DE60125543T2

DE60125543T2 - Löslicher zytokinrezeptor zalpha11

Info

Publication number: DE60125543T2
Application number: DE60125543T
Authority: DE
Inventors: A. Cindy Hereford SPRECHER; E. Julia Suquamish NOVAK; W. James Seattle WEST; R. Scott Tacoma PRESNELL; D. Richard Seattle HOLLY; J. Andrew Shoreline NELSON
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2000-04-05
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-04-04
Also published as: CA2420992A1; DK1749888T3; DE60141234D1; US6777539B2; WO2001077171A3; US20090196882A1; US20020137677A1; US7763713B2; EP1303602A2; ATE349522T1; CA2420992C; ATE456654T1; AU2001253127A1; WO2001077171A2; ES2279809T3; US20080032333A1; US20100074905A1; US7189695B2; US20070224118A1; US20040235743A1

Description

Hormone und Polypeptid-Wachstumsfaktoren steuern die Proliferation und Differenzierung der Zellen mehrzelliger Organismen. Diese diffundierbaren Moleküle ermöglichen es den Zellen, miteinander zu kommunizieren und zusammen zu wirken, um Zellen und Organe zu bilden und geschädigtes Gewebe zu reparieren. Zu Beispielen für Hormone und Wachstumsfaktoren zählen Steroidhormone (z. B. Östrogen, Testosteron), Parathyroid-Hormon, das Follikel-stimulierende Hormon, die Interleukine, der von Blutplättchen stammende Wachstumsfaktor (PDGF), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der Granulocyten-Macrophagen-Koloniestimulierende Faktor (GM-CSF), Erythropoietin (EPO) und Calcitonin.
Die Hormone und Wachstumsfaktoren beeinflussen den zellulären Metabolismus, indem sie an Rezeptoren binden. Bei den Rezeptoren kann es sich um integrale Membranproteine handeln, die mit Signalwegen innerhalb der Zelle, wie beispielsweise Second-Messenger-Systemen, verbunden sind. Andere Klassen von Rezeptoren sind lösliche Moleküle, wie beispielsweise die Transkriptionsfaktoren. Von besonderem Interesse sind Rezeporen für Cytokine, Moleküle, die die Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen fördern. Zu Beispielen für Cytokine zählen Erythropoietin (EPO), welches die Entwicklung der roten Blutzellen stimuliert, Thrombopoietin (TPO), welches die Entwicklung von Zellen der Megakaryocyten-Linie stimuliert, und der Granulocyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF), welcher die Entwicklung von Neutrophilen stimuliert. Diese Cytokine sind geeignet, bei Patienten, die an Anämie, Thrombocytopenie und Neutropenie leiden oder eine Chemotherapie bei Krebs erhalten, die normalen Blutzell-Niveaus wiederherzustellen.
Parrish J. et al., American J. of Human Genetics, Vol. 65, Nr. 4, 19. Oktober 1999, Seite A378, beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung des Zalpha11-Cytokin-Rezeptors.
WO 00/17235 beschreibt den Cytokin-Rezeptor Zalpha11 und damit in Zusammengang stehende Zusammensetzungen und Verfahren.
WO 00/08152 beschreibt Nukleinsäuren, welche Orphan-Säugetier-Rezeptor-Polypeptide kodieren und als OCR-10 und OCR-10A bezeichnet werden, und damit im Zusammenhang stehende Assay-Systeme und Verfahren.
EP 1 088 831 beschreibt Hemopoietin-Rezeptor-Proteine.
Die demonstrierten In-Vivo-Aktivitäten dieser Cytokine veranschaulichen das enorme klinische Potential und den Bedarf an anderen Cytokinen, Cytokin-Agonisten und Cytokin-Antagonisten oder Bindungspartnern.
Die vorliegende Erfindung ist auf diesen Bedarf gerichtet, indem sie ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung stellt, welches einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor- Komplex kodiert, welcher lösliche Rezeptor-Untereinheiten umfasst, wobei der Rezeptor-Komplex eine Sequenz von Aminosäure-Resten, die zu mindestens 90% mit der in SEQ ID NO 6 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist, und ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, welches ein lösliches Rezeptor-Polypeptid kodiert, welches eine Sequenz von Aminosäure-Resten umfasst, die zu mindestens 90% mit der Aminosäure-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, identisch ist, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, das durch die Polynukleotid-Sequenz kodiert wird, an einen Liganden bindet, welcher ein Polypeptid der SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47 umfasst, oder die Liganden-Aktivität antagonisiert. In einer Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polynukleotid kodiert wird, einen homodimeren Rezeptor-Komplex ausbildet.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, welches ein lösliches Rezeptor-Polypeptid kodiert, welches eine Sequenz von Aminosäure-Resten umfasst, die zu mindestens 90% mit der Aminosäure-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, identisch ist, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polynukleotid kodiert wird, einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet. In einer Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polynukleotid kodiert wird, einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet, welcher außerdem einen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfasst.
In einer Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polynukleotid kodiert wird, einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet, der außerdem ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) oder ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82) umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das Polypeptid außerdem ein WSXWS-Motiv, wie in SEQ ID NO: 13 wiedergegeben, umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, welches ein lösliches Rezeptor-Polypeptid kodiert, das eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, umfasst, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polynukleotid kodiert wird, einen heterodimeren oder multimeren Rezeptorkomplex ausbildet. In einer Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polypeptid kodiert wird, au ßerdem einen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid, welches durch das Polynukleotid kodiert wird, einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet, welcher außerdem ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) oder ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82) umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid durch das in SEQ ID NO: 7 gezeigte Polynukleotid kodiert wird. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polynukleotid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid außerdem einen Affinitäts-Tag umfasst.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressions-Vektor zur Verfügung, welcher die folgenden operabel miteinander verknüpften Elemente umfasst: (a) einen Transkriptions-Promotor; ein erstes DNA-Segment, welches ein lösliches Rezeptor-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und einen Transkriptions-Terminator; und (b) einen zweiten Transkriptions-Promotor; ein zweites DNA-Segment, welches ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) kodiert; und einen Transkriptions-Terminator; wobei das erste und zweite DNA-Segment(e) innerhalb eines einzigen Expressions-Vektors enthalten sind.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine kultivierte Zelle zur Verfügung, welche einen oder mehr Expressions-Vektor(en) umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen oder mehr Expressions-Vektoren zur Verfügung, welche(r) die folgenden Elemente umfasst/umfassen: (a) einen Transkriptions-Promotor; ein erstes DNA-Segment, welches ein lösliches Rezeptor-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segemt und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; und (b) einen zweiten Transkriptions-Promotor; ein zweites DNA-Segment, welches ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) kodiert; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind, wobei das erste und zweite DNA-Segment(e) innerhalb eines einzigen Expressions-Vektors enthalten sind oder in unabhängigen Expressions-Vektoren enthalten sind, und wobei die Polypeptide, die von den DNA-Segmenten exprimiert werden, miteinander assoziieren, um einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex auszubilden.
In einer Ausführungsform umfasst der oben offenbarte Expressions-Vektor außerdem eine Sekretions-Signalsequenz, die mit das erste und zweite DNA-Segment(e) operabel verknüpft ist.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine kultivierte Zelle zur Verfügung, welche einen oder mehr Expressions-Vektor(en) umfasst, welche(r) die folgenden Elemen te umfasst/umfassen: (a) einen Transkriptions-Promotor; ein erstes DNA-Segment, welches ein lösliches Rezeptor-Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; und (b) einen zweiten Transkriptions-Promotor; ein zweites DNA-Segment, welches ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) kodiert; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind, wobei das erste und das zweite DNA-Segment(e) innerhalb eines einzigen Expressions-Vektors oder in unabhängigen Expressions-Vektoren enthalten sind, und wobei die Zelle die Polypeptide exprimiert, die durch die DNA-Segmente kodiert werden.
In einer Ausführungsform ist die kultivierte Zelle, die einen Expressions-Vektor umfasst, wie oben beschrieben, wobei das erste und das zweite DNA-Segment(e) auf unabhängigen Expressions-Vektoren lokalisiert sind und in die Zelle co-transfiziert sind, und die Zelle die durch die DNA-Segmente kodierten Polypeptide exprimiert. In einer anderen Ausführungsform ist die einen Expressions-Vektor umfassende kultivierte Zelle wie oben offenbart, wobei die Zelle ein heterodimeres oder multimeres lösliches Rezeptor-Polypeptid, welches durch die DNA-Segmente kodiert wird, exprimiert. In einer anderen Ausführungsform ist die einen Expressions-Vektor umfassende kultivierte Zelle wie oben offenbart, wobei die Zelle einen heterodimeren oder multimeren Komplex eines löslichen Rezeptor-Polypeptids sekretiert. In einer anderen Ausführungsform ist die einen Expressions-Vektor umfassende kultivierte Zelle wie oben offenbart, wobei die Zelle einen heterodimeren oder multimeren Komplex eines löslichen Rezeptor-Polypeptids sekretiert, welcher einen Liganden bindet, der ein Polypeptid von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47 umfasst, oder die Liganden-Aktivität antagonisiert.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt zur Verfügung, welches ein Fusionsprotein kodiert, umfassend: ein erstes DNA-Segment, welches ein Polypeptid mit einer Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und mindestens ein anderes DNA-Segment, welches ein lösliches Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Polypeptid kodiert, wobei das erste und das/die andere(n) DNA-Segmente im Leserahmen verbunden sind und wobei das erste und andere(n) DNA-Segment(e) das Fusionsprotein kodieren. In einer Ausführungsform kodiert das DNA-Konstrukt ein Fusionsprotein, wie oben offenbart, wobei zumindest ein anderes DNA-Segment ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) oder ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82) kodiert.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressions-Vektor zur Verfügung, welcher die folgenden operabel miteinander verknüpften Elemente umfasst: einen Transkriptions-Promotor; ein DNA-Konstrukt, welches ein Fusionsprotein, wie oben offenbart, kodiert; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor mit dem DNA-Konstrukt operabel verknüpft ist, und das DNA-Konstrukt mit dem Transkriptions-Terminator operabel verknüpft ist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine kultivierte Zelle zur Verfügung, welche einen Expressions-Vektor, wie oben offenbart, umfasst, wobei die Zelle ein durch das DNA-Konstrukt kodiertes Polypeptid exprimiert.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins zur Verfügung, welches das Kultivieren einer Zelle, wie oben offenbart, und das Isolieren des durch die Zelle produzierten Polypeptids umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes lösliches Rezeptor-Polypeptid zur Verfügung, welches eine Sequenz von Aminosäure-Resten umfasst, die zu mindestens 90% identisch mit der in SEQ ID NO: 6 gezeigten Aminosäure-Sequenz ist, und wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen Liganden bindet, der ein Polypeptid der SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47 umfasst, oder die Liganden-Aktivität antagonisiert. In einer Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen homodimeren Rezeptor-Komplex ausbildet.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, welches eine Sequenz aus Aminosäure-Resten umfasst, die zu mindestens 90% mit einer Aminosäure-Sequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, identisch ist, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet. In einer Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet, der außerdem einen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet, welcher außerdem ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) oder ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82) umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das Polypeptid außerdem ein WSXWS-Motiv, wie in SEQ ID NO: 13 gezeigt, umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes lösliches Rezeptor-Polypeptid zur Verfügung, welches eine Sequenz aus Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, umfasst, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet. In einer Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, welcher außerdem einen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfasst, ausbil det. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex ausbildet, welcher außerdem ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) oder ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82) umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist das isolierte Polypeptid wie oben offenbart, wobei das lösliche Rezeptor-Polypeptid außerdem einen Affinitäts-Tag, einen chemischen Rest, ein Toxin oder eine Markierung umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen isolierten heterodimeren oder multimeren löslichen Rezeptor-Komplex zur Verfügung, welcher lösliche Rezeptor-Untereinheiten umfasst, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, welches eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, umfasst. In einer Ausführungsform umfasst der oben offenbarte, isolierte heterodimere oder multimere lösliche Rezeptor-Komplex außerdem ein lösliches Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Polypeptid. In einer anderen Ausführungsform umfasst der oben offenbarte, isolierte heterodimere oder multimere lösliche Rezeptor-Komplex außerdem ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) oder ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82).
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen Rezeptor-Polypeptids, welches einen heterodimeren oder multimeren Komplex ausbildet, zur Verfügung, welches das Kultivieren einer Zelle, wie oben offenbart, und das Isolieren des von der Zelle produzierten löslichen Rezeptor-Polypeptids umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gegen ein lösliches Rezeptor-Polypeptid zur Verfügung, welches das Impfen eines Tieres mit einem löslichen Rezeptor-Polypeptid-Komplex, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid, umfassend einen homodimeren löslichen Rezeptor-Komplex, umfassend die SEQ ID NO: 6; (b) einem Polypeptid, umfassend einen löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, umfassend die SEQ ID NO: 6; (b) einem Polypeptid, umfassend einen löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, umfassend die SEQ ID NO: 6 und weiterhin umfassend ein lösliches Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Polypeptid; (c) einem Polypeptid, umfassend einen löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, umfassend SEQ ID NO: 6 und weiterhin umfassend ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4); (d) einem Polypeptid, umfassend einen löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, umfassend die SEQ ID NO: 6 und weiterhin umfassend ein lösliches IL-13α'-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 82); wobei der Polypeptid- Komplex bei dem Tier eine Immunantwort zur Produktion des Antikörpers auslöst, und das Isolieren des Antikörpers aus dem Tier umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen durch das oben offenbarte Verfahren hergestellten Antikörper zur Verfügung, welcher spezifisch an einen homodimeren, heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, umfassend ein lösliches Rezeptor-Polypeptid, umfassend SEQ ID NO: 6, bindet. In einer Ausführungsform ist der oben offenbarte Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein In-Vitro-Verfahren zur Inhibierung eines Liganden, welcher ein Polypeptid der SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47 umfasst, oder zur Antagonisierung der durch die Liganden-Aktivität induzierten Proliferation von hämatopoetischen Zellen und hämatopoetischen Vorläufer-Zellen zur Verfügung, welches das Kultivieren von Knochenmark oder peripheren Blutzellen mit einer Zusammensetzung, die eine Menge des löslichen Rezeptors, umfassend SEQ ID NO: 6, umfasst, ausreichend, um die Proliferation der hämatopoetischen Zellen in dem Knochenmark oder den peripheren Blutzellen im Vergleich zum Knochenmark oder zu peripheren Blutzellen, die in Abwesenheit des löslichen Rezeptors kultiviert werden, zu reduzieren, umfasst. In einer Ausführungsform ist das Verfahren wie oben offenbart, wobei die hämatopoetischen Zellen und hämatopoetischen Vorläufer-Zellen lymphoide Zellen sind. In einer anderen Ausführungsform ist das Verfahren wie oben offenbart, wobei die lymphoiden Zellen NK-Zellen oder cytotoxische T-Zellen sind.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplexes, welcher lösliche Rezeptor-Untereinheiten umfasst, wobei wenigstens eine der Untereinheiten eine Sequenz von Aminosäuren umfasst, die zu mindestens 90% mit der SEQ ID NO: 6 identisch ist, und wobei der Rezeptor-Komplex weiterhin ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion der Proliferation neoplastischer B- oder T-Zellen in einem Säugetier mit einem B- oder T-Zell-Neoplasma zur Verfügung.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplexes, welcher lösliche Rezeptor-Untereinheiten umfasst, wobei wenigstens eine der Untereinheiten eine Sequenz von Aminosäuren umfasst, die zu mindestens 90% mit der SEQ ID NO. 6 identisch ist, und wobei der Rezeptor-Komplex weiterhin ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst, in einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung einer Immunantwort in einem Säugetier, welches einem Antigen oder Pathogen ausgesetzt wurde, zur Verfügung.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung deutlich.
Bevor die Erfindung im Einzelnen erläutert wird, ist es hilfreich, zum Verständnis der Erfindung folgende Ausdrücke zu definieren:
Der Ausdruck „Affinitäts-Tag" wird hierin verwendet, um ein Polypeptid-Segment zu bezeichnen, welches an ein zweites Polypeptid angehängt werden kann, um die Aufreinigung oder Detektion des zweiten Polypeptids zu ermöglichen oder Stellen bereitzustellen, welche die Anlagerung des zweiten Polypeptids an ein Substrat ermöglichen. Im Prinzip kann jegliches Peptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsagens verfügbar ist, als Affinitäts-Tag verwendet werden. Zu Affinitäts-Tags zählen ein Polyhistidin-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), Glutathion-S-Transferase (Smith and Johnson, Gene 67: 31, 1988), ein Glu-Glu-Affinitäts-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), Substanz P, Flag^TM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), Streptavidin-Bindungs-Peptid oder andere antigene Epitope oder Bindungsdomänen. Dazu sei allgemein auf Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, verwiesen. DNAs, die Affinitäts-Tags kodieren, sind von verschiedenen kommerziellen Anbietern erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Die Bezeichnungen „Amino-terminal" und „Carboxyl-terminal" werden hierin verwendet, um Positionen innerhalb von Polypeptiden anzugeben. Wenn es der Kontext ermöglicht, werden diese Bezeichnungen mit Bezug auf eine bestimmte Sequenz oder einen Teil eines Polypeptids verwendet, um die Nähe oder relative Position anzugeben. Beispielsweise ist eine bestimmte Sequenz, welche Carboxyl-terminal zu einer Bezugs-Sequenz innerhalb eines Polypeptids positioniert ist, proximal zu dem Carboxyl-Terminus der Bezugs-Sequenz gelegen, befindet sich jedoch nicht notwendigerweise am Carboxyl-Terminus des gesamten Polypeptids.
Die Bezeichnung „Komplement/Anti-Komplement-Paar" bezeichnet nicht-identische Reste/Teile, die unter geeigneten Bedingungen ein nicht-kovalent assoziiertes, stabiles Paar ausbilden. Typische Teile eines Komplement/Anti-Komplement-Paares sind beispielsweise Biotin und Avidin (oder Streptavidin). Zu weiteren Komplement/Anti-Komplement-Paaren zählen beispielsweise Rezeptor/Ligand-Paare, Antikörper/Antigen(oder Hapten oder Epitop)-Paare, Sense/Antisense-Polynukleotid-Paare und Ähnliches. Wo eine nachfolgende Dissoziation des Komplement/Anti-Komplement-Paares wünschenswert ist, besitzt das Komplement/Anti-Komplement-Paar bevorzugt eine Bindungsaffinität von < 10⁹ M^–1.
Der Ausdruck „Komplementäre eines Polynukleotid-Moleküls" bezeichnet ein Polynukleotid-Molekül, welches eine komplementäre Basensequenz und umgekehrte Orientierung im Vergleich zu einer Bezugs-Sequenz aufweist. Beispielsweise ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Ausdruck „degenerierte Nukleotid-Sequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, welche einen oder mehr degenerierte Codons (im Vergleich zu einem Referenz-Polynukleotid-Molekül, welches ein Polypeptid kodiert) einschließt. Degenerierte Codons enthalten verschiedene Triplets von Nukleotiden, kodieren jedoch den gleichen Aminosäure-Rest (d. h., GAU- und GAC-Triplets kodieren beide Asp).
Der Ausdruck „Expressions-Vektor" wird verwendet, um ein lineares oder zirkuläres DNA-Molekül zu bezeichnen, welches ein Segment umfasst, das ein Polypeptid von Interesse kodiert, welches operabel mit zusätzlichen Segmenten, die seine Transkription vermitteln, verbunden ist. Zu derartigen zusätzlichen Segmenten zählen Promotor- und Terminator-Sequenzen und ebenso gegebenenfalls ein oder mehr Replikations-Origins (Ursprünge), ein oder mehr selektierbare Marker, ein Enhancer (Verstärker), ein Polyadenylierungs-Signal usw. Expressions-Vektoren sind im Allgemeinen von Plasmid- oder viraler DNA abgeleitet oder können Elemente aus beiden enthalten.
Der Ausdruck „isoliert" bedeutet, wenn er auf ein Polynukleotid angewendet wird, dass das Polynukleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder unerwünschten kodierenden Sequenzen ist, und in einer Form vorliegt, die geeignet ist zur Verwendung innerhalb genetisch konstruierter Protein-Produktions-Systeme. Bei derartigen isolierten Molekülen handelt es sich um solche, die aus ihrer natürlichen Umgebung separiert wurden; dazu zählen cDNA und genomische Klone. Isolierte DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit denen sie gewöhnlich assoziiert sind, können jedoch natürlich vorkommende nicht-translatierte 5'- und 3'-Bereiche, wie beispielsweise Promotoren und Terminatoren, enthalten. Die Identifizierung assoziierter Bereiche ist für einen Fachmann auf dem Gebiet leicht möglich (siehe beispielsweise Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).
Ein „isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, das unter einer Bedingung vorgefunden wird, die sich von seiner ursprünglichen Umgebung unterscheiden, wie beispielsweise getrennt vom Blut und tierischem Gewebe. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es ist bevorzugt, die Polypeptide in einer hoch gereinigten Form bereitzustellen, d. h., in einer Reinheit von mehr als 95%, bevorzugter mehr als 99%. Wenn er in diesem Zusammenhang verwendet wird, schließt der Ausdruck „isoliert" nicht das Vorliegen des gleichen Polypeptids in alternativen physikalischen Formen, wie beispielsweise als Dimere oder, alternativ, in glycosylierten oder derivatisierten Formen, aus.
Der Ausdruck „operabel miteinander verknüpft" gibt, wenn er sich auf DNA-Segmente bezieht, an, dass die Segmente derart angeordnet sind, dass sie zusammenwirken, um ihren beabsichtigten Zweck zu erreichen; z. B. startet die Transkription im Promotor und schreitet durch das kodierende Segment bis zum Terminator fort.
Der Ausdruck „Ortholog" bezeichnet ein Polypeptid oder Protein, welches aus einer Art erhalten wurde und das funktionelle Gegenstück zu einem Polypeptid oder Protein aus einer anderen Art ist. Sequenzunterschiede zwischen Orthologen sind das Ergebnis von Artenbildung („speciation").
„Paraloge" sind unterschiedliche jedoch strukturell verwandte Proteine, die durch einen Organismus hergestellt werden. Es wird angenommen, dass Paraloge durch Genduplikation entstehen. Beispielsweise sind α-Globin, β-Globin und Myoglobin Paraloge voneinander.
Ein „Polynukleotid" ist ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Basen, gelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Polynukleotide umfassen RNA und DNA und können aus natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination natürlicher und synthetischer Moleküle hergestellt sein. Die Größe von Polynukleotiden wird in Basenpaaren (abgekürzt „bp"), Nukleotiden („nt") oder Kilobasen („kb") angegeben. Je nach Kontext können die zwei letzteren Bezeichnungen einzelsträngige oder doppelsträngige Polynukleotide bezeichnen. Wenn der Ausdruck auf doppelsträngige Moleküle angewendet wird, bezeichnet er die Gesamtlänge und ist somit äquivalent zu der Bezeichnung „Basenpaare". Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass sich die zwei Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids leicht in der Länge unterscheiden können, und dass ihre Enden als Ergebnis enzymatischer Spaltung gegeneinander versetzt sein können; somit müssen nicht alle Nukleotide innerhalb eines doppelsträngigen Polynukleotid-Moleküls gepaart vorliegen.
Ein „Polypeptid" ist ein Polymer aus Aminosäure-Resten, die durch Peptid-Bindungen, die entweder natürlich oder synthetisch erzeugt wurden, verbunden sind. Polypeptide von weniger als ungefähr 10 Aminosäure-Resten werden im Allgemeinen als „Peptide" bezeichnet.
Bei den hierin verwendeten „Sonden und/oder Primern" kann es sich um RNA oder DNA handeln. Die DNA kann entweder cDNA oder genomische DNA sein. Bei Polynukleotid-Sonden und -Primern handelt es sich um einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA, im Allgemeinen synthetische Oligonukleotide; sie können jedoch aus klonierter cDNA oder genomischen Sequenzen oder ihren Komplementären generiert sein. Analytische Sonden weisen im Allgemeinen eine Länge von wenigstens 20 Nukleotiden auf, obwohl auch etwas kürzere Sonden (14 bis 17 Nukleotide) verwendet werden können. PCR-Primer besitzen eine Länge von wenigstens 5 Nukleotiden, bevorzugt 15 oder mehr nt, bevorzugter 20-30 nt. Kurze Polynukleotide können verwendet werden, wenn auf einen kleinen Bereich des Gens für eine Analyse abgezielt wird. Für eine grobe Analyse von Genen kann eine Polynukleotid-Sonde ein gesamtes Exon oder mehr umfassen. Sonden können markiert sein, um ein detektierbares Signal bereitzustellen, wie beispielsweise mit einem Enzym, Biotin, einem Radionuklid, Fluorophor, chemilumineszierenden Agens, paramagnetischen Partikel und Ähnlichem, welche aus vielen Quellen, wie beispielsweise Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, und Amersham Corp., Arlington Heights, IL, kommerziell erhältlich sind, wobei Techniken angewendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.
Der Ausdruck „Promotor" wird hierin in seiner aus dem Stand der Technik bekannten Bedeutung verwendet und bezeichnet einen Bereich eines Gens, welcher DNA-Sequenzen enthält, welche die Bindung von RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription vermitteln. Promotor-Sequenzen werden gewöhnlich, jedoch nicht ausschließlich, in den nicht-kodierenden 5'-Bereichen von Genen gefunden.
Ein „Protein" ist ein Makromolekül, welches eine oder mehr Polypeptidketten umfasst. Ein Protein kann außerdem nicht-peptidische Komponenten, wie beispielsweise Kohlehydrat-Gruppen, umfassen. Kohlehydrate und andere nicht-peptidische Substituenten können einem Protein durch die Zelle, in der das Protein produziert wird, zugefügt werden, wobei sie von Zelltyp zu Zelltyp variieren. Proteine werden hierin in Bezug auf ihre Aminosäure-Rückgrat-Strukturen definiert; Substituenten, wie beispielweise Kohlehydrat-Gruppen, werden im Allgemeinen nicht spezifiziert, können jedoch trotzdem vorliegen.
Der Ausdruck „Rezeptor" wird hierin verwendet, um ein Zell-assoziiertes Protein oder eine Polypeptid-Untereinheit eines derartigen Proteins zu bezeichnen, welches an ein bioaktives Molekül (den „Liganden") bindet und die Wirkung des Liganden auf die Zelle vermittelt. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung in dem Rezeptor (und in einigen Fällen zur Rezeptor-Multimerisierung, d. h., Assoziation identischer oder unterschiedlicher Rezeptor-Untereinheiten), welche Interaktionen zwischen der/den Effektordomäne(n) und (einem) anderen Molekül(en) in der Zelle bewirkt. Diese Interaktionen führen wiederum zu Veränderungen in dem Metabolismus der Zelle. Zu metabolischen Ereignissen, die mit Rezeptor-Ligand-Interaktionen in Verbindung stehen, zählen Gentranskription, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Zellproliferation, Anstieg der zyklischen AMP-Produktion, Mobilisierung von zellulärem Calcium, Mobilisierung von Membran-Lipiden, Zell-Adhäsion, Hydrolyse von Inositol-Lipiden und Hydrolyse von Phospholipiden. Zelloberflächen-Cytokin-Rezeptoren sind durch eine Multi-Domänen-Struktur gekennzeichnet, was später im Detall diskutiert wird. Diese Rezeptoren sind in der Zellmembran durch eine Transmembran-Domäne verankert, die durch eine Sequenz von hydrophoben Aminosäure-Resten (typischerweise 21-25 Reste), welche im Allgemeinen von positiv geladenen Resten (Lys oder Arg) flan kiert ist, gekennzeichnet. Im Allgemeinen können Rezeptoren Membran-gebunden sein, im Cytosol oder im Kern vorliegen; sie können monomer (z. B. der Thyroid-stimulierende Hormon-Rezeptor, Beta-adrenerge Rezeptor) oder multimer (z. B. der PDGF-Rezeptor, Wachstumshormon-Rezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietin-Rezeptor und IL-6-Rezeptor) sein. Der Ausdruck „Rezeptor-Polypeptid" wird verwendet, um vollständige Rezeptor-Polypeptid-Ketten und Teile davon, einschließlich isolierter funktioneller Domänen (z. B. Liganden-Bindungsdomänen), zu bezeichnen.
Eine „sekretorische Signalsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „sekretorisches Peptid") kodiert, welches, als Komponente eines größeren Polypeptids, das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Weg einer Zelle, in der es synthetisiert wird, schleust. Das größere Peptid wird gewöhnlich gespalten, um das sekretorische Peptid während seines Durchgangs durch den sekretorischen Weg zu entfernen.
Ein „löslicher Rezeptor" ist ein Rezeptor-Peptid, das nicht an eine Zellmembran gebunden ist. Bei löslichen Rezeptoren handelt es sich meist um Liganden-bindende Rezeptor-Polypeptide, denen Transmembran- und cytoplasmatische Domänen fehlen. Lösliche Rezeptoren können zusätzliche Aminosäure-Reste, wie beispielsweise Affinitäts-Tags, welche der Aufreinigung des Polypeptids dienen oder Stellen zur Anlagerung des Polypeptids an ein Substrat bereitstellen, oder Sequenzen konstanter Immunoglobulin-Bereiche, umfassen. Viele Zelloberflächen-Rezeptoren haben natürlich vorkommende, lösliche Gegenstücke, die durch Proteolyse erzeugt werden. Lösliche Rezeptor-Polypeptide werden als im Wesentlichen frei von Transmembran- und intrazellulären Polypeptid-Segementen angesehen, wenn ihnen die Bereiche dieser Segmente fehlen, die notwendig sind, um Membran-Verankerung bzw. Signal-Transduktion zu vermitteln.
Der Ausdruck „Splice-Variante" wird hierin verwendet, um alternative Formen von RNA, die von einem Gen transkribiert werden, zu bezeichnen. Splice-Variation tritt natürlicherweise durch Verwendung alternativer Splice-Stellen innerhalb eines transkribierten RNA-Moleküls oder, weniger häufig, zwischen separat transkribierten RNA-Molekülen auf und kann zu verschiedenen, vom gleichen Gen transkribierten mRNAs führen. Splice-Varianten können Polypeptide mit veränderter Aminosäure-Sequenz kodieren. Der Ausdruck „Splice-Variante" wird hierin ebenso verwendet, um ein Protein zu bezeichnen, welches durch eine Splice-Variante einer von einem Gen transkribierten mRNA kodiert wird.
Bei den Molekulargewichten und Längen von Polymeren, die durch ungenaue analytische Methoden (z. B. Gelelektrophorese) bestimmt werden, handelt es sich um Näherungswerte. Wenn ein derartiger Wert als „etwa" X oder „ungefähr" X angegeben ist, ist damit gemeint, dass der betreffende Wert von X zu ± 10% genau ist.
Die vorliegende Erfindung basiert zu einem Teil auf der Entdeckung eines neuen heterodimeren löslichen Rezeptor-Proteins, welches die Struktur eines Klasse-I-Cytokin-Rezeptors aufweist. Der heterodimere lösliche Rezeptor enthält wenigstens eine lösliche Zalpha11-Rezeptor-Untereinheit, die in der allgemein verfügbaren US-Patentanmeldung 09/404,641 offenbart ist. Ein zweites lösliches Rezeptor-Polypeptid, welches in dem heterodimeren löslichen Rezeptor enthalten ist, gehört zu der Rezeptor-Unterfamilie, zu der auch der übliche IL-2-γ-Rezeptor (IL-2Rγ oder γc), die β-Untereinheit des IL-2-Rezeptors und der übliche β-Rezeptor (d. h., die β-Untereinheiten der IL-3-, IL-5-, IL-13-, IL-15- und GM-CSF-Rezeptoren), IL-13α-, IL-13α'-, IL-15-Rezeptor-Untereinheiten und Ähnliche gehören. Es wurde gezeigt, dass das lösliche humane und Maus-Zalpha11-Rezeptor (IL-21R)-Monomer und -Homodimer die Aktivität des natürlichen Liganden für den Zalpha11-Rezeptor, Zalpha11-Ligand (IL-21), antagonisiert (Parrish-Novak, J. et al., Nature 408: 57-63, 2000). Der Zalpha11-Ligand ist in der allgemein verfügbaren US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217 offenbart. Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass ein heterodimerer löslicher Zalpha11-Rezeptor, bei dem es sich in einer bevorzugten Ausführungsform beispielsweise um ein Heterodimer aus dem löslichen Zalpha11-Rezeptor und dem löslichen IL-2Rγ-Rezeptor (Zalpha11/IL-2Rγ) handelt, als ein potenter Antagonist des Zalpha11-Liganden wirkt. Wie in den Beispielen offenbart, war das bevorzugte Zalpha11/IL-2Rγ-Heterodimer ein wirksamerer Antagonist der Zalpha11-Liganden-Aktivität und somit ein besserer Antagonist als ein Zalpha11-Homodimer oder -Monomer.
Außerdem beinhaltet die vorliegende Erfindung homodimere und monomere Zalpha11-umfassende lösliche Rezeptoren sowie homodimere, heterodimere und multimere Zalpha11-umfassende Rezeptoren, die zur intrazellulären Signalgebung fähig sind. Derartige Rezeptoren können wenigstens eine extrazelluläre Domäne eines Zalpha11-Rezeptors und eine intrazelluläre Domäne von Zalpha11 oder einem anderen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfassen. Die zusätzliche heterodimere oder multimere Untereinheit kann die extrazelluläre Domäne des IL-2Rγ-Rezeptors (z. B. SEQ ID NO: 4), IL-13α-Rezeptors (ebenso bekannt als IL-13RA2; SEQ ID NO: 84), IL-13α'-Rezeptors (ebenso bekannt als IL-13RA1; SEQ ID NO: 82, IL-15 (SEQ ID NO: 86) oder eines anderen Klasse-I-Rezeptors und eine intrazelluläre Domäne von Zalpha11 oder einem anderen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfassen.
Die Nukleotid-Sequenz einer repräsentativen Zalpha11-kodierenden DNA ist in SEQ ID NO: 1 beschrieben (von Nukleotid 1 bis 1614); die daraus abgeleitete 538 Amonisäuren lange Sequenz ist in SEQ ID NO: 2 beschrieben. In seiner Gesamtheit stellt das Zalpha11-Polypeptid (SEQ ID NO: 2) ein Polypeptid-Segment voller Länge (Rest 1 (Met) bis Rest 538 (Ser) der SEQ ID NO: 2) dar. Die Domänen und strukturellen Merkmale des Zalpha11-Polypeptids sind unten ausführlicher beschrieben.
Die Analyse des Zalpha11-Polypeptids, welches durch die DNA-Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert wird, zeigt einen offenen Leserahmen, welcher 538 Aminosäuren kodiert (SEQ ID NO: 2) und ein erwartetes sekretorisches Signalpeptid von 19 Aminosäure-Resten (Rest 1 (Met) bis Rest 19 (Gly) von SEQ ID NO: 2) und ein reifes Polypeptid von 519 Aminosäuren (Rest 20 (Cys) bis Rest 538 (Ser) von SEQ ID NO: 2) umfasst. Zusätzlich zu dem WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13), welches den Resten 214 bis 218 der SEQ ID NO: 2 entspricht, umfasst der Rezeptor eine Cytokin-Bindungsdomäne von ungefähr 200 Aminosäure-Resten (Reste 20 (Cys) bis 237 (His) von SEQ ID NO: 2), einen Domänen-Linker (Reste 120 (Pro) bis 123 (Pro) von SEQ ID NO: 2), einen vorletzten Strangbereich (Reste 192 (Lys) bis 202 (Ala) der SEQ ID NO: 2), eine Transmembran-Domäne (Reste 238 (Leu) bis 255 (Leu) von SEQ ID NO: 2), eine vollständige intrazelluläre Signal-Domäne (Reste 256 (Lys) bis 538 (Ser) von SEQ ID NO: 2), welche eine „Box I"-Signalstelle (Reste 267 (Ile) bis 273 (Pro) von SEQ ID: 2) und eine „Box II"-Signal-Stelle (Reste 301 (Leu) bis 304 (Gly) von SEQ ID NO: 2) enthält. Des weiteren befindet sich eine STAT3-Bindungsstelle (YXXQ) in der Nähe des C-Terminus von den Resten 519 (Tyr) bis 522 (Gln) der SEQ ID NO: 2. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass diese Domänen-Grenzen Näherungswerte sind und auf Anordnungen mit bekannten Proteinen und Voraussagen der Proteinfaltung beruhen. Zusätzlich zu diesen Domänen zählen zu konservierten Rezeptor-Merkmalen in dem kodierten Rezeptor (wie in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben) ein konservierter Trp-Rest an Position 138 und ein konservierter Arg-Rest an Position 201. Des Weiteren enthält Zalpha11 konservierte Cys-Reste, die typisch für Klasse-I-Cytokin-Rezeptoren sind, dargestellt durch die Reste 25, 35, 65 und 81 der SEQ ID NO: 2 und die entsprechenden Bereiche von SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 69, die später beschrieben werden. Die entsprechenden Polynukleotide, welche die oben beschriebenen Zalpha11-Polypeptid-Bereiche, -Domänen, -Motive, -Reste und -Sequenzen kodieren, sind wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Das humane lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid, welches die Reste 20 (Cys) bis 237 (His) von SEQ ID NO: 2 umfasst, ist in SEQ ID NO: 6 gezeigt, und die entsprechende Polynukleotid-Sequenz für das humane lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt.
SEQ ID NO: 3 ist eine Polynukleotid-Sequenz, die ein Fragment des humanen IL-2Rγ-Rezeptors umfasst, das ein lösliches 232-Aminosäuren-langes IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid kodiert (SEQ ID NO: 4). Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass diese Domänen-Grenzen für die extrazelluläre IL-2Rγ-Rezeptor-Domäne Näherungswerte sind und andere lösliche IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise solche, die eine sekretorische Signalsequenz des IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptids oder zusätzliche Aminosäuren des IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptids in der extrazellulären Domäne enthalten, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen.
Es wurde eine Variante des humanen Zalpha11-Polypeptids identifiziert (WIPO-Veröffentlichung Nr. WO 00/27822, gezeigt als SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4); diese ist in der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 64 dargestellt; die entsprechende Polypeptid-Sequenz ist in SEQ ID NO: 65 gezeigt. Dieses spezielle alternative Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid enthält 568 Aminosäuren und umfasst ein erwartetes sekretorisches Signalpeptid von 20 Aminosäure-Resten (Rest 1 (Met) bis Rest 20 (Gly) von SEQ ID NO: 65) und ein reifes Polypeptid von 548 Aminosäuren (Rest 21 (Met) bis Rest 568 (Ser) von SEQ ID NO: 65). Zusätzlich zu dem WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13), entsprechend den Resten 244 bis 248 von SEQ ID NO: 65, umfasst der Rezeptor eine Cytokin-Bindungs-Domäne von ungefähr 200 Aminosäure-Resten (Reste 21 (Met) bis 267 (His) von SEQ ID NO: 65); keinen Domänen-Linker, einen vorletzten Strangbereich (Reste 222 (Lys) bis 232 (Ala) von SEQ ID NO: 65), eine Transmembran-Domäne (Reste 268 (Leu) bis 285 (Leu) von SEQ ID NO: 65), eine vollständige intrazelluläre Signaldomäne (Reste 286 (Lys) bis 568 (Ser) von SEQ ID NO: 65), welche eine „Box I"-Signalstelle (Reste 297 (Ile) bis 303 (Pro) von SEQ ID NO: 65) und eine „Box II"-Signalstelle (Reste 331 (Leu) bis 334 (Gly) von SEQ ID NO: 65) enthält. Außerdem befindet sich eine STAT3-Bindungsstelle (YXXQ) in der Nähe des C-Terminus von den Resten 549 (Tyr) bis 552 (Gln) der SEQ ID NO: 65. Ein Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, dass diese Domänengrenzen Näherungswerte sind und auf den Anordnungen mit bekannten Proteinen und Voraussagen der Proteinfaltung basieren. Zusätzlich zu diesen Domänen zählen zu konservierten Rezeptor-Merkmalen in dem kodierten Rezeptor (wie in SEQ ID NO: 65 wiedergegeben) ein konservierter Trp-Rest an Position 168 und ein konservierter Arg-Rest an Position 231. Die entsprechenden Polynukleotide, welche die oben beschriebenen Zalpha11-Polypeptid-Bereiche, -Domänen, -Motive, -Reste und -Sequenzen kodieren, sind wie in SEQ ID NO: 64 dargestellt. Diese spezielle humane lösliche Variante des Zalpha11-Rezeptor-Polypeptids umfasst die Reste 21 (Met) bis 267 (His) der SEQ ID NO: 65 (SEQ ID NO: 69); die entsprechende Polynukleotid-Sequenz für dieses spezielle humane lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid ist in SEQ ID NO: 68 wiedergegeben. Diese Variante des humanen Zalpha11-Rezeptors ist in den heterodimeren und multimeren Zalpha11-Rezeptor-Komplexen der vorliegenden Erfindung, wie hierin offenbart, inbegriffen.
Außerdem werden andere Varianten des Zalpha11-Rezeptors von der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei die extrazelluläre Domäne der oben offenbarten Variante (z. B. 21 (Met) bis 267 (His) der SEQ ID NO: 65 oder SEQ ID NO: 69) einen Domänen-Linker umfasst, welcher die Aminosäuren PAPP (SEQ ID NO: 70), eingefügt zwischen der Aminosäure 161 (Ser) und 162 (Arg) der SEQ ID NO: 65, oder den entsprechenden Bereich von SEQ ID NO: 69 umfasst. Ein bevorzugter Domänen-Linker umfasst eine Sequenz von Aminosäuren von bevorzugt 4 bis 14 Aminosäuren Länge, am bevorzugtesten 14 Aminosäuren Länge, wobei neben der PAPP (SEQ ID NO: 70) -Motiv-Sequenz jegliche Aminosäure vorliegen kann. Eine repräsentative, Linker-enthaltende Variante des löslichen Zalpha11-Rezeptors ist beispielsweise in SEQ ID NO: 71 dargestellt. Des Weiteren können andere Varianten der Zalpha11-Sequenzen, in Bezug auf SEQ ID NO: 65, ein Gly an Position 162 anstelle eines Arg oder die gleiche Arg-zu-Gly-Substitution in dem entsprechenden Bereich von SEQ ID NO: 69 oder SEQ ID NO: 71, oder eine andere Variante der SEQ ID NO: 65 oder SEQ ID NO: 69, enthaltend einen Domänen-Linker, wie oben beschrieben, enthalten. Entsprechende DNA-Sequenzen, die derartige Varianten kodieren, können durch einen Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung der in Tabelle 1 und Tabelle 2 wiedergegebenen Informationen leicht bestimmt werden.
Der Zalpha11-Ligand ist ein Cytokin mit einer „Kurz-Helix"-Form, die in einem Vier-Helix-Bündel sekretiert wird. Die Polynukleotid-Sequenz des Zalpha11-Liganden ist in SEQ ID NO: 9 und die entsprechende Aminosäure-Sequenz in SEQ ID NO: 10 dargestellt. Die sekretorische Signal-Sequenz umfasst die Aminosäure-Reste 1 (Met) bis 31 (Gly), und das reife Polypeptid umfasst die Aminsoäure-Reste 32 (Gln) bis 162 (Ser) (wie in SEQ ID NO: 10 dargestellt). Allgemein wird angenommen, dass Cytokine eine Vier-Alpha-Helix-Struktur aufweisen, wobei die Helices A, C und D für die Ligand-Rezeptor-Interaktionen am wichtigsten und unter den Mitgliedern der Familie stärker konserviert sind. Bezüglich der in SEQ ID NO: 10 dargestellten humanen Aminosäuresequenz des Zalpha11-Liganden wird aufgrund der Anordnung der Aminosäuresequenzen des humanen Zalpha11-Liganden, des humanen IL-15, humanen IL-4 und humanen GM-CSF angenommen, dass die Helix A des Zalpha11-Liganden durch die Aminosäure-Reste 41-56, die Helix B durch die Aminosäure-Reste 69-84, die Helix C durch die Aminosäure-Reste 91-105 und die Helix D durch die Aminosäure-Reste 135-148 definiert werden, wie in SEQ ID NO: 10 dargestellt. Die strukturelle Analyse deutet darauf hin, dass die A/B-Schleife (Loop) lang ist, die B/C-Schleife kurz ist und die C/D-Schleife parallel lang ist. Die konservierten Cystein-Reste innerhalb des Zalpha11-Liganden entsprechen den Aminosäure-Resten 71, 78, 122 und 125 der SEQ ID NO: 10. Die übereinstimmende Platzierung der Cysteine ist eine weitere Bestätigung für die Vier-Helix-Bündel-Struktur. Ebenso stark konserviert in der Familie, welche IL-15, IL-2, IL-4, GM-CSF und den Zalpha11-Liganden umfasst, ist die Glu-Phe-Leu-Sequenz, die in SEQ ID NO: 10 an den Resten 136-138 dargestellt ist.
Eine weitere Analyse des Zalpha11-Liganden auf der Grundlage von Mehrfach-Anordnungen bekannter Cytokine deutet darauf hin, dass die Aminosäure-Reste 44, 47 und 135 (wie in der SEQ ID NO: 10 wiedergegeben) eine wichtige Rolle der Zalpha11-Liganden-Bindung an seinen spezifischen Rezeptor spielen. Auf der Grundlage eines Vergleichs von Sequenzen des humanen und murinen Zalpha11-Liganden werden gut konservierte Reste in den Bereichen gefunden, von denen angenommen wird, dass sie die Alpha-Helices A und D kodie ren. Die entsprechenden Polynukleotide, welche die hierin beschriebenen Zalpha11-Liganden-Polypeptid-Bereiche, -Domänen, -Motive, -Reste und -Sequenzen kodieren, sind wie in der SEQ ID NO: 9 dargestellt. Der murine Zalpha11-Ligand ist in SEQ ID NO: 46 wiedergegeben, und die entsprechende Polypeptid-Sequenz ist in SEQ ID NO: 47 gezeigt.
Die Aktivität der Moleküle der vorliegenden Erfindung kann unter Anwendung verschiedener Assays gemessen werden, in denen die Proliferation von Zellen und/oder die Bindung an Zellen, die den Zalpha11-Rezeptor exprimieren, gemessen wird. Von besonderem Interesse sind Veränderungen in Zalpha11-Ligand-abhängigen Zellen. Es wurde eine geeignete Zalpha11-Ligand-abhängige Zelllinie erzeugt, welche eine IL-3-abhängige BaF3-Zelllinie umfasst (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Zu anderen geeigneten Zelllinien, bei denen eine Zalpha11-Ligand-Abhängigkeit erzeugt wird, zählen außerdem FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984) und MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993). Wachstumsfaktor-abhängige Zelllinien können gemäß den veröffentlichten Methoden etabliert werden (z. B. Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., in Baum et al., Eds., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980).
Der Zalpha11-Ligand stimuliert Proliferation, Aktivierung, Differenzierung und/oder Induktion oder Inhibition spezialisierter Zellfunktion von Zellen, die an der Homöostase der Hämatopoese und Immunfunktion beteiligt sind. Insbesondere stimulieren Zalpha11-Ligand-Polypeptide die Proliferation, Aktivierung, Differenzierung, Induktion oder Inhibition spezialisierter Zellfunktionen von Zellen der hämatopoetischen Linien; dazu zählen T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, dendritische Zellen, Monocyten und Macrophagen sowie epitheliale Zellen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Proliferation und/oder Differenzierung von hämatopoetischen Zellen kann in vitro unter Verwendung kultivierter Zellen oder in vivo durch Verabreichen des Zalpha11-Liganden in einem geeigneten Tiermodell gemessen werden. Assays, mit denen die Zellproliferation oder -Differenzierung gemessen wird, sind auf dem Gebiet gut bekannt und hierin beschrieben. Zu Assays, welche die Proliferation messen, zählen beispielsweise die Chemosensitivität gegenüber einem neutralen roten Farbstoff (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990), Einbau radioaktiv markierter Nukleotide (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989), Einbau von 5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU) in die DNA proliferierender Zellen (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985), und die Verwendung von Tetrazolium-Salzen (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5: 69-84, 1995; und Scudiero et al., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988). Zu Assays, welche die Differenzierung messen, zählen beispielsweise die Bestimmung von Zelloberflächen-Markern, die mit Stadium spezifischer Expression eines Gewebes verbunden sind, das Messen der enzymatischen Aktivität, der funktionellen Aktivität oder von morphologischen Veränderungen (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989). Umgekehrt können diese Assays in einer Kompetition verwendet werden, um die antagonistische Aktivität oder Zalpha11-Ligand-Bindungsaktivität des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise der löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, zu bewerten. Des weiteren können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise die löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, als Antagonisten oder Ligand-Bindungs-Agenzien verwendet werden, um das Immunsystem und die hämatopoetischen Aktivitäten des Zalpha11-Liganden zu modulieren.
Der Zalpha11-Ligand wurde aus Gewebe isoliert, von dem bekannt war, dass es beträchtliche immunologische Funktionen aufweist und Zellen enthält, die eine Rolle im Immunsystem spielen. Der Zalpha11-Ligand wird in CD3⁺-selektierten, aktivierten peripheren Blutzellen exprimiert, und es wurde gezeigt, dass Zalpha11-Ligand-Expression nach T-Zell-Aktivierung ansteigt. Des weiteren zeigen Ergebnisse von Experimenten, die in der allgemein verfügbaren Patentanmeldung Nr. 09/522,217 beschrieben sind, und des hierin beschriebenen experimentellen Teils, dass der Zalpha11-Ligand eine Wirkung auf das Wachstum/die Expansion und/oder den differenzierten Zustand von NK-Zellen oder NK-Vorläuferzellen hat. Zusätzliche Belege zeigen, dass der Zalpha11-Ligand die Proliferation und/oder Differenzierung von T-Zellen und B-Zellen in vivo beeinflusst. Faktoren, die sowohl die Proliferation hämatopoetischer Vorläuferzellen stimulieren als auch reife Zellen aktivieren, sind allgemein bekannt. NK-Zellen sprechen auf IL-2 allein an, für die Proliferation und Aktivierung sind jedoch im Allgemeinen zusätzliche Wachstumsfaktoren erforderlich. Beispielsweise wurde gezeigt, dass IL-7 und der Steel-Faktor (c-Kit-Ligand) für die Koloniebildung von NK-Vorläuferzellen notwendig waren. IL-15 + IL-2 in Kombination mit IL-7 und dem Steel-Faktor war noch wirksamer (Mrózek et al., Blood 87: 2632-2640, 1996). Jedoch können auch nicht identifizierte Cytokine für die Proliferation spezifischer Untergruppen von NK-Zellen und/oder NK-Vorläuferzellen notwendig sein (Robertson et al., Blood 76: 2451-2438, 1990). Eine Zusammensetzung, welche Zalpha11-Ligand und IL-15 umfasst, stimuliert NK-Vorläuferzellen und NK-Zellen, was belegt, dass diese Zusammensetzung wirksamer ist, als die zuvor beschriebenen Faktoren und Kombinationen von Faktoren. Derartige Zusammensetzungen können außerdem den Kit-Liganden oder Stammzell-Faktor umfassen. Somit können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise die löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptoren der vorlie genden Erfindung, als Antagonisten oder Ligand-Bindungs-Agenzien verwendet werden, um die Wirkung des Zalpha11-Liganden auf NK-Zellen herabzusetzen.
Zudem gibt die Gewebeverteilung eines Rezeptors für ein bestimmtes Cytokin einen starken Hinweis auf die potentiellen Wirkungsstellen dieses Cytokins. Eine Northern-Analyse des Zalpha11-Rezeptors zeigte Transkripte in der humanen Milz, dem Thymus, den Lymphknoten, dem Knochenmark und in peripheren Blut-Leukocyten. Es wurden spezifische Zelltypen identifiziert, die Zalpha11-Rezeptoren exprimieren; starke Signale wurden in einer Gemischt-Lymphocyten-Reaktion (MLR) und in Burkitts Lymphom Raji beobachtet. Die zwei monocytischen Zelllinien, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer 26: 171-176, 1980) und U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer 17: 565-577, 1976), waren negativ. Der Zalpha11-Rezeptor wird mit relativ hohem Niveau in der MLR exprimiert, in der periphere mononukleare Blutzellen (PBMNC) aus zwei Individuen gemischt werden, was zu einer wechselseitigen Aktivierung führt. Der Nachweis hoher Niveaus an Transkript in der MLR, jedoch nicht in ruhenden T- oder B-Zell-Populationen, weist darauf hin, dass Zalpha11-Rezeptor-Expression in einem oder mehreren Zelltypen während der Aktivierung induziert werden könnte. Die Aktivierung isolierter Populationen von T- und B-Zellen kann künstlich erreicht werden, indem die Zellen mit PMA und Ionomycin stimuliert werden. Wenn gesonderte/sortierte Zellen diesen Aktivierungsbedingungen ausgesetzt wurden, stiegen in beiden Zelltypen die Niveaus des Zalpha11-Rezeptor-Transkripts an, was eine Rolle dieses Rezeptors und des Zalpha11-Liganden bei Immunantworten, insbesondere in autokrinen und parakrinen T- und B-Zell-Expansionen während der Aktivierung, unterstreicht. Der Zalpha11-Ligand könnte ebenso bei der Expansion primitiverer Vorläuferzellen, die in die Lymphopoese verwickelt sind, eine Rolle spielen. Somit können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise die löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, als Antagonisten oder Liganden-Bindungs-Agenzien verwendet werden, um die lymphopoetischen Aktivitäten des Zalpha11-Liganden zu modulieren.
Es stellte sich heraus, dass der Zalpha11-Rezeptor in geringen Mengen in ruhenden T- und B-Zellen vorliegt und während der Aktivierung in beiden Zelltypen hochreguliert wird. Interessanterweise regulieren die B-Zellen ebenfalls die „Message" schneller herunter, als die T-Zellen, was darauf hinweist, dass die Amplitude des Signals und das Timing des Löschens (Quenching) des Signals wichtig sind für die angemessene Regulation der B-Zell-Antworten.
Außerdem zeigt ein großer Anteil der Lamina-Propria-Zellen im Darm positive Hybridisierungs-Signale mit dem Zalpha11-Rezeptor. Dieses Gewebe besteht aus einer gemischten Population von lymphoiden Zellen, einschließlich aktivierter CD4⁺-T-Zellen und aktivierter B-Zellen. Eine Immundysfunktion, insbesondere eine chronische Aktivierung der mukosalen Im munantwort, spielt eine wichtige Rolle bei der Ätiologie von Morbus Crohn und entzündlichen Darmerkrankungen (IBD); die abnormale Antwort auf und/oder die Produktion von proinflammatorische(n) Cytokine(n) spielt vermutlich ebenso eine Rolle (Braegger et al., Annals Allergy 72: 135-141, 1994; Sartor RB Am. J. Gastroenterol. 92: 5S-11S, 1997). Der Zalpha11-Ligand führt zusammen mit IL-15 zur Expansion von NK-Zellen aus Knochenmark-Vorläuferzellen und erhöht die Effektor-Funktion der NK-Zellen. Zalpha11-Ligand co-stimuliert außerdem reife B-Zellen, die mit Anti-CD40-Antikörpern stimuliert wurden, inhibiert jedoch die B-Zell-Proliferation auf Signale durch IgM. Der Zalpha11-Ligand verstärkt T-Zell-Proliferation zusammen mit einem Signal durch den T-Zell-Rezeptor; und eine Überexpression in transgenen Mäusen führt zu Lymphopenie und einer Expansion von Monocyten und Granulocyten. Diese pleiotropen Wirkungen des Zalpha11-Liganden weisen darauf hin, dass Moleküle, die den Zalpha11-Liganden antagonisieren oder binden, wie beispielsweise die Moleküle der vorliegenden Erfindung, einen therapeutischen Nutzen für einen weiten Bereich von Erkrankungen, die auf Defekte im Immunsystem zurückzuführen sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, systemischem Lupus Erythematosus (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), Multipler Sklerose (MS), Myasthenia Gravis, Morbus Crohn, IBD und Diabetes, haben können. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass diese Erkrankungen das Ergebnis eines komplexen Netzwerks einer Immundysfunktion sind (beispielsweise ist SLE die Manifestation von Defekten sowohl in T- als auch in B-Zellen), und dass Immunzellen von einer gegenseitigen Interaktion abhängig sind, um eine wirksame Immunantwort hervorzurufen. Aus diesem Grund ist der Zalpha11-Ligand (oder ein Antagonist des Liganden, wie beispielsweise ein Molekül der vorliegenden Erfindung), welcher verwendet werden kann, um mehr als einen Typ von Immunzellen zu manipulieren, ein attraktiver therapeutischer Kandidat, um an mehreren Stadien der Erkrankung einzugreifen.
