ES2216176T3 - Quimioquinas de mamiferos. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN NUEVAS QUIMOQUINAS CC DE HUMANOS, LOS REACTIVOS RELACIONADOS CON LAS MISMAS, INCLUIDAS LAS PROTEINAS PURIFICADAS, ANTICUERPOS ESPECIFICOS Y LOS ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHAS QUIMOQUINAS. SE PROPORCIONAN AL MISMO TIEMPO LOS PROCEDIMIENTOS PARA REALIZAR Y UTILIZAR DICHOS REACTIVOS Y KITS PARA DIAGNOSTICO.

Description

Quimioquinas de mamíferos.

La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de patente de Estados Unidos 60/031,805, presentada el 27 de noviembre de 1996; y las solicitudes de patente de utilidad de los Estados Unidos, regular 08/761,071, presentada el 5 de diciembre de 1996; y la presentada por Morales et al, el 24 de octubre de 1997.

Campo de la invención

La presente invención trata de composiciones relacionadas con proteínas que funcionan en el control del desarrollo, diferenciación, tránsito, y fisiología de células de mamífero, por ejemplo, células del sistema inmune de mamíferos. En particular, proporciona proteínas que regulan o evidencian el desarrollo, diferenciación y función de diferentes tipos de células, incluidas las células hematopoyéticas.

Antecedentes de la invención

El componente circulante del sistema circulatorio de mamíferos consiste en diferentes tipos de células, que incluye los glóbulos rojos y blancos de la sangre de los linajes de células eritroides y mieloides. Véase, por ejemplo, Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2ª ed.) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA.; y Paul (ed.) (1993) Fundamental Immunology (3ª ed.) Raven Press, N.Y.

Durante algún tiempo se ha sabido que la respuesta inmune en mamíferos se basa en una serie de interacciones celulares complejas, conocidas como la "red inmune". La investigación reciente ha proporcionado nuevas percepciones en las funciones internas de esta red. Aunque sigue siendo claro que muchas de estas respuestas, de hecho, giran en torno de las interacciones parecidas a una red tridimensional de linfocitos, macrófagos, granulocitos y otras células, los inmunólogos mantienen ahora generalmente la opinión de que las proteínas solubles, conocidas como linfoquinas, citoquinas o monoquinas desempeñan una función crucial en el control de estas interacciones celulares. Por ello, existe un interés considerable en el aislamiento, caracterización y los mecanismos de acción de los factores moduladores de las células, una comprensión de lo cual debe conducir a avances significativos en el diagnóstico y terapia de numerosas anormalidades médicas, por ejemplo, trastornos del sistema inmune y otros.

Las linfoquinas aparentemente median las actividades celulares en una variedad de formas. Se ha demostrado que soportan la proliferación, crecimiento y diferenciación de las células madres pluripotenciales hematopoyéticas en un vasto número de progenitores que comprende diversos linajes celulares que constituyen un sistema inmune complejo. Estas interacciones entre los componentes celulares son necesarias para una respuesta inmune saludable. Estos diferentes linajes celulares con frecuencia responden de un modo diferente cuando se administran linfoquinas junto con otros agentes.

Las quimioquinas son una superfamilia muy grande y diversa de proteínas. La superfamilia se subdivide en dos ramas clásicas, basadas en si las primeras dos cisteínas en el resto de quimioquina están adyacentes (denominada la rama "C-C"), o separadas por un residuo intermedio ("C-X-C"). Una rama de quimioquinas recientemente identificada carece de dos cisteínas en el resto correspondiente, y es representada por las quimioquinas conocidas como linfotactinas. Otra rama recientemente identificada tiene tres residuos intermedios entre dos cisteínas, por ejemplo, las quimioquinas CX3C. Véase, por ejemplo, Schall y Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6:865-873 y Bacon y Schall (1996) Int. Arch. Allergy & Immunology. 109:97-109.

Se han identificado múltiples factores que tienen influencia en el proceso de diferenciación de las células precursoras, o que regulan la fisiología o las propiedades de migración de tipos específicos de células. Estas observaciones indican que existen otros factores cuyas misiones en la función inmune hasta ahora eran desconocidas. Estos factores proporcionan las actividades biológicas cuyos espectros de efectos puede ser diferente de los factores de diferenciación o activación conocidos. La ausencia de conocimiento acerca de las propiedades estructurales, biológicas y fisiológicas de los factores reguladores que regulan la fisiología celular in vivo impide la modulación de los efectos de estos factores. Por tanto, los estados médicos en los que se requiere la regulación del desarrollo o fisiología de células relevantes sigue siendo no manejable.

Compendio de la invención

La presente invención describe la existencia de moléculas que contienen el resto de quimioquina anteriormente desconocido que en la presente memoria se denominan DNAX Vic-1 (DVic-1). Con base en el análisis de la secuencia de las secuencias de la proteína químioquina que se describe más adelante es evidente que la DVic-1 pertenece a la familia de las quimioquinas CC.

Por consiguiente, en un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido Dvic-1 sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos madura del polipéptido representado en SEQ ID No: 2.

En realizaciones preferidas, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende dicho polipétido. Los polipéptidos de la invención puede estar formulados como una composición que comprende: una proteína o péptido DVic-1 estéril; una proteína o péptido DVic-1 y un vehículo; en donde el vehículo es: un compuesto acuoso que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

Otras formas de polipéptido incluyen una proteína de fusión, que comprende: la secuencia de la proteína madura de las SEQ ID No: 2; una secuencia marcadora (tag) para detección o purificación, que incluye una FLAG, His6, o la secuencia Ig, o la secuencia de otra proteína quimioquina. Los polipéptidos de la invención pueden ser usados en kits que comprenden dicha proteína o polipéptido y; un compartimento que contiene la proteína o polipéptido DVic-1; un compartimento que contiene la proteína o polipéptido DVic-1; o instrucciones para uso o desecho de los reactivos en el kit.

Se proporcionan compuestos y composiciones de unión los cuales consisten en, por ejemplo, una porción de unión a un antígeno de un anticuerpo, la cual se une específicamente a las proteína DVic-1 de la invención; el compuesto de unión puede ser un fragmento Fv, Fab, o Fab2; el compuesto de unión puede estar conjugado a otro resto químico; o el anticuerpo: se produce contra una secuencia peptídica de un polipéptido maduro que consiste en la SEQ ID NO: 2; se produce contra una DVic-1 madura; se produce contra una DVic-1 purificada; es inmunoseleccionado; es un anticuerpo policlonal; se une a una DVic-1 desnaturalizada; presenta una Kd para antígeno de al menos 30 mM; se une a un sustrato sólido, incluye una perla o membrana de plástico; es una composición estéril; o está marcado detectablemente, incluyendo un marcador radioactivo o fluorescente.

Los kits con composiciones de unión incluyen aquellos con dicho compuesto de unión, y: un compartimento que contiene el compuesto de unión; y/o instrucciones para uso o desecho de los reactivos en el kit. típicamente, con el kit se pueden hacer análisis cualitativos o cuantitativos. Se describen otras diversas composiciones, por ejemplo que comprenden: un compuesto de unión estéril; o el compuesto de unión y un vehículo, en donde el vehículo es: un compuesto acuoso, que incluye agua, solución salina y/o tampón; y/o formulado para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral.

Se proporcionan ácidos nucleicos que incluyen un ácido nucleico aislado o recombinante que codifica una proteína del primer aspecto indicado en la presente memoria péptido o la proteína de fusión que se describe, El ácido nucleico de la invención puede ser un vector de expresión; además puede contener un origen de replicación; puede ser de origen natural; puede contener un marcador detectable; puede contener una secuencia de nucleótido sintética; puede ser menor que 6 kb, de preferencia menor que 3 kb; puede ser de primate, incluyendo un ser humano; puede comprender una secuencia codificante de longitud completa, natural; puede ser una sonda de hibridación para un gen que codifica la proteína DVic-1; o puede ser usado como un cebador para la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR); puede ser un producto de PCR o cebador para mutagénesis.

También se proporciona una célula o tejido que comprende dicho ácido nucleico recombinante, cuando la célula es: una célula procariótica; una célula eucariótica; una célula bacteriana; una célula de levadura; una célula de insecto; una célula de mamífero; una célula de ratón; una célula de primate o una célula de ser humano. Los ácidos nucleicos pueden ser usados en kits, por ejemplo que contienen el ácido nucleico, y: un compartimento que contienen el ácido nucleico; un compartimento más que contiene una proteína o polipéptido DVic-1; y/o las instrucciones para uso o desecho de los reactivos en el kit. Típicamente, con el kit se puede hacer un análisis cualitativo o cuantitativo.

Estos ácidos nucleicos incluyen aquellos que: se hibridan bajo condiciones de lavado de: 30ºC y sal menor que 2M, de 45ºC y/o sal 500 mM, o de 55ºC y/o sal 150 mM, a la SEQ ID NO: 1; presentan al menos aproximadamente: 85% identidad sobre un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, o al menos 90% y/o el tramo es al menos 55 nucleótidos, o al menos 95% y/o el tramo es al menos 75 nucleótidos para una DVic-1.

Además, se proporciona un método de modular la fisiología o desarrollo de una célula o células para cultivo de tejidos, consistiendo el método en exponer la célula a un agonista o antagonista de DVic-1. También se describe en la presente memoria un método para detectar la unión específica a un compuesto, que consiste en: poner en contacto el compuesto con una composición seleccionada del grupo de: un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una quimioquina DVic-1; un vector de expresión que codifica una quimioquina DVic-1 o fragmento de la misma; una proteína sustancialmente pura que sea específicamente reconocida por el sitio de unión al antígeno descrito; una quimioquina DVic-1 sustancialmente pura o péptido de la misma, o una proteína de fusión que contiene una porción de secuencia de 30 aminoácidos de la secuencia de la quimioquina DVic-1.

Descripción detallada

Se apreciará que en la siguiente descripción detallada y los Ejemplos que cuando se hace referencia a DVic-1 es para fines ilustrativos y que pueden usarse procedimientos y técnicas análogas en relación con la invención reivindicada.

I.- Generalidades

La presente invención proporciona secuencias de DNA de primate que codifican proteínas que presentan propiedades estructurales o restos característicos de una citoquina o quimioquina. Para una revisión de la familia de las quimioquinas véase, por ejemplo, Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1767; Gronenborn y Clore (1991) Protein Engineering 4:263-269; Miller y Kranger (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:2950-2954; Matsushima y Oppenheim (1989) Cytokine 1:2-13; Stoeckle y Baker (1990) New Biol.2:313-323; Oppenheim, et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:617-648; Schall (1991) Cytokine 3:165-183; y The Cytokine Handbook Academic Press, NY.

Las nuevas citoquinas que se describen en la presente memoria se denominan DNAX Vic-1 (DVic-1) y quimioquina CC expresada en DNAX Groin Wound (DGWCC).

Las SEQ ID NO 3 y 4 definen dos EST obtenidos de genoteca de corazón humano fetal HHFFQ25R y genoteca de osteoblasto humano HOEDH11R, respectivamente. Estos muestran elevada homología y probablemente son los EST de un transcrito similar. Los restos de quimioquina de estos dos EST fueron comparados, y se obtuvo una secuencia de consenso y posteriormente se confirmó como DVic-1 humana codificante (SEQ ID NO: 1). Una secuencia de señal esta indicada entre Ala y Ile, aunque esta puede variar en diferentes líneas de células. También se describe un transcrito más grande alternativo para DVic-1 humana, que tiene un tramo N-terminal que no muestra restos característicos de quimioquina (SEQ ID NO: 11 y 12).

Las secuencias de polipéptido y ácido nucleico de DGWCC humana se describen como SEQ ID NO 5 y 6. La secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico de quimioquina DGXCC humana comienza en aproximadamente el nucléotido 1 de la SEQ ID NO: 5 y termina en aproximadamente el nucléotido 336. El resto CC característico puede encontrarse en los residuos de aminoácidos 9-10 de la SEQ ID NO: 6. Una secuencia de señal esta indicada, pero con base en los genes relacionados, puede ocurrir un procesamiento ligeramente diferente en diferentes tipos de células. La secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos correspondiente de quimioquina DGWCC de ratón (anteriormente denominada mDVic-1; véase, USSN 08/761,071) se describen como SEQ ID NO: 7 y 8. Una señal poli A es desde los nucleótidos 384 a 389 y contienen parte del codón antisentido. La señal P predice una escisión entre Ala (-1) y Leu 1l; pero la escisión real puede ser en cualquier lado por un residuo o similar.

Las siguientes descripciones se refieren, para propósitos de ejemplo, a las realizaciones de primate, por ejemplo, ser humano, pero de la misma manera son aplicables a las realizaciones relacionadas de otras fuentes de mamífero, por ejemplo, natural, que incluye roedores. Estas fuentes deben incluir diferentes vertebrados, típicamente animales de sangre caliente, por ejemplo, aves y mamíferos, particularmente animales domésticos, roedores y primates. La comparación con otras quimioquinas se proporciona en la Tabla 1.

Tabla 1

Alineamiento de las secuencias de proteínas. La MCP-1 humana (SEQ ID NO: 9) tiene el número de acceso de GenBank S71513; la MIP-3a (SEQ ID NO: 10) tiene el número de acceso de GenBank U77035; con DVic-1 humana (SEQ ID NO: 2). Un alineamiento semejante de las secuencias del ácido nucleico indicara regiones de identidad y diferencia.

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Las proteínas quimioquinas de esta invención se definen en parte por sus propiedades fisicoquímicas y biológicas. Las propiedades biológicas de las quimioquinas descritas en la presente, por ejemplo, DVic-1 o DGWCC, se definen en parte por su secuencia de aminoácidos, y tamaño maduro. Estas también deben compartir al menos algunas de las propiedades biológicas con otras quimioquinas similares. Una persona experta fácilmente reconocerá que algunas de las variaciones de las secuencias pueden ser toleradas, por ejemplo, las sustituciones conservativas o posiciones remotas de los residuos cruciales para la interacción con el receptor o características de estructura terciaria importantes, sin alterar de manera significativa la actividad biológica de la molécula. Por el contrario, las sustituciones no conservativas pueden ser adaptadas para suprimir las funciones seleccionadas.

Estas quimioquinas están presentes en tipos de tejidos específicos, por ejemplo, tejidos de la piel, y la interacción de la proteína con el receptor será importante para mediar diferentes aspectos de la fisiología o desarrollo celular. Los tipos celulares que expresan mensaje que codifica DVic-1 o DGWCC sugieren que las señales importantes en la diferenciación y desarrollo celular son mediadas por las mismas. Véase, por ejemplo, Gilbert (1991) Developmental Biology (3ª ed.) Sinauer Associates, Sunderland, MA; Browder, et al. (1991) Developmental Biology (3ª ed) Saunders, Philadelphia, PA.; Russo, et al. (1992) Development: The Molecular Genetic Approach Springer-Verlag, New York, N.Y.; y Wilkins (1993) Genetic Analysis of Animal Development (2ª ed.) Wiley-Liss, New, N.Y. además, la expresión o capacidad de respuesta de la DVic-1 o DGWCC deben servir como marcadores, por ejemplo, para definir ciertas subpoblaciones de células.

Las nuevas quimioquinas fueron descubiertas a través de búsquedas y análisis cuidadoso de secuencias de bases de datos. La ausencia de secuencias en las bases de datos disponibles sugiere fuertemente que los mensajes son raramente expresados y/o a niveles muy bajos. Esto puede manifestar expresión celular altamente restringida y/o niveles muy bajos en la mayor parte de los tipos de células.

