KR20050037552A - Ｔ 헬퍼(ｔｈ) 세포 발생 및 기능을 조절하는 방법 및조성물 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 IL-21, 예를 들어 인간 IL-21의 활성 또는 수준의 조절 인자를 사용하여 T 헬퍼(Th) 세포 발생 및 기능을 조절하는 방법 및 조성물에 대해 개시한다.

Description

Ｔ 헬퍼(ＴＨ) 세포 발생 및 기능을 조절하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING T HELPER(TH) CELL DEVELOPMENT AND FUNCTION}
본 발명은 IL-21, 예를 들어 인간 IL-21의 활성 또는 수준의 조절 인자 및 T 세포, 예를 들어 T 헬퍼(Th) 세포의 발생 및 기능을 조절하는 데 있어서의 상기 조절 인자의 용도에 관한 것이다.
T 헬퍼(Th) 아군은 별개의 사이토카인 유형을 생성하고 특이적 면역 반응을 촉진할 수 있는 능력에 의해 서로 구별된다. Th1 세포는 IFNγ를 생성하고 세포내 병원균에 대하여 유도되는 세포 매개 면역을 촉진한다. 이와는 달리, Th2 세포는 사이토카인 IL-4, IL-5, 및 IL-13을 생성하고, 비만 세포 및 호산구를 활성화시키고, 세포외 병원균에 대하여 B 세포를 유도한다. Th 반응의 조절 이상은 비정상적 Th1 반응이 기관 특이적 자가 면역의 원인이 될 수 있고, 지나치게 증가된 Th2 반응은 알러지 반응과 관련될 수 있다는 점에서 면역 질환을 초래할 수 있다.
분극화된 Th 세포에 의해 생성된 특이적 사이토카인은 전구체 Th 세포의 분화를 촉진하는 1차 작동체이지만, 이들 세포들은 또한 다른 아군의 기능적 활성을 상호 조절할 수 있다. 예를 들어 IL-4는 Th2 작동체(effector)로의 Thp 세포의 분화를 촉진하는 데 있어서 유효한 인자인 것으로 보고되어 있다. 뿐만 아니라, IL-4는 IFNγ에 대하여 길항작용을 한다. Th2 세포에 의해 생성되는 또 다른 사이토카인인 IL-10 역시 Th1 발생 및 IFNγ에 의해 유도된 대식 세포 기능을 억제한다고 알려져 있다. 반대로, Th1 세포에 의해 생성된 IFNγ는 Th1 발생을 증폭시키고 Th2 세포의 증식을 억제한다. 이러한 사이토카인의 능력은 특이적 Th 세포 아군의 발생을 촉진하는 한편, 동시에 택일적인 발생 경로를 억제하여 점진적으로 분극화된 반응을 유도한다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로, 사이토카인 인터루킨-21(IL-21)이 T 헬퍼(Th) 세포의 아군인 Th2 세포에 의해 발현되며, Th1 세포 발생 과정에서 인터페론 γ(IFNγ) 수준을 선택적으로 억제한다는 발견에 기초한다. 보다 구체적으로, 본원에서는 IL-21이 시험관내 및 생체내에서 생성된 Th2 세포에 의해 차별적으로 발현된다는 것을 보여준다. 한 구체예에서, 발생중인 Th 세포를 IL-21에 노출시키면 발생중인 Th1 세포로부터 IFNγ수준을 선택적으로 감소시켰고, 따라서 Th2 반응을 증강시켰다. 또한, 발생중인 Th 세포를 IL-21에 노출시키면 Stat4 신호 전달을 감소시키는데, 예를 들어 Stat4 단백질 및/또는 mRNA 발현을 감소시킴으로써 다른 사이토카인, 예를 들어 IL-12에 대한 Th 세포 반응성을 조절한다. 따라서, Th 세포 발생 및 활성을 조절하는 방법 및 조성물에 대해 개시한다. 본원에 기술된 방법 및 조성물, 예를 들어 IL-21의 효현제 또는 길항제는 Th 세포 및/또는 IFNγ관련 질환 또는 병태, 예를 들어 Th2 관련 질환, 예를 들어 천식, 알러지 및 항체 성분과 관련된 질환(예, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 루프스); 및 Th-1 관련 질환, 예를 들어 자가면역 질환(예, 특히 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 크론병, 건선 및 중증 근무력증)을 치료하는 데(예를 들어 치유, 개선, 지연시키거나 또는 발병을 예방하거나, 또는 재현 또는 재발을 예방하는 데) 유용하다.
한 양태에서, 본 발명은 T 세포 또는 T 세포 집단에서 인터페론 감마(IFNγ)수준을 억제하는 방법, 예를 들어 감소시키거나 제거하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은, 예를 들어 T 세포, 예를 들어 T 세포 전구체 세포(Thp 세포), 또는 Th1 세포 (예, 분화하는 Th1 세포 또는 작동체 Th 세포), 또는 이의 T 세포 집단 내에서의 IFNγ의 활성, 발현, 분비 또는 프로세싱을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 T 세포 또는 T 세포 집단을 T 세포 또는 T 세포 집단에서 IFNγ를 억제하기에(예를 들어, 감소 또는 제거하기에) 충분한 양의 IL-21 효현제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이때 효현제는 서열 번호 2와 85% 이상 동일하고 IL-21R에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-21 폴리펩티드이다. 몇몇 구체예에서, 본 방법은 IFNγ수준의 억제가 요망되는 T 세포 또는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 Th 전구체(Thp) 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 촉진하는 방법을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 이 방법은 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단을 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 유도하기에 충분한 양의 IL-12 효현제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 효현제는 서열 번호 2와 85% 이상 동일하고 IL-21R에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-21 폴리펩티드이다. 몇몇 구체예에서, 본 방법은 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화가 요망되는 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th1 세포 또는 Th1 세포 집단으로의 분화를 억제하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단을 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th1 세포 또는 Th1 세포 집단으로의 분화를 억제하기에 충분한 양의 IL-12 효현제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 효현제는 서열 번호 2와 85% 이상 동일하고 IL-21R에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-21 폴리펩티드이다. 한 구체예에서, 본 방법은 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th1 세포 또는 Th1 세포 집단으로의 분화의 억제가 요망되는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함한다.
이러한 방법들의 몇몇 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 방법들의 몇몇 구체예에서, 접촉 단계는 생체외, 시험관내, 또는 생체내에서 수행된다. 생체외 또는 생체내 방법에 적합한 피험체는 포유동물 피험체, 예를 들어 인간을 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 Th 전구체(Thp) 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 억제하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단을 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 세포 집단으로의 분화를 억제하기에 충분한 양의 인터루킨-21(IL-12)/IL-21 수용체(IL-21R)의 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 효현제는 항-IL21R 항체, 항-IL21R 항체의 항원 결합 단편 및 IL-21R의 가용성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 방법은 임의로, Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화의 억제가 요망되는 T 세포 또는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 구체예에서, T 세포 집단은 하나 이상의 Th1 세포를 포함한다.
몇몇 구체예에서, IL-21R의 가용성 단편은 IL-21 수용체의 세포외 영역을 포함한다. 예를 들어 가용성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 20∼235와 85% 이상 동일하고 IL-21에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 대안으로 가용성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 1∼235를 포함한다. 관련 구체예에서, 가용성 단편은 Fc 단편을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 길항제는 항-IL21R 항체 또는 항-IL21R 항체의 항원 결합 단편이다.
또 다른 구체예에서, 접촉 단계는 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 수행된다. 접촉 단계는 포유동물 피험체에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 포유동물 피험체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 T 세포 또는 T 세포 집단에서 인터페론 감마(IFNγ)를 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 T 세포 또는 T 세포 집단을 T 세포 또는 T 세포 집단에서 IFNγ수준을 증가시키기에 충분한 양의 IL-12/IL-21R의 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 길항제는 항-IL21R 항체, 항-IL21R 항체의 항원 결합 단편 및 IL-21R의 가용성 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 본 방법의 한 구체예는 IFNγ수준의 증가가 요망되는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함한다.
몇몇 구체예에서, IL-21R의 가용성 단편은 IL-21 수용체의 세포외 영역을 포함한다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 가용성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 20∼235와 85% 이상 동일하고 IL-21에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 대안으로 가용성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 1∼235를 포함한다. 관련 구체예에서, 가용성 단편은 Fc 단편을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 길항제는 항-IL21R 항체 또는 항-IL21R 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.
또 다른 관련 구체예에서, 접촉 단계는 접촉 단계는 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 접촉 단계는 포유동물 피험체, 예를 들어 인간에수 수행된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 아래에서 기술한다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 본원에서 그 전체를 참고 문헌으로 포함한다. 상충되는 경우에는 정의를 비롯하여 본 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시를 위한 것으로 제한을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 장점들은 하기의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1A는 하기 실시예에서 기술하는 다양한 Th1 및 Th2 편향 조건 하에서의 IL-21, IL-4, IFNγ및 γ액틴의 발현의 노던 블롯 하이브리드화 분석을 나타낸 것이다.
도 1B는 1차 및 2차 자극 후에 Th1 및 Th2 세포 내의 GAPDH mRNA에 대한 IL-21 mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다.
도 1C는 IL-4 및 IFNγ존재 또는 부재 하에 배양된 1차 및 2차 Th1 및 Th2 세포에서 GAPDH mRNA에 대한 IL-21 mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다.
도 1D는 레이쉬마니아 메이져(L. major)로 감염시킨 후의 C57BL/g 및 BALB/c마우스에서 GAPDH mRNA에 대한 IL-21 mRNA, IL-4 mRNA, 및 IFNγ mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다.
도 2A는 중립 조건, 또는 Th1 편향 조건 하에 배양된 Thp 세포에서의 IL-4 및 IL-21 사이토카인 생성의 그래프 도식이다.
도 2B는 IL-21 처리된 또는 mock 처리된 Thp 세포에서의 IFNγ생성을 보여주는 히스토그램이다.
도 3A는 IL-22 존재 또는 부재 하에 Th1 편향 조건 하에 배양된 Thp 세포에서의 IL-4 및 IFNγ생성의 그래프 도식이다.
도 3B는 야생형 및 Stat-/- 마우스로부터 유래된, Th1 편향 조건 하에 IL-21 처리된 또는 mock 처리된 Thp 세포에서의 IL-4 및 IFNγ생성의 그래프 도식이다.
도 3C는 야생형 및 Stat-/- 마우스로부터 유래된, IL-21 처리된 또는 mock 처리된 Th1 세포의 IFNγ, IL-2, 및 TNFα발현의 그래프 도식이다.
도 4A는 Th1 또는 Th2 편향 조건 하에 배양된 Thp 세포 내의 T-bet 및 액틴 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석의 도식이다.
도 4B는 Th1 세포 내의 수준에 대한 IL-12Rβ2 mRNA의 상대적 수준을 보여주는 히스토그램이다.
도 4C는 IL-21 또는 mock 상청액 존재 하에 항-CD3로 자극된 Thp 세포 내에서의 인산화된 Stat4, Stat4, Statl, 및 IL-12 폴리펩티드 수준의 웨스턴 블롯 분석의 도식이다.
도 4D는 IL-21 또는 mock 상청액 존재 하에 48 시간 동안 항-CD3로 자극된 mock 처리된 Thp 세포 또는 IL-21 처리된 Thp 세포 내에서의 GAPDH mRNA에 대한 Stat4 mRNA의 수준을 보여주는 히스토그램이다.
도 5A는 TNP-KLH 또는 PBS를 주사한 후 TNP-KLH 면역화된 야생형 및 IL21-21R-/- 마우스에서의 특이적 팽윤을 보여주는 그래프이다.
도 5B는 항원에 의해 재자극된 TNP-KLH 면역화된 야생형 및 IL21-21R-/- 마우스의 배출 림프절로부터 정제된 CD4+ T 세포 내에서의 IFNγ생성을 보여주는 히스토그램이다.
본 발명은 IL-21과 IL-21 수용체 간의 상호작용을 조절함으로써 T 헬퍼 세포 분화, 발생 및 활성을 조절하는 방법 및 조성물을 제공한다. 세포 집단 내의 IL-21, 또는 IL-21 또는 IL-21 수용체 수준을 증가시키는 제제가 Thp 또는 Th1 세포 집단 내의 IFNγ수준을 억제하기 위해 T 헬퍼 세포의 집단에 첨가된다. IL-21, 또는 IL-21 수준을 증가시키는 제제 역시 Th2 발생을 촉진하거나 Th2 매개 면역 반응을 증강시키고/시키거나 Th1 발생을 억제하는 데 사용될 수 있다.
IL-21, 또는 IL-21 수준을 증가시키는 제제는 또한 T 헬퍼 세포 집단에 대한 IL-21의 효과를 억제하는 데 사용될 수 있다. IL-21 또는 IL-21의 수준을 증가시키거나 다른 방식으로 IL-21 효현제로서 작용하는 제제는 자가면역 질환, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 제1형 당뇨병과 같은 Th1 매개 질환을 억제하는 데 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 세포 집단, 예를 들어 T 세포 집단에서 인터페론 감마(IFNγ)의 활성 또는 수준을 조절하는 방법, 예를 들어 증가시키거나 감소시키거나 억제하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, T 세포에서, 예를 들어 T 세포 전구체 세포(Thp 세포)에서 또는 Th1 세포(예, 분화하는 Th1 세포 또는 작동체 Th 세포), 또는 이의 T 세포 집단에서 IFNγ의 활성, 발현, 분비 또는 프로세싱 중 하나 이상을 조절하는 방법이 제공된다. 이 방법은
(경우에 따라) IFNγ의 활성 또는 수준의 조절(예, 증가 또는 감소)이 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 세포 집단, 예를 들어 T 세포 집단을 확인하는 단계; 및
상기 세포 또는 세포 집단을 상기 세포 또는 세포 집단 내에서 IFNγ의 활성 또는 수준을 조절(예, 증가 또는 감소)하는 데 충분한 양의 IL-21 조절 인자, 예를 들어 IL-21 효현제 또는 길항제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 방법은 배양 세포에, 예를 들어 시험관내 또는 생체외 세포에 대하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술하는 T 세포와 같은 면역 세포는 시험관내 배양 배지에서 배양될 수 있으며, 접촉 단계는 하나 이상의 IL-21 조절 인자(예, IL-21 효현제 또는 길항제)를 배양 배지에 첨가함으로써 실시할 수 있다. 대안으로, 본 방법은 피험체 내에 존재하는 세포(예, 본원에서 기술하는 면역 세포 또는 T 세포)에 대하여, 예를 들어 생체내(예, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.
