JPH11507648A - コンホメーション的に制限された組合わせライブラリー組成物および方法 - Google Patents

コンホメーション的に制限された組合わせライブラリー組成物および方法

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JPH11507648A
JPH11507648A JP9502436A JP50243697A JPH11507648A JP H11507648 A JPH11507648 A JP H11507648A JP 9502436 A JP9502436 A JP 9502436A JP 50243697 A JP50243697 A JP 50243697A JP H11507648 A JPH11507648 A JP H11507648A
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Abstract

(57)【要約】 異なる配列のペプチドメンバーの組合わせライブラリーが開示される。このライブラリーは、類似した三次構造であるが配列中の特定の「可変」位置に異なるアミノ酸残基を有する安定化されたαヘリックスポリペプチドから構成される。このポリペプチドは、他のαヘリックスポリペプチドとのコイルドコイル相互作用によっておよび/またはヘリックス内ラクタム架橋によって安定化される。このようなライブラリーを使用する、選択された巨大分子リガンドについてスクリーニングする方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 コンホメーション的に制限された組合わせライブラリー組成物 および方法発明の分野 本発明は、コンホメーション的に制限されたポリペプチドの組合わせライブラ リーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングする方法に関する。参考文献 発明の背景 現在、生物学的に活性な化合物を検索するためにランダム配列オリゴヌクレオ チド、ポリペプチド、または合成オリゴマーの組合わせライブラリーを使用する ことに、広い興味がある(Kramerら;Houghtenら、1991、1992;Houghten、1994 ;Ohlmayerら;Dooleyら、1993a-1993b;Eichlerら;Pinillaら、1993、1992;E ckerら;およびBarbasら)。このタイプのライブラリーをスクリーニングするこ とによって発見されたリガンドは、天然のリガンドを模倣することまたはブロッ クすること、あるいは生物学的標的の天然に生じる相互作用を妨害することに有 用であり得る。これらはまた、より所望の特性、例えば、より高い結合親和性、 より大きな安定性および/またはより大きなバイオアベイラビリティーを有する 関連分子を開発するための開始点を提供し得る。ペプチドまたはペプトイド組合 わせライブラリーの場合、このような関連分子をペプトイド模倣物と呼ぶ。 かなりの努力が、組合わせライブラリーからの活性ペプチドのようなペプチド 構造中にコードされる情報のペプチド模倣物への理論的変換に向けられている( Farmer、1980;WileyおよびRich,1993;Olsonら、1994;RizoおよびGierasch、 1992;Hruby、1993;Moore、1994)。ペプチド模倣物設計のための現在の模範例 は、プロセスを3つの工程に分ける(Moore、1994):(i)アゴニスト/アンタゴ ニスト活性を担うアミノ酸側鎖(ファーマコホアな基)の同定、(ii)ファーマコ ホアな基(「ファーマコホア(pharmacophore)」)の空間的配置の決定、および( iii)これらの基が親ペプチドの空間的配向を保持するように載せられ得るテンプ レートの設計。 組合わせペプチドライブラリーの開発(ScottおよびSmith、1990;Feliciら、 1991;Houghtenら、1991、Lamら、1991;GeysenおよびMason、1993;Gallopら、 1994)が第1工程の達成を非常に促進した一方で、第2および第3工程、すなわ ち、ファーマコホアのためのコンホメーションモデルの確立およびこれらの基が 親ペプチドの空間的配向を保持するように載せられ得るテンプレートの設計につ いてなされた進歩は比較的少ない。本発明は、このようなファーマコホアモデル が、コンホメーション的に制限されたペプチド、ペプトイド、およびポリペプチ ド組合わせライブラリーの開発および合成のために設計および使用され得る手段 を提供する。本発明の要旨 1つの局面では、本発明は、異なる配列のポリペプチドメンバーの組合わせラ イブラリーを包含する。このような各メンバーは、αヘリックスコイルドコイル ダイマー形状において互いに可逆的に結合した2つのポリペプチド(第1および 第2のポリペプチド)から形成されるコイルドコイルダイマー「骨格(scaffold) 」である。