ES2281205T3 - Anticuerpos antagonistas de quimiocina de atraccion de celulas t cutaneas (ctack) o quimiocinas de contractor intestinal vasoactivo (vic). - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo antagonista de quimiocina atrayente de células T cutáneas para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar la inflamación cutánea en un mamífero.

Description

Anticuerpos antagonistas de quimocina de atracción de células T cutáneas (CTACK) o quimiocinas de contractor intestinal vasoactivo (Vic).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones relacionadas con proteínas que actúan en el control de la fisiología, el desarrollo y/o la diferenciación de las células de mamíferos. En particular, proporciona proteínas que están implicadas en la regulación de la fisiología, el desarrollo, la diferenciación o la función de diversos tipos de células, p. ej., quimiocinas, receptores transmembrana 7, reactivos relacionados con cada uno de ellos, p. ej., anticuerpos o los ácidos nucleicos que los codifican, y sus usos. También proporciona métodos para el uso de las diversas composiciones de quimiocinas, y las composiciones usadas para ello, y más en particular, métodos para tratar enfermedades o trastornos cutáneos asociados a la regulación incorrecta de las quimiocinas CTACK y/o Vic.

Antecedentes

El sistema inmunitario consiste en una amplia variedad de distintos tipos de células, cada uno con importantes funciones que desempeñar. Véase Paul (ed. 1997) Fundamental Immunology 4ª ed., Raven Press, Nueva York. Los linfocitos ocupan una posición central, porque son las células que determinan la especificidad de la inmunidad, y es su respuesta la que organiza las ramas efectoras del sistema inmunitario. Se reconocen dos clases generales de linfocitos: los linfocitos B, que son los precursores de las células secretoras de anticuerpos, y los linfocitos T (dependientes del timo). Los linfocitos T expresan funciones reguladoras importantes, tales como la capacidad de promover o inhibir el desarrollo de tipos específicos de respuestas inmunitarias, que incluyen la producción de anticuerpos y la actividad microbicida incrementada de los macrófagos. Otros linfocitos T están implicados en funciones efectoras directas, tales como la lisis de células infectadas por virus o de ciertas células neoplásicas.

Las quimiocinas son una superfamilia grande y variada de proteínas. La superfamilia se subdivide en dos ramas clásicas, basándose en si las dos primeras cisteínas del motivo de quimiocina son adyacentes (denominada rama "C-C"), o si están espaciadas mediante un residuo intermedio ("C-X-C"). Una rama identificada más recientemente de quimiocinas carece de las dos cisteínas en el motivo correspondiente, y está representada por las quimiocinas conocidas como linfotactinas. Otra rama identificada recientemente tiene tres residuos intermedios entre las dos cisteínas, p. ej., quimiocinas CX3C. Véase, p. ej., Schall y Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6:865-873; y Bacon y Schall (1996) Int. Arch. Allergy & Immunol. 109:97-109.

Se han identificado muchos factores que influyen en el proceso de diferenciación de las células precursoras, o que regulan la fisiología o las propiedades de migración de tipos celulares específicos. Estas observaciones indican que existen otros factores cuyas funciones en la función inmunitaria no se han reconocido hasta ahora. Estos factores proporcionan actividades biológicas cuyo espectro de efectos puede ser distinto del de los factores de diferenciación o activación conocidos. La falta de conocimiento sobre las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de los factores reguladores que regulan la fisiología celular in vivo impide la modulación de los efectos de tales factores. Así, los estados médicos en los que es necesaria la regulación del desarrollo o de la fisiología de células relevantes siguen sin ser controlables.

Resumen de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de diversas moléculas de unión de quimiocina para los receptores transmembrana 7, y en el descubrimiento sorprendente de que las quimiocinas CTACK y Vic se expresan en las células cutáneas. Se ha demostrado que tienen efectos sobre las células inmunitarias relacionadas con la salud dermatológica.

La presente invención se refiere, p. ej., a métodos de modulación del movimiento de una célula dentro o hacia la piel de un mamífero, y el método comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de: un antagonista de CTACK; o un antagonista de Vic. También se describen métodos que comprenden administrar una cantidad eficaz de un agonista de CTACK o de un agonista de Vic. A menudo, en el método, la modulación es el bloqueo y la administración es un antagonista de CTACK o Vic, p. ej., en el que: el movimiento es: dentro de la piel, quimiotáctico o quimiocinético; la administración es local, tópica, subcutánea, intradérmica o transdérmica; la administración es un antagonista de CTACK o Vic; la célula es una célula CLA+, una célula T, una célula dendrítica, o un precursor de célula dendrítica, o la célula se mueve hacia las capas de la dermis y/o epidermis de la piel. En particular, tal método será uno en el que: el antagonista se selecciona de una muteína de CTACK o Vic natural, un anticuerpo que neutraliza CTACK o Vic, o un anticuerpo que bloquea la unión del ligando a GPR2; el mamífero es objeto de un trasplante o injerto de piel; o el antagonista se administra en combinación con un antibiótico, analgésico, compuesto terapéutico inmunosupresor, fármaco antiinflamatorio, factor de crecimiento o agente inmunoadyuvante.

En otros métodos descritos aquí, la modulación es la atracción y la administración es un agonista de CTACK o Vic. En ciertas realizaciones, el movimiento es: dentro de la piel, quimiotáctico o quimiocinético; la administración es local, tópica, subcutánea, intradérmica o transdérmica; la administración es un ligando de CTACK o Vic; la célula es una célula CLA+, una célula T, una célula dendrítica, o un precursor de célula dendrítica; o la célula se mueve hacia las capas de la dermis y/o epidermis de la piel. Habrá ciertos métodos preferidos en los que el agonista se selecciona de CTACK o Vic, o un ligando de GPR2; el mamífero es objeto de una lesión cutánea; o el agonista se administra en combinación con un antibiótico, analgésico, agente terapéutico inmunosupresor, fármaco antiinflamatorio, factor de crecimiento o agente inmunoadyuvante.

Otros aspectos de la invención incluyen métodos de identificación de células que expresan un receptor para CTACK o Vic, que comprenden permitir que una célula migre hacia CTACK o Vic, en el que se identifica que dicha célula expresa el receptor si ésta migra. Las formas particulares incluyen aquellas en las que la puesta en contacto da como resultado el movimiento específico de las células hacia un sitio para la purificación, p. ej., a través de los poros de una membrana.

La invención también proporciona métodos in vitro de producción de un complejo ligando:receptor, que comprenden poner en contacto: un CTACK de mamífero con un receptor GPR2; o un Vic de mamífero con un receptor GPR2; en el que al menos uno del ligando o el receptor es recombinante o purificado, por lo que permite que se forme el complejo. En tales métodos se incluyen aquellos en los que: el complejo da como resultado un flujo de Ca++; el receptor GPR2 está en una célula; la formación del complejo da como resultado un cambio fisiológico en la célula que expresa el receptor GPR2; la puesta en contacto se da en combinación con IL-2 y/o interferón-\alpha; o la puesta en contacto permite la detección cuantitativa del ligando.

Además, se describen métodos de modulación de la fisiología o del desarrollo de una célula que expresa GPR2, que comprenden poner en contacto la célula con un agonista o antagonista de Vic o CTACK de mamífero, en el que uno del receptor GPR2 o del agonista o del antagonista es recombinante o purificado. Esto incluirá aquellos en los que: el antagonista es: un anticuerpo que: neutraliza el Vic de mamífero, neutraliza el CTACK de mamífero, o bloquea la unión del ligando a GPR2; o una muteína de Vic o CTACK; o la fisiología se selecciona de: un flujo de calcio celular; una respuesta quimioatrayente; una respuesta de modificación de la morfología celular; recambio de lípidos de fosfatidilinositol; o una respuesta antiviral. Dentro de tales métodos están aquellos en los que: el antagonista es un anticuerpo y la fisiología es una respuesta quimioatrayente; o la modulación es el bloqueo, y la fisiología es una respuesta inflamatoria.

Se proporcionan métodos de ensayo, p. ej., el ensayo de un compuesto en función de su capacidad para afectar a la interacción receptor GPR2-ligando, y el método comprende comparar la interacción de GPR2 con Vic o CTACK en presencia y ausencia del compuesto. Entre tales métodos están aquellos en los que el compuesto es un anticuerpo contra GPR2, Vic o CTACK.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo antagonista de CTACK o Vic para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar la inflamación cutánea en un mamífero.

También se describen diversas composiciones de GPR2, p. ej., un GPR2 de primate, que comprende la secuencia MGTEVLEQ (véase la ID SEC Nº: 2); un GPR2 de roedor (véase la ID SEC Nº: 4); un ácido nucleico que codifica el GPR2 de la ID SEC Nº: 2 ó 4; o un anticuerpo que se une de forma selectiva a MGTEVLEQ (véase la ID SEC Nº: 2).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. General

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que las quimiocinas CTACK y Vic desempeñan un papel en la inmunidad de la piel. La piel consiste en una capa superficial de epitelio denominada epidermis y una capa subyacente de tejido conectivo llamada dermis. Debajo de la dermis hay una capa que contiene grandes cantidades de tejido adiposo, la hipodermis. La piel cumple una diversidad de funciones, y las variaciones en el carácter de la dermis y de la epidermis ocurren según las necesidades funcionales. Los anejos de la piel, pelo, uñas y glándulas sudoríparas y sebáceas, son las especializaciones locales de la epidermis. Juntos, la piel y sus anejos forman el integumento. Véase, p. ej., Fitzpatrick, et al. (eds. 1993) Dermatology in General Medicine 4ª ed., McGraw-Hill, NY; Bos (ed. 1989) Skin Immune System CRC Press, Boca Raton, FL; Callen (1996) General Practice Dermatology, Appleton y Lange; Rook, et al. (eds. 1998) Textbook of Dermatology Blackwell; Habifor y Habie (1995) Clinical Dermatology: A Color Guide to Diagnosis and Therapy Mosby; y Grob (ed. 1997) Epidemiology, Causes and Prevention of Skin Diseases Blackwell.

La epidermis consiste en muchos tipos celulares diferentes en diversas proporciones. El tipo celular más prevalente son los queratinocitos, que constituyen alrededor del 95% de las células. Las células en el intervalo del 1-2% incluyen los melanocitos y las células de Langerhans. Las células de Langerhans son particularmente importantes porque retienen los antígenos que han penetrado en la piel, y transportan los antígenos a los ganglios linfáticos regionales. Una pequeña población de células T \gamma\delta puede residir también en epidermis.

La dermis varía en grosor en las diferentes regiones del organismo. Es fuerte, flexible y sumamente elástica, y consiste en una red de fibras de colágeno con abundantes fibras elásticas. El tejido conectivo está dispuesto en la capa reticular profunda y la capa papilar superficial.

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Además, la invención proporciona combinaciones quimiocina-receptor de quimiocinas con un receptor transmembrana 7. Véase, p. ej., Ruffolo y Hollinger (eds. 1995) G-Protein Coupled Transmembrane Signaling Mechanisms CRC Press, Boca Raton, FL; Watson y Arkinstall (1994) The G-Protein Linked Receptor FactsBook Academic Press, San Diego, CA; Peroutka (ed. 1994) G Protein-Coupled Receptors CRC Press, Boca Raton, FL; Houslay y Milligan (1990) G-Proteins as Mediators of Cellular Signaling Processes Wiley and Sons, Nueva York, NY. Aquí se describen realizaciones en humano y ratón.

Entre los muchos tipos de ligandos que intervienen en procesos biológicos a través de los receptores transmembrana 7 están las quimiocinas y ciertas proteasas. Las quimiocinas desempeñan un papel importante en las respuestas inmunitarias e inflamatorias induciendo la migración y la adhesión de los leucocitos. Véase, p. ej., Schall (1991) Cytokine 3:165-183; y Thomson (ed.) The Cytokine Handbook Academic Press, NY. Las quimiocinas son secretadas por los leucocitos activados y actúan como quimioatrayentes para una diversidad de células que están implicadas en la inflamación. Además de las propiedades quimioatrayentes, se ha demostrado también que las quimiocinas inducen otras respuestas biológicas, p. ej., la modulación de los niveles de segundos mensajeros tales como Ca^{++}; cambios en la reserva de fosfato de inositol (véase, p. ej., Berridge (1993) Nature 361:315-325 o Billah y Anthes (1990) Biochem. J. 269:281-291); respuestas de modificación de la morfología celular; recambio de lípidos de fosfatidilinositol, posibles respuestas antivirales; y otros. Así, las quimiocinas proporcionadas aquí pueden, solas o en combinación con otros reactivos terapéuticos, tener efectos combinados ventajosos.

Además, hay razones para sugerir que las quimiocinas pueden tener efectos sobre otros tipos de células, p. ej., atracción o activación de monocitos, células dendríticas, células T, eosinófilos, basófilos y/o neutrófilos. También pueden tener efectos quimioatrayentes sobre diversas células neuronales que incluyen, p. ej., neuronas de los ganglios de la raíz dorsal en el sistema nervioso periférico y/o neuronas del sistema nervioso central.

Los receptores acoplados a proteína G, p. ej. los receptores de quimiocinas, son importantes en los mecanismos de transducción de señales mediados por sus ligandos. Son marcadores útiles para distinguir las poblaciones celulares, y se les ha identificado como receptores específicos para infecciones retrovirales.

La superfamilia de quimiocinas se dividió de manera clásica en dos grupos que exhibían motivos estructurales característicos, las familias Cys-X-Cys (C-X-C) y Cys-Cys (C-C). Estas se distinguían basándose en la inserción de un único aminoácido entre el par NH-proximal de residuos de cisteína y la similitud de secuencias. Típicamente, las quimiocinas C-X-C, es decir, IL-8 y MGSA/Gro-\alpha, actúan sobre los neutrófilos pero no sobre los monocitos, mientras las quimiocinas C-C, es decir, MIP-1\alpha y RANTES, son quimioatrayentes potentes para los monocitos y los linfocitos, pero no para los neutrófilos. Las quimiocinas CC son eficaces preferentemente sobre los macrófagos, linfocitos y eosinófilos. Véase, p. ej., Miller, et al. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12:17-46. Una quimiocina recientemente aislada, linfotactina, no pertenece a ningún grupo y puede constituir el primer miembro de una tercera familia de quimiocinas, la familia C. Linfotactina no tiene un motivo característico CC o CXC, y actúa sobre los linfocitos pero no sobre los neutrófilos y monocitos. Véase, p. ej., Kelner et al. (1994) Science 266:1395-1399. Esta quimiocina define una nueva familia C de quimiocinas. Aún más recientemente se ha identificado otra quimiocina que exhibe un motivo CX3C, lo que establece una cuarta clase estructural.

La quimiocina GWCC, de ratón y humano, se ha descrito anteriormente en el documento WO 98/23750, que se incorpora aquí como referencia para todos los fines. Basándose en las nuevas observaciones dirigidas a la biología de esta quimiocina, se denomina aquí quimiocina atrayente de células T cutáneas o CTACK. Las secuencias se proporcionan en las ID SEC Nºs 11 y 12 (primate) y en las ID SEC Nºs 13 y 14 (ratón), y se han depositado en las bases de datos GenBank/EMBL/DDBJ con los números de acceso AF082392 (CTACK de ratón) y AF082393 (CTACK de humano). Los clones de CTACK de humano y de ratón se cartografían en regiones cromosómicas sinténicas, el segmento humano 9p13 y la región proximal del cromosoma 4 de ratón, respectivamente. Las quimiocinas C-C con la mayor similitud a CTACK (6Ckine, y MIP-3\beta) también se cartografían en estas regiones cromosómicas. De manera similar, se describe la quimiocina Vic. Se proporciona una realización de humano de una quimiocina de primate designada Vic en las ID SEC Nºs 5 y 6 (el sitio de escisión predicho está alrededor del enlace peptídico ala(-1) - ile(1)). El término "Vic" abarcará otros homólogos de primate. Se proporciona una variante humana en las ID SEC Nºs 7 y 8. Se proporciona un homólogo de roedor (ratón) en las ID SEC Nºs: 9 y 10. La quimiocina Vic exhibe una biología similar a CTACK, pero es ligeramente diferente, p. ej., en la expresión en las placas de Peyer del intestino delgado, una segunda superficie epitelial respecto del exterior topológico, y que tiene un patrón de expresión más regulado, p. ej., aumento en la psoriasis.

Las quimiocinas o los receptores descritos deberían ser importantes para intervenir en diversos aspectos de la fisiología o del desarrollo celular, de los órganos, de los tejidos o de los organismos. En particular, la quimiocina Vic es una quimiocina proinflamatoria clásica que interviene en procesos inflamatorios. CTACK es una quimiocina expresada de forma cutánea. Véase, p. ej., el documento de EE.UU. de nº de serie 08/978.964 y los casos relacionados.

En contraste con los linfocitos vírgenes, los linfocitos memoria/efectores pueden acceder a sitios efectores no linfoides y exhibir un comportamiento de migración restringido, a menudo selectivo de tejido. El antígeno asociado a linfocitos cutáneos (CLA) define un subgrupo bien descrito de células T memoria circulantes que se localizan de forma selectiva en sitios cutáneos, en parte mediante la interacción de CLA con su ligando vascular E-selectina. Picker, et al. (1991) Nature 349:796-799; y Rossiter, et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:205-210. E-selectina se expresa en general en el endotelio inflamado; así, la infiltración específica de la piel por células CLA^{+} debe requerir señales adicionales. Aquí está la descripción de quimiocinas C-C particulares, una originariamente designada GWCC pero aquí denominada CTACK, y la otra Vic. Véanse los documentos de EE.UU. de nº de serie 08/978.964 o WO 98/23750, que se incorporan aquí como referencia para todos los fines.

Basándose en la nueva información dirigida a la función, una quimiocina se denomina aquí quimiocina atrayente de células T cutáneas o CTACK. CTACK tanto de humano como de ratón se detecta exclusivamente en la piel, específicamente en la epidermis de ratón y en los queratinocitos humanos. El mensaje de CTACK se incrementa en los queratinocitos tras tratamiento con citocinas proinflamatorias. CTACK atrae de forma selectiva a las células T memoria CLA^{+}, y también tiene efectos sobre las células dendríticas de la piel (células de Langerhans) y sus precursores. La quimiocina Vic tiene características similares, pero también se expresa en el intestino y a veces está aumentada. Estas características sugieren un papel importante para CTACK y/o Vic en el reclutamiento de células T CLA^{+} y de células dendríticas hacia los sitios cutáneos. CTACK es la primera quimiocina descrita que se expresa específicamente en la piel y que atrae de forma selectiva a una subpoblación específica de tejido de linfocitos memoria.

