KR20000057278A - 포유류 케모킨 - Google Patents

Abstract

본원에는 사람으로부터의 신규의 CC 케모킨; 정제된 단백질을 포함한, 이와 관련된 시약; 특이적 항체; 및 이들 케모킨을 암호화하는 핵산이 제공된다. 또한, 이러한 시약의 제조 방법 및 사용 방법, 및 진단용 키트가 제공된다.

Description

포유류 케모킨{Mammalian chemokines}

본 출원은 미국 가(provisional) 특허원 제60/031,805호(1996. 11. 27.); 및 미국 실용신안 출원 제08/761,071호(1996. 12. 5.) 및 모랄레스(Morales) 등에 의한 출원(1997. 10. 24.)을 우선권의 기초로 주장하고 있으며, 이들 각각이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다.

포유류 순환 시스템의 순환 성분에는 적혈구성 및 골수성 세포 계열의 적혈구와 백혈구를 포함한, 각종 세포 유형이 포함된다[참조: Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2d ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl(1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA; and Paul(ed.)(1993) Fundamental Immunology (3d ed.) Raven Press, N.Y.].

이전에는, 포유류 면역 반응이 "면역 네트워크"라 불리우는 일련의 복합적인 세포내 상호작용에 의하는 것으로 공지되었다. 최근의 연구 조사 결과, 이러한 네트워크의 내부 작용에 대해 새롭게 통찰하게 되었다. 사실상, 이러한 반응의 상당 부분이 임파구, 대식구, 과립구 및 기타 세포의 상기 네트워크-유사 상호작용을 중심으로 일어난다는 것이 명백하므로, 현재 면역학자들은 대체로, 림포킨, 사이토킨 또는 모노킨으로서 공지된 가용성 단백질이 이들 세포내 상호작용을 조절하는데 있어서 결정적인 역할을 한다는 견해를 고수하고 있다. 따라서, 세포 조절성 인자를 분리하고, 이의 특징을 확인하고 작용 기전을 파악하는 것은 상당히 중요한 일이며, 이러한 것을 정확히 이해함으로써, 수 많은 의학적 비정상, 예를 들면, 면역 시스템등의 장애를 진단 및 치료하는데 있어서 상당한 진전을 가져올 수 있다.

림포킨은 각종 방식으로 세포내 활성을 명백히 매개한다. 이들은, 다능성 조혈 간(stem) 세포가 복잡한 면역 시스템을 구성하는 다양한 세포 계열을 포함하는 수 많은 원종(progenitor)으로 증식, 성장 및 분화되는 것을 지원해주는 것으로 밝혀졌다. 이러한 세포내 성분들 간의 상호작용은 건강한 사람의 면역 반응에 필요한 것이다. 이들 상이한 세포 계열들은 종종, 림포킨이 다른 제제와 연계해서 투여되는 경우에 상이한 방식으로 반응하게 된다.

케모킨은 크고 광범위한 슈퍼 계열(superfamily)의 단백질이다. 이러한 슈퍼 계열은 케모킨 모티브에서의 처음 2개의 시스테인이 서로 인접하여 있는지("C-C" 브랜치로 명명됨), 아니면 개재 잔기에 의해 서로 떨어져 있는지("C-X-C")의 여부에 따라서 2가지 전형적인 브랜치로 나누어진다. 보다 최근에 동정된 케모킨 브랜치에서는 상응하는 모티브중 2개의 시스테인이 결여되어 있고, 이는 림포택틴(lymphotactin)으로서 공지된 케모킨으로 나타낸다. 최근에 동정된 또 다른 브랜치는 2개의 시스테인 사이에 3개의 개재 잔기를 갖고 있는데, 예를 들면, CX3C 케모킨이다[참조: Schall and Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6:865-873; and Bacon ad Schall (1996) Int. Arch. Allergy ＆ Immunol. 109:97-109].

전구체 세포의 분화 과정에 영향을 미치거나, 또는 특정한 세포 유형의 생리학 또는 이동성을 조절하는 많은 인자들이 동정된 바 있다. 이러한 관찰들은 면역 기능 상의 기능이 지금까지 인식된 바 없었던 기타 인자들이 존재한다는 것을 나타낸다. 이들 인자들은 효과 스펙트럼이 공지된 분화 또는 활성 인자들과는 구별될 수 있는 생물학적 활성을 제공해준다. 생체내에서 세포 생리학을 조절해주는 조절 인자의 구조적 특성, 생물학적 특성 및 생리학적 특성에 관한 지식이 부재하기 때문에, 이러한 인자들의 효과를 조정하지 못한다. 따라서, 관련 세포의 발생 또는 생리학을 조절할 필요가 있는 의학적 질환 상태는 여전히 치료하기 힘들다.

〈발명의 요약〉

본 발명은 본원에서 DNAX Vic-1(DVic-1) 및 DNAX Groin Wound-발현된 CC 케모킨(DGWCC)으로 명명된, 앞서 공지된 바 없는 케모킨-모티브 함유 분자의 존재를 밝히는 것이다. 다음에 기재된 케모킨 단백질 서열의 서열 분석을 기초로 하면, DVic-1과 DGWCC가 CC 케모킨 계열에 속하는 것은 명백하다.

바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 서열 2와 약 12개 이상의 아미노산에 있어 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DVic-1 단백질 또는 펩티드; 서열 2의 천연 서열 DVic-1; DVic-1 서열을 포함하는 융합 단백질; 서열 6 또는 8과 약 12개 이상의 아미노산에 있어 약 85% 이상의 서열 동일성을 나타내는, 실질적으로 순수한 또는 재조합 DGWCC 단백질 또는 펩티드; 서열 6 또는 8의 천연 서열 DGWCC; 및 DGWCC 서열을 포함하는 융합 단백질 중에서 선택된 물질의 조성물을 제공한다. 실질적으로 순수하거나 분리된 단백질 양태에 있어서, 본 발명은 다음의 상응하는 부분과 서열 동일성을 나타내는 절편을 포함하는 단백질을 제공한다: DVic-1(여기서, 약 90% 이상의 동일성을 나타내면, 상기 부분은 약 9개 이상의 아미노산이거나; 약 80% 이상의 동일성을 나타내면, 상기 부분은 약 17개 이상의 아미노산이거나; 약 70% 이상의 동일성을 나타내면, 상기 부분은 약 25개 이상의 아미노산이다) 또는 DGWCC(여기서, 약 90% 이상의 동일성을 나타내면, 상기 부분은 약 9개 이상의 아미노산이거나; 약 80% 이상의 동일성을 나타내면, 상기 부분은 약 17개 이상의 아미노산이거나; 약 70% 이상의 동일성을 나타내면, 상기 부분은 약 25개 이상의 아미노산이다). 기타 폴리펩티드 양태로는 1) DVic-1가 서열 2의 성숙한 서열을 포함하는 것, 2) DVic-1 단백질 펩티드가 사람을 포함한 영장류 기원인 것; 서열 2의 하나 이상의 폴리펩티드 절편을 포함하는 것; 상기 동일성을 나타내는 다수의 부분을 나타내는 것; DVic-1의 천연 대립유전자 변이체인 것; 약 30개 이상의 아미노산 길이를 갖는 것; 영장류 DVic-1에 특이적인 2개 이상의 비-중첩 에피토프를 나타내는 것; DVic-1와 약 20개 이상의 아미노산에 있어 약 90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 것; DVic-1에 특이적인 2개 이상의 비-중첩 에피토프를 나타내는 것; DViv-1와 약 20개 이상의 아미노산에 있어 약 90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 것; 글리코실화된 것; 합성 폴리펩티드인 것; 고체 기질에 부착된 것; 또 다른 화학적 잔기에 접합된 것; 천연 서열로부터 5배 이하 치환된 것; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체인 것 3) DGWCC가 서열 6 또는 8의 성숙한 서열을 포함하는 것, 또는 4) DGWCC 단백질 또는 펩티드가 영장류 또는 설치류를 포함한 포유류 기원인 것; 서열 6 또는 8의 하나 이상의 폴리펩티드 절편을 포함하는 것; 상기 동질성을 나타내는 다수의 부분을 나타내는 것; DGWCC의 천연 대립유전자 변이체인 것; 약 30개 이상의 아미노산 길이를 갖는 것; 영장류 DGWCC에 특이적인 2개 이상의 비-중첩 에피토프를 나타내는 것; DGWCC와 약 20개 이상의 아미노산에 있어 약 90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 것; DGWCC에 특이적인 2개 이상의 비-중첩 에피토프를 나타내는 것; DGWCC와 약 20개 이상의 아미노산에 있어 약 90% 이상의 서열 동일성을 나타내는 것; 글리코실화된 것; 합성 폴리펩티드인 것; 고체 기질에 부착된 것; 또 다른 화학적 잔기에 접합된 것; 천연 서열로부터 부터 5배 이하 치환된 것; 또는 천연 서열로부터의 결실 또는 삽입 변이체인 것이 있다. 멸균성 DVic-1 단백질 또는 펩티드; 또는 DVic-1 단백질 또는 펩티드 및 담체(여기서, 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다)를 포함하는 조성물; 또는 멸균성 DGWCC 단백질 또는 펩티드; 또는 DGWCC 단백질 또는 펩티드 및 담체(여기서, 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다)를 포함하는 조성물을 포함한, 기타 폴리펩티드의 제형이 제공된다.

기타 폴리펩티드 형태로는 서열 2 또는 12의 성숙한 단백질 서열; 서열 6 또는 8의 성숙한 단백질 서열; FLAG, His6 또는 Ig 서열을 포함한, 검출 또는 정제용 태그; 또는 또 다른 케모킨 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질이 있다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드와, DVic-1 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 구획; DVic-1 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 구획; 또는 키트 시약의 사용 또는 처리에 관한 지침서를 포함하는 키트가 제공된다.

예를 들면, 천연의 DVic-1 단백질과 특이적으로 결합하는, 특정 항체로부터의 항원 결합 부분을 포함하는 결합성 화합물 및 조성물(여기서, Dvic-1 단백질은 영장류 단백질이거나; 상기 결합성 화합물은 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나; 상기 결합성 화합물은 또 다른 화학적 잔기와 접합되거나; 또는 상기 항체는 서열 2 또는 12를 포함하는 성숙한 폴리펩티드의 펩티드 서열에 대해 발생되거나, 성숙한 DVic-1에 대해 발생되거나, 정제된 DVic-1에 대해 발생되거나, 면역선택되거나, 폴리클로날 항체이거나, 변성된 DVic-1에 결합되거나, 항원에 대한 Kd가 30mM 이상이거나, 비드 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되거나, 멸균성 조성물 내에 존재하거나, 또는 방사성 또는 형광성 표지를 포함한 탐지 가능하게 표지된다), 또는 천연의 DGWCC 단백질과 특이적으로 결합하는, 특정 항체로부터의 항원 결합 부분을 포함하는 결합성 화합물 및 조성물(여기서, DGWCC 단백질은 영장류 또는 설치류 단백질이거나; 상기 결합성 화합물은 Fv, Fab 또는 Fab2 단편이거나; 상기 결합성 화합물은 또 다른 화학적 잔기와 접합되거나; 또는 상기 항체는 서열 6 또는 8을 포함하는 성숙한 폴리펩티드의 펩티드 서열에 대해 발생되거나, 성숙한 DGWCC에 대해 발생되거나, 정제된 DGWCC에 대해 발생되거나, 면역선택되거나, 폴리클로날 항체이거나, 변성된 DVic-1에 결합되거나, 항원에 대한 Kd가 30mM 이상이거나, 비드 또는 플라스틱 막을 포함한 고체 기질에 부착되거나, 멸균성 조성물 내에 존재하거나, 또는 방사성 또는 형광성 표지를 포함하여, 탐지 가능하게 표지된다)이 제공된다.

결합 조성물을 갖는 키트 양태에는 상기와 같은 결합 조성물과, 당해 결합 조성물을 포함하는 구획; 및/또는 키트 시약의 사용 또는 처리에 관한 지침서를 갖는 키트가 있다. 전형적으로, 이러한 키트는 정성적 또는 정량적 분석을 할 수 있다. 예를 들면, 상기와 같은 멸균성 결합 조성물; 또는 상기와 같은 결합 조성물과 담체(여기서, 담체는 물, 식염수 및/또는 완충액을 포함한 수성 화합물이고/이거나 경구, 직장, 비내, 국소 또는 비경구 투여용으로 제형화된다)를 포함하는 기타 각종 조성물이 제공된다.

앞서 기재된 바와 같은 단백질 또는 펩티드 또는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산을 포함한 핵산이 제공되며, 여기서 1) DVic-1 단백질은 사람을 포함한 영장류로부터 기원된 것이거나; 2) DVic-1 핵산은 서열 1 내지 4 또는 11 내지 12 중의 어느 하나의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나; 서열 1 내지 4 또는 11 내지 12의 다수의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나; 상기 절편을 암호화하는 천연 cDNA와 약 80% 이상의 동일성을 나타내거나; 발현 벡터이거나; 복제 기점을 추가로 포함하거나; 천연 공급원으로부터의 것이거나; 검출 가능한 표지를 포함하거나; 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 6kb 미만, 바람직하게는 3kb 미만이거나; 사람을 포함한 영장류로부터의 것이거나; 천연의 완전한 길이의 암호화 서열을 포함하거나; DVic-1 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화 프로브이거나; 또는 PCR 프라이머, PCR 생성물 또는 돌연변이유발 프라이머이고; 3) DGWCC 단백질은 사람 또는 마우스를 포함한 영장류 또는 설치류로부터 기원된 것이거나 4) DGWCC 핵산은 서열 6 또는 8의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나; 서열 6 또는 8의 다수의 항원성 펩티드 서열을 암호화하거나; 상기 절편을 암호화하는 천연 cDNA와 약 80% 이상의 동일성을 나타내거나; 발현 벡터이거나; 복제 기점을 추가로 포함하거나; 천연 공급원으로부터의 것이거나; 검출 가능한 표지를 포함하거나; 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하거나; 6kb 미만, 바람직하게는 3kb 미만이거나; 사람 또는 마우스를 포함한 영장류 또는 설치류로부터의 것이거나; 천연의 완전한 길이의 암호화 서열을 포함하거나; DGWCC 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 하이브리드화 프로브이거나; 또는 PCR 프라이머, PCR 생성물 또는 돌연변이유발 프라이머이다.

또한, 이러한 재조합 핵산을 포함하는 세포 또는 조직이 제공되며, 이러한 세포로는 원핵 세포; 진핵 세포; 세균성 세포; 효모 세포; 곤충 세포; 포유류 세포; 마우스 세포; 영장류 세포; 또는 사람 세포가 있다. 예를 들면, 이러한 핵산과, 상기 핵산을 포함하는 구획; DVic-1 또는 DGWCC 단백질 또는 폴리펩티드를 추가로 포함하는 구획; 및/또는 키트 내에서의 시약의 사용 또는 처리에 관한 지침서를 포함하는, 상기 핵산을 함유하는 키트가 제공된다. 전형적으로, 이러한 키트는 정성적 또는 정량적 분석을 할 수 있다.

이러한 핵산으로는 30℃ 및 2M 미만 염, 45℃ 및/또는 500mM 염, 또는 55℃ 및/또는 150mM 염의 세척 조건하에서 서열 1과 하이브리드화하거나; DVic-1과, 약 30개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 있어 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나, 약 55개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 있어 약 90% 이상의 동일성을 나타내거나 또는 75개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 있어 약 95% 이상의 동일성을 나타내거나; 30℃ 및 2M 미만 염, 45℃ 및/또는 500mM 염, 또는 55℃ 및/또는 150mM 염의 세척 조건하에서 서열 5 또는 7과 하이브리드화하거나; 또는 DGWCC와, 약 30개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 있어 약 85% 이상의 동일성을 나타내거나, 55개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 있어 약 90% 이상의 동일성을 나타내거나 또는 75개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 있어 약 95% 이상의 동일성을 나타내는 것이 있다.

또한, 특정 세포를 DVic-1 또는 DGWCC의 효능제 또는 길항제에 노출시키는 것을 특징으로하여, 이러한 세포 또는 조직 배양 세포의 생리 또는 발생을 조절하는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한, DVic-1 케모킨과 특이적으로 결합되는 항원 결합 부위; DVic-1 케모킨 또는 이의 단편을 암호화하는 발현 벡터; 기재된 항원 결합 부위에 의해 특이적으로 인식되는 실질적으로 순수한 단백질; 실질적으로 순수한 DVic-1 케모킨 또는 이의 펩티드, 또는 DVic-1 케모킨 서열의 30개 아미노산 서열 부분을 포함하는 융합 단백질; DGWCC 케모킨과 특이적으로 결합되는 항원 결합 부위; DGWCC 케모킨 또는 이의 단편을 암호화하는 발현 벡터; 기재된 항원 결합 부위에 의해 특이적으로 인식되는 실질적으로 순수한 단백질; 및 실질적으로 순수한 DGWCC 케모킨 또는 이의 펩티드, 또는 DGWCC 케모킨 서열의 30개 아미노산 서열 부분을 포함하는 융합 단백질의 그룹 중에서 선택된 조성물을 특정 화합물과 접촉시키는 단계; 및 이러한 조성물에 대한 상기 화합물의 결합을 탐지하는 단계를 포함하여, 상기 화합물에 대한 특이적 결합을 탐지하는 방법을 제공한다.

본 발명은 포유류 세포, 예를 들면, 포유류 면역 시스템 세포의 발생, 분화, 트래픽킹(trafficking) 및 생리학을 조절하는 기능을 하는 단백질과 관련된 조성물을 고려하고 있다. 특히, 본 발명은 조혈 세포를 포함한 각종 세포 유형의 발생, 분화 및 기능을 조절하거나 입증해주는 단백질을 제공한다.

Ⅰ. 개론

본 발명은 사이토킨 또는 케모킨의 특징적인 구조적 성질 또는 모티브를 나타내는 단백질을 암호화하는 영장류 DNA 서열을 제공한다. 케모킨 계열에 관한 고찰은 다음 문헌을 참조할 수 있다[참조: Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1767; Gronenborn and Clore (1991) Protein Engineering 4:263-269; Miller and Kranger (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:2950-2954; Matsushima and Oppenheim (1989) Cytokine 1:2-13; Stoeckle and Baker (1990) New Biol. 2:313-323; Oppenheim, et al.(1991) Ann. Rev. Immunol. 9:617-648; Shall (1991) Cytokine 3:165-183; and The Cytokine Hnadbook Academic Press, NY].

본원에 기재된 신규한 사이토킨은 DNAX Vic-1(DVic-1) 및 DNAX Groin Wound 발현된 CC 케모킨(DGWCC)으로 명명된다.

