DE3688333T2

DE3688333T2 - Antikörper gegen Polypeptide, die gegen Peptide oder Proteine mit mindestens teilweise bekannter Aminosäure oder kodierender Nukleotidsequenz komplementär sind und diesbezügliches Aufbauverfahren.

Info

Publication number: DE3688333T2
Application number: DE89106162T
Authority: DE
Inventors: Edwin J Blalock; Kenneth L Bost; Eric M Smith
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1985-03-01
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2006-02-25
Also published as: DE3688333D1; DE3679017D1; ES8800266A1; NO174971B; GR860576B; IE860527L; EP0332225B1; NO864369L; BR8606615A; NO174971C; ATE88572T1; DK521386D0; US5077195A; EP0214232B1; EP0332225A2; AU592781B2; IE58837B1; ES557188A0; KR870700100A; ES557189A0

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren für die Bestimmung der Struktur von Polypeptiden mit spezieller struktureller und biologischer Wirksamkeit und Affinität, und insbesondere auf Antikörper zu den Polypeptiden.
Die systematische Konzeption von pharmazeutischen Mittel hat derzeit einen Stand erreicht, an dem Arzneimittel-Pharmakologen oft die Wirksamkeit eines bestimmten pharmakologischen Mittels aus der Kenntnis über dessen Struktur/Funktionsaktivität auf chemischer Basis vorhersagen können. Dieses Wissen ist insbesondere bei der Konzeption von neuen pharmakologischen Mittel nützlich, die strukturell mit einer Mutterverbindung zusammenhängen, jedoch neue pharmakologische Eigenschaften oder Wirkungen aufweisen.
Zum Beispiel wurde auf dem Gebiet der Biochemie und Konzeption von Steroiden die Struktur von verschiedenen Steroiden in vielfältiger Weise verändert, um eine bessere oder spezifische Wirksamkeit zu erzielen. Ein weiteres Beispiel für die systematische Konzeption von Arzneimittel ist die Arzneimittelchemie von synthetischen Penicillinen: es werden nun synthetische Penicilline konzipiert, die eine Reihe von Wirkungen zeigen, die nicht-synthetische Penicilline nicht aufweisen. Zu diesen Verbesserungen zählt, daß dem Produkt orale Wirkung, Breitspektrum-Wirkung und Wirksamkeit gegen Penicillinase-erzeugende Bakterien verliehen wurden.
Über die Struktur/Funktionswirkung von makromolekularen Strukturen wie beispielsweise Proteine ist jedoch relativ wenig bekannt. Während zum Beispiel bekannt ist, daß Antikörper sich an Antigene binden, weiß man über die zugrundeliegenden Wechselwirkungen nur unvollständig Bescheid. Noch weniger ist über den zugrundeliegenden Mechanismus der Reaktion auf eine antigene Eignung, ein Protein in form eines Antikörpers zu erzeugen, der in der Lage ist, ein Antigen zu binden, bekannt.
Gleichermaßen ist auch die Wechselwirkung zwischen Peptidhormonen und ihren Hormonrezeptoren nur unzulänglich bekannt. Es ist bekannt, daß sowohl hinsichtlich der Bindungsaffinität des Peptidhormons zu seinem Rezeptor wie auch bei der intrinsischen Wirksamkeit dieses gebundenen Hormons, den Rezeptor zu "stimulieren", Hormone eine Rolle spielen. Basierend auf bekannten Struktur/Funktions-Verhältnissen von Nicht-Protein-Hormonen wurde postuliert, daß die Bindungsaktivität und die intrinsische Stimulationsaktivität getrennte strukturelle Faktoren betreffen. Es scheint, daß bestimmte chemische Strukturen die Ligandenbindung, beispielsweise eines Hormons, an seinen Rezeptor bewirken. Andere chemische Strukturen scheinen jedoch die "Stimulation" des Rezeptors zu bewirken, sobald das Hormon daran gebunden ist.
Agenzien, die Bindungsaktivität, jedoch keine intrinsische Stimulationswirkung aufweisen, sind als "Blocker" oder Antagonisten bekannt, da sie die Wirkung von echten Hormonen hemmen. Ein Beispiel eines solchen Blockermittels ist Isoproterenol, ein gut bekannter Katecholamin- Beta-Blocker, der basierend auf einer gewissen Kenntnis über das Struktur/Funktionsverhältnis von Katecholamin mit seinen Rezeptoren konzipiert wurde. Agonisten, die hormonelle Rezeptoren sowohl binden wie auch aktivieren, wurden in ähnlicher Weise hergestellt. Für Polypeptidhormone sind keine dieser Struktur/Funktionsverhältnisse vollumfänglich bekannt. Daher gibt es derzeit keine Möglichkeit für eine exakte, systematische Konzeption eines Polypeptids, das in der Lage ist, spezifisch mit einem bestimmten Proteinhormon-Rezeptor oder mit einem bestimmten Polypeptidhormon zu intereagieren.
Alle Organismen mit einem intakten Immunsystem verfügen über die biologische Fähigkeit, eine Klasse von sehr spezialisierten Proteinen zu erzeugen, die als Immunoglobuline bekannt sind. Immunoglobuline werden von spezialisierten Zellen eines immunokompetenten Organismus als Reaktion auf das Vorhandensein eines Fremdmoleküls in diesem Organismus produziert. Diese Fremdmoleküle werden allgemein als Antigene bezeichnet. Antigene werden in der Praxis als Moleküle definiert, die in der Lage sind, die Bildung eines komplementären Antikörpers in einem bestimmten Organismus auszulösen. Somit wird ein spezifischer Antikörper gebildet, der in der Lage ist, das Antigen zu binden, das seine Bildung anregte. Die biologische Funktion eines spezifischen Antikörpers liegt darin, ein fremdantigen zu binden und dadurch dessen Inaktivierung zu bewirken.
Wissenschaftlern ist es gelungen, durch Manipulation des Immunsystems verschiedener Organismen eine große Anzahl von Antikörpern herzustellen, die sich sowohl in der therapeutischen wie auch in der diagnostischen Medizin als nützlich erwiesen. Durch die Einführung der Hybridomtechnik ist die Wissenschaft seit kurzem in der Lage, monoklonale Antikörper herzustellen, die sich mit Spezifität an eine ausgewählte Molekularstruktur, die sogenannte Determinante, binden. Der Nutzen dieser spezifischen Antikörper ist enorm und reicht von den kürzlich durchgeführten klinischen Versuchen, aufgrund derer eine wesentliche Rolle in der Krebsbekämpfung zu erwarten ist, bis zu klinischen Routine- Anwendungen zur Erkennung zahlreicher Krankheitszustände durch Blutuntersuchungen.
Eine sehr interessante, jedoch weitgehend theoretische Anwendung der Antikörper-Technologie liegt im Bereich der anti-idiotypischen Antikörper. Ein anti-idiotypischer Antikörper ist ein zweiter Antikörper mit Bindungsfähigkeit für die idiotype oder Bindungsstelle eines ersten Antikörpers. Ein solcher anti-idiotypischer Antikörper zeigt die gleichen Eigenschaften wie das Antigen, an das sich der erste Antikörper bindet. Erzeugt man zum Beispiel Antikörper gegen Insulin und anschließend antiidiotypische Antikörper, die sich gegen die Anti-Insulin-Antikörper richten, weist ein (idiotypischer) Teil der anti-idiotypischen Antikörper Insulin-ähnliche Eigenschaften auf. Diese Erkenntnis macht die Theorie glaubwürdig, daß die Bindungsstelle eines Antikörpers ein dreidimensionales Negativbild des Antigens ist und daß ein anti-idiotypischer Antikörper zu einem ersten Antikörper somit ein Positivbild des ursprünglichen Antigens ist. Aus dieser Beobachtung läßt sich schließen, daß, falls diese interaktiven Strukturen konzipiert und hergestellt werden könnten, eine ganze Reihe von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise Polypeptidhormone oder deren Rezeptoren, entwickelt werden könnten, die ein breites Spektrum neuer und nutzbringender Wirkungen aufweisen.
Obwohl die Antikörper-Technologie rasche Fortschritte verzeichnet, stößt sie doch auf grundsätzliche technologische Grenzen. Wissenschaft und Medizin sind beispielsweise nach wie vor auf Antikörper-produzierende Zellen angewiesen, um Antikörper zu erzeugen. Deshalb können Wissenschaftler die Antikörper-Produktion nicht direkt kontrollieren. Eine solche direkte Kontrolle wäre ein sehr wesentlicher Vorteil. Sie würde beispielsweise die Möglichkeit eröffnen, synthetische "Antikörper", herzustellen, die nicht einfach nur mit einem ausgewählten Molekül intereagieren oder sich daran binden, sondern mit einem vorbestimmten Teil dieses Moleküls. Der zugrundeliegende Ablauf dieser Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und dem Antigen ist nach wie vor nur unvollständig bekannt.
Aus der vorhergehenden Diskussion wird klar, daß Antikörperproduzierende Zellen über einen Mechanismus verfügen, die chemische Struktur eines Antigens festzustellen und eine komplementäre chemische Struktur in form eines Antikörpers zu erzeugen. Diese Komplementarität führt zur Bindungsfähigkeit an die antigene Struktur. Um eine Proteinstruktur zu konzipieren oder zu konstruieren, die komplementär zu einer anderen Proteinstruktur und somit in der Lage ist, sich mit dieser anderen Proteinstruktur zu verbinden, war es vor Einführung dieser Erfindung erforderlich, die chemische Wechselwirkung, die diesem Bindungsphänomen zugrundeliegt, zu kennen.
Alle Proteine oder Peptide sind in erster Linie Polymere von monomerischen Aminosäureeinheiten. Im großen und ganzen gibt es zwanzig verschiedene Aminosäuren, wobei jede eine andere chemische Struktur und somit unterschiedliche chemische und physikalische Eigenschaften aufweist.
Zum Beispiel sind einige Aminosäuren an sich eher hydrophob, wohingegen andere eher hydrophil sind. Desgleichen ziehen einige Aminosäuren bestimmte andere Aminosäuren an, während sie andere Aminosäuren wieder abstoßen. Infolgedessen kommt in einem bestimmten Protein durch die einzelnen Aminosäuren dieses Proteins eine Vielfalt von sowohl anziehenden wie auch abstoßenden Kräften vor. Zusätzlich zu diesen interaktiven Kräften zwischen den Aminosäuren eines bestimmten Proteins gibt es auch interaktive Kräfte zwischen den Aminosäuren und der Umgebung. Diese Kräfte hängen davon ab, ob sich das Protein beispielsweise in einer wäßrigen oder hydrophilen Umgebung oder in einer nicht-wäßrigen oder hydrophoben Umgebung befindet.
Die durch die Aminosäuren eines bestimmten Proteins bewirkten interaktiven Kräfte stellen einen wesentlichen Faktor bei der Bestimmung der dreidimensionalen, oder "ternaren" Struktur dieses Proteins dar. Deshalb binden bestimmte Bereiche innerhalb des Proteins bestimmte andere Bereiche des gleichen Proteins oder ziehen diese an, wohingegen andere Bereiche bestimmte andere Bereiche innerhalb des Proteins abstoßen können. Das Endergebnis liegt darin, jedem Protein eine charakteristische Form und somit seine funktionelle Wirksamkeit zu verleihen.
Kürzlich wurden Mittel entwickelt, Aminosäuren Hydropathie-bezüglich zu charakterisieren, was die relative Hydrophilie und Hydrophobizität widerspiegelt (Kyte et al, (1982) J. Molec. Biol. Bd. 157, S. 105-132). Darin wurde eine Hydropathie-Skala abgeleitet, in der die hydrophilen und hydrophoben Eigenschaften aller zwanzig Aminosäure-Ketten berücksichtigt wurden. Es wurde ein Computerprogramm verwendet, um die durchschnittliche Hydropathie innerhalb einer Polypeptidsequenz mit vorbestimmter Länge kontinuierlich zu bestimmen. Diese Studie zeigt auf, daß Proteine sehr deutliche Bereiche von Hydrophobizität und Hydrophilie aufweisen und daß - selbstverständlich zusätzlich - die intermolekulare Wechselwirkung mit der internen Disulfid-Bindung dieser Bereiche auf die dreidimensionale Struktur der Proteine zurückzuführen ist.
In einer noch jüngeren Untersuchung wird vorgebracht, daß amphiphile Proteinstrukturen, das heißt Proteinstrukturen, die sowohl hydrophile wie auch hydrophobe Aminosäuren und Bereiche umfassen, eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Aktivität der Proteinhormone und ihrer Rezeptoren spielen (Kaiser et al (1984) Science Bd. 223, S. 249-255). In dieser Untersuchung wird des weiteren vorgebracht, daß amphiphile Strukturen in Hormonrezeptoren zum Beispiel als Spiegelbild der amphiphilischen Strukturen in den Hormonen selbst komplementär sein könnten. Deshalb könnte die Wechselwirkung zwischen einem Hormon und seinem Rezeptor durch eine spezifische Wechselwirkung zwischen der amphiphilischen Struktur des Hormons und einer komplementären amphiphilischen Struktur des Rezeptors herbeigeführt werden. Eine Methode, wie man diese Vorstellung veranschaulichen kann, ist, sich ein Schloß mit dem passenden Schlüssel vorzustellen, wobei das Schloß die amphiphile Struktur des Rezeptors und der Schlüssel die komplementäre amphiphilische Struktur des Hormonagens darstellt.
Demgemäß wäre ein Mittel für die systematische Konzeption von Polypeptiden, die in der Lage sind, bekannte Peptide, Proteine oder proteinische Rezeptoren zu binden oder in Wechselwirkung mit ihnen zu treten, sehr nützlich. Beispielsweise müßten praktische Kenntnisse über den Aufbau von Rezeptor-interaktiven Strukturen von proteinischen Hormonen zur Entwicklung von ganz neuen Klassen von synthetischen Hormonen mit größerer Spezifizität der Wirksamkeit führen. Umgekehrt könnte man Polypeptide konzipieren und herstellen, die komplementär zu bekannten proteinischen Hormonen und deshalb in der Lage sind, diese Hormone zu binden. Diese konzipierten Polypeptide könnten beispielsweise dazu verwendet werden, das komplementäre Hormon zu inaktivieren.
Desgleichen könnte die Kenntnis über den Protein- oder Peptid-Aufbau für viele Bereiche der wissenschaftlichen Forschung sehr bedeutsam sein. Wenn zum Beispiel ein synthetisches Polypeptid, das komplementär zu einem Proteinhormon ist, strukturell analog zum biologischen Rezeptor für dieses Hormon ist, müßte ein gegen das komplementäre Protein gerichteter Antikörper auch den echten Hormonrezeptor binden. Solche Antikörper wären bei der Untersuchung und Isolierung von spezifischen Hormonrezeptoren oder Teilen davon sehr nützlich, da sie dadurch zu einem noch besseren Verständnis der Hormon-Rezeptor-Wechselwirkungen führen würden. Zusätzlich wäre ein synthetisches Protein oder Peptid, das zu einem bestimmten Protein komplementär ist, bei der Kristallisierung dieses Proteins sehr nützlich, wenn man beispielsweise die Proteinstruktur mittels Röntgenkristallographie analysieren will. Des weiteren könnten Entgiftungs-Polypeptide konzipiert werden, die paßgenau und spezifisch an giftige Peptide, welche in der Natur vorkommen und gelegentlich mit der Nahrung aufgenommen werden, binden.
Die vorgängig erwähnten Erläuterungen sind nur einige der zahlreichen möglichen Anwendungen, die dank der Fähigkeiten von synthetischen Proteinen oder Peptiden realisierbar wären. Die Möglichkeit einer systematischen Konzeption eines Polypeptids, das mit bekannten Proteinen in Wechselwirkung tritt oder es bindet, bei der die Konzeption auf strukturellen Erwägungen des bekannten Proteins beruht, würde eindeutig einen wissenschaftlichen Durchbruch mit großer Tragweite auf dem Gebiet der Peptid- und/oder chemischen und medizinischen Pharmakologie bedeuten.
Zur Klarstellung und Übereinstimmung werden die folgenden Begriffe entsprechend ihrer hier gültigen allgemeinen Bedeutung definiert.
Der Ausdruck antiparallel in Zusammenhang mit Nucleinsäure-Paarung gibt die Richtung bezogen auf die gepaarten Nucleinsäuren an. Die ursprüngliche Nucleinsäure kann in Richtung von 5' zu 3' vorkommen, wobei 5' und 3' sich auf die Position an den Zucker-Anteilen bei der Nucleotidkopplung beziehen. Der zweite Nucleinsäurestrang, der basengepaart oder komplementär zum ursprünglichen Nucleinsäurestrang ist, liegt in Richtung von 3' zu 5', wenn er linear mit dem ursprünglichen Strang mit Richtungssinn von 5' zu 3' gerichtet ist.
Die codierende Nucleinsäure enthält die Sequenz der Nucleotidtripletten (Codone), die die Sequenz von Aminosäuren spezifiziert, wenn sie von 5' in Richtung 3' gelesen wird. Die nichtcodierende (komplementäre) Nucleinsäure (oder Nucleinsäurestrang) ist komplementär zur codierenden Nucleinsäure (oder Nucleinsäurestrang), wobei diese Stränge in antiparalleler Richtung liegen oder basenpaaren.
Der Ausdruck hydropathische Komplementarität im Zusammenhang mit einer hydropathischen Marke (ein relatives Maß für die Hydrophilie und Hydrophobizität) von Aminosäuren zeigt eine niedrige Hydrophatie im Vergleich zu einer hohen Hydropathie und umgekehrt an.
Wird auf Aminosäuren umfassende Strukturen Bezug genommen, so spricht man im allgemeinen von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, wobei diese Reihenfolge die Größenzunahme beispielsweise zwischen Dipeptiden, Oligopeptiden und Proteinen anzeigt, die viele Hunderte Aminosäuren enthalten.
Der Ausdruck komplementär oder Komplement wird hier in seiner anwendungsgemäßen Bedeutung verwendet. Beispielsweise sind komplementäre Basen oder Nucleotide jene, die typischerweise Wasserstoffbindungen (G-C und A-T oder A-U) bilden; komplementäre Codone, Nucleinsäuren oder deren Stränge sind wasserstoffgebundene Polynucleotid-Komponenten eines doppelten Nucleinsäurestranges wie beispielsweise der einer klassisch definierten Doppelhelix; komplementäre Aminosäuren, die normalerweise hydropathische Komplementarität haben, sind jene, die von den Gliedern eines komplementären Codonen-Paares gerichtet werden.
Komplementäre Peptide oder Polypeptide und ihre entsprechenden ursprünglichen Peptide oder Proteine sind ein Peptiden-Paar, das von den komplementären Nucleotid- oder Aminosäurensequenzen gerichtet wird und weisen typischerweise eine Bindungsaffinität zwischen den Gliedern eines Paares auf. Polypeptide, die zu einem Peptid oder zumindest einem Teil eines Proteins komplementär sind, weisen beispielsweise eine Bindungsaffinität zum Peptid- oder Proteinteil auf. Obgleich die Peptid- Bindungsaffinitäten nur unvollständig bekannt sind, lassen sie sich, zumindest teilweise, durch die von Kaiser et al (Science (1984) Bd. 223 S. 249-255) beschriebene amphiphilische Sekundärstruktur erklären.
Ein Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wurde bisher noch nicht gefunden.
Gemäß unserer europäischen Haupt-Patentanmeldung 86901662.6 (EP 214232-B), wird ein solches Verfahren für die Bestimmung der Aminosäurensequenz eines Polypeptids zur Verfügung gestellt, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte:
(a) Bestimmen einer ersten Nucleotidsequenz einer ersten Nucleinsäure, wobei die erste Nucleotidsequenz für eine Aminosäuresequenz wenigstens eines Teiles des ursprünglichen Peptids oder Proteins codiert;
(b) Ermitteln einer zweiten Nucleotidsequenz einer zweiten Nucleinsäure, die mit der ersten Nucleotidsequenz der ersten Nucleinsäure basenpaart, wobei die erste und die zweite Nucleinsäure sich in antiparalleler Richtung paaren; und
(c) Bestimmen der Aminosäuresequenz des komplementären Polypeptids durch Auffinden der durch die zweite Nucleotidsequenz codierten Aminosäuresequenz bei Lesen von 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' und im gleichen Leserahmen wie die erste Nucleotidsequenz, wobei die Aminosäuresequenz vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus oder vom Carboxy- Terminus zum Amino-Terminus orientiert ist.
Die gegenständliche Erfindung stellt nun Antikörper zu diesen Polypeptiden zur Verfügung. Somit stellt diese Erfindung gemäß einem Aspekt einen Antikörper zu einem Polypeptid zur Verfügung, wobei dieses Polypeptid:
a) Sequenzposition um Sequenzposition zu einem ursprünglichen Peptidliganden komplementär ist, wenn es in bezug auf den ursprünglichen Peptidliganden entweder vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus, oder vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus orientiert ist;
b) durch einen DNS-Strang codiert ist, der zu einem Teil eines DNS-Strangs komplementär ist, der den ursprünglichen Peptidliganden, gemäß der Definition durch die komplementären DNS-Codone, oder die zweite Base der komplementären Codone, für jeden Strang, der in antiparalleler Richtung basenpaart, codiert, wobei das Lesen jeweils entweder von 3' in Richtung 5' oder von 5' in Richtung 3' im gleichen Leserahmen wie dem Leserahmen für die den ursprünglichen Peptidliganden codierenden DNS-Codone erfolgt, und
c) eine Bindungsaffinität zu einem Teil des ursprünglichen Peptidliganden hat, und wobei dieser Antikörper dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine Affinität zu einer Rezeptorstelle hat, bei der der Peptidligand seine hormonalen Wirkungen bindet und überträgt.
Weitere Aspekte der gegenständlichen Erfindung werden zur Verfügung gestellt und der Leser sei auf die Patentansprüche dieser Patentschrift verwiesen.
Das komplementäre Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz bestimmt wurde, kann mittels verschiedener Methoden gewonnen werden, beispielsweise durch chemische Synthese, Derivatisierung aus einem Protein oder einem größerem Polypeptid, das diese Aminosäuresequenz enthält, oder, wenn die zweite Nucleinsäure eine DNA ist, durch Einsetzen der zweiten Nucleotidsequenz in ein Plasmid zur Bildung eines rekombinanten DNA- Plasmidvektors, wodurch ein einzelliger Organismus umgewandelt wird, um einen transformanten einzelligen Organismus zu erzeugen, der dieses komplementäre Polypeptid biosynthetisiert.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen den hydropathischen Marken von Aminosäuren, die durch einen Nucleotidstrang spezifiziert sind, welcher die Codier-Information enthält und dem antiparallelen, basengepaarten, komplementären oder nichtcodierenden Nucleotidstrang. Der Tripletten-Nucleotidcode jedes Stranges wurde von 5' in Richtung 3' gelesen. Die hydropathischen Marken der codierten Aminosäuren werden gegen die durchschnittlichen hydropathischen Marken der komplementär codierten Aminosäuren geplottet.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen hydropathischen Marken von Aminosäuren, die durch einen codierenden Nucleotidstrang codiert sind und dem antiparallelen, basengepaarten, nichtcodierenden Nucleotidstrang. Der Tripletten-Nucleotidcode des codierten Stranges wurde von 5' in Richtung 3' gelesen, der des nichtcodierenden Stranges hingegen von 3' in Richtung 5'. Die hydropathischen Marken der codierten Aminosäuren werden gegen die hydropathischen Marken der komplementär codierten Aminosäuren geplottet.
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung der Bindung von freien ACTH an mit HTCA (einem komplementären Peptid zu ACTH) oder Insulin überzogenen Mikrotiterquellen. Das gebundene ACTH wurde mittels enzymverbundener Immunabsorptionsbestimmung gemessen.
Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der Bindung von ACTH an Mikrotiterquellen, die jeweils mit HTCA (3,7 nmol/Quelle) überzogen sind. Jede ACTH-Beimengung enthielt 3,7 nmol lösliches ACTH und wurde mit den in der Abszisse bezeichneten Mengen an löslichen HTCA vorvermischt. Das gebundene ACTH wurde mittels enzymverbundener Immunabsorptionsbestimmung gemessen und das freie ACTH aus dem Unterschied zwischen dem gesamten ACTH und dem gebundenen ACTH errechnet.
Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Bindung eines Antikörpers für HTCA (Anti-HTCA) an fixierte Mäuse-Nebennierenzellen (V-I) und die Hemmung dieser Bindung durch ACTH.
Fig. 6 ist eine graphische Darstellung des Elutionsmittels von der Gelchromatographie von Mäuse-Nebennierenzellenkomponenten (Y-1), die vorher an Anti-HTCA banden.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Bindung von Gamma-(γ) Endorphin von verschiedenen Mengen, die Mikrotiterquellen beigemengt wurden, welche überzogen waren mit: einem Peptid (Gamma-Odne), codiert durch den zu Rinder-Gamma-Endorphin komplementären Nucleotidstrang, 40 ug/Quelle; Insulin, 20 Einheiten/Quelle; oder Rinderserumalbumin (BSA), 200 ug/Quelle.
Fig. 8 zeigt Nucleotid- und Aminosäuresequenzen für den Epidermiswachstumsfaktor (EGF), EGF-Rezeptor. Die zur Nucleotidsequenz für den EGF-Rezeptor komplementäre Nucleotidsequenz und die durch die komplementäre Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz, wenn sie von 3' in Richtung 5' gelesen wird, sind ebenfalls dargestellt. Bei den Sequenzen des EGF und EGF-Rezeptors stellen die Positionen mit niedrigeren Nummern die 5' Nucleotid-Richtung und die endständige Aminosäure-Richtung dar. Bei den Sequenzen der komplementären Meldung an den EGF-Rezeptor stellen die Positionen mit niedrigeren Nummern die 3' Nucleotid-Richtung und die endständige Aminosäure-Richtung dar. Homologe Sequenzen sind eingerahmt.
Fig. 9A und 9B zeigen bestimmte Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von: Peptidhormonen [EGF, Interleukin-2 (IL-2) und Transferrin (TF)]; Peptidhormonrezeptoren [EGF-Rezeptor, IL-2 Rezeptor und TF Rezeptor]; und komplementäre Meldung an die Rezeptoren. Bei den Peptidhormon- und Rezeptorsequenzen stellen die Positionen mit den niedrigeren Nummern die 5' Nucleotid-Richtung und die endständige Aminosäure-Richtung dar. Bei den Sequenzen der komplementären Meldung stellen die Positionen mit den niedrigeren Nummern die 3' Nucleotid-richtung und die endständige Aminosäure-Richtung dar. Das komplementäre Nucleotid wurde von 3' in Richtung 5' gelesen, um die entsprechende Aminosäuresequenz zu erzeugen.
Die Wechselwirkung von biologisch signifikanten Molekülen bildet die Grundlage für die interzellulare und interorganische Nachrichtenübermittlung. Wenn die speziellen, biologisch signifikanten Übermittlermoleküle beispielsweise Peptidhormone und die entsprechenden Peptid-enthaltenden zelluläre Rezeptoren sind, wurde seit langem die Ursache und eine rationale Erklärung für ihre kommunikative Wechselwirkung gesucht.
Es wurde eine früher nicht bemerkte, fundamentale Beziehung entdeckt, wie hier beschrieben, nämlich die Beziehung, die zwischen den antiparallelen, basenpaarenden Strängen von Nucleinsäuren gegeben ist. In einer Hinsicht kann diese Beziehung zu Peptidpaaren führen, bei denen jedes Glied eines bestimmten Paares eine Affinität zu dem anderen Glied aufweist. Die grundlegende Beziehung wird in Tabelle 1 veranschaulicht, in der verschiedene Codone und deren komplementäre (d. h. basenpaarende) Codone dargestellt sind. Die Codone eines codierenden Stranges (d. h. jenes Stranges, der die codierende Information für eine Aminosäuresequenz enthält) werden so dargestellt, wie sie von links nach rechts (von 5' in Richtung 3') gelesen werden. Die Codone des komplementären (d. h. nichtcodierenden) antiparallen, basengepaarten Stranges werden ebenfalls von 5' in Richtung 3' gelesen. Nichtcodierende und codierende Nucleinsäurestränge paaren, wenn sie in antiparalleler Richtung (d. h. der codierende Strang von links nach rechts ist von 5' zu 3' und der nichtcodierende Strang von links nach rechts ist von 3' zu 5') liegen, so daß die gepaarten Codone so gesehen werden, daß sie in entgegengesetzter Richtung (d. h. links nach rechts vgl. mit rechts nach links) liegen, wenn sie von 5' in Richtung 3' gelesen werden. Die in Tabelle 1 angeführten Codone sind, wie von Kyte et al definiert, Hydropathie-bezogen gruppiert. Diese spezifische Gruppierung wird nur aus Gründen der Anschaulichkeit verwendet und darf nicht als Einschränkung des Umfangs dieses Patentes aufgefaßt werden. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigen die komplementären Codone, die mit Codonen für hydrophobe (hohe Hydropathie) Aminosäuren paaren eine Tendenz, hydrophile (niedrige Hydropathie) Aminosäuren zu codieren. Die umgekehrte Situation wird mit Codonen der hydrophilen Aminosäuren dargelegt. Für geringfügig hydrophile Aminosäuren (geringfügige negative Hydropathie) werden ähnliche Aminosäuren durch die komplementären Codone codiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 graphisch dargestellt. Wie im nachfolgenden beschrieben, ist diese Beziehung von erheblicher biologischer Bedeutung. TABELLE 1 AMINOSÄUREN, DEREN CODONE KOMPLEMENTÄR SIND ZU JENEN VON: Codierender Strang Nichtcodierender Strang Codon Aminosäure (1) hydrophobe Aminosäuren Isoleucin Aspargin Asparaginsäure Tyrosin Valin Histidin Leucin Lysin Glutaminsäure Glutamin Phenylalanin Cystein Threonin Alanin Methionin Alanin Arginin Serin Glycin Cystin TABELLE 1 (Fortsetzung) Codierender Strang Nichtcodierender Strang Codon Aminosäure (2) hydrophile Aminosäuren Arginin Alanin Threonin Serin Prolin Lysin Leucin Phenylalanin Asparagin Isoleucin Valin Asparaginsäure Glutamin Glutaminsäure Histidin Methionin TABELLE 1 (Fortsetzung) Codierender Strang Nichtcodierender Strang Codon Aminosäure (3) geringfügig hydrophile Aminosäuren Glycin Threonin Serin Prolin Alanin Threonin Glycin Arginin Cystein Thryptophan Serin Tyrosin Isoleucin Valin Prolin Tryptophan
Die gepaarten Codone (Nucleotid-Tripletten) in Tabelle 1 ergeben sich aus dem Vergleich zwischen hypothetisch codierenden Nucleinsäuresträngen (in diesem Fall RNA) und nichtcodierenden Nucleinsäuresträngen (RNA in antiparalleler Richtung gepaart). Beide Stränge wurden dann im gleichen Leserahmen von 5' in Richtung 3' gelesen, um die ursprünglichen Codone und ihre komplementären (basengepaarte) Codone zu erhalten.
Von den möglichen 20 komplementären Codonen für die hydrophoben Aminosäure-codierenden Codone codierten nur zwei (GCA und UCG) für hydrophobe Aminosäuren. Von den möglichen 18 komplementären Codonen für hydrophile Aminosäure-codierende Codone codierten 13 für hydrophobe Aminosäuren und 5 codierten für geringfügig hydrophile Aminosäuren.
Von den möglichen 20 Codonen, die komplementär zu den für geringfügig hydrophile Aminosäure codierenden Codonen sind, codierten 10 für geringfügig hydrophobe Aminosäuren, 5 codierten für stark hydrophile Aminosäuren und 5 codierten für stark hydrophobe Aminosäuren, so daß die Nettowirkung nur eine geringe Änderung der hydropathischen Eigenschaft ergibt.
In Tabelle 2 sind die codierten Aminosäuren und deren entsprechende komplementär codierten Aminosäuren aus Tabelle 1 aufgelistet und beinhaltet ihre hydropathischen Marken (Kyte et al, 1982). TABELLE 2 HYDROPATHISCHE MARKEN VON AMINOSÄUREN UND DEREN KOMPLEMENTEN GEMÄß TABELLE 1 AMINOSÄUREN MARKE KOMPLEMENTE DURCHSCHNITTL. MARKEN MARKE TABELLE 2 (Fortsetzung) AMINOSÄUREN MARKE KOMPLEMENTE DURCHSCHNITTL. MARKEN MARKE
Wie in Tabelle 2 gezeigt und in Fig. 1 graphisch dargestellt, besteht, wie durch die Reihen der Aminosäuren veranschaulicht, eine allgemeine Beziehung. Beispielsweise ist eine erste Reihe von Aminosäuren durch eine erste Gruppe von Codonen gerichtet (d. h. codiert) und eine zweite Reihe (komplementär codierter) Aminosäuren ist durch eine zweite Gruppe von Codonen, die komplementär zur ersten Gruppe von Codonen ist, gerichtet. Es wurde eine Beziehung zwischen der ersten Reihe von Aminosäuren und der zweiten Reihe von Aminosäuren festgestellt, die als hydropathisch umgekehrt charakterisiert werden kann. In einem Fall sind die komplementär codierten, hydrophilen (niedrige Hydropathie) Aminosäuren durch Codone gerichtet, die komplementär zu jenen sind, die für die hydrophoben (hohe Hydropathie) Aminosäuren codieren. Diese Beziehung kann als hydropathische Komplementarität bezeichnet werden.
Fig. 1 zeigt ein Diagramm der Daten aus Tabelle 2, aus dem die hydropathischen Marken der Aminosäuren hervorgehen, die durch Codone eines codierenden Nucleinsäurestranges gerichtet sind, im Vergleich zu den durchschnittlichen hydropathischen Marken der Aminosäuren, die durch Codone des komplementären, nichtcodierenden Stranges gerichtet sind. Eine lineare Regressionsanalyse dieser Daten ergibt einen Korrelationskoeffizient von -0,77. Ein ähnliches Muster wird beobachtet, wenn mit einem anderen hydropathischen Markensystem gerechnet wird, das bei Tryptophan, Tyrosin, Glutamin und Asparagin von etwas unterschiedlichen Werten ausgeht (Daten nicht angeführt, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1981) Bd. 78, S. 3824-3828). Folglich tendieren die hydropathischen Marken der nichtcodierenden stranggerichteten Aminosäuren dazu, umgekehrt mit den hydropathischen Marken der codierenden stranggerichteten Aminosäuren zusammenzuhängen und diese Beziehung ist nicht zufällig und ließe sich mit jedem beliebigen Markensystem für Aminosäureeigenschaften feststellen, welches die hydrophoben und hydrophilen Tendenzen aufzeigt, sei es allein oder in Kombination mit anderen physikalischen Eigenschaften von Aminosäuren.
Interessanterweise ergibt sich eine ähnliche Beziehung, wenn die komplementären Codone von 3' in Richtung 5' gelesen werden. Die Codierungsbeziehungen von komplementären Codonen, die von 3' in Richtung 5' gelesen werden, sind in Tabelle 3 aufgezeigt. TABELLE 3 AMINOSÄUREN, DEREN CODONE KOMPLEMENTÄR SIND ZU JENEN VON: Codierender Strang Nichtcodierender Strang Codon Aminosäure (1) hydrophobe Aminsäuren Isoleucin Tyrosin Valin Glutamin Histidin Leucin Asparagin Glutaminsäure Asparaginsäure Phenylalanin Lysin Cystein Threonin Methionin Thyrosin Alanin Arginin (2) hydrophile Aminosäuren Arginin Alanin Serin Lysin Phenylalanin TABELLE 3 (Fortsetzung) Codierender Strang Nichtcodierender Strang Codon Aminosäure Asparagin Leucin Asparaginsäure Glutamin Valin Glutaminsäure Histidin (3) geringfügig hydrophile Aminosäuren Glycin Prolin Threonin Tryptophan Cystein Tryptophan Threonin Serin Arginin Tyrosin Isoleucin Methionin Prolin Glycin
Wie in Tabelle 3 gezeigt, codierten von den 20 möglichen Codonen, die komplementär zu den Codonen für hydrophobe Aminosäuren sind, wenn sie von 3' in Richtung 5' gelesen werden, keines für hydrophobe Aminosäuren, 16 codierten für hydrophile Aminosäuren und 4 (UAU, ACA, ACG und UAC) codierten für geringfügig hydrophile Aminosäuren.
Von den 18 möglichen Codonen, die komplementär zu den Codonen für die stark hydrophilen Aminosäuren sind, codierte, wenn sie von 3' in Richtung 5' gelesen werden, keines für stark hydrophile Aminosäuren, 16 codierten für hydrophobe Aminosäuren und zwei (UCU und UCC) für geringfügig hydrophile Aminosäuren.
In Tabelle 4 sind die in Tabelle 3 beschriebenen hydropathischen Marken von Aminosäuren und deren Komplementen (d. h. komplementär oder durch die entsprechenden komplementären Codone codierten Aminosäuren) aufgelistet. TABELLE 4 HYDROPATHISCHE MARKEN VON AMINOSÄUREN UND DEREN KOMPLEMENTEN GEMÄß TABELLE 3 AMINSÄUREN MARKE KOMPLEMENTE MARKEN
Von den möglichen Codonen, die komplementär zu den codierenden Codonen für geringfügig hydrophilen Aminosäuren sind, codieren, wenn sie von 3' in Richtung 5' gelesen werden, 14 für geringfügig hydrophile Aminosäuren, 2 (ACA und ACG) codieren für stark hydrophile Aminosäuren und 4 (UCG, UGU, AUA und AUG) codieren für hydrophobe Aminosäuren. Die Nettowirkung ergibt hier nur eine kleine Änderung der durchschnittlichen hydropathischen Eigenschaften der Aminosäuren mit nichtcodierendem Strang.
Fig. 2 zeigt eine Graphik der hydropathischen Marken der Aminosäuren mit codierenden Strang im Vergleich zu den hydropathischen Marken der Aminosäuren mit nichtcodierenden Strang. Eine lineare Regressionsanalyse dieser Daten ergibt einen Korrelationskoeffizienten von -0,77. Somit sind, wie in der Richtung von 5' zu 3', auch in der Richtung 3' zu 5' die hydropathischen Marken der Aminosäuren mit nichtcodierendem Strang umgekehrt bezogen auf jene des codierenden Stranges und diese Beziehung ist nicht zufällig.
Diese im genetischen Code enthaltene Informationsbeziehung zeigt eine hydropathische Komplementarität der Aminosäuren auf. Von 5' in Richtung 3' gelesene Codone für hydrophile und hydrophobe Aminosäuren wurden im allgemeinen durch Codone für hydrophobe, respektive hydrophile Aminosäuren komplementiert. Die durchschnittliche Tendenz von Codonen für "ungeladene" (geringfügig hydrophile) Aminosäuren mußte durch Codone für "ungeladene" Aminosäuren komplementiert werden.
Wie durch diese Beobachtungen verdeutlicht wird, ergibt sich ein fast identischen Muster, wenn das komplementäre Nucleotidcodon von 3' in Richtung 5' anstatt von 5' in Richtung 3' gelesen wird. Nachdem, unabhängig von der Leserichtung, das zweite Nucleotid des komplementären Codons sich niemals ändert, ist dieses zweite Nucleotid des Triplettencodons die hauptsächliche Determinante für die hydropathische Komplementarität von Aminosäuren, die durch komplementäre Codone spezifiziert sind. Dies scheint sich weitgehend aus der Tatsache zu ergeben, daß der überwiegende Teil (6 von 7) der hydrophilen Aminosäuren als zweites Nucleotidcodon Adenin aufweist, wohingegen das komplementäre Nucleotid Uridin das zweite Nucleotid des Triplettencodons für die meisten (5 von 7) hydrophoben Aminosäuren ist. Eine der zwei Ausnahmen davon in der hydrophoben Gruppe (Alanin) beeinträchtigt diese Allgemeingültigkeit nicht wesentlich, da sie eine zweite Base, Cytosin, aufweist, während die zweite Base für die einzige Ausnahme in der hydrophilen Gruppe (Arginin) eine zweite Base, Guanin, aufweist. Somit besteht ein praktisch perfekter Austausch von hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, egal ob das komplementäre Codon von 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' gelesen wird. Von den sechs ungeladenen (geringfügig hydrophilen) Aminosäuren, mit Ausnahme von Tyrosin, ist die zweite Base des entsprechenden Codons entweder ein G oder C. Somit ergeben die Codone für diese Gruppe, ungeachtet der Richtung, in der das komplementäre Codon gelesen wird, üblicherweise eine gleiche Art von Aminosäuren.
In Tabelle 5 sind die Aminosäuren aufgelistet, deren Codone eine bestimmte zweite (mittlere) Base enthalten. TABELLE 5 AMINOSÄUREN MIT EINER BESTIMMTEN ZWEITEN BASE IN IHREN CODONEN ZWEITE BAS DES RNA CODONS AMINOSÄURN
Die Gruppe der durch eine zweite Base aus Uridin gerichteten Aminosäuren (U Gruppe) besitzt eine komplementär codierte Gruppe von Aminosäuren (A Gruppe), die durch eine zweite Base aus Adenin codiert ist, und umgekehrt. Die Cytosin und Guanin gerichteten Gruppen (C Gruppe respektive G Gruppe) weisen die gleichen Beziehung auf.
In Tabelle 6 sind die hydropathischen Marken der Aminosäuren aufgelistet, die durch Codone mit einer bestimmten zweiten Base gerichtet sind; aus Gründen der Zweckmäßigkeit sind die entsprechenden Marken der komplementär codierten Aminosäuren (Komplemente) getrennt aufgeführt. Auch hier wird die hydropathische, komplementäre Beziehung veranschaulicht. TABELLE 6 HYDROPATHISCHE MARKEN VON AMINOSÄUREN UND DEREN KOMPLEMENTE GEMÄß DER IN TABELLE 5 AUFGEZEIGTEN GRUPPIERUNGEN Zweite Basen Gruppe Durchschnittl. hydropathische Marken Codiert Komplement
Aus den Tabellen 2, 4 und 6 läßt sich klar erkennen, daß Peptide und ihre Komplemente durch eine allgemeine Inversion der hydropathischen Beschaffenheit an eine Aminosäure durch die Aminosäure-basis zusammenhängen, wenn die Sequenzen, je nach Herstellungsverfahren, parallel oder antiparallel gerichtet sind. Bevorzugte Ausführungsarten dieser Erfindung, wie die in Tabelle 1 und Tabelle 3 gezeigten spezifischen Codon- Beziehungen, sind Sonderfälle eines eher allgemeinen Verfahrens zur Herstellung vom komplementären Peptiden.
Sind die Nucleinsäuresequenzen nicht bekannt, können für die Herstellung von Homologen von spezifisch bevorzugten komplementären Peptiden die allgemeinen Verfahren, die auf der zweiten Basen- Komplementarität oder der hydropathischen Inversion beruhen, verwendet werden. Wenn beispielsweise zwar eine Aminosäuresequenz, jedoch nicht die einzelnen Codone für ein gesamtes oder für Teile eines Proteins oder Peptids bekannt sind, kann basierend auf der in Tabelle 6 gezeigten allgemeinen Beziehung ein komplementäres Peptid konzipiert werden. Für eine Aminosäure in der ursprünglichen Protein- oder Peptidsequenz mit einer zweiten Codonbase aus Uridin (U Gruppe Aminosäure), wird eine Aminosäure für die A Gruppe ersetzt und umgekehrt. Für eine Aminosäure in der Protein- oder Peptidsequenz mit einer zweiten Codonbase aus Cytosin (C Gruppe), wird eine Aminosäure aus Guanin (G Gruppe) ersetzt und umgekehrt. Nach diesen Substitutionen ist die Sequenz der so gewonnenen Aminosäuren komplementär zu den jeweiligen Teilen des ursprünglichen Peptids oder Proteins.
Die Tabellen 1, 3 und 6 können in einer allgemeinen Weise verwendet werden, wenn die Nucleinsäuresequenzen nicht bekannt sind. In diesen Fällen wird für eine Aminosäure in der ursprünglichen Peptid- oder Proteinsequenz eine Aminosäure aus dem entsprechenden Satz aus Aminosäuren mit nichtcodierendem Strang ersetzt. Nach diesen Substitutionen ist die so gewonnene Sequenz der Aminosäuren komplementär zu den jeweiligen Teilen des ursprünglichen Peptids oder Proteins.
Als zusätzliche Erweiterung der erfindungsgemäßen Prinzipien gilt, daß der spezifische Richtungssinn der komplementären Aminosäure-sequenz nicht kritisch ist. Wie jedem Fachmann auf diesem Gebiet nach Studium dieser Beschreibung klar sein wird, kann die Juxtaposition von Aminosäuren in der Konzeption von komplementären Polypeptiden sowohl in die eine wie auch in die andere Richtung orientiert sein. Bezogen auf den Aminosäuresequenz-Richtungssinn von Aminosäuren mit bestimmten hydropathischen Eigenschaften sind die Richtungen des Amino-Terminus und des Carboxy-Terminus austauschbar, beide Konstruktionen ergeben komplementäre Polypeptide. Einfacher ausgedrückt würde zum Beispiel in dem Fall, in dem das Amino-Terminus-Ende einer bestimmten Aminosäure-sequenz ein Valin enthält (zweite Codon-Base = U), eine komplementäre Aminosäuresequenz am Amino-Terminus-Ende oder am Carboxy-Terminus-Ende eine Aminosäure mit einer zweiten Codon-Base A (LYS, ASN, ASP, GLN, GLU, HIS oder TYR) enthalten, wenn das allgemeine Verfahren gemäß Tabelle 6 angewendet wird.
Der genetische Code kann sich im Verlaufe der Evolution infolge der chemischen Ähnlichkeit von anticodonen Basen und ihrer jeweiligen Aminosäuren entwickelt haben. Vielleicht führte diese Ähnlichkeit zu den hier beobachteten Mustern. Ein funktioneller und evolutionsmäßiger Vorteil dieses Phänomens kann in der Tatsache begründet sein, daß die zweite Base von Codonen für hydropathisch ähnliche Aminosäuren die gleiche ist. Vielleicht wäre vor dem Aufkommen des Lesens des Richtungssinnes von Nucleinsäuren eine Aminosäure aus der gleichen hydropathischen Gruppe vorhanden und die daraus resultierenden Peptide oder Proteine hätten eine etwa gleiche Konformation, egal, ob die Nucleinsäuren von 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' gelesen würden.
Diese Erfindung bezieht sich ein einem wesentlichen Aspekt auf die Entdeckung, daß Polypeptide, die zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins, das eine bekannte Aminosäuresequenz oder Nucleotid-Codierungssequenz aufweist, komplementär sind und Bindungsaffinität an das ursprüngliche Peptid oder Protein aufweisen, konzipiert und hergestellt werden können. Falls die Aminosäuresequenz von zumindest einem Teil (beispielsweise vier bis fünf Aminosäuren) eines ursprünglichen Peptids oder Proteins bekannt ist, kann die Information dieser Sequenz in verschiedener Weise verwendet werden, um die Konzeption eines komplementären Polypeptids zu bestimmen, um zu einem Antikörper der gegenständlichen Erfindung zu kommen.
In einer bevorzugten Methode für die Konzeption eines komplementären Polypeptids wird die in Tabelle 3 dargestellte Aminosäure-Beziehung verwendet. Dementsprechend wird jede Isoleucin-Position einer ermittelten Aminosäuresequenz des gesamten oder eines Teiles des ursprünglichen Peptids oder Proteins durch Tyrosin ersetzt. Als weiteres Beispiel wird jedes Valin durch Glutamin oder Histidin ersetzt. Die verbleibenden 18 Aminosäuren werden ebenfalls gemäß der in Tabelle 3 aufgezeigten Beziehung ersetzt. Wie nachstehend veranschaulicht (beispielsweise in Beispiel 2A, 2B und 2C), erhält man, wenn Peptid-Hormon-Rezeptorort-Aminosäuresequenzen als ursprüngliche Peptide oder Proteine verwendet werden, statistisch signifikante und eindeutige Codonrichtungen für Teile der Peptidhormone, die typisch an diese Rezeptororte binden und daher komplementär dazu sind. Bei weiterer Betrachtung der Beispiele 2A, 2B und 2C sowie der Fig. 8, 9A und 9B zeigt sich, daß darin für spezifische Aminosäuren aufgrund bekannter Nucleotidsequenzen günstigere Substitutionen gemacht wurden, zum Beispiel wurde Serin durch Arginin ersetzt und Serin oder Cystein wurde durch Threonin ersetzt.
In einem anderen bevorzugten Verfahren für die Konzeption von komplementären Polypeptiden wird die in Tabelle 1 gezeigte Aminosäure- Beziehung verwendet. Demgemäß wird jedoch eine Aminosäuresequenz des ursprünglichen Peptids, Proteins oder gewünschten Teilen davon von der Carboxy-Terminus-Richtung gelesen. Diese Carboxy-Terminus-Richtung entspricht substitutionell (d. h. gibt die Richtungen für die Aminosäure Einlagerung) der Amino-Terminus-Richtung des komplementären Polypeptids. Ist die Umkehrung dieser Reihenfolge einmal erfolgt, können Substitutionen gemäß der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäure-Beziehung erfolgen. Zum Beispiel wird jedes Isoleucin durch Tyrosin, Asparagin oder Asparaginsäure ersetzt. Weitere Substitutionen für die anderen 19 Aminosäuren können anhand der in Tabelle 1 gezeigten Aminosäure-Beziehung erfolgen.