Gleichermaßen zeigt die Gewebeverteilung der mRNA, welche der IL-2Rγ-Rezeptor-cDNA entspricht, Expression in hämatopoetischen und lymphoiden Zellen, einschließlich CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, CD20⁺-B-Zellen, CD56⁺-NK-Zellen, CD14⁺-Monocyten sowie Granulocyten. IL-2Rγ-Rezeptor-cDNA wird im Allgemeinen nicht in anderen Zelltypen, einschließlich epithelialen Zellen und Fibroblasten-Zellen, gefunden. Das Expressionsmuster dieses Rezeptors korreliert mit den Aktivitäten des Zalpha11-Liganden und der Lokalisation des Zalpha11-Rezeptors. Zudem setzen Antikörper gegen den IL-2Rγ-Rezeptor die Wirkung des Zalpha11-Liganden in B-Zellen und BaF3/Zalpha11-Rezeptor-Zellen herab oder beseitigen sie, was zeigt, dass der Zalpha11-Rezeptor und der IL-2Rγ-Rezeptor in vivo und in vitro heterodimerisieren können.
Der Zalpha11-Ligand fördert die Expansion von NK-Zell-Populationen aus Knochenmark und reguliert die Proliferation reifer T- und B-Zellen als Antwort auf aktivierende Stimuli. Der Zalpha11-Ligand wirkt durch einen Rezeptor-Komplex, welcher zumindest eine Zalpha11-Rezeptor-Untereinheit und die γc-Untereinheit von IL-2R enthält, auch wenn die cytoplasmatische Domäne des Zalpha11-Rezeptors ein Signal in einer homodimeren Konfiguration transduzieren kann (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217). IL-4Rα ist ebenso als Homodimer zur Signalisierung fähig (Kammer, W. et al., J. Biol. Chem. 271: 23634-23637, 1996), obwohl der eigentliche funktionelle IL-4-Rezeptor-Komplex ein IL-4Rα/γc-Heterodimer ist. Die Signalisierung im BaF3/Zalpha11-Rezeptor könnte aus Interaktionen des humanen Zalpha11-Rezeptors mit endogenem murinem γc resultiert haben, und die vorliegenden Beispiele zeigen, dass Antikörper gegen die γc-Untereinheit die Zalpha11-Liganden-Signalisierung in diesen Zellen herabsetzt.
Des Weiteren wurde der IL-2-Rezeptor detallliert untersucht; er ist aus einem α-β-γc-Heterotrimer zusammengesetzt. Die β- und γc-Untereinheiten sind beide wesentlich für die Signaltransduktion und sind Mitglieder der Hämatopoetin-Rezeptor-Superfamilie (Cosman, D., Cytokine 5: 95-106, 1993), während die α-Untereinheit primär in die Hochaffinitätsbindungs-Konversion verwickelt zu sein scheint und sich strukturell von der Hämatopoetin-Rezeptor-Familie unterscheidet. Es wurde gezeigt, dass die γc-Untereinheit an der Bildung der Rezeptoren für IL-4, IL-7, IL-9 und IL-15 und außerdem IL-2 Anteil hat (siehe zum Überblick Sugamura, K., et al., Annu. Rev. Immunol. 14: 179-205, 1996); und es wurde gezeigt, dass Null-Mutationen in dem γc-Gen X-gebundene schwere kombinierte Immunodefizienz (X-SCID) verursacht (Noguchi, M. et al., Cell 73:147-157, 1993).
Der Zalpha11-Ligand-Antagonismus von Anti-IgM- und IL-4-induzierter B-Zell-Proliferation (allgemein verfügbare Patentanmeldung Nr. 09/522,217 und vorliegende Beispiele) könnte auf eine Kompetition für γc zurückzuführen sein; dennoch ist offensichtlich, dass IL-4 durch einen γc-unabhängigen Rezeptor (IL-4Rα + IL-13Rα') signalisieren kann (Murata, T. et al., Blood 91: 3884-3891, 1998). B-Zellen aus humanen SCID-Patienten proliferieren normalerweise als Antwort auf Anti-IgM und IL-4 (Matthews, D.J. et al., Blood 85: 38-42, 1995), und die IL-4-Ansprechempfindlichkeit in normalen humanen B-Zellen steht sowohl mit der IL-13-Ansprechempfindlichkeit als auch mit den IL-13R-Niveaus in Verbindung (Ford, D. et al., J. Immunol. 163: 3185-3193, 1999). Gleichfalls könnte der Zalpha11-Ligand durch einen heterodimeren, heterotrimeren oder multimeren Komplex, welcher den Zalpha11-Rezeptor und eine Nicht-γc-Untereinheit enthält, signalisieren. Als solches betrifft die vorliegende Erfindung lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Antagonisten und Zalpha11-Ligand-Bindungsagenzien, welche keine γc-Untereinheit enthalten, sondern eine zusätzliche Klasse-I-Cytokin-Untereinheit, beispielsweise IL-13Rα' und Ähnliches enthalten.
Die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung sind geeignet als Antagonisten des Zalpha11-Liganden-Cytokins. Derartige antagonistische Wirkungen können durch direkte Neutralisation oder Bindung des Zalpha11-Liganden erreicht werden. Zusätzlich zu antagonistischen Verwendungen können die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung den Zalpha11-Liganden binden und als Trägerproteine für das Zalpha11-Ligand-Cytokin wirken, um den Liganden zu verschiedenen Geweben, Organen und Zellen innerhalb des Körpers zu transportieren. Als solche können die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung mit Molekülen, Polypeptiden oder chemischen Resten fusioniert oder gekoppelt sein, welche den löslichen Rezeptor-Ligand-Komplex an eine spezifische Stelle, wie beispielsweise ein Gewebe, eine spezifische Immunzelle oder einen Tumor, lenken. Somit können die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um spezifisch die Aktion des Zalpha11-Liganden zu lenken; siehe Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; und Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000.
Des Weiteren können die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um den Zalpha11-Liganden zu stabilisieren, die Bio-Verfügbarkeit, therapeutische Langlebigkeit und/oder Effizienz des Liganden zu erhöhen, indem der Ligand vor Abbau oder Beseitigung stabilisiert wird oder der Ligand zielgerichtet an eine Aktionsstelle innerhalb des Körpers gebracht wird. Beispielsweise kann der natürlich vorkommende IL-6-/löslicher IL-6R-Komplex IL-6 stabilisieren und durch den gp130-Rezeptor signalisieren; siehe Cosman, D. supra, und Fernandez-Botran, R. supra.
Beispielsweise wird der Zalpha11-Ligand bei der Behandlung von Tumorgenese und somit bei der Behandlung von Krebs von Nutzen sein. Der Zalpha11-Ligand inhibiert IL-4-stimulierte Proliferation von Anti-IgM-stimulierten normalen B-Zellen; eine ähnliche Wirkung wird in B-Zell-Tumorlinien beobachtet, was darauf hinweist, dass es von therapeutischem Nutzen sein könnte, Patienten mit dem Zalpha11-Liganden zu behandeln, um die B-Zell-Tumorzellen in einen weniger proliferativen Zustand zu versetzen. Der Ligand könnte in Kombination mit anderen Agenzien, die bereits in der Anwendung sind und sowohl konventionelle chemotherapeutische Agenzien als auch Immunmodulatoren, wie beispielsweise Interferon-Alpha umfassen, verabreicht werden. Es wurde gezeigt, dass Alpha/Beta-Interferone wirksam bei der Behandlung einiger Leukämien und in Tierkrankheits-Modellen sind, und die Wachstums-inhibierenden Wirkungen von Interferon-Alpha und dem Zalpha11-Liganden bei wenigstens einer B-Zell-Tumor-abgeleiteten Zelllinie additiv sind. Zudem wäre die Stabilisierung des Zalpha11-Liganden oder die Fähigkeit, den Liganden an spezifische Aktionsstellen zu lenken, mit den löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung in diesem therapeutischen Ansatz wünschenswert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Reduzierung der Proliferation von neoplastischen B- oder T-Zellen zur Verfügung, welches die Verabreichung einer Zusammensetzung des Zalpha11-Ligand-Antagonisten, wie beispielsweise der löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung, in einer Menge, die ausreichend ist, um die Proliferation von neoplastischen B- oder T-Zellen zu reduzieren, an ein Säugetier mit einem B- oder T-Zell-Neoplasma umfasst. In anderen Ausführungsformen kann die Zusammensetzung zumindest ein weiteres Cytokin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, FIt3-Ligand oder Stammzellfaktor, umfassen. Des Weiteren kann der Zalpha11-Ligand-Antagonist eine toxische Fusion sein. Gleichfalls können toxische lösliche Rezeptor-Fusionen und lösliche Rezeptoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Proliferation von lymphoiden und hämatopoetischen Neoplasmen, die den Zalpha11-Liganden überexprimieren oder als Antwort auf den Zalpha11-Liganden wachsen, zu reduzieren. Des Weiteren können indirekte Wirkungen der löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung die durch den Zalpha11-Liganden induzierte NK-Zell-Funktion modulieren und somit indirekt die Zerstörung von Tumorzellen verstärken.
Die vorliegende Erfindung stellt Polynukleotid-Moleküle, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, zur Verfügung, welche die hierin offenbarten heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide kodieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass im Hinblick auf die Degeneration des genetischen Codes beträchtliche Sequenz-Variationen unter diesen Polynukleotid-Molekülen möglich sind. SEQ ID NO: 7 stellt eine degenerierte DNA-Sequenz dar, welche alle DNAs umfasst, die das lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid der SEQ ID NO: 6 kodieren. SEQ ID NO: 66 ist eine degenerierte DNA-Sequenz, welche alle DNAs umfasst, die das lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid der SEQ ID NO: 69 kodieren. SEQ ID NO: 8 ist eine degenerierte DNA-Sequenz, welche alle DNAs umfasst, die das lösliche humane IL-2Rγ-Polypeptid der SEQ ID NO: 4 kodieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass die degenerierte Sequenz von SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 66 und SEQ ID NO: 8 ebenso alle RNA-Sequenzen bereitstellen, die SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 69 bzw. SEQ ID NO: 4 kodieren, die durch die Substitution von T durch U entstehen. Somit sind Zalpha11-Polypeptid-kodierende Polynukleotide, welche Nukleotid 1 bis Nukleotid 654 der SEQ ID NO: 7 oder Nukleotid 1 bis Nukleotid 741 der SEQ ID NO: 66 umfassen, lösliche humane IL-2Rγ-Polypeptid-kodierende Polynukleotide, welche Nukleotid 1 bis Nukleotid 696 der SEQ ID NO: 8 umfassen, und ihre RNA-Äquivalente Gegenstand der vorliegenden Erfindung. In Tabelle 1 sind die Ein-Buchstaben-Codes, die innerhalb der SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 66 und SEQ ID NO: 8 verwendet werden, angegeben, um degenerierte Nukleotid-Positionen zu kennzeichnen. Die „Auflösungen" geben die Nukleotide an, die durch einen Code-Buchstaben bezeichnet sind. Das „Komple mentäre" gibt den Code für das/die komplementäre(n) Nukleotide(e) an. Beispielsweise bezeichnet der Code Y entweder C oder T, und sein Komplementäres R bezeichnet A oder G, wobei A komplementär zu T und G komplementär zu C ist.
Tabelle 1
Die degenerierten Codons, die in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 66 und SEQ ID NO: 8 verwendet werden, umfassen alle möglichen Codons für eine gegebene Aminosäure und sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass bei der Bestimmung eines degenerierten Codons, welches repräsentativ für alle möglichen Codons ist, welche die jeweilige Aminosäure kodieren, Vieldeutigkeit entsteht. Beispielsweise kann das degenerierte Codon für Serin (WSN) unter bestimmten Umständen Arginin (AGR) kodieren, und das denegerierte Codon für Arginin (MGN) kann, unter bestimmten Umständen, Serin kodieren (AGY). Eine ähnliche Beziehung existiert zwischen den Codons, die Phenylalanin und Leucin kodieren. Somit können einige Polynukleotide, die von der degenerierten Sequenz umfasst werden, unterschiedliche Aminosäuren kodieren; ein Fachmann auf dem Gebiet kann jedoch leicht derartige unterschiedliche Sequenzen durch Bezugnahme auf die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 69 oder SEQ ID NO: 4 identifizieren. Unterschiedliche Sequenzen können, wie hierin beschrieben, leicht auf ihre Funktionalität getestet werden.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ebenso erkennen, dass verschiedene Spezies eine „bevorzugte Codon-Verwendung" aufweisen können; siehe allgemein Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Waln-Hobson, et al., Gene 13: 355-64, 1981 ; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982 ; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Die hierin verwendete Bezeichnung "bevorzugte Codon-Verwendung" oder "bevorzugte Codons" ist ein Fachbegriff, der sich auf Protein-Translations-Codons bezieht, die am häufigsten in den Zellen einer bestimmten Art/Spezies verwendet werden, wodurch ein oder einige repräsentative Codons unter den möglichen Codons, welche die jeweilige Aminosäure kodieren, bevorzugt werden (siehe Tabelle 2). Beispielsweise kann die Aminosäure Threonin (Thr) durch ACA, ACC, ACG oder ACT kodiert werden, in Säugetierzellen ist jedoch ACC das am häufigsten verwendete Codon; in anderen Arten, beispielsweise Insektenzellen, Hefe, Viren oder Bakterien, können andere Thr-Codons bevorzugt sein. Bevorzugte Codons für eine bestimmte Art können in die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung durch verschiedene, auf dem Gebiet bekannte Verfahren eingeführt werden. Die Einführung bevorzugter Codon-Sequenzen in rekombinante DNA kann beispielsweise die Produktion des Proteins verstärken, indem die Protein-Translation innerhalb eines bestimmten Zelltyps oder einer bestimmten Art effizienter gemacht wird. Aus diesem Grund dienen die in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 66 und SEQ ID NO: 8 offenbarten Codon-Sequenzen als Vorlage zur Optimierung der Expression von Polynukleotiden und Polypeptiden in verschiedenen Zelltypen und Arten, die üblicherweise auf dem Gebiet verwendet werden und hierin offenbart sind. Sequenzen, die bevorzugte Codons enthalten, können in verschiedenen Spezies im Hinblick auf die Expression getestet und optimiert und auf ihre Funktionalität, wie hierin offenbart, getestet werden.
Innerhalb bestimmter Ausführungsformen der Erfindung hybridisieren die isolierten Polynukleotide mit Bereichen ähnlicher Größe der SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 68 oder SEQ ID NO: 3 oder mit einer dazu komplementären Sequenz unter stringenten Bedingungen. Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen derart ausgewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert liegen. Die T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH-Wert), bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt passenden Sonde hybridisiert. Es sind verschiedene Gleichungen zur Berechnung der T_m auf dem Fachgebiet bekannt; sie sind spezifisch für DNA, RNA und DNA-RNA-Hybride und Polynukleotid-Sonden-Sequenzen verschiedener Länge (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); und Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)). Sequenzanalyse-Software, wie beispielsweise OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) und Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) sowie Internet-Seiten sind verfügbare Werkzeuge zur Analyse einer gegebenen Sequenz und Berechnung der T_m, basierend auf Anwender-definierten Kriterien. Derartige Programme können ebenso eine gegebene Sequenz unter definierten Bedingungen analysieren und geeignete Sonden-Sequenzen identifizieren. Typischerweise wird die Hybridisierung längerer Polynukleotid-Sequenzen (z. B. > 50 Basenpaare) bei Temperaturen von ungefähr 20 bis 25°C unter der berechneten T_m durchgeführt. Für kleinere Sonden (z. B. < 50 Basenpaare) wird die Hybridisierung typischerweise bei der T_m oder 5 bis 10°C darunter durchgeführt. Dies ermöglicht die maximale Hybridierungsgeschwindigkeit für DNA-DNA- und DNA-RNA-Hybride. Höhere Stringenz-Grade bei niedrigeren Temperaturen können durch die Zugabe von Formamid, welches die T_m des Hybrids um etwa 1°C pro 1% Formamid in der Pufferlösung herabsetzt, erreicht werden. Geeignete stringente Hybridisierungsbedingungen sind äquivalent zu einer etwa fünfstündigen bis Übernacht-Inkubation bei ungefähr 42°C in einer Lösung, enthaltend ungefähr 40-50% Formamid, bis zu etwa 6 × SSC, etwa 5 × Denhardts Lösung, 0 bis etwa 10% Dextransulfat und etwa 10-20 μg/ml denaturierte, kommerziell erhältliche Träger-DNA. Im Allgemeinen beinhalten derartige stringente Bedingungen Temperaturen von 20-70°C und einen Hybridisierungspuffer, enthaltend bis zu 6 × SSC und 0-50% Formamid; auf die Hybridierung folgt dann ein Waschen der Filter in bis zu etwa 2 × SSC. Beispielsweise ist eine geeignete Stringenz beim Waschen äquivalent zu 0,1 × SSC bis 2 × SSC, 0,1% SDS, bei 55°C bis 65°C. Verschiedene Stringenz-Grade können während der Hybridisierung und des Waschens verwendet werden, um eine maximale spezifische Bindung an die Zielsequenz zu erreichen. Typischerweise werden die Waschungen, die auf die Hybridisierung folgen, mit ansteigenden Stringenz-Graden durchgeführt, um nicht-hybridisierte Polynukleotid-Sonden von den hybridisierten Komplexen zu entfernen. Stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind abhängig von der Länge der Sonde, die sich in der T_m, widerspiegelt, und den verwendeten Hybridisierungs- und Waschlösungen; sie werden routinemäßig durch einen Fachmann auf dem Gebiet empirisch bestimmt.
Wie zuvor erwähnt, umfassen die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNA und RNA. Methoden zur Herstellung von DNA und RNA sind auf dem Gebiet gut bekannt. Im Allgemeinen wird RNA aus einem Gewebe oder einer Zelle isoliert, das/die große Mengen an Zalpha11-Rezeptor-RNA oder die RNA für die heterodimere Komponente des Rezeptors, wie beispielsweise IL-2Rγ oder einen anderen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor, produziert. Derartige Gewebe und Zellen werden durch Northern-Blotting identifiziert (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980); dazu zählen PBLs, Milz, Thymus und Lymphgewebe, Raji-Zellen, humane Erythroleukämie-Zelllinien (z. B. TF-1), akute monocytische Leukämie-Zelllinien, andere lymphoide und hämatopoetische Zelllinien und Ähnliches, für den Zalpha11-Rezeptor. Die RNA für eine heterodimere Komponente des Rezeptors, wie beispielsweise IL-2Rγ oder einen anderen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor, kann aus lymphoiden Zellen, wie beispielsweise den oben beschriebenen, und anderen Zellen und Geweben, die für diese Rezeptoren bekannt sind, isoliert werden. Gesamt-RNA kann unter Verwendung der Guanidinium-Isothiocyanat-Extraktion und anschließende Isolierung durch Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten präpariert werden (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poly(A)⁺-RNA wird aus Gesamt-RNA unter Verwendung des Verfahrens von Aviv and Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972) hergestellt. Komplementäre DNA (cDNA) wird aus Poly(A)⁺-RNA unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt. Alternativ kann genomische DNA isoliert werden. Polynukleotide, welche Zalpha11-Polypeptide kodieren, werden dann, beispielsweise durch Hybridisierung oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR), identifiziert und isoliert (Mullis, US-Patent Nr. 4,683,202).
Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können außerdem unter Verwendung von DNA-Synthese-Vorrichtungen synthetisiert werden. Die Methode der Wahl ist derzeit das Phosphoramidit-Verfahren. Wenn chemisch synthetisierte doppelstängige DNA für eine Anwendung, wie beispielsweise die Synthese eines Gens oder Genfragments, erforderlich ist, wird jeder komplementäre Strang separat hergestellt. Die Herstellung kurzer Polynukleotide (60 bis 80 bp) ist technisch unkompliziert und kann durch die Synthese der komplementären Stränge und ihr anschließendes Hybridisieren (Annealing) erreicht werden. Für die Herstellung längerer Polynukleotide (> 300 bp) werden jedoch gewöhnlich spezielle Strategien angewendet, da die Kopplungseffizienz jedes Zyklus während der chemischen DNA-Synthese selten 100% erreicht. Um dieses Problem zu lösen, werden synthetische Gene (doppelsträngig) in modularer Form aus einzelsträngigen Fragmenten von 20 bis 100 Nukleotiden Länge zusammengesetzt.
Ein alternativer Weg zur Herstellung eines Gens voller Länge ist, einen spezifischen Satz überlappender Oligonukleotide (40 bis 100 Nukleotide) zu synthetisieren. Nach Hybridisierung der kurzen überlappenden komplementären 3'- und 5'-Bereiche (6 bis 10 Nukleotide) verblei ben noch große Lücken, die kurzen Bereiche mit Basenpaarungen sind jedoch lang und stabil genug, um die Struktur zusammenzuhalten. Die Lücken werden aufgefüllt, und die DNA-Duplex wird durch enzymatische DNA-Synthese durch E.-coli-DNA-Polymerase I vervollständigt. Nach Beendigung der enzymatischen Synthese werden die Schnitte („nicks") mit T4-DNA-Ligase geschlossen. Doppelsträngige Konstrukte werden nacheinander miteinander verbunden, um die gesamte Gensequenz zu bilden, welche durch DNA-Sequenzanalyse verifiziert wird; siehe Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323-56, 1984 und Climie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-7, 1990. Außerdem werden im Allgemeinen andere Sequenzen angefügt, die Signale für die richtige Initiation und Termination der Transkription und Translation enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Gegenstück-Polypeptide und -Polynukleotide aus anderen Arten (Orthologe) zur Verfügung. Zu diesen Arten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Säugetier-, Vogel-, Amphibien-, Reptilien-, Fisch-, Insekten- und andere Vertebraten- und Nicht-Vertebraten-Arten. Von besonderem Interesse sind heterodimere lösliche Rezeptor-Komplexe, welche den löslichen Zalpha11-Rezeptor und das lösliche humane IL-2Rγ oder andere lösliche Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Polypeptide aus anderen Säugetier-Arten, einschließlich der Polypeptide aus Maus, Schwein, Schaf, Rind, Hund, Katze, Pferd und anderen Primaten, kombinieren. Bekannte und unbekannte Orthologe des humanen löslichen Zalpha11-Rezeptors und löslichen humanen IL-2Rγ oder anderer löslicher Klasse-I-Cytokin-Rezeptoren können unter Verwendung der Information und der Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, in Kombination mit konventionellen Klonierungstechniken kloniert werden. Beispielsweise kann eine cDNA unter Verwendung von mRNA, welche aus einem Gewebe oder Zelltyp, wie beispielweise lymphoiden Zellen, welches/welcher den Zalpha11-Rezeptor, das humane IL-2Rγ oder andere Klasse-I-Cytokin-Rezeptoren exprimiert, erhalten wurde, kloniert werden. Geeignete mRNA-Quellen können außerdem durch Hybridisieren von Northern-Blots mit Sonden, die anhand der hierin offenbarten Sequenzen konstruiert wurden, identifiziert werden. Dann wird eine Bibliothek von mRNA eines positiven Gewebes oder einer positiven Zelllinie hergestellt. Anschließend kann eine Zalpha11-kodierende cDNA durch verschiedene Methoden, wie beispielsweise durch Hybridisieren mit einer vollständigen oder partiellen humanen cDNA oder mit einem oder mehreren Sätzen degenerierter Sonden auf der Grundlage der offenbarten Sequenzen isoliert werden. Eine cDNA kann ebenso durch Anwendung von PCR (Mullis, supra) unter Verwendung von Primern, die anhand der hierin offenbarten repräsentativen humanen Zalpha11-Sequenz oder der Sequenz für das lösliche humane IL-2Rγ konstruiert wurden, kloniert werden. In einem weiteren Verfahren kann die cDNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu tranformieren oder zu transfizieren; die Expression der interessierenden cDNA kann mit einem Antikörper gegen das Zalpha11-Polypeptid nachgewiesen werden. Ähnliche Techniken können ebenso bei der Isolierung genomischer Klone angewendet werden.
Cytokin-Rezeptor-Untereinheiten sind gekennzeichnet durch eine Multi-Domänen-Struktur, welche eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembran-Domäne, die das Polypeptid in der Zellmembran verankert, und eine intrazelluläre Domäne umfasst. Die extrazelluläre Domäne des Zalpha11-Rezeptors ist eine Liganden-Bindungs-Domäne, welche den Zalpha11-Liganden bindet, und die intrazelluläre Domäne ist eine Effektor-Domäne, die in Signal-Transduktion verwickelt ist, obwohl die Liganden-Bindung und die Effektor-Funktionen auf separaten Untereinheiten eines multimeren Rezeptors beruhen können. Die Liganden-Bindungs-Domäne kann selbst eine Multi-Domänen-Struktur aufweisen. Zu multimeren Rezeptoren zählen Homodimere (z. B. αα- und ββ-Isoformen des PDGF-Rezeptors, der Erythropoietin-Rezeptor, MPL und G-CSF-Rezeptor), Heterodimere, deren Untereinheiten jeweils Liganden-Bindungs- und Effektor-Domänen aufweisen (z. B. die αβ-Isoform des PDGF-Rezeptors) und Multimere, die Teiluntereinheiten mit verschiedenen Funktionen aufweisen (z. B. IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-13-, IL-15- und GM-CSF-Rezeptoren). Einige Rezeptor-Untereinheiten sind bei einer Anzahl von Rezeptoren gleich. Beispielsweise ist die AIC2B-Untereinheit, die selbst keine Liganden binden kann, jedoch eine intrazelluläre Signal-Transduktions-Domäne enthält, eine Komponente von IL-3- und GM-CSF-Rezeptoren. Viele Cytokin-Rezeptoren können auf der Grundlage ihrer Struktur und Funktion in eine von vier verwandten Familien eingeordnet werden. Beispielsweise sind hämatopoetische Rezeptoren gekennzeichnet durch die Gegenwart einer Domäne, welche konservierte Cystein-Reste und das WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13) enthält. Cytokin-Rezeptor-Strukturen sind in Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228, 1991; und Cosman, Cytokine 5: 95-106, 1993, zusammengefasst. Unter dem selektiven Druck, dem Organismen ausgesetzt sind, neue biologische Funktionen zu erwerben, entstehen wahrscheinlich neue Mitglieder der Rezeptor-Familie aus Duplikation existierender Rezeptor-Gene, was zur Existenz von Multi-Gen-Familien führt. Die Familienmitglieder enthalten somit Überreste des Stammgens, und diese charakteristischen Merkmale können bei der Isolierung und Identifizierung weiterer Familienmitglieder ausgenutzt werden. Somit wird die Cytokin-Rezeptor-Superfamilie unterteilt in verschiedene Familien, beispielsweise die Immunoglobulin-Familie (einschließlich der CSF-1-, MGF-, IL-1- und PDGF-Rezeptoren), die Hämatopoetin-Familie (einschließlich der β-Untereinheit des IL-2-Rezeptors, der α-Untereinheit des GM-CSF-Rezeptors, der β-Untereinheit des GM-CSF-Rezeptors und G-CSF-, EPO-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-9-, IL-13- und IL-15-Rezeptoren), die TNF- Rezeptor-Familie (einschließlich der TNF(p80)- und TNF(p60)-Rezeptoren, CD27-, CD30-, CD40-, Fas- und des NGF-Rezeptors).
Die Analyse der Zalpha11-Rezeptor-Sequenz weist darauf hin, dass es sich um ein Mitglied der gleichen Rezeptor-Unterfamilie handelt, zu der auch die β-Untereinheit des IL-2-Rezeptors, der/die IL-4- und IL-9-Rezeptoren gehören. Bestimmte Rezeptoren dieser Unterfamilie (z. B. EPO-R oder MPL) assoziieren unter Bildung von Homodimeren, welche ein Signal transduzieren. Andere Mitglieder der Unterfamilie (z. B. IL-6-, IL-11- und LIF-Rezeptoren) vereinigen sich mit einer zweiten Untereinheit (bezeichnet als β-Untereinheit), um einen Liganden zu binden und ein Signal zu transduzieren. Spezifische β-Untereinheiten assoziieren mit einer Vielzahl spezifischer Cytokin-Rezeptor-Untereinheiten. Beispielsweise assoziiert die β-Untereinheit gp130 (Hibi et al., Cell 63: 1149-1157, 1990) mit Rezeptor-Untereinheiten, die für IL-6, IL-11 und LIF spezifisch sind (Gearing et al., EMBO J. 10: 2839-2848, 1991; Gearing et al., US-Patent Nr. 5,284,755). Oncostatin M bindet an ein Heterodimer des LIF-Rezeptors und gp130. CNTF bindet an trimere Rezeptoren, welche den CMTF-Rezeptor, den LIF-Rezeptor und gp130-Untereinheiten umfassen. Außerdem rufen IL-4 und IL-13 Antworten durch die IL-4- und IL-13-Rezeptoren hervor, indem sie auf verschiedene funktionelle heterodimere Rezeptor-Komplexe, z. B. mit und ohne die γc-Untereinheit, wirken; derartige heterodimere Rezeptor-Komplexe können auch Einfluss darauf haben, ob die Cytokine auf hämatopoetische oder nicht-hämatopoetische Zellen wirken (Andersson, A. et al., Eur. J. Immunol. 27: 1762-1768, 1997; Murata, T. et al., Blood 10: 3884-3891, 1998). Zudem wird die Bindungs-Affinität von IL-4 zu seinem Rezeptor erhöht, wenn die γc-Untereinheit des IL-4R-Komplexes durch eine IL-13-Rα'-Untereinheit ersetzt wird (Murata, T. et al., supra). Somit umfassen die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung Zalpha11-Rezeptor-Homodimere und Heterodimere, welche eine Zalpha11-Rezeptor-Komponente aufweisen, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, oder den löslichen Zalpha11-Rezeptor, der mit einem anderen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor heterodimerisiert ist, wie beispielsweise IL-13Rα(SEQ ID NO: 84), IL-13Rα'(SEQ ID NO: 82) oder einer IL-15(SEQ ID NO: 86)-Rezeptor-Untereinheit.
Beispielsweise umfassen geeignete lösliche Klasse-I-Cytokin-Rezeptoren, welche mit einer löslichen Zalpha11-Rezeptor-Komponete (z. B. SEQ ID NO: 6) heterodimerisieren können, einen löslichen Rezeptor für IL-13Rα, wie in SEQ ID NO: 84 dargestellt, IL-13Rα', wie in SEQ ID NO: 82 dargestellt, oder IL-15, wie in SEQ ID NO: 86 dargestellt. Außerdem können funktionelle Unterfragmente, wie beispielsweise minimale Cytokin-bindende Fragmente, dieser löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptoren verwendet werden. Zu derartigen funktionellen Fragmenten zählen 1 bis 322, 7 bis 322 und 105 bis 322 der SEQ ID NO 82; 1 bis 317, 10 bis 317 und 105 bis 317 der SEQ ID NO: 84; und 1 bis 173 der SEQ ID NO: 86. Die entsprechenden Poly nukleotid-Sequenzen sind wie in SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83 bzw. SEQ ID NO: 85 dargestellt. Ein Fachmann auf dem Gebiet ist leicht dazu in der Lage zu erkennen, welche Sequenzen einer bekannten Klasse-I-Cytokin-Sequenz die extrazelluläre Cytokin-Bindungs-Domäne, die frei von der Transmembran-Domäne und der intrazellulären Domäne ist, umfassen.
Eine Polynukleotid-Sequenz für das Maus-Orthologe des humanen Zalpha11-Rezeptors wurde identifiziert und ist in SEQ ID NO: 11 dargestellt; die entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 12 wiedergegeben. Die Analyse des Maus-Zalpha11-Polypeptids, welches durch die DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 11 kodiert wird, zeigte einen offenen Leserahmen, welcher 529 Aminosäuren kodiert (SEQ ID NO: 12) und ein erwartetes sekretorisches Signalpeptid von 19 Aminosäure-Resten (Rest 1 (Met) bis Rest 19 (Ser) der SEQ ID NO: 12) und ein reifes Polypeptid von 510 Aminosäuren (Rest 20 (Cys) bis Rest 529 (Ser) der SEQ ID NO: 2) umfasst. Zusätzlich zu dem WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13), welches den Resten 214 bis 218 der SEQ ID NO: 12 entspricht, umfasst der Rezeptor eine Cytokin-Bindungs-Domäne von ungefähr 200 Aminosäure-Resten (Reste 20 (Cys) bis 237 (His) der SEQ ID NO: 12), einen Domänen-Linker (Reste 120 (Pro) bis 123 (Pro) der SEQ ID NO: 12), einen vorletzten Strangbereich (Reste 192 (Lys) bis 202 (Ala) der SEQ ID NO: 12), eine Transmembran-Domäne (Reste 238 (Met) bis 254 (Leu) der SEQ ID NO: 12), eine vollständige intrazelluläre Signal-Domäne (Reste 255 (Lys) bis 529 (Ser) der SEQ ID NO: 12), welche eine „Box I"-Signalstelle (Reste 266 (Ile) bis 273 (Pro) der SEQ ID NO: 12) und eine „Box II"-Signalstelle (Reste 301 (Ile) bis 304 (Val) der SEQ ID NO: 2) enthält. Ein Vergleich der humanen und Maus-Aminosäure-Sequenzen zeigt, dass sowohl humane als auch orthologe Polypeptide die entsprechenden oben beschriebenen strukturellen Merkmale enthalten. Die reife Sequenz für das Maus-Zalpha11 beginnt bei Cys₂₀ (wie in SEQ ID NO: 12 dargestellt), welches dem Cys₂₀ (wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt) in der humanen Sequenz entspricht. Es besteht ungefähr 69% Identität zwischen der Maus- und der humanen Zalpha11-Sequenz in der extrazellulären Cytokin-Bindungs-Domäne, welche den Resten 20 (Cys) bis 237 (His) der SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 6) und den Resten 20 (Cys) bis 237 (His) der SEQ ID NO: 12 entspricht. Die obigen prozentualen Übereinstimmungen wurden unter Verwendung eines FASTA-Programms mit ktup = 1, einem „Gap-Opening-Penalty" = 12, „Gap-Extension-Penalty" = 2 und einer Substitutions-Matrix = BLOSUM62, wobei die anderen FASTA-Programm-Parameter wie vorgegeben eingestellt wurden, bestimmt. Die entsprechenden Polynukleotide, welche die oben beschriebenen Maus-Zalpha11-Polypeptid-Bereiche, -Domänen, -Motive, -Reste und -Sequenzen kodieren, sind wie in SEQ ID NO: 11 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen heterodimeren löslichen Rezeptor zur Verfügung, wobei das darin enthaltene isolierte lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid im Wesentlichen den Polypeptiden von SEQ ID NO: 6 und ihren Orthologen entspricht. Zudem stellt in einer bevorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung außerdem einen heterodimeren löslichen Rezeptor zur Verfügung, wobei das darin enthaltene isolierte lösliche IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid im Wesentlichen den Polypeptiden der SEQ ID NO: 4 und ihren Orthologen entspricht. Die Bezeichnung „im Wesentlichen entspricht" wird hierin verwendet, um Polypeptide zu bezeichnen, die wenigstens 70%, bevorzugter wenigstens 80%, Sequenzidentität in Bezug auf die in SEQ ID NO: 6 dargestellten Sequenzen oder ihren Orthologen aufweisen. Derartige Polypeptide sind bevorzugter zu wenigstens 90% identisch, am bevorzugtesten zu 95% oder mehr identisch zu der SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 4 und ihre Orthologen. Die prozentuale Sequenz-Identität wird durch konventionelle Verfahren bestimmt; siehe beispielsweise Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986, und Henikoff and Henikoff, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992. Dabei werden zwei Aminosäuresequenzen so angeordnet, dass die Anordnungs-Scores optimiert werden, wobei ein „Gap-Opening-Penalty" von 10, ein „Gap-Extension-Penalty" von 1 und die „Blosum 62"-Scoring-Matrix von Henikoff and Henikoff (ibid.), wie in Tabelle 3 dargestellt (die Aminosäuren sind durch die Standard-Ein-Buchstaben-Codes angegeben), verwendet werden. Die prozentuale Identität wird dann folgendermaßen berechnet:
Gesamtzahl der Übereinstimmungen × 100 ,[Länge der längeren Sequenz plus Anzahl der Lücken, die in die längere Sequenz eingeführt werden, um die zwei Sequenzen anzuordnen]
Tabelle 3
Die Sequenz-Identität der Polynukleotid-Moleküle wird durch ähnliche Verfahren, die ein Verhältnis wie oben beschrieben verwenden, bestimmt.
Ein Fachmann auf dem Gebiet weiß, dass viele etablierte Algorithmen zur Verfügung stehen, um zwei Aminosäuresequenzen anzuordnen. Der Algorithmus der „FASTA-Ähnlichkeits-Suche von Pearson und Lipman stellt ein geeignetes Protein-Anordnungs-Verfahren dar, um das Ausmaß der Identität zwischen einer hierin offenbarten Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz einer vermeintlichen Variante zsig57 zu untersuchen. Der FASTA-Algorithmus ist in Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) und von Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990), beschrieben.
Durch FASTA wird zunächst die Sequenz-Ähnlichkeit charakterisiert, indem Bereiche identifiziert werden, die sowohl bei der Abfrage-Sequenz (z. B. SEQ ID NO: 6) als auch bei der Testsequenz vorliegen und entweder die höchste Dichte an Identitäten (wenn die ktup-Variable 1 ist) oder Identitäten-Paaren (wenn ktup = 2) aufweisen, wobei konservative Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen nicht berücksichtigt werden. Die zehn Bereiche mit der höchsten Identitäts-Dichte werden dann erneut ausgewertet, indem die Ähnlichkeit aller gepaarten Aminosäuren unter Verwendung einer Aminosäure-Substitutions-Matrix verglichen und die Enden der Bereiche „getrimmt" werden, um lediglich solche Reste zu enthalten, die zu dem höchsten „Score" beitragen. Wenn mehrere Bereiche mit Werten über dem „Cutoff"-Wert (der durch eine vorbestimmte Formel, basierend auf der Länge der Sequenz und dem ktup-Wert berechnet wird) vorliegen, werden die „getrimmten" Anfangsbereiche untersucht, um zu bestimmen, ob die Bereiche zusammengefügt werden können, um eine ungefähre Anordnung mit Lücken zu bilden. Schließlich werden die Bereiche mit den höchsten Scoring-Bereichen der zwei Aminosäuresequenzen unter Anwendung einer Modifikation des Needleman-Wunsch-Sellers-Algorithmus (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), welcher Aminosäure-Insertionen und -Deletionen ermöglicht, angeordnet. Bevorzugte Programm-Parameter für die FASTA-Analyse sind: ktup = 1, Gap-Operning-Penalty = 10, Gap-Extension-Penalty = 1 und Substitions-Matrix = BLOSUM62, wobei die anderen Parameter wie vorgegeben eingestellt werden. Diese FASTA-Programm-Parameter können in ein FASTA-Programm durch Modifizierung des „Scoring-Matrix-Files" („SMATRIX"), wie in dem Appendix 2 von Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) beschrieben, eingeführt werden.
FASTA kann ebenso dazu verwendet werden, die Sequenz-Identität von Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung eines Verhältnisses, wie oben beschrieben, festzustellen. Für die Nukleotid-Sequenz-Vergleiche kann der ktup-Wert im Bereich zwischen eins und sechs, bevorzugt von drei bis sechs, am bevorzugtesten bei drei, liegen, wobei die anderen Programm-Parameter wie vorgegeben eingestellt werden.
Die BLOSUM62-Tabelle (Tabelle 3) ist eine Aminosäure-Substitutions-Matrix, die aus etwa 2.000 lokalen multiplen Anordnungen von Proteinsequenz-Segmenten erhalten wurde, die hochkonservierte Bereiche von mehr als 500 Gruppen verwandter Proteine repräsentieren (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992)). Demgemäß können die BLOSUM62-Substitutions-Häufigkeiten verwendet werden, um konservative Aminosäure-Substitutionen, die in die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung eingeführt sein können, zu definieren. Ebenso ist es möglich, Aminosäure-Substitutionen zu konstruieren, die lediglich auf chemischen Eigenschaften (wie später diskutiert) basieren, wobei sich der Ausdruck „konservative Aminosäure-Substitution" bevorzugt auf eine Substitution bezieht, die durch einen BLOSUM62-Wert von höher als –1 gekennzeichnet ist. Beispielsweise ist eine Aminosäure-Substitution konservativ, wenn die Substitution durch einen BLOSUM62-Wert von 0, 1, 2 oder 3 gekennzeichnet ist. Gemäß diesem System sind bevorzugte konservative Aminosäure-Substitutionen gekennzeichnet durch einen BLOSUM62-Wert von mindestens 1 (z. B. 1, 2 oder 3), während bevorzugtere konservative Aminosäure-Substitutionen durch einen BLOSUM62-Wert von wenigstens 2 (z. B. 2 oder 3) gekennzeichnet sind.

Varianten der Zalpha11-Polypeptide oder im Wesentlichen homologe Zalpha11-Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehr Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Additionen aufweisen. Diese Veränderungen sind bevorzugt untergeordneter Natur, das heißt, es handelt sich um konservative Aminosäure-Substitutionen (siehe Tabelle 4) und andere Substitutionen, welche die Faltung oder die Aktivität des Polypeptids nicht signifikant beeinflussen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren, und kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Extensionen, wie beispielsweise einen Aminoterminalen Methionin-Rest, ein kleines Linker-Peptid von bis zu etwa 20-25 Resten, oder einen Affinitäts-Tag. Die vorliegende Erfindung umfasst somit lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide von etwa 190 bis etwa 245 Aminosäure-Resten, welche eine Sequenz umfassen, die zu mindestens 80%, bevorzugt zu mindestens 90% und bevorzugter zu 95% oder mehr, identisch mit dem entsprechenden Bereich der SEQ ID NO: 6 sind. Polypeptide, welche Affinitäts-Tags umfassen, können außerdem eine proteolytische Spaltungsstelle zwischen dem Zalpha11-Polypeptid und dem Affinitäts-Tag umfassen. Zu geeigneten Stellen zählen Thrombin-Spaltungsstellen und Faktor-Xa-Spaltungsstellen. Tabelle 4 Konservative Aminosäure-Substitutionen

Basisch:	Arginin
	Lysin
	Histidin
Sauer:	Glutamat
	Aspartat
Polar:	Glutamin
	Asparagin
Hydrophob:	Leucin
	Isoleucin
	Valin
Aromatisch:	Phenylalanin
	Tryptophan
	Tyrosin
Klein:	Glycin
	Alanin
	Serin
	Threonin
	Methionin

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem verschiedene andere Polypeptid-Fusionen und damit in Zusammenhang stehende multimere Proteine, welche eine oder mehr Polypeptid-Fusionen umfassen, zur Verfügung. Beispielsweise kann ein löslicher Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise lösliches Zalpha11/IL-2Rγ, als eine Fusion an ein dimerisierendes Protein, wie in den US-Patenten Nr. 5,155,027 und 5,567,584 offenbart, hergestellt werden. Zu bevorzugten dimerisierenden Proteinen zählen in dieser Hinsicht konstante Bereichs-Domänen von Immunoglobulin, z. B. IgGγ1, und die humane leichte κ-Kette. Fusionen aus Immunoglobulin und dem löslichen Zalpha11-Rezeptor oder Immunoglobulin und einem löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise Immunoglobulin und dem löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, können in genetisch konstruierten Zellen exprimiert werden, um verschiedene multimere Zalpha11-Rezeptor-Analoge herzustellen. Hilfsdomänen können an den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, fusioniert werden, um sie zu spezifischen Zellen, Geweben oder Makromolekülen (z. B. Kollagen oder Zellen, die den Zalpha11-Liganden exprimieren) zu lenken. Ein Zalpha11-Polypeptid kann an zwei oder mehr Reste, wie beispielsweise einen Affinitäts-Tag zur Aufreinigung und eine Targeting-Domäne, fusioniert sein. Polypeptid-Fusionen können ebenso ein oder mehr Spaltungsstellen, insbesondere zwischen den Domänen, umfassen; siehe Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können außerdem nicht in der Natur vorkommende Aminosäure-Reste umfassen. Zu nicht in der Natur vorkommenden Aminosäure-Resten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, trans-3-Methylprolin, 2,4-Methanprolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, N-Methylglycin, allo-Threonin, Methylthreonin, Hydroxyethylcystein, Hydroxyethylhomocystein, Nitroglutamin, Homoglutamin, Pipecolsäure, Thiazolidin-Carbonsäure, Dehydroprolin, 3- und 4-Methylprolin, 3,3-Dimethylprolin, tert-Leucin, Norvalin, 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin und 4-Fluorphenylalanin. Es sind verschiedene Verfahren auf dem Gebiet bekannt, um nicht-natürlich vorkommende Aminosäure-Reste in Proteine einzubauen. Beispielsweise kann ein In-vitro-System verwendet werden, wobei Nonsense-Mutationen unter Verwendung chemisch aminoacylierter Suppressor-tRNAs unterdrückt werden. Verfahren zur Synthese von Aminosäuren und Aminoacylierung von tRNA sind auf dem Gebiet bekannt. Die Transkription und Translation von Plasmiden, welche Nonsense-Mutationen enthalten, wird in einem zellfreien System, welches einen E.-coli-S30-Extrakt und kommerziell erhältliche Enzyme und andere Reagenzien umfasst, durchgeführt. Die Proteine werden durch Chromatographie aufgereinigt; siehe beispielsweise Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; und Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). In einem zweiten Verfahren wird die Translation in Xenopus-Oocyten durch Mikroinjektion mutierter mRNA und chemisch aminoacylierter Suppressor-tRNAs durchgeführt (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). In einem dritten Verfahren werden die E.-coli-Zellen in Abwesenheit natürlicher Aminosäuren, die ersetzt werden sollen (z. B. Phenylalanin) und in Gegenwart der gewünschten nicht in der Natur vorkommenden Aminosäure(n) (z. B. 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin oder 4-Fluorphenylalanin) kultiviert. Die nicht in der Natur vorkommende Aminosäure wird in das Protein an Stelle ihres natürlichen Gegenstücks eingebaut; siehe Koide et al., Biochem. 33: 7470-7476, 1994. Natürlich vorkommende Aminosäure-Reste können durch chemische In-vitro-Modifikation in nicht in der Natur vorkommende Arten umgewandelt werden. Chemische Modifikation kann mit ortsspezifischer Mutagenese kombiniert werden, um den Umfang der Substitutionen weiter auszudehnen (Wynn and Richards, Protein Sci., 2: 395-403, 1993).
Eine begrenzte Anzahl an nicht-konservativen Aminosäuren, Aminosäuren, die nicht durch den genetischen Code kodiert werden, nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuren und unnatürlichen Aminosäuren können Zalpha11-Aminosäure-Reste ersetzen.
Essentielle Aminosäuren in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung können gemäß den auf dem Gebiet bekannten Verfahren, wie beispielsweise durch stellenspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-502, 1991), identifiziert werden. In der letztgenannten Technik werden einzelne Alanin-Mutationen an jeden Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutanten Moleküle hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität (z. B. Liganden-Bindung und Signal-Transduktion), wie weiter unten offenbart, getestet, um die Aminosäure-Reste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls wesentlich sind; siehe ebenso Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Stellen der Ligand-Rezeptor-, Protein-Protein- oder anderer biologischer Interaktion können ebenso durch physikalische Analyse der Struktur durch Techniken, wie beispielsweise Kernspin-Resonanz, Kristallographie, Elektronenbeugung oder Fotoaffinitäts-Labeling, zusammen mit der Mutation vermeintlicher Kontaktstellen-Aminosäuren, bestimmt werden; siehe beispielsweise de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Die Identitäten der essentiellen Aminosäuren können ebenso aus Analysen der Homologien mit verwandten Rezeptoren abgeleitet werden.
Es können die Aminosäure-Reste, die innerhalb von Bereichen oder Domänen liegen, die für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität entscheidend sind, bestimmt werden. Innerhalb dieser Bereiche können die spezifischen Reste, die mehr oder weniger tolerant bezüglich eines Austausches sind und die Gesamt-Tertiär-Struktur des Moleküls aufrechterhalten, bestimmt werden. Zu Verfahren zur Analyse der Sequenzstruktur zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Anordnung mehrerer Sequenzen mit hoher Aminosäure- oder Nukleotid-Identität und Computeranalyse unter Verwendung verfügbarer Software (z. B. the Insight II^® Viewer and Homolgy Modeling Tools; MSI, San Diego, CA), Neigungen zur Ausbildung von Sekundärstrukturen, binäre Muster, komplementäre Anordnung (Packing) und verborgene polare Interaktionen (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995; und Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). Beim Erzeugen von Modifikationen in Molekülen oder bei der Identifizierung spezifischer Fragmente geht die Bestimmung der Struktur im Allgemeinen mit der Evaluierung der Aktivität modifizierter Moleküle einher.
Aminosäuresequenz-Austausche werden in dem löslichen Zalpha11-Rezeptor oder einem löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise dem löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, derart durchgeführt, dass die Unterbrechung der Struktur höherer Ordnung, die für die biologische Aktivität essentiell ist, minimiert wird. Beispielsweise werden, wenn der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, ein oder mehr Helices umfassen, Austausche in den Aminosäure-Resten derart vorgenommen, dass die Helix-Geometrie und andere Komponenten des Moleküls, bei denen Veränderungen in der Konformation einige kritische Funktionen, wie beispielsweise die Bindung des Moleküls an den Zalpha11-Liganden oder das Antagonisieren der Zalpha11-Liganden-Aktivität, vermindern, nicht zerstört werden. Die Wirkungen von Aminosäuresequenz-Änderungen können beispielsweise im „Computermodeling", wie oben offenbart, vorhergesagt oder durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden (siehe z. B. Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995). Andere Techniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, vergleichen die Faltung einer Variante eines Proteins mit einem Standardmolekül (z. B. dem nativen Protein). Beispielsweise kann ein Vergleich des Cystein-Musters zwischen einer Variante und den Standardmolekülen vorgenommen werden. Massenspektrometrie und chemische Modifikation unter Anwendung von Reduktion und Alkylierung stellen Verfahren zur Bestimmung von Cysteinresten bereit, die durch Disulfid-Bindungen verbunden oder frei von derartigen Assoziationen sind (Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993; und Patterson et al., Anal. Chem. 66: 3727-3732, 1994). Es wird allgemein angenommen, dass, wenn ein modifiziertes Molekül nicht das gleiche Muster von Disulfid-Bindungen wie das Standardmolekül aufweist, die Faltung beeinflusst würde. Ein weiteres gut bekanntes und akzeptiertes Verfahren zur Messung der Faltung ist Zirkular-Dichronismus (CD). Das Messen und der Vergleich der CD-Spektren, die durch ein modifiziertes Molekül und ein Standardmolekül erzeugt werden, ist Routine (Johnson, Proteins 7: 205-214, 1990). Kristallographie ist ein weiteres gut bekanntes Verfahren zur Analyse der Faltung und Struktur. Magnetische Kernresonanz (NMR), Peptid-Verdau-Mappierung und Epitop-Mappierung stellen ebenso bekannte Verfahren zur Analyse der Faltung und struktureller Ähnlichkeiten zwischen Proteinen und Polypeptiden dar (Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992).
Es kann ein Hopp/Woods-Hydrophilizitäts-Profil der Zalpha11-Proteinsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt, erzeugt werden (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 und Triquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). Das Profil basiert auf einem gleitenden Sechs-Reste-Fenster. Verborgene G-, S- und T-Reste und exponierte H-, Y- und W-Reste wurden ignoriert. Beispielsweise umfassen in dem löslichen Zalpha11-Rezeptor die hydrophilen Bereiche die Aminosäure-Reste 55 bis 60 der SEQ ID NO: 2, die Aminosäure-Reste 56 bis 61 der SEQ ID NO: 2, die Aminosäure-Reste 139 bis 144 der SEQ ID NO: 2 und die Aminsosäure-Reste 227 bis 232 der SEQ ID NO: 2. Die ent sprechenden hydrophilen Bereiche mit Bezug auf SEQ ID NO: 6 können unter Querverweis auf die obigen Aminosäure-Reste der SEQ ID NO: 2 erstellt werden.
Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass die Hydrophilizität oder Hydrophobizität bei der Erzeugung von Modifikationen in der Aminosäuresequenz des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, berücksichtigt werden, so dass die Gesamtstruktur und das biologische Profil nicht zerstört werden. Von besonderem Interesse bezüglich des Austausches sind hydrophobe Reste, ausgewählt aus der Gruppe Val, Leu und Ile oder der Gruppe Met, Gly, Ser, Ala, Tyr und Trp. Zu Resten, die tolerant bezüglich einer Substitution sind, zählen beispielsweise solche Reste, die in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 69 und SEQ ID NO: 4 dargestellt sind. Jedoch sind die Cystein-Reste vermutlich relativ intolerant bezüglich einer Substitution.
Die Identitäten essentieller Aminosäuren können ebenso aus der Analyse der Sequenzähnlichkeit zwischen Mitgliedern der Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Familie mit dem löslichen Zalpha11-Rezeptor oder dem löslichen IL-2Rγ-Rezeptor abgeleitet werden. Unter Verwendung von Verfahren, wie beispielsweise der zuvor beschriebenen „FASTA"-Analyse, können Bereiche hoher Übereinstimmung innerhalb einer Proteinfamilie identifiziert und zur Analyse der Aminosäuresequenz bezüglich konservierter Bereiche verwendet werden. Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung einer Variante des Zalpha11-Polynukleotids der extrazellulären Domäne auf der Basis der Struktur ist, zu bestimmen, ob ein Nukleinsäure-Molekül, welches eine potentielle Variante des Zalpha11-Polynukleotids kodiert, mit einem Nukleinsäure-Molekül, welches die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 68, wie oben diskutiert, aufweist, hybridisieren kann. Ebenso können Varianten des löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptors, die innerhalb eines heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise der löslichen IL-2Rγ-Rezeptor-Komponente im löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, enthalten sind, wie oben beschrieben identifiziert werden.
Zu weiteren Verfahren zur Identifizierung essentieller Aminosäuren in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung zählen auf dem Gebiet bekannte Verfahren, wie beispielsweise stellenspezifische Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498 (1991), Coombs and Corey, „Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering" in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.) Seiten 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). In der letztgenannten Technik werden einzelne Alanin-Mutationen an jeden Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutanten Moleküle hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität, wie weiter unten offenbart, getestet, um die Aminosäure-Reste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls entscheidend sind; siehe ebenso Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996).
Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem funktionelle Fragmente löslicher Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise löslicher Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, und Nukleinsäure-Moleküle, welche derartige funktionelle Fragmente kodieren. Ein „funktionelles" lösliches Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid oder lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, oder hierin definierte Fragmente davon, sind gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, an einen Anti-Zalpha11-Antikörper oder Zalpha11-Liganden (entweder gelöst oder immobilisiert) zu binden oder die Zalpha11-Ligand-Aktivität – beispielsweise in einem biologischen oder Bindungs-Assay – zu antagonisieren. Wie hierin zuvor beschrieben, ist der Zalpha11-Rezeptor gekennzeichnet durch eine Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Struktur. Somit stellt die vorliegende Erfindung außerdem Fusionsproteine zur Verfügung, welche (a) homodimere oder multimere Polypeptid-Moleküle, umfassend eine extrazelluläre Domäne, wie hierin beschrieben, und (b) funktionelle Fragmente, umfassend ein oder mehr dieser Domänen, umfassen. Der andere Polypeptidteil des Fusionsproteins kann aus einem anderen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor, beispielsweise IL-2Rγ, der β-Untereinheit des IL-2-Rezeptors und üblicher β-Rezeptoren (d. h., IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptor-β-Untereinheiten), IL-13α-, IL-13α'- oder IL-15-Rezeptor-Untereinheiten oder aus einem nicht-nativen und/oder einem nicht-verwandten sekretorischen Signalpeptid, welches die Sekretion des löslichen Fusionsproteins erleichtert, bestehen.
Routine-Deletions-Analysen von Nukleinsäure-Molekülen können durchgeführt werden, um funktionelle Fragmente von Nukleinsäure-Molekülen zu erhalten, die einen löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, kodieren. Zur Veranschaulichung können DNA-Moleküle mit der Nukleotid-Sequenz von SEQ ID NO: 1 oder Fragmente davon mit Bal3I-Nuklease verdaut werden, um eine Reihe ineinander greifender Deletionen zu erhalten. Diese DNA-Fragmente werden dann im richtigen Leserahmen in Expressions-Vektoren eingesetzt und die exprimierten Polypeptide isoliert und auf ihre Fähigkeit, die biologische Aktivität des Zalpha11-Liganden oder die Bindungs-Aktivität des Zalpha11-Liganden zu antagonisieren, oder auf ihre Fähigkeit, an Antikörper gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen lösliche heterodimere Zalpha11-Polypeptide zu binden, oder auf ihre Fähigkeit, den Zalpha11-Liganden zu binden, getestet. Eine Alternative zu dem Exonuklease-Verdau ist die Verwendung Oligonukleotidgerichteter Mutagenese zur Einführung von Deletionen oder Stopp-Codons zur Spezifizierung der Produktion eines gewünschten Polypeptid-Fragments. Alternativ können bestimmte Fragmente eines Polynukleotids des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodime ren Zalpha11-Polypeptids unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion synthetisiert werden.