서열 3 및 4는 HHFFQ25R 사람 태아 심장 라이브러리 및 HOEDH11R 사람 조골 세포 라이브러리로부터 각각 수득된 2개의 EST's를 규정하고 있다. 이들은 고도의 상동성을 나타내므로 아마도 유사한 전사체로부터의 EST's일 것이다. 이들 두 EST's의 케모킨 모티브를 비교하고, 컨센스 서열을 유도한 결과, 사람 DVic-1(서열 1)을 암호화하는 것으로 확인되었다. 시그날 서열은 Ala와 Ile 사이에 지시되지만, 이는 상이한 세포주마다 다양할 수 있다. 또한, 특징적인 케모킨 모티브를 전혀 나타내지 않는 N-말단 연장체를 갖는, 사람 DVic-1에 대한 보다 긴 대체 전사체가 기재되어 있다(서열 11 및 12).

사람 DGWCC의 폴리펩티드 및 핵산 서열은 서열 5 및 6으로서 기재되어 있다. 사람 DGXCC 케모킨 핵산 서열의 암호화 서열은 대략 서열 5의 1번 뉴클레오티드에서 시작되어 대략 336번 뉴클레오티드에서 종결된다. 특징적인 CC 모티브가 서열 6의 아미노산 잔기 9 내지 10에서 발견될 수 있다. 시그날 서열이 지시되긴 하지만, 관련된 유전자를 기초로 하여 약간 상이한 프로세싱이 상이한 세포 유형에서 발생될 수 있다. 마우스 DGWCC 케모킨(초기에는 mDVic-1로 명명됨; 미국 특허원 제08/761,071호 참조)의 핵산 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 서열 7 및 8로서 기재되어 있다. 폴리 A 시그날은 뉴클레오티드 384번에서부터 389번까지이고 정지 코돈의 일부를 함유한다. 시그날 P는 Ala(-1)과 Leu1 사이의 절단을 예보하지만; 실제적인 절단이 특정 잔기에 의해 어느 한 측면 상에서 이루어질 수 있다.

다음 기재 내용은 예시 목적상 영장류 양태, 예를 들면, 사람에 관한 것이지만, 기타(예: 설치류를 포함한 다른 천연의 포유류 공급원)으로부터의 관련 양태에도 적용 가능하다. 이들 공급원은 각종 척추동물, 전형적으로는 온혈 동물, 예를 들면, 조류 및 포유류, 특히 가축용 동물, 설치류 및 영장류를 포함해야 한다. 기타 케모킨과의 비교가 다음 표 1에 제시되어 있다.

본 발명의 케모킨 단백질은 부분적으로는 이들의 물리화학적 및 생물학적 성질에 의해 규정된다. 본원에 기재된 케모킨, 예를 들면, DVic-1 및 DGWCC의 생물학적 성질은 부분적으로는 이들의 아미노산 서열과 성숙한 크기에 의해 규정된다. 이들은 또한, 적어도 몇몇 생물학적 성질을 기타 유사한 케모킨과 공유해야 한다. 당해 분야의 숙련인은 상기 분자의 생물학적 활성을 상당히 변형시키지 않고서도, 몇몇 서열상의 변화, 예를 들면, 수용체 상호작용 또는 중요한 3차 구조 형상에 있어 결정적인 잔기로부터 멀리 떨어진 보존적 치환 또는 위치가 허용될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 이에 비해, 비-보존적 치환에 의해 선택된 기능이 제거될 수 있다.

이들 케모킨은 특이적 조직 유형, 예를 들면, 피부 조직에 존재하고, 이러한 단백질과 수용체와의 상호작용은 세포내 생리학 또는 발생의 각종 양상을 매개하는데 중요할 것이다. DVic-1 또는 DGWCC를 암호화하는 메시지를 발현하는 세포 유형은 세포 분화와 발생에 중요한 시그날이 이들에 의해 매개된다는 것을 제시하고 있다[참조: Gilbert (1991) Development Biology (3d ed.) Sinauer Associates, Sunderland, MA; Browder, et al. (1991) Developmental Biology (3d ed.) Saunders, Philadelphia, PA; Russo, et al. (1992) Development: The Molecular Genetic Approach Springer-Verlag, New York, N.Y.,; and Wilkins (1993) Genetic Analysis of Animal Development (2d ed.) Wiley-Liss, New York, N.Y.]. 더우기, DVic-1 또는 DGWCC 발현 또는 반응성은, 예를 들면, 특정한 세포 아집단을 규정하기 위한 마커로서 작용해야 한다.

당해 신규의 케모킨은 데이타베이스 서열을 조사하고 주의깊게 분석한 결과 발견된 것이다. 입수 용이한 데이타베이스 내에 서열이 존재하지 않는다는 것은 메시지가 거의 발현되지 않고/않거나 극히 낮은 수준으로 발현된다는 것을 강력하게 제시하고 있다. 이는 대부분의 세포 유형에서 고도로 제한된 세포 발현 및/또는 극히 낮은 수준의 세포 발현을 반영할 수 있다.

문헌[참조: Maniatis, et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.) Vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; and Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY].

Ⅱ. 정의

용어 "결합 조성물"은 예를 들면, 항체-항원 상호작용에 있어서 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨과 특이적이고도 선택적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 그러나, 기타 화합물, 예를 들면, 수용체 단백질도 또한, 다른 분자의 배제하에 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨과 특이적 및/또는 선택적으로 결합될 수 있다. 전형적으로, 이러한 결합은 공유적이거나 비-공유적인, 자연 생리학적으로 관련된 단백질-단백질 상호작용일 것이며, 담체 화합물 또는 이량체화 파트너를 포함한 다중 단백질 복합체의 구성원을 포함할 수 있다. 이러한 분자는 중합체 또는 화학적 시약일 수 있다. DVic-1 또는 DGWCC 케모킨이 반드시 볼록한 형태의 분자, 예를 들면, 리간드-수용체 상호작용의 리간드인지 아니면 수용체인지에 관한 어떠한 암시도 반드시 나타나는 것은 아니지만, 이러한 상호작용이 유사한 특이성, 예를 들면, 특이적 친화성을 나타내는지에 관한 암시는 나타날 수 있다. 작용성 동족체는 구조적으로 변형된 리간드일 수 있거나, 또는 완전하게 관련이 없는 분자, 예를 들면, 적절한 리간드 결합 결정기와 상호작용하는 분자 형태를 갖는 분자일 수 있다. 이러한 리간드는 상기 수용체의 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다[참조: Goodman, et al. (eds.)(1990) Goodman ＆ Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergaman Press, Tarrytown, N.Y.].

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "결합제-케모킨 단백질 복합체"는 케모킨 단백질에 대한 특정 결합제의 특이적 결합에 의해 형성되는, 상기 결합제와 케모킨, 예를 들면, DVic-1 또는 DGWCC 단백질의 복합체를 지칭한다. 결합제의 특이적 또는 선택적 결합은 이러한 결합제가 다른 많은 단백질에서는 공유되지 않는 DVic-1 케모킨 단백질 상의 특정 부위를 인식하는 특이적 결합 부위, 예를 들면, 항원 결합 부위를 갖는다는 것을 의미한다. 예를 들면, DVic-1 케모킨 단백질에 대해 발생되고 이러한 케모킨 단백질 상의 에피토프를 인식하는 항체는 특이적이고도 선택적인 결합에 의해 결합제:DVic-1 케모킨 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 결합제:DVic-1 케모킨 단백질 복합체의 형성으로 인해, 다른 단백질과 생물학적 약제의 혼합물 중에서 DVic-1 케모킨 단백질을 측정할 수 있다. 마찬가지로, 용어 "항체:DGWCC 케모킨 단백질 복합체"는 결합제가, 예를 들면, 항체로부터의 항원 결합 부분인 양태를 지칭한다. 이러한 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 또는 항체의 결합성 단편, 예를 들면, Fab 또는 F(ab)2 단편일 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 교차-반응성 시험 목적상 폴리클로날 항체일 것이다.

"상동" 핵산 서열은 비교할 경우, 상당한 유사성 또는 동일성을 나타낸다. 핵산에서의 상동성에 대한 기준은 서열 비교 및/또는 계통발생적 관계에 의해 당해 분야에서 일반적으로 사용된 상동성에 대한 측정치이거나, 또는 하이브리드화 조건을 기준으로 한 것이다. 하이브리드화 조건은 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.

"분리된" 핵산은 고유 서열, 예를 들면, 기원이 되는 종으로부터의 단백질과 플랭킹 게놈 서열을 천연적으로 수반하는 기타 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리되는 핵산, 예를 들면, RNA, DNA 또는 혼합 중합체이다. 이러한 용어는 이의 천연 환경으로부터 회수된 핵산 서열을 포괄하고, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물 및 화학적으로 합성된 동족체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 동족체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자에는 이러한 분자의 분리된 형태가 포함된다. 분리된 핵산은 통상적으로 동종 핵산 분자를 함유할 것이지만, 몇몇 양태에서는, 소수의 서열 이종성을 지닌 핵산을 함유할 것이다. 이러한 이종성은 전형적으로, 목적하는 생물학적 기능이나 활성에 중요하지 않은 중합체 말단 또는 부위에서 발견된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "DVic-1 케모킨 단백질"은 단백질 관점에서 사용되는 경우에는, 특히 서열 2에 제시된 케모킨 모티브 부분으로부터의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 이러한 단백질, 바람직하게는 천연 양태의 단백질에 독특하고/하거나 특징적인 중요한 단편을 포괄할 것이다. 사람 및 마우스 DGWCC에 대해서도 마찬가지로 서열 6과 8이 적용될 수 있다. 본 발명은 또한, 이러한 케모킨과 유사한 구조를 나타내는 폴리펩티드, 예를 들면, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 특이적 결합 성분과 상호작용하는 폴리펩티드를 포괄한다. 이들 결합 성분, 예를 들면, 항체는 전형적으로, 예를 들면, 약 100nM 이상, 통상적으로 약 30nM 이상, 바람직하게는 약 10nM 이상, 더욱 바람직하게는 약 3nM 이상에서 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨과 고 친화적으로 결합된다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"에는 예를 들면, DGWCC 케모킨의 케모킨 모티브 부분의 중요한 단편 또는 절편이 포함되며, 약 8개 이상의 아미노산 잔기, 일반적으로는 10개 이상의 아미노산 잔기, 보다 일반적으로는 12개 이상의 아미노산 잔기, 종종 14개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 종종 16개 이상의 아미노산 잔기, 전형적으로는 18개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 전형적으로는 20개 이상의 아미노산 잔기, 통상적으로는 22개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 통상적으로는 24개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 26개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 28개 이상의 아미노산 잔기, 특히 바람직한 양태에서는 약 30개 이상의 아미노산 잔기, 예를 들면, 35개, 40개, 45개 50개, 60개, 70개, 80개 등의 연속되는 아미노산 잔기를 포괄한다. 이러한 절편은 적절한 길이를 갖는, 예를 들면, 1, 2, 3번 등의 잔기에서 시작하여, 예를 들면, 95, 94, 93, 92번 등의 잔기에서 종결되는 아미노 및 카복시 말단을 가질 수 있다. 본 발명은 다수의 상기 절편을 포함하는 단백질을 포괄한다.

"재조합" 핵산은 이의 생성 방법이나 구조에 의해 규정된다. 이의 생성 방법면에 있어서, 예를 들면, 뉴클레오티드 서열에서 사람의 개입을 필요로 하는 재조합 핵산 기술, 전형적으로는 선별 또는 생성 과정을 이용하는 공정에 의해 만들어진 생성물이다. 또 다른 한편, 이는 서로 천연적으로 연속적이지 않은 2개 단편의 융합물을 포함하는 서열을 발생시킴으로써 제조된 핵산일 수 있지만, 천연 생성물, 예를 들면, 천연의 돌연변이체는 제외시킨다. 따라서, 예를 들면, 천연적으로 존재하지 않는 벡터를 이용하여 세포를 형질전환시킴으로써 제조된 생성물이 포괄되며, 이는 어떠한 합성 올리고뉴클레오티드 공정을 이용하여 유도된 서열을 포함하는 핵산의 경우도 마찬가지이다. 이는 전형적으로 특정 서열 인식 부위를 도입하거나 제거하면서, 특정 코돈을 동일한 또는 보존성 아미노산을 암호화하는 중복된 코돈으로 대체하기 위해 종종 수행된다. 또 다른 한편, 이는 통상 입수 가능한 천연 형태에서는 발견되지 않는 목적하는 기능의 조합을 포함하는 단일 유전 물질을 생성하기 위하여 목적하는 기능의 핵산 절편을 함께 결합시킨다. 제한 효소 인식 부위는 종종 이러한 인공적인 조작의 표적물이지만, 기타 부위 특이적 표적, 예를 들면, 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 컨트롤(control) 서열, 또는 기타 유용한 특징들이 고안에 의해 포함될 수 있다. 유사한 개념이 재조합, 예를 들면,융합 폴리펩티드에 대해서도 적용된다. 구체적으로 언급하면, 이에는 유전 암호 중복성에 의해 이들 항원의 단편과 유사한 폴리펩티드를 암호화하는 합성 핵산, 및 각종 상이한 종 변이체로부터의 서열 융합체가 포함된다.

"가용성"은 특정 조건하에서의 분자의 침강 속도의 측정치인 스베드베리 단위(Svedberg unit)로 측정된 침강을 반영한 것이다. 이러한 침강 속도의 결정은 전통적으로 분석적 초원심분리기에서 수행되지만, 현재에는 전형적으로 표준 초원심분리기에서 수행한다[참조: Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2d ed.) W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, CA; and Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry parts 1-3, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, CA]. 대략적인 결정 방법으로서, 추정상의 가용성 폴리펩티드를 함유하는 샘플을 완전한 크기의 표준 초원심분리기에서 약 50K rpm으로 약 10분 동안 회전시키면, 가용성 분자가 상기 상등액에 잔존할 것이다. 가용성 입자 또는 폴리펩티드는 전형적으로 약 30S 미만, 더욱 전형적으로는 약 15S 미만, 통상적으로는 약 10S 미만, 보다 통상적으로는 약 6S 미만일 것이며, 특정한 양태에서는, 바람직하게 약 4S 미만, 더욱 바람직하게는 약 3S 미만일 것이다. 폴리펩티드 또는 이의 단편의 가용성은 환경과 폴리펩티드에 따라서 결정된다. 온도, 전해질 환경, 폴리펩티드의 크기 및 분자상 특징, 및 용매 성질을 포함한 수 많은 파라미터가 폴리펩티드 가용성에 영향을 미친다. 전형적으로, 폴리펩티드가 사용되는 온도는 약 4℃ 내지 약 65℃의 범위이다. 통상적으로, 사용 온도는 약 18℃를 초과하고, 보다 통상적으로는 약 22℃를 초과한다. 진단 목적을 위해서는, 온도가 통상적으로 약 실온 이상이지만, 검정에서의 성분들의 변성 온도 보다는 낮을 것이다. 치료 목적을 위해서는, 상기 온도가 사람의 체온, 전형적으로는 약 37℃일 것이지만, 특정 상황하에서는 상기 온도가 동일한 위치에서 또는 시험관내에서 상승되거나 강하될 수 있다.

이러한 폴리펩티드의 크기와 구조는 일반적으로 실질적으로 안정한 상태여야 하고, 통상적으로는 변성된 상태가 아니어야 한다. 상기 폴리펩티드는, 예를 들면, 가용성을 부여하기 위하여 4차 구조로 다른 폴리펩티드와 결합하거나, 또는 천연 지질 복층 상호작용과 비슷한 방식으로 지질 또는 세정제와 결합할 수 있다.

용매는 통상적으로, 생물학적 활성의 보존을 위해 사용된 유형의 생물학적으로 적합한 완충액일 수 있고, 통상적으로 생리학적 용매와 비슷할 것이다. 통상적으로, 이러한 용매는 중성 pH, 전형적으로는 약 5 내지 10, 바람직하게는 약 7.5의 pH를 지닐 것이다. 몇몇 경우에서는, 세정제, 전형적으로는 순한 비-변성 세정제, 예를 들면, CHS(콜레스테릴 헤미석시네이트) 또는 CHAPS(3-[3-콜아미도프로필-디메틸암모니오]-1-프로판 설포네이트)를 가하거나, 또는 이를 상기 단백질의 구조적 성질이나 생리학적 성질의 상당한 파괴를 피하기에 충분한 저 농도로 가할 것이다.

단백질 관점에서의 "실질적으로 순수한"이란 전형적으로, 단백질이 기타 오염성 단백질, 핵산, 및 본래의 공급원 유기체로부터 유래된 기타 생물학적 약제로부터 분리된다는 것을 의미한다. 순도, 또는 "분리"는 표준 방법에 의해 검정될 수 있으며, 통상적으로는 약 50% 이상이 순수하고, 더욱 통상적으로는 약 60% 이상이 순수하며, 일반적으로는 약 70% 이상이 순수하고, 더욱 일반적으로는 약 80% 이상이 순수하며, 종종 약 85% 이상이 순수하고, 더욱 종종 약 90% 이상이 순수하며, 바람직하게는 약 95% 이상이 순수하고, 더욱 바람직하게는 약 98% 이상이 순수하며, 가장 바람직한 양태에서는 99% 이상이 순수하다. 유사한 개념이, 예를 들면, 항체 또는 핵산에도 적용된다.

핵산 서열 비교 관점에서의 "상당한 유사성"은 절편이나 이들의 상보적 쇄들을 비교하였을 때, 이들의 최적의 정렬 상태에서, 뉴클레오티드의 약 50% 이상, 일반적으로는 56% 이상, 더욱 일반적으로는 59% 이상, 통상적으로는 62% 이상, 더욱 통상적으로는 65% 이상, 종종 68% 이상, 더욱 종종 71% 이상, 전형적으로는 74% 이상, 더욱 통상적으로는 77% 이상, 통상적으로는 80% 이상, 더욱 통상적으로는 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 내지 98% 이상, 및 특히 바람직한 양태에서는 약 99% 이상이, 적당한 뉴클레오티드 삽입체 또는 결실체와 동일한 것을 의미한다. 또 다른 한편, 전형적으로 서열 1, 5 또는 7로부터 유도된 서열을 사용하는 경우, 상기 절편들이 선별적인 하이브리드화 조건하에서 특정 쇄 또는 이의 보체와 하이브리드화 할 경우에 상당한 유사성이 존재한다. 전형적으로, 선별적인 하이브리드화는 약 30개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 걸쳐 약 55%의 유사성을 나타내고, 바람직하게는 약 25개 이상의 연속되는 뉴클레오티드에 걸쳐 약 65% 이상의 유사성을 나타내며, 더욱 바람직하게는 약 20개의 연속되는 뉴클레오티드에 걸쳐 약 75% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 유사성을 나타내는 경우에 선별적인 하이브리드화가 발생될 것이다[참조: Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213]. 기재된 바와 같은 유사성 비교 길이는 보다 긴 연속물에 걸쳐진 것일 수 있으며, 특정 양태에서는 약 17개 이상의 연속되는 뉴클레오티드, 통상적으로는 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로는 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로는 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 더욱 전형적으로는 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 약 75 내지 100개 이상, 예를 들면, 150, 200개 등의 뉴클레오티드에 걸쳐진 것일 수 있다.

