ES2301164T3 - Slam, antigeno coestimulador de la superficie de celulas t. - Google Patents

Abstract

GENES PURIFICADOS QUE CODIFICAN UN ANTIGENO DE SUPERFICIE DE CELULA T DE UN MAMIFERO, REACTIVOS RELACIONADOS INCLUYENDO PROTEINAS PURIFICADAS, ANTICUERPOS ESPECIFICOS Y ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHO ANTIGENO. TAMBIEN SE DESCRIBEN LOS METODOS DE UTILIZACION DE DICHOS REACTIVOS Y KITS DIAGNOSTICOS.

Description

SLAM, antígeno coestimulador de la superficie de células T.

Antecedentes de la invención

La activación de células T en reposo es crítica para la mayoría de las respuestas inmunológicas y permite que estas células ejerzan sus capacidades reguladoras o efectoras. Véase Paul (ed., 1993), Fundamental Immunology, 3ª ed., Raven Press, N.Y. Una mayor adhesión entre las células T y las células de presentación del antígeno (APC) u otras formas de estímulos primarios, por ejemplo, anticuerpos monoclonales (mAb) inmovilizados, pueden potenciar las señales del receptor de células T. La activación de células T y la expansión de células T depende de la unión del receptor de células T (TCR) y de señales coestimuladoras proporcionadas por células auxiliares. Véase, por ejemplo, Jenkins y Johnson (1993), Curr. Opin. Immunol., 5:361-367; Bierer y Hahn (1993), Semin. Immunol., 5:249-261; June, et al. (1990), Immunol. Today, 11:211-216; y Jenkins (1994), Immunity, 1:443-446. Una interacción coestimuladora bien estudiada, principal, para las células T implica a CD28 o CTLA-4 sobre las células T, con B7 o B70 (Jenkins (1994), Immunity, 1:443-446). Recientes estudios sobre ratones deficientes en CD28 (Shahinian et al. (1993), Science, 261:609-612; Green, et al. (1994), Immunity, 1:501-508) y ratones transgénicos que expresan la inmunoglobulina CTLA-4 (Ronchese, et al. (1994), J. Exp. Med., 179:809-817) han revelado deficiencias en algunas respuestas de células T aunque estos ratones tienen respuestas inmunológicas primarias normales y respuestas CTL normales al virus de la coriomeningitis linfocítica y al virus de la estomatitis vesicular. Como resultado de esto, ambos estudios concluyen que otras moléculas coestimuladoras deben estar apoyando la función de las células T. Sin embargo, la identificación de estas moléculas que median en señales coestimuladoras diferenciadas ha sido difícil.

La incapacidad para modular las señales de activación evita el control de las respuestas fisiológicas o de desarrollo inapropiadas en el sistema inmunológico. La presente invención proporciona al menos una molécula coestimuladora alternativa, que será útil para modular una plétora de respuestas inmunológicas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un antígeno que actúa como coestimulador de la activación de células T. En particular, proporciona un gen que codifica una proteína glicosilada de 70 kDa, denominada SLAM, que se expresa sobre células T CD4+, CD8+, timocitos y de memoria CD45RO^{high} de sangre periférica, y es inducida con rapidez sobre células T indiferenciadas después de la activación. La unión de SLAM estimula directamente la proliferación de clones de células T CD4+ y potencia la proliferación específica de antígenos y la producción de citoquinas por las células T CD4+. En particular, la producción de IFN-\gamma se sobrerregula notablemente, incluso en clones de células T CD4+ auxiliares de tipo 2 (Th2), mientras que no se ha observado inducción de la producción de IL-4 o IL-5 en clones de Th1. Estos datos indican que SLAM es una nueva molécula coestimuladora de células T que, cuando está unida, potencia la expansión de células T e induce un perfil de producción de citoquinas Th0/Th1. Se describen realizaciones en seres humanos y ratones, que permiten obtener genes, proteínas y anticuerpos de mamíferos, y sus usos. Los equivalentes funcionales que muestran una significativa homología de secuencia están disponibles a partir de especies que no son mamíferos. Además, SLAM puede actuar como su compañero de unión para estimular otras células que expresan el antígeno en una interacción homofílica.

Más en concreto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una proteína SLAM purificada o recombinante: (a) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12. Las proteínas incluyen aquellas que muestran un patrón de modificación postraduccional diferenciado de la SLAM natural, y en las que la proteína es un coestimulador de una célula T. La proteína puede ser una proteína de fusión. Otra realización es una composición que comprende una proteína SLAM y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también incluye un anticuerpo que se une específicamente a una proteína SLAM, por ejemplo, en la que la proteína SLAM es una proteína de mamífero, incluyendo un ser humano o un ratón; el anticuerpo se genera contra una secuencia peptídica de SLAM purificada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12; el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; o el anticuerpo está marcado. Los anticuerpos también permiten acceder a un método para purificar una proteína o péptido SLAM a partir de otros materiales en una mezcla, que comprende poner en contacto la mezcla con un anticuerpo anti-SLAM, y separar la SLAM unida de los otros materiales.

Otro aspecto de la invención es un ácido nucleico aislado o recombinante que es capaz de codificar una proteína SLAM, incluyendo un ácido nucleico que codifica una secuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12; que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11. Estas realizaciones de ácidos nucleicos también incluyen un vector de expresión o replicante.

La invención también proporciona un kit que contiene un SLAM purificado; un anticuerpo que se une específicamente a SLAM; o un ácido nucleico que codifica SLAM. Este kit también proporciona métodos para detectar en una muestra la presencia de un ácido nucleico, proteína o anticuerpo, que comprenden ensayar dicha muestra con dicho kit.

La invención también suministra métodos in vitro para modular la fisiología de una célula T, que comprenden poner en contacto dicha célula con una SLAM purificada; un anticuerpo que se une específicamente a SLAM; o un ácido nucleico que codifica SLAM. Ciertas realizaciones preferidas incluyen un método en el que la célula es una célula T, y la modulación de la fisiología es la activación de la célula T; o en el que la célula está en un tejido y/o en un organismo.

También se proporciona un método para expresar un péptido SLAM mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SLAM. La invención también proporciona una célula o tejido, que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido SLAM.

La invención también proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia con al menos 85% de coincidencia con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9 u 11, en el que el ácido nucleico codifica una proteína que es un coestimulador de una célula T. La invención proporciona además un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 70% de coincidencia con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11, en el que el ácido nucleico está unido operablemente a un promotor, en el que el ácido nucleico codifica una proteína que es un coestimulador de una célula T. Otra realización codifica un polipéptido que comprende al menos aproximadamente 60% de coincidencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12, en el que dicha proteína es un coestimulador de una célula T.

La invención también proporciona una proteína SLAM purificada, o un anticuerpo que se une específicamente con una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12; o un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 para su uso como medicamento. Una proteína purificada o anticuerpo de la invención puede utilizarse para tratar un trastorno médico, seleccionado del grupo que consiste en un trastorno autoinmunológico, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroidosis autoinmunológica de Hashimoto, inflamación aguda e inflamación crónica, o puede utilizarse para tratar un trastorno médico seleccionado del grupo que consiste en una infección por VIH, infección por herpesvirus, infección por citomegalovirus, alergia alimentaria, alergia a fármacos, rinitis, dermatitis atópica, asma, síndrome de hiper-IgE, hipereosinofilia, enfermedad infecciosa, infección de lepra lepromatosa, leishmaniasis, enfermedad de Chagas, esquistomiasis, glomerulonefritis, y artritis juvenil.

También se proporciona el uso de un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno médico seleccionado del grupo que consiste en un trastorno autoinmunológico, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroidosis autoinmunológica de Hashimoto, inflamación aguda e inflamación crónica. También se proporciona el uso de una proteína de la invención, F(Ab')_{2} anti-SLAM, o un anticuerpo producido por una línea celular de hibridoma que tiene el número de registro HB11760, para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno médico seleccionado del grupo que consiste en una infección por VIH, infección por herpesvirus, infección por citomegalovirus, alergia alimentaria, alergia a fármacos, rinitis, dermatitis atópica, asma, síndrome de hiper-IgE, hipereosinofilia, enfermedad infecciosa, infección de lepra lepromatosa, leishmaniasis, enfermedad de Chagas, esquistomiasis, glomerulonefritis, y artritis juvenil.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. General

La presente invención proporciona secuencias de aminoácidos y secuencias de ADN que codifican diversas proteínas de mamíferos que son antígenos que se encuentran en las etapas tempranas de la activación de células T, por ejemplo, que pueden activar una célula T. Entre estas proteínas se encuentran antígenos que inducen la proliferación de células T, entre otros efectos fisiológicos. Los antígenos de longitud completa y sus fragmentos serán útiles es la modulación fisiológica de las células que expresan el antígeno. Las proteínas también serán útiles como antígenos, por ejemplo, inmunógenos, para generar anticuerpos contra diversos epitopos sobre la proteína, tanto epitopos lineales como conformacionales.

Se generaron anticuerpos monoclonales (mAb) contra moléculas expresadas en la fase temprana de la activación de células T. Un anticuerpo denominado A12 tiene efectos agonistas exclusivos sobre clones de células T, y reconoce una molécula de activación temprana previamente desconocida denominada SLAM. El A12 induce directamente la proliferación de clones de células T CD4+ que pertenecen a los subgrupos de tipo Th0, Th1 y Th2. En ausencia de cualquier otro estímulo, A12 o su F(Ab')_{2} induce la proliferación de los clones de células T B21, ChT38, HY06 y TA23, mientras que, en coherencia con estudios previos, véase June et al. (1990), Immunol. Today, 11:211-216, la unión de CD28 resultó ineficaz. Estos datos indican que SLAM actúa independientemente de CD28, y que desempeña un papel nuevo e importante en la activación de células T.

Se aisló un ADNc que codifica SLAM a partir de un banco de ADNc de células T mediante clonación de expresión utilizando A12 para la selección. El ADNc de SLAM tiene una longitud de 1860 pb y contiene un gran marco de lectura abierto que codifica una proteína transmembrana de tipo I con una secuencia conductora hidrófoba N-terminal de 27 aminoácidos, una región extracelular de 202 aminoácidos que contiene 8 sitios de N-glicosilación potenciales, un porción hidrófoba que abarca la membrana de 22 aminoácidos, y un dominio citoplásmico de 77 aminoácidos. Véase la SEQ ID NO: 1. Tres de los cuatro sitios de fosforilación de tyr potenciales en el dominio citoplásmico de SLAM se adaptan a la secuencia consenso de fosfotirosina-hidrófobo-X-hidrófobo, determinada para la unión a una clase de dominios SH2. Véase Zhou et al. (1993), Cell, 72:767-778. Un antisuero generado contra SLAM recombinante precipita una glicoproteína de 70 kD a partir de un clon de célula T CD4+ activado. Un tratamiento con N-glicanasa del inmunoprecipitado de SLAM reveló un núcleo de la proteína de 40 kDa, que se correlaciona con el tamaño molecular predicho. La SLAM muestra características de un miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulina (Ig), con un dominio variable y un dominio constante, y muestra cierto grado de homología con CD48 (26% de homología; véase Staunton y Thorley-Lawson (1987), EMBO J., 6:3695-3701), LFA-3/CD58 (17% de homología; véase Seed (1987), Nature, 329:840-842), y una molécula de señalización recientemente clonada expresada sobre células T citotóxicas y NK murinas denominada 2B4 (28% de homología; véase Matthew et al. (1993), J. Immunol., 151:5328-5337).

Utilizando una PCR para detectar transcritos en diversos tejidos y tipos celulares, resulta evidente que SLAM se expresa principalmente en células linfoides. Las células mononucleares de sangre periférica (PMBC) activadas contienen un transcrito de 1,9 kb, que corresponde al tamaño del ADNc de SLAM clonado, y también un transcrito de 4 kb. El ARNm de 4 kb está compuesto por al menos dos transcritos diferentes, incluyendo uno que codifica una forma segregada de SLAM que carece de 30 aminoácidos, incluyendo la región transmembrana de 22 aminoácido completa, y otro que codifica la SLAM transmembrana. También se identificó un clon de ADNc de 2 kb cortado de forma alternativa, que codifica una forma de SLAM con un dominio citoplásmico truncado.

El ARNm de SLAM se induce en 2 h después de la activación, lo cual se correlaciona con su rápida aparición sobre la superficie de las células T. La SLAM no se expresa sobre células T indiferenciadas CD45RA+, pero puede detectarse a niveles bajos sobre células T de memoria CD45RO^{high} en ausencia de la activación in vitro. La expresión SLAM es inducida con rapidez (en 3 h) sobre las células T CD45RA+ indiferenciadas y es potenciada sobre células T CD45RO^{high} después de la activación, y la expresión máxima se produce a las 6-8 h. Los timocitos fetales CD3^{low}, CD4+ y CD8+ inmaduros expresan SLAM, mientras que los timocitos más maduros CD^{high}, individuales CD4+ o CD8+ son, en su mayor parte, negativos. La SLAM se expresa a niveles muy bajos sobre células B periféricas y se sobrerregula con la activación, pero no está presente sobre monocitos.

La presencia de SLAM sobre células B y células T de memoria CD45RO^{high}, y la aparición natural de una forma soluble de SLAM, sugiere una función amplia de esta molécula. El descubrimiento de que la coestimulación a través de SLAM potencia respuestas proliferativas específicas de Ag e induce perfiles de producción de citoquinas Th0/Th1 en clones de células T, incluyendo clones de Th2, sugiere que la interacción entre SLAM y su ligando contribuirá a la expansión de células T y la generación de respuestas Th0 o Th1.

Además de sus efectos estimuladores directos sobre clones de células T, SLAM actúa como molécula coestimuladora para la activación de células T. Las respuestas proliferativas específicas de antígeno óptimas de células T de sangre periférica de donantes inmunizados con el toxoide del tétanos (TT) o derivado de proteína purificado (PPD) fueron aún más potenciadas de una manera dependiente de la dosis por la adición de A12 F(Ab')_{2}, indicando que la unión específica de SLAM es responsable de las respuestas de células T potenciadas. En general, se observó un aumento en 2-3 veces de la proliferación. De forma similar, la proliferación específica de antígeno óptima de clones de células T CD4+ fue potenciada en presencia de A12 o A12 F(Ab')_{2} de una manera dependiente de la dosis. Esta potenciación se observó con clones de células T CD4+ que pertenecen a los subgrupos Th2, Th0 y Th1. Los efectos coestimuladores mediados a través de SLAM sobre células T no se restringían a una estimulación específica de Ag, puesto que la proliferación de células T inducida por mAb anti-CD3 también fue potenciada por A12. Incluso a concen-
traciones anti-CD3 óptimas, se observó otro aumento en 2-3 veces de la proliferación tras la unión de SLAM por A12.

La producción de citoquinas por un panel de clones de células T CD4+ que pertenecen a diferentes subgrupos estimulados por sus respectivos antígenos fue sobrerregulada después de la unión de SLAM por A12. En particular, la producción de IFN-\gamma fue muy potenciada por A12 y A12 F(Ab')_{2}.

La coestimulación de clones de Th2 con A12 o su F(Ab')_{2} sobrerreguló en gran medida (en 5-7 veces) la producción de IFN-\gamma, mientras que no se produjeron efectos potenciadores o se produjeron efectos pequeños (en menos de 2 veces), de la producción de IL-4 en los cuatro clones ensayados. Los niveles de producción de IFN-\gamma inducidos en presencia de A12 por los clones de Th2 fueron comparables con los inducidos por el antígeno en clones de Th1 y Th0. Una coestimulación con A12 también potenció, de manera preferente, la producción de IFN-\gamma por los clones de Th0 y Th1. Por contraste con sus potentes efectos inductores de IFN-\gamma sobre clones de Th2, la coestimulación mediante SLAM no indujo la producción de IL-4 o IL-5 por parte de los clones de Th1.

