DE69728897T2

DE69728897T2 - Saeugetierchemokine

Info

Publication number: DE69728897T2
Application number: DE69728897T
Authority: DE
Inventors: Alain Vicari; Janine Morales; A. Joseph HEDRICK; Albert Zlotnik
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-26
Publication date: 2005-01-05
Anticipated expiration: 2017-11-27
Also published as: WO1998023750A3; WO1998023750A2; CA2274313A1; EP0944723A2; EP0944723B1; DE69728897D1; IL130164A0; AU724460B2; NZ335609A; AU7410698A; KR20000057278A; BR9713450A; CN1245533A; JP2000512855A; ES2216176T3; ATE265533T1; JP2004135675A

Description

Die vorliegende Hinterlegung beansprucht die Priorität der provisional U.S. patent application 60/031,805 (eingereicht am 27. November 1996) sowie die Priorität der regulären U.S. utility patent application 08/761,071 (eingereicht am 5. Dezember 1996) und die Priorität der von Morales et al. am 24. Oktober 1997 eingereichten Patentanmeldung.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung schlägt Zusammensetzungen vor, die Proteine betreffen, die eine Funktion bei der Kontrolle der Entwicklung, Differenzierung, beim Stofftransport sowie bei der Physiologie von Säugetierzellen (z. B. Zellen eines Säugetier-Immunsystems) ausüben. Sie stellt insbesondere Proteine bereit, die die Entwicklung, Differenzierung und Funktion verschiedener Zelltypen, einschließlich hämatopoetischer Zellen, regulieren oder belegen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der zirkulierende Bestandteil des Kreislaufsystems eines Säugetiers umfasst verschiedene Zelltypen, einschließlich roter und weißer Blutzellen erythroider und myeloider Abstammung. Vgl. beispielsweise Rapaport (1987) Introduction to Hematology (2. Auflage) Lippincott, Philadelphia, PA; Jandl (1987) Blood: Textbook of Hematology, Little, Brown and Co., Boston, MA; sowie Paul (Hrsg.) (1993) Fundamental Immunology (3. Auflage) Raven Press, N.Y.
Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass die Immunantwort des Säugetiers auf einer Reihe von komplexen, zellulären Interaktionen beruht, die als Immun-Netzwerk („immune network") bezeichnet werden. Neueste Forschungen führten zu neuen Einsichten in die inneren Prozesse dieses Netzwerks. Während unzweifelhaft bleibt, dass ein großer Teil der Antwort tatsächlich die Netzwerk-ähnlichen Interaktionen von Lymphozyten, Makrophagen, Granulozyten und anderen Zellen betrifft, sind Immunologen nunmehr im Allgemeinen der Ansicht, dass lösliche, als Lymphokine, Cytokine oder Monokine bekannte Proteine eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle dieser zellulären Interaktionen spielen. Es besteht daher ein erhebliches Interesse an der Isolierung, Charakterisierung und an den Wirkmechanismen von Zell-modulierenden Faktoren, deren Verständnis zu einem signifikanten Fortschritt bei der Diagnose und Therapie von zahlreichen medizinischen Abnormalitäten (z. B. Erkrankungen des Immunsystem und anderen Erkrankungen) führen sollte.
Lymphokine vermitteln zelluläre Aktivitäten offenbar über eine Vielzahl von Wegen. Es konnte gezeigt werden, dass sie die Proliferation, das Wachstum und die Differenzierung der pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen in eine große Anzahl von Vorläuferzellen unterstützen, welche verschiedene zelluläre Abstammungen umfassen und ein komplexes Immunsystem bilden. Diese Interaktionen zwischen den zellulären Bestandteilen sind für eine gesunde Immunantwort notwendig. Diese verschiedenen zellulären Abstammungen antworten oftmals in verschiedener Weise, wenn Lymphokine in Verbindung mit anderen Mitteln verabreicht werden.
Die Chemokine sind eine große und diverse Superfamilie von Proteinen. Die Superfamilie ist in zwei klassische Zweige unterteilt; dies richtet sich danach, ob die ersten beiden Cysteine in dem Chemokin-Motiv nebeneinander angeordnet sind (als der „C-C"-Zweig bezeichnet) oder durch einen dazwischen liegenden Rest voneinander getrennt sind („C-X-C"). Einem erst kürzlich identifizierten Zweig von Chemokinen fehlen die zwei Cysteine in dem entsprechenden Motiv; dieser Zweig wird durch die als Lymphotaktine bekannten Chemokine repräsentiert. Ein weiterer kürzlich identifizierter Zweig weist drei zwischen den beiden Cysteinen angeordnete Reste auf, z. B. CX3C-Chemokine. Vgl. beispielsweise Schall und Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6: 865–873; sowie Bacon und Schall (1996) Int. Arch. Allergy & Immunol. 109: 97–109.
Es wurden zahlreiche Faktoren identifiziert, die den Differenzierungsprozess von Vorläuferzellen beeinflussen oder die Physiologie- oder Wanderungseigenschaften von spezifischen Zelltypen regulieren. Diese Beobachtungen verweisen darauf, dass weitere Faktoren existieren, deren Funktionen im Zusammenhang mit der Immunität bislang nicht erkannt worden sind. Diese Faktoren stellen biologische Aktivitäten bereit, deren Wirkungsspektren sich von bekannten Differenzierungs- oder Aktivierungsfaktoren unterscheiden könnten. Die mangelnde Kenntnis hinsichtlich der strukturellen, biologischen und physiologischen Eigenschaften der Regulierungsfaktoren, die die Zellphysiologie in vivo regulieren, verhindert das Modulieren der Wirkungen solcher Faktoren. Daher bleiben medizinische Zustände, die eine Regulation der Entwicklung oder Physiologie der relevanten Zellen erfordern, nicht behandelbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung offenbart die Existenz eines zuvor unbekannten Chemokin-Motivs und umfasst Moleküle, die vorliegend als DNAX Vic-1 (DVic-1) bezeichnet werden. Ausgehend von der Sequenzanalyse der hier beschriebenen Chemokin-Proteinsequenzen ist es offensichtlich, dass DVic-1 zur CC-Chemokinfamilie gehört.
Demnach stellt die vorliegende Erfindung gemäß eines ersten Aspektes ein im wesentlichen reines DVic-1-Polypeptid bereit, das die reife Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 2 dargestellten Polypeptids umfasst. Gemäß bevorzugter Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Fusionsprotein bereit, das dieses Polypeptid umfasst. Das Polypeptid kann glykosyliert sein; es kann ein synthetisches Polypeptid sein; es kann an ein festes Substrat gebunden sein; es kann an einen anderen chemischen Rest konjugiert sein. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können als Zusammensetzung formuliert sein, umfassend: ein steriles DVic-1-Protein oder -Peptid; das DVic-1-Protein oder -Peptid und einen Träger, wobei der Träger: eine wässrige Verbindung, einschließlich Wasser, Saline und/oder Puffer ist; und/oder formuliert ist für die orale, rektale, nasale, topische oder parenterale Verabreichung.
Weitere Polypeptid-Formen schließen ein Fusionsprotein ein, umfassend: die reife Proteinsequenz von SEQ ID NO: 2, ein Detektions- oder Reinigungs-Tag, einschließlich eine FLAG-, His6- oder Ig-Sequenz; oder eine Sequenz eines weiteren Chemokin-Proteins. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in Kits verwenden werden, die ein solches Protein oder Polypeptid umfassen, sowie: ein Fach, welches das DVic-1-Protein oder -Polypeptid umfasst; ein Fach, welches das DVic-1-Protein oder -Polypeptid umfasst; oder Instruktionen zur Verwendung oder Entsorgung von Reagenzien des Kits.
Bindungs-Verbindungen und -Zusammensetzungen werden bereitgestellt, die beispielsweise einen Antigen-bindenden Anteil eines Antikörpers umfassen, der spezifisch an das erfindungsgemäße DVic-1-Protein bindet. Die Bindungs-Verbindung kann ein Fv-, Fab- oder Fab2-Fragment sein; die Bindungs-Verbindung kann an einen weiteren chemischen Rest konjugiert sein; oder der Antikörper wird gegen eine Peptidsequenz eines reifen Polypeptids erzeugt, das SEQ ID NO: 2 umfasst; er wird gegen ein reifes DVic-1 erzeugt; er wird gegen ein gereinigtes DVic-1 erzeugt; er wird immunselektiert; er ist ein polyklonaler Antikörper; er bindet an ein denaturiertes DVic-1; er weist einen Kd-Wert von mindestens 30 mM gegenüber dem Antigen auf; er ist an ein festes Substrat gebunden, einschließlich einem Kügelchen oder einer Kunststoffmembran; er liegt in einer sterilen Zusammensetzung vor; oder er ist detektierbar markiert, einschließlich mittels einer radioaktiven oder fluoreszenten Markierung.
Kits mit Bindungs-Zusammensetzungen umfassen diejenigen mit einer solchen Bindungs-Verbindung, und: einem Fach, das die Bindungs-Verbindung umfasst; und/oder Instruktionen zur Verwendung oder Entsorgung von Reagenzien des Kits. Üblicherweise ist das Kit in der Lage, die Durchführung einer qualitativen oder quantitativen Analyse zu ermöglichen. Verschiedene weitere Zusammensetzungen werden beschrieben; beispielsweise umfassen sie: eine solche sterile Bindungs-Verbindung, oder eine solche Bindungs-Verbindung und einen Träger, wobei der Träger: eine wässrige Verbindung, einschließlich Wasser, Saline, und/oder Puffer ist; und/oder für die orale, rektale, nasale, topische oder parenterale Verabreichung formuliert ist.
Es werden Nukleinsäuren bereitgestellt, einschließlich einer isolierten oder rekombinanten Nukleinsäure, die für ein Protein gemäß des vorliegend besprochenen, ersten Aspektes oder für ein Fusionsprotein (wie beschrieben) kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann ein Expressionsvektor sein; sie kann ferner einen Replikationsursprung umfassen; sie kann natürlicher Herkunft sein; sie kann eine detektierbare Markierung umfassen; sie kann eine synthetische Nukleotidsequenz umfassen; sie kann kleiner als 6 kb, vorzugsweise kleiner als 3 kb sein; sie kann von einem Primaten, einschließlich einem Menschen stammen; sie kann eine natürliche kodierende Sequenz vollständiger Länge umfassen; sie kann als Hybridisierungssonde für ein Gen verwendet werden, welches für das DVic-1-Protein kodiert; sie kann als PCR Primer verwendet werden; sie kann ein PCR Produkt oder ein Mutagenese-Primer sein.
Ferner wird eine Zelle oder ein Gewebe bereitgestellt, welches) eine solche Nukleinsäure umfasst, einschließlich der Tatsache, dass die Zelle eine prokaryontische Zelle; eine eukaryontische Zelle; eine bakterielle Zelle, eine Hefe-Zelle, eine Insekten-Zelle; eine Säugetier-Zelle; eine Maus-Zelle; eine Primaten-Zelle oder eine humane Zelle ist. Die Nukleinsäuren können in Kits verwendet werden, die z. B. die Nukleinsäure und ein Fach, das die Nukleinsäure enthält; ein Fach, das darüber hinaus ein DVic-1-Protein oder Polypeptid enthält; und/oder Instruktionen zur Verwendung oder Entsorgung von Reagenzien des Kits umfassen. Üblicherweise ist das Kit in der Lage, die Durchführung einer qualitativen oder quantitativen Analyse zu ermöglichen.
Solche Nukleinsäuren umfassen diejenigen, die: unter Wasch-Bedingungen von: 30°C und weniger als 2 M Salz, 45°C und/oder 500 mM Salz oder 55°C und/oder 150 mM Salz mit SEQ ID NO: 1 hybridisieren; die mindestens etwa 85% Identität über einen Abschnitt von mindestens etwa 30 Nukleotiden zu einem DVic-1 aufweisen, mindestens 90% zu einem DVic-1 aufweisen und/oder wobei der Abschnitt mindestens 55 Nukleotide lang ist, oder mindestens 95% zu einem DVic-1 aufweisen und/oder wobei der Abschnitt mindestens 75 Nukleotide lang ist.
Zusätzlich wird ein Verfahren zur Modulierung der Physiologie oder Entwicklung einer Zelle oder einer Gewebekulturzelle bereitgestellt, welches das in Kontakt bringen der Zelle mit einem Agonisten oder Antagonisten eines DVic-1 umfasst. Ferner wird vorliegend ein Verfahren zum Detektieren einer spezifischen Bindung an eine Verbindung offenbart, umfassend: in Kontakt bringen der Verbindung mit einer Zusammensetzung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einer Antigen-Bindungsstelle, die spezifisch an ein DVic-1-Chemokin bindet; einem Expressionsvektor, der für ein DVic-1-Chemokin oder ein Fragment desselben kodiert; einem im Wesentlichen reinen Protein, das spezifisch durch die beschriebene Antigen-Bindungsstelle erkannt wird; einem im Wesentlichen reinen DVic-1-Chemokin oder einem Peptid desselben oder einem Fusionsprotein, das einen Sequenzteil von 30 Aminosäuren der DVic-1-Chemokin-Sequenz umfasst.
Es ist offensichtlich, dass in der nachfolgenden, detaillierten Beschreibung und in den Beispielen DGWCC nur zum Zwecke der Veranschaulichung erwähnt wird, und dass analoge Verfahren und Methoden im Zusammenhang mit der beanspruchten Erfindung verwendet werden können.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung stellt Primaten-DNA-Sequenzen bereit, die für Proteine kodieren, welche strukturelle Eigenschaften oder Motive aufweisen, die charakteristisch für ein Cytokin oder Chemokin sind. Um einen Überblick über die Chemokin-Familie zu erhalten, vgl. z. B. Lodi et al. (1994) Science 263: 1762–1767; Gronenborn und Clore (1991) Protein Engineering 4: 263–269; Miller und Kranger (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 2950–2954; Matsushima und Oppenheim (1989) Cytokine 1: 2–13; Stoeckle und Baker (1990) New Biol. 2: 313–323; Oppenheim et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 617–648; Schall (1991) Cytokine 3: 165–183 und The Cytokine Handbook, Academic Press, NY.
Die vorliegend beschriebenen, neuen Cytokine werden DNAX Vic-1 (DVic-1) und DNAX Groin Wound expressed CC chemokine (DGWCC) genannt.
SEQ ID NO: 3 und 4 stellen zwei EST's dar, die jeweils von der HHFFQ25R humanen fötalen Herz-Bibliothek bzw. der HOEDH11R humanen Osteoblasten-Bibliothek erhalten wurden. Diese zeigen hohe Homologie und sind wahrscheinlich EST's von einem ähnlichen Transkript. Die Chemokin-Motive dieser zwei EST's wurden verglichen, und es wurde eine Consensus-Sequenz erhalten; anschließend wurde bestätigt, dass diese für humanes DVic-1 (SEQ ID NO: 1) kodiert. Eine Signal- Sequenz ist zwischen Ala und Ile angedeutet, obwohl dies in verschiedenen Zelllinien variieren kann. Ferner wird ein alternatives, längeres Transkript für Maus-DGWCC offenbart, das eine N-terminale Extension aufweist, die keine charakteristischen Chemokin-Motive zeigt (SEQ ID NO: 11 und 12).
Die Polypeptid- und Nukleinsäuresequenzen von humanem DGWCC werden als SEQ ID NO: 5 und 6 offenbart. Die kodierende Sequenz der humanen DGWCC-Chemokin-Nukleinsäuresequenz beginnt etwa bei Nukleotid 1 von SEQ ID NO: 5 und endet etwa bei Nukleotid 336. Das charakteristische CC-Motiv kann bei den Aminosäureresten 9–10 der SEQ ID NO: 6 gefunden werden. Eine Signalsequenz ist angedeutet; basierend auf verwandten Genen kann jedoch in verschiedenen Zelltypen eine geringfügig andere Prozessierung stattfinden. Die Nukleinsäuresequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz von Maus-DGWCC-Chemokin (früher als mDVic-1 bezeichnet; vgl. USSN 08/761,071) werden als SEQ ID NO: 7 und 8 offenbart. Ein PolyA-Signal reicht von den Nukleotiden 384–389 und enthält einen Teil des Stop-Codons. SignalP sagt eine Spaltung zwischen Ala(–1) und Leu1 voraus; die tatsächliche Spaltung kann um einen Rest o. ä. zu einer der beiden Seiten verschoben sein.
Die nachfolgenden Beschreibungen beziehen sich beispielhaft auf Ausführungsformen beim Primaten (z. B. beim Menschen), sind jedoch in ähnlicher Weise auf verwandte Ausführungsformen anwendbar, wenn es sich z. B. um natürliche Bezugsquellen aus Säugetieren, einschließlich Nagetieren handelt. Diese Bezugsquellen sollte verschiedene Vertebraten umfassen, üblicherweise warmblütige Tiere, z. B. Vögel und Säugetiere, insbesondere Haustiere, Nagetiere und Primaten. Ein Vergleich mit anderen Chemokinen wird in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Vergleich von Proteinsequenzen. Humanes MCP-1 (SEQ ID NO: 9), das GenBank-Hinterlegungsnummer S71513 entspricht; humanes MIP-3a (SEQ ID NO: 10), das GenBank-Hinterlegungsnummer 077035 entspricht; mit humanem DVic-1 (SEQ ID NO: 2). Eine ähnliche Gegenüberstellung von Nukleinsäuresequenzen wird auf identische und unterschiedliche Regionen verweisen.
Die erfindungsgemäßen Chemokin-Proteine werden teilweise durch ihre physikochemischen und biologischen Eigenschaften definiert. Die biologischen Eigenschaften der vorliegend beschriebenen Chemokine, z. B. DVic-1 oder DGWCC, werden teilweise durch ihre Aminosäuresequenz sowie durch ihre Größe im reifen Zustand definiert. Sie sollten ferner zumindest einige biologische Eigenschaften mit anderen ähnlichen Chemokinen gemeinsam haben. Der Fachmann wird problemlos erkennen, dass einige Sequenzabweichungen tolerierbar sind, z. B. konservative Substitutionen oder Positionen, die von den für die Rezeptor-Interaktion oder für wichtige Tertiärstruktur-Eigenschaften entscheidenden Resten entfernt sind, wobei die biologische Aktivität des Moleküls nicht in signifikanter Weise verändert wird. Umgekehrt können nicht-konservative Substitutionen angepasst werden, um ausgewählte Funktionen zu entfernen.
Diese Chemokine sind in spezifischen Gewebetypen vorhanden (z. B. Hautgewebe), und die Interaktion des Proteins mit einem Rezeptor wird für das Vermitteln verschiedener Aspekte der zellulären Physiologie und Entwicklung wichtig sein. Die zellulären Typen, die ein Botenmolekül exprimieren, das für DVic-1 oder DGWCC kodiert, lassen darauf schließen, dass für die Zelldifferenzierung und Zellentwicklung wichtige Signale von ihnen vermittelt werden. Vgl. beispielsweise Gilbert (1991) Developmental Biology (3. Auflage) Sinauer Associates, Sunderland, MA; Browder et al. (1991) Developmental Biology (3. Auflage) Saunders, Philadelphia, PA; Russo et al. (1992) Development: The Molecular Genetic Approach Springer-Verlag, New York, N.Y.; und Wilkins (1993) Genetic Analysis of Animal Development (2. Auflage) Wiley-Liss, New York, N.Y. Darüber hinaus sollten die Expression von oder das Ansprechen auf DVic-1 oder DGWCC als Marker dienen, z. B. um bestimmte Subpopulationen von Zellen zu definieren.
Die neuen Chemokine wurden durch Durchsuchen und sorgfältige Analyse von Datenbank-Sequenzen entdeckt. Das Fehlen von Sequenzen in verfügbaren Datenbanken verweist stark darauf, dass die Botenmoleküle selten und/oder in geringen Mengen exprimiert werden. Dies könnte auf eine stark eingeschränkte Zellexpression und/oder sehr geringe Mengen in den meisten Zelltypen verweisen.
Eine Northern-Blot-Analyse kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, vgl. beispielsweise Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bd. 1–3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; und Ausubel, et al. (1987 und Ergänzungsbände) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY.
