【発明の詳細な説明】
哺乳動物ケモカイン
本出願は、1996年11月27日に提出された米国特許仮出願第60/031,805号；なら
びに1996年12月５日に提出された通常の米国特許出願第08/761,071号；ならびに
Moralesらにより1997年10月24日に提出された米国の特許出願優先権を主張する
；これらは参考として本明細書中に援用される。
発明の分野
本発明は、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物の免疫系の細胞）の発達、分化、
運搬、および生理機能の制御に機能するタンパク質に関連する組成物を意図する
。特に、種々の細胞型（造血細胞を含む）の発達、分化、および機能を制御また
は証明するタンパク質を提供する。発明の背景
哺乳動物の循環系の循環する成分は、種々の細胞型（赤血球系の赤血球および
白血球ならびに骨髄細胞系列を含む）を含む。例えば、Rapaport(1987)Introduc tion to Hematology
（第２版）Lippincott,Philadelphia,PA;Jandl(1987)Blood: Textbook of Hematology
, Little,BrownおよびCo.,Boston,MA.;and Paul（編）
（1993）Fundamental Immunology（第３版）Raven Press,N.Y.を参照のこと。
しばらくの間、哺乳動物の免疫応答は「免疫ネットワーク」と呼ばれる細胞間
で相互作用する複合体の系に基づくことが知られていた。最近の研究により、新
しい見識がこの系の内部機構に提供された。多くの応答が、実際に、リンパ球、
マクロファージ、顆粒球、ならびに他の細胞のネットワーク様相互作用の周囲を
回転することが明らかであるが、免疫研究者達は今日、溶解性タンパク質（リン
ホカイン、サイトカイン、もしくはモノカインとして知られる）がこれらの細胞
性相互作用を制御する重大な役割を担うという見解を一般に支持している。従っ
て、細胞を調節する因子の作用の単離、特徴付けならびに機構について多くの興
味があり、それらの理解は多数の医療的異常（例えば、免疫系および他の疾患）
の診断および治療に有意な進歩を導くはずである。
リンホカインは、広範な用途の細胞間活性を明らかに媒介する。それらは多能
性の造血幹細胞の複雑な免疫系を構成する多様な細胞系列を含む膨大な数の前駆
体への増殖、成長、および分化を補助することが示される。これらの細胞成分間
の相互作用は健常な免疫応答に必要である。リンホカインを他の薬剤と組合せて
投与した場合、これらの異なる細胞系列はしばしば異なる様式で応答する。
ケモカインは多数ならびに多様なタンパク質のスーパーファミリーである。こ
のスーパーファミリーは、ケモカインモチーフ中の最初の二つのシステインが隣
接するか（C-C分枝と称する）、または介在性の残基による空間形成のいずれか
により二つの典型的な枝に分割される(“C-X-C”)。ごく最近に同定されたケモ
カインの分枝は、対応するモチーフ中の二つのシステインが欠失し、ならびにリ
ンホタクチンとして公知のケモカインによって表される。別の最近同定された枝
は二つのシステインの間に3個の介在性の残基を有する（例えば、CX3Cケモカイ
ン）。SCHALLおよびBacon(1994)Current Opinionin Immunology 6:865-873;なら
びにBaconおよびSchall（1996）Int.Arch.Allergy & Immunology. 109:97-109を
参照のこと。
多くの因子が、前駆細胞の分化プロセスに影響するか、または生理機能もしく
は特定の細胞型の移動の特性を制御することが同定されている。これらの観察は
、免疫機能での機能がこれまで無認識であった他の因子が存在することを示す。
これらの因子は生物学的な活性を提供し、それらの効果の範囲は既知の分化、も
しくは活性因子とは異なり得る。インビボで細胞生理機能を調節する調節因子の
構造的、生物学的、および生理学的な特性に関する知識の不在は、このような因
子の効果の調節を妨げる。従って、関連する細胞の発達もしくは生理機能の調製
が必要とされる医療的な状態は、処理が困難なままである。
発明の要旨
本発明は、DNAX Vic-1(DVic-1)およびDNAX鼠径部創傷発現CCケモカイン(DGWC
C)と本明細書により命名された、以前には知られていなかったケモカインモチー
フを含む分子の存在を示す。以下に記載のケモカインタンパク質配列の配列解析
に基づき、DVic-1およびDGWCCがCCケモカインファミリーに属することは明らか
である。
好ましい実施態様において、本発明は以下より選択された物質の組成物を提供
する：配列番号２の少なくとも約12アミノ酸の長さにわたって、少なくとも約85
％の配列同一性を示す実質的に純粋または組換えのDVic-1タンパク質もしくはペ
プチド；配列番号２の天然配列DVic-1；DVic-1配列を含む融合タンパク質；配列
番号６もしくは８の少なくとも約12アミノ酸の長さにわたって、少なくとも約85
％の配列同一性を示す、実質的に純粋な組換えDGWCCタンパク質またはペプチド
；配列番号６もしくは８の、天然配列DGWCC；およびDGWCC配列を含む融合タンパ
ク質。実質的に純粋または単離されたタンパク質の実施態様では、本発明は以下
の対応する部分に配列同一性を示すセグメントを含むタンパク質を提供する：ホ
モロジーが少なくとも約90％の同一性があり、その部分が少なくとも約９アミノ
酸であるDVic-1；ホモロジーが少なくとも約80％の同一性であり、その部分が少
なくとも約17アミノ酸であるDVic-1；もしくはホモロジーが少なくとも約70％の
同一性であり、そしてその部分が少なくとも約25アミノ酸であるDVic-1；または
：ホモロジーが少なくとも約90％の同一性であり、そしてその部分が少なくとも
約９アミノ酸であるDGWCC；ホモロジーが少なくとも80％の同一性であり、そし
てその部分が少なくとも約17アミノ酸であるDGWCC；もしくはホモロジーが少な
くとも約70％の同一性であり、そしてその部位が少なくとも約25アミノ酸である
DGWCC。他のポリペプチドの実施態様は以下のものを含む：DVic-1が配列番号２
の成熟配列を含むの実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドがヒトを含む
霊長類に由来する実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドが配列番号2の
少なくともひとつのポリペプチドセグメントを含む実施態様；DVic-1タンパク質
もしくはペプチドが同一性を示す部分を多く示す実施態様；DVic-1タンパク質も
しくはペプチドが、DVic-1の天然の対立遺伝子改変体である実施態様；DVic-1タ
ンパク質もしくはペプチドが少なくとも約30アミノ酸長を有する実施態様；DVic
-1タンパク質もしくはペプチドが霊長類DVic-1に特異的な、少なくとも二つの
非重複エピトープを示す実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドがDVic-1
に特異的な、少なくとも二つの非重複エピトープを示す実施熊様；DVic-1タンパ
ク質もしくはペプチドがDVic-1に対して少なくとも約20アミノ酸長にわたって少
なくとも約90％の配列同一性を示す実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチ
ドがグリコシル化されている実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドが、
合成ポリペプチドである実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドが、固体
基板に付着している実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドが他の化学成
分に結合している実施態様；DVic-1タンパク質もしくはペプチドが、天然配列か
らの置換の５倍またはそれより少ない置換物である実施態様；またはDVic-1タン
パク質もしくはペプチドが天然の配列に由来する欠失改変体もしくは挿入改変体
である実施態様；DGWCCが配列番号６もしくは配列番号８の成熟配列を含む実施
態様；またはDGWCCタンパク質もしくはペプチドが霊長類もしくは齧歯類を含む
哺乳動物に由来する実施態様；DGWCCタンパク質、もしくはペプチドが配列番号
６もしくは８の少なくとも一つのポリペプチドセグメントを含む実施態様；DGWC
Cタンパク質もしくはペプチドが同一性を示す部分を多数示す実施態様；DGWCCタ
ンパク質、もしくはペプチドがDGWCCの天然の対立遺伝子改変体である実施態様
；DGWCCタンパク質もしくはペプチドが少なくとも30アミノ酸長を有する実施態
様：DGWCCタンパク質もしくはペプチドが霊長類のDGWCCに特異的な少なくとも二
つの非重複エピトープを示す実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドがDGW
CCに対して少なくとも約20アミノ酸長にわたって少なくとも約90％の配列同一性
を示す実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドがDGWCCに特異的な、少なく
とも二つの非重複抗原決定基を示す実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチ
ドがDGWCCに対して少なくとも約20アミノ酸長にわたって少なくとも約90％の配
列同一性を示す実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドがグリコシル化さ
れている実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドが合成ポリペプチドであ
る実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドが固体基板に付着している実施
態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドが他の化学成分と結合している実施態
様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドが天然配列に由来する5倍またはそれより
少ない置換体である実施態様；DGWCCタンパク質もしくはペプチドがまたは天
然の配列に由来する欠失改変体もしくは挿入改変体である実施態様。ポリプチド
の他の調製物が提供され、これは以下のものを含む組成物を含む：無菌のDVic-1
タンパク質もしくはペプチド；DVic-1タンパク質もしくはペプチドおよびキャリ
ア（このキャリアは：水、生理食塩水、および／または緩衝液を含む水性化合物
であるが；および／または経口的、直腸、経鼻、局所的、もしくは非経口的な投
与のために処方される）；無菌のDWGCCタンパク質もしくはペプチド；DWGCCタン
パク質もしくはペプチドおよびキャリア（このキャリアは：水、生理食塩水、な
らびに／もしくは緩衝液を含む水性化合物であるか；および／または経口的、直
腸、経鼻、局所的、もしくは非経口的な投与のために処方される）を含む。
他のポリペプチド形態は以下のものを含む融合タンパク質を含む：配列番号2
もしくは12の成熟タンパク質配列；配列番号6もしくは８の成熟タンパク質配列
；FLAG,His6を含む；もしくはIg配列；もしくは他のケモカインタンパク質の配
列を含む検出または精製用のタグ。キットはこのようなタンパク質もしくはペプ
チド、および以下のものを含み提供される：DVic-1タンパク質もしくはポリペプ
チドを含むコンパートメント；DVic-1タンパク質もしくはポリペプチドを含むコ
ンパートメント；もしくはキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための説明書。
結合化合物および結合組成物の結合が提供され、例えば、抗体に由来する抗原
結合部分を含み、特異的に天然の：DVic-1タンパク質、（このタンパク質が霊長
類のタンパク質であるか；結合化合物がFv、Fab、もしくはFab2フラグメントで
あるか；結合化合物が他の化学的成分と結合しているか；または抗体が；配列番
号２もしくは12を含む成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されている
か；成熟したDVic-1に対して惹起されているか；精製されたDVic-1に対して惹起
されているか；免疫選択されているか；ポリクローナル抗体であるか；変性され
たDVic-1に結合するか；抗原に対して少なくとも30mMのKdを示すか；ビーズもし
くはプラスチック膜を含む固体基板に付着しているか；無菌組成物中にあるか；
または検出可能に標識（放射性もしくは蛍光標識を含む）されている）；DGWCC
タンパク質（このタンパク質が霊長類もしくは蓄歯類のタンパク質であるか；結
合化合物がFv、Fab、もしくはFab2フラグメントであるか；結合化合物が他の化
学的成分と結合しているか；または抗体が：配列番号６もしくは８を含む天然の
ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されているか；成熟したDGWCCに対し
て惹起されているか；精製されたDWGCCに対して惹起されているか；免疫選択さ
れているか；ポリクローナル抗体であるか；変性されたDWGCCに結合するか；抗
原に対して少なくとも30mMのKdを示すか；ビーズもしくはプラスチック膜を含む
固体基板に付着しているか；無菌組成物中にあるか；もしくは検出可能に標識（
放射性もしくは蛍光標識を含む）されている。
結合組成物を有するキットの実施態様はこのような結合化合物および以下を含
む：結合化合物を含むコンパートメント；および／もしくはキット中の試薬の使
用もしくは廃棄のための説明書。代表的に、キットは定性的もしくは定量的な分
析に行うことが可能である。種々の他の組成物が提供され、例えば、以下を含む
：上記のような無菌の結合化合物；もしくは上記のような結合化合物およびキャ
リア（このキャリアは：水、生理食塩水、ならびに／もしくは緩衝液を含む水性
化合物であるか；および／または経口的、直腸、経鼻、局所的、もしくは非経口
的な投与のために処方されている）。
核酸が提供され、これには記載されたようなタンパク質もしくはペプチドもし
くは融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換えの核酸が含まれる。こ
こで、DVic-1タンパク質がヒトを含む霊長類に由来するか；配列番号１〜４また
は11〜12の多数の抗原性ペプチドをコードするか；またはDVic-1核酸は：配列番
号１〜４もしくは11〜12の任意の抗原性ペプチド配列をコードし；天然のcDNAが
コードするそのセグメントをコードする天然のcDNAに少なくとも約80％の同一性
を示すか；発現ベクターであるか；さらに複製起点を含むか；天然の供給源に由
来するか；同定可能なレベルを含むか；合成ヌクレオチド配列を含むか；6kb未
満、好ましくは3kb未満であるか；ヒトを含む霊長類に由来するか；天然の全長
コード配列を含むか；DVic-1タンパク質をコードするハイブリダイゼーションプ
ローブであるか；もしくはPCRプライマーであり；PCR産物；もしくは変異誘発プ
ライマーであるか；DGWCCタンパク質がヒトもしくはマウスを含む霊長類もしく
は齧歯類に由来するか；あるいはDGWCC核酸が：配列番号６もしくは８の抗原性
ペプチド配列をコードするか；配列番号６もしくは８の抗原性ペプチド配列の多
数をコードするか；そのセグメントをコードする天然のcDNAに対して少なくとも
約80％の同一性を示すか；発現ベクターであるか；さらに複製起点を含むか；天
然の供給源に由来するか；検出可能な標識を含むか；合成ヌクレオチド配列を含
むか；６kb未満、好ましくは3kb未満であるか；ヒトもしくはマウスを含む霊長
類もしくは齧歯類に由来するか；天然の全長コード配列を含むか；DGWCCタンパ
ク質をコードする遺伝子のハイブリダイゼーションプローブであるか；またはPC
Rプライマーであるか；PCR産物、もしくは変異誘発プライマーである。
上記のような組換え核酸を含む細胞もしくは組織も提供され、これには以下の
ものが含まれる：原核生物細胞；真核生物細胞；細菌細胞；酵母細胞；昆虫細胞
；哺乳動物細胞；マウス細胞；霊長類細胞；もしくはヒト細胞。核酸を含むキッ
トが提供され、これは例えば、核酸、および以下を含む：核酸を含むコンパート
メント；DVic-1またはDGCWCCタンパク質もしくはポリペプチドを更に含むコンパ
ートメント；および／もしくはキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための説明
書）。代表的には、キットは定性的もしくは定量的な分析を行うことが可能であ
る。
このような核酸は以下のものを含む：30℃および２M未満の塩、45℃および/ま
たは500mMの塩、あるいは55℃および/または150mMの塩の洗浄条件下で、配列番
号１にハイブリダイズする核酸；DVic-1に対して、少なくとも約30ヌクレオチド
のストレッチにわたって少なくとも約85％の同一性を示すか、少なくとも90％お
よび/またはストレッチが少なくとも55ヌクレオチドであるか、あるいは少なく
とも95％および/またはストレッチがDVic-1に対して少なくとも75ヌクレオチド
である核酸；30℃および２M未満の塩、45℃および/または500mMの塩、または55
℃および/または150mMの塩の洗浄条件下で、配列暗号５または７にハイブリダイ
ズする核酸；DGWCCに対して、少なくとも約30ヌクレオチドにわたって少なくと
も約80％の同一性を示すか、少なくとも90％および/またはストレッチが少なく
とも55ヌクレオチドであるか、あるいは少なくとも95％および/またはストレッ
チが少なくとも75ヌクレオチドである核酸。
さらに、細胞もしくは組織培養細胞の生理的機能もしくは発達を調節する方法
が提供され、この方法はDVic-1またはDGWCCのアゴニストもしくはアンタゴニス
トへの細胞の曝露を含む。本発明はまた、化合物、化合物への特異的な結合を検
出する方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：DVic-1ケモカインに特異的
に結合する抗原結合部位；DVic-1ケモカインもしくはそのフラグメントをコード
する発現ベクター；記載される抗原結合部位により特異的に認識される実質的に
純粋なタンパク質；実質的に純粋なDVic-1ケモカインもしくはそのペプチド、ま
たはDVic-1ケモカイン配列の30アミノ酸配列部分を含む融合タンパク質；DGWCC
ケモカインに特異的に結合する抗原結合部位；DGWCCケモカインもしくはそのフ
ラグメントをコードする発現ベクター；記載される抗原結合部位により特異的に
認識される実質的に純粋なタンパク質；および実質的に純粋なDGWCCケモカイン
もしくはそのペプチド、あるいはDGWCCケモカイン配列の30アミノ酸配列部分を
含む融合タンパク質からなる群から選択される組成物に化合物を接触させる工程
：および組成物への化合物の結合を検出する工程。
詳細な説明
I.一般
本発明はサイトカインもしくはケモカインの構造特性またはモチーフ特徴を示
すタンパク質をコードする霊長類のDNA配列を提供する。ケモカインファミリー
の総説については、例えば、Lodiら、（1994）Science 263:1762-1767;Gronenbo