Al haberse identificado CTACK y Vic como quimiocinas relacionadas con la piel, tendrán utilidad para influir en las anormalidades médicas de la piel. Los trastornos cutáneos comunes que implican al sistema inmunitario incluyen psoriasis, cánceres cutáneos, carcinomas, inflamación, alergias, dermatitis, cicatrización, infecciones (tanto microbianas como parasitarias), y muchos otros. Véase, p. ej., The Merck Manual, en particular el capítulo sobre trastornos dermatológicos. Estos agentes terapéuticos pueden tener efectos útiles sobre el crecimiento o la salud de los anejos de la piel, que incluyen, p. ej., pelo, uñas y glándulas sudoríparas y sebáceas.

La psoriasis es una enfermedad cutánea inflamatoria crónica que está asociada a queratinocitos epidérmicos hiperplásicos y células mononucleares infiltrantes, que incluyen células T memoria CD4+, neutrófilos y macrófagos. Debido a este cuadro inflamatorio sumamente mezclado y a las interrelaciones complejas resultantes entre estas diferentes células, ha sido muy difícil analizar minuciosamente los mecanismos que subyacen en la inducción y la progresión de la enfermedad.

Esta hipótesis también implica que aunque pueden preexistir células T autorreactivas latentes en los individuos susceptibles, es necesario un estímulo ambiental para desencadenar la inducción de la enfermedad. Otros creen que el sistema inmunitario desempeña solamente un papel modulador menor en el proceso de la enfermedad y que la hiperproliferación de los queratinocitos es, de hecho, el suceso iniciador en un hospedador genéticamente susceptible. La investigación de la patogénesis de la psoriasis ha estado dificultada durante mucho tiempo por la carencia de modelos animales adecuados.

Existen datos crecientes que indican que las células T, y no los queratinocitos, son el componente patógeno principal en la enfermedad. Las presentes observaciones proporcionan pruebas que apoyan el concepto de que los trastornos similares a psoriasis pueden ser el resultado, de hecho, de respuestas de células T sin regular.

Además, los cánceres cutáneos, tales como el carcinoma basocelular y el carcinoma espinocelular, están entre las neoplasias malignas más comunes. Véase, p. ej., Miller y Maloney (eds. 1997) Cutaneous Oncology: Pathophysiology, Diagnosis, and Management Blackwell; Emmett y Orourke (1991) Malignant Skin Tumours Churchill Livingstone; Friedman (1990) Cancer of the Skin Saunders. La mayoría de esos tumores surgen en áreas de la piel expuestas al sol. La regulación o remisión inmunitaria de tales tumores puede depender de la función del sistema inmunitario de la piel. Las células que efectúan tales procesos pueden estar comprometidas por una regulación incorrecta o una supresión local. CTACK o Vic o los antagonistas pueden interrumpir una homeostasis temporal que inhibe la respuesta inmunitaria normal, por lo que llevan a la activación de rutas reguladoras e inmunitarias correctas.

La dermatitis es una inflamación superficial de la piel, caracterizada por vesículas (cuando es aguda), eritema, edema, exudado, formación de costras, descamación y prurito. Véase, p. ej., Lepoittevin (ed. 1998) Allergic Contact Dermatitis: The Molecular Basis Springer-Verlag; Rietschel y Fowler (eds. 1995) Fisher's Contact Dermatitis Lippincott; y Rycroft, et al. (eds. 1994) Textbook of Contact Dermatitis Springer-Verlag. La expresión dermatitis eccematosa se usa a menudo para referirse a una dermatitis vesicular. La dermatitis puede acompañar a diversos trastornos o enfermedades por inmunodeficiencias, trastornos metabólicos congénitos, o enfermedades por deficiencias nutricionales. Algunos de los síntomas de tales trastornos se pueden tratar mediante el uso de la presente invención.

El prurito es una sensación que el paciente intenta aliviar mediante rascado. Véase, p. ej., Fleischer y Fleischer (1998) The Clinical Management of Itching: Therapeutic Protocols for Pruritus Parthenon. Muchos trastornos parasitarios o infecciosos pueden dar como resultado estos síntomas, y dichos trastornos se pueden hacer remitir mediante la reactivación o inhibición correcta de las funciones inmunitarias de la piel. De forma similar para diversas reacciones alérgicas u otras reacciones inmunitarias a la exposición a diversos antígenos alérgicos o inflamatorios.

Vic y CTACK se unen y señalizan a través del receptor común GPR-2, como se demuestra por su capacidad para inducir la quimiotaxis en células transfectadas con cADN de GPR-2, pero no en células sin transfectar o en células transfectadas con GPR-2 truncado (carente de los 8 aminoácidos erminales). Estas quimiocinas comparten un receptor en las células T CLA+, como se demostró mediante el hallazgo de que son capaces de desensibilizar mutuamente la respuesta quimiotáctica.

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Tanto Vic como CTACK atraen químicamente de forma selectiva a las células T memoria CLA+ de migración a la piel y no a otros subgrupos de células T memoria, que incluyen las células T \beta7+ de migración al intestino. Ni CTACK ni Vic atraen células T vírgenes, células B o monocitos.

II. Quimiocinas purificadas; receptores

Las secuencias de nucleótidos y las secuencias derivadas de aminoácidos de un receptor de quimiocinas designado GPR2 se muestran en las ID SEC Nºs: 1 y 2 (humano) y en las ID SEC Nºs: 3 y 4 (ratón). La expresión abarcará otros homólogos de primate y de roedor. Se pueden usar secuencias complementarias de ácidos nucleicos para muchos fines, p. ej., en un par de cebadores de PCR o como un cebador de mutagénesis. Se pueden usar fragmentos de la secuencia nucleotídica como sondas de hibridación o como cebadores de PCR, o para codificar péptidos antigénicos. Los fragmentos del polipéptido serán útiles como péptidos antigénicos. De forma similar para las otras secuencias génicas. Los genes codifican proteínas nuevas que exhiben estructuras y motivos característicos de un receptor de quimiocina. Véase Marchese, et al. (1994) Genomics 23:609-618. El ARNm de GPR-2 se expresa en las células T CLA+ pero no en otros subgrupos de células T memoria o en células T vírgenes; así, ya que se sabe que las células T CLA+ desempeñan un papel clave en la inflamación cutánea, cualquier método para bloquear la interacción de GPR2 con CTACK o Vic es un agente terapéutico potencialmente importante.

La presente invención ha relacionado el receptor de quimiocinas GPR2 con las quimiocinas Vic y CTACK.

Ciertas descripciones generales de las propiedades físicas de los polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos, cuando se dirigen a una realización, claramente son aplicables normalmente a otras quimiocinas o receptores descritos aquí.

Estas secuencias de aminoácidos, proporcionadas de amino a carboxilo, son importantes para proporcionar información de secuencia sobre el ligando o receptor de quimiocina, por lo que permiten distinguir la proteína de otras proteínas, en particular las versiones que se dan de forma natural. Además, las secuencias permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer y distinguir tales segmentos, y permiten la preparación de sondas oligonucleotídicas, y ambas son estrategias para el aislamiento, p. ej. clonado, de los genes que codifican tales secuencias, o secuencias relacionadas, p. ej., variantes polimórficas naturales o de otro tipo, que incluyen las proteínas de fusión. Las similitudes de las quimiocinas se han observado con otras quimiocinas. Véase, p. ej., Bosenberg, et al. (1992) Cell 71:1157-1165; Huang, et al. (1992) Molecular Biology of the Cell 3:349-362; y Pandiella, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:24028-24033. De forma similar para los receptores GPC.

Como se usa aquí, el término "GPR2" abarcará, cuando se use en el contexto de proteínas, una proteína que tiene una secuencia madura de aminoácidos como se muestra en las ID SEC Nºs 1-4. La invención también abarca polipéptidos selectivos, p. ej., que comprenden un fragmento específico de tal proteína. La invención también abarca un polipéptido que es un homólogo de una especie primate, p. ej., que exhibe una secuencia similar, y es más homólogo en la secuencia codificante natural que otros genes de una especie primate. Típicamente, tal receptor de quimiocina interaccionará también con sus componentes de unión específicos, p. ej., el ligando, o los anticuerpos que se unen a él. Estos componentes de unión, p. ej. anticuerpos, se unen típicamente al receptor de quimiocina con una afinidad elevada, p. ej., al menos alrededor de 100 nM, normalmente mejor que alrededor de 30 nM, preferiblemente mejor que alrededor de 10 nM, y más preferiblemente mejor que alrededor de 3 nM. Se aplican términos similares a los ligandos de quimiocina.

El término "polipéptido", como se usa aquí, incluye un fragmento o segmento significativo, y abarca un tramo de residuos de aminoácidos de al menos alrededor de 8 aminoácidos, generalmente al menos 10 aminoácidos, más generalmente al menos 12 aminoácidos, a menudo al menos 14 aminoácidos, más a menudo al menos 16 aminoácidos, típicamente al menos 18 aminoácidos, más típicamente al menos 20 aminoácidos, normalmente al menos 22 aminoácidos, más normalmente al menos 24 aminoácidos, preferiblemente al menos 26 aminoácidos, más preferiblemente al menos 28 aminoácidos, y, en las realizaciones particularmente preferidas, al menos alrededor de 30 o más aminoácidos, p. ej., alrededor de 35, 40, 45, 50, 60, 75, 80, 100, 120, etc. Las proteínas similares comprenderán probablemente una pluralidad de tales segmentos. Tales fragmentos pueden tener extremos que comienzan y/o terminan virtualmente en todas las posiciones, p. ej., que comienzan en los residuos 1, 2, 3, etc., y que terminan en, p. ej., 69, 68, 67, 66, etc., en todos los pares combinatorios del segmento codificante. Los péptidos particularmente interesantes tienen extremos que corresponden a los límites de los dominios estructurales, p. ej., bucles intracelulares o extracelulares de las realizaciones del receptor. Tales péptidos serán típicamente péptidos inmunógenos, o se pueden concatenar para generar polipéptidos mayores. Los péptidos cortos se pueden unir o acoplar a un portador mayor.

La expresión "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a la quimiocina o al receptor respectivo, p. ej., de una forma ligando-receptor o en una interacción anticuerpo-antígeno. Estas composiciones pueden ser compuestos, p. ej. proteínas, que se asocian de forma específica a la quimiocina o al receptor, que incluyen interacciones proteína-proteína naturales fisiológicamente relevantes, covalentes o no covalentes. La composición de unión puede ser un polímero u otro reactivo químico. No existe necesariamente ninguna implicación en cuanto a si la quimiocina presenta una forma cóncava o convexa en su interacción ligando-receptor, aparte de que la interacción exhiba una especificidad similar, p. ej., afinidad específica. Un análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula completamente no relacionada, p. ej., que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión apropiados del ligando. Los ligandos pueden servir como agonistas o antagonistas de un receptor fisiológico o natural, véase, p. ej., Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.), Pergamon Press. La expresión incluye expresamente los anticuerpos, policlonales o monoclonales, que se unen de forma específica al antígeno respectivo.

Sustancialmente puro significa que la proteína está exenta de otras proteínas, ácidos nucleicos y/o otros productos biológicos contaminantes derivados típicamente del organismo de origen. La pureza se puede determinar mediante métodos estándar, y será habitualmente al menos alrededor del 40% de pureza, más habitualmente al menos alrededor del 50% de pureza, generalmente al menos alrededor del 60% de pureza, más generalmente al menos alrededor del 70% de pureza, a menudo al menos alrededor del 75% de pureza, más a menudo al menos alrededor del 80% de pureza, típicamente al menos alrededor del 85% de pureza, más típicamente al menos alrededor del 90% de pureza, preferiblemente al menos alrededor del 95% de pureza, más preferiblemente al menos alrededor del 98% de pureza, y en las realizaciones más preferidas, al menos el 99% de pureza. Los análisis serán típicamente en peso, pero pueden estar en cantidades molares.

La solubilidad de un polipéptido o de un fragmento depende del medio y del polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, e incluyen la temperatura, el medio de electrolitos, el tamaño y las características moleculares del polipéptido, y la naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la que se usa el polipéptido oscila de alrededor de 4ºC a alrededor de 65ºC. Normalmente, la temperatura de uso es mayor de alrededor de 18ºC, y más normalmente mayor de alrededor de 22ºC. Para fines de diagnóstico, la temperatura será normalmente aproximadamente la temperatura ambiente o más elevada, pero inferior que la temperatura de desnaturalización de los componentes del ensayo. Para fines terapéuticos, la temperatura será normalmente la temperatura corporal, típicamente alrededor de 37ºC para humanos, aunque en ciertas situaciones la temperatura se puede elevar o disminuir in situ o in vitro.

Los electrolitos se aproximarán normalmente a las condiciones fisiológicas in situ, pero se pueden modificar a fuerzas iónicas superiores o inferiores cuando sea ventajoso. Se pueden modificar los iones precisos, p. ej., para ajustarse a los tampones estándar usados en los contextos fisiológicos o analíticos.

El tamaño y la estructura del polipéptido deberían estar en general en un estado sustancialmente estable, y normalmente no en un estado desnaturalizado, aunque en ciertas circunstancias la proteína desnaturalizada será importante. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, p. ej. para conferir solubilidad, o puede estar asociado con lípidos o detergentes de una manera que se aproxima a las interacciones en la bicapa lipídica natural.

El disolvente será normalmente un tampón biológicamente compatible, de un tipo usado para la conservación de las actividades biológicas, y se aproximará normalmente a un disolvente fisiológico. Normalmente, el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente de al menos alrededor de 5, preferiblemente al menos 6, y típicamente menor de 10, preferiblemente menor de 9, y más preferiblemente alrededor de 7,5. En algunas ocasiones se añadirá un detergente, típicamente uno suave no desnaturalizante, p. ej., CHS (hemisuccinato de colesterol) o CHAPS (sulfonato de 3-([3-colamidopropil]dimetilamonio)-1-propano), o una concentración lo suficientemente baja como para evitar la alteración significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

La solubilidad se refleja mediante la sedimentación medida en unidades Svedberg, que es una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula en condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se realizaba de forma clásica en una ultracentrífuga analítica, pero actualmente se realiza típicamente en una ultracentrífuga estándar. Véase Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2ª ed.), W.H. Freeman; y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco. Como determinación rudimentaria, se centrifuga una muestra que contiene un polipéptido supuestamente soluble en una ultracentrífuga de tamaño completo estándar a alrededor de 50.000 rpm durante alrededor de 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble será típicamente menor de alrededor de 30S, más típicamente menor de alrededor de 15S, normalmente menor de alrededor de 10S, más normalmente menor de alrededor de 6S, y, en realizacio-
nes particulares, preferiblemente menor de alrededor de 4S, y más preferiblemente menor de alrededor de 3S.

III. Variantes físicas

También se describen proteínas o péptidos que tienen una homología de secuencia de aminoácidos sustancial con la secuencia de aminoácidos de cada receptor respectivo. Las variantes incluyen variantes de especie o polimórficas.

La homología de la secuencia de aminoácidos, o la identidad de la secuencia, se determina mediante la optimización de las correspondencias de residuos, si es necesario introduciendo huecos según se requiera. Esto cambia cuando se consideran las sustituciones conservativas como correspondencias. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente las sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicocola, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias homólogas de aminoácidos pretenden incluir típicamente las variaciones naturales alélicas o interespecies en cada secuencia proteica respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán una homología desde el 25-100% (si se pueden introducir huecos), a una homología del 50-100% (si se incluyen las sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de la quimiocina o el receptor apropiado. Las medidas de homología serán al menos alrededor del 35%, generalmente al menos del 40%, más generalmente al menos del 45%, a menudo al menos del 50%, más a menudo al menos del 55%, típicamente al menos del 60%, más típicamente al menos del 65%, normalmente al menos del 70%, más normalmente al menos del 75%, preferiblemente al menos del 80%, y más preferiblemente al menos del 80%, y en las realizaciones particularmente preferidas, al menos del 85% o más. Véase también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) capítulo uno de Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes informáticos de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y del University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

Cada uno de los ADNs de la quimiocina o del receptor GPC aislados se pueden modificar fácilmente mediante sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos, e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones pueden dar como resultado secuencias de ADN nuevas que codifican estos antígenos, sus derivados o proteínas que tienen una actividad fisiológica, inmunógena o antigénica similar. Estas secuencias modificadas se pueden usar para producir antígenos mutantes o para incrementar la expresión, o para introducir sitios de reconocimiento enzimático convenientes en la secuencia nucleotídica sin afectar significativamente a la secuencia de la proteína codificada. La expresión incrementada puede implicar la amplificación génica, la transcripción incrementada, la traducción incrementada, y otros mecanismos. Tales derivados mutantes de los receptores incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la proteína respectiva o de sus fragmentos. "Quimiocina mutante" abarca un polipéptido que se ajusta, por otra parte, a la definición de homología de la quimiocina como se expuso anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la quimiocina tal como se encuentra en la naturaleza, ya sea por medio de deleción, sustitución o inserción. De forma similar para los GPCRs. Estos incluyen niveles de sustitución de residuos de aminoácidos de ninguno, uno, dos, tres, cinco, siete, diez, doce, quince, etc. En particular, "mutante específico de sitio" incluye generalmente las proteínas que tienen una homología significativa con una proteína que tiene las secuencias de las ID SEC Nºs. 1-14, y que comparten diversas actividades biológicas, p. ej., antigénicas o inmunógenas, con aquellas secuencias, y en las realizaciones preferidas contienen la mayoría de las secuencias descritas, en particular aquellas halladas en diversos grupos de animales. Como se indicó anteriormente, se enfatiza que las descripciones en general pretenden abarcar las diversas proteínas de quimiocina o de receptor de otros miembros de los grupos relacionados, sin limitarse a las realizaciones de ratón o de humano específicamente discutidas.

Aunque los sitios de las mutaciones específicas de sitio están habitualmente predeterminados, no es necesario que los mutantes sean específicos de sitio. La mutagénesis de la quimiocina o del receptor se puede llevar a cabo haciendo inserciones o deleciones de aminoácidos. Se pueden generar sustituciones, deleciones, inserciones o combinaciones para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino- o carboxi-terminales. Se puede llevar a cabo mutagénesis aleatoria en un codon de interés, y los mutantes expresados se pueden cribar en función de la actividad deseada. Los métodos para realizar mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en un ADN que tiene una secuencia conocida se conocen en la técnica, p. ej. mediante técnicas de mutagénesis con el cebador M13 o de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase también Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y suplementos). Se conocen muchas características estructurales de las quimiocinas y GPCRs que permiten la determinación de si hay insertados residuos específicos en el núcleo de las estructuras secundarias o terciarias, o si los residuos tendrán un efecto relativamente pequeño sobre el plegamiento de la proteína. Las posiciones preferidas para la mutagénesis son aquellas que no impiden el plegamiento funcional de la proteína resultante.