コイルドコイルダイマー骨格は、(i)両方のポリペプチドにおいてア ミノ酸残基を規則的に繰り返すことによって形成される内部領域、および(ii)そ れぞれ、2つのポリペプチドにおいてアミノ酸残基を規則的に繰り返すことによ って形成される2つの露出した領域によって特徴づけられる。コイルドコイルダ イマー骨格は、骨格の内部領域におけるサブユニット間の疎水性相互作用によっ て安定化される。ライブラリーの各メンバーはまた、少なくとも1つのポリペプ チドの露出した領域内にアミノ酸残基の独特の改変を含む。 1つの実施例では、ライブラリーは、少なくとも103メンバーを含み、そして アミノ酸改変は、コイルドコイルダイマー骨格を構築するポリペプチドの1つに 対応する少なくとも1つの露出した領域に、少なくとも3つの異なる可変残基位 置を生じる。 種々の一般的実施態様では、アミノ酸改変は、(i)少なくとも1つのポリペプ チドに対応する露出した領域における隣接する残基の位置で、(ii)少なくとも1 つのポリペプチドにおける単一のαヘリックスターンの露出した領域内の残基の 位置で、(iii)少なくとも1つのポリペプチドにおける2つの隣接するαヘリッ クスターンの露出した領域内の残基の位置で、または(iv)各ポリペプチドの露出 した領域における少なくとも2つの異なる残基の位置の全体で生じる。他の一般 的実施態様では、ライブラリー中の各ポリペプチドは、少なくとも3つのヘリッ クスターンを含む。さらに他の一般的実施態様では、少なくとも1つのポリペプ チドが、ラクタム架橋によってαヘリックスコンホメーションにおいて安定化さ れる。 他の実施例では、第1および第2のペプチドは、不変の位置に異なる残基を有 し、そしてαヘリックスコイルドコイルヘテロダイマーを形成するためにともに 結合する。関連する実施例では、第1および第2のペプチドは、不変の位置に同 一の残基を有し、そしてαヘリックスコイルドコイルホモダイマーを形成するた めにともに結合する。 さらに他の実施例では、露出した領域におけるアミノ酸残基の独特の改変は、 天然に存在するアミノ酸に関連する基本的物理化学的特性を示すが、これらの天 然に存在するアミノ酸の多くが排除される、代表的アミノ酸を使用して完成され る。言い換えると、ペプチド配列における可変位置で使用される残基は、(a)Ala 、(b)GluおよびAsp、(c)Phe、Tyr、およびTrp、(d)Gly、(e)IleおよびVal、(f)L ys、His、およびArg、(g)Leu、Met、およびCys、(h)GlnおよびAsn、および(i)Se rおよびThrからなる群のそれぞれからの少なくとも1つのアミノ酸のような、代 表的なアミノ酸である。 1つの一般的な実施態様では、第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドの 隣接する末端に第1のポリペプチドの末端を連結する末端架橋セグメントを含み 、第1の露出した領域は、この架橋セグメントをさらに含み、そしてアミノ酸改 変がこの架橋セグメントに生じる。 他の局面では、本発明は、異なる配列のポリペプチドメンバーの組合わせライ ブラリーを包含する。ライブラリーの各メンバーは、中間の独特の配列領域によ って接合されるN-およびC-末端領域を有するポリペプチドであり、ここで2つの 末端領域は、安定なαヘリックスコイルドコイルダイマー構造を形成するために 、互いに結合され、そのことにより、独特の配列領域の移動は抑制される。 1つの一般的な実施例では、ライブラリーは、少なくとも103メンバーを含み 、そしてアミノ酸改変はポリペプチドの独特の配列領域における少なくとも3つ の異なる残基の位置に生じる。1つの一般的な実施態様では、2つの末端領域は それぞれ、少なくとも3つのヘリックスターンを含む。他の一般的な実施態様で は、少なくとも1つの末端領域は、ラクタム架橋によってαヘリックスコンホメ ーション内で安定化される。ポリペプチドは、可変位置に、前記のような代表的 アミノ酸を含み得る。 さらに他の局面では、本発明は、異なる配列のペプチドメンバーの組合わせラ イブラリーを含み、ここで、ライブラリーの各メンバーは、アミノ酸残基の配列 を含むαヘリックスペプチドである。αヘリックスペプチドは、(i)15と50残基 との間の長さであり、(ii)隣接していない残基を連結する少なくとも1つのラク タム架橋によって安定化され、そして(iii)配列中の少なくとも3つの(可変) 位置にアミノ酸残基の独特の改変を有する。 さらに他の局面では、本発明は、選択された巨大分子リガンドと特異的に相互 作用し得る化合物を同定する方法を包含する。この方法は、(a)多数の異なる配 列のポリペプチドメンバーを含む前記の組成物のいずれかのようなライブラリー 組成物を、リガンドと接触させる工程、および(b)リガンドと特異的に相互作用 するライブラリーメンバーを同定する工程、を包含する。