Es posible realizar transferencia Northern utilizando los métodos estándares, véase, por ejemplo, Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) volúmenes. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn NY: y Ausubel, et al., (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY.

II.- Definiciones

El término "composición de unión" se refiere a moléculas que se unen con especificidad y selectividad a una quimioquina DVic-1, por ejemplo, en una interacción anticuerpo-antígeno. Sin embargo, otros compuestos, por ejemplo, proteínas de receptor también pueden asociarse de manera específica y/o selectiva con las quimioquinas DVic-1 para la exclusión de otras moléculas. Típicamente, la asociación será en una interacción proteína-proteína natural, fisiológicamente relevante, covalente o no covalente, y puede incluir miembros de un complejo multiproteína, que incluye compuestos vehículos o parejas para la dimerización. La molécula puede ser un polímero o reactivo químico. Ninguna implicación es necesariamente representada como si una quimioquina DVic-1 es necesariamente una molécula de forma convexa, por ejemplo, el ligando o el receptor de una interacción ligando-receptor, además de si la interacción presenta especificidad similar, por ejemplo, afinidad específica. Un análogo funcional puede ser un ligando con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula completamente no relacionada, por ejemplo, que tenga una forma molecular que interactúe con los determinantes de unión al ligando adecuados. Los ligandos pueden servir como agonistas o antagonistas del receptor, por ejemplo, Goodman, et al. (eds.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.

La expresión "complejo agente de unión : proteína quimioquina", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un complejo de un agente de unión y una quimioquina, por ejemplo, DVic-1, proteína que se forma por unión específica del agente de unión a la proteína quimioquina. La unión específica o selectiva del agente de unión significa que el agente de unión tiene un sitio de unión específico, por ejemplo, el sitio de unión al antígeno, que reconoce un sitio en la proteína quimioquina DVic-1 que no se comparte en muchas otras proteínas. Por ejemplo, los anticuerpos producidos contra una proteína quimioquina DVic-1 y que reconocen un epítopo en la proteína quimioquina son capaces de formar un complejo agente de unión : proteína quimioquina DVic-1 por unión específica y selectiva. Típicamente, la formación de un complejo agente de unión : proteína quimioquina DVic-1 permite la medición de la proteína DVic-1 en una mezcla de otras proteínas y sustancias biológicas. De la misma manera, la expresión "complejo anticuerpo: proteína quimioquina DGWCC" se refiere a una realización en la cual el agente de unión, por ejemplo, es una porción de unión al antígeno de un anticuerpo. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal o un fragmento de unión de un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab o F(ab)2. El anticuerpo, de preferencia será un anticuerpo policlonal para propósitos de ensayo de reactividad cruzada.

Las secuencias "homólogas" de ácido nucleico, cuando se comparan, presentan similitud o identidad significativa. Los patrones para la homología en los ácidos nucleicos son medidos para la homología generalmente utilizada en la técnica por comparación de la secuencia y/o relación filogenética, o basada en condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con mayor detalle posteriormente.

Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un RNA, DNA o un polímero mixto, que está sustancialmente separado de otros componentes biológicos que acompañan de forma natural una secuencia nativa, por ejemplo, proteínas y secuencias genómicas flanqueantes de las especies de origen. El término comprende una secuencia de ácido nucleico de ácido retirada de su medio natural, e incluye aislados de DNA recombinante o clonado y análogos químicamente sintetizados, o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula. Un ácido nucleico aislado contendrá típicamente moléculas homogéneas del ácido nucleico, pero en algunas realizaciones contendrá ácidos nucleicos con heterogeneidad menor en la secuencia. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o porciones no cruciales para una función o actividad biológica deseada.

Como se utiliza en la presente, la expresión "proteína quimioquina DVic-1" debe comprender, cuando se utiliza en el contexto de una proteína, una proteína que tiene las secuencias de aminoácidos, particularmente de las porciones del resto de quimioquina, mostradas en la SEQ ID NO: 2, o un fragmento significativo único para y/o característico de tal proteína, de preferencia una realización natural. La invención también describe un péptido que presenta estructura similar a estas quimioquinas, por ejemplo, que interactúa con los componentes de unión específicos de quimioquina DVic-1 o DGWCC. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, se unen típicamente a la quimioquina DVic-1 o DGWCC con elevada afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 100 nM, usualmente mejor que aproximadamente 30 nM, de preferencia menor que aproximadamente 10 nM, y de mayor preferencia mejor que aproximadamente 3 nM.

Un ácido nucleico "recombinante" se define bien por su método de producción o bien por su estructura. Con referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto preparado por un proceso, un proceso es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que incluyen la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente selección o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico preparado generando una secuencia que comprende fusión de dos fragmentos que no son contiguos en forma natural entre sí, pero se entiende que excluye los productos naturales, por ejemplo, mutantes que se presentan naturalmente. De esta manera, están comprendidos, por ejemplo, los productos elaborados transformando células con cualquier vector que no se presenta en la naturaleza, como son los ácidos nucleicos que contienen secuencias obtenidas utilizando cualquier proceso sintético de oligonucleótidos. Con frecuencia esto se hace para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o uno conservativo, aunque típicamente introduciendo o eliminando un sitio de reconocimiento de la secuencia. Alternativamente se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas para generar una sola entidad genética que contenga una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento por enzimas de restricción con frecuencia son la diana de estas manipulaciones artificiales, pero otras dianas específicas de sitio, por ejemplo, promotores, sitios de replicación del DNA, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles pueden ser incorporadas por diseño. Un concepto semejante se propone para un polipéptido recombinante, por ejemplo, fusión. Específicamente se incluyen los ácidos nucleicos sintéticos que, por redundancia del código genético, codifican polipéptidos similares para fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de diferentes variantes de especies distintas.

"Solubilidad" se refleja por la sedimentación medida en unidades Sverdberg, que son una medida de la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación se realizó tradicionalmente en una ultracentrifuga analítica, pero típicamente ahora se realiza en una ultracentrífuga estándar. Véase, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2ª ed.) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA; y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical Chemistry partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Como una determinación en bruto, una muestra que contenga un polipéptido putativamente soluble se centrifuga en una ultracentrífuga estándar de tamaño normal a aproximadamente 50K rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el líquido sobrenadante. Una partícula o polipéptido soluble típicamente será menor que aproximadamente 30S, más comúnmente menor que aproximadamente 15S, menor que aproximadamente 10S, más comúnmente menor que aproximadamente 6S, y, en las realizaciones particulares, de preferencia menor que aproximadamente 4S, y de mayor preferencia menor que aproximadamente 3S. La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del medio y el polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, incluida la temperatura, el medio de electrólitos, el tamaño y características moleculares del polipéptido y la naturaleza del disolvente. Típicamente, la temperatura a la cual se utiliza el polipéptido está en el intervalo desde aproximadamente 4ºC a aproximadamente 65ºC. Típicamente, la temperatura de uso es mayor que aproximadamente 18ºC, y más comúnmente mayor que aproximadamente 22ºC. Para propósitos de diagnóstico, la temperatura típicamente será aproximadamente la temperatura ambiente o más caliente, pero menor que la temperatura de desnaturalización de los componentes en el ensayo. Para propósitos terapéuticos, la temperatura típicamente será la temperatura corporal, normalmente alrededor de 37ºC para seres humanos, aunque bajo ciertas circunstancias la temperatura puede ser elevada o reducido in situ o in vitro.

El tamaño y estructura del polipéptido generalmente debe estar en un estado sustancialmente estable y, típicamente, no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociado con lípidos o detergentes en una forma que se aproxime a las interacciones de la bicapa lipídica natural.

El disolvente típicamente será un tampón biológicamente compatible, o de un tipo utilizado para la conservación de las actividades biológicas, y típicamente se aproximará a un disolvente fisiológico. Típicamente el disolvente tendrá un pH neutro, típicamente entre aproximadamente 5 y 10, y de preferencia aproximadamente 7,5. en algunas ocasiones se añadirá un detergente, típicamente uno suave no desnaturalizante, por ejemplo, CHS (hemisuccinato de colesterilo) o CHAPS (3-[3-colamidopropil-dimetilamonio]-1-propansulfonato), o una concentración bastante baja para evitar rompimiento significativo de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína.

"Sustancialmente pura" en el contexto de una proteína significa típicamente que la proteína está aislada de otras proteínas, ácidos nucleicos y otras sustancias biológicas contaminantes provenientes del organismo fuente original. La pureza, o "aislamiento" puede ser ensayado por los métodos estándar, y típicamente será al menos 50% pura, más comúnmente al menos aproximadamente 60% pura, en general, al menos aproximadamente 70% pura, más generalmente al menos alrededor de 80% pura, con frecuencia al menos alrededor de 85% pura, con más frecuencia al menos alrededor de 90% pura, de preferencia al menos aproximadamente 95% pura, de mayor preferencia al menos aproximadamente 98% pura, y en las realizaciones más preferidas, al menos 99% pura. Conceptos similares se aplican, por ejemplo, a anticuerpos o ácidos nucleicos.

"Similitud sustancial" en el contexto de la comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que los segmentos, o sus cadenas complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando se alinean en una posición óptima, con las inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas, en al menos aproximadamente 50% de los nucleótidos, en general al menos 56%, más generalmente al menos 59%, típicamente al menos 62%, más comúnmente al menos 65%, con frecuencia al menos 68%, con mayor frecuencia al menos 71%, por lo regular al menos 74%, más regularmente al menos 75%, normalmente al menos 80%, más normalmente al menos cerca de 85%, de preferencia al menos aproximadamente 90%, de mayor preferencia al menos alrededor de 95 a 98% o más, y en las realizaciones particulares, tan alta como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, similitudes sustanciales existen cuando los segmentos se hibridarán bajo condiciones de hibridación selectiva, a una cadena, o su complemento, típicamente utilizando una secuencia obtenida de SEQ ID NO: 1, 5 ó 7. Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando haya al menos aproximadamente 55% de similitud en un tramo de al menos aproximadamente 30 nucleótidos, de preferencia al menos aproximadamente 65% en un tramo de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, de más preferencia al menos aproximadamente 75%, y de mayor preferencia al menos aproximadamente 90% en aproximadamente 20 nucleótidos. Véase, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. La longitud de la comparación de similitud, como se describió, puede ser sobre tramos más grandes, y en ciertas realizaciones será sobre un tramo de al menos aproximadamente 17 nucleótidos, típicamente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más comúnmente al menos cerca de 24 nucleótidos, por lo regular al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más regularmente al menos cerca de 40 nucleótidos, de preferencia al menos aproximadamente 50 nucleótidos, y de mayor preferencia al menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos, por ejemplo, 150, 200, etcétera.

"Condiciones severas", con relación a la homología o similitud sustancial en el contexto de la hibridación serán condiciones combinadas severas de sal, temperatura, disolventes, orgánicos y otros parámetros, típicamente los controlados en las reacciones de hibridación. La combinación de parámetros es más importante que la medida de cualquier parámetro individual. Véase, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370. Una sonda de ácido nucleico que se une a un ácido nucleico diana bajo condiciones severas es específica para este ácido nucleico diana. Esta sonda típicamente es de más que 11 nucleótidos de longitud, y es suficientemente idéntica o complementaria para un ácido nucleico diana sobre la región especificada por la secuencia de la sonda para unirse a la diana bajo condiciones de hibridación severas.

Las quimioquinas DGWCC de otras especies de mamíferos pueden ser clonadas y aisladas por hibridación de especies cruzadas de especies estrechamente relacionadas. Véase, por ejemplo, en lo siguiente. La similitud puede ser relativamente baja entre especies distintamente relacionadas, y de esta manera, es aconsejable la hibridación de especies relativamente estrechamente relacionadas. Alternativamente, la preparación de un anticuerpo que presente menos especificidad de especie puede ser útil en los métodos de clonación de expresión.

La frase "se une específicamente a un anticuerpo" o "específicamente inmuno-reactivo con", cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinativa de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros componentes biológicos. De esta manera, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos específicos se unen a una proteína particular y no se unen significativamente a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo estas condiciones puede requerir que un anticuerpo sea seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos producidos contra el inmunógeno de la proteína quimioquina DVic-1 con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 pueden ser seleccionados para obtener anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con las proteínas quimioquina de la invención y no con otras proteínas. Los anticuerpos pueden ser específicos de especie, por ejemplo reconociendo también las variantes polimórficas de escisión o de desarrollo.

III.- Ácidos nucleicos

La quimioquina DGWCC es un ejemplo de proteínas estructurales y funcionalmente relacionadas. Estas proteínas quimioquinas solubles servirán para transmitir señales entre diferentes tipos de células. Las realizaciones preferidas, como se describe, serán útiles en procedimiento estándar para aislar genes de diferentes individuos u otras especies, por ejemplo, animales de sangre caliente, como aves y mamíferos. La hibridación cruzada permitirá el aislamiento de genes relacionados que codifiquen proteínas de individuos, cepas o especies. Algunos métodos diferentes están a disposición para aislar de manera satisfactoria un clon de ácido nucleico adecuado basado en la información proporcionada en la presente memoria. Los estudios de la hibridación por transferencia Southern pueden determinar cualitativamente la presencia de genes homólogos en genomas de seres humano, mono, rata, ratón, perro, gato, vaca y conejo bajo condiciones específicas de hibridación.

Las secuencias complementarias también serán utilizadas como sondas o cebadores. Con base en la identificación de los grupos amino terminales probables, otros péptidos deben ser particularmente útiles, por ejemplo, acoplados con las técnicas del vector anclado o de la PCR complementaria del poli A o con el DNA complementario de otros péptidos.

Las técnicas para manipulación de ácidos nucleicos de genes que codifican las proteínas de quimioquina DGWCC, como puede ser la sub-clonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptido en los vectores de expresión, sondas de marcado, hibridación de DNA y similares se describen, en general, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) vol. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY. Este manual en adelante será mencionado como "Sambrook et al".

Hay diversos métodos para aislar secuencias de DNA que codifican proteínas quimioquina DGWCC. Por ejemplo, el DNA se aisla de una genoteca o de cDNA utilizando sondas marcadas de oligonucleótidos que tengan secuencias idénticas o complementarias con la secuencia que se describe en la presente memoria. Es posible utilizar sondas de longitud completa o pueden ser generadas sondas de oligonucleótidos por comparación de las secuencias descritas. Estas sondas pueden ser utilizadas directamente en ensayos de hibridación para aislar el DNA que codifica proteínas quimioquinas DGWCC, o es posible diseñar sondas para uso en técnicas de amplificación, como puede ser la PCR, para el aislamiento del DNA que codifica las proteínas quimioquinas DGWCC. Programas de ordenadores de traducción inversa también pueden proporcionar secuencias alternativas de ácidos nucleicos que codifiquen las mismas proteínas.

Para preparar una genoteca de cDNA, el mRNA se aisla de las células que expresan una proteína quimioquina DGWCC. El cDNA se prepara a partir del mRNA y se liga en un vector recombinante. El vector es transfectado en un hospedante recombinante para la propagación, escrutinio y clonación. Los métodos para preparar y escrutar genotecas de cDNA son bien conocidos. Véase, Gubler y Hoffman (1983) Gene 25:263-269 y Sambrook et al.

Para una genoteca genómica el DNA puede ser extraído de tejido y cortado mecánicamente o digerido enzimáticamente para producir fragmentos de aproximadamente 12-20 kb. Los fragmentos se separan luego por centrifugación en gradiente y se clonan en vectores lambda de bacteriofago. Estos vectores y fagos se empaquetan in vitro, como se describe en Sambrook et al. Los fagos recombinantes se analizan por hibridación en placa como se describe en Benton y Davis (1977) Science 196:180-182. La hibridación de colonias se lleva a cabo como se describe, en general, Grunstein, et al. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72:3961-3965.