한 구체예에서, 세포, 예를 들어 T 세포(예, T 세포 전구체 세포(Thp 세포), 또는 Th1 세포(예, 분화하는 Th1 세포 또는 작동체 Th 세포)), 또는 이의 세포 집단에서 IFNγ의 활성 또는 수준을 감소 또는 억제하는 방법이 제공된다. 본 방법은 방법은 (경우에 따라) IFNγ의 활성 또는 수준의 감소 또는 억제가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 세포 집단, 예를 들어 T 세포 집단을 확인하는 단계; 및 상기 세포 또는 세포 집단을 상기 세포 또는 세포 집단 내에서 IFNγ의 활성 또는 수준을 감소 또는 억제하는 데 충분한 양의 IL-21 효현제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, IL-21 효현제는 IFNγ수준 또는 활성을 특이적으로 억제하는데, 예를 들어, 이는 IL-2 또는 TNFα와 같은 다른 사이토카인의 활성 또는 수준은 감소시키거나 억제하지 않는다. 한 구체예에서, IL-21 효현제는 IFNγ생성 세포, 예를 들어 IFNγ생성 Th1 세포에 의한 IFNγ의 생성을 억제한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 피험체에서 IFNγ수준 또는 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 (경우에 따라) IFNγ수준 또는 활성의 감소가 요망되는 피험체를 확인하는 단계; 및 상기 피험체에 IFNγ수준 또는 활성을 감소시키기에 충분한 양의 IL-21 효현제를 투여하는 단계를 포함한다. IFNγ는 당분야에 공지된 기법을 이용하여, 예를 들어 세포내 사이토카인 염색, 또는 세포 상청액 중의 수준을 측정하기 위한 ELISA 기법에 의해 측정할 수 있다.
IL-21 효현제는 IL-21 폴리펩티드, 인간 IL-21 폴리펩티드, 또는 이의 활성 단편(예, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 코딩되는 인간 IL-21 폴리펩티드)일 수 있다. 다른 구체예에서, IL-21 효현제는 IL-21 폴리펩티드(예, 인간 IL-21 폴리펩티드)를 포함하는 융합 단백질, 또는 다른 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 폴리펩티드 또는 이의 일부분(예, 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역)에 융합된 IL-21 폴리펩티드의 단편; IL-21 수용체에 대한 효현제 항체; 또는 저분자 효현제이다. 다른 구체예에서, IL-21 효현제는, 예를 들어 기능성 IL-21의 발현, 프로세싱 및/또는 분비를 증가시킴으로써 IL-21의 활성 또는 수준을 증가시키는 제제이다.
바람직하게는 피험체는 포유동물, 예를 들어 비정상적인, 예를 들어 증가된 IFNγ수준 또는 활성과 관련된 질환, 예를 들어 면역 질환(예, T 세포 매개 질환)을 앓고 있는 인간 피험체이다.
IL-21의 길항제를 사용하여 치료하거나(예를 들어 개선시키거나) 또는 예방할 수 있는 대표적인 면역 질환으로는, 예를 들어 Th1 관련 질환, 예컨대 자가면역 질환(비제한적인 예로 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 염증성 장 질환(IBD), 건선 및 중증 근무력증을 포함함)을 포함한다.
본 발명은 또한 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 세포 집단, 예를 들어 T 세포 집단에서 IFNγ수준 또는 활성을 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 예를 들어, 본 발명은 T 세포, 예를 들어 T 세포 전구체 세포(Thp 세포), 또는 Th1 세포(예, 분화하는 Th1 세포 또는 작동체 Th 세포), 또는 이의 T 세포 집단에서 IFNγ활성, 발현, 분비 또는 프로세싱을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 (경우에 따라) IFNγ발현의 증가가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 세포 집단, 예를 들어 T 세포 집단을 확인하는 단계; 및 상기 세포를 IL-21의 결합 또는 활성을 억제하기에 충분한 양, 예를 들어 IL-21 수용체에 대한 IL-21의 결합을 억제하기에 충분한 양의 IL-21 길항제와 접촉시킴으로써 상기 세포 내에서의 IFNγ발현 수준을 증가시키는 단계를 포함한다.
IL-21 길항제는 IL-21, 예를 들어 인간 IL-21, 또는 IL-21 수용체, 예를 들어 인간 IL-21 수용체 폴리펩티드에 대한 항체(예, 모노클로날 또는 단일 특이성 항체)일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 IL-21 또는 인간 IL-21 수용체 폴리펩티드에 대한 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 시험관내에서 생성된 항체이다. 다른 구체예에서, 길항제는 IL-21 폴리펩티드의 단편, 예를 들어 IL-21 폴리펩티드의 IL-21 수용체 결합 도메인을 포함한다. 대안으로, 길항제는 IL-21 수용체 폴리펩티드의 단편, 예를 들어 IL-21 수용체 폴리펩티드의 IL-21 결합 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 길항제는 제2 부분, 예를 들어 폴리펩티드(예, 면역글로불린 사슬)에 융합된 상기한 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어 Th2 세포 활성 및/또는 세포 수를 증가시키거나 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 한 구체예에서, Th2 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화(예를 들어, T 세포 전구체, 예를 들어 Th 전구체(Thp)의 Th2 세포로의 분화) 중 하나 이상을 조절하는 방법, 예를 들어 촉진하거나 억제하는 방법이 제공된다. 이 방법은
(경우에 따라) 증식, 생존 및/또는 분화가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th2 세포), 또는 세포 집단을 확인하는 단계; 및
상기 세포 또는 세포 집단을 Th2 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화 중 하나를 조절(예를 들어, 상기 Thp 세포에서 Th2 세포로의 분화를 조절)하는 데 충분한 양의 IL-21 조절 인자, 예를 들어 IL-21 효현제 또는 길항제와 접촉시킴으로써 Th2 활성 및/또는 세포 수를 조절하는 단계를 포함한다.
본 방법은 배양 세포에 대하여, 예를 들어 시험관내 또는 생체외 세포에 대하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술하는 T 세포와 같은 면역 세포는 시험관내 배양 배지에서 배양될 수 있으며, 접촉 단계는 하나 이상의 IL-21 조절 인자(예, 하나 이상의 IL-21 효현제 또는 길항제)를 배양 배지에 첨가함으로써 실시할 수 있다. 대안으로, 본 방법은 피험체 내에 존재하는 세포(예, 본원에서 기술하는 면역 세포 또는 T 세포)에 대하여, 예를 들어 생체내(예, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.
한 구체예에서, Th2 세포 활성 및/또는 세포 수를 감소 또는 억제하는 방법이 제공된다. 예를 들어, Th2 세포 활성 및/또는 세포 수는 Th2 세포로 증식, 생존 및/또는 분화(예를 들어, T 세포 전구체, 예를 들어 Th 전구체(Thp)의 Th2 세포로의 분화) 중 하나 이상의 억제 또는 감소시킴으로써 감소 또는 억제할 수 있다. 이 방법은 (경우에 따라) 증식, 생존 및/또는 분화의 억제가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th2 세포), 또는 세포 집단을 확인하는 단계; 및 상기 세포 또는 세포 집단을 Th2 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화 중 하나 이상을 억제 또는 감소시키기에(예를 들어, 상기 Thp 세포의 Th2 세포로의 분화를 억제 또는 감소시키기에) 충분한 양의 IL-21 길항제와 접촉시킴으로써 Th2 세포 활성 및/또는 세포 수를 억제 또는 감소시키는 단계를 포함한다.
본 방법은 배양 세포, 예를 들어 시험관내 또는 생체외의 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th2 세포)에 대하여 사용될 수 있다.
대안으로, 본 방법은, 예를 들어 생체내(예, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서, 피험체 내에 존재하는 세포(예, 본원에서 기술하는 면역 세포 또는 T 세포)에 대하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 피험체의 Th2 매개 질환, 예를 들어 천식 및 알러지를 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험체에서 Th2 관련 질환을 치료(예, 치유, 억제, 개선, 지연하거나 또는 발병을 예방하거나, 재현 또는 재발을 예방)하는 방법을 제공한다. 이 방법은 Th2 세포 활성 및/또는 세포 수를 억제 또는 감소시키기에 충분한 양의 IL-21 길항제를 피험체에 투여함으로써 Th2 관련 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 피험체는, 예를 들어 비정상적인 Th2 세포 수 또는 활성과 관련된 질환, 예를 들어 면역 질환(예, Th2 관련 질환)을 앓고 있는 포유동물, 예를 들어 인간이다. 세포 활성 및/또는 수를 억제 또는 감소시키는 데 충분한 양은 상기 질환을 개선 또는 예방하는 데 충분한 양이다.
IL-21 길항제는 IL-21, 예를 들어 인간 IL-21, 또는 IL-21 수용체, 예를 들어 인간 IL-21 수용체 폴리펩티드에 대한 항체(예, 모노클로날 또는 단일 특이성 항체)일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 IL-21 또는 인간 IL-21 수용체 폴리펩티드에 대한 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 시험관내에서 생성된 항체이다. 다른 구체예에서, 길항제는 IL-21 폴리펩티드의 단편, 예를 들어 IL-21 폴리펩티드의 IL-21 수용체 결합 도메인을 포함한다. 대안으로, 길항제는 IL-21 수용체 폴리펩티드의 단편, 예를 들어 IL-21 수용체 폴리펩티드의 IL-21 결합 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 길항제는 제2 부분, 예를 들어 폴리펩티드(예, 면역글로불린 사슬)에 융합된 상기한 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질이다.
또 다른 구체예에서, Th2 세포 활성 및/또는 세포 수를 증가시키는 방법이 제공된다. 예를 들어, Th2 세포 활성 및/또는 세포 수는 Th2 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화(예를 들어, T 세포 전구체, 예를 들어 Th 전구체(Thp)의 Th2 세포로의 분화) 중 하나 이상을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이 방법은 (경우에 따라) 증가된 증식, 생존 및/또는 분화가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th2 세포)를 확인하는 단계; 및 Th2 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화 중 하나 이상을 증가시킴으로써(예를 들어, 상기 Thp 세포의 Th2 세포로의 분화를 증가시킴으로써) Th2 세포 활성 및/또는 세포 수를 증가시키는 단계를 포함한다.
IL-21 효현제는 IL-21 폴리펩티드, 인간 IL-21 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편(예, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 코딩되는 인간 IL-21 폴리펩티드)일 수 있다. 다른 구체예에서, IL-21 효현제는 IL-21 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IL-21 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 또는 다른 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 폴리펩티드 또는 이의 일부분(예, 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역)에 융합된 IL-21 폴리펩티드의 단편; IL-21 수용체에 대한 효현제 항체; 또는 저분자 효현제이다.
또 다른 양태에서, Th1 세포 수 및/또는 활성을 조절하는 방법, 예를 들어 증가 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, Th1 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화(예를 들어, T 세포 전구체, 예를 들어 Th 세포(Thp)의 Th1 세포로의 분화) 중 하나 이상을 조절하는 방법, 예를 들어 촉진 또는 억제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (경우에 따라) 증식, 생존 및/또는 분화의 조절이 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th1 세포), 또는 세포 집단을 확인하는 단계; 및 상기 세포 또는 세포 집단을 Th1 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화 중 하나 이상을 조절하기에(예를 들어, 상기 Thp 세포에서 Th1 세포로의 분화를 조절하기에) 충분한 양의 IL-21 조절 인자, 예를 들어 효현제 또는 길항제와 접촉시킴으로써 Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 조절하는 단계를 포함한다.
본 방법은 배양 세포에 대하여, 예를 들어 시험관내 또는 생체외 세포에 대하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술하는 T 세포와 같은 면역 세포는 시험관내 배양 배지에서 배양될 수 있으며, 접촉 단계는 하나 이상의 IL-21 조절 인자(예, IL-21 효현제 또는 길항제)를 배양 배지에 첨가함으로써 실시할 수 있다. 대안으로, 본 방법은 피험체 내에 존재하는 세포(예, 본원에서 기술하는 면역 세포 또는 T 세포)에 대하여, 예를 들어 생체내(예, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 수행될 수 있다.
한 구체예에서, Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 억제 또는 감소하는 방법이 제공된다. 예를 들어, Th1 세포 활성 및/또는 세포 수는 Th1 세포로 증식, 생존 및/또는 분화(예를 들어, T 세포 전구체, 예를 들어 Th 전구체(Thp)의 Th1 세포로의 분화) 중 하나 이상의 억제 또는 감소시킴으로써 감소 또는 억제할 수 있다. 이 방법은 (경우에 따라) 증식, 생존 및/또는 분화의 억제가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp, TNFγ생성 세포, 예를 들어 Th1 세포), 또는 세포 집단을 확인하는 단계; 및 상기 세포 또는 세포 집단을 Th1 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화 중 하나 이상을 억제 또는 감소시키기에(예를 들어, 상기 Thp 세포의 Th1 세포로의 분화를 억제 또는 감소시키기에) 충분한 양의 IL-21 효현제와 접촉시킴으로써 Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 억제 또는 감소시키는 단계를 포함한다.
