EA011686B1 - Способ модуляции развития и функций т-клеток-хелперов - Google Patents

Abstract

Способ модуляции развития и функции Т-клеток-хелперов с использованием модуляторов активности или уровня IL-21, например человеческого IL-21.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается модуляторов активности интерлейкина ГЬ-21, например человеческого ГЬ-21, и их использования в модуляции развития и функции Т-лимфоцитов, например Т-клеток-хелперов (Тх).

Уровень техники

Субпопуляции Т-хелперов (Тх) отличаются своей способностью продуцировать особый набор цитокинов и запускать специфический иммунный ответ. Клетки Тх1 продуцируют γ-интерферон и запускают опосредованный клетками иммунитет к внутриклеточным патогенам. В отличие от них клетки Тх2 продуцируют цитокины интерлейкины 1Ь-4, 1Ь-5 и ГЬ-13, активируют тучные клетки и эозинофилы и направляют В-клетки против внеклеточных патогенов. Нарушение регуляции ответов Тх может привести к иммунопатологии, при которой аберрантный ответ Тх1 может быть причиной органо-специфической аутоиммунной реакции, а избыточный ответ Тх2 может быть связан с аллергическими заболеваниями.

Специфические цитокины, продуцируемые поляризованными клетками Тх, - это первичные эффекторы, которые запускают дифференцировку клеток-предшественников Тх, однако эти клетки также регулируют другие типы функциональной активности. Например, сообщается, что интерлейкин 1Ь-4 является мощным фактором, осуществляющим промоцию дифференцировки клеток-предшественников Тх в Тх2эффекторы. Кроме того, 1Ь-4 является антагонистом продукции γ-интерферона. Интерлейкин ГЬ-10, другой цитокин, продуцируемый клетками Тх2, как известно, ингибирует развитие клеток Тх1 и индуцируемую γ-интерфероном функцию макрофагов. Напротив, γ-интерферон, продуцируемый Тх1-клетками, усиливает развитие Тх1 и ингибирует рост клеток Тх2. Способность этих цитокинов осуществлять промоцию развития специфических субпопуляций Тх-клеток при одновременном ингибировании их альтернативных вариантов приводит к развитию прогрессивно поляризованного ответа.

Сущность изобретения

Изобретение частично основано на открытии, что цитокин интерлейкин-21 (1Ь-21) экспрессируется субпопуляцией клеток Т-хелперов (Тх) - Тх2 и селективно ингибирует уровень γ-интерферона (ИФН') в ходе развития клеток Тх1. Более конкретно, показано, что интерлейкин 1Ь-21 предпочтительно экспрессируется клетками Тх2, развивающимися ίη νίίτο и ίη νίνο. В одном из вариантов реализации воздействие 1Ь-21 на развивающиеся клетки Тх специфически снижает уровень ИФН' из развивающихся клеток Тх1 и, таким образом, потенцирует ответ клеток Тх2. Кроме того, воздействие 1Ь-21 на развивающиеся клетки Тх уменьшает передачу сигнала через 8ΐ;·ιΐ4. например, путем снижения экспрессии белка 81а(4 и/или соответствующей мРНК, что модулирует реактивность клеток Тх на другие цитокины, например, 1Ь-12. Таким образом, выявлены способы и препараты для модуляции развития и активности клеток Тх. Способы и препараты, например, агонисты и антагонисты 1Ь-21, описанные в данном изобретении, пригодны для терапии (т.е. излечения, улучшения состояния, замедления или предупреждения возникновения или предупреждения возобновления течения или рецидивов) или предупреждения заболеваний или состояний, связанных с Тх-клетками и/или γ-интерфероном, таких как заболевания, связанные с Тх2-клетками, например астмы и аллергии, и заболеваний, связанных с компонентами антител (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и волчанка); и заболеваний, связанных с Тх1-клетками, например аутоиммунных заболеваний (например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет первого типа, болезнь Крона, псориаз, бульбоспинальный паралич и др.).

С одной стороны, в изобретении описан способ ингибирования, например, снижения уровня или устранения γ-интерферона (ИФН') в Тх-клетке или клеточной популяции. Способ обеспечивает, например, ингибирование активности γ-интерферона, его экспрессии, секреции или процессинга в Тх-клетках, например, в предшественниках Тх-клеток (клетках Тхп) или в клетках Тх1 (например, в дифференцирующихся клетках Тх1 или эффекторных клетках Тх), или в дочерней популяции Т-клеток. Способ включает в себя обеспечение контакта Т-клетки или клеточной популяции с агонистом цитокина ГЬ-21 в количествах, достаточных для ингибирования ИФН' (т.е. снижения уровня или устранения) в Т-клетке или клеточной популяции, причем агонистом является полипептид 1Ь-21, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности 8ЕО Ш N0:2 и который способен связываться с рецептором ГЕ-21 (ГЬ-21В). В некоторых вариантах реализации способ также включает в себя идентификацию Т-клетки или клеточной популяции, в которой требуется ингибирование уровня ИФН'.

С другой стороны, в изобретении описан способ запуска дифференцировки Тх-клетокпредшественников (Тхп) или клеточной популяции в Тх2-клетку или клеточную популяцию. В одном из вариантов реализации способ включает в себя обеспечение контакта клетки Тхп или такой клеточной популяции с агонистом ГЬ-21 в количестве, достаточном для того, чтобы индуцировать дифференцировку клетки Тхп или такой клеточной популяции в клетку Тх2 или соответствующую клеточную популяцию, при этом агонист представляет собой полипептид ГЬ-21, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности 8Е0 ГО N0:2 и который способен связываться с ГЬ-21В. В некоторых вариантах реализации способ включает в себя идентификацию клетки Тхп или соответствующей клеточной популяции, в которой необходимо получить дифференцировку в клетки Тх2.

- 1 011686

Еще один аспект состоит в том, что изобретение связано со способом ингибирования клетки Тхп или такой клеточной популяции. Способ включает в себя обеспечение контакта клетки Тхп или такой клеточной популяции с агонистом 1Ь-21 в количестве, достаточном для того, чтобы индуцировать дифференцировку клетки Тхп или такой клеточной популяции в клетку Тх2 или соответствующую клеточную популяцию, при этом агонист представляет собой полипептид 1Б-21. аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности 8ЕО ΙΌ N0:2 и который способен связываться с 1Ь-21К В одном из вариантов реализации способ также включает в себя идентификацию популяции Т-клеток, в которой необходимо вызвать дифференцировку клетки Тхп или соответствующую клеточной популяции в клетку Тх1 или такую клеточную популяцию.

В некоторых вариантах реализации этого способа полипептид включает в себя аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0:2. В некоторых вариантах реализации этого способа стадия контактирования с агонистом выполнялась ех νίνο, ίη νίίτο или ίη νίνο. Подходящим субъектом для реализации способов ех νίνο или ίη νίνο является млекопитающее, в частности человек.

Далее, в изобретении описан способ ингибирования дифференцировки Тх-клетки-предшественника или соответствующей популяции клеток в Тх2-клетку или такую клеточную популяцию. Способ включает в себя контакт клетки Тхп или такой клеточной популяции с антагонистом интерлейкина-21 (1Ь21)/рецептора 1Ь-21 (1Ь-21В), в количествах, достаточных для того, чтобы ингибировать дифференцировку клетки Тхп или такой клеточной популяции в клеточную популяцию Тх2, а антагонист выбран из группы, включающей в себя антитела против 1Ь-21В, антигенсвязывающий фрагмент антител против 1Ь21В и растворимый фрагмент 1Ь-2ЕВ. Способ, кроме того, включает в себя также идентификацию Тклеток и их популяций, в которых требуется вызвать ингибирование дифференцировки клеток Тхп или их популяций в клетки или популяции клеток Тх2. В одном из вариантов реализации популяция Т-клеток включает в себя по меньшей мере одну клетку Тх1.

В некоторых вариантах реализации растворимый фрагмент 1Ь-21В включает в себя внеклеточный участок рецептора 1Ь-21 (1Ь-21В). Например, растворимый фрагмент, который способен связывать 1Ь-21 и может включать в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности аминокислот с 20-й по 235-ю в 8Е0 ΙΌ N0:4; альтернативный вариант реализации это растворимый фрагмент, содержащий аминокислоты с 1-й по 235-ю из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:4. В соответствующих вариантах реализации растворимый фрагмент также содержит Ее-фрагмент. Еще в одном варианте реализации антагонист представляет собой антитела против 1Б-21В или антигенсвязывающий фрагмент антител против 1Ь-21В.

Еще в одном варианте реализации стадия контактирования с антагонистом выполняется ех νίνο, ίη νίίτο или ίη νίνο. Процесс контакта может выполняться в [организме] млекопитающего, в частности человека.

Еще один аспект изобретения состоит в описании способа повышения уровня γ-интерферона (ИФНу) в Т-клетке или популяции таких клеток. Способ в одном из вариантов реализации включает в себя контакт Т-клетки или популяции таких клеток с антагонистом 1Ь-21/1Ь-21В, в количестве, достаточном для повышения уровня ИФНу в Т-клетке или популяции таких клеток, причем антагонист выбран из группы, в которую входят антитела против 1Б-21В, антигенсвязывающий фрагмент антитела против 1Ь21В и растворимый фрагмент 1Ь-21В. Вариант реализации этого способа также включает в себя идентификацию популяции Т-клеток, в которой необходимо повысить уровень ИФНу.

В некоторых вариантах реализации растворимый фрагмент 1Б-21В включает в себя внеклеточный участок рецептора 1Ь-21. Например, в некоторых вариантах реализации растворимый фрагмент включает в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную аминокислотам с 20-й по 235-ю из последовательности 8Е0 ΙΌ N0:4 и способен связывать 1Ь-21; в другом варианте реализации растворимый фрагмент включает в себя аминокислоты с 1-й по 235-ю из последовательности 5>Е0 ΙΌ N0:4. В других вариантах реализации растворимый фрагмент также включает в себя Есфрагмент. Еще в одном варианте реализации антагонистом могут служить антитела против ΙΕ-21Β или антигенсвязывающий фрагмент антител против ΙΕ-21Β.

Еще в одном варианте реализации стадия контактирования с антагонистом выполнялась ех νίνο, ίη νίίτο или ίη νίνο. В некоторых вариантах реализации стадия контактирования выполняется в [организме] млекопитающего, например человека.

Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют те же значения, которые обычно вкладываются в них специалистами, работающими в данной отрасли знания, если значения не определены иначе специально. Хотя в практике или при тестировании данного изобретения могут использоваться способы и материалы, сходные или эквивалентные с описанными в этом документе, адекватные материалы и способы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и иные ссылки, указанные в данном документе, включены во всей их полноте. В случае конфликта будет иметь силу данный перечень, включая дефиниции. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и неограничительными.

Другие особенности и преимущества изобретения будут ясны из нижеследующих подробного описания и формулы изобретения.

- 2 011686

Краткое описание чертежей

На фиг. 1А представлена картина нозерн-блот-гибридизации при изучении экспрессии ГБ-21, 1Б-4, ИФНу и γ-актина под действием различных факторов направленной дифференцировки, описанных в прилагаемых примерах.

Фиг. 1В - гистограмма, показывающая уровень мРНК 1Б-21 по отношению к мРНК САРБН (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) в клетках Тх1 и Тх2 после первичной и вторичной стимуляции.

Фиг. 1С - гистограмма, показывающая уровень мРНК 1Б-21 по отношению к мРНК 6ΑΡΌΗ в первичных и вторичных клетках Тх1 и Ех2, культивируемых в присутствии или в отсутствие 1Б-4 и ИФНу.

Фиг. 1Ό - гистограмма, показывающая уровень мРНК 1Б-21, мРНК 1Б-4 и мРНК ИФНу относительно мРНК 6ΑΡΌΗ у мышей с57ВБ/д и ВАБВ/с после инфекции БеЫташа та)ог.

Фиг. 2А - графическое представление продукции цитокинов 1Б-4 и 1Б-21 клетками Тхп, культивируемыми в нейтральных условиях, или клетками Тх1 в условиях направленной дифференцировки.

Фиг. 2В - гистограмма, показывающая продукцию ИФНу в клетках Тхп, обработанных 1Б-21 или ложно обработанных.

Фиг. ЗА - графическое представление продукции 1Б-4 и ИФНу клетками Тхп, культивируемыми в условиях направленной дифференцировки в Тх1 в присутствии или в отсутствие 1Б-22.

Фиг. ЗВ - графическое представление продукции обработанных 1Б-4 и ИФНу или ложно обработанных клеток Тхп в условиях направленной дифференцировки в Тх1 на мышах дикого типа и линии 81а16-/-.

Фиг. ЗС - графическое представление экспрессии ИФНу, 1Б-2 и ΤΝΕα (фактор некроза опухоли α) в обработанных 1Б-21 или ложно обработанных Тх1-клетках мышей дикого типа и мышей линии 81а16-/-.

Фиг. 4А - анализ вестерн-блоттинга уровней белка Τ-Ье! и актина в клетках Тхп, культивированных в условиях направленной дифференцировки в Тх1 или Тх2.

Фиг. 4В - гистограмма, показывающая относительные уровни мРНК 1Ε-12Κ.β2 по отношению к уровням в клетках Тх1.

Фиг. 4С представляет собой картину вестерн-блоттинга уровней полипептидов фосфорилированного 81а14, 81а14, 81а11 и 1Б-12 в клетках Тхп, стимулированных антителами против СО-3 в присутствии 1Б21 или пустых супернатантов.

Фиг. 4Ό - гистограмма, на которой показан уровень мРНК 81а14, относительно мРНК 6ΑΡΌΗ в ложно обработанных и обработанных 1Б-21 клетках Тхп, стимулированных антителами против СОЗ в течение 48 ч в присутствии 1Б-21 или пустых супернатантов. 1Б-4 и ИФНу.

Фиг. 5А - график, на котором показано специфическое опухание у мышей дикого типа и линии 1Б21-21К.-/-, иммунизированных ΤΝΡ-ΚΕΗ (2,4,6-тринитрофенилгемоцианин из моллюска Меда1ита сгепи1а1а (Кеу1о1е Б1тре1)) и инъецированных затем ΤΝΡ-ΚΕΗ или фосфатным буфером.

Фиг. 5В - гистограмма, на которой показано продуцирование ИФНу в СБ4+ Т-клетках, выделенных из дренированных лимфатических узлов иммунизированных ΤΝΡ-ΚΕΗ мышей дикого типа и 1Б21-21К.-/мышей, рестимулированных антигеном.

Подробное описание изобретения

Изобретение представляет собой способы и композиции для модуляции дифференцировки клеток Т-хелперов, их развития и активности путем модуляции взаимодействия между 1Б-21 и рецептором к 1Б21. 1Б-21 или агент, повышающий уровни 1Б-21 или рецепторов к 1Б-21 в клеточной популяции, вносятся в популяцию клеток Т-хелперов, чтобы снизить уровень ИФНу в популяции клеток Тхп или Тх1. 1Б-21 или агент, повышающий уровень 1Б-21, могут быть использованы для промоции развития клеток Тх2 или потенциирования опосредованного клетками Тх2 иммунного ответа и/или подавления развития клеток Тх1.

1Б-21 или агент, повышающий уровень 1Б-21, могут также использоваться для ингибирования эффектов 1Б-21 на популяцию клеток Т-хелперов. 1Б-21 или агенты, повышающие уровень 1Б-21 или иначе действующие как агонисты 1Б-21, могут использоваться для подавления опосредованных Тх1 заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, рассеянный склероз, ревматоидный артрит и диабет 1 типа.

В одном из аспектов изобретения описан способ модуляции, например, повышения или уменьшения или ингибирования активности или уровня у-интерферона (ИФНу) в клетках, например, в Т-клетке или в клеточной популяции, например, популяции Т-клеток. Например, это способ модуляции одного или более показателей: активности ИФНу, экспрессии, секреции или процессинга в Т-клетках, например, клетках-предшественниках Т-клеток (клеток Тхп) или клетках Тх1 (например, дифференцирующихся клетках Тх1 или в эффекторных клетках Тх) или в образующихся популяциях Т-клеток. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки или клеточной популяции, в которой требуется достичь модуляции (например, повышения или понижения) активности или уровня ИФНу; и обеспечение контакта указанных клеток или клеточной популяции с количествами модулятора 1Б-21, например, агониста или антагониста 1Б-21, достаточными, чтобы модулировать (например, повышать или понижать) активность или уровень ИФНу в указанных клетках или клеточной популяции.

Рассматриваемый способ может быть использован на культуре клеток, например, ίη νίίτο или ех νίνο. Например, иммунные клетки, например Т-клетки, описанные в данном изобретении, могут культи

- З 011686 вироваться ίη νίΐΓΟ в культуральной среде, и стадия контакта с модулятором выполняться добавлением одного или более модуляторов 1Ь-21 (например, агониста или антагониста 1Ь-21) в культуральную среду. Одновременно способ может применяться на клетках (например, иммунных или Т-клетках, как описано в данном изобретении) целого организма, например, ίη νίνο (как терапевтический или профилактический протокол).

В одном из вариантов реализации предлагается способ снижения или ингибирования активности или уровня ИФНу в клетке, например, Т-клетке (например, предшественнике Т-клеток (клетке Тхп)) или в клетке Тх1 (например, дифференцирующейся клетке Тх1 или эффекторной клетке Тх) или их клеточных популяциях. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки или клеточной популяции, например, популяции Т-клеток, в которой требуется уменьшить или ингибировать активность или уровень ИФНу; а также обеспечение контакта указанных клеток или клеточной популяции с такими количествами агониста 1Ь-21, которых достаточно для уменьшения или ингибирования активности или уровня ИФНу в указанной клетке или клеточной популяции. Предпочтительно агонист 1Ь-21 специфически ингибирует уровень ИФНу, например, не уменьшает и не ингибирует активность или уровень других цитокинов, таких как 1Ь-2 или ΤΝΕα. В одном из вариантов реализации агонист 1Ь-21 ингибирует продукцию ИФНу ИФНу-продуцирующей клеткой, например ИФНупродуцирующей клеткой Тх1.