Standardverfahren zur Identifizierung funktioneller Domänen, wie beispielsweise Liganden-Bindungs-Domänen, sind für einen Fachmann auf dem Gebiet Routine. Beispielsweise wurden Studien bezüglich der Verkürzung (Trunkierung) an einem oder beiden Enden von Interferonen von Horisberger und Di Marco, Pharmac. Ther. 66: 507 (1995), zusammengefasst. Außerdem sind Standardtechniken zur funktionellen Analyse von Proteinen beispielsweise von Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993), Content et al., „Expression and preliminary deletion analyses of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), Seiten 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor," in Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.) Seiten 169-199 (Academic Press 1985), Coumallleau et al., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995) und Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996), beschrieben.
Mehrfache Aminosäure-Substitutionen können unter Anwendung bekannter Mutagenese-Verfahren und Sceening-Verfahren, beispielsweise der von Reidhaar-Olson und Sauer (Science 241: 53-57, 1988) oder Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989) offenbarten Verfahren, durchgeführt und getestet werden. Zusammengefasst offenbaren diese Autoren Verfahren zur gleichzeitigen Randomisierung von zwei oder mehr Positionen in einem Polypeptid, Selektieren funktioneller Polypeptide, und anschließende Sequenzierung der mutagenisierten Polypeptide zur Bestimmung des Spektrums zulässiger Substitutionen an jeder Position. Zu anderen Verfahren, die Anwendung finden können, zählen Phagen-Displays (z. B. Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991, Ladner et al., US-Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO-Veröffentlichung WO 92/062045) und regionsspezifische Mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Varianten der offenbarten DNA- und Polypeptid-Sequenzen des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder der löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptide können durch DNA-Shuffling, wie von Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994; Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51, 1994, und in der WIPO-Veröffentlichung WO 97/20078 offenbart, erzeugt werden. Zusammengefasst werden Varianten der DNAs durch homologe Rekombination in vitro durch Zufalls(Random)-Fragmentierung der Ausgangs-DNA und anschließendes Wiederzusammensetzen unter Verwendung von PCR erzeugt, was zu zufällig eingeführten Punktmutationen führt. Diese Technik kann durch Verwendung einer Familie von Ausgangs-DNA, wie beispielsweise allelische Varianten oder DNA aus verschiedenen Arten, modifiziert werden, um zusätzliche Variabilität in den Prozess einzuführen. Selektion und Screening auf die gewünschte Aktivität und anschließende zusätzliche Iterationen der Mutagenese und Assays gestatten eine schnelle „Evolution" der Sequenzen durch Selektion der gewünschten Mutationen, wobei gleichzeitig gegen schädliche/nachteilige Veränderungen selektiert wird.
Die hierin offenbarten Mutagenese-Verfahren können mit automatisierten Hochdurchsatz-Screening-Verfahren kombiniert werden, um Zalpha11-Ligand-Antagonist oder -Bindungsaktivität in den Wirtszellen des klonierten, mutagenisierten löslichen Zalpha11-Rezeptors oder der löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide nachzuweisen. Zu bevorzugten Assays zählen in dieser Hinsicht Zell-Proliferations-Assays und Liganden-Bindungs-Assays auf Biosensor-Basis, welche unten und in den Beispielen beschrieben sind. Mutagenisierte DNA-Moleküle, welche aktive Rezeptoren oder Teile davon (z. B. Ligand-Bindungs-Fragmente und Ähnliches) kodieren, können aus der Wirtszelle gewonnen und unter Verwendung moderner Vorrichtungen schnell sequenziert werden. Diese Verfahren ermöglichen die schnelle Bestimmung der Bedeutung einzelner Aminosäure-Reste in einem Polypeptid von Interesse und können auf Polypeptide mit unbekannter Struktur angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine Reihe neuer Hybrid-Moleküle zur Verfügung, in denen ein Segment, welches ein oder mehr der Domänen des löslichen Zalpha11-Rezeptors umfasst, mit einem anderen löslichen Rezeptor-Polypeptid fusioniert ist. Die Fusion wird bevorzugt durch Splicen auf DNA-Ebene erreicht, um die Expression chimärer Moleküle in rekombinanten Produktionssystemen zu ermöglichen. Die resultierenden Moleküle werden dann auf derartige Eigenschaften, wie beispielsweise verbesserte Löslichkeit, verbesserte Stabilität, verlängerte Beseitigungs-Halbwertzeit, verbesserte Expressions- und Sekretions-Niveaus und pharmakodynamische Eigenschaften, getestet. Derartige Hybrid-Moleküle können außerdem zusätzliche Aminosäure-Reste (z. B. einen Polypeptid-Linker) zwischen den Protein- oder Polypeptid-Komponenten umfassen.
Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren kann ein Fachmann auf dem Gebiet eine Anzahl verschiedener Polypeptid-Fragmente oder Varianten der SEQ ID NO: 6, welche die Zalpha11-Ligand-Bindungs- oder -Antagonisten-Aktivität beibehalten, identifizieren und/oder herstellen. Beispielsweise kann ein löslicher Zalpha11-Rezeptor hergestellt werden, indem verschiedene Polypeptide, die im Wesentlichen homolog zu der Cytokin-Bindungs-Domäne (Reste 20 (Cys) bis 237 (His) der SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 6) oder einer Untersequenz davon, die an den Zalpha11-Liganden bindet, oder allelischen Varianten oder Art-Orthologen davon) sind und die Liganden-Bindungs-Aktivität des Wild-Typ-Zalpha11-Proteins bewahren, hergestellt werden. Derartige Polypeptide können zusätzliche Aminosäuren, beispielsweise aus einem Teil oder der gesamten Signalpeptid-Sequenz, Transmembran- und in trazellulären Domänen, enthalten. Derartige Polypeptide können außerdem zusätzliche Polypeptid-Segmente, wie sie hierin allgemein offenbart sind, wie beispielsweise Markierungen, Affinitäts-Tags und Ähnliches, enthalten. Ebenso kann ein Fachmann auf dem Gebiet eine Anzahl verschiedener Polypeptid-Fragmente oder Varianten der SEQ ID NO: 4 oder andere lösliche Klasse-I-Cytokin-Rezeptoren, die Heterodimere mit dem Zalpha11-Rezeptor bilden, identifizieren und/oder herstellen.
Für jegliches lösliche Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid, einschließlich Varianten und Fusions-Polypeptiden oder -Proteinen, kann ein Fachmann auf dem Gebiet leicht eine vollständig degenerierte Polynukleotid-Sequenz, welche diese Variante kodiert, unter Verwendung der in den obigen Tabellen 1 und 2 gegebenen Information erzeugen.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich löslicher Rezeptor-Polypeptide voller Länge, biologisch aktiver Fragmente und Fusions-Polypeptide, können in genetisch veränderten Wirtszellen gemäß konventionellen Techniken produziert werden. Geeignete Wirtszellen sind solche Zelltypen, die mit exogener DNA transformiert und transfiziert und in Kultur gezüchtet werden können; dazu zählen Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind eukaryotische Zellen, insbesondere kultivierte Zellen mehrzelliger Organismen. Techniken zur Manipulation klonierter DNA-Moleküle und zum Einführen exogener DNA in verschiedene Wirtszellen sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, und Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. NY, 1987, offenbart.
Im Allgemeinen werden eine DNA-Sequenz, die ein Zalpha11-Polypeptid kodiert, und andere genetische Elemente, die für ihre Expression erforderlich sind – wozu im Allgemeinen ein Transkriptions-Promotor und -Terminator zählen – innerhalb eines Expressions-Vektors operabel miteinander verknüpft. Der Vektor enthält gewöhnlich außerdem einen oder mehr selektierbare Marker und einen oder mehr Replikations-Origins, obwohl es für einen Fachmann auf dem Gebiet erkennbar ist, dass innerhalb bestimmter Systeme selektierbare Marker auf separaten Vektoren vorliegen können und die Replikation der exogenen DNA durch Integration in das Wirtszellgenom erfolgen kann. Die Selektion von Promotoren, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen gehört zu den Routinearbeiten eines Fachmanns auf dem Gebiet. Viele derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und von kommerziellen Anbietern erhältlich.
Um einen löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, in den sekretorischen Weg einer Wirtszelle zu schleusen, wird eine sekretorische Signalsequenz (ebenso bekannt als Leader-Sequenz, Prepro-Sequenz oder Pre-Sequenz) in dem Expressions-Vektor bereitgestellt. Bei dieser sekretorischen Signalsequenz kann es sich um die des hierin offenbarten Zalpha11-Rezeptors, die von IL-2Rγ (Aminosäure 1 (Met) bis 22 (Gly) der SEQ ID NO: 18) handeln; sie kann auch aus einem anderen sekretierten Protein (z. B. t-PA) stammen oder de novo synthetisiert werden. Die sekretorische Signalsequenz ist operabel mit der Zalpha11-DNA-Sequenz verknüpft, d. h., die zwei Sequenzen sind in korrektem Leserahmen miteinander verbunden und derart positioniert, dass das neu synthetisierte Polypeptid in den sekretorischen Weg der Wirtszelle geschleust wird. Sekretorische Signalsequenzen sind gewöhnlich 5' zu der DNA-Sequenz, welche das Polypeptid von Interesse kodiert, positioniert, obwohl bestimmte sekretorische Signalsequenzen an beliebiger Stelle in der interessierenden DNA-Sequenz positioniert sein können (siehe z. B. Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; Holland et al., US-Patent Nr. 5,143,830).
Kultivierte Säugetierzellen sind geeignete Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung. Zu Verfahren zum Einführen exogener DNA in Säugetier-Wirtszellen zählen Calciumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO). 1: 841-845, 1982), DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., ibid.) und Liposomen-vermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993), und virale Vektoren (Miller and Rosman, Bio Techniques 7: 980-90, 1989; Wang and Finer, Nature Med. 2: 714-716, 1996). Die Herstellung rekombinanter Polypeptide in kultivierten Säugetierzellen ist beispielsweise in Levinson et al., US-Patent Nr. 4,713,339; Hagen et al., US-Patent Nr. 4,784,950; Palmiter et al., US-Patent Nr. 4,579,821, und Ringold, US-Patent Nr. 4,656,134, offenbart. Zu geeigneten kultivierten Säugetierzellen zählen die Zelllinien COS-1 (ATCC Nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC Nr. CRL 1651), BHK (ATCC Nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC Nr. CRL 10314), 293 (ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) und Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (z. B. CHO-K1, ATCC Nr. CCL 61). Weitere geeignete Zelllinien sind aus dem Stand der Technik bekannt und von öffentlichen Aufbewahrungseinrichtungen, wie beispielsweise der „American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, erhältlich. Im Allgemeinen sind starke Transkriptions-Promotoren, wie beispielsweise Promotoren von SV-40 oder dem Cytomegalovirus (CMV), bevorzugt; siehe z. B. US-Patent Nr. 4,956,288. Zu anderen geeigneten Promotoren zählen die von Metallothionein-Genen (US-Patente Nr. 4,579,821 und 4,601,978) und der Adenovirus-Major-Late-Promotor.
Im Allgemeinen wird Selektion mittels Agenzien verwendet, um kultivierte Säugetierzellen, in die Fremd-DNA eingeführt wurde, zu selektieren. Derartige Zellen werden gewöhnlich als „Transfektanten" bezeichnet. Zellen, die in Gegenwart des selektiven Agens kultiviert wurden und das interessierende Gen an ihre Nachkommenschaft weitergeben können, werden als „stabile Transfektanten" bezeichnet. Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist ein Gen, welches die Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert. Die Selektion wird in Gegenwart eines Agens vom Neomycin-Typ, wie beispielsweise G-418, durchgeführt. Ebenso können Selektionssysteme verwendet werden, um das Expressionsniveau des interessierenden Gens zu erhöhen, ein Prozess, der als „Amplifikation" bezeichnet wird. Die Amplifikation wird durchgeführt, indem die Transfektanten in Gegenwart eines geringen Niveaus des selektiven Agens kultiviert werden und dann die Menge des selektiven Agens erhöht wird, um Zellen zu selektieren, welche die Produkte der eingeführten Gene auf hohen Niveaus produzieren. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist Dihydrofolat-Reduktase, welche Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Ebenso können andere Agenzien-Resistenz-Gene (z. B. Hygromycin-Resistenz, Multi-Drug-Resistenz, Puromycin-Acetyltransferase) verwendet werden. Alternative Marker, welche einen veränderten Phänotyp einführen, wie beispielsweise das grün-fluoreszierende Protein oder Zelloberflächen-Proteine, wie beispielsweise CD4, CD8, Klasse-I-MHC, Plazenta-Alkalische-Phosphatase, können verwendet werden, um transfizierte Zellen von nicht transfizierten Zellen mittels FACS-Sortierung, Flusszytometrie oder Trennungstechnologie mittels magnetischer Beads zu trennen.
Es können ebenso andere höhere eukaryotische Zellen als Wirtszellen verwendet werden; dazu zählen Pflanzenzellen, Insektenzellen und Vogelzellen. Die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektor zur Expression von Genen in Pflanzenzellen wurde von Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987, zusammengefasst. Die Transformation von Insektenzellen und Produktion fremder Polypeptide darin ist in Guarino et al., US-Patent Nr. 5,162,222 und der WIPO-Veröffentlichung WO 94/06463 offenbart. Insektenzellen können mit rekombinatem Baculovirus, der gewöhnlich von Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) abgeleitet ist, infiziert werden; siehe King, L. A. and Possee, R. D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D. R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; und Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Ein zweites Verfahren zur Herstellung des rekombinaten Zalpha11-Baculovirus verwendet ein System auf Transposon-Basis, welches von Luckow beschrieben wurde (Luckow, V. A., et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Dieses System, welches Transfer-Vektoren verwendet, wird in dem Bac-to-Bac^TM-Kit (Life Technologies, Rockville, MD) vertrieben. Dieses System verwendet einen Transfer-Vektor, pFastBac1^TM (Life Technologies), welcher ein Tn7-Transposon enthält, um die DNA, welche das Zalpha11-Polypeptid kodiert, in ein Baculovirus-Genom einzubringen, welches in E. coli als großes Plasmid, genannt „Bacmid", aufrecht erhalten wird; siehe Hill-Perkins, M. S. und Possee, R. D., J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning, B. C. et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994; und Chazenbalk G. D. and Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Des Weiteren können Transfer-Vektoren eine In-Frame-Fusion mit DNA enthalten, welche einen Epitop-Tag am C- oder N-Terminus des exprimierten Zalpha11-Polypeptids, beispielsweise einen Glu-Glu-Epitop-Tag, kodiert (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). Unter Verwendung einer auf dem Gebiet bekannten Technik wird E. coli mit einem Zalpha11-enthaltenden Transfer-Vektor transformiert und nach Bacmiden, welche ein unterbrochenes LacZ-Gen enthalten, was indikativ für ein rekombinantes Baculovirus ist, gescreent. Die Bacmid-DNA, welche das rekombinante Baculovirus-Genom enthält, wird unter Anwendung üblicher Techniken isoliert und zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, z. B. Sf9-Zellen, verwendet. Anschließend wird das rekombinante Virus, welches Zalpha11 exprimiert, produziert. Durch Verfahren, die üblicherweise auf dem Gebiet angewendet werden, werden rekombinante virale Stöcke angelegt.
Das rekombinante Virus wird verwendet, um Wirtszellen, typischerweise eine Zelllinie, die von dem „Fall-Armyworm" Spodoptera frugiperda abgeleitet ist, zu infizieren; siehe allgemein Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Eine weitere geeignete Zelllinie ist die High-FiveO^TM-Zelllinie (Invitrogen), die von Tüchoplusia ni abgeleitet ist (US-Patent Nr. 5,300,435). Zur Züchtung und Lagerung der Zellen werden kommerziell erhältliche serumfreie Medien verwendet. Geeignete Medien sind Sf900 II^TM (Life Technologies) oder ESF 921^TM (Expression Systems) für die Sf9-Zellen und Ex-cellO405^TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) oder Express FiveO^TM (Life Technologies) für die T.-ni-Zellen. Die angewendeten Verfahren sind im Allgemeinen in verfügbaren Laborhandbüchern beschrieben (King, L. A. and Possee, R. D., ibid.; O'Reilly, D. R. et al., ibid.; Richardson, C. D., ibid.). Die anschließende Aufreinigung des Zalpha11-Polypeptids aus dem Überstand kann unter Anwendung der hierin beschriebenen Verfahren erreicht werden.
In der vorliegenden Erfindung können ebenso Pilzzellen, einschließlich Hefezellen, verwendet werden. Zu Hefearten, die in dieser Hinsicht von besonderem Interesse sind, zählen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Pichia methanolica. Verfahren zur Transformierung von S.-cerevisiae-Zellen mit exogener DNA und Produktion rekombinanter Polypeptide daraus sind beispielsweise in Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4,599,311; Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4,931,373; Brake, US-Patent Nr. 4,870,008; Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; und Murray et al., US-Patent Nr. 4,845,075, offenbart. Die transformierten Zellen werden durch ihren Phänotyp, der durch den selektierbaren Marker bestimmt wird, wobei es sich gewöhnlich um eine Resistenz gegen ein Agens oder die Fähigkeit, in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs (z. B. Leucin) zu wachsen, handelt, selektiert. Ein bevorzugtes Vektor-System zur Anwendung in Saccharomyces cerevisiae ist das POT1-Vektor-System, offenbart von Kawasaki et al. (US-Patent Nr. 4,931,373), welches es ermöglicht, transformierte Zellen durch ihr Wachstum in Glukose-haltigen Medien zu selektieren. Zu geeigneten Promotoren und Terminatoren zur Anwendung in Hefe zählen Promotoren und Terminatoren aus Genen für glykolytische Enzyme (siehe z. B. Kawasaki, US-Patent Nr. 4,599,311; Kingsman et al., US-Patent Nr. 4,615,974; und Bitter, US-Patent Nr. 4,977,092) und Alkohol-Dehydrogenase-Genen; siehe ebenso US-Patente Nr. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 und 4,661,454. Transformations-Systeme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa, sind auf dem Gebiet bekannt; siehe beispielsweise Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986, und Cregg, US-Patent Nr. 4,882,279. Aspergillus-Zellen können gemäß den Verfahren von McKnight et al., US-Patent Nr. 4,935,349, Anwendung finden. Verfahren zur Transformation von Acremonium chrysogenum sind von Sumino et al., US-Patent Nr. 5,162,228, offenbart. Methoden zur Transformation von Neurospora sind von Lambowitz, US-Patent Nr. 4,486,553, offenbart.
Die Verwendung von Pichia methanolica als Wirt zur Herstellung rekombinanter Proteine ist in den WIPO-Veröffentlicheungen WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 und WO 98/02565 offenbart. DNA-Moleküle zur Verwendung bei der Transformation von P. methanolica werden gewöhnlich als doppelsträngige, zirkuläre Plasmide, welche bevorzugt vor der Transformation linearisiert werden, hergestellt. Bei der Polypeptid-Herstellung in P. methanolica handelt es sich bei dem Promotor und Terminator in dem Plasmid bevorzugt um die von einem P.-methanolica-Gen, wie beispielsweise ein P.-methanolica-Alkohol-Verwertungs-Gen (AUG1 oder AUG2). Zu weiteren geeigneten Promotoren zählen die der Dihydroxyaceton-Synthase(DHAS)-, Format-Dehydrogenase(FMD)- und Katalase(CAT)-Gene. Um die Integration der DNA in das Wirts-Chromosom zu erleichtern, wird bevorzugt das gesamte Expressions-Segment des Plasmids an beiden Enden von Wirts-DNA-Sequenzen flankiert. Ein bevorzugter selektierbarer Marker zur Verwendung in Pichia methanolica ist ein ADE2-Gen von P.-methanolica, welches die Phosphoribosyl-5-Aminoimidazol-Carboxylase (AIRC; EC 4.1.1.21) kodiert, die es den ade2-Wirtszellen ermöglicht, in Abwesenheit von Adenin zu wachsen. Für industrielle Verfahren in großem Maßstab, wo es wünschenswert ist, die Verwendung von Methanol zu minimieren, werden bevorzugt Wirtszellen verwendet, in denen beide Methanol- Verwertungs-Gene (AUG1 und AUG2) delektiert sind. Für die Herstellung sekretierter Proteine sind Wirtszellen bevorzugt, denen die Vacuolar-Protease-Gene (PEP4 und PRB1) fehlen. Elektroporation wird angewendet, um die Einführung eines Plasmids, welches DNA enthält, die ein Polypeptid von Interesse kodiert, in P.-methanolica-Zellen zu erleichtern. Bevorzugt werden P.-methanolica-Zellen durch Elektroporation unter Verwendung eines exponentiell abfallenden gepulsten elektrischen Feldes mit einer Feldstärke von 2,5 bis 4,5 kV/cm, bevorzugt etwa 3,75 kV/cm, und einer Zeitkonstante (t) von 1 bis 40 Millisekunden, am bevorzugtesten von etwa 20 Millisekunden, transformiert.
Prokaryotische Wirtszellen, einschließlich Stämme des Bakterium Escherichia coli Bacillus und anderer Gattung, sind ebenso geeignete Wirtszellen in der vorliegenden Erfindung. Techniken zur Transformation dieser Wirtszellen und Expression von eingebrachten klonierten Fremd-DNA-Sequenzen sind auf dem Gebiet bestens bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., ibid.). Bei der Expression eines Zalpha11-Polypeptids in einem Bakterium, wie beispielsweise E. coli kann das Polypeptid im Cytoplasma, typischerweise als unlösliche Granulen zurückgehalten oder durch eine bakterielle Sekretionssequenz in den periplasmatischen Raum geleitet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert und die Granulen unter Verwendung von beispielsweise Guanidin-Isothiocyanat oder Harnstoff gewonnen und denaturiert. Das denaturierte Polypeptid kann dann durch Verdünnen des Denaturierungsmittels, wie beispielsweise durch Dialyse gegen eine Harnstoff-Lösung und eine Kombination aus reduziertem und oxidiertem Glutathion, und anschließende Dialyse gegen eine gepufferte Salzlösung, wieder gefaltet und dimerisiert werden. Im letzteren Fall kann das Polypeptid aus dem periplasmatischen Raum in einer löslichen und funktionellen Form gewonnen werden, indem die Zellen (beispielsweise durch Ultraschall oder osmotischen Schock) zerstört werden, um den Inhalt des periplasmatischen Raums freizusetzen und das Protein zu gewinnen, wobei sich Denaturierung und Rückfaltung erübrigen.
Die transformierten oder transfizierten Wirtszellen werden gemäß konventionellen Verfahren in einem Kulturmedium kultiviert, welches Nährstoffe und andere Komponenten enthält, die für das Wachstum der ausgewählten Wirtszellen notwendig sind. Es sind eine Vielzahl geeigneter Medien, einschließlich definierter Medien und komplexer Medien, auf dem Gebiet bekannt; sie enthalten im Allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralstoffe. Gegebenenfalls können die Medien außerdem Komponenten, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren oder Serum, enthalten. Durch das Wachstumsmedium werden im Allgemeinen Zellen, welche die exogen zugeführte DNA enthalten, beispielsweise durch Selektion mit einem Agens oder den Mangel an einem essentiellen Nährstoff, welcher durch den selektierbaren Marker, der auf dem Expressions-Vektor vorliegt oder in die Wirtszelle co-transfiziert wird, komplementiert wird, selektiert. P.-methanolica-Zellen werden in einem Medium mit hinreichenden Kohlenstoff-, Stickstoff- und Spurenelement-Quellen bei Temperaturen von etwa 25°C bis 35°C kultiviert. Flüssigkulturen werden durch konventionelle Mittel, wie beispielsweise Schütteln von kleinen Flaschen oder Durchblasen von Fermentoren, ausreichend belüftet. Ein bevorzugtes Kulturmedium Für P. methanolica ist YEPD (2% D-Glukose, 2% Bacto^TM-Pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto^TM-Hefeextrakt (Difco Laboratories), 0,004% Adenin und 0,006% L-Leucin).
Säugetierzellen, die geeignet sind, um die antagonistische Aktivität des neuen löslichen Rezeptors der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, exprimieren einen Zalpha11-Rezeptor oder eine Zalpha11-Rezeptor-Fusion, die ein Rezeptor-vermitteltes Signal des Zalpha11-Liganden auslösen und transduzieren kann. Zu derartigen Zellen zählen Zellen, die eine β-Untereinheit, wie beispielsweise gp130, IL-2Rγ, exprimieren, und Zellen, die Rezeptoren co-exprimieren (Gearing et al., EMBO J. 10: 2839-2848, 1991; Gearing et al., US-Patent Nr. 5,284,755). In dieser Hinsicht ist es allgemein bevorzugt, eine Zelle zu verwenden, die auf andere Cytokine anspricht, die an Rezeptoren in der gleichen Unterfamilie binden, wie beispielsweise IL-6 oder LIF, da diese Zellen den/die erforderlichen Signal-Transduktions-Weg(e) enthalten. Zu bevorzugten Zellen dieses Typs zählen die humane TF-1-Zelllinie (ATCC Nummer CRL-2003) und die DA-1-Zelllinie (Branch et al., Blood 69: 1782, 1987; Broudy et al., Blood 75: 1622-1626, 1990). Alternativ können geeignete Wirtszzellen konstruiert werden, um eine β-Untereinheit oder eine andere zelluläre Komponente, die für die gewünschte zelluläre Antwort erforderlich sind, zu produzieren. Beispielsweise wurde die murine Zelllinie BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) verwendet, um eine Zelllinie herzustellen, die auf den Zalpha11-Liganden anspricht (siehe Beispiele). Zu anderen derartigen Linien zählen eine Baby-Hamster-Nieren(BHK)-Zelllinie, die CTLL-2-Zelllinie (ATCC TIB-214), die derart transfiziert werden können, dass sie eine IL-2Rγ-Untereinheit zusätzlich zu dem Zalpha11-Rezeptor exprimieren. Allgemein werden bevorzugt die Wirtszelle und (ein) Rezeptor(en) aus der gleichen Art verwendet; dieser Ansatz ermöglicht jedoch die Konstruktion von Zelllinien, die mehrere Rezeptor-Untereinheiten aus beliebigen Arten exprimieren, wobei potentielle Einschränkungen, die aus Artenspezifität entstehen, überwunden werden. Alternativ können Arten-Homologe der humanen Rezeptor-cDNA kloniert werden und innerhalb von Zelllinien aus den gleichen Arten verwendet werden, wie beispielsweise eine Maus-cDNA in der BaF3-Zelllinie. Zelllinien, die von einem hämatopoetischen Wachstumsfaktor, wie beispielsweise IL-3, abhängig sind, können somit derart konstruiert werden, dass sie von einem Zalpha11-Liganden abhängig werden. Derartige Zellen können, wie hierin beschrieben, in Gegenwart des Zalpha11-Liganden verwendet werden, um die antago nistische Aktivität des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines lösliches heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, auf die Zalpha11-Liganden-Signalisierungs- und Proliferations-Aktivität zu bewerten.
Zellen, die den funktionellen löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, exprimieren, werden in Screening-Assays verwendet. Es sind verschiedene geeignete Assays auf dem Fachgebiet bekannt. Diese Assays basieren auf dem Nachweis einer biologischen Antwort auf den Zalpha11-Liganden in der Zielzelle in Gegenwart oder Abwesenheit der löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung. Ein derartiger Assay ist ein Zellproliferations-Assay. Die Zellen werden in Gegenwart oder Abwesenheit des Zalpha11-Liganden mit oder ohne Zugabe weiterer Cytokine oder proliferativer Agenzien kultiviert und die Zellproliferation, beispielsweise durch Messen des Einbaus von mit Tritium markiertem Thymidin oder durch ein kolorimetrisches Assay auf der Basis des metabolischen Abbaus von Alamar Blue^TM (AccuMed, Chicago, IL) oder 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-Tetrazoliumbromid (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983) nachgewiesen. Eine alternative Assayform verwendet Zellen, die außerdem so konstruiert sind, dass sie ein Reportergen exprimieren. Das Reportergen ist mit einem Promotor-Element verbunden, welches auf den mit dem Rezeptor verknüpften Signalweg anspricht, und der Assay weist die Aktivierung der Transkription des Reportergens nach. Zu DNA-Response-Elementen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, zyklisches AMP-Response-Elemente (CRE), Hormon-Response-Elemente (HRE), Insulin-Response-Elemente (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273-7, 1990) und Serum-Response-Elemente (SRE) (Shaw et al. Cell 56: 563-72, 1989). Zyklisches AMP-Response-Elemente sind in Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063-6, 1988, und Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-94, 1990, zusammengefasst. Hormon-Response-Elemente sind in Beato, Cell 56: 335-44, 1989, zusammengefasst. Ein bevorzugtes Promotor-Element ist in dieser Hinsicht ein Serum-Response-Element oder SRE (siehe beispielsweise Shaw et al., Cell 56: 563-572, 1989). Ein bevorzugtes derartiges Reportergen ist ein Luziferase-Gen (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725, 1987). Die Expression des Luziferase-Gens wird durch Lumineszenz unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren nachgewiesen (z. B. Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269: 19094-29101, 1994; Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41: 11, 1993). Luziferase-Assay-Kits sind beispielsweise von Promega Corp., Madison, WI, kommerziell erhältlich. Target-Zelllinien dieses Typs können verwendet werden, um Bibliotheken von Chemikalien, Zell-konditionierten Kulturmedien, Pilznährmedien, Bodenproben, Wasserproben und Ähnliches auf antagonistische Aktivität zu screenen. Derartige Zellen können wie hierin beschrieben in Gegenwart des Zalpha11-Liganden in einem kompetitiven Assay vom Inhibitions-Typ verwendet werden, um die antago nistische Aktivität des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, auf die Zalpha11-Liganden-Signalisierungs- und -Proliferations-Aktivität zu bewerten.
T- und B-Zell-Proliferations-Assay-Verfahren können ebenso dazu verwendet werden, die antagonistische Aktivität des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, auf die Zalpha11-Liganden-Signalisierungs- und -Proliferations-Aktivität in Gegenwart anderer Cytokine, beispielsweise IL-15, Flt3 und Ähnlichem, zu bewerten. Derartige Assays sind in den hierin enthaltenen Beispielen beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt. Zusammengefasst werden unter Verwendung von Flusszytometrie reife oder unreife Untergruppen von T-Zellen oder B-Zellen auf der Grundlage der Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Zelloberflächen-Moleküle (z. B. CD4, CD8, CD19, CD3, CD40, CD28 usw.) isoliert. Die Zellen können in Abhängigkeit des untersuchten Zelltyps und der Wirkung des Zalpha11-Liganden auf diesen Zelltyp selektiert werden, bevor oder nachdem sie dem Zalpha11-Liganden ausgesetzt wurden. Die löslichen Rezeptoren oder Antikörper der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Konzentrationen zugegeben werden, um die antagonistische Aktivität oder Bindungsaktivität auf/an den Liganden in dem T-Zell- oder B-Zell-Proliferations-Assay zu bestimmen. Derartige Assays sind auf dem Gebiet bekannt und hierin beschrieben.
Des Weiteren kann ein Sekretions-Trap-Verfahren, welches den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide verwendet, angewendet werden, um transfizierte Zellen, welche den Zalpha11-Liganden exprimieren, zu isolieren. Dieses Verfahren ist in Aldrich, et al., Cell 87: 1161-1169, 1996, beschrieben. Eine cDNA-Expressions-Bibliothek, die aus einer bekannten oder vermuteten Liganden-Quelle hergestellt wurde, wird in COS-7-Zellen transfiziert. Der cDNA-Bibliotheks-Vektor besitzt im Allgemeinen einen SV40-Origin zur Amplifikation in COS-7-Zellen und einen CMV-Promotor zur hohen Expression. Die transfizierten COS-7-Zellen werden in einer Schicht (Monolayer) kultiviert und dann fixiert und permeabilisiert. Der mit einem „Tag" versehene oder Biotin-markierte lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die hierin beschrieben löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezetor-Polypeptide werden dann in Kontakt mit der Zellschicht gebracht, so dass sie an die Zellen in dem Monolayer, welche ein anti-komplementäres Molekül, d. h. einen Zalpha11-Liganden, exprimieren, binden können. Eine Zelle, welche einen Liganden exprimiert, wird auf diese Weise mit gebundenen Rezeptor-Molekülen versehen. Ein Anti-Tag-Antikörper (Anti-Ig bei Ig-Fusionen, M2 oder Anti-FLAG bei FLAG-Tag-Fusionen, Streptavidin usw.), welcher mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert ist, wird verwendet, um die Zellen sichtbar zu machen, an die der „getaggte" oder Biotin-markierte lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen hetero dimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide gebunden haben. Die HRP katalysiert die Abscheidung eines Tyramid-Reagenzes, beispielsweise Tyramid-FITC. Ein kommerziell erhältlicher Kit kann für diesen Nachweis verwendet werden (beispielsweise Renaissance-TSA-Direct^TM-Kit, NEN Life Science Products, Boston, MA). Zellen, die den Zalpha11-Rezeptor-Liganden exprimieren, werden unter Fluoreszenz-Mikroskopie als grüne Zellen identifiziert und für das nachfolgende Klonieren des Liganden unter Anwendung von Verfahren für Plasmid-Wiederaufnahme, wie in Aldrich et al., supra, ausgeführt, gepickt; danach folgen Durchläufe eines Sekretions-Trap-Assays, bis einzelne Klone identifiziert sind.
Des Weiteren können histologische und immunohistochemische Verfahren, welche den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide verwenden, angewendet werden, um Zellen und Gewebe(zellen) zu identifizieren, die den Zalpha11-Liganden exprimieren. Derartige Verfahren sind auf dem Gebiet bekannt und hierin beschrieben.
Weitere Assays zum Nachweis der antagonistischen Aktivität oder Bindungsaktivität des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder der löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, umfassen die Verwendung von Hybrid-Rezeptor-Polypeptiden. Diese Hybrid-Polypeptide können in zwei allgemeine Klassen eingeteilt werden. Innerhalb der ersten Klasse ist die intrazelluläre Domäne von Zalpha11, welche ungefähr die Reste 256 (Lys) bis 528 (Ser) der SEQ ID NO: 2 umfasst, mit der Liganden-Bindungs-Domäne eines zweiten Rezeptors verbunden. Bevorzugt handelt es sich bei dem zweiten Rezeptor um einen hämatopoetischen Cytokin-Rezeptor, wie beispielsweise den mpl-Rezeptor (Souyri et al., Cell 63: 1137-1147, 1990). Der Hybrid-Rezeptor umfasst außerdem eine Transmembran-Domäne, welche von einem beliebigen Rezeptor abgeleitet sein kann. Ein DNA-Konstrukt, welches den Hybrid-Rezeptor kodiert, wird dann in eine Wirtszelle eingeführt. Zellen, welche den Hybrid-Rezeptor exprimieren, werden in Gegenwart eines Liganden für die Bindungs-Domäne kultiviert und hinsichtlich einer Antwort (Response) getestet. Dieses System stellt ein Mittel zur Analyse von durch Zalpha11 vermittelter Signal-Transduktion zur Verfügung, wobei leicht verfügbare Liganden verwendet werden. Dieses System kann außerdem verwendet werden, um zu bestimmen, ob bestimmte Zelllinien in der Lage sind, auf durch Zalpha11 transduzierte Signale anzusprechen. Eine zweite Klasse von Hybrid-Rezeptor-Polypeptiden umfasst die extrazelluläre (Liganden-Bindungs)-Domäne von Zalpha11 (ungefähr die Reste 20 (Cys) bis 237 (His) der SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 6) mit einer cytoplasmatischen Domäne eines zweiten Rezeptors, bevorzugt eines Cytokin-Rezeptors, und einer Transmembran-Domäne. Die Transmembran-Domäne kann von einem beliebigen Rezeptor abgeleitet sein. Derartige Hybrid-Rezeptoren werden in Zellen exprimiert, von denen bekannt ist, dass sie auf Signale ansprechen können, die durch den Rezeptor, welcher die extrazelluläre Domäne umfasst, transduziert werden, beispielsweise in Gegenwart des Zalpha11-Liganden. Die Zugabe des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder der löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide in Gegenwart des Zalpha11-Liganden wird verwendet, um die antagonistische Aktivität des Zalpha11-Liganden oder die Bindungsaktivität des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder der löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide an den Zalpha11-Liganden zu bewerten.
Die Gewebe-Spezifität und die biologischen Aktivitäten der Zalpha11-Ligand-Expression deuten auf eine Rolle in frühen NK-Zellen und bei der Thymocyten-Entwicklung, der Expansion reifer B-Zellen, Stimulation der allgemeinen Immunantwort und der Regulation der Immunantwort hin. Diese Prozesse beinhalten die Stimulation der Zellproliferation und -differenzierung als Antwort auf die Bindung des Zalpha11-Liganden an seinen spezifischen Rezeptor, welcher wenigstens eine Zalpha11-Rezeptor-Untereinheit umfasst. Im Hinblick auf die biologische Aktivität, die für diesen Liganden beobachtet wird, besitzen die Antagonisten ein enormes Potential sowohl bei In-vitro- als auch bei In-viva-Anwendungen. Als Antagonisten des Zalpha11-Liganden können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide nützlich sein bei der Suppression des Immunsystems, wie beispielsweise bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, einschließlich rheumatoider Arthritis, Multiple Sklerose, Diabetes Mellitus, entzündlicher Darmerkrankung, Morbus Crohn und Ähnlichen. Die Immunsuppression kann ebenso dazu verwendet werden, die Abstoßung von Gewebe- oder Organ-Transplantaten und -Implantaten (Grafts) zu reduzieren und B-Zell-Malignitäten, T-Zell-spezifische Leukämien oder Lymphome durch Inhibierung der Proliferation des betroffenen Zelltyps zu behandeln.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide können ebenso in diagnostischen Systemen zum Nachweis zirkulierender Niveaus des Zalpha11-Liganden verwendet werden. In einer diesbezüglichen Ausführungsform können Antikörper oder andere Agenzien, welche spezifisch an den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide binden, verwendet werden, um zirkulierende Rezeptor-Polypeptide nachzuweisen. Erhöhte oder erniedrigte Niveaus des Liganden oder der Rezeptor-Polypeptide können indikativ sein für pathologische Zustände, einschließlich Krebs. Lösliche Rezeptor-Polypeptide können an pathologischen Prozessen mitwirken und ein indirekter Marker einer zugrundeliegenden Krankheit sein. Beispielsweise wurden erhöhte Niveaus des löslichen IL-2-Rezeptors in humanem Serum mit einer Vielzahl entzündlicher und neoplastischer Zustände, wie beispielsweise Herzinfarkt, Asthma, Myasthenia Gravis, rheumatioder Arthritis, akuter T-Zell-Leukämie, B-Zell-Lymphomen, chronischer Lymphocyten- Leukämie, Darmkrebs, Brustkrebs und Ovarial-Krebs, in Verbindung gebracht (Heaney et al., Blood 87: 847-857, 1996).
Ein Liganden-bindendes Polypeptid eines Zalpha11-Rezeptors, wie beispielsweise der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, können hergestellt werden, indem eine trunkierte DNA, welche die Zalpha11-Cytokin-Bindungsdomäne (ungefähr Rest 20 (Cys) bis Rest 237 (His) des humanen Rezeptors (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 6)) oder den entsprechenden Bereich eines nicht-humanen Rezeptors (z. B. SEQ ID NO: 12) kodiert, exprimiert wird. Ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL2-Rγ, kann hergestellt werden, indem eine trunkierte DNA, welche die Zalpha11-Cytokin-Bindungsdomäne (SEQ ID NO: 6) kodiert, und die trunkierte DNA, welche die extrazelluläre Domäne eines anderen Klasse-I-Cytokin-Rezeptors, wie beispielsweise IL-2Rγ (SEQ ID NO: 4), kodiert, co-exprimiert werden. Bevorzugt werden die extrazellulären Domänen des löslichen Zalpha11-Homodimers oder Heterodimers in einer Form hergestellt, die im Wesentlichen frei von Transmembran- und intrazellulären Polypeptid-Segmenten sind. Des Weiteren können die Liganden-bindenden Polypeptid-Fragmente innerhalb des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder des löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids (z. B. des lösliches Zalpha11/IL-2Rγ) oder die oben beschriebene Cytokin-Bindungsdomäne ebenso als lösliche Zalpha11-Rezeptoren für die hierin beschriebenen Verwendungen dienen. Um den Export eines Rezeptor-Polypeptids aus der Wirtszelle zu steuern, wird die Rezeptor-DNA mit einem zweiten DNA-Segement verbunden, welches ein sekretorisches Peptid, wie beispielsweise ein sekretorisches t-PA-Peptid, ein sekretorisches Peptid aus einem anderen Cytokin-Rezeptor, ein anderes sekretiertes Molekül oder ein sekretorisches Zalpha11-Rezeptor-Peptid, kodiert. Um die Aufreinigung des sekretierten Rezeptor-Polypeptids zu erleichtern, kann eine C-terminale Extension, wie beispielsweise ein Poly-Histidin-Tag, die Substanz P, Flag^TM-Peptid (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204-1210, 1988; erhältlich von Eastman Kodak Co., New Haven, CT), ein Glu-Glu-Tag (SEQ ID NO: 14) oder ein anderes Polypeptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderes spezifisches Bindungsagens verfügbar ist, mit dem löslichen Rezeptor-Polypeptid fusioniert werden.
In einem alternativen Ansatz kann die extrazelluläre Rezeptor-Domäne als eine Fusion mit der schweren Kette des konstanten Bereichs des Immunoglobulins exprimiert werden; dabei handelt es sich typischerweise um ein F_c-Fragment, welches zwei konstante Bereichsdomänen enthält und dem der variable Bereich fehlt. Derartige Fusionen werden typischerweise als multimere Moleküle sekretiert, wobei die Fc-Teile durch Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind und zwei Rezeptor-Polypeptide in enger Nachbarschaft zueinander angeordnet sind. Fusi onen dieses Typs können zur Affinitäts-Aufreinigung des spezifischen Liganden aus der Lösung, als In-vitro-Assay-Werkzeug, zur Blockierung von Signalen in vitro durch spezifisches Austitrieren des Liganden und als Antagonisten in vivo durch ihre parenterale Verabreichung zur Bindung des zirkulierenden Liganden und seiner Beseitigung aus dem Blutkreislauf verwendet werden. Zur Aufreinigung des Liganden wird eine Zalpha11-Ig-Chimäre (z. B. das hierin beschriebene Zalpha11-Fc4) zu einer Probe gegeben, welche den Liganden enthält (z. B. Zellkonditioniertes Kulturmedium oder Gewebeextrakte) unter Bedingungen, die die Rezeptor-Liganden-Bindung erleichtern (typischerweise bei einer Temperatur, einem pH-Wert und einer Ionenstärke in der Nähe der physiologischen Werte). Der Chimäre-Ligand-Komplex wird dann unter Verwendung von Protein A, immobilisiert auf einem festen Träger (z. B. unlösliche Harz-Beads), von der Mischung abgetrennt. Der Ligand wird dann unter Verwendung konventioneller chemischer Techniken, wie beispielsweise mit einem Salz- oder pH-Gradienten, eluiert. Alternativ kann die Chimäre selbst an einen festen Träger gebunden sein, wobei die Bindung und die Elution wie oben beschrieben durchgeführt werden. Die gesammelten Fraktionen können refraktioniert werden, bis der gewünschte Reinheitsgrad erreicht ist.
Des Weiteren kann der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, als „Liganden-Senker" verwendet werden, das heißt, als Antagonist, um den Liganden in vivo oder in vitro bei therapeutischen oder anderen Anwendungen, bei denen die Gegenwart des Liganden nicht erwünscht ist, zu binden. Beispielsweise können bei Krebserkrankungen, bei denen große Mengen an bioaktivem Zalpha11-Liganden exprimiert werden, der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, als direkte Antagonisten des Liganden in vivo verwendet werden und dazu beitragen, das Fortschreiten und die Symptome, die mit dieser Erkrankung verbunden sind, zu reduzieren; dabei können sie zusammen mit anderen Therapien (z. B. Chemotherapie) verwendet werden, um die Wirkung der Therapie durch Herabsetzen des Fortschreitens und der Symptome zu verstärken und einen Rückfall zu verhindern. Außerdem können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, verwendet werden, um das Fortschreiten von Krebserkrankungen, bei denen Zalpha11-Rezeptoren überexprimiert werden, durch Binden des Liganden in vivo, der anderenfalls die Proliferation derartiger Krebserkrankungen verstärken würde, zu verlangsamen.
Des Weiteren können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, in vivo oder in diagnostischen Anwendungen verwendet werden, um Zalpha11-Ligand-exprimierende Tu moren in vivo oder in Gewebeproben nachzuweisen. Beispielsweise können der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, an eine radioaktive Markierung oder fluoreszierende Markierung, wie hierin beschrieben, konjugiert werden und verwendet werden, um die Gegenwart des Zalpha11-Liganden in einer Gewebeprobe unter Verwendung eines In-vitro-Bindungs-Assays vom Liganden-Rezeptor-Typ oder Fluoreszenz-Imaging-Assays nachzuweisen. Des Weiteren können ein radioaktiv markierter löslicher Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, in vivo verabreicht werden, um Liganden-exprimierende solide Tumoren durch ein auf dem Gebiet bekanntes radioaktives Abbildungsverfahren (Radioimaging) nachzuweisen.
Bevorzugt werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung bis zu einer Reinheit von 80%, bevorzugter 90%, noch bevorzugter 95%, aufgereinigt; besonders bevorzugt ist ein pharmazeutisch reiner Zustand, d. h. eine Reinheit von mehr als 99,9%, bezüglich kontaminierender Makromoleküle, insbesondere anderer Proteine und Nukleinsäuren, und frei von infektiösen und pyrogenen Agenzien. Bevorzugt ist ein gereinigtes Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs.
Der exprimierte rekombinante lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ (oder Zalpha11-Chimäre(–) oder -Fusions-Polypeptide), können unter Verwendung von Fraktionierung und/oder konventionellen Aufreinigungsverfahren und -Medien aufgereinigt werden. Für die Fraktionierung der Proben können Ammoniumsulfat-Präzipitation und Säureextraktion oder choatrope Extraktion angewendet werden. Zu den Aufreinigungsschritten zählen beispielsweise Hydroxyapatit, Größenausschluss, FPLC und Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Zu geeigneten chromatographischen Medien zählen derivatisierte Dextrane, Agarose, Zellulose, Polyacrylamid, Spezial-Silicas und Ähnliches. Bevorzugt sind PEI-, DEAE-, QAE- und Q-Derivate. Zu Chromatographie-Medien zählen beispielsweise solche Medien, die mit Phenyl-, Butyl- oder Octyl-Gruppen derivatisiert sind, wie beispielsweise Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl-Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) und Ähnliches, oder Polyacrylharze, wie beispielsweise Amberchrom CG 71 (Toso Haas) und Ähnliches. Geeignete feste Träger beinhalten Glas-Beads, Harze auf Silica-Basis, Zelluloseharze, Agarose-Beads, vernetzte Agarose-Beads, Polystyrol-Beads, vernetzte Polyacrylamid-Harze und Ähnliches, die unter den Bedingungen, bei denen sie verwendet werden sollen, unlöslich sind. Diese Träger können mit reaktiven Gruppen modifiziert sein, welche eine Verbindung von Proteinen durch Aminogruppen, Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen, Hydroxylgruppen und/oder Kohlehydrat-Reste ermöglichen. Zu Beispielen für Kopplungs-Chemietechniken zählen Cyanogen-Bromid-Aktivierung, N-Hydroxysuccinimid-Aktivierung, Epoxid-Aktivierung, Sulfhydryl-Aktivierung, Hydrazid-Aktivierung und Carboxyl- und Amino-Derivate für Carbodiimid-Kopplungs-Chemietechniken. Diese und weitere feste Medien sind auf dem Gebiet gut bekannt und finden häufig Anwendung; sie sind von kommerziellen Anbietern erhältlich. Verfahren zur Bindung von Rezeptor-Polypeptiden an Träger-Medien sind auf dem Gebiet allgemein bekannt. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens gehört zur Routinearbeit und wird teilweise durch die Eigenschaften des ausgewählten Trägers bestimmt; siehe beispielsweise Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Ausnutzung ihrer biochemischen, strukturellen und biologischen Eigenschaften isoliert werden. Beispielsweise kann immobilisierte Metallionen-Adsorption(IMAC)-Chromatographie verwendet werden, um Histidin-reiche Proteine, einschließlich solcher, welche Polyhistidin-Tags umfassen, aufzureinigen. Dabei wird zunächst ein Gel mit zweiwertigen Metallionen geladen, um ein Chelat zu bilden (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Die Histidin-reichen Proteine werden – in Abhängigkeit von dem verwendeten Metallion – mit verschiedenen Affinitäten an diese Matrix adsorbiert und durch kompetitive Elution, Herabsetzen des pH-Wertes oder Verwendung starker Chelat-bildender Agenzien eluiert. Zu weiteren Aufreinigungsverfahren zählen Aufreinigung von glykolisierten Proteinen durch Lektin-Affinitäts-Chromatographie und Ionenaustausch-Chromatographie (Methos in Enzymol., Vol. 182, „Guide to Protein Purification". M. Deutscher, (ed.) Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können eine Fusion aus dem interessierenden Polypeptid und einem Affinitäts-Tag (z. B. Maltose-Bindungs-Protein, eine Immunglobulin-Domäne) konstruiert werden, um die Aufreinigung zu erleichtern. Des Weiteren können Zalpha11-Ligand-Affinitäts-Säulen verwendet werden, um den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, aufzureinigen. Derartige Affinitäts-Chromatographie-Verfahren sind auf dem Gebiet bestens bekannt.
Des Weiteren werden unter Verwendung beschriebener Verfahren Polypeptid-Fusionen oder Zalpha11-Protein-Hybride konstruiert, wobei Bereiche oder Domänen des erfindungsgemäßen Zalpha11 in Kombination mit Bereichen oder Domänen anderer humaner Proteine aus der Cytokin-Rezeptor-Familie oder heterologe Proteine verwendet werden (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511-5, 1994, und darin enthaltene Referenzen). Diese Verfahren ermöglichen die Bestimmung der biologischen Bedeutung größerer Domänen oder Bereiche in einem interessierenden Polypeptid. Derartige Hybride können die Reaktionskinetiken und/oder die Bindung verändern, die Substratspezifität einschränken oder ausdehnen, oder die Gewebe- und zelluläre Lokalisation eines Polypeptids verändern; sie können auf Polypeptide unbekannter Struktur angewendet werden.
Lösliche Rezeptor-Fusions-Polypeptide oder -Proteine können durch Verfahren, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, durch Herstellen der jeweiligen Komponenten des Fusionsproteins und ihre chemische Konjugation hergestellt werden. Alternativ kann ein Polynukleotid, welches eine oder mehr Komponenten des Fusionsproteins im korrekten Leserahmen enthält, unter Verwendung bekannter Techniken erzeugt und durch die hierin beschriebenen Verfahren exprimiert werden. Beispielsweise können ein Teil oder sämtliche Domänen, welche eine biologische Funktion verleihen, zwischen dem Zalpha11 der vorliegenden Erfindung und der/den funktionell äquivalenten Domäne(n) aus anderen Mitgliedern der Cytokin-Familie ausgetauscht werden. Zu derartigen Domänen zählen beispielsweise, aber nicht ausschließlich, die extrazelluläre Cytokin-Bindungs-Domäne, die Ligand-Bindungs-Domäne und -Reste, die Transmembran-Domäne, wie hierin offenbart. Es wird erwartet, dass derartige Fusionsproteine ein biologisches funktionelles Profil aufweisen, welches – in Abhängigkeit der konstruierten Fusion – dem der Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder anderer bekannter Proteine der Familie entspricht oder ähnlich ist. Derartige Fusionsproteine können außerdem andere Eigenschaften als hierin offenbart aufweisen.
Es können molekularbiologische Standardtechniken und Standard-Klonierungstechniken angewendet werden, um die äquivalenten Domänen zwischen dem Zalpha11-Polypeptid und den Polypeptiden, an die sie fusioniert sind, auszutauschen. Im Allgemeinen wird ein DNA-Segment, welches eine interessierende Domäne, z. B. eine hierin beschriebene Zalpha11-Domäne, kodiert, mit wenigstens einem anderen DNA-Segment, welches ein zusätzliche Polypeptid kodiert (beispielsweise eine Domäne oder einen Bereich aus einem anderen Cytokin-Rezeptor, wie beispielsweise dem IL-2Rγ-Rezeptor) operabel im Leserahmen verknüpft und in einen geeigneten Expression-Vektor, wie hierin beschrieben, eingefügt. Im Allgemeinen werden die DNA-Konstrukte derart hergestellt, dass die verschiedenen DNA-Segmente, welche die entsprechenden Bereiche eines Polypeptids kodieren, operabel im Leserahmen miteinander verknüpft sind, um ein einziges Konstrukt herzustellen, welches das gesamte Fusionsprotein oder einen funktionellen Teil davon kodiert. Beispielsweise könnte ein DNA-Konstrukt vom N-Terminus zum C-Terminus ein Fusionsprotein kodieren, welches ein Signal-Polypeptid gefolgt von einer Cytokin-Bindungsdomäne umfasst. Derartige Fusionsproteine können, wie hierin beschrieben, exprimiert, isoliert und auf ihre Aktivität getestet werden.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder die löslichen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, oder Fragmente davon, können ebenso durch chemische Synthese hergestellt werden. Derartige Polypeptide können Monomere oder Multimere sein; sie können glykolisiert oder nicht-glykosiliert, pegyliert oder nicht-pegyliert sein; sie können am Anfang einen Methionin-Aminosäure-Rest enthalten oder nicht.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ebenso durch Ausschluss-Festphasen-Synthese, partielle Festphasen-Verfahren, Fragment-Kondensation oder klassische Lösungssynthese synthetisiert werden. Verfahren zur Synthese von Polypeptiden sind auf dem Fachgebiet bestens bekannt; siehe beispielsweise Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963; und Kalser et al., Anal. Biochem. 34: 595, 1970. Nach der vollständigen Synthese des gewünschten Peptids auf einem festen Träger wird das Peptidharz mit einem Reagenz umgesetzt, welches das Polypeptid vom Harz abspaltet und die meisten der Seitenketten-Schutzgruppen entfernt. Derartige Verfahren sind auf dem Fachgebiet gut etabliert.
Die Aktivität der Moleküle der vorliegenden Erfindung kann unter Anwendung verschiedener Assays, mit denen Zelldifferenzierung und -proliferation gemessen wird, bestimmt werden. Derartige Assays sind auf dem Gebiet bestens bekannt und hierin beschrieben.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise geeignet in der Behandlung von Lymphom- und Immunerkrankungen, hämatopoetischen und entzündlichen Erkrankungen und Ähnlichem; ihre Wirksamkeit kann in vitro unter Verwendung kultivierter Zellen oder in vivo durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Moleküle in einem geeigneten Tiermodell bestimmt werden. Beispielsweise können Wirtszellen, welche einen löslichen Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, exprimieren, in eine Alginat-Umgebung eingebettet und in Empfänger-Tiere injiziert (implantiert) werden. Alginat-Poly-L-Lysin-Mikroeinkapselung, permselektive Membran-Einkapselung und Diffusionskammern sind Mittel zum Einschließen transfizierter Säugetierzellen oder primärer Säugetierzellen. Diese Typen nicht-immunogener „Einkapselungen" ermöglichen die Diffusion von Proteinen und anderen Makromolekülen, die durch die eingeschlossenen Zellen sekretiert oder freigesetzt werden, in das Empfängertier. Von großer Bedeutung ist, dass die Kapseln die fremden, eingebetteten Zellen vor der Immunantwort des Empfängertiers schützen und abschirmen. Derartige Einkapselungen können die Lebensdauer der injizierten Zellen von einigen Stunden oder Tagen (nackte Zellen) bis zu mehreren Wochen (eingebettete Zellen) ausdehnen. Alginat-Fäden stellen ein einfaches und schnelles Mittel zur Erzeugung eingebetteter Zellen dar.
Die Materialien, die zur Erzeugung von Alginat-Fäden notwendig sind, sind auf dem Gebiet bekannt. In einem beispielhaften Verfahren wird 3%iges Alginat in sterilem H₂O hergestellt und steril filtriert. Vor der Herstellung der Alginat-Fäden wird die Alginat-Lösung wiederum filtriert. Eine etwa 50%ige Zellsuspension (enthaltend etwa 5 × 10⁵ bis etwa 5 × 10⁷ Zellen/ml) wird mit der 3%igen Alginat-Lösung gemischt. Ein ml der Alginat/Zell-Suspension wird über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten in eine steril filtrierte 100 mM CaCl₂-Lösung extrudiert, wodurch ein „Faden" gebildet wird. Der extrudierte Faden wird dann in eine 50 mM CaCl₂-Lösung und anschließend in eine 25 mM CaCl₂-Lösung überführt. Der Faden wird dann mit deionisiertem Wasser gespült, bevor er durch Inkubieren in einer 0,01%igen Poly-L-Lysin-Lösung beschichtet wird. Schließlich wird der Faden mit laktierter Ringers Lösung gespült und aus der Lösung in einen Spritzenzylinder (ohne Nadel) gezogen. Dann wird eine Nadel mit großer Bohrung an der Spritze befestigt und der Faden in einem minimalen Volumen der laktierten Ringers Lösung intraperitoneal in einen Empfänger injiziert.
