ES2239317T3

ES2239317T3 - Genes de timoquina de mamiferos.

Info

Publication number: ES2239317T3
Application number: ES95908734T
Authority: ES
Inventors: Gregory S. Kelner; Jacqueline L. Kennedy; Albert Zlotnik
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1994-02-08
Filing date: 1995-02-07
Publication date: 2005-09-16
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: DE69534178D1; JP3213946B2; EP0743983A1; DE69534178T2; US6245329B1; EP0743983B1; CA2182574A1; ATE294237T1; US5877285A; JPH09502358A; WO1995021921A1; AU1695595A; US5786210A; US5985580A; MX9603266A

Abstract

SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA TIMOQUINA DE UN MAMIFERO, REACTIVOS RELACIONADOS CON LOS MISMOS, INCLUYENDO ANTICUERPOS ESPECIFICOS Y PROTEINAS PURIFICADAS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN LOS METODOS PARA EL USO DE DICHOS REACTIVOS Y EQUIPOS DE DIAGNOSTICO ASOCIADOS.

Description

Genes de timoquina de mamíferos.

Antecedentes de la invención

El componente circulante del sistema circulatorio de los mamíferos comprende diversos tipos de células, incluyendo los glóbulos rojos y blancos de las citogenéresis eritroide y mieloide. Véase, por ejemplo, Rapaport (1987) introduction to Hematology, (2ª ed.) Lippincott, Filadelfia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA; y Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunology (3ª ed.) Raven Press, Nueva York, NY. La producción de células mieloides ocurre a través de la diferenciación y posterior asignación de citogenéresis mieloides progenitoras. La evolución a través de fases finales de diferenciación está regulada por diversas señales proporcionadas a las células, sólo una pequeña parte de las cuales ha sido identificada. Las células resultantes están incluidas, principalmente en el subconjunto de células B o en el subconjunto de células T. Se cree, en líneas generales, que el desarrollo del subconjunto de células T está estrechamente relacionado con el timo, que proporciona un medio apropiado para el desarrollo y diferenciación de los precursores de las células T. La diferenciación a partir de células germinales multipotenciales a precursores de células T asignados y desarrollo a células T funcionalmente maduras proporciona diversos subconjuntos de células T que muestran funciones inmunológicas especializadas. Esta diferenciación y procesos de desarrollo parecen ocurrir a lo largo de toda la vida de un individuo.

El timo contiene una población poco común de células progenitoras multipotenciales primitivas, por ejemplo, células germinales, que tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier célula T madura encontrada más tarde en la circulación periférica. Las células germinales pueden proliferar y generar células con casi idéntica capacidad (autorrenovación) o iniciar una ruta de diferenciación de volverse más restringida en la producción de tipos particulares de células, convirtiéndose finalmente en una célula con una función sumamente especializada.

Los precursores más inmediatos de los progenitores de las células T son de especial interés porque pueden servir como una reserva de células disponibles para diferenciación a células T más maduras cuando es necesario o apropiado. Tales necesidades pueden aparecer por pérdida de sangre, enfermedades inmunocomprometidas a corto o largo plazo o problemas similares, por ejemplo, como resultado de una quimioterapia o radioterapia. Alternativamente, enfermedades de producción excesiva de células T, por ejemplo trastornos proliferativos de células mieloides, pueden resultar de una regulación anormal por factores que estimulan el desarrollo celular.

Se han identificado muchos factores que influyen en el proceso de diferenciación celular de las células T precursoras, incluyendo los kits de ligando de citocinas c, IL-4 e IL-7. Véanse, por ejemplo, Godfrey, et al (1992) J. Immunol. 149: 2281-2285; y Suda y Zlotnik (1991) J. Immunol. 146: 3068-3073. Estas citocinas estimulan las fases tempranas de la diferenciación de las células mieloides in vitro, pero sólo las últimas han demostrado ser necesarias para estimular la diferenciación de las células T in vivo.

Estas observaciones indican que existen otros factores cuyas funciones en hematopoyesis Nº eran reconocidas hasta el momento. Estos factores proporcionan actividades biológicas cuyo espectro de efectos es distinto de los factores de diferenciación o activación conocidos. La ausencia de conocimiento sobre las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de los factores reguladores que regulan la fisiología de las células T in vivo impide la modificación de los efectos de tales factores. De esta forma, las dolencias médicas en las que se requiere la regulación del desarrollo o fisiología de células relevantes permanece imposible de controlar.

Las quimiocinas son una superfamilia grande y variada de proteínas. La superfamilia se divide en dos ramas, basándose en si las primeras dos cisteínas en la quimiocina tema son adyacentes (calificada como rama "C-C") o separadas por un resto intermedio ("C-X-C"). Véase Lindley et al. Immunology Today 14: 24 (1993). La presente invención pone de manifiesto la existencia de una clase de quimiocinas previamente desconocida que se califican por la presente como timocinas. Las timocinas sólo tienen una única cisteína en la región correspondiente del motivo de la quimiocina. Basado tanto en la cartografía cromosómica como en el análisis de la secuencia de las dos proteínas de timocinas linfotactinas descritas a continuación, mostramos que las timocinas Nº pertenecen a la familia de quimiocinas C-C o C-X-C. Representan el primer miembro de una nueva clase de quimiocinas denominadas timoquinas o, alternativamente, la familia C de quimiocinas. Se presentan estudios quimiotácticos que sugieren que las timoquinas linfotactinas muestran funciones que son específicas de los linfocitos. Como tales, son el primer ejemplo de quimiocinas específicas de linfocitos.

Compendio de la invención

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de una nueva familia de genes calificados timoquinas que codifican proteínas con lejana similitud con las quimiocinas C-C y C-X-C. Las timocinas se encontraron originariamente en subconjuntos de células encontradas en el timo. Estos subconjuntos se aislaron basándose en su expresión de las moléculas de la superficie celular, que indicaba que estas células T (es decir, los timocitos CD44^{+} CD25^{+} CD3^{-} CD4^{-} CD8^{-}) estaban experimentando fases críticas en la diferenciación o que representan otro linaje específico de células T cuyas funciones permanecen sin definir (es decir, células T CD4^{-} CD8^{-} \alpha\betaTcR^{+}). Los genes y proteínas de timocinas presentados en la presente memoria definen una clase sin identificar hasta el momento de proteínas pequeñas similares a las quimiocinas.

La presente invención proporciona métodos para modular la fisiología o desarrollo de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con un agonista o antagonista de una timoquina. En realizaciones preferidas, el antagonista es un anticuerpo que se une específicamente a una timoquina de un mamífero, como la linfotactina humana, o la linfotactina de ratón.

La presente invención describe un ácido nucleico que codifica una timoquina de un mamífero o su fragmento. Se describen varias realizaciones específicas en la descripción detallada y los ejemplos, incluyendo las secuencias de proteínas de linfotactinas y ácidos nucleicos de ratón y ser humano que aparecen de forma natural y los ácidos nucleicos de timocina organizados genéticamente que se alteraron para crear sitios de clonación específicos. Como se describe en la presente memoria, todas estas moléculas comparten propiedades biológicas similares, incluyendo las moléculas de linfotactina de ratón y ser humano, que son idénticas sólo en aproximadamente el 60% en el nivel de aminoácido. Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención comprenden una secuencia de, al menos, 25 nucleótidos similares en al menos un 90% a una secuencia de SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3; al menos, 50 nucleótidos similares en al menos un 80% a una secuencia de SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 3; similares en al menos un 90% a la secuencia de SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 32 al 352; similares en al menos un 90% a la secuencia de SEQ ID Nº 3 desde el nucleótido 15 al 334; similares en al menos un 90% a la secuencia de SEQ ID Nº 1 desde el nucleótido 92 al 352; similares en al menos un 90% a la secuencia de SEQ ID Nº 3 desde el nucleótido 75 al 334; codificados por la secuencia codificante de la inserción en el clon m3C9; o codificados por la secuencia codificante de la inserción en el clon A10-4.

En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a una timocina. En diversas realizaciones la timocina es una proteína de mamífero, incluyendo proteínas de ratón y humanas; el anticuerpo se genera contra un péptido de al menos 10 aminoácidos con una secuencia de SEQ ID Nº 2 o SEQ ID Nº 4; el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; o el anticuerpo está marcado.

La invención proporciona también una timocina básicamente pura o fragmento de péptido de la misma, o una proteína de fusión que comprende secuencia de timocina. En diversas realizaciones, la timocina o fragmento de péptido de la misma es de un animal de sangre caliente seleccionado del grupo de aves y mamíferos, incluyendo seres humanos y ratones; el polipéptido comprende al menos un segmento de polipéptido de al menos 15 aminoácidos de la SEQ ID Nº 2 o SEQ ID Nº 4; un polipéptido que comprende una secuencia que muestra al menos un 90% de identidad respecto a una secuencia de proteínas desde el aminoácido 1 al 19 de la SEQ ID Nº 2; un polipéptido que comprende una secuencia que muestra al menos un 90% de identidad respecto a una secuencia de proteínas desde el aminoácido 1 al 19 de la SEQ ID Nº 4; un polipéptido que comprende una secuencia que muestra al menos un 80% de identidad respecto a una secuencia de proteínas desde el aminoácido 21 al 113 de la SEQ ID Nº 2; un polipéptido que comprende una secuencia que muestra al menos un 80% de identidad respecto a una secuencia de proteínas desde el aminoácido 21 al 113 de la SEQ ID Nº 4; un polipéptido que comprende una secuencia que muestra al menos un 80% de identidad respecto a una secuencia de proteínas desde el aminoácido 56 al 83 de la SEQ ID Nº 2; un polipéptido que comprende una secuencia que muestra al menos un 80% de identidad respecto a una secuencia de proteínas desde el aminoácido 56 al 83 de la SEQ ID Nº 4; y la timocina o péptido muestra una pauta de modificación después de la traducción distinta de las timocinas naturales de mamíferos.

Preferentemente, la timocina, en la posición que corresponde al resto 57 de la linfotactina de ratón o ser humano, es hidrófoba, por ejemplo, alanina; al resto 58 es hidrófoba, por ejemplo, valina, leucina, o isoleucina; al resto 59 es hidrófoba, por ejemplo, isoleucina o valina; al resto 60 es fenilalanina; al resto 62 es un OH que contiene resto, por ejemplo, treonina o serina; al resto 63 es hidrófila (lisina o arginina); al resto 64 es hidrófila, por ejemplo, lisina o arginina; al resto 65 es glicina; al resto 66 es leucina; al resto 67 es hidrófila, por ejemplo, lisina, glutámico, o glutamina; al resto 68 es hidrófoba, por ejemplo, isoleucina, valina, o alanina; al resto 69 es cisteína; al resto 70 es alanina; al resto 71 es aspártico; al resto 72 es prolina; y que corresponde a la linfotactina de ratón, al resto 75 es hidrófila, por ejemplo, lisina, o arginina; al resto 76 es triptófano; al resto 77 es valina; al resto 78 es hidrófila, por ejemplo, lisina, glutamina, o arginina; al resto 84 es hidrófoba, por ejemplo, valina o leucina; y/o al resto 85 está cargada negativamente, por ejemplo, aspártico o glutámico.

Las proteínas de linfotactina de ratón y ser humano comparten un 60% de la identidad de aminoácidos. Se espera que las proteínas de timocina derivadas de animales relacionados más estrechamente con los ratones, como los roedores, tengan mayor similitud con la linfotactina de ratón que la linfotactina del ser humano descrita en la presente memoria. A la inversa, especies relacionadas más estrechamente con los seres humanos, como los primates, tendrán proteínas de timocina con mayor similitud de secuencia con la linfotactina del ser humano que tiene la linfotactina de ratón descrita. Debe destacarse que, a pesar de la divergencia evolutiva de la linfotactina de ratón y ser humano, las proteínas comparten propiedades biológicas.

Otras características de la invención proporcionan un kit que comprende un ácido nucleico que codifica una timocina o fragmento de péptido de la misma; un anticuerpo o receptor que se une específicamente a una timocina; o una timocina básicamente pura o fragmento de la misma. Por ejemplo, se proporciona un anticuerpo que es específicamente inmunorreactivo con una proteína codificada por el polipéptido de la SE ID Nº 2 o SEQ ID Nº 4. Tales kits pueden incluir también instrucciones, embalaje de componentes en contenedores y otras variantes similares.

La presente invención proporciona una proteína de timocina aislada, en la que dicha proteína de timocina se une específicamente a un anticuerpo generado contra un inmunógeno como los polipéptidos descritos por la SEQ ID Nº 2 y la SEQ ID Nº 4. La proteína de timocina induce una respuesta quimiotáctica dependiente de la dosis por los timocitos en un análisis de la quimiotaxia de la célula de timocina. La proteína de timocina Nº induce una respuesta quimiotáctica dependiente de la dosis en células THP-1 humanas en el análisis de quimiotaxia de la célula de timocina, ni induce un flujo intracelular de Ca^{+2} en células THP-1 humanas en un análisis del flujo intracelular de Ca^{+2}. El análisis de la quimiotaxia de la célula y los análisis del Ca^{+2} intracelular se describen en detalle en los ejemplos a continuación. Proteínas de timocina especialmente preferidas incluyen la linfotactina de ratón y la linfotactina humana, como se describe, por ejemplo, en la SEQ ID Nº 2 y SEQ ID Nº 4. La proteína de timocina puede producirse de forma recombinante o darse de forma natural.

Esta invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de timocina. El ácido nucleico es capaz de hibridarse selectivamente con el ácido nucleico mostrado en la SEQ ID Nº 1 o la SEQ ID Nº 3 en presencia de ADN competitivo como una biblioteca genómica humana, en condiciones de hibridación restrictivas. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica una proteína de timocina se hibrida selectivamente con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº 3 en condiciones de hibridación de 42ºC y formamida al 50% y permanece unido al ácido nucleico de la SEQ ID Nº 3 en condiciones de lavado de 2x citrato de sodio, cloruro de sodio (SSC) y dodecilsulfato de sodio al 0,1% (SDS) a 65ºC durante, al menos, 20 minutos. La secuencia de ácidos nucleicos puede codificar, por ejemplo, un polipéptido de timocina con una identidad de secuencia completa respecto a una proteína de timocina que aparece de forma natural. El ácido nucleico puede codificar también un polipéptido de timocina que no es idéntico a un polipéptido que aparece de forma natural, como una proteína de fusión de timocina, o una proteína mutante de timocina organizada genéticamente que retiene las bases críticas para la función o capacidad inmunógena de la timocina como se describe en la presente memoria.

La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de timocina, en el que la proteína de timocina se une específicamente a un anticuerpo generado contra un inmunógeno polipéptido generado a partir del polipéptido de las SEQ ID Nº 2 y SEQ ID Nº 4. El ácido nucleico aislado incluye los ácidos nucleicos de las SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 3. El ácido nucleico aislado puede codificar un polipéptido de timocina con una identidad de secuencia completa respecto a una proteína de timocina que aparece de forma natural, o puede codificar uno de sus fragmentos con la capacidad inmunógena especificada anteriormente.

Ejemplos de ácidos nucleicos aislados incluyen el ácido nucleico que codifica las proteínas de timocina que abarcan el polipéptido de las SEQ ID Nº 2 y SEQ ID Nº 3, y sus variantes organizadas genéticamente descritas en los ejemplos siguientes.

El ácido nucleico aislado que codifica la proteína de timocina descrito anteriormente puede usarse para transinfectar una célula para generar copias adicionales del ácido nucleico aislado (a través de la clonación, usando técnicas estándar) o para producir la proteína de timocina que él codifica (por ejemplo, en un sistema de expresión estándar). Por ejemplo, la célula puede ser transinfectada con una secuencia de polinucleación como la que se describe en la SEQ ID Nº 1 o la SEQ ID Nº 3, o una secuencia organizada para facilitar la clonación o expresión, por ejemplo, como se describe en los ejemplos a continuación.

La invención proporciona un método de detectar una proteína de timocina en una muestra biológica poniendo en contacto un agente de unión que tiene afinidad por una proteína de timocina con la muestra biológica; incubando el agente de unión con la muestra biológica para formar un de complejo agente de unión:proteína de timocina y detectando dicho complejo. La muestra biológica puede derivarse de cualquier fuente natural u organizada genéticamente, como tejido humano o de otro mamífero, cultivo de tejido o tejido de un no mamífero. El agente de unión puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, una proteína que se une a una timocina como una molécula de receptor de timocina, o un polímero como una matriz de afinidad, hidrato de carbono o lípido. La detección puede transcurrir por cualquier método conocido, como inmunotransferencia, transferencia Western, análisis de movilidad de gel, fluorescencia en pruebas de hibridación in situ (FISH), seguimiento de marcadores radiactivos o bioluminiscentes, resonancia magnética nuclear, resonancia paramagnética electrónica, espectroscopía de detención de flujo, cromatografía en columna, electroforesis capilar, u otros métodos que sigan una molécula basados en una alteración del tamaño y/o la carga.

La presente invención proporciona un método para detectar anticuerpos reactivos con una proteína de timocina en una muestra biológica poniendo en contacto una composición que contiene proteína de timocina recombinante o aislada con la muestra biológica; incubar la composición con la muestra biológica para formar un complejo de anticuerpo:proteína de timocina; y detectar el complejo, por ejemplo, por los métodos descritos anteriormente.

Las sondas de ácido nucleico capaces de hibridarse selectivamente con un ácido nucleico que codifica una proteína de timocina se describen en la presente memoria. La sonda de ácido nucleico unirá, por ejemplo, el ácido nucleico de la SEQ ID Nº 1 y/o el ácido nucleico de la SEQ ID Nº 3.

La presente invención proporciona un método de detectar un ácido nucleico que codifica una proteína de timocina en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse selectivamente con el ácido nucleico; incubar la sonda de ácido nucleico con la muestra biológica para formar un híbrido de la sonda del ácido nucleico con secuencias de ácido nucleico complementarias presentes en la muestra biológica; y determinar la extensión de la hibridación de la sonda del ácido nucleico con las secuencias de ácido nucleico complementarias por técnicas estándar como el análisis Southern, el análisis Northern y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La sonda de ácido nucleico es capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica una proteína como el polipéptido de la SEQ ID Nº 2 o el polipéptido de la SEQ ID Nº 4.

Descripción de la figura

La Figura 1 muestra el alineamiento de una secuencia de una secuencia de aminoácidos de linfotactina de ratón (LTn) con la quimiocina C-X-C Gro \alpha (Gro) y la quimiocina C-C proteína macrófago inflamatoria 1\beta (Mip-1\beta).

Descripción detallada de la invención I. General

La presente invención proporciona secuencias de ADN que codifican proteínas de mamíferos que muestran propiedades estructurales características de una citocina o una quimiocina. Para una revisión de la familia de quimiocinas véanse por ejemplo, Lodi et al (1994) Science 263: 1762-1767; Gronenborn y Clore (1991) Protein Engineering 4: 263-269; Miller y Kranger (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 2950-2954; Matsushima y Oppenheim (1989) Cytokine 1: 2-13; Stoeckle y Baker (1990) New Biol. 2: 313-323; Oppenheim et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 617-648; Schall (1991) Cytokine 3: 165-183; y The Cytokine Handbook, Academic Press, NY. Estas proteínas se denominan timocinas debido a que se encontraron inicialmente en subconjuntos de células del timo, por ejemplo, timocitos, y se caracterizaron como proteínas que muestran características estructurales de quimiocinas. El marcador no implica que las moléculas tengan actividad biológica directa sobre los timocitos. Estudios iniciales localizaron una timocina en una subpoblación de células que se creía que eran progenitoras de células T primitivas sin asignar. Una citogenéresis T separada, las células (CD4^{-} CD8^{-} \alpha\betaTCR^{+}) receptoras de células T CD4^{-} CD8^{-} \alpha\beta, expresaban también un mensaje que codificaba esta proteína. De esta forma, el gen derivaba de forma independiente de dos subpoblaciones diferentes de células.