Las mutaciones en el ADN no deberían colocar normalmente secuencias codificantes fuera de los marcos de lectura, y preferiblemente no crearán regiones complementarias que podrían hibridar para producir una estructura de ARNm secundario tal como bucles u horquillas. Pero existen ciertas situaciones en las que tales problemas están compensados. Véase, p. ej., Gesteland y Atkins (1996) Ann. Rev. Biochem. 65:741-768.

También se describen proteínas recombinantes, p. ej., proteínas de fusión heterólogas mediante el uso de segmentos de estas proteínas, o anticuerpos. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que no están fusionados normalmente de forma natural de la misma manera. Así, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido receptor es una molécula proteica continua que tiene secuencias fusionadas en una unión peptídica típica, típicamente producida en forma de un único producto de traducción, y que exhibe propiedades derivadas de cada péptido originario. Se aplica un concepto quimérico similar a las secuencias heterólogas de ácidos nucleicos.

Además, se pueden producir nuevas construcciones a partir de la combinación de dominios funcionales o estructurales similares de otras proteínas. Por ejemplo, se pueden "intercambiar" segmentos de unión de ligandos u otros segmentos entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Véase, p. ej., Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336; y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. Así, los polipéptidos quiméricos nuevos que exhiben combinaciones nuevas de especificidades resultarán de la unión funcional de especificidades de unión de ligandos y otros dominios funcionales. Estos pueden ser moléculas quiméricas con mezcla o unión de los diversos segmentos estructurales, p. ej., los dominios estructurales de lámina \beta o hélice \alpha para la quimiocina, o los segmentos del receptor que corresponden a cada uno de los segmentos transmembrana (TM1-TM7), o los bucles intracelulares (citosólicos, C1-C4) o extracelulares (E1-E4) de los diversos tipos de receptores. El bucle C3 es particularmente importante.

El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Se obtendrá a menudo un fragmento bicatenario mediante la síntesis de la cadena complementaria y la hibridación de la cadena en condiciones apropiadas, o mediante la adición de la cadena complementaria mediante el uso de la ADN polimerasa con una secuencia cebadora apropiada, p. ej., técnicas de PCR.

IV. Variantes funcionales

Se describieron las quimiocinas CTACK de mamífero previamente en el documento de EE.UU. de nº de serie 08/978.964, que describe diversos ensayos de migración. Se pueden producir diversos agonistas y antagonistas de los ligandos naturales. Los ensayos de migración pueden aprovechar el movimiento de las células a través de los poros de las membranas. La quimiotaxis se puede medir así. De forma alternativa, se pueden desarrollar ensayos quimiocinéticos, que miden la inducción del movimiento cinético, no necesariamente respecto de un gradiente, per se.

Los agonistas de CTACK o Vic exhibirán algunas o todas las funciones de señalización de la quimiocina respectiva, p. ej., unión y quimioatracción de las células apropiadas. Se pueden estudiar diversas secuencias de CTACK o Vic de mamíferos para determinar qué residuos están conservados entre las especies, lo que sugiere qué residuos se pueden cambiar sin efectos drásticos sobre la actividad biológica. De forma alternativa, las sustituciones conservativas mantienen probablemente la actividad biológica, y conducen así a variantes de la quimiocina que mantendrán la actividad agonista. Los métodos estándar para cribar polipéptidos de CTACK o Vic mutantes o variantes determinarán qué secuencias serán agonistas terapéuticos útiles.

Además, se pueden aplicar ciertos métodos de expresión de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en el contexto de injertos cutáneos, puede ser útil transfectar los injertos con ácidos nucleicos que se expresarán, según sea apropiado. Se pueden unir de forma operable diversos promotores al gen, por lo que se permite la expresión regulada.

De forma alternativa, se puede ensayar la actividad antagonista. Los ensayos de la capacidad para antagonizar la actividad quimioatrayente se pueden desarrollar como se describe más adelante. Se pueden crear diversos homólogos de ligando que mantienen la capacidad de unión al receptor, pero que carecen de la capacidad de señalización. También se pueden cribar pequeñas moléculas en función de su capacidad para antagonizar la función de CTACK, p. ej. la quimioatracción, la unión al receptor, el flujo de Ca^{++}, y otros efectos mediados por CTACK. Véase en general Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn, los cuales se incorporan aquí como referencia.

El bloqueo de la respuesta fisiológica para diversas realizaciones de estas quimiocinas o GPCRs puede ser el resultado de la inhibición de la unión del ligando a su receptor, probablemente por medio de inhibición competitiva. Así, los ensayos in vitro de la presente invención usarán a menudo proteína aislada, membranas de células que expresan un receptor recombinante asociado a membrana, p. ej., los segmentos de unión del ligando, o fragmentos unidos a sustratos en fase sólida. Estos ensayos permitirán también la determinación diagnóstica de los efectos de las mutaciones y modificaciones del segmento de unión, o las mutaciones y modificaciones del ligando, p. ej., en los análogos de ligando.

Esta invención también contempla el uso de ensayos de cribado de fármacos competitivos, p. ej., en los que las composiciones de unión neutralizantes, p. ej. anticuerpos, hacia antígenos o fragmentos de receptor compiten con un compuesto de ensayo para la unión a la proteína. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de polipéptidos que comparten uno o más sitios de unión antigénica del ligando, y se pueden usar también para ocupar sitios de unión en la proteína que podrían interaccionar de otra forma con un receptor.

Además, los anticuerpos neutralizantes contra una realización de quimiocina específica y los fragmentos solubles de la quimiocina que contienen un sitio de unión al receptor de elevada afinidad, se pueden usar para inhibir la actividad de la quimiocina en los tejidos, p. ej., tejidos que experimentan una fisiología anormal.

Los ensayos de cribado para determinar la unión y la actividad de los mAcs y las composiciones de unión abarcan una diversidad de métodos. La unión se puede ensayar marcando de forma detectable el anticuerpo o la composición de unión descrita anteriormente. Las células que responden a CTACK o Vic se pueden usar para ensayar la composición de anticuerpo o de unión.

Para determinar la capacidad de quimioatracción o quimiocinética de CTACK o Vic, se usan preferiblemente animales experimentales, p. ej. ratones. Se hacen recuentos de células cutáneas, p. ej. de Langerhans, antes y en diversos momentos después de la administración de una inyección rápida del agonista o antagonista candidato. Las concentraciones se analizan en diversas muestras, p. ej. sangre, suero, lavados nasales o pulmonares, o tinción de biopsia de tejido. Una composición eficaz de disminución de mAc o de unión disminuirá de forma significativa el nivel de células CLA+. Esto puede ser al menos alrededor del 10%, preferiblemente al menos alrededor del 20%, 30%, 50%, 70% o más.

La determinación de los anticuerpos se puede realizar en otros animales, p. ej. humanos, mediante el uso de diversos métodos. Por ejemplo, las muestras de sangre se extraen de pacientes que padecen una enfermedad o trastorno relacionado con la piel antes y después del tratamiento con un mAc candidato.

La perfecta migración selectiva de tejido de los linfocitos se ha considerado durante mucho tiempo fundamental para el control de las respuestas inmunitarias sistémicas. Los avances recientes en este campo apoyan un modelo en el que la migración de los leucocitos se consigue mediante la expresión secuencial de moléculas de adhesión vasculares y de leucocitos expresadas de forma diferencial y reguladas independientemente, y receptores de señalización y sus ligandos. Butcher y Picker (1996) Science 272:60-66. La observación de que las quimiocinas, una superfamilia de pequeñas proteínas secretadas con receptores acoplados a proteína G (Baggiolini (1998) Nature 392:565-568), pueden atraer leucocitos llevó a la hipótesis de que las quimiocinas proporcionan señales clave que dirigen el reclutamiento de subgrupos de linfocitos T hacia sitios efectores inmunitarios linfoides y extralinfoides. La expresión específica de piel de CTACK y/o Vic unida a su quimioatracción selectiva para células T memoria CLA^{+} de migración a la piel proporciona datos que apoyan la hipótesis de que existen quimiocinas específicas de tejido que atraen de forma selectiva subgrupos funcionalmente únicos de linfocitos memoria.

Como tal, la presente invención proporciona medios para purificar células deseadas, p. ej., CLA+. Los efectos quimioatrayentes o quimiocinéticos sobre esas células pueden ser la base de los métodos de purificación. Existen métodos para la migración y la recuperación selectiva de células hacia o desde la quimiocina, p. ej., a través de una membrana porosa, o hacia diversas localizaciones en un cultivo. Existen otros métodos para separar selectivamente células de formas particulares de otras. De forma alternativa, se pueden usar moléculas marcadoras para separar mediante FACS células que se unen específicamente a la quimiocina. Las poblaciones de células de Langerhans o derivadas de piel sustancialmente homogéneas tendrán una utilidad importante en los medios de investigación o terapéuticos.

Mientras CTACK y Vic exhiben efectos sobre las células CLA+, otras células que pueden responder también incluyen fibroblastos y queratinocitos. Los efectos sobre los diversos tipos de células pueden ser indirectos, y también directos. Un cambio estadísticamente significativo en el número de células será típicamente al menos alrededor del 10%, preferiblemente 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, o más. A menudo se desearán efectos mayores del 100%, p. ej., 130%, 150%, 2X, 3X, 5X, etc. Los efectos pueden ser específicos para provocar la quimiotaxis hacia puntos específicos, o pueden ser quimiocinéticos en la inducción de movimiento en general de las células, pero no necesariamente en una dirección específica.

CTACK puede inducir la adhesión mediada por integrina para los ligandos vasculares ICAM-1 y VCAM-1. ICAM-1 o VCAM-1 son moléculas de adhesión vascular (moléculas de adhesión expresadas por las células endoteliales que tapizan los vasos) y se sabe que se incrementan en las células endoteliales en respuesta a la estimulación proinflamatoria in vitro e in vivo. Estas moléculas de adhesión mantienen la adhesión de los leucocitos por medio de la interacción con las moléculas de integrina (ICAM-1 se une a las integrinas \beta2 LFA-1 y MAC-1) y VCAM-1 se une a las integrinas \alpha4 \alpha4\beta1 y \alpha4\beta7. El tratamiento de las células con ciertas quimiocinas (pero no todas las quimiocinas) puede provocar la modulación de las integrinas, lo que da como resultado una unión mucho mejor de las células a estos ligandos vasculares. CTACK puede provocar esta modulación: el tratamiento de células T o de una línea de células T que expresa GPR2 provoca un incremento rápido (2 minutos) en la capacidad de unión. Esto indica que CTACK podría ser responsable de la adhesión de las células T CLA+ a las células endoteliales de la piel.

CTACK también puede intervenir en la migración transendotelial de las células T CLA+ a través de las monocapas endoteliales estimuladas. En estos experimentos, las células endoteliales se cultivan en cámaras Transwell, estimuladas con, por ejemplo, factor de necrosis tumoral \alpha (TNF\alpha), CTACK se coloca en el pocillo inferior y las células T memoria se colocan en la cámara superior. CTACK provoca que las células T CLA+ (pero no otras células T memoria, que incluyen las células T \beta7) migren a través de la monocapa hacia la cámara inferior. Esto indica que CTACK puede intervenir en el reclutamiento de células T hacia sitios cutáneos inflamatorios induciendo la migración de las células T CLA+ a través de las células endoteliales que tapizan los vasos sanguíneos.

Esto sugiere la utilidad de estas quimiocinas o antagonistas en el tratamiento de trastornos o enfermedades médicas asociadas a trastornos inmunológicos de la piel. Véase, p. ej., Bos (ed. 1990) Skin Immune System CRC Press, Boca Raton, FLA; Fitzpatrick, et al. (eds. 1993) Dermatology in General Medicine (4ª ed.) McGraw-Hill, NY; Rook, et al. (eds. 1998) Textbook of Dermatology Blackwell; Habifor y Habie (1995) Clinical Dermatology: A Color Guide to Diagnosis and Therapy Mosby; Grob (ed. 1997) Epidemiology, Causes and Prevention of Skin Diseases Blackwell; Frank, et al. (eds. 1995) Samter's Immunologic Diseases, 5ª ed., vols. I-II, Little, Brown and Co., Boston, MA; Coffman, et al (1989) Science 245:308-310; y Frick, et al. (1988) J. Allergy Clin. Immunol. 82:199-225. Los agonistas o antagonistas descritos se pueden combinar con otros tratamientos de los trastornos médicos descritos aquí, p. ej., un antibiótico, agente terapéutico inmunosupresor, agente inmunoadyuvante, analgésico, fármaco antiinflamatorio, factor de crecimiento, citocina, vasodilatador o vasoconstrictor.

Los "derivados" de los antígenos de quimiocina incluyen mutantes de la secuencia de aminoácidos, variantes de glicosilación, y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes se pueden preparar mediante unión de funciones a grupos que se hallan en las cadenas laterales de los aminoácidos de la quimiocina o en los extremos N- o C-terminales, mediante medios que se conocen en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticas del extremo carboxilo, o de los residuos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados O-acilo de los residuos que contienen grupos hidroxilo, y derivados N-acilo del aminoácido aminoterminal o de los residuos que contienen grupos amino, p. ej. lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo que incluyen alquilo normal C3 a C18, por lo que forman especies alcanoil-aroilo. La unión covalente a proteínas portadoras puede ser importante cuando los restos inmunógenos son haptenos.

En particular, están incluidas las alteraciones de la glicosilación, p. ej., realizadas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas de procesamiento adicionales. Los medios particularmente preferidos para realizar esto son mediante exposición del polipéptido a enzimas de glicosilación derivadas de células que normalmente proporcionan tal procesamiento, p. ej., enzimas de glicosilación de mamífero. También se contemplan las enzimas de desglicosilación. También están incluidas las versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos que tienen otras modificaciones menores, que incluyen residuos de aminoácidos fosforilados, p. ej., fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina, o derivados de nucleósidos o nucleótidos, p. ej., guanilo derivado.

Un grupo importante de derivados son los conjugados covalentes de la respectiva quimiocina o receptor o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados se pueden sintetizar en cultivo recombinante como fusiones N- o C-terminales o mediante el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad para entrecruzar proteínas a través de grupos laterales reactivos. Los sitios de derivatización de quimiocinas preferidos con agentes de entrecruzamiento están en los grupos amino libres, restos de carbohidratos y residuos de cisteína.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre estas quimiocinas o receptores y otras proteínas homólogas o heterólogas, p. ej. otras quimiocinas o receptores. Muchos factores de crecimiento y citocinas son entidades homodiméricas, y una construcción repetitiva puede tener diversas ventajas, que incluyen susceptibilidad disminuida a la escisión proteolítica. Además, muchos receptores de citocina requieren la dimerización para transducir una señal, y pueden ser deseables diversos ligandos diméricos o repeticiones de dominios. Los polipéptidos homólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores de superficie, lo que da como resultado, p. ej., una proteína híbrida que exhibe especificidad de unión al receptor. De forma similar, se pueden construir fusiones heterólogas que exhibirían una combinación de propiedades o actividades de las proteínas de las que derivan. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, p. ej., luciferasa, con un segmento o dominio de un ligando, p. ej., un segmento de unión a receptor, de forma que la presencia o localización del ligando fusionado, o una composición de unión, se puede determinar fácilmente. Véase, p. ej., Dull, et al., patente de EE.UU. nº 4.859.609. Otras moléculas de fusión génica incluyen \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, \beta-lactamasa, \alpha-amilasa, alcohol deshidrogenasa, una proteína de fusión FLAG, y factor de apareamiento \alpha de levaduras. Véase, p. ej., Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.

El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Un fragmento bicatenario se obtendrá a menudo sintetizando la cadena complementaria y fusionando las cadenas en condiciones apropiadas, o añadiendo la cadena complementaria mediante el uso de la ADN polimerasa con una secuencia cebadora adecuada.

Tales polipéptidos pueden tener también residuos de aminoácidos que se han modificado químicamente mediante fosforilación, guanilación, sulfonación, biotinilización o la adición o eliminación de otros restos, en particular aquellos que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato o guanilo. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos marcadores útiles, o servirán como objetivos de purificación, p. ej., indicadores de afinidad como FLAG.

Las proteínas de fusión se producirán típicamente mediante métodos de ácidos nucleicos recombinantes o mediante métodos de polipéptidos sintéticos. Las técnicas para la manipulación y expresión de ácidos nucleicos se describen en general, por ejemplo, en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory. Las técnicas para la síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232:341-347; y Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y ligadura química, p. ej., Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779, un método de unión de péptidos sintéticos largos mediante un enlace peptídico.

Esta invención también contempla el uso de derivados de estas quimiocinas o receptores, distintos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o en la glicosilación. Tales derivados pueden implicar la asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos derivados incluyen en general: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de la cadena lateral y del residuo terminal, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con membranas celulares. Tales derivados covalentes o de agregación son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación tales como la purificación mediante afinidad de ligandos o de otros ligandos de unión. Por ejemplo, un antígeno de quimiocina se puede inmovilizar mediante enlace covalente a un soporte sólido tal como sefarosa activada con bromuro de cianógeno, mediante métodos que se conocen en la técnica, o se puede adsorber en superficies de poliolefina, con o sin entrecruzamiento con glutaraldehído, para el uso en el análisis o en la purificación de anticuerpos anti-quimiocina o de su receptor. Estas quimiocinas se pueden marcar además con un grupo detectable, por ejemplo se pueden radioyodar mediante el procedimiento de cloramina T, unir covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugar a un resto fluorescente para el uso en ensayos diagnósticos. La purificación de la quimiocina, el receptor o las composiciones de unión se puede efectuar mediante anticuerpos o receptores inmovilizados.

Se pueden introducir otras modificaciones con el objetivo de modificar la farmacocinética o la farmacodinámica terapéutica de una quimiocina de interés. Por ejemplo, ciertos medios para minimizar el tamaño de la entidad pueden mejorar su farmacoaccesibilidad; otros medios para maximizar el tamaño pueden afectar a la farmacodinámica. De forma similar, se pueden modificar los cambios en la cinética o el equilibrio de unión del ligando de un receptor.