El DNA que codifica una proteína quimioquina DGWCC puede ser identificado en genotecas de cDNA o genómicas por su capacidad para hibridar con las sondas de ácido nucleico que se describen en la presente memoria, por ejemplo, en ensayos de hibridación en colonias o placa. Las regiones de DNA correspondientes son aisladas por los métodos estándar familiares para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al.

Diversos métodos para la amplificación de las secuencias dianas, como puede ser la reacción en cadena de la polimerasa, también pueden ser utilizados para preparar el DNA que codifica las proteínas quimioquina DGWCC. La tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar estas secuencias de ácido nucleico directamente a partir de mRNA, a partir de cDNA y de genotecas genómicas o genotecas de cDNA. Las secuencias aisladas que codifican las proteínas quimioquina DGWCC también pueden ser utilizadas como moldes para la amplificación por PCR.

Típicamente, en las técnicas de PCR se sintetizan los cebadores oligonucleótidos complementarios para dos regiones 5' en la región del DNA que va a ser amplificada. La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo entonces utilizando los dos cebadores. Véase, Innis, et al. (Eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA. Los cebadores pueden ser seleccionados para amplificar las regiones completas que codifican una proteína quimioquina DGWCC de longitud completa o para amplificar segmentos de DNA más pequeños según se desee. Una vez que estas regiones son amplificadas por PCR, estas pueden ser secuenciadas y pueden ser preparadas sondas de oligonucleótidos a partir de la secuencia obtenida utilizando las técnicas estándares. Estas sondas pueden entonces ser utilizadas para aislar los DNA que codifican las proteínas quimioquina DGWCC.

Los oligonucleótidos para uso como sondas usualmente son químicamente sintetizados de acuerdo con el método del triéster fosforamidito en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22:(20):1859-1862, o utilizando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168. La purificación de los oligonucleótidos se realiza, por ejemplo, por la electroforesis en gel de acrilamida natural o por HPLC de intercambio aniónico, como se describe en Pearson y Regnier (1983) J. Chrom. 255:137-149. La secuencia del oligonucleótido sintético puede ser verificada utilizando, por ejemplo, el método de degradación química de Maxam y Gilbert en Grossman y Moldave (eds. 1980) Methods in Enzymology 65:499-560 Academic Press, New York.

Los ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína quimioquina se identifican. Las secuencias de nucleótidos y los marcos de lectura abiertos correspondiente se muestran en las SEQ ID NO: 1 ó 5 ó 7.

Estas quimioquinas DVic-1 y DGWCC presentan similitud limitada a las porciones de quimioquinas. Véase, por ejemplo, Matsushima y Oppenheim (1989) Cytokine 1:2-13; Oppenheim, et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:617-648; Schall (1991) Cytokine 3:165-183; y Gronenborn y Clore (1991) Protein Engineering 4:263-269. Otras características de comparación son evidentes entre las quimioquina DGWCC y las familias de quimioquina. Véase, por ejemplo, Lodi, et al. (1994) Science 263:1762-1766. En particular, los residuos lámina \beta y hélice \alpha pueden ser determinados, por ejemplo, el programa RASMOL, véase, Sayle y Milner-White (1995) TIBS 20:374-376; o Gronenberg, et al. (1991) Protein Engineering 4:263-269; y otras características estructurales se definen en Lodi et al., (1994) Science 263:1762-1767. Estas características secundarias y terciarias ayudan a definir otras características estructurales C, CC, CXC, y CX3C, junto con el espaciamiento de los residuos de cisteína adecuados.

Esta invención proporciona DNA aislado que codifican una proteína quimioquina DVic-1. Además, esta invención proporciona el DNA aislado o recombinante que codifica una proteína o polipéptido que es capaz de hibridarse bajo condiciones adecuadas, por ejemplo, alta severidad, con las secuencias de DNA descritas en la presente memoria. Dicha proteína biológicamente activa o polipéptido puede ser un ligando intacto, y tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 2, realizaciones particularmente naturales. Las realizaciones preferidas serán secuencias naturales de longitud completa, a partir de aislado, por ejemplo, aproximadamente 11.000 a 12.500 daltons de tamaño cuando no está glucosilada, o fragmentos de al menos aproximadamente 6000 daltons, de mayor preferencia al menos aproximadamente 8000 daltons. En la forma glucosilada, la proteína puede exceder de 12,500 daltons. Además, esta invención contempla el uso de DNA aislado o recombinante, que codifica las proteínas que son homologas a la proteína quimioquina DVic-1 o que fueron aislados utilizando cDNA que codifica una proteína quimioquina DVic-1 como una sonda. El DNA aislado puede tener secuencias reguladoras respectivas en los flancos 5' y 3', por ejemplo, promotores, potenciadores, señales de adición poli-A y otros. También abarca los métodos para preparar vectores de expresión con estas secuencias, o para preparar, por ejemplo, para expresar y purificar productos proteínicos.

IV.- Preparación de quimioquinas DVic-1

Los DNA que codifican una quimioquina DVic-1 o fragmentos de las mismas pueden ser obtenidos por síntesis química, escrutinio de genotecas de cDNA o por escrutinio de genotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o muestras de tejidos. Los métodos para hacerlo o de preparación de los vectores de expresión se describen en la presente memoria.

Estos DNA pueden ser expresados en una amplia variedad de células hospedantes para la síntesis de una proteína de longitud completa o fragmentos que pueden a su vez ser utilizados, por ejemplo, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada quimioquina DVic-1 o sus fragmentos pueden ser expresadas en células hospedantes que se transforman o transfectan con los vectores de expresión adecuados. Estas moléculas pueden ser sustancialmente purificadas para estar libres de contaminantes proteínicos o celulares, diferentes de los derivados del hospedante recombinante y, por tanto, son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un vehículo y/o diluyentes farmacéuticamente aceptable. El antígeno, por ejemplo, quimioquina DGWCC, o porciones de la misma, pueden ser expresados como fusiones con otras proteínas o presentando una secuencia marcadora epitópica.

Los vectores de expresión típicamente son construcciones de DNA o RNA auto-replicantes que contienen el gen del antígeno deseado o sus fragmentos, usualmente enlazado de manera operativa a los elementos de control genético adecuados que son reconocidos en una célula hospedante adecuada. El tipo específico de elementos de control necesario para efectuar la expresión dependerá de la célula hospedante utilizada. En general, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procariótico o un sistema de control de expresión promotor eucariótico, y típicamente incluyen un promotor de transcripción, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, potenciadores de la transcripción para elevar el nivel de la expresión del mRNA, una secuencia que codifica un sitio de unión de ribosoma adecuado, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión usualmente también contienen un origen de replicación que permite al vector replicarse independientemente de la célula hospedante.

Los vectores de esta invención contienen los DNA que codifican una quimioquina DVic-1, o un fragmento de las mismas, típicamente codifican, por ejemplo, un polipéptido o proteína biológicamente activos. El DNA puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar para un marcador de selección. Esta invención además contempla el uso de estos vectores de expresión que son capaces de expresar cDNA eucariótico que codifica una proteína quimioquina DVic-1 en un hospedante eucariótico o procariótico, donde el vector es compatible con el hospedante y donde el cDNA eucariótico que codifica la proteína se inserta en el vector de manera que el crecimiento del hospedante que contiene el vector exprese el cDNA en cuestión. Usualmente, los vectores de expresión se diseñan para replicación estable en sus células hospedantes o para amplificación para incrementar en gran medida el número total de copias del gen deseable por célula. No siempre es necesario requerir que un vector de expresión se replique en una célula hospedante, por ejemplo, es posible efectuar la expresión transitoria de la proteína o sus fragmentos en diferentes hospedantes utilizando vectores que no contengan un origen de replicación que sea reconocido por la célula hospedante. También es posible utilizar vectores que causan la integración de un gen de quimioquina DVic-1 o sus fragmentos en el DNA del hospedante por recombinación, o integrar un promotor que controle la expresión de un gen endógeno.

Los vectores, como se utiliza en la presente memoria, contemplan plásmidos, virus, bacteriofagos, fragmentos de DNA integrables y otros vehículos que permitan la integración de los fragmentos de DNA en el genoma del hospedante. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que efectúan la expresión de genes operablemente enlazados. Los plásmidos son la forma de vector más común utilizada, pero muchas otras formas de vectores que sirven para una función equivalente son adecuadas para uso en la presente invención. Véase, por ejemplo, Pouwels, et al. (1985 y suplementos) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N.Y.; y Rodriguez, et al. (eds) (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.

Las células hospedantes incluyen procariotas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores. Las eucariotas incluyen organismos gram-negativos y gram-positivos, por ejemplo, E. coli y B. subtilis. Las eucariotas inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del género Dictyostelium. Las eucariotas superiores incluyen líneas de células de cultivos tisulares establecidos provenientes de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insecto, y aves, como de origen mamífero, por ejemplo, ser humano, primates y roedores.

Los sistemas procarióticos hospedante-vector incluyen una amplia gama de vectores para múltiples especies diferentes. Como se utiliza en la presente, E. coli y sus vectores serán utilizados genéricamente para incluir vectores equivalentes utilizados en otros procariotas. Un vector representativo para amplificar DNA es pBR322 o sus derivados. Los vectores que pueden ser utilizados para expresar quimioquinas DGWCC o fragmentos de quimioquina DGWCC incluyen, pero no se limitan a, vectores tales como los que contienen el promotor lac (la serie pUC); el promotor trp (pBR322trp); el promotor Ipp (la serie pIN); los promotores lambda-pP o pR (pOTS); o promotores híbridos como ptac (pDR540). Véase Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodriguez y Denhardt (eds) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10:205-236 Buttersworth, Boston, MA.

Los eucariotas inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium pueden ser transformados con vectores que contengan la secuencia de quimioquina DVic-1. Para los fines de esta invención, el hospedante eucariótico inferior más común es la levadura de panadería, Saccharomyces cerevisiae. Ésta será utilizada en forma genérica para representar eucariotas inferiores, aunque también están a la disposición un número de otras cepas y especies. Los vectores de levadura típicamente consisten en un origen de replicación (salvo el tipo de integración) un gen de selección, un promotor, DNA que codifica la proteína deseada o sus fragmentos, y secuencias para la terminación de la traducción, poliadenilación y terminación de la transcripción. Los vectores de expresión adecuados para levadura incluyen tales promotores constitutivos como 3-fosfoglicerato-quinasa y algunos otros promotores genéticos de enzimas glucolíticas o tales promotores inducibles como el promotor alcohol-deshidrogenasa-2 o promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: bajo número de copias auto-replicante (como puede ser la serie YRp), alto número de copias auto-replicante (como puede ser la serie YEp); tipos de integración (como puede ser la serie YIp), o mini-cromosomas (como puede ser la serie YCp).

Las células de cultivos tisulares eucarióticos superiores son típicamente las células hospedantes preferidas para la expresión de la proteína quimioquina DVic-1 funcionalmente activa. En principio es posible utilizar muchas de las líneas de células de cultivos tisulares eucarióticos superiores, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insecto, ya sea de origen de vertebrado o invertebrado. Sin embargo, las células de mamífero son preferidas para lograr un procesamiento adecuado, tanto co-traduccionalmente como post-traduccionalmente. La transformación o transfección y propagación de las células es rutinaria. Las líneas de células útiles incluyen las células HeLa, líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), líneas de células de riñón de rata recién nacida (BRK), líneas de células de insecto, líneas de células de ave y líneas de célula de mono (COS). Los vectores de expresión para estas líneas de células incluyen típicamente un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la traducción, sitios de escisión del RNA (por ejemplo, si se utiliza DNA genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también pueden contener un gen de selección o gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus o retrovirus que lleven promotores obtenidos de, por ejemplo, fuentes tales como de adenovirus, SV40, parvovirus, virus de vacuna o citomegalovirus. Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pCDNA1; pCD, véase Okayama et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMClneo Poly-A véase Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610.

Es muy probable que las quimioquinas DVic-1 no necesiten ser glucosiladas para desencadenar respuestas biológicas. Sin embargo, ocasionalmente será deseable expresar un polipéptido de quimioquina DVic-1 en un sistema que proporcione un patrón de glucosilación específico o definido. En este caso, el patrón normal será el proporcionado naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable exponiendo el polipéptido, por ejemplo, en forma no glucosilada, a las proteínas glucosilantes adecuadas introducidas en un sistema de expresión heterólogo. Por ejemplo, el gen de quimioquina o DGWCC puede ser co-transformado con uno o más genes que codifican enzimas de mamífero u otras enzimas glucosilantes. Se entiende además que la sobreglucosilación puede ser perjudicial para la actividad biológica de la quimioquina DGWCC, y que un experto puede ensayos habituales para optimizar el grado de glucosilación que confiera actividad biológica óptima.

Una quimioquina DVic-1 o un fragmento de la misma, puede ser diseñada para ser enlazada por fosfatidil-inositol (PI) a una membrana celular, pero puede ser separada de las membranas por tratamiento con una enzima de escisión de fosfatidil-inositol, por ejemplo, fosfatidil-inositol-fosfolipasa-C. Esta libera el antígeno en una forma biológicamente activa y permite la purificación por los procedimientos estándar de la química de proteínas. Véase, por ejemplo, Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988:427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner, et al, (1991) J. Celi Biol. 114:1275-1283.

Ahora que las quimioquinas DVic-1 han sido caracterizadas, pueden ser preparados fragmentos o derivados de las mismas por los procesos convencionales para sintetizar péptidos. Estos incluyen procesos tales como los que se describen en Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY; y Bodanszky (1984) The Principies of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York. Es posible utilizar, por ejemplo, un proceso con azida, un proceso con cloruro de ácido, un proceso con anhídrido ácido, un proceso anhídrido mixto, un proceso con éster activo (por ejemplo, éster p-nitrofenílico, N-éster de hidroxisuccinimida, o éster cianometílico), un proceso de carbodiimidazol, un proceso de oxidación-reducción o un proceso de diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo. Las síntesis en fase sólida y en fase de solución son ambas aplicables a los procesos antes mencionados. Véase también la ligación química, por ejemplo, Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779, un método de enlazar péptidos sintéticos largos por un enlace peptídico.

La proteína preparada y los fragmentos de la misma pueden ser aislados y purificados a partir de la mezcla de reacción por medio de separación peptídica, por ejemplo, por extracción, precipitación electroforesis y diversas formas de cromatografía y similares. Las quimioquinas DVic-1 de esta invención pueden ser obtenidas en diferentes grados de pureza dependiendo del uso deseado. La purificación puede llevarse a cabo mediante el uso de las técnicas de purificación de proteínas conocidas o mediante el uso de anticuerpos o compuestos correspondientes de unión descritos en la presente memoria, por ejemplo, en cromatografía en afinidad con inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad con inmunoabsorbente se lleva a cabo primero enlazando los anticuerpos a un soporte sólido y luego poniendo en contacto los anticuerpos unidos con lisados solubilizados de células fuentes adecuadas, lisados de otras células que expresen el ligando o lisados o líquidos sobrenadantes de células que producen las quimioquinas DVic-1 como resultado de las técnicas del DNA recombinantes que se ven a continuación.

Múltiples líneas de células pueden ser escrutadas para una que exprese una quimioquina DGWCC a un nivel elevado en comparación con otras células. Las quimioquinas DVic-1 naturales pueden ser aisladas de fuentes naturales, o por expresión a partir de células transformadas utilizando un vector de expresión adecuado. La purificación de la proteína expresada se lleva a cabo por los procedimientos estándar, o puede ser combinada con medios diseñados para la purificación efectiva a una eficacia elevada a partir de lisados o líquidos sobrenadantes celulares. Los epítopos u otras secuencias marcadoras, por ejemplo, FLAG o segmentos His_{6} pueden ser utilizados para estos aspectos de purificación.