La realización mejor caracterizada de esta familia de proteínas se descubrió en el ratón y se denominó linfotactina de ratón. Se describe también en la presente memoria una timocina adicional encontrada en los seres humanos, denominada linfotactina humana. Las descripciones siguientes están dirigidas, con intenciones de ejemplo, a las linfotactinas humana y de ratón, pero se pueden aplicar probablemente a realizaciones relacionadas de otras fuentes.

Las proteínas de timocina de la presente invención se definen por sus propiedades fisicoquímicas y biológicas. Las propiedades biológicas de las timocinas de ratón y humanas descritas en la presente memoria, por ejemplo, linfotactina de ratón y linfotactina humana, se definen en la presente memoria por su tamaño, secuencia de aminoácidos y propiedades biológicas en los análisis biológicos especificados. A pesar de compartir propiedades biológicas, las moléculas de linfotactina humanas y de ratón son idénticas sólo en un 60% y de esta forma, alguien con experiencia reconocerá rápidamente que hay un número mayor de sustituciones de aminoácidos, deleciones e inserciones de las que pueden hacerse sin alterar sustancialmente la actividad biológica de la molécula. Esta descripción enseña al experto que los aminoácidos pueden cambiarse sin afectar la actividad biológica de la molécula.

Las timocinas están presentes en tipos de tejido específicos y la interacción de la proteína con un receptor es importante para mediar en diversos aspectos de la fisiología o desarrollo celular. Los tipos celulares que expresan timocinas que codifican mensaje sugieren que las señales importantes en la diferenciación y desarrollo celular son mediadas por ellos. Véase, por ejemplo, Gilbert (1991) Developmental Biology (3d ed.) Sinauer Associates, Sunderland, MA; Browder et al. (1991) Developmental Biology (3ª ed.) Saunders, Philadelphia, PA; Russo et al (1992) Development: The Molecular Genetic Approach Springer-Verlag, New York, NY; y Wilkins (1993) Genetic Analysis of Animal Development (2ª ed.) Wiley-Liss, New York, NY. Además, la expresión de la timocina sirve como un medio para definir ciertas subpoblaciones de células.

La citocina que produce células T (Pro T) del perfil del progenitor se elucida en la presente memoria. Mientras se identificaba sistemáticamente una biblioteca de ADNc generada a partir de células Progenitoras T de ratón activadas, se descubrió una citocina novedosa, denominada linfotactina de ratón. La linfotactina de ratón mostraba una lejana similitud con miembros tanto de las familias de quimiocinas C-C como C-X-C, a las que les faltaban dos de las cuatro cisteínas características de las quimiocinas. La linfotactina se expresa de forma abundante en células T CD8^{+} y timocitos CD4^{-} CD8^{-} \alpha\betaTCR^{+} activados. De forma significativa, tiene actividad quimiotáctica en los linfocitos, pero no en los monocitos o neutrófilos. A diferencia de los genes de quimiocinas C-C o C-X-C, la cartografía génica o la cromosómica de la linfotactina de ratón, sugieren además que es evolutivamente distinta de las dos superfamilias de quimiocinas conocidas. Tomadas en conjunto, estas observaciones muestran que la timocina representa una adición novedosa ala superfamilia de las quimiocinas.

II. Definiciones

La terminología "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad a una timocina, por ejemplo, de una manera tipo ligando-receptor, una interacción antígeno anticuerpo, o compuestos por ejemplo, proteínas que se asocian específicamente con timocinas. En líneas generales, la asociación será en una interacción natural proteína-proteína fisiológicamente relevante, covalente o no covalente, y puede incluir miembros de un complejo multiproteína, que incluyen compuestos transportadores o copartícipes de dimerización. La molécula puede ser un polímero, o reactivo químico. No está necesariamente representada implicación en cuanto a si la timocina es el ligando o el receptor de una interacción ligando-receptor, distinta de si la interacción muestra especificidad similar, por ejemplo, afinidad específica. Un análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales o puede ser una moléculas sin ninguna relación, por ejemplo, que tiene un forma molecular que interacciona con los determinantes de unión del ligando apropiados. Los ligandos pueden servir de agonistas o antagonistas del receptor, véase, por ejemplo, Goodman et al. (eds.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press, Tarrytown, NY.

La terminología "complejo de agente de unión:proteína de timocina" como se usa en la presente memoria, se refiere a un complejo de un agente de unión y una proteína de timocina que se forma por la unión específica del agente de unión a la proteína de timocina. Unión específica del agente de unión significa que el agente de unión tiene un sitio de unión específica que reconoce un sitio en la proteína de timocina. Por ejemplo, anticuerpos generados para una proteína de timocina y que reconocen un epítopo en la proteína de timocina son capaces de formar un complejo de agente de unión:proteína de timocina por unión específica. En líneas generales, la formación de un complejo de agente de unión:proteína de timocina permite la medida de la proteína de timocina en una mezcla de otras proteínas y productos biológicos. La terminología "complejo de anticuerpo:proteína de timocina" se refiere a un complejo de agente de unión:proteína de timocina en el que el agente de unión es un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o incluso un fragmento de unción de un anticuerpo.

Cuando se comparan secuencias de ácidos nucleicos "homólogos", muestran una similitud considerable. Los patrones para homología en ácidos nucleicos son medidas para homología que se usan, en general, en la técnica por comparación de secuencias y/o relación filogénica, o que se basan en condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con más detalle a continuación.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN, o una mezcla de polímeros, que está básicamente separado de otros componentes que acompañan de forma natural una secuencia natural, por ejemplo, proteínas y secuencias genómicas que la flanquean, de las especies que las originan. El término abarca una secuencia de ácidos nucleicos que se ha eliminado del medio en el que aparece de forma natural e incluye ADN recombinante o clonado aislado y análogos sintetizados químicamente sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye formas aisladas de la molécula. Un ácido nucleico aislado será, en líneas generales, una composición homogénea de moléculas, pero, en algunas realizaciones, contendrá menor heterogeneidad. Esta heterogeneidad se encuentra, en general, en los extremos o porciones del polímero no críticos para una función o actividad biológicamente deseada.

Como se usa en la presente memoria, la terminología "proteína de timocina" englobará, cuando se usa en el contexto de una proteína, una proteína que tiene secuencias de aminoácidos de ratón mostradas en la SEQ ID Nº 2, o SEQ ID Nº 4, o un fragmento significativo de tal proteína. Se refiere a un polipéptido que muestra una función biológica similar a las linfotactinas de ratón o humanas, como se determinó por los análisis descritos en los ejemplos siguientes, y que interacciona con componentes de unión específica de la timocina. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, se unen, en general, a una timocina con una afinidad elevada, por ejemplo, al menos 100 nM, habitualmente mejor de aproximadamente 30 nM, preferentemente mejor de 10 nM y más preferentemente mejor de aproximadamente 3 nM.

El término "polipéptido" o "proteína" como se usa en la presente memoria incluye un fragmento o segmento significativo de una timocina y engloba un tramo de restos de aminoácido de, al menos, aproximadamente 8 aminoácidos y se extiende en longitud desde 10 aminoácidos, 12 aminoácidos, 14 aminoácidos, 16 aminoácidos, 18 aminoácidos, 20 aminoácidos, 22 aminoácidos, 24 aminoácidos, 26 aminoácidos, 28 aminoácidos, y, en realizaciones especialmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos.

Un ácido nucleico "recombinante" se define por su método de producción o por su estructura. Respecto a su método de producción, por ejemplo, un producto fabricado por un procedimiento, el procedimiento se usa en técnicas recombinantes de ácidos nucleicos, por ejemplo, que implican intervención humana en la secuencia de nucleótidos, en líneas generales, selección o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico fabricado generando una secuencia que comprende la fusión de dos fragmentos que no son contiguos el uno con el otro de forma natural, pero se supone que se excluyen los productos de la naturaleza, por ejemplo, los mutantes que aparecen de forma natural. De esta forma se engloban, por ejemplo, productos fabricados transformando células con cualquier vector que no aparece de forma natural, como son los ácidos nucleicos que comprenden derivados de secuencias que usan cualquier procedimiento de oligonucleótidos sintéticos. Esto se hace con frecuencia para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica la misma o un aminoácido conservante, mientras que, generalmente, se introduce o se elimina un sitio de reconocimiento de una secuencia. Alternativamente, se realiza para unir segmentos de ácidos nucleicos con funciones deseadas para generar una entidad genética única que comprende una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción son, con frecuencia, el objetivo de tales manipulaciones artificiales, pero pueden incorporarse por diseño otros sitios objetivos específicos, por ejemplo, promotores, sitios de replicación del ADN, secuencias de regulación, secuencias de control, u otras características útiles. Un concepto similar se destina para un recombinante, por ejemplo, polipéptido de fusión. Se incluyen específicamente los ácidos nucleicos sintéticos que, por redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares a fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de diversas variantes de especies diferentes.

La "solubilidad" se refleja por la sedimentación medida en unidades de Svedberg, que son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula en condiciones especiales. La determinación de la velocidad de sedimentación se realizaba clásicamente en una ultracentrifugadora analítica, pero ahora se realiza generalmente en una ultracentrifugadora estándar. Véanse, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2ª ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical Chemistry partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Como una determinación en bruto, una muestra que contiene un polipéptido supuestamente soluble se da vueltas en una centrifugadora grande a aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble será generalmente menor de aproximadamente 30S, más generalmente menor de aproximadamente 15S, normalmente menor de aproximadamente 10S, más normalmente menor de aproximadamente 6S y, en realizaciones particulares, preferentemente menor de aproximadamente 4S y más preferentemente menor de aproximadamente 3S.

La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del entorno y del polipéptido. Muchos parámetros afectan la solubilidad de un polipéptido, incluyendo temperatura, entorno de electrolitos, tamaño y características moleculares del polipéptido y naturaleza del disolvente. En líneas generales, la temperatura a la que se usa el polipéptido está en el intervalo de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 6ºC. Normalmente la temperatura de uso es mayor de aproximadamente 18ºC y más normalmente mayor de aproximadamente 22ºC. Para propósitos diagnósticos, la temperatura será, normalmente, aproximadamente la temperatura ambiente o más cálida, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes del análisis. Para propósitos terapéuticos, la temperatura será normalmente la temperatura corporal, en general 37ºC para seres humanos, aunque en ciertas situaciones la temperatura puede elevarse o bajarse in situ o in vitro.

El tamaño y estructura del polipéptido deberá estar generalmente en un estado básicamente estable y, por lo general, no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes de una forma que se aproxima a las interacciones bicapa naturales de los lípidos.

El disolvente será, por lo general, un tampón compatible biológicamente, o un tipo usado para conservación de actividades biológicas, y se aproximará normalmente a un disolvente fisiológico. Por lo general, el disolvente tendrá un pH neutro, en general entre aproximadamente 5 y 10 y preferentemente aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones se añadirá un detergente, en líneas generales uno suave no desnaturalizante, por ejemplo, CHS o CHAPS, o una concentración suficientemente baja para evitar una perturbación importante de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

"Básicamente puro" significa, en líneas generales, que la proteína está aislada de otras proteínas contaminantes, ácidos nucleicos y otros productos biológicos derivados del organismo fuente original. La pureza, o "aislamiento" pueden analizarse por métodos estándar, y por lo común variará desde puro al 50%, puro al 60%, puro al 70%, puro al 80%, puro al 85%, puro al 90%, puro al 95% y en las realizaciones más preferidas al menos puro al 99%.

"Similitud considerable" en el contexto de comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que el segmento, o sus cadenas complementarias, cuando se comparan, son idénticos cuando están alineados óptimamente, con las inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente un 50% de los nucleótidos, y preferentemente el porcentaje es mayor, variando desde, generalmente, al menos 56%, 59%, 62%, 65%, 68%, 71%, 74%, 77%, 80%, 85%, 90%, más preferentemente al menos aproximadamente 95% a 98% o más, y en realizaciones especiales, tan elevado como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos.

Alternativamente, existe una similitud considerable cuando los segmentos se hibridan, en condiciones de hibridación selectivas, con una cadena o su complemento, por regla general usando una secuencia derivada de la SEQ ID Nº 1 o la SEQ ID Nº 2. por regla general, la hibridación selectiva ocurre cuando hay al menos aproximadamente 55% de similitud sobre un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 65% sobre un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 65% sobre un tramo de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferentemente al menos aproximadamente 75%, y lo más preferentemente al menos aproximadamente 90% sobre aproximadamente 20 nucleótidos. Véase Kenhisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203-213. La longitud de la comparación de similitud, como se ha descrito, puede ser sobre tramos más largos, y en ciertas realizaciones será sobre un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, 24 nucleótidos, 28 nucleótidos, 40 nucleótidos, 50 nucleótidos y más preferentemente al menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos.

"Condiciones restrictivas" en referencia a la homología o similitud considerable en el contexto de hibridación, serán condiciones restrictivas combinadas de sal, temperatura, disolventes orgánicos y otros parámetros, por regla general aquéllos controlados en las reacciones de hibridación. La combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro aislado. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370. Una sonda de ácido nucleico que se une a un ácido nucleico objetivo en condiciones restrictivas es específica para dicho ácido nucleico objetivo. Tal sonda tiene, por regla general, una longitud mayor de 11 nucleótidos, y es suficientemente idéntica o complementaria a un ácido nucleico objetivo sobre la región especificada por la secuencia de la sonda para unirse al objetivo en condiciones restrictivas de hibridación.

Las timocinas de otras especies de mamíferos pueden clonarse y aislarse por hibridación de especies cruzadas de especies estrechamente relacionadas. Véase, por ejemplo, a continuación. La similitud puede ser relativamente baja entre especies relacionadas de forma lejana, y de esta forma es aconsejable la hibridación de especies relativamente relacionadas estrechamente. Alternativamente, puede ser útil la preparación de una preparación de un anticuerpo que muestra menos especificidad de especie en los enfoques de expresión de clonación.

La frase "se une específicamente a un anticuerpo" o "específicamente inmunorreactivo con", cuando hacen referencia a una proteína o péptido, se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. Así, condiciones de inmunoanálisis señaladas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular y no se unen de forma significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona para su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, anticuerpos generados para el inmunógeno de la proteína de linfotactina de ratón con la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID Nº 2 pueden seleccionarse para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con proteínas de timocina y no con otras proteínas. Estos anticuerpos reconocen proteínas sumamente similares a la proteína de linfotactina de ratón homóloga.

III. Ácidos nucleicos

La timocina de ratón es ejemplo de una clase mayor de proteínas relacionadas estructuralmente y funcionalmente. Estas proteínas solubles sirven para transmitir señales entre diferentes tipos de células, por ejemplo, entre progenitores de células T y células estroma. Las realizaciones preferidas, como se ha descrito, serán útiles en procedimientos estándar para aislar genes de otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de proteínas relacionadas a partir de ejemplares, estirpes o especies. Están disponibles varios planteamientos con éxito diferentes para aislar un clon adecuado de un ácido nucleico basados en la información proporcionada en la presente memoria. Los estudios de hibridación de la transferencia Southern han identificado genesinas homólogas de genomas humanos, de mono, rata, perro, vaca y conejo en condiciones de hibridación de 65ºC 2X SSC y SDS al 0,1%.

Una proteína purificada o péptidos determinados son útiles para generar anticuerpos por métodos estándar, como se describe a continuación. Un sistema inmunitario pueden exponerse a péptidos sintéticos o proteínas purificadas para generar anticuerpos monoclonales y policlonales. Véanse, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY. Alternativamente, un receptor de timocina puede ser útil como un reactivo de unión específico y se puede aprovechar esta especificidad de unión, por ejemplo, para purificación de un ligando o receptor de timocina.

La composición de unión específica puede usarse para detección sistemática de una biblioteca de expresión fabricada a partir de una estirpe celular que expresa una timocina. Están disponibles muchos métodos para la detección sistemática, por ejemplo, tinción estándar de superficie de ligando expresado, o por separación celular por "panning". La detección sistemática de la expresión intracelular puede realizarse también por diversos métodos de tinción o procedimientos de fluorescencia. Las composiciones de unión pueden usarse para purificar por afinidad u organizar células que expresan el ligando.

Los segmentos de péptido, junto con la comparación a genes homólogos, puede usarse también para producir oligonucleótidos apropiados para detectar sistemáticamente una biblioteca. El código genético puede usarse para seleccionar oligonucleótidos apropiados útiles como sondas para detección sistemática. Junto con las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), oligonucleótidos sintéticos pueden ser útiles para seleccionar clones deseados a partir de una biblioteca.

Las secuencias complementarias se usarán también como sondas o cebadores. Basado en la identificación del probable amino terminal, otros péptidos deberían ser especialmente útiles, por ejemplo, acoplados con técnicas de PCR de complementarias de vector anclado o poli-A o con ADN complementario de otros péptidos.

Hay diversos métodos para aislar las secuencias de ADN que codifican proteínas de timocina. Por ejemplo, el ADN se aísla a partir de una biblioteca genómica o de ADNc usando sondas de oligonucleótidos marcados que tienen secuencias idénticas o complementarias a las secuencias descritas en la presente memoria. Pueden usarse sondas completas o pueden generarse sondas de oligonucleótidos por comparación de las secuencias descritas. Tales sondas pueden usarse directamente en pruebas de hibridación para aislar ADN que codifica proteínas de timocina, o se pueden diseñar sondas para usarse en técnicas de amplificación como la PCR, para el aislamiento de AN que codifica proteínas de timocina.

Para preparar una biblioteca de ADNc, se aísla ARNm de células que expresan una proteína de timocina. El ADNc se prepara a partir del ARNm y se liga en un vector recombinante. El vector se transinfecta en un anfitrión recombinante para la propagación, detección sistemática y clonación.

Para una biblioteca genómica, el ADN puede extraerse de tejido y cizallarse mecánicamente o digerirse enzimáticamente para dar fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. Los fragmentos se separan entonces por centrifugación en gradiente y se clonan en vectores lambda bacteriófagos. Estos vectores y fagos se envasan in vitro. Los fagos recombinantes se analizan por hibridación en placa como se describe en Benton y Davis (1977) Science 96: 180-182. La hibridación de colonias se realiza, en líneas generales, como se describe en, por ejemplo, Grunstein et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72: 3961-3965.

El ADN que codifica una proteína de timocina puede identificarse en ADNc o bibliotecas genómicas por su capacidad para hibridarse con las sondas de ácido nucleico descritas en la presente memoria, por ejemplo en experimentos de hibridación de colonias o placas. Las regiones de ADN correspondientes se aíslan por métodos estándar familiares para aquellos expertos habituales en la técnica.

Pueden usarse también diversos métodos para aumentar secuencias objetivo, como la PCR, para preparar ADN que codifica proteínas de timocina. La tecnología de la PCR se usa para aumentar tales secuencias de ácidos nucleicos directamente a partir de ARNm, de ADNc y de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. Las secuencias aisladas que codifican proteínas de timocina pueden usarse también como plantillas para la amplificación de la PCR.