Es können adenovirale und andere virale Systeme, wie beispielsweise das Vaccinia-Virus, verwendet werden, um die Proteine der vorliegenden Erfindung zu exprimieren und zu produzieren. Beispielsweise werden unter Verwendung von adenoviralen Vektoren, in denen Teile des Adenovirus-Genoms deletiert sind, durch direkte Ligation oder durch homologe Rekombination mit einem co-transfizierten Plasmid Inserts in die virale DNA eingebaut. In einem beispielhaften System wurde das essentielle Gen E1 aus dem viralen Vektor deletiert; das Virus repliziert sich nicht, bis das E1-Gen durch die Wirtszelle (beispielsweise die humane 293-Zelllinie) bereitgestellt wird. Wenn das adenovirale Ausschüttungssystem eine E1-Gen-Delektion aufweist, kann sich das Virus nicht in humanen Zellen replizieren, exprimiert und prozessiert (und – bei Vorliegen einer sekretorischen Signalsequenz – sekretiert) jedoch das heterologe Protein. Durch Deletieren des gesamten Adenovirus-Genoms können zudem sehr lange Inserts heterologer DNA untergebracht werden. Die Erzeugung so genannter „Eingeweidefreier" Adenoviren, in denen alle viralen Gene deletiert sind, sind insbesondere vorteilhaft für die Insertion großer Inserts heterologer DNA; siehe beispielsweise Yeh, P. und Perricaudet, M. FASEB J. 11: 615-623, 1997.
Das Adenovirus-System kann zur Proteinherstellung in vitro verwendet werden. Durch Kultivieren von Nicht-293-Zellen, die mit dem Adenovirus infiziert sind, unter Bedingungen, bei denen die Zellen sich nicht schnell teilen, können die Zellen Proteine über längere Zeiträume produzieren. Beispielsweise werden BHK-Zellen bis zur Konfluenz in Zellfabriken kultiviert und dem adenoviralen Vektor, welcher das interessierende sekretierte Protein kodiert, exponiert. Die Zellen werden dann unter serumfreien Bedingungen kultiviert, wodurch die infizierten Zellen für einige Wochen ohne signifikante Zellteilung überleben können. Alternativ können mit dem Adenovirus-Vektor infizierte 293-Zellen als anhaftende Zellen oder in Suspensionkultur mit relativ hoher Zelldichte zur Herstellung signifikanter Mengen des Proteins kultiviert werden (siehe Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145-55, 1994). Mit jeder dieser Vorgehensweisen kann ein exprimiertes, sekretiertes heterologes Protein – in Abhängigkeit der Verteilung des exprimierten Proteins in der Zelle – schnell aus dem Zellkultur-Überstand, dem Lysat oder den Membran-Fraktionen isoliert werden. Bei Verwendung von infizierten 293-Zellen zur Produktion können zudem nicht-sekretierte Proteine effizient erhalten werden.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptor-Antagonisten, können in vitro in einem Assay verwendet werden, um eine Abnahme der Stimulation der Koloniebildung durch den Zalpha11-Liganden anhand isolierter primärer Knochenmark-Kulturen zu bestimmen. Derartige Assays sind hierin offenbart und auf dem Fachgebiet bestens bekannt.
Zalpha11-Ligand-Antagonisten und -Bindungs-Agenzien sind ebenso geeignet als Versuchs-Reagenzien zur Charakterisierung der Stellen der Ligand-Rezeptor-Interaktion. Zu Inhibitoren der Zalpha11-Ligand-Aktivität (Zalpha11-Ligand-Antagonisten) zählen gegen den Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid gerichtete Antikörper, wie beispielsweise gegen das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ gerichtete Antikörper, und der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptoren, sowie andere peptidische und nicht-peptidische Agenzien (einschließlich Ribozyme).
Ein löslicher Zalpha11-Rezeptor oder lösliche heterodimere Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Ligand-bindende Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, der vorliegenden Erfindung können außerdem zur Aufreinigung des Zalpha11-Liganden verwendet werden. Das Polypeptid wird auf einem festen Träger, wie beispielsweise Agarose-Beads, vernetzter Agarose, Glas, Zelluloseharzen, Harzen auf Silica-Basis, Polysterol, vernetztem Polyacrylamid oder ähnlichen Materialien, die unter den Verwendungsbedingungen stabil sind, immobilisiert. Verfahren zum Binden von Polypeptiden an feste Träger sind auf dem Gebiet bekannt und beinhalten Amin-Chemie, Cyanogen-Bromid-Aktivierung, N-Hydroxysuccinimid-Aktivierung, Epoxid-Aktivierung, Sulfhydryl-Aktivierung und Hydrazid-Aktivierung. Das resultierende Medium liegt im Allgemeinen in Form einer Säule vor, und Fluide, welche den Liganden enthalten, werden ein oder mehr Male durch die Säule geleitet, um eine Bindung des Liganden an das Rezeptor-Polypeptid zu ermöglichen. Der Ligand wird dann durch Veränderung der Salzkonzentration, chaotropische Agenzien (Guanidin-HCl) oder Veränderungen des pH-Werts zur Unterbrechung der Ligand-Rezeptor-Bindung eluiert.
Vorteilhafterweise kann ein Assay-System angewendet werden, welches einen Ligandbindenden Rezeptor (oder einen Antikörper, einen Teil eines Komplement/Anti-Komplement-Paares) oder ein Bindungsfragment davon und ein kommerziell erhältliches Biosensor-Instrument verwendet (z. B. BIAcore^TM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ; oder SELDI^TM, Technology, Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA). Derartige Rezeptoren, Antikörper, Teile eines Komplement/Anti-Komplement-Paares oder Fragmente werden auf der Oberfläche eines Rezeptor-Chips immobilisiert. Die Verwendung dieses Instruments ist in Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991, und Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993, offenbart. Ein Rezeptor, Antikörper, Teil oder Fragment wird unter Verwendung von Amin- oder Sulfhydryl-Chemie kovalent an Dextranfasern, welche an einem Goldfilm innerhalb der Fließzelle befestigt sind, gebunden. Dann wird eine Testprobe durch die Zelle geschickt. Wenn ein Ligand, Epitop oder entgegengesetzter Teil des Komplement/Anti-Komplement-Paares in der Probe vorliegt, wird er an den immobilisierten Rezeptor, Antikörper bzw. Teil binden, was zu einer Veränderung des Brechungsindex des Mediums führt, welche als eine Veränderung der Oberflächen-Plasmon-Resonanz des Goldfilms detektiert wird. Dieses System ermöglicht die Bestimmung der On- und Off-Raten, aus denen die Bindungsaffinität berechnet werden kann, und eine Bewertung der Stöchiometrie der Bindung.
Die Ligand-bindenden Rezeptor-Polypeptide, wie beispielsweise die der vorliegenden Erfindung, können ebenso innerhalb anderer, auf dem Gebiet bekannter Assay-Systeme verwendet werden. Zu derartigen Systemen zählen die Scatchard-Analyse zur Bestimmung der Bindungs-Affinität (siehe Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) und kalorimetrische Assays (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise die löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, können ebenso zur Herstellung von Antikörpern, welche an Epitope, Peptide oder Polypeptide, die in dem Antigen enthaltenen sind, binden, verwendet werden. Der Zalpha11-Rezeptor oder das lösliche heterodimere Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise die löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, oder Fragmente davon dienen als Antigen (Immunogen) zur Impfung eines Tiers, um eine Immunantwort hervorzurufen. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass antigene, Epitop-tragende Polypeptide eine Sequenz von wenigstens 6, bevorzugt wenigstens 9, und bevorzugter wenigstens 15 bis etwa 30 benachbarten Aminosäure-Resten eines Zalpha11-Rezeptors oder löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise eines löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptids (z. B. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 4) enthalten. Polypeptide, die einen größeren Teil eines Zalpha11-Rezeptors oder löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptids, enthalten, d. h. von 30 bis 100 Resten bis zu der gesamten Länge der Aminsosäuresequenz, zählen ebenso dazu. Antigene oder immunogene Epitope können außerdem angeheftete Tags, Adjuvanzien und Träger, wie hierin beschrieben, enthalten. Zu geeigneten Antigenen zählen das Zalpha11-Polypeptid, welches durch die SEQ ID NO: 2 von der Aminosäure Nummer 20 (Cys) bis zu der Aminosäure Nummer 237 (His) (SEQ ID NO: 6) kodiert wird, oder ein zusammenhängendes Aminosäure-Fragment davon, von der Aminosäure 9 bis zu der Aminosäure 218. Bevorzugte Peptide zur Verwendung als Antigene sind die hierin offenbarte Cytokin-Bindungs-Domäne und hydrophile Zalpha11-Peptide, wie beispielsweise solche, die sich für einen Fachmann auf dem Gebiet aus einem Hydrophobizitäts-Plot ergeben, welcher beispielsweise anhand eines Hopp/Woods-Hydrophilizitäts-Profils, basierend auf einem Gleitfenster von sechs Resten, wobei verborgene G-, S- und T-Reste und exponierte H-, Y- und W-Reste ignoriert werden, bestimmt wurde. Beispielsweise zählen zu hydrophilen Zalpha11-Peptiden Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die ausgewählt sind aus der Gruppe: (1) Aminosäure Nummer 51 (Trp) bis Aminosäure Nummer 61 (Glu) der SEQ ID NO: 2; (2) Aminosäure Nummer 136 (Ile) bis Aminosäure Nummer 143 (Glu) der SEQ ID NO: 2; (3) Aminosäure Nummer 187 (Pro) bis Aminosäure Nummer 195 (Ser) der SEQ ID NO: 2; und (4) Aminosäure Nummer 223 (Phe) bis Aminosäure Nummer 232 (Glu) der SEQ ID NO: 2. Die entsprechenden hydrophilen Bereiche in Bezug auf SEQ ID NO: 6 können unter Querverweis zu den obigen Aminosäure-Resten der SEQ ID NO: 2 vorgenommen werden. Des Weiteren sind antigene Epitop-tragende Polypeptide, die durch einen Jameson-Wolf-Plot, beispielsweise unter Verwendung des DNASTAR-Protean-Programms (DNASTAR, Inc. Madison, WI) vorhergesagt werden, geeignete Antigene. Zudem sind konservierte Motive und variable Bereiche zwischen konservierten Motiven des löslichen Zalpha11-Rezeptors geeignete Antigene. Zu geeigneten Antigenen zählen außerdem die oben offenbarten Zalpha11-Polypeptide in Kombination mit der extrazellulären Domäne weiterer Klasse-I-Cytokine, wie beispielsweise solcher, die lösliche heterodimere Zalpha11-Polypeptide, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, bilden. Außerdem können entsprechende Bereiche des löslichen Zalpha11-Rezeptor-Polypeptides der Maus (Reste 20 (Cys) bis 237 (His) der SEQ ID NO: 12) verwendet werden, um Antikörper gegen den löslichen Maus-Zalpha11-Rezeptor zu erzeugen. Zudem können Antikörper, die durch diese Immunantwort erzeugt wurden, wie hierin beschrieben isoliert und gereinigt werden. Verfahren zur Herstellung und Isolierung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet gut bekannt; siehe beispielsweise Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995:, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; und Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.
Für einen Fachmann auf dem Gebiet ist es offensichtlich, dass polyklonale Antikörper durch das Impfen einer Anzahl verschiedener warmblütiger Lebewesen, wie beispielsweise Pferde, Kühe, Ziegen, Schafe, Hunde, Hühner, Kaninchen, Mäuse und Ratten, mit einem lösli chen Zalpha11-Rezeptor oder einem löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise dem löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, oder einem Fragment davon erzeugt werden können. Die Immunogenität des Zalpha11-Polypeptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans, beispielsweise Alaun (Aluminiumhydroxid) oder Freunds kompletten oder inkompletten Adjuvans, erhöht werden. Zu Polypeptiden, die zur Immunisierung geeignet sind, zählen außerdem Fusions-Polypeptide, wie beispielsweise Fusionen von Zalpha11 oder einem Teil davon mit einem Immunoglobulin-Polypeptid oder einem Maltose-bindenden Protein. Bei dem Polypeptid-Immunogen kann es sich um ein Molekül voller Länge oder einen Teil davon handeln. Wenn der Polypeptid-Teil „Hapten-ähnlich" ist, kann ein derartiger Teil vorteilhafterweise mit einem makromolekularen Träger (wie beispielsweise „Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH), bovinem Serum-Albumin (BSA) oder Tetanus-Toxoid) zur Immunisierung verbunden oder verknüpft sein.
Der hierin verwendet Ausdruck „Antikörper" umfasst polyklonale Antikörper, Affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und Antigen-bindende Fragmente, wie beispielsweise F(ab')₂ und proteolytische Fab-Fragmente. Ebenso gehören genetisch konstruierte intakte Antikörper oder Fragmente, wie beispielsweise chimäre Antikörper, Fv-Fragmente, Einzelketten-Antikörper und Ähnliches sowie synthetische Antigen-bindende Peptide und Polypeptide dazu. Nicht humane Antikörper können durch Aufpfropfen nicht-humaner CDRs auf humane Framework- und konstante Bereiche oder durch Einbau der gesamten nicht-humanen variablen Domänen humanisiert werden (ggf. durch ihr „Verhüllen" mit einer human-ähnlichen Oberfläche durch Ersetzen der exponierten Reste, wobei das Ergebnis ein „furnierter" Antikörper ist). In einigen Fällen können humanisierte Antikörper nicht-humane Reste innerhalb des variablen Bereichs der humanen Framework-Domänen beibehalten, um die eigenen Bindungseigenschaften zu verstärken. Durch Humanisierung der Antikörper kann die biologische Halbwertzeit erhöht und das Potential für entgegenwirkende/nachteilige Immunreaktionen nach Verabreichung an den Menschen reduziert werden.
Es wird von einer spezifischen Bindung der Antikörper gesprochen, wenn: 1) sie ein Schwellenniveau der Bindungsaktivität aufweisen und 2) sie nicht signifikant mit verwandten Polypeptid-Molekülen kreuz-reagieren. Ein Schwellenniveau der Bindung wird bestimmt, wenn gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise gegen lösliches Zalpha11/IL-2Rγ, gerichtete Antikörper an einen löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, -Peptid oder -Epitop mit einer Affinität binden, die wenigstens 10-fach höher ist als die Bindungsaffinität zu einem Kontroll-Polypeptid (nicht-löslicher Zalpha11-Rezeptor oder lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise lösliches Zalpha11/IL-2Rγ). Bevorzugt weisen die Antikörper eine Bindungsaffinität (K_a) von 10⁶ M^–1 oder mehr, bevorzugt von 10⁷ M^–1 oder mehr, bevorzugter von 10⁸ M^–1 oder mehr, und am bevorzugtesten von 10⁹ M^–1 oder mehr, auf. Die Bindungsaffinität eines Antikörpers kann leicht durch einen Fachmann auf dem Gebiet, beispielsweise durch Scatchard-Analyse (Scatchard, G., Ann. NY Acad, Sci. 51: 660-672, 1949) bestimmt werden.
Ob gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise gegen lösliches Zalpha11/IL-2Rγ, gerichtete Antikörper nicht signifikant mit verwandten Polypeptid-Molekülen kreuz-reagieren, kann, unter Anwendung einer Standard-Western-Blot-Analyse (Ausubel et al., ibid.), beispielsweise dadurch gezeigt werden, dass der Antikörper den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, jedoch nicht verwandte Polypeptide detektiert. Zu Beispielen für bekannte verwandte Polypeptide zählen beispielsweise die im Stand der Technik offenbarten, bekannten Orthologen und Paralogen und ähnliche bekannte Mitglieder einer Proteinfamilie. Ein Screening kann ebenso unter Verwendung eines nicht-humanen löslichen Zalpha11-Rezeptors oder löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, und mutanter Polypeptide des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, durchgeführt werden. Des Weiteren können Antikörper „gegen" bekannte verwandte Polypeptide „gescreent" werden, um eine Population zu isolieren, die spezifisch an den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, bindet. Beispielsweise werden Antikörper, die gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, gerichtet sind, an verwandte Polypeptide, die an eine unlösliche Matrix gebunden sind, adsorbiert; Antikörper, die spezifisch für den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, sind, fließen unter den geeigneten Pufferbedingungen durch die Matrix. Ein Screening ermöglicht die Isolierung polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die nicht mit bekannten, eng verwandten Polypeptiden kreuz-reagieren (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). Das Screening und die Isolierung spezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet bestens bekannt; siehe „Fundamental Immunology", Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Spezifisch bindende, gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise gegen das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, gerichtete Antikörper können durch eine Anzahl von Verfahren, die bekannt und im Folgenden offenbart sind, nachgewiesen werden.
Es können eine Anzahl verschiedener Assays, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, die an den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Proteine oder -Polypeptide, binden. Beispielhafte Assays sind detallliert in "Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, beschrieben. Zu repräsentativen Beispielen für derartige Assays zählen: Parallel-Immunelektrophorese, Radioimmunoassay, Radioimmuno-Präzipitation, Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA), Dot-Blot- oder Western-Blot-Assay, Inhibitions- oder Kompetitions-Assay und Sandwich-Assay. Des Weiteren können Antikörper bezüglich ihrer Bindung an den Wild-Typ im Vergleich zu einem mutanten löslichen Zalpha11-Rezeptor oder einem löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise einem löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Protein oder -Polypeptid, gesreent werden.
Zu alternativen, hierin geeigneten Techniken zur Erzeugung oder Selektion von Antikörpern zählen In-vitro-Exposition von Lymphocyten an den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Poylpeptid, wie beispielsweise ein lösliches Zalpha11/IL-2Rγ-Protein oder -Peptid, und Selektion von Antikörper-Display-Bibliotheken in Phagen oder ähnlichen Vektoren (beispielsweise durch Verwendung eines immobilisierten oder markierten löslichen Zalpha11-Rezeptors oder löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise eines löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Proteins oder -Peptids). Gene, die für Polypeptide kodieren, die potentielle Bindungsdomänen für den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise ein lösliches Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptid, aufweisen, können erhalten werden, indem Peptid-Zufalls-Bibliotheken, die auf Phagen (Phagen-Display) oder auf Bakterien, wie beispielsweise E. coli dargestellt sind, gescreent werden. Nukleotid-Sequenzen, welche die Polypeptide kodieren, können auf verschiedenen Wegen, wie beispielsweise durch Zufalls(Random)-Mutagenese oder Zufalls(Random)-Polynukleotid-Synthese, erhalten werden. Diese Random-Peptid-Display-Bibliotheken können verwendet werden, um nach Peptiden zu screenen, die mit einem bekannten Zielmolekül (Target) interagieren, bei dem es sich um ein Protein oder Polypeptid, wie beispielsweise einen Liganden oder Rezeptor, ein biologisches oder synthetisches Makromolekül oder organische oder anorganische Substanzen handeln kann. Techniken zur Erzeugung und zum Screenen derartiger Random-Peptid-Display-Bibliotheken sind auf dem Gebiet bekannt (Ladner et al., US-Patent Nr. 5,223,409; Ladner et al., US-Patent Nr. 4,946,778; Ladner et al., US-Patent Nr. 5,403,484 und Ladner et al., US-Patent Nr. 5,571,698); Random-Peptid-Display-Bibliotheken und Kits zum Screenen derartiger Bibliotheken sind beispielsweise von Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) und Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) kommerziell erhältlich. Die Random-Peptid-Display-Bibliotheken können unter Verwendung des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise den hierin offenbarten löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Sequenzen, gescreent werden, um Proteine, die an den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder das lösliche heterodimere Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, binden, zu identifizieren. Diese „Bindungspolypeptide", die mit dem löslichen Zalpha11-Rezeptor oder dem löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptiden, interagieren, können zum „Tagging" von Zellen, zur Isolierung homologer Polypeptide durch Affinitäts-Aufreinigung, verwendet werden; sie können direkt oder indirekt an Agenzien, Toxine, Radionuklide und Ähnliches konjugiert werden. Diese Bindungspolypeptide können ebenso in analytischen Verfahren, wie beispielsweise zum Screenen von Expressions-Bibliotheken und Neutralisieren der Aktivität, z. B. zur Blockierung der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor oder der viralen Bindung an einen Rezeptor, verwendet werden. Die Bindungspolypeptide können ebenso für diagnostische Assays zur Bestimmung zirkulierender Niveaus des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise löslicher Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, zum Nachweis oder zur Quantifizierung des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder löslicher heterodimerer Zalpha11-Polypeptide, wie beispielsweise löslicher Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, als Marker einer zugrundeliegenden Pathologie oder Erkrankung verwendet werden. Diese Bindungspolypeptide können außerdem als „Antagonisten" des Zalpha11-Rezeptors oder eines heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, wirken, um die Bindung und Signaltransduktion des Zalpha11-Rezeptors oder eines heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, in vitro und in vivo zu blockieren. Wiederum sind diese gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Polypeptid, wie beispielsweise gegen das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, gerichteten Bindungspolypeptide geeignet zur Inhibierung der Zalpha11-Ligand-Aktivität sowie der Rezeptor-Aktivität oder Protein-Bindung. Antikörper, die gegen die heterodimeren oder multimeren Kombinationen der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, zählen zu bevorzugten Ausführungsformen, da sie spezifischer und effektiver gegen den Zalpha11-Liganden wirken können als Antikörper, die lediglich gegen eine Untereinheit gerichtet sind. Zudem kann die antagonistische Aktivität und Bindungs-Aktivität der Antikörper der vorliegenden Erfindung in den hierin beschriebenen Zalpha11-Ligand-Proliferations-Assays und anderen biologischen Assays untersucht werden.
Antikörper gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, können zum „Tagging" von Zellen, die den Zalpha11-Rezeptor oder heterodimere Zalpha11-Polypeptide, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, exprimieren; zur Isolierung des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptids, durch Affinitäts-Reinigung; für diagnostische Assays zur Bestimmung zirkulierender Niveaus des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise löslicher Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide; zum Nachweis oder zur Quantifizierung des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, als Marker einer zugrundeliegenden Pathologie oder Erkrankung; in analytischen Verfahren, welche FACS anwenden; zum Screenen von Expressions-Bibliotheken; zur Erzeugung von anti-idiotypischen Antikörpern; und als neutralisierende Antikörper oder Antagonisten zur Blockierung des Zalpha11-Rezeptors oder eines heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, oder der Zalpha11-Ligand-Aktivität in vitro und in vivo verwendet werden. Zu geeigneten direkten Tags oder Markierungen zählen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Marker, chemilumineszierende Marker, magnetische Partikel und Ähnliches; indirekte Tags oder Markierungen können die Verwendung von Biotin-Avidin oder anderen Komplement/Anti-Komplement-Paaren als Intermediate beinhalten. Die Antikörper können hierbei außerdem direkt oder indirekt an Agenzien, Toxine, Radionuklide und Ähnliches konjugiert sein; diese Konjugate können für diagnostische oder therapeutische Anwendungen in vivo verwendet werden. Des Weiteren können Antikörper gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, oder Fragmente davon in vitro verwendet werden, um den denaturierten oder nicht-denaturierten löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, oder Fragmente davon in Assays, beispielsweise Western-Blots oder anderen auf dem Gebiet bekannten Assays, nachzuweisen.
Antikörper gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, sind geeignet zum "Tagging" von Zellen, welche die entsprechenden Rezeptoren exprimieren, und zum Untersuchen ihrer Expressions-Niveaus, zur Affinitäts-Reinigung, in diagnostischen Assays zur Bestimmung zirkulierender Niveaus der löslichen Rezeptor-Polypeptide und in analytischen Verfah ren, welche Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung verwenden. Zudem können divalente Antikörper und anti-idiotypische Antikörper als Agonisten verwendet werden, um die Wirkung des Zalpha11-Liganden zu imitieren.
Die Antikörper können hierbei ebenso direkt oder indirekt an Agenzien, Toxine, Radionuklide und Ähnliches konjugiert sein und diese Konjugate für diagnostische oder therapeutische Anwendung in vivo verwendet werden. Beispielsweise können Antikörper oder Bindungspolypeptide, welche den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise die löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Polypeptide, der vorliegenden Erfindung erkennen, verwendet werden, um Gewebe oder Organe, welche ein entsprechendes anti-komplementäres Molekül (d. h., einen Zalpha11-Rezeptor oder heterodimeren Zalpha11-Rezeptor, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ) exprimieren, zu identifizieren oder zu behandeln. Insbesondere können gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise gegen das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, gerichtete Antikörper oder biologisch aktive Fragmente oder Teile davon an nachweisbare oder cytotoxische Moleküle gekoppelt werden und einem Säugetier verabreicht werden, welches Zellen, Gewebe oder Organe aufweist, die den Zalpha11-Rezeptor oder einen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptor-Moleküle, exprimieren.
Geeignete detektierbare Moleküle können direkt oder indirekt an Polypeptide, die den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, angehängt werden („Bindungspolypeptide", einschließlich der oben offenbarten Bindungspeptide), Antikörper oder bioaktive Fragmente oder Teile davon gebunden sein. Zu geeigneten nachweisbaren Molekülen zählen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Marker, chemilumineszierende Marker, magnetische Partikel und Ähnliches. Geeignete cytotoxische Moleküle können direkt oder indirekt an das Polypeptid oder den Antiköper angehängt sein und beinhalten bakterielle oder pflanzliche Toxine (z. B. Diphtherie-Toxin, Pseudomonas-Exotoxin, Ricin, Abrin und Ähnliches) sowie therapeutische Radionuklide, wie beispielsweise Iod-131, Rhenium-188 oder Yttrium-90 (entweder direkt an das Polypeptid oder den Antikörper angehängt oder indirekt, beispielsweise mittels eines Chelat-bildenden Rests, angehängt). Die Bindungspolypeptide oder Antikörper können ebenso an cytotoxische Agenzien, wie beispielsweise Adriamycin, konjugiert sein. Zur indirekten Befestigung eines detektierbaren oder cytotoxischen Moleküls kann das detektierbare oder cytotoxische Molekül mit einem Teil eines Komplement/Anti-Komplement-Paares konjugiert sein, wobei der andere Teil an das Bindungspolypeptid oder den Antikörper-Teil gebunden ist. In dieser Hinsicht stellt Biotin/Strepavidin ein beispielhaftes komplementäres/anti-komplementäres Paar dar.
In einer anderen Ausführungsform können die Bindungspolypeptid-Toxin-Fusionsproteine oder Antikörper-Toxin-Fusionsproteine für zielgerichtete Zell- oder Gewebe-Inhibition oder -Ablation (beispielsweise zur Behandlung von Krebszellen oder -geweben) verwendet werden. Wenn das Bindungspolypeptid mehrere funktionelle Domänen aufweist (d. h., eine Aktivierungsdomäne oder eine Liganden-Bindungsdomäne plus eine Targeting-Domäne), kann alternativ ein Fusionsprotein, welches lediglich die Targeting-Domäne enthält, geeignet sein, um ein detektierbares Molekül, ein cytotoxisches Molekül oder ein komplementäres Molekül zu einem bestimmten Zell- oder Gewebetyp zu schleusen. In Fällen, in denen das Fusionsprotein, welches lediglich eine einzige Domäne enthält, ein komplementäres Molekül enthält, kann das anti-komplementäre Molekül an ein detektierbares oder cytotoxisches Molekül konjugiert sein. Derartige Fusionsproteine aus einer Domäne und einem komplementären Molekül stellen somit ein generisches Targeting-Vehikel zur zell-/gewebespezifischen Abgabe generischer Konjugate aus einem anti-komplementären detektierbaren Molekül/cytotoxischen Molekül dar.
In einer anderen Ausführungsform können Fusionsproteine aus den Bindungspolypeptiden des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/II-2Rγ, und Cytokinen oder Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine verwendet werden, um in vivo das Abtöten eines Zielgewebes (z. B. bei Blut-, Lymph-, Darm- und Knochenmarkkrebs) zu verstärken, wenn das Bindungspolypeptid-Cytokin oder der gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor oder gegen ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise gegen das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, gerichtete Antikörper auf die hyperproliferativen Zellen abzielen (siehe allgemein Hornick et al., Blood 89: 4437-47, 1997). Die beschriebenen Fusionsproteine ermöglichen ein zielgerichtetes Führen (Targeting) eines Cytokins zu einer gewünschten Aktionsstelle, wobei eine erhöhte lokale Konzentration des Cytokins bereitgestellt wird. Geeignete Anti-Zalpha11-Homodimer- und -Heterodimer-Antikörper zielen auf einen unerwünschten Zell- oder Gewebetyp (d. h., einen Tumor oder eine Leukämie), und das fusionierte Cytokin vermittelt eine verbesserte Lyse der Zielzellen durch Effektor-Zellen. Zu geeigneten Cytokinen für diesen Zweck zählen beispielsweise das Interleukin-2 und der Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF).
Alternativ können die hierin beschriebenen Fusionsproteine der Bindungspolypeptide des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, oder Antikörper-Fusionsproteine verwendet werden, um in vivo das Abtöten eines Zielgewebes durch direkte Stimulation eines durch den Zalpha11- Rezeptor modulierten apoptotischen Wegs, welcher zu Zelltod der hyperproliferativen Zellen, welche den Zalpha11-Rezeptor oder einen heterodimeren Zalpha11-Rezeptor, wie beispielsweise den löslichen Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptor, exprimieren, zu verstärken.
Vier-Helix-Bündel-Cytokine, welche an Cytokin-Rezeptoren binden, sowie andere Proteine, die durch aktivierte Lymphocyten produziert werden, spielen eine wichtige biologische Rolle bei der Zelldifferenzierung, Aktivierung, Rekrutierung und Homeostase von Zellen im gesamten Körper. Der therapeutische Nutzen umfasst die Behandlung von Erkrankungen, die eine Immunregulation erfordern, einschließlich Autoimmun-Erkrankungen, wie beispielsweise rheumatiode Arthritis, Multiple Sklerose, Myasthenia Gravis, systemischer Lupus Erythomatosis und Diabetes. Zalpha11-Ligand-Antagonisten, einschließlich des Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, könnten bei der Regulation von Entzündungen eine wichtige Rolle spielen und somit geeignet sein, bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis, Asthma, Colitis Ulcerosa, entzündlicher Darmerkrankung, Morbus Crohn und Sepsis. Zalpha11-Ligand-Antagonisten, einschließlich des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, könnten eine Rolle bei der Vermittlung von Tumorgenese spielen und somit zur Behandlung von Krebs geeignet sein. Zalpha11-Ligand-Antagonisten, einschließlich des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, könnten potentielle Therapeutika bei der Unterdrückung des Immunsystems darstellen und somit wichtig bei der Reduzierung von Implantat-Abstoßung sein. Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, könnten bei der Vorbeugung einer „Implantat-gegen-Wirt"(„graft vs. host")-Erkrankung geeignet sein.
Alternativ könnten Zalpha11-Ligand-Antagonisten, einschließlich des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptoren, in Verbindung mit anderen Cytokinen eine selektive Aktivierung, Verstärkung oder selektive Suppression des Immunsystems in Verbindung mit dem Zalpha11-Liganden oder anderen Cytokinen, die eine Immunität gegenüber Infektionskrankheiten fördern, und damit eine Behandlung immun-kompromittierter Patienten, wie beispielsweise HIV⁺-Patienten, oder die Verbesserung von Impfstoffen ermöglichen. Insbesondere könnten Zalpha11-Antagonisten, einschließlich des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, die Expansion einer Untergruppe des Immunsystems, in die der Zalpha11-Ligand verwickelt ist (z. B. NK-Zellen und reife B-Zellen), verhindern, während die Expansion von Vorläufern, die durch andere Cytokine induziert werden (z. B. T-Zellen) ermöglicht wird, und somit von therapeutischen Wert bei der Behandlung viraler Infektion und anderer Infektion sein. Beispielsweise wird bei der Dengue-Virus-Infektion, welche das Dengue-hämorrhagische Fieber/Dengue-Schock-Syndrom (DHF/DSS) verursacht, angenommen, dass schwere DHF/DSS als Ergebnis einer „Immun-Verstärkung" auftritt, d. h., einer verstärkten Replikation des Virus in Gegenwart vor-existierender Antikörper gegen einen anderen Serotyp. In der zweiten Infektion durch einen anderen Dengue-Virus-Serotyp bringt das Immunsystem Antikörper gegen das erste Virus hervor, welche mit dem Virus kreuz-reagieren, es jedoch nicht neutralisieren, was potentiell zu seinem Eintritt in Makrophagen beiträgt. Somit könnte die Unterdrückung der Antikörper-Immunantwort oder der B-Zell-Antwort während einer zweiten oder dritten Dengue-Infektion dem Immunsystem helfen, angemessen in der zweiten Infektion zu reagieren, um das Virus durch Unterdrückung der „verstärkenden" Antikörper aus der ersten Serotyp-Infektion zu neutralisieren und folglich eine schwere DHF/DSS zu vermeiden. Für einen Review sei beispielsweise auf White, D. O. and Fenner F. J. (Eds.) Medical Virology, 3rd ed., Academic Press, Orlando Fl, 1986, Seiten 479-508, verwiesen. Gleichfalls kann die Unterdrückung mütterlicher Antikörper-Antworten gegen fötale Antigene durch die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung dazu beitragen, Geburtsdefekte und spontane Aborte zu verhindern. Zudem können bei derartigen Anwendungen die löslichen Rezeptoren der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen Cytokinen verwendet werden, um einige Aktivitäten des Immunsystems zu unterdrücken (z. B. B-Zell-Proliferation unter Verwendung der löslichen Rezeptoren) die Erhöhung anderer jedoch zu ermöglichen, z. B. in Gegenwart anderer, hierin beschriebener und auf dem Gebiet bekannter Cytokine.
Die hierin beschriebenen bioaktiven Bindungspolypeptide oder Antikörper-Konjugate können oral, intravenös, intraarteriell oder intraduktal verabreicht werden oder lokal in die gewünschte Wirkungsstelle eingeführt werden. Zur pharmazeutischen Verwendung werden der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder das lösliche heterodimere Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise lösliche Zalpha11/IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, zur parenteralen, insbesondere intravenösen oder subkutanen Verabreichung gemäß den konventionellen Verfahren formuliert. Intravenöse Verabreichung wird durch die Injektion eines Bolus oder Infusion über einen typischen Zeitraum von einer bis zu mehreren Stunden bewirkt. Im Allgemeinen enthalten pharmazeutische Formulierungen ein lösliches Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten Vehikel, wie beispielsweise Salzlösung, gepufferte Salzlösung, 5% Dextrose in Wasser oder Ähnliches. Die Formulierungen können außerdem ein oder mehr Arzneistoffträger, Konservierungsmittel, Lösungsvermittler, Pufferagenzien, Albumin zur Verhinderung von Protein-Verlust auf den Gefäßoberflächen usw. enthalten. Formulierungsverfahren sind auf dem Gebiet bestens bekannt und beispielsweise in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed. 1995, offenbart. Die therapeutischen Dosen liegen im Allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 μg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag, bevorzugt 0,5 bis 20 μg/kg pro Tag, wobei die exakte Dosis durch das Klinikpersonal gemäß den akzeptierten Standards unter Berücksichtigung der Natur und Schwere des zu behandelnden Zustands, der Patienten-Merkmale usw. bestimmt wird. Die Bestimmung der Dosis liegt innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet. Die Proteine können zur akuten Behandlung über eine Woche oder weniger, oftmals über einen Zeitraum von ein bis drei Tagen, verabreicht werden oder zur chronischen Behandlung über mehrere Monate oder Jahre verwendet werden. Im Allgemeinen handelt es sich bei einer therapeutisch wirksamen Menge des löslichen Zalpha11-Rezeptor-Polypeptids um eine Menge, die ausreicht, um eine klinisch signifikante Wirkung hervorzurufen.
Die Erfindung wird im Weiteren durch die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion eines Expressions-Vektors, welcher Zalpha11 in voller Länge exprimiert
Der vollständige Zalpha11-Rezeptor wurde unter Anwendung von PCR mit den Primern ZC19,905 (SEQ ID NO: 19) und ZC19,906 (SEQ ID NO: 20) aus einem Plasmid, welches die Zalpha11-Rezeptor-cDNA (SEQ ID NO: 1) enthielt, isoliert. Die Reaktionsbedingungen waren folgendermaßen: 1 Minute bei 95°C; 35 Zyklen, bestehend aus 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 55°C und 2 Minuten bei 72°C; anschließend 10 Minuten bei 72°C und Halten bei 10°C. Das PCR-Produkt wurde auf einem Gel aus 1%iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Boehringer Mannheim) aufgetrennt und die ungefähr 1,5 kb große Zalpha11-cDNA unter Verwendung des Qiaquick^TM-Gel-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert.
Die gereinigte Zalpha11-cDNA wurde mit BamHI (Boehringer Mannheim) und EcoRI (BRL) gemäß den Anweisungen der Hersteller verdaut. Der gesamte Verdau wurde auf ein Gel aus 1%iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Boehringer Mannheim) aufgetrennt und das ausgeschnittene Zalpha11-Fragment unter Verwendung des Qiaquick^TM-Gel-Extraktions-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Das resultierende geschnittene Zalpha11-Fragment wurde in einen Expressions-Vektor, wie im Folgenden beschrieben, eingefügt.
Der Empfänger-Expressions-Vektor pZP-5N wurde mit BamHI (Boehringer Mannheim) und EcoRI (BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut und, wie oben beschrieben, mit Hilfe eines Gels gereinigt. Dieses Vektor-Fragment wurde mit dem oben isolierten, BamHI und EcoRI gespaltenen Zalpha11-Fragment in einer Ligations-Reaktion unter Verwendung von T4-Ligase (BRL) vereinigt. Die Ligation wurde bei 15°C über Nacht inkubiert. Eine Probe der Ligation wurde elektroporetisch in bezüglich DH10B-ElektroMax^TM elektrokompetente E.-coli-Zellen eingeführt (25 μF, 200 Ω, 2,3 V). Die Tranformanten wurden auf LB + Ampicillin-Platten ausplattiert und einzelne Kolonien durch PCR gescreent, um die Zalpha11-Sequenz nachzuweisen, wobei ZC19,905 (SEQ ID NO: 19) und ZC19,906 (SEQ ID NO: 20) unter den oben beschriebenen PCR-Bedingungen verwendet wurden. Die Zalpha11-Sequenz wurde durch Sequenz-Analyse bestätigt. Das Insert hatte eine Größe von ungefähr 1,6 kb und besaß volle Länge.
Beispiel 2
Auf Zalpha11 basierende Proliferation in einem BAF3-Assay unter Verwendung von Alamar-Blue
Unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Zalpha11-Expressions-Vektors wurden BaF3-Zellen, welche den Zalpha11-Rezeptor in voller Länge exprimieren, konstruiert. Die BaF3-Zellen, welche die Zalpha11-Rezeptor-mRNA exprimieren, wurden als BaF3/Zalpha11 bezeichnet. Diese Zellen stellen ein Assay-System zum Nachweis der Zalpha11-Ligand-Aktivität, wie in verschiedenen Beispielen später beschrieben wird, dar. Umgekehrt liefern diese Zellen ebenso ein Assay-System zum Nachweis antagonistischer oder inhibitorischer Aktivität auf den Zalpha11-Liganden durch die löslichen Rezeptoren und Antikörper der vorliegenden Erfindung.
A. Konstruktion von BaF3-Zellen, welche den humanen Zalpha11-Rezeptor exprimieren
BaF3, eine Interleukin-3(IL-3)-abhängige prä-lymphoide Zelllinie, die aus murinem Knochenmark erhalten wurde (Palacios und Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) wurde in Komplettmedium (RPMI-Medium (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS), supplementiert mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum, 2 ng/ml murinem IL-3 (mIL-3) (R&D, Minneapolis, MN), 2 mM L-GlutaMax-1^TM (Gibco BRL), 1 mM Natriumpyruvat (Gibco BRL) und PSN-Antikörpern (Gibco BRL)), kultiviert. Vor der Elektroporation wurde pZP-5N/Zalpha11-Plasmid-DNA (Beispiel 1) hergestellt und unter Verwendung eines Qiagen-Maxi-Prep-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die BaF3-Zellen wurden zur Elektroporation einmal in RPMI-Medium gewaschen und dann mit einer Zelldichte von 10⁷ Zellen/ml in RPMI-Medium resuspendiert. Ein ml der re suspendierten BaF3-Zellen wurde mit 30 μg der pZP-5N/Zalpha11-Plasmid-DNA gemischt und in separate Einweg-Elektroporations-Kammern (GIBCO BRL) überführt. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen zwei aufeinander folgenden Impulsen (800 IFad/300 V; 1180 IFad/300 V) ausgesetzt, die durch eine Elektroporations-Vorrichtung (CELL-PORATOR^TM; GIBCO BRL) abgegeben wurden. Nach einer 5-minütigen Erholungszeit wurden die elektroporierten Zellen in 50 ml Komplettmedium überführt und für 15 bis 24 Stunden in einem Inkubator platziert (37°C, 5% CO₂). Die Zellen wurden dann zentrifugiert und in 50 ml Komplettmedium, enthaltend Geneticin^TM(Gibco)-Selektion (500 μg/ml G418) in einem T-162-Kolben resuspendiert, um den G418-resistenten Pool zu isolieren. Pools der transfizierten BaF3-Zellen, im Folgenden als BaF3/Zalpha11-Zellen bezeichnet, wurden auf ihre Signalisierungs-Fähigkeit, wie im Folgenden beschrieben, untersucht.
B. Testen der Signalisierungs-Fähigkeit der BaF3/Zalpha11-Zellen unter Verwendung eines Alarmar-Blue-Proliferations-Assays
Die BaF3/Zalpha11-Zellen wurden zentrifugiert in dem oben beschrieben Komplettmedium, jedoch ohne mIL-3 (im Folgenden als „mIL-3-freies Medium" bezeichnet), gewaschen. Die Zellen wurden zentrifugiert und dreimal gewaschen, um die Entfernung des mIL-3 sicherzustellen. Die Zellen wurden dann in einem Hämacytometer gezählt. Die Zellen wurden in einem 96-Kammer-Format mit 5.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl pro Kammer unter Verwendung des mIL-3-freien Mediums ausplattiert.
Die Proliferation der BaF3/Zalpha11-Zellen wurde unter Verwendung von konditioniertem Medium von Zalpha11-Ligand-exprimierenden Zellen, verdünnt mit mIL-3-freiem Medium auf Konzentrationen von 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% und 0,375%, oder gereinigtem Zalpha11-Liganden (allgemein verfügbare US-Patent-Anmeldung Nr. 09/522,217), verdünnt mit mIL-3-freiem Medium auf Konzentrationen von 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7,5 ng/ml, 3,75 ng/ml, 1,8 ng/ml, 0,9 ng/ml, 0,5 ng/ml und 0,25 ng/ml, untersucht. Zu den BaF3/Zalpha11-Zellen wurden 100 μl des verdünnten mTPO gegeben. Das Gesamt-Assay-Volumen betrug 200 μl. Die Negativ-Kontrollen wurden parallel durchgeführt, wobei lediglich mIL-3-freies Medium verwendet wurde. Die Assay-Platten wurden bei 37°C, 5% Co₂ für 3 Tage inkubiert; zu diesem Zeitpunkt wurde alamar-Blue (Accumed, Chicago, IL) mit 20 μl/Kammer zugegeben. Alamar-Blue ergibt ein fluorometrisches Signal auf der Grundlage der metabolischen Aktivität von Zellen und ermöglicht somit ein direktes Messen der Zellproliferation im Vergleich zu einer Negativ-Kontrolle. Die Platten wurden wiederum bei 37°C, 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden auf dem Fmax^TM-Plattenleser (Molecular Devices Sunnyvale, CA) unter Verwendung des SoftMax^TM-Pro-Programms bei Wellenlängen von 544 (Erregung) und 590 (Emission) gelesen. Die Ergeb nisse bestätigten die Signalisierungs-Fähigkeit des Zalpha11-Rezeptors, da der Zalpha11-Ligand signifikant die Proliferation über die Hintergrund-Niveaus hinaus induzierte.
Beispiel 3
Screening nach dem Zalpha11-Liganden unter Verwendung von BaF3/Zalpha11-Zellen unter Anwendung eines Alamar-Blue-Proliferations-Assays
A. Aktivierung primärer Affen-Splenocyten (Milzzellen) zur Feststellung der Anwesenheit des Zalpha11-Liganden
Affen-Splenocyten wurden in vitro stimuliert, um ein konditioniertes Medium zum Testen des Vorliegens von Zalpha11-Ligand-Aktivität, wie im Folgenden beschrieben, herzustellen. Die Affenmilz wurde aus 8 Jahre alten weiblichen M.-nesestrian-Affen erhalten. Die Milz wurde zerkleinert, um eine einzige Zellsuspension herzustellen. Die mononuklearen Zellen wurden durch einen Ficoll-Paque^®-PLUS(Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)Dichtegradienten isoliert. Die mononuklearen Zellen wurden mit 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% FBS, ausgesät und mit 5 ng/ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) und 0,5 mg/ml Ionomycin^TM (Calbiochem) für 48 Stunden aktiviert. Der Überstand der stimulierten Affenmilz-Zellen wurde verwendet, um die Proliferation der BaF3/Zalpha11-Zellen, wie im Folgenden beschrieben, zu untersuchen.
B. Screening nach dem Zalpha11-Liganden unter Verwendung von BaF3/Zalpha11-Zellen unter Anwendung eines Alamar-Blue-Proliferations-Assays
Die BaF3/Zalpha11-Zellen wurden zentrifugiert und in mIL-3-freiem Medium gewaschen. Die Zellen wurden zentrifugiert und dreimal gewaschen, um die Entfernung des mIL-3 sicherzustellen. Die Zellen wurden dann in einem Hämacytometer gezählt. Die Zellen wurden in einem 96-Kammer-Format mit 5.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl pro Kammer unter Verwendung des mIL-3-freien Mediums ausplattiert.
Die Proliferation der BaF3/Zalpha11-Zellen wurde unter Verwendung von konditioniertem Medium aus aktivierter Affenmilz (siehe Beispiel 3A) untersucht. Das konditionierte Medium wurde mit mIL-3-freiem Medium auf Konzentrationen von 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% und 0,375% verdünnt. 100 μl des verdünnten konditionierten Mediums wurden zu den BaF3/Zalpha11-Zellen gegeben. Das Gesamt-Assay-Volumen betrug 200 μl. Die Assay-Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂ für 3 Tage inkubiert; zu diesem Zeitpunkt wurde Alamar-Blue (Accumed, Chicago, IL) mit 20 μl/Kammer zugegeben. Die Platten wurden wiederum bei 37°C, 5% CO₂ für 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden auf dem Fmax^TM-Platten-Leser (Molecular devices), wie oben beschrieben (Beispiel 2), gelesen.
Die Ergebnisse bestätigten die proliferative Antwort der BaF3/Zalpha11-Zellen auf einen Faktor, der in dem aktivierten konditionierten Affenmilz-Medium vorliegt. Die gemessene Antwort lag ungefähr 4-fach über dem Hintergrund bei der 50%igen Konzentration. Die nicht-transfizierten BaF3-Zellen proliferierten nicht als Antwort auf diesen Faktor, was zeigt, dass dieser Faktor spezifisch für den Zalpha11-Rezeptor ist.
C. Verwendete humane primäre Quelle zur Isolierung des Zalpha11-Liganden
Von sechs Spendern wurden jeweils 100 ml Blut entnommen. Das Blut wurde unter Verwendung von 10 × 10 ml Vacutainer-Röhrchen, enthaltend Heparin, abgenommen. Das Blut von sechs Spendern wurde vereinigt (600 ml), 1:1 in PBS verdünnt und unter Verwendung von Ficoll-PaqueO PLUS (Pharmacia Biotech) aufgetrennt. Die Ausbeute an isolierten primären humanen Zellen nach der Auftrennung auf dem Ficoll-Gradienten betrug 1,2 × 10⁹ Zellen.
Die Zellen wurden in 9,6 ml MACS-Puffer (PBS, 0,5% EDTA, 2 mM EDTA) suspendiert. 1,6 ml der Zellsuspension wurde entnommen und 0,4 ml CD3-Microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Diese mit CD3-Beads markierten Zellen wurden mit 30 ml MACS-Puffer gewaschen und dann in 2 ml MACS-Puffer resuspendiert.
Es wurde eine VS+-Säule (Miltenyi) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die VS+-Säule wurde dann in einem magnetischen VarioMACS^TM-Feld (Miltenyi) platziert. Die Säule wurde mit 5 ml MACS-Puffer äquilibriert. Die isolierten primären humanen Zellen wurden dann auf die Säule aufgetragen. Die CD3-negativen Zellen wurden durchgeleitet. Die Säule wurde mit 9 ml (3 × 3 ml) MACS-Puffer gespült. Die Säule wurde dann aus dem magnetischen Feld entfernt und über einem 15-ml-Falcon-Röhrchen platziert. Die CD3+-Zellen wurden durch Zugabe von 5 ml MACS-Puffer zu der Säule eluiert und die gebundenen Zellen unter Anwendung eines Plungers, der vom Hersteller mitgeliefert wurde, ausgespült. Die Inkubation der Zellen mit den magnetischen CD3-Beads, die Waschungen und die VS+-Säulen-Schritte (Inkubation bis Elution) wurden fünf weitere Male wiederholt. Die resultierenden CD3+-Fraktionen aus den sechs Säulentrennungen wurden vereinigt. Die Ausbeute an selektierten humanen CD3+-Zellen ergab insgesamt 3 × 10⁸ Zellen.
Eine Probe der vereinigten CD3+-selektierten humanen Zellen wurde zur Anfärbung und Sortierung auf einem Fluoreszenz-Antikörper-Zellsortierer (FACS) entnommen, um ihre Reinheit festzustellen. Die humanen CD3+-selektierten Zellen bestanden zu 91% aus CD3+-Zellen.
Die humanen selektierten CD3+-Zellen wurden durch Inkubation in RPMI + 5% FBS + 10 ng/ml PMA und 0,5 μg/ml Ionomycin (Calbiochem) für 13 Stunden bei 37°C aktiviert. Der Überstand von diesen aktivierten selektierten humanen CD3+-Zellen wurde auf Zalpha11-Ligand-Aktivität, wie im Folgenden beschrieben, getestet. Des Weiteren wurden die aktivierten selektierten humanen CD3+-Zellen verwendet, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, wie in der allgemein verfügbaren US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217 beschrieben.
D. Testen des Überstands aus aktivierten CD3+-selektierten humanen Zellen auf den Zalpha11-Liganden unter Verwendung von BaF3/Zalpha11-Zellen und eines Alamar-Blue-Proliferations-Assays
Die BaF3/Zalpha11-Zellen wurden herunterzentrifugiert und in mIL-3-freiem Medium gewaschen. Die Zellen wurden dreimal zentrifugiert und gewaschen, um die Entfernung des mIL-3 sicherzustellen. Die Zellen wurden dann in einem Hämacytometer gezählt. Die Zellen wurden in einem 96-Kammer-Format mit 5.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl pro Kammer unter Verwendung des mIL-3-freien Mediums ausplattiert.
Die Proliferation der BaF3/Zalpha11-Zellen wurde unter Verwendung von konditioniertem Medium von aktivierten selektierten humanen CD3+-Zellen (siehe Beispiel 5C), verdünnt mit mIL-3-freiem Medium auf Konzentrationen von 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% und 0,375%, untersucht. 100 μl des verdünnten konditionierten Mediums wurden zu den BaF3/Zalpha11-Zellen gegeben. Das Gesamtvolumen des Assays betrug 200 μl. Die Assay-Platten wurden inkubiert und wie in Beispiel 5B beschrieben getestet.
Die Ergebnisse bestätigten die proliferative Antwort der BaF3/Zalpha11-Zellen auf einen Faktor, der in dem konditionierten Medium der aktivierten selektierten humanen CD3+-Zellen vorliegt. Die gemessene Antwort lag ungefähr 10-fach über dem Hintergrund bei der 50%igen Konzentration. Die nicht-transfizierten BaF3-Zellen proliferierten nicht als Antwort auf diesen Faktor, was zeigt, dass dieser Faktor spezifisch für den Zalpha11-Rezeptor ist. Zudem blockierte der lösliche Zalpha11-Rezeptor diese proliferative Aktivität in den BaF3/Zalpha11-Zellen (siehe Beispiel 16).
Beispiel 4
Konstruktion von Säugetier-Expressions-Vektoren, welche lösliche Zalpha11-Rezeptoren exprimieren: Zalpha11 CEE, Zalpha11 CFLG Zalpha11 CHIS und Zalpha11-Fc4
A. Konstruktion eines Zalpha11-Säugetier-Expressions-Vektors enthaltend Zalpha11CEE Zalpha11 CFLG und Zalpha11 CHIS
Zur Expression der löslichen, extrazellulären Domäne des Zalpha11-Polypeptids, pC4Zalpha11 CEE, wurde ein Expressions-Vektor hergestellt, wobei das Konstrukt derart konstruiert ist, dass ein Zalpha11-Polypeptid exprimiert wird, welches das erwartete initiierende Methionin enthält und angrenzend an die erwartete Transmembran-Domäne trunkiert ist und einen C-terminalen Glu-Glu-Tag (SEQ ID NO: 14) aufweist.
Ein 700 bp großes, durch PCR erzeugtes Zalpha11-DNA-Fragment wurde unter Verwendung von ZC19,931 (SEQ ID NO: 21) und ZC19,932 (SEQ ID NO: 22) als PCR-Primer zur Anfügung von Asp718- und BamHI-Restriktionsstellen erzeugt. Ein Plasmid, welches die Zalpha11-Rezeptor-cDNA (SEQ ID NO: 1) enthielt, wurde als Template verwendet. Die PCR-Amplifikation des Zalpha11-Fragments wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 Zyklen bei 94°C für 0,5 Minuten; 5 Zyklen, bestehend aus 10 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C, 45 Sekunden bei 68°C, anschließendes Halten bei 4°C. Die Reaktion wurde durch Chloroform/Phenol-Extraktion und Isopropanol-Präzipitation gereinigt; dann wurde ein Verdau mit Asp718 und BamHI (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Eine Bande der erwarteten Größe von 700 bp wurde durch 1%ige Agarose-Gel-Elektrophorese sichtbar gemacht; diese wurde ausgeschnitten und die DNA unter Verwendung eines QiaexII^TM-Aufreinigungssystem (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Die ausgeschnittene DNA wurde in das Plasmid pC4EE, welches mit BamHI und Asp718 geschnitten worden war, subkloniert. Der pC4Zalpha11 CEE-Expressions-Vektor verwendet das native Zalpha11-Signalpeptid und hängt den Glu-Glu-Tag (SEQ ID NO: 14) an den C-Terminus der Zalpha11-Polypeptid-kodierenden Polynukleotid-Sequenz an. Das Plasmid pC4EE ist ein Säugetier-Expressions-Vektor, welcher eine Expressions-Kassette mit dem Maus-Metallothionin-1-Promotor, mehrfache Restriktionsstellen zur Insertion von kodierenden Sequenzen, ein Stopp-Codon und einen Terminator eines humanen Wachstumhormons enthält. Das Plasmid weist außerdem einen E.-coli-Replikations-Origin, eine Säugetier-Expressionseinheit eines selektierbaren Markers mit einem SV40-Promotor, Enhancer und Replikations-Origin, einem DHFR-Gen und dem SV40-Terminator auf.
Etwa 30 ng des Restriktions-verdauten Zalpha11-Inserts und ungefähr 12 ng des verdauten Vektors wurden über Nacht bei 16°C ligiert. Ein Mikroliter jeder Ligationsreaktion wurde unabhängig elektroporetisch in kompetente DH10B-Zellen (GIBCO BRL, Galthersburg, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers eingebracht und auf LB-Platten, enthaltend 50 mg/ml Ampicillin, ausplattiert und über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden durch Restriktions-Analyse von DNA, die aus 2 ml Flüssigkulturen einzelner Kolonien hergestellt wurden, gescreent. Die Insert-Sequenz der positiven Klone wurde durch Sequenzanalyse verifiziert. Eine Plasmid-Präparation im großen Maßstab wurde unter Verwendung eines QIAGEN^® Maxi-Prep-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um lösliche Zalpha11-Rezeptoren mit einem C-terminalen His-Tag, bestehend aus 6 His-Resten in einer Reihe, und einem C-terminalen Flag(SEQ ID NO: 23)-Tag, Zalpha11CFLAG, herzustellen. Um diese Konstrukte zu konstruieren, besaß der zuvor beschriebene Vektor entweder einen His-Tag oder den FLAG^®-Tag anstelle des Glu-Glu-Tags (SEQ ID NO: 14).
