JP2001157593A - 哺乳動物ケモカインｃｃｆ１８およびレセプターｃｃｋｒ３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物免疫系の細
胞）の発生及び分化の制御に機能するタンパク質に関す
る組成物の提供。特に、造血細胞を含む種々の細胞型の
発生、分化、及び機能を調節するタンパク質及び模倣物
の提供。更に、このようなタンパク質に対するレセプタ
ー試薬の提供。 【解決手段】 ＣＣケモカインレセプター３をコードす
る核酸配列からなるポリヌクレオチドであって、該核酸
配列が、以下：ａ）特定の核酸配列又はその相補鎖；及
びｂ）ａ）に規定される核酸配列に、ストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする核酸配列、からなる群か
ら選択される、ポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】（発明の分野）本発明は、哺
乳動物細胞（例えば、哺乳動物免疫系の細胞）の発生お
よび分化の制御に機能するタンパク質に関する組成物に
関する。特に、造血細胞を含む種々の細胞型の発生、分
化、および機能を調節するタンパク質および模倣物を提
供する。このようなタンパク質に対するレセプター試薬
もまた提供する。

【０００２】

【従来の技術】（発明の背景）哺乳動物循環系の循環成
分は、種々の細胞型（赤血球細胞系統または骨髄細胞系
統の赤血球および白血球を含む）を含む。例えば、Ｒａ
ｐａｐｏｒｔ （１９８７） Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｔｏ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ （第２版）Ｌｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ；
Ｊａｎｄｌ（１９８７） Ｂｌｏｏｄ： Ｔｅｘｔｂ
ｏｏｋ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｌｉｔｔｌ
ｅ， Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｂｏｓｔｏｎ，
ＭＡ．； およびＰａｕｌ （編）（１９９３） Ｆ
ｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第３
版， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．を参照のこ
と。分化の種々の段階を通した進行は、細胞に提供され
る種々のシグナルにより調節され、しばしばサイトカイ
ンとして知られるタンパク質のクラスにより媒介され
る。この群の分子のうち、化学誘引物質サイトカインす
なわちケモカインとして知られるさらなる群が存在す
る。例えば、Ｓｃｈａｌｌ （１９９４）「ＴｈｅＣｈ
ｅｍｏｋｉｎｅｓ」 Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ （第２版） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ； ＳｃｈａｌｌおよびＢａｃｏｎ（１９９４）
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ６： ８６５を参照のこと。

【０００３】ケモカインの生物学的活性の完全なスペク
トルは広範に調べられていないが、化学誘引物質効果は
認識されている。これらの分子の最も良く知られている
生物学的機能は、白血球の化学誘引に関する。しかし、
新たなケモカインが発見され、そして免疫学的応答を担
う種々の細胞に対するそれらの生物学的効果は、継続さ
れる研究のトピックである。マウスＣＣＦ１８は、日本
人グループにより報告され、そして本発明者により、Ｈ
ａｒａら、（１９９５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５
５： ５３５２において発表もされている。

【０００４】これらの観察は、造血、免疫発生、および
白血球輸送における機能がこれまで未確認であった他の
因子が存在することを示す。これらの因子は、効果スペ
クトルが公知の分化因子、活性化因子、または他のシグ
ナリング因子と異なる生物学的活性を提供する。インビ
ボでのＴ細胞の生理を調節する調節因子の構造的、生物
学的、そして生理学的特性についての知識がないため、
この様な因子の効果の改変が妨げられる。従って、関連
細胞の発生または生理の調節が必要とされる医療条件
は、依然として解決されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、哺乳
動物細胞（例えば、哺乳動物免疫系の細胞）の発生およ
び分化の制御に機能するタンパク質に関する組成物を提
供することである。

【０００６】本発明の目的は、特に、造血細胞を含む種
々の細胞型の発生、分化、および機能を調節するタンパ
ク質および模倣物を提供することである。

【０００７】本発明の目的は、さらに、このようなタン
パク質に対するレセプター試薬を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】（発明の要旨）本発明
は、ＣＣケモカインをコードする新規の遺伝子、および
ケモカインの種々のレセプターをコードする新規の遺伝
子の発見に部分的に基づく。ＣＣ１８と呼ばれるケモカ
インのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、天然
配列の変異（ムテイン）、融合タンパク質、化学的模倣
物、抗体、および他の構造的または機能的アナログ）を
含む。本発明のタンパク質をコードする単離された遺伝
子にも関する。これらの異なるタンパク質または核酸組
成物の種々の使用もまた提供される。レセプターについ
ても同様に、本明細書中に記載される。

【０００９】本発明は、実質的に純粋なＣＣＦ１８ケモ
カイン；ＣＣＦ１８ケモカイン配列を含む融合タンパク
質；ＣＣＦ１８ケモカインへの結合に特異的な抗体；お
よびＣＣＦ１８ケモカインまたはその融合タンパク質を
コードする核酸を提供する。

【００１０】ＣＣＦ１８ケモカインの実施態様におい
て、ケモカインは、鳥類、およびマウスまたはヒトを含
む哺乳動物からなる群から選択される温血動物由来であ
り得るか；表１または３の配列を含み得るか；天然のＣ
ＣＦ１８ケモカインとは異なる翻訳後修飾パターンを示
し得るか；あるいは表２に開示される特性を示し得る。
本発明はまた、ケモカインおよび薬学的に受容可能なキ
ャリアを含む組成物を包含する。

【００１１】融合タンパク質の実施態様において、タン
パク質は、表１または３のいずれかの配列；および／ま
たは別のサイトカインもしくはケモカインの配列を含み
得る。

【００１２】抗体の実施態様において、ＣＣＦ１８ケモ
カインは、マウスまたはヒトを含む哺乳動物タンパク質
であり得るか、あるいは抗体は、表１もしくは３のペプ
チド配列に対して惹起され得るか；モノクローナル抗体
であり得るか；または抗体は標識され得る。

【００１３】核酸の実施態様において、ケモカインは、
鳥類、およびマウスまたはヒトを含む哺乳動物からなる
群より選択される温血動物由来であり得る。核酸は、表
１もしくは３の配列を含み得るか；発現ベクターであり
得るか；またはデオキシリボ核酸ヌクレオチドを含み得
る。

【００１４】本発明はまた、実質的に純粋なＣＣＦ１８
ケモカインもしくはそのフラグメント；哺乳動物ケモカ
インＣＣＦ１８に特異的に結合する抗体；またはＣＣＦ
１８ケモカインもしくはペプチドをコードする核酸を含
むキットを提供する。キットはまた、定性的分析または
定量的分析を行い得る。

【００１５】別の実施態様において、本発明は、細胞と
哺乳動物ＣＣＦ１８ケモカインのアゴニストまたはアン
タゴニストとを接触させる工程を包含する、細胞の生理
または発生を調節する方法を提供する。アンタゴニスト
は、哺乳動物ＣＣＦ１８ケモカインに対する抗体であり
得る。細胞は、リンパ球を含む造血細胞；胎盤細胞；生
殖線細胞；または神経細胞（ニューロン細胞もしくは非
ニューロン細胞を含む）であり得る。種々の生理学的効
果は、細胞カルシウムフラックス；化学誘引物質応答；
細胞形態改変応答；ホスホイノシチド脂質代謝回転；ま
たは抗ウイルス応答をもたらすことを含む。

【００１６】本発明はまた、ＣＣＫＲ３と呼ばれるケモ
カインレセプターに関する試薬を提供する。特定の実施
態様において、本発明は、実質的に純粋なＣＣＫＲ３ケ
モカインレセプター、ＣＣＫＲ３ケモカインレセプター
配列を含む融合タンパク質；ＣＣＫＲ３ケモカインレセ
プターへの結合に特異的な抗体；およびＣＣＫＲ３ケモ
カインレセプターまたはその融合タンパク質をコードす
る核酸を提供する。

【００１７】ＣＣＫＲ３は、鳥類、およびマウスまたは
ヒトを含む哺乳動物からなる群より選択される温血動物
由来であり得るか；表４の配列を含み得るか、；または
天然のＣＣＫＲ３ケモカインレセプターとは異なる翻訳
後修飾パターンを示し得る。

【００１８】レセプター融合の実施態様において、タン
パク質は、表４の配列および／またはケモカインの別の
レセプターの配列を含み得る。

【００１９】レセプター抗体の実施態様において、ＣＣ
ＫＲ３ケモカインレセプターは、マウスまたはヒトを含
む哺乳動物タンパク質であり得る。抗体は、表４のペプ
チド配列に対して惹起され得るか；モノクローナル抗体
であり得るか；または標識され得る。

【００２０】レセプター核酸の実施態様において、ケモ
カインレセプターは、鳥類、およびマウスまたはヒトを
含む哺乳動物からなる群から選択される温血動物由来で
あり得る。あるいは、核酸は、表４の配列を含み得る
か；発現ベクターであり得るか；またはデオキシリボ核
酸ヌクレオチドを含み得る。

【００２１】本発明の組成物は、以下：ａ）実質的に純
粋なＣＣＦ１８ケモカイン；ｂ）ＣＣＦ１８ケモカイン
配列を含む融合タンパク質；ｃ）ＣＣＦ１８ケモカイン
への結合に特異的な抗体；およびｄ）ＣＣＦ１８ケモカ
インまたはその融合タンパク質をコードする核酸、から
なる群から選択される組成物を包含する。

【００２２】１つに実施態様において、上記のＣＣＦ１
８ケモカインは、以下：ａ）鳥類、およびマウスもしく
はヒトを含む哺乳動物の群より選択される温血動物由来
であるか；ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、
もしくは配列番号４によって規定される配列を含むか；
ｃ）天然のＣＣＦ１８ケモカインとは異なる翻訳後修飾
パターンを示すか；またはｄ）表２に開示される特徴を
示すケモカインであり得る。

【００２３】本発明はさらに、上記のケモカインおよび
薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。

【００２４】本発明の融合タンパク質は、以下：ａ）配
列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号
４によって規定される配列；および／またはｂ）別のサ
イトカインもしくはケモカインの配列を含む、融合タン
パク質を包含する。

【００２５】１つの実施態様において、上記の抗体は、
以下：ａ）上記ＣＣＦ１８ケモカインが、マウスもしく
はヒトを含む哺乳動物タンパク質であるか；ｂ）該抗体
が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配
列番号４によって規定されるペプチド配列に対して惹起
されるか；ｃ）該抗体が、モノクローナル抗体である
か；またはｄ）該抗体が、標識されている抗体であり得
る。

【００２６】１つの実施態様において、上記の核酸は、
以下：ａ）前記ケモカインが、鳥類、およびマウスもし
くはヒトを含む哺乳動物の群より選択される温血動物由
来であるか；ｂ）該核酸が、表１もしくは表３に記載の
配列を含むか；ｃ）該核酸が、発現ベクターであるか；
またはｄ）該核酸が、デオキシリボ核酸ヌクレオチドを
含む、核酸であり得る。

【００２７】本発明の組成物は、以下：ａ）実質的に純
粋なＣＣＫＲ３ケモカインレセプター；ｂ）ＣＣＫＲ３
ケモカインレセプター配列を含む融合タンパク質；ｃ）
ＣＣＫＲ３ケモカインレセプターへの結合に特異的な抗
体；およびｄ）ＣＣＫＲ３ケモカインレセプターまたは
その融合タンパク質をコードする核酸、からなる群より
選択される組成物を包含する。

【００２８】１つの実施態様において、上記のＣＣＫＲ
３ケモカインレセプターは、以下： ａ）鳥類、およびマウスもしくはヒトを含む哺乳動物の
群より選択される温血動物由来であるか；ｂ）表４に記
載の配列を含むか；またはｃ）天然のＣＣＫＲ３ケモカ
インレセプターとは異なる翻訳後修飾パターンを示すＣ
ＣＫＲ３ケモカインレセプターであり得る。

【００２９】本発明の融合タンパク質は、以下：ａ）配
列番号５および配列番号６によって規定される配列；な
らびに／またはｂ）ケモカインの別のレセプターの配列
を含む、融合タンパク質を包含する。

【００３０】１つの実施態様において、上記の抗体は、
以下：ａ）前記ＣＣＫＲ３ケモカインレセプターが、マ
ウスもしくはヒトを含む哺乳動物タンパク質であるか；
ｂ）該抗体が、配列番号５もしくは配列番号６に規定さ
れるペプチド配列に対して惹起されるか；ｃ）該抗体
が、モノクローナル抗体であるか；またはｄ）該抗体
が、標識されている、抗体であり得る。

【００３１】１つの実施態様において、上記の核酸は、
以下：ａ）前記ケモカインレセプターが、鳥類、および
マウスもしくはヒトを含む哺乳動物の群より選択される
温血動物由来であるか；ｂ）該核酸が、表４に記載の配
列を含むか；ｃ）該核酸が、発現ベクターであるか；ま
たはｄ）該核酸が、デオキシリボ核酸ヌクレオチドを含
む、核酸であり得る。

【００３２】

【発明の実施の形態】（発明の詳細な説明）本発明は、
走化性のサイトカインまたはケモカインに特徴的な種々
の構造特性を示す哺乳動物タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を提供する。例えば、Ｌｏｄｉら， （１９９
４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： １７６２； Ｇｒｏ
ｎｅｎｂｏｒｎおよびＣｌｏｒｅ （１９９１） Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４： ２６３；
ＭｉｌｌｅｒおよびＫｒａｎｇｅｒ （１９９２）Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ
８９： ２９５０；ＭａｔｓｕｓｈｉｍａおよびＯｐ
ｐｅｎｈｅｉｍ （１９８９） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ
１：２； ＳｔｏｅｃｋｌｅおよびＢａｋｅｒ （１９
９０） ＮｅｗＢｉｏｌ． ２： ３１３； Ｏｐｐｅ
ｎｈｅｉｍら （１９９１） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． ９： ６１７； Ｓｃｈａｌｌ （１
９９１） Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ３： １６５； および
Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．を参照のこと。マ
ウスおよびヒト両方の実施態様が、本明細書中に記載さ
れる。

【００３３】ケモカインは、白血球の移動および接着を
誘導することより、免疫応答および炎症応答において重
要な役割を果たす。これらの小さな分泌分子は、保存さ
れた４つのシステインモチーフにより特徴づけられた８
〜１４ｋＤａタンパク質の増大するスーパーファミリー
である。例えば、Ｓｃｈａｌｌ（１９９１）Ｃｙｔｏｋ
ｉｎｅ ３： １６５；およびＴｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ ＨａｎｄｂｏｏｋＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
ＮＹ．を参照のこと。ケモカインは、活性化白血球に
より分泌され、そして炎症に関与する種々の細胞に対す
る化学誘引物質として作用する。化学誘引物質特性の他
に、ケモカインは、他の生物学的応答（例えば、Ｃａ⁺⁺
のような２次メッセンジャーレベルの調節；イノシトー
ルリン酸プール変化（例えば、Ｂｅｒｒｉｄｇｅ （１
９９３） Ｎａｔｕｒｅ ３６１： ３１５またはＢｉ
ｌｌａｈおよびＡｎｔｈｅｓ（１９９０） Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｊ． ２６９： ２８１）；細胞形態改変応答；
ホスホイノシチド脂質代謝回転；潜在的な抗ウイルス応
答；およびその他）を誘導することが示されている。従
って、ＣＣＦ１８は、単独でまたは他の治療試薬と組合
わせて、有利な組合せ効果を有し得る。ケモカインが他
の細胞型に対する効果（例えば、単球、樹状細胞、Ｔ細
胞、好酸球、ならびに／あるいは、恐らく好塩基球およ
び／または好中球の誘引または活性化）を有し得ること
を示唆する理由が存在する。それらはまた、種々の神経
細胞（例えば、末梢神経系における後根神経節ニューロ
ンおよび／または中枢神経系ニューロン）に対する化学
誘引性効果を有し得る。