En las técnicas de la PCR, se sintetizan los cebadores de oligonucleótidos complementarios a dos regiones 5' en la región del ADN a ser aumentada. La reacción en cadena de la polimerasa se realiza entonces usando los dos cebadores. Los cebadores pueden seleccionarse para aumentar las regiones completas que codifican una proteína de timocina completa o para aumentar como se desea fragmentos de ADN más pequeños. Una vez tales regiones se aumentan por la PCR, pueden secuenciarse y pueden preparase las sondas de oligonucleótidos a partir de la secuencia obtenida usando técnicas estándar. Estas sondas pueden usarse entonces para aislar ADNs que codifican proteínas de timocina

Los oligonucleótidos para usarse como sondas se sintetizan químicamente según el método del triéster de fosforamidito en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22(20): 1859-1862, o usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168. La purificación de oligonucleótidos se realiza, por ejemplo, por electroforesis en gel de acrilamida natural o por HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson y Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137-149. La secuencia de los oligonucleótidos sintéticos puede verificarse usando el método de degradación química de Maxam, A.M. y Gilbert, W. en Grossman, L. y Moldave (eds.) (1980) Methods in Enzymology 65: 499-560 Academic Press, Nueva York.

Se aisló y secuenció un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de timocina de ratón. Este clon se ha denominado m3C9 y se depositó el 28 de febrero, en la A.T.C.C. con el número de registro 69574, y su secuencia de nucleótidos y correspondiente marco de lectura abierto se proporcionan en las SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2. Por consiguiente, se aisló un clon humano, denominado A10-4 y se describió en las SEQ ID Nº 3 y SEQ ID Nº 4 y se depositó el 19 de abril de 1994 en la A.T.C.C. con número de registro 69608.

Estas timocinas tienen una similitud limitada a porciones de quimiocinas. Véase, por ejemplo, Matsushima y Oppenheim (1989) Cytokine 1: 2-13; Oppenheim et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 617-648; Schall (1991) Cytokine 3: 165-183; y Gronenborn y Clore (1991) Protein Engineering 4: 263-269. En concreto, la linfotactina de ratón muestra similitud con la clase de timocinas C-C en la porción del carboxilo terminal, especialmente en las posiciones que corresponden, en la numeración asignada de la SEQ ID Nº 1, a la secuencia Ala-Val-Ile en las posiciones 67-69 por el segmento de Ile-Cys-Ala-Asp-Pro en las posiciones 78-82, la valina conservada en la posición 87, el resto hidrófobo en la posición 94, y el resto cargado en la posición correspondiente a la 95. También existe una similitud considerable en la porción correspondiente de la linfotactina humana, por ejemplo, los aminoácidos de la región 67-84 del ratón corresponden a los restos 61-78 del ser humano. Las timocinas tienen una cola terminal de carboxilo más larga que los miembros de la familia C-C de quimiocinas. En particular, el espaciamiento de los otros restos conservados en las familias C-X-C y C-C de timocinas está ausente en la realización de timocina m3C9. Otras características de comparación están claras entre las familias de timocinas y quimiocinas. Véase, por ejemplo, Lodi et al. (1994) Science 263: 1762-1766. En concreto, los restos -hoja y -hélice se describen en Gronenberg et al. (1991) Protein Engineering 4: 263-269; y otras características estructurales se definen en Lodi et al. (1994) Science 263: 1762-1767. Estas características secundarias y terciarias ayudan a definir adicionalmente las características estructurales de los C-C y C-X-C, junto con el espaciamiento de los restos de cisteína apropiados entre 34 y 40, preferentemente 36-38 y en realizaciones específicas, se conserva en 37.

Esta invención proporciona ADN o fragmentos aislados para codificar una proteína de timocina biológicamente activa. Además, esta invención proporciona ADN aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activos que son capaces de hibridarse en condiciones apropiadas, por ejemplo, elevada restricción, con las secuencias descritas en la presente memoria. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activos pueden ser un ligando intacto, o fragmento, y tener una secuencia de aminoácidos como se describe en las SEQ ID Nº 2 o SEQ ID Nº 4. Realizaciones preferidas serán aislados naturales completos, por ejemplo, de aproximadamente 11.000 a 12.500 daltons de tamaño cuando no están glicosilados, o fragmentos de al menos aproximadamente 6.000 daltons, más preferentemente al menos aproximadamente 8.000 daltons. En la forma glicosilada, la proteína puede superar los 12.500 daltons. Además, esta invención trata el uso de una ADN aislado o recombinante, o sus fragmentos, que codifican proteínas que son homólogas a la proteína de timocina o que se aislaron usando ADNc que codifica una proteína de timocina como una sonda. El ADN aislado puede tener las respectivas secuencias de regulación en los extremos 5' y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición poli-A y otros.

IV. Fabricación de timocinas

Pueden obtenerse ADNs que codifican una timocina o sus fragmentos por síntesis química rastreo sistemático de bibliotecas de ADNc o por rastreo sistemático de bibliotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de estirpes celulares de muestras de tejidos.

Estos ADNs pueden expresarse en una amplia variedad de células anfitrionas para la síntesis de una proteína completa o de fragmentos que pueden usarse sucesivamente, por ejemplo, para generar anticuerpos monoclonales o policlonales; para estudios de unión; para construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada timocina o sus fragmentos pueden expresarse en células anfitrionas que se transforman o transinfectan con vectores de expresión apropiados. Estas moléculas pueden modificarse sustancialmente para estar libres de proteínas o contaminantes celulares, distintos de aquéllos derivados del anfitrión recombinante, y por tanto son especialmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. El antígeno, por ejemplo, la timocina, o sus porciones, puede expresarse como fusiones con otras proteínas.

Los vectores de expresión son, por regla general, montajes de ADN o ARN autorreplicantes que contienen el deseado gen antígeno o sus fragmentos, unidos de forma operable a elementos de control genético adecuados que se reconocen en una célula anfitriona adecuada. Estos elementos de control son capaces de lograr expresión dentro de un anfitrión adecuado. El tipo específico de elemento de control necesario para lograr expresión dependerá de la célula anfitriona final usada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariótico o un sistema de control de expresión promotor eucariótico, y por regla general, incluyen un promotor de la transcripción, un operador opcional para controlar en comienzo de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión a un ribosoma adecuado y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión también contienen normalmente un origen de la replicación que permite al vector replicar independientemente a partir de la célula anfitriona.

Los vectores de esta invención contienen ADNs que codifican una timocina, o su fragmento, codifican por regla general, por ejemplo, un polipéptido o proteína biológicamente activo. El ADN puede estar bajo el control de un promotor vírico y puede codificar un marcador de selección. Esta invención contempla además el uso de tales vectores de expresión que son capaces de expresar ADNc eucariótico que codifica una proteína de timocina en un anfitrión procariótico o eucariótico, en el que el vector es compatible con el anfitrión y en el que el ADNc eucariótico que codifica la proteína se inserta en el vector tal que el crecimiento del anfitrión que contiene el vector expresa el ADNc en cuestión. Normalmente, los vectores de expresión se diseñan para replicado estable en sus células anfitrionas o para amplificación para aumentar enormemente el número total de copias por célula del gen deseable. No es siempre necesario requerir que un vector de expresión replique en una célula anfitriona, por ejemplo, es posible lograr una expresión transitoria de la proteína o sus fragmentos en varios anfitriones usando vectores que no contienen un origen de replicación que la célula anfitriona reconozca. También es posible usar vectores que causan integración de un gen de timocina o sus fragmentos en el ADN anfitrión por recombinación, o para integrar un promotor que controla la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, como se usan en la presente memoria, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del anfitrión. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que logran expresión de genes unidos de forma operable. Los plásmidos son las formas de vectores usadas de forma más común, pero todas las otras formas de vectores que cumplen con una función equivalente son adecuadas para usarse en la presente memoria. Véanse, por ejemplo, Pouwels et al. (1985 y suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, NY; y Rodriquez et al. (eds.) (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.

Células anfitrionas adecuadas incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Los procariotas incluyen tanto organismos gram negativos como gram positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Los eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Los eucariotas superiores incluyen cultivos tisulares consolidados de estirpes celulares de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insectos y aves, como de origen mamífero, por ejemplo, seres humanos, primates y roedores.

Los sistemas de vectores de anfitriones procarióticos incluyen una amplia variedad de vectores de muchas especies diferentes. Como se usa en la presente memoria, la E. coli y sus vectores se usará genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar ADN es el pBR322 o sus derivados. Los vectores que pueden usarse para expresar timocinas o fragmentos de timocinas incluyen, pero no están limitados a, tales vectores como los que contienen el promotor lac (series pUC); promotor trp (pBR322-trp); promotor Ipp (las series pIN); promotores lambda-pP o PR (pOTS); o promotores híbridos como ptac (pDR540). Véanse Brosius et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodriguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10: 205-236, Buttersworth, Boston, MA.

Se pueden transformar eucariotas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, con secuencias de timocinas que contienen vectores. Para propósitos de esta invención, el anfitrión eucariótico inferior más común es la levadura de panadería, Saccharomyces cerevisiae. Se usará genéricamente para representar a los eucariotas inferiores aunque están disponibles también otras diversas cepas y especies. Los vectores de levaduras consisten, por regla general, en un origen de replicación (excepto los del tipo integrante), un gen de selección, un promotor, ADN que codifica la proteína deseada o sus fragmentos y secuencias para finalización de la traducción, poliadenilación y finalización de la transcripción. Vectores de expresión adecuados para levadura incluyen promotores constitutivos tales como 3-fosfoglicerato cinasa y otros diversos promotores de genes de enzimas glicolíticas o promotores inducibles tales como el promotor de 2-alcohol deshidrogenasa o el promotor de metalotionina. Vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: autorreplicantes de bajo número de copias (como las series de YRp), autorreplicantes con alto número de copias (como las series de YEp); tipos de integración (como las series YIp) o minicromosomas (como las series YCp).

Las células de cultivos de tejidos eucarióticos superiores son las células anfitrionas preferidas para la expresión de la proteína de timocina funcionalmente activa. En principio, se puede usar cualquier estirpe celular de cultivos de tejidos eucarióticos superiores, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insectos, sea de una fuente invertebrada o vertebrada. Sin embargo, se prefieren las células de mamíferos para conseguir un procesamiento apropiado, tanto en el momento de la traducción como después de la traducción. Es rutina la transformación o transinfección y propagación de tales células.

Estirpes celulares útiles incluyen células HeLa, estirpes celulares de ovario de hámster chino (CHO), estirpes celulares de riñón de crías de rata (BRK), estirpes celulares de insectos, estirpes celulares de aves y estirpes celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para tales estirpes celulares incluyen normalmente un origen de la replicación, un promotor, un sitio de comienzo de la traducción, sitios de corte y empalme de ARN (por ejemplo, si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación y un sitio de final de la transcripción. Estos vectores pueden contener también un gen de selección o un gen de amplificación. Vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que transportan promotores derivados de, por ejemplo, fuentes tales como adenovirus, SV40, parvovirus, virus de la vacuna o citomegalovirus. Ejemplos representativos de vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136-1142; pMC1neo Poli-A, véase Thomas et al. (1987) Cell 51: 503-512; y un vector baculovirus como el pAC 373 o el pAC 610.

Nuestro trabajo indica que las timocinas necesitan no estar glicosiladas para suscitar respuestas biológicas en los análisis descritos en la presente memoria. Sin embargo, a menudo será deseable expresar un polipéptido de timocina en un sistema que proporcione un patrón de glicosilación específico o definido. En este caso, el patrón habitual será el proporcionado de forma natural por el sistema. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo el polipéptido, por ejemplo, en la forma sin glicosilar, a proteínas de glicosilación adecuadas inducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen de timocina puede ser transformado conjuntamente con uno o más genes que codifican enzimas glicosilantes de mamíferos u otras. Se puede entender además que la sobreglicosilación puede ir en detrimento de la actividad biológica de de las timocinas y que alguien experto puede realizar análisis rutinarios para optimizar el grado de glicosilación que confiere una actividad biológica óptima.

Una timocina, o un fragmento de la misma, puede organizarse para unirse a una membrana celular con fosfatidil inositol (PI), pero puede eliminarse de las membranas por tratamiento con una enzima de división de fosfatidil inositol, por ejemplo, fosfatidil inositol fosfolipasa C. Esto libera el antígeno en una forma biológicamente activa y permite la purificación por procedimientos estándar de a química de las proteínas. Véanse, por ejemplo, Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988: 427-454; Tse et al. (1985) Science 230: 1003-1008; y Brunner et al. (1991) J. Cell Biol. 114: 1275-1283.

Ahora que se han caracterizado las timocinas, sus fragmentos o derivados pueden prepararse por procedimientos convencionales para sintetizar péptidos. Esto incluye procedimientos como los descritos en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL.; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, Nueva York, NY; y Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag, Nueva York, NY. Por ejemplo, puede usarse un procedimiento de azida, un procedimiento de ácido clorhídrico, un procedimiento de anhídrido de ácido, un procedimiento de anhídrido mezclado, un procedimiento de un éster activo (por ejemplo, éster p-nitrofenílico, éster de N-hidroxisuccinimida o éster cianometílico), un procedimiento de carbodiimidazol, un procedimiento de oxidación-reducción o un procedimiento de diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis en fase sólida y en fase de disolución pueden aplicarse ambas a los procedimientos anteriores.

La proteína preparada y sus fragmentos pueden aislarse y purificarse a partir de la mezcla de reacción por medios de separación de péptidos, por ejemplo, por extracción, precipitación, electroforesis y diversas formas de cromatografía, y similares. Las timocinas de esta invención pueden obtenerse con mayor o menor grado de pureza dependiendo del uso deseado. La purificación puede conseguirse por el uso de técnicas conocidas de purificación de proteínas o por el uso de anticuerpos o copartícipes de unión descritos en la presente memoria, por ejemplo, en cromatografía de afinidad inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbente se realiza uniendo primero los anticuerpos a un soporte sólido y poniendo después en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de células fuente adecuadas, lisados de otras células que expresan el ligando o lisados o sobrenadantes de células que producen las timocinas como resultado de técnicas de ADN, véase a continuación.

Múltiples estirpes celulares pueden ser detectadas sistemáticamente para una que expresa una timocina en un nivel elevado comparado con otras células. Diversas estirpes celulares, por ejemplo, estirpes celulares del estroma tímico de ratón TA4, se detecta sistemáticamente y se selecciona por sus favorables propiedades de manejo. Las timocinas naturales pueden aislarse a partir de las fuentes naturales o por expresión a partir de una célula transformada usando un vector de expresión apropiado. La purificación de la proteína expresada se consigue por procedimientos estándar o puede combinarse con medios organizados para la purificación eficaz con elevada eficiencia a partir de lisados o sobrenadantes de células. Los segmentos FLAG o His_{6} pueden usarse para tales características de purificación.

V. Anticuerpos

Los anticuerpos pueden generarse para varias timocinas, incluyendo individuales, alélicas, de cepa o de especie y sus fragmentos, tanto en sus formas de aparición natural (completas) como en sus formas recombinantes. Adicionalmente, los anticuerpos pueden generarse para timocinas en sus formas activas o en sus formas inactivas. Pueden usarse también anticuerpos antiidiotípicos.

a. Producción de anticuerpos

Pueden usarse diversos inmunógenos para producir específicamente anticuerpos reactivos con proteínas de timocina. Una proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. Pueden usarse también proteínas que aparecen de forma natural, en forma pura o impura. Pueden usarse también los péptidos sintéticos hechos usando las secuencias de proteínas de linfotactina humanas o de ratón descritas en la presente memoria, como un inmunógeno para la producción de anticuerpos para timocinas. Una proteína recombinante puede expresarse en células eucarióticas o procarióticas como se describe en la presente memoria. El producto se inyecta después en un animal capaz de producir anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden generarse para uso posterior en inmunoanálisis para medir la proteína.

Los expertos en la técnica conocen los métodos para producir anticuerpos policlonales. En resumen, un inmunógeno, preferentemente una proteína purificada, se mezcla con un adyuvante y se inmuniza a los animales con la mezcla. La respuesta inmune de los animales a la preparación del inmunógeno se controla tomando muestras de sangre y determinando el valor de reactividad a la proteína de timocina de interés. Cuando se obtienen valores adecuadamente altos de anticuerpo al inmunógeno, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Puede realizarse, si se desea, un fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecerlo en anticuerpos reactivos a la proteína. (Véase Harlow y Lane, citado anteriormente).

Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse por diversas técnicas familiares para aquéllos expertos en la técnica. Brevemente, se inmortalizan células esplénicas de un animal inmunizado con un antígeno deseado, normalmente por fusión con una célula de mieloma (véase, Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511-519). Métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos muy conocidos en la técnica. Las colonias que surgen a partir de células sencillas inmortalizadas se detectan sistemáticamente para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células puede aumentarse por varias técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un anfitrión vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo por detección sistemática de una biblioteca de ADN a partir de células B humanas según el protocolo general esbozado por Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y las versiones de cadena sencilla, contra fragmentos predeterminados de timocinas, pueden generarse para inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas transportadoras como se describió anteriormente. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan en anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser detectados sistemáticamente para unirse a timocinas normales o defectuosas, o detectarse sistemáticamente para actividad agonística o antagonística, por ejemplo, mediada a través de un receptor. Estos anticuerpos monoclonales se unirán normalmente con, al menos, una K_{D} de aproximadamente 1mM o mejor incluyendo una K_{D} de 300 \muM, 30 \muM, 10 \muM, y preferentemente de al menos 3 \muM o mejor.

En algunos casos es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos anfitriones mamíferos, como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. la descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales puede encontrarse, por ejemplo, en Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en él; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, New York, NY; y especialmente en Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497, que trata un método para generar anticuerpos monoclonales. Resumiendo brevemente, este método implica inyectar un inmunógeno a un animal. Después, se sacrifica el animal y se toman células de su bazo que se fusionan entonces con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es susceptible de reproducirse in vitro. La población de hibridomas se detecta sistemáticamente para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta unas especies de anticuerpos únicas para el inmunógeno. De esta forma, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de las células B sencillas inmortalizadas y clonadas a partir de un animal inmune generado en respuesta al sitio específico reconocido en la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véanse, Huse et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia, los polipéptidos y anticuerpos estarán marcados uniéndose, covalentemente o no covalentemente, a una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen y se han descrito extensamente tanto en la bibliografía científica como en la de patentes, una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación. Marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos fluorescentes, restos luminiscentes, partículas magnéticas y similares. Patentes, que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las patentes de los EE.UU. nº 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes. Véase, Cabilly, patente de los EE.UU. nº 4.816.567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención pueden usarse también para cromatografía de afinidad en proteínas de timocina que se aíslan. Pueden prepararse columnas en las que los anticuerpos están unidos a un soporte sólido, por ejemplo, partículas como agarosa, Sephadex o similares, en los que se puede hacer pasar un lisado celular a través de la columna, se lava la columna seguido de un aumento de las concentraciones de un desnaturalizante suave, con lo que se liberará la proteína de timocina purificada.

Los anticuerpos pueden usarse también para detectar bibliotecas de expresión para productos de expresión particulares. Normalmente, los anticuerpos usados el tal procedimiento estarán marcados con un resto que permite la fácil detección de la presencia de antígeno por unión al anticuerpo.

Los anticuerpos de timocinas pueden usarse para la identificación de poblaciones de células que expresan timocinas. Analizando los productos de expresión de células que expresan timocinas es posible diagnosticar enfermedades, por ejemplo, dolencias que comprometen la inmunidad.