II. Definitionen
Der Begriff „Bindungs-Zusammensetzung" bezieht sich auf Moleküle, die mit Spezifität und Selektivität an das DVic-1-Chemokin binden, z. B. durch eine Antikörper-Antigen-Interaktion. Andere Verbindungen (z. B. Rezeptorproteine) können jedoch ebenfalls spezifisch und/oder selektiv mit DVic-1-Chemokinen assoziieren, wobei andere Moleküle ausgeschlossen werden. Üblicherweise wird die Assoziierung durch eine natürliche, physiologisch relevante Protein-Protein-Interaktion erfolgen, die entweder kovalent oder nicht-kovalent sein kann, und Mitglieder eines Multiprotein-Komplexes umfassen kann, einschließlich Trägerverbindungen oder Dimerisierungspartner. Das Molekül kann ein Polymer oder ein chemisches Reagenz sein. Es wird keine Feststellung darüber getroffen, ob ein DVic-1-Chemokin unbedingt ein konvex geformtes Molekül sein muß (z. B. der Ligand oder der Rezeptor einer Ligand-Rezeptor-Interaktion), wohl aber eine Feststellung darüber, ob die Interaktion eine ähnliche Spezifität (z. B. spezifische Affinität) aufweist. Ein funktionelles Analog kann ein Ligand mit strukturellen Modifikationen sein, oder ein vollständig unverwandtes Molekül, z. B. ein Molekül, das eine Molekülform aufweist, die mit den entsprechenden Liganden-Bindungs-Determinanten interagiert. Die Liganden können als Agonisten oder Antagonisten des Rezeptors fungieren, vgl. beispielsweise Goodman, et al. (Hrsg.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. Auflage) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y.
Der Begriff „Bindungsmittel:Chemokin-Protein-Komplex" bezieht sich wie vorliegend verwendet auf einen Komplex eines Bindungsmittels und eines Chemokin (z. B. eines DVic-1)-Proteins, das durch spezifische Bindung eines Bindungsmittels an das Chemokin-Protein gebildet wird. Spezifische oder selektive Bindung des Bindungsmittels bedeutet, daß das Bindungsmittel eine spezifische Bindungsstelle aufweist (z. B. eine Antigen-Bindungsstelle), die eine Stelle auf dem DVic-1-Chemokin-Protein erkennt, die nicht in vielen anderen Proteinen vorkommt. Antikörper, die gegen ein DVic-1-Chemokin-Protein erzeugt wurden und ein Epitop auf dem Chemokin-Protein erkennen, sind beispielsweise in der Lage, einen Bindungsmittel:DVic-1-Chemokin-Protein-Komplex durch spezifische und selektive Bindung zu bilden. Üblicherweise erlaubt die Bildung eines Bindungsmittel:DVic-1-Chemokin-Protein-Komplexes die Messung von DVic-1-Chemokin-Protein in einer Mischung von anderen Proteinen und biologischen Substanzen. In ähnlicher Weise bezeichnet der Begriff „Antikörper:DGWCC-Chemokin-Protein-Komplex" eine Ausführungsform, bei der das Bindungsmittel beispielsweise der Antigen-bindende Anteil eines Antikörpers ist. Der Antikörper kann monoklonal, polyklonal oder ein bindendes Fragment eines Antikörpers (z. B. ein Fab- oder F(ab)2-Fragment) sein. Der Antikörper wird vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper zum Zwecke der Untersuchung der Kreuz-Reaktivität sein.
„Homologe" Nukleinsäuresequenzen weisen (wenn sie verglichen werden) signifikante Ähnlichkeit oder Identität auf. Die Homologie-Standards bei Nukleinsäuren sind entweder die im Stand der Technik üblichen Messungen der Homologie durch Sequenzvergleich und/oder phylogenetische Verwandtschaft, oder sie basieren auf Hybridisierungsbedingungen. Hybridisierungsbedingungen werden nachfolgend ausführlich beschrieben.
Eine „isolierte" Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure (z. B. eine RNA, DNA oder ein gemischtes Polymer), die im wesentlichen von anderen biologischen Bestandteilen getrennt ist, die natürlicherweise eine native Sequenz begleiten, z. B. Proteine und flankierende genomische Sequenzen der ursprünglichen Spezies. Der Begriff umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die aus ihrer natürlich vorliegenden Umgebung entfernt worden ist, und schließt rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte oder durch heterologe Systeme biologisch synthetisierte Analogy ein. Ein im Wesentlichen reines Molekül umfasst isolierte Formen des Moleküls. Eine isolierte Nukleinsäure wird üblicherweise homogene Nukleinsäuremoleküle enthalten; sie wird jedoch in einigen Ausführungsformen Nukleinsäure mit geringfügiger Sequenzheterogenität enthalten. Diese Heterogenität wird üblicherweise an den Polymerenden oder in Abschnitten gefunden, die für die gewünschte biologische Funktion oder Aktivität nicht entscheidend sind.
Der Begriff „DVic-1-Chemokin-Protein" soll vorliegend (sofern im Zusammenhang mit einem Protein verwendet) ein Protein einschliessen, das Aminosäuresequenzen (insbesondere aus den Teilen des Chemokin-Motivs) aufweist, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt sind, oder ein signifikantes Fragment, das einzigartig und/oder charakteristisch für ein solches Protein ist, vorzugsweise eine natürliche Ausführungsform. Die Erfindung beschreibt ferner ein Polypeptid, das eine Struktur aufweist, die der Struktur dieser Chemokine ähnelt, und das z. B. mit den DVic-1-Chemokin-spezifischen Bindungskomponenten interagiert. Diese Bindungskomponenten (z. B. Antikörper) binden üblicherweise mit hoher Affinität entweder an das DVic-1- oder das DGWCC-Chemokin, z. B. mindestens etwa 100 nM, üblicherweise besser als etwa 30 nM, vorzugsweise besser als etwa 10 nM und besonders bevorzugt besser als etwa 3 nM.
Eine „rekombinante" Nukleinsäure ist entweder durch die Methode ihrer Herstellung oder durch ihre Struktur definiert. In Bezug auf die Methode ihrer Herstellung (z. B. ein Produkt, das durch ein Verfahren hergestellt wird) nutzt das Verfahren rekombinante Nukleinsäure-Methoden, z. B. das menschliche Eingreifen in die Nukleotidsequenz, üblicherweise durch Selektion oder Herstellung. Daneben kann es sich um eine Nukleinsäure handeln, die durch Erzeugung einer Sequenz hergestellt wird, die die Fusion von zwei Fragmente umfasst, die natürlicherweise nicht miteinander verbunden sind; natürliche Produkte, z. B. natürlich vorkommende Mutanten, sollen jedoch nicht mit umfasst sein. Somit werden beispielsweise Produkte erfasst, die durch Transformieren von Zellen mit irgendeinem nicht natürlich vorkommenden Vektor hergestellt worden sind, wie auch Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, welche unter Anwendung irgendeines synthetischen Oligonukleotid-Verfahrens abgeleitet worden ist. Dies wird oft durchgeführt, um ein Codon durch ein redundantes Codon zu ersetzen, das für dieselbe oder eine konservative Aminosäure kodiert, wobei üblicherweise eine Sequenz-Erkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Außerdem wird es durchgeführt, um Nukleinsäure-Segmente mit erwünschten Funktionen zusammenzufügen, um eine einzelne genetische Einheit zu erzeugen, die eine erwünschte Kombination von Funktionen umfasst, welche in den herkömmlich verfügbaren, natürlichen Formen nicht gefunden werden kann. Oft sind Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme das Ziel solcher künstlichen Manipulationen; jedoch können auch andere ortsspezifische Ziele (z. B. Promotoren, DNA-Replikationsstellen, Regulationssequenzen, Kontrollsequenzen oder andere nützliche Eigenschaften) durch Konstruktion eingebracht werden. Ähnliches wird für rekombinante Polypeptide (z. B. Fusions-Polypeptide) beabsichtigt. Insbesondere sind synthetische Nukleinsäuren umfasst, die (durch die Redundanz des genetischen Codes) Polypeptide kodieren, die Fragmenten dieser Antigene ähneln, sowie Fusionen von Sequenzen von zahlreichen verschiedenen Spezies-Varianten.
Die „Löslichkeit" zeigt sich anhand der Sedimentation, die in Svedberg-Einheiten gemessen wird und ein Maß für die Sedimentations-Geschwindigkeit eines Moleküls unter den bestimmten Bedingungen ist. Die Bestimmung der Sedimentations-Geschwindigkeit wurde gewöhnlich in einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt; sie wird jedoch nunmehr üblicherweise in einer Standard-Ultrazentrifuge durchgeführt. Vgl. Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2. Auflage) W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA; und Cantor und Schimmel (1980) Biophysical Chemistry Teile 1–3, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Um eine grobe Bestimmung durchzuführen, wird eine Probe, die ein vermeintlich lösliches Polypeptid enthält, in einer Standard-Ultrazentrifuge vollständiger Größe bei etwa 50K rpm für etwa 10 Minuten zentrifugiert, wobei die löslichen Moleküle im Überstand verbleiben. Ein lösliches Partikel oder Polypeptid wird typischerweise weniger als 30S entsprechen, noch typischer weniger als etwa 15S, üblicherweise weniger als etwa 10S, noch üblicher weniger als etwa 6S, und gemäß besonderer Ausführungsformen vorzugsweise weniger als etwa 4S und insbesondere bevorzugt weniger als etwa 3S. Die Löslichkeit eines Polypeptids oder Fragments hängt von der Umgebung sowie von dem Polypeptid ab. Zahlreiche Parameter, einschließlich Temperatur, Elektrolyte der Umgebung, Größe und molekulare Eigenschaften des Polypeptids sowie die Natur des Lösungsmittels beeinflussen die Löslichkeit des Polypeptids. Üblicherweise reicht die Temperatur, bei der das Polypeptid verwendet wird, von etwa 4°C bis etwa 65°C. Üblicherweise liegt die Temperatur bei der Benutzung höher als etwa 18°C, wobei höher als etwa 22°C noch üblicher ist. Für diagnostische Zwecke wird die Temperatur üblicherweise etwa der Raumtemperatur oder einer wärmeren Temperatur entsprechen, jedoch niedriger liegen als die Denaturierungs-Temperatur der Assay-Komponenten. Für therapeutische Zwecke wird die Temperatur üblicherweise der Körpertemperatur entsprechen, üblicherweise etwa 37°C für Menschen, obgleich die Temperatur in bestimmten Situationen in situ oder in vitro erhöht oder erniedrigt werden kann.
Die Größe und die Struktur des Polypeptids sollten üblicherweise im weitgehend stabilen Zustand vorliegen, und nicht in einem denaturierten Zustand. Das Polypeptid kann mit anderen Polypeptiden in einer Quartärstruktur assoziiert sein (z. B. um Löslichkeit zu verleihen), oder es kann mit Lipiden oder Detergenzien in einer Weise assoziiert sein, die an die natürlichen Interaktionen des Lipid-Bilayer heranreicht.
Das Lösungsmittel wird üblicherweise ein biologisch kompatibler Puffer von der Art sein, wie er für die Erhaltung von biologischen Aktivitäten verwendet wird. Der Puffer wird üblicherweise einem physiologischen Lösungsmittel ähneln. Das Lösungsmittel wird üblicherweise einen neutralen pH-Wert aufweisen, üblicherweise etwa zwischen 5 und 10 und vorzugsweise etwa 7,5. In manchen Fällen wird ein Detergenz zugegeben sein, üblicherweise ein mildes, nicht-denaturierendes Detergenz (z. B. CHS (Cholesteryl-Hemisuccinat) oder CHAPS (3-[3-Cholamidopropyl-Dimethylammonio]-1-Propansulfonat)), oder eine Konzentration, die gering genug ist, um eine signifikante Zerstörung der strukturellen oder physiologischen Eigenschaften des Proteins zu verhindern.
Im Zusammenhang mit einem Protein bedeutet „im Wesentlichen rein" üblicherweise, dass das Protein von anderen kontaminierenden Proteinen, Nukleinsäuren und anderen biologischen Substanzen, die von dem ursprünglichen als Bezugsquelle dienenden Organismus stammen, isoliert wird. Die Reinheit oder „Isolierung" kann mittels Standardverfahren überprüft werden und wird üblicherweise mindestens etwa zu 50% rein sein, noch üblicher mindestens etwa zu 60% rein, typischerweise mindestens etwa zu 70% rein, noch typischer mindestens etwa zu 80% rein, oftmals mindestens etwa zu 85% rein, öfter mindestens etwa zu 90% rein, vorzugsweise mindestens etwa zu 95% rein, noch bevorzugter mindestens etwa zu 98% rein, und gemäß den am meisten bevorzugten Ausführungsformen mindestens zu 99% rein. Ähnliches gilt beispielsweise für Antikörper oder Nukleinsäuren.
Im Zusammenhang mit einem Nukleinsäuresequenz-Vergleich bedeutet „wesentliche Ähnlichkeit", dass entweder die Segmente oder deren komplementäre Stränge bei einem Vergleich mit optimaler Gegenüberstellung und geeigneten Nukleotid-Insertionen oder -deletionen in mindestens etwa 50% der Nukleotide, üblicherweise in mindestens 56%, noch üblicher in mindestens 59%, gebräuchlicherweise in mindestens 62%, noch gebräuchlicher in mindestens 65%, oftmals in mindestens 68%, noch öfter in mindestens 71%, typischerweise in mindestens 74%, noch typischer in mindestens 77%, häufig mindestens 80%, noch häufiger in mindestens 85%, vorzugsweise in mindestens etwa 90%, mehr bevorzugt in mindestens etwa 95–98% oder mehr, und gemäß bestimmter Ausführungsformen in bis zu 99% oder mehr der Nukleotide übereinstimmen. Daneben besteht eine wesentliche Ähnlichkeit, wenn die Segmente unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an einen Strang oder sein Komplement hybridisieren, wobei üblicherweise eine Sequenz verwendet wird, die von SEQ ID NO: 1, 5 oder 7 abgeleitet ist. Üblicherweise erfolgt eine selektive Hybridisierung, wenn mindestens etwa 55% Ähnlichkeit über einen Abschnitt von mindestens 30 Nukleotiden vorliegt, vorzugsweise mindestens etwa 65% über einen Abschnitt von mindestens etwa 25 Nukleotiden, mehr bevorzugt mindestens etwa 75% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% über 20 Nukleotide. Vgl. Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203–213. Die Länge des Ähnlichkeitsvergleichs kann (wie beschrieben) über längere Abschnitte erfolgen und kann in bestimmten Ausführungsformen über einen Abschnitt von mindestens etwa 17 Nukleotiden, üblicherweise von mindestens etwa 20 Nukleotiden, noch üblicher von mindestens etwa 24 Nukleotiden, typischerweise von mindestens etwa 28 Nukleotiden, noch typischer von mindestens etwa 40 Nukleotiden, vorzugsweise von mindestens etwa 50 Nukleotiden und mehr bevorzugt von mindestens etwa 75 bis 100 oder mehr Nukleotiden (z. B. 150, 200 usw.) erfolgen.
„Stringente Bedingungen" in Bezug auf Homologie oder wesentliche Ähnlichkeit bedeutet im Zusammenhang mit der Hybridisierung stringente, kombinierte Bedingungen von Salz, Temperatur, organischen Lösungsmitteln und anderen Parametern, die üblicherweise bei Hybridisierungsreaktionen kontrolliert werden. Die Kombination der Parameter ist wichtiger als die Messung jedes einzelnen Parameters. Vgl. beispielsweise Wetmur und Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349–370. Eine Nukleinsäuresonde, die unter stringenten Bedingungen an eine Ziel-Nukleinsäure bindet, ist für diese Ziel-Nukleinsäure spezifisch. Eine solche Sonde ist üblicherweise mehr als 11 Nukleotide lang, und ist in dem Bereich, der durch die Sequenz der Sonde dazu bestimmt ist, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen das Ziel zu binden, ausreichend identisch oder komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure.
DGWCC-Chemokine von anderen Säugetier-Spezies können mittels Kreuz-Spezies-Hybridisierung von nah verwandten Spezies kloniert und isoliert werden. Vgl. z. B. nachstehend. Da die Ähnlichkeit zwischen entfernt verwandten Spezies relativ gering sein kann, ist die Hybridisierung von relativ nah verwandten Spezies ratsam.
Daneben kann die Herstellung einer Antikörper-Präparation, die geringere Spezies-Spezifität aufweist, bei Expressions-Klonierungs-Ansätzen ratsam sein.
Der Ausdruck „bindet spezifisch an einen Antikörper" oder „ist spezifisch immunoreaktiv mit" bezieht sich bei einem Protein oder Peptid auf eine Bindungs-Reaktion, die für das Vorhandensein des Proteins in Gegenwart einer hetereogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Komponenten bestimmend ist. Unter bekannten Bedingungen eines Immunoassay binden daher die spezifizierten Antikörper an ein bestimmtes Protein, und binden nicht im signifikanten Maße an andere Proteine, die in der Probe vorhanden sind. Die spezifische Bindung an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der im Hinblick auf seine Spezifität für ein bestimmtes Protein selektiert wird. Beispielsweise können Antikörper, die gegen das DVic-1-Chemokin-Protein-Immunogen mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz erzeugt wurden, selektiert werden, um Antikörper zu erhalten, die in spezifischer Weise mit den erfindungsgemäßen Chemokin-Proteinen und nicht mit anderen Proteinen immunoreaktiv sind. Die Antikörper können Spezies-spezifisch sein, z. B. also auch polymorphische Varianten sowie Splicing- oder Entwicklungsvarianten erkennen.
III. Nukleinsäuren
Das DGWCC-Chemokin steht beispielhaft für strukturell und funktionell verwandte Proteine. Diese löslichen Chemokin-Proteine dienen dazu, Signale zwischen verschiedenen Zelltypen zu übertragen. Die bevorzugten Ausführungsformen (wie offenbart) werden nützlich bei Standardverfahren zur Isolierung von Genen aus unterschiedlichen Individuen oder anderen Spezies sein, z. B. aus Warmblütern, wie beispielsweise Vögeln oder Säugetieren. Die Kreuz-Hybridisierung wird die Isolierung von verwandten Genen erlauben, die für Proteine von Individuen, Stämmen oder Spezies kodieren. Ausgehend von den vorliegend bereitgestellten Informationen ist eine Vielzahl von verschiedenen Ansätzen verfügbar, um einen geeigneten Nukleinsäure-Klon erfolgreich zu isolieren. Untersuchungen mittels Southern-Blot-Hybridisierung können unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen qualitativ das Vorhandensein von homologen Genen in den Genomen von Mensch, Affe, Ratte, Maus, Hund, Katze, Kuh und Kaninchen bestimmen.
Komplementäre Sequenzen werden ferner als Sonden oder Primer verwendet werden. Ausgehend von der Identifizierung des voraussichtlichen Amino-Terminus sollten andere Peptide besonders nützlich sein, z. B. verbunden mit einer „anchored vector"-Methode oder mit einem PolyA-komplementären PCR-Verfahren oder mit komplementärer DNA von anderen Peptiden.
Verfahren zur Nukleinsäure-Manipulation von Genen, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodieren, wie beispielsweise das Subklonieren von für Polypeptide kodierenden Nukleinsäuresequenzen in Expressionsvektoren, das Markieren von Sonden, die DNA-Hybridisierung und ähnliches werden allgemein in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage) Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, beschrieben. Dieses Handbuch wird im folgenden als „Sambrook et al." bezeichnet.
Es existieren zahlreiche Verfahren zur Isolierung von DNA-Sequenzen, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodieren. Beispielsweise wird DNA aus einer genomischen Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung markierter Oligonukleotid-Sonden isoliert, die Sequenzen aufweisen, welche identisch oder komplementär zu den vorliegend offenbarten Sequenzen sind. Es können Sonden in voller Länge verwendet werden, oder es können Oligonukleotid-Sonden durch Vergleich der vorliegend offenbarten Sequenzen erzeugt werden. Solche Sonden können direkt im Rahmen von Hybridisierungs-Assays verwendet werden, um DNA zu isolieren, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodiert, oder es können Sonden zur Verwendung in Amplifikationsverfahren (wie beispielsweise einer PCR) erzeugt werden, um DNA zu isolieren, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodiert. Computerprogramme zur reversen Translation können darüber hinaus alternative Nukleinsäuresequenzen bereitstellen, die für diesselben Proteine kodieren.
Um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, wird mRNA aus Zellen isoliert, die ein DGWCC-Chemokin-Protein exprimieren. Die cDNA wird ausgehend von der mRNA hergestellt und in einen rekombinanten Vektor ligiert. Der Vektor wird zum Zwecke der Vermehrung, des Screenings und der Klonierung in einen rekombinanten Wirt transfiziert. Verfahren zur Herstellung und zum Screening von cDNA-Bibliotheken sind hinreichend bekannt. Vgl. Gubler und Hoffmann (1983) Gene 25: 263–269 und Sambrook et al..
Zur Herstellung einer genomischen Bibliothek kann DNA aus Geweben extrahiert werden und entweder mechanisch zerkleinert oder enzymatisch verdaut werden, was zu Fragmenten von etwa 12–20 kb führt. Diese Fragmente werden dann durch Gradientenzentrifugation getrennt und in Vektoren des Bakteriophagen Lambda kloniert. Diese Vektoren und Phagen werden in vitro verpackt (wie in Sambrook et al. beschrieben). Rekombinante Phagen werden durch Plaque-Hybridisierung wie in Benton und Davis (1977) Science 196: 180–182 beschrieben analysiert. Die Kolonie-Hybridisierung wird durchgeführt, wie sie beispielsweise allgemein in Grunstein et al. (1975) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72: 3961–3965 beschrieben ist.