Estos resultados indican que la coestimulación de células T mediante SLAM da como resultado una inducción preferente de la producción de IFN-\gamma, incluso en clones de células T CD4+ específicos de alergenos del subgrupo Th2, invirtiendo, con ello, el fenotipo de estas células hacia un perfil claro de producción de citoquinas Th0. Sin embargo, el patrón de producción de citoquinas que define a los clones de Th1 establecidos no resulta alterado por la coestimulación mediante SLAM.

Células T de sangre periférica activadas mediante PHA durante 5 días (PHA-blastos) proliferan directamente en respuesta a una estimulación con mAb anti-SLAM, indicando que una vez que se activan las células T mediante el receptor de las células T, el acoplamiento directo de SLAM da como resultado la expansión de las células T. Además, la activación de estos PHA-blastos con fragmentos F(Ab')_{2} anti-SLAM durante 24 horas da como resultado unos niveles altos de producción de IFN-\gamma, mientras que la IL-4 resulta indetectable, lo cual es indicativo de que el acoplamiento de SLAM da como resultado un perfil de producción de citoquinas Th1.

El mAb anti-SLAM, en presencia de PHA, es capaz de inducir la expansión a largo plazo de células T de sangre periférica CD4+ muy purificadas. Las células T continúan proliferando con un tiempo de duplicación estimado de 16 horas durante 9 semanas (que es el periodo máximo analizado) en respuesta a reestimulaciones semanales con PHA (1 \mug/ml) y mAb anti-SLAM (10 \mug/ml). Estos resultados, junto con la observación de que la unión de SLAM por F(Ab')_{2} anti-SLAM induce unos niveles altos de producción de IFN-\gamma (y, por tanto, un perfil de producción de citoquinas de tipo Th0, Th1) en clones de Th2 humanos, indican que el tratamiento con F(Ab')_{2} de mAb anti-SLAM, o fragmentos F(Ab')_{2} anti-SLAM humanizados, puede tener una utilidad clínica potencial en varias situaciones de enfermedad.

Los F(Ab')_{2} anti-SLAM, o composiciones de unión similares, pueden ser útiles para tratar, por ejemplo, deficiencias inmunológicas de células T adquiridas caracterizadas por una proliferación de células T específicas de antígeno defectuosa, como la que se observa en las infecciones por herpesvirus, tal como la infección por citomegalovirus. La aceleración del restablecimiento del compartimento de células T después de una quimioterapia y/o terapia de radiación en pacientes con cáncer, o después de una terapia inmunosupresora anterior a un transplante de médula ósea, pueden ser otros trastornos que se beneficiarían de la anterior terapia.

El anticuerpo SLAM o las composiciones de unión pueden utilizarse, por ejemplo, como adyuvantes para la vacunación o para compensar la disminución, mediada por VIH, de células T en pacientes de SIDA. Esta terapia también puede redirigir las respuestas de Th2 que provocan enfermedad (caracterizadas por unos altos niveles de producción de IL-4 e IL-5) en respuestas curativas de Th0 o Th1 caracterizadas por una producción de IFN-\gamma, por ejemplo, alergias alimentarias y a fármacos; rinitis; dermatitis atópica; asma; síndrome de hiper-IgE e hipereosinofilia; y enfermedades infecciosas, tales como lepra lepromatosa, véase Yamamura et al. (1991), Science, 254:277-279; leishmaniasis; enfermedad de Chagas; esquistomiasis; y tripanosomiasis, véase de Vries et al. (eds.) (1995), Interleukin-10, R.G. Landes Company, Austin, Texas, pp. 70 y 91.

Varios estudios han indicado que los patrones alterados de producción de citoquinas de células T están asociados con el avance de la patogénesis del SIDA. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), obtenidas a partir de individuos infectados por VIH-1 con infección temprana, son relativamente normales con respecto a sus perfiles de producción de citoquinas en respuesta a antígenos de recuerdo. En esta etapa asintomática, estas PBMC activadas producen predominantemente IL-2, y sólo niveles muy bajos de IL-4 e IL-10. Más adelante, en el rechazo de VIH, los perfiles cambian a unos niveles reducidos de producción de IL-2 y unos niveles aumentados de producción de IL-4 e IL-10. Véase Clerici et al. (1993), J. Clin. Invest., 91:759-765; y Clerici et al. (1994), J. Clin. Invest., 93:768-775. Además, las células Th2 parecen más susceptibles a la infección por VIH. Los anticuerpos SLAM o la composición de unión pueden ser útiles para redirigir las respuestas de Th2 (que favorecen la producción de anticuerpos) hacia respuestas de Th1 (que dirigen las respuestas mediadas por células). Esta terapia también puede ser beneficiosa en enfermedades que están provocadas por complejos inmunológicos, tales como la glomerulonefritis y la artritis juvenil.

Para identificar el ligando natural para SLAM, se generó una proteína de fusión de SLAM-inmunoglobulina (SLAM-Ig). La porción de SLAM de SLAM-Ig se unió específicamente a células L transfectadas de forma estable con SLAM. Además, SLAM-Ig interaccionó homofílicamente en disolución, demostrando que SLAM puede actuar como autoligando. La unión de SLAM-Ig a diversos tipos celulares también se correlaciona con su expresión de SLAM. A diferencia de otros ligandos descritos para células T, la SLAM expresada sobre células L proporciona una señal proliferativa directa para clones de células T humanas en ausencia de cualquier otro estímulo. Esta nueva actividad estimuladora proporcionada por la interacción homofílica de SLAM fue resistente a la ciclosporina.

Secuencias SLAM humanas

En SEQ ID NO: 1 y 2 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM1 humana (pSURslam1) y la secuencia de aminoácidos predicha. La secuencia conductora predicha y la secuencia transmembrana son los aminoácidos 1-27 y 237-258, aunque los límites naturales pueden ser diferentes, y también dependen del tipo celular. Un exón que codifica el dominio transmembrana que no está presente en SLAM3 humana (pSECslam) incluye los nucleótidos 761-780. Aparecen cisteínas en los aminoácidos numerados como 53, 57, 102, 125, 150, 155, 189 y 217. Los fragmentos entre cisteínas y/o sitios de glicosilación N-unidos son particularmente útiles en la generación de anticuerpos.

En SEQ ID NO: 3 y 4 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM2 humana (pSURslam2) y la secuencia de aminoácidos predicha. La SLAM2 humana aparentemente se diferencia de la SLAM1 humana por un acontecimiento de corte diferencial en una secuencia C-terminal diferente que empieza en el nucleótidos 924.

En SEQ ID NO: 5 y 6 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM3 humana (pSECslam) y la secuencia de aminoácidos predicha. La unión del corte y empalme en el que se deleciona la secuencia del dominio transmembrana de SLAM1 está en el nucleótido 761. La SLAM3 es segregada por células COS transfectadas con pSECslam, confirmando que SLAM3 codifica una forma soluble de SLAM. Empleando cebadores específicos para esta forma soluble de SLAM para una RT-PCR, se ha detectado el transcrito de SLAM3 en diferentes tipos celulares, confirmando que es un ARNm genuino.

En SEQ ID NO: 7 y 8 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM4 humana (pCYTslam) y la secuencia de aminoácidos predicha. El punto antes del cual la secuencia de SLAM4 se diferencia de SLAM1 se encuentra en el nucleótido 145. La presencia de este exón alternativo en el extremo 5' predice que la SLAM4 carece de una secuencia conductora. La molécula de SLAM4, cuando se expresa en células COS, no se transfiere de forma eficaz a la superficie celular y, probablemente, es citoplásmica. Empleando un cebador 5' específico para el exón 5' no traducido de SLAM4, y un cebador 3' específico para la región codificadora de SLAM para una RT-PCR, este transcrito se ha detectado en diferentes tipos celulares, confirmando que es un ARNm genuino.

En SEQ ID NO: 9, 10, 11 y 12 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM de ratón y la secuencia de aminoácidos predicha. Una versión de la SLAM de ratón es una proteína transmembrana de tipo I que contiene 9 sitios de glicosilación N-unidos potenciales. El P.M. no glicosilado predicho es de 40.000. La secuencia mostrada es para la SLAM1 de ratón (en el plásmido pMSLAM1), que es el ADNc de SLAM de 1,8 kb más abundante, pero, sin embargo, también se aisló otro ADNc de SLAM2 de 1,8 kb (en pMSLAM2), que representa aproximadamente 25% de los ADNc. La SLAM2 comparte aproximadamente el primer 1 kb de secuencia con la secuencia de SLAM1, pero tiene una secuencia diferente en su extremo 3'. Este ADNc de SLAM2 en pMSLAM2 codifica una proteína SLAM con un dominio citoplásmico diferente. La tabla 1 muestra un alineamiento de secuencias de proteína SLAM humana y de ratón seleccionadas. Igual que en el caso de la SLAM humana, la SLAM de ratón tiene, de forma típica, un dominio de inmunoglobulina V y otro C, y comparte una gran homología de aminoácidos con la SLAM humana a lo largo de la molécula entera, siendo 88% sustituciones conservativas. La homología a nivel de nucleótidos es de aproximadamente 70%. Esta proteína de ratón contiene ocho inserciones de aminoácidos separadas con relación a la SLAM humana. Las cisteínas en el dominio extracelular están todas conservadas, y el contexto de las tres tirosinas en el dominio citoplásmico se mantiene perfectamente. Las dos tirosinas distales en el dominio citoplásmico no están presentes en la molécula de SLAM2 de ratón cortada de forma alternativa, codificada por pSLAM2 (SEQ ID NO: 11 y 12), y la porción exclusiva de este dominio citoplásmico no comparte mucha homología con la SLAM humana. Existe una forma de SLAM humana cortada de forma alternativa con una cola citoplásmica diferente. La secuencia alternativa en pHSLAM2 no es homóloga con la secuencia exclusiva de la SLAM2 humana (pSURslam2) pero, sin embargo, la posición en la secuencia de nucleótidos en la que el exón alternativo se corta es idéntica en ambas secuencias.

Secuencias de SLAM de ratón

En SEQ ID NO: 9 y 10 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM1 de ratón (pMSALM1) y la secuencia de aminoácidos predicha. La secuencia conductora predicha y la secuencia transmembrana son los aminoácidos 1-28 y 242-267, aunque los límites naturales pueden ser diferentes, y también dependen del tipo celular. Aparecen cisteínas en los restos aminoácidos numerados como 32, 133, 161, 167, 212, 232, 276 y 310. Se encuentran sitios de glicosilación N-unidos potenciales en los restos numerados como 54, 58, 103, 126, 151, 158, 192, 210 y 226. Los fragmentos entre cisteínas y/o sitios de glicosilación N-unidos son particularmente útiles en la generación de anticuerpos.

En SEQ ID NO: 11 y 12 se muestran la secuencia de nucleótidos de SLAM2 de ratón (pMSALM2) y la secuencia de aminoácidos predicha. El punto tras el cual la secuencia de la SLAM2 de ratón se diferencia de la SLAM1 de ratón comienza en el nucleótido 944.

TABLA 1 Alineamiento de SLAM1 de ratón con SLAM1 humana. \bullet indica una cisteína conservada; * indica aminoácidos idénticos; . indica un aminoácido conservado; las cisteínas conservadas en el dominio citoplásmico están subrayadas

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Algo de homología resulta evidente en los dominios extracelulares de SLAM humana con las secuencias de proteína 2B4 de ratón, CD48 humana, y LFA-3 humana (CD58). El alineamiento de las secuencias revela porciones de homología compartida, de homología desapareada, de motivos comunes, y de características parcialmente compartidas.

Los antígenos naturales son capaces de mediar en diversas respuestas bioquímicas que conducen a respuestas biológicas o fisiológicas en células diana. La realización mejor caracterizada se describió, inicialmente, en seres humanos, pero en la presente también se describen variantes humanos y de ratón. También deberían estar disponibles otras secuencias para proteínas en otras especies de mamífero, por ejemplo, primates y roedores. Véase a continuación. Las descripciones a continuación están dirigidas, con objetivo de constituir un ejemplo, a una SLAM humana, pero también son aplicables, de forma similar, a las realizaciones relacionadas de otras especies.

La proteína SLAM humana aislada es una proteína que muestra características estructurales que son características de un antígeno de la superficie celular. La proteína se detecta con facilidad sobre tipos celulares particulares, otros expresan cantidades menores. Véase la tabla 2. La SLAM media en una respuesta biológica de unión a un anticuerpo, u otros ligandos aún no identificados, conduciendo a la transducción de señales y la respuesta celular. En particular, el antígeno SLAM se ha aislado mediante clonación de expresión utilizando un anticuerpo específico. El antígeno SLAM se aisló y caracterizó como una proteína que migra en una electroforesis en gel de poliacrilamida con una movilidad característica de una proteína de aproximadamente 70 kD. El núcleo de la proteína, después de un tratamiento con N-glicanasa, tiene una movilidad de aproximadamente una proteína de 40 kD.

TABLA 2 Expresión celular de SLAM. El ARN de diversas células y tejidos se sometió a transcripción inversa y PCR utilizando cebadores específicos de SLAM. Se proporcionan determinaciones cualitativas brutas, aunque un signo negativo puede significar simplemente unos niveles de detección por debajo del umbral. El timo también expresa el mensaje

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El antígeno SLAM debería estar presente en los tipos tisulares identificados, y la interacción del antígeno con su compañero de unión debe ser importante para mediar en los diversos aspectos de la fisiología o desarrollo celular.

II. SLAM purificada

En SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12 se muestran las secuencias de aminoácidos de SLAM humana y de ratón. Estas secuencias de aminoácidos, mostradas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi, son importantes porque proporcionan información de secuencia en el antígeno, permitiendo distinguir la proteína de otras otras proteínas y ejemplificando numerosos variantes. Además, las secuencias peptídicas permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer dichos segmentos, y permiten la preparación de sondas oligonucleotídicas, siendo ambas estrategias para la detección o aislamiento, por ejemplo, clonación, de genes que codifican dichas
secuencias.

Tal como se emplea en la presente, la expresión "SLAM humana" incluye, cuando se emplea en un contexto de proteínas, una proteína que tiene las secuencias de aminoácidos que aparecen en SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8, o un fragmento significativo de dicha proteína, u otra proteína muy homóloga derivada de un ser humano. Evidentemente, existen especies de ARNm que representan a los variantes de corte. También se refiere a un polipéptido de origen humano que muestra un función biológica similar o interacciona con componentes de unión específica de SLAM. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, se unen de forma típica a una SLAM con alta afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 nM, normalmente mejor que aproximadamente 30 nM, preferiblemente mejor que aproximadamente 10 nM, y más preferiblemente mejor que aproximadamente 3 nM. Deberían encontrarse proteínas homólogas en especies de mamíferos diferentes de la humana, por ejemplo, primates o roedores. Las especies que no son mamíferos también deberían poseer genes y proteínas estructural o funcionalmente relacionados, por ejemplo, aves y anfibios.

El término "polipéptido", tal como se utiliza en la presente, incluye un fragmento o segmento significativo, y abarca un tramo de restos aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, en general al menos aproximadamente 12 aminoácidos, de forma típica al menos aproximadamente 16 aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 20 aminoácidos y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos.

La expresión "composiciones de unión" se refiere a moléculas que se unen específicamente a SLAM, por ejemplo, de una manera de tipo apareamiento de adhesión celular, o una interacción antígeno-anticuerpo. También incluye compuestos, por ejemplo, proteínas, que se asocian específicamente con SLAM, incluyendo una interacción proteína-proteína fisiológicamente pertinente natural, de forma covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. Un análogo funcional puede ser un antígeno con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión apropiados. Los compuestos pueden actuar como agonistas o antagonistas de la interacción de unión, véase, por ejemplo, Goodman et al. (eds.) (1990), Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon
Press.