하이브리드화 관점에서 상동성 또는 실질적 유사성을 지칭하는데 있어서, "엄격한 조건"은 염, 온도, 유기 용매 및 기타 파라미터의 엄격한 조합 조건, 전형적으로 하이브리드화 반응에서 조절된 조건일 것이다. 이러한 파라미터의 조합은 어떠한 단일 파라미터의 측정치 보다 더 중요하다[참조: Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370]. 엄격한 조건하에서 표적 핵산에 결합되는 핵산 프로브는 이러한 표적 핵산에 특이적이다. 이러한 프로브는 전형적으로 11개 이상 길이의 뉴클레오티드이고, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 표적에 결합하기에 충분하게 상기 프로브의 서열에 의해 특정화된 영역에 걸쳐 특정 표적 핵산과 동일하거나 이에 상보적이다.

다른 포유류 종으로부터의 DGWCC 케모킨을 클로닝한 다음, 밀접하게 관계된 종을 교차-종 하이브리드화(cross-species hybridization)함으로써 분리시킬 수 있다[하기 참조]. 관계가 먼 종 간의 유사성은 비교적 낮을 수 있기 때문에, 비교적 밀접한 관계의 종을 하이브리드화하는 것이 바람직하다. 또 다른 한편, 종 특이성을 덜 나타내는 항체 제제의 제조가 발현 클로닝 방법에 유용할 수 있다.

특정 단백질 또는 펩티드를 지칭하는 경우에 사용된 문구인 "항체와 특이적으로 결합되는" 또는 "..와 특이적으로 면역 반응성인"은 단백질 및 기타 생물학적 성분의 이종 집단의 존재하에서 상기 단백질의 존재를 결정해주는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 면역검정 조건하에서, 상기와 같이 특정화된 항체는 특정한 단백질과 결합하며 샘플 내에 존재하는 다른 단백질과는 실질적으로 결합하지 않는다. 이러한 조건하에서의 항체에 대한 특이적 결합을 위해서는, 특정한 단백질에 대한 특이성을 기준으로 하여 선별된 항체가 요구된다. 예를 들면, 서열 2, 또는 6 또는 8에 도시된 아미노산 서열을 갖는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질 면역원에 대해 생성된 항체를 선별하여 DGWCC 케모킨 단백질과는 특이적으로 면역반응성이지만 다른 단백질과는 특이적으로 면역반응성이 아닌 항체를 수득할 수 있다. 이러한 항체는 종 특이적일 수 있는데, 예를 들면, 다형성 및 스플라이싱 변이체 및 발생적 변이체를 인식할 수 있다.

Ⅲ. 핵산

DGWCC 케모킨은 구조적 및 기능적으로 관련된 단백질의 한 예이다. 이들 가용성 케모킨 단백질은 상이한 세포 유형 간의 시그날을 전달하는 작용을 할 것이다. 기술된 바와 같은 바람직한 양태는 상이한 개개인 또는 기타 종, 예를 들면, 조류 및 포유류 등의 온혈 동물로부터의 유전자를 분리시키기 위한 표준 과정에 유용할 것이다. 교차 하이브리드화함으로써, 개개인, 주(strain) 또는 종으로부터의 단백질을 암호화하는 관련 유전자를 분리할 수 있다. 본원에서 제공된 정보를 기초로 하여 적합한 핵산 클론을 성공적으로 분리시키기 위한 수 많은 상이한 시도가 이용될 수 있다. 서던 블롯(Southern blot) 하이브리드화 연구를 통해, 특이적 하이브리드화 조건하에서 사람, 원숭이, 랫트, 마우스, 도그, 캣, 카우 및 래빗트 게놈에서 상동 유전자의 존재를 정량적으로 측정할 수 있다.

상보적 서열을 또한 프로브 또는 프라이머로서 사용할 것이다. 있음직한 아미노 말단의 동정을 기초로 하여, 예를 들면, 앵커된(anchored) 벡터 또는 폴리-A 상보적 PCR 기술과 연관된 또는 기타 펩티드의 상보적 DNA와 연관된 기타 펩티드가 특히 유용하다.

DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 유전자의 핵산 조작을 위한 기술, 예를 들면, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 발현 벡터 내로 아클로닝시키는 기술, 프로브를 표지시키는 기술, DNA 하이브리드화 기술 등이 일반적으로 본원에 참조문헌으로 삽입된 문헌[Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY]에 기재되어 있다. 이러한 매뉴얼은 "Sambrook, et al."으로서 후술될 것이다.

DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 분리하는 각종 방법이 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 서열과 동일하거나 이에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 게놈성 또는 cDNA 라이브러리로부터 DNA를 분리시킨다. 완전한 길이의 프로브를 사용할 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프로브를 기술된 서열을 비교함으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 프로브를 하이브리드화 검정에 직접적으로 사용하여 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA를 분리시킬 수 있거나, 또는 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA를 분리하기 위한 PCR 등의 증폭 기술에 사용할 수 있도록 프로브를 고안할 수 있다. 역 해독 컴퓨터 프로그램은 또한 동일한 단백질을 암호화하는 대체 핵산 서열을 제공할 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여, DGWCC 케모킨 단백질을 발현하는 세포로부터 mRNA를 분리한다. 이러한 mRNA로부터 cDNA를 제조하고 이를 재조합 벡터에 연결한다. 이 벡터를 증식, 스크리닝 및 클로닝을 위해 재조합 숙주 내로 형질감염시킨다. cDNA 라이브러리의 제조 및 스크리닝 방법이 널리 공지되어 있다[참조: Gubler and Hoffman (1983) Gene 25:263-269 and Sambrook, et al.].

게놈성 라이브러리의 경우에는, DNA를 조직으로부터 추출하고 기계적으로 전단시키거나 효소적으로 분해시켜 약 12 내지 20kb의 단편을 생성시킬 수 있다. 이어서, 이러한 단편을 구배 원심분리시켜 분리하고 박테리오파아지 람다 벡터에 클로닝시킨다. 이들 벡터 및 파아지를 문헌[참조: Sambrook, et al.]에 기재된 바와 같이 시험관내에서 패키징한다. 재조합 파아지를 문헌[참조: Benton and Davis (1977) Science 196:180-182]에 기재된 바와 같이 플라크 하이브리드화에 의해 분석한다. 콜로니 하이브리드화를 문헌[참조: Grunstein, et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965]에 총칭적으로 기재된 바와 같이 수행한다.

cDNA 또는 게놈성 라이브러리중에서, 예를 들면, 콜로니 또는 플라크 하이브리드화 검정에서 본원에 기재된 핵산 프로브와 하이브리드화할 수 있는 능력에 의해 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA를 동정할 수 있다. 당해 분야의 숙련인에게 잘 알려진 표준 방법으로 상응하는 DNA 영역을 분리시킨다[참조: Sambrook, et al.].

폴리머라제 연쇄 반응과 같이, 표적 서열을 증폭시키는 각종 방법을 사용하여 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA를 제조할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 사용하여, mRNA, cDNA 및 게놈성 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접적으로 상기 핵산 서열을 증폭시킨다. 이와 같이 분리된, DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 서열을 또한, PCR 증폭용 주형으로서 사용할 수 있다.

전형적으로, PCR 기술를 통해, 증폭시킬 DNA 영역내에 2개의 5' 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성한다. 이어서, 이러한 두개의 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 수행한다[참조: Innis, et al. (eds.)(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA]. 완전한 길이의 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 완전한 영역을 증폭시키거나, 또는 보다 작은 DNA 절편을 목적하는 바대로 증폭시키기 위한 프라이머를 선별할 수 있다. 이러한 영역이 일단 PCR-증폭되면, 이들을 서열화하고 표준 기술을 사용하여 수득된 서열로부터 올리고뉴클레오티드 프로브를 제조할 수 있다. 이어서, 이들 프로브를 사용하여 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA를 분리할 수 있다.

프로브로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 통상적으로, 먼저 문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22(20):1859-1862]에 기재된 고체상 포스포르아미다이트 트리에스테르 방법에 따라서 화학적으로 합성하거나, 또는 문헌[참조: Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168]에 기재된 바와 같이 자동화 합성기를 이용하여 합성한다. 문헌[참조: Pearson and Regnier (1983) I. Chrom. 255:137-149]에 기재된 바와 같은 음이온-교환 HPLC 또는 천연의 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 올리고뉴클레오티드의 정제를 수행한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은, 예를 들면, 문헌[참조: Maxam and Gilbert, Grossman and Moldave (eds. 1980) Methods in Enzymology 65:499-560 Academic Press, New York]의 화학적 분해 방법을 사용하여 확인할 수 있다.

DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 분리된 핵산을 동정한다. 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 개방 판독 프레임이 서열 1 또는 5 또는 7에 제시되어 있다.

이들 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨은 케모킨의 부분에 대해 제한된 유사성을 나타낸다[참조: Matsushima and Oppenheim (1989) Cytokine 1:2-13; Oppenheim, et al.(1991) Ann. Rev. Immunol. 9:617-648; Shall (1991) Cytokine 3:165-183; and Gronenborn and Clore (1991) Protein Engineering 4:263-269]. DGWCC 케모킨과 케모킨 계열 간의 기타 비교 특징은 명백하다[참조: Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766]. 특히, RASMOL 프로그램[참조: Sayle and Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; or Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269]을 사용하여 b-시트와 a-나선형 잔기를 결정할 수 있으며; 기타 구조적 특징은 문헌[참조: Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1767]에 규정되어 있다. 이들 2차 및 3차 특징은 적당한 시스테인 잔기의 스페이싱(spacing)과 함께, C, CC, CXC 및 CX3C 구조 특징을 추가로 규정하는데 도움을 준다.

본 발명은 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하기 위한 분리된 DNA 또는 이의 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 예를 들어, 고도로 엄격한 적당한 조건하에서 본원에 기재된 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 또는 재조합 DNA를 제공한다. 상기 생물학적으로 활성인 단백질 또는 폴리펩티드는 본래의 리간드 또는 단편일 수 있고, 서열 2, 6 또는 8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열, 특히 천연적인 양태를 갖는다. 바람직한 양태는 글리코실화되지 않았을 때, 예를 들면, 크기가 약 11,000 내지 12,500달톤인 분리물로부터의 완전한 길이의 천연 서열, 또는 약 6,000달톤 이상, 더욱 바람직하게는 약 8,000달톤 이상의 단편일 것이다. 글리코실화된 형태에서는, 상기 단백질이 12,500달톤을 초과할 수 있다. 추가로, 본 발명은 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질에 동종인 단백질을 암호화하거나, 또는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 cDNA를 프로브로서 사용하여 분리되는, 분리된 또는 재조합 DNA 또는 이의 단편의 용도를 고려하고 있다. 이와 같이 분리된 DNA는 5' 및 3' 플랭크에 각각의 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서(enhancer), 폴리-A 부가 시그날 등을 가질 수 있다. 또한, 이들 서열을 갖는 발현 벡터의 제조 방법, 또는 단백질 생성물을 발현 및 정제시키는 방법이 포함된다.

Ⅳ. DVic-1, DGWCC 케모킨의 제조 방법

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 암호화하는 DNA 또는 이의 단편은 화학적으로 합성하거나, cDNA 라이브러리를 스크리닝하거나, 또는 광범위한 세포주 또는 조직 샘플로부터 제조된 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 발현 벡터를 수행하는 방법 또는 제조 방법이 본원에 기재되어 있다.

이들 DNA를 광범위한 숙주 세포에서 발현시켜, 완전한 길이의 단백질 또는 단편을 합성할 수 있으며; 이를 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 발생시킬 수 있으며; 이를 결합성 연구, 변형된 분자의 작제 및 발현, 및 구조/기능 연구에 사용한다. 각각의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 또는 이의 단편을, 적당한 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 이들 분자를 실질적으로 정제함으로써 재조합 숙주로부터 유래된 것을 제외하고는 단백질이나 세포성 오염물질이 제거되므로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 배합되는 경우에 약제학적 조성물에 특히 유용하다. 항원, 예를 들면, DGWCC 케모킨 또는 이의 부분을 기타 단백질과의 융합물로서 발현시킬 수 있거나 에피토프 태그를 보유하는 것으로 발현시킬 수 있다.

발현 벡터는 전형적으로, 적합한 숙주 세포에서 인식되는 적절한 유전적 컨트롤 요소에 작동가능하게 연결된, 목적하는 항원 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 자가 복제성 DNA 또는 RNA 작제물이다. 발현시키는데 필요한 특정 유형의 컨트롤 요소는 결국 사용된 숙주 세포에 좌우될 것이다. 일반적으로, 이러한 유전적 컨트롤 요소는 원핵생물 프로모터 시스템 또는 진핵생물 프로모터 발현 컨트롤 시스템을 포함할 수 있으며, 전형적으로 전사 프로모터, 전사 개시를 컨트롤하기 위한 임의의 작동인자, mRNA 발현 수준을 증가시키기 위한 전사 인핸서, 적합한 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독을 종결시키는 서열을 포함하고 있다. 발현 벡터는 또한 통상적으로, 이러한 벡터가 숙주 세포와 독립적으로 복제할 수 있도록 하는 복제 기점을 함유하고 있다.

본 발명의 벡터는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨, 또는 이의 단편, 전형적으로 생물학적으로 활성인 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한다. 이러한 DNA는 바이러스성 프로모터의 컨트롤 하에 있고 선별 마커를 암호화할 수 있다. 본 발명은 추가로, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 진핵성 cDNA를 원핵 또는 진핵 숙주에서 발현시킬 수 있는 상기 발현 벡터의 용도를 고려하며, 이 경우 상기 벡터는 숙주에 적합하고 상기 단백질을 암호화하는 진핵성 cDNA를 상기 벡터에 삽입시켜 이러한 벡터를 함유하는 숙주가 성장하면서 문제의 cDNA가 발현되도록 한다. 통상적으로, 발현 벡터는 이들의 숙주 세포에서 안정하게 복제되거나, 세포당 목적하는 유전자의 총 복사수를 상당히 증가시키기 위한 증폭을 위해 고안된다. 특정한 발현 벡터가 특정 숙주 세포 내에서 복제되는 것이 반드시 요구되지는 않는데, 예를 들면, 숙주 세포에 의해 인식되는 복제 기점을 함유하지 않는 벡터를 사용하여 각종 숙주 내에서 상기 단백질 또는 이의 단편을 일시적으로 발현시키는 것이 가능하다. 또한, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 유전자 또는 이의 단편을 재조합에 의해 숙주 DNA에 통합시키는 벡터를 사용하거나, 또는 내인성 유전자의 발현을 컨트롤하는 프로모터를 통합시키는 것이 가능하다.

본원에서 사용된 바와 같은 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파아지, 통합 가능한 DNA 단편, 및 DNA 단편을 숙주의 게놈 내로 통합시킬 수 있는 기타 비히클을 포함한다. 발현 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시키는 유전적 컨트롤 요소들을 함유하는 특정화된 벡터이다. 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이지만, 등가 작용을 하는 기타 많은 형태의 벡터가 본원에서 사용하기에 적합하다[참조: Pouwels, et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N.Y.; and Rodriquez, et al. (eds.)(1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA].

적합한 숙주 세포로는 원핵 생물, 하등 진핵 생물 및 고등 진핵 생물이 있다. 원핵 생물로는 그램 음성 유기체와 그램 양성 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis) 모두가 있다. 하등 진핵 생물로는 효모, 예를 들면, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 및 피치아(Pichia), 및 딕튜오스텔륨(Dictyostelium) 속의 종이 있다. 고등 진핵 생물로는 비-포유류 기원, 예를 들면, 곤충 세포 및 조류의 동물 세포와 포유류 기원, 예를 들면, 사람, 영장류 및 설치류의 동물 세포로부터 확립된 조직 배양 세포주가 있다.

원핵성 숙주-벡터 시스템에는 많은 상이한 종에 대한 광범위한 벡터가 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은 이. 콜라이 및 이의 벡터는 일반적으로, 다른 원핵 생물에서 사용된 등가의 벡터를 포함하는 것으로 사용될 것이다. DNA를 증폭시키는데 있어서 대표적인 벡터는 pBR322 또는 이의 유도체이다. DGWCC 케모킨 또는 DGWCC 케모킨 단편을 발현시키는데 사용될 수 있는 벡터에는 lac 프로모터(pUC-계열); trp 프로모터(pBR322-trp); Ipp 프로모터(pIN-계열); 람다-pP 또는 pR 프로모터(pOTS); 또는 ptac 등의 하이브리드 프로모터(pDR540)를 함유하는 것과 같은 벡터가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다[참조: Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10; 205-236 Buttersworth, Boston, MA].

하등 진핵 생물, 예를 들면, 효모 및 딕튜오스텔륨을 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 서열 함유 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 목적상, 가장 통상적인 하등 진핵성 숙주는 빵 효모인 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 이는 일반적으로 하등 진핵 생물을 나타내기 위해 사용될 것이지만, 기타 수 많은 주(strain)와 종 또한 이용 가능하다. 효모 벡터는 전형적으로, 복제 기점(통합 유형이 아닌 한), 선별 유전자, 프로모터, 목적하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA, 및 해독 종결, 폴리아데닐화 및 전사 종결용 서열로 이루어진다. 효모에 적합한 발현 벡터로는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타 각종 당분해성 효소 유전자 프로모터와 같은 구성적(constitutive) 프로모터, 또는 알콜 데하이드로게나제 2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 유도성 프로모터가 있다. 적합한 벡터에는 다음 유형의 유도체가 포함된다: 자가 복제성 저 복사수(예를 들면, YRp-계열), 자가 복제성 고 복사수(예를 들면, YEp 계열), 통합 유형(예를 들면, YIp 계열) 또는 미니-염색체(예를 들면, YCp-계열).