V.- Anticuerpos

Los anticuerpos pueden ser producidos contra diversas quimioquinas DVic-1, incluidas las variantes individuales, polimórficas, alélicas, de cepa, o de especies, y fragmentos de las mismas, en sus formas naturales (de longitud completa) y en sus formas recombinantes. Además, los anticuerpos pueden ser producidos contra quimioquinas DVic-1 en cualquiera de sus formas activas o en sus formas inactivas. También pueden utilizarse anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos pueden presentar diferentes especificidades de unión para las variantes de especie, individuales o polimórficas.

A.- Producción de anticuerpos

Es posible utilizar una variedad de inmunógenos para producir anticuerpos específicamente reactivos con las proteínas quimioquina DVic-1. La proteína recombinante es el inmunógeno preferido para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales. También puede utilizarse proteína natural en forma pura o impura. Los péptidos sintéticos, preparados utilizando las secuencias de la proteína quimioquina DVic-1 también pueden ser utilizados como un inmunógeno para la producción de anticuerpos para las quimioquinas DVic-1. La proteína recombinante puede ser expresada en células eucarióticas o procarióticas como se describe en la presente memoria, y purificadas como se describe. El material naturalmente plegado o desnaturalizado puede ser utilizado, como sea adecuado, para producir anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden ser generados para uso posterior en inmunoensayos para medir la proteína.

Los métodos de producción de anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Típicamente, un inmunógeno, de preferencia una proteína purificada, se mezcla con un coadyuvante y se inmunizan los animales con la mezcla. La respuesta inmune de los animales a la preparación del inmunógeno es monitorizada tomando muestras de sangre y determinando el título de la reactividad a la proteína quimioquina DVic-1 de interés. Cuando se obtienen títulos adecuadamente elevados del anticuerpo para el inmunógeno, típicamente después de inmunizaciones repetidas, se recoge sangre del animal y se prepara el antisuero. Puede realizarse, si se desea, otro fraccionamiento del antisuero para enriquecer los anticuerpos reactivos a la proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane; o Coligan.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos por diversos métodos conocidos para los expertos en la técnica. Típicamente, células del bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado son inmortalizadas, comúnmente por fusión con una célula de mieloma (véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519, que se incorpora en la presente memoria como referencia). Métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con virus Epstein-Barr, oncogenes o retrovirus u otros métodos conocidos. Las colonias que se desarrollan a partir de células inmortalizadas individuales se escrutan para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad para el antígeno deseadas, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por estas células puede ser mejorado por diversas técnicas, que incluye la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedante vertebrado. Alternativamente, es posible aislar secuencias de DNA que codifiquen un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión del mismo, escrutando una genoteca de DNA a partir de células B humanas de acuerdo con, por ejemplo, el protocolo general delineado por Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión y versiones monocatenarias, contra fragmentos predeterminados de quimioquina DGWCC pueden producirse por inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas vehículos como ya se describió. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser escrutados para unirse a quimioquinas DVic-1 o DGWCC normales o defectuosas, o escrutados para actividad agonista o antagonista, por ejemplo, mediada a través de un receptor. Estos anticuerpos monoclonales típicamente se unirán con al menos una K_{D} de aproximadamente 1 \muM, más comúnmente al menos aproximadamente 300 \muM, típicamente al menos aproximadamente 10 \muM, más comúnmente al menos aproximadamente 30 \muM, de preferencia al menos aproximadamente 10 \muM y de mayor preferencia al menos aproximadamente 3 \muM o mejor.

En algunos casos es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedantes mamíferos, como pueden ser ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. La descripción de las técnicas para la preparación de estos anticuerpos monoclonales puede encontrarse en, por ejemplo, Stites, et al. (eds.) Baseic and Clinical Inmmunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en la misma; Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, New York, NY; y particularmente en Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256:495-497, que describen un método para generar anticuerpos monoclonales. Resumido brevemente, este método incluye la inyección en un animal con un inmunógeno. El animal se sacrifica luego y se toman de su bazo células, las cuales luego se fusionan con células del mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducción in vitro. Esta población de hibridomas se escruta luego para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una sola especie de anticuerpo para el inmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de células B individuales inmortalizadas y clonadas provenientes de un animal inmune generadas en respuesta a un sitio específico reconocido en la sustancia inmunogénica.

Otras técnicas adecuadas incluyen la selección de colecciones de anticuerpos de vectores fago o similares. Véase, por ejemplo, Huse et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda" Science 246:1275-1281; y Ward et al. (1989) Nature 341:544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados con o sin modificación, incluidos los anticuerpos quiméricos o humanizados. Con frecuencia los polipéptidos y anticuerpos serán marcados por unión, ya sea en forma covalente o no covalente, de una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y están descritas ampliamente en la literatura científica y de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que muestran el uso de estos marcadores incluyen las Patentes Estadounidenses números 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes. Véase Cabilly, Patente Estadounidense No. 4.816.567; y Queen, et al. (1989) Proc. Nat' Acad. Sci. USA 86:10029-10033.

Los anticuerpos de esta invención son útiles para cromatografía de afinidad en el aislamiento de la proteína quimioquina DVic-1. Pueden prepararse columnas donde los anticuerpos se unen a un soporte sólido, por ejemplo, partículas como agarosa, SEPHADEX, o similares, donde un lisado de células o líquido sobrenadante puede pasar a través de la columna, la columna se lava, seguido por concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, por medio de lo cual se liberará la proteína quimioquina DVic-1 purificada. De la misma manera, el anticuerpo que se une a la quimioquina puede ser capaz de neutralizar la unión del receptor, y puede servir como un antagonista del receptor. Estos pueden ser también útiles como reactivos de detección en transferencia Western o reactivos de ELISA.

Los anticuerpos también pueden ser utilizados para escrutar genotecas de expresión para productos de expresión particulares. Típicamente, los anticuerpos utilizados en este procedimiento serán marcados con una porción que permita la fácil detección de la presencia del antígeno por unión del anticuerpo.

Los anticuerpos para las quimioquinas DVic-1 pueden ser utilizados para la identificación de poblaciones de células que expresen las quimioquinas DVic-1. Mediante el ensayo de los productos de expresión de las células que expresan, por ejemplo, las quimioquinas de la invención es posible diagnosticar enfermedades, por ejemplo, estados inmuno-comprometidos.

Los anticuerpos producidos contra cada quimioquina DVic-1 también serán útiles para cultivar anticuerpos anti-idiotípicos. Estos serán útiles en la detección o diagnóstico de diferentes estados inmunológicos relacionados con la expresión de los antígenos.

B.- Inmunoensayos

Una proteína particular puede ser medida por una serie de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo en general, véase, Stites y Terr (eds) (1991) Basic and Clinical Immunology (7ª ed.). Además, los inmunoensayos de la presente invención pueden ser realizados en diversas configuraciones, las cuales se revisan ampliamente en Maggio (ed) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tojan (1985) "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V, Amsterdam; y Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, supra, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Véase, también Chan (ed) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price and Newman (eds) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; y Ngo (ed) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY.

Los inmunoensayos para la medición de, por ejemplo proteínas quimioquina DVic-1 pueden ser realizados por una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. En breve, los inmunoensayos para medir la proteína pueden ser ensayos de unión competitiva o no competitiva. En los ensayos de unión competitiva la muestra que va a ser analizada compite con una analito marcado por los sitios de unión específicos sobre una agente de captura unido a una superficie sólida. El agente de captura preferido es un anticuerpo especialmente reactivo con las proteínas quimioquinas DVic-1 producidas como ya se describió. La concentración del analito marcado unido al agente de captura es inversamente proporcional a la cantidad del analito libre presente en la muestra.

En un inmunoensayo de unión competitiva, la proteína quimioquina DVic-1 presente en la muestra compite con la proteína marcada por la unión a un agente de unión específico, por ejemplo, un anticuerpo específicamente reactivo con la proteína quimioquina DVic-1. El agente de unión puede ser unido a una superficie sólida para efectuar la separación de la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Alternativamente, el ensayo de unión competitiva puede ser realizado en fase líquida y es posible utilizar una variedad de técnicas conocidas para separar la proteína marcada unida de la proteína marcada no unida. Después de la separación se determina la cantidad de proteína marcada unida. La cantidad de proteína presente en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de unión de la proteína marcada.

De manera alternativa, es posible realizar un inmunoensayo homogéneo en el cual no sea necesario una etapa de separación. En estos inmunoensayos el marcador en la proteína se altera por la unión de la proteína a su agente de unión específico. Esta alteración en la proteína marcada da como resultado una disminución o incremento en la señal emitida por la marca, de manera que la medición de la marca al término del inmunoensayo permite la detección o cuantificación de la proteína.

Las proteínas quimioquina DVic-1 también pueden ser determinadas por una variedad de métodos de inmunoensayo no competitivos. Por ejemplo, es posible utilizar un inmunoensayo "sándwich" en fase sólida, de dos sitios. En este tipo de ensayo un agente de unión para la proteína, por ejemplo, un anticuerpo, se une a un soporte sólido. Un segundo agente de unión a la proteína, que puede también ser un anticuerpo, y que se une a la proteína en un sitio diferente, se encuentra marcado. Después que ha ocurrido la unión en ambos sitios de la proteína se elimina el agente de unión marcado, no unido y se mide la cantidad del agente de unión marcado unido a la fase sólida. La cantidad de agente de unión marcado unida es directamente proporcional a la cantidad de proteína en la muestra.

Es posible utilizar el análisis de transferencia Western para determinar la presencia de, por ejemplo, proteínas quimioquina DGWCC en una muestra. La electroforesis se lleva a cabo, por ejemplo, en una muestra de tejido que se sospecha contiene la proteína. Después de la electroforesis para separar las proteínas, y de transferir las proteínas a un soporte sólido adecuado, por ejemplo, un filtro de nitrocelulosa, el soporte sólido se incuba con un anticuerpo reactivo con la proteína. Este anticuerpo puede estar marcado o, alternativamente, puede ser detectado por incubación posterior con un segundo anticuerpo marcado que se une al anticuerpo primario.

Los formatos de inmunoensayo antes descritos emplean componentes de ensayo marcados. El marcador puede ser acoplado directa o indirectamente al componente deseado del ensayo, de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Se puede utilizar una amplia variedad de marcadores y métodos. Tradicionalmente se utilizó un marcador radioactivo que incorporaba ^{3}H, ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C ó ^{32}P. Los marcadores no radioactivos incluyen ligandos que se unen a los anticuerpos marcados, fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y anticuerpos que pueden servir como miembros del par de unión específico para un ligando marcado. La elección del marcador dependerá de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugación con el compuesto, los requisitos de estabilidad y la instrumentación disponible. Para una revisión de diferentes sistemas de producción de marcado o señal que pueden ser utilizados véase la Patente Estadounidense No. 4.391.904, la cual se incorpora en la presente como referencia.

Los anticuerpos reactivos con una proteína particular también pueden ser medidos por una variedad de métodos de inmunoensayo. Para una revisión de los procedimientos inmunológicos y de inmunoensayo aplicables para la medición de los anticuerpos por las técnicas de inmunoensayos, véase Stites y Terr (eds) Basic and Clinical Immunology (7ª ed) supra; Maggio (ed.) Enzyme Immunoassay, supra; y Harlow y Lane. Antibodies, A Laboratory Manual, supra.

En breve, los inmunoensayos para medir antisueros reactivos con, por ejemplo, las proteínas quimioquina DVic-1 pueden ser ensayos de unión competitiva o no competitiva. En los ensayos de unión competitiva el analito de la muestra compite con un analito marcado por los sitios de unión específicos sobre un agente de captura unido a una superficie sólida. De preferencia el agente de captura es una proteína quimioquina DVic-1 recombinante, purificada producida como se describe antes. También pueden ser utilizadas otras fuentes de proteínas quimioquina DVic-1, incluida la proteína natural aislada o parcialmente purificada. Los ensayos no competitivos incluyen ensayos "sándwich" en los cuales el analito muestra está unido entre dos reactivos de unión específica del analito. Uno de los agentes de unión se utiliza como un agente de captura y se une a una superficie sólida. El segundo agente de unión se marca y se utiliza para medir o detectar el complejo resultante por medio visual o instrumental. Es posible utilizar diversas combinaciones del agente de captura y el agente de unión marcado. También pueden utilizarse una variedad de diferentes formatos de inmunoensayos, técnicas de separación y marcas de la misma manera como los descritos antes para la medición de las proteínas quimioquina DGWCC.

VI.- Quimioquinas DVic-1 purificadas

La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la DVic-1 humana se proporciona en la SEQ ID NO: 1 y 2. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la DGWCC humana se muestra en la SEQ ID NO: 5 y 6; la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la DGWCC de ratón se muestra en la SEQ ID NO: 7 y 8.

La proteína purificada y los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos por los métodos típicos, como se describe antes. Los péptido sintéticos o proteína purificada pueden ser presentados a un sistema inmune para generar anticuerpos policlonales y monoclonales. Véase, Colligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Press, NY. Alternativamente, un receptor de quimioquina DVic-1 o DGWCC puede ser útil como reactivo de unión específica y puede tomarse ventaja de su especificidad de unión para, por ejemplo, la purificación de un ligando de quimioquina DGWCC.

Es posible utilizar una composición de unión específica para escrutar una geenoteca de expresión preparada a partir de una línea de células que exprese una quimioquina DGWCC. Muchos métodos para escrutinio están disponibles, por ejemplo, la tinción estándar del ligando expresado en la superficie, o por toma panorámica (panning). El escrutinio de la expresión intracelular también puede ser realizado por diversos procedimientos de tinción o inmunoflorescencia. Las composiciones de unión pueden ser utilizadas para purificar por afinidad o clasificar células que expresen el ligando.

Los segmentos peptídicos, junto con la comparación a los genes homólogos, también pueden ser utilizados para producir los oligonucléotidos adecuados para escrutar una genoteca. El código genético puede ser utilizado para seleccionar oligonucleótidos adecuados útiles como sondas para el escrutinio. En combinación con las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos sintéticos serán útiles en la selección de los clones deseados a partir de una genoteca, que incluyen variantes alélicas y polimórficas naturales.

Las secuencias de péptidos permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos para reconocer tales segmentos, y permite la preparación de los oligonucleótidos que codifican estas secuencias. La secuencia también permite la preparación sintética, por ejemplo, véase, Dawson et al. (1994) Science, 266:776-779. Dado que las quimioquinas DVic-1 y DGWCC pueden ser proteínas secretadas, el gen normalmente posee una secuencia señal N-terminal, que se elimina con el procesamiento y la secreción. Sin embargo, el punto de procesamiento exacto puede variar en diferentes tipos de células, y con frecuencia se detectan formas de longitudes diferentes. La predicción del punto de escisión de la señal puede realizarse, por ejemplo, utilizando los métodos de Nielsen, et al., (1997) Protein Eng. 10:1-8. El análisis de las características estructurales en comparación con las secuencias reportadas más estrechamente relacionadas ha revelado similitudes con otras citoquinas, particularmente la clase de proteínas conocidas como quimioquinas CC y CXC.

VII.- Variantes físicas

También se describen en la presente memoria las proteínas o péptidos que tienen similitud sustancial en la secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de una quimioquina DVic-1 o DGWCC. Las variantes naturales incluyen variantes individuales, polimórficas, alélicas, de cepa o especie.

