JPH05262788A - ペプチド類、その設計方法及び製造方法並びに受容体上の生理活性ペプチドの結合部位の決定方法 - Google Patents
ペプチド類、その設計方法及び製造方法並びに受容体上の生理活性ペプチドの結合部位の決定方法Info
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- JPH05262788A JPH05262788A JP23195592A JP23195592A JPH05262788A JP H05262788 A JPH05262788 A JP H05262788A JP 23195592 A JP23195592 A JP 23195592A JP 23195592 A JP23195592 A JP 23195592A JP H05262788 A JPH05262788 A JP H05262788A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生理活性ペプチドに対し高い結合性を有する
ペプチドを設計し、製造する。 【構成】 ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配
列（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中
の部分配列を選択する工程の各工程を含むことを特徴と
する、生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の
設計方法。
ペプチドを設計し、製造する。 【構成】 ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配
列（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中
の部分配列を選択する工程の各工程を含むことを特徴と
する、生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の
設計方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物体起源の薬剤の有
する不安定性、偶然性を排除し、生物学的特異性、生物
学的親和性のみを保持させた、生理活性ペプチドに結合
性を有するペプチド類、その設計方法及びその製造方法
並びに受容体上の生理活性ペプチドの結合部位の決定方
法に関する。さらに詳しくは、設計されるペプチド類の
基本アミノ酸配列が、生理活性ペプチドを暗号化できる
遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の対合ＤＮＡ鎖配列の解読
により得られるアミノ酸配列と生理活性ペプチド受容体
の一次アミノ酸配列との相同性により規定することを特
徴とする。
する不安定性、偶然性を排除し、生物学的特異性、生物
学的親和性のみを保持させた、生理活性ペプチドに結合
性を有するペプチド類、その設計方法及びその製造方法
並びに受容体上の生理活性ペプチドの結合部位の決定方
法に関する。さらに詳しくは、設計されるペプチド類の
基本アミノ酸配列が、生理活性ペプチドを暗号化できる
遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の対合ＤＮＡ鎖配列の解読
により得られるアミノ酸配列と生理活性ペプチド受容体
の一次アミノ酸配列との相同性により規定することを特
徴とする。
【０００２】本発明の該設計方法により得られるペプチ
ド類は、例えば特異性、親和性等の生物体起源の薬剤の
根本的な性能を具備しており、また生物体起源の薬剤が
生体高分子化合物であることに起因する不安定性等を排
除している点で、現行診断剤または生化学試薬の発展的
代替薬剤として利用できる。さらには生理活性ペプチド
の生体内存在量または比活性の増加に伴う病態形成に対
する予防薬、または該生理活性ペプチドの生理効果を抑
制、阻害する治療薬等、医薬としても利用できる。
ド類は、例えば特異性、親和性等の生物体起源の薬剤の
根本的な性能を具備しており、また生物体起源の薬剤が
生体高分子化合物であることに起因する不安定性等を排
除している点で、現行診断剤または生化学試薬の発展的
代替薬剤として利用できる。さらには生理活性ペプチド
の生体内存在量または比活性の増加に伴う病態形成に対
する予防薬、または該生理活性ペプチドの生理効果を抑
制、阻害する治療薬等、医薬としても利用できる。
【０００３】
【従来の技術】生物体で営まれる特異的な反応にあずか
る２つの分子間、例えばホルモンとその受容体、抗原と
抗体、酵素と基質間に存在する親和性は両分子を構成す
るアミノ酸の一次配列または高次構造に関連している
が、具体的な部位を特定することは困難であり経験や推
測に基づく置換や欠失等の部位改変した分子または部位
特異的な修飾の設計から導かざるをえなかった。受容体
のホルモン結合部位の同定に関しては、受容体タンパク
質の二次構造予測、酵素消化実験、他受容体における結
合部位配列からの予測に基づく部位改変や部位特異的な
修飾により該結合部位を限定することにより試みられ
る。また、このような試みは、酵素の基質結合部位の同
定に関しても同様である。一方、抗体の抗原結合部位の
同定に関しては、超可変領域のアミノ酸配列が該結合部
位として抗原に対する特異性を決定していることが抗体
分子を暗号化している構造遺伝子の解析から証明されて
いるが、結合部位を特定する試みは一部の抗体分子に限
られている。
る２つの分子間、例えばホルモンとその受容体、抗原と
抗体、酵素と基質間に存在する親和性は両分子を構成す
るアミノ酸の一次配列または高次構造に関連している
が、具体的な部位を特定することは困難であり経験や推
測に基づく置換や欠失等の部位改変した分子または部位
特異的な修飾の設計から導かざるをえなかった。受容体
のホルモン結合部位の同定に関しては、受容体タンパク
質の二次構造予測、酵素消化実験、他受容体における結
合部位配列からの予測に基づく部位改変や部位特異的な
修飾により該結合部位を限定することにより試みられ
る。また、このような試みは、酵素の基質結合部位の同
定に関しても同様である。一方、抗体の抗原結合部位の
同定に関しては、超可変領域のアミノ酸配列が該結合部
位として抗原に対する特異性を決定していることが抗体
分子を暗号化している構造遺伝子の解析から証明されて
いるが、結合部位を特定する試みは一部の抗体分子に限
られている。
【０００４】近年ブラロック（Blalock）らによって、
ペプチドホルモン受容体のホルモン結合部位を構成する
アミノ酸配列は該ペプチドホルモンを暗号化するＤＮＡ
配列の対合ＤＮＡ鎖の転座を起始として進化過程での変
異を経た転写翻訳産物として位置づけられるとした概念
が提唱されている〔プロシーディング オブ ザ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ
ユナイテッド スティツ オブ アメリカ(Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 82, 1372-1375, 1985)〕。該概念
に基づけばペプチドホルモンを暗号化するＤＮＡ配列の
対合鎖により規定されるペプチドは、本来のペプチドと
結合反応性を有していることになる。事実、例えば副腎
皮質刺激ホルモンと該ホルモンを暗号化するＤＮＡの対
合鎖によって規定されるペプチドとの間には親和性があ
ることが証明されている(Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.
A., 82, 1372-1375, 1985)。
ペプチドホルモン受容体のホルモン結合部位を構成する
アミノ酸配列は該ペプチドホルモンを暗号化するＤＮＡ
配列の対合ＤＮＡ鎖の転座を起始として進化過程での変
異を経た転写翻訳産物として位置づけられるとした概念
が提唱されている〔プロシーディング オブ ザ ナシ
ョナル アカデミー オブ サイエンシズ オブ ザ
ユナイテッド スティツ オブ アメリカ(Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 82, 1372-1375, 1985)〕。該概念
に基づけばペプチドホルモンを暗号化するＤＮＡ配列の
対合鎖により規定されるペプチドは、本来のペプチドと
結合反応性を有していることになる。事実、例えば副腎
皮質刺激ホルモンと該ホルモンを暗号化するＤＮＡの対
合鎖によって規定されるペプチドとの間には親和性があ
ることが証明されている(Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.
