DE69934906T2

DE69934906T2 - Antagonist-antikörper für cutaneous t cell-attracting chemokine (ctack) oder vasoactive intestinal contractor (vic) chemokine

Info

Publication number: DE69934906T2
Application number: DE69934906T
Authority: DE
Inventors: Wei Palo Alto WANG; R. Elizabeth Mountain View OLDHAM; Hortensia Sunnyvale SOTO; Ying Mountain View LUI; A. Susan Redwood City HUDAK; Bernhard Palo Alto HOMEY; M. Janine San Francisco MORALES; Sirid-Aimee Los Altos KELLERMANN; M. Leslie Mountain View MCEVOY; Albert Palo Alto ZLOTNIK
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2019-12-24
Also published as: DE69934906D1; CA2356661A1; EP1140174B1; JP2002533403A; EP1140174A1; AU2593800A; WO2000038713A1; ES2281205T3

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die Proteine betreffen, die bei der Kontrolle der Physiologie, der Entwicklung und/oder der Differenzierung von Säugetierzellen wirken. Insbesondere stellt sie Proteine zur Verfügung, die mit der Regulation der Physiologie, der Entwicklung, der Differenzierung oder der Funktion von verschiedenen Zelltypen in Verbindung gebracht werden, z.B. Chemokine, 7-Transmembranrezeptoren, mit diesen in Verbindung stehende Reagenzien, z.B. Antikörper oder für sie kodierende Nukleinsäuren, und deren Verwendungen. Sie stellt ferner Verfahren zum Benutzen verschiedener Chemokinzusammensetzungen und für sie verwendete Zusammensetzungen zur Verfügung, und insbesondere Verfahren zum Behandeln von Hautkrankheiten oder Zuständen, die mit einer Fehlregulation der Chemokine CTACK und/oder Vic zusammenhängen.
HINTERGRUND
Das Immunsystem besteht aus einer großen Vielzahl von einzelnen Zelltypen, von denen jedes wichtige Funktionen aufweist. Siehe Paul (Herausgeber, 1997) Fundamental Immunology 4. Auflage, Raven Press, New York. Die Lymphozyten nehmen eine zentrale Rolle ein, da sie die Zellen sind, welche die Spezifität der Immunität bestimmen, und es ist ihre Reaktion, welches die ausführenden Teile des Immunsystems steuert. Zwei große Klassen von Lymphozyten sind bekannt: die B-Lymphozyten, die Vorläufer von Antikörper-absondernden Zellen sind, und die T-(Thymus-abhängigen) Lymphozyten. Die T-Lymphozyten zeigen wichtige regulatorische Funktionen, wie beispielsweise die Fähigkeit, bei der Entwicklung von spezifischen Typen der Immunantwort zu helfen oder diese zu inhibieren, einschließlich der Antikörperbildung und der erhöhten mikrobiziden Aktivität von Makrophagen. Andere T-Lymphozyten sind an direkten Effek torfunktionen beteiligt, wie beispielsweise der Lyse von mit Virus infizierten Zellen oder bestimmten neoplastischen Zellen.
Die Chemokine sind eine große und vielfältige Proteinsuperfamilie. Abhängig davon, ob die ersten beiden Cysteine in dem Chemokinmotiv benachbart sind (als "C-C"-Zweig bezeichnet) oder durch einen dazwischen liegenden Rest getrennt sind ("C-X-C"), wird die Superfamilie in zwei klassische Zweige unterteilt. Einem erst kürzlich identifizierten Zweig der Chemokine fehlen zwei Cysteine in dem entsprechenden Motiv, wobei dieser Zweig durch Chemokine, die als Lymphotactine bekannt sind, verkörpert wird. Ein weiterer kürzlich identifizierter Zweig, z.B. CX3C-Chemokine, weist drei intervenierende Reste zwischen den beiden Cysteinen auf. Siehe z.B. Schall und Bacon (1994) Current Opinion in Immunology 6:865-873, und Bacon und Schall (1996) Int. Arch. Allergy & Immunol. 109:97-109.
Es sind viele Faktoren identifiziert worden, die den Differenzierungsprozess von Vorläuferzellen beeinflussen oder die physiologischen Eigenschaften oder Wanderungseigenschaften von spezifischen Zelltypen regulieren. Diese Beobachtungen legen nahe, dass andere Faktoren existieren, deren Funktion in Immunfunktionen bis dato unbekannt war. Diese Faktoren stellen biologische Aktivitäten bereit, deren Wirkungsspektren von denen bekannter Differenzierungs- oder Aktivierungsfaktoren unterschiedlich sind. Das Fehlen von Wissen über die strukturellen, biologischen und physiologischen Eigenschaften der regulatorischen Faktoren, welche die Zellphysiologie in vivo regulieren, verhindert die Modulierung der Wirkungen solcher Faktoren. Daher bleiben medizinische Zustände, bei denen eine Regulierung der Entwicklung oder Physiologie von relevanten Zellen benötigt wird, unbeherrschbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung von verschiedenen Chemokin-Bindungspartnern für 7-Transmembranrezeptoren, und auf der überraschenden Entdeckung, dass die CTACK- und Vic-Chemokine auf Hautzellen exprimiert werden. Es wurde für sie gezeigt, dass sie Einfluss auf. Immunzellen haben, die mit der dermatologischen Gesundheit in Verbindung stehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft z.B. Verfahren zum Modulieren der Bewegung einer Zelle innerhalb der Haut oder zur Haut eines Säugetiers, wobei das Verfahren die Gabe einer wirksamen Menge eines Antagonisten von CTACK oder eines Antagonisten von Vic an ein Säugetier umfasst. Verfahren, die das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Agonisten von CTACK oder eines Agonisten von Vic umfassen, werden ebenfalls offenbart. In dem Verfahren ist das Modulieren oft ein Blockieren und das Verabreichte ist ein Antagonist von CTACK oder Vic, wobei z.B. die Bewegung innerhalb der Haut stattfindet und chemotaktisch oder chemokinetisch erfolgt; das Verabreichen lokal, topisch, subkutan, intradermal oder transdermal stattfindet; das Verabreichte ein Antagonist von CTACK oder Vic ist; die Zelle eine CLA⁺-Zelle, eine T-Zelle, eine dendritische Zelle oder eine Vorläuferzelle einer dendritischen Zelle ist, oder wobei die Zelle in die Dermis- und/oder Epidermisschichten der Haut wandern. Insbesondere wird ein derartiges Verfahren eines sein, bei dem der Antagonist ausgewählt ist aus einem Mutein eines natürlichen CTACK oder Vic, einem Antikörper, der CTACK oder Vic neutralisiert; oder einem Antikörper, der die GPR2-Ligandenbindung blockiert, wobei das Säugetier ein Transplantat oder eine Hautverpflanzung aufweist, oder wobei der Antagonist in Verbindung mit einem Antibiotikum, Analgetikum, immunsuppressiven Therapeutikum, entzündungshemmenden Wirkstoff, Wachstumsfaktor oder Immunadjuvans verabreicht wird.
In anderen, hier offenbarten Verfahren ist das Modulieren ein Anziehen und das Verabreichte ist ein Agonist von CTACK oder Vic. In bestimmten Ausführungsformen erfolgt die Bewegung innerhalb der Haut chemotaktisch oder chemokinetisch, das Verabreichen erfolgt lokal, topisch, subkutan, intradermal oder transdermal, das Verabreichte ist ein CTACK- oder Vic-Ligand, die Zelle ist eine CLA⁺-Zelle, eine T-Zelle, eine dendritische Zelle oder eine Vorläuferzelle einer dendritischen Zelle, oder die Zellen wandern in die Dermis- und/oder Epidermisschichten der Haut. Bestimmte bevorzugte Verfahren werden solche sein, bei denen der Agonist ausgewählt ist aus CTACK oder Vic oder einem GPR2-Liganden, wobei das Säugetier unter einer kutanen Schädigung leidet, oder der Agonist wird in Verbindung mit einem Antibiotikum, Analgetikum, immunsuppressiven Therapeutikum, entzündungshemmenden Wirkstoff, Wachstumsfaktor oder Immunadjuvans verabreicht.
Andere Aspekte der Erfindung schließen Verfahren zum Identifizieren einer Zelle ein, die einen Rezeptor für das CTACK oder Vic exprimiert, Schritte umfassend, bei denen man es einer Zelle ermöglicht, in Richtung von CTACK oder Vic zu wandern, wobei die Zelle als den Rezeptor exprimierend identifiziert wird, wenn sie wandert. Besondere Formen schließen solche ein, bei denen Inkontaktbringen zu einer spezifischen Bewegung der Zelle zu einem Ort für eine Aufreinigung führt, z.B. durch Poren einer Membran.
Die Erfindung stellt auch in vitro-Verfahren zum Herstellen eines Ligand:Rezeptor-Komplexes zur Verfügung, welches das Inkontaktbringen eines CTACK aus einem Säugetier mit einem GPR2-Rezeptor, oder eines Vic aus einem Säugetier mit einem GPR2-Rezeptor umfasst, wobei zumindest der Ligand oder der Rezeptor rekombinant oder gereinigt ist, wodurch es dem Komplex ermöglicht wird, sich zu bilden. Bei solchen Verfahren sind solche eingeschlossen, bei denen der Komplex zu einem Ca⁺⁺-Fluss führt, der GPR2-Rezeptor auf einer Zelle vorliegt, die Komplexbildung zu einer physiologischen Veränderung in der Zelle führt, die den GPR2-Rezeptor exprimiert, das Inkontaktbringen in Verbindung mit IL-2 und/oder Interferon-α erfolgt, oder das Inkontaktbringen einem quantitativen Nachweis des Liganden ermöglicht.
Zusätzlich werden Verfahren zum Modulieren der Physiologie oder der Entwicklung einer GPR2-exprimierenden Zelle offenbart, welches das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Agonisten oder Antagonisten eines Vic oder CTACK aus einem Säugetier umfasst, wobei von dem GPR2-Rezeptor oder dem Agonisten oder Antagonisten einer rekombinant oder gereinigt ist. Dies wird Fälle einschließen, bei denen der Antagonist ein Antikörper ist, der das Vic aus einem Säugetier neutralisiert, der das CTACK aus einem Säugetier neutralisiert, oder der die Ligandenbindung von GPR2 blockiert, oder der ein Mutein des Vic oder des CTACK ist, oder wobei die Physiologie ausgewählt ist aus einem zellulären Calciumfluss, einer chemotaktilen Reaktion, einer die zelluläre Morphologie verändernden Antwort, Phosphoinositid-Turnover oder einer antiviralen Reaktion. Zu solchen Verfahren gehören solche, bei denen der Antagonist ein Antikörper ist und die Physiologie eine chemotaktile Reaktion ist, oder bei denen das Modulieren ein Blockieren ist und wobei die Physiologie eine Entzündungsreaktion ist.
Es werden Testverfahren bereitgestellt, beispielsweise das Testen einer Verbindung auf ihre Fähigkeit, die GPR2-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu beeinflussen, wobei das Verfahren das Vergleichen der Wechselwirkung von GPR2 mit Vic oder CTACK in der Gegenwart oder der Abwesenheit der Verbindung umfasst. Zu solchen Verfahren gehören welche, bei denen die Verbindung ein Antikörper gegen GPR2, Vic oder CTACK ist.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines Antikörperantagonisten von CTACK oder Vic für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Hautentzündung in einem Säugetier bereit.
Es werden auch verschiedene GPR2-Zusammensetzungen offenbart, z.B. ein GPR2 aus Primaten, das die Sequenz MGTEVLEQ (siehe SEQ ID NO: 2) umfasst, ein Nagetier-GPR2 (siehe SEQ ID NO: 4), eine Nukleinsäure, die für das GPR2 gemäß SEQ ID NO: 2 oder 4 kodiert, oder ein Antikörper, der selektiv an MGTEVLEQ (siehe SEQ ID NO: 2) bindet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. Allgemeines
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf der überraschenden Entdeckung, dass die Chemokine CTACK und Vic Funktionen bei der Hautimmunität aufweisen. Die Haut besteht aus einer Epithelschicht an der Oberfläche, die als Epidermis bezeichnet wird, und einer darunterliegenden Schicht von Bindegewebe, die als Dermis bezeichnet wird. Unter der Dermis befindet sich eine Schicht, die große Mengen von fetthaltigem Gewebe enthalten, die Hypodermis. Die Haut dient einer Vielzahl von Funktionen, und Variationen in der Beschaffenheit der Dermis und der Epidermis treten funktionalen Anforderungen entsprechend auf. Die Haare, Nägel und Schweiß- und Talgdrüsen als Anhänge der Haut sind solche lokalen Spezialisierungen der Epidermis. Die Haut und ihre Anhänge bilden zusammen das Integument. Siehe z.B. Fitzpatrick, et al. (Herausgeber, 1993) Dermatology in General Medicine 4. Auflage, McGraw-Hill, NY; Bos, (Herausgeber, 1989) Skin Immune System CRC Press, Boca Raton, FL; Callen (1996) General Practice Dermatology Appleton und Lange; Rook, et al. (Herausgeber, 1998) Textbook of Dermatology, Blackwell; Habifor und Habie (1995) Clinical Dermatology: A Color Guide to Diagnosis and Therapy; Mosby und Grob (Herausgeber, 1997) Epidemiology, Causes and Prevention of Skin Diseases, Blackwell.
Die Epidermis besteht in unterschiedlichen Anteilen aus vielen verschiedenen Zelltypen. Der häufigste Zelltyp sind Keratinozyten, die um 95 % der Zellen ausmachen. Zellen im Bereich von 1-2 % schließen Melanozyten und Langerhans-Zellen ein. Die Langerhans-Zellen sind besonders wichtig, da sie Antigene einfangen, welche die Haut durchdrungen haben, und die Antigene zu regionalen Lymphknoten transportieren. Eine kleine Population von γδ T-Zellen kann ebenfalls in der Epidermis vorkommen.
Die Dicke der Dermis variiert in verschiedenen Bereichen des Körpers. Sie ist zäh, flexibel und hoch elastisch und besteht aus einem Geflecht von Kollagenfasern mit vielen elastischen Fasern. Das Bindegewebe ist in tiefen retikulären und oberflächlich liegenden papillären Schichten angeordnet.
Zusätzlich stellt die Erfindung Chemokin-Rezeptorpaarungen von Chemokinen mit einem 7-Transmembranrezeptor zur Verfügung. Siehe z.B. Ruffolo und Hollinger (Herausgeber, 1995) G-Protein Coupled Transmembrane Signaling Mechanismus CRC Press, Boca Raton, FL; Watson und Arkinstall (1994) The G-Protein Linked Receptor FactsBook Academic Press, San Diego, CA; Peroutka (Herausgeber, 1994) G-Protein-Coupled Receptors CRC Press, Boca Raton, FL; Houslay und Milligan (1990) G-Proteins as Mediators of Cellular Signaling Processes Wiley und Söhne, New York, NY. Ausführungsformen aus Mensch und Maus werden hier beschrieben.
Unter den vielen Ligandentypen, die über 7-Transmembranrezeptoren biologisch wirken, befinden sich Chemokine und bestimmte Proteasen. Chemokine spielen bei Immun- und Entzündungsreaktionen eine wichtige Rolle, indem sie die Wanderung und Adhäsion von Leukozyten induzieren. Siehe z.B. Schall (1991) Cytokine 3:165-183 und Thomson (Herausgeber) The Cytokine Handbook, Academic Press, NY. Chemokine werden durch aktivierte Leukozyten ausgeschieden und wirken für eine Vielzahl von Zellen, die an der Entzündung beteiligt sind, als chemisches Lockmittel. Neben Eigenschaften als chemischer Lockstoff wurde für Chemokine gezeigt, daß sie andere biologische Reaktionen induzieren, z.B. die Modulation von Gehalten von sekundären Botenstoffen, wie beispielsweise Ca⁺⁺, Veränderungen des Inositolphosphatpools (siehe zum Beispiel Berridge (1993) Nature 361: 315-325 oder Billah und Anthes (1990) Biochem. J. 269:281-291), die zelluläre Morphologie modifizierende Reaktionen, Phosphoinositidlipid-Trunover, mögliche antivirale Antworten und weitere. Daher könnten die hier zur Verfügung gestellten Chemokine alleine oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Reagenzien vorteilhafte Wirkungskombinationen aufweisen.
Zudem gibt es Gründe darauf hinzuweisen, daß Chemokine Wirkungen auf andere Zelltypen haben können, z.B. die Anziehung oder Aktivierung von Monozyten, dendritischen Zellen, T-Zellen, Eosinophilen, Basophilen und/oder Neutrophilen. Sie könnte ebenfalls chemisch anziehende Wirkungen auf verschiedene neurale Zellen haben, einschließlich zum Beispiel der Neuronen des Spinalganglions im peripheren Nervensystem und/oder der Neuronen des Zentralnervensystems.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, z.B. Chemokinrezeptoren, sind für die Signaltransduktionsmechanismen wichtig, die durch ihre Liganden vermittelt werden. Sie sind für das Unterscheiden von Zellpopulationen nützliche Marker und wurden als spe zifische Rezeptoren für retroviralen Infektionen in Verbindung gebracht.
Die Chemokin-Superfamilie wurde klassisch in zwei Gruppen aufgeteilt, die charakteristische strukturelle Motive aufweisen, die Cys-X-Cys (C-X-C)- und Cys-Cys (C-C)-Familien. Diese wurden auf der Grundlage der Einfügung einer einzelnen Aminosäure in das NH-proximale Cysteinrestepaar und Sequenzähnlichkeit unterschieden. Üblicherweise wirken die C-X-C-Chemoline, d.h. IL-8 und MGSA/Gro-α auf Neutrophile, aber nicht auf Monozyten, während die C-C-Chemokine, d.h. MIP-1α und RANTES potente Chemolockstoffe für Monozyten und Lymphozyten, jedoch nicht für Neutrophile sind. Die CC-Chemokine sind auf Makrophagen, Lymphozyten und Eosinophile bevorzugt wirksam. Siehe z.B. Miller, et al. (1992) Crit. Rev. Immunol. 12:17-46. Ein kürzlich isoliertes Chemokin, das Lymphotactin, gehört nicht zu einer der Gruppen und könnte das erste Mitglied einer dritten Chemokinfamilie, der C-Familie, darstellen. Lymphotactin weist kein charakteristisches CC- oder CXC-Motiv auf und wirkt auf Lymphozyten, jedoch nicht auf Neutrophile und Monozyten. Siehe z.B. Kelner et al. (1994) Science 266:1395-1399. Dieses Chemokin definiert eine neue C-Chemokinfamilie. Vor noch kürzerer Zeit wurde ein weiteres, ein CX3C-Motiv aufweisendes Chemokin identifiziert, das eine vierte strukturelle Klasse begründet.
Das Chemokin GWCC aus Maus und Mensch wurde bereits in der WO 98/23750 beschrieben, die hier durch Bezugnahme für alle Zwecke aufgenommen wird. Auf neueren Beobachtungen bezüglich der Biologie dieses Chemokins beruhend wird es hier als kutanes T-Zell-anziehendes Chemokin oder CTACK bezeichnet. Die Sequenzen werden als SEQ ID NOs: 11 und 12 (Primat) und SEQ ID NOs: 13 und 14 (Maus) bereitgestellt und wurden in den Datenbanken GenBank/EMBL/DDBJ mit den Zugangsnummern AF082392 (Maus-CTACK) und AF082393 (Human-CTACK) hinterlegt. Die CTACK- Klone aus Mensch und Maus kartieren auf syntenischen chromosomalen Bereichen, dem Abschnitt 9p13 beim Menschen bzw. dem proximalen Bereich des Maus-Chromosoms 4. Die C-C-Chemokine mit der größten Ähnlichkeit zu CTACK (6Ckine und MIP-3β) kartieren ebenfalls auf diesen chromosomalen Bereichen. Auf die gleiche Weise wird das Chemokin Vic beschrieben. Eine Ausführungsform aus dem Menschen eines Primaten-Chemokins, das als Vic bezeichnet wird, wird in SEQ ID NOs: 5 und 6 bereitgestellt (die vorhergesagte Signalspaltungsstelle liegt im Bereich der ala(--1)-ilel-Peptidbindung). Der Begriff "Vic" wird andere Primatenpendants umfassen. Eine menschliche Variante wird in den SEQ ID NOs: 7 und 8 bereitgestellt. Ein Nagetierpendant (Maus) wird in den SEQ ID NOs: 9 und 10 bereitgestellt. Das Vic-Chemokin zeigt eine ähnliche Biologie wie CTACK, ist jedoch etwas unterschiedlich, z.B. bei der Expression in Peyer-Plaques und im Dünndarm, einer zweiten epithelialen Oberfläche mit dem topologischen Äußeren, und durch Ausweisen eines regulierten Expressionsmusters, beispielsweise einem Hochregulieren bei Psoriasis.
Die beschriebenen Chemokine und Rezeptoren sollten zum Vermitteln verschiedener Aspekte der zellulären Physiologie oder Entwicklung, der Physiologie oder Entwicklung von Organen, Geweben oder des Organismus wesentlich sein. Insbesondere ist das Vic-Chemokin ein klassisches entzündungsförderndes Chemokin, das entzündliche Prozesse vermittelt. Das CTACK ist ein kutan exprimiertes Chemokin. Siehe z.B. USSN 08/978,964 und verwandte Fälle.
Im Gegensatz zu naiven Lymphozyten können Gedächtnis/Effektor-Lymphozyten nicht-lymophoide Effektorstellen ansteuern und ein beschränktes, oft Gewebs-selektives Wanderungsverhalten zeigen. Das kutane Lymphozyten-assoziierte Antigen (CLA) definiert eine gut beschriebene Untergruppe von zirkulierenden Gedächtnis-T-Zellen, die sich teilweise durch die Wechselwirkung von CLA mit seinem vaskulären Ligand E-Selektin vermittelt selektiv an kutanen Orten lokalisieren. Picker, et al. (1991) Nature 349:796-799, und Rossiter, et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:205-210. E-Selektin wird in entzündetem Endothelium großflächig exprimiert, daher muss die spezifische Infiltration der Haut durch CLA⁺-Zellen zusätzliche Signalstoffe ("cue") erfordern. Hier findet sich eine Beschreibung von bestimmten C-C-Chemokinen, von denen eines ursprünglich als GWCC bezeichnet wurde, hier aber als CTACK bezeichnet wird, und das andere Vic ist. Siehe USSN 08/978,964 oder WO 98/23750 , welche hier durch Bezugnahme für alle Zwecke aufgenommen werden.
Auf Grundlage der neuen, auf die Funktion gerichteten Informationen wird ein Chemokin hier als kutane T-Zellen anziehendes Chemokin oder CTACK bezeichnet. Sowohl das humane als auch das CTACK aus der Maus werden ausschließlich in der Haut, insbesondere in der Maus-Epidermis und in menschlichen Keratinozyten nachgewiesen. Die CTACK-Nachricht wird in Keratinozyten bei Behandlung mit entzündungsfördernden Cytokinen hochreguliert. CTACK zieht selektiv CLA⁺-Gedächtnis-T-Zellen an und hatte ferner Einflüsse auf dendritische Zellen der Haut (Langerhans-Zellen) und deren Vorläufer. Das Chemokin Vic weist ähnliche Eigenschaften auf, wird jedoch auch im Darm exprimiert und ist manchmal hochreguliert. Diese Eigenschaften legen eine wichtige Rolle für CTACK und/oder Vic beim Rekrutieren von CLA⁺-T-Zellen und dendritischen Zellen hin zu kutanen Orten nahe. CTACK ist das erste beschriebene Chemokin, das spezifisch in der Haut exprimiert wird, und das eine Gewebs-spezifische Subpopulation von Gedächtnis-Lymphozyten anzieht.
Nachdem das CTACK und Vic als mit der Haut in Beziehung stehende Chemokine identifiziert wurden, werden sie beim Beeinflussen medizinischer Anomalien der Haut eine Verwendung finden. Verbreitete Hautstörungen, die das Immunsystem einbe ziehen, umfassen Psoriasis, Hautkrebse, Karzinome, Entzündung, Allergien, Dermatitis, Wundheilung, Infektionen (sowohl mikrobielle als auch parasitische) und viele andere. Siehe zum Beispiel The Merck Manual, insbesondere das Kapitel über dermatologische Störungen. Diese Therapeutika könnten nützliche Wirkungen auf das Wachstum oder die Gesundheit von Anhängen der Haut, einschließlich beispielsweise der Haare, Nägel und Schweiß- und Talgdrüsen haben.