La similitud de la secuencia de aminoácidos o identidad de la secuencia, se determina optimizando las coincidencias de los residuos, si es necesario introduciendo espacios como se requiera. Esto cambia cuando se consideran sustituciones conservativas como coincidencias. Típicamente, las sustituciones conservativas incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias homólogas de aminoácidos incluyen variaciones polimórficas, alélicas e interespecies en la secuencia de la proteína. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán desde 50-100% de similitud (si es posible introducir espacios), hasta 75-100% de similitud (si se incluyen sustituciones conservativas) con la secuencia de aminoácidos de la quimioquina DGWCC. Las medidas de la similitud serán al menos aproximadamente 50%, generalmente al menos 60%, más generalmente al menos 65%, usualmente al menos 70%, más comúnmente al menos 75%, de preferencia al menos 80% y de mayor preferencia al menos 80% [sic], y en las realizaciones particularmente preferidas, al menos 85% o más. Véase, también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison capítulo uno Addison-Wesley, Reading, MA; y los paquetes de programas de ordenador de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y la University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas quimioquina DVic-1 de mamífero típicamente se hibridarán a la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones severas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de quimioquina DVic-1 normalmente se hibridarán al ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de hibridación severas. Generalmente las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 10ºC menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia sonda a una concentración iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo concentración y pH definidos) a la cual 50% de la secuencia diana se híbrida a una sonda perfectamente acoplada. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las que la concentración salina es aproximadamente 0,2 molar a pH 7 y la temperatura es al menos aproximadamente 50ºC. Otros factores pueden afectar significativamente la severidad de la hibridación, que incluye, entre otros, la composición de las bases y el tamaño de las cadenas complementarias, la presencia de disolventes orgánicos como formamida, y el grado de no apareamiento de las bases. Una realización preferida incluye ácido nucleicos que se unirán a las secuencias descritas en formamida al 50% y NaCl 200 mM a 42ºC.

Un DNA aislado para quimioquina DGWCC puede ser fácilmente modificado por sustituciones de nucleótidos, deleciones de nucleótidos, inserciones de nucleótidos e inversiones cortas de tramos de nucleótidos. Estas modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de DNA que codifican los antígenos quimioquina DVic-1 o DGWCC, sus derivados, o proteínas que tengan actividad fisiológica, inmunogénica o antigénica altamente semejante.

Las secuencias modificadas pueden ser utilizadas para producir antígenos mutantes o para mejorar la expresión. La expresión mejorada puede incluir amplificación genética, transcripción incrementada, traducción incrementada y otros mecanismos. Estos derivados de quimioquina DGWCC mutantes incluyen mutaciones predeterminadas o específicas de sitio de la proteína o sus fragmentos. "Quimioquina DGWCC mutante" comprende un polipéptido que alternativamente entra dentro de la definición de homología de la quimioquina DGWCC humana como ya se estableció, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de una quimioquina DGWCC como se encuentra en la naturaleza, ya sea por medio de deleción, sustitución o inserción. En particular, "quimioquina DGWCC mutante específica de sitio" en general incluye las proteínas que tienen similitud significativa con una proteína que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 6 u 8, y compartiendo diferentes actividades biológicas, por ejemplo, antigénica o inmunogénica, con estas secuencias, y contienen la mayor parte o toda la secuencia descrita. Esto se aplica también a las variantes polimórficas de individuos diferentes. Conceptos similares se aplican a diferentes proteínas de quimioquina DVic-1 o DGWCC, particularmente las que se encuentran en algunos animales de sangre caliente, por ejemplo, mamíferos y aves. Como ya se estableció, se pone énfasis que las descripciones generalmente se proponen para comprender otras proteínas de quimioquina DVic-1 o DGWCC, no limitadas a las proteínas de ratón o humano específicamente descritas.

Aunque los sitios de mutación específicos de sitio son predeterminados, los mutantes no necesitan ser específicos de sitio. Por ejemplo, la mutagénesis de quimioquina DGWCC puede realizarse haciendo inserciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación puede generarse para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones amino o carboxilo terminales, por ejemplo, secuencias marcadores de epítopos. La mutagénesis aleatoria puede realizarse en un codón diana y los mutantes expresados pueden entonces ser escrutados para la actividad deseada. Los métodos para la preparación de mutaciones por sustitución en sitios predeterminado en DNA que tengan una secuencia conocida son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por mutagénesis de cebador M13 o las técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, también, Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y suplementos). Las mutaciones en el DNA normalmente no deberán colocar las secuencias codificantes fuera de los marcos de lectura y de preferencia no crearan regiones complementarias que puedan hibridarse para producir la estructura mRNA secundaria como bucles u horquillas.

La presente invención también proporciona las proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas utilizando los segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que se fusionan naturalmente, no normalmente en la misma forma. De esta manera, el producto de la fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de quimioquina DGWCC es una molécula de proteína continua que tiene las secuencias fusionadas en un enlace peptídico típico, por lo regular hecho como un solo producto de traducción y que presenta las propiedades provenientes de cada péptido fuente. Un concepto semejante se aplica a las secuencias heterólogas de ácidos nucleicos.

Además, es posible preparar nuevas construcciones a partir de la combinación de dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, los segmentos de unión a una proteína u otros segmentos pueden ser "intercambiados" entre nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión diferentes. Véase, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336 y O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992. De esta manera, nuevos polipéptidos quiméricos que presenten nuevas combinaciones de especificidades resultarán del enlace funcional de las especificidades de unión a proteína y otros dominios funcionales.

VIII.- Complejos agente de unión: proteína quimioquina

Una proteína DVic-1 que específicamente, o selectivamente, se une a o que es específicamente inmuno-reactiva con un anticuerpo generado contra un inmunógeno conocido, como puede ser un inmunógeno que consista en una secuencia de ácido nucleicos de SEQ ID NO: 2 u 8, típicamente se determina en un inmunoensayo. El inmunoensayo utiliza un antisuero policlonal que se cultiva para una proteína de SEQ ID NO: 2 u 8. Este antisuero se selecciona para tener reactividad cruzada baja contra otras quimioquinas y cualquier reactividad cruzada se elimina por inmunoabsorción antes del uso en el inmunoensayo.

Para producir el antisuero para uso en un inmunoensayo, la proteína de SEQ ID NO: 2 ó 6 u 8, se aisla como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, la proteína recombinante puede ser producida en una línea de células de mamífero. Una cepa endogámica de ratón como puede ser la BALB/c se inmuniza con la proteína de SEQ ID NO: 2 ó 6 u 8, utilizando un coadyuvante estándar, como puede ser el coadyuvante de Freund y un protocolo de inmunización de ratón estándar (véase, Harlow y Lane, supra).Alternativamente, un péptido sintético, de preferencia de longitud casi completa, derivado de las secuencias que se describen en la presente memoria y conjugado a una proteína vehículo puede ser utilizado como inmunógeno. Los sueros policlonales se recogen y titulan contra la proteína inmunogénica en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo de fase sólida con el inmunógeno inmovilizado sobre un soporte sólido. Los antisueros policlonales con un título de10^{4}o mayores se seleccionan y ensayan para su reactividad cruzada contra quimioquinas C, CC, CX3X, y CXC, utilizando un inmunoensayo de unión competitiva como puede ser el que se describe en Harlow y Lane, supra, en las páginas 570, 573. De preferencia en esta determinación se utilizan dos quimioquinas junto con la quimioquina DGWCC humana.

Los inmunoensayos en el formato de unión competitiva pueden ser utilizados para las determinaciones de reactividad cruzada, por ejemplo, una proteína de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 6 y/o 8 puede ser inmovilizada a un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión de los antisueros al antígeno inmovilizado. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada se compara con la proteína de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 6 y/o 8. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calcula utilizando los cálculos normales. Aquellos antisueros con menos que 10% de rectividad cruzada con cada una de las proteínas mencionadas antes se seleccionan y reúnen. Los anticuerpos que reaccionan en forma cruzada se eliminan luego de los antisueros combinados por inmunoabsorción con las proteínas antes mencionadas.

Los antisueros inmunoabsorbidos y reunidos se utilizan luego en un inmunoensayo de unión competitiva como ya se describió para comparar una segunda proteína a la proteína inmunogena (por ejemplo, el resto de quimioquina DGWCC de SEQ ID NO: 6 u 8). Para hacer esta comparación, cada una de las proteínas es ensayada en un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada proteína necesaria para inhibir 50% de la unión de los antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la segunda proteína requerida es menos que el doble de la cantidad de la proteína, por ejemplo, de SEQ ID NO: 6 u 8 que se requiere, entonces se dice que la segunda proteína se une específicamente a un anticuerpo generado para el inmunógeno.

Ha de entenderse que la proteína quimioquina DGWCC es una forma de especie de un grupo de proteínas homólogas a través de especies que incluye genes estrechamente relacionados. Para un producto genético particular, como puede ser la proteína quimioquina DGWCC, el término se refiere no solo a las secuencias de aminoácidos aquí descritas, sino también a otras proteínas que son variantes polimórficas, alélicas o no alélicas. También se ha de entender que el término "DGWCC" incluye mutaciones no naturales introducidas por mutación deliberada utilizando la tecnología recombinante convencional, como puede ser la mutación en un solo sitio, o por escisión de secciones cortas de DNA que codifica las proteínas quimioquina DGWCC, o por sustitución de nuevos aminoácidos, o adición de nuevos aminoácidos. Estas alteraciones menores deben mantener sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Así, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmuno-reactivas con una proteína quimioquina DGWCC que se encuentra en forma natural diseñada por ejemplo, la proteína quimioquina DGWCC que se muestra en la SEQ ID NO: 6 u 8. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas pueden ser determinadas expresando la proteína en una línea de células adecuada inhibiendo una actividad biológica adecuada, por ejemplo, el efecto quimiotáctico. Las modificaciones de proteínas particulares consideradas menores incluirían sustituciones conservativas de aminoácidos con propiedades químicas similares, como se describe antes para la quimioquina DGWCC como un todo. Al alinear una proteína en forma óptima con la proteína de SEQ ID NO: 6 u 8, y utilizando los inmunoensayos convencionales que se describen en la presente memoria para determinar la inmunoidentidad, o utilizando ensayos de quimiotaxis de linfocitos, es posible determinar las composiciones de las proteínas de la invención.

IX.- Variantes funcionales

El bloque de la respuesta fisiológica a la quimioquina DVic-1 o DGWCC puede resultar de la inhibición de la unión de la proteína a su receptor, por ejemplo a través de la inhibición competitiva. De esta manera, los ensayos in vitro con frecuencia utilizarán proteína aislada, membranas de células que expresen para una quimioquina DVic-1 de la presente invención asociada a una membrana recombinante, fragmentos solubles que contengan segmentos de unión al receptor de estas proteínas, o fragmentos unidos a sustratos en fase sólida. Estos ensayos también permitirán la determinación para diagnóstico de los efectos de las mutaciones o modificaciones de los segmentos de unión, o mutaciones y modificaciones de la proteína, por ejemplo, análogos de la proteína. Esta invención también contempla el uso de ensayos de escrutinio de fármacos competitivos, por ejemplo, donde los anticuerpos neutralizantes para el antígeno o fragmentos de receptor compiten con un compuesto de ensayo para la unión a la proteína. En esta forma, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de un polipéptido que comparte uno o más sitios de unión antigénicos de la proteína y también pueden ser utilizados para ocupar sitios de unión sobre la proteína que alternativamente podría interactuar con un receptor.

"Derivados" de, por ejemplo, antígenos de quimioquina DGWCC incluyen mutantes de secuencias de aminoácidos, variantes de glucosilación, y conjugados covalentes o agregados con otros restos químicos. Los derivados covalentes pueden ser preparados mediante el enlace de las funcionalidades a los grupos que se encuentran en las cadenas laterales de aminoácidos de quimioquina DGWCC o en el N o C terminal, por medio de los cuales son bien conocidos en la técnica. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, ésteres o amidas alifáticos del carboxilo terminal, o de residuos que contengan cadenas laterales carboxilo, derivados de 0-acilo de residuos que contengan grupos hidroxilo, y derivados de N-acilo del aminoácido amino terminal o residuos que contengan grupos amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo que incluyen, por ejemplo, alquilo normal de C3 a C18 formando por este medio las especies alcanoill-aroilo. La unión covalente a las proteínas vehículos es puede ser importante cuando los restos inmunogénicos son haptenos.

En particular se incluyen alteraciones por glucosilación, por ejemplo, preparadas modificando los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en otras etapas de procesamiento. Los medios particularmente preferidos para conseguir esto son exponer el polipéptido a las enzimas glucosilantes derivadas de células que normalmente proporcionan este procesamiento, por ejemplo, enzimas de glucosilación de mamífero. También se contemplan las enzimas de desglucosilación. También se abarcan las versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos que tienen otras modificaciones menores, incluidos los residuos aminoácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina, u otros restos, que incluyen grupos ribosilo o reactivos de reticulación.

Un grupo importante de derivados son conjugados covalentes de la quimioquina DGWCC o fragmentos de la misma con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden ser sintetizados en cultivos recombinantes, como pueden ser fusiones N- o C-terminales o por el uso de agentes conocidos en la técnica por su utilidad en las proteínas reticulantes a través de grupos laterales reactivos. Los sitios preferidos para la derivatización de proteínas con agentes reticulantes están en grupos amino libres, restos de carbohidrato, y residuos de cisteína.

También se proporcionan polipéptidos de fusión entre las quimioquinas de la invención y otras proteínas homólogas o heterólogas. Múltiples factores de crecimiento y citoquinas son entidades homodiméricas, y una construcción repetida puede tener diversas ventajas, que incluye susceptibilidad reducida a la degradación proteolítica. Además, muchos receptores requieren dimerización del ligando para transducir una señal, y pueden ser deseables diversas proteínas diméricas o repeticiones de dominios. Los polipéptidos heterólogos pueden ser fusiones entre diferentes marcadores superficiales, dando como resultado, por ejemplo, una proteína híbrida que presente especificidad de unión al receptor. De la misma manera, las fusiones heterólogas pueden ser construidas de manera que presenten una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos comunes son fusiones de un polipéptído informador, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de una proteína, por ejemplo, un segmento de unión al receptor, de manera que la presencia o localización de la proteína fusionada puede ser fácilmente determinada. Véase, por ejemplo, Dull, et al. Patente Estadounidense No. 4.859.609. Otras contrapartes de fusión genética incluyen \beta-galactosidasa, trpE, proteína A, \beta-lactamasa, alfa-amilasa, alcohol-deshidrogenasa y factor de acoplamiento alfa de levadura. Véase, Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.

Estos polipéptidos también pueden tener residuos de aminoácidos que hayan sido químicamente modificados por fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o eliminación de otros restos, particularmente los que tengan formas moleculares similares a los grupos fosfato. En algunas realizaciones las modificaciones serán reactivos marcadores útiles o servirán como dianas de purificación, por ejemplo, ligandos de afinidad.

