 항-토끼 Ig-FITC(Biosource, Camarillo, CA)를 사용하여 zalpha11 리셉터에 결합한 Rb 항-huzalpha11-CEE-BHK를 가시화했다. 다른 항체를 동시에 사용하여 T 세포(CD3-PE; PharMingen, San Diego, CA), B 세포 (CD19-PE)(PharMingen), 및 단핵세포(CD-14-PE)(PharMingen)을 염색하여 이들 세포형 상에서 항-zalpha11 리셉터 항체의 공-염색을 확인했다. 여러 가지 대조표준을 사용하여 비-특이 결합 및 염색의 바탕 수준을 결정했다: (1) 부적절한 토끼 단클론성 세라를 비-특이 대조표준으로 사용했고; (2) 이차 항체만을 시약의 바탕 결합을 결정하기 위해 사용했다. 정제된 zalpha11CEE 가용성 리셉터(실시예 11)를 경쟁 억제제로서 약 10-배 과량으로 사용하여 zalpha11 가용성 리셉터에 대한 토끼 항-huzalpha -CEE-BHK 항체의 특이성을 증명했다.

세포 플레이팅 및 이차 및 공-염색 항체의 첨가 후, 세포를 30분 동안 얼음 상에서 배양하고, 염색 완충액으로 2× 세척하고, 30분 동안 얼음 상에서 이차 항체인 염소 항-토끼 Ig-FITC(Biosource)로 염색했다. 세포를 염색 완충액으로 2× 세척하고, 약 1㎍/ml의 최종 농도로 생육 염색 7AAD를 함유하는 염색 완충액(Sigma, St. Louis, MO)으로 웰 당 200㎕로 재현탁했다. 샘플을 FACS-캘리버(Becton-Dickenson, San Jose, CA) 상에서 읽고, 생육가능한 세포를 분석했다.

zalpha11 리셉터에 대한 토끼 단클론성을 휴면 B 세포로 염색했다. 휴면 B 세포에 대한 신호는 부적절한 토끼 세라를 사용한 활성 신호 보다 더 밝았고, 신호는 zalpha11-CEE 가용성 리셉터를 과량 첨가한 T 세포 상에서 보다 B 세포 상에서더 큰 범위로 감소했다. 이 실험을 분리된 B 및 T 세포를 사용하여 반복했고, 결과는 매우 유사했다. 또한, zalpha11 리셉터에 대한 단클론성 토끼 항-huzalpha11-CEE-BHK 항체를 사용한 염색은 휴면 B 세포 상에서 최고였다.

실시예 19

A.실시간 정량 RT/PCR을 사용한 여러 조직에서의 zalpha11 리셉터 발현

ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템(PE Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA)를 사용한 실시간 정량 RT/PCR은 이미 기재되어 있다(Heid, C. A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U. E. M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터 및 퀀처 형광 염료 모두를 함유하는 유전자 특이 프로브의 사용을 조합한다. 프로브가 리포터 염료를 손상시키지 않는 경우, 퀀처 염료가 아주 근접하므로 방출이 무효로된다. 추가의 유전자-특이 앞뒤 프라이머를 사용한 PCR 확장 동안, 프로브는 형광 방출 증가의 결과로 프로브로부터 리포터 염료를 방출하는 Taq 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 절단된다.

zalpha11 발현에 대한 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머 및 프로브를 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer Express^TM(PE Applied BioSystems, Foster City, CA)를 사용하여 디자인했다. 사람 zalpha11을 위한 프라이머를 인트론-엑손 접합을 스파닝하도록 디자인하여 게놈성 DNA의 증폭을 제거했다. 앞 프라이머 ZC22,277(SEQ ID NO:59) 및 뒤 프라이머 ZC22,276(SEQ ID NO:60)을 약 300nm에서PCR 반응(아래)에 사용하여 143bp 생성물을 합성했다. ZG31(SEQ ID NO:61)로 지정된 해당 zalpha11 TaqMan프로브를 합성하고, PE Applied BioSystems에 의해 표지화했다. ZG31 프로브를 리포터 형광 염료(6-카르복시-플루오레세인)(FAM)(PE Applied BioSystems)를 사용하여 5' 단부에서, 그리고 퀀처 형광 염료(6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied BioSystems)를 사용하여 3' 단부에서 표지화했다.

시험된 RNA 샘플의 보존 및 질을 시험하기 위한 대조표준으로서, 모든 RNA 샘플(아래)을 PE Applied BioSystems(cat No. 4304483)으로부터 정렬된 프라이머 및 프로브를 사용하여 rRNA에 대해 스크린했다. 키트는 rRNA 앞 프라이머 (SEQ ID NO:66) 및 rRNA 뒤 프라이머(SEQ ID NO:67), rRNA TaqMan프로브(SEQ ID NO:68)를 함유한다. rRNA 프로브를 리포터 형광 염료 VIC(PE Applied BioSystems)로 5' 단부에, 그리고 퀀쳐 형광 염료 TAMRA(PE Applied BioSystems)로 3' 단부에 표지했다. 또한, rRNA 결과물은 내인성 대조표준으로서 작용하고, 시험 샘플에 나타난 zalpha11 mRNA 발현 결과물의 정규화를 허가한다.