B. Säugetier-Expressions-Konstruktion des löslichen Zalpha11-Rezeptors Zalpha11-Fc4
Durch homologe Rekombination wurde ein Expressions-Plasmid, welches das gesamte Zalpha11-kodierende Polynukleotid oder einen Teil davon enthielt, konstruiert. Ein Fragment der Zalpha11-cDNA wurde unter Verwendung von PCR isoliert; dieses enthielt die Polynukleotid-Sequenz der extrazellulären Domäne des Zalpha11-Rezeptors. Die beiden Primer, die bei der Herstellung des Zalpha11-Fragments verwendet wurden, waren folgendermaßen aufgebaut: (1) Die Primer für die PCR enthielten jeweils vom 5'- bis zum 3'-Ende: 40 bp der Vektorflankierenden Sequenz (5' des Inserts) und 17 bp, entsprechend dem 5'-Ende der extrazellulären Domäne von Zalpha11 (SEQ ID NO: 24); und (2) 40 bp des 5'-Endes der Fc4-Polynukleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 25) und 17 bp, entsprechend dem 3'-Ende der extrazellulären Domäne von Zalpha11 (SEQ ID NO: 26). Das Fragment von Fc4 zur Fusion mit Zalpha11 wurde durch PCR auf ähnliche Weise erzeugt. Die beiden Primer, die bei der Herstellung des Fc4-Fragments verwendet wurden, waren: (1) ein 5'-Primer, bestehend aus 40 bp der Sequenz vom 3'-Ende der extrazellulären Domäne von Zalpha11 und 17 bp vom 5'-Ende von Fc4 (SEQ ID NO: 27); und (2) ein 3'-Primer, bestehend aus 40 bp der Vektorsequenz (3' des Inserts) und 17 bp des 3'-Endes von Fc4 (SEQ ID NO: 28).
Die PCR-Amplifikation jeder der oben beschriebenen Reaktionen wurde folgendermaßen durchgeführt: ein Zyklus bei 94°C für 2 Minuten; 25 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 1 Minute bei 72°C; ein Zyklus bei 72°C für 5 Minuten, anschließendes Halten bei 4°C. Zehn μl der 100-μl-PCR-Reaktion wurden auf einem 0,8%igen LMP-Agarosegel (Seaplaque GTG) mit 1 × TBE-Puffer zur Analyse aufgetrennt. Die verbleibenden 90 μl der PCR-Reaktion wurden durch Zugabe von 5 μl 1 M NaCl und 250 μl absolutem Ethanol ausgefällt. Der verwendete Expressions-Vektor wurde aus dem Plasmid pCZR199 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, Hinterlegungs-Nr. 98668) erhalten und mit SmaI (BRL) geschnitten. Der Expressions-Vektor, der von dem Plasmid pCZR199 abgeleitet wurde, ist ein Säugetier-Expressions-Vektor, enthaltend eine Expressions-Kassette mit dem unmittelbar frühen (immediate early) CMV-Promotor, einem Consensus-Intron aus der variablen Region der schweren Kette des Maus-Immunglobulins, mehrfachen Restriktionsstellen zur Insertion von kodierenden Sequenzen, einem Stopp-Codon und einem Terminator aus einem humanen Wachstumshormon. Der Expressions-Vektor besitzt ebenso ein E.-coli-Replikations-Origin, eine Säugetier-Expressionseinheit eines selektierbaren Markers mit einem SV40-Promotor, einem Enhancer und einem Replikations-Origin, einem DHFR-Gen und einem SV40-Terminator. Der verwende te Expressions-Vektor wurde aus pCZR199 durch Ersetzen des Metallothionin-Promotors durch den unmittelbar frühen CMV-Promotor konstruiert.
Einhundert Mikroliter kompetenter Hefezellen (S. cerevisiae) wurden mit 10 μl, enthaltend ungefähr jeweils 1 μg der Zalpha11- und Fc4-Inserts, und 100 ng SmaI(BRL)-verdauten Expressions-Vektor, vereinigt und in eine 0,2-cm-Elektroporations-Küvette überführt. Die Hefe/DNA-Mischungen wurden bei 0,75 kV (5 kV/cm), „unendlich" Ohm, 25 μF elektrogepulst. Zu jeder Küvette wurden 600 μl 1,2 M Sorbitol gegeben; die Hefe wurde in zwei 300-μl-Aliquots auf zwei URA-D-Platten ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
Nach etwa 48 Stunden wurden die Ura⁺-Hefe-Transformanten von einer einzigen Platte in 1 ml H₂O resuspendiert und kurz zentrifugiert, um die Hefezellen zu pelletieren. Das Zellpellet wurde in 1 ml Lyse-Puffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) respuspendiert. Fünfhundert Mikroliter der Lyse-Mischung wurden in ein Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 300 μl Säure-gewaschener Glasbeads und 200 μl Phenol-Chloroform, gegeben, zwei- oder dreimal in 1-Minuten-Intervallen „gevortext" und anschließend 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Dreihundert Mikroliter der wässrigen Phase wurden in ein frisches Röhrchen überführt; die DNA wurde mit 600 μl Ethanol (EtOH) ausgefällt; anschließend wurde 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde in 100 μl H₂O resuspendiert.
Die Tranformation der elektrokompetenten E.-coli-Zellen (DN10B, GibcoBRL) wurde mit 0,5 bis 2 ml Hefe-DNA-Präp und 40 μl DH10B-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden bei 2,0 kV, 25 mF und 400 Ohm elektrogepulst. Nach der Elektroporation wurden sie in 1 ml SOC (2 Bacto^® Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glucose) in 250-μl-Aliquots auf vier LB-AMP-Platten (LB Broth (Lennox), 1,8% Bacto-Agar (Difco), 100 mg/l Ampicillin) ausplattiert.
Individuelle Klone, welche das korrekte Expressions-Konstrukt für Zalpha11-Fc4 besitzen, wurden durch Restriktions-Verdau identifiziert, um die Anwesenheit des Zalpha11-Fc4-Inserts zu verifizieren und zu bestätigen, dass die verschiedenen DNA-Sequenzen korrekt aneinander gefügt wurden. Das Insert positiver Klone wurde einer Sequenzanalyse unterzogen. Plasmid-DNA wurde in größerem Maßstab unter Verwendung des Qiagen-Maxi-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert.
Beispiel 5
Transfektion und Expression von löslichen Zalpha11-Rezeptor-Polypeptiden
BKH-570-Zellen (ATCC Nr. CRL-10314), Passage 27, wurden mit 1,2 × 106 Zellen/Kammer (6-Kammer-Platte) in 800 μl serumfreiem (SF) DMEM-Medium (DMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Galthersburg, MD) ausplattiert. Die Zellen wurden mit Expressions-Plasmiden, enthaltend Zalpha11 CEE, Zalpha11 CFLG oder Zalpha11 CHIS, wie oben beschrieben (siehe Beispiel 4), unter Verwendung von Lipofectin^TM (Gibco BRL) in serumfreiem (SF) DMEM transfiziert. Drei Mikrogramm Zalpha11 CEE, Zalpha11 CFLG oder Zalpha11 CHIS wurden jeweils separat in 1,5-ml-Röhrchen zu einem Gesamt-Endvolumen von 100 μl SF DMEM verdünnt. In separaten Röhrchen wurden 15 μl Lipofectin^TM (Gibco BRL) mit 100 μl SF DMEM gemischt. Die Lipofectin^TM-Mischung wurde bei Raumtemperatur 30-45 Minuten inkubiert; dann wurde die DNA-Mischung dazugegeben und das Ganze ungefähr 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die gesamte DNA-Lipofectin^TM-Mischung wurde zu den ausplattierten Zellen gegeben und gleichmäßig über ihnen verteilt. Die Zellen wurden für ungefähr fünf Stunden bei 37°C inkubiert und dann in einem Endvolumen von 30 ml DMEM/5% fötales Kälerserum (FBS) (Hyclone, Logan, UT) auf separaten 150-mm-MAXI-Platten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂, über Nacht inkubiert; die DNA-Lipofectin^TM-Mischung wurde am nächsten Tag durch Selektionsmedium (5% FBS/DMEM mit 1 μM Methotrexat (MTX) ersetzt.
Ungefähr 10-12 Tage nach der Transfektion wurden die Platten mit 10 ml SF DMEM gewaschen. Das Waschmedium wurde abgezogen und durch 7,25 ml serumfreies DMEM ersetzt. Sterile Teflon-Gitter (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA), die zuvor in SF DMEM getränkt wurden, wurden dann über den klonalen Zellkolonien platziert. Ein steriler Nitrozellulose-Filter, der zuvor in SF DMEM eingeweicht wurde, wurde dann über dem Gitter platziert. Orientierungs-Markierungen auf der Nitrozellulose wurden auf die Kulturschale überführt. Die Platten wurden dann für 5-6 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ in einem Inkubator inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Filter/Gitter entfernt, das Medium abgesaugt und durch 5% FBS/DMEM mit 1 μM MTX ersetzt. Die Filter wurden dann in einem 10%igen fettfreinen Trockenmilch/Western-A-Puffer (Western A: 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl und 0,25% Gelatine) für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler blockiert. Die Filter wurden dann mit Anti-Glu-Glu-, Anti-FLAG^®- bzw. Anti-His-Antikörper-HRP-Konjugaten, 2,5% fettfreiem Trockenmilch/Western-A-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die Filter wurden anschließend dreimal bei Raumtemperatur mit Western A für jeweils 5 bis 10 Minuten pro Waschung gewaschen. Die Filter wurden mit Ultra-ECL-Reagenz (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers entwickelt und auf dem Lumi-Imager (Roche Corp.) sichtbar gemacht.
Positiv-exprimierende klonale Kolonien wurden mechanisch auf 12-Kammer-Platten in 1 ml 5% FCS/DMEM mit 5 μM MTX überführt und bis zur Konfluenz inkubiert. Proben des konditionierten Mediums wurden dann durch SDS-PAGE und Western-Analyse bezüglich ihrer Expressions-Niveaus getestet. Die drei höchsten Expressions-Klone für jedes Konstrukt wurden gepicked; zwei von den dreien wurden als Reserve eingefroren; einer wurde für einen Mycoplasmen-Test und zum Aussäen im großen Maßstab vermehrt.
B. Säugetier-Expression des löslichen Zalpha11-Rezeptors Zalpha11-Fc4
BHK-570-Zellen (ATCC Nr.: CRL-10314) wurden in 10-cm-Gewebekulturschalen ausplattiert und bis zu einem Wachstum von ungefähr 50 bis 70% Konfluenz über Nacht bei 37°C, 5% CO₂ in DMEM/FBS-Medium (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Galthersburg, MD), 5% fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-Glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM Natriumpyruvat (Gibco BRL)) inkubiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von Lipofectamine^TM (Gibco BRL) in einer serumfreien (SF) Medium-Formulierung (DMEM, 10 mg/ml Transferrin, 5 mg/ml Insulin, 2 mg/ml Fetuin, 1% L-Glutamin und 1 Natriumpyruvat) mit dem Zalpha11-Fc4-enthaltenden Plasmid transfiziert. Das Zalpha11-Fc4-enthaltende Plasmid wurde in 15-ml-Röhrchen bis zu einem Gesamt-Endvolumen von 640 ml mit SF-Medium verdünnt. 35 ml Lipofectamin^TM (Gibco BRL) wurden mit 605 ml SF-Medium gemischt. Die Lipofectamin^TM-Mischung wurde zu der DNA-Mischung gegeben und das ganze ungefähr 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Fünf Milliliter des SF-Mediums wurden zu der DNA-Lipofectamin^TM-Mischung gegeben. Die Zellen wurden einmal mit 5 ml SF-Medium gespült; dann wurde abgesaugt und die DNA-Lipofectamin^TM-Mischung zugegeben. Die Zellen wurden bei 37°C für fünf Stunden inkubiert; dann wurden zu jeder Platte 6,4 ml DMEM/10 FBS, 1% PSN-Medium gegeben. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert; am nächsten Tag wurde die DNA-Lipofectamin^TM-Mischung durch frisches 5%iges FBS/DMEM-Medium ersetzt. An Tag 2 nach der Transfektion wurden die Zellen in Selektions-Medium (DMEM/FBS-Medium, wie oben, mit Zugabe von 1 mM Methotrexat (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) in 150-mm-Platten mit 1:10, 1:20 und 1:50 aufgeteilt. Die Medien auf den Zellen wurden an Tag 5 nach der Transfektion durch frisches Selektionsmedium ersetzt. Ungefähr 10 Tage nach der Transfektion wurden zwei 150-mm-Kulturschalen der Methotrexat-resistenten Kolonien von jeder Transfektion trypsiniert, die Zellen gesammelt, in einer T-162-Flasche ausplattiert und in eine Großkultur überführt.
Beispiel 6
Aufreinigung löslicher Zalpha11-Rezeptoren aus BHK-570-Zellen
A. Aufreinigung des Zalpha11CEE-Polypeptids aus BHK 570
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde angewendet, um Zalpha11-Polypeptide aufzureinigen, welche C-terminale Glu-Glu(EE)-Tags enthalten. Dreißig Liter des konditionierten Mediums der Zellfabrik wurden mit einer Amicon-S10Y3-Spiralkartusche auf einem ProFlux-A30 auf 1,6 Liter konzentriert. Zu den konzentrierten 1,6 Litern des konditionierten Mediums der Zellfabrik aus transfizierten BHK-570-Zellen (Beispiel 5) wurde eine Protease-Inhibitor-Lösung gegeben, so dass die Endkonzentrationen 2,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0,003 mM Leupeptin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM Pepstatin (Boehringer-Mannheim) und 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim) betrugen. Zur Analyse wurden Proben entnommen; der Großteil des Volumens wurde bei –80°C bis zum Beginn der Aufreinigung eingefroren. Die Gesamt-Konzentration des Zielproteins in dem konzentrierten, konditionierten Medium der Zellfabrik wurde über SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse mit dem konjugierten Anti-EE-HRP-Antikörper bestimmt.
Eine 100-ml-Säule aus Anti-EE-G-Sepharose (die wie im Folgenden beschrieben vorbereitet wurde) wurde in eine Waters-AP-S-Glassäule von 5 cm × 10 cm gegossen. Die Säule wurde im Durchfluss gepackt und auf einem BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4, äquilibriert. Das konzentrierte, konditionierte Medium der Zellfabrik wurde aufgetaut, auf 0,2 Mikron sterilfiltriert, auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und dann über Nacht auf die Säule geladen, wobei die Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute betrug. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumen (CVs) Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, dann mit 200 ml PBS (pH 6,0), enthaltend 0,5 mg/ml EE-Peptid (Anaspec, San Jose, CA), mit 5 ml/Minute im Pfropfenstrom eluiert. Das verwendete EE-Peptid weist die Sequenz EYMPME (SEQ ID NO: 14) auf. Die Säule wurde mit 10 CVs PBS gewaschen, dann mit 5 CVs 0,2 M Glycin, pH 3,0, eluiert. Der pH-Wert der Glycin-eluierten Säule wurde mit 2 CVs 5 × PBS auf 7,0 eingestellt, dann in PBS (pH 7,4) äquilibriert. Während der gesamten Elutions-Chromatographie wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt und die Absorbanz bei 280 und 215 nm verfolgt; die Durchgangs- und Waschlösungen wurden ebenso gesammelt und analysiert. Die Peak-Fraktionen aus der EE-Polypeptid-Eluierung wurden mittels SDS-PAGE-Silberfärbung und Western-Blotting mit dem konjugierten Anti-EE-HRP-Antikörper hinsichtlich des Zielproteins analysiert. Die Polypeptid-Elutions-Fraktionen von Interesse wurden gesammelt und mit einem Rotationskonzentrator (Millipore, Bedford, MA) unter Verwendung einer 10.000-Dalton-Molekulargewicht-Ausschluss-Membran gemäß den Anweisungen des Herstellers von 60 ml auf 5,0 ml konzentriert.
Um Zalpha11CEE von anderen co-gereinigten Proteinen zu trennen, wurden die konzentrierten, vereinigten Fraktionen aus der Polypeptid-Elution mit POROS HQ-50 (starkes Anionen- Austauscher-Harz von PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) bei einem pH-Wert von 8,0 behandelt. Eine Säule von 1,0 × 6,0 cm wurde umgegossen und auf einem BioCad-Sprint im Fluss gepackt. Die Säule wurde Gegenion-geladen, dann in 20 mM TRIS pH 8,0 (Tris (Hydroxymethyl-Aminomethan)) äquilibriert. Die Probe wurde 1:13 verdünnt (um die Ionenstärke des PBS zu reduzieren) und dann mit 5 ml/Minute auf die Poros-HQ-Säule geladen. Die Säule wurde mit 10 CVs 20 mM Tris, pH 8,0, gewaschen und dann mit einem Gradienten von 40 CVs 20 mM Tris/1 M Natriumchlorid (NaCl) mit 10 ml/Minute eluiert. Es wurden 1,5-ml-Fraktionen über die gesamte Chromatographie gesammelt und die Absorbanz bei 280 und 215 nm verfolgt. Die Peak-Fraktionen der Elution wurden mittels SDS-PAGE-Silber-Anfärbung analysiert. Die interessierenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung eines Rotationskonzentrators (Millipore, Bedford, MA) unter Verwendung einer 10.000-Dalton-Molekulargewicht-Ausschluss-Membran gemäß den Anweisungen des Herstellers auf 1,5-2 ml konzentriert.
Um das Zalpha11 CEE-Polypeptid von dem freien EE-Peptid und jeglichen konterminierenden co-gereinigten Proteinen abzutrennen, wurden die vereinigten konzentrierten Fraktionen einer Chromatographie auf einer 1,5 × 90 cm Sephadex-S200-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) unterzogen, wobei die Äquilibrierung und das Beladen in PBS mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Minute unter Verwendung eines BioCad-Sprints durchgeführt wurde. Während der gesamten Chromatographie wurden 1,5-ml-Fraktionen gesammelt; die Absorbanz wurde bei 280 und 215 nm verfolgt. Die Peak-Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE-Silberfärbung charakterisiert und nur die reinsten Fraktionen gesammelt. Dieses Material stellte das gereinigte Zalpha11 CEE-Polypeptid dar.
Dieses gereinigte Material wurde schließlich einer 4-ml-ActiClean-Etox-Säule (Sterogene) zugeführt, um jegliche verbleibenden Endotoxine zu entfernen. Die Probe wurde viermal über die mit PBS äquilibrierte Schwerkraftsäule geschickt; dann wurde die Säule mit einem einzigen 3-ml-Volumen PBS gewaschen; dieses wurde mit der "gereinigten" Probe vereinigt. Das Material wurde dann auf 0,2 Mikron sterilfiltriert und bis zur Aliquotierung bei –80°C gelagert.
Auf Western-geblottetem, Coomassie-Blau- und Silber-gefärbten SDS-PAGE-Gelen stellte sich das Zalpha11CEE-Polypeptid als eine Hauptbande mit einem augenscheinlichen Molekulargewicht von 50.000 Dalton dar. Die Mobilität dieser Bande war die gleiche auf reduzierenden und nicht-reduzierenden Gelen.
Die Protein-Konzentration des gereinigten Materials wurde durch BCA-Analyse (Pierce, Rockford, IL) bewirkt; dann wurde das Protein aliquotiert und gemäß den Standardverfahren bei –80°C gelagert. Auf IEF (isoelektrisch fokussierenden) Gelen lief das Protein mit einer PI von weniger als 4,5. Die Konzentration des Zalpha11 CEE-Polypeptids betrug 1,0 mg/ml.
Das gereinigte Zalpha11CEE-Polypeptid wurde zur Injektion in Kaninchen vorbereitet und an R & R Research and Development (Standwood, WA) zur Antikörper-Herstellung geschickt. Das Polypeptid wurde in Kaninchen injiziert, um Anti-huzalpha11-CEE-BHK-Serum herzustellen (Beispiel 10, unten).
Zur Herstellung von Anti-EE-Sepharose wurde ein 100-ml-Bett-Volumen Protein-G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) dreimal mit 100 ml PBS, enthaltend 0,02% Natriumazid, unter Verwendung einer 500-ml-Nalgen-Filtereinheit von 0,45-Mikron gewaschen. Das Gel wurde mit 6,0 Volumen 200 mM Triethanolamin, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO) gewaschen; dann wurde ein gleiches Volumen an EE-Antikörper-Lösung, enthaltend 900 mg des Antikörpers, zugegeben. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 4°C wurden nicht-gebundene Antikörper durch Waschen des Harzes mit 5 Volumen 200 mM TEA, wie oben beschrieben, entfernt. Das Harz wurde in 2 Volumen TEA resuspendiert und in ein geeignetes Behältnis überführt; dann wurde Dimethylpimilimidat-2HCl (Pierce, Rockford, IL), gelöst in TEA, zu einer Endkonzentration von 36 mg/ml des Protein-G-Sepharose-Gels zugegeben. Das Gel wurde bei Raumtemperatur 45 Minuten geschwenkt und die Flüssigkeit unter Verwendung der Filtereinheit, wie oben beschrieben, entfernt. Nicht spezifische Stellen auf dem Gel wurden dann durch 10-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur mit 5 Volumen 20 mM Ethanolamin in 200 mM TEA blockiert. Das Gel wurde dann mit 5 Volumen PBS, enthaltend 0,02% Natriumazid, gewaschen und in dieser Lösung bei 4°C gelagert.
B. Aufreinigung des Zalpha11 CFLAG-Polypeptids aus BHK 570
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde angewendet, um das Zalpha11-Polypeptid, enthaltend C-terminale FLAG^® (FLG)(Sigma-Aldrich Co.)-Tags, aufzureinigen. Dreißig Liter des konditionierten Mediums der Zellfabrik wurden mit einer Amicon-S10Y3-Spiralkartusche auf einem ProFlux A30 auf 1,7 Liter konzentriert. Zu den 1,7 Litern des konzentrierten, konditionierten Mediums der Zellfabrik von tranfizierten BHK-570-Zellen (siehe Beispiel 5) wurde eine Protease-Inhibitor-Lösung gegeben, so dass die Endkonzentrationen 2,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Luois, MO), 0,003 mM Leupeptin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM Pepstatin (Boehringer-Mannheim) und 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim) betrugen. Es wurden Proben zur Analyse entnommen; der Großteil des Volumens wurde bis zum Beginn der Aufreinigung bei –80°C eingefroren. Die Gesamtkonzentrationen des Zielproteins in dem konzentrierten Medium der Zellbabrik wurden mittels SDS-PAGE und Western-Blott-Analyse mit dem konjugierten Anti-FLAG^®(Kodak)-HRP-Antikörper bestimmt. Eine 125-ml-Säule aus Anti-FLAG^®-M2-Agarose-Affinitäts-Gel (Sigma-Aldrich Co.) wurde in eine Waters-AP-5-Glassäule von 5 cm × 10 cm umgegossen. Die Säule wurde im Fluss gepackt und auf einem BioCad-Sprint (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 7,4 äquilibriert. Das konzentrierte, konditionierte Medium der Zellfabrik wurde abgezogen, auf 0,2 Mikron sterilfiltriert, auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt und dann über Nacht mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumen (CVs) Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7,4) gewaschen, dann mit 250 ml PBS (pH 6,0), enthaltend 0,5 mg/ml FLAG^®(Sigma-Aldrich Co.)-Peptid, mit 5 ml/Minute im Pfropfenstrom eluiert. Das verwendete FLAG^®-Peptid wies die Sequenz DYKDDDDK (SEQ ID NO: 23) auf. Die Säule wurde mit 10 CVs PBS gewaschen, dann mit 5 CVs 0,2 M Glycin, pH 3,0, eluiert. Der pH-Wert der Glycin-eluierten Säule wurde mit 2 CVs 5 × PBS auf 7,0 eingestellt; dann wurde in PBS äquilibriert (pH 7,4). Während der gesamten Elutions-Chromatographie wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt und die Absorbanz bei 280 und 215 nm verfolgt; die Durchfluss- und Wasch-Lösungen wurden ebenso gesammelt und analysiert. Die Peak-Fraktionen der FLAG^®-Polypeptid-Elution wurden mittels SDS-PAGE-Silberfärbung und Western-Blotting mit dem konjugierten Anti-FLAG-HRP-Antikörper in Bezug auf das Target-Protein analysiert. Die Polypeptid-Elutions-Fraktionen von Interesse wurden vereinigt und unter Verwendung eines Rotationskonzentrators (Millipore, Bedford, MA) mit einer 10.000-Dalton-Molekulargewicht-Ausschluss-Membran gemäß den Anweisungen des Herstellers von 80 ml auf 12 ml konzentriert.
Um Zalpha11CFLG von den anderen co-gereinigten Proteinen zu trennen, wurden die vereinigten Polypeptid-Elutions-Fraktionen bei einem pH-Wert von 8,0 einem POROS-HQ-50 (starkes Anionen-Austauscher-Harz von PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) unterworfen. Eine 1,0 × 6,0 cm Säule wurde auf einen BioCad Sprint umgegossen und unter Fluss gepackt. Die Säule wurde Gegenion-geladen und dann in 20 mM TRIS pH 8,0 (Tris (Hydroxymethyl-Aminomethan)) äquilibriert. Die Probe wurde 1:13 verdünnt (um die Ionenstärke des PBS zu reduzieren) und dann mit 5 ml/Minute auf die Poros-HQ-50-Säule geladen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumen (CVs) 20 mM Tris pH 8,0 gewaschen und dann mit einem 40-CV-Gradienten von 20 mM Tris/1 M Natriumchlorid (NaCl) mit 10 ml/Minute eluiert. Während der gesamten Chromatographie wurden 1,5-ml-Fraktionen gesammelt und die Absorbanz bei 280 und 215 nm verfolgt. Die Peak-Fraktionen der Elution wurden mittels SDS-PAGE-Silberfärbung analysiert. Die interessierenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung eines Rotationskonzentrators mit einer 10.000-Dalton-Molekulargewicht-Ausschluss-Membran (Millipore, Bedford, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf 1,5-2 ml konzentriert.
Um das Zalpha11 CFLG-Polypeptid von freiem FLAG^®-Peptid und jeglichen kontaminierenden co-gereinigten Proteinen zu trennen, wurden die vereinigten konzentrierten Fraktionen unter Verwendung eines BioCad-Sprints auf einer 1,5 × 90 cm Sephacryl-S200-Säule (Pharma cia, Piscataway, NJ), äquilibriert und geladen in PBS, einer Chromatographie mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min unterzogen. Während der gesamten Chromatographie wurden 1,5-ml-Fraktionen gesammelt und die Absorbanz bei 280 und 215 nm verfolgt. Die Peak-Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE-Silberfärbung charakterisiert und nur die reinsten Fraktionen gesammelt. Dieses Material stellte das gereinigte Zalpha11CFLG-Polypeptid dar.
Dieses gereinigte Material wurde schließlich auf eine 4-ml-ActiClean-Etox-Säule (Sterogene) gegeben, um jegliche verbleibenden Endotoxine zu entfernen. Die Probe wurde viermal über die mit PBS äquilibrierte Schwerkraftsäule geschickt; dann wurde die Säule mit einem einzigen 3-ml-Volumen PBS gewaschen, welches mit der "gereinigten" Probe vereinigt wurde. Das Material wurde dann auf 0,2 Mikron sterilfiltriert und bis zur Aliquotierung bei –80°C gelagert.
Auf Western-geblotteten, Coomassie-Blau- und Silber-gefärbten SDS-PAGE-Gelen stellte das Zalpha11CFLG-Polypeptid eine Hauptbande mit einem augenscheinlichen Molekulargewicht von 50.000 Dalton dar. Die Mobilität dieser Bande war die gleiche auf reduzierenden und nicht-reduzierenden Gelen.
Die Protein-Konzentration des gereinigten Materials wurde durch BCA-Analyse (Pierce, Rockford, IL) bewirkt; das Protein wurde aliquotiert und gemäß den Standardverfahren bei –80°C gelagert. Auf IEF (isoelektrisch-fokussierenden) Gelen lief das Protein mit einer PI von weniger als 4,5. Die Konzentration des Zalpha11 CFLG-Polypeptids betrug 1,2 mg/ml.
C. Aufreinigung des Zalpha11-Fc4-Polypeptids aus tranfizierten BHK-570-Zellen
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde angewendet, um das Zalpha11-Polypeptid, enthaltend eine C-terminale Fusion an das humane IgG/Fc (Zalpha11-Fc4; Beispiele 4 und 5) aufzureinigen. 12.000 ml konditioniertes Medium von BHK-570-Zellen, die mit Zalpha11-Fc4 transfiziert waren (Beispiel 5), wurden durch einen 0,2-mm-Sterilfilter filtriert; dann wurde eine Lösung aus Protease-Inhibitoren zugegeben, so dass die Endkonzentrationen 0,001 mM Leupeptin (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0,001 mM Pepstatin (Boehringer-Mannheim) und 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim) betrugen. Eine Protein-G-Sepharose (6 ml Bettvolumen, Pharmacia Biotech) wurde gepackt und mit 500 ml PBS (Gibco/BRL) gewaschen. Das supplementierte, konditionierte Medium wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Minute über die Säule geleitet; anschließend wurde mit 1.000 ml PBS (BRL/Gibco) gewaschen. Zalpha11-Fc4 wurde mit 0,1 M Glycin, pH 3,5, aus der Säule eluiert; 2-ml-Fraktionen wurden direkt in 0,2 ml 2 M Tris pH 8,0 gesammelt, um den End-pH-Wert in den Fraktionen auf 7,0 einzustellen.
Die eluierten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE und Western-Blotting mit anti-humanen Fc-Antikörpern (Amersham) charakterisiert. Die Western-Blot-Analyse der reduzierenden SDS-PAGE-Gele zeigte ein immunreaktives Protein von 80.000 KDa in den Fraktionen 2 bis 10. Silber-gefärbte SDS-PAGE-Gele zeigten ebenso ein 80.000 KDa großes Zalpha11:Fc-Polypeptid in den Fraktionen 2 bis 10. Die Fraktionen 2 bis 10 wurden vereinigt.
Die Protein-Konzentration der vereinigten Fraktionen wurde durch BCA-Analyse (Pierce, Rockford, IL) bewirkt; das Material wurde aliquotiert und gemäß den Standardverfahren bei –80°C gelagert. Die Konzentration der vereinigten Fraktionen betrug 0,26 mg/ml.
Beispiel 7
Verwendung der löslichen Zalpha11-Rezeptoren Zalpha11CEE, Zalpha11CFLG und Zalpha11-Fc4 in kompetitiven Inhibitions-Assays
BaF3/Zalpha11-Zellen wurden zentrifugiert und in mIL-3-freiem Medium gewaschen. Die Zellen wurden zentrifugiert und dreimal gewaschen, um das Entfernen von mIL-3 sicherzustellen. Die Zellen wurden dann in einem Hämacytometer gezählt. Die Zellen wurden in einem 96-Kammer-Format mit 5.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl pro Kammer unter Verwendung des mIL-3-freien Mediums ausplattiert.
Beide Medien aus der Affenmilz-Zellaktivierung und den CD3+-selektierten Zellen, beschrieben in Beispiel 3, wurden in getrennten Experimenten mit Konzentrationen von 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% und 0,375%, mit oder ohne lösliche Zalpha11-Rezeptoren (CEE-, C-Flag- und Fc4-Konstrukte; siehe Beispiel 6) in Konzentration von 10 μg/ml zugegeben. Das Gesamt-Assay-Volumen betrug 200 μl.
Die Assay-Platten wurden bei 37°C, 5% CO₂, für 3 Tage inkubiert; zu diesem Zeitpunkt wurde Alamar-Blue (Accumed) mit 20 μl/Kammer zugegeben. Die Platten wurden wieder bei 37°C, 5% CO₂, für 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden auf einem Fmax^TM-Plattenleser (Molecular Devices), wie oben beschrieben (Beispiel 2), gelesen. Die Ergebnisse zeigten eine vollständige Inhibierung des Zellwachstums bei jedem der verschiedenen löslichen Zalpha11-Rezeptor-Konstrukte bei einer Konzentration von 10 μg/ml, was bestätigte, dass der Faktor in jeder Probe spezifisch für den Zalpha11-Rezeptor ist.
Ebenso wurden Titrationskurven, in denen die löslichen Rezeptoren verdünnt wurden, unter Anwendung der obigen Assays durchgeführt. Sowohl der lösliche Zalpha11CEE- als auch der lösliche Zalpha11CFLG-Rezeptor konnte bei geringen Konzentrationen von 20 ng/ml das Wachstum vollständig inhibieren. Der lösliche Zalpha11-Rezeptor Zalpha11-Fc4 war erst bei einer Konzentration von 1,5 μg/ml wirksam.
Beispiel 8
Expression des löslichen humanen Zalpha11-Rezeptors in E. coli
A. Konstruktion des Expressions-Vektors pCZR225, welcher das huzalpha11/MBP-6H-Fusions-Polypeptid exprimiert
Ein Expressions-Plasmid, enthaltend ein Polynukleotid, welches einen humanen löslichen Zalpha11-Rezeptor kodiert, der C-terminal an das Maltose-Bindungs-Protein (MBP) fusioniert ist, wurde über homologe Rekombination konstruiert. Die Polynukleotid-Sequenz für das lösliche MBP-Zalpha11-Rezeptor-Fusions-Polypeptid ist in SEQ ID NO: 29 wiedergegeben; die entsprechende Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 30 gezeigt. Das Fusions-Polypeptid, welches in Beispiel 9 als huzalpha11/MBP-6H bezeichnet wird, enthält einen MBP-Anteil (Aminosäure 1 (Met) bis Aminosäure 388 (Ser) der SEQ ID NO: 30) fusioniert an den humanen löslichen Zalpha11-Rezeptor (Aminosäure 389 (Cys) bis Aminosäure 606 (His) der SEQ ID NO: 30). Ein Fragment der humanen Zalpha11-cDNA (SEQ ID NO: 31) wurde unter Anwendung von PCR isoliert. Zwei Primer wurden bei der Herstellung des humanen Zalpha11-Fragments in einer PCR-Reaktion verwendet: (1) Primer ZC20,187 (SEQ ID NO: 32), enthaltend 40 bp der flankierenden Vektor-Sequenz und 25 bp, die dem Amino-Terminus des humanen Zalpha11 entsprechen, und (2) Primer ZC20,185 (SEQ ID NO: 33), enthaltend 40 bp des 3'-Endes, die der flankierenden Vektor-Sequenz entsprechen, und 25 bp, die dem Carboxyl-Terminus des humanen Zalpha11 entsprechen. Die PCR-Reaktions-Bedingungen waren folgendermaßen: 25 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und 1 Minute bei 72°C; anschließendes Halten bei 4°C; doppelte Läufe. Zwei μl der 100-μl-PCR-Reaktion wurden zur Analyse auf einem 1,0%igen Agarosegel mit 1 × TBE-Puffer aufgetrennt; das erwartete Fragment mit einer Länge von ungefähr 660 bp wurde sichtbar. Die verbleibenden 90 μl der PCR-Reaktion wurden mit dem zweiten PCR-Röhrchen vereinigt und mit 400 μl absolutem Ethanol präzipitiert. Die ausgefällte DNA wurde zur Rekombination in den mit SmaI geschnittenen Empfänger-Vektor pTAP98 verwendet, um das Konstrukt herzustellen, welches die MBP-Zalpha11-Fusion kodiert, wie im Folgenden beschrieben ist.
Das Plasmid pTAP98 wurde von den Plasmiden pRS316 und pMAL-c2 abgeleitet. Das Plasmid pRS316 ist ein Saccharomyces-cerevisiae-Shuttle-Vektor (Hieter P. and Sikorski, R., Genetics 122: 19-27, 1989); pMAL-C2 (NEB) ist ein E.-coli-Expressions-Plasmid. Es trägt den Tac-Promotor, welches das MalE (MBP-kodierendes Gen) anschaltet, gefolgt von einem His-Tag, einer Thrombin-Spaltungsstelle, einer Klonierungsstelle und dem rrnB-Terminator. Der Vektor pTAP98 wurde unter Verwendung homologer Rekombination in Hefe konstruiert. 100 ng EcoRI-geschnittenes pMAL-c2 wurden mit 1 μg PvuI-geschnittenem pRS316, 1 μg Linker und 1 μg ScaI/EcoRI-geschnittenem pRS316 vereinigt. Der Linker bestand aus den in einer PCR- Reaktion vereinigten Oligos ZC19,372 (SEQ ID NO: 34) (100 pmol), ZC19,351 (SEQ ID NO: 35) (1 pmol), ZC19,352 (SEQ ID NO: 36) (1 pmol) und ZC19,371 (SEQ ID NO: 37) (100 pmol). Die PCR-Reaktions-Bedingungen waren folgendermaßen: 10 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und 30 Sekunden bei 72°C; anschließendes Halten bei 4°C. Die PCR-Produkte wurden mittels Präzipitation mit 100%igem Ethanol konzentriert.
Einhundert Mikroliter der kompetenten Hefezellen (S. cerevisiae) wurden mit 10 μl einer Mischung, enthaltend ungefähr 1 μg des obigen PCR-Produkts des humanen Zalpha11-Rezeptors und 100 ng des SmaI-verdauten pTAP98-Vektors, vereinigt und in eine 0,2-cm-Elektroporations-Küvette überführt. Die Hefe/DNA-Mischung wurde bei 0,75 kV (5 kV/cm), „unendlich" Ohm, 25 μF elektrogepulst. Zu jeder Küvette wurden 600 μl 1,2 M Sorbitol gegeben; die Hefe wurde dann in zwei 300-μl-Aliquots auf zwei URA-D-Platten ausplattiert und bei 30°C inkubiert.
Nach etwa 48 Stunden wurden die Ura+-Hefe-Transformanten von einer einzigen Platte in 1 ml H₂O resuspendiert und kurz zentrifugiert, um die Hefezellen zu pelletieren. Das Zellpellet wurde in 1 ml Lyse-Puffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert. Fünfhundert Mikroliter der Lyse-Mischung wurden in ein Eppendorf-Gefäß, welches 300 μl Säure-gewaschene Glasbeads und 200 μl Phenol-Chloroform enthielt, gegeben, zwei- oder dreimal in 1-Minuten-Intervallen „gevortext" und anschließend 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. 300 μl der wässrigen Phase wurden in ein frisches Gefäß überführt; die DNA wurde mit 600 μl Ethanol (EtOH) ausgefällt; anschließend wurde 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde in 100 μl H₂O resuspendiert.
Die Transformation der elektrokompetenten E.-coli-Zellen (MC1061, Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138: 179-207) wurde mit 1 μl Hefe-DNA-Präp und 40 μl der MC1061-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden bei 2,0 kV, 25 μF und 400 Ohm elektrogepulst. Nach der Elektroporation wurden 0,6 ml SOC (2% Bacto^TM-Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glucose) in einem Aliquot auf MM/CA + 100 mg/l AMP-Platten (Pryor and Leiting, Protein Expression and Pruification 10: 309-319, 1997) ausplattiert.
Zellen, die das korrekte Expressions-Konstrukt für den humanen Zalpha11-Rezeptor besaßen, wurden durch Expression identifiziert. Die Zellen wurden in MM/CA mit 100 μg/ml Ampicillin für zwei Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubiert. 1 ml der Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert. 2-4 Stunden später wurden 250 μl aus jeder Kultur mit 250 μl Säuregewaschenen Glas-Beads und 250 μl Thorner-Puffer mit 5% βME und Farbstoff (8 M Harnstoff, 100 mM Tris pH 7,0, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, 5% SDS) gemischt. Die Proben wurden eine Minute gevortext und für 10 Minuten auf 65°C erhitzt. 20 μl wurden pro Spur auf ein 4%iges bis 12%iges PAGE-Gel (NOVEX) geladen. Die Gele wurden in 1 × MES-Puffer laufen gelassen. Die positiven Klone wurden als pCZR225 bezeichnet und einer Sequenzanalyse unterzogen. Die Polynukleotid-Sequenz der MBP-Zalpha11-Fusion ist in SEQ ID NO: 50 dargestellt.
B. Bakterielle Expression des humanen huzalpha11/MBP-6H-Fusionspolypeptids
Ein Mikroliter der Sequenzierungs-DNA wurde zur Transformierung des Stammes BL21 verwendet. Die Zellen wurden bei 2,0 kV, 25 μF und 400 Ohm elektrogepulst. Nach der Elektroporation wurden 0,6 ml MM/CA mit 100 mg/l Ampicillin zugegeben.
Die Zellen wurden in MM/CA mit 100 μg/ml Ampicillin für zwei Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubiert. 1 ml der Kultur wurde mit 1 mM IPTG induziert. 2-4 Stunden später wurden 250 μl jeder Kultur mit 250 μl Säure-gewaschenen Glas-Beads und 250 μl Thorner-Puffer mit 5% βME und Farbstoff (8 M Harnstoff, 100 mM Tris pH 7,0, 10% Glycerol, 2 mM EDTA, 5 SDS) gemischt. Die Proben wurden eine Minute gevortext und für 10 Minuten auf 65°C erhitzt. 20 μl wurden pro Spur auf ein 4- bis 12%iges PAGE-Gel (NOVEX) geladen. Die Gele liefen in 1 × MES-Puffer. Die positiven Klone wurden zum Wachstum zum Zweck der Protein-Aufreinigung des huzalpha11/MBP-6H-Fusions-Proteins verwendet (folgendes Beispiel 9).
Beispiel 9
Aufreinigung des löslichen huzalpha11/MBP-6H-Rezeptors aus einer E.-coli-Fermentation
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde angewendet, um das lösliche huzalpha11-MBP-6H-Rezeptor-Polypeptid aufzureinigen. E.-coli-Zellen, welche das pCZR225-Konstrukt enthielten und den löslichen huzalpha11/MBP-6H-Rezeptor exprimierten (Beispiel 8) wurden in SuperBroth II (12 g/l Casein, 24 g/l Hefeextrakt, 11,4 g/l Dikaliumphosphat, 1,7 g/l Monokaliumphosphat; Becton Dickenson, Cockeysville, MD) kultiviert und in 0,5%igem Glycerol eingefroren. Zwanzig Gramm der gefrorenen Zellen in SuperBroth II + Glycerol wurden zur Aufreinigung des Proteins verwendet. Die gefrorenen Zellen wurden aufgetaut und 1:10 in einer Protease-Inhibitor-Lösung (Extraktions-Puffer) verdünnt, um die Zellen zu lysieren und das lösliche huzalpha11/MBP-6H-Rezeptor-Protein freizusetzen. Die verdünnten Zellen enthielten Endkonzentrationen von 20 mM Tris (JT Baker, Philipsburg, NJ), 100 mM Natriumchlorid (NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY), 0,5 mM Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 2 μg/ml Leupeptin (Fluka, Switzerland) und 2 μg/ml Aprotinin (Sigma). Ein French-Press-Zellaufbruchsystem (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) mit einer Temperatur von –7 bis –10°C und 30 K PSI wurde verwendet, um die Zellen zu lysieren. Die verdünnten Zellen wurden vor und nach Anwendung der French-Press bezüglich des Aufbruchs durch A₆₀₀-Ablesung überprüft. Die lysierten Zellen wurden bei 18.000 G für 45 Minuten zentrifugiert, um die gebrochenen Zelltrümmer zu entfernen; der Überstand wurde verwendet, um das Protein aufzureinigen. Die Gesamtkonzentrationen des Zielproteins im Überstand wurde mittels BCA-Protein-Assay (Pierce, Rockford, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Eine 25-ml-Säule aus Talon-Metall-Affinitäts-Harz (Clontech, Palo Alto, CA) (die wie im Folgenden beschrieben vorbereitet wurde) wurde in eine Bio-Rad-Glassäule von 2,5 cm D × 10 cm H geschüttet. Die Säule wurde unter Schwerkraft gepackt und mit 10 Säulenvolumen (CVs) Talon-Äquilibrierungs-Puffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0) äquilibriert. Der Überstand wurde schubweise auf das Talon-Metall-Affinitäts-Harz geladen und über Nacht geschwenkt. Das Harz wurde zurück in die Säule geschüttet und mit 10 Säulenvolumen Talon-Äquilibrierungs-Puffer unter Schwerkraft gewaschen; dann wurde mit 140 ml Elutions-Puffer (Talon-Äquilibrierungs-Puffer + 200 mM Imidazol-Fluka Chemical) unter Schwerkraft eluiert. Die Talon-Säule wurde mit 5 CVs 20 mM 2-(N-Morpholino)-Ethansulfonsäure pH 5,0 (MES, Sigma) und 5 CVs destilliertem H₂O gereinigt und dann in 20% Ethanol/0,1% Natriumazid gelagert. Während der gesamten Elutions-Chromatographie wurden 14-ml-Fraktionen gesammelt und die Fraktionen bezüglich einer Absorbanz bei 280 und 320 nm und in einem BCA-Protein-Assay analysiert; die Durchfluss- und Wasch-Lösungen wurden ebenso gesammelt und analysiert. Die Protein-Elutions-Fraktionen von Interesse wurden vereinigt und auf Amylose-Harz (New England Biolabs, Beverly, MA) geladen.
Um ein reineres huzalpha11/MBP-6H-Polypeptid zu erhalten, wurden die vereinigten Fraktionen aus der Talon-Affinitäts-Elution einem Amylose-Harz (22 mls) bei pH 7,4 ausgesetzt. Eine Bio-Rad-Säule von 2,5 cm D × 10 cm H wurde gegossen, gepackt und in 10 CVs Amylose-Äquilibrierungs-Puffer – 20 mM Tris (JT Baker), 100 mM NaCl (Mallinkrodt), 1 mM PMSF (Sigma), 10 mM Beta-Mercaptoethanol (BME, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) pH 7,4 – äquilibriert. Die Probe wurde unter Schwerkraft mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 10 CVs Amylose-Äquilibrierungs-Puffer gewaschen und dann mit ca. 2 CVs Amylose-Äquilibrierungs-Puffer + 10 mM Maltose (Fluka Biochemical, Schweiz) durch Schwerkraft eluiert. Während der gesamten Chromatographie wurden 5-ml-Fraktionen gesammelt und die Absorbanz bei 280 und 320 nm gelesen. Die Amylose-Säule wurde mit 1 CV destilliertem H₂O, 5 CVs 0,1%igem (w/v) SDS (Sigma), 5 CVs destilliertem H₂O und 5 CVs Amylose-Äquilibrierungs-Puffer regeneriert.
Die interessierenden Fraktionen wurden vereinigt und in einem Slide-A-Lyzer (Pierce) mit 4 × 4 l PBS pH 7,4 (Sigma) dialysiert, um niedermolekulare Kontaminanten zu entfernen, den Puffer auszutauschen und zu entsalzen. Nach den PBS-Austauschen stellte das erhaltene Mate rial das gereinigte huzahlpha11/MBP-6H-Polypeptid dar. Das gereinigte huzalpha11/MBP-6H-Polypeptid wurde mittels SDS-PAGE, Coomassie-Färbung und Western-Blot-Analyse mit dem konjugierten Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper (Rockland, Gilbertsville, PA) analysiert. Die Konzentration des huzalpha11/MBP-6H-Polypeptids wurde durch BCA-Analyse mit 1,92 mg/ml bestimmt.
Das gereinigte huzalpha11/MBP-6H-Polypeptid wurde zur Injektion in Kaninchen vorbereitet und an R & R Research and Development (Stanwood; WA) zur Antikörper-Herstellung geschickt. Diese wurden in Kaninchen injiziert, um ein Anti-huzalpha11/MBP-6H-Serum herzustellen (folgendes Beispiel 10).
Beispiel 10
Polyklonale Antikörper gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor
Durch Immunisierung zweier weiblicher weißer Neuseeland-Kaninchen mit dem gereinigten huzalpha11/MBP-6H-Polypeptid (Beispiel 9) oder dem gereinigten rekombinanten löslichen Zalpha11CEE-Rezeptor (Beispiel 6A) wurden Polyklonale Antikörper hergestellt. Die entsprechenden polyklonalen Antikörper wurden als Rabbit-Anti-huzalpha11/MBP-6H bzw. Rabbit-Anti-huzalpha11-CEE-BHK bezeichnet. Den Kaninchen wurden jeweils eine anfängliche intraperitoneale (IP) Injektion von 200 mg gereinigtem Protein in Freunds komplettem Adjuvanz (Pierce, Rockford, IL) und anschließend alle drei Wochen IP Booster-Injektionen von 100 mg gereinigtem Protein in Freunds inkomplettem Adjuvanz verabreicht. Sieben bis zehn Tage nach der Verabreichung der dritten Booster-Injektion wurde den Tieren Blut abgenommen und das Serum gesammelt. Den Kaninchen wurden dann alle drei Wochen Booster-Injektionen verabreicht und Blut entnommen.
Aus dem Kaninchen-Serum wurden unter Verwendung einer CNBr-SEPHAROSE-4B-Protein-Säule (Pharmacia LKB), die unter Verwendung von 10 mg des gereinigten huzalpha11/MBP-6H-Polypeptids (Beispiel 9) pro Gramm CNBr-SEPHAROSE und anschließende Übernacht-Dialyse 20 × in PBS hergestellt worden war, die Zalpha11-spezifischen polyklonalen Antikörper Affinitäts-gereinigt. Die Zalpha11-spezifischen Antikörper wurden durch einen ELISA-Titer-Check unter Verwendung von 1 mg/ml des entsprechenden Protein-Antigens als Antikörper-Target charakterisiert. Die untere Detektionsgrenze (LLD) des Affinitäts-gereinigten Anti-huzalpha11/MBP-6H-Kaninchen-Antikörpers ist eine Verdünnung von 500 pg/ml. Die LLD des Affinitäts-gereinigten Anti-huzalpha11-CEE-BHK-Kaninchen-Antikörpers ist eine Verdünnung von 50 pg/ml.
Beispiel 11
Identifizierung von den Zalpha11-Rezeptor exprimierenden Zellen unter Anwendung von RT-PCR
Spezifische humane Zelltypen wurden isoliert und durch RT-PCR nach Zalpha11-Expression gescreent. B-Zellen wurden aus frischen humanen Mandeln durch mechanische Zerstörung durch 100-μm-Nylon-Zellfilter (Falcon^TM; Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ) isoliert. Die B-Zell-Suspensionen wurden durch positive Selektion mit einer magnetischen VarioMACS-VS+-Säule und CD19-Mikrobeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf CD19+-B-Zellen angereichert. Die T-Zellen und Monocyten wurden aus humanen apherisierten Blutproben isoliert. Die CD3+-T-Zellen wurden durch positive Selektion durch CD3-Mikrobead-VarioMACS gereinigt; die Monocyten wurden durch negative Selektion mit VarioMACS-Säulen (Miltenyi) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Proben aus jeder Population wurden gefärbt und durch Analyse mittels Fluoreszenz-Antikörper-Zellsortierung (FACS) (Bectin Dickinson, San Jose, CA) analysiert, um die prozentuale Anreicherung und die resultierenden Ausbeuten zu bestimmen. Die CD19+-B-Zellen besaßen eine Reinheit von ungefähr 96%, die CD3+-T-Zellen besaßen eine Reinheit von ungefähr 95%, und die Monocyten besaßen eine Reinheit von ungefähr 96%.
Unter Anwendung eines auf dem Gebiet bekannten Standardverfahrens wurde aus allen drei Zelltypen, die sich entweder in ruhendem oder aktiviertem Zustand befanden, RNA hergestellt. Die RNA wurde aus den ruhenden Zellen direkt aus den obigen Säulen-Präparationen isoliert. Die CD19+- und CD3+-Zellen wurden aktiviert, indem sie mit 500.000 Zellen/ml in RPMI + 10% FBS, enthaltend 5 ng/ml PMA (Calbiochem, La Jolla, CA) und 0,5 μg/ml Ionomycin (Calbiochem), für 4 und 24 Stunden kultiviert wurden. Die Monocyten wurden aktiviert, indem die Zellen in RPMI + 10% FBS, enthaltend 10 ng/ml LPS (Sigma St. Louis, MO) und 10 ng/ml rhIFN-γ (R&D, Minneapolis, MN), für 24 Stunden kultiviert wurden. Die Zellen wurden geerntet und in PBS gewaschen. Die RNA wurde aus den Zellpellets unter Verwendung des RNeasy-Midiprep^TM-Kits (Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert; die cDNA-Synthese des ersten Strangs wurde mit dem Superscript-II^TMKit (Gibco BRL, Grand Island, NY) gemäß den Anweisungen des Herstellers erzeugt.
Die Oligos ZC19907 (SEQ ID NO: 38) und ZC19908 (SEQ ID NO: 39) wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, um in den oben beschriebenen Proben nach einem 1,2 kb großen Fragment, welches der Zalpha11-Message entspricht, zu screenen. Die PCR-Amplifikation wurde mit Taq-Polymerase (BRL Grand Island, NY) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 35 Zyklen, bestehend aus 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 60°C, 30 Sekunden bei 72°C; 1 Zyklus, bestehend aus 10 Minuten bei 72°C; und Halten bei 4°C. 10 μl jedes 50-μl-Reaktions-Volumens wurden auf einem 2%igen Agarosegel in 1 × TAE aufgetrennt, um die erhaltenen Produkte zu identifizieren. Die PCR-Produkte wurden bei keinem Produkt mit (–), bei einer sichtbaren Bande mit (+), bei einer erhöhten Bandenstärke mit (++) und bei einer vorherrschenden starken Bande mit (+++) bewertet; die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 5 wiedergegeben.
Tabelle 5
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zalpha11-„Message" in ruhenden humanen CD19+-B-Zellen vorliegt und mit mitogener Aktivierung ansteigt. Ebenso scheint sie durch humane CD3+-T-Zellen – jedoch nur 4 Stunden nach der Aktivierung – exprimiert zu werden. Weder in ruhenden noch in aktivierten humanen Monocyten lag eine nachweisbare „Message" vor.
Beispiel 12
Zalpha11-Immunhistochemie
A. Zell- und Gewebe-Präparationen
Die positiven Kontrollen bestanden aus BaF3-Zellen, transfiziert mit dem Zalpha11-Rezeptor (Beispiel 2), und Lymphoid-Geweben, von denen bekannt ist, dass sie den Zalpha11-Rezeptor exprimieren, einschließlich Lymphknoten, Milz und Thymus der Maus, Erhalten von HSD (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN), Lymphknoten und Milz vom Affen, erhalten vom Regional Primate Research Center (University of Washington, Seattle, WA), humane Lymphknoten und Milz, erhalten von CHTN (Cleveland, OH). Die Negativ-Kontrollen, die bei jeder Probe durchgeführt wurden, umfassten: (1) nicht-tranfizierte BaF3-Zellen, (2) Leber- und Gehirngewebe von der Maus und dem Menschen, von denen bekannt ist, dass sie den Zalpha11-Rezeptor nicht exprimieren, (3) Anfärben mit Antikörper-Verdünnungs-Puffer (Ventann Bioteck Systems, Tucson, AZ) in Abwesenheit des primären Antikörpers und (4) Verwendung des löslichen Zalpha11-Rezeptor-Proteins in Kompetitions-Experimenten.
Es wurden andere Zellproben untersucht. Es wurden sowohl nicht-stimulierte als auch stimulierte HL60-Zellen getestet. Bei den HL60-Zellen handelt es sich um eine promyelocytische Zelllinie, welche mit verschiedenen Reagenzien in Myeloid- oder Granulocyten-Linien differenzieren kann. Stimulierte HL60-Prober, wurden folgendermaßen hergestellt: (1) HL60-Zellen wurden für 48 Stunden mit 10 ng/ml Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) (Sigma, St. Luois, MO) behandelt, um in Zellen der Monocyten-Linie zu differenzieren; (2) HL60-Zellen wurden 4 Tage lang mit 1,25% DMSO (Sigma) behandelt, um zu Neutrophilen-ähnlichen Zellen zu differenzieren. Außerdem wurden humane polymorphonukleare (PMN) Zellen, humane Granulocyten, humane periphäre Blut-Lymphocyten (PBL) und humane Monocyten aus frischem humanen Blut untersucht (im Haus unter Anwendung von Routineverfahren hergestellt). Die oben beschriebenen Zellen und Gewebe wurden über Nacht in 10% NBF (Surgipath, Richmond, IL) fixiert und in Paraplast X-Tra (Oxford Scientific, St. Louis, MO) eingebettet; mit einem Reichart-Jung-2050-Mikrom (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Germany) wurden Schnitte von 5 μm hergestelltt.