Wie nachstehend in den Beispielen 1A bis 1H veranschaulicht, wurden, wenn zu Gamma-Endorphin und ACTH komplementäre Polypeptide entsprechend einer bevorzugten Variante des zuletzt erwähnten Verfahrens konzipiert und hergestellt wurden, spezifische Aminosäuresubstitutionen basierend auf bekannten Nucleotidsequenzen gemacht. Beispielsweise wurde Valin durch Asparaginsäure oder Histidin ersetzt; Leucin durch Lysin oder Glutaminsäure ersetzt; Phenylalanin durch Glutaminsäure; Arginin durch Alanin oder Prolin; Lysin durch Leucin; Histidin durch Valin; Glycin durch Prolin oder Alanin; Threonin durch Glycin oder Arginin; Serin durch Glycin, Arginin oder Alanin; Tyrosin durch Valin; und Prolin durch Glycin oder Arginin.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren, spezifische Reihen komplementärer Aminosäuren aus der allgemeinen zweiten Basen-Gruppierung auszuwählen, wird nachfolgend beschrieben. Für jede Aminosäure ist eine Liste aller möglichen komplementären Aminosäuren zu erstellen, die aus all den möglichen Codon- Lesungen von 3'-5' und von 5'-3' für die ausgewählte Aminosäure hergestellt werden könnten. Aus dieser Liste ist die Aminosäure auszuwählen, die am häufigsten vorkommt. Beispielsweise gibt es für Valin 4 Codone, die in beiden Richtungen gelesen werden können, um eine Reihe von möglichen Komplementen zu Valin zu erzeugen. Codon Komplement Valin 5'-Translation 3'-Translation
Aus dieser Liste wird HIS als Komplement zu VAL gewählt. Diese Art der Auswahl wird im nachfolgenden als Consensus-Komplement bezeichnet. In der nachfolgenden Tabelle wird diese Auswahl für jede einzelne Aminosäure aufgeführt. TABELLE 6A CONSENSUS-KOMPLEMENT-SUBSTITUTIONEN Aminosäure Consensus Komplement
Jene, die mit der Produktion und Verarbeitung von Peptiden vertraut sind, werden erkennen, daß das Vorhandensein eines Cystein-Rückstandes in einer Peptidsequenz in einigen Situationen zu Oxydations- und Dimerisierungsproblemen führen kann. Aus diesen Gründen wird es für einige Untersuchungen wünschenswert sein, die Cysteinrückstände in komplementären Peptidsequenzen durch eine andere, hydropathisch neutrale Aminosäure wie beispielsweise Serin zu ersetzen und diese Substitutionen werden in dieser Erfindung berücksichtigt.
Ein zusätzliches bevorzugtes Verfahren für die Auswahl einer spezifischen Reihe von komplementären Aminosäuren aus der allgemeinen zweiten Basen-Gruppierung liegt darin, das am häufigsten verwendete (artspezifische) Codon für jede Aminosäure zu bestimmen und das komplementäre Codon entweder von 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' zu translatieren (hier als "frequenz-basierende Komplemente" bezeichnet). Somit können für jede Aminosäure (und jede Art) zwei frequenzbasierende komplementäre Aminosäuren abgeleitet und für die Herstellung von komplementären Peptidsequenzen verwendet werden. Falls im Verlauf dieses Verfahrens ein Stoppcodon auftritt (das das Ende der Translation in den Zellen anzeigt), kann das zweithäufigste Codon für die entsprechende Aminosäure verwendet werden (und so weiter). In Tabelle 6B werden die frequenz-basierenden Komplemente für Aminosäuren anhand von menschlichen Codonfrequenzen nach Grantham et. al. (Nuc. Acids. Res., 9, S. r43-r75, 1981) angeführt. TABELLE 6B MENSCHLICHE FREQUENZ-BASIERENDE KOMPLEMENT SUBSTITUTIONEN Aminosäure 5'-3'-Komplement 3'-5'-Komplement
Eine weiteres alternatives und bevorzugtes Verfahren für die Auswahl einer spezifischen Reihe von komplementären Aminosäuren aus der allgemeinen zweiten Basen-Gruppierung besteht darin, das am häufigsten verwendete Codon für jede zweite Basengruppe zu bestimmen. Nachdem die Codonfrequenz von Art zu Art verschieden ist, kann diese Methode eine unterschiedliche Auswahl für die verschiedenen Arten ergeben. Bei Verwendung der menschlichen Codon- Frequenzen nach Grantham et al. (Nuc. Acid. Res., 9, S. r43-r75, 1981), wurden die ausgewählten, vereinfachten komplementären Aminosäuren der nachstehenden Tabelle hergestellt (diese Aminosäuren werden hier als "vereinfachte Komplemente" bezeichnet). TABELLE 6C MENSCHLICHE VEREINFACHTE KOMPLEMENT-SUBSTITIONEN Aminosäure Vereinfachtes Komplement
In einigen Fällen kann ein Peptid aufgrund besonderer Eigenschaften seiner Sequenz selbst-komplementär sein. Eine Sequenz ist dann selbst-komplementär, wenn sie in ihrer zweiten Basensequenz einen Umkehrpunkt enthält. Beispiel: N-Terminus Glu-Leu-Glu-Leu Peptidsequenz 5'-Terminus A-U-A-U 3'-Terminus U-A-U-A Komplementsequenz C-Terminus Leu-Glu-Leu-Glu
Dieses Tetrapeptid ist eindeutig sein eigenes Komplement mit antiparalleler Orientierung. Dieses Peptid weist eine Anzahl von weiteren antiparallelen Komplementen mit unterschiedlichen Sequenzen von Aminosäuren auf, die nach wie vor die gleiche zweite Basensequenz haben. Es könnten alle antiparallelen Komplemente als zweite Basen-Analoge betrachtet werden.
Die besondere Beschaffenheit dieser Sequenzen kann zu Analyse- Komplexitäten gewisser Versuchsergebnisse führen, wenn ein selbstkomplementäres Peptid zusammen mit einem anderen antiparallelen Komplement vorhanden ist. Weitere antiparallele Komplemente könnten die Eigenschaften von konventionellen Analogen (Agonist- oder Antagonist-Wirkung) aufweisen oder könnten Eigenschaften haben, die üblicherweise mit Komplementen (nicht-konventionelle Antagonisten und Antikörper, die konventionelle Agonisten und Antagonisten sind) in Verbindung gebracht werden. Das Prinzip der komplementären Peptide kann, ungeachtet der genauen Wirkungsweise von Komplementen in diesen speziellen Fällen, zur Herstellung von neuen Molekülen mit gewünschten, bioaktiven Eigenschaften verwendet werden.
Die komplementären Polypeptide, deren Sequenz mittels irgendeines der vorgängig beschriebenen Verfahren gemäß der ursprünglichen Aminosäuresequenz oder Nucleotidsequenz bestimmt wurde, können dann durch chemische Synthese, spezifische biologische Synthese oder Derivation < zum Beispiel durch Exzision) von Peptiden oder Proteinen gewonnen werden, welche die festgestellte Aminosäuresequenz aufweisen.
Die hier beschriebene komplementäre Aminosäure-Beziehung ermöglicht die Konzenption, Konstruktion und Verwendung vieler Polypeptidstrukturen, die Aminosäuresequenzen umfassen, die komplementär zu den gewünschten Sequenzen der Aminosäuren sind. Die komplementäre Aminosäuresequenz kann ein voll ständiges Peptid oder Polypeptid sein, wie dies hier zum Beispiel anhand von HTCA und Gamma-Odne gezeigt wird, die jeweils komplementär zur gesamten Sequenz der Zielpeptide ACTH (1-24) bzw. zu Gamma-Endorphin sind.
In speziellen Anwendungsfällen kann ein komplementäres Peptid an ein größeres Molekül gebunden werden, und zwar durch chemische Quervernetzung oder durch Einbau in eine größere Polypeptidstruktur. Komplementäre Polypeptide können auch an Trägermatrixen angeheftet werden, beispielsweise für Anwendungen wie beispielsweise der Affinitätschromatographie.
In der Praxis kann diese Erfindung, insbesondere wenn für das Zielpeptid eine codierende Nucleotidsequenz bekannt ist, dazu verwendet werden, die Aminosäuresequenz eines Komplements zu richten. Dabei können einzelne Codone für Isoleucin (AUU, AUC), Leucin (UUA, CUA), Threonin (ACU) oder Serin (UCA) komplementäre Codone ergeben, die, wenn sie von Richtung 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' gelesen werden, Stoppcodone sind und für die Beendigung der Proteinsynthese codieren. In dieser Situation würde die zweite Base des Stoppcodons verwendet, um eine Aminosäure mit geeigneter hydropathischer, komplementärer Eigenschaft auszuwählen (aus den in Tabellen 5 und 6 gezeigten Gruppen). Die Auswahl aus einer speziellen Gruppe kann vorzugsweise eingeengt werden, in dem die hydropathische Komplementarität optimiert wird. Beispielsweise könnte bei einem ILE (hydropathische Marke +4,5) -Codon (AUU oder UAA) ein LYS (hydropathische Marke -3,9) aus der komplementären zweiten Base A-Gruppe gewählt werden; bei einem Serin (hydropathische Marke -0,9) -Codon (UCA) oder Threonin (hydropathische Marke -0,9) -Codon (ACU) könnte ein Tryptophan (-0,9) oder Serin (-0,9) aus der zweiten Base G-Gruppe gewählt werden.
Der Umfang der Erfindung läßt sich des weiteren durch die Anwendung von speziellen Ausführungsarten beschreiben. Zum Beispiel ist das das Luteinisierungshormon freisetzende Hormon (LH-RH) ein Decapeptid, dessen codierende Nucleotidsequenz unbekannt ist, dessen Aminosäuresequenz jedoch in der obersten Zeile in Tabelle 7 angeführt ist. TABELLE 7 LH-RH Tabelle 1 Alternativen Tabelle 3 Alternativen Tabelle 6 Alternativen
Aufgrund der erfindungsgemäßen Erkenntnisse und Prinzipien läßt sich zuverlässig vorhersagen, daß die meisten, wenn nicht alle, der gemäß dem Verfahren in Tabelle 7 hergestellten Komplemente eine Affinität für LH-RH zeigen werden und bei der Modulierung der Wirkungen dieses Hormons sehr nützlich sind.
Die Auswahl des oder der spezifischen komplementären Peptide, die in jedem der gegebenen Fälle die am meisten gewünschten biologischen oder biochemischen Eigenschaften oder Wirkungen aufweisen, hängt von mehreren Faktoren ab, unter anderem von der Art des biologischen Systems, in dem das komplementäre Peptid verwendet werden soll, ob eine diagnostische oder therapeutische Gebrauchseignung gewünscht wird, sowie von der Art der biologischen Wirkung oder Wirkungsweise, die für das komplementäre Peptid im biologischen Zielsystem vorgesehen ist. Je nach der gewünschten Wirkung können bestimmte komplementäre Peptide anderen vorgezogen werden. Die nachfolgende Anregung ist eine von vielen möglichen Konzeptionsmethoden, die für die Herstellung von komplementären Peptidsequenzen verwendet werden kann, die bei einer Konzentration von komplementären Peptiden von 10&supmin;&sup4; Mol oder niedriger in einem biologischen, diagnostischen oder physikalischen Versuch ansprechen. Diese Konzentration von komplementären Peptiden von 10&supmin;&sup4; Mol oder niedriger (hier als "minimale komplementäre Peptid-Bindungsaktivität" bezeichnet) ist ein nützlicher Parameter bei der erfindungsgemäßen Auswahl von geeigneten komplementären Peptiden, da in der Praxis Konzentrationen, die über den für die minimale komplementäre Peptid-Bindungsaktivität festgelegten Werten liegen, unbrauchbare therapeutische Dosierungen mit sich bringen und Peptide ergeben, deren Bindung nicht spezifisch genug ist, um für therapeutische oder diagnostische Anwendungen brauchbar zu sein.
Die im nachfolgenden beschriebene Auswahlmethode ermöglicht es Fachleuten, problemlos komplementäre Peptide zu erzielen, welche sich durch die minimale komplementäre Peptid-Bindungsaktivität auszeichnen. Insbesondere wenn die Nucleinsäuresequenzen bekannt sind, können vier komplementäre Peptide direkt aus den vorerwähnten Angaben konzipiert werden (indem die komplementäre Nucleinsäuresequenz entweder von 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' translatiert wird und die nachfolgende Sequenz der Aminosäuren entweder vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus oder vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus orientiert wird). Falls keine dieser komplementären Peptide den gewünschten Wirkungsgrad aufweist oder falls die Nucleinsäuresequenz der Zielsequenz nicht bekannt ist, können zwei komplementäre Peptide von einer Aminosäure-Zielsequenz konzipiert werden, indem die Consensus-Komplement-Methode (Tabelle 6A) angewendet wird, wobei die Komplement-Aminosäuresequenz entweder vom Amino-Terminus zum Carboxy- Terminus oder vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus orientiert wird. Wird der gewünschte Wirkungsgrad nicht erreicht, können vier zusätzliche komplementäre Peptide mittels der Codonfrequenz-Komplementmethode (z. B. Tabelle 6B) konzipiert werden, indem das artspezifische, am häufigsten verwendete Codon für jede Aminosäure in der Zielsequenz zu seinem 5' zu 3' Komplement oder seinem 3' zu 5' Komplement translatiert wird und die Komplement-Aminosäuresequenz entweder vom Amino-Terminus zum Corboxy- Terminus oder vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus orientiert wird. Zwei zusätzliche Komplemente können mittels der vereinfachten Komplementmethode (z. B. Tabelle 6C) konzipiert werden, indem die artspezifische, am häufigsten verwendete Aminosäure für jede zweite Basen-Gruppierung identifiziert wird und die komplementäre Aminosäuresequenz gemäß der zweiten Basen-Gruppierung von jeder Aminosäure in der Zielsequenz erzeugt wird und die Komplement-Aminosäure-sequenz entweder vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus oder vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus orientiert wird.
In gewissen Systemen kann beobachtet werden, daß eine Orientierung der Peptidbindungen besser geeignetere komplementäre Peptide erbringt als die andere Orientierung, das heißt, Peptide mit einer minimalen komplementären Peptidbindungsaktivität oder Peptide mit einem über der minimalen komplementären Peptidbindungsaktivität liegenden Aktivitätsbereich. In diesem Fall kann das Ausmaß der Untersuchung auf die besser geeignete Orientierung beschränkt werden, um die weiteren Experimente zu vereinfachten. Des weiteren kann, wie dies üblich ist, wenn diese Konzeptionsmethode zu einem besonders geeigneten komplementären Peptid geführt hat, die Untersuchung fortgeführt werden, um ein noch besser geeigneteres komplementären Peptid zu finden, indem eine oder mehrere Aminosäuren im Komplement der Aminosäuresequenz selektiv mit anderen Aminosäuren innerhalb der zweiten Basengruppierung ausgetauscht werden.
Die Konzeption von wirksamen oder wünschenswerten komplementären Peptiden ließe sich auch durch Vorbereitung einer Mischung aus komplementären Peptiden erleichtern, die mittels einer Festphasen- Peptidsynthese gewonnen werden könnte, bei der in einer oder mehreren Kopplungsreaktionen mehrere Aminosäurenreagenzien in einem Schritt beigemengt werden können, worauf eine Gradientenelution der Mischung aus einer affinitätschromatographischen Säule folgt, die das auf eine feste Auflage geheftete Zielpeptid enthält. Das am dichtest gebundene komplementäre Peptid eluiert zuletzt. Die Strukturen der Peptide in den verschiedenen Elutionsfraktionen können durch Sammeln der Fraktionen und Sequentierung mit herkömmlichen Mitteln bestimmt werden. Auf diese Weise lassen sich viele Peptide mit einem minimalen Aufwand beurteilen und Peptide mit minimaler komplementärer Wirkung können einfach hergestellt werden.
Eine alternative Methode, um die geeigneten komplementären Peptidsequenzen zu bestimmen, besteht darin, eine Reihe von monoklonalen Antikörpern zum Zielpeptid herzustellen und die hypervariablen Bereiche des Gens zu sequenzieren, die Immunoglobulin codieren. Die durch Sequenzsuche gefundenen Komplementaritätsbereiche zeigen, wenn sie richtig zusammengefügt werden, eine komplementäre Peptidsequenz auf.
Bei der Konzeption von komplementären Polypeptiden können die natürlichen Aminosäuren teilweise oder zur Gänze durch Analoge ersetzt werden, die eine gleiche Struktur oder Hydropathie aufweisen. Beispielsweise kann Alanin durch Alpha Amino-Isobuttersäure, Arginin durch Canavanin, Aspartat durch Beta-Hydroxy-Aspartate, Leucin durch Norleucin oder Gamma- Chloroleucin, Phenylalanin durch Beta-Phenylserin oder D-Phenylalanin ersetzt werden, um nur einige der vielen strukturellen Analogen zu nennen, die den Fachleuten bekannt sind. Die Verwendung dieser Ersatz-Aminosäuren bei der Konstruktion von komplementären Polypeptiden gemäß einer der erfindungsgemäßen Verfahren ist im Umfang dieser Erfindung eingeschlossen.
Peptide, die komplementär zu allen oder Teilen von natürlichen Hormonen sind, können für die Herstellung von Antikörper der gegenständlichen Erfindung verwendet werden, die Hormonrezeptoren erkennen und binden. Diese Antikörper haben die Eigenschaften von anti-idiotypischen Antikörpern zum Hormon und können somit zur Reinigung von Rezeptoren, zur Stimulierung der biologischen Reaktion, die üblicherweise mit dem Hormon verbunden ist, verwendet werden, oder dazu, der Wirkung der natürlichen Hormone entgegenzuwirken. Die biologische Reaktion aufgrund eines Antikörpers eines Peptids, das komplementär zu einem Hormon ist, wird teilweise durch die Art gesteuert, in der eine bestimmte Antikörpererzeugende Zelle mit dem Antigen eingeführt wird (komplementäres Peptid). Bestimmte Einfügungen können, je nach der gewünschten Reaktionsart, bevorzugt werden.
Im allgemeinen werden Peptide an Trägersubstrate wie beispielsweise große Proteine gekoppelt, wenn sie zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Fachleuten auf diesem Gebiet sind verschiedenste Kopplungsverfahren bekannt. Die jeweilige Kopplungsart kann die Darstellung der komplementären Peptid-Antigene beeinflussen.
Je nach der Art der Immunisierung, d. h., in vitro oder in vivo, können diverse andere Zusatzstoffe (Adjuvans) mit dem Antigen selbst kombiniert werden, um die Immunantwort abzuschwächen. Diese Adjuvans können die Darstellung der komplementären Peptid-Antigene ebenfalls beeinflussen.
Aus dem Serum von Tieren entnommene Antikörper sind polyklonal, was bedeutet, daß sie eine Mischung aus Antikörpern sind, die aus einer Anzahl von Zellsätzen hergestellt wurden. Werden Tiere mit komplementären Paptiden immunisiert, bindet ein Subsatz der gesamten Antikörper an das komplementären Peptid und an den Rezeptor des Moleküls, von dem das komplementäre Peptid stammt. Dieser Subsatz, der sich ebenfalls aus einer Anzahl von Antikörper-Typen zusammensetzt, kann mittels herkömmlicher Affinitätschromatographie von anderen Antikörpern getrennt werden. Der gereinigte Subsatz der Antikörper wird üblicherweise mono-spezifisch genannt. Mono-spezifische Antikörper zu einem komplementären Peptid können zur Reinigung von Rezeptoren verwendet werden, um diagnostische Analysen für Rezeptoren durchzuführen, oder um biologische Reaktionen abzuschwächen.
Die mono-spezifischen Antikörper können als der Satz von Antikörpern angesehen werden, der sich aus der Darstellung des Antigens in einer Vielzahl an Konformationen ergibt. Da die Peptid-Antigene etwas flexibel sind, können sie sehr unterschiedliche Konformationen oder dreidimensionale Strukturen annehmen. Jede dieser Konformationen könnte zur Bildung von geringfügig unterschiedlichen Antikörpern führen, die alle zum mono-spezifischen Satz gehören.
Unter Verwendung von monoklonalen Verfahren, die in Fachkreisen bekannt sind, ist es möglich, große Mengen eines bestimmten Antikörpers des mono-spezifischen Satzes zu erzeugen. Solche monoklonale Antikörper könnten auf ihre Fähigkeit hin ausgewählt werden, fest an ein komplementäres Peptid oder einen Rezeptor zu binden, um biologische Reaktionen ähnlich jenen von Molekülen, von dem das komplementäre Peptid abgeleitet wurde, zu erzeugen, oder um die biologische Reaktion zu hemmen. So wird es möglich,eine Auswahl für die gewünschte Reaktionsart zu treffen.
Komplementäre Peptide können in Verbindung mit Hilfsmittel zur Erzeugung von Impfstoffen verwendet werden. Auf diese Weise kann das Immunsystem eines Organismus zur Abschwächung der biologischen Reaktion seines Hormonsystems verwendet werden. Die Einführung von Antigenen kann spezielle Änderungen erfordern, um die größte Antikörper-Population zu gewährleisten, die die gewünschte biologische Reaktion ergibt. Verschiedene Peptide, die komplementär zu einem bestimmten bioaktiven Peptid sind, können bei der Impfung aufgrund der Unterschiede in ihren dreidimensionalen Konformationen unterschiedliche biologische Reaktionen hervorrufen.
Verfahren und Zusammensetzungen unter Verwendung der Antikörper zu den komplementären Peptiden bieten sich auch für die Behandlung von Krankheiten an, die mit der Überproduktion oder Unterproduktion einer proteinischen Substanz zusammenhängen oder für Therapien, bei denen eine durch eine proteinische Substanz verursachte Steigerung oder Verringerung der biologischen Reaktion günstig wirkt. Insbesondere umfassen diese therapeutischen Zusammensetzungen wirksame Mengen der Antikörper in Beimischungen mit pharmazeutisch zulässigen Trägern. Insbesondere werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Antikörper als aktive Bestandteile enthalten, üblicherweise entsprechend der jeweiligen zu verwendenden Verabreichungsart mit einem geeigneten festen oder flüssigen Träger zubereitet. Zum Beispiel sind parenterale Rezepturen üblicherweise injizierbare Flüssigkeiten, für die als Träger pharmazeutisch und physiologisch zulässige Flüssigkeiten, wie beispielsweise physiologische Kochsalzlösungen, ausgeglichene Salzlösungen oder dergleichen, verwendet werden. Oral einzunehmende Rezepturen können dagegen fest, z. B. Tabletten oder Kapseln, oder auch flüssige Lösungen oder Suspensionen sein.
Bei therapeutischen Verfahren der Erfindung können die Antikörper Menschen oder anderen Zielorganismen in verschiedener Weise verabreicht werden, zum Beispiel oral, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, intradermal und subkutan. Die spezielle Art der Verabreichung und Dosierung wird vom Fachmann unter Berücksichtigung der individuellen Daten des Patienten, der Art der erforderlichen Behandlung und/oder der jeweiligen Krankheit und Krankheitszustand gewählt. Zum Beispiel wird eine Infektion, die durch fremdproteinische Toxine oder dadurch hervorgerufen wird, daß der Organismus diesen ausgesetzt ist, üblicherweise durch eine ein- oder zweimalige tägliche Dosierung über einige Tage oder einige Wochen behandelt; hingegen ergibt sich bei der Behandlung von proliferativen Krankheiten wie der Tumor- oder Krebsbehandlung eine tägliche oder mehrmalige tägliche Dosierung über Monate oder Jahre hinweg. Die erfindungsgemäße Antikörper-Therapie kann mit anderen Behandlungsformen kombiniert werden und kann mit anderen chemotherapeutischen oder chemopräventiven Agenzien kombiniert oder angewendet werden, um somit eine Therapie gegen die jeweiligen Krankheitszustände oder Bedingungen, gegen die sie wirksam sind, zu bilden.
Die Aufzählung solcher potentieller Vorteile für die Menschheit der verschiedenen Anwendungen dieser Erfindung ließe sich endlos fortsetzen und umfaßt alle Arten der Diagnostik, Agenszuführung, Protein- und Zell- Quervernetzungsvermögen, Neutralisation von Pflanzen-, Bakterien- oder Insektengiften und der Hemmung des Tumorwachstums durch zahlreiche Mechanismen, einschließlich der Neutralisation von Peptid-Wachstumsfaktoren, die bei einem bestimmten Tumorwachstum wesentlich sind. Die Nützlichkeit dieser Erfindung geht weit über die hier erwähnten, speziellen Beispiele hinaus.
Die Bedeutung der Beziehung zwischen paarenden Nucleotid- Triplettcodonsequenzen von Nucleinsäuren wurde des weiteren durch Untersuchungen hinsichtlich der funktionellen Aktivitäten und Wechselbeziehungen von spezifischen Polypeptiden aufgedeckt. Die nachfolgenden Beispiele sind angeführt, um bestimmte bevorzugte Ausführungen dieser Erfindung und der damit eng verbundenen Erfindung der Europäischen Patentanmeldung 86901662.6 darzulegen und grenzen die Erfindung nicht ein, sofern dies nicht speziell in den Ansprüchen angeführt ist.