사람 CD3, CD19 및 단핵세포 세포 유형으로부터 RNA 샘플을 제조하고, 상기 실시예 16에 의해 기재했다. 사람 zalpha11 리셉터(실시예 7)를 발현하는 대략 10 밀리온 BaF3 세포로부터, 제조자의 지시에 따라 RNeasy MiniprepTM 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 대조표준 RNA를 제조했다.

B. 실시간 정량 RT-PCR

zalpha11 mRNA의 상대 수준을 일-단계 RT-PCR 방법(PE Applied BioSystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함에 의해 결정했다. 사람 zalpha11 리셉터를 발현하는 BaF3 세포로부터의 총 RNA를 표준 방법에 의해 분리하고, 정량에 사용되는 표준 곡선을 발생시키기 위해 사용했다. 곡선은 3회 분석된 각 표준 곡선 포인트를 가지는 rRNA 스크린을 위한 2.5- 2.5×10⁴및 zalpha11 스크린을 위한 250-0.025ng/㎕를 범위로 하는 10-배 연속 희석으로 구성된다. 또한, 사람 CD3, CD19 및 단핵세포 세포로부터의 총 RNA 샘플을 사람 zalpha11 전사 수준 및 내인성 대조표준으로서 rRNA의 수준에 대해 3회 분석했다. 25㎕의 총 부피에서, 각 RNA 샘플에 완충액 A(50mM KCl, 10mM 트리스-HCl)중 대략 25ng의 총 RNA; 내부 표준 염료인 카르복시-x-로다민(ROX); 적합한 프라이머(rRNA 샘플을 위한 대략 50nM rRNA 프라이머(SEQ ID NO:66 및 SEQ ID NO:67); 및 zalpha11 샘플을 위한 대략 300nM ZC22,277(SEQ ID NO:59) 및 ZC22,276(SEQ ID NO:60) 프라이머); 적합한 프로브(rRNA 샘플을 위한 대략 50nM rRNA TaqMan프로브(SEQ ID NO:68), zalpha11 샘플을 위한 대략 100nM ZG31(SEQ ID NO:61) 프로브); 5.5mM MgCl2; 각 300μM d-CTP, d-ATP 및 d-GTP 및 600μM d-UTP; MuLV 역 트랜스크립타제(0.25U/㎕); AmpliTaq^TMGold DNA 폴리머라제(0.025U/㎕)(PE Applied BioSystems); 및 RNase 억제제(0.4U/㎕)(PE Applied BioSystems)를 함유하는 일-단계 RT-PCR 반응을 행했다. PCR 열 순환 조건은 다음과 같았다: 30분 동안 48℃에서 1 사이클의 초기 역 전사(RT) 단계; 이어서 10분 동안 95℃에서 1 사이클의 AmpliTaq Gold^TM(0.025U/㎕)(PE Applied BioSystems) 활성화 단계; 이어서 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃에서 증식 40사이클.

상대 zalpha11 RNA 수준을 제조자인 PE BioSystems에 의해 기재된 바대로 표준 곡선 방법을 사용하여 결정했다(사용자 공보 No.2:ABI Prism 7700 서열 검출 시스템, 유전자 발현의 상대 정량, 1997, 12, 11). rRNA 측정을 사용하여 zalpha11 수준을 정규화하고, 휴면 CD3+ RNA 샘플을 캘리브레이터로 사용했다. 휴면 CD3를 캘리브레이터로 마음대로 선택했고, 1.00의 값을 제공했다. 샘플의 휴면를 캘리브레이터에 관하여 비교했다. 데이타를 아래 표 6에 나타냈다.

4 및 24시간에서 CD3+의 zalpha11 리셉터 발현에 대해 15 배 증가가 있었다. 휴면 CD19는 휴면 CD3+와 비교하여 리셉터 수용체에 20 배 증가를 가졌다. 24시간에 의해 휴면 수준을 다시 떨어뜨리는 4시간 자극을 하면 3배 증가했다. 단핵세포는 이 분석에서 검출가능한 zalpha11 리셉터 발현을 나타내지 않았다.

실시예 20

제자리 혼성을 사용한 zalpha11 리셉터 발현 세포의 확인

특이 사람 조직을 분리하고, 제자리 혼성에 의해 zalpha11 발현에 대해 스크린했다. 흉선, 비장, 편도선, 림프절 및 폐를 포함하는 여러 가지 사람 조직을 제조했고, 구획하여 제자리 혼성을 행했다. 조직을 10% 완충된 포르말린에 고정하고, 표준 기술을 사용하여 파라핀으로 차단했다(실시예 17). 조직을 4-8 마이크론으로 구획했다. 조직을 표준 프로토콜을 사용하여 제조했다("Development of non-isotopic in situ hybridization" http://dir.niehs.nih.gov/ dirlep/ish.html). 간단히, 조직 구획을 HistoClear(National Diagnostics, Atlanta, GA)을 사용하여 탈파라핀화한 후, 에탄올을 사용하여 탈수했다. 다음 날, 37℃에서 2-20분 동안 Proteinase K(50㎍/ml)(Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN)로 분해했다. 이 단계에 이어서 조직을 아세틸화 및 재-탈수했다.