본 방법은 배양 세포, 예를 들어 시험관내 또는 생체외의 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th2 세포)에 대하여 사용될 수 있다.
대안으로, 본 방법은, 예를 들어 생체내(예, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서, 피험체 내에 존재하는 세포(예, 본원에서 기술하는 면역 세포 또는 T 세포)에 대하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 피험체의 Th1 매개 질환, 예를 들어 자가면역 질환(예를 들어, 특히 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 크론병, 건선 및 중증 근무력증)을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험체에서 Th1 관련 질환을 치료(예, 치유, 억제, 개선, 지연시키거나 또는 발병을 예방하거나, 재현 또는 재발을 예방)하는 방법을 제공한다. 이 방법은 Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 억제 또는 감소시키기에 충분한 양의 IL-21 효현제를 피험체에 투여함으로써 Th1 관련 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 피험체는, 예를 들어 비정상적인 Th1 세포 수 또는 활성과 관련된 질환, 예를 들어 면역 질환(예, 본원에서 기술하는 Th1 관련 질환)을 앓고 있는 포유동물, 예를 들어 인간이다. Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 억제 또는 감소시키는 데 충분한 양은 상기 질환을 개선 또는 예방하는 데 충분한 양이다.
IL-21 효현제는 IL-21 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IL-21 폴리펩티드, 또는 이의 활성 단편(예, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열에 의해 코딩되는 인간 IL-21 폴리펩티드)일 수 있다. 다른 구체예에서, IL-21 효현제는 IL-21 폴리펩티드, 예를 들어 인간 IL-21 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 또는 다른 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 폴리펩티드 또는 이의 일부분(예, 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역)에 융합된 IL-21 폴리펩티드의 단편; IL-21 수용체에 대한 효현제 항체; 또는 저분자 효현제이다. 다른 구체예에서, IL-21 효현제는, 예를 들어 기능성 IL-21의 발현, 프로세싱 및/또는 분비를 증가시킴으로써 IL-21의 활성 또는 수준을 증가시키는 제제이다.
또 다른 구체예에서, Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 증가시키는 방법이 제공된다. 예를 들어, Th1 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화(예를 들어, T 세포 전구체, 예를 들어 Th 전구체(Thp)에서 Th1 세포로의 분화) 중 하나 이상을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이 방법은
(경우에 따라) 증식, 생존 및/또는 분화가 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포(예, Thp 또는 Th1 세포), 또는 세포 집단을 확인하는 단계; 및
상기 세포 또는 세포 집단을 Th1 세포로의 증식, 생존 및/또는 분화 중 하나를 증가시키기에(예를 들어, 상기 Thp 세포에서 Th1 세포로의 분화를 증가시키기에) 충분한 양의 IL-21 길항제와 접촉시킴으로써 Th1 세포 활성 및/또는 세포 수를 증가시키는 단계를 포함한다.
IL-21 길항제는, 예를 들어 IL-21(예, 인간 IL-21), 또는 IL-21 수용체(예, 인간 IL-21 수용체 폴리펩티드)에 대한 항체(예, 모노클로날 또는 단일 특이성 항체)일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 IL-21 또는 인간 IL-21 수용체 폴리펩티드에 대한 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 시험관내에서 생성된 항체이다. 다른 구체예에서, 길항제는 IL-21 폴리펩티드의 단편, 예를 들어 IL-21 폴리펩티드의 IL-21 수용체 결합 도메인을 포함한다. 대안으로, 길항제는 IL-21 수용체 폴리펩티드의 단편, 예를 들어 IL-21 수용체 폴리펩티드의 IL-21 결합 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 길항제는 제2 부분, 예를 들어 폴리펩티드(예, 면역글로불린 사슬)에 융합된 상기한 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포, 세포 집단, 또는 피험체에서 인터루킨-12(IL-12) 활성 또는 수준을 조절하는 방법, 예를 들어 감소 또는 억제 또는 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은
(경우에 따라) IL-21의 조절이 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포, 세포 집단 또는 피험체를 확인하는 단계; 및
상기 세포, 세포 집단, 또는 피험체에서 IL-12 활성 또는 수준을 조절하는 데 충분한 양의 IL-21 조절 인자, 예를 들어 IL-21의 효현제 또는 길항제를 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉시키거나 또는 상기 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, IL-12의 활성 또는 수준은 IL-12의 활성 또는 수준을 감소시키기에 충분한 양으로 IL-21 효현제, 예를 들어 본원에서 기술하는 IL-21 효현제를 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉시키거나 상기 피험체에 투여함으로써 감소시킨다.
다른 구체예에서, IL-21의 활성 또는 수준은 IL-12의 활성 또는 수준을 증가시키기에 충분한 양으로 IL-21 길항제, 예를 들어 본원에서 기술하는 IL-21 길항제를 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉시키거나 상기 피험체에 투여함으로써 증가시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포, 세포 집단 또는 피험체에서 Stat, 예를 들어 Stat 4 활성 또는 수준을 조절하는 방법, 예를 들어 감소 또는 억제하거나 또는 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은
(경우에 따라) Stat 활성 또는 수준의 조절이 요망되는 세포, 예를 들어 T 세포, 세포 집단 또는 피험체를 확인하는 단계; 및
상기 세포, 세포 집단, 또는 피험체에서 Stat 활성 또는 수준을 조절하기에 충분한 양의 IL-21 조절 인자, 예를 들어 IL-21의 효현제 또는 길항제를 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉시키거나 상기 피험체에 투여하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, Stat의 활성 또는 수준은 Stat, 예를 들어 Stat 단백질 또는 mRNA의 활성 또는 수준을 감소시키기에 충분한 양으로, IL-21 효현제, 예를 들어 본원에서 기술하는 IL-21 효현제를 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉시키거나 상기 피험체에 투여함으로써 감소시킨다.
다른 구체예에서, Stat의 활성 또는 수준은 Stat, 예를 들어 Stat 단백질 또는 mRNA의 활성 또는 수준을 증가시키기에 충분한 양으로, IL-21 길항제, 예를 들어 본원에서 기술하는 IL-21 길항제를 상기 세포 또는 세포 집단과 접촉시키거나 상기 피험체에 투여함으로써 증가시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험체에서 자가면역 반응(예, Th1 매개 자가면역 반응)을 감소, 억제, 저해, 개선 또는 지연시키는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 상기 피험체에서 상기 자가면역 반응을 감소, 억제, 저해, 개선, 또는 지연시키기에 충분한 양으로 IL-21 효현제, 예를 들어 본원에서 기술하는 IL-21 효현제를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피험체에서 Th2 관련 반응(예, 알러지 반응 또는 천식 반응)을 감소, 억제, 저해, 개선, 또는 지연시키는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 상기 피험체에서 상기 Th2 관련 반응을 감소, 억제, 저해, 개선 또는 지연시키는 데 충분한 양으로, IL-21 길항제, 예를 들어 본원에서 기술하는 IL-21 길항제를 이를 필요로 하는 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 집단, 예를 들어 Th 세포 집단 내의 Th2 세포를 선택적으로 확인하는 방법을 특징으로 하며, 이 방법은 테스트 샘플, 예를 들어 Th 세포 및 기준 샘플, 예를 들어 Th1 세포 내의 IL-21 핵산(예, IL-21 유전자 생성물) 또는 폴리펩티드의 수준을 측정하는 단계, 및 기준 샘플(예, Th1 세포) 내의 상기 IL-21 핵산의 수준에 대해 상기 테스트 샘플 내의 상기 IL-21 핵산의 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 상기 기준 샘플에 대한 상기 테스트 샘플 내의 상기 IL-21 핵산 수준의 증가는 테스트 샘플이 Th2 세포임을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "Th1 관련 질환"은 기준 물질(예, 정상 대조군)과 비교하여 비정상적인, 예를 들어 증가 또는 감소된 Th1 세포 활성(예를 들어, 증가 또는 감소된 Th1 세포 반응) 또는 수와 관련된 질환 또는 병태이다. Th1 관련 질환의 예로는 자가면역 질환(예를 들어, 특히 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병, 크론병, 건선 및 중증 근무력증)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "Th2 관련 질환"은 기준 물질(예, 정상 대조군)과 비교하여 비정상적인, 예를 들어 증가 또는 감소된 Th2 세포 활성(예, 증가 또는 감소된 Th2 세포 반응) 또는 수와 관련된 질환 또는 병태이다. Th2 질환의 예로는 천식, 알러지 및 항체 성분과 관련된 질환(예, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 루푸스)을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 사용되는 IL-21 폴리펩티드는, 예를 들어 포유동물 IL-21 폴리펩티드의 아미노산 서열(예컨대 설치류, 인간, 또는 인간을 제외한 영장류)을 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-21 폴리펩티드는 인간 IL-21 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 적합한 아미노산 서열은 서열 번호 2(하기)에 제시된 IL-21 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 비롯하여 IL-21 및 IL-21 수용체 폴리펩티드는, 예를 들어 미국 특허 제6,057,128호, Parrish-Novak 등의 문헌[Nature 408: 57-63, 2000]; Vosshenrich 등의 문헌[Curr. Biol. 11:R157-77, 2001], Asao 등의 문헌[J. Immunol. 167:1-5, 2001]; 및 Ozaki 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11439-44, 2000]에 기술된 바 있다. IL-21의 아미노산 서열은 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 IL-21의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 진뱅크 등록 번호 X_011082에서 입수 가능하다. 상기 등록 번호의 인간 IL-21 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.
개시된 인간 IL-21 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 다음과 같다.
인간 IL-21 수용체 핵산의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.
개시된 IL-21 수용체 핵산 서열은 하기 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
핵산 서열 상동성은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 동일성 정도로서 결정할 수 있다. 상동성은 당분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 GCG 프로그램 패키지에 제공된 GAP 소프트웨어를 이용하여 결정할 수 있다(참조: Needleman 및 Wunsch 1970 J Mol Biol 48: 443-453). 핵산 서열 비교를 위한 다음과 같은 설정: GAP 생성 패널티 5.0 및 GAP 연장 페널티 0.3을 갖는 GCG GAP 소프트웨어를 이용하면, 상기에 언급된 유사한 핵산 서열의 코딩 영역은 바람직하게는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 DNA 서열의 CDS(코딩) 부분과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성 정도를 나타낸다. 마찬가지로, 본원에서 언급하는 아미노산 서열은 서열 번호 4, 서열 번호 5 또는 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성 정도를 나타낸다.
"서열 동일성"이란 용어는 두 개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 서열이 특정 비교 영역에 대하여 잔기 대 잔기 기준으로 동일한 정도를 의미한다. "서열 동일성의 백분율"은 비교 영역에 대하여 최적으로 정렬된 두 개의 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예, 핵산의 경우 A, T, C, G, U, 또는 I)가 두 서열에서 발생하여 일치된 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교 영역의 총 위치 수(예, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산한다. 본원에서 사용되는 "실질적인 동일성"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 나타내며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 비교 영역에 대하여 기준 서열과 비교하여 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 종종 90∼95%, 보다 일반적으로는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. "양의 값 잔기의 백분율"이란 용어는 비교 영역에 대하여 최적으로 정렬된 두 개의 서열을 비교하고, 상기에 정의된 바와 같은 동일한 보존적 아미노산 치환이 두 서열에 발생하여 일치된 위치의 수를 산출하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교 영역 내의 총 위치 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 양의 값 잔기의 백분율을 산출함으로써 계산한다.
세포 또는 세포 집단 내의 IL-21 또는 IL-21 수용체 수준을 증가시키는 제제는 IL-21 효현제 또는 IL-21 수용체 효현제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 효현제는 T 헬퍼 세포 집단에 IL-21이 나타내는 활성 중 하나 이상을 나타내는 테스트 화합물을 확인함으로써 동정할 수 있다.
피험체는 포유동물, 예를 들어 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 또는 설치류(래트 또는 마우스 포함)일 수 있다. IL-21의 임의의 바람직한 투여 경로가 이용될 수 있다. 적합한 경로는 정맥내(거환 및 주입 둘 다), 복강내, 피하 또는 근육내 투여 형태를 포함하며, 모두 제약 업계의 일반적인 기술자에게 공지된 형태를 이용한다. 주사제는 통상적인 형태, 예를 들어 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다.
비경구 주사제 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 주입에 사용된다.
IL-21 길항제
IL-21 매개 T 헬퍼 세포 효과를 억제하기 위해, IL-21 수용체에 대한 IL-21의 상호작용을 차단하거나 다른 방식으로 억제하는 제제가 T 세포, 또는 T 세포의 집단, 예를 들어 T 헬퍼 세포에 첨가될 수 있다. 편의상, 이들 억제제는 본원에서 "IL-21 길항제"라 칭한다. IL-21 길항제의 예로는 IL-21 또는 IL-21 수용체의 가용성 단편, 이들 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이들 단편에 대한 항체를 포함한다. IL-21 길항제는 항체 매개 질환을 비롯하여 Th2 매개 질환에서 IL-21을 차단하는 데 유용하다. 이러한 질환으로는 천식, 알러지, 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 루푸스를 포함한다.