Se puede usar una quimiocina o receptor solubilizado o un fragmento apropiado de esta invención como inmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos para el ligando, receptor o sus fragmentos. Las proteínas purificadas se pueden usar para cribar anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión de quimiocina preparados mediante inmunización con diversas formas de preparaciones impuras que contienen la proteína. En particular, los equivalentes de anticuerpos incluyen fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos naturales, p. ej., Fv, Fab, o F(ab)_{2}.
También se pueden usar quimiocinas purificadas como reactivo para detectar anticuerpos generados en respuesta a la presencia de concentraciones elevadas de la proteína o de fragmentos celulares que contienen la proteína, y ambos pueden ser diagnósticos de un estado fisiológico anormal o específico, o enfermedad. Además, los fragmentos de proteína quimiocina, o sus concatenaciones, pueden servir también como inmunógenos para producir composiciones de unión, p. ej., los anticuerpos de la presente invención, como se describe inmediatamente a continuación. Por ejemplo, esta invención contempla anticuerpos generados contra ciertas secuencias de aminoácidos, p. ej., las ID SEC Nºs: 1-14, o las proteínas que las contienen. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de unión a, o que se generan contra, fragmentos específicos, p. ej., aquellos que se predice que se encuentran en las superficies exteriores de la estructura terciaria de la proteína. Se aplican conceptos similares a los anticuerpos específicos para los receptores de la invención.

La presente invención contempla el aislamiento de variantes de especie estrechamente relacionadas adicionales. Los análisis de transferencia de Southern y Northern deberían establecer que existen entidades genéticas similares en otros mamíferos relacionados, y establecer la rigurosidad de las condiciones de hibridación para aislarlos. Es probable que estas quimiocinas y los receptores estén muy extendidos en las variantes de especie, p. ej., entre los roedores y los primates.

La invención también proporciona medios para aislar un grupo de quimiocinas o receptores relacionados que exhiben tanto peculiaridades como similitudes en la estructura, expresión y función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de las proteínas se acelerará enormemente mediante el aislamiento y la caracterización de las distintas variantes de especie de los ligandos. Los genes relacionados hallados, p. ej., en diversas bases de datos informáticas también serán útiles, en muchos casos, para fines similares con proteínas relacionadas estructuralmente. En particular, la presente invención proporciona sondas útiles o características de búsqueda para identificar entidades genéticas homólogas adicionales en diferentes especies.

Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una quimiocina o receptor correspondiente, p. ej., tipos o células de especies que carecen de los antígenos correspondientes y que exhiben una actividad de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permitirá el aislamiento de líneas celulares antigénicamente puras, con variantes de especie definidas o únicas. Esta aproximación permitirá la detección y discriminación más sensible de los efectos fisiológicos de las proteínas de quimiocina o de receptor. Se pueden aislar y usar fragmentos subcelulares, p. ej., citoplastos o fragmentos de membrana.

La disección de los elementos estructurales críticos que efectúan las diversas funciones de diferenciación proporcionadas por los ligandos es posible mediante el uso de técnicas estándar de la biología molecular moderna, en particular al comparar los miembros de la clase relacionada. Véase, p. ej., la técnica de mutagénesis de exploración de homólogos descrita en Cunningham, et al. (1989) Science 243:1339-1336; y las aproximaciones usadas en O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992; y Lechleiter et al. (1990) EMBO J. 9:4381-4390.

Además, se pueden sustituir diversos segmentos entre variantes de especie para determinar qué características estructurales son importantes tanto en la afinidad como en la especificidad de unión al receptor, así como en la transducción de la señal. Se usará cualquier colección de diferentes variantes de quimiocina o de receptor para cribar las variantes que exhiben propiedades combinadas de interacción con diferentes variantes de especie.

Las funciones intracelulares implicarían probablemente segmentos del receptor que son accesibles normalmente al citosol. Sin embargo, se puede producir en ciertas circunstancias la interiorización del ligando, y se puede producir la interacción entre los componentes intracelulares y los segmentos "extracelulares". Los segmentos específicos de interacción de una quimiocina particular con otros componentes intracelulares se puede identificar mediante mutagénesis o medios bioquímicos directos, p. ej., métodos de entrecruzamiento o afinidad. El análisis estructural mediante métodos físicos cristalográficos o de otro tipo también será aplicable. La investigación adicional del mecanismo de transducción de la señal incluirá el estudio de los componentes asociados que pueden ser aislables mediante métodos de afinidad o mediante medios genéticos, p. ej. análisis de complementación de mutantes.

Se aplicará un estudio adicional de la expresión y el control de las diversas quimiocinas o receptores. Los elementos de control asociados a las proteínas pueden exhibir patrones de expresión diferenciales de desarrollo, específicos de tejido, o de otro tipo. Son de interés las regiones genéticas en dirección 5' o 3', p. ej. los elementos de control. El corte y empalme diferencial del mensaje puede conducir a formas asociadas a membrana, formas solubles y versiones modificadas del ligando.

Los estudios estructurales de las proteínas llevarán al diseño de ligandos o receptores nuevos, en particular análogos que exhiben propiedades agonistas o antagonistas sobre el receptor. Esto se puede combinar con los métodos de cribado previamente descritos para aislar los ligandos que exhiben los espectros deseados de actividades.

La expresión en otros tipos celulares a menudo dará como resultado diferencias de glicosilación en una quimiocina o receptor particular. Las diversas variantes de especie pueden exhibir funciones distintas basadas en diferencias estructurales distintas de la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones diferenciales pueden ser responsables de la función diferencial, y la elucidación de los efectos se hace ahora posible.

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Así, la presente invención proporciona reactivos importantes relacionados con una interacción fisiológica ligando-receptor. Aunque la descripción anterior se ha centrado principalmente en las realizaciones de ratón y humano de las quimiocinas o receptores específicamente descritas, los expertos en la técnica reconocerán inmediatamente que la invención proporciona otros homólogos, p. ej., de especies relacionadas, roedores o primates.

V. Anticuerpos

Se pueden generar anticuerpos para estas quimiocinas o receptores, que incluyen las variantes de especie o polimórficas, y sus fragmentos, tanto en sus formas naturales como en sus formas recombinantes. Además, se pueden generar anticuerpos para quimiocinas o receptores en sus formas activas o inactivas, o en sus formas nativas o desnaturalizadas. También se contemplan los anticuerpos anti-idiotipo.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos para los expertos en la técnica. Típicamente, se mezcla un inmunógeno, preferiblemente una proteína purificada, con un adyuvante, y los animales se inmunizan con la mezcla. La respuesta inmunitaria de los animales a la preparación de inmunógeno se monitoriza tomando muestras de sangre y determinando el título de la reactividad hacia la proteína CTACK o hacia el péptido de interés. Por ejemplo, cuando se obtienen títulos elevados apropiados de anticuerpo para el inmunógeno, normalmente después de inmunizaciones repetidas, se recoge la sangre del animal y se preparan los antisueros. Se puede realizar el fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer los anticuerpos reactivos contra la proteína, si se desea. Véase, p. ej., Harlow y Lane Antibodies, A Laboratory Manual; o Coligan (ed.) Current Protocols in Immunology. La inmunización se puede llevar a cabo también a través de otros métodos, p. ej., inmunización con vector de ADN. Véase, p. ej., Wang, et al. (1997) Virology 228:278-284.

Se pueden obtener anticuerpos monoclonales mediante diversas técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Típicamente, se inmortalizan células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, normalmente mediante fusión con una célula de mieloma. Véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Doyle, et al. (eds. 1994 y suplementos periódicos) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Las colonias que se generan de células únicas inmortalizadas se criban en función de la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células se puede aumentar mediante diversas técnicas, que incluyen la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. De forma alternativa, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión suyo cribando una biblioteca de ADN de células B humanas según, p. ej., el protocolo general resumido por Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281.

Se pueden generar anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión y versiones de cadena simple, contra fragmentos predeterminados de los ligandos mediante inmunización de animales con concatémeros o conjugados de los fragmentos con proteínas inmunógenas. Los anticuerpos monoclonales se preparan de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos se pueden cribar en función de la unión a quimiocinas o receptores normales o incompletos, o se pueden cribar en función de la actividad agonista o antagonista. Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con al menos una K_{D} de alrededor de 1 mM, más normalmente al menos alrededor de 300 \muM, típicamente al menos alrededor de 10 \muM, más típicamente al menos alrededor de 30 \muM, preferiblemente al menos alrededor de 10 \muM, y más preferiblemente al menos alrededor de 3 \muM o mejor.

Los anticuerpos de esta invención, que incluyen fragmentos de unión a antígeno, pueden tener un valor preparativo, diagnóstico o terapéutico significativo. Pueden ser útiles para purificar o marcar el antígeno deseado en una muestra, o pueden ser antagonistas potentes que se unen al ligando e inhiben la unión al receptor o inhiben la capacidad de un ligando de provocar una respuesta biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y se pueden unir a, o como proteínas de fusión con, toxinas o radionucleidos de forma que cuando el anticuerpo se une al antígeno, la célula que lo expresa, p. ej. en su superficie por medio del receptor, se destruye. Además, estos anticuerpos se pueden conjugar con fármacos u otros agentes terapéuticos, directa o indirectamente por medio de una molécula espaciadora, y pueden realizar el guiado del fármaco. Los anticuerpos para los receptores se pueden usar más fácilmente para bloquear la unión del ligando y/o la transducción de la señal.

Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles en aplicaciones diagnósticas o de purificación de reactivos. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, se pueden cribar en función de la capacidad de unirse a las quimiocinas o receptores sin inhibir la unión ligando-receptor. Como anticuerpos neutralizantes, pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También serán útiles en la detección o cuantificación de quimiocinas o receptores, p. ej. en inmunoanálisis. Se pueden usar como reactivos de purificación en columnas de inmunoafinidad o como reactivos de inmunohistoquímica.

Los fragmentos de ligando o receptor se pueden concatenar o unir a otros materiales, en particular polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente, para usarlos como inmunógenos. Los péptidos cortos se producirán preferiblemente como estructuras repetitivas para incrementar el tamaño. Un ligando y sus fragmentos se pueden fusionar o unir covalentemente a una diversidad de inmunógenos, tales como hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero bovino, toxoide tetánico, etc. Véase Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, Nueva York, y Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, vol. 1, Academic Press, Nueva York, para las descripciones de los métodos de preparación de antisueros policlonales. Un método típico implica la hiperinmunización de un animal con un antígeno. La sangre del animal se recoge poco después de las inmunizaciones repetidas y se aísla la fracción de \gamma-globulinas.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se puede encontrar, p. ej., en Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas ahí; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que discute un método para generar anticuerpos monoclonales. Brevemente resumido, este método implica inyectar un inmunógeno a un animal. El animal se sacrifica después y se toman las células, p. ej., de su bazo, que después se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se criba después para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una especie única de anticuerpo para el inmunógeno. De esta manera, las especies individuales de anticuerpos obtenidos son los productos de las células B únicas inmortalizadas y clonadas procedentes del animal inmunizado, generadas en respuesta a un sitio específico reconocido en la sustancia inmunógena. Se pueden derivar grandes cantidades de anticuerpo del líquido ascítico de un animal.

Otras técnicas adecuadas implican la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o, de forma alternativa, la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246:1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación, e incluyen los anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y los anticuerpos se marcarán uniendo, de forma covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una gran variedad de marcadores y técnicas de conjugación, y se informan exhaustivamente tanto en la bibliografía científica como en la de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las patentes de EE.UU. nºs 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Además, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly, patente de EE.UU. nº 4.816.567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 86:10029-10033; o se pueden producir en ratones transgénicos, véase Méndez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156.

Los anticuerpos de esta invención se pueden usar también para cromatografía de afinidad en el aislamiento de la proteína. Se pueden preparar columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido, p. ej. partículas, tales como agarosa, Sephadex, o similares, en las que se puede hacer pasar un lisado celular a través de la columna, la columna se lava, seguido de concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, por lo que se liberará la proteína de quimiocina purificada.

Los anticuerpos se pueden usar también para cribar bibliotecas de expresión en función de productos de expresión particulares. Normalmente los anticuerpos usados en tal procedimiento estarán marcados con un resto que permite la detección sencilla de la presencia del antígeno mediante unión al anticuerpo.

Los anticuerpos generados contra estas quimiocinas o receptores serán también útiles para generar anticuerpos anti-idiotipo. Estos serán útiles en la detección o el diagnóstico de diversos trastornos inmunológicos relacionados con la expresión de los antígenos respectivos.

Los anticuerpos son simplemente una forma de composiciones de unión específica. Otras composiciones de unión, que a menudo tendrán usos similares, incluyen moléculas que se unen con especificidad al receptor de CTACK o Vic, p. ej., de una manera molécula de unión-molécula de unión, una interacción anticuerpo-antígeno, o en una interacción natural proteína-proteína fisiológicamente relevante, covalente o no covalente, p. ej. proteínas que se asocian específicamente con la proteína receptora de CTACK o Vic. La molécula puede ser un polímero o reactivo químico. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula estructuralmente no relacionada, p. ej. que tiene una forma molecular que interacciona con los determinantes de unión apropiados. Así, la identificación de GPR2 como el receptor de CTACK y Vic proporciona medios para producir tal composición de unión.

Se puede realizar el cribado de fármacos mediante el uso de anticuerpos, CTACK, Vic o sus fragmentos para identificar compuestos que tienen afinidad de unión a CTACK, Vic o GPR2, o que pueden bloquear o estimular la interacción natural con el ligando. Se pueden utilizar ensayos biológicos posteriores para determinar si el compuesto tiene actividad intrínseca de bloqueo y es por tanto un antagonista. De forma similar, un compuesto que tiene actividad estimuladora intrínseca puede actuar como señal para las células, p. ej. por medio de la ruta de CTACK, y así es un agonista, ya que estimula la actividad de un ligando. Se pueden desarrollar antagonistas de muteína que mantienen la unión al receptor pero que carecen de la capacidad de señalización.

Los estudios estructurales de los ligandos conducirán al diseño de nuevas variantes, en particular análogos que exhiben propiedades agonistas o antagonistas sobre el receptor. Esto se puede combinar con los métodos de cribado descritos previamente para aislar muteínas que exhiben los espectros deseados de actividades.

De la misma forma que se describen moléculas de unión específicas de receptor, también se describen moléculas pequeñas identificadas mediante procedimientos de cribado. En particular, se conoce en la técnica cómo cribar moléculas pequeñas que interfieren, p. ej., con la unión del ligando al receptor, a menudo mediante unión específica al receptor y bloqueo de la unión del ligando natural. Véase, p. ej., las sesiones sobre Cribado de Elevado Rendimiento, International Business Communications, Southborough, MA 01772-1749. Tales moléculas pueden competir con los ligandos naturales, y unirse de forma selectiva a CTACK, Vic o GPR2.

VI. Ácidos nucleicos

Las secuencias peptídicas descritas y los reactivos relacionados son útiles en el aislamiento de un clon de ADN que codifica estas quimiocinas o receptores, p. ej., de una fuente natural. Típicamente, serán útiles en el aislamiento de un gen de otro individuo, y se aplicarán procedimientos similares para aislar genes de especies relacionadas, p. ej., roedores o primates. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento del ligando de otra especie estrechamente relacionada. Debería haber disponibles varias aproximaciones diferentes para aislar con éxito un clon de ácido nucleico adecuado. Se aplican conceptos similares para las realizaciones del receptor.

La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos estándar, como se describió anteriormente. Los péptidos sintéticos o la proteína purificada se pueden presentar a un sistema inmunitario para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Véase, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. De forma alternativa, se puede usar una quimiocina o receptor como reactivo de unión específica, y se puede aprovechar la ventaja de su especificidad de unión, de forma muy similar a como se usaría un anticuerpo. Los receptores de quimiocina son típicamente proteínas transmembrana 7, que podrían ser sensibles a la interacción apropiada con lípidos o con membranas. La transducción de la señal está mediada típicamente a través de una proteína G, a través de la interacción con un receptor acoplado a proteína G.

Por ejemplo, la composición de unión específica se podría usar para el cribado de una biblioteca de expresión producida a partir de una línea celular que expresa una quimiocina particular. El cribado puede ser la tinción estándar del ligando expresado en la superficie, o mediante fijación. El cribado de la expresión intracelular también se puede realizar mediante diversos procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Las composiciones de unión se podrían usar para purificar mediante afinidad o separar las células que expresan el ligando.

Los segmentos peptídicos también se pueden usar para predecir los oligonucleótidos apropiados para cribar una biblioteca, p. ej., para aislar variantes de especie. El código genético se puede usar para seleccionar los oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para el cribado. Véase, p. ej., las ID SEC Nºs. 1-14. En combinación con las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles en la selección de los clones correctos de una biblioteca. Se usarán también secuencias complementarias como sondas o cebadores. Pueden ser útiles las técnicas de vectores anclados o PCR complementaria de poli-A o ADN complementario de otros péptidos.

Esta invención contempla el uso de ADN aislado o fragmentos para codificar un polipéptido de quimiocina correspondiente biológicamente activo. Además, esta invención cubre el ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo que es capaz de hibridar en condiciones apropiadas con las secuencias de ADN descritas aquí. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo puede ser un ligando, receptor o fragmento intacto, y tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en las ID SEC Nºs: 1-14. Además, esta invención cubre el uso de ADN aislado o recombinante, o de sus fragmentos, que codifican proteínas que son homólogas para una quimiocina o receptor o que se aisló mediante el uso de un cADN que codifica una quimiocina o receptor como sonda. El ADN aislado puede tener las secuencias reguladoras respectivas en los lados 5' y 3', p. ej., promotores, potenciadores, señales de adición de poli-A, y otros.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, p. ej. un ARN, ADN, o un polímero mixto, que está separado sustancialmente de otros componentes que acompañan de forma natural a la secuencia nativa, p. ej., ribosomas, polimerasas, y secuencias genómicas flanqueantes de la especie originaria. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha extraído de su medio natural, e incluye aislamientos de ADN recombinante o clonado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula.

Un ácido nucleico aislado será en general una composición homogénea de moléculas, pero contendrá, en algunas realizaciones, una heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad se halla típicamente en los extremos o porciones del polímero que no son críticas para la función o actividad biológica deseada.

Un ácido nucleico "recombinante" está definido por su método de producción o por su estructura. En referencia a su método de producción, p. ej., un producto hecho mediante un procedimiento, el procedimiento es el uso de técnicas de ácidos nucleicos recombinantes, p. ej. que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente la selección o producción. De forma alternativa, puede ser un ácido nucleico producido generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son contiguos de forma natural entre sí, pero pretende excluir los productos de la naturaleza, p. ej., las formas purificadas naturales. Así, por ejemplo, se incluyen los productos hechos transformando células con cualquier vector que no se da de forma natural, como son los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada mediante el uso de un procedimiento sintético de oligonucleótidos. Ello se realiza a menudo para sustituir un codon con un codon redundante que codifica el mismo aminoácido o uno conservativo, mientras típicamente se introduce o elimina un sitio de reconocimiento de secuencia. De forma alternativa, se realiza para unir segmentos de ácidos nucleicos de funciones deseadas para generar una entidad genética única que comprende una combinación deseada de funciones que no se hallan en las formas naturales normalmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son a menudo el objetivo de tales manipulaciones artificiales, pero se pueden incorporar a propósito otros objetivos específicos, p. ej., promotores, sitios de replicación del ADN, secuencias de regulación, secuencias de control, u otras características útiles. Se aplica un concepto similar para un polipéptido recombinante, p. ej., de fusión. Se incluyen específicamente los ácidos nucleicos sintéticos que, mediante redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de diferentes variantes de especie.

