CZ20011026A3 - Izolovaný polynukleotid, expresní vektor, kultivovaná buňka, konstrukt DNA, způsob produkce proteinu, izolovaný polypeptid, způsob produkce protilátky, protilátka a způsob detekce - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se zabývá novým cytokinovým receptorem zalphall, polynukleotidy, kterými je tento polypeptid kódován, způsoby jeho přípravy a použití.

Dosavadní stav techniky

Množení a diferenciace buněk v mnohobuněčném organizmu jsou kontrolovány hormony a polypeptidovými růstovými faktory. Tyto molekuly schopné difúze, umožňují buňkám vzájemně komunikovat a působí ve vzájemné souhře při vytváření buněk a orgánů a při opravě poškozených tkání. Příklady hormonů a růstových faktorů zahrnují steroidní hormony (např. estrogen, testosteron), hormon příštítných tělísek, hormon stimulující folikul, interleukiny, růstový faktor z krevních destiček (PDGF), epidermální růstový faktor (EGF), faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF), erytropoetin (EPO) a kalcitonin.

Hormony a růstové faktory ovlivňují buněčný metabolizmus tím, že se váží na receptory. Receptory mohou být nedílnou součástí proteinů membrány, které jsou spojeny se signálními dráhami uvnitř buněk, jako jsou druhotné systémy přenašečů. Jiné třídy receptorů jsou rozpustné molekuly, jako jsou transkripční faktory. Zvláště zajímavé jsou receptory pro cytokiny, molekuly které podporují množení a/nebo diferenciaci buněk. Příklady cytokinů zahrnují erytropoetin (EPO), který stimuluje vývoj červených krvinek; trombopoetin (TPO), který stimuluje vývoj buněk, které patří k liniím megakaryocytů; a faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), který stimuluje vývoj neutrofilů. Tyto cytokiny jsou užitečné při znovuobnovení hladin normálních krevních buněk u pacientů, kteří trpí anémií, nedostatkem krevních destiček a neutropenií nebo u nich právě probíhala chemoterapie rakoviny.

Aktivity těchto cytokinů, demonstrované in vitro, ukazují jejich neobyčejný léčebný potenciál a potřebu jiných cytokinů, agonistů cytokinů a antagonistů cytokinů. Předložený vynález se zaměřuje na tyto potřeby a poskytuje nový cytokinový receptor krvetvorby a rovněž s ním související prostředky a metody.

• · · · •··· ··· φ · φ · φ · φ φ φ φφφφ φ φ

ΦΦΦ φφφφφφφ φ

Předložený vynález poskytuje takové polypeptidy pro tato a jiná použití, která by měla být ze zde uvedeného popisu zřejmá osobám se zkušeností v oboru.

Podstata vynálezu

V jednom ohledu poskytuje předložený vynález izolovaný polynukleotid, který kóduje polypeptid zalphall, obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je alespoň z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 (sekvence číslo 2) od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 538 (Ser), přičemž procento shodnosti aminokyselin je určováno pomocí programu FASTA s ktup=1, penalizace vzniklé mezery=10, penalizace rozšíření mezery=1, a substituční matice=BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA. V jednom provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid sekvenci polynukleotidů, vybranou ze skupiny zahrnující: (a) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:4 od nukleotidu 1 k nukleotidu 1614; (b) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 126 k nukleotidu 779; (c) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 126 k nukleotidu 833; (d) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 834 k nukleotidu 1682; (e) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od nukleotidu 126 (Met) k nukleotidu 1682; a (f) polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 69 k nukleotidu 1682. V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid sekvenci aminokyselinových zbytků, které jsou vybrány ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo • 4

4444 4· 4 444

4 444«444

4 ·44444 4

444 4444444 44

4444 44 ·4 4 44 444

256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 538 (Ser). V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid sekvenci aminokyselinových zbytků, které jsou vybrány ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 538 (Ser). V jiném provedení dále obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid doménu WSWSX. V jiném provedení dále obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid transmembránovou doménu. V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid transmembránovou doménu, skládající se ze zbytků 238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2. V jiném provedení dále obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid vnitrobuněčnou doménu. V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid vnitrobuněčnou doménu, skládající se ze zbytků 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2. V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polynukleotid vnitrobuněčnou doménu, která dále obsahuje místa Boxl a Boxll.

V druhém ohledu poskytuje předložený vynález expresní vektor, který obsahuje následující, operativně vázané elementy: transkripční promotor; segment DNA kódující polypeptid zalphall, který má aminokyselinovou sekvenci takovou, jaká je uvedena v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a terminátor transkripce, přičemž promotor je operativně vázán k segmentu DNA a segment DNA je operativně vázán k terminátoru transkripce. V jednom provedení výše popsaný expresní vektor dále obsahuje sekreční signální sekvenci, která je operativně vázána k segmentu DNA.

Ve třetím ohledu poskytuje předložený vynález kultivovanou buňku, která obsahuje výše popsaný expresní vektor, přičemž buňka exprimuje polypeptid, kódovaný segmentem DNA.

• · ···· · · e • · ···* · ·

Ve čtvrtém ohledu poskytuje předložený vynález expresní vektor obsahující: segment DNA kódující polypeptid zalphall, který má aminokyselinovou sekvenci takovou, jaká je uvedena v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); a terminátor transkripce, přičemž promotor, segment DNA a terminátor transkripce jsou operativně vázány. V jednom provedení výše popsaný expresní vektor dále obsahuje sekreční signální sekvenci, která je operativně vázána k segmentu DNA. V jiném provedení výše popsaný expresní vektor dále obsahuje transmembránovou doménu, která je operativně vázána k segmentu DNA. V jiném provedení výše popsaný expresní vektor dále obsahuje transmembránovou doménu, skládající se ze zbytků 238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2. V jiném provedení výše popsaný expresní vektor dále obsahuje vnitrobuněčnou doménu, která je operativně vázána k segmentu DNA. V jiném provedení obsahuje výše popsaný expresní vektor dále obsahuje vnitrobuněčnou doménu, skládající se ze zbytků 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2.

V jiném ohledu, předložený vynález poskytuje kultivovanou buňku, do které byl vnesen expresní vektor podle nároku 15, kdy buňka exprimuje rozpustný polypeptid receptoru, kódovaný segmentem DNA. V jednom provedení výše popsaná kultivovaná buňka je závislá na zvnějšku dodávaném růstovém faktoru pro krvetvorbu.

V jiném ohledu, předložený vynález poskytuje DNA konstrukt kódující fúzní protein, který obsahuje: první segment DNA kódující polypeptid, který má sekvenci aminokyselinových zbytků vybranou ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 19 (Gly); (b) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (c) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (d) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 238 (Leu) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (e) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 238 (Leu) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (f) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (g) aminokyselinovou sekvenci z SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a alespoň jeden jiný segment DNA kódující další polypeptid, přičemž první a další segmenty DNA kódují fúzní protein.

• · φ · · · · · · · · • ··· ······· · ♦

V jiném ohledu, předložený vynález poskytuje expresní vektor, který obsahuje následující, operativně vázané elementy: transkripční promotor; konstrukt DNA kódující výše popsaný fúzní protein; a terminátor transkripce, přičemž promotor je operativně vázán ke konstruktu DNA a konstrukt DNA je operativně vázán k terminátoru transkripce.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález kultivovanou buňku, která obsahuje výše popsaný expresní vektor, přičemž buňka exprimuje polypeptid, kódovaný konstruktem DNA.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález izolovaný polypeptid, obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je alespoň z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 538 (Ser), přičemž procento shodnosti aminokyselin je určováno pomocí programu FASTA s ktup=1, penalizace vzniklé mezery=10, penalizace rozšíření mezery=1, a substituční matice=BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA. V jednom provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid sekvenci aminokyselinových zbytků, vybranou ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 538 (Ser). V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid sekvenci aminokyselinových zbytků, které jsou vybrány ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny ······ · · · ·· • · · · · · · • · · · · · · · • ·«· ·····» Λ číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 255 (Leu); (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); a (e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) k aminokyselině číslo 538 (Ser). V jiném provedení dále obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid motiv WSWSX. V jiném provedení dále obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid transmembránovou doménu. V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid transmembránovou doménu, přičemž se tato transmembránová doména skládá ze zbytků 238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2. V jiném provedení dále obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid vnitrobuněčnou doménu. V jiném provedeni obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid vnitrobuněčnou doménu, přičemž se tato vnitrobuněčná doména skládá ze zbytků 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2. V jiném provedení obsahuje výše popsaný izolovaný polypeptid vnitrobuněčnou doménu, která dále obsahuje místa Boxl a Boxll.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález metodu produkce polypeptidu zalphall, která zahrnuje: kultivaci výše popsané buňky a izolaci polypeptidu zalphall, produkovaného buňkou.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, vybranou ze skupiny zahrnující: (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); a kde je polypeptid v podstatě bez transmembránových a vnitrobuněčných domén, která jsou obyčejně spojeny s receptory krvetvorby. V jiném provedení obsahuje výše popsaný polypeptid afinitní značku.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález metodu produkce polypeptidu zalphall, která zahrnuje: kultivaci výše popsané buňky a izolaci polypeptidu zalphall, produkovaného buňkou.

metodu produkce protilátky proti polypeptidu zalphall, která zahrnuje: očkování zvířete polypeptidem, vybraným ze skupiny zahrnující: (a) polypeptid obsahující 9 až 519 aminokyselin, přičemž se polypeptid skládá ze spojité sekvence aminokyselin v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser); (b) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny • · · « · · · ·· · • · · · · · · ·· • ··· ······· ·· • · · · · ···· y ···· ·· «· * «♦··· číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); (c) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 101 (Leu) k aminokyselině číslo 122 (Gly); (d) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 141 (Asn) k aminokyselině číslo 174 (Ala); (e) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 193 (Cys) k aminokyselině číslo 261 (Val); (f) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 51 (Trp) k aminokyselině číslo 61 (Glu); (g) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 136 (Ile) k aminokyselině číslo 143 (Glu); (h) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 187 (Pro) k aminokyselině číslo 195 (Ser); (i) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 223 (Phe) k aminokyselině číslo 232 (Glu); a (j) polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 360 (Glu) k aminokyselině číslo 368 (Asp); kde polypeptid vyvolává u zvířete imunitní odpověď a tvorbu protilátky; a izolování protilátky ze zvířete.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález protilátku, produkovanou výše popsaným způsobem, která se specificky váže k polypeptidu zalphall. V jednom provedení je výše popsaná protilátka monoklonální protilátkou.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález protilátku, která se specificky váže k výše popsanému polypeptidu.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález způsob, jak v testovaném vzorku detekovat přítomnost modulátoru aktivity proteinu zalphall, který zahrnuje: kultivaci buňky, do které byl vnesen výše popsaný expresní vektor, kde buňka exprimuje protein zalphall, kódovaný segmentem DNA, v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku, a porovnání hladin aktivity zalphal 1 v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku pomocí biologického nebo biochemického testu; a z tohoto porovnání určení přítomnosti modulátoru aktivity zalphal 1 v testovaném vzorku.

V jiném ohledu poskytuje předložený vynález jak v testovaném vzorku detekovat přítomnost ligandu receptoru zalphall, který zahrnuje: testovaný vzorek je uveden do kontaktu polypeptidem, obsahujícím aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 237 (His); a detekování vazby polypeptidu k ligandu ve vzorku. V jednom provedení dále výše popsaná metoda • · • · · · · · · t · • · · · ···*··· · · • · · · · · «·· θ ···· ·· ·· · ··· obsahuje polypeptid, který obsahuje transmembránové a vnitrobuněčné domény. V jiném provedení dále výše popsaná metoda obsahuje polypeptid, který je vázán na membránu uvnitř kultivované buňky a detekční krok zahrnuje měření biologické odpovědi v kultivované buňce. V jiném provedení dále výše popsaná metoda obsahuje polypeptid, který je vázán na membránu uvnitř kultivované buňky a detekční krok zahrnuje měření biologické odpovědi v kultivované buňce, kde biologickou odpovědí je množení buňky nebo aktivace transkripce reportérového genu. V jiném provedení dále výše popsaná metoda obsahuje polypeptid, který je imobilizován na pevné podložce.

Tyto a jiné stránky vynálezu se stanou zřejmé po odvolání na následující podrobný popis vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Před podáním podrobného popisu vynálezu může pro jeho pochopení být užitečné definovat následující termíny:

Termín afinitní značka je zde použit pro označení polypeptidového segmentu, který může být připojen ke druhému polypeptidu pro umožnění čištění nebo detekce tohoto druhého polypeptidu nebo poskytuje místa pro připojení druhého polypeptidu k substrátu. V principu jakýkoli peptid nebo protein, pro který jsou dostupné protilátky nebo jiné specificky se vázající činidlo, může být použit jako afinitní značka. Afinitní značky zahrnují polyhistidinový úsek, protein A (Nilsson a kol., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson a kol., Methods Enzymol. 198:3, 1991), transferázu glutathionu S (Smith a Johnson, Gene 67:31, 1988), afinitní značka Glu-Glu (Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), látka S, peptid Flag™ (Hopp a kol., Biotechnology 6:1204-10, 1988), peptid který váže streptavidin nebo jiné antigenní epitopy nebo vazebné domény. Všeobecně viz ve Ford a kol., Protein Expresion and Purification 2:95-107, 1991. DNA kódující afinitní značky jsou dostupné od komerčních dodavatelů (např. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termín alelová varianta je zde použit pro označení jakékoli ze dvou nebo více alternativních forem genu, které se nacházejí na tomtéž místě na chromozómu. Alelové varianty vznikají přirozenou cestou vlivem mutací a jejich výsledkem může být fenotypový polymorfizmus uvnitř populací. Mutace genů mohou být skryté (žádná změna v kódovaném peptidu) nebo mohou kódovat polypeptidy, které mají změněnou aminokyselinovou sekvenci. Termín alelová varianta je zde také použit pro označení proteinu, kódovaného alelovou variantou genu.

♦ · · · · · · · · • · · · · · · · • ··· ······· ·

Termíny aminový konec a karboxylový konec jsou zde použity pro označení pozicí uvnitř polypeptidů. Tam, kde kontext dovoluje, jsou tyto termíny použity s odkazem na určitou sekvenci nebo část polypeptidů pro označení blízkosti nebi relativní pozice. Například určitá sekvence umístěná uvnitř polypeptidů vzhledem k referenční sekvenci směrem ke karboxylovému konci je umístěna blíže ke karboxylovému konci než referenční sekvence, ale není nezbytně na karboxylovém konci celého peptidu.

Termín pár komplement/antikomplement označuje nestejné účinné složky, které vytváří za vhodných podmínek nekovalentně spojený, stabilní pár. Například biotin a avidin (nebo streptavidin) jsou prototypem páru komplement/antikomplement. Jiné příklady párů komplement/antikomplement zahrnují páry receptor/ligand, páry protilátka/antigen (nebo hapten nebo epitop), polynukleotidové páry sense/antisense a podobně. Tam kde je žádoucí následná disociace páru komplement/antikomplement, pár komplement/antikomplement má nejspíš vazebnou afinitu <10⁹ M‘¹.

Termín komplementy polynukleotidové molekuly je polynukleotidové molekula, která má komplementární sekvenci bází a opačnou orientaci ve srovnání s referenční sekvencí. Například sekvence 5' ATGCACGGG 3' je komplementární k 5' CCCGTGCAT 3'.

Termín kontig označuje polynukleotid, který má souvislý úsek totožné nebo komplementární sekvence s jiným polynukleotidem. O souvislých sekvencích se řekne že překrývají daný úsek polynukleotidové sekvence buď v celé délce nebo podél části polynukleotidového úseku. Například reprezentativní kontigy k polynukleotidové sekvenci 5'-ATGGCTTAGCTT-3' jsou 5'-TAGCTTgagtct-3' a gtcgacTACCGA-5'.

Termín degenerovaná sekvence nukleotidová sekvence označuje sekvenci nukleotidů, které obsahuje jeden nebo více degenerovaných kodonů (ve srovnání s referenční polynukleotidovou molekulou, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony obsahují odlišné triplety nukleotidů, ale kódují stejný aminokyselinový zbytek (např. každý z tripletů GAU a GAC kóduje Asp).

Termín expresní vektor je použit pro označení molekuly DNA, lineární nebo kruhové, která obsahuje segment kódující polypeptid o který jde, operativně vázaný k dalším segmentům, které podporují jeho transkripci. Tyto další segmenty zahrnují promotorové a terminátorové sekvence a mohou také zahrnovat jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selekčních markérů, zesilovač transkripce, • · · · · · · · · • · · · · · ·· • · · · ····«>·· · polyadenylační signál atd. Expresní vektory jsou obecně odvozeny z plazmidové nebo virové DNA nebo mohou obsahovat elementy obou z nich.

Termín izolovaný, pokud je aplikovaný na polynukleotid, označuje že polynukleotid byl odstraněn ze svého přirozeného genetického prostředí a je tedy zbaven ostatních nepatřičných nebo nežádoucích kódujících sekvencí a je ve formě vhodné pro použití v produkčních systémech pro geneticky manipulované proteiny. Takové izolované molekuly jsou ty, které jsou odděleny ze svého přírodního okolí a zahrnují klony cDNA a genomické klony. Izolované DNA molekuly, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou zbaveny jiných genů se kterými jsou obyčejně spojeny, ale mohou obsahovat přirozeně se vyskytující 5' a 3' nepřekládané oblasti, jako jsou promotory a terminátory. Určování připojených oblastí bude zřejmé osobě se zkušeností v oboru (viz například Dynan a Tijan, Nátuře 316:774-78, 1985).

Izolovaný polypeptid nebo protein je polypeptid nebo protein, který se nachází za podmínek jiných, než v jeho přirozeném prostředí, jako je mimo krev nebo mimo živočišnou tkáň. Ve výhodné formě je izolovaný polypeptid v podstatě zbaven jiných polypeptidů, zvláště jiných polypeptidů živočišného původu. Přednostně jsou tyto polypeptidy poskytovány ve vysoce čištěné formě, tj. více než v 95% čistotě, nejlépe ve více než v 99% čistotě. Když je používán v tomto smyslu, termín izolovaný nevylučuje přítomnost téhož polypeptidů v alternativních fyzikálních formách, jako jsou dimery nebo různě glykosylované nebo odvozené formy.

Termín operativně vázaný, pokud označuje segmenty DNA, znamená, že segmenty jsou uspořádány tak, že fungují v souladu se svým zamýšleným účelem, např. transkripce začíná na promotoru a probíhá přes kódující segment k terminátoru.

Termín ortolog označuje polypeptid nebo protein získaný z jednoho druhu, který je funkčním partnerem polypeptidů nebo proteinu z jiných druhů. Sekvenční odchylky mezi ortology jsou výsledkem druhového rozrůznění.

Paralogy jsou odlišné ale strukturně příbuzné proteiny tvořené v organizmu. Má se za to, že paralogy vznikají genovou duplikací. Například a-globin, β-globin a jsou vzájemnými paralogy.

Polynukleotid je jednovláknový nebo dvouvláknový polymer deoxyribonukleotidových nebo ribonukleotidových bází, čtený od 5'-konce k 3'-konci. Polynukleotidy zahrnují RNA a DNA a mohou být izolované z přírodních zdrojů, syntetizované in vitro nebo připravené kombinací přírodních a syntetických molekul.

···*·· ·«· »· • · · · · · · • · · · · · ·· • · · · ······· ·

Velikosti polynukleotidů jsou vyjádřeny v párech bází (zkráceně bp), nukleotidech (nt) nebo tisících bází - kilobázích (kb). Kde to kontext dovoluje, dva posledně jmenované termíny mohou popsat polynukleotidy, které jsou jednovláknové nebo dvouvláknové. Když je termín použit pro dvouvláknové molekuly, je použit pro označení celkové délky a bude to chápáno jako odpovídající termínu páry bází. Osobám se zkušeností v oboru bude patrné, že dvě vlákna dvouvláknového polynukleotidu se mohou slabě lišit délkou a že jejich konce mohou být nestejné následkem enzymatického štěpení; tedy v rámci dvouvláknové polynukleotidové molekuly nemusí být všechny nukleotidy párovány.

Polypeptid je polymer aminokyselinových zbytků spojených peptidickými vazbami, ať je vytvořený přirozeně nebo synteticky. Polypeptidy s méně než 10 aminokyselinovými zbytky jsou obecně označovány jako peptidy.

Termín promotor je zde použit pro označení části genu, obsahující sekvence DNA, které umožňují vazbu RNA polymerázy a zahájení transkripce. Promotorové sekvence se běžně, ne však vždy, nacházejí v 5' nekódujících oblastech genů.

Protein je makromolekula obsahující jeden nebo více polypeptidových řetězců. Protein může také obsahovat nepeptidové složky, jako jsou cukerné skupiny. Cukry a jiné nepeptidové substituenty mohou být k proteinu přidány buňkou, ve které je protein produkován a budou se měnit podle typu buňky. Proteiny jsou zde definovány podle svých aminokyselinových struktur; substituenty jako jsou cukerné skupiny nejsou obecně upřesňovány, nicméně mohou být přítomny.

Termín receptor je zde použit pro označení s buňkou spojeného proteinu nebo polypeptidové podjednotky takového proteinu, který se váže k biologicky aktivní molekule (ligandu) a zprostředkuje vliv ligandu na buňku. Vazba ligandu na receptor má za následek konformační změny v receptoru (a v některých případech multimerizaci receptoru, tj. spojení totožných nebo odlišných podjednotek receptoru), které způsobují interakce mezi efektorovou doménou (doménami) a jinou molekulou (jinými molekulami) v buňce. Tyto interakce vedou ke změnám v metabolizmu buňky. Metabolické děje, které jsou spojeny s interakcemi receptor-ligand zahrnují transkripci genu, fosforylaci, defosforylaci, buněčné bujení, zvýšení produkce cyklického AMP, mobilizaci buněčného vápníku, mobilizaci membránových lipidů, soudržnost buněk, hydrolýzu inozitolových lipidů a hydrolýzu fosfolipidů. Receptory cytokinů na buněčném povrchu jsou charakteristické svou multidoménovou strukturou, jak bude podrobněji diskutováno dále. Tyto receptory jsou zakotveny v buněčné membráně pomocí transmembránové domény, pro kterou je charakteristická sekvence hydrofobních aminokyselinových zbytků (typicky 21 až 25 zbytků), se kterou obyčejně po stranách sousedí kladně nabité zbytky (Lys nebo Arg). Obecně mohou být receptory vázané na membránu, cytosolové nebo jaderné; monomerní (např. receptor hormonu stimulujícího štítnou žlázu, beta-adrenergický receptor) nebo multimerní (např. receptor PDGF, receptor růstového hormonu, receptor IL-3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, receptor erytropoetinu a receptor IL-6). Termín polypeptid receptoru je použit pro označení polypeptidových řetězců kompletního receptoru a jeho částí, včetně izolovaných funkčních domén (např. domény, které vážou ligand).

Sekreční signální sekvence je DNA sekvence, která kóduje polypeptid (sekreční peptid), který jako součást většího polypeptidu vede větší polypeptid sekretorickou dráhou buňky, v níž je syntetizován. Větší polypeptid je obecně štěpen a sekreční peptid je odstraněn v průběhu průchodu sekreční dráhou.

Rozpustný receptor je polypeptid receptoru, který není vázán na membránu buňky. Rozpustné receptory jsou nejčastěji polypeptidy receptoru, které vážou ligandy, které však postrádají transmembránové a cytoplazmové domény. Rozpustné receptory mohou obsahovat další aminokyselinové zbytky, jako jsou afinitní značky, které usnadňují purifikaci polypeptidu nebo poskytují místa pro připojení polypeptidu k substrátu nebo sekvencím konstantních oblastí imunoglobulinu. Mnoho receptorů, vyskytujících se na buněčném povrchu má přirozeně se vyskytující rozpustné protějšky, které vznikají proteolýzou. O polypeptidech rozpustných receptorů lze říci že jsou v podstatě zbavené transmembránových a vnitrobuněčných polypeptidových segmentů, pokud postrádají dostatečné části těchto segmentů, které by jim umožnily zakotvení v membráně, popřípadě převod signálu.

Termín sestřihová varianta je zde použit pro označení alternativních forem RNA transkribované z genu. Sestřihové varianty vznikají přirozeně použitím alternativních sestřihových míst uvnitř transkribované molekuly RNA nebo méně běžně mezi odděleně transkribovanými molekulami RNA a výsledkem může být několik molekul mRNA z téhož genu. Sestřihové varianty mohou kódovat polypeptidy, které mají změněnou aminokyselinovou sekvenci. Termín sestřihová varianta je zde také používán pro označení proteinu kódovaného sestřihovou variantou mRNA, transkribovanou z genu.

• · · · · · · ♦ · « · · · · · · · • · ♦ · ······· ·

Molekulové hmotnosti a délky polymerů určené nepřesnými analytickými metodami (např. gelovou elektroforézou) budou chápány jako přibližné hodnoty. Když je taková hodnota vyjádřena asi X nebo přibližně X, u uvedené hodnoty X bude předpokládána odchylka ±10 %.

Všechny zde uvedené odkazy jsou zahrnuty ve své úplnosti.

Předložený vynález je založen částečně na objevu nové sekvence DNA, která kóduje protein mající strukturu cytokinového receptoru třídy I. Odvozená aminokyselinová sekvence naznačuje, že kódovaný receptor patří k podtřídě receptorů, která zahrnuje β-podjednotku IL-2 receptoru a β-obecný receptor (tj. β-podjednotky receptorů IL3, IL-5 a GM-CSF). Analýza tkáňové distribuce mRNA odpovídající této nové DNA, ukázala expresi v lymfatických uzlinách, periferních krevních leukocytech (PBLs), slezině a brzlíku. Kromě toho byla mRNA hojná v buněčné linii Ráji (ATCC č. CCL-86), odvozené z Burkittova lymfomu. Polypeptid byl označen zalphall.

Nové polypeptidy zalphall, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byly původně určeny dotazem v EST databázi. EST byl nalezen a jeho odpovídající cDNA byla sekvenována. Nový polypeptid kódovaný cDNA vykazoval homologii s cytokinovými receptory třídy I. Polynukleotidová sekvence zalphall kóduje celou kódující sekvenci předpověděného proteinu. Zalphall je nový cytokinový receptor, který může být součástí apoptické buněčné dráhy, signální molekuly typu buňka-buňka, receptoru růstového faktoru nebo proteinu spojeného s extracelulární základní hmotou, který má aktivitu hormonu růstového faktoru nebo podobně.

Sekvence polypeptidů zalphal 1 byla odvozena z jednoho klonu, který obsahoval jeho odpovídající polynukleotidovou sekvenci. Klon byl získán z knihovny, která byla připravena z míchy. Jiné knihovny, které mohou být také prohledávány na tuto sekvenci, zahrnují PBL, brzlík, slezinu, lymfatické uzliny, buněčné linie lidských erytroleukemických buněk (např. TF-1), buňky Ráji, buněčné linie akutní monocytické leukémie, jiné lymfoidní buněčné linie, buněčné linie krvetvorných buněk a podobně.

Nukleotidová sekvence reprezentativní DNA kódující zalphall je popsána v SEQ ID NO:1 (od nukleotidu 69 do 1682) a z ní dedukovaná aminokyselinová sekvence z 558 aminokyselin je popsána v SEQ ID NO:2. Ve své úplnosti polypeptid zalphall (SEQ ID NO:2) představuje polypeptidový segment o plné délce (zbytek 1 (Met) až zbytek 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2). Domény a strukturní rysy polypeptidů zalphall jsou popsány dále.

··«·«· ··· ♦· · · · * ·· • · 9 9 9 9 ·9

9 9 9 9 9999 9 99

Analýza polypeptidu zalphall, kódovaného sekvencí DNA ze SEQ ID NO:1 odhalila otevřený čtecí rámec kódující 538 aminokyselin (SEQ ID NO:2), obsahující předpověděný sekreční signální peptid z 19 aminokyselinových zbytků (zbytek 1 (Met) až zbytek 19 (Gly) ze SEQ ID NO:2) a zralý polypeptid z 519 aminokyselin (zbytek 20 (Cys) až zbytek 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2). Vedle motivu WSXWS (SEQ ID NO:3) odpovídajícího zbytkům 214 až 218 ze SEQ ID NO:2, receptor obsahuje vazebnou doménu pro cytokin, dlouhou přibližně 200 aminokyselinových zbytků (zbytky 20 (Cys) až 237 (His) ze SEQ ID NO:2); vazebnou část domény (zbytky 120 (Pro) až 123 (Pro) ze SEQ ID NO:2); předposlední oblast řetězce (zbytky 192 (Lys) až 202 (Ala) ze SEQ ID NO:2); transmembránovou doménu (zbytky 238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2); kompletní vnitrobuněčnou signální doménu (zbytky 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2), která obsahuje signální místo Box I (zbytky 267 (Ile) až 273 (Pro) ze SEQ ID NO:2) a signální místo Box II (zbytky 301 (Leu) až 304 (Gly) ze SEQ ID NO:2). Osoby se zkušeností v oboru poznají, že tyto hranice domén jsou přibližné a jsou založeny na porovnání se známými proteiny a na předpovědích prostorového uspořádání proteinu. Vedle těchto domén jsou v kódovaném receptorů zahrnuty konzervativní rysy receptorů (jak je ukázáno v SEQ ID NO:2), konzervativní zbytek Trp na pozici 138 a konzervativní zbytek Arg na pozici 201. Odpovídající polynukleotidy kódující výše popsané polypeptidové oblasti, domény, motivy zbytky a sekvence zalphal 1 jsou ukázány v SEQ ID NO:1.

Přítomnost transmembránových oblastí, konzervativních motivů a motivů s nízkou variabilitou obecně koreluje s důležitými strukturními oblastmi nebo vyznačuje důležité strukturní oblasti. Oblasti s nízkou variabilitou, (např. hydrofilní shluky) jsou obecně přítomny ve strukturně důležitých oblastech (Sheppard, P. a kol., viz výše). Takové oblasti s nízkou variabilitou často obsahují vzácné nebo zřídka se vyskytující aminokyseliny jako je tryptofan. Oblasti po stranách nebo mezi takovými konzervativními motivy a motivy s nízkou variabilitou mohou být více variabilní, ale jsou často funkčně významné, protože se mohou podobat nebo mohou vyznačovat důležité struktury a aktivity jako jsou vazebné domény, biologická a enzymatická aktivita, převod signálu interakce typu buňka-buňka, tkáňově lokalizované domény a podobně.

Oblasti konzervativních aminokyselinových zbytků v zalphall popsané výše, mohou být použity jako nástroje pro identifikaci nových členů této rodiny proteinů. Například reverzně transkripční polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) může být použita pro amplifikaci sekvencí kódujících konzervativní oblasti z RNA získané z různých tkáňových zdrojů nebo buněčných linií. Pro tento účel jsou zvláště vhodné vysoce degenerované primery navržené podle sekvencí zalphall. Návrh a použití takových degenerovaných primerů mohou být snadno provedeny osobou se zkušeností v oboru.

Předložený vynález poskytuje polynukleotidové molekuly, zahrnující molekuly DNA a RNA, které kódují zde popsané polypeptidy zalphall. Osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že z důvodu degenerace genetického kódu je mezi těmito polynukleotidovými molekulami možná značná sekvenční variabilita. SEQ ID NO:4 je degenerovaná sekvence DNA, která zahrnuje všechny DNA, kódující polypeptid zalphall ze SEQ ID NO:2. Osoby se zkušeností v oboru si budou vědomy, že degenerovaná sekvence SEQ ID NO:4 také poskytuje všechny RNA sekvence kódující SEQ ID NO:2 po záměně U za T. V předloženém vynálezu jsou tedy uvažovány polynukleotidy kódující polypeptid zalphall, které obsahují nukleotid 1 až nukleotid 1614 ze SEQ ID NO:4 a jejich RNA ekvivalenty. Tabulka 1 uvádí jednopísmenné kódy použité v SEQ ID NO:4 pro označení degenerovaných nukleotidových pozic. Komplement ukazuje kód komplementárního nukleotidu (nukleotidů). Například kód Y označuje buď C nebo T a jeho komplement R označuje A nebo G, A je komplementární k T a G je komplementární k C.

•Φ φφφφ φφ φ φφ • Φ φφφφ ΦΦΦ φ φ φφφφ φφ • ΦΦΦ φφφφφφφ φ • ΦΦΦ φφ φφ φ φφ ΦΦΦ

Tabulka 1

Nukleotid	Označuje	Komplement	Označuje
A	A	Τ	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	a|g	Y	c|t
Y	c|t	R	a|g
M	a|c	K	G|T
K	g|t	M	a|c
S	c|g	S	c|g
W	a|t	W	a|t
H	a|c|t	D	a|g|t
B	c|g|t	V	a|c|g
V	a|c|g	B	c|g|t
D	a|g|t	H	a|c|t
N	a|c|g|t	N	a|c|g|t

Degenerované kodony použité v SEQ ID N0:4 zahrnují všechny možné kodony pro danou aminokyselinu, jak je uvedeno v Tabulce 2.

·♦ • ·

4·Φ·

Tabulka 2

Aminokyselina	Jednopísmenný kód	Kodony	Degenerovaný kodon
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter		TAA TAG TGA	TRR
Asn | Asp	B		RAY
Glu |Gln	Z		SAR
libovolná	X		NNN

•4 4*44 4» 444

4 4 4 4 44

4 444444

444 44444444

Osoba se zkušeností v oboru si bude vědoma toho, že existuje určitá nejednoznačnost v určování degenerovaných kodonů, reprezentujících všechny možné kodony, které kódující určitou aminokyselinu. Například degenerovaný kodon pro serin (WSN) může za určitých okolností kódovat arginin (AGR) a degenerovaný kodon pro arginin (MGN) může za určitých okolností kódovat AGY). Podobný vztah existuje mezi kodony kódujícími fenylalanin a leucin. Tedy některé polynukleotidy obsažené v degenerované sekvenci mohou kódovat variantní aminokyselinové sekvence, ale osoba se zkušeností v oboru může takové variantní sekvence snadno určit odkazem na aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2. Variantní sekvence mohou být snadno testovány na jejich funkčnost tak, jak je zde popsáno.

Osoba se zkušeností v oboru si bude vědoma toho, že různé druhy mohou vykazovat přednostní užívání kodonů. Obecně viz Grantham a kol., Nucleic Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas a kol., Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson a kol., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean a Fiers, Gene 18:199-209,1982; Holm, Nucleic Acids Res. 14:3075-87, 1986; lkemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Termín přednostní užívání kodonů nebo upřednostňované kodony je termín z oboru označující kodony, které jsou při translaci proteinu používány častěji v buňkách určitých druhů, a tím je dávána přednost jednomu nebo několika reprezentantům možných kodonů, kódujících každou aminokyselinu (viz tabulka 2). Například aminokyselina threonin (Thr) může být kódována ACA, ACC, AAG nebo ACT, ale v savčích buňkách je nejčastěji používaným kodonem ACC; v jiných druzích, například hmyzích buňkách, kvasinkách, virech nebo bakteriích mohou být upřednostňovány jiné Thr kodony. Upřednostňované kodony pro určité druhy mohou být vneseny do polynukleotidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pomocí různých, v oboru známých metod. Vnesení sekvencí přednostně používaných kodonů do rekombinantní DNA může například zvýšit produkci proteinu tím, že se translace stane efektivnější v určitém typu buňky nebo v určitém druhu organizmu. Proto sekvence degenerovaných kodonů uvedené v SEQ ID NO:4 slouží jako matrice pro optimalizaci exprese polynukleotidů v různých typech buněk a druzích, obecně v oboru používaných a zde uvedených. Sekvence obsahující přednostně používané kodony mohou být, jak je zde popsáno, testovány a optimalizovány pro expresi v různých druzích a testovány na svoji funkčnost.

Φ Φ Φ · Φ · ·♦ · ·« • · φ φ · · · · φ • φ φφφφ φφ • φφφ · φ φ φ φ φ φ φ

Ve výhodném provedení vynálezu budou izolované polynukleotidy hybridizovat za přísných hybridizačních podmínek s podobně velikými oblastmi ze SEQ ID NO:1 nebo ke komplementární sekvenci. Obecně jsou přísné hybridizační podmínky vybírány tak, že jsou asi o 5 °C nižší než je teplota tání (T_m) pro specifickou sekvenci při definované iontové síle a pH. T_m je teplota (při definované iontové síle a pH), při níž 50 % cílových sekvencí hybridizuje s přesně odpovídající sondou. Rovnice pro výpočet T_m jsou v oboru známé a jsou specifické pro DNA, RNA a DNA-RNA hybridy a sekvence polynukleotidových sond o různé délce (viz například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel a kol., (vyd.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, lne. 1987); Kimmel (vyd.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academie Press, lne. 1987); a Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Software pro analýzu sekvencí, jako je OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) a Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) a rovněž místa na internetu, jsou dostupnými nástroji pro analýzu dané sekvence a výpočet T_m v závislosti na podmínkách stanovených uživatelem. Takové programy mohou také analyzovat danou sekvenci za definovaných podmínek a určit vhodné sekvence sond. Běžně je hybridizace delších polynukleotidových sekvencí (např. >50 párů bází) prováděna při teplotách asi 20 až 25 °C pod vypočtenou T_m. Pro menší sondy (např. <50 párů bází) je hybridizace běžně prováděna při T_m nebo teplotách 5 až 10 °C nižších. To umožňuje maximální rychlost hybridizace DNA-DNA a DNA-RNA hybridů. Vyšší specifičnosti hybridizace při nižších teplotách může být dosaženo při přidání formamidu, který snižuje T_m hybridu asi o 1 °C při každém 1 % formamidu v roztoku pufru. Vhodné podmínky specifické hybridizace odpovídají asi inkubační době 5 hodin až přes noc, při teplotě 42 °C v roztoku, který obsahuje: 40 až 50% formamid, až 6x SSC, asi 5x Denhardtův roztok, 0 až 10% dextransulfát a 10 až 20 pg/ml denaturované, komerčně dostupné nosičové DNA. Obecně takové specifické podmínky zahrnují teploty 20 až 70 °C a hybridizační pufr obsahující až 6x SSC a 0 až 50% formamid; hybridizace je pak následována promytím filtrů v až 2x SSC. Například vhodné podmínky promývání odpovídají 0,1x SSC až 2x SSC, 0,1% SDS, při 50 až 65 °C. V průběhu hybridizace a promývání mohou být použity různé stupně přísnosti, aby bylo dosaženo maximálně specifické vazby k cílové sekvenci. Typicky jsou promývací kroky prováděny při zvyšující se přísností, aby došlo k odstranění nehybridizovaných polynukleotidových ······ · · · 9 99

9 9 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9999999 99

9 9 9 9 9 · fc· e · · · · 9 9 9 9 9 999 sond z hybridizovaných komplexů. Přísnost hybridizačních a promývacích podmínek závisí na délce sondy, má svůj odraz v T_m, použitých hybridizačních a promývacích roztocích, a jsou osobami se zkušeností v oboru běžně určovány empiricky.

Jak bylo již dříve zmíněno, izolované polynukleotidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnují DNA a RNA. Způsoby přípravy DNA a RNA jsou v oboru rovněž dobře známé. Obecně, RNA je izolována z tkáně nebo buněk, které produkují velká množství zalphall RNA. Takové tkáně a buňky jsou určovány metodou Northern blotování (Thomas, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) a zahrnují PBLs, slezinu, brzlík, lymfatické uzliny, buňky Ráji, linie lidských erytroleukemických buněk (např. TF-1), buněčné linie z akutní monocytické leukémie, jiné lymfoidní buněčné linie, buněčné linie krvetvorných buněk a podobně. Celková RNA může být připravena pomocí extrakce guanidinizothiokyanátem, poté následuje centrifugace v gradientu CsCI (Chirgwin a kol., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poly(A)⁺ RNA je připravena z celkové RNA pomocí metody Aviv a Leder (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). Komplementární DNA (cDNA) je připravena z poly(A)⁺ RNA pomocí známých metod. Alternativní možností je izolace genomové DNA. Polynukleotidy kódující polypeptidy zalphall jsou potom určeny a izolovány například pomocí hybridizace nebo polymerázové řetězové reakce (PCR) (Mullis, patent US 4 683 202).

Klon o plné délce, kódující zalphall, může být získán pomocí běžných klonovacích postupů. Je dávána přednost klonům komplementární DNA (cDNA), třebaže pro některé aplikace (např. exprese v transgenních zvířatech) může být výhodné použít genomové klony, nebo modifikovat cDNA klon tak, aby obsahoval alespoň jeden genomový intron. Metody přípravy cDNA a genomových klonů jsou dobře známé a jsou v rozsahu běžné zkušenosti v tomto oboru a zahrnují použití zde popsaných sekvencí nebo jejich částí pro sondování nebo založení knihovny. Expresní knihovny mohou být sondovány pomocí protilátek proti zalphall, fragmentům receptorů nebo jiným specificky se vázajícím molekulám.

Polynukleotidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být také syntetizovány pomocí přístrojů syntetizujících DNA. Běžně používanou metodou je dnes fosforamiditová metoda. Pokud je pro aplikaci, jako je syntéza genu nebo fragmentu genu, vyžadována chemicky syntetizovaná dvouvláknová DNA, potom je každé komplementární vlákno vytvořeno odděleně. Produkce krátkých polynukleotidů (60 až 80 bp) je technicky jednoduchá a může být uskutečněna syntézou

9 9 9 9 «9

9 9 9 99

999 99999099 komplementárních vláken a potom jejich teplotní hybridizací. Avšak pro produkci delších polynukleotidu (>300 bp) jsou obvykle použity specielní strategie, protože účinnost připojení v každém cyklu chemické syntézy DNA je málokdy 100%. Aby se tento problém obešel, syntetické geny (dvouvláknové) jsou sestavovány z jednovláknových fragmentů, které jsou dlouhé 20 až 100 nukleotidů.

Jedna metoda vytvoření syntetického genu vyžaduje počáteční vytvoření souboru překrývajících se, komplementárních oligonukleotidů, z nichž každý je dlouhý mezi 20 až 60 nukleotidy. Každý vnitřní úsek genu má komplementární 3' a 5' koncová prodloužení navržená tak, aby báze přesně párovaly s přilehlými úseky. Poté co je gen sestaven, proces je ukončen zaplněním přerušení, která se nacházejí podél obou vláken, pomocí T4 DNA ligázy. Vedle sekvence kódující protein, mohou být syntetické geny navrženy s koncovými sekvencemi, které usnadňují vložení do místa pro restrikční endonukleázu v klonovacím vektoru. Kromě toho mohou být přidány další sekvence, které obsahují signály pro vhodné zahájení a ukončení transkripce a translace.

Alternativním způsobem přípravy genu o plné délce je syntetizovat specifický soubor překrývajících se oligonukleotidů (40 až 100 nukleotidů). Poté co jsou teplotně hybridizovány krátké překrývající se 3' a 5' komplementární oblasti (6 až 10 nukleotidů), stále zbývají dlouhé mezery, ale krátké oblasti hybridizovaných bází jsou dostatečně dlouhé a dostatečně stabilní, aby udržely strukturu pohromadě. Mezery jsou zaplněny a dvouvláknová DNA je zkompletována enzymatickou syntézou pomocí E. coli DNA polymerázy I. Po ukončení enzymatické syntézy jsou přerušení zaplněna pomocí T4 DNA ligázy. Dvouvláknové konstrukty jsou postupně připojovány jeden ke druhému až vytvoří celou sekvenci genu, která je pak ověřena DNA sekvenční analýzou. Viz Glick a Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura a kol., Annu. Rev. Biochem. 53:323-56,1984 a Climie a kol., Proč. Natí. Acad. Sci. USA 87:633-7,1990.

Předložený vynález dále poskytuje funkční protějšky polypeptidu a polynukleotidů z jiných druhů (ortology). Tyto druhy zahrnují mimo jiné savce, ptáky, obojživelníky, plazy, ryby, hmyz a jiné druhy obratlovců a bezobratlých. Zvláště zajímavé jsou polypeptidy zalphall z jiných savčích druhů, včetně myších, vepřových, ovčích, hovězích, psích, kočičích, koňských a polypeptidů jiných primátů. Ortology lidského zalphall mohou být klonovány za použití informace a prostředků

•.-» ···· 4 · ·4 4 • * · 4 · 44 • * 444»44 ·»· 44444444 poskytnutých předloženým vynálezem ve spojení s běžnými klonovacími technikami. Například, jak zde bylo popsáno, cDNA může být klonována za použití mRNA, získané ze tkáně nebo typu buňky, která exprimuje zalphall. Vhodné zdroje mRNA mohou být určeny sondováním Northern blotů pomocí sond, navržených podle zde popsaných sekvencí. Z mRNA pozitivní tkáně nebo buněčné linie je potom připravena knihovna. cDNA kódující zalphall může být potom izolována různými metodami, jako je sondování pomocí kompletní nebo částečné lidské cDNA nebo jednoho nebo více souborů degenerovaných sond, založených na popsaných sekvencích. cDNA může být také klonována pomocí PCR (Mullis, viz výše), za použití primerů navržených podle zde popsané reprezentativní lidské sekvence zalphal 1. V rámci dalších metod může být cDNA knihovna použita pro transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a exprese cDNA o kterou se jedná, může být detekována pomocí protilátek proti polypeptidu zalphall. Podobné techniky mohou být také aplikovány na izolaci genomových klonů.

Podjednotky cytokinových receptorů jsou charakterizovány multidoménovou strukturou, obsahující extracelulární doménu, transmembránovou doménu, která ukotvuje polypeptid v membráně buňky a vnitrobuněčnou doménu. Extracelulární doména může být doména, která váže ligand a vnitrobuněčná doména může být efektorová doména, která se účastní převodu signálu, třebaže vázání ligandu a efektorová funkce mohou být umístěny na oddělených podjednotkách multimerního receptorů. Doména, která váže ligand, může sama mít multidoménovou strukturu. Multimerní receptory zahrnují homodimery (např. αα a ββ izoformy receptorů PDGF, erytropoetinový receptor, MPL a receptor G-CSF), heterodimery, jejichž podjednotky mají každá doménu, která váže ligand a efektorovou doménu (např. αβ izoforma receptorů PDGF) a multimery, jejichž složkami jsou podjednotky s různorodými funkcemi (např. receptory IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 a GM-CSF). Některé podjednotky receptorů jsou společné pro více receptorů. Například podjednotka AIC2B, která nemůže sama vázat ligand, ale obsahuje vnitrobuněčnou doménu pro převod signálu, je součástí receptorů IL-3 a GM-CSF. Mnoho cytokinových receptorů může být zařazeno do jedné ze čtyř příbuzných rodin na základě struktury a funkce. Například receptory krvetvorby jsou charakterizovány přítomností domény, obsahující konzervativní cysteinové zbytky a motiv WSXWS (SEQ ID NO:3). Struktura cytokinových receptorů byla přehledně uvedena v Urdal, Ann. Reports Med. Chem.

· • · · 4 4 · · · ·· • · 4 · · ♦ * ·· · • 4 4Φ4444 4

444 4444··· 44 *·· ..:.

26:221-228, 1991, a Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993. Za působení selekčního tlaku na organizmy, který vede k získání nových biologických funkcí, pravděpodobně noví členové rodiny receptorů vznikají duplikací existujících receptorových genů, což vede k existenci rodin o mnoha genech. Členové rodiny tak obsahují pozůstatky starších genů a tyto charakteristické rysy mohou být využity při izolaci a identifikaci dalších členů rodiny. Tedy skupina cytokinových receptorů je rozdělena do několika rodin, například rodina imunoglobulinů (zahrnující receptory CSF-1, MGF, IL-1 a PDGF); rodina hematopoetinu (zahrnující β-podjednotku receptorů IL-2, α-podjednotku receptorů GMCSF, β-podjednotku receptorů GM-CSF,; a receptory G-CSF, EPO, IL-3, IL-4, IL-5, IL6, IL-7 a IL-9); rodina receptorů TNF (zahrnující TNF (p80) TNF (p60) receptory, CD27, CD30, CD40, Fas a receptor NGF).

