【発明の詳細な説明】
哺乳動物ケモカイン
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物免疫系の細胞）の発生、分化、輸
送、および生理の制御において機能するタンパク質に関連する組成物を意図する
。特に、造血細胞を含む種々の細胞型の発生、分化、および機能を調節または証
明するタンパク質を提供する。
発明の背景
哺乳動物循環系の循環成分は、種々の細胞型（赤血球細胞系統および骨髄細胞
系統の赤血球および白血球を含む）を含む。例えば、Rapaport（1987）Introduc tion to Hematology
（第２版）Lippincott，Philadelphia，PA;Jandl（1987）Bl ood:Textbook of Hematology
，Little，Brown and Co.，Boston，MA.；およびPa
ul（編）(1993)Fundamental Immunology第３版，Raven Press，N.Y.を参照のこ
と。
しばらくの間、哺乳動物免疫応答は、「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の
複雑な細胞相互作用に基づいていると知られてきた。最近の研究によって、この
ネットワークの内部作用への新たな洞察が提供された。多くの応答は、実際、リ
ンパ球、マクロファージ、顆粒球、および他の細胞のネットワーク様の相互作用
を繰り返していることが明らかである一方、免疫学者らは、現在では、リンホカ
イン、サイトカイン、またはモノカインとして知られる可溶性タンパク質が、こ
れらの細胞の相互作用の制御に決定的な役割を果たしているという意見を一般に
有している。従って、細胞調節因子の単離、特徴付け、およびその作用の機構に
かなりの関心があり、それらの理解が、免疫系の障害および他の障害のような数
多くの医学的異常の診断および治療において著しい進歩を導くはずである。
リンホカインは、見かけ上、種々の様式で細胞活動を媒介する。それらは、複
雑な免疫系を作る多様な細胞系統を含む莫大な数のその前駆体への多能性造血幹
細胞の増殖、成長、および分化を助長することが示されてきた。細胞成分間のこ
れらの相互作用は、健全な免疫応答に必要である。これらの異なる細胞系統は、
リンホカインが他の薬剤とともに投与される場合、しばしば異なる様式で応答す
る。
ケモカインは、広大で多様なタンパク質のスーパーファミリーである。このス
ーパーファミリーは、ケモカインモチーフの中の最初の２つのシステインが隣接
している（「C-C」部門と命名）か、もしくは介在する残基で隔てられているか
（「C-X-C」と命名）どうかに基づいて２つの古典的分野に再分割される。さら
に、最近同定されたケモカインの部門は、対応するモチーフにおいて２つのシス
テインが欠如しており、そしてリンホタクチンとして知られるケモカインによっ
て代表される。他に、最近発見された部門は、２つのシステイン（例えば、CX3C
ケモカイン）の間に介在する３つの残基を有する。例えば、SchallおよびBacon
（1994）Current Opinion in Immunology 6:865-873；およびBaconおよびSchall
（1996）Int．Arch．Allergy & Immunol．109:97-109を参照のこと。
前駆体細胞の分化プロセスに影響を与えるか、または特定の細胞型の生理学も
しくは遊走特性を調節する多数の因子が同定されている。これらの観察は、免疫
機能における機能がこれまで未確認であった他の因子が存在することを示す。こ
れらの因子は、効果スペクトルが公知の分化因子、または活性化因子と異なり得
る生物学的活性を提供する。インビボで細胞の生理を調節する因子の構造的、生
物学的、そして生理学的特性についての知識がないため、この様な因子の効果の
改変が妨げられる。従って、関連する細胞の発生または生理の調節が要求される
医学的状態は、手に負えないままである。
発明の要旨
本発明は、本明細書により、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン（m6Ckine）、h6Cカイ
ン（h6Ckine）、またはChr19カイン（Chr19kine）のケモカインとして呼称され
る分子を含む、従来未知のケモカインモチーフの存在を開示する。以下に記載さ
れるケモカインタンパク質配列の配列分析に基づいて、mpf4、mCTAP3、およびCh
r19カインがCXCケモカインファミリーに属し、m6Cカインおよびh6Cカインは、CC
ケモカインファミリーに属することが明らかである。
本発明は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインに特異的に結合する抗体からの抗原結合部位；mpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまたはそれらのフラグメントをコ
ードする発現ベクター；それぞれの抗原結合部位によって特異的に認識される実
質的に純粋なタンパク質；および実質的に純粋なmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6C
カイン、もしくはChr19カインのケモカインまたはそれらのペプチド、またはmpf
4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、もしくはChr19カインのケモカイン配列の30
アミノ酸フラグメントを含む融合タンパク質を含む組成物から選択される物質の
組成物、を提供する。上記の試薬を作製しそして使用するための方法もまた提供
される。
抗原結合部位を含む実施態様において、抗原結合部位は：配列番号２、４、６
、８、または10のポリペプチドからなる群より選択される成熟タンパク質と特異
的に免疫応答性であり得るか；精製したか、または組換え産生されたmpf4、mCTA
P3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対して惹起され
得るか；モノクローナル抗体において、FabもしくはF(ab)2であり得るか；また
は標識抗体中にあり得る。特定の実施態様では；抗原結合部位は、以下の方法に
より生物学的な試料中に検出される：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、ま
たはChr19カインのケモカインタンパク質への親和性を有する結合因子と生物学
的試料とを接触させること；結合因子：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、
またはChr19カインのケモカインタンパク質複合体を形成するために生物学的試
料と結合因子をインキュベートすること；およびこの複合体を検出すること。好
ましい実施態様では、生物学的試料はヒトまたはマウスであり、そして結合因子
は抗体である。
上述の化合物を有するキットの実施態様が、化合物の使用のための説明的な材
料とともにか、または化合物が分離される区画のいずれかにより提供される。
本発明の核酸の実施態様は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカインタンパク質をコードする発現ベクターを含み、ここで、
このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、または10の成熟ポリペプチド部分
から選択される免疫原、より具体的には天然のタンパク質に対して生成された抗
体を特異的に結合する。ベクターは：天然に存在するmpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質と完全な配列同一性を
有するmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン
ポリペプチドをコードし得るか；配列番号２、４、６、８、または10のポリペプ
チド、より具体的には天然のタンパク質から選択される配列を含むmpf4、mCTAP3
、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質をコード
し得るか；または配列番号１、３、５、もしくは７の核酸から選択される配列を
含み得る。他の実施態様では、ベクターはmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン
、またはChr19カインのケモカインタンパク質をコードする核酸（例えば、配列
番号１、３、５、または７の成熟タンパク質コードセグメント）に選択的にハイ
ブリダイズし得る。種々の好ましい実施態様では、単離された核酸は、生物学的
試料において、以下の方法により検出される：生物学的試料を核酸と選択的にハ
イブリダイズし得る核酸プローブと接触させること；核酸プローブを生物学的試
料とインキュベートして、生物学的試料中に存在する相補的核酸配列と核酸プロ
ーブとのハイブリッドを形成すること；および相補核酸配列への核酸プローブの
ハイブリダイゼーションの程度を決定すること。このような方法では、好ましく
は、核酸プローブは、配列番号２、４、６、８、または10のポリペプチドからな
るタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得る。上記核酸を包含するベ
クターの構築または発現を含むベクターの発現またはタンパク質の作製の方法も
また提供される。
種々の実施態様において、単離されたmpf4、mCTAP3、m6Cカインは、マウス由
来であり；単離されたh6Cカインは、ヒト由来であり；配列番号２、４、６、８
、または10からの配列を含むポリペプチドからなり；組換え産生または天然に存
在するタンパク質である。配列番号２、４、６、８、もしくは10の配列、および
/または別のサイトカインもしくはケモカインの配列を含む融合タンパク質もま
た提供される。
本発明はまた、例えば、核酸が配列番号１、３、５、または７を有する場合、
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインをコー
ドする核酸でトランスフェクトした細胞を含む。この細胞は、原核生物のまたは
真核生物のものであり得る。
本発明はまた、細胞を、mPf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、もしくはChr1
９カインのケモカインまたはアンタゴニスト（例えば、ケモカインの中和抗体）
と接触させることにより、細胞の生理または発生を調節する方法を提供する。好
ましい実施態様では、生理は、ケモカインの天然のレセプターを有する細胞の誘
引である。
発明の詳細な説明
I．総説
本発明は、サイトカインまたはケモカインの構造的特性またはモチーフ特徴を
示す哺乳動物タンパク質をコードするマウスおよびヒトのDNA配列を提供する。
このケモカインファミリーの総説については、例えば、Lodiら（1994）Science
263:1762-1767;GronenbornおよびClore(1991)Protein Engineering 4:263-269;M
illerおよびKranger（1992）Proc ．Nat'l Acad．Sci．USA 89:2950-2954;Matsus
himaおよびOppenheim（1989）Cytokine 1:2-13;StoeckleおよびBaker（1990）Ne w Biol
．2:313-323;Oppenheimら（1991）Ann ．Rev．Immunol．9:617-648;Schall
（1991）Cytokine 3:165-183;およびThe Cytokine Handbook Academic Press，N
Y.を参照のこと。
本明細書中に記載の新規のサイトカインを、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカ
イン、またはChr19カインと命名する。以下の記載は、例示の目的で、哺乳動物
（例えば、ヒトおよびマウス）の実施態様に関するが、他の（例えば、天然の）
供給源由来の関連する実施態様にも同様に適用可能である。これらの供給源は、
種々の脊椎動物、代表的には温血動物（例えば、トリおよび哺乳動物、特に家畜
および霊長類）を含むはずである。
新規のマウスmpf4ケモカインの核酸およびアミノ酸配列は、配列番号１および
配列番号２にそれぞれ提供される。mpf4コード配列は、塩基141で始まり、そし
て塩基458で終わる。CXCモチーフは、アミノ酸残基５〜７である。CXCの直前にE
LRモチーフが存在しないことは、抗炎症性特性らしいものを示唆する。シグナル
配列が示されるが、関連の遺伝子に基づいており、可変の形態が異なる細胞型に
よって生成され得る。
新規のマウスCTAP3（mCTAP3）の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号３およ
び配列番号４にそれぞれ提供される。CXCモチーフは、10〜12と番号づけたアミ
ノ酸残基に対応する。推定シグナル配列が示されるが、実際には、そのタンパク
質を発現する細胞に部分的に依存して、より長くかまたはより短くなり得る。CX
Cモチーフの直前のELRモチーフは、炎症性メディエーター輸送における機能を示
唆する。
新規のマウス6Cカイン(m6Cカイン)ケモカインの核酸およびアミノ酸配列は、
配列番号５および配列番号６にそれぞれ提供される。推定のコード領域は、約71
位で始まり、そして469位で終わる。推定のシグナル配列が示され、そしてCCモ
チーフが７〜８と番号づけられた残基にある。m6Cカインは、成熟ペプチド中に
合計６の保存されたシステイン残基を有し、このことは延長したカルボキシ末端
配列を示すCCケモカインの新たなサブクラスを示唆する。
新規のヒト6Cカイン（h6Cカイン）の核酸配列および対応する推定アミノ酸配
列は、配列番号７および配列番号８にそれぞれ提供される。推定コード配列は、
６位から407位にわたる。CCモチーフは、８〜９と番号づけられた残基に対応す
る；推定シグナル配列が、示される。h6Cカインは、m6Cカインと同様に、６個の
保存されたシステイン残基を成熟ペプチドに有し、そしてカルボキシ末端の延長
を示す。
以下の表１は、ブタ6Cカイン(p6Cカイン)(配列番号９)、マウス、およびヒト6
Cカインアミノ酸配列のアラインメントを示す。
表１：ブタ（配列番号９）、マウス、およびヒト6Cカインアミノ酸配列のアライ
ンメント。「＊」は、同一性を示し、そして「.」は、類似性を示す。ブタ6Cカ
インの部分のみが、ここで比較される。他のケモカインは、約Glu56〜Asp67に対
応する配列に対応する構造ドメインを有する。6Cカイン（マウスおよびヒトの両
方）のこれのすぐ後に、他のケモカインとは異なるさらなる配列である。ヒトの
Lys69の後に始まるのは、一連のプロリンであり、これはヘリカル構造を破壊す
る。従って、２つのシステイン（80および99位）を含むさらなるセグメントは、
これらの分子に独特であるようである。これらの新たな構造的特徴は、新たな生
物学およびさらなるケモカインサブクラスを規定し得る。
ヒトChr19カイン（CXCケモカイン；配列番号10）の部分アミノ酸配列。CXCモ
チーフに下線を付す。ELRモチーフの不在は、抗炎症性特性を示唆する。Chr19カ
インは、公のESTデータベースの検索および注意深い分析によって見出された。
例えば、gn1|dbest|14024（H14024）を参照のこと。この遺伝子は、ヒト染色体
１9p12-13.1にマップされる。
本発明のケモカインタンパク質は、その生理化学的および生物学的特性によっ
て部分的に規定される。ケモカインの生物学的特性は、本明細書中に記載される
。例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインは、部分
的にそのアミノ酸配列および成熟サイズによって規定される。それらはまた、他
の類似のケモカインと少なくともいくらかの生物学的特性を共有するはずである
。当業者は、いくらかの配列の変化（例えば、保存的置換、またはレセプター相
互作用に重要な残基もしくは重要な三次構造的特徴から離れた位置）が、分子の
生物学的活性を有意に変化させることなく許容され得ることを容易に認識する。
反対に、非保存的置換が、選択された機能を消去するために適合され得る。
これらのケモカインは、特定の組織型（例えば、リンパ球組織）に存在し、そ
してレセプターとのタンパク質の相互作用は、細胞の生理または発達の種々の局
面を媒介するために重要である。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、または
Chr19カインをコードするメッセージを発現する細胞型は、細胞の分化および発
達に重要なシグナルがそれらによって媒介されることを示唆する。例えば、Gilb
ert(1991)Developmental Biology(第三版)Sinauer Associates，Sunderland，MA
,Browderら（1991）Developmental Biology（第三版）Saunders，Philadelphia
，PA.：Russoら(1992)Development:The Molecular Genetic Approach Springer-
Verlag，New York，N.Y.；およびWilkins（1993）Genetic Analysis of New Yor
k，N.Y.;およびWilkins（1993）Genetic Analysisi of Animal Development（第
２版）Wiley-Liss，New York，N.Y.を参照のこと。さらに、mpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カイン発現または応答性は、例えば、特定の細
胞亜集団を規定するマーカーとして作用するはずである。
mpf4およびmCTAP3ケモカインは、GENBANK EST(WashU-Merck ESTプロジェクト
、St．Louis，MO)公のデータベースの検索および注意深い分析を通じて発見され
た。mpf4は、巨核球分化のマーカーとして機能するラット血小板因子４（pf4）
に対する約71％のアミノ酸同一性を示す。例えば、Doiら、（1987）Mol．Cell．
Biol．7:898-904;およびGenBank受託番号M15254(1987)を参照のこと。mCTAP3配
列の同一性の比較（例えば、Marraら、（1996）GenBank受託番号W53807を参照の
こと）は、ヌクレオチドレベルでヒト好中球刺激ペプチド２（NAP-2）に対する6
5％の同一性、およびアミノ酸レベルでヒト結合組織活性化ペプチド３（hCTAP3
）に対する55％の同一性を明らかにした。mCTAP3は、ヒトタンパク質のマウスの
対応物であるようである。
m6Cカインはまた、SWISS PROTデータベースにおけるケモカイン構造を示す配
列での公のESTデータベースの検索および注意深い分析によって発見された。表
３のヌクレオチド配列および配列番号５は、３つのマウスESTにおいて見出され
る。例えば、gn1|dbest|17930(W17930)；gn1|dbest|167046(W67046)；およびgn1
|dbest|08383(W08383)を参照のこと。h6Cカインは、類似の様式で見出された。
表４のヌクレオチド配列および配列番号６は、例えば、gn1|dbest|366929;gn1|d
best|302355;gn1|dbest|342967:gn1|dbest|356690に；およびest703と命名され
るクローンに見出され得る。
Chr19カインは、公のESTデータベースの検索および注意深い分析によって発見
された。例えば、gn1|dbest|14024(H14024)を参照のこと。この遺伝子は、ヒト
染色体19p12-13.1にマッピングされる。
ノーザンブロット分析を、標準的な方法（例えば、Maniatisら、（1982）Mole
cular Cloning，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratoty，Cold S
pring Harbor Press，NY;Sambrookら、（1989）Molecular Clonlng:A Laborator
y Manual（第二版）１〜３巻、CSH Press，NY;Ausubelら、Biology Greene Publ
ishing Associates，Brooklyn，NY;およびAusubelら、（1987および補遺）Curre
nt Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene，NY.を参照のこと）を使用
して、m6Cカインについて行った。予備的なデータは、マウスの肺および脾臓に
おいて高レベルで発現される約900bpの転写物を示す。より低い発現レベルが、
マウス心臓、肝臓、骨格筋、腎臓、睾丸、およびRAG1胸腺組織において見出され
た。ヒト胎児脳、肺、肝臓、腎臓組織においてメッセージは検出されなかった。
また、種々のＴ細胞ライブラリーにおいても何ら発現は検出されなかった。しか
し、ヒト免疫組織の分析は、リンパ節、盲腸において発現を生じ、そして低レベ
ルで脾臓において発現を生じる。種々の組織におけるこの広範囲の分布は、正常
白血球の輸送における役割を示し得る。h16Cカインのノーザン分析は、ヒド扁桃
、リンパ節、および胎児脾臓組織、ならびに胚中心細胞における発現を示す。よ
り低いメッセージを、胎児睾丸および小腸において見出した。
標準Ca++フラックス分析（例えば、Coliganら（編）(1992および定期的補遺)C
urrent Protocols in Immunology，Greene/Wiley，NY）により、m6Cカインのレ
セプターは、CXCR3であることが決定された。このレセプターは、他の公知のケ
モカイン（例えば、IP-10およびMig）によって共有される。例えば、Sgadariら
（1997）Blood 89:2635-2643;およびLoetscherら（1996）J．Exp．Med．184:963
-969を参照のこと。これは、興味深いリガンド−レセプター対である。なぜなら
、上記のように、m6Cカインは、CCケモカインであり、一方CXCR3は、通常CXCケ
モカインに結合するからである。
IP-10およびMigは、血管抑制特性を有することが知られている。例えば、Kean
eら(1997)J．Immunol．159:1437-1443;およびFarber(1997)J．Leukoc．Biol．61
:246-257を参照のこと。この血管抑制効果のために、MigおよびIP-10は、新血
管形成に関連する腫瘍を予防し、なおかつ創傷治癒および瘢痕組織形成の速度を
調節する。6Cカインは、IP-10およびMigとレセプターを共有するので、6Cカイン
はまた、腫瘍形成、肺瘍転移の予防、および/または創傷治癒の調節において役
割を果たし得る。さらに、6CカインがＴ細胞化学誘引物質であるので（特に、活
性化されたＴ細胞について）、多くのＴ細胞媒介性抗腫瘍効果を増強するように
作用し得る。これは、6Cカイン単独で、またはIP-10、Mig、リンホタクチン（例
えば、Kelnerら(1994)Science 266:1395-1399を参照のこと）、および/またはMI
P3α（例えば、U.S.S.N．08/675,814を参照のこと）との組み合わせで起こり得
る。h6Cカインは、マウスCXCR3に結合するので、ケモカインはまたヒトCXCR3に
結合することがあり得る。