Un "fragmento" significativo en el contexto de un ácido nucleico es un segmento contiguo de al menos alrededor de 17 nucleótidos, generalmente al menos alrededor de 20 nucleótidos, más generalmente al menos alrededor de 23 nucleótidos, comúnmente al menos alrededor de 26 nucleótidos, más comúnmente al menos alrededor de 29 nucleótidos, a menudo al menos alrededor de 32 nucleótidos, más a menudo al menos alrededor de 35 nucleótidos, típicamente al menos alrededor de 38 nucleótidos, más típicamente al menos alrededor de 41 nucleótidos, normalmente al menos alrededor de 44 nucleótidos, más normalmente al menos alrededor de 47 nucleótidos, preferiblemente al menos alrededor de 50 nucleótidos, más preferiblemente al menos alrededor de 53 nucleótidos, y en las realizaciones particularmente preferidas será de al menos alrededor de 56 o más nucleótidos, p. ej., 60, 65, 75, 85, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 400, etc. Tales fragmentos pueden tener extremos que comienzan y/o terminan en virtualmente todas las posiciones, p. ej., que comienzan en los nucleótidos 1, 2, 3, etc., y que terminan, p. ej., en 300, 299, 298, 287, etc., en pares combinatorios. Los polinucleótidos particularmente interesantes tienen extremos que corresponden a los límites de los dominios estructurales.

Un ADN que codifica una proteína de quimiocina o receptor particular será muy útil para identificar genes, ARNm, y especies de cADN que codifican ligandos o receptores relacionados u homólogos, así como ADNs que codifican proteínas homólogas de diferentes especies. Existen probablemente homólogos en especies estrechamente relacionadas, p. ej. roedores o primates. Las diversas proteínas de quimiocina deberían ser homólogas y se incluyen aquí, como debería ser para los receptores. Sin embargo, las proteínas se pueden aislar fácilmente en condiciones apropiadas mediante el uso de estas secuencias si son suficientemente homólogas. Típicamente, son de interés particular las quimiocinas o receptores de primate.

También se describen moléculas y fragmentos de ADN recombinantes que tienen una secuencia de ADN idéntica o sumamente homóloga a la de los ADNs aislados expuestos aquí. En particular, las secuencias estarán unidas de forma operable a segmentos de ADN que controlan la transcripción, traducción y replicación del ADN. De forma alternativa, serán útiles los clones recombinantes derivados de secuencias genómicas, p. ej., que contienen intrones, para los estudios transgénicos, que incluyen, p. ej., células y organismos transgénicos, y para terapia génica. Véase, p. ej., Goodnow (1992) "Transgenic Animals" en Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, págs 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; y Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199.

Las secuencias homólogas de ácidos nucleicos, cuando se comparan, exhiben similitud significativa, o identidad. Los patrones de homología en ácidos nucleicos son medidas de homología usadas en general en la técnica mediante la comparación de secuencias o basadas en las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con más detalle más adelante.

La homología sustancial en el contexto de la comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que al comparar los segmentos, o sus cadenas complementarias, son idénticos cuando se alinean de forma óptima, con inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos, en al menos alrededor del 50% de los nucleótidos, generalmente al menos alrededor del 56%, más generalmente al menos alrededor del 59%, habitualmente al menos alrededor del 62%, más habitualmente al menos alrededor del 65%, a menudo al menos alrededor del 68%, más a menudo al menos alrededor del 71%, típicamente al menos alrededor del 74%, más típicamente al menos alrededor del 77%, normalmente al menos alrededor del 80%, más normalmente al menos alrededor del 85%, preferiblemente al menos alrededor del 90%, más preferiblemente al menos alrededor del 95 al 98% o más, y en las realizaciones particulares, hasta alrededor del 99% o más de los nucleótidos. De forma alternativa, existe homología sustancial cuando los segmentos hibriden en condiciones de hibridación selectivas con una cadena, o su complemento, típicamente usando una secuencia derivada de las ID SEC Nºs: 1-14. Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando hay al menos alrededor del 55% de homología a lo largo de un tramo de al menos alrededor de 30 nucleótidos, preferiblemente al menos alrededor del 65% a lo largo de un tramo de al menos alrededor de 25 nucleótidos, más preferiblemente al menos alrededor del 75%, y lo más preferiblemente al menos alrededor del 90% a lo largo de alrededor de 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de la homología, como se describe, puede ser a lo largo de tramos más largos, y en ciertas realizaciones será a lo largo de un tramo de al menos alrededor de 17 nucleótidos, habitualmente al menos alrededor de 20 nucleótidos, más habitualmente al menos alrededor de 24 nucleótidos, típicamente al menos alrededor de 28 nucleótidos, más típicamente al menos alrededor de 40 nucleótidos, preferiblemente al menos alrededor de 50 nucleótidos, y más preferiblemente al menos alrededor de 75 a 100 o más nucleótidos. Los cebadores
de PCR tendrán en general niveles elevados de coincidencia a lo largo de longitudes potencialmente más cortas.

Las condiciones restrictivas, en lo que se refiere a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones combinadas restrictivas de salinidad, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, típicamente aquellos controlados en las reacciones de hibridación. Las condiciones restrictivas de temperatura incluirán habitualmente temperaturas superiores a alrededor de 30ºC, más habitualmente superiores a alrededor de 37ºC, típicamente superiores a alrededor de 45ºC, más típicamente superiores a alrededor de 55ºC, preferiblemente superiores a alrededor de 65ºC, y más preferiblemente superiores a alrededor de 70ºC. Las condiciones restrictivas de salinidad serán habitualmente menores de alrededor de 1000 mM, normalmente menores de alrededor de 500 mM, más normalmente menores de alrededor de 400 mM, típicamente menores de alrededor de 300 mM, preferiblemente menores de alrededor de 200 mM, y más preferiblemente menores de alrededor de 150 mM, p. ej., 20-50 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro independiente. Véase, p. ej., Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370.

Las quimiocinas o receptores correspondientes de otra especie estrechamente relacionada se pueden clonar y aislar mediante hibridación interespecie. De forma alternativa, se puede reconocer que las secuencias de una base de datos de secuencias poseen similitud. La homología puede ser muy baja entre especies lejanamente relacionadas, y así es conveniente la hibridación de especies estrechamente relacionadas. De forma alternativa, puede ser útil la preparación de una preparación de anticuerpo que exhibe menos especificidad de especie en las aproximaciones de clonado de expresión. También se usarán las aproximaciones de PCR mediante el uso de segmentos de secuencias conservadas.

VII. Producción de quimiocinas o receptores; moléculas miméticas

El ADN que codifica la quimiocina, el receptor o sus fragmentos respectivos se puede obtener mediante síntesis química, cribado de bibliotecas de cADN, o cribando bibliotecas genómicas preparadas a partir de una amplia diversidad de líneas celulares o muestras de tejido.

Este ADN se puede expresar en una amplia diversidad de células hospedadoras para la síntesis de un ligando de longitud completa o de fragmentos que se pueden usar a su vez, por ejemplo, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; para el clonado de expresión o purificación; y para estudios de estructura/función. Cada antígeno o sus fragmentos se pueden expresar en células hospedadoras que se transforman o se transfectan con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas se pueden purificar sustancialmente para que estén exentas de contaminantes proteicos o celulares, distintos de los derivados del hospedador recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en las composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los antígenos o anticuerpos, o sus porciones, se pueden expresar como fusiones con otras proteínas.

Los vectores de expresión son típicamente construcciones de ADN o ARN de replicación autónoma que contienen el gen del antígeno deseado o sus fragmentos, habitualmente unido de forma operable a elementos de control genético adecuados que son reconocidos en una célula hospedadora adecuada. Estos elementos de control son capaces de efectuar la expresión dentro de un hospedador adecuado. El tipo específico de elementos de control necesarios para efectuar la expresión dependerá de la célula hospedadora utilizada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariota o un sistema de control de la expresión de promotor eucariota, e incluye típicamente un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de expresión del ARNm, una secuencia que codifica un sitio adecuado de unión al ribosoma, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión también contienen habitual-
mente un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula hospedadora.

Los vectores de esta invención contienen ADN que codifica realizaciones de una quimiocina, receptor, o un fragmento suyo, que codifican típicamente un polipéptido biológicamente activo. El ADN puede estar bajo control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla además el uso de los vectores de expresión que son capaces de expresar cADN eucariota que codifica cada quimiocina o receptor en un hospedador procariota o eucariota, en el que el vector es compatible con el hospedador y en el que el cADN eucariota que codifica la proteína se inserta en el vector de forma que el cultivo del hospedador que contiene el vector expresa el cADN en cuestión. Normalmente, los vectores de expresión se diseñan para la replicación estable en sus células hospedadoras o para la amplificación para incrementar enormemente el número total de copias del gen deseado por célula. No siempre es necesario que un vector de expresión se replique en una célula hospedadora, p. ej., es posible efectuar la expresión transitoria del ligando o de sus fragmentos en diversos hospedadores mediante el uso de vectores que no contienen un origen de replicación que es reconocido por la célula hospedadora. También es posible usar vectores que provocan la integración de un gen de quimiocina o de receptor o de sus fragmentos en el ADN hospedador mediante recombinación, o integrar un promotor que controla la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, como se usan aquí, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos, que incluyen aquellos que permiten la integración de los fragmentos de ADN en el genoma del hospedador. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de los genes unidos de forma operable. Los plásmidos son la forma de vector más habitualmente usada, pero son adecuadas para el uso aquí muchas otras formas de vectores que proporcionan una función equivalente y que son, o pasan a ser, conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Pouwels, et al. (1985 y suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., y Rodríguez, et al. (1988) (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.

Las células transformadas incluyen células, preferiblemente de mamíferos, que se han transformado o transfectado con un vector de contiene un gen de quimiocina o de receptor construido mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. Las células hospedadoras transformadas habitualmente expresan el ligando, receptor o sus fragmentos, pero para los fines de clonado, amplificación y manipulación de su ADN, no necesitan expresar la proteína. Esta invención contempla además cultivar las células transformadas en un medio nutriente, por lo que se permite que la proteína se acumule en el cultivo. La proteína se puede recuperar del cultivo o del medio de cultivo, o de las membranas celulares.

Para el propósito de esta invención, las secuencias de ADN se unen de forma operable cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o señal de secreción se une de forma operable a un polipéptido si se expresa como una preproteína o participa en dirigir al polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor se une de forma operable a una secuencia codificante si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión al ribosoma se une de forma operable a una secuencia codificante si se posiciona para permitir la traducción. Normalmente, unido de forma operable significa contiguo y en el marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como los genes represores no se unen de forma contigua, pero aún así se unen a las secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen tanto organismos gram negativos como organismos gram positivos, p. ej. E. coli y B. subtilis. Los eucariotas inferiores incluyen levaduras, p. ej., S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas de cultivo de tejidos de células animales, tanto de origen no mamífero, p. ej. células de insecto y pájaros, como de origen mamífero, p. ej. humanos, primates y roedores.

Los sistemas hospedador procariota-vector incluyen una amplia diversidad de vectores para muchas especies diferentes. Como se usa aquí, E. coli y sus vectores se usarán de forma genérica para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que se pueden usar para expresar estas quimiocinas o sus fragmentos incluyen, pero no se limitan a, vectores tales como los que contienen el promotor lac (serie pUC); promotor trp (pBR322-trp); promotor Ipp (la serie pIN); promotores \lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, capítulo 10, págs. 205-236.

Los eucariotas inferiores, p. ej., levaduras y Dictyostelium, se pueden transformar con ácidos nucleicos que contienen una secuencia de quimiocina o de receptor. Para el propósito de esta invención, el hospedador eucariota inferior más habitual es la levadura de cerveza, Saccharomyces cerevisiae. Se usará para representar de forma genérica los eucariotas inferiores, aunque también hay disponibles otras cepas y especies. Los vectores de levadura consisten típicamente en un origen de replicación (a menos que sean del tipo de integración), un gen de selección, un promotor, el ADN que codifica la proteína deseada o sus fragmentos, y secuencias para la terminación de la traducción, la poliadenilación, y la terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levadura incluyen promotores constitutivos tales como los promotores génicos de la 3-fosfoglicerato quinasa y otras diversas enzimas glicolíticas o promotores inducibles tales como el promotor de alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen los derivados de los siguientes tipos: replicación autónoma de bajo número de copias (tal como la serie YRp), replicación autónoma de elevado número de copias (tal como la serie YEp); tipos de integración (tal como la serie YIp), o minicromosomas (tal como la serie YCp).

Las células de cultivo tisular de eucariotas superiores son las células hospedadoras preferidas para la expresión de las proteínas de quimiocina o de receptor funcionalmente activas. En principio, la mayoría de las líneas celulares de cultivo tisular de eucariotas superiores son factibles, p. ej., sistemas de expresión con baculovirus de insectos, ya sean de origen invertebrado o vertebrado. Sin embargo, se prefieren las células mamíferas, ya que el procesamiento, tanto de forma cotraduccional como de forma postraduccional, será típicamente más parecido al natural. La transformación o la transfección y la propagación de tales células se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen células HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñón de rata recién nacida (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares aviares, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para tales líneas celulares incluyen normalmente un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la traducción, sitios de corte y empalme del ARN (si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también contienen normalmente un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que portan promotores derivados, p. ej., de orígenes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus vaccinia, o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMC1neo Poly-A, véase Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610.

A menudo se deseará expresar un polipéptido de quimiocina o de receptor en un sistema que proporciona un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón habitual será el proporcionado de forma natural por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo al polipéptido, p. ej., una forma sin glicosilar, a proteínas apropiadas de glicosilación introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, un gen de quimiocina o de receptor se puede cotransformar con uno o más genes que codifican enzimas de glicosilación de mamífero o de otro origen. Mediante el uso de esta aproximación, se podrán conseguir o será posible aproximarse a ciertos patrones de glicosilación de mamíferos en células procariotas o de otro origen.

Una quimiocina, receptor, o un fragmento suyo se puede modificar para estar unido mediante fosfatidil inositol (PI) a una membrana celular, pero se puede separar de las membranas mediante tratamiento con una enzima que escinde fosfatidil inositol, p. ej., fosfatidil inositol fosfolipasa-C. Esta libera el antígeno en una forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos estándar de química de proteínas. Véase, p. ej., Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988:427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283.

Una vez que se han caracterizado estas quimiocinas y receptores, se pueden preparar fragmentos o derivados suyos mediante procedimientos convencionales de síntesis de péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los descritos en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York; y Bodanszky (1984) The Principes of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Nueva York. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento con azida, un procedimiento con ácido clorhídrico, un procedimiento con anhídrido de ácido, un procedimiento con anhídrido mixto, un procedimiento con éster activo (por ejemplo, éster de p-nitrofenilo, éster de N-hidroxisuccinimida, o éster de cianometilo), un procedimiento con carbodiimidazol, un procedimiento de oxidación-reducción, o un procedimiento aditivo con diciclohexilcarbodiimida (DCCD). Las síntesis en fase sólida y en fase de disolución son aplicables a los procedimientos anteriormente mencionados.

Estas quimiocinas, receptores, fragmentos o derivados se preparan de forma adecuada de acuerdo con los procedimientos anteriores tal como se emplean típicamente en la síntesis de péptidos, en general mediante un procedimiento por etapas que comprende condensar un aminoácido al aminoácido terminal, en orden uno por uno, o mediante la unión de fragmentos peptídicos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se van a usar en la reacción de unión típicamente se protegen para evitar la unión en una localización incorrecta.

Si se adopta una síntesis en fase sólida, el aminoácido C-terminal se une típicamente a un portador o soporte insoluble a través de su grupo carboxilo. El portador insoluble no está limitado particularmente, mientras tenga capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de tales portadores insolubles incluyen resinas de halometilo, tales como resina de clorometilo o resina de bromometilo, resinas de hidroximetilo, resinas de fenol, resinas de tert-alquiloxicarbonilo modificadas con hidrazida, y similares.

Se une un aminoácido con el grupo amino protegido en orden por medio de condensación de su grupo carboxilo activado y del grupo amino reactivo del péptido o cadena previamente formada para sintetizar el péptido por etapas. Después de sintetizar la secuencia completa, el péptido se separa del portador insoluble para producir el péptido. Esta aproximación en fase sólida fue descrita en términos generales, p. ej., por Merrifield, et al. (1963) en J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156.

El ligando preparado y sus fragmentos se pueden aislar y purificar de la mezcla de reacción por medio de separación de péptidos, p. ej., mediante extracción, precipitación, electroforesis y diversas formas de cromatografía y similares. Las diversas quimiocinas o receptores de esta invención se pueden obtener en grados variables de pureza dependiendo de su uso deseado. La purificación se puede realizar mediante el uso de las técnicas de purificación de proteínas descritas aquí o mediante el uso de los anticuerpos descritos aquí, p. ej., en cromatografía de afinidad por inmunoabsorción. Esta cromatografía de afinidad por inmunoabsorción se lleva a cabo típicamente, p. ej., uniendo primero los anticuerpos a un soporte sólido, y después poniendo en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de las células originarias apropiadas, lisados de otras células que expresan el ligando o receptor, o lisados o sobrenadantes de células que producen las proteínas deseadas como resultado de las técnicas de ADN, véase más adelante.

VIII. Usos

También se describen reactivos que tendrán utilidad en las aplicaciones diagnósticas como se describe en otra parte aquí, p. ej., en la descripción general de anormalidades del desarrollo, o más adelante en la descripción de los equipos de diagnóstico. En particular, parece que GPR2 se expresa de forma selectiva en el subgrupo de células T Th2. Esto sugiere que los reactivos descritos aquí pueden tener valor en la caracterización de enfermedades relacionadas con Th2 o Th1, o en el tratamiento de los tipos de enfermedad respectivos actuando sobre los subgrupos selectivos de células T. Véase, p. ej., Romagnani (1997) Current Op. Immunology 9:773-775; Romagnani (1997) The Th1/Th2 Paradigm in Disease Springer-Verlag and Landes, Austin, TX.