【００３４】ケモカインスーパーファミリーは、主に、
特徴的な構造モチーフ（Ｃｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ（Ｃ−Ｘ−
Ｃ）およびＣｙｓ−Ｃｙｓ（Ｃ−Ｃ）ファミリーを示す
２つの主要な群に分けられる。これらは、システイン残
基のＮＨ近位対間の単一アミノ酸挿入および配列類似性
に基づいて区別される。代表的には、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカ
イン（すなわち、ＩＬ−８およびＭＧＳＡ／Ｇｒｏ−
α）は、好中球に作用するが、単球には作用しない。一
方、Ｃ−Ｃケモカイン（すなわち、ＭＩＰ−１αおよび
ＲＡＮＴＥＳ）は、単球およびリンパ球の強力な化学誘
引物質であるが、好中球の強力な化学誘引物質でない。
例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅ
ｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２：１７を参照のこと。最近
単離されたケモカインであるリンホタクチン（ｌｙｍｐ
ｈｏｔａｃｔｉｎ）は、いずれの群にも属せず、第３の
ケモカインファミリー（Ｃファミリー）の最初のメンバ
ーを構成し得る。リンホタクチンは、特徴的なＣＣまた
はＣＸＣモチーフを有さず、リンパ球に作用するが、好
中球および単球には作用しない。例えば、Ｋｅｌｎｅｒ
ら、（１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６： １３９
５を参照のこと。本明細書中に記載されるケモカイン分
子は、Ｃ−Ｃケモカインファミリーのメンバーであり、
ＣＣＦ１８と呼ばれる。

【００３５】別の実施態様において、本発明は、ＣＣケ
モカインレセプター３またはＣＣＫＲ３と呼ばれるケモ
カインレセプターをコードする遺伝子を提供する。その
リガンドは、まだ詳しく同定されていない。しかし、こ
のレセプターは、公知のケモカインレセプターに代表的
な構造的特性（例えば、７つの膜貫通構造である）を示
す。種々の特異性（共有された特異性または無差別的な
特異性）で多くの異なるサイトカインに結合する特性を
示し得るか、またはケモカインのうちの１つ（特異的
な）またはサブセット（共有した）に対して高親和性を
示し得る。

【００３６】記載されたケモカインおよびレセプター
は、細胞の生理または発生の種々の局面を媒介するため
に重要であるはずである。

【００３７】（精製ＣＣＦ１８ケモカイン）マウスＣＣ
Ｆ１８ケモカインのヌクレオチド配列およびアミノ酸配
列を表１に示す。ヒトケモカインのヌクレオチド配列お
よびアミノ酸配列を表３に示す。マウスおよびヒトのヌ
クレオチド配列は、それぞれ配列番号１および３に対応
し、そしてマウスおよびヒトのアミノ酸配列は、それぞ
れ配列番号２および４に対応する。ヒトケモカインは、
タンパク質レベルでマウスの対応物に対して約５０％の
類似性を示す。ケモカインレセプター（ＣＣＫＲ３）の
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、表４ならびに
配列番号６および７に示す。これらのアミノ酸配列（ア
ミノ→カルボキシで提供される）は、他のタンパク質か
らこのタンパク質を区別し得るリガンドに関する配列情
報を提供することにおいて重要である。さらに、ペプチ
ド配列は、このようなセグメントを認識する抗体を生じ
るペプチドの調製、およびオリゴヌクレオチドプローブ
の調製（両方とも、このような配列をコードする遺伝子
の単離（例えば、クローニング）のためのストラテジー
である）を可能にする。類似性は、他のサイトカインと
も観察されている。例えば、Ｂｏｓｅｎｂｅｒｇら、
（１９９２） Ｃｅｌｌ ７１：１１５７； Ｈｕａｎ
ｇら、（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ３：３４９；およびＰａ
ｎｄｉｅｌｌａら、（１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ． ２６７：２４０２８を参照のこと。このこ
とは、細胞結合タンパク質とともに作用するか、または
細胞結合タンパク質を投与するという特定の問題を回避
し、そして細胞特異性の可能な機構への洞察を提供す
る。

【００３８】（表１）マウス由来のＣＣＦ１８ケモカイ
ンのヌクレオチド配列（５’→３’）および対応するア
ミノ酸配列（アミノ→カルボキシ）（配列番号１および
２）。保存された４つのシステイン残基および１つの可
能性のあるＲＮＡ不安定化配列（ＡＴＴＴＡ）を、その
下部のアスタリスクによって示す。推定シグナル配列、
１つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｘ
−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、および２つのポリ（Ａ）付加シグ
ナル（ＡＡＴＡＡＡ）には、下線を施している。

【００３９】

【表１】 （表２） マウスＣＣＦ１８ケモカインの物理学的性質 −約１２３アミノ酸のポリペプチドをコードするオープ
ンリーディングフレーム −約１０２アミノ酸の成熟タンパク質 −４つのシステイン残基 −約１１５４９ダルトンの分子量 −１つの可能性のあるＮ−グリコシル化部位。

【００４０】（表３） ヒトＣＣケモカイン核酸コード配列 配列番号３および４。

【００４１】

【表３】 （表４） ヒトケモカインレセプター（ＣＣＫＲ３）のヌクレオチ
ド配列およびアミノ酸配列 配列番号５および６。

【００４２】

【表４】 本明細書で用いられている用語「ＣＣＦ１８ケモカイ
ン」は、タンパク質の意味に用いられる場合、表１に示
されるマウスアミノ酸配列、または表３に示されるヒト
アミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。本発明は
また、このようなタンパク質の重要なフラグメントを含
むポリペプチドを包含する。本発明は、同様の生物学的
機能を示すか、またはＣＣＦ１８ケモカインに特異的な
結合成分と相互作用する、マウスまたはヒト由来のポリ
ペプチドもまた包含する。これらの結合成分（例えば、
抗体）は、代表的には、高い親和性（例えば、少なくと
も約１００ｎＭ、通常は約３０ｎＭより良好、好ましく
は約１０ｎＭより良好、そしてより好ましくは約３ｎＭ
より良好）でＣＣＦ１８ケモカインに結合する。相同な
タンパク質は、マウス以外の哺乳動物種（例えば、ラッ
ト）に見出される。非哺乳動物種もまた、構造的または
機能的に関連した遺伝子およびタンパク質を有する。

【００４３】本明細書で用いられる用語「ポリペプチ
ド」は、重要なフラグメントまたはセグメントを含み、
そして少なくとも約８アミノ酸、一般的には少なくとも
１０アミノ酸、より一般的には少なくとも１２アミノ
酸、しばしば少なくとも１４アミノ酸、よりしばしば少
なくとも１６アミノ酸、代表的には少なくとも１８アミ
ノ酸、より代表的には少なくとも２０アミノ酸、通常は
少なくとも２２アミノ酸、より通常は少なくとも２４ア
ミノ酸、好ましくは少なくとも２６アミノ酸、より好ま
しくは少なくとも２８アミノ酸、および、特に好ましい
実施態様では、少なくとも約３０以上（例えば、３５、
４０、４５、５０、６０、７５、８０、１００、１２０
など）のアミノ酸の一続きのアミノ酸残基を包含する。

【００４４】用語「結合組成物」は、例えば、リガンド
−レセプター型の様式または抗体−抗原相互作用で、Ｃ
ＣＦ１８ケモカインと特異的に結合する分子をいう。こ
れらの組成物は、ＣＣＦ１８ケモカインと特異的に会合
する化合物（例えば、タンパク質）であり得る。会合
は、天然の、生理学的に関連するタンパク質−タンパク
質相互作用（共有結合または非共有結合のいずれでも）
を含む。結合組成物は、ポリマー、または別の化学試薬
であり得る。ＣＣＦ１８ケモカインが、そのリガンド−
レセプター相互作用において、凹または凸の形状を呈す
るかどうかについては、その相互作用が、同様の特異性
（例えば、特異的親和性）を示す以外は、言及されな
い。機能的アナログは、構造的な修飾を有するリガンド
であり得るか、または例えば、適切なリガンド結合決定
基と相互作用する分子形状を有する、全く無関係な分子
であり得る。リガンドは、レセプターのアゴニストまた
はアンタゴニストとして働き得る。例えば、Ｇｏｏｄｍ
ａｎら、（編）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉ
ｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
（第８版），Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照のこ
と。

【００４５】実質的にというのは、タンパク質が、他の
混在するタンパク質、核酸、および元の供給源の生物に
代表的に由来する他の生物製剤を含まないことを意味す
る。純度は、標準的方法でアッセイされ得、そして通常
には少なくとも約４０％純粋、より通常には少なくとも
約５０％純粋、一般的には少なくとも約６０％純粋、よ
り一般的には少なくとも約７０％純粋、しばしば少なく
とも約７５％純粋、よりしばしば少なくとも約８０％純
粋、代表的には少なくとも約８５％純粋、より代表的に
は少なくとも約９０％純粋、好ましくは少なくとも約９
５％純粋、より好ましくは少なくとも約９８％純粋の範
囲であり、そして最も好ましい実施態様では、少なくと
も９９％純粋であり得る。

【００４６】ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性
は、環境およびそのポリペプチドに依存する。多くのパ
ラメーターがポリペプチドの可溶性に影響し、温度、電
解質環境、ポリペプチドのサイズおよび分子的特徴、お
よび溶媒の性質を包含する。代表的には、ポリペプチド
が使用される温度は、約４℃〜約６５℃の範囲である。
通常、使用時の温度は、約１８℃より高く、そしてより
通常は、約２２℃よりも高い。診断目的には、温度は通
常はおよそ室温かまたはそれより暖かいが、アッセイ中
の成分の変性温度よりは低い。治療目的では、温度は通
常体温、代表的にはヒトで約３７℃であるが、特定の状
況下では、温度は、インサイチュまたはインビトロで上
昇または低下させてもよい。

【００４７】電解質は、通常は、インサイチュでの生理
学的条件に近いが、有利な場合、高イオン強度または低
イオン強度に改変され得る。実際のイオンは、例えば、
生理学的または分析的に用いられる標準的な緩衝液に合
わせるよう改変され得る。

【００４８】ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般
的に、実質的に安定な状態であり、そして通常、変性し
た状態ではない。ポリペプチドは、他のポリペプチド
と、四次構造に会合して、例えば、可溶性を付与し得る
か、または天然脂質二重層の相互作用に近い様式で、脂
質または界面活性剤と会合し得る。

【００４９】溶媒は、通常、生物学的活性の保存に用い
られるタイプの生物学的に適合性のある緩衝液であり、
そして通常、生理学的溶媒に近い。通常は、溶媒は、中
性のｐＨ、代表的には約５〜１０の間、そして好ましく
は約７．５を有する。いくつかの場合、界面活性剤が添
加され、代表的にはマイルドな非変性界面活性剤（例え
ば、ＣＨＳまたはＣＨＡＰＳ）が添加されるか、または
リガンドの構造的または生理学的性質の重大な破壊を回
避するに十分低い濃度で添加される。

【００５０】可溶性は、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ単位（特定の
条件下での分子の沈降速度の尺度）で測定された沈降に
反映される。沈降速度の決定は、古典的には分析的超遠
心分離で行われたが、代表的には現在は標準超遠心分離
で行われる。Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ （１９８２） Ｐ
ｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第二
版）， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ；ならびにＣａｎ
ｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ （１９８０） Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｐａｒｔｓ
１−３， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃ
ｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏを参照のこと。粗
決定としては、推定の可溶性ポリペプチドを含むサンプ
ルを、標準完全サイズの超遠心分離で、約５０Ｋ ｒｐ
ｍで約１０分間遠心し、そしてその可溶性分子が上清に
残る。可溶性粒子またはポリペプチドは、代表的には約
３０Ｓ未満、より代表的には約１５Ｓ未満、通常は約１
０Ｓ未満、より通常は約６Ｓ未満、そして、特定の実施
態様においては、好ましくは約４Ｓ未満、そしてより好
ましくは約３Ｓ未満である。

【００５１】（物理的変異体）本発明はまた、ＣＣＦ１
８ケモカインのアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列相
同性を有するタンパク質またはペプチドを包含する。変
異体は、種変異体または対立遺伝子変異体を包含する。

【００５２】アミノ酸配列相同性または配列同一性は、
必要であれば、必要なギャップを導入して、残基のマッ
チを最適化することにより決定される。これは、保存的
置換をマッチとして考慮する場合は、変化する。保存的
置換は、代表的には以下のグループ内での置換を包含す
る：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイ
シン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、
グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニ
ン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同なアミノ
酸配列は、代表的にはそれぞれのタンパク質配列におけ
る天然の対立遺伝子変異体および種間変異体を包含する
と意図される。代表的な相同タンパク質またはペプチド
は、ＣＣＦ１８ケモカインのアミノ酸配列と２５〜１０
０％の相同性（ギャップを導入可能な場合）から５０〜
１００％の相同性（保存的置換が包含される場合）を有
する。相同性の程度は、少なくとも約３５％、一般的に
は少なくとも４０％、より一般的には少なくとも４５
％、しばしば少なくとも５０％、よりしばしば少なくと
も５５％、代表的には少なくとも６０％、より代表的に
は少なくとも６５％、通常は少なくとも７０％、より通
常には少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０
％、そしてより好ましくは少なくとも８０％であり、そ
して特に好ましい実施態様では、少なくとも８５％以上
である。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら（１９７０） Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３； Ｓａｎｋｏｆｆら
（１９８３） Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ， Ｓｔｒｉｎ
ｇ Ｅｄｉｔｓ， ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ： Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
第１章， Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ， Ｒｅａ
ｄｉｎｇ， ＭＡ； およびＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔ
ｉｃｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）社のソ
フトウェアパッケージ； およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ
ｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩも
また参照のこと。

【００５３】単離されたＣＣＦ１８ケモカインＤＮＡ
は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチ
ド挿入、およびヌクレオチドストレッチの倒置により容
易に改変され得る。これらの改変により、これらの抗
原、その誘導体、または同様の生理学的、免疫原もしく
は抗原活性を有するタンパク質をコードする新規のＤＮ
Ａ配列が得られる。これらの改変された配列は、変異抗
原を生成するため、または発現を増強するために使用さ
れ得る。増強された発現は、遺伝子の増幅、転写の増
大、翻訳増大、および他の機構を包含し得る。このよう
な変異ＣＣＦ１８ケモカイン誘導体は、それぞれのタン
パク質またはそのフラグメントの予め決定された（ｐｒ
ｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）変異体または部位特異的変異
体を包含する。「変異ＣＣＦ１８ケモカイン」は、他の
点では上述のマウスＣＣＦ１８ケモカインの相同性の定
義に該当するが、しかし、欠失、置換、または挿入のい
ずれによろうと、天然に見出されるＣＣＦ１８ケモカイ
ンのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを包含する。特に、「部位特異的変異ＣＣＦ１
８ケモカイン」は、一般に表１または３の配列を有する
リガンドと顕著な相同性を有し、そして種々の生物学的
活性（例えば、抗原活性または免疫原活性）をこれらの
配列と共有するタンパク質を包含し、そして好ましい実
施態様では、開示された配列の大部分を含有するタンパ
ク質を包含する。同様の概念は、異なるＣＣＦ１８ケモ
カインタンパク質、特に種々の温血動物（例えば、哺乳
動物および鳥類）に見出されるＣＣＦ１８ケモカインタ
ンパク質に適用される。前に述べたように、記載は、一
般に全てのＣＣＦ１８ケモカインタンパク質を包含する
ことを意図しており、具体的に議論したマウスまたはヒ
トの実施態様に限定されないことを強調する。

【００５４】部位特異的変異部位は予め決定されている
が、変異体が部位特異的である必要はない。ＣＣＦ１８
ケモカインの変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を
作製することにより行われ得る。置換、欠失、挿入、ま
たは任意の組み合わせが生成されて、最終構築物に到達
し得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカルボキシ末
端融合物を包含する。ランダムな変異誘発は、標的コド
ンにて行われ得、次いで、発現された変異体が所望の活
性についてスクリーニングされ得る。公知の配列を有す
るＤＮＡ中の予め決定された部位での置換変異の作製方
法は、当該分野で周知である（例えば、Ｍ１３プライマ
ー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術
による）。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡ
ｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および補遺）もまた、参照
のこと。

【００５５】ＤＮＡ中の変異は、通常、コード配列を読
み取り枠の外にするべきではなく、そして好ましくは、
ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような２次
的なｍＲＮＡの構造を生成し得る相補的な領域を作らな
い。

【００５６】本発明はまた、組換えタンパク質（例え
ば、これらのタンパク質由来のセグメントを使用する異
種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質
は、本来、同じ方式では通常融合されないタンパク質ま
たはセグメントの融合物である。従って、免疫グロブリ
ンとＣＣＦ１８ケモカインポリペプチドとの融合産物
は、代表的なペプチド結合で融合される配列を有し、代
表的には単一の翻訳産物として作られ、そしてそれぞれ
の供給源のペプチドに由来する特性を示す連続的なタン
パク質分子である。同様の概念が異種核酸配列にも適用
される。