DNA, die für ein DGWCC-Chemokin-Protein kodiert, kann entweder in cDNA-Bibliotheken oder in genomischen Bibliotheken anhand ihrer Fähigkeit, mit den vorliegend beschriebenen Nukleinsäure-Sonden zu hybridisieren, identifiziert werden, z. B. in Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsassays. Die entsprechenden DNA-Regionen werden mittels Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert. Vgl. z. B. Sambrook et al..
Zahlreiche Verfahren zur Amplifikation von Zielsequenzen, wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion, können ebenfalls dazu verwendet werden, um DNA herzustellen, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodiert. Die Technologie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird angewendet, um solche Nukleinsäuresequenzen direkt aus mRNA, cDNA sowie aus genomischen Bibliotheken oder cDNA-Bibliotheken zu amplifizieren. Die isolierten Sequenzen, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodieren, können ferner als Matrizen für eine PCR-Amplifikation verwendet werden.
In PCR-Verfahren werden üblicherweise Oligonukleotidprimer synthetisiert, die zu zwei 5'-Bereichen der zu amplifizierenden DNA-Region komplementär sind. Die Polymerase-Kettenreaktion wird anschließend unter Verwendung der zwei Primer durchgeführt. Vgl. Innis et al. (Hrsg.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, CA. Die Primer können so ausgewählt werden, dass die gesamten Bereiche amplifiziert werden, die für ein DGWCC-Chemokin-Protein vollständiger Länge kodieren, oder so ausgewählt werden, dass je nach Wunsch kleinere DNA-Segmente amplifiziert werden. Sobald diese Regionen mittels PCR amplifiziert worden sind, können sie sequenziert werden, und Oligonukleotid-Sonden können aus der Sequenz hergestellt werden, die unter Verwendung von Standardverfahren erhalten wurde. Diese Sonden können anschließend dazu verwendet werden, DNAs zu isolieren, die für DGWCC-Chemokin-Proteine kodieren.
Oligonukleotide, die als Sonden verwendet werden sollen, werden üblicherweise auf chemischen Weg mittels der Festphasen-Phosphoramidit-Triester-Methode, die zuerst von Beaucage und Carruthers (1983) Tetrahedron Lett. 22 (20): 1859–1862 beschrieben wurde, oder unter Verwendung eines automatisierten Synthesegerätes (wie in Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 6159–6168 beschrieben) synthetisiert. Die Aufreinigung der Oligonukleotide erfolgt beispielsweise durch native Acrylamid-Gelelektrophorese oder durch eine Anionen-Austausch-HPLC, wie sie in Pearson und Regnier (1983) J. Chrom. 255: 137–149 beschrieben wird. Die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids kann beispielsweise unter Verwendung des chemischen Degradations-Verfahrens von Maxam und Gilbert (in Grossmann und Moldave (Hrsg. 1980) Methods in Enzymology 65: 499–560, Academic Press, New York) verifiziert werden.
Es wurden isolierte Nukleinsäuren identifiziert, die für Chemokin-Proteine kodieren. Die Nukleotidsequenzen und die entsprechenden offenen Leserahmen sind in SEQ ID NO: 1 oder 5 oder 7 gezeigt.
Diese DVic1- und DGWCC-Chemokine weisen eine begrenzte Ähnlichkeit zu Teilen von Chemokinen auf. Vgl. z. B. Matsushima und Oppenheim (1989) Cytokine 1: 2–13; Oppenheim et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 617–648; Schall (1991) Cytokine 3: 165–183 und Gronenborn und Clore (1991) Protein Engineering 4: 263–269. Andere Vergleichsmerkmale sind zwischen den DGWCC-Chemokinen und den Chemokin-Familien offensichtlich. Vgl. beispielsweise Lodi et al. (1994) Science 263: 1762–1766.
Insbesondere β-Faltblatt-Reste und α-Helix-Reste können bestimmt werden, beispielsweise unter Verwendung des RASMOL-Programms (vgl. Sayle und Milner-White (1995) TIBS 20: 374–376; oder Gronenberg et al. (1991) Protein Engineering 4: 263–269); weitere strukturelle Merkmale sind in Lodi et al. (1994) Science 263: 1762–1767 definiert. Diese sekundären und tertiären Merkmale helfen dabei, die strukturellen Merkmale der C, CC, CXC und CX3C zusammen mit den Abständen geeigneter Cystein-Reste weiter zu definieren.
Die Erfindung stellt eine isolierte DNA bereit, die für ein DVic-1-Chemokin-Protein kodiert. Zusätzlich stellt die Erfindung isolierte oder rekombinante DNA bereit, die für ein Protein oder Polypeptid kodiert, und in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen (z. B. hohe Stringenz) mit den vorliegend beschriebenen DNA-Sequenzen zu hybridisieren. Das besagte biologisch aktive Protein oder Polypeptid kann ein intakter Ligand sein und eine wie in SEQ ID NO: 2 offenbarte Aminosäuresequenz aufweisen, insbesondere natürliche Ausführungsformen. Bevorzugte Ausführungsformen werden natürliche Sequenzen von Isolaten in voller Länge sein, z. B. Sequenzen einer Größe von etwa 11.000–12.500 Dalton (sofern diese unglykosyliert sind), oder Fragmente von mindestens etwa 6.000 Dalton, mehr bevorzugt mindestens etwa 8.000 Dalton. Bei glykosylierten Formen kann das Protein 12.500 Dalton übersteigen. Die Erfindung schlägt ferner die Verwendung von isolierter oder rekombinanter DNA vor, die für Proteine kodiert, die zu einem DVic-1-Chemokin-Protein homolog sind oder unter Verwendung einer cDNA als Sonde isoliert worden sind, die für ein DVic-1-Chemokin-Protein kodiert. Die isolierte DNA kann die entsprechenden regulatorischen Sequenzen an den 5'- und 3'-Seiten aufweisen, z. B. Promotoren, Verstärker (enhancer), PolyA-Additions-Signale und ähnliches. Ebenfalls umfasst sind Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren mit diesen Sequenzen, oder zur Herstellung (z. B. Expression und Aufreinigung) von Proteinprodukten.
IV. Herstellung von DVic-1-Chemokinen
DNAs, die für ein DVic-1-Chemokin oder Fragmente desselben kodieren, können durch chemische Synthese, durch Screening von cDNA-Bibliotheken oder durch Screening von genomischen Bibliotheken, die aus einer großen Vielzahl von Zelllinien oder Gewebeproben hergestellt worden sind, erhalten werden. Verfahren für eine solche Vorgehensweise oder für die Herstellung von Expressionsvektoren werden vorliegend beschrieben.
Diese DNAs können zum Zwecke der Synthese eines Proteins in vollständiger Länge oder eines Fragments in einer großen Vielzahl von Wirtszellen exprimiert werden, die beispielsweise wiederum verwendet werden können, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen; für Bindungsstudien; zur Konstruktion und Expression von modifizierten Molekülen; sowie für Struktur/Funktions-Studien. Jedes DVic-1-Chemokin oder sein Fragment können in Wirtszellen exprimiert werden, die mit geeigneten Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert worden sind. Diese Moleküle können im wesentlichen aufgereinigt sein, so dass sie frei von Protein oder zellulären Kontaminationen sind, die nicht vom rekombinanten Wirt stammen, und daher insbesondere nützlich in pharmazeutischen Zusammensetzungen sein, wenn sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder einem Verdünnungsmittel kombiniert werden. Das Antigen (z. B. das DGWCC-Chemokin) oder Teile desselben können als Fusionen mit anderen Proteinen oder mit einem Epitop-Tag exprimiert werden.
Expressionsvektoren sind üblicherweise selbstreplizierende DNA- oder RNA-Konstrukte, die das gewünschte Antigen-Gen oder seine Fragmente enthalten, wobei diese üblicherweise funktionell mit geeigneten genetischen Kontrollelementen verbunden sind, die in einer geeigneten Wirtszelle erkannt werden. Die spezifische Art der Kontrollelemente, die notwendig sind, um die Expression zu bewirken, wird von der im Einzelfall verwendeten Wirtszelle abhängen. Üblicherweise können die genetischen Kontrollelemente ein prokaryontisches Promotorsystem oder ein eukaryontisches Promotor-Expressions-Kontrollsystem umfassen, und sie schließen in der Regel einen transkriptionalen Promotor, ein optionalen Operator zur Kontrolle des Transkriptionsstarts, Transkriptionsverstärker zur Erhöhung des Grads der mRNA-Expressions, eine für eine geeignete Ribosomenbindungsstelle kodierende Sequenz sowie Sequenzen, die die Transkription und Translation terminieren, ein. Expressionsvektoren umfassen darüber hinaus üblicherweise einen Replikationsursprung, der dem Vektor erlaubt, sich unabhängig von der Wirtszelle zu replizieren.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten DNAs, die für ein DVic-1-Chemokin oder ein Fragment desselben kodieren, üblicherweise z. B. ein biologisch aktives Polypeptid oder Protein. Die DNA kann unter der Kontrolle eines viralen Promotors stehen und für einen Selektionsmarker kodieren. Die Erfindung schlägt ferner die Verwendung solcher Expressionsvektoren vor, die in der Lage sind, für ein DVic-1-Chemokin-Protein kodierende, eukaryontische cDNA in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt zu exprimieren, wobei der Vektor mit dem Wirt kompatibel ist und die für das Protein kodierende eukaryontische cDNA so in den Vektor insertiert ist, dass durch das Wachstum des den Vektor enthaltenden Wirts die betreffende cDNA exprimiert wird. Üblicherweise werden Expressionsvektoren für die stabile Replikation in ihren Wirtszellen oder zur Amplifikation konstruiert, um die Gesamtzahl von Kopien des erwünschten Gens pro Zelle im hohen Maße zu steigern. Es ist nicht in jedem Fall erforderlich, dass ein Expressionsvektor in einer Wirtszelle repliziert wird; es ist z. B. möglich, die transiente Expression des Proteins oder seines Fragments in zahlreichen Wirten zu bewirken, wobei Vektoren verwendet werden, die keinen Replikationsursprung besitzen, der von der Wirtszelle erkannt wird. Es ist ferner möglich, Vektoren zu verwenden, die durch Rekombination die Integration eines DVic-1-Chemokin-Gens oder seines Fragments in die DNA des Wirts bewirken; ferner ist es möglich, einen Promotor zu integrieren, der die Expression eines endogenen Gens kontrolliert.
Vektoren (wie vorliegend verwendet) umfassen Plasmide, Viren, Bakteriophagen, integrierbare DNA-Fragmente und andere Vehikel, die die Integration von DNA-Fragmenten in das Genom des Wirts ermöglichen. Expressionsvektoren sind spezialisierte Vektoren, die genetische Kontrollelemente umfassen, welche die Expression von funktional verbundenen Genen bewirken. Plasmide sind die am häufigsten verwendete Form eines Vektors, jedoch sind auch andere Formen von Vektoren, die einer äquivalenten Funktion dienen, für die vorliegende Verwendung geeignet. Vgl. z. B. Pouwels et al. (1985 und Ergänzungsbände) Cloning Vectors: A Laboratory Manual Elsevier, N.Y.; und Rodriquez et al. (Hrsg.) (1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth, Boston, MA.
Geeignete Wirtszellen umfassen Prokaryonten, niedere Eukaryonten und höhere Eukaryonten. Prokaryonten umfassen sowohl gramnegative als auch grampositive Organismen, z. B. E. coli und B. subtilis. Niedere Eukaryonten umfassen Hefen (z. B. S. cerevisiae und Pichia) sowie Spezies der Gattung Dictyostelium. Höhere Eukaryonten umfassen etablierte Gewebekultur-Zelllinien tierischer Zellen, sowohl von Nichtsäugern (z. B. Insektenzellen und Vögel) als auch von Säugern (z. B. Menschen, Primaten und Nagetiere).
Prokaryontische Wirt-Vektor-Systeme umfassen eine große Vielzahl von Vektoren von vielen verschiedenen Spezies. Wie vorliegend verwendet, werden E. coli und seine Vektoren generisch verwendet werden, wobei äquivalente Vektoren, die in anderen Prokaryonten verwendet werden, eingeschlossen sind. Ein repräsentativer Vektor zur Amplifikation von DNA ist pBR322 oder seine Derivate. Vektoren, die dazu verwendet werden können, DGWCC-Chemokine oder DGWCC-Chemokin-Fragmente zu exprimieren, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) solche Vektoren, die den lac-Promotor (pUC-Serie); trp-Promotor (PBR322-trp); lpp-Promotor (die pIN-Serie); Lambda-pP oder pR-Promotoren (pOTS); oder hybride Promotoren, wie beispielsweise ptac (pDR540) umfassen. Vgl. Brosius et al. (1988) „Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and lpp-derived Promotors", in Rodriquez und Denhardt (Hrsg.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses 10: 205–236, Buttersworth, Boston, MA.
Niedere Eukaryonten, z. B. Hefen und Dictyostelium, können mit Vektoren transformiert werden, die die DVic-1-Chemokin-Sequenz enthalten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der gebräuchlichste Wirt aus der Gruppe der niederen Eukaryonten die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Sie wird generisch verwendet werden, um niedere Eukaryonten zu repräsentieren, obwohl eine Vielzahl von anderen Stämmen und Spezies ebenfalls verwendet werden kann. Hefe-Vektoren bestehen üblicherweise aus einem Replikationsursprung (sofern sie nicht vom Integrations-Typ sind), einem Selektions-Gen, einem Promotor, aus DNA, die für das gewünschte Protein oder sein Fragment kodiert, sowie aus Sequenzen für die Termination der Translation, die Polyadenylierung und die Termination der Transkription. Geeignete Expressionsvektoren für Hefe umfassen konstitutive Promotoren wie den Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase und zahlreiche andere glykolytische Promotoren von Enzym-Genen oder induzierbare Promotoren wie den Alkohol-Dehydrogenase-2-Promotor oder den Metallothionin-Promotor. Geeignete Vektoren schließen Derivate der folgenden Typen ein: selbstreplizierende Vektoren mit geringer Kopienzahl („low copy number", wie beispielsweise die YRP-Serie), selbstreplizierende Vektoren mit hoher Kopienzahl („high copy number, wie beispielsweise die YEP-Serie); integrierende Vektortypen (wie beispielsweise die YIp-Serie) oder Mini-Chromosomen (wie beispielsweise die YCp-Serie).
Höhere eukaryontische Gewebekulturzellen sind üblicherweise die bevorzugten Wirtszellen für die Expression von funktionell aktivem DVic-1-Chemokin-Protein. Grundsätzlich können zahlreiche höhere eurkaryontische Gewebekultur-Zelllinien verwendet werden, z. B. Insekten-Baculovirus-Expressionssysteme, entweder von Invertebraten oder Vertebraten. Säugetierzellen werden jedoch bevorzugt, um eine angemessene Prozessierung (sowohl co-translational als auch posttranslational) zu erreichen. Die Transformation oder Transfektion und Vermehrung solcher Zellen ist Routine. Nützliche Zelllinien umfassen HeLa-Zellen, Zelllinien aus den Ovarien chinesischer Hamster (chinese hamster ovary; CHO), Zelllinien aus Nieren von Ratten (baby rat kidney; BRK), Insekten-Zelllinien, Vogel-Zelllinien und Affen (COS)-Zelllinien. Expressionsvektoren für solche Zelllinien umfassen üblicherweise einen Replikationsursprung, einen Promotor, eine Translation-Initiationsstelle, RNA-Spleiß-Stellen (z. B. wenn genomische DNA verwendet wird), eine Polyadenylierungs-Stelle und eine Transkriptions-Terminationsstelle. Diese Vektoren können ferner ein Selektions-Gen oder ein Amplifikations-Gen umfassen. Geeignete Expressionsvektoren können Plasmide, Viren oder Retroviren sein, die Promotoren aufweisen, welche z. B. von dem Adenovirus, SV40, Parvoviren, Vacciniavirus oder Cytomegalovirus abgeleitet sind. Representative Beispiele geeigneter Expressionsvektoren umfassen pCDNA1; pCD, vgl. Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136–1142; pMC1neo Poly-A, vgl. Thomas et al. (1987) Cell 51: 503–512; sowie einen Baculovirus-Vektor, wie beispielsweise pAC 373 oder pAC 610.
Es ist wahrscheinlich, dass DVic-1-Chemokine nicht glykosyliert sein müssen, um biologische Antworten auszulösen. Es wird jedoch gelegentlich erstrebenswert sein, ein DVic-1-Chemokin-Polypeptid in einem System zu exprimieren, das ein spezifisches oder definiertes Glykosylierungsmuster bereitstellt. In diesem Fall wird das übliche Muster dasjenige sein, das natürlicherweise durch das Expressionsystem bereitgestellt wird. Das Muster wird sich jedoch modifizieren lassen, indem das Polypeptid (z. B. in unglykosylierter Form) geeigneten glykolysierenden Proteinen ausgesetzt wird, die in ein heterologes Expressionssystem eingebracht wurden. Das DGWCC-Chemokin-Gen kann beispielsweise mit einem oder mehreren Genen, die für glykosylierende Enzyme aus Säugetieren oder für andere glykosylierende Enzyme kodieren, co-transformiert werden. Es sollte ferner verständlich sein, dass die Glykosylierung für die biologische Aktivität des DGWCC-Chemokins entscheidend sein kann und dass der Fachmann routinemäßige Untersuchungen durchführen kann, um den Grad der Glykosylierung zu optimieren, was zu einer optimalen biologischen Aktivität führt.
Ein DVic-1-Chemokin oder ein Fragment desselben kann so erzeugt werden, dass es über Phosphatidyl-Inositol (PI) mit der Zellmembran verbunden ist; es kann jedoch durch Behandlung mit einem Enzym, das Phosphatidyl-Inositol spaltet (z. B. Phosphatidyl-Inositol Phospholipase-C) von den Membranen entfernt werden. Dies setzt das Antigen in einer biologisch aktiven Form frei und erlaubt die Aufreinigung durch Standardverfahren der Proteinchemie. Vgl. z. B. Low (1989) Biochem. Biophys. Acta 988: 427–454; Tse et al. (1985) Science 230: 1003–1008; und Brunner et al. (1991) J. Cell Biol. 114: 1275–1283.
Da DVic-1-Chemokine nunmehr charakterisiert worden sind, können Fragmente oder Derivate derselben durch herkömmliche Verfahren zur Synthese von Peptiden hergestellt werden. Diese umfassen Verfahren wie beispielsweise diejenigen, die von Stewart und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky und Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY; und Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis Springer-Verlag, New York, NY, beschrieben worden sind. Es kann beispielsweise ein Azid-Verfahren, ein Säurechlorid-Verfahren, ein Säureanhydrid-Verfahren, ein gemischtes Anhydrid-Verfahren, ein Verfahren mit einem aktiven Ester (beispielsweise p-Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester oder Cyanomethylester), ein Carbodiimidazol-Verfahren, ein Redox-Verfahren oder ein Dicylclohexyl-carbodiimid (DCCD)/additives Verfahren verwendet werden. Sowohl Festphasen- als auch Flüssigphasensynthesen sind für die vorgenannten Verfahren anwendbar. Vgl. ferner die chemische Ligation, z. B. Dawson et al. (1994) Science 266: 776–779, ein Verfahren zur Verbindung von langen synthetischen Peptiden durch eine Peptidbindung.
Das hergestellte Protein und die Fragmente desselben können isoliert und durch Verfahren zur Peptidtrennung, beispielsweise durch Extraktion, Präzipitation, Elektophorese sowie zahlreiche Formen der Chromatographie u. ä. aus der Reaktionsmischung gereinigt werden. Die erfindungsgemäßen DVic-1-Chemokine können abhängig von der angestrebten Verwendung in verschiedenen Reinheitsstufen erhalten werden. Die Aufreinigung kann durch Anwendung von bekannten Protein-Aufreinigungsverfahren oder durch die Vewendung der hier beschriebenen Antikörper oder Bindungspartner, z. B. durch Immunoabsorbant-Affinintäts-Chromatographie erreicht werden. Diese Immunabsorptions-Affinintäts-Chromatographie wird durchgeführt, indem zunächst die Antikörper an einen festen Träger gebunden werden, und die gebundenen Antikörper anschließend mit solubilisierten Lysaten von geeigneten Zellen, mit Lysaten von anderen den Liganden exprimierenden Zellen, oder mit Lysaten oder Überständen von Zellen, die die DVic-1-Chemokine als Ergebnis rekombinanter DNA-Verfahren exprimieren (vgl. unten) in Kontakt gebracht werden.