PCR에 의해 발생된 두개의 제자리 프로브를 사람 zalpha11 서열에 대해 지정했다. 두 세트의 올리고스를 zalpha11 cDNA의 분리 영역에 대한 프로브를 발생시키도록 지정했다: (1) 올리고스 ZC23,684(SEQ ID NO:62) 및 ZC23,656(SEQ ID NO:63)을 사용하여 zalpha11에 대한 413bp 프로브를 발생시켰고; (2) 올리고스 ZC23,685(SEQ ID NO:64) 및 ZC23,657(SEQ ID NO:65)를 사용하여 zalpha11에 대한 430bp 프로브를 발생시켰다. 이차 프로브는 일차 zalpha11 프로브의 1500bp 3'이다. 또한, 각 세트로부터의 안티센스 올리고는 이들 PCR 생성물로부터 안티센스 RNA 프로브의 용이한 전사를 허가하는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 위한 작업 서열을 함유했다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다. 30초 동안 94℃, 1분 동안 60℃, 1.5분 동안 72℃에서 30 사이클. PCR 생성물을 Qiagen 스핀 컬럼에 의해 정제하고, 이어서 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 행했다. 프로브를 시험관내 전사 시스템(Promega, Medison, WI)을 사용하여 디곡시게닌(Boehringer) 또는바이오틴(Boehringer)로 연속하여 표지화했다.

제자리 혼성을 디곡시게닌- 또는 바이오틴-표지화된 zalpha11 프로브(상기)를 사용하여 수행했다. 프로브를 12-16시간 동안 55-60℃에서 1-5pmol/ml의 농도로 슬라이드에 가했다. 슬라이드를 연속하여 50℃에서 2×SSE 및 0.1×SSC로 세척했다. 시그널을 티라미드 신호 증폭(TSA)(TSA, 제자리 간접 키트; NEN)을 사용하여 증폭하고, 제조자의 지시에 의해 Vector Red 기질 키트(Vector Lab)을 사용하여 가시화했다. 다음에, 슬라이드를 헤마톡실린(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하여 반대-염색했다.

신호를 흉선, 편도선, 폐 및 림프절에서 나타냈다. 양성-염색 세포가 림프구 및 관련된 세포임이 명백했다.

실시예 21

마우스 zalpha11 리셉터의 분리

A. 마우스 게놈성 라이브러리 스크린

초기 부분 마우스 zalpha11 서열을 전체 cDNA를 함유하는 사람 zalpha11 리셉터 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마우스 게놈성 라이브러리를 프로빙함에 의해 얻었다. 사람 zalpha11 cDNA를 ZC19,905(SEQ ID NO:36) 및 ZC19,906(SEQ ID NO:37) 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 발생시켰고, 최대 길이 사람 zalpha11(예들 들어, 실시예 1)을 함유하는 플라스미드를 템플레이트에 사용했다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 1분 동안 98℃, 1분 동안 68℃, 2분 동안 72℃에서 35사이클; 이어서 10분 동안 72℃에서 1 사이클. PCR 생성물을 1% 저 용융점아가로스(Boerhinger Mannheim) 상에 두었고, 제조자의 지시에 의해 대략 1.5kb 사람 zalpha11 cDNA를 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 분리했다. 이 사람 zalpha11 cDNA를 사용하여 마우스 게놈성 DNA 라이브러리(아래)를 스크린했다.