В другом варианте реализации изобретение представляет способ уменьшения уровня ИФНу или его активности у субъекта. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию субъекта, у которого нужно достичь уменьшения уровня или активности ИФНу, и введение указанному субъекту таких количеств агониста 1Ь-21, которые достаточны для уменьшения уровня или активности ИФНу. ИФНу может быть определен с использованием методик, известных в данной отрасли, например, внутриклеточного окрашивания цитокинов или с помощью методики ЕЬ18А (иммунодерментный анализ) для определения уровня вещества в супернатантах клеток.

Агонист 1Ь-21 может представлять собой 1Ь-21-полипептид, человеческий 1Ь-21-полипептид или его активных фрагмент (например, человеческий 1Ь-21-полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, показанную как 8ЕО ΙΌ N0:2 или кодируемую нуклеотидной последовательностью, указанной, как 8Е0 ΙΌ N0:1, или последовательностью, существенно гомологичной указанным). В другом варианте реализации агонист 1Ь-21 представляется собой белок, включающий полипептид 1Ь21, например, человеческий полипептид 1Ь-21, или его фрагмент, связанный с другим полипептидом, например, полипептидом иммуноглобулина или его частью (например, Ее-участком полипептида иммуноглобулина); либо агонист ]Е-21 представляется собой антитело-агонист рецептора ]Е-21 либо низкомолекулярный агонист. В других вариантах реализации агонист 1Ь-21 представляет собой агент, повышающий активность или уровень 1Ь-21 путем, например, повышения экспрессии, процессинга и/или секреции функционального 1Ь-21.

Преимущественно субъектом являются млекопитающие, например человек, страдающий нарушениями, связанными с изменениями, например, повышением, уровня или активности ИФНу, например, иммунными заболеваниями (например, заболеваниями, опосредованными Т-клетками), а агонист вносится в количествах, достаточных, чтобы ослабить или предупредить указанное заболевание.

Типичные иммунные расстройства, при которых применение агонистов 1Ь-21 может давать терапевтический эффект (например, улучшать состояние) или предупреждать их, включают в себя, например, заболевания, связанные с клетками Тх1, такие как аутоиммунные заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет I типа, воспалительная болезнь кишечника (ΙΒΌ), псориаз и бульбоспинальный паралич (туакШеша дгасй).

В изобретении дополнительно описан способ повышения уровня или активности ИФНу в клетке, например, Т-клетке, или в клеточной популяции, например, популяции Т-клеток. Например, изобретение включает в себя способ повышения активности ИФНу, его экспрессии, секреции или процессинга в Тклетках, например, в клетке-предшественнике Т-клетки (клетки Тхп) или в клетке Тх1 (например, в дифференцирующейся клетке Тх1 или в эффекторной клетке Тх), или в таких клеточных популяциях. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки, или клеточной популяции, например, популяции Т-клеток, в которых необходимо добиться повышения экспрессии ИФНу; обеспечение контакта указанных клеток с антагонистом 1Ь-21 в количествах, достаточных для ингибирования связывания или активности 1Ь-21, например, ингибирования связывания 1Ь-21 с рецептором 1Ь-21, тем самым повышая уровень экспрессии ИФНу в указанной клетке.

Антагонистом 1Ь-21 может быть, например, антитело (например, моноклональное антитело, или антитело единственной специфичности) к 1Ь-21, например, человеческому 1Ь-21, или к рецептору 1Ь-21, например, человеческому полипептиду рецептора 1Ь-21. Преимущественно антитела являются человеческими, гуманизированными, химерными или полученными ίη νίίτο против человеческого 1Ь-21 или человеческого полипептида 1Ь-21-рецептора. В других вариантах реализации антагонист включает в себя фрагмент полипептида 1Ь-21, например, связывающий домен полипептида рецептора 1Ь-21. В другом варианте антагонист включает в себя фрагмент полипептида рецептора 1Ь-21, например, связывающий

- 4 011686 домен 1Ь-21 или полипептида рецептора 1Ь-21. В одном из вариантов реализации антагонист представляется собой белок, включающий в себя вышеуказанный 1Ь-21 или полипептид рецептора 1Ь-21, или их фрагменты, соединенные со вторым остатком, например, полипептидом (например, цепью иммуноглобулина).

Другим аспектом изобретения является описание способа модуляции, например, повышения или снижения, активности клеток Тх2 и/или их числа. Один из вариантов реализации представляет собой способ модуляции, например, промоции или ингибирования, одного или нескольких процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественников Т-клеток, например, предшественников клеток Тх) в клетки Тх2. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клеток, например, Т-клетки (например, клетки Тхп или клетки Тх2) или клеточной популяции, в которой требуется добиться модуляции пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с модулятором 1Ь-21, например, агонистом или антагонистом 1Ь-21, в количествах, достаточных для модуляции одного или нескольких процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, модуляции дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх2) в клетку Тх2, таким образом модулируя активность и/или число клеток Тх2.

Предлагаемый способ может использоваться на клетках в культуре, например, ίη νίΐτο или ех νίνο. Например, иммунные клетки, например, Т-клетки, описанные в данном изобретении, могут культивироваться ίη νίίτο в культуральной среде, и стадия контакта может реализовываться добавлением одного или более модуляторов 1Ь-21 (например, одного или более агонистов или антагонистов 1Ь-21) в культуральную среду. В другом варианте способ может реализовываться на клетках (например, иммунных или Тклетках, как описано в данном изобретении) пациента, например, как часть протокола ίη νίνο (терапевтического или профилактического).

В одном из вариантов реализации с помощью предлагаемого способа уменьшается или ингибируется активность клеток Тх2 и/или число этих клеток. Например, активность клетки Тх2 и/или число этих клеток могут быть уменьшены или ингибированы путем ингибирования или уменьшения одного или нескольких процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественников Т-клетки, например, предшественников Тх (Тхп)) в клетки Тх2. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки (например, Тхп или клетки Тх2), или клеточной популяции, в которой требуется добиться ингибирования пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с антагонистом 1Ь-21 в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения одного или более процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, ингибирования или уменьшения дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх2), таким образом ингибируя или уменьшая активность и/или число клеток Тх2.

Рассматриваемый способ может использоваться на клетках, например, Т-клетках (например, клетках Тхп или Тх2) в культуре, например, ίη νίΐτο или ех νίνο.

В другом варианте способ может применяться на клетках (например, иммунных или Т-клетках, как описано в данном изобретении), присутствующих в организме пациента, например, как часть протокола ίη νίνο (терапевтического или профилактического). Например, способ может использоваться для лечения или предупреждения заболеваний, опосредованных клетками Тх2, например, астмы или аллергии. Соответственно, изобретение представляет собой способ лечения (например, излечения, подавления, облегчения, задержки развития или предупреждения возникновения или рецидива) или предупреждения у пациента заболеваний, связанных с клетками Тх2. Способ включает в себя введение пациенту антагониста 1Ь21 в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения активности и/или числа клеток Тх2, таким образом излечивая или предупреждая связанные с клетками Тх2 заболевания.

Преимущественно субъектом применения способа являются млекопитающие, например человек, страдающий заболеваниями, связанными с нарушениями числа клеток Тх2 или их активности, например, иммунными заболеваниями (например, заболеваниями, связанными с клетками Тх2). Количество агента, достаточное для ингибирования или уменьшения активности клеток и/или их числа, - это количество, достаточное для ослабления или предупреждения указанного заболевания.

Антагонист 1Ь-21 может быть, например, антителом (например, моноклональным или моноспецифичным антителом) к 1Ь-21, например, 1Ь-21 человека или к рецептору 1Ь-21, например, полипептиду рецептора 1Ь-21 человека. В другом варианте реализации антагонист включает в себя фрагмент полипептида 1Ь-21, например, домен, связывающийся с полипептидом рецептора 1Ь-21. В другом варианте, антагонист включает в себя фрагмент полипептида рецептора 1Ь-21, например, домен, связывающий 1Ь-21, или полипептида рецептора 1Ь-21. В одном из вариантов реализации антагонист представляет собой белок, содержащий вышеуказанный 1Ь-21 или полипептид рецептора 1Ь-21 или их фрагменты, соединенные со вторым фрагментом, например, полипептидом (например, цепью иммуноглобулина).

Еще в одном варианте реализации предоставляется способ повышения активности клеток Тх2 и/или числа этих клеток. Например, активность клеток Тх2 и/или число этих клеток могут быть увеличены путем повышения одного или более процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественника Т-клетки, например, предшественника Тх (Тхп)) в клетку Тх2.

- 5 011686

Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например Т-клетки (например, клетки Тхп или клетки Тх2), или популяции клеток, в которых требуется добиться усиления пролиферации, выживания и/или дифференцировки; контакт указанной клетки или клеточной популяции с агонистом 1Ь-21 в количествах, достаточных для усиления одного или более из следующих процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, усиления дифференцировки указанных клеток Тхп в клетки Тх2) в клетки Тх2, повышая, таким образом активность клеток Тх2 и/или увеличивая их число.

Агонист 1Ь-21 может представлять собой полипептид 1Ь-21, например, полипептид 1Ь-21 человека, или его активный фрагмент (например, полипептид 1Ь-21 человека, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как 8Е0 ΙΌ N0:2, или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной как 8Е0 ΙΌ N0:1, или последовательностью, существенно гомологичной указанной). В другом варианте реализации агонист 1Ь-21 может представлять собой белок, образуемый полипептидом 1Ь-21, например, полипептидом 1Ь-21 человека, или его фрагментом, соединенным с другим полипептидом, например, полипептидом иммуноглобулина или его частью (например, Ее-участком полипептида иммуноглобулина); агонистическое антитело к рецептору 1Ь-21 или низкомолекулярный агонист.

Еще один аспект изобретения предоставляет способ модуляции, например, повышения или понижения числа и/или активности клеток Тх1. В одном из вариантов реализации предоставляется способ модуляции, например, промоции или ингибирования одного или нескольких из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественника Т-клетки, например, предшественника клетки Тх (Тхп)) в клетку Тх1. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки (например, клетки Тхп или Тх1), или клеточной популяции, в которой требуется добиться модуляции пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и контакт указанной клетки или клеточной популяции с модулятором 1Ь-21, например, агонистом или антагонистом, в количествах, достаточных, чтобы модулировать один или более из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, модуляции дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх1) в клетку Тх1, таким образом модулируя активность клетки Тх1 и/или число таких клеток.

Предлагаемый способ может быть использован на клетках в культуре, например, ίη νίΐτο или ех νίνο. Например, иммунные клетки, например, Т-клетки, как описано в данном изобретении, могут культивироваться ίη νίΐτο в культуральной среде, и стадия контакта может выполняться добавлением одного или более модуляторов 1Ь-21 (например, агониста 1Ь-21 или его антагониста) в культуральную среду. В то же время способ может применяться на клетках (например, иммунных или Т-клетках, как описано в данном изобретении), присутствующих в организме, например, как часть протокола ίη νίνο (например, терапевтического или профилактического).

В одном из вариантов реализации предлагается способ уменьшения или ингибирования активности и/или числа клеток Тх1. Например, активность клетки Тх1 и/или число таких клеток могут быть уменьшены или ингибированы путем ингибирования или снижения одного из процессов: пролиферации, выживания и (или) дифференцировки в клетки Тх1 (например, дифференцировки предшественника Тклетки, например, предшественника Тх (Тхп)). Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, предшественника Т-клетки (например, Тхп, клетки, продуцирующей ИФНу, например, клетки Тх1), или клеточной популяции, в которой необходимо добиться ингибирования пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и контакт указанной клетки или клеточной популяции с агонистом 1Ь-21, в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения одного или более процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки в клетку Тх1 (например, ингибирование или уменьшение дифференцировки указанных клеток Тхп в клетки Тх1), таким образом ингибируя или уменьшая активность клеток Тх1 и/или число таких клеток.

Предлагаемый способ может использоваться на клетках, таких как Т-клетки (например, Тхп или клетки Тх2), в культуре, например, ίη νίΐτο или ех νίνο.

Другой вариант состоит в том, что способ может применяться на клетках (например, иммунных клетках или Т-клетках, описанных в данном изобретении), присутствующих в организме, например, как часть протокола ίη νίνο (например, терапевтического или профилактического). Например, способ может быть использован для лечения или предупреждения у пациентов заболеваний, опосредованных клетками Тх1, например, аутоиммунных заболеваний (например, среди прочих, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, диабета I типа, болезни Крона, псориаза и бульбоспинального паралича). Соответственно, изобретение предоставляет способ лечения (например, излечения, подавления, ослабления, замедления или предупреждения возникновения, предупреждения возврата болезни или рецидива) или предупреждения заболевания, связанного с клетками Тх1 у пациентов. Способ включает в себя введение пациенту агониста 1Ь-21 в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения активности и/или числа клеток Тх1, таким образом излечивая или предупреждая заболевания, связанные с клетками Тх1.

Преимущественно субъектом воздействия являются млекопитающие, например человек, страдающий заболеванием, связанным с нарушением количества или активности клеток Тх1, например, иммунным заболеванием (например, заболеванием, связанным с клетками Тх1, как описано в данном изобретении). Количество, достаточное для ингибирования или уменьшения активности и/или числа клеток Тх1, это количество, достаточное для ослабления или предупреждения указанного заболевания.

- 6 011686

Агонистом 1Ь-21 может служить полипептид 1Ь-21, например, полипептид 1Ь-21 человека или его активный фрагмент (например, полипептид 1Ь-21 человека, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как 8ЕО Ш N0:2 или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной как 8Е0 Ш N0:1, или последовательностью, существенно гомологичной указанной). В других вариантах реализации агонист 1Ь-21 представляет собой белок, включающий в себя полипептид 1Ь-21, например, полипептид 1Ь-21 человека, или его фрагмент, соединенный с другим полипептидом, например, полипептидом иммуноглобулина или его частью (например, Ес-участком полипептида иммуноглобулина); агонистическое антитело или низкомолекулярный агонист. В других вариантах реализации агонист 1Ь-21 представляет собой агент, повышающий активность или уровень 1Ь-21 путем, например, усиления экспрессии, процессинга и/или секреции функционального 1Ь-21.

Еще в одном варианте реализации предоставляется способ повышения активности клеток Тх1 и/или числа этих клеток.

Например, активность клеток Тх1 и/или их число могут быть увеличены путем усиления одного из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки в клетки Тх1 (например, дифференцировки предшественника Т-клеток, например, предшественника Тх (Тхп)). Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки (например, Тхп или клетки Тх1) или их клеточной популяции, в которой требуется добиться повышения пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции таких клеток с антагонистом 1Ь21 в количествах, достаточных для усиления одного или более из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки в клетки Тх1 (например, усиления дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх1), что повышает активность и/или число клеток Тх1.

Антагонистом 1Ь-21 может служить, например, антитело (например, моноклональное или моноспецифическое антитело) к 1Ь-21 или к рецептору 1Ь-21, например, полипептиду рецептора 1Ь-21 человека. Преимущественно антитела являются человеческими, гуманизированными, химерными или генерированными ίη νίίτο к 1Ь-21 человека или полипептиду рецептора 1Ь-21 человека. В других вариантах реализации антагонист включает в себя фрагмент полипептида 1Ь-21, например, домен полипептида 1Ь-21, связывающийся с рецептором к 1Ь-21. В качестве альтернативы антагонист может включать в себя фрагмент полипептида рецептора 1Ь-21, например, домен полипептида рецептора 1Ь-21, связывающий 1Ь-21. В одном из вариантов реализации антагонист представляет собой белок, включающий в себя вышеуказанный 1Ь-21 или полипептид рецептора 1Ь-21 или их фрагменты, соединенные со вторым фрагментом, например, полипептидом (например, цепью иммуноглобулина).

Еще один аспект изобретения - это описание способа модуляции, например, уменьшения или ингибирования, активности интерлейкина-12 (1Ь-12) или его уровня в клетке, клеточной популяции или у пациента. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки, клеточной популяции или субъекта, где требуется модуляция 1Ь-12; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с модулятором 1Ь-12, например, агонистом или антагонистом 1Ь-12, или введение модулятора указанному субъекту, в количествах, достаточных для модуляции активности или уровня 1Ь-12 в указанных клетках, клеточной популяции или у субъекта.

В одном из вариантов реализации активность или уровень 1Ь-12 снижаются благодаря контакту указанной клетки или клеточной популяции с агонистом 1Ь-21, например, агонистом 1Ь-21, как описано в данном изобретении, в количествах, достаточных для снижения активности или уровня 1Ь-12.

В другом варианте реализации активность или уровень 1Ь-12 повышаются благодаря контакту указанных клетки или клеточной популяции или введению указанному субъекту антагониста 1Ь-21, например, антагониста 1Ь-21, как описано в данном изобретении, в количествах, достаточных для повышения активности или уровня 1Ь-12.

Еще один аспект изобретения состоит в описании способа модуляции, например, уменьшения или ингибирования или повышения 81а1. например, активности или уровня 81а14 в клетке, клеточной популяции или у субъекта. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Тклетки, клеточной популяции или субъекта, в которых требуется добиться модуляции активности или уровня 8(а(; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с модулятором 1Ь-12, например, агониста или антагониста 1Ь-12, или введение модулятора 1Ь-12 указанному субъекту в количестве, достаточном для модулирования активности или уровня 81а1 в указанной клетке, клеточной популяции или у субъекта.

В одном из вариантов реализации активность или уровень 8ΐαΐ уменьшается путем контакта указанной клетки или клеточной популяции с агонистом 1Ь-21, например, агонистом 1Ь-21, как это описано в данном изобретении, или введением субъекту агониста 1Ь-21 в количестве, достаточном для уменьшения активности или уровня 81аЕ например, белка δία! или его мРНК.

В другом варианте реализации активность или уровень 81а1 повышается путем контакта указанной клетки или клеточной популяции с антагонистом 1Ь-21, например, антагонистом 1Ь-21, как это описано в данном изобретении, или введение его указанному субъекту в количестве, достаточном для повышения активности или уровня 81аЕ например, белка 81а1 или мРНК.