BEISPIEL 1A

ADRENOKORTIKOTROPES HORMON (ACTH, AMINOSÄUREN 1-24 ENTHALTEND ES FRAGMENT) UND KONZEPTION UND GEWINNUNG SEINES KOMPLEMENTÄREN POLYPEPTIDS (HTCA, 1-24)

Synthetisches ACTH, Fragment 1-24, wurde von Organon (West Orange, NJ) bezogen. Die Primärstruktur der für ACTH (1-24) codierenden mRNA (Messenger- RNA) wurde nach Nakanishi et al (Nature (1979) Bd. 278, S. 423-427) gewonnen und ist in Tabelle 8 angeführt. In der Zeile über der mRNA-Sequenz ist die entsprechende Aminosäuresequenz für ACTH (1-24) angeführt. Wurde die mRNA in antiparalleler Richtung basengepaart, ergab sich die in Tabelle 8 angeführte, jeweilige komplementäre Nucleotidsequenz (cRNA) (parallel zur mRNA gedreht). In der Zeile unter der cRNA-Sequenz ist die Aminosäuresequenz von HTCA angeführt, wobei sich das komplementäre Polypeptid zu ACTH (1-24) durch Lesen der cRNA-Sequenz von 5' in Richtung 3' ergibt. TABELLE 8
Ein Polypeptid mit der oben angeführten Aminosäuresequenz von HTCA wurde für die Erfinder von den Peninsula Laboratories (San Carlos CA) synthetisiert.

BEISPIEL 1B

BINDUNG VON ACTH (1-24) ZU SEINEM KOMPLEMENTÄREN POLYPEPTIDHTCA (1-24)

Die von Johnson et al (J. Immunol. (1982) Bd. 129, S. 2357-2359) allgemein beschriebenen Verfahren wurden angewendet, um die Bindungsaffinität der komplementären Peptide ACTH und HTCA zu demonstrieren. Pro Quelle wurden von 1 bis 25 Mikrogramm (ug) HTCA oder Insulin in mit Karbonat-Bikarbonat überzogenem Buffer rundbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Quellen beigemengt und während 8 Stunden bei 4ºC inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit einem Buffer aus Kochsalzlösung mit Phosphatbuffer (PBS)-Tween® 20 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) gewaschen.
Den Insulin-überzogenen und einigen der HTCA-überzogenen Quellen wurden 10 ug synthetisches ACTH (1-24) in PBS-Tween® Buffer beigemengt. Kontrollquellen (nur HTCA) enthielten nur PBS-Tween®. Die Platten wurden bei Raumtemperatur während 2 Stunden inkubiert und anschließend 3 mal mit einer PBS-Tween® Bufferlösung gewaschen. Gegen das Amid des synthetischen ACTH 1-13 (Accurate Biochemicals, Westbury N.Y.) gerichtete Kaninchen-Antisera wurde jeder Quelle beigemengt und die Platten während einer Stunde bei Raumtemperaturinkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit einer PBS-Tween® Bufferlösung wurde alkalisches, Phosphatase-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen IgM (Miles Laboratories, Elkharbt, IN) in einer PBS-Tween
Bufferlösung (Verdünnung 1 : 300) beigemengt. Nach einer Inkubationsdauer von einer Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten 3 mal mit einer PBS-Tween® Bufferlösung gewaschen und jede Quelle mit 200 Mikroliter (ul) p-Nitro-phenylphosphat (1 mg/ml in Karbonat-Bikarbonat-Buffer) während 1 ½ Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Die enzymatische Reaktion wurde gestoppt, indem jeder Quelle 3M NaOH (50 ul) beigemengt wurde und dann wurde die optische dekadische Extinktion von p-Nitrophenol, das alkalische Phosphataseprodukt, bei 405 nm gemessen. Das an die überzogenen Mikrotiter-Quellen gebundene ACTH wurdemittels dieser enzymverbundenen Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) gemessen.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 3 gezeigt. Das synthetische ACTH (1-24) ist durch die mit HTCA überzogenen Mikrotiterquellen gebunden, jedoch nicht durch die mit Insulinüberzogenen Mikrotiterquellen. Der für ACTH (Amid 1-13) spezifische Antikörper bindet nicht an den HTCA-Überzug und ACTH bindet auch nicht an den Insulin-Überzug. Die molare Menge des gebundenen ACTH war direkt proportional zur Konzentration des HTCA-Überzugs, was auf eine Eins-zu-Eins-Bindung der zwei Peptide hindeutet (Datenanalyse nicht angegeben).
Eine Mikrotiterplatte wurde präpariert und im allgemeinen so behandelt wie vorgängig beschrieben, wurde jedoch mit 3,7 nmol/Quelle HTCA überzogen. Jeder überzogenen Quelle wurde eine Lösung aus 3,7 nmol ACTH, zusammen mit der in Abszisse in Fig. 4 angegebenen Menge an HTCA beigemengt. Bei der Bewertung der ACTH Bindung mittels ELISA zeigte sich, daß ungefähr 90% der ACTH-HTCA Bindung spezifisch war. Eine (nicht gezeigte) Scatchard-Analyse der Daten in Fig. 4 ergab eine einzige, einheitliche Bindungsstelle mit einem Kd von 1,9 Mikromol, was mit der Affinität eines Antikörper-Antigen- Komplexes vergleichbar ist.

BEISPIEL 1C

BINDUNG VON I¹²&sup5; ACTH AN 3'-5' HTCA

Bei Verwendung der in Tabelle 8 in Beispiel 1A gezeigten, komplementären RNA (cRNA)-Sequenz, wobei jedoch die cRNA von 3' in Richtung 5' gelesen wurde, wurde folgende Aminosäuresequenz erzielt und das jeweilige Peptid (3'-5' HTCA) chemisch synthetisiert:
Unter Anwendung der in Beispiel 1B beschriebenen Verfahren wurden Polyvynil-Mikrotiterquellen mit 3'-5' HTCA, aus einer 1 mM Lösung daraus oder mit BSA überzogen.
Die mit BSA und 3'-5' HTCA überzogenen Quellen wurden gewaschen und dann mit einer der drei Lösungen aus I¹²&sup5; ACTH (1-39) (New England Nuclear Boston, MA) mit unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Nach einer Inkubationsdauer von 45 Minuten wurde die Lösung entfernt und die Mikrotiterquellen gründlich gewaschen. Die Mikrotiterquellen wurden getrennt und in einem Beckmann Gamma 5500 Gamma-Zähler auf den Jod¹²&sup5;-Gehalt hin untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 9 angeführt. Gebundenes ¹²&sup5;I-ACTH wurde in drei Konzentrationen zweifach gemessen und zwar mit und ohne überschüssiges, unmarkiertes ACTH. TABELLE 9 ACTH UND 3'-5'-HTCA Gebundenes CPM - ¹²&sup5;I-ACTH BSA Überzug 3'-5'-HTCA+Überschuß ACTH
Wie aus den Angaben in Tabelle 9 hervorgeht, bindet ¹²&sup5;I-ACTH an überzogenes 3'-5' HTCA, jedoch nicht an überzogenes BSA, ein gut bekanntes Protein mit großer Bindungsfähigkeit. Die Bindung von ¹²&sup5;I-ACTH an die mit 3'-5' HTCA-überzogenen Mikrotiterquellen wird durch das Vorhandensein von überschüssigem freien ACTH verhindert. Dieses Ergebnis veranschaulicht sowohl die Affinität eines komplementären Peptids zu einem ursprünglichen Peptid wie auch die Tatsache, daß diese Polypeptide durch Lesen der Sequenz von komplementären Nucleinsäurecodonen von 3' in Richtung 5' und chemische Synthetisierung des so gerichteten Peptids konzipiert und gewonnen werden können.

BEISPIEL 1D

BINDUNG VON ¹²&sup5;I-ACTH AN TEILPEPTIDSEQUENZEN VON HTCA

Unter Verwendung der in Tabelle 8 in Beispiel IA gezeigten cRNA- Sequenz und HTCA-Sequenz wurde eine Reihe von Peptiden mit einem Carboxy- Terminus-Teil der HTCA Aminosäure synthetisch hergestellt. Ein Pentamer (5-mer) enthielt die Aminosäuresequenz: H&sub2;N-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Ein Dekamer (10-mer) enthielt die Aminosäuresequenz: H&sub2;N-Ala-Pro-Ala-Glu-Val- Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Ein zwanzig-gliedriges Peptid (20-mer) enthielt die Aminosäuresequenz: H&sub2;N-His-Arg-Ala-Pro-Leu-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ala-Pro- Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Jedes dieser Peptide wurde zum Überziehen der Mikrotiterquellen verwendet und die überzogenen Quellen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, ¹²&sup5;I-ACTH gemäß Beschreibung in Beispiel 1C zu binden. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 10 angeführt. TABELLE 10 ¹²&sup5;I-ACTH BINDUNG AN HTCA-KOMPONENTEN CPM GEBUNDENES ¹²&sup5;I-ACTH BSA Überzug 5-mer+Überschuß 10-mer+Überschuß 20-mer+Überschuß Überzug ACTH
Wie aus den Angaben in Tabelle 10 hervorgeht, zeigen alle Peptide der 125 HTCA-Sequenz die Fähigkeit, ¹²&sup5;I-ACTH zu binden.

BEISPIEL 1E

HTCA MIT UMGEKEHRTER AUSRICHTUNG UND BINDUNG VON ¹²&sup5;I-ATCH (1-39) AN HTCA

Eine 24-mer HTCA Variante (R-HTCA) mit umgekehrter Aminosäuresequenz- Ausrichtung (umgekehrte Amino-Terminus und Carboxy-Terminus-Enden) wurde synthetisiert und hatte folgende Sequenz: H&sub2;N-Arg-Val-Gly-His-Phe-Val -Glu- Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Arg-His-Leu-His-Val-Gly--COOH.
Das Überziehen der Quelle und die ¹²&sup5;I-ACTH Bindung wurden gemäß Beschreibung in Beispiel 1C durchgeführt und die daraus resultierenden Daten sind in Tabelle 11 angeführt. TABELLE 11 ¹²&sup5;I-ACTH BINDUNG AN R-HTCA CPM GEBUNDENES ¹²&sup5;I-ACTH BSA R-HTCA +Überschuß ACTH
Wie in Tabelle 11 dargestellt, zeigt das zu ACTH komplementäre R-HTCA Polypeptid eine signifikante Affinität zu ACTH. Dies veranschaulicht noch einen weiteren Aspekt dieser Erfindung und die hier speziell untersuchte, umgekehrte Ausrichtung ermöglicht eine weitere Variante in der Konzeption von Polypeptiden, wenn eine optimale Kombination chemischer, physikalischer und biologischer Wirkungen für spezielle Fälle oder Anwendungen gesucht wird. Wenn man davon ausgeht, daß HTCA eine Aminosäuresequenz aufweist, die antiparallel zur ACTH Sequenz ist, dann ist die R-HTCA Sequenz parallel zur ACTH Aminosäuresequenz. Somit weisen sowohl parallele wie auch antiparallele Peptide oder Polypeptide, die komplementär zu einer ursprünglichen oder zu einer Ziel-Aminosäuresequenz sind, eine effektive Affinität dazu auf. Die Komplementarität oder Affinität eines komplementären Polypeptids zu einem ursprünglichen Peptid oder Protein wird, ungeachtet der Amino-Terminus- oder der Carboxy-Terminus-Ausrichtung dieses komplementären Polypeptids, aufrechterhalten.

BEISPIEL 1F

PRÄPARIERUNG UND EIGENSCHAFTEN EINES ANTIKÖRPERS ZU HTCA

Eine antigene HTCA-Art wurde durch Koppeln von 200 ug HTCA an 200 ug Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) mit 6,7 mM Glutaraldehyd gemäß den Verfahren von Avrameas et al (Immunochemistry (1969) Bd. 6, S. 53-66) präpariert. Überschüssiges Glutaraldehyd wurde vom HTCA-KLH-Konjugat mittels Durchlauf durch eine Bio-Rad P-10-Säule (Bio-Rad, Richmond, CA) entfernt.
Drei Injektionen, enthaltend 25 ug HTCA-KLH in 0,5 ml Freundsches Voll-Adjuvans, wurden einem Kaninchen in zweiwöchigen Abständen verabreicht. Das aus dem Kaninchen-Antiserum gewonnene Gesamtimmunglobulin wurde mittels Immunoaffinitätschromatographie an eine an Ziegen Anti-Kaninchen Immunglobulin gekoppelte Sepharose® 4B Säule (Pharmacia Fine Chemincals, Uppsala, Schweden) abgesondert. Um den Anti-HTCA Antikörper zu reinigen, wurde der KLH-Antikörper mittels Durchlauf durch eine an KLH gekoppelte Sepharose® 4B Säule vom Gesamtimmunglobulin entfernt. Eine Verdünnung von 1 : 300 des gereinigten Antikörper-Präparates (Anti-HTCA) würde in einer indirekten ELISA mindestens 100 ng des HTCA nachweisen.
Eine Induktion der Glukokortikoid-Produktion durch ACTH und Anti-HTCA wurde bei gezüchteten Säugetierzellen festgestellt. Duplikatkulturen von Nebennierentumorzellen (Y-1) von Mäusen in Mikrotiterplatten wurden mit den Kulturmedien, ACTH (10 Mikroeinheiten/Quelle) oder verschiedenen Verdünnungen des Anti-HTCA behandelt. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in Tabelle 12 angeführt. TABELLE 12 Wirkstoff a Kortikosteron-Äquivalent (Üg/ml) b Experiment ACTH Anti-HTCA Medium a Duplikatkulturen von Mäuse-Nebennierenzellen in Mikrotiterplatten wurden mit den Kulturmedien, ACTH (10 Mikroeinheiten/Quelle) oder den angeführten Verdünnungen des Antikörpers zu HTCA behandelt. Nach einer Inkubationsdauer von 18 Stunden bei 370 in 4%igem Co2 wurden verdoppelte Kulturen gepoolt und mittels Radioimmuntest (RIA) für Kortikosteron auf die Glukokortikoid-Produktion hin untersucht (Smith et al, Science (1982), Bd. 218, S. 1311-1312). b Die Vergleichs-Dosis-Wirkung der Testproben und das Kortikosteron-Niveau wurden über einen zehnfachen Bereich erzielt. Die Streuung der Versuchswerte betrug 8,8 Prozent. c Nicht durchgeführt
Die Aktivierung des Mäuse-Nebennierentumorzellen-ACTH-Rezeptors durch Anti-HTCA weist auf eine Konfigurationsanalogie zwischen Antikörper und ACTH hin. Weder normales Kaninchenserum noch Antikörper zu KLH verursachten eine Steroidreaktion (Daten nicht gezeigt). Die Aktivierung der Rezeptoren für Insulin (Sege et al, Proc. Nat'l. Aca. Sci. (1978) und für Beta-adrenerge Agenzien (Schreiber et al, Proc. Nat'l. Acad. Scie. (1980), Bd. 77, S. 7385-7389) durch anti-idiotype Antikörper, die gegen Antikörper für Insulin oder Beta-adrenerge Agenzien eingesetzt wurden, wird beschrieben. Somit besteht eine Analogiebeziehung zwischen komplementären Peptid-Liganden und antiidiotype Antikörpern.

BEISPIEL 1G

BINDEN VON ANTI-HTCA AN MÄUSE- NEBENNIERENTUMOR (Y-1)-ZELLEN

Mäuse-Nebennierentumor (Y-I)-Zellen wurden mittels Glutaraldehyd in flachbödige Quellen einer Mikrotiterplatte aufgebracht. Die befestigten Zellen wurden dann nur mit Kaninchen Anti-KLH oder Kaninchen Anti-HTCA oder mit verschiedenen ACTH-Anteilen behandelt. Nach dem Waschen wurden die Mikrotiterquellen mit Ziegen-Antikörper zu Kaninchen Immunglobulin behandelt, wobei der Ziegen-Antikörper an ein alkalisches Phosphatase-Enzym gekoppelt war. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Antikörper- Phosphatasekomplexes wurde p-Nitrophenylphosphat beigemengt und die Enzymabhängige Entwicklung der dekadischen Extinktion bei 405 nM aufgezeichnet. Wie in Fig. 5 gezeigt, hemmte ACTH die Bindung von Anti-HTCA in einer Dosisabhängigen Weise. ACTH und Anti-HTCA schienen sich für die gleiche Bindungsstelle an den Mäuse-Nebennierentumor (Y-1)-Zellen zu konkurrenzieren. Kaninchen Anti-KLH zeigte keine Wirkung (schattierter Bereich).