사용된 주 게놈성 DNA 라이브러리는 embl3 SP6/T7 lambda BamHI 클론된 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)였다. 7.2×105pfu를 나타내는 이 라이브러리를 24 NZY 플레이트의 대장균 K802 숙주 잔디 상에 플레이트했다. 플라그 리프트를 제조자의 지시에 의해 Hybond-N 필터(Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, England, UK)를 사용하여 수행했다. 필터를 10분 동안 1.5M NaCl 및 0.5M NaOH에서 변성시킨 후, 다음에 10분 동안 1.5M NaCl 및 0.5M 트리스-HCl(pH 7.2)에서 중화시켰다. DNA를 1200J로 STRATALINKER UV 교차결합제(Stratagene)을 사용하여 필터에 부착시켰다. 필터를 총 45분 동안 용액을 3회 교환하면서, 65℃에서 예비-세척 완충액(0.25×SSC, 0.25% SDS 및 1mM EDTA)로 예비 세척하여 세포 부스러기를 제거했다. 필터를 50℃에서 0.1mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 Expresshyb^TM용액(Clontech)로 하룻밤 동안 예비혼성화했다. 대략 50ng의 정제된 사람 zalpha11 cDNA(상기)를 제조자의 지시에 의해 Rediprime II 무작위 프라임 표지화 시스템(Amersham Pharmacia)를 사용하여³²P로 표지화했다. 비조합 방사선을 NucTrap^TM푸시 컬럼(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 zalpha11 cDNA 프로브로부터 제거했다. 필터를 약 0.5-1×10⁶cpm/ml zalpha11 cDNA 프로브, 약 0.1mg/ml변성 연어 정자 DNA 및 변성 0.5㎍/ml cot-1 DNA를 함유하는 Expresshyb^TM용액(Clontech)에서 혼성화했다. 혼성화가 50℃에서 하룻밤 동안 일어났다. 필터를 2시간 동안 실온에서 2×SSC, 0.1% SDS로 세척한 후, 온도를 1시간 동안 60℃까지 올렸다(완충액 1회 교환). -80℃에서 하룻밤 노출시켜 일차 분리를 나타내는 6 플라그를 나타냈다.

이차 플라그 분리를 얻기 위해서, 일차 분리를 나타내는 6 플라그를 파스퇴르 피펫으로 뽑아내고, 4℃에서 몇 방울의 클로로포름을 함유하는 1ml SM(0.1M NaCl, 50mM 트리스 pH 7.5, 10mM MgSO₄, 0.02% 겔라틴)으로 용리했다. 파지 적정농도를 결정한 후, 6 일차의 원 플러그(12.5× 적용 범위) 중의 약 12.5× 파지 추정량을 NZY 맥시 플레이트 상의 10mM MgSO₄/NZY 상부 아가로스에서 포매된 대장균 K802 세포 잔디 상에 플레이트하고, 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 플라그 리프트를 제조자의 지시에 의해 Hybond-N 필터(Amersham Pharmacia)를 사용하여 행했다. 필터를 상기와 같이 고정시켰다. 이차 라운드 필터를 총 45분 동안 용액을 3회 교환하면서, 65℃에서 예비-세척 완충액(0.25×SSC, 0.25% SDS 및 1mM EDTA)로 예비 세척하여 세포 부스러기를 제거했다. 다음에, 이차 라운드 필터 리프트를 예비혼성화했고, zalpha11 cDNA 프로브를 상기 기재된 바대로 제조했다.

이차 라운드 필터를 약 0.1mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 약 10⁶cpm/ml zalpha11 cDNA 프로브를 함유하는 Expresshyb^TM용액(Clontech)에서 상기와 같이 혼성화했다. 혼성화가 50℃에서 하룻밤 동안 일어났다. 일차 스크린에 대한 상기 기재된 세척 조건을 이 이차 스크린에 대해 반복했다. -80℃에서 하룻밤 노출시킨 후, 6 원 일차 플라그 분리 중 두개가 이차 스크린에서 양성으로서 증명됐다. 이차 스크린에서 사람 zalpha11 cDNA에 대해 혼성화한 양성 플라그를 파스퇴르 피펫으로 뽑아내고, 7bl 및 20bl로 지정했다.

분리된 플라그 No. 7bl 및 20bl을 4℃에서 하룻밤 동안 200㎕ SM으로 용리했다. 각 분리에 대해 10^-2-10^-6범위의 연속 10-배 연속 희석을 숙주 대장균 K802 세포에 플레이트하여 적정 농도를 결정했다. 분리 20bl은 4×10³pfu/㎕의 적정 농도를 가졌고, 더 수행되었다. 4 플레이트를 파지 DNA prep를 만들기 위해 합류 숙주 대장균 K802 세포 상에105pfu/플레이트로 플레이팅하여 제조했다. 플레이트를 파지 리시스가 합류되기 시작할때까지, 약 6.5시간 동안 37℃에서 성장시켰다. 다음에 박테리로파지를 4℃에서 플레이트 당 12ml의 SM으로 하룻밤 동안 용리했다. 다음에, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 교반하고, 상층액을 제거했다; 1% 클로로포름을 가하고, 상층액을 15분 동안 다시 교반했다. 20bl 파지 DNA를 Wizard Lambda Preps DNA 정제 시스템(Promega, Medison, WI; 섹션 IV 및 VI)를 사용하여 준비했다.