IL-21 및 IL-21 수용체 융합 단백질
IL-21, 또는 IL-21 수용체, 또는 이들 단백질의 활성 단편은 본원에서 기술하는 방법에 사용하기 위해 면역글로불린과 같은 캐리어 분자에 융합시킬 수 있다. 예를 들어, IL-21 수용체의 가용성 형태는 면역글로불린의 Fc 부분에 "링커" 서열을 통해 또는 면역글로불린의 Fc 부분에 바로 융합시킬 수 있다. 다른 융합 단백질, 예컨대 GST(즉, 글루타티온 S-트랜스퍼라제), LexA 또는 MBP(즉, 말토스 결합 단백질)를 갖는 융합 단백질 역시 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, IL-21 또는 IL-21 수용체 융합 단백질은 하나 이상의 추가 부분에 결합될 수 있다. 예를 들어 IL-21 또는 IL-21 수용체 융합 단백질은 IL-21 수용체 융합 단백질 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합되는 GST 융합 단백질에 추가로 결합될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 IL-21 또는 IL-21 수용체 융합 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 융합 단백질은 그 N-말단에 이종성 시그널 서열(즉, IL-21 또는 IL-21 수용체 핵산에 의해 자연적으로 코딩되는 폴리펩티드 내에 존재하지 않는 폴리펩티드 서열)을 포함한다. 예를 들어, 천연 IL-21 또는 IL-21 수용체 시그널 서열은 제거될 수 있고 다른 단백질로부터의 시그널 서열로 치환될 수 있다.
본 발명의 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은 통상적인 기법에 따라, 예를 들어 결찰을 위해 평활 말단 또는 스태거 말단을 이용하고, 적절한 말단을 제공하기 위해 제한 효소 분해를 이용하고, 적절하게 응집성 말단을 채우고, 알칼리 포스파타제로 처리하여 바람직하지 않은 결합을 피하고, 효소로 결찰시킴으로써 프레임내에 서로 결찰시킨다. 또 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기법에 의해 합성할 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은, 나중에 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 두 개의 연속 유전자 단편 사이에 상보성 돌출부를 만드는 앵커 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다(참고 문헌: Ausubel 등 (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). 뿐만 아니라, 융합 부분(예, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역)을 코딩하는 다수의 발현 벡터는 시판된다. IL-21 또는 IL-21 수용체 코딩 핵산은 융합 부분이 면역글로불린 단백질로 프레임내에 결합되도록 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
몇몇 구체예에서, IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드 부분은 자연 발생 IL-21 또는 IL-21 수용체 서열(야생형) 내에 (비돌연변이 서열에 비하여) 더 높은 친화력의 IL-21 수용체에 대한 변경된 IL-21의 결합을 유도하거나 또는 (비돌연변이 서열에 비하여) 더 높은 친화력의 IL-21에 대한 변경된 IL-21 수용체 폴리펩티드의 결합을 유도하는 돌연변이를 갖는 변형 IL-21 수용체 폴리펩티드로서 제공된다.
몇몇 구체예에서, IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드 부분은 자연 발생 IL-21 또는 IL-21 수용체 서열(야생형) 내에 (비돌연변이 서열에 비하여) 단백질 분해에 대하여 내성이 더 큰 IL-21 또는 IL-21 수용체 서열을 유도하는 돌연변이를 갖는 변형 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드로서 제공된다.
융합 단백질 내에 포함될 수 있는 시그널 펩티드는 MPLLLLLLLLPSPLHP(서열 번호 5)이다. 경우에 따라, 하나 이상의 아미노산은 IL-21 또는 IL-21 수용체 부분을 포함하는 제1 폴리펩티드 부분 및 제2 폴리펩티드 부분 사이에 추가적으로 삽입될 수 있다.
제2 폴리펩티드는 바람직하게는 가용성이다. 몇몇 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 결합된 폴리펩티드의 반감기(예, 혈청 반감기)를 증가시킨다. 몇몇 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 제2 IL-21 수용체 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드의 회합을 촉진하는 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 면역글로불린 폴리펩티드의 적어도 한 영역을 포함한다. 면역글로불린 융합 폴리펩티드는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,516,964호; 제5,225,538호; 제5,428,130호; 제5,514,582호; 제5,714,147호; 및 제5,455,165호에 기술되어 있다.
몇몇 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 전길이 면역글로불린 폴리펩티드를 포함한다. 대안으로, 제2 폴리펩티드는 전길이보다 짧은 면역글로불린 폴리펩티드, 예를 들어 중쇄, 경쇄, Fab, Fab2, Fv, 또는 Fc를 포함한다. 바람직하게는, 제2 폴리펩티드는 면역글로불린 폴리펩티드의 중쇄를 포함한다. 보다 바람직하게는, 제2 폴리펩티드는 면역글로불린 폴리펩티드의 Fc 영역을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 야생형 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 작동체 기능보다 약한 작동체 기능을 갖는다. Fc 작동체 기능은, 예를 들어 Fc 수용체 결합, 보체 고정 및 T 세포 제거 활성을 포함한다(참조: 미국 특허 제6,136,310호). T 세포 제거 활성, Fc 작동체 기능 및 항체 안정성을 분석하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 한 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 Fc 수용체에 대한 친화력이 낮거나 없다. 또 다른 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 보체 단백질 C1q에 대한 친화력이 낮거나 없다.
바람직한 제2 폴리펩티드 서열은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 이 서열은 Fc 영역을 포함한다. 밑줄 친 아미노산은 야생셩 면역글로불린 서열의 해당 위치에서 발견되는 아미노산 서열과는 상이한 것이다.
IL-21 및 IL-21 수용체 항체
본원에서 사용되는 "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자의 면역학적 활성 단편, 즉, 항원과 특이적으로 결합하는(면역 반응하는) 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 의미한다. 이러한 항체들은, 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함한다. 일반적으로, 인간으로부터 얻은 항체 분자는 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 부류 중 하나와 관련이 있는데, 이들은 분자 내에 존재하는 중쇄의 성질에 의해 서로 구별된다. 특정 부류는 또한 하위 부류, 예컨대 IgG1, IgG2 등을 갖는다. 또한, 인간의 경우, 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다. 본원에서 사용되는 항체란 인간 항체 종의 그러한 모든 부류, 하위 부류 및 유형을 포함한다. IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드 또는 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드의 단편을 포함하는 융합 단백질에 대한 항체를 포함한다.
IL-21 폴리펩티드 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드는 항원, 또는 이의 일부분 또는 단편으로서 사용될 수 있으며, 추가적으로 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제조를 위한 표준 기법을 이용하여 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 면역원으로서 사용하기 위한 항원의 항원성 펩티드 단편은, 예를 들어 아미노 말단 영역의 아미노산 서열의 적어도 7개 아미노산 잔기, 예컨대 서열 번호 1 또는 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 이는 그 펩티드에 대하여 생성된 항체가 전길이 단백질 또는 에피토프를 함유하는 임의의 단편과 특이적 면역 복합체를 형성하도록 하는 그의 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 항원성 펩티드는 적어도 10개의 아미노산 잔기, 또는 적어도 15개의 아미노산 잔기, 또는 적어도 20개의 아미노산 잔기, 또는 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 항원성 펩티드에 의해 포함되는 바람직한 에피토프는 그 표면 상에 위치하는 단백질의 영역이며, 이들은 일반적으로 친수성 영역이다.
몇몇 구체예에서, 항원성 펩티드에 의해 포함되는 적어도 하나의 에피토프는 단백질의 표면 상에 위치하는 IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드의 영역, 예를 들어 친수성 영역이다. IL-21 또는 IL-21 수용체 폴리펩티드의 소수성 분석은, IL-21 또는 IL-21 수용체 단백질의 영역이 친수성이 현저하며, 따라서 항체 생성을 목표로 하는 데 유용한 표면 잔기를 코딩할 가능성이 있음을 나타낸다. 항체 생성을 위한 수단으로서, 친수성 및 소수성의 영역을 보여주는 하이드로퍼시(hydropathy) 플롯은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성할 수 있으며, 예를 들어 푸리에 변환을 사용하거나 사용하지 않고, 예를 들어 Kyte Doolittle 또는 Hopp Woods 방법에 의해 생성할 수 있다(참조: Hopp and Woods(1981) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157: 105-142). 항원성 단백질, 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체 내의 하나 이상의 도메인에 특이적인 항체 역시 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 단백질, 이의 유도체, 단편, 유사체, 상동체, 또는 동족체는 이들 단백질 성분들에 면역 특이적으로 결합하는 항체의 생성에 면역원으로서 사용될 수 있다.
당분야에 공지된 다양한 절차들이 본 발명의 단백질, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체, 상동체 또는 동족체에 대해 유도된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 생산에 사용될 수 있다(참고 문헌: ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Harlow and Lane(1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 상기한 항체들 중 일부에 대해서는 후술한다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 생산을 위해서는, 다양한 적합한 숙주 동물(예, 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유동물)을 천연 단백질, 이의 합성 변이체, 또는 상기한 것들의 유도체를 1회 이상 주사하여 면역화할 수 있다. 적절한 면역원성 제제는, 예를 들어 자연 발생 면역원성 단백질, 면역원성 단백질을 나타내는 화학적으로 합성된 폴리펩티드, 또는 재조합에 의해 발현되는 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 게다가, 단백질은 면역화된 포유동물에서 면역원성인 것으로 알려져 있는 제2의 단백질에 접합될 수 있다. 그러한 면역원성 단백질의 비제한적인 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 싸이로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함한다.
제제는 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 면역 반응을 증가시키는 데 사용되는 다양한 보조제로는 프로인트(완전 및 불완전) 보조제, 미네랄 겔(예, 수산화알루미늄), 계면 활성 물질(예, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중 음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 디니트로페놀 등), 인간에 사용 가능한 보조제, 예컨대 바실 칼메트-구에린(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리엄 파르범(Corynebacterium parvum), 또는 유사한 면역자극성 제제를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 보조제의 또 다른 예로는 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다.
면역원성 단백질에 대하여 유도된 폴리클로날 항체 분자는 포유동물로부터(예를 들면 혈액으로부터) 분리할 수 있으며, 당분야에 공지된 기법, 예컨대 주로 면역 혈청의 IgG 분획을 제공하는, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 추가 정제할 수 있다. 그 후, 또는 대안으로, 얻고자 하는 면역글로불린의 표적인 특이적 항원 또는 이의 에피토프는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제하기 위한 컬럼에 고정시킬 수 있다. 면역글로불린의 정제에 대해서는, 예를 들어 Wilkinson의 문헌[Wilkinson(2000) The Scientist, 14:25-28]에 기술되어 있다.
모노클로날 항체
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"(MAb) 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특유의 경쇄 유전자 생성물 또는 특유의 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 항체 분자의 단 하나의 분자 종을 포함하는 항체 분자의 집단을 의미한다. 특히, 모노클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR)은 그 집단 내의 모든 분자에 있어 동일하다. 따라서 MAb는 그에 대한 특유의 결합 친화력을 특징으로 하는 항원의 특정한 에피토프와 면역 반응할 수 있는 항원 결합 부위를 포함한다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해, 예를 들어 Kohler 및 Milstein(1975)의 문헌[Nature, 256:495]에 기술된 방법에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 마우스, 햄스터, 또는 기타 적절한 숙주 동물은 통상적으로 면역화제에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 림프구를 유도하는 면역화제에 의해 면역화한다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화할 수 있다.
면역화제는 전형적으로 단백질 항원, 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 필요하다면 말초 혈액 림프구를, 인간을 제외한 포유동물 공급원이 필요하다면 비장 세포 또는 림프절 세포를 사용한다. 그 후 림프구를, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 불멸화된 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(참고 문헌: Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된 세포주는 일반적으로 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포로 형질전환시킨다. 통상 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합의 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 어버이 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 통상적으로 HGPRT 결핍 세포의 성장을 저해하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 함유할 것이다.
바람직한 불멸화된 세포주는 선택된 항체 생산 세포와 효과적으로 융합하여 이에 의한 항체의 안정하고 높은 발현 수준을 유지하고, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 세포주이다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 마우스 골수종 세포주인데, 이는 예를 들어, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 솔크 연구소 세포 분배 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 미국 버지니아주 매너사스 소재의 미국 모식균 배양 수집소로부터 입수할 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이형골수종 세포주 역시 인간 모노클로날 항체의 생산에 대하여 기술된 바 있다(Kozbor(1984) J. Immunol., 133:3001; Brodeur 등, MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc., New York,(1987) pp. 51-63).
그 후 하이브리도마 세포를 배양할 수 있는 배양 배지는 항원에 대하여 유도된 모노클로날 항체의 존재에 대하여 분석될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사능 면역 분석(RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정한다. 이러한 기법 및 분석은 당분야에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화력은, 예를 들어 Munson 및 Pollard(1980)의 스캐챠드(Scatchard) 분석[Anal. Biochem., 107:220]에 의해 결정할 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원에 대하여 고도의 특이성을 갖고 높은 결합 친화력을 갖는 항체가 분리된다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 그 클론을 제한 희석 절차에 의해 서브 클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킨다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브 클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수로부터 분리 또는 정제할 수 있다.
또한 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법에 의해, 예를 들어 미국 특허 4,816,567호에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 분리가 용이하며, 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 서열을 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 사용된다. 일단 분리되면 그 DNA는 발현 벡터에 삽입하고, 그 후 이를, 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염시켜서 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. DNA는 또한, 예를 들어 인간 중쇄 및 경쇄 불면 도메인의 코딩 서열을 상동성 마우스 서열 대신에 치환시키거나(미국 특허 제4,816,567호; Morrison(1994) Nature 368, 812-13) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시켜 변형시킬 수 있다. 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 도메인 대신에 치환될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신에 치환되어 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.