A., 82, 1372-1375, 1985)。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ブラロックらの提唱す
る概念によれば、ホルモンに代表される生理活性ペプチ
ドの受容体は、生理活性ペプチドを暗号化するＤＮＡの
対合鎖の進化過程における変異の結果、発現される機能
的な転写翻訳産物として位置づけられる。自然淘汰の原
則によれば遺伝子変異は、より機能的な生体分子を産す
る遺伝情報を暗号化するように方向付けられる。したが
って、同じくブラロックらによって発表された生理活性
ペプチドを暗号化することのできるＤＮＡの対合鎖配列
に規定される「相補的なポリペプチド類の設計方法」
(特表昭62-502513号公報)によっては、結合反応性のあ
るペプチドを設計することは可能であるが、充分な結合
反応性を有するそのペプチドの部分配列を設計すること
は困難であり、また生体成分である受容体のホルモン結
合部位のように結合活性の高いペプチドを得ることも困
難であった。
る概念によれば、ホルモンに代表される生理活性ペプチ
ドの受容体は、生理活性ペプチドを暗号化するＤＮＡの
対合鎖の進化過程における変異の結果、発現される機能
的な転写翻訳産物として位置づけられる。自然淘汰の原
則によれば遺伝子変異は、より機能的な生体分子を産す
る遺伝情報を暗号化するように方向付けられる。したが
って、同じくブラロックらによって発表された生理活性
ペプチドを暗号化することのできるＤＮＡの対合鎖配列
に規定される「相補的なポリペプチド類の設計方法」
(特表昭62-502513号公報)によっては、結合反応性のあ
るペプチドを設計することは可能であるが、充分な結合
反応性を有するそのペプチドの部分配列を設計すること
は困難であり、また生体成分である受容体のホルモン結
合部位のように結合活性の高いペプチドを得ることも困
難であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の課
題を解決するため、鋭意研究を行った結果、生理活性ペ
プチドに対し高い結合性を有するペプチド類を設計する
方法及び製造する方法を完成させるに至った。すなわち
本発明は、 ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配列（アミノ
酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中
の部分配列を選択する工程の各工程を含むことを特徴と
する、生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の
設計方法、該設計方法により設計されたペプチド配列の
少なくとも４個のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを
製造することを特徴とする生理活性ペプチドに結合性を
有するペプチド類の製造方法並びに該製造方法により得
られるペプチド類およびその塩に関する。
題を解決するため、鋭意研究を行った結果、生理活性ペ
プチドに対し高い結合性を有するペプチド類を設計する
方法及び製造する方法を完成させるに至った。すなわち
本発明は、 ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配列（アミノ
酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中
の部分配列を選択する工程の各工程を含むことを特徴と
する、生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の
設計方法、該設計方法により設計されたペプチド配列の
少なくとも４個のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを
製造することを特徴とする生理活性ペプチドに結合性を
有するペプチド類の製造方法並びに該製造方法により得
られるペプチド類およびその塩に関する。
【０００７】また本発明は、ａ．生理活性ペプチドの受
容体のアミノ酸配列（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工
程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ中の部分配列を選択する工
程の各工程を含むことを特徴とする、受容体上の生理活
性ペプチドの結合部位の決定方法に関する。
容体のアミノ酸配列（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工
程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ中の部分配列を選択する工
程の各工程を含むことを特徴とする、受容体上の生理活
性ペプチドの結合部位の決定方法に関する。
【０００８】本発明の設計方法を行なうには、まず工程
ａとして、生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配列Ｒ
が決定されなければならない。受容体のアミノ酸配列が
公知であればそれを用いればよいが、公知でない場合は
各種方法により受容体のアミノ酸配列を分析する必要が
ある。このことは生理活性ペプチドのアミノ酸配列Ａに
ついても同様である。次いで、生理活性ペプチドのアミ
ノ酸配列（アミノ酸配列Ａ）を暗号化できる遺伝コドン
から成るＤＮＡ鎖の塩基配列（塩基配列Ａ）を求め、そ
の対合ＤＮＡ鎖の塩基配列（塩基配列Ｃ）を決定し、前
記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ酸配列
（アミノ酸配列Ｃ）を決定する。この一連の工程にはブ
ラロックの方法(特表昭62-502513号公報)を用いること
ができる。ここで、１つのアミノ酸を暗号化できる遺伝
コドンは複数あるので、一つのアミノ酸配列Ａを暗号化
できる塩基配列Ａは多数求められ、その対合ＤＮＡ鎖の
塩基配列Ｃも多数求められる。次いで塩基配列Ｃを遺伝
コドンとして解読し、アミノ酸配列（アミノ酸配列Ｃ）
を決定するが、遺伝コドンの解読方向が５’末端からと
３’末端から、また、アミノ酸の配置方向がＮ末端から
とＣ末端からにすることにより、４通りのアミノ酸配列
が設計可能であり、結局かなり多くのアミノ酸配列Ｃ
（相補ペプチド）が求められることになる。続く工程ｄ
及びｅには、得られた全てのアミノ酸配列Ｃを使用する
のが好ましい。
ａとして、生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配列Ｒ
が決定されなければならない。受容体のアミノ酸配列が
公知であればそれを用いればよいが、公知でない場合は
各種方法により受容体のアミノ酸配列を分析する必要が
ある。このことは生理活性ペプチドのアミノ酸配列Ａに
ついても同様である。次いで、生理活性ペプチドのアミ
ノ酸配列（アミノ酸配列Ａ）を暗号化できる遺伝コドン
から成るＤＮＡ鎖の塩基配列（塩基配列Ａ）を求め、そ
の対合ＤＮＡ鎖の塩基配列（塩基配列Ｃ）を決定し、前
記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ酸配列
（アミノ酸配列Ｃ）を決定する。この一連の工程にはブ
ラロックの方法(特表昭62-502513号公報)を用いること
ができる。ここで、１つのアミノ酸を暗号化できる遺伝
コドンは複数あるので、一つのアミノ酸配列Ａを暗号化
できる塩基配列Ａは多数求められ、その対合ＤＮＡ鎖の
塩基配列Ｃも多数求められる。次いで塩基配列Ｃを遺伝
コドンとして解読し、アミノ酸配列（アミノ酸配列Ｃ）
を決定するが、遺伝コドンの解読方向が５’末端からと
３’末端から、また、アミノ酸の配置方向がＮ末端から
とＣ末端からにすることにより、４通りのアミノ酸配列
が設計可能であり、結局かなり多くのアミノ酸配列Ｃ
（相補ペプチド）が求められることになる。続く工程ｄ
及びｅには、得られた全てのアミノ酸配列Ｃを使用する
のが好ましい。
【０００９】次いで、前記アミノ酸配列Ｒと前記アミノ
酸配列Ｃとを比較する。具体的な比較方法としては、両
アミノ酸配列をそれぞれアミノ末端側から、少なくとも
６アミノ酸残基以上の数で構成される部分配列、好まし
くは６アミノ酸残基で構成される部分配列を作成し、次
いで前記両アミノ酸配列のアミノ末端側から１つずつア
ミノ酸をずらしながら、同数のアミノ酸残基を有する部
分配列をカルボキシル末端に至るまで、全て作成する。
例えば、アミノ酸配列Ｒのアミノ酸数が２０であり、６
アミノ酸残基の部分配列を作成する場合は、合計１５の
部分配列が得られることになる。ここで、部分配列のア
ミノ酸数は連続６残基以上であれば特に制限はない。な
ぜならば、６個のアミノ酸配列が生理活性ペプチドに対
し特異的である数学的な確立は６，４００万分の１であ
り生物学的な確立と特異性を論じるには十分な値である
からである。
酸配列Ｃとを比較する。具体的な比較方法としては、両
アミノ酸配列をそれぞれアミノ末端側から、少なくとも
６アミノ酸残基以上の数で構成される部分配列、好まし
くは６アミノ酸残基で構成される部分配列を作成し、次
いで前記両アミノ酸配列のアミノ末端側から１つずつア
ミノ酸をずらしながら、同数のアミノ酸残基を有する部
分配列をカルボキシル末端に至るまで、全て作成する。
例えば、アミノ酸配列Ｒのアミノ酸数が２０であり、６
アミノ酸残基の部分配列を作成する場合は、合計１５の
部分配列が得られることになる。ここで、部分配列のア
ミノ酸数は連続６残基以上であれば特に制限はない。な
ぜならば、６個のアミノ酸配列が生理活性ペプチドに対
し特異的である数学的な確立は６，４００万分の１であ
り生物学的な確立と特異性を論じるには十分な値である
からである。
【００１０】得られたアミノ酸配列Ｒの部分配列と、ア
ミノ酸配列Ｃの部分配列とを全て比較し、相同性のある
部分を求める。ここで、相同性があるとは、同順位で一
致するアミノ酸数が一致しないアミノ酸数に等しいかそ
れ以上であるときをいう。例えば、６アミノ酸残基の部
分配列を作成した場合、３以上が一致する場合をいう。
次いで、相同性があるとされた部分配列を含む前記アミ
ノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中の部分配列を、生
理活性ペプチドに結合性を有するペプチドとして選択す
る。この方法により選択されるペプチドは、受容体ペプ
チド側のアミノ酸配列Ｒでも、対合ＤＮＡ鎖配列の解読
により得られるアミノ酸配列Ｃ（相補ペプチド）側の部
分配列でもよいが、相対的に結合活性が高いので、受容
体側の部分配列を選択することが好ましい。さらにこの
場合は、受容体の主として細胞表面に位置する領域の部
分配列中に見い出される部分配列を選択するのが好まし
く、さらには、受容体上でβターンまたはコイル構造を
とる部分配列や、糖鎖結合部位でない部分配列を選択す
るのが、結合活性が高いので好ましい。以上の様な方法
により選択されるペプチドが多い場合は、相同性がある
部分として、連続する３以上のアミノ酸が一致するもの
に限定して選択するのが好ましく、さらにより多くの連