20bl 파지 DNA 샘플을 몇개의 제한 효소로 절단하여 사우던 블롯팅을 위한 DNA 단편을 발생시켰다. 분해물을 1% TBE 아가로스 겔 상에 두었다. 겔을 30분 동안 0.25M HCl에서 소킹하고, 증류된 H₂O로 헹구고, 용액을 1회 교환하면서 40분 동안 0.5M NaOH 및 1.5M NaCl에서 소킹하고, 40분 동안 1.5M NaCl 및 0.5 트리스-HCl에서 중화시켰다. TURBOBLOTTER^TMRapid Downward Transfer System(Schleicher & Schuell, Keene, NH)을 하룻밤 동안 Nytran/BA-S 막(Schleicher & Schuell) 상에 DNA를 전이시키도록 설정했다. DNA를 1200J에서 STRATALINKER UV 교차결합제 (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 Nytran에 부착시켰다. 블롯을 상기 기재된 바대로 예비혼성화했다. 약 50ng의 사람 zalpha11 cDNA를 상기 기재된 바대로 표지화하고, 프로브를 위해 정제했다. 필터를 약 106cpm/ml zalpha11 cDNA 프로브 및 약 0.1mg/ml 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 Expresshyb^TM용액(Clontech)에서 상기와 같이 혼성화했다. 혼성화는 50℃에서 하룻밤 동안 일어났다. 블롯을 상기 기재된 바대로 세척하고, -80℃에서 하룻밤 동안 필름에 노출시켰다.

사우던은 1.3-1.6kb의 예상 크기 범위로 사람 zalpha11 cDNA 프로브에 혼성화된 BamHI/StuI 분해물로부터 발생된 DNA 단편을 나타냈다. 이 단편을 수행했다. 20bI lambda DNA 중 대략 3㎍를 37℃에서 2시간 동안 BamHI(Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN) 20 유니트 및 20 유니트 StuI(NEB, Beverly, MA)로 절단했다. 분해물을 1% TBE 겔 상에 두었고, 1.3kb 더블렛 및 1.6kb 더블렛 밴드를 겔로부터 절제했고, DNA를 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 아가로스로부터 추출했다. prep로부터 DNA의 낮은 수율로 인해, 사람 zalpha11 cDNA 프로브에 혼성화된 단편이 BamHI/StuI 또는 StuI/StuI 단편인지 아닌지 추가의 제한 분해물 분석에 의한 결정이 불가능했다. 따라서, 5㎕의 1.3kb 더블렛 단편 및 5㎕의1.6kb 더블렛 단편을 사용한 두가닥 결합을 Zero Blunt PCR 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 행했다. 두가닥 결합은 1.6kb 단편 중 두개 및 1.3kb 단편 중 하나를 가지는 양성 클론을 제공했다. 이들 클론을 1.6 및 1.3kb 단편이 삽입된 T-오버행 부위를 플랭크하는 EcoRI(Life Technologies)를 사용하여 분해했다. 다른 사우던 블롯을 사람 zalpha11 cDNA 프로브에 혼성화한 원 단편을 결정하기 위해 수행했다. 1% TBE 겔을 처리하고, DNA를 상기 기재된 바대로 Nytran 블롯에 전이시켰다.

블롯을 상기와 같이 10ml 혼성화 용액에서 예비혼성화했다. 상이한 사람 zalpha11 폴리뉴클레오티드 프로브를 제조했다. 다른 최대 길이 zalpha11 cDNA 사람 zalpha11 단편을 올리고스 ZC19,905(SEQ ID NO:36) 및 ZC20,097(SEQ ID NO:27)을 사용하는 PCR에 의한 프로브로서 사용하기 위해 발생시켰다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 1분 동안 95℃; 1분 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 2분 동안 72℃ 35 사이클; 이어서 10분 동안 72℃ 1 사이클. PCR 생성물을 1% 저 용융점 아가로스(Boerhinger Mannheim) 상에 두었고, 대략 1.5kb 사람 zalpha11 cDNA를 제조자의 지시에 따라 Qiaquick^TM겔 추출 키트(Qiagen)을 사용하여 분리했다. 이 분리된 사람 zalpha11 cDNA 단편 약 50ng을³²P로 표지화하고, 상기 기재된 바대로 정제했다. 필터를 상기와 같이 약 10⁶cpm/ml zalpha11 cDNA 프로브, 약 0.1mg/ml 변성 연어 정자 DNA 및 변성 0.5㎍/ml cot-1 DNA를 함유하는 Expresshyb^TM용액(Clontech)에서 혼성화했다. 혼성화 및 세척을 상기 기재된 바대로 했다. 블롯을 -80℃에서 1.5시간 동안 필름에 노출시키면, 1.3kb 삽입이 사람 zalpha11 프로브에 강하게 혼성화한다.

이 클론을 서열화하여 터미네이션 코돈 및 업스트림 인트론 서열을 가지는 마우스 zalpha11 3' 코팅 엑손을 함유하는 것을 밝혔다. 사용된 서열화 프라이머는 ZC3,424(SEQ ID NO:86), ZC694(SEQ ID NO:87), ZC24,399(SEQ ID NO:88) 및 ZC24,400(SEQ ID NO:89)였다. 3' 엑손을 포함하는 마우스 zalpha11의 게놈성 서열은 SEQ ID NO:69에서 나타났다. 3' 엑손 코딩 서열은 SEQ ID NO:69의 뉴클레오티드 543에서 시작하고, 뉴클레오티드 1262에서 끝나며, 240 아미노산 엑손(SEQ ID NO:70)을 암호화한다.