BEISPIEL 1H

REINIGEN DES ACTH-REZEPTORS

Gereinigtes Anti-HTCA wurde kovalent an bromcyan-aktivierte Sepharose® 4B gekoppelt. Ungefähr 10&sup8; Mäuse-Nebennierentumor (Y-I)-Zellen wurden bei Vorhandensein von 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid fünf Minuten mit 40 KHz (Branson E Module Bath Beschallungsgerät) beschallt. Nach Entfernen der Zellgewebstrümmer mittels Zentrifugieren wurde die überstehende Flüssigkeit durch eine chromatographische Säule, die an Anti-HTCA gekoppelte Sepharose
4B enthielt, geleitet. Nach gründlichem Waschen wurde das restliche Bindungsmaterial mit 0,1 M Glycin mit einem pH-Wert von 2,0 aus der Säule ausgewaschen. Das eluierte Material wurde neutralisiert und mittels Dialyse gegen Trocken-Polyethylenglycol konzentriert. Das konzentrierte Material wurde anschließend einer Gelchromatographie auf einer geeichten Sephacryl® S-200 Säule (Pharmacia, Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) unterzogen.
Aliquote Teile der Gelchromatographie-Fraktionen wurden mittels Radiorezpetor-Verfahrens auf ACTH Rezeptor-Aktivität hin untersucht. Kurz erklärt, umfaßt dieses Verfahren das Inkubieren dieser aliquoten Teile in Polyvinyl-Platten mit 96 Quellen während 18 Stunden und anschließender Entfernung des ungebundenen Materials durch Waschen. Mit radioaktivem Iod markiertes ACTH (¹²&sup5;I-ACTH, 70 Mikro-curie/ug, New England Nuclear, Boston, MA) wurde dann den Quellen beigemengt, und zwar mit und ohne unmarkierten ACTH-Überschuß (10 ug/Quelle). Die Platten wurden anschließend gründlich gewaschen und die Quellen aus den Platten entfernt und das ¹²&sup5;I-ACTH mittels eines Beckman Gamma 5500 Gammazählers gemessen. Die chromatographischen Fraktionen wurden auch auf dekadische Extinktion bei 280 nM überwacht. Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in Fig. 6 angeführt.
Spezifisch gebundenes ¹²&sup5;I-ACTH wurde durch Subtraktion der gebundenen Radioaktivität bei Vorhandensein von überschüssigem, unmarkiertem ACTH (im allgemeinen weniger als 10%) von der ohne unmarkiertes ACTH gebundene Radioaktivität festgestellt. Die Elutionspunkte der Molekulargewichtsniveaus bei 158 Kilo-Dalton (K), 67 K, 45 K und 14,4 K sind mit Pfeilen markiert.
Die ACTH Rezeptor-Aktivität hatte ein Molekulargewicht von ungefähr 80 bis 100 K und entspricht somit jenem, das in früheren Untersuchungen mittels Photoaffinitätsmarkierungsverfahren (Ramachandran et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (1980), Bd. 77, S. 3697-3970) für einen ACTH-Rezeptor festgestellt wurde.
Das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren veranschaulicht ein allgemeines erfindungsgemäßes Verfahren zur Gewinnung von Bausteinen jeder beliebigen Peptid- oder Protein-Ligandenrezeptorstelle. Zuerst wird ein Polypeptid, das zu wenigstens einem Teil des Peptids oder Proteins komplementär ist, hergestellt. Dann wird ein Antikörper gegen dieses komplementäre Polypeptid präpariert. Der Antikörper wird anschließend mittels chemischer oder adsorptiver Mittel an eine feste Matrix gekoppelt. Eine einen Rezeptor enthaltende Probe wird dann mit der Antikörpergekoppelten Matrix behandelt, um die Komponenten der Rezeptorstelle spezifisch zu binden. Zuletzt werden die gebundenen Komponenten eluiert.

BEISPIEL 1I

GAMMA-ENDORPHIN, KONZEPTION UND GEWINNUNG SEINES KOMPLEMENTÄREN POLYPEPTIDS

Um die allgemeine Anwendbarkeit und Bedeutung dieser Erfindung weiter zu veranschaulichen, wurde ein zweites Paar interaktiver, komplementärer Peptide untersucht. Nakanishi et al (Nature (1979), Bd. 278, S. 423-427) zeigte die Positionen 104 bis 120 der Vorstufe der Aminosäuresequenz von Rinder-Gammaendorphin und der entsprechenden mRNA-Sequenzcodierung auf. In Tabelle 13 ist diese Gamma-Endorphin-Aminosäuresequenz (mit Endo bezeichnet) und die entsprechende mRNA-Sequenz angeführt. Der komplementäre Strang der RNA (cRNA) Basenpaarung in antiparaller Richtung mit der mRNA für Gamma-Endo ist unter der mRNA angeführt, die cRNA ist in Tabelle 13 parallel zur mRNA angegeben. Das Polypeptid (Gamma-Odne), dessen Sequenz durch Lesen der cRNA von 5' in Richtung 3' gerichtet ist, ist unter der cRNA (mit Gamma-Odne bezeichnet) angeführt. TABELLE 13
Ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Gamma-Odne wurde von Peninsula Laboratories (San Carlos, CA) für die Erfinder synthetisiert.

BEISPIEL 1J

EIGENSCHAFTEN VON GAMMA (γ)-ODNE, DAS ZU GAMMA-ENDORPHIN (γ-ENDO) KOMPLEMENTÄRE POLYPEPTID

Synthetisches Rinder-Gamma-Endorphin wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) bezogen und Kaninchen Antikörper für synthetisches Gamma- Endo wurde von Accurate Biochemicals (Westbury, NY) bezogen.
Die Quellen einer rundbödigen Mikrotiterplatte mit 96 Quellen wurden (mittels des in Beispiel IB beschriebenen Verfahrens) mit Gamma-Odne (40 ug/Quelle), Insulin (20U/Quelle) oder Rinderserumalbumin (BSA, 200 ug/Quelle) überzogen. Unterschiedliche Konzentrationen von Gamma-Endorphin (wie in Abszisse in Fig. 7 angeführt) wurden während einer Stunde in den überzogenen Quellen inkubiert und anschließend wurden die Platten drei mal mit einer PBS-Tween Bufferlösung gewaschen. Die Quellen wurden dann mit Kaninchen Antikörper für Gamma-Endorphin behandelt, gewaschen und anschließend mit Ziegen Antikörper gegen Kaninchen-Immunoglobulin behandelt, wobei der Ziegen-Antikörper an eine alkalische Phosphatase konjugiert war. Nachdem das ungebundene Ziegen Antikörper Konjugat weggewaschen wurde, wurde die gebundene alkalische Phosphatase-Aktivität wie vorgängig beschrieben mittels p-Nitrophenylphosphat gemessen. Die nach dieser Behandlung erzielten Ergebnisse sind in Fig. 7 angeführt, wobei das Ausmaß der dekadischen Extinktion bei 405 nM den Grad der Gamma-Endorphin-Bindung an mit Gamma- Odne, Insulin oder BSA überzogenen Quellen widerspiegelt. Es war eindeutig, daß Gamma-Endorphin, im Vergleich zu seiner Bindung an das fixierte Insulin oder BSA, signifikant an das fixierte Gamma-Odne bindet. Der schattierte Bereich in Fig. 7 stellt das Ausmaß der Gamma-Endorphin-Bindung bei Vorhandensein eines löslichen Überschusses an Gamma-Odne dar. Somit wird veranschaulicht, daß ein zweites Paar von komplementären Peptiden in einer Weise interagiert, die eine Affinität und deutliche Kongruenz zeigt.

BEISPIEL 1K

ALLGEMEINE ANWENDBARKEIT FÜR DIE HERSTELLUNG VON KOMPLEMENTÄREN POLYPEPTIDEN

Die Ergebnisse der Beispiele 1A bis 1J zeigen spezielle Anwendungen eines allgemeinen Verfahrens für die Konzeption und Gewinnung von Polypeptiden, die komplementär zu Proteinen oder Peptiden sind, die zumindest eine zum Teil bekannte Nucleotidcodierungssequenz aufweisen. Beispielsweise kann die komplementäre Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid codiert, das zu wenigstens einem Teil eines ersten Proteins oder Peptids komplementär ist, wenn es von 5' in Richtung 3' gelesen wird, eine DNA sein. Diese DNA kann in ein Plasmid eingefügt werden, um einen rekombinanten DNA-Transfervektor zu bilden. Ein einzelliger Organismus, geeigneterweise eine Bakterienhefe oder Säugerzelle, kann dann mit dem rekombinanten DNA-Vektor umgewandelt werden, um einen transformanten einzelligen Organismus zu erzeugen, der das jeweilige komplementäre Polypeptid durch Biosynthese aufbaut. Die Methoden dieser Insertionen und Transformationen sind in den entsprechenden Fachkreisen gut bekannt.
Methoden für die chemische Polypeptid-Synthese aus Aminosäuren sowie Verfahren zur Gewinnung von Polypeptiden, beispielsweise mittels proteolytischen Ausschneidens aus Proteinen, die eine längere Aminosäuresequenz haben, aber die gewünschte komplementäre Aminosäuresequenz aufweisen, sind ebenfalls bekannt. Somit stehen viele Möglichkeiten für die Gewinnung von Polypeptiden, die komplementär zum Peptid- oder Proteinliganden sind, zur Verfügung.

BEISPIEL 1L

HEMMEN DER STREßREAKTION VON MÄUSEN MITTELS EINES PEPTIDS, DAS ZUM ADRENOKORTIKOTROPEN HORMON (ACTH) KOMPLEMENTÄR IST.

Als Reaktion auf verschiedene Streßarten produzieren Tiere Adrenokortikotropin (ACTH), das auf die Zellen der Nebennierenrinde wirkt, um einen erhöhten Serumspiegel des Kortikosterons zu produzieren. Um die Wirksamkeit der Hemmung der ACTH-Aktivität in vivo mittels eines komplementären Peptids, nämlich HTCA (siehe Beispiel 1A), zu testen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt. Mäusen (BALC/c) wurde das komplementäre Peptid HTCA injiziert, woraufhin sie eine Zeitlang gehalten und unter Streß gesetzt und anschließend enthauptet wurden und dann wurde der jeweilige Serum-Kortikosteronspiegel mittels herkömmlichen Immuntests bestimmt.
Beim ersten Experiment wurden 8 Gruppen von jeweils 3 BALB/c Mäusen je 1 mg in PBS (phosphatgebufferte Kochsalzlösung) aufgelöstes HTCA injiziert. Zwei Gruppen von jeweils 3 BALB/c Mäusen wurde nur PBS injiziert. Der durchschnittliche Kortikosteronspiegel jeder Mäusegruppe wurde nach unterschiedlicher Dauer und Streßbedingungen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 angeführt, wobei der Streß darin bestand, daß die Mäuse 30 Sekunden lang in Eiswasser getaucht wurden. TABELLE 14 Injektion Art* Dauer (Std.) Streß Kortikosteron * IM - intramuskuläre Injektion IP - intraperitoneale Injektion
Die größte beobachtete Wirkung, eine Verringerung des Serumkortikosterons von ungefähr 50%, erfolgte, wenn der Streß zwei Stunden nach der intramuskulären Injektion von 1 mg HTCA erfolgte. In einem zweiten Experiment wurden Gruppen von jeweils 3 BALB/c Mäusen das HTCA in unterschiedlicher Dosierung intramuskulär injiziert. Die Mäuse wurden zwei Stunden lang gehalten und durch Eintauchen in Eiswasser gestreßt. In Tabelle 15 ist der jeweilige Serumkortikosteronspiegel der verschiedenen Mäusegruppen angeführt. TABELLE 15 Injektion Streß Kortikosteron
Zusammengefaßt zeigen diese Experimente die Fähigkeit eines zu ACTH komplementären Peptids, die Kortikosteron-Streßreaktion in Mäusen zu verringern.

BEISPIEL 1M

HEMMEN DER BINDUNG VON ¹²&sup5;I-BETA-ENDORPHIN AN NG108-15 ZELLEN MITTELS EINES ZU GAMMA-ENDORPHIN KOMPLEMENTÄREN PEPTIDS

Es ist bekannt, daß NG108-15-Zellen Rezeptoren für Beta-Endorphin, die sogenannten Opiat-Rezeptoren, enthalten. Zusätzlich zu Beta-Endorphin binden Gamma-Endorphin und mehrere Analogien von Beta-Endorphin an diese Opiat- Rezeptoren. Das Peptid Gamma-Odne, das zu dem in Beispiel II beschriebenen Gamma-Endorphin komplementär ist, wurde auf seine Fähigkeit hin untersucht, die Bindung von ¹²&sup5;I-Beta-Endorphin an Opiat-Rezeptoren an NG108-15 Zellen zu hemmen. Gamma-Endorphin ist ein Fragment des größeren Peptids Beta- Endorphins.
In getrennten Experimenten wurde die spezifische Bindung von ¹²&sup5;I-Beta-Endorphin an in Mikrotiterquellen ausplattierte NG108-15 Zellen bestimmt, und zwar durch Konkurrenz mit unmarkiertem Beta-Endorphin. Siebzig Prozent der gesamten Bindung war nach herkömmliche Kriterien spezifisch.
Für dieses Experiment wurde ¹²&sup5;I-Beta-Endorphin zuerst 30 Minuten mit unterschiedlichen Mengen des komplementären Peptids, Gamma-Odne, vorinkubiert und dann 30 Minuten mit NG108-15 Zellen in Mikrotiterquellen bei 37ºC inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Zellen 3 mal gewaschen und die Zell-bezügliche Radioaktivität mittels eines Packard Multi-Prias Gammazählers bestimmt. Tabelle 16 veranschaulicht die Fähigkeit von Gamma- Odne, die Bindung von ¹²&sup5;I-Beta-Endorphin (10-¹¹M, 2000 Cl/mmol) an NG108-15 Zellen zu hemmen. TABELLE 16 Gamma-Odne-Konzentration % Hemmung von spezifischem ¹²&sup5;I-BETA-Endorphin

BEISPIEL 1N

INDUKTION VON KATATONIE IN MÄUSEN MITTELS ANTIKÖRPER ZU EINEM PEPTID, DAS KOMPLEMENTÄR ZU GAMMA-ENDORPHIN IST.

Es ist allgemein bekannt, daß hohe Dosen von opiatähnlichen Substanzen in Tieren einen katatonischen Zustand induzieren können, der durch eine Behandlung mit dem Opiat-Antagonist Naloxon gehemmt oder umgekehrt wird. In Analogie zu den Ergebnissen der vorhergehenden Beispiele wurde die Fähigkeit eines Peptids (Gamma-Odne), das komplementär zu einem Opiatpeptid, nämlich Gamma-Endorphin ist, untersucht, Antikörper zu induzieren, die Opiat-Eigenschaften aufweisen.
Gamma-Odne (Beispiel II) wurde mit Napfschnecken-Hämocyanin (KLN) konjugiert und mit Freundschen Adjuvans verwendet, um in herkömmlicher Weise (siehe Beispiel 1F) Kaninchen-Antikörper zu erzeugen. Sowohl das normale wie auch das induzierte Kaninchenserum wurde intrazerebroventikulär (i.c.) in weibliche ICR-Mäuse injiziert. Die Injektion von 50 ul eines normalen Kaninchenserums (1 : 100 verdünnt) ergab keine Induktion einer opiatähnlichen Katatonie. Die Injektion von 50 ug eines durch ein komplementäres Peptid (Gamma-Odne) induziertes Kaninchenserum (1 : 100 verdünnt) führte zu einer ausgeprägten Auslösung einer Katatonie, die durch gleichzeitige i.c. Injektion von 0,2 mg des Opiat-Antagonist Naloxon umgekehrt wurde.
Diese Ergebnisse veranschaulichen die Fähigkeit eines Antikörpers zu einem komplementären Peptid zu einem Opiat, seinerseits Opiataktivität zu zeigen.

BEISPIEL 10

ANTIGENE BEZIEHUNG ZWISCHEN ZWEI PEPTIDEN, DIE KOMPLEMENTÄR ZU ADRENOKORTIKOTROPIN (ACTH) SIND.

Zwei zu ACTH komplementäre Peptide, die in den Beispielen 1B und 1C als HTCA und 3'-5' HTCA beschrieben sind, wurden jeweils mit Glutaraldehyd an Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) gekoppelt (1 mg Peptid, 1 mg KLH, 30 mM Glutaraldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließender Dialyse), um Antigene zur Immunisierung von Kaninchen herzustellen. Zwei Kaninchen wurde über einem Zeitraum von vier Wochen ein mal pro Woche jeweils 250 ug des Peptid-KLH Antigens injiziert. Jedem Kaninchen wurde im Anschluß an die letzte Injektion zwei mal wöchentlich über einen Zeitraum von drei Wochen Blut abgenommen. Die Antikörper, die das gesamte Immunoglobulin aus dem Serum der zwei Kaninchen darstellten, wurden durch Ausfällen aus dem Serum mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat bei 4ºC gereinigt und anschließend erfolgte eine herkömmliche Ionenaustausch-Chromatographie an einer DEAE Säule.
Um die Bindung jedes Immunoglobulins an jedes der Peptide zu untersuchen, wurden enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmungen durchgeführt. Bei diesen Untersuchungen wurde eines der komplementären Peptide auf Polycarbonatplatten gestrichen und über Nacht in einem Carbonatschichtbuffer mit einem pH Wert von 9,0 belassen. Das ungebundene Peptid wurde durch dreimaliges Waschen mit Kochsalzlösung mit Phosphatbuffer (PBS) - TWEEN® 20 ausgeschieden. Den mit Peptid überzogenen Quellen in PBS- TWEEN® 20 Lösung wurden unterschiedliche Mengen des Immunoglobulins beigemengt und eine Stunde lang inkubiert. Das ungebundene Immunoglobulin wurde durch Waschen mit PBS TWEEN® 20 entfernt. Jeder Quelle wurde das an alkalische Phosphataseenzym gekoppelte Anti-Kaninchen IgG in einer Verdünnung von 1 : 300 beigemengt. Nach einer Stunde wurden die Quellen mit PBS-TWEEN® 20 gewaschen, um die ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen. Die Menge der verbleibenden Sekundärantikörper wurde bestimmt, indem das p-Nitrophenyl-phosphat mit dem verbleibenden alkalischen Phosphataseenzym 15 Minuten lang zur Reaktion gebracht wurde, die Reaktion dann mit 3M NaOH gestoppt und das Nitrophenol mittels Spektrophotometrie bei 490 nm gemessen wurde.
In Tabelle 17 sind die Ergebnisse dieses Versuchs aufgeführt. Die drei Kontrollversuche (ACTH Platten + immunisiertes Kaninchen-Immunoglobul in, HTCA Platten + normales Kaninchen-Immunoglobulin und 3'-5' HTCA Platten + normales Kaninchen-Immunoglobulin), bei denen sich in dieser Analyse in allen drei Fällen weniger als 0,01 dekadische Extinktion ergab, sind nicht angeführt. TABELLE 17 Beigemengter Antikörper Immunogen dekad. Extinktion bei 490 mm Mit HTCA überzogene Platten Mit 3'-5'-HTCA überzogne Platten
Diese Ergebnisse verdeutlichen, daß Antikörper zu einem komplementären Peptid ein anderes komplementäre Peptid erkennen und daran binden. Die zwei komplementären Peptide sind daher antigenisch verwandt, obwohl ihre Sequenzen nur eine Stelle aufweisen, an der die gleiche Aminosäure in der gleichen absoluten Stelle vorkommt.

BEISPIEL 1P

IDIOTVPE:ANTI-IDIOTVPE - BEZIEHUNG ZWISCHEN ANTIKÖRPERN ZU ADRENOKORTIKOTROPIN (ACTH) UND ANTIKÖRPER ZU EINEM ZU ACTH KOMPLEMENTÄREN PEPTID

Ein üblicher Radioimmuntest (RIA) für ACTH (Immuno Nuclear Corporation, Kat. Nr. 2400) wurde verwendet, um die Fähigkeit von Antikörpern zu einem Peptid (HTCA), das komplementär zu ACTH ist, sich mit Antikörpern zu ACTH zu binden, festzustellen. In einem üblichen RIA für ACTH wird unmarkiertes ACTH in bekannten Mengen einer Lösung von radiomarkierten ACTH und Antikörpern zu ACTH beigemengt, um die Bindung von radiomarkierten ACTH zu seinem Antikörper zu konkurrenzieren. Die Menge der radiomarkierten Bindung wird durch Immunoausfällung des Antikörpers und Messung der Radioaktivität der Ausfällung festgestellt.
In diesem Experiment wurde unmarkiertes ACTH, Immunoglobulin von Kaninchen, die mit dem komplementären Peptid HTCA immunisiert wurden, und Immunoglobulin von normalen Kaninchen verwendet, um beim RIA mit den radiomarkierten ACTH zu konkurrenzieren. Es wurden Immunoglobulinlösungen (35 mg/ml) in phosphatgebufferter Kochsalzlösung präpariert und ACTH und ¹²&sup5;I-ACTH wurden gemäß Anleitung des RIA Gerätes präpariert. Die Ergebnisse dieses Konkurrenzierungstests sind in Tabelle 18 angegeben. TABELLE 18 beigemengte Konkurrenzsubstanz Prozent spezifischer Bindung keine IgG HTCA (Verdünnung 1:10) Normal
Diese Ergebnisse verdeutlichen, daß Antikörper zu einem Peptid, das komplementär zu ACTH ist, Antikörper zu ACTH erkennen und daran binden und somit eine idiotype:antiidiotype Beziehung zwischen den Antikörpern klarlegen.