Еще в одном варианте реализации изобретения описан способ снижения, ингибирования, подавле

- 7 011686 ния, ослабления или задержки аутоиммунного ответа (например, опосредованного Тх1 аутоиммунного ответа) у пациента. Метод включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, агониста 1Ь-21, например, агониста 1Ь-21, как это описано в данном изобретении, в количестве, достаточном, чтобы уменьшить, ингибировать, подавить, ослабить или замедлить указанный аутоиммунный ответ у указанного пациента.

Еще один аспект изобретения состоит в описании способа снижения, ингибирования, подавления, ослабления или замедления ответа, связанного с клетками Тх2 (например, аллергического или астматического ответов) у пациента. Способ включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, антагониста 1Ь-21, например, антагониста 1Ь-21, как это описано в данном изобретении, в количестве, достаточном, чтобы уменьшить, ингибировать, подавить, ослабить или замедлить указанный ответ, связанный с клетками Тх2, у указанного пациента.

Другой аспект изобретения состоит в описании способа селективной идентификации клеток Тх2 в клеточной популяции, например, популяции клеток Тх, способ включает в себя определение уровня нуклеиновой кислоты 1Ь-21 (например, продукта гена 1Ь-21) или полипептида в тестовом образце, например, клетке Тх, и сравнительном образце, например, клетке Тх1; и сравнение уровня указанной нуклеиновой кислоты 1Ь-21 в указанном тестовом образце с уровнем указанной нуклеиновой кислоты 1Ь-21 в образце сравнения, например, клетке Тх1, повышение уровня указанной нуклеиновой кислоты 1Ь-21 в указанном тестовом образце по сравнению с указанным образцом сравнения показывает, что тестовый образец представляет собой клетку Тх2.

Понятие «заболевания, связанные с клетками Тх1», как это понимается в данном изобретении, представляет собой заболевание, связанное с нарушением, например, повышением или снижением активности клеток Тх1 (например, усиленным или ослабленным ответом клетки Тх1) или их числом по сравнению с образцом сравнения, например, нормальным контролем. Примеры заболеваний, связанных с клетками Тх1, включают в себя, в частности, среди прочих, аутоиммунные заболевания (например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет I типа, болезнь Крона, псориаз и бульбоспинальный паралич).

Понятие «заболевания, связанные с клетками Тх2», как это понимается в данном изобретении, представляет собой заболевание, связанное с нарушением, например, повышением или снижением активности клеток Тх2 (например, усиленным или ослабленным ответом клетки Тх2) или их числом по сравнению с образцом сравнения, например, нормальным контролем. Примеры заболеваний, связанных с клетками Тх2, включают в себя, например, астму, аллергию и заболевания, связанные с компонентами антител (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и волчанка).

Полипептид 1Ь-21, использованный в способе, описанном в данном изобретении, может включать в себя аминокислотную последовательность, например, полипептид 1Ь-21 млекопитающих (таких как грызуны, человек или нечеловекообразные приматы). Например, полипептид 1Ь-21 может включать в себя аминокислотную последовательность полипептида 1Ь-21 человека. Соответствующая аминокислотная последовательность - это последовательность полипептида 1Ь-21, показанная как 8ЕО Ш N0:2 (см. ниже).

Полипептиды 1Ь-21 и рецепторы 1Ь-21, включая нуклеотидные и аминокислотные последовательности, описаны, например, в патенте США (И8 Ра1еп1 № 6057128, ΡαιτΜι-ΝοναΚ е! а1., №Шгс 408:57-63, 2000; Уо5511сппе11 е! а1., Сшт. Βίο1. 11:К.157-77, 2001, Акао е! а1., I. 1ттипо1. 167:1-5, 2001; и ОхаЮ е! а1., Ргос. Асаб. δει. И8А 97:11439-44, 2000). Аминокислотная последовательность полипептидов Ш-21 опубликована. Например, нуклеотидная и аминокислотная последовательности 1Ь-21 человека доступна в ОепЬапк Асс. Νο. Х_011082. Нуклеотидная последовательность 1Ь-21 человека, полученная в данном источнике, представлена ниже.

дсЕдаадЕда ааасдадасс ааддЕсЕадс ЕсЕасЕдЕЕд дЕасЕЕаЕда даЕсеадЕсс

ЕддсаасаЕд дададдаЕЕд ЕсаЕсЕдЕсЕ даЕддгсасс СЕсЕЕдддда сасЕддЕсса

121 саааЕсаадс ЕсссааддЕс аадаЕсдсса саЕдаЕЕада аЕдсдЕсаас ЕЕаЕадаСаС

181 ЕдЕЕдаЕсад сЕдаааааЕЕ аЕдЕдааЬда сЕСддгЕсссЕ дааЕЕЕсЕдс садсЕссада

241 адаЕдЕадад асааассдЕд адЕддЕсадс ЕЕЕЕЕссЕдс ЕЕЕсадаадд сссаасЕааа

301 дссадсаааЕ асаддаааса аЕдаааддаЕ ааСсааЕдЕа ЕсааЕЕаааа адсЕдаадад

361 дааассассе ЕссасаааЕд садддадаад асадааасас адасЕаасаЕ дсссЕЕсаЕд

421 ЕдаЕЕсЕЕаЕ дадаааааас сасссааада аЕЕссЕадаа адаЕЕсаааЕ сасЕЕсЕсса

481 ааадаЕдаЬЕ саЕсадсаЕс ЕдессесЕад аасасасдда адсдаадаЕЕ ессдаддаЕс

541 ЕаасЕЕдсад ЕЕддасасЕа ЕдЕЕасаЕас ЕсЕааЕаЕад ЕадЕдааадЕ саЕЕЕсЕЕЕд

501 ЕаЕЕссаадЕ ддаддад (БЕФ ΙΡ N0:1)

Аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты ГЕ21 человека, представлена ниже.

мк88РокмшиукдмУ1Рильунк5880боо1иваю4кош1У1хгиа4тго^Ег Π»ΑΡΕθνΕΙΝ0ΈΨ5ΑΡ5σΓΡΚΑςΐΚ8ΑΝΤσΝΝΕΚΙΙΝν5ΙΚΐακΚΚΡΡ8ΤΝΑ(№ΚΟΚΗΙϋ. ТСКСМУЫСКРРКЕРШипсЗШгКМШОНЬЗЗКТНОЗЕОЗ (8Е0 ГО N0:2).

Нуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты рецептора 1Ь-21 человека представлена ниже.

- 8 011686 даадсадсад дЕасссссЕс сасагсссЕа дддсЕсЕдЕд «ЕдЕаддсад аддсссдСдд дадссадсас дссдсдсддс Едддссдссс ссЕЕдсЕссЕ дсЕдсЕдсЕс садддаддсЕ

121 ддддсЬдссс сдассСсдЕс ЕдсЕасассд асгассЕсса дасддЕсаЕс ЕдсаЕссЕдд 1В1 аааЕдЕддаа ссЕссасссс адсасдсСса сссЕЕассЕд дсаадассад сасдаададс 241 Едааддасда ддссассксс ЕдсадссЕсс аеаддЕсддс ссасааЕдсс асдсаЕдсса 301 ссьасаесЕд ссасаЕддаь дЕаЕЕссасЕ ЕсаЕддесда сдасаЕЕЕЕс адЕдЕсааса 361 Есасадасса дЕсЕддсаас ЕасЕсссадд адЕдЕддсад сЕЕЕсЕссЕд дсЕдададса 421 Есаадссддс СсссссЕЕЕс аасдЕдасЕд ЕдассЕЕсЕс аддасадЕаЕ ааЕаЕсЕссЕ 481 ддсдсЕсада ЕЕасдаждас ссЕдссЕЕСЕ асасдссдаа дддсаадсЕЕ садааЕдадс 541 ЕдсадЕасад даассдддда дассссЕддд сЕдЕдадЕсс даддадааад сЕдаЕсьсад 601 ЕддасЕсаад аадЕдЕсЕсс сЕссЕссссс ЕддадЕЕссд сааадасЕсд адсЕаЕдадс 661 ЕдсаддЕдсд ддсадддссс аЕдссЕддсЕ ссСссСасса ддддассЕдд адЕдааЕдда 721 дЕдасссддЕ саЕсЕЕЕсад асссадЕсад аддадЕЕааа ддааддсЕдд аасссЕсасс 781 ЕдсЕдсЕЕСЕ ссЕсседсЕЕ дксаЕадЕсс ЕсаЕЕссЕде сЕЕсЕддадс сЕдаадассс 841 аЕссаЕЕдЕд даддсЕаЕдд аадаадаЕаЕ дддссдЕссс садсссЕдад сддЕЕсЕЕса 901 ЕдссссЕдЕа саадддсьдс адсддадаеЕ ЕсаадаааЕд ддЕдддЕдса сссЕЕсасЕд 961 дсЕссадссЕ ддадсЕддда сссЕддадсс сададдЕдсс сЕссассссд даддсдсаса 1021 дсЕдссассс ассасддадс ссддссаада ддсЕдсадсЕ сасддадсЕа саадаассад 1081 сададсЕддЕ ддадЕсЕдас ддСдСдссса адсссадсЕЕ сЕддссдаса дсесадаасЕ 1141 сддддддсЕс адсЕЕасадЕ даддададдд аЕсддесаЕа сддссЕддЕд ЕссаЕЕдаса 1201 садЕдасЕдЕ дсЕадаЕдса даддддссаЕ дсассЕддсс сЕдсадсЕдЕ даддаЕдасд 1261 дсЕасссадс ссЕддассЕд даедссддсс Еддадсссад сссаддссЕа даддасссас 1321 ЕсЕЕддасдс адддассаса дсссЕдсссс дЕддспдСдЕ сЕсвдседдс адсссЕдддс 1381 Еаддадддсс ссЕдддаадс сЕссЕддаса дасЕааадсс ассссЕЕдса даЕддддадд 1441 асЕдддседд дддасЕдссс ЕддддЕддсс ддЕсассЕдд аддддЕсЕса дададЕдадд 1501 сдддсссасс ссЕддссддс ссддаЕаЕдд асасдЕЕЕда садЕддсЕЕЕ дЕдддсЕсЕд 1561 асЕдсадсад сссСдЕддад ЕдЕдааЕЕса ссадссссдд ддаедаадда сссссссдда 1621 дсЕассЕссд ссадЕдддЕд дЕсаЕЕссЕс сдссасЕЕЕс дадсссЕдда ссссаддсса 1681 дсЕааЕдадд сЕдасЕддаЕ дЕссададсЕ ддссаддсса сЕдддсссЕд адссададас 1741 ааддЕсассЕ дддсЕдЕдаЕ дЕдаадасас сЕдсадссЕЕ сддЕсеесЕд даЕдддссЕЕ 1801 ЕдадссЕдаЕ дЕЕЕасадЕд ЕсЕдЕдЕдЕд ЕдЕдедсаЕа ЕдЕдЕдЕдЕд ЕдсаЕаЕдеа 1861 ЕдЕдЕдЕдЕд ЕдЕдЕдЕдЕс ЕЕаддЕдсдс адЕддсаЕдЕ ссасдЕдЕдЕ дЕдЕдаЕЕдс 1921 асдЕдссЕдЕ дддесЕддда ЕаагдсссаС ддЕасЕссаЕ дсаЕЕсассЕ дсссЕдЕдса 1981 ЕдЕсЕддасЕ сасддадсСс асссаЕдедс асаадЕдЕдс асадЕааасд ЕдЕЕЕдЕддЕ 2041 саасадаЕда саасадссдс сссссссссЕ адддЕсЕЕдЕ дЕЕдсаадЕЕ ддЕосасадс 2101 аЕсЕссдддд сЕЕЕдЕддда ЕсадддсаЕЕ дссЕдедасЕ даддсддадс ссадсссЕсс 2161 адсдгсЕдсс ЕссаддадсЕ дсаадаадЕс сагаЕЕдСЕс сЕЕаЕсассЕ дссаасадда 2221 адсдаааддд дасддадЕда дсссаЕддЕд ассЕсдддаа ЕддсааЕЕЕЕ ЕЕдддсддсс 2281 есЕддасдаа ддЕсЕдааЕс ссдасЕсЕда ЕассЕЕсЕдд «ЕдЕдсЕасс Сдадссаадг 2341 сдссЕссссЕ сЕсЕдддсЕа дадЕЕЕссЕЕ аЕссадасад Еддддааддс аЕдасасасс 2401 ЕдддддаааЕ ЕддсдаЕдЕс асседЕдЕас ддЕасдсадс ссададсада сссЕсааЕаа 2461 асдЕсадсСЕ ссеессеесе дсддссадад ссдаддсддд сдддддЕдад аасаЕсааЕс 2521 дЕсадсдаса дссЕдддсас ссдсддддсс дссссдссЕд сададддсса сссддддддд 2581 ЕЕЕссаддсЕ ЕааааЕеадЕ есдЕЕЕсдЕс ЕсЕЕддааас адсЕсессас сааесаадаЕ 2641 ЕЕсЕЕЕЕЕеЕ жасЕЕеЕдсЕ асЕаадЕЕЕЕ ЕаааааЕЕсс сЕЕЕаЕдсас есаададаЕа 2701 ЕЕЕаЕЕааас ассааЕЕасд Еадсаддсса ЕддсЕсаЕдд дасссасссс ссдЕддсаеЕ

2761 саЕддадддд дсЕдсаддСЕ ддаасЕаЕдс адЕдЕдсЕсс ддссасасаЕ ссЕдсСдддс 2821 ссссЕасссЕ дссссааЕЕс ааЕееЕдсеа аЕаааЕссЕд ЕсЕЕаЕЕЕдС ЕсаЕссЕдда 2881 дааЕЕда (ЗВф Ю И0:3)

Выявленная нуклеотидная последовательность рецептора 1Ь-21 кодирует полипептид со следующей аминокислотной последовательностью:

МРКаЫААРЫДЦДДХ2О0НОСР0ЬУСГТЦП<гТУ1С1ЦЕМННЬНР5Т1ТЬТИ0ОаУЕЕЬКЕЕАТЗС8ЦНЯЗАНМАтаАТ ΥΤυΗΜϋνΡΗΡΝΑΠηΐΡ3νΝΙΤΙ)08αΒΥ80Εα38ΡΕΙΛΕ5ΙΚΡΑΡΡΡΗνΤνΤΡ300ΥΝΙ8ΗΚ3ηΥΕηΡΑΡΥΜΙΛΟΚΙΧ2Υ ЕЬРУПНРСОРИАУЗРКЯКЫЗУЦЗКЗУЗШРЦБГВКПББУЕЬОУНАОРМРаЗЗУОСТНЗВНБЦРУТГОТСЗЕВЬКЕОН НРНЬШЬЦШУТУР1РЛШЗЬКТК₽ЬИПЬ»ПСХ1НАУРБРЕНРРМРЬУКССБСОРККНТСАРРТа58ЦЕЬа1>И5РКУ₽5 ТЪВУУЗСНРРЕБРАККЬОЦТВЦОВРАБЬУЕБОаУРКРЗРНРТАОНЗбСЗАУВЕЕНОРРУОЬЦВПУПГтЛАааРСТИ рС8СВихпрыщыжаьЕР8иплтрь1дмотт\п<8СбсиБШ38га1>вдИ|в8111Л!11ъкрр11Ы)ОЕОимэ(31>РН(Ю1г 5РССи5Е5ЕАС8Р1ЛСЬГ*ГОТГО5аРТО31>С53РУЕСЦРТЗРаОВСРРКЗУЪК0НУЕ1РРРЬ£ЗРСР0АЗ (БЕЦ ш N0:4}

Гомология нуклеотидной последовательности может быть определена как степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Гомология может быть определена с помощью известных компьютерных программ, таких как программное обеспечение САР программного пакета ССС. См. №ей1етап апй Ашъей 1970, ί. Μοί. ΒίοΙ. 48:443-453. При использовании программного обеспечения ССС САР со следующими установками сравнения нуклеотидных последовательностей: штраф за пропуск 5.0 и штраф за удлинение 0.3 - можно показать, что кодирующие участки указанных выше нуклеотидных последовательностей имеют степень идентичности с СЭ8 (кодирующей) частью ДНК, показанной для 8Е0 ΙΌ N0:1 или 8Е0 ΙΌ N0:3, составляющей по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 и 99%. Аналогичным образом, аминокислотная последовательность, указанная в данном изобретении, имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% степень идентичности по отношению к аминокислотным последовательностям, показанным в 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:5 или 8Е0 ΙΌ N0:6.

- 9 011686

Термин «идентичность последовательностей» относится к степени, с которой две полинуклеотидные или полипептидные последовательности идентичны при сравнении «основание за основанием» в конкретном участке сравнения. «Процент идентичности последовательностей» вычисляется путем сравнения двух оптимально совмещенных в области сравнения последовательностей и определения положений, в которых обнаруживаются совпадающие нуклеотидные основания (например, А, Т, С, С, и или I в случае нуклеиновых кислот) в обеих последовательностях, получения общего числа совпадающих положений и путем деления числа совпадающих положений на общее число положений в области сравнения (например, в размере окна) и умножения на 100 для получения значения в процентах идентичности последовательности. Термин «существенная идентичность» используется в данном изобретении для описания характеристики полинуклеотидной последовательности, в которой полинуклеотид включает в себя последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентичную, часто - на 90-95%, а наиболее часто - по меньшей мере на 98 или 99% идентичную последовательности сравнения в рассматриваемой области. Величина «процента позитивных остатков» рассчитывается путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей в области сравнения, с определением числа положений, в которых идентичные или консервативные замещены аминокислот, как это определено выше, обнаруживаются в обеих последовательностях, составляя число совпадающих положений, делением числа совпадающих положений на общее число положений в области сравнения (например, в размере окна), и умножением на 100, что дает процент позитивных остатков.

Агенты, которые повышают уровни 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21 в клетке или клеточной популяции, могут дополнительно включать в себя агонисты 1Ь-21 или агонисты рецептора 1Ь-21. Такие агонисты могут быть идентифицированы идентифицирующими тестовыми соединениями, которые вызывают один или более видов активности, которые проявляет 1Ь-21 на популяции клеток Т-хелперов.