さらに、CXCR3レセプターの他のリガンドに関して、6Cカインは、迅速なリン
パ球接着を媒介し得る。これは、抗腫瘍応答を増強するのに有用であり得る。ま
たは、6Cカインは、活性化Ｔ細胞を抗原（例えば、感染性因子）に指向させるの
に使用され得る。
II．定義
用語「結合組成物」は、例えば抗体-抗原相互作用において、それぞれ、mpf4
、mCTAP3、m6Cカイン(m6Ckine)、h6Cカイン（h6Ckine）、またはChr19カイン（C
hr19kine）ケモカインに特異的に結合する分子をいう。しかし、他の化合物(例
えばレセプタータンパク質)もまた、他の分子を排除するためにmpf4、mCTAP3、m
6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに特異的に会合し得る。
代表的には、会合は、天然の生理学的に関連するタンパク質-タンパク質相互作
用において、共有結合または非共有結合のいずれかであり、そしてキャリア化合
物または二量体化パートナーを含む多タンパク質の複合体のメンバーを含み得る
。分子は、ポリマーまたは化学因子であり得る。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6C
カイン、またはChr19カインのケモカインがリガンド−レセプター相互作用のリ
ガンドまたはレセプターのいずれかであるか否かについての関連は、この相互作
用が類似する特異性(例えば、特異的な親和性)を示すか否かということ以外は必
ずしも示されていない。機能的アナログは、構造的に修飾されたリガンドであり
得
るか、または全く関連のない分子(例えば、適切なリガンド結合決定基と相互作
用する分子形状を有する分子)であり得る。リガンドは、レセプターのアゴニス
トまたはアンタゴニストとして作用し得る(例えば、Goodmanら(編)(1990)Goodma n およびGilman：The Pharmacological Bases of Therapeutics
(第８版)、Pergam
on Press，Tarrytown，N．Y.を参照のこと)。
本明細書中で使用する用語「結合因子：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン
、またはChr19カインのケモカインタンパク質複合体」は、結合因子のmpf4、mCT
AP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質への特
異的な結合によって形成される、結合因子とMPF4、MCTAP3、M6Cカイン、H6Cカイ
ン、またはCHR19カインのケモカインタンパク質との複合体をいう。結合因子の
特異的な結合とは、結合因子がmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカインタンパタ質上の部位を認識する特異的な結合部位（例え
ば、抗原結合部位）を有することを意味する。例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質に対して惹起されそ
してmpf4、CTAP3、または6Cカインのケモカインタンパク質上のエピトープを認
識する抗体は、特異的な結合によって結合因子：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6C
カイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質複合体を形成し得る。代表
的には、結合因子：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
のケモカインタンパク質複合体の形成により、他のタンパク質および生物製剤と
の混合物中のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインタンパク質の測定が可能になる。用語「抗体：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質複合体」は、結合因子
が抗体の抗原結合部分である実施態様をいう。抗体は、モノクローナル、ポリク
ローナル、または抗体の結合フラグメント(例えば、F(ab)2フラグメントのFab)
であり得る。抗体は、好ましくは交叉反応性試験の目的のために、ポリクローナ
ル抗体である。
「相同な」核酸配列は、比較した場合に顕著な類似性を示す。核酸における相
同性の規準は、配列比較および／または系統発生学的関係により当該分野で一般
に使用される相同性についての測定値であるか、あるいはハイブリダイゼーショ
ン条件に基づくかのいずれかである。ハイブリダイゼーション条件は、以下によ
り詳細に記載する。
「単離された」核酸は、天然の配列(例えば、元の種由来のタンパク質および
隣接するゲノム配列)に本来付随する他の生物学的成分から実質的に分離された
核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマー)である。この用語は、その天然に
存在する環境から取り出されている核酸配列を包含し、そして組換え体もしくは
クローン化されたDNA単離体および科学的に合成されたアナログ、または異種の
系によって生物学的に合成されたアナログを含む。実質的に純粋な分子は、分子
の単離された形態を含む。単離された核酸は、通常、均一な核酸分子を含むが、
しかし、ある実施態様では配列がわずかに不均一である核酸を含む。この不均一
性は、代表的にはポリマー末端または所望の生物学的機能もしくは活性に必須で
ない部分に見出される。
本明細書中で使用する用語「mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカインタンパク質」は、タンパク質の文脈で用いられる場合、
特に、ケモカインモチーフ部分(配列番号２、４、６、８、または１０に示す)、
あるいはこのようなタンパク質(例えば、好ましくはケモカインドメイン)の重要
なフラグメントに由来するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。本発明
はまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ン(例えば、これは、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
のケモカイン特異的結合成分と相互作用する)と類似する構造を示すポリペプチ
ドを包含する。これらの結合成分(例えば抗体)は、代表的には、高い親和性(例
えば、少なくとも約100nM、通常は約30nMより高く、好ましくは約10nMより高く
、そしてより好ましくは約3nMより良好)でmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン
、またはChr19カインのケモカインに結合する。
本明細書中で使用する用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、mpf4、
mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインのケモカイン
モチーフ部分の重要なフラグメントまたはセグメントを含み、そして少なくとも
約８アミノ酸、一般に少なくとも10アミノ酸、より一般には少なくとも12アミノ
酸、しばしば少なくとも14アミノ酸、よりしばしば少なくとも16アミノ酸、代表
的には少なくとも18アミノ酸、より代表的には少なくとも20アミノ酸、通常は少
なくとも22アミノ酸、より通常は少なくとも24アミノ酸、好ましくは少なくとも
26アミノ酸、より好ましくは少なくとも28アミノ酸、および、特に好ましい実施
態様では少なくとも約30アミノ酸以上(例えば、35、40、45、50、60、70、80な
ど)のアミノ酸残基の範囲を包含する。セグメントは、適切な長さでアミノ末端
およびカルボキシ末端（例えば、残基１、２、３などで開始し、そして残基１３
４、１３３、１３２などで終結する）を有し得る。本発明は、複数の上述のセグ
メントを含むタンパク質を包含する。
「組換え」核酸は、その生成方法またはその構造のいずれかによって定義され
る。その生成方法(例えば、あるプロセスによって作製された産物)を参照して、
そのプロセスは組換え核酸技術の使用であり、これは例えば、ヌクレオチド配列
におけるヒトの介入(代表的には選択または生成)を含む。あるいは、それは、天
然では互いに連続しない２つのフラグメントの融合を含む配列の生成によって作
製される核酸であり得るが、天然の産物(例えば、天然に生じる変異)は除外する
ことを意味する。従って、例えば、任意の天然に存在しないベクターで細胞を形
質転換して作製された産物は、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて
誘導される配列を含む核酸がそうであるように、含まれる。このプロセスは、し
ばしば、同じアミノ酸または保存的アミノ酸をコードするが、一方、代表的には
、配列認識部位を導入するかまたは除去する余剰なコドンでコドンを置換するた
めに行われる。あるいは、このプロセスは、所望の機能の核酸セグメントを結合
して通常天然に得られる形熊では見出されない機能の所望の組合せを含む単一の
遺伝的存在(genetic entity)を生成するために行われる。制限酵素認識部位は、
しばしば、このような人工操作の標的になるが、しかし他の部位特異的標的(例
えば、プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列)、または他の有用な特
性が設計に取り込まれ得る。組み換え(例えば、融合)ポリペプチドについて、同
様の概念が意図される。遺伝コード縮重によって、これらの抗原のフラグメント
に類似するポリペプチドをコードする合成核酸、および種々の異なる種改変体由
来の配列の融合体が特に含まれる。
「可溶性」は、Svedbergユニットで測定される沈降によって反映される。これ
は、特定の条件下での分子の沈降速度の測定値である。沈降速度の決定は、古典
的には分析用の超遠心分離で行われていたが、現在は代表的には標準的な超遠心
分離で行われている。Frelfelder(1982)Physical Biochemistry(第２版)W．H．F
reeman & Co.，San Franclsco，CA;ならびにCantorおよびSchimmel(1980)Biophy sical Chemistry
１部〜３部、W．H．Freeman & Co.，San Francisco，CAを参照
のこと。粗決定値として、可溶性ポリペプチドを含むと推定されるサンプルを、
約50Krpmで約10分間、標準サイズの超遠心分離で回転させると、可溶性分子は上
清中に残る。可溶性の粒子またはポリペプチドは、代表的には約30Ｓ未満、より
代表的には約15Ｓ未満、通常は約10Ｓ未満、より通常は約６Ｓ未満、そして特定
の実施態様において、好ましくは約４Ｓ未満、そしてより好ましくは約３Ｓ未満
である。ポリペプチドまたはフラグメントの可溶性は、環境およびポリペプチド
に依存する。多くのパラメーター(温度、電解質環境、ポリペプチドのサイズお
よび分子の特徴、ならびに溶媒の性質を含む)がポリペプチドの可溶性に影響す
る。代表的には、ポリペプチドが使用される温度は、約４℃〜約65℃の範囲であ
る。通常は、使用温度は約18℃より高く、そしてより通常は約22℃より高い。診
断目的のためには、アッセイにおいて、温度は通常ほぼ室温またはそれより暖か
い温度であるが、成分の変性温度より低い。治療目的のためには、温度は、通常
体温であり、代表的にはヒトについては約37℃である。しかし、特定の条件下で
の温度はインサイチュまたはインビトロにおいて上昇または低下し得る。
ポリペプチドのサイズおよび構造は、一般に、実質的に安定な状態で評価され
るべきであり、通常は変性状態では評価されるべきでない。ポリペプチドは、例
えば可溶性を付与するために、四次構造で他のポリペプチドと会合し得るか、ま
たは天然の脂質二重層の相互作用に近い様式で脂質または界面活性剤と会合し得
る。
溶媒は、通常生物学的活性の保護のために用いられるタイプの生物学的に適合
性の緩衝液であり、そして通常は生理的溶媒に近い。通常、溶媒は中性のpHを有
し、代表的には約５と10との間、そして好ましくは約7.5である。ある場合は、
界面活性剤(これは代表的にはおだやかな非変性性のもの(例えば、CHS(コレステ
リルヘミスクシネート)(cholesteryl hemisuccinate)またはCHAPS(3-[3-コラミ
ドプロピル)ジメチル−アンモニオ]-1-プロパンスルホネート(3-[3-cholamidopr
o
pyl)dimethy1-ammonlo]-1-propane sulfonate))が添加されるか、またはタンパ
ク質の構造または生理学的特性の顕著な破壊を避けるのに十分に低い濃度である
。
タンパク質の文脈において、「実質的に純粋」は、代表的には、タンパク質が
元の供給源生物由来の他の混入しているタンパク質、核酸、および他の生物製剤
から単離されていることを意味する。純度または「単離」は、標準的な方法によ
りアッセイされ、そして通常は少なくとも約50％純粋、より通常は少なくとも約
60％純粋、一般に少なくとも約70％純粋、より一般には少なくとも約80％純粋、
しばしば少なくとも約85％純粋、よりしばしば少なくとも約90％純粋、好ましく
は少なくとも約95％純粋、より好ましくは少なくとも約98％純粋であり、そして
最も好ましい実施態様では、少なくとも99％純粋である。同様の概念が、例えば
、抗体または核酸に適用される。
核酸配列の比較の文脈において「実質的な類似性」は、セグメントまたはその
相補鎖のいずれかが、比較される場合、最適に配列される時に、適切なヌクレオ
チド挿入または欠失と、ヌクレオチドの少なくとも約50％、一般に少なくとも56
％、より一般には少なくとも59％、通常は少なくとも62％、より通常は少なくと
も65％、しばしば少なくとも68％、よりしばしば少なくとも71％、代表的には少
なくとも74％、より代表的には少なくとも77％、通常は少なくとも80％、より通
常は少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくと
も約95〜98％またはそれ以上、そして特定の実施態様では、ヌクレオチドの約99
％または以上が、同一であることを意味する。あるいは、実質的な類似性は、セ
グメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で代表的に配列番号１、３、５
、または７由来の配列を使用して、鎖またはその相補体にハイブリダイズする場
合に存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約30
ヌクレオチドの範囲にわたり少なくとも約55％の類似性が存在する場合、好まし
くは約25ヌクレオチドの範囲にわたり少なくとも約65％、より好ましくは少なく
とも約75％、そして最も好ましくは約20ヌクレオチドにわたり少なくとも約90％
の類似性が存在する場合に起こる。Kanehisa(1984)Nuc ．Acids Res．12:203-213
を参照のこと。記載されるように、類似性比較の長さはより長い範囲にわたり得
、そして特定の実施態様では、少なくとも約17ヌクレオチド、通常は少なく
とも約20ヌクレオチド、より通常は少なくとも約24ヌクレオチド、代表的には少
なくとも約28ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好ま
しくは少なくとも約50ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約75〜10
0ヌクレオチドまたはそれ以上(例えば、150、200など)の範囲にわたる。
ハイブリダイゼーションの文脈において相同性または実質的な類似性に言及し
て、「ストリンジェントな条件」は、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメー
ターのストリンジェントな組合わせられた条件であり、これは代表的にはハイブ
リダイゼーション反応において制御される。パラメーターの組合せは、任意の１
つのパラメーターの測定よりも重要である。例えば、WetmurおよびDavidson(196
8)J ．Mol．Biol．31:349-370を参照のこと。ストリンジェントな条件下で標的核
酸に結合する核酸プローブは、その標的核酸に特異的である。このようなプロー
ブは、代表的には長さが11ヌクレオチドより長く、そしてプローブの配列により
特定される領域にわたる標的核酸に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下で標的に結合するのに十分に同一であるかまたは相補的である。
他の哺乳動物種由来のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインは、近縁種の種交叉ハイブリダイゼーションによってクローニ
ングおよび単離され得る。例えば、以下を参照のこと。類似性は、遠縁種間では
比較的低く、従って比較的近縁種のハイブリダイゼーションが望ましい。あるい
は、種特異性の低い抗体調製物の調製が、発現クローニングアプローチでは有用
であり得る。
句「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性である」は、タン
パク質またはペプチドをいう場合、タンパク質の異種の集団および他の生物学的
成分の存在下で、タンパク質の存在の決定因子となる結合反応をいう。従って、
指定された免疫アッセイ条件下では、特異的な抗体が特定のタンパク質に結合し
、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質には顕著には結合しない。このよ
うな条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性
について選択された抗体を必要とし得る。例えば、配列番号２、４、６、８、ま
たは１０で示されるアミノ酸配列を有する、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイ
ン、またはChr19カインのケモカインタンパク質免疫原に対して惹起された抗体
が、m
pf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク
質に特異的に免疫反応性であるが他のタンパク質とは特異的に免疫反応性でない
抗体を得るために選択され得る。これらの抗体は、種特異的であり得、例えば、
多型性およびスプライス改変体または発生改変体を認識する。
III．核酸
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインは、
構造的および機能的に関連するタンパク質より大きなクラスの例である。これら
の可溶性ケモカインタンパク質は、異なる細胞型間でのシグナルを伝達するよう
に作用する。好ましい実施態様は、開示されるように、異なる個体または他の種
(例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物)から遺伝子を単離するための標
準的な手順において有用である。交叉ハイブリダイゼーションによって、個体、
系統、または種からのタンパク質をコードする関連遺伝子の単離が可能になる。
本明細書中で提供される情報に基づいて、適切な核酸クローンを首尾良く単離す
るために、多数の異なるアプローチが利用可能である。サザンブロットハイブリ
ダイゼーション研究により、特定のハイブリダイゼーション条件下で、ヒト、サ
ル、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、およびウサギのゲノムにおける相同な遺伝子の
存在を定性的に決定し得る。
相補配列はまた、プローブまたはプライマーとして使用される。有望なアミノ
末端の同定に基づいて、他のペプチド(例えば、アンカーベクターまたはポリＡ
相補PCR技術と、あるいは他のペプチドの相補的DNAとカップリングしたペプチド
)が特に有用であるはずである。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質をコードする遺伝子の核酸操作の技術(例えば、発現ベクターへのポリペ
プチドをコードする核酸配列のサブクローニング、プローブの標識、DNAハイブ
リダイゼーションなど)は、一般に、Sambrookら、（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual
(第２版)、１〜３巻、Cold Spring Harbor Laboratory，Cold
Spring Harbor Press，NYに記載される(本明細書中に参考として援用される)。
このマニュアルは、本明細書中以下で、「Sambrookら」という。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質をコードするDNA配列を単離する種々の方法がある。例えば、DNAは、本明
細書中で開示する配列と同一であるかまたはこれに相補的である配列を有する標
識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブ
ラリーから単離される。完全長プローブが使用され得るか、またはオリゴヌクレ
オチドプローブが開示される配列の比較によって生成され得る。このようなプロ
ーブは、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンタンパク質をコードするDNAを単離するためにハイブリダイゼーションアッセ
イにおいて直接使用され得るか、またはプローブが、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパタ質をコードするDNAの単
離のために、PCRのような増幅技術での使用のために、例えば隣接配列を用いて
設計され得る。逆翻訳コンピュータープログラムはまた、同一のタンパク質をコ
ードする代替の核酸配列を提供し得る。
cDNAライブラリーを調製するために、mRNAがmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカ
イン、またはChr19カインのケモカインタンパク質を発現する細胞から単離され
る。cDNAは、mRNAから調製され、そして組換えベクター中に連結される。ベクタ
ーは、増殖、スクリーニング、およびクローニングのために組換え宿主中にトラ
ンスフェクトされる。cDNAライブラリーを作製およびスクリーニングするための
方法は、周知である。GublerおよびHoffman(1983)Gene 25263-269およびSambroo
kらを参照のこと。
ゲノムライブラリーのために、DNAは、組織から抽出され、そして機械的に剪
断されるかまたは酵素的に消化されてフラグメント(例えば、約12〜20kb)を生じ
る。次いで、フラグメントは、勾配遠心分離によって分離され、そしてλバクテ
リオファージベクターにクローニングされる。これらのベクターおよびファージ
は、Sambrookらに記載されるように、インビトロでパッケージされる。組換えフ
ァージは、BentonおよびDavis（1977）Science 196:180-182に記載されるように
、プラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイ
ゼーションは、例えば、Grunsteinら、（1975）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA．7
2:3961-3965に一般に記載されるように行われる。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質をコードするDNAは、例えばコロニーハイブリダイゼーションアッセイま
たはプラークハイブリダイゼーションアッセイで、本明細書中に記載される核酸
プローブとハイブリダイズするその能力によってcDNAライブラリーまたはゲノム
ライブラリーのいずれかにおいて同定され得る。対応するDNA領域は、当業者に
公知の標準的な方法によって単離される。例えば、Sanbrookらを参照のこと。
標的配列を増幅する種々の方法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)もまた、mpf4
、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパタ質
をコードするDNAを調製するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技
術が、mRNA、cDNA、およびゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーからこの
ような核酸配列を増幅するために用いられる。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカ
イン、またはChr19カインのケモカインタンパク質をコードする単離された配列
もまた、PCR増幅のためのテンプレートとして使用され得る。
代表的には、PCR技術において、増幅されるべきDNA領域の２本鎖の２つの５’
領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。次いで、ポリメラ
ーゼ連鎖反応が２つの逆方向のプライマーを用いて行われる。Innisら、(編)(19
90)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications Academic Press，San
Diego，CA.を参照のこと。プライマーは、完全長のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、
h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質をコードする全領域を増
幅するため、または所望のより小さなDNAセグメントを増幅するために選択され
得る。一旦このような領域がPCR増幅されると、これらは配列決定され得、そし
てオリゴヌクレオチドプローブが標準的な技術を用いて得られた配列から調製さ
れ得る。次いで、これらのプローブは、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、
またはChr19カインのケモカインタンパク質をコードするDNAを単離するために使
用され得る。
プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、通常、Beaucageおよび
Carruthers(1983)Tetrahedron Lett ．22(20):1859-1862に最初に記載された固相
ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、またはNeedham-VanDevanterら、
（1984）Nucleic Acids Res ．12:6159-6168に記載されるように、自動合成機を
用
いて化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、例えば、天然のアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって、またはPearsonおよびRegnier(1983)J.Chrom ．2
55:137-149に記載されるように、陰イオン交換HPLCによって行われる。合成オリ
ゴヌクレオチドの配列は、例えば、Maxam，A.M.およびGilbert，W.、Grossman，
L.およびMoldave(編)中、（1980）Methods in Enzymology 65:499-560 Academic
Press，New Yorkの、化学的分解法を用いて確認され得る。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質をコードする単離された核酸が同定された。ヌクレオチド配列および対応
するオープンリーディングフレームは、配列番号１、３、５、または７に提供さ
れる。
これらのmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカ
インは、ケモカインの一部に対して限定された類似性を示す。例えば、Matsushi
maおよびOppenheim(1989)Cytokine 1:2-13;Oppenheimら、（1991）Ann ．Rev．Im munol．
9:617-648;Schall（1991）Cytokine 3:165-183;およびGronenbornおよび
Clore（1991）Protein Engineering 4:263-269を参照のこと。比較の他の特徴は
、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインおよ
びケモカインファミリーの間では明らかである。例えば、Lodiら(1994)Science
263:1762-1767を参照のこと。特に、βシートおよびαヘリックス残基は、RASMO
Lプログラムを用いて決定され得る。SayleおよびMilner-White(1995)TIBS 20:37
4-376;またはGronenbergら、（1991）Protein Engineering 4:263-269を参照の
こと；および他の構造的特徴は、Lodiら、（1994）Science 263.1762-1767に規
定される。これらの２次的特徴および３次的特徴は、適切なシステイン残基のス
ペーシングと共に、C、CC、CXCおよびCX3Cの構造的特徴のさらなる定義付けを補
助する。本明細書で提供される6Cカイン実施態様はケモカインの分子クラスにつ
いてカルボキシ末端を提示する。特に、そこにおいて残基Asp68からPro111にわ
たって延びるh6Cカインの配列は、現在まで認識されていないCCケモカインサブ
グループに特徴的であり得るか、または代表し得る。
本発明は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインタンパク質をコードする単離されたDNAまたはフラグメントを提供する。
さらに、本発明は、本明細書中に記載されたDNA配列と、適切な条件（例えば、
高ストリンジェンシー）下でハイブリダイズし得るタンパク質またはポリペプチ
ドをコードする単離されたDNAまたは組換えDNAを提供する。上記生物学的に活性
なタンパク質またはポリペプチドは、インタクトなリガンドまたはフラグメント
であり得、そして配列番号２、４、６、８、または１０に開示されるアミノ酸配
列（特に天然の実施態様である）を有する。好ましい実施態様は、単離物（例え
ば、グリコシル化されていない場合、サイズが約11,000〜12,500ダルトン、）由
来の完全長の天然配列または少なくとも約6,000ダルトン、より好ましくは少な
くとも約8,000ダルトンのフラグメントである。グリコシル化形態において、タ
ンパク質は12,500ダルトンを超え得る。6Cカイン実施態様は対応して、より大き
なサイズを示す。さらに、本発明は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、ま
たはChr19カインのケモカインタンパク質と相同なタンパク質、もしくはプロー
ブとしてmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、もしくはChr19カインのケモカ
インタンパク質をコードするcDNAを用いて単離されるタンパク質をコードする、
単離されたDNAもしくは組換えDNAまたはそのフラグメントの使用を意図する。単
離されたDNAは、5'および3'隣接においてそれぞれの調節配列（例えば、プロモ
ーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、およびその他）を有し得る。これ
らの配列を伴う発現ベクターを作製する方法か、またはタンパク質産物を作製（
例えば、発現および精製）する方法もまた、包含される。
IV．mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの
作製
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまた
はそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成、cDNAライブラリーのスクリ
ーニングにより、または広範な種々の細胞株もしくは組織サンプルから調製され
たゲノムライブラリーのスクリーニングにより得られ得る。それらを行う方法、
または発現ベクターを作製する方法は本明細書中に記載される。
これらのDNAは、完全長タンパク質またはフラグメント（例えば、次いで、そ
れはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成するために使用され得
る）の合成のために；結合研究のために；改変分子の構築および発現のために；
および構造/機能研究のために、広範な種々の宿主細胞において発現され得る。
各mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまた
はそのフラグメント（例えば、ケモカインドメイン）は、適切な発現ベクターで
形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞において発現され得る。これら
の分子は、組換え宿主由来の物以外のタンパク質または細胞混入物を含まないよ
うに実質的に精製され得、従って薬学的に受容可能なキャリアおよび/または希
釈剤と組み合わせた場合、薬学的組成物において特に有用である。抗原（例えば
、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン）ま
たはその一部は、他のタンパク質との融合物として発現され得るか、またはエピ
トープタグを有し得る。
発現ベクターは、代表的には、通常、適切な宿主細胞に認識される適切な遺伝
子制御エレメントに作動可能に連結された所望の抗原遺伝子またはそのフラグメ
ントを含む自己複製DNAまたはRNA構築物である。発現をもたらすために必要な制
御エレメントの特定の型は、使用される最終的な宿主細胞に依存する。一般的に
、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモータ
ー発現制御系を含み得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制
御するための任意のオペレーター、mRNA発現のレベルを増強するための転写エン
ハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻
訳を終結する配列を含み得る。発現ベクターはまた、通常、ベクターが宿主細胞
から独立して複製するのを可能にする複製起点を含む。
本発明のベクターは、代表的には、例えば、生物学的に活性なポリペプチドま
たはタンパク質をコードする、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカインまたはそのフラグメントをコードするDNAを含む。DNAは
、ウイルスプロモーターの制御下にあり得、そして選択マーカーをコードし得る
。本発明は、原核生物宿主または真核生物宿主におけるmpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質をコードする真核生
物cDNAを発現し得るこのような発現ベクターの使用をさらに意図し、ここでベク
ターは宿主に適合し、そしてタンパク質をコードする真核生物cDNAは、ベクター
を含
む宿主の増殖が問題のcDNAを発現させるようにベクターに挿入される。通常、発
現ベクターは、それらの宿主細胞における安定な複製、細胞あたりの所望の遺伝
子の総コピー数を非常に増大させるための増幅のために設計される。発現ベクタ
ーが宿主細胞において複製することは必ずしも必要とされない（例えば、宿主細
胞により認識される複製起点を含まないベクターを用いて、種々の宿主における
タンパク質またはそのフラグメントの一過性発現をもたらすことを可能にする）
。組換えによるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケ
モカイン遺伝子もしくはそのフラグメントの宿主DNAへの組込みを引き起こすベ
クターを使用すること、または内因性遺伝子の発現を制御するプロモーターを組
込むこともまた可能である。
本明細書中で使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファ
ージ、組込み可能なDNAフラグメント、および宿主ゲノムへのDNAフラグメントの
組込みを可能にする他のビヒクルを意図する。発現ベクターは、作動可能に連結
された遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む特殊化したベクター
である。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形態であるが、等価
な機能をもたらすベクターの多くの他の形態は、本明細書中での使用に適切であ
る。例えば、Pouwelsら、（1985および補遺）Cloning Vectors:A Laboratory Ma nual
Elsevier，N.Y.；およびRodriquezら、（編）(1988)Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Theier Uses
Buttersworth，Boston，MA。
適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を含む。原
核生物は、グラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方(例えば、E．coliおよび
B．subtilis)を含む。下等真核生物は、酵母(例えば、S.cerevisiaeおよびPichi
a)、ならびにDictyostelium属の種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源（
例えば、昆虫細胞および鳥類）、ならびに哺乳動物起源（ヒト、霊長類、および
齧歯類）の両方の動物細胞由来の樹立された組織培養細胞株を含む。
原核生物宿主-ベクター系は、多くの異なる種に対する広範な種々のベクター
を含む。本明細書中に使用される、E.collおよびそのベクターは、他の原核生物
において使用される等価なベクターを包括的に含むために使用される。DNAを増
幅するための代表的なベクターは、pBR322またはその誘導体である。mpf4、mCTA
P3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまたはmpf4、mCTAP
3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインフラグメントを発現
するために使用され得るベクターは、以下を含むがそれらに限定されない：lac
プロモーター（pUCシリーズ）；trpプロモーター(pBR322-trp)；Ippプロモータ
ー（pINシリーズ）；λ-pPまたはpRプロモーター(pOTS)；またはハイブリッドプ
ロモーター（例えば、ptac(pDR540)）のようなベクター。Brosiusら、（1988）
「λ、trp、lac、およびIpp由来のプロモーターを使用する発現ベクター」、Rod
rigueZおよびDenhardt（編）Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses
10:205-236 Buttersworth，Boston，MA。
下等真核生物（例えば、酵母およびDictyostelium）は、mpf4、mCTAP3、m6Cカ
イン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン配列含有ベクターで形質転換
され得る。本発明の目的のために、最も通常の下等真核生物宿主は、パン酵母Sa
ccharomyces cerevisiaeである。それは、下等真核生物を代表するように一般的
に使用されるが、多くの他の株および種もまた利用可能である。酵母ベクターは
、代表的に、複製起点（組込み型でなければ）、選択遺伝子、プロモーター、所
望のタンパク質またはそのフラグメントをコードするDNA、ならびに翻訳終結、
ポリアデニル化、および転写終結のための配列からなる。酵母に適切な発現ベク
ターは、3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよび種々の他の解糖系酵素遺伝子プロ
モーターのような構成性プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ２プ
ロモーターまたはメタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモーターを
含む。適切なベクターは、以下の型の誘導体を含む：自己複製低コピー数（例え
ば、YRpシリーズ）、自己複製高コピー数（例えば、YEpシリーズ）；組み込み型
（例えば、YIpシリーズ）、またはミニ染色体（例えば、YCpシリーズ）。
代表的に、高等真核生物組織培養細胞は、機能的に活性なmpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質の発現に好まし
い宿主細胞である。原則として、多くの高等真核生物組織培養細胞株（例えば、
昆虫バキュロウイルス発現系）が、無脊椎動物供給源または脊椎動物供給源にか
かわらず使用され得る。しかし、哺乳動物細胞は、翻訳同時または翻訳後の両方
で、適切なプロセシングを達成するために好ましい。このような細胞の形質転換
またはトランスフェクションおよび増殖は、日常的である。有用な細胞株は、He
La細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、ベビーラット腎臓(BRK)細胞
株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル(COS)細胞株を含む。このような細胞
株の発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、RNAスプ
ライス部位（例えば、ゲノムDNAを使用する場合）、ポリアデニル化部位、およ
び転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、選択遺伝子または増幅遺伝子
を含み得る。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、SV40、パルボウ
イルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源由来
のプロモーターを保持するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり
得る。適切な発現ベクターの代表的な例は、pCDNA1；pCD、Okayamaら、（1985）Mol ．Cell Biol．
5:1136-1142を参照のこと；pMClneoポリA、Thomasら、（1987
）Cell 51:503-512を参照のこと；およびpAC 373またはpAC610のようなバキュロ
ウイルスベクターを含む。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインは、
生物学的応答を誘発するためにグリコシル化される必要はないらしい。しかし、
特定のまたは規定されたグリコシル化パターンを提供する系においてmpf4、mCTA
P3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインポリペプチドを発
現することが、時々、所望される。この場合において、通常のパターンは、発現
系により天然に提供されるパターンである。しかし、このパターンは、ポリペプ
チド（例えば、グリコシル化されていない形態）を、異種発現系に導入された適
切なグリコシル化タンパク質に曝露することにより改変し得る。例えば、mpf4、
mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン遺伝子は、哺
乳動物または他のグリコシル化酵素をコードする１つ以上の遺伝子で同時形質転
換され得る。過剰なグリコシル化は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、ま
たはChr19カインのケモカイン生物学的活性に有害であり得、そして当業者は、
最適な生物学的活性を付与するグリコシル化の程度を最適化するために日常的な
試験を行い得ることがさらに理解される。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまた
はそのフラグメントは、細胞膜にホスファチジルイノシトール(PI)結合される
ように操作され得るが、ホスファチジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスフ
ァチジルイノシトールホスホリパーゼ-C）を用いた処理により膜から除去され得
る。これは、生物学的に活性な形態における抗原を放出し、そしてタンパク質化
学の標準的な手順による精製を可能にする。例えば、Low(1989)Biochem ．Biophy s．Acta
988:427-454;Tseら、（1985）Science 230:1003-1008;およびBrunnerら
、（1991）J ．Cell Blol．114:1275-1283を参照のこと。
今や、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンは特徴付けられたので、フラグメントまたはその誘導体は、ペプチドを合成す
るための従来のプロセスにより調製され得る。これらは、例えば、Stewartおよ
びYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co.，Rockfo
rd，IL;BodanszkyおよびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthesis
Springer-Verlag，New York，NY；ならびにBodanszky（1984）The Principles of Peptide Synthesis
Springer-Verlag，New York，NYに記載されるプロセスを
含む。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、酸無水物プロセス、混合無
水物プロセス、活性エステルプロセス（例えば、p-ニトロフェニルエステル、N-
ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシアノメチルエステル）、カルボジ
イミダゾールプロセス、酸化還元プロセス、またはジシクロヘキシルカルボジイ
ミド(DCCD)/添加剤プロセスが使用され得る。固相および液相合成の両方は、前
述のプロセスに適用可能である。さらに、化学連結（例えば、Dawsonら（1994）
Science 266:776-779，a method of linking long synthetic peptides by apep
tide bond）を参照のこと。
調製されたタンパク質およびそのフラグメントは単離され、そしてペプチド分
離の手段により（例えば、抽出、沈澱、電気泳動、およびクロマトグラフィーの
種々の形態などにより）、反応混合物から精製され得る。本発明のmpf4、mCTAP3
、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインは、その所望される
使用に依存する種々の程度の純度で得られ得る。精製は、公知のタンパク質精製
技術の使用により、または本明細書中に記載される抗体または結合パートナーの
使用により（例えば、免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーにおいて）達
成され得る。この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーは、最初に抗体を
固
体支持体に結合させることにより、次いで結合された抗体と、適切な供給源細胞
の可溶化溶解物、リガンドを発現する他の細胞の溶解物、または組換えDNA技術
（以下を参照のこと）の結果としてmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、また
はChr19カインのケモカインを産生する細胞の溶解物もしくは上清とを接触させ
ることにより行われる。
複数の細胞株が、他の細胞と比較して高レベルでmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h
6Cカイン、またはChr19カインのケモカインを発現する細胞についてスクリーニ
ングされ得る。天然のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイ
ンのケモカインは、天然の供給源から、または適切な発現ベクターを用いて形質
転換された細胞からの発現により単離され得る。発現タンパク質の精製は、標準
的な手順により達成されるか、または細胞の溶解物または上清から高効率で効果
的な精製のための操作手段と組み合わされ得る。エピトープまたは他のタグ（例
えば、FLAGまたはHis6セグメント）は、このような精製特徴のために使用され得
る。
V．抗体
抗体は、種々のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカイン（個体変異体、多型変異体、対立遺伝子変異体、系統変異体、または
種変異体を含む）およびそのフラグメントに対して、それらの天然に生じる（完
全長）形態およびそれらの組換え形態の両方で惹起され得る。さらに、抗体は、
それらの活性形態もしくは天然形態、またはそれらの不活性形態もしくは変性形
態のいずれかのmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケ
モカインに対して惹起され得る。抗イディオタイプ抗体もまた使用され得る。抗
体は、種変異体、個体変異体、または多型変異体について種々の結合特性を示し
得る。
A．抗体生成
多くの免疫原が、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
のケモカインタンパク質と特異的に反応する抗体を生成するために使用され得る
。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生成の
た
めの好ましい免疫原である。天然に生じるタンパク質もまた、純粋形態または不
純形態のいずれかで使用され得る。本明細書中に記載される、ヒトまたはマウス
のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質配列を用いて作製される合成ペプチドもまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン（例えば、そのケモカインドメイ
ン）に対する抗体の生成のための免疫原として使用され得る。組換えタンパク質
は、本明細書中に記載される真核生物細胞または原核生物細胞において発現され
、そして記載されるように精製され得る。天然に折り畳まれたまたは変性された
物質は、適切であれば、抗体を生成するために使用され得る。モノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するための免疫ア
ッセイにおける後の使用のために生成され得る。
ポリクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知である。代表的に、免疫
原、好ましくは精製タンパク質はアジュバントと混合され、そして動物はその混
合物を用いて免疫される。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験採血を
行うことにより、そしてmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインタンパク質または目的のフラグメントに対する反応性の力価を
測定することによりモニターされる。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得
られる場合、通常、免疫化を繰り返した後に、血液は動物から回収され、そして
抗血清が調製される。タンパク質に対して反応性の抗体を富化するための抗血清
のさらなる分画が、所望であれば行われ得る。例えば、HarlowおよびLane；また
はColiganを参照のこと。
モノクローナル抗体は、当業者によく知られている種々の技術により得られ得
る。代表的に、所望の抗原で免疫した動物由来の牌細胞は、通常ミエローマ細胞
との融合により不死化される（KohlerおよびMilstein（1976）Eur ．J．Immunol ．
6:511-519（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。不死化の
別の方法は、エプスタインバーウイルス、ガン遺伝子、もしくはレトロウイルス
を用いた形質転換、または当該分野で公知の他の方法を含む。単一の不死化細胞
から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の生成に
ついてスクリーニングされ、そしてこのような細胞により生成されるモノクロー
ナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む、種々の技術により増強
され得る。あるいは、例えば、Huseら、（1989）Science 246:1275-1281により
概説される一般的なプロトコルに従ってヒトＢ細胞由来のDNAライブラリーをス
クリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合フラグメント
をコードするDNA配列を単離し得る。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの予
め決定されたフラグメントに対する抗体（結合フラグメントおよび単鎖型を含む
）は、フラグメントと上記のようなキャリアタンパク質との結合体での動物の免
疫により惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から
調製される。これらの抗体は、正常なmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、ま
たはCHr19カインのケモカインまたは欠損mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン
、またはCHr19カインのケモカインに対する結合についてスクリーニングされ得
るか、またはアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性（例えば、レセプターに
より媒介される）についてスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗
体は、通常には少なくとも約１mMのKD、より通常には少なくとも約300μM、代表
的には少なくとも約10μM、より代表的には少なくとも約30μM、好ましくは少な
くとも約10μM、およびより好ましくは少なくとも約３μM以上で結合する。
いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊
長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのよ
うなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら（編
）Basic and Clinical Immunology（第４版）、Lange Medical Publications，L
os Altos，CA、およびそこで引用される参考文献；HarlowおよびLane（1988）An tibodies:A Laboratory Manual
，CSH Press：Goding（1986）Monoclonal Antibo dies:Principles and Practice
（第２版）Academic Press，New York，NY；なら
びに特に、KohlerおよびMilstein（1975）Nature 256:495-497（これは、モノク
ローナル抗体を生成する一つの方法を記載する）において見出され得る。簡潔に
要約すると、この方法は、動物に免疫原を注入することを包含する。次いで、動
物は屠殺され、そして細胞はその脾臓から採取され、次いでその細胞はミエロー
マ細胞に融合される。これにより、インビトロで再生され得るハイブリッ
ド細胞または「ハイブリドーマ」を生じる。次いで、ハイブリドーマの集団をス
クリーニングして、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクロー
ンを単離する。この様式において、得られる個々の抗体種は、免疫原物質上で認
識される特異的部位に応答して生成される免疫動物由来の不死化およびクローン
化されたシングルＢ細胞の生産物である。
他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリ
ーの選択を包含する。例えば、Huseら(1989)「λファージにおける免疫グロブリ
ンレパートリーのラージコンビナトリアルライブラリーの作製」、Science 246:
1275-1281：およびWardら(1989)Nature 341:544-546を参照のこと。本発明のポ
リペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む改変を伴ってまた
は伴わずに使用され得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシ
グナルを提供する基質を共有結合的にかまたは非共有結合的にかのいずれかで結
合することにより標識される。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、
そして科学文献および特許文献の両方で多数報告されている。適切な標識として
は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部分、化学発
光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許とし
ては、米国特許第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996
,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号；および同第4,366,241号が挙げら
れる。組換え免疫グロブリンもまた生成され得る。Cabilly、米国特許第4,816,5
67号；およびQueenら（1989）Proc ．Nat'l．Acad．Sci. USA 86:10029-10033を
参照のこと。
本発明の抗体は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
のケモカインタンパク質の単離におけるアフィニティークロマトグラフィーに有
用である。カラムは、抗体を固相支持体（例えば、アガロース、SEPHADEXなどの
ような粒子）に連結させて調製され得、ここで、細胞溶解物または上清は、カラ
ムを通過され得、カラムを洗浄し、続いて温和な変性剤の濃度を増加させること
によって、精製mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケ
モカインタンパク質が遊離される。同様に、ケモカインに結合する抗体は、レセ
プター結合を中和し得、そしてレセプターアンタゴニストとして作用し得る。そ
れらはまた、ウェスタンブロット検出試薬またはELISA試薬として有用であり得
る。
抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングする
ために使用され得る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体の結合に
より抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対
する抗体は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインを発現する細胞集団の同定のために使用され得る。mpf4、mCTAP3、m6Cカ
イン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインを発現する細胞の発現産物を
アッセイすることにより、疾患（例えば、免疫妥協症状）を診断することが可能
である。
各mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに
対して惹起される抗体はまた、抗イディオタイプの抗体を惹起するために有用で
ある。これらは、それぞれの抗原の発現に関連する種々の免疫学的症状を検出ま
たは診断するにおいて有用である。
Ｂ．イムノアッセイ
特定のタンパク質は、種々のイムノアッセイ法によって測定され得る。一般的
な免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の総説については、StitesおよびTerr
（編）(1991)Basic and Clinical Immunology(第７版)を参照。さらに、本発明
のイムノアッセイは、Maggio(編)(1980)Enzyme Immunoassay CRC Press，Boca R
aton，Florida；Tijan（1985）「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」
，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier
Science Publishers B.V.，Amsterdam；ならびにHarlowおよびLane，Antibodie
s，A Laboratory Manual,前出(これらのそれぞれは、本明細書中で参考として援
用される)において広範に概説される、多くの形態で実行され得る。Chan(編)（1
987）Immunoassay:A Practical Guide Academic Press，Orlando，FL；Priceお
よびNewman(編)（1991）Principles and Practice of Immunoassays Stockton P
ress，NY；ならびにNgo(編)（1988）Non-isotopic Immunoassays Plenum Press
，NYもまた参照。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質の測定用イムノアッセイは、当業者に公知の種々の方法によって実行され
得る。簡潔には、このタンパク質を測定するためのイムノアッセイは、競合また
は非競合結合アッセイであり得る。競合結合アッセイにおいて、分析すべきサン
プルは、固体表面に結合した捕捉因子上の特異的結合部位ついて、標識した分析
物と競合する。好ましくは、捕捉因子は、上記のように産生されたmpf4、mCTAP3
、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質と特異的
に反応する抗体である。捕捉因子に結合した標識分析物の濃度は、サンプル中に
存在する遊離分析物の量に反比例する。
競合結合イムノアッセイにおいて、サンプル中に存在するmpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質は、特異的結合
因子(例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインタンパク質と特異的に反応する抗体)への結合について、標識したタンパ
ク質と競合する。結合因子は、未結合の標識タンパク質からの結合した標識タン
パク質の分離をもたらす固体表面に結合され得る。あるいは、競合結合アッセイ
は液層において行われ得、そして当該分野において公知の種々の技術が、未結合
の標識タンパク質から、結合した標識タンパク質を分離するために使用され得る
。分離後、結合した標識タンパク質の量を決定する。サンプル中に存在するタン
パク質の量は、結合している標識タンパク質の量に反比例する。
あるいは、分離工程を必要としない同質イムノアッセイが実施され得る。これ
らのイムノアッセイにおいて、タンパク質上の標識は、タンパク質と特異的結合
因子との結合によって変化する。標識タンパク質のこの変化は、標識により発せ
られるシグナルの減少または増大を生じ、その結果、イムノアッセイの終了時の
標識の測定は、タンパク質の検出または定量を可能にする。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質はまた、種々の非競合イムノアッセイ法により決定され得る。例えば、二
部位固相サンドイッチイムノアッセイが使用され得る。このタイプのアッヤイで
は、タンパク質用の結合因子(例えば、抗体)は、固体支持体に付着されている。
第二のタンパク質結合因子(これもまた、抗体であり得、そして異なる部位でタ
ンパク質と結合する)が、標識されている。タンパク質上の両部位での結合が生
じた後、未結合の標識結合因子は除去され、そして固相に結合した標識結合因子
の量が測定される。結合している標識結合因子の量は、サンプル中のタンパク質
の量に正比例する。
ウエスタンブロット分析は、サンプル中のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイ
ン、またはChr19カインのケモカインタンパク質の存在を決定するために使用さ
れ得る。電気泳動は、例えば、タンパク質の含有が疑われる組織サンプルについ
て実行される。電気泳動でタンパク質を分離し、適切な固体支持体(例えば、ニ
トロセルロースフィルター)にタンパク質を移した後、固体支持体は、タンパク
質と反応性である抗体とともにインキュベートされる。この抗体は、標識され得
るか、あるいは、続く、この一次抗体と結合する標識二次抗体とのインキュベー
ションにより検出され得る。
上記のイムノアッセイ形式は、標識アッセイ成分を使用する。標識は、当該分
野において周知の方法に従ってアッセイの所望の成分に直接または間接的にカッ
プリングされ得る。広範な標識および方法が使用され得る。伝統的には、3Ｈ、1 25
Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐを組み込む放射活性標識を使用した。非放射活性
標識には、標識抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光因子、酵素、および
標識リガンドに特異的な結合対メンバーとして役立ち得る抗体が含まれる。標識
の選択は、必要な感度、化合物との結合の容易さ、安定性の要件、および利用可
能な機器に依存する。使用され得る、種々の標識法またはシグナル生成システム
の総説については、米国特許第4,391,904号(これは、参考として本明細書中に援
用される)を参照。
特定のタンパク質と反応性である抗体はまた、種々のイムノアッセイ法により
測定され得る。イムノアッセイ技術による抗体測定に適用可能な免疫学的手順お
よびイムノアッセイ手順の総説については、StitesおよびTerr(編)、Basic and
Clinical Immunology(第７版)、前出；Magglo(編)、Enzyme Immunoassay、前出
；ならびにHarlowおよびLane、Antibodies，A Laboratory Manual、前出を参照
。
簡潔に述べると、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
のケモカインタンパク質と反応性である抗血清を測定するためのイムノアッセイ
は、競合または非競合結合アッセイであり得る。競合結合アッセイでは、サンプ
ルの分析物は、固体表面に結合された捕捉因子上の特異的結合部位について、標
識分析物と競合する。好ましくは、捕捉因子は、上記のように産生された精製組
換えmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタ
ンパク質である。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインタンパク質(単離または部分精製した天然に生じるタンパク質を含む)
の他の供給源もまた、使用され得る。非競合アッセイは、サンプル分析物が２つ
の分析物特異的結合因子の間に結合されるサンドイッチアッセイを含む。１つの
結合因子は捕捉因子として使用され、そして固体表面に結合される。第二の結合
因子は標識され、そして視覚的手段または機器的手段により、得られる複合体を
測定または検出するために使用される。捕捉因子と標識結合因子との多くの組合
せが使用され得る。種々の異なるイムノアッセイ形式、分離技術、および標識も
また、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン
タンパク質の測定のために、上記のものと同様に使用され得る。
VI．精製mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ン
マウスヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１〜６に提供され、そし
てh6Cカインについてのヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号７お
よび８に提供される。
精製タンパク質または規定されたペプチドが、上記のように、標準的な方法に
より抗体を作製するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質が、