BEISPIEL 10

IN VIVO WIRKSAMKEIT VON ANTIKÖRPERN ZU EINEM ZU ADRENOKORTIKOTROPIN (ACTH) KOMPLEMENTÄREN PEPTID, DURCH TIERIMPFUNG HERGESTELLT

Ein zu ACTH komplementäres Peptid (siehe HTCA gemäß Beispiel 1A) wurde mittels dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahrens mit Napfschnecken- Hämocyanin (KLH) konjugiert. Pro Zeitfolgepunkt wurden drei BALB/c Mäuse immunisiert (100 ug Konjugat/0,2 ml Voll-Freundsches Adjuvans am Tag Null intraperitoneal und subkutan injiziert, 100 ug Konjugat/0,2 ml unvollständiges Freundsches Adjuvans in den Wochen 1, 2, 3 und 4 intraperitoneal und subkutan injiziert). Vier Kaninchen wurden immunisiert (300 ug Konjugat/ 1,0 ml Voll-Freundsches Adjuvans am Tag Null injiziert, 200 ug Konjugat/1,0 ml unvollständiges Freundsches Adjuvans an den Tagen 10, 20, 30, 40 und 60 injiziert).
Im Verlauf des Mäuse-Experiments wurden bei jedem Zeitfolgepunkt drei Mäuse geopfert, ihr Blut aufgefangen und gerinnen lassen, dann wurden ihre Antikörpertiter mittels eines Festphasenradioimmuntests (RIA) wie folgt bestimmt. HTCA wurde in Quellen einer Polyvinyl-Mikrotiterplatte mit einer Lösung (0,25 mg/ml) überzogen. Die Quellen wurden mit einer TWEEN® 20 enthaltenden, phosphatgebufferten Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und Serum in seriellen Verdünnungen von 1 : 5 beigemengt. Nach einer Stunde wurde ¹²&sup5;I Kaninchen Anti-Mäuse-Immunoglobulin beigemengt und die Quellen mit PBS- TWEEN® 20 gewaschen, um die ungebundene Radiomarkierungen zu entfernen. Die Quellen wurden gestanzt und gemessen, um die Titer zu bestimmen. Bei Mäuse-Untersuchungen wird der Titer als die Serumverdünnung definiert, die 100 Zählimpulse pro Minute über dem Hintergrund produziert. Der Kortikosteronspiegel des Serums wurde ebenfalls bei jedem Zeitfolgepunkt mittels üblichem RIA analysiert.
Im Verlauf des Kaninchen-Experiments wurden bei jedem Zeitfolgepunkt 2 ml Blut abgenommen, das man gerinnen ließ und bis zu den Analysen einfror. Antikörper wurden mittels enzymverbundener Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) wie folgt bestimmt. HTCA wurde über Nacht mit einer 0,25 mg/ml- Lösung in Quellen einer Polycarbonatplatte überzogen. Dann wurden die Quellen gewaschen und Serum in seriellen Verdünnungen von 1 : 5 beigemengt. Nach einer Stunde wurde mit alkalischer Phosphatase (Verdünnung 1 : 300) konjugiertes Ziegen Anti-Kaninchen Immunoglobulin beigemengt. Nach einer Stunde wurden die Quellen mit PBS-TWEEN® 20 gewaschen. P-Nitrophenolphosphat Substrat wurde beigemengt, worauf man sie 15 Minuten lang reagieren ließ und die Reaktion anschließend mit 3M NaOH gestoppt wurde. Die Titer wurden mittels Spektrophotometrie durch dekadische Extinktion bei 490 nm bestimmt. Bei der Kaninchen-Untersuchung wird der Titer als die Serumverdünnung definiert, die eine dekadische Extinktion von 0,05 (Hintergrund gleich 0,01) erzeugt. Der Kortikosteronspiegel des Serums wurde ebenfalls bei jedem Zeitfolgepunkt mittels üblichem RIA analysiert.
In den Tabellen 19 und 20 sind die Ergebnisse dieser Experimente dargestellt, wobei die Antikörper zu HTCA-Titer und die Serum- Kortikosteronspiegel als Prozent der Kontrollversuche (Tiere, die nur mit KLH immunisiert wurden und denen in den gleichen Zeitabständen wie jenen, denen HTCA verabreicht wurde, das Blut abgenommen wurde), angeführt sind. TABELLE 19 Mäuse-Experiment Tag HTCA-Titer Kortikosteron (% der Kontrolle) TABELLE 20 Kaninchen-Experiment Tag HTCA-Titer Kortikosteron (% der Kontrolle)
Beim Mäuse-Experiment waren die Kortikosteronspiegel der Kontrollen nahezu normal, ausgenommen beim letzten Zeitfolgepunkt, wo er etwa drei mal so hoch wie normal war. Die Kortikosteronspiegel bei den Kontroll-Kaninchen waren unter den Normalwerten, fielen zwischen den Tagen 0 und 30 ab und stiegen bis zum 60. Tag wieder auf die normalen Werte an.
In beiden Experimenten erfolgte ein plötzlicher Anstieg einer hormonähnlichen (ACTH) Reaktion, auf die ein allgemeiner Abfall der Reaktion folgte. Diese Experimente beweisen die Fähigkeit von komplementären Peptid- Antigenen, Hormonreaktion in vivo abzuschwächen, und zwar durch Stimulieren der Antikörperproduktion mit Rezeptor-Bindungswirksamkeit. Es wurden keine Anstrengungen in der Richtung unternommen, die Antigene für die Produktion von Agonist- oder Antagonist-Antikörper zu verändern, wie dies für andere Situationen wünschenswert sein mag.

BEISPIEL 1R

POTENTIELLER DIAGNOSEVERSUCH BEZÜGLICH AUF KOMPLEMENTÄRE PEPTID-BINDUNG BERUHENDES ADRENOKORTIKOTROPIN (ACTH)

Die potentiellen Möglichkeiten für die Verwendung eines Peptids, das komplementär zu ACTH, insbesondere zu HTCA gemäß Beispiel 1A, ist, durch Bestimmen des ACTH Spiegels in Serum wurde untersucht, wobei ein Festphasenradiobindungstest angewendet wurde.
Komplementäres Peptid (HCTA) wurde in phosphatgebufferter Kochsalzlösung (PBS) zu 1 mg/ml aufgelöst und jeweils 200 ul in aliquoten Teilen in Quellen einer Polyvinyltestplatte mit 96 Quellen (Microtest 111, Falcon Kat. Nr. 3911) gegeben. Über Nacht ließ man das HTCA bei 4ºC die Quellen überziehen. Die Überzugslösung wurde entfernt und die Quellen drei mal mit PBS gewaschen. Radiomarkiertes ACTH (¹²&sup5;I-ACTH, New England Nucelar NEX-65) wurde in PBS, das 0,0005% TWEEN®-20 enthielt, verdünnt, so daß sich 50 pg (oder ungefähr 30.000 cpm) in einem Volumen von 20 ul ergab.
Serumproben wurden in einer Gewebekulturplatte durch serielle Verdünnung des Serums in PBS/TWEENOR 20 aufbereitet, so daß sich ein Endvolumen von 180 ul/Quelle ergab. Dann wurden die Serumproben auf die HTCA überzogene Versuchsplatte übertragen und inkubiert. Zuletzt wurden 20 ul der ¹²&sup5;I-ACTH Lösung beigemengt, inkubiert und die gesamte Probe von 200 ul entfernt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Quellen von der Platte ausgeschnitten und in einem Gammazähler gemessen. Die nicht-spezifische Bindung wurde dadurch bestimmt, daß einigen Proben 5 ug eines unmarkierten ACTH beigemengt wurden, bevor sie auf die Versuchsplatte übertragen wurden.
Die in dieser Untersuchung verwendeten Serumproben enthielten entweder 50 pg/ml oder 500 pg/ml ACTH, das fötalem Kalbsserum (FCS) beigemengt wurde.
Die Angaben in Tabelle 21 zeigen die prozentuelle Hemmung der spezifischen ¹²&sup5;I-ACTH Bindung als Funktion der Serumverdünnung für beide droben. TABELLE 21 Log&sub1;&sub0; Verdünnung 50 pg/ml % Hemmung der spezif. Bindung 500 pg/ml % Hemmung der spezif. Bindung
Bei diesem Versuch wurde festgestellt, daß die gesamte spezifische Bindung 1000 Zählimpulse pro Minute betrug und, ausgehend von der spezifischen Aktivität, 50% der spezifischen Bindung 0,85 pg des ACTH in einer Serumverdünnung entspricht.
Wie durch übliche Radioimmuntests festgestellt wurde, trat bei den 50 pg/ml Serumproben 50% Hemmung bei einer Log&sub1;&sub0; Verdünnung von -1,1 auf (mittels graphischer Interpolation bestimmt). Bei dieser Untersuchung wird also die Serumprobe als 54 pg/ml gemessen, was mit den üblichen Verfahren gut übereinstimmt.
Durch graphische Interpolation trat, wie erwartet, bei der 500 pg/ml Serumprobe eine 50% Hemmung bei einer Log&sub1;&sub0; Verdünnung von -2,0 auf.
Diese Ergebnisse beweisen die Machbarkeit der Entwicklung von diagnostischen Tests, die auf der komplementären Peptidbindung beruhen.

BEISPIEL 1S

VERGLEICH DER BINDUNG VON ¹²&sup5;I-ADRENOKORTIKOTROPIN MIT 5'-3'UND 3'-5' KOMPLEMENTÄREN PEPTIDEN

Eine Festphasenbindungs-Analyse wurde angewandt, um die Fähigkeit von 5'-3' sowie von 3'-5' komplementären RNA-Strang-Peptiden (siehe Beispiel 1A und 1C) an ¹²&sup5;I-ACTH zu binden, zu ermitteln. Die Peptide wurden in phosphatgebufferter Kochsalzlösung (140 mM-NaCl/3mM-KCl/0,1% NaN3/20 mM- Phosphatbuffer, pH-Wert 7,4) auf 2 mg/ml verdünnt und 0,2 ml/Quelle wurden in Poly(vinylchlorid)-Mikrotiterplatten (Becton und Dickinson, Oxnard, CA, U.S.A.) gegeben. Nach 18 Stunden bei 4ºC wurde das ungebundene Peptid durch 3-maliges Waschen mit phosphatgebufferter Kochsalzlösung, die 0,1%
5 Rinderserumalbumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S. A.) enthielt, entfernt. Das ¹²&sup5;I-ACTH wurde mit phosphatgebufferter Kochsalzlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und in Peptidüberzogenen Quellen während 60 Minuten bei 4ºC inkubiert.
Einigen Quellen wurden, zusätzlich zum ¹²&sup5;I-ACTH, verschiedene Konzentrationen von löslichen Peptiden beigemengt, um die Spezifität der Bindung zu demonstrieren. Nach dem Inkubieren wurde die ungebundene Radiomarkierung mit phosphatgebufferter Kochsalzlösung, die 0,1% Rinderserumalbumin enthielt, ausgewaschen und die Radioaktivität der einzelnen Quellen wurde mittels Gammastrahlung-Zählung gemessen. Der Betrag der spezifisch gebundenen Radioaktivität wurde dadurch festgestellt, daß die ¹²&sup5;I-ACTH-Bindung mit unmarkiertem ACTH blockiert wurde. Zusätzliche Kontrollversuche bestanden darin, Quellen mit Insulin oder Rinderserumalbumin (2 mg/ml) zu überziehen, bevor das ¹²&sup5;I-ACTH beigemengt wurde.
Bei diesen Experimenten trat bei beiden komplementären Peptiden eine halb-maximale Bindung von ¹²&sup5;I-ACTH bei 0,3 mM ACTH auf. Es wurde festgestellt, daß mehr als 84% der Bindung spezifisch war und weniger als 5% Bindung an komplementäre Peptidplatten wurde bei den Insulin- oder Rinderserumalbumin-Platten beobachtet. Wenn beide komplementäre Peptide in der Lösung vorhanden waren, konkurrenzierten sie im gleichen Ausmaß, die ¹²&sup5;I-ACTH-Bindung an ihre jeweiligen absorbierten Gegenstücke zu hemmen.
Durch diese Daten wird belegt, daß beim ACTH-System die 5'-3' und die 3'-5' komplementären Peptide hinsichtlich der Bindung von ACTH gleich wirksam sind.

BEISPIEL 2A

HOMOLOGIEN ZWISCHEN PEPTID-HORMONEN UND POLYPEPTIDEN, DIE DURCH UMGEKEHRT GELESENE NUCLEINSÄUREN CODIERT SIND, DIE KOMPLEMENTÄR ZU NUCLEINSÄUREN SIND, DIE FÜR DIE PEPTIDHORMONREZEPTORPROTEINE CODIEREN.

Es besteht eine subtile, jedoch signifikante funktionelle und strukturelle Beziehung zwischen Peptiden, die durch komplementäre Stränge der Nucleinsäure codierend spezifiziert sind. Diese Beziehung zeigte sich, wenn die komplementäre Nucleinsäure in der üblicherweise transkribierten Richtung von 5'-3' gelesen wurde (siehe beispielsweise Tabelle 1, Fig. 1 und Beispiele 1A bis 1H). Werden die komplementären Nucleinsäuren in umgekehrter Richtung oder von 3' in Richtung 5' gelesen, ist die Beziehung der sich daraus ergebenden codierten Aminosäuresequenzen ähnlich offensichtlich wie dies in den folgenden Beispielen demonstriert wird.

BEISPIEL 2B

EPIDERMISWACHSTUMSFAKTOR (EGF), EGF REZEPTOR UND KOMPLEMENTÄRE BOTSCHAFT AN DEN EGF REZEPTOR

Die in Fig. 8 angeführte Aminosäuresequenz vom EGF und dessen codierende Nucleotid-(mRNA)-Sequenz sind aus Gray et al (Nature (London, 1983), Bd. 303, S. 722) und Scott et al (Science (1983), Bd. 221, S. 236) entnommen. Des weiteren ist in Fig. 8 eine partielle Aminosäuresequenz und eine partielle codierende Nucleotidsequenz (cDNA) für EGF angeführt, die aus Ulrich et al (Nature London, 1984), Bd. 309, S. 418) entnommen sind.
In der letzten Spalte in Fig. 8 ist die Nucleotid-(RNA)-Sequenz angeführt, die komplementär zur RNA-Sequenz ist, die für den EGF Rezeptor codiert. Eine antiparallele Basenpaarung-Ausrichtung der EGF Rezeptor- Nucleotidsequenz und deren komplementäre Nucleotidsequenz wurde vorausgesetzt. Die komplementäre Nucleotidsequenz wurde im gleichen Leserahmen wie die codierende Sequenz gelesen, jedoch von 3' in Richtung 5'. Die über der komplementären Nucleotidsequenz angeführte codierte Aminosäuresequenz wurde damit erzielt. Das XXX Codon symbolisiert das Ende. Wenn die Amino-Terminus-Richtungen der in Fig. 8 gezeigten Aminosäuresequenzen in der niedriger numerierten Richtung sind, erscheinen zwei homologe Bereiche (in Kästchen) der Rezeptor-komplementären Polypeptide und der EGF. Die gesamte EGF Rezeptor-komplementäre Sequenz (nicht aufgeführt) wurde analysiert, um nur diese zwei komplementären Aminosäurebereiche zu erhalten. Es wurde festgestellt, daß die EGF Aminosäuresequenzen 11-16 und 24-29 homolog zu den Aminosäuresequenzen 111-116 und 149-154 sind, die jeweils durch die zu der des EGF Rezeptors komplementären Nucleotidsequenzen codiert sind.
Wie in Fig. 8 veranschaulicht, sind bei den zwei homologen Bereichen des EGF, der aus sechs Aminosäuren besteht, fünf Aminosäuren in jeder Sequenz identisch (83% Homologie). Des weiteren ist bei den Nucleotidsequenzen zwischen den zwei Bereichen eine Nucleotid-Homologie von 67 resp. 78%, wobei der größte Teil der Nucleotid-Unterschiede die codierten Aminosäuren (z. B. dritter Basenaustausch) nicht beeinflußt. Die zwei homologen Aminosäurebereiche umfassen ungefähr 23% der gesamten EGF Aminosäuresequenz (12 von 53 Seitenketten) und die Homologie ist so auffallend, daß ein Zufall äußerst unwahrscheinlich ist. Daß es sich bei dieser Aminosäure-Homologie um keinen Zufall handelt, wird durch die Beobachtung stark untermauert, daß, als die Sequenzen ASP-GLY-TYR-X-LEU-ASN und GLU-SER-LEU-X-SER-TYR (wobei X jede beliebige Aminosäure ist) in der Proteinsequenzbank der National Biomedical Research Foundation (NBRF) mit 3060 Proteinen verglichen wurden, nur EGF diese Sequenzen aufwies. Es wurde die SIAO [Blomquist] NEW. PRO: 80 Files Proteinsequenz-Datenbank der National Biomedical Research Foundation abgesucht. Im gesamten wurden 3.060 Proteinsequenzen untersucht, die 616.748 Testsegmente von 6 Aminosäuren- Längen oder 619.803 Testsegmente von 5 Aminosäuren-Längen umfaßten. Um die Suche nach homologen Sequenzen an Stellen mit Unterschieden zwischen den Liganden- und Rezeptorkomplementsequenzen nicht einschränkend zu beeinflussen, wurde jede beliebige Aminosäure (X) als passendes Gegenstück akzeptiert. Somit beschränkte sich die Suche nach homologen Sequenzen nicht auf die in Fig. 2 gezeigten, spezifischen Liganden- oder Rezeptorkomplementsequenzen, vielmehr war jede Aminosäuresubstitution an Stellen mit Unterschieden möglich. Von den auf Homologie untersuchten 616.748 Segmenten von 6 Aminosäurenlängen enthielt nur EGF diese Sequenzen. Daher verdeutlicht die Beziehung zwischen diesen Aminosäurensequenzen eine signifikante Beziehung zwischen dem EGF und seinem Rezeptor.

BEISPIEL 2C

STATISTISCHE SIGNIFIKANZ VON AMINOSÄURE UND NUCLEOTID-HOMOLOGIEN ZWISCHEN PEPTIDHORMONEN UND POLYPEPTIDEN, DIE DURCH NUCLEOTIDSEQUENZEN CODIERT SIND, WELCHE KOMPLEMENTÄR ZU NUCLEOTIDSEQUENZEN SIND, DIE FÜR PROTEINE DER PEPTIDHORMONREZEPTOREN CODIEREN.

Die statistische Signifikanz der Homologie zwischen zwei beliebigen Nucleotidsequenzen wurde durch Berechnung der Pa-Werte bestimmt, welche die Wahrscheinlichkeit einer sich zufällig ergebenden Homologie aufweisen würden. Die verwendete Gleichung war eine Summierung der Poisson-Verteilung.
Dabei ist N die Länge der Nucleotide in der homologen Sequenz, i ist die Anzahl der passenden Gegenstücke in der Sequenz und p ist die Wahrscheinlichkeit, daß irgendein gegebenes Nucleotid paßt. Bei einer vollkommenen Zufälligkeit ist p gleich 0,25, falls keine Präferenz für irgendein Nucleotid an irgendeiner Stelle gegeben ist. Um festzustellen, ob irgendeine signifikante Abweichung von der Zufälligkeit vorkam, wurden die p-Werte für alle drei Rezeptoren empirisch bestimmt. Tatsächlich lagen die p-Werte immer zwischen 0,25 und 0,27, daher setzten wir für die Berechnung der Pa Werte der Einfachheit halber voraus, daß p = 0,25. Ist in Sequenzen mit vollkommener Zufälligkeit N=18 und N=15, ist die Anzahl der passenden Nucleotid-Gegenstücke (i) 4,5 respektive 3,75. Um die Abweichung von der Zufälligkeit der Rezeptorsequenzen für N=18 und N=15 zu festzustellen, wurden die i-Werte für jeden Rezeptor empirisch ermittelt und sie betrugen 4,75 (1,41) respektive 3,88 (1,45). Um als statistisch signifikant zu gelten, mußten die i-Werte größer als zwei Standardabweichungen vom Durchschnitt (d. h. i 7,57 für N=18 und i 6,78 für N=15) sein. Somit wurden Pa-Werte von 4,63·10&supmin;² für N=18 oder 4,87·10&supmin;² für N=15 als statistisch signifikant erachtet. Pa-Werte, die kleiner oder gleich 4,63·10&supmin;² für 18 Nucleotide und 4,87· 10&supmin;² für 15 Nucleotide waren, wurden empirisch als statistisch signifikant bestimmt. Aus Fig. 9A geht hervor, daß die errechneten Pa-Werte der Nucleotidsequenz-Homologien zwischen EGF und den zwei EGF-Rezeptorkomplementen 1,60·10&supmin;³ respektive 1,78·10&supmin;&sup4; betragen.
Die Homologien zwischen diesen Sequenzen sind daher äußerst signifikant, nachdem die Anzahl der passenden Gegenstücke größer als fünf Standardabweichungen von der durchschnittlich vollkommenen Zufälligkeit ist.
In weiteren Analysen, die im allgemeinen gemäß dem Verfahren in Beispiel 2B durchgeführt wurden, wurde die Beziehung von anderen Peptidhormonen mit ihren Rezeptoren und Rezeptor-komplementären Polypeptiden aufgedeckt.
Die in Fig. 9B angegebenen Aminosäure- und Nucleotidsequenzen wurden folgenden Quellen entnommen:
Interleukin -2 (IL-2) von Taniguchi et al (Nature (London, 1984) Bd. 302, S. 305) und Devos et al (Nucl. Acid Res. (1983) Bd. VII, S. 4307).
Interleukin-2 Rezeptor (IL-2 Rezeptor) von Nikaido et al (Nature (London, 1984) Bd. 311, S. 631).
Transferrin (TF) von Yang et al (Proc. Nat'l. Acad. Sci. (1984) Bd. 81, S. 2752).
Transferrin Rezeptor (TF Rezeptor) von Schneider et al (Nature (London, 1984) Bd. 311, S. 675).
Wie aus Fig. 9A und 9B hervorgeht, wurden ähnliche Ergebnisse wie jene hinsichtlich des EGF Systems erzielt, wenn IL-2 und TF auf Homologie mit ihren entsprechenden Rezeptorkomplementen untersucht wurden. Bei IL-2 wurden zwei homologe Bereiche von 6 und 5 Aminosäuren (Fig. 9A) mit 83 respektive 80% Aminosäure-Homologie gefunden. Dazu war auch noch die Nucleotid-Homologie zwischen den zwei Sequenzen (61 respektive 67%) äußerst signifikant (Pa = 4,26·10&supmin;³ respektive 3,56·10&supmin;³). Beide Aminosäuresequenzen (LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU und TYR-ARG-MET-X-LEU, wobei X jede beliebige Aminosäure ist) wurden mit 3060 Proteinen in der NBRF Sequenz-Datenbank auf Homologien überprüft.
Bei 616.748 Testsegmenten von sechs Aminosäuren-Längen wiesen nur 7 Proteine, einschließlich IL-2, eine Homologie mit LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU auf.
Bei der Überprüfung der Sequenz LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU (wobei X jede beliebige Aminosäure ist) auf Homologien mit 616.748 Testsegmenten von 6 Aminosäure-Längen enthielten sieben Proteine homologe Sequenzen. Dazu zählten menschliches IL-2, menschliches und Mäuse Ig Alpha schwere Kette, Arabinose Operon Regulationsprotein von E.coli und S.typhimurium, Gen K Protein aus OX-174 und Protein 4 von Asperqillus amstelodami mitochondra. Es wies jedoch nur ein Protein (IL-2) vollständige Homologie mit IL-2 auf, bei dem X ein HIS ist, und nur ein Protein (Protein 4 von Aspergillus amstelodami mitochindria) wies vollständige Homologie mit dem IL-2 Rezeptorkomplement auf, bei dem X ein THR ist. Bei der Überprüfung der Sequenz TYR-ARG-MET-X-LEU auf Homologien im Vergleich zu 619.803 Segmenten von fünf Aminosäuren-Längen, enthielten nur IL-2 und die Hämoglobin-Alpha- Kette der südafrikanischen Kröte homologe Sequenzen. Zusammenfassend wurde festgestellt, daß die zwei homologen Sequenzen nur in Verbindung mit IL-2 vorkamen.
Bei TF und seinem Rezeptorkomplement zeigten sich viele Bereiche signifikanter Sequenz-Homologie, es sei jedoch darauf hingewiesen, daß aus Platzgründen nicht alle Bereiche von Homologie gezeigt werden. Die in Fig. 9B gezeigten, repräsentativen Sequenzen weisen zumindest 53% Nucleotid- Homologie auf und haben Pa-Werte, die unter jenen als statistisch signifikant beurteilten Werten liegen. Bei der Überprüfung auf Homologie in der NBRF Sequenz-Datenbank der Aminosäuresequenzen ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU und GLU-PHE-X-LEU-PHE-SER (wobei X eine beliebige Aminosäure ist) im Vergleich zu 3.060 Proteinen zeigte sich, daß nur TF beide Sequenzen enthielt. Die zweite Sequenz wurde nur in Transferrin gefunden, wohingegen ILE-PRO-X-GLY- LEU-LEU in Transferrin, Lactotransferrin und nur drei unverbundenen Proteinen (baktierielle Tryptophan-Syntheta-se, E. coli Colicin E1 Immunitätsprotein und Influenza C Hämagglutinin-Präkursor) gefunden wurde.