인간화된 항체
본 발명의 단백질 항원에 대해 유도된 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 항체들은 투여된 면역글로불린에 대하여 인간에 의한 면역 반응을 유발하지 않고 인간에게 투여하기에 적합하다. 항체의 인간화된 형태는 기본적으로 인간 면역글로불린의 서열로 이루어지고, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열은 최소한 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 기타 항원 결합 부분 서열)이다. 인간화는 Winter 및 그 동료의 방법[Jones 등 (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann 등 (1988) Nature, 332:323-327; Verhoeyen 등 (1988) Science, 239:1534-1536]에 따라, 인간 항체의 해당 서열을 설치류 CDR들 또는 CDR 서열로 치환함으로써 수행할 수 있다(참조: 미국 특허 제5,225,539호). 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 기본구조(framework) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용자 항체에서도 발견되지 않고 이입된 CDR 또는 기본구조 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 통상적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함하며, 이때 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 기본구조 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함한다(Jones 등, 1986; Riechmann 등, 1988; 및 Presta(1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596).
인간 항체
완전 인간 항체는 본질적으로 CDR을 포함하여 경쇄 및 중쇄 둘 다의 전체 서열이 인간 유전자로부터 유래된 항체 분자를 의미한다. 그러한 항체들을 본원에서는 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"라 칭한다. 인간 모노클로날 항체는 트리오마 기법에 의해; 예를 들어, 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 인간 B 세포 하이브리도마 기법; 인간 B 세포 하이브리도마 기법(참조: Kozbor 등 (1983) Immunol Today 4: 72) 및 EBV 하이브리도마 기법에 의해 제조할 수 있다(참조: Cole 등, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). 인간 모노클로날 항체는 본 발명의 실시에 이용될 수 있으며, 인간 하이브리도마를 이용하거나(참조: Cote 등 (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) 또는 인간 B 세포를 엡슈타인 바 바이러스로 시험관내에서 형질전환시켜(참조: Cole 등 (1985) In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 제조할 수 있다.
뿐만 아니라, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯하여 추가적인 기법을 이용하여 제조할 수도 있다(참조: Hoogenboom 및 Winter(1991) J. Mol. Biol., 227:381; Marks 등 (1991) J. Mol. Biol., 222:581). 마찬가지로, 인간 항체는 인간 면역글로불린 좌를 내생 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 형질전환 동물, 예를 들어 마우스에 도입하여 제조할 수 있다. 도입 후 인간 항체 생산이 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 비롯하여 모든 양상에 있어 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 Marks 등의 문헌[Bio/Technology 10, 779-783 (1992)]; Lonberg 등의 문헌[Nature 368:856-859(1994)]; Morrison의 문헌[Nature 368, 812-13(1994)]; Fishwild 등의 문헌[Nature Biotechnology 14, 845-51(1996)]; Neuberger의 문헌[Nature Biotechnology 14, 826(1996)]; 및 Lonberg 및 Huszar의 문헌[Intern. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)]에 기술되어 있다.
인간 항체는 또한 항원 투여에 반응하여 동물의 내생 항체가 아니라 완전한 인간 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 비-인간 동물을 사용하여 제조될 수 있다(참조: PCT 공보 W0 94/02602). 비-인간 숙주에서 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 내생 유전자는 무력화되고, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 활성 좌가 숙주 게놈에 삽입된다. 인간 유전자는, 예를 들어 필수 인간 DNA 분절을 포함하는 효모 인공 염색체를 사용하여 통합시킨다. 그 후 변형을 완전히 포함하고 있지는 않은 중간 형질전환 동물을 이종 교배하여 원하는 변형을 모두 나타내는 동물을 그 자손으로서 얻는다. 그러한 비-인간 동물의 바람직한 예는 마우스이며, 이는 PCT 공보 WO 96/33735 및 WO 96/34096에 개시된 바와 같이 Xenomouse(상표명)라 칭한다. 이 동물은 완전한 인간 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생산한다. 항체는 소정의 면역원으로 면역화한 후 그 동물로부터, 예를 들어 폴리클로날 항체 제제로서 직접 얻을 수 있거나, 또는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마와 같은, 그 동물로부터 유래된 불멸화된 B 세포로부터 얻을 수 있다. 추가적으로, 인간 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 회수하고 발현시켜 항체를 직접 얻을 수 있거나, 또는 이를 추가로 변형시켜, 예를 들어 단일쇄 Fv 분자와 같은 항체의 유사체를 얻을 수 있다.
내생 면역글로불린 중쇄의 발현이 결여된 비-인간 숙주, 대표적인 예로 마우스를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 제5,939,598호에 개시되어 있다. 이것은 좌의 재배열을 방지하고 재배열된 면역글로불린 중쇄 좌의 전사체의 형성을 방지하기 위하여 배아 줄기 세포 내의 하나 이상의 내생 중쇄 좌로부터 J 분절 유전자를 결실시키는 단계로서, 이때 결실은 선별 마커를 코딩하는 유전자를 포함하는 표적화 벡터에 의해 이루어지는 것인 단계; 및 배아 줄기 세포로부터 체세포 및 생식 세포가 선별 마커를 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환 마우스를 생산하는 단계 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다.
인간 항체와 같은 소정의 항체의 제조 방법은 미국 특허 제5,916,771호에 개시되어 있다. 이 방법은 배양되는 한 포유동물 숙주 세포로 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 도입하는 단계, 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 또 다른 포유동물 숙주 세포로 도입하는 단계 및 상기 두 세포를 융합하여 하이브리드 세포를 형성하는 단계를 포함한다. 하이브리드 세포는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 발현한다.
이 절차의 추가로 개량된 절차로서, 면역원 상의 임상적으로 관련이 있는 에피토프를 확인하는 방법 및 고친화력으로 관련 에피토프에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 선별하는 상호 관계가 있는 방법이 PCT 공보 WO 99/53049에 개시되어 있다.
Fab 단편 및 단일쇄 항체
본 발명에 따르면, 본 발명의 항원성 단백질에 특이적인 단일쇄 항체를 생산하기 위한 기법에 적용될 수 있다(참조: 미국 특허 제4,946,778호). 이에 더하여, 단백질 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대한 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효율적으로 동정하기 위하여 Fab 발현 라이브러리(참조: Huse 등 (1989) Science 246:1275-1281)를 작제하기 위한 방법이 적용될 수 있다. 단백질 항원에 대한 이디오타입을 포함하는 항체 단편은 당분야에 공지된 기법에 의해 제조할 수 있으며, 그 비제한적인 예로는 (i) 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성된 F(ab')2 단편; (ii) F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원시켜 생성된 Fab 단편; (iii) 파파인 및 환원제로 항체 분자를 처리하여 생성된 Fab 단편 및 (iv) Fv 단편을 포함한다.
이중 특이적 항체
이중 특이적 항체는 2 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 본 발명의 경우, 결합 특이성 중 하나는 본 발명의 항원성 단백질에 대한 것이다. 제2 결합 표적은 임의의 다른 항원이며, 유리하게는 세포 표면 단백질 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다.
이중 특이적 항체의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중 특이적 항체의 재조합적 생산은 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시 발현에 기초하는데, 이때 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다(Milstein 및 Cuello(1983) Nature, 305:537-539). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류로 인하여 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 10 가지의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하는데, 이중에서 단 하나만 정확한 이중 특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행된다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 Traunecker 등(1991)의 문헌[EMBO J., 10:3655-3659]에 개시되어 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합을 코딩하는 DNA 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄는 개별 발현 벡터에 삽입시켜 적절한 숙주 유기체에 동시 형질감염시킨다. 이중 특이적 항체에 대한 추가적인 세부 사항에 대해서는, 예를 들어 Suresh 등 (1986)의 문헌[Methods in Enzymology, 121:210]을 참조할 수 있다.
WO 96/27011에 기재된 또 다른 방법에 의하면, 항체 분자쌍 간의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이형이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 이 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환하면 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)에 대하여 동일한 또는 유사한 크기의 보충적인 "공동"이 형성된다. 이는 동형이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 산물에 비하여 이형이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중 특이적 항체는 전길이 항체 또는 항체 단편(예, F(ab')2 이중 특이적 항체)으로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중 특이적 항체를 생성하는 기법은 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 화학 결합을 이용하여 제조할 수 있다. Brennan 등 (1985)의 문헌[Science 229:81]은 완전한 항체를 단백질 분해에 의해 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차를 기술한다. 이러한 단편들은 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 이황화 결합 형성을 막기 위한 디티올 복합체화 아비산나트륨 존재 하에 환원시킨다. 그 후 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캡토에틸아민을 사용하여 환원시켜 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중 특이적 항체를 형성한다. 제조된 이중 특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
추가적으로, Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수하여 화학적으로 커플링시켜 이중 특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby 등 (1992)의 문헌[J. Exp. Med. 175:217-225]은 완전히 인간화된 이중 특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산에 대해 기술한다. 각 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분리하고, 시험관내에서 유도 화학적 커플링에 적용하여 이중 특이적 항체를 형성한다. 그렇게 형성된 이중 특이적 항체는 ErbB2 수용체 및 정상 인간 T 세포를 과발현하는 세포에 결합할 수 있을 뿐 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발시킬 수 있었다.
재조합 세포 배양물로부터 이중 특이적 항체 단편을 직접 제조 및 분리하는 다양한 기법들 역시 공지되어 있다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 루신 지퍼를 이용하여 제조된 바 있다(Kostelny 등 (1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553). Fos 및 Jun 단백질로부터의 루신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 두 개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 결합시켰다. 항체 동형이량체는 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성하고, 그 후 재산화시켜 항체 이형이량체를 형성하였다. 이 방법은 항체 동형이량체의 생산에도 이용될 수 있다. Hollinger 등(1993)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]에 의해 소개된 "다이아바디(diabody)" 기법은 이중 특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공하였다. 이 단편들은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 제공하였으며, 상기 링커는 너무 짧으면 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 접합이 발생하게 된다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 됨으로써 두 개의 항원 결합 부위가 형성된다. 단일쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중 특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 방법 역시 보고된 바 있다(참조: Gruber 등 (1994) J. Immunol. 152:5368).
2 이상의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다(참조: Tutt 등 (1991) J. Immunol. 147:60).
대표적인 이중 특이적 항체는 두 개의 서로 다른 에피토프에 결합할 수 있는데, 그 중 적어도 하나는 본 발명의 단백질 항원에서 유래된 것이다. 대안으로, 면역글로불린 분자의 항-항원성 팔은 T 세포 수용체 분자(예, CD2, CD3, CD28, 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(Fc R), 예컨대 Fc RI(CD64), Fc RII(CD32) 및 Fc RIII(CD16)와 같은 백혈구 상의 촉발 분자에 결합하는 팔과 결합되어서, 세포 방어 메카니즘을 특정 항원을 발현하는 세포로 집중시킬 수 있다. 이중 특이적 항체는 또한 특정 항원을 발현하는 세포로 세포독성제를 유도하는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체들은 항원 결합 팔과, 세포독성제 또는 방사성 핵종 킬레이트제, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA, 또는 TETA에 결합하는 팔을 보유한다. 또 다른 소정의 이중 특이적 항체는 본원에 기술된 단백질 항원에 결합하며, 추가로 조직 인자(TF)에도 결합한다.
약학 조성물
본원에 기재된 IL-21 조절 인자는 약학 조성물에 편리하게 사용될 수 있다. 이 조성물은 바람직하게는 내복약으로 사용하기에 적합하며, 본 발명의 약학적 활성 화합물 유효량을 단독으로 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함한다. 이 화합물은 독성이 있다고 해도 매우 낮다는 점에서 특히 유용하다.
실제로, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 원하는 변화, 즉 IL-21 수준의 증가 또는 감소를 유발하기에 충분한 양으로 투여되며, 그러한 목적에 가장 적합한 약학적 형태로 사용된다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예, 젤라틴 캡슐)의 형태로 경구 투여하기 위해서는, 활성 약물 성분을 경구의 비독성의 약학적으로 허용되는 불활성 담체, 예컨대 에탄올, 글리세롤, 물 등과 함께 혼합할 수 있다. 뿐만 아니라, 경우에 따라, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제 역시 이 혼합물에 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당, 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 고무, 예컨대 아카시아고무, 트래거캔스 또는 나트륨 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이러한 제형에 사용되는 윤활제는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈크, 스테아르산, 이의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제로는 비제한적으로 전분, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토나이트, 크산탄 고무 전분, 아가, 알긴산 또는 이의 나트륨 염, 또는 비등성 혼합물 등을 들 수 있다. 희석제, 예를 들어 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리세린을 포함한다.
주사 가능한 조성물은 바람직하게는 수성 등장성 용액 또는 현탁액이고, 좌제는 지방 에멀션 또는 현탁액으로부터 용이하게 제조된다. 이 조성물은 멸균될 수 있고/있거나 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 조촉매, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 기타의 치료적으로 유효한 물질들을 함유할 수 있다. 이 조성물은 각각 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제조되며, 약 0.1∼75 중량%, 바람직하게는 약 1∼50 중량%의 활성 성분을 함유한다.
본 발명의 화합물은 또한 지효성 및 지속 방출형 정제 또는 캡슐, 환약, 분말, 과립, 엘릭서, 팅크제, 현탁제, 시럽 및 에멀션과 같은 경구 제형으로 투여될 수 있다.
액체, 특히 주사 가능한 조성물은, 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 활성 화합물을 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해시키거나 이와 혼합하여 주사 가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 추가적으로, 주사 하기 전에 액체에 용해시키기에 적합한 고체 형태를 제형화할 수 있다. 주사 가능한 조성물은 바람직하게는 등장성의 수용액 또는 수성 현탁액이다. 이 조성물은 멸균하고/하거나, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 조촉매, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 이 조성물은 치료적으로 유효한 기타 물질들을 함유할 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥내(거환 및 주입 둘 다), 복강내, 피하 또는 근육내 형태로 투여될 수 있으며, 이는 모두 제약 업계의 일반적인 기술자에게 공지된 형태를 이용한다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다.
비경구 주사 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 주입에 사용된다. 추가적으로, 비경구 투여에 적합한 한 가지 방법은 서방형 또는 지속 방출형 시스템의 이식을 이용하는 것인데, 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제3,710,795호에 따르면, 이 방법에 의해 일정한 투여량 수준의 유지가 보장된다.