고등 진핵성 조직 배양 세포가 전형적으로, 작용적으로 활성인 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질의 발현에 바람직한 숙주 세포이다. 원칙상, 많은 고등 진핵성 조직 배양 세포주, 예를 들면, 비척추동물 공급원이든지 척추동물 공급원으로부터이든지에 상관없이 곤충 바쿨로바이러스(baculovirus) 발현 시스템를 사용할 수 있다. 그러나, 해독과 동시에 및 해독 후에 적당한 프로세싱을 달성하기 위해서는 포유류 세포가 바람직하다. 이러한 세포의 형질전환이나 형질감염 및 증식은 통상적인 일이다. 유용한 세포주로는 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포주, 유아 랫트 신장(BRK) 세포주, 곤충 세포주, 조류 세포주, 및 원숭이(COS) 세포주가 있다. 이러한 세포주에 대한 발현 벡터는 통상적으로, 복제 기점, 프로모터, 해독 개시 부위, RNA 스플라이스 부위(예를 들면, 게놈성 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이들 벡터는 또한, 선별 유전자 또는 증폭 유전자를 함유할 수 있다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 아데노바이러스, SV40, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 등의 공급원으로부터 유도된 프로모터를 수반하는 레트로바이러스일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예로는 pCDNA1; pCD[참조: Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMC1neo 폴리-A[참조: Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512]; 및 pAC 373 또는 pAC 610 등의 바쿨로바이러스 벡터가 있다.

생물학적 반응을 유발시키기 위해 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 글리코실화할 필요가 없는 것 같다. 그러나, 종종 특이적이거나 한정된 글리코실화 패턴을 제공하는 시스템에서 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 것이다. 이러한 경우, 통상적인 패턴은 이러한 발현 시스템에 의해 자연적으로 제공되는 것일 것이다. 그러나, 이러한 패턴은 예를 들면, 글리코실화되지 않은 형태의 폴리펩티드를 이종 발현 시스템내로 도입된 적당한 글리코실화 단백질에 노출시킴으로써 변형될 수 있다. 예를 들면, DGWCC 케모킨 유전자를, 포유류 또는 기타 글리코실화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 공동-형질전환시킬 수 있다. 과도한 글리코실화는 DGWCC 케모킨 생물학적 활성에 유해할 수 있으며, 당해 분야의 숙련인은 최적의 생물학적 활성을 부여하는 글리코실화도를 최적화하기 위한 일상적인 시험을 수행할 수 있다는 것을 또한 인식해야 한다.

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨, 또는 이의 단편을 공학적으로 처리함으로써 세포막에 연결된 포스파티딜 이노시톨(PI)이 될 수 있지만, 포스파티딜 이노시톨 절단 효소, 예를 들면, 포스파티딜 이노시톨 포스포리파제-C로 처리함으로써 막으로부터 제거될 수 있다. 이로써, 생물학적 활성 형태의 항원이 방출되고, 단백질 화학의 표준 과정에 의해 정제를 수행할 수 있다[참조: Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988:427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; and Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283].

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨의 특징이 확인되었기 때문에, 펩티드를 합성하기 위한 통상적인 방법에 의해 이의 단편 또는 유도체를 제조할 수 있다. 이들 방법으로는 문헌[참조: Stewart and Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York; and Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY]에 기재된 것과 같은 방법이 있다. 예를 들면, 아지드 방법, 산 클로라이드 방법, 산 무수물 방법, 혼합 무수물 방법, 활성 에스테르 방법(예를 들면, p-니트로페닐 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 방법, 산화-환원적 방법 또는 디사이클로헥실카보디이미드(DCCD)/부가제 방법을 사용할 수 있다. 고체 상 및 용액 상 합성법이 모두 앞서의 방법에 적용될 수 있다. 또한, 펩티드 결합에 의해 긴 합성 펩티드를 연결하는 방법인 화학적 연결 방법이 사용될 수 있다[참조: Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779].

이와 같이 제조된 단백질 및 이의 단편을 분리한 다음, 펩티드 분리 공정, 예를 들면, 추출, 침전, 전기영동 및 각종 형태의 크로마토그래피 등에 의해 반응 혼합물로부터 정제시킬 수 있다. 본 발명의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨은 이의 목적하는 용도에 따라서 각종 순도로 수득될 수 있다. 예를 들면, 면역흡착성 친화 크로마토그래피에서, 공지된 단백질 정제 기술을 이용하거나 본원에 기재된 항체 또는 결합 파트너를 사용함으로써 정제를 수행할 수 있다. 이러한 면역흡착성 친화 크로마토그래피는 먼저, 항체를 고체 지지체에 연결한 다음, 이와 같이 연결된 항체를 적절한 공급원 세포의 가용화된 용해물, 리간드를 발현하는 기타 세포의 용해물 또는 재조합 DNA 기술의 결과로서 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 생성하는 세포의 용해물 또는 상등액과 접촉시킴으로써 수행한다[하기 참조].

DGWCC 케모킨을 다른 세포와 비교해서 고 수준으로 발현하는 세포주에 대해, 다중 세포주를 스크리닝할 수 있다. 천연의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 천연의 공급원으로부터 분리할 수 있거나, 또는 적당한 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 세포로부터 발현시킴으로써 분리할 수 있다. 이와 같이 발현된 단백질의 정제는 표준 과정에 의해 달성되거나, 또는 세포 용해물 또는 상등액으로부터 고 효율로 효과적으로 정제시키기 위한 공학처리 수단과 병행하여 정제할 수 있다. 에피토프 또는 기타 태그, 예를 들면, FLAG 또는 His₆절편을 이러한 정제 양태에 사용할 수 있다.

Ⅴ. 항체

천연(완전한 길이) 형태 및 재조합 형태 모두의, 개별적인, 다형성, 대립유전자성 주(strain) 또는 종 변이체를 포함한 각종 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨, 및 이의 단편에 대한 항체가 발생될 수 있다. 부가적으로, 활성 형태 또는 비활성 형태의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 항체가 발생될 수 있다. 항-이디오 타입(idiotypic) 항체를 사용할 수도 있다. 이러한 항체는 종, 개체 또는 다형성 변이체에 대한 각종 결합 특이성을 나타낼 수 있다.

A. 항체 생성

수 많은 면역원을 사용하여 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질과 특이적으로 반응성인 항체를 생성시킬 수 있다. 재조합 단백질이 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생성에 바람직한 면역원이다. 순수하거나 순수하지 못한 형태의 천연 단백질을 사용할 수도 있다. 본원에 기재된 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질 서열을 이용하여 만든 합성 펩티드를, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 항체 생성을 위한 면역원으로서 사용할 수도 있다. 재조합 단백질을 본원에 기재된 바와 같은 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 발현시킨 다음, 본원에 기재된 바와 같이 정제할 수 있다. 천연적으로 폴딩되거나 변성된 물질을 경우에 따라 항체 생성에 사용할 수 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성시켜, 상기 단백질을 측정하기 위한 면역검정에 연속적으로 사용할 수 있다.

폴리클로날 항체를 생성하는 방법은 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있다. 전형적으로, 특정 면역원, 바람직하게는 정제된 단백질을 보조제와 혼합하고, 동물을 상기 혼합물로 면역시킨다. 시험용 혈액을 채취한 다음 목적하는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질에 대한 반응성 역가를 측정하여, 상기 면역원 제제에 대한 상기 동물의 면역 반응을 모니터한다. 상기 면역원에 대한 적절히 높은 항체 역가가 수득되는 경우에는, 통상적으로 반복된 면역화 이후에 상기 동물로부터 혈액을 수집하고 항혈청을 제조한다. 경우에 따라, 상기 단백질에 반응성인 항체를 풍부하게 하기 위해 항혈청을 추가로 분별할 수 있다[참조: Harlow and Lane; or Coligan].

당해 분야의 숙련인에게 잘 알려진 각종 기술에 의해 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 전형적으로, 목적하는 항원으로 면역시킨 동물로부터의 비장 세포를, 통상적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화시킨다[참조: Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519; 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 불멸화시키는 또 다른 방법으로는 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus), 온코진(oncogene) 또는 레트로바이러스로의 형질전환 방법, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법이 있다. 불멸화된 단일 세포로부터 발생된 콜로니를 대상으로 하여, 상기 항원에 대한 목적하는 특이성과 친화성을 지닌 항체의 생성에 대해 스크리닝하고, 이러한 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 수율을, 척추동물 숙주의 복강 내로의 주입을포함한 각종 기술에 의해 증진시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는, 예를 들면, 문헌[참조: Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281]에 요약된 일반적인 프로토콜에 따라서 사람 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 모노클로날 항체 또는 이의 결합성 단편을 암호화하는 DNA 서열을 분리할 수 있다.

DGWCC 케모킨의 예정된 단편에 대한 항체(결합성 단편 및 단일 쇄 버전을 포함함)는, 동물을 이러한 단편과 상기 언급된 바와 같은 담체 단백질과의 접합체로 면역시킴으로써 생성될 수 있다. 모노클로날 항체는 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 제조된다. 이들 항체를 대상으로 하여, 정상적이거나 결함있는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 결합에 대해 스크리닝하거나, 또는 특정 수용체를 통하여 매개된 효능제 또는 길항제 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 통상적으로 약 1mM 이상, 더욱 통상적으로는 약 300μM 이상, 전형적으로는 약 10μM 이상, 더욱 전형적으로는 약 30μM 이상, 바람직하게는 약 10μM 이상, 더욱 바람직하게는 약 3μM 이상의 K_D로 결합될 것이다.

몇몇 경우에서는, 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등의 각종 포유류 숙주로부터 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 기술에 관한 기재 내용이, 예를 들면, 다음 문헌에서 발견될 수 있다[참조: Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 본원에 인용된 참조문헌; Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York, NY; 및 특히 Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497, 이에는 모노클로날 항체의 생성 방법이 기재되어 있다]. 간략하게 요약하면, 이러한 방법은 특정 동물에게 면역원을 주입하는 것을 포함한다. 이어서, 상기 동물을 희생시키고 이의 비장으로부터 취한 세포를 골수종 세포와 융합시킨다. 그 결과, 시험관내에서 재생될 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"가 생성된다. 이어서, 하이브리도마 집단을 스크리닝하여, 각각 상기 면역원에 대한 단일 항체 종을 분비하는 개개의 클론을 분리시킨다. 이러한 방식으로 수득된 개별적인 항체 종은 면역원성 물질 상에 인식된 특이적 부위에 대해 반응하여 생성된 면역 동물로부터의 불멸화되고 클로닝된 단일 B 세포의 생성물이다.

기타 적합한 기술은 파아지 또는 유사한 벡터에서 항체의 라이브러리를 선별하는 것을 포함한다[참조: Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281; and Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546]. 키메라성 또는 사람화 항체를 포함한, 본 발명의 항체 및 폴리펩티드를 변형시키면서 또는 변형시키지 않고서 사용할 수 있다. 종종, 이러한 폴리펩티드 및 항체를, 검출 가능한 시그날을 제공해주는 물질과 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시켜 표지시킬 것이다. 광범위한 표지 및 접합 기술은 공지되어 있고 과학지 및 특허 문헌 모두에 광범위하게 보고되었다. 적합한 표지로는 방사성핵종, 효소, 기질, 조인자, 억제인자, 형광성 잔기, 화학 발광성 잔기, 자기 입자 등이 있다. 이러한 표지의 용도를 교시하고 있는 특허로는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 있다. 또한, 재조합 면역글로불린을 생성시킬 수 있다[참조: Cabilly, 미국 특허 제4,816,567호; 및 Queen, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033].

본 발명의 항체는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질을 분리하는데 있어서 친화성 크로마토그래피에 유용하다. 상기 항체가 고체 지지체, 예를 들면, 아가로즈 등의 입자, SEPHADEX 등에 결합된 칼럼을 제조하고, 이러한 칼럼을 통하여 세포 용해물 또는 상등액을 통과시킬 수 있으며, 이 칼럼을 세척한 다음, 농도를 증가시키면서 순한 변성제로 세척함으로써, 정제된 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질이 방출될 것이다. 마찬가지로, 이러한 케모킨에 결합되는 항체는 수용체 결합을 중화시킬 수 있으며, 수용체 길항제로서 작용할 수 있다. 이들은 또한, 웨스턴 블롯 검출용 시약 또는 ELISA 시약으로서 유용할 수 있다.

상기 항체를 사용하여 특정한 발현 생성물에 대한 발현 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 통상적으로, 이러한 과정에 사용된 항체는 항원 결합에 의한 항원의 존재 여부를 용이하게 탐지해주는 잔기로 표지될 것이다.

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 발현하는 세포 집단을 동정하기 위하여, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 항체를 사용할 수 있다. 예를 들면, DGWCC 케모킨을 발현하는 세포의 발현 생성물을 검정함으로써, 특정 질병, 예를 들면, 면역-보상(immune-compromised) 질환을 진단할 수 있다.

각각의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대해 발생된 항체는 또한, 항-이디오타입 항체를 발생시키기에 유용할 것이다. 이들은 상기 항원의 발현과 관련된 각종 면역학적 질환을 탐지 또는 진단하는데 유용할 것이다.

B. 면역검정

각종 면역검정법에 의해 특정한 단백질을 측정할 수 있다. 일반적으로 면역학적 및 면역검정 과정을 고찰하기 위하여, 다음 문헌[Stites and Terr (eds.)(1991) Basic and Clinical Immunology (7th ed.)]을 참조할 수 있다. 더우기, 본 발명의 면역검정은 문헌[참조: Maggio(ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, 상기 참조, 이들 각각은 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다; 또한, Chan(ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price and Newman(eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; and Ngo(ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY]에 광범위하게 고찰된, 많은 양태로 수행될 수 있다.

예를 들면, DVic-1 케모킨 단백질을 측정하기 위한 면역검정은 당해 분야의 숙련인에게 공지된 각종 방법에 의해 수행될 수 있다. 간략하게 언급하면, 이러한 단백질을 측정하기 위한 면역검정은 경쟁적이거나 비경쟁적인 결합 검정일 수 있다. 경쟁적 결합 검정에서는, 분석될 샘플이 고체 표면에 결합된 포획제 상의 특이적 결합 부위에 대해 표지된 분석물과 경쟁한다. 바람직하게는, 이러한 포획제는 상기 언급된 바와 같이 제조된 DVic-1 케모킨 단백질과 특이적으로 반응하는 항체이다. 이러한 포획제에 결합된 표지된 분석물의 농도는 샘플 내에 존재하는 자유 분석물의 양에 반비례한다.

경쟁적인 결합 면역검정에서는, 샘플 내에 존재하는 DVic-1 케모킨 단백질은 특이적인 결합제, 예를 들면, DVic-1 케모킨 단백질과 특이적으로 반응하는 항체와의 결합에 대해 표지된 단백질과 경쟁한다. 이러한 결합제를 고체 표면에 결합시켜, 결합된 표지된 단백질을 결합되지 않은 표지된 단백질로부터 분리시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는, 경쟁적 결합 검정을 액체상에서 수행할 수 있으며 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 결합된 표지된 단백질을 결합되지 않은 표지된 단백질로부터 분리시킬 수 있다. 분리를 수행한 후, 결합된 표지된 단백질의 양을 측정한다. 샘플 내에 존재하는 단백질의 양은 표지된 단백질 결합 양에 반비례한다.

또 다른 한편, 분리 단계가 필요하지 않은 동종 면역검정을 수행할 수 있다. 이들 면역검정에서는, 단백질을 이의 특이적 결합제에 결합시킴으로써, 상기 단백질 상의 표지를 변형시킬 수 있다. 이러한 표지된 단백질에서의 변형으로 인해, 표지에 의해 방출된 시그날이 감소되거나 증가되기 때문에, 면역검정의 말기에 표지를 측정하여 상기 단백질을 검출하거나 정량화할 수 있다.

각종의 비-경쟁적 면역검정법에 의해 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질을 또한 측정할 수 있다. 예를 들면, 2개-부위의 고체 상 샌드위치 면역검정을 이용할 수 있다. 이러한 유형의 검정에서는, 상기 단백질에 대한 결합제, 예를 들면, 항체를 고체 지지체에 부착시킨다. 항체일 수 있고 단백질을 상이한 위치에 결합시키는 제2의 단백질 결합제를 표지시킨다. 이러한 단백질 상의 양 부위에서 결합이 이루어진 후에, 결합되지 않은 표지된 결합제를 제거하고 상기 고체 상에 결합된 표지된 결합제의 양을 측정한다. 결합된 표지된 결합제의 양은 샘플 내의 단백질의 양에 정비례한다.

웨스턴 블롯 분석을 이용하여, 예를 들면, 샘플 내의 DGWCC 케모킨 단백질의 존재 여부를 결정할 수 있다. 이러한 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 조직 샘플 상에서 전기영동을 수행한다. 전기영동을 수행하여 단백질을 분리시키고 단백질을 적합한 고체 지지체, 예를 들면, 니트로셀룰로즈 필터에 옮긴 후, 고체 지지체를 상기 단백질과 반응하는 항체와 함께 항온처리 한다. 이러한 항체를 표지시킬 수 있거나, 또는 1차 항체와 결합되는 제2의 표지된 항체로 후속적으로 항온처리함으로써 검출될 수 있다.

상기 언급된 면역검정 포맷은 표지된 검정 성분들을 이용한다. 이 표지를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라서 검정의 목적하는 성분과 직접적으로 또는 간접적으로 커플링시킬 수 있다. 광범위한 표지 및 방법을 이용할 수 있다. 전통적으로,³H,¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C 또는³²P를 혼입하는 방사성 표지를 사용한다. 비-방사성 표지에는 표지된 항체와 결합되는 리간드, 형광단, 화학발광성제, 효소, 및 표지된 리간드에 대한 특이적 결합 쌍 구성원으로서 작용할 수 있는 항체가 포함된다. 표지의 선택은 요구되는 민감도, 화합물과의 접합 용이성, 안정성 요구 사항, 및 이용 가능한 기계류에 좌우된다. 사용될 수 있는 각종 표지화 또는 시그날 생성 시스템에 대한 고찰을 위해서, 본원에 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 제4,391,904호를 참조할 수 있다.

특정한 단백질과 반응성인 항체를 각종 면역검정법에 의해 측정할 수도 있다. 면역검정 기술에 의한 항체 측정에 적용될 수 있는 면역학적 및 면역검정 과정의 고찰을 위해서, 다음 문헌[Stites and Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) 상기 참조; Maggio(ed.) Enzyme Immunoassay, 상기 참조; and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, 상기 참조]를 참조할 수 있다.