Analýza sekvence zalphall naznačuje, že je členem téže podskupiny, jako je βpodjednotka receptorů IL-2, receptory IL-3, IL-4 a IL-6. Určité receptory v této podskupině (např. G-CSF) se spojují a vytvářejí homodimery, které převádějí signál. Ostatní členové podskupiny (např. receptory IL-6, IL-11 a LIF) se spojují s druhou podjednotkou (nazývanou β-podjednotka) kvůli vazbě ligandu a převod signálu. Specifické β-podjednotky se spojují s množstvím podjednotek specifických cytokinových receptorů. Například β-podjednotka gp130 (Hibi a kol., Cell 63:11491157, 1990) se spojuje s receptorovou podjednotkou specifickou pro IL-6, IL-11 a LIF (Gearing a kol., EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing a kol., patent US 5 284 755). Oncostatin M se váže na heterodimer receptorů LIF a gp130. CNTF se váže na trimerní sestavu receptorů, obsahující receptor CNTF, receptor LIF a podjednotku gp130.

Byla určena polynukleotidová sekvence pro myší ortolog lidského zalphall a je ukázána v SEQ ID NO:84 a jí odpovídající aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID NO:85. Analýza myšího polypeptidu zalphall kódovaného DNA sekvencí v SEQ ID NO:84 ukázala otevřený čtecí rámec kódující 529 aminokyselin (SEQ ID NO:85), obsahující předpověděný sekreční signální peptid z 19 aminokyselinových zbytků (zbytek 1 (Met) až zbytek 19 (Ser) ze SEQ ID NO:85) a zralý polypeptid z 510 aminokyselin (zbytek 20 (Cys) až zbytek 529 (Ser) ze SEQ ID NO:2). Vedle motivu WSXWS (SEQ ID NO:3) odpovídajícího zbytkům 214 až 218 ze SEQ ID NO;85, receptor obsahuje vazebnou doménu pro cytokin, dlouhou přibližně 200 aminokyselinových zbytků (zbytky 20 (Cys) až 237 (His) ze SEQ ID NO:85); vazebnou část domény (zbytky 120 (Pro) až 123 (Pro) ze SEQ ID NO:85); předposlední oblast • · ♦ ♦ · · « « φ • φ φφφφ φφ φ φφφ φ φφφφ · φ φ řetězce (zbytky 192 (Lys) až 202 (Ala) ze SEQ ID NO:85); transmembránovou doménu (zbytky 238 (Met) až 254 (Leu) ze SEQ ID NO:85); kompletní vnitrobuněčnou signální doménu (zbytky 255 (Lys) až 529 (Ser) ze SEQ ID NO:85), která obsahuje signální místo Box I (zbytky 266 (Ile) až 273 (Pro) ze SEQ ID NO:85) a signální místo Box II (zbytky 301 (Ile) až 304 (Val) ze SEQ ID NO:2). Porovnání lidské a myší aminokyselinové sekvence ukázalo, že jak lidský tak i ortologní polypeptidy obsahují odpovídající strukturní rysy, které byly popsány výše (viz obrázek 2). Zralá sekvence myšího zalphal 1 začíná na Cys₂₀ (jak je uvedeno v SEQ ID NO:85), který odpovídá Cys₂₀ Cak J^e uvedeno v SEQ ID NO:2) v lidské sekvenci. Existuje asi 63% shoda mezi myší a lidskou sekvencí v rámci celé aminokyselinové sekvence, odpovídající SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:85. Existuje asi 69% shoda mezi myší a lidskou sekvencí v rámci extracelulární domény, která váže cytokin, odpovídající zbytkům 20 (Cys) až 237 (His) ze SEQ ID NO:2 a zbytkům 20 (Cys) až 237 (His) ze SEQ ID NO:85. Existuje asi 60% shoda mezi myší a lidskou sekvencí v rámci vnitrobuněčné signální domény, odpovídající zbytkům 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2 a zbytkům 255 (Lys) až 529 (Ser) ze SEQ ID NO:85. Výše uvedené procentní shody byly určovány pomocí programu FASTA s ktup=1, penalizace vzniklé mezery=12, penalizace rozšíření mezery=2, a substituční matice=BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA. Odpovídající polynukleotidy kódující u myšího zalphal 1 polypeptidu oblasti, domény, motivy, zbytky a sekvence popsané výše, jsou ukázány v SEQ ID NO:84.

Osoby se zkušeností v oboru si jsou vědomy, že sekvence uvedené v SEQ ID NO:1 představují jednu alelu lidského zalphal 1 a že je možno očekávat, že bude docházet ke vzniku alelových variant a alternativního sestřihu. Alelové varianty této sekvence mohou být klonovány sondováním cDNA knihoven nebo genomových knihoven z různých jedinců podle standardních postupů. Alelové varianty sekvence DNA uvedené v SEQ ID NO:1, včetně těch které obsahují skryté mutace a těch, v nichž mají mutace za následek změny v aminokyselinové sekvenci, spadají do rozsahu předloženého vynálezu, stejně jako proteiny, které jsou alelovými variantami SEQ ID NO:2. cDNA vytvořené z alternativně sestřižené mRNA, které si podrží vlastnosti polypeptidu zalphal 1, jsou zahrnuty do rozsahu předloženého vynálezu, stejně jako proteiny, které jsou takovými cDNA a mRNA kódovány. Alelové varianty a sestřihové varianty těchto sekvencí mohou být klonovány sondováním cDNA knihoven nebo · ···· « · · · · • · · · · · · • ♦ · · · · · ♦ « <»·· ······· · genomových knihoven z různých jedinců nebo tkání podle standardních postupů v oboru známých.

Předložený vynález také poskytuje izolované polypeptidy zalphall, které jsou značně podobné polypeptidům ze SEQ ID NO:2 a jejich ortologům. Termín značně podobný je zde použit pro označení polypeptidů, které mají alespoň 70%, výhodněji alespoň 80% sekvenční shodu se sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO:2 nebo jejich ortology. Takové polypeptidy budou ještě výhodněji alespoň z 90 % totožné a nejvýhodněji z 95 % nebo více totožné se SEQ ID NO: nebo jejími ortology. Procento sekvenční shody je určeno běžně používanými metodami. Viz například Altschul a kol., Bull. Math. Bio. 48:603-616, 1986 a Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:10 915-10 919, 1992. Krátce řečeno, dvě sekvence jsou porovnány tak, aby se optimalizovalo porovnávací skóre za použití penalizace vzniklé mezery=10, penalizace rozšíření mezery=1, a blosum62 hodnotící matice podle Henikoff a Henikoff (tamtéž), jak je ukázáno v tabulce 3 (aminokyseliny jsou značeny standardními jednopísmennými kódy).

Procento shody je tedy spočteno jako:

Celkový počet shod ________________________ x100 [délka delší sekvence plus počet mezer vnesených do delší sekvence, aby byly obě sekvence srovnány]

<	-<		—1	ω	τ	“Π		π	Γ —
ο	1 ΝΟ	1 00	ο	-	1	όο	-	1	1	I
1 00	ΝΟ	I 00	1	1	1 Μ	1 00	1	ΓΌ	1 ΝΟ	1 00
1 00	I ΝΟ	I Φ»	Ο	-	1 Μ	1 00	1 Μ	Ο	f οο	I 00
όο	I 00	Κ	-	ο	1	1 00	1 00	I	I Φ*>	00
1	ΝΟ	όο	1	I	1 C0	όο	I	1 00	-	I
ΝΟ	I	I ΝΟ	1	Ο	1	I 00	Ο		1 ΝΟ	1 00
1 ΝΟ	1 ΝΟ	όο	1	Ο	1	I ΟΟ	I rxo	-	I 00	I 00
1 00	όο	όο	1 Μ	Ο	1 Ν)	I 00	1 οο	1 ΝΟ	1 -Ν	Κ
όο	ΝΟ	I ιχο	1 Κ)	-	fb	I	rb	I	όο	1 00
οο	I	όο	1	1 Μ	I 00	Ο	—Λ	1 00	1X0	4Χ-
—X.	-	1 ΐχο	1 «X	I Ν)	I 00	Ο	Μ	1 Μ	Ν
1 ΝΟ	1 Μ	1 00	I	Ο	I	ΟΟ	I -Α	σι
-	1 -Λ	I	1	I —Λ.	rb	Ο	σι
1	G0	-	ΓΌ	1 Ν>	I Φ»	σο
1 Ν)	I C0	1 4^		I
1 Μ	I ro	1 οο	-	4^
Ο	1 ΓΌ	I Μ	σι

ΞΓ	0	m	0	Ο	ο	ζ	7J	>
1 ΝΟ	Ο		1	ο	1 Ν>	όο	1	>
Ο	I ΝΟ	ο	-	1 οο	I Ν)	ο	σι
-	Ο	ο	ο	όο	-	σο		Ζ
	1 —X	ΝΟ	ο	1 00	σο			Ο
I 00	1 00	I -Ν-	I 00	<ο				ο
Ο	όο	ΝΟ	σι					ο
Ο	όο	σι						m
1 ΝΟ	σο							0
00								I

Tabulka 3

Π τι ω —ι οο

ΝΟ

-<

Ν • · · · · · · · · • · ···· · · • ·«· ······· ·

Sekvenční shoda polynukleotidových molekul je určována podobnými metodami za pomoci zlomku, který byl výše popsán.

Osoby se zkušeností v oboru si uvědomí, že je k dispozici mnoho zavedených algoritmů pro porovnávání dvou aminokyselinových sekvencí. Algoritmus FASTA pro hledání podobnosti od Pearsona a Lipmana je vhodnou metodou porovnávání proteinů pro zjišťování úrovně shodnosti, která je sdílena zde popsanou aminokyselinovou sekvencí a aminokyselinovou sekvencí předpokládané varianty zsig57. Algoritmus FASTA je popsán v Pearson a Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) a v Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).

Krátce řečeno, FASTA napřed charakterizuje sekvenční podobnost určením oblastí sdílených zkoumanou sekvencí (např. SEQ ID NO:2) a testovací sekvencí, které mají buď nejvyšší hustotu shod (jestliže proměnná ktup je 1) nebo párů shod (jestliže ktup je 2), bez uvažování substitucí konzervativních aminokyselin, inzercí nebo delecí. Deset oblastí s nejvyšší hustotou shod je potom znovu zhodnoceno tak, že je porovnána podobnost všech párovaných aminokyselin za pomoci aminokyselinové substituční matice a konce oblastí jsou zkráceny, aby byly zahrnuty pouze ty zbytky, které přispívají k nejvyššímu skóre. Pokud existuje několik oblastí se skóre vyšším než mezní hodnota (vypočtená podle předem určeného vzorce, založeného na délce sekvence a hodnotě ktup), potom jsou zkoumány zkrácené oblasti, aby bylo zjištěno zda oblasti mohou být spojeny, aby vytvořily přibližné porovnání s mezerami. Nakonec jsou oblasti s nejvyšším skóre u dvou aminokyselinových sekvencí porovnány pomocí modifikovaného algoritmu podle Needelman-Wunsch-Sellers (Needelman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), který umožní inzerce a delece aminokyselin. Výhodné parametry pro FASTA analýzu jsou: ktup=1, penalizace vzniklé mezery=10, penalizace rozšíření mezery=1, a substituční matice=BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA. Tyto parametry mohou být zavedeny do programu FASTA pomocí modifikace vyhodnocovacího maticového souboru (SMATRIX), jak je vysvětleno v dodatku 2 v Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).

Program FASTA může být také použit pro určení sekvenční shody molekul nukleových kyselin za pomoci výše uvedeného zlomku. Pro porovnávání nukleotidových sekvencí může být hodnota ktup v rozmezí 1 až 6, výhodně od 3 do 6, • ♦ · · · · · · a · · · · · · · • a · · ······· a nejvýhodněji 3, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA.

Tabulka BLOSUM62 (tabulka 3) je substituční matice aminokyselin, odvozená z asi 2000 mnohonásobných místních porovnávání úseků proteinových sekvencí, představujících vysoce konzervativní oblasti více než 500 skupin příbuzných proteinů (Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89.Ί0 915 (1992)). Tedy substituční frekvence podle BLOSSUM62 mohou být použity pro definování konzervativních aminokyselinových substitucí, které mohou být zavedeny do aminokyselinových sekvencí, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Třebaže je možno navrhnout aminokyselinové substituce pouze na základě chemických vlastností (jak je probíráno dále), formulace konzervativní aminokyselinová substituce s výhodou označuje substituci představovanou hodnotou BLOSSUM62 větší než -1. Například aminokyselinová substituce je konzervativní, jestliže je charakterizována hodnotou BLOSSUM62 alespoň 0, 1, 2 nebo 3. Podle tohoto systému jsou výhodné konzervativní aminokyselinové substituce charakterizovány hodnotou BLOSSUM62 alespoň 1 (např. 1, 2 nebo 3), zatímco výhodnější konzervativní aminokyselinové substituce jsou charakterizovány hodnotou BLOSSUM62 alespoň 2 (např. 2 nebo 3).

Variantní polypeptidy zalphall nebo značně homologické zalphall polypeptidy jsou charakteristické tím, že mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Je výhodné, když tyto změny jsou ve své podstatě malé, tj. konzervativní aminokyselinové substituce (viz tabulka 4) a jiné substituce, které neovlivní významně uspořádání nebo aktivitu polypeptidů; malé delece, typicky od 1 do 30 aminokyselin; a malá prodloužení na aminovém konci nebo karboxylovém konci, jako je zbytek metioninu na aminovém konci, malý spojující peptid dlouhý 20 až 25 zbytků nebo afinitní značka. Předložený vynález tedy zahrnuje polypeptidy dlouhé přibližně od 489 do 568 aminokyselinových zbytků, které obsahují sekvenci, která je alespoň z 80 %, výhodně z 90 % a ještě výhodněji z 95 % nebo více shodná s odpovídající oblastí SEQ ID NO:2. Polypeptidy obsahující afinitní značku mohou dále obsahovat proteolytické štěpné místo mezi polypeptidem zalphall a afinitní značkou. Vhodnými místy jsou trombinová štěpná místa a štěpná místa pro faktor Xa.

Tabulka 4

Konzervativní aminokyselinové substituce

Zásadité:	arginin lyzin histidin
Kyselé:	kyselina glutamová kyselina asparagová
Polární:	glutamin asparagin
Hydrofobni:	leucin izoleucin valin
Aromatické:	fenylalanin tryptofan ty rozin
Malé:	glycin alanin serin threonin metionin

Předložený vynález dále poskytuje výběr jiných fúzních polypeptidu a podobných multimerních proteinů, obsahujících jeden nebo více fúzních polypeptidu. Například polypeptid zalphall může být připraven jako fúzni polypeptid s dimenzujícím proteinem, jak je uvedeno v patentech US 5 155 027 a US 5 567 584. Výhodné dimenzující proteiny z tohoto hlediska zahrnují oblast konstantní domény imunoglobulinu. Fúzni polypeptidy typu imunoglobulin-zalphall mohou být exprimovány v buňkách geneticky upravených, aby produkovaly paletu multimerních analogů zalphall. S polypeptidy zalphall mohou být fúzovány pomocné domény, které je směrují ke specifickým buňkám, tkáním nebo makromolekulám (např. kolagen). Polypeptid zalphal 1 může být fúzován k jedné nebo více složkám, jako je např. afinitní značka pro purifikaci a doména navádějící fúzni polypeptid na jeho cíl. Fúzni • ·φ · φ φ φ · φ · · · φ φ φ φ φ··· · φ · φ φφφ φ φ φ φ φ · φ φ φ ····*·· \· ί *··* ·ί· polypeptidy mohou také obsahovat jedno nebo více štěpných míst, zvláště mezi doménami. Viz Tuan a kol., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996.

Proteiny předloženého vynálezu mohou také obsahovat aminokyselinové zbytky, které se přirozeně nevyskytují. Mezi tyto přirozeně se nevyskytující aminokyseliny patří mimo jiné trans-3-methylprolín, 2,4-methanoprolin, cis-4-hydroxyprolin, trans-4hydroxyprolin, N-methylglycin, allo-threonin, methylthreonin, hydroxyethylcystein, hydroxyethylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, kyselina pipekolová, kyselina thiazolidinkarboxylová, dehydroprolin, 3- a 4-methylprolin, 3,3-dimethylprolin, tertleucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin a 4fluorofenylalanin. V oboru je známo několik metod pro zabudování těchto přirozeně se nevyskytujících aminokyselin do proteinů. Například může být použit in vitro systém, kde jsou nonsense mutace potlačeny pomocí supresorových tRNA, které byly chemicky pozměněny aminoacetylací. Metody pro syntézu aminokyselin a aminoacetylaci tRNA jsou v oboru známé. Transkripce a translace plazmidů, obsahujících nonsense mutace se provádí v bezbuněčných systémech, které obsahují extrakt E. coli S30 a komerčně dostupné enzymy a další reagencie. Proteiny jsou purifikovány pomocí chromatografie. Viz například Robertson a kol., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman a kol., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung a kol., Science 259:806-9, 1993; a Chung a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:10 145-9,1993). Ve druhé metodě je translace provedena v oocytech Xenopus a mutovaná mRNA spolu s aminoacetylovanými supresorovýmí tRNA je do nich vpravena pomocí mikroinjekce (Turcatti a kol., J. Bioi. Chem. 271:19 991-8, 1996). Ve třetí metodě jsou buňky E. coli pěstovány v nepřítomnosti přirozené aminokyseliny, která má být zaměněna (např. fenylalanin) a naopak v přítomnosti požadované, přirozeně se nevyskytující aminokyseliny (aminokyselin) (např. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin a 4fluorofenylalanin). Přirozeně se nevyskytující aminokyselina je zabudována do proteinu na místo svého přirozeného partnera. Viz Koide a kol., Biochem. 33:7470-7476, 1994. Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky mohou být převedeny na přirozeně se nevyskytující druhy pomocí chemické modifikace in vitro. Aby se dále rozšířil rozsah substitučních možností, může být chemická modifikace kombinována s místně cílenou mutagenezí (Wynn a Richards, Protein Sci. 2:395-403,1993).

Omezený počet nekonzervativních aminokyselin, aminokyseliny, které nejsou kódovány genetickým kódem, přirozeně se nevyskytující aminokyseliny a nepřirozené aminokyseliny mohou být substituovány za aminokyselinové zbytky zalphal 1.

Podstatné aminokyseliny v polypeptidech předloženého vynálezu je možno zjistit pomocí postupů v oboru známých, jako je místně cílená mutageneze nebo mutageneze pomocí skenování alaninem (Cunningham a Wells, Science 244:1081-5, 1989; Bass a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:4498-502,1991). V posledně uvedené technice jsou jednotlivé alaninové mutace vneseny na místo každého zbytku v molekule a výsledné mutované molekuly jsou testovány na svou biologickou aktivitu (např. vazbu ligandu a převod signálu) jak je popsáno níže, aby byly určeny aminokyselinové zbytky, které jsou kritické pro aktivitu molekuly. Viz též Hilton a kol., J. Biol. Chem. 271:4699-4708, 1996. Místa interakce ligand-receptor, protein-protein nebo jiné biologické interakce mohou být také určována pomocí fýzikální analýzy struktury, jako jsou techniky nukleární magnetická rezonance, krystalografie, elektronová difrakce nebo fotoafinitní značení, ve spojení s mutací aminokyselin na domnělém kontaktním místě. Viz například de Vos a kol., Science 255:306-312,1992; Smith a kol., J. Mol. Biol. 224:899904, 1992; Wlodaver a kol., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Totožnost podstatných aminokyselin může být také odvozena z analýzy homologií s příbuznými receptory.

Je možno určit aminokyselinové zbytky, které jsou uvnitř oblastí nebo domén, kritických pro udržení strukturní celistvosti molekuly. Uvnitř těchto oblastí je možno určit specifické zbytky, které budou více či méně tolerantní ke změně a udržení všeobecné terciální struktury molekuly. Metody analýzy sekvenční struktury zahrnují mimo jiné porovnávání mnoha sekvencí s vysokou shodou aminokyselin nebo nukleotidů a počítačová analýza za pomoci vhodného software (např. Insight II® prohlížeč a nástroje homologického modelování; MSI, San Diego, CA), tendence sekundární struktury, binární vzorky, komplementární uspořádání a skryté polární interakce (Bartoň, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 a Cordes a kol., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). Obecně, při navrhování modifikací u molekul nebo určování specifických fragmentů, určování struktury bude doprovázeno hodnocením aktivity modifikovaných molekul.

Aminokyselinové změny v polypeptidech zalphal 1 jsou prováděny tak, aby bylo minimalizováno narušení struktury vyššího řádu, podstatné pro biologickou aktivitu. Například když polypeptid zalphall obsahuje jednu nebo více šroubovic, změny v • ·· · aminokyselinových zbytcích budou prováděny tak, aby nebyla narušena šroubovicová geometrie a jiné složky molekuly tam, kde změny v konformaci ruší nějakou kritickou funkci, například vazbu molekuly a jejího vazebného partnera. Vlivy změn v aminokyselinové sekvenci mohou být předpovězeny, například pomocí počítačového modelování jak bylo uvedeno výše, nebo určeny analýzou krystalové struktury (viz např. Lapthorn a kol., Nat. Struct. Biol. 2:226-268, 1995). V oboru jsou rovněž známy jiné techniky pro porovnávání uspořádání variantního proteinu se standardní molekulou (např. původní protein). Například může být provedeno porovnání rozložení cysteinů ve variantní a standardní molekule. Hmotnostní spektrometrie a chemické modifikování pomocí redukce a alkylace poskytují metody pro určování cysteinových zbytků, které jsou spojeny s disulfidickými vazbami a které nikoli (Beán a kol., Anal. Biochem. 210:216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993 a Patterson a kol., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Obecně se má za to, že pokud modifikovaná molekula nemá tentýž vzorek rozložení disulfidických vazeb jako standardní molekula, pak bude ovlivněno prostorové uspořádání. Jinou dobře známou a uznávanou metodou měření prostorového uspořádání je cirkulární dichroismus (CD). Měření a porovnání CD spekter, vytvořených modifikovanou a standardní molekulou je běžné (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). Krystalografie je jiná dobře známá metoda pro analýzu prostorového uspořádání a struktury. Nukleární magnetická rezonance (NMR), mapování štěpných peptidů a epitopové mapování jsou také známými metodami pro analýzu prostorového uspořádání a strukturních podobností mezi proteiny a polypeptidy (Schaanan a kol., Science 257:961-964, 1992).

Může být vytvořen hydrofilní profil podle Hoppa a Woodse pro proteinovou sekvenci zalphall uvedenou v SEQ ID NO:2 (Hopp a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 a Triquier a kol., Protein Engineering 11:153-169, 1998). Viz obrázek 1. Profil je založen na posunu okénka, zabírajícího šest aminokyselinových zbytků. Skryté zbytky G, S a T a exponované zbytky Η, Y a W byly ignorovány. Například hydrofilní oblasti v zalphall zahrnují aminokyselinové zbytky 55 až 60 ze SEQ ID NO:2, aminokyselinové zbytky 56 až 61 ze SEQ ID NO:2, aminokyselinové zbytky 139 až 144 ze SEQ ID NO:2, aminokyselinové zbytky 227 až 232 ze SEQ ID NO:2 a aminokyselinové zbytky 364 až 369 ze SEQ ID NO:2.

·♦·· • · • · ···« · · · • ··· ······· · · ··· · · ♦ « · ·

..............

Osobám se zkušeností v oboru bude zřejmé, že hydrofilnost nebo hydrofobnost budou vzaty v úvahu, když budou navrhovány modifikace aminokyselinové sekvence polypeptidu zalphal 1, aby nedošlo k narušení obecného strukturního a biologického profilu. Zvláště zajímavé pro záměnu jsou hydrofobní zbytky vybrané ze skupiny zahrnující Val, Leu a Ile nebo ze skupiny zahrnující Met, Gly, Ser, Ala, Tyr a Trp. Například zbytky odolné k substituci mohou zahrnovat takové zbytky, jaké jsou ukázány v SEQ ID NO:2. Cysteinové zbytky však mohou být k substituci poměrně málo odolné.

Totožnost podstatných aminokyselin může být také odvozena z analýzy sekvenční podobnosti mezi členy rodiny cytokinových receptorů třídy I a zalphal 1. Pomocí metod jako je výše popsaná analýza FASTA, jsou uvnitř rodiny proteinů určovány oblasti s vysokou podobností a použity k analyzování aminokyselinové sekvence konzervativních oblastí. Další možný přístup určení variantního zalphal 1 polynukleotidu na základě struktury je určit zda molekula nukleové kyseliny, kódující možnou variantu zalphal 1, může hybridizovat s molekulou nukleové kyseliny, která má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1, jak bylo diskutováno výše.

Jinými metodami pro určení podstatných aminokyselin v polypeptidech předloženého vynálezu jsou postupy v oboru známé, jako je místně cílená mutageneze nebo mutageneze pomocí skenování alaninem (Cunningham a Wells, Science 244:1081-5, 1989; Bass a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:4498-502, 1991, Coombs a Corey, Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering, in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (vyd.), str. 259 až 311, (Academie Press, lne. 1998)). V posledně uvedené technice jsou jednotlivé alaninové mutace vneseny na místo každého zbytku v molekule a výsledné mutované molekuly jsou testovány na svou biologickou aktivitu jak je popsáno níže, aby byly určeny aminokyselinové zbytky, které jsou kritické pro aktivitu molekuly. Viz též Hilton a kol., J. Biol. Chem. 271:4699-4708, (1996).

Předložený vynález také zahrnuje funkční fragmenty polypeptidů zalphal 1 a molekuly nukleové kyseliny, které takové funkční fragmenty kódují. Funkční zalphal 1 nebo jeho fragment, jak je zde definován, je charakterizován svou proliferační nebo diferenciační aktivitou, svojí schopností indukovat nebo inhibovat speciální buněčné funkce nebo svojí schopností se specificky vázat k protilátce proti zalphal 1 nebo k zalphal 1 ligandů (buď rozpustný nebo imobilizovaný). Jak zde bylo již dříve popsáno, pro zalphal 1 je charakteristická struktura cytokinového receptoru třídy I. Předložený vynález tedy dále poskytuje fuzní proteiny zahrnující: (a) polypeptidové molekuly • a · ··· ♦ · · • ♦ · · · · ·· • ··· ······· · obsahující zde popsanou extracelulární nebo intracelulární doménu; a (b) funkční fragmenty obsahující jednu nebo více těchto domén. Další polypeptidová část fúzního proteinu může být příspěvkem od jiné třídy cytokinových receptorů, například βpodjednotka receptoru IL-2 a β-obecný receptor (tj. IL-3, IL-5 a β-podjednotka receptoru GM-CSF), nebo nepřirozený a/nebo nepříbuzný sekreční signální peptid, který usnadňuje vylučování fúzního proteinu.

Mohou být provedeny rutinní analýzy molekul nukleové kyseliny, aby byly získány funkční fragmenty molekuly nukleové kyseliny kódující polypeptid zalphall. Pro ilustraci, molekuly DNA, které mají nukleotidovou sekvenci z SEQ ID NO:1 nebo její fragment, mohou být štěpeny nukleázou Bal31, aby byly získány hnízdované delece. Tyto fragmenty DNA jsou potom vloženy ve vhodném čtecím rámci do expresních vektorů a exprimované polypeptidy jsou izolovány a testovány na aktivitu zalphall nebo na schopnost vázat protilátky proti zalphall nebo ligandy zalphall. Jednou alternativou ke štěpení exonukleázou je použití oligonukleotidem řízené mutageneze pro vnesení delecí nebo stop kodonů pro upřesnění produkce požadovaného fragmentu zalphall. Alternativně, zvláště fragmenty polynukleotidu zalphall mohou být syntetizovány pomocí polymerázové řetězové reakce.

Standardní metody pro určování funkčních domén jsou osobám se zkušeností v oboru dobře známé. Například studie zkracování jednoho nebo obou konců interferonů byly souhrnně zpracovány v Horisberger a Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Kromě toho jsou standardní techniky pro funkční analýzu proteinů popsány například v Treuter a kol., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Content a kol., Exprese a předběžná deleční analýza syntetázy 42 kDa 2-5A indukované lidským interferonem, v Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-ΤΝΟ Meeting on Interferon Systems, Cantell (vyd.), str. 65 až 72 (Nijhoff 1987); Herschman, The TGF Receptor, v Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton a kol., (vyd.) str. 169 až 199 (Academie Press 1985); Coumailleau a kol., J. Biol. Chem. 270:29 270 (1995); Fukunaga a kol., J. Biol. Chem. 270:25 291 (1995); Yamaguchi a kol., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); a Meisel a kol., Planí Molec. Biol. 30:1 (1996).

Mnoho substitucí aminokyselin může být provedeno a testováno pomocí známých metod mutageneze a hromadného prohledávání, jak jsou popsány v Reidhaar-Olson a Sauer (Science 241:53-57, 1988) nebo Bowie a Sauer (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989). Krátce řečeno, tito autoři popisují metody pro ·· ··*· ·· · • · · · · ····· ·· · * ♦ · · ♦· • ··· ······· ·· ··· · · 4 « ·· ···· ·^β ** * **·** současné náhodné obsazení dvou nebo více pozic v polypeptidu, selekci funkčního polypeptidu a potom sekvenování mutovaných polypeptidu, pro určení spektra přípustných mutací na každé pozici. Jiné metody, které mohou být použity, zahrnují reprezentaci pomocí fága (např. Lowman a kol., Biochem. 30:10 832-10 837, 1991; Ladner a kol., patent US 5 223 409; Huse, publikace WIPO WO 92/062 045) a mutageneze cílená do určité oblasti (Derbyshire a kol., Gene 46:145, 1986; Ner a kol., DNA 7:127,1988).

Varianty popsaných zalphall DNA a polypeptidových sekvencí mohou být vytvořeny pomocí promíchávání DNA, jak bylo popsáno v Stemmer, Nátuře 370:389-91, 1994, Stemmer, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:10 747-51, 1994 a publikaci WIPO WO 97/20 0078. Krátce řečeno, variantní DNA jsou vytvořeny in vitro homologickou rekombinací pomocí náhodné fragmentace rodičovské DNA, po které následuje opětné uspořádání pomocí PCR, což má za následek náhodně vnesené bodové mutace. Tato technika může být modifikována za použití rodiny rodičovských DNA, jako jsou alelové varianty nebo DNA z různých druhů, aby byla do procesu vnesena další variabilita. Selekce nebo testování na požadovanou aktivitu, následované dalšími opakováními mutageneze a testu, umožňuje rychlou evoluci sekvencí vybíráním požadovaných mutací, přičemž současně dochází k selekci proti nežádoucím změnám.

Metody mutageneze, které jsou zde popsány, mohou být kombinovány s vysokou průchodností vzorků, automatizací prohledávacích metod při detekci aktivity klonovaných, mutovaných polypeptidů zalphall receptoru v hostitelských buňkách. Výhodné testy v tomto ohledu zahrnují testy proliferace buněk a testy vazby s ligandem, založené na biosenzorech, které jsou popsány níže. Mutované molekuly DNA kódující aktivní receptory nebo jejich části (např. fragmenty, které vážou ligand, signální domény a podobně), mohou být z hostitelské buňky získány a rychle sekvenovány pomocí moderních zařízení. Tyto metody umožňují rychlé určení důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků ve sledovaném polypeptidu a mohou být aplikovány na polypeptidy neznámé struktury.

Kromě toho proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu (nebo jejich polypeptidové fragmenty) mohou být připojeny k jiným biologicky aktivním molekulám, zvláště k jiným cytokinům a poskytnout tak multifunkční molekuly. Například jedna nebo více šroubovic ze zalphall může být připojeno k jiným cytokinům, aby se rozšířily jejich biologické vlastnosti nebo se zvýšila efektivnost jejich produkce.

····

9» 9 999 9999

9 9999 999 • 999 9999999 99

999 999999 ···· ·· ·· · ·*···

Předložený vynález tedy poskytuje série nových hybridních molekul, v nichž segment obsahující jednu nebo více šroubovic ze zalphall je fúzován s jiným peptidem. Fúze je s výhodou provedena sestřihem na úrovni DNA a umožněním exprese chimerních molekul v rekombinantních produkčních systémech. Výsledné molekuly jsou potom testovány na takové vlastnosti, jako je vylepšená rozpustnost, dokonalejší stabilita, prodloužený poločas odstranění, zvýšené hladiny exprese a sekrece, a dokonalejší farmakodynamika. Takové hybridní molekuly mohou dále obsahovat další aminokyselinové zbytky (např. polypeptidový linker) mezi složkami proteinů nebo polypeptidu.

Pomocí zde diskutovaných metod může osoba se zkušeností v oboru určit a/nebo připravit paletu polypeptidových fragmentů nebo variant SEQ ID NO:2, u kterých je zachována schopnost přeměňovat signál nebo vázat ligand. Například může připravit zalphall ve formě rozpustného receptoru tím, že je připraveno množství polypeptidů, které jsou značně homologické s doménou, která váže cytokin (zbytky 20 (Cys) až 237 (His) ze SEQ ID NO:2 nebo alelové varianty nebo jejich ortology) a mají zachovanou schopnost vázat ligand jako standardní typ proteinu zalphall. Takové polypeptidy mohou obsahovat další aminokyseliny, například z části nebo celé transmembránové nebo intracelulární domény. Takové polypeptidy mohou také obsahovat další polypeptidové segmenty, které zde byly obecně popsány, jako jsou značky, afinitní značky a podobně.

Pro jakýkoli polypeptid zalphall, včetně variant, rozpustných receptorů a fúzních polypeptidů nebo proteinů, může osoba se zkušeností v oboru za pomoci informace uvedené výše v tabulkách 1 a 2, snadno vytvořit zcela degenerovanou polynukleotidovou sekvenci, kódující tuto variantu.

Polypeptidy zalphall, které jsou předmětem tohoto vynálezu, včetně polypeptidů o plné délce, biologicky aktivních fragmentů a fúzních polypeptidů, mohou být produkovány v geneticky upravených hostitelských buňkách pomocí běžně užívaných technik. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou takové typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfekovány exogenní DNA a pěstovány v kultuře a patří mezi ně bakterie, buňky hub a kultivované buňky vyšších eukaryot. Výhodné jsou eukaryotické buňky, zvláště kultivované buňky nebo mnohobuněčné organizmy. Techniky pro manipulaci s molekulami klonované DNA a vnesení exogenní DNA do rozličných hostitelských buněk jsou popsány v Sambrook a kol., Molecular Cloning: A ·· ···· ·· ♦ 99 9

9 · · · t 9 9 99 • 9 · · 9 · 9 9 9 • · · · · ···· · · · · • 9 · 9 9 9 9 9»

........... *·’

Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a Ausubel a kol., vyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987.

Obecně řečeno, sekvence DNA kódující polypeptid zalphall je operačně vázána k jiným genetickým elementům, vyžadovaným pro její expresi, obecně zahrnujících transkripční promotor a terminátor, v expresním vektoru. Vektor bude také obecně obsahovat jeden nebo více selekčních markérů a jeden nebo více počátků replikace, třebaže osoby se zkušeností v oboru si uvědomí, že v určitých systémech mohou být selekční markéry poskytnuty na oddělených vektorech a replikace vnější DNA může být zabezpečena integrací do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selekčních markérů, vektorů a jiných elementů je záležitostí návrhu v rámci běžné zkušenosti v oboru. Mnoho takových elementů je popsáno v literatuře a je dostupných od komerčních dodavatelů.

Pro nasměrování polypeptidu zalphall do sekreční dráhy hostitelské buňky, je v expresním vektoru poskytnuta sekreční signální sekvence (také známá jako leader sekvence, prepro sekvence nebo pre sekvence). Sekreční signální sekvence může být od zalphall, nebo může být odvozena z jiného sekretovaného proteinu (např. t-PA) nebo může být syntetizována de novo. Sekreční signální sekvence je operačně vázána k DNA sekvenci zalphall, tj. dvě sekvence jsou spojeny ve správném čtecím rámci a umístěny tak, aby řídily nově syntetizovaný polypeptid do sekreční dráhy hostitelské buňky. Sekreční signální sekvence jsou obecně umístěny na 5' konci sekvence DNA, kódující polypeptid o který se jedná, třebaže jisté sekreční signální sekvence mohou být umístěny jinde v DNA sekvenci o kterou se jedná (viz např. Welch a kol., patent US 5 037 743; Holland a kol., patent US 5 143 830).

Jinou možností je, že sekreční signální sekvence obsažená v polypeptidech, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je použita pro řízení jiných polypeptidů do sekreční dráhy. Předložený vynález poskytuje takové fúzní polypeptidy. Může být vytvořen fúzní polypeptid se signálem, kde je sekreční signální sekvence, odvozená z aminokyseliny 1 (Met) až aminokyseliny 19 (Gly) ze SEQ ID NO:2, operačně vázaná k jinému polypeptidu pomocí metod v oboru známých a zde popsaných. Sekreční signální sekvence obsažená ve fúzních polypeptidech, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je s výhodou fúzována na aminovém konci k přídatnému peptidu, aby řídila tento přídatný peptid do sekreční dráhy. Takové konstrukty mají množství aplikací • · · · · · · · · • · ···· ·· • · · · ······> · známých v oboru. Například tyto nové konstrukty fúzované se sekreční signální sekvencí mohou řídit sekreci aktivní složky normálně nesekretovaného proteinu. Takové fúzní konstrukty mohou být použity in vivo nebo in vitro pro řízení peptidů sekreční dráhou.

Kultivované savčí buňky jsou v předloženém vynálezu vhodnými hostiteli. Metody pro vnesení exogenní DNA do savčí hostitelské buňky zahrnují transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým (Wigler a kol., Cell 14:725, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetice 7:603, 1981; Graham a Van der Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporaci (Neumann a kol., EMBO J. 1:841-845, 1982), transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem (Ausubel a kol., tamtéž) a transfekci zprostředkovanou lipozomy (Hawley-Nelson a kol., Focus 15:73, 1993; Ciccarone a kol., Focus 15:80, 1993) a virovými vektory (Miller a Rosman, BioTechniques 7:980.90, 1989; Wang a Finer, Nátuře Med. 2:714-716, 1996). Produkce rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savčích buňkách je popsána například v Levinson a kol., patent US 4 713 339; Hagen a kol., patent US 4 784 950; Palmiter a kol., patent US 4 579 821 a Ringold a kol., patent US 4 656 950. Vhodné kultivované savčí buňky zahrnují buněčné linie COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10 314), 293 (ATCC No. CRL 1573); Graham a kol., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) a buňky z vaječníků čínského křečka (např. CHO-K1; (ATCC No. CCL 61). V oboru jsou známy další vhodné buněčné linie a jsou dostupné ve veřejných sbírkách, jako je americká sbírka typových kultur, Rockville, Maryland. Obecně jsou preferovány silné transkripční promotory, jako jsou promotory z SV40 nebo cytomegaloviru. Viz např. patent US 4 956 288. Jiné vhodné promotory zahrnují promotory z metallothioneinových genů (patenty US 4 579 821 a 4 601 978) a velký pozdní promotor adenoviru.

Selekce pomocí léků se obecně používá pro selekci těch kultivovaných savčích buněk, do nichž byla vložena cizí DNA. Takové buňky jsou obecně označovány jako transfekované. Buňky, které byly kultivovány v přítomnosti selekčního činidla a jsou schopny přenést gen o který se jedná, do svého potomstva, jsou označovány jako stabilně transfekované. Výhodným selekčním markérem je gen kódující rezistenci k antibiotiku neomycin. Selekce je provedena v přítomnosti léku neomycinového typu, jako je G-418 nebo podobně. Selekční systémy je možno také použít pro zvýšení expresní hladiny genu o který se jedná, v procesu nazývaném amplifikace.

• 4 • · • · • · 4 4 4 4···· * · · 4 · ·* 4 · • 4 4 4 4444444 44 «44 444444

......... ”··’

Amplifikace je provedena pěstováním transfekovaných buněk v přítomnosti nízkých hladin selekčního činidla a poté zvýšením množství selekčního činidla, aby došlo k selekci buněk, které produkují vysoké úrovně produktů vnesených genů. Výhodným amplifikačním selekčním markérem je reduktáza kyseliny dihydrolistové, která způsobuje rezistenci k methotrexátu. Také mohou být použity jiné geny rezistence k lékům (rezistence k hygromycinu, rezistence k více lékům, acetyltransferáza puromycinu). Alternativní markéry, které navozují změněný fenotyp, jako je zelený fluoreskující protein, nebo proteiny buněčného povrchu jako CD4, CD8, MHC třídy I, alkalická fosfatáza z placenty, mohou být použity pro roztřídění transfekovaných buněk od netransfekovaných, takovými způsoby jako separační technologie FACS nebo pomocí magnetických zrnek.

Jako hostitelské buňky mohou být také použity jiných vyšších eukaryot, včetně rostlinných buněk, hmyzích buněk a ptačích buněk. Použití Agrobacterium rhizogenes jako vektoru pro expresi genů v rostlinných buňkách bylo přehledně zpracováno v Sinkar a kol., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Transformace hmyzích buněk a produkce cizích polypeptidů v nich je popsána v Guarin a kol., patent US 5 162 222 a v publikaci WIPO WO 94/06 463. Hmyzí buňky mohou být infikovány rekombinantním bakulovirem, obecně odvozeným z viru nukleární polyhedrózy Autographa californica (AcNPV). Viz King, L.A. a Possee, R.D., The Baculovirus Expression Systém: A Laboratory Guide, London, Chapman & Halí; O'Reilly, D.R. a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; a Richardson, C. D., vyd. Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druhá metoda přípravy rekombinantního zalphall bakuloviru využívá systém založený na transpozonu a popsaný Luckowem (Luckow, V.A. a kol., J. Virol. 67:4566-79, 1993). Tento systém, který využívá přenášecí vektor, je prodáván v soupravě Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Tento systém využívá přenášecí vektor pFastBad™ (Life Technologies), obsahující transpozon Tn7, aby přenesl DNA kódující polypeptid zalphall do genomu bakuloviru, který je udržován v E. coli jako velký plazmid nazývaný bacmid. Viz HillPerkins, M.S. a Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. a kol., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; a Chazenbalk, G.D., a Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. Přenášecí vektor může dále obsahovat na C-konci nebo N-konci exprimovaného polypeptidů zalphall ve čtecím rámci fúzovanou DNA kódující · · · • ·

9 9 · · ·9··

999 999···· ··

9 · ··· · ··

...... ** * .....

epitopovou značku, například epitopovou značku Glu-Glu (Grussenmeyer, T. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985). Za použití techniky známé v oboru, je přenášecí vektor, obsahující zalphall, transformován do E. coli a je provedena selekce na bacmidy, obsahující přerušený gen LacZ, což je známkou přítomnosti rekombinantního bakuloviru. DNA bacmidu, který obsahuje genom rekombinantního bakuloviru je izolována pomocí běžných technik, a použita k transfekci buněk Spodoptera frugiperda, např. buněk Sf9. Následně je produkován rekombinantní virus, který exprimuje zalphall. Zásobní rekombinantní virus je připraven pomocí v oboru běžně používaných postupů.

Rekombinantní virus je použit k infekci hostitelských buněk, obyčejně buněčné linie odvozené z vojnice podzimní, Spodoptera frugiperda. Obecně viz Glick a Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Jinou vhodnou buněčnou linií je buněčná linie High FiveO™ (Invitrogen), odvozená z Trichoplusia ni (patent US 5 300 435). Pro růst a udržování buněk jsou používána komerčně dostupná média bez séra. Vhodnými médii pro buňky Sf9 jsou Sf900 II™ (Life Technologies) nebo ESF 921™ (Expression Systems); a pro buňky T. ni Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Používané postupy jsou obecně popsány v dostupných laboratorních manuálech (King, L. A. a Possee, R.D., tamtéž; O'Reilly, D.R. a kol., tamtéž; Richardson, C.D., tamtéž). Následné purifikace polypeptidu zalphall ze supernatantu může být dosaženo zde popsanou metodou.

Buňky hub, včetně kvasinkových buněk, mohou také být použity v rámci předloženého vynálezu. Druhy kvasinek v tomto ohledu zvláště zajímavé zahrnují Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Pichia methanolica. Metody pro transformování buněk S. cerevisiae exogenní DNA a produkování rekombinantních polypeptidů v nich jsou popsány například v Kawasaki, patent US 4 599 311; Kawasaki, patent US 4 931 373; Brake, patent US 4 870 008; Welch a kol., patent US 5 037 743; a Murray a kol., patent US 4 845 075. Transformované buňky jsou vybrány podle fenotypu určeného selekčním markérem, obyčejně rezistence k léku nebo schopnost růst v nepřítomnosti určité živiny (např. leucin). Výhodný vektorový systém pro použití u Saccharomyces cerevisiae je vektorový systém POTÍ popsaný v Kawasaki a kol., (patent US 4 931 373), který umožňuje aby byly transformované buňky selektovány růstem v médiu obsahujícím glukózu. Promotory a terminátory vhodné pro použití u • 9

9 9 9 9 9 9 99 9

9 ¢ 9 9 9 9 99

999 9999999 9· kvasinek zahrnují promotory a terminátory od genů glykolytických enzymů (viz např. Kawasaki, patent US 4 599 311; Kingsman a kol., patent US 4 615 974; a Bitter, patent US 4 977 092) a genů pro alkoholdehydrogenázu. Viz také patenty US 4 990 447; 5 063 154; 5 139 936 a 4 661 454. Transformační systémy pro jiné kvasinky, včetně Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii a Candida maltosa jsou v oboru známé. Viz například Gleeson a kol., J. Gen Microbiol. 132:3459-3465, 1986 a Cregg, patent US 4 882 279. Buňky Aspergillus mohou být použity podle metody McKnight a kol., patent US 4 935 349. Metody pro transformování Acremonium chrysogenum jsou popsány v Sumino a kol., patent US 5 162 228. Metody pro transformování Neurospora jsou popsány v Lambowitz, patent US 4 486 533.

Použití Pichia methanolica jako hostitele pro produkování rekombinantních proteinů je popsáno v publikacích WIPO WO 97/17 450, WO 97/17 451, WO 98/02 526 a WO 98/02565. Molekuly DNA používané při transformování P. methanolica budou běžně připravovány jako dvouvláknové, kruhové plazmidy, které jsou s výhodou před transformací linearizovány. Pro produkci polypeptidu v P. methanolica je výhodné, když promotor a terminátor v plazmidu bude z genu P. methanolica, jako je P. methanolica gen pro využívání alkoholu (AUG1 nebo AUG2). Jiné užitečné promotory zahrnují promotory z genů dihydroxyacetonsyntházy (DHAS), dehydrogenázy kyseliny mravenčí (FMD) a katalázy (CAT). Pro usnadnění integrace DNA do hostitelského chromozomu je výhodné, mít celý expresní segment v plazmidu ohraničen na obou koncích sekvencemi hostitelské DNA. Výhodný selekční markér pro použití v Pichia methanolica je Pichia methanolica ADE2 gen kódující karboxylázu fosforibozyl-5aminoimidazolu (AIRC; EC 4.1.1.21), která umožňuje ade2 hostitelským buňkám růst v nepřítomnosti adeninu. Pro velkoobjemové, průmyslové procesy, kde je žádoucí minimalizovat použití methanolu, je výhodné použít hostitelské buňky, u kterých byly oba geny pro využití methanolu (AUG1 a AUG2) odstraněny. Pro produkci sekretovaných proteinů jsou výhodné hostitelské buňky postrádající geny vakuolární proteázy (PEP4 a PRB1). Elektroporace se používá pro usnadnění vnášení plazmidu, obsahujícího DNA kódující polypeptid o který se jedná, do buněk P. methanolica. Je výhodné transformovat buňky P. methanolica elektroporací pomocí exponenciálně ···· · · ·9 9

9 9 9 99

9 9 9 9 ·♦

999 99999999 klesajícího, pulsujícího elektrického pole o napětí od 2,5 do 4,5 kV/cm, s výhodou 3,75 kV/cm s časovou konstantou (t) od 1 do 40 milisekund, nejvýhodněji 20 milisekund.