BEISPIEL 2D

Betrachtet man die in Beispiel 2C dargelegten Ergebnisse, besteht wohl kaum ein Zweifel darüber, daß die Nucleotidsqequenzen für Liganden und Rezeptoren äußerst signifikante Bereiche an Komplementarität aufweisen. Bis heute waren das die einzigen Liganden-Rezeptor-Paare, für die die komplette Aminosäure- und Nucleotidsequenzen bekannt waren. Somit stützen alle bis heute zur Verfügung stehenden Daten über Sequenz die Hypothese, daß Rezeptor- und Liganden-Bindungsstellen sich aus komplementären Strängen der Nucleinsäure entwickelt haben können. Es gibt mehrere Beobachtungen, die die Ansicht untermauern, daß die hier aufgezeigten komplementären Bereiche tatsächlich an der Bindungsstelle für die Rezeptoren für die Aminosäuresequenzen codieren. Erstens wurden die komplementären Aminosäuresequenzen immer in dem zur zytoplasmatischen Membran äußeren Teil des Rezeptors gefunden. Beispielsweise waren die zwei im EGF Rezeptor- Komplement entdeckten, homologen Sequenzen im äußeren 100.000 Dalton Bereich (der Bereich, der EGF an den Rezeptor bindet), wohingegen im 60.000 Dalton zytoplasmatischen Bereich (der Bereich der Protein Kinase-Aktivität) keine Homologien gefunden wurden. Diese Entdeckung traf auch bei den IL-2 und TF-Rezeptorsequenzen zu, da in allen Fällen die Homologien im äußeren Bereich auftreten, der zur Ligandenbindung beiträgt. Zweitens entspricht die Größe der Liganden (5-6 Aminosäuren) annähernd der, die zu erwarten ist, um eine vollständige Rezeptorstelle auszufüllen, wenn man Antikörper- Verbindungsstellen für ein Beispiel verwenden würde, wie es von Nisenoff et al (The Antibody Molecule (Academic Press, N.Y. 1984) S. 29-38) aufgezeigt wurde. Diese Sequenzen scheinen Bindungsstellen darzustellen, wobei anzunehmen ist, daß eine davon sich an jedem Kontaktpunkt zwischen dem Rezeptor und dem Liganden befindet. Drittens und wichtigstens wurde, wie vorher erwähnt, bewiesen, daß die Hormone ACTH und Gamma-Endorphin mit großer Affinität an synthetisch abgeleitete Peptide binden, die durch eine RNA codiert sind, welche komplementär zur jeweiligen Hormon-mRNA ist. Diese Beobachtung verdeutlicht, daß Aminosäuresequenzen, die komplementär zu einem Peptid sind, tatsächlich dieses Peptid binden und daher die zu dem Peptid komplementäre Sequenz eine rezeptorähnliche Bindungsstelle aufweisen muß. Des weiteren wurde die "synthetische" Bindungsstelle für ACTH antigenisch mit einer ACTH Nebennierenzellen-Rezeptor verbunden. Alles in allem deuten diese Beobachtungen darauf hin, daß Peptid-Rezeptor-Bindungsstellen letztlich von komplementären Strängen der Nucleinsäure abgeleitet werden können.
Falls sich herausstellen sollte, daß Protein-Protein Bindungswechselwirkungen, die von den komplementären Strängen der Nucleinsäure herrühren, in der Biologie ein so allgemeines Phänomen darstellen, wie dies hier dargelegt wurde, ergäben sich viele Anwendungsmöglichkeiten für dieses Konzept. Zum Beispiel würde die Kenntnis über die Ligandensequenzen bei Anwendung von ähnlichen Methoden wie vorher beschrieben, eine einfache Reinigung und Charakterisierung von Rezeptoren ermöglichen. Wertvolle Informationen über die Liganden-konformation in der Umgebung der Bindungsstellen können gewonnen werden, indem klar definierte Liganden-"Bindungsstellen"-Paare konzipiert werden. Schlußendlich ermöglicht die Kenntnis über die Bindungsstellesequenzen für Rezeptor- Ligandenpaare auch die Konzeption von kleinen, klar definierten Rezeptor- Agonisten und/oder von Antagonisten, die für die Manipulation von biologischen Reaktionen wertvoll sind. Diese Erkenntnisse können auch bei der Untersuchung und dem Verständnis der Differenzierung und Embryogenesis von Bedeutung sein. Zum Beispiel könnte allein die Transkription einer DNA-Sequenz durch eine Zelle und die ihres Komplements durch eine andere Zelle die zelluläre Erkennung und Kommunikation mittels der sich daraus ergebenden, interagierenden Peptide oder Proteine ermöglichen. Die hier beschriebenen Konzepte können beispielsweise eine genetische und molekulare Grundlage für die Einsicht in das Immunsystem und die Bildung von Schaltkreisen im Zentralnervensystem liefern.
Die hier beschriebenen Entdeckungen, insbesondere die in den Beispielen 2A bis 2C, erläutern ein Verfahren für die Herstellung von Polypeptiden mit Affinität für zelluläre Rezeptorstellen von bestimmten Peptidhormonen. Dieses Verfahren umfaßt eine Reihe von Schritten. Zuerst wird eine zweite Nucleotidsequenz einer zweiten Nucleotidstrang-Basenpaarung mit einem ersten Nucleotidstrang, der für wenigstens einen Teil einer proteinischen Komponente einer Peptidhormonrezeptorstelle codiert, ermittelt. Dann werden homologe Aminosäuresequenzen zwischen der Peptidhormon- und der Aminosäuresequenz, die durch die zweite Nucleotidsequenz codiert sind, wenn sie von 3' in Richtung 5' gelesen wird, bestimmt.
Nachdem diese homologen Aminosäuresequenzen festgestellt sind, die für die charakteristische Bindung von Peptidhormonen an ihre Rezeptorstellen verantwortlich zu sein scheinen, können Polypeptide, die wenigstens einen Teil von zumindest einer dieser homologen Sequenzen umfassen, beispielsweise mittels routinemäßiger chemischer oder biologischer synthetischer Verfahren, hergestellt werden. Diese Polypeptide, die Schlüsselbereiche für Homologie und Rezeptorbindungsaffinität mit einem Peptidhormon oder Liganden enthalten, können mittels üblicherweise verwendeten Verfahren als Agonisten oder Antagonisten für das Peptidhormon oder den Liganden aussortiert werden.

BEISPIEL 3A

AGIOTENSIN II UD KONZEPTION UND GEWINNUNG VON KOMPLEMENTÄREN PEPTIDEN AUF DER GRUNDLAGE VON NUCLEIDSÄURESEQUENZEN

Das Angiotensin-System wird nachstehend gezeigt:
Angiotensinogen Angiotensin I Angiotensin II
Reaktion 1 ist eine enzymatische Spaltung durch das Enzym Renin und Reaktion 2 ist eine enzymatische Spaltung durch das Angiotensinumwandelnde Enzym (ACE). Angiotensinogen enthält 453 Amino-säureneketten, Angiotensin I besteht aus den 10 N-Terminus-Resten von Angiotensinogen und Angiotensin II enthält die 8 N-Terminus-Reste von Angiotensin I. Angiotensin II ist das aktive Molekül, das die Blutdruckregulation kontrolliert.
Die Nucleinsäuresequenz für Ratten-Angiotensin II wurde gemäß Ohkubo et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, S. 2197-2200, 1983) durch Translation der gesamten mRNA für Angiotensinogen und Beachtung der Aminosäuresequenz (von Base 134 bis 157), von der man weiß, daß sie Angiotensin II ist, gewonnen. Die Sequenz, ihre Translation, ihr Komplement und die durch Lesen von 3' und 5' bestimmten komplementären Aminosäuren sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt. Angiotensin II Carboxy Terminus mRNA 3' Terminus cRNA 5' Lesen 3' Lesen 5' Lesen
Da die 3' Lesung ein Terminationssignal ergab (UAG/END), wurde END durch ASP ersetzt. Komplementäre Peptide wurden mittels herkömmlicher Festphasen-Synthese von Triton Biosciences Inc., (Alameda, CA) für die folgenden komplementären Peptide beschafft. Es sei darauf hingewiesen, daß zwei Peptide eine parallele Peptidbindungsrichtung und zwei eine antiparallele Richtung aufweisen. SEQUENZ Bezeichnung N-Terminus C-Terminus

BEISPIEL 3B

ANGIOTENSIN II UND KONZEPTION UND GEWINNUNG VON KOMPLEMENTÄREN PEPTIDEN AUF DER GRUNDLAGE VON AMINOSÄURESEQUENZEN (CONSENSUS-KOMPLEMENTE)

Die Aminosäuresequenz von menschlichen Angiotensin II wurde der Sequenz eines von Tewksbury et al (BBRC, 99, S. 1311-1315, 1981) bestimmten Fragments eines menschlichen Angiotensinogen entnommen.
Unter Verwendung der in Tabelle 6A angegebenen Substitutionen wurden zwei Consensus-Komplemente von Angiotensin II konzipiert, eines mit paralleler Peptidbindungsrichtung und eines mit antiparalleler Orientierung, wie nachstehend gezeigt:
Diese komplementären Peptide wurden mittels herkömmlicher Festphasen-Synthese von Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA) hergestellt.

BEISPIEL 3C

ANGIOTENSIN II UND KONZEPTION UND GEWINNUNG VON KOMKLEMENTÄREN PEPTIDEN AUF DER GRUNDLAGE VON AMINOSÄURESEQUENZEN (VEREINFACHTE KOMPLEMENTE)

Unter Verwendung der Aminosäuresequenz für Angiotensin II aus dem vorhergehenden Beispiel und der in Tabelle 6C angegebenen Substitutionen wurde folgendes (antiparallele) vereinfachte, komplementäre Peptid zu Angiotensin II (menschlich) konzipiert.
Dieses komplementäre Peptid wurde mittels herkömmlicher Festphasensynthese von Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA) hergestellt.

BEISPIEL 3D

ANGIOTENSIN UND KONZEPTION UND GEWINNUNG VON VERWANDTEN KOMPLEMENTÄREN PEPTIDEN

Basierend auf dem bekannten Reaktionsnetz im Angiotensin-System wurden komplementäre Peptide hergestellt, die vielfache günstige Wirkungen ergeben könnten.
Basierend auf der Beobachtung der komplementären Peptidbindung werden Moleküle konzipiert, die spezifisch mit einem oder mehreren der Moleküle des Angiotensin-Systems interagieren. Infolge dieser Interaktionen unterliegt ein Angiotensin-Molekül keiner enzymatischen Reaktion. Daher könnte die Umwandlung von beispielsweise Angiotensin I in Angiotensin II erfolgen, ohne daß ACE oder dessen andere Funktionen gehemmt würden.
Basierend auf der menschlichen Angiotensinogen-Fragment-Sequenz gemäß Beispiel 3B wurden unter Verwendung des Consensus-Komplement-Verfahrens die folgenden zwei Peptide konzipiert.
Diese komplementären Peptide wurden durch Festphasensynthese von Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA) beschafft.
Man könnte erwarten, daß das Molekül CCA-A(1-13) alle drei Glieder der oben gezeigten Angiotensin-Familie bindet und dabei die Reaktionen 1 und 2 sowie die Fähigkeit von Angiotensin II, seinen Rezeptor zu aktivieren, hemmt.

BEISPIEL 3E

ANGIOTENSIN II UND DIE KONZEPTION UND GEWINNUNG VON POTENTIELL METABOLISCH STABILEN KOMPLEMENTÄREN PEPTIDEN

Basierend auf der Struktur von einem der komplementären Peptiden von Angiotensin II (CCA-AII, Beispiel 3B) wurden mehrere Derivate konzipiert, die im Hinblick auf verschiedene Peptidasen eine bessere metabolische Stabilität aufweisen könnten. Es ist bekannt, daß sowohl die Amino- wie auch die Carboxy-Peptidase in vielen Organismen vorkommt. Es ist bekannt, daß Peptide durch viele Veränderungen der Peptidstruktur vor der Wirkung dieser Enzyme geschützt werden können. Acylierung (Ac) der endständigen Aminosäuregruppen und Prolyation und Amidierung (Am) der endständigen Carboxy-Gruppen sind bekannte Verfahren, um Peptide vor Amino- respektive Carboxy-Peptasen zu schützen.
Folgende Moleküle wurden auf der Grundlage dieser Prinzipien und der Struktur der aktiven, komplementären Peptid-CCA-AII konzipiert. Bezeichnung Struktur
Die Moleküle wurden durch herkömmliche Festphasenchemie von Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA) bezogen. Für die Gewinnung von amidierten Peptiden wurden Amidharze in einer Festphasensynthese verwendet. Die Acylierung erfolgte durch Reaktion von Essigsäureanhydrid mit einem vollständig geschützten Peptid, während dieses sich noch am Harz der Festphasen-Synthese befand.
Ein anderes Verfahren, um Peptide vor enzymatischen Angriffen zu schützen besteht darin, die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren durch D- Aminosäuren zu ersetzen. Zu diesem Zweck wurde, basierend auf der Sequenz von CCA-AII (Beispiel 3B), ein reines D komplementäres Peptid konzipiert.
CCA-AII (rein D) LYS-GLV-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU
Dieses Molekül wurde durch herkömmliche Festphasen-Synthese von Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA) hergestellt.

BEISPIEL 3F

WIRKUNG VON PEPTIDEN, DIE KOMPLEMENTÄR ZU ANGIOTENSIN II SIND, AUF DIE BINDUNG VON RADIOMARKIERTEM ANGIOTENSIN II ZU SEINEM REZEPTOR

Die Hemmung der Angiotensin II Bindung an Angiotensin II Rezeptoren durch komplementäre Peptide wurde mittels Messung unter Verwendung von radioaktiven Angiotensin II getestet. Kaninchenleber wurde homogenisiert und Teilchen davon zwischen 1.000 und 100.000 xg mittels Absetzzentrifuge isoliert. Die Solubilisierung der Bindungsaktivität erfolgte mit 1% Digitonin, anschließender Ammoniumsulfat-Fraktionierung mit Sättigung zwischen 49 und 65%, und darauf folgender DEAE-Zellulose-Chromatographie bei einem pH-Wert von 7,5 unter Verwendung eines linearen Gradienten zwischen 0,0 und 0,3 M KCl. Bei der Scatchard-Analyse band das teilweise gereinigte, löslich gemachte Rezeptor-Präparat 17 pmol des Angiotensins II pro ng Protein, was eine Reinheit von ungefähr 0,1% anzeigt.
Die Standardanalyse für die Bindung von Angiotensin II zum Rezeptor ist folgende: Das komplette System (150 ul) enthält 30 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 2,5 mM K&sub2;EDTA, 0,2 mM PCMS, 0,25 nM [¹²&sup5;I] Angiotensin II (ca. 100.000 cpm), 100 ug BSA, 0,25% (V/V) Br&ijlig;o® 99 und 30 ug des teilweise gereinigten Rezeptors. Die Reaktion wird durch Beimengen des Rezeptors ausgelöst und die Proben während 60 Minuten bei 20ºC inkubiert. Die Reaktion wird mit 1 ml kaltem, 0,5% Aktiv-kohle/0,05% Dextran in 100 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, gestoppt. Die Rohre werden gewirbelt, dann 10 Minuten lang stehen gelassen und anschließend zentrifugiert und der Überstand, der Protein-gebundenes Angiotensin II enthält, gezählt.
Unter diesen Umständen ergab das komplette System regelmäßig ungefähr 10.000 cpm gebundene Radioaktivität. Ein Kontrollversuch ohne Rezeptor ergab Werte von 50-2000 cpm, die von diesen Daten abgezogen wurden. Wenn 120 uM kaltes Angiotensin II in der Reaktionsmischung vorhanden war, wurden Werte von 50-2000 cpm erzielt, was darauf hinweist, daß praktisch die gesamte Bindung spezifisch ist. Eine Probe mit 20 nM kaltem Angiotensin II wurde ebenfalls getestet. Die Restbindung der Radioaktivität bei diesem Kontrollversuch lag bei 35-45%. Zu Angiotensin II komplementäre Peptide wurden in Wasser aufgelöst, ausgenommen CCA-A (1-13), das in 3%igem DMSO, 0,04 M Essigsäure und 0,05 M HCl aufgelöst wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 22 aufgeführt.
ID&sub5;&sub0; ist die Peptid-Konzentration, die die Bindung von radiomarkiertem Angiotensin II um 50% hemmt. TABELLE 22 HEMMUNG DER ANGIOTENSIN II BINDUNG AN EINEN ISOLIERTEN, HEPATISCHEN REZEPTOR DURCH KOMPLEMENTÄRE PEPTIDE Peptid ID&sub5;&sub0; (nM)Angiotensin II Ratten

BEISPIEL 4A

LUTEINISIERUNGSHORMON-FREISETZENDES HORMON (LHRH) UND DIE KONZEPTION UND GEWINNUNG EINES KOMPLEMENTÄREN PEPTIDS

Das Luteinisierungshormon-freisetzende Hormon besitzt eine große Vielfalt biologischer Wirkungen und Rezeptoren für dieses Hormon kommen vermutlich auf vielen Zellarten vor (Miller, et al., Nature, 313, S. 231-233, 1985). Ein Bericht über die Nucleinsäuresequenz für die Vorstufenform von LHRH liegt vor (Seeburg und Adelman, Nature, 311, S. 666-668, 1984) und wurde für die folgende Konzeption eines komplentären Peptids verwendet. Die Sequenz für LHRH, seine Translation, sein Komplement und die 5'-3' Translation seines Komplements werden nachstehend gezeigt.
Das komplementäre Peptid 5CA-LHRH wurde durch Festphasensynthese von Triton Biosciences Inc. (Alamed, CA) beschafft.

BEISPIEL 4B

WIRKUNG EINES ZU LHRL (5CA-LHRL) KOMPLEMENTÄREN PEPTIDS AUF DIE LHRL-STIMULIERTE LH-FREISETZUNG VON HYPOPHYSEZELLEN

Es wurde eine umgekehrte hämolytische Plaque-Analyse (Smith, et al., Method in Enzymology, 124, S. 443) verwendet, um die Wirkung eines zu LHRH komplementären Peptids (5CA-LHRH) auf LHRH-stimulierte Freisetzung von LH von Hypophysezellen zu untersuchen. Die Analyse wurde wie angegeben durchgeführt, ausgenommen daß in den als (Vor)markierten Experimenten das komplementäre Peptid und das LHRH während einer Stunde vorinkubiert wurden, bevor sie den dispergierten Hypophysezellen beigemengt wurden.
Die Plaquen wurden analysiert, indem der Plaque-Bereich mittels Bildanalyse (Bioquant oder Image Technology Corp. Modell 300) mit 125x-500x mikroskopischer Vergrößerung bestimmt wurde. Die Ergebnisse werden als prozentuelle Reaktion einer bestimmten Analyse zu einer Kontrollanalyse (Plaquen, die bei Stimulation durch 5·10&supmin;¹&sup0; M LHRH gebildet wurden) dargestellt.
Die Wirkung des komplementären Peptids (5CA-LHRH) ist in Tabelle 23 dargelegt. TABELLE 23 Behandlung Exp. (Vor) (ohne) Kontrolle 5·10&supmin;¹&sup0;M LHRH+Somatostatin 5CA-LHRH
Die Ergebnisse zeigen eine eindeutige Hemmung der Wirkung von LHRH durch das komplementäre Peptid 5CA-LHRH bei dieser Analyse.

BEISPIEL 4C

WIRKUNG DES ANTIKÖRPERS ZU 5CH-LHRH (A5CALHRH) AUF LHRH-STIMULIERTE LH-SEKRETION DURCH HYPOPHYSEZELLEN

Die umgekehrte hämolytische Plaque-Analyse für LH-Sekretion durch dispersierte Hypophysezellen von Prooestrus Ratten wurde im wesentlichen gemäß Beschreibung in Beispiel 4B durchgeführt, ausgenommen daß die Hypophysezellen mit A5CALHRH oder mit dem normalen Kaninchenserum (NRS) während zwei Stunden vorinkubiert wurden. Nach dem Waschen wurde die umgekehrte hämolytische Plaquebildung durch die Beimengung von LHRH und Anti-LH Antiserum angeregt. Zwei Stunden später wurde für 30 Minuten das Komplement beigemengt. Während der umgekehrten hämolytischen Plaquebildung wurde des weiteren A5CALHRH mit der gleichen Konzentration beigemengt. A5CALHRHB1 ist die IgG-Fraktion von Antiserum aus der ersten Blutabnahme nach 40 Tagen nach der Immunisierung eines männlichen Kaninchens mit an Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) (300 ug Antigen in 1 ml Voll-Freundsches Adjuvans, erstmalige Injektion am Tag 0, 200 ug Antigen in 1 ml unvollständigem Freundsches Adjuvans, Injektionen an Tag 10, 20, 30, 40, 50 und 60) gekoppeltem 5CA-LHRH. A5CALHRHB3 stammt von der dritten Blutabnahme des Kaninchen am 60. Tag. F(ab)&sub2;-Fragmente von A5CALHRHB1 wurden durch herkömmliche Verfahren (Methods in Immunology, 3. Ausg., S. 256, 1977) hergestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 aufgeführt. TABELLE 24 Behandlung % Kontrolle keine (Kontrolle) * Von Hypophysezellen wurde berichtet, daß sie Rezeptoren für den FC-Teil von Antikörper-Molekülen haben. (Pouglane et al, Nature 261, 142 (1976), Buffa et al Histochem 63, 15 (1979)). Es wurden F(ab)&sub2; Fragmente von A5CALHRH präpariert um zu gewährleisten, daß eine Wirkung auf die LHRH-Stimulation von Hypophysezellen nicht infolge der Wechselwirkung zwischen A5CALHRH mit nicht-spezifischen FC-Rezeptoren verursacht werden konnte.
Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein sowohl von antagonistischen wie auch von agonistischen Antikörpern im Immunserum von mit einem zu LHRH komplementären Peptid immunisierten Kaninchen auf.