Zahlreiche Zelllinien können einem Screening nach einer Zelllinie unterworfen werden, die ein DGWCC-Chemokin im Vergleich zu anderen Zellen in einer hohen Menge exprimiert. Natürliche DVic-1-Chemokine können aus natürlichen Bezugsquellen oder durch Expression von einer tranformierten Zelle unter Verwendung eines geeigneten Expressionsvektors isoliert werden. Die Aufreinigung des exprimierten Proteins wird mittels Standardverfahren erreicht oder kann mit technischen Mitteln kombiniert werden, um eine wirksame Aufreinigung von den Zelllysaten oder Zellüberständen mit hoher Effizienz zu erreichen. Epitope oder andere Tags, z. B. FLAG- oder His₆-Segmente, können für solche Aufreinigungen verwendet werden.
V. Antikörper
Antikörper können gegen zahlreiche DVic-1-Chemokine, einschließlich individuelle, polymorphische, allelische Varianten, Stamm- oder Spezies-Varianten sowie Fragmenten derselben, die sowohl in ihren natürlich vorkommenden Formen (volle Länge) als auch in ihren rekombinanten Formen vorliegen können, erzeugt werden. Zusätzlich können Antikörper gegen DVic-1-Chemokine erzeugt werden, die entweder in ihrer aktiven Form oder in ihrer inaktiven Form vorliegen. Anti-idiotypische Antikörper können ebenfalls verwendet werden. Die Antikörper können zahlreiche Bindungsspezifitäten für Spezies-Varianten, individuelle oder polymorphische Varianten aufweisen.
A. Antikörper-Herstellung
Eine Vielzahl von Immunogenen kann verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die in spezifischer Weise mit DVic-1-Proteinen reaktiv sind. Rekombinantes Protein ist das bevorzugte Immunogen für die Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern. Natürlich vorkommendes Protein kann darüber hinaus entweder in reiner oder unreiner Form verwendet werden. Synthetische Peptide, die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen DVic-1-Chemokin-Proteinsequenzen hergestellt worden sind, können ebenfalls als Immunogen für die Herstellung von Antikörpern gegen DVic-1-Chemokine verwendet werden. Rekombinantes Protein kann wie vorliegend beschrieben in eukaryontischen und prokaryontischen Zellen exprimiert werden und wie beschrieben aufgereinigt werden. Natürlich gefaltetes oder denaturiertes Material kann – sofern geeignet – zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper für die nachfolgende Verwendung in Immunoassays zur Messung des Proteins erzeugt werden.
Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Üblicherweise wird ein Immunogen, vorzugsweise ein gereinigtes Protein, mit einem Adjuvans vermischt, und es werden Tiere mit der Mischung immunisiert. Die Immunantwort des Tiers auf die Immunogen-Präparation wird durch Entnahme von Testblut und Bestimmung des Reaktivitäts-Titers gegen das jeweilige DVic-1-Chemokin-Protein verfolgt. Wenn geeignete hohe Antikörper-Titer gegen das Immunogen erhalten werden (üblicherweise nach wiederholter Immunisierung) wird Blut von dem Tier gesammelt, und es werden Antiseren hergestellt. Sofern es erwünscht ist, kann eine weitere Fraktionierung der Antiseren vorgenommen werden, um Antikörper anzureichern, die gegen das Protein reaktiv sind. Vgl. z. B. Harlow und Lane; oder Coligan.
Monoklonale Antikörper können durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden. Üblicherweise werden Zellen der Milz von einem Tier, das mit dem gewünschten Antigen immunisiert worden ist, immortalisiert, was in der Regel durch Fusion mit einer Myelomzelle erfolgt (vgl. Kohler und Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511–519). Alternative Verfahren der Immortalisierung umfassen die Transformation mit einem Epstein-Barr-Virus, mit Onkogenen oder Retroviren, oder andere Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Kolonien, die aus einzelnen immortalisierten Zellen entstehen, werden auf die Produktion von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen geprüft, und die Ausbeute an monoklonalen Antikörpern, die von solchen Zellen produziert werden, kann durch zahlreiche Verfahren verstärkt werden, einschließlich der Injektionen in die Peritonialhöhle eines Vertebraten-Wirts. Daneben können DNA-Sequenzen, die für einen monoklonalen Antikörper oder ein bindendes Fragment desselben kodieren, durch Screening einer DNA-Bibliothek aus humanen B-Zellen isoliert werden, z. B. gemäß dem allgemeinen Protokoll von Huse et al. (1989) Science 246: 1275–1281.
Antikörper (einschließlich bindende Fragmente und Einzelketten-Versionen) gegen vorbestimmte Fragmente von DGWCC-Chemokinen können wie oben beschrieben durch Immunisierung von Tieren mit Konjugaten aus den Fragmenten und Trägerproteinen erzeugt werden. Monklonale Antikörper werden mit Hilfe von Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper ausscheiden. Diese Antikörper können auf die Bindung an normale oder defekte DVic-1- oder DGWCC-Chemokine untersucht werden, oder auf agonistische oder antagonistische Aktivität, z. B. die durch einen Rezeptor vermittelte Aktivität. Diese monoklonalen Antikörper werden üblicherweise mit mindestens einem K_D von 1 mM binden, noch üblicher mit einem K_D von mindestens etwa 300 μM, typischerweise mit einem K_D von mindestens etwa 10 μM, noch typischer mit einem K_D von mindestens etwa 30 μM, vorzugsweise mit einem K_D von mindestens etwa 10 μM, und noch bevorzugter mit einem K_D von mindestens etwa 3 μM oder besser.
In manchen Fällen ist es erstrebenswert, monoklonale Antikörper von zahlreichen Säugetier-Wirten, wie beispielsweise von Mäusen, Nagetieren, Primaten, Menschen usw., herzustellen. Die Beschreibung von Verfahren zur Herstellung solcher monoklonalen Antikörper können beispielsweise in Stites et al. (Hrsg.) Basic and Clinical Immunology (4. Auflage) Lange Medical Publications, Los Altos, CA und den darin zitierten Literaturhinweisen; Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Auflage) Academic Press, New York, NY; und insbesondere in Kohler und Milstein (1975) Nature 256: 495–497, gefunden werden, die ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper diskutieren. Zusammenfassend dargestellt, betrifft dieses Verfahren die Injektion eines Immunogens in ein Tier. Das Tier wird anschließend getötet, und die Zellen der Milz werden entnommen und anschließend mit Myelomzellen fusioniert. Das Ergebnis ist eine hybride Zelle oder ein „Hybridom", das in der Lage ist, sich in vitro zu reproduzieren. Die Population von Hybridomen wird anschließend untersucht, um einzelne Klone zu isolieren, von denen jeder eine einzige Antikörper-Art gegen das Immunogen ausscheidet. Somit sind die einzelnen Arten von Antikörpern, die erhalten werden, die Produkte von immortalisierten und klonierten einzelnen B-Zellen aus dem immunen Tier, die als Antwort auf eine spezifische Stelle erzeugt werden, die auf der immunogenen Substanz erkannt wird.
Andere geeignete Verfahren betreffen die Selektion von Antikörper-Bibliotheken in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Vgl. z. B. Huse et al. (1989) „Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lamda," Science 246: 1275–1281; und Ward et al. (1989) Nature 341: 544–546. Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Antikörper können mit oder ohne Modifikationen verwendet werden, einschließlich chimere oder humanisierte Antikörper. Oftmals werden die Poylpeptide und Antikörper markiert werden, indem entweder kovalent oder nicht-kovalent eine Substanz angehängt wird, die für ein detektierbares Signal sorgt. Eine große Vielzahl von Markierungen und Konjugations-Verfahren sind bekannt und werden in umfassender Weise sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur beschrieben. Geeignete Markierungen umfassen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszente Reste, chemilumineszente Reste, magnetische Partikel und ähnliche. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen betreffen, umfassen U.S.-Patentnummern 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241. Darüber hinaus können rekombinante Immunglobuline hergestellt werden. Vgl. Cabilly, U.S. Patent No. 4,816,567; und Queen et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind für die Affinitätschromatography zur Isolierung des DVic-1-Chemokin-Proteins nützlich. Es können Säulen hergestellt werden, wobei die Antikörper an einen festen Träger (z. B. an Partikel, wie beispielsweise Agarose, Sephadex oder ähnliches) gebunden werden, und wobei ein Zelllysat oder ein Zellüberstand durch die Säule geleitet werden kann, die Säule gewaschen wird, gefolgt von aufsteigenden Konzentrationen eines milden denaturierenden Mittels, wodurch gereinigtes DVic-1-Chemokin-Protein freigesetzt wird. In ähnlicher Weise kann die Antikörperbindung an das Chemokin in der Lage sein, die Rezeptorbindung zu neutralisieren, und kann als ein Rezeptor-Antagonist dienen. Sie können ferner als Western-Blot-Detektionsreagenzien oder ELISA-Reagenzien nützlich sein.
Die Antikörper können ferner dazu verwendet werden, um Expression-Bibliotheken auf bestimmte Expressions-Produkte zu untersuchen. Üblicherweise werden die bei einer solchen Vorgehensweise verwendeteten Antikörper mit einem Rest markiert sein, der einen einfachen Nachweis des Vorhandenseins eines Antigens durch Antikörperbindung erlaubt.
Antikörper gegen DVic-1-Chemokine können zur Identifizierung von Zellpopulationen verwendet werden, die DVic-1-Chemokine exprimieren. Durch Untersuchen der Expressionsprodukte von Zellen, die die erfindungsgemäßen Chemokine exprimieren, ist es möglich, eine Krankheit zu diagnostizieren, z. B. Zustände mit geschwächtem Immunsystem.
Antikörper, die gegen jedes DVic-1-Chemokin erzeugt wurden, werden ferner nützlich sein, um anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen. Diese werden bei der Detektion oder Diagnose zahlreicher immunologischer Zustände, die im Zusammenhang mit der Expression des Antigens stehen, nützlich sein.
B. Immunoassays
Ein bestimmtes Protein kann durch eine Vielzahl von Immunoassay-Verfahren gemessen werden. Für eine Übersicht über immunologische Verfahren und Immunoassay-Verfahren im allgemeinen, vgl. Stites und Terr (Hrsg.) (1991) Basic and Clinical Immunology (7. Auflage). Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Immunoassays in zahlreichen Ausgestaltungen durchgeführt werden, die umfassend in Maggio (Hrsg.) (1080) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Tijan (1985) „Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam; und Harlow und Lane Antibodies, A Laboratory Manual, s. o., behandelt werden, wobei jeder Literaturhinweis hiermit durch Querverweis eingeschlossen ist. Vgl. ferner Chan (Hrsg.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price und Newman (Hrsg.) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY; und Ngo (Hrsg.) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY.
Immunoassays zur Messung (z. B.) des DVic-1-Chemokin-Proteins können mittels einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die Immunoassays zur Messung des Proteins können entweder kompetitive oder nicht-kompetitive Bindungs-Assays sein. In kompetitiven Bindungs-Assays konkurriert die zu analysierende Probe mit einem markierten Analyten um spezifische Bindungsstellen auf einem Capture („Einfang")-Mittel, das an eine feste Oberfläche gebunden ist. Vorzugsweise ist das Capture-Mittel ein Antikörper, der spezifisch mit den DVic-1-Chemokin-Proteinen reaktiv ist und wie oben beschrieben hergestellt wird. Die Konzentration des markierten Analyten, der an das Capture-Mittel gebunden hat, ist umgekehrt proportional zu der Menge des freien Analyen, der in der Probe vorliegt.
In einem kompetitiven Immunoassay konkurriert das in der Probe vorhandene DVic-1-Chemokin-Protein mit einem markierten Protein um die Bindung an ein spezifisches Bindungsmittel, beispielsweise einen Antikörper, der spezifisch mit dem DVic-1-Chemokin-Protein reaktiv ist. Das Bindungsmittel kann an eine feste Oberfläche gebunden sein, um die Trennung des gebundenen markierten Proteins von dem ungebundenen markierten Protein zu bewirken. Der kompetitive Bindungs-Assay kann alternativ in einer Flüssigphase durchgeführt werden, und eine Vielzahl von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, können angewendet werden, um das gebundene markierte Protein von dem ungebundenen markierten Protein zu trennen. Nach der Trennung wird die Menge des gebundenen markierten Proteins bestimmt. Die Menge des Proteins, das in der Probe vorhanden ist, ist umgekehrt proportional zu der Menge der Bindung von markierten Proteinen.
Daneben kann ein homogener Immunoassay durchgeführt werden, bei dem der Trennungsschritt nicht erforderlich ist. In diesen Immunoassays wird die Markierung auf dem Protein durch die Bindung des Proteins an sein spezifisches Bindungsmittel verändert. Diese Veränderung des markierten Proteins führt zu einer Abschwächung oder Verstärkung des Signals, das von der Markierung emittiert wird, sodass die Messung der Markierung am Ende des Immunoassays die Detektion oder Quantifizierung des Proteins erlaubt.
Die DVic-1-Chemokin-Proteine können darüber hinaus durch eine Vielzahl von nicht kompetitiven Immunoassay-Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann ein „two site"-Festphasen-Sandwich-Immunoassay durchgeführt werden. Bei dieser Art von Assay ist ein Bindungsmittel für das Protein (z. B. ein Antikörper) an einen festen Träger gebunden. Es wird ein zweites Protein-Bindungsmittel markiert, das ebenfalls ein Antikörper sein kann und an eine andere Stelle des Proteins bindet. Nachdem eine Bindung an beiden Stellen auf dem Protein erfolgt ist, wird das ungebundene markierte Bindungsmittel entfernt, und die Menge des an die feste Phase gebundenen markierten Bindungsmittels wird gemessen. Die Menge des gebundenen markierten Bindungsmittels ist direkt proportional zu der Menge des Proteins in der Probe.
Eine Western-Blot-Analyse kann verwendet werden, um (z. B.) das Vorhandensein von DGWCC-Chemokin-Proteinen in der Probe zu bestimmen. Eine Elektrophorese wird z. B. bei einer Gewebeprobe durchgeführt, von der angenommen wird, dass sie das Protein enthält. Nach der zur Trennung der Proteine durchgeführten Elektrophorese und dem Transfer der Proteine auf einen geeigneten festen Träger (z. B. auf einen Nitrozellulosefilter) wird der feste Träger mit einem Antikörper inkubiert, der mit dem Protein reaktiv ist. Dieser Antikörper kann markiert sein oder alternativ dazu durch eine anschließende Inkubation mit einem zweiten markierten Antikörper, der an den ersten Antikörper bindet, nachgewiesen werden.
Die oben beschriebenen Arten von Immunoassays verwenden markierte Assay-Komponenten. Die Markierung kann gemäß im Stand der Technik hinreichend bekannten Verfahren direkt oder indirekt an die gewünschte Komponente des Assays gekoppelt sein. Eine große Vielzahl von Markierungen und Verfahren können verwendet werden. Üblicherweise wird eine radioaktive Markierung verwendet, die ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P einbaut. Nicht-radioaktive Markierungen umfassen Liganden, die an markierte Antikörper, Fluorophore, chemilumineszente Mittel, Enzyme und Antikörper binden, welche als spezifische Bindungspaar-Mitglieder für einen markierten Liganden dienen können. Die Wahl der Markierung hängt von der erforderlichen Sensitivität, von der Handhabung der Konjugation mit der Verbindung, den Stabilitätserfordernissen und der verfügbaren Ausstattung ab. Für einen Überblick über verschiedene Markierungs- oder Signal-produzierende Systeme, die verwendet werden können, vgl. U.S. Patent Nr. 4,391,904.
Antikörper, die mit einem bestimmten Protein reaktiv sind, können ferner mittels einer Vielzahl von Immunoassay-Verfahren gemessen werden. Für einen Überblick an immunologischen Verfahren und Immunoassay-Verfahren, die bei der Messung von Antikörpern durch Immunoassay-Methoden anwendbar sind, vgl. Stites und Terr (Hrsg.) Basic and Clinical Immunology (7. Auflage) s. o.; Maggio (Hrsg.) Enzyme Immunoassay, s. o.; und Harlow und Lane Antibodies, A Laboratory Manual s. o.
Immunoassays zur Messung von Antiseren, die beispielsweise mit DVic-1-Chemokin-Proteinen reaktiv sind, können entweder kompetitive oder nicht-kompetitive Bindungs-Assays sein. In kompetitiven Bindungs-Assays konkurriert der Probenanalyt mit einem markierten Analyten um spezifische Bindungsstellen auf einem Capture-Mittel, das an eine feste Oberfläche gebunden ist. Vorzugsweise ist das Capture-Mittel ein aufgereinigtes, rekombinantes DVic-1-Chemokin-Protein, das wie oben beschrieben hergestellt worden ist. Andere Bezugsquellen der DVic-1-Chemokin-Proteine, einschließlich isolierter oder partiell aufgereinigter natürlich vorkommender Proteine, können ebenfalls verwendet werden. Nicht-kompetitive Assays umfassen Sandwich-Assays in denen der Probenanalyt zwischen zwei Analyt-spezifischen Bindungsreagenzien gebunden wird. Eines dieser Bindungsmittel wird als Capture-Mittel verwendet und ist an eine feste Oberfläche gebunden. Das zweite Bindungsmittel ist markiert und wird verwendet, um den resultierenden Komplex durch visuelle oder instrumentale Mittel zu messen oder zu detektieren. Es kann eine Vielzahl von Kombinationen von Capture-Mittel und markiertem Bindungsmittel verwendet werden. Eine Vielzahl von verschiedenen Arten von Immunoassay, Separationsverfahren und Markierungen kann verwendet werden, die denen für die Messung von DGWCC-Chemokin-Proteinen beschriebenen ähneln.
VI. Aufgereinigte DVic-1-Chemokine
Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von humanem DVic-1 werden in SEQ ID NO: 1 und 2 bereitgestellt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von humanem DGWCC wird in SEQ ID NO: 5 und 6 gezeigt; die Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz von DGWCC der Maus wird in SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigt.
Gereinigtes Protein oder definierte Peptide sind für die Erzeugung von Antikörpern durch Standardverfahren (wie oben beschrieben) nützlich. Synthetische Peptide oder gereinigtes Protein können einem Immunsystem präsentiert werden, um polyklonale und monoklonale Antikörper herzustellen. Vgl. z. B. Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; und Harlow und Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY. Daneben kann ein DVic-1- oder DGWCC-Chemokin-Rezeptor als spezifisches Bindungs-Reagenz nützlich sein. und seine Bindungsspezifität kann z. B. als Vorteil für die Aufreinigung eines DGWCC-Chemokin-Liganden genutzt werden.
Die spezifische Bindungszusammensetzung kann für das Screening einer Expressions-Bibliothek verwendet werden, die aus einer Zelllinie hergestellt worden ist, welche ein DGWCC-Chemokin exprimiert. Zahlreiche Verfahren für das Screening sind verfügbar, z. B. Standardfärbung von Oberflächen-exprimierten Liganden oder durch Panning. Das Screening nach einer intrazellulären Expression kann ferner durch verschiedene Färbungs- oder Immunfluoreszenz-Verfahren durchgeführt werden. Die Bindungszusammensetzungen können verwendet werden, um Zellen, die den Liganden exprimieren, mittels Affinität aufzureinigen oder auszusortieren.
Die Peptidsegmente können in Verbindung mit einem Vergleich mit homologen Genen ferner dazu verwendet werden, um geeignete Oligonukleotide für das Screening einer Bibliothek herzustellen. Der genetische Code kann verwendet werden, um geeignete Oligonukleotide auszuwählen, die als Sonden für das Screening nützlich sind. Die synthetischen Oligonukleotide werden in Kombination mit Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren bei der Selektion von gewünschten Klonen aus einer Bibliothek nützlich sein (einschließlich bei der Selektion von natürlichen, allelischen und polymorphischen Varianten).
Die Peptidsequenzen erlauben die Herstellung von Peptiden, um Antikörper zu erzeugen, die solche Segmente erkennen, und erlauben die Herstellung von Oligonukleotiden, die für solche Sequenzen kodieren. Die Sequenz erlaubt ferner die synthetische Herstellung, siehe z. B. Dawson, et al. (1994) Science 266: 776–779. Da DVic-1- und DGWCC-Chemokine sekretorische Proteine sein können, wird das Gen normalerweise eine N-terminale Signalsequenz aufweisen, die bei der Prozessierung und der Sekretion entfernt wird. Der exakte Prozessierungspunkt kann jedoch bei verschiedenen Zelltypen variieren und Formen mit unterschiedlicher Länge werden oftmals detektiert. Die Vorhersage des Signal-Spaltungspunktes kann z. B. unter Verwendung der Verfahren von Nielsen, et al. (1997) Protein Eng. 10: 1–8 durchgeführt werden. Die Analyse der strukturellen Merkmale im Vergleich mit den am nächsten verwandten, beschriebenen Sequenzen hat Ähnlichkeiten mit anderen Cytokinen aufgezeigt, insbesondere mit der Klasse von Proteinen, die als CC- und CXC-Chemokine bekannt sind.