Prokaryotické hostitelské buňky, včetně kmenů bakterií E. coli, Bacillus a jiných rodů, jsou také vhodnými hostitelskými buňkami v předloženém vynálezu. Techniky pro transformování těchto hostitelů a expresi cizorodých sekvencí DNA v nich klonovaných, jsou v oboru dobře známé (viz např. Sambrook a kol., tamtéž). Když je exprimován polypeptid zalphal 1 v bakteriích jako jsou E. coli, polypeptid může být zadržován v cytoplazmě, typicky ve formě nerozpustných granulí, nebo může být směrován do periplazmatického prostoru působením bakteriální sekreční sekvence. V prvém případě jsou buňky lyžovány, granule získány a denaturovány pomocí například izothiokyanátu nebo močoviny. Denaturovaný polypeptid potom může být znovu sestaven a dimerizován zředěním denaturačního činidla, jako je dialýza proti roztoku močoviny a kombinace redukovaného a oxidovaného glutathionu, následovaná dialýzou proti pufrovanému fyziologickému roztoku. Ve druhém případě může být polypeptid získán z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě tím, že buňky jsou rozrušeny (například pomocí sonikování nebo osmotickým šokem), aby se uvolnil obsah periplazmatického prostoru a získán protein, tímto je vyloučena potřeba denaturování a opětného sestavování.

Transformované a transfekované hostitelské buňky jsou pěstovány podle běžných postupů v kultivačním médiu, obsahujícím živiny a jiné složky potřebné pro růst vybraných hostitelských buněk. V oboru je znám široký výběr vhodných médií, včetně definovaných a komplexních médií; média běžně zahrnují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, základní aminokyseliny, vitamíny a minerály. Média mohou také obsahovat, pokud je to vyžadováno, takové složky jako růstové faktory nebo sérum. Růstové médium bude obecně selektovat buňky, obsahující exogenně přidanou DNA, například pomocí selekce léky nebo nedostatkem základní živiny, která je doplňována selekčním markérem, neseném na expresním vektoru nebo společně transfekováným do hostitelské buňky. Buňky P. methanolica jsou pěstovány v médiu obsahujícím odpovídající zdroje uhlíku, dusíku a stopové živiny při teplotě 25 až 35 °C. Tekutým kulturám je poskytováno dostatečné vzduchování běžnými způsoby, jako je třepání malých lahví nebo postřikováním fermentorů. Výhodné kultivační médium pro P. methanolica je YEPD (2% D-glukóza, 2% Bacto™ Pepton (Difco Laboratories, Detroit, • · • · • · φ · · · φφ φ • · · φ · φ · · · · φ φ ·

ΜΙ), 1% kvasničný extrakt Bacto™(Difco Laboratories), 0,004% adenin a 0,006% Lleucin).

Z jednoho hlediska na předložený vynález, cytokinový receptor zalphall (obsahující transmembránovou a intracelulární doménu) je produkován v kultivovaných buňkách a buňky jsou použity pro vyhledávání ligandů pro receptor, včetně přirozených ligandů a rovněž agonistů a antagonistů přirozených ligandů. Stručně je možno tento přístup popsat: cDNA nebo gen kódující receptor je spojen s jinými genetickými elementy, které jsou vyžadovány pro jeho expresi (např. transkripční promotor) a výsledný expresní vektor je vložen do hostitelských buněk. Buňky, které exprimují DNA a produkují funkční receptor jsou selektovány a použity v množství prohledávacích a testovacích systémů.

Savčí buňky vhodné pro použití při expresi nových receptorů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, a pro převod receptorem zprostředkovaného signálu zahrnují buňky, které exprimují β-podjednotku jako je gp130, a buňky které současně exprimují gp130 a receptor LIF (Gearing a kol., EMBO J. 10:2839-2848, 1991; Gearing a kol., patent US 5 284 755). Z tohoto hlediska je obecně dávána přednost použití buněk, které odpovídají na jiné cytokiny, které se vážou na receptory v téže podrodině, jako je IL-6 nebo LIF, protože takové buňky budou obsahovat nezbytnou dráhu (dráhy) pro převod signálu. Výhodné buňky tohoto typu zahrnují lidskou buněčnou linii TF-1 (ATCC No. CRL-2003) a buněčnou linii DA-1 (Branch a kol., Blood 69:1782? 1987; Broudy a kol., Blood 75:1622-1626, 1990). Jako alternativa mohou být vhodné hostitelské buňky geneticky upraveny tak, aby produkovaly β-podjednotku nebo jinou buněčnou složku, potřebnou pro žádanou buněčnou odpověď. Například myší buněčná linie BaF3 (Palacios a Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot a kol., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986), buněčná linie z ledvin novorozených křečků (BHK) nebo buněčná linie CTLL-2 (ATCC No. TIB-214), mohou být transfekovány tak, aby spolu s zalphall exprimovaly myší podjednotku gp130 nebo myší podjednotku gp130 a receptor LIF. Obecně se přednostně používají hostitelské buňky a receptor (receptory) pocházející z týchž druhů, avšak tento způsob umožňuje, aby byly buněčné linie geneticky upraveny tak, aby exprimovaly mnoho podjednotek receptorů z jakýchkoli druhů, a tak překonat možná omezení, která vyplývají z druhové specificity. Jako alternativa mohou být cDNA druhových homologů lidského receptorů klonovány a použity v buněčných liniích, pocházejících z týchž druhů, jako je např. myší cDNA v ······ ··· · · • 4 4 · · · 4 • · · · 4 ♦ 4 4 buněčné linii BaF3. Tedy buněčné linie, které jsou závislé na jednom hematopoetickém růstovém faktoru, jako je IL-3, mohou být geneticky upraveny tak, aby byly závislé na ligandu zalphall.

Buňky exprimující funkční zalphall jsou použity pro hromadné prohledávací testy. V oboru je známo množství vhodných testů. Tyto testy jsou založeny na detekci biologické odpovědi v cílové buňce. Jedním takovým testem je test buněčného množení. Buňky jsou pěstovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti testované sloučeniny a množení buněk je detekováno například měřením inkorporace triciovaného tymidinu nebo kolorimetrickým testem, založeným na metabolickém štěpení Alamar Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) nebo 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5difenyltetrazolium bromidu (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). V alternativním formátu tohoto testu jsou používány buňky, které jsou dále geneticky upraveny tak, aby exprimovaly reportérový gen. Reportérový gen je vázán k promotorovému elementu, který je odpovědný za biochemickou dráhu, vázanou na receptor, a test detekuje aktivaci transkripce reportérového genu. Výhodným promotorovým elementem v tomto ohledu je element sérové odpovědi SRE (viz například Shaw a kol., Cell 56:563-572, 1989). Takovým výhodným reportérovým genem je gen luciferázy (de Wet a kol., Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987) Exprese luciferázového genu je detekována luminiscencí za pomoci metod známých v oboru (např. Baumgartner a kol., J. Biol. Chem. 269:19 094-29 101, 1994; Schenborn a Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Luciferázové testovací soupravy jsou komerčně dostupné například od Promega Corp., Madison, Wl. Cílové buněčné linie tohoto typu mohou být použity pro prohledávání knihoven chemikálií, buňkami upravených kultivačních médií, médií pro kultivaci hub, vzorků půdy, vzorků vody a podobně. Například banka vzorků buňkami nebo tkáněmi upravených médií může být testována na cílové buňce, aby byly zjištěny buňky produkující ligand. Pozitivní buňky jsou pak použity pro produkci knihovny cDNA, která je rozdělena do frakcí, transfekována do hostitelských buněk a exprimována v expresním vektoru savčí buňky. Vzorky médií od transfekovaných buněk jsou potom testovány, následuje dělení frakcí, opětná transfekce, pěstování kultur a opětné testování pozitivních buněk, až jsou izolovány klonované buněčné linie, které exprimují ligand. Vzorky médií upravené ledvinovými, jaterními, slezinnými, brzlíkovými, jinými lymfoidními tkáněmi, nebo T-buňkami, jsou výhodnými zdroji ligandů pro použití v hromadných prohledávacích postupech.

• · · · · » · • · » · φ · φφφ ···«··« ·

Přirozený ligand pro zalphal 1 může být také určen pomocí mutování buněčné linie závislé na cytokinů a exprimující zalphal 1, pěstované za podmínek, které selektují na autokrinní růst. Viz publikace WIPO WO 95/21 930. V průběhu typického postupu jsou buňky exprimující zalphal 1 mutovány, např. pomocí EMS. Tyto buňky jsou pak ponechány zotavit v přítomnosti vyžadovaného cytokinů, potom přeneseny do média bez cytokinů. Přeživší buňky jsou prohledávány na produkci ligandů pro zalphal 1, buď přidáním rozpustného polypeptidu receptoru (který váže ligand) ke kultivačnímu médiu, nebo testováním upraveného média na standardním typu buněk a transfekovaných buněk, exprimujících zalphal 1. Buněčné linie, výhodné pro použití v této metodě, zahrnují buňky, které jsou transfekovány aby exprimovaly gp130 nebo gp130 v kombinaci s receptorem LIF. Takové výhodné hostitelské buněčné linie zahrnují transfekované buňky CTLL-2 (Gillis a Smith, Nátuře 268:154-156, 1977) a transfekované buňky BaF3.

Kromě toho může být pro izolaci ligandů zalphal 1 použita metoda zachycení •sekrece, používající polypeptid rozpustného receptoru zalphal 1 (Aldrich a kol., Cell 87:1161-1169, 1996). Expresní knihovna cDNA, připravená ze známého nebo očekávaného zdroje ligandů, je transfekována do buněk COS-7. Vektor cDNA knihovny má pro množení v buňkách COS-7 obyčejně SV40 origin a CMV promotor pro vysokou expresi. Transfekované buňky COS-7 jsou pěstovány v jedné vrstvě a poté fixovány a jejich povrch učiněn prostupný (permeabilizovány). Označený nebo biotinem značený rozpustný receptor zalphal 1, který je zde popsán, je potom umístěn tak, aby byl v kontaktu s vrstvou buněk a ponechán navázat na vrstvu buněk, které exprimují antikomplementární molekulu, tj. ligand zalphal 1. Buňka exprimující ligand tak bude vázána s molekulami receptoru. Protilátka proti značce (anti-lg při fúzním proteinu s Ig, M2 nebo anti-FLAG při fúzním proteinu značeném FLAG, streptavidin a podobně), která je značena křenovou peroxidázou (HRP), je použita pro zviditelnění těch buněk, k nimž se navázal označený nebo biotinem značený rozpustný receptor zalphal 1. HRP katalyzuje ukládání tyramidového činidla, například tyramid-FITC. Pro tuto detekci může být použita komerčně dostupná souprava (například Renaissance TSA-Direct™ Kit; NEN Life Science Products, Boston, MA). Buňky, které exprimují ligand receptoru zalphal 1, budou detekovány pomocí fluorescenční mikroskopie jako zelené buňky a vybrány pro následující klonování ligandů, za pomoci procedur pro záchranu plazmidu, • 4 • 44« 4444444 44

4 4 4 4 4··· ···· *’ *· *** jak je naznačeno v Aldrich a kol., (viz výše), následovaných dalšími koly testu zachycení sekrece, dokud nejsou identifikovány jednotlivé klony.

Protože se jedná o receptor, aktivita polypeptidu zalphall může být měřena na křemíku založeným biosenzorovým mikrofyziometrem, který měří rychlost extracelulárního okyselování nebo vylučování protonů, spojené s vazbou receptorů a následujícími fyziologickými buněčnými změnami. Příkladem takového je Cytosensor™ Microphysiometer vyrobený v Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Touto metodou mohou být měřeny různé buněčné odpovědi, jako je buněčné množení, transport iontů, produkce energie, zánětlivá odpověď, aktivace regulace a aktivace receptorů a podobně. Viz například McConnell, H.M. a kol., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford a kol., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Armilli, S. a kol., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. a kol., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. Mikrofyziometr může být používán pro testování eukaryotických, prokaryotických, přichycených nebo nepřichycených buněk. Při měření změn extracelulárního okyselení v buněčném médiu v průběhu času, mikrofyziometr přímo měří buněčné odpovědi na různé podněty, včetně agonistů, ligandů nebo antagonistů polypeptidu zalphall. S výhodou je mikrofyziometr používán pro měření odpovědí eukaryotických buněk, které exprimují zalphall, ve srovnání s kontrolními eukaryotickými buňkami, které polypeptid zalphall neexprimují. Eukaryotické buňky exprimující zalphall se skládají buď z buněk, do kterých byl zalphal 1 transfekován, jak je zde popsáno, čímž je vytvořena buňka odpovídající na zalphall modulační podněty, nebo se jedná o buňky, které exprimují zalphall přirozeně, jako jsou zalphall exprimující buňky odvozené z lymfoidní tkáně, sleziny, brzlíku nebo PBL. Rozdíly naměřené ve zvýšení nebo snížení extracelulárního okyselení při odpovědi buněk exprimujících zalphall, vzhledem ke kontrole, jsou přímou mírou buněčných odpovědí modulovaných zalphall. Kromě toho mohou být takové buněčné odpovědi, modulované zalphall, testovány pod vlivem rozličných podnětů. Použití mikrofyziometru také poskytuje metodu určování agonistů a antagonistů polypeptidu zalphall, která sestává z poskytnutí buněk exprimujících polypeptid zalphall, kultivování první části buněk v nepřítomnosti testované sloučeniny, kultivování druhé části buněk v přítomnosti testované sloučeniny, a detekování zvýšení nebi snížení buněčné odpovědi druhé části buněk ve srovnání s částí první. Antagonisté a agonisté, včetně přirozených ligandů pro polypeptid zalphal 1, mohou být za použití této metody rychle určeni.

·· • « · ··· · ·· · • · 4 · 4 · · 4· • · ♦ · ·····«· 4· • Ú · · · 4 · ·· ··♦· ·’ ·· · ·*···

Další testy, které poskytuje tento vynález, zahrnují použití polypeptidů hybridních receptorů. Tyto hybridní polypeptidy spadají do dvou obecných tříd. V první třídě je intracelulární doména zalphal 1, obsahující přibližně zbytky 256 (Lys) až 528 (Ser) ze SEQ ID NO:2, připojena k doméně druhého receptoru, která váže ligand. Je výhodné, když druhý receptor je hematopoetický cytokinový receptor, jako je receptor mpl (Souyri a kol., Cell 63:1137-1147, 1990). Hybridní receptor bude dále obsahovat transmembránovou doménu, která může být odvozena z kteréhokoli z receptorů. Konstrukt DNA, kódující hybridní receptor je potom vložen do hostitelské buňky. Buňky exprimující hybridní receptor jsou kultivovány v přítomnosti ligandů pro vazebnou doménu a je testována jejich odpověď. Tento systém poskytuje způsob, jak analyzovat převod signálu, zprostředkovaný zalphal 1, který využívá snadno dostupné ligandy. Tento systém může být také použit pro zjištění, zda určité buněčné linie jsou schopny odpovědi na signály převáděné zalphal 1. Druhá třída polypeptidů hybridních receptorů obsahuje extracelulární (která váže ligand) doménu zalphal 1 (přibližně zbytky 20 (Cys) až 237 (His) ze SEQ ID NO:2) s cytoplazmatickou doménou druhého receptoru, s výhodou cytokinového receptoru, a transmembránovou doménu. Transmembránová doména může být odvozena z kteréhokoli z receptorů. Hybridní receptory této druhé třídy jsou exprimovány v buňkách, o nichž je známo, že jsou schopny odpovědět na signály převedené druhým receptorem. Společně jsou tyto dvě třídy hybridních receptorů schopny používat v testovacích systémech založených na receptorech široké spektrum buněčných typů.

Buňky, u kterých byla zjištěna exprese ligandů pro zalphal 1, jsou potom použity pro přípravu cDNA knihovny, z níž může být izolována DNA kódující ligand, jak bylo popsáno výše. Předložený vynález tedy poskytuje, vedle polypeptidů nových receptorů, metody pro klonování polypeptidů ligandů pro receptory.

Tkáňová specificita exprese zalphal 1 naznačuje roli v časném stádiu vývoje thymocytů a v regulaci imunitní odpovědi. Tyto procesy zahrnují stimulaci buněčného množení a diferenciaci v odpovědi na vazbu jednoho nebo více cytokinů k jejich rozpoznávacím receptorům. Z hlediska tkáňového rozdělení, pozorovaného u tohoto receptoru, agonisté (včetně přirozeného ligandů) a antagonisté mají neobyčejný potenciál jak pro in vitro, tak pro in vivo aplikace. Sloučeniny, o kterých bylo zjištěno, že jsou agonisté receptoru, jsou užitečné pro stimulaci množení a vývoje cílových buněk in vitro a in vivo. Například sloučeniny agonistů jsou užitečné jako složky ·· ···· ·♦ · · · • · · ♦ · · · · • · φ · φ · φφ • ΦΦΦ >······ φ definovaných médií pro kultivaci buněk a mohou být použity samotné nebo v kombinaci s jinými cytokiny a hormony jako náhrada za sérum, které je běžně v buněčné kultuře používané. Agonisté jsou tedy užiteční při specifické podpoře růstu a/nebo vývoje Tbuněk, B-buněk a jiných buněk lymfoidních a myeloidních linií a buněk krvetvorby v kultuře.

Agonisté ligandů pro zalphall mohou být užiteční při stimulaci buňkami zprostředkované imunity a pro stimulaci množení lymfocytů, jako je při léčení infekcí zahrnujících imunosupresi, včetně určitých virových infekcí. Další použití zahrnuje potlačování růstu nádorů, kde nádorová transformace má za následek to, že nádorové buňky jsou antigenní. Agonisté ligandů mohou být použiti pro indukci cytotoxicity, která může být zprostředkována aktivací efektorových buněk jako jsou T-buňky, NK (přirození zabíječi) nebo buňky LAK (aktivovaní lymfoidní zabíječi), nebo indukována přímo prostřednictvím apoptických biochemických drah. Agonisté ligandů mohou být také užiteční při léčení leukopenií tím, že jsou zvýšeny hladiny postiženého buněčného typu a rozšířena regenerace repertoáru T-buněk po transplantaci kostní dřeně.

Antagonisté ligandů nebo sloučeniny mohou nalézt použití při potlačování imunitní odpovědi, jako je při léčení autoimunních nemocí, včetně revmatické artritidy, roztroušené sklerózy, diabetů, zánětu střev, Crohnovy nemoci atd. Potlačení imunity může být také použito pro redukci odmítnutí tkáňových nebo orgánových transplantátů a štěpů a pro léčení specifických Τ-buněčných leukémií nebo lymfomů tím, že je potlačeno množení postiženého buněčného typu.

Zalphall také může být použit v diagnostických systémech pro detekci hladin ligandů v oběhu. V podobném provedení mohou být použity protilátky nebo jiná činidla, která se specificky vážou na zalphall, pro detekci polypeptidů receptorů v oběhu. Zvýšené nebo snížené hladiny polypeptidů ligandu nebo receptoru může být znakem patologických stavů, včetně rakoviny. Polypeptidy rozpustných receptorů mohou přispívat k patologickým procesům a mohou být nepřímým znakem vlastní nemoci. Například zvýšené hladiny rozpustného receptoru IL-2 v lidském séru bylo spojeno s řadou stavů zánětlivých a neoplastických stavů, jako je infarkt myokardu, astma, myasthenia gravis, revmatická artritida, akutní leukémie T-buněk, lymfomy B-buněk, chronická lymfocytická leukémie, rakovina tlustého střeva, rakovina prsu a rakovina vaječníku (Heaney a kol., Blood 87:847-857,1996).

·· ···· • · · ··· · ·· · · · · · · 9 99

9 9 9 9999999 99

9 9 9 9 9 9 99 ··*· ·* ** ’ .....

Polypeptid receptoru zalphall, který váže ligand nebo rozpustný receptor může být připraven expresí zkrácené DNA, kódující doménu zalphall, která váže ligand (přibližně zbytky 20 (Cys) až 237 (His) lidského receptoru (SEQ ID NO:2)) nebo odpovídající oblast v receptoru jiného než lidského původu. Je výhodné, když je extracelulární doména připravena ve formě v podstatě zbavené segmentů transmembránových a intracelulárních polypeptidů. Kromě toho polypeptidové fragmenty, které vážou ligand uvnitř cytokin vazebné domény zalphal 1, popsané výše, mohou také sloužit, v rámci zde popsaných použití, jako rozpustné receptory zalphall. Aby byl řízen export polypeptidu receptoru z hostitelské buňky, DNA receptoru je připojena k jinému segmentu DNA, kódujícímu sekreční peptid, jako je sekreční peptid t-PA nebo sekreční peptid zalphall. Pro usnadnění čištění sekretovaného polypeptidu receptoru může k němu být fúzováno na C-konci prodloužení, jako je polyhistidinová značka, látka P, peptid Flag™ (Hopp a kol., Bio/Technology 6:1204-1210, 1988; dostupná od Eastman Kodak Co., New Haven, CT) nebo jiný polypeptid nebo protein, pro který je dostupná protilátka nebo jiné specificky vazebné činidlo.

Při alternativním přístupu, extracelulární doména receptoru může být exprimována jako fúzni protein s konstantními oblastmi těžkého řetězce imunoglobulinu, obyčejně s fragmentem F_c, který obsahuje dvě domény konstantní oblasti a postrádá variabilní oblast. Takové fúzni polypeptidy jsou obyčejně vylučovány jako multimerní molekuly, kde F_c části jsou vzájemně vázány disulfidickými vazbami a dva polypeptidy receptoru jsou umístěny ve vzájemné těsné blízkosti. Fúzni polypeptidy tohoto typu mohou být použity pro afinitní čištění rozpoznávacích ligandů z roztoku, jako nástroj v in vitro testech, pro blokování signálů in vitro pomocí specifického titrování ligandů a jako antagonisty in vivo jejich parenterálním podáním, aby vázaly ligand a odstranily jej z oběhu. Pro čištění ligandu je chiméra zalphal 1-lg přidána ke vzorku obsahujícímu ligand (např. buňkami upravení kultivační médium nebo tkáňový extrakt) za podmínek, které usnadňují vazbu receptor-ligand (obyčejně za teploty, pH a iontové síly, které jsou blízké fyziologickým hodnotám). Komplex chimeraligand je potom ze směsi oddělen pomocí proteinu A, který je imobilizován k pevnému podkladu (např. nerozpustná zrnka pryskyřice). Ligand je potom vymyt pomocí běžných chemických technik, jako je použití solného nebo pH gradientu. Jinou možností je, že sama chiméra může být vázána k pevnému podkladu, a vazba a vymytí je provedeno ♦ ♦ · · · φ · · · φ φ φφφφ · · tak, jak bylo výše popsáno. Odebírané frakce mohou být opětně frakcionovány, dokud není dosažena požadovaná úroveň čistoty.

Kromě toho mohou být rozpustné receptory zalphal 1 použity pro vyvažování ligandu, tj. jako antagonisté, pro vázání ligandu in vivo nebo in vitro při léčebných nebo jiných aplikacích, kdy přítomnost ligandu není žádoucí. Například u rakovin, při kterých je exprimováno velké množství biologicky aktivního ligandu zalphall, rozpustné receptory zalphall mohou být použity jako přímý antagonista ligandu in vivo a může pomoci při snížení progrese a příznaků, spojených s nemocí. Kromě toho rozpustný receptor zalphall může být použit pro zpomalení postupu rakovin, které exprimují nadbytek receptorů zalphall, in vivo vázáním ligandu, který by jinak podporoval bujení takových rakovin. Podobné in vitro aplikace pro rozpustné receptory zalphall mohou být použity například jako negativní výběr při selektování buněčných linií, které rostou v nepřítomnosti ligandu zalphall.

Kromě toho může být rozpustný receptor zalphall použit in vivo nebo v diagnostických aplikacích pro detekci rakovin, které exprimují ligand zalphall, in vivo nebo ve vzorcích tkání. Například rozpustný receptor zalphall může být konjugován s radioaktivní značkou nebo fluorescenční značkou, jak zde bylo popsáno, a použit pro detekci přítomnosti ligandu ve vzorku tkáně za pomoci in vitro vazebného testu typu ligand-receptor, nebo za pomoci fluorescenčního zobrazování. Kromě toho může být radioaktivně označený rozpustný receptor zalphall podán in vivo kvůli detekci pevných nádorů, které exprimující ligand, a zobrazení se provede pomocí metod zobrazujících radioaktivitu, které jsou v oboru známé.

Analýza tkáňového rozložení mRNA odpovídající této nové DNA, ukázalo expresi v lymfoidních tkáních, včetně brzlíku, sleziny, lymfatických uzlin a v leukocytech periferní krve. Tyto údaje ukazují na roli receptorů zalphall při množení, diferenciaci a/nebo aktivaci imunních buněk, a naznačují jeho roli při vývoji a regulaci imunitních odpovědí. Tyto údaje také naznačují, že interakce zalphall s jeho ligandem může stimulovat množení a vývoj myeloidních buněk a může, jako IL-2, IL-6, LIF, IL-11 a OSM (Baumann a kol., J. Biol. Chem. 267:8414-8417, 1993), indukovat syntézu proteinů akutní fáze v hepatocytech.

Je výhodné čistit polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, do >80% čistoty, výhodněji >90% čistoty, ještě výhodněji >95% čistoty a zvláště výhodný je farmaceuticky čistý stav, tj. více než 99,9% čistota, pokud se týká kontaminujících

• · · · · · ·

4 4 4 4 4 · • 44444·· ·4 • · · 4 44 • 4 4 44444 makromolekul, zvláště jiných proteinů a nukleových kyselin, a zbavený infekčních a pyrogenních činidel. Je výhodné, když je čištěný polypeptid v podstatě zbavený jiných polypeptidů, zvláště jiných polypeptidů živočišného původu.

Exprimované rekombinantní polypeptidy zalphall (nebo chimerní či fúzní polypeptidy zalphall) mohou být čištěny pomocí frakcionačních a/nebo běžných purifikačních metod a prostředků. Pro frakcionaci vzorků může být použito srážení síranem amonným a kyselá nebo chaotropní extrakce. Příklady purifikačních kroků mohou zahrnovat hydroxylapatit, dělení podle velikosti, FPLC a HPLC reverzní fáze. Vhodné chromatografické prostředky zahrnují deriváty dextranů, agarózu, celulózu, polyakrylamid, speciálně upravený kysličník křemičitý a podobně. Výhodné jsou PEI, DEAE, QAE a Q deriváty. Příklady chromatografických prostředků zahrnují ty, které jsou derivovány fenylovou, butylovou nebo oktylovou skupinou, jako je PhenylSepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) a podobně. Vhodnými pevnými médii jsou skleněná zrnka, pryskyřice založené na kysličníku křemičitém, celulózové pryskyřice, sesíťované polyakrylamidové pryskyřice a podobné, které jsou nerozpustné za podmínek, za kterých budou používány. Tato média mohou být modifikována reaktivními skupinami, které umožňují připojení proteinů aminoskupinami, karboxylovými skupinami, sulfhydrylovými skupinami, hydroxylovými skupinami a/nebo cukernými složkami. Příklady chemických postupů, vhodných pro připojení, zahrnují aktivaci bromkyanovou, aktivaci N-hydroxysuccinimidovou, aktivaci epoxidovou, aktivaci sulfhydrylovou, aktivaci hydrazidovou a karboxylové a aminové deriváty pro karbodiimidový chemický postup připojení. Tato a jiná pevná média jsou dobře známa a v oboru široce používána a jsou dostupná od komerčních dodavatelů. Metody pro vazbu polypeptidů receptorů na pevná média jsou v oboru dobře známa. Výběr určité metody je záležitostí rutinního návrhu a je určen částečně vlastnostmi vybraného podkladového média. Viz například Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být izolovány za využití jejich biochemických, strukturních a biologických vlastností. Například chromatografie absorbcí na imobilizovaných iontech kovů (IMAC) může být použita pro čištění proteinů bohatých na histidin, včetně těch, které obsahují polyhistidinové značky. Krátce řečeno, gel je napřed nasycen ionty dvojmocných kovů, aby se vytvořil

ΦΦ »·Φ· ·· φ φ φ · ··· • φφφ ·····♦· φ φ φφφ φφφ φφφ

..............

chelát (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Proteiny bohaté histidinem se budou adsorbovat na tuto základní hmotu s různými afinitami, závisejícími na použitém kovovém iontu a budou eluovány kompetitivní elucí, snižováním pH nebo použitím silných chelatačních činidel. Další metody čištění zahrnují čištění glykozylovaných proteinů afinitní chromatografií na lektinech a chromatografií výměny iontů (Methods in Enzymol., sv. 182, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, (vyd.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529 až 39). V jiných provedeních vynálezu mohou být, pro usnadnění čištění, konstruovány fúze polypeptidů o který se jedná, s afinitními značkami (např. proteinem, který váže maltózu, doménami imunoglobulinu).

Kromě toho jsou, pomocí metod v oboru popsaných, konstruovány fúze polypeptidů nebo hybridní proteiny zalphall, ve kterých jsou využívány oblasti nebo domény zalphall, který je předmětem tohoto vynálezu, v kombinaci s oblastmi nebo doménami jiných lidských proteinů z rodiny cytokinových receptorů nebo z proteinů heterologních (Sambrook a kol., tamtéž, Altschul a kol., tamtéž, Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994, a odkazy v nich uvedené). Tyto metody umožňují určování biologického významu větších domén nebo oblastí ve zkoumaném polypeptidů. Takové hybridy mohou změnit reakční kinetiku, schopnost vazby, zúžit nebo rozšířit substrátovou specificitu nebo změnit tkáňovou či buněčnou lokalizaci polypeptidů a mohou být aplikovány na polypeptid o neznámé struktuře.

Fúzní polypeptidy nebo proteiny mohou být připraveny metodami známými osobám se zkušeností v oboru, tak že se připraví jednotlivě každá složka fúzního proteinu a ty jsou potom chemicky spojeny. Alternativním postupem je pomocí známých technik vytvoření polynukleotidu, kódujícího jednu nebo více složek fúzního proteinu ve vhodném čtecím rámci, a jeho exprese metodami zde popsanými. Například všechny domény, přispívající k biologické funkci mohou být prohozeny u zalphall, který je předmětem tohoto vynálezu, za funkčně rovnocenné domény z jiných členů rodiny cytokinů. Takové domény zahrnují, mimo jiné, sekreční signální sekvence, extracelulární vazebné domény cytokinů, transmembránové domény a intracelulární signální domény, místa Box I a Box II, jak zde bylo popsáno. U takových fúzních proteinů je možno očekávat, že budou mít biologický funkční profil totožný nebo podobný s polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, nebo jiné známé rodiny proteinů, v závislosti na způsobu konstrukce fúze. Kromě toho mohou takové proteiny, jak zde bylo popsáno, vykazovat i jiné vlastnosti.

·· ·♦·· • · · • · • · · · · · · ·· • · 9 · · 9999 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

..............

Standardní molekulárně biologické a klonovací techniky je možno použít pro prohození odpovídajících si domén mezi polypeptidem zalphal 1 a těmi polypeptidy, k nimž jsou fúzovány. Obecně řečeno, segment DNA kódující doménu o kterou se jedná, např. zde popsanou doménu zalphall, je operativně vázán ve čtecím rámci k alespoň jednomu jinému segmentu DNA, který kóduje další polypeptid (například doménu nebo oblast z jiného cytokinového receptorů, jako je receptor IL-2) a vložen do vhodného expresního vektoru tak, jak je zde popsáno. Obecně jsou konstrukty DNA vytvářeny tak, že několik segmentů DNA, které kódují odpovídající oblasti polypeptidu, jsou operativně vázány ve čtecím rámci a vytvářejí jeden konstrukt, který kóduje celý fúzní protein nebo jeho funkční část. Například DNA konstrukt by kódoval od N-konce až po C-konec fúzní protein, obsahující signální polypeptid, následovaný doménou, která váže cytokin, následovanou transmembránovou doménou, která by byla následována intracelulární signální doménou. Takové fúzní proteiny mohou být exprimovány, izolovány a testovány na jejich aktivitu tak, jak je zde popsáno.

Polypeptidy zalphall nebo jejich fragmenty mohou být také připraveny pomocí chemické syntézy. Polypeptidy zalphall mohou být monomery nebo multimery; glykozylované nebo neglykozylované; pegylované nebo nepegylované; a mohou nebo nemusí obsahovat počáteční metioninový aminokyselinový zbytek.

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být také syntetizovány výlučnou syntézou na pevné fázi, metodami částečné pevné fáze, kondenzací fragmentů nebo klasickou syntézou v roztoku. Metody pro syntézu polypeptidů jsou dobře v oboru známy. Viz například Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Kaiser a kol., Anal. Biochem. 34:595, 1970. Po celkové syntéze požadovaného peptidu na pevném podkladu, je k pryskyřici s navázaným peptidem přidáno činidlo, které peptid od pryskyřice odštěpí a odstraní většinu skupin chránících postranní skupiny. Takové metody jsou rovněž v oboru zavedené.

Aktivita molekul, které jsou předmětem tohoto vynálezu, může být měřena pomocí řady testů, které měří buněčnou diferenciaci a množení. Takové metody jsou v oboru dobře známé.

Proteiny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou výhodné například při léčení lymfoidních, imunních, zánětlivých, slezinných, krevních nebo kostních poruch a mohou být měřeny in vitro pomocí kultivovaných buněk nebo in vivo podáním molekul z nárokovaného vynálezu vhodnému živočišnému modelu. Například hostitelské buňky ·· ··♦· • ·

A · · · · ♦ · · · · φ · · · · ♦« · · • a · 1 » »··· u · *· ······ · * ·

.......... ·’· exprimující polypeptid rozpustného receptoru zalphall mohou být obaleny v alginátovém obalu a injekčně podány (implantovány) do živočišných příjemců. Mikrokapsle z alginát-poly-L-lyzinu, mikrokapsle ze selektivně propustných membrán a difúzní komůrky jsou způsoby, jak zachytit transfekované savčí buňky nebo primární savčí buňky. Tyto typy neimunogenního obalení umožňuje difúzi proteinů a jiných makromolekul sekretovaných nebo uvolňovaných zachycenými buňkami do živočišných příjemců. Nejdůležitější je, že kapsle skrývají a chrání cizí, obalené buňky před imunitní odpovědí živočišného příjemce. Takové obalení může prodloužit dobu života injekčně podaných buněk z několika hodin nebo dnů (nahé buňky) na několik týdnů (obalené buňky). Alginátová vlákna poskytují jednoduchý a rychlý způsob, jak připravit obalené buňky.

Materiály pro přípravu alginátových vláken jsou v oboru známy. V příkladu takového postupu je ve vodě připraven 3% alginát a sterilně přefiltrován. Těsně před přípravou alginátových vláken je alginátový roztok opět filtrován. Přibližně 50% buněčná suspenze (obsahující 5x 10⁵ až 5x 10⁷ buněk/ml) je smíchána s 3% roztokem alginátu. Jeden mililitr suspenze alginát/buňky je vytlačen do 100 mM roztoku sterilního filtrovaného CaCI₂ v průběhu časového úseku ~15 minut, přičemž se tvoří vlákna. Vytlačené vlákno je potom přeneseno do roztoku 50 mM CaCI₂ a potom do roztoku 25 mM CaCI₂. Před tím než je vlákno potaženo v 0,01% roztoku poly-L-lyzinu, je opláchnuto deionizovanou vodou. Nakonec je vlákno opláchnuto v Ringerově roztoku s kyselinou mléčnou a vytaženo z roztoku do válce stříkačky (bez jehly). Na injekci je potom nasazena jehla s dírou o velkém průměru a vlákno je podáno intraperitoneálně příjemci v minimálním objemu Ringerova roztoku s kyselinou mléčnou.

In vivo přístup pro testování proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnuje použití virových podávačích systémů. Příklady virů, vhodných pro tento účel, zahrnují adenovirus, herpesvirus, retroviry, virus vakcínie a s adenovirem asociovaný virus (AAV). Adenovirus, virus s dvouvláknovou DNA, je nyní nejlépe prostudovaný vektor pro přenos heterologní nukleové kyseliny (pro přehled viz T.C. Becker a kol., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; a J.T.Douglas a D.T.Curiel, Science & Medicine 4:4453, 1997). Adenovirový systém poskytuje několik výhod: (i) adenovirus může pojmout relativně velké DNA inzerty; (ii) může vyrůst do vysokého titru; (iii) infikuje široké spektrum typů savčích buněk; a (iv) může být použit s velkým počtem různých promotorů, včetně všeobecně se vyskytujících, tkáňově specifických a regulovatelných ·· ···· • 4 · 4« · « e · b · · · · ·· • · · · ♦ · · · · • 4 · · ♦ ···· · · · · • •••44 ···

........... ··· promotorů. Také, protože adenoviry jsou stabilní v krevním oběhu, mohou být podávány pomocí nitrožilní injekce.

Při použití adenovirových vektorů, kdy části adenovirového genomu jsou odstraněny, do virové DNA jsou vloženy inzerty pomocí přímé ligace nebo pomocí homologické rekombinace se současně transfekovaným plazmidem. V systému, který je uveden jako příklad, byl odstraněn z virového vektoru esenciální gen E1, a virus se nebude replikovat, pokud není gen E1 poskytnut hostitelskou buňkou (příkladem je lidská buněčná linie 293). Když je adenovirus podán nitrožilně do nedotčeného živočicha, primárně směřuje do jater. Pokud má podávači adenovirový systém deleci genu E1, virus se nemůže v hostitelské buňce replikovat. Avšak hostitelská tkáň (např. játra) budou exprimovat a zpracovávat (a jestliže je přítomen sekreční signál, sekretovat) heterologní protein. Sekretované proteiny vstoupí do oběhu ve vysoce krevně zásobených játrech a mohou být určeny účinky na infikovaného živočicha.

Kromě toho adenovirové vektory, obsahující rozličné delece virových genů, mohou být použity při pokusu snížit nebo zcela zamezit imunitní odpovědi k vektoru. Takové adenoviry mají deleci genu E1 a navíc obsahují delece genů E2A nebo E4 (Lusky, M. a kol., J. Virol. 72:2022-2032, 1998; Raper, S.E. a kol., Human Gene Therapy 9:671-679, 1998). Dále bylo popsáno, že delece genu E2b snižuje imunitní odpovědi (Amalfitano, A. a kol., J. Virol. 72:926-933, 1998). Kromě toho, po deleci celého adenovirového genomu, mohou být vloženy velmi velké inzerty heterologní DNA. Příprava tak zvaných vyprázdněných adenovirů, kde jsou odstraněny všechny virové geny je zvláště výhodná pro vkládání velkých inzertů heterologní DNA. Pro přehled viz Yeh, P. a Perricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997.

Adenovirový systém může být také použit pro produkci proteinu in vitro. Při kultivaci adenovirem infikovaných buněk, jiných než jsou buňky 293, za podmínek, kdy se buňky příliš rychle nedělí, buňky mohou produkovat proteiny po dlouhá časová období. Například buňky BHK jsou vypěstovány do souvislého nárůstu, potom jsou vystaveny adenovirovému vektoru, který kóduje požadovaný sekretovaný protein. Buňky jsou potom pěstovány za podmínek bez séra, které umožní infikovaným buňkám přežívat několik týdnů bez výrazného buněčného dělení. Jinou možností je, že adenovirovým vektorem infikované buňky 293 mohou být pěstovány jako přisedlé buňky nebo v suspenzní kultuře při relativně vysoké hustotě buněk, což umožňuje produkovat významná množství proteinu (viz Garnier a kol., Cytotechnol. 15:145-55, ·· ···· ··· • · ···· 9 9 • ··· 9 · · · · · · *

1994). Podle kteréhokoli postupu, může být exprimovaný , sekretovaný heterologní protein opakovaně izolován ze supernatantu buněčné kultury, z lyzátu nebo z membránových frakcí, v závislosti na rozmístění exprimovaného proteinu v buňce. Při použití protokolu produkce v infikovaných buňkách 293 mohou být také efektivně získávány nesekretované proteiny.

Z hlediska tkáňového rozložení, které bylo pozorováno u zalphall, mají agonisté (včetně přirozeného ligandu/substrátu/kofaktoru/ atd.) a antagonisté mají ohromný potenciál jak v in vitro, tak v in vivo aplikacích. Sloučeniny určené jako agonisté zalphall jsou výhodné pro stimulaci růstu imunitních a hematopoetických buněk in vitro a in vivo. Například zalphall a sloučeniny agonistů jsou výhodné jako složky definovaných médií pro buněčné kultury a mohou být použity samotné nebo v kombinaci s jinými cytokiny a hormony jako náhrada séra, které je běžně používáno v kulturách buněk. Agonisté jsou tedy výhodní při specifické podpoře růstu a/nebo vývoje T-buněk, B-buněk a jiných buněk lymfoidních a myeloidních linií v kultuře. Kromě toho, rozpustný receptor zalphall, agonista nebo antagonista může být používán in vitro v pokusu měřit stimulaci tvorby kolonií z izolovaných primárních kultur z kostní dřeně. Takové testy jsou v oboru dobře známé.

Antagonisté jsou také výhodní jako testovací reagencie pro charakterizaci míst interakce ligand-receptor. Inhibitory aktivity zalphall (antagonisté zalphall) zahrnují protilátky proti zalphall a rozpustné receptory zalphall, a rovněž jiná peptidická a nepeptidická činidla (včetně ribozymů).

Zalphall může být také použit pro identifikaci modulátorů (např. antagonistů) nebo jeho aktivitu. Testované sloučeniny jsou přidány do zde popsaných testů, pro určení sloučenin, které inhibují aktivitu zalphall. Vedle takových testů, které jsou zde popsány, vzorky mohou být testovány na inhibici aktivity zalphall v řadě testů, navržených pro měření vazby zalphall, oligomerizace nebo stimulace/inhibice buněčných odpovědí, závislých na zalphall. Například buněčná linie exprimující zalphall, mohou být transfekovány konstruktem s reportérovým genem, který citlivý na buněčnou dráhu stimulovanou zalphall. Tento typ konstruktů s reportérovým genem je v oboru znám a bude obyčejně obsahovat DNA elementu citlivého k zalphall, který je operativně vázaný ke genu kódujícímu testem detekovatelný protein, jako je luciferáza. DNA citlivých elementů může obsahovat, mimo jiné, elementy citlivé na cyklický AMP (CRE), elementy citlivé na hormony (HRE), elementy citlivé na inzulín (IRE) (Nasrin a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990) a elementy citlivé na sérum (SRE) (Shaw a kol., Cell 56:563-72, 1989). Elementy citlivé na cyklický AMP jsou přehledně zpracovány v Roestler a kol., J. Biol. Chem. 263 (19):9063-6, 1988 a v Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8):1087-94, 1990. Elementy citlivé na hormony jsou přehledně zpracovány v Beato, Cell 56:335-44, 1989. Kandidátské sloučeniny, roztoky, směsi nebo extrakty nebo různými typy buněk upravená média jsou testována na schopnost zvýšit aktivitu receptoru zalphall, což je zjišťováno zvýšením zalphall stimulace exprese reportérového genu. Testy tohoto typu budou detekovat sloučeniny, které přímo stimulují aktivitu zalphall, která převádí signál, pomocí vazby receptoru nebo pomocí jinak stimulujících částí signální kaskády. Jako taková je poskytována metoda identifikace agonistů polypeptidu zalphall, která sestává z poskytnutí buněk citlivých k polypeptidu zalphall, pěstování jedné části buněk v nepřítomnosti testované sloučeniny, pěstování druhé části buněk v přítomnosti testované sloučeniny, a detekování zvýšení buněčné odpovědi u druhé části buněk, ve srovnání s částí první. Kromě toho třetí buňka, která obsahuje výše popsaný konstrukt s reportérovým genem, ale neexprimující receptor zalphall, může být použita jako kontrolní buňka pro stanovení nespecifické stimulace reportérového genu, nebo stimulace reportérového genu nezprostředkované zalphall. Agonisté, včetně přirozených ligandů, jsou proto výhodní pro stimulaci nebo zesílení funkce polypeptidu zalphal 1.

Polypeptid zalphal 1, který váže ligand, jako je zde popsaná doména, která váže cytokin, může být také použit pro čištění ligandu. Polypeptid je imobilizován k pevnému podkladu, jako jsou zrnka agarózy, sesíťovaná agaróza, sklo, ceiulózové pryskyřice, pryskyřice založené na upraveném kysličníku křemičitém, polystyren, sesíťovaný polyakrylamid nebo podobné materiály, které jsou stabilní za podmínek, za kterých jsou používány. Metody připojení polypeptidů k pevnému podkladu jsou v oboru známé a zahrnují chemii aminů, aktivaci bromkyanovou, aktivaci N-hydroxysuccinimidovou, aktivaci epoxidovou, aktivaci sulfhydrylovou a aktivaci hydrazidovou. Výsledné médium bude obyčejně uspořádáno ve formě sloupce a tekutiny obsahující ligand procházejí sloupcem jednou nebo vícekrát, aby se umožnila vazba ligandu na polypeptid receptoru. Ligand je potom vymyt pomocí změn v koncentraci soli, chaotropních činidel (guanidin HCI) nebo pH, aby došlo k rozpadu vazby ligand-receptor.

Testovací systém, který používá receptor, který váže ligand (nebo protilátku či jeden člen páru komplement/antikomplement) nebo jeho vazebný fragment a komerčně ·· • φ • · ···· 9 9 9

9 9 9 9 9999 999 9

9 9 9 9 » 9 I» 9 ·**’ ** ** ‘ .....

dostupný přístroj s bíosenzorem mohou být s výhodou použity (např. BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ; nebo SELDI™ technology, Ciphergen, lne., Palo Alto, CA). Takový receptor, protilátka člen páru komplement/antikomplement nebo fragment je imobilizován na povrchu receptorového čipu. Použití tohoto přístroje je popsáno v Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-240, 1991 a Cunningham a Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Receptor, protilátka člen nebo fragment je kovalentně připojen, pomocí aminoskupin nebo sulfhydrylových aminoskupin k vláknům dextranu, jež jsou připojeny ke zlatému filmu, umístěnému v průtokové buňce. Testovaný vzorek prochází buňkou. Pokud je ve vzorku přítomen ligand, epitop nebo opačný člen páru komplement/antikomplement, bude se vázat k imobilizovanému receptoru, protilátce nebo členu, a bude způsobovat změny v indexu lomu média, který je detekován jako změna v povrchové plazmonové rezonanci zlatého filmu. Tento systém umožňuje určení rychlostí vazby a uvolňování, z čehož může být spočtena afinita vazby, a stanovení stechiometrie vazby.

Polypeptidy receptoru, které vážou ligand, mohou být také použity v rámci jiných, v oboru známých testovacích systémů. Takové systémy zahrnují analýzu podle Scatcharda pro určení afinity vazby (viz Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:545-48, 1991; Cunningham a kol., Science 245:821-25,1991).