Sustancialmente puro significa, de forma típica, que la proteína está exenta de otras proteínas, ácido nucleicos u otros compuestos biológicos contaminantes derivados del organismo fuente original. La pureza puede ensayarse mediante métodos convencionales, de forma típica en peso, y normalmente será al menos aproximadamente 40% puro, en general al menos aproximadamente 50% puro, a menudo al menos aproximadamente 60% puro, de forma típica al menos aproximadamente 80% puro, preferiblemente al menos aproximadamente 90% puro, y en realizaciones más preferidas, al menos aproximadamente 95% puro. A menudo se añadirán vehículos o
excipientes.

La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad, incluyendo la temperatura, entorno de electrolitos, tamaño y características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. De forma típica, la temperatura a la cual el polipéptido se utiliza varía de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Normalmente, la temperatura que se emplea es mayor que aproximadamente 18ºC. Para fines de diagnóstico, la temperatura será normalmente la temperatura ambiente o mayor, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes en el ensayo. Para fines terapéuticos, la temperatura normalmente será la temperatura corporal, de forma típica aproximadamente 37ºC para seres humanos y ratones, aunque en ciertas situaciones la temperatura puede aumentarse o disminuirse in situ o in vitro.

El tamaño y estructura del polipéptido deberá estar, en general, en un estado sustancialmente estable y normalmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede asociarse con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociarse con lípidos o detergentes de una manera que se aproxima a las interacciones de bicapas lipídicas naturales.

El disolvente y los electrolitos normalmente serán un tampón biológicamente compatible, del tipo empleado para la conservación de actividades biológicas, y normalmente se aproxima a un disolvente acuoso fisiológico. Normalmente, el disolvente tendrá un pH neutro, de forma típica entre aproximadamente 5 y 10, y preferiblemente de aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se añadirán uno o más detergentes, de forma típica un detergente no desnaturalizante suave, por ejemplo, CHS (hemisuccinato de colesterol) o CHAPS (sulfonato de 3-[3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano), o a una concentración lo suficientemente baja para evitar la desorganización de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

III. Variantes físicos

Esta invención también incluye proteínas o péptidos que tiene una coincidencia de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SLAM según se define en las reivindicaciones adjuntas. Los variantes incluyen variantes de especie o alélicos.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o coincidencia de secuencia, se determina optimizando los apareamientos de restos, si es necesario introduciendo huecos según se requiera. Véase también Needleham et al. (1970), J. Mol. Biol., 48:443-453; Sankoff et al. (1983), capítulo uno en Time Waros, String Edit.; y Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de programas informáticos de IntelliGenetics: Mountain View, CA; y University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. La coincidencia de secuencia cambia cuando se consideran a las sustituciones conservativas como apareamientos. Las sustituciones conservativas, de forma típica, incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleuciona, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. De forma típica, las secuencias de aminoácidos homólogas pretenden incluir variaciones interespecíficas y alélicas naturales en cada respectiva secuencia de proteína. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán de 25-100% de coincidencia (si pueden introducirse huecos) a 50-100% de coincidencia (si se incluyen sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de SLAM. Las medidas de coincidencia serán al menos aproximadamente 35%, en general al menos aproximadamente 40%, a menudo al menos aproximadamente 50%, de forma típica al menos aproximadamente 60%, normalmente al menos aproximadamente 70%, preferiblemente al menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90%.

El ADN de SLAM aislado puede modificarse con facilidad mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones producen nuevas secuencias de ADN que codifican estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunogénica, antigénica u otra actividad funcional similares. Estas secuencias modificadas pueden utilizarse para producir antígenos mutantes o para potenciar la expresión. La expresión potenciada puede implicar la amplificación de genes, una mayor transcripción, una mayor traducción, y otros mecanismos. Una "SLAM mutante" incluye un polipéptido que, de otra manera, se encontraría dentro de la definición de coincidencia de secuencia de SLAM indicada anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la de SLAM que se encuentra normalmente en la naturaleza, mediante deleción, sustitución o inserción. Esto incluye, en general, proteínas que tienen una coincidencia significativa con una proteína que tiene las secuencias de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12, y que comparten diversas actividades biológicas, por ejemplo, antigénicas o inmunogénicas, con estas secuencias, y en realizaciones preferidas contienen la mayoría de las secuencias descritas de longitud completa. De forma típica, se prefieren las secuencias de longitud completa, aunque las versiones truncadas también serán útiles. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas SLAM, en particular las que se encuentran en diversos animales de sangre caliente, por ejemplo, mamíferos y aves. Estas descripciones pretenden, en general, incluir todas las proteínas SLAM, y no se limitan a las realizaciones de humano o ratón particulares específicamente analizadas.

También puede llevarse a cabo la mutagénesis de SLAM realizando inserciones o deleciones de aminoácidos. Pueden generarse sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación para llegar a un constructo final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi-terminales. Puede realizarse una mutagénesis aleatoria en un codón diana, y los mutantes expresados entonces seleccionarse para la actividad deseada. Los métodos para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante técnicas de mutágenesis del cebador M13 o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989); Ausubel et al. (1987 y suplementos); y Kunkel et al. (1987), Methods in Enzymol., 154:367-382.

La presente invención también proporciona proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas empleando segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que están fusionados de la misma manera en la naturaleza, pero no normalmente. Un concepto similar se aplica a secuencias de ácidos nucleicos heterólogas.

Además pueden producirse constructos nuevos combinando dominios funcionales similares procedentes de otras proteínas. Por ejemplo, la unión a la diana u otros segmentos pueden "intercambiarse" entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Véase, por ejemplo, Cunningham et al. (1989), Science, 243:1330-1336; y O'Dowd et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:15985-15992.

El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981), Tetra. Letts., 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. A menudo se puede obtener un fragmento bicatenario sintetizando la hebra complementaria y reasociando las hebras bajo condiciones apropiadas, o añadiendo la hebra complementaria empleando ADN polimerasa con una secuencia de cebador apropiada, por ejemplo, técnicas de PCR.

IV. Variantes funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a las SLAM puede ser el resultado de la inhibición de la unión del antígeno a su compañero de unión, por ejemplo, otro de sí mismo, probablemente a través de inhibición competitiva. Por tanto, los ensayos in vitro de la presente invención a menudo emplean proteína aislada, membranas de células que expresan una SLAM recombinante asociada a membrana, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión al antígeno de estas proteínas, o fragmentos unidos a sustratos en fase sólida. Estos ensayos también permiten la determinación diagnóstica de los efectos de las mutaciones y modificaciones de los segmentos de unión, o de las mutaciones y modificaciones del antígeno, por ejemplo, análogos de SLAM.

Esta invención también contempla el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos, por ejemplo, en los que anticuerpos neutralizantes contra el antígeno o fragmentos de unión compiten con un compuesto de ensayo por la unión a la proteína.

Los "derivados" de antígenos SLAM incluyen mutantes de secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes pueden prepararse mediante enlace de las funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos de SLAM, o en los N- o C-terminales, por ejemplo, mediante medios convencionales. Véase, por ejemplo, Lundblad y Noyes (1988), Chemical Reagents for Protein Modification, vol. 1-2, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL; Hugli (ed.) (1989), Techniques in Protein chemistry, Academic Press, San Diego, CA; y Wong (1991), Chemistry of Protein conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Ratón, FL.

En particular, se incluyen alteraciones de glicosilación, por ejemplo, realizadas mediante la modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas del procesamiento posteriores. Véase, por ejemplo, Elbein (1987), Ann. Rev. Biochem., 56:497-534. También se incluyen versiones de los péptidos con la misma secuencia de aminoácidos primaria que tienen otras modificaciones pequeñas, incluyendo restos aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre SLAM y otras proteínas homólogas o heterólogas. Muchos receptores de citoquinas u otras proteínas de superficie son multiméricas, por ejemplo, entidades homodiméricas, y un constructo de repetición puede tener diversas ventajas, incluyendo una menor susceptibilidad a la ruptura proteolítica. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de unión al receptor, de forma que la presencia o localización del ligando unido puede determinarse con facilidad. Véase, por ejemplo, Dull et al., patente de EEUU nº 4.859.609. Otros compañeros de fusión de genes incluyen \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, \beta-lactamasa, \alpha-amilasa, alcohol deshidrogenasa, factor \alpha de apareamiento de levadura, y marcadores de detección o purificación, tales como una secuencia FLAG de la secuencia His6. Véase, por ejemplo, Godowski et al. (1988), Science, 241:812-816.

Los péptidos de fusión se preparan, de forma típica, mediante métodos de ácidos nucleicos recombinantes o mediante métodos de polipéptidos sintéticos. Las técnicas para la manipulación y expresión de ácidos nucleicos se describen, en general, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y Ausubel et al. (eds.) (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield (1963), J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-2156; Merrifield (1986), Science, 232:341-347; Atherton et al. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IFL Press, Oxford; y Grant (1992), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman, NY.

Esta invención también contempla el uso de derivados de SLAM diferentes de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o glicosilación. Estos derivados pueden implicar la asociación covalente o agregativa con restos químicos. Los derivados covalentes o agregativos serán útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación, tales como para la purificación por afinidad de compañeros de unión, por ejemplo, otros antígenos. Una SLAM puede inmovilizarse mediante enlace covalente a un soporte sólido, tal como SEPHAROSE activado con bromuro de cianógeno, mediante métodos que son muy conocidos en la técnica, o adsorberse sobre superficies de poliolefina, con o sin reticulación con glutaraldehído, para su uso en el ensayo o purificación de anticuerpos anti-SLAM o una composición de unión alternativa. Las SLAM también pueden marcarse con un grupo detectable, por ejemplo, para su uso en ensayos de diagnóstico. La purificación de SLAM puede realizarse mediante un anticuerpo inmovilizado o un compañero de unión complementario.

Una SLAM solubilizada o fragmento de esta invención puede utilizarse como inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos para la unión al antígeno o sus fragmentos. El antígeno purificado puede emplearse para seleccionar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión al antígeno, que incluyen fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos naturales. Las SLAM purificadas también pueden emplearse como reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados del antígeno o fragmentos celulares que contienen el antígeno, pudiendo ambos ser un diagnóstico de un trastorno o enfermedad fisiológico anómalo o específico. Esta invención contempla anticuerpos generados contra secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de nucleótidos que aparecen en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11, o fragmentos de proteínas que las contienen. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión o están generados contra fragmentos específicos, los cuales se ha predicho que están fuera de la bicapa lipídica, extracelulares o intracelulares.

La presente invención contempla el aislamiento de otros variantes de especie estrechamente relacionadas. Los análisis de la transferencia Southern y Northern deberían establecer que entidades genéticas similares existen en otros mamíferos. Es probable que las SLAM estén ampliamente distribuidas en variantes de especie, por ejemplo, roedores, lagomorfos, carnívoros, artiodáctilos, perisodáctilos y primates.

La invención también proporciona un medio para aislar un grupo de antígenos relacionados que muestran diferenciaciones y similitudes en estructura, expresión y función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de las moléculas se acelerará en gran medida por el aislamiento y caracterización de otros variantes de especie diferenciados de ellos. En particular, la presente invención proporciona sondas útiles para identificar otras entidades genéticas homólogas en diferentes especies.

Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una correspondiente SLAM, por ejemplo, células o tipos de especies que carecen de los correspondientes antígenos y muestran actividad de fondo negativa. Esto debería permitir el análisis de la función de SLAM en comparación con células control no transformadas.

La disección de elementos estructurales críticos que llevan a cabo las diversas funciones de activación o diferenciación mediadas a través de estos antígenos resulta posible empleando técnicas convencionales de la biología molecular moderna, en particular para la comparación de miembros de la clase relacionada. Véase, por ejemplo, la técnica de mutagénesis de selección de homólogos descrita en Cunningham et al. (1989), Science, 243:1339-1336; y las estrategias en O'Dowd et al. (1988), J. Biol. Chem., 263:15985-15992; y Lechleiter et al. (1990), EMBO J., 9:4318-4390.

Las funciones intracelulares probablemente impliquen a segmentos del antígeno que normalmente están accesibles al citosol. Sin embargo, la internalización de la proteína puede producirse en ciertas circunstancias, y puede producirse una interacción entre los componentes intracelulares y los segmentos "extracelulares". Los segmentos específicos de interacción de SLAM con otros componentes intracelulares pueden identificarse mediante mutagénesis o medios bioquímicos directos, por ejemplo, métodos de entrecruzamiento o de afinidad. El análisis estructural mediante métodos cristalográficos u otros métodos físicos también será aplicable. Otras investigaciones acerca del mecanismo de la transducción de señales incluirán el estudio de los componentes asociados que pueden aislarse mediante métodos de afinidad o métodos genéticos, por ejemplo, análisis de complementación de mutantes.

Se perseguirá el estudio más a fondo de la expresión y control de SLAM. Los elementos controladores asociados con los antígenos deberían mostrar diferentes patrones fisiológicos, de desarrollo, de especificidad de tejido u otros patrones de expresión. Resultan interesantes las regiones genéticas cadena arriba o cadena abajo, por ejemplo, elementos de control. En particular, se han descubierto variantes fisiológicos o de desarrollo, por ejemplo, múltiples formas del antígeno procesadas de manera alternativa. Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y 3. Por tanto, el corte diferente del mensaje puede conducir a un conjunto de formas unidas a membrana, formas solubles, y versiones modificadas del antígeno.

Los estudios estructurales del antígeno conducirán al diseño de nuevos antígenos, en particular de análogos que muestran propiedades agonistas o antagonistas sobre la molécula. Esto puede combinarse con los métodos de selección descritos previamente para aislar antígenos que muestren los espectros deseados de actividades.

V. Anticuerpos

Pueden generarse anticuerpos contra diversas SLAM, incluyendo variantes alélicos o de especie, y sus fragmentos, tanto en la forma que aparece en la naturaleza como en sus formas recombinantes. Además, pueden generarse anticuerpos contra SLAM en sus formas activas o en sus formas inactivas, incluyendo las versiones nativas o desnaturalizadas. También se contemplan anticuerpos antiidiotípicos.

Pueden generarse anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones monocatenarias, contra fragmentos predeterminados de los antígenos mediante inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Se preparan anticuerpos monoclonales a partir de células que segregan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden seleccionarse para su unión a SLAM normales o defectuosas, o seleccionarse para la actividad agonista o antagonista, por ejemplo, mediada a través del antígeno o su compañero de unión. Estos anticuerpos monoclonales normalmente se unen con al menos una K_{D} de aproximadamente 1 mM, más habitualmente al menos aproximadamente 300 \muM, de forma típica al menos aproximadamente 100 \muM, de forma más típica al menos aproximadamente 30 \muM, preferiblemente al menos aproximadamente 10 \muM, y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 \muM o mejor.

Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden seleccionarse para la capacidad de unirse a los antígenos sin inhibir la unión de un compañero. Como anticuerpos neutralizantes, pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También serán útiles para la detección o cuantificación de la proteína SLAM o sus compañeros de unión. Véase, por ejemplo, Chan (ed.) (1987), Immunology: A Practical Guide, Academic Press, Orlando, FLA; Price y Newman (eds.) (1991), Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, N.Y.; y Ngo (ed.) (1988), Nonisotopic Immunoassay, Plenum Press, N.Y. Unos ensayos de absorción cruzada u otros ensayos identificarán anticuerpos que muestren diversos espectros de especificidades, por ejemplo, especificidades de especie exclusivas o compartidas.