Die Psoriasis ist eine chronische entzündliche Hautkrankheit, die mit hyperplastischen epidermalen Keratinozyten und infiltrierenden mononukleären Zellen, einschließlich CD4⁺-Gedächtnis-T-Zellen, Neutrophilen und Makrophagen verbunden ist. Wegen dieses hochgradig uneinheitlichen Entzündungsbildes und der dadurch entstehenden komplexen Zusammenhänge zwischen diesen verschiedenen Zellen war es sehr schwierig, die Mechanismen zu ermitteln, die dem Auslösen und dem Fortschreiten dieser Krankheit zugrunde liegen.
Diese Hypothese legt auch nahe, dass, obwohl ruhende autoreaktive T-Zellen in empfänglichen Individuen bereits vorliegen können, ein Stimulus aus der Umgebung notwendig ist, um den Beginn der Krankheit auszulösen. Andere glauben, dass das Immunsystem nur eine kleinere modulatorische Rolle in dem Krankheitsverlauf spielt, und dass die Hyperproliferation von Keratinozyten in Wirklichkeit das auslösende Ereignis in einem genetisch empfänglichen Wirt ist. Die Forschung zur Pathogenese von Psoriasis wurde lange durch das Fehlen von geeigneten Tiermodellen behindert.
Es gibt eine zunehmende Menge von Daten, die nahelegen, dass T-Zellen und nicht Keratinozyten die primäre pathogene Komponente der Krankheit ist. Die vorliegenden Beobachtungen liefern Belege, die das Konzept unterstützen, dass Psoriasis ähnliche Zustände tatsächlich von unregulierten T-Zell-Antworten herrühren können.
Ebenso gehören Krebserkrankungen der Haut, wie beispielsweise Basalzellkarzinome und Plattenepithelkarzinome zu den häufigsten bösartigen Tumoren. Siehe z.B. Miller und Maloney (Herausgeber, 1997) Cutaneous Oncology: Pathophysiology, Diagnosis, and Management, Blackwell; Emmett und Orourke (1991) Malignant Skin Tumours, Churchill Livingstone; Friedman (1990) Cancer of the Skin, Saunders. Die meisten dieser Tumore entstehen in Bereichen der Haut, die der Sonne ausgesetzt sind. Die Immunregulation oder Beseitigung von solchen Tumoren kann von der Funktion des Immunsystems der Haut abhängen. Zellen, die derartiges bewirken, können durch lokale Fehlregulation oder Unterdrückung beeinträchtigt sein. Das CTACK oder Vic oder Antagonisten können eine vorübergehende Homöostase durchbrechen, welche die normale Immunreaktion unterdrückt, und dadurch zu einer Aktivierung der angemessenen regulatorischen Signalwege sowie Immunsignalwege führen.
Die Dermatitis ist eine oberflächliche Entzündung der Haut, die durch Bläschen (im akuten Fall), Rötung, Ödeme, Wässern, Verkrustung, Schuppung und Jucken gekennzeichnet ist. Siehe z.B. Lepoittevin (Herausgeber, 1998) Allergic Contact Dermatitis: The Molecular Basis Springer-Verlag; Rietschel und Fowler (Herausgeber, 1995) Fisher's Contact Dermatitis, Lippincott; und Rycroft, et al. (Herausgeber, 1994) Textbook of Contact Dermatitis, Springer-Verlag. Der Begriff exzematöse Dermatitis wird oft verwendet, um eine vesikuläre Dermatitis zu bezeichnen. Eine Dermatitis kann verschiedene Immunschwächezustände oder -krankheiten, angeborene metabolische Störungen oder Mangelerkrankungen begleiten. Bestimmte Symptome von solchen Zuständen können durch Verwenden der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Pruritus (Juckreiz) ist eine Sinnesempfindung, die der Patient durch Kratzen zu lindern versucht. Siehe zum Beispiel Fleischer und Fleischer (1998) The Clinical Management of Itching: Therapeutic Protocols for Pruritus, Parthenon. Viele parasitische oder infektiöse Zustände können zu diesen Symptomen führen, wobei die Zustände durch eine angemessene Reaktivierung oder Unterdrückung von Immunfunktionen in der Haut beseitigt werden können. Ähnliches gilt für verschiedene allergische oder andere Immunreaktionen, die bei einem Aussetzen mit verschiedenen allergischen oder entzündlichen Antigenen hervorgerufen werden.
Vic und CTACK binden an und signalisieren durch den gemeinsamen Rezeptor GPR-2, wie anhand ihrer Fähigkeit gezeigt wurde, in Zellen Chemotaxis auszulösen, die mit GPR-2-cDNA transfiziert wurden, jedoch in nicht-transfizierten Zellen oder in Zellen, die mit trunkiertem GPR-2 (dem die 8 N-terminalen Aminosäuren fehlen) transfiziert wurden. Diese Chemokine teilen sich einen Rezeptor auf CLA⁺-T-Zellen, wie anhand des Ergebnisses gezeigt wurde, wonach sie in der Lage sind, gegenüber der jeweils anderen chemotaktischen Antwort unempfindlich zu machen.
Sowohl Vic als auch CTACK ziehen selektiv in die Haut wandernde („homing") CLA⁺-Gedächtnis-T-Zellen und keine anderen Gedächtnis-T-Zelluntergruppen, einschließlich β7⁺- in den Darm wandernde T-Zellen, chemisch an. Weder CTACK noch Vic ziehen naive T-Zellen, B-Zellen oder Monzyten an.
II. Aufgereinigte Chemokine; Rezeptoren
Die Nukleotid- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen eines Chemokinrezeptors, der als GPR2 bezeichnet wird, werden in den SEQ ID NOs: 1 und 2 (Mensch) und den SEQ ID NOs: 3 und 4 (Maus) gezeigt. Dieser Begriff wird weitere Pendants aus Pri maten und Nagetieren mit umfassen. Komplementäre Nukleinsäuresequenzen können für viele Zwecke verwendet werden, z.B. in einem Primerpaar für PCR oder als ein Mutageneseprimer. Fragmente der Nukleotidsequenz können als Hybridisierungssonden oder PCR-Primer oder zum Kodieren antigener Peptide verwendet werden. Fragmente des Polypeptids werden als antigene Peptide verwendbar sein. Ähnliches gilt für die anderen Gensequenzen. Die Gene kodieren für neue Proteine, die für einen Chemokinrezeptor charakteristische Struktur und Motive aufweisen. Siehe Marchese, et al. (1994) Genomics 23:609-618. GPR-2-mRNA wird in CLA⁺-T-Zellen, jedoch nicht in anderen Gedächtnis-T-Zelluntergruppen oder in naiven T-Zellen exprimiert; daher ist jedes Verfahren zum Blockieren der GPR2-Wechselwirkung mit CTACK oder Vic ein potentiell wichtiges therapeutisches Mittel, da von CLA⁺-T-Zellen bekannt ist, dass sie eine Schlüsselrolle bei kutaner Entzündung spielen.
Die vorliegende Erfindung hat eine Verknüpfung des menschlichen GPR2-Chemokinrezeptors mit den Chemokinen Vic und CTACK hergestellt.
Bestimmte allgemeine Beschreibungen von physikalischen Eigenschaften von Polypeptiden, Nukleinsäuren und Antikörpern, die auf eine Ausführungsform gerichtet sind, sind eindeutig auf andere, hier beschriebene Chemokine oder Rezeptoren anwendbar.
Diese Aminosäuresequenzen, die in der Ausrichtung Amino zu Carboxy bereitgestellt werden, sind für das Bereitstellen der Sequenzinformation auf dem Chemokinliganden oder -rezeptor wichtig, und ermöglichen die Unterscheidung des Proteins von anderen Proteinen, insbesondere von natürlich vorkommenden Versionen. Zudem erlauben die Sequenzen die Herstellung von Peptiden, um Antikörper zu erzeugen, um derartige Abschnitte zu erkennen und zu unterscheiden, und ermöglichen die Herstel lung von Oligonukleotidsonden, wobei beides Strategien zur Isolierung, z.B. Klonieren, von Genen sind, die für solche Sequenzen oder verwandte Sequenzen, z.B. natürliche polymorphe Sequenzen oder andere Varianten, einschließlich Fusionsproteine, kodieren. Ähnlichkeiten der Chemokine wurden mit anderen Cytokinen beobachtet. Siehe zum Beispiel Rosenberg et al. (1992) Cell 71:1157-1165; Huang, et al. (1992) Molecular Biology of the Cell 3:349-362, und Pandiella, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:24028-24033. Gleiches gilt für die GPC-Rezeptoren.
Der Begriff "GPR2", wie er hier verwendet wird, soll, wenn er in Zusammenhang mit einem Protein benutzt wird, ein Protein umfassen, das eine reife Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NOs: 1-4 gezeigt aufweist. Die Erfindung soll auch selektive Polypeptide umfassen, die zum Beispiel ein spezifisches Fragment eines solchen Proteins umfassen. Die Erfindung umfasst ebenso ein Polypeptid, das ein Pendant aus einer Primatenart ist, das zum Beispiel eine ähnliche Sequenz aufweist und in der natürlichen kodierenden Sequenz homologer ist als andere Gene aus einer Primatenart. Üblicherweise werden solche Chemokinrezeptoren auch mit ihren spezifischen Bindungskomponenten, zum Beispiel den Liganden oder den Antikörpern, an denen sie binden, wechselwirken. Diese Bindungskomponenten, zum Beispiel Antikörper, werden üblicherweise mit hoher Affinität, zum Beispiel mit mindestens ungefähr 100 nM, für gewöhnlich mehr als ungefähr 30 nM, bevorzugt mehr als ungefähr 10 nM und bevorzugter mehr als ungefähr 3 nM an den Chemokinrezeptor binden. Gleichermaßen zutreffende Bedingungen gelten für die Chemokinliganden.
Der Begriff "Polypeptid", wie er hier verwendet wird, beinhaltet ein wesentliches Fragment oder einen wesentlichen Abschnitt, und umspannt einen Abschnitt von Aminosäureresten von mindestens ungefähr 8 Aminosäuren, allgemein mindestens 10 Aminosäuren, allgemeiner mindestens 12 Aminosäuren, oft mindestens 14 Aminosäuren, öfter mindestens 16 Aminosäuren, üblicherweise mindestens 18 Aminosäuren, üblichererweise mindestens 20 Aminosäuren, für gewöhnlich 22 Aminosäuren, gewöhnlichererweise mindestens 24 Aminosäuren, bevorzugt mindestens 26 Aminosäuren, bevorzugter mindestens 28 Aminosäuren und in besonders bevorzugten Ausführungsformen mindestens ungefähr 30 oder mehr Aminosäuren, zum Beispiel ungefähr 35, 40, 45, 50, 60, 75, 80, 100, 120, etc. Ähnliche Proteine werden wahrscheinlich eine Vielzahl von solchen Abschnitten umfassen. Derartige Fragmente können in allen kombinatorischen Paaren in dem kodierenden Abschnitt Enden aufweisen, die an praktisch allen Positionen beginnen und/oder enden können, beispielsweise beginnend bei den Resten 1, 2, 3, etc. und endend bei zum Beispiel 69, 68, 67, 66, etc. Peptide von besonderem Interesse weisen Enden auf, die den Grenzen struktureller Domänen entsprechen, zum Beispiel intrazelluläre oder extrazelluläre Schleifen der Ausführungsformen der Rezeptoren. Derartige Peptide werden üblicherweise immunogene Peptide sein oder können verknüpft werden, um größere Polypeptide zu erzeugen. Kurze Peptide können an einen größeren Träger angeheftet oder gekoppelt werden.
Der Begriff "Bindungszusammensetzung" bezieht sich auf Moleküle, die mit Spezifität an das entsprechende Chemokin oder den entsprechenden Rezeptor binden, beispielsweise auf die Art und Weise eines Ligand-Rezeptors oder einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung. Diese Zusammensetzungen können Verbindungen sein, zum Beispiel Proteine, die mit dem Chemokin oder Rezeptor spezifisch assoziieren, einschließlich natürlicher physiologisch relevanter Protein-Protein-Wechselwirkungen, die entweder kovalent oder nicht-kovalent stattfinden. Die Bindungszusammensetzung kann ein Polymer sein oder ein anderes chemisches Reagenz. Es wird keine zwangsläufige Schlußfolgerung dahingehend geliefert, ob das Chemokin bei seiner Ligand- Rezeptor-Wechselwirkung eine konkave oder konvexe Form zeigt, abgesehen davon, daß die Wechselwirkung eine ähnliche Spezifität, zum Beispiel eine ähnliche spezifische Affinität aufweist. Ein funktionelles Analog kann ein Ligand mit strukturellen Modifikationen sein oder ein vollständig unverwandtes Molekül, das zum Beispiel eine molekulare Form aufweist, die mit den geeigneten Ligand-Bindungsdeterminanten wechselwirkt. Die Liganden können als Agonisten oder Antagonisten eines physiologischen oder natürlichen Rezeptors dienen, siehe zum Beispiel Goodman, et al. (Herausgeber, 1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8. Auflage), Pergamon Press. Der Begriff schließt ausdrücklich Antikörper, polyklonal oder monoklonal, ein, die an das entsprechende Antigen spezifisch binden.
Im Wesentlichen rein bedeutet, dass das Protein frei von anderen kontaminierenden Proteinen, Nukleinsäuren und/oder anderen biologischen Stoffen ist, die üblicherweise aus dem ursprünglichen Quellorganismus stammen. Die Reinheit kann durch Standardverfahren getestet werden und wird für gewöhnlich mindestens ungefähr 40 % Reinheit, gewöhnlicher mindestens ungefähr 50 % Reinheit, allgemein mindestens ungefähr 60 % Reinheit, allgemeiner mindestens ungefähr 70 % Reinheit, oft mindestens ungefähr 75 % Reinheit, öfter mindestens ungefähr 80 % Reinheit, üblicherweise mindestens ungefähr 85 % Reinheit, üblichererweise mindestens ungefähr 90 % Reinheit, bevorzugt mindestens ungefähr 95 % Reinheit, bevorzugter mindestens ungefähr 98 % Reinheit und in den am meisten bevorzugten Ausführungsformen mindestens 99 % Reinheit betragen. Die Auswertungen werden üblicherweise pro Gewicht erfolgen, können jedoch auch pro molekularer Mengen erfolgen.
Die Löslichkeit eine Polypeptids oder Fragmentes hängt von der Umgebung und dem Polypeptid ab. Viele Parameter beeinflussen die Polypeptidlöslichkeit, einschließlich der Temperatur, der Elektrolytumgebung, der Größe und der molekularen Eigenschaften des Polypeptids und der Natur des Lösungsmittels. Üblicherweise reicht die Temperatur, bei der das Polypeptid verwendet wird, von ungefähr 4 °C bis ungefähr 65 °C. Für gewöhnlich ist die Temperatur der Verwendung größer als ungefähr 18 °C und noch gewöhnlicher größer als ungefähr 22 °C. Für diagnostische Zwecke wird die Temperatur für gewöhnlich bei ungefähr Raumtemperatur oder darüber liegen, jedoch niedriger als die Denaturierungstemperatur der Komponenten in dem Assay sein. Für therapeutische Zwecke wird die Temperatur für gewöhnlich Körpertemperatur sein, üblicherweise ungefähr 37 °C für Menschen, obwohl bei bestimmten Situationen die Temperatur in situ oder in vitro erhöht oder gesenkt werden kann.
Die Elektrolyte werden für gewöhnlich den physiologischen in situ-Bedingungen in etwa entsprechen, können jedoch, soweit vorteilhaft, auf höhere oder niedrige Ionenstärke modifiziert werden. Die tatsächlichen Ionen können modifiziert werden, um sich zum Beispiel an Standardpuffer anzupassen, die in physiologischen oder analytischen Zusammenhängen verwendet werden.
Die Größe und die Struktur des Polypeptids sollte im Allgemeinen in einem im Wesentlichen stabilen Stadium sein und für gewöhnlich nicht in einem denaturiertem Stadium, obwohl denaturiertes Protein in bestimmten Fällen wichtig sein wird. Das Polypeptid kann mit anderen Polypeptiden in einer Quartärstruktur assoziiert sein, beispielsweise um Löslichkeit zu verleihen, oder mit Lipiden oder Detergenzien auf eine Weise assoziiert sein, die den Wechselwirkungen einer natürlichen Lipiddoppelschicht entspricht.
Das Lösungsmittel wird für gewöhnlich ein biologisch verträglicher Puffer eines Typs sein, der für die Erhaltung der biologischen Aktivitäten verwendet wird, und wird für gewöhnlich einem physiologischen Lösungsmittel entsprechen. Das Lö sungsmittel wird für gewöhnlich einen neutralen pH aufweisen, üblicherweise mindestens ungefähr 5, bevorzugt mindestens 6 und üblicherweise geringer als 10, bevorzugt niedriger als 9 und bevorzugter ungefähr 7,5. In einigen Fällen wird ein Detergens zugegeben, üblicherweise ein mildes, nicht-denaturierendes, zum Beispiel CHS (Cholesterylhemisuccinat) oder CHAPS (3-([3-Cholamido-propyl]dimethylammonio)-1-propansulfonat) oder in einer Konzentration, die gering genug ist, um eine wesentlichen Störung der strukturellen oder physiologischen Eigenschaften des Proteins zu vermeiden.
Die Löslichkeit wird durch Sedimentation dargestellt, die in Svedberg-Einheiten gemessen wird, die ein Maß der Sedimentationsgeschwindigkeit eines Moleküls unter bestimmten Bedingungen sind. Die Bestimmung der Sedimentationsgeschwindigkeit wird klassisch in einer analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt, wird jedoch heutzutage üblicherweise in einer Standard-Ultrazentrifuge durchgeführt. Siehe Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2. Auflage), W.H. Freeman, und Cantor und Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, Teile 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco. Für eine grobe Bestimmung wird eine Probe, die ein vermutlich lösliches Polypeptid enthält, in einer Standard-Ultrazentrifuge mit Normalgröße bei ungefähr 50 000 UpM für ungefähr 10 Minuten zentrifugiert und lösliche Moleküle werden im Überstand verbleiben. Ein lösliches Partikel oder Polypeptid wird für gewöhnlich weniger als ungefähr 30 S, üblichererweise weniger als etwa 15 S, für gewöhnlich weniger als ungefähr 10 S, gewöhnlichererweise weniger als ungefähr 6 S und in bestimmten Ausführungsformen bevorzugt weniger als ungefähr 4 S und noch bevorzugter weniger als ungefähr 3 S aufweisen.
III. Physikalische Varianten
Proteine oder Peptide, die eine wesentliche Aminosäuresequenzhomologie mit der Aminosäuresequenz von jedem entsprechenden Rezeptor aufweisen, werden ebenfalls offenbart. Diese Varianten beinhalten Artvarianten oder polymorphe Varianten.
Aminosäuresequenzhomologie, oder Sequenzidentität wird durch Optimieren der Restübereinstimmung bestimmt, indem, soweit erforderlich, Lücken eingeführt werden. Dies ändert sich, wenn konservative Substitutionen als Übereinstimmungen in Betracht gezogen werden. Konservative Substitutionen beinhalten üblicherweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Aspartat, Glutamat; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Bei homologen Aminosäuresequenzen ist üblicherweise beabsichtigt, natürliche allelische und Variationen innerhalb der Art („interspecies variations") in jeder entsprechenden Proteinsequenz zu berücksichtigen. Übliche homologe Proteine oder Peptide werden von 25-100 % Homologie (wenn Lücken eingefügt werden können) bis 50-100 % Homologie (wenn konservative Substitutionen berücksichtigt werden) mit der Aminosäuresequenz des entsprechenden Chemokins oder Rezeptors aufweisen. Homologiemaße werden mindestens ungefähr 35 %, allgemein mindestens 40 %, allgemeiner mindestens 45 %, oft mindestens 50 %, öfter mindestens 55 %, üblicherweise mindestens 60 %, üblichererweise mindestens 65 %, für gewöhnlich mindestens 70 %, gewöhnlichererweise mindestens 75 %, bevorzugt mindestens 80 % und noch bevorzugter mindestens 80 % und in besonders bevorzugten Ausführungsformen mindestens 85 % oder mehr betragen. Siehe auch Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Kapitel Eins in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison, Addison-Wesley, Reading, MA; und die Softwarepakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA und der Genetics-Computergruppe der Universität von Wisconsin, Madison, WI.
Jede der isolierten Chemokin- oder GPC-Rezeptor-DNAs kann durch Nukleotidsubstitutionen, Nukleotiddeletionen, Nukleotidinsertionen und Inversionen von Nukleotidbereichen einfach modifiziert werden. Diese Modifikationen können zu neuen DNA-Sequenzen führen, die diese Antigene, ihre Derivate oder Proteine mit ähnlicher physiologischer, immunogener oder antigener Aktivität kodieren. Diese modifizierten Sequenzen können verwendet werden, um Mutantenantigene zu bilden oder um die Expression zu erhöhen, oder um passende Enzymerkennungsstellen in die Nukleotidsequenz einzuführen, ohne die kodierte Proteinsequenz wesentlich zu beeinflussen. Verbesserte Expression kann Genamplifikation, erhöhte Transkription, erhöhte Translation und andere Mechanismen einschließen. Derartige Mutantenrezeptorderivate beinhalten vorbestimmte oder ortsspezifische Mutationen des entsprechenden Proteins oder seiner Fragmente. Ein "Mutantenchemokin" umfasst ein Polypeptid, das ansonsten in die Homologiedefinition des Chemokins, wie oben dargestellt, fällt, jedoch eine Aminosäuresequenz aufweist, die von der des Chemokins, entweder durch Deletion, Substitution oder Insertion abweicht, das in der Natur gefunden wird. Gleiches gilt für die GPCRs. Dieses beinhaltet Substitutionslevel für Aminosäurereste von null, eins, zwei, drei, fünf, sieben, zehn, zwölf, fünfzehn etc. Insbesondere beinhaltet ein "ortsspezifischer Mutant" allgemein Proteine, die eine wesentliche Homologie mit einem Protein aufweisen, das Sequenzen aus den SEQ ID NOs: 1-14 aufweist, und verschiedene biologische Aktivitäten mit diesen Sequenzen teilt, zum Beispiel antigen oder immunogen ist, und in bevorzugten Ausführungsformen die meisten der offenbarten Sequenzen enthält, insbesondere die in verschiedenen Tiergruppen aufgefundenen. Wie oben angegeben wird betont, dass die Beschreibungen allgemein gedacht sind, die verschiedenen Chemokin- oder Rezeptorproteine von anderen Mitgliedern verwandter Gruppen zu umfassen, ohne auf die spezifisch diskutierten Ausführungsformen der Maus oder des Menschen beschränkt zu sein.
Obwohl ortsspezifische Mutationsstellen oft vorbestimmt sind, müssen die Mutationen nicht ortsspezifisch sein. Chemokin- oder Rezeptormutagenese kann durch Ausführen von Aminosäureinsertionen oder -deletionen vorgenommen werden. Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Kombinationen können erzeugt werden, um zu einem Endkonstrukt zu gelangen. Insertionen beinhalten amino- oder carboxyterminale Fusionen. Eine Zufallsmutagenese kann an einem Zielkodon durchgeführt werden und die exprimierten Mutanten können dann nach der gewünschten Aktivität durchmustert werden. Verfahren zum Durchführen von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA, die eine bekannte Sequenz aufweist, sind im Fachgebiet gut bekannt, zum Beispiel mittels M13-Primermutagenese- oder Polymerasekettenreaktions- (PCR) Techniken. Siehe ebenso Sambrook, et al. (1989) und Ausubel, et al. (1987 und Ergänzungen). Viele strukturelle Eigenschaften sind für die Chemokine und GPCRs bekannt, die eine Bestimmung ermöglichen, ob spezifische Reste in dem Kern der Sekundär- oder Tertiärstrukturen eingebettet sind, oder ob diese Reste einen verhältnismäßig geringen Einfluss auf die Proteinfaltung haben. Bevorzugte Positionen für die Mutagenese sind solche, die das funktionelle Falten des entstehenden Proteins nicht verhindern.
Die Mutationen in der DNA sollten normalerweise kodierende Sequenzen nicht aus den Leserahmen nehmen und werden bevorzugt keine komplementären Bereiche erzeugen, die hybridisieren könnten und dabei sekundäre mRNA-Strukturen, wie Schleifen oder Haarnadeln, bilden. Es gibt jedoch bestimmte Situationen, bei denen solche Probleme kompensiert werden. Siehe zum Beispiel Gesteland und Atkins (1996) Ann. Rev. Biochem. 65:741-768.