Los anticuerpos generados contra cada timocina serán útiles también para generar anticuerpos antiidiotípicos. Éstos serán útiles para detectar o diagnosticar diversas dolencias inmunológicas relacionadas con la expresión de los respectivos antígenos.

b. Inmunoanálisis

Una proteína particular puede medirse mediante una variedad de métodos de inmunoanálisis. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoanálisis en general, véase Stites y Terr (eds.) 1991 Basic and Clinical Immunology (7ª ed.). Además, los inmunoanálisis de la presente invención pueden realizarse en cualquiera de varias configuraciones, que se revisan extensamente en Maggio (ed.) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam; y Harlow y Lane Antibodies, A Laboratory Manual, citado anteriormente. Véase también Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY.

Los inmunoanálisis para medidas de proteínas de timocina pueden realizarse por una diversidad de métodos conocidos para aquéllos expertos en la técnica. En resumen, los inmunoanálisis para medir la proteína pueden ser análisis de unión competitiva o no competitiva. En los análisis de unión competitiva, la muestra a ser analizada compite con un analito marcado para los sitios de unión específica en un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferentemente, el agente de captura es un anticuerpo específicamente reactivo con proteínas de timocina producidas como se describió anteriormente. La concentración de analito marcado unido al agente de captura es inversamente proporcional a la cantidad de analito libre presente en la muestra.

En un inmunoanálisis de unión competitiva, la proteína de timocina presente en la muestra compite con la proteína marcada por unirse a un agente de unión específico, por ejemplo, un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína de timocina. El agente de unión puede estar unido a una superficie sólida para realizar la separación de la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Unas veces el análisis de unión competitiva puede realizarse en fase líquida y otras puede usarse cualquiera variedad de procedimientos conocidos en la técnica para separar la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Después de la separación, se determina la cantidad de proteína marcada unida. La cantidad de proteína presente es inversamente proporcional a la cantidad de proteína marcada que se une.

Si no, puede realizarse un inmunoanálisis homogéneo en el que no es necesaria una etapa de separación. En estos inmunoanálisis el marcador de la proteína se altera por la unión de la proteína a su agente de unión específico. Esta alteración en la proteína marcada da como resultado una disminución o aumento de la señal emitida por el marcador, de forma que la medida del marcador al final del inmunoanálisis permite la detección o cuantificación de la proteína.

Se pueden determinar también proteínas de timocina por diversos métodos de inmunoanálisis no competitivos. Por ejemplo, se puede usar un inmunoanálisis tipo sandwich en fase sólida de dos sitios. En este tipo de análisis, un agente de unión para la proteína, por ejemplo un anticuerpo, se une a un soporte sólido. Se marca un segundo agente de unión de la proteína, que puede ser también un anticuerpo, y que se une a la proteína en un sitio distinto. Después de que se ha producido la unión en ambos sitios en la proteína, se elimina el agente de unión marcado no unido y se mide la cantidad de agente de unión marcado unido a la fase sólida. La cantidad de agente de unión marcado unido es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.

Puede usarse el análisis de transferencia de Western para determinar la presencia de proteínas de timocina en una muestra. La electroforesis se realiza, por ejemplo, en una muestra de tejido que se sospecha que contiene la proteína. Después que la electroforesis separa las proteínas y se transfieren las proteínas a un soporte sólido apropiado como un filtro de nitrocelulosa, se incuba el soporte sólido con un anticuerpo reactivo con la proteína. Este anticuerpo puede estar marcado o, si no, puede detectarse por incubación posterior con un segundo anticuerpo marcado que se une al anticuerpo primario.

Los formatos de inmunoanálisis descritos anteriormente emplean componentes de análisis marcados. El marcador puede estar en diversas formas. El marcador puede acoplarse directamente o indirectamente al componente del análisis deseado según métodos muy conocidos en la técnica. Pueden usarse una amplia variedad de marcadores. Los componentes pueden marcarse por uno de varios métodos. Tradicionalmente se usaba un marcador radiactivo que incorporaba ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C o ^{32}P. Marcadores no radiactivos incluyen ligandos que se unen a anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que pueden servir como miembros del par específico de unión para un ligando marcado. La elección del marcador depende de la sensibilidad requerida, facilidad de conjugación con el compuesto, requerimientos de estabilidad e instrumentación disponible. Para una revisión de diversos marcadores o sistemas que producen señales que pueden usarse, véase la patente de los EE.UU. nº 4.391.904.

Los anticuerpos reactivos con una proteína particular pueden medirse también por diversos métodos de inmunoanálisis. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoanálisis aplicables a la medida de anticuerpos por técnicas de inmunoanálisis, véanse Stites y Terr (eds.) Basic and Clinical Immunology (7ª ed.) citado anteriormente; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, citado anteriormente; y Harlow y Lane Antibodies, A Laboratory Manual, citado anteriormente.

En resumen, los inmunoanálisis para medir antisueros reactivos con proteínas de timocina pueden ser análisis de unión competitiva o no competitiva. En los análisis de unión competitiva, el analito muestra compite con un analito marcado por los sitios de unión específica en un agente de captura unido a una superficie sólida. Preferentemente, el agente de captura es una proteína de timocina recombinante purificada producida como se describió anteriormente. Se pueden usar también otras fuentes de proteínas de timocina, incluyendo proteínas que aparecen de forma natural aisladas o parcialmente purificadas. Los análisis no competitivos son, por regla general, ensayos tipo sandwich, en los que el analito muestra está unido entre dos reactivos de unión específicos del analito. Uno de los agentes de unión se usa como un agente de captura y está unido a una superficie sólida. El segundo agente de unión está marcado y se usa para medir o detectar el complejo resultante por medios visuales o instrumentales. Pueden usarse diversas combinaciones de agentes de captura y agente de unión marcado. Pueden usarse también diversos formatos diferentes de inmunoanálisis, técnicas de separación y marcadores similares a los descritos anteriormente para la medida de proteínas de timocina.

VI. Timocinas purificadas

Se proporciona una secuencia de aminoácidos de timocina de ratón en la SEQ ID nº 2. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos humanos se proporcionan en las SEQ ID nº 3 y SEQ ID nº 4. Las secuencias de péptidos permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer tales segmentos y permiten la preparación de oligonucleótidos que codifican tales secuencias. Ya que las timocinas parecen ser proteínas secretadas, tendrán una secuencia señal terminal N-, que se elimina tras el procesado y secreción, y el sitio supuesto de división está entre los aminoácidos 20 (Glu) y 21 (Gly) en la SEQ ID nº 2. El análisis de las características estructurales en comparación con las secuencias descritas relacionadas más estrechamente ha revelado similitudes con otras citocinas, especialmente la clase de proteínas conocidas como quimiocinas. Dentro de las quimiocinas hay dos subgrupos, los subgrupos C-C y C-X-C. La familia de timocinas comparte varias características con cada uno de estos grupos, pero sus características de combinación son distintivas y definen una nueva familia de quimiocinas relacionadas.

VII. Variantes físicas

Esta invención también engloba proteínas o péptidos que tienen una similitud sustancial en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de una timocina. Las variantes naturales incluyen variantes individuales, alélicas, de cepa o de especie.

La similitud en la secuencia de aminoácidos, o identidad de secuencia, se determina optimizando emparejamientos de restos introduciendo, si es necesario, huecos según se requiera. Esto cambia, cuando se consideran sustituciones conservadoras como coincidencias. Las sustituciones conservadoras incluyen, por regla general, sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácido homólogos incluyen variaciones alélicas naturales e interespecies en cada secuencia respectiva de proteína. Proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán de 50-100% de similitud (si se pueden introducir huecos) a 75-100% de similitud (si se incluyen sustituciones conservadoras) con la secuencia de aminoácidos de la timocina. Las medidas de similitud serán, al menos, de aproximadamente 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% y 80%, y en realizaciones especialmente preferidas, al menos de 85% o más. Véanse también Needleham et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Capítulo uno, Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y el University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

Los ácidos nucleicos que codifican proteínas de timocina de mamíferos se hibridarán, por regla general, con la secuencia de ácido nucleicos de la SEQ ID nº 1 o la SEQ ID nº 3 en condiciones restrictivas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican proteínas de linfotactina de ratón se hibridarán con los ácidos nucleicos de la SEQ ID nº 1 en condiciones restrictivas de hibridación. En general, las condiciones restrictivas se seleccionan para ser aproximadamente 10ºC menores que el punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia que se hibrida a una fuerza iónica y pH definidos. El Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la que el 50% de la secuencia de acceso se hibrida con una sonda que encaja perfectamente. Por lo general, condiciones restrictivas serán aquéllas en las que la concentración de sal es aproximadamente 0,02 molar a un pH de 7 y la temperatura es de al menos aproximadamente 50ºC. Otros factores pueden afectar de forma significativa la restricción de la hibridación, incluyendo entre otros, la composición de bases y tamaño de las cadenas complementarias, la presencia de disolventes orgánicos como formamida, y la extensión del mal emparejamiento de bases. Una realización preferida incluirá ácidos nucleicos que se unen a secuencias descritas en formamida al 50% y 200 mM de NaCl a 42ºC.

Un ADN de timocina puede modificarse rápidamente por sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado secuencias novedosas de ADN que codifican antígenos de timocina, sus derivados o proteínas que tienen una actividad fisiológica, inmunogénica o antigénica sumamente similar.

Las secuencias modificadas pueden usarse para producir antígenos mutantes o para intensificar la expresión. La intensificación de la expresión puede implicar amplificación de genes, aumento de la transcripción, aumento de la traducción y otros mecanismos. Tales derivados mutantes de timocinas incluyen mutaciones predeterminadas o específicas del sitio de la respectiva proteína o de sus fragmentos. La "timocina mutante" engloba un polipéptido que de lo contrario cae dentro de la definición de homología de la timocina de ratón como se expuso anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una timocina como se encuentra en la naturaleza, sea mediante una deleción, sustitución o inserción. En concreto, una "timocina mutante específica del sitio" incluye, en general, proteínas que tienen una similitud considerable con una proteína que tiene una secuencia de las SEQ ID nº 2 o SEQ ID nº 4 y ya que comparte diversas actividades biológicas, por ejemplo, antigénica o mutagénica, con aquellas secuencias, y en realizaciones preferidas contiene la mayoría o todas las secuencias descritas. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas de timocina, especialmente aquéllas que se encuentran en diversos animales de sangre caliente, por ejemplo, mamíferos y aves. Como se estableció anteriormente, se hace hincapié en que las descripciones son por lo general medios para abarcar otras proteínas de timocina, no limitadas a las realizaciones de ratón o seres humanos tratadas específicamente.

Aunque los sitios de mutación específicos del sitio están predeterminados, los mutantes no necesitan ser específicos del sitio. La mutagénesis de timocina puede conducirse realizando inserciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones, deleciones, sustituciones o cualquier combinación puede generarse para conseguir una creación final. Las inserciones incluyen fusiones terminales de amino- o carboxilo-. La mutagénesis al azar puede conducirse a un codón objetivo y puede detectarse entonces sistemáticamente la actividad deseada en los mutantes expresados. Son muy conocidos en la técnica métodos para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida, por ejemplo, por técnicas de mutagénesis del cebador M13 o de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Normalmente, las mutaciones en el ADN no deberían situarse codificando secuencias fuera de marcos de lectura y, preferentemente, no crearán regiones complementarias que puedan hibridarse para producir estructuras de ARNm secundarias como bucles u horquillas.

La presente invención proporciona también proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas que usan segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que no están normalmente fusionados de forma natural de la misma forma. De esta forma, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de timocina es una molécula de proteína continua que tiene secuencias fusionadas en una unión de péptido típica, hecha, en general, como un producto único de traducción y que muestra propiedades derivadas de cada péptido fuente. Un concepto similar se aplica a secuencias heterólogas de ácidos nucleicos.

Además, pueden realizarse nuevas creaciones combinando dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, pueden "intercambiarse" uniones mediante proteínas u otros segmentos entre diferentes polipéptidos o fragmentos de fusión nuevos. Véanse, por ejemplo, Cunningham et al. (1989) Science 243: 1330-1336; y O'Dowd et al. (1988) J. Biol Chem. 263: 15985-15992. Así, nuevos polipéptidos quiméricos que muestran nuevas combinaciones de especificidades resultarán de la unión funcional de especificidades de proteínas de unión y otros dominios funcionales.

VIII. Agente de unión: complejos de proteínas de timocina

Una proteína de timocina que se une específicamente a o que es específicamente inmunorrreactiva con un anticuerpo generado contra un inmunógeno determinado, como un inmunógeno que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº 2 o la SEQ ID nº 4, se determina en un inmunoanálisis. El inmunoanálisis usa un antisuero policlonal que se genera para la proteína de las SEQ ID nº 2 o SEQ ID nº 4. Este antisuero se selecciona para tener una reactividad cruzada baja contra otras quimiocinas y cualquier reactividad cruzada tal se elimina por inmunoabsorción antes de usarlo en el inmunoanálisis.

Para producir antisueros para uso en un inmunoanálisis, se aísla la proteína de las SEQ ID nº 2 o SEQ ID nº 4 como se describió en la presente memoria. Por ejemplo, la proteína recombinante puede producirse en una estirpe celular de mamíferos. Se inmuniza una estirpe consanguínea de ratones como balb/c con la proteína de la SEQ ID nº 2 o la SEQ ID nº 4 usando un adyuvante estándar, como el adyuvante de Freund y un protocolo normalizado de inmunización de ratones.

Alternativamente, puede usarse como inmunógeno un péptido sintético derivado de las secuencias descritas en la presente memoria y conjugado con una proteína transportadora. Los sueros policlonales se recogen y se valoran contra la proteína de inmunógeno en un inmunoanálisis, por ejemplo, un inmunoanálisis en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. Se seleccionan y se analiza la reactividad cruzada contra las quimiocinas C-C y C-X-C, de los antisueros policlonales con una concentración de 10^{4} o mayor, usando un inmunoanálisis como el descrito en Harlow y Lane, citado anteriormente, en las páginas 570-573. Preferentemente, se usan dos quimiocinas en esta determinación junto con linfotactina humana o linfotactina de ratón.

Junto con la linfotactina de ratón, la proteína quimiotáctica de monocito 1 (MCP-1) y la proteína macrófago inflamatoria 1\alpha (Mip-1\alpha) se usan para identificar anticuerpos que están específicamente unidos por una timocina. Junto con la linfotactina humana, la proteína quimiotáctica de monocito 2 (MCP-2) y la Mip-1\alpha se usan para identificar anticuerpos que están específicamente unidos por una timocina. Estas quimiocinas pueden producirse como proteínas recombinantes y aislarse usando técnicas normalizadas de biología molecular y química de las proteínas, como se describe en la presente memoria.

Los inmunoanálisis en el formato de unión competitiva, pueden usarse para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína de la SEQ ID nº 2 o la SEQ ID nº 4 pueden inmovilizarse en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al análisis compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de la SEQ ID nº 2 o la SEQ ID nº 4. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calcula usando cálculos normalizados. Se seleccionan y se mezclan aquellos antisueros con menos del 10% de reactividad cruzada con cada una de las proteínas listadas anteriormente. Los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada se eliminan entonces de los antisueros mezclados por inmunoabsorción con las proteínas listadas anteriormente.

Los antisueros inmunoabsorbidos y mezclados se usan entonces en un inmunoanálisis de unión competitiva como se describió anteriormente para comparar una segunda proteína con la proteína de inmunógeno (por ejemplo, la proteína de quimiocina de la SEQ ID nº 2 o la SEQ ID nº 4). Para realizar esta comparación, se analiza cada una de las dos proteínas en un amplio rango de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad requerida de la segunda proteína es menor que dos veces la cantidad requerida de la proteína de la SEQ ID nº 2, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.

Se entiende que las proteínas de timocina son una familia de proteínas homólogas que comprenden dos o más genes. Para un producto de gen particular, tal como la proteína de linfotactina humana, la terminología se refiere no sólo a las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, sino también a otras proteínas que son variantes alélicas, no alélicas o de especie. Se entiende también que la terminología "linfotactina humana" o "linfotactina de ratón" incluye mutaciones no naturales introducidas por mutación intencionada usando tecnología recombinante convencional como mutación de sitio único, o escindiendo pequeñas secciones de ADN que codifican proteínas de linfotactina, o sustituyendo aminoácidos nuevos, o añadiendo aminoácidos nuevos. Tales alteraciones menores deben mantener sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. De esta forma, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunorreactivas con una proteína de linfotactina indicada que aparece de forma natural, por ejemplo, la proteína de linfotactina humana que se muestra en la SEQ ID nº 4.

Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas pueden determinarse expresando la proteína en una estirpe celular apropiada y midiendo el efecto quimiotático sobre los linfocitos como se describe en la presente memoria. Modificaciones especiales de proteínas consideradas menores incluirían la sustitución conservadora de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se describió anteriormente para la familia de timocinas como un todo. Alineando una proteína de forma óptima con la proteína de las SEQ ID nº 2 y SEQ ID nº 4 y usando los inmunoanálisis convencionales para determinar inmunoidentidad descritos en la presente memoria, o usando el análisis de la quimiotaxia del linfocito, se pueden determinar las composiciones de proteínas de la invención.

IX. Variantes funcionales

El bloqueo de la respuesta fisiológica a las timocinas puede ser el resultado de la inhibición de la unión de la proteína a su receptor, por ejemplo, mediante inhibición competitiva. De esta forma, los análisis in vitro de la presente invención usarán a menudo la proteína aislada, membranas de células que expresan una timocina asociada a una membrana recombinante, fragmentos solubles que comprenden segmentos de unión del receptor de estas proteínas, o fragmentos unidos a sustratos de fase sólida.

Estos análisis permitirán también la determinación diagnóstica de los efectos de las mutaciones y modificaciones del segmento de unión o las mutaciones y modificaciones de la proteína, por ejemplo, análogos de proteínas. Esta invención contempla también el uso de análisis de detección sistemática de fármacos, por ejemplo, en los que se neutralizan anticuerpos a un antígeno o fragmentos de receptor compiten con un compuesto de prueba por unirse a la proteína. De esta forma, pueden usarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier polipéptido que comparte uno o más sitios antigénicos de unión de la proteína y pueden usarse también para ocupar sitios de unión en la proteína que de otra forma podrían interactuar con un receptor.

"Derivados" de antígenos de timocina incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de glicosilación y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes pueden prepararse por unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en cadenas laterales de aminoácidos de timocina o en los N- o C- terminales, por medios que son muy conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticos del carboxilo terminal, o de restos que contienen cadenas laterales de carboxilo, derivados de O-acilo de restos que contienen grupos hidroxilo, y derivados acilados en el N de restos que contienen grupos amino o aminoácido amino terminal, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo que incluye alquilos normales C3 a C18, formando de esta forma especies alcanoilo aroilo. La unión covalente a proteínas transportadoras puede ser importante cuando los restos inmunogénicos son haptenos.

En concreto, se incluyen las alteraciones de la glicosilación, por ejemplo, hechas modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en etapas adicionales de procesamiento. Medios especialmente preferidos para conseguir esto son exponiendo el polipéptido a enzimas de glicosilación derivadas de células que normalmente proporcionan tal procesamiento, por ejemplo, enzimas de glicosilación de mamíferos. También se contemplan las enzimas de desglicosilación. También se aceptan las versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos que tiene otras modificaciones menores, incluyendo restos de aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina, u otros restos, incluyendo grupos ribosilo o reactivos de reticulación.