【００５７】さらに、新たな構築物が他のタンパク質由
来の類似の機能的ドメインの組み合わせから作製され得
る。例えば、リガンド結合セグメントまたは他のセグメ
ントが、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメ
ントの間で「交換」され得る。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇ
ｈａｍら （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１
３３０； およびＯ’Ｄｏｗｄら （１９８８） Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３： １５９８５を参照の
こと。従って、特異性の新たな組み合わせを示す新たな
キメラポリペプチドは、リガンド結合特異性および他の
機能的ドメインの機能的結合により得られる。

【００５８】ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅ
ｒｓ （１９８１） Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ． ２
２： １８５９に記載されたホスホラミダイト法は、適
切な合成ＤＮＡフラグメントを作製する。二本鎖フラグ
メントはしばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下
で鎖を互いにアニールすること、または適切なプライマ
ー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付
加すること（例えば、ＰＣＲ技術）のいずれかにより得
られる。

【００５９】（機能的変異体）ＣＣＦ１８ケモカインに
対する生理学的な応答のブロックは、例えば、競合的阻
害を介しての、そのレセプターへのリガンドの結合の阻
害により生じ得る。従って、本発明のインビトロアッセ
イは、しばしば単離されたタンパク質、組換え膜結合Ｃ
ＣＦ１８ケモカインを発現する細胞に由来する膜、これ
らのリガンドのレセプター結合セグメントを含む可溶性
のフラグメント、または固相基質に付着したフラグメン
トを使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメン
ト変異および改変、またはリガンド変異および改変（例
えば、リガンドアナログ）のいずれかの効果の診断的測
定を可能にする。

【００６０】本発明はまた、競合的薬物スクリーニング
アッセイ（例えば、ここで、抗原に対する中和抗体また
はレセプターフラグメントが、タンパク質との結合につ
いて試験化合物と競合する）の使用を意図する。この方
式では、抗体はリガンドの１またはそれより多い抗原結
合部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出する
ために使用され得、そしてまた、さもなければレセプタ
ーと相互作用し得るタンパク質上の結合部位を占めるた
めに使用され得る。

【００６１】さらに、ＣＣＦ１８ケモカインに対する中
和抗体および高親和性レセプター結合部位を含むケモカ
インの可溶性フラグメントは、組織（例えば、異常な生
理学を経験している組織）におけるケモカイン活性を阻
害するために使用され得る。

【００６２】ＣＣＦ１８ケモカイン抗原の「誘導体」
は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、および
他の化学的部分との共有結合的または凝集結合物を包含
する。共有結合誘導体は、当該分野で周知の手段によ
り、ＣＣＦ１８ケモカインのアミノ酸側鎖中あるいはＮ
末端またはＣ末端で見出される基への官能基の連結によ
り調製され得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端
またはカルボキシル側鎖を含有する残基の脂肪族エステ
ルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル
誘導体、およびアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基含
有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のＮ−アシ
ル誘導体を包含し得るが、これに限定されない。アシル
基は、Ｃ３〜Ｃ１８の直鎖アルキルを包含するアルキル
部分の群から選択され、これにより、アルカノイルアロ
イル種が形成される。キャリアタンパク質への共有結合
的付着は、免疫原性部分がハプテンである場合には重要
であり得る。

【００６３】特に、グリコシル化改変（例えば、その合
成およびプロセシングの間、またはさらなるプロセシン
グの工程でのポリペプチドのグリコシル化パターンの改
変により作られるもの）が包含される。これを達成する
最も好ましい手段は、通常そのようなプロセシングを提
供する細胞に由来するグリコシル化酵素（例えば、哺乳
動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによ
る。脱グリコシル化酵素もまた、意図される。他の小さ
い改変を有する同一の１次アミノ酸配列のバージョンも
また包含され、これはリン酸化アミノ酸残基（例えば、
ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニ
ン）を包含する。

【００６４】誘導体の主要な群は、ＣＣＦ１８ケモカイ
ンまたはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリ
ペプチドとの共有結合物である。これらの誘導体は、Ｎ
末端またはＣ末端融合物のような組換え培養物中で、ま
たは反応性側鎖基を介してのタンパク質の架橋結合に有
用な当該分野で公知の薬剤の使用により合成され得る。
架橋結合剤を用いる好ましいケモカイン誘導体化部位
は、遊離アミノ基、炭化水素部分、およびシステイン残
基である。

【００６５】ＣＣＦ１８ケモカインと他の相同性タンパ
ク質または異種タンパク質（例えば、他のケモカイン）
との融合ポリペプチドもまた、提供される。多くの増殖
因子およびサイトカインがホモ２量体の存在であり、そ
して反復構築物（ｒｅｐｅａｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）
は、タンパク質分解的切断に対する感受性の減少を包含
する種々の利点を有し得る。さらに、多くのレセプター
はシグナルの伝達のために２量体化が必要であり、そし
て種々の２量体リガンドまたはドメイン反復が所望され
得る。相同性ポリペプチドは、異なる表面マーカー間で
の融合物であり得、例えば、レセプター結合特異性を示
すハイブリッドタンパク質が得られる。同様に、誘導体
タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融
合物が構築され得る。代表的な例は、融合リガンドの存
在または位置を容易に測定し得るための、レポーターポ
リペプチド（例えば、ルシフェラーゼ）とリガンドのセ
グメントまたはドメイン（例えば、レセプター結合セグ
メント）との融合物である。例えば、Ｄｕｌｌら、米国
特許第４，８５９，６０９号を参照のこと。他の遺伝子
融合パートナーは、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐ
Ｅ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラー
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＦＬＡＧ融合物、お
よび酵母のα接合因子を包含する。例えば、Ｇｏｄｏｗ
ｓｋｉら （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
８１２を参照のこと。

【００６６】ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅ
ｒｓ （１９８１） Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ． ２
２： １８５９に記載されたホスホラミダイト法は、適
切な合成ＤＮＡフラグメントを作製する。二本鎖フラグ
メントはしばしば、相補鎖を合成しそして適切な条件下
で鎖を互いにアニールすること、または適切なプライマ
ー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付
加することのいずれかにより得られる。

【００６７】そのようなポリペプチドはまた、リン酸
化、スルホン化、ビオチン化、または他の部分（特にリ
ン酸基と類似の分子形を有する部分）の付加または除去
により化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。い
くつかの実施態様では、改変は有用な標識試薬である
か、または精製の標的（例えば、ＦＬＡＧのような親和
性タグ）として作用する。

【００６８】融合タンパク質は、代表的には、組換え核
酸法または合成ポリペプチド法のいずれかにより作製さ
れる。核酸操作および発現の技術は、例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（第２版）、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに一般的に記載されて
いる。ポリペプチド合成の技術は、例えば、Ｍａｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ． ８５：２１４９； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ
（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４１；および
Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８９）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓ
ｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅ
ｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄに記載されている。

【００６９】本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコ
シル化での変化以外のＣＣＦ１８ケモカインの誘導体の
使用を意図する。そのような誘導体は、化学部分との共
有結合または凝集会合を包含し得る。これらの誘導体
は、一般に３つのクラスに分類される：（１）塩、
（２）側鎖および末端残基の共有結合改変、および
（３）例えば細胞膜との、吸着複合体。そのような共有
結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノ
アッセイにおける試薬として、あるいは精製法（例え
ば、リガンドまたは他の結合リガンドの親和性精製のた
めの）において有用である。例えば、ＣＣＦ１８ケモカ
イン抗原は、抗ＣＣＦ１８ケモカイン抗体またはそのレ
セプターのアッセイあるいは精製に使用するために、臭
化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのような固体支持体
への共有結合により、当該分野で周知の方法により固定
化され得るか、あるいは、グルタルアルデヒド架橋結合
を有して、あるいは有さないで、ポリオレフィン表面に
吸着され得る。ＣＣＦ１８ケモカインはまた、検出可能
な基で標識され得る。例えば、クロラミンＴ手順により
放射性ヨウ素化され、希土類キレートに共有結合され、
または診断的アッセイで使用するために別の蛍光部分と
結合される。ＣＣＦ１８ケモカインの精製は、固定化抗
体またはレセプターにより行われ得る。

【００７０】本発明の可溶化されたＣＣＦ１８ケモカイ
ンまたはフラグメントは、リガンドまたはそのフラグメ
ントに特異的な抗血清または抗体の産生のための免疫原
として使用され得る。精製したケモカインは、タンパク
質を含む不純な調製物の種々の形態での免疫化により調
製されるモノクローナル抗体またはケモカイン結合フラ
グメントをスクリーニングするために使用され得る。特
に、用語「抗体」はまた、天然の抗体の抗原結合フラグ
メントも包含する。精製されたＣＣＦ１８ケモカインは
また、タンパク質またはタンパク質を含む細胞フラグメ
ントレベルの上昇（これらは両方とも、異常なもしくは
特定の生理学的状態または疾患状態の診断基準になり得
る）の存在に反応して産生された抗体を検出するための
試薬として使用され得る。さらに、ケモカインタンパク
質フラグメントはまた、直後に記載するように、本発明
の抗体を産生するための免疫原として役立ち得る。例え
ば、本発明は、表１もしくは表３に示されるアミノ酸配
列に対して惹起された抗体、またはそれらを含むタンパ
ク質を意図する。特に、本発明は、特定のフラグメント
（例えば、タンパク質の三次構造の外側の表面上にある
ことが予測されるフラグメント）に結合親和性を有する
抗体またはこれに対して惹起される抗体を意図する。

【００７１】本発明は、さらなる密接に関連した種改変
体の単離を意図する。サザンブロット分析またはノーザ
ンブロット分析は、類似の遺伝的存在が他の哺乳類動物
において存在することを確立するはずである。ＣＣＦ１
８ケモカインは、種改変体（例えば、齧歯類、ウサギ
目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目、および霊長類）において
広範であるらしい。

【００７２】本発明はまた、構造、発現、および機能に
おいて性質および類似性の両方を示す関連したケモカイ
ンの一群を単離する手段を提供する。タンパク質の多く
の生理学的影響の解明は、リガンドの別個の種改変体の
単離および特徴付けにより大いに加速される。特に、本
発明は、異なる種におけるさらなる相同的な遺伝的存在
の同定に有用なプローブを提供する。

【００７３】単離された遺伝子により、ＣＣＦ１８ケモ
カインに対応する発現を欠く細胞（例えば、対応するリ
ガンドを欠きそしてネガティブバックグラウンド活性を
示す種の型または細胞）の形質転換が可能になる。形質
転換された遺伝子の発現により、規定されたまたは単一
の種改変体を用いて、抗原性が純粋な細胞株の単離が可
能となる。このアプローチにより、ＣＣＦ１８レセプタ
ータンパク質の生理学的影響のより感度の高い検出およ
び区別が可能になる。亜細胞フラグメント（例えば、細
胞質フラグメントまたは膜フラグメント）は単離され、
そして使用され得る。

【００７４】リガンドにより提供される、種々の分化機
能をもたらす決定的な構造エレメントの分析（特に、関
連するクラスのメンバーの比較）は、現代の分子生物学
の標準的な技術を用いて可能である。例えば、Ｃｕｎｎ
ｉｎｇｈａｍら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：
１３３９において記載されたホモログ走査変異誘発技
術（ｈｏｍｏｌｏｇ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）；およびＯ’Ｄｏｗ
ｄら（１９８８）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６
３：１５９８５において使用されたアプローチ；および
Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅｒら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．
９：４３８１を参照のこと。

【００７５】特に、レセプター結合セグメントは、レセ
プター結合親和性および特異性の両方、ならびにシグナ
ル伝達においてどの構造的特徴が重要であるかを決定す
るために、種改変体の間で置換され得る。異なるケモカ
イン改変体の配列は、異なるレセプター種改変体との相
互作用の組み合わせられた特性を示すリガンドについて
スクリーニングするために使用される。

【００７６】細胞内機能は、おそらく、サイトゾルに通
常接近し得るレセプターのセグメントに関与する。しか
し、リガンドの内部移行は、特定の状況下で起こり得、
そして細胞内成分と「細胞外」セグメントとの間の相互
作用が起こり得る。ＣＣＦ１８ケモカインと他の細胞内
成分との相互作用の特異的セグメントは、変異誘発また
は直接的な生化学的手段（例えば、架橋法またはアフィ
ニティー法）により同定され得る。結晶学的方法または
他の物理的方法による構造分析もまた、適用可能であ
る。シグナル伝達機構のさらなる調査は、アフィニティ
ー法によりまたは遺伝的手段（例えば、変異体の相補性
分析）により単離可能であり得る結合した成分の研究を
含む。

【００７７】ＣＣＦ１８ケモカインの発現および制御の
さらなる研究が探求される。タンパク質に結合した制御
しているエレメントは、異なる発生パターン、組織特異
的パターン、または他の発現パターンを示し得る。遺伝
子領域の上流または下流（例えば、制御エレメント）が
目的である。メッセージのディファレンシャルスプライ
シング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎ
ｇ）は、膜に結合した形態、可溶性形態、およびリガン
ドの改変された型を導き得る。

【００７８】タンパク質の構造の研究により、新しいリ
ガンド（特に、レセプターのアゴニストまたはアンタゴ
ニストの特性を示すアナログ）の設計が導かれる。これ
は、所望の活性スペクトルを示すリガンドを単離するた
めに、前に記載したスクリーニング法と組み合わせられ
得る。

【００７９】他の細胞型における発現はしばしば、特定
のケモカインにおいてグリコシル化の差異を生じる。種
々の種改変体は、アミノ酸配列以外の構造的な差異に基
づく別個の機能を示し得る。特異な改変は、特異な機能
の原因であり得、そしてその影響は、現在解明できるよ
うになっている。

【００８０】従って、本発明は、生理学的ケモカイン結
合タンパク質相互作用に関連した重要な薬剤を提供す
る。以前の記載は、主にマウスおよびヒトＣＣＦ１８ケ
モカインに焦点を合わせているが、本発明が他の種の対
応物（例えばラットおよび他の哺乳動物種または対立遺
伝子変異体）、ならびにそれらの変異体を包含すること
は、当業者により即座に認識される。

【００８１】（抗体）抗体は、種変異体、または対立遺
伝子変異体を含むＣＣＦ１８ケモカイン、ならびにその
フラグメントに対して、天然に存在する形態およびそれ
らの組換え形態の両方において、惹起され得る。さら
に、抗体は、活性形態または不活性形態のいずれかのＣ
ＣＦ１８ケモカインに対して惹起され得る。抗イディオ
型抗体もまた意図され得る。

【００８２】リガンドの予め決定されているフラグメン
トに対する、抗体（結合フラグメントおよび単一鎖バー
ジョン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ）
を含む）が、上記のようにフラグメントと免疫原性タン
パク質との結合物で動物を免疫することにより惹起され
得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細
胞から調製される。これらの抗体は、正常型ＣＣＦ１８
ケモカインまたは欠陥型ＣＣＦ１８ケモカインに対する
結合についてスクリーニングされ得るか、または、例え
ば、ＣＣＦ１８のレセプターを介して媒介されるアゴニ
スト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニ
ングされ得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、
少なくとも約１ｍＭのＫ_Dで結合され、より通常には少
なくとも約３００μＭ、代表的に少なくとも約１０μ
Ｍ、より代表的には少なくとも約３０μＭ、好ましくは
少なくとも約１０μＭ、およびより好ましくは少なくと
も約３μＭのＫ_Dで、またはより良好に結合する。

【００８３】本発明の抗体（抗原結合フラグメントを含
む）は、有意な診断的または治療的価値を有し得る。そ
れらはレセプターに結合し、そしてリガンド結合を阻害
するかまたは生理的応答を誘発するリガンドの能力を阻
害する、強力なアンタゴニストであり得る。それらはま
た、非中和抗体として有用であり得、そしてトキシンま
たは放射性核種に連結され得る。その結果、抗体がリガ
ンドへ結合する場合、例えば、細胞表面でリガンドを発
現する細胞は傷害される。さらに、これらの抗体は、直
接的にまたはリンカーの手段により間接的にのいずれか
で、薬物または他の治療剤に結合され得、そして薬物標
的化に影響し得る。