BEISPIEL 4D

IMMUNOZYTOCHEMISCHE ANALYSE FÜR LHRH ZELLOBERFLÄCHENREZEPTOREN, BASIEREND AUF ANTIKÖRPERN ZU PEPTIDEN, DIE ZU LHRH KOMPLEMENTÄR SIND

Verschiedene Zellen haben auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für LHRH. Es ist gut bekannt, daß 5% der Hypophysezellen solche Rezeptoren aufweisen, da sie durch Freisetzung von LH auf LHRH reagieren. Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um die Fähigkeit von Antikörpern zu Peptiden, die komplementär zu LHRH sind, spezifisch jene Hypophysezellen zu markieren, die LHRH-Rezeptoren aufweisen, nachzuweisen.
Nachdem herkömmliche Plaque-Analysen (wie in Beispiel 4B) durchgeführt wurden, wurden die Kammern mit Natriumacetat aufgegossen, um die gebundenen Antikörper auszuwaschen und dann schrittweise in einem B5 Fixiermittel, Ethanol, Lugol-Iodid und Natriumthiosulfat (gemäß Beschreibung in Smith et al., Methods in Enzvmoloqv, 124, S. 443) fixiert. Bevor geeignete Verdünnungen der Antikörper aufgebracht wurden, wurden die Objektträger mit Wasserstoffperoxid und normalem Ziegenserum behandelt. Die immunozytochemische Analyse wurde mittels ABC-Verfahrens (Vector Labs, Burlingame, CA) mit Diaminodiphenyl als Substrat durchgeführt.
LH enthaltende Zellen wurden selektiv mit Antikörpern zu LH gefärbt. Im allgemeinen enthielten Plaquen, die in den Versuchen der vorher erwähnten Beispiele gebildet wurden, eine LH-enthaltende Zelle nahe der Mitte jeder runden Plaque. Zellen, die LHRH-Rezeptoren aufwiesen, wurden mittels IgG- Fraktionen von Immunserum von mit einem zu LHRH komplementären Peptid immunisierten Kaninchen (siehe Beispiel 4C) gefärbt. Dann wurde wieder eine Zelle pro runder Plaque gefärbt und das waren dieselben Zellen, die LH enthielten. Kontrollexperimente bewiesen, daß die Färbung von Rezeptoren durch Antikörper zu dem Komplement von LHRH sowohl mit LHRH (durch Bindung an den Rezeptor) wie auch mit dem Komplement zu LHRH (durch Bindung an den Antikörper) blockiert werden konnte.
Diese Experimente beweisen, daß die Antikörper zu dem Komplement von LHRH Hypophysenzellen, die LHRH-Rezeptoren aufweisen, selektiv färben.

BEISPIEL 5A

RIBONUCLEASE A S-PEPTID UND DIE KONZEPTION UND GEWINNUNG EINES KOMPLEMENTÄREN PEPTIDS

Bei Behandlung von Rinder-Ribonuclease A (RNase), ein 124 Aminosäure- Protein, mit dem proteolytischem Enzym Subtilisin wird RNase in zwei S-Peptid genannte Fragmente, Aminosäurereste 1-20 und 5-Protein, Aminosäurereste 12-124 aufgespaltet. Die mRNA-Sequenz für Ratten-RNase wurde gemäß MacDonald et al (J. Biol. Chem., 257, S. 14582-14585, 1982) gewonnen, die eine beträchtliche Sequenzhomologie mit Rinder-RNase aufweist. Die Reste 4 bis einschließlich 23 sind mit dem S-Peptid von Rinder S-Peptid homolog. Die mutmaßliche mRNA-Struktur für Rinder-RNase wurde abgeleitet, indem in der Ratten-mRNA-Sequenz eine minimale Anzahl an Basenänderungen durchgeführt wurde; sie ist in der folgenden Tabelle angegeben.
Ratten RNase Aminosäurereste 4-23 ARG GLU SER SER ALA ASP LYS PHE LYS ARG GLN HIS MET ASP THR GLU GLY PRO SER LYS
Ratten mRNA Sequenz für Ratten RNase Reste 4-23 Lesen von 5'-3' AGG GAA UCA UCG GCG GAU AAG UUU AAG AGG CAG CAC AUG GAC ACA GAG GGU CCC UCC AGG
Mutmaßliche mRNA für Rinder-S-Peptid Lesen von 5'-3' AAG GAA ACA GCG GCG GCU AAG UUU GAG AGG GAG CAC AUG GAC UCA UCG ACU UCC GCC GCG
Aminosäuresequenz von Rinder-S-Peptid LYS GLU THR ALA ALA ALA LYS PHE GLU ARG GLU HIS MET ASP SER SER THR SER ALA ALA
Die Aminosäuren für das komplementäre Peptid zu Rinder-S-Peptid wurden von der Nucleinsäurestruktur durch Lesen des komplementären Stranges von 5' in Richtung 3' im Leserahmen gemäß nachfolgender Tabelle bestimmt:
Komplementäre Nucleinsäurestruktur für Rinder S-Peptid CGC GGC GGA AGU CGA UGA GUC CAU GUG CUC CCU CUC AAA CUU AGC CGC CGC UGU UUC CUU
Die parallele, komplementäre Aminosäuresequenz für Rinder S-Peptid LEU PHE SER ARG ARG SER LEU LYS LEU PRO LEU VAL HIS VAL SER ARG SER GLY GLY ARG
Nachdem das sechste Codon ein Stoppsignal (UGA/END) ergab, wurde END durch SER ersetzt. Für das Codon 18 (UGU/CYS), wurde SER durch CYS ersetzt. Diese Aminosäuresubstitutionen bewahren die zweite Basen-Komplementarität mit dem Rinder S-Peptid. Das komplementäre Peptid wurde durch herkömmliche Festphasensynthese von Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA) beschafft.

BEISPIEL 5B

RIBUNUCLEASE A S-PEPTID UND BINDUNG UND REINIGUNG EINES KOMPLEMENTAREN PEPTIDS

Die Wechselwirkung zwischen dem zum S-Peptid komplementären Peptid und dem S-Peptid wurde untersucht, indem ein S-Peptid mittels eines herkömmlichen chemischen Verfahrens kovalent an eine N-Hydroxysukzinimid aktivierte Silicagel Bindungsphase gekoppelt wurde. Die Peptidmischung, die durch Fluorwasserstoff-Behandlung des komplementären Petpids mittels eines herkömmlichen chemischen Verfahrens gewonnen wurde, wurde direkt auf die S-Peptid Chromatographie-Säule (3 mm·44 mm) aufgebracht, die vorher entweder auf 0,10 M Tris-Acetat mit pH-Wert 7,0, oder auf 0,10 M Tris-Acetat mit pH- Wert 5,1, bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min ausbalanciert wurde. Der Säulenabfluß wurde durch dekadische Extinktion bei 226 nm aufgezeichnet. Unter diesen Umständen wurde an der Lösungsfront ein großer Peak, der sich aus Peptid- und Nichtpeptid-Substanz zusammensetzte, erzielt. Die Säule wurde mit 45 ml einer Bufferlösung, dann mit 30 ml Wasser gewaschen und anschließend wurde 0,10 M Essigsäure in die Säule eingebracht, wodurch 226 nm Absorptionsmaterial eluiert wurden. Die Chromatographie dieses eluierten Materials auf einer umgekehrten Phase C-18 Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. und einer Gradientenelution für eine 10%ige Lösung A auf eine 40%ige Lösung B während 35 Minuten (Lösung A, 0,1% Trifluorethan-säure/Wasser; Lösung B, 0,1% Trifluorethansäure/100% Acetonitril) ergab einen einzigen Peak mit einer Beibehaltungsdauer von ungefähr 26 Minuten. Die Sequenzanalyse dieses Materials mittels eines Gas- Phasen-Sequenators (Applied Biosystems, Foster City, CA) bestätigte, daß seine Struktur identisch mit dem des synthetisierten, komplementären Peptids war. Kontroll-Peptide banden nicht an die S-Peptid-Affinitätssäule. Diese Ergebnisse beweisen eine spezifische Bindung zwischen dem S-Peptid und einem seiner Komplemente und beweisen auch, daß die S-Peptid-Affinitätssäule dazu verwendet werden kann, Peptid-Rohpräparate zu reinigen.

Claims

1. Antikörper eines Polypeptids, wodurch dieses Polypeptid:

a) Sequenzposition um Sequenzposition zu einem ursprünglichen Peptidliganden komplementär ist, wenn es in bezug auf den ursprünglichen Peptidliganden entweder vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus, oder vom Carboxy-Terminus zum Amino-Terminus orientiert ist;

b) durch einen DNS-Strang codiert ist, der zu einem Teil eines DNS-Strangs komplementär ist, der den ursprünglichen Peptidliganden, gemäß der Definition durch die komplementären DNS-Codone, oder die zweite Base der komplementären Codone, für jeden Strang, der in antiparalleler Richtung basenpaart, codiert, wobei das Lesen jeweils entweder von 3' in Richtung 5' oder von 5' in Richtung 3' im gleichen Leserahmen wie dem Leserahmen für die den ursprünglichen Peptidliganden codierenden DNS-Codone erfolgt; und

c) eine Bindungsaffinität zu einem Teil des ursprünglichen Peptidliganden hat;

dadurch gekennzeichnet, daß er eine Affinität zu einer Rezeptorstelle hat, bei der der Peptidligand seine hormonalen Wirkungen bindet und überträgt.

2. Antikörper gemäß Anspruch 1, wobei der Peptidligand adenocorticotropes Hormon (ACTH) ist, und das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz hat:

3. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wobei dieses Polypeptid gemäß einem Prozeß hergestellt wird, der durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Bestimmen einer ersten Nucleotidsequenz einer ersten Nucleinsäure, wobei diese erste Nucleotidsequenz für eine Aminosäuresequenz wenigstens eines Teils des ursprünglichen Peptids oder Proteins codiert;

b) Ermitteln einer zweiten Nucleotidsequenz einer zweiten Nucleinsäure, die mit der ersten Nucleotidsequenz der ersten Nucleinsäure basenpaart, wobei die erste und die zweite Nucleinsäure sich in antiparalleler Richtung paaren;

c) Bestimmen der Aminosäuresequenz des komplementären Polypeptids durch Auffinden der durch die zweite Nucleotidsequenz codierten Aminosäuresequenz bei Lesen von 5' in Richtung 3' oder von 3' in Richtung 5' und im gleichen Leserahmen wie die erste Nucleotidsequenz; und

d) Herstellen eines Polypeptids, das die bei Schritt (c) bestimmte Aminosäuresequenz aufweist.

4. Antikörper gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Nucleotidsequenz von 5' in Richtung 3' gelesen wird.

5. Antikörper gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Nucleotidsequenz von 3' in Richtung 5' gelesen wird.

6. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das nach einem Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids erhalten wurde, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Ermitteln der Aminosäuresequenz von wenigstens einem Teil des ursprünglichen Proteins oder Peptids;

- Lesen der ermittelten Aminosäuresequenz vom Carboxy-Terminus in Richtung Amino-Terminus;

- Ausrichten des Carboxy-Terminus der Aminosäuresequenz entsprechend dem Amino-Terminus der bestimmten Sequenz;

- Ersetzen jedes Isoleucins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Tyrosin, Asparagin oder Asparaginsäure;

- Ersetzen jedes Valins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Asparagin, Asparaginsäure, Histidin oder Tyrosin;

- Ersetzen jedes Leucins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Lysin, Glutamin oder Glutaminsäure;

- Ersetzen jedes Phenylalanins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Lysin oder Glutaminsäure;

- Ersetzen jedes Cysteins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Threonin oder Alanin;

- Ersetzen jedes Methionins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Histidin;

- Ersetzen jedes Alanins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Arginin, Serin, Glycin oder Cystein;

- Ersetzen jedes Arginins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Alanin, Serin, Threonin oder Prolin;

- Ersetzen jedes Lysins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin oder Phenylalanin;

- Ersetzen jedes Asparagins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Isoleucin oder Valin;

- Ersetzen jeder Asparaginsäure der ermittelten Aminosäuresequenz durch Isoleucin oder Valin;

- Ersetzen jedes Glutamins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin;

- Ersetzen jeder Glutaminsäure der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin oder Phenylalanin;

- Ersetzen jedes Histidins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Valin oder Methionin;

- Ersetzen jedes Glycins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Prolin, Serin, Threonin oder Alanin;

- Ersetzen jedes Threonins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin, Serin, Arginin oder Cystein;

- Ersetzen jedes Tryptophans der ermittelten Aminosäuresequenz durch Prolin;

- Ersetzen jedes Serins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin, Threonin, Alanin oder Arginin;

- Ersetzen jedes Tyrosins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Isoleucin oder Valin;

- Ersetzen jedes Prolins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin, Arginin oder Tryptophan; und

- Erhalten eines Polypeptids, das die durch die obigen Substitutionen bestimmte Aminosäuresequenz aufweist.

7. Antikörper gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch chemische Synthese erhalten wird.

8. Antikörper gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch Exzision aus einem Protein oder größeren Polypeptid, das diese Aminosäuresequenz umfaßt, erhalten wird.

9. Antikörper gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid erhalten wird durch Einfügen einer DNS-Sequenz, die dieses Polypeptids in ein Plasmid codiert, und Umwandeln eines einzelligen Organismus mit diesem Plasmid, wodurch dieser Organismus dieses Polypeptid biosynthetisiert.

10. Antikörper gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der einzellige Organismus aus Bakterienzellen, Hefezellen und Säugetierzellen ausgewählt wird.

11. Antikörper gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des komplementären Polypeptids erhalten wird durch:

- Ersetzen jedes Valins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Asparaginsäure oder Histidin;

- Ersetzen jedes Leucins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Lysin oder Glutamin;

- Ersetzen jedes Phenylalanins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glutaminsäure;

- Ersetzen jedes Arginins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Alanin oder Prolin;

- Ersetzen jedes Lysins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin;

- Ersetzen jedes Histidins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Valin;

- Ersetzen jedes Glycins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Prolin oder Alanin;

- Ersetzen jedes Threonins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin oder Arginin;

- Ersetzen jedes Serins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin, Arginin oder Alanin;

- Ersetzen jedes Tyrosins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Valin;

- Ersetzen jedes Prolins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin oder Arginin.

12. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das nach einem Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids erhalten wurde, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wobei die Aminosäuren des Polypeptids, des ursprünglichen Peptids oder des ursprünglichen Proteins dadurch festgelegt sind, daß sie in Gruppen (U, A, C oder G) entsprechend der zweiten Base ihrer Codone enthalten sind, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Ermitteln der Aminosäuresequenz von wenigstens einem Teil des ursprünglichen Peptids oder Proteins;

- Ersetzen jeder Aminosäure der Gruppe A durch eine Aminosäure der Gruppe U;

- Ersetzen jeder Aminosäure der Gruppe U durch eine Aminosäure der Gruppe A;

- Ersetzen jeder Aminosäure der Gruppe C durch eine Aminosäure der Gruppe G;

- Ersetzen jeder Aminosäure der Gruppe G durch eine Aminosäure der Gruppe C; und

- Erhalten eines Polypeptids, das die durch die obigen Substitutionen festgelegte Aminosäuresequenz aufweist.

13. Antikörper gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch chemische Synthese erhalten wird.

14. Antikörper gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch Exzision aus einem Protein oder größeren Polypeptid, das diese Aminosäuresequenz umfaßt, erhalten wird.

15. Antikörper gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid erhalten wird durch Einfügen einer DNS-Sequenz, die dieses Polypeptid in ein Plasmid codiert, und Umwandeln eines einzelligen Organismus mit diesem Plasmid, wodurch dieser Organismus dieses Polypeptid biosynthetisiert.

16. Antikörper gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der einzellige Organismus aus Bakterienzellen, Hefezellen und Säugetierzellen ausgewählt wird.

17. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wobei dieses Polypeptid gemäß einem Prozeß hergestellt wird, der durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Bestimmen der Aminosäuresequenz dieses Polypeptids nach einem Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das zu mindestens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Ersetzen jedes Isoleucins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Tyrosin;

- Ersetzen jedes Valins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Histidin;

- Ersetzen jedes Leucins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glutaminsäure;

- Ersetzen jedes Phenylalanins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Lysin;

- Ersetzen jedes Methionins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Tyrosin oder Histidin;

- Ersetzen jedes Lysins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Phenylalanin;

- Ersetzen jedes Asparagins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin;

- Ersetzen jeder Asparaginsäure der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin;

- Ersetzen jedes Glutamins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin oder Valin;

- Ersetzen jeder Glutaminsäure der ermittelten Aminosäuresequenz durch Leucin;

- Ersetzen jedes Histidins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Valin;

- Ersetzen jedes Tyrosins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Isoleucin;

- Ersetzen jedes Cysteins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Threonin;

- Ersetzen jedes Arginins (jeder Argininsäure) der ermittelten Aminosäuresequenz durch Alanin;

- Ersetzen jedes Glycins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Prolin; - Ersetzen jedes Tryptophans der ermittelten Aminosäuresequenz durch Threonin oder Prolin;

- Ersetzen jedes Serins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Serin oder Arginin;

- Ersetzen jedes Threonins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Cystein oder Serin;

- Ersetzen jedes Prolins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Glycin;

- Ersetzen jedes Alanins der ermittelten Aminosäuresequenz durch Arginin.

b) Herstellen des Polypeptids, das die durch den Schritt (a) bestimmte Aminosäuresequenz aufweist.

18. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wobei dieses Polypeptid gemäß einem Prozeß hergestellt wird, der durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Bestimmen der Aminosäuresequenz dieses Polypeptids nach einem Verfahren zum Bestimmen der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Ermitteln des am häufigsten verwendeten Codons für jede Aminosäure in der Sequenz der interessierenden Spezies, so daß das Lesen des komplementären Codons von 5' in Richtung 3' nicht einen Stoppcodon ergibt;

- Ersetzen jeder Aminosäure der ermittelten Aminosäuresequenz durch die Aminosäure, die durch die Translation des Komplements des ermittelten, am häufigsten verwendeten Codons von 5' nach 3' festgelegt ist;

b) Herstellen des Polypeptids, das die bei Schritt (a) bestimmte Aminosäuresequenz aufweist.

19. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wobei dieses Polypeptid gemäß einem Prozeß hergestellt wird, der durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

- Ermitteln des am häufigsten verwendeten Codons für jede Aminosäure in der Sequenz der interessierenden Spezies, so daß das Lesen des komplementären Codons von 3' in Richtung 5' nicht den Stoppcodon ergibt; - Ersetzen jeder Aminosäure der ermittelten Aminosäuresequenz durch die Aminosäure, die durch die Translation des Komplements des ermittelten, am häufigsten verwendeten Codons von 3' nach 5' festgelegt ist;

20. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen Antigen erzeugt wird, das ein komplementäres Polypeptid ganz oder teilweise aufweist, das zu wenigstens einem Teil eines ursprünglichen Peptids oder Proteins komplementär ist, wobei dieses Polypeptid gemäß einem Prozeß hergestellt wird, der durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

- Ermitteln der Aminosäure, die dem für die interessierende Spezies am häufigsten verwendeten Codon entspricht, für jede Gruppe von Codonen mit zweiten Basen G, C, A und U/T;

- Ersetzen jeder Aminosäure in der ermittelten Sequenz durch die ermittelte Aminosäure aus der Gruppe der Aminosäuren mit einer zweiten Base, die komplementär zu der zweiten Base des für die Aminosäure in der ermittelten Sequenz am häufigsten verwendeten Codons bei der interessieren Spezies ist;

21. Antikörper gemäß Anspruch 17, 18, 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch chemische Synthese hergestellt wird.

22. Antikörper gemäß Anspruch 17, 18, 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch Exzision aus einem Protein oder größeren Polypeptid, das diese Aminosäuresequenz umfaßt, erhalten wird.

23. Antikörper gemäß Anspruch 17, 18, 29 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid erhalten wird durch Einfügen einer DNS-Sequenz, die dieses Polypeptid in ein Plasmid codiert, und Umwandeln eines einzelligen Organismus mit diesem Plasmid, um einen umwandelnden, einzelligen Organismus herzustellen, der dieses komplementäre Polypeptid biosynthetisiert.

24. Antikörper gemäß Anspruch 17, 18, 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß der einzellige Organismus aus Bakterienzellen, Hefezellen und Säugetierzellen ausgewählt wird.

25. Antikörper gemäß Anspruch 17, 18, 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß das komplementäre Polypeptid die Komplementarität oder Bindungsaffinität zu dem ursprünglichen Peptid oder Protein behält, ungeachtet der Amino- Terminal- und Carboxy-Terminal-Richtung des komplementären Polypeptids.

26. Antikörper gemäß irgendeinem der Ansprüche 3 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

27. Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Peptidligand Gamma-Endorphin ist, und das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz aufweist: H&sub2;N-Gln-Arg-Asp-Lys-Gly-Arg-Leu-Ala-Leu-Leu-Gly-Gly-His- Glu-Pro-Ala-Val-COOH.

28. Antikörper eines Polypeptids, hergestellt nach einem Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, das eine Affinität zu der zellularen Rezeptorstelle für einen bestimmten Peptidliganden hat, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

- Ermitteln einer zweiten Nucleotidsequenz eines zweiten Nucleotidstrangs, der mit einem ersten Nucleotidstrang basenpaart, der für wenigstens einen Teil einer proteinartigen Komponente einer Peptidliganden- Rezeptorstelle codiert;

- Bestimmen eventueller Aminosäuresequenzen in dem Peptidliganden, die homolog zu Aminosäuresequenzen sind, die durch die zweite Nucleotidsequenz codiert sind, wenn diese zweite Sequenz von 3' in Richtung 5' gelesen wird; und

- Herstellen eines Polypeptids, das wenigstens einen Teil von wenigstens einer dieser homologen Aminosäuresequenzen aufweist.

29. Antikörper eines Polypeptids, hergestellt nach einem Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden, die eine Affinität zu einem Polypeptid-Liganden haben, die auf der Sequenz seiner zellularen Rezeptorstelle basiert, wobei dieses Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

- Ermitteln einer zweiten Nukleotidsequenz eines zweiten Nucleotidstrangs, der mit einem ersten Nucleotidstrang basenpaart, der für wenigstens einen Teil einer proteinartigen Komponente einer Peptidliganden- Rezeptorstelle codiert;

- Bestimmen eventueller Aminosäuresequenzen in dem Peptidliganden, die homolog zu Aminosäuresequenzen sind, die durch die zweite Nukleotidsequenz codiert sind, wenn diese zweite Sequenz von 3' in Richtung 5', oder von 5' in Richtung 3' gelesen wird;

- Bestimmen der Aminosäuresequenzen des proteinartigen Rezeptors für den Polypeptidliganden, die den homologen Gebieten des vorhergehenden Schritts entsprechen; und

- Herstellen eines Polypeptids, das wenigstens einen Teil von wenigstens einer dieser Aminosäuresequenzen des proteinartigen Rezeptors aufweist.

30. Verfahren zum Herstellen von Komponenten einer Peptidliganden- Rezeptorstelle aus einem Gemisch, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

- Herstellen des Antikörpers gemäß Anspruch 1 bis 27;

- Koppeln des Antikörpers an eine feste Matrix;

- Behandeln des Gemischs mit der an die der Antikörper gekoppelten Matrix, um Komponenten der Rezeptorstelle spezifisch zu binden; und

- Eluieren der gebundenen Komponenten.

31. Verfahren zum Nachweisen von Rezeptoren für proteinartige Substanzen auf Zelloberflächen oder Fluids eines Organismus, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a) Herstellen des Antikörpers gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 27;

b) Einführen dieses Antikörpers in Zelloberflächen oder Fluids eines Organismus;

c) Nachweisen dieses an die Rezeptoren dieser proteinartigen Substanz gebundenen Antikörpers.