続するアミノ酸配列が一致するものを選択するのが好ま
しい。また、選択されるペプチドが多い場合にさらに限
定する他の手段として、生理活性ペプチドを暗号化でき
る遺伝コドンからなる塩基配列Ａとして、該生理活性ペ
プチドを実際に暗号化している遺伝コドンからなる塩基
配列に限定して設計することができる。さらに、アミノ
酸配列Ｃを、前記４通りの設計方法で設計して、少なく
とも２種類の方法で選択された部分配列、好ましくはよ
り多くの方法で選択された部分配列を選択するのがより
高い結合反応性を有すると考えられるので好ましい。ま
た、以上のいずれかの方法により設計されたペプチドの
アミノ酸配列のＮ末端側とＣ末端側を逆にして配列しな
おしたペプチドも、生理活性ペプチドに結合性を有する
ものとして選択可能である。
ミノ酸配列Ｃの部分配列とを全て比較し、相同性のある
部分を求める。ここで、相同性があるとは、同順位で一
致するアミノ酸数が一致しないアミノ酸数に等しいかそ
れ以上であるときをいう。例えば、６アミノ酸残基の部
分配列を作成した場合、３以上が一致する場合をいう。
次いで、相同性があるとされた部分配列を含む前記アミ
ノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中の部分配列を、生
理活性ペプチドに結合性を有するペプチドとして選択す
る。この方法により選択されるペプチドは、受容体ペプ
チド側のアミノ酸配列Ｒでも、対合ＤＮＡ鎖配列の解読
により得られるアミノ酸配列Ｃ（相補ペプチド）側の部
分配列でもよいが、相対的に結合活性が高いので、受容
体側の部分配列を選択することが好ましい。さらにこの
場合は、受容体の主として細胞表面に位置する領域の部
分配列中に見い出される部分配列を選択するのが好まし
く、さらには、受容体上でβターンまたはコイル構造を
とる部分配列や、糖鎖結合部位でない部分配列を選択す
るのが、結合活性が高いので好ましい。以上の様な方法
により選択されるペプチドが多い場合は、相同性がある
部分として、連続する３以上のアミノ酸が一致するもの
に限定して選択するのが好ましく、さらにより多くの連
続するアミノ酸配列が一致するものを選択するのが好ま
しい。また、選択されるペプチドが多い場合にさらに限
定する他の手段として、生理活性ペプチドを暗号化でき
る遺伝コドンからなる塩基配列Ａとして、該生理活性ペ
プチドを実際に暗号化している遺伝コドンからなる塩基
配列に限定して設計することができる。さらに、アミノ
酸配列Ｃを、前記４通りの設計方法で設計して、少なく
とも２種類の方法で選択された部分配列、好ましくはよ
り多くの方法で選択された部分配列を選択するのがより
高い結合反応性を有すると考えられるので好ましい。ま
た、以上のいずれかの方法により設計されたペプチドの
アミノ酸配列のＮ末端側とＣ末端側を逆にして配列しな
おしたペプチドも、生理活性ペプチドに結合性を有する
ものとして選択可能である。
【００１１】以上のような本発明のペプチド類の設計方
法は、生理活性ペプチドのアミノ酸配列及びその受容体
のアミノ酸配列が決定できれば、種々の生理活性ペプチ
ドに適用することができる。例えば、エンドセリン、利
尿ホルモン、インターロイキン、アンジオテンシン、サ
ブスタンスＰ、小腸血管作動性ペプチド等の生理活性ペ
プチドが挙げられるが、特に制限はない。以上の様にし
て設計されたペプチドから、生理活性ペプチドに対して
結合性を有するものとして、該ペプチドの少なくとも４
個のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを製造すること
ができる。なぜならば、４個のアミノ酸配列が生理活性
ペプチドに対し特異的である数学的な確率は１６万分の
１であり、生物学的な特異性を論ずるには十分な値であ
るからである。一方、製造されるペプチドのアミノ酸配
列の数は、特に制限されないが、結合活性と扱い易さの
バランスから、生理活性ペプチドのアミノ酸数の２／３
以下程度が好ましく、具体的な数としては１５以下程度
が好ましい。ペプチド類の製造は、公知の方法、例え
ば、固相法および液相法による化学合成法、該ペプチド
を暗号化できるＤＮＡ鎖を含むＤＮＡベクターを作成
し、それにより培養原核細胞または真核細胞を形質転換
後、得られる形質転換体によりペプチドを生産させる生
体合成法等により製造することができる。
法は、生理活性ペプチドのアミノ酸配列及びその受容体
のアミノ酸配列が決定できれば、種々の生理活性ペプチ
ドに適用することができる。例えば、エンドセリン、利
尿ホルモン、インターロイキン、アンジオテンシン、サ
ブスタンスＰ、小腸血管作動性ペプチド等の生理活性ペ
プチドが挙げられるが、特に制限はない。以上の様にし
て設計されたペプチドから、生理活性ペプチドに対して
結合性を有するものとして、該ペプチドの少なくとも４
個のアミノ酸の連続配列を含むペプチドを製造すること
ができる。なぜならば、４個のアミノ酸配列が生理活性
ペプチドに対し特異的である数学的な確率は１６万分の
１であり、生物学的な特異性を論ずるには十分な値であ
るからである。一方、製造されるペプチドのアミノ酸配
列の数は、特に制限されないが、結合活性と扱い易さの
バランスから、生理活性ペプチドのアミノ酸数の２／３
以下程度が好ましく、具体的な数としては１５以下程度
が好ましい。ペプチド類の製造は、公知の方法、例え
ば、固相法および液相法による化学合成法、該ペプチド
を暗号化できるＤＮＡ鎖を含むＤＮＡベクターを作成
し、それにより培養原核細胞または真核細胞を形質転換
後、得られる形質転換体によりペプチドを生産させる生
体合成法等により製造することができる。
【００１２】以上の様に製造されたペプチド類の医薬
用、診断薬用または生物体由来物質調製用として許容さ
れるイオンから構成されるその塩も本発明に含まれる。
このような塩としては、酸付加塩、塩基性塩などが挙げ
られ、具体的には、塩酸、硫酸、燐酸、ピロ燐酸等の無
機酸の塩、酢酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコル
ビン酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の塩などの酸
付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金
属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの塩が
挙げられる。
用、診断薬用または生物体由来物質調製用として許容さ
れるイオンから構成されるその塩も本発明に含まれる。
このような塩としては、酸付加塩、塩基性塩などが挙げ
られ、具体的には、塩酸、硫酸、燐酸、ピロ燐酸等の無
機酸の塩、酢酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、
プロピオン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコル
ビン酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の塩などの酸
付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金
属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの塩が
挙げられる。
【００１３】本発明により設計されるペプチド類または
その塩を医薬用途として用いる場合は、その有効量に等
しいかまたはそれ以下の所定量から製剤化され、製剤学
的に許容される担体を含有する粉剤、エリキシル剤、溶
液剤、丸剤、カプセル剤、小丸剤、錠剤、スプレー剤、
嗅剤等の形状をとることができる。本目的に使用が許容
される担体としては、澱粉、砂糖、蛋白、タルク、慣用
的に用いられる合成ゴム、もしくは天然ゴム、水等があ
る。さらにこれら医薬の投与方法としては、特に制限は
ないが、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、場合によっては
脳脊髄腔への注射、経口、経皮、座剤、スプレー剤、点
眼剤等による経粘膜経路がある。
その塩を医薬用途として用いる場合は、その有効量に等
しいかまたはそれ以下の所定量から製剤化され、製剤学
的に許容される担体を含有する粉剤、エリキシル剤、溶
液剤、丸剤、カプセル剤、小丸剤、錠剤、スプレー剤、
嗅剤等の形状をとることができる。本目的に使用が許容
される担体としては、澱粉、砂糖、蛋白、タルク、慣用
的に用いられる合成ゴム、もしくは天然ゴム、水等があ
る。さらにこれら医薬の投与方法としては、特に制限は
ないが、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、場合によっては
脳脊髄腔への注射、経口、経皮、座剤、スプレー剤、点
眼剤等による経粘膜経路がある。
【００１４】本発明により製造されるペプチドで、その
Ｎ末端もしくはＣ末端、または両方において随意に遮断
または保護されているペプチドもまた、本発明に含まれ
る。ここで遮断とは、例えば高分子化合物、蛋白質、酵
素、固定化用担体等に結合している場合をいう。また、
保護とは、アセチル化、アミド化等の種々の化学修飾を
受けた場合をいう。さらに本発明により設計されるペプ
チドは、設計の基になった生理活性ペプチドに対し結合
性を有することから、該生理活性ペプチドまたはその前
駆体を精製する際に用いられる親和性クロマトグラフィ
用担体のリガンドとしての用途がある。また、本発明に
より設計されるペプチドは設計の基になった生理活性ペ
プチドに対する受容体のリガンド結合部位を含有するペ
プチド配列であるため、設計されるペプチドに対する抗
体は生理活性ペプチド受容体を精製する際の免疫クロマ
トグラフィ用担体のリガンドとしても利用でき、さらに
は受容体反応に対する中和抗体としての用途も付加され
る。抗体を得る場合は、ペプチドを高分子量の蛋白質類
や機能性高分子化合物に結合させて免疫原として用いる
ことができる。ペプチドを結合せしめる高分子蛋白質と
しては貝ヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛サイログ
ロブリン、鳥ガンマグロブリン等があり、機能性高分子
化合物としては、ポリビニルピロリドン等があるが、特
にこれらに制限されるものではない。
Ｎ末端もしくはＣ末端、または両方において随意に遮断
または保護されているペプチドもまた、本発明に含まれ
る。ここで遮断とは、例えば高分子化合物、蛋白質、酵
素、固定化用担体等に結合している場合をいう。また、
保護とは、アセチル化、アミド化等の種々の化学修飾を
受けた場合をいう。さらに本発明により設計されるペプ
チドは、設計の基になった生理活性ペプチドに対し結合
性を有することから、該生理活性ペプチドまたはその前
駆体を精製する際に用いられる親和性クロマトグラフィ
用担体のリガンドとしての用途がある。また、本発明に
より設計されるペプチドは設計の基になった生理活性ペ
プチドに対する受容体のリガンド結合部位を含有するペ
プチド配列であるため、設計されるペプチドに対する抗