Esta invención también contempla el uso de derivados de quimioquina de la invención además de variaciones en secuencia de aminoácidos o glucosilación. Estos derivados pueden incluir asociación covalente o agregativa con restos químicos. Estos derivados generalmente entran dentro de tres clases: (1) sales, (2) modificaciones covalentes de residuos de cadena lateral y residuos terminales, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo, con membranas celulares. Estos derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos o en métodos de purificación como puede ser para purificación por afinidad de ligandos u otros ligandos de unión. A modo de ejemplo, un antígeno de quimioquina DGWCC puede ser inmovilizado por unión covalente a un soporte sólido, como puede ser SEPHAROSE, activada con bromuro de cianógeno, por métodos que son bien conocidos en la técnica, o adbsorbido sobre superficies poliolefínicas con o sin reticulación de glutaraldehído, para uso en el ensayo o purificación de anticuerpos anti-quimioquina DGWCC o su receptor. La quimioquina DGWCC también puede ser marcada con un grupo detectable, por ejemplo, radioyodada por el procedimiento de la cloramina T, unida en forma covalente a quelatos de tierras raras o conjugada a otra porción fluorescente para uso en ensayos de diagnóstico. La purificación de las quimioquinas DGWCC puede efectuarse por anticuerpos o receptor inmovilizados.

Los genes aislados de quimioquina DGWCC permitirán la transformación de células que carezcan de expresión de la quimioquina DGWCC correspondiente, por ejemplo, de tipos de especies o células que carezcan de las proteínas correspondientes y que presenten actividad de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permitirá el aislamiento de líneas de células antigénicamente puras con variantes de especie definidas o únicas. Este método permitirá la detección más sensible y la discriminación de los efectos fisiológicos de las proteínas del receptor quimioquina de DGWCC. Los fragmentos subcelulares, por ejemplo, los citoplastos o fragmentos de membrana pueden ser aislados y utilizados. Las descripciones que utilizan DGWCC como un ejemplo generalmente serán aplicables de manera alternativa a la DVic-1.

X.- Usos

La presente invención proporciona los reactivos que encontrarán uso en aplicaciones de diagnóstico como ya se describió en la presente memoria, por ejemplo, en la descripción general para anormalidades del desarrollo o, a continuación, en la descripción de los kits para diagnóstico.

A modo de ejemplo los nucleótidos de quimioquina DGWCC, por ejemplo, el DNA o RNA para la quimioquina DGWCC pueden ser utilizados como un componente en un ensayo forense. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos provistas pueden ser marcadas utilizando, por ejemplo, 32P o biotina y pueden ser utilizados para sondar franjas de polimorfismo de fragmento de restricción estándar proporcionando un carácter medible para ayudar a distinguir entre individuos o, por ejemplo, fuentes de especies. Estas sondas pueden ser utilizadas en técnicas forenses bien conocidas como huella genética. Además, las sondas de nucleótidos preparadas a partir de las secuencias de quimioquina DGWCC pueden ser utilizadas en ensayos in situ para detectar anormalidades cromosómicas. Por ejemplo, las transposiciones en el cromosoma humano que contiene un gen de quimioquina DGWCC pueden ser detectados a través de las técnicas in situ bien conocidas, utilizando sondas de quimioquina DGWCC junto con otros marcadores de cromosomas conocidos.

Los anticuerpos y otros agentes de unión dirigidos hacia las proteínas o ácido nucleicos de quimioquina DGWCC pueden ser utilizados para purificar la molécula de quimioquina DGWCC correspondiente. Como se describe en los ejemplos siguientes, la purificación del anticuerpo de los componentes de quimioquina DGWCC es posible y practicable. Los anticuerpos y otros agentes de unión también pueden ser utilizados en una forma de diagnóstico para determinar si los componentes de quimioquina DGWCC están presentes en una muestra de tejido o población celular utilizando técnicas bien conocidas, como se describen en la presente memoria. La capacidad para unir un agente de unión a una quimioquina DGWCC proporciona un medio para diagnosticar trastornos asociados con la falta de regulación de quimioquina DGWCC. Los anticuerpos y otros agentes de unión de quimioquina DGWCC también pueden ser útiles como marcadores histológicos. Como se describe en los ejemplos siguientes, la expresión quimioquina DGWCC se limita a tipos de tejido específicos. Al dirigir una sonda, como puede ser un anticuerpo o ácido nucleico a una quimioquina DGWCC, es posible utilizar la sonda para distinguir tipos de tejido y células in situ o in vitro.

Esta invención también proporciona reactivos con valor terapéutico significativo. Las quimioquinas de la presente invención (naturales o recombinantes), fragmentos de las mismas, y anticuerpos para las mismas, junto con los compuestos identificados con afinidad de unión a dicha quimioquina, son útiles en el tratamiento de los estados asociados con la fisiología o desarrollo anormal, incluida la proliferación anormal, por ejemplo, estados cancerosos o estados degenerativos. La proliferación anormal, regeneración, degeneración y atrofia pueden ser modulados por tratamiento terapéutico adecuado utilizando los compuestos que se proporcionan en la presente invención. A modo de ejemplo, una enfermedad o trastorno asociado con expresión anormal o señalización anormal por una quimioquina DGWCC es una diana para un agonista o antagonista de la proteína. Las proteínas probablemente desempeñan un papel en la regulación o desarrollo de células neuronales o hematopoyéticas, por ejemplo, células linfoides, que afectan a las respuestas inmunológicas.

Otros estados anormales del desarrollo son conocidos en tipos de células en las que se ha demostrado que poseen mRNA de quimioquina DVic-1 o DGWCC por análisis mediante transferencia Northern. Véase, Berkow (ed.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Rahway, NJ; y Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY. Las anormalidades de desarrollo o funcionales, por ejemplo del sistema neuronal o inmune, causan anormalidades y estados médicos significativos que pueden ser susceptibles de prevención o tratamiento utilizando las composiciones que se proporcionan en la presente invención.

Ciertas quimioquinas también han sido implicadas en mecanismos de replicación viral. Véase, por ejemplo, Cohen (1996) Science 272:809-810; Feng, et al. (1996) Science 272:872-877; y Cocchi, et al. (1995) Science 270:1811-1816. La quimioquina DVic-1 o DGWCC puede ser útil en un contexto semejante.

La quimioquina DVic-1 o DGWCC recombinante o anticuerpos contra quimioquina pueden ser purificados y luego administrados a un paciente. Estos reactivos pueden ser combinados para uso terapéutico con ingredientes activos inertes adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, coadyuvantes inmunogénicos, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser filtradas en forma estéril y colocadas en formas de dosificación, como por liofilización, en pequeños frascos de dosificación o almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, que incluye las formas que no se unen al complemento.

Durante el escrutinio utilizando anticuerpos o receptor o fragmentos de los mismos es posible identificar compuestos que tengan afinidad de unión a quimioquina DVic-1 o DGWCC, incluyendo el aislamiento de los componentes asociados. Los ensayos biológicos posteriores pueden entonces ser utilizados para determinar si el compuesto tiene actividad estimulante intrínseca y por tanto es un bloqueador o antagonista en cuanto a que bloquea la actividad de la proteína. De la misma manera, un compuesto que tenga actividad estimulante intrínseca puede activar el receptor y, de esta manera, es un agonista en cuanto a que estimula la actividad de, por ejemplo, una quimioquina DGWCC. También se describen en la presente memoria el uso terapéutico de los anticuerpos contra quimioquina DGWCC como antagonistas. Este método debe ser particularmente útil con otras variantes de especies de quimioquina DGWCC.

Las cantidades de reactivos necesarias para la terapia efectiva dependerán de múltiples factores diferentes, que incluye el medio de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. De esta manera, las dosificaciones de tratamiento deben ser tituladas para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosificaciones utilizadas in vitro pueden proporcionar una guía útil en las cantidades útiles para administración in situ de estos reactivos. Los ensayos de las dosis efectivas en animales para el tratamiento de trastornos específicos proporcionarán otros indicios predictivos de la dosificación humana. Diversas consideraciones se describen, por ejemplo, en Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press; y (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA. Los métodos para la administración se describen en la presente y a continuación, por ejemplo, para administración oral, intravenosa, intreperitoneal o intramuscular, difusión transdérmica y otros. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos que se describen en, por ejemplo, The Merck Index Merck & Co., Rahway, NJ. Típicamente se esperará que los intervalos de dosificación estén en cantidades inferiores a concentraciones 1 \muM, típicamente concentraciones menores que aproximadamente 10 \muM, típicamente menores que aproximadamente 100 n, de preferencia menores que aproximadamente 10 p (picomolar), y de mayor preferencia menores que aproximadamente 1 fM (fentolmolar), con un vehículo adecuado. Formulaciones de liberación lenta o un aparato de liberación lenta con frecuencia serán utilizados para administración continua.

Las quimioquinas DVic-1 de la invención, fragmentos de las mismas y anticuerpos para éstas o sus fragmentos, antagonistas y agonistas, pueden ser administrados directamente al hospedante que va a ser tratado o, dependiendo del tamaño de los compuestos, puede ser deseable conjugarlos a las proteínas vehículos, como ovoalbúmina o seroalbúmina, antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden ser administradas en cualquier formulación de dosificación convencional. Aunque es posible que el ingrediente activo sea administrado sólo, se prefiere presentarlo como una formulación farmacéutica. Las formulaciones típicamente consisten en al menos un ingrediente activo, como ya se definió, junto con uno o más vehículos aceptables para el mismo. Cada vehículo debe ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable, en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no ser perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, nasal o parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Véase, por ejemplo, Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8ª ed.) Pergamon Press; and (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª ed.) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis, et al. (Eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms,: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia de esta invención puede ser combinada con o utilizada en asociación con otros agentes terapéuticos.

Tanto las formas naturales como las recombinantes de las quimioquinas DVic-1 de esta invención son particularmente útiles en kits y métodos de ensayo que sean capaces de escrutar compuestos para actividad de unión a las proteínas. En los últimos años se han desarrollado diversos métodos de ensayos automatizados para permitir escrutinio de decenas de miles de compuestos en un periodo corto. Véase, por ejemplo, Fodor et al. (1991) Science 251:767-773, y otras descripciones de colecciones de diversidad química, que describen medios para ensayar la afinidad de unión mediante una pluralidad de compuestos. El desarrollo de los ensayos adecuados puede ser facilitado en gran medida por la disponibilidad de cantidades grandes de quimioquina purificada, soluble como se proporciona por esta invención.

Por ejemplo, los antagonistas pueden encontrarse normalmente una vez que la proteína ha sido estructuralmente definida. El ensayo de los análogos potenciales de la proteína ahora es posible con el desarrollo de métodos de ensayo altamente automatizados utilizando un receptor purificado. En particular, nuevos agonistas y antagonistas serán descubiertos utilizando las técnicas de escrutinio descritas en la presente memoria. De importancia específica son los compuestos que se han encontrado con afinidad de unión combinada para múltiples receptores de quimioquina DGWCC, por ejemplo, compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de especies de una quimioquina DGWCC.

Esta invención es particularmente útil para escrutar compuestos utilizando la proteína recombinante en una variedad de técnicas de escrutinio de fármacos. Las ventajas de utilizar una proteína recombinante en el escrutinio para ligandos específicos incluyen: (a) fuente renovable mejorada de la quimioquina DGWCC a partir de una fuente específica; (b) número potencialmente mayor de ligandos por célula dando mejor relación señal a ruido en los ensayos; y (c) especificidad de la variante de especies (dando teóricamente mejor especificidad biológica y de la enfermedad).

Un método de escrutinio de fármacos utiliza células hospedantes eucarióticas o procarióticas que se transforman de manera estable con moléculas de DNA recombinante que expresan un receptor de quimioquina. Es posible aislar células que expresen un receptor en el aislamiento de cualesquiera otros. Estas células, en forma viable o fija, pueden ser utilizadas para ensayos tipo estándar de unión al ligando/receptor. Véase, también Parce, et al. (1989) Science 246: 243-247; y Owicki, et al. (1990) Proc Nat'l Acad. Sci USA 87:4007-4011, los cuales describen métodos sensibles para determinar las respuestas celulares. Los ensayos competitivos son particularmente útiles donde las células (fuente de quimioquina DGWCC) se ponen en contacto y se incuban con un receptor o anticuerpo marcado que se sabe tiene afinidad de unión conocida para el ligando, como puede ser ^{125}I-anticuerpo, y una muestra de ensayo cuya afinidad de unión a la composición de unión este siendo medida. Las composiciones de unión marcadas unidas y libres se separan entonces para valorar el grado de unión al ligando, la cantidad de compuesto de ensayo unido es inversamente proporcional a la cantidad del receptor marcado que se une a la fuente conocida. Cualesquiera de numerosas técnicas pueden ser utilizadas para separar el ligando unido del libre para valorar el grado de unión al ligando. Esta etapa de separación típicamente incluirá un procedimiento como adherencia a filtros seguido por lavado, adherencia a plástico seguido por lavado o centrifugación de las membranas celulares. Las células viables también pueden ser utilizadas para escrutar los efectos de los fármacos sobre las funciones mediadas por quimioquina DGWCC, por ejemplo, niveles del segundo mensajero, es decir, Ca^{++}; proliferación celular; cambios en la combinación inositol-fosfato; y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación de una etapa de separación, por ejemplo un sistema de detección sensible a la proximidad. Los colorantes sensibles al calcio serán útiles para detectar niveles de Ca^{++} con un fluorímetro o un aparato para clasificar de células por fluorescencia.

Otro método utiliza membranas provenientes de células hospedantes eucarióticas o procarióticas transformadas como la fuente de una quimioquina DGWCC. Estas células se transforman de manera estable con vectores de DNA dirigiendo la expresión de una quimioquina DGWCC, por ejemplo, una forma unida de membrana diseñada. Esencialmente, las membranas serían preparadas a partir de las células y utilizadas en un ensayo de unión receptor/ligando como puede ser el ensayo competitivo ya mencionado.

Todavía otro método es utilizar quimioquina DGWCC solubilizada, no purificada o solubilizada, purificada proveniente de células hospedantes eucarióticas o procarióticas transformadas. Esto permite un ensayo de unión "molecular" con las ventajas de especificidad incrementada, la capacidad para automatizar y el elevado rendimiento del ensayo del fármaco.

Otra técnica para escrutar fármacos incluye un método que proporciona escrutinio de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada para un anticuerpo de quimioquina DGWCC y se describe con detalle en Geysen, solicitud de Patente Europea 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Primeramente, se sintetizan gran cantidad de compuestos de ensayo peptídicos pequeños, diferentes sobre un sustrato sólido, por ejemplo, alfileres de plástico o alguna otra superficie adecuada, véase, Fodor et al., supra. A continuación todos los alfileres se hacen reaccionar con anticuerpo de quimioquina DGWCC solubilizado, no purificado o solubilizado, purificado, y se lavan, la siguiente etapa incluye detectar el anticuerpo unido a quimioquina DGWCC.

El diseño racional de fármacos también puede basarse en estudios estructurales de las formas moleculares de la quimioquina DGWCC y otros efectores o análogos, véase, por ejemplo, Methods in Enzymology Vols. 202 y 203. Los efectores pueden ser otras proteínas que medien otras funciones en respuesta a la unión al ligando, u otras proteínas que normalmente interactúan con el receptor. Un medio para determinar los sitios que interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas bidimensionales de NMR. Estas proporcionarán una gría a cuales residuos de aminoácidos forman regiones de contacto molecular. Para una descripción detallada de la determinación estructural de proteínas véase, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crystallography Academic Press, NY.

Una quimioquina DGWCC purificada puede ser revestida directamente sobre placas para uso en las técnicas de escrutinio de fármacos antes mencionadas. No obstante, los anticuerpos no neutralizantes para estos ligandos pueden ser utilizados como anticuerpos de captura para inmovilizar el ligando respectivo sobre la fase sólida. Alternativamente los ejemplos con DGWCC serán realizados con la quimioquina DVic-l.

XI.- Kits

Las proteínas quimioquina DVic-1 de la invención y sus productos de fusión en pueden usarse en una variedad de kits de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de quimioquina o un receptor de quimioquina. Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contiene un péptido de quimioquina DVic-1 definido o segmento genético o un reactivo que reconoce uno u otro, por ejemplo, fragmentos de receptor.