B. Immunhistochemie
Die Gewebe-Schnitte wurden deparaffinisiert, mit Puffer (Wasser) hydriert und in Antigen-Retrieval-Citra-Puffer (BioGenex, San Roman, CA) für 20 Minuten einer Dampf-HIER-Behandlung unterzogen. 5%iges normales Ziegenserum (Vector, Burlingame, CA) wurde verwendet, um über 10 Minuten nicht-spezifische Bindungen zu blockieren. Unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen das lösliche Zalpha11-Rezeptor-Protein (Kaninchen-Antihuzalpha11-MBP-6H und Kaninchen-Anti-huzalpha11-CEE-BKH, Beispiel 10) als primäre Antikörper in Verdünnungen von 1:200 bzw. 1:400 wurden immuncytochemische Screening-Analysen durchgeführt. Biotin-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Vector; Cat Nr. BA-1000, 1,5 mg/ml) wurde als sekundärer Antikörper mit einer Verdünnung von 1:200 verwendet. In separaten Proben wurde Protein-Kompetition unter Zugabe zusätzlichen löslichen Zalpha11 CEE-Rezeptor-Proteins (in 10-fachem Überschuss) (Beispiel 6A) zu dem primären Antikörper durchgeführt, um eine Immunreaktion des primären Antikörpers im Voraus zu blockieren. Diese Kompetition wurde als Kontrolle der Spezifität des polyklonalen Kaninchen-Antikörpers bezüglich Zalpha11 verwendet. Die Detektion wurde auf einem Ventana-ChemMate-500-Instrument unter Verwendung eines ChemMate-DAB-Kits (markierter Streptavidin-Biotin-Kit mit Anwendung eines Streptavidin-Horseradish-Peroxidase-Konjugats und DAB-Substrats) gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Anwendung der vom Hersteller vertriebenen Hämatoxylin-Gegenfärbung für 30 Sekunden (Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ) durchgeführt.
Eine hohe Expression von Zalpha11 wurde in den PMA-aktivierten HL60-Zellen beobachtet. Niedrige Expressions-Niveaus wurden in PBL- und HL60-Zellen ohne Stimulation beobachtet. Eine Untergruppe von Zellen in der Milz, dem Thymus und den Lymphknoten der Maus zeigte positive Anfärbung. Die Lymphknoten und die Milz von Mensch und Affe sowie die HL60-Zellen mit DMSO-Stimulation zeigten minimale oder keine Anfärbung. Das in den Zellen und Geweben beobachtete Signal verschwand größtenteils durch Verwendung eines Überschusses an löslichem Zalpha11-Rezeptor-Protein. Die negativen Kontrollgewebe von Gehirn und Leber zeigten keine Anfärbung.
Beispiel 13
Identifizierung mononuklearer Zellen aus dem peripheren Blut (PBMNCs), welche den Zalpha11-Rezeptor exprimieren, unter Verwendung polyklonaler Kaninchen-Antiseren gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor
200 ml frisches heparinisiertes Blut wurden von einem normalen Spender erhalten. Das Blut wurde 1:1 in PBS verdünnt und unter Verwendung eines Ficoll-Paque-PLUS-Gradienten (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) aufgetrennt; die Lymphocyten-Phase wurde gesammelt. Die Zellen wurden 2 × in PBS gewaschen und in RPMI + 5% FBS-Medium mit einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert.
Um zu bestimmen, ob die Expression des Zalpha11-Rezeptors durch den Aktivierungszustand der Lymphocyten-Zellen, d. h., zwischen ruhenden und aktivierten Zellen, beeinflusst wird, wurden verschiedene Stimulations-Bedingungen verwendet: 1) nicht-stimuliert, d. h., Medium allein (RMPI + 5% FBS-Medium); 2) stimuliert mit 10 ng/ml PMA + 0,5 μg/ml Ionomycin (beides von Calbiochem); und 3) PHA-Aktivierung (Phytohemagglutinin-P, Difco/VWR). Die Zellen wurden für 17 Stunden bei 37°C inkubiert und dann gesammelt, um die Expression des Zalpha11-Rezeptors durch Färbung nachzuweisen.
Es wurde ein indirektes Färbungsprotokoll verwendet. Dabei wurden die humanen Lymphocyten-Zellen in Färbepuffer (PBS + 0,02% NaN₃ + 1% BSA + 2% normales humanes Serum) suspendiert und mit 2 × 10⁵ Zellen mit 50 μl/Kammer in einer 96-Kammer-Platte ausplattiert. Die Antikörper gegen den löslichen Zalpha11CEE-Rezeptor (Beispiel 15) wurden verwendet, um zu bestimmen, ob sie mit einem B-Zellen-(CD19), T-Zellen-(CD3) oder Monocyten-Marker (CD14) auf den isolierten humanen Lymphocyten co-anfärben. Ein polyklonales Kaninchen-Serum gegen den löslichen Zalpha11-Rezeptor (Rb-Anti-huzalpha11-CEE-BHK) (Beispiel 10) wurde mit 10 μg/ml als Antikörper verwendet, um Zalpha11 auf den Lymphocyten zu identifizieren. Ein sekundärer Antikörper, Ziegen-Anti-Kaninchen-Ig-FITC (Biosource, Camarillo, CA) wurde verwendet, um die Bindung des Rb-Anti-huzalpha11-CEE-BHK-Antikörpers an die Zalpha11-Rezeptoren sichtbar zu machen. Andere Antikörper wurden gleichzeitig verwendet, um T-Zellen (CD3-PE; PharMingen, San Diego, CA), B-Zellen (CD19-PE) (PharMingen) und Monocyten (CD14-PE) (PharMingen) anzufärben, um eine Co-Anfärbung des Anti-Zalpha11-Rezeptor-Antikörpers auf diesen Zelltypen nachzuweisen. Es wurden verschiedene Kontrollen verwendet, um eine nicht-spezifische Bindung und Hintergrund-Anfärbung zu bestimmen: (1) ein irrelevantes polyklonales Kaninchen-Serum wurde als nicht-spezifische Kontrolle verwendet; (2) sekundärer Antikörper alleine wurde verwendet, um die Hintergrund-Bindung dieses Reagenz zu bestimmen. Gereinigter löslicher Zalpha11-CEE-Rezeptor (Beispiel 6) wurde in etwa 10-fachem Überschuss als kompetitiver Inhibitor verwendet, um die Spezifität des Kaninchen-Anti-huzalpha11-CEE-BHK-Antikörpers bezüglich des löslichen Zalpha11-Rezeptors zu verifizieren.
Nach Ausplattieren der Zellen und Zugabe der primären und co-anfärbenden Antikörper wurden die Zellen für 30 Minuten auf Eis inkubiert, 2 × mit Färbepuffer gewaschen und mit dem sekundären Antikörper, Ziegen-Anti-Kaninchen-Ig-FITC (Biosource) 30 Minuten lang auf Eis gefärbt. Die Zellen wurden 2 × mit Färbepuffer gewaschen und mit 200 μl pro Kammer in Färbepuffer, enthaltend den Lebensfähigkeits(Viability)-Farbstoff 7AAD mit einer Endkonzentration von etwa 1 μg/ml (Sigma, St. Louis, MO), resuspendiert. Die Proben wurden auf dem FACS-Caliber (Becton-Dickinson, San Jose, CA) gelesen und die lebensfähigen Zellen analysiert.
Der polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen den Zalpha11-Rezeptor färbte ruhende B-Zellen an. Das Signal auf ruhenden B-Zellen war stärker als das Signal, das unter Verwendung des irrelevanten Kaninchenserums erreicht wurde; und das Signal wurde in größerem Umfang auf B-Zellen als auf T-Zellen durch Zugabe eines Überschusses an löslichem Zalpha11-CEE-Rezeptor vermindert. Dieses Experiment wurde unter Verwendung separierter B- und T-Zellen wiederholt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten wurden. Wiederum war die Färbung mit dem polyklonalen Kaninchen-Anti-huzalpha11-CEE-BHK-Antikörper gegen den Zalpha11-Rezeptor am höchsten auf ruhenden B-Zellen.
Beispiel 14
Zalpha11-Rezeptor-Expression in verschiedenen Geweben unter Verwendung quantitativer Echtzeit-RT-PCR
A. Primer und Sonden für die quantitative RT-PCR
Quantitative Echtzeit-RT-PCR unter Verwendung des ABI PRISM 7700 Sequenz-Detektions-Systems (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) wurde bereits beschrieben (siehe Heid, C. A. et al., Genome Research 6: 986-994, 1996; Gibson, U. E. M. et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139: 4756-4764, 1998). Dieses Verfahren beinhaltet die Verwendung einer Gen-spezifischen Sonde, welche sowohl fluoreszierende Reporter- als auch Quencher-Farbstoffe enthält. Wenn die Sonde intakt ist, wird die Reporter-Farbstoff-Emission auf Grund der engen Nachbarschaft zu dem Quencher-Farbstoff negiert. Während der PCR-Extension unter Verwendung zusätzlicher Gen-spezifischer Vorwärts- und Rückwärts-Primer wird die Sonde durch die 5'-Nuklease-Aktivität der Taq-Polymerase gespalten, wodurch der Reporter-Farbstoff von der Sonde freigesetzt wird, was zu einem Anstieg der Fluoreszenz-Emission führt.
Die Primer und Sonden, die für die quantitative Echtzeit-RT-PCR-Analysen der Zalpha11-Rezeptor-Expression verwendet wurden, wurden unter Verwendung der Primer-Design-Software Primer Express^TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) konstruiert. Die Primer für den humanen Zalpha11-Rezeptor wurden derart konstruiert, dass sie eine Intron-Exon-Verbindung umspannen, um die Amplifikation genomischer DNA zu verhindern. Der Vorwärts-Primer ZC22,277 (SEQ ID NO: 40) und der Rückwärts-Primer ZC22,276 (SEQ ID NO: 41) wurden in einer PCR-Reaktion (unten) mit Konzentrationen von etwa 300 nM verwendet, um ein 143 bp großes Produkt zu synthetisieren. Die entsprechende Zalpha11-TagMan^®-Sonde, bezeichnet als ZG31 (SEQ ID NO: 42), wurde synthetisiert und durch PE Applied Biosystems markiert. Die ZG31-Sonde wurde am 5'-Ende mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff (6-Carboxy-Fluorescein) (FAM) (PE Applied Biosystems) und am 3'-Ende mit einem fluoreszierenden Quencher-Farbstoff (6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin) (TAMRA) (PE Applied Biosystems) markiert.
Als Kontrolle zum Überprüfen der Integrität und Qualität der getesteten RNA-Proben wurden alle RNA-Proben (unten) unter Verwendung eines von PE Applied Biosystems bestellten Primer- und Sonden-Sets (Kat Nr. 4304483) nach rRNA gescreent. Der Kit enthält einen rRNA-Vorwärts-Primer (SEQ ID NO: 43) und den rRNA-Rückwärts-Primer (SEQ ID NO: 44), rRNA-TagMan^®-Sonde (SEQ ID NO: 45). Die rRNA-Sonde wurde am 5'-Ende mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff VIC (PE Applied Biosystems) und am 3'-Ende mit dem fluoreszierenden Quencher-Farbstoff TAMRA (PE Applied Biosystems) markiert. Die rRNA-Ergebnisse dienen ebenso als eine interne Kontrolle und ermöglichen die Standardisierung der in den Testproben erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Zalpha11-mRNA-Expression.
Es wurden RNA-Proben aus humanen CD3-, CD19- und Monocyten-Zelltypen, wie im obigen Beispiel 11 beschrieben, hergestellt. Unter Anwendung des RNeasy-Miniprep^TM-Kits (Qiagen, Valencia, CA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers aus ungefähr 10 Millionen BaF3-Zellen, welche den humanen Zalpha11-Rezeptor exprimieren (Beispiel 2A), Kontroll-RNA hergestellt.
B. Quantitative Echtzeit-RT-PCR
Die relativen Niveaus der Zalpha11-mRNA wurden durch Analyse von Gesamt-RNA-Proben unter Verwendung des Einschritt-RT-PCR-Verfahrens (PE Applied Biosystems) bestimmt. Gesamt-RNA aus BaF3-Zellen, welche den humanen Zalpha11-Rezeptor exprimieren, wurde durch Standardverfahren isoliert und verwendet, um eine Standardkurve zur Quantifizierung zu erzeugen. Die Kurve bestand aus 10-fachen seriellen Verdünnungen in einem Bereich von 2,5-2,5 × 10^–4 ng/μl für den rRNA-Screen und von 250-0,025 ng/μl für den Zalpha11-Screen, wobei jeder Standardkurvenpunkt dreifach analysiert wurde. Die Gesamt-RNA-Proben von den Zellen wurden ebenso dreifach bezüglich humaner Zalpha11-Rezeptor-Transkript-Niveaus und rRNA-Niveaus als endogene Kontrolle analysiert. In einem Gesamtvolumen von 25 μl wurde jede RNA-Probe einer Einschritt-RT-PCR-Reaktion, welche ungefähr 25 ng Gesamt-RNA in Puffer A (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl), den internen Standard-Farbstoff Carboxy-x-Rhodamin (ROX), geeignete Primer (ungefähr 50 nm rRNA-Primer (SEQ ID NO: 43 und SEQ ID NO: 44) für die rRNA-Proben und ungefähr 300 nM der Primer ZC22,277 (SEQ ID NO: 40) und ZC22,276 (SEQ ID NO: 41) für die Zalpha11-Proben), die entsprechende Sonde (ungefähr 50 nM rRNA TagMan^®-Sonde (SEQ ID NO: 45) für die rRNA-Proben, ungefähr 100 nM ZG31-Sonde (SEQ ID NO: 42) für die Zalpha11-Proben), 5,5 mM MgCl₂, jeweils 300 μM d-CTP, d-ATP und d-GTP und 600 μM d-UTP, MuLV-Reverse-Transkriptase (0,25 U/μl), AmpliTag^TM-Gold-DNA-Polymerase (0,025 U/μl) (PE Applied Biosystems) und RNase-Inhibitor (0,4 U/μl) (PE Applied Biosystems) enthielt, unterzogen. Die thermischen Zyklusbedingungen bei der PCR waren folgendermaßen: ein anfänglicher reverser Transkriptions(RT)-Schritt, bestehend aus einem Zyklus von 30 Minuten bei 48°C, gefolgt von einem AmpliTaq-GoId^TM(PE Applied Biosystems)-Aktivierungsschritt, bestend aus einem Zyklus von 10 Minuten bei 95°C, anschließend 40 Amplifikations-Zyklen, bestehend aus 15 Sekunden bei 95°C und 1 Minute bei 60°C.
Die relativen Zalpha11-RNA-Niveaus wurden unter Verwendung des Standardkurven-Verfahrens, wie vom Hersteller PE Biosystems beschrieben (User Bulletin Nr. 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11. Dezember 1997) bestimmt. Die rRNA-Messungen wurden verwendet, um die Zalpha11-Niveaus zu normieren, und die RNA-Proben aus ruhenden CD3+-Zellen wurden als Kalibrator verwendet. Ruhende CD3 wurden willkürlich als Kalibrator ausgewählt; diesen wurde ein Wert von 1,00 gegeben. Die restlichen Proben wurden mit dem Kalibrator verglichen. Die Daten sind in folgender Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6
Es trat ein 15-facher Anstieg der Zalpha11-Rezeptor-Expression in CD3+ nach 4 und 24 Stunden auf. Ruhende CD19 besaßen eine 20-fach erhöhte Rezeptor-Expression im Vergleich zu ruhenden CD3+. Es trat ein 3-facher Anstieg nach 4-stündiger Stimulation auf, welcher nach 24 Stunden zurück auf Ruhe-Niveaus fiel. Monocyten zeigten keine nachweisbare Zalpha11-Rezeptor-Expression in diesem Assay.
C. Gereinigte humane T-, NK- und B-Zellen als primäre Quelle zur Bewertung humaner Zalpha11-Rezeptor-Expression
Von einem gesunden menschlichen Spender wurde Gesamtblut (150 ml) entnommen und in konischen 50-ml-Röhrchen 1:1 mit PBS gemischt. 30 ml des verdünnten Bluts wurden dann mit 15 ml Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) unterlegt. Diese Gradienten wurden 30 Minuten bei 500 g zentrifugiert, wobei ohne Abbremsung gestoppt wurde. Die RBC-abgereicherten Zellen an der Grenzfläche (PBMC) wurden gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Die Ausbeute an isolierten humanen PBMC betrug 200 × 10⁶ vor der im Folgenden beschriebenen Selektion.
Die PBMCs wurden in 1,5 ml MACS-Puffer (PBS, 0,5% EDTA, 2 mM EDTA) suspendiert und 3 × 10⁶ Zellen für die Kontroll-RNA und für die fließcytometrische Analyse beiseite gelegt. Es wurden 0,25 ml Mikrobeads mit anti-humanem CD8 (Miltenyi Biotec) zugegeben; dann wurde die Mischung für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Die mit CD8-Mikrobeads markierten Zellen wurden mit 30 ml MACS-Puffer gewaschen und dann in 2 ml MACS-Puffer resuspendiert.
Eine VS+-Säule (Miltenyi) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet. Die VS+-Säule wurde dann in einem magnetischen VarioMACS-Feld (Miltenyi) platziert. Die Säule wurde mit 5 ml MACS-Puffer äquilibriert. Die isolierten primären Mauszellen wurden dann auf die Säule aufgetragen. Die CD8-negativen Zellen wurden durchgeleitet. Die Säule wurde mit 9 ml (3 × 3 ml) MACS-Puffer gespült. Die Säule wurde dann aus dem magnetischen Feld entfernt und über einem 15-ml-Falcon-Röhrchen platziert. Die CD8+-Zellen wurden durch Zugabe von 5 ml MACS-Puffer zu der Säule eluiert und die gebundenen Zellen unter Verwendung des von dem Hersteller bereitgestellten Plungers ausgespült. Die Ausbeute an CD3+-selektierten humanen peripheren T-Zellen betrug insgesamt 51 × 10⁶ Zellen. Die durchgeflossenen CD8-negativen Zellen wurden gesammelt, gezählt, mit Beads, beschichtet mit anti- humanem CD4, angefärbt, dann inkubiert und bei den gleichen Konzentrationen wie oben beschrieben über eine neue VS+-Säule geleitet. Die Ausbeute an CD4+-selektierten humanen peripheren T-Zellen betrug insgesamt 42 × 10⁶ Zellen.
Es wurde jeweils eine Probe der humanen selektierten CD8+- und CD4+-Zellen zur Anfärbung und Sortierung auf einem Fuoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) entnommen, um ihre Reinheit festzustellen. Ein PE-konjugierter anti-humaner CD4-Antikörper, ein anti-humaner CD8-FITC-Antikörper und ein anti-humaner CD19-CyChrome-Antikörper (sämtlich von Phar-Mingen) wurden zur Anfärbung der selektierten CD8+- und CD4+-Zellen verwendet. Die CD8-selektierten Zellen im ersten Experiment bestanden zu 80% aus CD8+, und die CD4-selektierten Zellen bestanden zu 85% aus CD4+. In zwei nachfolgenden Experimenten (Beispiel 14B) besaßen die gereinigten CD8+-Zellen eine Reinheit von 84% bzw. 81%, und die CD4+-Zellen besaßen eine Reinheit von 85% bzw. 97%. In einem Experiment wurden die nicht-bindenden (durchfließenden) Zellen mit Beads, beschichtet mit anti-humanem CD19 (Miltenyi), angefärbt und über eine dritte Säule mit magnetischen Beads geleitet, um CD19+-B-Zellen zu isolieren (diese besaßen eine Reinheit von 92%).
Die humanen selektierten CD8+-, CD4+- und CD19+-Zellen wurden durch Inkubieren von 0,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI + 5% humanes Ultraserum (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) + 10 ng/ml PMA und 0,5 μg/ml Ionomycin (Calbiochem) für 4, 16 oder 24 Stunden bei 37°C aktiviert. Die T-Zellen (2,5 × 10⁶/Kammer) wurden abwechselnd in 24-Kammer-Platten, die über Nacht mit 0,5 μg/ml Platten-gebundenem Anti-CD3-mAk UCHT1 (PharMingen) vorbeschichtet worden waren, mit und ohne löslichen Anti-CD28-mAk (PharMingen) mit 5 μg/ml stimuliert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Zellen geerntet, pelletiert, einmal mit PBS gewaschen und wiederum pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Pellets in einem Trockeneis/Ethanol-Bad blitzgefroren; dann wurden sie bei –80°C gelagert, um eine spätere RNA-Präparation durchzuführen.
In einem separaten Experiment wurden humane NK-Zellen aus Ficoll-PBMC durch negative Selektion unter Verwendung des humanen NK-Anreichungs-Systems (bestehend aus Antikörpern gegen CD3, CD4, CD14, CD19, CD66b und Glycophorin A) von Stem Cell Technologies (Vancouver, B. C. Canada) angereichert. Die Zellpellets wurden von frisch isolierten NK-Zellen von zwei verschiedenen Spendern oder von NK-Zellen, die 24 Stunden in nicht-supplementiertem Medium oder in Medium, supplementiert mit 20 ng/ml IL-15, kultiviert worden waren, hergestellt. Die RNA aus einer humanen NK-Zelllinie, die von einem malignen Nicht-Hodkins Lymphom abgeleitet und als NK-92 (ATCC Nr. CRL-2407) bezeichnet wurde, wurde ebenso getestet. Als positive Kontrollen diente RNA, die aus den humanen B-Zelllinien CESS (ATCC Nr. TIB-190), IM-9 (ATCC Nr. CCL-159) und HS-Sultan (CRL-1484) isoliert wurde.
Mit diesen humanen selektierten NK-, CD8+-, CD4+- und CD19+-Zellen wurde wie oben beschrieben Echtzeit-PCR durchgeführt, um die Expression des humanen Zalpha11-Rezeptors zu bewerten. Relative Niveaus der Zalpha11-Rezeptor-RNA wurden durch Analyse der Gesamt-RNA-Proben unter Verwendung des Einschritt-RT-PCR-Verfahrens (PE Applied Biosystems) bestimmt. RNA aus BaF3-Zellen, welche den humanen Zalpha11-Rezeptor exprimieren, wurde verwendet, um eine entsprechende Kontrolle für die Standardkurven für die im obigen Beispiel 14C beschriebene Echtzeit-PCR zu erstellen. Die Ergebisse der Experimente, welche die Expression des Zalpha11-Liganden und des Zalpha11-Rezeptors in stimulierten und nicht stimulierten Zellen untersuchen, sind in den folgenden Beispielen 14D-E beschrieben.
D. Expression des humanen Zalpha11-Rezeptors und -Liganden in CD4+-, CD8+- und CD19+-Zellen
Das erste Experiment verwendete die oben beschriebene RT-PCR, um Zalpha11-Rezeptor-Expression in nicht stimulierten und Anti-CD3-stimulierten CD4+- und CD8+-Proben zu den Zeitpunkten 0 Stunden (nicht stimulierte, "ruhende" Zellen) und nach 4 Stunden, 15,5 Stunden und 24 Stunden nach Stimulation festzustellen. Die Probe der ruhenden CD4+-Zellen wurde willkürlich als Kalibrator ausgewählt; ihr wurde ein Wert von 1,00 gegeben. Es trat ein ungefähr 4-facher Anstieg der Rezeptor-Expression in nicht stimulierten CD4+-Zellen von 4 Stunden bis 24 Stunden Kultur und ein etwa 8-facher Anstieg über den gleichen Zeitraum in Anti-CD3-stimulierten CD4+-Zellen auf. Die CD8+-Zellen zeigten einen 7-fachen Anstieg der Zalpha11-Rezeptor-Expression, welche bei 4 Stunden den höchsten Wert erreichte und im weiteren Zeitverlauf abnahm. Bei einer Anti-CD3-Stimulation wiesen die CD8+-Zellen einen konstanten 8-fachen Anstieg der Rezeptor-Expression auf.
Das zweite Experiment verwendete RT-PCR, um Zalpha11-Rezeptor-Expression in Anti-CD3-stimulierten, PMA + Ionomycin-stimulierten und nicht stimulierten CD4+- und CD8+-Proben zu den Zeitpunkten 0 Stunden und nach 3,5 Stunden, 16 Stunden und 24 Stunden nach Aktivierung festzustellen. Die ruhende CD8+-Probe wurde willkürlich als Kalibrator ausgewählt; ihr wurde ein Wert von 1,00 gegeben. Die ruhenden CD4+- und CD8+-Zellen wiesen keine signifikante Rezeptor-Expression auf. Die Expression war in den PMA + Ionomycinstimulierten CD4+-Proben 3,5 Stunden, 16 Stunden und 24 Stunden nach der Stimulation etwa 3-fach höher. Die Expression in Anti-CD3-aktivierten CD4+-Zellen erreichte 3,5 Stunden nach Stimulation einen Peak mit einem 10-fachen Anstieg über den Hintergrund-Niveaus, fiel dann 16 Stunden nach der Stimulation auf Niveaus zurück, die 4-fach über dem Hintergrund lagen. Die CD8+-Zellen zeigten einen 4-fachen Anstieg der Expression 3,5 Stunden nach PMA + Ionomycin-Stimulation, wobei die Expression an den nachfolgenden Zeitpunkten abnahm. Wie im ersten Experiment wiesen wiederum die Anti-CD3-stimulierten CD8+-Zellen eine 8-fache Induktion der Rezeptor-Expression über den Hintergrund-Niveaus auf.
Das letzte Experiment verwendete RT-PCR, um Zalpha11-Rezeptor-Expression in Anti-CD3- und Anti-CD3/Anti-CD28-stimulierten und nicht stimulierten CD4+- und CD8+-Proben zu den Zeitpunkten 0 Stunden und 2 Stunden, 4 Stunden und 16 Stunden nach Stimulation festzustellen. CD19+-Zellen, aktiviert mit PMA + Ionomycin, wurden ebenso auf Rezeptor-Expression in den gleichen Zeitintervallen getestet. Die ruhende CD4+-Probe wurde willkürlich als Kalibrator ausgewählt; ihr wurde ein Wert von 1,00 gegeben. Die Anti-CD3-stimulierten CD4+-Zellen zeigten nach 2 Stunden lediglich eine 4-fache Induktion des Rezeptors, während im Vergleich dazu eine 10-fache Induktion nach 3,5 Stunden im vorhergehenden Experiment beobachtet wurde. Die Kombination von Anti-CD3 und Anti-CD28 erhöhte die Expression auf das 8-fache über dem Hintergrund. Die Anti-CD3/Anti-CD28-stimulierten CD8+-Zellen wiesen nach 16 Stunden sehr geringe Rezeptor-Expressions-Niveaus auf, wie sie auch bei den CD8+-Zellen in den vorhergehenden Experimenten beobachtet wurden. Die mit PMA + Ionomycin stimulierten CD19+-Zellen zeigten die signifikanteste Rezeptor-Expression mit einem 19-fachen Anstieg nach 2 Stunden, die Expressions-Niveaus gingen jedoch nach 16 Stunden auf die Niveaus ruhender Zellen zurück.
Es wurde erwartet, dass zwischen den entnommenen Blutproben (d. h., mehreren, zu verschiedenen Zeitpunkten vom gleichen Patienten entnommenen Proben und von mehreren Patienten stammenden Proben) eine bestimmte Variation auftritt. Aus diesem Grund wurden Daten-Trends innerhalb jeder Studie oder von einer einzelnen Blutprobe analysiert und die drei obigen Experimente für eine Gesamt-Schlussfolgerung verglichen. Der Trend der oben beschriebenen Echtzeit-PCR-Experimente ist der, dass von allen getesteten Zelltypen die mit PMA + Ionomycin-aktivierten CD19+-B-Zellen die höchsten Niveaus an Zalpha11-Rezeptor-RNA exprimieren. CD4+- und CD8+-Zellen können ebenso zur Exprimierung des Rezeptors stimuliert werden, jedoch mit niedrigeren Niveaus als in B-Zellen.
E. Expression des humanen Zalpha11-Rezeptors in humanen NK-Zellen
Echtzeit-PCR wurde ebenso an humanen NK-Zellen, die wie im obigen Beispiel 14C beschrieben gereinigt wurden, durchgeführt. Die NK-92-Probe wurde willkürlich als Kalibrator ausgewählt; ihr wurde ein Wert von 1,00 gegeben. Es trat ein ungefähr 4,5-facher Anstieg der Rezeptor-Expression in den positiven Kontroll-CESS-Zellen, ein 1,5-facher Anstieg in IM-9-Zellen und kein Anstieg in HS-Sultan-Zellen (0,9-fach in Bezug auf NK-92) auf. Die NK-Zellen, entweder frisch oder über Nacht mit oder ohne IL-15 kultiviert, exprimierten sehr ähnliche Niveaus des Zalpha11-Rezeptors wie die NK-92-Zellen (mit Werten, die sich um das 0,9- bis 1,2-fache in Bezug auf NK-92 unterschieden).
Beispiel 15
Identifizierung von Zellen, die den Zalpha11-Rezeptor exprimieren, unter Anwendung von In-situ-Hybridisierung
Es wurden spezifische humane Gewebe isoliert und nach Zalpha11-Expression durch In-situ-Hybridisierung gescreent. Zu den verschiedenen präparierten humanen Geweben, die geschnitten und In-situ-Hybridisierung unterzogen wurden, zählten Thymus, Milz, Mandeln, Lymphknoten und Lunge. Die Gewebe wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und unter Verwendung von Standardtechniken in Paraffin geblockt. Die Gewebe wurden in Schnitte von 4 bis 8 Mikrons sektioniert. Die Gewebe wurden unter Verwendung eines Standardprotokolls ("Development of non-isotopic in situ hybridization", http://dir.niehs.nih.gov/dirlep/ish.html) präpariert. Dabei wurden die Gewebeschnitte mit HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) deparaffinisiert und dann mit Ethanol dehydriert. Als nächstes wurden sie mit Proteinase K (50 μg/ml) (Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN) bei 37°C für 2 bis 20 Minuten verdaut. Diesem Schritt folgte eine Acetylierung und Rehydrierung der Gewebe.
Durch PCR wurden zwei In-sitiu-Sonden gegen die humane Zalpha11-Sequenz konstruiert. Zwei Oligo-Sets wurden konstruiert, um Sonden für separate Bereiche der Zalpha11cDNA zu erzeugen: (1) Oligos ZC23,684 (SEQ ID NO: 60) und ZC23,656 (SEQ ID NO: 61) wurden verwendet, um eine 413 bp große Sonde für Zalpha11 zu erzeugen; (2) die Oligos ZC23,685 (SEQ ID NO: 62) und ZC23,657 (SEQ ID NO: 63) wurden verwendet, um eine 430 bp große Sonde für Zalpha11 zu erzeugen. Die zweite Sonde liegt 1.500 bp 3' der ersten Zalpha11-Sonde. Das Antisense-Oligo jedes Sets enthielt außerdem die Arbeitssequenz für den T7-RNA-Polymerase-Promotor, um eine leichte Transkription der Antisense-RNA-Sonden von diesen PCR-Produkten zu ermöglichen. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren folgendermaßen: 30 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 1 Minute bei 60°C und 1,5 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden durch Qiagen-Spin-Säulen gereinigt und anschließend durch Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die Sonden wurden anschließend mit Digoxigenin (Boehringer) oder Biotin (Boehringer) unter Anwendung eines In-vitro-Transkriptions-Systems (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert.
Mit einer Digoxigenin- oder Biotin-markierten Zalpha11-Sonde (oben) wurde In-situ-Hybridisierung durchgeführt. Die Sonde wurde den Objektträgern mit einer Konzentration von 1 bis 5 pmol/ml für 12 bis 16 Stunden bei 55-60°C zugegeben. Die Objektträger wurden anschließend in 2 × SSC und 0,1 × SSC bei 50°C gewaschen. Die Signale wurden unter Verwendung von Tyramid-Signal-Amplifikation (TSA) (TSA, in situ indirect kit; NEN) amplifiziert und mit dem Vector-Red-Substrat-Kit (Vector Lab) gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht. Die Objektträger wurden dann mit Hematoxylin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gegengefärbt.
Es wurde ein Signal im Thymus, den Mandeln, der Lunge und den Lymphknoten beobachtet. Bei den positiv-gefärbten Zellen schien es sich um Lymphocyten zu handeln.
Beispiel 16
Sekretions-Trap-Assay
Es wurde ein Sekretions-Trap-Assay verwendet, um die cDNA für den Zalpha11-Liganden zu identifizieren. Die positiven DNA-Pools, die aus dem Expressions-Klonierungs-Ansatz erhalten wurden, sind in der allgemein verfügbaren US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217 beschrieben.
Konditioniertes Medium von DNA-Klonen, die in BHK-Zellen in einem 96-Kammer-Format transfiziert wurden, wurden dem Proliferations-Assay unter Verwendung von BaF3/Zalpha11-Zellen, wie in Beispiel 2 beschrieben, zugeführt. Verschiedene DNA-Pools ergaben wiederholt positive Aktivitäten, die mit löslichen Zalpha11-Rezeptoren neutralisiert wurden (Beispiel 6). Ein positiver DNA-Pool wurde in COS-Zellen in einem 12-Kammer-Format unter Verwendung des im Folgenden beschriebenen Lipofectamin^TM-Verfahrens transfiziert.
Ein Sekretions-Trap-Assay wurde dann unter Verwendung der löslichen Zalpha11-Rezeptoren (mit einem C-terminalen Glu-Glu-Tag mit oder ohne Biotinylierung; einem C-terminalen Flag-Tag oder löslichen Fc4-Zalpha11-Rezeptor-Fusionen) (Beispiel 6) durchgeführt, um die direkte Bindung zwischen dem Zalpha11-Liganden in dem positiven Pool und den löslichen Zalpha11-Rezeptoren zu testen (siehe unten). Das Ergebnis war positiv, was den Nachweis und die Isolierung von Klonen, welche den Zalpha11-Liganden exprimieren, ermöglichte. Die Platten wurden bei 37°C 24 Stunden geschüttelt; dann wurden DNA-Minipräps (QiaPrep^TM 96 Turbo Miniprep Kit, Qiagen) unter Verwendung eines TomTech Quadra 9600 in einem 96-Kammer-Format hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde dann im Reihen- und Säulenformat gepoolt und in COS-Zellen transfiziert; die positiven Pools wurden dann durch „Sekretions-Trap", wie im Folgenden beschrieben, bestimmt.
Transfektionen von COS-Zellen
Die COS-Zell-Transfektion wurde folgendermaßen durchgeführt: Mischen von 3 μl gepoolter DNA und 5 μl Lipofectamin^TM in 92 μl serumfreiem DMEM-Medium (55 mg Natriumpyruvat, 146 mg L-Glutamin, 5 mg Transferrin, 2,5 mg Insulin, 1 μg Selen und 5 mg Fetuin in 500 ml DMEM), 30-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur und anschließende Zugabe von 400 μl serumfreiem DMEM-Medium. Diese 500-μl-Mischung wurde auf 1,5 × 10⁵ COS- Zellen/Kammer, die auf 12-Kammer-Gewebekultur-Platten ausplattiert waren, gegeben; dann wurde 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Es wurden 500 μl DMEM-Medium mit 20% FBS (100 ml FBS, 55 mg Natriumpyruvat und 146 mg L-Glutamin in 500 ml DMEM) zugegeben; dann wurde über Nacht inkubiert.
Sekretions-Trap-Assay
Der Sekretions-Trap wurde folgendermaßen durchgeführt: Das Medium wurde von den Zellen mit PBS abgespült; diese wurden dann 15 Minuten mit 1,8% Formaldehyd in PBS fixiert. Die Zellen wurden dann mit TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl und 0,05% Tween-20 in H₂O) gewaschen und mit 0,1% Triton-X in PBS für 15 Minuten permeiert und wieder mit TNT gewaschen. Die Zellen wurden für 1 Stunde mit TNB (0,1 M Tris-HCL, 0,15 M NaCl und 0,5 Blocking-Reagenz (NEN Renalssance TSA-Direct Kit) in H₂O) geblockt und wieder mit TNT gewaschen. Bei Verwendung des biotinylierten Proteins wurden die Zellen in 15-minütigen Inkubationen mit Avidin und dann mit Biotin (Vector Labs) geblockt, wobei dazwischen mit TNT gewaschen wurde. In Abhängigkeit des verwendeten löslichen Rezeptors wurden die Zellen für 1 Stunde mit: (A) 1-3 μg/ml des löslichen Zalpha11-Rezeptors Zalpha11-Fc4-Fusionsprotein (Beispiel 6); (B) 3 μg/ml des löslichen Zalpha11-Rezeptors mit C-terminalem FLAG-Tag, Zalpha11CFLG (Beispiel 6); (C) 3 μg/ml des löslichen Zalpha11-Rezeptors mit C-terminalen GluGlu-Tag, Zalpha11CEE (Beispiel 6), oder (D) 3 μg/ml biotinyliertem löslichen Zalpha11-Rezeptor Zalpha11CEE (Beispiel 6), in TNB inkubiert. Die Zellen wurden dann mit TNT gewaschen. In Abhängigkeit des verwendeten löslichen Rezeptors wurden die Zellen für eine weitere Stunde mit: (A) 1:200-verdünntem Ziegen-Anti-Mensch-Ig-HRP (Fc-spezifisch), (B) 1:1000-verdünntem M2-HRP, (C) 1:1000 verdünntem Anti-GluGlu-Antikörper-HRP, oder (D) 1:300-verdünntem Streptavidin-HRP (NEN Kit) in TNB inkubiert. Die Zellen wurden wieder mit TNT gewaschen.
Positive Bindung wurde durch Fluoreszin-Tyramid-Reagenz, 1:50 verdünnt in Verdünnungspuffer (NEN Kit), nach 4- bis 6-minütiger Inkubation nachgewiesen; dann wurde mit TNT gewaschen. Die Zellen wurden mit Vectashield-Mounting-Medium (Vector Labs Burlingame, CA), 1:5 verdünnt in TNT, konserviert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines FITC-Filters auf einem Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar gemacht.
Beispiel 17
Der Maus-Zalpha11-Ligand bindet an den humanen löslichen Zalpha11-Rezeptor in dem Sekretions-Trap-Assay
Ein Plasmid, welches die für den Maus-Zalpha11-Liganden (SEQ ID NO: 47) kodierende DNA enthielt, wurde in COS-Zellen transfiziert und die Bindung des humanen löslichen Zalpha11-Rezeptors Zalpha11-Fc4 (Beispiel 6C) an die transfizierten COS-Zellen durch einen Sekretions-Trap-Assay (Beispiel 16) getestet. Der Assay bestätigte, dass der Maus-Zalpha11-Ligand an den humanen löslichen Zalpha11-Rezeptor bindet.
Die Transfektion der COS-Zellen wurde wie in Beispiel 16 unter Verwendung von 0,7 μg des Plasmids in 3 μl durchgeführt. Der Sekretions-Trap wurde wie in Beispiel 16 unter Verwendung von 1 μg/ml des löslichen Zalpha11-Rezeptor-Fc4-Fusionsproteins (Beispiel 6C) in TNB und 1:200-verdünntem Ziegen-Anti-Mensch-Ig-HRP (Fc-spezifisch) in TNB für den nachweisbaren Antikörper durchgeführt. Die positive Bindung des löslichen humanen Zalpha11-Rezeptors an die präparierten fixierten Zellen wurde mit Fluoreszin-Tyramid-Reagenz nachgewiesen; diese wurden gemäß Beispiel 16 visualisiert und konserviert. Das positive Ergebnis zeigte, dass der Maus-Zalpha11-Ligand an den humanen löslichen Zalpha11-Rezeptor bindet.
Beispiel 18
Der Maus-Zalpha11-Ligand aktiviert den humanen Zalpha11-Rezeptor in einem BaF3-Assay unter Verwendung von Alamar-Blue
Die BaF3/Zalpha11-Zellen wurden herunterzentrifugiert, gewaschen und in mIL-3-freiem Medium, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausplattiert. Die Proliferation der BaF3/Zalpha11-Zellen wurde unter Verwendung von serumfreinem konditioniertem Medium von BHK-Zellen, welche den Maus-Zalpha11-Liganden (SEQ ID NO: 47) exprimieren, untersucht. Das konditionierte Medium wurde mit mIL-3-freiem Medium auf Konzentrationen von 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% und 0,375% verdünnt. Der Proliferations-Assay wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die proliferative Antwort der BaF3-Zalpha11-Zellen auf den Maus-Zalpha11-Liganden. Die gemessene Antwort lag ungefähr 5-fach über dem Hintergrund bei 50%iger Konzentration.
Beispiel 19
Der Zalpha11-Ligand aktiviert den humanen Zalpha11-Rezeptor in einem Luciferase-Assay
A. Konstruktion der BaF3/KZ134/Zalpha11-Zelllinie
Mit den komplementären Oligonukleotiden ZC12,749 (SEQ ID NO: 48) und ZC12,748 (SEQ ID NO: 49) wurde das KZ134-Plasmid konstruiert, welches STAT-Transkriptionsfaktor-Bindungselemente aus vier Genen enthält: Ein modifiziertes Sis-induzierbares c-fos-Element (m67SIE oder hSIE) (Sadowski, H. et al., Science 261: 1739-1744, 1993), das p21 SIE1 aus dem p21-WAF1-Gen (Chin, Y. et al., Science 272: 719-722, 1996), das Brustdrüsen-Response-Element des β-Casein-Gens (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991) und ein STAT-induzierbares Element des Fcg-RI-Gens (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995). Diese Oligonukleotide enthalten Asp718-XhoI-kompatible Enden und wurden unter Verwendung von Standardverfahren in einen Leuchtkäfer-Luciferase-Reporter-Empfänger-Vektor mit einem c-fos-Promotor (Poulsen, L. K. et al., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998), welcher mit den gleichen Enzymen verdaut wurde und einen selektierbaren Neomycin-Marker enthielt, ligiert. Das KZ134-Plasmid wurde verwendet, um unter Anwendung von Standard-Transfektions- und -Selektions-Verfahren BaF3-Zellen stabil zu transfizieren und die BaF3/KZ134-Zelllinie herzustellen.
Eine stabile BaF3/KZ134-Indikator-Zelllinie, welche den Zalpha11-Rezeptor in voller Länge exprimiert, wurde wie in Beispiel 1 unter Verwendung von etwa 30 μg des Zalpha11-Expressions-Vektors konstruiert. Die Klone wurden verdünnt, ausplattiert und unter Anwendung von Standardtechniken selektiert. Die Klone wurden durch einen Luciferase-Assay (siehe folgendes Beispiel 19B) unter Verwendung von Medium, konditioniert mit dem humanen Zalpha11-Liganden als Induktor, gescreent. Die Klone mit der höchsten Luciferase-Antwort (über STAT-Luciferase) und dem niedrigsten Hintergrund wurden selektiert. Es wurde eine stabile Transfektanten-Zelllinie selektiert. Die Zelllinie wurde als BaF3/KZ134/Zalpha11 bezeichnet.
B. Der humane und Maus-Zalpha11-Ligand aktiviert den humanen Zalpha11-Rezeptor in einem BaF3/KZ134/Zalpha11-Luciferase-Assay
Die BaF3/KZ134/Zalpha11-Zellen wurden herunterzentrifugiert und in mIL-3-freiem Medium gewaschen. Die Zellen wurden zentrifugiert und dreimal gewaschen, um das Entfernen von mIL-3 sicherzustellen. Die Zellen wurden dann in einem Hämacytometer gezählt. Die Zellen wurden in einem 96-Kammer-Format mit ungefähr 30.000 Zellen pro Kammer in einem Volumen von 100 μl pro Kammer unter Verwendung des mIL-3-freien Mediums ausplattiert. Das gleiche Verfahren wurde für nicht-transfizierte BaF3/KZ134-Zellen verwendet, die als Kontrolle in dem anschließenden Assay verwendet wurden.
Die STAT-Aktivierung der BaF3/KZ134/Zalpha11-Zellen wurde unter Verwendung von konditioniertem Medium aus (1) BHK570-Zellen, transfiziert mit einem Expressions-Vektor, welcher den humanen Zalpha11-Liganden (SEQ ID NO: 10) kodiert, oder (2) BHK570-Zellen, transfiziert mit einem Expressions-Vektor, welcher den Maus-Zalpha11-Liganden (SEQ ID NO: 47) kodiert, oder (3) mIL-3-freiem Medium zur Bestimmung der durch das Medium verursachten Kontrollantwort, untersucht. Das konditionierte Medium wurde mit mIL-3-freiem RPMI-Medium auf Konzentrationen von 50%, 25%, 12,5,%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% und 0,375% verdünnt. 100 μl des verdünnten konditionierten Mediums wurden zu den BaF3/KZ134/Zalpha11-Zellen gegeben. Der Assay, welcher das konditionierte Medium verwendete, wurde parallel anhand nicht-transfizierter BaF3/KZ134-Zellen als Kontrolle durchgeführt. Das Gesamt-Assay-Volumen betrug 200 μl. Die Assay-Platten wurden bei 37°C, 5 CO₂ für 24 Stunden inkubiert; zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 2.000 rpm pelletiert; dann wurde das Medium abgezogen und 25 μl Lyse-Puffer (Promega) zugegeben. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten hinsichtlich der Aktivierung des STAT-Reporter-Konstrukts durch Lesen auf einem Luminometer (Labsystems Luminoskan, Modell RS), wobei 40 μl Luciferase-Assay-Substrat (Promega) bei einer Fünf-Sekunden-Integration zugegeben wurden, bewertet.
Die Ergebnisse bestätigten die STAT-Reporter-Antwort der BaF3/KZ134/Zalpha11-Zellen auf den humanen Zalpha11-Liganden. Die gemessene Antwort lag ungefähr 50-fach über der "Nur-Medium-Kontrolle" bei 50%iger Konzentration. Die STAT-Aktivierung als Antwort auf den humanen Zalpha11-Liganden lag in den nicht-transifzierten BaF3/KZ134-Kontrollzellen nicht vor, was zeigt, dass die Antwort durch den Zalpha11-Rezeptor-vermittelt wird.
Die Ergebnisse bestätigten außerdem die STAT-Reporter-Antwort der BaF3/KZ134/Zalpha11-Zellen auf den Maus-Zalpha11-Liganden. Die gemessene Antwort lag ungefähr 40-fach über der "Nur-Medium-Kontrolle" bei 50%iger Konzentration. Außerdem wurde eine STAT-Aktivierung als Antwort auf den Maus-Zalpha11-Liganden (etwa 5-fach) auf den nicht-transfizierten BaF/KZ134-Kontrollzellen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die murinen BaF3-Zellen einen endogenen Maus-Rezeptor aufweisen.
Beispiel 20
Der Maus-Zalpha11-Ligand ist aktiv in einem Maus-Knochenmark-Assay
A. Isolierung von nicht-adhärenten Knochenmarkzellen mit niedriger Dichte
Frisches Femur-Aspirat (Knochenmark) wurde von 6-10 Wochen alten männlichen Balb/C- oder C57BL/6-Mäusen gewonnen. Das Knochenmark wurde dann mit RPMI + 10 FBS QRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) gewaschen und in RPMI + 10% FBS als Gesamt-Knochenmark-Zellsuspension suspendiert. Die Gesamtmark-Zellsuspension wurde dann einem Dichtegradienten (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL) unterworfen, um die größtenteils mononuklearen Zellen mit geringer Dichte folgendermaßen anzureichern: Die Gesamt-Knochenmark-Zellsuspension (etwa 8 ml) wurde sorgfältig auf etwa 5 ml Nycoprep-Gradienten-Lösung in einem konischen 15-ml-Röhrchen pipettiert und dann 20 Minuten bei 600 × g zentrifugiert. Die Zwischenschicht, welche die mononuklearen Zellen mit geringer Dichte enthielt, wurde dann entfernt, mit einem Überschuss an RPMI + 10% FBS gewaschen und durch 5- bis 10-minütige Zentrifugation bei 400 × g pelletiert. Dieses Pellet wurde in RPMI + 10% FBS resuspendiert und mit ungefähr 10⁶ Zellen/ml in einer T-75-Flasche ausplattiert und bei 37°C, 5% CO₂ für ungefähr 2 Stunden inkubiert. Die resultierenden Zellen in Suspension waren nicht-adhärente Knochenmarkzellen mit geringer Dichte (NA LD).
B. 96-Kammer-Assav
Die NALD-Maus-Knochenmarkzellen wurden mit 25.000 bis 45.000 Zellen/Kammer in 96-Kammer-Gewebe-Kulturplatten in RPMI + 10% FBS + 1 ng/ml Maus-Stammzellfaktor (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, NM), plus 5% konditioniertes Medium aus: (1) BHK-570-Zellen, welche den Maus-Zalpha11-Liganden (SEQ ID NO: 47) exprimieren, (2) BHK-570-Zellen, welche den humanen Zalpha11-Liganden (SEQ ID NO: 10) exprimieren, oder (3) Kontroll-BKH-570-Zellen, welche den Vektor enthalten und keinen Liganden exprimieren, ausplattiert. Diese Zellen wurden dann verschiedenen Cytokin-Behandlungen ausgesetzt, um die Expansion oder Differenzierung der hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmark zu untersuchen. Für den Test wurden die ausplattierten NALD-Maus-Knochenmarkzellen humanem Interleukin-15 (hIL-15) (R&D Systems) oder einem Cytokin aus einer anderen Cytokin-Reihe (R&D Systems) ausgesetzt. Es wurden serielle Verdünnungen von hIL-15 oder den anderen Cytokinen getestet, wobei 2-fach serielle Verdünnungen von Konzentrationen von etwa 50 ng/ml bis zu etwa 6.025 ng/ml verwendet wurden. Nach 8 bis 12 Tagen wurde die Zellproliferation in den 96-Kammer-Assays durch einen Alamar-Blue-Assay, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt.
C. Ergebnisse aus dem 96-Kammer-NALD-Maus-Knochenmark-Assay
Konditioniertes Medium von BHK-Zellen, welche sowohl den Maus- als auch den humanen Zalpha11-Liganden exprimieren, wirkte zusammen mit hIL-15, um die Expansion einer Population hämatopoetischer Zellen in NALD-Maus-Knochenmark zu fördern. Diese Expansion hämatopoetischer Zellen wurde nicht bei den Kontroll-BHK-Zellen mit konditioniertem Medium plus IL-15 beobachtet. Die Population hämatopoietischer Zellen, die durch den Maus-Zalpha11-Liganden mit hIL-15 expandierte, und die Population hämatopoetischer Zellen, die durch den humanen Zalpha11-Liganden mit hIL-15 expandierte, wurden weiter in Zellkultur gehalten. Diese hämatopoetischen Zellen wurden mit einem Phycoerythrin-markierten Anti-Pan-NK-Zell-Antikörper (Pharmingen) gefärbt und einer Fließcytometrie-Analyse unterzogen, die zeigte, dass die expandierten Zellen positiv bezüglich dieses natürlichen NK(Natural Killer)-Zellmarkers anfärbten.
Der gleiche 96-Kammer-Assay wurde unter Verwendung von frischen humanen Knochenmarkzellen, bezogen von Poietic Technologies, Galthersburg, MD, durchgeführt. Wiederum führten der Maus- und der humane Zalpha11-Ligand zusammen mit IL-15 zu einer Expansion einer hämatopoietischen Zellpopulation, welche unter Verwendung der oben offenbarten Antikörper positiv bezüglich des NK-Zellmarkers anfärbte.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise Zalpha11/IL-2Rγ, können in diesem Assay verwendet werden, um die Bindung, antagonistische oder inhibitorische Wirkungen des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, auf den Zalpha11-Liganden zu bestimmen.
Beispiel 21
Aufreinigung des Zalpha11-MBP-Rezeptors
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeitsschritte bei 4°C durchgeführt. Das folgende Verfahren wurde angewendet, um humane (oder Maus) lösliche Zalpha11-MBP-Rezeptor-Fusionen aus E. coli aufzureinigen (Beispiel 8). Vor-zentrifugierter, gefrorener E.-coli-Brei wurde aufgetaut und in 2 Litern Puffer B (0,02 M TRIS (EM Science), 0,2 M NaCl (Mallincrodt), 0,01 M 2-Mercapto-Ethanol (EM Science), pH 8,0, mit 5 mg/l Pepstatin A (Boehringer Mannheim), 5 mg/l Aprotinin (Boehringer Mannheim) und 1 mg/l PMSF (Fluka)) plus 1-2 ml eines Anti-Schaummittels AF289 Antifoam (Sigma) verdünnt. Die Mischung wurde in einem vorgekühlten French-Press-Zellzerstörer (Constant Systems LTD) mit 20-30 kPSI bearbeitet.
Das Lysat wurde dann 45 Minuten bei 18.000 × g und 4°C zentrifugiert; der Überstand wurde aufbewahrt. Eine 200-ml-Aufschlämmung von Amylose-Harz (New England BioLabs), pre-äquilibriert in Puffer A (0,02 M TRIS (EM Science), 0,2 M NaCl (Mallincrodt), 0,01 M 2-Mercapto-Ethanol (EM Science), pH 8,0) wurde dem Lysat-Überstand zugegeben und das Ganze über Nacht in 2-l-Rollflaschen inkubiert, um eine maximale Batch-Absorption des MBP-Fusionsproteins zu ermöglichen. Das Harz wurde im Batch-Säulenformat mit ≥ 5 Säulenvolumen Puffer A gewaschen und dann mit Puffer C (Puffer A mit 0,02 M Maltose (Sigma)) schubweise(Batch)-eluiert. Die rohen Fraktionen wurden gesammelt und die Absorbanz bei 280 nm verfolgt.
Das eluierte Protein wurde durch SDS-NuPAGE (NOVEX) Coomassie(Sigma)-Färbung analysiert. Die Probe und der Großteil des Proteins wurden bei –80°C gelagert.
Beispiel 22
Aktivität von durch den humanen und den Maus-Zalpha11-Liganden expandierten Zellen und reifen murinen NK-Zellen in NK-Zell-Cytotoxizitäts-Assays
A. NK-Zell-Assay
NK-Zell-vermittelte Target-Cytolyse wurde durch einen Standard-⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay untersucht. Den Target-Zellen (K562-Zellen (ATCC Nr. CCL-243) in humanen Assays und YAC-1-Zellen (ATCC Nr. TIB-160) in Maus-Assays) fehlt die Expression der Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex(MHC)-Moleküle, welche sie empfänglich für NK-Zell-vermittelte Lyse machen. Eine Negativ-Kontroll-Target-Zelllinie in Maus-Assays ist die Zelllinie MHC⁺-Thymoma-EL4 (ATCC Nr. TIB-39). K562-, EL4- und YAC-1-Zellen wurden in RP10- Medium (Standard RPMI 1640 (Gibco/BRL, Grand Island, NY), supplementiert mit 10% FBS (Hyclone, Logan, UT) sowie 4 mM Glutamin (Gibco/BRL), 100 I.U./ml Penizillin + 100 MCG/ml Streptomycin (Gibco/BRL), 50 μM β-Mercaptoethanol (Gibco/BRL) und 10 mM HE-PES-Puffer (Gibco/BRL)), kultiviert. Am Tag des Assays wurden 1-2 × 10⁶ Targetzellen geerntet und mit 2,5-5 × 10⁶ Zellen/ml in RP10-Medium resuspendiert. Es wurden 50-100 μl 5 mCi/ml ⁵¹Cr-Natriumchromat (NEN, Boston, MA) direkt zu den Zellen gegeben; diese wurden für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, dann zweimal mit 12 ml PBS gewaschen und in 2 ml RP10-Medium resuspendiert. Nach Zählen der Zellen auf einem Hämacytometer wurden die Targetzellen auf 0,5-1 × 10⁵ Zellen/ml verdünnt und 100 μl (0,5-1 × 10⁴ Zellen) mit den Effektorzellen, wie im Folgenden beschrieben, gemischt. ⁵¹Cr-Freisetzung wurde aus der Formel 100 × (X – Y)/(Z – Y) berechnet, wobei X die ⁵¹Cr-Freisetzung in Gegenwart der Effektorzellen, Y die spontane Freisetzung in Abwesenheit von Effektoren und Z die gesamte ⁵¹Cr-Freisetzung von Targetzellen, inkubiert mit 0,5% Triton X-100, sind. Die Daten wurden als prozenuale spezifische Lyse gegen das Effektor-zu-Target-Verhältnis in jeder Kammer aufgetragen.
In den humanen Assays wurden die Effektorzellen aus selektierten und expandierten humanen CD34⁺-BM-Zellen präpariert, welche geerntet, gewaschen, gezählt, in verschiedenen Konzentrationen mit ⁵¹Cr-markierten Targetzellen gemischt und in 96-Kammer-Rundboden-Platten für 4 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Nach Co-Inkubation der Effektorzellen und der markierten Targetzellen wurde die Hälfte des Überstands aus jeder Kammer gesammelt und in einem Gamma-Counter 1 Minute/Probe gezählt. Der prozentuale Anteil der spezifischen
B. Aktivität von durch den humanen Zalpha11-Liganden expandierten Zellen
Isolierte humane CD34⁺ HPCs, kultiviert mit flt3 +/– Zalpha11-Ligand und flt3 + IL-15 +/– Zalpha11-Ligand, wurden an Tag 15 geerntet, um ihre Fähigkeit zur Lyse von MHC^–-K562-Zellen in einem Standard-⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay, wie oben beschrieben, zu bewerten und ihren Oberflächen-Phänotyp durch Fließcytometrie zu analysieren. Wie auf Grund vorangegangener Veröffentlichungen zu erwarten war (Mrozek, E. et al., Blood 87: 2632-2640, 1996; Yu, H. et al., Blood 92: 3647-3657, 1998), induzierte die gleichzeitige Zugabe von IL-15 und flt3L das Auswachsen einer kleinen Population von CD56⁺-Zellen. Obwohl BM-Zellen, die gleichzeitig mit dem Zalpha11-Liganden und flt3L kultiviert worden waren, nicht signifikant expandierten, trat interessanterweise ein signifikanter Anstieg der Gesamtzellzahlen in Kulturen auf, welche eine Kombination aus flt3L, Zalpha11-Ligand und IL-15 enthielten.