体は生理活性ペプチド受容体を精製する際の免疫クロマ
トグラフィ用担体のリガンドとしても利用でき、さらに
は受容体反応に対する中和抗体としての用途も付加され
る。抗体を得る場合は、ペプチドを高分子量の蛋白質類
や機能性高分子化合物に結合させて免疫原として用いる
ことができる。ペプチドを結合せしめる高分子蛋白質と
しては貝ヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛サイログ
ロブリン、鳥ガンマグロブリン等があり、機能性高分子
化合物としては、ポリビニルピロリドン等があるが、特
にこれらに制限されるものではない。
【００１５】さらに診断薬用途として、該ペプチドまた
はその塩の所定量を検出用酵素、検出用物質または固定
化用担体に結合させて用いることができる。検出用酵素
としては、西洋わさび過酸化酵素、アルカリフォスファ
ターゼ、ブドウ糖酸化酵素、ブドウ糖６燐酸脱水素酵
素、ガラクトース分解酵素等があり、検出用物質として
は、125Ｉ等のラジオアイソトープ、ＦＩＴＣ等の蛍光
発光物質、磁性化デキストラン等があるが、特にこれら
に制限されるものではない。固定化用担体としては、ラ
テックス粒子、アガロース樹脂、アクリルアミド樹脂、
ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂等があるが特に制
限を加えるものではない。さらに検出用酵素、検出用物
質および固定化用担体に該ペプチドを結合させる場合、
これらの物質とペプチドとの間にスペーサ構造物を共有
結合等により介在させてもよい。
はその塩の所定量を検出用酵素、検出用物質または固定
化用担体に結合させて用いることができる。検出用酵素
としては、西洋わさび過酸化酵素、アルカリフォスファ
ターゼ、ブドウ糖酸化酵素、ブドウ糖６燐酸脱水素酵
素、ガラクトース分解酵素等があり、検出用物質として
は、125Ｉ等のラジオアイソトープ、ＦＩＴＣ等の蛍光
発光物質、磁性化デキストラン等があるが、特にこれら
に制限されるものではない。固定化用担体としては、ラ
テックス粒子、アガロース樹脂、アクリルアミド樹脂、
ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂等があるが特に制
限を加えるものではない。さらに検出用酵素、検出用物
質および固定化用担体に該ペプチドを結合させる場合、
これらの物質とペプチドとの間にスペーサ構造物を共有
結合等により介在させてもよい。
【００１６】また、本発明のペプチドの設計方法は、生
理活性ペプチド受容体のリガンド結合部位を決定する方
法として用いることができる。 即ち、ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配列
（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ中の部分配列を選択する工
程の各工程により受容体上の生理活性ペプチドの結合部
位が決定できる。さらにこの場合は、決定された受容体
上の結合部位の部分配列を基にブラロックの方法(特表
昭62-502513号公報)によって、受容体に対して結合反応
性を有するペプチドを設計することが可能である。この
ようにして得たペプチドは生理活性ペプチドの拮抗薬剤
または作動薬剤として機能する。さらにはこれらの拮抗
ペプチドまたは作動ペプチドは、より高性能な薬剤を設
計する際の基本化合物としても利用できる。
理活性ペプチド受容体のリガンド結合部位を決定する方
法として用いることができる。 即ち、ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ酸配列
（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ中の部分配列を選択する工
程の各工程により受容体上の生理活性ペプチドの結合部
位が決定できる。さらにこの場合は、決定された受容体
上の結合部位の部分配列を基にブラロックの方法(特表
昭62-502513号公報)によって、受容体に対して結合反応
性を有するペプチドを設計することが可能である。この
ようにして得たペプチドは生理活性ペプチドの拮抗薬剤
または作動薬剤として機能する。さらにはこれらの拮抗
ペプチドまたは作動ペプチドは、より高性能な薬剤を設
計する際の基本化合物としても利用できる。
【００１７】
【実施例】本発明を実施例により、さらに具体的に詳述
するが、これにより本発明の範囲を限定するものではな
い。本実施例中のペプチドのアミノ酸配列表は、Ｌ−ア
ミノ酸を１文字で表記する略号として慣用されている下
記の略号を使用し、ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）側
を先頭にして記載した。 Ａ；アラニン、Ｒ；アルギニン、Ｎ；アスパラギン、
Ｄ；アスパラギン酸、Ｃ；システイン、Ｑ；グルタミ
ン、Ｅ；グルタミン酸、Ｇ；グリシン、Ｈ；ヒスチジ
ン、Ｉ；イソロイシン、Ｌ；ロイシン、Ｋ；リジン、
Ｍ；メチオニン、Ｆ；フェニルアラニン、Ｐ；プロリ
ン、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニン、Ｗ；トリプトファ
ン、Ｙ；チロシン、Ｖ；バリン。 実施例１ 本実施例では、生理活性ペプチドとしてエンドセリン１
を使用し、受容体としてウシＡ型受容体およびラットＢ
型受容体を用いた。なお、エンドセリン１の一次構造
は、特開平１−２０６９９７号公報等に記載され、知ら
れているように、表１に示すとおりである。
するが、これにより本発明の範囲を限定するものではな
い。本実施例中のペプチドのアミノ酸配列表は、Ｌ−ア
ミノ酸を１文字で表記する略号として慣用されている下
記の略号を使用し、ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）側
を先頭にして記載した。 Ａ；アラニン、Ｒ；アルギニン、Ｎ；アスパラギン、
Ｄ；アスパラギン酸、Ｃ；システイン、Ｑ；グルタミ
ン、Ｅ；グルタミン酸、Ｇ；グリシン、Ｈ；ヒスチジ
ン、Ｉ；イソロイシン、Ｌ；ロイシン、Ｋ；リジン、
Ｍ；メチオニン、Ｆ；フェニルアラニン、Ｐ；プロリ
ン、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニン、Ｗ；トリプトファ
ン、Ｙ；チロシン、Ｖ；バリン。 実施例１ 本実施例では、生理活性ペプチドとしてエンドセリン１
を使用し、受容体としてウシＡ型受容体およびラットＢ
型受容体を用いた。なお、エンドセリン１の一次構造
は、特開平１−２０６９９７号公報等に記載され、知ら
れているように、表１に示すとおりである。
【表１】
【００１８】１．ブラロックの方法によるエンドセリン
１の相補ペプチドの設計 ブラロックの方法に従い、エンドセリン１を暗号化でき
る遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖を設計し、次いでこの対
合ＤＮＡ配列により規定されるアミノ酸配列を遺伝コド
ンの３'末端及び５’末端のそれぞれから解読し、それ
ぞれについてペプチドを構成するアミノ酸をアミノ末端
（Ｎ側）及びカルボキシル末端（Ｃ側）から配置して下
記表２〜５に示す４通りの設計法による相補ペプチドを
設計した。なお、各表において２段目以降のアミノ酸の
略号は、１段目のアミノ酸の代わりに置換可能なアミノ
酸を示す。
１の相補ペプチドの設計 ブラロックの方法に従い、エンドセリン１を暗号化でき
る遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖を設計し、次いでこの対
合ＤＮＡ配列により規定されるアミノ酸配列を遺伝コド
ンの３'末端及び５’末端のそれぞれから解読し、それ
ぞれについてペプチドを構成するアミノ酸をアミノ末端
（Ｎ側）及びカルボキシル末端（Ｃ側）から配置して下
記表２〜５に示す４通りの設計法による相補ペプチドを
設計した。なお、各表において２段目以降のアミノ酸の
略号は、１段目のアミノ酸の代わりに置換可能なアミノ
酸を示す。
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００１９】２．相補ペプチドと受容体間の相同性の解
析 上記により設計した相補ペプチドを、ウシＡ型受容体及
びラットＢ型受容体のそれぞれの一次アミノ酸配列との
相同性解析を行った。具体的には、まず相補ペプチド及
び受容体のアミノ酸配列に従い、それぞれアミノ末端か
ら１つずつアミノ酸をずらして６アミノ酸ずつの部分配
列を作成した。相補ペプチドの部分配列の群と受容体の
部分配列の群を全て比較し、同順位で一致するアミノ酸
数が３以上連続する、各受容体上の部位を同定した。こ
の同定は実際には、コンピュータを使用して行った。こ
の結果を表６及び表７に示す。
析 上記により設計した相補ペプチドを、ウシＡ型受容体及
びラットＢ型受容体のそれぞれの一次アミノ酸配列との
相同性解析を行った。具体的には、まず相補ペプチド及
び受容体のアミノ酸配列に従い、それぞれアミノ末端か
ら１つずつアミノ酸をずらして６アミノ酸ずつの部分配
列を作成した。相補ペプチドの部分配列の群と受容体の
部分配列の群を全て比較し、同順位で一致するアミノ酸
数が３以上連続する、各受容体上の部位を同定した。こ
の同定は実際には、コンピュータを使用して行った。こ
の結果を表６及び表７に示す。
【００２０】
【表６】
【００２１】
【表７】
【００２２】一方、同様の方法により、各受容体に相同
である相補ペプチド上の部位を解析した一例を表８に示
す。なお、表８に示す相補ペプチドは、エンドセリン１
を実際にコードしているＤＮＡ鎖の対合ＤＮＡ鎖配列を
解読したものである。
である相補ペプチド上の部位を解析した一例を表８に示
す。なお、表８に示す相補ペプチドは、エンドセリン１
を実際にコードしているＤＮＡ鎖の対合ＤＮＡ鎖配列を
解読したものである。
【表８】 以上の表６，７，８に示した相同部位を含むペプチドが
本発明の設計方法により選択され得るペプチドである。
本発明の設計方法により選択され得るペプチドである。
【００２３】３．選択されたペプチドの合成と結合性の
評価 以下に、ペプチドの合成例を示すが、この記載中で使用
するアミノ酸の略号は、Ｌ−アミノ酸を３文字で表記す
る略号として慣用されている下記の略号を使用し、ペプ
チドのアミノ末端（Ｎ末端）側を先頭にして記載した。 Ala；アラニン、Arg；アルギニン、Asn；アスパラギ
ン、Asp；アスパラギン酸、Cys；システイン、Gln；グ
ルタミン、Glu；グルタミン酸、Gly；グリシン、His；
ヒスチジン、Ile；イソロイシン、Leu；ロイシン、Ly
s；リジン、Met；メチオニン、Phe；フェニルアラニ
ン、Pro；プロリン、Ser；セリン、Thr；スレオニン、T
rp；トリプトファン、Tyr；チロシン、Val；バリン。
評価 以下に、ペプチドの合成例を示すが、この記載中で使用
するアミノ酸の略号は、Ｌ−アミノ酸を３文字で表記す
る略号として慣用されている下記の略号を使用し、ペプ
チドのアミノ末端（Ｎ末端）側を先頭にして記載した。 Ala；アラニン、Arg；アルギニン、Asn；アスパラギ