Además, los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, de esta invención pueden ser potentes antagonistas que se unen al antígeno e inhiben la unión funcional o inhiben la capacidad de un compañero de unión para producir una respuesta biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y pueden acoplarse a toxinas o radionúclidos de forma que cuando el anticuerpo se une al antígeno, se destruye una célula que lo expresa, por ejemplo, sobre su superficie. Además, estos anticuerpos pueden conjugarse con fármacos u otros agentes terapéuticos, de forma directa o indirecta mediante un conector, y pueden realizar el transporte dirigido del fármaco.

Pueden unirse fragmentos de antígenos a otros materiales, en particular polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente, para utilizarse como inmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos pueden fusionarse o unirse covalentemente a una diversidad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa de agujero, albúmina de suero bovina, toxoide del tétanos, etc. Véase, Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1982), Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, Nueva York; Williams et al. (1967), Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1, Academic Press, Nueva York; y Harlow y Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY, para descripciones de métodos para preparar antisueros policlonales.

En algunos casos, resulta deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedantes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Puede encontrarse una descripción de las técnicas para preparar estos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, en Stites et al. (eds.), Basic and clinical immunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en ello; Harlow y Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.), Academic Press, Nueva York; y en particular, Kohler y Milstein (1975), Nature, 256:495-497, que analizan un método para generar anticuerpos monoclonales.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o, como alternativa, seleccionar bancos de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase, Huse et al. (1989), "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science, 246:1275-1281; y Ward et al. (1989), Nature, 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniendo, de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación, y se indican en profundidad en la bibliografía científica y de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que indican el uso de estos marcadores incluyen las patentes de EEUU nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.336.241. Además pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, véase, Cabilly, patente de EEUU nº 4.816.567; Moore et al., patente de EEUU nº 4642.334; y Queen et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención también pueden utilizarse para una cromatografía de afinidad para aislar la proteína. Pueden prepararse columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido. Véase, por ejemplo, Wilchek et al. (1984), Meth. Enzymol., 104:3-55.

Los anticuerpos generados contra cada SLAM también serán útiles para generar anticuerpos antiidiotípicos. Éstos serán útiles para detectar o diagnosticar diversos trastornos inmunológicos relacionados con la expresión de los respectivos antígenos.

VI. Ácidos nucleicos

Las secuencias peptídicas descritas y los reactivos relacionados son útiles para detectar, aislar o identificar un clon de ADN que codifica SLAM, por ejemplo, a partir de una fuente natural. De forma típica, serán útiles para aislar un gen de un mamífero, y procedimientos similares se aplicarán para aislar genes a partir de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente, tales como aves y mamíferos. Una hibridación cruzada permitirá el aislamiento de SLAM procedente de otras especies. Una serie de diferentes estrategias está disponible para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado.

La proteína o péptidos definidos purificados son útiles para generar anticuerpos mediante métodos convencionales, como se describió anteriormente. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada pueden presentarse a un sistema inmunológico para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, por ejemplo, Coligan (1991), Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Como alternativa, la SLAM puede utilizarse como un reactivo de unión específica, y pueden obtenerse ventajas de su especificidad de unión, de forma muy similar a la manera en que se emplea un anticuerpo.

Por ejemplo, la composición de unión específica puede utilizarse para seleccionar un banco de expresión preparado a partir de una línea celular que expresa una SLAM. La selección puede ser una tinción convencional de un antígeno expresado sobre la superficie, o mediante inmunoplaqueteo. La selección de la expresión intracelular también puede realizarse mediante diversos procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Las composiciones de unión pueden utilizarse para purificar por afinidad o para escoger las células que expresan la proteína.

Los segmentos de péptidos también pueden utilizarse para predecir los oligonucleótidos apropiados para seleccionar un banco. El código genético puede emplearse para seleccionar los oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para la selección. Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ó 3. En combinación con las técnicas de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar los clones correctos a partir de un banco. Las secuencias complementarias también pueden utilizarse como sondas, cebadores, o hebras antisentido. Basándose en la identificación del dominio extracelular probable, diversos fragmentos deberían ser particularmente útiles, por ejemplo, acoplados con técnicas de PCR complementario de poli-A o vector anclado, o con ADN complementario de otros péptidos.

La invención contempla el uso de ADN aislado o fragmentos que codifican un correspondiente polipéptido SLAM biológicamente activo. Además, esta invención cubre un ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo que es capaz de hibridarse bajo las condiciones apropiadas con las secuencias de ADN descritas en la presente. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser un antígeno intacto, o un fragmento, y tiene una secuencia de aminoácidos descrita, por ejemplo, en SEQ ID NO: 1 ó 3. Además, esta invención cubre el uso de ADN aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifica proteínas que son homólogas a una SLAM, o que se aisló utilizando ADNc que codifica una SLAM como sonda. El ADN aislado puede tener las respectivas secuencias reguladoras en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición de poli-A y otros.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN o un polímero mixto, que está sustancialmente separado de otros componentes que, en la naturaleza, acompañan a la secuencia nativa, por ejemplo, ribosomas, polimerasas y/o secuencia genómicas flanqueantes de la especie originadora. El término incluye una secuencia de ácido nucleico que se ha retirado del entorno en que aparece en la naturaleza, e incluye aislados de ADN recombinante o clonado y análogos químicamente sintetizados, o análogos biológicamente sintetizados mediante sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula. En general, el ácido nucleico estará en un vector o un fragmento menor que aproximadamente 50 kb, normalmente menor que aproximadamente 30 kb, de forma típica menor que aproximadamente 10 kb, y preferiblemente menor que aproximadamente 6 kb.

Un ácido nucleico aislado será, en general, una composición homogénea de moléculas, pero en algunas realizaciones contendrá una pequeña heterogeneicidad. Esta heterogeneicidad se encuentra, de forma típica, en los extremos del polímero o en porciones que no son críticas para una función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico "recombinante" se define mediante su método de producción, o su estructura. Haciendo referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto fabricado mediante un proceso, el proceso es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que implican una intervención humana en la secuencia de nucleótidos, de forma típica selección o producción. Como alternativa, puede ser un ácido nucleico fabricado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que, en la naturaleza, no están contiguos, pero pretende excluir productos de la naturaleza, por ejemplo, mutantes que aparecen en la naturaleza. Así, por ejemplo, se incluyen los productos fabricados transformando células con cualquier vector que no aparece en la naturaleza, como son los ácidos nucleicos que incluyen una secuencia obtenida utilizando cualquier proceso con oligonucleótidos sintéticos. Esto se hace a menudo para sustituir un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, al mismo tiempo que, de forma típica, se introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencia.

Como alternativa, se pueden unir entre sí segmentos de ácidos nucleicos con las funciones deseadas para generar una única entidad genética que comprende una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales que se encuentran habitualmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son, a menudo, la diana de estas manipulaciones artificiales, pero otras dianas específicas de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación del ADN, secuencias de regulación, secuencias control u otras características útiles pueden incorporarse mediante diseño. Se pretende un concepto similar para un polipéptido recombinante, por ejemplo, de fusión. Se incluyen específicamente ácidos nucleicos sintéticos que, mediante la redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias procedentes de diversos variantes de especie diferentes.

Un "fragmento" significativo en un contexto de ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, en general al menos aproximadamente 22 nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 29 nucleótidos, más a menudo al menos aproximadamente 35 nucleótidos, de forma típica al menos aproximadamente 41 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 55 nucleótidos, y en realizaciones particularmente preferidas será al menos aproximadamente 60 o más nucleótidos.

Un ADN que codifica una proteína SLAM será particularmente útil para identificar genes, ARNm y especies de ADNc que codifican proteínas relacionadas u homólogas, así como ADN que codifican proteínas homólogas procedentes de diferentes especies. Probablemente existen homólogos en otras especies, incluyendo primates, roedores y aves. Diversas proteínas SLAM deberían ser homólogas y se incluyen en la presente. Sin embargo, incluso proteínas que tienen una relación evolutiva más lejana con el antígeno pueden aislarse con facilidad bajo condiciones apropiadas utilizando estas secuencias, si son lo suficientemente homólogas. Las proteínas SLAM de primates tienen un interés particular.

Los clones recombinantes derivados de secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos, por ejemplo, células y organismos transgénicos, y para la terapia génica. Véase, por ejemplo, Goodnow (1992), "Transgenic Animals", en Roitt (ed.), Encyclopedia of Immunology, Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992), Science, 256:1392-1394; Kuhn et al. (1991), Science, 254:707-710; Capecchi (1989), Science, 244:1288; Robertson (1987) (ed.), Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Rosenberg (1992), J. Clinical Oncology, 10:180-199.

Una homología sustancial en el contexto de la comparación de una secuencia de ácido nucleico significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están óptimamente alineados, con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, al menos en aproximadamente 50% de los nucleótidos, en general al menos aproximadamente 58%, normalmente al menos aproximadamente 65%, a menudo al menos aproximadamente 71%, de forma típica al menos aproximadamente 77%, habitualmente al menos aproximadamente 85%, preferiblemente al menos aproximadamente de 95 al 98% o más, y en realizaciones particulares, una cifra tan alta como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Como alternativa, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibridan bajo condiciones de hibridación selectiva, con una hebra, o su complemento, de forma típica utilizando una secuencia de SLAM, por ejemplo, en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11. De forma típica, la hibridación selectiva se producirá cuando existe al menos aproximadamente 55% de homología a lo largo de un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 75% a lo largo de un tramo de aproximadamente 25 nucleótidos, y lo más preferible al menos aproximadamente 90% a lo largo de aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984), Nuc. Acids Res., 12:203-213. La longitud de la comparación de la homología, como se describe, puede realizarse en tramos más largos, y en ciertas realizaciones se realizará a lo largo de un tramo de aproximadamente 17 nucleótidos, normalmente al menos aproximadamente 28 nucleótidos, de forma típica al menos aproximadamente 40 nucleótidos, y preferiblemente al menos aproximadamente 75 a 100 o más
nucleótidos.

Unas condiciones rigurosas, en referencia a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones rigurosas combinadas de sales, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, de forma típica los que se controlan en las reacciones de hibridación. Una condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas en exceso de aproximadamente 30ºC, normalmente en exceso de aproximadamente 37ºC, de forma típica en exceso de aproximadamente 55ºC, preferiblemente en exceso de aproximadamente 70ºC. Una condiciones de sales rigurosas normalmente serán de menos de aproximadamente 1000 nM, normalmente menos de aproximadamente 400 mM, de forma típica menos de aproximadamente 250 nM, preferiblemente menos de aproximadamente 150 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968), J. Mol. Biol., 31:349-370.

La SLAM de otras especies de mamífero puede clonarse y aislarse mediante hibridación cruzada entre especies, de especies muy relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies lejanamente relacionadas y, por tanto, la hibridación de especies relativamente muy relacionadas resulta recomendable. Como alternativa, la preparación de una preparación de anticuerpos que muestra menos especificidad de especie puede ser útil en estrategias de clonación de expresión.

VII. Preparación de SLAM; miméticos

El ADN que codifica la SLAM o sus fragmentos puede obtenerse mediante síntesis química, selección de bancos de ADNc, o selección de bancos genómicos preparados a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejido. Véase, por ejemplo, Okayama y Berg (1982), Mol. Cell. Biol., 2:161-170; Gubler y Hoffman (1983), Gene, 25:263-269; y Glover (ed.) (1984), DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Como alternativa, las secuencias proporcionadas en la presente proporcionan cebadores de PCR útiles, o permiten la preparación sintética, o de otra forma, de genes adecuados que codifican una SLAM.

Este ADN puede expresarse en una amplia variedad de células hospedantes para la síntesis de una SLAM de longitud completa o de fragmentos que, a su vez, por ejemplo, pueden utilizarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función.

Los vectores, tal como se utilizan en la presente, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del hospedante. Véase, por ejemplo, Pouwels et al. (1985 y suplementos), Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodríguez et al. (1988) (eds.), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Para los fines de esta invención, las secuencias de ADN se unen operablemente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, un ADN para una presecuencia o conductor de la secreción se une operablemente a un polipéptido si se expresa como una preproteína o participa para dirigir al polipéptido hacia la membrana celular o para la secreción del polipéptido. Un promotor se une operablemente a una secuencia codificadora si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión a ribosomas se une operablemente a una secuencia codificadora si está colocado para permitir la traducción. Normalmente, unido operablemente significa contiguo y en marco de lectura pero, sin embargo, ciertos elementos genéticos, tales como genes represores, no están unido de forma contigua, pero se siguen uniendo a secuencias operadoras que, a su vez, controlan la expresión. Véase, por ejemplo, Rodríguez et al., capítulo 10, pp. 205-236; Balbas y Bolívar (1990), Methods in Enzymology, 185:13-37; y Ausubel et al. (1993), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, NY.

Los ejemplos representatives de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase, Okayama et al. (1985), Mol. Cell Biol., 5:1136-1142; pMC1neo poli-A, véase, Thomas et al. (1987), Cell, 51:503-512; y un vector de baculovirus, tal como pAC 373 o pAC 610. Véase, por ejemplo, Miller (1988), Ann. Rev. Microbiol., 42:177-199.

A menudo será deseable expresar un polipéptido SLAM en un sistema que proporcione un patrón de glicosilación específico o definido. Véase, por ejemplo, Luckow y Summers (1988), Bio/Technology, 6:47-55; y Kaufman (1990), Meth. Enzymol., 185:487-511.

La SLAM, o su fragmento, puede modificarse para unirse a través de fosfatidilinositol (PI) a una membrana celular, pero puede retirarse de las membranas mediante un tratamiento con una enzima de escisión de fostaditilinositol, por ejemplo, fosfatidilinositol fosfolipasa-C. Esto libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos convencionales de la química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989), Biochim. Biophys. Acta, 988:427-454; Tse et al. (1985), Science, 230:1003-1008; y Brunner et al. (1991), J. Cell Biol., 114:1275-1283.

Una vez la SLAM se ha caracterizado, sus fragmentos o derivados pueden prepararse mediante procesos convencionales para sintetizar péptidos. Éstos incluyen procesos tales como los descritos en Stewart y Young (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984), The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; Bodanszky (1984), The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; y Villafranca (ed.) (1991), Techniques in Protein Chemistry II, Academic Press, San Diego, Ca.

VIII. Usos

La presente invención proporciona reactivos que se emplearán en aplicaciones de diagnóstico como se describe en otro punto en la presente, por ejemplo, en la descripción general para trastornos mediados por células T, o a continuación en la descripción de kits para el diagnóstico.

La invención también proporciona reactivos con un valor terapéutico significativo. La SLAM (que aparece en la naturaleza o recombinante), sus fragmentos, y los anticuerpos contra ellos, junto con compuestos que se ha identificado que tienen afinidad de unión a SLAM, serán útiles en el tratamiento de trastornos asociados con un desarrollo o fisiología anómalos, incluyendo la proliferación anómala, por ejemplo, trastornos cancerosos, o trastornos degenerativos. En particular, la modulación del desarrollo de células linfoides se logrará mediante el tratamiento terapéutico apropiado empleando las composiciones proporcionadas en la presente. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con la expresión anómala o la señalización anómala por una SLAM sería una diana probable para un agonista o antagonista del antígeno. El antígeno desempeña un papel en la regulación o desarrollo de células hematopoyéticas, por ejemplo, células linfoides, que afectan a respuestas inmunológicas, por ejemplo, enfermedades autoinmunológicas.

En particular, se ha demostrado que el antígeno proporciona una señal coestimuladora para la activación de células T. Por tanto, la SLAM desempeña un papel en las interacciones entre células T y células T. Estas interacciones conducen, en contextos particulares, a la proliferación celular, una síntesis de citoquinas potenciada por parte de las células, y la consiguiente amplificación de la proliferación de células T.