Für eine Bewertung des Oberflächen-Phänotyps dieser humanen BM-Kulturen wurden kleine Aliquots der Zellen für eine 3-Farben-Fließcytometrie-Analyse mit Anti-CD3-FITC-, Anti-CD56-PE- und Anti-CD16-CyChrome-mAks (alle von PharMingen, San Diego, CA) angefärbt und auf einem FACSCalibur unter Verwendung von CellQuest-Software (Becton Dickinson, Mountaln View, CA) analysiert. Diese fließcytometrische Analyse bestätigte, dass die Zellen, die aus diesen Kulturen auswuchsen, differenzierte NK-Zellen waren, da sie groß und granulär waren und sowohl CD56 als auch CD16 exprimierten und CD3^– waren (Lanier, LL Annu. Rev. Immunol. 16: 359-393, 1998). Des Weiteren wiesen diese Zellen eine signifikant höhere Effektor-Funktion auf als die Zellen, die mit IL-15 und flt3 kultiviert worden waren. Insbesondere lysierten die Zellen, die mit allen drei Cytokinen kultiviert worden waren, mehr als 40% der K562-Targets mit einem Effektor-zu-Target-Verhältnis (E:T) von 1,5, während Zellen, die in IL-15 + flt3L kultiviert wurden, weniger als 5% der Target-Zellen mit einem E:T von 2 lysierten. Diese Daten zeigen, dass der Zalpha11-Ligand (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) zusammen mit IL-15 die Differenzierung von NK-Zellen aus CD34⁺-BM-Zellen stimuliert.
C. Aktivierung von durch den Maus-Zalpha11-Liganden expandierten Zellen
Um die Wirkungen des Maus-Zalpha11-Liganden (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) auf murine hämatopoetische Vorläuferzellen zu testen, wurden gereinigte, Linien-negative (Lin-)Knochenmarkzellen von C57B1/6-Mäusen in flt3 + IL-15 +/– Zalpha11-Ligand expandiert. An Tag 6 der Kultur wurden die Zellen ("Effektoren") geerntet und gezählt, dann in 0,4 ml RP10-Medium (Beispiel 22A) resuspendiert. Zwei Aliquots (jeweils 0,15 ml) jeder Probe, die mit oder ohne Zalpha11-Ligand (Beispiel 22A) expandiert wurden, wurden seriell 3-fach im Doppel in 96-Kammer-Rundboden-Platten verdünnt, so dass insgesamt 6 Kammern mit jeweils 100 μl erhalten wurden. Die verbleibenden 100 ul an Zellen wurden zum Nachweis von NK-Zelloberflächen-Markern mit FITC-Anti-2B4- und PE-Anti-DX5-mAks (PharMingen) gefärbt und durch Fließcytometrie analysiert. Jede Gruppe der Zellen, die flt3 + IL-15 mit oder ohne Anwesenheit des Maus-Zalpha11-Liganden ausgesetzt worden waren, wiesen ähnliche Fraktionen von 2B4+DX5+-Zellen auf und waren bezüglich beider NK-Marker zu 65-75% positiv.
Für den NK-Lyse-Assay wurden die Targetzellen (YAC-1 und EL4), wie oben beschrieben, mit ⁵¹Cr markiert. Nach dem Zählen der Targetzellen auf einem Hämacytometer wurden die Targetzellen auf 0,5-1 × 10⁵ Zellen/ml verdünnt; 100 μl YAC-1 oder EL4 (0,5-1 × 104 Zellen) wurden mit 100 μl Effektor-Zellen gemischt und für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die spezifische Lyse wurde für jede Kammer wie oben beschrieben bestimmt.
Es stellte sich heraus, dass Zellen, die in Gegenwart von flt3 + IL-15 + Zalpha11-Ligand wuchsen, verstärkte lytische Aktivität (ungefähr 2-fach) gegenüber den YAC-1-Zielzellen aufwiesen (jedoch nicht die MHC⁺-Kontrollzelllinie EL4 abtöteten). Bei einem Effektor-zu-Target-Verhältnis (E:T) von 5 lysierten die NK-Zellen, die in Gegenwart aller drei Cytokine (Zalpha11- Ligand + flt3 + IL-15) erzeugt worden waren, 12% der YAC-1-Zellen, während die NK-Zellen, die mit flt3 + IL-15 expandiert worden waren, 6% der YAC-1-Zielzellen lysierten. Nachfolgende Experimente bestätigten diesen Trend.
In einem zweiten Ansatz zur Bestimmung der biologischen Aktivität des Zalpha11-Liganden auf murine NK-Zellen wurden unreife CD4^–CD8^– ("doppelnegativ", DN) Maus-Thymocyten unter Anwendung von Routineverfahren isoliert und mit IL-15 + flt3 + IL-7 oder IL-15 + flt3 + IL-2 mit oder ohne Zalpha11-Ligand kultiviert. An Tag 6 der Kultur wurden die Zellen geerntet und bezüglich lytischer NK-Aktivität auf YAC-1- und EL4-Zellen, wie oben beschrieben, getestet. Es stellte sich heraus, dass Zellen, die in Gegenwart von Zalpha11-Ligand kultiviert worden waren, die größte lytische Aktivität in diesem Assay aufwiesen, wobei eine verstärkte lytische Aktivität im Vergleich zu solchen Zellen gefunden wurde, die in Gegenwart anderer Cytokine kultiviert wurden. Insbesondere töteten DN-Thymocyten, die mit IL-15 + flt3 + IL-7 wuchsen, 18% der YAC-1-Zellen mit einem E:T von 24, während Zellen, die in Gegenwart von IL-15 + flt3 + IL-7 plus Zalpha11-Ligand wuchsen, 48% der Zielzellen bei gleichem E:T abtöteten. DN-Thymocyten, die in IL-15 + flt3 + IL-2 wuchsen, töteten 15% der YAC-1-Zielzellen mit einem E:T von 6, während Zellen, die mit diesen drei Cytokinen und Zalpha11-Ligand wuchsen, 35% der YAC-1-Zellen mit einem E:T von 9 abtöteten. Einen Tag vor dem NK-Lyse-Assay wurde an den kultivierten Zellen eine Fließcytometrie durchgeführt. Wie bei den Knochenmark-Kulturen verstärkte der Zalpha11-Ligand trotz seiner proliferativen Wirkung (die Zellzahlen stiegen um das ungefähr 2-fache bei Zugabe des Zalpha11-Liganden an) nicht signifikant die Fraktion an DX5⁺-Zellen (17-20% der Gesamtzellen in den Kulturen mit IL-7 und 35-46% der Gesamtzellen in den Kulturen mit IL-2). Diese Daten weisen darauf hin, dass der Zalpha11-Ligand, in Kombination mit IL-15 und flt3, die lytische Aktivität von NK-Zellen, die aus murinem Knochenmark oder Thymus stammen, verstärkt.
D. Aktivität des Maus-Zalpha11-Liganden auf reife murine NK-Zellen
Um die Wirkungen des Maus-Zalpha11-Liganden auf reife NK-Zellen zu testen, wurden die Milzen von vier 5 Wochen alten C57B1/6-Mäusen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) isoliert und mit Glas-Objektträgern mit geschliffenem Ende zu Brei zerquetscht, um eine Zellsuspension herzustellen. Die roten Blutzellen wurden durch hypotonische Lyse folgendermaßen entfernt: Die Zellen wurden pelletiert und der Überstand durch Absaugen entfernt. Das Zellpellet wurde durch gemäßigtes Vortexen zerstört; dann wurden 900 μl steriles Wasser unter Schütteln zugegeben und gleich danach (weniger als 5 Sekunden später) 100 μl 10 × HBSS (Gibco/BRL). Die Zellen wurden dann in 10 ml 1 × HBSS resuspendiert und die Zelltrümmer durch Passieren der Zellen über ein Nylon-Maschen-Zellsieb (Falcon) entfernt. Diese von RBC befreiten Milzzellen wurden dann pelletiert und in MACS-Puffer (PBS + 1% BSA + 1 mM ED TA) resuspendiert und gezählt. Es wurden 300 × 10⁶ der Zellen mit Anti-DX5-beschichteten magnetischen Beads (Miltenyi Biotec) angefärbt und DX5⁺-NK-Zellen über eine MACS-VS+-Trennungssäule gemäß den Anweisungen des Herstellers positiv selektiert, wodurch 8,4 × 10⁶ DX5⁺-Zellen und 251 × 10⁶ DX5^–-Zellen gewonnen wurden. Jede dieser Zellgruppen wurde in 24-Kammer-Platten (0,67 × 10⁶ Zellen/Kammer, 2 Kammern pro Behandlungsbedingung) in RP10-Medium (Beispiel 22A) allein oder mit: 1) 30 ng/ml Maus-Zalpha11-Ligand (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217), 2) 30 ng/ml rekombinantem Maus-IL-2 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), 3) 30 ng/ml rekombinantem humanen IL-15 (R&D), 4) jeweils 30 ng/ml Maus-Zalpha11-Ligand und hIL-15, oder 5) jeweils 30 ng/ml mIL-2 und hIL-15 kultiviert. Die Zellen wurden nach 21 Stunden geerntet, gewaschen und in RP10-Medium resuspendiert und gezählt. Die Zellen wurden dann auf ihre Fähigkeit getestet, ⁵¹Cr-markierte YAC-1- oder EL4-Zielzellen, wie in Beispiel 22A beschrieben, zu lysieren.
Im Allgemeinen trat eine geringe NK-Aktivität bei den DX5^–(Nicht-NK-Zellen)-Gruppen auf, die DX5^–-Zellen, die mit Zalpha11-Ligand und hIL-15 kultiviert wurden, lysierten jedoch 25% der YAC-1-Zielzellen mit einem E:T von 82. Im Vergleich dazu lysierten DX5^–-Zellen, die mit hIL-15 allein kultiviert wurden, 14% der YAC-1-Zielzellen mit einem E:T von 110. Dies deutet darauf hin, dass der Zalpha11-Ligand und IL-15 zusammen auf die verbleibenden NK1.1⁺-NK-Zellen in dieser Zellpräparation wirken. Bei der DX5⁺-Zell-Präparation führte eine Behandlung mit dem Maus-Zalpha11-Liganden allein zu keiner signifikanten Erhöhung ihrer Effektor-Funktion (die Lyse der YAC-1-Zellen war ähnlich wie die der unbehandelten Gruppen). Wie erwartet, verbesserten sowohl IL-2 als auch IL-15 signifikant die NK-Aktivität. Die höchsten Lyse-Niveaus wurden jedoch in der Gruppe nachgewiesen, die mit Zalpha11-Ligand und hIL-15 behandelt wurde (65% Lyse der YAC-1-Zellen bei einem E:T von 3,3 vs. 45% Lyse bei einem E:T von 4 bei der hIL-15-behandelten Gruppe). Zusammengefasst weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass obwohl der Zalpha11-Ligand allein die NK-Zell-Lyse-Aktivität nicht erhöhen kann, er die NK-Lyse-Aktivität auf reife NK-Zellen verstärkt, wenn er zusammen mit IL-15 verabreicht wird.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, können in diesem Assay verwendet werden, um die Bindung, antagonistische oder inhibitorische Wirkungen des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, auf den Zalpha11-Liganden zu bestimmen.
Beispiel 23
Proliferation von humanen und Maus-T-Zellen durch den Zalpha11-Liganden in einem T-Zell-Proliferations-Assay
A. Proliferation von Maus-T-Zellen durch den murinen Zalpha11-Liganden
T-Zellen von C57B1/6-Mäusen (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) wurden aus einem Pool von Milzzellen und Lymphocyten aus axillaren, brachialen, inguinalen, cervicalen und mesenterischen Lymphknoten (LNs) isoliert. Die Milzgewebe wurden mit dem matt geschliffenen Ende eines Glas-Objektträgers zerquetscht, um eine Zellsuspension herzustellen. Die Lymphknoten wurden mit Pinzetten auseinandergezogen und durch ein Zellsieb passiert, um die Zelltrümmer zu entfernen. Die gesammelten Milzzellen und Lymphknotenzellen wurden unter Verwendung zwei aufeinander folgender magnetischer MACS-Trennungssäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) in CD8⁺- und CD4⁺-Untergruppen getrennt. Von den gleichen Mäusen wurden Gesamt-Thymocyten gewonnen.
Die Zellen wurden mit 3 × 10⁵ Zellen/Kammer (Thymocyten) oder 10⁵ Zellen/Kammer (reife T-Zellen) mit ansteigenden Konzentrationen des gereinigten murinen Zalpha11-Liganden (0-30 ng/ml) (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) in 96-Kammer-Flachboden-Platten, die über Nacht bei 4°C mit verschiedenen Konzentrationen Anti-CD3-mAk-2C11 (PharMingen) beschichtet worden waren, für 3 Tage bei 37°C inkubiert. Die Anti-CD3-Antikörper dienten der Aktivierung der murinen T-Zellen durch den T-Zell-Rezeptor. Jede Kammer wurde an Tag 2 mit 1 μCi ³H-Thymidin gepulst; die Platten wurden geerntet und 16 Stunden später gezählt, um die Proliferation zu untersuchen.
Als der Zalpha11-Ligand in T-Zell-Proliferations-Assays getestet wurde, stellte sich heraus, dass es zu einer Co-Stimulation Anti-CD3-aktivierter muriner Thymocyten kam, was zu einem beschleunigten Auswachsen der CD8⁺CD4^–-Zellen führte (der Hauptteil der mit dem Anti-CD3 + Zalpha11-Liganden kultivierten Thymocyten war an Tag 3 der Kultur CD8⁺CD4^–, während Zellen, die mit Anti-CD3 allein kultiviert wurden, bis Tag 5 keine signifikante Entwicklung zu diesem Phänotyp zeigte). In Abwesenheit von Anti-CD3 wurde keine signifikante Proliferation der Thymocyten durch den Zalpha11-Liganden beobachtet.
Als reife periphere murine T-Zellen auf ihre Fähigkeit, auf den Zalpha11-Ligand + Anti-CD3 anzusprechen, getestet wurden, stellte sich interessanterweise heraus, dass lediglich die CD8⁺-, jedoch nicht die CD4⁺-Untergruppe, in einer Dosis-abhängigen Weise auf den Zalpha11-Liganden ansprach. Es wurde außerdem eine schwache, aber reproduzierbare Proliferation der CD8+-Zellen (jedoch nicht der CD4⁺-Zellen) als Antwort auf den Zalpha11-Liganden allein beobachtet. Interessanterweise wurde dies nicht bei humanen T-Zellen beobachtet (siehe Beispiel 22B).
B. Proliferation von humanen T-Zellen durch den humanen Zalpha11-Liganden
Humane CD4+- und CD8+-T-Zellen wurden, wie in Beispiel 14 beschrieben, aus PBMC isoliert. Die Zellen wurden mit etwa 10⁵ Zellen/Kammer mit ansteigenden Konzentrationen des gereinigten humanen Zalpha11-Liganden (0-50 ng/ml) (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) in 96-Kammer-Flachboden-Platten, die über Nacht bei 4°C mit verschiedenen Konzentrationen des anti-humanen CD3-mAk UCHT1 (PharMingen) beschichtet worden waren, für 3 Tage bei 37°C inkubiert. Jede Kammer wurde an Tag 2 mit 1 μCi ³H-Thymidin gepulst; die Platten wurden 16 Stunden später geerntet und gezählt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit den Maus-T-Zellen wiesen die vorläufigen Daten darauf hin, dass der humane Zalpha11-Ligand humane CD4+-, jedoch nicht CD8+-, T-Zellen in dosisabhängiger Weise co-stimuliert.
Der lösliche Zalpha11-Rezeptor oder ein lösliches heterodimeres Zalpha11-Polypeptid, wie beispielsweise das lösliche Zalpha11/IL-2Rγ, kann in diesem Assay verwendet werden, um die Bindung und die antagonistischen und inhibitorischen Wirkungen des löslichen Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen heterodimeren Zalpha11-Polypeptids, wie beispielsweise des löslichen Zalpha11/IL-2Rγ, an/auf den Zalpha11-Liganden zu bestimmen.
Beispiel 24
Monoklonale Antikörper gegen den humanen Zalpha11-Rezeptor
Monoklonale Antikörper gegen den Zalpha11-Rezeptor wurden durch Immunisierung von 5 männlichen BalbC-Mäusen (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) mit dem gereinigten rekombinanten Protein huzalpha11-CEE-BHK (Beispiel 6) hergestellt. Den Mäusen wurde jeweils eine anfängliche intraperitoneale (IP) Injektion von 20 mg des gereinigten Proteins in Freunds komplettem Adjuvanz (Pierce, Rockford, IL) gegeben; anschließend folgten intraperitoneale Booster-Injektionen von 10 mg gereinigtem Protein in Freunds inkomplettem Adjuvanz alle 2 Wochen. Sieben bis zehn Tage nach der Verabreichung der dritten Booster-Injektion wurde den Tieren Blut abgenommen und das Serum gesammelt.
Die Maus-Serum-Proben, die gegen den huzalpha11-CEE-BHK gerichtet wrden, wurden durch eine ELISA-Titer-Überprüfung unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem CHO-huzalpha11-Fc-Protein (Beispiel 10C) als Antikörper-Target charakterisiert. Eine Maus-Serum-Probe besaß einen Titer in Bezug auf das spezifische Antikörper-Target bei einer Verdünnung von 1:1.000.000 (1:1E6). Vier Maus-Serum-Proben besaßen Titer bezüglich des spezifischen Antikörper-Targets bei einer Verdünnung von 1:100.000 (1:1E5).
Es wurden Splenocyten von vier Hoch-Titer-Mäusen geerntet und mit murinen SP2/0-Myelomzellen unter Verwendung von PEG 1500 (Boehringer Mannheim, UK) in zwei separaten Fusionsverfahren unter Verwendung eines Fusionsverhältnisses von Splenocyten zu Mye lomzellen von 4:1 fusioniert (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Press). Nach 10 Tagen Wachstum nach der Fusion wurden spezifische Antikörper-produzierende Hybridome durch ELISA unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem humanem BHK-Zalpha11-Fc4-Protein (Beispiel 6C) als Antikörper-Target und durch FACS unter Verwendung von BaF3-Zellen, welche die huzalpha11-Sequenz (Beispiel 2) als Antikörper-Target exprimieren, identifiziert. Die resultierenden vier Hybridome, die bei beiden Verfahren positiv waren, wurden dreimal durch limitierende Verdünnung kloniert. Die Antikörper wurden als 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5 und 249.15.2.4.2.7 bezeichnet.
Beispiel 25
Dosis-Antwort-Studie des gereinigten rekombinanten humanen Zalpha11-Rezeptor-Proteins in normalen Mäusen
A. Zusammenfassung
Normale neun Wochen alte weibliche C57B1/6-Mäuse (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) wurden einmal täglich über sieben Tage mit einer von drei Dosismengen des gereinigten rekombinantem humanen löslichen Zalpha11-Fc4-Rezeptors (Beispiel 6C) (5, 50 oder 250 μg/Maus/Tag) oder einem PBS-Vehikel plus 250 μg pro Dosis BSA durch intraperitoneale Injektion behandelt. Die Körpergewichte wurden täglich aufgezeichnet. An Tag sieben wurden die fünf Mäuse aus der Gruppe mit der höchsten Dosis und die fünf Mäuse der Vehikel-Kontrollgruppe getötet. Es wurden das Blut, das Knochenmark und Gewebe gewonnen und analysiert. Die verbleibenden Mäuse wurden am folgenden Tag getötet und die Entnahmen vorgenommen. Es wurden potentielle Störungen in den Lymphoid-Geweben sowie allgemeine physiologische und toxikologische Parameter untersucht.
Es lag kein klinisches Anzeichen für Toxizität vor. Leber, Nieren, Milz, Thymus und Gehirn wurden gewogen; es wurden keine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen bezüglich der Organgewichte festgestellt. In den untersuchten Geweben wurden keine histologischen Veränderungen festgestellt.
B. Herstellung der Dosislösung
Gereinigtes rekombinantes Zalpha11-Rezeptor-Fc4-Fusionsprotein (Zalpha11-Fc4) (Beispiel 6C) wurde in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (Gibco/BRL, Grand Island, NY) mit Konzentrationen zur Abgabe von 5, 50 oder 250 Mikrogramm des Proteins in 0,1 ml PBS-Vehikel verdünnt. Bovines Serum-Albumin (BSA) (Sigma, St. Luois, MO) wurde in PBS gelöst, um eine 250-μg-Dosis pro 0,1 ml herzustellen; diese wurde dann durch einen 0,2-μm-Spritzen-Filter für die Vehikel-Kontroll-Behandlung filtriert. Die Lösungen für die tägliche Dosis wurden an Tag 0 hergestellt, aliquotiert und in einem Gefrierschrank bei –20°C bis zur Verwendung eingefroren. Am Tag der Verabreichung wurden die entsprechenden Aliquots aufgetaut und 0,1 ml der Lösung intraperitoneal über sieben Tage im Laufe des Vormittags injiziert.
C. Studienaufbau
Zu Beginn der Studie waren die Mäuse neun Wochen alt. Jede Zalpha11-Fc4-Behandlungsgruppe bestand aus fünf Mäusen; die Kontrollgruppe umfasste 10 Mäuse. Die Mäuse mit der höchsten Dosis und die Hälfte der Kontrollmäuse wurden am Tag nach der letzten von sieben Behandlungen getötet (Tag 7). Die beiden Gruppen mit den niedrigeren Dosen und der Rest der Kontrollgruppe wurden am darauf folgenden Tag (Tag 8) getötet.
Die Körpergewichte der Mäuse wurden während der Behandlung täglich aufgezeichnet. Es bestand kein Unterschied in der Gewichtszunahme zwischen den behandelten Gruppen während der Behandlungswoche.
Die nach der Tötung entnommenen Gewebe zur Untersuchung der Lymphocyten-Populationen durch FACS-Analyse umfassten Knochenmark, Thymus und Milz. Fließcytometrie-Analyse der Lymphoid-Organe und des Knochenmarks wurde mit dem FACSCalibur (Becton Dickinson, Mansfield, MA) durchgeführt. Zu den entnommenen Geweben zur histologischen Untersuchung auf Anzeichen von Toxizität des Proteins zählten: Milz, Thymus, Leber, Niere, Nebennierendrüse, mesenterischer Lymphknoten, Duodenum, Pankreas, Jejunum, Sternum, Uterus, Ovarien, Narn- und Gallenblasen, Speicheldrüse, Herz und Lungen. Alle Gewebe wurden zur Histologie fixiert und bei 4°C über Nacht in 10%iger normaler gepufferter Salzlösung (Surgipath, Richmond, IL) aufbewahrt. Am folgenden Tag wurde das NBF durch 70% Ethanol ersetzt; die Gewebe wurden bis zur Weiterverarbeitung für die Histologie wieder auf 4°C gebracht.
Die Gewebe wurden bearbeitet und für eine H&E-Analyse im Hause angefärbt; anschließend wurden sie an den Vertragspathologen David Falrchild geschickt. Das Blut wurde zur Zählung der Gesamt-Blutzellen und zur Erstellung von Serum-Chemie-Profilen gesammelt. Die CBCs wurden im Haus mit der Hämatologie-Analysevorrichtung Cell Dyn 3500 (Abbott Diagnostics Division, Abbott Park, IL) durchgeführt. Das Serum wurde in einem Gefrierschrank bei –20°C bis zur Übersendung an Phoenix Central Laboratory (Everett, WA) zur Durchführung kompletter Serum-Chemie-Reihen eingefroren. Zum Vergleich der Myeloid-Erythoid-Verhältnisse zwischen den 250-μg-Dosis-Gruppen von Zalpha11R und BSA wurde ein Aliquot des Knochenmarks von einem Femur auf CytoSpin-Objektträger aufgetragen (CYTOSPIN 3 CYTOCENTRIFUGE und CYTO SLIDES, Shandon, Pittsburgh, PA). Die Knochenmark-Objektträger wurden bei Phoenix Central Laboratories analysiert.
D. Ergebnisse der Studien
Es bestanden keine ersichtlichen klinischen Hinweise auf physiologische Wirkungen oder auf Toxizität des Rh-Zalpha11R-Fc4-Fusionsproteins bei den getesteten Dosen (250 μg/Tag oder darunter). Die Körpergewichte blieben während der Behandlungsdauer normal. Die Zahlen der roten Blutzellen und Blutplättchen waren normal. Bei zwei Mäusen in der 250-μg-Dosis-Zalpha11-Fc4-Gruppe ergab die differentielle WBC-Zählung eine mögliche Erhöhung des prozentualen Anteils der Monocyten; jedoch wiesen die anderen drei Mäuse in der Gruppe prozentuale Monocyten-Anteile auf, die äquivatent zu dem Durchschnitt der Kontrollmäuse waren. Die unterschiedliche Anzahl der weißen Blutzell-Monocyten wurde als nicht signifikant betrachtet. Es traten keine weiteren Unterschiede bei den Zählungen des Gesamtbluts auf. Die Knochenmark-Cytologie zeigte keine Verschiebung in den Myeloid- und Eryhroid-Verläufer-Populationen, und alle vorliegenden Zelltypen erschienen normal. Alle Chemie-Parameter des Standardserums lagen in normalen Bereichen. Es traten keine Unterschiede zwischen den behandelten Gruppen bezüglich des Gewichts von Thymus, Milz, Niere, Leber oder Gehirn auf. Die histologische Bewertung der folgenden Gewebe zeigte keine Anzeichen für Abnormalitäten: Thymus, Milz, Leber, Niere, Nebennierendrüse, Duodenum, Pankreas, Jejunum, Blinddarm, Darm, mesenterische Lymphknoten, Uterus, Ovarien, Speicheldrüse, Herz, Trachea, Lunge und Gehirn. Das Nicht-Vorliegen von physiologischen Wirkungen in normalen Mäusen zeigt, dass der lösliche Zalpha11-Rezeptor geringe Toxizität in vivo aufweist, was für ein therapeutisches Agens wünschenswert ist.
Beispiel 26
Zalpha11-Ligand-abhängige Proliferation von B-Zellen, stimuliert mit Anti-CD40 oder Anti-IgM
A. Aufreinigung humaner B-Zellen
Ein Gefäß, enthaltend 1 × 10⁸ gefrorene, apherisierte humane periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs), wurde in einem 37°C-Wasserbad schnell aufgetaut und in 25 ml B-Zell-Medium (RPMI-Medium 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum, 5% L-Glutamin, 5% Pen/Strep) (Gibco BRL)) in einem 50-ml-Röhrchen (Falcon VWR, Seattle, WA) resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypan Blue (Gibco BRL) auf ihre Lebensfähigkeit getestet. Zehn ml Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc. Piscataway, NJ) wurden unter die Zellsuspension geschichtet; das Ganze wurde 30 Minuten bei 1.800 rpm zentrifugiert, wobei mit ausgeschalteter Bremse gestoppt wurde. Die Zwischenschicht wurde dann entfernt und in ein frisches 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt, mit PBS auf ein Endvolumen von 40 ml gebracht und 10 Minuten bei 1.200 rpm zentrifugiert, wobei die Bremse eingeschaltet war. Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen wurde unter Verwendung von Trypan Blue getestet. Gleichzeitig wurde frisch entnommenes humanes Blut 1:1 mit PBS (Gibco BRL) verdünnt und über Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia) geschichtet, wie oben beschrieben zentrifugiert und gewaschen. Mit den aus frischen und gefrorenen Quellen isolierten Zellen wurden äquivalente Ergebnisse erhalten.
Die B-Zellen wurden aus den Ficoll-behandelten peripheren Blutzellen von normalen humanen Spendern (oben) mit magnetischen Anti-CD19-Beads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Die Reinheit der resultierenden Präparationen wurde durch Fließcytometrie-Analyse mit einem Anti-CD22-FITC-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA) verfolgt. Die B-Zell-Präparationen besaßen typischerweise eine Reinheit von > 90%.
B. Aufreinigung muriner B-Zellen
Eine Suspension muriner Splenocyten wurde hergestellt, indem die Milzen adulter C57B1/6-Mäuse (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) mit Winkelnadeln in B-Zell-Medium zerrupft wurden. Die RBCs wurden durch hypotonische Lyse entfernt. CD43-positive Zellen wurden mit magnetischen CD43-Beads (Miltenyi Biotec) gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. Die Reinheit der resultierenden Präparationen wurde durch Fließcytometrie-Analyse mit einem Anti-CD45R-FITC-Antikörper (Pharmingen) verfolgt. Die B-Zell-Präparationen wiesen typischerweise eine Reinheit von > 90% auf.
C. Proliferation der Anti-CD40-stimulierten B-Zellen in Gegenwart des humanen oder murinen Zalpha11-Liganden
Die entweder vom Menschen oder der Maus stammenden B-Zellen wurden in einer Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml in B-Zell-Medium resuspendiert und mit 100 μl/Kammer in einer 96-Kammer-U-Bodenplatte (Falcon, VWR), enthaltend verschiedene Stimulationsbedingungen, ausplattiert, wodurch das Endvolumen auf 200 μl/Kammer gebracht wurde. Für die Anti-CD40-Stimulation wurden die humanen Kulturen mit 1 μg/ml Anti-Human-CD40 (Genzyme, Cambridge, MA) und die Mauskulturen mit 1 μg/ml Anti-Murin-CD40 (Serotec, UK) supplementiert. Der humane oder murine Zalpha11-Ligand (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) wurde in entsprechenden Verdünnungen im Bereich von 1 pg/ml-100 ng/ml zugegeben. Die Spezifität der Wirkung des Zalpha11-Liganden wurde durch Inhibierung des Zalpha11-Liganden mit 25 mg/ml löslichem humanem Zalpha11CEE (Beispiel 6A) bestätigt. Alle Behandlungen wurden dreifach durchgeführt. Die Zellen wurden dann bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator für 120 Stunden (Mensch) oder 72 Stunden (Maus) inkubiert. Sechzehn Stunden vor dem Ernten wurde 1 μCi ³H-Thymidin (Amersham, Piscataway, NJ) zu allen Kammern gegeben, um eine Proliferation der B-Zellen festzustellen. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Zellernters (Packard) in eine 96-Kammer-Filterplatte (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) gebracht und gemäß den Anweisungen des Herstellers gesam melt. Die Platten wurden bei 55°C für 20-30 Minuten getrocknet; der Boden der Kammern wurde mit einer lichtundurchlässigen Plattenabdichtung verschlossen. Zu jeder Kammer wurden 0,25 ml Szintillations-Flüssigkeit (Microscint-O, Packard) gegeben; dann wurde die Platte unter Verwendung eines TopCount-Mikroplatten-Szintillations-Zählers (Packard) gelesen.
Die Inkubation mit dem Zalpha11-Liganden in Konzentrationen von 3 ng/ml oder mehr verstärkte die durch lösliches Anti-CD40 induzierte Proliferation in einer dosisabhänigen Weise sowohl in den murinen als auch in den humanen B-Zellen um das 30-fache. Die murinen und die humanen B-Zellen sprachen auch gleich auf ihren jeweiligen Zalpha11-Liganden an. In beiden Arten war die Stimulation spezifisch für den Zalpha11-Liganden, da sie durch die Anwesenheit des löslichen Zalpha11-Rezeptors in der Kultur aufgehoben wurde.
D. Proliferation von Anti-IgM-stimulierten B-Zellen in Gegenwart des humanen oder murinen Zalpha11-Liganden
Die entweder vom Menschen oder der Maus stammenden B-Zellen (obige Abschnitte A und B) wurden wie oben beschrieben ausplattiert (Abschnitt C). Für die Anti-IgM-Stimulation der humanen Zellen wurden die Platten über Nacht mit 10 mg/ml F(ab')₂ anti-humanen IgM-Antikörpern (Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama) vorbeschichtet und unmittelbar vor der Verwendung mit sterilem Medium gewaschen. Die Kulturen wurden mit 0-10 ng/ml hu-rIL-4 (R&D Systems, Minneapolis, NM) supplementiert. Für die Anti-IgM-Stimulation der murinen Zellen wurde lösliches Anti-IgM (Biosource, Camarillo, CA) mit 10 mg/ml zu den Kulturen gegeben. Zu jeder der beschriebenen Anti-IgM/IL-4-Bedingungen wurde der humane oder murine Zalpha11-Ligand mit Verdünnungen im Bereich von 1 pg/ml bis 100 ng/ml, wie oben beschrieben, gegeben. Die Spezifität der Wirkung des Zalpha11-Liganden wurde durch Inhibierung mit löslichem humanem Zalpha11-Rezeptor (wie im obigen Abschnitt C beschrieben), bestätigt. Alle Behandlungen wurden 3-fach durchgeführt. Die Zellen wurden inkubiert, mit ³H-Thymidin markiert, geerntet und, wie im obigen Abschnitt C beschrieben, analysiert.
Die Inkubation mit Zalpha11-Ligand in Konzentration von 0,3 ng/ml oder mehr inhibierte die durch unlösliches Anti-IgM (Maus) oder Anti-IgM und IL-4 (Mensch) induzierte Proliferation in dosisabhängiger Weise. Die Inhibition war Zalpha11-Ligand-spezifisch, da sie durch die Gegenwart des löslichen Zalpha11-Rezeptors in der Kultur aufgehoben wurde.
E. B-Zell-Proliferation durch Anti-CD40 erfordert den IL-2-Rezeptor-Gamma Murine B-Zellen wurden gereinigt und mit dem monoklonalen Anti-CD40-Antikörper, wie in den obigen Beispielen 26B und C beschrieben, stimuliert. Die durch den murinen Zalpha11-Liganden induzierte Co-Stimulation wurde vollständig durch die Zugabe der monoklonalen Anti-IL-2-Rezeptor-Gamma(IL-2Rγ)-Antikörper welche die IL-2γ-Wirkung blockieren, blockiert. Die Antikörper 3E12 und TUG/m2 (PharMingen, San Diego, CA) wurden dem Proliferations-Assay mit 50 μg/ml zugegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass IL-2Rγ in B-Zellen physiologisch in die Zalpha11-Ligand-Stimulation von B-Zellen verwickelt ist. Des Weiteren liefern diese Ergebnisse einen indirekten funktionellen Beweis in vivo dafür, dass IL-2Rγ mit dem Zalpha11-Rezeptor in vitro heterodimerisiert (folgendes Beispiel 27).
F. Die Wirkungen des Zalpha11-Liganden auf B-Zellen werden durch lösliche Zalpha11-Rezeptor-Konstrukte inhibiert.
Murine B-Zellen wurden gereinigt und mit monoklonalen Anti-CD40- oder Anti-IgM-Antikörpern, wie in den obigen Beispielen 26C und D beschrieben, stimuliert. Die durch den murinen Zalpha11-Liganden induzierte Wirkung wurde vollständig durch die Zugabe entweder des gereinigten heterodimeren löslichen hu-Zalpha11R:IL-2Rγ-Rezeptors (Beispiel 28) oder des homodimeren löslichen Rezeptors mu-Zahlpha11-Fc (Beispiel 6C) blockiert. Wiederum liefern diese Ergebnisse einen weiteren funktionellen Beweis dafür, dass IL-2Rγ mit dem Zalpha11-Rezeptor heterodimerisiert (Beispiel 27) und als Antagonist der Wirkung des Zalpha11-Liganden auf B-Zellen wirkt.
Beispiel 27
Der humane Zalpha11-Rezeptor heterodimerisiert mit IL-2-Rezeptor-Gamma
A. Assay, welcher konditioniertes Medium von transfizierten BHK-570-Zellen, die den humanen Zalpha11-Liganden exprimieren, verwendet.
Der lösliche humane Zalpha11-Rezeptor Zalpha11CFLAG (Beispiel 6B) oder gp130 (Hibi, M. et al., Cell 63: 1149-11:57, 1990) wurden durch Reaktion mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Inc., Rockford, IL) gemäß den Anweisungen des Herstellers biotinyliert. Der lösliche Zalpha11-Rezeptor und der lösliche IL-2R-Rezeptor-γ (sIL-2Rγ) (R&D Systems, Minneapolis, MN) wurden mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Ru-BPY-NHS (Igen, Inc., Galthersburg, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Die biotinylierten und Ru-BPY-NHS-markierten Formen des löslichen Zalpha11-Rezeptors wurden als Bio-Zalpha11-Rezeptor bzw. Ru-Zalpha11 bezeichnet; die biotinylierten und Ru-BPY-NHS-markierten Formen des löslichen IL-2Rγ wurden als Bio-IL2Rγ bzw. Ru-IL2Rγ bezeichnet.
Zur Charakterisierung der initialen Rezeptor-Bindung des humanen Zalpha11-Liganden wurde konditioniertes Medium von transfizierten BHK-570-Zellen, welche den humanen Zalpha11-Liganden exprimieren, oder Kontrollmedium von nicht-transfizierten BHK-570-Zellen verwendet, um zu untersuchen, ob der Zalpha11-Ligand die Homodimerisierung des Zalpha11-Rezeptors vermitteln kann, und ob er die Heterodimerisierung des Zalpha11-Rezeptors mit IL-2Rγ oder gp130 vermitteln kann. Zu diesem Zweck wurden 50 μl des konditionierten Mediums von den Kontrollzellen oder des konditionierten Mediums von den Zellen, die den Zalpha11-Liganden exprimieren, mit 50 μl TBS-B (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, pH 7,2), enthaltend 400 ng/ml Ru-Zalpha11-Rezeptor und Bio-Zalpha11 oder 400 ng/ml Ru-Zalpha11-Rezeptor und Bio-gp130 oder 400 ng/ml Ru-IL2Rγ und Bio-Zalpha11, vereinigt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 30 μg Streptavidin-beschichtete magnetische 2,8-mm-Beads (Dynal, Inc. Oslo, Norwegen) zugegeben; die Reaktion wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 200 μl ORIGEN-Assay-Puffer (Igen, Inc., Galthersburg, MD) zugegeben; das Ausmaß der Rezeptor-Assoziation wurde unter Verwendung einer M8-ORIGEN-Analyse-Vorrichtung (Igen, Inc.) bestimmt.
Den Zalpha11-Liganden enthaltendes, konditioniertes Medium verursachte die Heterodimerisierung des Bio-Zalpha11-Rezeptors mit Ru-IL2Rγ. Keine Rezeptor-Dimerisierung wurde in Gegenwart von Kontrollmedium beobachtet. Das den Zalpha11-Liganden enthaltende, konditionierte Medium verursachte weder die Homodimerisierung des Ru-Zalpha11-Rezeptors mit dem Bio-Zalpha11-Rezeptor noch die Heterodimerisierung des Ru-Zalpha11-Rezeptors mit Bio-gp130.
B. Assay, welcher den gereinigten humanen Zalpha11-Liganden verwendet
Um die Liganden-Spezifität der Heterodimerisierung von Zalpha11-Rezeptor und IL2Rγ zu bewerten, wurden 50 μl TBS-B, enthaltend 400 ng/ml Ru-Zalpha11-Rezeptor und Bio-Zalpha11 oder 400 ng/ml Ru-IL2Rγ und Bio-Zalpha11, mit 50 μl TBS-B, enthaltend IL-2, IL-4, IL-15 oder den gereinigten humanen Zalpha11-Liganden (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) mit Konzentrationen von 133 pg/ml bis 300 ng/ml, vereinigt. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 3 μg Streptavidin-beschichtete magnetische 2,8-mm-Beads (Dynal, Inc.) zugegeben; die Reaktion wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 200 μl Origlo-Assay-Puffer (Igen, Inc.) zugegeben; das Ausmaß der Rezeptor-Assoziation wurde unter Verwendung einer M8-Origen-Analysevorrichtung (Igen, Inc.) bestimmt. Der humane Zalpha11-Ligand verursachte die Heterodimerisierung des Bio-Zalpha11-Rezeptors mit Ru-IL-2Rγ in einer dosisabhängigen Weise mit einer halb-maximalen Konzentration von 10 ng/ml. Bei keiner der getesteten Konzentrationen des Zalpha11-Liganden wurde eine Homodimerisierung des Ru-Zalpha11-Rezeptors mit dem Bio-Zalpha11-Rezeptor beobachtet. Bei keiner der getesteten Konzentrationen wurde mit IL-2, IL-4 oder IL-15 eine Homodimerisierung des Ru-Zalpha11-Rezeptors mit dem Bio-Zalpha11-Rezeptor oder eine Heterodimerisierung des Bio-Zalpha11-Rezeptors mit Ru-IL2Rγ beobachtet. Somit zeigen die Ergebnisse, dass der humane Zalpha11-Rezeptor spezifisch mit dem IL-2-Rezeptor-γ in Gegenwart des humanen Zalpha11-Liganden heterodimerisiert, und dass der Zalpha11-Rezeptor in Gegenwart anderer getesteter Cytokine nicht homodimerisiert oder heterodimerisiert.
Beispiel 28
Konstrukt zur Erzeugung eines humanen Zalpha11-Rezeptor/IL-2Rγ-Heterodimers
Es wurde ein Vektor konstruiert, welcher ein sekretiertes humanes hZalpha11/hIL-2Rgamma-Heterodimer exprimiert. In diesem Konstrukt wurde die extrazelluläre Domäne von hZalpha11 mit der schweren Kette des IgG-Gamma-1 (IgGγ1) (SEQ ID NO: 16) fusioniert, wobei der extrazelluläre Teil von hIL-2Rγ an eine humane Kappa-Leichtkette (humane κ-Leichtkette) (SEQ ID NO: 18) fusioniert wurde.
A. Konstruktion des Fusionsvektors aus IgG-Gamma-1 und humaner κ-Leichtkette
Die schwere Kette von IgGγ1 wurde in den Säugetier-Expressions-Vektor Zem229R (ATCC Hinterlegungs-Nr. 69447) derart kloniert, dass jeglicher extrazelluläre Teil eines Rezeptors, der eine 5'-EcoRI- und 3'-NheI-Stelle aufweist, kloniert werden kann, so dass eine Fusion aus einer N-terminalen extrazellulären Domäne und einem C-terminalen IgGγ1 entsteht. Das in diesem Konstrukt verwendete IgGγ1-Fragment wurde unter Anwendung von PCR zur Isolierung der IgGγ1-Sequenz aus einer humanen, fötalen Leber-cDNA-Bibliothek von Clontech als Template hergestellt. Es wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligos ZC11,450 (SEQ ID NO: 50) und ZC11,443 (SEQ ID NO: 51) folgendermaßen durchgeführt: 40 Zyklen, bestehend aus 60 Sekunden bei 94°C, 60 Sekunden bei 53°C und 120 Sekunden bei 72°C; 7 Minuten bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung eines QiaQuick^TM(Qiagen)-Gel-Extraktions-Kits gereinigt. Das isolierte, 990 bp große DNA-Fragment wurde mit MluI und EcoRI (Boehringer Mannheim) verdaut, mit Ethanol präzipitiert und mit den Oligos ZC11,440 (SEQ ID NO: 52) und ZC11,441 (SEQ ID NO: 53), welche einen MluI/EcoRI-Linker umfassen, in Zem229R, welcher zuvor unter Anwendung von molekular-biologischen Standardtechniken mit (MluI) und EcoRI verdaut worden war, ligiert. Dieser generische Klonierungs-Vektor wurde als Vektor #76 hlgGgamma1 w/Ch1 #786 Zem229R (Vektor #76) bezeichnet. Die Polynukleotid-Sequenz der extrazellulären Domäne von hzalpha11, fusioniert an die schwere Kette von IgG-Gamma-1 ist in SEQ ID NO: 15 und die entsprechende Polypeptidsequenz in SEQ ID NO: 16 wiedergegeben.
Die humane κ-Leichtkette wurde in den Zem228R-Säugetier-Expressions-Vektor (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 69446) derart kloniert, dass jeglicher extrazelluläre Teil eines Rezeptors, der eine 5'-EcoRI-Stelle und eine 3'-KpnI-Stelle aufweist, kloniert werden kann, so dass eine Fusion aus einer N-terminalen extrazellulären Domäne und der C-terminalen humanen κ-Leichtkette entsteht. Das in diesem Konstrukt verwendete Fragment der humanen κ-Leichtkette wurde unter Anwendung von PCR hergestellt, wobei die Sequenz der humanen κ-Leichtkette aus der gleichen humanen fötalen Leber-cDNA-Bibliothek, die oben verwendet wurde, isoliert wurde. Es wurde eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligos ZC11,501 (SEQ ID NO: 54) und ZC11,451 (SEQ ID NO: 55) unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und unter Verwendung eines QiaQuick^TM(Qiagen)-Gel-Extraktions-Kits gereinigt. Das isolierte, 315 bp große DNA-Fragment wurde mit MluI und EcoRI (Boehringer Mannheim) verdaut, mit Ethanol präzipitiert und mit dem oben beschriebenen MluI/EcoRI-Linker in Zem228R, der zuvor unter Anwendung molekular-biologischer Standardtechniken mit MluI und EcoRI verdaut worden war, ligiert. Dieser generische Klonierungs-Vektor wurde als Vektor #77 hKlight #774 Zem228R (Vektor #77) bezeichnet. Die Polynukleotid-Sequenz für den extrazellulären Teil von hIL-2Rγ, fusioniert an eine humane Kappa-Leichtkette, ist in SEQ ID NO: 17 und die entsprechende Polynukleotid-Sequenz in SEQ ID NO: 18 wiedergegeben.
B. Insertion der extrazellulären Domänen des Zalpha11-Rezeptors oder von IL-2Rγ in die Fusions-Vektor-Konstrukte
Unter Verwendung der obigen Konstruktions-Vektoren wurde ein Konstrukt, welches das humane Zalpha11 fusioniert an IgGγ1 aufweist, hergestellt. Dieses Konstrukt wurde durch Isolieren des humanen Zalpha11-Rezeptors aus einer CD4+-Knochenmark-Bibliothek (selektiert und im Haus hergestellt) durch PCR mit den Oligos ZC24,052 (SEQ ID NO: 56) und ZC24,053 (SEQ ID NO: 57) unter folgenden Bedingungen hergestellt: 30 Zyklen, bestehend aus 60 Sekunden bei 94°C, 60 Sekunden bei 57°C und 120 Sekunden bei 72°C; 7 Minuten bei 72°C. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und NheI verdaut, wie oben beschrieben Gelgereinigt und in einen zuvor mit EcoRI und NheI verdauten und Banden-gereinigten Vektor #76 (siehe oben) ligiert. Der resultierende Vektor wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Fusion aus dem humanen Zalpha11 und IgGγ1 (hZalpha11/Ch1 IgG) korrekt war. Der hZalpha11/Ch1 IgGγ1-Vektor wurde als Vektor #190 bezeichnet.
Außerdem wurde ein separates Konstrukt, in dem IL-2Rγ an κ-Leicht fusioniert ist, konstruiert. Die Konstruktion aus IL-2Rγ und humaner κ-Leichtkette wurde wie oben hergestellt, indem eine PCR anhand der gleichen CD4+-Bibliothek, wie oben erwähnt, mit den Oligos ZC12,834 (SEQ ID NO: 58) und ZC12,831 (SEQ ID NO: 59) durchgeführt wurde, die resultierende Bande mit EcoRI und KpnI verdaut wurde, und dieses Produkt dann in einen zuvor mit EcoRI und KpnI verdauten und Banden-gereinigten Vektor #77 (siehe oben) ligiert wurde. Der resultierende Vektor wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die Fusion aus humanem IL-2Rγ und humaner κ-Leichtkette (hIL-2Rγ/Klight) korrekt war. Dieser hIL-2γ/Klight-#1052-Zem228R-Vektor wurde als Vektor #101 bezeichnet.
D. Co-Expression der humanen Zalpha11- und humanen IL-2Rγ-Rezeptoren
Ungefähr 16 μg von jedem der obigen Vektoren #190 und #101 wurden unter Verwendung von LipofectaminPIus^TM-Reagenz (Gibco/BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers in BHK-570-Zellen (ATCC Nr. CRL-10314) co-transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden über 10 Tage in DMEM + 5% FBS (Gibco/BRL), enthaltend 1 μM Methotrexat (MTX) (Sigma, St. Luois, MO) und 0,5 mg/ml G418 (Gibco/BRL), selektiert. Der resultierende Transfektanten-Pool wurde wiederum in 10 μM MTX und 0,5 mg/ml G418 über 10 Tage selektiert.
Der resultierende Pool aus doppelt-selektierten Zellen wurde verwendet, um das Protein zu erzeugen. Drei "Fabriken" (Nunc, Dänemark) dieses Pools wurden verwendet, um 10 l eines serumfreien konditionierten Mediums zu erzeugen. Dieses konditionierte Medium wurde über eine 1-ml-Protein-A-Säule geleitet und in (10) 750-Mikroliter-Fraktionen eluiert. Vier von diesen Fraktionen, die die höchsten Konzentrationen enthielten, wurden vereinigt und gegen PBS (10 kD MW-Ausschluss) dialysiert. Schließlich wurde das dialysierte Material einer Aminosäure-Analyse (AAA) unterzogen, wobei sich herausstellte, dass es eine Konzentration von 227,17 μg/ml aufwies. Insgesamt wurden 681,5 μg aus dieser 10-l-Aufreinigung erhalten. Der gereinigte lösliche humane Zalpha11-Rezeptor/IL-2Rγ-Rezeptor wurde verwendet, um seine Fähigkeit, mit dem humanen Zalpha11-Liganden in einem BaF3-Proliferations-Assay (Beispiel 29) zu konkurrieren, zu bewerten.
Beispiel 29
Der lösliche humane Zalpha11-Rezeptor/humane IL-2Rγ-Rezeptor-Fc als Zalpha11-Ligand-Antagonist
BaF3-Zellen, welche stabil den humanen Zalpha11-Rezeptor exprimieren (Beispiel 2) wurden mit 5.500 Zellen pro Kammer in Standard-96-Kammer-Gewebekultur-Platten in Basismedium + 3 ng/ml humaner Zalpha11-Ligand ausplattiert. Das Basismedium bestand aus 500 ml RPMI 1640 QRH Biosciences), 5 ml 100 × Natriumpyruvat (Gibco BRL), 5 ml 100 × L-Glutamin (Gibco BRL) und 50 ml Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS) (Hyclone Laboratories). Zu diesen Zellen wurde eine abnehmende Dosis entweder des gereinigten löslichen humanen Zalpha11-Rezeptor-Fc-Homodimers (Beispiel 6C) oder des gereinigten Heterodimers aus dem löslichen humanen Zalpha11-Rezeptor und dem humanen IL-2-γ-Rezeptor-Fc (Beispiel 27) gegeben. Es wurden ein Alamar-Blue-Proliferations-Assay und eine fluorimetrische Analyse wie in Beispiel 2B durchgeführt.
Das Zalpha11-Rezeptor/IL-2Rγ-Rezeptor-Fc-Heterodimer inhibierte die Aktivität des humanen Zalpha11-Liganden in einer Dosis-abhängigen Weise, wobei 0,312 μg/ml die Aktivität von 3 ng/ml humanem Zalpha11-Liganden vollständig inhibieren konnten. Das lösliche Zalpha11-Rezeptor-Fc-Homodimer konnte ebenso die Zalpha11-Ligand-Aktivität in einer do sisabhängigen Weise inhibieren, es waren jedoch etwa 10 μg/ml des löslichen Homodimers notwendig, um die Aktivität von 3 ng/ml Zalpha11-Ligand vollständig zu inhibieren. Diese Daten weisen darauf hin, dass das Zalpha11-Rezeptor/IL2-Gamma-Rezeptor-Fc-Heterodimer bei der Inhibierung des humanen Zalpha11-Liganden ungefähr 30- bis 100-fach potenter ist als der homodimere lösliche Zalpha11-Rezeptor.
Beispiel 30
Zalpha11-Rezeptor-Verteilung
Um die Verteilung des Zalpha11-Rezeptors auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, wurden sowohl polyklonale Kaninchen-Antikörper als auch monoklonale Maus-Antikörper (mAks), welche gegen den humanen Rezeptor gerichtet waren (Beispiel 24 und Beispiel 10) erzeugt und diese Antikörper an Biotin konjugiert, um in Fließcytometrie verwendet zu werden. Anfänglich wurden die polyklonalen Antikörper, welche eine relativ geringe Affinität aufwiesen, zum Anfärben einer Reihe von Zelllinien verwendet: IL-3-abhängige murine Wildtyp-BaF3-Zellen der Prä-B-Zelllinie (Palacios and Steinmetz, ibid.; Mathey-Prevot et al., ibid.); mit dem humanen Zalpha11 transfizierte BaF3-Zellen (Beispiel 2); die humanen Burkitts Lymphom-Zellinien Raji (ATCC Nr. CCL-86), Ramos (ATCC Nr. CRL-1596), RPMI 8226 (ATCC Nr. CCL-155) und Daudi (ATCC Nr. CCL-213); die humane T-Zell-Leukämie-Zelllinie Jurkat (ATCC Nr. TIB-152); die humanen myelomonocytischen Leukämie-Zelllinien Thp-1 (ATCC Nr. TIB-202) und U937 (ATCC Nr. CRL-1593.2); die humanen pro-myelomonocytischen Zellen HL-60 (ATCC Nr. CCL-240); die murine B-Zell-Lymphom-Zelllinie A20 (ATCC Nr. TIB-208); und die murine Thymom-Zelllinie EL4 (ATCC Nr. TIB-39).
Die Zellen wurden geerntet und einmal mit FACS-Waschpuffer mit Serum (WBS) gewaschen. WBS besteht aus einer ausbalancierten Hanks Salzlösung (Gibco/BRL) + 10 mM HEPES (Gibco/BRL) + 1% BSA (Sigma) + 10% normales Ziegenserum (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) + 10% normales Kaninchen-Serum (Sigma); der Waschpuffer (WB) ist identisch zu WBS, mit dem Unterschied, dass er serumfrei ist. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 100 μl WB, enthaltend 10 μg/ml polyklonale Kaninchen-Anti-Zalpha11-Antikörper (Beispiel 10), resuspendiert. Die Zellen wurden mit dem Antikörper für 20 Minuten auf Eis gehalten, dann mit WB gewaschen und in WB, enthaltend Ziegen-Anti-Kaninchen-FITC (BioSource, International), resuspendiert, weitere 20 Minuten auf Eis inkubiert, dann gewaschen und in 400 μl WB zur Analyse auf einem FACSCalibur-Fließcytometer (Becton Dickinson) resuspendiert. Die Kontrollproben wurden nur mit dem sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-FITC-Antikörper angefärbt. Ein positives Anfärben wurde als eine Verschiebung nach oben im Vergleich zu der Anfärbung mit sekundärem Antikörper allein definiert. Obwohl die polyklonalen Antikörper eine geringe Affinität aufwiesen, bestand Grund zu der Annahme, dass Zalpha11-Expression auf den BaF3/Zalpha11-Transfektanten auf allen vier humanen Burtitts Lymphomen (Raji, Ramos, Daudi und RPMI 8226) und auf Jurkat-T-Zellen nachgewiesen werden. Die Daten mit den monocytischen Zelllinien waren zweideutig. Ruhende (undifferenzierte) HL-60-Zellen banden nicht die Anti-Zalpha11-Antikörper; es wurde jedoch ein positives Signal auf HL-60-Zellen, die 24 Stunden mit PMA (Calbiochem, La Jolla, CA) aktiviert worden waren, welches eine Differenzierung der HL-60-Zellen in Monocyten-ähnliche Zellen induziert, nachgewiesen. Ebenso wurde ein positives Signal auf U937- und Thp-1-Zellen beobachtet; dieses Signal könnte jedoch auf nicht-spezifische Bindung zurückzuführen sein. Die polyklonalen Antikörper kreuzreagierten schwach auf der Maus-B-Zelllinie A20; es war jedoch keine Anfärbung des murinen EL4-Thymoms zu beobachten.