B. 마우스 cDNA 패널의 PCR 스크린

입수가능한 집 및 상업용 마우스 cDNAs의 패널(Clontech; Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 프라이머(각 약 20pmol)로서 ZC24,432(SEQ ID NO:71) 및 ZC24,433(SEQ ID NO:72)를 사용하여 PCR에 의해 스크린했다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 94℃ 2분; 20초 동안 94℃, 30초 동안 64℃, 30초 동안 72℃ 32 사이클; 이어서 5분 동안 72℃ 1 사이클. 마우스 비장, 수지상 세포, 신생 피부, 골수, 야생형 BaF3 세포, EL4 세포, 및 폐가 예측 크기 450bp의 강한 PCR 생성물을 나타냈다.

C. 5' 네스티드 RACE

5' RACE 반응을 각 프라이머 ZC9,739(SEQ ID NO:73) 및 ZC24,434(SEQ IDNO:74) 20pmol을 사용하여 수행하고, 템플레이트로서 CD90+를 마우스 비장 마라톤 cDNA를 선택했다. 마라톤 cDNA를 제조자의 지시에 따라 Marathon cDNA 증폭 키트(Clontech)를 사용하여 제조했다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 1분 동안 94℃; 20초 동안 94℃, 1.5분 동안 70℃ 5 사이클; 이어서 20초 동안 94℃, 20초 동안 64℃, 1.5분 동안 70℃ 25 사이클; 이어서 5분 동안 72℃ 1 사이클.

마우스 zalpha11 5' RACE 생성물에 대해 부화하기 위해, 네스트된 5' RACE 반응을 초기 5' RACE에 대해 상기 기재된 바의 PCR 반응 조건을 사용하여 수행했다. 단 네스트 프라이머 ZC24,431(SEQ ID NO:75) 및 ZC9,719(SEQ ID NO:76)을 사용하고, 템플레이트로서 초기 5' RACE 반응(상기)의 1/20 희석물 1㎕를 사용했다. 생성물을 겔 전기영동에 의해 정제했고, DNA를 Qiaex II 아가로스 겔 추출 키트(Qiagen)을 사용하여 용리하고, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)을 사용하여 하위클론했다. 양성 클론을 각 ZC24,431(SEQ ID NO:75) 및 ZC24,511(SEQ ID NO:77) 10pmol을 사용하여 콜로니 PCR에 의해 확인했다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 94℃ 2분, 20초 동안 94℃, 20초 동안 64℃, 30초 동안 72℃ 35 사이클; 이어서 5분 동안 72℃ 1 사이클. 각 네스트 5' RACE 반응으로부터의 두개의 하위클론을 서열화했다. 모든 서열은 어떤 zalpha11 서열을 포함하지만, 완전한 것은 아니다. 편집된 서열을 마우스 zalpha11 폴리뉴클레오티드의 예비적인 부분 서열 및 해당 폴리펩티드를 나타내는 불완전한 5' RACE 클론 및 3' 엑손 서열(SEQ ID NO:70)으로부터 발생시켰다. 부분 마우스 zalpha11 cDNA의 예비 서열을 SEQ ID NO:78(5' 단부) 및 SEQ ID NO:80(3' 단부)으로 나타냈다. 전체 마우스 zalpha11 cDNA(아래 참조)를포함하기 위한 SEQ ID NO:78(5' 단부)과 SEQ ID NO:80(3' 단부) 사이에 아직 알려지지 않은 대략 330 뉴클레오티드가 있었다. SEQ ID NO:78 및 SEQ ID NO:80에 대한 해당 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO:79(N-말단) 및 SEQ ID NO81(C-말단)으로 나타냈다.

D. 최대 길이 PCR

프라이머를 최대 길이 PCR을 위해 초기 Met의 마우스 업스트림 UTR 및 터미네이션 코돈의 다운스트림으로부터 디자인했다. 각 프라이머 ZC24,616(SEQ ID NO:82) 및 ZC24,615(SEQ ID NO:83) 20pmol을 템플레이트로서 마우스 수지상 세포 마라톤 cDNA 또는 신생 마우스 피부 집 cDNA 라이브리를 사용하는 PCR 반응에 사용했다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: 94℃ 1분; 20초 동안 94℃, 2분 동안 66℃ 30 사이클; 이어서 5분 동안 72℃ 1 사이클. PCR 생성물을 겔 전기영동에 의해 정제했고, cDNA를 Qiaquick 겔 추출 키트를 사용하여 용리하고, TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 하위클론했다. 각 PCR 반응물로부터의 2개의 하위클론을 서열화했다. 사용된 서열화 프라이머는 ZC694(SEQ ID NO:87), ZC3,424(SEQ ID NO:86), ZC24,431(SEQ ID NO:75), ZC24,511(SEQ ID NO:77), ZC24,806(SEQ ID NO:90) 및 ZC24,807(SEQ ID NO:91)였다. 최대 길이 마우스 zalpha11 cDNA의 서열을 SEQ ID NO:84에 나타냈다. 해당 아미노산 서열은 SEQ ID NO:85로 나타냈다.