간략하게 언급하면, 예를 들어, DVic-1 케모킨 단백질과 반응성인 항혈청을 측정하기 위한 면역검정은 경쟁적 또는 비경쟁적 결합 검정일 수 있다. 경쟁적 결합 검정에서는, 샘플 분석물이 고체 표면에 결합된 포획제 상의 특이적 결합 부위에 대해 표지된 분석물과 경쟁한다. 바람직하게는, 이러한 포획제는 상기 언급된 바와 같이 제조된 정제된 재조합 DVic-1 케모킨 단백질이다. 분리되거나 부분적으로 정제된 천연 단백질을 포함한, DVic-1 케모킨 단백질의 기타 공급원을 사용할 수도 있다. 비경쟁적 검정으로는, 샘플 분석물을 두개의 분석물-특이적 결합 시약 사이에 결합시킨 샌드위치 검정이 있다. 결합제 중의 하나가 포획제로서 사용되고 고체 표면에 결합된다. 제2의 결합제를 표지시키고 이를 사용하여, 생성된 복합체를 가시적 수단이나 기계를 통해 측정하거나 검출한다. 포획제와 표지된 결합제의 수 많은 조합이 이용될 수 있다. DGWCC 케모킨 단백질을 측정하기 위해 상기 기재된 바와 유사한, 각종의 상이한 면역검정 포맷, 분리 기술 및 표지를 사용할 수도 있다.

Ⅵ. 정제된 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨

사람 DVic-1 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 1 및 2에 제시되어 있다. 사람 DGWCC 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 5 및 6에 제시되어 있고; 마우스 DGWCC 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 7 및 8에 제시되어 있다.

정제된 단백질 또는 규정된 펩티드는 상기 언급된 바와 같이, 표준 방법에 의해 항체를 생성시키는데 유용하다. 합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 표시하여 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다[참조: Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; and Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 본원에 참조문헌으로 삽입됨]. 또 다른 한편, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 수용체는 특이적 결합 시약으로서 유용할 수 있으며, 예를 들어, DGWCC 케모킨 리간드의 정제를 위해 이의 결합 특이성을 이용할 수 있다.

DGWCC 케모킨을 발현시키는 세포주로부터 만든 발현 라이브러리를 스크리닝하기 위해 특이적 결합 조성물을 사용할 수 있다. 스크리닝하기 위한 많은 방법, 예를 들면, 표면 발현된 리간드의 표준 염색법 또는 패닝에 의한 방법이 이용 가능하다. 각종 염색법 또는 면역형광 과정에 의해 세포내 발현을 스크리닝할 수 있다. 이러한 결합 조성물을 사용하여 상기 리간드를 발현하는 세포를 친화 정제하거나 분류할 수 있다.

상동 유전자에 대한 비교와 함께, 펩티드 절편을 사용하여 특정 라이브러리를 스크리닝하기에 적당한 올리고뉴클레오티드를 생성시킬 수도 있다. 유전 암호를 이용하여 스크리닝용 프로브로서 유용한 적당한 올리고뉴클레오티드를 선별할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술과 조합하여, 합성 올리고뉴클레오티드는 천연, 대립유전자성, 다형성 변이체를 포함한, 특정 라이브러리로부터 목적하는 클론을 선별하는데 유용할 것이다.

이러한 펩티드 서열은, 상기 절편을 인식하는 항체를 생성하는 펩티드의 제조를 가능하게 하고, 또한 이러한 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오티드의 제조를 가능케 해준다. 이 서열은 또한, 합성 제조를 가능케 한다[참조: Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779]. DVic-1 및 DGWCC 케모킨은 분비 단백질일 수 있기 때문에, 유전자는 통상적으로 프로세싱 및 분비시 제거되는 N-말단 시그날 서열을 보유할 것이다. 그러나, 정확한 프로세싱 지점은 상이한 세포 유형마다 다양할 수 있으며 상이한 길이의 형태가 종종 검출된다. 문헌[참조: Nielson, et al. (1977) Protein Eng. 10:1-8]의 방법을 사용하여 시그날 절단 지점을 예견할 수 있다. 가장 밀접하게 관계되는 것으로 보고된 서열과 비교하여 구조적 특징에 관하여 분석한 결과, 다른 사이토킨, 특히 CC 및 CXC 케모킨으로서 공지된 부류의 단백질과 유사성을 나타내었다.

Ⅶ. 물리적 변이체

본 발명은 또한, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨의 아미노산 서열과 상당한 아미노산 서열 유사성을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 포괄한다. 천연 변이체에는 개체, 다형성, 대립유전자성 주 또는 종 변이체가 포함된다.

아미노산 서열 유사성 또는 서열 동일성은 필요할 경우, 갭을 요구되는 바대로 도입하여 잔기 매치(match)를 최적화함으로써 결정한다. 이는 보존적 치환을 매치물로서 간주하는 경우에는 변하게 된다. 보존적 치환에는 전형적으로, 다음 그룹 내에서의 치환이 포함된다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 상동 아미노산 서열에는 단백질 서열 내에서의 천연의 다형성, 대립유전자성, 및 종간 변이가 포함된다. 전형적인 상동 단백질 또는 펩티드는 DGWCC 케모킨의 아미노산 서열과 50 내지 100% 유사성(갭이 도입될 수 있는 경우)에서부터 75 내지 100% 유사성(보존적 치환이 포함되는 경우)을 지닐 것이다. 유사성 측정치는 약 50% 이상, 일반적으로 60% 이상, 더욱 일반적으로 65% 이상, 통상적으로 70% 이상, 더욱 통상적으로 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직한 양태에서는 85% 이상일 것이다[참조: Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; IntelliGenetics, Mountain View, CA로부터의 소프트웨어 패키지; 및 the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI].

포유류 DVic-1 케모킨 단백질을 암호화하는 핵산은 전형적으로 엄격한 조건하에서 서열 1의 핵산 서열과 하이브리드화될 것이다. 예를 들면, DVic-1 케모킨 단백질을 암호화하는 핵산은 통상적으로 엄격한 하이브리드화 조건하에서 서열 1의 핵산과 하이브리드화할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도와 pH에서 프로브 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 10℃ 정도 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매치된 프로브와 하이브리드화되는 온도(규정된 이온 강도와 pH에서)이다. 전형적으로, 엄격한 조건은 pH 7에서의 염 농도가 약 0.2몰이고 온도가 약 50℃ 이상인 조건일 것이다. 상보적 쇄의 염기 조성 및 크기, 포름아미드와 같은 유기 용매의 존재 여부 및 염기 미스매칭 정도를 포함한 기타 인자들이 하이브리드화의 엄격함에 상당한 영향을 미칠 것이다. 바람직한 양태는 42℃에서 50% 포름아미드 및 200mM NaCl 중에서 기재된 서열과 결합되는 핵산이 포함될 것이다.

분리된 DGWCC 케모킨 DNA는 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입 및 뉴클레오티드 연속물의 짧은 역위에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 이들 변형으로 인해, 고도로 유사한 생리학적, 면역원성 또는 항원성 활성을 지니고 있는 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 항원, 이들의 유도체 또는 단백질을 암호화하는 신규의 DNA 서열이 생성된다.

변형된 서열을 사용하여 돌연변이체 항원을 생성시킬 수 있거나, 또는 발현을 증진시킬 수 있다. 증진된 발현은 유전자 증폭, 전사 증가, 해독 증가 및 기타 기전과 연관이 있을 수 있다. 이러한 돌연변이체 DGWCC 케모킨 유도체에는 상기 단백질 또는 이의 단편의 예정되거나 부위-특이적인 돌연변이체가 포함된다. "돌연변이체 DGWCC 케모킨"은 앞서 제시된 바와 같은 DGWCC 케모킨의 상동성 정의 내에는 속하지만, 결실, 치환 또는 삽입을 통해서든지 간에 천연 상태로 발견되는 DGWCC 케모킨의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포괄하고 있다. 특히, "부위 특이적 돌연변이체 DGWCC 케모킨"에는 일반적으로, 서열 6 또는 8의 서열을 갖는 단백질과 상당한 유사성을 나타내는, 예를 들면, 천연 양태이고, 이들 서열과 각종 생물학적 활성, 예를 들면, 항원성 또는 면역원성 활성을 공유하는 단백질이 포함되고, 바람직한 양태에서는, 기재된 서열의 대부분 또는 전부를 함유하는 단백질이 포함된다. 이는 상이한 개체로부터의 다형성 변이체에도 적용된다. 유사한 개념이 특히 각종 온혈 동물, 예를 들면, 포유류 및 조류에서 발견되는 상이한 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질에도 적용된다. 앞서 언급된 바와 같이, 기재 내용이 구체적으로 논의된 마우스 또는 사람 양태로 제한되지 않고, 다른 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질도 포괄하는 것으로 일반적으로 인식되어야 한다.

부위 특이적 돌연변이 부위가 예정된 것이긴 하지만, 돌연변이체가 부위 특이적일 필요는 없다. 예를 들면, DGWCC 케모킨 돌연변이 발생은 아미노산을 삽입 또는 결실시킴으로써 수행할 수 있다. 최종 작제물을 수득하기 위해 치환, 결실, 삽입 또는 어떠한 조합도 발생시킬 수 있다. 삽입에는 아미노- 또는 카복실 말단 융합, 예를 들면, 에피토프 태그가 포함된다. 랜덤한 돌연변이 발생을 표적 코돈에서 수행할 수 있으며, 이어서 발현된 돌연변이체를 목적하는 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 중의 예정된 부위에서 치환 돌연변이를 발생시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있는데, 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이 발생 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술에 의해서이다[참조: Sambrook, et al. (1989) and Ausubel, et al. (1987 and Supplements)]. DNA에서의 돌연변이는 판독 프레임을 벗어나서 암호화 서열을 위치시켜서는 안되고 바람직하게는 루프나 헤어핀과 같은 2차 mRNA 구조를 형성하도록 하이브리드화할 수 있는 상보적 영역을 만들지 말아야 할것이다.

본 발명은 또한, 재조합 단백질, 예를 들면, 이들 단백질로부터의 절편을 이용한 이종 융합 단백질을 제공한다. 이종 융합 단백질은 천연적으로는 통상적으로 동일한 방식으로 융합되지 않는 단백질 또는 절편의 융합체이다. 따라서, 면역글로불린과 DGWCC 케모킨 폴리펩티드의 융합 생성물은 전형적으로 단일 해독 생성물로서 이루어진 전형적인 펩티드 연결부에 융합된 서열을 갖는 연속적인 단백질 분자이고, 각각의 공급원 펩티드로부터 유래된 성질을 나타낸다. 유사한 개념이 이종 핵산 서열에도 적용된다.

또한, 다른 단백질로부터의 유사한 작용성 도메인을 조합함으로써 새로운 작제물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 단백질 결합성 절편 또는 기타 절편을 상이한 신규의 융합 폴리펩티드 또는 단편 사이에 "대체"시킬 수 있다[참조: Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; and O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992]. 따라서, 신규의 특이성 조합을 나타내는 신규의 키메라성 폴리펩티드가 단백질 결합 특이성의 작용성 연결부 및 기타 작용성 도메인으로부터 생성될 것이다.

Ⅷ. 결합제:케모킨 단백질 복합체

서열 2 또는 8의 아미노산 서열로 이루어진 면역원과 같은 규정된 면역원에 대해 발생된 항체와 특이적 또는 선택적으로 결합되거나, 또는 이러한 항체와 특이적으로 면역반응성인 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질은 전형적으로 면역검정으로 결정된다. 이러한 면역검정은 서열 2, 6 또는 8의 단백질에 대해 발생된 폴리클로날 항혈청을 이용한다. 이러한 항혈청은 다른 케모킨에 대해 낮은 교차 반응성을 지니도록 선택되고, 이러한 교차 반응성은 상기 면역검정에서 사용하기에 앞서 면역흡착에 의해 제거된다.

특정 면역검정에 사용하기 위한 항혈청을 생성시키기 위해서는, 서열 2, 6 또는 8의 단백질을 본원에 기재된 바와 같이 분리시킨다. 예를 들면, 재조합 단백질을 포유류 세포주에서 생성시킬 수 있다. 동계교배된 마우스 주(strain), 예를 들면, BALB/c를 프로인트(Freund) 보조액 등의 표준 보조액과 표준 마누스 면역화 프로토콜(Harlow and Lane, 상기 참조)을 사용하여, 서열 2, 6 또는 8의 단백질로 면역시킨다. 또 다른 방법으로는, 본원에 기재된 서열로부터 유도되고 담체 단백질에 접합된 합성 펩티드, 바람직하게는 거의 완전한 길이의 합성 펩티드를 면역원으로 사용할 수 있다. 폴리클로날 혈청을 수집하고 면역검정, 예를 들면, 고체 지지체 상에 고정화된 면역원과의 고체 상 면역검정에서 상기 면역원 단백질에 대해 역가 측정한다. 역가치가 10⁴이상인 폴리클로날 항혈청을 선별하고, 문헌[Harlwo and Lane, pages 570-573, 상기 참조]에 기재된 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정을 이용하여, C, CC, CX3C 및 CXC 케모킨에 대한 이들의 교차 반응성에 대해 시험한다. 바람직하게는, 이러한 결정 방법에 2가지 케모킨을 사람 DGWCC 케모킨과 함께 사용한다.

교차 반응성 결정을 위해 경쟁적 결합 포맷의 면역검정을 사용할 수 있다. 예를 들면, 서열 2의 단백질 및/또는 서열 6 및/또는 8의 단백질을 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 이러한 검정에 가해진 단백질은 고정화된 항원과의 결합을 두고 항혈청과 경쟁한다. 상기 단백질이 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합과 경쟁하는 능력을 서열 2의 단백질 및/또는 서열 6 및/또는 8의 단백질과 비교한다. 표준 산정 방법을 이용하여 상기 단백질의 교차 반응도(%)를 산정한다. 앞서 열거된 각각의 단백질과 10% 미만의 교차 반응도를 나타내는 항혈청을 선별하고 수집한다. 이어서, 상기 언급된 단백질과의 면역흡착에 의해 상기와 같이 수집된 항혈청으로부터 교차 반응하는 항체를 제거한다.

이어서, 면역흡착되고 수집된 항혈청을 앞서 기재된 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정에 사용하여 면역원 단백질(예를 들면, 서열 6 또는 8의 DGWCC 케모킨 모티브)에 대한 제2의 단백질과 비교한다. 이러한 비교를 하기 위해서는, 2개의 단백질을 광범위한 농도에서 각각 검정하고, 고정화된 단백질에 대한 항혈청의 결합을 50% 억제시키는데 필요한 각 단백질의 양을 결정한다. 요구된 제2의 단백질의 양이 요구되는 단백질의 양, 예를 들면, 서열 6 또는 8의 단백질의 양의 2배 보다 적으면, 제2의 단백질은 상기 면역원에 대해 발생된 항체와 특이적으로 결합되는 것으로 여겨진다.

DGWCC 케모킨 단백질은 밀접하게 관계된 유전자를 포함하는 종 간의 상동 단백질 그룹의 종 형태라는 것을 인지해야 한다. DGWCC 케모킨 단백질과 같은 특정한 유전자 생성물의 경우에는, 상기 용어가 본원에 기재된 아미노산 서열 뿐만 아니라 다형성, 대립유전자성 또는 비-대립유전자성 변이체인 기타 단백질을 지칭한다. 용어 "DGWCC"는 단일 부위 돌연변이와 같은 통상적인 재조합 기술을 이용하는 계획적인 돌연변이에 의하거나, DGWCC 케모킨 단백질을 암호화하는 DNA의 짧은 절편을 절단하거나, 또는 새로운 아미노산으로 치환시키거나 새로운 아미노산을 가함으로써 도입된 비-천연의 돌연변이를 포함한다. 이러한 보다 작게 이루어진 변형물은 본래 분자의 면역동질성 및/또는 이의 생물학적 활성을 상당히 유지해야만 한다. 따라서, 이들 변형물에는 지정된 천연의 DGWCC 케모킨 단백질, 예를 들면, 서열 6 또는 8에 도시된 DGWCC 케모킨 단백질과 특이적으로 면역반응성인 단백질이 포함된다. 이와 같이 변형된 단백질의 생물학적 성질은 상기 단백질을 적당한 세포주에서 발현시킨 다음, 적절한 생물학적 활성, 예를 들면, 화학주성 효과를 측정함으로써 결정할 수 있다. 보다 작은 것으로 간주된 특정한 단백질 변형에는 전체로서 DGWCC 케모킨에 대해 앞서 기재된 바와 같은 유사한 화학적 성질을 갖는 아미노산의 보존적 치환이 포함된다. 서열 6 또는 8의 단백질과 최적으로 특정 단백질을 정렬하고 면역동질성을 측정하기 위해 본원에 기재된 통상적인 면역검정을 사용하거나, 또는 임파구 화학주성 검정을 이용함으로써, 본 발명의 단백질 조성을 결정할 수 있다.

Ⅸ. 작용성 변이체

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 생리학적 반응을 차단하는 것은 상기 단백질이, 예를 들면, 경쟁적 억제를 통하여 이의 수용체와 결합되는 것을 억제시킴으로써 비롯될 수 있다. 따라서, 본 발명의 시험관내 검정은 종종, 분리된 단백질, 재조합 막-결합된 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 발현하는 세포로부터의 막, 이들 단백질의 수용체 결합 절편을 포함하는 가용성 단편, 또는 고체 상 기질에 부착된 단편을 이용할 것이다. 이들 검정은 또한, 결합성 절편 돌연변이체 및 변형체의 효과, 또는 단백질 돌연변이체 및 변형체, 예를 들면, 단백질 동족체의 효과를 진단적으로 결정해줄 수 있을 것이다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 항원 또는 수용체 단편에 대한 중화 항체가 단백질에 대한 결합을 두고 시험 화합물과 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 검정의 사용을 고려하고 있다. 이러한 방식으로, 항체를 사용하여 상기 단백질의 하나 이상의 항원성 결합 부위를 공유하는 폴리펩티드의 존재 여부를 탐지할 수 있으며, 또한 이를 사용하여 수용체와 상호작용할 수도 있는 단백질 상의 결합 부위를 점유할 수 있다.

예를 들면, DGWCC 케모킨 항원의 "유도체"에는 아미노산 서열 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 및 다른 화학적 잔기와의 공유적 또는 집합적 접합체가 포함된다. 공유적 유도체는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, DGWCC 케모킨 아미노산 측쇄 또는 N- 또는 C-말단에서 발견되는 그룹에 작용기를 연결함으로써 제조할 수 있다. 이들 유도체에는 카복실 말단의 지방족 에스테르 또는 아미드, 또는 카복실 측쇄를 함유하는 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 하이드록실 그룹 함유 잔기의 O-아실 유도체, 및 아미노 말단 아미노산 또는 아미노 그룹 함유 잔기, 예를 들면, 리신 또는 아르기닌의 N-아실 유도체가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 아실 그룹은, 예를 들어, C3 내지 C18 정상적인 알킬을 포함한 알킬 잔기 그룹 중에서 선택됨으로써, 알카노일 아로일 종을 형성시킨다. 담체 단백질에 대한 공유적 결합은 면역원성 잔기가 합텐인 경우에 중요하다.