또한, 본 발명의 바람직한 화합물은 적합한 비내 비이클의 국소 사용에 의해, 또는 경피 경로에 의해, 당분야에 공지된 경피 피부 패치의 그러한 형태를 사용하여 비내 형태로 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템의 형태로 투여하기 위해서는 투약은 당연히 투약 계획 전반에 걸쳐 간헐적이 아니라 연속적으로 이루어질 것이다. 다른 바람직한 국소 제제는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 젤을 포함하며, 이때 활성 성분의 농도는 0.1∼15%(w/w 또는 w/v) 범위이다.
고체 조성물의 경우, 부형제는 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 상기에 정의된 활성 화합물은 또한, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜(예, 프로필렌 글리콜)을 담체로서 사용하여 좌제로서 제형화할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 좌제는 지방 에멀션 또는 현탁액으로부터 제조되는 것이 유리하다.
또한 본 발명의 화합물은 리포솜 전달 시스템, 예컨대 소형 단층 소낭, 대형 단층 소낭 및 다층 소낭의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 지질 성분의 막은 미국 특허 제5,262,564호에 기재된 바와 같이 약물의 수용액으로 수화시켜 약물을 캡슐화하는 지질층을 형성한다.
본 발명의 화합물은 화합물 분자가 커플링되는 개별 캐리어로서 모노클로날 항체를 사용함으로써 전달할 수도 있다. 본 발명의 화합물은 또한 표적이 될 수 있는 약물 캐리어로서 가용성 중합체와 커플링될 수 있다. 그러한 중합체로는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록실프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파나마이드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 약물의 제어 방출을 위해 유용한 생분해성 중합체 부류, 예를 들어 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르쏘에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로젤의 가교된 또는 친양매성 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 벡터에 삽입시켜 유전자 치료 벡터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 벡터는, 예를 들어 정맥 주사, 국소 투여(예를 들어 미국 특허 제 5,328,470호 참조) 또는 정위 주사(예를 들어 Chen 등, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057 참조)에 의해 피험체에 전달될 수 있다. 유전자 치료 벡터의 약학 제제는 허용되는 희석제 내의 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비이클이 매립된 서방형 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포로부터 무결한 상태로 생성될 수 있는 경우(예를 들어, 레트로바이러스 벡터), 약학 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
필요에 따라, 투여되어질 약학 조성물은 또한 소량의 비독성 보조 성분, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및 기타 물질들, 예를 들어 아세트산나트륨, 트리에탄올아민 올레이트 등을 함유할 수 있다.
화합물을 이용하는 투약 계획은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료할 증상의 심각성; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 이용되는 특정 화합물 또는 이의 염을 비롯하여 다양한 요인들에 따라 선택된다. 전문적인 의사 또는 수의사라면 증상의 진행을 예방하거나 역행시키거나 저지하는 데 필요한 약물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 경구 제형은 표시된 효과를 위해 사용될 경우 그 범위가 경구 투여시 약 0.05∼1,000 mg/일이다. 이 조성물은 바람직하게는 0.5 mg, 1.0 mg, 2.5 mg, 5.0 mg, 10.0 mg, 15.0 mg, 25.0 mg, 50.0 mg, 100.0 mg, 250.0 mg, 500.0 mg 및 1000.0 mg의 활성 성분을 함유하는 분할선이 있는 정제의 형태로 제공된다. 본 발명의 화합물의 유효한 혈장 농도는 1일에 체중 1 kg당 0.002∼50 mg이다.
본 발명의 화합물은 1일 1회 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 1일 투여량을 1일 2회, 3회 또는 4회로 분할하여 투여될 수 있다.
상기한 임의의 약학 조성물은 0.1∼99%, 바람직하게는 1∼70%의 IL-21, IL-21 수용체, IL-21 효현제 또는 IL-21 길항제를 함유할 수 있다.
경우에 따라, 약학 조성물은 보조제와 함께 제공될 수 있다. 보조제는 전술한 바와 같다. 몇몇 구체예에서, 보조제는 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시키기 위하여 사용될 수 있으며, 프로인트(완전 및 불완전), 미네랄 젤, 예컨대 수산화알루미늄, 계면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중 음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG(바실 칼메트-구에린) 및 코리네박테리엄 파르범과 같은 인간에 사용할 수 있는 보조제를 포함한다. 일반적으로, 동물에게 연속적인 몇 회의 주사를 이용하여 항원을 주사하는데, 바람직하게는 적어도 3회의 추가 접종을 이용하는 것을 포함한다.
하기의 비제한적인 실시예에서 본 발명을 추가로 예시한다. 실시예 1∼8은 하기 재료 및 방법을 이용하여 수행하였다.
마우스
달리 나타내지 않는다면, 6∼8 주령의 C57BL/6 마우스를 모든 실험에 사용하였다. C57BL/6 결핍 배경의 Stat 결핍 마우스는 Kaplan, M.H. 등의 문헌[Immunity 4:313-9, 1996]에 기재된 바와 같이 생성하였다.
림프구 준비 및 배양
림프구는 Kaplan, M.H. 등의 문헌[Immunity 4:313-9, 1996]에 기술된 바와 같이 보강된 RPMI 1640에서 배양하였다. 나이브(naive) Thp 세포를 항-CD4 및 항-CD26L(파민젠; BD 라이프 사이언시즈, 샌 디에고, 캘리포니아)을 사용하여 세포 분류에 의해 림프절 및 비장으로부터 순도 95∼98%가 되도록 정제하였다.
항체 및 사이토카인
T-bet 특이적 항혈청은 Szabo, S.J. 등의 문헌[Cell 100:655-69, 2000]에 기재된 바와 같이 준비하였다. Stat4, Stat1, 및 액틴에 대해 특이적인 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀러지(캘리포니아주 산타 크루즈)로부터 입수하였다. 인산화된 Stat4에 특이적인 항체는 지메드(캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 입수하였다, Th 분화 배양에 사용되는 항-CD3, 및 항-CD28, IL-4, 및 IFNγ에 대한 항체는 파민젠으로부터 입수하였다. 재조합 IL-4는 프리프로텍으로부터 입수하였다. 재조합 IL-2는 카이런(캘리포니아주 에머리빌)에 의해 제공받았다. 재조합 IL-12는 호프만-라로쉐(뉴저지주 뉴틀리)에 의해 제공받았다. COS 상청액에서 발현되는 마우스 IL-21을 준비하여 농축시켰다. 1 단위 활성은 IL-21R로 형질감염시킨 BAF3 세포의 최대 증식의 50%를 유도하는 데 필요한 상청액의 농도로서 정의하였다. IL-21과 동시에 준비하여 농축시킨 mock 형질감염된 COS 상청액은 대조군으로서 사용하였다.
시험관내 T 헬퍼 세포 분화
10 ng/ml의 IL-4, 10 ㎍/ml 항-IFNγ(Th2 조건) 또는 1 ng/ml의 IL-12, 10 ㎍/ml의 항-IL-4(Th1 조건) 존재 하에 1∼2 x 106/ml 농도로 항-CD3, 항-CD28(1 ㎍/ml)로 코팅한 평판 상에 나이브 T 세포를 도말하였다. 3일 후에 세포를 IL-2(100 U/ml) 중에서 증폭시켰다. 배양한 지 1 주일 후, 세포들을 PMA/이오노마이신으로 자극하고, Bird, J.J. 등의 문헌[Immunity 9:229-37, 1998]에 기재된 바와 같은 세포내 사이토카인 염색에 의해 사이토카인 생산을 측정하였다.
RNA 분석
전체 RNA를 RNeasy(퀴아젠; 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 분리하였다. 노던 분석을 위해서, RNA를 1.5% 아가로스/6% 포름알데히드 젤 상에서 분리하고, GeneScreen 멤브레인(뉴 잉글랜드 뉴클리어)으로 이전시켰다. 이 멤브레인을 IL-21, IL-4, IFNγ, γ-액틴에 대한 방사능 표지된 cDNA 프로브와 함께 하이브리드화하였다. 실시간 PCR을 위해서, 1 ㎍의 RNA를 올리고(dT)로 프라이밍하고, Superscript(인비트로젠 라이프 테크놀러지스; 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 25 ng의 cDNA를, SYBR Green 2X 또는 TaqMan 2X PCR 믹스(어플라이드 바이오시스템즈; 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였고, 하기 프라이머를 사용하여 ABI 프리즘 7700 서열 검출기(어플라이드 바이오시스템즈)에서 분석하였다.
IL-21 전방향: 5'aagattcctgaggatccgagaag-3'(서열 번호 7)
IL-21 후방향: 5'gcattcgtgagcgtctatagtgtc-3'(서열 번호 8)
IL-21 TaqMan 프로브: 5'ttcccgaggactgaggagacgcc-3'(서열 번호 9)
IL-12Rγ2 전방향: 5'tttccatttttgcatcaagttctc3'(서열 번호 10)
IL-12Rγ2 후방향: 5'ccgatctagagtcagccgct3'(서열 번호 11)
Stat4 전방향: 5'aaacctgagcccaacgacaa3'(서열 번호 12)
Stat4 후방향: 5'agtgtccgtttgcaccgtc3'(서열 번호 13)
IL-4, IFNγ, 및 GAPDH에 대한 프라이머 및 TaqMan 프로브는 이전에 공개되었다(Overbergh, L. 등, Cytokine 11:305-12, 1999).
면역블롯 분석
50 mM Tris, 0.5% NP40, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl에서 세포를 용해시켜 전세포 추출물을 준비하고 원심분리에 의해 용해물을 맑게 하였다. 단백질 추출물은 8∼10% 폴리아크릴아미드 젤 상에서 분리하고, 옵티트란(Optitran) 멤브레인(슐라이허 앤드 슈엘; 뉴 헴프셔주 키니)에 이전시켰다. 면역 블롯을 TBST(50 mM Tris Ph 7.5, 100 mM NaCl, 0.03% Tween 20) 중 5% 밀크 중에서 실온에서 1 시간 동안 차단시키고, 표시된 항체와 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 블롯은 TBST로 세척하고, 항-토끼 HRP 접합 항체(지메드)와 실온에서 항온처리하였다. 블롯을 TBST로 세척한 후, 제조업자의 지시에 따라 증강 화학발광(아머샴; 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 검출을 수행하였다.
실시예 1. IL-21은 시험관내 Th2 경로에 따라 발생하도록 유도된 Th 세포에서 차별적으로 발현된다.
Th 아군에서의 IL-21의 발현을 측정하였다. 1 주 동안 Th1 또는 Th2 세포로 분화된 나이브 Thp(Th 전구체) 세포로부터 분리된 mRNA에 대하여 노던 분석을 수행하고 사이토카인 생산을 유도하기 위해 4 시간 동안 재자극하였다. 결과는 도 1A∼1D에 도시되어 있다. 도 1A에 도시된 결과의 경우, Thp 세포를 Tg1 및 Th2 편향 조건에서 6 일간 배양하였다. 세포는 휴지 상태(-)로 유지시키거나 또는 PMA/이오노마이신(P+I)으로 4 시간 동안 재자극하였다. RNA을 정제하고 노던 블롯에 의해 사이토카인 발현을 평가하였다. 도시된 결과는 3회의 독립적인 실험의 대표이다. IL-21을 코딩하는 mRNA는 자극된 Th2 세포에서만 검출되었으며, 이와는 달리 IL-21 mRNA는 Th1 배양물에서는 검출할 수 없었다. 이러한 결과들은 IL-21이 Th2 특이적 사이토카인임을 나타낸다.
세포가 Th2 경로를 따라 발생함에 따라 IL-21을 발현하는 능력이 증가하는 지를 확인하기 위해, 1차 자극된 Thp 세포에서의 IL-21 발현을 2차 자극된 Th2 세포에서의 IL-21 mRNA 발현과 비교하였다. 결과는 도 1B에 도시되어 있다. 도시된 결과의 경우, Thp 세포를 중립 조건, Th1 및 Th2 편향 조건 하에 배양하였다. 1차 및 2차 항-CD3 자극 후 24 시간이 지나서 RNA를 정제하였다. 사이토카인 발현은 실시간 PCR에 의해 이중으로 평가하였으며, GAPDH에 상대적으로 나타내었다. IL-21 mRNA는 IL-4와 마찬가지로 1차 자극 후에 Thp 세포에서 상대적으로 낮게 관찰되었다. 이와는 달리, IL-21 발현은 세포가 Th2 경로를 따라 분화하도록 한 후 현저히 증가되었다. 이러한 결과들은 IL-21 유전자 발현이 다른 Th2 특이적 사이토카인과 유사하게 조절된다는 것을 입증한다.
분화된 세포에서의 IL-21 발현에 대한 사이토카인 환경의 영향을 측정하였다. Th1 및 Th2 세포는 2차 자극 전에, 각각 IL-4 및 IFNγ존재 하에 배양하였다. IL-4 및 IFNγ에 의한 Stat6 및 Stat1의 활성화에 의해 입증되는 바와 같이 세포는 이들 사이토카인에 대해 반응성이었다.
IL-4가 IL-21 발현을 회복하는 능력을 조사하였다. 결과는 도 1C에 도시하였다. Thp 세포는 Th1 및 Th2 편향 조건 하에 5 일간 배양하였다. 항-CD3으로 2차 자극하기 24 시간 전에 표시된 배양물에 IL-4 또는 IFNγ를 첨가하였다. 2차 자극한지 24 시간 후에 RNA를 정제하고, 실시간 PCR에 의해 GAPDH에 대해 이중으로 IL-21 발현을 평가하였다. Th1 세포에 IL-4를 첨가하는 것은 Th2 세포에서 관찰되는 수준으로 IL-21 발현을 회복시킬 수 없었다. 뿐만 아니라, Th2 배양물에 IFNγ를 첨가하는 것은 IL-21의 발현에 억제 효과를 나타내지 못하였다. 이러한 결과들은 Th2 세포에서의 IL-21의 발현이 Th2 분화에 있어 조기에 고정되는 것으로 보이며, 이는 IL-4 또는 IFNγ에 의해 직접 조절되는 것이 아님을 입증한다.