Субъект может быть млекопитающим, например человеком, иным приматом, собакой, кошкой, коровой, лошадью, свиньей или грызуном (включая крысу или мышь). Может использоваться любой нужный способ введения 1Ь-21. Подходящими способами являются внутривенный (и болюсы, и вливания), внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный, все применяемые способы хорошо известны специалистам в данной области фармацевтической технологии. Инъекции могут быть приготовлены в обычных формах как растворов, так и суспензий.

Парентеральное инъекционное введение обычно используется для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и вливаний.

Антагонисты 1Ь-21.

Чтобы ингибировать опосредованный 1Ь-21 эффект клеток Т-хелперов, агент, который блокирует или ингибирует взаимодействие 1Ь-21 с рецептором к 1Ь-21, может быть добавлен Т-клетке или популяции Т-клеток, например клеток Т-хелперов. Для удобства эти ингибиторы обозначены в данном документе как «антагонисты 1Ь-21». Примеры 1Ь-21 включают в себя, например, растворимые фрагменты 1Ь21 или рецептора 1Ь-21, гибридные белки, содержащие эти фрагменты, и антитела к этим фрагментам. Антагонисты 1Ь-21 пригодны для блокирования 1Ь-21 в опосредованных Тх2 заболеваниях, включая заболевания, опосредованные антителами. Эти болезни включают в себя астму, аллергию, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и волчанку.

Гибридные белки 1Ь-21 и рецептора 1Ь-21.

1Ь-21 или рецептор 1Ь-21, или активные фрагменты этих белков могут быть присоединены к молекулам-переносчикам, таким как иммуноглобулины, для использования способами, описанными в данном документе. Например, растворимые формы рецептора 1Ь-21 могут быть присоединены через «линкерные» последовательности к участку Те иммуноглобулина или к Ре-участку иммуноглобулина. Могут использоваться и другие гибридные белки, такие как с С8Т (т.е. глутатион 8-трансферазой), ЬехА или МВР (т.е. белком, связывающим мальтозу).

В другом варианте реализации гибридные белки 1Ь-21 или рецептор 1Ь-21 могут быть присоединены к одному или более дополнительным фрагментам. Например, гибридные белки 1Ь-21 или рецептор 1Ь-21 могут быть дополнительно связаны с гибридным белком С8Т. в котором последовательность гибридного белка рецептора 1Ь-21 соединена с С-концом последовательности С8Т. Такие гибридные белки могут облегчать очистку гибридных белков 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21.

В другом варианте реализации гибридный белок включает в себя гетерологическую сигнальную последовательность (т. е. полипептидную последовательность, которая не представлена в естественном полипептиде, кодируемом нуклеиновыми кислотами 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21) на его Ν-конце. Например, естественная сигнальная последовательность 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21 может быть удалена и замещена сигнальной последовательностью другого белка.

Химерный или гибридный белок, используемый в данном изобретении, может быть получен путем стандартной рекомбинантной технологии ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, сшиты воедино в соответствии со стандартной технологией, например, используя для сшивки тупые или смещенные концы двунитевой ДНК, переваривание ферментами рестрикции для получения соответствующих концов, заполнение липких концов адекватным образом, обработку щелочной фосфатазой с целью устранить нежелательное соединение и ферментативную

- 10 011686 сшивку. В другом варианте реализации с помощью стандартных технологий, включая автоматический синтезатор ДНК, может быть синтезирован гибридный ген. В ином случае может быть выполнена ПЦРамплификация фрагментов гена с помощью якорных праймеров, которая вызывает комплементарное перекрывая между двумя последовательными фрагментами гена, которое затем могут подвергнуться отжигу и реамплификации, с получением химерной последовательности гена (см., например, Ли8иЬе1 с1 а1. (ебк.) Ситгеи! Рто1осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, ίοΐιη XV Неу & 8ои§, 1992). Далее, коммерчески доступны многие векторы экспрессии, кодирующие гибридные участки (например, участок Ре тяжелой цепи иммуноглобулина). Нуклеиновые кислоты, кодирующие 1Ь-21 или рецептор 1Ь-21, могут быть клонированы в таком векторе экспрессии так, что гибридный участок связывается с белком иммуноглобулина.

В некоторых вариантах реализации участки 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21 представлены как вариант полипептида рецептора 1Ь-21, имеющий мутацию в природной последовательности 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21 (дикий тип), что приводит к повышению аффинности (по сравнению с не содержащей мутации последовательностью) связывания измененного 1Ь-21 с рецептором к 1Ь-21 или повышению аффинности (по сравнению с не содержащей мутации последовательностью) измененного полипептида рецептора Ш21 с Ш-21.

В некоторых вариантах реализации полипептид 1Ь-21 или участок полипептида рецептора 1Ь-21 представлены как вариант 1Ь-21 или полипептида рецептора 1Ь-21, имеющих мутацию в природной последовательности 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21 (дикий тип), которая приводит к тому, что последовательности 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21 более резистентны к протеолизу (по сравнению с немутировавшей последовательностью).

Сигнальный пептид, который может быть включен в гибридный белок - это МРЬЬЬЬЬЬЬЬР8РЬНР (8ЕО Ш N0:5). Если это желательно, одна или более аминокислот могут быть дополнительно встроены между первым полипептидным участком, включающим в себя участок 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21, и вторым полипептидным участком.

Второй полипептид предпочтительно растворим. В некоторых вариантах реализации второй полипептид увеличивает время полужизни (например, полужизни сыворотки) присоединенного полипептида. В некоторых вариантах реализации второй полипептид включает в себя последовательность, которая облегчает ассоциацию гибридного полипептида со вторым полипептидом рецептора 1Ь-21. В предпочтительных вариантах реализации второй полипептид включает в себя, по меньшей мере, участок полипептида иммуноглобулина.

Иммуноглобулиновые гибридные полипептиды известны в данной области и описаны, например, в Патенте США № 5516964; 5225538; 5428130; 5514582; 5714147 и 5455165.

В некоторых вариантах реализации второй полипептид включает в себя полноразмерный полипептид иммуноглобулина. В ином варианте второй полипептид включает в себя не полноразмерный полипептид иммуноглобулина, например, тяжелую цепь, легкую цепь, РаЬ, РаЬ₂, Ρν или Рс. Предпочтительно, чтобы второй полипептид включал в себя тяжелую цепь полипептида иммуноглобулина.

В некоторых вариантах реализации второй полипептид имеет меньшую эффекторную функцию, чем эффекторная функция участка Рс тяжелой цепи иммуноглобулина дикого типа. Эффекторная функция Рс включает в себя, например, связывание с рецептором Рс, фиксацию комплемента и активность, истощающая Т-клетки (см., например, Патент США № 6136310). Способы определения активности, истощающей Т-клетки, эффекторной функции Рс и стабильности антител в этой области техники известны. В одном из вариантов реализации второй полипептид имеет низкую или отсутствующую аффинность к комплементарному белку С1с.|.

Предпочтительная последовательность второго полипептида включает в себя аминокислотную последовательность 8Е0 Ш N0:6. Эта последовательность включает в себя участок Рс. Подчеркнуты аминокислоты, которые отличаются от аминокислот, обнаруженных в соответствующем положении последовательности иммуноглобулина дикого типа:

ΗΤσ₽ΡϋΡΑ₽ΕΜΛ^8νΡΙ^ΡΡΚΡΚΙ>ΤΙΛΙ8ΚΤ₽ΒνΤσνννπν8ΗΕ0₽ΕνΚΡΝΗϊνησνΕνΗΝΛΚ

ΤΚΡΚΕΕ0ΥΝ5ΤΥΚνν8νΒΤνΜ0ΟΗΕΝ<3ΚΕΥΚΟΚν3ΝΚΑΤΡνΡΙΕΚΤΙ5ΚΑΚ0αΡΒΕΡ0νΥΊΤ,ΡΡ ЗКВВМТК»0УЗЬТСЬУК6РТР8О1ЛУЕИЕ81К30РВЫ№ГКГта'Р7ЬПЭ0С8ГРЬ¥8КЬТТОК8Л»Ю 0(3ΝνΡ5Ο8νΜΗΕΜΛΝΗΪΤ0Κ8ϋ3Ε5₽ΟΚ (5Εβ Ιϋ N0:6)

Антитела к Ш-21 и к рецептору Ш-21.

Термин «антитело», как он используется в данном документе, относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным участкам молекул иммуноглобулина (1д), например, молекул, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (иммунно реагирует) с антигеном. Такие антитела включают в себя, например, поликлональные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, фрагменты Р_аЬ, Р_аЬ и Р(_аЬ')₂ и библиотеку экспрессии Р_аЬ. В общем, молекула антитела, полученная от человека, относится к одному из классов 1дО, 1дМ, 1дА, 1дЕ и 1дЭ, которые отличаются один от другого природой тяжелой цепи, представленной в молекуле. Определенные классы имеют также подклассы, такие как 1дС1, 1дО₂ и другие. Кроме того, у человека легкая цепь может представлять собой κ-цепь или λ-цепь. Ссылки в данном документе на антитела включают в себя все классы, подклассы и типы человеческих антител. Антитела к полипептидам Ш-21 или рецептора Ш-21 также включают в

- 11 011686 себя антитела к гибридным белкам, содержащим полипептиды 1Б-21 или рецептора 1Б-21 или фрагменты полипептидов 1Ь-21 или рецептора 1Ь-21.

Полипептид 1Б-21 или полипептид рецептора 1Б-21 может быть использован как антиген или часть или фрагмент его, и дополнительно может быть использован как иммуноген, чтобы генерировать антитела, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, используя стандартную технологию приготовления поликлональных и моноклональных антител. Антигенные пептидные фрагменты антигена для использования в качестве иммуногена включают в себя, например, по меньшей мере 7 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности амино-концевого участка, такие как аминокислотные последовательности, показанные в 8ΕΟ ΙΌ N0:1 или 3, и охватывают его эпитоп, так что выработанное против пептида антитело образует специфический иммунный комплекс с полноразмерным белком или с каким-то фрагментом, содержащим эпитоп. Предпочтительно, антигенный пептид содержит не менее чем 10 аминокислотных остатков, или не менее чем 15 аминокислотных остатков, или не менее чем 20 аминокислотных остатков, или не менее чем 30 аминокислотных остатков. Предпочтительные эпитопы, окруженные антигенным пептидом, - это область белка, которая расположена на его поверхности, обычно в гидрофильной части.

В некоторых вариантах реализации не менее чем один эпитоп, окруженный антигенным пептидом, это участок 1Б-21 или полипептида рецептора 1Ь-21, который расположен на поверхности белка, например, в гидрофильном участке. Анализ гиброфобности 1Б-21 или полипептида рецептора 1Б-21 покажет, какой участок 1Б-21 или полипептида рецептора 1Б-21 особенно гидрофилен, и следовательно, вероятно, кодирует поверхностные остатки, пригодные для нацеливания продукции антител. Как средства для нацеливания продукции антител графики гидропатии, показывающие участки гидрофильности и гидрофобности, могут быть получены любым известным в этой области способом, включая, например, способы Ку1е - Эоо1Ш1е или Норр - \Уооб5 с преобразованием или без преобразования Фурье. См., например, Норр апб \Уооб5 (1981) Ргос. Ναι. Асаб. 8е1 υδΑ 78: 3824-3828; Ку1е апб ЭооНШе (1982) 1. Μοί. ΒίοΙ. 157:105-142. Антитела, специфичные к одному или более доменам в антигенном белке или его производном, фрагментах, аналогах или гомологах, также могут быть получены.

Белок, предмет данного изобретения или его производное, фрагмент, аналог, гомолог или ортолог может быть использован для генерирования антител, которые иммуноспецифически связывают эти белковые компоненты.

Различные процедуры, известные в данной области техники, могут быть использованы для получения поликлональных или моноклональных антител против белка согласно изобретению или против его производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов. См., например, ΑΝΤΙΒ0ΌΙΕ8: А ЬАВ0ΚΑΤ0ΚΥ ΜΑΝυΑΕ, Η;πΊο\ν апб Ьапе (1988) Со1б 8рппд НагЬог БаЬогаЮгу Рге55. Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ. Некоторые из этих антител обсуждены ниже.

Поликлональные антитела.

Для получения поликлональных антител могут быть иммунизированы различные подходящие организмы хозяина (например, кролик, коза, мышь или другие млекопитающие) путем одной или более инъекций нативным белком, его синтетическим вариантом или производными указанных. Соответствующий иммуногенный препарат может содержать, например, естественный иммуногенный белок, химически синтезированный полипептид, представляющий иммуногенный белок, или рекомбинантно экспрессированный иммуногенный белок. Кроме того, белок может быть конъюгирован со вторым белком, про который известно, что он иммуногенен для иммунизируемого млекопитающего. Примеры таких иммуногенных белков включают в себя, но не ограничиваются гемоцианином моллюска МедаШга сгепи1а!а (Кеу11о1е Ышре!), сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином и соевым ингибитором трипсина.

Препарат может также включать в себя адъювант. Различные адъюванты, используемые для повышения иммунологического ответа, включают в себя, но не ограничиваются, адъювантом Фройнда (полным или неполным), минеральными гелями (например, гидратом окиси алюминия), поверхностноактивные вещества (например, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и т.д.), адъюванты, используемые для человека, такие как ВасШе Са1ше11еОиепп и СогупеЬас1епиш рагуиш или сходные иммуностимуляторные агенты. Дополнительные примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают в себя адъювант МРЬ-ΤΌΜ (монофосфорил липид А, синтетическая трегалоза дикориномиколат).

Молекулы поликлонального антитела, направленного против иммуногенного белка, могут быть выделены из млекопитающих (например, из крови) и затем очищены с помощью известных технологий, таких как аффинная хроматография, использующая белок А или белок О, которые представляют собой в первую очередь фракцию иммуноглобулинов 1дО иммунной сыворотки. Затем, или как альтернатива, специфический антиген, который является мишенью поиска иммуноглобулина, или его эпитоп могут быть иммобилизованы на колонке, чтобы очистить иммуноспецифические антитела с помощью иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, Вилкинсоном. ХУбкпъоп (2000) ТНе 8с1епЙ51, 14:25-28.

Моноклональные антитела.

Термин «моноклональные антитела» (МА) или композиции моноклональных антител», как это ис

- 12 011686 пользуется в данном изобретении, относится к популяции молекул антител, которые содержат только один молекулярный вид молекулы антитела, состоящей из уникальной легкой цепи продукта гена, и уникальную тяжелую цепь продукта гена. В частности, участки, определяющие комплементарность (КОУ) моноклонального антитела, идентичны у всех молекул популяции. МА, таким образом, содержат антигенсвязывающий сайт, способный к иммунореактивности с особым эпитопом антигена, характеризующейся уникальной аффинностью связывания с ним.

Моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием способов гибридом, так, как это описано КоЫет апб ΜίΜοίη (1975) Ыа1иге, 256:495. Способом гибридом мышь, хомячок или другое подходящее животное-хозяин обычным образом иммунизируется иммунизирующим агентом, чтобы активировать лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим агентом. В качестве альтернативы, лимфоциты могут быть иммунизированы ίη νίΐτο.

Иммунизирующий агент обычно включает белковый антиген, его фрагмент или его химерный белок. Обычно используются либо лимфоциты периферической крови, если нужны клетки человеческого происхождения, либо клетки селезенки или лимфатического узла, если в качестве источника используется млекопитающее, кроме человека. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией, используя подходящий для слияния агент, такой как полиэтиленгликоль, чтобы образовать клетку гибридомы. Соб1п§, Х1ОХОС1.ОХА1. ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8: РН1ХС1Р1.Е8 ΆΝΏ РВАСТ1СЕ, Лсабеш1с Рге§8, (1986) рр. 59-103. Иммортализованные клеточные линии - это обычно трансформированные клетки млекопитающих, особенно клетки миеломы, происходящие от грызунов, быка или человека. Обычно используются клеточные линии миеломы крыс или мышей. Клетки гибридомы могут культивироваться в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслившихся, иммортализованных клеток. Например, если у парентеральных клеток отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансфераза (ГГПРТ или ГПРТ), культуральная среда для гибридом обычно включает в себя гипоксантин, аминоптерин и тимидин («среда ГАТ»), упомянутые вещества предупреждают рост ГГПРТ-дефицитных клеток.

Предпочтительно линии иммортализованных клеток - это такие, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильно высокий уровень экспрессии антител отобранными клетками, продуцирующими антитела, и чувствительны к среде, такой как среда ГАТ. Более предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются мышиные линии миеломы, которые могут быть получены, например, в 8а1к ЕъШШе Се11 ОМпЬибоп Сеп1ег, 8ап О1едо, СаНГогша и в Атепсап Туре Си11иге СоПесБоп, Мапаккак, УйДша. Также описано использование миеломы человека и мышино-человеческой клеточной линии гетеромиеломы для продукции моноклональных человеческих антител (КохЬог (1984) 1. 1ттипо1., 133:3001; Вгобеиг е1 а1., МОХОСРОХАР ΑΝΤΙΒΟΌΥ ΡΚΟΌ^ΤΙΟΝ ТЕСИXIΡΗ.,ΊΑ ΑΝΏ АРРМСАΤΙΟΝ8, Магсе1 Эеккег. 1пс., Xе\ν Υο^к, (1987) рр. 51-63).

Культуральная среда, в которой культивируются клетки гибридомы, может затем быть исследована на присутствие моноклональных антител, направленных против антигена.

Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяется по иммунопреципитации или по анализу связывания 1п νίΙΐΌ, такому как радиоиммуноанализ (К1А) или ферментсвязанный иммуносорбентный анализ (ЕЫ8А). Такие технологии и анализы известны в данной области. Аффинность связывания моноклональных антител может определяться, например, анализом Скэтчарда по Мшъоп апб Ро11агб (1980) Апа1. Вюсйет, 107:220.

Предпочтительно выделяются антитела, имеющие высокую степень специфичности и высокую аффинность связывания с антигеном-мишенью.