【００８４】本発明の抗体はまた、診断的適応において
有用であり得る。捕獲または非中和抗体として、これら
はレセプター結合を阻害せずにケモカインへ結合する能
力についてスクリーニングされ得る。中和抗体として、
これらは競合的結合アッセイに有用であり得る。これら
はまた、ＣＣＦ１８ケモカインの、または間接的にレセ
プターの、検出または定量に有用である。

【００８５】リガンドフラグメントは、免疫原として使
用される融合または共有結合ポリペプチドとして、他の
物質、特にポリペプチドに結合され得る。リガンドおよ
びそのフラグメントは、種々の免疫原（例えば、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、破
傷風トキシンなど）へ融合または共有結合され得る。Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｏｅｂｅｒ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， ＨａｒｐｅｒおよびＲｏ
ｗ， １９６９； Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ （１９６
２） Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｅｒｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｄｏｖｅｒ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， およびＷ
ｉｌｌｉａｍｓら、（１９６７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，第１巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを、ポリクローナル抗血清の調
製方法の記載について参照のこと。典型的な方法は、抗
原での動物の過免疫を含む。次いで、繰り返した免疫の
少し後に、動物の血液が回収され、そしてガンマグロブ
リンが単離される。

【００８６】いくつかの場合において、種々の哺乳動物
宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）か
らモノクローナル抗体を調製することが所望される。そ
のようなモノクローナル抗体を調製するための技術の記
載は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）Ｂａｓｉｃ ａｎ
ｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４
版）、Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， ＣＡ、およびそこ
で引用される参考文献；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ
（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；
Ｇｏｄｉｎｇ （１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎ
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；および特に、Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕ
ｒｅ２５６： ４９５（これは、モノクローナル抗体を
産生する一つの方法を記載する）において見出され得
る。簡潔に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注
入することを包含する。次いで、動物は屠殺され、そし
て細胞はその脾臓から採取され、次いでその細胞は骨髄
腫細胞に融合される。これにより、インビトロで再生さ
れ得るハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を生
じる。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニング
して、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個
々のクローンを単離する。この様式において、得られる
個々の抗体種は、免疫原物質上で認識される特異的部位
に応答して作製される免疫動物由来の不死化およびクロ
ーン化されたＢ単細胞の生産物である。

【００８７】他の適切な技術は、リンパ球の抗原性ポリ
ペプチドへの、またはファージもしくは類似のベクター
における抗体のライブラリーの選択へのインビトロ曝露
を包含する。Ｈｕｓｅら（１９８９）「λファージにお
ける免疫グロブリンレパートリーのラージコンビナトリ
アルライブラリーの作製」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：
１２７５：およびＷａｒｄら（１９８９） Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４１：５４４を参照のこと。本発明のポリペプチ
ドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む改
変を伴ってまたは伴わずに使用され得る。しばしば、ポ
リペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供す
る基質を共有結合的にまたは非共有結合的に結合するこ
とにより標識される。広範に多様な標識および結合技術
が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方で
多数報告されている。適切な標識としては、放射性核
種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部
分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このよ
うな標識の使用を教示する特許としては、米国特許第
３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同
第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；
同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９
号；および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。組
換え免疫グロブリンもまた産生され得る。Ｃａｂｉｌｌ
ｙ、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＱｕｅｅ
ｎら （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ． ８６： １００２９を参照のこと。

【００８８】本発明の抗体はまた、タンパク質の単離に
おけるアフィニティークロマトグラフィーに使用され得
る。カラムは、抗体を固相支持体（例えば、アガロー
ス、Ｓｅｐｈａｄｅｘなどのような粒子）に連結させて
調製され得、ここで、細胞溶解物は、カラムを通過され
得、カラムを洗浄し、続いて温和な変性剤の濃度を増加
させることによって、精製ＣＣＦ１８ケモカインタンパ
ク質が遊離される。

【００８９】抗体はまた、特定の発現産物について発現
ライブラリーをスクリーニングするために使用され得
る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体の
結合により抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で
標識される。

【００９０】ＣＣＦ１８ケモカインに対して惹起される
抗体はまた、抗イディオ型の抗体を惹起するために有用
である。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種
々の免疫学的症状を検出または診断するにおいて有用で
ある。

【００９１】（核酸）記載されたペプチド配列および関
連試薬は、ＣＣＦ１８ケモカインをコードするＤＮＡク
ローンを、例えば天然の供給源から単離するにおいて有
用である。典型的に、これはマウスからの遺伝子の単離
において有用であり、そして同様の手順は他の種（例え
ば、鳥類および哺乳動物のような温血動物）に適用され
る。クロスハイブリダイゼーションは、他の種からのリ
ガンドを単離し得る。多くの異なるアプローチが、適切
な核酸クローンを首尾よく単離するために利用可能であ
るべきである。

【００９２】精製タンパク質または定義されたペプチド
は、上記のように標準的な方法により抗体を作製するた
めに有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は
免疫系に提示され、モノクローナル抗体およびポリクロ
ーナル抗体を生じ得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ （１
９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ；
ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ （１９８９）
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。あるいは、ＣＣＦ１８レ
セプターは、特異的結合試薬として使用され得、そし
て、その結合の特異性が利用され得る。抗体が最も利用
されるであろう。しかし、ケモカインレセプターは、代
表的には７つの膜貫通タンパク質であり、脂質または膜
との適切な相互作用に感受性であり得る。

【００９３】例えば、特異的結合組成物は、ＣＣＦ１８
ケモカインを発現する細胞株から作製される発現ライブ
ラリーをスクリーニングするために使用され得る。スク
リーニングは、例えば、表面に発現されるリガンドの標
準的な染色であり得るか、またはパニングにより得る。
細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色または
免疫蛍光手順により行われ得る。結合組成物は、リガン
ドを発現する細胞をアフィニティ精製するために、また
は選別するために使用され得た。

【００９４】ペプチドセグメントはまた、ライブラリー
をスクリーニングするため（例えば、種変異体を単離す
るため）の適切なオリゴヌクレオチドを予測するために
使用され得る。遺伝子コードが、スクリーニングのため
のプローブとして有用な適切なオリゴヌクレオチドを選
択するために使用され得る。例えば、表１または３を参
照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術と組み
合わせて、合成オリゴヌクレオチドはライブラリーから
正しいクローンを選択するにおいて有用である。相補的
な配列もまた、プローブまたはプライマーとして使用さ
れる。可能なアミノ末端の同定に基づいて、第３ペプチ
ドは、例えば、アンカーベクターもしくはポリＡ相補的
ＰＣＲ技術と組み合わせて、または、他のペプチドの相
補的なＤＮＡと組み合わせて特に有用である。

【００９５】本発明は、生物学的に活性な対応するＣＣ
Ｆ１８ケモカインポリペプチドをコードする単離された
ＤＮＡまたはフラグメントの使用を意図する。さらに、
本発明は、本明細書中に記載されるＤＮＡ配列に適切な
条件下でハイブリダイズし得る生物学的に活性なタンパ
ク質またはポリペプチドをコードする、単離、または組
換えＤＮＡを含む。上記の生物学的に活性なタンパク質
またはポリペプチドは、完全なリガンド、またはフラグ
メントであり得、そして表１または３に開示されるアミ
ノ酸配列を有する。さらに、本発明は、ＣＣＦ１８ケモ
カインに相同であるタンパク質をコードするか、または
ＣＣＦ１８ケモカインをコードするｃＤＮＡをプローブ
として用いて単離した、単離ＤＮＡもしくは組換えＤＮ
Ａ、またはそれらのフラグメントの使用を含む。この単
離ＤＮＡは、５’および３’隣接においてそれぞれの制
御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ
付加シグナルなど）を有し得る。

【００９６】「単離」核酸は、内生配列に天然に伴う他
の成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、およびも
との種からの隣接するゲノム配列）から実質的に分離さ
れた核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ポリマー）で
ある。この用語は、天然に生じる環境から取り除かれた
核酸配列を包含し、そして組換えまたはクローン化ＤＮ
Ａ単離物および化学的に合成されたアナログ、または異
種の系により生物学的に合成されるアナログを含む。実
質的に単一な分子は、分子の単離された形態を含む。

【００９７】単離核酸は、一般に、分子の均質な組成物
であるが、いくつかの実施態様において、少量の不均質
成分を含む。この不均質成分は、典型的にポリマー末端
または所望される生物学的機能または活性に重要でない
部分に見出される。

【００９８】「組換え」核酸は、その生産方法またはそ
の構造のいずれかにより定義される。その生産方法を参
照すると、例えば、生産物はあるプロセスにより作製さ
れ、このプロセスは組換え核酸技術の使用であり、例え
ば、ヌクレオチド配列における人の介入、代表的には、
選択または生産を包含する。あるいは、天然ではお互い
に隣接しない２つのフラグメントの融合物を含む配列を
生成することにより作製される核酸であり得るが、天然
の生産物（例えば、天然に存在する変異体）は排除する
ことを意味する。従って、例えば、細胞を、天然に存在
しない任意のベクターで形質転換することによって作製
される生産物が包含され、この生産物は、任意の合成オ
リゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導される配列を含
む核酸である。このようなことをしばしば行って、コド
ンを、同一または保存アミノ酸をコードする縮重コドン
で置換し、同時に、代表的には配列認識部位を導入する
かまたは除去する。あるいは、一般に利用可能な天然の
形態では見出されない所望の組み合わせの機能を含む単
一の遺伝子物質（ｅｎｔｉｔｙ）を生成するために、所
望の機能の核酸セグメントを一緒に結合することが行わ
れる。制限酵素認識部位は、しばしばこのような人工的
操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、プ
ロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列、ま
たは他の有用な特徴）が設計により組み込まれ得る。同
様の概念が、組換え体（例えば、融合ポリペプチド）に
ついて意図される。具体的には、遺伝子コードの縮重性
により、これらの抗原のフラグメントに類似のポリペプ
チドをコードする合成核酸および種々の異なる種変異体
由来の配列融合物を包含する。

【００９９】核酸の状況において、重要な「フラグメン
ト」は、少なくとも約１７ヌクレオチドの連続するセグ
メントであり、一般的には少なくとも約２０ヌクレオチ
ドであり、より一般的には少なくとも約２３ヌクレオチ
ドであり、通常、少なくとも約２６ヌクレオチドであ
り、より通常には少なくとも約２９ヌクレオチドであ
り、しばしば、少なくとも約３２ヌクレオチドであり、
さらにしばしば少なくとも約３５ヌクレオチドであり、
代表的には少なくとも約３８ヌクレオチドであり、より
代表的には少なくとも４１ヌクレオチドであり、通常は
少なくとも約４４ヌクレオチドであり、より通常には少
なくとも４７ヌクレオチドであり、好ましくは少なくと
も約５０ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくと
も約５３ヌクレオチドであり、そして特に好ましい実施
態様において少なくとも約５６以上のヌクレオチド（例
えば、６０、６５、７５、８５、１００、１２０、１５
０、２００、２５０、３００、４００など）である。

【０１００】ＣＣＦ１８ケモカインタンパク質またはペ
プチドをコードするＤＮＡは、関連するかまたは相同で
あるリガンドをコードする遺伝子、ｍＲＮＡ、およびｃ
ＤＮＡ種、ならびに異なる種由来の相同タンパク質をコ
ードするＤＮＡを同定するために特に有用である。これ
らは、霊長類を含む他の種において相同であるようであ
る。種々のＣＣＦ１８ケモカインタンパク質が相同であ
るはずであり、そして本明細書中に含まれる。しかし、
リガンドに進化的により遠い関連を有するタンパク質で
さえ、それらが十分に相同である場合、これらの配列を
用いて適切な条件下で容易に単離され得る。霊長類ＣＣ
Ｆ１８ケモカインが特に興味深い。

【０１０１】本発明はさらに、本明細書中に示される単
離されたＤＮＡに同一であるかまたは高く相同であるＤ
ＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子およびフラグメント
をカバーする。詳細には、この配列は、転写、翻訳、お
よびＤＮＡ複製を制御するＤＮＡセグメントにしばしば
作動可能に連結される。あるいは、ゲノム配列由来の組
換えクローン（例えば、イントロンを含む）は、トラン
スジェニック実験（例えば、トランスジェニック細胞お
よび生物）ならびに遺伝子治療に有用である。例えば、
Ｇｏｏｄｎｏｗ （１９９２） 「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ａｎｉｍａｌｓ」、Ｒｏｉｔｔ（編）、Ｅｎｃｙｃ
ｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＳａｎＤｉｅｇｏ， １５
０２−１５０４頁；Ｔｒａｖｉｓ （１９９２） Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２５６：１３９２；Ｋｕｈｎら、（１９９
１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：７０７；Ｃａｐｅｃｃ
ｈｉ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８
８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９８７） 編、Ｔｅｒａｔ
ｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
ＡｐｐｒｏａｃｈＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒ
ｄ；およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ （１９９２） Ｊ．
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：１８０を
参照のこと。

【０１０２】比較される場合、相同な核酸配列は重要な
類似性を示す。核酸における相同性についての標準法
は、当業者に一般的に使用される配列比較による相同性
の測定、またはハイブリダイゼーション条件に基づく測
定のいずれかである。ハイブリダイゼーション条件は以
下にさらに詳細に記載される。

【０１０３】核酸配列比較の状況に関する「実質的な相
同性」は、比較される場合、セグメントまたはその相補
鎖のいずれかが、適切なヌクレオチドの挿入または欠失
で最適に配置される場合に、少なくとも約５０％のヌク
レオチドが同一であり、一般的には少なくとも約５６
％、より一般的には少なくとも約５９％、通常少なくと
も約６２％、より通常は少なくとも約６５％、しばしば
少なくとも約６８％、よりしばしば少なくとも約７１
％、代表的には少なくとも約７４％、より代表的には少
なくとも約７７％、通常は少なくとも約８０％、より通
常は少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０
％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％、または
それ以上であり、そして特に好ましい実施態様において
は、最高約９９％またはそれ以上のヌクレオチドが同一
であることを意味する。あるいは、実質的な相同性は、
セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下
で、代表的には表１または３に由来する配列を用いて１
本鎖またはその相補鎖にハイブリダイズする場合に存在
する。代表的には、少なくとも約３０ヌクレオチドの範
囲にわたって少なくとも約５５％の相同性が存在する場
合、好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの範囲に
わたって少なくとも約６５％の相同性が存在する場合、
より好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好まし
くは約２０ヌクレオチドにわたって少なくとも約９０％
の類似性が存在する場合、選択的なハイブリダイゼーシ
ョンが生じる。Ｋｅｎｅｈｉｓａ （１９８４） Ｎｕ
ｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ２０３を参照の
こと。相同性比較の長さは、記載のように、より長い範
囲にわたり得、そして特定の実施態様では、少なくとも
約１７ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオ
チド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代
表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的に
は少なくとも約４０ヌクレオチド、好ましくは少なくと
も約５０ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくと
も約７５〜１００またはそれ以上のヌクレオチドの範囲
にわたる。

【０１０４】「ストリンジェントな条件」は、ハイブリ
ダイゼーションの状況において相同性をいうとき、塩、
温度、有機溶媒、および代表的にはハイブリダイゼーシ
ョン反応において制御される他のパラメーターの、スト
リンジェントな組み合わされた条件である。ストリンジ
ェントな温度条件は、通常、約３０℃以上、より通常に
は、約３７℃以上、代表的には約４５℃、より代表的に
は約５５℃以上、好ましくは約６５℃以上、そしてより
好ましくは約７０℃以上の温度が含まれる。ストリンジ
ェントな塩条件は、通常、約１０００ｍＭ未満であり、
通常は約５００ｍＭ未満であり、より通常は約４００ｍ
Ｍ未満であり、代表的には約３００ｍＭ未満であり、好
ましくは約２００ｍＭ未満であり、そしてより好ましく
は約１５０ｍＭ未満である。しかし、パラメーターの組
み合わせは、任意の単一のパラメーターの測定よりもは
るかにより重要である。例えば、ＷｅｔｍｕｒおよびＤ
ａｖｉｄｓｏｎ （１９６８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉ
ｏｌ． ３１： ３４９を参照のこと。

【０１０５】他の哺乳動物種由来のＣＣＦ１８ケモカイ
ンは、密接に関連する種の種交差ハイブリダイゼーショ
ンによりクローニングされ、そして単離され得る。ある
いは、データベースからの配列は、類似性を有すると認
識され得る。相同性は、遠縁種間では比較的低くあり
得、従って、比較的密接に関連する種のハイブリダイゼ
ーションが望ましい。あるいは、低い種特異性を示す抗
体調製物の調製は、発現クローニングアプローチに有用
であり得る。