실시예 2. Th2 세포는 생체내 Th2 면역 반응 중에 IL-21을 발현한다.
생체내 면역 반응 과정에서 Th2 세포에서의 IL-21의 발현을 병원성 원생동물 모델 시스템에서 측정하였다. 원생동물 레이쉬마니아 메이져(Leishmania major)를 이용한 감염은 Th 세포의 생체내 반응을 연구하기 위한 잘 규명된 모델을 제공한다(Reiner, S.L. 등, Annu Rev Immunol 13:151-77, 1995). 레이쉬마니아 메이져로 감염시킨 몇몇 동종 번식 종, 예컨대 C57BL/6는 병원균에 대하여 방어적이고 효과적인 Th1 반응을 유도한다. 반대로, 다른 동종 번식 마우스 종, 예컨대 BALB 마우스 종은 주로 Th2 반응을 발달시키며 감염을 제거할 수 없다.
C57BL/6 및 BALB/c 마우스 둘 다 레이쉬마니아 메이져로 감염시켰다. 8 마리의 8 BALB/c 및 C57BL/6 마우스 코호트를 그 뒷발에 레이쉬마니아 메이져를 주사하여 감염시켰다. 6 주 후, 배출 림프절로부터 CD4+ T 세포를 정제하고, 항-CD3로 자극하였다. 자극한 지 6 시간 후에 RNA를 정제하고, 실시간 PCR에 의해 GAPDH에 대하여 사이토카인 발현을 평가하였다.
그 결과는 도 1D에 도시되어 있다. 예상한 바와 같이, 감염된 C57BL/6 마우스로부터의 CD4+ 세포는 감염된 BALB/c 마우스로부터의 세포보다 더 많은 IFNγ를 발현하였다. 주된 Th2 반응과 일치하게, 감염된 BALB/c 마우스로부터의 CD4+ T 세포는 C57BL/6 마우스로부터의 T 세포보다 현저히 더 많은 IL-4를 생성하였다. 시험관내 Th2 편향 조건에서 관찰되는 것과 유사하게, IL-21은 또한 BALB/c 마우스에서의 생체내 Th2 반응 중에 차별적으로 발현되었다. 이러한 결과들을 시험관내 결과(실시예 1)와 종합해 보면 IL-21이 Th2 사이토카인임이 입증된다.
실시예 3. IL-21은 발생중인 Th 세포에서 IFNγ의 생성을 특이적으로 억제한다.
IL-21은 Th 세포에서 IL-4와 유사한 발현 프로필을 공유할 뿐 아니라 구조적 유사성도 공유하기 때문에, IL-4와 마찬가지로 IL-21가 Th 분화에 직접적으로 영향을 주는 지를 확인하였다.
IL-21이 Thp 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 Thp 세포를 중립 조건 및 Th1 및 Th2 편향 조건 하에 배양하였다.
정제된 나이브 Thp 세포는 중립 조건, Th1 및 Th2 편향 조건 하에 IL-21 존재 또는 부재 하에 자극하였다. 이들 세포의 사이토카인 잠재성은 배양 1 주 후에 세포내 사이토카인 염색에 의해 평가하였다.
그 결과는 도 2A 및 2B에 도시한다. 도 2A에 도시된 결과의 경우, 세포를 IL-21 또는 mock 상청액 존재 하에 1 주간 배양하였다. 사이토카인 생성은 PMA/이오노마이신으로 재자극한 지 4 시간 후에 세포내 사이토카인 염색에 의해 평가하였다. 결과는 최소한 10회 실험의 대표이다.
IL-4와 마찬가지로 중립 조건 및 Th1 편향 조건 배양물에 IL-21을 첨가하자 IFNγ생성 세포의 수가 현저히 감소되었다(도 2A, 중립 및 Th1 조건). Th1 배양물 중에서의 IFNγ생성 세포 수의 감소는 ELISPOT 분석에 의해 확인하였다. 그러나, IL-4에서 관찰되는 것과는 달리, IL-21 자체는 IL-4 생성 Th2 세포의 생성을 증강시킬 수 없었다(도 2A, 중립 조건). IL-21 처리는 Th2 편향 조건 하에 IL-4 생성 세포의 생성에 자극 효과 또는 억제 효과를 주지 않았다(도 2A, Th2).
IL-21이, 가장 나중에 자극시킨 Thp 세포로부터의 IFNγ생성에 영향을 주는 능력을 측정하였다. 정제된 나이브 Thp 세포를 중립 및 Th1 조건 하에 IL-21 존재 또는 부재 하에 48 시간 동안 배양하였다. 생성된 배양 상청액은 ELISA를 이용하여 IFNγ생성에 대해 조사하였다. IL-21은 분화하는 배양물에서 조기에 생성된 IFNγ의 양을 감소시켰음이 확인되었다(도 2B). 따라서, Th 자극 중의 IL-21의 존재는 분화하는 Th1 세포와 작동체 세포 둘 다의 IFNγ생산 능력에 영향을 준다.
실시예 4. IL-21은 Th1 작동체 세포로부터의 IFNγ생성을 직접적으로 억제하지 않는다.
IL-21이 IL-21의 생성을 직접적으로 억제하는지, 아니면 IFNγ세포의 분화에 영향을 주는 지를 확인하기 위하여, 정제된 나이브 Thp 세포를 Th1 편향 조건 하에 배양하였다. IL-21 또는 mock 상청액은 재자극 및 분석(5일) 전에, 배양 초기(0일) 또는 24 시간째 첨가하였다. 사이토카인 생산은 세포내 사이토카인 염색에 의해 평가하였다, 결과는 도 3A에 제시되어 있다.
0일째 IL-21을 첨가하였을 때 관찰되는 것과는 달리, Th1 세포가 IL-21R을 발현하고 IL-21에 반응성임에도 불구하고, 분화 기간 후반부에 Th1 배양물에 IL-21을 첨가하는 것은 IFNγ생산에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이러한 발견은 IL-21이 Thp 세포가 IFNγ생산 Th1 세포로 분화하는 능력을 손상시키지만, Th1 작동체 세포로부터의 IFNγ생산은 직접적으로 억제하지 않음을 입증한다.
실시예 5. IL-21에 의한 IFNγ억제는 Stat6와는 무관하다.
IL-4가 Th1 세포의 분화를 억제하는 능력은 Stat6의 발현에 의존한다(Kaplan, M.H. 등, Immunity 4:313-9, 1996, Takeda, K. 등, Nature 380:627-30, 1996, 및 Shimoda, K. 등, Nature 380:630-3, 1996).
IFNγ생산의 IL-21 매개 억제 역시 Stat6에 의존하는 지를 확인하기 위해, Stat6가 결여된 세포에서 IL-21이 Th1 분화에 영향을 주는 능력을 확인하였다. 야생형 또는 Stat6 결핍 마우스로부터 정제된 Thp 세포를 Th1 편향 조건 하에 IL-21 또는 mock 상청액 존재 하에 1 주일간 배양하였다. 사이토카인 생산은 세포내 사이토카인 염색에 의해 평가하였다.
결과는 도 3B에 도시되어 있다. Stat6의 부재 하에 IL-21은 Stat6 존재 하에서와 같이 IFNγ생성 세포의 생성을 방지하는 데 유효하였다. 따라서, IL-4와는 달리, IL-21은 IFNγ생성 Th1 세포의 발생을 막기 위하여 Stat6 신호 전달에 의존하지 않는다. 추가로, 이러한 결과들은 IL-21에 의해 유도된 IFNγ의 억제가 IL-4의 작용을 통해 직접적으로 매개되지 않음을 입증한다.
실시예 6. IL-21은 다른 Th1 사이토카인을 억제하지 않는다.
IL-21이 IFNγ생산의 억제 외에도 Th1 발생의 양상에 영향을 주는 지를 확인하기 위해, IL-21 처리된 Th1 세포가 다른 Th1 관련 사이토카인을 생산하는 능력을 조사하였다.
Thp 세포는 Th1 편항 조건 하에 IL-21 존재 또는 mock 상청액 존재 하에 배양하고, 그 후 이들을 2차 자극한 후 세포내 사이토카인 염색에 의해 사이토카인 생산에 대하여 평가하였다.
결과는 도 3C에 도시되어 있다. 놀랍게도, IL-21이 자극 조건에 포함되었을 때 IFNγ생성 세포의 수가 현저히 감소되었음에도 불구하고, 이 세포 집단은 IL-2 및 TNFα생성 세포의 수가 정상 수준이었다. 이러한 결과들은 IL-21이 Th1 세포의 IFNγ생성 능력을 효율적으로 억제하지만 이 세포는 Th1 세포를 생성하는 능력을 유지하며 Th2 사이토카인을 생성하지 못함을 입증한다.
실시예 7. T-bet 발현은 IL-21에 의해 영향을 받지 않는다.
T-bet는 분화하는 Th1 세포에서 특이적으로 발현되고, 또한 IFNγ를 강하게 유도할 수 있는, 최근에 확인된 전사 인자이다. 분화하는 Th1 세포의 IL-21 처리가 Th 세포에서의 T-bet 발현의 유도에 영향을 주는 지를 확인하기 위해 Thp 세포를 Th1 또는 Th2 편향 조건 하에 배양하였다. 배양 초기(나이브) 및 배양 48 시간 후(Th1 및 Th2)에 단백질 추출물을 회수하였다. T-bet 및 액틴 발현은 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
결과는 도4A에 도시되어 있다. IL-21 또는 mock 상청액은 표시된 배양물에 포함시켰다. 예상한 바와 같이, T-bet 발현은 Th1 배양에서 유도되었고 Th2 조건에서는 낮게 유지되었다. IL-21의 첨가는 Th1 세포에서 T-bet 발현에 어떠한 영향도 주지 않았다. 이 결과는 IL-21 매개 IFNγ발현이 감소된 T-bet 발현에 의한 것이 아님을 나타낸다.
실시예 8. IL-21은 IL-21 신호 전달을 억제한다.
IL-21 신호 전달은 Th1 세포의 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. IL-21R이 결여된 Th 세포는 IFNγ생성 능력이 심각하게 손상된다(Wu, C. 등 , J Immunol 159:1658-65, 1997). 게다가, IL-12Rβ2 사슬 발현은 발생중인 Th2 세포에서 특이적으로 소실되는데, 이는 IL-4에 의해 매개되는 효과이다(Szabo, S. J. 등, J Exp Med 185:817-24, 1997). IL-21이 IL-4와 마찬가지로 Th1 세포에서 IL-12b2 사슬의 발현에 영향을 주는 지를 확인하기 위해, Th1 및 Th2 편향 조건 하에 IL-21 존재 및 부재 하에 배양된 나이브 Thp 세포로부터의 RNA를 실시간 PCR에 의해 12Rβ2 발현에 대하여 분석하였다. Thp 세포는 Th1 또는 Th2 편향 조건 하에 1 주간 배양하였다. IL-21 또는 mock 상청액은 표시된 배양물에 포함되었다. RNA는 항-CD3로 2차 자극한 지 24 시간 후에 회수하고, 실시간 PCR에 의해 IL-12Rβ2 발현에 대하여 평가하였다.
결과는 도 4B에 도시되어 있다. 이 결과는 3회의 독립적인 실험의 대표이다. 예상한 바와 같이, IL-12Rβ2 발현은 Th2 세포와 비교하였을 때 Th1 세포에서 높았다. 그러나, Th1 배양물에 IL-21을 첨가한 것은 IL-12Rβ2 발현에 영향을 주지 못했다. 따라서, IL-4에 대하여 보고된 결과와는 달리, IL-21은 IL-12Rβ2의 발현을 감소시키지 못하였다. 뿐만 아니라, 높은 IL-12Rβ2 발현과 함께 나타나는 높은 TNFα및 IL-2 수준은, IL-21 처리된 Th1 세포가 IFNγ생성이 감소된다는 명백한 점을 제외하고는 다수의 Th1 특성을 유지한다는 것을 시사한다.
Stat4는 IL-12에 의해 특이적을 활성화되며, IFNγ생산 Th1 세포의 생성을 위한 중요한 매개체인 것으로 보고되어 있다(Wurster, A. L. 등, Oncogene 19:2577-84, 2000). IL-21이 STAT-4를 활성화시킬 수 있는 IL-12의 능력에 영향을 주는 지를 확인하기 위해, 나이브 Thp 세포를 IL-21 존재 또는 부재 하에 48 시간 동안 활성화하였다. 그 후 세포를 IL-12로 자극하고, 웨스턴 블롯 분석에 의해 Stat4 인산화 정도를 확인하였다. Thp 세포를 IL-21 또는 mock 상청액 존재 하에 항-CD3로 48 시간 동안 자극하였다. 단백질 추출물로는 웨스턴 블롯에 의해, 인산화된 Stat4(p-Stat4), Stat4 및 Stat1에 대하여 평가하였다. 결과는 4회의 독립적 실험의 대표이다.
결과는 도 4C에 도시되어 있다. IL-21 처리된 세포는 정상 수준의 IL-12Rβ2를 발현하는 것으로 확인되었으나, IL-21 자극에 반응하는 Stat4 인산화는 IL-21 처리된 세포에서 감소되었다. 인산화된 Stat4의 감소된 수준 역시 총 Stat4 단백질 수준의 감소에 의해 반영된다. 비교로서, Stat1 단백질은 IL-21 처리에 의해 영향을 받지 않았다.