После идентификации желаемых клеток гибридомы, клоны могут быть субклонированы путем ограничивающих процедур разведения и выращивания стандартными способами. Подходящие для этих целей культуральные среды включают в себя, например модифицированную ЭЫЬессо среду Игла и среду КРМЫ640.

В качестве альтернативы, клетки гибридомы могут выращиваться 1п νί\Ό как асцит у млекопитающих.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть выделены и очищены из культуральной среды или асцитной жидкости с помощью стандартной процедуры очистки иммуноглобулинов, такой, например, как метод протеин А-сефарозы, хроматографии на гидроксиапатите, гельэлектрофореза, диализа или аффинной хроматографии.

Моноклональные антитела могут быть получены методом рекомбинантной ДНК, как это описано в патенте США № 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела согласно изобретению, может быть без затруднений выделена и секвенирована с использованием стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Клетки гибридомы согласно изобретению служат предпочтительным источником для такой ДНК. После выделения, ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируются в клетки хозяина, такие как клетки обезьяны СО8, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иным образом не продуциру

- 13 011686 ют белок иммуноглобулина, чтобы получить синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина. ДНК также может быть модифицирована, например, вставкой кодирующей последовательности постоянных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичной последовательности мыши (патент США № 4816567; Моткоп (1994) Ыа!иге 368, 812-813) или ковалентной сшивкой кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей кодирующей последовательностью неиммуноглобулинового полипептида или его частью. Такой неиммуноглобулиновый полипептид может быть замещен на постоянные домены антител согласно изобретению или может быть замещен различными доменами сайта, включая антиген, антитела согласно изобретению для создания химерного бивалентного антитела.

Гуманизированные антитела.

Антитела против белковых антигенов согласно изобретению могут далее включать гуманизированные антитела или антитела человека. Эти антитела пригодны для введения человеку без возбуждения иммунного ответа человека против введенного иммуноглобулина. Гуманизированные формы антител являются химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулина или их фрагментами (такими как Εν, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂ или другими антигенсвязывающими последовательностями антител), которые в основном включают в себя последовательность человеческого иммуноглобулина и содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Гуманизация может быть выполнена в соответствии со способом Винтера с сотрудниками (УйНег) (1опе§ е! а1. (1986) Ыа!иге, 321:522-525; Ктесйтапп е! а1. (1988) Ыа!иге, 332:323-327; Уегйоеуеп е! а1. (1988) 8с1епсе, 239:15341536) путем замещения последовательностей СЭК или СЭК. грызунов на соответствующие последовательности человеческих антител. (См. патент США № 5225539.) В некоторых случаях остатки каркасного участка Εν человеческого иммуноглобулина замещаются соответствующими остатками из последовательности, не принадлежащей человеку. Гуманизированные антитела могут также включать в себя остатки, которые не встречаются ни в антителах реципиента, ни в импортированной последовательности СЭВ. ни в каркасной последовательности. В общем, гуманизированное антитело включает в себя практически целиком не менее чем один, обычно два из вариабельных доменов, в которых все или почти все из участков СЭК соответствуют таковым из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, и все или практически все каркасные участки - это консенсусная последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также включает в себя по меньшей мере часть консервативного участка иммуноглобулина (Ес), обычно - это человеческий иммуноглобулин (1опе§ е! а1., 1986; Ктесйшапп е! а1., 1988; и РгеЧа (1992) Сигг. Ор. 8!тис!. Вю1., 2:593-596).

Человеческие антитела.

Полностью человеческие антитела - это молекулы антител, в которых практически целиком последовательности легкой и тяжелой цепей, включая СЭК., происходят из человеческих генов. Такие антитела в данном документе именуются «человеческими антителами» или «полностью человеческими антителами».

Человеческие моноклональные антитела могут быть приготовлены с помощью технологии триомы; технологии человеческой В-клеточной гибридомы (см. Кохйог е! а1. (1983) 1ттипо1 Тойау 4:72) и технологии гибридомы ЕВУ для получения человеческих моноклональных антител (см. Со1е е! а1., 1985 1п: ΜΟΝΟ^ΟΝΑΕ ΑΝΤΙΒΟΌΙΕ8 ΑΝΏ СЛЫСЕК. ТНЕКЛРУ, А1ап К. Щ 1пс., рр. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут использоваться в практике применения данного изобретения и могут быть получены с использованием человеческих гибридом (см. Со!е е! а1. (1983) Ргос Ыа!1 Асай. δα. ϋδΑ 80:2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейна-Барр (ЕрЦеш-Ватг) ш νίύΌ (см. Со1е е! а1. (1985) 1п: \1О\ОС1.О\Л1. Л\Т1ВО1)1Е8 ΑΝΏ СЛЫСЕК ТНЕКАРУ, Л1ап К. Щ 1пс., рр. 77-96).

Кроме того, человеческие антитела также могут быть получены с использованием дополнительных технологий, включая библиотеки фагов. См. НоодепЬоот апй УйНег (1991) 1. Мо1. Вю1., 227:381; Магкк е! а1. (1991) 1. Мо1. Вю1., 222:581. Сходным образом, человеческие антитела могут быть получены введением локусов человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например, мыши, у которой эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. При введении в организм вещества наблюдается продукция человеческих антител, которые очень близки к наблюдаемым у человека во всех отношениях, включая перестройку гена, упорядоченность структуры и набор антител. Такой подход описан, например, в патентах США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и у Магкк е! а1. (Вю/Тесйпо1оду 10, 779-783 (1992)); ЬопЬегд е! а1. (ЫаШге 368 856-859 (1994)); Моткоп (Ыа!иге 368, 812-813 (1994)); ЕщйМ1й е! а1., (Ыа!иге Вю!есйпо1оду 14, 845-51 (1996)); ЫеиЬетдег (Ыа!иге Вю!есйпо1оду 14, 826 (1996)) и ЬопЬегд апй Ннкхаг (1п!егп. Кет. 1ттипо1. 13 65-93 (1995)).

Человеческие антитела, кроме того, могут быть получены с использованием трансгенных животных, неидентичных человеку, которые модифицированы так, что продуцируют полностью человеческие антитела, а не эндогенные антитела данного животного в ответ на введение антигена. См. опубликованный договор о патентной кооперации РСТ УО 94/02602. Эндогенные гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина в организме неидентичного человеку хозяина, инактивировались, и активные локусы, кодирующие тяжелую и легкую цепи человеческого иммуноглобулина, встраивались в геном хозяина. Человеческие гены встраиваются, например, с помощью искусственных хромосом дрож

- 14 011686 жей, содержащих требуемый сегмент человеческой ДНК. Животное, которое обладает всеми требуемыми модификациями, затем получают как потомство скрещивания промежуточных трансгенных животных, обладающих неполным набором модификаций. Предпочтительным вариантом реализации такого неидентичного человеку животного являются мыши, именуемые Хепотоике™, как это изложено в публикациях договоров о патентной кооперации РСТ \У0 96/33735 и \У0 96/34096. Такие животные продуцируют В-клетки, которые секретируют полностью человеческие иммуноглобулины. Антитела могут быть получены непосредственно из животного после иммунизации иммуногеном, представляющим интерес, как, например, при приготовлении поликлональных антител, или, в качестве альтернативы, из иммортализованных В-клеток, полученных у животного, таких как гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела. Дополнительно, гены, кодирующие иммуноглобулины человека с вариабельными участками, могут быть восстановлены и экспрессированы, чтобы получить антитела непосредственно, или могут быть затем модифицированы для получения аналогов антител, таких как одиночная цепь молекул Εν.

Пример способа получения организма-хозяина, неидентичного человеку, обычно мыши, у которого отсутствует экспрессия эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина, изложен в патенте США № 5939598. Этого можно достигнуть способом, включающим в себя делецию генов 1-сегмента из не менее чем одного эндогенного локуса, кодирующего тяжелую цепь, в эмбриональной стволовой клетке, чтобы предупредить перестройку локуса, а также предотвратить транскрипцию перестроенного локуса, кодирующего тяжелую цепь иммуноглобулина; делеция осуществляется нацеливанием вектора, содержащего ген, кодирующий избранный маркер; в результате из эмбриональной стволовой клетки образуется трансгенная мышь, соматические и генеративные клетки которой содержат ген, кодирующий избранный маркер.

Способ получения интересующего антитела, такого как человеческое антитело, изложен в патенте США № 5916771. Он включает в себя введение вектора экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, в одну клетку млекопитающего-хозяина в культуре, введение вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, в другую клетку млекопитающего-хозяина в культуре, и слиянии двух клеток с образованием гибридной клетки. Гибридная клетка экспрессирует антитело, содержащее и тяжелую цепь, и легкую цепь.

Дальнейшее усовершенствование этой процедуры - способ идентификации клинически значимого эпитопа на иммуногене и соответственный способ отбора антитела, которое с высокой аффинностью иммуноспецифически связывается со значимым эпитопом, изложен в публикации договора о патентной кооперации РСТ \У0 99/53049.

ЕаЬ-фрагменты и одноцепочечные антитела.

В соответствии с данным изобретением, технология может быть адаптирована для получения одноцепочечных антител против белка согласно изобретению (см., например, патент США № 4946778). Кроме того, способ может быть адаптирован для конструирования библиотек экспрессии ЕаЬ (см., например, Нике еί а1. (1989) 8с1епсе 246: 1275-1281), что позволяет быструю и эффективную идентификацию моноклональных ЕаЬ-фрагментов с желательной специфичностью к белку или его производным, фрагментам, аналогам или гомологам. Фрагменты антител, которые содержат идиотипы к белковому антигену, могут быть получены с помощью технологий, известных в данной области (но не исчерпываются ими): (1) фрагмент Е(аЬ')₂, полученный пепсиновым перевариванием молекулы антитела; (2) фрагмент ЕаЬ, полученный редукцией дисульфидных мостиков фрагмента Е(аЬ')₂; (3) фрагмент ЕаЬ, полученный обработкой молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом, и (4) фрагменты Εν.

Биспецифические антитела.

Биспецифические антитела - это моноклональные, предпочтительно человеческие или гуманизированные, антитела, которые обладают специфичностью связывания не менее чем с двумя различными антигенами. В данном случае одна из специфичностей связывания относится к антигенному белку согласно изобретению. Второй мишенью связывания является другой антиген, предпочтительно белок клеточной поверхности или рецептор, или субъединица рецептора.

Способ получения биспецифических антител известен в данной области техники. Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител основывается на коэкспрессии двух пар «легкая цепь - тяжелая цепь» иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают разной специфичностью. (МПкШп апб Сие11о (1983) №1иге, 305:537-539). Вследствие случайного сочетания легких и тяжелых цепочек иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) могут продуцировать десять различных молекул антител, из которых только одна обладает надлежащей биспецифической структурой. Очистка надлежащей молекулы обычно достигается с помощью аффинной хроматографии. Сходные процедуры изложены в \У0 93/08829 и у Тгаипескег е1 а1. (1991) ЕМВ0 к, 10:3655-3659.

Вариабельные домены антитела с желаемыми специфичностями (антигенсвязывающий активный центр антитела) могут быть объединены с последовательностями консервативных доменов иммуноглобулина. Объединение предпочтительно с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающим в себя, по меньшей мере, шарнирный участок и участки СН2 и СН3. Предпочтительно, чтобы в первом консервативном участке тяжелой цепи (СН1) был сайт, необходимый для связывания легкой це

- 15 011686 пи, присутствующей не менее чем в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулина и, если это желательно, легких цепей иммуноглобулина, встраиваются в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируются в подходящий организм хозяина. Дальнейшие детали получения биспецифических антител см., например, у Зигекй е1 а1. (1986) Ме11юб5 ίη Εηζутο1οду, 121:210.

В соответствии с другим подходом, описанным в XVО 96/27011, интерфейс между парой молекул антител может быть сконструирован так, чтобы максимально увеличить процент гетеродимеров, получаемых из рекомбинантной клеточной культуры.

Предпочтительный интерфейс включает в себя по меньшей мере часть участка СН3 консервативно го домена антитела. Согласно этому способу одна или более малых боковых цепей аминокислот из интерфейса первой молекулы антитела замещаются большими боковыми цепами (например, содержащими тирозин или триптофан). Компенсаторные «полости» идентичного или сходного с большой боковой цепью (цепями) размера создаются на границе второй молекулы антитела путем замещения крупной аминокислотной боковой цепи на меньшую (например, содержащую аланин или треонин). Это обеспечивает механизм, повышающий выход гетеродимера по сравнению с нежелательным продуктом, которым являются гомодимеры.

Биспецифические антитела могут быть приготовлены как полноразмерные антитела или фрагменты антител (например, биспецифические антитела Р(аЬ')₂). Технологии получения биспецифических антител из фрагментов антител были описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть приготовлены с использованием химической сшивки. У Вшивав е1 а1. (1985) 8<левее 229:81 описана процедура, согласно которой интактные антитела протеолитически расщепляются для получения фрагментов Р(аЬ')₂. Эти фрагменты восстанавливаются в присутствии дитиол-комплексообразующего агента арсенита натрия для стабилизации соседствующих дитиолов и предупреждения формирования межмолекулярных дисульфидных мостиков. Полученные фрагменты РаЬ' затем преобразовывали в тринитробензойные производные (ΤΝΒ). Одно из производных РаЬ'-ΤΝΒ затем обратно преобразовывали в РаЬ'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешиванием в эквимолекулярных количествах с другим производным РаЬ'-ΤΝΒ для образования биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела могут быть использованы как агенты для селективной иммобилизации ферментов.

Дополнительно фрагменты РаЬ' могут быть получены непосредственно из Ε.οοίί и химически связаны с образованием биспецифических антител. 8На1аЬу е1 а1. (1992) ί. Ехр. Меб. 175:217-225 описывает производство полностью гуманизированных биспецифических молекул антитела Р(аЬ')2. Каждый фрагмент РаЬ' секретируется Ε.οοίί отдельно и используется для непосредственного химического связывания ίη νίΐτο с образованием биспецифических антител. Биспецифические антитела, сформированные таким образом, были способны связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ЕгЬВ2 (гомолог 2 вирусного онкогена эритробластной лейкемии), и нормальными человеческими Т-клетками, так же как запускать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против мишеней рака молочной железы человека.

Также описаны различные технологии приготовления и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантных клеточных культур. Например, биспецифические антитела были получены с использованием лейциновой «застежки-молнии». Κο^ί^ еΐ а1. (1992) ί. Iттиηο1. 148 (5):1547-1553. Пептиды лейциновой «застежки-молнии» из белков Ροκ и Лт были связаны с участками РаЬ' двух разных антител путем соединения генов. Гомодимеры антитела восстанавливали в области шарнира с образованием мономеров и затем реокислением, ведущим к образованию гетеродимеров. Этот способ может также быть использован для получения гомодимеров антитела. «Двутелая» технология, описанная Ηοίίίη^τ еΐ а1. (1993) Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 90:6444-6448, предоставляет альтернативный механизм изготовления фрагментов биспецифических антител. Фрагменты включают в себя вариабельный домен тяжелой цепи (ν_Η), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (У_ь) линкером, который слишком короток, чтобы допустить спаривание между доменами одной и той же цепи. Соответственно, домены ν_Η и V,. одного фрагмента вынуждены спариваться с доменами ν_Η и V,. другого фрагмента, образуя таким образом два антигенсвязывающих сайта. Также сообщена другая стратегия приготовления биспецифических фрагментов антител путем использования димера одиночной цепи Ρν (κΡν). См. СгиЬег еΐ а1. (1994) I. Iттиηο1. 152:5368.

Предполагается получение антител с числом детерминант более чем два. Например, могут быть изготовлены триспецифические антитела. Тий еΐ а1. (1991) ί. ^тимЕ 147:60.

Типичные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами, по меньшей мере один из которых происходит от белкового антигена согласно изобретению. Другой вариант антиантигенное плечо молекулы иммуноглобулина может сочленяться с плечом, которое связывается с триггерной молекулой на лейкоците, такой как рецепторная молекула Т-клетки (например, СЭ2. СЭ3. СЭ28 или В7) или Рс-рецептор к 1дС (Рс-Е), такой как Рс ΕΙ (СЭ64), Рс ЕН (СЭ32) и Рс ЕШ (СЭ16), как с центром клеточного защитного механизма клетки, экспрессирующей специфический антиген. Биспецифические антитела могут также использоваться для направления цитотоксических агентов в клетки, которые экспрессируют специфический антиген. Эти антитела обладают антигенсвязывающим плечом и плечом, которое связывается с цитотоксическим агентом или радионуклидным хелатором, таким как

- 16 011686

ЕОТиВЕ, ΌΡΤΆ, Ό0ΤΛ или ТЕТА. Другие биспецифические антитела, представляющие интерес, связываются с белковым антигеном, описанным в данном изобретении, а затем - с тканевым фактором (ТФ).

Фармацевтические композиции.

Модуляторы 1Ь-21, описанные в данном изобретении, могут с удобством включаться в фармацевтические композиции. Композиции особенно удобны для внутреннего приема и включают в себя эффективные количества фармакологически активного соединения по изобретению самого по себе или в комбинации с одним или более фармацевтически допустимыми переносчиками. Вещества особенно удобны тем, что имеют очень низкую токсичность или не имеют ее вообще.

В практике соединения или их фармацевтически допустимые соли вводятся в количествах, которые будут достаточными, чтобы вызвать желаемые изменения, например, повышение или понижение уровня 1Ь-21, и в фармацевтической форме, наиболее подходящей для этих целей.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы (например, желатиновой капсулы) активный компонент лекарства может сочетаться с пероральным, нетоксичным фармацевтически допустимым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода или подобные. Далее, когда желательно или необходимо, в смесь могут быть включены подходящие линкерные вещества, скользящие вещества, расщепляющие агенты, красящие агенты. Подходящие линкерные вещества включают в себя крахмал, магний-алюминий силикат, крахмальную паста, желатин, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон, природные сахара, такие как глюкоза или βлактоза, кукурузный подсластитель, природные и синтетические камеди, такие как гуммиарабик, смола астрагала или альгинат натрия, полиэтиленгликоль, парафины и подобные вещества. Скользящие вещества, используемые в таких фармакологических формах, включают в себя олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, безоат натрия, ацетат натрия, поваренную соль, кремнезем, тальк, стеариновую кислоту, ее магниевую или кальциевую соли и/или полиэтиленгликоль и тому подобное. Расщепляющие агенты включают в себя крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановые крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль, не ограничиваясь ими, шипучие смеси и им подобное, не ограничиваясь ими. Разжижители включают в себя, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицин.