Rekombinante Proteine, zum Beispiel heterologe Fusionsproteine, die Abschnitte von diesen Proteinen verwenden, oder Antikörper werden ebenfalls offenbart. Eine heterologes Fusionsprotein ist eine Fusion von Proteinen oder Abschnitten, die natürlicherweise nicht auf die gleiche Weise fusioniert vorliegen. Daher ist das Fusionsprodukt eines Immunglobulins mit einem Rezeptorpolypeptid ein durchgehendes Proteinmolekül, das Sequenzen aufweist, die durch eine typische Peptidverknüpfung verknüpft sind, das üblicherweise als ein einzelnes Translationsprodukt hergestellt wird und Eigenschaften aufweist, die von jedem der Ursprungspeptide herrühren. Ein ähnliches chimäres Konzept gilt für heterologe Nukleinsäuresequenzen.
Zusätzlich können neue Konstrukte durch Kombinieren gleichartiger funktioneller oder struktureller Domänen aus anderen Proteinen hergestellt werden. Beispielsweise können Ligand-Bindungsabschnitte oder andere Abschnitte zwischen verschiedenen neuen Fusionspolypeptiden oder -fragmenten ausgetauscht werden. Siehe zum Beispiel Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1336 und O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. Auf diese Weise werden sich neue chimäre Polypeptide, die neue Kombinationen von Spezifitäten aufweisen, aus der funktionellen Verknüpfung von Ligand-Bindungsspezifitäten und anderen funktionalen Domänen ergeben. Solche Peptide können chimäre Moleküle mit einem Vermischen oder einem Anpassen der verschiedenen strukturellen Abschnitte sein, beispielsweise die β-Faltblatt- oder α-Helixstrukturdomänen für das Chemokin, oder Rezeptorabschnitte, die jedem der Transmembranabschnitte (TM1-TM7) oder den intrazellulären (zytosolischen, C1-C4) oder extrazellulären (E1-E4)-Schleifen der verschiedenen Rezeptortypen entsprechen. Die C3-Schleife ist besonders wichtig.
Das von Beaucage und Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862 beschriebene Phosphoramiditverfahren wird geeignete synthetische DNA-Fragmente hervorbringen. Ein doppelsträngiges Fragment wird oft entweder durch Synthetisieren des komplementären Stranges und Aneinanderlagern der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Hinzufügen des komplementären Stranges unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz, beispielsweise durch PCR-Techniken, erhalten.
IV. Funktionelle Varianten
CTACK-Chemokine aus Säugetieren wurden bereits in der USSN 08/978,964 beschrieben, die verschiedene Wanderungsassays beschreibt. Verschiedene Agonisten und Antagonisten der natürlichen Liganden können hergestellt werden. Die Wanderungsassays können sich die Bewegung der Zellen durch Poren in Membranen zu Nutze machen. Dadurch kann die Chemotaxis gemessen werden. Alternativ können chemokinetische Assays entwickelt werden, welche die Induktion einer kinetischen Bewegung, nicht notwendigerweise relativ zu einem Gradienten, an sich messen.
CTACK- oder Vic-Agonisten werden einige oder alle der Signalfunktionen des entsprechenden Chemokins zeigen, zum Beispiel das Binden an und das chemische Anziehen der entsprechenden Zellen. Verschiedene CTACK- oder Vic-Sequenzen aus Säugetieren können bewertet werden, um zu bestimmen, welche Reste über die Arten hinweg konserviert sind, was nahelegt, welche Reste ohne dramatische Wirkungen auf die biologische Aktivität verändert werden können. Da alternativ konservative Substitutionen wahrscheinlich die biologische Aktivität erhalten werden, wird dies zu abweichenden Formen des Chemokins führen, welche die Agonistenaktivität erhalten werden. Standardverfahren zum Durchmustern von mutierten oder abweichenden CTACK- oder Vic-Polypeptiden werden bestimmen, welche Sequenzen für therapeutische Agonisten verwendbar sind.
Zusätzlich können bestimmte Nukleinsäureexpressionsverfahren angewendet werden. Beispielsweise kann es im Zusammenhang mit Hautverpflanzungen nützlich sein, die Transplantate mit Nukleinsäuren zu transfizieren, die soweit erforderlich exprimiert werden. Verschiedene Promotoren können in funktionsfähiger Weise an das Gen geknüpft werden und dadurch eine regulierte Expression ermöglichen.
Alternativ kann auf antagonistische Aktivität getestet werden. Tests auf die Fähigkeit, der Aktivität des chemischen Anziehens entgegen zu wirken, können durch Verwendung von Assays, wie sie unten beschrieben werden, entwickelt werden. Verschiedene Ligandenhomologe können erzeugt werden, welche die Rezeptorbindungsaktivität erhalten, denen jedoch das Signalisierungsvermögen fehlt. Kleine Moleküle können ebenfalls auf ihre Fähigkeit hin durchmustert werden, die CTACK-Funktion, beispielsweise Chemotaxis, Rezeptorbindung, Ca⁺⁺-Fluss und andere Wirkungen, die durch CTACK vermittelt werden, zu antagonisieren. Siehe im allgemeinen Gilman, et al. (Herausgeber, 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. Auflage, Pergamon Press; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn., wobei jedes dieser beiden durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird.
Das Blockieren der physiologischen Antwort gegenüber verschiedenen Ausführungsformen dieser Chemokine oder GPCRs kann aus der Inhibierung der Bindung des Liganden an seinen Rezeptor, wahrscheinlich durch kompetitive Inhibierung, herrühren. Daher werden in vitro-Assays der vorliegenden Erfindung oft isolierte Proteine, Membranen von Zellen, die einen rekombinanten Membran-assoziierten Rezeptor exprimieren, beispiels weise Ligand-Bindungsabschnitte, oder Fragmente verwenden, die an Festphasensubstrate angeheftet sind. Diese Assays werden auch die diagnostische Bestimmung der Wirkungen von entweder Bindungsabschnittmutationen und -modifikationen oder Ligandenmutationen und -modifikationen, zum Beispiel Ligandanaloga, ermöglichen.
Die Erfindung zieht auch die Verwendung von kompetitiven Drogenscreeningssassays in Betracht, zum Beispiel von solchen, bei denen neutralisierende Bindungszusammensetzungen, zum Beispiel Antikörpern, für Antigen- oder Rezeptorfragmente mit einer Testverbindung um die Bindung an das Protein konkurrieren. Auf diese Weise können Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart von Polypeptiden nachzuweisen, die eine oder mehrere antigene Bindungsstellen des Liganden teilen, und können ebenfalls verwendet werden, um Bindungsstellen auf dem Protein zu besetzen, die ansonsten mit einem Rezeptor Wechselwirken könnten.
Zusätzlich können neutralisierende Antikörper gegen eine spezifische Chemokinausführungsform und lösliche Fragmente des Chemokins, die eine hochaffine Rezeptorbindungsstelle enthalten, verwendet werden, um die Chemokinaktivität in Geweben, zum Beispiel Geweben, die eine abnorme Physiologie erfahren, zu inhibieren.
Durchmusterungen zur Bewertung der Bindung und der Aktivität von mAbs und Bindungszusammensetzungen umfassen eine Vielzahl von Verfahren. Die Bindung kann durch nachweisbares Markieren des Antikörpers oder der Bindungszusammensetzung, wie oben beschrieben, getestet werden. Zellen, die für CTACK oder Vic empfänglich sind, können verwendet werden, um den Antikörper oder die Bindungszusammensetzung zu testen.
Um die chemische Anziehung durch CTACK oder Vic oder deren chemokinetischen Eigenschaften zu bewerten, werden bevorzugt Versuchstiere, zum Beispiel Mäuse, verwendet. Hautzellzählungen, zum Beispiel Langerhans-Zellen, werden vor der und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung eines Bolus des Kandidatenagonisten oder -antagonisten durchgeführt. Die Gehalte werden in verschiedenen Proben, zum Beispiel Blut, Serum, Nasen- oder Lungenspülungen oder durch Gewebsbiopsiefärbung analysiert. Eine erfolgreiche Abreicherung von mAb oder der Bindungszusammensetzung wird den Gehalt an CLA⁺-Zellen wesentlich verringern. Diese kann mindestens ungefähr 10 %, bevorzugt mindestens ungefähr 20 %, 30 %, 50 %, 70 % oder mehr betragen.
Die Bewertung von Antikörpern kann in anderen Tieren, zum Beispiel Menschen unter Verwendung verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise werden Blutproben von Patienten, die unter einer hautbedingten Krankheit oder Störung leiden, vor und nach Behandlung mit einem Kandidaten-mAb entnommen.
Das außerordentliche Gewebe-selektive Ausrichten ("homing") von Lymphozyten wurde lange als für die Kontrolle von systemischen Immunantworten entscheidend angesehen. Neueste Fortschritte im Fachgebiet unterstützen ein Modell, bei dem das Leukozytenhoming durch sequenzielle Beteiligung von unterschiedlich exprimierten und unabhängig regulierten vaskulären und Leukozytenadhäsionsmolekülen und Signalrezeptoren und deren Liganden erhalten wird. Butcher und Picker (1996) Science 272:60-66. Die Beobachtung, dass Chemokine, eine Superfamilie von kleinen, sekretierten Proteinen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Baggiolini (1998) Nature 392:556-568) Leukozyten anziehen können, führte zu der Hypothese, dass Chemokine die Schlüsselsignale bereitstellen, die das Rekrutieren von T-Lymphozytenuntergruppen hin zu lymphoiden und extra lymphoiden Immuneffektorstellen dirigieren. Die hautspezifische Expression von CTACK und/oder Vic gekoppelt mit ihrer selektiven chemischen Anziehung für auf die Haut gerichtet CLA⁺-Gedächtnis-T-Zellen liefert Daten, welche die Hypothese unterstützen, daß es gewebsspezifische Chemokine gibt, die funktionell einzigartige Untergruppen von Gedächtnis-Lymphozyten selektiv anziehen.
Auf diese Weise stellt die vorliegende Erfindung Mittel zum Aufreinigen gewünschter Zellen, zum Beispiel CLA⁺-Zellen zur Verfügung. Die chemisch anziehenden oder chemokinetischen Wirkungen auf diese Zellen können die Grundlage von Aufreinigungsverfahren bilden. Es existieren Verfahren für die selektive Wanderung und Gewinnung von Zellen hin zum oder von dem Chemokin weg, beispielsweise durch poröse Membranen oder hin zu verschiedenen Orten in einer Kultur. Andere Verfahren existieren, um selektiv Zellen mit bestimmten Formen von anderen zu trennen. Alternativ kann ein Markieren verwendet werden, um Zellen, die spezifisch an das Chemokin binden, mittels FACS zu sortieren. Populationen mit im Wesentlichen homogenen Langerhans- oder aus der Haut abgeleiteten Zellen werden einen großen Nutzen in Forschungs- oder Therapieumgebungen haben.
Während CTACK und Vic Wirkungen auf CLA⁺-Zellen zeigen, schließen andere Zellen, die ebenfalls ansprechen können, Fibroblasten und Keratinozyten ein. Die Wirkungen auf verschiedenen Zelltypen können sowohl indirekt als auch direkt sein. Eine statistisch signifikante Veränderung in der Anzahl der Zellen wird üblicherweise mindestens ungefähr 10 %, bevorzugt 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, 90 % oder mehr betragen. Wirkungen von mehr als 100 %, zum Beispiel 130 %, 150 %, 2X, 3X, 5X, etc. werden oft wünschenswert sein. Die Wirkungen können spezifisch sein, indem sie Chemotaxis hin zu spezifischen Punkten verursachen, oder sie können chemokinetisch sein, indem sie eine allgemeine Bewegung von Zellen induzieren, jedoch nicht notwendigerweise in eine bestimmte Richtung.
CTACK kann die Integrin-vermittelte Adhäsion an die vaskuläre Liganden ICAM-1 und VCAM-1 induzieren. ICAM-1 oder VCAM-1 sind vaskuläre Adhäsionsmoleküle (Adhäsionsmoleküle, die durch die Gefäße auskleidende endotheliale Zellen exprimiert werden) und von Ihnen ist bekannt, daß sie auf endothelialen Zellen als Antwort auf eine entzündungsfördernde Stimulation in vitro und in vivo hochreguliert werden. Diese Adhäsionsmoleküle unterstützen die Leukozytenadhäsion durch Wechselwirkung mit Integrinmolekülen (ICAM-1 bindet an die β2-Integrine LFA-1 und MAC-1 und VCAM-1 bindet an die α4-Integrine α4β1 und α4β7). Die Behandlung von Zellen mit bestimmten Chemokinen (jedoch nicht mit allen Chemokinen) kann eine Modulierung der Integrine verursachen, die zu einer viel besseren Bindung dieser Zellen an diese vaskulären Liganden führen kann. CTACK kann diese Modulierung verursachen: eine Behandlung von T-Zellen oder einer T-Zellinie, die GPR2 exprimiert, verursacht eine schnelle (2 Minuten) Erhöhung des Bindungsfähigkeit. Dies deutet an, dass CTACK für die Adhäsion von CLA⁺-T-Zellen an die endothelialen Zellen in der Haut verantwortlich sein könnte.
CTACK kann ebenfalls die transendotheliale Wanderung von CLA⁺-T-Zellen über stimulierte endotheliale Einzelzellschichten vermitteln. Bei diesen Experimenten werden endotheliale Zellen in „transwell"-Kammern angezogen, mit beispielsweise Tumornekrosefaktor α (TNFα) stimuliert, CTACK wird in die untere Vertiefung („well") gegeben und Gedächtnis-T-Zellen werden in die obere Kammer gegeben. CTACK veranlasst die CLA⁺-T-Zellen (jedoch nicht andere Gedächtnis-T-Zellen einschließlich der β7-T-Zellen) über die Zelleinzelschicht in die untere Kammer zu wandern. Dies legt nahe, dass CTACK das Rekrutieren von T-Zellen hin zu kutanen Entzündungsorten durch Induzieren der Wanderung von CLA⁺-T-Zellen durch die endothelialen Zellen, welche die Blutgefäße auskleiden, vermitteln kann.
Dies legt eine Nützlichkeit dieser Chemokine oder Antagonisten in der Behandlung von medizinischen Zuständen oder Krankheiten nahe, die mit immunologischen Zuständen der Haut assoziiert sind. Siehe zum Beispiel Bos (Herausgeber, 1990) Skin Immune System, CRC Press, Boca Raton, FLA; Fitzpatrick, et al. (Herausgeber, 1993) Dermatology in General Medicine, (4. Auflage) McGraw-Hill, NY; Rook, et al. (Herausgeber, 1998) Textbook of Dermatology Blackwell, Habifor und Habie (1995) Clinical Dermatology: A Color Guide to Diagnosis and Therapy Mosby; Grob (Herausgeber, 1997) Epidemiology, Causes and Prevention of Skin Diseases Blackwell; Frank, et al. (Herausgeber, 1995) Samter's Immunologic Disease 5. Auflage, Bände I-II, Little, Brown und Co., Boston, MA; Coffman, et al. (1989) Science 245:308-310; und Frick, et al. (1988) J. Allergy Clin. Immunol. 82:199-225. Die beschriebenen Agonisten oder Antagonisten können mit anderen Behandlungen des hier beschriebenen medizinischen Zustandes kombiniert werden, zum Beispiel einem Antibiotikum, einem immunsuppressiven Therapeutika, Immunadjuvans, Analgetikum, entzündungshemmenden Wirkstoff, Wachstumsfaktor, Zytokin, Vasodilatator oder Vasokonstriktor.
"Derivate" von Chemokinantigenen beinhalten Aminosäuresequenzmutanten, Glykosylierungsvarianten und kovalente oder Aggregatkonjugate mit anderen chemischen Resten. Kovalente Derivate können durch Verknüpfen von Funktionalitäten mit Gruppen, die in Chemokinaminosäureseitenketten oder an den N- oder C-Termini gefunden werden, durch Mittel, die im Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Diese Derivate können ohne Einschränkung aliphatische Ester oder Amine des Carboxyterminus oder von Resten, die Carboxylseitenketten enthalten, O-Acylderivate von Hydroxylgruppen-enthaltenden Resten und N-Acylderivate der Amino-terminalen Aminosäure oder von Aminogruppen-enthaltenden Resten, zum Beispiel Lysin oder Arginin, enthalten. Acylgruppen werden aus der Gruppe bestehend aus Alkyl-Resten einschließlich C3- bis C18-Normalalkyl ausgewählt, wodurch Alkanoyl-Aroyl-Arten gebildet werden. Kovalentes Anheften an Trägerproteine kann wichtig sein, wenn immunogene Reste Haptene sind.
Insbesondere sind Glykosylierungsveränderungen eingeschlossen, zum Beispiel solche, die durch Modifizieren des Glykosylierungsmusters eines Polypeptids während seiner Synthese und seiner Prozessierung oder in weiteren Prozessierungsschritten durchgeführt werden. Besonders bevorzugte Mittel, um dies auszuführen, sind das Exponieren des Polypeptids mit glykosylierenden Enzymen, die aus Zellen erhalten werden, die normalerweise ein derartiges Prozessieren bereitstellen, zum Beispiel Glykosylierungsenzyme aus Säugetieren. Deglykosylierungsenzyme sind ebenfalls umfasst. Auch umfasst sind Versionen der gleichen primären Aminosäuresequenz, die andere geringfügige Modifikationen aufweist, einschließlich phosphorylierter Aminosäurereste, zum Beispiel Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreonin oder Nukleosid- oder Nukleotidderivate, beispielsweise Guanyl-derivatisierte.
Eine Hauptgruppe von Derivaten sind kovalente Konjugate des entsprechenden Chemokins oder Rezeptors oder deren Fragmente mit anderen Proteine oder Polypeptiden. Diese Derivate können in rekombinanter Kultur synthetisiert werden, wie beispielsweise als N- oder C-terminale Fusionen oder durch die Verwendung von Mitteln, die im Fachgebiet hinsichtlich ihrer Verwendbarkeit beim Kreuzvernetzen von Proteinen durch reaktive Seitengruppen bekannt sind. Bevorzugte Chemokinderivatisierungsstellen mit kreuzvernetzenden Wirkstoffen liegen auf freien Aminogruppen, Kohlenhydratseitenketten und Cysteinresten.
Fusionspolypeptide zwischen diesen Chemokinen oder Rezeptoren und anderen homologen und heterologen Proteinen, zum Beispiel anderen Chemokinen oder Rezeptoren werden ebenfalls bereitgestellt. Viele Wachstumsfaktoren oder Zytokine sind homodimere Gebilde, und ein sich wiederholendes Konstrukt kann verschiedene Vorteile, einschließlich einer verringerten Empfänglichkeit gegenüber proteolytischer Spaltung aufweisen. Zudem erfordern viele Zytokinrezeptoren eine Dimerisierung, um ein Signal zu übertragen, und verschiedene dimere Liganden oder Domänwiederholungen können wünschenswert sein. Homologe Polypeptide können Fusionen zwischen verschiedenen Oberflächenmarkern sein, die zu beispielsweise einem Hybridprotein führen, das Rezeptorbindungsspezifität aufweist. Auf die gleiche Weise können heterologe Fusionen gebildet werden, die eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der Ursprungsproteine aufweisen würden. Typische Beispiele sind Fusionen eines Reporterpolypeptids, zum Beispiel Luciferase, mit einem Abschnitt oder einer Domäne eines Liganden, zum Beispiel einem Rezeptor-Bindungsabschnitt, so dass die Gegenwart oder die Lokalisierung des fusionierten Liganden oder einer Bindungszusammensetzung einfach bestimmt werden kann. Siehe zum Beispiel Dull, et al., US-Patent Nr. 4,859,609 . Weitere Genfusionspartner schließen die bakterielle β-Galaktosidase, trpE, Protein A, β-Laktamase, α-Amylase, Alkoholdehydrogenase, eine FLAG-Fusion und den Hefe-α-Matingfaktor ein. Siehe zum Beispiel Godowski, et al. (1988) Science 241:812-816.
Das von Beaucage und Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862 beschriebene Phosphoramiditverfahren wird geeignete synthetische DNA-Fragmente hervorbringen. Ein doppelsträngiges Fragment wird oft entweder durch Synthetisieren des komplementären Stranges und Aneinanderlagern der Stränge unter geeigneten Bedingungen oder durch Hinzufügen des komplementären Stranges unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer geeigneten Primersequenz erhalten.
Derartige Polypeptide können ebenfalls Aminosäurereste aufweisen, die durch Phosphorylierung, Guanylierung, Sulfonierung, Biotinylierung oder die Zugabe oder Entfernung von anderen Seitenketten, insbesondere solcher, die molekulare Formen aufweisen, die denen von Phosphat- oder Guanylgruppen ähnlich sind, chemisch modifiziert wurden. In einigen Ausführungsformen werden die Modifikationen als Markierungsreagenzien verwendbar sein oder als Aufreinigungstargets dienen, wie beispielsweise Affinitätstags wie FLAG.
Fusionsproteine werden üblicherweise entweder durch rekombinante Nukleinsäureverfahren oder durch synthetische Polypeptidverfahren hergestellt. Techniken zur Nukleinsäuremanipulation und -expression werden im Allgemeinen zum Beispiel in Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Bände 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, beschrieben. Techniken für die Synthese von Polypeptiden werden zum Beispiel in Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232:341-347; und Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, beschrieben, und die chemische Ligation, zum Beispiel Dawson, et al. (1994) Science. 266:776-779, ein Verfahren zum Verknüpfen von langen synthetischen Peptiden mittels einer Peptidbindung.
Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von Derivaten dieser Chemokine oder Rezeptoren in Betracht, die keine Variationen in der Aminosäuresequenz oder Glykosylierung sind. Derartige Derivate können eine kovalente oder aggregative. Vereinigungen mit chemischen Seitenketten einbeziehen. Diese Derivate schließen im Allgemeinen (1) Salze, (2) kovalente Modifizierungen der Seitenkette und des terminalen Restes, und (3) Adsorptionskomplexe, zum Beispiel mit Zellmembranen ein. Solche kovalente oder aggregativen Derivate sind als Immunogene, als Reagenzien in Immunoassays oder in Aufreinigungsverfahren, wie beispielsweise zur Affinitätsaufreinigung von Liganden oder anderen Bindungsliganden verwendbar. Beispielsweise kann ein Chemokinantigen durch kovalentes Binden auf einem festen Träger, wie beispielsweise Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose, durch im Fachgebiet bekannte Verfahren immobilisiert werden, oder auf Polyolefinoberflächen mit oder ohne Glutaraldehydkreuzvernetzung für eine Verwendung in dem Assay oder zur Aufreinigung von anti-Chemokin-Antikörpern oder deren Rezeptoren adsorbiert werden. Diese Chemokine können auch mit einer nachweisbaren Gruppe markiert werden, beispielsweise durch das Chloramin-T-Verfahren radiojodiert werden, kovalent an seltene Erdchelate gebunden oder für die Verwendung in diagnostischen Assays an eine fluoreszierende Seitengruppe konjugiert werden. Die Aufreinigung von Chemokin, Rezeptor oder Bindungszusammensetzungen kann durch immobilisierte Antikörper oder Rezeptoren bewirkt werden.
Andere Modifikationen können mit dem Ziel eingeführt werden, die therapeutischen Pharmakokinetiken oder Pharmakodynamiken eines Zielchemokins zu modifizieren. Beispielsweise können bestimmte Mittel zum Verringern der Größe der Einheit dessen pharmazeutische Zugänglichkeit erhöhen, andere Mittel zum Maximieren der Größe können die Pharmakodynamiken beeinflussen. Auf die gleiche Weise können Veränderungen in den Ligand-Bindungskinetiken oder dem Gleichgewicht eines Rezeptors ausgeführt werden.
Ein solubilisiertes erfindungsgemäßes Chemokin oder Rezeptor oder geeignetes Fragment kann für die Herstellung von Antiseren oder Antikörpern, die für den Ligand, Rezeptor oder dessen Fragmente spezifisch sind, als ein Immunogen verwendet werden. Die aufgereinigten Proteine können verwendet werden, um monoklonale Antikörper oder Chemokin-Bindungsfragmente zu durchmustern, die durch Immunisierung mit verschiedenen Formen von unreinen Zubereitungen, die das Protein enthalten, hergestellt wurden. Insbesondere enthalten Antikörperäquivalente Antigen-Bindungsfragmente von natürlichen Antikörpern, zum Beispiel Fv, Fab oder F(ab)₂. Aufgereinigte Chemokine können auch als Reagenzien verwendet werden, um Antikörper nachzuweisen, die als Reaktion auf die Gegenwart erhöhter Gehalten des Proteins oder der Zellfragmente, die das Protein enthalten, erzeugt werden, wobei beide für einen abnormen oder spezifischen physiologischen Zustand oder einen Krankheitszustand diagnostisch sein können. Zusätzlich können Chemokinproteinfragmente oder deren Verknüpfungen als Immunogen dienen, um Bindungszusammensetzungen, zum Beispiel erfindungsgemäße Antikörper, wie unmittelbar im Anschluß beschrieben, zu bilden. Beispielsweise zieht diese Erfindung Antikörper in Betracht, die gegen bestimmte Aminosäuresequenzen, zum Beispiel in SEQ ID NOs: 1-14, oder Proteine, die diese enthalten, erzeugt wurden. Insbesondere zieht diese Erfindung Antikörper in Betracht, die Bindungsaffinität für spezifische Antikörper aufweisen oder gegen diese erzeugt wurden, zum Beispiel solche, für die vorhergesagt wurde, dass sie auf den äußeren Oberflächen von Proteintertiärstrukturen liegen. Ähnliche Konzepte gelten für Antikörper, die für die erfindungsgemäßen Rezeptoren spezifisch sind.