Un grupo importante de derivados son conjugados covalentes de la timocina o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden sintetizarse en cultivo recombinante como fusiones de N- o C- terminales o por el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en proteínas de reticulación mediante grupos laterales reactivos. Sitios preferidos de derivatización de proteínas con agentes de reticulación son en los grupos amino libres, restos de carbohidrato y restos de cisteína.

También se proporcionan péptidos de fusión entre timocinas y otras proteínas homólogas o heterólogas. Muchos factores de crecimiento y citocinas son entidades homodímeras y una creación repetida puede tener diversas ventajas, incluyendo susceptibilidad a la degradación proteolítica disminuida. Además, muchos receptores requieren dimerización para transducir una señal, y pueden ser deseables diversas proteínas dímeras o creaciones que se repiten.

Polipéptidos heterólogos pueden ser pueden ser fusiones entre diferentes marcadores superficiales, lo que resulta, por ejemplo, en una proteína híbrida que muestra especificidad de unión al receptor. Asimismo, pueden crearse fusiones heterólogas que mostrarán una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido indicador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de unión a un receptor, de forma que la presencia o situación de la proteína fusionada pueda determinarse fácilmente. Véase, por ejemplo, Dull et al., patente de los EE.UU. nº 4.859.609. Otros copartícipes de fusión de genes incluyen \beta-galactosidasa bacteriana, trpE, Proteína A, \beta-lactamasa, alfaamilasa, alcoholdeshidrogenasa y factor alfa de apareamiento de levaduras. Véase, por ejemplo, Godowski et al. (1988) Science 241: 812-816.

Tales polipéptidos pueden tener también restos de aminoácidos que han sido modificados químicamente por fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o eliminación de otros restos, especialmente aquéllos que tienen formas moleculares similares a los grupos fosfato. En algunas realizaciones, las modificaciones serán reactivos de marcado útiles, o servirán como objetivos de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad.

Esta invención contempla también el uso de derivados de timocinas distintos de las variaciones en la secuencia de aminoácidos o la glicosilación. Tales derivados pueden implicar asociación covalente o agregante con restos químicos. Estos derivados se dividen, por lo general, en tres clases: (1) sales, (2) cadenas laterales y modificaciones covalentes de restos terminales, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares.

Tales derivados covalentes o agregantes son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoanálisis, o en métodos de purificación como por purificación por afinidad de ligandos u otros ligandos de unión. Por ejemplo, un antígeno de timocina puede inmovilizarse por enlace covalente a un soporte sólido como Sefarosa activada con bromuro de cianógeno, por métodos que son muy conocidos en la técnica, o adsorbido sobre superficies de poliolefina, con o sin reticulación de glutaraldehído, para uso en el análisis o purificación de anticuerpos antitimocina o su receptor. Las timocinas pueden marcarse también con un grupo detectable, por ejemplo radioyodado por el procedimiento de la cloramina T, unidos de forma covalente quelatos de tierras raras, o conjugados a otro resto fluorescente para uso en pruebas diagnósticas. La purificación de timocinas puede realizarse por anticuerpos o receptor inmovilizados.

Los genes aislados de timocina permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de una timocina correspondiente, por ejemplo, tipos de especies o células a las que les faltan las proteínas correspondientes y muestran actividad de fondo negativa. La expresión de genes transformados permitirá el aislamiento de estirpes celulares antigenicamente puras, con variantes de especies definidos o únicos. Este planteamiento permitirá una detección más sensible la discriminación de los efectos fisiológicos de proteínas receptoras de timocinas. Los fragmentos subcelulares, por ejemplo, citoplastos o fragmentos de membranas, pueden aislarse y usarse.

X. Usos

La presente invención proporciona reactivos que encontrarán uso en aplicaciones diagnósticas como se describió en otra parte de la presente invención, por ejemplo, en la descripción general para anormalidades de desarrollo, o a continuación en la descripción de kits para diagnosis.

Los nucleótidos de timocina, por ejemplo, ADN o ARN de linfotactina humana o de ratón, pueden usarse como un componente en un análisis forense. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos proporcionadas pueden marcarse usando, por ejemplo, ^{32}P o biotina, y pueden usarse para probar transferencias de polimorfismos de fragmentos de restricción estándar, proporcionando una característica medible para ayudar en la distinción entre individuos. Tales sondas pueden usarse en técnicas forenses muy conocidas como huella dactilar genética. Además, las sondas de nucleótidos hechas de secuencias de timocinas pueden usarse en análisis in situ para detectar anormalidades cromosómicas. Por ejemplo, pueden detectarse cambios en el cromosoma 1 del ratón vía técnicas in situ muy conocidas, usando sondas de timocina junto con otros marcadores conocidos del cromosoma 1.

Las proteínas de timocina pueden usarse como agente quimiotácticos para separar células de linfocitos, como células pro-T, de una población general de células, in vitro o in vivo. Por ejemplo, subpoblaciones de linfocitos como las células pro-T (células CD44^{+} CD25^{+} CD3^{-} CD4^{-} CD8^{-}) pueden separarse de los neutrófilos y monocitos basándose en las propiedades quimiotácticas de timocinas como las linfotactinas humana y de ratón. La proporción relativa de tales células en una población de tipos de células puede usarse como un indicador diagnóstico de estados de enfermedad que implican, por ejemplo, trastornos en el sistema inmunitario y defectos genéticos. Además, las células aisladas pueden usarse como agentes terapéuticos, o como objetivos para terapia génica. Nótese en este contexto que las células pluripotenciales como las células pro-T son objetivos especialmente deseables para la terapia génica.

Los anticuerpos u otros agentes de unión dirigidos hacia las proteínas o ácidos nucleicos de timocina pueden usarse para purificar la correspondiente molécula de timocina. Como se describe a continuación en los Ejemplos la purificación de anticuerpos de componentes de timocina es tan posible como practicable. Los anticuerpos y otros agentes de unión pueden usarse también de una manera diagnóstica para determinar si los componentes de la timocina están presentes en una muestra de tejido o población celular, usando técnicas muy conocidas descritas en la presente memoria. La capacidad de unir un agente de unión a una timocina proporciona un medio para diagnosticar trastornos asociados con la mala regulación de timocinas. Los anticuerpos y otros agentes de unión de timocinas pueden ser útiles también como marcadores histiológicos. Como se describe a continuación en los ejemplos, la expresión de la timocina se limita a tipos específicos de tejidos. Dirigiendo una sonda, como un anticuerpo o ácido nucleico a una timocina, es posible usar la sonda para distinguir tejidos y tipos celulares in situ o in vitro.

Esta invención proporciona también reactivos con valor terapéutico importante. Las timocinas (que aparecen de forma natural o recombinantes), sus fragmentos y los anticuerpos de ellas, junto con compuestos identificados por tener afinidad de unión a una timocina, son útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con fisiología o desarrollo anormales, incluyendo proliferación anormal, por ejemplo, enfermedades cancerosas o enfermedades degenerativas. La proliferación anormal, regeneración, degeneración y atrofia pueden modularse por tratamientos terapéuticos apropiados usando las composiciones proporcionadas en la presente memoria. Por ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con una expresión anormal o una señalización anormal por una timocina es un objetivo para un agonista o antagonista de la proteína. Las proteínas juegan, probablemente, un papel en la regulación o desarrollo de células hematopoyéticas, por ejemplo, células linfocíticas, que afectan las respuestas inmunológicas, por ejemplo, trastornos autoinmunes.

Se conocen otras enfermedades de desarrollo anormal en tipos de células que demuestran poseer ARNm de timocina por análisis de transferencia de Northern. Véanse, Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, NJ; y Thorn et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY. Las anormalidades de desarrollo o funcionales, por ejemplo, del sistema inmunitario, causan anormalidades médicas y enfermedades importantes que pueden ser susceptibles de prevención o tratamiento usando composiciones proporcionadas en la presente memoria.

Pueden purificarse timocina recombinante o anticuerpos de timocina y administrarse después a un paciente. Estos reactivos pueden combinarse para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, adyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizantes y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden filtrarse de forma estéril y situarse en formas farmacéuticas como por liofilización en viales de dosificación en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o sus fragmentos de unión, incluyendo formas que no son uniones de complementos.

La detección sistemática de fármacos usando anticuerpos o su receptor o sus fragmentos puede identificar compuestos que tienen afinidad de unión a timocinas, incluyendo aislamiento de componentes asociados. Pueden utilizarse entonces análisis biológicos posteriores para determinar si el compuesto tiene actividad estimulante intrínseca y es, por tanto, un bloqueante o antagonista en el sentido de que bloquea la actividad de la proteína. Asimismo, un compuesto que tiene actividad estimulante intrínseca puede activar el receptor y es, de esta forma, un agonista en el sentido de que estimula la actividad de una timocina. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos a timocinas como antagonistas. Este planteamiento debería ser especialmente útil con otras variantes de especies de timocinas.

Las cantidades de reactivos necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. De esta forma, las dosis de tratamiento deberían valorarse para optimizar la seguridad y eficacia. Por regla general, las dosis usadas in vitro pueden proporcionar una guía útil de las cantidades útiles para administración in situ de estos reactivos. El análisis en animales de las dosis eficaces para el tratamiento de trastornos particulares proporcionará información predictiva adicional de la dosificación en seres humanos. Se describen diversas consideraciones, por ejemplo, en Gilman et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press; y (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Se tratan en ellos y a continuación métodos para la administración, por ejemplo, para administración por vía oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otras. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ.

Normalmente, se esperaría que los intervalos de dosificación fueran de cantidades menores de 1 mM de concentración, y estuvieran en intervalos desde concentraciones de 10 \muM, 100 nM, 10 pM (picomolar) y lo más preferentemente menores de aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un vehículo apropiado. Se utilizarán a menudo formulaciones de liberación lenta o un equipo de liberación lenta para administración continua.

Las timocinas, sus fragmentos y anticuerpos para ella o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden administrarse directamente al anfitrión a ser tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos a proteínas transportadoras como ovoalbúmina o seroalbúmina antes de su administración.

Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en cualquier formulación convencional. Mientras sea posible para el ingrediente activo ser administrado solo, es preferible presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden, por regla general, al menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables de él. Cada vehículo debe ser tanto farmacéuticamente como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no dañino para el paciente. Las formulaciones incluyen aquéllos adecuados para administración por vía oral, rectal, nasal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse de forma conveniente en formas de dosificación unitarias y pueden preparase por cualquiera de los métodos muy conocidos en la técnica de farmacia. Véanse, por ejemplo, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, NY; y Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia de esta invención puede combinarse con o usarse en asociación con otros agentes de quimioterapia o quimioprevención.

Tanto la forma que aparece naturalmente como la forma recombinante de las timocinas de esta invención son especialmente útiles en kits y métodos de análisis que son capaces de detectar sistemáticamente la actividad de unión a las proteínas de compuestos. Se han desarrollado en los últimos años diversos métodos automáticos de análisis para permitir la detección sistemática de decenas de miles de compuestos en un corto periodo de tiempo. Véanse, por ejemplo, Fodor et al. (1991) Science 251: 767-773, y otras descripciones de bibliotecas de diversidad química, que describen medios para analizar la afinidad de unión por una pluralidad de compuestos. El desarrollo de análisis adecuados puede ser sumamente facilitado por la disponibilidad de grandes cantidades de timocina soluble purificada, como proporciona esta invención.

Por ejemplo, los antagonistas pueden encontrarse normalmente una vez que la proteína se ha definido estructuralmente. El análisis de análogos potenciales de la proteína es ahora posible tras el desarrollo de métodos de análisis sumamente automatizados usando un receptor purificado. En concreto, se descubrirán nuevos agonistas y antagonistas usando técnicas de detección sistemática descritas en la presente memoria. De especial importancia son los compuestos que se encuentra que tienen una afinidad de unión combinada por múltiples receptores de timocinas, por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especies de una timocina.

Esta invención es especialmente útil para la detección sistemática de compuestos usando un receptor recombinante en una diversidad de técnicas de detección sistemática de fármacos. Las ventajas de usar una proteína recombinante en la detección sistemática para ligandos específicos incluye: (a) una fuente renovable mejorada del receptor de timocina de una fuente específica; (b) un potencialmente mayor número de ligandos por célula que dan una mejor relación señal ruido en los análisis; y (c) especificidad de variantes de especies (que dan teóricamente mayor especificidad biológica y de enfermedad).

Un método de detección sistemática de fármacos utiliza células anfitrionas eucarióticas o procarióticas que se transforman de forma estable con moléculas de ADN recombinante que expresa un receptor de timocina. Las células pueden aislarse, lo que expresa un receptor aislado de cualquier otro. Tales células, en forma viable o fijada, pueden usarse para análisis estándar de unión ligando/receptor. Véanse también, Parce et al. (1989) Science 246: 243-247; y Owicki et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. EE.UU. 87: 4007-4011, que describe métodos sensibles para detectar respuestas celulares.

Los análisis competitivos son especialmente útiles, en los que las células (fuente de timocina) se ponen en contacto y se incuban con un receptor o anticuerpo marcados que tienen afinidad de unión al ligando conocida, como ^{125}I-anticuerpo, y una muestra de prueba cuya afinidad de unión a la composición de se está midiendo. El enlace y composiciones de unión marcadas libres se separan entonces para valorar el grado de ligando que se une. La cantidad de compuesto de prueba unido es inversamente proporcional a la cantidad de receptor que se une a la fuente conocida. Puede usarse cualquier otra de numerosas técnicas para separar el enlace del ligando libre para valorar el grado de ligando que se une. Esta etapa de separación podría, por regla general, implicar un procedimiento como adhesión a filtros seguida de lavado, adhesión a plástico seguida de lavado o centrifugado de las membranas celulares. Las células viables podrían usarse también para detectar sistemáticamente los efectos de fármacos en funciones mediadas por timocinas, por ejemplo, niveles de mensajero secundario, es decir, Ca^{++}; proliferación celular; cambios de mezclas de inositol fosfato; y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo, un sistema de detección sensible a la proximidad. Tintes sensibles al calcio serán útiles para detectar niveles de Ca^{++}, con un fluorímetro o un aparato de clasificación de células pro fluorescencia.

Otro método utiliza membranas de células anfitrionas eucarióticas o procarióticas transformadas como la fuente de una timocina. Estas células se transforman de forma estable con vectores de ADN que dirigen la expresión de una timocina, por ejemplo, una forma unida a una membrana organizada. Básicamente, las membranas se prepararían a partir de células y se usarían en un análisis de unión receptor/ligando como el análisis competitivo definido anteriormente.

Aún otro planteamiento es usar timocina sin purificar solubilizada o purificada solubilizada de células anfitrionas eucarióticas o procarióticas transformadas. Esto permite un análisis de unión "molecular" con las ventajas de especificidad aumentada, la capacidad de ser automático y elevada capacidad de procesamiento de análisis de fármacos.

Otra técnica para detección sistemática de fármacos implica un planteamiento que proporciona una elevada capacidad de procesamiento de detección sistemática de compuestos que tienen afinidad de unión a un receptor de timocina adecuada y se describe en detalle en solicitud de patente europea 84/03564 de Geysen, publicada el 13 de septiembre de 1984. En primer lugar, se sintetizan en un sustrato sólido un gran número de diferentes compuestos de prueba de péptidos pequeños, por ejemplo, puntas de plástico o alguna otra superficie apropiada, véase Fodor et al., citado anteriormente. Después, se hacen reaccionar todas las puntas con receptor de timocina sin purificar solubilizada o purificada solubilizada y se lava. La etapa siguiente implica detectar el receptor de timocina unido.

El diseño racional de fármacos puede basarse también en estudios estructurales de las formas moleculares de la timocina y otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas que median otras funciones en respuesta a la unión del ligando, otras proteínas que interactúan normalmente con el receptor. Un medio para determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas de RMN en dos dimensiones. Éstas proporcionarán guía en cuanto a qué restos de aminoácidos forman regiones moleculares de contacto. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas, véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography Academic Press, NY.

Una proteína purificada puede cubrirse directamente en placas para uso en las técnicas de detección sistemática de fármacos mencionadas. Sin embargo, los anticuerpos a estos ligandos que no se neutralizan pueden usarse como anticuerpos de captura para inmovilizar el ligando respectivo en la fase sólida.

XI. Kits

Esta invención contempla también el uso de proteínas de timocina, sus fragmentos, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de kits y métodos de diagnóstico para detectar la presencia de timocina o un receptor de timocina. Por regla general, el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido o segmento de gen de timocina determinado o un reactivo que reconoce uno o el otro, por ejemplo, fragmentos de receptor o anticuerpos.

Un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de prueba a una timocina comprendería, por regla general, un compuesto de prueba; un compuesto marcado, por ejemplo, un receptor o anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida por la timocina; una fuente de timocina (que aparece naturalmente o recombinante); y un medio para separar el enlace del compuesto marcado libre, como una fase sólida para inmovilizar la timocina. Una vez que los compuestos se han detectado sistemáticamente, aquéllos que tienen afinidad de unión a la timocina adecuada pueden evaluarse en análisis biológicos adecuados, que son muy conocidos en la técnica, para determinar si actúan como agonistas o antagonistas al receptor. La disponibilidad de polipéptidos de timocina recombinantes proporciona también patrones bien definidos para calibrar tales análisis.

Un kit preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una timocina en una muestra comprendería, por regla general, un compuesto marcado, por ejemplo, un receptor o anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida por la timocina; una fuente de timocina (que aparece naturalmente o recombinante); y un medio para separar el enlace del compuesto marcado libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar la timocina. Se proporcionarán también, normalmente, compartimentos que contienen reactivos e instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión a antígenos, específicos para los fragmentos de ligando o timocina, son útiles en aplicaciones diagnósticas para detectar la presencia de niveles elevados de timocinas y/o sus fragmentos. Tales análisis diagnósticos pueden emplear lisados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales, y además pueden implicar la detección de antígenos relacionados con el ligando en suero o similares. Los análisis diagnósticos pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo antígeno-timocina) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, como radioinmunoanálisis (RIA), ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), inmunoanálisis enzimático (EIA), técnica de inmunoanálisis multiplicado por enzimas (EMIT), inmunoanálisis fluorescente con sustrato marcado (SLFIA), y similares. Por ejemplo, pueden emplearse anticuerpos sin marcar usando un segundo anticuerpo que está marcado y que reconoce el anticuerpo para una timocina o de un fragmento particular suyo. Se han tratado también ampliamente en la bibliografía ensayos similares. Véanse, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY; y Ngo (ed.) (1988) Nonisotopic Immunoassay Plenum Press, NY.

Los anticuerpos antiidiotípicos pueden tener un uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una timocina, como tal puede ser diagnóstico de diversos estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de timocina puede dar como resultado la producción de diversas reacciones inmunológicas que pueden ser diagnósticas de diversos estados fisiológicos anormales, especialmente en enfermedades celulares proliferativas como cáncer o diferenciación anormal.

Con frecuencia, los reactivos para ensayos diagnósticos se suministran en kits, para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para el objeto de la invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, se proporcionan, el protocolo, y el marcador, anticuerpo o receptor marcado o no marcado, o la timocina marcada. Esto es, normalmente, junto con otros aditivos, como tampones, estabilizantes, materiales necesarios para la producción de señal, como sustratos para enzimas, y similares. Preferentemente, el kit contendrá también instrucciones para el uso apropiado y eliminación de los contenidos después del uso. Por regla general, el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Los reactivos se proporcionan, de forma deseable, como un polvo liofilizado seco, en el que los reactivos pueden reconstituirse en un medio acuosos proporcionando concentraciones apropiadas de reactivos para realizar el ensayo.