Инъекционные композиции являются предпочтительно водными изотоническими растворами или суспензиями, а суппозитории преимущественно изготавливаются из жировых эмульсий или суспензий. Композиция может быть стерилизована и/или может содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизирующие, увлажняющие или эмульгирующие агенты, промоторы растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически ценные вещества. Композиции приготавливаются в соответствии со стандартными методами смешивания, гранулирования или покрытия, соответственно, и содержат около 0,1%-75%, предпочтительно около 1-50% активного ингредиента.

Соединения согласно изобретению могут также вводиться в таких пероральных фармацевтических формах, как таблетки или капсулы временного и пролонгированного действия, пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, тинктуры, суспензии, сиропы и эмульсии.

Жидкие, особенно инъекционные композиции могут быть, например, приготовлены путем растворения, диспергирования и т.д. Активное соединение растворяется или смешивается с фармацевтически чистым растворителем, таким, например, как вода, солевой раствор, водная декстроза, глицерин, этанол и подобное, чтобы образовать инъекционный раствор или суспензию. Кроме того, могут быть сформированы твердые формы, пригодные для растворения в жидкости перед инъекцией. Инъекционные композиции являются преимущественно водными изотоническими растворами или суспензиями. Композиции могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажняющие или эмульгирующие агенты, промоторы растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически значимые вещества.

Соединения согласно изобретению могут вводиться во внутривенной (в виде болюсов или вливаний), внутрибрюшинной, подкожной или внутримышечной формах, все используемые формы известны специалистам в области фармации. Инъекционные формы могут быть приготовлены в стандартных формах в виде растворов или суспензий.

Парентеральное инъекционное введение обычно используется для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и вливаний. Кроме того, еще один подход к парентеральному введению использует имплантацию медленно выделяющих или пролонгированного действия систем, которые обеспечивают поддержание постоянного уровня фармацевтической формы, в соответствии с патентом США № 3710795, включенным в данное изобретение в виде ссылки.

Кроме того, соединения согласно изобретению предпочтительно могут быть введены в интраназальной форме путем местного использования подходящих интраназальных носителей, или трансдермальным путем, с использованием известных специалистам в данной области трансдермальных кожных наклеек. При введении через интраназальную систему поступление вещества будет, конечно, непрерывным, а не прерывистым, в течение всего периода введения. Другие предпочтительные препараты местно

- 17 011686 го действия включают в себя кремы, мази, лосьоны, аэрозольные спреи и гели, концентрация активного ингредиента в которых находится в пределах от 0,1 до 15 объемных или весовых процентов.

В качестве наполнителя для твердых композиций могут быть использованы фармацевтически приемлемые вещества, которые включают в себя маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и подобные. Активные соединения, определенные выше, могут также изготавливаться в виде суппозиториев с использованием, например, полиалкиленгликолей, например, пропиленгликоля в качестве носителя. В некоторых вариантах реализации суппозитории предпочтительно изготавливаются из жировых эмульсий или суспензий.

Соединения согласно изобретению могут также вводиться в форме липосомной системы введения, такой как малые однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть сформированы из различных фосфолипидов, содержащих холестерин, стериламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах реализации пленка липидных компонентов гидратируется водным раствором лекарства для образования липидного слоя, инкапсулирующего лекарство, как это описано в патенте США № 5262564.

Соединения согласно изобретению могут также доставляться с использованием моноклональных антител как индивидуальных носителей, с которыми связаны молекулы соединения. Соединения согласно изобретению могут также быть связаны с растворимыми полимерами как адресными носителями лекарства. Такие полимеры могут включать в себя поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропил-метакриламид-фенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин с замещениями пальмитоиловыми остатками. Кроме того, соединения согласно изобретению могут быть связаны с классом биодеградирующих полимеров, пригодных для достижения контролируемого выделения лекарства, например, полимолочная кислота, поли-е-капролактон, полигидроксимасляная кислота, полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианакрилаты и поперечно сшитые или амфипатически блокированные сополимеры гидрогелей.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть встроены в векторы и использованы как векторы генной терапии. Векторы генной терапии могут доставляться субъекту путем, например, внутривенной инъекции, местного введения (см., например, патент США № 5328470) или стереотаксической инъекции (см., например., СНен еί а1., 1994. Ргос. Асаб. 8с1. И8А 91:3054-3057).

Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать в себя вектор генной терапии в приемлемом разбавителе или может содержать медленно выделяющую основу, в которую погружен носитель, доставляющий ген. Альтернативный вариант, в котором интактный полный вектор доставки гена может быть получен из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может включать в себя одну или более клеток, которые продуцируют систему доставки гена.

Если желательно, вводимая фармацевтическая композиция может также содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, агенты, забуферивающие рН, и другие вещества, такие как, например, ацетат натрия, триэтаноламин олеат и т. п.

Режим применения соединений выбирается в соответствии с различными факторами, включающими в себя тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть излечиваемого заболевания; способ введения; функции почек и печени пациента; и выбор конкретного соединения или его соли. Врачи и ветеринары обычной квалификации легко могут определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для предупреждения, противодействия или остановки развития заболевания.

Пероральные дозировки согласно изобретению, когда они используются для достижения показанного действия, находятся в пределах около 0,05-1000 мг/день перорально. Композиции предпочтительно изготавливаются в форме шероховатых таблеток, содержащих 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 и 1000,0 мг активного ингредиента. Эффективный уровень соединений по изобретению в плазме находится в пределах от 0,002 до 50 мг на кг веса в день.

Соединения согласно изобретению могут быть введены в виде разовой ежедневной дозы, или дневная доза может быть введена дробно в два, три или четыре приема в день.

Все вышеуказанные фармацевтические композиции могут содержать 0,1-99%, предпочтительно 170% Ш-21, рецептора Ш-21, агонист Ш-21 или антагонист Ш-21.

Если желательно, фармацевтические композиции могут быть снабжены вспомогательными веществами. Вспомогательные вещества обсуждены выше. В некоторых вариантах реализации вспомогательные вещества могут быть использованы для усиления иммунологического ответа, причем это зависит от вида организма-хозяина, включая адъювант Фройнда (полный или неполный), минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин из моллюска Меда1ига сгеш^а, динитрофенол и потенциально пригодные человеческие адъюванты, такие как БСС (бацилла Калмета-Герэна) или ί.'οΓνικόα^πιιιη рагуит. В общем, животных инъецируют антигеном с помощью нескольких инъекций в серии, предпочтительно, включая по меньшей мере три бустер-дозы.

Изобретение далее будет проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами.

- 18 011686

Примеры 1-8 выполнены с использованием нижеследующих материалов и способов.

Примеры

Мышь.

Если не указано иное, во всех экспериментах использовались мыши С57ВЬ/6 в возрасте 6-8 недель. Мышей, дефицитных по 8!а!6, получали на основе С57ВЬ/6-дефицитных мышей так, как это описано у Кар1ап, М.Н., е! а1., 1штипбу 4:313-319, 1996.

Приготовление и культура лимфоцитов.

Лимфоциты культивировали в среде КРМ1 1640, дополненной, как описано в Кар1ап, М.Н., е! а1., Ептипку 4:313-9, 1996. Интактные клетки Тхп очищались из лимфатических узлов и селезенки клеточным сортингом с использованием анти-СО4 и анти-СП26Ь (Ркаттшдеп; ΒΌ ЫГе 8с1епсе8, 8ап О1едо, СА) до чистоты 95-98%.

Антитела и цитокины.

Т-Ье! (Тх1-специфический фактор транскрипции, контролирующий экспрессию Тх1 цитокинов, ИФНу) специфическая антисыворотка изготавливалась так, как это описано в 8хаЬо, 8.1. е! а1., Се11 100: 655-69, (2000). Антитела, специфичные к 81а14, 81а11 и актина были получены от фирмы 8ап!а Сгих Βίο1ескпо1оду (8ап!а Сгих, СА). Антитела, специфичные к фосфорилированному 81а(4, были получены от 2утеб (8ои1к 8ап Ртапсбсо, СА). Антитела к анти-СИ3 и -СИ28, 1Ь-4 и ИФНу, использовавшиеся в дифференцировке культур Тх, были получены от Ркаттшдеп. Рекомбинантный 1Ь-4 был получен от Ргерго1ес11. Рекомбинантный 1Ь-2 был получен от СЫгоп (ЕтетууШе, СА). Рекомбинантный 1Ь-12 был получен от НоЕГтап-БаКоске (Жбеу, N1). Приготовляли и концентрировали мышиный 1Ь-21, экспрессированный в клетках СО8 супернатанте. Одна единица активности была определена как концентрация супернатанта, требующаяся для вызова 50%-ной пролиферации клеток ВАР3, трансфицированных рецептором к 1Ь-21. Ложно трансфицированная культура СО8, приготовленная и концентрированная параллельно с 1Ь-21, использовалась как контроль.

Клеточная дифференцировка клеток Т-хелперов ш уйто.

Исходные Т-клетки (1-2х10⁶/мл) помещались на планшеты, покрытые анти-СО3, анти-СЭ28 (1 мкг/мл) в присутствии 10 нг/мл 1Ь-4, 10 мкг/мл анти-ИФНу (условия для Тх2) или 1 нг/мл 1Ь-12, 10 мкг/мл анти-1Ь-4 (условия для Тх1). Через три дня клетки наращивали с помощью 1Ь-2 (100 ед/мл). Через одну неделю в культуре клетки стимулировали ФМА (форбол-миристат ацетатом)/иономицином, и продукцию цитокинов определяли внутриклеточным окрашиванием цитокинов, как это описано у В1гб, ЕЕ е! а1., 1ттипбу 9: 229-237, 1998.

Анализ РНК.

Тотальную РНК выделяли с использованием К№а§у Жадеп; Уа1епаа, СА). Для анализа нозернблоттинга РНК выделяли на геле 1,5% агароза/6% формальдегид и переносили на мембрану Оепе8сгееп (№\ν Епд1апб №с1еат). Мембрану гибридизовали с меченными радиозотопом кДНК-зондами к 1Ь-21, 1Ь4, ИФНу, у-актину. Для ПЦР в реальном времени (КТ-РСК) 1 мкг РНК использовали в качестве затравки с олиго (бТ) и конвертировали в кДНК с помощью 8ирег5спр1 Цпуйгодеп ЫГе Тескпо1од1е§; СатНЬаб, СА). 25 нг кДНК использовали как матрицу для ПЦР-реакции с использованием смеси 8УВК Огееп 2Х или ТадМап 2Х РСК (АррНеб Вюкубетк; ЕоЧег Сйу, СА) и анализировали на АВ1 Ргбт 7700 8ес.|иепсе Эе1ес!ог (АррНеб Вюкубетк) с использованием следующих праймеров:

1Ь-21 прямой: 5'аада!!сс!дадда!ссдадаад-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:7)

1Ь-21 обратный: 5'дсайсд!дадсд1с(а(ад!д!с-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:8)

1Ь-21 ТадМап-зонд: 5'йсссдаддас!даддадасдсс-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:9)

1Ь-12Ку2 прямой: 5'!йсса!ййдса!саадйс!с-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:10)

1Ь-12Ку2 обратный: 5'ссда!с!адад!садссдс!-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:11)

8!а!4 прямой: 5'ааасс!дадсссаасдасаа-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:12)

8!а!4 обратный: 5'ад!д!ссд!йдсассд!с-3' (8ЕЦ ΙΌ N0:13).

Праймеры и зонды ТадМап для Ш-4, ИФНу и САРЭН опубликованы ранее (0уетЬетдк, Ь. е! а1., Су!окте 11:305-12 1999).

Анализ с помощью иммуноблоттинга.

Тотальные клеточные экстракты готовили путем лизиса клеток в 50 мМ Трис, 0,5% №40, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ №1С1 и очистки лизата с помощью центрифугирования. Белковые экстракты разделяли на 8-10% полиакриламидном геле и переносили на мембрану 0р!йгап (8ск1еккег апб 8ские11; Кеепе, NН). Иммуноблоттинги блокировали на один час при комнатной температуре в 5% молоке в ТВ8Т (50 мМ Трис рН 7,5, 100 мМ №С1, 0,03% Т\тееп 20) и инкубировали с указанными антителами в течение ночи при 4°С. Блоттинги отмывали ТВ8Т и инкубировали с антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (2утеб), при комнатной температуре. После отмывки блоттингов с помощью ТВ8Т выполнялось детектирование с помощью усиленной хемилюминесценции (Атегакат; Р18са(атеау, N1), в соответствии с инструкцией производителя.

Пример 1. Ш-21 предпочтительно экспрессируется в клетках Тх, чье развитие индуцировано по пути клеток Тх2 ш уйто.

- 19 011686

Определяли экспрессию 1Ь-21 в субпопуляции клеток Тх. Анализ нозерн-блоттинга выполняли на мРНК из исходных клетках Тхп (предшественниках Тх), дифференцировавшихся в клетки Тх1 или Тх2 в течение одной недели и рестимулированных в течение 4 ч, чтобы вызвать продукцию цитокинов. Результаты показаны на фиг. 1Ά-1Ό. Для получения результата, показанного на фиг. 1А, клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки к Тх1 и Тх2 в течение 6 дней. Клетки либо оставлялись без стимуляции (-) или рестимулировались с помощью ФМА/иономицина (Ф+И) в течение 4 ч. РНК очищали и оценивали экспрессию цитокинов с помощью нозерн-блоттинга. Представленные результаты репрезентативны по трем независимым экспериментам. Последовательность, кодирующая 1Ь21, была детектирована только стимулированных клетках Тх2, напротив, в культуре Тх1 она обнаружена не была. Эти результаты показывают, что 1Ь-21 является цитокином, специфичным для Тх2.

Чтобы определить, увеличивается ли потенциал экспрессии 1Ь-21, когда клетка развивается по пути Тх2, экспрессию 1Ь-21 в первично стимулированных клетках Тхп сравнивали с экспрессией сигнала 1Ь21 во вторично стимулированных клетках Тх2. Результаты показаны на фиг. 1В. Для получения показанного результата клетки Тхп культивировали при нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки в Тх1 и Тх2. РНК очищали через 24 ч после первичной и вторичной анти-СЭ3стимуляции. Экспрессию цитокинов оценивали в дупликатах с помощью КТ-РСК. и по отношению к ΟΆΡΌΗ. Наблюдавшийся сигнал 1Ь-21, как 1Ь-4, был после первичной стимуляции клеток Тхп относительно низким. Напротив, экспрессия 1Ь-21 значительно возрастала после того, как клетка дифференцировалась по пути Тх2. Эти результаты показывают, что экспрессия гена 1Ь-21 регулируется другими Тх2специфическими цитокинами.

Определено влияние среды цитокинов на экспрессию 1Ь-21.

Клетки Тх1 и Тх2 культивировали в присутствии 1Ь-4 и ИФНу, соответственно, до вторичной стимуляции. Клетки были чувствительны к этим цитокинам, о чем свидетельствует активация 81а(6 и δίηίΐ цитокином 1Ь-4 и ИФНу.

Проверяли способность 1Ь-4 восстанавливать экспрессию 1Ь-21. Результаты показаны на фиг. 1С. Клетки Тхп культивировали в условиях направленной дифференцировки в Тх1 и Тх2 в течение 5 дней. 1Ь-4 или ИФНу добавляли к указанной культуре за 24 ч до вторичной стимуляции с помощью анти-СЭ3. РНК очищали через 24 ч после вторичной стимуляции и оценивали экспрессию 1Ь-21 в дупликатах относительно ΟΆΡΌΗ с помощью КТ-РСК. Добавление 1Ь-4 клеткам Тх1 не способно было восстановить экспрессию 1Ь-21 до уровня, наблюдаемого в клетках Тх2. Далее, добавление ИФНу в культуры Тх2 не оказывало ингибирующего эффекта на экспрессию 1Ь-21. Эти результаты показывают, что экспрессия 1Ь-21 в клетки Тх2, вероятно, стабилизируется в начале дифференцировки в Тх2 и непосредственно не модулируется 1Ь-4 и ИФНу.

Пример 2. Клетки Тх2 экспрессируют 1Ь-21 в ходе иммунного ответа Тх2 ίη νίνο.

Экспрессию 1Ь-21 в клетках Тх2 в ходе иммунного ответа ίη νίνο определяли в модельной системе патогенных простейших. Инфицирование простейшим ЬеЦЬташа та]ог предоставляет хорошо охарактеризованную модель изучения ответа клеток Тх ίη νίνο (Кешег, 8.Ь., е1 а1., Лппи Кем Ιιηιηιιηοΐ 13:151177, 1995). Некоторые инбредные линии мышей, такие как С57ВЬ/6, будучи инфицированы Ь.тарг дают эффективный защитный эффект клеток Тх1 против патогена. Напротив, другие инбредные линии мышей, такие как ВЛЬВ, развивают в первую очередь Тх2-ответ и не способны бороться с инфекцией.

И мыши С57ВЬ/6, и ВЛЬВ/с инфицировались Ь.тарг. Группы из восьми мышей ВЛЬВ/с и С57ВЬ/6 инфицировались Ь.та.щг в подушечки передних лап. Через 6 недель СЭ4+ Т-клетки, дренированные из лимфатических узлов, очищались и стимулировались с помощью анти СЭ3. РНК выделяли через 6 ч после стимуляции, а экспрессия цитокина определялась относительно ΟΆΡΌΗ с помощью КТРСК.