rnおよびClore(1991)Protein Engineering4:263-269;MillerおよびKranger(1992
)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89:2950-2954;MatsushimaおよびOppenheim(1989)Cyt
okine 1:2-13;StoeckleおよびBaker(1990)New Boil．2:313-323;Oppenheimら、
（1991）Ann.Rev.Immunol．9:617-648;Schall(1991)Cytokine 3:165-183;ならび
にThe Cytokine Handbook Academic Press,NY。
本明細書中に記載される新規のサイトカインは、DNAX Vic-1（DVic-1）および
DNAX鼠蹊部創傷で発現されたCCケモカイン(DGWCC)と命名された。
配列番号3および4は、HHFFQ25Rヒト胎児心臓ライブラリーおよびHOEDH11Rヒト
造骨細胞ライブラリーより、それぞれ入手した二つのESTを定義する。これらは
高い相同性を示し、そしておそらくは類似する転写産物由来のESTである。これ
ら二つのESTのケモカインモチーフは比較され、ついでコンセンサス配列が誘導
され、ついでヒトDVic-1(配列番号1)をコードすることが確かめられた。シグナ
ル配列は、アラニン(Ala)と(Ile)との間で示されるが、これは細胞株が異なると
変化し得る。ヒトDVic-1転写産物の代替的なより長い転写物もまた開示され、こ
れはケモカインモチーフの特徴を示さないアミノ末端の伸長を有する（配列番号
11および12)。
ヒトDGWCCのポリペプチドおよび核酸配列は配列番号5および6として開示され
る。ヒトDGXCCケモカイン核酸配列のコード配列は配列番号5のおよそ１番目のヌ
クレオチドから始まり、およそ336ヌクレオチドで終了する。特徴的なCCモチー
フは配列番号６の９〜10アミノ酸残基で見られ得る。シグナル配列が示されるが
、関連する遺伝子に基づいて、僅かに異なるプロセシングが異なる細胞型で生じ
得る。マウスDGWCCケモカイン（mDVic-1と以前に命名された；USSN/08/761,071
を参照のこと）の核酸配列および対応するアミノ酸配列は配列番号7および8とし
て開示される。ポリAシグナルはヌクレオチド384〜389由来であり、そして終止
コドンの一部を含む。Pシグナルはアラニン(Ala(-1))とロイシン1(Leul)との間
の切断を予測するが；実際の切断は残基の隣もしくはその近傍であり得る。
以下の記載は例示的な目的のために、霊長類の実施態様（例えば、ヒト）に関
するが、他の物（例えば、齧歯類を含む天然の哺乳動物供給源に由来する）に関
連する実施態様は同様に適用可能である。これらの供給源は、種々の脊椎動物（
代表的には温血動物（例えば、トリおよび哺乳動物、特に家畜、齧歯類、霊長類
）を含むはずである。他のケモカインとの比較は表1に提供される。
表１：タンパク質配列のアライメント。ヒトMCP-1（配列番号９）はGenBank登録
番号S71513である；ヒトMIP-3a（配列番号10）はGenBank登録番号U77035である
；ヒトDVic-1（配列番号２）をともなう。核酸配列の類似したアライメントは、
同一性および差異の領域を示す。 本発明のケモカインタンパク質は、それらの物理化学的ならびに生物学的な特
性により部分的に規定される。本明細書中で記載されるケモカイン(例えば、DVi
c-1もしくはDGWCC)の生物学的特性は、それらのアミノ酸配列ならびに成熟した
サイズにより、部分的に規定される。それらはまた、少なくとも生物学的な特性
のいくつかを他の類似するケモカインと共有するはずである。当業者は、いくつ
かの配列の改変が分子の生物学的活性を有意に変化させずに寛容性であり得るこ
とを容易に認識し得る（例えば、保存的な置換もしくはレセプター相互作用また
は重要な３次元構造の特徴に重要な残基から離れた位置）。逆に、非保存的置換
は選択された機能を削除するために適応され得る。
これらのケモカインは、特異的な組織の型（例えば、皮膚組織）に存在し、そ
してレセプターとのタンパク質の相互作用は、細胞の生理的機能、もしくは発達
の様々な局面を媒介するのに重要である。DVic-1またはDGWCCをコードするメッ
セージを発現する細胞型は、細胞分化ならびに発達における重要なシグナルが、
それらにより媒介されることを示唆する。例えば、Gilbert(1991)Developementa l Biology
(第三版)Sinauer Associates,Sunderland,MA;Browderら、(1991)Devel opmental Biology
(第三版)Saunders,Phliadelphia,PA.;Russoら、(1992)Develop ment:The Molecular Genetic Approach
Springer-Verlag,New York,N.Y．;なら
びにWilkins(1993)Genetic Analysis of Animal Development(第二版)Wiley-Lis
s,New York,N.Y.を参照のこと。さらに、DVic-1もしくはDGWCC発現または応答性
は、例えば、特定の細胞の分集団を規定するためのマーカーとして貢献するはず
である。
新規のケモカインは研究ならびに配列データベースの注意深い解析から発見さ
れた。利用可能なデータベースにおける配列の不在は、そのメッセージは滅多に
発現させず、および／または非常に低いレベルであることを強く示唆する。これ
は非常に制限された細胞発現、および／またはほとんどの細胞型では非常に低い
レベルであることを反映し得る。
ノーザンブロット解析は、標準的な方法を用いて実施され得る（例えば、Mani
atisら、(1982)Molecular Cloning,A Laboratory Manual Cold Spring Harbor L
aboratory,Cold Spring Harbor Press,NY;Sambrookら(1989)Molecular Cloning:
A Laboratory Manual(第二版）第１〜３巻、CSH Press,NY;Ausubelら、Biology
Grcene Publishing Associatcs,Brooklyn,NY;ならびにAusubelら、（1987および
捕捉）Current Protocols in Molecular Boiology Wiley/Green,NYを参照のこと
。
II.定義
用語「結合組成物」は、抗体−抗原相互作用におけるように、DVic-1もしくは
DGWCCケモカインと特異的ならびに選択的に結合する分子をいう。しかし、レセ
プタータンパク質のような他の組成物もまた、特異的ならびに／または選択的に
DVic-1もしくはDGWCCケモカインと結合し、他の分子を排除する。代表的に、結
合は天然の生理的機能に関連したタンパク質−タンパク質相互作用において共有
結合もしくは非共有結合のいずれかであり、そしてキャリア化合物もしくは二量
体化のパートナーを含む多タンパク質複合体のメンバーを含み得る。分子はポリ
マー、もしくは化学的試薬であり得る。相互作用が類似の特異性（例えば、特異
的親和性）を示す限り、DVic-1またはDGWCCケモカインが必ず凸形状の分子（例
えば、リガンドーレセプター相互作用のリガンドまたはレセプターが）であるか
どうかについて関わりがないことが必然的に示される。機能的アナログは構造的
に改変されたリガンドであり得、または、例えば、適切なリガンド結合決定基と
相互作用する分子形状を有する完全に無関係な分子であり得る。リガンドはレセ
プターのアゴニストもしくはアンタゴニストとして貢献し得る。例えば、Goodma
nら(編)(1990)Goodman & Gilman's;The Pharmacologlcal Bases of Therapeutic s
(第8版)Pergamon Press,Tarrytown,N.Y.を参照のこと。
用語「結合因子：ケモカインタンパク質複合体」は、本明細書中で使用される
場合、結合因子ならびにケモカインタンパク質（例えば、DVic-1ならびにDWGCC
）の複合体に関する結合因子のケモカインタンパク質への特異的な結合により形
成される。結合因子の特異的もしくは選択的な結合は、結合因子が、多くの他の
タ冫パク質において共有されないDVic-1ケモカインタンパク質上の部位を認識す
る特異的結合部位（例えば、抗原結合部位）を有することを意味する。例えば、
DVic-1ケモカインタンパク質に対して惹起され、そしてケモカインタンパク質上
のエピトープを認識する抗体は、特異的ならびに選択的な結合による結合因子：
DVic-1ケモカインタンパク質複合体を形成し得る。代表的には、結合因子：DVic
-1ケモカインタンパク質複合体の形成は、他のタンパク質ならびに生物製剤の混
合物中のDVic-1ケモカインタンパク質の測定を可能にする。同様に、用語「抗体
：DGWCCケモカインタンパク質複合体」は、結合因子が例えば、抗体由来の抗原
結合部分である態様をいう。抗体はモノクローナル、ポリクローナル、もしくは
抗体の結合フラグメント（例えば、FabもしくはF(ab)２フラグメント）であり得
る。抗体は、交差反応性試験の目的のために、好ましくはポリクローナル抗体で
ある。
「相同的な」核酸配列は、比較された場合、有意な類似性もしくは同一性を示
す。核酸におけるホモロジーのための標準は、配列比較および／または系統学的
な関連性による、当該分野で一般に使用されるホモロジーの基準であるか、もし
くはハイブリダイゼーションの条件に基づくかのいずれかである。ハイブリダイ
ゼーションの条件は以下でより詳細に記載される。
「単離された」核酸は、例えば、RNA、DNA、もしくは混合されたポリマーの核
酸であり、天然の配列に自然に付随する他の生物学的成分（例えば、元の種に由
来するタンパク質ならびに隣接するゲノム配列）から実質的に分離される。用語
「核酸配列」は、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列を含み
、そして組換え体もしくはクローン化されたDNA単離物、および化学的に合成さ
れたアナログ、または異種の系で生物学的に合成されたアナログを含む。実質的
に純粋な分子は、単離された形態の分子を含む。単離された核酸は通常均質な核
酸分子を含むが、いくつかの実施態様では不均質な少数の配列を有する核酸を含
む。この不均質性は代表的にはポリマーの末端、または所望の生物学的機能もし
くは活性に重要ではない部分で見られる。
本明細書中で使用される、用語「DVic-1ケモカインタンパク質」は、タンパク
質の文脈で使用される場合、配列番号2に示される、特にケモカインモチーフ部
分からの、アミノ酸配列を有するタンパク質、またはこのようなタンパク質（好
ましくは天然の実施態様）に独特の、および／もしくは特徴的な有意なフラグメ
ントを含む。ヒトおよびマウスDGWCC、ならびに配列番号6および8についても同
様である。本発明はまた、このようなケモカインと似た構造を示すポリペプチド
（例えば、DVic-1またはDGWCCケモカイン特異的結合成分と相互作用するもの）
を包含する。これらの結合成分、例えば抗体は、代表的にDVic-1またはDGWCCケ
モカインのいずれかと高い親和性（例えば、少なくとも約100nM、通常約30nMよ
り良好であり、好ましくは約10nMより良好であり、そして更に好ましくは約3nM
より良好である）で結合する。
本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」は、例
えばDGWCCケモカインのケモカインモチーフ部分の有意なフラグメントまたはセ
グメントを含み、そして以下のようなアミノ酸残基のストレッチを包含する：少
なくとも約8アミノ酸、一般には少なくとも10アミノ酸、更に一般的には少なく
とも12アミノ酸、しばしば少なくとも14アミノ酸、更に頻繁には少なくとも16ア
ミノ酸、代表的には少なくとも18アミノ酸、更に代表的には少なくとも20アミノ
酸、通常少なくとも22アミノ酸、更に通常は少なくとも24アミノ酸、好ましくは
少なくとも26アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも28アミノ酸、ならびに、特
に好ましい実施態様では少なくとも約30、もしくは更に多いアミノ酸（例えば、
35,40,45,50,60,70,80など）。セグメントは適切な長さのアミノ末端およびカル
ボキシ末端を有し得る（例えば、例えば残基1,2,3などで始まり、そして例えば
残基95,94,93,92などで終わる）。本発明は複数の上記セグメントを含むタンパ
ク質を包含する。
「組換え」核酸は、その産生方法、もしくはその構造のいずれかにより定義さ
れる。その産生方法（例えばプロセスにより作られる産物）に関しては、このプ
ロセスは、例えば、ヌクレオチド配列、代表的には選択もしくは産生においてヒ
トの介入を含む組換え核酸の技術の使用である。あるいは、組換え核酸は、天然
では互いに連続していない二つのフラグメントの融合体を含む配列を生成するこ
とにより作製される核酸であり得るが、天然の産物を（例えば、天然に生じた変
異体）を排除することが意図される。従って、例えば、任意の天然には存在しな
いベクターで細胞を形質転換することにより作られた産物は、任意の合成オリゴ
ヌクレオチドプロセスを使用して誘導される配列を含む核酸と同様に包含される
。このようなことは、代表的には配列認識部位を導入もしくは除去すると同時に
、コドンを、同じもしくは保存されたアミノ酸をコードする重複コドンに置き換
えるために頻繁に行われる。あるいは、通常で利用可能な天然の形態では見られ
ない所望の組合せの機能を含む単一の遺伝的実体を生成するために、所望の機能
の核酸セグメントを共に結合させることにより実施される。制限酵素認識部位は
しばしばこのような人為的操作の標的であるが、他の部位特異的標的（例えば、
プロモーター、DNA複製部位、調節配列、制御配列、もしくは他の有用な特徴）
が設計により取り込まれ得る。類似する概念は、組換え（例えば融合）ポリペプ
チドについて意図される。特に含まれるのは、遺伝コードの重複性により、これ
らの抗原のフラグメントに類似するポリペプチドをコードする合成核酸、および
種々の異なる種改変体に由来する配列の融合体を含む。
「溶解度」は、スベードベリー単位で測定される沈降に反映される。スベード
ベリー単位は、特定の条件下での分子の沈降速度の測定単位である。沈降速度の
決定は分析的な超遠心分離により古典的に実施されたが、代表的には今日では標
準的な超遠心分離により実施される。Freifelder(1982)Physical Biochemistry
（第二版）W.H.Freeman & Co.,San Francisco,CA;ならびにCanterおよびSchimme
l(1980)Biophysical Chemistry 1-3部,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,CAを
参照のこと。大雑把な決定として、おそらく可溶性ポリペプチドを含むサンプル
を、標準的フルサイズの超遠心分離機で、約50K rpmで約10分間で回転させ、そ
して可溶性分子は上清中に残留する。可溶性の粒子もしくはポリペプチドは代表
的には約30S未満であり、さらに代表的には約15S未満であり、通常は約10S未満
であり、さらに通常では約6S未満であり、そして特定の実施態様では、好ましく
は約4S未満であり、そしてさらに好ましくは約3S未満である。ポリペプチドもし
くはフラグメントの溶解度は環境およびポリペプチドに依存する。多くのパラメ
ーター（温度、電解質の環境、サイズ、およびポリペプチドの分子的特徴、なら
びに溶媒の性質を含む）はポリペプチドの溶解度に影響する。代表的には、ポリ
ペプチドが用いられる温度は約4℃から約65℃の範囲である。通常、使用時での
温度は約18℃を超え、さらに通常では約22℃を超える。診断上の目的のために、
温度は通常、ほぼ室温以上であるが、アッセイでの成分の変性温度より低い。治
療上の目的のために、温度は通常、体温、代表的にはヒトについては約37℃であ
るが、特定の状況下では、インサイチュもしくはインビトロでは温度は上昇もし
くは下降し得る。
ポリペプチドのサイズおよび構造は一般には、実質的に安定な状態にあり、大
抵は変性状態にない。ポリペプチドは四次構造において他のポリペプチドと会合
して、例えば溶解度を与え得るか、または脂質もしくは界面活性剤と、天然の脂
質二重層相互作用に近い様式で会合し得る。
溶媒は通常、生物学的活性の保存のために使用されるタイプの、生物学的に適
合性の緩衝液であり、そして通常、生理的な溶媒に近い。通常、溶媒は中性のpH
、代表的には約5と10との間、そして好ましくは約7.5を有する。いくつかの場合
には、代表的には穏やかな非変性性界面活性剤（例えば、CHS(コレステリルヘミ
サクシネート)もしくはCHAPS（3-[3-コラミドプロピル−ジメチルアンモニオ]-1
-プロパンスルホネート）が、またはタンパク質の構造的もしくは生理的な特性
の有意な破壊を避けるために十分に低濃度で界面活性剤が添加される。
タンパク質の文脈での「実質的に純粋」は、代表的にはタンパク質が、元の供
給源生物体に由来する他の混入タンパク質、核酸、および他の生物学的製剤から
単離されることを意味する。純度、もしくは「単離」は標準的な方法によりアッ
セイされ得、そして通常は少なくとも約50％の純度、、さらに通常では少なくと
も約60％の純度、一般には少なくとも約70％の純度、さらに一般には少なくとも
約80％の純度、しばしば少なくとも約85％の純度、さらに頻繁には少なくとも約
90％の純度、好ましくは少なくとも約95％の純度、さらに好ましくは少なくとも
約98％の純度、および最も好ましい実施態様では少なくとも99％の純度である。
類似の概念は、例えば、抗体または核酸に適用される。
核酸配列比較の文脈での「実質的類似性」とは、比較した場合にセグメントま
たはそれらの相補的鎖のいずれかが、適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失を有
して、最適に整列させた場合に、少なくとも約50％のヌクレオチド、一般的には
少なくとも56％、さらに一般的には少なくとも59％、通常は少なくとも62％、さ
らに通常では少なくとも65％、しばしば少なくとも68％、さらに頻繁には少なく
とも71％、代表的には少なくとも74％、さらに代表的には少なくとも77％、大抵
は少なくとも80％、さらに大抵では少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約
90％、さらに好ましくは少なくとも約95から98％以上、そして特定の実施態様で
は約99％以上の高い程度のヌクレオチドが同一であることを意味する。あるいは
、実質的類似性は、セグメントが、選択的なハイブリダイゼーションの条件下で
、代表的には配列番号1、5、または7から誘導される配列を使用する鎖またはそ
の相補体に対してハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、選択的ハイ
ブリダイゼーションは、少なくとも約30ヌクレオチドのストレッチにわたって少
なくとも約55％の類似性が、好ましくは少なくとも約25ヌクレオチドのストレッ
チにわたって少なくとも約65％の類似性が、さらに好ましくは約20ヌクレオチド
のストレッチにわたって少なくとも約75％の類似性が、そして最も好ましくは少
なくとも約90％の類似性が存在する場合に生じる。Kanehisa(1984)Nuc.Acids Re s.