Cualquiera de los constituyentes de la detección sistemática de fármacos y de los ensayos diagnósticos mencionados puede usarse sin modificación o puede modificarse de diversas maneras. Por ejemplo, el marcado puede conseguirse por unión covalente o no covalente de un resto lo que proporciona una señal detectable directamente o indirectamente. En cualquiera de estos ensayos, pueden marcarse directamente o indirectamente la proteína, el compuesto de prueba, la timocina o los anticuerpos de ella. Las posibilidades para el marcado directo incluyen grupos marcadores: radiomarcadores como ^{125}I, enzimas (patente de los EE.UU. nº 3.645.090) como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (patente de los EE.UU. nº 3.940.475) capaces de controlar el cambio de intensidad de la fluorescencia, deriva de longitud de onda, o polarización de fluorescencia. Las posibilidades para el marcado indirecto incluyen biotinilación de un constituyente seguida de unión a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores.

Existen también numerosos métodos de separación del enlace del ligando libre, o alternativamente el enlace del compuesto de prueba libre. La timocina puede inmovilizarse en varias matrices seguido de lavado. Matrices adecuadas incluyen plásticos como una placa de ELISA, filtros y lechos. Los métodos de inmovilización de la timocina en una matriz incluyen, sin limitación, la adhesión directa al plástico, el uso de un anticuerpo de captura, el acoplamiento químico, y biotina-avidina. La última etapa en este planteamiento implica la precipitación de ligando/receptor o ligando/complejo de anticuerpo por cualquiera de varios métodos incluyendo aquéllos que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico como polietilenglicol o una sal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de la partícula magnetizable de anticuerpo de fluoresceína descrito en Rattle et al. (1984) Clin. Chem. 30: 1457-1461, y la separación de la partícula magnética del anticuerpo doble como se describe en la patente de los EE.UU. nº 4.659.678.

Se han descrito ampliamente en la bibliografía los métodos para ligar proteínas o sus fragmentos a los diversos marcadores y no requieren discusión detallada en la presente memoria. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados a través del uso de carbodiimida o ésteres activados para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres por reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado como cloroacetilo, o una olefina activada como maleimida, por unión, o similares. Las proteínas de fusión también encontrarán uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de una timocina. Estas secuencias pueden usarse como sondas para detectar niveles del mensaje de timocina en muestras de pacientes que se sospecha que una enfermedad, por ejemplo, cáncer o problema de desarrollo. La preparación de las secuencias de nucleótidos tanto de ARN como de ADN, el marcado de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y tratamiento en la bibliografía.

Normalmente, una sonda de oligonucleótidos debería tener al menos aproximadamente 14 oligonucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 18 nucleótidos, y las sondas de polinucleótidos pueden ser de hasta varias kilobases. Pueden emplearse diversos marcadores, lo más comúnmente radionúclidos, especialmente ^{32}P. Sin embargo, pueden emplearse también otras técnicas, como usar nucleótidos modificados con biotina para introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden estar marcados con una amplía variedad de marcadores, como radionúclidos, fluoróforos, enzimas, o similares.

Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex híbridos de ADN-ARN, o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos pueden marcarse sucesivamente y realizarse el ensayo en el que el dúplex se une a una superficie, con lo que puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al dúplex tras la formación del dúplex en la superficie. El uso de sondas para el ARN complementario novedoso puede realizarse por cualquier técnica convencional como hibridación de ácidos nucleicos, detección sistemática positiva y negativa, sondeo recombinatorio, translación por liberación del híbrido (HRT), y traslación por parada del híbrido (HART). Esto incluye también las técnicas de amplificación como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se contemplan también los kits de diagnóstico que analizan también la presencia cualitativa o cuantitativa de otros marcadores. El diagnóstico o pronóstico puede depender de la combinación de múltiples marcadores usados como marcadores. De esta forma, los kits pueden analizar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89-97.

XII. Aislamiento de receptores

Habiendo aislado un copartícipe de unión de una interacción específica, existen métodos para aislar el copartícipe contrario. Véase, Gaearing et al. (1989) EMBO J. 8: 3667-3676. Por ejemplo, pueden determinarse medios para marcar una timocina sin interferir con la unión a su receptor. Por ejemplo, un marcador de afinidad puede fusionarse con el amino o carboxilo terminales del ligando. Puede detectarse sistemáticamente una biblioteca de expresión para la unión específica de la timocina, por ejemplo, por ordenamiento celular u otra detección sistemática para detectar subpoblaciones que expresan tal componente de unión. Véase, por ejemplo, Ho et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11267-11271. Alternativamente, puede usarse un método de separación celular por "panning". Véase, por ejemplo, Seed y Aruffo (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 3365-3369.

Las técnicas de reticulación de proteínas con marcadores pueden aplicarse a copartícipes de unión de una timocina aislados. Esto permitiría la identificación de proteínas que interactúan específicamente con una timocina, por ejemplo, de una forma similar a ligando-receptor.

El amplio alcance de esta invención se entiende mejor con referencia a los ejemplos siguientes, que no tienen la intención de limitar la invención a realizaciones específicas.

Ejemplos Métodos Generales

Muchos de los métodos normalizados siguientes están descritos o referenciados, por ejemplo, en Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) volúmenes 1-3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel et al. (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis et al. (eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY. Métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización, y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes de esta serie; y bibliografía de los fabricantes del uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas de recombinación permite la fusión de los segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente que puede fusionarse vía una secuencia eliminable por proteasa. Véanse, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY; y Crowe et al. (1992) QlAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Los análisis de FACS se describen en Melamed et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; y Robinson et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

Ejemplo 1 Aislamiento de un gen de timocina de un ratón por hibridación sustractiva a partir de células CD44^{+} CD25^{+} CD3^{-} CD4^{-} CD8^{-} estimuladas

El planteamiento de detección sistemática usado para aislar linfotactina de ratón se denomina detección sistemática diferencial, o detección sistemática diferencial por hibridación sustractiva. En general, este procedimiento utiliza sondas generadas a partir de dos categorías de bibliotecas de ADNc. La primera categoría contiene sondas de bibliotecas de ADNc generadas a partir de tipos de células que no tienen que ser caracterizadas. Las bibliotecas de ADNc empleadas en esta detección sistemática se generaron como se describe a continuación a partir de estirpes celulares T D10.G4.1, HC7, y HT-2 en los plásmidos PCDNA I o PCDNA II (Invitrogen) que contenían un promotor SP6 y T7. La segunda categoría contiene sondas de la biblioteca de ADNc que tienen que ser caracterizadas. La biblioteca de ADNc empleada en esta detección sistemática se preparó a partir de las células Pro T como se describe a continuación.

Las células Pro T (CD44^{+} CD25^{+} CD3^{-} CD4^{-} CD8^{-}) de ratones Balb/c se prepararon para clasificación en un FACS marcando con anticuerpos apropiados usando técnicas estándar (Godfrey et al. (1993) J. Immunol. 150: 4244-52). Las células Pro T se activaron durante 6 horas como se describe a continuación, y se cultivaron en IL-7, factor de las células madre, e IL-2 durante 12 días para expandirse. Se reactivaron entonces las células durante 6 horas antes de recolectarlas y se conservaron a -70ºC. Para valorar la calidad de la segunda activación, se transfirió una alícuota de células a medio completo fresco después de 6 horas de activación y se cultivaron durante toda la noche. Se analizó la estirpe celular HT-2 dependiente de IL-2 en el sobrenadante de estos cultivos. Sólo los cultivos que demostraron valores altos de IL-2 después de la activación se usaron para generar las bibliotecas de ADNc. De esta forma, se acumularon células y después se mezclaron para aislar ARNm.

La estirpe celular T D10.G4.1 que demostró un fenotipo Th2, la estirpe celular T HC7 que demostró un fenotipo Th1, y la estirpe celular T TH-2 que se usó como un gen "doméstico" de la estirpe celular T se emplearon para fabricar bibliotecas de ADNc para detectar sistemáticamente la biblioteca de ADNc de células Pro T. la estirpe D10.G4.1 se expandió en cultivo y se activó en placas de cultivo (10 \mug/ml) recubiertas con anti-CD3 (Pharmingen) durante 6 horas antes de recolectar y almacenar a -70ºC. Se analizó la calidad de la activación de estas células como se describió anteriormente. Las células HT-2 se expandieron en medios de cultivo que contenían IL-2 (490 U7ml), se lavaron en PBS, y se almacenaron a -70ºC.

El ARNm se preparó mediante el kit FastTrack (Invitrogen) a partir del que se generó ADNc usando el SuperScript Plasmid System para síntesis de ADNc de GIBCO-BRL (Gathesburg, MD) básicamente como describe el fabricante. Una modificación del procedimiento fue la sustitución de los adaptadores BstXl (Invitrogen) por los adaptadores Sal 1 proporcionados con el kit. El ADNc resultante de estas células se usó para generar bibliotecas en el plásmido PCDNA II (Invitrogen). El ADNc se clonó en el sitio BstXI/Notl en el poliligador y se usó para transformar la cadena DH10B de E. coli. El plásmido se aisló y se purificó con el sistema Qiagen (Chastworth, CA) que se usó para generar sondas de ARN a partir del promotor SP6. Se generó una segunda biblioteca de ADNc a partir de células Pro T en el poliligador BstXI/Notl del plásmido pJFE14 SR alfa (J. F. Elliott et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6363-7). Esta biblioteca se usó para transformar DH10B y la bacteria se sembró en agarosa, se transfirió a membranas de nylon por triplicado, y se detectó sistemáticamente con sondas de ARN de las otras bibliotecas. La detección por quimioluminiscencia de la hibridación empleó el sistema Genius (Boerhringer Mannheim).

Las sondas de ARN se marcaron usando el sistema Genius (Boerhringer Mannheim) como describía el fabricante. Sin embargo, tanto la polimerasa SP6 como el ARN T7 usados se obtuvieron a partir de Promega (Madison, WI). Tanto la sonda HT-2 como la sonda de célula Pro T se usaron cada una a 10 ng/ml, las sondas HC7 y D10.G4.1 se usaron cada una a 5 ng/ml y se combinaron en una sonda mezcla. Los elevadores de filtros de la biblioteca de ADN c pJFE de célula Pro T se prohibridaron a 42ºC durante 3-6 horas en tampón de Church (formamida al 50%, 6X SSPE, NaHPO_{4} 50 nM a un pH de 7,2, SDS al 7%, N-laurilsarcosina al 0,1%, reactivo de bloqueo al 2% de Boerhringer Mannheim. Los filtros se sondearon toda la noche en el mismo tampón que contenía las sondas apropiadas. Cada filtro de este conjunto de filtros triplicados se sondeó, específicamente, con sondas ARN HT-2, sondas ARN de célula Pro T, o sondas mezcladas HC7 + D10.G4.1 ARN. Los filtros se lavaron como describía el Sistema Genius. Las colonias que se hibridaron con la sonda CD44^{+} CD25^{+} TN pero no la HT-2; o las sondas D10.G4.1 + HC7 se seleccionaron como únicas a la biblioteca de ADNc CD44^{+} CD25^{+} TN. Los clones se secuenciaron y se compararon con una serie de bancos de datos de secuencias para determinar si existía homología entre los clones descritos previamente. Se demostró que no se había descrito previamente el clon m3C9, y se aisló independientemente fuera del método de clonación sustractiva descrito anteriormente.

Ejemplo 2 Aislamiento de linfotactina de ratón por hibridación sustractiva a partir de células TcR^{+} CD4^{-} CD8^{-} estimuladas Anticuerpos y clasificación citométrica de flujo

Los timocitos \alpha\betaTcR^{+} CD4^{-} CD8^{-} (DN) se clasificaron usando CD4/CD8^{-}PE y TcR^{-}FITC mAbs (Pharmingen, San Diego, CA). Véase Zlotnik et al. (1992) J. Immunol. 4: 1211-1215. Las células clasificadas (aproximadamente 5 x 10^{5}) se estimularon en fase sólida anti-CD3 durante 24 h y entonces se expandieron y se cultivaron en IL-2 (500 U/ml) e IL-7 (100 U/ml) durante una semana (a aproximadamente 1 x 10^{8} células). Las células se recolectaron después de una semana en cultivo o se estimularon de nuevo durante 6 h en anti-CD3 y después se recolectaron.

Construcción de bibliotecas de ADNc directivo

Se utilizó ARN Poli(A)+ de timocitos \alpha\betaDN estimulados en anti-CD3 o de timocitos \alpha\betaDN no estimulados para sintetizar la primera cadena de ADNc usando NotI/cebador Oligo-DT (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). Se sintetizó ADNc bicatenario, ligado con adaptadores BstXI, se digirió con NotI, se fraccionó por tamaño para > 0,5 pares de kilobases (kb) y se ligó en los sitios NotI/BstXI de pJFE-14, un derivado del vector pCDSRa. Véase Takebe et al. Mol Cell Biol. 8: 466-472. Se usaron para la transformación células DH10a electrocompetentes de E. coli (Gibco-BRL). El número total de clones de las bibliotecas de ADNc era de 1,2 x 10^{6} para timocitos \alpha\betaDN estimulados y de 8 x 10^{5} para timocitos \alpha\betaDN no estimulados, respectivamente.

Sustracción de biblioteca basada en PCR

El sistema de sustracción de biblioteca basada en PCR desarrollado por Wang y Brown (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11505-11509, se modificó para aplicarlo a bibliotecas de ADNc de plásmidos. Se generó una biblioteca de ADNc específica para timocitos \alpha\betaDN activados usando 100 mg de la biblioteca de ADNc de los \alpha\betaDN no estimulados digeridos con XbaI, NotI, y ScaI como ADN conductor y 5 mg de biblioteca de ADNc de los \alpha\betaDN estimulados como ADN trazador.

Tras la digestión de restricción, se trató el ADN conductor con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para rellenar los sitios de restricción. Después de precipitar con etanol, se disolvió el ADN en 100 ml de agua, se desnaturalizó con calor y se mezcló con 100 ml (100 mg) de biotina Photoprobe (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se irradió entonces el ADN conductor con una lámpara de luz solar de 270 W en hielo durante 20 min. Se añadieron 50 ml más de biotina Photoprobe y se repitió la reacción de biotinilación. Después de extraer con butanol, el ADN fotobiotinilado (U conductor) se precipitó con etanol y se disolvió en 30 ml de Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM, a un pH de 8 (TE). Como ADN trazador, se digirieron 5 mg de ADNc de \alpha\betaDN estimulados con XbaI y NotI; se precipitó con etanol; y se disolvió en 4 ml de TE (S trazador). El S trazador se mezcló con 15 ml de U conductor, 1 ml (10 mg) de ARNt de E. coli (Sigma, St. Louis, MO), y 20 ml de 2 x tampón de hibridación (NaCl 1,5 M, EDTA 10 mM, HEPES 50 mM, a un pH de 7,5, SDS al 0,2%), se recubrió con aceite mineral y se desnaturalizó con calor.

El tubo de muestra se introdujo inmediatamente en un baño de agua a 68ºC y se incubó durante 20 h. La mezcla de reacción se sometió entonces a un tratamiento con estreptavidina seguido de extracción con fenol/cloroformo. Se precipitó en ADN sustraído, se disolvió en 12 ml de TE, se mezcló con 8 ml de U conductor y 20 ml de 2 x tampón de hibridación, y se incubó entonces a 68ºC durante 2 horas. Después del tratamiento con estreptavidina, el AFN restante se ligó con 250 ng de un fragmento purificado de XbaI / NotI de pJFE-14 y se transformó entonces en células de E. coli electrocompetentes para generar la activación de la biblioteca sustraída (S1) de \alpha\betaDN específicos. Se recogieron al azar 100 clones independientes y se detectaron sistemáticamente por hibridación usando una combinación de ADNcs conocidos de citocinas. Los ADNs de plásmidos se prepararon a partir de clones que no se hibridaron con las sondas de citocina. Estos clones se agruparon por tamaño de inserción y se caracterizaron adicionalmente por secuenciación de ADN. Se aislaron los clones correspondientes al clon m39c9 descrito anteriormente.

Ejemplo 3 Expresión de la linfotactina de ratón

Se aisló ARN Poli(A)^{+} a partir de poblaciones de células clasificadas usando el kit de ARNm FastTrack (Invitrogen, San Diego, CA). Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% que contenía formaldehído y se transfirieron a una membrana GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA). Se realizó la hibridación a 65ºC en NaHPO_{4} 0,5 M a un pH de 7,2, SDS al 7%, EDTA 1 mM, y BSA (fracción V) al 1% con ADNc de linfotactina marcado con ^{32}P-dCTP a 10^{7} cpm/ml. Después de la hibridación se lavaron los filtros tres veces a 50ºC en SSC 0,2X, SDS al 0,1%, y se expusieron a radiografía durante 24 h. En comparación con las células sin activar, las células timocito y esplenocito CD8^{+} activadas con éster forbólico, y las células Pro T tenían elevados niveles de expresión. Las células timocito y esplenocito CD4^{+}, y las células timocito DP no mostraron incremento en la expresión después de la activación.

La linfotactina es abundante en la biblioteca de ADNc de células Pro T, con una frecuencia de 1 en 125 clones. La linfotactina se aisló también a partir de una biblioteca de ADNc generada a partir de timocitos \alpha\betaTCR4^{+} CD4^{-} CD8^{-} (Zlotnik et al. (1992) J. Immunol. 149: 1211-5). El análisis de transferencia de ARN de subconjuntos de células T confirmó que la Linfotactina estaba presente en células Pro T activadas pero no en las aisladas recientemente.

Se detectó un elevado nivel de expresión de Linfotactina tanto en células activadas CD8^{+} CD3^{+} del timo como en células T CD8^{+} CD3^{+} activadas derivadas del bazo. Se detectó un bajo nivel de expresión en timocitos CD4^{+} maduros activados. Esta señal de hibridación débil puede ser debida a la pequeña subpoblación de células CD4^{+} NK1.1^{+} (Arase et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6506-10). No había expresión detectable de Linfotactina en timocitos CD4^{+} CD8^{+}. Además, la hibridación con una transferencia de ARN de tejido múltiple de ratón fracasó en detectar Linfotactina en corazón, cerebro, bazo, pulmón, hígado, riñón, testículos, o músculo esquelético.

Ejemplo 4 Perfiles de citocinas de células T in vivo e in vitro

Hemos caracterizado previamente células T, un subconjunto de timocitos inmaduros que deben ser probablemente la fase de diferenciación final antes del comienzo de la colocación génica de la cadena \beta del receptor de células T (Godfrey et al. (1993) Immunol. Today 14: 547-53; Godfrey et al. (1994) J. Immunol. 152: 4783-92). Las células Pro T son capaces de producir elevadas concentraciones de IL-2, TNF-\alpha, e IFN-\gamma, cuando se activan in vitro con éster forbólico (PMA), ionóforo de calcio (A23187), e IL-1. En este ejemplo se describen perfiles de producción de citocinas de las células Pro T in vivo e in vitro. Se detectó sistemáticamente una biblioteca de ADNc generada a partir de células Pro T activadas para detectar citocinas novedosas.