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するために免疫系に提示され得
る。例えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology、Wiley/Greene
，NY；ならびにHarlowおよびLane（1989）Antibodies:A Laboratory Manual、Co
ld Spring Harbor Press，NY(これらは、本明細書中に参考として援用される)を
参照。あるいは、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインレセプターが、特異的結合因子として有用であり得、そして例えば、
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインリガン
ドの精製のためにその結合特異性が利用され得る。
特異的結合組成物は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインを発現する細胞株から作製される発現ライブラリーをスクリー
ニングするために使用され得る。スクリーニングのための多くの方法(例えば、
リガンドを発現した表面の標準的な染色法、またはパニングによる)が利用可能
である。細胞内発現のスクリーニングもまた、種々の染色または免疫蛍光手順に
より実行され得る。結合組成物は、リガンドを発現する細胞をアフィニティー精
製または選別するために使用され得る。
ペプチドセグメントはまた、相同遺伝子に対する比較とともに、ライブラリー
をスクリーニングするに適切なオリゴヌクレオチドを産生するために使用され得
る。遺伝コードは、スクリーニング用のプローブとして有用である適切なオリゴ
ヌクレオチドを選択するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術
との組合せでは、合成オリゴヌクレオチドは、ライブラリーから所望のクローン
(天然対立遺伝子多形改変体を含む)を選択することにおいて有用である。
ペプチド配列は、このようなセグメントを認識する抗体を作製するためのペプ
チドの調製を可能にし、そしてこのような配列をコードするオリゴヌクレオチド
の調製を可能にする。配列はまた、合成的調製を可能にする(例えば、Dawsonら
、（1994）Science 266:776-779を参照)。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン
、またはChr19カインのケモカインは分泌されたタンパク質であり得るので、遺
伝子は、通常、Ｎ末端シグナル配列(これは、プロセシングおよび分泌の際に除
去される)を有する。しかし、正確なプロセシング点は、異なる細胞型において
変化し得、そして異なる長さの形態がしばしば検出される。シグナル切断部位の
予測は、例えばNielsenら、（1997）Protein Eng ．10:1-8の方法を用いて実施さ
れ得る。最も密接に関連する報告された配列との比較における構造的特徴の分析
により、他のサイトカイン(特に、CCおよびCXCケモカインとして公知のクラスの
タンパク質)との類似性が明らかになった。6Cカインの実施態様のより長いカル
ボキシ末端は、CCケモカインの異なるサブファミリーを示唆する。このサブファ
ミリーは、さらなる生物学的または構造的特徴を示し得る。
VII．物理的改変体
本発明はまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン、
ケモカインのアミノ酸配列との実質的なアミノ酸配列類似性を有するタンパク質
またはペプチドを包含する。天然の改変体には、個々の、多形の、対立遺伝子、
株、または種改変体が含まれる。
アミノ酸配列類似性、または配列同一性は、残基マッチを最適化し、必要であ
れば、必要なギャップを導入することによって決定される。これは、保存的置換
をマッチとして考慮する場合、変化する。保存的置換には、代表的には、以下の
群内での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシ
ン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレ
オニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同アミノ
酸配列には、個々のタンパク質配列それぞれにおいて、天然多形、対立遺伝子、
および種間改変が含まれる。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、mpf4、
mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインのアミノ酸配
列と、50〜100％の類似性(ギャップを導入し得る場合)から、75〜100％の類似性
(保存置換を含む場合)までを有する。類似性の測定は、少なくとも約50％、一般
には少なくとも60％、より一般には少なくとも65％、通常には少なくとも70％、
より通常には少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、そしてより好ましく
は少なくとも80％、そして特に好ましい実施態様において、少なくとも85％以上
である。Needlehamら、（1970）J.Mol.Blol．48:443-453；Sankoffら、（1983）
Time Warps，String Edits，and Macromolecules:The Theory and Practice of
Sequence Comparison、第１章、Addison-Wesley，Reading，MA；およびIntelliG
enetics(Mountain View，CA)のソフトウエアパッケージ；ならびにUniversity o
f Wisconsin Genetics Computer Group(Madison，WI)もまた参照。
哺乳動物mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカ
インタンパク質をコードする核酸は、代表的には、ストリンジェントな条件下で
、配列番号１、３、５、または７の核酸配列にハイブリダイズする。例えば、mp
f4、mCTAP3、m6Cカイン、またはh6Cカインのケモカインタンパク質をコードする
核酸
は、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、
３、５、または７の核酸にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条
件は、規定されたイオン強度およびpHでのプローブ配列の融解温度(Tm)より約10
℃低く選択される。Tmは、標的配列の50％が完全にマッチしたプローブにハイブ
リダイズする温度(規定されたイオン強度およびpH下)である。代表的には、スト
リンジェントな条件は、塩濃度がpH7にて約0.2モルであり、温度が少なくとも約
50℃である条件である。他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェン
シーに顕著に影響し得る。これには、とりわけ、塩基組成および相補鎖のサイズ
、有機溶媒(例えば、ホルムアミド)の存在、および塩基ミスマッチングの程度が
含まれる。好ましい実施態様には、42℃にて50％ホルムアミドおよび200mM NaCl
において、開示された配列と結合する核酸が含まれる。
単離されたmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインDNAは、ヌクレオチド置換、ヌタレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、およ
びヌクレオチドストレッチの短い倒置により容易に改変され得る。これら改変は
、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、もしくはChr19カインのケモカイン抗
原、その誘導体、または高度に類似する生理学的、免疫原性、もしくは抗原性活
性を有するタンパク質をコードする新規のDNA配列を生じる。
改変配列は、変異体抗原を産生するかまたは発現を増強するために使用され得
る。増強された発現には、遺伝子増幅、増大した転写、増大した翻訳、および他
の機構が含まれ得る。このような変異体mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、
またはChr19カインのケモカイン誘導体には、個々のタンパク質またはそのフラ
グメントの予め決定されたまたは部位特異的変異が含まれる。「変異体mpf4、mCT
AP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン」は、他の点では
上記のヒトmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカ
インの相同性の規定に該当するが、欠失、置換、または挿入のいずれによるかに
かかわらず、天然に見い出されるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、または
Chr19カインのケモカインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、ポ
リペプチドを包含する。特に、「部位特異的変異体mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6
Cカイン、またはChr19カインのケモカイン」には、一般に、配列番号２、４、６
、
８、または10の配列を有するタンパク質との顕著な類似性を有し（例えば、天然
の実施態様）、それら配列と種々の生物活性(例えば、抗原性または免疫原性)を
共有するタンパク質が含まれ、そして好ましい実施態様において、部位特異的変
異体mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン、ケモカインは
、開示された配列のほとんどもしくはすべてを含む。これはまた、異なる個体由
来の多形改変体に適用される。同様な概念は、異なるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質、特に種々の温血動物
(例えば、哺乳動物およびトリ)に見い出されるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカ
イン、またはChr19カインのケモカインタンパク質に適用される。前述のように
、記載は、一般に、他のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインタンパク質を包含することを意味し、具体的に議論したヒトま
たはマウスの実施態様に限定されないことが、強調される。
部位特異的変異部位は予め決定されているが、変異体が部位特異的である必要
はない。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンの変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を作製することにより行われ得る。
置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせが生成されて、最終構築物に到達し
得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカルボキシ末端融合物（例えば、エピト
ープタグ）を含む。ランダムな変異誘発は、標的コドンにて行われ得、次いで、
発現された変異体が所望の活性についてスクリーニングされ得る。既知の配列を
有するDNA中の予め決定された部位での置換変異の作製方法は、当該分野で周知
である（例えば、M13プライマー変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術
による）。Sambrookら、(1989)、およびAusubelら、(1987および補遺)もまた、
参照のこと。DNA中の変異は、通常、コード配列を読み取り枠の外にするべきで
はなく、そして好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンのような
２次的なmRNAの構造を生成し得る相補的な領域を作らない。
本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらのタンパク質由来のセグメ
ントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、本来
、同じ方式では通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。
従って、免疫グロブリンとmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19
カ
インのケモカインポリペプチドとの融合産物は、代表的なペプチド結合で融合さ
れる配列を有し、代表的には単一の翻訳産物として作られ、そしてそれぞれの供
給源のペプチドに由来する特性を示す連続的なタンパク質分子である。同様の概
念が異種核酸配列にも適用される。
さらに、新たな構築物が、他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインの組み
合わせから作製され得る。例えば、タンパク質結合セグメントまたは他のセグメ
ントが、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」され
得る。例えば、Cunninghamら（1989）Science 243:1330-1336;およびO'Dowdら（
1988）J.Biol.Chem ．263:15985-15992を参照のこと。従って、特異性の新たな組
み合わせを示す新たなキメラポリペプチドは、タンパク質結合特異性および他の
機能的ドメインの機能的結合により得られる。
VIII．結合因子：mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインタンパク質複合体
規定された免疫原(例えば、配列番号２、４、６、８、または10のアミノ酸配
列からなる免疫原)に対して作成された抗体に特異的に結合するか、またはこれ
と特異的に免疫反応性であるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr1
9カインのケモカインタンパク質は、代表的には、イムノアッセイにおいて決定
される。イムノアッセイは、配列番号２、４、６、８、または10のタンパク質に
対して惹起されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、他のケモカ
インに対する低い交叉反応性を有するように選択され、そして任意のこのような
交叉反応性は、イムノアッセイでの使用の前に免疫吸収により除去される。
イムノアッセイにおいて使用する抗血清を生成するために、配列番号２、４、
６、８、または10のタンパク質は、本明細書中に記載のように単離される。例え
ば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株において産生され得る。マウス同系交
配系統(例えば、balb/c)を、標準的なアジュバント(例えば、フロイントアジュ
バント)および標準的マウス免疫プロトコル(HarlowおよびLane(前出)を参照のこ
と)を使用して、配列番号２、４、６、８、または10のタンパク質で免疫する。
あるいは、本明細書中に開示された配列に由来し、そしてキャリアタンパク質に
結合された合成ペプチド(好ましくは、完全長に近いもの)が、免疫原として使用
され得る。ポリクローナル血清は回収され、そしてイムノアッセイ(例えば、固
体支持体に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイ)において免疫原タン
パク質に対して力価決定される。104以上の力価を有するポリクローナル抗血清
が選択され、そして競合結合イムノアッセイ(例えば、HarlowおよびLane(前出)
の570〜573頁に記載のもの)を使用して、Ｃ、CC、CX3C、およびCXCケモカインに
対する交叉反応性について試験される。好ましくは、２つのケモカインが、ヒト
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまたは
マウスmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン
のいずれかとの組み合わせでこの決定に使用される。
競合結合形式のイムノアッセイは、交叉反応性の決定のために使用され得る。
例えば、配列番号２、４、６、８、または10のタンパク質は、固体支持体に固定
され得る。アッセイに加えられたタンパク質は、固定された抗原への抗血清の結
合と競合する。上記タンパク質が、固定されたタンパク質への抗血清の結合と競
合する能力は、配列番号２、４、６、８、または10のタンパク質と比較される。
上記タンパク質についての交叉反応性の割合は、標準的な計算を使用して算出さ
れる。上記に掲げた各タンパク質と10％未満の交叉反応性を有するこれらの抗血
清が選択され、そしてプールされる。次いで、交叉反応性の抗体が、上掲のタン
パク質との免疫吸収により、プールされた抗血清から除去される。
次いで、免疫吸収されプールされた抗血清は、第二のタンパク質を免疫原タン
パク質(例えば、配列番号２、４、６、８、または10のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインモチーフ)と比較するために、上
記のような競合結合イムノアッセイにおいて使用される。この比較をなすために
、これら２つのタンパク質がそれぞれ、広範な濃度でアッセイされ、そして固定
されたタンパク質への抗血清の結合を50％阻害するに必要な各タンパク質の量が
決定される。必要な第二のタンパク質の量が、例えば必要な配列番号２、４、６
、８、または10のタンパク質の量の２倍未満である場合、次いで第二のタンパク
質は、免疫原に対して生成された抗体に特異的に結合するといえる。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質が、それぞれ２つ以上の遺伝子を含む相同のタンパタ質のファミリーであ
ることが理解される。ヒトmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19
カインのケモカインタンパク質のような特定の遣伝子産物について、用語は、本
明細書中に開示されるアミノ酸配列にのみ言及されるのではなく、多型変異体、
対立形質変異体、非対立形質変異体、または種変異体である他のタンパク質も言
及する。用語「ヒトmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
」は、単一部位変異のような従来の組換え技術を使用する意図的な変異により、
またはmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン
タンパク質をコードするDNAの短い切片を切り出すことにより、または新しいア
ミノ酸を置換するか、もしくは新しいアミノ酸を付加することにより誘導された
非天然型変異体を含むこともまた理解される。そのような微小な改変は、元の分
子の免疫学的同一性（immunoldentity）および／またはその生物学的活性を実質
的に維持しているはずである。それゆえ、これらの改変体は、例えば、配列番号
２、４、６、８、または10に示したmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、また
はChr19カインのケモカインタンパク質のような特定の天然に存在するmpf4、mCT
AP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタンパク質と特異
的に免疫反応性であるタンパク質を含む。改変されたタンパク質の生物学的特性
は、タンパク質を適切な細胞株で発現させ、そして例えば、走化性効果を測定す
ることにより決定され得る。軽度と考えられる特定のタンパク質の改変体は、全
体としてmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンファミリーについて上述のように、類似の化学的性質を有するアミノ酸の保存
的置換を含む。配列番号２、４、６、８、または10のタンパク質と最適にアライ
ンすることにより、そして、免疫学的同一性を決定するために本明細書中に記載
される従来の免疫アッセイを使用することにより、または、リンパ球走化性アッ
セイを使用することにより、本発明のタンパク質組成物が決定され得る。
IX.機能的変異体
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対
する生理学的な応答のブロックは、例えば、競合的阻害を介しての、そのレセプ
ターへのタンパク質の結合の阻害により生じ得る。従って、本発明のインビトロ
アッセイは、しばしば単離されたタンパク質、組換え膜結合mpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインを発現する細胞に由来する
膜、これらのタンパク質のレセプター結合セグメントを含む可溶性のフラグメン
ト、または固相基質に付着したフラグメントを使用する。これらのアッセイはま
た、結合セグメント変異および改変、またはタンパク質変異および改変（例えば
、タンパク質アナログ）のいずれかの効果の診断的測定を可能にする。本発明は
また、競合的薬物スクリーニングアッセイ（例えば、ここで、抗原に対する中和
抗体またはレセプターフラグメントが、タンパク質との結合について試験化合物
と競合する）の使用を意図する。この方式では、抗体はタンパク質の１またはそ
れより多い抗原結合部位を共有する任意のポリペプチドの存在を検出するために
使用され得、そしてまた、さもなければレセプターと相互作用し得るタンパク質
上の結合部位を占めるために使用され得る。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン抗原
の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変体、および他の化学的
部分との共有結合的または凝集結合物を包含する。共有結合誘導体は、当該分野
で周知の手段により、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイ
ンのケモカインのアミノ酸側鎖中あるいはＮ末端またはＣ末端で見出される基へ
の官能基の連結により調製され得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端また
はカルボキシル側鎖を含有する残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシ
ル基含有残基のO-アシル誘導体、およびアミノ末端のアミノ酸またはアミノ基含
有残基（例えば、リジンまたはアルギニン）のN-アシル誘導体を含み得るが、こ
れらに限定されない。アシル基は、C3〜C18の通常のアルキルを包含するアルキ
ル部分の群から選択され、これにより、アルカノイルアロイル種が形成される。
キャリアタンパク質への共有結合的付着は、免疫原性部分がハプテンである場合