Debido a que Vic es una quimiocina proinflamatoria, los antagonistas deberían bloquear tal respuesta. Tanto Vic como CTACK se encuentran en la piel, de forma que los antagonistas pueden ser útiles para bloquear la inflamación cutánea. Las quimiocinas pueden ser útiles para atraer células GPR2+, y pueden ser útiles como adyuvantes tumorales o inmunitarios.

Así, la reducción de los subgrupos Th2 en una enfermedad mediada por Th2 puede prevenir o mejorar los síntomas. A la inversa, el enriquecimiento de los subgrupos Th2 en una enfermedad mediada por Th1 puede ser eficaz, p. ej., inhibiendo el subgrupo Th1. En particular, las reacciones asmáticas o alérgicas se pueden regular mediante el uso de los métodos de la presente invención.

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Esta invención también se refiere a reactivos con potencial terapéutico significativo. Estas quimiocinas y receptores (naturales o recombinantes), sus fragmentos, y las composiciones de unión, p. ej., anticuerpos hacia ellos, junto con los compuestos que se identifica que tienen afinidad de unión hacia ellos, deberían ser útiles en el tratamiento de trastornos asociados a la fisiología o el desarrollo anormal, que incluyen enfermedades inflamatorias, p. ej. asma. En particular, la modulación del tráfico de leucocitos es una actividad biológica probable, pero una distribución tisular más amplia podría sugerir una actividad biológica más extensa, que incluye, p. ej., efectos antivirales. La proliferación anormal, regeneración, degeneración y atrofia se pueden modular mediante el tratamiento terapéutico apropiado que usa las composiciones proporcionadas aquí. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado a la expresión anormal o a la señalización anormal por una quimiocina o ligando para un receptor debería ser un objetivo probable para un agonista o antagonista del ligando.

Se conocen diversas enfermedades asociadas a fisiología o desarrollo anormal en tipos celulares que se ha demostrado que poseen los ARNms de quimiocina o de receptor mediante análisis de transferencia de Northern. Véase Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; y Thorn, et al. Harrison's Principes of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y. Las anormalidades del desarrollo o funcionales, p. ej., del sistema inmunitario, provocan anormalidades y enfermedades médicas significativas que pueden ser susceptibles de prevención o tratamiento mediante el uso de las composiciones proporcionadas aquí. La presente invención enseña que diversas enfermedades relacionadas con la piel son trastornos susceptibles de análisis o diagnóstico determinando CTACK, Vic o GPR2. Por ejemplo, la probabilidad de rechazo cutáneo en una situación de injerto se debería determinar mediante la cantidad de CTACK y/o Vic presente. La disminución profiláctica puede ser útil para prevenir el reclutamiento de células T o NK dérmicas. La respuesta a diversos tumores cutáneos se puede determinar mediante la presencia o ausencia de CTACK y/o Vic.

Los anticuerpos hacia las quimiocinas o receptores, que incluyen las formas recombinantes, se pueden purificar y después usar de forma diagnóstica o terapéutica, solos o en combinación con otras quimiocinas, citocinas o sus antagonistas. Estos reactivos se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, p. ej., en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, p. ej., agentes inmunoadyuvantes, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones se pueden filtrar de forma estéril y colocar en formas farmacéuticas, tal como mediante liofilización en viales o almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o de sus fragmentos de unión, que incluyen formas que no se unen al complemento. Además, se pueden adoptar modificaciones para las moléculas de anticuerpo o sus fragmentos de unión al antígeno, que afectan a la farmacocinética o a la farmacodinámica de la entidad terapéutica.

Se puede realizar el cribado de fármacos mediante el uso de anticuerpos o receptores o sus fragmentos para identificar compuestos que tienen afinidad de unión para cada quimiocina o receptor, lo que incluye el aislamiento de los componentes asociados. Después se pueden utilizar ensayos biológicos posteriores para determinar si el compuesto tiene actividad de estimulación intrínseca y es, por lo tanto, un bloqueante o antagonista ya que bloquea la actividad del ligando. De forma similar, un compuesto que tiene actividad estimulante intrínseca puede activar el receptor, y así es un agonista ya que estimula la actividad de un ligando. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos hacia estas quimiocinas como antagonistas, o hacia los receptores como antagonistas o agonistas. Esta aproximación debería ser particularmente útil con otras variantes de especie de las quimiocinas o receptores.

Las cantidades de reactivos necesarias para la terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, que incluyen los medios de administración, el lugar de destino, el estado fisiológico del paciente, y los otros medicamentos administrados. Así, se deberían determinar las dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia de las diversas poblaciones, que incluyen subgrupos raciales, de edad, género, etc. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proporcionar una orientación útil sobre las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. La experimentación con animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionará una indicación predictiva adicional de la dosis humana. Se describen diversas consideraciones, p. ej., en Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos de administración se discuten ahí y más adelante, p. ej., para administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica, y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen típicamente agua, solución salina, tampones, y otros compuestos descritos, p. ej., en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, Nueva Jersey. Sería esperable habitualmente que los intervalos de dosis estuvieran en concentraciones menores de 1 mM, típicamente concentraciones menores de alrededor de 10 \muM, normalmente menores de alrededor de 100 nM, preferiblemente menores de alrededor de 10 pM (picomolar), y lo más preferiblemente menores de alrededor de 1 fM (femtomolar), con un vehículo apropiado. Se utilizarán a menudo formulaciones de liberación lenta, o un aparato de liberación lenta para la administración continua.

La selección de un régimen de administración para un agonista o antagonista terapéutico depende de diversos factores, que incluyen la velocidad de recambio sérico o tisular del agente terapéutico, la inmunogenicidad del agente terapéutico, o la accesibilidad de las células de interés. Preferiblemente, un régimen de administración maximiza la cantidad del agente terapéutico administrado al paciente de forma coherente con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por lo tanto, la cantidad de agente terapéutico administrado depende en parte del agonista o antagonista particular y de la gravedad de la enfermedad que se está tratando. La orientación sobre la selección de las dosis apropiadas de anticuerpos se halla en la bibliografía sobre usos terapéuticos, p. ej., Bach et al., capítulo 22, en Ferrone, et al. (eds. 1985), Handbook of Monoclonal Antibodies Noges Publications, Park Ridge, NJ; y Russell, págs. 303-357, y Smith et al., págs. 365-389, en Haber, et al. (eds. 1977) Antibodies in Human Diagnosis and Therapy Raven Press, Nueva York, NY.

La determinación de la dosis apropiada la realiza el clínico, p. ej., mediante el uso de parámetros o factores que se sabe en la técnica que afectan al tratamiento o que se predice que afectan al tratamiento. En general, la dosis comienza con una cantidad algo inferior que la dosis óptima, y se incrementa después mediante pequeños incrementos hasta que se consigue el efecto deseado u óptimo respecto de cualquier efecto secundario negativo. Los niveles de células CLA+ podrían ser indicadores importantes de cuándo se ha alcanzado una dosis eficaz. Preferiblemente, el anticuerpo o su composición de unión que se usará deriva de la misma especie que el animal al que se dirige el tratamiento, por lo que se minimiza la respuesta humoral hacia el reactivo.

Los intervalos de dosis semanales totales para los anticuerpos o sus fragmentos, que se unen específicamente a CTACK, oscilan generalmente alrededor de 1 ng, más generalmente alrededor de 10 ng, típicamente alrededor de 100 ng; más típicamente alrededor de 1 \mug, más típicamente alrededor de 10 \mug, preferiblemente alrededor de 100 \mug, y más preferiblemente alrededor de 1 mg por kilogramo de peso corporal. Aunque las cantidades superiores pueden ser más eficaces, las dosis menores tendrán típicamente menos efectos adversos. En general, el intervalo será menor de 100 mg, preferiblemente menor de alrededor de 50 mg, y más preferiblemente menor de alrededor de 25 mg por kilogramo de peso corporal.

Los intervalos de dosis semanales para los antagonistas, p. ej., anticuerpos, fragmentos de unión, oscilan alrededor de 10 \mug, preferiblemente al menos alrededor de 50 \mug, y más preferiblemente al menos alrededor de 100 \mug por kilogramo de peso corporal. En general, el intervalo será menor de alrededor de 1000 \mug, preferiblemente menor de alrededor de 500 \mug, y más preferiblemente menor de alrededor de 100 \mug por kilogramo de peso corporal. Las dosis se administran en un calendario que efectúa el tratamiento deseado y pueden ser periódicas durante periodos más cortos o más largos. En general, los intervalos serán de al menos alrededor de 10 \mug a alrededor de 50 mg, preferiblemente alrededor de 100 \mug a alrededor de 10 mg por kilogramo de peso corporal.

También se describen otros antagonistas de los ligandos, p. ej., muteínas. Los intervalos de dosis horarias para las muteínas oscilan al menos alrededor de 10 \mug, generalmente al menos alrededor de 50 \mug, típicamente al menos alrededor de 100 \mug, y preferiblemente al menos 500 \mug por hora. En general, la dosis será menor de alrededor de 100 mg, típicamente menor de alrededor de 30 mg, preferiblemente menor de alrededor de 10 mg, y más preferiblemente menor de alrededor de 6 mg por hora. Los intervalos generales serán de al menos alrededor de 1 \mug a alrededor de 1000 \mug, preferiblemente alrededor de 10 \mug a alrededor de 500 \mug por hora.

Los contextos particulares, p. ej. trasplantes o injertos de piel, pueden implicar la administración de los agentes terapéuticos en diferentes formas. Por ejemplo, en un injerto de piel, el tejido se puede sumergir en un medio estéril que contiene el agente terapéutico, lo que da como resultado un efecto profiláctico sobre la migración celular poco después de aplicar el injerto.

Se puede administrar una quimiocina, sus fragmentos, o anticuerpos hacia ella o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, directamente al hospedador a ser tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos a proteínas portadoras tales como ovoalbúmina o albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas se pueden administrar en muchas formulaciones farmacéuticas convencionales. Aunque es posible administrar solo el ingrediente activo, a menudo es preferible presentarlo en forma de una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente al menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables. Cada vehículo debería ser aceptable tanto farmacéuticamente como fisiológicamente en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no ser dañino para el paciente. Los vehículos pueden mejorar la duración de almacenamiento, la estabilidad, etc. Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (que incluye la subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones se pueden presentar de forma conveniente en una forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica de farmacia. Véase, p. ej., Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª ed., Pergamon Press; y Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds. 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, Nueva York; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, Nueva York; y Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, Nueva York. La terapia de esta invención se puede combinar, o usar en asociación, con otros agentes terapéuticos. Se aplicarán consideraciones similares a menudo a los reactivos basados en
receptores.

La presente invención también proporciona la administración de anticuerpos o composiciones de unión de CTACK, Vic o GPR2 en combinación con las terapias conocidas, p. ej., esteroides, particularmente glucocorticoides, que alivian los síntomas asociados a las respuestas inflamatorias excesivas. Las dosis diarias de glucocorticoides oscilarán al menos alrededor de 1 mg, generalmente al menos alrededor de 2 mg, y preferiblemente al menos alrededor de 5 mg por día. En general, la dosis será menor de alrededor de 100 mg, típicamente menor de alrededor de 50 mg, preferiblemente menor de alrededor de 20 mg, y más preferiblemente al menos alrededor de 10 mg por día. En general, los intervalos serán de al menos alrededor de 1 mg a alrededor de 100 mg, preferiblemente alrededor de 2 mg a 50 mg por día.

La frase "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para efectuar una respuesta deseada, o para mejorar un síntoma o un signo del trastorno cutáneo. Los hospedadores mamíferos típicos incluirán ratones, ratas, gatos, perros y primates, que incluyen humanos. Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como el trastorno a tratar, el estado de salud general del paciente, el método, la vía, y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios. Preferiblemente, el efecto dará como resultado un cambio en la cuantificación de al menos alrededor del 10%, preferiblemente al menos el 20%, 30%, 50%, 70%, o incluso 90% o más. Cuando están en combinación, una cantidad eficaz está en proporción respecto de una combinación de componentes, y el efecto no se limita a los componentes individuales solamente.

Una cantidad eficaz de agente terapéutico modulará los síntomas típicamente en al menos alrededor del 10%; habitualmente al menos alrededor del 20%; preferiblemente al menos alrededor del 30%; o más preferiblemente al menos alrededor del 50%. De forma alternativa, la modulación del movimiento significará que el movimiento o el tráfico de diversos tipos celulares se ve afectado. Ello dará como resultado, p. ej., cambios estadísticamente significativos y cuantificables en el número de células que se ven afectadas. Esto puede ser un incremento o disminución en el número de células de interés que son atraídas en un periodo de tiempo o en un área de interés.

La presente invención proporciona reactivos que tendrán utilidad en aplicaciones terapéuticas como se describió aquí, p. ej., en la descripción general para tratar trastornos asociados a enfermedades cutáneas. Véase, p. ej., Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn, et al. Harrison's Principes of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY; Gilman, et al. (eds. 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn; Langer (1990) Science 249:1527-1533; y Merck Index, Merck & Co., Rahway, Nueva Jersey.

Tanto las formas naturales como las recombinantes de las quimiocinas o de los receptores de esta invención son particularmente útiles en equipos y métodos de ensayo que son capaces de cribar compuestos en función de la actividad de unión a las proteínas. En los últimos años se han desarrollado varios métodos para automatizar los ensayos para permitir el cribado de decenas de miles de compuestos en un periodo corto. Véase, p. ej., Fodor, et al. (1991) Science 251:767-773, que describe los medios para ensayar la afinidad de unión mediante una diversidad de polímeros definidos sintetizados en un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados se puede facilitar enormemente mediante la disponibilidad de grandes cantidades de quimiocina purificada soluble, como se proporciona mediante esta invención.

Por ejemplo, una vez que se ha definido estructuralmente un ligando normalmente se pueden descubrir los antagonistas. El ensayo de los análogos potenciales del ligando es ahora posible con el desarrollo de métodos de análisis sumamente automatizados que usan células que responden fisiológicamente. En particular, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas mediante el uso de las técnicas de cribado descritas aquí.

Se podrían usar también células viables para cribar en función de los efectos de los fármacos sobre la quimiocina respectiva o sobre las funciones mediadas por el receptor acoplado a proteína G, p. ej., las concentraciones de segundo mensajero, es decir, Ca^{++}; cambios en la reserva de fosfato de inositol (véase, p. ej., Berridge (1993) Nature 361:315-325 o Billah y Anthes (1990) Biochem. J. 269:281-291); respuestas de modificación de la morfología celular; recambio de lípidos de fosfatidilinositol; una respuesta antiviral, y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, p. ej., un sistema de detección sensible a la proximidad. Las tinciones sensibles a calcio serán útiles para detectar las concentraciones de Ca^{++}, con un fluorímetro o con un aparato de separación de células activada por fluorescencia.

El diseño racional de fármacos se puede basar también en estudios estructurales de las formas moleculares de las quimiocinas, de otros efectores o análogos, o de los receptores. Los efectores pueden ser otras proteínas que intervienen en otras funciones en respuesta a la unión del ligando, u otras proteínas que interaccionan normalmente con el receptor. Un medio para determinar qué sitios interaccionan con otras proteínas específicas es una determinación física de la estructura, p. ej., cristalografía de rayos X o técnicas de RMN bidimensional. Estas proporcionarán orientación relativa a qué residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, p. ej., Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, Nueva York.

Las quimiocinas o receptores purificados se pueden revestir directamente en placas para el uso en las técnicas de cribado de fármacos anteriormente mencionadas, y se pueden asociar con detergentes o lípidos. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes, p. ej. hacia las quimiocinas o receptores, se pueden usar como anticuerpos de captura para inmovilizar la proteína respectiva en la fase sólida.

También son aplicables conceptos similares a las realizaciones de receptores de quimiocina de la invención.

IX. Equipos

También se describe el uso de proteínas de quimiocina o receptor, sus fragmentos, péptidos, composiciones de unión y sus productos de fusión en una diversidad de equipos y métodos diagnósticos para detectar la presencia del ligando, anticuerpos o receptores. Típicamente, el equipo tendrá un compartimento que contiene un péptido de quimiocina o receptor definido o un segmento génico o un reactivo que reconoce uno u otro, p. ej., reactivos de unión.

Un equipo para determinar la afinidad de unión de un compuesto de ensayo a una quimiocina o receptor comprendería típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida por la proteína; una fuente de quimiocina o receptor (natural o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, tal como una fase sólida para inmovilizar el ligando o el receptor. Una vez que se criban los compuestos, aquellos que tienen una afinidad de unión adecuada por el ligando o el receptor se pueden analizar en ensayos biológicos adecuados, como se conoce en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas para el receptor. La disponibilidad de los polipéptidos recombinantes de quimiocina o receptor también proporciona patrones definidos para calibrar tales ensayos, o como muestras de control positivo.

Un equipo preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una quimiocina o un receptor en una muestra comprendería típicamente un compuesto marcado, p. ej., anticuerpo, que tiene una afinidad de unión conocida por el objetivo, una fuente de ligando o de receptor (natural o recombinante) y un medio para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar la quimiocina o el receptor. Se proporcionarán normalmente compartimentos que contienen los reactivos, e instrucciones para el uso o para la eliminación de los desechos.

Los anticuerpos, que incluyen los fragmentos de unión al antígeno, específicos para la quimiocina o el receptor, o sus fragmentos, son útiles en aplicaciones diagnósticas para detectar la presencia de concentraciones elevadas de quimiocina, receptor, y/o sus fragmentos. Tales ensayos diagnósticos pueden emplear lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, líquidos corporales, y además pueden implicar la detección de antígenos relacionados con el ligando o el receptor en suero, o similares. Los ensayos diagnósticos pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo de antígeno) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, tales como radioinmunoanálisis (RIA), análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), enzimoinmunoanálisis (EIA), técnica de inmunoanálisis multiplicado enzimáticamente (EMIT), inmunoanálisis fluorescente con sustrato marcado (SLFIA), y similares. Por ejemplo, se pueden emplear anticuerpos sin marcar usando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo primario hacia una quimiocina o receptor o hacia un fragmento particular suyo. Se han discutido exhaustivamente ensayos similares en la bibliografía. Véase, p. ej., Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.

Los anticuerpos anti-idiotipo pueden tener usos similares para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una quimiocina o un receptor, y ello puede ser diagnóstico de diversos estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de una quimiocina o de un receptor puede dar como resultado la producción de diversas reacciones inmunológicas que pueden ser diagnósticas de estados fisiológicos anormales, en particular en diversas enfermedades inflamatorias o asmáticas.