12:203-213を参照のこと。記載のように、類似性比較の長さはより長いストレ
ッチにわたり得、そしていくつかの実施態様では少なくとも約17ヌクレオチド、
通常は少なくとも約20ヌクレオチド、さらに通常は少なくとも約24ヌクレオチド
、
代表的には少なくとも約28ヌクレオチド、さらに代表的には少なくとも約40ヌク
レオチド、好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド、そしてさらに好ましくは少
なくとも75から100以上のヌクレオチド（例えば、150,200など）のストレッチに
わたる。
ハイブリダイゼーションの文脈における相同性または実質的類似性に言及する
際の「ストリンジェントな条件」とは、塩、温度、有機溶媒、および他のパラメ
ーター（代表的には、ハイブリダイゼーション反応において制御されるもの）の
、ストリンジェントな組み合わせ条件である。パラメーターの組合せは、単一の
任意のパラメーターの測定単位よりもさらに重要である。例えば、Wetmurおよび
Davidson(1968)J.Mol.Biol.31:349-370を参照のこと。ストリンジェントな条件
下で標的核酸に結合する核酸プローブは、上記標的核酸に特異的である。このよ
うなプローブは、代表的には11ヌクレオチド長より長く、そしてストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件下で標的に結合するために、プローブの配列に
より特定される領域にわたって標的核酸に対して十分に同一または相補的である
。
他の哺乳動物種に由来するDGWCCケモカインは、近縁種の種間(Cross-species)
ハイブリダイゼーションによりクローン化および単離され得る。例えば、以下を
参照のこと。類似性は遠縁種間では相対的に低いかもしれず、従って比較的近縁
な種のハイブリダイゼーションが望ましい。あるいは、より低い種特異性を示す
抗体調製物の調製は、発現クローニングのアプローチに有用であり得る。
句「抗体に特異的に結合する」または「特異的に免疫応答性である」は、タン
パク質またはペプチドを言及する場合、タンパク質および他の生物学的成分の異
種集団の存在下でのタンンパク質の存在の決定因である結合反応をいう。従って
、示されたイムノアッセイの条件下では、特定の抗体は特定のタンパク質に結合
し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質とは有意には結合しない。この
ような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質についてのその特
異性について選択された抗体を要求し得る。例えば、配列番号2、または6もしく
は8に示されるアミノ酸配列を有するDVic-1もしくはDGWCCケモカインタンパク質
免疫原に対して惹起された抗体は、DGWCCケモカインタンパク質については特異
的に免疫反応性だが、他のタンパク質に対してはそうでない抗体を入手するため
に
選択され得る。抗体は、例えば、多型性およびスプライシング、もしくは発生的
な改変体も認識して種特異的であり得る。
III.核酸
DGWCCケモカインは、構造的および機能的に関連するタンパク質の例である。
これらの可溶性ケモカインタンパク質は、異なる細胞型間にシグナルを伝達する
のに役立つ。開示されるように、好ましい実施態様は、異なる個体もしくは他の
種（例えば、鳥類および哺乳動物のような温血動物）に由来する遺伝子を単離す
るための標準的な手順において有用である。交差ハイブリダイゼーションは、個
体、株、または種からの、タンパク質をコードする関連遺伝子の単離を可能にす
る。多数の異なるアプローチは、本明細書中で提供される情報に基づいて、適切
な核酸クローンを首尾良く単離するために利用可能である。サザンブロットハイ
ブリダイゼーションの研究は、特定のハイブリダイゼーション条件下で、ヒト、
サル、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、およびウサギのゲノム中の相同遺伝
子の存在を定性的に決定し得る。
相補的な配列はプローブもしくはプライマーとしても使用される。もっともら
しいアミノ末端の同定に基づけば、他のペプチドは、例えば、係留されたベクタ
ーもしくはポリA相補的PCR技術とを結びつけて、または他のペプチドの相補的DN
Aと結びつけて特に有用であるはずである。
DGWCCケモカインタンパク質をコードする遺伝子の核酸操作の技術（例えば、
ポリペプチドをコードする核酸配列の発現ベクターへのサブクローニング、プロ
ーブの標識化、DNAハイブリダイゼーションなど）は、一般に、Sambrookら、(19
89)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)第1〜3巻,Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NYに記載され、これは本明細書中で
参考として援用される。このマニュアルは以下、「Sambrookら」と言及される。
DGWCCケモカインタンパク質をコードするDNA配列の単離の様々な方法がある。
例えば、本明細書で開示される配列と同一もしくは相補的な配列を有する標識し
たオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムDNAライブラリーもしくはcDN
AライブラリーからDNAは単離される。全長のプローブが使用され得、またはオリ
ゴヌクレオチドプローブが、開示された配列との比較により生成され得る。この
ようなプローブをハイブリダイゼーションアッセイで直接使用して、DGWCCケモ
カインタンパク質をコードするDNAを単離し得るか、またはプローブはDGWCCケモ
カインタンパク質をコードするDNAの単離のための、PCRのような増幅技術での使
用のために設計され得る。逆翻訳コンピュータープログラムは、同じタンパク質
をコードする代わりの核酸配列もまた提供し得る。
cDNAライブラリーを調製するために、mRNAは、DGWCCケモカインタンパク質を
発現する細胞から単離される。cDNAはmRNAから調製され、組換えベクター中に連
結される。ベクターは、増殖、スクリーニング、およびクローニングのために組
換え宿主にトランスフェクトされる。cDNAライブラリーを作製およびスクリーニ
ングするための方法は周知である。GublerおよびHoffman(1983)Gene25:263-269
ならびにSambrookらを参照のこと。
ゲノムライブラリーのために、DNAは、組織から抽出され、そして機械的に剪
断されるか、もしくは酵素消化されるのかのいずれかにより約12〜20kbのフラグ
メントを生じ得る。次に、フラグメントは勾配遠心分離により分離され、そして
バクテリオファージλベクター中にクローン化される。これらのベクターおよび
ファージは、Sambrookらの記載のように、インビトロでパッケージングされる。
組換えファージは、BentonおよびDavis(1977)Science196:180-182中の記載のよ
うに、プラークハイブリダイゼーションにより解析される。コロニーハイブリダ
イゼーションは、例えば、Grunsteinら(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.72:3961-
3965に一般的に記載されるように実施される。
DGWCCケモカインタンパク質をコードするDNAは、例えば、コロニーもしくはプ
ラークハイブリダイゼーションアッセイにおいて本明細書中で記載される核酸プ
ローブにハイブリダイズする能力により、cDNAライブラリーもしくはゲノムライ
ブラリーのいずれかにおいて同定され得る。対応するDNA領域は、当業者に周知
の標準的な方法により単離される。例えば、Sambrookらを参照のこと。
標的配列を増幅する種々の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）はまた、DG
WCCケモカインタンパク質をコードするDNAを調製するために使用され得る。ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)技術は、mRNAから、cDNAから、およびゲノムライブラリ
ーまたはcDNAライブラリーからこのような核酸配列を直接増幅するために使用さ
れる。DGWCCケモカインタンパク質をコードする単離された配列は、PCR増幅のテ
ンプレートとしてもまた使用され得る。
代表的には、PCR技術では、増幅されるDNA領域の二つの5’領域に相補的なオ
リゴヌクレオチドプライマーが合成される。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応が二
つのプライマーを使用して実施される。Innisら（編）(1990)PCR Protocols:A G uide to Methods and Applications
Academic Press,San Diego,CAを参照のこと
。プライマーは、全長のDGWCCケモカインタンパク質をコードする全領域を増幅
するための、または所望により、さらに小さなDNAセグメントを増幅するように
選択され得る。一度このような領域がPCR増幅されると、それらは配列決定され
得、そして標準的な技術を使用して得られた配列からオリゴヌクレオチドプロー
ブが調製され得る。次いで、これらのプローブは、DGWCCケモカインタンパク質
をコードするDNAの単離に使用され得る。
プローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、通常、BeaucageおよびCarrut
hers(1983)Tetrahedron Lett.22(20):1859-1862により最初に記載された固相ホ
スホルアミダイトトリエステル法に従って、またはNeedham-VanDevanterら、(19
84)Nucleic Acids Res.12:6159-6168に記載されたように自動合成機を使用して
、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、例えば、未変性のアクリ
ルアミドゲル電気泳動により、またはPearsonおよびRegnier(1983)J.Chrom.255:
137-149により記載されるようにアニオン交換HPLCにより実行される。合成オリ
ゴヌクレオチドの配列は、例えば、GrossmanおよびMoldave編(1980年)Methods i n Enzymology
65:499-560,Academic Press,New Yorkでの、MaxamおよびGilbert
の化学的分解法を用いて検証され得る。
DGWCCケモカインタンパク質をコードする単離された核酸が同定された。ヌク
レオチド配列および対応するオープンリーディングフレームは配列番号1または5
または７に提供される。
これらのDVic-1およびDGWCCケモカインは、ケモカインの部分に限定された類
似性を示す。例えば、MatsushimaおよびOppenheim(1989)Cytokine 1:2-13;Oppen
heimら(1991)Ann.Rev.Immunol.9:617-648;Schall(1991)Cytokine 3:165-183;な
らびにGronenbornおよびClore(1991)Protein Engineering 4:263-269を参照のこ
と。比較の他の特徴は、DGWCCケモカインとケモカインファミリーとの間で明白
である。例えば、Lodiら、(1994)Science 263:1762-1766を参照のこと。詳細に
は、b-シート残基およびa-ヘリックス残基は、例えばRASMOLプログラム(Sayleお
よびMilner-White(1995)TIBS 20:374-376；またはGronenbergら、(1991)Protein Engineering
4:263-269を参照のこと)を使用して決定され得、そして他の構造
的な特徴はLodiら、(1994)Science 263:1762-1767で定義されている。これらの
二次的特徴および三次的特徴は、適切なシステイン残基の間隔とともに、C,CC,C
XC,およびCX3Cの構造的特徴をさらに定義するのを助ける。
本発明は、DVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質をコードする単離されたD
NAまたはフラグメントを提供する。加えて、本発明は、適切な条件下（例えば、
高いストリンジェンシー）で本明細書に記載されるDNA配列とハイブリダイズし
得る、タンパク質もしくはポリペプチドをコードする、単離されたDNAもしくは
組換えDNAを提供する。上記生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドは
、インタクトなリガンドまたはフラグメントであり得、そしてとりわけ天然の実
施態様では、配列番号2または6または8に開示されるようなアミノ酸配列を有す
る。好ましい実施態様は、単離物由来の、例えば、グリコシル化されていない場
合のサイズが約11,000から12,500ダルトンの全長の天然の配列、または少なくと
も約6,000ダルトン、さらに好ましくは少なくとも約8,000ダルトンのフラグメン
トである。グリコシル化形態では、タンパク質は12,500ダルトンを超え得る。更
に、本発明は、DVic-1もしくはDGWCCケモカインタンパク質に相同であるタンパ
ク質をコードするか、または、DVic-1もしくはDGWCCケモカインタンパク質をコ
ードするcDNAをプローブとして使用することにより単離された、単離されたDNA
もしくは組換えDNAまたはそのフラグメントの使用を意図する。単離されたDNAは
、5’および3’に隣接する調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポ
リ-A付加シグナルなど）をそれぞれ有し得る。これらの配列を有する発現ベクタ
ーを作製するための方法、または例えば、タンパク質産物を発現および精製する
ための方法もまた含まれる。
IV.DVic-1、DGWCCケモカインの作製
DVic-1もしくはDGWCCケモカインをコードするDNAまたはそのフラグメントは、
化学的合成、cDNAライブラリーのスクリーニング、または広範な種々の細胞株も
しくは組織サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングにより
入手され得る。このようなことを行うための方法、または発現ベクターを作製す
るための方法は、本明細書中に記載される。
これらのDNAは、全長タンパク質またはフラグメントの合成のために、広範な
種々の宿主細胞で発現され得る。次いで、これらの全長タンパク質もしくはフラ
グメントは、例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の産生のため
に；結合の研究のために；改変した分子の構築および発現のために；ならびに構
造／機能の研究のために使用され得る。各DVic-1もしくはDGWCCケモカインまた
はそのフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクト
した宿主細胞中で発現され得る。これらの分子は、組換え宿主由来のもの以外は
、タンパク質または細胞の混入物を含まないように実質的に精製され得、それゆ
え薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤と組み合わされた場合、薬
学的組成物中で特に有用である。抗原（例えば、DGWCCケモカイン）またはその
部分は、他のタンパク質との融合物として、またはエピトープタグを有して発現
され得る。
発現ベクターは、代表的には、適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝
的制御エレメントに作動可能に連結された所望の抗原遺伝子もしくはそのフラグ
メントを含む自己複製性DNAもしくはRNA構築物である。発現をもたらすために必
要とされる特定の型の制御エレメントは、使用される最終的な宿主細胞に依存す
る。一般には、遺伝制御エレメントは、原核生物のプロモーター系または真核生
物プロモーター発現制御系を含み得、そして代表的には転写プロモーター、転写
開始を制御する任意のオペレーター、mRNA発現のレベルを上昇させる転写エンハ
ンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳
を終結させる配列を含む。発現ベクターはまた、通常、ベクターが宿主細胞から
独立的に複製することを可能にする複製起点を含む。
本発明のベクターは、DVic-1もしくはDGWCCケモカイン、または代表的には、
例えば、生物学的に活性なポリペプチドすなわちタンパク質をコードするフラグ
メントを含む。DNAはウイルスのプロモーターの制御下にあり得、そして選択マ
ーカーをコードし得る。本発明は、原核生物もしくは真核生物宿主においてDVic
-1もしくはDGWCCケモカインタンパク質をコードする真核生物cDNAを発現し得る
ような発現ベクターの使用を更に意図し、ここで、このベクターは宿主と適合性
であり、そしてタンパク質をコードする真核生物cDNAは、ベクターを含む宿主の
増殖により目的のcDNAが発現されるようにベクター中に挿入される。通常、発現
ベクターは、それらの宿主細胞における安定な複製のために、もしくは増幅して
細胞当たりの所望の遺伝子の全コピーを大いに増加させるために設計される。発
現ベクターの宿主細胞中での複製を要求することは、必ずしも必要ではない（例
えば、宿主細胞により認識される複製起点を含まないベクターを使用して、種々
の宿主においてタンパク質もしくはそのフラグメントの一過性の発現をもたらす
ことは可能である）。DVic-1もしくはDGWCCケモカイン遺伝子またはそのフラグ
メントの、宿主DNA中への組換えによる組み込みを生じるベクターの使用、ある
いは内在性の遺伝子の発現を制御するプロモーターの取り込みもまた可能である
。
本明細書で使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファー
ジ、組み込み可能なDNAフラグメント、および宿主のゲノム中へのDNAフラグメン
トの組込みを可能にする他のビヒクルが意図される。発現ベクターは、作動可能
に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝的制御エレメントを含む特殊化された
ベクターである。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるが
、同等の機能を果たす多くの他の形態のベクターは、本明細書中の使用に適する
。例えば、Pouwelsら、（1985および補遺）Cloning Vectors:A Laboratory Manu al
Elsevier,N.Y．；およびRodriquezら(編)、（1988）Vectors:A Survey of Mo lecular Cloning Vectors and Their Uses
Buttersworth,Boston,MAを参照のこ
と。
適切な宿主細胞は、原核生物、下等真核生物、および高等真核生物を含む。原
核生物はグラム陰性生物およびグラム陽性生物の両方(例えば、E.coliおよびB.s
ubtilis)を含む。下等真核生物は、酵母（例えば、S.cerevisiaeおよびPichia）
、ならびにDictyosteliumの種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源（例え
ば、昆虫細胞および鳥類）、ならびに哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類、
ならびに齧歯類）の両方の動物細胞に由来する、樹立された組織培養細胞株を含
む。
原核生物宿主ベクター系は、各種の、多くの異なる種のための広範な種々のベ
クターを含む。本明細書で使用される場合、E.coliおよびそのベクターは、他の
原核生物で使用される等価なベクターを含むように包括的に使用される。DNAを
増幅するための代表的なベクターは、pBR322もしくはその誘導体である。DGWCC
ケモカインもしくはDGWCCケモカインのフラグメントを発現するために使用され
得るベクターは以下のプロモーターを含むベクターのようなベクターを含むがこ
れらに限定されない：lacプロモーター（pUCシリーズ）；trpプロモーター(pBR3
22-trp);IPPプロモーター（pINシリーズ）；λ-pPもしくはpRプロモーター(pOTS
)；またはptacのようなハイブリッドプロモーター(pDR540)。RodriguezおよびDe
nhardt(編)Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 1
0:205-236 Buttersworth,Boston,MA中の、Brosiusら、（1988）「Expression Vec
tors Empioying Lambda-,trp-,lac-,and Ipp-derived Promotors」を参照のこと
。
下等真核生物(例えば、酵母およびDictyosteilu)は、DVic-1またはDGWCCケモ
カイン配列を含有するベクターで形質転換され得る。本発明の目的のために、最
も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母のSaccharomyces cerevisiaeである。
多くの他の株および種類もまた利用可能であるが、これは、下等真核生物を代表
するために一般に使用される。酵母ベクターは、代表的に複製起点（組込み型を
除いて）、選択遺伝子、プロモーター、所望のタンパク質またはそのフラグメン
トをコードするDNA、ならびに翻訳終止、ポリアデニル化、および転写終結のた
めの配列からなる。酵母に関して適切な発現ベクターは、３−ホスホグリセリン
酸キナーゼおよび種々の他の糖分解酵素遺伝子プロモーターのような構成性プロ
モーターまたは、アルコールデヒドロゲナーゼ２プロモーターまたはメタロチオ
ネインプロモーターのような誘発性プロモーターを含有する。適切なベクターは
、以下のタイプの誘導体を含有する：低いコピー数で自己複製すること（YRp-系
列のような）、高いコピー数で自己複製すること(YEp-系列のような)；組込み型
(YIp-系列のような)、またはミニ染色体(YCp-系列のような)。
高等真核生物組織培養細胞は、代表的には、機能的に活性なDVic-1またはDGWC
Cケモカインタンパク質の発現のために好ましい宿主細胞である。原則として、
多くの高等真核生物組織培養細胞株は、無脊椎動物供給源由来または脊椎動物供
給源由来にかかわらず、例えば昆虫バキュロウイルス発現系を使用し得る。しか
しながら、哺乳類細胞は、同時翻訳および翻訳後の両方で適切なプロセシングを
達成するために好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクショ
ンおよび増殖は日常的である。有用な細胞株はHeLa細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞株、ベビーラット腎臓(BRK)細胞株、昆虫細胞株、鳥細胞株、そ
してサル(COS)細胞系を包含する。そのような細胞株のための発現ベクターは、
通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、RNAスプライス部位（例えば、
ゲノムDNAが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含
有する。これらのベクターはまた、選択遺伝子または増幅遺伝子を含有し得る。
適切な発現ベクターは、例えばアデノウイルス、SV40、パルボウイルス、ワクシ
ニアウイルス、またはサイトメガロウイルス由来のような起源に由来するプロモ
ーターを保有するプラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。適
切な発現ベクターの代表的な例は、pCDNA1;pCD、Okayamaら、（1985）Mol ．Cell ．Biol.