A modo de ejemplo, un kit para determinar la afinidad de unión de un compuesto de prueba a una quimioquina DGWCC típicamente contendrá un compuesto de ensayo; un compuesto marcado, por ejemplo, un receptor o anticuerpo que tenga afinidad de unión conocida para la quimioquina DGWCC; una fuente de quimioquina DGWCC (natural o recombinante); y medios para separar el compuesto marcado unido del libre, como puede ser una fase sólida para inmovilizar la quimioquina DGWCC. Una vez que se escrutan los compuestos, los que tengan afinidad de unión adecuada para la quimioquina DGWCC pueden ser evaluados en ensayos biológicos adecuados, como son bien conocidos en la técnica, para determinar si estos actúan como agonistas o antagonistas para el receptor. La disponibilidad de polipéptidos de quimioquina DGWCC recombinante también proporciona patrones bien definidos para calibrar estos ensayos.

Un kit preferido para determinar la concentración de, por ejemplo, una quimioquina DGWCC en una muestra, típicamente, contendrá un compuesto marcado, por ejemplo, receptor o anticuerpo, que tenga afinidad de unión conocida para la quimioquina DGWCC, una fuente de quimioquina DGWCC (natural o recombinante), y medios para separar el compuesto marcado unido del libre, por ejemplo, una fase sólida para inmovilizar la quimioquina DGWCC. Normalmente se proporcionaran compartimentos que contienen los reactivos, y las instrucciones.

Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para la quimioquina DGWCC o fragmentos de ligando son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de quimioquina DGWCC y/o sus fragmentos. Estos ensayos de diagnóstico pueden emplear lisados, células vivas, células fijas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, fluidos corporales y además, pueden implicar la detección de antígenos relacionados con el ligando en suero, o similares. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin una etapa de separación entre reactivo libre y complejo antígeno-quimioquina DGWCC) o heterogéneos (con una etapa de separación). Existen diversos ensayos comerciales, como puede ser el radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmuno absorbente de enzimas ligadas (ELISA), inmunoensayo enzimático (EIA), técnica de inmunoensayo multiplicado con enzimas (EMIT), inmunoensayo fluorescente marcado en el sustrato (SLFIA), y similares. Por ejemplo, los anticuerpos marcados pueden ser empleados utilizando un segundo anticuerpo que se encuentre marcado y que reconozca en el anticuerpo para una quimioquina DGWCC o para un fragmento específico de la misma. Ensayos similares también han sido ampliamente descritos en la bibliografía. Véase, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, NY; Chan (ed.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY; and Ngo (ed.) (1988) Nonisotopic Immunoaassay Plenum Press, NY.

Anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener uso semejante para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra una quimioquina DGWCC, como puede ser el diagnóstico de diferentes estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de quimioquina DGWCC puede dar como resultado la producción de diferentes reacciones inmunológicas u otras reacciones médicas que pueden ser el diagnóstico de estados fisiológicos anormales, por ejemplo, en el crecimiento activación o diferenciación de células.

Con frecuencia los reactivos para ensayos de diagnóstico se suministran en kits, para optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, se describe el protocolo y el marcador, el anticuerpo o receptor marcado o no marcado o la quimioquina DGWCC marcada. Esto normalmente es junto con otros aditivos, como tampones, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de la señal como sustratos para enzimas, y similares. De preferencia, el kit también contendrá las instrucciones para el uso adecuado y para desechar el contenido después del uso. Normalmente el kit tiene compartimentos para cada reactivo útil. Es deseable que los reactivos sean proporcionados como un polvo liofilizado, seco, donde los reactivos puedan ser reconstituidos en un medio acuoso proporcionando las concentraciones adecuadas de los reactivos para realizar el ensayo.

Muchos de los constituyentes antes mencionados del escrutinio de fármacos y los ensayos de diagnóstico pueden ser utilizados sin modificación, o pueden ser modificados en una variedad de formas. Por ejemplo, el marcado puede lograrse uniendo de manera covalente o no covalente un resto que proporcione directa o indirectamente una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos la proteína, el compuesto de ensayo, la quimioquina DGWCC o los anticuerpos para la misma pueden ser marcados directa o indirectamente. Las posibilidades para dirigir el marcado incluyen los grupos de marcares: radiomarcadores como ^{125}I, enzimas (Patente Estadounidense No. 3.645.090) como puede ser peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcadores fluorescentes (Patente Estadounidense No. 3.940.475) capaces de monitorizar el cambio en la intensidad de la fluorescencia, desplazamiento de la longitud de onda o la polarización de la fluorescencia. Las posibilidades para marcar indirectamente incluyen biotinilación de un constituyente seguido por la unión a avidina acoplada a uno de los grupos marcadores anteriores.

También hay numerosos métodos de separación del ligando unido del libre, o alternativamente el compuesto de ensayo unido del libre. La quimioquina DGWCC puede ser inmovilizada en diferentes matrices seguido por lavado. Las matrices adecuadas incluyen plásticos como placa, filtros y perlas para ELISA. Los métodos de inmovilización de la quimioquina DGWCC a una matriz incluyen, sin limitación, adherencia directa a plástico, el uso de un anticuerpo de captura, acoplamiento químico y biotina-avidina. La última etapa en el método incluye la precipitación del complejo ligando/receptor o ligando/anticuerpo por cualquiera de los diversos métodos que incluyen los que utilizan, por ejemplo, un disolvente orgánico como puede ser polietilenglicol o una sal como sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de las partículas magnetizables de anticuerpo-fluoresceína descrito en Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461, y la separación de la partícula magnética de doble anticuerpo que se describe en la Patente Estadounidense No. 4.659.678.

Los métodos para enlazar proteínas o sus fragmentos a diversos marcadores han sido ampliamente descritos en la bibliografía y no requieren mayor descripción en la presente memoria. Muchas de las técnicas incluyen el uso de grupos carboxilos activados a través del uso de carbodiimida o ésteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres por reacción de un grupo de mercapto con un halógeno activado como cloroacetilo o una olefina activada como maleimida, para el enlace, o similares. Las proteínas de fusión también encuentran uso en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico descritos en la presente memoria incluye el uso de secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos tomadas de la secuencia de una quimioquina DGWCC. Estas secuencias pueden ser utilizadas como sondas para detectar marcadores del mensaje de quimioquina DGWCC en muestras de fuentes naturales, o pacientes de los que se sospecha tienen un estado anormal, por ejemplo cáncer o problema de desarrollo. La preparación de secuencias tanto de nucleótidos como de RNA y DNA, el marcado de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias han recibido amplia descripción y discusión en la bibliografía. Normalmente una sonda de oligonucleótido debe tener al menos aproximadamente 14 nucleótidos, típicamente al menos 18 nucleótidos y las sondas de nucleótidos pueden ser hasta de varias kilobases. Diferentes marcadores pueden emplearse, más comúnmente radionúclidos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, otras técnicas también pueden ser empleadas, como puede ser el uso de nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para la unión a avidina o anticuerpos, los cuales pueden ser marcados con una amplia variedad de marcadores, como puede ser radionúclidos, fluoróforos, enzimas o similares. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que reconozcan dúplex específicos, que incluye dúplex de DNA dúplex de RNA, dúplex híbridos DNA-RNA o dúplex-DNA proteína. Los anticuerpos a su vez pueden ser marcados y el ensayo llevarse a cabo donde el dúplex esta unido a una superficie, de manera que por la formación del dúplex en la superficie es posible detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex. El nuevo uso de sondas para el RNA anti-sentido puede llevarse a cabo utilizando muchas de las técnicas convencionales como puede ser la hibridación del ácido nucleico, escrutinio más y menos, sondeo recombinacional, traducción liberada por hibridación (HRT), y traducción interrumpida de híbrido (HART). Esto también incluye las técnicas de amplificación como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Están considerados kits de diagnóstico que también ensayan la presencia cualitativa y cuantitativa de éstos y otros marcadores también. La diagnosis o prognosis puede depender de la combinación de indicaciones múltiples utilizadas como marcadores. De esta manera, los kits pueden ensayar combinaciones de marcadores. Véase, por ejemplo, Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97. La expresión cualitativa o cuantitativa de cada quimioquina puede ser evaluada por los métodos estándar a los niveles de proteína o mRNA.

XII.- Aislamiento del receptor

Habiendo aislado una parte de unión de una interacción específica existen métodos para aislar la contraparte. Véase, Gearing, et al. (1989) EMBO J. 8:3667-3676. Por ejemplo, pueden determinarse medios para marcar una quimioquina DVic-1 sin interferir con la unión a su receptor. Por ejemplo, un marcador de afinidad o secuencia marcadora epitópica puede ser fusionado al amino o carboxilo terminal del ligando. Una genoteca de expresión puede ser escrutada para la unión específica de la quimioquina DVic-1 o, por ejemplo, por clasificación celular, u otro escrutinio para detectar las subpoblaciones que expresan tal componente de unión. Véase, por ejemplo, Ho, et al. (1993) Proc. Nat'l Acad Sci USA 90:11267-11271. Alternativamente, es utilizar el método de toma panorámica, véase, Seed y Aruffo (1987) Proc Nat'1 Acad. Sci USA 84:3365-3369. También puede aplicarse un sistema de selección de dos híbridos haciendo construcciones adecuadas con las secuencias de quimioquina disponibles. Véase, por ejemplo, Fields y Song (1989) Nature 340:245-246. También es posible utilizar los métodos estándar del flujo de Ca^{++}. Véase, por ejemplo, Coligan, et al. (Eds.) (1992 y sus suplementos periódicos) Current Protocols in Immunology Greene/Wiley, New York, NY.

Las técnicas de reticulación de proteínas con marcador pueden ser aplicadas para aislar socios de unión de una quimioquina DVic-1. Esto permitiría la identificación de las proteínas que interactúan específicamente con una quimioquina DVic-1, por ejemplo, en una forma semejante a ligando-receptor. Típicamente, la familia de quimioquinas se une a los receptores de las siete familias de receptores de transmembrana y es muy probable que el receptor para la quimioquina DVic-1 presente una estructura semejante. De esta manera, es muy probable que el receptor sea encontrado por expresión en un sistema que sea capaz de expresar tal proteína de membrana en una forma capaz de presentar capacidad de unión al ligando.

El amplio alcance de esta invención se comprende mejor con referencia a los siguientes ejemplos, con los cuales no se propone limitar la invención a las realizaciones específicas.

Ejemplos I.- Métodos generales

Muchos de los siguientes métodos estándar se describen o tienen referencia en, por ejemplo, Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.) vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y suplementos) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis, et al. (Eds.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen tales métodos como: precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel et al. (1987 y sus suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y la bibliografía del fabricante sobre el uso de los productos para la purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a los segmentos adecuados (secuencias marcadoras epitópicas) por ejemplo, para una secuencia FLAG o un equivalente que pueda ser fusionado, por ejemplo, a través de una secuencia eliminable por proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe, et al. 81992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.

Las técnicas inmunológicas estándar se describen, por ejemplo, en Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Methods in Enzymology volúmenes. 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162, y 163. Los ensayos para actividades biológicas de células neurales se describen, por ejemplo, en Wouterlood (ed. 1995) Neuroscience Protocols modules 10, Elsevier Methods in Neurosciences Academic Press; y Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. La metodología de los sistemas de desarrollo se describe, por ejemplo, en Meisami (ed.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; y Chrispeels (ed.) Molecular Techniques and Approaches in Developmental Biology Interscience.

Los análisis FACS se describen en Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY.

II.- Aislamiento del clono de quimioquina DVic-1 o DGWCC

Un clon que codifica la quimioquina DVic-1 o DGWCC se aisla de una fuente natural por muchos de los diferentes métodos posibles. Dadas las secuencias que se proporcionan en la presente, los cebadores de la PCR o sondas de hibridación se seleccionan y/o construyen para aislar segmentos de DNA genómico o transcritos inversos de cDNA. Las fuentes de células adecuadas incluyen los tejidos mencionados, por ejemplo, colecciones de piel o epiteliales o de curación de heridas. Las variantes genéticas y polimórficas o alélicas se aislan por escrutinio de una población de individuos.

La detección basada en la PCR se realiza por los métodos estándar, de preferencia utilizando cebadores de extremos opuestos de la secuencia codificante, pero para propósitos específicos podrían seleccionarse segmentos flanqueadores.

Alternativamente, se seleccionan sondas de hibridación. El contenido específico de AT o GC de las sondas se selecciona dependiendo de la homología esperada y la falta de acoplamiento esperada. Las condiciones severas adecuadas se seleccionan para equilibrar una relación señal positiva a fondo adecuada. Las etapas de lavado sucesivas se utilizan para recoger clones de homología mayor.

Otros clones se aislan utilizando un procedimiento de selección basado en anticuerpos. Se aplican los métodos de clonación de expresión estándar, incluida, por ejemplo, la tinción FACS del producto de expresión asociado con membrana. Los anticuerpos se utilizan para identificar clones que producen una proteína reconocida. Alternativamente, los anticuerpos se utilizan para purificar una quimioquina DVic-1 o DGWCC, con secuenciación de proteína y medios estándar para aislar un gen que codifica esta proteína.

Los métodos basados en la secuencia genómica también permitirán la identificación de las secuencias naturalmente disponibles, o alternativamente, que presentan homología para las secuencias proporcionadas.

III.- Aislamiento de una contraparte de primate para clon de quimioquina

Se utilizan métodos similares a los anteriores para aislar un gen de quimioquina de primate adecuado a partir de otro primate. Materiales fuente similares se utilizan para aislar genes naturales, incluidas las variantes genéticas, polimórficas, alélicas o de raza. Otras variantes de especie también se aislan utilizando métodos similares. Alternativamente, es posible escrutar bases de datos genéticas para los restos adecuados.

IV.- Aislamiento de un clon de quimioquina de roedor

Una fuente de roedor adecuada se selecciona como en lo anterior, por ejemplo, rata, hámster, etcétera. Se utilizan métodos similares para aislar una variante de especie, aunque el nivel de similitud típicamente será menor para la quimioquina de roedor en comparación con una secuencia de ser humano o de otro primate.

V.- Localización cromosómica

El cDNA se marca, por ejemplo con traslación de muesca con biotina-14 dATP y se híbrida in situ a una concentración final de 5 ng/\mul a las metafases de dos animales normales, de preferencia machos. El método de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) puede ser modificado a partir del que se describe por Callen, et al. (1990). Ann. Genet. 33:219-221, en que los cromosomas se tiñen antes del análisis con yoduro de propidio (como tinción inversa) y DAPI (para identificación de cromosomas). Las imágenes de las preparaciones en metafase se capturan por una cámara de CDD y se mejoran por ordenador. Se determina la identificación de los cromosomas marcados adecuados. La localización para las ubicaciones estándar para esta molécula, o localización diferente también puede proporcionar información según la función.

La DVic-1 humana ha sido localizada para el cromosoma 9p13 humano.

VI.- Expresión; purificación; caracterización

Con un clon adecuado de los anteriores, la secuencia codificante se inserta en un vector de expresión adecuado. Esto puede ser en un vector específicamente seleccionado para un procariota, levadura, insecto o vertebrado superior, por ejemplo, un sistema de expresión de mamífero. Los métodos estándar se aplican para producir el producto genético, de preferencia como una molécula secretada soluble, pero, en ciertos casos, también se hará como una proteína intracelular. Las proteínas intracelulares típicamente requieren lisis de células para recuperar la proteína, y los anticuerpos de inclusión insolubles son un material inicial común para otra purificación.