には重要であり得る。
特に、グリコシル化改変（例えば、その合成およびプロセシングの間、または
さらなるプロセシングの工程でのポリペプチドのグリコシル化パターンの改変に
より作られるもの）が包含される。これを達成する特に好ましい手段は、通常そ
のようなプロセシングを提供する細胞に由来するグリコシル化酵素（例えば、哺
乳動物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによる。脱グリコシル化酵
素もまた、意図される。他の小さい改変を有する同一の１次アミノ酸配列のバー
ジョンもまた包含され、これはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン
、ホスホセリン、もしくはホスホトレオニン）、またはリボシル基もしくは架橋
剤を含む他の部分を含む。
誘導体の主要な群は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインまたはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチド
との共有結合物である。これらの誘導体は、Ｎ末端またはＣ末端融合体のような
組換え培養物中で、または反応性側鎖基を介してのタンパク質の架橋結合に有用
な当該分野で公知の薬剤の使用により合成され得る。架橋結合剤を用いる好まし
いケモカイン誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭化水素部分、およびシステイン
残基である。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインと他
の相同性タンパク質または異種タンパタ質（例えば、他のケモカイン）との融合
ポリペプチドもまた、提供される。多くの増殖因子およびサイトカインがホモ二
量体の存在であり、そして反復構築物(repeat construct)は、タンパク質分解的
切断に対する感受性の減少を包含する種々の利点を有し得る。さらに、多くのレ
セプターはシグナルの伝達のために二量体化が必要であり、そして種々の二量体
リガンドまたはドメイン反復が所望され得る。相同性ポリペプチドは、異なる表
面マーカー間での融合物であり得、例えば、レセプター結合特異性を示すハイブ
リッドタンパク質を生じる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み
合わせを示す異種融合物が構築され得る。代表的な例は、融合リガンドの存在ま
たは位置を容易に測定し得るための、レポーターポリペプチド（例えば、ルシフ
ェラーゼ）とタンパク質のセグメントまたはドメイン（例えば、レセプター結合
セグメント）との融合物である。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609号を参
照のこと。他の遺伝子融合パートナーは、細菌β−ガラクトシダーゼ、trpE、プ
ロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ
、および酵母のα接合因子を包含する。例えば、Godowskiら（1988）Science 24
1:812-816を参照のこと。
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または
他の部分（特にリン酸基と類似の分子形を有する部分）の付加または除去により
化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施態様では、改変は
有用な標識試薬であるか、または精製の標的（例えば、親和性リガンド）として
作用する。
本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化での変化以外のmpf4、mCTAP3
、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの誘導体の使用を意
図する。このような誘導体は、化学部分との共有結合または凝集会合を包含し得
る。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分類される：(1)塩、(2)側鎖およ
び末端残基の共有結合改変、および(3)例えば細胞膜との、吸着複合体。このよ
うな共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイにおけ
る試薬として、あるいは精製法（例えば、リガンドまたは他の結合リガンドの親
和性精製のための）において有用である。例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h
6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン抗原は、抗mpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン抗体またはそのレセプターのアッ
セイあるいは精製に使用するために、臭化シアン活性化SEPHAROSEのような固体
支持体への共有結合により、当該分野で周知の方法により固定化され得るか、あ
るいは、グルタルアルデヒド架橋結合を用いるか、または用いないで、ポリオレ
フィン表面に吸着され得る。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr1
9カインのケモカインはまた、検出可能な基で標識され得る。例えば、クロラミ
ンＴ手順により放射性ヨウ素化され、希土類キレートに共有結合され、または診
断的アッセイで使用するために別の蛍光部分と結合される。mpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの精製は、固定化抗体また
はレセプターにより行われ得る。
単離されたmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カイン遺伝子により、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイ
ンのケモカインに対応する発現を欠く細胞（例えば、対応するリガンドを欠きそ
してネガティブバックグラウンド活性を示す種の型または細胞）の形質転換が可
能になる。形質転換された遺伝子の発現により、規定されたまたは単一の種改変
体を用いて、抗原性が純粋な細胞株の単離が可能となる。このアプローチにより
、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインレセ
プタータンパク質の生理学的影響のより感度の高い検出および区別が可能になる
。亜細胞フラグメント（例えば、細胞質フラグメントまたは膜フラグメント）は
単離され、そして使用され得る。
X.使用
本発明は、本明細書中の他所に（例えば、発達異常についての一般的な記載に
おいて）、または以下に（診断用のキットの記載において）記載されるような診
断的適用における使用を見出す試薬を提供する。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインヌク
レオチド（例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイン
のケモカインDNAまたはRNA）は、法医学的アッセイで、成分として使用され得る
。例えば、提供されるヌクレオチド配列は、例えば、32Pまたはビオチンを使用
して標識され、標準的な制限フラグメント多様性ブロットをプローブするために
使用され、個人間の識別を補助する測定可能な特徴を提供する。そのようなプロ
ーブは、遺伝子のフィンガープリントのような周知の法医学技術において使用さ
れ得る。さらに、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカイン配列から作製されるヌクレオチドプローブは、染色体異常を検出する
ためにインサイチュアッセイで使用され得る。例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン遺伝子をコードするヒト染色体
における転位は、他の公知の染色体マーカーと結合したmpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインプローブを用いて、周知のイン
サイチュ技術を介して検出され得る。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインタン
パク質に対する抗体もしくは他の結合因子、または核酸は、対応するmpf4、mCTA
P3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン分子を精製するた
めに使われ得る。以下の実施例に記載されるように、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン
、
h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン成分の抗体精製は、可能であり、し
かも実行可能である。抗体および他の結合因子はまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン成分が組織サンプルまたは細胞
集団に存在するか否かを、本明細書中に記載した周知の技術を用いて決定する診
断様式においても使用され得る。mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、または
Chr19カインのケモカインへの結合因子に付与させる能力は、mpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの調節ミスに関連する障害
を診断するための手段を提供する。抗体および他のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h
6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン結合因子はまた、組織学的マーカー
としても有用であり得る。以下の実施例に記載されるように、mpf4、mCTAP3、m6
Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン発現は、特定の組織型に
限定される。抗体または核酸のようなプローブをmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6C
カイン、またはChr19カインのケモカインに対して指向させることにより、組織
および細胞型をインサイチュまたはインビトロで識別するプローブを使用するこ
とが可能である。
本発明はまた、顕著な治療的価値を有する因子を提供する。mpf4、mCTAP3、m6
Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン（天然に存在するまたは
組換え体）、そのフラグメント、およびそれに対する抗体は、mpf4、mCTAP3、m6
Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対する結合親和性を有
するとして同定された化合物とともに、異常な生理機能または発生（ガン症状ま
たは、退行性症状のような異常増殖を含む）に関連する症状の処置において有用
である。異常増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細書中に提供される組成物
を使用する適切な治療的処置により調整され得る。例えば、mpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインによる異常な発現または異
常なシグナリングに関連する疾患または障害は、このタンパク質のアゴニストま
たはアンタゴニストのための標的である。このタンパク質は、おそらく、神経ま
たは造血細胞（例えば、免疫学的応答に影響するリンパ球）の調節または発達に
おいて役割を担っているようである。
詳細には、h6Cカインのアンタゴニストは、Ｔ細胞媒介自己免疫性（例えば、
関節の炎症、器官／組織の炎症）についての可能性を有し得る。h6Cカインが二
次的リンパ器官（例えば、リンパ節、扁桃）において発現されるという事実は、
h6Cカインが、初期の炎症応答に関与する予備的分子であり得ることを示す。
他の異常な発生状態は、ノーザンブロット分析によってmpf4、mCTAP3、m6Cカ
イン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインmRNAを有すると示される細胞
タイプにおいて公知である。Berkow（編）The Merck Manual of Diagnosis and Therapy
，Merck & Co.，Rahway，NJ；およびThornらHarrison's Principles of Internal Medicine
，McGraw-Hill，NYを参照のこと。発生的または機能的異常（
例えば、神経系または免疫系の異常）は、本明細書中に提供される組成物を使用
する予防または処置に感受性であり得る、顕著な医学的異常および状態を生じる
。
特定のケモカインもまた、ウイルス複製機構と関連づけられている。例えば、
Cohen(1996)Science 272:809-810；Fengら（1996）Science 272:872-877；およ
びCocchiら（1995）Science 270:1811-1816を参照のこと。mpf4、mCTAP3、m6Cカ
イン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインは、同様な意味で有用であり
得る。あるいは、茎（stalk）構造が、リガンドドメインの提示に非常に重要で
あり得、そして他のケモカインはこの分子中のケモカインドメインについて有利
に置換され得る。
組換えmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンまたはmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ン抗体は、精製され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は治療的使用
のためにさらなる有効成分または不活性成分と、例えば、従来の薬学的に受容可
能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中で、生理学的に
無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。これらの組み合わせは
濾過滅菌され、そして凍結乾燥により用量バイアル中に、または安定化水性調製
物中の貯蔵物として用量形態にされ得る。本発明はまた、抗体またはその結合フ
ラグメント（補体結合でない形態を含む）の使用を意図する。
抗体もしくはレセプターまたはそのフラグメントを使用する薬物スクリーニン
グは、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン
に対する結合親和性を有する化合物を同定（会合成分の単離を含む）し得る。次
いで、その化合物が固有の刺激活性を有し、そしてそれゆえ、タンパク質の活性
をブロックするという点でブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうか決定
するために、次の生物学的アッセイが利用され得る。同様に、固有の刺激活性を
有する化合物はレセプターを活性化し得、そして従って、それがmpf4、mCTAP3、
m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの活性を刺激するとい
う点で、アゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしてのmpf4、mC
TAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対する抗体の
治療的使用を意図する。このアプローチは、他のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6C
カイン、またはChr19カインのケモカイン種変異体について特に有用であるはず
である。
効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存する。この因子は
、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、および投与される他の薬物(medic
ant)を包含する。従って、処置用量は、安全性および効力を最適化するために滴
定(titrate)されるべきである。代表的には、インビトロで使用される用量は、
これら試薬のインサイチュでの投与に有用な量について有用な手引きを提供し得
る。特定の障害の処置に効果的な用量の動物実験は、ヒトでの用量のさらなる予
測的な指標を提供する。以下には、種々の考察が記載されている：例えば、Gilm
anら（編）（1990）Goodman and Gimnan's:The Pharmacological Bases of Ther apeutics
（第８版）Pergamon Press；および(1990)Remington's Pharmaceutical Sciences
（第17版）Mack Publishing Co.，Easton PA。投与法は、それらの中
および以下で考察されている：例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、ま
たは筋肉内投与、経皮拡散など。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩
水、緩衝液、および例えば、Merck Index，Merck & Co.,Rahway，NJに記載され
た他の化合物を包含する。用量の範囲は通常、適切なキャリアを有して、１mM濃
度より低い量であり、代表的には約10μM濃度未満、通常約100nM未満、好ましく
は10pM（ピコモル濃度）未満、そして最も好ましくは約１fM（フェムトモル濃度
）未満であると予想される。徐放性処方物または徐放性装置が、連続的な投与に
しばしば利用される。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン、そ
のフラグメント、およびそれに対する抗体またはそのフラグメント、アンタゴニ
スト、およびアゴニストは、処置される宿主に直接投与され得るか、または、化
合物のサイズに依存して、それらの投与前にオボアルブミンまたは血清アルブミ
ンのようなキャリアタンパク質とそれらを結合させることが所望され得る。治療
的処方物は、多くの従来の用量処方物中で投与され得る。有効成分を単独で投与
することは可能であるが、治療的処方物としてそれを呈することが望ましい。処
方物は、上記で定義したように、その１以上の受容可能なキャリアとともに、代
表的には少なくとも１つの有効成分を包含する。それぞれのキャリアは、他の成
分に適合性であり、そして患者に対して有害でないという意味で薬学的および生
理学的の両方で受容可能であるべきである。処方物は、経口投与、直腸投与、鼻
投与、または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、および皮内投与
を包含する）に適切な処方物を包含する。処方物は、便宜的に単位用量形態で存
在し得、そして薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。例えば、Gilm
anら（編）(1990)Goodman およびGilmanの：The Pharmacological Bases of The rapeutics
，第８版、Pergamon Press;および(1990)Remington's pharmaceutical Sciences
，第17版、Mack Publishing Co.，Easton，PA;Avisら（編）(1993)Pha rmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker
，NY;Liebermanら（
編）(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker，NY;およびLieberman
ら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker，NY
を参照のこと。本発明の治療は、他の治療剤と併用されるかまたは関連して使用
され得る。
本発明のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカ
インの天然に存在する形態および組換えの形態の両方は、このタンパク質に対す
る結合活性について化合物をスクリーニングし得る、キットおよびアッセイ方法
に特に有用である。自動化アッセイのいくつかの方法は、短期間に多数の化合物
のスクリーニングを可能にするように近年開発されている。例えば、Fodorら（1
991）Science 251:767-773、および多数の化合物による結合親和性の試験のため
の手段を記載している他の化学多様性ライブラリーの記載を参照のこと。適切
なアッセイの開発は、本発明で提供される大量の精製された可溶性mpf4、mCTAP3
、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの利用可能性により
、非常に容易になり得る。
例えば、アンタゴニストは、一旦タンパク質が構造的に定義されれば、通常見
出され得る。潜在的なタンパク質アナログの試験は、精製されたレセプターを使
用する高度に自動化されたアッセイ法の開発により、現在可能である。特に、新
たなアゴニストおよび新たなアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニ
ング技術を使用することにより発見される。特に重要なものは、多数のmpf4、mC
TAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインレセプターに対
して組み合わせた結合親和性（例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、
またはChr19カインのケモカインの種変異体に対してアンタゴニストとして作用
し得る化合物）を有することが見い出された化合物である。
本発明は、特に、種々の薬物スクリーニング技術において、組換えタンパク質
を使用することにより化合物をスクリーニングするために有用である。特異的リ
ガンドのスクリーニングにおいて組み換えタンパク質を使用する利点は以下を含
む：（a）特定の供給源からの改善された再生可能なmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、
h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの供給源；（b）アッセイ中のノイ
ズとシグナルとの比率に改善を生じる潜在的により大きい細胞当たりのリガンド
数；および（c）種変異体特異性（理論的には、より大きい生物学的および疾患
特異性を生じる）。
薬物スクリーニングの一つの方法は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、
またはChr19カインのケモカインレセプター（例えば、6CカインについてのCXCR3