VII. Physikalische Varianten
Vorliegend werden ferner Proteine oder Peptide beschrieben, die wesentliche Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz eines DVic-1- oder DGWCC-Chemokins aufweisen. Natürliche Varianten umfassen individuelle, polymorphische, allelische Varianten, Stamm- oder Speziesvarianten.
Die Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit (oder Sequenzidentität) wird – sofern erforderlich – durch Optimierung der Aminosäurerest-Übereinstimmung optimiert, indem je nach Notwendigkeit Lücken eingeführt werden. Dies ändert sich, sobald konservative Substitutionen als Übereinstimmungen angesehen werden. Konservative Substitutionen umfassen üblicherweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Aspartatsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Homologe Aminosäuresequenzen umfassen natürliche, polymorphische, allelische und Interspezies-Variationen der Proteinsequenz. Typische homologe Proteine oder Peptide werden von 50% bis 100% Ähnlichkeit (wenn Lücken eingeführt werden können), und von 75% bis 100% Ähnlichkeit (wenn konservative Substitutionen eingeschlossen sind) mit der Aminosäuresequenz des DGWCC-Chemokins aufweisen. Die Messungen der Ähnlichkeit werden mindestens etwa 50% betragen, üblicherweise mindestens 60%, noch üblicher mindestens 65%, gebräuchlicherweise mindestens 70%, noch gebräuchlicher mindestens 75%, vorzugsweise mindestens 80% und mehr bevorzugt mindestens 80%, und in besonders bevorzugten Ausführungsformen mindestens 85% oder mehr. Vgl. ebenfalls Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453; Sankoff et al. (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Chapter One, Addison-Wesley, Reading, MA; sowie die Software-Pakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA; und University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI.
Nukleinsäuren, die für DVic-1-Chemokin-Proteine aus dem Säugetier kodieren, werden üblicherweise unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 hybridisieren. Nukleinsäuren beispielsweise, die für DVic-1-Chemokin-Proteine kodieren, werden unter normalen Umständen mit der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 1 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Üblicherweise werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH etwa 10°C geringer sind als der thermale Schmelzpunkt (Tm) für die Sondensequenz. Der Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH) bei der 50% der Zielsequenz mit einer perfekt übereinstimmenden Sonde hybridisieren. Üblicherweise werden stringente Bedingungen diejenigen sein, bei denen die Salzkonzentration etwa 0,2 M bei pH 7 beträgt, und die Temperatur mindestens etwa 50°C beträgt. Andere Faktoren können die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen, einschließlich, u. a., die Basenzusammensetzung und die Größe des komplementären Strangs, das Vorhandensein von organischen Lösungsmitteln wie beispielsweise Formamid, sowie das Ausmaß der Basen-Fehlpaarung. Eine bevorzugte Ausführungsform wird Nukleinsäuren einschließen, die bei 42° Celsius in 50% Formamid und 200 mM NaCl an die offenbarten Sequenzen binden.
Eine isolierte DGWCC-Chemokin-DNA kann problemlos durch Nukleotid-Substitutionen, Nukleotid-Deletionen, Nukleotid-Insertionen und durch kurze Invertierungen von Nukleotidabschnitten modifiziert werden. Diese Modifikationen führen zu neuen DNA-Sequenzen, die für DVic-1- oder DGWCC-Chemokin-Antigene, ihre Derivate oder Proteine mit im hohen Maße ähnlichen physiologischen, immunogenen oder antigenischen Aktivitäten kodieren.
Modifizierte Sequenzen können verwendet werden, um Antigen-Mutanten herzustellen oder die Expression zu verstärken. Die verstärkte Expression kann eine Gen-Amplifikation, eine erhöhte Transkription, eine erhöhte Translation oder andere Mechanismen betreffen. Solche mutierten DGWCC-Chemokin-Derivate schließen vorbestimmte oder ortsspezifische Mutationen des Proteins oder seiner Fragmente ein. Der Begriff „DGWCC-Chemokin-Mutanten" umfasst ein Polypeptid, das andernfalls in die oben beschriebene Homologie-Definition des humanen DGWCC-Chemokins fallen würde, jedoch eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der eines DGWCC-Chemokins, das in der Natur vorgefunden wird, entweder durch Deletion, Substitution oder Insertion unterscheidet. Der Begriff „ortsspezifisch mutiertes DGWCC-Chemokin" umfasst üblicherweise Proteine mit signifikanter Ähnlichkeit mit einem Protein, das die Sequenz von SEQ ID NO: 6 oder 8 aufweist, und verschiedene biologische Aktivitäten (z. B. antigenische oder immunogene) mit diesen Sequenzen gemeinsam hat und den überwiegenden Teil oder die gesamte offenbarte Sequenz umfassen kann. Dies gilt ebenfalls für polymorphische Varianten von verschiedenen Individuen. Ähnliches gilt für verschiedene DVic-1- oder DGWCC-Chemokin-Proteine, insbesondere für diejenigen, die in verschiedenen warmblütigen Tieren gefunden werden, z. B. in Säugetieren oder Vögeln. Wie oben dargestellt, ist zu beachten, dass die Beschreibungen im Allgemeinen andere DVic-1- oder DGWCC-Chemokin-Proteine umfassen sollen, und nicht auf die im einzelnen diskutierten Proteine der Maus oder die menschlichen Proteine beschränkt sind.
Obwohl ortsspezifische Mutations-Stellen vorbestimmt sind, müssen die Mutanten nicht ortsspezifisch zu sein. Eine DGWCC-Chemokin-Mutagenese kann beispielsweise durch Aminosäure-Insertionen oder -Deletionen durchgeführt werden. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder sämtliche andere Kombinationen können erzeugt werden, um zu einem endgültigen Konstrukt zu gelangen. Insertionen umfassen Amino- oder Carboxy-terminale Fusionen, z. B. Epitop-Tags. Es kann eine Zufallsmutagenese bei einem Ziel-Codon durchgeführt werden, und die exprimierten Mutanten können anschließend auf die erwünschte Aktivität untersucht werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutions-Mutationen an vorbestimmten Stellen in einer DNA mit bekannter Sequenz sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, z. B. durch M13 Primer-Mutagenese oder Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren. Vgl. ferner Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1987 und Ergänzungsbände). Die Mutationen in der DNA sollten unter normalen Umständen die kodierenden Sequenzen nicht aus den Leserahmen bringen, und sie werden vorzugsweise keine komplementären Regionen erzeugen, die hybridisieren könnten, wodurch mRNA-Sekundärstrukturen, wie beispielsweise Schleifen- oder Haarnadel-Strukturen gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner rekombinante Proteine bereit, z. B. heterologe Fusionsproteine, wobei Segmente dieser Proteine verwendet werden. Ein heterologes Fusionsprotein ist eine Fusion von Proteinen oder Segmenten, die unter normalen Bedingungen in der Natur nicht in derselben Weise fusioniert sind. Daher ist das Fusionsprodukt eines Immunglobulins mit einem DGWCC-Chemokin-Polypeptid ein kontinuierliches Proteinmolekül mit Sequenzen, die mit einer typischen Peptid-Bindung fusioniert sind, und das üblicherweise als einzelnes Translations produkt hergestellt wird und Eigenschaften aufweist, die sich von den ursprünglichen Peptiden ableiten. Ähnliches gilt für heterologe Nukleinsäuresequenzen.
Darüber hinaus können neue Konstrukte durch Kombination ähnlicher funktioneller Domänen von unterschiedlichen Proteinen hergestellt werden. Es können beispielsweise Protein-bindende Segmente oder andere Segmente zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder -Fragmenten „getauscht" werden. Vgl. z. B. Cunningham et al. (1989) Science 243: 1330–1336; und O'Dowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985–15992. Daher werden aus der funktionellen Verknüpfung von Protein-bindenden Spezifitäten und anderen funktionellen Domänen neue chimäre Polypeptide resultieren, die neue Kombinationen von Spezifitäten aufweisen.
VIII. Bindungsmittel: Chemokin-Protein-Komplexe
Ein DVic-1-Chemokin-Protein, das spezifisch (oder selektiv) an einen Antikörper bindet oder in spezifischer Weise mit einem Antikörper immunoreaktiv ist, der gegen ein definiertes Immunogen erzeugt worden ist, wie beispielsweise gegen ein Immunogen, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 8 besteht, wird üblicherweise mit Hilfe eines Immunoassays bestimmt. Der Immunoassay verwendet ein polyklonales Antiserum, das gegen ein Protein gemäß SEQ ID NO: 2, 6 oder 8 erzeugt worden ist. Dieses Antiserum wird selektiert, so dass es eine geringe Kreuzreaktivität mit anderen Chemokinen aufweist, und jegliche Kreuzreaktivität wird durch Immunoabsorption vor der Verwendung in dem Immunoassay entfernt.
Um Antiseren für eine Verwendung in einem Immunoassay herzustellen, wird das Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder 6 oder 8 wie vorliegend beschrieben isoliert. Beispielsweise kann rekombinantes Protein in einer Säugetier-Zelllinie hergestellt werden. Ein Inzucht-Stamm von Mäusen, wie beispielsweise BALB/c, wird mit dem Protein von SEQ ID NO: 2 oder 6 oder 8 immunisiert, wobei ein Standard-Adjuvans (wie beispielsweise Freud'sches Adjuvans) sowie ein Standard-Immunisierungs-Protokoll für Mäuse (vgl. Harlow und Lane, oben aufgeführt) verwendet werden.
Daneben kann ein synthetisches Peptid (vorzugsweise ein Peptid von annähernd voller Länge) als Immunogen verwendet werden, das sich von den vorliegend offenbarten Sequenzen ableitet und an ein Trägerprotein konjugiert ist. Polyklonale Seren werden gesammelt und gegen das Immunogene Protein in einem Immunoassay titriert, z. B. in einem Festphasen-Immunoassay, bei dem das Immunogen an einen festen Träger immobilisiert ist. Polyklonale Antiseren mit einem Titer von 10⁴ oder höher werden ausgewählt und auf ihre Kreuzreaktivität gegen C-, CC-, CX3C-, und CXC-Chemokine untersucht, wobei ein kompetitiver Bindungsimmunoassay verwendet wird, wie er beispielsweise in Harlow und Lane, oben aufgeführt, Seiten 570–573, beschrieben wird. Vorzugsweise werden im Rahmen dieser Bestimmung zwei Chemokine in Verbindung mit humanem DGWCC-Chemokin verwendet.
Immunoassays vom Typ der kompetitiven Bindung können für die Bestimmung der Kreuzreaktivität verwendet werden. Ein Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 und/oder SEQ ID NO: 8 kann beispielsweise an einen festen Träger immobilisiert werden. Proteine, die dem Assay zugegeben werden, konkurrieren mit der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Antigen. Die Fähigkeit der obigen Proteine, mit der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Protein zu konkurrieren, wird mit dem Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6 und/oder 8 verglichen. Der prozentuale Wert für die Kreuzreaktivität der obigen Proteine wird berechnet, wobei Standardberechnungsverfahren benutzt werden. Diejenigen Antiseren mit weniger als 10%iger Kreuzreaktivität mit jedem der oben aufgeführten Proteine werden ausgewählt und vereinigt. Die kreuzreaktiven Antikörper werden anschließend aus den vereinigten Antiseren durch Immunabsorption mit den oben aufgeführten Proteinen entfernt.
Die immunabsorbierten und vereinigten Antiseren werden anschließend in einem wie oben beschriebenen kompetitiven Bindungsimmunoassay verwendet, um ein zweites Protein mit dem immunogenen Protein (z. B. dem DGWCC-Chemokin-Motiv gemäß SEQ ID NO: 6 oder 8) zu vergleichen. Um diesen Vergleich durchzuführen, werden die beiden Proteine jeweils in einem großen Konzentrationsbereich in den Assay eingesetzt, und es wird die Menge jedes Proteins bestimmt, die erforderlich ist, um 50% der Bindung der Antiseren an das immobilisierte Protein zu inhibieren. Wenn die dazu erforderliche Menge des zweiten Proteins weniger als doppelt so hoch wie die erforderliche Menge des Proteins ist (z. B. des Proteins gemäß SEQ ID NO: 6 oder 8), wird von dem zweiten Protein angenommen, dass es spezifisch an einen Antikörper bindet, der gegen das Immunogen erzeugt wurde.
Es ist verständlich, dass das DGWCC-Chemokin-Protein eine Spezies-Form aus einer Gruppe von homologen Proteinen von Spezies ist, die nah verwandte Gene umfasst. Für ein bestimmtes Gen-Produkt (wie beispielsweise das DGWCC-Chemokin-Protein) bezeichnet der Begriff nicht nur die vorliegend offenbarten Aminosäuresequenzen, sondern darüber hinaus auch andere Proteine, die polymorphische, allelische oder nicht-allelische Varianten darstellen. Es ist ferner selbstverständlich, dass der Begriff „DGWCC" nicht-natürliche Mutationen umfasst, die durch eine gezielte Mutation unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter Verfahren, wie beispielsweise einer Mutation an einer einzelnen Stelle (single site muation), oder durch Ausschneiden kurzer Bereiche der für DGWCC-Chemokin-Proteine kodierenden DNA, oder durch Substitution neuer Aminosäuren oder durch Zufügen neuer Aminosäuren eingeführt worden sind. Solche geringfügigen Veränderungen sollten im Wesentlichen die Immunidentität des ursprünglichen Moleküls und/oder seine biologische Aktivität erhalten. Daher umfassen diese Veränderungen Proteine, die in spezifischer Weise mit einem natürlich vorkommenden DGWCC-Chemokin-Protein, z. B. dem DGWCC-Chemokin-Protein, das in SEQ ID NO: 6 oder 8 dargestellt ist, immunoreaktiv sind. Die biologischen Eigenschaften der veränderten Proteine können durch Exprimieren des Proteins in einer geeigneten Zelllinie und Messung einer geeigneten biologischen Aktivität (z. B. einer chemotaktischen Wirkung) gemessen werden. Bestimmte Protein-Modifikationen, die als geringfügig eingeschätzt werden, umfassen konservative Substitutionen von Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften, wie oben für das Gesamt-DGWCC-Chemokin beschrieben ist. Die erfindungsgemäßen Proteinzusammensetzungen lassen sich durch optimales Gegenüberstellen eines Proteins mit dem Protein gemäß SEQ ID NO: 6 oder 8 sowie unter Verwendung der vorliegend beschriebenen, herkömmlichen Immunoassays zur Bestimmung der Immunidentität, oder durch Verwendung des Lymphozyten-Chemotaxis-Assays bestimmen.
IX. Funktionelle Varianten
Die Blockierung der physiologischen Antwort auf ein DVic-1- oder DGWCC-Chemokin kann aus der Inhibierung der Bindung des Proteins an seinen Rezeptor resultieren, z. B. durch kompetitive Inhibierung. Daher werden in vitro-Assays häufig isoliertes Protein, Membranen von Zellen, die ein rekombinantes, Membran-assoziiertes erfindungsgemäßes DVic-1 exprimieren, lösliche Fragmente, die Rezeptor-bindende Segmente dieser Proteine umfassen, oder Fragmente, die an Festphasen-Substrate gebunden sind, verwendet. Diese Assays werden ferner die diagnostische Bestimmung der Auswirkung von Mutationen und Modifikationen der bindenden Segmente, oder von Mutationen und Modifikationen des Proteins (z. B. Proteinanaloga) erlauben. Diese Erfindung schlägt ferner die Verwendung eines kompetitiven Wirkstoff-Screening-Assays vor, z. B. eines Assays, bei dem neutralisierende Antikörper gegen Antigen- oder Rezeptorfragmente mit einer Testverbindung um die Bindung an das Protein konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorhandensein eines Polypeptids nachzuweisen, das eine oder mehrere Antigen-Bindungsstellen mit dem Protein gemeinsam hat, und sie können ferner verwendet werden, um Bindungsstellen auf dem Protein zu besetzen, die andernfalls mit einem Rezeptor interagieren könnten.
„Derivate" (beispielsweise von DGWCC-Chemokin-Antigenen) umfassen Aminosäuresequenz-Mutanten, Glykosylierungs-Varianten sowie kovalente und aggregierte Konjugate mit anderen chemischen Resten. Kovalente Derivate können mit Hilfe von im Stand der Technik hinreichend bekannten Mitteln durch Bindung von Funktionalitäten an Gruppen hergestellt werden, die in Aminosäure-Seitenketten des DGWCC-Chemokins oder an den N- oder C-Termini vorgefunden werden. Diese Derivate können ohne Einschränkung umfassen: aliphatische Ester oder Amide des Carboxy-Terminus oder von Resten, die Carboxyl-Seitenketten enthalten, O-Acyl-Derivate von Hydroxylgruppen-enthaltenden Resten sowie N-Acylderivate der aminoterminalen Aminosäure oder Aminogruppen-enthaltende Reste, z. B. Lysin oder Arginin. Acylgruppen werden aus der Gruppe von Alkyl-Resten ausgewählt, einschließlich z. B. C3-C18-Normalalkyl, wodurch Alkanoyl-Aroyl-Arten gebildet werden. Eine kovalente Anbindung an Trägerproteine kann wichtig sein, wenn die immunogenen Reste Haptene sind.
Insbesondere sind Änderungen der Glykosylierung umfasst, die z. B. durch Modifizieren des Glykosylierungs-Musters eines Polypeptids während seiner Synthese und Prozessierung oder in weiteren Prozessierungsschritten erreicht wird. Besonders bevorzugte Mittel zur Erreichung dieses Ziels bestehen darin, daß das Polypeptid glykosylierenden Enzymen ausgesetzt wird, die von Zellen stammen, die normalerweise eine solche Prozessierung bereitstellen, z. B. Glykosylierungsenzyme aus einem Säugetier. Deglykosylierungsenzyme werden ebenfalls vorgeschlagen. Ferner umfasst sind Versionen der gleichen primären Aminosäuresequenz, die andere geringfügige Modifikationen aufweisen, einschließlich phosphorylierte Aminosäurereste, z. B. Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreonin, oder andere Reste, einschließlich Ribosyl-Gruppen oder quervernetzende Reagenzien.
Eine große Gruppe von Derivaten sind kovalente Konjugate des DGWCC-Chemokins oder von Fragmente desselben mit anderen Proteinen oder Polypeptiden. Diese Derivate können in rekombinanter Kultur (wie beispielsweise N- oder C-terminale Fusionen) oder durch die Verwendung von Mitteln, die im Stand der Technik für ihre Verwendbarkeit in quervernetzenden Proteinen durch reaktive Seitengruppen bekannt sind, synthetisiert werden. Bevorzugte Protein-Derivatisierungsstellen mit quervernetzenden Mitteln befinden sich an freien Aminogruppen, Kohlenhydrat- und Cysteinresten.
Fusionspolypeptide zwischen dem erfindungsgemäßen Chemokin und anderen homologen oder heterologen Proteinen werden ebenfalls bereitgestellt. Zahlreiche Wachstumsfaktoren und Cytokine sind homodimere Gebilde und ein Wiederholungs-Konstrukt könnte verschiedene Vorteile haben, einschließlich der verringerten Empfindlichkeit gegenüber proteolytischer Degradation. Darüber hinaus benötigen zahlreiche Rezeptoren eine Liganden-Dimerisierung, um ein Signal zu transduzieren, und mehrere dimere Proteine oder Domaine-Wiederholungen können erstrebenswert sein. Heterologe Polypeptide können aus Fusionen zwischen verschiedenen Oberflächenmarkern bestehen, die beispielsweise zu einem Hybridprotein führen, das Rezeptor-Bindungsspezifität aufweist. Auf ähnliche Weise können heterologe Fusionen konstruiert werden, die eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der Derivat-Proteine aufweisen würden. Typische Beispiele sind Fusionen von einem Reporterpolypeptid (z. B. Luziferase) mit einem Segment oder einer Domäne eines Proteins (z. B. einem Rezeptor-bindenden Segment), sodass das Vorhandensein oder die Lokalisierung des fusionierten Proteins problemlos festgestellt werden kann. Vgl. z. B. Dull et al., U.S. Patent-Nr. 4,859,609. Andere Gen-Fusionspartner umfassen bakterielle β-Galaktosidase, trpE, Protein A, β-Laktamase, alpha-Amylase, Alkohol-Dehydrogenase sowie den Mating-Faktor α aus der Hefe. Vgl. z. B. Godowski et al. (1988) Science 241: 812–816.