ン、Asp；アスパラギン酸、Cys；システイン、Gln；グ
ルタミン、Glu；グルタミン酸、Gly；グリシン、His；
ヒスチジン、Ile；イソロイシン、Leu；ロイシン、Ly
s；リジン、Met；メチオニン、Phe；フェニルアラニ
ン、Pro；プロリン、Ser；セリン、Thr；スレオニン、T
rp；トリプトファン、Tyr；チロシン、Val；バリン。
【００２４】（１）固相合成装置による合成例 上記設計法により得られた、アミノ酸配列がLys-Arg-Gl
y-Phe-Pro-Proで示されるヘキサペプチドを合成した。
固相として、Fmoc-Pro-Pep Syn KA樹脂カラム（MilliGe
n社製、Fmocとは9-フルオレニルメチルオキシカルボニ
ルの略号である）を用い、９０５０型ペプチド合成装置
〔ミリジェン（MilliGen）社製〕でFmoc-ポリアミド法
により表記のペプチドの合成を行った。２．２ｇの該固
相樹脂（０．０９meq／ｇ）カラムを流速５ｍｌ／分の
ジメチルホルムアミドで１分間平衡化後、Fmoc基を流速
５ｍｌ／分の２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド
（容積／容積）で１０分間除去処理し、その後さらに流
速５ｍｌ／分のジメチルホルムアミドで１５分間該樹脂
を洗浄した。引き続き、固相表面上に結合しているアミ
ノ酸の４倍量(mol数)の Fmoc-Proのペンタフルオロフェ
ニルエステル(Opfp)を５％（重量／容積） 1-ヒドロキ
シベンゾトリアゾール(HOBT)／ジメチルホルムアミド
２．６４ｍｌに溶解し該樹脂カラムに３０分間循環させ
アミノ酸の伸長反応を行った。反応後、該樹脂カラムを
ジメチルホルムアミドで洗浄し次の段階に供した。上記
記載の１段階の反応には約１時間を要した。さらに上記
の段階を次に記載する固相表面上に結合しているアミノ
酸の４倍量(mol数)の保護アミノ酸のペンタフルオロフ
ェニルエステル；Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Mtr),
Fmoc-Lys(Boc)をこの順で用いて反復反応させた後、流
速５ｍｌ／分の２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミ
ドで１０分間、同流速のジメチルホルムアミドで１５分
間、さらに同流速のジクロロメタンで１５分間順次洗浄
することにより Fmoc基を除去したペプチド樹脂；Lys(B
oc)-Arg(Mtr)-Gly-Phe-Pro-Pro-Pep Syn KA-樹脂を得
た。但し、２アミノ酸伸長後のFmoc基除去処理は０．２
％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（容積／容積）で
１時間行った。上記反応により得られたペプチド樹脂を
カラムから取り出し、m-クレゾールの０．６ｍｌ、チオ
アニソールの３．６ｍｌ、トリフルオロ酢酸２０．０ｍ
ｌを加え室温で１時間撹拌し、樹脂からペプチドを溶離
させた。溶離液は濾液として回収し、該濾液にエタンジ
チオールの１．８ｍｌ、トリメチルブロモシランの４．
０ｍｌを加え０℃で１時間撹拌後窒素ガスを吹き付け
た。引き続き、該混合液を撹拌しつつエーテルの１００
ｍｌを添加してペプチドを析出させ３，０００×ｇで５
分間遠沈回収した。その後さらに上記操作により回収し
た沈澱をエーテルにより４回遠沈洗浄した後、減圧乾固
して表記のペプチドを得た。
y-Phe-Pro-Proで示されるヘキサペプチドを合成した。
固相として、Fmoc-Pro-Pep Syn KA樹脂カラム（MilliGe
n社製、Fmocとは9-フルオレニルメチルオキシカルボニ
ルの略号である）を用い、９０５０型ペプチド合成装置
〔ミリジェン（MilliGen）社製〕でFmoc-ポリアミド法
により表記のペプチドの合成を行った。２．２ｇの該固
相樹脂（０．０９meq／ｇ）カラムを流速５ｍｌ／分の
ジメチルホルムアミドで１分間平衡化後、Fmoc基を流速
５ｍｌ／分の２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド
（容積／容積）で１０分間除去処理し、その後さらに流
速５ｍｌ／分のジメチルホルムアミドで１５分間該樹脂
を洗浄した。引き続き、固相表面上に結合しているアミ
ノ酸の４倍量(mol数)の Fmoc-Proのペンタフルオロフェ
ニルエステル(Opfp)を５％（重量／容積） 1-ヒドロキ
シベンゾトリアゾール(HOBT)／ジメチルホルムアミド
２．６４ｍｌに溶解し該樹脂カラムに３０分間循環させ
アミノ酸の伸長反応を行った。反応後、該樹脂カラムを
ジメチルホルムアミドで洗浄し次の段階に供した。上記
記載の１段階の反応には約１時間を要した。さらに上記
の段階を次に記載する固相表面上に結合しているアミノ
酸の４倍量(mol数)の保護アミノ酸のペンタフルオロフ
ェニルエステル；Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Mtr),
Fmoc-Lys(Boc)をこの順で用いて反復反応させた後、流
速５ｍｌ／分の２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミ
ドで１０分間、同流速のジメチルホルムアミドで１５分
間、さらに同流速のジクロロメタンで１５分間順次洗浄
することにより Fmoc基を除去したペプチド樹脂；Lys(B
oc)-Arg(Mtr)-Gly-Phe-Pro-Pro-Pep Syn KA-樹脂を得
た。但し、２アミノ酸伸長後のFmoc基除去処理は０．２
％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（容積／容積）で
１時間行った。上記反応により得られたペプチド樹脂を
カラムから取り出し、m-クレゾールの０．６ｍｌ、チオ
アニソールの３．６ｍｌ、トリフルオロ酢酸２０．０ｍ
ｌを加え室温で１時間撹拌し、樹脂からペプチドを溶離
させた。溶離液は濾液として回収し、該濾液にエタンジ
チオールの１．８ｍｌ、トリメチルブロモシランの４．
０ｍｌを加え０℃で１時間撹拌後窒素ガスを吹き付け
た。引き続き、該混合液を撹拌しつつエーテルの１００
ｍｌを添加してペプチドを析出させ３，０００×ｇで５
分間遠沈回収した。その後さらに上記操作により回収し
た沈澱をエーテルにより４回遠沈洗浄した後、減圧乾固
して表記のペプチドを得た。
【００２５】このようにして得られたペプチドは、ＹＭ
Ｃ−ＯＤＳ−５（直径4.6mm×150mm，山村化学製)上で
溶離剤として０．１％トリフルオロ酢酸水溶液-アセト
ニトリル(５％-２３％グラジエント、１５分間、０．５
ｍｌ／分)を用いるＨＰＬＣにおいて、２９分間の保持
時間を示した。１０μｇ／５μｌのペプチド水溶液をイ
ンジェクトして得た保持時間２９分のピーク画分をチュ
ーブに入れ減圧乾燥させた後、PICO TAGワークステーシ
ョン(ウォーターズ社製)の反応槽に１％フェノール／６
Ｎ塩酸（容積／容積）を減圧気化（500mTorr）させ、１
５０℃で１時間処理してペプチドを酸分解した。引き続
き、湿潤状態のペプチドを減圧乾燥させ、エタノール、
水、トリエチルアミンの２：２：１（容積：容積：容
積）混合液１０μｌに溶解後再度減圧乾燥させた。その
後さらにエタノール、トリエチルアミン、水、フェニル
イソチオシアネートの７：１：１：１（容積：容積：容
積：容積）混合液を２０μｌ添加し、室温で２５分間反
応させた後、５０μｌのＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ａ（和
光純薬工業社製）／ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ（和光純
薬工業社製）（ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ容積比０％−
７０％グラジェント、１５分間、１ｍｌ／分）を展開溶
液に用いるＨＰＬＣのアミノ酸を分離し、同様に処理し
たアミノ酸標準液のピーク高から該合成ペプチドのアミ
ノ酸組成を求めた結果、Lys 0.96(1), Arg 0.78(1),Gly
1.13(1), Phe 0.97(1), Pro 2.15(2)であった。
Ｃ−ＯＤＳ−５（直径4.6mm×150mm，山村化学製)上で
溶離剤として０．１％トリフルオロ酢酸水溶液-アセト
ニトリル(５％-２３％グラジエント、１５分間、０．５
ｍｌ／分)を用いるＨＰＬＣにおいて、２９分間の保持
時間を示した。１０μｇ／５μｌのペプチド水溶液をイ
ンジェクトして得た保持時間２９分のピーク画分をチュ
ーブに入れ減圧乾燥させた後、PICO TAGワークステーシ
ョン(ウォーターズ社製)の反応槽に１％フェノール／６
Ｎ塩酸（容積／容積）を減圧気化（500mTorr）させ、１
５０℃で１時間処理してペプチドを酸分解した。引き続
き、湿潤状態のペプチドを減圧乾燥させ、エタノール、
水、トリエチルアミンの２：２：１（容積：容積：容
積）混合液１０μｌに溶解後再度減圧乾燥させた。その
後さらにエタノール、トリエチルアミン、水、フェニル
イソチオシアネートの７：１：１：１（容積：容積：容
積：容積）混合液を２０μｌ添加し、室温で２５分間反
応させた後、５０μｌのＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ａ（和
光純薬工業社製）／ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ（和光純
薬工業社製）（ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ容積比０％−
７０％グラジェント、１５分間、１ｍｌ／分）を展開溶
液に用いるＨＰＬＣのアミノ酸を分離し、同様に処理し
たアミノ酸標準液のピーク高から該合成ペプチドのアミ
ノ酸組成を求めた結果、Lys 0.96(1), Arg 0.78(1),Gly
1.13(1), Phe 0.97(1), Pro 2.15(2)であった。
【００２６】（２）ペプチドの結合性の評価のためのピ
ンテクノロジ法による合成 ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル社（ＣＲＢ
社）のＰＴ−０２−３０００マニュアルに従い、ＮＥＣ
社製のＡＰＣ Ｈ５０２０型コンピュータ上でＣＲＢ社
製ソフトウエアを起動させ、ペプチドの合成に必要なア
ミノ酸量、試薬量およびピンの配置を計算した。ペプチ
ドの合成は上記マニュアルおよび文献〔ジェイセン（Ge
ysen）H M.:ユーズ オブ ペプタイド シンセシス
トゥー プローブ バイラル アンチゲンス フォー
エピトープス トゥー ア レゾリュウーション オブ
ア シングル アミノ アシド（Use of peptide syn
thesis to probe viral antigensfor epitopes to a re
solution of a single amino acid）: Proc.Natl.Acad.