）を発現する組換えDNA分子で安定に形質転換した真核生物または原核生物宿主
細胞を利用する。他の細胞からの単離においてレセプターを発現する細胞が単離
され得る。そのような細胞は、生存しているかまたは固定された形態のいずれか
で、標準的なリガンド／レセプター結合アッセイのために使用され得る。細胞性
応答を検出する感受性の高い方法を記載する、Parceら(1989)Science 246:243-2
47;および0wickiら(1990)Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 87:4007-4011もまた参照
のこと。細胞（mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインの供給源）が、リガンドに対して公知の結合親和性を有する標識レセ
プターまたは抗体（例えば、125I-抗体）および結合組成物に対するその結合親
和性が測定される試験サンプルと接触させられ、そしてインキュベートされる競
合アッセイは、特に有用である。次いで、結合および遊離の標識された結合組成
物は、リガンド結合の程度を評価するために分離される。結合した試験化合物の
量は、公知の供給源に結合する標識レセプターの量に反比例する。多数の技術の
任意の１つが、リガンド結合の程度を評価するために遊離のリガンドから結合リ
ガンドを分離するために使用され得る。この分離工程は、代表的には、フィルタ
ーへの結合の後の洗浄、プラスチックへの結合後の洗浄、または細胞膜の遠心分
離のような手順を含み得る。生存している細胞もまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン媒介性機能（例えば、二次メッ
センジャーレベル、すなわち、Ca++；細胞増殖；イノシトールリン酸プールの変
化；など）への薬物の効果をスクリーニングするために使用され得る。例えば、
近接感受性検出系のようないくつかの検出方法は、分離工程の省略を可能にする
。カルシウム感受性染色は、蛍光測定器または、蛍光細胞分別装置でCa++レベル
を検出するために有用である。
6Cカイン−CXCR3リガンドレセプター対はまた、他のCXCR3リガンドを同定する
ためのポジティブコントロールとして使用され得る。例えば、CXCR3は、固体支
持体（例えば、チップ、アフィニティーカラム中のビーズ、マイクロタイタープ
レートウェル）に結合され得る。潜在的なリガンドを含む未知のサンプルは、レ
セプターとともにインキュベートされる。6Cカインは、別々のサンプルにおいて
同様に処理される。結合親和性は、上記のように測定され、そして6Cカインに対
して比較される。同様に、CXCR3を発現する細胞（この細胞は、リガンド結合に
生物学的に応答する）は、アッセイされ得、そして応答は6Cカイン誘導活性に対
して比較される。
別の方法は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケ
モカイン供給源として、形質転換した真核生物または原核生物宿主細胞由来の膜
を利用する。これらの細胞は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカイン（例えば、操作された膜結合型形態）の発現を指向するD
NAベクターで安定に形質転換される。本質的に、膜は、細胞から調製され、そし
て上述の競合アッセイのようなレセプター／リガンド結合アッセイにおいて使用
される。
なお、別のアプローチは、形質転換した真核生物または原核生物宿主細胞由来
の、可溶化した未精製のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインまたは可溶化し精製したmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン
、またはChr19カインのケモカインを使用することである。このことは、増大し
た特異性、自動化する能力、および高い薬物試験スループットの利点を有する「
分子」結合をアッセイを可能にする。
薬物スクリーニングのための別の技術は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイ
ン、またはChr19カインのケモカイン抗体に対する適切な結合親和性を有する化
合物について高スループットスクリーニングを提供するアプローチに関与する。
そして、1984年９月13日発行のGeysen、欧州特許出願第84/03564号に詳細に記載
される。第一に、多数の異なる小さいペプチド試験化合物が固体支持体上（例え
ば、プラスチックピンまたは他のいくつかの適切な表面、Fodorら、上述を参照
のこと）で合成される。次いで、すべてのピンは、可溶化された未精製のmpf4、
mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン抗体、または
可溶化され精製されたmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カイ
ンのケモカイン抗体と反応させられ、そして洗浄される。次の工程は結合したmp
f4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン抗体を検
出する工程を含む。
合理的な薬物の設計はまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカインおよび他のエフェクターまたはアナログの分子の形態の
構造的研究に基づき得る。例えば、Methods in Enzymology第202巻および第203
巻を参照のこと。エフェクターは、リガンド結合に応答して他の機能を媒介する
他のタンパク質、または通常はレセプターと相互作用する他のタンパク質であり
得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定する１つの手段
は、物理的な構造決定（例えば、Ｘ線結晶学または２次元NMR技術）である。こ
れらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての手引きを提供
する。タンパク質の構造決定の詳細な記載については、例えば、Blundellおよび
Johnson（1976）Protein Crystallography，Academic Press，NYを参照のこと。
精製されたmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモ
カインは、前述の試薬スクリーニング技術における使用のためにプレートに直接
コートされ得る。しかし、これらのリガンドに対する非中和抗体は、それぞれの
リガンドを固相に固定化する捕獲抗体として使用され得る。
XI．キット
本発明はまた、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、もしくはChr19カイン
のケモカインまたはmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、もしくはChr19カイ
ンのケモカインレセプターの存在を検出するための種々の診断キットおよび方法
におけるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンタンパク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を
意図する。代表的には、キットは、定義されたmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカ
イン、またはChr19カインのケモカインペプチドまたは遺伝子セグメント、ある
いはどちらか一方を認識する試薬（例えば、レセプターフラグメントまたは抗体
）のいずれかを含む区画を有する。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対
する試験化合物の結合親和性を測定するためのキットは、代表的には、試験化合
物；標識化合物（例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19
カインのケモカインに対して既知の結合親和性を有するレセプターまたは抗体）
；mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの供
給源（天然に存在するかまたは組換え体）；およびmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h
6Cカイン、またはChr19カインのケモカインを固定化するための固相のような、
遊離の標識化合物から結合標識化合物を分離するための手段を含有する。一旦化
合物がスクリーニングされると、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、または
Chr19カインのケモカインに対する適切な結合親和性を有する化合物が、それら
がレセプターに対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか否かを
決定するために、当該分野で周知のような、適切な生物学的アッセイで評価され
得る。組換えmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインポリペプチドの利用可能性は、そのようなアッセイを較正するための
良く規定された標準をまた提供する。
例えば、サンプル中のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カ
インのケモカインの濃度を測定するための好ましいキットは、代表的には、標識
化合物（例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインに対する既知の結合親和性を有するレセプターまたは抗体）、mpf4、
mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの供給源（天
然に存在するかまたは組換え体）、および遊離の標識化合物から結合標識化合物
を分離するための手段（例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、または
Chr19カインのケモカインを固定化するための固相）を含有する。試薬および説
明書を含む区画が、通常提供される。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまた
はリガンドフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメントを包含する抗体は、
mpf4、m1CTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインおよび
／またはそのフラグメントの上昇したレベルの存在を検出するための診断的適用
に有用である。このような診断的アッセイは、溶解物、生細胞、固定化細胞、免
疫蛍光、細胞培養物、体液を用い得、そしてさらに血清などの中のリガンドに関
連する抗原の検出を包含し得る。診断アッセイは、等質（遊離の試薬と抗原−mp
f4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイン複合体と
の間の分離工程を有しない）または異質（分離工程を有する）であり得る。ラジ
オイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素イムノアッセ
イ(EIA)、酵素増幅イムノアッセイ技術(EMIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SL
FIA)などのような種々の市販のアッセイが存在する。例えば、未標識抗体は、第
２の抗体を使用することにより用いられ得、この第２の抗体は標識され、そして
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインまたは
その特定のフラグメントに対する抗体を認識する。類似のアッセイがまた、文献
で広範に考察されている。例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Lab
oratory Manual，CSH Press，NY;Chan(編)(1987)Immunoassay:A Practical Guid
e Academic Press，Orland，FL;PrlceおよびNewman(編)（1991）Principl
es and Practice of Immunoassay Stockton Press，NY;およびNgo(編)（1988）N
onisotopic Immunoassay Plenum Press，NYを参照のこと。
抗イディオタイプ抗体は、種々の異常な状態の徴候であり得るmpf4、mCTAP3、
m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対する抗体の存在を
診断するための類似の使用を有し得る。例えば、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6C
カイン、またはChr19カインのケモカインの過剰産生により、種々の免疫学的ま
たは他の医学的応答を生じることになり得、この応答は、異常な生理状態（例え
ば、細胞増殖、活性化、または分化において）の徴候であり得る。
しばしば、診断アッセイのための試薬が、アッセイの感度を最適化するように
キット中に供給される。本発明のために、アッセイ、プロトコル、および標識の
性質に依存して、標識もしくは未標識抗体もしくはレセプター、または標識mpf4
、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインのいずれか
が提供される。これは通常、緩衝液、安定化剤、酵素の基質のようなシグナル生
成に必要な物質などのような他の添加剤に関連する。好ましくは、キットはまた
、適切な使用および使用後の内容物の処分のための説明書を含む。代表的には、
キットはそれぞれの有用な試薬のための区画を有する。望ましくは、試薬は、乾
燥した凍結乾燥粉末として提供され、ここで、試薬は水性の媒体中で再構成され
得、アッセイを行うために適当な濃度の試薬を提供し得る。
薬物スクリーニングアッセイおよび診断アッセイの前述の成分の多くは、改変
せずに使用され得るか、または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、直
接または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分に、共有結合的にまたは非
共有結合的に連結することにより達成され得る。これらのアッセイの任意のもの
において、タンパク質、試験化合物、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、ま
たはChr19カインのケモカイン、またはそれらに対する抗体が、直接または間接
のいずれかで標識され得る。直接標識の可能性は、以下の標識グループを包含す
る：125Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファター
ゼのような酵素（米国特許第3,645,090号）、および蛍光強度、波長シフト、ま
たは蛍光偏光の変化をモニターし得る蛍光標識（米国特許第3,940,475号）。間
接標識の可能性には、１成分のビオチン化とそれに続く上記の標識群の１つに結
合
したアビジンへの結合が含まれる。
遊離のリガンドから結合リガンドを分離する、あるいは、遊離の試験化合物か
ら結合試験化合物を分離する多数の方法もまた存在する。mpf4、mCTAP3、m6Cカ
イン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインは、種々のマトリックスに固
定化され得、続いて洗浄され得る。適切なマトリックスには、ELISAプレート、
フィルター、およびビーズのようなプラスチックが含まれる。mpf4、mCTAP3、m6
Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインをマトリックスに固定化
する方法には、プラスチックへの直接結合、捕獲抗体の使用、化学的カップリン
グ、およびビオチン−アビジンが含まれるがこれらに限定されない。このアプロ
ーチの最後の工程は、例えば、ポリエチレングリコールのような有機溶媒または
硫酸アンモニウムのような塩を利用する方法を包含する任意のいくつかの方法に
よるリガンド／レセプターまたはリガンド／抗体複合体の沈降を包含する。他の
適切な分離技術には、Rattleら（1984）Ciln ．Chem．30:1457-1461に記載される
フルオレセイン抗体磁化粒子法、および米国特許第4,659,678号に記載のような
２重抗体磁性粒子分離が含まれるが、これらに限定されない。
種々の標識にタンパク質またはそれらのフラグメントを連結する方法は、文献
で広範に報告されており、ここでは詳細に考察する必要はない。技術の多くは、
カルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用を介してのペプチド結合の
形成のための活性化カルボキシル基の使用、連結のためのメルカプト基と活性化
ハロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフィン（例えば、マレイ
ミド）との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はま
た、これらの適用における使用が見出され得る。
本発明の別の診断的局面は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはCh
r19カインのケモカインの配列から得られたオリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチド配列の使用を包含する。これらの配列は、天然の供給源由来、または異
常な状態（例えば、ガンまたは発達の問題）を有すると疑われる患者由来のサン
プル中のmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカイ
ンメッセージのレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAおよ
びDNAヌクレオチド配列の両方の調製、配列の標識、および配列の好ましいサイ
ズは、文献中に充分記載および考察されている。標準的には、オリゴヌクレオチ
ドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常は、少なくとも約18ヌクレオ
チドを有すべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブは、数kbまでであり得
る。種々の標識、最も一般的には放射性核種、特に32Ｐが用いられ得る。しかし
、ポリヌクレオチドに導入するためのビオチン改変ヌクレオチドの使用のような
他の技術もまた用いられ得る。次いで、ビオチンがアビジンまたは抗体への結合
のための部位として作用し、これは、広範な種々の標識（例えば、放射性核種、
蛍光団（fluorophore）、酵素など）で標識され得る。あるいは、特定の２本鎖
（DNA２本鎖、RNA２本鎖、DNA−RNAハイブリッド２本鎖、またはDNA−タンパク
質２本鎖を含む）を認識し得る抗体が用いられ得る。次いで、抗体が標識され得
、そしてアッセイが行われる。ここで、２本鎖は表面に結合され、そして表面で
の２本鎖の形成により２本鎖に結合する抗体の存在が検出され得る。新規なアン
チセンスRNAに対するプローブの使用は、多くの従来技術（例えば、核酸ハイブ
リダイセーション(スクリーニングを含むか含まない)、組換えプローブ(recombi
national probing)、ハイブリッド放出翻訳(hybrid release translation)(HRT)
、およびハイブリッド停止翻訳(hybrid arrested translation)(HART)）で実行
され得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅技術を包含す
る。
これらおよび他のマーカーの質的存在または量的存在を試験する診断キットも
また意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多数の指標の組
み合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み合わせを試験し得る
。例えば、Vialletら（1989）Progress in Growth Factor Res ．1:89-97を参照
のこと。各ケモカインの定性的および定量的発現は、タンパク質またはmRNAレベ
ルで標準的な方法によって評価され得る。
XII．レセプター単離
特異的相互作用のリガンド結合パートナーが単離されれば、対のパートナーを
単離するための方法が存在する。Gearingら、(1989)EMBO J ．8:3667-3676を参照
のこと。例えば、そのレセプターへの結合に干渉せずにmpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインを標識する手段が決定され得
る。例えば、親和性標識またはエピトープタグがリガンドのアミノ末端またはカ
ルボキシル末端のいずれかに融合され得る。発現ライブラリーが、例えば、細胞
選別により、またはそのような結合成分を発現するサブ集団を検出するための他
のスクリーニングにより、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19
カインのケモカインの特異的結合についてスクリーニングされ得る。例えば、Ho
ら（1993）Proc ．Nat'l Acad．Sci.USA 90:11267-11271を参照のこと。あるいは
、パニング法が使用され得る。例えば、SeedおよびAruffo（1987）Proc ．Nat'l Acad．Sci.USA
84:3365-3369を参照のこと。ツーハイブリッド選択系はまた、入
手可能なケモカイン配列で適切な構築物を作製するのに適用され得る。例えば、
FieldsおよびSong(1989)Nature 340:245-246を参照のこと。標準的なCa++流動法
もまた利用され得る。例えば、Coliganら、（編）(1992および定期的補充物)Cur
rent Protocols in Immunology Greene/Wiley，New York，NYを参照のこと。
標識物によるタンパク質架橋技術は、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、
またはChr19カインのケモカインの結合パートナーを単離するために適用され得
る。これは、例えば、リガンドーレセプター様様式においてmpf4、mCTAP3、m6C
カイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインと特異的に相互作用するタ
ンパク質の同定を可能にする。代表的には、ケモカインファミリーは、７回膜貫
通レセプターファミリーのレセプターに結合し、そしてmpf4、mCTAP3、m6Cカイ
ン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインについてのレセプターは、おそ