Die vier monoklonalen Anti-Zalpha11-Antikörper (Beispiel 24) wurden an Biotin konjugiert, und in einer Untergruppe der oben beschriebenen Zellen wurde nach Zalpha11-Rezeptor-Expression gescreent (BaF3, BaF3/Zalpha11, Raji, Jurkat und ruhende HL-60). Die Zellen wurden geerntet, gewaschen, dann in 100 μl WB, enthaltend 15 μg/ml eines der vier biotinylierten monoklonalen Antikörper, resuspendiert. Die Zellen wurden mit dem mAk für 20 Minuten auf Eis inkubiert, dann mit 1,5 ml WB gewaschen und in einer Zentrifuge pelletiert. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt; die Pellets wurden in 100 μl CyChromkonjugiertem Streptavidin (CyC-SA; PharMingen) resuspendiert, dann für weitere 20 Minuten auf Eis inkubiert und wie zuvor gewaschen und pelletiert. Die Kontrollröhrchen enthielten Zellen, die nur mit CyC-SA angefärbt wurden. Die Pellets wurden in 400 μl WB resuspendiert; dann wurde wie oben Fließcytometrie durchgeführt. Ein positives Anfärben wurde definiert als ein Signal, welches über das Hintergrund-Niveau der Anfärbung mit Cyc-SA allein hinausgeht. Unter Verwendung des BaF3/Zalpha11-Transfektanten als Kontrolle konnten die 4 monoklonalen Antikörper hinsichtlich ihrer jeweiligen mittleren Fluoreszenz-Intensitäten (MFI), welche die Antikörper-Affinität und/oder das Ausmaß der Biotinylierung der monoklonalen Antikörper widerspiegeln können, eingeordnet werden. Die mAks wurden von der höchsten bis zu der geringsten MFI folgendermaßen eingeordnet: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4.6, 249.19.2.2.3.5 und 249.15.2.4.2.7. Dieses Muster war auf Raji- und Jurkat-Zellen im Wesentlichen das gleiche, was darauf hindeutet, dass Zalpha11 auf diesen B- und T-Zellinien exprimiert wird. Die Färbungsmuster auf nicht-aktivierten HL-60-Zellen waren für alle mAks gleich, und das Signal war sehr schwach. Es ist zu vermuten, dass dies nicht die tatsächliche Expression von Zalpha11 durch diese Zelllinie widerspiegelt, sondern eine Funktion der nicht-spezifischen Bindung der Maus-mAks an die humanen Zellen, vermutlich über Fc-Rezeptoren, ist.
Beispiel 31
Rekonstitution des humanen Zalpha11-Rezeptors in vitro
Um die Komponenten zu identifizieren, die in den Zalpha11-Signalisierungs-Komplex verwickelt sind, wurden folgende Rezeptor-Rekonstitutions-Studien durchgeführt. BHK-570-Zellen (ATCC Nr. CRL-10314), die unter Anwendung von hierin beschriebenen Standardverfahren mit dem KZ134-Luciferase-Reporter-Plasmid (Beispiel 19) transfiziert waren, dienten als Bioassay-Zelllinie zur Messung der Signaltransduktions-Antwort von einem transfizierten Zalpha11-Rezeptor-Komplex bis zu dem Luciferase-Reporter in Gegenwart des Zalpha11-Liganden. BHK-Zellen exprimieren den Zalpha11-Rezeptor nicht endogen. Die Bioassay-Zelllinie wurde mit dem Zalpha11-Rezeptor allein transfiziert oder mit dem Zalpha11-Rezeptor zusammen mit einer von verschiedenen anderen bekannten Rezeptor-Untereinheiten co-transfiziert. Jede Rezeptor-Untereinheit wurde unter Anwendung von PCR kloniert und anschließend in geeignete Expressions-Vektoren ligiert; die korrekte Sequenz jedes Konstrukts wurde vor der Transfektion bestätigt. Die Zelllinien wurden vor den Assays durch RT/PCR hinsichtlich der Rezeptor-Expression getestet. Zu den getesteten Rezeptor-Komplexen zählten: Zalpha11-Rezeptor allein; Zalpha11-Rezeptor mir IL-2Rγ; Zalpha11-Rezeptor mit IL-2Rγ und IL-2Rβ; Zalpha11-Rezeptor mit IL-2Rγ und IL-13Rα; Zalpha11-Rezeptor mit IL-2Rγ und IL-2Rα; und Zalpha11-Rezeptor mit IL-2Rγ und IL-4Rα. Jede unabhängige Rezeptor-Komplex-Zelllinie wurde in Gegenwart des humanen Zalpha11-Liganden getestet und die Luciferase-Aktivität, wie in Beispiel 19 beschrieben, gemessen. Die nicht-transfizierte Bioassay-Zelllinie diente als Kontrolle für die Hintergrund-Luciferase-Aktivität und wurde als Grundlinie verwendet, um die Signalisierung durch die verschiedenen Rezeptor-Komplex-Kombinationen zu vergleichen. In jeder Zelllinie, die sowohl den Zalpha11-Rezeptor als auch IL-2Rγ enthielt, lag die maximale Luciferase-Aktivität ungefähr 2-fach über dem Hintergrund in Gegenwart des Zalpha11-Liganden. Kein Anstieg des Signals wurde in Gegenwart der anderen getesteten Rezeptor-Untereinheiten (IL-2Rβ, IL-2Rα, IL-4Rα, oder IL-13Rα) beobachtet.
Zu weiteren Zalpha11-Rezeptor-Komplexen, die durch dieses Verfahren untersucht werden können, zählen Kombinationen des Zalpha11-Rezeptors mit einer oder mehreren der Rezeptor-Komponenten der IL-4/IL-13-Rezeptor-Familie (IL-13Rα') sowie andere Interleukin-Rezeptoren (z. B. IL-15Rα, IL-7Rα, IL-9Rα).
Beispiel 32
Bindungsstudie des ¹²⁵I-markierten humanen Zalpha11-Liganden in Zelllinien
25 Mikrogramm des gereinigten humanen Zalpha11-Liganden (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) wurden mit 2 mCi ¹²⁵I unter Verwendung von Iod-Beads (Pierce, Rockford, Illinois) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Dieses markierte Protein wurde verwendet, um die Bindung des humanen Zalpha11-Liganden an humane Raji-Zellen (ATCC Nr. CCL-86) zu bewerten, wobei die Bindung an murine Wildtyp-BaF3-Zellen und an mit dem Zalpha11-Rezeptor transfizierte BaF3-Zellen (BaF3/hZalpha11-Zellen) als Kontrolle verwendet wurde. Auf der Grundlage der Ergebnisse des Proliferations-Assays (Beispiel 2) wurde eine Bindung des Zalpha11-Liganden an BaF3/hZalpha11-Zellen erwartet (positive Kontrolle), während keine Bindung an Wildtyp-BaF3-Zellen erwartet wurde (negative Kontrolle). Es wurden ungefähr 5 × 10⁵ Raji-Zellen/Kammer, 1 × 10⁶ BaF3/hZalpha11 und 1 × 10⁶ BaF3-Zellen/Kammer jeweils in 96-Kammer-Platten ausplattiert. Zu den Kammern wurden 10 ng/ml des markierten humanen Zalpha11-Liganden im Doppel gegeben, wobei eine Verdünnungreihe des nicht-markierten humanen Zalpha11-Ligand-Kompetitors von einem 250-fachen molaren Überschuss in 1:4-Verdünnungen hinunter bis zu einem 0,061-fachen molaren Überschuss zugegeben wurde. Jeder Punkt wurde doppelt durchgeführt. Nach Zugabe des markierten humanen Zalpha11-Liganden zu den Kammern wurden die Zellen bei 4°C für zwei Stunden inkubiert, um eine Bindung des Liganden an die Zellen zu ermöglichen. Die Zellen wurden dann 3 × in Bindungspuffer (RPMI-1710 QRH Biosciences) mit 1% BSA (Sigma)) gewaschen und auf dem COBRA-11-AUTO-GAMMA-Gammazähler (Packard Instrument Company, Meriden, CT) gezählt.
Die Bindung des markierten Zalpha11-Liganden an die Zellen war in den Raji-Zellen und den BaF3/hZalpha11-Zellen offensichtlich. Zudem wurde bei den Raji-Zellen durch einen durchschnittlichen 250-fachen molaren Überschuss an nicht-markiertem Zalpha11-Liganden die Bindung in Gegenwart eines nicht-spezifischen nicht-markierten Kompetitors (Interferon Gamma von R&D Systems, Minneapolis, MN) um das 3-fache und um das 3,7-fache, wenn kein Kompetitor vorlag, herabgesetzt. Die Kompetition trat in einer dosisabhängigen Weise für den spezifischen nicht-markierten Kompetitor, den humanen Zalpha11-Liganden, auf. Somit war die Bindung des Zalpha11-Liganden an die Raji-Zellen spezifisch. Auf ähnliche Weise wurde bei den positiven BaF3/Zalpha11-Kontrollzellen durch einen 250-fachen molaren Überschuss an nicht-markiertem Zalpha11-Liganden die Bindung in Bezug auf den nicht-spezifischen Kompetitor um das 2-fache und, wenn kein Kompetitor vorlag, um das 3,06-fache herabgesetzt. Somit war die Bindung des Zalpha11-Liganden an die BaF3/Zalpha11-Zellen ebenso spezifisch. Mit den Wildtyp-BaF3-Zellen wurde keine kompetitive Bindung beobachtet. Somit wurde gezeigt, dass der Zalpha11-Ligand spezifisch an Raji-Zellen und an BaF3/hZalpha11-Zellen, jedoch nicht an die negativen BaF3-Kontrollzellen bindet.
Der gebundene radioaktiv markierte Zalpha11-Ligand wurde dann unter Anwendung von Standard-Vernetzungs-Verfahren mit dem Molekül vernetzt, an das er auf der Zelloberfläche von Raji-Zellen bindet, um den Rezeptor-Komplex, an den er auf diesen Zellen bindet, zu identifizieren. Des Weiteren wurden Anti-Zalpha11-Rezeptor-Antikörper (Beispiel 24 und Beispiel 10) und andere Anti-Cytokin-Rezeptor-Untereinheit-Antikörper verwendet, um festzustellen, welche Untereinheit-Komponenten einen funktionellen hZalpha11-Rezeptor-Komplex umfassen, beispielsweise auf den Raji-Zellen und anderen Zelllinien, an die der Zalpha11-Ligand bindet. Derartige Antikörper können verwendet werden, um mit dem Zalpha11-Liganden in einem Bindungs-Assay, wie oben beschrieben, zu konkurrieren und somit zu zeigen, welche Rezeptor-Untereinheiten auf der Oberfläche der Raji-Zellen und auf anderen Zelllinien, an die der Zalpha11-Ligand bindet, vorliegen. Des Weiteren können derartige Antikörper verwendet werden, um unter Anwendung von auf dem Gebiet bekannten und hierin beschriebenen Verfahren radioaktiv-markiertes, mit dem Zalpha11-Liganden vernetztes Material zu immunpräzipitieren. Außerdem können die Anti-Zalpha11-Ligand-Antikörper (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) verwendet werden, um radioaktiv-markiertes, mit dem Zalpha11-Liganden vernetztes Material zu immunpräzipitieren.
Beispiel 33
Zalpha11-Rezeptor-Expression auf humanen Blutzellen
A. Präparation und Kultivierung humaner peripherer Blutzellen
Frisch entnommenes humanes Blut wurde 1:1 mit PBS (Gibco BRL) verdünnt und über Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) gelagert; dann wurde 30 Minuten bei 1.800 rpm zentrifugiert, wobei mit ausgeschalteter Bremse gestoppt wurde. Die Zwischenschicht wurde entfernt und in ein frisches 50-ml-Falcon-Röhrchen (Falcon, VWR, Seattle, WA) überführt, mit PBS auf ein Endvolumen von 40 ml gebracht und 10 Minuten bei 1.200 rpm mit eingeschalteter Bremse zentrifugiert. Die Lebensfähigkeit der isolierten Zellen wurde unter Verwendung von Trypan Blau (Gibco BRL) getestet; dann wurden die Zellen mit einer Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml Zellmedium (RPMI-Medium 1640, 10% Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 5% L-Glutamin, 5% Pen/Strep) (Gibco BRL) resuspendiert.
Die Zellen wurden in 6-Kammer-Platten (Falcon, VWR) für 0,4 oder 24 Stunden mit einer Anzahl verschiedener, unten beschriebener Stimuli kultiviert. Es wurde Anti-IgM-, Anti-CD40- und Anti-CD3-Stimulation wie in Beispiel 26 durchgeführt. Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) und Ionomycin (Sigma, St. Luois, MO) wurden den entsprechenden Kammern mit 10 ng/ml bzw. 0,5 mg/ml zugegeben. Die Zellen wurden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator für verschiedene Zeiträume inkubiert.
B. Antikörper-Färbung und Analyse
Die Zellen wurden aus den Platten entfernt, gewaschen und in eiskaltem Färbemedium (HBSS, 1% fötales Kälberserum, 0,1% Natriumazid) mit einer Konzentration von ungefähr zehn Millionen Zellen pro Milliliter resuspendiert. Die Blockierung des Fc-Rezeptors und nicht-spezifische Bindung der Antikörper an die Zellen wurde durch Zugabe von 10% normalem Ziegenserum (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) und 10% normalem humanen Serum (Ultraserum, Gemini) zu der Zellsuspension erreicht. Die Aliquots der Zellsuspensionen wurden mit einem FITC-markierten monoklonalen Antikörper gegen einen der Linien-Marker CD3, CD19 oder CD14 (PharMingen, La Jolla, CA) und einem biotinylierten monoklonalen Antikörper gegen den humanen Zalpha11-Rezeptor (hu-Zahlpha11) (Beispiel 24) gemischt. Nach 60-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem Färbemedium gewaschen und in 50 ml Färbemedium, enthaltend Strepatvidin-PE (Caltag, Burlingame, CA), resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen zweimal mit eiskaltem Waschpuffer (PBS, 1% fötales Kälberserum, 0,1% Natriumazid) gewaschen und in Waschpuffer, enthaltend 1 mg/ml 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) als Lebensfähigkeits-(Viability)-Marker resuspendiert. Die Fließdaten wurden an lebenden Zellen unter Verwendung eines FACSCalibur-Fließcytometers (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA) erhalten. Sowohl der Erhalt der Daten als auch die Analyse wurden unter Verwendung der CellQuest-Software (BD Immunocytometry Systems) durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, dass der humane Zalpha11-Rezeptor auf humanen peripheren Blutzellen, welche entweder CD3, CD19 oder CD14 exprimieren, exprimiert wird. Die Aktivierung der T-Zellen mit Anti-CD3 oder der B-Zellen mit Anti-CD40 führte zu einem erhöhten Niveau von Zalpha11 auf der Zelloberfläche nach 24 Stunden. Mit keinem der Stimuli wurde bei den Zellpopulationen ein Anstieg des Expressionsniveaus von Zalpha11 nach 4 Stunden beobachtet. Die Behandlung der Zellen mit dem Zalpha11-Liganden führte zu einer Verminderung der Zalpha11-Färbung auf CD3-positiven und CD19-positiven Zellen, jedoch nicht auf CD14-positiven Zellen, sowohl nach 4 als auch nach 24 Stunden.
Beispiel 34
Die Aktivität des humanen Zalpha11-Liganden wird mit Anti-IL-2Rγ-Antikörpern in einem BaF3/Zalpha11-Proliferations-Assay blockiert
Die Rolle des IL-2γ-Rezeptors wurde unter Verwendung monoklonaler Anti-IL-2γ-Rezeptor-Antikörper untersucht, um festzustellen, ob sie die Zalpha11-Ligand-Aktivität in einem BaF3/Zalpha11-Proliferations-Assay (Beispiel 2) blockieren. Konditioniertes Medium von BKH-570-Zellen, die mit dem humanen Zalpha11-Liganden transfiziert waren, wurde dem As say in Konzentrationen von 5%, 2,5%, 1,25% und 0,625% mit oder ohne IL-2-Rezeptor-Antikörper zugegeben.
Die folgenden monoklonalen Maus-Anti-IL-2-Antikörper von PharMingen International, San Diego, Kalifornien, wurden mit jeweils 50 μg/ml zugegeben: (a) 4G3 + TUGm2 oder (b) TM-β1. 4G3 und TUGm2 sind gereinigte Ratten-Anti-Maus-γ_c Ketten-Antikörper, TM-β1 ist ein gereinigter Ratten-Anti-Maus-CD122(IL-2-Rezeptor-β-Kette)-Antikörper. Die Assay-Ergebnisse zeigten eine nahezu vollständige Inhibierung der Zalpha11-Ligand-Antwort mit der 4G3 + TUGm2-Antikörper-Kombination im Vergleich zu der Kontrolle ohne Antikörper. Der TM-β1-Antikörper hatte keine Wirkung. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle für den IL-2Rγ-Rezeptor bei der proliferativen Antwort des Zalpha11-Liganden hin und bestätigen außerdem, dass IL-2Rγ mit dem Zalpha11-Rezeptor heterodimerisiert, um diese Antwort hervorzurufen.
Beispiel 35
Post-translationale Mannosylierung des Zalpha11-Rezeptor-Polypeptids auf einem hoch-konservierten Trp-Rest
Die Mannosylierung des humanen Zalpha11-Rezeptors wurde unter Anwendung des Verfahrens zur C-2-Mannosylierung von Tryptophan, wie von Hofsteenge, J. et al., Biochemistry 33: 13524-13530, 1994, und Loeffler, A. et al., Biochemistry 35: 12005-14, 1996, beschrieben, untersucht. Diese Studien zeigten zudem, dass in einem Aminosäure-Motiv WXXW (SEQ ID NO: 67) das Trp mannosyliert werden kann.
Ein löslicher Zalpha11-Rezeptor, welcher einen C-terminalen Glu-Glu(CEE)(SEQ ID NO: 14) oder FLAG(SEQ ID NO: 23)-Tag trägt, wurde in BHK-Zellen exprimiert und durch Anti-Flag- oder Anti-EE-Affinitäts-Chromatographie (Beispiel 4A) aufgereinigt. Ein löslicher Zalpha11-Rezeptor, welcher C-terminal mit einem Fc4-Tag (SEQ ID NO: 25) versehen ist und in CHO-Zellen exprimiert wird, wurde durch Anti-Fc4-Affinitäts-Chromatographie (Beispiel 4B) Affinitäts-gereinigt. Diese Polypeptide wurden enzymatisch gespalten, um Peptidfragmente für die Studie zu erzeugen.
Alle enzymatischen Verdaue wurden über Nacht bei einer Proteinkonzentration von 1,0 mg/ml durchgeführt. Der Verdau mit PNGaseF (Oxford GlycoSciences, Abingdon, Oxford, UK) wurde durch Verdünnen jedes löslichen Zalpha11-Rezeptor-Polypeptids in einem Puffer mit 50 mM EDTA, 20 mM Na-Phosphat, pH 7,5, und Inkubieren mit 0,4 U des Enzyms pro μg des Proteins durchgeführt. Der Verdau mit Glu-C (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana) wurde bei einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 durch Bringen der Probe in einen Puffer mit 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,8, und Inkubieren des Ganzen bei 25°C durchgeführt; im Unterschied dazu wurde das mit einem Fc4-Tag versehene Material in 50 mM Na-Phosphat, pH 7,8, + 5% Acetonitril (EM Science, Darmstadt, Deutschalnd) bei 37°C verdaut. Der GIu-C-Verdau erzeugte ein WSXWS-enthaltendes Zalpha11-Peptid, entsprechend Aminosäure 178 (Leu) bis Aminosäure 199 (Ser) der SEQ ID NO: 6 (197 (Leu) bis Aminosäure 218 (Ser) der SEQ ID NO: 2). Der Verdau mit Asp-N (Roche Molecular Biochemicals, Indianapois, Indiana) wurde durch Bringen des Proteins in einen 50 mM Na-Phosphat-Puffer pH 7,7 und Inkubieren des Ganzen bei 37°C durchgeführt, wobei das Enzym in einem Verhältnis von 1:50 zu dem Zalpha11-Rezeptor-Polypeptid enthalten war. Der Asp-N-Verdau erzeugte ein WSXWS-enthaltendes Zalpha11-Peptid entsprechend Aminosäure 179 (Glu) bis Aminosäure 210 (Ser) der SEQ ID NO: 6 (198 (Leu) bis Aminosäure 229 (Glu) der SEQ ID NO: 2).
Die LCMS- und LCMS-MS-Analysen wurden auf einem Magic-HPLC (Michrom Bioresources, Auburn, CA), welcher in Reihe mit einem Finnigan-LCQ-Massenspektrometer (Finnigan MAT, San Jose, CA) verbunden war, durchgeführt. Die LC-Auftrennung wurde auf einer Vydac-C4-Säule von 5 μ 300 Å (Michrom Bioresources) mit einem Elutionsgradienten von 20-80% Lösungsmittel B über 80 Minuten durchgeführt, wobei das Lösungsmittel A aus 2 Acetonitril + 0,1% TFA und das Lösungsmittel B aus 90% Acetonitril + 0,095% TFA bestanden (EM Science; Sigma, St. Louis, MO). Das LCQ-Massenspektrometer wurde derart eingestellt, dass MS-Spektren für die Dauer des Laufs gesammelt wurden. Die LCMS-MS-Analyse der Polypeptid-Verdaue wurde auf dem gleichen Instrumenten-System unter Verwendung einer Vydac-C18-Säule von 5 μ 300 Å (Michrom Bioresources) mit einem Elutionsgradienten von 5-65% Lösungsmittel B über 80 Minuten durchgeführt, wobei das Lösungsmittel-System das gleiche war, wie oben für die LCMS-Analyse beschrieben. Das LCQ-Massenspektrometer wurde derart konfiguriert, dass MS-, Zoom-Scan- und MS-MS-Spektren für jedes Ion über eine minimale Schwelle gesammelt wurden.
Das Ausmaß der Tryptophan-Mannosylierung wurde durch Vergleich der Ionenstärke der 2+- und 3+-Ionen der Peptide, welche das WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13) enthalten, aus den oben beschriebenen Glu-C- und Asp-N-Verdauen beurteilt. Zuerst wurde die Peak-Zusammensetzung unter Verwendung der MS-Daten bestimmt und eine Peptid-Karte erzeugt. Als nächstes wurde ein mittleres Spektrum erzeugt, wobei ungefähr 1 Minute vor der frühen Eluierung des Peptids, enthaltend das mannosylierte WSXWS (SEQ ID NO: 13), begonnen und ungefähr 1 Minute nach der späten Eluierung des nicht-mannosylierten Begleiter-Peptids aufgehört wurde. Die normalisierten Intensitäten der Ione, entsprechend dem mannosylierten und nicht-mannosylierten Peptid, wurden verglichen und zur Erzeugung einer prozentualen Besetzungszahl verwendet. Die für die 2+- und 3+-Ladungszustände erhaltenen Werte wurden gemittelt, um einen prozentualen Besetzungswert für jeden Verdau zu erhalten. Dieser Wert wur de dann für jede Protein-Partie mit dem Wert aus dem Verdau des Begleiters gemittelt, um einen Endwert zu erhalten.
In der folgenden Tabelle 7 sind die Daten, die für jeden Peptid-Tag berechnet wurden, und die Wirtszelle, die für die Expression des löslichen Zalpha11-Rezeptors verwendet wurde, zusammengefasst.
Tabelle 7
Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass die Mannosylierung oder Nicht-Mannosylierung des WSXWS-Motivs (SEQ ID NO: 13) des Zalpha11-Rezeptors die Fähigkeit des Zalpha11-Rezeptors oder eines löslichen Zalpha11-Rezeptors zu homodimerisieren oder heterodimerisieren und/oder seine Fähigkeit, an den Zalpha11-Liganden zu binden, beeinflussen kann. Da die Mannosylierung auf dem Zalpha11-Rezeptor in Abhängigkeit des Zelltyps, in dem der Rezeptor exprimiert wird, zu variieren scheint, sollte bei der Optimierung der Expression und Produktion des Zalpha11-Rezeptors und von löslichen Rezeptor-Polypeptiden berücksichtigt werden, ob der durch die Zelle produzierte Zalpha11-Rezeptor mannosyliert ist oder nicht. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt ohne weiteres, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung entweder mannosyliert oder nicht-mannosyliert sein können.
Da das Ereignis der Mannosylierung innerhalb des WSXWS-Motivs (SEQ ID NO: 13) des Zalpha11-Klasse-I-Cytokin-Rezeptors auftritt, kann sich die Mannosylierung des Trp oder ihr Fehlen auf die Funktionalität des Polypeptids auswirken. Beispielsweise können Insertionen oder Deletionen in dem WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13) des EPOR die Expression auf der Zelloberfläche aufheben, die proliferative Antwort zerstören oder reduzieren, die Internalisierung des Rezeptors herabsetzen und die EPO-Bindung beeinflussen (Yoshimura, A. et al., J. Biol. Chem. 267: 11619-11625, 1992; Quelle, DE et al., Mol. Cell. Biol. 12: 4553-4561, 1992; Hilton, DJ et al., Acad. Proc. Natl. Sci. USA 92 : 190-194, 1995). Jedoch kann die Mutation in dem WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13) ebenso zu einem effizienteren Export aus dem ER und erhöhter Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche führen (Hilton, D. J. et al., supra). Die Wirkungen auf die Zelloberflächen-Expression, Liganden-Bindung und stimulatorische Antwort wurden ebenso bei Studien des WSXWS-Motivs (SEQ ID NO: 13) und verwandten Motiven in Mutations-Analysen an IL-2Rβ, GM-CSFR und GHR beobachtet (Miyazaki, et al., EMBO J. 10: 3191-3197, 1991; Ronco L. V. et al., J. Biol. Chem. 269: 277-283, 1994; Baumgartner, J. W. et al., J. Biol. Chem. 269: 29094-29101, 1994).
Gleichermaßen kann die Mannosylierung des ersten Trp-Rests in dem WSXWS-Motiv (SEQ ID NO: 13) der Zalpha11-Rezeptor-Polypeptide, einschließlich der hierin beschriebenen Rezeptoren voller Länge und der löslichen Rezeptoren, bedeutende strukturelle und funktionelle Bedeutungen haben, wie beispielsweise Auswirkungen auf die Gesamt-Stabilität des Rezep tors, die Proteolyse-Rate, das intrazelluläre Prozessing, die Antigenizität, die Zelloberflächen-Expression, die Dimerisierung oder Multimerisierung, die Co-Rezeptor-Bindung, Signalisierung oder Internalisation, Wirkungen auf die Zalpha11-Liganden-Bindung und die Stabilität der Rezeptor-Ligand-Interaktion. Ein Vergleich der mannosylierten und nicht-mannosylierten Zalpha11-Rezeptoren kann unter Anwendung von Röntgen-Kristallographie oder NMR an gereinigten Zalpha11-Polypeptiden (z. B. löslichen Rezeptoren) vorgenommen werden; oder es können funktionelle Studien durchgeführt werden, in denen Zalpha11, welches in Zelllinien exprimiert wird, die entweder mannosylieren (z. B. BHK oder andere Zelllinien) oder keine oder reduzierte Mannosylierung zeigen (z. B. CHO und andere Zelllinien), mit Rezeptoren in den verschiedenen hierin beschriebenen Assays verglichen wird.
Beispiel 36
Bindungsstudien der BKH-Transfektanten
Gereinigtes humanes Zalpha11-Ligand-Protein (25 μg) (allgemein verfügbare US-Patentanmeldung Nr. 09/522,217) wurde unter Verwendung von Iodo-Beads (Pierce) mit ¹²⁵I (Amersham) iodiert und auf einer Sephadex-G25-PD-10-Säule (Pharmacia) gereinigt. Die BHK-Transfektanten (Beispiel 31), welche entweder humanes Zalpha11 allein oder den humanen Zalpha11-Rezeptor + humanen IL-2Rγ-Rezeptor exprimieren, wurden mit 30 K/Kammer in einer 24-Kammer-Platte 24 Stunden vor der Bindungsstudie ausplattiert. Die BHK-Transfektanten wurden für 2 Stunden bei 4°C mit 2,5 ng (0,147 pMol) ¹²⁵I-Zalpha11-Ligand (spezifische Aktivität 6,4 × 10⁷ cpm/μg) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen des kalten Zalpha11-Liganden (in einem Bereich von einem etwa 10.884-fachen Überschuss bis zu keiner Kompetition in 15 4-fach-Verdünnungen) inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit Bindungspuffer gewaschen, bevor sie in 0,8 M NaOH lysiert wurden; anschließend wurde eine Gamma-Emissions-Zählung vorgenommen. Die Analyse dieser Daten ergab eine Affinität von ungefähr 1 nM für die Zalpha11-Transfektanten und ungefähr 0,1 nM für die „humanes Zalpha11 + humaner IL-2Rγ-Rezeptor"-Transfektanten. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass der Zalpha11-Ligand eine hohe Affinität sowohl für den homodimeren humanen Zalpha11-Rezeptor als auch für den heterodimeren humanen Zalpha11 + humanen IL-2Rγ-Rezeptor aufweist, und dass die Affinität für das Heterodimer höher ist.
Beispiel 37
Murines homodimeres Zalpha11-Rezeptor-mG2a-Fusionsprotein
Der Expressions-Vektor pEZE2 wurde verwendet, um das Fusionsprotein aus murinem Zalpha11-Rezeptor und murinem IgGamma2a-Fc (Zalpha11m-mG2a) zu exprimieren. Die DNA-Sequenz des Fusionsproteins aus der extrazellulären Domäne des Maus-Zalpha11 und der Fc-Region der schweren Kette des murinen Immunglobulins Gamma 2a (Zalpha11 m-mG2a) ist in SEQ ID NO: 72 und die entsprechende Polypeptid-Sequenz in SEQ ID NO: 73 wiedergegeben.
Der pEZE2-Vektor ist ein von pDC312 (Immunex Corp., Seattle, WA) abgeleitetes Plasmid und enthält ein EASE-Segment, wie in der WIPO-Veröffentlichung WO 97/25420 beschrieben. Die Anwesenheit des EASE-Segments in einem Expressions-Vektor kann die Expression rekombinanter Proteine um das etwa zwei- bis achtfache in stabilen Zell-Pools anheben. Das pEZE2-Plasmid ist ein dicistronischer Expressions-Vektor, der verwendet werden kann, um zwei verschiedene Proteine in Säugetierzellen, wie beispielsweise den Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO), zu exprimieren. Die pEZE2-Expressions-Einheit enthält einen CMV-Enhancer/Promotor, eine dreiteilige Adenovirus-Leader-Sequenz, eine multiple Klonierungsstelle (MCS) zur Insertion des kodierenden Bereichs des interessierenden rekombinanten Proteins, eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle des Encephalomyocarditis-Virus, ein kodierendes Segment für die Maus-Dihydrofolat-Reduktase und den SV40-Transkriptions-Terminator. Außerdem enthält pEZE2 einen E.-coli-Replikations-Origin und das bakterielle Beta-Lactamase-Gen.
Das Zalpha11 m-mG2a-Fusionsprotein ist ein durch Disulfid-Brücken verbundenes Homodimer, welches aus zwei Ketten der extrazellulären Domäne des Maus-Zalpha11, fusioniert mit dem Fc-Bereich des murinen Wildtyp-Immunglobulins Gamma-2a, besteht. Das murine Immunglobulin Gamma 2a-Fc vermittelt Effektor-Funktionen, FcγRI-Bindung und C1q-Komplement-Fixierung. Das Fusions-Konstrukt aus der extrazellulären Domäne des Maus-Zalpha11 und dem konstanten Fc-Bereich des murinen Immunglobulins 2a wurde durch überlappende PCR dreier separater DNA-Fragmente, die jeweils durch separate PCR-Amplifikations-Reaktionen erzeugt worden waren, erzeugt. Das erste Fragment enthielt eine optimierte tPA-Signalsequenz (Gewebe-Plasminogen-Aktivator) (SEQ ID NO: 80). Die optimierte tPA(otPA)-Signalsequenz wurde unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer ZC26,644 (SEQ ID NO: 74) und ZC26,641 (SEQ ID NO: 75) unter Verwendung eines zuvor im Haus erzeugten Expressions-Vektors als Template amplifiziert. Der PCR-Reaktions-Mischung enthielt 20 pmol jedes Primers, 10 ng Template-cDNA, 20 μM jedes dNTP, 1 × Taq-Puffer (Life Technologies, Galthersburg, MD), 0,5 μl Taq-Polymerase in einer 100-μl-Reaktion. Die PCR-Bedingungen waren folgendermaßen: 1 Zyklus über 2 Minuten bei 94°C; 25 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C; 1 Zyklus über 5 Minuten bei 72°C. Das zweite Fragment enthielt den kodierenden Bereich der extrazellulären Domäne des Maus-Zalpha11 von den Aminosäuren 20 bis 257 der SEQ ID NO: 12. Die Oligonukleotid-Primer ZC26,642 (SEQ ID NO: 76) und ZC26,662 (SEQ ID NO: 77) wurden verwen det, um dieses Maus-Zalpha11-Segment unter Verwendung eines zuvor erzeugten Klons des Maus-Zalpha11 (SEQ ID NO: 11) als Template zu amplifizieren. Dieses PCR-Fragment wurde unter Verwendung der gleichen PCR-Reaktions-Mischung, wie oben spezifiziert, hergestellt. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren folgendermaßen: 1 Zyklus über 2 Minuten bei 94°C; 25 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 50°C und 45 Sekunden bei 72°C; 1 Zyklus über 5 Minuten bei 72°C.
Der Fc-Bereich der schweren Kette des murinen Gamma-2a wurde aus einem zuvor erzeugten Klon der cDNA der schweren Kette des murinen IgGamma-2a erzeugt. Das Segment, enthaltend das Gelenk, die C_H2- und C_H3-Domänen der konstanten Region der schweren Kette des murinen Immunglobulin-Gamma-2a, wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Oligonukleotid-Primer ZC26,643 (SEQ ID NO: 78) und ZC26,645 (SEQ ID NO: 79) erzeugt. Dieses PCR-Fragment wurde unter Verwendung der gleichen Reaktions-Mischung, wie oben spezifiziert, hergestellt. Die PCR-Bedingungen waren folgendermaßen: 1 Zyklus über 2 Minuten bei 94°C; 25 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C; 1 Zyklus über 5 Minuten bei 72°C.
Zur Herstellung des Fusionsprotein-kodierenden Segments wurden drei Protein-kodierende Domänen durch überlappende PCR unter Verwendung der Oligonukleotide ZC26,644 (SEQ ID NO: 74) und ZC26,662 (SEQ ID NO: 77), zur Verbindung der ersten zwei PCR-Produkte, und ZC26,644 (SEQ ID NO: 74) und ZC26,645 (SEQ ID NO: 79), zur Verbindung mit der Fc-Region, miteinander verbunden. Es wurden zwei Reaktionen durchgeführt: Die erste lief über 25 Zyklen, bestehend aus 2 Minuten bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 1 Minute 30 Sekunden bei 72°C. Die andere Reaktion lief über 25 Zyklen, bestehend aus 2 Minuten bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 1 Minute und 30 Sekunden bei 72°C. Die PCR-Produkte aus den zwei Reaktionen wurden vereinigt und unter Verwendung des QIAquick-PCR-Aufreinigungs-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Das Produkt wurde in 60 μl Puffer eluiert. 30 μl dieses Eluats wurden mit den Restriktions-Enzymen Fse1 und Asc1 in verdünntem NEB-10×-Puffer Nr. 4 (New England Biolabs, Beverly, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut. Das Material wurde dann auf einem 1%igen TAE-Agarosegel aufgetrennt und die ungefähr 1.500 bp große Bande ausgeschnitten; die DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen-Agarosegel-Extraktions-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Das Fragment wurde in 30 μl H₂O eluiert.
Zur Herstellung des Empfänger-Vektors für das Insert wurden etwa 3 μg pEZE2-Vektor mit Asc1 und Fse1 auf die gleiche Weise wie oben verdaut, mit dem Unterschied, dass 1 μl Kälberdarm-Phosphatase (CIP) (New England Biolabs) nach dem Restriktionsenzym-Verdau zugegeben wurde (die Reaktion wurde für weitere 2 Stunden durchgeführt). Der Vektor wurde dann auf einem Agarosegel aufgetrennt und wie oben gereinigt. Das Material wurde in 30 μl H₂O eluiert.
Das Fusionsprotein-kodierende Segment wurde in die MCS von pEZE2 von der Fse1-Stelle zu der Asc1-Stelle in dem Polylinker kloniert und unter Anwendung molekularbiologischer Standard-Reagenzien und -Verfahren in 20 μl ligiert. Die Ligations-Reaktion wurde über Nacht bei 16°C inkubiert. Ungefähr 4 μl dieser Ligations-Mischung wurden elektroporetisch in 50 μl elektrokompetente DH12s-E.-coli-Zellen (Life Technologies, Rockvelle, MD) eingeführt; die Zellen wurden in 1 ml LB-Medium aufgenommen und für 1 Stunde unter Schütteln inkubiert; dann wurden 100 μl auf Amp-100-Agarplatten verteilt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. An einer einzelnen Kolonie wurde Sequenzanalyse vorgenommen. Es wurde eine Mutation entdeckt, die zu einem Austausch von Glu zu Lys an Position 25 in der SEQ ID NO: 73 führen würde. Diese Aminosäure-Substitution liegt innerhalb des otPA-Leaders und könnte zu einem ungenauen Prozessing des Signalpeptids geführt haben, da die Leader-Sequenz am N-Terminus unvollständig gespalten war und an einem Pyroglutamin-Rest stromaufwärts des vorhergesagten Starts begann. Jedoch war dieses homodimere Konstrukt immer noch aktiv bei der Inhibierung des Zalpha11-Liganden (Beispiel 40).
Unter Verwendung des Qiagen-Maxi-Prep-Kits (Qiagen) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Großpräparation vorgenommen. Das Plasmid wurde verwendet, um CHO-Zellen zu transfizieren. Die Zellen wurden in Medium ohne Hypoxanthin oder Thymidin selektiert und die Transgenen unter Verwendung von Methotrexat (Beispiel 38) vermehrt. Die Anwesenheit des Proteins wurde durch Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen den konstanten Bereich der schweren Kette des humanen Gamma1 und gegen die humane Kappa-Leichtkette (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA) getestet.
Beispiel 38
Herstellung von zAlpha11m-mG2A in DG-44-CHO-Zellen
20 μg eines zAlpha11m-mG2A/pEZE2-Konstrukts (Beispiel 37) wurden mit 40 Einheiten PvuI bei 37°C für drei Stunden verdaut und dann mit Isopropanol präzipitiert und in einem 1,5-ml-Mikrofugen-Röhrchen pelletiert. Der Überstand wurde von dem Pellet abgesaugt und das Pellet in 100 μl Wasser resuspendiert. Ungefähr 200 μg (20 μl) gescherter Heringssperma-DNA wurden zu dem verdauten zAlpha11m-mG12A/pEZE2-Konstrukt gegeben. Die DNA-Mischung wurde unter Verwendung von 0,1 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) und 2,2 Volumen Ethanol co-präzipitiert. Das Röhrchen wurde für 15 Minuten auf Trockeneis platziert und dann in einer Mikrofuge bei 14.000 rpm für 15 Minuten herunterzertrifugiert, wodurch ein DNA-Pellet gebildet wurde. Der Überstand wurde von dem Pellet abgezogen und das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Röhrchen wurde in einer Mikrofuge für 10 Minuten bei 14.000 rpm zentrifugiert und der Überstand von dem Pellet abgezogen. Das Pellet wurde 30 Minuten an der Luft getrocknet. Das Pellet wurde dann in 100 μl Wasser resuspendiert und bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert. 500 μl, enthaltend etwa 5 × 10⁶ DG-44-CHO-Zellen, wurden zu der DNA in dem Mikrofugen-Röhrchen gegeben; dann wurde die DNA/Zellmischung in einer 0,4-cm-Spalt-Küvette platziert und unter Verwendung der folgenden Parameter elektroporiert: 1.070 μF, hohe Kapazität und 376 V. Der Inhalt der Küvette wurde dann entfernt und mit Protein-freiem EX-CELL^TM 325 PF-CHO-Medium (JRH Biosciences, Lenexa, KS) mit 3 mM L-Glutamin auf 25 ml verdünnt und in einem 125-ml-Schüttelkolben platziert. Der Kolben wurde in einem Inkubator auf einer Schüttelvorrichtung bei 37°C, 6% CO₂ platziert und bei 120 rpm geschüttelt.
Die DG-44-CHO-zAlpha11m-mG2A-Kultur wurde mit Methotrexat (MTX) unter Anwendung von Standardverfahren auf ein MTX-Endniveau von 50 nM MTX vermehrt. Die Kultur wurde Verdünnungs-kloniert und unter Durchführung einer Reihe von Western-Blots gescreent. Ein finaler Klon wurde ausgewählt und in MTX auf ein Niveau von 200 nM MTX weiter selektiert und anschließend in vergrößertem Maßstab produziert. Die Produktion jedes Batches des Klons wurde durch 8-maliges Aussäen von 4-l-Zentrifugen-Kolben mit 2 l Kultur mit ungefähr 5 × 10⁵ Zellen/ml erreicht. Die Kulturen wurden bei 70 rpm zentrifugiert, bei 37°C, 6% CO₂ gehalten und für entweder 72 oder 96 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden herunterzentrifugiert und die Überstände durch 0,2 μm filtriert. Eine ausreichende Anzahl an Zellen wurde gewonnnen, um die nächste Kolben-Serie anzuimpfen. Auf diese Weise wurden insgesamt vier Serien zur Protein-Aufreinigung hergestellt (Beispiel 39).
Beispiel 39
Aufreinigung des homodimeren löslichen Zalpha11m-mG2a-Rezeptor-Proteins
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Verfahren bei 4°C durchgeführt. Konditioniertes Medium (Beispiel 38) wurde direkt auf einer POROS-50-A-Säule angemessener Größe (gekoppeltes Protein A; PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) mit einer optimalen Auffang-Fließgeschwindigkeit aufgefangen. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumen (CVs) Ladepuffer gewaschen, dann schnell mit 3 CVs 0,1 M Glycin pH 2,5 eluiert. Die gesammelten Fraktionen hatten ein vorbestimmtes Volumen von 2 M TRIS pH 8,0, welches vor der Elution zugegeben wurde, um den pH-Wert auf ungefähr 7,2 zu neutralisieren.
Es wurden Brilliant-Blue(Sigma)-angefärbte NuPAGE-Gele laufen gelassen, um die Elution zu analysieren. Die interessierenden Fraktionen wurden vereinigt und gegen einen 30 kD MWCO-Zentrifugen-Konzentrator zu einem Nominal-Volumen konzentriert. Der konzentrierte Protein-A-Pool wurde auf eine Pharmacia-Sephacryl-200-Säule (Pharmacia) geeigneter Größe gespritzt, um Aggregate zu entfernen und den Puffer gegen PBS pH 7,2 auszutauschen.
Wiederum wurden Brilliant-Blue(Sigma)-gefärbte NuPAGE-Gele (NOVEX) verwendet, um die Elution zu analysieren. Die Fraktionen wurden wie zuvor vereinigt und auf ungefähr 1-2 mg/ml konzentriert. Es wurden Western- und Brilliant-Blue(Sigma)-gefärbte NuPAGE-Gele (NOVEX) laufen gelassen, um die Reinheit und den Gehalt zu bestätigen. Außerdem wurde das Protein einer Aminosäure-Analsyse (AAA) und einer N-terminalen Sequenzierung zur weiteren Analyse unterzogen.
Beispiel 40
Das lösliche homodimere Zalpha11m-mg2a-Fusionsprotein als Zalpha11-Ligand-Antagonist
BaF3-Zellen, die stabil den Maus-Zalpha11-Rezeptor (konstuiert in Beispiel 2 unter Verwendung der Primer zu der SEQ ID NO: 11) exprimieren, wurden mit 5.500 Zellen pro Kammer in Standard-96-Kammer-Gewebekultur-Platten in Basismedium plus 3 ng/ml humaner Zalpha11-Ligand ausplattiert. Das Basismedium ist 500 ml RPMI 1640 (JRH Biosciences), 5 ml 100 × Natrium-Pyruvat (Gibco BRL), 5 ml 100 × L-Glutamin (Gibco BRL) und 50 ml Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FBS) (Hyclone Laboratories). Zu den Zellen wurde eine abnehmende Dosis des gereinigten homodimeren Zalpha11m-mg2a (Beispiel 39) gegeben. Es wurden ein Alamar-Blue-Proliferations-Assay und eine fluorometrische Analyse, wie in Beispiel 2B, durchgeführt.
Das homodimere Zalpha11 m-mG2a-Fusionsprotein inhibierte die Aktivität des humanen Zalpha11-Liganden in einer dosisabhängigen Weise, wobei 1-5 μg/ml die Aktivität von 1,25 ng/ml humanem Zalpha11-Liganden inhibieren konnte.
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Polynukleotid, kodierend für einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei der Rezeptor-Komplex eine Sequenz von Aminosäure-Resten, die zu mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, identisch ist, und ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4), umfasst.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz von Aminosäure-Resten in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Rezeptor-Komplex ein WSXWS-Motiv, wie in SEQ ID NO: 13 gezeigt, umfasst.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 2, wobei die Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, durch das Polynukleotid, wie in SEQ ID NO: 7 gezeigt, kodiert wird.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, kodierend für einen multimeren Rezeptor-Komplex, wobei der multimere Rezeptor-Komplex weiterhin einen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor umfasst.
Isoliertes Polynukleotid gemäß jedem beliebigen vorherigen Anspruch, wobei der lösliche Rezeptor-Komplex weiterhin einen Affinitäts-Tag umfasst.
Expressions-Vektor, umfassend die folgenden Elemente: (a) einen Transkriptions-Promotor; ein erstes DNA-Segment, kodierend für ein lösliches Rezeptor-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; und (b) einen zweiten Transkriptions-Promotor; ein zweites DNA-Segment, kodierend für ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4); und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind.
Zwei Expressions-Vektoren, umfassend die folgenden Elemente: (a) einen Transkriptions-Promotor; ein erstes DNA-Segment, kodierend für ein lösliches Rezeptor-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; und (b) einen zweiten Transkriptions-Promotor; ein zweites DNA-Segment, kodierend für ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4); und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; wobei die ersten und zweiten DNA-Segmente in unabhängigen Expressions-Vektoren enthalten sind und wobei die von den DNA-Segmenten exprimierten Polypeptide miteinander assoziieren, um einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex auszubilden.
Expressions-Vektor gemäß Anspruch 7 oder zwei Expressions-Vektoren gemäß Anspruch 8, weiterhin umfassend eine mit den ersten und zweiten DNA-Segmenten operabel verknüpfte Sekretions-Signalsequenz.
Kultivierte Zelle, umfassend einen oder mehr Expressions-Vektor(en), umfassend die folgenden Elemente: (a) einen Transkriptions-Promotor; ein erstes DNA-Segment, kodierend für ein lösliches Rezeptor-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; und (b) einen zweiten Transkriptions-Promotor, ein zweites DNA-Segment, kodierend für ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4); und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor, das DNA-Segment und der Terminator operabel miteinander verknüpft sind; wobei die ersten und zweiten DNA-Segmente in einem einzigen Expressions-Vektor enthalten sind oder in unabhängigen Expressions-Vektoren enthalten sind und wobei die Zelle die durch die DNA-Segmente kodierten Polypeptide exprimiert.
Kultivierte Zelle gemäß Anspruch 10, wobei die ersten und zweiten DNA-Segmente auf unabhängigen Expressions-Vektoren untergebracht sind und in die Zelle co-transfiziert sind.
Kultivierte Zelle gemäß Anspruch 10, wobei die Zelle einen heterodimeren oder multimeren löslichen durch die DNA-Segmente kodierten Rezeptor-Komplex exprimiert.
Zelle gemäß Anspruch 10, wobei die Zelle einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex aus löslichen Rezeptor-Polypeptiden sekretiert.
Zelle gemäß Anspruch 10, wobei die Zelle einen heterodimeren oder multimeren Komplex aus löslichen Rezeptor-Polypeptiden sekretiert, der einen Liganden bindet, umfassend ein Polypeptid von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47, oder die Liganden-Aktivität antagonisiert.
DNA-Konstrukt, kodierend für ein Fusionsprotein, umfassend, ein erstes DNA-Segment, kodierend für ein Polypeptid, das eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, aufweist; und mindestens ein anderes DNA-Segment, kodierend für ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4), wobei die ersten und anderen DNA-Segmente im Leserahmen verbunden sind und wobei die ersten und anderen DNA-Segmente für das Fusionsprotein kodieren.
Expressions-Vektor, umfassend die folgenden operabel verknüpften Elemente: einen Transkriptions-Promotor; ein DNA-Konstrukt, kodierend für ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 15 und einen Transkriptions-Terminator, wobei der Promotor mit dem DNA-Konstrukt operabel verknüpft ist und das DNA-Konstrukt mit dem Transkriptions-Terminator operabel verknüpft ist.
Kultivierte Zelle, umfassend einen Expressions-Vektor gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle ein durch das DNA-Konstrukt kodiertes Polypeptid exprimiert.
Verfahren zur Herstellung eines durch ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 15 kodierten Fusionsproteins, umfassend: Kultivierung einer Zelle gemäß Anspruch 17, in der Weise, dass die Zelle das durch das DNA-Konstrukt kodierte Polypeptid exprimiert; und Isolierung des durch die Zelle produzierten Polypeptids.
Isolierter heterodimerer oder multimerer Rezeptor-Komplex, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten eine Sequenz von Aminosäure-Resten umfasst, die zu mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, identisch ist, und wobei der Rezeptor-Komplex weiterhin ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst.
Isolierter heterodimerer oder multimerer löslicher Rezeptor-Komplex gemäß Anspruch 19, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
Isolierter heterodimerer oder multimerer Rezeptor-Komplex gemäß Anspruch 19 oder 20, umfassend ein WSXWS-Motiv, wie in SEQ ID NO: 13 gezeigt.
Isolierter multimerer löslicher Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 19-21, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten aus einem löslichen Rezeptor-Polypeptid besteht, umfassend SEQ ID NO: 6, und wobei mindestens eine andere der löslichen Rezeptor-Untereinheiten aus einem löslichen Rezeptor-Polypeptid besteht, umfassend ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4).
Isolierter multimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 19-22, weiterhin umfassend einen löslichen Klasse-I-Cytokin-Rezeptor.
Isolierter heterodimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 19-21, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, und ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4).
Isolierter heterodimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 19-21 oder 24, bestehend aus zwei löslichen Rezeptor-Untereinheiten, wobei die erste lösliche Rezeptor-Untereinheit aus einem löslichen Rezeptor-Polypeptid besteht, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, und die zweite Rezeptor-Untereinheit aus einem löslichen Rezeptor-Polypeptid besteht, umfassend ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4).
Isolierter heterodimerer oder multimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 19-21 oder isolierter multimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 22-23 oder isolierter heterodimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 24-25, wobei der heterodimere Rezeptor-Komplex einen Liganden bindet, umfassend ein Polypeptid von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47, oder die Liganden-Aktivität antagonisiert.
Isolierter heterodimerer oder multimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 19-21 oder 26 oder isolierter multimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 22-23 oder 26 oder isolierter heterodimerer Rezeptor-Komplex gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 24-26, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten weiterhin einen Affinitäts-Tag, eine Markierung, einen chemischen Rest, ein Toxin, eine Biotin/Avidin-Markierung, ein Radionuklid, ein Enzym, ein Substrat, einen Cofaktor, einen Inhibitor, einen fluoreszenten Marker, einen chemilumineszenten Marker, ein Toxin, ein cytotoxisches Molekül oder eine Immunoglobulin-Fc-Domäne umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines löslichen heterodimeren oder multimeren Komplexes, umfassend: Kultivierung einer Zelle gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 10-14 oder 17 und Isolierung der löslichen durch die Zelle produzierten Rezeptor-Polypeptide.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gegen einen löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex, wobei der inokulierte lösliche heterodimere oder multimere Rezeptor-Komplex SEQ ID NO: 6 und ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst; wobei der Komplex eine Immunantwort zur Produktion des Antikörpers auslöst und wobei der Antikörper spezifisch an einen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplex bindet, umfassend SEQ ID NO: 6 und ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4).
In-Vitro-Verfahren zur Inhibierung eines Liganden, umfassend ein Polypeptid von SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 47, oder zur Antagonisierung der Liganden-Aktivität-induzierten Proliferation von hämatopoietischen Zellen oder hämatopoietischen Vorläufer-Zellen, umfassend: Kultivierung von Knochenmark oder periphären Blutzellen mit einer Zusammensetzung, umfassend einen heterodimeren oder multimeren Rezep tor-Komplex, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei mindestens eine der Untereinheiten eine Sequenz von Aminosäure-Resten umfasst, die zu mindestens 90% mit SEQ ID NO: 6 identisch ist, und wobei der Rezeptor-Komplex weiterhin ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst; wobei die Zusammensetzung die Proliferation von hämatopoietischen Zellen im Knochenmark oder in periphären Blutzellen reduziert, im Vergleich zum Knochenmark oder zu periphären Blutzellen, die in Abwesenheit des löslichen Rezeptor-Komplexes kultiviert werden.
In-Vitro Verfahren zur Inhibierung eines Liganden, umfassend ein Polypeptid von SEQ ID NO: 10, oder zur Antagonisierung der Liganden-Aktivität-induzierten Proliferation von hämatopoietischen Zellen oder hämatopoietischen Vorläufer-Zellen, umfassend: Kultivierung von Knochenmark oder periphären Blutzellen mit einer Zusammensetzung, umfassend einen löslichen Rezeptor, wobei der lösliche Rezeptor einen heterodimeren Rezeptor-Komplex umfasst, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei die erste lösliche Rezeptor-Untereinheit ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, die zu mindestens 90% mit SEQ ID NO: 6 identisch ist, und wobei die zweite lösliche Rezeptor-Untereinheit ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst; wobei die Zusammensetzung die Proliferation von hämatopoietischen Zellen im Knochenmark oder in periphären Blutzellen reduziert, im Vergleich zum Knochenmark oder zu periphären Blutzellen, die in Abwesenheit des löslichen Rezeptors kultiviert werden.
In-Vitro-Verfahren zur Inhibierung eines Liganden, umfassend ein Polypeptid von SEQ ID NO: 10, oder zur Antagonisierung der Liganden-Aktivität-induzierten Proliferation von hämatopoietischen Zellen oder hämatopoietischen Vorläufer-Zellen, umfassend: Kultivierung von Knochenmark oder periphären Blutzellen mit einer Zusammensetzung, umfassend einen löslichen Rezeptor, wobei der lösliche Rezeptor einen multimeren löslichen Rezeptor-Komplex umfasst, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheit ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, die zu mindestens 90% mit SEQ ID NO: 6 identisch ist, und wobei mindestens eine andere der löslichen Rezeptor-Untereinheiten ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4); wobei die Zusammensetzung die Proliferation von hämatopoietischen Zellen im Knochenmark oder in periphären Blutzellen reduziert, im Vergleich zum Knochenmark oder zu periphären Blutzellen, die in Abwesenheit des löslichen Rezeptors kultiviert werden.
In-Vitro-Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 30-32, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend eine Sequenz aus Aminosäuren, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
In-Vitro-Verfahren gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 30-33, wobei die hämatopoietischen Zellen und hämatopoietischen Vorläufer-Zellen Lymphoid-Zellen sind.
In-Vitro-Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die Lymphoid-Zellen NK-Zellen oder cytotoxische T-Zellen sind.
Verwendung eines löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplexes, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei mindestens eine der Untereinheiten eine Sequenz von Aminosäuren umfasst, die zu mindestens 90% mit SEQ ID NO: 6 identisch ist, und wobei der Rezeptor-Komplex weiterhin ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst, in einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel zur Herstellung eines Medikaments zur Unterdrückung einer Immunantwort in einem Säugetier, das einem Antigen oder Pathogen ausgesetzt wurde.
Verwendung eines Löslichen heterodimeren oder multimeren Rezeptor-Komplexes, umfassend lösliche Rezeptor-Untereinheiten, wobei mindestens eine der Untereinheiten eine Sequenz von Aminosäuren umfasst, die zu mindestens 90% mit SEQ ID NO: 6 identisch ist, und wobei der Rezeptor-Komplex weiterhin ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4) umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Reduktion der Proliferation neoplastischer B- oder T-Zellen in einem Säugetier mit einem B- oder T-Zell-Neoplasma.
Verwendung eines löslichen heterodimeren Rezeptor-Komplexes gemäß Anspruch 36 oder 37, wobei der lösliche heterodimere Rezeptor-Komplex eine erste lösliche Rezeptor-Untereinheit umfasst, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, und eine zweite lösliche Rezeptor-Untereinheit, umfassend ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4).
Verwendung eines löslichen multimeren Rezeptor-Komplexes gemäß Anspruch 36 oder 37, wobei mindestens eine der löslichen Rezeptor-Untereinheiten ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend eine Sequenz von Aminosäure-Resten, wie in SEQ ID NO: 6 gezeigt, und wobei mindestens eine andere der löslichen Rezeptor-Untereinheiten ein lösliches Rezeptor-Polypeptid umfasst, umfassend ein lösliches IL-2Rγ-Rezeptor-Polypeptid (SEQ ID NO: 4).
Verwendung eines löslichen multimeren Rezeptor-Komplexes gemäß jedem beliebigen der Ansprüche 36-37 oder 39, wobei der lösliche multimere Rezeptor-Komplex weiterhin ein Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Polypeptid umfasst.