전술한 바로부터, 본 발명의 특정 구체예가 실례의 목적으로 본원에 기재되었지만, 여러 가지 변형이 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 만들어질수 있다는 것이 인정될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims (49)

1. (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

   (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

   (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

   (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

   (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

   로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여 적어도 90% 동일한 아미노산 잔기의 서열(여기에서, 아미노산 퍼센트 동일성은 ktup=1, 갭 개방 패널티=10, 갭 확장 패널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62와 초기값으로서 설정된 다른 매개변수를 사용하는 FASTA 프로그램을 사용하여 결정된다)을 포함하는 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
2. (a) SEQ ID NO:4에 뉴클레오티드 1에서 뉴클레오티드 1614로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열;

   (b) SEQ ID NO:1에 뉴클레오티드 126에서 뉴클레오티드 779로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열;

   (c) SEQ ID NO:1에 뉴클레오티드 126에서 뉴클레오티드 833로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열;

   (d) SEQ ID NO:1에 뉴클레오티드 834에서 뉴클레오티드 1682로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열;

   (e) SEQ ID NO:1에 뉴클레오티드 126에서 뉴클레오티드 1682로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열; 및

   (f) SEQ ID NO:1에 뉴클레오티드 69에서 뉴클레오티드 1682로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열;

   로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
3. 제 1 항에 있어서, zalpha11 폴리펩티드가

   (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

   (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

   (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

   (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

   (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

   로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
4. 제 3 항에 있어서, zalpha11 폴리펩티드가

   (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

   (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

   (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

   (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

   (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

   로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
5. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 WSWSX 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
6. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 트랜스멤브레인 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
7. 제 6 항에 있어서, 트랜스멤브레인 도메인이 SEQ ID NO:2의 잔기 238(Leu)에서 255(Leu)로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
8. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 세포내 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
9. 제 8 항에 있어서, 세포내 도메인이 SEQ ID NO:2의 잔기 256(Lys)에서 538(Ser)로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
10. 제 9 항에 있어서, 세포내 도메인이 Box I 및 Box II 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
11. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드가 친화성 태그를 더 포함하는 것을 특징으로하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
12. 다음의 작동가능하게 연결된 요소들;

    전사 프로모터;

    SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열을 가지는 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및

    전사 터미네이터

    를 포함하며,

    프로모터가 DNA 절편에 작동가능하게 연결되고, DNA 절편이 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
13. 제 12 항에 있어서, DNA 절편에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
14. 제 12 항에 따르는 발현 벡터를 포함하는 배양 세포로, 세포가 DNA 절편에 의해 코드화된 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 배양 세포.
15. 전사 프로모터;

    SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열을 가지는 zalpha11 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 절편; 및

    전사 터미네이터

    를 포함하며,

    프로모터, DNA 절편, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
16. 제 15 항에 있어서, DNA 절편에 작동가능하게 연결된 분비 신호 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
17. 제 15 항에 있어서, 폴리펩티드가 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 트랜스멤브레인 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
18. 제 17 항에 있어서, 트랜스멤브레인 도메인이 SEQ ID NO:2의 잔기 238(Leu)에서 255(Leu)를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
19. 제 15 항에 있어서, 폴리펩티드가 DNA 절편에 작동가능하게 연결된 세포내 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
20. 제 19 항에 있어서, 세포내 도메인이 SEQ ID NO:2의 잔기 256(Lys)에서 538(Ser)로 구성되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
21. 제 15 항에 따르는 발현 벡터가 도입된 배양 세포로, 세포가 DNA 절편에 의해 코드화되는 가용성 리셉터 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 배양 세포.
22. 제 21 항에 있어서, 세포가 증식을 위한 외인성 공급된 조혈생장인자에 좌우되는 것을 특징으로 하는 세포.
23. (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 19(Gly)로 나타낸 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 238(Leu)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

    (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 238(Leu)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

    (f) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

    (g) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 첫번째 DNA 절편; 그리고

    추가의 폴리펩티드를 코드화하는 적어도 하나의 다른 DNA 절편

    을 포함하며,

    첫번째 및 다른 DNA 절편이 프레임 내에서 연결되고, 융합 단백질을 코드화하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질을 코드화하는 DNA 구성물.
24. 다음의 작동가능하게 연결된 요소들;

    전사 프로모터;

    제 23 항에 따르는 융합 단백질을 코드화하는 DNA 구성물; 및

    전사 터미네이터

    를 포함하며,

    프로모터가 DNA 구조물에 작동가능하게 연결되고, DNA 구성물이 전사 터미네이터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
25. 제 24 항에 따르는 발현 벡터를 포함하는 배양 세포로, 세포가 DNA 구성물에 의해 코드화되는 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 배양 세포.
26. 제 25 항에 따르는 세포를 배양하는 단계; 및