【０１０６】（ＣＣＦ１８ケモカインの作製；模倣物）
ＣＣＦ１８ケモカインまたはそのフラグメントをコード
するＤＮＡは、化学合成、ｃＤＮＡライブラリーのスク
リーニング、または広範な種々の細胞株または組織サン
プルから調製されるゲノムライブラリーのスクリーニン
グにより得ることができる。

【０１０７】このＤＮＡは、完全長リガンドまたはフラ
グメントの合成のために広範な種々の宿主細胞で発現さ
れ得、これは順番に、例えば、ポリクローナル抗体また
はモノクローナル抗体を作製するために；結合研究のた
めに；改変された分子の構築および発現のために；なら
びに構造／機能研究のために使用され得る。各々の抗原
またはそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質
転換またはトランスフェクトされた宿主細胞で発現され
得る。これらの分子は、実質的に精製され得て、タンパ
ク質または細胞混入物を除かれるか、そうでなければ、
組換え宿主から誘導され得、それゆえ、薬学的に受容可
能なキャリアーおよび／または希釈剤と組み合わされる
場合、薬学的組成物において特に有用である。抗原また
はその一部は、他のタンパク質との融合物として発現さ
れ得る。

【０１０８】発現ベクターは、代表的には所望の抗原遺
伝子またはそのフラグメントを含有する、通常は、適切
な宿主細胞で認識される適切な遺伝子制御エレメントに
作動可能に連結される、自己複製するＤＮＡまたはＲＮ
Ａ構築物である。これらの制御エレメントは、適切な宿
主内で発現をもたらし得る。発現をもたらすのに必要な
制御エレメントの特定のタイプは、使用される最後の宿
主細胞に依存する。一般に、遺伝子制御エレメントは、
原核細胞のプロモーター系または真核細胞のプロモータ
ー発現制御系を包含し得、そして代表的には、転写プロ
モーター、転写の開始を制御する任意のオペレーター、
ｍＲＮＡの発現レベルを高めるための転写エンハンサ
ー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、およ
び転写および翻訳を終止させる配列を含む。発現ベクタ
ーはまた、通常、ベクターを宿主細胞とは独立に複製さ
せ得る複製開始点を含有する。

【０１０９】本発明のベクターは、ＣＣＦ１８ケモカイ
ンをコードするＤＮＡか、または代表的には、生物学的
に活性なポリペプチドをコードするそのフラグメントを
含有する。ＤＮＡは、ウイルスプロモーターの制御下で
あり得、そして選択マーカーをコードし得る。本発明は
さらに、原核生物宿主または真核生物宿主中でＣＣＦ１
８ケモカインをコードする真核生物のｃＤＮＡを発現し
得るこのような発現ベクターの使用を包含し、ここで、
ベクターは宿主に適合性であり、そしてリガンドをコー
ドする真核生物のｃＤＮＡは、ベクターを含む宿主の増
殖により目的のｃＤＮＡが発現されるようにベクターに
挿入される。通常、発現ベクターは、宿主細胞内での安
定な複製、または細胞あたりの所望の遺伝子の総コピー
数を著しく増大させる増幅のために設計される。発現ベ
クターが宿主細胞内で複製する必要は必ずしもなく、例
えば、宿主細胞によって認識される複製開始点を含有し
ないベクターを使用して、種々の宿主におけるリガンド
またはそのフラグメントの一時的な発現をもたらすこと
が可能である。ＣＣＦ１８ケモカイン遺伝子またはその
フラグメントの宿主ＤＮＡへの組換えによる組込みを生
じるベクターを使用すること、または内因性遺伝子の発
現を制御するプロモーターを組込むこともまた可能であ
る。

【０１１０】本明細書中で使用されるベクターは、プラ
スミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能な
ＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノムへのＤＮＡフラ
グメントの組込みを可能にする他のビヒクルを包含す
る。発現ベクターは、作動可能に連結される遺伝子の発
現をもたらす遺伝子制御エレメントを含有する、分化し
たベクターである。プラスミドは、最も多く共通に使用
される形態のベクターであるが、同等の機能を供し、当
該分野で公知であるかまたは公知になる全ての他の形態
のベクターが、本明細書中で使用するのに適切である。
例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら （１９８５および補遺）
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ； ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．
Ｙ．； および、Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚら （編） （１
９８８） Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｓ
ｗｏｒｔｈ， Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。

【０１１１】形質転換された細胞は、組換えＤＮＡ技術
を用いて構築されたベクターを含有するＣＣＦ１８ケモ
カイン遺伝子で形質転換されたかまたはトランスフェク
トされた細胞（好ましくは哺乳動物細胞）を含む。形質
転換された宿主細胞は、通常、リガンドまたはそのフラ
グメントを発現するが、クローニング、増幅、およびそ
のＤＮＡの操作の目的のためには、そのタンパク質の発
現を必要としない。本発明はさらに、栄養培地で形質転
換細胞を培養することを包含し、従って、培養物中にタ
ンパク質を蓄積することを可能にする。タンパク質は、
培養物または培養培地のいずれかから回収され得る。

【０１１２】本発明の目的のために、ＤＮＡ配列は、そ
れらが互いに機能的に関連している場合、作動可能に連
結される。例えば、予備的な配列決定のためのＤＮＡま
たは分泌リーダーは、それがプレタンパク質として発現
されるか、または細胞膜へのポリペプチドの指向もしく
はポリペプチドの分泌に関連する場合、ポリペプチドに
作動可能に連結される。プロモーターは、それがポリペ
プチドの転写を制御する場合、コード配列に作動可能に
連結される；リボソーム結合部位は、それが翻訳を可能
にするように位置づけられる場合、コード配列に作動可
能に連結される。通常、作動可能に連結されたとは、隣
接およびリーディングフレーム内を意味する。しかし、
リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝エレメントは、
隣接しては連結されないが、オペレーター配列になお結
合されて、次に発現を制御する。

【０１１３】適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生
物、および高等真核生物を包含する。原核生物は、グラ
ム陰性およびグラム陽性の生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ
およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方を包含する。下等
真核生物は、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
およびＰｉｃｈｉａ）、およびＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉ
ｕｍ属の種を包含する。高等真核生物は、非哺乳動物起
源（例えば、昆虫細胞、および鳥類）および哺乳動物起
源（例えば、ヒト、霊長類、および齧歯動物）の両方の
動物細胞に由来する確立された組織培養細胞株を包含す
る。

【０１１４】原核生物宿主−ベクター系は、多くの異な
る種に対して広範な種々のベクターを包含する。本明細
書中で使用するように、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクタ
ーは、他の原核生物に使用される同等のベクターを包含
するために一般的に使用される。ＤＮＡを増幅するため
の代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２およびその多くの
誘導物である。ＣＣＦ１８ケモカインまたはそのフラグ
メントを発現するために使用され得るベクターとして
は、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣ−シリーズ）；ｔｒｐ
プロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；Ｉｐｐプロモ
ーター（ｐＩＮ−シリーズ）；λ−ｐＰまたはｐＲプロ
モーター（ｐＯＴＳ）；またはｐｔａｃ（ｐＤＲ５４
０）のようなハイブリッドプロモーターを含有するベク
ターが挙げられるが、これに限定されない。Ｂｒｏｓｉ
ｕｓら （１９８８）「λ−、ｔｒｐ−、ｌａｃ−、お
よびＩｐｐ−由来プロモーターを用いる発現ベクタ
ー」，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ
（編） Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ， Ｂｕｔｔｅｒｓｗ
ｏｒｔｈ， Ｂｏｓｔｏｎ，１０章、２０５−２３６頁
を参照のこと。

【０１１５】下等真核生物（例えば、酵母およびＤｉｃ
ｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）は、ＣＣＦ１８ケモカイン配列
含有ベクターで形質転換され得る。本発明の目的のため
には、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであ
る。これは下等真核細胞を総称的に代表するように使用
されるが、多数の他の株および種もまた利用可能であ
る。酵母ベクターは、代表的には、複製起点（組込み型
でない限り）、選択遺伝子、プロモーター、所望される
タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮ
Ａ、ならびに翻訳終結、ポリアデニル化、および転写終
結のための配列からなる。酵母のために適切な発現ベク
ターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび
種々の他の解糖系酵素の遺伝子プロモーターのような構
成性プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ
２プロモーターもしくはメタロチオニンプロモーターの
ような誘導性プロモーターが挙げられる。適切なベクタ
ーとしては、以下の型の誘導体が挙げられる：自己複製
低コピー数（例えば、ＹＲｐ−シリーズ）、自己複製高
コピー数（例えば、ＹＥｐ−シリーズ）；組込み型（例
えば、ＹＩｐ−シリーズ）、またはミニ染色体（例え
ば、ＹＣｐ−シリーズ）。

【０１１６】高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活
性なＣＣＦ１８ケモカインタンパク質の発現のために好
ましい宿主細胞である。原則的には、無脊椎動物供給源
に由来しても脊椎動物供給源に由来しても、任意の高等
真核生物組織培養細胞株（例えば、昆虫のバキュロウイ
ルス発現システム）が作用可能である。しかし、プロセ
シング（翻訳と同時および翻訳後の両方）の点で、哺乳
動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換または
トランスフェクションおよび増殖は慣例的な手順となっ
ている。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ベビーラ
ット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、
およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。このような
細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロ
モーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノ
ムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、お
よび転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通
常選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベク
ターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウ
イルス、ワクシニアウイルス、もしくはサイトメガロウ
イルスのような供給源に由来するプロモーターを有す
る、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであ
り得る。適切な発現ベクターの代表的な例としては、ｐ
ＣＤＮＡ１；ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら （１９８５）
Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５： １１３６を
参照のこと）； ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈ
ｏｍａｓら （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１： ５０３
を参照のこと）； および、ｐＡＣ ３７３またはｐＡ
Ｃ ６１０のようなバキュロウイルスベクターが挙げら
れる。

【０１１７】特異的なまたは規定されたグリコシル化パ
ターンを提供する系においてＣＣＦ１８ケモカインポリ
ペプチドを発現させることがしばしば所望される。この
場合、通常のパターンは、発現系により天然に提供され
るパターンである。しかし、パターンは、ポリペプチド
（例えば、グリコシル化されていない形態）を、異種発
現系中に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝
すことにより改変可能である。例えば、ＣＣＦ１８ケモ
カイン遺伝子は、哺乳動物または他のグリコシル化酵素
をコードする１つ以上の遺伝子と同時形質転換され得
る。このアプローチを使用して、原核生物または他の細
胞において、特定の哺乳動物グリコシル化パターンが達
成可能であるかまたは模倣される。

【０１１８】ＣＣＦ１８ケモカイン、またはそのフラグ
メントは、細胞膜に連結されるホスファチジルイノシト
ール（ＰＩ）に加工され得るが、ホスファチジルイノシ
トール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトール
ホスホリパーゼＣ）での処理により膜から除去され得
る。これは、抗体を生物学的に活性な形態で放出し、そ
してタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能に
する。例えば、Ｌｏｗ（１９８９） Ｂｉｏｃｈｉｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ９８８： ４２７；Ｔ
ｓｅら （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １
００３；およびＢｒｕｎｎｅｒ ら（１９９１） Ｊ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１４： １２７５を参照の
こと。

【０１１９】今やＣＣＦ１８ケモカインが特徴付けられ
ており、そのフラグメントまたは誘導体がペプチドを合
成するための従来のプロセスにより調製され得る。これ
らとしては、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ （１９
８４） Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ； Ｂｏｄａｎ
ｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙ （１９８４） Ｔ
ｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ； およびＢｏｄａｎｓｚ
ｋｙ （１９８４） Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ
Ｙに記載のようなプロセスが挙げられる。例えば、アジ
ドプロセス、酸性塩化物プロセス、酸性無水物プロセ
ス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例え
ば、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル、もしくはシアノメチルエステ
ル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化的−還元的
プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣＤ）／添加的プロセスが使用され得る。固相および
液相合成の両方が、前記のプロセスに適用可能である。

【０１２０】ＣＣＦ１８ケモカイン、フラグメント、ま
たは誘導体は、一般に、いわゆる段階的プロセス（これ
はアミノ酸を末端アミノ酸に、１つずつ順番に、縮合す
る工程を包含する）によるか、またはペプチドフラグメ
ントを末端アミノ酸にカップリングすることによるかの
いずれかで、代表的にペプチド合成において用いられる
ような上記のプロセスに従って適切に調製される。カッ
プリング反応において使用されないアミノ基は、代表的
には不適正な位置でのカップリングを防止するために保
護される。

【０１２１】固相合成が採用される場合、Ｃ末端アミノ
酸は、そのカルボキシル基を介して、不溶性キャリアま
たは支持体に結合される。不溶性キャリアは、それが反
応性カルボキシル基への結合能力を有する限り、特に限
定されない。そのような不溶性キャリアの例としては、
ハロメチル樹脂（例えば、クロロメチル樹脂またはブロ
モメチル樹脂）、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹
脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジド
化樹脂などが挙げられる。

【０１２２】アミノ基保護アミノ酸が、その活性化カル
ボキシル基と以前に形成されたペプチドまたは鎖の反応
性アミノ基との縮合を介して順番に結合されて、ペプチ
ドが一歩ずつ合成される。完全な配列の合成後、ペプチ
ドは不溶性キャリアからはずされて、ペプチドが生成さ
れる。この固相アプローチは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら
（１９６３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．
８５：２１４９により一般的に記載されている。

【０１２３】調製されたリガンドおよびそのフラグメン
トは、ペプチド分離の手段（例えば、抽出、沈殿、電気
泳動、および種々の形態のクロマトグラフィーなど）に
より、反応混合物から単離および精製され得る。本発明
のＣＣＦ１８ケモカインは、その所望される使用に依存
して、変動する程度の純度で得られ得る。精製は、本明
細書において開示されるタンパク質精製技術の使用によ
り、または免疫吸収剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂａｎ
ｔ）親和性クロマトグラフィーにおいて本明細書中に記
載の抗体の使用により達成され得る。この免疫吸収剤親
和性クロマトグラフィーは、まず、抗体を固相支持体に
連結し、次いで、連結した抗体を、適切な供給源細胞の
可溶化された溶解物、リガンドを発現する他の細胞の溶
解物、またはＤＮＡ技術の結果としてＣＣＦ１８ケモカ
インを産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させる
ことにより行われる（以下を参照のこと）。

【０１２４】（使用）本発明は、本明細書中の他所に
（例えば、発達異常についての一般的な記載におい
て）、または以下に（診断用のキットの記載において）
記載されるような診断的適用における使用を見出す試薬
を提供する。

【０１２５】本発明はまた、顕著な治療的価値を有する
試薬を提供する。ＣＣＦ１８ケモカイン（天然に生じる
または組換え）、そのフラグメント、およびそれに対す
る抗体は、ＣＣＦ１８ケモカインに対する結合親和性を
有するとして同定された化合物とともに、異常な生理機
能または発達（炎症状態を含む）に関連する状態の処置
において有用であるはずである。特に、白血球のトラフ
ィッキングの調整はそれらしいが、より広い組織分布は
より広い生物学的活性（抗ウイルス効果を含む）を示唆
し得る。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細
書中に提供される組成物を使用する適切な治療的処置に
より調整され得る。例えば、ＣＣＦ１８ケモカインによ
る異常な発現または異常なシグナリングに関連する疾患
または障害は、このリガンドのアゴニストまたはアンタ
ゴニストのためのそれらしい標的であるはずである。

【０１２６】種々の異常な生理的または発達的状態は、
ノーザンブロット分析によってＣＣＦ１８ｍＲＮＡを有
すると示される細胞タイプにおいて公知である。Ｂｅｒ
ｋｏｗ（編） Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，
Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．
Ｊ．；およびＴｈｏｒｎら Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆＩｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎ．Ｙ．を参
照のこと。発達的または機能的異常（例えば、免疫系の
異常）は、本明細書中に提供される組成物を使用する予
防または処置に感受性であり得る、顕著な医学的異常お
よび状態を引き起こす。