Con un clon que codifica una quimioquina DVic-1 o DGWCC, se utilizan medios de producción recombinantes, aunque pueden ser purificadas formas naturales de fuentes adecuadas. El producto proteínico se purifica por los métodos estándar de purificación de proteínas, en ciertos casos, por ejemplo, acoplados con métodos de inmunoafinidad. Los métodos de inmunoafinidad se utilizan como una etapa de purificación, como ya se describió, o como un ensayo de detección para determinar las propiedades de separación de la proteína.

De preferencia la proteína se secreta en el medio, y el producto soluble se purifica del medio en una forma soluble. Alternativamente, como ya se describió anteriormente, los cuerpos de inclusión de sistemas de expresión procarióticos son una fuente de materia útil. Típicamente, la proteína insoluble se solubiliza de los cuerpos de inclusión y se vuelven a plegar utilizando los métodos estándar. Los métodos de purificación se desarrollan como ya se describió antes.

El producto del método de purificación antes descrito se caracteriza por determinar múltiples características estructurales. Se aplican los métodos físicos estándar, por ejemplo, análisis de aminoácidos y secuenciación de proteínas. La proteína resultante es sometida a espectroscopia de CD y otros métodos espectroscópicos, por ejemplo NMR, ESR, espectroscopía de masas, etc. El producto se caracteriza para determinar su forma molecular y tamaño, por ejemplo, utilizando cromatografía en gel y técnicas similares. La comprensión de las propiedades cromatográficas dará origen a métodos de purificación más suaves y eficientes.

La predicción de los sitios de glucosilación puede hacerse, por ejemplo, como se describe en Hansen, et al. (1995) Biochem. J. 308:801-813.

VII.- Preparación de anticuerpos contra quimioquina

Con DNA para expresión o la proteína producida, por ejemplo, como ya se señaló, los animales se inmunizan para producir anticuerpos. El antisuero policlonal se produce en algunos casos utilizando antígeno no purificado, aunque el suero resultante presentará niveles de fondo superiores. De preferencia, el antígeno se purifica utilizando las técnicas de purificación de proteínas estándar, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de afinidad utilizando suero policlonal ya indicado. La presencia de los anticuerpos específicos se detecta utilizando fragmentos peptídicos sintéticos definidos.

El suero policlonal se produce contra un antígeno purificado, purificado como ya se indicó, o utilizando, por ejemplo, una pluralidad de péptidos sintéticos. Una serie de péptidos sintéticos solapantes que comprende toda la secuencia de longitud completa, si se presenta en un animal, producirá suero que reconozca la mayor parte de los epítopos lineales en la proteína. Este antisuero se utiliza para purificar proteína por afinidad, que a su vez se utiliza para producir proteína de longitud completa intacta en otro animal para producir otra preparación de antisuero.

Se utilizan técnicas similares para generar anticuerpos monoclonales inducidos para antígeno no purificado o, de preferencia el antígeno purificado. El antisuero o los anticuerpos pueden reconocer proteína natural, o puede reconocer antígeno desnaturalizado. Las preparaciones pueden ser inmunoseleccionadas o inmunopurificadas, como se desee.

VIII.- Distribución celular y en tejido

La distribución de la proteína o productos genéticos se determina, por ejemplo, utilizando inmunohistoquímica con un reactivo de anticuerpo, como se produjo antes, o por escrutinio para ácidos nucleicos que codifican la quimioquina. La hibridación o los métodos PCR son utilizados para detectar DNA, cDNA, o contenido de mensaje. La histoquímica permite la determinación de tipos de células específicos dentro del tejido que expresa niveles superiores o menores del mensaje o DNA, las técnicas de anticuerpos son útiles para cuantificar proteína en una muestra biológica, que incluye una muestra líquida o de tejido. Los inmunoensayos se desarrollan para cuantificar proteína. Así mismo, el análisis FACS puede ser utilizado para evaluar la expresión en una población de células.

La secuencia DGWCC de ratón ha. sido detectada en ratón fetal, una secuencia de 14,5 días después de la concepción y tres secuencias de 19,5 días después de la concepción. Tres secuencias han procedido de ratón adulto, cada una de hígado, placenta y piel. El análisis Northern muestra señal en testículos que es mucho mayor que en cerebro, la cual es mucho mayor que en pulmón.

IX.- Ensayos de microquimiotaxis

Las actividades promigratorias de quimioquina DGWCC se valoran en ensayos de microquimiotaxis véase, por ejemplo, Bacon et al. (1988) Br. J. Pharmacol. 95:866-974. También se utilizan otros ensayos de tránsito. Por ejemplo, Quidling-Járbrink, et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:322-327; Koch, et al. (1994) J. Clinical Investigation 93:921-928; y Antony, et al. (1993) J. Immunol. 151: 7216-7223.

Las quimioquinas también pueden ser ensayadas para la actividad en ensayos hematopoyéticos como se describe, por ejemplo, por H. Broxmeyer. Véase Bellido, et al. (1995) J. Clinical Investigation 95:2886-2895; y Jilka, et al (1995) Exptl Hematology 23:500-506. Estas pueden ser ensayadas para actividades angiogénicas como se describe, por ejemplo, por Streiter et al. (1992) Am J. Pathol. 141:1279-1284. 0 para una función en inflamación. Véase, por ejemplo, Wakefield, et al. (1996) J. Surgical Res, 64:26-31.

X.- Actividades biológicas, directas o indirectas

Un ensayo robusto y sensible se selecciona como ya se describió, por ejemplo, en células inmunes, células neuronales o células madres. La quimioquina se añade al ensayo en dosis crecientes para ver si se detecta una dosis de respuesta. Por ejemplo, en ensayo de proliferación las células se cultivan en placas. Se proporciona medio de cultivo adecuado, y la quimioquina se añade en cantidades variables. El crecimiento se monitoriza en un periodo de tiempo que detectará un efecto directo sobre la célula o un efecto indirecto de la quimioquina.

Alternativamente se utiliza un ensayo de activación o ensayo de atracción. Se selecciona un tipo de célula adecuado, por ejemplo, células hematopoyéticas, células mieloides (macrófagos, neutrófilos, células polimorfonucleares, etc.) o linfoides (células T, células B o células NK), células neuronales (neuronas, neuroglia, oligodendrocitos, astrocitos, etc.) o células madres, por ejemplo, células progenitoras que diferencien otros tipos de células, por ejemplo, células cryp de intestino y tipos de células no diferenciados.

Otros ensayos serán aquellos que han sido demostrados con otras quimioquinas. Véase, por ejemplo, Schall y Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6:865-873; y Bacon y Schall (1996) Int. Arch. Allergy & Immunol. 109:97-109.

XI.- Relación estructura-actividad

La información sobre la importancia de los residuos específicos se determina utilizando los procedimientos y análisis estándar. El análisis de mutagénesis estándar se realiza, por ejemplo, generando múltiples variantes diferentes en posiciones determinadas, por ejemplo, en las posiciones antes identificadas, y evaluando las actividades biológicas de las variantes. Esto puede realizarse hasta el grado de determinar posiciones que modifican la actividad, o para enfocar posiciones específicas para determinar los residuos que pueden ser sustituidos para conservar, bloquear o modular la actividad biológica.

Alternativamente, el análisis de variantes naturales puede indicar que posiciones toleran mutaciones naturales. Esto puede resultar de análisis poblacional de variación entre individuos o razas o especies cruzadas. Las muestras de individuos seleccionados se analizan, por ejemplo, por análisis de PCR y secuenciación. Esto permite la evaluación de polimorfismos de población.

XII.- Escrutinio para agonistas y antagonistas

Los agonistas o antagonistas se escrutan para la capacidad para inducir o bloquear la actividad biológica. Los compuestos candidatos, por ejemplo, variantes de secuencia de quimioquina DGWCC natural se ensayan para determinar sus actividades biológicas. Alternativamente, los compuestos se escrutan, solos o en combinaciones para determinar los efectos sobre la actividad biológica.

XIII.- Aislamiento de un receptor para quimioquina

Una quimioquina DVic-1 o DGWCC puede ser utilizada como un reactivo de unión específico para identificar su socio de unión, tomando ventaja de su especificidad de unión, como se utilizaría un anticuerpo. Un reactivo de unión es marcado como se describe antes, por ejemplo, con fluorescencia o alternativamente, o es inmovilizado en un sustrato para los métodos de toma panorámica. El receptor de quimioquina común es un receptor con siete dominios transmembranales.

La composición de unión, por ejemplo, la quimioquina, se utiliza para escrutar una genoteca de expresión hecha a partir de una línea de célula que expresan un socio de unión, es decir, receptor. Las técnicas de tinción estándar se utilizan para detectar o clasificar el receptor expresado intracelular o superficial, o células transformadas que se expresan en superficies y se escrutan por toma panorámica. El escrutinio de la expresión intracelular se realiza por diferentes procedimientos de tinción o inmunofluorescencia. Véase, también McMahan, et al. (1991) EMBO J: 10:2821-2832.

Los protocolos de flujo de Ca^{++} estándar, véase, por ejemplo, Coligan, et al. (Eds.) (1992 y sus suplementos periódicos) Current Protocols in Immunolol. Greene/Wiley, New York, NY, pueden ser utilizados para identificar un receptor para DGWCC.

Por ejemplo, el día 0 se pre-revisten los portaobjetos permanox de 2 cámaras con 1 ml por cámara, con fibronectina, 10 ng/ml en PBS, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lava una vez con PBS. Después se cultivan en placas células COS a 2-3 x 10^{5} células por cámara en 1,5 ml de medio de crecimiento. Se incuba durante la noche a 37ºC.

El día 1 para cada muestra, se preparan 0,5 ml de una solución de 66 mg/ml DEAE-dextrano, cloroquina 66 mM y 4 mg de DNA en DME libre de suero. Para cada serie se prepara un control positivo, por ejemplo, cDNA de quimioquina DGWCC humana en una dilución 1 y 1/200, y una simulación negativa. Las células se lavan con DME libre de suero. Se añade la solución de DNA y se incuba 5 horas a 37ºC. Se eliminar el medio y se añaden 0,5 ml de DMSO al 10% en DME durante 2,5 minutos. Se elimina y lava una vez con DME. Se añaden 1,5 ml de medio de crecimiento y se incuba durante la noche.

En el día 2 se cambia el medio. Los días 3 ó 4 las células se fijan y se tiñen. Se lavan las células dos veces con solución salina amortiguada de Hank's (HBSS) y se fijan en paraformaldehído al 4% (PFA)/glucosa durante 5 minutos. Se lava 3 veces con HBSS. Los portaobjetos pueden ser almacenados a -80ºC después que todo el líquido sea eliminado. Para cada cámara se realizan incubaciones de 0,5 ml como sigue. Se añade HBSS/saponina (0,1%) con 32 ml/ml de NaN_{3} 1M durante 20 minutos. Las células se lavan luego con HBSS/saponina 1X. Se añade quimioquina o complejo quimioquina/anticuerpo a las células y se incuba durante 30 minutos. Se lavan las células dos veces con HBSS/saponina. Si es adecuado, añadir primero el anticuerpo durante 30 minutos. Se añade el segundo anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo Vector anti-ratón a 1/200 de dilución, y se incuba durante 30 minutos. Se preparar la solución de ELISA, por ejemplo solución de peroxidasa de rábano silvestre Vector Elite ABC, y se preincuba durante 30 minutos. Se utilizar, por ejemplo, una gota de solución A (avidina) y una gota de solución B (biotina) por 2,5 ml HBSS/saponina. Lavar las células dos veces con HBSS/saponina. Se añade solución ABC HRP y se incuba durante 30 minutos. Se lavan las células dos veces con HBSS, un segundo lavado durante 2 minutos, el cual cierra las células. Luego se añade ácido diaminobenzoico (DAB) Vector durante 5 a 10 minutos. Se utilizan dos gotas de tampón más 4 gotas de DAB más 2 gotas de H_{2}O_{2} por 5 ml de agua destilada en destilador de vidrio. Se retira cuidadosamente la cámara y se lava el portaobjeto en agua. Se seca al aire durante algunos minutos, después se añade una gota de Crystal Mount y un cubreobjetos. Se trata en horno durante 5 minutos a 85-90ºC.

Se evalúa la tinción positiva de los combinados y se subclonan progresivamente para aislar los genes individuales responsables de la unión.

Alternativamente, los reactivos de quimioquina se utilizan para purificar por afinidad o clasificar células que expresen un receptor. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. O Ausubel, et al.

Otra estrategia es escrutar un receptor unido a membrana por toma panorámica. El receptor cDNA se construye como ya se describió. El ligando puede ser inmovilizado y utilizado para inmovilizar células de expresión. La inmovilización puede llevarse a cabo durante el uso de anticuerpos adecuados que reconozcan, por ejemplo, una secuencia FLAG de una construcción de fusión de quimioquina, o mediante el uso de anticuerpos producidos contra los primeros anticuerpos. Los ciclos recursivos de selección y amplificación conducen al enriquecimiento de los clones adecuados y por último al aislamiento de clones que expresen el receptor.

Las genotecas de expresión de fagos pueden ser escrutadas por quimioquina. Las técnicas de marcado adecuadas, por ejemplo, anticuerpos anti-FLAG, permitirán el marcado específico de los clones adecuados.

XIV.- Localización inmunohistoquímica

El anticuerpo antes descrito se utiliza para identificar la expresión de DVic-1 o DGWCC en diversos tejidos. Los métodos para tinción inmunohistoquímica se describen, por ejemplo, en Sheehan, et al. (Eds.) (1987) Theory and Practice of Histotechnology, Battelle Press, Columbus, OH.

Las realizaciones específicas que se describen en la presente memoria se ofrecen a manera de ejemplo solamente, y la invención se limita solo por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el amplio alcance de los equivalentes a los cuales estas reivindicaciones confieren derecho.

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<110> Schering Corporation

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<120> Quimioquinas de mamíferos

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<130> DX0684K EP

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<140> 07949478.8

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<141> 26 noviembre 1997

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<150> US 08/761,071

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<151> 5 diciembre 1996

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<150> US 60/031,805

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<151> 27 noviembre 1996

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<160> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<170> PantentIn Ver. 2.1

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<210> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 731

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<212> DNA

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<213> homo sapiens

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<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (56)..(436)

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<221> aspectos misceláneos

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<222> (565)

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<223> nota; "los nucleótidos 565 y 281 designados N, pueden ser A o C"

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<220>

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<221> aspectos misceláneos

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<222> (712)

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<223> nota; "el nucleótido 712 designado N, pueden ser A , C, G p T"

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<400> 1

2

3

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<210> 2

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<211> 127

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

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\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

4

5

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<210> 3

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 496

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 3

6

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 4

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<211> 445

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

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<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

7

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 362

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<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(336)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Péptido de acoplamiento

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (73)..(336)

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 5

8

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 6

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<211> 112

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 6

9

10

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 7

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<211> 433

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<212> DNA

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<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (23)..(382)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Péptido de acoplamiento

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (98)..(382)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 7

11

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 8

12

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 9

13

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 10

14

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 543

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<221> DNA

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<222> (1)..(492)

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 11

15

16

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 12

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<211> 164

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<212> PRT

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<213> homo sapiens

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 12

17

18

Claims (7)

1. Un polipéptido DVic-1 sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidos madura que se representa en la SEQ ID NO: 2.

2. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 1.

3. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 1.

4. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 ó 2.

5. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. Una célula hospedante que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Un proceso para producir de forma recombinante un polipéptido, que consiste en cultivar la célula hospedante de la reivindicación 6 bajo condiciones en las cuales se expresa el polipéptido.