5:1136-1142を参照のこと;pMC1neo Poly-A、Thomasら、(1987)Cell 51:
503-512を参照のこと；およびpAC373またはpAC610のようなバキュロウイルスを
包含する。
DVic-1またはDGWCCケモカインは、生物学的応答を惹起するためにグリコシル
化される必要はないようである。しかしながら、特定のまたは定義されたグリコ
シル化パターンを提供する系においてDVic-1またはDGWCCケモカインポリペプチ
ドを発現することは、時折望ましい。この場合、有用なパターンは、発現系によ
り自然に提供されるパターンである。しかしながら、このパターンは、ポリペプ
チド（例えば、非グリコシル化型の）を、異種発現系に導入された適切なグリコ
シル化タンパク質に曝露することにより、修正可能となる。例えば、DGWCCケモ
カイン遺伝子は、哺乳類または他のグリコシル化酵素をコードする１つ以上の遺
伝子と同時形質転換され得る。過度のグリコシル化は、DGWCCケモカインイン生
物学的活性に有害となり得、当業者は最適な生物学的活性を与えるグリコシル化
の程度を最適化するために日常的な試験を実施し得ることがさらに理解される。
DVic-1またはDGWCCケモカイン、またはそのフラグメントは、細胞膜に連結さ
れたホスフアチジルイノシトール(PI)であるように操作され得るが、ホスファチ
ジルイノシトール切断酵素（例えば、ホスファチジルイノシトールホスホリパー
ゼＣ）での処理により膜から除去され得る。これは、抗体を生物学的に活性な形
態で放出し、そしてタンパク質化学の標準的な手順による精製を可能にする。例
えば、Low（1989）Biochem ．Biophys．Acta 988:427-454；Tseら（1985）Scienc e
230:1003-1008；およびBrunnerら(1991)J．Cell Biol. 114:1275-1283を参照
のこと。
今やDVic-1およびDGWCCケモカインが特徴付けられており、そのフラグメント
または誘導体はペプチドを合成するための従来のプロセスにより調製され得る。
これらとしては、StewartおよびYoung（1984）Solid Phase Peptide Synthesis
，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL;BodanszkyおよびBodanszky（1984）The Practice of Peptide Synthesls
，Springer-Verlag，New York，NY;およびBodan
szky（1984）The Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New Yo
rk，NYに記載のようなプロセスが挙げられる。例えば、アジド処理、酸塩化物プ
ロセス、酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス（例え
ば、p-ニトロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、もしく
はシアノメチルエステル）、カルボジイミダゾールプロセス、酸化−還元プロセ
ス、またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)／付加剤プロセスが使用され
得る。固相および液相合成の両方が、前記のプロセスに適用可能である。また、
化学的連結、例えばDawsonら、（1994）Science 266:776-779、ペプチド結合に
より長鎖合成ペプチドを連結する方法、を参照のこと。
調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、単離され得、ペプチド分離
、例えば、抽出、沈澱、電気泳動、および種々の型のクロマトグラフィなどによ
り反応混合物から精製され得る。本発明のDVic-1またはDGWCCケモカインは、そ
の所望の用途に依存して種々の精製の程度で得られ得る。精製は、公知のタンパ
ク質精製法の使用または本明細書に記載の抗体または結合パートナー（例えば、
免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーにおける）の使用により達成され得
る。
この免疫吸着アフィニティークロマトグラフィは、まず、固体支持体に抗体を連
結させ、次いで、連結した抗体を、適切な起源細胞の溶解した溶解物、リガンド
を発現する他の細胞の溶解物、または組換えDNA技術の結果としてのDVic-1また
はDGWCCケモカインを産生する細胞の溶解物もしくは上清と接触させることによ
り実施される。以下を参照のこと。
複数の細胞株が、他の細胞と比べて高レベルでDGWCCケモカインを発現する細
胞についてスクリーニングされ得る。天然DVic-1またはDGWCCケモカインは、天
然起源から単離し得るか、または適切な発現ベクターを使用する形質転換細胞か
らの発現により得る。発現したタンパク質の精製は、標準的手順により達成され
るか、または細胞溶解物もしくは上清から高い効率での効果的精製のための設計
された手段と併用され得る。エピトープまたは他のタグ（例えば、FLAGまたはHi
s6セグメント）は、このような精製の特徴にために使用され得る。
V。抗体
抗体は、それらの天然に存在する（全長）形態およびそれらの組換え形態の両
方において、個々の、多型性の、対立遺伝子の、株の、または種改変体、そして
そのフラグメントを包含する種々のDVic-1またはDGWCCケモカインに対して惹起
され得る。さらに抗体は、それらの活性形態または不活性形態のどちらかのDVic
-1またはDGWCCケモカインに対して惹起され得る。抗イディオタイプ抗体もまた
、使用され得る。抗体は、種、個々のまたは多型性の改変体に対する種々の結合
特異性を示し得る。
A。抗体産生
多数の免疫原が、DVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質と特異的に反応性
の抗体を産生するために使用され得る。組換えタンパク質は、モノクローナルま
たはポリクローナル抗体の産生のために好ましい免疫原である。天然に存在する
タンパク質はまた、純粋形態または不純形態のどちらかで使用され得る。本明細
書に記載のDVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質配列を使用して生成される
合成ペプチドもまた、DVic-1またはDGWCCケモカインに対する抗体の産生のため
の免疫原として使用され得る。組換えタンパク質は、本明細書に記載されるよう
な真核生物または原核生物細胞において発現され得、そして記載されるように精
製され得る。天然に折り畳まれたまたは変性した物質は、抗体産生のために、適
切なように、使用され得る。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のどちら
かが、タンパク質を測定するための免疫アッセイにおける、引き続く使用のため
に生成され得る。
ポリクローナル抗体産生の方法は、当業者に公知である。代表的には、免疫原
（好ましくは精製タンパク質）を、アジュバントと混合し、そして動物をこの混
合物で免疫する。免疫原調製物に対する動物の免疫応答を、試験出血を採取し、
そして目的のDVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質への反応性の力価を決定
することによりモニターする。免疫原に対する抗体の適度に高い力価が得られる
場合、通常、反復免疫化後、血液を哺乳類から採集し、そして抗血清を調製する
。所望される場合、タンパク質に対して反応性の抗体について富化するために抗
血清のさらなる分画を、実施し得る。例えば、HarlowおよびLane;またはColigan
を参照のこと。
モノクローナル抗体は当業者に周知の種々の技術により得られ得る。代表的に
は、所望の抗原で免疫化された動物由来の肺臓細胞を、通常にはミエローマ細胞
との融合により、不死化する(KohlerおよびMilstein（1976）Eur ．J．Immunol.
6:511-519(参考として本明細書中に援用される）を参考のこと)。不死化の代替
的方法は、エプスタインバールウイルス、オンコジーン、もしくはレトロウイル
スでの形質転換、または当業者に公知の他の方法を包含する。単一の不死化細胞
から生じるコロニーを、抗原についての所望の特異性および親和性の抗体の産生
に関してスクリーニングもする。このような細胞により生じるモノクローナル抗
体の収量を、脊椎動物宿主の腹腔内への注射を含有する種々の技術により高め得
る。あるいは、当業者は、例えば、Huseら、（1989）Science 246:1275-1281に
より概説される一般的プロトコールに従って、ヒトB細胞由来DNAライブラリーを
スクリーニングすることにより、モノクローナル抗体またはその結合フラグメン
トをコードするDNA配列を単離し得る。
DGWCCケモカインの所定のフラグメントに対する抗体、（結合フラグメントお
よび単鎖バージョンを包含する）は、上記のようなキャリヤータンパク質とのフ
ラグメントの結合体での動物の免疫化により惹起され得る。モノクローナル抗体
は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常のまたは
欠陥のDVic-1またはDGWCCケモカインへの結合に関してスクリーニングされ得る
か、または、例えば、レセプターを通して仲介されるアゴニストもしくはアンタ
ゴニスト活性に関してスクリーニングされ得る。これらのモノクローナル抗体は
、通常、少なくとも約1mM、より通常には少なくとも約300μＭ以上で、代表的に
は少なくとも灼く10μＭで、代表的には少なくとも約30μＭで、好ましくは、少
なくとも約10μＭで、そしてより好ましくは少なくとも約３μＭまたはそれより
良い、ＫDで結合する。
いくつかの場合において、種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊
長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製することが所望される。そのよ
うなモノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら（編
）Basic and Clinical Immunology（第４版）、Lange Medical Publications，L
os Altos，CA、および本明細書中で引用される参考文献；HarlowおよびLane（19
88）Antibodies:A Laboratory Manual CSH Press；Goding（1986）Monoclonal A ntibodies:Principles and Practice
（第２版）Academic Press，New York，NY
；および特に、KohlerおよびMilstein（1975）Nature 256:495-497（これは、モ
ノクローナル抗体を産生する一つの方法を記載する）において見出され得る。簡
潔に要約すると、この方法は、動物に免疫原を注入することを包含する。次いで
、動物は屠殺され、そして細胞はその脾臓から採取され、次いでその細胞は骨髄
肺細胞に融合される。この結果は、インビトロで再生され得るハイブリッド細胞
または「ハイブリドーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニ
ングして、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離
する。この様式において、得られる個々の抗体種は、免疫原物質上で認識される
特異的部位に応答して作製される免疫動物由来の不死化およびクローン化された
Ｂ単細胞の生産物である。
他の適切な技術は、ファージもしくは類似のベクターにおける抗体のライブラ
リーの選択を包含する。例えば、Huseら(1989)「λファージにおける免疫グロブ
リンレパートリーのラージコンビナトリアルライブラリーの作製」、Science 24
6:1275-1281：およびWardら(1989)Nature 341:544-546を参照のこと。本発明の
ポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む改変を伴ってま
たは伴わずに使用され得る。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能な
シグナルを提供する基質を共有結合的にまたは非共有結合的に結合することによ
り標識される。広範に多様な標識および結合技術が公知であり、そして科学文献
および特許文献の両方で多数報告されている。適切な標識としては、放射性核種
、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒
子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許
第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,
277,437号；同第4,275,149号；および同第4,366,241号が挙げられる。組換え免
疫グロブリンもまた産生され得る。Cabilly、米国特許第4,816,567号；およびQu
eenら（1989）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:10029-10033を参照のこと。
本発明の抗体は、DVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質の単離におけるア
フィニティークロマトグラフィーに有用である。カラムは、抗体を固相支持体（
例えば、アガロース、SEPHADEXなどのような粒子）に連結させて調製され得、こ
こで、細胞溶解物または上清は、カラムを通過され得、カラムを洗浄し、続いて
温和な変性剤の濃度を増加させることによって、精製DVic-1またはDGWCCケモカ
インタンパク質が遊離される。同様に、ケモカインへ結合する抗体は、レセプタ
ー結合を中和し得、レセプターアンタゴニストとして役立ち得る。それらはまた
、ウエスタンブロット検出試薬またはELISA試薬として有用であり得る。
抗体はまた、特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングする
ために使用され得る。通常、このような手順に使用される抗体は、抗体の結合に
より抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。
DVic-1またはDGWCCケモカインに対する抗体は、DVic-1またはDGWCCケモカイン
を発現する細胞集団の同定に使用し得る。例えば、DGWCCケモカインを発現する
細胞の発現産物をアッセイすることにより、疾患、例えば免疫易無防備状態の診
断が可能となる。
個々のDVic-1またはDGWCCケモカインに対して惹起される抗体はまた、抗イデ
ィオ型の抗体を惹起するために有用である。これらは、それぞれの抗原の発現に
関連する種々の免疫学的状態を検出または診断するにおいて有用である。
Ｂ．免疫アッセイ
特定のタンパク質は、種々の免疫アッセイ方法により測定し得る。一般に、免
疫学的および免疫アッセイ手段の総説に関して、StitesおよびTerr（編）(1991)Basic and Clinical Immunology
(第７編)を参照のこと。さらに、本発明の免疫
アッセイは、Maggio（編）(1980)Enzyme Immunoassay CRC Press，Boca Raton，
Florida;Tijan（1985）「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays」，Lab oratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology
，Elsevier Scien
ce Publishers B．V.，Amsterda;ならびに、HarlowおよびLane Antibodi es ，A Laboratory Manual
，（前出）,において広く概説される多くの構成で実施し得る
。それぞれは、本明細書中に参考として援用される。また、Chan（編）(1987)Im munoassay:A Practical Guide
Academic Press，Orlando，FL;PriceおよびNewma
n(編)（1991）Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press，NY;
およびNgo（編）(1988)Non-isotopic Immunoassays Plenum Press，NY.を参照の
こと。
例えば、DVic-1ケモカインタンパク質の測定のための免疫アッセイは、当業者
に公知の種々の方法により実施され得る。要するに、タンパク質を測定するため
の免疫アッセイは競合的または非競合的結合アッセイのどちらかであり得る。競
合結合アッセイにおいて、分析すべきサンプルは、固体表面に結合した捕獲剤の
特異的結合部位に関して標識された分析物と競合する。好ましくは、捕獲剤は、
上述のように産生したDVic-1ケモカインタンパク質と特異的に反応する抗体であ
る。捕獲剤へ結合した標識化分析物の濃度は、サンプル中に存在する遊離分析物
の量に反比例する。
競合結合免疫アッセイにおいて、サンプル中に存在するDVic-1ケモカインタン
パク質は、特異的な結合剤、例えば、DVic-1ケモカインタンパク質と特異的に反
応する抗体と結合することについて、標識化タンパク質と競合する。結合剤は、
結合していない標識化タンパク質からの結合した標識タンパク質の分離を成立さ
せるように固体表面に結合され得る。あるいは、競合結合アッセイは、液相で実
施され得、そして当該分野で公知の種々の技術が、結合していない標識タンパク
質から結合した標識化タンパク質を分離するために使用され得る。分離後、結合
した標識タンパク質の量が決定される。サンプル中に存在するタンパク質の量は
、標識したタンパク質結合の量に反比例する。
代わりに、分離工程が必要でない均一免疫アッセイが、実施され得る。これら
の免疫アッセイにおいて、タンパク質における標識は、その特異的結合剤へのタ
ンパク質への結合により変わる。標識化したタンパク質におけるこの変化は、従
って、標識により励起されたシグナルの減少または増加を生じ、その結果免疫ア
ッセイの終わりでの標識の測定がタンパク質の検出または定量を可能にする。
DVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質はまた、様々な非競合的イムノアッ
セイ法により決定され得る。例えば、ツーサイト固相サンドイッチイムノアッセ
イが使用され得る。このタイプのアッセイにおいて、タンパク質結合剤、例えば
抗体は、固相支持体に結合される。抗体でもあり得、そして異なる部位でタンパ
ク質を結合する第二のタンパク質結合剤は、標識される。タンパク質の両側での
結合が生じた後、非結合標識結合剤は除去され、そして固相へ結合した標識結合
剤の量が測定される。結合した標識結合剤の量は、サンプル中のタンパク質量に
直接比例する。
ウエスタンブロット分析は、例えば、サンプル中のDGWCCケモカインタンパク
質の存在を決定するために使用され得る。電気泳動が、例えば、タンパク質を含
むと予期される組織サンプルにおいて実施される。タンパク質を分離するための
電気泳動、および適切な固相支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター）へ
のタンパク質の移動に続いて、固体支持体はタンパク質と反応する抗体とインキ
ュベートされる。この抗体は標識され得、または、代わりに一次抗体に結合する
二次標識抗体との引き続きのインキュベーションにより検出され得る。
上記のイムノアッセイ形式は、標識したアッセイ成分を使用する。この標識は
、当該分野に周知の方法に従うアッセイの所望の成分へ直接的または非直接的に
結合され得る。多種多様の標識物および方法が使用され得る。伝統的には、3H、125
I、35S、14C、または32Pを取り込んだ放射活性標識体が使用された。非放射
活性標識は、標識された抗体、蛍光体、化学発光剤、酵素、および標識されたリ