Sci.USA.,81,3998-4002,(1984)〕に準じ、ＣＲＢ社製の
ミモトープ・デザインキットに含まれるピン・ブロック
とFmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ
−アミノ酸を用いて行った。セリンとスレオニンを除く
全てのアミノ酸はアミノ末端をFmoc基で保護されたペン
タフルオロフェニルエステル(-Opfp)エステルであり、
セリンとスレオニンはアミノ末端をFmoc基で保護された
ジヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(-ODhbt)エステルで
ある。また、セリン、スレオニン、チロシンの側鎖保護
基はt-ブチルエーテル(-tBu)、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸の側鎖保護基はt-ブチルエステル(-OtBu)、リジ
ン、ヒスチジンの側鎖保護基はt-ブトキシカルボニル(B
oc-)、アルギニンの側鎖保護基は4-メトキシ-2,3,6-ト
リメチルベンゼンスルフォニル(Mtr-)、システィンの側
鎖保護基はトリチル(Trt-)である。また、合成に供する
ピンは表面にアクリル酸がグラフト重合させてあるポリ
エチレンの支持体にヘキサメチレンジアミン(HMD)をス
ペーサとしてFmoc-βアラニン(bAla)が結合させてあ
る。以下に具体的合成例を示す。
ンテクノロジ法による合成 ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル社（ＣＲＢ
社）のＰＴ−０２−３０００マニュアルに従い、ＮＥＣ
社製のＡＰＣ Ｈ５０２０型コンピュータ上でＣＲＢ社
製ソフトウエアを起動させ、ペプチドの合成に必要なア
ミノ酸量、試薬量およびピンの配置を計算した。ペプチ
ドの合成は上記マニュアルおよび文献〔ジェイセン（Ge
ysen）H M.:ユーズ オブ ペプタイド シンセシス
トゥー プローブ バイラル アンチゲンス フォー
エピトープス トゥー ア レゾリュウーション オブ
ア シングル アミノ アシド（Use of peptide syn
thesis to probe viral antigensfor epitopes to a re
solution of a single amino acid）: Proc.Natl.Acad.
Sci.USA.,81,3998-4002,(1984)〕に準じ、ＣＲＢ社製の
ミモトープ・デザインキットに含まれるピン・ブロック
とFmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ
−アミノ酸を用いて行った。セリンとスレオニンを除く
全てのアミノ酸はアミノ末端をFmoc基で保護されたペン
タフルオロフェニルエステル(-Opfp)エステルであり、
セリンとスレオニンはアミノ末端をFmoc基で保護された
ジヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(-ODhbt)エステルで
ある。また、セリン、スレオニン、チロシンの側鎖保護
基はt-ブチルエーテル(-tBu)、アスパラギン酸、グルタ
ミン酸の側鎖保護基はt-ブチルエステル(-OtBu)、リジ
ン、ヒスチジンの側鎖保護基はt-ブトキシカルボニル(B
oc-)、アルギニンの側鎖保護基は4-メトキシ-2,3,6-ト
リメチルベンゼンスルフォニル(Mtr-)、システィンの側
鎖保護基はトリチル(Trt-)である。また、合成に供する
ピンは表面にアクリル酸がグラフト重合させてあるポリ
エチレンの支持体にヘキサメチレンジアミン(HMD)をス
ペーサとしてFmoc-βアラニン(bAla)が結合させてあ
る。以下に具体的合成例を示す。
【００２７】Lys-Arg-Gly-Phe-Pro-Proで示されるペプ
チドの合成 ポリエチレンロッド末端のピン球(直径４ｍｍ)にアクリ
ル酸をグラフト重合させ、ヘキサメチレンジアミン基(H
MD)を介し9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmo
c)基でαアミノ基が保護されたβ-アラニンを結合させ
てある樹脂のFmoc基を２０％ピペリジン／ジメチルホル
ムアミド（容積／容積）で３０分間除去処理し、ジメチ
ルホルムアミド、メタノールのそれぞれ過剰量で順に洗
浄後風乾し、さらにジメチルホルムアミド中で樹脂を平
衡化後、２２．５ｍＭ 1-ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル(HOBT)／ジメチルホルムアミドに溶解した２０ｍＭ F
moc-Proのペンタフルオロフェニルエステル(-Opfp)の１
００μｌに３０℃で１晩浸漬し、その後過剰量のジメチ
ルホルムアミド、メタノールで樹脂を順次洗浄してFmoc
-Pro-bAla-HMD-樹脂を得た。引き続き該ペプチド樹脂の
αアミノ基の保護基(Fmoc)を上記の処理により除き、さ
らに上記の段階を次に記載する２０ｍＭの保護アミノ酸
のペンタフルオロフェニルエステル；Fmoc-Pro, Fmoc-P
he, Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Mtr),Fmoc-Lys(Boc)をこの順
で用いて反復反応させ保護されたペプチド樹脂；Fmoc-L
ys(Boc)-Arg(Mtr)-Gly-Phe-Pro-Pro-bAla-HMD-樹脂を得
た。該ペプチド樹脂のαアミノ基の保護基(Fmoc)を上記
の処理により除き、過剰量のジメチルホルムアミド、メ
タノールで樹脂を順次洗浄後風乾した。その後、ジメチ
ルホルムアミド、無水酢酸、トリエチルアミンの５：
２：１（容積：容積：容積）混合液中に該ペプチド樹脂
を浸漬してアセチル化反応を３０℃で９０分間行い、同
様に過剰量のジメチルホルムアミド、メタノールで樹脂
を順次洗浄後風乾した。引き続き、トリフルオロ酢酸、
アニソール、エタンジチオールの９５：２．５：２．５
（容積：容積：容積）混合液中に該ペプチド樹脂を浸漬
し室温で４時間反応させて保護基を除去、風乾後０．１
％（容積／容積）塩酸、５０％（容積／容積）メタノー
ルの混液中で該ペプチドを十分に超音波洗浄して、Ac-L
ys-Arg-Gly-Phe-Pro-Pro-bAla-HMD-樹脂を得た。
チドの合成 ポリエチレンロッド末端のピン球(直径４ｍｍ)にアクリ
ル酸をグラフト重合させ、ヘキサメチレンジアミン基(H
MD)を介し9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmo
c)基でαアミノ基が保護されたβ-アラニンを結合させ
てある樹脂のFmoc基を２０％ピペリジン／ジメチルホル
ムアミド（容積／容積）で３０分間除去処理し、ジメチ
ルホルムアミド、メタノールのそれぞれ過剰量で順に洗
浄後風乾し、さらにジメチルホルムアミド中で樹脂を平
衡化後、２２．５ｍＭ 1-ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル(HOBT)／ジメチルホルムアミドに溶解した２０ｍＭ F
moc-Proのペンタフルオロフェニルエステル(-Opfp)の１
００μｌに３０℃で１晩浸漬し、その後過剰量のジメチ
ルホルムアミド、メタノールで樹脂を順次洗浄してFmoc
-Pro-bAla-HMD-樹脂を得た。引き続き該ペプチド樹脂の
αアミノ基の保護基(Fmoc)を上記の処理により除き、さ
らに上記の段階を次に記載する２０ｍＭの保護アミノ酸
のペンタフルオロフェニルエステル；Fmoc-Pro, Fmoc-P
he, Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Mtr),Fmoc-Lys(Boc)をこの順
で用いて反復反応させ保護されたペプチド樹脂；Fmoc-L
ys(Boc)-Arg(Mtr)-Gly-Phe-Pro-Pro-bAla-HMD-樹脂を得
た。該ペプチド樹脂のαアミノ基の保護基(Fmoc)を上記
の処理により除き、過剰量のジメチルホルムアミド、メ
タノールで樹脂を順次洗浄後風乾した。その後、ジメチ
ルホルムアミド、無水酢酸、トリエチルアミンの５：
２：１（容積：容積：容積）混合液中に該ペプチド樹脂
を浸漬してアセチル化反応を３０℃で９０分間行い、同
様に過剰量のジメチルホルムアミド、メタノールで樹脂
を順次洗浄後風乾した。引き続き、トリフルオロ酢酸、
アニソール、エタンジチオールの９５：２．５：２．５
（容積：容積：容積）混合液中に該ペプチド樹脂を浸漬
し室温で４時間反応させて保護基を除去、風乾後０．１
％（容積／容積）塩酸、５０％（容積／容積）メタノー
ルの混液中で該ペプチドを十分に超音波洗浄して、Ac-L
ys-Arg-Gly-Phe-Pro-Pro-bAla-HMD-樹脂を得た。
【００２８】（３）上記で合成されたペプチドのエンド
セリン１結合活性の測定 ａ：〔酵素免疫競合阻害測定法〕上記（２）おいて得ら
れたペプチド樹脂を０．２％脱脂粉乳溶液で易吸着性部
位を被覆後、２００μｌのヒト・エンドセリン１溶液
(０．２μｇ／ｍｌ)［０．１％脱脂粉乳及び０．１％ト
ウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液に溶
解して調製］に浸漬し、室温で緩やかに撹拌しながら３
時間反応を行った後の溶液を試料液(i)とした。これと
は別にＥＬＩＳＡ用マイクロプレートの孔をヒト・エン
ドセリン１溶液(１μｇ／ｍｌ)の２００μｌで４℃１晩
処理し、さらに翌日０．２％脱脂粉乳溶液でプレート上
の未反応部位を保護してヒト・エンドセリン１吸着プレ
ート(ii)を調製した。ヒト・エンドセリン１吸着プレー
ト(ii)を洗浄用緩衝液［０．１％トウィーンを含有する
ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液］で洗浄後、試料液(i)
の５０μｌを添加、その後直ちに５，０００分の１に希
釈した抗ヒト・エンドセリン１ウサギ抗体溶液［希釈用
緩衝液として、０．１％脱脂粉乳及び０．１％トウィー
ンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液を使用］の
２００μｌを加え室温で２時間競合反応を行った。該競
合反応後プレートを洗浄用緩衝液で十分に洗浄して、
２，０００分の１に希釈したアルカリフォスファターゼ
標識抗ウサギＩｇＧ，Ａ，Ｍヤギ抗体溶液の２００μｌ
を加えプレート上に捕捉されている抗ヒト・エンドセリ
ン１ウサギ抗体と室温で２時間結合反応させた。その後
同様にプレートを洗浄し、基質溶液(１ｍｇ p-ニトロフ
ェニル燐酸／ｍｌ １Ｍジエタノールアミン緩衝液)の２
００μｌを添加、プレート上に捕捉残存している標識酵
素により遊離されるp-ニトロフェノール量を４０５ｎｍ
の吸光度を測定することにより求め、別に作成した検量
線から試料液(i)中のヒト・エンドセリン１量を算出し