Die vorliegende Erfindung zieht die Isolierung von zusätzlichen, eng verwandten Artvarianten in Betracht. Southern Blot- und Northern Blot-Analysen sollten feststellen, dass ähnliche genetische Einheiten in anderen verwandten Säugetieren vorkommen und die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen festlegen, um diese zu isolieren. Es ist wahrscheinlich, dass diese Chemokine und Rezeptoren in Artvarianten weit verbreitet sind, beispielsweise innerhalb der Nagetiere und der Primaten.
Die Erfindung stellt auch Mittel zur Verfügung, um eine Gruppe von verwandten Chemokinen oder Rezeptoren zu isolieren, die sowohl Verschiedenheit als auch Ähnlichkeiten in der Struktur, der Expression und der Funktion zeigen. Das Aufschlüsseln von vielen der physiologischen Wirkungen dieser Proteine wird durch die Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen Artvarianten der Liganden deutlich beschleunigt werden. Verwandte Gene, die beispielsweise in verschiedenen Computerdatenbanken gefunden werden, werden ebenfalls in vielen Fällen für ähnliche Zwecke mit strukturell verwandten Proteinen einsetzbar sein. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung nützliche Sonden oder Suchmerkmale zum Identifizieren zusätzlicher homologer genetischer Gebilde in verschiedenen Arten zur Verfügung.
Die isolierten Gene werden die Transformation von Zellen ermöglichen, in denen die Expression eines entsprechenden Chemokins oder Rezeptors fehlt, zum Beispiel entweder Arttypen oder Zellen, denen die entsprechenden Antigene fehlen und die eine negative Hintergrundaktivität aufweisen. Die Expression der transformierten Gene wird die Isolierung von antigenisch reinen Zelllinien mit definierten oder einzelnen Artvarianten ermöglichen. Dieser Ansatz wird einen empfindlicheren Nachweis und eine empfindlichere Abgrenzung der physiologischen Wirkungen der Chemokin- oder Rezeptorproteine ermöglichen. Subzelluläre Fragmente, zum Beispiel Cytoplasten oder Membranfragmente, können isoliert und verwendet werden.
Eine Zerlegung der kritischen Strukturelemente, welche die verschiedenen Differenzierungsfunktionen bewirken, die durch die Liganden bereitgestellt werden, ist durch Verwendung von Standardtechniken der modernen Molekularbiologie möglich, insbesondere durch Vergleichen von Mitgliedern der verwandten Klasse. Siehe zum Beispiel das "Homolog-Scanning Mutagenesis"-Verfahren, das von Cunnigham, et al. (1989) Science 243:1339- 1336 beschrieben wurde, und die in O'Dowd, et al (1988) J. Biol. Chem. 263:15985-15992, und in Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9:4381-4390, verwendeten Ansätze.
Zusätzlich können verschiedene Abschnitte zwischen Artvarianten ausgetauscht werden, um zu ermitteln, welche strukturellen Eigenschaften sowohl für die Rezeptorbindungsaffinität und -spezifität als auch für die Signaltransduktion wichtig sind. Eine Reihe von unterschiedlichen Chemokin- oder Rezeptorvarianten wird verwendet werden, um nach Varianten zu durchmustern, die gemeinsame Eigenschaften der Wechselwirkung mit verschiedenen Artvarianten zeigen.
Intrazelluläre Funktionen würden vermutlich Abschnitte des Rezeptors einbeziehen, die normalerweise dem Cytosol zugänglich sind. Eine Ligandeninternalisierung kann jedoch unter bestimmten Umständen eintreten und eine Wechselwirkung zwischen intrazellulären Komponenten und "extrazellulären" Abschnitten kann auftreten. Die spezifischen Abschnitte für die Wechselwirkung eines bestimmten Chemokins mit anderen intrazellulären Komponenten kann durch Mutagenese oder direkte biochemische Mittel, zum Beispiel Kreuzvernetzen oder Affinitätsverfahren identifiziert werden. Strukturelle Analyse durch kristallographische oder andere physikalische Verfahren werden ebenfalls anwendbar sein. Eine weitere Untersuchung der Mechanismen der Signaltransduktion wird eine Untersuchung der assoziierten Komponenten beinhalten, die durch Affinitätsverfahren oder durch genetische Mittel, zum Beispiel Komplementierungsanalysen von Mutanten, isolierbar sein werden.
Weitere Untersuchungen der Expression und der Kontrolle der verschiedenen Chemokine oder Rezeptoren werden verfolgt werden. Die kontrollierenden Elemente, die mit diesen PrOteinen assoziiert sind, können differentielle Entwicklungs-, Gewebsspezifitäts- oder andere Expressionsmuster aufweisen.
Stromaufwärts oder stromabwärts gelegene genetische Bereiche, zum Beispiel Kontrollelemente, sind von Interesse. Differentielles Spleißen der Nachricht kann zu membrangebundenen Formen, löslichen Formen und modifizierten Versionen des Liganden führen.
Strukturelle Untersuchungen des Proteins werden zum Design von neuen Liganden oder Rezeptoren führen, insbesondere Analoga, die Agonisten- oder Antagonisteneigenschaften im Hinblick auf den Rezeptor zeigen. Dies kann mit bereits beschriebenen Durchmusterungsverfahren verbunden werden, um Liganden zu isolieren, die gewünschte Aktivitätsspektren aufweisen.
Die Expression in anderen Zelltypen wird oft zu Glykosylierungsunterschieden in einen bestimmten Chemokin oder Rezeptor führen. Verschiedene Artvarianten können verschiedene Funktionen auf Grundlage von anderen strukturellen Unterschieden als der Aminosäuresequenz aufweisen. Unterschiedliche Modifizierungen können für eine unterschiedliche Funktion verantwortlich sein, und eine Aufschlüsselung dieser Wirkungen wird nun möglich gemacht.
Daher stellt die vorliegende Erfindung wichtige Reagenzien zur Verfügung, die mit einer physiologischen Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung in Verbindung stehen. Obwohl die vorangehende Beschreibung primär auf die Ausführungsformen der Chemokine oder Rezeptoren aus der Maus und dem Menschen, die spezifisch beschrieben wurden, beschränkt ist, werden die Fachleute sofort erkennen, dass die Erfindung weitere Pendants, zum Beispiel aus verwandten Arten, Nagetieren oder Primaten, bereitstellt.
V. Antikörper
Es können gegen diese Chemokine oder Rezeptoren, einschließlich Art- oder polymorpher Varianten und deren Fragmente sowohl in ihren natürlicherweise vorkommenden Formen als auch in ihren rekombinanten Formen Antikörper erzeugt werden. Zusätzlich können Antikörper gegen Chemokine oder Rezeptoren in entweder ihren aktiven oder inaktiven Formen oder in ihren nativen oder denaturierten Formen erzeugt werden. Antiidiotypische Antikörper werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Verfahren zum Erzeugen polyklonaler Antikörper sind dem Fachmann gut bekannt. Üblicherweise wird ein Immunogen, bevorzugt ein aufgereinigtes Protein, mit einem Adjuvans vermischt und Tiere mit dieser Mischung immunisiert. Die Immunantwort des Tieres gegenüber der Immunogenzubereitung wird durch Abnehmen von Testblutungen und Bestimmen des Titers der Reaktivität des CTACK-Proteins oder -Peptids von Interesse bestimmt. Beispielsweise wird, wenn ausreichend hohe Antikörpertiter gegen das Immunogen erhalten werden, für gewöhnlich nach wiederholter Immunisierung, Blut vom Tier gesammelt und Antiseren werden hergestellt. Weiteres Fraktionieren der Antiseren zur Anreicherung von Antikörpern, die gegen das Protein reaktiv sind, können, soweit gewünscht, durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel Harlow und Lane Antibodies, A Laboratory Manual; oder Coligan, (Herausgeber) Current Protocols in Immunology. Die Immunisierung kann ebenfalls durch andere Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel Immunisierung mit einem DNA-Vektor. Siehe zum Beispiel Wang, et al. (1997) Virology 228:278-284.
Monoklonale Antikörper können mittels verschiedener Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. Üblicherweise werden Milzzellen aus einem Tier, das mit einem gewünschten Antigen immunisiert wurde, immortalisiert, für gewöhnlich durch Fusion mit einer Myelomzelle. Siehe Kohler und Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Alternative Verfahren der Immortalisierung schließen Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus, Onkogenen oder Retroviren, oder andere im Fachgebiet bekannte Verfahren ein. Siehe zum Beispiel Doyle, et al. (Herausgeber, 1994 und periodische Ergänzungsbände) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley und Söhne, New York, NY. Aus einer einzelnen immortalisierten Zelle entstehende Kolonien werden im Hinblick auf die Bildung von Antikörpern der gewünschten Spezifität und Affinität für das Antigen durchmustert, und die Ausbeute des von solchen Zellen gebildeten monoklonalen Antikörpers kann durch verschiedene Techniken erhöht werden, einschließlich der Injektion in die Bauchfellhöhle eines Vertebratenwirts. Alternativ kann man DNA-Sequenzen, die für einen monoklonalen Antikörper oder eines seiner Bindungsfragmente kodieren, mittels Durchmustern einer DNA-Bibliothek aus menschlichen B-Zellen entsprechend beispielsweise dem allgemeinen Verfahren isolieren, das von Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281 kurz dargestellt wurde.
Antikörper, einschließlich der Bindungsfragmente und Einzelkettenversionen, gegen vorbestimmte Fragmente des Liganden können durch Immunisieren von Tieren mit Konkatemeren oder Konjugaten des Fragments mit immunogenen Proteinen erzeugt werden. Monoklonale Antikörper werden aus Zellen hergestellt, die den gewünschten Antikörper ausscheiden. Diese Antikörper können hinsichtlich der Bindung an normale oder defekte Chemokine oder Rezeptoren durchmustert werden oder hinsichtlich einer agonistischen oder antagonistischen Aktivität durchmustert werden. Diese monoklonalen Antikörper werden für gewöhnlich mit einer K_D von mindestens ungefähr 1 mM, gewöhnlicher mindestens ungefähr 300 μM, üblicherweise mindestens ungefähr 10 μM, üblichererweise mindestens ungefähr 30 μM, bevorzugt mindestens ungefähr 10 μM und bevorzugter mindestens ungefähr 3 μM oder besser binden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, einschließlich der Antigenbindungsfragmente können einen signifikanten präparativen, diagnostischen oder therapeutischen Wert haben. Sie können verwendbar sein, um das gewünschte Antigen in einer Probe aufzureinigen oder zu markieren, oder können potente Antagonisten sein, die an den Liganden binden und die Bindung an Rezeptoren inhibieren, oder die Fähigkeit des Liganden inhibieren, eine biologische Antwort auszulösen. Sie können auch als nicht-neutralisierende Antikörper verwendbar sein und können an, oder als Fusionsproteine mit Toxinen oder Radionukliden gekoppelt sein, so dass, wenn der Antikörper an ein Antigen bindet, eine Zelle, die dieses exprimiert, zum Beispiel auf ihrer Oberfläche über einen Rezeptor, abgetötet wird. Weiterhin können diese Antikörper an Wirkstoffe oder andere therapeutische Mittel entweder direkt oder indirekt mittels eines Linkers konjugiert werden, und können das Wirkstofftargeting beeinflussen. Antikörper gegen Rezeptoren können leichter verwendet werden, um Ligandenbindung und/oder Signaltransduktion zu blockieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können ebenfalls in diagnostischen oder Reagenzienaufreinigungsanwendungen verwendbar sein. Als Fang- oder nicht-neutralisierende Antikörper können sie auf die Fähigkeit hin durchmustert werden, an die Chemokine oder Rezeptoren ohne Inhibieren der Ligand-Rezeptorbindung zu binden. Als neutralisierende Antikörper können sie in kompetitiven Bindungsassay nutzbar sein. Sie werden auch beim Nachweisen oder Quantifizieren eines Chemokins oder von Rezeptoren, zum Beispiel in Immunoassays verwendbar sein. Sie können als Aufreinigungsreagenzien in Immunaffinitätssäulen oder als immunhistochemische Reagenzien verwendet werden.
Ligand- oder Rezeptorfragmente können verknüpft werden oder mit anderen Materialien, insbesondere Polypeptiden, in Form von fusionierten oder kovalent vereinten Polypeptiden vereint werden, um als Immunogene verwendet zu werden. Kurze Peptide werden bevorzugt als Wiederholungsstrukturen hergestellt, um die Größe zu erhöhen. Ein Ligand und seine Fragmente können an eine Vielzahl von Immunogene fusioniert oder kovalent geknüpft werden, wie beispielsweise das Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, bovines Serumalbumin, Tetanus-Toxoid, etc. Siehe Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper und Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, und Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Band 1, Academic Press, New York, für Beschreibungen von Verfahren zum Herstellen polyklonaler Antiseren. Ein typisches Verfahren beinhaltet die Hyperimmunisierung eines Tieres mit einem Antigen. Das Blut dieses Tieres wird dann kurz nach den wiederholten Immunisierungen gesammelt und die gamma-Globulinfraktion isoliert.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper von verschiedenen Säugetierwirten, wie beispielsweise Mäusen, Nagetieren, Primaten, Menschen, etc., herzustellen. Die Beschreibung von Techniken zum Herstellen solcher monoklonalen Antikörper kann zum Beispiel in Stites, et al. (Herausgeber) Basic and Clinical Immunology (4. Auflage), Lange Medical Publications, Los Altos, CA und den dort zitierten Referenzen; in Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies; Principles and Practice (2. Auflage) Academic Press, New York; und insbesondere in Kohler und Milstein (1975) in Nature 256:495-497, gefunden werden, die ein Verfahren zum Erzeugen monoklonaler Antikörper beschreiben. Kurz zusammengefasst beinhaltet dies Verfahren das Injizieren eines Immunogens in ein Tier. Das Tier wird dann getötet und Zellen werden entnommen, zum Beispiel aus seiner Milz, die dann mit Myelomzellen fusioniert werden. Das Ergebnis ist eine Hybridzelle oder ein "Hybridom", das in der Lage ist, sich in vitro zu reproduzieren. Die Popu lation von Hybridomas wird dann durchmustert, um individuelle Klone zu isolieren, von denen jedes eine einzelne Antikörperart gegen das Immunogen ausscheidet. Auf diese Weise sind die erhaltenen individuellen Antikörperarten die Produkte von immortalisierten und klonierten einzelnen B-Zellen aus dem immunen Tier, die als Reaktion auf eine spezifische Stelle, die auf der immunogenen Substanz erkannt wurde, erzeugt wurden. Große Antikörpermengen können aus der Aszitesflüssigkeit eines Tieres erhalten werden.
Andere geeignete Techniken beinhalten in vitro-Exposition von Lymphozyten mit dem antigenen Polypeptid oder alternativ einer Auswahl von Antikörperbibliotheken in Phagen oder ähnlichen Vektoren. Siehe Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,", Science 246:1275-1281, und Ward, et al. (1989) Nature 341:544-546. Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Antikörper, einschließlich chimärer oder humanisierter Antikörper, können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch Verbinden, entweder kovalent oder nicht-kovalent, mit einer Substanz markiert, die ein nachweisbares Signal bereitstellt. Eine große Vielfalt von Markierungen und Konjugationstechniken ist bekannt, und von ihnen wird in sowohl der wissenschaftlichen als auch der Patentliteratur ausführlich berichtet. Geeignete Markierungen schließen Radionuklide, Enzyme, Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Seitenketten, chemilumineszierende Seitenketten, magnetische Partikel und dergleichen ein. Patente, welche die Verwendung von solchen Markierungen lehren, schließen die US-Patente Nr. 3,817,837 , 3,850,752 , 3,939,350 , 3,996,345 , 4,277,437 , 4,275,149 und 4,366,241 ein. Ebenso können rekombinante Immunoglobuline gebildet, siehe Cabilly, US-Patent Nr. 4,816,567 , und Queen et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 86:10029-10033, oder in transgenen Mäusen hergestellt werden, siehe Mendez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch für Affinitätschromatographie beim Isolieren des Proteins verwendet werden. Säulen können hergestellt werden, bei denen die Antikörper an einen festen Träger, zum Beispiel Partikel, wie beispielsweise Agarose, Sephadex oder dergleichen geknüpft sind, wobei ein Zelllysat durch die Säule gegeben werden kann, die Säule gewaschen wird, gefolgt von zunehmenden Konzentrationen eines milden Denaturierungsmittel, wodurch das aufgereinigte Chemokinprotein freigesetzt werden wird.
Die Antikörper können auch verwendet werden, um Expressionsbibliotheken auf bestimmte Expressionsprodukte hin zu durchmustern. Üblicherweise werden die Antikörper, die in einem solchen Verfahren verwendet werden, mit einer Seitenkette markiert sein, die den einfachen Nachweis des Vorkommens des Antigens durch Antikörperbindung ermöglicht.
Gegen diese Chemokine oder Rezeptoren erzeugte Antikörper werden auch verwendbar sein, um anti-idiotypische Antikörper zu erzeugen. Diese werden beim Nachweisen oder Diagnostizieren verschiedener immunologischer Zustände verwendbar sein, die mit der Expression der entsprechenden Antigene zusammenhängen.
Antikörper sind lediglich eine Form von spezifischen Bindungszusammensetzungen. Andere Bindungszusammensetzungen, die oft ähnliche Verwendungen haben, schließen Moleküle ein, die mit Spezifität an den CTACK- oder Vic-Rezeptor binden, beispielsweise auf eine Bindungspartner-Bindungspartner-Weise, eine Antikörper-Antigen-Wechselwirkung oder als eine natürliche, physiologisch relevante Protein-Protein-Wechselwirkung, entweder kovalent oder nicht-kovalent, zum Beispiel Proteine, die mit dem CTACK- oder Vic-Rezeptorprotein spezifisch assozi ieren. Das Molekül kann ein Polymer oder chemisches Reagenz sein. Ein funktionelles Analoga kann ein Protein mit strukturellen Modifikationen sein, oder kann ein strukturell nicht verwandtes Molekül sein, das zum Beispiel eine molekulare Form aufweist, die mit der entsprechenden Bindungsdeterminante wechselwirkt. Daher stellt die Identifizierung von GPR2 als den Rezeptor für CTACK und Vic Mittel zum Herstellen einer derartigen Bindungszusammensetzung zur Verfügung.
Wirkstoffscreening unter Verwendung von Antikörpern, CTACK, Vic oder deren Fragmente kann durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Bindungsaffinität für CTACK, Vic oder GPR2 aufweisen, oder welche die natürliche Wechselwirkung mit dem Liganden blockieren oder stimulieren können. Sich anschließende biologische Assays können dann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine inhärente Blockierungsaktivität aufweist und daher ein Antagonist ist. Gleichermaßen kann eine Verbindung, die inhärente Stimulierungsaktivität aufweist, hin zu den Zellen signalisieren, beispielsweise über den CTACK-Weg und ist daher ein Agonist, indem sie die Aktivität eines Liganden stimuliert. Muteinantagonisten können entwickelt werden, in denen die Rezeptorbindung erhalten ist, denen aber das Signalisieren fehlt.
Strukturelle Untersuchungen der Liganden werden zu dem Design von neuen Varianten führen, insbesondere Analoga, die Agonisten- oder Antagonisteneigenschaften hinsichtlich des Rezeptors zeigen. Dies kann mit bereits beschriebenen Durchmusterungsverfahren kombiniert werden, um Muteine zu isolieren, die gewünschte Aktivitätsspektren aufweisen.
Insoweit Rezeptor-spezifische Bindungsmoleküle offenbart sind, sind auch kleine Moleküle offenbart, die mittels Durchmusterungsverfahren identifiziert werden. Insbesondere ist es im Fachbereich bekannt, wie nach kleinen Molekülen gescreent werden kann, die beispielsweise die Bindung des Liganden an den Rezeptor beeinträchtigen, häufig durch spezifisches Binden an den Rezeptor und Blockieren der Bindung durch den natürlichen Liganden. Siehe zum Beispiel die Treffen zum Hochdurchsatzscreening, International Business Communication, Southborough, MA 01772-1749. Derartige Moleküle können mit natürlichen Liganden konkurrieren und selektiv an das CTACK, Vic oder GPR2 binden.
VI. Nukleinsäuren
Die beschriebenen Peptidsequenzen und die verwandten Reagenzien sind zum Isolieren eines DNA-Klons, der für diese Chemokine oder Rezeptoren kodiert, zum Beispiel aus einer naturlichen Quelle verwendbar. Üblicherweise werden sie beim Isolieren eines Gens aus einem anderen Individuum verwendbar sein, und ähnliche Verfahren werden angewendet, um Gene aus verwandten Arten, zum Beispiel Nagetieren oder Primaten zu isolieren. Eine Kreuzhybridisierung wird die Isolierung eines Liganden aus anderen nahe verwandten Arten ermöglichen. Eine Anzahl von verschiedenen Ansätzen sollte verfügbar sein, um einen geeigneten Nukleinsäureklon erfolgreich zu isolieren. Ähnliche Konzepte gelten für die Rezeptorausführungsformen.
Das aufgereinigte Protein oder die definierten Peptide sind zum Erzeugen von Antikörpern durch Standardverfahren, wie oben beschrieben, verwendbar. Synthetische Peptide oder aufgereinigtes Protein kann einem Immunsystem präsentiert werden, um monoklonale oder polyklonale Antikörper zu erzeugen. Siehe zum Beispiel Coligan (1991) Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene; und Harlow und Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. Alternativ kann ein Chemokin oder Rezeptor als ein spezifisches Bindungsreagenz verwendet werden und dessen Bindungsspezifität ganz ähnlich, wie ein Antikörper verwendet worden wäre, ausgenutzt werden. Die Che mokinrezeptoren sind üblicherweise 7-Transmembranproteine, die gegenüber einer angemessenen Wechselwirkung mit Lipid oder Membran empfindlich sind. Die Signaltransduktion wird üblicherweise durch ein G-Protein oder durch Wechselwirkung mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor vermittelt.
Beispielsweise könne die spezifische Bindungszusammensetzung verwendet werden, um eine Expressionsbibliothek zu durchmustern, die aus einer Zelllinie hergestellt wurde, die ein bestimmtes Chemokin exprimiert. Das Durchmustern kann eine Standardfärbung von Oberflächen-exprimiertem Ligand sein oder durch "Panning" erfolgen. Das Durchmustern von intrazellulärer Expression kann auch durch verschiedene Färbungs- oder Immunfluoreszenzverfahren erfolgen. Die Bindungszusammensetzungen können verwendet werden, um Zellen, die den Liganden exprimieren, über Affinität aufzureinigen oder auszusortieren.
Die Peptidabschnitte können auch verwendet werden, um geeignete Oligonukleotide vorherzusagen, um eine Bibliothek zu durchmustern, beispielsweise um Artvarianten zu isolieren. Der genetische Kode kann verwendet werden, um geeignete Oligonukleotide auszuwählen, die als Sonden zum Durchmustern verwendbar sind. Siehe zum Beispiel SEQ ID NOs: 1-14. In Verbindung mit Polymerasekettenreaktions- (PCR) Techniken werden synthetische Oligonukleotide beim Auswählen richtiger Klone aus einer Bibliothek verwendbar sein. Komplementäre Sequenzen werden ebenfalls als Sonden oder Primer verwendet. Verankerte Vektoren oder poly-A-komplementäre PCR-Techniken oder komplementäre DNA von anderen Peptiden können verwendet werden.