Frecuentemente, los reactivos para los ensayos diagnósticos se proporcionan en equipos para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, el protocolo, y la molécula marcadora, se proporciona un anticuerpo marcado o sin marcar o una quimiocina o receptor marcado. Esto es así normalmente junto con otros aditivos, tales como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de la señal tales como sustratos para enzimas, y similares. Preferiblemente, el equipo también contendrá instrucciones para el uso correcto y la eliminación de los contenidos después del uso. Típicamente, el equipo tiene compartimentos o recipientes para cada reactivo útil. De forma deseable, los reactivos se proporcionan en forma de un polvo liofilizado seco en el que los reactivos se pueden reconstituir en un medio acuoso, con lo que se proporcionan las concentraciones apropiadas de reactivos para realizar el ensayo.

Los constituyentes anteriormente mencionados del cribado de fármacos y de los ensayos diagnósticos se pueden usar sin modificación, o se pueden modificar en una diversidad de formas. Por ejemplo, el marcado se puede conseguir mediante la unión covalente o no covalente de un resto que proporciona directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el ligando, el compuesto de ensayo, la quimiocina, el receptor, o los anticuerpos hacia ellos se pueden marcar de forma directa o indirecta. Las posibilidades para el marcado directo incluyen grupos de marcadores: radiomarcadores tales como ^{125}I, enzimas (patente de EE.UU. nº 3.645.090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de EE.UU. nº 3.940.475) capaces de monitorizar el cambio en la intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda, o la polarización de fluorescencia. Las posibilidades para el marcado indirecto incluyen la biotinilización de un constituyente, seguido por la unión de avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores.

También hay numerosos métodos para separar el ligando unido del libre, o alternativamente el compuesto de ensayo unido del libre. La quimiocina o el receptor se pueden inmovilizar en diversas matrices, quizás con detergentes o lípidos asociados, seguido de lavado. Las matrices adecuadas incluyen plástico, tal como una placa de ELISA, filtros y esferas. Los métodos de inmovilización de la quimiocina o del receptor a una matriz incluyen, sin limitación, la adhesión directa al plástico, el uso de un anticuerpo de captura, la unión química y biotina-avidina. La última etapa en esta aproximación puede implicar la precipitación del complejo antígeno/anticuerpo mediante cualquiera de varios métodos, que incluyen aquellos que utilizan, p. ej., un disolvente orgánico tal como polietilenglicol o una sal tal como sulfato amónico. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables con anticuerpos de fluoresceína descrito en Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461, y la separación con partículas magnéticas con anticuerpos dobles como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.659.678.

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Los métodos para unir proteínas o sus fragmentos a los diversos marcadores se han informado exhaustivamente en la bibliografía y no es necesaria una discusión detallada aquí. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados a través del uso de carbodiimida o de ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como cloroacetilo, o una olefina activada tal como maleimida, para la unión, o similares. Las proteínas de fusión también tendrán utilidad en estas aplicaciones.

Otro aspecto diagnóstico descrito aquí implica el uso de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas tomadas de la secuencia de la quimiocina o el receptor. Estas secuencias se pueden usar como sondas para detectar los niveles del mensaje del ligando en las muestras de los pacientes que se sospecha que tienen un trastorno anormal, p. ej., un problema inflamatorio, fisiológico o del desarrollo. La preparación de secuencias nucleotídicas de ARN y ADN, el marcado de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y discusión en la bibliografía. Normalmente, una sonda oligonucleotídica debería tener al menos alrededor de 14 nucleótidos, normalmente al menos alrededor de 18 nucleótidos, y las sondas polinucleotídicas pueden ser hasta de varias kilobases. Se pueden emplear diversos marcadores, de forma más común radionucleidos, en particular ^{32}P. Sin embargo, se pueden emplear también otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve después como sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplia diversidad de marcadores, tales como radionucleidos, moléculas fluorescentes, enzimas, o similares. De forma alternativa, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer moléculas dobles específicas, que incluyen moléculas dobles de ADN, moléculas dobles de ARN, moléculas dobles híbridas ADN-ARN, o moléculas dobles ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, se pueden marcar y se puede llevar a cabo el ensayo en el que la molécula doble se une a una superficie, de forma que tras la formación de la molécula doble en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido a la molécula doble. El uso de sondas para el ARN antisentido nuevo se puede llevar a cabo en técnicas convencionales tales como hibridación de ácidos nucleicos, cribado más/menos, uso de sondas recombinantes, traducción permitida por hibridación (HRT), y traducción detenida por hibridación (HART). Esto también incluye las técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).

También se contemplan equipos diagnósticos que también analizan la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. La diagnosis o la prognosis puede depender de la combinación de múltiples indicaciones usadas como marcadores. Así, los equipos pueden analizar combinaciones de marcadores. Véase, p. ej., Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.

X. Receptor; ligandos para receptores

Al haber identificado una molécula de unión de ligando de una interacción específica, existen métodos para aislar la molécula contraria. Véase Gearing, et al EMBO J. 8:3667-4676 o McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2832. Por ejemplo, se pueden determinar los medios para marcar una quimiocina sin interferir en la unión a su receptor. Por ejemplo, se puede fusionar un marcador de afinidad al extremo amino o carboxilo del ligando. Se puede cribar una biblioteca de expresión en función de la unión específica de la quimiocina, p. ej. mediante separación de células, u otro cribado para detectar subpoblaciones que expresan el componente de unión. Véase, p. ej., Ho, et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. 90:11267-11271. De forma alternativa, se puede usar un método de fijación. Véase, p. ej., Seed y Aruffo (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 84:3365-3369.

Con un receptor, existen medios para identificar el ligando. Se pueden usar métodos para utilizar el receptor, p. ej. en una membrana celular, para cribar el ligando mediante, p. ej., el análisis de una señal asociada a la proteína G común, tal como el flujo de Ca^{++}. Véase Lerner (1994) Trends in Neurosciences 17:142-146. Es probable que los ligandos para estos receptores sean quimiocinas.

Se pueden aplicar técnicas de entrecruzamiento de proteínas con marcadores para aislar moléculas de unión de una quimiocina. Esto permitiría la identificación de una proteína que interacciona específicamente con una quimiocina, p. ej., de una manera similar a ligando-receptor.

El amplio alcance de esta invención se entiende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar la invención a realizaciones específicas.

Ejemplos I. Métodos generales

Algunos de los métodos estándar están descritos o se hace referencia a ellos, p. ej., en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2ª ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, Nueva York; Innis, et al. (eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, N.Y. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato amónico, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, p. ej., Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology, vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; la bibliografía del fabricante sobre el uso de productos de purificación de proteínas, p. ej., Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA; y Coligan, et al. (eds.) (1995 y suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Nueva York, NY. La combinación con técnicas recombinantes permiten la fusión con segmentos apropiados, p. ej., a una secuencia FLAG o un equivalente que se puede fusionar por medio de una secuencia eliminable mediante proteasas. Véase, p. ej., Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Se describen técnicas inmunológicas estándar, p. ej., en Hertzenberg, et al. (eds. 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology vols. 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology volúmenes 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 y 163.

Se describen análisis de FACS en Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, Nueva York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, Nueva York, NY.

II. Cultivo celular y muestras de tejido

Se obtuvieron células primarias de humano adulto que incluían queratinocitos, melanocitos y fibroblastos dérmicos de Clonetics, y se cultivaron según las instrucciones del proveedor. La línea de células T \gamma\delta, 7-17, fue proporcionada amablemente por Richard Boismenu (The Scripps Institute, La Jolla, California). Para el tratamiento con citocina, las células se cultivaron con 10 ng/ml de hTNF-\alpha más 3 ng/ml de hIL-1\beta (R&D Systems) en medio de cultivo durante los tiempos indicados. Se separó la piel de la oreja de ratones BALB/c en epidermis y dermis tras incubación con un 2,5% de tripsina en PBS durante 30 minutos a 37ºC. Se obtuvieron PBMC humanas de donantes sanos mediante sedimentación de eritrocitos seguida de sedimentación con Ficoll-Histopaque-1077 (Sigma Chem. Co.). Las células T humanas se purificaron de las PBMCs mediante el uso de una columna de enriquecimiento de células T (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante.

III. Aislamiento de las secuencias que codifican CTACK, Vic o GPR2

La secuencia de CTACK de humano o de ratón está disponible fácilmente. ID SEC Nºs: 11-14. Se pueden seleccionar cebadores de PCR o sondas de hibridación apropiadas. De forma similar para Vic y GPR2, ID SEC Nºs:
1-10.

Análisis de secuencias. Las búsquedas mediante TBLASTN en la base de datos dbEST de Genbank y en una patentada, con las secuencias de las quimiocinas CC conocidas, identificó las ESTs para CTACK humano y murino, respectivamente. El cADN de CTACK murino, clon del consorcio IMAGE nº 316475, se obtuvo de Genome Systems como un inserto de EcoRI-NotI en el vector pT7T3-PacD. CTACK humano se obtuvo como un inserto de SaII-NotI en el vector pSPORT 3.0. La secuencia de nucleótidos de ambos clones se confirmó mediante secuenciación automatizada. Los sitios de escisión del péptido señal se predijeron mediante el uso del servidor SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/signalp/cbssignalp.html). Las secuencias se alinearon mediante el uso de CLUSTAL W.

El GPR2 se aisló a partir de una biblioteca de cADN producida a partir de una biblioteca de cADN humano. Una secuencia parcial fue informada por Marchese, et al. (1994) Genomics 23:609-618. Se secuencian los clones de cADN individuales mediante el uso de métodos estándar, p. ej., el equipo Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA), y la secuencia se caracteriza adicionalmente.

Se han aislado y descrito otros homólogos de roedor. Una transferencia de Southern puede indicar el grado de homología entre especies, y se puede cribar una biblioteca de cADN o de ARNm para identificar una fuente apropiada de células. También se puede estudiar el estado fisiológico de muchos tipos diferentes de células para la expresión incrementada del gen.

Los análisis informáticos sugieren que los genes más relacionados son diversos receptores acoplados a proteína G. Estos incluyen los receptores de quimiocina y los receptores de proteasas, p. ej. trombina. Los motivos estructurales sugieren que el receptor puede contener motivos característicos de la familia de receptores de quimiocinas, y de la familia de receptores de proteasas. Los gráficos de hidrofobicidad y las comparaciones con otros GPCRs deberían permitir la predicción de los segmentos transmembrana. Véase, p. ej., Loetscher, et al. (1996) J. Expt'l Med. 184:963-969. Un análisis informático de las secuencias de GPCR indicará los residuos característicos de los miembros de la familia.

Otros homólogos de primate deberían ser aislables mediante el uso de la porción codificante completa de este clon humano como sonda de hibridación. La transferencia de Southern puede indicar el grado de homología entre especies, y se puede cribar una biblioteca de cADN o de ARNm para identificar una fuente celular apropiada. También se puede estudiar el estado fisiológico de muchos tipos diferentes de células para la expresión incrementada del gen.

Los receptores de quimiocina se consideran en general objetivos útiles para el descubrimiento de fármacos nuevos, en los que los agentes terapéuticos actuarían como agonistas o antagonistas en la unión de el/los ligando(s) natural(es)
del receptor. Estas interacciones receptor-ligando pueden dar como resultado procesos de inflamación, de reclutamiento celular, y/o de activación celular. El GPR2 está aumentado en la tiroiditis de Hashimoto y en la psoriasis.

Algunos de estos receptores son la puerta de entrada de agentes infecciosos, p. ej., virus. Por lo tanto, los agentes terapéuticos dirigidos contra el receptor de quimiocina pueden tener aplicación en estas enfermedades. Además, los receptores pueden ser importantes para determinar la estructura fundamental o las respuestas fisiológicas.

Otros homólogos de especie deberían ser aislables mediante el uso de la porción codificante completa de estos clones como sonda de hibridación. Una transferencia de Southern puede indicar el grado de homología entre especies, y se puede cribar una biblioteca de cADN o de ARNm para identificar una fuente de células apropiadas. También se puede estudiar el estado fisiológico de muchos tipos diferentes de células para la expresión incrementada del gen.

IV. Cartografía cromosómica

El cADN se marca, p. ej., mediante traslación de mella con biotina-14 dATP y se hibrida in situ a una concentración final de 5 ng/\mul a metafases de dos machos normales. El método de hibridación in situ de fluorescencia (FISH) se puede modificar a partir del descrito por Callen, et al. (1990) Ann. Genet. 33:219-221, ya que los cromosomas se tiñen antes del análisis tanto con yoduro de propidio (como tinción de contraste) como con DAPI (para la identificación de los cromosomas). Las imágenes de las preparaciones de metafases se capturan mediante una cámara CCD y se mejoran informáticamente. Se determina la identificación de los cromosomas marcados apropiados.

CTACK se colocó en el cromosoma 4 de ratón mediante análisis de retrocruzamiento interespecífico esencialmente como se describe en Kelner, et al. (1994) Science 266:1395-1399, excepto que en este caso se usó un fragmento de EcoRI/NotI de 400 pb de cDNA de CTACK de ratón para la transferencia de Southern. Se detectaron fragmentos de 14,5 y 8,9 kb en el ADN C57BL/6J digerido con BglI y se detectaron fragmentos de 8,9 y 4,4 kb en ADN de M. spretus digerido con Bgll. La presencia o ausencia del fragmento específico de BgII de 4,4 kb se siguió en ratones retrocruzados. Se calcularon las distancias de recombinación mediante el uso de Map Manager, versión 2.6.5.

mCTACK se cartografía en la región proximal del cromosoma 4 de ratón. CTACK se colocó en el cromosoma 4 de ratón mediante análisis de retrocruzamiento interespecífico. Se tipificaron más de 98 animales. Una búsqueda de Genbank con la secuencia de hCTACK reveló que el gen para hCTACK se solapa con el extremo 3' terminal (después de la señal de poli A) del gen de la cadena \alpha del receptor de IL-11, pero en la cadena opuesta. La cadena \alpha de IL-11R está localizada en el cromosoma 9p13, una región sinténica con el brazo proximal del cromosoma 4 de ratón.

Se pueden usar métodos similares para cartografiar Vic y GPR2.

V. Análisis de distribución

Para la transferencia de Southern, se digirieron 5 \mug de cada biblioteca de cADN con las enzimas de restricción apropiadas para liberar el inserto, se sometieron a electroforesis en gel, y se transfirieron a una membrana Hybond-N^{+}. Para la transferencia de Northern se aislaron todos los ARNs mediante el uso de RNAzol B (TEL-TEST, Inc.) y se analizaron mediante electroforesis en un gel de 1% de formaldehído-agarosa y se transfirieron a una membrana Hybond-N^{+}. Las transferencias de Northern y de Southern se hibridaron durante 16 h a 65 ºC con sondas marcadas con ^{32}P obtenidas mediante cebado aleatorio (Prime-it; Stratagene) de toda la longitud de los insertos de clones de CTACK de ratón y humano. Tras la hibridación, las transferencias se lavaron en condiciones restrictivas y se expusieron con una película.

El análisis de transferencia de Southern de la expresión de CTACK en bibliotecas de cADN generadas a partir de muestras humanas incluyó: riñón fetal, pulmón e hígado, células mononucleares de sangre periférica (PBMC y PBMC-act) en reposo o activadas (act) con anti-CD3 y PMA, y células T (MOT72 y MOT72-act) en reposo o activadas con anti-CD28 y anti-CD3, GM-CSF más células dendríticas generadas con IL-4, monocitos levigados activados con LPS, IFN\gamma y anti-IL-10 o IL-10, células A549 (epiteliales) tratadas con IL-1\beta, órganos y tejidos de adultos, enfermos y normales.

El análisis mediante transferencia de Northern de la expresión de CTACK en tejidos y órganos de ratón incluyó: epidermis y dermis derivada de piel de oreja, hígado, bazo, timo, ganglios linfáticos periféricos (GLP), y ganglios linfáticos de drenaje de la oreja (GL auriculares). El análisis de transferencia de Northern de la expresión de CTACK se realizó en queratinocitos primarios, melanocitos primarios, células 7-17 (línea de células T \gamma\delta) y fibroblastos dérmicos primarios sin tratar o tratados con TNF-\alpha e IL-1\beta. Esto, junto con los resultados de RT-PCR, sugiere que el ARN de CTACK se expresa en queratinocitos humanos y aumenta por las citocinas proinflamatorias.

De forma alternativa, los ARNs se trataron con DNasaI y se transcribieron inversamente, y los cADNs resultantes se usaron como moldes para la RT-PCR competitiva como se describe. Gilliland, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2725-2729; y Platzer, et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:1179-1184. El fragmento de ADN competidor para CTACK se generó según Celi, et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:1047. Se usaron los siguientes cebadores para obtener un fragmento competidor de CTACK humano (155 pb): cebador de la hebra codificante 5'-CTGTACT
CAGCTCTACCGAAAGCC-3' (véase la posición 99-122 de la ID SEC Nº: 1); cebador de la hebra no codificante 5'-GCCCATTTTCCTTAGCATCCCATGCAGATGCTGCGTTGAGC-3' (véase la posición 336-316 + la posición 233-214 de la ID SEC Nº: 1). El fragmento competidor para \beta-actina humana fue proporcionado amablemente por el Dr. J. Krüssel (Dep. de Ginecología y Obstetricia, Universidad Heinrich Heine, Düsseldorf, Alemania; Krüssel, et al. (1997) J. Reprod. Immunol. 34:103-120). Los pares de cebadores usados para la PCR competitiva fueron los siguientes: cebador de la hebra codificante de CTACK humano (244 pb) 5'-CTGTACTCAGCTCTACCGAAA
GCC-3' (véase la posición 99-122 de la ID SEC Nº: 11); cebador de la hebra no codificante 5'-GCCCATTTTCCT
TAGCATCCC-3' (véase la posición 336-316 de la ID SEC Nº: 11); cebador de la hebra codificante de \beta-actina humana 5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3' (véase la ID SEC Nº: 15); cebador de la hebra no codificante 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3' (véase la ID SEC Nº: 16). Los productos de RT-PCR competitiva se cuantificaron en geles de agarosa digitalizados mediante el uso del paquete informático de análisis de imágenes Eagle Eye II (Stratagene).

Las muestras de ARN se transcribieron inversamente y se usaron como molde para amplificar CTACK y \beta-actina. La \beta-actina se usó para la normalización de los resultados, que se comparan con los niveles de expresión de ARNm de \beta-actina.