ガンドの特異的結合対メンバーとして作用し得る抗体と結合するリガンドを含む
。標識
の選択は、所望の感度、化合物との結合の容易さ、安定性の要求度、および利用
可能な機器に依存する。使用され得る種々の標識システムまたはシグナル産生シ
ステムの概要については、参考として本明細書中に援用される米国特許第4,391,
904号を参照のこと。
特定のタンパク質と反応する抗体はまた、種々のイムノアッセイ法により測定
され得る。イムノアッセイ技術による抗体の測定に適用可能である免疫学的手順
およびイムノアッセイ法の再検討に関して、StitesおよびTerr(編)Basic and Cl
inical Immunology（第７編）(前出)：Maggio（編）Enzymcle Immunoassay、前
出；ならびにHarlowおよびLane Antibodies，A Laboratory Manual、前出を参照
のこと。
手短に言うと、例えば、DVic-1ケモカインタンパク質と反応する抗血清を測定
するためのイムノアッセイは、競合的のまたは非競合的結合アッセイのどちらか
であり得る。競合的結合アッセイにおいて、サンプル分析物は、固体表面に結合
した捕獲剤上の特異的な結合部位において標識された分析物と競合する。好まし
くは、捕獲剤は、上述のように産生された、精製された組換えDVic-1ケモカイン
タンパク質である。単離されたまたは部分的に精製された自然に存在するタンパ
ク質を含有するDVic-1ケモカインタンパク質の他の供給源がまた、使用され得る
。非競合アッセイは、サンプル分析物が、２つの分析物特異的結合試薬の間に結
合される、サンドイッチアッセイを含む。結合剤の１つは、捕獲剤として使用さ
れ、そして、固体表面に結合される。第２の結合剤は標識され、そして、視覚的
または機械的手段により得られた複合体を測定または検出するために使用される
。多数の捕獲剤と標識された結合剤との組合せが、使用され得る。種々の異なる
イムノアッセイ形式、分離技術、および標識体はまた、DGWCCケモカインタンパ
ク質の測定に関する、上述のこれらと同様に使用され得る。
VI。精製DVic-1またはDGWCCケモカイン
ヒトDVic-1ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号１および２に提供され
る。ヒトDGWCCヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号５および６に提供さ
れ；マウスDGWCCヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号７および８に提供
される。
精製タンパク質または定義されたペプチドは、上記のように、標準的な方法に
より抗体を作製するために有用である。合成ペプチドまたは精製タンパク質は免
疫系に提示され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生じ得る。例
えば、Coligan（1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene，NY;な
らびにHarlowおよびLane（1989）Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring
Harbor Press，NYを参照のこと、これらは参考として本明細書中に引用される
。あるいは、DVic-1またはDGWCCケモカインレセプターは、特異的結合試薬とし
て使用され得、そして、例えば、DGWCCケモカインリガンドの精製のために、そ
の結合の特異性が利用され得る。
特異的結合組成物は、DGWCCケモカインを発現する細胞株から作製される発現
ライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングのため
の多くの方法は、例えば、表面に発現されるリガンドの標準的な染色、またはパ
ニングが利用可能である。細胞内発現のスクリーニングはまた、種々の染色また
は免疫蛍光手順により行われ得る。結合組成物は、リガンドを発現する細胞をア
フィニティ精製するために、または選別するために使用され得た。
ペプチドセグメントはまた、同種遺伝子との比較に加えて、ライブラリーをス
クリーニングするための適切なオリゴヌクレオチドを産生するために使用され得
る。遺伝子コードが、スクリーニングのためのプローブとして有用な適切なオリ
ゴヌクレオチドを選択するために使用され得る。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドは、自然の対立遺伝子の多型変異
体を含むライブラリーから所望のクローンを選択することにおいて有用である。
ペプチド配列はこのようなセグメントを認識する抗体を産生するペプチドの調
製を可能にし、このような配列をコードするオリゴヌクレオチドの調製を可能に
する。この配列はまた、合成的調製を可能にする、例えば、Dawsonら、(1994)Sc ience
266:776-779を参照のこと。DVic-1およびDGWCCケモカインは分泌タンパク
質であり得るので、この遺伝子は、通常、プロセシングおよび分泌に際して除去
されるN-末端シグナル配列を有する。しかしながら、正確なプロセシングポイン
トは異なる細胞型において変わり得、そして、異なる長さの形態が、しばしば検
出される。例えば、シグナル切断ポイントの予測は、Nielsenら、（1997）Prote in Eng.
10:1-8の方法により実施され得る。最も密接に関係する報告された配列
との比較における構造的特徴の分析は、別のサイトカイン、特に、CCおよびCXC
ケモカインとして公知であるタンパク質種との類似性を明らかにした。
VII．物理学的変異体
本発明はまた、DVic-1またはDGWCCケモカインのアミノ酸配列と実質的なアミ
ノ酸配列類似性を有するタンパク質またはペプチドを含む。天然の変異体は、個
々の変異体、多型性の変異体、対立遺伝子変異体、株変異体または種変異体を含
む。
アミノ酸配列類似性または配列同一性は、必要であれば、必要なギャップを導
入して、残基のマッチを最適化することにより決定される。これは、保存的置換
をマッチとして考慮する場合は、変化する。保存的置換は、代表的には以下の群
内での置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；ア
スパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン
；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。相同なアミノ酸配
列は、タンパク質配列における、天然の多型変異、対立遺伝子変異、および種間
変異を含む。代表的な相同タンパク質またはペプチドは、DGWCCケモカインのア
ミノ酸配列と50〜100％の類似性（ギャップが導入され得る場合）から75〜100％
の類似性（保存的置換が含まれる場合）を有する。類似性の測定は、少なくとも
約50％、一般的には少なくとも60％、より一般的には少なくとも65％、通常は少
なくとも70％、より通常には少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、そし
てより好ましくは少なくとも80％であり、そして特に好ましい実施態様では、少
なくとも85％以上である。Needlehamら(1970)J.Mol.Biol．48:443-453;Sankoff
ら（1983）Time Warps，String Edits，and Macromolecules:The Theory and Pr
actice of Sequence Comparison第１章，Addison-Wesley，Reading，MA;およびI
ntelliGenetics，Mountain View，CAのソフトウェアパッケージ;およびUniversi
ty of Wisconsin Genetics Computer Group，Madison，WIもまた参照のこと。
哺乳動物DVic-1ケモカインタンパク質をコードする核酸は、ストリンジェント
な条件下で、代表的には配列番号１の核酸配列にハイブリダイズする。例えば、
DVic-1ケモカインタンパク質をコードする核酸は、通常、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下で、配列番号１の核酸にハイブリダイズする。一般
には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHで、プローブ
配列に対する融解点温度(Tm)よりも約10℃低いように選択される。Tmは、50%の
標的配列が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定されたイオ
ン強度およびpHの下で）温度である。代表的には、ストリンジェントな条件は、
pH7で塩濃度が約0.2モルであり、そして温度が少なくとも約５０℃である条件で
ある。とりわけ、相補鎖の塩基組成およびサイズ、有機溶媒（例えば、ホルムア
ミド）の存在、および塩基ミスマッチの程度を含む他の因子が、ハイブリダイゼ
ーションのストリンジェンシーに有意に影響を及ぼし得る。好ましい実施態様に
は、50%ホルムアミドおよび200mM NaCl中で、42℃で、開示された配列に結合す
る核酸が含まれる。
単離されたDGWCCケモカインDNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌ
クレオチド挿入、およびヌクレオチドストレッチの短い逆位により容易に改変さ
れ得る。これらの改変により、DVic-1またはDGWCCケモカイン抗原、それらの誘
導体、または高度に類似した生理学的活性、免疫原活性もしくは抗原活性を有す
るタンパク質をコードする新規のDNA配列が得られる。
改変された配列は、変異抗原を生成するため、または発現を増強するために使
用され得る。増強された発現は、遺伝子の増幅、転写の増大、翻訳の増大、およ
び他の機構を含み得る。このような変異DGWCCケモカイン誘導体は、タンパク質
またはそのフラグメントの予め決定された(predetermined)変異または部位特異
的変異を含む。「変異DGWCCケモカイン」は、他に上述のようにヒトDGWCCケモカ
インの相同性定義に該当するが、欠失、置換、または挿入のいずれかにより、天
然に見出されるDGWCCケモカインのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを含む。特に、「部位特異的変異DGWCCケモカイン」は、一般に
、配列番号６または８の配列を有するタンパク質と有意な類似性を有し、（例え
ば、天然の実施態様）、そして種々の生物学的活性（例えば、これらの配列との
抗原
性または免疫原性）を共有するタンパク質を含み、そして好ましい実施態様では
、開示された配列の大部分または全てを含有するタンパク質を含む。これはまた
、異なる個体由来の多型変異体にも適用される。同様の概念は、異なるDVic-1ま
たはDGWCCケモカインタンパク質、特に種々の温血動物（例えば、哺乳動物およ
び鳥類）に見出されるDGWCCケモカインタンパク質に適用される。前に述べたよ
うに、記載は、一般に他のDVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質を含むこと
を意図しており、特に議論されたマウスまたはヒトの実施態様に限定されないこ
とを強調する。
部位特異的変異部位は予め決定されているが、変異体は部位特異的である必要
はない。例えば、DGWCCケモカインの変異誘発は、アミノ酸の挿入または欠失を
作製することにより行われ得る。置換、欠失、挿入、または任意の組み合わせが
生成されて、最終構築物に到達し得る。挿入は、アミノ末端融合物またはカルボ
キシ末端融合物、（例えば、エピトープタグ）を含む。ランダムな変異誘発は、
標的コドンにて行われ得、次いで、発現された変異体は、所望の活性についてス
クリーニングされ得る。公知の配列を有するDNA中の予め決定された部位での置
換変異の作製方法は、当該分野で周知である（例えば、M13プライマー変異誘発
またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による）。Sambrookら、(1989)およびAus
ubelら、(1987および補遺)もまた、参照のこと。DNA中の変異は、通常、コード
配列を読み取り枠の外にするべきではなく、そして好ましくは、ハイブリダイズ
してループまたはヘアピンのような２次的なmRNAの構造を生成し得る相補的な領
域を作らない。
本発明はまた、組換えタンパク質（例えば、これらのタンパク質由来のセグメ
ントを使用する異種融合タンパク質）を提供する。異種融合タンパク質は、本来
、同じ方式では通常融合されないタンパク質またはセグメントの融合物である。
従って、免疫グロブリンとDGWCCケモカインポリペプチドとの融合産物は、代表
的なペプチド結合で融合される配列を有し、代表的には単一の翻訳産物として作
られ、そしてそれぞれの供給源のペプチドに由来する特性を示す、連続したタン
パク質分子である。同様の概念が異種核酸配列に適用される。
さらに、新たな構築物が他のタンパク質由来の類似の機能的ドメインの組み合
わせから作製され得る。例えば、タンパク質結合セグメントまたは他のセグメン
トが、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントの間で「交換」され得
る。例えば、Cunninghamら（1989）Science 243:1330-1336;およびO'Dowdら（19
88）J.Biol.Chem. 263:15985-15992を参照のこと。従って、特異性の新たな組み
合わせを示す新たなキメラポリペプチドは、タンパク質結合特異性および他の機
能的ドメインの機能的結合により得られる。
VIII。結合剤：ケモカインタンパク質複合体
配列番号２または８のアミノ酸配列からなる免疫原のような規定された免疫原
に対して作成された抗体へ特異的または選択的に結合するか、または特異的免疫
反応するDVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質は、イムノアッセイで代表的
に決定される。イムノアッセイは、配列番号２、６、または８のタンパク質に対
して惹起されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、他のケモカイ
ンに対して低交差反応性を有するように選択され、そして、任意のこのような交
差反応性はイムノアッセイの使用前の免疫吸着により除去される。
イムノアッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、配列番号２ま
たは６または８のタンパク質は、本明細書中に記載されるように単離される。例
えば、組換えタンパク質は哺乳類動物細胞株で産生され得る。BALB/cのようなマ
ウスの純系株は、Freundのアジュバントのような標準的なアジュバント、および
標準的なマウス免疫化プロトコル(HarlowおよびLane、前出を参照のこと)を使用
して、配列番号２または４または８のタンパク質で免疫化される。あるいは、本
明細書中で開示される配列由来およびキャリアタンパク質に結合された合成ペプ
チド（好ましくは、全長に近い）が免疫原として使用され得る。ポリクローナル
血清は採集され、そして、イムノアッセイ（例えば固体支持体に固定化された免
疫原の固相イムノアッセイ）において免疫原タンパク質に対して力価測定される
。104またはそれよりも大きな力価をもつポリクローナル抗血清が選択され、Har
lowおよびLane 570〜573頁（前出）に記載されるような競合的結合イムノアッセ
イを使用して、Ｃ、CC、CX3C、およびCXCケモカインに対するこれらの交差反応
性が試験された。好ましくは、２つのケモカインが、この決定において、ヒトDG
WC
Cケモカインとの組合せで使用される。
競合的結合形式におけるイムノアッセイは、交差反応性決定に使用され得る。
例えば配列番号２または配列番号６および／または配列番号８のタンパク質は、
固体支持体へ固定化され得る。アッセイに添加されたタンパク質は、固定化され
た抗原に対する抗血清の結合と競合する。固定化されたタンパク質に対する抗血
清の結合と競合する上記タンパク質の能力は、配列番号２または配列番号６およ
び／または配列番号８のタンパク質と比較される。上記タンパク質のパーセント
交差反応性は、標準的計算法を使用して計算される。上に列挙された個々のタン
パク質と10%未満の交差反応性をもつこれらの抗血清は選択され、そしてプール
される。次いで、交差反応性抗体は、上の列挙されたタンパク質との免疫吸着に
よりプールされた抗血清から除去される。
次いで、免疫吸着しそしてプールされた抗血清は、二次タンパク質と免疫原タ
ンパク質（例えば、配列番号６または８のDGWCCケモカインモチーフ）と比較す
るために、上記のような競合的結合イムノアッセイにおいて使用される。この比
較を実施するために、２つのタンパク質は、広範囲の濃度でそれぞれアッセイさ
れ、そして、固定化されたタンパク質への抗血清の結合の50％を抑制するために
必要とされる各タンパク質の量が、決定される。所望の二次タンパク質の量が、
タンパク質（例えば、所望の配列番号６または８のタンパク質）の量の２倍未満
である場合、次いで、二次タンパク質は、免疫原に対して産生された抗体に特異
的に結合するといわれる。
DGWCCケモカインタンパク質は、密接に関連した遺伝子を含む種を越えた、同
種タンパク質の群の種形成であることが理解される。DGWCCケモカインタンパク
質のような特定の遺伝子産物について、その用語は、本明細書中で開示されるア
ミノ酸配列のみならず、また多型変異体、対立遺伝子変異体、または非対立遺伝
子変異体である別のタンパク質を表す。用語「DGWCC」は、従来の技術（例えば
、点変異のような組換え技術、またはDGWCCケモカインタンパク質をコードする
短いDNAセクションを切除することにより、または新しいアミノ酸を置換するこ
とによりまたは新しいアミノ酸の付加）を使用する計画的変異により導入される
非天的変異体を含むことが理解される。このような主要でない変異体は、本来の
分
子の免疫学的同一性および／またはその生物学的活性を実質的に維持するべきで
ある。従って、これらの変異体は、設計自然に存在するDGWCCケモカインタンパ
ク質（例えば、配列番号６または８に示されるDGWCCケモカインタンパク質）と
特定的に免疫反応するタンパク質を含む。変化したタンパク質の生物学的特徴は
、適切な細胞系でのタンパク質の発現および適切な生物学的活性（例えば走化作
用効果）を測定することにより、決定され得る。少数であるとみなされる特定の
タンパク質修飾は、全体としてDGWCCケモカインタンパク質に関して上述のよう
な、同様の化学的特徴を有するアミノ酸の保存的置換を含む。配列番号６または
８のタンパク質に最適なタンパク質を並べることにより、そして免疫同一性を決
定するために本明細書中に記載される通常の免疫アッセイの使用により、または
リンパ球化学走性アッセイの使用により、研究者は、本発明のタンパク質組成物
を決定し得る。
IX。機能的変異体
DVic-1またはDGWCCケモカインに対する物理学的応答のブロックは、そのレセ
プターへのタンパク質の結合の阻害（例えば、競合から阻害により）から生じ得
る。従って、本発明のインビトロアッセイは、単離タンパク質、DVic-1またはDG
WCCケモカインを結合した組換え膜を発現する細胞由来の膜、これらのタンパク
質のレセプター結合セグメントを含む溶解性フラグメント、または固相基質に結
合したフラグメントをしばしば使用する。これらのアッセイはまた、結合セグメ
ント変異体およびその修飾体またはタンパク質変異体および修飾体（例えば、タ
ンパク質類似体）のどちらかの効果の診断上の決定を可能にする。本発明はまた
、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図する（例えば、抗原またはレセ
プターフラグメントに対する中和抗体が、タンパク質の結合のために試験化合物
と競合する場合）。この様式で、抗体は、タンパク質の１つ以上の抗原性結合部
位を共有するポリペプチドの存在を検出するために使用され得、そしてまた、他