Polypeptidy zalphal 1 mohou být také použity pro přípravu protilátek, které se vážou k epitopům, peptidům nebo polypeptidům zalphal 1. Polypeptid zalphal 1 nebo jeho fragment slouží jako antigen (imunogen) pro očkování do živočicha a vyvolání imunitní odpovědi. Osoba se zkušeností v oboru si je vědoma, že antigeny nebo imunogenní epitopy se mohou skládat z úseků aminokyselin v rámci delšího polypeptidu, od asi 10 aminokyselin do celé délky polypeptidu nebo delších, v závislosti na polypeptidu. Vhodné antigeny zahrnují polypeptid zalphal 1, kódovaný SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) k aminokyselině číslo 538 (Ser), nebo jeho sousedící 9 až 518 AA aminokyselinový fragment. Peptidy výhodné pro použití jako antigeny jsou domény, které vážou cytokin, intracelulární signální domény, místa Boxl a Boxll, které zde byly popsány, a hydrofilní polypeptidy zalphal 1, jako jsou ty, které může předpovědět osoba se zkušeností v oboru z vynesení hydrofobnosti, určené například z profilu hydrofilnosti podle Hoppa a Woodse, založeného na posunu okénka zabírajícího šest aminokyselinových zbytků, přičemž skryté zbytky G, S a T a exponované zbytky Η, Y a W jsou ignorovány (viz obrázek 1). Hydrofilní peptidy zalphall zahrnují peptidy obsahující aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující: (1) aminokyselinu číslo 51 (Trp) až aminokyselinu číslo 61 (Glu) ze SEQ ID NO:2; (2) aminokyselinu číslo 136 (Ile) až aminokyselinu číslo 143 (Glu) ze SEQ ID NO:2; (3) aminokyselinu číslo 187 (Pro) až aminokyselinu číslo 195 (Ser) ze SEQ ID NO:2; (4) aminokyselinu číslo 223 (Phe) až aminokyselinu číslo 232 (Glu) ze SEQ ID NO:2; a (5) aminokyselinu číslo 360 (Glu) až aminokyselinu číslo 368 (Asp) ze SEQ ID NO:2. Kromě toho jsou vhodnými antigeny konzervativní motivy a variabilní oblasti mezi konzervativními motivy v zalphall. Mimoto odpovídající oblasti polypeptidu myšího zalphall (SEQ ID NO:85) mohou být použity pro přípravu protilátek proti myšímu zalphall. Protilátky vytvořené při této imunitní odpovědi mohou být izolovány a čištěny tak, jak zde bylo popsáno. Metody pro přípravu a izolaci polyklonálních a monoklonálních protilátek jsou v oboru dobře známé. Viz například Current Protocols in Immunology, Cooligan a kol., (vyd.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, lne., 1995; Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; a Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applicationa, CRC Press, lne., Boča Raton, FL, 1982.

Jak by bylo zřejmé osobě se zkušeností v oboru, polyklonální protilátky mohou být připraveny očkováním řady teplokrevných živočichů, jako jsou koně, krávy, kozy, ovce, psi, kuřata, králíci, myši a krysy s polypeptidem zalphall nebo jeho fragmentem. Imunogenicita polypeptidu zalphall může být zvýšena použitím adjuvans, jako je hydroxid hlinitý nebo kompletní či nekompletní Freudovo adjuvans. polypeptidy výhodné pro imunizaci také zahrnují fúzní polypeptidy, jako jsou fúzní polypeptidy zalphall nebo jejich části, s polypeptidem imunoglobulinu nebo s proteinem, který váže maltózu. Polypeptidový imunogen může být molekula o plné délce nebo její část. Pokud část polypeptidu je podobná haptenu, taková část může být pro imunizaci s výhodou připojena nebo vázána k makromolekulárnímu nosiči (jako je hemokyanin keyhole limpet (KLH), hovězí sérumalbumin (BSA) nebo tetanický toxoid).

Termín protilátky jak je zde používán zahrnuje polyklonální protilátky, afinitní purifikací čištěné polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a fragmenty vázající antigen, jako jsou proteolytické fragmenty F(ab')2 a Fab. Geneticky upravené původní protilátky nebo fragmenty, jako jsou chimerní protilátky fragmenty Fv, jednořetězcové protilátky a podobně, a rovněž syntetické peptidy a polypeptidy vázající antigen, jsou také do tohoto termínu zahrnuty. Protilátky jiných druhů než člověka mohou být · 4 · ·€ • · 4 4 4 · 4 44 4 • 4 4 4 4 4 444

444 4444444 44 ₆₀ : ’··* .i.

humanizovány tím, že k podpůrné a konstantní lidské oblasti jsou připojeny CDR, pocházející z jiného druhu, nebo zabudováním celých variabilních domén, pocházejících z jiného druhu (popřípadě jejich překrytím pomocí povrchu lidského původu tím, že dojde k záměně exponovaných zbytků a výsledkem je obkládaná protilátka). V-některých případech si humanizované protilátky mohou podržet zbytky z jiného druhu uvnitř podpůrných domén lidské variabilní oblasti, aby se posílily vhodné vazebné charakteristiky. V důsledku humanizování protilátek může být prodloužen jejich biologický poločas a jejich potenciál pro vyvolání odmítavých imunitních reakcí po podání člověku je snížen.

Alternativní techniky pro přípravu nebo výběr zde výhodných protilátek zahrnuje in vitro expozici lymfocytů k proteinu nebo peptidu zalphall, a výběr z knihoven prezentujících protilátky na fágu nebo podobných vektorech (například za použití imobilizovaného nebo značeného proteinu nebo peptidu zalphall). Geny kódující polypeptidy, které mají potenciální vazebné domény polypeptidů zalphall, mohou být získány prohledáváním náhodných peptidových knihoven prezentovaných na fágu (fágová prezentace) nebo na bakterii, jako je E. coli. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy mohou být získány různými cestami, jako je pomocí náhodné mutageneze a náhodnou syntézou polynukleotidů. Tyto knihovny, prezentující náhodné peptidy, mohou být použity pro hledání peptidů, které interagují se známým cílem, což může být protein nebo polypeptid, jako je ligand nebo receptor, biologická nebo syntetická makromolekula, nebo organické či anorganické látky. Techniky pro vytváření a prohledávání takových náhodných peptidových prezentačních knihoven jsou v oboru známé (Ladner a kol., patent US 5 223 409; Ladner a kol., patent US 4 946 778; Ladner a kol., patent US 5 403 484 a Ladner a kol., patent US 5 571 698) a prezentační knihovny náhodných peptidů a soupravy pro prohledávání takových knihoven jsou komerčně dostupné, například od Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne. (San Diego, CA), New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia LKB Biotechnology lne. (Piscataway, NJ). Prezentační knihovny náhodných peptidů mohou být prohledávány pomocí zde popsaných sekvencí zalphal 1, aby byly zjištěny proteiny, které se vážou k zalphall. Tyto vazebné peptidy, které interagují s polypeptidy zalphall, mohou být použity pro značkování buněk; pro izolování homologických polypeptidů pomocí afinitní chromatografie; mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně. Tyto vazebné peptidy • φ φ · φ

Φ 9 • · φ ΦΦΦ Φ«ΦΦ φφ ΦΦΦΦ ΦΦΦ φ ΦΦΦ ΦΦΦΦΦΦΦ Φ Φ «Φ···· ΦΦΦ

Φ·®#®· «φ * ·· ··· mohou být také použity v analytických metodách, jako je pro prohledávání expresních knihoven a neutralizační aktivity. Vazebné peptidy mohou být také použity v diagnostických testech pro určení hladin polypeptidů zalphal 1 v oběhu; pro detekování nebo kvantifikaci rozpustných polypeptidů zalphal 1, jakožto znaku skrytého patologického stavu nebo nemoci. Tyto vazebné peptidy mohou také působit jako antagonisté zalphal 1 a blokovat vazbu zalphal 1 a převod signálu in vitro a in vivo. Tyto anti-zalpha11 vazebné peptidy by byly užitečné pro inhibici působení ligandů, který se váže k zalphal 1.

Protilátky jsou považovány za specificky se vázající jestliže: 1) vykazují prahovou úroveň vazebné aktivity, a/nebo 2) nereagují významným způsobem křížově s příbuznými molekulami polypeptidů. Zaprvé, protilátky zde s vážou specificky pokud se vážou k polypeptidu, peptidu nebo epitopu zalphal 1 s afinitou alespoň 10x vyšší než je vazebná afinita k polypeptidu kontrolnímu (jiný polypeptid než zalphal 1). Je výhodné když protilátky vykazují vazebnou afinitu (K_a) 10⁶ M'¹ nebo vyšší, výhodně 10⁷ M'¹ nebo vyšší, výhodněji 10⁸ M’¹ nebo vyšší a nejvýhodněji 10⁹ M'¹ nebo vyšší. Vazebná afinita protilátky může být snadno určena osobou se zkušeností v oboru, například pomocí analýzy podle Scatcharda (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949).

Za druhé protilátky jsou považovány za specificky se vázající pokud nereagují významným způsobem křížově s příbuznými polypeptidy. Protilátky nereagují významným způsobem křížově s příbuznými molekulami polypeptidů, například když detekují zalphal 1 ale nikoli známé příbuzné polypeptidy pomocí standardní analýzy typu Western blot (Ausubel a kol., tamtéž). Příklady známých příbuzných polypeptidů jsou ortology, proteiny z týchž živočišných druhů, které Jsou členy stejné rodiny proteinů (např. IL-6), polypeptidy zalphal 1 a zalphal 1 z jiného živočišného druhu než z člověka. Kromě toho protilátky mohou být prohledávány proti známým příbuzným polypeptidům, aby byly izolovány populace, které se specificky vážou k polypeptidům, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Například protilátky vzniklé proti zalphal 1 jsou adsorbovány na příbuzné polypeptidy, které jsou připojeny k nerozpustnému podkladu; protilátky specifické k zalphal 1 budou protékat za vhodných pufračních podmínek matricí. Takové prohledávání umožňuje izolaci polyklonálních a monoklonálních protilátek, které nereagují křížově s blízce příbuznými polypeptidy (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow a Lané (vyd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988;

······ «· • · · · · * · · • 9 9 9 9· · 9

Current Protocols in Immunology, Cooligan a kol., (vyd.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, lne., 1995). Prohledávání a izolace specifických protilátek je dobře v oboru známá. Viz Fundamental Immunology, Paul (vyd.), Raven Press, 1993; Getzoff a kol., Adv. in Immunol. 43:1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (vyd.), Academie Press Ltd., 1996; Benjamin a kol., Ann, Rev, Immunol. 2:67-101, 1984.

Pro detekování protilátek, které se specificky vážou k proteinům nebo polypeptidům zalphall, je možno použít množství testů, které jsou známy osobám se zkušeností v oboru. Příklady testů jsou podrobně popsány v Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow a Lané (vyd.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Typické příklady takových testů zahrnují: ELISA, dot blot test nebo test typu Western blot, inhibiční nebo imunoabsorbční test a sendvičový test. Kromě toho mohou být protilátky prohledávány na vazbu ke standardnímu typu popřípadě mutované formě proteinu nebo polypeptidu zalphal 1.

Protilátky proti zalphal 1 mohou být použity pro označení buněk, které exprimují zalphall; pro izolaci zalphall pomocí afinitního čištění; pro diagnostické testy pro určování hladin polypeptidů zalphall v krevním oběhu; pro detekování nebo kvantifikaci rozpustného zalphall, jako znaku skrytého patologického stavu nebo nemoci; v analytických metodách používajících FACS; pro prohledávání expresních knihoven; pro přípravu anti-idiotypických protilátek; a jako neutralizačních protilátek nebo jako antagonistů pro blokování aktivity zalphall in vitro a in vivo. Vhodné přímé značky nebo označení zahrnují radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické částice a podobné; nepřímé značky nebo označení se mohou vyznačovat použitím biotinuavidinu nebo jiných párů komplement/antikomplement jako intermediátů. Protilátky zde také mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně, a tyto konjugáty mohou být in vivo použity pro diagnostické nebo léčebné aplikace. Kromě toho protilátky proti zalphall nebo jeho fragmentům mohou být použity in vitro pro detekování denaturovaného zalphall nebo jeho fragmentů v testech, jako jsou například testy typu Western blot nebo jiné v oboru známé testy.

Protilátky proti zalphall mohou být výhodné pro značkování buněk, které exprimují receptor a testování hladiny exprese zalphal 1, pro afinitní čištění, v diagnostických testech pro určování hladin polypeptidů rozpustného receptoru v ··»· «·4··

4··44 • 4 ···· ··

4·· ········ krevním oběhu, v analytických metodách používajících třídění fluorescenčně aktivovaných buněk. Protilátky s dvěma vazbami mohou být použity jako agonisté pro napodobení vlivu ligandu zalphal 1.

Protilátky zde také mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně, a tyto konjugáty mohou být in vivo použity pro diagnostické nebo léčebné aplikace. Například protilátky nebo vazebné peptidy, které rozpoznávají zalphall, který je předmětem tohoto vynálezu, mohou být použity pro určování nebo léčení tkání nebo orgánů, které exprimují odpovídající antikomplementární molekuly (tj. receptor zalphall). Přesněji řečeno, protilátky proti zalphall nebo jejich biologicky aktivní fragmenty či části, mohou být připojeny k detekovatelným nebo cytotoxickým molekulám a podány savci, který má buňky, tkáně nebo orgány, které exprimují molekulu zalphall.

Vhodné detekovatelné molekuly mohou být přímo nebo nepřímo připojeny k polypeptidům, které vážou zalphall (vazebné polypeptidy, včetně vazebných peptidů popsaných výše), protilátkám nebo jejich biologicky aktivním fragmentům či částem. Vhodné detekovatelné molekuly zahrnují radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické částice a podobně. Vhodné cytotoxické molekuly mohou být přímo nebo nepřímo připojeny k polypeptidu nebo protilátce a zahrnují bakteriální nebo rostlinné toxiny (například difterický toxin, exotoxin z Pseudomonas, ricin, abrin a podobně), rovněž terapeutické radioaktivní izotopy jako je jód-131, rhenium-188 nebo ytrium-90 (buď připojené přímo k polypeptidu nebo protilátce, nebo připojené nepřímo, například pomocí chelatační složky). Vazebné polypeptidy nebo protilátky také mohou být konjugovány k cytotoxickým lékům, jako je adriamycin. Pro nepřímé připojení detekovatelné nebo cytotoxické molekuly, může být konjugována se členem páru komplement/antikomplement, přičemž druhý člen páru je vázán k vazebnému polypeptidu nebo části protilátky. Pro tyto účely je pár biotin/avidin příkladem páru komplement/antikomplement.

V jiném provedení mohou být fúzní proteiny vazebný polypeptid-toxin nebo protilátka-toxin použity pro inhibici nebo odstranění cílových buněk nebo tkání (například léčení rakovinných buněk nebo tkání). V jiném případě, jestliže vazebný polypeptid má mnoho funkčních domén (tj. aktivační doménu nebo doménu vázající ligand, plus cílovou doménu), fúzní protein obsahující pouze cílovou doménu může být

444444 4·· «·

4> 4 »444 444 vhodný pro nasměrování detekovatelné molekuly, cytotoxické molekuly nebo komplementární molekuly na typ buňky nebo tkáně, o kterou se jedná. V případech kdy fúzní protein obsahující pouze jednu doménu obsahuje komplementární molekulu, antikomplementární molekula může být konjugována k detekovatelné nebo cytotoxické molekule. Takové molekuly fúzních proteinů s komplementárními doménami tedy představují obecně použitelné cílené prostředky pro buněčně specifické nebo tkáňově specifické podávání obecně použitelných konjugátů antikomplementární doména/detekovatelná molekula nebo antikomplementární doména/cytotoxická molekula.

V jiném provedení mohou být fúzní proteiny vazebný polypeptid zalphal 1cytokin nebo protilátka-cytokin použity in vivo pro podporu zabíjení cílových tkání (například rakovin krve, rakovin lymfoidních tkání, rakoviny střev a rakoviny kostní dřeně), jestliže vazba polypeptid-cytokin nebo protilátka proti zalphall je zaměřena na nadměrně se množící buňky (obecně viz Hornick a kol., Blood 89:4437-47, 1997). Autoři tam popisují fúzní proteiny schopné zaměřit cytokin na žádané místo působení, čímž je vytvořena zvýšená místní koncentrace cytokinu. Vhodné protilátky proti zalphall míří na nežádoucí buňky nebo tkáně (tj. nádor nebo leukémie) a fúzovaný cytokin zprostředkuje dokonalejší lýzu cílové buňky efektorovými buňkami. Výhodné cytokiny pro tyto účely zahrnují například interleukin 2 a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF).

Jinou možností je, že zde popsané fúzní proteiny vazebného polypeptidů zalphall nebo protilátky mohou být použity in vivo pro podporu zabíjení cílových tkání tak, že přímo stimulují apoptickou dráhu modulovanou zalphall, co má za následek buněčnou smrt nadměrně se množících buněk, které exprimují zalphall.

Zde popsané biologicky aktivní konjugáty vazebných polypeptidů nebo protilátek mohou být podávány orálně, nitrožilně, do tepny nebo do vývodu, nebo mohou být naneseny místně na zamýšlené místo působení.

Cytokiny se svazkem čtyř šroubovic, které se vážou na cytokinové receptory a rovněž jiné proteiny, vytvářené aktivovanými lymfocyty, hrají důležitou biologickou roli v buněčné diferenciaci, aktivaci, vyrovnávání a homeostáze buněk v těle. Terapie zahrnuje léčení nemocí, které vyžadují regulaci imunity, včetně autoimunních nemocí jako je revmatická artritida, roztroušená skleróza, myasthenia gravis, systémový lupus erythematodes a diabetes. Agonisté nebo antagonisté zalphall, včetně rozpustných ······ 9 · 9 9»9

9 999 β 99 ·

9 9 9 · 999«

9 · 9 9999999 9 • 9999 » · 9 ··9 9 9 receptorů a přirozených ligandů, mohou být důležití při regulaci zánětu a proto by byli výhodní při léčení revmatické artritidy, astma, vředové koliky, zánětu střev, Crohnovy nemoci a sepse. Může existovat role agonistů nebo antagonistů zalphall, včetně rozpustných receptorů a přirozených ligandů, ve zprostředkování vzniku nádorů a proto mohou být důležití při léčení rakoviny. Agonisté nebo antagonísté zalphall, včetně rozpustných receptorů a přirozených ligandů, mohou být potenciálními léčivy při potlačení imunního systému, které by bylo důležité pro omezení odmítnutí štěpu. Ligand zalphall může být užitečný při zabránění reakce štěpu proti hostiteli.

Jinou možností je, že agonisté nebo antagonísté zalphall, včetně rozpustných receptorů a přirozených ligandů, mohou aktivovat imunitní systém, což by bylo důležité pro posílení imunity proti infekčním nemocem, léčení pacientů s ohroženou imunitou, jako jsou pacienti HIV+, nebo pro zdokonalení vakcín. Zvláště mohou agonisté nebo antagonísté zalphall, včetně rozpustných receptorů a přirozených ligandů, modulovat, stimulovat nebo rozšiřovat buňky NK nebo jejich předchůdce, a poskytli by možnost léčení virových infekcí, a antineoplastický faktor. Má se za to, že buňky NK hrají hlavní roli při odstraňování metastatických nádorových buněk a pacienti jak s metastázemi, tak s pevnými nádory mají snížené úrovně aktivity buněk NK. (Whiteside a kol., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998).

Polynukleotidy kódující polypeptidy zalphall jsou výhodné v aplikacích genové terapie, kde je žádoucí posílit nebo potlačit aktivitu zalphall. Jestliže savec má mutovaný nebo mu chybí gen pro zalphal 1, může být tento gen pro zalphal 1 do buněk savce vnesen. V jednom provedení je gen kódující polypeptid zalphall vnesen in vivo do virového vektoru. Takové vektory zahrnují oslabený nebo defektní DNA virus, jako je mimo jiné herpes simplex virus (HSV), papillomavirus, virus Epsteina a Baarové (EBV), adenovirus, s adenovirem asociovaný virus (AAV) a podobně. Výhodné jsou defektní viry, které zcela nebo téměř zcela postrádají virové geny. Defektní virus není po vnesení do buňky infekční. Použití defektních virových vektorů umožňuje podání do buněk na specifických, lokalizovaných oblastech, bez obavy, že by vektor mohl infikovat jiné buňky. Příklady zvláštních vektorů zahrnují, mimo jiné defektní vektor ze herpes simplex viru 1 (HSV1) (Kaplitt a kol., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991); oslabený adenovirový vektor, jako je vektor popsaný v Stratford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992; a defektní vektor viru asociovaného s adenovirem ♦ φ φ φ φ φ · φ φ· φ φ · φ φ · · · φ φ » · φφφφφφφ φ (Samulski a kol., J. Virol. 61:3096-101, 1987; Samulski a kol., J. Virol. 63:3822-8, 1989).

V jiném provedení může být gen pro zalphall vnesen v retrovirovém vektoru, např. jak je popsáno v Anderson a kol., patent US 5 399 346; Mann a kol., Cell 33:153, 1983; Temin a kol., patent US 4 650 764; Temin a kol., patent US 4 980 289; Markowitz a kol., J. Virol. 62:1120, 1988; Temin a kol., patent US 5 124 263; mezinárodní patentová publikace WO 95/07 358, publikovaná 16. března 1995 Dougherty a kol.; a Kuo a kol., Blood 82:845, 1993. Jiná možnost je, že vektor může být vnesen lipofekcí in vivo pomocí lipozomů. Syntetické kationtové lipidy mohou být použity pro přípravu lipozomů pro in vivo transfekci genu kódujícího markér (Felgner a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7, 1987; Mackay a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:802731, 1988). Použití lipofekce pro vnesení exogenních genů do specifických orgánů má určité praktické výhody. Molekulární zaměření lipozomů na určité buňky představuje jednu oblast použití. Přesněji řečeno, řízení transfekce do určitých buněk představuje jednu oblast užitku. Například řízení transfekce do určitých typů buněk by bylo zvláště výhodné u tkání s heterogenitou buněk, jako je slinivka, játra, ledviny a mozek. Lipidy mohou být pro účely zaměření chemicky vázány k jiným molekulám. K lipozomům mohou být chemicky navázány peptidy, které pomohou navést na cíl (např. hormony nebo neurotransmitery), proteiny jako jsou protilátky, nebo nepeptidové molekuly.

Je možné odstranit cílové buňky z těla; vnést vektor, jako je nahá plazmidová DNA, a potom opětně implantovat transformované buňky do těla. Nahé DNA vektory pro genovou terapii mohou být do požadovaných hostitelských buněk vneseny pomocí metod v oboru známých, např. transfekce, elektroporace, mikroinjekce, transdukce, buněčná fúze, DEAE-dextran, srážení fosforečnanem vápenatým, použití genového děla nebo použití transportéru DNA vektoru. Viz např. Wu a kol., J. Biol. Chem. 267:963-7,1992; Wu a kol., J. Biol. Chem. 263:14 621-4,1988.

Pro inhibici transkripce genu zalphall je možno použít antisense metody a tak inhibovat množení buněk in vivo. Polynukleotidy, které jsou komplementární k segmentu polynukleotidu kódujícího zalphall (např. polynukleotid který je uveden v SEQ ID ΝΟ.Ί) jsou použity se záměrem vázat se na mRNA kódující zalphall a tak zamezit translaci této mRNA. Takové antisense polynukleotidy jsou použity pro inhibici exprese genů kódujících polypeptid zalphall v buněčné kultuře nebo v jedinci.

9 · · · · · · ·9 · • 9 · · · ··

9 · · · ·9«

999 99999999

Kromě toho, jakožto molekula buněčného povrchu, může být polypeptid zalphall použit jako cíl pro vnesení genové terapie do buňky. Toto uplatnění by bylo zvláště vhodné pro vnesení terapeutických genů do buněk, v nichž je zalphall normálně exprimován, jako jsou lymfoidní tkáně a PBL, nebo rakovinné buňky, které exprimují polypeptid zalphall. Například virová genová terapie, jak byla popsána výše, může být zaměřena na specifické typu buněk, v nichž je exprimován buněčný receptor, jako je polypeptid zalphall, spíše než virový receptor. Protilátky nebo jiné molekuly, které rozpoznávají molekuly zalphall na povrchu cílových buněk, mohou být použity pro nasměrování viru, aby infikoval a podal genový terapeutický materiál této cílové buňce. Viz Woo, S.L.C., Nátuře Biotech. 14:1538, 1996; Wickham, T.J. a kol., Nátuře Biotech. 14:1570-1573, 1996; Douglas, J.T. a kol., Nátuře Biotech. 14:1574-1578, 1996; Říhova, B., Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169, 1997; a Vile, R.G. a kol., Mol. Med. Today 4:84-92,1998. Například bispecifická protilátka obsahující virus neutralizující Fab fragment spojený s protilátkou specifickou proti zalphall, může být použita pro nasměrování viru k buňkám, které exprimují receptor zalphall a umožní účinný vstup viru, obsahujícího genetický element, do buňky. Viz například Wickham, T.J. a kol., J. Virol. 71:7663-7669, 1997 a Wickham, T.J. a kol., J. Virol. 70:6831-6838, 1996.

Předložený vynález také poskytuje reagencie, které najdou použití v diagnostických aplikacích. Například gen pro zalphall, sonda obsahující zalphall DNA nebo RNA a jejich částečné sekvence mohou být použity pro určování, zda je gen pro zalphall přítomen na chromozómu 16 nebo jestli nastala mutace. Zalphall je umístěn v oblasti 16p11.1 chromozómu 16 (viz příklad 3). Detekovatelné chromozomální odchylky v lokusu genu zalphall zahrnují mimo jiné aneuploidii, změny počtu kopií genu, inzerce, delece, změny restrikčních míst a přeskupení. Takové odchylky mohou být detekovány pomocí polynukleotidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, za pomoci molekulárně genetických technik, jako je analýza polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP), fluorescenční hybridizační metody in šitu, analýza krátkých tandemových opakování (STR) za použití technik PCR a jiné techniky pro analýzu genetické vazby, známé v oboru (Sambrook a kol., tamtéž; Ausubel a kol., tamtéž; Marian, Chest 108:255-65,1995).

Přesná znalost o poloze genu může být užitečná pro řadu účelů: 1) určení, zda sekvence je částí existujícího kontigu a získání dalších obklopujících genetických sekvencí v různých formách, jako jsou YAC, BAC nebo klony cDNA; 2) poskytnutí možného kandidátního genu dědičné nemoci, který vykazuje vazbu k téže oblasti chromozómu; a 3) křížově reagující modelové organizmy, jako je myš, které mohou pomoci při určování, jakou funkci může určitý gen mít.

Gen pro zalphall je umístěn v oblasti 16p11.1 chromozómu 16. Do této oblasti mapuje několik genů, jejichž funkce je známa. Například alfa-podjednotka receptoru cytokinu interleukinu 4 (IL-4), člena rodiny hematopoetických receptorů se nachází v oblasti 16p12.1-p11.2. Táto podjednotka může vytvářet heterodimer se zalphall. Kromě toho, sondy z polynukleotidu zalphall mohou být použity pro detekování abnormalit nebo genotypů spojených s defekty v receptoru IL-4, jako jsou ty, které jsou spojeny s některými alergickými zánětlivými poruchami· a astmatem (Deichman, k.A. a kol., Exp. Allergy 28:151-155, 1998; Mitsuyasu, H. a kol., Nátuře Genet. 19:119-120, 1998). Kromě toho mohou být sondy z polynukleotidu zalphall použity pro detekování abnormalit nebo genotypů spojených se zánětlivou střevní nemocí, kde markér citlivosti mapuje do oblasti 16p12-q13 (Cho, J.H. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95:75027507, 1998). Dále mohou být sondy z polynukleotidu zalphall použity pro detekování abnormalit nebo genotypů spojených s hemoglobinovými lokusy, umístěnými na 16pterp13.3 a zvláště defektů hemoglobinu alfa, spojených se syndromy alfa-talasémie, jako je vodnatelnost plodu (pro přehled viz Chui, M.P. a Waye, J.S. Blood 91:2213-2222, 1998). Kromě toho, mezi jinými genetickými lokusy, rovněž do této oblasti lidského genomu mapují lokusy pro Wilmsův nádor, typ III (16q), Rubinstein-Taybiho syndrom (16p13.3), prudká dětská polycystická nemoc ledvin (16p13.3), které se všechny projevují v lidských chorobných stavech. Viz genovou mapu OIMN (Online Mendelian Inheritance of Man) pro tuto oblast chromozómu 16 a odkazy v ní, na veřejně přístupném WWW serveru (http://www3.ncbi.mln.nih.gov/htbin-post/Omim/getmap? chromosome=16p11.1). Všechny v nich slouží za možné kandidátní geny na dědičné choroby, které vykazují vazby k téže oblasti chromozómu, jako gen pro zalphal 1.

Podobně poškození v lokusu zalphall samotném může mít za následek stav dědičné lidské nemoci. Molekuly, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jako jsou polypeptidy, antagonisté, agonisté, polynukleotidy a protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, by pomohly při detekování, diagnóze prevence a léčení, spojenými genetickou poruchou zalphall.

♦ · · · · · · • · · · · · ♦ · • · * · ······· ·

Mohou být také připraveny myši geneticky upravené tak, kdy jedna exprimuje gen zalphall, označená jako transgenní myš a druhá, která vykazuje naprostou nepřítomnost funkce genu zalphall, označená jako knockoutovaná myš (Snouwaert a kol., Science 257:1083, 1992; Lowell a kol., Nátuře 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244:1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. a kol., Annu Rev. Genet. 20:465499, 19986). Například transgenní myš, která exprimuje nadbytek zalphall, buď všude nebo pod tkáňově specifickým nebo pod tkáňově omezeným promotorem, může být použita pro zodpovědění otázky, zda nadbytečná exprese způsobuje fenotyp. Například nadbytečná exprese standardního typu polypeptidu zalphall, jeho polypeptidového fragmentu nebo jeho mutované formy, může změnit normální buněčné procesy a mít za následek vznik fenotypu, který identifikuje tkáň v níž exprese zalphal 1 je funkčně závažné a může označit cíl léčení pro zalphall, jeho agonisty nebo antagonisty. Například transgenní myš, která je pro přípravu výhodná je taková, která exprimuje dominantně negativní fenotyp, to je ta, která exprimuje nadbytek zalphal 1 extracelulární vazebné domény pro cytokin s připojenou transmembránovou doménou (přibližně aminokyseliny 20 (Cys) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2). Kromě toho, taková nadbytečná exprese může vést ke vzniku fenotypu, který vykazuje podobnost s lidskými nemocemi. Podobně myš s vyřazeným zalphall může být použita pro zodpovědění otázky, zda zalphall je absolutně potřebný in vivo. Fenotyp knockoutované myši může předpovídat in vivo účinky takových antagonistů zalphall, které zde byly popsány. Myší nebo lidská cDNA zalphall může být použita pro izolaci myší zalphall mRNA, cDNA a genomové DNA, které jsou následně použity pro přípravu knockoutované myši. Takové myši mohou být použity pro studium genu zalphall a jím kódovaného proteinu v in vivo systému a mohou být použity jako in vivo modely pro odpovídající lidské nemoci. Kromě toho, zde popsaná exprese antisense polynukleotidů nebo ribozymů namířených proti zalphall může být použita obdobně jako u výše popsané transgenní myši.

Pro farmaceutické použití jsou rozpustné polypeptidy receptorů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, upraveny pro parenterální, zvláště nitrožilní nebo podkožní podávání běžnými metodami. Nitrožilní podávání bude prováděno formou injekční dávky nebo formou infúze po dobu obyčejně jedné až několika hodin. Obecně budou farmaceutické přípravky obsahovat polypeptid rozpustného receptoru zalphal 1 ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je fyziologický roztok, pufrovaný ······ ··· · · • 9 9 9 9 99 · · · 9 9 99

9 9 9 9 9999 99· fyziologický roztok, 5% dextróza ve vodě a podobně. Přípravky mohou dále obsahovat jeden nebo více excipientů, konzervační činidla, solubilizátory, pufrovací činidla, albumin pro zabránění ztráty proteinu na povrchu lahvičky, atd. Metody výroby léčivého přípravku jsou v oboru dobře známy a jsou popsány například v Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro (vyd.), Mack Publishing C., Easton, PA, 19. vydání, 1995. Terapeutické dávky budou obecně v rozsahu 0,1 až 100 pg/kg pacientovy hmotnosti za den, výhodně 0,5 až 20 mg/kg pacientovy hmotnosti za den, přičemž přesná dávka bude stanovena klinikem podle přijatých standardů, přičemž budou v úvahu vzaty podstata a prudkost léčeného stavu, vlastnosti pacienta atd. Určování dávky je v rámci běžné zkušenosti v oboru. Proteiny mohou být podávány pro bezprostřední léčení, v průběhu jednoho týdne nebo méně, často po dobu jednoho nebo tří dnů, nebo mohou být použity při trvalém léčení po dobu několika měsíců nebo roků. Obecně řečeno, terapeuticky účinná dávka polypeptidů rozpustného receptoru zalphall je takové množství, které je postačující pro vyvolání klinicky významného účinku.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je vynesena hydrofilnost lidského proteinu zalphall podle Hoppa a Woodse.

Na obrázku 2 je srovnání lidského proteinu zalphall (zalpha) (SEQ ID NO:2) a myšíhozalphall (muzalp) (SEQ ID NO:85).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Identifikace lidského zalphal 1 pomocí EST sekvence pro získání zalphal 1 o plné délce.

Výsledkem prohledávání databáze překládané DNA byla identifikace exprimované sekvence značkové (EST) sekvence, o které bylo zjištěno, že je členem rodiny cytokinových receptorů třídy I a byla označena jako zalphal 1.

Potvrzení EST sekvence bulo provedeno pomocí sekvenčních analýz cDNA, z nichž EST pocházela. Tento klon cDNA byl získán a sekvenován za pomoci následujících primerů: ZC 447 (SEQ ID NO:5), ZC 976 (SEQ ID NO:6), ZC 19 345 ·< · · · · · · · ·· ♦ ♦ · · · · · · • · · · · ♦ 9 9 • 9 9 9 9 9999 9 9 9 (SEQ ID N0:7), ZC 19 346 (SEQ ID N0:8), ZC 19 349 (SEQ ID N0:9), ZC 19 350 (SEQ ID NO:10), ZC 19 458 (SEQ ID ΝΟ.Ί1), ZC 19 459 (SEQ ID ΝΟ.Ί2), ZC 19 460 (SEQ ID NO:13), ZC 19 461 (SEQ ID NO:14), ZC 19 572 (SEQ ID NO:15), ZC 19 573 (SEQ ID NO:16), ZC 19 657 (SEQ ID NO:17). Inzert byl dlouhý 2945 bází a měl plnou délku.

Příklad 2: Distribuce ve tkáních.

Analýza typu Northern blot byla provedena za použití Human Multiple Tissue Northern Blots™ (MTN I, MTN II a MTN III) (Clontech). cDNA popsaná v příkladu 1 byla použita v PCR reakci za použití oligonukleotidů ZC 19 181 (SEQ ID NO:18) a ZC 19 182 (SEQ ID ΝΟ.Ί9) jako primerů. Podmínky PCR byly následující: 94 °C po dobu 1,5 minuty; 35 cyklů při 94 °C po dobu 15 sekund, potom 68 °C po dobu 30 sekund; 72 °C po dobu 4 minut; 4 °C přes noc. Vzorek produktu PCR reakce byl elektroforézován na 1,5% agarózovém gelu. Byl vidět proužek očekávané velikosti 175 bp. PCR fragment dlouhý 175 bp byl čištěn na gelu za použití komerčně dostupné soupravy (Qiaexll™; Qiagen) a poté označen radioaktivně s ³²P-dCTP za použití Rediprime II™ (Amersham), systému značení pomocí náhodných primerů, podle návodu výrobce. Sonda byla potom čištěna na sloupci Nuc-Trap™ (Stratagene) podle návodu výrobce. Roztok ExpressHyb™ (Clontech) byl použit jak pro prehybridizaci, tak i jako hybridizační roztok pro Northern bloty. Hybridizace se uskutečnila přes noc při teplotě 65 °C za použití 1 až 2x 10⁶ cpm/ml značené sondy. Bloty byly potom 4x promyty po dobu 15 minut v 2x SSC/1% SDS při 25 °C, následovalo promytí v 0,1x SSC/0,1% SDS při 50 °C. Transkripty o přibližné délce 3 kb a 5 kb byly detekovány v lymfatických uzlinách, v leukocytech periferní krve a v brzlíku.

Byly také provedeny dot bloty za použití Human RNA Master Blots™ (Clontech). Metody a podmínky pro dot bloty jsou tytéž, které byly uvedeny výše pro Multiple Tissue Blots. Dot bloty vykazovaly nejvyšší signály v brzlíku, v lymfatických uzlinách a ve slezině.

Byla také provedena analýza typu Northern za použití Human Cancer Cell Line MTN™ (Clontech). cDNA popsaná v příkladu 1 byla použita v PCR reakci za použití oligonukleotidů ZC 19 907 (SEQ ID NO:20) a ZC 19 908 (SEQ ID NO:21) jako primerů. Podmínky PCR byly následující: 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 minuty; potom při 60 °C po dobu 1 minuty; 72 °C po dobu 1,5 minuty; 72 °C po dobu 10 minut; 4 °C přes noc.

9 ··«· · · · · · • ♦ · · · · · · · φ 9 ···· · ·

9 · · ······· ·

Vzorek produktu PCR reakce byl elektroforézován na 1,5% agarózovém gelu. Byl vidět proužek očekávané velikosti 1,2 kb. PCR fragment dlouhý 1,2 kb byl čištěn na gelu za použití komerčně dostupné soupravy (QiaQuickll™Gel Extraction Kit; Qiagen) a poté označen radioaktivně s ³²P-dCTP za použití Prime-lt II™ (Stratagene), systému značení pomocí náhodných primerů, podle návodu výrobce. Sonda byla potom čištěna na sloupci Nuc-Trap™ (Stratagene) podle návodu výrobce. Roztok ExpressHyb™ (Clontech) byl použit jak pro prehybridizaci, tak i jako hybridizační roztok pro Northern bloty. Hybridizace se uskutečnila po dobu 2 hodin při teplotě 65 °C za použití 1 až 2x 10⁶ cpm/ml značené sondy. Bloty byly potom 4x promyty po dobu 15 minut v 2x SSC/1% SDS při 25 °C, následovalo 2x promytí po dobu 30 minut v 0,1x SSC/0,1% SDS při 50 °C. Byl vidět silný signál v buněčné linii Ráji, odvozené z Burkittova lymfomu.

Příklad 3: Chromozomální mapování genu pro zalphall, založené na PCR.

Zalphall byl mapován na chromozom 16 za použití komerčně dostupného GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel (Resarch Genetics, lne., Huntsvillle, AL). GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel obsahuje DNA z každého z 93 radiačních hybridních klonů použitelné v PCR reakci, plus dvě kontrolní DNA (HFL dárce a A23 příjemce). Veřejně přístupný WWW server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/contig/rhmapper.pl) umožňuje mapování ve vztahu k Whitehead Institute/MIT centrem pro genom, Výzkumnou radiační hybridní mapou lidského genomu (WICGR radiační hybridní mapa), která byla konstruována za použití GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel.

Pro mapování zalphal 1 s GeneBridge 4 RH Panel byly sestaveny 20 μΙ reakce v 96jamkových mikrotitračních destičkách (Stratagene, La Jolla, CA) a použity v termocykleru RoboCycIer Gradient 96 (Stratagene). Každá z 95 PCR reakcí se skládala z 2 μΙ 10x PCR reakčního pufru (Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA),

1,6 μί směsi dNTP (každý 2,5 mM, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1 μΙ sense primeru ZC 19 954 (SEQ ID NO:22), 1 μΙ antisense primeru ZC 19 955 (SEQ ID NO:23), 2 μΙ RediLoad (Research Genetics, lne., Huntsville, AL), 0,4 μΙ 50x Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech), 25 ng DNA z jednotlivých hybridních klonů nebo kontroly a ddH₂O do celkového objemu 20 μΙ. Reakce byly překryty stejným objemem minerálního oleje a utěsněny. Podmínky PCR cykleru byly následující: úvodní 1 cyklus 4 minuty • · · · · · · ♦ · • · ···· · · • · · · ······· · denaíurace při 94 °C; 35 cyklů 45 sekund při 94 °C, 45 sekund při 68 °C, a 1 minutu při 72 °C; následovalo 7 minut při 72 °C. Reakce byly rozděleny elektroforézou na 2% agaróze (Life Technologies).

Výsledky ukázaly, že zalphall mapuje 9,54 cR_3000 od markéru WI-3768 na chromozómu 16 WICGR radiační hybridní mapy. Počátečním a koncovým markérem byly WI-3768, respektive TIGR-A002K05. Po použití obklopujících markérů je možno umístit zalphall do oblasti 16p11.1 na integrované LDB mapě chromozómu 16 (Genetická lokalizační databáze, Southamptonská universita, WWW server: http:// cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/).

Příklad 4: Konstrukce chiméry lidský MPL-polypeptid zalphall: extracelulární a TM doména MPL jsou fúzovány s intracelulární signální doménou zalphal 1.

Extracelulární a transmembránová doména MPL receptoru byly izolovány z plazmidu obsahujícího MPL receptor (plazmid PHZ1/MPL) za použití PCR s primery ZC 17 212 (SEQ ID NO:24) a ZC 19 914 (SEQ ID NO:25). Reakční podmínky byly následující: 95 °C po dobu 1 minuty; 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 minuty, 45 °C po dobu 1 minuty, 72 °C po dobu 2 minut; následovalo 72 °C po dobu 10 minut; a potom 10 °C lázeň. Produkt PCR byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a přibližně 1,5 kb dlouhý fragment MPL receptoru byl izolován za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquickll™gel extraction kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

Intracelulární doména zalphall byla izolována z plazmidu obsahujícího cDNA receptoru zalphall za použití PCR s primery ZC 19 913 (SEQ ID NO:26) a ZC 20 097 (SEQ ID NO:27). Polynukleotidová sekvence odpovídající kódující sekvenci receptoru zalphall je uvedena v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 69 do nukleotidu 1682. Reakční podmínky byly stejné, jak byly uvedeny výše. Produkt PCR byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a přibližně 900 bp dlouhý fragment zalphal 1 byl izolován za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick gel extraction kit podle návodu výrobce.

Všechny výše popsané izolované fragmenty byly smíchány v objemových poměrech 1:1 a použity v PCR reakci za použití primerů ZC 17 212 (SEQ ID NO:24) a ZC 20 097 (SEQ ID NO:27), a vytvořena chiméra MPL-zalpha11. Reakční podmínky byly následující: 95 °C po dobu 1 minuty; 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po ···**· ·· · »· * · · · · · « • · · · · ♦ · · • 9 9 9 9 9999 99 9 dobu 1 minuty, 72 °C po dobu 2 minut; následovalo 72 °C po dobu 10 minut; a potom 10 °C lázeň. Veškerý PCR produkt byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a přibližně 2,4 kb dlouhý chimerní fragment MPL-zalpha11 byl izolován za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick gel extraction kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Chimerní fragment MPL-zalpha11 byl štěpen EcoRI (BRL) a Xbal (Boehringer Mannheim) podle návodu výrobců. Veškerý produkt štěpení byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a štěpená chiméra MPL-zalpha11 byla izolována za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick™ gel extraction kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Výsledná štěpená chiméra MPL-zalpha11 byla vložena do expresního vektoru tak, jak je popsáno níže.

Příjemcem byl expresní vektor pZP-5N, který byl štěpen EcoRI (BRL) a Hindlll (BRL) podle návodu výrobce a čištěn na gelu, jak bylo popsáno výše. Tento fragment vektoru byl v ligační reakci spojen s chimérou MPL-zalpha11 štěpenou EcoRI a Xbal a izolovanou, jak je uvedeno výše, a fragmentem linkeru Xbal/Hindlll. Ligace byla provedena za použití T4 ligázy (BRL) při 15 °C přes noc. Vzorek ligační reakce byl vpraven elektroporací do DH10B ElectroMAX™ elektrokompetentních buněk E. coli (25 pF, 200 Ω, 2,3 V). Transformanty byly vysety na plotny s LB a ampicilinem a jednotlivé kolonie testovány pomocí PCR na přítomnost chiméry MPL-zalpha11 za použití primerů ZC 17 212 (SEQ ID NO:24) a ZC 20 097 (SEQ ID NO:27) a podmínek PCR, jak byly popsány výše.

Potvrzení sekvence chiméry MPL-zalpha11 bylo provedeno analýzami sekvence za použití následujících primerů: ZC 12 700 (SEQ ID NO:28), ZC 5020 (SEQ ID NO:29), ZC 6675 (SEQ ID NO:30), ZC 7727 (SEQ ID NO:31), ZC 8290 (SEQ ID NO:32), ZC 19 572 (SEQ ID NO:15), ZC 6622 (SEQ ID NO:33), ZC 7736 (SEQ ID NO:34) a ZC 9273 (SEQ ID NO:35). Inzert byl dlouhý přibližně 2,4 kb a měl plnou délku.

Příklad 5: Proliferace buněk BAF3 vyvolaná chimérou MPL-zalpha11 testovaná za použití modři Alamar.

A. Konstrukce buněk BaF3, exprimujících chiméru MPL-zalpha11.

BaF3, na interleukinu-3 (IL-3) závislá prelymfoidní buněčná linie, odvozená z kostní dřeně myši (Palacios a Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot a kol., ····«· ·· · ·♦ • · · · · · · • 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9999 9 9 9

Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986) byla udržována v kompletním médiu (médium RPMI (JRH Bioscience lne., Lenexa, KS) doplněné 10 % tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra, 2 ng/ml myší IL-3 (mlL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2 mM L-glutaMax1™ (Gibco BRL), 1 mM pyrohroznan sodný (Gibco BRL) a PSN antibiotika (Gibco BRL)). Před elektroporací byla DNA pZP-5N/MPL-zalpha11 (příklad 4) připravena a čištěna za použití Qiagen Maxi Prep Kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Buňky pro elektroporací byly jednou promyty v médiu RPMI a potom resuspendovány v médiu RPMI na koncentraci 10⁷ buněk/ml. Jeden mililitr resuspendovaných buněk BaF3 byl smíchán s 30 μΙ DNA plazmidu pZP-5N/MPL-zalpha11 a přenesena do oddělených elektroporačních komůrek na jedno použití (Gibco BRL). Po inkubaci po dobu 15 minut při teplotě místnosti, byly buňkám aplikovány dva následné šoky (800 IKad/300 V; 1180 IFad/300 V) podané přístrojem Cell-Porator™; Gibco BRL). Po 5 minutách klidu byly elektroporované buňky přeneseny do 50 ml kompletního média a umístěny v inkubátoru po dobu 15 až 24 hodin (37 °C, 5% CO₂). Buňky byly potom odcentrifugovány a resuspendovány v 50 ml kompletního média, obsahujícího jako selekční činidlo Geniticin™ (Gibco) (500 pg/ml G418) v lahvích T-162, aby se selektovaly buňky rezistentní ke G418. Rezistentní transfekované buňky, dále zde nazývané buňky BaF3/MPL-zalpha11, byly testovány na signální schopnost, jak je popsáno níže.

B. Testování signální schopnosti buněk BaF3/MPL-zalpha11 za použití proliferačního testu s modří Alamar.

Buňky BaF3/MPL-zalpha11 byly odcentrifugovány a promyty v kompletním médiu, jak bylo popsáno výše, ale bez mlL-3 (je zde dále označováno jako médium bez mlL-3). Buňky byly odcentrifugovány a 3x promyty, aby se zajistilo odstranění mlL-

3. Poté byly buňky spočteny hematocytometrem. Buňky byly vysety do 96jamkové destičky v koncentraci 5000 buněk na jamku v objemu 100 μΙ na jamku za použití média bez mlL-3.

Množení buněk BaF3/MPL-zalpha11 bylo hodnoceno za použití trombopoetinu (TPO) ředěného v médiu bez mlL-3 na koncentrace 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7,5 ng/ml, 3,75 ng/ml, 1,8 ng/ml, 0,9 ng/ml, 0,5 ng/ml a 0,25 ng/ml. 100 μΙ ředěného TPO bylo přidáno k buňkám BaF3/MPL-zalpha11. Celkový objem v testu byl 200 μΙ. Negativní kontroly byly testovány souběžně při použití pouze média bez mlL-3, tj. bez přidání TPO. Testované plotny byly inkubovány při 37 °C a 5 % CO₂ po dobu tří dní, a potom byla přidána modř Alamar (Accumed, Chicago, IL) v • ♦ · · ·· ·*· • · ···· · · • ··· ··*···· · množství 20 μΙ/jamku. Fluorímetrický odečet modři Alamar závisí na počtu živých buněk a je tak přímým měřením množení buněk ve srovnání s negativní kontrolou. Plotny byly znovu inkubovány při 37 °C, 5 % CO₂ po dobu 24 hodin. Potom byly plotny odečítány na odečítacím zařízení pro plotny Fmax™ plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) za použití programu SoftMax™ Pro, při vlnových délkách 544 (excitace) a 590 (emise).