특히, 예를 들어, 특정 폴리펩티드의 합성 및 프로세싱 동안, 또는 추가의 프로세싱 단계에서 이러한 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시킴으로써 제조된 글리코실화 변형체가 포함된다. 이를 수행하는데 특히 바람직한 방법은 정상적으로 이러한 프로세싱을 제공해주는 세포로부터 유도된 글리코실화 효소, 예를 들면, 포유류 글리코실화 효소에 상기 폴리펩티드를 노출시키는 것이다. 탈글리코실화 효소가 또한 고려된다. 또한, 포스포릴화 아미노산 잔기, 예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌, 또는 리보실 그룹이나 가교결합용 시약을 포함한 기타 잔기를 포함한, 기타 보다 작은 변형을 지닌 동일한 1차적 아미노산 서열의 유형도 포괄된다.

주요 유도체 그룹은 DGWCC 케모킨 또는 이의 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩티드와의 공유 접합체이다. 이들 유도체는 N- 또는 C-말단 융합물과 같은 재조합 배양물에서 합성하거나, 또는 반응성 측쇄 그룹을 통하여 단백질을 가교결합시키는데 유용한 것으로 당해 분야에 공지된 제제를 사용함으로써 합성할 수 있다. 가교결합제를 이용한 바람직한 단백질 유도체화 부위는 유리 아미노 그룹, 탄수화물 잔기 및 시스테인 잔기이다.

DGWCC 케모킨과 기타 동종 또는 이종 단백질 간의 융합 폴리펩티드가 또한 제공된다. 많은 성장 인자 및 사이토킨은 동종 이량체이고, 반복 작제물은 단백질 분해적 분해에 대한 감수성이 떨어지는 것을 포함한 각종 이점을 지닐 수 있다. 더우기, 많은 수용체는 특정 시그날을 형질도입하기 위해 리간드 이량체화를 필요로 하며, 각종 이량체성 단백질 또는 도메인 반복체가 바람직할 수 있다. 이종 폴리펩티드는 상이한 표면 마커 간의 융합물일 수 있기 때문에, 예를 들어, 수용체 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 단백질이 생성된다. 마찬가지로, 유도체 단백질의 성질이나 활성의 조합을 나타내는 이종 융합물이 작제될 수 있다. 전형적인 예는 리포터 폴리펩티드, 예를 들면, 루시퍼라제와 특정 단백질의 절편 또는 도메인, 예를 들면, 수용체 결합성 절편과의 융합물이기 때문에, 이와 같이 융합된 단백질의 존재 또는 위치가 용이하게 결정될 수 있다[참조: Dull, et al. 미국 특허 제4,859,609호]. 기타 유전자 융합 파트너로는 세균성 b-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, β-락타마제, 알파-아밀라제, 알콜 데하이드로게나제 및 효모 알파 교배 인자가 있다[참조: Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816].

이러한 폴리펩티드는 포스포릴화, 설폰화, 바이오티닐화 또는 기타 잔기의 부가 또는 제거에 의해 화학적으로 변형시킨 아미노산 잔기, 특히 포스페이트 그룹과 유사한 분자 형태를 갖는 것을 가질 수도 있다. 몇몇 양태에서는, 이러한 변형이 시약을 표지시키는데 유용하거나 정제용 표적, 예를 들면, 친화 리간드로서 작용할 것이다.

본 발명은 또한, 아미노산 서열 또는 글리코실화의 변이 이외의 DGWCC 케모킨의 유도체의 사용을 고려하고 있다. 이러한 유도체는 화학적 잔기와의 공유적 또는 집합적 결합과 관련이 있을 수 있다. 이들 유도체는 일반적으로, 다음 세 가지 부류에 속한다: (1) 염, (2) 측쇄 및 말단 잔기 공유적 변형, 및 (3) 예를 들면, 세포막과의 흡착 복합체. 이러한 공유적 또는 집합적 유도체는 면역원으로서, 면역검정에서의 시약으로서, 또는 리간드 또는 다른 결합성 리간드의 친화 정제와 같은 정제 방법에서 유용하다. 예를 들면, DGWCC 케모킨 항원을 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 시아노겐 브로마이드-활성화된 SEPHAROSE 등의 고체 지지체에 대한 공유 결합에 의해 고정화시킬 수 있거나, 또는 항-DGWCC 케모킨 항체 또는 이의 수용체의 검정 또는 정제에 사용하기 위해, 글루타르알데히드 가교결합을 이용하거나 이용하지 않으면서 폴리올레핀 표면 상으로 흡착시킬 수 있다. DGWCC 케모킨을 또한, 검출 가능한 그룹, 예를 들면, 클로라민 T 과정에 의해 방사성요오드화되거나, 희토금속 킬레이트에 공유적으로 결합되거나, 또는 진단 검정에 사용하기 위해 또 다른 형광성 잔기에 접합된 탐지 가능한 그룹으로 표지시킬 수 있다. DGWCC 케모킨의 정제는 고정화 항체 또는 수용체에 의해 수행될 수 있다.

분리된 DGWCC 케모킨 유전자는 상응하는 DGWCC 케모킨의 발현이 결여된 세포, 예를 들면, 상응하는 단백질이 결여되어 있고 음성 백그라운드(background) 활성을 나타내는 종 유형 또는 세포를 형질전환시켜 줄 것이다. 형질전환된 유전자를 발현시킴으로써, 규정되거나 단일의 종 변이체를 갖는, 항원적으로 순수한 세포주를 분리할 수 있다. 이러한 접근 방식은 DGWCC 케모킨 수용체 단백질의 생리학적 효과를 보다 민감하게 탐지해주고 구별시켜 준다. 아세포성 단편, 예를 들면, 세포원형질 또는 막 단편을 분리하여 사용할 수 있다. 한 예로서 DGWCC을 이용한 기재 내용은 일반적으로, DVic-1에도 또한 적용 가능할 것이다.

Ⅹ. 용도

본 발명은 예를 들어, 발생적 이상에 대한 개론에서 앞서 기재된 바와 같은 진단 적용 분야에 사용할 수 있거나 다음 진단용 키트에 관한 기재에서 사용될 시약을 제공한다.

DGWCC 케모킨 뉴클레오티드, 예를 들면, DGWCC 케모킨 DNA 또는 RNA가 법정상 검정의 성분으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 제공된 뉴클레오티드 서열을, 예를 들어,³²P 또는 바이오틴을 사용하여 표지시킬 수 있으며, 이를 개체들간 또는 종 공급원들 간을 구별시키는데 도움을 주는 측정 가능한 특성을 제공해주면서, 프로브 표준 제한 단편 다형성 블롯에 사용한다. 이러한 프로브를 유전적 지문 날인과 같은 널리 공지된 법정상의 기술에 사용될 수 있다. 또한, DGWCC 케모킨 서열로부터 제조된 뉴클레오티드 프로브를 원 위치(in situ) 검정에서 사용하여 염색체 이상 여부를 탐지할 수 있다. 예를 들면, DGWCC 케모킨 유전자를 암호화하는 사람 염색체의 재배열을, DGWCC 케모킨 프로브를 다른 공지된 염색체 마커와 함께 사용하여 널리 공지된 원 위치 기술을 통하여 탐지할 수 있다.

DGWCC 케모킨 단백질 또는 핵산에 대해 지시된 항체 및 기타 결합제를 사용하여 상응하는 DGWCC 케모킨 분자를 정제할 수 있다. 다음 실시예에 기재되는 바와 같이, DGWCC 케모킨 성분의 항체 정제는 가능할 뿐만 아니라 실용적이다. 항체 및 기타 결합제를 또한 진단 방식으로 이용하여, 본원에 기재된 널리 공지된 기술을 사용하여 DGWCC 케모킨 성분이 조직 샘플 또는 세포 집단 내에 존재하는 지의 여부를 결정할 수 있다. 결합제를 DGWCC 케모킨에 결합시키는 능력은 DGWCC 케모킨의 부적절한 조절과 연관된 질환을 진단하기 위한 수단을 제공해준다. 항체 및 기타 DGWCC 케모킨 결합제는 조직학적 마커로서 유용할 수 있다. 다음 실시예에 기재되는 바와 같이, DGWCC 케모킨 발현은 특이적 조직 유형에 한정된다. DGWCC 케모킨에 대한 항체 또는 핵산 등의 프로브를 지시함으로써, 이러한 프로브를 동일계 또는 시험관내 조직 및 세포 유형을 구별하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상당한 치료학적 가치를 지닌 시약을 제공해준다. DGWCC 케모킨(천연 또는 재조합), 이의 단편 및 이에 대한 항체는 DGWCC 케모킨에 대한 결합 친화성을 나타내는 것으로 동정된 화합물과 함께, 비정상적인 증식, 예를 들면, 암 발생 상태, 또는 변성적 질환 상태를 포함한, 비정상적인 생리학 또는 발생과 연관된 질환을 치료하는데 유용하다. 비정상적인 증식, 재생, 변성 및 위축은 본원에 제공된 조성물을 사용하여 적절한 치료를 함으로써 완화될 수 있다. 예를 들면, DGWCC 케모킨에 의한 비정상적인 발현 또는 비정상적인 시그날 발생과 연관된 질환이나 장애가 상기 단백질의 효능제 또는 길항제에 대한 표적이다. 이러한 단백질은 면역학적 반응에 영향을 미치는 신경 또는 조혈 세포, 예를 들면, 임파양 세포의 조절 또는 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.

기타 비정상적인 발생학적 상태가 노던 블롯 분석에 의해 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 mRNA을 보유하는 것으로 나타난 세포 유형에 공지되어 있다[참조: Berkow(ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy; Merck ＆ Co., Rahway, NJ; and Thorn, et al. Harrison's Principle of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY]. 예를 들면, 신경 또는 면역 시스템의 발생학적 또는 기능적 이상으로 인해, 본원에 제공된 조성물을 이용한 예방이나 치료에 영향을 받을 수 있는, 상당한 의학적 이상 현상 및 질환이 야기된다.

특정 케모킨은 또한, 바이러스성 복제 기전과 연관이 있다[참조: Cohen (1986) Science 272:809-810; Feng, et al. (1996) Science 272:872-877; and Cocchi, et al. (1995) Science 270:1811-1816]. DVic-1 또는 DGWCC 케모킨이 유사한 관점에서 유용할 수 있다.

재조합 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 또는 케모킨 항체를 정제한 다음, 환자에 투여할 수 있다. 이들 시약을 치료 목적을 위해 생리학적으로 무해한 안정화제 및 부형제와 함께, 예를 들면, 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 예를 들면, 면역원성 보조액 중에서 부가적 활성 또는 불활성 성분과 배합할 수 있다. 이들 배합물을 멸균 여과시킨 다음, 투여용 바이알에서 동결건조시키거나 안정화된 수성 제제에서 저장함으로써 투여형태속에 넣을 수 있다. 본 발명은 또한, 보체 결합되지 않은 형태를 포함한, 항체 또는 이의 결합성 단편의 용도를 고려하고 있다.

연관된 화합물을 분리하는 것을 포함한, 항체 또는 이의 수용체 또는 단편을 이용한 약물 스크리닝으로, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 결합 친화성을 지니고 있는 화합물을 동정할 수 있다. 이어서, 후속 생물학적 검정을 활용하여, 화합물이 고유의 자극 활성을 지니고 있어 단백질의 활성을 차단시킨다는 점에서 차단제 또는 길항제인지를 결정할 수 있다. 마찬가지로, 고유의 자극 활성을 지닌 화합물이 수용체를 활성화할 수 있으므로, 이것이, 예를 들면, DGWCC 케모킨의 활성을 자극한다는 점에서 효능제이다. 본 발명은 추가로, 길항제로서의 DGWCC 케모킨에 대한 항체의 치료학적 용도를 고려하고 있다. 이러한 접근 방식은 다른 DGWCC 케모킨 종 변이체의 경우에 특히 유용하다.

효과적인 치료에 필요한 시약의 양은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태 및 투여된 기타 약물을 포함한 수 많은 상이한 요인에 좌우될 것이다. 따라서, 치료 투여량을 역가 측정하여 안전성과 효능을 최적화시켜야 한다. 전형적으로, 시험관내에서 사용된 투여량은 이들 시약의 동일계 투여에 유용한 양에 유용한 지침을 제공할 수 있다. 특정한 질환 치료에 유효한 투여량에 관한 동물 시험은 사람 투여량을 예견할 수 있게 해준다. 각종 고려 사항이 예를 들어, 문헌[참조: Gilman, et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Science (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA]. 예를 들어, 경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여, 경피 확산 투여 방법 등이 본원 및 다음에 논의된다. 약제학적으로 허용되는 담체에는 물, 식염수, 완충액, 및 문헌[참조: the Merck Index, Merck ＆ Co., Rahway, NJ]에 기재된 기타 화합물이 포함될 것이다. 투여량 범위는 적절한 담체의 경우, 1mM 농도 미만, 전형적으로는 약 10μM 미만, 통상적으로는 약 100nM 미만, 바람직하게는 약 10pM(피코몰) 미만, 가장 바람직하게는 약 1fM(펨토몰) 미만의 양이 되는 것으로 통상 예상된다. 서방출 제형 또는 서방출 장치가 연속적인 투여에 종종 활용될 것이다.

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨, 이의 단편, 및 이에 대한 항체 또는 이의 단편, 길항제 및 효능제를 치료하고자 하는 숙주에 직접적으로 투여할 수 있거나, 화합물의 크기에 따라서, 이들을 투여하기 전에 오브알부민 또는 혈청 알부민 등의 담체 단백질과 이들을 접합시키는 것이 바람직할 수 있다. 치료학적 제형은 통상적인 임의의 투여용 제형으로 투여할 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여하는 것이 가능하긴 하지만, 이것이 약제학적 제형 내에 존재하는 것이 바람직하다. 제형은 전형적으로, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을 이에 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 포함한다. 각 담체는 다른 성분과의 상용성 측면과 환자에 손상을 입히지 않는다는 점에서 약제학적 및 생리학적으로 둘 다 허용되어야 한다. 제형은 경구, 직장, 비내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내) 투여용으로 적합한 것을 포함한다. 이러한 제형은 단위 투여량 형태로 편리하게 제시될 수 있으며 약제학 분야에 널리 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조할 수 있다[참조: Gilman, et al. (eds) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Science (17th ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al. (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; and Lieberman, et al.(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY]. 본 발명의 치료법을 다른 치료제와 함께 또는 연합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 천연 형태의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨과 재조합 형태의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 모두가, 상기 단백질과의 결합 활성에 대해 화합물을 스크리닝할 수 있는 키트 및 검정 방법에 특히 유용하다. 단기간 내에 수 만개의 화합물을 스크리닝해주는 몇몇 자동화 검정 방법이 최근 수년간 개발된 바 있다[참조: Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773; 및 다수의 화합물에 의한 결합 친화성을 시험하기 위한 수단이 기재되어 있는, 화학적 다양성 라이브러리의 기타 기재서]. 적합한 검정법의 개발은 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 다량의 정제된 가용성 DGWCC 케모킨의 이용도에 의해 상당히 촉진될 수 있다.

예를 들면, 단백질을 구조적으로 규정하기만 하면 이에 대한 길항제를 통상적으로 밝혀낼 수 있다. 정제된 수용체를 사용하는 고도로 자동화된 검정 방법을 개발하게 되면, 효능있는 단백질 동족체를 시험하는 것이 현재 가능해진다. 특히, 본원에 기재된 스크리닝 기술을 사용함으로써 신규의 효능제 및 길항제를 밝혀낼 것이다. 특히 중요한 것은 다수의 DGWCC 케모킨 수용체에 대한 조합된 결합 친화성을 지니는 것으로 밝혀진 화합물, 예를 들면, DGWCC 케모킨의 종 변이체에 대한 길항제로서 작용할 수 있는 화합물이다.

본 발명은 각종 약물 스크리닝 기술에 재조합 단백질을 사용함으로써 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. 특이적 리간드를 스크리닝하는데 재조합 단백질을 사용하는 경우의 이점으로는 (a) 특정 공급원으로부터 재생 가능한 DGWCC 케모킨의 공급원 증진; (b) 검정에서 보다 우수한 시그날 대 잡음(noise) 비를 제공해주는, 세포당 잠재적으로 훨씬 많은 수의 리간드; 및 (c) 종 변이체 특이성(이론적으로 보다 큰 생물학적 및 질병 특이성을 제공해준다).

약물 스크리닝하는 한 방법은 케모킨 수용체를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환되는 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 기타 어떠한 것으로부터의 분리시 수용체를 발현하는 세포를 분리할 수 있다. 생존 가능한 형태 또는 고정된 형태의 상기 세포를 표준 리간드/수용체 결합 검정에 사용할 수 있다[참조: Parce, et al. (1989) Science 246:243-247; and Owicki, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011, 이에는 세포성 반응을 탐지하는 민감한 방법이 기재되어 있다]. 세포(DGWCC 케모킨의 공급원)를¹²⁵I-항체 등의 리간드에 대한 공지된 결합 친화성을 지닌 표지된 수용체 또는 항체, 및 결합 조성물에 대한 이의 결합 친화도가 측정된 시험 샘플과 접촉시킨 다음 배양하는 경쟁적 검정이 특히 유용하다. 이어서, 결합된 및 자유 표지된 결합 조성물을 분리하여 리간드 결합도를 평가한다. 결합된 시험 화합물의 양은 공지된 공급원에 대한 표지된 수용체 결합물의 양에 반비례한다. 수 많은 기술 중의 어느 하나의 기술을 사용하여 유리 리간드로부터 결합된 리간드를 분리하여 리간드 결합도를 평가할 수 있다. 이러한 분리 단계는 전형적으로, 필터에 접착시킨 다음 세척하거나, 플라스틱에 접착시킨 다음 세척하거나, 세포막을 원심분리시키는 것과 같은 과정을 포함한다. 생존하는 세포를 또한 사용하여 DGWCC 케모킨-매개된 기능에 대한 약물의 효과, 예를 들면, 제2 메신저 수준, 즉 Ca⁺⁺; 세포 증식; 이노시톨 포스페이트 풀(pool) 변화 등에 대해 스크리닝할 수 있다. 몇몇 탐지 방법은, 분리 단계, 예를 들면, 근접해 있는 민감성 탐지 시스템의 제거를 허용한다. 칼슘 민감성 염료가 형광계 또는 형광성 세포 분류 장치를 이용하여 Ca⁺⁺수준을 탐지하는데 유용할 것이다.