た。その結果、該試料液(i)中のヒト・エンドセリン１
の抗原活性はペプチド樹脂ピンへの結合反応を行う前の
７８．９％（阻害活性２１．１％）に低下していた。
セリン１結合活性の測定 ａ：〔酵素免疫競合阻害測定法〕上記（２）おいて得ら
れたペプチド樹脂を０．２％脱脂粉乳溶液で易吸着性部
位を被覆後、２００μｌのヒト・エンドセリン１溶液
(０．２μｇ／ｍｌ)［０．１％脱脂粉乳及び０．１％ト
ウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液に溶
解して調製］に浸漬し、室温で緩やかに撹拌しながら３
時間反応を行った後の溶液を試料液(i)とした。これと
は別にＥＬＩＳＡ用マイクロプレートの孔をヒト・エン
ドセリン１溶液(１μｇ／ｍｌ)の２００μｌで４℃１晩
処理し、さらに翌日０．２％脱脂粉乳溶液でプレート上
の未反応部位を保護してヒト・エンドセリン１吸着プレ
ート(ii)を調製した。ヒト・エンドセリン１吸着プレー
ト(ii)を洗浄用緩衝液［０．１％トウィーンを含有する
ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液］で洗浄後、試料液(i)
の５０μｌを添加、その後直ちに５，０００分の１に希
釈した抗ヒト・エンドセリン１ウサギ抗体溶液［希釈用
緩衝液として、０．１％脱脂粉乳及び０．１％トウィー
ンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液を使用］の
２００μｌを加え室温で２時間競合反応を行った。該競
合反応後プレートを洗浄用緩衝液で十分に洗浄して、
２，０００分の１に希釈したアルカリフォスファターゼ
標識抗ウサギＩｇＧ，Ａ，Ｍヤギ抗体溶液の２００μｌ
を加えプレート上に捕捉されている抗ヒト・エンドセリ
ン１ウサギ抗体と室温で２時間結合反応させた。その後
同様にプレートを洗浄し、基質溶液(１ｍｇ p-ニトロフ
ェニル燐酸／ｍｌ １Ｍジエタノールアミン緩衝液)の２
００μｌを添加、プレート上に捕捉残存している標識酵
素により遊離されるp-ニトロフェノール量を４０５ｎｍ
の吸光度を測定することにより求め、別に作成した検量
線から試料液(i)中のヒト・エンドセリン１量を算出し
た。その結果、該試料液(i)中のヒト・エンドセリン１
の抗原活性はペプチド樹脂ピンへの結合反応を行う前の
７８．９％（阻害活性２１．１％）に低下していた。
【００２９】ｂ：〔放射性リガンドの結合活性〕上記
（２）において得られたペプチド樹脂を０．２％脱脂粉
乳溶液で易吸着性部位を被覆後、１００ｍｌの125Ｉ-ヒ
ト・エンドセリン１(比活性−７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ)溶
液（０．１３１ｎｇ／ｍｌ）［０．１％脱脂粉乳及び
０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理
食塩液に溶解して調製］に懸濁し室温で２時間反応させ
た。結合反応後、ペプチド樹脂を洗浄用緩衝液［０．１
％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
液］で十分に洗浄し、ペプチド樹脂に結合した放射活性
をγカウンタで測定した。その結果、ペプチド樹脂に結
合したヒト・エンドセリン１は、５．１７６ｐｇである
と計算された。
（２）において得られたペプチド樹脂を０．２％脱脂粉
乳溶液で易吸着性部位を被覆後、１００ｍｌの125Ｉ-ヒ
ト・エンドセリン１(比活性−７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ)溶
液（０．１３１ｎｇ／ｍｌ）［０．１％脱脂粉乳及び
０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理
食塩液に溶解して調製］に懸濁し室温で２時間反応させ
た。結合反応後、ペプチド樹脂を洗浄用緩衝液［０．１
％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
液］で十分に洗浄し、ペプチド樹脂に結合した放射活性
をγカウンタで測定した。その結果、ペプチド樹脂に結
合したヒト・エンドセリン１は、５．１７６ｐｇである
と計算された。
【００３０】上記（２）の方法で、本発明の設計方法に
より選択された多種のペプチドを合成し、上記（３）の
方法に従ってそれらの結合活性を評価した。その結果を
表９に示す。
より選択された多種のペプチドを合成し、上記（３）の
方法に従ってそれらの結合活性を評価した。その結果を
表９に示す。
【００３１】
【表９】
【００３２】実施例２ 本実施例では、生理活性ペプチドとして利尿ホルモンを
使用し、受容体としてＡ型受容体、Ｂ型受容体及びＣ型
受容体を用いた。なお、利尿ホルモンの一次構造は、表
１０に示すとおりである。
使用し、受容体としてＡ型受容体、Ｂ型受容体及びＣ型
受容体を用いた。なお、利尿ホルモンの一次構造は、表
１０に示すとおりである。
【表１０】
【００３３】１．Blalockの方法によるエンドセリン１
の相補ペプチドの設計 Blalockの方法に従い利尿ホルモンを暗号化できる遺伝
コドンから成るＤＮＡ鎖を設計し、次いでこの対合ＤＮ
Ａ配列により規定されるアミノ酸配列を遺伝コドンの
３'末端及び５’末端のそれぞれから解読し、それぞれ
についてペプチドを構成するアミノ酸をアミノ末端（Ｎ
側）及びカルボキシル末端（Ｃ側）から配置して下記表
２〜５に示す４通りの設計法によるペプチドを設計し
た。なお、各表において２段目以降のアミノ酸の略号
は、１段目のアミノ酸の代わりに置換可能なアミノ酸を
示す。
の相補ペプチドの設計 Blalockの方法に従い利尿ホルモンを暗号化できる遺伝
コドンから成るＤＮＡ鎖を設計し、次いでこの対合ＤＮ
Ａ配列により規定されるアミノ酸配列を遺伝コドンの
３'末端及び５’末端のそれぞれから解読し、それぞれ
についてペプチドを構成するアミノ酸をアミノ末端（Ｎ
側）及びカルボキシル末端（Ｃ側）から配置して下記表
２〜５に示す４通りの設計法によるペプチドを設計し
た。なお、各表において２段目以降のアミノ酸の略号
は、１段目のアミノ酸の代わりに置換可能なアミノ酸を
示す。
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【００３４】２．相補ペプチドと受容体間の相同性の解
析 上記により設計した相補ペプチドを、Ａ型受容体、Ｂ型
受容体及びＣ型受容体のそれぞれの一次アミノ酸配列と
の相同性解析を行った。具体的には、まず相補ペプチド
及び受容体のアミノ酸配列に従い、それぞれアミノ末端
から１つずつアミノ酸をずらして６アミノ酸ずつの部分
配列を作成した。相補ペプチドの部分配列の群と受容体
の部分配列の群を全て比較し、同順位で一致するアミノ
酸数が４以上連続する、各受容体上の部位を解析した。
それとともに、実際に利尿ホルモンのアミノ酸配列を暗
号化している遺伝子コドンのみに基づいて設計した相補
ペプチドについて、Ａ型受容体、Ｂ型受容体及びＣ型受
容体のそれぞれの一次アミノ酸配列との相同性解析を、
同順位で一致するアミノ酸数を４以上ではなく、３以上
連続するものとした以外は、上記と同様に行った。この
解析は実際には、コンピュータを使用して行った。この
結果を表１５、表１６及び表１７に示す。
析 上記により設計した相補ペプチドを、Ａ型受容体、Ｂ型
受容体及びＣ型受容体のそれぞれの一次アミノ酸配列と
の相同性解析を行った。具体的には、まず相補ペプチド
及び受容体のアミノ酸配列に従い、それぞれアミノ末端
から１つずつアミノ酸をずらして６アミノ酸ずつの部分
配列を作成した。相補ペプチドの部分配列の群と受容体
の部分配列の群を全て比較し、同順位で一致するアミノ
酸数が４以上連続する、各受容体上の部位を解析した。
それとともに、実際に利尿ホルモンのアミノ酸配列を暗
号化している遺伝子コドンのみに基づいて設計した相補
ペプチドについて、Ａ型受容体、Ｂ型受容体及びＣ型受
容体のそれぞれの一次アミノ酸配列との相同性解析を、
同順位で一致するアミノ酸数を４以上ではなく、３以上
連続するものとした以外は、上記と同様に行った。この
解析は実際には、コンピュータを使用して行った。この
結果を表１５、表１６及び表１７に示す。
【００３５】
【表１５】
【００３６】
【表１６】
【００３７】
【表１７】 以上の表１５、１６及び１７に示した相同部位を含むペ
プチドが本発明の設計方法により選択され得るペプチド
である。
プチドが本発明の設計方法により選択され得るペプチド
である。
【００３８】３．選択されたペプチドの合成と結合性の
評価 上記の方法で選択したペプチドの利尿ホルモンに対する
結合性を評価するためにいくつかのペプチドを、実施例
１に記載のピンテクノロジー法に従って合成し、実施例
１記載の方法と同様にして評価した。その結果を表１８
に示す。
評価 上記の方法で選択したペプチドの利尿ホルモンに対する
結合性を評価するためにいくつかのペプチドを、実施例
１に記載のピンテクノロジー法に従って合成し、実施例
１記載の方法と同様にして評価した。その結果を表１８
に示す。
【００３９】
【表１８】
【００４０】
【発明の効果】本発明の方法により設計され、製造され
るペプチド類は、生理活性ペプチドに対し特異的な反応
性および高い結合能を有する。したがって、得られるペ
プチド類は、該生理活性ペプチドおよびその前駆物質あ
るいはその一部の測定に用いる検出試薬、さらには該生
理活性ペプチドの機能を抑制あるいは修飾する治療薬を
はじめとする薬剤等を設計する上で極めて有効である。
るペプチド類は、生理活性ペプチドに対し特異的な反応
性および高い結合能を有する。したがって、得られるペ
プチド類は、該生理活性ペプチドおよびその前駆物質あ
るいはその一部の測定に用いる検出試薬、さらには該生
理活性ペプチドの機能を抑制あるいは修飾する治療薬を
はじめとする薬剤等を設計する上で極めて有効である。