Výsledky potvrdily signální schopnost intracelulární části receptoru zalphall, protože trombopoetin indukoval přibližně 10násobné množení buněk oproti pozadí při koncentraci 62 ng/ml nebo více.

Příklad 6: Konstrukce expresního vektoru, exprimujícího plnou délku zalphall.

Úplný receptor zalphall byl izolován z plazmidu obsahujícího cDNA receptoru zalphall za použití PCR reakce s primery ZC 19 905 (SEQ ID NO:36) a ZC 19 906 (SEQ ID NO:37). Reakční podmínky byly následující: 95 °C po dobu 1 minuty; 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty, 72 °C po dobu 2 minut; následovalo 72 °C po dobu 10 minut; a potom 10 °C lázeň. PCR produkt byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a přibližně 1,5 kb dlouhý fragment cDNA zalphall byl izolován za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick™ gel extraction kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

Čištěná cDNA zalphall byla štěpena BamHI (Boehringer Mannheim) a EcoRI (BRL) podle návodu výrobců. Veškerý produkt štěpení byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a vyčištěn štěpený fragment za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick gel extraction kit podle návodu výrobce. Výsledná štěpená chiméra zalphall byla vložena do expresního vektoru tak, jak je popsáno níže.

Příjemcem byl expresní vektor pZP-5N, který byl štěpen BamHI (Boehringer Mannheim) a EtfoRI (BRL) podle návodu výrobce a čištěn na gelu, jak bylo popsáno výše. Tento fragment vektoru byl v ligační reakci spojen s fragmentem zalphall štěpeným BamHI a EcoRI a izolovaným, jak je uvedeno výše. Ligace byla provedena za použití T4 ligázy (BRL) při 15 °C přes noc. Vzorek ligační reakce byl vpraven elektroporaci do DH10B electroMAX™ elektrokompetentních buněk E. coli (25 pF, 200 Ω, 2,3 V). Transformanty byly vysety na plotny s LB a ampicilinem a jednotlivé kolonie

«· ····

9 ·

• 6 9

9 9 9 9 9999

9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 ·

99

9 99

99

99999 testovány pomocí PCR na přítomnost sekvence zalphall za použití primerů ZC 19 905 (SEQ ID NO:36) a ZC 19 906 (SEQ ID NO:37) a podmínek PCR, jak byly popsány výše.

Potvrzení sekvence MPL-zalpha11 bylo provedeno analýzami sekvence za použití následujících primerů: ZC 12 700 (SEQ ID NO:28), ZC 5020 (SEQ ID NO:29), ZC 20 114 (SEQ ID NO:38), ZC 19 459 (SEQ ID ΝΟ.Ί2), ZC 19 954 (SEQ ID NO:39) a ZC 20 116 (SEQ ID NO:40). Inzert byl dlouhý přibližně 1,6 kb a měl plnou délku.

Příklad 7: Proliferace buněk BAF3 vyvolaná zalphall testovaná za použití modři Alamar.

A. Konstrukce buněk BaF3, exprimujících receptor zalphal 1.

Buňky BaF3 exprimující receptor zalphall v plné délce, byly konstruovány jako v příkladu 5A výše, za použití 30 gg expresního vektoru zalphall, popsaného výše v příkladu 6. Buňky BaF3 exprimující mRNA receptorů zalphall byly označeny jako BaF3/zalpha11. Tyto buňky byly použity pro hledání aktivity zalphall, jak je popsáno dále v příkladech 8 a 12.

Příklad 8: Hledání aktivity zalphall pomocí buněk BaF3/zalpha11 a proliferačního testu s modří Alamar.

A. Primární opičí zdroj použitý pro testování přítomnosti aktivity zalphall.

Média upravená pomocí primárních opičích slezinných buněk byla použita pro testování přítomnosti aktivity, jak je popsáno dále. Opičí slezinné buňky byly aktivovány 5 ng/ml forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA), a 0,5 gg/ml lonomycinu™ (Calbiochem) po dobu 72 hodin. Supernarant ze stimulovaných opičích slezinných buněk byl použit pro testování množení buněk BaF3/zalpha11, jak je popsáno dále.

B. Hledání aktivity zalphall pomocí buněk BaF3/zalpha11 a proliferačního testu s modří Alamar.

Buňky BaF3/zalpha11 byly odcentrifugovány a promyty v médiu bez mlL-3.

Buňky byly odcentrifugovány a 3x promyty, aby se zajistilo odstranění mlL-3. Poté byly buňky spočteny hematocytometrem. Buňky byly vysety do 96jamkové destičky v koncentraci 5000 buněk na jamku v objemu 100 gl na jamku za použití média bez mlL3.

·· ···· • ·

Množení buněk BaF3/zalpha11 bylo hodnoceno za použití média upraveného aktivovanými opičími slezinnými buňkami (viz výše příklad 8A), které bylo ředěno médiem bez mlL-3 na 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375% koncentraci. 100 μΙ ředěného upraveného média bylo přidáno k buňkám BaF3/ zalphall. Celkový objem v testu byl 200 μΙ. Testované plotny byly inkubovány při 37 °C a 5 % CO₂ po dobu tří dní, a potom byla přidána modř Alamar (Accumed, Chicago, IL) v množství 20 μΙ/jamku. Plotny byly znovu inkubovány při 37 °C, 5 % CO₂ po dobu 24 hodin. Potom byly plotny odečítány na odečítacím zařízení pro plotny Fmax™ plate reader (Molecular Devices), jak bylo popsáno výše (příklad 5).

Výsledky potvrdily proliferační odpověď buněk BaF3/zalpha11 na faktor přítomný v médiu upraveném aktivovanými opičími slezinnými buňkami. Odpověď byla, jak bylo naměřeno, přibližně čtyřnásobná vzhledem k pozadí při 50% koncentraci. Standardní typ buněk BaF3 neodpovídá množením na tento faktor, což ukazuje, že tento faktor je specifický pro receptor zalphal 1.

C. Primární lidský zdroj použitý pro izolaci aktivity zalphal 1.

Od každého ze šesti dárců bylo odebráno 100 ml krve. Krev byla odebrána za použití deseti 10 ml vakuových zkumavek, obsahujících heparin. Krev byla od šesti dárců spojena (600 ml), zředěna 1:1 v PBS a rozdělena pomocí Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Po separaci na gradientu Ficollu bylo získáno jako výtěžek 1,2x 10⁹ izolovaných primárních lidských buněk.

Buňky byly suspendovány v 9,6 ml pufru MACS (PBS, 0,5% EDTA, 2 mM EDTA). Bylo odebráno 1,6 ml buněčné suspenze a přidáno 0,4 ml CD4 mikrozrnek (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Směs byla inkubována po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. Tyto buňky označené zrnky CD4 byly promyty 30 ml MACS pufru a potom resuspendovány v 2 ml pufru MACS.

Podle návodu výrobce byl připraven sloupec VS+ (Miltenyi). Poté byl sloupec VS+ umístěn do VarioMACS™ magnetického pole (Miltenyi). Sloupec byl ekvilibrován 5 ml pufru MACS. Izolované primární lidské buňky byly naneseny na sloupec CD3 negativní buňky byly ponechány projít sloupcem. Sloupec byl promyt 9 ml (3 x 3 ml) pufru MACS. Potom byl sloupec odstraněn z magnetu a umístěn nad 15 ml zkumavku falcon. Buňky CD3+ byly vymyty přidáním 5 ml pufru MACS na sloupec a vázané buňky byly vymyty za pomoci pístu, dodávaného výrobcem. Všechny výše uvedené kroky, jako je inkubace buněk s CD3 magnetickými zrnky, promývání a sloupec VS+ (od • ·

99 9 • · · ··· ···· ·· · · · · · * · • · · · ······· · · ········· /y ···· ·· 99 9 99 999 inkubace až po eluci) byly opakovány pětkrát Výsledné frakce CD3+ ze šesti separací na sloupci byly spojeny. Výtěžek lidských, CD3+ selektovaných T-buněk, byl celkem 3x 10⁸ buněk.

Z těchto spojených, CD3+ selektovaných lidských T-buněk, byl odebrán vzorek pro barvení a třídění na přístroji, který třídí buňky obarvené fluorescenčními protilátkami (FACS), aby byla zhodnocena jejich čistota. CD3+ selektované lidské Tbuňky byly z 91 % CD3+ buňky.

CD3+ selektované lidské T-buňky byly aktivované inkubací v RPMI+ 5% FBS+PMA 10 ng/ml a lonomycin 0,5 gg/ml (Calbiochem) po dobu 13 hodin při teplotě 37 °C. Supernatant z těchto aktivovaných CD3+ selektovaných lidských T-buněk byl testován na aktivitu zalphall, jak je popsáno dále.

D. Testování supernatantu z aktivovaných CD3+ selektovaných lidských T-buněk na aktivitu zalphall pomocí buněk BaF3/zalpha11 a prolíferačního testu s modří Alamar.

Buňky BaF3/zalpha11 byly odcentrifugovány a promyty v médiu bez mlL-3. Buňky byly odcentrifugovány a 3x promyty, aby se zajistilo odstranění mlL-3. Poté byly buňky spočteny hematocytometrem. Buňky byly vysety do 96jamkové destičky v koncentraci 5000 buněk na jamku v objemu 100 μΙ na jamku za použití média bez mlL-

3.

Množení buněk BaF3/zalpha11 bylo hodnoceno za použití média upraveného aktivovanými CD3+ selektovanými lidskými T-buňkami (viz výše příklad 8C), které bylo ředěno médiem bez mlL-3 na 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375% koncentraci. 100 μΙ ředěného upraveného média bylo přidáno k buňkám BaF3/ zalphall. Celkový objem v testu byl 200 μΙ. Testované plotny byly inkubovány a testovány tak, jak bylo popsáno výše v příkladu 8B.

Výsledky potvrdily proliferační odpověď buněk BaF3/zalpha11 na faktor přítomný v médiu upraveném aktivovanými CD3+ selektovanými lidskými T-buňkami. Odpověď byla, jak bylo naměřeno, přibližně desetinásobná vzhledem k pozadí při 50% koncentraci. Standardní typ buněk BaF3 neodpovídá množením na tento faktor, což ukazuje, že tento faktor je specifický pro receptor zalphal 1.

Příklad 9: Konstrukce savčích expresních vektorů, které exprimují rozpustné receptory: zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG, zalphal 1CHIS a zalph11-Fc4.

• ·· · • · · · · · · · · · ♦ · · · · · ··· • · · é ······· · · _Qn ·»···· © · · OU · ® · · ·· · · · © · · · ·

A. Konstrukce zalphall savčího expresního vektoru, který obsahuje zalph11CEE, zalph11CFLG a zalph11CHIS.

Byl připraven expresní vektor pro expresi rozpustné intracelulární domény polypeptidu zalphall, pC4zalph11CEE, přičemž konstrukt byl navržen pro exprimování polypeptidu zalphall, obsahujícího předpověděný počáteční metionin a ukončený v sousedství předpověděné transmembránové domény a obsahující na C-konci značku Glu-Glu (SEQ IDNO:41).

700 bp dlouhý fragment DNA zalphall byl vytvořen pomocí PCR reakce za použití primerů ZC 19 931 (SEQ ID NO:42) a ZC 19 932 (SEQ ID NO:43), pomocí nichž byla přidána restríkční místa pro Asp718 a BamHl. Jako matrice byl použit plazmid obsahující cDNA receptorů zalphall. PCR amplifikace fragmentu zalphall byla provedena následovně: 25 cyklů při 94 °C po dobu 0,5 minuty; 5 cyklů při 94 °C po dobu 10 sekund, 50 °C po dobu 30 sekund, 68 °C po dobu 45 sekund, následováno držením reakce při teplotě 4 °C. Reakce byla čištěna extrakcí směsí chloroform/fenol, izopropanolovou precipitací a následně štěpena Asp718 a BamHl (Gibco BRL) podle návodu výrobce. Po elektroforéze v 1% agarózovém gelu byl viditelný fragment předpověděné velikosti 700 bp, ten byl vyříznut a DNA byla čištěna za použití purifikačního systému Qiaexll™ (Qiagen), podle návodu výrobce.

Vyštěpená DNA byla klonována do plazmidu pC4EE, který byl rozštěpen BamHl a Asp718. Expresní vektor pC4zalph11 využívá přirozený signální peptid a připojuje značku Glu-Glu (SEQ ID NO:41) na C-konec polynukleotidové sekvence kódující zalphall polypeptid. Plazmid pC4EE je savčí expresní vektor, obsahující expresní kazetu, ve které je obsažen promotor myšího metallothioneinu-1, mnohočetná restrikční místa pro vložení kódujících sekvencí, stop kodon a terminátor lidského růstového hormonu. Plazmid také má počátek replikace z E. coli, expresní jednotku savčího selektovatelného markéru, obsahující promotor SV40, zesilovač transkripce a počátek replikace, gen pro DHFR a SV40 terminátor.

Asi 30 ng restrikčními enzymy vyštěpeného inzertu zalphall a asi 12 ng rozštěpeného vektoru bylo přes noc ligováno při 16 °C. Jeden mikrolitr každé ligační reakce byl nezávisle elektroporován do kompetentních buněk DH10B (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) podle návodu výrobce a vyset na plotny s LB, obsahující 50 mg/ml ampicilinu, a inkubován přes noc. Kolonie byly prohledávány restrikční analýzou DNA, připravené ze 2 ml tekuté kultury z jednotlivých kolonií. Vložená sekvence pozitivních

9

9 klonů byla ověřována sekvenční analýzou. Příprava plazmidu ve velkém měřítku byla provedena za použití soupravy QIAGEN® Maxi prep kit (Qiagen), podle návodu výrobce.

Tentýž postup byl použit pro přípravu rozpustných receptorů zalphall, které měly na C-konci umístěnou značku his, složenou z řady šesti zbytků His; a C-koncové označení (SEQ ID NO:49) značkou, zalphal 1CFLAG. Při konstruování těchto konstruktů měl výše uvedený vektor buď HIS nebo značku FLAG® na místě značky glu-glu (SEQ ID NO:41).

B. Konstrukce zalphal 1-Fc4, rozpustného receptoru zalphal 1, exprimovaného v savci.

Expresní plazmid obsahující celý nebo část polynukleotidu, kódujícího zalphall, byl konstruován pomocí homologické rekombinace. Fragment zalphall cDNA byl izolován pomocí PCR, která zahrnuje polynukleotidovou sekvenci z extracelulární domény receptoru zalphall. Dva primery použité při produkci fragmentu zalphall byly: (1) Každý primer pro PCR obsahoval od 5' konce ke 3' konci: 40 bp sekvence, která sousedí ve vektoru (ve směru 5' od inzertu) a 17 bp odpovídajících 5' konci extracelulární domény zalphall (SEQ ID NO:44); a (2) 40 bp z 5' konce polynukleotidové sekvence Fc4 (SEQ ID NO:45) a 17 bp odpovídajících 3' konci extracelulární domény zalphal 1 (SEQ ID NO:46). Fragment Fc4 pro fúzi s zalphal 1 byl připraven pomocí PCR podobným způsobem. Dva primery použité při produkci fragmentu Fc4 byly: (1) 5' primer obsahoval 40 bp sekvence ze 3' konce extracelulární domény zalphall a 17 bp z 5' konce Fc4 (SEQ ID NO:47); a (2) 3' primer obsahoval 40 bp sekvence vektoru (3' od inzertu) a 17 bp ze 3' konce Fc4 (SEQ ID NO:48).

PCR amplifikace každé z výše popsaných reakcí byla provedena následovně: jeden cyklus při 94 °C po dobu 2 minut; 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 30 sekund; 72 °C po dobu 1 minuty; jeden cyklus při 72 °C po dobu 5 minut; následovalo držení při 4 °C. Deset mikrolitrů ze 100 μΙ PCR reakce bylo analyzováno elektroforézou na 0,8% LMP agarózovém gelu (Seaplaque GTG) v 1x TBE pufru. Zbývajících 90 μΙ PCR reakce bylo vysráženo přidáním 5 μΙ 1 M NaCI a 250 μΙ absolutního ethanolu. Použitý expresní vektor byl odvozen z plazmidu pCZR199 (uložen v Americké typové sbírce kultur, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 a označen č. 98668), a byl rozštěpen Smál (BRL). Expresní vektor byl odvozen z plazmidu pCZR199 a jedná se o savčí expresní vektor, obsahující expresní kazetu, která má bezprostředně časný promotor CMV, konsenzuální intron z variabilní

9 · · · · 9 · 9 9 9 • 9 · 9 9 «9

9 9999 99

99« 9999999 9 oblasti fokusu těžkého řetězce myšího imunoglobulinu, mnohočetná restrikční místa pro vložení kódujících sekvencí, stop kodon a terminátor lidského růstového hormonu. Expresní vektor také má počátek replikace z E. coli, expresní jednotku savčího selektovatelného markéru, obsahující promotor SV40, zesilovač transkripce a počátek replikace, gen pro DHFR a SV40 terminátor. Použitý expresní vektor byl konstruován z pCZR199 záměnou metallothioneinového promotoru za bezprostředně časný promotor CMV.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasničných buněk (S. cerevisiae) bylo spojeno s 10 μΙ, obsahujícími přibližně 1 pg obou inzertů zalphall a Fc4 a 100 ng expresního vektoru štěpeného Smál (BRL), a přeneseno do 0,2 cm elektroporační kyvety. Směsi kvasinky/DNA byly elektroporovány při 0,75 kV (5 kV/cm), nekonečně ohmů, 25 μΡ. Do každé kyvety je přidáno 600 μΙ 1,2 M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou alikvotech na dvě plotny s URA-D a inkubovány při 30 °C.

Po 48 hodinách byly resuspendovány kvasinkové transformanty Ura+ z jedné plotny v 1 ml H₂O a krátce zcentrifugovány, aby buňky kvasinek sedimentovaly. Buněčný sediment byl resuspendován v 1 ml lyzovacího pufru (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8,0 1 mM EDTA). Pět set mikrolitrů lyzovací směsi bylo přidáno do zkumavky typu eppendorf, obsahující 300 μί skleněných zrnek promytých kyselinou a 200 μΙ směsi fenol-chloroform, vortexováno 2 až 3x po dobu 1 minuty, poté následovala centrifugace 5 minut při maximální rychlosti v centrifuze Eppendorf. Tři sta mikrolitrů vodné fáze bylo přeneseno do nové zkumavky a DNA byla sražena 600 μΙ ethanolu (EtOH), poté následovala centrifugace 10 minut při 4 °C. Sediment DNA byl resuspendován v 100 μΙ H₂O.

Transformace elektrokompetentních buněk E. coli (DH10B, GibcoBRL) je provedena s 0,5 až 2,0 ml preparátu kvasničné DNA a 40 μΙ buněk DH10B. Na buňky bylo působeno elektrickými impulzy při 2,0 kV, 25 mF a 400 ohmů. Po elektroporaci byl 1 ml SOC (2% Bactoě Tryptone (Difco, Detroit, Ml), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), 10 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glukóza) vyset v 250 μΙ alikvotech na 4 plotny s LB AMP (LB bujón (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ampicilin).

Jednotlivé klony obsahující správný expresní konstrukt pro zalpha11-Fc4 byly určeny pomocí restrikční analýzy, aby byla ověřena přítomnost inzertu zalpha11-Fc4 a potvrzeno, že různé sekvence DNA byly vzájemně správně spojeny. Inzert pozitivních

4 • 444

4

4 444 44 4

4 «444 4*4 • · * · 44444·· ·· *44 44· I ·4 • 444·· 44 φ 44··· klonů byl podroben sekvenční analýze. Velká množství plazmidové DNA je izolováno za použití Qiagen Maxi kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

Příklad 10: Transfekce a exprese polypeptidů rozpustného receptoru zalphal 1.

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314), pasáž 27, byly vysety v koncentraci 1,2x 10⁶ buněk/jamku (6jamková plotna) v 800 μΙ média DMEM bez séra (SF) (DMEM, Gibco/BRL s vysokým obsahem glukózy) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Buňky byly transfekovány expresními plazmidy, obsahujícími zalphal 1CEE/CFLG/CHIS, které byly popsané výše (viz příklad 9), za použití Lipofectin™ (Gibco BRL), v médiu DMEM bez séra (SF). Tři mikrogramy každého zalphal 1CEE/CFLG/CHIS byly jednotlivě naředěny v 1,5 ml zkumavkách do celkového konečného objemu 100 μΙ SF DMEM. V oddělených zkumavkách bylo smícháno 15 μΙ Lipofectin™ (Gibco BRL) se 100 μΙ SF DMEM. Směs Lipofectin™ byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 30 až 45 minut, potom byla přidána směs DNA a ponecháno inkubovat přibližně 10 až 15 minut při teplotě místnosti.

Celá směs DNA/Lipofectin™ byla přidána na vyseté buňky a rovnoměrně na nich rozprostřena. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu přibližně 5 hodin, poté byly přeneseny na oddělené 150 mm MAXI plotny v konečném objemu 30 ml DMEM/5% fetální hovězí sérum (FBS) (Hyclone, Logan, UT). Plotny byly inkubovány při 37 °C, 5% CO₂, přes noc a směs DNA/Lipofectin™ byla příští den nahrazena selekčním médiem (5% FBS/DMEM s 1 μΜ methotrexátem (MTX)).

Deset až 12 dní po transfekci byly plotny promyty 10 ml SF DMEM. Promývací médium bylo odsáto a nahrazeno 7,25 ml DMEM bez séra. Sterilní teflonové síťky (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA), předem nasáté v SF DMEM, pak byly položeny na kolonie buněčných klonů. Sterilní nitrocelulózový filtr, předem nasátý v SF DMEM, pak byl položen na síťku. Orientační značky na nitrocelulóze byly přeneseny na kultivační misku. Plotny byly potom inkubovány po dobu 5 až 6 hodin v inkubátoru při 37 °C a 5% CO₂.

Po inkubaci byly filtry se síťkami odstraněny, média odsáta a nahrazena 5% FBS/DMEM s 1 μΜ MTX. Filtry byly potom blokovány v 10% sušeném mléku bez tuku/Western A pufru (Western A: 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCI a 0,25% gelatin) po dobu 15 minut při teplotě místnosti na rotující třepačce. Filtry byly potom inkubovány s anti-Glu-Glu, anti-FLAG® respektive anti-HIS • · • · 9 *

protilátkami konjugovanými s HRP, v 2,5% sušeném mléku bez tuku/Western A pufru po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti na rotující třepačce. Filtry byly potom 3x promyty při teplotě místnosti Western A pufrem, každé promytí po dobu 5 až 10 minut. Filtry byly vyvolány pomocí reagencie ultra ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) podle návodu výrobce a zviditelněny pomocí přístroje Lumi-lmager (Roche Corp.)

Pozitivně exprimující kolonie klonů byly mechanicky vybrány a naočkovány do 12jamkových ploten v 1 ml 5% FCS/DMEM a 5 μΜ NTX, a potom pěstovány do souvislého nárůstu. Vzorky upraveného média byly pak testovány na expresní úrovně pomocí SDS-PAGE a Western analýzy. Pro každý druh konstruktu byly vybrány tři nejvíce exprimující klony; dva z těchto tří byly zmraženy jako zásobní a jeden byl nepěstován pro testování na mykoplazmu a pro velkoobjemové tovární pěstování.

B. Exprese rozpustného receptoru zalphal 1 zalphal 1-Fc4 v savci.

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) byly vysety na 10 cm kultivační tkáňové misky a ponechány narůst asi do 50 až 70% souvislého nárůstu přes noc při 37 °C, 5% CO₂, médiu DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL s vysokým obsahem glukózy, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% fetální hovězí sérum (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 1 mM Lglutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pyrohroznan sodný (Gibco BRL)). Buňky byly potom transfekovány plazmidem obsahujícím zalphal 1-Fc4 (viz příklad 9), za použití Lipofectamine™ (Gibco BRL), v médiu bez séra (SF) o složení (DMEM, 10 mg/ml transferin, 5 mg/ml inzulín, 2 mg/ml fetuin, 1% L-glutamin a 1% pyrohroznan sodný). Plazmid obsahující zalphal 1-Fc4 byl naředěn v 15 ml zkumavkách do celkového konečného objemu 640 ml SF médiem. 35 ml Lipofectamine™ (Gibco BRL) bylo smícháno s 605 ml SF média. Směs Lipofectamine™ byla přidána ke směsi DNA a ponechány inkubovat po dobu přibližně 30 minut při teplotě místnosti. Pět mililitrů SF média bylo přidáno ke směsi DNA:Lipofectamine™. Buňky byly jednou opláchnuty 5 ml SF média, to bylo odsáto a poté byla přidána směs DNA:Lipofectamine™. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 5 hodin, potom bylo ke každé plotně přidáno 6,4 ml média DMEM/10%FBS, 1% PSN. Plotny byly inkubovány při 37 °C přes noc a směs DNA:Lipofectamine™ byla příští den nahrazena čerstvým 5% FBS/DMEM médiem. Dva dny po transfekci byly buňky rozděleny do selekčního média (DMEM/FBS médium uvedené výše s přidaným 1 mM methotrexátem (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo)) v 150 mm plotnách 1:10, 1:20 a 1:50. Médium na buňkách bylo nahrazeno čerstvým selekčním médiem 5 dní po transfekci. Přibližně 10 dní po transfekci byly z každé • · • ·· · • · φ

transformace trypsinizovány dvě 150 mm kultivační misky kolonií rezistentních k methotrexátu a buňky byly spojeny do lahví T-162 a převedeny na kultury pěstované ve velkém měřítku.

Příklad 11: Purifikace rozpustných receptorů zalphal 1 z buněk BHK 570

A. Purifikace polypeptidu zalphal 1CEE z BHK 570

Pokud není řečeno jinak, všechny operace byly provedeny při teplotě 4 °C. Následující postup byl použit pro čištění polypeptidu zalphall, obsahujícího na C-konci značky GluGlu (EE). Třicet litrů buňkami upraveného média bylo koncentrováno do objemu 1,6 litru pomocí spirální vložky Amicon S10Y3 na ProFlux A30. K tomuto 1,6 litru koncentrovaného upraveného média z transfekovaných buněk BHK 570 byl přidán roztok proteázového inhibitoru (viz příklad 10) do konečných koncentrací: 2,5 mM kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,003 mM leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 0,4 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Byly odebrány vzorky pro analýzu a hlavní část objemu byla zmražena na -80 °C, dokud nebyla zahájena purifikace. Celkové koncentrace cílového proteinu v koncentrovaném, buňkami upraveném médiu, byla určena pomocí SDSPAGE a pomocí Western blot analýzy s anti-EE protilátkou, konjugovanou s HRP.

Sloupec 100 ml anti-EE G-Sepharosy (připravena, jak bude popsáno níže) byl nalit do skleněného sloupce Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. Sloupec byl ekvilibrován na BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) pH 7,4. Koncentrované, buňkami upravené médium, bylo rozmraženo, sterilizováno filtrací přes 0,2 pm filtr, bylo u něho upraveno pH na 7,4 a potom bylo nanášeno na sloupec přes noc průtokovou rychlostí 1 ml/minutu. Sloupec byl promyt 10 objemy sloupce (CV) fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS pH 7,4), potom byla část eluována 200 ml PBS (pH 6,0), obsahujícím 0,5 mg/ml peptidu EE (Anaspec, San Jose, CA), rychlostí 5 ml/minutu. Použitý EE peptid měl sekvenci EYMPME (SEQ ID NO:41). Sloupec byl promyt 10 CV PBS, potom eluován 5 CV 0,2 M glycinu, pH 3,0. pH glycinem promytého sloupce bylo upraveno na 7,0 dvěma CV 5x PBS, potom byl sloupec ekvilibrován v PBS (pH 7,4). V průběhu celého postupu byly odebírány 5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 215 nm, všechny objemy při nanášení i promývání byly uchovány a analyzovány. Frakce, ve kterých byl «· · 4 4 « • · · · · 4 4 · « · ♦ · «··· 4 f · • 4 4 · 4444444 A 4 ···· ·· *··* · *··* **· maximálně eluován EE-polypeptid, byly analyzovány na cílový protein pomocí SDSPAGE a pomocí Western blot analýzy s anti-EE protilátkou, konjugovanou s HRP. Frakce s eluovaným polypeptidem, o který se jedná, byly spojeny a koncentrovány z objemu 60 ml do 5,0 ml za použití spirálního koncentrátoru s membránou zachycující molekuly s molekulovou hmotností vyšší než 10 000 daltonů (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

Aby byl zalphal 1CEE oddělen od ostatních proteinů, které se dělily společně s ním, byly spojené koncentrované frakce eluovaných polypeptidů aplikovány na POROS HQ-50 (pryskyřice, ochotně vyměňující anionty - iontoměnič typu anex - od PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) při pH 8,0. Byl nalit sloupec 1,0 x 6,0 cm a promyt na BioCad Sprint Sloupec byl nabit opačným nábojem a pak ekvilibrován v 20 mM TRIS pH 8,0 (Tris(hydroxymethylaminomethan)). Vzorek byl zředěn 1:13 (aby byla snížena iontová síla PBS) a nanesen na sloupec Poros HQ rychlostí 5 ml/minutu. Sloupec byl promyt 10 CV 20 mM TRIS pH 8,0 a potom eluován 40 CV gradientem 20 mM TRIS/1 M chlorid sodný (NaCl) rychlostí 10 ml/minutu. V průběhu celého postupu byly odebírány 1,5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 215 nm. Frakce, ve kterých docházelo k maximální eluci proteinů, byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Frakce, které byly zajímavé, byly spojeny a koncentrovány do objemu

1,5 až 2,0 ml za použití spirálního koncentrátoru s membránou zachycující molekuly s molekulovou hmotností vyšší než 10 000 daltonů (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

Aby byl polypeptid zalphal 1CEE oddělen od volného EE peptidů a jakýchkoli kontaminujících doprovodných proteinů, byly spojené koncentrované frakce podrobeny chromatografii na sloupci 1,5 x 90 cm Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ), navrstveném a ekvilibrovaném v PBS při rychlosti průtoku 1 ml/minutu za použití BioCad Sprint. V průběhu celého postupu byly odebírány 1,5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 215 nm. Frakce, ve kterých docházelo k maximální eluci proteinů, byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem a byly spojeny pouze nejčistší frakce. Tento materiál představoval purifikovaný polypeptid zalphal 1CEE.

Tento purifikovaný materiál byl na závěr aplikován na 4 ml sloupec ActiClean Etox (Sterogene), aby došlo k odstranění jakýchkoli zbývajících endotoxinú. Vzorek byl 4x nanesen na sloupec ekvilibrovaný v PBS a potom byl sloupec jednou promyt 3 ml • Φ Φ Φ Φ φ ·· · ·· • φ φ « « φ φ · φ φ φ φφφφ φ φ

Φ φφφ I φ «« »» 9 φ

PBS, který byl spojen s vyčištěným vzorkem. Materiál byl sterilizován filtrací přes filtr 0,2 pm a uložen při -80 °C, dokud nebyl rozdělen na alikvoty.

Na Western blotech a SDS-PAGE barvené Coomassie Blue nebo stříbrem tvořil polypeptid zalphal 1CEE jednu hlavní zónu se zřejmou molekulovou hmotností 50 000 daltonů. Pohyblivost této zóny byla stejná na redukujících i na neredukujících gelech.

Proteinová koncentrace purifikovaného materiálu byla provedena pomocí BOA analýzy (Pierce, Rockford, IL) a protein byl rozdělen na alikvoty a uložen při -80 °C podle našich standardních postupů. Na IEF (izoelektrická fokusace) gelech se protein pohybuje s Pl méně než 4,5. Koncentrace polypeptidů zalphal 1CEE byla 1,0 mg/ml.

Purifikovaný polypeptid zalphal 1CEE byl připraven pro injekční podávání králíkům a poslán do R & R Research and Development (Stanford, WA) na přípravu protilátek. Králíci byli očkováni pro přípravu anti-huzalpha11-CEE-BHK séra (příklad 15, uvedený dále).

Pro přípravu anti-EE Sepharosy bylo 100 ml Sepharosy s proteinem G (Pharmacia, Piscataway, NJ) promyto 3x 100 ml PBS, obsahujícího 0,02% azid sodný za použití filtrační jednotky 500 ml Nalgene 0,45 pm. Gel byl promyt 6 objemy 200 mM triethanolaminu, pH 8,2 (TEA Sigma, St. Louis, MO) a byl přidán stejný objem roztoku EE protilátek, který obsahoval 900 mg protilátek. Po inkubaci při 4 °C přes noc, byly nenavázané protilátky odstraněny promytím pryskyřice 5 objemy 200 mM TEA, jak je popsáno výše. Pryskyřice byla resuspendována ve 2 objemech TEA, přenesena do vhodného zásobníku a byl přidán dimethylpimilimidát-2HCI (Pierce, Rockford, IL), rozpuštěný v TEA, do konečné koncentrace 36 mg/ml gelu Sepharosy s proteinem G. Gelem bylo kýváno při teplotě místnosti po dobu 45 minut a tekutina byla odstraněna za použití filtrační jednotky, jak bylo popsáno výše. Nespecifická místa na gelu byla potom blokována inkubací po dobu 10 minut při teplotě místnosti s 5 objemy 20 mM ethanolaminu v 200 mM TEA. Gel byl potom promyt 5 objemy PBS, obsahujícího 0,02% azid sodný a uložen v tomto roztoku při 4 °C.

B. Purifikace polypeptidů zalphal 1CFLAG z BHK 570

Pokud není řečeno jinak, všechny operace byly provedeny při teplotě 4 °C. Následující postup byl použit pro čištění polypeptidů zalphal 1, obsahujícího na C-konci značky FLAG® (FLG) (Sigma Aldrich Co.). Třicet litrů buňkami upraveného média bylo koncentrováno do objemu 1,7 litru pomocí spirální vložky Amicon S10Y3 na ProFlux A30. K tomuto 1,7 litru koncentrovaného upraveného média z transfekovaných buněk • · • · · · · · · ·· « · · · · · · · • · 9 · *·····« »

ΒΗΚ 570 byl přidán roztok proteázového inhibitoru (viz příklad 10) do konečných koncentrací: 2,5 mM kyselina ethylendiaminotetraoctová (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,003 mM leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 0,4 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Byly odebrány vzorky pro analýzu a hlavní část objemu byla zmražena na -80 °C, dokud nebyla zahájena purifikace. Celkové koncentrace cílového proteinu v koncentrovaném, buňkami upraveném médiu, byla určena pomocí SDS-PAGE a pomocí Western blot analýzy s anti-FLAG® (Kodak) protilátkou, konjugovanou s HRP. Sloupec afinitního gelu o objemu 125 ml anti-FLAG® M2Agarose (Sigma-Aldrich) byl nalit do skleněného sloupce Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. Sloupec byl ekvilibrován na BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) pH 7,4. Koncentrované, buňkami upravené médium, bylo rozmraženo, sterilizováno filtrací přes 0,2 μίτι filtr, bylo u něho upraveno pH na 7,4 a potom bylo nanášeno na sloupec přes noc průtokovou rychlostí 1 ml/minutu. Sloupec byl promyt 10 objemy sloupce (CV) fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS pH 7,4), potom byla část eluována 250 ml PBS (pH 6,0), obsahujícím 0,5 mg/ml FLAG® (Sigma-Aldrich Co.), rychlostí 5 ml/minutu. Použitý FLAG® peptid měl sekvenci DYKDDDDK (SEQ ID NO:49). Sloupec byl promyt 10 CV PBS, potom eluován 5 CV 0,2 M glycinu, pH 3,0. pH glycinem promytého sloupce bylo upraveno na 7,0 dvěma CV 5x PBS, potom byl sloupec ekvilibrován v PBS (pH 7,4). V průběhu celého postupu byly odebírány 5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 215 nm, všechny objemy při nanášení i promývání byly uchovány a analyzovány. Frakce, ve kterých byl maximálně eluován FLAG®-poly peptid, byly analyzovány na cílový protein pomocí SDS-PAGE a pomocí Western blot analýzy s anti-FLAG® protilátkou, konjugovanou s HRP. Frakce s eluovaným polypeptidem, o který se jedná, byly spojeny a koncentrovány z objemu 80 ml do 12 ml za použití spirálního koncentrátoru s membránou zachycující molekuly s molekulovou hmotností vyšší než 10 000 daltonů (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

Aby byl oddělen zalpha11CFLG od ostatních proteinů, které se dělily společně s ním, byly spojené koncentrované frakce eluovaných polypeptidu aplikovány na POROS HQ-50 (pryskyřice, ochotně vyměňující anionty - iontoměnič typu anex - od PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) při pH 8,0. Byl nalit sloupec 1,0 x 6,0 cm a promyt na • · * · · · 9 ·9 ·

9 9 9 9 9 * 9·

9«· ·····«« 99 ···**··’ *..* : *..* .:.

na BioCad Sprint Sloupec byl nabit opačným nábojem a pak ekvilibrován v 20 mM TRIS pH 8,0 (Tris(hydroxymethylaminomethan)). Vzorek byl zředěn 1:13 (aby byla snížena iontová síla PBS) a nanesen na sloupec Poros HQ rychlostí 5 ml/minutu. Sloupec byl promyt 10 objemy sloupce (CV) 20 mM TRIS pH 8,0 a potom eluován 40 CV gradientem 20 mM TRIS/1 M chlorid sodný (NaCl) rychlostí 10 ml/minutu. V průběhu celého postupu byly odebírány 1,5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 215 nm. Frakce, ve kterých docházelo k maximální eluci proteinů, byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Frakce, které byly zajímavé, byly spojeny a koncentrovány do objemu 1,5 až 2,0 ml za použití spirálního koncentrátoru s membránou zachycující molekuly s molekulovou hmotností vyšší než 10 000 daltonů (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

Aby byl oddělen polypeptid zalphal 1CFLG od volného FLAG® peptidu a jakýchkoli kontaminujících doprovodných proteinů, byly spojené koncentrované frakce podrobeny chromatografii na sloupci 1,5 x 90 cm Sephacryl S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ), navrstveném a ekvilibrovaném v PBS při rychlosti průtoku 1 ml/minutu za použití BioCad Sprint. V průběhu celého postupu byly odebírány 1,5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 215 nm. Frakce, ve kterých docházelo k maximální eluci proteinů, byly analyzovány pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem a byly spojeny pouze nejčistší frakce. Tento materiál představoval purifikovaný polypeptid zalphal 1CFLG.

Tento purifikovaný materiál byl na závěr aplikován na 4 ml sloupec ActiClean Etox (Sterogene), aby došlo k odstranění jakýchkoli zbývajících endotoxinů. Vzorek byl 4x nanesen na sloupec ekvilibrovaný v PBS a potom byl sloupec jednou promyt 3 ml PBS, který byl spojen s vyčištěným vzorkem. Materiál byl sterilizován filtrací přes filtr 0,2 μπι a uložen při -80 °C, dokud nebyl rozdělen na alikvoty.

Na Western blotech a SDS-PAGE barvené Coomassie Blue nebo stříbrem tvořil polypeptid zalphal 1CFLAG jednu hlavní zónu se zřejmou molekulovou hmotností 50 000 daltonů. Pohyblivost této zóny byla stejná na redukujících i na neredukujících gelech.

Proteinová koncentrace purifikovaného materiálu byla provedena pomocí BCA analýzy (Pierce, Rockford, IL) a protein byl rozdělen na alikvoty a uložen při -80 °C podle našich standardních postupů. Na IEF (izoelektrická fokusace) gelech se protein pohybuje s Pl méně než 4,5. Koncentrace polypeptidu zalphal 1CEE byla 1,2 mg/ml.

• « · · · · • 4 · · 4 · 4 4 4

C. Purifikace polypeptidů zalphal 1-Fc4 z BHK 570

Pokud není řečeno jinak, všechny operace byly provedeny při teplotě 4 °C. Následující postup byl použit pro čištění polypeptidů zalphall, obsahujícího na C-konci fúzi s lidským IgG/Fc (zalphal 1-Fc4; příklady 8 a 9). 12 000 mililitrů média upraveného buňkami BHK 570, transfekovanými zalphal 1-Fc4 (příklad 10), bylo filtrováno přes 0,2 μΠΊ sterilizační filtr a doplněno roztokem proteázových inhibitorů do konečných koncentrací 0,001 mM leupeptin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 0,4 mM Pefabloc (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sloupec sepharosy s proteinem G (objem 6 ml, Pharmacia Biotech) byl nalit a promyt 500 ml PBS (Gibco/BRL). Buňkami upravené, doplněné médium, bylo nanášeno na sloupec průtokovou rychlostí 10 ml/minutu, pak následovalo promytí 1000 ml PBS (Gibco/BRL). zalphal 1-Fc4 byl ze sloupce eluován pomocí 0,1 M glycinu, pH 3,5 a byly odebírány 2 ml frakce přímo do 0,2 ml 2M Tris pH 8,0, aby se upravilo konečné pH frakcí na pH 7,0. Eluované frakce byly charakterizovány pomocí SDS-PAGE a pomocí Western blot analýzy s protilátkami proti lidskému Fc (Amersham). Analýza Western blotů redukujících SDS-PAGE gelů ukázala imunoreaktivní protein o molekulové hmotnosti 80,000 kDa ve frakcích 2 až 10. Stříbrem barvené SDS-PAGE gely také ukázaly polypeptid zalphal 1:Fc o molekulové hmotnosti 80,000 kDa ve frakcích 2 až 10. Frakce 2 až 10 byly spojeny.

Proteinová koncentrace spojených frakcí byla provedena pomocí BCA analýzy (Pierce, Rockford, IL) a materiál byl rozdělen na alikvoty a uložen při -80 °C podle našich standardních postupů. Koncentrace spojených frakcí byla 0,26 mg/ml.

Příklad 12: Test používající zalphall rozpustný receptor zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG a zalphal 1-Fc4 (mutant) rozpustné receptory v kompetitivně inhibičním testu.

Buňky BaF3/Zalpha11 byly odcentrifugovány a promyty v médiu bez mlL-3. Buňky byly odcentrifugovány a 3x promyty, aby se zajistilo odstranění mlL-3. Poté byly buňky spočteny hematocytometrem. Buňky byly vysety do 96jamkové destičky v koncentraci 5000 buněk na jamku v objemu 100 μΙ na jamku za použití média bez mlL-

3.

Jak médium pocházející z aktivace opičích slezinných buněk, tak od buněk selektovaných CD3+, popsané výše v příkladu 8, bylo přidáno v oddělených pokusech v koncentracích 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375%, buď s • · · ·

9 999 9 9 • · · nebo bez zalphall rozpustných receptoru (konstruktů CEE, C-FLG a Fc4; viz příklad 10 a 11) v koncentracích 10 gg/ml. Celkový objem testu byl 200 μΙ.

Testovací plotny byly inkubovány při 37 °C, v 5% CO₂ po dobu 3 dnů a po této době byla přidána barvička Alamar Blue (Accumed) v množství 20 μΙ/jamku. Plotny byly znovu inkubovány při 37 °C, 5 % CO₂ po dobu 24 hodin. Potom byly plotny odečítány na odečítacím zařízení pro plotny Fmax™ plate reader (Molecular Devices), jak bylo popsáno výše (příklad 5). Výsledky ukázaly kompletní inhibici buněčného růstu každým z různých konstruktů zalphall rozpustných receptorů při koncentraci 10 pg/ml, což potvrzuje, že faktor v každém vzorku byl specifický pro zalphal 1 receptor.

Titrační křivky, ředění rozpustných receptorů, byly také ve výše uvedeném testu provedeny. Jak zalphal 1CEE, tak zalphal 1CFLG rozpustné zalphall receptory, byly schopny kompletně inhibovat buněčný růst již při koncentraci 20 ng/ml. Mutovaný zalphal 1-Fc4 rozpustný zalphal 1 receptor byl tak účinný až při koncentraci 1,5 μς/ιηΙ.

Příklad 13: Exprese lidského zalphall v E. coli.

A. Konstrukce expresního vektoru pCZR225, který exprimuje fúzní polypeptid huzalpha11/MBP-6H.

Expresní plazmid obsahující polynukleotid, kódující lidský zalphall rozpustný receptor, který je na C-konci fúzován s proteinem, který váže maltózu (MBP), byl konstruován pomocí homologické rekombinace. Polynukleotidová sekvence fúzního polypeptidu rozpustného receptoru MBP-zalpha11 je ukázána v SEQ ID NO:50, a jí odpovídající proteinová sekvence je ukázána v SEQ ID NO:51. Fúzního polypeptid, označený huzalpha11/MBP-6H, v příkladu 14, obsahuje část MBP (aminokyselina 1 (Met) až aminokyselina 388 (Ser) ze SEQ ID NO:51) fúzovanou k lidskému zalphall rozpustnému receptoru (aminokyselina 389 (Cys) až aminokyselina 606 (His) ze SEQ ID NO:51). Fragment lidské zalphall cDNA (SEQ ID NO:52) byl izolován pomocí PCR. Dva primery použité v PCR reakci při produkci fragmentu lidského zalphall byly: (1) primer ZC 20 187 (SEQ ID NO:53), obsahující 40 bp sekvence, která sousedí ve vektoru a 25 bp odpovídajících aminovému konci lidského zalphal 1; a (2) primer ZC 20 185 (SEQ ID NO:54), obsahující 40 bp z 3' konce odpovídajících sekvenci, která sousedí ve vektoru a 25 bp odpovídajících karboxylovému konci lidského zalphall. Reakční podmínky PCR byly následující: 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 50 °C po dobu 30 sekund; a 72 °C po dobu 1 minuty; následovalo držení při 4 °C, reakce byla • 9 9 999 • 9 9 99 9

9 9 9 99 «······ · · provedena ve dvou exemplářích. Dva mikrolitry ze 100 μΙ PCR reakce byly analyzovány elektroforézou na 1,0% agarózovém gelu v 1x TBE pufru, a byl zjištěn fragment o očekávané délce přibližně 660 bp. Zbývajících 90 μΙ PCR reakce bylo spojeno s druhou zkumavkou s PCR reakcí a vysráženo přidáním 400 μΙ absolutního ethanolu. Vysrážená DNA byla použita pro rekombinaci do vektoru pTAP98, štěpeného Smál, a byl vytvořen konstrukt kódující fúzi MBP-zalpha11, jak je popsáno dále.

Plazmid pTAP98 byl odvozen z plazmidů pRS316 a pMAL-c2. Plazmid pRS316 je kyvadlový vektor Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. a Sikorski, R., Genetics 122:19-27,1989). pMAL-C2 (NEB) je expresní plazmid E. coli. Nese tac promotor, který ovládá MalG (gen kódující MBP), za kterým následuje His značka, štěpné místo pro trombin, klonovací místo a terminátor rrnB. Vektor pTAP98 byl konstruován pomocí homologické rekombinace kvasinek. Sto nanogramů pMAL-c2 štěpeného EcoRI bylo rekombinováno s 1 μρ pRS316 štěpeného Pvul, 1 μg linkeru a 1 μg pRS316 štěpeného Scal/EcoRI. Linker sestával z oligonukleotidů ZC 19 372 (SEQ ID NO:55) (100 pmol): ZC 19 351 (SEQ ID NO:56) (1 pmol): ZC 19 352 (SEQ ID NO:57) (1 pmol) a ZC 19 371 (SEQ ID NO:58) (100 pmol), spojených v PCR reakci. Reakční podmínky PCR byly následující: 10 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 50 °C po dobu 30 sekund; a 72 °C po dobu 30 sekund; následovalo držení při 4 °C. Produkty PCR reakce byly koncentrovány pomocí precipitace 100% alkoholem.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasničných buněk (S. cerevisiae) bylo spojeno s 10 μΙ směsi, obsahující přibližně 1 pg PCR produktu lidského zalphal 1 receptoru, který byl popsán výše, a 100 ng vektoru pTAP98, štěpeného Smál, a přeneseno do 0,2 cm elektroporační kyvety. Na směs kvasinky/DNA bylo působeno elektrickými pulzy při 0,75 kV (5 kV/cm), nekonečně ohmů, 25 μΡ. Do každé kyvety bylo přidáno 600 μ11,2 M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou 300 μΙ alikvotech na dvě plotny s URA-D a inkubovány při 30 °C.