Además, la producción inducida por SLAM de interferón-\gamma sugiere que ciertos agonistas de SLAM pueden dirigir las respuestas de células T hacia la vía de Th0/Th1 y, por tanto, suprimir una respuesta de tipo Th2. Entre estos agonistas estarán diversos anticuerpos que reconocen a los epitopos apropiados, por ejemplo, que imitan la unión de SLAM a su ligando.

Al contrario, los antagonistas de SLAM, tales como la forma segregada que aparece en la naturaleza de SLAM o los anticuerpos bloqueantes, pueden proporcionar una manera selectiva y poderosa para bloquear las respuestas inmunológicas en situaciones anómalas, por ejemplo, enfermedades autoinmunológicas, incluyendo artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis autoinmunológica de Hashimoto, así como respuestas inflamatorias agudas y crónicas en las que la activación, expansión de células T y/o la memoria inmunológica de células T desempeña un papel importante. Véase, también, Samter et al. (eds.), Immunological Diseases, vol. 1 y 2, Little, Brown and Co. La supresión de la activación, expansión y/o liberación de citoquinas de células T por la forma segregada de SLAM que aparece en la naturaleza, que puede producirse en grandes cantidades mediante métodos recombinantes, o mediante anticuerpos bloqueantes, debería ser eficaz en muchos trastornos en los que las respuestas anómalas de células T son importantes.

Parece que la SLAM se coexpresa con CD45RO, que es un marcador para células T cebadas o de memoria. La SLAM también está ausente en células CD45RA, que representan el subgrupo de células T indiferenciadas. Como tal, la SLAM también puede actuar como marcador de diagnóstico para las células T de memoria.

Se conocen diversos trastornos anómalos en cada uno de los tipos celulares que se ha demostrado que poseen ARNm de SLAM mediante análisis de la transferencia Northern. Véase, Berkow (ed.), The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.; y Weatherall et al. (eds.), Oxford Textbook of Medicine, Oxford University Press, Oxford. Muchas otras enfermedades y trastornos médicos implican a las células T, o están mediados por células T, y muchos de éstos responderán al tratamiento con un agonista o antagonista proporcionado en la presente. Véase, por ejemplo, Stites y Terr (eds., 1991), Basic and Clinical Immunology, Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; y Samter et al. (eds.), Immunological Diseases, Little, Brown and Co. Estos problemas son susceptibles a la prevención o tratamiento utilizando las composiciones proporcionadas en la presente.

Los anticuerpos de SLAM pueden purificarse y después administrarse a un paciente, veterinario o humano. Estos reactivos pueden combinarse para un uso terapéutico con otros ingredientes activos o inertes, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizantes, excipientes o conservantes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden esterilizarse mediante filtración y colocarse en formas de dosificación, tal como mediante liofilización, en viales de dosificación, o conservarse en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión, incluyendo formas que no se unen al complemento.

La selección de fármacos utilizando SLAM o sus fragmentos puede realizarse para identificar compuestos que tienen afinidad de unión a SLAM u otros efectos biológicos pertinentes sobre funciones de SLAM, incluyendo el aislamiento de componentes asociados. Entonces pueden emplearse posteriores ensayos biológicos para determinar si el compuesto tiene una actividad estimuladora intrínseca y, por tanto, es un bloqueante o antagonista porque bloquea la actividad del antígeno. De forma similar, un compuesto que tiene una actividad estimuladora intrínseca puede activar la vía de señalización y, por tanto, es un agonista porque estimula la actividad de SLAM. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos bloqueantes contra SLAM como antagonistas, y de anticuerpos estimuladores, por ejemplo, A12, como agonistas. Esta estrategia será particularmente útil con otros variantes de especie de SLAM.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio de la diana, el estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. Por tanto, las dosificaciones del tratamiento deben valorarse para optimizar la seguridad y eficacia. De forma típica, las dosificaciones empleadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidad útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo con animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos concretos proporcionará más indicaciones predictivas de la dosificación humana. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al. (eds.) (1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. En estos trabajos se analizan los métodos de administración y también a continuación, por ejemplo, para la administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, la difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, disolución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en Merck Index, Merck & Co., Rahway, Nueva Jersey. Normalmente, se espera que los intervalos de dosificación estén en cantidades menores que concentraciones de 1 mM, de forma típica en concentraciones menores que aproximadamente 10 \muM, habitualmente menores que aproximadamente 100 nM, preferiblemente menores que aproximadamente 10 pM (picomolar), y lo más preferible menores que aproximadamente 1 fM (fentomolar), con un vehículo apropiado. Las formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta, a menudo se utilizarán para una administración continua o a largo plazo. Véase, por ejemplo, Langer (1990), Science, 249:1527-1533.

La SLAM, sus fragmentos, y los anticuerpos contra ella o sus fragmentos, antagonistas y agonistas pueden administrarse directamente al hospedante que se va a tratar o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede resultar deseable conjugarlos con proteínas vehículo, tales como ovoalbúmina o albúmina de suero, antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en cualquier formulación de dosificación convencional. Aunque es posible administrar el ingrediente activo por sí solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden, de forma típica, al menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos acetables para ello. Cada vehículo debe ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable, en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse de modo conveniente en una forma de dosificación unitaria, y pueden prepararse mediante métodos muy conocidos en la técnica de la farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman et al. (eds.) (1990), Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis et al. (eds.) (1993), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, Nueva York; Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Dekker, Nueva York; y Lieberman et al. (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, Nueva York. La terapia de esta invención puede combinarse o utilizarse junto con otros agentes.

Tanto las formas de SLAM que aparecen en la naturaleza como las formas recombinantes de esta invención son particularmente útiles en kits y métodos de ensayo que son capaces de seleccionar compuestos para la actividad de unión a las proteínas. En años recientes se han desarrollado varios métodos de ensayos automáticos para permitir la selección de decenas de miles de compuestos en un corto periodo de tiempo. Véase, por ejemplo, Fodor et al. (1991), Science, 251:767-773, que describe medios para ensayar la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados puede ser facilitado, en gran medida, por la disponibilidad de grandes cantidades de SLAM purificada, soluble, según proporciona esta invención.

Pueden emplearse otros métodos para determinar los restos críticos en las interacciones SLAM-SLAM. Pueden realizarse ensayos mutacionales, por ejemplo, véase, Somoza et al. (1993), J. Exptl. Med., 178:549-558, para determinar los restos específicos críticos en la interacción y/o señalización, en los dominios extracelulares, implicados en la interacción homofílica, o los dominios intracelulares, que proporcionan interacciones importantes en la señalización intracelular.

Por ejemplo, normalmente pueden encontrarse antagonistas una vez que el antígenos se ha definido estructuralmente, por ejemplo, mediante datos de la estructura terciaria. El ensayo de análogos de interacción potencial es posible en este momento tras el desarrollo de métodos de ensayo muy automáticos que emplean una SLAM purificada. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas empleando las técnicas de selección descritas en la presente. De particular importancia son los compuestos que se descubra que tienen una afinidad de unión combinada por un espectro de moléculas SLAM, por ejemplo, compuestos que pueden actuar como antagonistas para variantes de especie de SLAM.

Un método para la selección de fármacos utiliza células hospedantes eucariotas o procariotas que están transformadas de forma estable con moléculas de ADN recombinante que expresan una SLAM. Pueden aislarse células que expresen una SLAM aislada de otras moléculas. Estas células, en forma viable o fijadas, pueden emplearse para ensayos de unión del compañero de unión convencionales. Véase, también, Parce et al. (1989), Science, 246:243-247; y Owicki et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4007-4011, que describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares.

Otra técnica para la selección de fármacos implica una estrategia que proporciona una selección de alta capacidad de procesamiento para compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada por una SLAM, y se describe en detalle en Geysen, solicitud de patente europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre, 1984. En primer lugar, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de ensayo de péptidos pequeños sobre un sustrato sólido, por ejemplo, varillas de plástico u otra superficie apropiada, véase Fodor et al. (1991). Después todas las varillas se hacen reaccionar con SLAM solubilizada y no purificada o solubilizada y purificada, y se lava. La siguiente etapa implica detectar la SLAM unida.

El diseño de fármacos lógico también puede basarse en estudios estructurales de las formas moleculares de la SLAM y otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que median en otras funciones en respuesta a la unión, u otras proteínas que normalmente interaccionan con SLAM. Un medio para determinar cuáles son los sitios que interacción con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensional. Éstas proporcionarán una guía para saber cuáles son los restos aminoácidos que forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976), Protein Crystallography, Academic Press, Nueva York.

IX. Kits

Esta invención también contempla el uso de proteínas SLAM, sus fragmentos, péptidos y sus productos de fusión en una diversidad de kits de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de otra SLAM o compañero de unión. De forma típica, el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido SLAM definido o segmento génico, o un reactivo que reconoce uno u otro, por ejemplo, fragmentos o anticuerpos SLAM.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo por una SLAM comprende, de forma típica, un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo, un compañero de unión o anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida por SLAM; una fuente de SLAM (que aparece en la naturaleza o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la molécula. Cuando se han seleccionado los compuestos, los que tienen una afinidad de unión adecuada por el antígeno pueden evaluarse en ensayos biológicos adecuados, como se conoce en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas de la vía de señalización de SLAM. La disponibilidad de polipéptidos SLAM recombinantes también proporciona patrones bien definidos para calibrar dichos ensayos.

Un kit preferido para determinar la concentración, por ejemplo, de una SLAM en una muestra comprenderá, de forma típica, un compuesto marcado, por ejemplo, un compañero de unión o anticuerpo, que tiene una afinidad de unión conocida por el antígeno, una fuente de antígeno (que aparece en la naturaleza o recombinante), y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar la SLAM. Normalmente se proporcionarán compartimentos que contienen reactivos e instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, específicos para SLAM o los fragmentos son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de SLAM y/o sus fragmentos. Estos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales, y también pueden implicar la detección de antígenos relacionados con el antígeno en el suero, o similares. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de antígeno-compañero de unión) o heterogéneo (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA), inmunoensayo de enzimas (EIA), técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT), inmunoensayo fluorescente con sustrato marcado (SLFIA), y similares. Véase, por ejemplo, Van Vunakis et al. (1980), Meth. Enzymol., 70:1-525; Harlow y Lane (1980), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; y Coligan et al. (eds.) (1993), Current Protocols in Immunology, Greene y Wiley, NY.

Los anticuerpos antiidiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra SLAM, como puede ser el diagnóstico de diversos estados anómalos. Por ejemplo, la sobreproducción de SLAM puede dar como resultado la producción de diversas reacciones inmunológicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anómalos, en particular en trastornos de células proliferativas, tales como cáncer, o activación o diferenciación anómalas.

Con frecuencia, los reactivos en los ensayos de diagnóstico se suministran en kits, para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo y el marcador, se proporciona el anticuerpo o compañero de unión, marcado o no marcado, o SLAM marcada. Esto se hace normalmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señales, tales como sustratos para enzimas y similares. Preferiblemente, el kit también contendrá instrucciones para el uso apropiado y la eliminación de los contenidos después del uso. De forma típica, el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. De forma deseable, los reactivos se proporcionan como un polvo liofilizado seco, mediante el cual los reactivos pueden reconstituirse en un medio acuoso para proporcionar las concentraciones apropiadas de reactivos para realizar el ensayo.

Cualquiera de los constituyentes mencionados anteriormente de la selección de fármacos y los ensayos de diagnóstico pueden utilizarse sin modificación, o pueden modificarse en una diversidad de formas. Por ejemplo, puede realizarse el marcaje uniendo de forma covalente o no covalente un resto que proporciona, directa o indirectamente, una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el compañero de unión, el compuesto de ensayo, la SLAM o los anticuerpos contra éstos, pueden marcarse directa o indirectamente. Las posibilidades para el marcaje directo incluyen grupos marcadores: radiomarcadores, tales como ^{125}I, enzimas (patente de EEUU nº 3.645.090), tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de EEUU nº 3.940.475) capaces de controlar el cambio en la intensidad de fluorescencia, desplazamiento de la longitud de onda, o polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para el marcaje indirecto incluyen la biotinilación de un constituyente, seguido de la unión a avidina acoplada a uno de los anteriores grupos marcadores.

También existen numerosos métodos para separar la SLAM unida de la SLAM libre o, como alternativa, la SLAM unida del compuesto de ensayo libre. La SLAM se inmoviliza sobre diversas matrices, seguido de lavados. Las matrices adecuadas incluyen plástico, tal como placas de ELISA, filtros, y esferas. Véase, por ejemplo, Coligan et al. (eds.) (1993), Current Protocols in Immunology, vol. 1, capítulo 2, Greene and Wiley, NY. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables de anticuerpos de fluoresceína descrito en Rattle et al. (1984), Clin. Chem., 30:1457-1461, y la separación de partículas magnéticas de anticuerpos dobles según se describe en la patente de EEUU nº 4.659.678.

Los métodos para unir proteínas o sus fragmentos a los diversos marcadores se han indicado en profundidad en la bibliografía y no requieren un análisis detallado en la presente. Muchas de la técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados, a través del uso de carbodiimida o ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante la reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado, tal como cloroacetilo, o una olefina activada, tal como maleimida, para el enlace, o similares. Las proteínas de fusión también tienen uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas tomadas de la secuencia de una SLAM. Estas secuencias pueden utilizarse como sondas para detectar niveles del mensaje de SLAM en muestras de pacientes sospechosos de tener un trastorno anómalo, por ejemplo, cáncer o un problema de desarrollo. La preparación de secuencias de nucleótidos de ARN y ADN, el marcaje de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias han recibido un amplio análisis y descripción en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Langer-Safer et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., 79:4381-4385; Caskey (1987), Science, 236:962-967; y Wilchek et al. (1988), Anal. Biochem., 171:1-32.

También se contemplan kits de diagnóstico que también ensayen la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagóstico o la prognosis pueden depender de la combinación de múltiples indicaciones empleadas como marcadores. Por tanto, los kits pueden ensayar una combinación de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet et al. (1989), Progress in Growth Factor Res., 1:89-97.

La unión de SLAM-Ig a células L transfectadas con SLAM demuestra que la SLAM puede interaccionar con sí misma como ligando. Una electroforesis en gel nativo de SLAM-Ig purificada indica directamente, con la existencias de formas de alto peso molecular, que las moléculas de SLAM-Ig también son capaces de una interacción homofílica en disolución. Aunque las formas monómeras y dímeras de SLAM-Ig son predominantes en el gel nativo, no se observaron bandas diferenciadas, lo cual indica que se produce una interacción molecular bastante débil, susceptible a la disociación durante la electroforesis. En efecto, el nivel de unión de SLAM-Ig a células L que expresan SLAM fue menor que el observado utilizando una concentración equivalente de anticuerpo monoclonal, lo cual sugiere que la interacción SLAM-SLAM es más débil que la interacción del mAb A12 con SLAM. Las interacciones entre otros miembros de la superfamilia de Ig son sustancialmente más débiles que la interacción de los anticuerpos (van der Merwe y Barclay (1994), TIBS, 19:354-358). En coherencia con que la SLAM es un ligando para ella misma, se observó unión de SLAM-Ig sobre clones de células T y células B transformadas con EBV, expresando ambos tipos celulares unos niveles significativos de SLAM. Los niveles de SLAM sobre células T CD45RO+ de PBMC se correlacionaban con los niveles de unión de SLAM-Ig después de la activación. Estos datos no excluyen que pueda haber otro ligando para SLAM, pero no existen pruebas de otro ligando, puesto que, hasta la fecha, ningún tipo celular SLAM-negativo ensayado ha mostrado unión de SLAM-Ig, y cuando se observó unión de SLAM-Ig ésta era proporcional al nivel de expresión de SLAM.