【００４１】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４６】配列番号：６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４７】配列番号：７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４８】配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４９】配列番号：９ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５０】配列番号：１０ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５１】配列番号：１１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５２】配列番号：１２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５３】配列番号：１３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５４】配列番号：１４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５５】配列番号：１５ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５６】配列番号：１６ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５７】配列番号：１７ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５８】配列番号：１８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５９】配列番号：１９ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６０】配列番号：２０ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６１】配列番号：２１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６２】配列番号：２２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６３】配列番号：２３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６４】配列番号：２４ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １ 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20
Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ １ 5 10 15 Leu Asp Ile Ile Trp 20
【００６５】配列番号：２５ 配列の長さ：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 小田川 泰久 茨城県日立市東町四丁目13番１号 日立化 成工業株式会社山崎工場内 (72)発明者 馬場 憲三 茨城県つくば市和台48番地 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内
Claims (17)
- 【請求項１】 ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ又は前記アミノ酸配列Ｃ中
の部分配列を選択する工程の各工程を含むことを特徴と
する、生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の
設計方法。 - 【請求項２】 工程ｄが、両アミノ酸配列Ｒ及びＣの、
少なくとも６アミノ酸残基以上で構成される部分配列同
士を全て比較するものであり、工程ｅが、同順位で一致
するアミノ酸数が一致しないアミノ酸数に等しいかそれ
以上であるときに相同性があるものとして選択するもの
である請求項１記載の生理活性ペプチドに結合性を有す
るペプチド類の設計方法。 - 【請求項３】 工程ｄが、両アミノ酸配列Ｒ及びＣをそ
れぞれアミノ末端から１アミノ酸ずつづらして、６アミ
ノ酸残基で構成される部分配列を作成し、両部分配列同
士を全て比較するものであり、工程ｅが、同順位で一致
するアミノ酸数が３以上であるときに相同性があるもの
として選択するものである請求項１記載の生理活性ペプ
チドに結合性を有するペプチド類の設計方法。 - 【請求項４】 工程ｃが、塩基配列Ｃを遺伝コドンとし
て５’末端から解読し、アミノ酸をＮ末端側から配置し
てアミノ酸配列Ｃを決定するものである請求項１、２ま
たは３記載の生理活性ペプチドに結合性を有するペプチ
ド類の設計方法。 - 【請求項５】 工程ｃが、塩基配列Ｃを遺伝コドンとし
て５’末端から解読し、アミノ酸をＣ末端側から配置し
てアミノ酸配列Ｃを決定するものである請求項１、２ま
たは３記載の生理活性ペプチドに結合性を有するペプチ
ド類の設計方法。 - 【請求項６】 工程ｃが、塩基配列Ｃを遺伝コドンとし
て３’末端から解読し、アミノ酸をＮ末端側から配置し
てアミノ酸配列Ｃを決定するものである請求項１、２ま
たは３記載の生理活性ペプチドに結合性を有するペプチ
ド類の設計方法。 - 【請求項７】 工程ｃが、塩基配列Ｃを遺伝コドンとし
て３’末端から解読し、アミノ酸をＣ末端側から配置し
てアミノ酸配列Ｃを決定するものである請求項１、２ま
たは３記載の生理活性ペプチドに結合性を有するペプチ
ド類の設計方法。 - 【請求項８】 塩基配列Ａとして、生理活性ペプチドを
実際に暗号化している遺伝子コドンを使用する請求項１
〜７のいずれかに記載の生理活性ペプチドに結合性を有
するペプチド類の設計方法。 - 【請求項９】 選択されたペプチド類の中からさらに細
胞表面に位置する受容体の部分配列を選択する請求項１
記載の生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の
設計方法。 - 【請求項１０】 選択されたペプチド類の中からさらに
受容体上のβターンまたはコイル構造をとる部分配列を
選択する請求項１または９記載の生理活性ペプチドに結
合性を有するペプチド類の設計方法。 - 【請求項１１】 選択されたペプチド類の中からさらに
受容体上の糖鎖結合部位でない部分配列を選択する請求
項１、８または９記載の生理活性ペプチドに結合性を有
するペプチド類の設計方法。 - 【請求項１２】 請求項４、５、６および７に記載の各
方法で設計し、少なくとも２種類の方法で選択された部
分配列を選択する請求項１、２、３、８、９、１０また
は１１記載の生理活性ペプチドに結合性を有するペプチ
ド類の設計方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれかに記載の方
法により設計されたペプチドのアミノ酸配列のＮ末端側
とＣ末端側を逆にして配列しなおしたペプチドを選択す
る生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類の設計
方法。 - 【請求項１４】 請求項１〜１３記載のいずれかの方法
によりペプチド類を設計し、次いで設計されたペプチド
の少なくとも４個の連続するアミノ酸続配列を含むペプ
チドを製造することを特徴とする生理活性ペプチドに結
合性を有するペプチド類の製造方法。 - 【請求項１５】 請求項１４記載の製造方法により製造
された、生理活性ペプチドに結合性を有するペプチド類
およびその塩。 - 【請求項１６】 ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、ま
たは両方において随意に遮断または保護されている請求
項１５記載のペプチド類およびその塩。 - 【請求項１７】 ａ．生理活性ペプチドの受容体のアミ
ノ酸配列（アミノ酸配列Ｒ）を決定する工程、 ｂ．生理活性ペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸配列
Ａ）を暗号化できる遺伝コドンから成るＤＮＡ鎖の塩基
配列（塩基配列Ａ）を求め、その対合ＤＮＡ鎖の塩基配
列（塩基配列Ｃ）を決定する工程、 ｃ．前記塩基配列Ｃを遺伝コドンとして解読し、アミノ
酸配列（アミノ酸配列Ｃ）を決定する工程、 ｄ．前記アミノ酸配列Ｒと、前記アミノ酸配列Ｃとを比
較する工程、 ｅ．両アミノ酸配列の相同性のある部分を求め、その部
分を含む前記アミノ酸配列Ｒ中の部分配列を選択する工
程の各工程を含むことを特徴とする、受容体上の生理活
性ペプチドの結合部位の決定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-221971 | 1991-09-03 | ||
| JP22197191 | 1991-09-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05262788A true JPH05262788A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=16775038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23195592A Pending JPH05262788A (ja) | 1991-09-03 | 1992-08-31 | ペプチド類、その設計方法及び製造方法並びに受容体上の生理活性ペプチドの結合部位の決定方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0535804A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05262788A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7490694A (en) * | 1993-07-02 | 1995-01-24 | Sandoz Ltd. | Insect diuretic hormone receptor, preferably isolated from manduca sexta |
| US6273598B1 (en) | 1996-01-22 | 2001-08-14 | Creative Biomolecules, Inc. | Computer system and methods for producing morphogen analogs of human OP-1 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5077195A (en) * | 1985-03-01 | 1991-12-31 | Board Of Reagents, The University Of Texas System | Polypeptides complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known and methods of design therefor |
-
1992
- 1992-08-31 JP JP23195592A patent/JPH05262788A/ja active Pending
- 1992-09-03 EP EP92307976A patent/EP0535804A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0535804A1 (en) | 1993-04-07 |
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