らく、類似の構造を示す。従って、そのような膜タンパク質をリガンド結合能を
示し得るような形態で発現し得る系における発現によってレセプターが見い出さ
れるようである。
本発明の広い範囲は、以下の実施例を参考にして最も良く理解されるが、これ
は、特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。
実施例
Ｉ．一般的方法
以下の多くの標準的な方法を、例えば、Maniatisら、（1982）Molecular Clon i ng ，A Laboratory Manual
Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbo
r Press，NY；Sambrookら、（1989）Molecular Clonlng:A Laboratory Manual（
第２版）第1〜3巻、CSH Press、NY；Ausubelら、Biology Greene Publishing As
sociates、Brooklyn、NY；またはAusubelら、（1987および補遺）Current Proto cols in Molecular Biology
Wiley/Greene、NY；Innisら（編）(1990)PCR Proto cols:A Guide to Methods and Applications
Academic Press，NYに記載される
かまたは参照されている。タンパク質精製方法は、硫安沈澱、カラムクロマトグ
ラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化、およびその他の方法を包含する。例え
ば、Ausubelら、(1987および定期補遺)；Deutscher(1990)、「タンパク質精製の
ガイド」、Methods in Enzymology、第182巻およびこのシリーズの他の巻；およ
びタンパク質精製産物の使用法に関する製造者の著述、例えばPharmacia，Pisca
taway，NJ、またはBio-Rad，Richmond，CAを参照のこと。組換え技術と組み合わ
せることで、適切なセグメント（エピトープタグ）（例えばＦLAG配列または融
合し得る等価物）との融合が、例えばプロテアーゼ除去可能配列を介して可能に
なる。例えば、以下の文献を参照のこと：Hochuli(1989)、Chemische Industrie
、12:69-70；Setlow（編）Genetic Engineering ，Prinicple and Methods 12:87
-98、Plenum Press、NY中のHochuli(1990)、「金属キレート吸収剤を用いた組換
えタンパク質精製」；およびCroweら(1992)、QIAexpress ：The High Level Expr ession & Protein Purification System
QIAGEN、Inc.、Chatsworth、CAを参照
のこと。
標準的な免疫技術は、例えば、Coligan(1991)、Current Protocols in Immuno logy
、Wiley/Greene、NY；およびMethods in Enzymology、70，73，74，84，92
，93，108，116，121，132，150，162,および163巻に記載されている。神経細胞
の生物学的活性についてのアッセイは、例えば、Wouterlood（編、1995）、Neur oscience Protocols
modules10、Elsevier；Methods in Neurosciences Academi
c Press；およびNeuromethods Humana Press，Totowa，NJに記載されている。発
生系についての方法論は、例えば、Meisami（編）、Handbook of Human Growth and Developmental Biology
CRC Press；およびChrispeels（編）、Molecular T echniques and Approaches in Developmental Biology
Interscienceに記載され
ている。
FACS分析は、Melamedら(1990)、Flow Cytometry and Sorting Wiley-Llss，In
c.，New York，NY；Shapiro(1988)、Practical Flow Cytometry Liss、New York
，NY；およびRobinsonら(1993)、Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-L
iss，New York，NYに記載されている。
II.mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインクロ
ーンの単離
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインをコ
ードするクローンを、多くの異なる可能な方法によって天然供給源から単離する
。本明細書中でその配列を提供するところのPCRプライマーまたはハイブリダイ
ゼーションプローブを選択および／または構築して、ゲノムDNAセグメントまた
はcDNA逆転写産物のいずれかを単離する。適切な細胞供給源には、列挙される組
織（例えば、脳のライブラリー）が含まれる。以下の組織分布もまた、供給組織
を示唆する。遺伝的な、および多形性または対立遺伝子の改変体を、個体集団の
スクリーニングによって単離する。
PCRを基礎とした検出を標準的な方法（コード配列の反対の末端からのプライ
マーを用いるのが望ましいが、特定の目的のために隣接するセグメントを選択し
得る）で実施する。
あるいは、ハイブリダイゼーションプローブを選択する。プローブの特定のAT
またはGC含量を、推定した相同性および推定ミスマッチングに依存して選択する
。適切なストリンジェントな条件を選択して、バックグラウンドの割合と、適切
なポジティブシグナルとの均衡をとる。連続した洗浄工程を用いて、より相同的
なクローンを集める。
さらなるクローンを、抗体を基礎とした選択手順を用いて単離する。標準的な
発現クローニング方法（例えば、膜結合発現産物のFACS染色を含む）を適用する
。抗体を使用して、認識タンパク質を生産するクローンを同定する。あるいは、
抗体を使用して、mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインの
ケモカインを精製する（タンパク質配列決定およびそのタンパク質をコードする
遺
伝子を単離する標準的な手段を用いて）。
ゲノム配列を基礎とする方法もまた、天然に利用可能な、さもなくば、提供さ
れた配列と相同性を示す配列の同定を可能にする。
III.mpf4、mCTAP3、6Cカイン、またはChr19カインのケモカインクローンの霊長
類対応物単離
上記と同様の方法を用いて別の霊長類から適切な霊長類ケモカイン遺伝子を単
離する。上記のような、同様な供給源材料を用いて、遺伝的な、多形性の、対立
遺伝子の、または種変異体を含む天然遺伝子を単離する。他の種変異体もまた、
類似の方法を用いて単離する。あるいは、遺伝子データベースを適切なモチーフ
について検索し得る。
IV.齧歯類pf4、CTAP3、6Cカイン、またはChr19カインのケモカインクローンの単
離
適切な齧歯類供給源（例えば、ラット、ハムスターなど）を、上記のように選
択する。同様の方法を利用して変種を単離するが、類似性のレベルは、ヒトと他
の霊長類の配列に比べると齧歯類ケモカインの配列は概して低い。
V.発現；精製；特徴付け
上記からの適切なクローンを用いて、コード配列を適切な発現ベクターに挿入
する。これは、原核生物、酵母、昆虫、またはより高等な脊椎動物、例えば、哺
乳動物の発現系のために特異的に選択されたベクター中であり得る。標準的な方
法を適用して遺伝子産物（好ましくは、可溶性の分泌分子）を産生するが、特定
の場合においては、細胞内タンパク質としてもまた生成される。細胞内タンパク
質は、代表的にはタンパク質を修復するための細胞溶解を要し、そして不溶性の
封入体はさらなる精製のための一般的な出発材料である。
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインをコ
ードするクローンを用いて、組換え生産手段を使用する（しかし、天然の形態は
適切な供給源から精製され得るが）。タンパク質産物を、タンパク質精製の標準
的な方法によって精製し、特定の場合においては、例えば、免疫親和法と組み合
わせる。免疫親和法を、上記のように、精製工程として、または、タンパク質の
分離特性を決定するための検出アッセイとしてのいずれかで用いる。
好ましくは、タンパク質を培養液中に分泌させ、そして可溶性産物を溶解形態
で培養液から精製する。あるいは、上記のように、原核生物発現系由来の封入体
は材料の有用な供給源である。代表的には、不溶性タンパク質は封入体から溶解
し、そして標準的な方法を用いてリフォールディングされる。精製方法を上記の
通りに開発する。
上記の精製方法の産物を、多くの構造的特徴を決定するために特徴付けする。
標準的な物理的方法を適用する（例えば、アミノ酸分析およびタンパタ質の配列
決定）。得られたタンパク質をCD分光検査および他の分光分析法、例えば、NMR
、ESR、質量分光検査等に供する。産物を特徴付けし、その分子形態および大き
さを決定する（例えば、ゲルクロマトグラフィーおよび同様の技術を用いて）。
クロマトグラフィーの特性の理解は、より穏やかな、または効率的な精製方法を
導く。
グリコシル化部位の予測は、例えば、Hansenら、（1995）Biochem.J．308:801
-813に報告されたように行い得る。
VI.mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインに対
する抗体の調製
例えば、上記のように発現のためのDNA、または産生されるタンパク質を用い
て、動物を免疫化して抗体を生産させる。ポリクローナル抗血清を、非精製抗原
を用いて作るが、得られた血清はより高いバックグラウンドレベルを示す。好ま
しくは、標準的なタンパク質精製技術（例えば、上記のポリクローナル血清を用
いたアフィニティークロマトグラフィー）を用いて、抗原を精製する。特異的な
抗体の存在を、規定された合成ペプチドフラグメントを用いて検出する。
ポリクローナル血清を、精製された抗原（上記の通りに精製されるか、または
例えば、複数の合成ペプチドを用いて）に対して産生する。全ての全長の配列を
含む一連の重複する合成ペプチドは、動物に存在するならば、タンパク質にほと
んどの線状エピトープを認識する血清を生産する。このような抗血清を用いて、
別の抗血清調製物を生産するためにインタクトの全長タンパク質を別の動物に導
入するために使用されるタンパク質を親和性で精製する。
同様の技術を用いて、非精製抗原、または、好ましくは、精製された抗原に対
する誘導性モノクローナル抗体を生成する。
VII.細胞および組織の分布
タンパク質または遺伝子産物の分布を決定する（例えば、上記で産生した抗体
因子を用いた免疫組織化学を用いるか、またはケモカインをコードする核酸につ
いてのスクリーニングによって）。ハイブリダイゼーションまたはPCR法のいず
れかを用いて、DNA、cDNA、またはメッセージ内容物を検出する。組織化学は、
より高いかまたは低いレベルのメッセージまたはDNAを発現する組織内の特異的
な細胞型の決定を可能にする。抗体技術は、液体または組織サンプルを含む生物
サンプル中のタンパク質を定量するのに有用である。タンパク質を定量するため
に、イムノアッセイを行う。さらに、FACS分析は、細胞集団における発現を評価
するために使用され得る。
VIII.マイクロ走化性アッセイ
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの前
走化性活性(pro-migratory activity)を、マイクロ走化性アッセイにおいて評価
している。例えば、Baconら（1988）、Br ．J．Pharmacol．95:966-974を参照の
こと。
ケモカインはまた、例えば、H.Broxmeyerによって記載されるような造血アッ
セイにおいて活性についてアッセイされ得る。それらは、例えば、R.Streiterに
よって記載されるような血管形成活性についてアッセイされ得る。
IX．生物学的活性（直接および間接）
確立され、そして感度の高いアッセイを上記のように選択する（例えば、免疫
細胞、ニューロンの細胞、または幹細胞において）。ケモカインを漸増用量でア
ッセイに添加し、用量応答が検出されるかを見る。例えば、増殖アッセイでは、
細胞をプレート中から取り出す。適切な培地を提供し、そして種々の量のケモカ
インを細胞に添加する。増殖を一定の時間モニターリングし、ケモカインが細胞
に直接的に影響するのか、間接的に影響するのかを検出する。
あるいは、活性化アッセイまたは誘引アッセイを用いる。以下の適切な細胞型
を選択する。例えば、造血細胞、骨髄性細胞（マクロファージ、好中球、多形核
性細胞など）、またはリンパ性細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞）、神経
細胞（ニューロン、神経膠細胞、乏突起神経膠細胞、星状細胞など）、または幹
細胞（例えば、他の細胞型に分化する親細胞（例えば、腸陰窩細胞））、および
未分化の細胞型）である。
その他のアッセイは他のケモカインで実証されてきたものである。例えば、Sc
hallおよびBacon（1994）Current Opinion in Immunology 6:865-873;およびBac
onおよびSchall（1996）Int ．Arch．Allergy & Immunol．109:97-109を参照のこ
と。短縮茎構造の影響を同様に評価し得る。
Ｘ．構造活性の関係
特定の残存物の臨界についての情報を、標準的な手順および分析を用いて測定
した。標準的な変異誘発分析を、実施した（例えば、多くの異なる改変体を決定
した位置で（例えば、上記で識別された位置で）生成することによって、および
改変体の生物学的活性を評価することによって）。これは、活性を改変する位置
を決定する程度で、または、生物学的活性を保持、阻害、もしくは調節するため
に置換され得る残存物を決定するために、特異的位置に焦点を当てるために実施
され得る。
あるいは、天然の改変体の分析は、どの位置が天然の変異に耐えるかを示し得
る。これは、個体間の、または異なる株または種間での改変の集団分析から得ら
れ得る。選択された個体由来のサンプルを分析する（例えば、PCR分析および配
列決定法により）。これは、集団多形性の評価を可能にする。
ＸI．アゴニスト／アンタゴニストについてのスクリーニング
アゴニストまたはアンタゴニストを、生物学的活性を誘導するかまたは阻害す
るための能力についてスクリーニングする。候補化合物（例えば、天然のmpf4、
mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの配列改変体
）を、それらの生物学的活性についてアッセイする。あるいは、化合物を単独で
、または組み合わせてスクリーニングし、生物学的活性に対する影響を決定する
。
XII．mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインの
レセプターの単離
mpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインは、
抗体が使用されるのと同様に、その結合の特異性を利用して、その結合パートナ
ーを同定するための特異的結合試薬として使用され得る。結合試薬は、上記のよ
うに（例えば、蛍光または他の方法で/様式で）標識されるか、またはパニング
法の基質に固定化されるかのいずれかである。代表的なケモカインレセプターは
、７回膜貫通レセプターである。
結合組成物（例えば、ケモカイン）を使用して、結合パートナー（つまり、
レセプター）を発現する細胞株から作製された発現ライブラリーをスクリーニン
グする。標準的な染色技術を用いて、細胞内もしくは表面発現レセプターを検出
または分類するか、または、表面で発現する形質転換された細胞をパニングによ
りスクリーニングする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色または免疫
蛍光手順により実施する。McMahanら（1991）EMBO J ．102821-2832もまた参照の
こと。
標準的なCa++流動プロトコル（例えば、Coliganら、(編)(1992および定期的補
遺)Current Protocols in Immunol．Greene/Wiley，New York，NYを参照のこと
）を用いて、m6CカインのレセプターがCXCケモカインレセプター（CXCR3と命名
）であることが見出された。このレセプターは、強力な血管抑制（angiostatic
）特性および抗肺瘍特性を保有するケモカインであるIP-10およびMigと共有され
る。例えば、Keaneら、（1997）J.Immunol．159:1437-1443;およびFarber（1997
）J.Leukoc.Biol．61:246-257を参照のこと。
例えば、０日目に、２−チャンバーパーマノックススライドを１チャンバー当
たり1mlのフィブロネクチン（PBS中に10ng/ml）を用いて、室温で30分間プレコ
ートする。PBSで１回リンスする。次いで、１チャンバー当たり2〜3×105細胞の
COS細胞を1.5mlの増殖培地中に播種する。一晩37℃でインキュベートする。
各サンプルの１日目に、66μg/mlDEAE-デキストラン、66μMクロロキノン、お
よび無血清DME中の4μgのDNAの0.5mlの溶液を調製する。各セットについて、ポ
ジティブコントロール（例えば、１および1/200希釈のヒトmpf4、mCTAP3、m6Cカ
イン、h6Cカイン、またはChr19カインのケモカインcDNAの）、およびネガティヴ
模倣物を調製する。細胞を無血清DMEでリンスする。DNA溶液を添加し、そして37
℃で5時間インキュベートする。培地を除去し、そしてDME中の10％DMSOを0.5ml
、2.5分間添加する。DMEで、除去し、そして１回洗浄する。1.5mlの増殖培地を
添加し、そして一晩インキュベートする。
２日目に、培地を交換する。３日目または４日目に、細胞を固定し、そして染
色する。細胞をハンクスの緩衝生理食塩水（HBSS）で２回リンスし、そして４％
のパラホルムアルデヒド（PFA）／グルコース中で５分間固定する。HBSSで３回
洗浄する。スライドガラスを、全液体を除去した後、-80℃で保存し得る。各チ
ャンバーにつき、以下のように0.5mlのインキュベーションを実施する。32μl/m
lの1M NaN3を有するHBSS／サポニン（0.1％）を、20分間添加する。次いで細胞
を、HBSS／サポニンで１回洗浄する。ケモカインまたはケモカイン／抗体複合体
を細胞に添加し、そして30分間インキュベートする。細胞を、HBSS／サポニンで
２回洗浄する。適切な場合には、一次抗体を30分間添加する。２次抗体、例えば
、Vector抗マウス抗体を、1/200希釈で添加し、そして30分間インキュベートす
る。ELISA溶液（例えば、Vector Elite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液）
を調製し、そして30分間前インキュベートする。2.5mlのHBSS／サポニン当たり
、例えば一滴の溶液A（アビジン）および一滴の溶液Ｂ（ビオチン）を用いる。
細胞を、HBSS／サポニンで２回洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、30分間インキ
ュベートする。細胞を、HBSSで２回洗浄し、２回目の洗浄を２分間にし、細胞を
閉じさせる。次いで、Vectorジアミノ安息香酸（DAB）を５〜10分間添加する。5
mlのガラス蒸留水当たり、２滴の緩衝液と、４滴のDABと、２滴のH2O2を
用いる。注意深くチャンバーを除去し、そして水中でスライドをリンスする。数
分間のエアードライの後に、一滴のCrystal Mountを添加し、そしてカバーガラ
スをかける。85〜90℃で５分間焼き付ける。
プールのポジティブな染色を評価し、その結合を担う単一遺伝子の単離のため
に段階的にサブクローンする。
あるいは、ケモカイン試薬を用いて、レセプターを発現する細胞を親和性で精
製または選抜する。例えば、Sambrookら、またはAusubelらを参照のこと。
もう一つの戦略は、パニングにより膜結合レセプターをスクリーニングするこ
とである。レセプターcDNAを上記のように構築する。リガンドを固定し得、そし
て発現している細胞を固定するのに用いられ得る。固定は、例えば、ケモカイン
融合構築物のFLAG配列を認識する適切な抗体を用いることにより、または１次抗
体に対して産生した抗体を用いることにより達成され得る。選択および増幅の再
帰的サイクルから、適切なクローンの富化およびレセプター発現クローンの最終
的な単離が導かれる。
ファージ発現ライブラリーを、ケモカインによってスクリーニングし得る。適
切な標識技術（例えば、抗FLAG抗体）は、適切なクローンの特異的標識を可能に
する。
XIII．免疫組織化学的局在化
上記の抗体は、種々の組織におけるmpf4、mCTAP3、m6Cカイン、h6Cカイン、ま
たはChr19カインの発現を同定するために使用される。免疫組織化学的染色法は
、例えば、Sheehanら、(編)(1987)Theory and Practice of Histotechnology，B
attelle Press，Columbus，OHに記載される。
本明細書中で引用された全参考文献は、それぞれ個々の公開または特許出願が
詳細に、そして全ての目的のためにその全体が参考として援用されることを個々
に表示するように同じ範囲にまで、本明細書中で参考として援用される。
本発明の多くの改変および変更が、本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく、当業者に明らかなように行われ得る。本明細書中に記載された特定の実施
態様は、例示のためのみに提供され、そして本発明は、このような請求の範囲が
権利を与えられた等価物の全範囲とともに、添付された請求の範囲によってのみ
制限される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21
1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02
5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ
(31)優先権主張番号 ６０／０５８，００７
(32)優先日 平成９年８月28日(1997．8．28)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，
ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｇ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ
，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，
ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ
Ｔ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