Solche Polypeptide können darüber hinaus Aminosäurereste aufweisen, die chemisch durch Phosphorylierung, Sulfonierung, Biotinylierung oder durch Zusatz oder Entfernen von anderen Resten (insbesondere solchen, die eine den Phosphatgruppen ähnliche molekulare Form haben) modifiziert werden. In einigen Ausführungsformen werden die Modifikationen nützliche Markierungs-Reagenzien sein oder als Aufreinigungsziele (z. B. Affinitätsliganden) dienen. Diese Erfindung schlägt ferner die Verwendung von Derivaten des erfindungsgemäßen Chemokins vor, die keine Variationen der Aminosäuresequenz oder Glykosylierung darstellen. Solche Derivate können die kovalente oder aggregative Assoziierung mit chemischen Resten betreffen. Diese Derivate fallen üblicherweise in drei Klassen: (1) Salze, (2) kovalente Modifikationen der Seitenkette und kovalente Modifikationen des terminalen Rests und (3) Adsorptionskomplexe, beispielsweise mit Zellmembranen. Diese kovalenten oder aggregativen Derivate sind nützlich als Immunogene, als Reagenzien in Immunoassays oder bei Aufreinigungsverfahren, wie beispielsweise die Affinitäts-Aufreinigung von Liganden oder anderen bindenden Liganden. Ein DGWCC-Chemokin-Antigen kann beispielsweise durch im Stand der Technik hinreichend bekannte Verfahren über die kovalente Bindung an einen festen Träger (wie beispielsweise Cyanbromid-aktivierte Sepharose) immobilisiert werden, oder es kann mit oder ohne Glutaraldehyd-Quervernetzung auf Polyolefin-Oberflächen absorbiert werden, um in dem Assay oder bei der Aufreinigung von Anti-DGWCC-Chemokin-Antikörpern oder seinem Rezeptor verwendet zu werden. Das DGWCC-Chemokin kann ferner für die Verwendung in diagnostischen Assays mit einer detektierbaren Gruppe markiert werden; es kann z. B. durch das Chloramin T-Verfahren mit radioaktivem Iod iodiniert, kovalent an seltene Erd-Chelatverbindungen gebunden oder an andere fluoreszente Reste konjugiert werden. Die Aufreinigung von DGWCC-Chemokinen kann durch immobilisierte Antikörper oder durch den Rezeptor bewirkt werden.
Isolierte DGWCC-Chemokin-Gene werden die Transformation von Zellen erlauben, denen die Expression eines entsprechenden DGWCC-Chemokins fehlt, z. B. von anderen Spezies-Typen oder Zellen, denen die entsprechenden Proteine fehlen, und die eine negative Hintergrund-Aktivität aufweisen. Die Expression von transformierten Genen wird die Isolierung von antigenisch reinen Zelllinien mit definierten oder einzelnen Spezies-Varianten erlauben. Diese Vorgehensweise wird eine sensitivere Detektion und Unterscheidung der physiologischen Wirkungen von DGWCC-Chemonkin-Rezeptor-Proteinen ermöglichen. Subzelluläre Fragmente, z. B. Cytoplasten oder Membranfragmente können isoliert und verwendet werden. Die Beschreibungen, die sich beispielhaft auf DGWCC stützen, werden üblicherweise alternativ auf DVic-1 anwendbar sein.
X. Verwendungen
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit, die in diagnostischen Anwendungen Verwendung finden, wie vorliegend an anderer Stelle beschrieben wird, z. B. bei der allgemeinen Beschreibung der Entwicklungs-Abnormalitäten oder nachstehend im Rahmen der Beschreibung von Kits für die Diagnose.
DGWCC-Chemokin-Nukleotide (z. B. DGWCC-Chemokin-DNA oder -RNA) können beispielsweise als Komponente in einem forensischen Assay verwendet werden. Die bereitgestellten Nukleotidsequenzen können beispielsweise unter Verwendung von z. B. ³²P oder Biotin markiert werden und verwendet werden, um in standardmäßigen Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-Blots als Sonde eingesetzt zu werden, vorausgesetzt es existiert eine messbarere Größe, die dabei hilft, zwischen Individuen oder z. B. nach Spezies-Herkunft zu unterscheiden. Solche Sonden können in hinreichend bekannten forensischen Verfahren, wie beispielsweise dem genetischen Fingerabdruck, verwendet werden. Zusätzlich können die Nukleotid-Sonden, die aus DGWCC Cheomokin-Sequenzen hergestellt worden sind, in in situ-Assays verwendet werden, um chromosomale Abnormalitäten zu detektieren. Es können beispielsweise Umlagerungen im menschlichen Chromosom, das für ein DGWCC-Chemokin-Gen kodiert, mittels hinreichend bekannter in situ-Verfahren unter Verwendung von DGWCC-Chemokin-Sonden in Verbindung mit anderen bekannten Chromosom-Markern detektiert werden.
Antikörper und andere Bindungsmittel, die gegen DGWCC-Chemokin-Proteine oder DGWCC-Chemokin-Nukleinsäuren gerichtet sind, können dazu verwendet werden, um das entsprechende DGWCC-Chemokin-Molekül zu reinigen. Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, ist die Antikörper-Aufreinigung von DGWCC-Chemokin-Komponenten sowohl möglich als auch ausführbar. Antikörper und andere Bindungsmittel können ferner in diagnostischer Weise verwendet werden, um zu bestimmen, ob DGWCC-Chemokin-Komponenten in einer Gewebeprobe oder Zellpopulation vorhanden sind, wobei die vorliegend beschriebenen, hinreichend bekannten Verfahren angewendet werden. Die Fähigkeit, ein Bindungsmittel an ein DGWCC-Chemokin anzuheften, stellt ein Mittel zur Diagnose von Störungen bereit, die mit einer fehlerhaften Regulierung des DGWCC-Chemokins assoziiert sind. Antikörper und andere DGWCC-Chemokin-Bindungsmittel können ferner als biologische Marker nützlich sein. Wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, ist die DGWCC-Chemokin-Expression auf spezifische Gewebetypen beschränkt. Indem man eine Sonde, wie beispielsweise ein Antikörper oder eine Nukleinsäure, gegen ein DGWCC-Chemokin richtet, ist es möglich, die Sonde dazu zu verwenden, um Gewebe- und Zell-Typen in situ oder in vitro zu unterscheiden.
Diese Erfindung stellt ferner Reagenzien von signifikantem therapeutischen Wert bereit. Die erfindungsgemäßen Chemokine (natürlich vorkommende oder rekombinante), Fragmente derselben und Antikörper gegen selbige sind zusammen mit Verbindungen, bei denen eine Bindungsaffinität für das Chemokin nachgewiesen wurde, bei der Behandlung von Zuständen nützlich, die mit abnormaler Physiologie oder Entwicklung assoziiert sind, einschließlich abnormaler Proliferation (z. B. krebsartige Zustände) oder degenerativen Zuständen. Abnormale Proliferation, Regeneration, Degeneration und Atrophie können durch geeignete therapeutische Behandlung unter Verwendung der vorliegend bereitgestellten Zusammensetzungen moduliert werden. Eine Erkrankung oder Störung, die mit abnormaler Expression oder abnormaler Signalübertragung durch ein DGWCC-Chemokin assoziiert ist, stellt beispielsweise ein Ziel für einen Argonisten oder Antogonisten des Proteins dar. Die Proteine spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Regulation oder Entwicklung von neuronalen oder hämatopoetischen Zellen (z. B. lymphoiden Zellen), die immunologische Antworten bewirken.
Andere abnormale Entwicklungszustände sind in Zelltypen bekannt, bei denen durch Northern-Blot-Analyse gezeigt wurde, dass sie DVic-1- oder DGWCC-Chemokin-mRNA besitzen. Vgl. Berkow (Hrsg.) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy Merck & Co., Rahway, NJ; und Thorn et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y. Entwicklungsabnormalitäten oder funktionelle Abnormalitäten (z. B. des neuronalen Systems oder des Immunsystems) verursachen signifikante medizinische Abnormalitäten und Zustände, die einer Vorbeugung oder Behandlung unter Verwendung der vorliegend vorgeschlagenen Zusammensetzungen zugänglich sind.
Bestimmte Chemokine stehen ferner mit viralen Replikationsmechanismen im Zusammenhang. Vgl. z. B. Cohen (1996) Science 272: 809–810; Feng et al. (1996) Science 272: 872–877; und Cocchi et al. (1995) Science 270: 1811–1816. Das DVic-1- oder DGWCC-Chemokin könnte in einem ähnlichen Zusammenhang nützlich sein.
Rekombinantes DVic-1- oder DGWCC-Chemokin oder Chemokin-Antikörper können gereinigt und anschließend an einen Patienten verabreicht werden. Diese Reagenzien können zur therapeutischen Verwendung mit weiteren aktiven oder inerten Bestandteilen kombiniert werden, z. B. in konventionellen, pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln, z. B. immunogenen Adjuvanzien, zusammen mit physiologisch unbedenklichen Stabilisatoren und Arzneimittel-Trägerstoffen. Diese Kombinationen können steril filtriert und in Dosierungen eingebracht werden, wie z. B. durch Lyophilisierung in Dosierungs-Gefäßen oder Lagerung in stabilisierten wässrigen Präparationen. Diese Erfindung schlägt ferner die Verwendung von Antikörpern oder bindenden Fragmenten derselben vor, einschließlich Formen, die keine Komplementbindung darstellen.
Ein Wirkstoff-Screening unter Verwendung von Antikörpern oder des Rezeptors oder Fragmenten derselben kann Verbindungen mit Bindungsaffinität für das DVic-1- oder DGWCC-Chemokin identifizieren, einschließlich der Isolierung von assoziierten Bestandteilen. Nachfolgende biologische Assays können anschließend angewendet werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine innewohnende stimulierende Aktivität aufweist und somit ein Blockierungsmittel oder einen Antagonisten darstellt, da es die Aktivität des Proteins blockiert. In ähnlicher Weise kann eine Verbindung mit innewohnender stimulierender Aktivität den Rezeptor aktivieren und daher einen Agonisten darstellen, da es die Aktivität z. B. eines DGWCC-Chemokins stimuliert. Ferner wird vorliegend die therapeutische Verwendung von Antikörpern gegen DGWCC-Chemokin als Antagonisten offenbart. Dieser Ansatz sollte insbesondere bei weiteren Spezies-Varianten von DGWCC-Chemokin nützlich sein.
Die Mengen an Reagenzien, die für eine wirksame Therapie erforderlich sind, werden von zahlreichen verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich von den Verabreichungsmitteln, von der Zielstelle, vom physiologischen Zustand des Patienten und von anderen verabreichten Medikamenten. Aus diesem Grund sollten Behandlungs-Dosierungen titriert werden, um Sicherheit und Wirksamkeit zu optimieren. Typischerweise können die in vitro verwendeten Dosierungen einen nützlichen Hinweis für die Mengen darstellen, die für die in situ-Verabreichung dieser Reagenzien verwendet werden können. Untersuchungen an Tieren in Bezug auf wirksame Dosierungen für die Behandlung von bestimmten Störungen werden weitere prediktive Aussagen für die Dosierung beim Menschen ergeben. Verschiedene Überlegungen werden, z. B. in Gilman et al. (Hrsg.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. Auflage) Pergamon Press; und (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage) Mack Publishing Co., Easton, PA, beschrieben. Verfahren zur Verabreichung werden dort sowie im folgenden diskutiert, z. B. für die orale, intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung, für die transdermale Diffusion und andere. Pharmazeutisch verträgliche Träger werden Wasser, Saline, Puffer und andere Verbindungen umfassen, die z. B. im Merck Index, Merck & Co., Rahway, N.J., beschrieben sind. Normalerweise würde man erwarten, dass die Dosierungsbereiche in Mengen vorliegen, die geringer sind als 1 mM-Konzentrationen, typischerweise geringer als etwa 10 μM, üblicherweise geringer als etwa 100 nM, vorzugsweise geringer als etwa 10 pM (Picomolar), und am meisten bevorzugt weniger als etwa 1 fM (Femtomolar), mit einem geeigneten Träger. Depot-Formulierungen oder Depot-Vorrichtungen werden häufig für eine kontinuierliche Verabreichung verwendet.
Das erfindungsgemäße DVic-1 Chemokin, Fragmente desselben sowie Antikörper gegen das Chemokin oder seine Fragmente, Antagonisten und Argonisten können dem zu behandelnden Wirt direkt verabreicht werden, oder es kann (abhängig von der Größe der Verbindungen) erstrebenswert sein, diese vor ihrer Verabreichung an Trägerproteine, wie beispielsweise Ovalbumin oder Serumalbumin zu konjugieren. Therapeutische Formulierungen können in jeder herkömmlichen Dosierungs-Formulierung verabreicht werden. Während es für den aktiven Bestandteil möglich ist, allein verabreicht zu werden, wird es bevorzugt, diesen als eine pharmazeutische Formulierung zu präsentieren. Formulierungen umfassen üblicherweise mindestens einen wie oben definierten aktiven Bestandteil, zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern desselben. Jeder Träger sollte sowohl in pharmazeutischer als auch in physiologischer Hinsicht in dem Sinne verträglich sein, dass er mit den anderen Inhaltsstoffen kompatibel ist und dem Patienten keinen Schaden zufügt. Die Formulierungen umfassen solche, die für die orale, rektale, nasale oder parenterale (einschließlich subkutane, intramuskuläre, intravenöse und intradermale) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in Einheits-Dosierungen vorliegen und können durch jedes im Stand der Technik im Bereich Pharmazie bekanntes Verfahren hergestellt werden. Vgl. z. B. Gilman et al. (Hrsg.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. Auflage), Pergamon Press; und (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage) Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis et al. (Hrsg.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, N.Y.; Liebermann et al. (Hrsg.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, N.Y.; und Liebermann et al. (Hrsg.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, N.Y. Die erfindungsgemäße Therapie kann mit anderen therapeutischen Mitteln kombiniert werden oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln verwendet werden.
Sowohl die natürlich vorkommenden Formen als auch die rekombinanten Formen der erfindungsgemäßen DVic-1-Chemokine sind besonders nützlich in Kits und Assay-Verfahren, die in der Lage sind, Verbindungen auf eine Bindungsaktivität an die Proteine zu untersuchen. Zahlreiche automatisierte Assays-Verfahren sind in den vergangenen Jahren entwickelt worden, so dass das Screening von zehntausenden von Verbindungen in einem kurzen Zeitraum möglich ist. Vgl. z. B. Fodor et al. (1991) Science 251: 767–773, sowie andere Beschreibungen von chemischen Diversitäts-Bibliotheken, die Mittel für die Untersuchung von Bindungsaffinität durch eine Vielzahl von Verbindungen beschreiben. Die Entwicklung von geeigneten Assays kann durch die Verfügbarkeit von großen Mengen an gereinigtem, löslichen Chemokin, wie es erfindungsgemäß bereitgestellt wird, erheblich erleichtert werden.
Beispielsweise können normalerweise Antagonisten gefunden werden, sobald das Protein strukturell definiert worden ist. Die Untersuchung von potentiellen Protein-Analoga ist nunmehr durch die Entwicklung von stark automatisierten Assay-Verfahren unter Verwendung eines gereinigten Rezeptors möglich. Unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Screening-Verfahren werden insbesondere neue Agonisten und Antagonisten entdeckt werden. Besonders wichtig sind Verbindungen, bei denen man herausgefunden hat, dass sie eine kombinierte Bindungs-Affinität für mehrere DGWCC-Chemokin-Rezeptoren aufweisen, z. B. Verbindungen, die als Antagonisten für Spezies-Varianten eines DGWCC-Chemokins dienen können.
Diese Erfindung ist insbesondere nützlich für das Screening von Verbindungen durch Verwendung eines rekombinanten Proteins in einer Vielzahl von Wirkstoff-Screening-Verfahren. Die Vorteile der Verwendung eines rekombinanten Proteins beim Screening nach spezifischen Liganden umfassen: (a) eine verbesserte, erneuerbare Bezugsquelle für das DGWCC-Chemokin spezifischer Herkunft; (b) eine potentiell größere Anzahl von Liganden pro Zelle, was zu einer besseren Signal/Hintergrund-Rate in einem Assay führt; und (c) eine Spezifität für Spezies-Varianten (was theoretisch zu größerer biologischer Spezifität und Krankheits-Spezifität führt.
Ein Verfahren des Wirkstoff-Screenings verwendet eukaryontische oder prokaryontische Wirtszellen, die stabil mit rekombinanten DNA-Molekülen transformiert sind und einen Chemokin-Rezeptor exprimieren. Zellen, die einen Rezeptor exprimieren, können isoliert und von allen anderen Zellen getrennt werden. Solche Zellen (entweder in lebensfähiger oder fixierter Form) können für Standard-Liganden/Rezeptor-Bindungs-Assays verwendet werden. Vgl. ferner Parce et al. (1989) Science 246: 243–247; und Owicki et al. (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci USA. 87: 4007–4011, die sensitive Verfahren zur Detektion zellulärer Antworten beschreiben. Kompetitive Assays sind insbesondere nützlich, wo die Zellen (Bezugsquelle für das DGWCC-Chemokins) mit einem markierten Rezeptor oder mit einem Antikörper bekannter Bindungsaffinität für den Liganden (wie z. B. ein ¹²⁵I-Antikörper), und mit einer Testprobe, deren Bindungsaffinität für die Bindungs-Zusammensetzung gemessen wird, in Kontakt gebracht und inkubiert werden. Die gebundenen und freien markierten Bindungs-Zusammensetzungen werden anschließend getrennt, um den Grad der Ligandenbindung festzustellen. Die Menge der gebundenen Testverbindungen ist umgekehrt proportional zu der Menge an markiertem Rezeptor, der an die bekannte Quelle bindet. Jede von zahlreichen Methoden kann verwendet werden, um zur Feststellung des Grads der Ligandenbindung gebundene Liganden von freien Liganden zu trennen. Dieser Trennungsschritt kann üblicherweise ein Verfahren, wie z. B. die Adhäsion an Filter mit anschließendem Waschen, die Adhäsion an Kunststoff mit anschließendem Waschen oder die Zentrifugation der Zellmembranen umfassen. Lebensfähige Zellen können ferner dazu verwendet werden, die Auswirkungen von Wirkstoffen auf Funktionen zu untersuchen, die von DGWCC-Chemokin vermittelt werden, z. B. die Mengen von „Second Messenger"-Molekülen (d. h. Ca⁺⁺); die Zellproliferation; die Veränderungen des Inositol-Phosphat-Pools und andere. Einige Detektionsverfahren erlauben das Auslassen eines Trennungsschritts, z. B. ein Nähe-sensitives Detektionssystem. Calcium-sensitive Farbstoffe werden nützlich sein, um mittels eines Flourimeters oder eines Fluoreszenz-Zellsortierungsapparats Ca⁺⁺-Gehalte zu detektieren.
Ein weiteres Verfahren verwendet Membranen von transformierten eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen als Bezugsquelle für das DGWCC-Chemokin. Diese Zellen sind stabil mit DNA-Vektoren transformiert, die die Expression eines DGWCC-Chemokins steuern, z. B. einer konstruierten Membran-gebundenen Form. Die Membranen würden im wesentlichen von den Zellen präpariert werden und in einem Rezeptor/Liganden-Bindungs-Assay verwendet werden, wie beispielsweise dem zuvor erwähnten kompetitiven Assay.
Ein weiterer Ansatz ist die Verwendung von solubilisiertem ungereinigtem oder solubilisiertem gereinigtem DGWCC-Chemokin aus transformierten eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen. Dies ermöglicht einen „molekularen" Bindungs-Assay mit den Vorteilen einer erhöhten Spezifität, der Möglichkeit der Automatisierung sowie einem hohen Durchsatz bei der Wirkstoff-Untersuchung.
Eine weitere Methode zum Screening von Wirkstoffen betrifft einen Ansatz, der ein Screening mit hohem Durchsatz nach Verbindungen mit einer geeigneten Bindungsaffinität für einen DGWCC-Chemokin-Antikörper bereitstellt und im Detail in Geysen, Europäische Patentanmeldung 84/03564, veröffentlicht am 13. Dezember 1984, beschrieben wird. Zunächst wird eine große Anzahl von verschiedenen kleinen Peptid-Testverbindungen auf einem festen Substrat synthetisiert, z. B. auf Kunststoff-Stiften („pins") oder anderen geeigneten Oberflächen, vgl. Fodor et al., oben aufgeführt. Anschließend werden alle Stifte mit solubilisiertem ungereinigtem oder solubilisiertem gereinigtem DGWCC-Chemokin-Antikörper umgesetzt und gewaschen. Der nächste Schritt umfasst das Detektieren von gebundenem DGWCC-Chemokin-Antikörper.