Para caracterizar el potencial de producción de citocinas de las células Pro T tanto activadas in vitro como clasificadas recientemente, se analizaron las células Pro T por PCR. Las células se activaron durante 6 horas con ionóforo de calcio A23187 (Calbiochem, San Diego, CA) se resuspendieron a 1 mM en DMSO y se usaron a una concentración final de 0,35 \muM en 12-miristato-13-acetato de forbol (Calbiochem), se resuspendieron a 1 mg/ml en etanol y se usaron a 10 ng/ml, e IL-1 (Genzyme, Cambridge, MA). El ARN total se aisló a partir de pelets de células con RNAzol (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX). El ADNc se generó a partir del ARN total por transcripción inversa del cebador poli dT. El ADNc se usó para amplificación por PCR. Para PCR, se amplificaron 5 \mul de ADNc directamente de la reacción de transcripción inversa. A cada reacción se le añadieron 45 \mul de una mezcla de lo siguiente: 5 \mul de tampón de PCR AmpliTaq 10X (Perkin-Elmer Cetus), 1 \mul de dNTPs 10 mM, 37 \mul de agua estéril, 0,2 \mul de polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus), 1 \mul de cada cebador sentido y antisentido a 1 OD/ml (Butch et al. (1993) J. Immunol. 150: 39-47). Los tubos de PCR se recubrieron con aceite de parafina y se amplificaron durante 30 ciclos usando un ciclador térmico de ADN (Perkin-Elmer Cetus). Se desnaturalizó cada muestra a 94ºC durante 2 min, se aneló a 55ºC durante 0,5 min y se extendió a 72ºC durante 1 min. Los productos y marcadores de PCR se analizaron en un gel de agarosa UltraPure al 1,7% (Gibco BRL) usando tampón de Tris-borato (Boehringer-Mannheim). Se incorporó bromuro de etidio (0,5 \mug/ml) al gel para visualizar el ADNc con luz UV. Se usaron los cebadores para HPRT para comparar la eficacia de la transcripción inversa para diferentes muestras.

Como se muestra en la Tabla 1, las células Pro T activadas in vitro con PMA, A23187, e IL-1 produjeron ARNm para IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, GM-CSF, y ambas cadenas P35 y P-40 de IL-12. No se detectó ARNm para IL-4 o IL-10. De forma similar, células Pro T recientemente clasificadas mostraron contener ARNm para IL-2, IFN-\gamma, TNF-\alpha, GM-CSF. De nuevo no se detectó mensaje pata IL-4 o IL-10. Este perfil común de citocina de ARNm de células Pro T recientemente clasificadas y activadas in vitro indica que las células Pro T se activan in vivo.

Para verificar adicionalmente el potencial de producción de citocinas de las células Pro T, se sondeó una transferencia Southern de una biblioteca de ADNc de células Pro T activadas. Una biblioteca de ADNc de una sonde de células Pro T se digirió con XbaI / NotI para liberar las inserciones. Se cargó un \mug de digestión en cada pocillo de un gel de agarosa al 1%. Las inserciones de ADNc para cada sonda de citocina se sometieron a electroforesis en paralelo. El gel se desnaturalizó (NaOH 1,5 M, NaCl 1,5 M), se neutralizó, (NaCl 1,5 M, Tris a pH 7 0,5 M), y se transfirió a membranas GeneScreen (NEN Research Products, Boston, MA). Los caminos se cortaron en tiras de filtro y se sondeó cada tira con ADNc de citocina marcado con ^{32}P-dCTP (10^{6} cpm/ml) en tampón de hibridación (BSA al 1%, NaHPO_{4} 0,5 M a pH de 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 7%) a 65ºC durante toda la noche. Los filtros se lavaron tres veces en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 50ºC durante 30 min. Los filtros se expusieron a radiografía.

Como se indica en la Tabla 2, se detectaron en esta biblioteca IL-2, IL-3, GM-CSF, IFN-\gamma, y la cadena P40 de la IL-12. La diferencia en la detección entre la transferencia de Southern de la biblioteca y la amplificación por PCR de las células recientemente clasificadas puede explicarse por la abundancia relativa de cada ARNm de citocina. Por ejemplo, la detección de TNF-\alpha por PCR en células Pro T activadas pero no por análisis de transferencia de Southern de la biblioteca de ADNc de células Pro T activadas puede reflejar el nivel relativamente bajo de transcripción de este ARNm en las condiciones de activación in vitro empleadas, o las cinéticas diferentes de inducción de ARNm de TNF-\alpha. Por el contrario, la detección de GM-CSF tanto por células Pro T activadas in vitro como por análisis de transferencia de Southern del ADNc de las células Pro T activadas indica que el mensaje para esta citocina es abundante respecto al del TNF-\alpha o difieren las cinéticas de inducción de su ARNm.

TABLA 1

Perfil de producción de citocina de células Pro T por la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Las células Pro T se clasificaron por FACS como se ha descrito y se sometieron a ensayo de PCR como células sin activar recientemente clasificadas o células activadas in vitro. Una señal positiva de PCR se indica con (+) y la ausencia de señal de PCR se indica con (-).

IL-2	+	+
IL-4	-	-
IL-10	-	-
P35	-	+
P40	-	+
IFN-\gamma	+	+
TNF-\alpha	+	+
GM-CSF	+	+

TABLA 2

La biblioteca de ADNc de células Pro T se sondeó por transferencia de Southern con citocinas conocidas. Una señal fuerte de hibridación se indica con (++), una señal de hibridación de moderada a débil se indica con (+) y la ausencia de señal de hibridación se indica con (-).

\newpage

Citocina	Hibridación
IL-2	++
IL-3	+
IL-4	-
IL-5	-
IL-6	-
IL-10	-
P35	-
P40	+
IFN-\gamma	++
TNF-\alpha	-
GM-CSF	++
TGF-	-

Ejemplo 5 Comparación de linfotactina de ratón con la superfamilia de citocinas C-C y C-X-C

Mientras se detectaba sistemáticamente la biblioteca de ADNc de células Pro T se aisló un clon cuya traslación de proteína se ajustaba sistemáticamente con un segmento corto de carboxilo terminal de cadenas de proteínas de timocina C-C en búsquedas BLAST de bases de datos de proteínas y ácidos nucleicos (Altschul et al. (1990) J. Mol Biol. 403-410). Se detectó también una similitud más débil en esta región con las secuencias de quimiocinas C-X-C. Debido a estas actividades biológicas se denominó esta molécula como Linfotactina (LTn).

Los clones de ADNc se secuenciaron usando plantillas bicatenarias y un kit de secuenciado (United States Biochemicals, Cleveland, OH). Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias descritas previamente en los bancos de datos FASTDB (Intelligenetics, Mountain View, CA). La secuencia de aminoácidos de linfotactina se alineó con la quimiocina C-X-C Gro \alpha y la quimiocina C-C Mip-1\beta (Proteína macrófago inflamatoria 1 \beta). Una comparación estrecha de la Linfotactina con miembros tanto de la familia de quimiocinas C-C como C-X-C proporcionó la oportunidad de conocer mejor los orígenes de este gen. En la Figura 1 se muestran las secuencias de aminoácidos de Mip-1\beta y Gro \alpha, representativos de las quimiocinas C-C y C-X-C respectivamente (Davatelis et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 1939-44), basada en la organización del exón conservada de sus familias de genes de quimiocinas. La organización del Exón representada está basada en la comparación con el Mip-1\beta. Los restos en un recuadro son homólogos entre las dos secuencias. Los restos en un recuadro negro representan las cuatro cisteínas diagnósticas tanto de la familia de quimiocinas C-X-C como C-C. Además, los restos en un recuadro sombreado representan los restos que son diagnósticos de la familia de quimiocinas C-C (Bairoch (1993) Nucleic Acids Res. 21: 3097-103).

El alineamiento de la secuencia de Linfotactina con estas moléculas muestra que el mayor grado de identidad se da dentro de los tres homólogos del exón. Las familias de quimiocinas C-C y C-X-C están definidas por dos cisteínas conservadas estructuralmente en los aminos terminales de sus respectivas proteínas, que forman parte sucesivamente de dos uniones disulfuro distintas a un carboxilo terminal localizado en el par de restos de cisteína. La secuencia de Linfotactina carece sorprendentemente de la primera cisteína de los motivos de C-C or C-X-C de amino terminal distintivos, así como el correspondiente copartícipe disulfuro en otro sitio de la cadena. Por lo tanto, la Linfotactina mantiene sólo uno de los dos puentes disulfuro (Cys2-Cys4) del pliegue de quimiocina (Lodi et al. (1994) Science 263: 1762-1767). Aparte de esta anormalidad, la Linfotactina parece estar más estrechamente relacionada con la familia de quimiocinas C-C a juzgar por los patrones de secuencia poco densos diagnósticos de las quimiocinas C-C. Específicamente, se conserva en la Linfotactina una fenilalanina y un resto de tirosina (Figura 1, recuadros sombreados) característicos de la familia de quimiocinas C-C pero que no se encuentran en la familia C-X-C.

Los genes de quimiocinas de vertebrados están estrechamente reagrupados en cromosomas discretos basados en su relación con la familia C-C o C-X-C. Por ejemplo, todas las cartografías de quimiocinas C-C descritas previamente cartografían el cromosoma diecisiete humano y el cromosoma once de ratón. De forma similar, las quimiocinas C-X-C cartografían el cromosoma cuatro humano y basado en las similitudes entre los cromosomas de ratón y humano las quimiocinas C-X-C probablemente cartografían el cromosoma cinco de ratón. La Linfotactina cartografía en particular la región distal del cromosoma uno de ratón ligado a Fasl, At3, Sele, y Otfl. Tomados junto con las comparaciones de secuencias, estos datos apoyan la hipótesis de que la Linfotactina representa el prototipo estructural de una nueva clase de quimiocinas.

Ejemplo 6 Cartografía del cromosoma 1 de la linfotactina de ratón

Obsérvese que el gen de Linfotactina se representa por LTn, el gen del ligando Fas por Fas1, el gen de la antitrombina 3 por At3, el gen del endotelio de la selectina por sele (antiguamente Elam), y el gen del factor 1 de transcripción de unión a octámero por Otf1 en la siguiente discusión.

El LTn cartografía en la región distal del cromosoma uno de ratón. El LTn se localizó en el cromosoma uno de ratón por una prueba de retrocruzamiento interespecífico. La progenie retrocruzada interespecífica se generó apareando [(C57BL/6J x Mus Spretus)F_{1} hembras y C57BL/6J] machos como se describe en (Copeland et al. (1991) Trends Genet. 7: 113-118). Se usaron un total de 205 ratones F_{2} para cartografiar el locus del LTn. El aislamiento de ADN, digestión con enzima de restricción, electroforesis en gel de agarosa, transferencia de Southern e hibridación se realizaron según técnicas normalizadas (Jenkins et al. (1982) J. Virol. 43: 26-36). Todas las transferencias se prepararon con una membrana de nylon Hybond-N (Amersaham).

La sonda, un fragmento de 536 pares de bases de ADNc de LTn de ratón, se marcó con ^{32}P-dCTP; el lavado se realizó a una restricción final de SSC 0,1X, SDS al 0,1%, 65ºC. Se detectó un fragmento de 13.0 kb en ADN de C57BL/6J digerido con Sphl y se detectó un fragmento de 8,6 kb en ADN de M. spretus digerido con Sphl. Se siguió en ratones retrocruzados la presencia o ausencia del fragmento de 8,6 kb de Sphl específico de M. spretus.

Las distancias de recombinación se calcularon usando el programa de ordenador SPRETUS MADNESS (National Cancer Institute Frederick Cancer Center, Frederick MD). El orden de genes se determinó minimizando el número de sucesos de recombinación requeridos para explicar los modelos de distribución de alelos. Las proporciones del número total de ratones que mostraban cromosomas recombinantes respecto al número total de ratones analizados para cada par de loci y el orden de genes más probable son: centrómero - Fast - 0/180 - At3 - 3/164 - Sele - 2/162 - LTn - 1/170 -
Otf1. Las frecuencias de recombinación (expresadas como distancias genéticas en centiMorgans (cM) +/- el error estándar) son - [Fasl, At3] - 1,8 +/- 1,1 - Sele - 1,2 +/- 0,9 - LTn - 0,6 +/- 0,6 - Otf1.

La Tabla 3 muestra los modelos de segregación de LTn y se muestran los genes que lo flanquean en 154 animales retrocruzados que se tipificaron para todos los loci. Se tipificaron, para pares individuales de loci, más de 154 animales. Cada columna representa el cromosoma identificado en la progenie retrocruzada que se heredó de los progenitores (C57BL/6J x M. Spretus)F_{1}. Un "+" representa la presencia de un alelo de C57BL/6J y un "#" representa la presencia de un alelo de M. Spretus. El número de descendencia que hereda cada tipo de cromosoma se lista al final de cada columna. Al pie de la Tabla 3 se describe una cartografía parcial del ligamiento del cromosoma uno que muestra la localización de LTn en relación con los genes ligados. Se describen las distancias de recombinación entre loci en centimorgans, y las posiciones de los loci en cromosomas humanos se dan también, cuando se conocen. Pueden obtenerse referencias para las posiciones de los loci en cartografía humana citados en este estudio a partir de GDB (Base de datos genómica), una base de datos computerizada de información de ligamiento humano mantenida por The William H. Welch Medical Library of The Johns Hopkins University (Baltimore, MD).

TABLA 3 Cartografiado génico de Linfotactina de ratón

1

En los seres humanos, Fas1 y AT3 están localizados en 1q23-q25.1; Sele está localizado en 1q22-q25; y Otf1 está localizado en 1 cen-q32. Ltn de ratón cartografía entre Sele y Otf1 en el cromosoma 1 de ratón en la posición 1.2 centimorgans desde Sele y 0,6 centimorgans desde Otf1. Ltn cartografía a una posición de 3 centimorgans desde Fas1 y At3.

Ejemplo 7 Expresión de la proteína de Linfotactina de ratón en E. coli

La PCR se usó para mutagenizar el ADNc de Linfotactina para insertar un sitio de restricción HindIII proximal a Gly2 (siendo 1 el resto de N terminal esperado de la proteína secretada madura) y un sitio Xho1 distal al codón de parada de traducción del marco abierto de lectura. El fragmento HindIII/Xhol resultante se insertó en el plásmido pFLAG-1 HindIII y Xhol dividido (International Biotechnologies, New Haven, CT). El plásmido de expresión resultante se transformó en la cepa de E. coli Topp5 (Stratagene, La Jolla, CA) y se hicieron crecer transformantes resistentes a ampicilina (50 \mug/ml) en Luria Broth (Gibco) a 37ºC hasta que la densidad óptica a 550 nm fue de 0,7. Se indujo la proteína recombinante con isopropil-\betaD-tiogalactopiranósido (Sigma, St. Louis, MO) y la incubación de células continuó a 20ºC durante 18 horas más. Se recolectaron las células de 1 litro de cultivo por centrifugación y se resuspendieron en 200 ml de sacarosa al 30%, Tris HCl 50 mM a un pH de 8,0, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM enfriado en hielo. Después de 10 minutos en hielo, se añadió agua helada hasta un volumen total de 2 litros. Después de 20 minutos en hielo, se eliminaron las células por centrifugación y se clarificó el sobrenadante por filtración vía Millipak 60 5 \muM (Millipore Corp., Bedford, MA). La proteína recombinante se purificó vía 25 ml de matriz de afinidad M2 (International Biotechnologies) después de ciclar a 200 ml/hora durante 48 horas a 4ºC, lavar con solución salina tamponada con fosfato, elución con glicina HCl 0,1 M a un pH de 3,0, y neutralización con Tris HCl hasta un pH de 8,0.

Ejemplo 8 Actividad biológica de la Linfotactina de ratón

La Linfotactina recombinante se generó por expresión en E. coli como se muestra en el Ejemplo 7 anterior, y se analizó su actividad biológica. En general, cuando las quimiocinas C-C se unen a sus receptores en leucocitos hay un flujo intracelular de Ca^{2+} medible (Neote et al. (1993) Cell 72, 415-425). Por lo tanto, se examinó la capacidad de la Linfotactina de iniciar un flujo de calcio en células THP-1, una estirpe celular monocítica humana que es sensible a la Mip-1\alpha de ratón y a la mayoría de las demás quimiocinas C-C y C-X-C de ratón y humanas (las células THP-1 están disponibles en ATCC en el Tumor Immunology Bank con número de registro TIB 203). En ensayo usado se denominó un análisis del flujo intracelular de Ca^{2+}. Las células THP-1 se cargaron en presencia de indol-1 AM 3 \muM (Calbiochem). Se midió la fluorescencia en un espectrofluorímetro PTI a una longitud de onda de excitación de 350 nm. Se registraron emisiones duales simultáneas a 400 y 490 nm. Se calcularon las proporciones a 2 puntos por segundo. La proporción de fluorescencia se calculó a 400/490 nm. A diferencia de la Mip-1\alpha, la linfotactina de ratón fue incapaz de generar flujo de calcio en las células THP-1. Este resultado sugiere que la Linfotactina puede emplear un receptor que no usan otras quimiocinas conocidas. Esta posibilidad está reforzada adicionalmente por los datos presentados en la presente memoria para linfotactina humana, que muestran que la linfotactina causa un flujo intracelular de calcio en PBL humano.

Otra característica que define a las quimiocinas es su capacidad para inducir una respuesta quimiotáctica en células del sistema inmunitario. Un tipo de células mostrará quimiotaxia en un intervalo relativamente estrecho de concentración de quimiocina in vitro, en el que una concentración elevada causa adhesión y una concentración baja no provocará quimiotaxia (Zigmond et al. (1973) J. Exp. Med. 137: 387-410). Para valorar las capacidades quimiotácticas de la Linfotactina, se analizó la capacidad de varias poblaciones de leucocitos para migrar en respuesta a la Linfotactina usando una prueba de quimiotaxia de células de timocina. Diversas células mostraron una respuesta quimiotáctica a la Linfotactina dependiente de la dosis. Entre el tipo de células más sensible se encuentran los timocitos CD8^{+}, en los que una concentración de 10^{-10} M indujo quimiotaxia. En contrate, se requirió una concentración de 10^{-8} M para inducir una respuesta quimiotáctica en células tímicas CD4^{+}. Esto iguala la respuesta de estos dos tipos de células con la quimiocina Mip-1\alpha. Comparable con la respuesta quimiotáctica de las CD4^{+} tímicas a la Linfotactina fueron las respuestas de las células esplénicas sin células T, células hepáticas de un feto de 15 días, y células de los ganglios linfáticos.

Estas poblaciones de células mostraron una respuesta quimiotáctica similar a Mip-1\alpha. Sin embargo, a diferencia de Mip-1\alpha, la Linfotactina no indujo una respuesta quimiotáctica en las células de exudado peritoneal o en la estirpe celular monocítica humana THP-1. El análisis adicional de las poblaciones de monocitos/macrófagos derivados de diversas fuentes así como de neutrófilos apoyó la conclusión de que la Linfotactina no induce quimiotaxia en monocitos/macrófagos o neutrófilos. Por lo tanto, la Linfotactina es única entre las quimiocinas ya que sólo induce respuestas quimiotácticas en poblaciones linfocíticas.

Los ensayos de quimiotaxia en células de timocina se realizaron usando un equipo de microquimiotaxia de 48 pocillos usando técnicas normalizadas (Bacon et al. (1988) Br. J. Pharmacol. 95: 966-74). La migración se midió como el número de células por 5 campos en gran aumento (x 400) con pocillos duplicados que se contaron para cada uno de los tres experimentos. Todas las células se obtuvieron a partir de ratones Balb/c a no ser que se indique lo contrario. La interpretación cualitativa de la importancia de la respuesta quimiotáctica comparando una población de células con otra se determina por diversas características: el número absoluto de células que muestran quimiotaxia, la concentración del factor que provoca la máxima respuesta quimiotáctica; y la diferencia en el número de células que experimentan quimiotaxia desde la menor a la mayor concentración óptima.