    세포에 의해 생성된 폴리펩티드를 단리하는 단계

    를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법.
27. (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

    (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일한 아미노산 잔기의 서열(여기에서, 아미노산 퍼센트 동일성은 ktup=1, 갭 개방 패널티=10, 갭 확장 패널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62와 초기값으로서 설정된 다른 매개변수를 사용하는 FASTA 프로그램을 사용하여 결정된다)을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
28. 제 27 항에 있어서, 폴리펩티드가

    (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

    (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
29. 제 27 항에 있어서, 아미노산 잔기의 서열이

    (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열;

    (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 255(Leu)로 나타낸 아미노산 서열;

    (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 256(Lys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열;

    (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열; 및

    (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 1(Met)에서 아미노산 번호 538(Ser)로 나타낸 아미노산 서열

    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
30. 제 27 항에 있어서, 폴리펩티드가 WSXWS 모티프를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
31. 제 27 항에 있어서, 폴리펩티드가 트랜스멤브레인 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
32. 제 31 항에 있어서, 트랜스멤브레인 도메인이 SEQ ID NO:2의 잔기 238(Leu)에서 255(Leu)로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
33. 제 27 항에 있어서, 폴리펩티드가 세포내 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
34. 제 33 항에 있어서, 세포내 도메인이 SEQ ID NO:2의 잔기 256(Lys)에서538(Ser)를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
35. 제 34 항에 있어서, 세포내 도메인이 Box I 및 Box II 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
36. 제 15 항에 따르는 세포를 배양하는 단계; 및

    세포에 의해 생성된 zalpha11 폴리펩티드를 단리하는 단계

    를 포함하는 zalpha11 폴리펩티드의 제조 방법.
37. (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열; 및

    로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며,

    폴리펩티드가 조혈 리셉터와 통상적으로 관련된 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 실질적으로 가지지 않는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
38. 제 37 항에 있어서, 친화성 태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
39. 제 21 항에 따르는 세포를 배양하는 단계; 및

    세포에 의해 생성된 zalpha11 폴리펩티드를 단리하는 단계

    를 포함하는 zalpha11 폴리펩티드의 제조 방법.
40. (a) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 538(Ser)의 연속되는 아미노산 서열로 구성되며, 9-519 개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드;

    (b) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (c) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 101(Leu)에서 아미노산 번호 122(Gly)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (d) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 141(Asn)에서 아미노산 번호 174(Ala)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (e) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 193(Cys)에서 아미노산 번호 261(Val)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (f) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 51(Trp)에서 아미노산 번호 61(Glu)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (g) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 136(Ile)에서 아미노산 번호 143(Glu)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (h) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 187(Pro)에서 아미노산 번호 195(Ser)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;

    (i) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 223(Phe)에서 아미노산 번호 232(Glu)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드; 및

    (j) SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 360(Glu)에서 아미노산 번호 368(Asp)의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드

    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드로 동물을 접종하는 단계, 여기서 폴리펩티드는 동물로부터 면역 반응을 유도하여 항체를 생산하며; 그리고

    동물로부터 항체를 단리하는 단계

    를 포함하는 zalpha11 폴리펩티드에 대한 항체의 제조 방법.
41. zalpha11 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제 40 항의 방법에 의해 제조된 항체.
42. 제 41 항에 있어서, 항체가 단클론성 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
43. 제 27 항의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
44. 시험 샘플의 존재 및 부재하에서 DNA 절편에 의해 코드화된 zalpha11 단백질을 발현하는, 제 15 항에 따르는 발현 벡터가 도입된 세포를 배양하는 단계;

    생물학적 또는 생화학적 분석에 의해, 시험 샘플의 존재 및 부재하에서 zalpha11의 활성 수준을 비교하는 단계; 그리고

    비교로부터, 시험 샘플 중의 zalpha11 활성의 조절인자의 존재를 결정하는 단계

    를 포함하는, 시험 샘플 중의 zalpha11 단백질 활성 조절인자의 존재의 검출 방법.
45. 시험 샘플을 SEQ ID NO:2에 아미노산 번호 20(Cys)에서 아미노산 번호 237(His)로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및

    샘플 중의 리간드에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계

    를 포함하는, 시험 샘플 내에 있는 zalpha11 리셉터 리간드의 검출 방법.
46. 제 45 항에 있어서, 폴리펩티드가 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
47. 제 45 항에 있어서, 폴리펩티드가 배양 세포내에서 멤브레인 결합되고, 검출 단계가 배양 세포내의 생물학적 반응을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
48. 제 47 항에 있어서, 생물학적 반응이 세포 증식 또는 리포터 유전자 전사의 활성화인 것을 특징으로 하는 방법.
49. 제 45 항에 있어서, 폴리펩티드가 고체 지지체 상에 고정되는 것을 특징으로 하는 방법.