Stat4 RNA 수준 역시 조사하였다. Thp 세포는 도 4C에 기재된 바와 같이 배양하고, 그 후 RNA를 회수하고, 실시간 PCR에 의해 이중으로 Stat4 발현에 대하여 평가하였다.
결과는 도 4D에 도시되어 있다. 결과는 3회의 독립적인 실험의 대표이다. 더 낮은 수준의 Stat4 RNA가 검출되었다. IL-21에 의해 유도된 Stat4 단백질 수준의 감소는 Stat4 mRNA의 감소에 의한 것으로 생각된다. 이러한 발견들은 Stat4 유전자 발현의 감소를 통해 IL-21이 발생중인 Th1 세포의 IL-21에 대한 반응성을 방해한다는 것을 시사한다.
실시예 9. IL-21 신호 전달은 생체내에서 Th1 반응을 제한하는 데 필요하다.
내생적으로 생산된 IL-21이 생체내에서 Th1 세포 기능에 있어 일정 역할을 하는 지를 확인하기 위해, 지연형 과민 반응(DTH)의 정도를 IL-21R 결핍 마우스에서 조사하였다. DTH는 전통적인 Th1 세포 매개 염증성 반응이다. C57BL/6 배경으로 역교배한 IL-21R 결핍 마우스는 Kasian 등의 문헌[Immunity 16:559-60, 2002]에 기재된 바와 같이 생성하였다. 8 주령의 수컷 마우스를 DFA에 유화시킨 100 mg의 TNP-KLH(2,4,6-트리니트로페닐-키홀 림펫 헤모시아닌; 바이오서치 테크놀러지스, 노바토, 캘리포니아주)를 꼬리 밑둥에 피하 주사하여 면역화하였다. 6일 후, 마우스에 50 ㎍의 TNP-KLH를 뒷발바닥 한 쪽에 주사하고, 대측성 뒷발바닥에 PBS를 주사하였다. 뒷발바닥 두께는 주사한 지 24 시간 후에 측정하였다.
결과는 도 5A에 도시되어 있다. 야생형 및 IL-21R 결핍(IL-21R-/-) 마우스의 특이적인 발바닥 팽윤은 TNP-KLH에 의해 유도된 팽윤으로부터 PBS가 주사된 발바닥의 비특이적 팽윤을 감하여 결정하였다. 각 데이터 지점은 한 마우스를 나타낸다. 가로선은 평균을 나타낸다. 결과는 2회의 독립적 실험으로부터 얻은 데이터를 수집한 것이다. 이 결과는 야생형 동물이 현저한 발바닥 팽윤 없이 항원 투여에 반응하였음을 보여준다. 놀라운 사실은, IL-21 결핍 마우스가 훨씬 더 강한 DHT 반응을 유발하여 평균 2배의 팽윤을 유도하였다는 점이다.
면역화된 마우스에서 IFNγ생성 역시 조사하였다. 결과는 도 5B에 도시되어 있다. 면역화된 마우스의 배출 림프절로부터의 정제된 CD4+ T 세포는 250 mg/ml의 TNP-KLH로 시험관내에서 자극하였다. 상청액은 ELISA에 의해 IFNγ수준에 대하여 분석하였다. 제시된 결과는 이중으로 수행된, 각 유전형으로부터의 마우스 2 마리로부터 얻은 데이터의 평균이다. IL-21R 결핍 동물에서의 증가된 DTH 반응은, 배출 림프절로부터 정제하고 시험관내에서 항원에 의해 재자극한 CD4+ 세포로부터의 IFNγ생성의 현저한 증가와 서로 관련이 있었다.
이러한 결과들은 IL-21이 IFNγ생성을 억제함으로써 TH1 세포 반응을 제한하는 과정에 관여한다는 것을 입증한다.
하기 청구의 범위에는 추가적인 구체예가 포함된다.
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tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc 540 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg 600 tattccaagt ggaggag 617 <210> 2 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser <210> 3 <211> 2887 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gaagcagcag gtaccccctc cacatcccta gggctctgtg atgtaggcag aggcccgtgg 60 gagtcagcat gccgcgtggc tgggccgccc ccttgctcct gctgctgctc cagggaggct 120 ggggctgccc cgacctcgtc tgctacaccg attacctcca gacggtcatc tgcatcctgg 180 aaatgtggaa cctccacccc agcacgctca cccttacctg gcaagaccag tatgaagagc 240 tgaaggacga ggccacctcc tgcagcctcc acaggtcggc ccacaatgcc acgcatgcca 300 cctacacctg ccacatggat gtattccact tcatggccga cgacattttc agtgtcaaca 360 tcacagacca gtctggcaac tactcccagg agtgtggcag ctttctcctg gctgagagca 420 tcaagccggc tccccctttc aacgtgactg tgaccttctc aggacagtat aatatctcct 480 ggcgctcaga ttacgaagac cctgccttct acatgctgaa gggcaagctt cagtatgagc 540 tgcagtacag gaaccgggga gacccctggg ctgtgagtcc gaggagaaag ctgatctcag 600 tggactcaag aagtgtctcc ctcctccccc tggagttccg caaagactcg agctatgagc 660 tgcaggtgcg ggcagggccc atgcctggct cctcctacca ggggacctgg agtgaatgga 720 gtgacccggt catctttcag acccagtcag aggagttaaa ggaaggctgg aaccctcacc 780 tgctgcttct cctcctgctt gtcatagtct tcattcctgc cttctggagc ctgaagaccc 840 atccattgtg gaggctatgg aagaagatat gggccgtccc cagccctgag cggttcttca 900 tgcccctgta caagggctgc agcggagact tcaagaaatg ggtgggtgca cccttcactg 960 gctccagcct ggagctggga ccctggagcc cagaggtgcc ctccaccctg gaggtgtaca 1020 gctgccaccc accacggagc ccggccaaga ggctgcagct cacggagcta caagaaccag 1080 cagagctggt ggagtctgac ggtgtgccca agcccagctt ctggccgaca gcccagaact 1140 cggggggctc agcttacagt gaggagaggg atcggccata cggcctggtg tccattgaca 1200 cagtgactgt gctagatgca gaggggccat gcacctggcc ctgcagctgt gaggatgacg 1260 gctacccagc cctggacctg gatgctggcc tggagcccag cccaggccta gaggacccac 1320 tcttggatgc agggaccaca gtcctgtcct gtggctgtgt ctcagctggc agccctgggc 1380 taggagggcc cctgggaagc ctcctggaca gactaaagcc accccttgca gatggggagg 1440 actgggctgg gggactgccc tggggtggcc ggtcacctgg aggggtctca gagagtgagg 1500 cgggctcacc cctggccggc ctggatatgg acacgtttga cagtggcttt gtgggctctg 1560 actgcagcag ccctgtggag tgtgacttca ccagccccgg ggacgaagga cccccccgga 1620 gctacctccg ccagtgggtg gtcattcctc cgccactttc gagccctgga ccccaggcca 1680 gctaatgagg ctgactggat gtccagagct ggccaggcca ctgggccctg agccagagac 1740 aaggtcacct gggctgtgat gtgaagacac ctgcagcctt tggtctcctg gatgggcctt 1800 tgagcctgat gtttacagtg tctgtgtgtg tgtgtgcata tgtgtgtgtg tgcatatgca 1860 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtc ttaggtgcgc agtggcatgt ccacgtgtgt gtgtgattgc 1920 acgtgcctgt gggcctggga taatgcccat ggtactccat gcattcacct gccctgtgca 1980 tgtctggact cacggagctc acccatgtgc acaagtgtgc acagtaaacg tgtttgtggt 2040 caacagatga caacagccgt cctccctcct agggtcttgt gttgcaagtt ggtccacagc 2100 atctccgggg ctttgtggga tcagggcatt gcctgtgact gaggcggagc ccagccctcc 2160 agcgtctgcc tccaggagct gcaagaagtc catattgttc cttatcacct gccaacagga 2220 agcgaaaggg gatggagtga gcccatggtg acctcgggaa tggcaatttt ttgggcggcc 2280 cctggacgaa ggtctgaatc ccgactctga taccttctgg ctgtgctacc tgagccaagt 2340 cgcctcccct ctctgggcta gagtttcctt atccagacag tggggaaggc atgacacacc 2400 tgggggaaat tggcgatgtc acccgtgtac ggtacgcagc ccagagcaga ccctcaataa 2460 acgtcagctt ccttccttct gcggccagag ccgaggcggg cgggggtgag aacatcaatc 2520 gtcagcgaca gcctgggcac ccgcggggcc gtcccgcctg cagagggcca ctcggggggg 2580 tttccaggct taaaatcagt ccgtttcgtc tcttggaaac agctccccac caaccaagat 2640 ttctttttct aacttctgct actaagtttt taaaaattcc ctttatgcac ccaagagata 2700 tttattaaac accaattacg tagcaggcca tggctcatgg gacccacccc ccgtggcact 2760 catggagggg gctgcaggtt ggaactatgc agtgtgctcc ggccacacat cctgctgggc 2820 cccctaccct gccccaattc aatcctgcca ataaatcctg tcttatttgt tcatcctgga 2880 gaattga 2887 <210> 4 <211> 538 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly 1 5 10 15 Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr 20 25 30 Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr 35 40 45 Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser 50 55 60 Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val 85 90 95 Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe 100 105 110 Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val 115 120 125 Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp 130 135 140 Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr 145 150 155 160 Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile 165 170 175 Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys 180 185 190 Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser 195 200 205 Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln 210 215 220 Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu 225 230 235 240 Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys 245 250 255 Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser 260 265 270 Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe 275 280 285 Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly 290 295 300 Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His 305 310 315 320 Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu 325 330 335 Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp 340 345 350 Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp 355 360 365 Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala 370 375 380 Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro 385 390 395 400 Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp 405 410 415 Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser 420 425 430 Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro 450 455 460 Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser 465 470 475 480 Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly 485 490 495 Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp 500 505 510 Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro 515 520 525 Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser 530 535 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 5 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 224 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Peptide <400> 6 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 20 25 30 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 35 40 45 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 50 55 60 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 65 70 75 80 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 85 90 95 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr 100 105 110 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 115 120 125 Pro Pro Ser Arg Glu 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Sequence: Synthetic Primer <400> 10 tttccatttt tgcatcaagt tctc 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 11 ccgatctaga gtcagccgct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 12 aaacctgagc ccaacgacaa 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 13 agtgtccgtt tgcaccgtc 19

Claims (23)

  1. T 세포 또는 T 세포 집단에서 인터페론 감마(IFNγ)를 억제하기에 충분한 양의 IL-21 효현제를 상기 T 세포 또는 T 세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 또는 T 세포 집단에서 IFNγ수준을 억제하는 방법으로서, 상기 효현제는 서열 번호 2와 85% 이상 동일하고 IL-21R에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-21 폴리펩티드인 방법.
  2. 제1항에 있어서, IFNγ수준의 억제가 요망되는 T 세포 또는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  3. Th 전구체(Thp) 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 유도하기에 충분한 양의 IL-21 효현제를 상기 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는, Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 촉진하는 방법으로서, 상기 효현제는 서열 번호 2와 85% 이상 동일하고 IL-21R에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-21 폴리펩티드인 방법.
  4. 제3항에 있어서, Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화가 요망되는 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th1 세포 또는 Th1 세포 집단으로의 분화를 억제하기에 충분한 양의 IL-21 효현제를 상기 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는, Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th1 세포 또는 Th1 세포 집단으로의 분화를 억제하는 방법으로서, 상기 효현제는 서열 번호 2와 85% 이상 동일하고 IL-21R에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-21 폴리펩티드인 방법.
  6. 제5항에 있어서, Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th1 세포 또는 Th1 세포 집단으로의 분화의 억제가 요망되는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  9. 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 포유동물 피험체에서 수행하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 포유동물 피험체는 인간인 방법.
  11. Th 전구체(Thp) 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 억제하기에 충분한 양의 인터루킨-21(IL-21)/IL-21 수용체(IL-21R)의 길항제를 상기 Thp 세포 또는 Thp 세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는, Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화를 억제하는 방법으로서, 상기 길항제는 항-IL21R 항체, 항-IL21R 항체의 항원 결합 단편 및 IL-21R의 가용성 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, Thp 세포 또는 Thp 세포 집단에서 Th2 세포 또는 Th2 세포 집단으로의 분화의 억제가 요망되는 T 세포 또는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. T 세포 또는 T 세포 집단에서 인터페론 감마(IFNγ) 수준을 증가시키기에 충분한 양의 IL-21/IL-21R의 길항제를 상기 T 세포 또는 T 세포 집단과 접촉시키는 단계를 포함하는, T 세포 또는 T 세포 집단에서 IFNγ수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 길항제는 항-IL21R 항체, 항-IL21R 항체의 항원 결합 단편 및 IL-21R의 가용성 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, IFNγ수준의 증가가 요망되는 T 세포 집단을 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 제11항 또는 제13항에 있어서, IL-21R의 가용성 단편은 IL-21 수용체의 세포외 영역을 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 가용성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 20∼235와 85% 이상 동일하고 IL-21에 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 가용성 단편은 서열 번호 4의 아미노산 1∼235를 포함하는 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 가용성 단편은 Fc 단편을 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제11항 또는 제13항에 있어서, 길항제는 항-IL21R 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
  20. 제12항에 있어서, T 세포 집단은 하나 이상의 Th1 세포를 포함하는 것인 방법.
  21. 제11항 또는 제13항에 있어서, 접촉 단계는 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 수행하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 접촉 단계는 포유동물 피험체에서 수행하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 포유동물 피험체는 인간인 방법.
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