Результаты показаны на фиг. 1Ό. Как ожидалось, клетки СЭ4+ из инфицированных мышей С57ВЬ/6 экспрессировали больше ИФНу, чем клетки инфицированных мышей ВЛЬВ/с. В соответствии с преимущественным Тх2-ответом, СЭ4+ Т-клетки инфицированных мышей ВЛЬВ/с производили значительно больше 1Ь-4, чем Т-клетки мышей С57ВЬ/6. Аналогично тому, что наблюдалось в условиях направленной дифференцировки в Тх2 ίη νίίτο, 1Ь-21 также преимущественно экспрессировался в ходе Тх2ответа у мыши ВЛЬВ/с ίη νίνο. Эти результаты вместе с данными ίη νίίτο (пример 1), показывают, что 1Ь21 является цитокином Тх2.

Пример 3. 1Ь-21 специфически ингибирует продукцию ИФНу в развивающихся клетках Тх.

Поскольку 1Ь-21 обладает сходством профиля экспрессии в клетках Тх и структурным сходством с 1Ь-4, определяли способность 1Ь-21, так же как 1Ь-4, непосредственно влиять на дифференцировку клеток Тх.

Чтобы определить эффект 1Ь-21 на дифференцировку Тхп, клетки Тхп культивировались при нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки в Тх1 и Тх2.

Очищенные исходные клетки Тхп подвергали первичному воздействию антигена при нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки в Тх1 и Тх2 в присутствии и в отсутствие 1Ь-21. Цитокиновый потенциал этих клеток оценивали с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинов

- 20 011686 через неделю в культуре.

Результаты показаны на фиг. 2А и 2В. Для получения показанных на фиг. 2А результатов клетки культивировались в присутствии 1Б-21 или в пустом супернатанте. Продукция цитокинов оценивалась через неделю с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинов в течение 4 ч после рестимуляции с помощью ФМА/иономицина. Результаты представляют по меньшей мере десять экспериментов.

Как и в случае 1Ь-4, добавление 1Б-21 к нейтральной культуре и культуре Тх1 приводило к значительному уменьшению числа клеток, продуцирующих ИФНу (фиг. 2А, нейтральные условия и направленная дифференцировка в Тх1). Снижение количества клеток, продуцирующих ИФНу в культуре Тх1, подтверждено анализом с помощью ΕΕ18ΡΘΤ. Однако, в отличие от того, что наблюдалось с 1Ь-4, 1Б-21 сам по себе был неспособен потенцировать продукцию клеток Тх2, продуцирующих 1Ь-4 (фиг. 2А, нейтральные условия). Обработка 1Б-21 не имела ни стимулирующего, ни ингибирующего эффекта на генерацию клеток, продуцирующих 1Ь-4, в условиях направленной дифференцировки Тх2 (фиг. 2А, Тх2).

Определяли способность 1Б-21 влиять на продукцию ИФНу в недавно стимулированных клетках Тхп. Очищенные исходные клетки Тхп культивировались в нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки Тх1 в присутствии или в отсутствие 1Б-21 в течение 48 ч. В полученных культуральных супернатантах с помощью ЕБ18А проверяли продукцию ИФНу. Было обнаружено, что 1Б-21 уменьшает количество ИФНу, продуцируемого в начале дифференцировки в культуре (фиг. 2В). Следовательно, присутствие 1Б-21 в период первичного воздействия антигена на клетки Тх влияет на способность и дифференцирующихся клеток Тх1, и эффекторных клеток продуцировать ИФНу.

Пример 4. 1Б-21 непосредственно не ингибирует продукцию ИФНу эффекторными клетками Тх1.

Чтобы определить, подавляет ли 1Б-21 продукцию 1Б-21 непосредственно или воздействует на дифференцировку клеток ИФНу, очищенные исходные клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки Тх1. 1Б-21 или пустой супернатант добавлялся или в начале культивирования (день 0) или за 24 ч до рестимуляции и анализа (день 5). Продукция цитокинов оценивалась по внутриклеточному окрашиванию цитокинов. Результаты показаны на фиг. ЗА.

В отличие от наблюдавшегося, когда 1Б-21 добавлялся в день 0, добавление 1Б-21 в культуру клеток Тх1 в конце периода дифференцировки не имело эффекта на продукцию ИФНу, даже хотя клетки Тх1 экспрессировали рецептор 1Б-21 и были чувствительны к 1Б-21. Этот факт показывает, что 1Б-21 ослабляет способность клеток Тхп дифференцироваться в продуцирующие ИФНу клетки Тх1, но не ингибирует непосредственно продукцию ИФНу эффекторными клетками Тх1.

Пример 5. Ингибирование ИФНу со стороны 1Б-21 не зависит от §1а!6.

Способность 1Ь-4 ингибировать дифференцировку клеток Тх1 зависит от экспрессии §!а!6 (Кар1ап, Μ.Η., е! а1., 1ттцпйу 4:313-9, 1996, Τакеάа, К. е! а1., №11иге 380: 627-30 1996, и 81нтоба. К. е! а1., №11иге 380: 630-3, 1996).

Чтобы определить, зависит ли опосредованное 1Б-21 ингибирование продукции ИФНу от §!а!6, определяли способность 1Б-21 влиять на дифференцировку Тх1 в клетки, у которых отсутствует §!а!6. Клетки Тхп, очищенные из мыши дикого типа или из 8!а!6-дефицитной мыши, культивировались в течение одной недели в условиях направленной дифференцировки в Тх1 в присутствии 1Б-21 или пустого супернатанта. Продукцию цитокинов оценивали по внутриклеточному окрашиванию цитокинов.

Результаты показаны на фиг. 3В. В отсутствии §!а!6 1Б-21 был так же эффективен в предупреждении генерации клеток, продуцирующих ИФНу, как в присутствии §1а!6. Следовательно, в отличие от 1Ь4, 1Б-21 не зависит от сигнализации §!а!6 в предупреждении генерации клеток Тх1, продуцирующих ИФНу. Кроме того, эти результаты показывают, что подавление ИФНу, вызванное 1Б-21 непосредственно не опосредовано действием 1Ь-4.

Пример 6. 1Б-21 не ингибирует другие цитокины Тх1.

Чтобы определить, влияет ли 1Б-21 на особенности развития Тх1 помимо ингибирования продукции ИФНу, проверяли способность обработанных 1Б-21 клеток Тх1 продуцировать другие цитокины, связанные Тх1.

Клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки Тх1 в присутствии 1Б-21 или пустого супернатанта, после чего оценивали продукцию цитокинов с помощью внутриклеточного окрашивания после вторичной стимуляции.

Результаты показаны на фиг. 3С. Удивительно, что, хотя число клеток, продуцирующих ИФНу, существенно уменьшается, когда при первичном воздействии антигена присутствует 1Б-21, та же клеточная популяция имеет нормальное число клеток, продуцирующих ИНФу и 1Ь-2. Эти результаты показывают, что хотя 1Б-21 эффективно подавляет способность клеток Тх1 продуцировать ИФНу, эти же клетки сохраняют способность продуцировать клетки Тх1 и не прекращают продуцировать цитокины Тх2.

Пример 7. 1Б-21 не влияет на экспрессию Τ-Ье!.

Τ-Ье! - это недавно идентифицированный фактор транскрипции, который специфически экспрессируется в дифференцирующихся клетках Тх1 и который также способен значительно индуцировать ИФНу. Чтобы определить, влияет ли обработка 1Б-21 дифференцирующихся клеток Тх1 на индукцию

- 21 011686 экспрессии Т-Ьс1 в клетках Тх, клетки Тхп культивировали в условиях направленной дифференцировки в Тх1 или Тх2. Белковые экстракты собирали в начале (исходные) и через 48 ч культивирования (Тх1 и Тх2). Экспрессию Т-Ьс1 и актина определяли с помощью вестерн-блоттинга.

Результаты показаны на фиг. 4 А. ГБ-21 или пустой супернатант добавляли в указанные культуры. Как ожидалось, экспрессия Т-Ьс1 индуцировалась в культуре Тх1 и оставалась малой в условиях направленной дифференцировки Тх2. Внесение ГБ-21 не оказывало эффекта на экспрессию Т-Ьс1 в клетках Тх1. Этот результат показывает, что опосредованная ГБ-21 экспрессия ИФНу не является результатом уменьшения экспрессии Т-ЬеГ

Пример 8. ГБ-21 ингибирует сигнализацию ГБ-12.

Сообщается, что сигнализация ГБ-12 играет важную роль в развитии клеток Тх1. У клеток Тх, у которых отсутствует рецептор к ГБ-12, резко подорвана способность продуцировать ИФНу (^и, С., е! а1., 1 1ттипо1 159: 1658-665, 1997). Кроме того, экспрессия цепи рецептора ΙΕ-12Κβ2 специфически снижена в развивающихся клетках Тх2, а этот эффект опосредуется ГБ-4 (8/аЬо, 8.1., е! а1., 1 Ехр Мей 185:817-24, 1997). Чтобы определить влияет ли ГБ-21, так же как ГБ-4, на экспрессию цепи 1Б-12Б2 в клетках Тх1, РНК из исходных клеток Тхп культивированные в условиях направленной дифференцировки в Тх1 и Тх2 в присутствии и в отсутствие ГБ-21 анализировались на экспрессию 12Κβ2 с помощью КТ-РСК. Клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки в Тх1 и Тх2 в течение одной недели. ГБ-21 или пустой супернатант включали в указанные культуры. РНК получали через 24 ч после вторичной стимуляции с использованием анти-СБЗ и оценивали экспрессию ΙΕ-12Ρβ2 с помощью КТ-РСК.

Результаты показаны на фиг. 4В. Результаты представляют три независимых эксперимента. Как ожидалось, экспрессия ГБ-12Кв2 была высока в клетках Тх1 по сравнению с клетками Тх2, однако, добавление ГБ-21 в культуру Тх1 не влияло на экспрессию ΙΕ-12Κβ2. Следовательно, в отличие от результатов, сообщенных о ГБ-4, ГБ-21 не вызывает снижения экспрессии ГБ-12Кв2. Далее, высокий уровень экспрессии ГБ-12Кв2, связанный с высокими уровнями ТКГа и ГБ-2, предполагает, что клетки Тх1, обработанные ГБ-21, сохраняют многие характеристики Тх1 с особым отличием в виде сниженной продукции ИФНу.

8ГаГ4 специфически активируется цитокином ГБ-21 и, как сообщается, является критически важным посредником в генерации продуцирующих ИФНу Тх1 клеток (^игкГег, Л.Б., еГ а1., Опсодепе 19: 2577-84, 2000). Чтобы определить, влияет ли ГБ-21 на способность ГБ-12 активировать 8ТАТ-4, исходные клетки Тхп активировались в течение 48 ч в присутствии или в отсутствие ГБ-21. Клетки затем стимулировались с помощью ГБ-12, и степень фосфорилирования 8!а!4 определяли с помощью вестерн-блоттинга. Клетки Тхп стимулировали с помощью анти-СЭ3 в течение 48 ч в присутствии ГБ-21 или пустого супернатанта. Белковые экстракты оценивались по фосфорилированному 8!а!4 (р-8!а!4), 8!а!4 и 8!а!1 с помощью вестерн-блоттинга. Результаты представляют четыре независимых эксперимента.

Результаты показаны на фиг. 4С. Хотя обнаружено, что клетки, обработанные ГБ-21, экспрессируют нормальный уровень ГБ-12Кв2, в таких клетках фосфорилирование 8!а!4 в ответ на стимуляцию ГБ-12 снижалось. Сниженный уровень фосфорилированного 8!а!4 также отражается в снижении общего уровня белка 8!а!4. Для сравнения, обработка ГБ-21 на белок 8!а!1 не влияла.

Также проверяли уровень РНК 81а14. Клетки Тхп культивировали, как описано для фиг. 4С, после чего получали РНК, и в дупликатах оценивали экспрессию 8!а!4 с помощью КТ-РСК.

Результаты показаны на фиг. 4Ό. Результаты представляют три независимых эксперимента. Обнаружен пониженный уровень РНК 8!а!4. ГБ-21 вызывал снижение уровня белка 8!а!4, вероятно, вследствие снижения уровня мРНК 8!а!4. Эти данные предполагают, что ГБ-21 препятствует реактивности развивающихся клеток Тх1 на ГБ-12 вследствие уменьшения экспрессии гена 8!а!4.

Пример 9. Сигнализация ГБ-21 требуется для ограничения ответа Тх1 ίη νίνο.

Чтобы определить, играет ли роль эндогенно продуцируемый ГБ-21 в ограничении функции клетки Тх1 ίη νίνο, проверяли уровень реакция гиперчувствительности замедленного типа (БТН) у ГБ-21Кдефицитной мыши. ΌΊΉ - это классический опосредованный клетками Тх1 воспалительный ответ. ГБ21К-дефицитная мышь путем обратного скрещивания была получена так, как описано у Каиап е! а1., Гттипйу 16: 559-560, 2002. Восьминедельных самцов мышей иммунизировали подкожно 100 мг Т№-КБН (2,4,6-тринитрофенил-гемоцианином из моллюска МедаГига сгепи1а!а (КеуНо1е Б1тре1)); ВюкеагсБ ТесНпо1од1е§, Nονаΐο, СА), эмульгированном в ΌΕΑ, в основание хвоста. Через шесть дней мышей сенсибилизировали 50 мкг ΊΝΡ-КБН в подушечку одной передней лапы и фосфатным буфером (РВ8) - в контралатеральную подушечку. Толщину подушечки измеряли через 24 ч после инъекции.

Результаты представлены на фиг. 5А. Специфическое опухание подушечки у мыши дикого типа и ГБ-21К-дефицитной (ГБ-21К-/-) мыши определяли, вычитая неспецифическое опухание подушечки, вызванное инъекцией фосфатного буфера, из опухания, вызванного ΊΝΡ-КБН. Каждая точка данных относится к одной мыши. Горизонтальные линии показывают средние значения. Результаты отражают выборки данных из двух независимых экспериментов. Результаты показывают, что животные дикого типа отвечают на антигенную стимуляцию сильным опуханием подушечки. Удивительно, но ГБ-21Кдефицитная мышь дала значительно более сильную реакцию гиперчувствительности замедленного типа

- 22 011686 (ΌΤΗ). что выразилось в среднем во вдвое более сильном опухании.

Также была проверена продукция ИФНу у иммунизированной мыши. Результаты показаны на фиг. 5В. Очищенные СЭ4+ Т-клетки из дренированных лимфатических узлов иммунизированной мыши стимулировали ίη νίίτο 250 мг/мл ΤΝΡ-КЬН. Супернатанты анализировали на предмет содержания ИФНу с помощью ЕЬ18А. Представленные результаты - это средние данные по двум мышам каждого генотипа, выполненные в дупликатах. Повышенная реакция гиперчувствительности замедленного типа (ΌΤΗ) у 1Ь21К.-дефицитных животных коррелировала со значительным повышением продукции ИФНу клетками СЭ4+. очищенными из дренированных лимфатических узлов и рестимулированных антигеном ίη νίίτο.

Эти результаты показывают. что 1Ь-21 вовлечен в ограничение ответа клеток Тх1 путем подавления продукции ИФНу.

Дополнительные варианты реализации находятся в рамках формулы изобретения.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110>1¥уЛЬ

ОгизЬу, М1сЬае11

У^агзХес, АпсЬеа

Υ«ιη£, ОеЬогаЬ

СоПтз, Магу

ХУЫнегз, МаЬЬст/ <120 Способ и композиции для модуляции развития и функции Т-хелперов (Гх) <130 22058-585-061 <140 РСТ/иЗОЗ/21975 <141> 2003-07-15 <15060/396,160 <151> 2002-07-15 <15060/403,001 <151> 2002-08-12 <160 13 <170 РаГепйп Уег. 2,1 <210> 1 <211> 617 <212>ДНК <213> Ното 5ар1еиз

<210 2 <211>162 <212> РК'Г <213> Ното зар1епз <400>2

Ме( Аг® Зег Зег Рго С1у Азп Ме101и Аг^ Не Уа1 Не Суя Ьеи Ме1 15 1015

А/а1 Пе РЬе Ьеи 01у ТЬг Ьеи Уа1 Из Ьуз Зег Зег Зег СНп С1у 61п 20 2530

Азр Ατβ ΗΪ8 ΜΛ Пе Ατβ ΜΛ Аг§ 61п Ьеи Пе Азр Пе Уа1 Азр 01п 35 4045

- 23 011686

Ьеи Ьуз Азп Туг Уа1 Азп Азр Ьеи Уа1 Рго О1и РЬе Ьеи Рго А1а Рго 50 5560

С1и Азр Уа1 С1и ТЬг Азп Суз О1и Тгр Бег А1а РЬе Зег Суз РЬе О1п 65 70 7580

Ьуз А1а С1п Ьеи Ьуз Зег А1а Азп ТЬг О1у Азп Азп О1и Агд Не Не

9095

Азп Уа1 Зег Пе Ьуз Ьуз Ьеи Ьуз Аг® Ьук Рго Рго Зег ТЬг Азп А1а

100 105110

С1у Аг£ Аг£ С1п Ьуз ΗΪ8 Агд Ьеи ТЬг Суз Рго Зег Суз Азр Зег Туг 115 120125

61и Ьуз Ьуз Рго Рго Ьуз О1и РЬе Ьеи <31и Ατβ РЬе Ьуз Зег Ьеи Ьеи 130 135140

О1п Ьуз Ме4 Пе Ηίβ СНп Н1з Ьеи Зег Зег Агд ТЬг Юз <31у Зег С1и

145 150 155160

Азр Зег <210> 3 <211>2887 <212>ДНК <213> Ното зар1епз <400>3 @аа£са£са$ айссссйс сасайссй а1§1а@£саё а{>§ссс@1£В 60