Diese Erfindung zieht die Verwendung von isolierter DNA oder Fragmenten in Betracht, um ein biologisch aktives entsprechendes Chemokinpolypeptid zu kodieren. Zusätzlich deckt diese Erfindung isolierte oder rekombinante DNA ab, die für ein biologisch aktives Protein oder Polypeptid kodiert, das in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen mit den hier beschriebenen DNA-Sequenzen zu hybridisieren. Dieses biologisch aktive Protein oder Polypeptid kann ein intakter Ligand, Rezeptor oder Fragment sein, und weist eine Aminosäuresequenz auf, wie die in den SEQ ID NOs: 1-14 dargestellte. Weiterhin deckt diese Erfindung die Verwendung von isolierter oder rekombinanter DNA oder deren Fragmente ab, die für Proteine kodieren, die zu einem Chemokin oder Rezeptor homolog sind, oder das/der unter Verwendung einer derartigen cDNA, die für ein Chemokin oder einen Rezeptor kodiert, als Sonde isoliert wurde. Die isolierte DNA kann in den 5'- und 3'-Flanken die entsprechenden regulatorischen Sequenzen, zum Beispiel Promotoren, Verstärker, poly-A-Adenylierungssignale und andere aufweisen.
Eine "isolierte" Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, zum Beispiel eine RNA, DNA oder ein gemischtes Polymer, die von anderen Komponenten im Wesentlichen getrennt ist, die natürlicherweise eine native Sequenz begleiten, beispielsweise Ribosomen, Polymerasen und flankierende genomische Sequenzen aus den Ursprungsarten. Der Begriff umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die aus ihrer natürlich vorkommenden Umgebung entnommen wurde, und schließt rekombinante oder klonierte DNA-Isolate und chemisch synthetisierte Analoga oder Analoga ein, die mittels heterologer Systeme biologisch synthetisiert wurden. Ein im Wesentlichen reines Molekül schließt isolierte Formen des Moleküls ein.
Eine isolierte Nukleinsäure wird im Allgemeinen eine homogene Zusammensetzung von Molekülen sein, wird jedoch in einigen Ausführungsformen eine geringfügige Heterogenität enthalten. Diese Heterogenität wird üblicherweise an den Polymerenden oder in Polymerbereichen gefunden, die für eine gewünschte biologische Funktion oder Aktivität nicht wesentlich sind.
Eine "rekombinante" Nukleinsäure wird entweder durch ihr Herstellungsverfahren oder ihre Struktur definiert. In Bezug auf ihr Herstellungsverfahren, beispielsweise ein Produkt, das durch ein Verfahren hergestellt wurde, ist das Verfahren die Verwendung von rekombinanten Nukleinsäuretechniken, zum Beispiel unter Einbeziehung von menschlichen Eingriffen in die Nukleotidsequenz, üblicherweise durch Selektion oder Produktion. Alternativ kann es eine Nukleinsäure sein, die durch Erzeugen einer Sequenz hergestellt wurde, welche die Fusion von zwei Fragmenten umfasst, die natürlicherweise nicht aneinander angrenzen, sie soll jedoch natürliche Produkte ausschließen, zum Beispiel natürlich vorkommende aufgereinigte Formen. Daher sind zum Beispiel Produkte umfasst, die durch Transformieren von Zellen mit einem nicht natürlich vorkommenden Vektor transformiert sind, ebenso wie Nukleinsäuren, die eine Sequenz umfassen, die unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotidverfahrens erhalten wird. Etwas derartiges wird oft durchgeführt, um ein Kodon durch ein redundantes Kodon zu ersetzen, das für die gleiche oder eine konservierte Aminosäure kodiert, während üblicherweise eine Sequenzerkennungsstelle eingeführt oder entfernt wird. Alternativ wird es durchgeführt, um Nukleinsäureabschnitte mit gewünschten Funktionen zu vereinen, um ein einzelnes genetisches Gebilde zu erzeugen, das eine gewünschte Kombination von Funktionen umfasst, die in den für gewöhnlich erhältlichen natürlichen Formen nicht gefunden wird. Restriktionsenzymerkennungsstellen sind oft das Ziel von derartigen künstlichen Manipulationen, jedoch können andere ortsspezifische Ziele, zum Beispiel Promotoren, DNA-Replizierungsorte, Regulationssequenzen, Kontrollsequenzen oder andere nützliche Merkmale über die Konstruktion eingefügt werden. Ein ähnliches Konzept wird für ein rekombinantes Polypeptid, zum Beispiel Fusionspolypeptid vorgesehen. Synthetische Nukleinsäuren, die durch Redundanz des genetischen Kodes für Polypeptide kodieren, die Fragmenten dieser Antigene ähn lich sind, sowie Fusionen von Sequenzen von verschiedenen unterschiedlichen Artvarianten sind spezifisch eingeschlossen.
Ein signifikantes "Fragment" in einem Nukleinsäurekontext ist ein durchgehender Abschnitt von mindestens ungefähr 17 Nukleotiden, allgemein mindestens ungefähr 20 Nukleotiden, allgemeiner mindestens ungefähr 23 Nukleotiden, gewöhnlich mindestens ungefähr 26 Nukleotiden, gewöhnlicher mindestens ungefähr 29 Nukleotiden, oft mindestens ungefähr 32 Nukleotiden, öfter mindestens ungefähr 35 Nukleotiden, üblicherweise mindestens ungefähr 38 Nukleotiden, üblichererweise mindestens ungefähr 41 Nukleotiden, gewöhnlich mindestens ungefähr 44 Nukleotiden, gewöhnlicher mindestens ungefähr 47 Nukleotiden, bevorzugt mindestens ungefähr 50 Nukleotiden, bevorzugter mindestens ungefähr 53 Nukleotiden und in besonders bevorzugten Ausführungsformen wird es mindestens ungefähr 56 Nukleotide oder mehr Nukleotide aufweisen, zum Beispiel 60, 65, 75, 85, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 400 etc. Derartige Fragmente können Enden aufweisen, die an theoretisch allen Positionen beginnen und/oder enden, zum Beispiel beginnend bei Nukleotid 1, 2, 3 etc. und endend bei zum Beispiel 300, 299, 298, 287 etc. in kombinatorischen Paaren. Besonders interessante Polynukleotide weisen Enden auf, die Strukturdomänengrenzen entsprechen.
Eine DNA, die für ein bestimmtes Chemokin- oder Rezeptorprotein oder -peptid kodiert, wird sehr nützlich sein, um Gene, mRNA- und cDNA-Arten zu identifizieren, die für verwandte oder homologe Liganden oder Rezeptoren kodieren ebenso wie für DNAs, die für homologe Proteine aus unterschiedlichen Arten kodieren. Es gibt wahrscheinlich Homologe in eng verwandten Arten, zum Beispiel Nagetieren oder Primaten. Verschiedene Chemokinproteine sollten homolog sein und werden hier umfasst, wie auch Rezeptoren. Jedoch können Proteine unter geeigneten Bedingungen unter Verwendung dieser Sequenzen leicht isoliert werden, wenn diese ausreichend homolog sind. Normalerweise sind Chemokine oder Rezeptoren aus Primaten von besonderem Interesse.
Ebenfalls offenbart werden rekombinante DNA-Moleküle und -Fragmente, die eine DNA-Sequenz aufweisen, die identisch oder hochgradig homolog zu den isolierten DNAs ist, die vorangehend dargestellt sind. Insbesondere werden die Sequenzen oft in funktionsfähiger Verknüpfung an DNA-Abschnitte geknüpft, welche die Transkription, Translation und DNA-Replikation kontrollieren. Alternativ werden rekombinante Klone, die von den genomischen Sequenzen abgeleitet sind und beispielsweise Introns enthalten, für transgene Untersuchungen verwendbar sein, einschließlich beispielsweise transgener Zellen und Organismen, und für die Gentherapie. Siehe zum Beispiel Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Roitt (Herausgeber) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, S. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288; Robertson (1987) (Herausgeber) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; und Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10:180-199.
Homologe Nukleinsäuresequenzen zeigen, wenn sie verglichen werden, signifikante Ähnlichkeit oder Identität. Die Standards für die Homologie bei Nukleinsäuren sind entweder Maße für Homologie, die allgemein Fachgebiet für Sequenzvergleiche verwendet werden, oder basieren auf den Hybridisierungsbedingungen. Die Hybridisierungsbedingungen werden im Einzelnen unten beschrieben.
Beträchtliche Homologie im Kontext des Nukleinsäuresequenzvergleichs bedeutet, dass entweder die Abschnitte oder ihre komplementären Stränge in mindestens ungefähr 50 der Nukleotide, allgemein mindestens ungefähr 56 allgemeiner minde stens ungefähr 59 %, gewöhnlich mindestens ungefähr 62 %, gewöhnlicher mindestens ungefähr 65 %, oft mindestens ungefähr 68 %, öfter mindestens ungefähr 71 %, üblicherweise mindestens ungefähr 74 %, üblichererweise mindestens ungefähr 77 %, für gewöhnlich mindestens ungefähr 80 %, gewöhnlicher mindestens. ungefähr 85 %, bevorzugt mindestens ungefähr 90 %, bevorzugter mindestens ungefähr 95 bis 98 % oder mehr und, in bestimmten Ausführungsformen, so hoch wie ungefähr 99 % oder mehr der Nukleotide identisch sind, wenn sie verglichen werden und wenn sie mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder -deletionen optimal abgeglichen sind. Alternativ liegt beträchtliche Homologie vor, wenn die Segmente unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an einen Strang oder dessen Gegenstrang üblicherweise bei Verwendung einer Sequenz, die aus SEQ ID NOs: 1-14 abgeleitet ist, hybridisieren werden. Üblicherweise tritt selektive Hybridisierung auf, wenn mindestens ungefähr 55 % Homologie über einen Bereich von mindestens ungefähr 30 Nukleotide, bevorzugt mindestens ungefähr 65 % über einen Bereich von mindestens ungefähr 25 Nukleotide, bevorzugter mindestens ungefähr 75 % und am bevorzugtesten mindestens ungefähr 90 % über ungefähr 20 Nukleotide vorliegt. Siehe Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213. Die Länge des Homologievergleichs, wie er beschrieben ist, kann über längere Bereiche erfolgen, und wird in bestimmten Ausführungsformen über einen Bereich von mindestens ungefähr 17 Nukleotiden, gewöhnlich mindestens ungefähr 20 Nukleotiden, gewöhnlicher mindestens ungefähr 24 Nukleotiden, üblicherweise mindestens ungefähr 28 Nukleotiden, üblichererweise mindestens ungefähr 40 Nukleotiden, bevorzugt mindestens ungefähr 50 Nukleotiden und bevorzugter mindestens ungefähr 75 bis 100 oder mehr Nukleotiden erfolgen. PCR-Primer werden im Allgemeinen hohe Übereinstimmungsniveaus über potentiell kürzere Längen aufweisen.
Stringente Bedingungen, in Bezug auf Homologie in dem Hybridisierungskontext, werden stringente zusammengefaßte Bedin gungen aus Salz, Temperatur, organischem Lösungsmittel und anderer Parameter sein, üblicherweise solche, die bei Hybridisierungsreaktionen eingestellt werden. Stringente Temperaturbedingungen werden üblicherweise Temperaturen über ungefähr 30 °C, üblichererweise über ungefähr 37 °C, typischerweise über ungefähr 45 °C, noch typischer über ungefähr 55 °C, bevorzugt über ungefähr 65 °C und bevorzugter über ungefähr 75 °C einschließen. Stringente Salzbedingungen werden für gewöhnlich geringer als ungefähr 1000 mM, für gewöhnlich geringer als ungefähr 500 mM, noch gewöhnlicher geringer als ungefähr 400 mM, typischerweise geringer als ungefähr 300 mM, bevorzugter geringer als ungefähr 200 mM und noch bevorzugter weniger als ungefähr 150 mM betragen, beispielsweise 20-50 mM. Jedoch ist die Kombination der Parameter viel wichtiger als die Messung eines jeden einzelnen Parameters. Siehe zum Beispiel Wetmur und Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31:349-370.
Durch Kreuzhybridisierung über Arten hinweg ("cross-species hydridization") können entsprechende Chemokine oder Rezeptoren aus anderen, eng verwandten Arten kloniert und isoliert werden. Alternativ können Sequenzen aus einer Sequenzdatenbank als Ähnlichkeit aufweisend erkannt werden. Die Homologie kann zwischen entfernt verwandten Arten sehr gering sein, und daher ist eine Hybridisierung von verhältnismäßig nah verwandten Arten anzuraten. Alternativ kann die Herstellung einer Antikörperzubereitung, die geringere Artspezifität aufweist, in Expressionsklonierungsansätzen nützlich sein. PCR-Ansätze unter Verwendung von Abschnitten von konservierten Sequenzen werden auch verwendet werden.
VII. Herstellen von Chemokinen oder Rezeptoren; Mimetika
Für jedes der Chemokine, Rezeptoren oder deren Fragmente kodierende DNA kann durch chemische Synthese, Durchmustern von cDNA-Bibliotheken oder durch Durchmustern von genomischen Bi bliotheken, die aus einer großen Vielzahl von Zelllinien oder Gewebsproben erzeugt wurden, erhalten werden.
Diese DNA kann in einer großen Vielzahl von Wirtszellen zur Synthese eines Vollängen-Liganden oder -Fragments exprimiert werden, der/das wiederum zum Beispiel verwendet werden kann, um für Bindungsstudien, für die Konstruktion und Expression von modifizierten Molekülen, für das Expressionsklonieren oder -aufreinigen und für Struktur/Funktionsstudien polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen,. Jedes Antigen oder dessen Fragmente kann/können in Wirtszellen exprimiert werden, die mit geeigneten Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert wurden. Diese Moleküle können im Wesentlichen aufgereinigt sein, um frei von Proteinverunreinigungen oder zellulären Verunreinigungen zu sein, die nicht aus dem rekombinanten Wirt stammen, und daher insbesondere in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendbar sein, wenn sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Streckmittel kombiniert werden. Die Antigene oder Antikörper oder deren Teile können als Fusionen mit anderen Proteinen exprimiert werden.
Expressionsvektoren sind üblicherweise selbst-replizierende DNA- oder RNA-Konstrukte, die das gewünschte Antigen-Gen oder dessen Fragmente üblicherweise in funktionsfähiger Weise an geeignete genetische Kontrollelemente gekoppelt enthalten, die in einer geeignete Wirtszelle erkannt werden. Diese Kontrollelemente sind in der Lage, die Expression in einem geeigneten Wirtes zu bewirken. Die spezifische Art von Kontrollelementen, die notwendig sind, um eine Expression zu bewirken, wird von der letztendlich verwendeten Wirtszelle abhängen. Allgemein können die genetischen Kontrollelemente ein prokaryotisches Promotorsystem oder ein eukaryotisches Promotorexpressionskontrollsystem einschließen und schließen üblicherweise einen transkriptionellen Promotor, wahlweise einen Operator, um den Beginn der Transkription zu kontrollieren, Transkriptionsver stärker, um das Niveau der mRNA-Expression zu erhöhen, eine Sequenz, die für eine geeignete Ribosomenbindungsstelle kodiert, und Sequenzen ein, welche die Transkription und Translation beenden. Expressionsvektoren enthalten ebenfalls für gewöhnlich einen Replikationsorigin, der es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der Wirtszelle zu replizieren.
Die erfindungsgemäßen Vektoren enthalten DNA, die für Ausführungsformen eines Chemokins, Rezeptors oder dessen/deren Fragmente kodieren, die üblicherweise für ein biologisch aktives Polypeptid kodieren. Die DNA kann unter der Kontrolle eines viralen Promotors stehen und kann für einen Selektionsmarker kodieren. Diese Erfindung zieht weiterhin die Verwendung von derartigen Expressionsvektoren, die in der Lage sind, eukaryotische cDNA, die für jedes Chemokin oder jeden Rezeptor kodiert, in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt zu exprimieren, in Betracht, wobei der Vektor mit dem Wirt kompatibel ist und wobei die eukaryotische cDNA, die für das Protein kodiert, in den Vektor eingefügt ist, so daß das Wachstums des Wirtes, der den Vektor enthält, die fragliche cDNA exprimiert. Für gewöhnlich sind Expressionsvektoren für eine stabile Replikation in ihren Wirtszellen oder für eine Amplifikation gestaltet, um die Gesamtzahl an Kopien des gewünschten Gens pro Zelle deutlich zu erhöhen. Es ist nicht immer notwendig zu verlangen, daß sich ein Expressionsvektor in einer Wirtszelle repliziert, beispielsweise ist es möglich, transiente Expression des Liganden oder dessen Fragmente in verschiedenen Wirten durch Vektoren zu erreichen, die keinen Replikationsorigin enthalten, der durch die Wirtszelle erkannt wird. Es ist ebenfalls möglich, Vektoren zu verwenden, die eine Integration eines Chemokin- oder Rezeptorgens oder dessen Fragmente in die Wirts-DNA durch Rekombination bewirken, oder einen Promotor einzubauen, der die Expression eines endogenen Gens kontrolliert.
Vektoren, wie sie hier verwendet werden, umfassen Plasmide, Viren, Bakteriophagen, integrierbare DNA-Fragmente und andere Vehikel, einschließlich derer, welche die Integration von DNA-Fragmenten in das Genom des Wirts ermöglichen. Expressionsvektoren sind spezialisierte Vektoren, die genetische Kontrollelemente enthalten, welche die Expression von funktionsfähig verknüpften Genen bewirken. Plasmide sind die am häufigsten verwendete Form eines Vektors, jedoch sind viele andere Formen von Vektoren, die einer ähnlichen Funktion dienen, und die im Fachgebiet bekannt sind oder bekannt werden, für die Verwendung hierin geeignet. Siehe zum Beispiel Pouwels, et al. (1985 und Ergänzungsbände) Cloning Vektors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.; und Rodriquez, et al. (1988) (Herausgeber) Vectors: A Survey of, Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA.
Transformierte Zellen schließen Zellen, bevorzugt Säugetierzellen, ein, die mit einem Vektor, der ein Chemokin- oder Rezeptorgen enthält und unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurde, transformiert oder transfiziert wurden. Transformierte Wirtszellen exprimieren den Liganden, Rezeptor oder deren Fragmente für gewöhnlich, aber für Zwecke des Klonierens, Amplifizierens und Manipulierens seiner DNA müssen sie das Protein nicht exprimieren. Diese Erfindung zieht ferner das Kultivieren von transformierten Zellen in einem Nährmedium in Betracht, wodurch es dem Protein ermöglicht wird, sich in der Zelle zu anzureichern. Das Protein kann aus der Kultur oder aus dem Kulturmedium oder von Zellmembranen gewonnen werden.
DNA-Sequenzen sind für Zwecke dieser Erfindung funktionsfähig verknüpft, wenn sie miteinander funktionell in Beziehung stehen. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder ein sekretorisches Signal funktionsfähig mit einem Polypeptid verknüpft, wenn es als ein Präprotein exprimiert wird oder an der Steuerung des Polypeptids zur Zellmembran oder an der Ausscheiden des Polypeptids beteiligt ist. Ein Promotor ist funktionsfähig an eine kodierende Sequenz geknüpft, wenn er die Transkription des Polypeptids kontrolliert; eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionsfähig an eine kodierende Sequenz geknüpft, wenn sie so positioniert ist, daß sie eine Translation ermöglicht. Für gewöhnlich bedeutet funktionsfähig verknüpft benachbart und im Leserahmen liegend, jedoch sind bestimmte genetische Elemente, wie beispielsweise Repressorgene, nicht aneinander angrenzend verknüpft, binden jedoch immer noch an Operatorsequenzen, die wiederum die Expression kontrollieren.
Geeignete Wirtszellen schließen Prokaryoten, niedrige Eukaryoten und höhere Eukaryoten ein. Prokaryoten schließen gramnegative und gram-positive Organismen ein, zum Beispiel E. coli und B. subtilis. Niedere Eukaryoten schließen Hefen, zum Beispiel S. cerevisiae und Pichia, und Arten der Gattung Dictyostelium ein. Höhere Eukaryoten schließen etablierte Gewebekulturzellinien aus Tierzellen, mit einer Herkunft sowohl aus Nicht-Säugetieren, beispielsweise Insektenzellen und Vögel, als auch aus Säugetieren, beispielsweise Mensch, Primaten und Nagetiere ein.
Prokaryotische Wirt-Vektorsysteme schließen eine große Vielzahl von Vektoren für viele verschiedene Arten ein. E. coli und seine Vektoren, wie hier verwendet, werden generisch verwendet, um äquivalente Vektoren, die in anderen Prokaryoten verwendet werden, einzuschließen. Ein repräsentativer Vektor zum Amplifizieren von DNA ist pBR322 oder viele seiner Derivate. Vektoren, die verwendet werden können, um diese Chemokine oder deren Fragmente zu exprimieren, schließen solche Vektoren ein, wie die, die den lac-Promotor (pUC-Serie); den trp-Promotor (pBR322-trp); den Ipp-Promotor (die pIN-Serie); den Lambda-pP- oder pR-Promotor (pOTS) enthalten oder Hybrid-Promotoren, wie beispielsweise ptac (pDR540), sind aber nicht auf diese beschränkt. Siehe Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters" in Rodriguez und Denhardt (Herausgeber) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Kapitel 10, S. 205-236.
Niedere Eukaryoten, zum Beispiel Hefen und Dictyostelium, können mit Nukleinsäuren transformiert werden, die Chemokin- oder Rezeptorsequenz enthalten. Für Zwecke dieser Erfindung ist der verbreitetste niedere eukaryotische Wirt die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Sie wird verwendet, um niedere Eukaryoten generisch zu repräsentieren, obwohl eine Anzahl von anderen Stämmen und Arten ebenfalls verfügbar sind. Hefevektoren bestehen üblicherweise aus einem Replikationsorigin (es sei denn, sie gehören zum integrierenden Typ), einem Selektionsgen, einem Promotor, DNA, die für das gewünschte Protein oder dessen Fragmente kodiert, und Sequenzen für die Translationsterminierung, Polyadenylierung und Trans kriptionsterminierung. Geeignete Expressionsvektoren für Hefe schließen solche konstitutiven Promotoren ein, wie den 3-Phosphoglyceratkinasepromoter und verschiedene andere Promotoren glykolytischer Enzymgene, oder solche induzierbare Promotoren, wie den Alkoholdehydrogenase-2-Promotor oder den Metallothioninpromotor. Geeignete Vektoren schließen Derivate der folgenden Typen ein: Sebst-Replizierende mit niedriger Kopienzahl (wie beispielsweise die YRp-Serie), Selbst-Replizierende mit hoher Kopienzahl (wie beispielsweise die YEp-Serie), integrierende. Typen (wie beispielsweise die YIp-Serie) oder Mini-Chromosomen (wie beispielsweise die YCp-Serie).
Gewebekulturzellen höherer Eukaryoten sind die bevorzugten Wirtszellen für die Expression der funktionell aktiven Chemokin- oder Rezeptorproteine. Im Prinzip sind die meisten Gewebekulturzellinien höherer Eukaryoten verwendbar, zum Beispiel Insekten-Baculovirus-Expressionssysteme, egal ob aus einer In vertebraten- oder Vertebratenquelle. Jedoch sind Säugetierzellen bevorzugt, da das Prozessieren, sowohl ko-translationell als auch post-translationell, üblicherweise dem Natürlichen am meisten ähnelt. Transformation oder Transfektion und Propagierung von solchen Zellen ist ein Routineverfahren geworden. Beispiele nützlicher Zellinien schließen HeLa-Zellen, Zellinien aus dem Eierstock des Chinesischen Hamsters (CHO), Babyrattennieren (BRK)-Zellinien, Insektenzellinien, Vogelzellinien und Affen (COS)-Zellinien ein. Expressionsvektoren für derartige Zellinien schließen üblicherweise einen Replikationsorigin, einen Promotor, eine Translationsinitiationsstelle, RNA-Spleißstellen (wenn genomische DNA verwendet wird), eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsterminierungsstelle ein. Diese Vektoren enthalten üblicherweise auch ein Selektionsgen oder ein Amplifikationsgen. Geeignete Expressionsvektoren können Plasmide, Viren oder Retroviren sein, die Promotoren tragen, die beispielsweise aus Quellen wie Adenovirus, SV40, Parvoviren, Vakziniavirus oder Zytomegalovirus stammen. Stellvertretende Beispiele von geeigneten Expressionsvektoren schließen pCDNA1; pCD, siehe Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMC1neo-Poly-A, siehe Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512, und einen Baculovirusvektor, wie beispielsweise pAC 373 oder pAC 610, ein.