En coherencia con las pruebas bioquímicas de que la SLAM es, en sí misma, un ligando natural, células L transfectadas con SLAM pueden proporcionar una señal coestimuladora directa para clones de células T CD4+. La unión de SLAM con mAb A12 proporciona una señal coestimuladora significativa para la activación de células T. Tal como se observó para el mAb A12 agonista, la activación de clones de células T CD4+ a través de SLAM expresada sobre las células L, en combinación con anti-CD3, conduce a un gran aumento en la proliferación. La coestimulación de la proliferación con dosis subóptimas de anti-CD3 se observó con transfectantes de SLAM. La estimulación proporcionada por células L transfectadas con SLAM fue lo suficientemente sustancial como para conducir directamente a la proliferación de células T en ausencia de otros estímulos. A este respecto, la señal estimuladora directa proporcionada por SLAM expresada sobre células L es exclusiva, y no se observa incluso para las moléculas coestimuladoras clásicas B7 (Jenkins y Johnson (1993), Curr. Opin. Immunol., 5:361-367) y B70 (Azuma et al. (1993), Nature,
366:76-79).

El ligando para B7 es CD28, y los mAb anti-CD28 no estimulan directamente la proliferación de clones de células T. Sin embargo, el mAb A12 anti-SLAM, o sus fragmentos F(Ab')_{2}, pueden inducir directamente la proliferación de células T. Las consecuencias de la unión de SLAM sobre los clones de células T por SLAM sobre células L transfectadas, o por mAb A12 o sus fragmentos F(Ab')_{2}, son concordantes. Por tanto, la unión directa de SLAM, sin la implicación de otras moléculas en la interacción, es suficiente para inducir los efectos funcionales observados. Esto no excluye la posible interacción de SLAM con moléculas transductoras de señales, ni disminuye la importancia de otras interacciones de moléculas de la superficie celular para lograr los efectos funcionales más potentes de la unión de SLAM, tales como los tremendos efectos coestimuladores a través de SLAM sobre células T estimuladas de manera específica de antígeno.

El gen SLAM se localizó en la interfase de las bandas q21.3 y q22 sobre el cromosoma 1 humano. Esta región del cromosoma 1 parece ser un locus importante para genes implicados en las interacciones célula-célula. Los genes para selectinas (Watson et al. (1990), J. Exp. Med., 172:263-272), las moléculas implicadas en la adhesión y tráfico de leucocitos, también se localizan en 1q22-23. Otro gen en este locus (1q21.3-23) es el gen de la mielina Po (Pham-Dinh et al. (1993), Hum. Mol. Genet., 2:2051-2054), la proteína más abundante en la mielina (Filbin et al. (1990), Nature, 344:871-872). Al igual que SLAM, la mielina Po es un miembro de la superfamilia de Ig (Williams y Barclay (1988), Annu. Rev. Immunol., 6:381-405) y también interacciona homofílicamente. La estructura de mielina normal se basa en la autointeracción de la mielina Po, y las mutaciones heredadas en la mielina Po son responsables de la neuropatía de Charcot-Marie-Tooth de tipo 1b (Kulkens et al. (1993), Nat. Genet., 5:35-39; Hayasaka et al. (1993), Nat. Genet., 5:31-34). Muchos miembros de la superfamilia de Ig interaccionan heterofílicamente con miembros de la familia relacionados, siendo ejemplos prominentes CD2 con LFA-3 (Selvaraj et al. (1987), Nature, 326:400-403) o CD48 (van der Merwe et al. (1993), EMBO J., 12:4945-4954); CD28 con B7-1 (Linsley et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5031-5035) o B7-2 (Freeman et al. (1993), Science, 262:909-911; Azuma et al. (1993), Nature, 366:76-79); y TCR con MHC de clase II (Matsui et al. (1991), Science, 254:1788-1791). El hecho de que muchos miembros de la superfamilia de Ig pueden interaccionar de esta manera puede ser el resultado de la evolución después de la duplicación de genes de un precursor de interacción homofílica (Williams y Barclay (1988), Annu. Rev. Immunol., 6:381-405). La SLAM y la mielina Po han mantenido una función primordial de los miembros de la superfamilia de Ig, la interación homofílica.

El gen de CD48 se localiza en la misma parte del cromosoma 1 que SLAM, en 1q21-23 (Staunton et al. (1989), J. Exp. Med., 169:1087-1099). El CD48, del cual se ha indicado que es un ligando débil para CD2 (van der Merwe et al. (1993), EMBO J., 12:4945-4954), y 2B4, una molécula de señalización expresada sobre células NK murinas y células T citotóxicas (Mathew et al. (1993), J. Immunol., 151:5328-5337) para las cuales no se ha indicado ningún ligando, son las moléculas con la relación más cercana a SLAM. De forma interesante, SLAM, CD48 y 2B4 tienen un dominio V y un dominio C, y pueden distinguirse de otros miembros de la superfamilia de Ig por la conservación de la secuencia CXLXLXC, siendo la segunda cisteína la unión para el dominio C, y la primer cisteína un resto conservado probablemente entre los dominios V y C. Aún no se han ensayado directamente CD48 y 2B4 para su capacidad para interaccionar homofílicamente, aunque sin embargo se ha indicado que una forma soluble recombinante de CD48 tiende a agregar en disolución. La relación y colocalización cromosómica de CD48 y SLAM indica una divergencia evolutiva tras la duplicación de genes.

Se ha indicado que otros miembros grandes de la superfamilia de Ig con múltiples dominios interaccionan homofílicamente, y éstos incluyen la molécula de adhesión de plaquetas-células endoteliales (CD31) (Watt et al. (1993), Blood, 82:2649-2663), la molécula de adhesión de neuronas-células gliales (Grumet y Edelman (1988), J. Cell. Biol., 106:487-503), la molécula de adhesión de neuronas-células relacionadas con las células gliales (Mauro et al. (1992), J. Cell. Biol., 199:191-202), la molécula de adhesión de células neuronales o CD56 (Rao et al. (1992), J. Cell. Biol., 118:937-949), y el antígeno carcinoembriónico (Zhou et al. (1993), J. Cell. Biol., 122:951-960).

Una forma de SLAM cortada de forma alternativa que carece de un exón de 90 bp, que se corresponde e incluye con precisión la región transmembrana de SLAM codifica una forma segregada de SLAM. Esta molécula producida en la naturaleza expresada por células T activadas puede suprimir la función de las células T y puede ser parte de un bucle de retroalimentación negativo para atenuar, o restringir localmente la activación mediada por SLAM tras la interacción célula-célula. La activación de células T mediada por SLAM es resistente a la ciclosporina, lo cual resulta coherente con la incapacidad de los anticuerpos anti-IL-2 para inhibir la proliferación de clones de células T inducida por SLAM. Dados los potentes efectos coestimuladores de la unión de SLAM sobre la proliferación de células T y la producción de citoquinas Th1, la actividad inmunosupresora potencial de la SLAM soluble la hace ser un adjunto eficaz para inhibir respuestas inmunológicas en curso relativamente resistente a la ciclosporina, tales como las que se observan en el rechazo de aloinjertos (Pereira et al. (1990), J. Immunol., 144:2109-2116; Zeevi et al. (1988), Hum. Immunol, 21:143-153).

La unión de SLAM tiene consecuencias exclusivas para la activación de células T, en términos de su capacidad para modular los perfiles de producción de citoquinas hacia el subtipo Th0/Th1 y, bajo algunas circunstancias, para inducir directamente la proliferación de células T. La SLAM recién descrita parece ser un miembro de la superfamilia de Ig, además de TCR, CD28, CTLA-4, CD4 y CD2, y su unión regula las respuestas de células T. La presencia de SLAM sobre linfocitos indica que los linfocitos activados, en sí mismos, pueden proporcionar un significativo coestímulo. Esto no resulta inesperado, puesto que el tipo celular más predominante en los órganos linfoides son los linfocitos, que son colaboradores estadísticamente siempre presentes, y son la principal fuente de factores del crecimiento de células T autocrinos, tales como IL-2. La SLAM no sólo puede proporcionar señales coestimuladoras potentes, sino que también puede estar implicada en el mantenimiento de la segregación relativa y la acumulación de linfocitos dentro de los órganos linfoides. La mayoría de los trabajos sobre la coestimulación de células T se han enfocado en las diferentes células de presentación del antígeno, y las moléculas que expresan, en particular B7 y B70, los ligandos para CD28 y CTLA-4 (Jenkins (1994), Immunity, 1:443-446). Las células B son células de presentación del antígeno que, cuando se activan, expresan SLAM, que puede apoyar la colaboración de células B-T que conduce a la producción de Ig. En coherencia con las funciones coestimuladoras descritas en la presente para SLAM, recientes estudios en ratones deficientes en CD28 han expuesto un papel para otras moléculas coestimuladoras en la activación de células T (Green et al. (1994), Immunity, 1:501-508; Shahinian et al. (1993), Science, 261:609-612), y han indicado que la coestimulación proporcionada por otras células T puede contribuir a la activación de células T (Green et al. (1994), Immunity, 1:501-508; Jenkins (1994), Immunity, 1:443-446). Además de SLAM, las células T humanas activadas expresan MHC de clase II y B7, y han demostrado que son capaces de presentar el antígeno (Azuma et al. (1993), J. Exp. Med., 177:845-850), enfatizando el potencial de interacciones entre células T, que puede aliviar el requerimiento de la presencia constante de células de presentación del antígeno durante la expansión clónica de células T. La SLAM soluble que se produce en la naturaleza debería proporcionar un antagonista útil para evaluar aún más fondo la importancia de las interacciones SLAM-SLAM en el desarrollo de las reacciones inmunológicas humanas.

Los anticuerpos monoclonales anti-SLAM inhiben la síntesis de IgE inducida por IL-4, lo cual indica que la señalización a través de SLAM, al nivel de células T auxiliares o al nivel de células B, inhibe la interacción de células T-B productiva, lo que produce como resultado un cambio hacia IgE dirigida por IL-4 y la producción de IgE. Este efecto puede ser directo, por ejemplo, a través de interacciones entre SLAM sobre células T y SLAM sobre células B, o indirecto, por ejemplo, mediante la inducción de la producción de citoquinas por la célula T auxiliar, que inhibe la síntesis de IgE dirigida por IL-4. El interferón-\gamma es el principal ejemplo de este tipo de citoquinas.

Estos resultados también sugieren que las formas solubles de SLAM con actividades agonistas pueden ser capaces de evitar la síntesis de IgE dirigida por IL-4 y/o IL-3 en pacientes atópicos y, por tanto, tendrán utilidad terapéutica para infrarregular las enfermedades alérgicas mediadas por IgE. Además, debido el hecho de que la unión de SLAM induce, prefentemente, la producción de citoquinas Th1, los agonistas de SLAM pueden tener una utilidad clínica general para redirigir las respuestas de Th2 hacia respuestas de Th1 en enfermedades en las que se ha implicado un claro perfil de Th2, tales como alergia, ciertas enfermedades autoinmunológicas, o ciertas enfermedades inflamatorias. Esto incluye la tiroiditis de Hashimoto.

Por otra parte, los antagonistas de SLAM tienen un efecto opuesto; es decir, bloquean las respuestas de Th1 en situaciones de enfermedad provocada por células Th1 y citoquinas derivadas de células Th1, tal como enfermedades infecciosas, incluyendo, por ejemplo, tuberculosis y lepra, o enfermedades autoinmunológicas, por ejemplo, artritis reumaotoide y uveitis autoinmunológica.

Estos reactivos terapéuticos también serán útiles para modular respuestas tales como las respuestas a infecciones parasitarias, para modular una reacción a una vacuna, etc.

Ejemplos Métodos generales

Algunos de los métodos convencionales se describen o se indican como referencia, por ejemplo, en Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), vol. 1-3, CHS Press, NY; Ausubel et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel et al. (1987 y suplementos), Current Protocols in Molecular Biology, Greene and Wiley, Nueva York; Innis et al. (eds.) (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990), "Guide to Protein Purification", en Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y la bibliografía de los fabricantes sobre el uso de productos para la purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión con segmentos apropiados, por ejemplo, con una secuencia FLAG o un equivalente que puede fusionarse a través de una secuencia que puede eliminarse mediante proteasas. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989), Chemische Industrie, 12:69-70; Hochuli (1990), "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent", en Setlow (ed.), Genetic Engineering, Principle and Methods, 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe et al. (1992), OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Las técnicas de cultivo de células se describen en Doyle et al. (eds.) (1994), Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley and Sons, NY.

Los análisis FACS se describen en Melamed et al. (1990), Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988), Practical Flow Cytometry, Liss, Nueva York, NY; y Robinson et al. (1993), Handbook of Flow Cytometry Methods, Wiley-Liss, Nueva York, NY. El marcaje fluorescente de los reactivos apropiados se realizó mediante métodos convencionales.

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Ejemplo 1

Preparación de mAb

El anticuerpo monoclonal anti-SLAM A12 (IgG1) se generó en una fusión de esplenocitos a partir de un ratón BALB/c inmunizado con células mononucleares de sangre periférica activadas durante 5 horas con 12-O-tetradecanoil-13-acetato (TPA) (1 ng/ml) y el ionóforo de Ca^{2+} A23187 (500 ng/ml) (Calbiochem-Behring Corporation).

Se emplearon procedimientos convencionales para seleccionar los clones productores apropiados, y el hibridoma A12 se aisló clónicamente y sometió a un análisis normal, por ejemplo, la determinación de la capacidad de producción y el tipo de inmunoglobulina. La línea celular de hibridoma A12 se depositó en el ATCC el 10 de noviembre, 1994, y se le asignó el número de registro HB11760.

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Ejemplo 2

Clonación de SLAM humana

Células COS-7 se transfectaron mediante electroporación como se describe en Cocks et al. (1993), Int. Immunol., 5:657-663, con un ADN del banco de células T CD8+ A10, preparado como se describe en McKinney y Parkinson (1987), J. Immunol. Methods, 96:271-278. Las células transfectadas se tiñeron con mAb A12 anti-SLAM conjugado con FITC y se clasificaron con un instrumento de clasificación de células FACStar plus (Becton Dickinson). Se aisló ADN de plásmido de las células clasificadas utilizando un kit Wizard miniprep (Promega Corporation). El ADN de plásmido se transformó en Escherichia coli (ElectroMAX, BRL) mediante electroporación para la amplificación, y luego se introdujo en células COS-7. Después de dos rondas de clasificación, los clones de ADNc de SLAM se enriquecieron hasta 45% del total de clones de ADNc. Se secuenció un inserto de 1,8 kb en uno de estos clones (pSURslam1) en ambas hebras utilizando el método de terminación de cadena didesoxi. Este plásmido se depositó en el ATCC el 10 de noviembre, 1994, y se le asignó el número de registro ATCC 69713. Se aislaron otros clones de ADNc que codifican variantes de SLAM y se caracterizaron utilizando métodos convencionales. En particular, se prepararon constructos que codifican una porción extracelular de SLAM, o una porción intracelular, mediante el uso de cebadores de PCR apropiados y pSURslam1 como molde.

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Ejemplo 3

Clonación de SLAM de ratón

Se clonó ADNc de SLAM de ratón a partir de un banco de ADNc de timocitos tempranos, es decir, timocitos \alpha\beta, CD4-, CD8-, empleando ADN que representa el dominio extracelular de SLAM humana como sonda de hibridación.

Los timocitos se aislaron y se tiñeron con anticuerpo primario durante 30 min a 4ºC, se lavaron dos veces, y después se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con FITC durante 30 min a 4ºC antes de lavar tres veces. Los timocitos recién aislados se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-SLAM o IgG, seguido de anticuerpo antirratón de oveja conjugado con FITC. Las células se evaluaron para la tinción utilizando un instrumento FACScan (Becton-Dickinson).