8а§1савса1 ессафадс (тессессс сс«ас(сс( βϋίβείβοίε саедааес! 120 8888⁰¾⁰⁰⁰ с§асс1с£1с 1$с1асасс§ айассГсса £асщ£1са1с 1§са1сс1щ; 180 ааа1§1££аа сс(ссасссс ацсасцссса сссПасс1§ £саа$асса£ 1а(а^аа8^а8^с 240 С@аа@§ас@а ££ссасс1сс (дсадссгсс аеа^Сс^с ссасаа1§сс ас£са1£сса 300 сс1асасс1§ ссаса^а! ^аПссасГ ГсаГ^осда с^асайКс а^дГсааса 360 (сасадасса аОД^саас (айсссацд а£1£Е££Са£ сШс1сс(а @с1@а@а@са 420 1саа£ссщ;с (сссссШс аас@1§ас1@ 1еассКйс аддасадГа! аа1а1с!сс1480 @§с@сГса£а 11ас(гаа£ас сс^ссКс! асаГ^ст^аа аадсаадсй са^ш^ацс 540 1£са§1аса£ ёаасс^^да яассссЦеа с^аа^сс £а£8Дёааа§ с1§а1с1сая 600 (88ас(сааа аад^&сс с!сс(ссссс (аваайссд сааа£ас&а аасШеадс 660 1§са^1в^с8 88са£88ссс а1асс1аас1 «ЯссШсса 8888^асс(88 а^каа!^ 720 аГеасссааГ саКЖсад ассса^сад адааЙааа 888888^88 аасссЮасс 780 1ас1£сйс1 сс!сс1§сй £1са1а$1с1 (сайсйдс сШЗ&авас с1£аа£ассс 840 аТссаП^а £а§8с1а18£ ааддадаШ са^ссс!^ С8£(1сйса 900

1§сссс1£1а саададс^ас аасааадас!1саа§ааа(£ 881888¾⁰³ сссйсас1£ 960 ес1ссаесс188а8^с*888^а «χοί^β⁰⁰ саеа^асс с1ссассс1{> 8а§81§1аса 1020 £с1£ссассс ассас§@а£с сса£ссааа^а £8<4£са£с1 сасваадсй саадаяссаа 1080 саеадс^ 88^^8³⁰ 88^8¾⁰⁰⁰³ «всссавсй ¢(88^8³⁰³ £ссса§аас11140 ^с888В88с1с аасйасадг дадаааааае ай^ссай 1сса«даса 1200 са^ас!# асгадагдса еааеаасса! ^сасс^сс οΐ^Β⁰*®! аа^а^ас^ 1260 дсгасссаас ссЦ»£асс1£ а^а18^с|88^сс (Вёаёсссаё сссадасси дадосссас 1320 (сйеааГас аддассаса дксЦ^ыЛ 81ёдс(д1д( йсадс^с адсссЦщдс 1380 (аддададсс сс1дадаа§с скхйддаса дайааадсс ассссНдса да1да88^а8ё 1440 аййвеЛве едайассс (8888188°° 88^^88 аессдМса 83888(8988 1500 С888С1сасс сс(88с°88° <488^88 асасдШаа са^аасШ а(888°Ь48 1560 ас^садсаа сссГдГдааа; г^дасйса ссадссссда аёасдаадаа сссссссдда 1620 8с(асс(сса ссадГаадГд 8*^сайсс1^с сдссасМс ^дск^да³ ссссаддсса 1680

- 24 011686 йс1аа1ца§5 σΐ^είβββί £1сса@а£С1 £§сса@§сса йб££ссй§ а§сса§а^ас 1740 аак§1сасс1 88§й0ба( ^аа^асас й£са£сс(( 1^(с(сй8 ^ёёбсс*¹ 1800 ΐββ^αΛβΒί 8Й1аса£1£ (с(000£ (00еса(а (00008 1£са(а(цса 1860 (8(0008 (0000с Оаё06^с?^{с 3}088Са(0 ссас000 00£айбс 1920 ас0£сс(0 бб£сс1ббба 1аа(бссса( £0ас(сса( £саНсасс( £ссс(0бса 1980 (0с(&бас( сас88а£с1с ассса(0вс асаа00£с аса0ааас£ (0Й0&0 2040 сааса£а(еа саасабес0 сйссс(сс( а££0сй0 0*ё^саа01 £0ссаса8с 2100 а1стсс£28£ ййб(880* (сабввсай £сс(08ай 8аб£Сёё^а8с сса£ссс(сс 2160 аес0с(8сс (ссабдадс: 8саа£аа0с са(ай0(с сйа(сасй бссаасабда 2220 абсзаааббб Β³¹!®^^³ ёссса(§0£ асйсбббаа (££саайй йб88^с88сс 2280 сс18£ас£аа £§(с(8аа(с сс£ас(с(ёа (ассййбб с10вс1асс (8а£ссаа0 2340 сбсс(сссй с1с(£8$с1а (»а0йссй а(ссае^аса8 (8888³³^ а(£асасасс 2400 (8§86бааа( (£8С£а(0с ассс00ас £0ас£са£с сса£аеса£а ссс(саа(аа 2460 ас0сабс(( ссйссйй 8С£8Сса0*@ сс^д^бйб С888808³8 ааса(саа(с 2520 0еа£С£аса £сс(£££сас СС£С££8£С<; 0ссс£сс(б саеабйёсса йс££££888 2580 (йссаббй: (аааа(са0 сс0йс0с (сй£8ааас адсхссссас саассаа£а( 2640 НсйШй адсйс(8с( айаа0Ш шааааНсс йШИцсас ссаабаеаГа 2700 Щайааас ассаайас£ (адсаббрса (£бс(са(^ дасссасссс сс08£сай 2760 са(£ба888ё 8С*8са£0( б£аасга18с а008йсс 8£ссасаса( сй£й8ббс 2820 сссйассй £ссссаайс аа(сс(£сса а(ааа(сс(£ (сйа(К0 (са(сй£8а 2880 баай^а 2887 <210>4 <211> 538 <2!2> РКТ <213> Ното заргепз <400>4

Мй Рго Аг§ С1у Тгр А1а А1а Рго Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи СИп СИу

1015

О1у Тгр С1у Суа Рго Аар Ьеи Уа1 Суа Туг ТЬг Аар Туг Ьеи СИп ТЬг

2530

Уа1 Пе Суз Пе Ьеи 61и Мй Тгр Азп Ьеи Н1з Рго 8сг ТЬг Ьеи ТЬг

4045

Ьеи ТЬг Тгр СПп Азр СИп Туг СИи СИи Ьеи Ьуз Азр СИи А1а ТЬг 8сг 50 5560

Суз Зег Ьеи Из Аг§ 8ег А1а Из Азп А1а ТЬг Из А1а ТЬг Туг ТЬг

70 7580

Суз Н15 Мй Азр Уа1 РЬе Из РЬе Мй А1а Азр Азр Пе РЬе 8ег Уа1

9095

Азп Пе ТЬг Азр ОЬ1 Зег С1у Азп Туг 8ег СИп СИи Суз СИу Зег РЬе 100 105110

Ьеи Ьеи А1а СИи Зег Пе Ьуз Рго А1а Рго Рго РЬе Азп Уа1 ТЬг Уа] 115 120125

ТЬг РЬе Зег (31у СИп Туг Азп Пе Зег Тгр Аг^ 8ег Азр Туг СИи Азр 130 135140

Рго А1а РЬе Туг Мй Ьеи Ьуз СИу Ьуз Ьеи СИп Туг СИи Ьеи О1п Туг

145 150 155160

Аге Азп Аге О1у Азр Рго Тгр А1а Уа18ег Рго Агб Аг& Ьуз Ьеи Пе

- 25 011686

165 170175

Зег Уа1 Азр Зег Агд 8ег Уа1 Зег Ьеи Ьеи Рго Ьеи СИи РЬе Агд Ьуз

180 185190

Азр Зег Зет Туг С1и Ьеи С1п Уа1 Агд А1а С1у Рго Ме! Рго СИу Зег

195 200205

Зет Туг О1п СИу ТЬг Тгр Зег СИи Тгр Зет Азр Рго Уа1 Не РЬе СИп

210 215220

ТЬг СИп Зет СИи СИи Ьеи Ьуз С1и О1у Тгр Азп Рго ΗΪ3 Ьеи Ьеи Ьеи 225 230 235240

Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Не Уа1 РЬе Не Рго А1а РЬе Тгр Зет Ьеи Ьуз

245 250255

ТЬг Н1з Рго Ьеи Тгр Агд Ьеи Тгр Ьуз Ьуз Не Тгр А1а Уа1 Рго Зег

260 265270

Рго СИи. Агд РЬе РЬе Ме1 Рго Ьеи Туг Ьуз С1у Суз Зет С1у Азр РЬе

275 280285

Ьуз Ьуз Тгр Уа! О1у А1а Рго РЬе ТЬг О1у Зет Зет Ьеи О1и Ьеи О1у 290 295300

Рго Тгр Зег Рго СИи Уа1 Рго Зет ТЬг Ьеи СИи Уа1 Туг Зег Суз ΗΪ8

305 310 315320

Рго Рго Агд Зет Рго А1а Ьуз Агд Ьеи СИп Ьеи ТЬг СИи Ьеи СИп СИи

325 330335

Рго А1а СИи Ьеи Уа1 С1и Зет Азр СИу Уа1 Рго Ьуз Рго Зет РЬе Тгр

340 345350

Рго ТЬг А1а СИп Азп Зег СИу О1у Зет А1а Туг Зет СИи СИи Агд Азр

355 360365

Агд Рго Туг О1у Ьеи Уа1 Зет Не Азр ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Ьеи Азр А1а 370 375380

О1и О1у Рго Суз ТЬг Тгр Рго Суз Зет Суз СИи Азр Азр СИу Туг Рго 385 390 395400

А1а Ьеи Азр Ьеи Азр А1а СИу Ьеи СИи Рго Зег Рго СИу Ьеи СИи Азр

405 410415

Рго Ьеи Ьеи Азр А1а СИу ТЬг ТЬг Уа1 Ьеи Зег Суз СИу Суз Уа1 Зет 420 425430

А1а СИу Зет Рго СИу Ьеи СИу СИу Рго Ьеи 61у Зег Ьеи Ьеи Азр Агд 435 440445

Ьеи Ьуз Рго Рго Ьеи А1а Азр СИу СИи Азр Тгр А1а СИу СИу Ьеи Рго 450 455460

Тгр СИу СИу Агд Зег Рго С1у СИу Уа1 Зег СИи Зег СИи А1а С1у Зег

465 470 475480

Рго Ьеи А1а С1у Ьеи Азр Ме! Азр ТЬг РЬе Азр Зет СИу РЬе Уа1 СИу

- 26 011686

485 490495

Зет Азр Суя Зег Зет Рго Уа101и Суя Азр РЬе ТЬг Зег Рго С1у Аяр

500 505510

О1и О1у Рго Рго Агд Зег Туг Ьеи Агд С1п Тгр Уа1 Уа1 Не Рго Рго

515 520525

Рго Ьеи Зег Зет Рго С1у Рго С1п А1а Зет

530535 <210> 5 <211> 16 <212>РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <4О0>5

Ме1 Рго Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Рго Зет Рго Ьеи Ню Рго

10 15 <210>6 <211> 224 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400>6

Нй ТЬг Суя Рго Рго Суя Рго А1а Рго О1и А1а Ьеи О1у А1а Рго Зет

Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуя Рго Ьуя Аяр ТЬг Ьеи Ме1 Не Зет Агд

2530

ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суя Уа1 Уа1 Уа1 Аяр Уа1 Зет Нй О1и Аяр Рго 35 4045

О1и Уа! Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа101и Уа1 НЙ Ляп А1а 50 5560

Ьуя ТЬг Ьуя Рго Агд О1и 61и О1п Туг Аяп Зег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1

70 7580

Зет Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи НЙ С1п Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз (31и Туг

9095

Ьуз Суя Ьуя Уа1 Зег Аяп Ьуз А1а Ьеи Рго Уа1 Рго Не О1и Ьуз ТЬг

100 105110

Пе Зет Ьуя А1а Ьуя <Э1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи

115 120125

Рго Рго Зег Агд С1и О1и Ме1 ТЬг Ьуз Аяп О1п Уа1 Зет Ьеи ТЬг Суя

- 27 011686

130 135140

Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Зег Азр Пе А1а Уа1 О1и Тгр С1и 8ег 145 150 155160

Азп С1у С1п Рго СИи Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр

165 170175

Зег Азр СНу Зег РЬе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз 8ег 180 185190

Аг8 Тгр С1п 61η С1у Азп Уа1 РЬе Зег Суз Зег Уа1 Ме1 Ηίβ С1и А1а 195 200205

Ьеи ΗΪ3 Азп Ηίβ Туг ТЬг 61л Ьуз Зег Ьеи Зет Ьеи Зег Рго С1у Ьуз 210 215220 <2107 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 7 аа§айсс1ё а§еа1сс?а§ аа^ 23 <210>8 <211> 24 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 8 @саТ1с§1§а $с$1с1а1а£ 1$1с 24 <210>9 <211> 23 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 9

Пссс£а££а сТ^а^^^ас ^сс 23

- 28 011686 <210> 10 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 10

ШссагШ 1£са1саа§11с1с 24 <210 11 <211> 20 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 11 ссда1сГа§а §1са§сс§сг 20 <210 12 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400 12 ааасс1еа£с ссаасдасаа 20 <210> 13 <211> 19 <212>ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <40013 а^^сс^й 1§сасс§1с 19

Claims (23)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ ингибирования уровня γ-интерферона (ИФНу) в Т-клетке-хелпере (Тх) или популяции Тхклеток или их предшественников, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тклетки или популяции Т-клеток или их предшественников с полипептидом ΙΕ-21, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности ЗЕО ΙΌ N0:2, и который способен связываться с ГО-21В, где полипептид ГО-21 используют в количестве, достаточном для ингибирования ИФНу в указанной Тх-клетке или популяции Тх-клеток или их предшественников.
2. 2. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий идентификацию Тх-клетки или популяции Тх-клеток, в которой желательно ингибирование уровней ИФНу.
3. 3. Способ стимуляции дифференцировки предшественников Т-клеток-хелперов (Тхп) или популяции Тхп-клеток в Тх2-клетки или популяцию Тх2-клеток, предусматривающий обеспечение контактирования указанных Тхп-клеток или популяции Тхп-клеток с полипептидом ГО-21, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности ЗЕО ΙΌ N0:2, и который способен связываться с ГО-21В, где полипептид ГО-21 используют в количестве, достаточном для стимуляции дифференцировки указанных Тхп-клеток или популяции Тхп-клеток в Тх2клетки или популяцию Тх2-клеток.

   - 29 011686
4. 4. Способ по п.3, дополнительно предусматривающий идентификацию Тхп-клеток или популяции Тхп-клеток, дифференцировку которых в Тх2-клетки или популяцию Тх2-клеток необходимо обеспечить.
5. 5. Способ ингибирования дифференцировки Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток в Тх1-клетку или популяцию Тх1-клеток, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток с полипептидом ГЬ-21, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности 8Ε0 ΙΌ N0:2, и который способен связываться с 1Ь-21К, где полипептид ГЬ-21 используют в количестве, достаточном для ингибирования дифференцировки указанной Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток в Тх1-клетку или популяцию Тх1клеток.
6. 6. Способ по п.5, дополнительно предусматривающий идентификацию Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток, в которых необходимо обеспечить ингибирование указанной дифференцировки.
7. 7. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, согласно которому полипептид ГЬ-21 содержит аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ N0:2.
8. 8. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, согласно которому стадию контактирования осуществляют ех νίνο, ш νίίΓο или т νίνο.
9. 9. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, согласно которому стадию контактирования осуществляют у млекопитающего ш νίνο.
10. 10. Способ по п.9, согласно которому млекопитающим является человек.
11. 11. Способ ингибирования дифференцировки Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток в Тх2-клетку или популяцию Тх2-клеток, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток с антагонистом интерлейкина-21 (1Ь-21)/1Ь-21-рецептора (1Ь-21К), в количестве, достаточном для ингибирования дифференцировки указанной Тхп-клетки или популяции Тхпклеток в указанную Тх2-клетку или популяцию Тх2-клеток, где антагонист выбран из группы, состоящей из анти-1Ь-21К-антитела, антигенсвязывающего фрагмента анти-1Ь-21К-антитела и растворимого фрагмента 1Ь-21К.
12. 12. Способ по п.11, дополнительно предусматривающий идентификацию Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток, в которой необходимо обеспечить ингибирование указанной дифференцировки.
13. 13. Способ повышения уровня γ-интерферона (ИФНу) в Т-клетке-хелпере (Тх) или популяции Тхклеток либо их предшественников, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тхклетки или популяции Тх-клеток либо их предшественников с антагонистом 1Ь-21/(1Ь-21К) в количестве, достаточном для повышения уровня ИФНу в указанной Тх-клетке или популяции Тх-клеток либо их предшественников, где антагонист выбран из группы, состоящей из анти-1Ь-21К-антитела, антигенсвязывающего фрагмента анти-1Ь-21К-антитела и растворимого фрагмента 1Ь-21К.
14. 14. Способ по п.13, дополнительно предусматривающий идентификацию Тх-клетки или популяции Тх-клеток либо их предшественников, в которых необходимо обеспечить повышение уровня ИФНу.
15. 15. Способ по п.11 или 13, где растворимый фрагмент 1Ь-21К содержит внеклеточный участок рецептора 1Ь-21.
16. 16. Способ по п.15, где растворимый фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотам 20-235 последовательности 8Ε0 ΙΌ N0:4 и которая способна связываться с ГЬ-21.
17. 17. Способ по п.15, где растворимый фрагмент содержит аминокислоты 1-235 последовательности 8ΕΟ ΙΌ N0:4.
18. 18. Способ по п.15, где растворимый фрагмент дополнительно содержит Ес-фрагмент.
19. 19. Способ по п.11 или 13, где антагонист является анти-[Ь-21Е-антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.
20. 20. Способ по п.12, где популяция Т-клеток включает в себя по меньшей мере одну Тх1-клетку.
21. 21. Способ по п.11 или 13, где стадию контактирования выполняют ех νίνο, ш νίίτο или ш νίνο.
22. 22. Способ по п.21, согласно которому стадию контактирования осуществляют у млекопитающего т νίνο.
23. 23. Способ по п.22, где млекопитающим является человек.