Po 48 hodinách byly resuspendovány kvasinkové transformanty Ura+ z jedné plotny v 1 ml H₂O a krátce zcentrifugovány, aby buňky kvasinek sedimentovaly. Buněčný sediment byl resuspendován v 1 ml lyzovacího pufru (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8,0 1 mM EDTA). Pět set mikrolitrů lyzovací směsi bylo přidáno do zkumavky typu eppendorf, obsahující 300 μΙ skleněných zrnek promytých kyselinou a 200 μΙ směsi fenol-chloroform, vortexováno 2 až 3x po dobu 1 minuty, poté následovala centrifugace 5 minut při maximální rychlosti v centrifuze • · · 4 φ < ·

Φ Φ · 4 » < ·

4 · Φ·»··»· φ

Eppendorf. Tři sta mikrolitrů vodné fáze bylo přeneseno do nové zkumavky a DNA byla sražena 600 μΙ ethanolu (EtOH), poté následovala centrifugace 10 minut při 4 °C. Sediment DNA byl resuspendován v 100 μΙ H₂O.

Transformace elektrokompetentních buněk E. coli (MC1061, Casadaban a kol.,

J. Mol. Biol. 138:179-207) byla provedena s 1 μΙ preparátu kvasničné DNA a 40 μΙ buněk MC1061. Na buňky bylo působeno elektrickými pulzy při 2,0 kV, 25 mF a 400 ohmů. Po elektroporaci byl 0,6 ml SOC (2% Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, Ml), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glukóza) vyset v 1 alikvotu na plotny s MM/CA+AMP 100 mg/l.

(Pryora Leiting, Protein Expression and Purification 10:309-319, 1997).

Buňky obsahující správný expresní konstrukt lidského zalphal 1 receptorů byly určeny pomocí exprese. Buňky byly pěstovány za třepání v médiu MM/CA se 100 pg/ml ampicilinu při 37 °C po dobu 2 hodin. Jeden mililitr kultury byl indukován s 1 mM IPTG. Po 2 až 4 hodinách bylo 250 μΙ každé kultury smícháno s 250 μΙ skleněných zrnek promytých kyselinou a 250 μΙ Thornerova pufru s 5 % βΜΕ a barvičkou (8 M močovina, 100 mM Tris pH 7,0, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 5% SDS). Vzorky byly vortexovány po dobu 1 minuty a zahřáté na 65 °C po dobu 10 minut. Dvacet mikrolitrů vzorku bylo naneseno do dráhy na 4 až 12% PAGE gelu (NOVEX). Elektroforéza byla provedena v pufru 1x MES. Pozitivní klony byly označeny pCZR225 a byly podrobeny sekvenční analýze. Polynukleotidová sekvence fúzního polypeptidu MBP-zalpha11 je ukázána v SEQ ID NO:50.

B. Bakteriální exprese lidského fúzního polypeptidu huzalpha11/MBP-6H.

Jeden mikrolitr sekvenované DNA byl použit pro transformaci kmene BL21. Na buňky bylo působeno elektrickými pulzy při 2,0 kV, 25 mF a 400 ohmů. Po elektroporaci, 0,6 ml MM/CA+AMP 100 mg/l.

Buňky byly pěstovány za třepání v médiu MM/CA se 100 μθ/ml ampicilinu při 37 °C po dobu 2 hodin. Jeden mililitr kultury byl indukován s 1 mM IPTG. Po 2 až 4 hodinách bylo 250 μΙ každé kultury smícháno s 250 μί skleněných zrnek promytých kyselinou a 250 μΙ Thornerova pufru s 5 % βΜΕ a barvičkou (8 M močovina, 100 mM Tris pH 7,0, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 5% SDS). Vzorky byly vortexovány po dobu 1 minuty a zahřáté na 65 °C po dobu 10 minut. Dvacet mikrolitrů vzorku bylo naneseno do dráhy na 4 až 12% PAGE gelu (NOVEX). Elektroforéza byla provedena v pufru 1x ······ · · · ·· · ♦ · · « · « • · · t · · · · * · · · ·····»· ·

MES. Pozitivní klony byly namnoženy ve velkém množství pro izolaci fúzního proteinu huzalpha11/MBP-6H (viz dále přiklad 14).

Příklad 14: Purifikace z E. coli.

Pokud není řečeno jinak, všechny operace byly provedeny při teplotě 4 °C. Následující postup byl použit pro čištění polypeptidů rozpustného receptoru huzalpha11/MBP-6H. Buňky E. coli, obsahující konstrukt pCZR225 a exprimující rozpustný receptor huzalpha11/MBP-6H (příklad 13), byly pěstovány v SuperBroth II (12 g/l Casien, 24 g/l kvasničný extrakt, 11,4 g/l primární fosforečnan draselný, 1,7 g/l sekundární fosforečnan draselný; Becton Dickenson, Cockeysville, MD) a zmraženy v 0,5% glycerolu. Dvacet gramů buněk zmražených v SuperBroth II + glycerolu bylo použito pro purifikaci proteinu. Zmražené buňky byly rozmraženy a zředěny 11:10 v roztoku proteázového inhibitoru (extrakční pufr) před lýzou buněk a uvolněním proteinu rozpustného receptoru huzalpha11/MBP-6H. Naředěné buňky obsahovaly jako konečné koncentrace 20 mM Tris (JT Baker, Philipsburg, NJ), 100 mM chlorid sodný (NaCI, Mallinkrodt, Paris, KY), 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 2 pg/ml Leupeptin (Fluka, Switzerland), a 2 gg/ml Aprotinin (Sigma). Systém na rozrušení buněk French Press (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) s teplotou -7 až -10 °C a 30 000 PSI byl použit pro lyžování buněk. U zředěných buněk byl kontrolován rozpad pomocí odečítání A^oo před a po použití systému French Press. Lyžované buňky byly centrifugovány @ 18 000 g po dobu 45 minut, aby se odstranily zbytky rozbitých buněk, a supernatant byl použit pro purifikaci proteinu. Celkové koncentrace cílového proteinu byly určeny pomocí BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL), podle návodu výrobce.

Sloupec 25 ml pryskyřice Talon Metal Affinity (Clontech, Palo Alto, CA) (připravena, jak bude popsáno níže) byl nalit do skleněného sloupce Bio-Rad, 2,5 cm průměr x 10 cm výška. Sloupec byl ekvilibrován s 10 objemy sloupce (CV) Talon ekvilibračního pufru (20 mM Tris, 100 mM NaCI, pH 8,0). Supernatant byl nalit v kádince na pryskyřici Talon Metal Affinity a se směsí bylo přes noc kýváno. Pryskyřice byla nalita zpět do sloupce a promyta 10 CV Talon ekvilibračního pufru, který byl potom eluován 140 ml elučního pufru (Talon ekvilibrační pufr + 200 mM imidazol, Fluka Chemical). Sloupec Talon byl vyčištěn s 5 CV 20 mM 2-(N-morfolino)ethansulfonové kyseliny pH 5,0 (MES, Sigma), 5 CV destilované H₂O, potom uložen v 20% · · · · · • ·♦ · ·· « • · · · · · · φ • · · · · · « • · · »······ » « • · 9 9 9 · · · ethanol/0,1% azid sodný. V průběhu celého elučního postupu byly odebírány 14 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 320 nm a proveden BCA proteinový test; všechny objemy při nanášení i promývání byly uchovány a analyzovány. Frakce, ve kterých byl eluován protein, o který se jedná, byly spojeny a naneseny na pryskyřici Amylose (New England Biolabs, Beverly, MA).

Aby byl získán čistší polypeptid huzalpha11/MBP-6H, spojené frakce eluované ze sloupce Talon Affinity byly aplikovány na pryskyřici Amylose (22 ml) při pH 7,4. Sloupec Bio-Rad, 2,5 cm průměr x 10 cm výška byl nalit a ekvilibrován s 10 CV Amylose ekvilibračního pufru - 20 mM Tris (JT Baker), 100 mM NaCl (Mallinkrodt), 1 mM PMSF (Sigma), 10 mM β-merkaptoethanol (BME, ICN Biomedicals lne., Aurora, OH), pH 7,4. Vzorek byl nanášen působením gravitace rychlostí průtoku 0,5 ml/minutu. Sloupec byl promyt s 10 CV Amylose ekvilibračního pufru, potom vymyt ~2 CV Amylose ekvilibračního pufru + 10 mM maltóza (Fluka Biochemical, Switzerland) působením gravitace. V průběhu celého elučního postupu byly odebírány 5 ml frakce a byla měřena jejich absorbance při 280 a 320 nm. Sloupec Amylose byl regenerován 1 CV destilované H₂O, 5 CV 0,1% (hmotnost/objem) SDS (Sigma), 5 CV destilované H₂O, a potom 5 CV Amylose ekvilibračního pufru.

Frakce, které byly zajímavé, byly spojeny a dialyzovány v zařízení Slide-A-Lyzer (Pierce) s 4x 4 litry PBS pH 7,4 (Sigma), aby byly odstraněny nízkomolekulární kontaminující látky, vyměněn pufr a aby byly odsoleny. Po změnách PBS představoval získaný materiál vyčištěný polypeptid huzalpha11/MBP-6H. Vyčištěný polypeptid huzalpha11/MBP-6H byl analyzován pomocí SDS-PAGE s barvením Coomassie a pomocí Western blotů s protikráličími protilátkami, konjugovanými s HRP (Rockland, Gilbertsville, PA). Koncentrace polypeptidu huzalpha11/MBP-6H byla 1,92 mg/ml, jak bylo určeno BCA analýzou.

Purifikovaný polypeptid huzalpha11/MBP-6H byl připraven pro injekční podávání králíkům a poslán do R & R Research and Development (Stanford, WA) na přípravu protilátek. Králíci byli očkováni pro přípravu anti anti-huzalpha11/MBP-6H séra (příklad 15, uvedený dále).

Příklad 15; Polyklonální protilátky proti zalphal 1.

Polyklonální protilátky byly připraveny imunizací dvou samic novozélandského bílého králíka purifikovaným polypeptidem huzalpha11/MBP-6H (příklad 14), nebo • · · *=♦ · · · · · · • · · · » ··· • · «··· · · • · · · ······· · purifikovaným rekombinantním rozpustným receptorem zalphal 1CEE (příklad 11A). Odpovídající polyklonální protilátky byly označeny králičí anti-huzalpha11/MBP-6H, respektive králičí anti-huzalpha11-CEE-BHK. Každý králík obdržel počáteční intraperitoneální injekci (IP) 200 mg purifikovaného proteinu v kompletním Freudově adjuvans (Pierce, Rockford, IL), následovanou každé tři týdny posilovacími IP injekcemi 100 mg purifikovaného proteinu v nekompletním Freudově adjuvans. Sedm až deset dní po podání třetí posilovači injekce byla zvířata krvácena a bylo odebráno sérum. Králíci tedy dostali posilovači injekci a byli krváceni každé 3 týdny.

Specifické polyklonální protilátky proti zalphall byly purifikovány z králičího séra afinitní chromatografií za použití sloupce CNBr-SEPHAROSE 4B s proteinem (Pharmacia LKB), která byla připravena použitím 10 mg vyčištěného polypeptidu huzalpha11/MBP-6H (příklad 14) na gram CNBr-SEPHAROSE, potom následovala 20x dialýza v PBS přes noc. zalphall-specifické protilátky byly charakterizovány kontrolou ELISA titru, při použití 1 mg/ml vhodného proteinového antigenu jako cílového proteinu. Spodní hranice detekovatelnosti (LLD) afinitní chromatografií purifikované králičí antihuzalpha11/MBP-6H protilátky je ředění 500 pg/ml. LLD afinitní chromatografií purifikované králičí anti-huzalpha11-CEE-BHK je ředění 50 pg/ml.

Příklad 16: Použití RT-PCR pro identifikaci buněk, exprimujících receptorzalphall.

Specifické typy lidských buněk byly izolovány a prohledávány na expresi zalphall pomocí RT-PCR. B-buňky byly izolovány z čerstvých lidských mandlí mechanickým rozrušením přes 100 pm nylonová buněčná sítka (Falcon™; Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ). Suspenze b-buněk byla obohacena o buňky CD19+ pozitivní selekcí s VarioMACS VS+ magnetickým sloupcem a CD19 mikrozrnky (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), podle návodu výrobce. T-buňky a monocyty byly izolovány z vyřazených lidských krevních vzorků. CD3+ T-buňky byly purifikovány pozitivní selekcí s VarioMACS VS CD3 mikrozrnky a monocyty byly purifikovány VarioMACS VS negativně selektujícími sloupci (Miltenyi), podle návodu výrobce. Vzorky z každé populace byly obarveny a analyzovány pomocí třídění buněk obarvených fluorescenčními protilátkami (FACS) (Bectin Dickinson, San Jose, CA), aby se zjistilo procento obohacení a získané výtěžky. CD19+ B-buňky byly purifikovány přibližně na 96 %, CD3+ T-buňky byly purifikovány^přibližně na 95 % a monocyty byly purifikovány přibližně na 96 %.

• 9 · · 99*9 • · 9 · 9 · 99

9999 9999 99·

RNA byla ze všech tří typů buněk, které byly buď ve stádiu klidu nebo byly aktivované, připravena pomocí postupů běžných v oboru. RNA z klidových buněk byla izolována přímo z výše uvedených preparátů ze sloupců. Buňky CD19+ a CD3+ byly aktivovány pěstováním při koncentraci 500 000 buněk/ml v RPMI + 10% FBS obsahující PMA 5 ng/ML (Calbiochem, La Jolla, CA) a lonomycin 0,5 pg/ml (Calbiochem) po dobu 4 a 24 hodin. Monocyty byly aktivovány pěstováním v RPMI + 10% FBS obsahující LPS 10 ng/ml (Sigma, St Louis, MO) a rhIFN-g 10 ng/ml (R&D, Minneapolis, MN) po dobu 24 hodin. Buňky byly sebrány a promyty v PBS. RNA byla připravena ze sedimentů buněk pomocí soupravy RNeasy Midiprep™ Kit (Qiagen, Valencia, CA), podle návodu výrobce a první vlákno cDNA syntézy bylo připraveno pomocí soupravy Superscript II™ Kit (GIBCO BRL, Grand Island, NY), podle návodu výrobce.

Oligonukleotidy ZC 19 907 (SEQ ID NO:20) a ZC 19 908 (SEQ ID NO:21) byly použity v PCR reakci při prohledávání výše uvedených vzorků na 1,2 kb fragment, odpovídající mRNA zalphall. PCR amplifikace byla provedena s Taq polymerázou (BRL, Grand Island, NY) za následujících podmínek: 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 minuty, 60 °C po dobu 1 minuty, 72 °C po dobu 30 sekund; 1 cyklus 72 °C po dobu 10 minut; a potom drženo při 4 °C. Deset mikrolitrů z každé 50 μΙ reakce bylo elektroforézováno na 2% agarózovém gelu v 1x TAE pufru pro zjištění výsledných produktů. PCR produkty byly hodnoceny jako (-) žádný produkt, (+) viditelný proužek, (++) silnější proužek a (+++) převládající pruh, a výsledky jsou ukázány v tabulce 5, uvedené dále.

Tabulka 5

zdroj cDNA	aktivace	PCR produkt
buňky CD19+	0 hodin -klidové	+
aktivované 4 hodiny	++
aktivované 24 hodin	+++
buňky CD3+	0 hodin -klidové	-
aktivované 4 hodiny	++
aktivované 24 hodin	-
monocyty	0 hodin -klidové	-
aktivované 24 hodin	-

«4·

4 44

444444 4 •·44 44 • · · · 4 »· 4

Výsledky ukazují, že mRNA zalphall je přítomna v klidových lidských Bbuňkách CD19+ a zvyšuje se v průběhu aktivace mitogenem. Také se zdá, že je exprimována v lidských T-buňkách CD3+, ale pouze 4 hodiny po aktivaci. Nebyla zřejmá přítomnost mRNA ani v klidových ani v aktivovaných lidských monocytech.

Příklad 17: Imunohistochemie zalphall.

A. Buněčné a tkáňové preparáty.

Pozitivní kontroly se skládaly z buněk BaF3, transfekovaných zalphal 1 (příklad 7) a lymfoidních tkání, o kterých je známo, že exprimují zalphall, jako jsou myší lymfatické uzliny, slezina a brzlík, získané od HSD (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN), opičí lymfatické uzliny a slezina získané z Oblastního výzkumného centra primátů (Washingtonská univerzita, Seattle, WA), lidské lymfatické uzliny a slezina získané od CHTN (Cleveland, OH). Negativní kontroly, provedené na každém vzorku tkáně zahrnovaly: (1) netransfekované buňky BaF3, (2) játra a mozek z myši a člověka, o kterých je známo, že neexprimují zalphall, (3) barvení s pufrem pro ředění protilátek (Ventann Bioteck Systems, Tucson, AZ) v nepřítomnosti primární protilátky, a (4) použití rozpustného proteinu zalphal 1 v kompetitivních pokusech.

Byly testovány jiné buněčné vzorky. Byly testovány jak nestimulované, tak stimulované buňky HL60. Buňky HL60 jsou promyelocytická buněčná linie, která může být pomocí různých reagencií diferencována buď na myeloidní linie nebo na linie granulocytů. Stimulované vzorky HL60 byly připraveny následujícím způsobem: (1) buňky HL60 byly opracovány 10 ng/ml forbol-myristát-acetát (PMA) (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 48 hodin, aby se diferencovaly na linie buněk monocytů; a (2) buňky HL60 byly opracovány 1,25% DMSO (Sigma) po dobu 4 dnů, aby se diferencovaly na buňky podobné neutrofilům. Kromě toho byly zkoumány lidské polymorfonukleární buňky (PMN), lidské granulocyty, lidské lymfocyty z periferní krve (PBL) a lidské monocyty v čerstvé lidské krve (připravené pomocí v oboru běžně používaných metod). Výše popsané buňky a tkáně byly přes noc fixovány v 10% NBF (Sugipath, Richmond, IL) a zality v parapalst X-tra (Oxford Scientific, St. Louis, MO) a nařezány na plátky 5 μΓη silné na mikrotomu Reichart-Jung 2050 (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Germany).

B. Imunochemie.

• · Φ · 4 4 44 4 • · ♦ · · φ··· » · « · • 44Φ ♦· 44 · ·» «4»

Plátky tkání byly zbaveny parafinu, hydratovány pufrem (vodou) a podrobeny působení páry v zařízení HIER v pufru Citra pro opravu antigenu (BioGenex, San Roman, CA) po dobu 20 minut. 5% normální kozí sérum (Vector, Burlingame, CA) bylo použito po dobu 10 minut pro blokování nespecifické vazby. Imunocytochemické analýzy byly provedeny za použití polyklonálních protilátek proti proteinu rozpustného receptoru zalphal 1 (králičí anti-huzalpha11-MBP-6H a králičí anti-huzalpha11-CEEBHK; viz příklad 15) jako primární protilátky při ředěních 1:200 respektive 1:400. Jako sekundární protilátka byl použit s biotinem konjugovaný kozí protikráličí IgG (Vector; kat. č. BA-1000, 1,5 mg/ml) v ředění 1:200. V jednotlivých vzorcích byla provedena kompetice proteinů za použití dalšího proteinu rozpustného receptoru zalphal 1CEE (v 10násobném přebytku) (příklad 11A) k primární protilátce, pro prvotní blokování imunitní reakce primární protilátky. Tato kompetice byla použita jako kontrola specifity králičích protilátek proti zalphal 1. Detekce byla provedena na zařízení Ventana ChemMate 500 za použití soupravy ChemMate DAB Kit (značeno soupravou Streptavidin-Avidin Kit, ve které je použita křenová peroxidáza konjugovaná se streptavidinem, a substrát DAB), podle návodu výrobce a za použití kontrastního barvení hematoxylinem po dobu 30 sekund podle výrobce (Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ).

Vysoká exprese zalphal 1 byla pozorována v buňkách HL60, aktivovaných působením PMA. Nízká úroveň exprese byla pozorována v nestimulovaných buňkách PBL a HL60. Část buněk ve slezině, brzlíku a myších lymfatických žlázách vykazovala pozitivní barvení. Jak myší, tak opičí lymfatické žlázy a slezina, a buňky HL60 po stimulaci DMSO vykazovaly minimální nebo žádné barvení. Signál viditelný v buňkách a tkáních bylo možno z největší části kompetovat při použití přebytku proteinu rozpustného receptoru zalphal 1. Negativní kontrolní tkáně mozku a jater nevykazovaly žádné barvení.

Příklad 18: Použití králičích polyklonálních antisér proti rozpustnému receptoru zalphal 1 pro identifikaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMNC), které exprimují receptor zalpha 11.

Od normálního dárce bylo získáno dvě stě mililitrů čerstvé krve s heparinem. Krev byla zředěna 1:1 v PBS a rozdělena pomocí gradientu Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) a odebrána mezifáze, obsahující lymfocyty.

100 ·· ·*<· 44 · ·· • · 4 4 · 4 4 • · · · < · • «44 4444444 9

Buňky byly promyty 2x v PBS a resuspendovány v médiu RPMI s 5 % FBS na koncentraci 2x 10⁶ buněk/ml.

Aby bylo určeno, zda exprese receptoru zalphal 1 je ovlivněna aktivačním stavem buňky lymfocytů, tj. pro klidové a aktivované buňky bylo použito několik stimulačních podmínek: 1) nestimulované, tj. v samotném médiu (médium RPMI + 5 % FBS); 2) stimulované PMA 10 ng/ML + lonomycin 0,5 pg/ml (oba od Calbiochem); a 3) aktivace PHA (fýtohemaglutinin-P, Difco/VWR). Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 17 hodin, potom byly odebrány pro barvení na detekci exprese receptoru zalphal 1.

Byl použit protokol nepřímého barvení. Krátce řečeno, buňky lidských lymfocytů byly suspendovány v barvícím pufru (PBS + 0,02% NaN₃ + BSA 1% normální lidské sérum 2%) a vysety v koncentraci 2x 10⁵ buněk v 50 μΙ/jamku do 96jamkových destiček. Protilátky proti rozpustnému receptoru zalphal 1CEE (příklad 15) byly použity pro určení, zda barví současně a B-buněčným (CD-19), T-buněčným (CD-3) nebo monocytovým markérem (CD-14) na izolovaných lidských lymfocytech. Králičí polyklonální sérum proti rozpustnému receptoru zalphal 1 (Rb anti-huzalpa11-CEEBHK) (příklad 15) bylo použito v koncentraci 10 pg/ml jako protilátka pro identifikaci zalphal 1 na lymfocytech. Sekundární protilátka, kozí protikráličí Ig-FITC (Biosource, Camarillo, CA), byla použita pro zviditelnění protilátky Rb anti-huzalpa11-CEE-BHK, vázané na receptorech zalphal 1. Jiné protilátky byly současně použity pro barvení Tbuněk (CD3-PE; PharMingen, San Diego, CA), B-buněk (CD19-PE) (PharMingen) a monocytů (CD-14-PE) (PharMingen), aby se určilo současné barvení protilátek proti rozpustnému receptoru zalphal 1 na těchto typech buněk. Aby bylo zjištěno nespecifické barvení a úroveň pozadí barvení, byly použity různé kontroly: (1)jako nespecifická kontrola bylo použito králičí polyklonální sérum, které nemělo k těmto proteinům žádný vztah; a (2) samotná sekundární protilátka byla použita pro určení úrovně pozadí vazby této reagencie. Čištěný rozpustný receptor zalphal 1 (příklad 11) byl použit v asi lOnásobném přebytku jako kompetitivní inhibitor pro ověření specifity králičí protilátky anti-huzalpa11-CEE-BHK proti rozpustnému receptoru zalphal 1.

Po vysetí buněk a přidání primární a současně barvící protilátky, byly buňky inkubovány na ledu po dobu 30 minut, promyty 2x barvícím pufrem a barveny sekundární protilátkou, kozí protikráličí Ig-FITC (Biosource) po dobu 30 minut na ledu. Buňky byly 2x promyty barvícím pufrem a resuspendovány v 200 μΙ na jamku v ♦· · · · 4 9 9 9

Φ · 9 4 4 · 4 4 • 9 · 4 *4*4444 4

101 barvícím pufru, obsahujícím barvičku pro označení životaschopných buněk 7AAD, v konečné koncentraci 1 pg/ml (Sigma, St. Louis, MO). Vzorky byly odečítány na přístroji FACS-Caliber (Becton-Dickinson, San Jose, CA) a životaschopné buňky byly analyzovány.

Králičí polyklonální sérum proti receptorů zalphall barvilo klidové B-buňky. Signál na klidových B-buňkách byl jasnější, než signál dosažený pomocí králičího séra, které nemělo k těmto proteinům žádný vztah, a pokud byl přidán přebytek rozpustného receptorů zalphall, byl signál zmenšen ve větší míře na B-buňkách, než na Tbuňkách. Tento pokus byl opakován za použití oddělených B a T buněk a výsledky byly velmi podobné. Opět barvení s polyklonální králičí protilátkou anti-huzalpa11-CEE-BHK proti receptorů zalphall bylo vyšší na klidových B-buňkách.

Příklad 19: Zjišťování exprese receptorů zalphall v různých tkáních pomocí kvantitativní RT-PCR v reálném čase.

A. Příměry a sondy pro kvantitativní RT-PCR.

Kvantitativní RT-PCR v reálném čase, provedená za použití ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systém (PE Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) byl dříve popsán (viz Heid, C.A. a kol., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.S. a kol., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. a kol., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Tato metoda zahrnuje použití genově specifické sondy, která obsahuje jak reportérovou, tak zhášecí fluorecenční barvičku. Když je sonda neporušena, emise reportérové barvičky je potlačena těsnou blízkostí zhášecí barvičky. V průběhu PCR prodlužování, za použití dalších genově specifických přímých a zpětných primerů, je sonda štěpena účinkem 5'-nukleázové aktivity Taq polymerázy, která uvolňuje reportérovou barvičku ze sondy a to má za následek zvýšení fluorescenční emise.

Primery a sondy, používané v analýzách exprese zalphall pomocí kvantitativní RT-PCR v reálném čase, byly navrženy za použití software pro návrhy primerů Primer Express™ (PE Applied Biosystems, lne., Foster City, CA). Primery pro lidský zalphall byly navrženy tak, aby překlenuly spojení intron-exon, aby se vyloučila amplifikace genomové DNA. Přímý primer ZC 22 277 (SEQ ID NO:59) a zpětný primer ZC 22 276 (SEQ ID NO:60) byly použity v PCR reakci (viz dále) v asi 300 nM koncentracích pro syntézu produktu 143 bp. Odpovídající zalphall TaqMan® sonda, označená ZG31

102

999999 9 9 9 · · • · 9 9 9 9* • · 99«·99

9999 9999 99· (SEQ ID NO:61) byla syntetizována a značena v PE Applied Biosystems. Sonda ZG31 byla značena na 5'-konci reportérovou fluorescenční barvičkou (6-karboxyfluoresceín) (FAM) (PE Applied Biosystems) a na 3'-konci zhášecí fluorescenční barvičkou (6karboxytetramethylrhodamin) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

Jako kontrola pro testování neporušenosti a kvality testovaných RNA vzorků, byly všechny vzorky (viz dále) testovány na rRNA za použití primeru a sady sond objednaných od PE Applied Biosystems (kat. č. 4 304 483). Souprava obsahuje přímý rRNA primer (SEQ ID NO:66) a zpětný rRNA primer (SEQ ID NO:67) a rRNA TaqMan® sondu (SEQ ID NO:68). rRNA sonda byla značena na 5'-konci reportérovou fluorescenční barvičkou VIC (PE Applied Biosystems) a na 3'-konci zhášecí fluorescenční barvičkou TAMRA (PE Applied Biosystems). Výsledky rRNA také slouží jako vnitřní kontrola a umožňují normalizování výsledků exprese zalphall mRNA, zjištěných v testovaných vzorcích.

Vzorky RNA z lidských buněčných typů CD3, CD19 a monocytů byly připraveny jako výše v příkladu 16. Kontrolní RNA byla připravena za použití soupravy RNeasy Miniprep™ Kit (Qiagen, Valencia, CA), podle návodu výrobce, přibližně z 10 milionů buněk BaF3, exprimujících receptor zalphall (příklad 7).

B. Kvantitativní RT-PCR v reálném čase

Relativní úrovně zalphal 1 mRNA byly určovány analýzou vzorků celkové RNA, za použití jednostupňové metody RT-PCR (PE Applied Biosystems). Celková RNA z buněk BaF3, exprimujících lidský receptor zalphall, byla izolována standardní metodou a použita pro vytvoření standardní křivky, používané pro kvantifikaci. Křivka se skládala z desetinásobných sériových ředění v rozmezí od 2,5 do 2,5x 10^-4 ng/μΙ pro měření rRNA a od 250 do 0,025 ng/μΙ pro měření zalphall, přičemž každý bod standardní křivky byl analyzován ve třech paralelních vzorcích. Vzorky celkové RNA z lidských buněk CD3, CD 19 a monocytů byly také analyzovány ve třech paralelních vzorcích pro úrovně transkriptů lidského zalphall a pro úrovně rRNA jako vnitřní kontroly. V celkovém objemu 25 μΙ byla s každým vzorkem RNA provedena jednostupňová RT-PCR reakce obsahující: přibližně 25 ng celkové RNA v pufru A (50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI); vnitřní standardní barvička karboxy-x-rhodamin (ROX)); vhodné primery (přibližně 50 nM rRNA primerů (SEQ ID NO:66 a SEQ ID NO:67) pro vzorky rRNA; a (přibližně 300 nM primerů ZC 22 277 (SEQ ID NO:59) a ZC 22 276 (SEQ ID NO:60) pro vzorky zalphall); vhodnou sondu (přibližně 50 nM rRNA «· ···· Φ· φ ·· · • · φφφφ φφφφ * · φφφ· φφφ • φφφ «·«···· φ · φφφφ·· φφφ •ΦΦΦ φφ ·· φ ·Φ ·Φ·

103

TaqMan® sondy (SEQ ID NO:68) pro vzorky rRNA, přibližně 100 nM sondy ZG31 (SEQ ID NO:61) pro vzorky zalphal 1); 5,5 mM MgCI₂; 300 μΜ každého d-CTP, d-ATP a d-GTP a 600 μΜ d-UTP; MuLV reverzní transkriptázu (0,25 U/μΙ); AmpliTaq® Gold DNA polymerázu (0,025 U/μΙ) (PE Applied Biosystems); a inhibitor RNázy (0,4 U/μΙ) (PE Applied Biosystems). Tepelné podmínky pro PCR reakci byly následující: jako úvodní reverzně transkripční (RT) krok jeden cyklus při 48 °C po dobu 30 minut; následoval aktivační krok pro AmpliTaq® Gold DNA polymerázu (PE Applied Biosystems) jeden cyklus při 95 °C po dobu 10 minut; následovalo 40 cyklů amplifikace při 95 °C po dobu 15 sekund a při 60 °C po dobu 1 minuty.

Relativní úrovně zalphal 1 RNA byly určeny za použití metody standardní křivky, jak je popsána výrobcem, PE Biosystems (Věstník pro uživatele č. 2: ABI Prism 7700 sekvenční detekční systém, Relativní kvantifikace genové exprese, 11. prosince 1097). Měření rRNA byla použita pro normalizování úrovní zalphal 1 a jako kalibrátor byl použit vzorek z klidových buněk CD3+. Klidové buňky CD3+ byly náhodně vybrány jako kalibrátor a byla jim přiřazena hodnota 1,00. Zbytek vzorků byl srovnáván relativně ke kalibrátoru. Získané údaje jsou ukázány dále v tabulce 6.

Tabulka 6

Vzorek	klidové buňky	stimulace 4 hodiny	stimulace 24 hodin
CD3	1,00	15,27	16,70
CD19	20,14	65,08	25,42
monocyty	0,05	bez údajů	0,26

Bylo zjištěno 15násobné zvýšení exprese rozpustného receptoru zalphal 1 v buňkách CD3+ po 4 a 24 hodinách. Klidové buňky CD19 měly 20násobné zvýšení exprese receptoru vhledem ke klidovým buňkám CD+. Bylo zjištěno trojnásobné zvýšení exprese receptoru zalphal 1 po 4 hodinách stimulace, které ve 24 hodinách pokleslo zpět na klidové hodnoty. Monocyty nevykazovaly v tomto testu detekovatelnou expresi receptoru zalphal 1.

Příklad 20: Zjišťování buněk exprimujících receptor zalphal 1 pomocí hybridizace in šitu.

·· ···· • » · «·· · · ·» • · ···· · · · • ·*· ···»>·· · · ·········

104 *......* * ” ’··

Určité lidské tkáně byly izolovány a u nich byla u nich pomocí hybridizace in šitu testována exprese zalphall. Různé lidské tkáně připravené, nakrájené na plátky, na kterých byla provedena hybridizace in šitu, zahrnovaly brzlík, slezinu, mandle, lymfatické uzliny a plíce. Tkáně byly fixovány v 10% pufrovaném formalínu a zality do parafínu běžně používanými technikami (příklad 17). Tkáně byly nakrájené na plátky o tloušťce 4 až 8 mikrometrů. Tkáně byly připravovány podle standardního postupu (Development of non-isotopic in šitu hybridization na http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/ish html). Krátce řečeno, tkáňové řezy byly zbaveny parafínu pomocí HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) a potom dehydratovány v ethanolu. Příští den byly štěpeny proteinázou K (50 gg/ml) (Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN) při 37 °C po dobu 2 až 20 minut. Po tomto kroku následovala acetylace a opětná hydratace tkání.

Pro lidskou sekvenci zalphall byly navrženy dvě in šitu sondy, připravené pomocí PCR. Byly navrženy dvě soupravy oligonukleotidů pro oddělené oblasti zalphall DNA: (1) oligonukleotidy ZC 23 684 (SEQ ID NO:62) a ZC 23 656 (SEQ ID NO:63) byly použity pro přípravu sondy pro zalphall, dlouhé 413 bp; a (2) oligonukleotidy ZC 23 685 (SEQ ID NO:64) a ZC 23 657 (SEQ ID NO:65) byly použity pro přípravu sondy pro zalphall, dlouhé 430 bp. Druhá sonda je umístěna 1500 bp ve směru 3' od první sondy pro zalphall. Antisense oligonukleotid z každé sady také obsahoval pracovní sekvenci pro T7 RNA polymerázový promotor, aby byla z těchto produktů umožněna snadná transkripce antisense RNA sond. Podmínky PCR reakce byly následující: 30 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 1 minuty, 72 °C po dobu 1,5 minuty. Produkty PCR byly čištěny na centrifugačních sloupcích Qiagen, potom následovala extrakce směsí fenol/chloroform a srážení ethanolem. Sondy byly potom označeny digoxigeninem (Boehringer) nebo biotinem (Boehringer) za použití in vitro transkripčního systému (Promega, Madison, Wl), podle návodu výrobce.

Hybridizace in šitu byla provedena se sondou pro zalphall, značenou digoxigeninem nebo biotinem (viz výše). Sonda byla přidána na plátky v koncentraci 1 až 5 pmol/ml po dobu 12 až 16 hodin při 55 až 60 °C. Plátky byly potom omyty v 2x SSC a 0,1x SSC při 50 °C. Signály byly zesíleny použitím tyramidové amplifikace signálu (TSA) (TSA, in šitu indirect kit, NEN) a zviditelněny soupravou Vector Red Substráte kit (Vector Lab) podle návodu výrobce. Řezy byly potom kontrastně obarveny hematoxylinem (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

•··· ··· ·· • · · · · · ♦ · · • · · · ♦ · · ·

Signál byl vidět v brzlíku, mandli, plíci a lymfatické uzlině. Pozitivně se barvícími buňkami se zdály být lymfocyty a buňky příbuzné.

Příklad 21: Izolace myšího receptorů zalphall.

A. Prohledávání myší genomové knihovny.

Původní částečná sekvence myšího zalphall byla získána sondováním myší genomové knihovny sondou připravenou z polynukleotidu lidského receptorů zalphall, obsahujícího celou cDNA. cDNA lidského zalphall byla připravena pomocí PCR s primery ZC 19 905 (SEQ ID NO:36) a ZC 19 906 (SEQ ID NO:37) a jako matrice byl použit plazmid, obsahující celou délku lidského zalphall (např. příklad 1). Podmínky PCR byly následující: 35 cyklů při 98 °C po dobu 1 minuty, 68 °C po dobu 1 minuty; a 72 °C po dobu 2 minut; následoval jeden cyklus při 72 °C po dobu 10 minut. Produkt PCR byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a přibližně 1,5 kb cDNA lidského zalphall byla izolována za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick™ gel extraction kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Tato cDNA lidského zalphall byla použita pro prohledávání myší genomové knihovny (viz dále).

Použitá myší genomové knihovna byla embl3 SP6/T7 lambda BamHl klonovaná knihovna (Clontech, Palo Alto, CA). Tato knihovna, představující 7,2x 10⁵ pfu, byla vyseta na narostlé hostitelské buňky E. coli K802 na plotnách 24 NZY. Otisky plaků byly provedeny pomocí filtrů Hybond-N (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, England, UK) podle návodu výrobce. Filtry byly denaturovány v 1,5 NaCI a 0,5 M NaOH po dobu 10 minut a potom neutralizovány v 1,5 NaCI a 0,5 M Tris-HCI (pH 7,2) po dobu 10 minut. DNA byla na filtr fixována pomocí zařízení STRATALINKER UV crosslinker (Stratagene) při 1200 joulech. Filtry byly předběžně promyty, aby se odstranily zlomky buněk při 65 °C v pufru pro předběžné promývání (0,25x SSC, 0,25% SDS a 1 mM EDTA), přičemž roztok byl vyměněn 3x za celkovou dobu 45 minut Filtry byly předhybridizovány přes noc při 50 °C v roztoku Expresshyb™ (Clontech), obsahujícím 0,1 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu. Přibližně 50 ng vyčištěné cDNA lidského zalphal 1 (viz výše) byla označena ³²P pomocí Rediprime II Random Prime Labeling Systém (Amersham Pharmacia), podle návodu výrobce. Nezabudovaná radiaktivita byla ze sondy pro cDNA zalphall odstraněna pomocí vytlačujícího sloupce NucTrap™ (Stratagene, La Jola, CA). Filtry byly hybridizovány v • · • · · · • · « · • · · · · · · ·· · • · · · · · · ·· • ··· ······· ··

106 *··* · ’··’ ·ί· roztoku Expresshyb™ (Clontech), obsahujícím přibližně 0,5 až 1x 10⁶ cpm/ml sondy pro cDNA zalphall, přibližně 0,1 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu a denaturovanou 0,5 pg/ml cot-1 DNA. Hybridizace byla provedena přes noc při 50 °C. Filtry byly promývány ve 2x SSC, 0,1% SDS při teplotě místnosti po dobu 2 hodin (promývací roztok byl několikrát vyměněn), potom byla teplota zvýšena na 60 °C po dobu 1 hodiny (promývací roztok byl 1x vyměněn). Expozice přes noc ukázala 6 plaků, představujících prvotní izoláty.

Pro získání sekundárních plakových izolátů bylo 6 plaků, představujících prvotní izoláty, vypíchnuto Pasteurovou pipetou a eluováno přes noc při 4 °C v 1 ml SM (0,1 M NaCI, 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgSO₄, 0,02% gelatin), obsahujícím několik kapek chloroformu. Po určení fágových titrů byl asi 12,5 násobek odhadnutého množství fága v původním plaku (12,5 pokrytí) šesti prvotních izolátů vyset na narostlé hostitelské buňky E. coli K802, zalité v 10 mM MgSOVNZY vrchní vrstvě agarózy na plotnách NZY maxi a ponecháno růst přes noc při 37 °C. Otisky plaků byly provedeny pomocí filtrů Hybond-N (Amersham Pharmacia) podle návodu výrobce. Filtry byly fixovány jak bylo uvedeno výše. Filtry druhého kola byly předběžně promyty, aby se odstranily zlomky buněk při 65 °C v pufru pro předběžné promývání (2x SSC, 0,1% SDS a 1 mM EDTA), přičemž roztok byl vyměněn 3x za celkovou dobu 45 minut. Filtry druhého kola potom byly předhybridizovány a sonda pro zalphall cDNA byla připravena tak, jak bylo popsáno výše.

Filtry druhého kola byly hybridizovány stejně jak bylo popsáno výše v roztoku Expresshyb™ (Clontech), obsahujícím přibližně 10⁶ cpm/ml sondy pro cDNA zalphall a přibližně 0,1 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu. Hybridizace byla provedena přes noc při 50 °C. Promývací podmínky, popsané výše pro primární prohledávání, byly opakovaně použity pro prohledávání sekundární. Po expozici přes noc při -80 °C byly z 6 původních prvotních plaků 2 ověřeny v sekundárním prohledávání jako pozitivní. Pozitivní plaky, hybridizující s lidskou zalphall cDNA v sekundárním prohledávání byly vypíchnuty Pasteurovou pipetou a označeny 7b1 a 20b1.

Izolované plaky č. 7b1 a 20b1 byly eluovány v 200 μΙ SM přes noc při 4 °C.

Sériová 10násobná ředění v rozmezí od 10'² do 10“⁶ od každého izolátů byla kvůli určení titru vyseta na hostitelské buňky E. coli K802. Izolát 20b1 měl titr 4x 10³ pfu/ml a bylo s ním dále pokračováno. Na 4 plotny se souvislým nárůstem hostitelských buněk ···· • ·

4 4 444 444

4 4444 44 «44 4444444 4

E. coli K802 bylo vyseto 10⁵ pfu/plotnu, pro přípravu preparátu DNA tohoto fága. Plaky byly ponechány růst po dobu asi 6,5 hodiny při 37 °C, dokud fágová lyže nezačala být souvislá. Fág z každé plotny byl potom eluován přes noc při 4 °C do 12 ml SM. Plotny byly potom třepány při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, supernatant byl potom odebrán; bylo přidáno 1 % chloroformu a supernatant byl třepán znovu po dobu 15 minut. DNA fága 20b 1 byla připravena za použití systému Wizard Lambda Preps DNA Purification Systém (Promega, Madison, Wl; odstavce IV a VI).

Vzorku DNA fága 20b1 byly štěpeny několika restrikčními enzymy, aby byly připraveny DNA fragmenty pro metodu Southern bloting. Produkty štěpení byly elektroforézovány na 1% agarózovém gelu v pufru TBE. Gel byl namočen v 0,25 M HCI po dobu 30 minut; opláchnut v destilované H₂O; namočen v 0,5 M NaOH a 1,5 M NaCl po dobu 40 minut s jednou výměnou roztoku a neutralizován v 1,5 M NaCl a 0,5 M TrisHCI (pH 7,2) po dobu 40 minut s jednou výměnou roztoku. Pro přenos DNA na membránu Nytran/BA-S (Schleicher & Schuell) byl proveden přes noc na zařízení TURBOBLOTTER™ Rapid Downward Transfer Systém (Schleicher & Schuell, Keene, NH). DNA byla na Nytran fixována pomocí zařízení STRATALINKER UV crosslinker (Stratagene, La Jolla, CA) při 1200 joulech. Blot byl předhybridizován, jak bylo popsáno výše. Asi 50 ng cDNA lidského zalphal 1 bylo označeno a vyčištěno jako sonda, jak bylo popsáno výše. Filtry byly hybridizovány stejně jak bylo popsáno výše v roztoku Expresshyb™ (Clontech), obsahujícím asi 10⁶ cpm/ml sondy pro cDNA zalphall a asi 0,1 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu. Hybridizace byla provedena přes noc při 50 °C. Bloty byly promyty tak, jak bylo popsáno výše a exponovány na film přes noc při -80 °C.

Metoda Southern ukázala DNA fragment, vytvořený štěpením BamHl/Stul, který hybridizoval se sondou k cDNA lidského zalphall v očekávaném velikostním rozsahu

1,3 až 1.6 kb. S tímto fragmentem bylo dále pokračováno. Přibližně 3 pg 20b1 lambda DNA bylo štěpeno 20 jednotkami BamHI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a 20 jednotkami Stul (NEB, Beverly, MA) po dobu 2 hodin při 37 °C. Produkty štěpení byly elektroforézovány na 1% agarózovém gelu v pufru TBE a dvojitý proužek o délce 1,3 kb a dvojitý proužek o délce 1,6 kb byly z gelu vyříznuty a DNA byla extrahována z agarózy za použití soupravy Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Kvůli nízkému výtěžku DNA z preparátu nebylo možné provést další analýzu restrikčního štěpení zda fragmenty, které hybridizovaly se sondou k cDNA lidského zalphall, byly «····· · · · ·· • · · · · 9 9

9 9 9 · · · · • 999 9999999 9

108 fragmenty BamHl/Stul nebo Stuf/Stuf. Byla tedy provedena ligace s tupými konci za použití 5 μΙ dvojitého fragmentu o délce 1,3 kb a 5 μΙ dvojitého fragmentu o délce 1,6 kb pomocí soupravy Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ligace s tupými konci poskytla pozitivní klony s oběma fragmenty o délce 1,6 kb a jedním z fragmentů o délce 1,3 kb. Tyto klony byly štěpeny EcoRI (Life Technologies), která sousedí s místem s přesahujícím T, kde byly vloženy fragmenty o délce 1,6 kb a 1,3 kb. Byl proveden další Southern blot, aby se zjistilo, který byl původní fragment, hybridizující se sondou k cDNA lidského zalphall. 1% agarózový gel v TBE pufru byl zpracován a DNA byla přenesena na Nytranový blot, jak bylo popsáno výše,

Blot byl předhybridizován, jak bylo popsáno výše, v 10 ml hybridizačního roztoku. Byly připraveny různé polynukleotidy lidského zalphall. Pro použití jako sonda, byl pomocí PCR reakce připraven jiný fragment cDNA lidského zalphall o plné délce, přičemž PCR reakce byla provedena za použití oligonukleotidů ZC 19 905 (SEQ ID NO:36) a ZC 19 906 (SEQ ID NO:37). Podmínky PCR byly následující: 95 °C po dobu 1 minuty; 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty; a 72 °C po dobu 2 minut; následoval jeden cyklus při 72 °C po dobu 10 minut. Produkt PCR byl elektroforézován na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání (Boehringer Mannheim) a přibližně 1,5 kb cDNA lidského zalphall byla izolována za použití soupravy pro extrakci z gelu Qiaquick™ gel extraction kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Asi 50 ng tohoto izolovaného fragmentu cDNA lidského zalphall bylo označeno ³²P a purifikováno, jak bylo popsáno výše. Filtry byly hybridizovány tak, jak bylo popsáno výše, v roztoku Expresshyb™ (Clontech), obsahujícím asi 10⁶ cpm/ml sondy pro cDNA zalphall, asi 0,1 mg/ml denaturované DNA z lososího spermatu a denaturovanou 0,5 pg/ml cot-1 DNA. Hybridizace a promývání bylo provedeno tak, jak bylo popsáno výše. Blot byl exponován na film po dobu 1,5 hodiny při teplotě -80 °C a ukázalo se, že inzert o délce 1,3 kb silně hybridizoval se sondou pro lidský zalphal 1.

Tento klon byl sekvenován a bylo zjištěno, že obsahuje 3' kódující exon myšího zalphall s terminačním kodonem a sekvencí intronu, nacházejícího se proti směru přepisu. Sekvenační primery byly: ZC 3428 (SEQ ID NO:86), ZC 694 (SEQ ID NO:87), ZC 4399 (SEQ ID NO:88) a ZC 4400 (SEQ ID NO:89). Genomová sekvence myšího zalphall, včetně 3' exonu je ukázána v SEQ ID NO:69. Sekvence 3' kódující exonu začíná na nukleotidu 543 a končí na nukleotidu 1262 v SEQ ID NO:69 a kóduje 240 aminokyselin dlouhý exon (SEQ ID NO:70).