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Ejemplo 4

Preparación de anticuerpos contra SLAM humana

Se inmunizaron ratones C3H con células L transfectadas de forma estable con pSURslam1. Se generaron hibridomas fusionando esplenocitos con la línea de mieloma NJ1. La detección de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales apropiados contra SLAM humana se realizó mediante inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo. Los sobrenadantes de los hibridomas se seleccionaron para detectar reactividad con células L transfectadas con pSURslam1, comparándose con células L no transfectadas como control.

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Ejemplo 5

Preparación de anticuerpos contra SLAM de ratón

Se inmunizaron ratas con 10^{7} células COS transfectadas con pMSLAM1. Se prepararon hibridomas fusionando células de nódulo linfático poplíteo de rata con células de mieloma de ratón. También se aisló suero policlonal de las ratas.

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Ejemplo 6

Inmunoprecipitación de SLAM humana

Proteínas de la superficie celular del clon de células T Th0 B21 se radiomarcaron con ^{125}I-Na (Amersham) utilizando la reacción catalizada por lactoperoxidasa. La SLAM se inmunoprecipitó utilizando Pansorbin^{TM} (Calbiochem) revestido con anti-Ig de ratón de conejo y el antisuero anti-SLAM. Los inmunoprecipitados se ensayaron en un minigel de acrilamida al 10% (ISS) bajo condiciones reductoras, y el gel secado se barrió y analizó con un Phosphorimager (Molecular Dynamics).

La SLAM natural migra de una manera difusa, característica de las glicoproteínas, con una movilidad característica de aproximadamente 70 kd. Si la SLAM se trata durante la noche con 1,2 \mul de N-glicanasa (Genzyme), la proteína migra con una movilidad característica de una proteína de aproximadamente 40 kd.

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Ejemplo 7

Expresión de SLAM sobre PBMC humanas

La expresión de SLAM sobre PBMC humanas se induce mediante la exposición de las células a anticuerpos anti-CD3 durante diferentes periodos de tiempo. Se incubaron linfocitos de sangre periférica con anticuerpos anti-CD3 (1 \mug/ml) durante 0, 1, 2, 4, 8 ó 24 horas. Se extrajo ARN y se sometió a una análisis de la transferencia Northern utilizando SLAM y sondas de actina, sucesivamente. Para los análisis de PCR, se seleccionaron sondas apropiadas para SLAM y para HPRT. Se sometieron 5 ng de cebadores de ADNc a 30 ciclos de PCR. La señal de la actina actuó como factor de normalización.

Una especie de 4 kb resulta evidente en los momentos del tiempo de 2 y 4 horas, y es mucho menos detectable en los momentos del tiempo de 0, 1, 8 y 24 horas. Una especie de 2 kb es menos detectable en los momentos del tiempo de 0 y 1 hora, es elevada en el momento del tiempo de 2 horas, disminuye a las 4 horas, y se estabiliza en los momentos del tiempo de 8 y 24 horas.

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Ejemplo 8

Expresión sobre la superficie de SLAM en células mononucleares y timocitos fetales

Para el análisis FACS, se incubaron células mononucleares de sangre periférica procedentes de un donante sano durante 6 h con o sin TPA e ionóforo de Ca^{2+} A23187, y se tiñeron con anti-CD3 conjugado con citocromo (Pharmingen), mAb A12 conjugado con PE, y CD45RO conjugado con FITC (Pharmigen). Además, los timocitos fetales se tiñeron durante 30 minutos con A12 conjugado con PE, y anti-CD3 conjugado con FITC (Becton-Dickinson), y se analizaron con un FACScan (Becton-Dickinson).

Las células T de sangre periférica no estimuladas y las células T activadas (células CD3+) se tiñeron con los mAb contra CD45RO y A12. De forma similar, los timocitos fetales se tiñeron con anti-CD3 y A12.

Las células T no estimuladas presentaban dos subpoblaciones significativas: una sin SLAM o con poca SLAM y sin CD45RO, que comprende aproximadamente 49% de las células; y otra con baja cantidad de SLAM y alta cantidad de CD45RO, comprendiendo esta subpoblación aproximadamente 51% de las células. El CD45RO es un marcador para las células T de memoria, y la SLAM parece correlacionarse positivamente con su expresión. Las células T indiferenciadas, que son CD45RO-, también carecen de SLAM. La SLAM parece ser un marcador útil para un fenotipo de célula T de memoria.

Las células T activadas presentan dos subpoblaciones principales: ambas con alta cantidad de SLAM, pero una tenía baja cantidad de CD45RO, formando aproximadamente 46% de las células, y la segunda tenía alta cantidad de CD45RO. Una subpoblación pequeña, aproximadamente 4% de las células, no expresaba ni CD45RO ni SLAM.

Los timocitos fetales presentaban un patrón que parece sugerir una progresión relacionada con el desarrollo. Existe una pequeña subpoblación de células, aproximadamente 2%, que no muestran SLAM ni CD3. Aproximadamente 13% de ls células, probablemente células en desarrollo temprano, muestran baja cantidad de CD3 y alta cantidad de SLAM. Aproximadamente 80% de las células, probablemente células en un etapa intermedio del desarrollo, expresan CD3 y SLAM. Una pequeña subpoblación, aproximadamente 5% de las células, son timocitos maduros que muestran una baja cantidad de SLAM pero una alta cantidad de CD3. Esto probablemente refleja una progresión de la expresión de SLAM con la maduración de los timocitos. En las etapas de maduración más tempranas, la SLAM se expresa en gran cantidad pero finalmente desaparece.

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Ejemplo 9

Expresión celular de SLAM humana

Se sometió a ARN procedente de diversas células y tejidos a una transcripción inversa y PCR utilizando cebadores específicos de SLAM. Véase la tabla 2 para la distribución tisular de SLAM humana.

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Ejemplo 10

Expresión celular de SLAM1 de ratón

Se empleó una sonda específica para ADN que codifica una porción del dominio extracelular de SLAM1 de ratón para determinar la distribución tisular del antígeno. Se generó una sonda de ADN de 600 pb para SLAM murina mediante digestión de límite con XhoI/PstI del plásmido pMSLAM1 (que contiene ADNc de SLAM de ratón) y se purificó después de una electroforesis en gel utilizando un sistema DNA Clean Up de Promega (Madison, WI). Todas las sondas se marcaron mediante cebado aleatorio. El análisis de la transferencia Northern de múltiples tejidos se adquirió en Clontech y se sondó utilizando Quick Hyb (Stratagene, La Jolla, CA).

Los resultados demuestran que SLAM se expresa mucho más abundantemente en bazo que en corazón, cerebro, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón o testículos. Parece que los testículos tienen más expresión que otros tejidos, pero no tanto como el timo. Aunque el timo no es uno de los tejidos del análisis de la transferencia Northern, la SLAM debe expresarse allí. Se clonó ADNc de SLAM de ratón a partir de timocitos \alpha\beta, CD4-, CD8- y, además, un anticuerpo monoclonal que reconoce la SLAM de ratón se unió específicamente con 90% de los timocitos recién aislados. La frecuencia de los clones de SLAM en el banco de timocitos era de aproximadamente 1 en 5000.

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Ejemplo 11

Distribución en especies de homólogos de SLAM

Se obtuvo ADN de diversas especies, se digirió con EcoRI, se sometió a electroforessis, se realizó un análisis de la transferencia y se transfirió, después se híbrido con una sonda de SLAM humana marcada con ^{32}P a 68ºC, incluyendo los nucleótidos 291-901. La transferencia se lavó en 0,2 x SSC a 60ºC. Un análisis de la transferencia Southern de ADN genómico de diferentes especies indicó que el gen SLAM está bien conservado entre los mamíferos, por ejemplo, ser humano, mono, ratón, perro, vaca, conejo, pero no se detectó en pollos ni en levaduras. Tampoco se detectó en rata, pero no se proporcionó un control positivo.

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Ejemplo 12

Potenciación de la producción de citoquinas inducida por antígeno por clones de células T coestimulados con el anticuerpo A12 anti-SLAM

Los clones de células T indicados, incluyendo los clones de células T CD4+ MoT72 (Th2) y MoT81 (Th0) específicos para el toxoide del tétanos, se cultivaron en condiciones similares a las de los ensayos proliferativos, con las siguientes modificaciones: se realizaron los cultivos en placas de 24 pocillos cultivando 10^{6} células T con 10^{6} células B transformadas con EBV autólogas irradiadas, antígeno, y mAb como se describe en los ensayos proliferativos, en 1 ml de medio de Yssel. Los sobrenadantes se recogieron 24 horas después y se determinó el contenido en citoquinas mediante ELISA como describe en Chretien et al. (1989), J. Immunol. Methods, 117:67-81; o Favre et al. (1989), Mol. Immunol., 26:17-25. Los clones de células T CD4+ MoT72 (Th2) y MoT81 (Th0) son específicos para el toxoide del tétanos, y se cultivaron como se describe. Véase la tabla 3. Los mAb utilizados en estos estudios y en los estudios funcionales de coestimulación se purificaron a partir de fluido de ascitis mediante fraccionamiento con ácido caprílico, véase McKinney y Parkinson (1987), J. Immunol. Methods, 96:271-278, seguido de precipitación con sulfato de amonio. Se produjeron F(Ab')_{2} mediante métodos convencionales, digiriendo los mAb con pepsina. Los mAb control utilizados fueron IgG1 de MOPC-21 y mAb control de IgG1 (Pharmingen).

TABLA 3 Producción de citoquinas, IFN-\gamma o IL-4

3

Ejemplo 13

Actividad coestimuladora para la activación de células T

Células mononucleares de sangre periférica (10^{5}/pocillo) de donantes recientemente reforzados se estimularon con 1 \mug/ml de toxoide del tétanos o derivado de proteína purificado (PPD) en placas de 96 de pocillos de fondo plano en 200 \mul de medio de Yssel en pocillos por triplicado. Los cultivos se recogieron cinco días después. Se añadió 1 \muCi de ^{3}H-Tdr a cada pocillo en las últimas 16 h de cultivo, y se midió la proliferación mediante la captación de ^{3}H-Tdr utilizando un contador \beta.

Se emplearon los siguientes clones de células T CD4+: Th0: B21 (Bacchetta et al. (1990), J. Immunol., 144:902-908); MoT72 específico para el fragmento 947-960 del toxoide del tétanos, y ChT38 específico para el fragmento 16-35 del toxoide del tétanos (preparado según Carballido et al. (1993), J. Immunol., 150:3582-3591. Th1: HY-06 (Haanen et al. (1991), J. Exp. Med., 174:583-592) específica para la proteína del choque térmico; TA20 y TA23 específicos para el derivado de proteína purificado (PPD). Th2: NP12 y NP44 (Th2) específicos para Der-p1 (Yssel et al. (1992), J. Immunol., 148:738-745). Todos los clones de células T se recogieron 5-7 días después de la reestimulación con PHA y PMBC irradiadas como células de alimentación, y se cultivaron en medio Yssel (5 x 10^{4}/pocillo) en presencia o ausencia del antígeno específico (1 \mug/ml) o péptidos del tétanos (100 ng/ml), y 2,5 x 10^{5} células B transformadas con EBV autólogas irradiadas (5000 rads), y mAbs como se indica. Se midió la proliferación 3 días
después.

Inducción directa de la proliferación de clones de células T por el mAb A12 anti-SLAM: se cultivaron los clones de células T B21 y ChT38 en medio de Yssel en presencia o ausencia de mAb y sus F(Ab')_{2}. La proliferación se midió 3 días después. Se observó una proliferación dependiente de la dosis de las dos líneas celulares.

La proliferación de células T específica de antígeno de linfocitos de sangre periférica fue potenciada por el anticuerpo A12 anti-SLAM; los fragmentos FAb de A12 indujeron una proliferación dependiente de la dosis. Se estimularon PBMC procedentes de donantes inmunizados con toxoide del tétanos o derivado de proteína purificado, con o sin fragmentos mAb.

Coestimulación de la proliferación de clones de células T inducida por antígeno por el anticuerpo A12: los clones de células T NP12, AR142, ChT38 o HY06 se estimularon con su antígeno específico con o sin mAb. Todos los resultados son coherentes con la interpretación de que A12, o los fragmentos FAb, pueden inducir la proliferación de una manera dependiente de la dosis.

Coestimulación de la proliferación de clones de células T inducida por anti-CD3 por el anticuerpo A12: los clones de células T B21 o TA20 se estimularon con mAb anti-CD3 en presencia o ausencia de mAb A12 o mAb IgG1 control. En cada caso, aparece una proliferación dependiente de la dosis con el A12, pero no con el anticuerpo control. La proliferación también depende de la cantidad de anti-CD3.

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Ejemplo 14

Preparación de la fusión SLAM-Ig

Para identificar un ligando potencial para la molécula SLAM coestimuladora de células T, se generó una proteína recombinante (SLAM-Ig) que comprende el dominio extracelular completo de SLAM condensado con la porción Fc de IgG humana. Se preparó la SLAM-Ig condensando ADN que codifica SLAM con ADN que codifica la porción Fc de Ig. Se generó el ADN que codifica el dominio extracelular de SLAM mediante PCR utilizando el plásmido pSURslam1 como molde y los cebadores apropiados. Después de una digestión con XhoI, el fragmento se condensó con ADNc que codifica la proporción Fc de la cadena pesada de IgG1. El vector de expresión de SLAM-Ig se transfectó en células COS y se purificó por afinidad la SLAM-Ig a partir de los sobrenadantes utilizando proteína G-Sepharose (Sigma).

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Ejemplo 15

SLAM-Ig se une a SLAM expresada sobre la superficie celular

La SLAM-Ig recombinante resultó eficaz para neutralizar el anticuerpo monoclonal A12 específico de SLAM, indicando que SLAM-Ig ha mantenido una conformación nativa similar a la SLAM transmembrana. Se empleó SLAM-Ig conjugada con fluoresceína para un análisis fluorocitométrico de diversos tipos celulares y no se unió a muchos de los tipos celulares ensayados. Sin embargo, SLAM-Ig sí se unió a los tipos celulares que han demostrado expresar SLAM.

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Ejemplo 16

Interacción intramolecular de SLAM-Ig

Se han descrito los clones de células T B21 (Bacchetta et al. (1990), J. Immunol., 144:902-908) y HY06 (Haanen et al. (1991), J. Exp. Med., 174:583-592). Se generaron líneas de células epiteliales tímicas como se describe en Galy y Spits (1991), J. Immunol., 147:3823-3830, mediante cultivo a partir de timo fetal, y las líneas TEC, TEC, U937 también se han descrito en Galy y Spits (1991). Células L portadas en RPMI se tranfectaron de forma estable con pSURslam1. Se purificaron monocitos mediante eliminación negativa, y las células L CD32 fueron proporcionadas por el doctor K. Moore (DNAX, Palo Alto). Las PBMC se aislaron de sangre periférica fresca mediante centrifugación sobre Ficoll (Histopaque-1077, Sigma).

La SLAM-Ig sí se unió a células L transfectadas con SLAM (SLAM/células L) y no a células L no transfectadas, lo cual indica que SLAM interacciona homofílicamente. La unión de SLAM-Ig a transfectantes de SLAM es específica para la porción SLAM de la molécula y no para la Ig, puesto que la tinción se realizó en presencia de un exceso de IgG en el suero humano al 30% añadido. Además, los transfectantes de SLAM no fueron teñidos por otras moléculas que contienen Fc, tales como CD40-Ig. La unión de SLAM-Ig fue aproximadamente 5 veces menor que la unión a SLAM/células L observada utilizando una concentración equivalente del mAb A12. La interacción de SLAM-Ig con la SLAM de superficie celular puede ser inhibida específicamente por un exceso de un anticuerpo monoclonal contra SLAM. La unión de SLAM-Ig a células transfectadas no fue inhibida por EDTA.