【０１２７】組換えＣＣＦ１８ケモカイン抗体は精製さ
れ得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は治療
的使用のためにさらなる有効成分または不活性成分と
（例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希
釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中で）、生理学
的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ
得る。これらの組み合わせは濾過滅菌され、そして凍結
乾燥により投薬バイアル中に、または安定化水性調製物
中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。本発明はまた、
抗体またはその結合フラグメント（補体結合でない形態
を含む）の使用を意図する。

【０１２８】抗体もしくはレセプターまたはそのフラグ
メントを使用する薬物スクリーニングを実施して、ＣＣ
Ｆ１８ケモカインに対する結合親和性を有する化合物
（会合成分の単離を含む）を同定し得る。次いで、その
化合物が固有の刺激活性を有し、そしてそれゆえ、リガ
ンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまた
はアンタゴニストであるかどうか決定するために、次の
生物学的アッセイが利用され得る。同様に、固有の刺激
活性を有する化合物はレセプターを活性化し得、そして
従って、それがＣＣＦ１８ケモカインの活性を刺激する
とうい点で、アゴニストである。本発明はさらに、アン
タゴニストとしてのＣＣＦ１８ケモカインに対する抗体
の治療的使用を意図する。このアプローチは、他のＣＣ
Ｆ１８ケモカイン種変異体について特に有用であるはず
である。

【０１２９】効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの
異なる因子に依存する。この因子は、投与手段、標的部
位、患者の生理学的状態、および投与される他の薬物
（ｍｅｄｉｃａｎｔ）を包含する。従って、処置用量
は、安全性および有効性を最適化するために滴定（ｔｉ
ｔｒａｔｅ）されるべきである。代表的には、インビト
ロで使用される用量は、これら試薬のインサイチュでの
投与に有用な量における有用な手引きを提供し得る。特
定の疾患の処置に効果的な用量の動物実験は、ヒトでの
用量のさらなる予測的な指標を提供する。以下には、種
々の考察が記載されている、例えば、Ｇｉｌｍａｎら
（編） （１９９０） Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉ
ｌｍａｎ’ｓ： Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
（第８版） Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ： および
（１９９０） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （第１７版）
Ｍａｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．， Ｅａｓｔｏ
ｎ Ｐｅｎｎ．。投与法は、それらの中および以下で考
察されている。例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内
投与、または筋肉内投与、経皮拡散など。薬学的に受容
可能なキャリアは、水、生理食塩水、緩衝液、および例
えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃ
ｏ．，Ｒａｈｗａｙ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ に記載
された他の化合物を包含する。用量の範囲は通常、適切
なキャリアを有して、１ｍＭ濃度より低い量であり、代
表的には約１０μＭ濃度未満、通常約１００ｎＭ未満、
好ましくは１０ｐＭ（ｐｉｃｏｍｏｌａｒ）未満、そし
て最も好ましくは約１ｆＭ（ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ）未
満の範囲であると期待される。徐放性処方物または徐放
性装置が、持続的な投与にしばしば使用される。

【０１３０】ＣＣＦ１８ケモカイン、そのフラグメン
ト、およびそれに対する抗体またはそのフラグメント、
アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿主
に直接投与され得るか、または、化合物のサイズに依存
して、それらを投与前にオボアルブミンまたは血清アル
ブミンのようなキャリアタンパク質に結合させることが
所望され得る。治療的処方物は、任意の従来の投与処方
物中で投与され得る。活性な成分を単独で投与すること
は可能であるが、治療的処方物として呈することが望ま
しい。処方物は、上記で定義したように、その１または
それより多い受容可能なキャリアとともに、代表的には
少なくとも１つの活性な成分を包含する。それぞれのキ
ャリアは、他の成分に適合性であり、そして患者に対し
て有害でないという意味で薬学的におよび生理学的に受
容可能であるべきである。処方物は、経口投与、直腸投
与、鼻投与、または非経口投与（皮下投与、筋肉内投
与、静脈内投与、および皮内投与を包含する）に適切な
処方物を包含する。処方物は、便宜的に単位用量形態で
存在し得、そして薬学分野で周知の任意の方法により調
製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９
０） ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎの：Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第８版、Ｐｅｒｇａｍｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， 第１７
版（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎ．； Ａｖｉｓら
（編）（１９９３） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ
Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ； Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒ
ｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ； およびＬｉｅｂｅｒｍａｎら（編） （１９
９０） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ
Ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。本発
明の治療は、他の化学治療剤または化学予防剤と併用さ
れるかまたは関連して使用され得る。

【０１３１】本発明のＣＣＦ１８ケモカインの天然に存
在する形態および組換えの形態の両方は、このタンパク
質に対する結合活性について化合物をスクリーニングし
得る、キットおよびアッセイ法に特に有用である。自動
化アッセイのいくつかの方法は、短期間に多数の化合物
のスクリーニングを可能にするように近年開発されてい
る。例えば、固体基質上に合成された多数の所定のポリ
マーによる結合親和性の試験のための手段を記載してい
るＦｏｄｏｒら （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５
１： ７６７を参照のこと。適切なアッセイの開発は、
本発明で提供される大量の精製可溶化ＣＣＦ１８ケモカ
インの利用可能性により、非常に容易になり得る。

【０１３２】例えば、アンタゴニストは、一旦リガンド
が構造的に定義されれば、通常見出され得る。潜在的な
リガンドアナログの試験は、生理学的に応答性の細胞を
使用する高度に自動化されたアッセイ法の開発により、
現在可能である。特に、新たなアゴニストおよび新たな
アンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニング
技術を使用することにより発見される。

【０１３３】生存細胞はまた、ＣＣＦ１８ケモカイン仲
介性機能（例えば、第２メッセンジャーのレベル、すな
わち、Ｃａ⁺⁺；イノシトールリン酸のプールの変化（例
えば、Ｂｅｒｒｉｄｇｅ （１９９３） Ｎａｔｕｒｅ
３６１：３１５またはＢｉｌｌａｈおよびＡｎｔｈｅ
ｓ （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２６９：
２８１を参照のこと）；細胞形態学改変応答；ホスホイ
ノシチド脂質ターンオーバー；抗ウイルス応答など）に
対する薬物の効果をスクリーニングするために使用され
得る。いくつかの検出方法は、分離工程の削除を可能に
する（例えば、近接感受性検出システム（ｐｒｏｘｉｍ
ｉｔｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓ
ｙｓｔｅｍ））。カルシウム感受性の色素は、蛍光計測
器または蛍光細胞選別装置を用いてＣａ⁺⁺レベルを検出
するために有用である。

【０１３４】合理的なドラッグデザインはまた、ＣＣＦ
１８ケモカインおよび他のエフェクターまたはアナログ
の分子の形の構造的研究に基づき得る。エフェクター
は、リガンド結合に応答して他の機能を仲介する他のタ
ンパク質、または通常はレセプターと相互作用する他の
タンパク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク
質と相互作用するかを決定する１つの手段は、物理的構
造決定（例えば、Ｘ線結晶学または２次元ＮＭＲ技術）
である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を
形成するかについての手引きを提供する。タンパク質の
構造決定の詳細な記載は、例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌお
よびＪｏｈｎｓｏｎ （１９７６） Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。

【０１３５】精製ＣＣＦ１８ケモカインは、前述の薬物
スクリーニング技術に使用するプレートに直接コートさ
れ得る。しかし、これらのリガンドに対する非中和抗体
は、それぞれのリガンドを固相に固定化する捕獲抗体と
して使用され得る。

【０１３６】（キット）本発明はまた、リガンド、抗
体、またはＣＣＦ１８ケモカインレセプターの存在を検
出するための種々の診断キットおよび方法におけるＣＣ
Ｆ１８ケモカインタンパク質、そのフラグメント、ペプ
チド、およびそれらの融合産物の使用を意図する。代表
的には、キットは、定義されたＣＣＦ１８ケモカインペ
プチドまたは遺伝子セグメント、あるいはどちらか一方
を認識する試薬（例えば、抗体）のいずれかを含む区画
を有する。

【０１３７】ＣＣＦ１８ケモカインに対する試験化合物
の結合親和性を測定するためのキットは、代表的には、
試験化合物；標識化合物（例えば、リガンドに対する既
知の結合親和性を有する抗体）；ＣＣＦ１８ケモカイン
の供給源（天然に存在するかまたは組換えの）；および
リガンドを固定化するための固相のような、遊離標識化
合物から結合標識化合物を分離するための手段を含有す
る。一旦化合物がスクリーニングされると、リガンドに
対する適切な結合親和性を有する化合物が、レセプター
に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用す
るか否かを決定するために、当該分野で周知のように、
適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えＣＣＦ
１８ケモカインポリペプチドの利用可能性は、そのよう
なアッセイを較正するための良く規定された標準をまた
提供する。

【０１３８】サンプル中の、例えばＣＣＦ１８ケモカイ
ンの濃度を測定するための好ましいキットは、代表的に
は、標識化合物（例えば、リガンドに対する既知の結合
親和性を有する抗体）、リガンドの供給源（天然に存在
するかまたは組換えの）、および遊離標識化合物から結
合標識化合物を分離するための手段（例えば、ＣＣＦ１
８ケモカインを固定化するための固相）を含有する。試
薬および説明書を含む区画が、通常提供される。

【０１３９】ＣＣＦ１８ケモカインまたはリガンドフラ
グメントに特異的な、抗原結合フラグメントを包含する
抗体は、ＣＣＦ１８ケモカインおよび／またはそのフラ
グメントの上昇したレベルの存在を検出する診断的適用
に有用である。このような診断的アッセイは、溶解物、
生細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を用い
得、そしてさらに血清などの中のリガンドに関連する抗
原の検出を包含し得る。診断アッセイは、等質（遊離試
薬と抗原−リガンド複合体との間の分離工程を有しな
い）または異質（分離工程を有する）であり得る。ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵
素増幅イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）、基質標識蛍光
イムノアッセイ（ＳＬＦＩＡ）などのような種々の市販
のアッセイが存在する。例えば、未標識抗体は、第２の
抗体を使用することにより用いられ得、この第２の抗体
は標識され、そしてＣＣＦ１８ケモカインまたはその特
定のフラグメントに対する抗体を認識する。類似のアッ
セイがまた、文献で広範に考察されている。例えば、Ｈ
ａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓ
ｓを参照のこと。

【０１４０】抗イディオタイプ抗体は、種々の異常な状
態の徴候であり得るＣＣＦ１８ケモカインに対する抗体
の存在を診断するための類似の使用を有し得る。例え
ば、ＣＣＦ１８ケモカインの過剰産生により、種々の免
疫学的応答の生成を生じ得、この応答は、異常な生理状
態（特に種々の炎症性状態）の徴候であり得る。

【０１４１】しばしば、診断アッセイのための試薬が、
アッセイの感度を最適化するようにキット中に供給され
る。本発明のために、アッセイ、プロトコル、および標
識の性質に依存して、標識抗体、未標識抗体または標識
ＣＣＦ１８ケモカインのいずれかが提供される。これは
通常、緩衝液、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル
生成に必要な物質などのような他の添加剤との結合体で
ある。好ましくは、キットはまた、適切な使用および使
用後の内容物の処分のための説明書を含む。代表的に
は、キットはそれぞれの有用な試薬のための区画を有す
る。望ましくは、試薬は、乾燥した凍結乾燥粉末として
提供され、ここで、試薬は水性の媒体中で再構成され
得、アッセイを行うために適当な濃度の試薬を提供し得
る。

【０１４２】薬物スクリーニングアッセイおよび診断ア
ッセイの任意の前述の成分は、改変せずに使用され得、
または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、直
接または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分
に、共有結合的にまたは非共有結合的に連結することに
より達成され得る。これらのアッセイの任意のものにお
いて、リガンド、試験化合物、ＣＣＦ１８ケモカイン、
またはそれらに対する抗体が、直接または間接のいずれ
かで標識され得る。直接標識の可能性は、以下の標識グ
ループを包含する：¹²⁵Ｉのような放射標識、ペルオキ
シダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素
（米国特許第３，６４５，０９０号）、および蛍光強
度、波長移動、または蛍光偏光の変化をモニターし得る
蛍光標識（米国特許第３，９４０，４７５号）。間接標
識の可能性には、１成分のビオチン化とそれに続く上記
の標識グループの１つに結合したアビジンへの結合が含
まれる。

【０１４３】遊離のリガンドから結合リガンドを分離す
る、あるいは、遊離の試験化合物から結合試験化合物を
分離する多数の方法もまた存在する。ＣＣＦ１８ケモカ
インは、種々の基質に固定化され得、続いて洗浄され得
る。適切な基質には、ＥＬＩＳＡプレート、フィルタ
ー、およびビーズのようなプラスチックが含まれる。Ｃ
ＣＦ１８ケモカインを基質に固定化する方法には、プラ
スチックへの直接接着、捕獲抗体の使用、化学的カップ
リング、およびビオチン−アビジンｇａ含まれるがこれ
らに限定されない。このアプローチの最後の工程は、例
えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒または
硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を包含する
任意のいくつかの方法によるリガンド／抗体複合体の沈
澱を包含する。他の適切な分離技術には、Ｒａｔｔｌｅ
ら （１９８４） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３０：
１４５７に記載されるフルオレセイン抗体磁化粒子法、
および米国特許第４，６５９，６７８号に記載のような
２重抗体磁性粒子分離が含まれるが、これらに限定され
ない。

【０１４４】種々の標識にタンパク質またはそれらのフ
ラグメントを連結する方法は、文献で広範に報告されて
おり、ここでは詳細に考察する必要はない。技術の多く
は、カルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使
用を介してのペプチド結合の形成のための活性化カルボ
キシル基の使用、連結のためのメルカプト基と活性化ハ
ロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフ
ィン（例えば、マレイミド）との反応によるチオエーテ
ルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた、これ
らの適用における使用が見出され得る。

【０１４５】本発明の別の診断的局面は、ＣＣＦ１８ケ
モカインの配列から得られたオリゴヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチド配列の使用を包含する。これらの配列
は、異常な状態（例えば、炎症または発達の問題）を有
すると疑われる患者由来のサンプル中のリガンドメッセ
ージのレベルを検出するためのプローブとして使用され
得る。ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチド配列の両方の調
製、配列の標識、および配列の好ましいサイズは、文献
中に充分記載および考察されている。標準的には、オリ
ゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約１４ヌクレオ
チド、通常は、少なくとも約１８ヌクレオチドを有すべ
きであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数ｋｂ
までであり得る。種々の標識、最も一般的には放射性核
種、特に ³²Ｐが用いられ得る。しかし、ポリヌクレオチ
ドに導入するためのビオチン改変ヌクレオチドの使用の
ような他の技術もまた用いられ得る。次いで、ビオチン
がアビジンまたは抗体への結合のための部位として作用
し、これは、広範な種々の標識（例えば、放射性核種、
フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、酵素など）
で標識され得る。あるいは、特定の２本鎖（ＤＮＡ２本
鎖、ＲＮＡ２本鎖、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本
鎖、またはＤＮＡ−タンパク質２本鎖を含む）を認識し
得る抗体が用いられ得る。次いで、抗体が標識され得、
そしてアッセイが行われる。ここで、２本鎖は表面に結
合され、そして表面での２本鎖の形成により２本鎖に結
合する抗体の存在が検出され得る。新規なアンチセンス
ＲＮＡに対するプローブの使用は、任意の従来技術（例
えば、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイ
ナススクリーニング、組換えプローブ（ｒｅｃｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｂｉｎｇ）、ハイブリッド放
出翻訳（ｈｙｂｒｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ）（ＨＲＴ）、およびハイブリッド停止翻訳
（ｈｙｂｒｉｄ ａｒｒｅｓｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎ）（ＨＡＲＴ））で実行され得る。これはまた、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を包
含する。

【０１４６】他のマーカーの質的存在または量的存在を
試験する診断キットもまた意図される。診断または予後
は、マーカーとして使用される多数の指標の組み合わせ
に依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わ
せを試験し得る。例えば、Ｖｉａｌｌｅｔら （１９８
９） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃ
ｔｏｒ Ｒｅｓ． １： ８９を参照のこと。