Es wird oft wünschenswert sein, ein Chemokin- oder Rezeptorpolypeptid in einem System zu exprimieren, das ein spezifisches oder definiertes Glykosylierungsmuster bereitstellt. In diesem Fall wird das gewöhnliche Muster das sein, das durch das Expressionssystem natürlicherweise bereitgestellt wird. Jedoch wird das Muster durch Exponieren des Polypeptids, zum Beispiel einer unglykosylierten Form, mit geeigneten Glykosylierungsproteinen, die in ein heterologes Expressionssystem eingeführt wurden, modifizierbar sein. Beispielsweise kann ein Chemokin- oder Rezeptorgen mit einem oder mehr Genen kotransformiert werden, die für Säugetier- oder andere Glykosy lierungsenzyme kodieren. Durch Verwenden dieses Ansatzes werden bestimmte Säugetierglykosylierungsmuster in Prokaryoten- oder anderen Zellen erhältlich sein oder sich diesen angenähert.
Ein Chemokin, Rezeptor oder dessen Fragmente kann/können manipuliert werden, um über Phosphatidylinositol (PI) an eine Zellmembran geknüpft zu sein, kann jedoch durch Behandlung mit einem Phosphatidylinositol-spaltenden Enzym, zum Beispiel Phosphatidylinositolphospholipase-C von Membranen entfernt werden. Dies setzt das Antigen in einer biologisch aktiven Form frei und ermöglicht eine Aufreinigung durch Standardverfahren der Proteinchemie. Siehe zum Beispiel Low (1989) Biochim. Biophys. Acta 988:427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008, und Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114:1275-1283.
Da diese Chemokine und Rezeptoren nun charakterisiert worden sind, können deren Fragmente oder Derivate durch herkömmliche Verfahren für das Synthetisieren von Peptiden hergestellt werden. Dies schließt Verfahren wie die in Stewart und Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky und Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; und Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, beschriebenen ein. Beispielsweise kann ein Azidverfahren, ein Säurechloridverfahren, ein Säureanhydridverfahren, ein gemischtes Anhydridverfahren, ein aktives Ester-Verfahren (zum Beispiel p-Nitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester oder Cyanmethylester), ein Carbodiimidazolverfahren, ein oxidativ-reduktives Verfahren oder ein Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD)/additives Verfahren verwendet werden. Festphasen- und Flüssigphasensynthesen sind beide auf die vorangehenden Verfahren anwendbar.
Diese Chemokine, Rezeptoren, Fragmente oder Derivate werden geeigneterweise in Übereinstimmung mit den oben genannten Verfahren, die üblicherweise in der Peptidsynthese angewandt werden, im Allgemeinen entweder in einem sogenannten schrittweisen Verfahren, welches das Kondensieren einer Aminosäure an die terminale Aminosäure Schritt für Schritt nacheinander umfasst, oder durch Koppeln von Peptidfragmenten an die terminale Aminosäure hergestellt. Aminogruppen, die in der Kopplungsreaktion nicht verwendet werden, werden üblicherweise geschützt, um Kopplung an einer falschen Stelle zu verhindern.
Wenn eine Festphasensynthese angewendet wird, wird die C-terminale Aminosäure über ihre Carboxylgruppe üblicherweise an einen unlöslichen Träger oder Auflage gebunden. Der unlösliche Träger ist nicht irgendwie eingeschränkt, solange er eine Bindungsfähigkeit für eine reaktive Carboxylgruppe aufweist. Beispiele von solchen unlöslichen Trägern schließen Halomethylharze, wie beispielsweise Chlormethylharz oder Brommethylharz, Hydroxymethylharze, Phenolharze, tert.-Alkyloxycarbonyl-Hydrazidatharze und dergleichen.
Eine Aminosäure mit geschützten Aminogruppen wird in Reihenfolge durch Kondensierung ihrer aktivierten Carboxylgruppe mit der reaktiven Aminogruppe des vorangehend gebildeten Peptids oder der vorangehend gebildeten Kette gebunden, um das Peptid Schritt für Schritt zu synthetisieren. Nach Synthetisieren der vollständigen Sequenz wird das Peptid von dem unlöslichen Träger abgespalten, um das Peptid zu erzeugen. Dieser Festphasenansatz wird beispielsweise durch Merrifield, et al. (1963) in J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 allgemein beschrieben.
Der erzeugte Ligand und dessen Fragmente können aus der Reaktionsmischung durch Peptidabtrennung, zum Beispiel durch Extraktion, Fällung, Elektrophorese und verschiedene Formen der Chromatographie und dergleichen isoliert und aufgereinigt werden. Die verschiedenen erfindungsgemäßen Chemokine oder Rezeptoren können in Abhängigkeit von ihrer gewünschten Verwendung in verschiedenen Reinheitsgraden erhalten werden. Eine Aufreinigung kann durch Verwendung der Proteinaufreinigungstechniken, die offenbart werden, oder durch die Verwendung der hier beschriebenen Antikörper, beispielsweise in Immunabsorptionsaffinitätschromatographie durchgeführt werden. Diese Immunabsorptionsaffinitätschromatographie wird üblicherweise ausgeführt, indem beispielsweise zuerst die Antikörper an eine festen Träger gekoppelt und dann die gekoppelten Antikörper mit gelösten Lysaten einer geeigneten Herkunftszelle, Lysaten von anderen Zellen, die den Liganden oder Rezeptor exprimieren, oder Lysaten oder Überständen von Zellen, welche die gewünschten Proteine als ein Ergebnis von DNA-Techniken exprimieren, in Kontakt gebracht werden, siehe unten.
VIII. Verwendungen
Reagenzien, die in diagnostischen Applikationen Verwendung finden werden, wie den anderweitig hier beschrieben, zum Beispiel in der allgemeinen Beschreibung der Entwicklungsabnormitäten oder unten in der Beschreibung von Kits für die Diagnose, werden ebenfalls offenbart. Insbesondere scheint es, daß das GPR2 auf der Untergruppe der Th2-T-Zellen selektiv exprimiert wird. Dies legt nahe, daß die hier beschriebenen Reagenzien beim Abgrenzen von Th2- oder Th1-Krankheiten wertvoll sein könnten, oder beim Behandeln der entsprechenden Krankheitstypen durch ein Einwirken auf die selektiven T-Zell-untergruppen. Siehe zum Beispiel Romagnani (1997) Current Op. Immunology 9:773-775; Romagnani (1997) The Th1/Th2 Paradigm in Disease Springer-Verlag und Landes, Austin, TX.
Da Vic ein entzündungsförderndes Chemokin ist, sollten Antagonisten eine derartige Antwort blockieren können. Da sowohl Vic als auch CTACK in der Haut gefunden werden, sollten Antagonisten beim Blockieren von Hautentzündung verwendbar sein. Die Chemokine können beim Herbeilocken von GPR2⁺-Zellen nützlich sein, und können als Tumor- oder Immunadjuvanzien verwendbar sein.
Daher kann die Abreicherung von Th2-Untergruppen bei einer Th2-vermittelten Krankheit Symptome verhindern oder abschwächen. Umgekehrt könnte das Ergänzen der Th2-Untergruppen in einer Th1-vermittelten Krankheit beispielsweise durch Inhibieren der Th1-Untergruppe wirksam sein. Insbesondere könnten asthmatische oder allergische Reaktionen durch Verwenden der erfindungsgemäßen Verfahren reguliert werden.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls Reagenzien mit erheblichem therapeutischen Potential. Diese Chemokine und Rezeptoren (natürlich vorkommend oder rekombinant), deren Fragmente und Bindungszusammensetzungen, zum Beispiel Antikörper gegen sie, zusammen mit Verbindungen, die als Bindungsaffinität für sie aufweisend identifiziert wurden, sollten in der Behandlung von Zuständen verwendbar sein, die mit abnormer Physiologie oder Entwicklung assoziiert sind, einschließlich entzündlicher Zustände, zum Beispiel Asthma. Insbesondere ist das Modellieren des Leukozyten-Traffickings eine wahrscheinliche biologische Aktivität, jedoch könnte eine größere Gewebsverteilung eine breitere biologische Aktivität nahelegen, einschließlich zum Beispiel antiviraler Wirkungen. Abnorme Proliferation, Regeneration, Degeneration und Atrophie können durch geeignete therapeutische Behandlung unter Verwendung der hier bereitgestellten Zusammensetzungen moduliert werden. Beispielsweise sollte eine Krankheit oder eine Störung, die mit abnormer Expression oder abnormen Signalisieren durch ein Chemokin oder Ligand für einen Rezeptor assoziiert ist, ein voraussichtliches Ziel für einen Agonisten oder Antagonisten des Liganden sein.
Verschiedene abnorme physiologische Zustände oder Entwicklungszustände sind in Zelltypen bekannt, für die durch Northern Blot-Analysen gezeigt wurde, daß sie Chemokin- oder Rezeptor-mRNAs aufweisen. Sie Berkow (Herausgeber) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N. J.; und Thora, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y. Entwicklungs- oder funktionelle Abnormitäten, beispielsweise des Immunsystems, verursachen signifikante medizinische Abnormitäten und Zustände, die für eine Prävention oder Behandlung unter Verwendung der hier bereitgestellten Zusammensetzungen empfänglich sein könnten. Die vorliegende Erfindung lehrt verschiedene hautspezifische Krankheiten als Zustände, die der Analyse oder Diagnose durch Bewerten von CTACK, Vic oder GPR2 zugänglich sind. Beispielsweise würde die Wahrscheinlichkeit des Abstoßens der Haut in einer Transplantatsituation anhand der Menge des vorhandenen CTACK und/oder Vic bewertet werden. Prophylaktisches Herunterregulieren könnte nützlich sein, um das Rekrutieren von dermalen T- oder NK-Zellen zu verhindern. Die Antwort auf verschiedene Hauttumoren könnte anhand des Vorkommens oder des Fehlens von CTACK und/oder Vic beurteilt werden.
Antikörper gegen die Chemokine oder Rezeptoren, einschließlich rekombinanter Formen, können aufgereinigt und dann alleine oder in Verbindung mit anderen Chemokinen, Cytokinen oder deren Antagonisten diagnostisch oder therapeutisch verwendet werden. Diese Reagenzien können für die therapeutische Verwendung mit zusätzlichen aktiven oder inerten Bestandteilen, beispielsweise in herkömmlichen, pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln, zum Beispiel immunogenen Adjuvanzien, zusammen mit physiologisch ungefährlichen Stabilisatoren und Arzneimittelhilfsstoffen kombiniert werden. Diese Kombinationen können steril filtriert und in Dosierungsformen eingebracht werden, wie zum Beispiel durch Lyophilisierung in Dosierungsröhrchen oder Lagerung in stabilisierten wäßrigen Zubereitungen. Diese Erfindung zieht auch die Verwendung von Antikörpern oder deren Bindungsfragmenten in Betracht, einschließlich von Formen, die keine Komplementäre binden. Weiterhin können Modifikationen in die Antikörpermoleküle oder deren Antigen-Bindungsfragmente eingeführt werden, welche die Pharmakokinetiken und Pharmakodynamiken des therapeutischen Gebildes beeinflussen.
Wirkstoffscreening unter Verwendung von Antikörpern oder Rezeptoren oder deren Fragmente kann durchgeführt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die Bindungsaffinität für jedes Chemokin oder jeden Rezeptor aufweisen, einschließlich der Isolierung von assoziierten Komponenten. Nachfolgende biologische Assays können dann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung eine intrinsische stimulierende Aktivität aufweist und daher ein Blockierer oder Antagonist ist, indem sie die Aktivität des Liganden blockiert. Auf die gleiche Weise kann eine Verbindung, die intrinsische stimulierende Aktivität aufweist, den Rezeptor aktivieren, und ist daher ein Agonist, indem sie die Aktivität eines Liganden simuliert. Diese Erfindung zieht ferner die therapeutische Verwendung von Antikörpern gegen diese Chemokine als Antagonisten, oder gegen die Rezeptoren als Antagonisten oder Agonisten in Betracht. Dieser Ansatz sollte besonders mit anderen Chemokin- oder Rezeptorartvarianten verwendbar sein.
Die für eine wirksame Therapie notwendigen Mengen an Reagenzien werden von vielen verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich der Mittel der Verabreichung, des Zielortes, des physiologischen Zustandes des Patienten und anderer verabreichter Medikamente. Daher sollten Behandlungsdosierungen titriert werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit in verschiedenen Populationen, einschließlich Rassenuntergruppen, Alter, Geschlecht, etc., zu optimieren. Üblicherweise bieten die in vitro verwendete Dosierungen eine nützliche Leitlinie für die für bei in situ-Verabreichung dieser Reagenzien nützlichen Mengen. Versuche mit zur Behandlung bestimmter Störungen wirksamen Dosen an Tieren werden einen weiteren vorhersagenden Hinweis für die menschliche Dosierung bereitstellen. Verschiedene Erwägungen werden beispielsweise in Gilman, et al. (Herausgeber) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Gases of Therapeutics, 8. Auflage, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. beschrieben. Verfahren zur Verabreichung werden dort und unten diskutiert, zum Beispiel für orale, intravenöse, intraperitoneale oder intramuskuläre Verabreichung, transdermale Diffusion und andere. Pharmazeutisch verträgliche Träger schließen üblicherweise Wasser, Salzlösung, Puffer und andere Verbindungen ein, die zum Beispiel in dem Merck Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey beschrieben werden. Es wird üblicherweise erwartet, daß die Dosierungsbereiche mit einem geeigneten Träger bei Konzentrationen kleiner als 1 mM, üblicherweise bei Konzentrationen kleiner als ungefähr 10 μM, gewöhnlich bei Konzentrationen kleiner als ungefähr 100 nM, bevorzugt kleiner als ungefähr 10 pM (Pikomolar) und am bevorzugtesten kleiner als ungefähr 1 fM (Femtomolar) liegen. Formulierungen mit langsamer Freisetzungen oder Apparate mit langsamer Freisetzung werden oft für eine kontinuierliche Verabreichung verwendet.
Das Auswählen eines Verabreichungsschemas für einen therapeutischen Agonisten oder Antagonisten hängt von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Serum- oder Gewebsumsatzrate des Therapeutikums, der Immunogenität des Therapeutikums oder der Zugänglichkeit der Zielzellen. Bevorzugt maximiert ein Verabreichungsschema die Menge des dem Patienten verabreichten Therapeutikums im Einklang mit einer verträglichen Stärke der Nebeneffekte. Dementsprechend hängt die Menge des verabreichten Therapeutikums teilweise von dem jeweiligen Agonisten oder Antagonisten und der Schwere des zu behandelnden Zustandes ab. Eine Leitlinie zur Auswahl geeigneter Antikörperdosen ist in der Literatur zu therapeutischen Verwendungen zu finden, zum Beispiel Bach et al., Kapitel 22, in Ferrone, et al. (Herausgeber, 1985), Handbook of Monoclonal Antibodies Noges Publications, Park Ridge, NJ.; und Russell, Seiten 303-357 und Smith et al., Seiten 365-389, in Haber, et al. (Herausgeber, 1977) Antibodies in Human Diagnosis and Therapy Raven Press, New York, NY.
Die Bestimmung der geeigneten Dosis wird durch den Krankenhausarzt durchgeführt, beispielsweise durch Verwendung von im Fachbereich bekannter Parameter oder Faktoren, welche die Behandlung beeinflussen, oder von denen vorhergesagt wird, daß sie die Behandlung beeinflussen. Im Allgemeinen beginnt die Dosis mit einer Menge, die ein wenig niedriger ist als die optimale Dosis, und wird anschließend in kleinen Schritten erhöht, bis die gewünschte oder die optimale Wirkung im Verhältnis zu den negativen Nebenwirkungen erreicht wird. CLA⁺-Zellgehalte könnten wichtige Indikatoren dafür sein, wann eine wirksame Dosis erreicht ist. Bevorzugt wird ein Antikörper oder deren Bindungszusammensetzung, die verwendet wird, von der gleichen Art erhalten, wie das Tier, für das die Behandlung gedacht ist, wodurch eine humorale Antwort auf das Reagenz minimiert wird.
Die Bereiche der wöchentlichen Gesamtdosis für Antikörper oder deren Fragmente, die spezifisch an CTACK binden, reichen im Allgemeinen von ungefähr 1 ng, allgemeiner von ungefähr 10 ng, üblicherweise von ungefähr 100 ng, üblichererweise von ungefähr 1 μg, üblichererweise von ungefähr 10 μg, bevorzugt von ungefähr 100 μg und bevorzugter von ungefähr 1 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Obwohl höhere Mengen wirksamer sein können, werden niedrigere Dosierungen üblicherweise weniger nachteilige Wirkungen haben. Im Allgemeinen wird der Bereich weniger als 100 mg, bevorzugt weniger als ungefähr 50 mg und bevorzugter weniger als ungefähr 25 mg pro Kilogramm Körpergewicht betragen.
Die Bereiche der wöchentlichen Dosis für Antagonisten, zum Beispiel Antikörper, Bindungsfragmente, reicht von ungefähr 10 μg, bevorzugt mindestens ungefähr 50 μg und bevorzugter mindestens ungefähr 100 μg pro Kilogramm Körpergewicht. Im Allgemeinen wird der Bereich weniger als ungefähr 1000 μg, bevorzugt weniger als ungefähr 500 μg und bevorzugter mindestens ungefähr 100 μg pro Kilogramm Körpergewicht. Die Dosierungen folgen einem Zeitplan, der die gewünschte Behandlung bewirkt und der über einen kürzeren oder längeren Zeitraum periodisch erfolgen kann. Im Allgemeinen werden die Bereiche von mindestens ungefähr 10 μg bis ungefähr 50 mg, bevorzugter von ungefähr 100 μg bis ungefähr 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht reichen.
Andere Antagonisten des Liganden, zum Beispiel Muteine, werden ebenfalls offenbart. Bereiche für stündliche Dosen liegen für Muteine im Bereich von mindestens ungefähr 10 μg, allgemein mindestens ungefähr 50 μg, üblicherweise mindestens ungefähr 100 μg und bevorzugt mindestens 500 μg pro Stunde. Im Allgemeinen wird die Dosierung weniger als ungefähr 100 μg, üblicherweise weniger als ungefähr 30 μg, bevorzugt weniger als ungefähr 10 μg und bevorzugter weniger als ungefähr 6 mg pro Stunde betragen. Allgemeine Bereiche werden von mindestens ungefähr 1 μg bis ungefähr 1000 μg, bevorzugt von ungefähr 10 μg bis ungefähr 500 μg pro Stunde betragen.
Bestimmte Zusammenhänge, zum Beispiel Transplantate oder Hautverpflanzungen, können die Verabreichung der Therapeutika in unterschiedlichen Formen mit sich bringen. Beispielsweise kann bei einer Hautverpflanzung das Gewebe in ein steriles Medium eingetaucht werden, welches das Therapeutikum enthält, was zu einer prophylaktischen Wirkung auf die Zellwanderung führt, kurz nachdem das Transplantat eingesetzt wurde.
Ein Chemokin, dessen Fragmente, oder Antikörper gegen es oder dessen Fragmente, Antagonisten und Agonisten können dem zu behandelnden Wirt direkt verabreicht werden, oder es kann abhängig von der Größe der Verbindungen wünschenswert sein, diese vor deren Verabreichung an Trägerproteine, wie beispielsweise Ovalbumin oder Serumalbumin, zu konjugieren. Therapeutische Formulierungen können in vielen herkömmlichen Dosierungsformulierungen verabreicht werden. Während es bei dem aktiven Bestandteil möglich ist, dieses allein zu verabreichen, ist es oft bevorzugt, es als pharmazeutische Formulierung bereitzustellen. Formulierungen umfassen üblicherweise mindestens einen aktiven Bestandteil, der wie oben definiert ist, zusammen mit einem oder mehreren von ihm vertragenen Träger(n). Jeder Träger sollte sowohl pharmazeutisch als auch physiologisch verträglich sein in dem Sinne, daß er mit den anderen Bestandteilen kompatibel und für den Patienten nicht schädlich ist. Träger können die Lagerzeit, die Stabilität, etc. verbessern. Die Formulierungen schließen solche ein, die für orale, rektale, nasale oder parenterale (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser und intradermaler) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können in geeigneter Weise in Einheitsdosierungsformen bereitgestellt werden und können durch jedes, im Bereich der Pharmazie gut bekannte Verfahren zubereitet werden. Siehe zum Beispiel Gilman, et al. (Herausgeber, 1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8. Auflage, Pergamon Press; und Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (Herausgeber, 1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman, et al. (Herausgeber, 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; und Lieberman, et al. (Herausgeber, 1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York. Die erfindungsgemäße Therapie kann mit anderen therapeutischen Wirkstoffen kombiniert oder in Verbindung mit ihnen verwendet werden. Gleiche Überlegungen werden oft für auf Rezeptoren beruhende Reagenzien gelten.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verabreichung von CTACK-, Vic- oder GPR2-Antikörpern oder Bindungszusammensetzungen in Verbindungen mit anderen bekannten Therapien bereit, zum Beispiel Steroide, insbesondere Glukokortikoide, welche die Symptome lindern, die mit übermäßigen Entzündungsreaktionen einhergehen. Die täglichen Dosierungen für Glukokortikoide werden von mindestens ungefähr 1 mg, allgemein mindestens ungefähr 2 mg und bevorzugt mindestens ungefähr 5 mg pro Tag reichen. Im Allgemeinen wird die Dosis weniger als ungefähr 100 mg, üblicherweise weniger als ungefähr 50 mg, bevorzugt weniger als ungefähr 20 mg und bevorzugter mindestens ungefähr 10 mg pro Tag betragen. Im Allgemeinen werden die Bereiche von mindestens ungefähr 1 mg bis ungefähr 100 mg, bevorzugt von ungefähr 2 mg bis 50 mg pro Tag reichen.
Der Ausdruck "wirksame Menge" bezeichnet eine Menge, die ausreichend ist, um eine gewünschte Reaktion zu bewirken, oder um ein Symptom oder ein Anzeichen der Hautkrankheit zu lindern. Übliche Säugetierwirte werden Mäuse, Ratten, Katzen, Hunde und Primaten, einschließlich der Menschen, einschließen. Eine wirksame Menge für einen bestimmten Patienten kann in Abhängigkeit von Faktoren, wie beispielsweise dem zu behandelnden Zustand, der Gesamtgesundheit des Patienten, des Verfahrens, der Route und der Verabreichungsdosis und der Schwere der Nebenwirkungen variieren. Bevorzugt wird die Wirkung zu einer Veränderung der Bewertung von mindestens ungefähr 10 %, bevorzugt mindestens 20 %, 30 %, 50 %, 70 %, oder sogar 90 %, oder mehr führen. Bei Verwendung in einer Kombination steht die wirksame Menge im Verhältnis zu einer Kombination von Be standteilen und die Wirkung ist nicht auf einzelne Bestandteile allein beschränkt.
Eine wirksame Menge eines Therapeutikums wird die Symptome üblicherweise um mindestens ungefähr 10 %, für gewöhnlich um mindestens ungefähr 20 %, bevorzugt um mindestens ungefähr 30 % und bevorzugter um mindestens ungefähr 50 % modulieren. Alternativ wird die Modulierung der Bewegung bedeuten, daß die Bewegung oder der Signalaustausch ("trafficking") von verschiedenen Zelltypen beeinflußt wird. Etwas derartiges wird zum Beispiel zu statistisch signifikanten und quantifizierbaren Veränderungen in der Anzahl der Zellen führen, die beeinflußt werden. Dies kann eine Zunahme oder Abnahme der Anzahl von Zielzellen sein, die innerhalb eines Zeitraums oder innerhalb eines Zielgebietes angezogen wird.
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit, die in therapeutischen Anwendungen, die hier anderweitig beschrieben sind, Anwendung finden, beispielsweise in der allgemeinen Beschreibung der Behandlung von Störungen, die mit Hautzuständen assoziiert sind. Siehe zum Beispiel Berkow (Herausgeber) The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, NY; Gilman, et al. (Herausgeber, 1990) Goodman und Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics 8. Auflage, Pergamon Press; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn; Langer (1990) Science 249:1527-1533, und Merck Index, Merck & Co., Rahway, New York.
Sowohl die natürlich vorkommenden als auch die rekombinanten Formen der erfindungsgemäßen Chemokine oder Rezeptoren sind in Kits und Assayverfahren besonders nützlich, die in der Lage sind, Verbindungen hinsichtlich der Bindungsaktivität für diese Proteine zu durchmustern. Verschiedene Verfahren zum Au tomatisieren von Assays wurden in den letzten Jahren entwikkelt, um so das Durchmustern von Zehntausenden von Verbindungen in einem kurzen Zeitraum zu ermöglichen. Siehe zum Beispiel Fodor et al. (1991) Science 251:767-773, die Mittel zum Testen der Bindungsaffinität mittels einer Vielzahl von definierten Polymeren beschreiben, die auf einem festen Substrat synthetisiert wurden. Die Entwicklung von geeigneten Assays kann durch die Verfügbarkeit von großen Mengen an aufgereinigten, löslichen Chemokin, wie es durch diese Erfindung bereitgestellt wird, sehr vereinfacht werden.