Die Wirkstoff-Forschung („rational drug design") kann ebenfalls auf strukturellen Untersuchungen der molekularen Formen des DGWCC-Ghemokins und anderen Effektoren oder Analoga basieren. Vgl. z. B. Methods in Enzymology, Bände 202 und 203. Effektoren können andere Proteine sein, die andere Funktionen als Antwort auf die Ligandenbindung vermitteln, oder andere Proteine, die normalerweise mit dem Rezeptor interagieren. Ein Mittel zur Bestimmung, welche Stellen mit spezifischen anderen Proteinen interagieren, ist eine physikalische Strukturbestimmung, z. B. Röntgenstrahlen-Kristallographie oder zweidimensionale NMR-Verfahren. Diese werden Aufschluss darüber geben, welche Aminosäurereste die molekularen Kontaktregionen bilden. Für eine ausführliche Beschreibung der Bestimmung der Proteinstruktur vgl. z. B. Blundell und Johnson (1976) Protein Crystallographx Academic Press, N.Y.
Ein gereinigtes DGWCC-Chemokin kann zur Verwendung in den zuvor genannten Verfahren des Wirkstoff-Screenings direkt auf Platten beschichtet werden. Es können jedoch nicht-neutralisierende Antikörper gegen diese Liganden als Capture-Antikörper verwendet werden, um den betreffenden Liganden an eine feste Phase zu immobilisieren. Beispiele mit DGWCC werden abwechselnd mit DVic-1-Chemokin durchgeführt werden.
XI. Kits
Die erfindungsgemäßen DVic-1-Chemokin-Proteine und ihre Fusionprodukte können in einer Vielzahl von diagnostischen Kits und bei einer Vielzahl von Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins eines Chemokins oder eines Chemokin-Rezeptors verwendet werden. Das Kit wird üblicherweise ein Fach aufweisen, das entweder ein definiertes DVic-1-Chemokin-Peptid oder ein DVic-1-Chemokin-Gen-Segment oder ein Reagenz umfasst, das entweder eines von beiden erkennt, z. B. Rezeptor-Fragmente oder Antikörper.
Ein Kit zur Bestimmung der Bindungsaffinität einer Testverbindung für ein DGWCC-Chemokin würde beispielsweise üblicherweise eine Testverbindung umfassen; eine markierte Verbindung, z. B. einen Rezeptor oder einen Antikörper mit bekannter Bindungsaffinität für das DGWCC-Chemokin; eine Bezugsquelle für das DGWCC-Chemokin (natürlich vorkommend oder rekombinant); sowie ein Mittel zur Trennung der gebundenen markierten von der freien markierten Verbindung, wie z. B. eine Festphase zur Immobilisierung des DGWCC-Chemokins. Sobald Verbindungen gescreent worden sind, können diejenigen mit geeigneter Bindungsaffinität für das DGWCC-Chemokin in geeigneten, im Stand der Technik hinreichend bekannten biologischen Assays untersucht werden, um zu bestimmen, ob diese gegenüber dem Rezeptor als Agonisten oder Antagonisten wirken. Die Verfügbarkeit von rekombinanten DGWCC-Chemokin-Polypeptiden stellt darüber hinaus hinreichend definierte Standards für die Kalibrierung solcher Assays bereit.
Ein bevorzugtes Kit zur Bestimmung der Konzentration z. B. eines DGWCC-Chemokins in einer Probe würde üblicherweise eine markierte Verbindung umfassen (z. B. einen Rezeptor oder Antikörper mit bekannter Bindungsaffinität für das DGWCC-Chemokin), eine Bezugsquelle für das DGWCC-Chemokin (natürlich vorkommendes oder rekombinantes) sowie ein Mittel zur Trennung der gebundenen markierten Verbindung von der freien markierten Verbindung, wie z. B. eine Festphase zur Immobilisierung des DGWCC-Chemokins. Normalerweise werden Fächer, die Reagenzien enthalten, sowie Instruktionen bereitgestellt.
Antikörper, einschließlich Antigen-bindender Fragmente, die spezifisch für das DGWCC-Chemokin oder die Liganden-Fragmente sind, sind im Rahmen von diagnostischen Anwendungen nützlich, um das Vorhandensein von erhöhten Mengen an DGWCC-Chemokin und/oder seinen Fragmenten nachzuweisen. Solche diagnostischen Assays können mit Lysaten, lebenden Zellen, fixierten Zellen, Immunfluoreszenz, Zellkulturen und Körperflüssigkeiten arbeiten, und können ferner die Detektion von mit dem Liganden verwandten Antigenen im Serum oder ähnliches einschließen. Diagnostische Assays können homogen (ohne Trennungsschritt zwischen dem freien Reagenz und dem Antigen-DGWCC-Chemokin-Komplex) oder heterogen (mit einem Trennungsschritt) sein. Es existieren zahlreiche kommerzielle Assays, wie beispielsweise der Radioimmunassay (RIA), der Enzym-gebundene Immunossay (ELISA), der Enzym-Immunoassay (EIA), das Enzym-verstärkte Immunoassay-Verfahren (EMIT), der Substrat-markierte Fluoreszenz-Immunoassay (SLFIA) und andere. Es können z. B. unmarkierte Antikörper verwendet werden, indem ein zweiter Antikörper verwendet wird, der markiert ist und den Antikörper gegen das DGWCC-Chemokin oder gegen ein bestimmtes Fragment desselben erkennt. Ähnliche Assays wurden ausführlich in der Literatur diskutiert. Vgl. z. B. Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press, NY; Chan (Hrsg.) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price und Newman (Hrsg.) (1991) Principles and Practice of Immunoassay Stockton Press, NY; und Ngo (Hrsg.) (1988) Nonisotopic Immunoassay Plenum Press, NY.
Anti-idiotypische Antikörper könnten eine ähnliche Verwendung bei der Diagnose des Vorhandenseins von Antikörpern gegen ein DGWCC-Chemokin finden, da dieses für zahlreiche abnormale Zustände diagnostisch sein kann. Die Überproduktion von DGWCC-Chemokin könnte beispielsweise zu zahlreichen immunologischen und anderen medizinischen Reaktionen führen, die für abnormale physiologische Zustände diagnostisch sein können, z. B. beim Zellwachstum, der Zellaktivierung oder der Zelldifferenzierung.
Die Reagenzien für diagnostische Assays werden häufig in Kits vertrieben, so daß die Sensitivität des Assays optimiert wird. Für die Erfindung wird in Abhängigkeit von der Art des Assays, dem Protokoll und der Markierung entweder markierter oder unmarkierter Antikörper oder Rezeptor oder markiertes DGWCC-Chemokin beschrieben. Dieses liegt üblicherweise in Verbindung mit anderen Additiven vor, wie beispielsweise mit Puffern, Stabilisatoren, Materialien, die für die Erzeugung eines Signals notwendig sind (wie z. B. Substrate für Enzyme) und ähnlichem. Vorzugsweise wird das Kit darüber hinaus Anweisungen für die geeignete Verwendung und Entsorgung der Inhalte nach Gebrauch enthalten. Üblicherweise verfügt das Kit über Fächer für jedes nützliche Reagenz. Vorzugsweise werden die Reagenzien als trockenes, lyophilisiertes Pulver bereitgestellt, wobei die Reagenzien in wäßrigem Medium wiederhergestellt werden können, wodurch geeignete Konzentrationen der Reagenzien für die Durchführung des Assays bereitgestellt werden.
Viele der zuvor genannten Bestandteile des Wirkstoff-Screenings und der diagnostischen Assays können ohne Modifikation verwendet oder auf vielfältige Weise modifiziert werden. Die Markierung kann beispielsweise durch kovalente oder nicht kovalente Bindung eines Restes erreicht werden, der auf direkte oder indirekte Art ein detektierbares Signal bereitstellt. In jedem dieser Assays kann das Protein, die Testverbindung, das DGWCC-Chemokin oder die Antikörper gegen selbiges entweder direkt oder indirekt markiert werden. Möglichkeiten für eine direkte Markierung umfassen folgende Markierungsgruppen: Radiomarkierungen, wie beispielsweise ¹²⁵I, Enzyme (U.S. Patent Nr. 3,645,090), wie beispielsweise Peroxidase oder alkalische Phosphatase, sowie fluoreszente Markierungen (U.S. Patent Nr. 3,940,475), die in der Lage sind, die Veränderung der Fluoreszenzintensität, der Wellenlänge oder der Fluoreszenz-Polarisierung zu verfolgen. Möglichkeiten für eine indirekte Markierung umfassen die Biotinylierung eines Bestandteils gefolgt von der Bindung an Avidin, welches an eine der obigen Markierungsgruppen gekoppelt ist.
Es existieren ferner zahlreiche Verfahren zum Trennen des gebundenen Liganden vom freien Liganden oder alternativ dazu Verfahren zum Trennen der gebundenen Testverbindung von der freien Testverbindung. Das DGWCC-Chemokin kann auf verschiedenen Matrices immobilisiert werden, gefolgt von einem Waschschritt. Geeignete Matrices umfassen Kunststoffe, wie beispielsweise eine ELISA-Platte, Filter und Kügelchen (beads). Verfahren zur Immobilisierung des DGWCC-Chemokins an eine Matrix umfassen (ohne Einschränkung) die direkte Adhäsion an den Kunststoff, die Verwendung eines Capture-Antikörpers, die chemische Kopplung sowie Biotin-Avidin. Der letzte Schritt bei diesem Ansatz umfaßt die Präzipitation des Ligand/Rezeptor- oder Ligand/Antikörper-Komplexes durch eines von zahlreichen Verfahren, einschließlich derjenigen Verfahren, die beispielsweise ein organisches Lösungsmittel (wie z. B. Polyethylen-Glycol) oder ein Salz (wie z. B. Ammoniumsulfat) verwenden. Andere geeignete Trennungsverfahren umfassen (ohne Einschränkung) das Fluoreszein-Antikörper-Verfahren unter Verwendung magnetisierbarer Partikel, das in Rattle, et. Al (1984) Clin. Chem. 30: 1457–1461 beschrieben ist, und das Trennungsverfahren mit zwei Antikörpern unter Verwendung magnetisierbarer Partikel, das in U.S. Patent Nr. 4,659,678 beschrieben ist.
Verfahren zur Verbindung von Proteinen oder deren Fragmenten mit verschiedenen Markierungen wurden ausführlich in der Literatur beschrieben und erfordern an dieser Stelle keine eingehende Erörterung. Viele dieser Verfahren umfassen die Verwendung von aktivierten Carboxylgruppen, entweder durch Verwendung von Carbodiimiden oder aktiven Estern zur Bildung von Peptidbindungen, durch Bildung von Thioethern mittels Reaktion einer Mercaptogruppe mit einem aktivierten Halogen (wie beispielsweise Chloracetyl) oder durch Verwendung eines aktivierten Olefins (wie beispielsweise Maleimid) zur Verbindung o. ä. Fusionsproteine werden ebenfalls in diesen Anwendungen verwendet werden.
Ein weiterer diagnostischer Aspekt, der vorliegend beschrieben wird, betrifft die Verwendung von Oligonukleotid- oder Polynucleotid-Sequenzen, die aus der Sequenz von einem DGWCC-Chemokin stammen. Diese Sequenzen können als Sonden für den Nachweis der Mengen an Botenmolekül für das DGWCC-Chemokin in Proben von natürlichen Bezugsquellen oder von Patienten dienen, bei denen der Verdacht besteht, daß sie einen abnormalen Zustand aufweisen, z. B. Krebs- oder ein Entwicklungsproblem. Die Herstellung von sowohl RNA- als auch von DNA-Nukleotidsequenzen, die Markierung der Sequenzen und die bevorzugte Größe der Sequenzen wurden in der Literatur ausführlich beschrieben und diskutiert.
Normalerweise sollte eine Oligonukleotid-Sonde mindestens etwa 14 Nukleotide, und üblicherweise mindestens etwa 18 Nukleotide umfassen, und die Polynukleotid-Sonden sollten bis zu einigen Kilobasen groß sein. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, wobei Radionuklide am gebräuchlichsten sind, insbesondere ³²P. Es können jedoch auch andere Methoden verwendet werden, wie beispielsweise die Verwendung von Biotin-modifizierten Nukleotiden zum Einbau in ein Polynukleotid. Das Biotin dient dabei als Stelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl von Markierungen markiert werden können, wie beispielsweise mit Radionukliden, Fluorophoren, Enzymen oder ähnlichem. Daneben können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe, DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Assay kann ausgeführt werden, wobei der Duplex an eine Oberfläche gebunden wird, so daß bei der Bildung des Duplex auf der Oberfläche die Gegenwart des Antikörpers detektiert werden kann, der an den Duplex gebunden hat. Die Verwendung von Sonden gegen die neue Anti-Sense-RNA kann unter Verwendung zahlreicher herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, wie beispielsweise der Nukleinsäure-Hybridisierung, dem Plus- und Minus-Screening, der rekombinanten Sonden-Untersuchung, dem Hybrid-released translation (HRT)-Verfahren und dem Hybrid-arrested translation (HART)-Verfahren. Ferner sind dabei Amplifikationsverfahren wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingeschlossen.
Diagnostische Kits, die ferner das qualitative oder quantitative Vorhandensein dieser oder anderer Marker untersuchen, werden ebenfalls vorgeschlagen. Die Diagnose oder Prognose kann von der Kombination zahlreicher Anzeichen abhängen, die als Marker verwendet werden. Daher können Kits der Untersuchung von Marker-Kombinationen dienen. Vgl. z. B. Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1: 89–97. Die qualitative oder quantitative Expression jedes Chemokins kann durch Standardverfahren auf Protein-Ebene oder mRNA-Ebene untersucht werden.
XII. Rezeptor-Isolierung
Wenn ein Bindungspartner einer spezifischen Interaktion isoliert worden ist, existieren Verfahren zur Isolierung des anderen Partners. Vgl. Gearing et al. (1989) EMPO J. 8: 3667–3676. Es können beispielsweise Mittel zur Markierung eines DVic-1-Chemokins bestimmt werden, ohne die Bindung an seinen Rezeptor zu stören. Beispielsweise kann eine Affinitäts-Markierung oder ein Epitop-Tag entweder an den Amino- oder an den Carboxy-Terminus des Liganden fusioniert werden. Eine Expressions-Bibliothek kann auf eine spezifische Bindung des DVic-1-Chemokins untersucht werden, z. B. durch Zellsortierung oder ein anderes Screening zur Detektion von Subpopulationen, die eine solche Bindungs-Komponente exprimieren. Vgl. z. B. Ho et al. (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11267–11271. Alternativ dazu kann ein Panning-Verfahren verwendet werden. Vgl. z. B. Seed und Aruffo (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84: 3365–3369. Ein Zwei-Hybrid-Selektionssystem („two-hybrid") kann ebenfalls verwendet werden, wobei mit den verfügbaren Chemokin-Sequenzen geeignete Konstrukte erzeugt werden. Vgl. z. B. Fields und Song (1989) Nature 340: 245–246. Standard-Ca⁺⁺-Flux-Verfahren können ebenfalls verwendet werden. Vgl. z. B. Coligan et al. (Hrsg.) (1992 und regelmäßige Ergänzungsbände) Current Protocols in Immunology Greene/Wiley, New York, NY.
Protein-Quervernetzungs-Verfahren mit Markierung können angewendet werden, um Bindungspartner eines DVic-1-Chemokins zu isolieren. Dies würde die Identifizierung von Proteinen erlauben, die spezifisch mit einem DVic-1 Chemokin interagieren, z. B. in einer Weise, die der Interaktion von Ligand und Rezeptor ähnelt. Üblicherweise bindet die Chemokin-Familie an Rezeptoren der „Sieben-Transmembran-Rezeptor"-Familie, und der Rezeptor für das DVic-1-Chemokin weist wahrscheinlich eine ähnliche Struktur auf. Es ist daher wahrscheinlich, daß der Rezeptor durch Expressionen in einem System gefunden wird, das in der Lage ist, ein solches Membranprotein in einer Form zu exprimieren, die Liganden-Bindungsfähigkeit aufweist.
Der große Umfang dieser Erfindung wird am besten anhand der nachfolgenden Beispiele deutlich, die nicht dahingehend zu verstehen sind, daß sie die Erfindung auf spezifische Ausführungsformen beschränken.
BEISPIELE
1. Allgemeine Verfahren
Zahlreiche der nachstehenden Standardverfahren werden beschrieben oder es wird auf sie Bezug genommen, z. B. in Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bände 1 bis 3, CSH Press, NY; Ausubel et al., Biology Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; oder Ausubel et al. (1987 und Ergänzungsbände) Current Protocols in Molecular Biology Wiley/Greene, NY; Innis et al. (Hrsg.) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, NY. Verfahren zur Proteinreinigung umfassen Verfahren wie beispielsweise Ammoniumsulfat-Präzipitation, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Zentrifugation, Kristallisation und andere. Vgl. z. B. Ausubel et al. (1987 und periodische Ergänzungsbände); Deutscher (1990) „Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology Band 182 und andere Bände dieser Reihe; sowie die Literatur des Herstellers zur Verwendung von Produkten zur Proteinaufreinigung, z. B. Pharmacia, Piscataway, N.J., oder Bio-Rad, Richmond, CA. Die Kombination mit rekombinanten Methoden ermöglicht die Fusion an geeignete Segmente (Epitop-Tags), z. B. an eine FLAG-Sequenz oder ein Equivalent, das z. B. über eine Protease-entfernbare Sequenz fusioniert werden kann. Vgl. z. B. Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69–70; Hochuli (1990) „Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (Hrsg.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87–98, Plenum Press, NY; und Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Immunologische Standard-Methoden werden, z. B. in Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; und Methods in Enzymology Bände 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 und 163 beschrieben. Assays für neurale zellbiologische Aktivitäten werden z. B. in Wouterlood (Auflage 1995) Neuroscience Protocols Module 10, Elsevier; Methods in Neurosciences Academic Press; und Neuromethods Humana Press, Totowa, NJ. Die Methodik von Entwicklungs-Systemen wird z. B. in Meisami (Hrsg.) Handbook of Human Growth and Developmental Biology CRC Press; und Chrispeels (Hrsg.) Molecular Techniques und Approaches in Developmental Biology Interscience, beschrieben.
FACS-Analysen werden in Melamed et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY; und Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY beschrieben.
II. Isolierung eines DVic-1- oder DGWCC-Chemokin-Klons
Ein Klon, der für das DVic-1- oder DGWCC-Chemokin kodiert, wird durch zahlreiche verschiedene mögliche Verfahren von einer natürlichen Bezugsquelle isoliert. Mit Hilfe der vorliegend bereitgestellten Sequenzen werden PCR-Primer oder Hybridisierungs-Sonden ausgewählt und/oder konstruiert, um entweder genomische DNA Segmente oder reverse Transkripte von cDNA zu isolieren. Geeignete als Bezugsquellen dienende Zellen umfassen die aufgelisteten Gewebe, z. B. Haut- oder Epithel- oder Wundheilungs-Bibliotheken. Genetische und polymorphische oder allelische Varianten werden durch Screening einer Population von Individuen isoliert.
Die auf einer PCR basierende Detektion wird mittels Standardverfahren durchgeführt, vorzugsweise unter Verwendung von Primern von entgegengesetzten Enden der kodierenden Sequenz; für bestimmte Zwecke können jedoch flankierende Segmente ausgewählt werden.
Daneben werden Hybridisierungs-Sonden ausgewählt. Bestimmte AT- oder GC-Gehalte von Sonden werden in Abhängigkeit von der erwarteten Homologie und der erwarteten Fehlpaarung ausgewählt. Geeignete stringente Bedingungen werden gewählt, um ein geeignetes Verhältnis des positiven Signals zum Hintergrund auszubalancieren. Die nachfolgenden Waschschritte werden verwendet, um Klone mit größerer Homologie zu sammeln.
Weitere Klone werden unter Verwendung eines Selektionsverfahrens isoliert, das auf einem Antikörper basiert. Es werden Standard-Expressions-Klonierungs-Verfahren angewendet, einschließlich z. B. FACS-Färbung des Membran-assoziierten Expressionsprodukts. Die Antikörper werden verwendet, um Klone zu identifizieren, die ein erkanntes Protein produzieren. Daneben werden Antikörper verwendet, um ein DVic-1- oder DGWCC-Chemokin aufzureinigen, wobei Protein-Sequenzierung sowie Standardmittel zur Isolierung eines für dieses Protein kodierenden Gens eingesetzt werden.
Verfahren, die auf genomischen Sequenz basieren, werden ferner die Identifizierung von natürlich verfügbaren Sequenzen oder anderenfalls von Sequenzen ermöglichen, die eine Homologie mit den bereitgestellten Sequenzen aufweisen.
III. Isolierung eines Gegenstücks für einen Chemokin-Klon aus Primaten
Ähnliche Verfahren wie oben werden verwendet, um ein geeignetes Primaten-Chemokin-Gen aus einem anderen Primaten zu isolieren. Es werden ähnliche Materialien als Bezugsquelle verwendet, um natürliche Gene, einschließlich genetischer, polymorphischer, allelischer oder Stamm-Varianten, zu isolieren. Andere Spezies-Varianten werden ebenfalls unter Verwendung ähnlicher Verfahren isoliert. Daneben können Gen-Datenbanken nach geeigneten Motiven durchsucht werden.