にレセプターと相互作用し得るタンパク質の結合部位を占領にするために使用さ
れ得る。
例えば、DGWCCケモカイン抗原の「誘導体」は、アミノ酸配列変異体、グリコ
シル化改変体、および他の化学成分との共有結合体または凝集結合体を含有する
。共有結合誘導体は、当該分野で周知の手段により、DGWCCケモカインアミノ酸
側鎖中または、N-末端またはC-末端に見られる群の機能性の結合により調製され
得る。これらの誘導体は、カルボキシル末端のまたはカルボキシル側鎖を有する
残基の脂肪族エステルまたはアミド、水酸基を有する残基のＯ−アシル誘導体、
およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基を有する残基（例えば、リジンまたは
アルギニン）のN-アシル誘導体を含有し得るがこれらに限定されない。アシル基
はアルキル部分（例えば、C3〜C18の通常のアルキル）を含む残基から選択され
、それにより、アルカノイルアロイル種を形成する。免疫原性部分がハプテンで
ある場合、キャリアタンパク質への共有結合は、重要であり得る。
特に、グリコシル化改変（例えば、その合成およびプロセシングの間、または
さらなるプロセシングの工程でのポリペプチドのグリコシル化パターンの改変に
よりなされる）が包含される。これを達成する特に好ましい手段は、通常そのよ
うなプロセシングを提供する細胞に由来するグリコシル化酵素（例えば、哺乳動
物グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すことによる。脱グリコシル化酵素も
また、意図される。他の小さな改変を有する同様の一次アミノ酸配列のバージョ
ンもまた包含され、これはリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン、ホ
スホセリン、またはホスホトレオニン）または、リボシル基もしくは架橋剤を含
む他の成分を包含する。
誘導体の主要な群は、DGWCCケモカインまたはそのフラグメントと他のタンパ
ク質またはポリペプチドとの共有結合体である。これらの誘導体は、Ｎ末端また
はＣ末端融合物のような組換え培養物中で、または反応性側鎖基を介するのタン
パク質の架橋結合に有用な当該分野で公知の薬剤の使用により合成され得る。架
橋結合剤を用いる好ましいタンパク質誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭化水素
部分、およびシステイン残基である。
DGWCCケモカインと他の相同性タンパク質または異種タンパク質との融合ポリ
ペプチドもまた、提供される。多くの増殖因子およびサイトカインがホモ２量体
であり、そして反復構築物(repeat construct)は、タンパク質分解的切断に対す
る感受性の減少を包含する種々の利点を有し得る。さらに、多くのレセプターは
シグナルの伝達のためにリガンド２量体化が必要であり、そして種々の２量体タ
ンパク質またはドメイン反復が所望され得る。異種ポリペプチドは、異なる表面
マーカー間での融合物であり得、例えば、レセプター結合特異性を示すハイブリ
ッドタンパク質が得られる。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み
合わせを示す異種融合物が構築され得る。代表的な例は、融合タンパク質の存在
または位置を容易に測定し得るための、レポーターポリペプチド（例えば、ルシ
フェラーゼ）とリガンドのセグメントまたはドメイン（例えば、レセプター結合
セグメント）との融合物である。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609号を参
照のこと。他の遺伝子融合パートナーには、細菌b−ガラクトシダーゼ、trpE、
プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、α−アミラーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、および酵母のα接合因子を包含する。例えば、Godowskiら（1988）Science2
41:812-816を参照のこと。
そのようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または
他の部分（特に、リン酸基と類似の分子形を有する部分）の付加もしくは除去に
より化学的に改変されたアミノ酸残基を有し得る。いくつかの実施態様では、改
変は有用な標識試薬であるか、または精製の標的（例えばアフィニティーリガン
ド）として作用する。
本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化での変更以外のDGWCCケモカ
インの誘導体の使用を意図する。そのような誘導体は、化学部分との共有結合ま
たは凝集会合を包含し得る。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分類され
る：(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合改変、および(3)例えば、細胞膜
との吸着複合体。そのような共有結合誘導体または凝集誘導体は、免疫原として
、イムノアッセイにおける試薬として、あるいは精製法（例えば、リガンドまた
は他の結合リガンドのアフィニティー精製のための）において有用である。例え
ば、DGWCCケモカイン抗原は、抗DGWCCケモカイン抗体またはそのレセプターのア
ッセイあるいは精製に使用するために、当該分野で周知の方法による臭化シアン
活性化SEPHAROSEのような固体支持体への共有結合により、固定化され得るか、
あるいは、グルタルアルデヒド架橋結合を有して、あるいは有さないで、ポリオ
レフィン表面に吸着され得る。DGWCCケモカインはまた、検出可能な基で標識さ
れ得
る。例えば、クロラミンＴ手順により放射性ヨウ素化され、希土類キレートに共
有結合され、または診断的アッセイで使用するために別の蛍光部分と結合される
。DGWCCケモカインの精製は、固定化抗体またはレセプターにより行われ得る。
単離されたDGWCCケモカイン遺伝子により、DGWCCケモカインに対応する発現を
欠く細胞（例えば、対応するタンパク質を欠きそしてネガティブバックグラウン
ド活性を示す種の型または細胞）の形質転換が可能になる。形質転換された遺伝
子の発現により、規定されたまたは単一の種改変体を用いて、抗原性が純粋な細
胞株の単離が可能となる。このアプローチにより、DGWCCレセプタータンパク質
の生理学的影響のより感度の高い検出および区別が可能になる。細胞成分フラグ
メント（例えば、細胞質フラグメントまたは膜フラグメント）は単離され得、そ
して使用され得る。DGWCCを例として用いる記載は、一般にDVic-1にも代替適応
可能である。
X．使用
本発明は、本明細書中の他所に、または以下の診断用のキットの記載において
記載されるような診断的適用における（例えば、発達異常についての一般的な記
載において）使用を見出す試薬を提供する。
DGWCCケモカインヌクレオチド、例えば、DGWCCケモカインDNAまたはRNA、は法
医学アッセイの成分として用いられ得る。例えば、提供されたヌクレオチド配列
は、例えば32Pまたはビオチンを用いて標識され得、そして標準的な制限フラグ
メントポリモルフィリンをプローブするために用いられ得る。これはそれぞれの
、または例えば供給源の種を区別するのに助けとなる測定可能な特徴を提供する
。このようなプローブは、遺伝子指紋法のような周知の法医学技術において用い
られ得る。さらに、DGWCCケモカイン配列から作製されたヌクレオチドプローブ
は、染色体異常を検出するためのインサイチュアッセイに用いられ得る。例えば
、DGWCCケモカイン遺伝子をコードするヒト染色体の再構成は、他の公知の染色
体マーカーと結合したDGWCCケモカインプローブを用いて、周知のインサイチュ
技術を介して検出され得る。
抗体、およびDGWCCケモカインタンパク質もしくは核酸に特異的な抗体、また
は他の結合薬剤は、対応するDGWCCケモカイン分子を精製するために用いられ得
る。以下の実施例に記載されるように、DGWCCケモカイン成分の抗体精製は、可
能、および実行可能の両方である。抗体および他の結合薬剤はまた、本明細書中
に記載される周知のテクニックを用いて、組織サンプル、または細胞集団中に、
DGWCCケモカイン成分が存在するかどうかを決定するための診断方法に用いられ
得る。結合剤がDGWCCケモカインに結合する能力は、DGWCCケモカインの誤った調
節に関連した障害を診断する手段を提供する。抗体、および他のDGWCCケモカイ
ンに結合する薬剤はまた、組織学的な標識として有用であり得る。以下の実施例
に記載されるように、DGWCCケモカインの発現は、特異的な組織型に限定されて
いる。抗体、または核酸のようなプローブを、DGWCCケモカインに指向させるこ
とにより、インサイチュ、またはインビトロで組織型および細胞型を区別するた
めのプローブの使用が可能となる。
本発明はまた、顕著な治療的価値を有する試薬を提供する。DGWCCケモカイン
ヌクレオチド（天然に存在するかまたは組換え）、そのフラグメント、およびそ
れらに対する抗体は、DGWCCケモカインに対する結合親和性を有するとして同定
された化合物とともに、異常な生理機能または発達（異常な増殖、たとえばガン
状態、または変性状態を含む）に関連する状態の処置において有用である。異常
増殖、再生、変性、および萎縮は、本明細書中に提供される組成物を使用する適
切な治療的処置により調節され得る。例えば、DGWCCケモカインによる異常な発
現または異常なシグナリングに関連する疾患または障害は、このタンパク質のア
ゴニストまたはアンタゴニストの標的である。このタンパク質は、神経細胞、ま
たは造血細胞（例えば、免疫応答に影響を与えるリンパ球）の制御または発達に
役割を果たすようである。
他の異常発達状態は、ノーザンブロット分析によってDVic-1またはDGWCC mRNA
を有すると示される細胞タイプにおいて公知である。Berkow（編）The Merck Ma nual of Diagnosis and Therapy
，Merck & Co.，Rahway，NJ；およびThornらHar rison's Principles of Internal Medicine
，McGraw-Hill，NYを参照のこと。発
達的または機能的異常（例えば、神経系または免疫系の異常）は、本明細書中に
提供される組成物を使用する予防または処置に感受性であり得る、顕著な医学
的異常および状態を引き起こす。
特定のケモカインは、ウイルス複製機構にもまた、関連付けられている。例え
ば、Cohen(1996)Science 272:809-810;Fengら、(1996)Science 272:872-877;お
よびCocchiら、(1995)Science 270:1811-1816。DVic-1またはDGWCCケモカインは
、同様の文脈で有用であり得る。
組換えDVic-1もしくは組換えDGWCCケモカイン、またはケモカイン抗体は精製
され得、次いで患者に投与され得る。これらの試薬は治療的使用のためにさらな
る有効成分または不活性成分（例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまた
は希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中で）と、生理学的に無毒の安定化
剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。これらの組み合わせは、濾過滅菌さ
れ、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に、または安定化水性調製物中の貯蔵
物として投薬形態にされ得る。本発明はまた、抗体またはその結合フラグメント
（補体結合でない形態を含む）の使用を意図する。
抗体もしくはレセプターまたはそれらのフラグメントを使用する薬物スクリー
ニングによって、DVic-1ケモカイン、またはDGWCCケモカインに対する結合親和
性を有する化合物（会合成分の単離を含む）が同定され得る。次いで、その化合
物が固有の刺激活性を有し、それゆえ、タンパク質の活性をブロックするという
点で、ブロッカーまたはアンタゴニストであるかどうか決定するために、次の生
物学的アッセイが利用され得る。同様に、固有の刺激活性を有する化合物はレセ
プターを活性化し得、従って、それが、例えば、DGWCCケモカインの活性を刺激
するとうい点で、アゴニストである。本発明はさらに、アンタゴニストとしての
DGWCCケモカインに対する抗体の治療的使用を意図する。このアプローチは、他
のDGWCCケモカイン種変異体について特に有用であるはずである。
効果的な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存する。この因子は
、投与手段、標的部位、患者の生理状態、および投与される他の医薬(medicant)
を包含する。従って、処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために力
価滴定されるべきである。代表的には、インビトロで使用される投薬量は、これ
ら試薬のインサイチュでの投与に有用な量における有用な手引きを提供し得る。
特定の障害の処置に効果的な用量の動物実験は、ヒトでの投薬量のさらなる予測
的
な指標を提供する。以下には、種々の考察が記載されている、例えば、Gilmanら
（編）（1990）Goodman and Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeu tics
（第８版）Pergamon Press:および(1990)Remington's Pharmaceutical Scie nces
（第17版）Mack Publishing Co.,Easton,PA。投与法は、それらの中および
以下で考察されている。例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、または筋
肉内投与、経皮拡散など。薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理食塩水、緩
衝液、および例えば、Merck Index，Merck & Co.,Rahway,NJに記載された他の化
合物を包含する。投薬量の範囲は通常、適切なキャリアを有して、１mM濃度より
低い量であり、代表的には約10μＭ濃度未満、通常約100nM未満、好ましくは10p
M（picomolar）未満、そして最も好ましくは約１fM（femtomolar）未満の範囲で
あると期待される。徐放性処方物または徐放性装置が、持続投与にしばしば利用
される。
DVic-１またはDGWCCケモカイン、そのフラグメント、およびそれまたはそのフ
ラグメントに対する抗体、アンタゴニスト、およびアゴニストは、処置される宿
主に直接投与され得るか、または、化合物のサイズに依存して、それらを投与前
に卵白アルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質に結合させ
ることが所望され得る。治療的処方物は、任意の従来の投与処方物中で投与され
得る。活性な成分を単独で投与することは可能であるが、治療的処方物として呈
することが望ましい。処方物は、上記で定義したように、その１以上の受容可能
なキャリアとともに、代表的には少なくとも１つの活性な成分を含有する。それ
ぞれのキャリアは、他の成分に適合性であり、そして患者に対して有害でないと
いう意味で薬学的におよび生理学的に受容可能であるべきである。処方物は、経
口投与、直腸投与、鼻投与、または非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内
投与、および皮内投与を包含する）に適切な処方物を包含する。処方物は、便宜
的に単位剤形で提示され得、そして薬学分野で周知の任意の方法により調製され
得る。例えば、Gilmanら（編）（1990）Goodman およびGilman's：The Pharmacol ogical Bases of Therapeutlcs
，第８版、Pergamon Press;および(1990)Remingt on's Pharmaceutical Science
，第17版(1990)、Mack Publishing Co.，Easton,P
A;Avisら（編）（1993）Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medication s
Dekker,NY;Liebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets
Dekker,NY;およびLiebermanら（編）（1990）Pharmaceutical Dosage Forms:Di sperse Systems
Dekker，NYを参照のこと。本発明の治療は、他の治療剤と併用
されるかまたは関連して使用され得る。
本発明の、DVic-1、またはDGWCCケモカインの天然に存在する形態および組換
えの形態の両方は、このタンパク質に対する結合活性について化合物をスクリー
ニングし得る、キットおよびアッセイ法に特に有用である。自動化アッセイのい
くつかの方法は、短期間に多数の化合物のスクリーニングを可能にするように近
年開発されている。例えば、Fodorら（1991）Science 251:767-773、および他の
化学物質多様性ライブラリーの記載（これには多数の化合物による結合親和性の
試験方法が記載されている）を、参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明
で提供される大量の精製可溶化DGWCCケモカインの利用可能性により、非常に容
易になり得る。
例えば、アンタゴニストは、一旦タンパク質が構造的に定義されれば、通常見
出され得る。潜在的なタンパク質アナログの試験は、精製したレセプターを使用
する高度に自動化されたアッセイ法の開発により、今や可能である。特に、新た
なアゴニストおよび新たなアンタゴニストは、本明細書中に記載のスクリーニン
グ技術を使用することにより見い出される。特に重要なものに、多型DGWCCケモ
カインレセプター（例えば、DGWCCケモカインの種改変体のアンタゴニストとし
て、提供し得る化合物）に対する結合親和性を、組み合わせていることが見出さ
れた。
本発明は、種々の薬剤スクリーニング技術において、組み換えタンパク質を用
いるスクリーニング化合物に、特に有用である。特異的なリガンド用のスクリー
ニングにおいて、組換えタンパク質を用いる利点には、:(a)特定の供給源由来の
DGWCCケモカインの再生し得る供給源の改良；(b)アッセイ中でノイズ比に対して
、よりよいシグナルを与える、潜在的に非常に多量の、細胞あたりのリガンド；
ならびに(c)種改変体特異性（理論上、より良い生物学的特異性、および疾患特
異性を与える）。
薬剤スクリーニングの一つの方法は、真核宿主細胞または原核宿主細胞（これ
は、ケモカインレセプターを発現する組換えDNA分子で安定に形質転換される）
を利用する。その他の単離物中において、レセプターを発現する細胞が単離され
得る。生存形態または固定形態のいずれかである、そのような細胞は、標準的な
リガンド／レセプター結合アッセイに用いられ得る。また、Parceら、(1989)Sci ence
246:243-247;およびOwickiら、(1990)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:4007-4
011、これに、細胞応答を検出する高感度な方法が記載されている。競合アッセ
イは、細胞（DGWCCケモカインの供給源である）が、125I-抗体のようなリガンド
に対する、公知の結合親和性を有する標識されたレセプターまたは抗体、および
結合組成物に対する結合親和性が測定される試験サンプルと接触され、インキュ
ベートされる場合に特に有用である。次いで、結合型および遊離型標識結合組成
物は、リガンド結合の程度を評価するために分離される。試験化合物結合体の量
は、既知の供給源に結合した標識レセプターの量に反比例する。多くの技術のう
ちの任意の技術が、リガンド結合の範囲を評価するため、遊離リガンドから結合