또 다른 방법은 DGWCC 케모킨의 공급원으로서 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포로부터의 막을 이용한다. 이들 세포는, 예를 들면, 조작된 막 결합된 형태의 DGWCC 케모킨의 발현을 지시하는 DNA 벡터로 안정하게 형질전환시킨다. 필수적으로, 이러한 막은 상기 세포로부터 제조되며 앞서 제시된 바와 같은 경쟁적 검정 등의 수용체/리간드 결합 검정에 사용될 것이다.

또 다른 접근법은 형질전환된 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포로부터 가용화되고 정제되지 않거나, 또는 가용화되고 정제된 DGWCC 케모킨을 사용하는 것이다. 이로써, 특이성 증가, 자동화 능력 및 약물 시험의 높은 처리율의 이점을 지닌 "분자상" 결합 검정이 가능해진다.

약물 스크리닝의 또 다른 기술은 DGWCC 케모킨 항체에 대한 적합한 결합 친화성을 지닌 화합물을 높은 처리율로 스크리닝하는 방법을 포함한다. 먼저, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 고체 기판, 예를 들면, 플라스틱 핀 또는 몇몇 기타 적당한 표면 상에서 합성한다[참조: Foder, et al. 상기 참조]. 이어서, 모든 핀을 가용화되고 정제되지 않거나 가용화되고 정제된 DGWCC 케모킨 항체와 반응시킨 다음 세척한다. 다음 단계는 결합된 DGWCC 케모킨 항체를 탐지하는 것을 포함한다.

합리적인 약물 고안은 또한, DGWCC 케모킨 및 기타 효과인자 또는 동족체의 분자 형태에 관한 구조적 연구를 근거로 하여 이루어질 수 있다[참조: Methods in Enzymology vols. 202 and 203]. 효과인자는 리간드 결합에 반응하여 다른 기능을 매개하는 기타 단백질, 또는 수용체와 정상적으로 반응하는 기타 단백질일 수 있다. 특이적 기타 단백질과 반응하는 부위를 결정하기 위한 한 가지 방법은 물리적 구조 결정법, 예를 들면, X선 결정학 또는 2차원적 NMR 기술이다. 이들은 아미노산 잔기가 분자상 접촉 영역을 형성하는 것에 관한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조상 결정에 관한 상세한 설명은 다음 문헌을 참조할 수 있다[Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography Academic Press, NY].

앞서 언급된 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위하여, 정제된 DGWCC 케모킨을 플레이트 상에 직접적으로 도포할 수 있다. 그러나, 이들 리간드에 대한 비-중화 항체를 포획 항체로서 사용하여 각각의 리간드를 고체 상에 고정화시킬 수 있다. DGWCC를 사용한 실시예는 또한 DVic-1 케모킨을 이용하여도 수행할 수 있다.

ⅩⅠ. 키트

본 발명은 또한, 케모킨 또는 케모킨 수용체의 존재 여부를 탐지하기 위한 각종 진단용 키트 및 방법에서의 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 단백질, 이의 단편, 펩티드 및 이들의 융합 생성물의 용도를 고려하고 있다. 전형적으로, 이러한 키트는 규정된 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 펩티드 또는 유전자 절편, 또는 수용체 단편 또는 항체 등을 인식하는 시약을 함유하는 구획을 가질 것이다.

예를 들면, DGWCC 케모킨에 대한 시험 화합물의 결합 친화성을 결정하기 위한 키트는 전형적으로, 시험 화합물; 표지된 화합물, 예를 들면, DGWCC 케모킨에 대한 공지된 결합 친화성을 지닌 수용체 또는 항체; DGWCC 케모킨의 공급원(천연 또는 재조합); 및 유리된 표지된 화합물로부터 결합된 표지된 화합물을 분리하기 위한 수단, 예를 들면, DGWCC 케모킨을 고정화하기 위한 고체 상을 포함할 것이다. 일단 화합물이 스크리닝되면, DGWCC 케모킨에 대한 적합한 결합 친화성을 지닌 것을 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 적합한 생물학적 검정으로 평가하여 이들이 수용체에 대한 효능제로서 작용하는지 아니면 길항제로서 작용하는지의 여부를 결정할 수 있다. 재조합 DGWCC 케모킨 폴리펩티드의 이용도는 또한, 이러한 검정의 정밀 측정하기 위한 잘 규정된 표준을 제공해준다.

예를 들면, 샘플 중의 DGWCC 케모킨의 농도를 결정하는데 바람직한 키트는 전형적으로, DGWCC 케모킨에 대한 공지된 결합 친화성을 지닌 표지된 화합물, 예를 들면, 수용체 또는 항체, DGWCC 케모킨의 공급원(천연 또는 재조합), 및 유리된 표지된 화합물로부터 결합물을 분리시키기 위한 수단, 예를 들면, DGWCC 케모킨을 고정화시키기 위한 고체 상을 포함할 것이다. 시약을 함유하는 구획, 및 지침서가 통상적으로 제공될 것이다.

DGWCC 케모킨 또는 리간드 단편에 특이적인, 항원 결합성 단편을 포함한 항체는 증가된 수준의 DGWCC 케모킨 및/또는 이의 단편의 존재 여부를 검출하기 위한 진단 적용 분야에 유용하다. 이러한 진단 검정은 용해물, 살아있는 세포, 고정된 세포, 면역형광성, 세포 배양물, 체액을 이용할 수 있으며, 추가로 혈청 중의 리간드와 관련된 항원의 검출 등을 포함할 수 있다. 진단 검정은 동종(유리된 시약과 항원-DGWCC 케모킨 복합체 간의 분리 단계를 수반하지 않음) 또는 이종(분리 단계를 수반함)일 수 있다. 방사성 면역검정(RIA), 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 효소 면역검정(EIA), 효소-다중화 면역검정 기술(EMIT), 기질 표지된 형광성 면역검정(SLFIA) 등의 각종 상업용 검정이 존재한다. 예를 들면, DGWCC 케모킨 또는 이의 특정한 단편에 대한 항체를 인식하고 표지시킨 제2의 항체를 사용함으로써, 표지되지 않은 항체를 이용할 수 있다. 유사한 분석이 또한, 다음 문헌에 광범위하게 논의되었다[참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan(ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price and Newman(eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; and Ngo(ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY].

항-이디오타입 항체는 각종 비정상적인 상태의 진단에서와 같이, DGWCC 케모킨에 대한 항체의 존재 여부를 탐지하기 위한 유사한 용도를 지닐 수 있다. 예를 들면, DGWCC 케모킨을 과생성시키면, 예를 들어, 세포 성장, 활성화 또는 분화에서 비정상적인 생리학적 상태를 진단할 수 있는 각종 면역학적 또는 기타 의학적 반응이 일어날 수 있다.

종종, 진단 검정용 시약이 키트에 공급되어 이러한 검정의 민감도를 최적화시킨다. 본 발명의 경우에는, 검정의 성질, 프로토콜 및 표지에 따라서, 표지되거나 표지되지 않은 항체 또는 수용체, 또는 표지된 DGWCC 케모킨이 제공된다. 이는 통상적으로, 완충제, 안정화제, 시그날 생성에 필요한 물질, 예를 들면, 효소에 대한 기질 등의 기타 부가제와 함께 사용된다. 바람직하게는, 상기 키트는 적절한 사용과 사용 후의 내용물의 처분에 관한 지침서를 포함할 것이다. 전형적으로, 이러한 키트는 각각의 유용한 시약에 대한 구획을 가진다. 바람직하게는, 이러한 시약은 이것이 수성 매질에서 재구성되어 상기 검정을 수행하기 위한 시약을 적절한 농도로 제공해주는, 동결건조된 분말로서 제공된다.

앞서 언급된 약물 스크리닝과 진단 검정의 많은 구성분을 변형없이 사용할 수 있거나, 또는 각종 방법으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공해주는 잔기를 공유적 또는 비-공유적으로 결합시킴으로써 표지화를 달성할 수 있다. 이들 검정 중의 어떠한 검정에서도, 단백질, 시험 화합물, DGWCC 케모킨 또는 이에 대한 항체를 직접적으로 또는 간접적으로 표지시킬 수 있다. 직접적인 표지화가 가능한 것으로는 표지 그룹, 즉¹²⁵I 등의 방사성 동위원소, 퍼옥시다제 및 알칼린 포스파타제 등의 효소(미국 특허 제3,645,090호), 및 형광성 세기, 파장 변동 또는 형광성 편광의 변화를 모니터할 수 있는 형광성 표지(미국 특허 제3,940,475호)가 있다. 간접적인 표지화가 가능한 것으로는 하나의 구성분을 바이오티닐화한 다음, 상기 표지 그룹 중의 하나에 커플링된 아비딘에 결합시키는 것을 포함한다.

유리된 리간드로부터 결합물을 분리시키거나, 또는 달리 유리된 시험 화합물로부터 결합물을 분리시키는 수 많은 방법이 있다. DGWCC 케모킨을 각종 매트릭스 상에 고정화시킨 다음, 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스로는 플라스틱, 예를 들면, ELISA 플레이트, 필터 및 비이드가 있다. DGWCC 케모킨을 매트릭스에 고정화시키는 방법으로는 플라스틱에 대한 직접적인 접착, 포획 항체의 사용, 화학적 커플링 및 바이오틴-아비딘이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법에서의 최종 단계는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등의 유기 용매 또는 황산암모늄 등의 염을 활용하는 방법을 포함한 몇몇 방법 중의 어떠한 한 방법에 의해 리간드/수용체 또는 리간드/항체 복합체를 침전시키는 것을 포함한다. 기타 적합한 분리 기술로는 문헌[참조: Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461]에 기재된 플루오레세인 항체 자화성 입자 방법, 및 미국 특허 제4,659,678호에 기재된 바와 같은 이중 항체 자기 입자 분리가 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

단백질 또는 이의 단편을 각종 표지에 연결하는 방법이 문헌에 광범위하게 보고되었기 때문에, 본원에서 상세하게 논의할 필요는 없다. 이러한 많은 기술은 카보디이미드 또는 활성 에스테르를 통하여 활성화된 카복실 그룹을 사용하여 펩티드 결합을 형성시키는 단계, 연결을 위해 머캅토 그룹을 클로로아세틸 등의 활성화 할로겐 또는 말레이미드 등의 활성화 올레핀과 반응시킴으로써 티오에테르를 형성시키는 단계 등을 포함한다. 융합 단백질을 이러한 적용 분야에 사용할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 진단 국면은 DGWCC 케모킨의 서열로부터 취한 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하는 것을 포함한다. 이들 서열을 천연 공급원, 또는 비정상적인 질환 상태, 예를 들면, 암 또는 발생학적 문제점이 있는 것으로 추정되는 환자로부터의 샘플 중에서의 DGWCC 케모킨 메시지 수준을 탐지하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. RNA와 DNA 뉴클레오티드 서열 모두의 제조, 이러한 서열의 표지화 및 상기 서열의 바람직한 크기는 당해 분야의 문헌에 충분히 기재되고 논의되었다. 통상적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로는 약 18개 이상의 뉴클레오티드를 가져야 하고, 폴리뉴클레오티드 프로브는 수 킬로염기 이하일 수 있다. 각종 표지, 가장 통상적으로는 방사성핵종, 특히³²P를 이용할 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 내로 도입하기 위해 바이오틴 변형된 뉴클레오티드를 사용하는 것과 같은 기타 기술을 이용할 수도 있다. 이때, 바이오틴은 방사성핵종, 형광단, 효소 등의 광범위한 표지로 표지시킬 수 있는 아비딘 또는 항체에 대한 결합 부위로서 작용한다. 또 다른 한편, DNA 이본쇄, RNA 이본쇄, DNA-RNA 하이브리드 이본쇄, 또는 DNA-단백질 이본쇄를 포함한 특이적 이본쇄를 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 이러한 항체를 표지시킬 수 있으며, 상기 이본쇄를 특정 표면에 결합시켜 이본쇄가 표면 상에 형성하게 되면 이러한 이본쇄에 결합된 항체의 존재 여부를 탐지할 수 있는 검정을 수행한다. 신규한 안티-센스 RNA에 프로브를 사용하는 것은 핵산 하이브리드화, 플러스 및 마이너스 스크리닝, 재조합 프로빙, 하이브리드 방출된 해독(HRT) 및 하이브리드 포획된 해독(HART) 등의 수 많은 통상적인 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 이에는 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 기술이 포함된다.

이들 마커 및 기타 마커의 존재를 정성적 및 정량적으로 시험해주는 진단용 키트가 또한 고려된다. 진단 또는 예후는 마커로서 사용된 다중 지시체의 조합에 의존될 수 있다. 따라서, 키트는 마커의 조합물에 대해 시험할 수 있다[참조: Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97]. 각 케모킨의 정성적 또는 정량적 발현은 표준 방법에 의해 단백질 또는 mRNA 수준에서 평가할 수 있다.

ⅩⅡ. 수용체 분리

특이적 상호작용의 결합 파트너를 분리하게 되면, 이러한 역-파트너를 분리하는 방법이 존재하게 된다[참조: Gearing, et al. (1989) EMBO J. 8:3667-3676]. 예를 들면, 수용체에 대한 결합을 방해하지 않으면서 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 표지시키는 방법을 결정할 수 있다. 예를 들면, 친화성 표지 또는 에피토프 태그를 리간드의 아미노- 또는 카복실 말단에 융합시킬 수 있다. 발현 라이브러리를 대상으로 하여, 예를 들어, 세포 분류 또는 기타 스크리닝에 의해 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨의 특이적 결합에 대해 스크리닝하여 이러한 결합 성분을 발현하는 아집단을 탐지할 수 있다[참조: Ho, et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:11267-11271]. 또 다른 방법으로는, 패닝 방법을 사용할 수 있다[참조: Seed and Aruffo (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:3365-3369]. 이용 가능한 케모킨 서열을 갖는 적절한 작제물을 제조하는데 2개-하이브리드 선별 시스템을 적용할 수도 있다[참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246]. 표준 Ca⁺⁺유출(flux) 방법을 또한 활용할 수도 있다[참조: Coligan, et al. (eds.) (1992 and periodic supplements) Current Protocols in Immunology Greene/Wiley, New York, NY].

표지와의 단백질 가교결합 기술을 적용하여 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨의 결합 파트너를 분리할 수 있다. 이로써, 예를 들어, 리간드-수용체 유사 방식으로, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨과 특이적으로 상호작용되는 단백질을 정제할 수 있다. 전형적으로, 이러한 케모킨 계열은 7개의 막관통(transmenbrane) 수용체 계열의 수용체와 결합되며, DVic-1 또는 DGWCC 케모킨에 대한 수용체는 유사한 구조를 나타내는 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 수용체는 리간드 결합 능력을 나타낼 수 있는 형태로 막 단백질을 발현시킬 수 있는 시스템에서의 발현에 의해 발견되는 것으로 여겨진다.

본 발명의 광범위한 국면은 다음 실시예를 참조로 하여 가장 잘 이해되지만, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

Ⅰ. 일반적인 방법

다음의 많은 표준 방법이 문헌[참조: Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed.) Vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis, et al. (eds.)(1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY]에 기재되어 있다. 단백질 정제 방법으로는 황산암모늄 침전법, 칼럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정화 방법 등이 있다[참조: Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182, 및 이러한 시리즈의 기타 권수; 및 단백질 정제 생성물의 사용에 관한 제조업자의 문헌, 예를 들면, Pharmacia, Piscataway, NJ 또는 Bio-Rad, Richmond, CA]. 재조합 기술과 조합함으로써, 적당한 절편(에피토프 태그), 예를 들면, FLAG 서열 또는 프로테아제-제거 가능한 서열을 통하여 융합될 수 있는 등가물에 융합시킬 수 있다[참조: Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow(ed.) Genetic Engineering , Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression ＆ Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA].

표준 면역학적 기술이 문헌[참조: Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; and Methods in Enzymology volumes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 and 163]에 기재되어 있다. 신경 세포 생물학적 활성에 대한 검정이 문헌[참조: Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; and Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ]에 기재되어 있다. 발생학적 시스템의 방법론이 문헌[참조: Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; and Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Intersicence]에 기재되어 있다.

PCR 분석법이 문헌[참조: Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; and Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY]에 기재되어 있다.

Ⅱ. DVic-1 또는 DGWCC 케모킨 클론의 분리

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 암호화하는 클론을 수 많은 상이한 가능한 방법에 의해 천연의 공급원으로부터 분리한다. 본원에 제공된 서열이 제시되면, PCR 프라이머 또는 하이브리드화 프로브를 선별하고/하거나 작제하여 게놈성 DNA절편 또는 cDNA 역 전사체를 분리한다. 적절한 세포 공급원에는 열거된 조직, 예를 들면, 피부, 상피 또는 상처 치유 라이브러리가 포함된다. 개체 집단을 스크리닝함으로써 유전적 및 다형성 또는 대립유전자성 변이체를 분리시킨다.

표준 방법, 바람직하게는 암호화 서열의 반대편 말단으로부터의 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 검출 방법을 수행하지만, 플랭킹 절편은 특별한 목적을 위해 선택할 것이다.

또 다른 한편, 하이브리드화 프로브를 선택한다. 프로브의 특정한 AT 또는 GC 함량을 예상되는 상동성과 미스매칭에 따라서 선택한다. 적당한 양성의 시그날 대 백그라운드 비의 균형이 맞도록 적당한 엄격한 조건을 선택한다. 연속적인 세척 단계를 사용하여 상동성이 보다 큰 클론을 수집한다.

항체-기준의 선별 과정을 이용하여 추가의 클론을 분리한다. 막-결합된 발현 생성물의 FACS 염색을 포함한 표준 발현 클로닝 방법을 적용한다. 이러한 항체를 사용하여, 인식된 단백질을 생성하는 클론을 동정한다. 또 다른 방법으로는, 항체를 사용하여 DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 정제하는데, 여기서 이러한 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하기 위한 표준 수단과 단백질 스크리닝을 이용한다.

또한, 게놈 서열을 기준으로 한 방법을 통해, 천연적으로 이용 가능한 서열, 또는 제공된 서열에 대해 상동성을 나타내는 서열을 동정할 수 있을 것이다.

Ⅲ. 케모킨 클론에 대한 영장류 대응물의 분리

상기와 유사한 방법을 사용하여 또 다른 영장류로부터 적절한 영장류 케모킨 유전자를 분리한다. 유사한 공급원 물질을 사용하여 유전적, 다형성, 대립유전자성 또는 주(strain) 변이체를 포함한 천연 유전자를 분리한다. 유사한 방법을 사용하여 기타 종 변이체를분리한다. 또 다른 한편, 유전자 데이타베이스를 대상으로 하여 적절한 모티브를 조사할 수 있다.