109

999999 ·· 9 ·· • 9 9 9 9 ·· • · · · · ♦ 99

Λ 999 99999999

Β. Prohledávání panelu myší cDNA pomocí PCR.

Panely myších cDNA připravené vlastnoručně nebo dostupné komerčně (Clontech; Life Technologies, Gaithersburg, MD) byly prohledávány pomocí PCR za použití primeru ZC 24 432 (SEQ ID NO:71) a ZC 24 433 (SEQ ID NO:72) (každý v množství 20 pmol). Podmínky PCR byly následující: 94 °C po dobu 2 minut; 32 cyklů při 94 °C po dobu 20 sekund, 64 °C po dobu 30 sekund; a 72 °C po dobu 30 sekund; následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 5 minut. Velké množství PCR produktů o předpovídané velikosti 450 bp bylo nalezeno v myší slezině, dendritických buňkách, kůži novorozených mláďat, kostním morku, standardním typu buněk BaF3, buňkách EL4 a plících.

C. 5'-uhnízděná metoda rychlé amplifikace konců vláken (RACE).

Reakce 5'RACE byly provedeny za použití 20 pmol každého z primerů ZC 9739 (SEQ ID NO:73) a ZC 24 434 (SEQ ID NO:74) a jako matrice byla použita maratón cDNA ze selektovaných buněk CD90+ z myší sleziny. Maratón cDNA byla připravena za použití soupravy Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) podle návodu výrobce. Podmínky PCR reakce byly následující: 94 °C po dobu 1 minuty; 5 cyklů při 94 °C po dobu 20 sekund, a při 70 °C po dobu 1,5 minuty; následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 20 sekund, 64 °C po dobu 20 sekund; a 70 °C po dobu 1,5 minuty; následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 5 minut.

Aby byl obohacen 5'RACE produkt myší zalphall, byla provedena uhnízděná 5'RACE reakce za použití podmínek PCR reakce, popsaných výše pro úvodní 5'RACE, s výjimkou toho, že byly použity uhnízděné primery ZC 24 431 (SEQ ID NO:75) a ZC 9719 (SEQ ID NO:76) a jako matrice jeden mikrolitr 20násobného zředění úvodní 5'RACE reakce (viz výše). Produkt byl vyčištěn gelovou elektroforézou, DNA byla eluována za použití soupravy Qiaex II Agarose Gel Extraction Kit (Qiagen) a klonován za použití soupravy TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). Pozitivní klony byly určeny pomocí PCR za použití 10 pmol každého z primerů ZC 24 431 (SEQ ID NO:75) a ZC 24 511 (SEQ ID NO:77). Podmínky PCR reakce byly následující: 94 °C po dobu 2 minut; 35 cyklů při 94 °C po dobu 20 sekund, 64 °C po dobu 20 sekund; a 72 °C po dobu 20 sekund; následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 5 minut. Dva klony z každé uhnízděné 5'RACE reakce byly sekvenovány. Všechny klony obsahovaly část sekvence zalphall, ale žádný nebyl kompletní. Z nekompletních 5'RACE klonů a ze sekvence 3'exonu (SEQ ID NO:70), představujícího částečnou předběžnou sekvenci

4 4*44 44 4

444 4444444 4 4

110 ···· *··* *··* · *··’ ··’ polynukleotídu myšího zalphall, byla vytvořena souhrnná sekvence a jí odpovídající polypeptid. Předběžná sekvence částečné cDNA myší zalphall je uvedena v SEQ ID N078 (5'konec) a v SEQ ID NO:80 (3'konec); existovalo přibližně 330 nukleotidů ještě neznámé sekvence mezi SEQ ID N078 (5'konec) a v SEQ ID NO:80 (3'konec), patřících do kompletní cDNA myší zalphall (víz dále). Odpovídající aminokyselinové sekvence pro SEQ ID N078 a SEQ ID NO:80 jsou uvedeny v SEQ ID N079 (Nkonec) respektive v SEQ ID NO:81 (C-konec).

D. Získání celého produktu pomocí PCR reakce.

Byly navrženy primery pro PCR celého produktu a to podle myší oblasti proti směru přepisu UTR od iniciačního kodonu Met a podle oblasti po směru přepisu od terminačního kodonu. Dvacet pikomolů každého z primeru ZC 24 616 (SEQ ID NO:82) a ZC 24 615 (SEQ ID NO:83) bylo použito v PCR reakcích, ve kterých byly jako matrice použity maratón cDNA z myších dendritických buněk nebo vlastnoručně připravená cDNA knihovna z kůže novorozených myších mláďat. Podmínky PCR reakce byly následující: 94 °C po dobu 1 minuty; 30 cyklů při 94 °C po dobu 20 sekund, 66 °C po dobu 2 minut; následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 5 minut. Produkty PCR byly vyčištěny gelovou elektroforézou a cDNA byla eluována za použití soupravy Qiaquick Gel Extraction Kit a klonovány za použití soupravy TA Cloning Kit (Invitrogen). Dva klony z každé PCR reakce byly sekvenovány. Byly použity sekvenační primery: ZC 694 (SEQ ID NO:87), ZC 3424 (SEQ ID NO:86), ZC 24 431 (SEQ ID NO75), ZC 24 511 (SEQ ID N077), ZC 24 806 (SEQ ID NO:90) a ZC 24 807 (SEQ ID NO:91). Sekvence celé délky cDNA myší zalphall je ukázána v SEQ ID NO:84. Odpovídající aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID NO:85.

Z toho, co bylo v předchozím uvedeno, by si čtenář měl být vědom toho, že třebaže zde byla popsána specifická provedení pro ilustrační účely, mohou být provedeny různé modifikace bez toho, že by došlo k odchýlení od povahy a rámce vynálezu. Vynález tedy není omezen, je omezen pouze připojenými nároky.

//7

SEZNAM SEKVENCÍ <110> ZymoGenetiqs,' lne.

<120> CYTOKINOVÝ RECEPTOR ZALPHAll <130 98-55PC <150 09/159,254 <151> 1998-09-23 <150> 09/265,117 <151> 1999-03-09 <150> 09/347,930 <151> 1999-07-06 <160> 91 <170> FastSEQ pro Windows verze 3.0 <210> 1 <211> 2887 <212> DNA <213> Homo sapiens <220 <221> CDS <222> (69)...(1682) <400> 1 gaagcagcag gtaccccctc cacatcccta gggctctgtg atgtaggcag aggcccgtgg 60 gagtcagc atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg ctg ctc 110

Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10

cag

gga

ggc

tgg

ggc

tgc

ccc

gac

ctc

gtc

tgc

tac

acc

gat

tac

ctc

158

Gin

Gly

Gly

Trp

Gly

Cys

Pro

Asp

Leu

Val

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

15

20

25

30

cag

acg

gtc

atc

tgc

atc

ctg

gaa

atg

tgg

aac

ctc

cac

ccc

agc

acg

206

Gin

Thr

Val

Ile

Cys

Ile

Leu

Glu

Met

Trp

Asn

Leu

His

Pro

Ser

Thr

35

40

45

ctc

acc

ctt

acc

tgg

caa

gac

cag

tat

gaa

gag

ctg

aag

gac

gag

gcc

254

i zj

Ί ůí

Leu

Thr

Leu

Thr

Trp

Gin Asp

Gin

Tyr

Glu

Glu

Leu

Lys

Asp

Glu

Ala

50

55

60

acc

tcc

tgc

agc

ctc

cac„ -agg

tcg

gcc

cac

aat

gcc

acg

cat

gcc

acc

302

Thr

Ser

Cys

Ser

Leu

Hís Arg

Ser

Ala

His

Asn

Ala

Thr

His

Ala

Thr

65

70

75

tac

acc

tgc

cac

atg

gat gta

ttc

cac

ttc

atg

gcc

gac

gac

att

ttc

350

Tyr

Thr

Cys

His

Met

Asp Val

Phe

His

Phe

Met

Ala

Asp

Asp

Ile

Phe

80

85

90

agt

gtc

aac

atc

aca

gac cag

tet

ggc

aac

tac

tcc

cag

gag

tgt

ggc

398

Ser

Val

Asn

Ile

Thr

Asp Gin

Ser

Gly

Asn

Tyr

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

95

100

105

110

agc ttt ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg 446

Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val

115

120

125

act

gtg

acc

ttc

tca

gga

cag

tat

aat

atc

tcc

tgg

ege

tca

gat

tac

494

Thr

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Gin

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Arg

Ser

Asp

Tyr

130

135

140

gaa

gac

cct

gcc

ttc

tac

atg

ctg

aag

ggc

aag

ctt

cag

tat

gag

ctg

542

Glu

Asp

Pro

Ala

Phe

Tyr

Met

Leu

Lys

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

145

150

155

cag

tac

agg

aac

cgg

gga

gac

ccc

tgg

gct

gtg

agt

ccg

agg

aga

aag

590

Gin

Tyr

Arg

Asn

Arg

Gly

Asp

Pro

Trp

Ala

Val

Ser

Pro

Arg

Arg

Lys

160

165

170

ctg

atc

tca

gtg

gac

tca

aga

agt

gtc

tcc

ctc

ctc

ccc

ctg

gag

ttc

638

Leu

Ile

Ser

Val

Asp

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Leu

Glu

Phe

175

180

185

190

ege

aaa

gac

tcg

agc

tat

gag

ctg

cag

gtg

cgg

gca

ggg

ccc

atg

cct

686

Arg

Lys

Asp

Ser

Ser

Tyr

Glu

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

Gly

Pro

Met

Pro

195

200

205

ggc

tcc

tcc

tac

cag

ggg

acc

tgg

agt

gaa

tgg

agt

gac

ccg

gtc

atc

734

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Asp

Pro

Val

Ile

210

215

220

ttt cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cct cac ctg

782 • ···

Phe Gin Thr Gin Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His

225 230 235

Leu

ctg

ctt

ctc

ctc

ctg

c-ťt.

-gtc

ata

gtc

ttc

att

cct

gcc

ttc

tgg

agc

830

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Léu

Val

Ile

Val

Phe

Ile

Pro

Ala

Phe

Trp

Ser

240

245

250

ctg

aag

acc

cat

cca

ttg

tgg

agg

cta

tgg

aag

aag

ata

tgg

gcc

gtc

878

Leu

Lys

Thr

His

Pro

Leu

Trp

Arg

Leu

Trp

Lys

Lys

Ile

Trp

Ala

Val

255

260

265

270

ccc

agc

cct

gag

cgg

ttc

ttc

atg

ccc

ctg

tac

aag

ggc

tgc

agc

gga

926

Pro

Ser

Pro

Glu

Arg

Phe

Phe

Met

Pro

Leu

Tyr

Lys

Gly

Cys

Ser

Gly

275

280

285

gac

ttc

aag

aaa

tgg

gtg

ggt

gca

ccc

ttc

act

ggc

tcc

agc

ctg

gag

974

Asp

Phe

Lys

Lys

Trp

Val

Gly

Ala

Pro

Phe

Thr

Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

290 295 300

ctg

gga

ccc

tgg

agc

cca

gag

gtg

ccc

tcc

acc

ctg

gag

gtg

tac

agc

1022

Leu

Gly

Pro

Trp

Ser

Pro

Glu

Val

Pro

Ser

Thr

Leu

Glu

Val

Tyr

Ser

305

310

315

tgc

cac

cca

cca

cgg

agc

ccg

gcc

aag

agg

ctg

cag

ctc

acg

gag

cta

1070

Cys

His

Pro

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Lys

Arg

Leu

Gin

Leu

Thr

Glu

Leu

320

325

330

ca a

gaa

cca

gca

gag

ctg

gtg

gag

tet

gac

ggt

gtg

ccc

aag

ccc

agc

1118

Gin

Glu

Pro

Ala

Glu

Leu

Val

Glu

Ser

Asp

Gly

Val

Pro

Lys

Pro

Ser

335

340

345

350

ttc

tgg

ccg

aca

gcc

cag

aac

tcg

ggg

ggc

tea

gct

tac

agt

gag

gag

1166

Phe

Trp

Pro

Thr

Ala

Gin

Asn

Ser

Gly

Gly

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Glu

355

360

365

agg

gat

cgg

cca

tac

ggc

ctg

gtg

tcc

att

gac

aca

gtg

act

gtg

cta

1214

Arg

Asp

Arg

Pro

Tyr

Gly

Leu

Val

Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Leu

370

375

380

gat

gca

gag

ggg

cca

tgc

acc

tgg

ccc

tgc

agc

tgt

gag

gat

gac

ggc

1262

Asp

Ala

Glu

Gly

Pro

Cys

Thr

Trp

Pro

Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

Asp

Gly

385

390

395

tac

cca

gcc

ctg

gac

ctg

gat

gct

ggc

ctg

gag

ccc

agc

cca

ggc

cta

1310

Tyr Pro Ala

400

Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly

405 410

Leu

gag

gac

cca

ctc

ttg

gat

-gca

ggg

acc

aca

gtc

ctg

tcc

tgt

ggc

tgt

1358

Glu

Asp

Pro

Leu

Leu

Ašp

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Leu

Ser

Cys

Gly

Cys

415

420

425

430

gtc

tea

get

ggc

age

cct

ggg

cta

gga

ggg

ccc

ctg

gga

age

ctc

ctg

1406

Val

Ser

Ala

Gly

Ser

Pro

Gly

Leu

Gly

Gly

Pro

Leu

Gly

Ser

Leu

Leu

435

440

445

gac

aga

cta

aag

cca

ccc

ctt

gca

gat

ggg

gag

gac

tgg

get

ggg

gga

1454

Asp

Arg

Leu

Lys

Pro

Pro

Leu

Ala

Asp

Gly

Glu

Asp

Trp

Ala

Gly

Gly

450

455

460

ctg

ccc

tgg

ggt

ggc

cgg

tea

cct

gga

ggg

gtc

tea

gag

agt

gag

gcg

1502

Leu

Pro

Trp

Gly

Gly

Arg

Ser

Pro

Gly

Gly

Val

Ser

Glu

Ser

Glu

Ala

465

470

475

ggc

tea

ccc

ctg

gcc

ggc

ctg

gat

atg

gac

acg

ttt

gac

agt

ggc

ttt

1550

Gly

Ser

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Asp

Met

Asp

Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

Phe

480

485

490

gtg

ggc

tet

gac

tgc

age

age

cct

gtg

gag

tgt

gac

ttc

acc

age

ccc

1598

Val

Gly

Ser

Asp

Cys

Ser

Ser

Pro

Val

Glu

Cys

Asp

Phe

Thr

Ser

Pro

495

500

505

510

ggg

gac

gaa

gga

ccc

ccc

cgg

age

tac

ctc

ege

cag

tgg

gtg

gtc

att

1646

Gly

Asp

Glu

Gly

Pro

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu

Arg

Gin

Trp

Val

Val

Ile

515

520

525

cct

ccg

cca

ctt

tcg

age

cct

gga

ccc

cag

gcc

age

taat

:gagc

|Ct

1692

Pro

Pro

Pro

Leu

Ser

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Ala

Ser

530

535

gactggatgt ccagagctgg ccaggccact gggccctgag ccagagacaa ggtcacctgg 1752 gctgtgatgt gaagacacct gcagcctttg gtctcctgga tgggcctttg agcctgatgt 1812 ttacagtgtc tgtgtgtgtg tgtgcatatg tgtgtgtgtg catatgcatg tgtgtgtgtg 1872 tgtgtgtctt aggtgcgcag tggcatgtcc acgtgtgtgt gtgattgcac gtgcctgtgg 1932 gcctgggata atgcccatgg tactccatgc attcacctgc cctgtgcatg tctggactca 1992 cggagctcac ccatgtgcac aagtgtgcac agtaaacgtg tttgtggtca acagatgaca 2052 acagccgtcc tccctcctag ggtcttgtgt tgcaagttgg tccacagcat ctccggggct 2112 ttgtgggatc agggcattgc ctgtgactga ggcggagccc agccctccag cgtctgcctc 2172 caggagctgc aagaagtcca tattgttcct tatcacctgc caacaggaag cgaaagggga 2232 tggagtgagc ccatggtgac ctcgggaatg gcaatttttt gggcggcccc tggacgaagg 2292

tctgaatccc gactctgata ccttctggct gtgctacctg agccaagtcg cctcccctct 2352 ctgggctaga gtttccttaťccagacagtg gggaaggcat gacacacctg ggggaaattg 2412 gcgatgtcac ccgtgtacgg-tacgcagccc agagcagacc ctcaataaac gtcagcttcc 2472 ttccttctgc ggccagagcc gaggcgggcg ggggtgagaa catcaatcgt cagcgacagc 2532 ctgggcaccc gcggggccgt/cccgcctgca gagggccact cgggggggtt tccaggctta 2592 aaatcagtcc gtttcgtctc ttggaaacag ctccccacca accaagattt ctttttctaa 2652 cttctgctac taagttttta aaaattccct ttatgcaccc aagagatatt tattaaacac 2712 caattacgta gcaggccatg gctcatggga cccacccccc gtggcactca tggagggggc 2772 tgcaggttgg aactatgcag tgtgctccgg ccacacatcc tgctgggccc cctaccctgc 2832 cccaattcaa tcctgccaat aaatcctgtc ttatttgttc atcctggaga attga 2887 <210> 2 <211> 538 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met

Pro

Arg

Gly

Trp

Ala

Ala

Pro

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Gly

1

5

10

15

Gly

Trp

Gly

Cys

Pro

Asp

Leu

Val

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

Thr

20

25

30

Val

Ile

Cys

Ile

Leu

Glu

Met

Trp

Asn

Leu

His

Pro

Ser

Thr

Leu

Thr

35

40

45

Leu

Thr

Trp

Gin

Asp

Gin

Tyr

Glu

Glu

Leu

Lys

Asp

Glu

Ala

Thr

Ser

50

55

60

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Ala

His

Asn

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Tyr

Thr

65

70

75

80

Cys

His

Met

Asp

Val

Phe

His

Phe

Met

Ala

Asp

Asp

Ile

Phe

Ser

Val

85

90

95

Asn

Ile

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Tyr

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

Phe

100

105

110

Leu

Leu

Ala

Glu

Ser

Ile

Lys

Pro

Ala

Pro

Pro

Phe

Asn

Val

Thr

Val

115

120

125

Thr

Phe

Ser

Gly

Gin

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Arg

Ser

Asp

Tyr

Glu

Asp

130 135 140

Pro Ala Phe Tyr

Met

Leu

Lys

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

145

150

155

160

Arg Asn Arg Gly

Asp

Pro

Trp

Ala

Val

Ser

Pro

Arg

Arg

Lys

Leu

Ile

165

170

175

Ser Val Asp Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Leu

Glu

Phe

Arg

Lys

180

185

190

Asp Ser Ser Tyr

Glu

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

Gly

Pro

Met

Pro

Gly

Ser

195

200

205

Ser Tyr Gin Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Asp

Pro

Val

Ile

Phe

Gin

210

215

220

····«· · · · · · ·· · · · · · · · • · · · · > ·· • · · · ·····«· ·

Thr

Gin

Ser

Glu

Glu

Leu

Lys

Glu

Gly

Trp

Asn

Pro

His

Leu

Leu

Leu

225

230

235

240

Leu

Leu

Leu

Leu

Val

Ile

Val

Phe

Ile

Pro

Ala

Phe

Trp

Ser

Leu

Lys

245

250

255

Thr

His

Pro

Leu

Trp

Arg

Leu

Trp

Lys

Lys

Ile

Trp

Ala

Val

Pro

Ser

260

265

270

Pro

Glu

Arg

Phe

Phe

Met

Pro

Leu

Tyr

Lys

Gly

Cys

Ser

Gly

Asp

Phe

275

280

285

Lys

Lys

Trp

Val

Gly

Ala

Pro

Phe

Thr

Gly

Ser

Ser

Leu

Glu

Leu

Gly

290

295

300

Pro

Trp

Ser

Pro

Glu

Val

Pro

Ser

Thr

Leu

Glu

Val

Tyr

Ser

Cys

His

305

310

315

320

Pro

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Lys

Arg

Leu

Gin

Leu

Thr

Glu

Leu

Gin

Glu

325

330

335

Pro

Ala

Glu

Leu

Val

Glu

Ser

Asp

Gly

Val

Pro

Lys

Pro

Ser

Phe

Trp

340

345

350

Pro

Thr

Ala

Gin

Asn

Ser

Gly

Gly

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Glu

Arg

Asp

355

360

365

Arg

Pro

Tyr

Gly

Teu

Val

Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Leu

Asp

Ala

370

375

380

Glu

Gly

Pro

Cys

Thr

Trp

Pro

Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

Asp

Gly

Tyr

Pro

385

390

395

400

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp.

Ala

Gly

Leu

Glu

Pro

Ser

Pro

Gly

Leu

Glu

Asp

405

410

415

Pro

Leu

Leu

Asp

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Leu

Ser

Cys

Gly

Cys

Val

Ser

420

425

430

Ala

Gly

Ser

Pro

Gly

Leu

Gly

Gly

Pro

Leu

Gly

Ser

Leu

Leu

Asp

Arg

435

440

445

Leu

Lys

Pro

Pro

Leu

Ala

Asp

Gly

Glu

Asp

Trp

Ala

Gly

Gly

Leu

Pro

450.

455

460

Trp

Gly

Gly

Arg

Ser

Pro

Gly

Gly

Val

Ser

Glu

Ser

Glu

Ala

Gly

Ser

465

470

475

480

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Asp

Met

Asp

Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

Phe

Val

Gly

485

490

495

Ser

Asp

Cys

Ser

Ser

Pro

Val

Glu

Cys

Asp

Phe

Thr

Ser

Pro

Gly

Asp

500

505

510

Glu

Gly

Pro

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu

Arg

Gin

Trp

Val

Val

Ile

Pro

Pro

515

520

525

Pro

Leu

Ser

Ser

Pro

Gly

Pro

Gin

Ala

Ser

530

535

<210> 3 <211> 5 <212> PRT ^<213^> umělá sekvence

···♦ <220 <223> konsenzuálni aminokyselinový motiv <221> varianta <222> (1)...(5) <223> Xaa = jakákoli aminokyselina <221> varianta <222> (1)...(5) <223> Xaa = jakákoli aminokyselina <400 3

Trp Ser Xaa Trp Ser

5 <210> 4 <211> 1614 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> degenerovaná nukleotidová sekvence zalphall <221> význačný rys <222> (1)...(1614) <223> n = A, T, C nebo G <221> význačný rys <222> (1)...(1614) <223> n = A, T, C nebo G <400> 4 atgccnmgng gntgggcngc nccnytnytn ytnytnytny tncarggngg ntggggntgy60 ccngayytng tntgytayac ngaytayytn caracngtna thtgyathyt ngaratgtgg120 aayytncayc cnwsnacnyt nacnytnacn tggcargayc artaygarga rytnaargay180 gargcnacnw sntgywsnyt ncaymgnwsn gcncayaayg cnacncaygc nacntayacn240 tgycayatgg aygtnttyca yttyatggcn gaygayatht tywsngtnaa yathacngay300 carwsnggna aytaywsnca rgartgyggn wsnttyytny tngcngarws nathaarccn360 gcnccnccnt tyaaygtnac ngtnacntty wsnggncart ayaayathws ntggmgnwsn420 gaytaygarg ayccngcntt ytayaťgytn aarggnaary tncartayga rytncartay480 mgnaaymgng gngayccntg ggcngtnwsn ccnmgnmgna arytnathws ngtngaywsn540 mgnwsngtnw snytnytncc nytngartty mgnaargayw snwsntayga rytncargtn600 mgngcnggnc cnatgccngg nwsnwsntay carggnacnt ggwsngartg gwsngayccn660 gtnathttyc aracncarws ngargarytn aargarggnt ggaayccnca yytnytnytn720

ytnytnytny tngtnathgt jittyathccn gcnttytggw snytnaarac ncayccnytn 780 tggmgnytnt ggaaraaraťhtgggcngtn ccnwsnccng armgnttytt yatgccnytn 840 tayaarggnt gywsnggnga.yttyaaraar tgggtnggng cnccnttyac nggnwsnwsn 900 ytngarytng gnccntggws- ncengargtn ccnwsnacny tngargtnta ywsntgycay 960 ccnccnmgnw snccngcna.a'‘rmgnytncar ytnacngary tncargarcc ngcngarytn 1020 gtngarwsng ayggngtncc naarccnwsn ttytggccna cngcncaraa ywsnggnggn 1080 wsngcntayw sngargarmg ngaymgnccn tayggnytng tnwsnathga yacngtnacn 1140 gtnytngayg cngarggncc ntgyacntgg ccntgywsnt gygargayga yggntayccn 1200 gcnytngayy tngaygcngg nytngarccn wsnccnggny tngargaycc nytnytngay 1260 gcnggnacna cngtnytnws ntgyggntgy gtnwsngcng gnwsnccngg nytnggnggn 1320 ccnytnggnw snytnytnga ymgnytnaar ccnccnytng cngayggnga rgaytgggcn 1380 ggnggnytnc cntggggngg nmgnwsnccn ggnggngtnw sngarwsnga rgcnggnwsn 1440 ccnytngcng gnytngayat ggayacntty gaywsnggnt tygtnggnws ngaytgywsn 1500 wsnccngtng artgygaytt yacnwsnccn ggngaygarg gnccnccnmg nwsntayytn 1560 mgncartggg tngtnathcc nccnccnytn wsnwsnccng gnccnčargc.nwsn 1614 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC447 <400> 5 taacaatttc acacagg 17 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC976 <400> 6 cgttgtaaaa cgacggcc 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> . ...

<223> oligonukleotidový primer ZC19345 u

• 9 ·««· 99 9 ·<* • · 9 · · 9· * · 9 9 9 9 99 • 9 9 9 9 99«9 99· <400> 7 gaccagtctg gcaactactcx ' i

4~ <210> 8 ' <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence .

<220>

ί _;<223> oligonukleotidový primer ZC19346 <400> 8 gctctcagcc aggagaaagc 20 <210> 9 <2U> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19349 .

<400> 9 ggttggtggg gagctgtttc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> ..

<223> oligonukleotidový primer ZC19350 f

<400> 10 gggtgagaac atcaatcgtc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19458 ·» · • 4 ·

9 9 9

9 9999

9 9

9 ±e·· 44·· • · * •♦ 4 • 44 ··- ·99 <400> 11 catatcttct tccatagccťc <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19459 <400 12 ctcctcctgc ttgtcatagt c <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19460 <400> 13 gtaaacgtgt ttgtggtcaa c <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19461 <400> 14 tgccctgatc ccacaaagcc <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19572 <400> 15 ·· · *· φ

9 9 9 9 9 · · ·φ • · Φ Φ φ Φ Φ Φ φ • · · · Φ ΦΦΦ* « · ♦ φ ·····♦ 9 9 φ ···· ΦΦ ·Φ φ φφ φφφ

·· ···· gtcctgtggc tgtgtctcag 20 <210> 16 · . :

<211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19573 <400> 16 cagtcagagc ccacaaagcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19657:

<400> 17 ctgagacaca gccacaggac 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19181 <400> 18 tccacatccc tagggctctg tgat 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19182 <400> 19 gaggttccac atttccagga tgcag 25 • · · · • · · · · ······ ·

7Z.2.

ΊΤ <210 20 <211> 24 <212> DNA -A.·<213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19907 <400> 20 atggatgtat tccacttcat ggcc 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19908/ <400> 21 actgtcaaac gtgtccatat ccag 24 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19954· <400> 22 actgggctgg gggactgc 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19955 <400> 23 ccccggggct ggtgaagt • · ···· · · · • · ···· ·· • · · β ······· · ······ ·· · · · <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> umělá sekvence · <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC17212 <400 24 ggggaattcg aagccatgcc ctcttgggcc ctc 33 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19914 <400> 25 caatggatgg gtctttagca gcagtaggcc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19913 <400> 26 ggcctactgc tgctaaagac ccatccattg 30 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC20097 <400> 27 acatctagat tagctggcct ggggtccagg cgt 33 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> _ < .

<223> oligonukleotidový primer ZC12700 <400> 28 ggaggtctat ataagcagag c 21 ,<210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220 <223> oligonukleotidový primer ZC5020 <400 29 cactggagtg gcaacttcca g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC6675 ' <400> 30 gtggatgccg aacccagtcc 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC7727 <400> 31 tgttcacagc tacctgggct c 21 <210> 32 <211> 26 • 4 • · · ··· · · 4 • 4 · · · · ·· « · <* 4 4444444 4

444444 44 4 44 4

W

1S,

ΙΊ <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukíeotidový primer ZC8290 <400 32 ccaccgagac tgcttggatc accttg 26 <210> 33 ,<211> 21 <212> DNA ^<213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukíeotidový primer ZC6622 <400> 33 ctgggctgga aactggcaca c 21 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukíeotidový primer ZC7736 <400> 34 cactgtcaga aatggagc 18 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukíeotidový primer ZC9273 <400> 35 ggtccctccc cgggcaccga gaga 24 <210> 36 <211> 36 <212> DNA • ··· • 9

72á t6<213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19905 .

<400> 36 acaggatccg tcagcatgcc gcgtggctgg gccgcc 36 <210> 37 <211> 33 •<212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19906 .

<400> 37 acagaattct tagctggcct ggggtccagg cgt 33 <210 38 <211> 22 <212> DNA <213> umělá sekvence <220 <223> oligonukleotidový primer ZC20114 <400 38 cctgccttct ácatgctgaa gg 22 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19554 <400> 39 actgggctgg gggactgc 18 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> umělá sekvence ······ · · · · · « ♦ · · ··· · * · · • · · · · · ··<* • ··· ··»···· · · ··· ··· · · · ···· ·· ·· · ·· «·· w

tr <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC20116 <400> 40 .

agcacagtca ctgtgtcaat gg 22 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>

<223> aminokyselinová sekvence Glu-Glu (CEE) značky <400> 41

Glu Tyr Met Pro Met Glu

5 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19931 <400> 42 ggttggtacc gcaagatgcc gcgtggctgg gccgcc 36 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19932 <400> 43 cggaggatcc gtgagggttc cagccttcc 29 <210> 44 <211> 66 <212> DNA <213> umělá sekvence • · · · · · • ·

-fZT ±8I 'i <220> · ' <223> oligonukleotidový primer překlenujíci 5 konec zalphall a sousedící oblast vektoru <400> 44 tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc agggaattca tcgataatgc cgcgtggctg 60 ggccgc 66 <210> 45 <211> 699 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 699 <210> 46 <211> 62 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> první oligonukleotidový primer překlenující 3'konecizalphall extracelulární domény a 5'konec Fc4 <400> 46 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tcgtgagggt tccagccttc 60 ct 62 <210> 47 <211> 61 <212> DNA ······ 9 9 9 9 9

9 » · 999

9 9999 99 • 9 * 9 9999*99 9 *9*· 99 ·« 9 99 999

Μη rs<213> umělá sekvence <220> _z <223> druhý oligonukleotidový primer překlenuj lei 3'konec zalphall extracelulární domény a 5'konec Fc4 <400> 47 agacccagtc agaggagtta aaggaaggct ggaaccctca cgagcccaga tcttcagaca 60 a 61 <210> 48 <2U> 67 <212> DNA <213> umělá sekvence ..... ¹ <220>

<223> oligonukleotidový primer překlenují cl

3'konec Fc4 a sousedící oblast vektoru <400> 48 gtgggcctct ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tetagattat ttacccggag 60 acaggga 67 <210 49 <211> 8 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>

<223> aminokyselinová sekvence FLAG značky <400> 49

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1.5 <210> 50 <211> 1821 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> Polynukleotid kódující rozpustný fúzní receptor MBP-zalphall

99 9

<221> COS <222> (1)...(1821)

<

400>

50

atg

aaa

atc

gaa

gaa

.ggt

aaa

ctg

gta

atc

tgg

att

aac

ggc

gat

aaa

Met

Lys

Ile

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile

Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

ggc

tat

aac

ggt

ctc

gct

gaa

gtc

ggt

aag

aaa

ttc

gag

aaa

gat

acc

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

gga

att

aaa

gtc

acc

gtt

gag

cat

ccg

gat

aaa

ctg

gaa

gag

aaa

ttc

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

cca

cag

gtt

gcg

gca

act

ggc

gat

ggc

cct

gac

att

atc

ttc

tgg

gca

Pro

Gin

Val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

50

55

60

cac

gac

cgc

ttt

ggt

ggc

tac

gct

caa

tet

ggc

ctg

ttg

gct

gaa

atc

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser

Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Ile

65

70

75

80

acc

ccg

gac

aaa

gcg

ttc

cag

gac

aag

ctg

tat

ccg

ttt

acc

tgg

gat

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

gcc

gta

cgt

tac

aac

ggc

aag

ctg

att

gct

tac

ccg

atc

gct

gtt

gaa

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala

Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

gcg

tta

tcg

ctg

att

tat

aac

aaa

gat

ctg

ctg

ccg

aac

ccg

cca

aaa

Ala

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Asn

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

acc

tgg

gaa

gag

atc

ccg

gcg

ctg

gat

aaa

gaa

ctg

aaa

gcg

aaa

ggt

Thr

Trp

Glu

Glu

Ile

Pro

Ala

Leu

Asp

Lys

Glu

Leu

Lys

Ala

Lys

Gly

130

135

140

aag

agc

gcg

ctg

atg

ttc

aac

ctg

caa

gáa

ccg

tac

ttc

acc

tgg

ccg

Lys

Ser

Ala

Leu

Met

Phe

Asn

Leu

Gin

Glu

Pro

Tyr

Phe

Thr

Trp

Pro

145

150

155

160

ctg

att

gct

gct

gac

ggg

ggt

tat

gcg

ttc

aag

tat

gaa

aac

ggc

aag

144

192

240

288

336

384

432

480

528

• · · · · · • · · · ·

2S-

Leu

Ile

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Ala

Phe

Lys

Tyr

Glu

Asn

Gly

Lys

165

170

175

tac

gac

att

aaa

gac

gtg

-ggc

gtg

gat

aac

gct

ggc

gcg

aaa

gcg

ggt

576

Tyr

Asp

Ile

Lys

Asp

vál

Gly

Val

Asp

Asn

Ala

Gly

Ala

Lys

Ala

Gly

180

185

190

ctg

acc

ttc

ctg

gtt

gac

ctg

att

aaa

aac

aaa

cac

atg

aat

gca

gac

624

Leu

Thr

Phe

Leu

Val

Asp

Leu

Ile

Lys

Asn

Lys

His

Met

Asn

Ala

Asp

195

200

205

acc

gat

tac

tcc

atc

gca

gaa

gct

gcc

ttt

aat

aaa

ggc

gaa

aca

gcg

672

Thr

Asp

Tyr

Ser

Ile

Ala

Glu

Ala

Ala

Phe

Asn

Lys

Gly

Glu

Thr

Ala

210

215

220

atg

acc

atc

aac

ggc

ccg

tgg

gca

tgg

tcc

aac

atc

gac

acc

agc

aaa

720

Met

Thr

Ile

Asn

Gly

Pro

Trp

Ala

Trp

Ser

Asn

Ile

Asp

Thr

Ser

Lys

225

230

235

240

gtg

aat

tat

ggt

gta

acg

gta

ctg

ccg

acc

ttc

aag

ggt

caa

cca

tcc

768

Val

Asn

Tyr

Gly

Val

Thr

Val

Leu

Pro

Thr

Phe

Lys

Gly

Gin

Pro

Ser

245

250

255

aaa

ccg

ttc

gtt

ggc

gtg

ctg

agc

gca

ggt

att

aac

gcc

gcc

agt

ccg

816

Lys

Pro

Phe

Val

Gly

Val

Leu

Ser

Ala

Gly

Ile

Asn

Ala

Ala

Ser

Pro

260

265

270

aac

aaa

gag

ctg

gca

aaa

gag

ttc

ctc

gaa

aac

tat

ctg

ctg

act

gat

864

Asn

Lys

Glu

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Asn

Tyr

Leu

Leu

Thr

Asp

275

280

285

gaa

ggt

ctg

gaa

gcg

gtt

aat

aaa

gac

aaa

ccg

ctg

ggt

gcc

gta

gcg

912

Glu

Gly

Leu

Glu

Ala

Val

Asn

Lys

Asp

Lys

Pro

Leu

Gly

Ala

Val

Ala

290

295

300

ctg

aag

tet

tac

gag

gaa

gag

ttg

gcg

aaa

gat

cca

cgt

att

gcc

gcc

960

Leu

Lys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Glu

Leu

Ala

Lys

Asp

Pro

Arg

Ile

Ala

Ala

305

310

315

320

acc

atg

gaa

aac

gcc

cag

aaa

ggt

gaa

atc

atg

ccg

aac

atc

ccg

cag

1008

Thr

Met

Glu

Asn

Ala

Gin

Lys

Gly

Glu

Ile

Met

Pro

Asn

Ile

Pro

Gin

325

330

335

atg

tcc

gct

ttc

tgg

tat

gcc

gtg

cgt

act

gcg

gtg

atc

aac

gcc

gcc

1056

Met

Ser

Ala

Phe

Trp

Tyr

Ala

Val

Arg

Thr

Ala

Val

Ile

Asn

Ala

Ala

340

345

350

agc

ggt

cgt

cag

act

gťc

-gat

gaa

gcc

ctg

aaa

gac

gcg

cag

act

aat

1104

Ser

Gly

Arg

Gin

Thr

Val

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

Ala

Gin

Thr

Asn

355

360

365

tcg

agc

tcc

cac

cat

cac

cat

cac

cac

gcg

aat

tcg

gta

ccg

ctg

gtt

1152

Ser

Ser

Ser

His

His

His

His

His

His

Ala

Asn

Ser

Val

Pro

Leu

Val

370

375

380

ccg

cgt

gga

tcc

tgc

ccc

gac

ctc

gtc

tgc

tac

acc

gat

tac

ctc

cag

1200

Pro

Arg

Gly

Ser

Cys

Pro

Asp

Leu

Val

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

385

390

395

400

acg

gtc

atc

tgc

atc

ctg

gaa

atg

tgg

aac

ctc

cac

CCC

agc

acg

ctc

1248

Thr

Val

Ile

Cys

Ile

Leu

Glu

Met

Trp

Asn

Leu

His

Pro

Ser

Thr

Leu

405

410

415

acc

ctt

acc

tgg

caa

gac

cag

tat

gaa

gag

ctg

aag

gac

gag

gcc

acc

1296

Thr

Leu

Thr

Trp

Gin

Asp

Gin

Tyr

Glu

Glu

Leu

Lys

Asp

Glu

Ala

Thr

420

425

430

tcc

tgc

agc

ctc

cac

agg

tcg

gcc

cac

aat

gcc

acg

cat

gcc

acc

tac

1344

Ser

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Ala

His

Asn

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Tyr

435

440

445

acc

tgc

cac

atg

gat

gta

ttc

cac

ttc

atg

gcc

gac

gac

att

ttc

agt

1392

Thr

Cys

His

Met

Asp

Val

Phe

His

Phe

Met

Ala

Asp

Asp

Ile

Phe

Ser

450

455

460

gtc

aac

atc

aca

gac

cag

tet

ggc

aac

tac

tcc

cag

gag

tgt

ggc

agc

1440

Val

Asn

Ile

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Tyr

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

465

470

475

480

ttt

ctc

ctg

gct

gag

agc

atc

aag

ccg

gct

ccc

cct

ttc

aac

gtg

act

1488

Phe

Leu

Leu

Ala

Glu

Ser

Ile

Lys

Pro

Ala

Pro

Pro

Phe

Asn

Val

Thr

485

490

495

gtg

acc

ttc

tea

gga

cag

tat

aat

atc

tcc

tgg

ege

tea

gat

tac

gaa

1536

Val

Thr

Phe

Ser

Gly

Gin

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Arg

Ser

Asp

Tyr

Glu

500

505

510

gac

cct

gcc

ttc

tac

atg

ctg

aag

ggc

aag

ctt

cag

tat

gag

ctg

cag

1584

···· • 9 « · 9 99 • · · 9 ·«φ

999 99999999 /33

2-3-

Asp

Pro

Ala

Phe

Tyr

Met

Leu

Lys

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

515

520

525

tac

agg

aac

cgg

gga

gac.

-ccc

tgg

gct

gtg

agt

ccg

agg

aga

aag

ctg

1632

Tyr

Arg

Asn

Arg

Gly

Asp

Pro

Trp

Ala

Val

Ser

Pro

Arg

Arg

Lys

Leu

530

535

540

atc

tca

gtg

gac

tca

aga

agt

gtc

tcc

ctc

ctc

ccc

ctg

gag

ttc

cgc

1680

Ile

Ser

Val

Asp

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Leu

Glu

Phe

Arg

545

550

555

560

aaa

gac

tcg

agc

tat

gag

ctg

cag

gtg

cgg

gca

ggg

ccc

atg

cct

ggc

1728

Lys

Asp

Ser

Ser

Tyr

Glu

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

Gly

Pro

Met

Pro

Gly

565

570

575

tcc

tcc

tac

cag

ggg

acc

tgg

agt

gaa

tgg

agt

gac

ccg

gtc

atc

ttt

1776

Ser

Ser

Tyr

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Asp

Pro

Val

Ile

Phe

580

585

590

cag

acc

cag

tca

gag

gag

tta

aag

gaa

ggc

tgg

aac

cct

cac

tag

1821

Gin

Thr

Gin

Ser

Glu

Glu

Leu

Lys

Glu

Gly

Trp

Asn

Pro

His

*

595

600

605

<210> 51 <211> 606 <212> PRT <213> umělá sekvence <400> 51

Met

Lys

Ile

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ile Trp

Ile

Asn

Gly

Asp

Lys

1

5

10

15

Gly

Tyr

Asn

Gly

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Lys Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

Thr

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His

Pro

Asp Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

Pro

Gin

Val

Ala

Ala

Thr

Gly

Asp

Gly

Pro Asp

Ile

Ile

Phe

Trp

Ala

50

55

60

His

Asp

Arg

Phe

Oly

Gly

Tyr

Ala

Gin

Ser Gly

Leu

Leu

Ala

Glu

Ile

65

70

75

80

Thr

Pro

Asp

Lys

Ala

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

95

Ala

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

Ile

Ala Tyr

Pro

Ile

Ala

Val

Glu

100

105

110

Ala

Leu

Ser

Leu

Ile

Tyr

Asn

Lys

Asp

Leu Leu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

♦ · · φφφ

Thr	Trp Glu	Glu	Ile	Pro	Ala	Leu Asp Lys	Glu	Leu Lys	Ala	Lys	Gly
	130				135			140
Lys	Ser Ala	Leu	Met	Phe	Asn	Leu Gin Glu	Pro	Tyr Phe	Thr	Trp	Pro
145				150			155			160
Leu	Ile Ala	Ala	Asp	GTy	Gly	Tyr Ala Phe	Lys	Tyr Glu	Asn	Gly	Lys
			165			170				175
Tyr	Asp Ile	Lys	Asp	Val	Gly	Val Asp Asn	Ala	Gly Ala	Lys	Ala	Gly
		180				185			190
Leu	Thr Phe	Leu	Val	Asp	Leu	Ile Lys Asn	Lys	His Met	Asn	Ala	Asp
	195					200		205
Thr	Asp Tyr	Ser	Ile	Ala	Glu	Ala Ala Phe	Asn	Lys Gly	Glu	Thr	Ala
	210				215			220
Met	Thr Ile	Asn	Gly	Pro	Trp	Ala Trp Ser	Asn	Ile Asp	Thr	Ser	Lys
225				230			235			240
Val	Asit Tyr	Gly	Val	Thr	Val	Leu Pro Thr	Phe	Lys Gly	Gin	Pro	Ser
			245			250				255
Lys	Pro Phe	Val	Gly	Val	Leu	Ser Ala Gly	Ile	Asn Ala	Ala	Ser	Pro
		260				265			270
Asn	Lys Glu	Leu	Ala	Lys	Glu	Phe Leu Glu	Asn	Tyr Leu	Leu	Thr	Asp
	275					280		285
Glu	Gly Leu	Glu	Ala	Val	Asn	Lys Asp Lys	Pro	Leu Gly	Ala	Val	Ala
	290				295			300
Leu	Lys Ser	Tyr	Glu	Glu	Glu	Leu Ala Lys	Asp	Pro Arg	Ile	Ala	Ala
305				310			315				320
Thr	Met Glu	Asn	Ala	Gin	Lys	Gly Glu Ile	Met	Pro Asn	Ile	Pro	Gin
			325			330				335
Met	Ser Ala	Phe	Trp	Tyr	Ala	Val Arg Thr	Ala	Val Ile	Asn	Ala	Ala
		340				345			350

Ser Gly Arg Gin Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gin Thr Asn

355

360

365

Ser

Ser

Ser

His

His

His

His

His

His

Ala

Asn

Ser

Val

-Pro

Leu

Val

370

375

380

Pro

Arg

Gly

Ser

Cys

Pro

Asp

Leu

Val

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

Gin

385

390

395

400

Thr

Val

Ile

Cys

Ile

Leu

Glu

Met

Trp

Asn

Leu

His

Pro

Ser

Thr

Leu

405

410

415

Thr

Leu

Thr

Trp

Gin

Asp

Gin

Tyr

Glu

Glu

Leu

Lys

Asp

Glu

Ala

Thr

420

425

430

Ser

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Ala

His

Asn

Ala

Thr

His

Ala

Thr

Tyr

435

440

445

Thr

Cys

His

Met

Asp

Val

Phe

His

Phe

Met

Ala

Asp

Asp

Ile

Phe

Ser

450

455

460

Val

Asn

Ile

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Tyr

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

465

470

475

480

·♦ · · ♦·

E>r

S5_

Phe

Leu Leu

Ala

Glu

Ser

Ile

Lys

Pro

Ala

Pro

Pro

Phe

Asn

Val

Thr

485

490

495

Val

Thr Phe

Ser

Gly

Gin

Tyr

Asn

Ile

Ser

Trp

Arg

Ser

Asp

Tyr

Glu

500

505

510

Asp

Pro Ala

Phe

Tyr

.Met

Leu

Lys

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

515

520

525

Tyr

Arg Asn

Arg

Gly

Asp

Pro

Trp

Ala

Val

Ser

Pro

Arg

Arg

Lys

Leu

530

535

540

Ile

Ser Val

Asp

Ser

Arg

Ser

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Leu

Glu

Phe

Arg

545

550

555

560

Lys

Asp; Ser

Ser

Tyr

Glu

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

Gly

Pro

Met

Pro

Gly

565

570

575

Ser

Ser Tyr

Gin

Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Asp

Pro

Val

Ile

Phe

580

585

590

Gin

Thr Gin

Ser

Glu

Glu

Leu

Lys

Glu

Gly

Trp

Asn

Pro

His

595

600

605

<210> 52 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 tgccccgacc tcgtctgcta caccgattac ctccagacgg tcatctgcat cctggaaatg60 tggaacctcc accccagcac gctcaccctt acctggcaag accagtatga agagctgaag120 gacgaggcca cctcctgcag cctccacagg tcggcccaca atgccacgca tgccacctac180 acctgccaca tggatgtatt ccacttcatg gccgacgaca ttttcagtgt caacatcaca240 gaccagtctg gcaactactc ccaggagtgt ggcagctttc tcctggctga gagcatcaag300 ccggctcccc ctttcaacgt gactgtgacc ttctcaggac agtataatat ctcctggcgc360 tcagattacg aagaccctgc cttctacatg ctgaagggca agcttcagta tgagctgcag420 tacaggaacc ggggagaccc ctgggctgtg agtccgagga gaaagctgat ctcagtggac480 tcaagaagtg tctccctcct ccccctggag ttccgcaaag actcgagcta tgagctgcag540 gtgcgggcag ggcccatgcc tggctcctcc taccagggga cctggagtga atggagtgac600 ccggtcatct ttcagaccca gtcagaggag ttaaaggaag gctggaaccc tcactag657 <210> 53 <211> 65 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC20187 <400> 53 tcaccacgcg aattcggtac cgctggttcc gcgtggatcc tgccccgacc tcgtctgcta 60 ·♦ ··*· • · caccg 65 <210> 54 : . ' <211> 68 <212> DNA . i· <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC2018-5 <400> 54 tctgtatcag gctgaaaatc ttatctcatc cgccaaaaca ctagtgaggg ttccagcctt 60 cctttaac 68 <210> 55 <211> 40 <212> DNA <213> umělá sekvence <220> . , .