型を分離するために使用する。この分離工程は、代表的にフィルターへの付着、
続いて洗浄、プラスチックへの付着の後に洗浄、または細胞膜の遠心のような手
順を含む。生存細胞もまた、DGWCCケモカイン媒介機能（例えば、２次メッセン
ジャー（すなわち、Ca++）のレベル；細胞増殖；イノシトールリン酸プールの変
化など）に対する薬物の効果についてスクリーニングするために使用され得る。
いくつかの検出方法は、分離工程の省略を可能にする（例えば、近接感受性検出
システム(proximity sensitive detection system)）。カルシウム感受性の色素
は、蛍光計測器または蛍光細胞選別装置を用いてCa++レベルを検出するのに有用
である。
別の方法は、DGWCCケモカインの供給源として、形質転換した真核宿主細胞、
または原核宿主細胞由来の膜を利用する。これらの細胞は、例えば、膜結合型に
操作されたDGWCCケモカインの発現を指向するDNAベクターで安定に形質転換され
ている。本質的に、膜はその細胞から調製され、そして上記の競合アッセイのよ
うなレセプター／リガンド結合アッセイに用いられる。
さらに別のアプローチは、形質転換した真核宿主細胞、原核宿主細胞由来の可
溶化された未精製の、または可溶化された精製のDGWCCケモカインに用ることで
ある。これは、特異性の増加、自動化能力、および高い薬剤試験処理能力という
利点を有する、「分子」結合アッセイを可能にする。
薬剤スクリーニングの別の技術は、DGWCCケモカイン抗体への適切な結合親和
性を有する化合物について高い処理能力スクリーニングを提供するアプローチを
包含し、そして詳細は、1984年9月13日発行の、Geysenの欧州特許出願84/03564
に記載されている。最初に、異なる小ペプチド試験化合物の多くが、固体基板上
（例えば、プラスチックピン）または他の適切な表面（Fodorら、前出を参照の
こと）で合成される。次いで、ピン全てが、可溶化された未精製の、または可溶
化された精製のDGWCCケモカイン抗体と反応させ、そして洗浄する。次の工程に
は、結合型DGWCCケモカイン抗体の検出が含まれる。
合理的な薬物設計はまた、DGWCCケモカインおよび他のエフェクターまたはア
ナログの分子の形の構造的研究に基づき得る。例えばMethods in Enzymology 20
2巻および203巻を参照のこと。エフェクターは、リガンド結合に応答して他の機
能を仲介する他のタンパク質、または通常はレセプターと相互作用する他のタン
パク質であり得る。どの部位が特定の他のタンパク質と相互作用するかを決定す
る１つの手段は、物理的構造決定（例えば、Ｘ線結晶学または２次元NMR技術）
である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての手
引きを提供する。タンパク質の構造決定の詳細な記載は、例えば、Blundellおよ
びJohnson（1976）Protein Crystallography Academic Press，New Yorkを参照
のこと。
精製DGWCCケモカインは、上述の薬物スクリーニング技術に使用するプレート
に直接コーティングされ得る。しかし、これらのリガンドに対する非中和抗体は
、それぞれのリガンドを固相に固定化する捕獲抗体として使用され得る。DGWCC
を用いた実施例は、DVic-1ケモカインをかわりに用いても行い得る。
XI．キット
本発明はまた、ケモカイン、またはケモカインレセプターの存在を検出するた
めの種々の診断キットおよび方法におけるDVic-1、またはDGWCCケモカインタン
パク質、そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用を意図す
る。代表的には、キットは、規定されたDVicまたはDGWCCケモカインペプチドま
たは遺伝子セグメント、あるいは一方または他方を認識する試薬（例えば、レセ
プターフラグメント、もしくは抗体）のいずれかを含む区画を有する。
例えば、DGWCCケモカインに対する試験化合物の結合親和性を測定するための
キットは、代表的には、試験化合物；標識化合物（例えば、DGWCCケモカインに
対する既知の結合親和性を有するレセプター、または抗体）；DGWCCケモカイン
の供給源（天然に存在するかまたは組換えの）；およびDGWCCケモカインを固定
化するための固相のような、遊離標識化合物から結合標識化合物を分離するため
の手段を含有する。一旦化合物がスクリーニングされると、DGWCCケモカインに
対する適切な結合親和性を有する化合物が、レセプターに対してアゴニストまた
はアンタゴニストとして作用するか否かを決定するために、当該分野で周知のよ
うに、適切な生物学的アッセイで評価され得る。組換えDGWCCケモカインポリペ
プチドの利用可能性は、そのようなアッセイを較正するための充分に規定された
標準をまた提供する。
サンプル中の、例えば、DGWCCケモカインの濃度を測定するための好ましいキ
ットは、代表的には、標識化合物（例えば、DGWCCケモカインに対する公知の結
合親和性を有するレセプターまたは抗体）、DGWCCケモカインの供給源（天然に
存在するかまたは組換えの）、および遊離標識化合物から結合標識化合物を分離
するための手段（例えば、DGWCCケモカインを固定化するための固相）を含有す
る。試薬および説明書を含む区画が、通常提供される。
DGWCCケモカインまたはリガンドフラグメントに特異的な、抗原結合フラグメ
ントを包含する抗体は、DGWCCケモカインおよび／またはそのフラグメントのレ
ベルの上昇の存在を検出する診断適用に有用である。このような診断的アッセイ
は、溶解物、生細胞、固定細胞、免疫蛍光、細胞培養物、体液を用い得、そして
さらに血清などの中のリガンドに関連する抗原の検出を包含し得る。診断アッセ
イは、同質（遊離試薬と抗原−DGWCCケモカイン複合体との間の分離工程を有し
ない）または異質（分離工程を有する）であり得る。放射イムノアッセイ(RIA)
、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、酵素増幅イム
ノアッセイ技術(EMIT)、基質標識蛍光イムノアッセイ(SLFIA)などのような種々
の
市販のアッセイが存在する。例えば、非標識抗体は、第２の抗体を使用すること
により用いられ得、この第２の抗体は標識され、そしてDGWCCケモカインまたは
その特定のフラグメントに対する抗体を認識する。類似のアッセイがまた、文献
で広範に考察されている。例えば、HarlowおよびLane（1988）Antibodies:A Lab oratory Manual
,CSH Press,NY;Chan（編）（1987）Immunoassay:A Practical Gu ide
Academic Press,Orlando,FL;PriceおよびNewman（編）(1991)Principles an d Practice of Immunoassay
Stockton Press,NY;ならびにNgo（編）(1988)Nonis otopic Immunoassay
Plenum Press,NYを参照のこと。
抗イディオタイプ抗体は、種々の異常な状態の徴候であり得るDGWCCケモカイ
ンに対する抗体の存在を診断するための類似の使用を有し得る。例えば、DGWCC
ケモカインの過剰産生により、種々の免疫学的、または他の医学的な反応の生成
を生じ得、この反応は、異常な生理状態（例えば、細胞増殖、活性化、または分
化において）の診断であり得る。
しばしば、診断アッセイのための試薬が、アッセイの感度を最適化するように
キット中に供給される。本発明のために、アッセイ、プロトコル、および標識の
性質に依存して、標識抗体、非標識抗体またはレセプター、または標識DGWCCケ
モカインのいずれかが提供される。これは通常、緩衝液、安定化剤、酵素の基質
のようなシグナル生成に必要な物質などのような、他の添加剤との結合体である
。好ましくは、キットはまた、適切な使用および使用後の内容物の処分のための
説明書を含む。代表的には、キットはそれぞれの有用な試薬のための区画を有す
る。望ましくは、試薬は、乾燥した凍結乾燥粉末として提供され、ここで、試薬
は水性の媒体中で再構成され得、アッセイを行うために適当な濃度の試薬を提供
し得る。
薬物スクリーニングアッセイおよび診断アッセイの任意の上述の成分の多くは
、改変せずに使用され得、または種々の方法で改変され得る。例えば、標識は、
直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する部分に、共有結合的にまたは
非共有結合的に連結することにより達成され得る。これらのアッセイの任意のア
ッセイにおいて、タンパク質、試験化合物、DGWCCケモカイン、またはそれらに
対する抗体が、直接または間接のいずれかで標識され得る。直接標識の候補は、
以
下の標識グループを包含する：125Ｉのような放射性標識、ペルオキシダーゼお
よびアルカリホスファターゼのような酵素（米国特許第3,645,090号）、および
蛍光強度、波長移動、または蛍光偏光の変化をモニターし得る蛍光標識（米国特
許第3,940,475号）。間接標識の可能性には、１成分のビオチン化とそれに続く
上記の標識グループの１つに結合したアビジンへの結合が含まれる。
遊離のリガンドから結合リガンドを分離する、あるいは、遊離の試験化合物か
ら結合試験化合物を分離する多数の方法もまた存在する。DGWCCケモカインを種
々のマトリクス上に固定化し、続いて洗浄し得る。適切なマトリクスには、ELIS
Aプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックが挙げられる。DGW
CCケモカインをマトリクスに固定化する方法には、プラスチックへの直接接着、
捕獲抗体の使用、化学的カップリング、およびビオチン−アビジンが含まれるが
これらに限定されない。このアプローチの最後の工程は、例えば、ポリエチレン
グリコールのような有機溶媒、もしくは硫酸アンモニウムのような塩を用いる方
法を含む、任意のいくつかの方法により、リガンド/レセプター複合体またはリ
ガンド／抗体複合体の沈降を含む。他の適切な分離技術は、Rattleら(1984)Clin
．Chem．30:1457〜1461に記載のフルオレセイン抗体磁化パーティクル法および
米国特許第4,659,678号に記載の二重抗体磁化パーティクル分離法を含むが、こ
れらに限定されない。
種々の標識にタンパク質またはこれらのフラグメントを連結する方法は、文献
に広範に報告されており、本明細書中で詳述する必要はない。技術の多くは、カ
ルボジイミドまたは活性エステルのいずれかの使用を介してのペプチド結合の形
成のための活性化カルボキシル基の使用、連結のためのメルカプト基と活性化ハ
ロゲン（例えば、クロロアセチル）または活性化オレフィン（例えば、マレイミ
ド）との反応によるチオエーテルの形成などを包含する。融合タンパク質はまた
、これらの適用における使用が見出される。
本発明の別の診断的側面は、DGWCCケモカインの配列から得られるオリゴヌク
レオチド配列またはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列は、天然
の供給源または異常な状態（例えば、ガンまたは発生における問題）を有すると
疑われる患者からのサンプル中にDGWCCケモカインメッセージのレベルを検出す
るためのプローブとして用いられ得る。RNAヌクレオチド配列およびDNAヌクレオ
チド配列の両方の調製、配列の標識、ならびに配列の好ましいサイズについては
、文献中で、十分な説明および考察がされている。通常、オリゴヌクレオチドプ
ローブは、少なくとも約14ヌクレオチドを有するべきであり、通常は、少なくと
も約18オリゴヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプロー
ブは、数キロベースまでであり得る。種々の標識が用いられ得るが、最も一般的
には放射性核種であり、特に32Pが用いられ得る。しかし、ポリヌクレオチド中
に導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いるような、他の技術もまた用
いられ得る。次いで、ビオチンは、アビジンまたは抗体に対する結合部位として
作用する。これは、広範な種々の標識(例えば、放射性核種、フルオロフォア(fl
uorophore)、酵素など)を用いて標識され得る。あるいは、特定の二重鎖（DNA二
重鎖、RNA二重鎖、DNA-RNAハイブリッド二重鎖、またはDNAタンパク質二重鎖を
含む）を認識し得る抗体が用いられ得る。次に、抗体が標識され得、そして二重
鎖が表面に結合されている場合、表面での二重鎖形成の際に、二重鎖に結合した
抗体の存在を検出し得るように、アッセイを実施し得る。新規のアンチセンスRN
Aに対するプローブの使用を、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイ
ナススクリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド放出翻訳(hybrid rele
ased translation)(HRT)、およびハイブリッド停止翻訳(hybrid arrested trans
lation)(HART)のような多くの従来の技術を用いて実施し得る。これはまた、ポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅技術を含む。
これらおよび他のマーカーの定量的または定性的存在についてもまた試験する
診断キットがまた、意図される。診断または予後は、マーカーとして用いられて
いる複数の指標の組み合わせに依存し得る。従って、キットは、マーカーの組み
合わせについて試験し得る。例えば、Vialletら(1989)Progress in Growth Fact
or Res．1:89〜97を参照のこと。各ケモカインの定性的または定量的発現を、タ
ンパク質またはmRNAレベルでの標準方法により評価し得る。
XII．レセプター単離
特異的相互作用の結合パートナーを単離した上で、そのカウンターパートナー
を単離するための方法が存在する。Gearingら(1989)EMBO J．8.3667〜3676を参
照のこと。例えば、レセプターに対する結合を妨げることなく、DVic-1またはDG
WCCケモカインを標識する手段が決定され得る。例えば、アフィニティー標識ま
たはエピトープタグを、リガンドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか
と融合し得る。発現ライブラリーを、DVic-1またはDGWCCケモカインの特異的結
合について（例えば、細胞選別またはこのような結合成分を発現する亜集団を検
出する他のスクリーニング方法によって）スクリーニングし得る。例えば、Hoら
（1993）Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 90:11267〜11271を参照のこと。あるい
は、パンニング法が用いられ得る。例えば、SeedおよびAruffo(1987)Proc．Nat'
l Acad．Sci．USA 84:3365〜3369を参照のこと。２ハイブリッド選択システムも
また、利用可能なケモカイン配列を用いて適切な構築物を作製するために適用さ
れ得る。例えば、FieldsおよびSong(1989)Nature 340:245〜246を参照のこと。
標準的なCa++フラックス法(flux methods)もまた利用され得る。例えば、Coliga
nら編(1992および定期的増補Current Protocols、in Immunology Greene/Wiley
，New York，NY)を参照のこと。
タンパク質を標識と架橋する技術は、DVic-1またはDGWCCケモカインの結合パ
ートナーを単離するために適用され得る。これにより、例えば、リガンド−レセ
プター様の様式で、DVlic-1またはDGWCCケモカインと特異的に相互作用するタン
パク質の同定が可能となる。代表的には、ケモカインファミリーは、７つの膜貫
通レセプターファミリーのレセプターに結合し、そしてDVic-1またはDGWCCケモ
カインに対するレセプターは、類似の構造を示すようである。従って、レセプタ
ーは、リガンド結合能力を示し得る形態でこのような膜タンパク質を発現し得る
系における発現によって見出される。
本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照することにより最も良く理解され
るが、これは、特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。
実施例
I.一般的方法
下記の多くの標準的方法を、以下に記載しまたは参照する：例えば、Maniatis
ら、（1982）Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor L
aboratory，Cold Spring Harbor Press，NY;Sambrookら、（1989）Molecular Cl oning:A Laboratory Manual
，(第二版)、第１〜３巻，CSH Press，NY;Ausubelら
、Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY;またはAusubelら、
（1987および補遺）Current Protocols in Molecular Biology，Wiley/Greene，
NY;Innisら、（編）(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Application s
Academic Press，NY。タンパク質精製のための方法には、硫安沈澱、カラムク
ロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化、およびその他のような方法が
含まれる。例えば、Ausubelら、(1987および定期的増補)；Deutscher（1990）「
タンパク質精製へのガイド」Methods in Enzymology，第182巻、およびこのシリ
ーズの他の巻；ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造者の印刷物（例
えば、Pharmacia，Piscataway，NJ、またはBio-Rad，Richmond，CA.）を参照の
こと。組換え技術との組合せにより、適切なセグメント（エピトープタグ）（例
えば、FLAG配列、または例えばプロテアーゼ除去可能配列を介して融合され得る
等価物）への融合が可能になる。例えば、Hochuli（1989）Chemische Industrie
12:69〜70;Hochuli（1990）「Purification of Recombinant Proteins with Met
al Chelate Absorbent」Setlow（編）Genetic Engineering ，Principle and Meth ods
12:87〜98，Plenum Press，NY;およびCroweら、（1992）OIAexpress:The Hi gh Level Expression ＆ Protein Purification System
QUIAGEN，Inc.，Chatsw
orth，CAを参照のこと。
標準的な免疫学的技術は、例えば、Coligan(1991)Current Protocols in Immu nology
Wiley/Greene，NY;およびMethods in Enzymology 70、73、74、84、92、
93、108、116、121、132、150、162、および163巻に記載される。神経細胞の生
物学的活性についてのアッセイは、例えば、Wouterlood（1995編）Neuroscience Protocols
modules 10、Elsevier;Methods in Neuroscience sAcademic Press;
およびNeuromethods Humana Press，Totowa，NJに記載される。開発系の方法論
は、例えば、Meisamiら(編)Handbook of Human Growth and Developmental Biol ogy