【０１４７】（レセプター）特異的相互作用のリガンド
結合パートナーが単離されれば、対のパートナーを単離
するための方法が存在する。Ｇｅａｒｉｎｇら、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ． ８： ３６６７を参照のこと。例えば、その
レセプターへの結合に干渉せずにＣＣＦ１８ケモカイン
を標識する手段が決定され得る。例えば、親和性標識が
リガンドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれ
かに融合され得る。発現ライブラリーが、例えば、細胞
選別により、またはそのような結合成分を発現するサブ
集団を検出するための他のスクリーニングにより、ＣＣ
Ｆ１８ケモカインの特異的結合についてスクリーニング
され得る。例えば、Ｈｏら （１９９３） Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０： １１２６
７を参照のこと。あるいは、パンニング法が使用され得
る。例えば、ＳｅｅｄおよびＡｒｕｆｆｏ （１９８
７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
８４： ３３６５を参照のこと。

【０１４８】標識とのタンパク質架橋結合技術は、ＣＣ
Ｆ１８ケモカインの結合パートナーを単離するために適
用され得る。これにより、例えば、リガンド−レセプタ
ー様の方法で、ＣＣＦ１８ケモカインと特異的に相互作
用するタンパク質の同定が可能となる。

【０１４９】別の実施態様において、ＣＣ ＣＫＲ３と
命名される新たなレセプターが単離された。ヒト構築物
および産物の配列が、表４に提供される。ヌクレオチド
レベルまたはタンパク質レベルで改変体を作製するため
の類似の手段、および抗体を作製するための手段が、上
記のように利用可能である。リガンドに対する多くの類
似の用途または関連する用途が、特異的な結合試薬とし
てレセプターに適用される。多くの用途（キットを含
む）もまた、類似の技術を通して利用可能である。

【０１５０】本発明の広い範囲は、以下の実施例を参考
にして最も良く理解されるが、これは、特定の実施態様
に本発明を限定することを意図しない。

【０１５１】

【実施例】（実施例） （一般的方法）いくつかの標準的な方法が、例えば以下
に記載されまたは参照される：Ｍａｎｉａｔｉｓら、
（１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ； Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９） Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （第二版）、第１〜３刊，ＣＳ
Ｈ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ；ま
たはＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８７および補遺）Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｉｎｎｉｓら、（編）（１９９
０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．。タ
ンパク質精製のための方法には、硫安沈澱、カラムクロ
マトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化、および
その他が含まれる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９
８７および定期的増補）； Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ （１
９９０）「タンパク質精製へのガイド」Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， 第１８２刊、および
このシリーズの他の刊；ならびにタンパク質精製製品の
使用に関する製造者の印刷物（例えば、Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．、またはＢ
ｉｏ−Ｒａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ．）を参照
のこと。組換え技術との組合せは、適切なセグメント
（例えば、ＦＬＡＧ配列またはプロテアーゼ除去配列を
介して融合され得る等価物）への融合を可能にする。例
えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ １２：６９； Ｈｏｃｈｕｌｉ
（１９９０）「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｍ
ｅｔａｌＣｈｅｌａｔｅ Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ」Ｓｅｔ
ｌｏｗ （編） ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ１
２：８７， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ；およ
びＣｒｏｗｅら、（１９９２）ＯＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：
Ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＳｙｓｔｅｍＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔ
ｓｗｏｒｔｈ， ＣＡを参照のこと。

【０１５２】ＦＡＣＳ分析は、Ｍｅｌａｍｅｄら、（１
９９０）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｒｔｉｎｇ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ， ＮＹ；Ｓｈａｐｉｒｏ （１９８８）
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；およびＲｏ
ｂｉｎｓｏｎら、（１９９３） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ
に記載されている。

【０１５３】（マウスおよびヒトＣＣＦ１８ ｃＤＮＡ
の単離および配列決定）ＢＦ−ＥＧＦＲ／ＥＰＯＲＨ
は、上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターの細胞外ドメイ
ンとエリスロポエチンレセプターの細胞質ドメインとの
間のキメラレセプターを発現するＢａ／Ｆ３（マウスプ
レＢ細胞株；Ｐａｌａｃｉｏｓら、（１９８５） Ｃｅ
ｌｌ ４１：７２７；およびＰａｌａｃｉｏｓら、（１
９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：１２６を参照のこと）
トランスフェクト体であり、そしてＩＬ−３またはＥＧ
Ｆのいずれかに応答して増殖する（例えば、Ｍａｒｕｙ
ａｍａら、（１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ． ２６９：５９７６を参照のこと）。ＢＦ−ＥＧＦ
Ｒ／ＥＰＯＲＨ細胞を、１０％仔ウシ血清（ＦＣＳ）お
よびＩＬ−３（１００ユニット／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ
１６４０中に維持した。ＣＯＳ細胞を、１０％ＦＣＳ
を含有するＤＭＥＭ中で培養した。ｃＤＮＡライブラリ
ーを、ＥＧＦ刺激ＢＦ−ＥＧＦＲ／ＥＰＯＲＨ細胞から
作製した（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、（１９９
５） ＥＭＢＯ Ｊ． １４：２８１６を参照のこ
と）。ポリ（Ａ）＋ ＲＮＡの単離、ｃＤＮＡ合成、お
よび発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ中への連結を、Ｈａｒａ
ら、（１９９４） Ｂｌｏｏｄ ８４：１８９に記載の
ように行った。

【０１５４】ＣＣＦ１８ ｃＤＮＡ挿入物の配列を、ベ
クターおよびｃＤＮＡ挿入物の配列に対応するオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いてＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘ
ｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）によって決定
した。マウスＣＣＦ１８ ｃＤＮＡのオープンリーディ
ングフレームは、２１アミノ酸残基の推定シグナル配列
を含む１２３アミノ酸のポリぺプチドをコードする。成
熟タンパク質は、約１０２アミノ酸からなり、１１５４
８ダルトンの計算された分子量を有する。他のＣ−Ｃケ
モカインファミリーメンバーを用いたコンピューターに
よる検索は、アミノ酸レベルでＭＩＰ−１β（６７
％）、ＭＩＰ−１α（５６％）、ＪＥ（５５％）、ＲＡ
ＮＴＥＳ（４８％）、リンホタクチン（ｌｙｍｐｈｏｔ
ａｃｔｉｎ）（４８％）、およびＮＳＧＡ／Ｇｒｏ−α
（４３％）との有意な相同性を明らかにした。

【０１５５】ヒト胎児脾臓ｃＤＮＡライブラリーをＳｔ
ｒａｔａｇｅｎｅから購入したが、他のライブラリーも
また首尾良く用いられ得た。ライブラリーを、マウスＣ
ＣＦ１８をプローブとして用いる標準的な方法によって
スクリーニングした。Ｈａｒａら、（１９９５） Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５：５３５２を参照のこと。
単離物は、上記および表３に記載される。

【０１５６】（マウスＣＣＦ１８の染色体位置）種間戻
し交雑子孫を、Ｃｏｐｅｌａｎｄら（１９９１） Ｔｒ
ｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１１３に記載される（Ｃ
５７ＢＬ／６Ｊ×Ｍ． ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１雌および
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄を交配することによって生成した。
全部で２０５の戻し交雑マウスが、ＣＣＦ１８遺伝子、
Ｓｃｙａ１０遺伝子座をマップするために用いられた。
ＤＮＡ単離、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、
サザンブロット移動、およびハイブリダイゼーション
を、本質的にＪｅｎｋｉｎｓら（１９８２） Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ． ４３：２６に記載のように行った。全てのブ
ロットをＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）を用いて調製した。Ｓｃｙａ１０プローブ、ＣＣ
Ｆ１８ ｃＤＮＡの約１．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ／Ｎｏｔ
Ｉフラグメントを、ニック翻訳標識キット（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いた［α−³²Ｐ］
ｄＣＴＰで標識し；洗浄を０．１×ＳＳＣＰ、０．１％
ＳＤＳ、６５℃の最終ストリンジェンシーまで行った。
７．８ｋｂフラグメントを、ＢａｍＨＩ消化Ｃ５７ＢＬ
／６Ｊ ＤＮＡにおいて検出した一方、５．１ｋｂフラ
グメントをＭ． ｓｐｒｅｔｕｓ ＤＮＡにおいて検出
した。５．１ｋｂのＭ． ｓｐｒｅｔｕｓ特異的Ｂａｍ
ＨＩフラグメントの存在または非存在を、戻し交雑マウ
スにおいて追跡した。

【０１５７】神経線維腫症１型（Ｎｆ１）およびミエロ
ペルオキシダーゼ（Ｍｐｏ）を含む、Ｓｃａ１０に連鎖
した遺伝子座のうち２つについてのプローブおよびＲＦ
ＬＰの説明は、以前にＢｕｃｈｂｅｒｇら（１９８８）
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ． ２：１４９；およびＢ
ｕｃｈｂｅｒｇら（１９８９） Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２
２：１５３に報告されている。Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ種間
戻し交雑マップ上のＳｃｙａ１０の位置を決めるために
用いられる２つの異なる遺伝子座、Ｓｃｙａ１およびＳ
ｃｙａ２の位置は、以前に報告されていない。約７００
ｂｐ Ｓｃｙａ１および約７００ｂｐ Ｓｃｙａ２のマ
ウスｃＤＮＡプローブを、ランダムプライミングによっ
て［α−³²Ｐ］ ｄＣＴＰで標識し；洗浄を、０．５×
ＳＳＣＰ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の最終ストリンジェ
ンシーまで行った。サイズが１０．５ｋｂおよび０．５
ｋｂの２つのＳｃｙａ１フラグメントを、ＥｃｏＲＩ消
化Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＤＮＡにおいて検出した。一方、
３．３ｋｂおよび０．５ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲ
Ｉ消化Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ ＤＮＡにおいて検出した。
さらに、１．６ｋｂ Ｓｃｙａｌフラグメントを、Ｐｓ
ｔＩ消化Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＤＮＡにおいて検出した。
一方、２．６ｋｂおよび１．６ｋｂフラグメントを、Ｐ
ｓｔＩ消化Ｍ． ｓｐｒｅｔｕｓ ＤＮＡにおいて検出
した。３．３ｋｂのＭ． ｓｐｒｅｔｕｓ特異的Ｅｃｏ
ＲＩフラグメントおよび２．６ｋｂのＭ．ｓｐｒｅｔｕ
ｓ特異的ＰｓｔＩフラグメント（これらは、同時分離さ
れている）の存在または非存在を、戻し交雑マウスにお
いて追跡した。データの２つのセットを組み合わせてＳ
ｃｙａ１のマップ位置を決定した。同様に、主要な５．
５ｋｂ Ｓｃｙａ２フラグメントを、ＴａｑＩ消化Ｃ５
７ＢＬ／６Ｊ ＤＮＡにおいて検出した一方、強力にハ
イブリダイズする７．４ｋｂおよび６．３ｋｂＳｃｙａ
２フラグメントを、Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ ＤＮＡにおい
て検出した。７．４ｋｂおよび６．３ｋｂ Ｍ．ｓｐｒ
ｅｔｕｓ特異的ＴａｑＩフラグメントの存在または非存
在を、戻し交雑マウスにおいて追跡した。戻し交雑マウ
スは、７．４ｋｂまたは６．３ｋｂ ＴａｑＩフラグメ
ントのいずれかを受け継いだが、両方を受け継ぐことは
なかった。この結果は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ種間戻し交
雑を生成するために用いられたＭ．ｓｐｒｅｔｕｓマウ
スは、まだ２つのＳｃｙａ２対立遺伝子について分離し
ていたことを示す。組換え距離（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）を、Ｇｒｅｅｎ （１９８
１）「連鎖、組換えおよびマッピング」、Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙｉｎ Ａｎｉｍ
ａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｏ
ｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ
Ｙ， ７７に記載のようにコンピュータープログラムＳ
ＰＲＥＴＵＳ ＭＡＤＮＥＳＳを用いて計算した。遺伝
子の順序を、染色体を横切る二重および多重組換え事象
の数を最小化することによって決定した。

【０１５８】ＣＣＦ１８（小さい誘導可能サイトカイン
ａ１０について命名された遺伝子記号Ｓｃｙａ１０）の
マウス染色体位置を、種間戻し交雑分析によって決定
し、そしてＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ
ＤＮＡをいくつかの酵素によって消化し、そしてマウ
スＳｃｙａ１０ ｃＤＮＡプローブを用いて情報を与え
る制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）のためのサザ
ンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。
５．１ｋｂ Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ特異的ＢａｍＨＩフラ
グメントを用いて、戻し交雑ＤＮＡにおけるＳｃｙａ１
０遺伝子座の分離を追跡した。マッピング結果は、Ｓｃ
ｙａ１０が、２つの異なるメンバー（Ｃ−Ｃケモカイン
ファミリー、Ｓｃｙａ１（Ｔｃａ３）およびＳｃｙａ２
（Ｊｅ））に密接に連鎖したマウス第１１染色体の中央
領域に位置していることを示した。５５匹のマウスが、
ハプロタイプ分析において５つのマーカーについて分析
されたが、１３４匹までのマウスがマーカーのいくつか
の対について分析された。各遺伝子座を、さらなるデー
タを用いて組み換え頻度について、対ごとの（ｐａｉｒ
ｗｉｓｅ）組合せで分析した。遺伝子座の各対について
分析されたマウスの総数に対する組換え染色体を示すマ
ウスの総数の比、および最もあり得る遺伝子の順序は：
セントロメア−Ｎｆ１−５１３４−ｓｃｙａ１−０／１
０７−ｓｃｙａ１０−０／９８−Ｓｃｙａ２−２／１１
３−Ｍｐｏである。組換え頻度（センチモルガン（ｃ
Ｍ）＋標準偏差の遺伝的距離として表わされた）は、セ
ントロメア−Ｎｆ１−３．７＋１．６−（Ｓｃｙａｌ，
Ｓｃｙａ１０， Ｓｃｙａ２）−１．８＋１．２−Ｍ
ｐｏである。共通に型分類された１０７匹の動物におけ
るＳｃｙａ１とＳｃｙａ１０との間に、または共通に型
分類された９８匹のマウスにおけるＳｃｙａ１０とＳｃ
ｙａ２との間に、組換え体を検出しなかった。このこと
は、各対の遺伝子座が、それぞれ互いの（信頼限界）
２．２ｃＭおよび３ｃＭ以内に存在することを示す。

【０１５９】３つの他のＣ−Ｃケモカイン遺伝子が、最
近Ｓｃｙａ１０の近隣にマップされている。これらに
は、ＭＩＰ−１α（Ｓｃｙａ３）、ＭＩＰ−１β（Ｓｃ
ｙａ４）、およびＲＡＮＴＥＳ（Ｓｃｙａ５）が含まれ
る。Ｓｃｙａ５は、Ｓｃｙａ１、Ｓｃｙａ２、およびＳ
ｃｙａ１０と組換えを起こさなかった；Ｓｃｙａ３およ
びＳｃｙａ４は、共通に型分類された１８９匹の動物に
おいて互いに組換えを起こさず、そして２つの遺伝子
が、Ｓｃｙａ１０遺伝子クラスターの０．６＋／−０．
６ｃＭ遠位にマップした。これらの結果は、全てのＣ−
Ｃケモカイン遺伝子が、マウス第１１染色体の中央領域
にマップするという初期の観察を確認および拡張する。
Ｗｉｌｓｏｎら（１９９０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅ
ｄ． １７１：１３０１； Ｂｅｒｇｅｒら（１９９
３） ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：
８３９；およびＤａｎｏｆｆら（１９９４） Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． １５２：１１８２を参照のこと。

【０１６０】最後に、マウス第１１染色体の中央領域
は、ヒト第１７ｑ染色体と相同領域を共有する。特に、
ＳＣＹＡ１およびＳＣＹＡ２は、ヒト１７ｑ１２および
１７ｑ１１．２−ｑ１２にそれぞれマップされている。
これは、ＣＣＦ１８（Ｓｃｙａ１０遺伝子座）のヒトホ
モログが、１７ｑ１１−ｑ１２にもマップされるべきで
あることを示唆する。

【０１６１】（走化性活性についてのアッセイ）ＣＣＦ
１８タンパク質を得るために、ＣＯＳ細胞を、エレクト
ロポレーションによってＣＣＦ１８ ｃＤＮＡを保有す
るプラスミドでトランスフェクトした。Ｈａｒａら（１
９９２） ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１８７５を参照のこ
と。トランスフェクションの３日後、培養上清を回収
し、そしてバイオアッセイに供した。モックコントロー
ルとして、ルシフェラーゼｃＤＮＡを保有するプラスミ
ドを用いた。ｄｅ Ｗｅｔら（１９８７） Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：７２５を参照のこと。組
換えマウスＭＩＰ−１αを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ
（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）から購入した。