<223> oligonukleotidový primer ZC19372 <400> 55 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19351 ,.

<400> 56 acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg 60 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC19352 j <400> 57 ·· 9 99 9

9

9 9 999 99

999999999999

999 999 99

999 9 99 9 9 9 9 9 9

I i actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg 60

Á* | <210> 58 ,' | <211> 42 A-·,· | <212>DNA <213> umělá sekvence

I f <223> oligonukleotidový primer ZC19371

I <400> 58 j acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg42 ; j <210> 59 i <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC22277 <400> 59 ccaggagtgt ggcagctttc 20 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC22276 <400> 60 gcttgccctt cagcatgtag a 21 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> zalphall TaqMan sonda, ZG31 <400> 61 cggctccccc tttcaacgtg act ·· · ··· j

/133

-μ <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC23684 <400> 62 tcacccttac ctggcaagac 2C <210> 63 <211> 41 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC23656 <400> 63 taatacgact cactataggg agggggagac acttcttgag t 41 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC23685 <400> 64 aggtctgaat cccgactctg 20 <210> 65 <211> 41 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC23657 <400> 65 taatacgact cactataggg aggacgtaat tggtgtttaa t 41 ·· ···· ·« • ♦ ·

9

9 9

9 φ

<210> 66 <211> 20 <212> DNA ·,. ' <2·13> umělá sekvence _; ' <220>

<223> oligonukleotidový primer, rRNA přímý primer <400> 66 cggctaccac atccaaggaa <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer, rRNA zpětný primer <400> 67 gctggaatta ccgcggct <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> rRNA TaqMan sonda <400> 68 tgctggcacc agacttgccc tc <210> 69 <211> 1298 <212> DNA <213> Mus miisculiis <220>

<221> CDS <222> (543)...(1262) <400> 69 aggcctttca acacggcttt ttagtaattc attccatcta taaacattta tggtacacct actgtgtgcc aggtactgag gacacagttg tgatcagggc tagtgtagac acacaagcaa

120 ·· 9 99 9 • 9

9 9

9

9

-3Ό aactagagac atccggaagt gtcaggagac ggagtagagg ctgggccact tagacctcag gctctccctg cacacgtccťcaagacctta ggacttagga acctggtccc agcacccagc tgttccttgg ctggggcact/ggtaactagc gtggatatga gacagaggac agtcagtcct tactaaaggt gggaacacggigctctgagaa cggacagtat tgggaaccca ctgggcaggg ggttcacaga cagacatcaťggcgcgctct ctctctctct ctctctcctg ttttcttgtt cttctgcttt ccccgtctct ggcttgtccc tgtactcccc ccčccacccc cátctttggc tctctctgtt cacacccgac cttgttgtcc ccagctcatg actgtgtgtt tctttctcat ag aaa tgg gtt aat acc cct ttc acg gcc tcc agc ata gag ttg gtg Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val 15 10 15

180

240

300

360

420

480

540

587

cca

cag

agt

tcc

aca

aca

aca

tea

gcc

tta

cat

ctg

tea

ttg

tat

cca

Pro

Gin

Ser

Ser

Thr

Thr

Thr

Ser

Ala

Leu

His

Leu

Ser

Leu

Tyr

Pro

20

25

30

gcc

aag

gag

aag

aag

ttc

ccg

ggg

ctg

ccg

ggt

ctg

gaa

gag

caa

ctg

Ala

Lys

Glu

Lys

Lys

Phe

Pro

Gly

Leu

Pro

Gly

Leu

Glu

Glu

Gin

Leu

35

40

45

gag

tgt

gat

gga

atg

tet

gag

cct

ggt

cac

tgg

tgc

ata

atc

ccc

ttg

Glu

Cys

Asp

Gly

Met

Ser

Glu

Pro

Gly

His

Trp

Cys

Ile

Ile

Pro

Leu

50

55

60

gca

get

ggc

caa

gcg

gtc

tea

gcc

tac

agt

gag

gag

aga

gac

cgg

cca

Ala

Ala

Gly

Gin

Ala

Val

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Pro

65

70

75

tat

ggt

ctg

gtg

tcc

att

gac

aca

gtg

act

gtg

gga

gat

gca

gag

ggc

Tyr

Gly

Leu

Val

Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

85 90 95

635

683

731

779

827

ctg

tgt

gtc

tgg

ccc

tgt

agc

tgt

gag

gat

gat

ggc

tat

cca

gcc

atg

Leu

Cys

Val

Trp

Pro

Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

Asp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Met

100

105

110

aac

ctg

gat

get

ggc

ega

gag

tet

ggc

cct

aat

tea

gag

gat

ctg

ctc

Asn

Leu

Asp

Ala

Gly

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Asn

Ser

Glu

Asp

Leu

Leu

115

120

125

ttg

gtc

aca

gac

cct

get

ttt

ctg

tet

tgc

ggc

tgt

gtc

tea

ggt

agt

Leu

Val

Thr

Asp

Pro

Ala

Phe

Leu

Ser

Cys

Gly

Cys

Val

Ser

Gly

Ser

130

135

140

ggt

ctc

agg

ctt

gga

ggc

tcc

cca

ggc

agc

cta

ctg

gac

agg

ttg

agg

875

923

971

1019

ΑΊ

Gly

Leu

Arg

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

Leu

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

145

150

155

ctg

tea

ttt

gca

aag

gaa.

-ggg

gac

tgg

aca

gca

gac

cca

acc

tgg

aga

1067

Leu

Ser

Phe

Ala

Lys

GTu

Gly

Asp

Trp

Thr

Ala

Asp

Pro

Thr

Trp

Arg

160

165

170

175

act

ggg

tcc

cca

gga

ggg

ggc

tet

gag

agt

gaa

gca

ggt

tcc

ccc

cct

1115

Thr

Gly

Ser

Pro

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Ser

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Pro

180

185

190

ggt

ctg

gac

atg

gac

aca

ttt

gac

agt

ggc

ttt

gca

ggt

tea

gac

tgt

1163

Gly

Leu

Asp

Met

Asp

Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

Phe

Ala

Gly

Ser

Asp

Cys

195

200

205

ggc

agc

ccc

gtg

gag

act

gat

gaa

gga

ccc

cct

ega

agc

tat

ctc

ege

1211

Gly

Ser

Pro

Val

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly

Pro

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu

Arg

210

215

220

cag

tgg

gtg

gtc

agg

acc

cct

cca

cct

gtg

gac

agt

gga

gcc

cag

agc

1259

Gin

Trp

Val

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Pro

Val

Asp

Ser

Gly

Ala

Gin

Ser

225

230

235

1298 agc tagcatataa taaccagcta tagtgagaag aggcct Ser

240 <210> 70 <211> 240 <212> PRT <213> Mus museu!us <400> 70

Lys

Trp

Val Asn

Thr

Pro

Phe

Thr

Ala Ser

Ser

Ile

Glu Leu

Val

Pro

1

5

10

15

Gin

Ser

Ser Thr

Thr

Thr

Ser

Ala

Leu His

Leu

Ser

Leu Tyr

Pro

Ala

20

25

30

Lys

Glu

Lys Lys

Phe

Pro

Gly

Leu

Pro Gly

Leu

Glu

Glu Gin

Leu

Glu

35

40

45

Cys

Asp

Gly Met

Ser

Glu

Pro

Gly

His Trp

Cys

Ile

Ile Pro

Leu

Ala

50

55

60

Ala

Gly

Gin Ala

Val

Ser

Ala

Tyr

Ser Glu

Glu

Arg

Asp Arg

Pro

Tyr

65

70

75

80

Gly

Leu

Val Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr Val

Gly

Asp

Ala Glu

Gly

Leu

90 95

··	··«»·	>·	•	·«
• 4	•	•	•	•	• 9	• «
•	•	•	«	• 4	4	•
•	• ·	• ·	• «44	• ·	•
•	• ·	• ·	*	• ♦
··*·		··	4	·«	··

Cys

Val

Trp Pro Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

Asp

Gly

Tyr

Pro

Ala Met

Asn

100

...

105

110

Leu

Asp

Ala Gly Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Asn

Ser

Glu

Asp

Leu Leu

Leu

115

120

125

Val

Thr

Asp Pro Ala

Pfe

Leu

Ser

Cys

Gly

Cys

Val

Ser

Gly Ser

Gly

130

135

140

Leu

Arg

Leu Gly Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

Leu

Leu

Asp

Arg

Leu Arg

Leu

145

150

155

160

Ser

Phe

Ala Lys Glu

Gly

Asp

Trp

Thr

Ala

Asp

Pro

Thr

Trp Arg

Thr

165

170

175

Gly

Ser

Pro Gly Gly

Gly

Ser

Glu

Ser

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro Pro

Gly

180

185

190

Leu

Asp

Met Asp Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

Phe

Ala

Gly

Ser

Asp Cys

Gly

195

200

205

Ser

Pro

Val Glu Thr

Asp

Glu

Gly

Pro

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu Arg

Gin

210

215

220

Trp

Val

Val Arg Thr

Pro

Pro

Pro

Val

Asp

Ser

Gly

Ala

Gin Ser

Ser

225

230

235

240

<210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24432 .

<400> 71 atgtctgagc ctggtcactg gtg 23 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24433 <400> 72 tctgaacctg caaagccact gtc 23 <210 73 <211> 27 <212> DNA <213> umělá sekvence

<220>

<223> oligonukleotidový primer ZC9739 <400> 73 . <

ccatcctaat acgactcact atagggc ' Z1 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> umělá sekvence <220 <223> oligonukleotidový primer ZC24434

I <400 74 caccagtgac caggctcaga ca 22 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24431 <400> 75 ccatcacact ccagttgctc ttc 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA ...

<213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC9719 <400> 76 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequf .* ···«·· ··· · · • · · · · · · • · ···· ·· • ··· ······· « ······ · · · »· <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24511 <400> 77 tccagcatag agttggtgcclaca <210 78 <211> 592 <212> DNA <213> Mus musculus <220 <221> CDS <222> (436)...(592) <400 78 cgcccgggca ggtctccgct ggtggccctg tgtttcagtc gcgcacagct gtctgcccac60 ttctcctgtg gtgtgcctca cggtcacttg cttgtctgac cgcaagtctg cccatccctg120 gggcagccaa ctggcctcag cccgtgcccc aggcgtgccc tgtctctgtc tggctgcccc180 agccctactg tcttcctctg tgtaggctct gcccagatgc ccggctggtc ctcagcctca240 ggactatctc agcagtgact cccctgattc tggacttgca cctgactgaa ctcctgccca300 cctcaaacct tcacctccca ccaccaccac tccgagtccc gctgtgactc ccacgcccag360 gagaccaccc aagtgcccca gcctaaagaa tggctttctg aggaagatcc tgaaggagta420 ggtctgggac acagc atg ccc cgg ggc cca gtg gct gcc tta ctc ctg ctg471

Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu

1510

att

ctc

cat

gga

gct

tgg

agc

tgc

ctg

grc

ctc

act

tgc

tac

act

gac

519

Ile

Leu

His

Gly

Ala

Trp

Ser

Cys

Leu

Xaa

Leu

Thr

Cys

Tyr

Thr

Asp

15

20

25

tac

ctc

tgg

acc

atc

acc

tgt

gtc

ctg

gag

aca

cgg

agc

ccc

aac

ccc

567

Tyr

Leu

Trp

Thr

Ile

Thr

Cys

Val

Leu

Glu

Thr

Arg

Ser

Pro

Asn

Pro

30

35

40

agc

ata

ctc

agt

ctc

acc

tgg

caa

g

592

Ser

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr

Trp

Gin

45

50

<210 79 <211> 52 <212> PRT <213> Mus musculus <220 • · · · · © · • · · · · · ·· • · · · ······· ·

Ár <221> varianta <222> (1)...(51) <223> Xaa = jakákoli aminokyselina <400> 79

Met

Pro

Arg

Gly

Pro

Val

Ala

Ala

Leu

Leu Leu

Leu

Ile

Leu

His

Gly

1

5

10

15

Ala

Trp

Ser

Cys

Leu

Xaa

Leu

Thr

Cys

Tyr Thr

Asp

Tyr

Leu

Trp

Thr

20

25

30

Ile

Thr

Cys

Val

Leu

Glu

Thr

Arg

Ser

Pro Asn

Pro

Ser

Ile

Leu

Ser

* 35 40 45

Leu Thr Trp Gin <210> 80 <211> 1229 <212> DNA <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (3)...(1196)

<

40 0>

80

ga

cgc

tat <

gat <

atc

tcc ’

tgg i

gac '

tca <

gct

tat <

gac

gaa i

CCC

tcc i

aac

47

Arg '

íyr i

Asp

Ile

Ser Trp >

Asp !

Ser Ala Tyr i

Asp i

Glu

Pro !

Ser i

Asn

1

5

10

15

tac

gtg

ctg

aga

ggc

aag

cta

caa

tat

gag

ctg

cag

tat

cgg

aac

ctc

95

Tyr

Val

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

Arg

Asn

Leu

20

25

30

aga

gac

ccc

tat

gct

gtg

agg

ccg

gtg

acc

aag

ctg

atc

tca

gtg

gac

143

Arg

Asp

Pro

Tyr

Ala

Val

Arg

Pro

Val

Thr

Lys

Leu

Ile

Ser

Val

Asp

35

40

45

tca

aga

aac

gtc

tet

ctt

ctc

cct

gaa

gag

ttc

cac

aaa

gat

tet

age

191

Ser

Arg

Asn

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Glu

Glu

Phe

His

Lys

Asp

Ser

Ser

50

55

60

tac

cag

ctg

cag

atg

cgg

gca

gcg

cct

cag

cca

ggc

act

tca

ttc

agg

239

Tyr

Gin

Leu

Gin

Met

Arg

Ala

Ala

Pro

Gin

Pro

Gly

Thr

Ser

Phe

Arg

65

70

75

ggg

acc

tgg

agt

gag

tgg

agt

gac

ccc

gtc

atc

ttt

cgg

acc

cag

gct

287

• · • · 9 ♦ • · • · · · · · ·· • · ···· · · • · · · ··*···· · • · · · · · « · ····*· ·· 9 9 9

Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Asp

Pro

Val

Ile

Phe

Arg

Thr

Gin

Ala

80

'85

90

95

ggg

gag

ccc

gag

gca

ggc.

-tgg

gac

cct

cac

atg

ctg

ctg

ctc

ctg

get

335

Gly

Glu

Pro

Glu

Ala

GTy

Trp

Asp

Pro

His

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

100

105

110

gtc

ttg

atc

att

gtc

ctg

gtt

ttc

atg

ggt

ctg

aag

atc

cac

ctg

cct

383

Val

Leu

Ile

Ile

Val

Leu

Val

Phe

Met

Gly

Leu

Lys

Ile

His

Leu

Pro

115

120

125

tgg

agg

cta

tgg

aaa

aag

ata

tgg

gca

cca

gtg

ccc

acc

cct

gag

agt

431

Trp

Arg

Leu

Trp

Lys

Lys

Ile

Trp

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Pro

Glu

Ser

130

135

140 1

ttc

ttc

cag

ccc

ctg

tgc

agg

gag

cac

age

ggg

aac

ttc

aag

aaa

tgg

479

Phe

Phe

Gin

Pro

Leu

Cys

Arg

Glu

His

Ser

Gly

Asn

Phe

Lys

Lys

Trp

145

150

155

gtt

aat

acc

cct

ttc

acg

gcc

tcc

age

ata

gag

ttg

gtg

cca

cag

agt

527

Val

Asn

Thr

Pro

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Pro

Gin

Ser

160

165

170

175

tcc

aca

aca

aca

tea

gcc

tta

cat

ctg

tea

ttg

tat

cca

gcc

aag

gag

575

Ser

Thr

Thr

Thr

Ser

Ala

Leu

His

Leu

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Lys

Glu

180

185

190

aag

aag

ttc

ccg

ggg

ctg

ccg

ggt

ctg

gaa

gag

caa

ctg

gag

tgt

gat

623

Lys

Lys

Phe

Pro

Gly

Leu

Pro

Gly

Leu

Glu

Glu

Gin

Leu

Glu

Cys

Asp

195

200

205

gga

atg

tet

gag

cct

ggt

cac

tgg

tgc

ata

atc

ccc

ttg

gca

get

ggc

671

Gly

Met

Ser

Glu

Pro

Gly

His

Trp

Cys

Ile

Ile

Pro

Leu

Ala

Ala

Gly

210

215

220

ca a

gcg

gtc

tea

gcc

tac

agt

gag

gag

aga

gac

cgg

cca

tat

ggt

ctg

719

Gin

Ala

Val

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Pro

Tyr

Gly

Leu

225

230

235

gtg

tcc

att

gac

aca

gtg

act

gtg

gga

gat

gca

gag

ggc

ctg

tgt

gtc

767

Val

Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

Leu

Cys

Val

240

245

250

255

tgg

ccc

tgt

age

tgt

gag

gat

gat

ggc

tat

cca

gcc

atg

aac

ctg

gat

815

yr-

Trp

Pro

Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

Asp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Met

Asn

Leu

Asp

260

265

270

gct

ggc

ega

gag

tet

ggc

-cct

aat

tea

gag

gat

ctg

ctc

ttg

gtc

aca

863

Ala

Gly

Arg

Glu

Ser

GTy

Pro

Asn

Ser

Glu

Asp

Leu

Leu

Leu

Val

Thr

275

280

285

gac

cct

gct

ttt

ctg

tet

tgc

ggc

tgt

gtc

tea

ggt

agt

ggt

ctc

agg

911

Asp

Pro

Ala

Phe

Leu

Ser

Cys

Gly

Cys

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

Leu

Arg

290

295

300

ctt

gga

ggc

tcc

cca

ggc

agc

cta

ctg

gac

agg

ttg

agg

ctg

tea

ttt

959

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

Leu

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Leu

Ser

Phe

305

310

315

gca

aag

gaa

ggg

gac

tgg

aca

gca

gac

cca

acc

tgg

aga

act

ggg

tcc

1007

Ala

Lys

Glu

Gly

Asp

Trp

Thr

Ala

Asp

Pro

Thr

Trp

Arg

Thr

Gly

Ser

320

325

330

335

cca

gga

ggg

ggc

tet

gag

agt

gaa

gca

ggt

tcc

ccc

cct

ggt

ctg

gac

1055

Pro

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Ser

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Pro

Gly

Leu

Asp

340

345

350

atg

gac

aca

ttt

gac

agt

ggc

ttt

gca

ggt

tea

gac

tgt

ggc

agc

ccc

1103

Met

Asp

Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

Phe

Ala

Gly

Ser

Asp

Cys

Gly

Ser

Pro

355

360

365

gtg

gag

act

gat

gaa

gga

ccc

cct

ega

agc

tat

ctc

ege

cag

tgg

gtg

1151

Val

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly

Pro

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu

Arg

Gin

Trp

Val

370

375

380

gtc

agg

acc

cct

cca

cct

gtg

gac

agt

gga

gcc

cag

agc

agc

tag

1196

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Pro

Val

Asp

Ser

Gly

Ala

Gin

Ser

Ser

*

385

390

395

1229 catataataa ccagctatag tgagaagagg cct <210> 81 <211> 397 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81

Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr 15 10 15 ······ · · · «· • · · · · · ··· • · · · · · ·· • ··· ······· ·

3-8—

Val

Leu Arg

Gly Lys

Leu

Gin Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

Arg

Asn

Leu

Arg

20

25

30

Asp

Pro Tyr

Ala Val

Arg

Pro Val

Thr

Lys

Leu

Ile

Ser

Val

Asp

Ser

35

-· 40

45

Arg

Asn Val

Ser Leu

Leu

Pro Glu

Glu

Phe

His

Lys

Asp

Ser

Ser

Tyr

50

55

60’

Gin

Leu Gin

Met Arg

Ala

Ala Pro

Gin

Pro

Gly

Thr

Ser

Phe

Arg

Gly

65

70

75

80

Thr

Trp Ser

Glu Trp

Ser

Asp Pro

Val

Ile

Phe

Arg

Thr

Gin

Ala

Gly

85

90

95

Glu

Pro Glu

Ala Gly

Trp

Asp Pro

His

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

Val

100

105

110

Leu

Ile Ile

Val Leu

Val

Phe Met

Gly

Leu

Lys

Ile

His

Leu

Pro

Trp

115

120

125

Arg

Leu Trp

Lys Lys

Ile

Trp Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Pro

Glu

Ser

Phe

130

135

140

Phe

Gin Pro

Leu Cys

Arg

Glu His

Ser

Gly

Asn

Phe

Lys

Lys

Trp

Val

145

150

155

160

Asn

Thr Pro

Phe Thr

Ala

Ser Ser

Ile

Glu

Leu

Val

Pro

Gin

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Thr Thr

Ser Ala

Leu

His Leu

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Lys

Glu

Lys

180

185

190

Lys

Phe Pro

Gly Leu

Pro

Gly Leu

Glu

Glu

Gin

Leu

Glu·

Cys

Asp

Gly

195

200

205

Met

Ser Glu

Pro Gly

His

Trp Cys

Ile

Ile

Pro

Leu

Ala

Ala

Gly

Gin

210

215

220

Ala

Val Ser

Ala Tyr

Ser

Glu Glu

Arg

Asp

Arg

Pro

Tyr

Gly

Leu

Val

225

230

235

240

Ser

Ile Asp

Thr Val

Thr

Val Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

Leu

Cys

Val

Trp

245

250

255

Pro

Cys Ser

Cys Glu

Asp

Asp Gly

Tyr

Pro

Ala

Met

Asn

Leu

Asp

Ala

260

265

270

Gly

Arg Glu

Ser Gly

Pro

Asn Ser

Glu

Asp

Leu

Leu

Leu

Val

Thr

Asp

275

280

285

Pro

Ala Phe

Leu Ser

Cys

Gly Cys

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

Leu

Arg

Leu

290 295 300

Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe Ala

305 310 315320

Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly SerPro

325 330335

Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp Met 340 345350

Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro Val 355 360365

···· ·· · · ·

Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gin Trp Val Val

370 375 380

Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gin Ser Ser

385 390,.--.· 395 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24616 <400> 82 ctgcccacct caaaccttca cct ' 23 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24615 <400> 83 atgctagctg ctctgggctc cact 24 <210> 84 <211> 1735 <212> DNA <213> Mus mušculus <220>

<221> CDS <222> (143)...(1729) <400> 84 ctgcccacct caaaccttca cctcccacca ccaccactcc gagtcccgct gtgactccca60 cgcccaggag accacccaag tgccccagcc taaagaatgg ctttctgaga aagaccctga120 aggagtaggt ctgggacaca gc atg ccc cgg ggc cca gtg gct gcc tta ctc172

Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu

510 ctg ctg att ctc cat gga gct tgg agc tgc ctg gac ctc act tgc tac

220 • · ·

Leu

Leu

Ile

Leu

His

Gly

Ala

Trp

Ser

' Cys

Leu

Asp

Leu

Thr

Cys

Tyr

15

20

25

act

gac

tac

ctc

tgg

acc

-atc

ácc

tgt

gtc

ctg

gag

aca

cgg

age

ccc

268

Thr

Asp

Tyr

Leu

Trp

Thr

Ile

Thr

Cys

Val

Leu

Glu

Thr

Arg

Ser

Pro

30

35

40

aac

ccc

age

ata

ctc

agt

ctc

acc

tgg

caa

gat

gaa

tat

gag

gaa

ctt

316

Asn

Pro

Ser

Ile

Leu

Ser

Leu

Thr

Trp

Gin

Asp

Glu

Tyr

Glu

Glu

Leu

45

50

55

cag

gac

caa

gag

acc

ttc

tgc

age

cta

cac

agg

tet

ggc

cac

aac

acc

364

Gin

Asp

Gin

Glu

Thr

Phe

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Gly

His

Asn

Thr

60

65

70

aca

cat

ata

tgg

tac

acg

tgc

cat

atg

ege

ttg

tet

caa

ttc

ctg

tcc

412

Thr

His

Ile

Trp

Tyr

Thr

Cys

His

Met

Arg

Leu

Ser

Gin

Phe

Leu

Ser

75

80

85

90

gat

gaa

gtt

ttc

att

gtc

aat

gtg

acg

gac

cag

tet

ggc

aac

aac

tcc

460

Asp

Glu

Val

Phe

Ile

Val

Asn

Val

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Asn

Ser

95

100

105

caa

gag

tgt

ggc

age

ttt

gtc

ctg

gct

gag

age

atc

aaa

cca

gct

ccc

508

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

Phe

Val

Leu

Ala

Glu

Ser

Ile

Lys

Pro

Ala

Pro

110

115

120

ccc

ttg

aac

gtg

act

gtg

gcc

ttc

tea

gga

ege

tat

gat

atc

tcc

tgg

556

Pro

Leu

Asn

Val

Thr

Val

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Ser

Trp

125

130

135

gac

tea

gct

tat

gac

gaa

ccc

tcc

aac

tac

gtg

ctg

agg

ggc

aag

cta

604

Asp

Ser

Ala

Tyr

Asp

Glu

Pro

Ser

Asn

Tyr

Val

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

140

145

150

caa

tat

gag

ctg

cag

tat

cgg

aac

ctc

aga

gac

ccc

tat

gct

gtg

agg

652

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

Arg

Asn

Leu

Arg

Asp

Pro

Tyr

Ala

Val

Arg

155

160

165

170

ccg

gtg

acc

aag

ctg

atc

tea

gtg

gac

tea

aga

aac

gtc

tet

ctt

ctc

700

Pro

Val

Thr

Lys

Leu

Ile

Ser

Val

Asp

Ser

Arg

Asn

Val

Ser

Leu

Leu

175

180

185

cct

gaa

gag

ttc

cac

aaa

gat

tet

age

tac

cag

ctg

cag

gtg

cgg

gca

748

Pro

Glu

Glu

Phe

His

Lys

Asp

Ser

Ser

Tyr

Gin

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

190

195

200

gcg

cct

cag

cca

ggc

act.

-tea

ttc

agg

ggg

acc

tgg

agt

gag

tgg

agt

796

Ala

Pro

Gin

Pro

Gly

Thr

Ser

Phe

Arg

Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

205

210

215

gac

ccc

gtc

atc

ttt

cag

acc

cag

get

ggg

gag

ccc

gag

gca

ggc

tgg

844

Asp

Pro

Val

Ile

Phe

Gin

Thr

Gin

Ala

Gly

Glu

Pro

Glu

Ala

Gly

Trp

220

225

230

gac

cct

cac

atg

ctg

ctg

ctc

ctg

get

gtc

ttg

atc

att

gtc

ctg

gtt

892

Asp

Pro

His

Met

Leu

Leu

Leu

Leu

Ala

Val

Leu

Ile

Ile

Val

Leu

Val

235

240

245

250

ttc

atg

ggt

ctg

aag

atc

cac

ctg

cct

tgg

agg

cta

tgg

aaa

aag

ata

940

Phe

Met

Gly

Leu

Lys

Ile

His

Leu

Pro

Trp

Arg

Leu

Trp

Lys

Lys

Ile

255

260

265

tgg

gca

cca

gtg

ccc

acc

cct

gag

agt

ttc

ttc

cag

ccc

ctg

tac

agg

988

Trp

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Pro

Glu

Ser

Phe

Phe

Gin

Pro

Leu

Tyr

Arg

270 275 280 gag cac agc ggg aac ttc aag aaa tgg gtt aat acc cct ttc acg gcc1036

Glu His Ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe ThrAla

285 290295 tcc agc ata gag ttg gtg cca cag agt tcc aca aca aca tea gcc tta1084

Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro Gin Ser Ser Thr Thr Thr Ser AlaLeu

300 305310

cat

ctg

tea

ttg

tat

cca

gcc

aag

gag

aag

aag

ttc

ccg

ggg

ctg

ccg

1132

His

Leu

Ser

Leu

Tyr

Pro

Ala

Lys

Glu

Lys

Lys

Phe

Pro

Gly

Leu

Pro

315

320

325

330

ggt

ctg

gaa

gag

caa

ctg

gag

tgt

gat

gga

atg

tet

gag

cct

ggt

cac

1180

Gly

Leu

Glu

Glu

Gin

Leu

Glu

Cys

Asp

Gly

Met

Ser

Glu

Pro

Gly

His

335

340

345

tgg

tgc

ata

atc

ccc

ttg

gca

get

ggc

caa

gcg

gtc

tea

gcc

tac

agt

1228

Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ala Gly Gin Ala Val Ser Ala Tyr Ser

350 355360 gag gag aga gac cgg cca tat ggt ctg gtg tcc att gac aca gtg act 1276

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Pro

Tyr

Gly

Leu

Val

Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr

365

370

375

gtg

gga

gat

gca

gag

ggc.

-ctg

tgt

gtc

tgg

ccc

tgt

age

tgt

gag

gat

1324

Val

Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

Leu

Cys

Val

Trp

Pro

Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

380

385

390

gat

ggc

tat

cca

gcc

atg

aac

ctg

gat

get

ggc

ega

gag

tet

ggc

cct

1372

Asp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Met

Asn

Leu

Asp

Ala

Gly

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

395

400

405

410

aat

tca

gag

gat

ctg

ctc

ttg

gtc

aca

gac

cct

get

ttt

ctg

tet

tgc

1420

Asn

Ser

Glu

Asp

Leu

Leu

Leu

Val

Thr

Asp

Pro

Ala

Phe

Leu

Ser

Cys

415

420

425

ggc

tgt

gtc

tca

ggt

agt

ggt

ctc

agg

ctt

gga

ggc

tcc

cca

ggc

age

1468

Gly

Cys

Val

Ser

Gly

Ser

Gly

Leu

Arg

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro

Gly

Ser

430

435

440

cta

ctg

gac

agg

ttg

agg

ctg

tca

ttt

gca

aag

gaa

ggg

gac

tgg

aca

1516

Leu

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Leu

Ser

Phe

Ala

Lys

Glu

Gly

Asp

Trp

Thr

445

450

455

gca

gac

cca

acc

tgg

aga

act

ggg

tcc

cca

gga

ggg

ggc

tet

gag

agt

1564

Ala

Asp

Pro

Thr

Trp

Arg

Thr

Gly

Ser

Pro

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Ser

460

465

470

gaa

gca

ggt

tcc

ccc

cct

ggt

ctg

gac

atg

gac

aca

ttt

gac

agt

ggc

1612

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Pro

Gly

Leu

Asp

Met

Asp

Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

475

480

485

490

ttt

gca

ggt

tca

gac

tgt

ggc

age

ccc

gtg

gag

act

gat

gaa

gga

ccc

1660

Phe

Ala

Gly

Ser

Asp

Cys

Gly

Ser

Pro

Val

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly

Pro

495

500

505

cct

ega

age

tat

ctc

ege

cag

tgg

gtg

gtc

agg

acc

cct

cca

cct

gtg

1708

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu

Arg

Gin

Trp

Val

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Pro

Val

510

515

520

gac

agt

gga

gcc

cag

age

age

tagc

at

1735

Asp Ser Gly Ala Gin Ser Ser

525 <210> 85 ···« «· · ·♦ • · ··<·· · · • · · · 9 · 99 • 9 9 9 99999999

9 9 9 9 9 99

-4β~ <211> 529 <212> PRT <213> Mus musculus ' <400> 85

Met

Pro

Arg

Gly

Pro

Val

Ala

Ala

Leu

Leu

Leu

Leu

Ile

Leu

His

Gly

1

5

10

15

Ala

Trp

Ser

Cys

Leu

Asp

Leu

Thr

Cys

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Leu

Trp

Thr

20

25

30

Ile

Thr

Cys

Val

Leu

Glu

Thr

Arg

Ser

Pro

Asn

Pro

Ser

Ile

Leu

Ser

-,35

40

45

Leu

Thr

Trp

Gin

Asp

Glu

Tyr

Glu

Glu

Leu

Gin

Asp

Gin

Glu

Thr

Phe

50

55

60

Cys

Ser

Leu

His

Arg

Ser

Gly

His

Asn

Thr

Thr

His

Ile

Trp

Tyr

Thr

65

70

75

80

Cys

His

Met

Arg

Leu

Ser

Gin

Phe

Leu

Ser

Asp

Glu

Val

Phe

Ile

Val

85

90

95

Asn

Val

Thr

Asp

Gin

Ser

Gly

Asn

Asn

Ser

Gin

Glu

Cys

Gly

Ser

Phe

100

105

110

Val

Leu

Ala

Glu

Ser

Ile

Lys

Pro

Ala

Pro

Pro

Leu

Asn

Val

Thr

Val

115

120

125

Ala

Phe

Ser

Gly

Arg

Tyr

Asp

Ile

Ser

Trp

Asp

Ser

Ala

Tyr

Asp

Glu

130

135

140

Pro

Ser

Asn

Tyr

Val

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Gin

Tyr

Glu

Leu

Gin

Tyr

145

150

155

160

Arg

Asn

Leu

Arg

Asp

Pro

Tyr

Ala

Val

Arg

Pro

Val

Thr

Lys

Leu

Ile

165

170

175

Ser

Val

Asp

Ser

Arg

Asn

Val

Ser

Leu

Leu

Pro

Glu

Glu

Phe

His

Lys

180

185

190

Asp

Ser

Ser

Tyr

Gin

Leu

Gin

Val

Arg

Ala

Ala

Pro

Gin

Pro

Gly

Thr

195

200

205

Ser

Phe

Arg

Gly

Thr

Trp

Ser

Glu

Trp

Ser

Asp

Pro

Val

Ile

Phe

Gin

210

215

220

Thr

Gin

Ala

Gly

Glu

Pro

Glu

Ala

Gly

Trp

Asp

Pro

His

Met

Leu

Leu

225

230

235

240

Leu

Leu

Ala

Val

Leu

Ile

Ile

Val

Leu

Val

Phe

Met

Gly

Leu

Lys

Ile

245

250

255

His

Leu

Pro

Trp

Arg

Leu

Trp

Lys

Lys

Ile

Trp

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

260

265

270

Pro

Glu

Ser

Phe

Phe

Gin

Pro

Leu

Tyr

Arg

Glu

His

Ser

Gly

Asn

Phe

275

280

285

Lys

Lys

Trp

Val

Asn

Thr

Pro

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Ile

Glu

Leu

Val

290

295

300

Pro

Gin

Ser

Ser

Thr

Thr

Thr

Ser

Ala

Leu

His

Leu

Ser

Leu

Tyr

Pro

305

310

315

320

·· φφφφ ·« « ·· • · φφφφ * · φ φ φφφφ φφ • φφφ φφφφφφφ ·

Ala

Lys

Glu

Lys

Lys

Phe

Pro

Gly

Leu

Pro

Gly

Leu

Glu

Glu

Gin

Leu

325

330

335

Glu

Cys

Asp

Gly

Met

Ser

Glu

Pro

Gly

His

Trp

Cys

Ile

Ile

Pro

Leu

340

-/-

345

350

Ala

Ala

Gly

Gin

Ala

Val

Ser

Ala

Tyr

Ser

Glu

Glu

Arg

Asp

Arg

Pro

355

360

365

Tyr

Gly

Leu

Val

Ser

Ile

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

370

375

380

Leu

Cys

Val

Trp

Pro

Cys

Ser

Cys

Glu

Asp

Asp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Met

385

390

395

400

Asn

Leu

;Asp

Ala

Gly

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Asn

Ser

Glu

Asp

Leu

Leu

405

410

415

Leu

Val

Thr

Asp

Pro

Ala

Phe

Leu

Ser

Cys

Gly

Cys

Val

Ser

Gly

Ser

420

425

430

Gly

Leu

Arg

Leu

Gly

Gly

Ser

Pro’

Gly

Ser

Leu

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

435

440

445

Leu

Ser

Phe

Ala

Lys

Glu

Gly

Asp

Trp

Thr

Ala

Asp

Pro

Thr

Trp

Arg

450

455

460

Thr

Gly

Ser

Pro

Gly

Gly

Gly

Ser

Glu

Ser

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Pro

465

470

475

480

Gly

Leu

Asp

Met

Asp

Thr

Phe

Asp

Ser

Gly

Phe

Ala

Gly

Ser

Asp

Cys

485

490

495

Gly

Ser

Pro

Val

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly

Pro

Pro

Arg

Ser

Tyr

Leu

Arg

500

505

510

Gin

Trp

Val

Val

Arg

Thr

Pro

Pro

Pro

Val

Asp

Ser

Gly

Ala

Gin

Ser

515

520

525

Ser <210> 86 <211> 16 <212> DNA <213> umělá sekvence ' <220 <223> oligonukleotidový primer ZC3424 <400 86 aacagctatg accatg <210 87 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

·· ···· <223> oligonukleotidový primer ZC694 <400 87 ;, ;

taatacgact cactataggg·-.-<210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24399 <400> 88 agcggtctca gcctacagtg <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence ! <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24400 ^? <400> 89 tgagctgggg acaacaaggt 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24806 <400> 90 tgacgaaccc tccaactacg 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>

<223> oligonukleotidový primer ZC24807

	·· ···· ·· » «· · 4 4 4 9 4 4 · · · · • · · » · · · · · • ♦ · · · ···· · · · « 4 4 4 4·· · 4 · ·»·· ·· ·· · ... //Z -4-r
<400> 91 tgctctcagc caggacaaag/. '	20

Claims (49)

1. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid zalphall, obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je alespoň z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser), přičemž procento shodnosti aminokyselin je určováno za použití programu FASTA s ktup = 1, penalizace vzniklé mezery =10, penalizace rozšíření mezery = 1, a substituční matice = BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA.

2. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci polynukleotidů, která je vybrána ze skupiny zahrnující:

a. polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:4 od nukleotidu 1 do nukleotidu 1614;

b. polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 126 do nukleotidu 779;

c. polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID ΝΟ.Ί od nukleotidu 126 do nukleotidu 833;

d. polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID ΝΟ.Ί od nukleotidu 834 do nukleotidu 1682;

e. polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1 od nukleotidu 126 do nukleotidu 1682; a

9 · · · · · ·

9 9 9 9 9 9 9

999 9999999 9

-ΓΤ2

f. polynukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID ΝΟ.Ί od nukleotidu 69 do nukleotidu 1682.

3. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde polypeptid zalphall obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je vybrána ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser).

4. Izolovaný polynukleotid podle nároku 3, kde polypeptid zalphall se skládá ze sekvence aminokyselinových zbytků, která jsou vybrány ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser).

5. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde polypeptid dále obsahuje doménu WSWSX.

6. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde polypeptid dále obsahuje transmembránovou doménu.

7. Izolovaný polynukleotid podle nároku 6, kde se transmembránová doména skládá ze zbytků 238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2.

8. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde polypeptid dále obsahuje intracelulární doménu.

9. Izolovaný polynukleotid podle nároku 8, kde se intracelulární doména skládá ze zbytků 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2.

10. Izolovaný polynukleotid podle nároku 9, kde intracelulární doména dále obsahuje místa Box I a Box II.

11. Izolovaný polynukleotid podle nároku 1, kde polypeptid dále obsahuje afinitní značku.

12. Expresní vektor obsahující následující operačně vázané elementy:

transkripční promotor;

segment DNA kódující polypeptid zalphall, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a transkripční terminátor, kde je promotor operačně vázán k segmentu DNA a segment DNA je operačně vázán k transkripčnímu terminátoru.

13. Expresní vektor podle nároku 12, který dále obsahuje sekreční signální sekvenci, operačně vázanou k segmentu DNA.

14. Kultivovaná buňka obsahující expresní vektor podle nároku 12, kde buňka exprimuje polypeptid, kódovaný segmentem DNA.

·«···· ··* · · · • · · ··· · · · · .·*. *: ·; :^:·:· ·: : :

44Φ ..............

15. Expresní vektor obsahující:

transkripční promotor;

segment DNA kódující polypeptid zalphal 1, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo

237 (His); a transkripční terminátor, kde promotor, segment DNA a terminátor jsou operačně vázány.

16. Expresní vektor podle nároku 15, který dále obsahuje sekreční signální sekvenci, operačně vázanou k segmentu DNA.

17. Expresní vektor podle nároku 15, kde polypeptid dále obsahuje transmembránovou doménu, operačně vázanou k segmentu DNA.

18. Expresní vektor podle nároku 17, kde transmembránová doména obsahuje zbytky

238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2.

19. Expresní vektor podle nároku 15, kde polypeptid dále obsahuje intracelulární doménu, operačně vázanou k segmentu DNA.

20. Expresní vektor podle nároku 19, kde se intracelulární doména skládá ze zbytků 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2.

21. Kultivovaná buňka do které byl vnesen expresní vektor podle nároku 15, kde buňka exprimuje polypeptid rozpustného receptoru, kódovaný segmentem DNA.

22. Buňka podle nároku 21, kde buňka je pro svým množením závislá na hematopoetickém růstovém faktoru, dodávaném zvenčí.

23. Konstrukt DNA kódující fuzní protein, kde konstrukt DNA obsahuje:

první segment DNA kódující polypeptid, který má sekvenci aminokyselinových zbytků vybranou ze skupiny zahrnující:

4 4 4 4 4 4 φ* ··*

4 4 4 4 4 44 • 4 444444

4 444 44444444

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 19 (Gly);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 238 (Leu) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 238 (Leu) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

f. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

g. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo

20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a alespoň jeden jiný segment DNA, kódující další polypeptid, kde první a další segmenty DNA jsou spojeny ve čtecím rámci; a kde první a další segmenty DNA kódují fúzní protein.

24. Expresní vektor obsahující následující operačně vázané elementy: transkripční promotor;

konstrukt DNA kódující fúzní protein podle nároku 23; a transkripční terminátor, kde je promotor operačně vázán ke konstruktu DNA a konstrukt DNA je operačně vázán k transkripčnímu terminátoru.

25. Kultivovaná buňka obsahující expresní vektor podle nároku 24, kde buňka exprimuje polypeptid, kódovaný konstruktem DNA.

26. Způsob produkce fúzního proteinu, vyznačující se tím, že obsahuje: kultivaci buňky podle nároku 25; a izolaci polypeptidu produkovaného buňkou.

27. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je alespoň z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser), přičemž procento shodnosti aminokyselin je určováno za použití programu FASTA s ktup = 1, penalizace vzniklé mezery =10, penalizace rozšíření mezery = 1, a substituční matice = BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA.

28. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je vybrána ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser).

29. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde sekvence aminokyselinových zbytků se skládá ze sekvence aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny zahrnující:

·· ♦··· · · · ··· · · ·· χ/Ζ'7 · · ··♦· 9 9 9 fO· 999 9999999 9 9

44e~ ···· *·· ·· · ·· ···

27. Izolovaný polypeptid obsahující sekvencí aminokyselinových zbytků, která je alespoň z 90 % shodná s aminokyselinovou sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser), přičemž procento shodnosti aminokyselin je určováno za použití programu FASTA s ktup = 1, penalizace vzniklé mezery = 10, penalizace rozšíření mezery = 1, a substituční matice = BLOSUM62, soubor ostatních parametrů je výchozí soubor parametrů programu FASTA.

28. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je vybrána ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser).

29. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde sekvence aminokyselinových zbytků se skládá ze sekvence aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny zahrnující:

• · ·

447 • · · · · ·· · • · · · · ·· · • · · ······· · · • · · · ·· · • ·· · ·· ···

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo

20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

b. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo

20 (Cys) do aminokyseliny číslo 255 (Leu);

c. aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo

256 (Lys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

d. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo

20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser); a

e. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 1 (Met) do aminokyseliny číslo 538 (Ser).

30. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde polypeptid dále obsahuje motiv

WSWSX.

31. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde polypeptid dále obsahuje transmembránovou doménu.

32. Izolovaný polypeptid podle nároku 31, kde se transmembránová doména skládá ze zbytků 238 (Leu) až 255 (Leu) ze SEQ ID NO:2.

33. Izolovaný polypeptid podle nároku 27, kde polypeptid dále obsahuje intracelulární doménu.

34. Izolovaný polypeptid podle nároku 33, kde se intracelulární doména obsahuje zbytky 256 (Lys) až 538 (Ser) ze SEQ ID NO:2.

35. Izolovaný polynukleotid podle nároku 34, kde intracelulární doména dále obsahuje místa Box I a Box II.

36. Způsob produkce polypeptidu zalphall, vyznačující se tím, že obsahuje:

kultivaci buňky podle nároku 15; a izolaci polypeptidu zalphall produkovaného buňkou.

ŤT8

37. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je vybrána ze skupiny zahrnující:

a. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His); a kde polypeptid je v podstatě zbaven transmembránové a intracelulární domény, které jsou běžně spojeny s hematopoetickými receptory.

38. Izolovaný polypeptid podle nároku 37 dále obsahující afinitní značku.

39. Způsob produkce polypeptidu zalphall, vyznačující se tím, že obsahuje:

kultivaci buňky podle nároku 21; a izolaci polypeptidu zalphall produkovaného buňkou.

40. Způsob produkce protilátky proti polypeptidu zalphall, vyznačující se t í m, že obsahuje:

očkování zvířete polypeptidem vybraným ze skupiny zahrnující:

a. polypeptid skládající se z 9 až 519 aminokyselin, kde se polypeptid skládá ze souvislé sekvence aminokyselin v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 538 (Ser);

b. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His);

c. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 101 (Leu) do aminokyseliny číslo 122 (Gly);

d. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 141 (Asn) do aminokyseliny číslo 174 (Ala);

e. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 193 (Cys) do aminokyseliny číslo 261 (Val);

f. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 51 (Trp) do aminokyseliny číslo 61 (Glu);

g. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 136 (Ile) do aminokyseliny číslo 143 (Glu);

h. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 187 (Pro) do aminokyseliny číslo 195 (Ser);

i. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 223 (Phe) do aminokyseliny číslo 232 (Glu); a

j. polypeptid skládající se z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 360 (Glu) do aminokyseliny číslo 368 (Asp); a kde polypeptid vyvolává u zvířete imunitní odpověď a vytváření protilátky; a izolaci protilátky ze zvířete.

41. Protilátka vytvořená způsobem podle nároku 40, která se specificky váže k polypeptidu zalphall.

42. Protilátka podle nároku 41, která je monoklonální protilátkou.

43. Protilátka, která se specificky váže k polypeptidu podle nároku 27.

44. Způsob detekce přítomnosti modulátoru aktivity proteinu zalphall v testovaném vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje:

kultivaci buňky do které byl vnesen expresní vektor podle nároku 15, kde buňka exprimuje protein zalphall, kódovaný segmentem DNA v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku; a porovnání úrovně aktivity zalphall v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného vzorku pomocí biologického nebo biochemického testu; a určení z tohoto porovnání, zda je v testovaném vzorku přítomen modulátor aktivity zalphall.

45. Způsob detekce ligandu receptorů zalphal 1 v testovaném vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje:

uvedení do kontaktu testovaného vzorku s polypeptidem obsahujícím aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2 od aminokyseliny číslo 20 (Cys) do aminokyseliny číslo 237 (His); a detekování vazby polypeptidu k ligandu ve vzorku.

• 9 ···· 4t 4 «· • 4 4 4 4 4 4 4 4 • « 4 · 4 4 4 4

4 444 4444444 4 .120• 444 44 44 4 «4

46. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že polypeptid dále obsahuje transmembránovou a intracelulární doménu.

47. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že polypeptid je vázán na membránu v kultivované buňce a detekční krok obsahuje měření biologické odpovědi v kultivované buňce.

48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že biologickou odpovědí je buněčné množení nebo aktivace transkripce reportérového genu.

49. Způsob podle nároku 45, vyznačující se tím, že polypeptid je imobilizován na pevném podkladu.