CRC Press;およびChrispeels（編）Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology
Interscienceに記載される。
FACS分析は、Melamedら、（1990）Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss，
Inc.，New York，NY；Shapiro（1988）Practical Flow Cytometry Liss，New Yo
rk，NY；およびRobinsonら、（1993）Handbook of Flow Cytometry Methods Wil
ey-Liss，New York，NYに記載されている。
II.DVic-1またはDGWCCケモカインクローンの単離
DVic-1またはDGWCCケモカインをコードするクローンを、多くの異なる可能な
方法により天然の供給源から単離する。本明細書中で提供される配列で、PCRプ
ライマー、もしくはハイブリダイゼーションプローブを、ゲノムDNAセグメント
またはcDNA逆性転写物のいずれかを単離するために、選択および/または構築す
る。適切な細胞供給源は、列挙される組織（例えば、皮膚または上皮または創傷
治癒ライブラリー）を含む。遺伝的改変体および多形性改変体または対立遺伝子
改変体を、個々の集団をスクリーニングすることによって単離する。
PCRベースの検出を、好ましくはコード配列の反対の末端からのプライマーを
用いて標準的方法により実施するが、隣接セグメントは、特定の目的のために選
択し得る。
あるいは、ハイブリダイゼーションプローブを選択する。プローブの特定のAT
またはGC含量を、予測される相同性およびミスマッチングに依存して選択する。
適切なストリンジェンシー条件を選択して、適切な正のシグナル対バックグラウ
ンド比を調整する。連続的な洗浄工程を用いて、より高い相同性のクローンを回
収する。
さらにクローンを、抗体に基づく選択手順を用いて単離する。標準的な発現ク
ローニング方法（例えば、膜関連発現産物のFACS染色を含む）を適用する。抗体
を用いて、認識されるタンパク質を産生するクローンを同定する。あるいは、抗
体を用いて、そのDVic-1またはDGWCCケモカインタンパク質をコードする遺伝子
を単離するためのタンパク質配列決定および標準的手段で、DVic-1またはDGWCC
ケモカインを精製する。
ゲノム配列に基づく方法はまた、天然に利用可能な配列、またはそうでなけれ
ば提供される配列に対する相同性を示す配列の同定を可能にする。
III.ケモカインクローンについての霊長類対応物の単離
類似の方法を、別の霊長類から適切な霊長類ケモカイン遺伝子を単離するため
に、上記のように用いる。類似の供給源物質を、天然の遺伝子（遺伝的改変体、
多形性改変体、対立遺伝子改変体、または系統改変体）を単離するために用いる
。他の種改変体もまた、類似の方法を用いて単離する。さらに、遺伝子データベ
ースを適切なモチーフについて検索し得る。
IV.齧歯類ケモカインクローンの単離
適切な齧歯類供給源を、上記のように選択する（例えば、ラット、ハムスター
など）。類似の方法を用い、種改変体を単離する。しかし、類似性のレベルは、
代表的には、蓄歯類のケモカイン配列は、ヒトから他の霊長類までの配列と比較
すると、より低い。
V.染色体局在化
cDNAを、例えば、ビオチン-14 dATPでニックトランスレーションして、ラベル
し、そして２種の正常動物（好ましくは雄性）由来の分裂中期に対して、５ng/
μｌの最終濃度でインサイチュでハイブリダイズする。蛍光インサイチュハイブ
リダイゼーション(FISH)法を、Callenら(1990)Ann．Genet．33:219〜221に記載
される方法から、染色体をヨウ化プロピジウム（対比染色）およびDAPI（染色体
同定のため）の両方で分析する前に染色するという点において、改変し得る。分
裂中期調製物の画像を、CCDカメラにより取り込み、そしてコンピューターで増
幅する。適切に標識された染色体の同定を、決定する。このような分子について
の標準的配置に対する局在性、または異なる配置もまた、機能に関する情報とし
て提供し得る。
ヒトDVic-1は、ヒト染色体9p13に局在する。
VI.発現；精製；特徴付け
上記からの適切なクローンを用いて、コード配列を適切な発現ベクターに挿入
する。これは、原核生物、酵母、昆虫、または高等脊椎動物について特異的に選
択されるベクターであり得る（例えば、哺乳類発現系）。標準法を、遺伝子産物
を産生させるために適用するが、この遺伝子産物は、好ましくは、可溶性分泌分
子として、しかし、ある例では細胞内タンパク質としてもまた生成される。細胞
内タンパク質は、代表的には、タンパク質を回収するために細胞溶解を必要とす
る。そして不溶性封入体は、さらなる精製のための一般的な開始物質である。
DVic-1またはDGWCCケモカインをコードするクローンを用いて、組み換え産生
手段が使用されるが、天然の形態を、適切な供給源から精製し得る。タンパク質
産物を、ある場合には、例えば、イムノアフィニティー法で結合させて、タンパ
ク質精製の標準的方法により精製する。イムノアフィニティー法を、上記のよう
に、タンパク質の精製工程として、またはタンパク質の分離特性を決定する検出
アッセイとしてのいずれかに用いる。
好ましくは、タンパク質は培地に分泌され、そして可溶性産物を、可溶性形態
で培地から精製する。代わりには、上記のように、原生動物発現系からの封入体
は、有用な材料供給源である。代表的には、不溶性タンパク質を封入体から可溶
化し、そして標準法を用いて再び折り畳む。精製法を、上記のように開発する。
上記の精製法による産物を特徴付けし、多くの構造的特徴を決定する。標準的
な物理学的方法を適用する（例えば、アミノ酸分析およびタンパク質配列決定）
。得られるタンパク質を、CD分光法および他の分光法に供する（例えば、NMR、E
SR、質量分析など）。産物を特徴付けして、その分子形態およびサイズを決定す
る（例えば、ゲルクロマトグラフィーおよび類似の技術）。クロマトグラフィー
の特徴を理解することにより、より穏やかで効率的精製法を導く。
グリコシル化部位の予測を、例えば、Hansenら(1995)Biochem．J．308:801〜8
13に報告されるように行い得る。
VII.ケモカインに対する抗体の調製
例えば、上記のように、発現のためのDNA、または産生されるタンパク質で、
動物を免疫して抗体を産生させる。ポリクローナル抗血清を、いくつかの場合で
は未精製抗原を用いて惹起するが、得られる血清は、より高いバックグラウンド
レベルを示す。好ましくは、抗原を、例えば、上記に示されるようなポリクロー
ナル血清を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む、標準タンパク質精
製技術を用いて精製する。特異的抗体の存在を、規定された合成ペプチドフラグ
メントを用いて検出する。
ポリクローナル血清を、上記のように精製した精製抗原に対して、または、例
えば多数のペプチドもしくは合成ペプチドを使用して惹起する。全長配列の全て
を含む、一連の重複している合成ペプチドは、動物に提示された場合、そのタン
パク質の最も直鎖状であるエピトープを認識する血清を産生する。このような抗
血清を、タンパク質をアフィニティー精製するために用い、次に別の抗血清調製
物を産生するために別の動物に完全な全長タンパク質を導入するために用いる。
類似の技術を用い、未精製抗原または好ましくは精製抗原のいずれかに対する
モノクローナル抗体を誘導する。抗血清または抗体は、天然のタンパク質を認識
するか、または変性抗原を認識し得る。調製物を、所望のように、免疫的に選択
し、免疫的に精製し得る。
VIII.細胞分布および組織分布
タンパク質または遺伝子産物の分布を、例えば、上記のように産生した抗体試
薬を用いる免疫組織化学を用いて、またはケモカインをコードする核酸をスクリ
ーニングすることによって、決定する。ハイブリダイゼーションまたはPCR法を
用い、DNA、cDNA、またはメッセージ含量を検出する。組織化学はまた、より高
いもしくはより低いレベルのメッセージもしくはDNAを発現する組織内の特異的
細胞型の決定を可能にする。抗体技術は、生物学的サンプル（体液または組織サ
ンプルを含む）のタンパク質を定量化するために有用である。イムノアッセイを
、タンパク質を定量化するために開発した。FACS分析もまた、細胞集団の発現を
評価するために使用し得る。
マウスDGWCC配列を、新生仔マウスで検出した（受胎後14.5日目から１つの配
列および受胎後19.5日目から３つの配列）。３つの配列は成体マウスに由来した
。それぞれ、肝臓、胎盤、および皮膚から１つずつである。ノーザン分析では、
精巣におけるシグナルは、脳におけるシグナルよりも遥かに大きく、脳における
シ
グナルは、肺におけるシグナルよりも遥かに大きいことを示す。
IX．微小走化性アッセイ
DGWCCケモカインの移動性（pro-migratory）活性を、微小走化性アッセイで評
価する。例えば、Baconら(1988)Br．J．Pharmacol．95:966〜974を参照のこと。
J．Immunol．25:322〜327;Kochら(1994)J．Clinical Investigation 93:921〜92
8;およびAntonyら(1993)J．Immunol．151:7216〜7223を参照のこと。
ケモカインをまた、例えば、H．Broxmeyerに記載されるような造血アッセイに
おける活性についてアッセイし得る。Bellidoら(1995)J．Clinical Investigati
on 95:2886〜2895;およびJilkaら(1995)Exptl Hematology 23:500〜506を参照の
こと。それらを、Streiterら(1992)Am．J．Pathol．141:1279〜1284に記載のよ
うに血管形成活性についてアッセイする。または、炎症における役割についてア
ッセイし得る。例えば、Wakefieldら(1996)J．Surgical Res，64:26〜31を参照
のこと。
Ｘ．直接的および間接的生物学的活性
頑強かつ鋭敏なアッセイを、例えば、免疫細胞、神経細胞、または幹細胞につ
いて、上記のように選択する。ケモカインを、用量応答が検出されるかどうかが
見えるように用量を増加させてアッセイに添加する。例えば、増殖アッセイにお
いて、プレートに細胞をプレートする。適切な培養培地を提供し、そしてケモカ
インを種々の量で細胞に添加する。増殖を、ケモカインの細胞に対する直接的影
響または間接的影響のいずれかを検出する期間にわたってモニターする。
あるいは、活性化アッセイもしくは誘引アッセイを用いる。適切な細胞型（例
えば、造血細胞、骨髄細胞（マクロファージ、好中球、多形核球など）もしくは
リンパ系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはNK細胞）、神経細胞（神経、神経膠細胞
、乏突起膠細胞、星状膠細胞など）、または幹細胞（例えば、他の細胞型（例え
ば、腸陰窩細胞）に分化する前駆細胞、および未分化細胞型）を選択する。
他のアッセイは、他のケモカインを用いて実証されているアッセイである。例
えば、SchallおよびBacon(1994)Current Opinion in Immunology 6:865〜873;お
よびBaconおよびSchall(1996)Int．Arch．Allergy ＆ Immunol．109:97〜109を
参照のこと。
XI.構造活性関連性
特定残基の臨界についての情報を、標準的手順および分析を用いて決定する。
例えば、所定の部位で（例えば、上記で同定された部位で）の多くの異なる改変
体を産生し、そして改変体の生物学的活性を評価することによって、標準的変異
誘発分析を実施する。これは、活性を改変する部位を決定する程度まで実施し得
るか、または生物学的活性を保持するか、ブロックするか、もしくは調節するか
のいずれかのために置換され得る残基を決定するために特定の部位に焦点を合わ
せるために実施し得る。
あるいは、天然の改変体の分析は、どの部位が天然の変異体を許容するかを示
す。これは、個体の間の、または系統もしくは種を超えての、改変体の集団的分
析から生じ得る。選択された個体からのサンプルを分析する（例えば、PCR分析
および配列決定）。これは、集団多形性の評価を可能にする。
XII.アゴニスト/アンタゴニストについてのスクリーニング
アゴニストまたはアンタゴニストを、生物学的活性を誘導またはブロックする
能力についてスクリーニングする。候補化合物（例えば、天然のDGWCCケモカイ
ンの配列改変体）をそれらの生物学的活性についてアッセイする。あるいは、化
合物を、単独または組み合わせてスクリーニングし、生物学的活性の効果を決定
する。
XIII.ケモカインのレセプターの単離
DVic-1またはDGWCCケモカインを、抗体が用いられるのとほぼ同様に、その結
合特異性を利用することにより、その結合パートナーを同定するための特異的結
合試薬として使用し得る。結合試薬は、上記のように、標識（例えば蛍光もしく
はその他）されるか、またはパンニング法についての基質に固定化されるかのい
ずれかである。代表的なケモカインレセプターは、７回膜貫通レセプター(seven
transmembrane receptor)である。
結合組成物（例えば、ケモカイン）を、結合パートナー（すなわち、レセプタ
ー）を発現する細胞株から作製された発現ライブラリーをスクリーニングするた
めに用いる。標準的染色技術を用いて、細胞内もしくは表面で発現されたレセプ
ターを検出または識別するか、または表面発現形質転換細胞をパンニング法によ
ってスクリーニングする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色手順また
は免疫蛍光手順により実施する。McMahanら(1991)EMBO J．10:2821〜2832もまた
参照のこと。
標準的Ca++フラックスプロトコルを、DGWCCのレセプターを同定するために使
用し得る（例えば、Collganら（編)(1992および定期的補遺)Current Protocols
in Immunol．Greene/Wilet，New York，NY）。
例えば、０日目に２チャンバーのペルマノックス（permanox）スライドを、チ
ャンバーあたり1mlのPBS中の10ng/mlのフィブロネクチンで、30分間室温で予め
コーティングする。PBSで１回リンスする。次いで、COS細胞を、1.5mlの増殖培
地中で、チャンバーあたり2〜3×105細胞でプレートする。37℃で一晩、インキ
ュベートする。
各サンプルについて１日目に、66mg/mlのDEAE-デキストラン、66mMのクロロキ
ン、および4mgのDNAを無血清DME中に含む溶液0.5mlを調製する。各セットについ
て、ポジティブコントロール（例えば、ヒトDGWCCケモカインcDNAの）を、１お
よび1/200希釈で調整し、ならびにネガティブモック（mock）を調製する。細胞
を無血清DMEでリンスする。DNA溶液を添加し、５時間37℃でインキュベートする
。培地を除去し、DME中の10％DMSOを0.5ml、2.5分間添加する。培地を除去し、D
MEで１回洗浄する。1.5mlの増殖培地を添加し、一晩インキュベートする。
２日目に、培地交換する。３または４日目に、細胞を固定し、染色する。細胞
をハンクス緩衝化生理食塩水溶液(HBSS)で２回リンスし、４％パラホルムアルデ
ヒド(PFA)/グルコースで５分間固定する。HBSSで３回洗浄する。スライドを、全
ての液体を除去した後に−80℃で保存し得る。各チャンバーについて、0.5mlに
てインキュベーションを、以下のように実施する。32ml/mlの1M NaN3を含むHBSS
/サポニン(0.1％）を20分間添加した。次いで、細胞を、HBSS/サポニンで１回洗
浄する。ケモカインまたはケモカイン/抗体複合体を細胞に添加し、30分間イン
キュベートする。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。適切な場合、１次抗体
を30分間添加する。２次抗体を添加し（例えば、Vector抗マウス抗体を1/200希
釈で）、30分間インキュベートする。ELISA溶液(例えば、Vector Elite ABC西洋
ワサビペルオキシダーゼ溶液)を調製し、そして30分間予めインキュベートする
。例えば、2.5mlHBSS/サポニンあたり溶液A（アビジン）を１滴および溶液B（ビ
オチン）を１滴使用する。細胞をHBSS/サポニンで２回洗浄する。ABC/HRP溶液を
添加し、30分間インキュベートする。HBSSで細胞を２回洗浄し、第２の洗浄を２
分間行い、これにより、細胞が閉じる。次いで、Vectorジアミノ安息香酸(DAB)
を5〜10分間添加する。5mlのガラス蒸留水あたり、２滴の緩衝液と４滴のDABと
２滴のH2O2を使用する。チャンバーを注意深く取り除き、スライドを水でリンス
する。数分間風乾し、次いで、１滴のCrystal Mountを添加し、カバースリップ
をかける。85〜90℃で５分間焼く。
プールのポジティブ染色を評価し、続いてサブクローン化して、結合を担う単
一遺伝子を単離する。
または、ケモカイン試薬を、レセプターを発現する細胞をアフィニティー精製
もしくは分類するために用いる。例えば、SambrookらまたはAusubelらを参照の
こと。
別の戦略は、パンニングにより、膜に結合したレセプターについてスクリーニ
ングすることである。レセプタ−cDNAを、上記のように構築する。リガンドは固
定化し得、そして発現細胞を固定するために使用し得る。固定化を、例えば、ケ
モカイン融合構築物のFLAG配列を認識する適切な抗体を使用することにより、ま
たは１次抗体に対して惹起された抗体を用いることにより達成し得る。選択およ
び増幅の循環サイクルは、適切なクローンの濃縮、およびレセプター発現クロー
ンの最終的な単離をもたらす。
ファージ発現ライブラリーを、ケモカインによりスクリーニングし得る。適切
な標識技術(例えば、抗FLGA抗体)により、適切なクローンの特異的標識が可能に
なる。
XIV.免疫組織化学的局在化
上記の抗体を、種々の組織におけるDVic-1またはDGWCCの発現を同定するため
に用いる。免疫組織化学的染色の方法は、例えば、Sheehanら（編）（1987）The
ory and Practice Histotechnology(Battlle Press，Columbus，OH)に記載され
る。
本明細書中に引用される全ての文献は、個々の刊行物または特許出願の各々が
、全ての目的についてその全体が参考として援用されることが具体的にそして個
々に示されるかのような程度に、本明細書中に参考として援用される。
本発明の多くの改変および変更は、当業者に明らかであるように、その精神と
範囲を逸脱することなくなされ得る。本明細書中に記載される特定の実施態様は
例示としてのみ提供され、そして本発明は、添付の請求の範囲の用語およびこの
ような請求の範囲に対する等価物の十分な範囲によってのみ制限される。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21
5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，
ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｇ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ
，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，
ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ
Ｔ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ
(72)発明者 ヘドリック，ジョセフ エイ.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086,
サニーベイル，ビセント ドライブ 1260
―ディー
(72)発明者 ズロトニック，アルバート
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94306,
パロ アルト，アルガー ドライブ 507