【０１６２】リンパ球遊走アッセイを、Ｂａｃｏｎら
（１９８８） Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
９５：９６６に以前に記載されたように、至適の遊走
が、アッセイのインキュベーションのわずか２時間後に
観察されるという改変を伴って行った。２つのマウスＴ
ｈ２ Ｔ細胞クローン、ＣＤＣ−２５（Ｔｏｎｙら（１
９８５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６１：２２３
を参照のこと）、およびＨＤＫ−１（Ｃｈｅｒｗｉｎｓ
ｋｉら（１９８７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１６
６：１２２９参照のこと）を、それぞれＲ． Ｃｏｆｆ
ｍａｎおよびＡ．Ｏ’Ｇａｒｒａ （ＤＮＡＸ， Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から好意により得た。ケモカ
イン刺激時のＣａ²⁺フラックスを、Ｂａｃｏｎら（１９
９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４：３６５４に
記載される公開された手順に従って測定した。

【０１６３】ＭＩＰ−１αに応答する遊走細胞の最大数
が、ヒトＴ細胞のＣＤ４＋集団についての最初の報告に
一致して１０^-8Ｍの濃度にて起こった。Ｓｃｈａｌｌ
（１９９３） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７７：１
８２１を参照のこと。マウスＴ細胞クローンは、類似す
る最大細胞数を伴ってＣＣＦ１８およびＭＩＰ−１αの
両方に応答し、特徴的な釣り鐘状の用量応答曲線を生じ
た。Ｔリンパ球の最大数は、ＣＣＦ１８含有上清の５０
０〜１０００倍希釈の存在下で遊走した。より高い濃度
のＣＣＦ１８において、細胞はフィルターの上部表面に
接着し、これは下部表面上で記録された細胞のより少な
い細胞数を説明した。全ての実験において、モック上清
の同一の濃度範囲が試験されたが、細胞に対していかな
る効果も有しなかった。走化性活性対化学運動性活性に
ついてのアッセイは、ＣＣＦ１８が走化性遊走を誘発し
たことを実証した。

【０１６４】Ｃ−Ｃケモカインでの刺激の後、リンパ球
は一般に、測定可能な細胞内Ｃａ²⁺フラックスを示す。
これはＣＣＦ１８を用いた場合も同様であった。ＭＩＰ
−１αおよびＣＣＦ１８の両方が、カルシウム可動化の
即時的トランジェント（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎ
ｓｉｅｎｔ）を誘導し得た。しかし、ＭＩＰ−１αは、
引き続くＣＣＦ１８の投与に対して細胞を完全に脱感作
した。ＣＣＦ１８の予投与（ｐｒｉｏｒ ａｄｍｉｎｉ
ｓｔｒａｔｉｏｎ）は、より小さいカルシウムフラック
スプロフィールによって証明されるように、ＭＩＰ−１
αの引き続く投与に対する応答を部分的に脱感作しただ
けであった。

【０１６５】これらのアッセイにおいて用いられるＣＣ
Ｆ１８のレベルは、走化性アッセイについて用いられた
レベルと類似していた（調製された上清の１／１０００
希釈）。全ての場合において、コントロールＣＯＳ上清
（モックトランスフェクトされた）は、いかなるカルシ
ウム可動化応答も誘発しなかった。

【０１６６】（マウスＣＣＦ１８のノーザンブロット分
析）ＲＮＡブロットおよびハイブリダイゼーションを、
１．１ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ ＣＣＦ１８ ｃＤ
ＮＡフラグメントをプローブとして用いることによっ
て、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹの標準的な方法に従
って行った。各レーンにロードされたＲＮＡの量を評価
するために、膜をＷＡＦ１ ｃＤＮＡを用いて再びプロ
ーブした（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら（１９９３） Ｃｅｌｌ
７５：８１７を参照のこと）。ＷＡＦ１ ｃＤＮＡ
を、この研究におけるｃＤＮＡライブラリーまたはグリ
セルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ
Ｈ）ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ ＣＡ）のスクリーニング中に得た。

【０１６７】ＣＣＦ１８ ｍＲＮＡ（主要バンドについ
てサイズが約１．４ｋｂ）は、マクロファージ細胞株Ｐ
３８８Ｄ１、およびＩＬ−３−依存性骨髄性細胞株３２
Ｄにおいて比較的高いレベルで構成的に発現した。少量
のＣＣＦ１８ ｍＲＮＡもまた、ＩＬ−３依存性肥満細
胞株ＭＣ／９、プレＢ細胞株Ｙ１６、および線維芽細胞
株ＮＩＨ３Ｔ３において検出された。しかし、Ｔ細胞
株、ＣＴＬＬ−２、およびプロＢ株、Ｂａ／Ｆ３、は、
ＣＣＦ１８ ｍＲＮＡを発現しない。さらに、Ｂａ／Ｆ
３細胞中のＣＣＦ１８ ｍＲＮＡの発現レベルは、クロ
ーンにより様々であった。ＢＦ−ＥＧＦＲ／ＥＰＯＲＨ
において、ＣＣＦ１８ ｍＲＮＡは、最も高く検出され
そしてサイトカイン刺激なしに構成的に発現した。一
方、他のＢａ／Ｆ３トランスフェクト体である６２６お
よびＢＦ−ＥＧＦＲにおいて、ＣＣＦ１８転写物の量は
低く、そして６２６細胞においてサイトカイン誘導性で
あるようであった。ｐ２１ ＷＡＦ１をコードするｃＤ
ＮＡ（そのｍＲＮＡ発現がサイトカイン刺激によって増
強される）は、それらの細胞株においてＲＮＡ量および
サイトカイン応答を確認するために用いられた。従っ
て、ＣＣＦ１８の産生がどのように調節されるかは不明
である。なぜなら、Ｃ−Ｃケモカインの発現は、種々の
刺激によって差別的に調節されていると思われるからで
ある。Ｏｒｌｏｆｓｋｙ（１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． １５２：５０８４を参照のこと。

【０１６８】（ヒトケモカインレセプターＣＣ ＣＫＲ
３ ｃＤＮＡの単離）ＣＣ ＣＫＲ３ ｃＤＮＡを、Ｎ
ｅｏｔｅら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：４１５−４２
５に記載の手順を用いて単離した。２つの縮重ＰＣＲプ
ライマーを、公知のケモカインレセプターの保存された
領域からの配列を用いて設計した。これらのプライマー
を用いて、ヒトゲノムＤＮＡの特定の領域を増幅した。

【０１６９】（縮重ＰＣＲプライマー） １．ＤＲＹＬＡＩＶＨＡｄｅｇ（＋） ５’−ＧＡＴ ＣＧＩ ＴＡＧ ＣＴＩ ＧＣＩ ＡＴ
Ｉ； ＧＴＩＣＡ（Ｔ／Ｃ） ＧＣ−３’ ２．ＴＭ７ｄｅｇ（−）α ５’−ＣＧ ＧＡＡ ＩＩＩ （Ｃ／Ａ）ＴＣ ＩＣ
（Ｇ／Ｃ） ＩＡＣ （Ｇ／Ａ）ＡＡ ＩＧＣ（Ｇ／
Ａ）ＴＡ−３’ Ｉは、デオキシイノシンを表す。

【０１７０】この方法によって同定されたＤＮＡ配列の
うち、１つはＣＣ ＣＫＲ３遺伝子の一部を表してい
た。次いで、このＤＮＡフラグメントを用いて、全長ｃ
ＤＮＡを得るために、Ｔ． ＭｃＣｌａｎａｈａｎ（Ｄ
ＮＡＸ， Ｐａｌｏ ＡｌｔｏＣＡ）によって提供され
たＴｈ０活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングした。

【０１７１】（ＣＣＦ１８およびＣＣ ＣＲＫ３に対す
る抗体の作製）精製タンパク質または規定されたペプチ
ドは、上記のような標準的な方法によって抗体を作製す
るために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク
質を、免疫系に対して提示し、モノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体を生成する。例えば、Ｃｏｌｉｇ
ａｎ （１９９１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒ
ｅｅｎｅ；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ （１
９８９） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。

【０１７２】結合試薬は、上記のように標識される（例
えば、蛍光またはその他の方法）か、あるいはパンニン
グ法のための基質に固定化されるかのいずれかである。

【０１７３】結合組成物は、ＣＣＦ１８ケモカインを発
現する細胞株から作製された発現ライブラリーをスクリ
ーニングするために用いられる。標準的な染色技術が、
細胞内または表面発現リガンドを検出または選別するた
めに用いられるか、あるいは表面発現形質転換細胞がパ
ンニングによりスクリーニングされる。細胞内発現のス
クリーニングは、種々の染色または免疫蛍光手順により
実施される。ＭｃＭａｈａｎら、（１９９１） ＥＭＢ
Ｏ．Ｊ． １０： ２８２１も参照のこと。

【０１７４】例えば、０日目に、３０分間室温にて、フ
ィブロネクチンのチャンバー当たり１ｍｌ（ＰＢＳ中に
１０ｎｇ／ｍｌ）で２−チャンバーパーマノックススラ
イド（２−ｃｈａｍｂｅｒ ｐｅｒｍａｎｏｘ ｓｌｉ
ｄｅ）を予備被覆する。ＰＢＳで１回リンスする。次い
で１．５ｍｌの増殖培地中に、チャンバーあたり２〜３
×１０⁵細胞でＣＯＳ細胞を播く。３７℃で一晩インキ
ュベートする。

【０１７５】それぞれのサンプルについて１日目に、血
清非含有ＤＭＥ中に６６μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキスト
ラン、６６μＭクロロキン、および４μｇ ＤＮＡの溶
液０．５ｍｌを調製する。それぞれのセットについて、
ポジティブコントロール（例えば、１および１／２００
倍の希釈度のｈｕＩＬ−１０−ＦＬＡＧ ｃＤＮＡ）、
およびネガティブモックを調製する。血清非含有ＤＭＥ
で細胞をリンスする。ＤＮＡ溶液を添加し、３７℃で５
時間インキュベートする。培地を除去し、０．５ｍｌの
ＤＭＥ中１０％ ＤＭＳＯを２．５分間添加する。これ
を除去し、ＤＭＥで１回洗浄する。１．５ｍｌの増殖培
地を添加し、そして一晩インキュベートする。

【０１７６】２日目に、培地を交換する。３日目または
４日目に、細胞を固定および染色する。細胞を、Ｈａｎ
ｋの緩衝化生理食塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、そ
して５分間４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／グル
コース中で固定する。ＨＢＳＳで３回洗浄する。全ての
液体を除去した後、このスライドを−８０℃で保存し得
る。それぞれのチャンバーについて、０．５ｍｌのイン
キュベーションを以下のように実施する。２０分間３２
μｌ／ｍｌの１Ｍ ＮａＮ₃とともにＨＢＳＳ／サポニ
ン（０．１％）を添加する。次いで細胞を、ＨＢＳＳ／
サポニンで１回洗浄する。細胞に抗体複合体を添加し、
そして３０分間インキュベートする。ＨＢＳＳ／サポニ
ンで細胞を２回洗浄する。１／２００の希釈度で二次抗
体（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ抗マウス抗体）を添加し、そ
して３０分間インキュベートする。ＥＬＩＳＡ溶液（例
えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ溶液）を調製し、そして３０分間予備イ
ンキュベートする。例えば、２．５ｍｌのＨＢＳＳ／サ
ポニン当たり、１滴の溶液Ａ（アビジン）および１滴の
溶液Ｂ（ビオチン）を用いる。ＨＢＳＳ／サポニンで２
回細胞を洗浄する。ＡＢＣ ＨＲＰ溶液を添加し、３０
分間インキュベートする。ＨＢＳＳで２回細胞を洗浄
し、２分間の２回目の洗浄で細胞を閉じ込める。次いで
Ｖｅｃｔｏｒジアミノ安息香酸（ＤＡＢ）を５〜１０分
間添加する。５ｍｌのガラス滅菌水あたり２滴の緩衝液
＋４滴のＤＡＢ＋２滴のＨ₂Ｏ₂を用いる。注意深くチャ
ンバーを取り出し、水中でスライドをリンスする。数分
間風乾し、次いで１滴のＣｒｙｓｔａｌ Ｍｏｕｎｔお
よびカバー片を添加する。８５〜９０℃で５分間ベーク
する。

【０１７７】あるいは、結合組成物は、リガンドを発現
する細胞をアフィニティー精製するかまたは選別するた
めに用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、または
Ａｕｓｕｂｅｌらを参照のこと。

【０１７８】本発明の多くの改変および変化は、当業者
に明らかなように、その意図および範囲を逸脱すること
なく行われ得る。本明細書中に記載した特定の実施態様
は、例示のためのみに提供され、そして本発明は、添付
の請求項の用語によってのみ、そのような請求項が与え
られる等価物の全範囲とともに、限定される。

【０１７９】

【発明の効果】本発明により、哺乳動物由来の新規のＣ
Ｃケモカイン、これに関連する試薬（精製タンパク質、
特異的抗体、およびこのケモカインをコードする核酸を
含む）が提供される。本発明はまた、ケモカインレセプ
ターも提供する。本発明はさらに、これらの試薬を用い
る方法および診断キットも提供する。

【０１８０】

【配列表】

【０１８１】

【表５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (71)出願人 596129215 2000 Ｇａｌｌｏｐｉｎｇ Ｈｉｌｌ Ｒ ｏａｄ， Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ， Ｎｅ ｗ Ｊｅｒｓｅｙ 07033−0530， Ｕ. Ｓ．Ａ (72)発明者 原 孝彦 千葉県印西市小倉台３−４−３−201 (72)発明者 宮島 篤 東京都江東区越中島１−３−17−811 (72)発明者 トーマス ジェイ． スカル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025, メンロ パーク， ミルズ アベニュー 2050 (72)発明者 ウェイ ワン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94036, パロ アルト， ミドルフィールド ロ ード 3090 (72)発明者 吉村 昭彦 福岡県久留米市御井町2526−12

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＣＣケモカインレセプター３をコードす
   る核酸配列からなるポリヌクレオチドであって、該核酸
   配列が、以下： ａ）配列番号６に示される核酸配列またはその相補鎖；
   および ｂ）ａ）に規定される核酸配列に、ストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズする核酸配列、からなる群から
   選択される、ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＣＣケモカインレセプター３をコードす
   るポリヌクレオチドであって、該ＣＣケモカインレセプ
   ター３が、以下： ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列；ならびに ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１ま
   たは数個のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加
   を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミ
   ノ酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ＣＣケモカインレセプター３の単離され
   たポリぺプチドであって、以下： ａ）配列番号６に示される核酸配列またはその相補鎖；
   および ｂ）ａ）に規定される核酸配列に、ストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズする核酸配列、からなる群から
   選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列
   を含む、ポリぺプチド。
4. 【請求項４】 ＣＣケモカインレセプター３の単離され
   たポリぺプチドであって、以下： ａ）配列番号７に示されるアミノ酸配列；ならびに ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１ま
   たは数個のアミノ酸の欠失、置換、および／または付加
   を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミ
   ノ酸配列を含む、ポリぺプチド。
5. 【請求項５】 抗原として使用するための単離されたポ
   リぺプチドであって、請求項１または２に記載のポリヌ
   クレオチドによってコードされるアミノ酸配列からの少
   なくとも８つのアミノ酸の連続した配列を含み、ここ
   で、該連続した配列が、請求項３または４に記載のポリ
   ぺプチドに対する抗体によって結合され得る抗原決定基
   を含む、ポリぺプチド。
6. 【請求項６】 請求項１または２に記載のポリヌクレオ
   チドを含む、ベクター。
7. 【請求項７】 請求項３から５のいずれか１項に記載の
   ポリぺプチドに対して惹起された、抗体。
8. 【請求項８】 融合タンパク質であって、以下： ａ）請求項３から５のいずれか１項に記載のポリぺプチ
   ド；および ｂ）別のケモカインレセプターの生物学的に活性なポリ
   ぺプチド、を含む、融合タンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載のポリヌクレオ
   チドを含む、組成物。
10. 【請求項１０】 請求項３から５のいずれか１項に記載
    のポリぺプチドを含む、組成物。
11. 【請求項１１】 請求項６に記載のベクターを含む、組
    成物。
12. 【請求項１２】 請求項７に記載の抗体を含む、組成
    物。
13. 【請求項１３】 請求項８に記載の融合タンパク質を含
    む、組成物。