Ejemplo 9 Aislamiento de Linfotactina humana

La Linfotactina humana comparte el 60% de la identidad de aminoácidos con la LTn de ratón. Se parece a su equivalente de ratón en muchos aspectos, incluyendo la capacidad de quimioatraer células T pero no monocitos.

Los clones de ADNc humano que codifican LTn se identificaron detectando sistemáticamente una biblioteca, generada a partir del clon A10 de la célula T CD8^{+} (Cocks et al. (1993) Int. Immunol. 5: 657), con el ADNc de LTn de ratón como sonda. La construcción de la biblioteca de ADNc se ha descrito previamente (Cocks et al., citado anteriormente). La biblioteca se detectó sistemáticamente por métodos normalizados (Maniatis et al., 1982), usando el ADNc de LTn de ratón como sonda. Se aislaron cuatro clones diferentes de ADNc para LTn, que representan las especies 730bp, 625bp, 562bp y 520bp.

Se secuenció todo el ADNc de la Linfotactina humana por el método de terminación de la cadena de didesoxinucleótido con polimerasa T7 (U.S. Biochemicals, Cleveland, OH) usando ADN bicatenario como plantilla. La búsqueda de bases de datos y análisis de secuencias se realizó usando programas de Intelligenetics (Mountain View, CA). Todos estos clones contenían marcos abiertos de lectura idénticos de 114 aminoácidos (con la excepción de la especie 625bp, que tenía dos cambios conservadores de aminoácidos en la secuencia de N terminal) pero diferían en la longitud de sus regiones 3' no traducidas. Los clones 562bp y 520bp fueron los más predominantes en la biblioteca. Sólo dos clones estaban representados por la especie 625bp y un clon por la especie 730bp. La región 3' no traducida del ADNc contenía dos sitios de señal de poliadenilación. Los clones 625bp y 520bp usan el primer sitio de señal de poliadenilación, mientras que la especie 730 bp usa el segundo pero contiene una inserción de 180bp gen arriba del primero que contiene dos sitios más de señal de poliadenilación.

Ejemplo 10 Comparación de la Linfotactina humana con las quimiocinas C-C

La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida del clon de ADNc humano con la LTn de ratón reveló que compartían el 60% de identidad de secuencias. Las dos timocinas son de tamaño similar, teniendo la LTn humana un peso molecular previsto de 12.000 daltons y teniendo la LTn de ratón una masa molecular prevista de aproximadamente 11.500 daltons, (excluyendo cualquier glicosilación para cualquiera de las dos moléculas). Cuando se compara la secuencia de linfotactina humana con la Swiss Protein Data Base, los miembros de la familia de quimiocinas C-C proteína quimiotáctica de monocito 2 (MCP-2) y proteína macrófago inflamatoria 1\alpha (Mip-1\alpha) se identifican como compartiendo homología significativa con la linfotactina humana (LTn humana). Por lo tanto, como la LTn de ratón, la LTn humana comparte la identidad de aminoácidos más alta con las quimiocinas C-C, especialmente en la región correspondiente al exón 3. La LTn humana carece también del primer y tercer restos de cisteína que se emparejarían para formar uno de los dos puentes disulfuro característicos de las familias de quimiocinas C-C y C-X-C (Lodi et al. 1994).

De manera interesante, existe un alto grado de homología en la región de cola de LTn de ratón y humana. Aunque puede encontrarse una extensión de C terminal similar en la MCP-1 de ratón (Rollins et al. 1988), esta región de cola se ha perdido en el equivalente humano (Chang et al. 1989; Furutani et al. 1989; Yoshimura et al. 1999). De esta forma, la LTn es el primer ejemplo de una quimiocina humana que ha conservado esta región de cola.

Ejemplo 11 Expresión y distribución de ARNm de LTn humana

El ARN total de timocitos CD8^{+} clasificados, de timocitos CD4^{+} clasificados, del clon TA20 de TH1, y del clon NP44 de Th2 se preparó usando el método de RNAzol B (TM Cinna Scientific Inc., Friendswood, TX). Las muestras de ARN se fraccionaron en geles desnaturalizantes de agarosa al 0,85% y se transfirieron a nitrocelulosa BA-S (Cocks et al. 1993). El ARN del bazo, timo, próstata, testículos, ovarios, intestino delgado, colon, y leucocitos de la sangre periférica se adquirieron como una transferencia de northern a Clontech (Palo Alto, CA). Los filtros se hibridaron con un fragmento XmnI-PvuII de pJFEhTLn que contenía la región que codifica la LTn.

La plantilla de expresión para ARNm de LTn humana es muy similar a de LTn de ratón. Los timocitos CD8^{+} activados expresan la LTn mientras que los timocitos CD4^{+} activados tienen niveles indetectables de LTn. La LTn humana se expresa también de forma abundante en un clon activado de Th1 pero se expresa sólo a niveles muy bajos en un clon activado de Th2. el ARNm de LTn humana se detectó en bazo en reposo, timo, intestino delgado y leucocitos de la sangre periférica (PBL) a niveles bastante elevados y a niveles muchos menores en los tejidos de la próstata y los ovarios.

Ejemplo 12 Producción de hLTn recombinante

Se construyó un plásmido de expresión bacteriano que contenía ADNc de LTn humana. El ADNc se mutagenizó usando la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para insertar un sitio HindIII de restricción proximal al resto de Val de la proteína madura y un sitio Xhol distal al codón de parada de traducción del marco abierto de lectura con lo que el fragmento resultante podía subclonarse en el plásmido pFLAG-1 (International Biotechnologies, New Haven, CT). El plásmido de expresión se transformó en la cepa Topp5 de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) y la proteína recombinante se indujo y se purificó como se ha descrito anteriormente. Las fracciones se recolectaron y se mezclaron.

Ejemplo 13 Propiedades biológicas de la linfotactina humana

La actividad quimiotáctica (determinada como se describió anteriormente para la linfotactina de ratón) de la LTn humana se midió por sus efectos en la migración de poblaciones de linfotactina usando los ensayos de quimiotaxia celular descritos anteriormente. La quimiotaxia inducida por LTn humana en clones de células T CD8^{+} y CD4^{+} a concentraciones similares que aquéllas que muestran inducir una respuesta quimiotáctica en timocitos CD8^{+} y CD4^{+} cuando se usa LTn de ratón (véase anteriormente). Las células CD8^{+} fueron sensibles a una concentración de 10^{-10} M y las células CD4^{+} a 10^{-7} M de LTn. Los monocitos humanos no fueron sensibles a la LTn humana.

Capacidad de la LTn para inducir un flujo de Ca^{++}

La medida de un flujo intracelular de Ca^{++} es, en general, un indicador de la unión al receptor de leucocitos por las quimiocinas y puede usarse para predecir varias señales de quimiocinas sea a través del mismo o diferentes receptores. Los análisis del flujo intracelular de Ca^{+2} se usaron para controlar los efectos de la linfotactina humana en poblaciones celulares como se describió anteriormente para la linfotactina de ratón. Los leucocitos de la sangre periférica humana se cargaron en presencia de del indicador de calcio indol-1 AM 3 \muM (Calbiochem, San Diego, CA) y después se estimularon con LTn o una combinación de LTn e IL-8. Se midió la fluorescencia en un espectrofluorímetro PTI a una longitud de onda de excitación de 350 nm. Se detectaron emisiones simultáneas a 400 y 490 nm y se calcularon las proporciones a dos puntos por segundo.

Cuando se usó LTn recombinante para inducir el flujo intracelular de Ca^{++} en PBL humanos, se observó un claro aumento en la concentración del Ca^{++} intracelular. Además, se observó un segundo flujo de calcio cuando se añadía IL-8 después del tratamiento con LTn, lo que sugiere que la LTn usa un receptor diferente de la IL-8. Resultados similares se obtuvieron cuando las quimiocinas C-C se añadían después del tratamiento con LTn.

Ejemplo 14 Aislamiento de un receptor para una timocina de ratón

Una timocina puede usarse como un reactivo específico de unión, tomando ventaja de su especificidad de unión, más como se usaría un anticuerpo. Un reactivo de unión se marca como se describió anteriormente, por ejemplo, por fluorescencia o de otra forma, o se inmoviliza en un sustrato para métodos de separación celular por "panning".

La composición de unión se usa para detectar sistemáticamente una biblioteca de expresión fabricada a partir de una estirpe celular que expresa una timocina. Se usan técnicas normalizadas de tinción para detectar o clasificar ligando expresado intracelular o de superficie, o se detectan sistemáticamente por separación celular por "panning" células transformadas que expresan superficie. La detección sistemática de la expresión intracelular se realiza por diversos procedimientos de tinción o de inmunofluorescencia. Véase también McMahan et al. (1991) EMBO J. 10: 2821-2832.

Por ejemplo, en el día 0, portaobjetos de 2 cámaras de permanox se recubrieron con 1 ml de fibronectina por cámara, 10 ng/ml en PBS, durante 30 min a temperatura ambiente. Aclarar una vez con PBS. Después, sembraron células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de cultivo. Incubar toda la noche a 37ºC.

En el día 1, para cada muestra, preparar 0,5 ml de una disolución de 66 mg/ml DEAE-dextrano, cloroquina 66 mM, y 4 mg de ADN en DME libre de suero. Se prepara un control positivo para cada grupo, por ejemplo de ADNc de FLAG de timocina de ratón a una dilución de 1 y 1/200, y un falso negativo. Aclarar las células con DME libre de suero. Añadir la disolución de ADN e incubar 5 h a 37ºC. Eliminar el medio y añadir 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 min. Eliminar y lavar una vez con DME. Añadir 1,5 ml de medio de cultivo e incubar toda la noche.

En el día 2 cambiar el medio. En los días 3 y 4 se fijan y se tiñen las células. Aclarar las células dos veces con Solución Salina Tamponada de Hank (HBSS) y fijarlas en paraformaldehído (PFA) al 4%/glucosa durante 5 min. Lavar 3X con HBSS. Los portaobjetos pueden almacenarse a -80ºC después de que se ha eliminado todo el líquido. Para cada cámara, se actúa sobre 0,5 ml de incubado como se indica a continuación. Se añade HBSS/saponina (0,1%) con 32 ml/ml de NaN_{3} 1M durante 20 min. Las células se lavan entonces con HBSS/saponina 1X. Se añade timocina o complejo de timocina/anticuerpo a las células y se incuba durante 30 min. Se lavan las células dos veces con HBSS/saponina. Si se considera apropiado, se añade primero anticuerpo durante 30 min. Añadir un segundo anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo de vector antiratón, a una dilución de 1/200 e incubar durante 30 min. Preparar una disolución ELISA, por ejemplo, disolución de Vector Elite ABC de peroxidasa de rábano picante, y preincubar durante 30 min. Usar, por ejemplo, 1 gota de disolución A (avidina) y una gota de disolución B (biotina) por 2,5 ml de HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Añadir disolución de HRP ABC e incubar durante 30 min. Lavar las células dos veces con HBSS, segundo lavar durante 2 min, lo que cierra las células. Añadir entonces ácido diaminobenzoico (DAB) Vector durante 5 a 10 min. Usar 2 gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml agua destilada en vidrio. Eliminar cuidadosamente la cámara y aclarar los portaobjetos en agua. Secar con aire durante unos minutos, añadir entonces 1 gota de Crystal Mount y cubrir el portaobjetos. Calentar en estufa durante 5 min. a 85-90ºC.

Alternativamente, reactivos de timocina se usan para purificar por afinidad o clasificar células que expresan un receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. o Ausubel et al.

Otra estrategia es detectar sistemáticamente un receptor unido a una membrana por separación celular por "panning". El ADNc receptor se construye como se describió anteriormente. El ligando puede inmovilizarse y usarse para inmovilizar que se expresan. La inmovilización puede conseguirse usando anticuerpos apropiados que reconocen, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de timocina, o usando anticuerpos generados contra los primeros anticuerpos. Ciclos recursivos de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones adecuados y al eventual aislamiento de los clones que expresan el ligando.

Las bibliotecas de expresión de fagos pueden detectarse sistemáticamente mediante timocina. Técnicas de marcado apropiadas, por ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcado específico de los clones apropiados.

Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para aquéllos expertos en la técnica. Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se ofrecen sólo a modo de ejemplo, y la invención debe estar limitada sólo por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que tales reivindicaciones tienen derecho.

SEQUENCE SUBMISSION

La SEQ ID nº: 1 es la secuencia de nucleótidos del clon de timocina m3C9 de ratón

La SEQ ID nº: 2 es la correspondiente secuencia de aminoácidos de timocina de ratón.

La SEQ ID nº: 3 es la secuencia de nucleótidos del clon de timocina A10-4 humana.

La SEQ ID nº: 4 es la correspondiente secuencia de aminoácidos de timocina humana.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Schering Corporation

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES DE TIMOCINA DE MAMÍFEROS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Schering Corporation

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(B): CALLE: 2000 Gallopin Hill Road

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(C): CIUDAD: Kenilworth

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(D): ESTADO: New Jersey

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): ZIP: 07033-0530

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(v): FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: Macintosh

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(C): SISTEMA OPERATIVO: 7.1

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(D): SOFTWARE: Microsoft Word 5.1a

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/193.483

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 8-feb-1994

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/231.421

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-abr-1994

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(viii): ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

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(A): NOMBRE: Lunn, Paul G.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.743

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE CERTIFICADO: DX0430K1

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: 908-298-5061

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(B): TELEFAX: 908-298-5388

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 536 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENCADENAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): RASGO DISTINTIVO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): SITUACIÓN: 32..373

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 1:

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 114 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 2:

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 562 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENCADENAMIENTO: sencillo

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

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(ix): RASGO DISTINTIVO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): SITUACIÓN: 15..356

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 3:

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº: 4:

6

7

Claims

1. Una proteína de timocina aislada de aproximadamente 11.000 a 12.500 daltons cuando está en forma no glicosilada, en la que dicha proteína de timocina se une específicamente a un anticuerpo generado contra un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste en:

(a) el polipéptido de la SEQ ID nº 2; y

(b) el polipéptido de la SEQ ID nº 4;

y en la que dicha proteína de timocina se define adicionalmente por las siguientes propiedades biológicas:

i): la capacidad de inducir una respuesta quimiotáctica dependiente de la dosis por timocitos en un ensayo de quimiotaxia de células de timocina;

ii): la incapacidad de inducir una respuesta quimiotáctica dependiente de la dosis en células THP-1 humanas en dicho ensayo de microquimiotaxia de células de timocina, y

iii): la incapacidad de inducir un flujo intracelular de Ca^{+2} en células THP-1 humanas en un ensayo del flujo intracelular de Ca^{+2}.

2. La proteína de timocina de la reivindicación 1, en la que la proteína de timocina se selecciona del grupo que consiste en el polipéptido de la SEQ ID nº 2 y el polipéptido de la SEQ ID nº 4.

3. La proteína de timocina de cualquier reivindicación precedente, en la que en la proteína de timocina se produce de forma recombinante o es una proteína que aparece de forma natural.

4. La proteína de timocina de cualquier reivindicación precedente, en la que en la proteína:

(a) está marcada de forma detectable;

(b) está unida a un soporte sólido; o

(c) es una proteína de fusión.

5. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de timocina de mamífero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. El ácido nucleico aislado según la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en el ácido nucleico de la SEQ ID nº 1 y el ácido nucleico de la SEQ ID nº 3.

7. Un vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6.

8. El vector de la reivindicación 7, en el que el vector es un vector de expresión que conduce la expresión de la proteína de timocina en un anfitrión procariótico o eucariótico.

9. Una célula transinfectada con un ácido nucleico de la reivindicación 5 ó 6, o con un vector de la reivindicación 7 u 8.

10. Un primer ácido nucleico aislado que codifica una proteína de timocina que, en presencia de ADN competitivo de una biblioteca genómica humana es capaz de hibridarse selectivamente con un segundo ácido nucleico que codifica la proteína de timocina de la reivindicación 1.

11. El primer ácido nucleico de la reivindicación 10, en el que el segundo ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en el ácido nucleico de la SEQ ID nº 1, el ácido nucleico de la SEQ ID nº 3, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID nº 2, y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID nº 4.

12. El primer ácido nucleico de la reivindicación 11, en el que dicho primer ácido nucleico se hibrida con el ácido nucleico de la SEQ ID nº 3 en condiciones de hibridación de 42ºC y formamida al 50% y permanece unido en condiciones de lavado de 2 x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC.

13. Un anticuerpo, o su fragmento, que se une específicamente a una proteína de timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. El anticuerpo o fragmento según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo se une específicamente a una proteína de timocina seleccionada del grupo que consiste en el polipéptido de la SEQ ID nº 2 y el polipéptido de la SEQ ID nº 4.

15. Un kit que comprende:

(a): una proteína de timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un ácido nucleico que codifica una proteína de timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un anticuerpo, o fragmento de un anticuerpo, que se une específicamente a una proteína de timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b): un recipiente en el que se segrega la proteína de timocina, el ácido nucleico, el anticuerpo o fragmento; y

(c): instrucciones para el uso de la proteína de timocina, el ácido nucleico, el anticuerpo o fragmento.

16. Un método de detectar en una muestra biológica un anticuerpo, o su fragmento, que se une específicamente a una proteína de timocina como se definió en la reivindicación 1, el método comprende:

(a): poner en contacto la muestra biológica con la proteína de timocina;

(b): incubar dicha muestra biológica con la proteína de timocina para formar un complejo de anticuerpo o fragmento:proteína de timocina; y

(c): detectar dicho complejo.

17. Un método de detectar una proteína de timocina como se definió en la reivindicación 1 en una muestra biológica, el método comprende:

(a): poner en contacto la muestra biológica con un agente de unión que tiene una afinidad por la proteína de timocina;

(b): incubar dicha muestra biológica con el agente de unión para formar un complejo de agente de unión: proteína de timocina; y

(c): detectar dicho complejo.

18. El método de la reivindicación 17, en el que el agente de unión es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a una proteína de timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

19. Un método de detectar en una muestra biológica un ácido nucleico que codifica una proteína de timocina como se definió en la reivindicación 1, el método comprende:

(a): poner en contacto dicha muestra biológica con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse selectivamente con un ácido nucleico que codifica una proteína de timocina seleccionada del grupo que consiste en el polipéptido de la SEQ ID nº 2 y el polipéptido de la SEQ ID nº 4;

(b): incubar dicha sonda de ácido nucleico con la muestra biológica para formar un híbrido de la sonda de ácido nucleico con secuencias complementarias de ácidos nucleicos presentes en la muestra biológica; y

(c): determinar la extensión de hibridación de la sonda de ácido nucleico con las secuencias complementarias de ácidos nucleicos.

20. El método de la reivindicación 19, en el que la sonda de ácido nucleico es capaz de hibridarse con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en el ácido nucleico de la SEQ ID nº 1 y el ácido nucleico de la SEQ ID nº 3.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que dicha muestra biológica deriva de tejido humano.

22. Un método in vitro de modular la fisiología o desarrollo de una célula, que comprende poner en contacto la célula con una proteína de timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

23. El uso de un polipéptido que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la SEQ ID nº 2 o la SEQ ID nº 4, para la fabricación de una composición para ser inyectada en un animal como parte de un método de producir un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 13 ó 14.

24. Una formulación farmacéutica que comprende una timocina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 13 ó 14, en combinación con un vehículo o diluyente.