Normalerweise können Antagonisten beispielsweise gefunden werden, sobald ein Ligand strukturell definiert worden ist. Das Testen von potentiellen Ligandanaloga ist nun nach der Entwicklung von hochgradig automatisierten Assayverfahren durch Verwenden von physiologisch reagierenden Zellen möglich. Insbesondere werden neue Agonisten und Antagonisten durch Verwendung der hier beschriebenen Durchmusterungstechniken entdeckt.
Lebende Zellen könnten ebenfalls verwendet werden, um nach den Wirkungen von Wirkstoffen auf entsprechende Chemokinvermittelte oder von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelte Funktionen zu screenen, beispielsweise Gehalte an sekundären Botenstoffen, d.h. Veränderungen des Ca⁺⁺:Inositolphosphatpools (siehe zum Beispiel Berridge (1993) Nature 361:315-325 oder Billah und Anthes (1990) Biochem. J. 269:281-291)), Antworten in Form von Veränderungen der zellulären Morphologie, Phosphoinositidlipidumsatz, eine antivirale Reaktion und andere. Einige Nachweisverfahren ermöglichen das Auslassen eines Trennungsschrittes, beispielsweise ein annäherungsempfindliches Nachweissystem. Calcium-sensitive Farbstoffe werden zum Nachweisen von Ca⁺⁺-Gehalten mit einem Fluorimeter oder einem Gerät zur Zellsortierung mittels Fluoreszenz nützlich sein.
Ein vernünftiges Wirkstoffdesign kann ebenfalls auf strukturellen Untersuchungen der molekularen Formen der Chemokine, anderer Effektoren oder Analoga oder den Rezeptoren beruhen. Die Effektoren können andere Proteine sein, die andere Funktionen als Reaktion auf Ligandenbindung vermitteln, oder andere Proteine, die üblicherweise mit dem Rezeptor wechselwirken. Ein Mittel zum Bestimmen, welche Stellen mit spezifischen anderen Proteinen wechselwirken, ist eine physikalische Strukturbestimmung, zum Beispiel Röntgenkristallographie oder zweidimensionale NMR-Techniken. Diese werden eine Leitlinie liefern, welche Aminosäurereste molekulare Kontaktbereiche bilden. Für eine ausführliche Beschreibung der Proteinstrukturbestimmung siehe zum Beispiel Blundell und Johnston (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York.
Aufgereinigtes Chemokin oder aufgereinigter Rezeptor können für eine Verwendung in den zuvor erwähnten Durchmusterungstechniken direkt auf Platten geschichtet werden, und können mit Detergenzien oder Lipiden in Verbindung gebracht werden. Nicht-neutralisierende Antikörper, beispielsweise gegen die Chemokine oder Rezeptoren, können jedoch als Fangantikörper verwendet werden, um das entsprechende Protein auf der festen Phase zu immobilisieren.
Gleiche Konzepte werden ebenfalls für die Ausführungsformen der Chemokinrezeptoren der vorliegenden Erfindung gelten.
IX. Kits
Die Verwendung von Chemokin- oder Rezeptorproteinen, deren Fragmente, Peptide, Bindungszusammensetzungen und ihre Fusionsprodukte in einer Vielzahl von diagnostischen Kits und Verfahren zum Nachweisen des Vorkommens eines Liganden, von Antikörpern oder Rezeptoren wird ebenfalls offenbart. Üblicherweise wird das Kit ein Fach aufweisen, das ein definiertes Chemo kin- oder Rezeptorpeptid oder einen Genabschnitt oder ein Reagenz enthält, welches das eine oder andere beispielsweise Bindungsreagenz erkennt.
Ein Kit zum Bestimmen der Bindungsaffinität einer Testverbindung für ein Chemokin oder einen Rezeptor wird üblicherweise eine Testverbindung umfassen, eine markierte Verbindung, zum Beispiel ein Antikörper, der eine bekannte Bindungsaffinität für das Protein aufweist, eine Quelle für das Chemokin oder den Rezeptor (natürlich vorkommend oder rekombinant), und ein Mittel zum Trennen der gebundenen von der freien markierten Verbindung, wie beispielsweise eine feste Phase zum immobilisieren des Liganden oder Rezeptors. Sobald Verbindungen durchmustert wurden, können solche, die eine geeignete Bindungsaffinität für den Ligand oder Rezeptor aufweisen, in geeigneten biologischen Assays, die in dem Fachgebiet bekannt sind, bewertet werden, um zu bestimmen, ob sie auf den Rezeptor als Agonisten oder Antagonisten wirken. Die Verfügbarkeit von rekombinanten Chemokin- oder Rezeptorpolypeptiden stellt ebenfalls gut definierte Standards zum Kalibrieren derartiger Assay oder als Positivkontrollproben zur Verfügung.
Ein bevorzugter Kit zum Bestimmen der Konzentration von zum Beispiel einem Chemokin oder Rezeptor in einer Probe wird üblicherweise eine markierte Verbindung umfassen, zum Beispiel einen Antikörper mit bekannter Bindungsaffinität für das Ziel, eine Quelle für den Liganden oder Rezeptor (natürlich vorkommend oder rekombinant) und ein Mittel zum Trennen der gebundenen von der freien markierten Verbindung, zum Beispiel eine feste Phase zum Immobilisieren des Chemokins oder Rezeptors. Fächer, welche die Reagenzien enthalten, sowie Anleitungen für die Verwendung oder Entsorgung werden normalerweise bereitgestellt.
Für das Chemokin oder den Rezeptor oder Fragmente spezifische Antikörper, einschließlich Antigenbindungsfragmente sind in diagnostischen Anwendungen nützlich, um die Anwesenheit von erhöhten Gehalten des Chemokins, Rezeptors und/oder deren Fragmente nachzuweisen. Derartige diagnostische Assays können Lysate, lebende Zellen, fixierte Zellen, Immunfluoreszenz, Zellkulturen und Körperflüssigkeiten verwenden, und können weiterhin den Nachweis von Antigenen einschließen, die mit dem Liganden oder dem Rezeptor im Serum oder dergleichen in Beziehung stehen. Diagnostische Assays können homogen (ohne ein Schritt der Trennung zwischen dem freien Reagenz und dem Antigenkomplex) oder heterogen sein (mit einem Trennungsschritt). Es gibt verschiedene kommerzielle Assays, wie beispielsweise der Radioimmunassay (RIA), der „enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA), der Enzymimmunassay (EIA), die "enzymemultiplied immunoassay"-Technik (EMIT), der "substrate-labeled fluorescent"-Immunassay (SLFIA) und dergleichen. Beispielsweise können unmarkierte Antikörper verwendet werden, indem ein zweiter Antikörper verwendet wird, der markiert ist, und der den primären Antikörper gegen ein Chemokin oder einen Rezeptor oder ein bestimmtes Fragment davon erkennt. Ähnliche Assays wurden ebenfalls in der Literatur ausführlich diskutiert. Siehe zum Beispiel Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH.
Anti-idiotypische Antikörper können ähnlich verwendet werden, um die Anwesenheit von Antikörpern gegen ein Chemokin oder einen Rezeptor zu diagnostizieren, und können als solche für verschiedene abnorme Zustände diagnostisch sein. Beispielsweise kann die Überproduktion eines Chemokins oder Rezeptors zur Bildung von verschiedenen immunologischen Reaktionen führen, die für einen abnormen physiologischen Zustand diagnostisch sein können, insbesondere bei verschiedenen entzündlichen oder asthmatischen Zuständen.
Häufig werden die Reagenzien für diagnostische Assays in Kits bereitgestellt, um auf diese Weise die Empfindlich des Assays zu optimieren. Für den Gegenstand der Erfindung wird, in Abhängigkeit von der Art des Assays, die Anleitung und die Markierung, entweder markierter oder unmarkierter Antikörper oder markiertes Chemokin oder markierter Rezeptor bereitgestellt. Dies geschieht üblicherweise in Verbindung mit anderen Zusatzstoffen, wie beispielsweise Puffern, Stabilisatoren, Materialien, die für die Signalerzeugung notwendig sind, wie beispielsweise Substrate für Enzyme, und dergleichen. Bevorzugt wird das Kit auch Anleitungen für die richtige Verwendung und die richtige Entsorgung der Inhaltsstoffe nach der Verwendung enthalten. Üblicherweise weist das Kit Fächer oder Behälter für jedes nützliche Reagenz auf. Wünschenswerterweise werden die Reagenzien als trockenes, lyophilisiertes Pulver bereitgestellt, wobei die Reagenzien in einem wäßrigen Medium rekonstituiert werden können, wodurch geeignete Konzentrationen der Reagenzien zum Durchführen des Assays bereitgestellt werden.
Die vorangehend erwähnten Bestandteile des Wirkstoffscreenings und der diagnostischen Assays können ohne Modifizierung verwendet werden oder können auf eine Vielzahl von Weisen modifiziert werden. Beispielsweise kann eine Markierung durch kovalentes oder nicht-kovalentes Anfügen einer Seitenkette erreicht werden, die ein nachweisbares Signal direkt oder indirekt bereitstellt. In jedem dieser Assays kann der Ligand, die Testverbindung, das Chemokin, der Rezeptor oder Antikörper gegen diese/s/n entweder direkt oder indirekt markiert sein. Die Möglichkeiten für direktes Markieren schließen Markierungsgruppen ein: Radiomarkierung, wie beispielsweise ¹²⁵I, Enzyme ( US-Patent Nr. 3,645,090 ), wie beispielsweise Peroxidase und alkaline Phosphatase, und fluoreszierende Farbstoffe ( US-Patent Nr. 3,940,475 ), die in der Lage sind, die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität, Wellenlängenverschiebung oder Fluoreszenzpolarisierung zu überwachen. Die Möglichkeiten für indirekte. Markierung schließen Biotinylierung eines der Bestandteile gefolgt von Bindung an Avidin, das an eine der oben genannten Markierungsgruppen gekoppelt ist, ein.
Es gibt auch verschiedene Verfahren zum Trennen von gebundenen von dem freien Liganden, oder alternativ gebundener von freier Testverbindung. Das Chemokin oder der Rezeptor kann auf verschiedenen. Matrizen immobilisiert werden, etwa mit Detergenzien oder assoziierten Lipiden, gefolgt von Waschen. Geeignete Matrizen schließen Plastik ein, wie beispielsweise eine ELISA-Platte, Filter und Kügelchen. Verfahren zum Immobilisieren des Chemokins oder des Rezeptors an einer Matrix schließen ohne Einschränkung die direkte Adhäsion an Plastik, die Verwendung eines Fangantikörpers, chemisches Koppeln und Biotin-Avidin ein. Der letzte Schritt in diesem Ansatz kann die Fällung des Antigen/Antikörper-Komplexes durch eines von verschiedenen Verfahren umfassen, einschließlich solcher, die beispielsweise ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Polyethylenglykol, oder ein Salz, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, verwenden. Andere geeignete Trennungstechniken schließen ohne Einschränkung das "fluorescein antibody magnetizable particle"-Verfahren, wie es in Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461 beschrieben ist, und die "double-antibody magnetic particle"-Trennung ein, wie im US-Patent Nr. 4,659,678 beschrieben.
Verfahren zum Knüpfen der Proteine oder ihrer Fragmente an die verschiedenen Markierungen wurden in der Literatur ausführlich beschrieben und erfordern hier keine ausführliche Diskussion. Viele der Techniken umfassen die Verwendung von aktivierten Carboxylgruppen durch die Verwendung von entweder Carbodiimid oder aktiven Estern, um Peptidbindungen auszubilden, die Bildung von Thioestern durch Umsetzen einer Mercaptogruppe mit einem aktvierten Halogen, wie beispielsweise Chloracetyl, oder einem aktivierten Olefin, wie beispielsweise Maleimid, für Bindung oder dergleichen. Fusionsproteine werden in diesen Anwendungen ebenfalls Verwendung finden.
Ein weiterer, hier offenbarter diagnostischer Aspekt umfasst die Verwendung von Oligonukleotid- oder Polynukleotidsequenzen, die aus der Sequenz des Chemokins oder des Rezeptors entnommen werden. Diese Sequenzen können als Sonden zum Nachweisen von Gehalte der Ligandnachricht in Proben von Patienten verwendet werden, bei denen vermutet wird, daß sie einen abnormen Zustand aufweisen, zum Beispiel eine Entzündung, ein physiologisches Problem oder ein Entwicklungsproblem. Die Herstellung von sowohl RNA- als auch DNA-Nukleotidsequenzen, die Markierung dieser Sequenzen sowie die bevorzugte Größe der Sequenzen wurde in der Literatur ausgiebig beschrieben und diskutiert. Normalerweise sollte eine Oligonukleotidsonde mindestens ungefähr 14 Nukleotide, gewöhnlich mindestens ungefähr 18 Nukleotide aufweisen, und die Polynukleotidsonden können bis zu mehrere Kilobasen aufweisen. Verschiedene Markierungen können eingesetzt werden, am häufigsten Radionuklide, insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Techniken für das Einbringen in eine Polynukleotid verwendet werden, wie beispielsweise die Verwendung von mit Biotin modifizierten Nukleotiden. Das Biotin dient dann als die Stelle für die Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer großen Vielzahl von Markierungen markiert worden sein können, wie beispielsweise Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen oder dergleichen. Alternativ können Antikörper verwendet werden, die bestimmte Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe, DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Proteinduplexe. Die Antikörper wiederum können markiert und der Assay durchgeführt werden, wobei der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, so daß bei Bildung des Duplex auf der Oberfläche die Anwesenheit von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann. Die Verwendung von Sonden für die neue Antisense-RNA kann in herkömmlichen Techniken, wie beispielsweise der Nukleinsäurehybridisierung, dem "Plus und Minus"-Screening, dem rekombinanten Beproben, der "hybrid released"-Translation (HRT) und der "hybrid arrested"-Translation" (HART), durchgeführt werden. Dies schließt Amplifikationstechniken wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) ein.
Diagnostische Kits, die auch die qualitative und quantitative Anwesenheit von anderen Markern testen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Die Diagnose oder Prognose kann von der Kombination von verschiedenen Indikationen, die als Marker verwendet werden, abhängen. Daher können Kits auf Kombinationen von Markern testen. Siehe zum Beispiel Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1:89-97.
X. Rezeptor; Liganden für Rezeptoren
Nachdem ein Ligandenbindungspartner einer spezifischen Wechselwirkung identifiziert wurde, bestehen Verfahren zum Isolieren des Pendants („counter-partner"). Siehe Gearing, et al. EMBO J. 8:3667-4676, oder McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2832. Beispielsweise können Mittel für eine Markierung eines Chemokin ohne Beeinflussung der Bindung an seinen Rezeptor bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Affinitätsmarkierung entweder an den Amino- oder den Carboxyterminus des Liganden gebunden werden. Eine Expressionsbibliothek kann auf spezifische Bindung von Chemokin hin durchmustert werden, zum Beispiel durch Zellsortieren oder anderes Durchmustern, um Subpopulationen nachzuweisen, die eine derartige Bindungskomponente exprimieren. Siehe zum Beispiel Ho, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:11267-11271. Alternativ kann ein Panning-Verfahren verwendet werden. Siehe zum Beispiel Seed und Aruffo (1987) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 84:3365-3369.
Mit einem Rezeptor liegen Mittel zum Identifizieren des Liganden vor. Es können Verfahren zum Verwenden des Rezeptors, zum Beispiel auf der Zellmembran, verwendet werden, um zum Beispiel durch Suchen nach einem gemeinsamen G-Proteinverknüpften Signal, wie beispielsweise dem Ca⁺⁺-Fluß, nach Liganden zu durchmustern. Siehe Lerner (1994) Trends in Neu roscience 17:142-146. Es ist wahrscheinlich, daß die Liganden für diese Rezeptoren Chemokine sind.
Proteinkreuzvernetzungstechniken mit einer Markierung können angewendet werden, um Bindungspartner eines Chemokins zu isolieren. Dies würde die Identifizierung eines Proteins ermöglichen, das mit einem Chemokin beispielsweise in der Weise eines Ligand-Rezeptors wechselwirkt.
Der breite Umfang dieser Erfindung wird am besten unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden, die nicht vorgesehen sind, die Erfindung auf spezifische Ausführungsformen zu beschränken.
BEISPIELE
I. Allgemeine Verfahren.
Einige der Standardverfahren werden zum Beispiel in Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2. Auflage) Bände 1-3, CSH-Press, NY; Ausubel, et al. Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY, oder Ausubel, et al. (1987 und Ergänzungsbände) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiley, New York; Innis, et al. (Herausgeber) (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, N.Y., beschrieben oder mit Verweisen versehen. Verfahren zur Proteinaufreinigung schließen derartige Verfahren ein, wie Ammoniumsulfatfällung, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Zentrifugation, Kristallisation und andere. Siehe zum Beispiel Ausubel, et al. (1987 und periodische Ergänzungsbände); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology, Band 182 und weitere Bände in dieser Serie, die Literatur der Hersteller zur Verwendung von Proteinaufreinigungsprodukten, zum Beispiel Pharmacia, Piscataway, N.J., oder Bio-Rad, Richmond, CA; und Coligan, et al. (Herausgeber) (1995 und periodische Ergänzungsbände) Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Söhne, New York, NY. Die Kombination mit rekombinanten Techniken ermöglicht die Bindung an geeignete Abschnitte, zum Beispiel an eine FLAG-Sequenz oder ein Äquivalent, das über eine von einer Protease entfernbare Sequenz gebunden werden kann. Siehe zum Beispiel Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Prufication of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" in Setlow (Herausgeber) Genetic Engineering, Principle und Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; und Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA.
Immunologische Standardtechniken werden zum Beispiel in Hertzenberg, et al. (Herausgeber, 1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology Bände 1-4, Blackwell Science; Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY.; und Methods in Enzymology Bände 70, 73, 74, 84, 92, 93, 108, 116, 121, 132, 150, 162 und 163 beschrieben.
FACS-Analysen werden in Melamed, et al. (1990) Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cytometry Liss, New York, NY.; und Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss, New York, NY, beschrieben.
II. Zellkultur und Gewebeproben
Adulte menschliche Primärzellen, einschließlich Keratinozyten, Melanozyten und dermale Fibroblasten wurden von Clonetics erhalten und den Anweisungen des Herstellers entsprechend kultiviert. Die γδ-T-Zellinie 7-17 wurde freundlicherweise von Richard Boismenu (The Scipps Institute, La Jolla, Kalifornien) bereitgestellt. Für die Behandlung mit Cytokin wurden die Zellen für die angegebenen Zeiten mit 10 ng/ml hTNF-α plus 3 ng/ml hIL-1β (R&D Systems) in Kulturmedium kultiviert. Die Haut des Mauseohrs von BALB/c-Mäusen wurde nach Inkubation mit 2,5 Trypsin in PBS für 30 Minuten bei 37 °C in Epidermis und Dermis aufgetrennt. Menschliche PBMC wurden aus gesunden Spendern durch Erythrozytensedimentation gefolgt von Ficoll-Histopaque-1077 (Sigma Chem. Co.)-Sedimentation erhalten. Menschliche T-Zellen wurden aus den PBMCs unter Verwendung einer T-Zellanreicherungssäule (R&D Systems) den Anweisungen des Herstellers entsprechend aufgereinigt.
III. Isolierung von für CTACK, Vic oder GPR2 kodierenden Sequenzen
Die CTACK-Sequenz aus dem Menschen oder der Maus ist leicht erhältlich. SEQ ID NOs: 11-14. Geeignete PCR-Primer oder Hybridisierungssonden können ausgewählt werden. Gleiches gilt für Vic und GPR2, SEQ ID NOs: 1-10.
Sequenzanalyse. Die TBLASTN-Suchen mit den Sequenzen von bekannten CC-Chemokinen in einer eigenen und in den dbEST-Datenbanken von Genbank identifizierten die ESTs für CTACK aus dem Menschen bzw. der Maus. Die CTACK-cDNA der Maus, Klon #3164675 des IMAGE-Konsortiums, wurde von Genome Systems als ein EcoRI-NotI-Insert in dem pT7T3-PacD-Vektor erhalten. Humanes CTACK wurde als ein SalI-NotI-Insert in dem pSPORT 3.0-Vektor erhalten. Die Nukleotidsequenz beider Klone wurde durch automatisiertes Sequenzieren bestätigt. Die Spaltstellen für das Signalpeptid wurden unter Verwendung des SignalP-Servers (http://www.cbs.dtu.dk/signalp/cbssignalp.html) vorhergesagt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von CLUSTAL W abgeglichen.
Das GPR2 wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek hergestellt wurde. Marchese, et al. (1994) Genomics 23:609-618 haben eine Teilsequenz berichtet. Individuelle cDNA-Klone wurden unter Verwendung von Standardverfahren, zum Beispiel dem „Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing"-Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) sequenziert und die Sequenz weiter charakterisiert.
Weitere Pendants aus Nagetieren wurden isoliert und beschrieben. Ein Southern Blot kann das Ausmaß der Homologie zwischen den Arten angeben, und entweder eine cDNA-Bibliothek oder mRNA kann durchmustert werden, um eine geeignete Quelle für Zellen zu identifizieren. Der physiologische Zustand von vielen verschiedenen Zelltypen kann ebenfalls im Hinblick auf eine erhöhte Expression des Gens bewertet werden.
Computeranalysen legen nahe, daß die am engsten verwandten Gene verschiedene G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind. Diese schließt die Chemokinrezeptoren und Proteaserezeptoren, beispielsweise. Thrombin-Rezeptoren ein. Strukturelle Motive legen nahe, daß der Rezeptor Motive enthalten kann, die für die Chemokinrezeptorfamilie und für die Proteaserezeptorfamilie charakteristisch sind. Hydrophobizitätsplots und Vergleiche mit weiteren ähnlichen GPCRs sollte eine Vorhersage der Transmembranabschnitte erlauben. Siehe zum Beispiel Loetscher, et al. (1996) J. Expt'l Med. 184:963-969. Eine Computeranalyse von GPCR-Sequenzen wird auf Reste hinweisen, die für die Familienmitglieder charakteristisch sind.
Durch Verwendung des gesamten kodierenden Teils dieses menschlichen Klons als eine Hybridisierungssonde sollten weitere Pendants aus Primaten isolierbar sein. Ein Southern Blot kann den Ausmaß der Homologie zwischen den Arten angeben, und entweder eine cDNA-Bibliothek oder mRNA kann durchmustert werden, um eine geeignete Quelle für Zellen zu identifizieren. Der physiologische Zustand von vielen verschiedenen Zelltypen kann ebenfalls im Hinblick auf eine erhöhte Expression des Gens bewertet werden.
Chemokinrezeptoren werden allgemein als nützliche Ziele für die Entdeckung von neuen Wirkstoffen angesehen, bei denen die Therapeutika die Bindung von einem natürlichen Ligand/von natürlichen Liganden des Rezeptors agonisieren oder antagonisieren würden. Diese Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen können zu Entzündung, Zellrekrutierung und/oder Zellaktivierungsprozessen führen. Das GPR2 ist bei der Hashimoto-Thyreoiditis und bei Psoriasis hochreguliert.
Einige dieser Rezeptoren sind das Einfallstor von infektiösen Agenzien, wie zum Beispiel Viren. Daher können Therapeutika, die gegen den Chemokinrezeptor gerichtet sind, eine Anwendung bei diesen Krankheiten finden. Darüber hinaus können die Rezeptoren beim Bestimmen der grundlegenden Struktur oder der physiologischen Reaktionen wichtig sein.
Durch Verwendung des gesamten kodierenden Teils dieser Klone als eine Hybridisierungssonde sollten weitere Pendants aus anderen Arten isolierbar sein. Ein Southern Blot kann den Ausmaß der Homologie zwischen den Arten angeben, und entweder eine cDNA-Bibliothek oder mRNA kann durchmustert werden, um eine geeignete Quelle für Zellen zu identifizieren. Der physiologische Zustand von vielen verschiedenen Zelltypen kann ebenfalls im Hinblick auf eine erhöhte Expression des Gens bewertet werden.