IV. Isolierung eines Chemokin-Klons aus Nagetieren
Eine geeignete Nagetier-Bezugsquelle wird wie oben beschrieben ausgewählt, z. B. eine Ratte, ein Hamster, usw. Es werden ähnliche Verfahren verwendet, um eine Spezies-Variante zu isolieren, obwohl der Grad der Ähnlichkeit üblicherweise beim Nagetier-Chemokin im Vergleich zu einem menschlichen Chemokin oder anderen Primaten-Sequenzen geringer sein wird.
V. Chromosomale Lokalisierung
Die cDNA wird markiert, z. B. durch Nick-Translation mit Biotin-14 dATP, und in situ bei einer Endkonzentration von 5 ng/μl an Metaphasen von zwei normalen Tieren (vorzugsweise Männchen) hybridisiert. Das Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungs (FISH)-Verfahren kann gegenüber dem von Callen et al. (1990) Ann. Genet. 33: 219–221 beschriebenen Verfahren dadurch modifiziert werden, dass die Chromosomen vor der Analyse sowohl mit Propidium-Iodid (als Gegenfärbung) als auch mit DAPI (zur Chromosomen-Identifizierung) gefärbt werden. Bilder der Metaphasen-Präparationen werden mit einer CCD Kamera aufgenommen und mittels eines Computers verstärkt. Die Identifizierung von geeignet markierten Chromosomen wird bestimmt. Die Lokalisierung an den herkömmlichen Orten für solche Moleküle oder an abweichenden Orten kann ebenfalls Informationen über die Funktion ergeben.
Das humane DVic-1 wurde auf dem humanen Chromosom 9p13 lokalisiert.
VI. Expression, Aufreinigung, Charakterisierung
Bei einem geeigneten der oben aufgeführten Klone wird die kodierende Sequenz in einen geeigneten Expressions-Vektor insertiert. Dies kann ein Vektor sein, der spezifisch für einen Prokaryonten, eine Hefe, ein Insekt oder einen höheren Vertebraten ausgewählt wurde, z. B. ein Säugetier-Expressionssystem. Standardverfahren werden verwendet, um das Gen-Produkt herzustellen, vorzugsweise als lösliches, sekretorisches Molekül; es kann jedoch in bestimmten Fällen auch als intrazelluläres Protein hergestellt werden. Intrazelluläre Proteine erfordern üblicherweise zur Gewinnung des Proteins eine Zelllyse, und unlösliche Einschlußkörper („inclusion bodies") sind ein gebräuchliches Ausgangsmaterial für weitere Aufreinigungen.
Bei einem Klon, der für ein DVic-1- oder DGWCC-Chemokin kodiert, werden rekombinante Herstellungsmittel verwendet, obwohl natürliche Formen von geeigneten Bezugsquellen gereinigt werden könnten. Das Proteinprodukt wird durch Standardverfahren der Proteinreinigung aufgereinigt, in einigen Fällen z. B. in Verbindung mit Immunoaffinitäts-Verfahren. Immunoaffinitäts-Verfahren werden entweder als Reinigungsschritt (wie oben beschrieben) oder als Detektions-Assay zur Bestimmung der Trennungseigenschaften des Proteins verwendet.
Vorzugsweise wird das Protein in das Medium ausgeschieden, und das lösliche Produkt wird in löslicher Form aus dem Medium gereinigt. Daneben stellen Einschlußkörper von prokaryontischen Expressionssystemen wie oben beschrieben eine nützliche Bezugsquelle für dieses Material dar. Üblicherweise wird das unlösliche Protein aus den Einschlußkörpern solubilisiert und unter Verwendung von Standardverfahren zurückgefaltet. Es werden wie oben beschrieben Aufreinigungsverfahren entwickelt.
Das Produkt des oben beschriebenen Reinigungsverfahrens wird charakterisiert, um zahlreiche strukturelle Eigenschaften zu bestimmen. Dazu werden standardmäßige physikalische Verfahren verwendet, wie z. B. Aminosäureanalyse und Protein-Sequenzierung. Das resultierende Protein wird einer CD-Spektroskopie sowie anderen spektroskopischen Verfahren (wie z. B. NMR, ESR, Massenspektroskopie usw.) unterworfen. Das Produkt wird charakterisiert, um seine molekulare Form und Größe zu bestimmen, z. B. unter Verwendung von Gel-Chromatographie und ähnlichen Methoden. Das Verständnis der chromatographischen Eigenschaften wird zu milderen und wirksameren Reinigungsverfahren führen.
Die Vorhersage der Glykosylierungsstellen kann durchgeführt werden, wie es beispielsweise in Hansen et al. (1995) Biochem. J. 308: 801–813 beschrieben ist.
VII. Herstellung von Antikörpern gegen Chemokine
Es werden Tiere mit DNA zur Expression oder mit hergestelltem Protein (z. B. wie oben beschrieben) immunisiert, um Antikörper herzustellen. Es wird polyklonales Antiserum erzeugt, wobei in einigen Fällen nicht-gereinigtes Antigen verwendet wird, obwohl das resultierende Serum einen stärkeren Hintergrund aufweisen wird. Das Antigen wird vorzugsweise unter Verwendung von Standard-Proteinreinigungs-Verfahren aufgereinigt, einschließlich z. B. Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des oben erwähnten polyklonalen Serums. Das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern wird unter Verwendung definierter synthetischer Peptidfragmente nachgewiesen.
Es wird polyklonales Serum gegen ein wie oben beschrieben gereinigtes Antigen erzeugt, oder unter Verwendung einer Vielzahl synthetischer Peptide. Wird eine Vielzahl von überlappenden, synthetischen Peptiden, die eine gesamte Sequenz in voller Länge erfassen, einem Tier präsentiert, so wird dieses Tier ein Serum produzieren, das die meisten der linearen Epitope auf dem Protein erkennt. Ein solches Antiserum wird verwendet, um das Protein über seine Affinität aufzureinigen; das Protein wiederum wird verwendet, um das intakte Protein voller Länge in ein anderes Tier einzubringen, um eine weitere Antiserum-Präparation herzustellen.
Ähnliche Verfahren werden verwendet, um monoklonale Antikörper entweder ausgehend von ungereinigtem Antigen oder (vorzugsweise) ausgehend von gereinigtem Antigen herzustellen. Das Antiserum oder die Antikörper können natives Protein oder denaturiertes Antigen erkennen. Die Präparationen können je nach Wunsch immunselektiert oder gereinigt werden.
VIII. Zelluläre Verteilung und Gewebeverteilung
Die Verteilung des Proteins oder Gen-Produkts wird bestimmt, z. B. unter Verwendung von Immunhistochemie mit einem wie oben produzierten Antikörperreagenz oder durch Screening nach Nukleinsäuren, die für das Chemokin kodieren. Die Hybridisierungs- oder PCR-Verfahren werden verwendet, um den Gehalt an DNA-, cDNA- oder mRNA nachzuweisen. Die Histochemie ermöglicht die Bestimmung der spezifischen Zelltypen innerhalb eines Gewebes, die höhere oder geringere Mengen von mRNA oder DNA exprimieren. Methoden mit Antikörpern sind nützlich, um Protein in einer biologischen Probe, einschließlich einer flüssigen Probe oder einer Gewebeprobe, zu quantifizieren. Immunoassays werden entwickelt, um Protein zu quantifizieren. Darüber hinaus kann auch eine FACS-Analyse verwendet werden, um die Expression in einer Zellpopulation zu untersuchen.
Die DGWCC-Sequenz der Maus ist in einer fetalen Maus detektiert worden (1 Sequenz aus einer Maus 14,5 Tage nach Empfängnis; und 3 Sequenzen aus einer Maus 19,5 Tage nach Empfängnis). Drei Sequenzen stammen aus der erwachsenen Maus, jeweils eine aus der Leber, der Placenta und der Haut. Northern-Analysen zeigen, dass das Signal in den Hoden um einiges größer ist als das Signal im Gehirn, welches wiederum größer ist als das in der Lunge.
IX. Mikrochemotaxis-Assays
Die pro-migratorischen Aktivitäten des DGWCC-Chemokins werden in Mikrochemotaxis-Assays festgestellt. Vgl. z. B. Bacon et al. (1988) Br. J. Pharmacol. 95: 966–974. Andere Stoffaustausch-Assays werden ebenfalls verwendet. Vgl. z. B. Quidling-Järbrink, et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 322–327; Koch et al. (1994) J. Clinical Investigation 93: 921–928; und Antony et al. (1993) J. Immunol. 151: 7216–7223.
Chemokine können ferner auf ihre Aktivität in hämatopoetischen Assays untersucht werden (wie beispielsweise durch H. Broxmeyer beschrieben). Vgl. Bellido, et al. (1995) J. Clinical Investigation 95: 2886–2895; und Jilka et al. (1995) Exptl Hematology 23: 500–506. Sie können wie z. B. von Streiter et al. (1992) Am. J. Pathol. 141: 1279–1284 beschrieben auf angiogenische Aktivitäten untersucht werden; oder auf eine Beteiligung am Entzündungsprozess. Vgl. beispielsweise Wakefield et al. (1996) J. Surgical Res. 64: 26–31.
X. Biologische Aktivitäten, direkte und indirekte
Ein robuster und sensitiver Assay wird wie oben beschrieben ausgewählt, z. B. für Immunzellen, neuronale Zellen oder Stammzellen. Das Chemokin wird in steigenden Dosen zum Assay zugesetzt, um zu beobachten, ob eine Dosis-Antwort nachweisbar ist. In einem Proliferations-Assay werden die Zellen beispielsweise in Platten ausplattiert. Geeignetes Kulturmedium wird bereitgestellt, und das Chemokin wird in verschiedenen Mengen zu den Zellen zugegeben. Das Wachstum wird über einen Zeitraum verfolgt, wobei entweder eine direkte Wirkung auf die Zellen oder eine indirekte Wirkung des Chemokins nachgewiesen wird.
Alternativ dazu wird ein Aktivierungs-Assay oder ein Attraktions-Assay verwendet. Es wird ein geeigneter Zelltyp ausgesucht, z. B. hämatopoetische Zellen, myeloide Zellen (Makrophagen, Neutrophile, polymorphonukleäre Zellen, usw.) oder lymphoide Zellen (T-Zellen, B-Zellen oder NK-Zellen), neuronale Zellen (Neuronen, Neuroglia, Oligodendrozyten, Astrozyten, usw.) oder Stammzellen, z. B. Vorläuferzellen, die in andere Zelltypen differenzieren, z. B. Darmkrypten-Zellen („gut crypt") und undifferenzierte Zelltypen.
Andere Assays werden diejenigen sein, die im Zusammenhang mit anderen Chemokinen gezeigt wurden. Vgl. beispielsweise Schall und Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6: 865–873; und Bacon und Schall (1996) Int. Arch. Allergy & Immunol. 109: 97–109.
XI. Struktur-Aktivitäts-Beziehungen
Informationen bezüglich der Bedeutung von bestimmten Resten werden unter Verwendung von Standardverfahren und -Analysen erhalten. Es wird eine Standard-Mutagene-Analyse durchgeführt, z. B. durch Erzeugung zahlreicher verschiedener Varianten an bestimmten Positionen, z. B. an den oben beschriebenen Positionen, sowie durch Evaluierung der biologischen Aktivitäten dieser Varianten. Dies kann bis zu einem Ausmaß durchgeführt werden, bei dem Positionen bestimmt werden, die die Aktivität modifizieren, oder sich auf spezifische Positionen beschränken, um die Reste zu bestimmen, die substituiert werden können, um die biologische Aktivität entweder zu erhalten, zu blockieren oder zu modulieren.
Daneben kann eine Analyse von natürlichen Varianten zeigen, welche Position natürliche Mutationen tolerieren. Dies kann sich aus einer Populationsanalyse der Variation unter Individuen oder über Stämme oder Spezies hinausgehend ergeben. Es werden Proben von ausgewählten Individuen analysiert, z. B. durch PCR-Analyse oder Sequenzierung. Dies erlaubt die Bewertung von Populations-Polymorphismen.
XII. Screening nach Agonisten/Antagonisten
Agonisten oder Antagonisten werden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, die biologische Aktivität zu induzieren oder zu blockieren. Die Kandidatenverbindungen, z. B. Sequenzvarianten von natürlichem DGWCC-Chemokin, werden auf ihre biologischen Aktivitäten untersucht. Daneben werden Verbindungen alleine oder in Kombination untersucht, um Auswirkungen auf die biologische Aktivität zu bestimmen.
XIII. Isolierung eines Chemokin-Rezeptors
Ein DVic-1- oder DGWCC-Chemokin kann als spezifisches Bindungsreagenz verwendet werden, um seinen Bindungspartner zu identifizieren, wobei seine Bindungsspezifität als Vorteil genutzt wird (so als ob ein Antikörper verwendet werden würde). Ein Bindungsreagenz ist entweder wie oben beschrieben markiert, z. B. mittels Fluoreszenz oder anderweitig, oder zur Durchführung eines Panning-Verfahrens an ein Substrat immobilisiert. Der typische Chemokin-Rezeptor ist ein Sieben-Transmembran-Rezeptor.
Die Bindungszusammensetzung, z. B. ein Chemokin, wird verwendet, um eine Expressions-Bibliothek zu untersuchen, die aus einer Zelllinie hergestellt worden ist, welche einen Bindungspartner (d. h. einen Rezeptor) exprimiert. Standardfärbeverfahren werden verwendet, um den intrazellulär exprimierten oder den Oberflächen-exprimierten Rezeptor zu detektieren oder zu sortieren, oder es werden Oberflächen-exprimierende, transformierte Zellen durch Panning untersucht. Das Screening der intrazellulären Expression wird durch verschiedene Färbungs- oder Immunfluoreszenz-Verfahren durchgeführt. Vgl. ferner McMahan et al. (1991) EMBO J. 10: 2821–2832.
Ca⁺⁺-Flux-Standardprotokolle (vgl. z. B. Coligan et al. (Hrsg.) (1992 und regelmäßige Ergänzungsbände) Current Protocols in Immunol. Greene/Wiley, New York, NY, können verwendet werden, um einen Rezeptor für DGWCC zu identifizieren.
Am Tag 0 werden beispielsweise 2-Kammer-Permanox-Objektträger mit 1 ml/Kammer Fibronectin, 10 ng/ml in PBS, für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorbeschichtet. Man wäscht einmal mit PBS. Anschließend plattiert man COS-Zellen bei 2–3 × 10⁵ Zellen pro Kammer in 1,5 ml Wachstumsmedium aus. Es wird über Nacht bei 37°C inkubiert.
Am Tag 1 wird für jede Probe 0,5 ml einer Lösung aus 66 mg/ml DEAE-Dextran, 66 mM Chloroquin und 4 mg DNA in serumfreiem DME hergestellt. Für jede Gruppe wird eine Positiv-Kontrolle hergestellt, z. B. aus humaner DGWCC-Chemokin-cDNA in 1 und 1/200-Verdünnung sowie eine Negativ-Probe. Die Zellen werden mit serumfreiem DME gespült. Die DNA-Lösung wird zugesetzt und es wird 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wird entfernt und 0,5 ml 10% DMSO in DME werden für 2,5 Minuten zugesetzt. Die Lösung wird entfernt und es wird einmal mit DME gewaschen. 1,5 ml Wachstumsmedium werden zugesetzt und es wird über Nacht inkubiert.
Am Tag 2 wird das Medium gewechselt. An den Tagen 3 oder 4 werden die Zellen fixiert und gefärbt. Die Zellen werden zweimal mit Hanks gepufferter Salzösung gespült (HBSS) und in 4% Paraformaldehyd (PFA)/Glukose für 5 Minuten fixiert. Es wird dreimal mit HBSS gewaschen. Die Objektträger können bei –80°C gelagert werden, nachdem sämtliche Flüssigkeit entfernt wurde. Für jede Kammer werden 0,5 ml-Inkubationen wie folgt durchgeführt: HBSS/Saponin (0,1%) mit 32 ml/ml 1 M NaN₃ wird für 20 Minuten zugesetzt. Die Zellen werden anschließend mit HBSS/Saponin 1 × gewaschen. Das Chemokin oder der Chemokin/Antikörper-Komplex wird zu den Zellen gegeben und es wird für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit HBSS/Saponin gewaschen. Sobald es geeignet erscheint, wird der erste Antikörper für 30 Minuten zugesetzt. Der zweite Antikörper, z. B. ein Anti-Maus-Antikörper von Vector, wird in einer 1/200-Verdünnung zugesetzt, und es wird 30 Minuten inkubiert. Die ELISA-Lösung wird hergestellt, z. B. Elite ABC-Meerrettich-Peroxidase-Lösung von Vector, und es wird 30 Minuten vorinkubiert. Es kann beispielsweise ein Tropfen der Lösung A (Avidin) und ein Tropfen der Lösung B (Biotin) pro 2,5 ml HBSS/Saponin verwendet werden. Die Zellen werden zweimal mit HBSS/Saponin gewaschen. ABC-HRP-Lösung wird zugesetzt, und es wird 30 Minuten inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit HBSS gewaschen, wobei der zweite Waschschritt für 2 Minuten durchgeführt wird, wodurch die Zellen verschlossen werden. Anschließend wird Diaminobenzoesäure (DAB) von Vector für 5 bis 10 Minuten zugegeben. Es werden 2 Tropfen des Puffers mit 4 Tropfen DAB mit 2 Tropen H₂O₂ pro 5 ml des destillierten Wassers verwendet. Die Kammer wird vorsichtig entfernt und in Wasser gespült. Die Kammer wird für einige Minuten an der Luft getrocknet; anschließend wird 1 Tropfen Crystal Mount sowie ein Deckglas zugegeben. Es wird für 5 Minuten bei 85–90°C gebacken.
Die positive Färbung der Pools wird ausgewertet, und anschließend wird stufenweise subkloniert, um einzelne Gene zu isolieren, die für die Bindung verantwortlich sind.
Daneben werden Chemokin-Reagenzien verwendet, um Zellen, die einen Rezeptor exprimieren, über ihre Affinität aufzureinigen oder auszusortieren. Vgl. beispielsweise Sambrook et al. oder Ausubel et al.
Ein weiterer Ansatz besteht darin, mittels Panning nach einem Membran-gebundenen Rezeptor zu suchen. Die Rezeptor-cDNA wird wie oben beschrieben konstruiert. Der Ligand kann immobilisiert und dazu verwendet werden, exprimierende Zellen zu immobilisieren. Die Immobilisierung kann durch Verwendung von geeigneten Antikörpern erreicht werden, die beispielsweise eine FLAG-Sequenz oder ein Chemokin-Fusionskonstrukt erkennen, oder durch Verwendung von Antikörpern, die gegen die ersten Antikörper erzeugt wurden. Rekursive Zyklen von Selektion und Amplifikation führen zur Anreicherung von geeigneten Klonen und schließlich zur Isolierung von Klonen, die den Rezeptor exprimieren.
Phagen-Expressions-Bibliotheken können mit Hilfe der Chemokine untersucht werden. Geeignete Markierungs-Methoden, z. B. Anti-FLAG-Antikörper, werden die spezifische Markierung von geeigneten Klonen ermöglichen.
XIV. Immunhistochemische Lokalisierung
Der oben beschriebene Antikörper wird verwendet, um die Expression von DVic-1- oder DGWCC in verschiedenen Geweben zu identifizieren. Methoden für das immun histochemische Färben sind beispielsweise in Sheehan et al. (Hrsg.) (1987) Theory and Practice of Histotechnology, Battelle Press, Columbus, OH, beschrieben.
Die vorliegend beschriebenen spezifischen Ausführungsformen sind lediglich beispielhaft, und die Erfindung wird ausschließlich durch den Wortlaut der beiliegenden Ansprüche beschränkt, in Verbindung mit dem vollen Umfang von Äquivalenten, auf die sich diese Ansprüche beziehen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Im Wesentlichen reines Dvic-1 Polypeptid, das die reife Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 2 dargestellten Polypeptids umfasst.
Fusionsprotein, welches das Polypeptid gemäß Anspruch 1 umfasst.
Antikörper oder Antikörperfragment mit Spezifität für das Polypeptid des Anspruchs 1.
Nukleinsäure, die für das Polypeptid des Anspruchs 1 kodiert.
Expressionsvektor, der die Nukleinsäure gemäß Anspruch 4 umfasst.
Wirtszelle, die den Vektor gemäß Anspruch 5 umfasst.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids, welches die Kultur der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 unter Bedingungen umfasst, bei denen das Polypeptid exprimiert wird.