Se ha descrito el mAb A12 anti-SLAM. Los mAb CD45RO y CD3 conjugados con fitoeritrina se obtuvieron en Becton-Dickinson. Las células teñidas con mAb, SLAM-Ig o CD40-Ig se lavaron tres veces con PBS, FCS al 2%, y se analizaron utilizando un FACScan (Becton-Dickinson).

Se empleó SLAM-Ig conjugado con fluoresceína para el análisis fluorocitométrico de diversos tipos celulares, y no se unió con muchos de los tipos celulares ensayados, incluyendo monocitos o líneas de células epiteliales tímicas. Sin embargo, SLAM-Ig sí se unió a clones de células B transformadas con EBV y clones de células T CD4+, habiendo demostrado los inventores que ambos tipos celulares expresan SLAM. En ninguno de los tipos celulares ensayados la SLAM-Ig se unió a células que no expresan SLAM. Además, los niveles de unión de SLAM-Ig comodularon la expresión de SLAM sobre células T CD45RO+ después de la activación con anti-CD3. El nivel de tinción de SLAM-Ig con relación a la tinción de A12 en diferentes tipos celulares resultó coherente con el observado en los transfectantes de células L, que era 5 veces menor e independiente de Ca^{++}.

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Ejemplo 17

Interacción intermolecular de SLAM-Ig

Se realizó una electroforesis en gel utilizando geles adquiridos en Integrated Separation Systems y un aparato multigel de BioRad. La SDS-electroforesis se realizó bajo las condiciones descritas, empleando gel al 10% y electroforesis en gel nativo según las instrucciones del fabricante, usando un gradiente de gel de 2-25%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie. Los patrones de PM se adquirieron en Sigma.

Puesto que la forma soluble de SLAM (SLAM-Ig) puede interaccionar con la SLAM de la superficie celular, se ensayó si la SLAM-Ig podría interaccionar homofílicamente, por ejemplo, autorreconociéndose, en disolución. La SLAM-Ig purificada migra hasta una posición coherente con su tamaño en una SDS-electroforesis en gel, y forma una banda discreta bajo condiciones reductoras o no reductoras. Sin embargo, la SLAM-Ig se desplaza de forma anómalamente grande en la electroforesis de gel nativo, lo cual es indicativo de la agregación de las moléculas SLAM-Ig en la disolución. El CD40-Ig y otras proteínas forman bandas definidas y de acuerdo con su tamaño, mientras que bajo las mismas condiciones, la SLAM-Ig forma una mancha que empieza en su tamaño predicho de 160.000 sin agregación, hasta más de 500.000. Dentro de este intervalo de pesos moleculares, existen dos bandas más predominantes: una a -160.000, y la otra a -300.000, correspondiendo a una y dos moléculas de SLAM-Ig, respectivamente. La filtración en gel de SLAM-Ig confirma la existencia de agregados de SLAM-Ig. Bajo estas condiciones, aunque la forma monómera es la más predominante, un pico que corresponde a SLAM dímera también resulta prominente entre el material de mayor peso molecular.

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Ejemplo 18

La interacción homofílica de SLAM conduce a la activación de células T

También se demostró que la SLAM expresada sobre células T activadas es una molécula coestimuladora significativa. La unión de SLAM por el mAb A12 conduce a un aumento de la proliferación de células T y la producción de citoquinas. El ligando natural para SLAM debería proporcionar dicha señal coestimuladora. Estos resultados sugieren que el ligando natural para SLAM es la propia SLAM. Por tanto, se ensayó la capacidad de la SLAM en la superficie para proporcionar señales estimuladoras a células T. En dosis subóptimas de anti-CD3, las células L que expresan SLAM proporcionan una señal coestimuladora directa para que las células T proliferen, mientras que las células L sin transfectar fueron ineficaces. Las SLAM/células L también fueron capaces de apoyar directamente la proliferación de células T en ausencia de anti-CD3 u otras señales estimuladoras. Esta capacidad para estimular directamente a las células T en ausencia de otros estímulos distingue a SLAM de otras moléculas coestimuladoras, incluyendo LFA-3 (Bierer y Hahn (1993), Semin. Immunol., 5:249-261), B7 (Jenkins y Johnson (1993), Curr. Opin. Immunol., 5:361-367), y B70 (Azuma et al. (1993), Nature, 366:76-79), cada una de las cuales necesita más señales para inducir la proliferación de células T.

Puesto que las interacciones SLAM-SLAM entre células L y células T tienen claros efectos funcionales, no resulta sorprendente que células L transfectadas con SLAM puedan distinguirse de células L no transfectadas mediante al menos tres criterios. En primer lugar, las células L SLAM+ son resistentes al desprendimiento con EDTA, requiriendo más de 30 min a 37ºC, comparado con células L normales y otros transfectantes de células L, que se desprenden en 5 min. En segundo lugar, los transfectantes de SLAM se inhiben estrictamente al contacto, mientras que las células L sin transfectar, aunque se inhiben al contacto, continúan proliferando hasta cierto grado después de haber alcanzado la confluencia. En tercer lugar, los transfectantes de SLAM tienen una morfología más alargada, evidente en cultivos de monocapas confluentes en los que las células están entrelazadas, por contraste con las células L normales, que tienen un aspecto más de guijarro. Las SLAM/células L desprendidas no parecieron adherirse con más facilidad en suspensión.

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Ejemplo 19

La proliferación de células T inducida por la interacción SLAM-SLAM es resistente a la ciclosporina

La activación de células T mediada a través de TCR es inhibida por la ciclosporina. Para ensayar si la activación de células T mediada por SLAM es susceptible a la ciclosporina, el clon de células T B21 se activó directamente con SLAM/células L en presencia de diversas concentraciones de ciclosporina. Las SLAM/células L fueron capaces de apoyar directamente la proliferación de células T, incluso en presencia de 1 \mug de ciclosporina. De manera interesante, la ciclosporina en realidad potenciaba la proliferación de células T inducida por la interacción homofílica de SLAM a concentraciones mayores que 100 ng/ml. A 2 \mug/ml, la ciclosporina potenciaba la proliferación de células T inducida por SLAM/células L en dos veces.

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Ejemplo 20

Localización cromosómica

En la sonda (pSURslam1) se realizó un desplazamiento de mella con biotina-14 dATP y se hibridó in situ a una concentración final de 5 ng/\mul hasta la metafase de dos machos normales. El método de hibridación in situ de fluorescencia (FISH) se modificó con respecto al descrito en Callen et al. (1990), Ann. Genet., 33:219-221, en que los cromosomas se tiñeron antes del análisis con yoduro de prodidio (como tinción de recuento) y DAPI (para la identificación de los cromosomas). Se capturaron imágenes de las preparaciones en metafase mediante una cámara CCD y se realzaron mediante ordenador.

Se estudiaron veinte metafases del primer macho normal para una señal fluorescente. Diecinueve de estas metafases mostraron señal en una o ambas cromátidas del cromosoma 1 en la región 1q21.2-1q23; 34% de esta señal estaba en 1a21.3, y 59% estaba en 1q22. Esto indica una localización probable cerca de la interfase entre estas dos bandas. Se observó un total de cuatro manchas de fondo no específicas en estas 20 metafases. Se obtuvo un resultado similar para la hibridación de la sonda con 20 metafases del segundo macho normal.

Los mapas génicos de la misma región indican que se correlaciona con la susceptibilidad al lupus eritematoso sistémico. Los dos genes pueden ser el mismo, por ejemplo, los reactivos de SLAM pueden utilizarse como producto terapéutico directo para el trastorno, o el gen puede ser un marcador genético útil para el cartografiado de dicho gen.

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Ejemplo 21

Kd de la interacción SLAM-SLAM

Las constantes de equilibrio para las interacciones SLAM/SLAM se analizaron mediante resonancia de plasmón de superficie, utilizando un instrumento BIAcore^{TM} (Pharmacia). Se empleó Ab 7D4 anti-SLAM.

Se midió la cinética de unión y la afinidad de Ab 7D4/SLAM-Ig y SLAM-Ig/SLAM-Ig. Aproximadamente 8000 unidades de resonancia (RU) de SLAM-Ig se unieron covalentemente a la matriz de dextrano en el chip detector mediante sus lisinas, según el protocolo del fabricante (manual de BIAcore^{TM}, Pharmacia Biosensor). Se hizo pasar tampón (fosfato-disolución salina, PBS, pH 7,0) a través de la célula de flujo hasta que toda la proteína disociable se eliminó y la línea de base permaneció estable. Entonces se hicieron pasar disoluciones que contenían diversas concentraciones del anticuerpo 7D4 en PBS (que varía de 10 nM a 500 nM) a través de la célula de flujo. Se observó un aumento en la masa de proteína unida, seguido por una disminución cuando la disolución de proteína fue sustituida por tampón. Se empleó un protocolo de análisis de datos no lineal, O'Shannessy et al. (1993), Anal. Biochem., 212:457-468, para analizar los datos para determinar las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd). Véase la tabla 4. Entonces se calculó la constante de disociación en equilibrio K_{d} a partir de la proporción kd/ka.

Se midió la cinética de la unión de SLAM-Ig/SLAM-Ig de una manera similar. Después de la inmovilización de SLAM-Ig sobre el chip, se hicieron pasar disoluciones de SLAM-Ig a concentraciones que varían de 100 nM a 1500 nM a través de la célula de flujo a un caudal de 5 \mul/min. A partir de las fases de asociación y disociación, se obtuvieron las correspondientes constantes de velocidad y, por tanto, la constante de unión en equilibrio.

Ambas velocidades k_{on} y k_{off} son más lentas que otras interacciones de adhesión célula-célula. La K_{d} es unas 10-100 veces mayor que otras interacciones de adhesión célula-célula, por ejemplo, la interacción de CD2 con CD48 (aproximadamente 60-80 \muM).

TABLA 4 Constantes de velocidad de asociación y disociación^{1} y la constante en equilibrio aparente K_{d} para interacciones SLAM/SLAM y SLAM/Ab 7D4

4

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Schering Corporation

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES PURIFICADOS QUE CODIFICAN ANTÍGENOS DE LA SUPERFICIE DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS; PROTEÍNAS Y ANTICUERPOS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

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(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Schering - Plough Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2000 Galloping Hill Road

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(C)

CIUDAD: Kenilworth

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(D)

ESTADO: Nueva Jersey

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 07033-0530

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Apple Macintosh

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: 7.1

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(D)

PROGRAMA: Microsoft 5.1a

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: Solicitud de Patente de EE.UU. con número de Serie 08/481,777 y número de Serie 08/348,792

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 2-DICIEMBRE-1994 y 7-JUNIO-1995

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(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Lunn, Paul G.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32,743

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: DX0436Q

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 908-298-5061

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 908-298-5388

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1716 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 61..1065

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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5

6

7

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 335 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1852 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 61..954

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 298 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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13

14

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1020 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 61..975

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

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15

16

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 305 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

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17

18

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1079 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 153..1073

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 307 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1200 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 61..1089

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 343 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1140 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 61..1047

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 329 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

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31

32

Claims (49)

1. Una proteína purificada o recombinante:

a) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12.

2. Una proteína de la reivindicación 1, en la que:

la proteína muestra un patrón de modificación postraduccional diferenciado de una proteína que aparece en la naturaleza, que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12, y en la que la proteína es un coestimulador de una célula T.

3. Un polipéptido purificado o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, en el que la proteína es un coestimulador de una célula T.

4. Una proteína de fusión que comprende una proteína de la reivindicación 1.

5. Una composición que comprende una proteína de la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un anticuerpo que se une específicamente con una proteína de la reivindicación 1.

7. Un anticuerpo de la reivindicación 6, en el que:

a) dicho anticuerpo se genera contra un péptido purificado que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12;

b) dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; o

c) dicho anticuerpo está marcado.

8. Un método para purificar una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12 procedente de otros materiales en una mezcla, que comprende poner en contacto dicha mezcla con un anticuerpo de la reivindicación 6, y separar la proteína unida de los otros materiales.

9. Un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteína de la reivindicación 1.

10. Un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11.

11. Un vector de expresión o replicante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 9.

12. Un kit que comprende:

a) una proteína purificada de la reivindicación 1;

b) un anticuerpo que se une específicamente a un proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12; o

c) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12.

13. Un método para detectar en una muestra la presencia de un ácido nucleico, proteína o anticuerpo, que comprende ensayar dicha muestra con un kit de la reivindicación 12.

14. Un método in vitro para modular la fisiología de una célula T, que comprende poner en contacto dicha célula con:

a) una proteína purificada de la reivindicación 1;

b) un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12; o

c) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

\newpage

15. Un método de la reivindicación 14, en el que dicha célula es una célula T, y dicha modulación de la fisiología es la activación de dicha célula T.

16. Un método de la reivindicación 14, en el que dicha célula está en un tejido.

17. Una proteína purificada de la reivindicación 1; o

un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12; o un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, para su uso como medicamento.

18. Un método para producir una proteína que comprende expresar un ácido nucleico de la reivindicación 9.

19. Una célula aislada que comprende que comprende un vector de la reivindicación 11.

20. Un ácido nucleico recombinante:

a) que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 85% de coincidencia con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 5, 7, 9 u 11; o

b) que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 70% de coincidencia con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 u 11, en el que el ácido nucleico está unido operablemente a un promotor;

en el que dicho ácido nucleico codifica una proteína que es un coestimulador de una célula T; o

c) codifica un polipéptido que comprende al menos 60% de coincidencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ó 12; en el que dicha proteína es un coestimulador de una célula T.

21. El uso de un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno médico seleccionado del grupo que consiste en un trastorno autoinmunológico, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmunológica de Hashimoto, inflamación aguda e inflamación crónica.

22. El uso de una proteína de la reivindicación 1, F(Ab')_{2} o anticuerpo anti-SLAM producida por una línea celular de hibridoma que tiene el número de registro ATCC HB11760 para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno médico seleccionado del grupo que consiste en infección por VIH, infección por herpesvirus, infección por citomegalovirus, alergia alimentaria, alergia a fármacos, rinitis, dermatitis atópica, asma, síndroma de hiper-IgE, hipereosinofilia, enfermedad infecciosa, infección de lepra lepromatosa, leishmaniasis, enfermedad de Chagas, esquistomiasis, glomerulonefritis, y artritis juvenil.

23. Un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12;

para su uso para tratar un trastorno médico seleccionado del grupo que consiste en un trastorno autoinmunológico, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis autoinmunológica de Hashimoto, inflamación aguda e inflamación crónica.

24. El anticuerpo según la reivindicación 23, en el que el trastorno médico es la artritis reumatoide.

25. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

26. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. Un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12.

28. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal aislado que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

29. Un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 27 que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2.

\newpage

30. Un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 27 que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4.

31. Un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 27 que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.

32. Un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 27 que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 8.

33. Un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 27 que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 10.

34. Un anticuerpo monoclonal aislado según la reivindicación 27 que se une específicamente a una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 12.

35. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 29, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

36. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 30, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 31, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

38. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 32, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

39. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 33, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

40. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 34, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

41. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

42. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

43. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

44. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

45. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

46. El polipéptido según la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

47. Un anticuerpo de la reivindicación 6 que es producido por una línea celular de hibridoma que tiene el número de registro ATCC HB11760.

48. Una célula de hibridoma que produce un anticuerpo de la reivindicación 25 ó 27.

49. La célula de hibridoma de la reivindicación 48 que tiene el número de registro ATCC HB11760.