IV. Chromosomenkartierung
Die cDNA wird markiert, zum Beispiel mit Biotin-14-dATP „Nick-translatiert", und in situ bei einer Endkonzentration von 5 ng/μl an Metaphasen von zwei normalen Männern hybridisiert. Das „Fluoreszenz in situ"-Hybridisierungsverfahren (FISH) kann von dem von Callen, et al. (1990) Ann. Genet. 33:219-221 beschriebenen Verfahren ausgehend modifiziert werden, indem die Chromosomen vor der Analyse mit sowohl Propidiumiod (als Gegenfärbung) und DAPI (zur Chromosomenidentifizierung) gefärbt werden. Bilder der Metaphasenpräparationen werden mittels einer CCD-Kamera eingefangen und im Computer verstärkt. Eine Identifizierung der entsprechenden markierten Chromosomen wird durchgeführt.
CTACK wurde durch interspezifische Rückkreuzungsanalysen, die im Wesentlichen wie in Kelner, et al. (1994) Science 266:1395-1399 beschrieben mit der Ausnahme durchgeführt wurden, daß in diesen Fall ein ~400 Bp EcoRI/NotI-Fragment der Maus-CTACK-cDNA für das Southern-Blotting verwendet wurde, dem Maus-Chromosom 4 zugeordnet. In mit BglI verdauter C57BL/6J-DNA wurden Fragmente von 14,5 und 8,9 kBp nachgewiesen, und Fragmente von 8,9 und 4,4 kBp wurden in mit BglI verdauter DNA von M. spretus nachgewiesen. Das Vorkommen oder das Fehlen des BglI-spezifischen Fragmentes von 4,4 kBp wurde in Rückkreuzungsmäusen beobachtet. Die Rekombinationsdistanzen wurden unter Verwendung des Map-Managers, Version 2.6.5, berechnet.
mCTACK kartiert in dem proximalen Bereich des Maus-Chromosoms 4. CTACK wurde dem Maus-Chromosom 4 durch interspezifische Rückkreuzungsanalysen zugeordnet. Mehr als 98 Tiere wurden typisiert. Eine Suche mit. der Sequenz des hCTACK in Genbank. ergab, daß das Gen für hCTACK mit dem äußersten 3'-Ende (nach dem poly-A-Signal) des Gens für die α-Kette des IL-11-Rezeptors überlappt, jedoch auf dem gegenüberliegenden Strang liegt. Die α-Kette des IL-11R ist auf dem Chromosom 9p13 lokalisiert, einer Region, die zu dem proximalen Arm des Maus-Chromosoms 4 syntenisch („syntenic") ist.
Vergleichbare Verfahren können angewendet werden, um Vic und GPR2 zu kartieren.
V. Verbreitungsanalysen
5 μg von jeder cDNA-Bibliothek wurden für das Southern-Blotting mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um das Insert freizusetzen, einer Gelelektrophorese unterzogen und auf eine Hybond-N⁺-Membran übertragen. Alle RNAs wurden für das Northern-Blotting unter Verwendung von RNAzol B (TEL-TEST, Inc.) isoliert und durch Elektrophorese auf einem 1 Formaldehyd-Agarosegel analysiert und auf eine Hybond-N⁺-Membran übertragen. Northern- und Southern-Blots wurden für 16 Stunden bei 65 °C mit ³²P-markierten Sonden hybridisiert, die durch zufälliges Primen (Prime-it, Stratagene) des Volllängeninserts aus CTACK-Klonen der Maus und des Menschen erhalten wurden. Nach der Hybridisierung wurden die Blots bei hoher Stringenz gewaschen und mit einem Film exponiert.
Die Southern Blot-Analysen der CTACK-Expression in cDNA-Bibliotheken, die aus menschlichen Proben hergestellt wurden, schlossen ein: fötale Niere, Lunge und Leber, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC und PBMC-act), die ruhten oder mit anti-CD3 und PMA aktiviert (act) wurden, und T-Zellen (MOT72 und MOT72-act), die ruhten oder mit anti-CD28 und anti-CD3 aktiviert wurden, mit Hilfe von GM-CSF plus IL-4 erzeugte dendritische Zellen, aufgeschwemmte Monozyten, die mit LPS, IFNγ und entweder anti-IL-10 oder IL-10 aktiviert wurden, A549-(epitheliale) Zellen, die mit IL-1β behandelt wurden, adulte Organe und Gewebe, die krank oder normal waren.
Die Northern Blot-Analysen der CTACK-Expression in Geweben und Organen der Maus schlossen ein: aus der Haus des Ohres erhaltene Epidermis und Dermis, Leber, Milz, Thymus, periphere Lymphknoten (PLK) und das Ohr entwässernde Lymphknoten (aurikulare LK). Die Northern Blot-Analysen der CTACK-Expression wurden mit primären Keratinozyten, primären Melanozyten, 7-17-Zellen (γδ-T-Zellinie) und primären dermalen Fibroblasten durchgeführt, die unbehandelt waren oder mit TNF-α und IL-1β behandelt wurden. Dies zusammen mit Ergebnissen der RT-PCR legte nahe, daß CTACK-RNA von humanen Keratinozyten exprimiert und durch entzündungsfördernde Cytokine hochreguliert wird.
Alternativ wurden RNAs mit DNaseI behandelt und revers transkribiert, und die entstehenden cDNAs wurden wie beschrieben als Matrizen für kompetitive RT-PCR verwendet. Gilliland, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2725-2729, und Platzer, et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:1179-1184. Das kompetitive DNA-Fragment für CTACK wurde entsprechend Celi, et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21:1047 erzeugt. Die folgenden Primer wurden verwendet, um ein kompetitives CTACK-Fragment (155 Bp) aus dem Menschen zu erhalten: Sinnprimer 5'-CTGTACTCAGCTCTACCGAAAGCC-3' (siehe Position 99-122 von SEQ ID NO: 1); Gegensinnprimer 5'-GCCCATTTTCCTTAGCATCCCATGCAGATGCTGCGTTGAGC-3' (siehe Position 336-316 + Position 233-214 von SEQ ID NO: 1). Das kompetitive Fragment für menschliches β-Actin wurde freundlicherweise von Dr. J. Krüssel (Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf, Deutschland; Krüssel, et al. (1997) J. Reprod. Immunol. 34:103-120) bereitgestellt. Die für die kompetitive PCR verwendeten Primerpaare waren wie folgt: Sinnprimer für humanes CTACK (244 Bp) 5'-CTGTACTCAGCTCTACCGAAAGCC-3' (siehe Position 99-122 von SEQ ID NO: 11); Gegensinnprimer 5'-GCCCATTTTCCTTAGCATCCC-3' (siehe Position 336-316 von SEQ ID NO: 11); Sinnprimer für humanes β-Actin 5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3' (siehe SEQ ID NO: 15); Gegensinnprimer 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3' (siehe SEQ ID NO: 16). Die Produkte der kompetitiven RT-PCR wurden auf digitalisierten Agarosegelen unter Verwendung der Eagle Eye II-Image-Analysesoftware (Stratagene) quantifiziert.
RNA-Proben wurden revers transkribiert und als Matrize verwendet, um CTACK und β-Actin zu amplifizieren. β-Actin wurde für die Normalisierung der Ergebnisse verwendet, die mit den Expressionsniveaus der β-Actin-mRNA verglichen wurden.
Diese Expressionsuntersuchungen zeigten, daß CTACK äußerst gewebspezifisch ist. Mehr als 70 menschliche cDNA-Bibliotheken wurden mittels Southern Blotting beprobt, einschließlich 46 Bibliotheken von hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen und 25 Bibliotheken von normalen und erkranktem Gewebe. Im Wesentlichen hybridisiert CTACK ausschließlich mit Bibliotheken, die aus normaler oder psoriatischer Haut erhalten wurden. Das Southern Blotting mit Maus-CTACK zeigt keine signifikante Hybridisierung mit über 45 Bibliotheken aus der Maus, die aus einer Vielzahl von Zellen und Geweben erhalten wurden, allerdings umfaßte dieses Reihe keine aus der Haut abgeleitete Bibliothek.
Um zu bestimmen, ob Maus-CTACK ebenfalls in der Haut exprimiert wird, wurde eine Northern Blot-Analyse unter Verwendung von RNA durchgeführt, die sowohl aus der Epidermis und der Dermis von Haut des Mauseohrs oder von anderen favorisierten Organen erzeugt wurde. Eine RNA-Art von 0,8 kBp wird in der Epidermis gut, in der Dermis nur schwach und in den anderen getesteten Organen überhaupt nicht nachgewiesen. Das schwache Signal in der Dermis kann einer unvollständigen Trennung der Epidermis von der Dermis zugerechnet werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Expression des CTACK nicht nur hochgradig gewebspezifisch ist, sondern daß seine selektive Expression in der Haut auf die Epidermis beschränkt ist. Dies steht im Gegensatz zu anderen Chemokinen, wie beispielsweise IP-10 und IL-8, die in der. Haut exprimiert werden (Schroeder (1995) J. Invest. Dermatol. 105:20S-24S, und Larsen, et al. (1989) Immunology 68:31-36), außerhalb dieses Gewebes jedoch ebenfalls allgemein exprimiert werden (Rollins (1997) Blood) 90:909-928)
Um den zellulären Ursprung von CTACK zu bestimmen, wurde in kultivierten, aus der Haut stammenden Zellen, die entweder unbehandelt gelassen wurden, oder für 6 h oder 18 h mit TNF-α plus IL-1β behandelt wurden, nach mRNA gesucht. Diese entzündungsfördernden Zytokine sind wichtige primäre Regulatoren der Immunantworten in der Haut, und können die Expression von anderen Entzündungsmediatoren, einschließlich Chemokinen induzieren. Schroder (1995) J. Invest. Dermatol. 105:20S-24S; Larsen, et al. (1989) Immunology 68:31-36; und Goebeler, et al. (1997) J. Invest. Dermatol. 108:445-451. Die CTACK-Nachricht wird in menschlichen Keratinozyten nachgewiesen, dem vorherrschenden Zelltyp in der Epidermis, und wird nach 6 h oder 18 h Zytokinbehandlung hochreguliert. Kompetitive RT-PCR-Analyse bestätigt dieses Ergebnis und zeigt eine bis zu 30-fache Induzierung der CTACK-Nachricht. Im Gegensatz dazu exprimieren andere aus der Haut stammenden Zelltypen, wie beispielsweise Melanozyten, γδ-T-Zellen und dermale Fibroblasten CTACK bei keiner der getesteten Bedingungen. Diese Experimente zeigen, daß die CTACK-Nachricht konstitutiv exprimiert wird, jedoch durch Entzündungssignale auch hochreguliert werden kann.
Die regulierte, hautspezifische Expression von CTACK macht es zu einem hervorragenden Kandidaten für selektives Rekrutieren von auf die Haut gerichteten („skin-homing") Gedächtnis-T-Zellen. Die Fähigkeit von CTACK, verschiedene T-Zelluntergruppen chemisch anzuziehen, wurde bewertet.
Umfangreiche quantitative PCR-Verfahren wurden angewendet, die zeigen, daß die Expression des menschlichen GPR2 in den vereinten Proben aus den Lungen starker Raucher und dendritischen Zellen aus Monozyten, die durch IL-4 und LPS aktiviert wurden, besonders hoch ist. Sehr hohe Mengen wurden in normalen menschlichen Lungenproben, aktivierten dendritischen Zellen, der aktivierten MOT72-Zellinie, der aktivierten der ruhenden JY-B-Zellinie, fötalen Eierstöcken, fötalem adipösen Gewebe, fötaler Gallenblase, Eosinophilen, ruhenden PBMC und anderen nachgewiesen.
Die Expression des Mauspendants scheint der in Menschen zu entsprechen.
VI. Chemotaxis
Rekombinantes CTACK aus der Maus wurde in E. coli hergestellt und von „R&D-Systems", wie zuvor für andere Chemokine beschrieben, aufgereinigt. Hedrick, et al. (1998) Blood 91:4242-4247. Menschliche Gesamt-T-Zellen in DMEM, pH 6,9, 1 bovines Serumalbumin wurden in die obere Kammer eines Polycarbonat-Transwell-Kultureinsatzes mit Poren von 3 μm (Costar) gegeben und mit den angegebenen Konzentrationen von aufgereinigtem Chemokin in der unteren Kammer für 3 h inkubiert. Die Anzahl der wandernden Zellen eines jeden Subtypus wurde durch Multi-Parameter-Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen CLA (HECA-452), CD4, CD8 und CD45RO (Pharmingen) bestimmt. Eine bekannte Anzahl von Mikrosphärenkügelchen von 15 μm (Bangs Laboratories, Fishers, IN) wurde vor der Analyse zu jeder Probe zugegeben, um die absolute Anzahl von wandernden Zellen zu bestimmen. Als ein Beispiel wanderten im Durchschnitt 6272 CLA⁺-Zellen als Reaktion auf die optimale Konzentration von CTACK verglichen mit 666 Zellen bei dem Medium allein.
Die Chemotaxis-Assays wurden mit aufgereinigten menschlichen T-Zellen aus dem peripheren Blut durchgeführt und auf die Haut gerichtete T-Zellen wurden durch ihre Expression von CLA identifiziert. Rekombinantes murines CTACK zieht sowohl CD4⁺- als auch CD8⁺-Zellen chemisch an, die CLA ko-exprimieren. Im Gegensatz dazu reagieren CLA^–-T-Zellen aus sowohl den CD4⁺- als auch den CD8⁺-Populationen nicht wesentlich auf CTACK. CLA⁺-Zellen wandern nur in Anwesenheit eines CTACK-Gradienten, was nahelegt, daß die Reaktion chemotaktisch und nicht unspezifisch chemokinetisch ist. Zum Vergleich dazu ist 6Ckine, ein bekanntes, T-Zellen chemisch anziehendes Mittel (Nagira, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:19518-19524; Hromas, et al. (1997) J. Immunol. 159:2554-2558; Hedrick und Zlotnik (1997) J. Immunol. 159:1589-1593) nicht nur ein wesentlich schwächeres Lockmittel für CLA⁺-Zellen, es fehlt ihm ferner die Spezifität für CLA⁺-Zellen, da es bevorzugt CLA^–-Zellen anzieht. Das CTACK zieht menschliche B-Zellen oder Neutrophile nicht wirksam an. Das Fehlen eines anti-Maus-CLA-Antikörpers schließt ähnliche Analysen bei der Maus aus.
Die Untergruppe der CLA⁺-Gedächtnis-T-Zellen stellt eine mit der Haut verbundene Population von Gedächtniszellen dar, die bevorzugt an normalen (Bos, et al. (1993) Arch. Dermatol. Res. 285:179-183) und chronisch entzündeten kutanen Orten (Dicker, et al. (1990) Am. J. Pathol. 136:1053-1068) extravasieren ("extravasate"). Für diese Subpopulation wurde gezeigt, daß sie an lokalen, kutanen Immunitäts- und Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Santamaria Babi, et al. (1995) Immunol. Res. 14:317-324. Es wurde vorgeschlagen, daß CLA Gedächtnis-T-Zellen über eine Wechselwirkung mit seinem vaskulären Liganden E-Selektin zu kutanen Orten leitet. Dicker, et al. (1991) Nature 349:796-799; und Berg, et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1461-1466. Neutrophile exprimieren jedoch CLA (De Boer, et al. (1994) Immunology 81:359-365), obwohl sie nicht bevorzugt zur Haut wandern. Weiterhin wird E-Selektin auf entzündetem Endothel an kutanen und nicht-kutanen Orten induziert. Daher kann die CLA/E-Selektin-Bindung das hautspezifische „Homing" von CLA⁺-Gedächtnis-T-Zellen nicht vollständig erklären. Verschiedene Chemokine werden in der Haut exprimiert (Schroder (1995) J. Invest. Dermatol. 105:20S-24S) und können eine Rolle bei der Entzündung dieses Gewebes spielen (Larsen, et al. (1995) J. Immunol. 155:2151-2157; Santamaria Babi, et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:2056-2061; Sarris, et al. (1995) [siehe Kommentare] Blood 86:651-658), jedoch werden diese Chemokine allgemein breit exprimiert (Rollins (1997) Blood 90:909-928). Wir beschreiben hier ein neues Chemokin, CTACK, das in der Haut spezifisch exprimiert wird, und auf die Haut gerichtete CLA⁺-T-Zellen selektiv chemisch anzieht. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, daß CTACK den hautsspezifischen Schlüssel darstellt, der das Rekrutieren von CLA⁺-Gedächtnis-T-Zellen zu kutanen Orten steuert, und der ein potentielles Ziel darstellt, um die Wanderung von T-Zellen zur Haut zu regulieren.
Ähnliche Assays können mit Vic aus einem Primaten oder einem Nagetier durchgeführt werden.
VII. Antikörperherstellung
Geeignete Säugetiere werden mit geeigneten Mengen an CTACK, Vic, GPR2 oder Gen-transfizierten Zellen immunisiert, zum Beispiel intraperitoneal alle 2 Wochen über 8 Wochen. Üblicherweise werden Nagetiere verwendet, obwohl andere Arten der Herstellung von selektiven und spezifischen Antikörpern Rechnung tragen sollten. Die Endimmunisierung wird durch die Schwanzvene intravenös (IV) verabreicht.
Generische polyklonale Antikörper können gesammelt werden. Alternativ können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Beispielsweise wird 4 Tage nach der IV-Injektion die Milz ent nommen und mit S22/0- und NS1-Zellen fusioniert. HAT-resistente Hybridome werden ausgewählt, zum Beispiel unter Verwendung eines von Stem Cell Technologies (Vancouver, BC) entworfenen Protokolls. Nach 10 Tagen HAT-Selektion werden resistente Foci in Platten mit 96 Vertiefungen überführt und für 3 Tage vermehrt („expanded"). Antikörperenthaltende Überstände werden analysiert, zum Beispiel durch FACS bezüglich einer Bindung an NIH3T3/Oberflächen-CTACK-Transfektanden. Üblicherweise werden viele verschiedene CTACK-mAbs gebildet. Diese Antikörper können isoliert und modifiziert werden, zum Beispiel durch Markieren oder andere Mittel, wie es im Fachgebiet Standard ist. Siehe zum Beispiel Harlow und Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Auflage) Academic Press, New York, NY. Verfahren zum Konjugieren magnetischer Reagenzien, toxischer Einheiten, Markierungen, zum Anheften der Antikörper an feste Substrate, zum Sterilfiltrieren, etc. sind im Fachgebiet bekannt.
VIII. Aufreinigung von Zellen
Auf CTACK oder Vic reagierende Zellen können unter Verwendung der hier beschriebenen Reagenzien identifiziert werden. Beispielsweise können Zellen, die in Richtung CTACK oder Vic chemisch angezogen werden, von anderen Zellen aufgereinigt werden, indem solche Zellen gesammelt werden, die sich in Richtung CTACK oder Vic bewegen. Eine derartige Chemotaxis kann in Richtung einer Quelle eines Chemokins erfolgen, oder kann über eine poröse Membran oder andere Substrate erfolgen. Siehe oben bei dem Mikrochemotaxis-Assay.
Eine Analyse von menschlichen Proben kann auf eine ähnliche Weise bewertet werden. Eine biologische Probe, zum Beispiel Blut, Gewebsbiopsieprobem Lungen- oder Nasalspülung, Hautpunktion wird von einem Individuum erhalten, das unter einer haut bezogenen. Störung leidet. Eine Analyse von auf CTACK oder Vic reagierenden Zellen -wird durchgeführt, beispielsweise durch FACS-Analyse oder ähnliche Mittel.
IX. Antagonisten
Verschiedene Antagonisten des CTACK oder Vic werden verfügbar gemacht. Beispielsweise können Antikörper gegen das Chemokin selber die Bindung eines Liganden an seinen Rezeptor blokkieren, und dabei als ein direkter Rezeptorantagonist dienen. Andere Antagonisten können durch Blockieren der Bindung des Liganden an den Rezeptor wirken, zum Beispiel durch Binden an den Liganden auf eine Weise, welche die Möglichkeit einer Bindung an den Rezeptor ausschließt. Andere Antagonisten, zum Beispiel Mutein-Antagonisten, können an den Rezeptor binden, ohne daß ein Signalisieren ausgelöst wird, wodurch eine Bindung des wirklichen Agonisten blockiert wird. Viele von diesen können dazu dienen, das Signal zu blockieren, das an Zielzellen, insbesondere an auf CTACK oder Vic reagierende Zellen übermittelt wird. Diese können Hautzellen sein, einschließlich Langerhans-Zellen, Fibroblasten oder Keratinozyten. Insbesondere legt die Paarbildung mit dem Rezeptor nahe, daß bestimmte Antikörper gegen mit dem Liganden wechselwirkende Epitope des GPR2-Rezeptors die Ligandenbindung blockieren sollten.
Informationen hinsichtlich der Bedeutung ("criticality") bestimmter Reste werden unter Verwendung von Standardverfahren und Standardanalysen bestimmt. Eine Standardmutagenese-Analyse wird zum. Beispiel durch Erzeugen vieler verschiedener Varianten an bestimmten Positionen, beispielsweise an den oben bestimmten Positionen, und durch Auswerten der biologischen Aktivitäten der Varianten durchgeführt. Dies kann in dem Ausmaß ausgeführt werden, daß Positionen bestimmt werden, welche die Aktivität modifizieren, oder durch Fokussierung auf spezifische Positionen, um die Reste zu bestimmen, die ausgetauscht werden können, um entweder die biologische Aktivität zu erhalten, zu blockieren oder zu modulieren.
Alternativ kann eine Analyse von natürlichen Varianten andeuten, welche Positionen natürliche Mutationen tolerieren. Dies kann durch Populationsanalysen der Variation zwischen Individuen oder über Stämme oder Arten erfolgen. Proben von ausgewählten Individuen werden analysiert, zum Beispiel durch PCR-Analyse und Sequenzierung. Dies erlaubt eine Bewertung von Populationspolymorphismen. Sequenzprotokoll

Sequenzprotokoll als Anhang

Claims

Verwendung eines Antikörperantagonisten eines kutanen T-Zell-anziehenden Chemokins für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Hautentzündung in einem Säugetier.
Verwendung eines Antikörperantagonisten des vasoaktiven intestinalen Kontraktors für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Hautentzündung in einem Säugetier.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Zusammensetzung eine Zusammensetzung für lokale, topische, subkutane, intradermale oder transdermale Verabreichung ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei welcher der Antagonist ausgewählt wird aus: i) einem Antikörper, der ein kutanes T-Zell-anziehendes Chemokin oder einen vasoaktiven intestinalen Kontraktor neutralisiert, oder ii) einem Antikörper, der die GPR2-Ligandenbindung blockiert.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der das Säugetier ein Transplantat oder ein Hauttransplantat erhält.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei welcher der Antagonist in Verbindung mit einem Antibiotikum, Anal getikum, immunsuppressiven Therapeutikum, entzündungshemmenden Wirkstoff, Wachstumsfaktor oder Immunadjuvans verabreicht wird.
In vitro-Verfahren zum Herstellen eines Ligand:Rezeptor-Komplexes, welches das Inkontaktbringen a) eines kutanen T-Zell-anziehenden Chemokins aus einem Säugetier mit einem GPR2-Rezeptor, oder b) eines vasoaktiven intestinalen Kontraktors aus einem Säugetier mit einem GPR2-Rezeptor umfaßt, wobei zumindest der Ligand oder der Rezeptor rekombinant oder gereinigt ist, wodurch es dem Komplex ermöglicht wird, sich zu bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem a) der Komplex zu einem Ca⁺⁺-Fluß führt, b) der GPR2-Rezeptor auf einer Zelle vorliegt, c) die Komplexbildung zu einer physiologischen Veränderung in der Zelle führt, die den GPR2-Rezeptor exprimiert, d) das Inkontaktbringen in Verbindung mit IL-2 und/oder Interferon-α erfolgt, oder e) das Inkontaktbringen einen quantitativen Nachweis des Liganden ermöglicht.
Verfahren zum Testen einer Verbindung auf ihre Fähigkeit, die GPR2-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung zu beeinflussen, wobei das Verfahren das Vergleichen der Wechselwirkung des GPR2 mit einem vasoaktiven intestinalen Kontraktor oder einem kutanen T-Zell-anziehenden Chemokin in der Gegenwart oder der Abwesenheit der Verbindung umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, bei dem die Verbindung ein Antikörper gegen GPR2, gegen einen vasoaktiven intestinalen Kontraktor oder gegen ein kutanes T-Zell-anziehendes Chemokin ist.
Verfahren zum Identifizieren einer Zelle, die einen Rezeptor für ein kutanes T-Zell-anziehendes Chemokin oder einen vasoaktiven intestinalen Kontraktor exprimiert, das es einer Zelle ermöglicht, in Richtung eines kutanen T-Zell-anziehenden Chemokins oder eines vasoaktiven intestinalen Kontraktors zu wandern, wobei die Zelle als den Rezeptor exprimierend identifiziert wird, wenn sie wanderte.