Estos estudios de expresión revelaron que CTACK es extremadamente específico de tejido. Se ensayaron más de 70 bibliotecas de cADN humano mediante transferencia de Southern, que incluyen 46 bibliotecas de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas y 25 bibliotecas de tejido normal y tejido enfermo. Básicamente, CTACK hibrida exclusivamente con las bibliotecas derivadas de piel normal o psoriásica. La transferencia de Southern con CTACK murino no revela una hibridación significativa con más de 45 bibliotecas de ratón derivadas de una diversidad de células y tejidos; sin embargo, este panel no incluyó una biblioteca derivada de piel.

Para determinar si CTACK murino se expresa también en la piel se realizó un análisis de transferencia de Northern mediante el uso de ARN generado tanto de la epidermis como de la dermis de piel de oreja de ratón o de otros órganos preferidos. Se detecta fácilmente una especie de ARN de 0,8 kb en la epidermis, solamente de forma débil en la dermis y no se detecta en absoluto en los otros órganos ensayados. La señal débil de la dermis se puede atribuir a la separación imperfecta de la epidermis y la dermis. Estos resultados indican que la expresión de CTACK no solamente es sumamente específica de tejido, sino que su expresión selectiva en la piel está restringida a la epidermis. Esto contrasta con otras quimiocinas tales como IP-10 e IL-8 que se expresan en la piel (Schroder (1995) J. Invest. Dermatol. 105:20S-24S; y Larsen, et al. (1989) Immunology 68:31-36), pero que también se expresan ampliamente fuera de este tejido (Rollins (1997) Blood 90:909-928).

Para determinar el origen celular de CTACK, se buscó ARNm en células derivadas de piel cultivadas que se dejaron sin tratar o se trataron con TNF-\alpha más IL-1\beta durante 6 h o 18 h. Estas citocinas proinflamatorias son importantes reguladores primarios de las respuestas inmunitarias en la piel y pueden inducir la expresión de otros mediadores inflamatorios, que incluyen quimiocinas. Schroder (1995) J. Invest. Dermatol. 105:20S-24S; Larsen, et al. (1989) Immunology 68:31-36; y Goebeler, et al. (1997) J Invest Dermatol 108:445-451. El mensaje de CTACK se detecta en queratinocitos humanos, el tipo celular predominante en la epidermis, y aumenta después de 6 h o 18 h de tratamiento con citocina. El análisis de RT-PCR competitiva confirma este resultado y demuestra una inducción de hasta 30 veces del mensaje de CTACK. Por contraste, otros tipos celulares derivados de piel tales como melanocitos, células T \gamma\delta y fibroblastos dérmicos no expresan CTACK en ninguna de las condiciones ensayadas. Estos experimentos demuestran que el mensaje de CTACK se expresa de forma constitutiva, pero también se puede incrementar por señales inflamatorias.

La expresión regulada, específica de piel de CTACK hacen de él un candidato excelente para el reclutamiento selectivo de células T memoria de migración a la piel. Se estudió la capacidad de CTACK para quimioatraer diferentes subgrupos de células T.

Se han aplicado métodos exhaustivos de PCR cuantitativa, y la expresión de GPR2 humano es particularmente elevada en muestras mezcladas de pulmón de fumadores empedernidos, y células dendríticas procedentes de monocitos activados mediante IL-4 y LPS. Se detectaron cantidades muy elevadas en muestras de pulmón humano normal, células dendríticas activadas, línea de células MOT72 activadas, línea de células B JY activadas o en reposo, ovario fetal, tejido adiposo fetal, vesícula biliar fetal, eosinófilos, PBMC en reposo, y otros.

La expresión del homólogo de ratón parece ser paralela a la del homólogo de humano.

VI. Quimiotaxis

Se produjo CTACK de ratón recombinante en E. coli y se purificó mediante R&D Systems como se describió previamente para otras quimiocinas. Hedrick, et al. (1998) Blood 91:4242-4247. Se añadieron células T humanas totales en DMEM, pH 6,9, 1% de albúmina de suero bovino, a la cámara superior de la placa de cultivo Transwell de policarbonato de 3 \mum de poro (Costar) y se incubó con las concentraciones indicadas de quimiocina purificada en la cámara inferior durante 3 h. El número de células que migraron de cada subtipo se determinó mediante citometría de flujo de parámetros múltiples mediante el uso de anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CLA (HECA-452), CD4, CD8, y CD45RO (Pharmingen). Se añadió un número conocido de microesferas de 15 \mum (Bangs Laboratories, Fishers, IN) a cada muestra antes del análisis para determinar el número absoluto de células que migran. Como ejemplo, una media de 6272 células CLA^{+} migraron en respuesta a la concentración óptima de CTACK comparado con 666 células con medio solo.

Los ensayos de quimiotaxis se realizaron con células T purificadas de sangre periférica humana, y las células T de migración a la piel se identificaron por su expresión de CLA. El CTACK murino recombinante quimioatrae células T CD4^{+} y CD8^{+} que coexpresan CLA. Por contraste, las células T CLA^{-}, de las poblaciones CD4^{+} y CD8^{+}, no responden de forma significativa a CTACK. Las células CLA^{+} migran solamente en presencia de un gradiente de CTACK, lo que indica que la respuesta es quimiotáctica y no inespecíficamente quimiocinética. En comparación, 6Ckine, un quimioatrayente conocido de células T (Nagira, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:19518-19524; Hromas, et al. (1997) J. Immunol. 159:2554-2558; Hedrick y Zlotnik (1997) J. Immunol. 159:1589-1593), no solamente es un atrayente menos potente para células T CLA^{+}, sino que también carece de especificidad por células CLA^{+}, ya que atrae de forma preferente células CLA^{-}. CTACK no atrae de forma eficaz células B o neutrófilos humanos. La carencia de un anticuerpo anti-CLA de ratón impide un análisis similar en el ratón.

El subgrupo de células T memoria CLA^{+} constituye una población asociada a la piel de células memoria que se extravasan preferentemente en sitios cutáneos normales (Bos, et al. (1993) Arch. Dermatol. Res. 285:179-183) e inflamados de forma crónica (Picker, et al. (1990) Am. J. Pathol. 136:1053-1068). Se ha demostrado que esta subpoblación está implicada en la inmunidad local y en las reacciones cutáneas inflamatorias. Santamaria Babi, et al. (1995) Immunol. Res. 14:317-324. Se ha propuesto que CLA dirige a las células T memoria a localizaciones cutáneas por medio de la interacción con su ligando vascular E-selectina. Picker, et al. (1991) Nature 349:796-799; y Berg, et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1461-1466. Sin embargo, los neutrófilos expresan CLA (De Boer, et al. (1994) 174:1461-1466, De Boer, et al. (1994) Immunology 81:359-365) aunque no migran preferentemente a la piel. Además, la E-selectina se induce en el endotelio inflamado de localizaciones cutáneas y no cutáneas. Por lo tanto, la unión CLA/E-selectina no puede explicar completamente la migración específica hacia la piel de las células T memoria CLA^{+}. Se expresan varias quimiocinas en la piel (Schroder (1995) J. Invest. Dermatol. 105:20S-24S) y pueden desempeñar un papel en la inflamación de este tejido (Larsen, et al. (1995) J. Immunol. 155:2151-2157; Santamaria Babi, et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:2056-2061; Sarris, et al. (1995) (véanse los comentarios) Blood 86:651-658); sin embargo, estas quimiocinas se expresan ampliamente (Rollins (1997) Blood 90:909-928). Aquí se describe una quimiocina nueva, CTACK, que se expresa de forma específica en la piel y quimioatrae selectivamente células T de migración específica hacia la piel CLA^{+}. En conjunto, estos datos sugieren que CTACK puede proporcionar el reclutamiento dirigido por una señal específica de la piel de las células T memoria CLA^{+} hacia localizaciones cutáneas, y proporciona un objetivo potencial para regular de forma específica el tráfico de células T hacia la piel.

Se pueden realizar ensayos similares con Vic de primate o de roedor.

VII. Producción de anticuerpos

Se inmunizan mamíferos apropiados con cantidades apropiadas de CTACK, Vic, GPR2, o células transfectadas con los genes, p. ej., de forma intraperitoneal cada 2 semanas durante 8 semanas. Típicamente, se usan roedores, aunque otras especies deberían permitir la producción de anticuerpos selectivos y específicos. La inmunización final se administra de forma intravenosa (IV) a través de la vena de la cola.

Se pueden recoger anticuerpos policlonales genéricos. De forma alternativa, se pueden producir anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, cuatro días después de la inyección IV, se extrae el bazo y se fusiona con células SP2/0 y NS1. Se seleccionan los hibridomas resistentes a HAT, p. ej. mediante el uso de un protocolo diseñado por Stem Cell Technologies (Vancouver, BC). Después de 10 días de selección con HAT, los focos resistentes se transfieren a placas de 96 pocillos y se cultivan durante 3 días. Se analiza la unión a transfectantes NIH3T3/CTACK de superficie en los sobrenadantes que contienen anticuerpos, p. ej. mediante FACS. Se producen típicamente muchos mAcs de CTACK diferentes. Los anticuerpos se pueden aislar y modificar, p. ej., mediante marcado o mediante otros métodos como es habitual en la técnica. Véase, p. ej., Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY. Los métodos para conjugar reactivos magnéticos, entidades tóxicas, marcadores, unir los anticuerpos a sustratos sólidos, para filtrar de forma estéril, etc., se conocen en la técnica.

VIII. Purificación de células

Las células que responden a CTACK o Vic se pueden identificar mediante el uso de los reactivos descritos aquí. Por ejemplo, las células que son quimioatraídas hacia CTACK o Vic se pueden purificar de otras células recogiendo aquellas células que migran hacia CTACK o Vic. Tal quimiotaxis puede ser hacia una fuente de quimiocina, o puede ser a través de una membrana porosa o de otro sustrato. Véase anteriormente, en el ensayo de microquimiotaxis.

El análisis de las muestras humanas se puede estudiar de una manera similar. Se obtiene una muestra biológica, p. ej. sangre, muestra de biopsia tisular, lavado pulmonar o nasal, biopsia cutánea en sacabocados, de un individuo que padece un trastorno relacionado con la piel. Se realiza el análisis de las células que responden a CTACK o Vic, p. ej., mediante análisis de FACS, o medios similares.

IX. Antagonistas

Se pueden conseguir diversos antagonistas de CTACK o Vic. Por ejemplo, los anticuerpos contra la propia quimiocina pueden bloquear la unión del ligando a su receptor, por lo que sirve como un antagonista directo del receptor. Otros antagonistas pueden funcionar bloqueando la unión del ligando al receptor, p. ej., uniéndose al ligando de forma que impiden la posibilidad de unión al receptor. Otros antagonistas, p. ej., antagonistas de muteína, se pueden unir al receptor sin provocar la señalización, por lo que bloquean la unión de un agonista verdadero. Muchos de éstos pueden servir para bloquear la señal transmitida a las células de interés, específicamente las células que responden a CTACK o Vic. Estas pueden ser células cutáneas, que incluyen células de Langerhans, fibroblastos o queratinocitos. En particular, la unión al receptor indica que ciertos anticuerpos contra epítopos que interaccionan con el ligando del receptor GPR2 deberían bloquear la unión del ligando.

La información sobre la importancia de residuos particulares se determina mediante el uso de procedimientos y análisis estándar. Se realiza un análisis de mutagénesis estándar, p. ej., generando muchas variantes diferentes en posiciones determinadas, p. ej., en las posiciones identificadas anteriormente, y estudiando las actividades biológicas de las variantes. Esto se puede realizar hasta el grado de determinar las posiciones que modifican la actividad, o para centrarse en las posiciones específicas para determinar los residuos que se pueden sustituir para mantener, bloquear o modular la actividad biológica.

De forma alternativa, los análisis de las variantes naturales pueden indicar qué posiciones toleran las mutaciones naturales. Esto puede ser el resultado del análisis poblacional de las variaciones entre individuos, o entre cepas o especies. Se analizan muestras de individuos seleccionados, p. ej., mediante análisis de PCR y secuenciación. Esto permite el estudio de los polimorfismos de la población.

ID SEC Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos de GPR2 de primate.

ID SEC Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos de GPR2 de primate.

ID SEC Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos de GPR2 de roedor.

ID SEC Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos de GPR2 de roedor.

ID SEC Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos de Vic de primate.

ID SEC Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos de Vic de primate.

ID SEC Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos alternativa de Vic de primate.

ID SEC Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos alternativa de Vic de primate.

ID SEC Nº: 9 es la secuencia de nucleótidos de Vic de roedor.

ID SEC Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos de Vic de roedor.

ID SEC Nº: 11 es la secuencia de nucleótidos de CTACK de primate.

ID SEC Nº: 12 es la secuencia de aminoácidos de CTACK de primate.

ID SEC Nº: 13 es la secuencia de nucleótidos de CTACK de roedor.

ID SEC Nº: 14 es la secuencia de aminoácidos de CTACK de roedor.

ID SEC Nº: 15 proporciona una secuencia cebadora de PCR de actina de primate.

ID SEC Nº: 16 proporciona una secuencia cebadora de PCR de actina de primate.

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<110> Schering Corporation

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Usos de Quimiocina y Receptor; Composiciones; Métodos

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> DX0882X

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 1089

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<212> ADN

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<213> primate

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1086)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

2

3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> primate

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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4

5

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<210> 3

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<211> 1089

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<212> ADN

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<213> roedor

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1086)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

6

7

8

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 731

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<212> ADN

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<213> primate

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<220>

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<221> CDS

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<222> (56)..(436)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

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<222> (122)..(436)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> característica misc

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<222> (529)

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<223> V; puede ser A, C, o G

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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11

12

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<210> 6

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<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 543

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(492)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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14

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<210> 8

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<211> 164

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<212> PRT

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<213> primate

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (1)..(390)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(390)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(336)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (73)..(336)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

19

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<210> 12

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<211> 112

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<212> PRT

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<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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20

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

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<212> ADN

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<213> roedor

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<220>

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<221> CDS

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<222> (23)..(382)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

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<222> (98)..(382)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

22

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<210> 14

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<211> 120

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<212> PRT

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<213> roedor

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<400> 14

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23

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<210> 15

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> primate

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTGGCACC ACACCTTCTA CAATGAGCTG CG

\hfill

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> primate

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<400> 16

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCATACTC CTGCTTGCTG ATCCACATCT GC

\hfill

32

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LISTADO DE SECUENCIAS COMO ANEXO

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ID SEC Nº: 1 es la secuencia de nucleótidos de GPR2 de primate.

ID SEC Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos de GPR2 de primate.

ID SEC Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos de GPR2 de roedor.

ID SEC Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos de GPR2 de roedor.

ID SEC Nº: 5 es la secuencia de nucleótidos de Vic de primate.

ID SEC Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos de Vic de primate.

ID SEC Nº: 7 es la secuencia de nucleótidos alternativa de Vic de primate.

ID SEC Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos alternativa de Vic de primate.

ID SEC Nº: 9 es la secuencia de nucleótidos de Vic de roedor.

ID SEC Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos de Vic de roedor.

ID SEC Nº: 11 es la secuencia de nucleótidos de CTACK de primate.

ID SEC Nº: 12 es la secuencia de aminoácidos de CTACK de primate.

ID SEC Nº: 13 es la secuencia de nucleótidos de CTACK de roedor.

ID SEC Nº: 14 es la secuencia de aminoácidos de CTACK de roedor.

ID SEC Nº: 15 proporciona una secuencia cebadora de PCR de actina de primate.

ID SEC Nº: 16 proporciona una secuencia cebadora de PCR de actina de primate.

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<110> Schering Corporation

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<120> Usos de Quimiocina y Receptor; Composiciones; Métodos

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<130> DX0882X

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<140>

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<141>

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<160> 16

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1089

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<212> ADN

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<213> primate

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1).. (1086)

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<400> 1

24

25

26

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<210> 2

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<211> 362

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<212> PRT

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<213> primate

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<400> 2

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27

28

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<210> 3

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<211> 1089

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<212> ADN

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<213> roedor

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1086)

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<400> 3

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29

30

31

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<210> 4

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<211> 362

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<212> PRT

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<213> roedor

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 731

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (56)..(436)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (122)..(436)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (529)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> V; puede ser A, C, o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 543

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(492)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(390)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(390)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(336)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (73)..(336)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)..(382)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido mat

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (98)..(382)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> roedor

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTGGCACC ACACCTTCTA CAATGAGCTG CG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> primate

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCATACTC CTGCTTGCTG ATCCACATCT GC

\hfill

32

Claims (11)

1. El uso de un anticuerpo antagonista de quimiocina atrayente de células T cutáneas para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar la inflamación cutánea en un mamífero.

2. El uso de un anticuerpo antagonista del contractor intestinal vasoactivo para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar la inflamación cutánea en un mamífero.

3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha composición es para administración local, tópica, subcutánea, intradérmica o transdérmica.

4. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho antagonista se selecciona de:

i)

un anticuerpo que neutraliza la quimiocina atrayente de células T cutáneas o el contractor intestinal vasoactivo; o

ii)

un anticuerpo que bloquea la unión del ligando de GPR2.

5. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho mamífero es objeto de un trasplante o injerto de piel.

6. El uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho antagonista se administra en combinación con un antibiótico, analgésico, agente terapéutico inmunosupresor, fármaco antiinflamatorio, factor de crecimiento o agente inmunoadyuvante.

7. Un método in vitro para producir un complejo ligando:receptor, que comprende poner en contacto:

a)

una quimiocina atrayente de células T cutáneas de mamífero con un receptor GPR2; o

b)

un contractor intestinal vasoactivo de mamífero con un receptor GPR2; en el que al menos uno de dicho ligando o receptor es recombinante o purificado, por lo que permite que se forme dicho complejo.

8. El método de la reivindicación 7, en el que:

a)

dicho complejo da como resultado un flujo de Ca^{++};

b)

dicho receptor GPR2 está en una célula;

c)

dicha formación del complejo da como resultado un cambio fisiológico en la célula que expresa dicho receptor GPR2;

d)

dicha puesta en contacto se da en combinación con IL-2 y/o interferón-\alpha; o

e)

dicha puesta en contacto permite la detección cuantitativa de dicho ligando.

9. Un método para analizar en un compuesto la capacidad de afectar a la interacción receptor GPR2-ligando, y dicho método comprende comparar la interacción de GPR2 con el contractor intestinal vasoactivo o la quimiocina atrayente de células T cutáneas en presencia y ausencia de dicho compuesto.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho compuesto es un anticuerpo contra GPR2, el contractor intestinal vasoactivo o la quimiocina atrayente de células T cutáneas.

11. Un método para identificar una célula que expresa un receptor para quimiocina atrayente de células T cutáneas o contractor intestinal vasoactivo, que comprende permitir que una célula migre hacia la quimiocina atrayente de células T cutáneas o hacia el contractor intestinal vasoactivo, en el que se identifica que dicha célula expresa el receptor si ésta migra.