Ⅳ. 설치류 케모킨 클론의 분리

적당한 설치류 공급원, 예를 들어, 랫트, 햄스터 등을 상기와 같이 선별한다. 유사한 방법을 이용하여 종 변이체를 분리하는데, 설치류 케모킨에 대한 유사성 수준은 전형적으로 사람 내지 다른 영장류 서열과 비교해서 더 낮다.

Ⅴ. 염색체 국재

cDNA를 표지시키는데, 예를 들면, 바이오틴-14 dATP로 틈(nick)-해독시키고, 원위치에서 5ng/㎕의 최종 농도에서 2마리의 정상적인 동물, 바람직하게는 숫컷 동물로부터의 중기상과 하이브리드화한다. 형광성 원위치 하이브리드화 방법(FISH) 문헌[참조: Callen, et al. (1990) Ann. Genet. 33:219-221]에 기재된 방법으로부터 변형시키는데, 여기서는 분석하기 전에 프로피듐 요오다이드(카운터 염색물로서)와 DAPI(염색체 동정을 위함) 모두로 염색시킨다. 중기상의 제제의 영상을 CCD 카메라로 포착하고 컴퓨터를 이용하여 영상의 질을 높인다. 적절하게 표지된 염색체을 동정한다. 이러한 분자에 대한 표준 위치, 또는 상이한 위치에 대한 국재는 기능에 관한 정보를 제공할 수도 있다.

사람 DVic-1를 사람 염색체 9p13에 국재시켰다.

Ⅵ. 발현; 정제; 특징 확인

상기로부터의 적당한 클론을 이용하여, 암호화 서열을 적당한 발현 벡터 내로 삽입한다. 이는 원핵 생물, 효모, 곤충 또는 고등 척추동물, 예를 들면, 포유류 발현 시스템용으로 특정하게 선택된 벡터 내일 수 있다. 표준 방법을 적용하여, 바람직하게는 가용성의 분비 분자로서의 유전자 생성물을 생성하지만, 특정한 경우에서는, 세포내 단백질로서 생성시킬 것이다. 세포내 단백질은 전형적으로, 이러한 단백질을 회수하는데 세포 용해물을 필요로 하고, 불용성 봉입체는 추가의 정제를 위한 통상의 출발물질이다.

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을 암호화하는 클론을 사용하는 경우, 재조합 생성 방법을 이용하긴 하지만, 적절한 공급원으로부터 천연 형태를 정제할 수 있다. 이러한 단백질 생성물은, 특정 경우에서는 면역친화 방법과 연계된 단백질 정제 표준 방법에 의해 정제한다. 면역친화 방법을 앞서 기재된 바와 같이 정제 단계로서 사용하거나, 또는 상기 단백질의 분리 성질을 결정하기 위한 탐지 검정으로서 사용한다.

바람직하게는, 상기 단백질을 매질 내로 분비시키고, 가용성 생성물을 이러한 매질로부터 가용성 형태로 정제한다. 또 다른 방법으로는, 상기 언급된 바와 같이, 원핵성 발현 시스템으로부터의 봉입체가 유용한 재료 공급원이다. 전형적으로, 불용성 단백질을 상기 봉입체로부터 가용화시키고 표준 방법을 사용하여 재폴딩시킨다. 정제 방법을 앞서 기재된 바와 같이 전개시킨다.

앞서 기재된 정제 방법의 생성물의 특징을 확인하여 수 많은 구조적 특징을 결정한다. 표준 물리적 방법, 예를 들면, 아미노산 분석 및 단백질 서열화를 적용한다. 이로써 생성된 단백질을 대상으로 하여 CD 분광 측정법, 및 기타 분광측정법, 예를 들면, NMR, ESR, 질량 분광측정법 등을 수행한다. 이러한 생성물의 특징을 확인하여, 예를 들어, 겔 크로마토그래피 및 유사한 기술을 이용하여 이의 분자 형태 및 크기를 결정한다. 크로마토그래피적 성질에 관한 이해는 보다 간편하거나 효율적인 정제 방법을 유도할 것이다.

문헌[참조: Hansen, et al. (1995) Biochem. J. 308:801-813]에 보고된 바와 같이, 글리코실화 부위를 예견할 수 있다.

Ⅶ. 케모킨에 대한 항체의 제조

발현용 DNA, 또는 상기 언급된 바와 같이 제조된 단백질의 경우, 동물을 면역시켜 항체를 생성시킨다. 몇몇 경우에서는 비-정제된 항원을 사용하여 폴리클로날 항혈청을 생성시키지만, 생성된 혈청은 보다 높은 백그라운드 수준을 나타낼 것이다. 바람직하게는, 앞서 기재된 바와 같은 폴리클로날 혈청을 이용한 친화 크로마토그래피를 포함한 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 상기 항원을 정제한다. 규정된 합성 펩티드 단편을 사용하여 특이적 항체의 존재 여부를 탐지한다.

앞서 지시된 바와 같이 정제되거나 예를 들어 다수의 합성 펩티드를 사용하여, 정제된 항원에 대한 폴리클로날 혈청을 생성시킨다. 동물에 제시되는 경우 완전한 길이의 서열 모두를 포괄하는 일련의 중복되는 합성 펩티드는 단백질 상에 대부분의 선형 에피토프를 인식하는 혈청을 생성시킬 것이다. 이러한 항혈청을 이용하여 단백질을 친화 정제하며, 이를 사용하여 본래의 완전한 길이의 단백질을 또 다른 동물 내로 도입하여 또 다른 항혈청 제제를 생성시킨다.

유사한 기술을 사용하여 정제되지 않은 항원, 또는 바람직하게는 정제된 항원에 대한 모노클로날 항체를 유도 발생시킨다. 항혈청 또는 항체는 본래의 단백질을 인식할 수 있거나, 또는 변성된 항원을 인식할 수 있다. 이 제제를 경우에 따라 면역선별하거나 면역정제할 수 있다.

Ⅷ. 세포성 및 조직 분포

상기 언급된 바와 같이 제조된 항체 시약을 이용한 면역조직화학을 이용하거나, 또는 상기 케모킨을 암호화하는 핵산에 대해 스크리닝함으로써, 단백질 또는 유전자 생성물의 분포를 결정한다. 하이브리드화 또는 PCR 방법을 사용하여 DNA, cDNA 또는 메시지 내용을 탐지한다. 조직화학을 이용함으로써, 메시지 또는 DNA를 보다 높은 수준이나 낮은 수준으로 발현시키는 조직 내에서 특이적 세포 유형을 결정할 수 있다. 항체 기술은 액체 또는 조직 샘플을 포함한 생물학적 샘플에서 단백질을 정량화하는데 유용하다. 면역검정을 전개하여 단백질을 정량화한다. 또한, FACS 분석을 이용하여 세포 집단에서의 발현을 평가할 수 있다.

마우스 DGWCC 서열을 태아 마우스, 임신한지 14.5일이 지난 후의 1개 서열 및 임신한지 19.5일이 지난 후의 3개 서열에서 검출하였다. 3개의 서열은 성체 마우스로부터 취한 것이고, 1개는 각각 간, 태반 및 피부로부터 취한 것이다. 노던 분석은 시험된 것에서의 시그날이 폐에서보다도 훨씬 더 큰 뇌에서보다도 훨씬 더 크다는 것을 나타낸다.

Ⅸ. 미세화학주성 검정

DGWCC 케모킨의 프로-이동성 활성을 미세화학주성 검정에서 평가한다[참조: Bacon, et al. (1988) Br. J. Pharmacol. 95:966-974]. 기타 트래픽킹 검정을 사용하기도 한다[참조: Quidling-Jarbrink, et al.(1995) Eur. J. Immunol. 25:322-327; Koch, et al. (1994) J. Clinical Investigation 93:921-928; and Antony, et al. (1983) J. Immunol. 151:7216-7223].

문헌[참조: H. Broxmeyer, Bellido, et al. (1995) J. Clinical Investigation 95:2886-2895; and Jilka, et al. (1995) Exptl Hematology 23:500-506]에 기재된 바와 같은 조혈 검정에서의 활성을 알아보기 위하여 케모킨을 검정할 수도 있다. 이들을 대상으로 하여, 문헌[참조: Streiter, et al. (1992) Am. J. Pathol. 141:1279-1284]에 기재된 바와 같은 맥관형성 활성을 검정할 수 있다. 또는 염증의 역할에 대해서는 문헌[Wakefield, et al. (1996) J. Surgical Res. 64:26-31]을 참조할 수 있다.

Ⅹ. 직접적 및 간접적인 생물학적 활성

예를 들어, 면역 세포, 신경 세포 또는 간 세포 상에서 앞서 기재된 바와 같이 확고하고 민감한 검정을 선택한다. 복용량 반응이 탐지되는지를 알아보기 위하여 케모킨의 복용량을 증가시키면서 상기 검정에 가한다. 예를 들면, 증식 검정에서는, 세포를 플레이트에 도말한다. 적당한 배양 배지를 제공하고, 케모킨을 다양한 양으로 상기 세포에 가한다. 세포에 대한 직접적인 효과 또는 케모킨의 간접적인 효과를 지시하는 시간 동안 성장을 모니터한다.

또 다른 한편, 활성화 검정 또는 유인 검정을 사용한다. 적당한 세포 유형, 예를 들면, 조혈 세포, 골수성 세포(대식구, 호중구, 다형핵 세포 등) 또는 임파양 세포(T 세포, B 세포 또는 NK 세포), 신경 세포(뉴런, 신경교, 과돌기신경교 세포, 성상 세포 등) 또는 간 세포, 예를 들면, 다른 세포 유형, 예를 들어, 소화관 음와 세포 및 분화되지 않은 세포 유형으로 분화되는 원종 세포가 선택된다.

기타 검정은 다른 케모킨을 이용하여 입증된 것일 것이다[참조: Schall and Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6:865-873; and Bacon and Schall (1996) Int. Arch. Allergy ＆ Immunol. 109:97-109].

ⅩⅠ. 구조 활성 관계

특정한 잔기의 중요성에 대한 정보는 표준 과정 및 분석을 이용하여 결정한다. 예정된 위치, 예를 들어, 앞서 확인된 위치에서 상이한 많은 변이체를 발생시키고, 이러한 변이체의 생물학적 활성을 평가함으로써, 표준 돌연변이발생 분석을 수행한다. 이는 활성을 변형시키는 위치를 결정하는 정도로 수행하거나, 또는 생물학적 활성을 보존하거나, 차단시키거나 조절하기 위해 치환될 수 있는 잔기를 결정하기 위해 특이적 위치에 초점을 맞추어 수행할 수 있다.

또 다른 방법으로는, 천연 변이체에 관한 분석은 어떠한 위치가 천연 돌연변이에 견디는지를 지시할 수 있다. 이는 개체간의 변이, 또는 균주 또는 종 교배간의 변이에 관한 집단적 분석으로부터 비롯된 것일 수 있다. 선택된 개체로부터의 샘플을, 예를 들어, PCR 분석 및 서열화에 의해 분석한다. 이로써, 집단 다형성을 평가할 수 있다.

ⅩⅡ. 효능제/길항제에 대한 스크리닝

생물학적 활성을 유도하거나 차단시키는 능력을 알아보기 위해 효능제 또는 길항제를 스크리닝한다. 후보 화합물, 예를 들면, 천연 DGWCC 케모킨의 서열 변이체를 대상으로 하여 이들의 생물학적 활성을 검정한다. 또 다른 한편, 화합물을 단독으로 또는 조합하여 스크리닝하여 생물학적 활성에 대한 효과를 결정한다.

ⅩⅢ. 케모킨에 대한 수용체의 분리

DVic-1 또는 DGWCC 케모킨을, 항체를 사용한 경우보다 훨씬 더 유사하게 이의 결합 특이성의 이점을 고려하여, 특이적 결합 시약으로서 사용하여 이의 결합 파트너를 동정한다. 결합 시약을 앞서 기재된 바와 같이, 예를 들어 형광성으로 표지시키거나, 또는 패닝 방법을 위해 기판에 고정화킨다. 전형적인 케모킨 수용체는 7개의 막관통 수용체이다.

결합 조성물, 예를 들어, 케모킨을 사용하여, 결합 파트너, 즉 수용체를 발현하는 세포주로부터 만든 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 표준 염색 기술을 이용하여 세포내 또는 표면 발현된 수용체를 검출 또는 분류하거나, 또는 형질전환된 세포를 발현하는 표면을 패닝에 의해 스크리닝한다. 각종 염색 또는 면역형광성 과정에 의해 세포내 발현의 스크리닝을 수행한다[참조: McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2832].

표준 Ca⁺⁺유출 프로토콜[참조: Coligan, et al.(eds.)(1992 and periodic supplements) Current Protocols in Immunol. Greene/Wiley, New York, NY]을 이용하여 DGWCC에 대한 수용체를 동정할 수 있다.

예를 들면, 0일째, 2-챔버 퍼마녹스 슬라이드를 챔버당 피브로넥틴 1ml, PBS 중의 10ng/ml로 실온에서 30분 동안 예비도포한다. PBS로 1회 세정한다. 이어서, COS 세포를 성장 배지 1.5ml 중의 챔버당 2 내지 3 x 10⁵세포로 도말한다. 37℃에서 밤새 배양한다.

각 샘플에 대한 1일 째, 혈청 무함유 DME 중의 66mg/ml DEAE-덱스트란, 66mM 클로로퀸 및 4mg DNA의 용액 0.5ml를 준비한다. 각 세트의 경우, 양성 대조군을 1 및 1/200 희석율로 사람 DGWCC 케모킨 cDNA로 제조하고, 음성 대조군을 모사한다. 세포를 혈청 무함유 DME로 세정한다. DNA 용액을 가하고 37℃에서 5시간 동안 배양한다. 배지를 제거하고 DME 중의 10% DMSO 0.5ml를 가한다. 제거하고 DME로 1회 세척한다. 성장 배지 1.5ml를 가하고 밤새 배양한다.

2일 째, 배지를 변화시킨다. 3일 또는 4일 째, 세포를 고정 및 염색시킨다. 세포를 한크스 완충 식염수(HBSS)로 2회 세정하고 5분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)/글루코즈에서 고정시킨다. HBSS로 3회 세척한다. 모든 액체가 제거된 후에 상기 슬라이드를 -80℃에서 저장할 수 있다. 각 챔버에 대해, 0.5ml 배양물을 다음과 같이 수행한다: HBSS/사포닌(0.1%)을 1M NaN₃32ml/ml와 함께 20분 동안 가한다. 이어서, 세포를 HBSS/사포닌으로 1회 세척한다. 케모킨 또는 케모킨/항체 복합체를 상기 세포에 가하고 30분 동안 배양한다. 세포를 HBSS/사포닌으로 2회 세척한다. 경우에 따라, 제1 항체를 30분 동안 가한다. 제2의 항체, 예를 들면, 벡터 항-마우스 항체를 1/200 희석율로 가하고 30분 동안 배양한다. ELISA 용액, 예를 들어, Vector Elite ABC 홀스래디쉬 퍼옥시다제 용액을 제조하고 30분 동안 예비배양한다. 예를 들어, 2.5ml HBSS/사포닌당 용액 A(아비딘) 1방울과 용액 B(바이오틴) 1방울을 사용한다. 세포를 HBSS/사포닌으로 2회 세척한다. ABC HRP 용액을 가하고 30분 동안 배양한다. 세포를 HBS로 2회 세척하고, 2분 동안 두 번째 세척하여 세포를 모은다. 이어서, 벡터 디아미노벤조산(DAB)을 5 내지 10분 동안 가한다. 유리 증류수 5ml당 완충액 2방울 + DAB 4방울 + H₂O₂2방울을 사용한다. 챔버를 조심스럽게 꺼내고 슬라이드를 수중에서 세정한다. 수분 동안 공기 건조시킨 다음, 크리스탈 마운트 1방울을 가하고 커버 슬립을 가한다. 85 내지 90℃에서 5분 동안 굽는다.

풀(pool)의 양성 염색을 평가하고 점차적으로 아클로닝하여 결합에 관련되는 단일 유전자를 분리한다.

또 다른 한편, 케모킨 시약을 사용하여 수용체를 발현하는 세포를 친화 정제하거나 분류한다[참조: Sambrook, et al. or Ausubel, et al.].

또 다른 방법은 패닝에 의해 막 결합된 수용체에 대해 스크리닝하는 것이다. 수용체 cDNA를 앞서 기재된 바와 같이 작제한다. 리간드를 고정화시킬 수 있으며, 이를 사용하여 발현 세포를 고정화시킨다. 예를 들어, 케모킨 융합 작제물의 FLAG 서열을 인식하는 적당한 항체를 사용하거나, 또는 제1 항체에 대해 발생된 항체를 사용함으로써, 고정화를 달성할 수 있다. 선별과 증폭의 반복적인 주기로 인해, 적절한 클론을 풍부하게 할 수 있고 수용체 발현 클론을 궁극적으로 분리할 수 있다.

케모킨에 의해 파아지 발현 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 적당한 표지 기술, 예를 들면, 항-FLAG 항체는 적당한 클론을 특이적으로 표지시켜 준다.

ⅩⅣ. 면역조직화학적 국재

상기 언급된 항체를 사용하여 각종 조직에서의 DVic-1 또는 DGWCC의 발현을 동정한다. 면역조직화학적 염색 방법은 문헌[참조: Sheehan, et al. (eds.)(1987) Theory and Practice of Histotechnology, Battelle Press, Columbus, OH]에 기재되어 있다.

본원에 인용된 모든 참조문헌은 각각의 특허공보 또는 공개공보가 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조문헌으로 삽입되었다고 구체적으로 지시되는 경우와 동일한 수준으로 본원에 참조 삽입된 것이다.

본 발명의 많은 변형 및 변이가 당해 분야의 숙련인에게 명백한 바와 같이 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정한 양태는 단지 예시를 위한 것이지, 본 발명이 첨부된 청구의 범위와 이와 연관된 등가물에 의해서만 제한된다.

Claims (9)

1. 서열 2에 제시된 성숙한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 DVic-1(DNAX Vic-1) 폴리펩티드.
2. 서열 6 또는 10에 제시된 성숙한 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 DGWCC(DNAX Groin Wound expressed CC chemokine) 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
4. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 결합성 화합물.
5. 제4항에 있어서, 항체 또는 항체 단편인 결합성 화합물.
6. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
7. 제6항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
8. 제7항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
9. 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 제8항의 숙주 세포를 배양하는 것을 특징으로하여, 상기 폴리펩티드를 재조합적으로 제조하는 방법.