この方法に使用される ライブラリー組成物のメンバーは、先のライブラリー組成物について先に記載し た特質、特徴、または実施態様のいずれかを有し得る。 1つの一般的な実施態様では、巨大分子リガンドは、少なくとも20アミノ酸残 基を有するポリペプチドと相互作用することが公知であるレセプターであり、そ してライブラリーのメンバーは、両方のポリペプチドの露出した領域にアミノ酸 改変を含む。関連の実施態様では、選択された巨大分子リガンドは、酵素によっ て検出可能な産物に酵素的変換し得る基質であり、そしてこれを同定することは 、このような産物を検出することを含む。 本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が付随する図 面とともに読まれるときに、より完全に明らかとなる。図面の簡単な説明 図1Aは、平行なαヘリックスヘテロダイマー形状における2つの典型的な骨格 ポリペプチドの末端ヘプタド(heptad)のヘリックスホイール表示を示す。図1Bは 、逆平行のαヘリックスヘテロダイマー形状における2つの典型的な骨格ポリペ プチドの末端ヘプタドのヘリックスホイール表示を示す。 図2A〜Eは、ホモダイマー対ヘテロダイマーにおけるeおよびg位置に電荷を 有する残基の安定化/脱安定化効果を比較する平行な形状における2つの骨格ポ リペプチドの隣接するヘプタドの模式図を示す。図2Aは、ヘプタドのeおよびg 位置に反対電荷を有する残基によって安定化されたホモダイマーを示す。図2Bは 、ヘプタドのeおよびg位置に反対電荷を有する残基によって脱安定化されたヘ テロダイマーを示す。図2Cは、ヘプタドのeおよびg位置に正電荷を有する残基 によって脱安定化されたホモダイマーを示す。図2Dは、ヘプタドのeおよびg位 置に同様の電荷を有する残基によって安定化されたヘテロダイマーを示す。図2E は、ヘプタドのeおよびg位置に負電荷を有する残基によって脱安定化されたホ モダイマーを示す。 図3Aは、本発明のライブラリー組成物における使用に適切な典型的な一般的な ペプチドのアミノ酸配列(配列番号11)およびラクタム架橋位置を示す。アミノ 酸残基が組合わせライブラリーを生成するために変化され得る位置は、Xiによ って示される。図3Bは、平行なαヘリックスホモダイマー形状にアレンジされた 図3Aのペプチドのヘリックスホイール表示を示す。 図4は、図3A(配列番号11)に示されるペプチドから形成されるαヘリックス のヘリックスネット表示を示す。 図5Aは、LPSエピトープペプチドのアミノ酸配列(配列番号12)およびラクタ ム架橋位置を示す。図5Bは、平行なαヘリックスホモダイマー形状にアレンジさ れた図5Aのペプチドのヘリックスホイール表示を示す。 図6は、図5A(配列番号12)に示されるペプチドから形成されるαヘリックス のヘリックスネット表示を示す。 図7は、競合ELISAアッセイにおけるコイルドコイルおよびコントロールペプ チドによる抗体結合の阻害百分率を示す。 図8は、ペプチド2EK(i,i+4)、Linear 5、およびEK(i,i+4)について、2 0℃で222nmでの扁平率(ellipticity)におけるペプチド濃度の効果を示す。 図9は、競合ELISAアッセイに使用されるLPSエピトープペプチドの配列を示す 。 図10A〜10Cは、可変位置1〜6で異なる残基Xjを有する6つの可変位置を有 するペプチドの組合わせライブラリー(図10A)、および可変位置を示すライブ ラリーの2つの相補的セット(図10Bおよび10C)の表示である。 図11Aおよび11Bは、それぞれ図10Bおよび10Cに表示されるものに対応する可変 残基を有する代表的ペプチドを示す。 図12A〜12Cは、抗体レセプターに対する特異的結合親和性を有するペプチドの 存在についてライブラリーをスクリーニングする方法における工程を例示する。配列の簡単な説明 配列番号1は、EEペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号2は、KKペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号3は、EE末端リピートのアミノ酸配列である。 配列番号4は、EE内部リピートのアミノ酸配列である。 配列番号5は、KK末端リピートのアミノ酸配列である。 配列番号6は、KK内部リピートのアミノ酸配列である。 配列番号7は、ペプチドKE、2EK、およびリニア5のアミノ酸配列である(表 1)。 配列番号8は、ペプチドEK、およびリニア7のアミノ酸配列である(表1)。 配列番号9は、ペプチド2KE、およびリニア9のアミノ酸配列である(表1) 。 配列番号10は、ペプチドリニア10のアミノ酸配列である(表1)。 配列番号11は、典型的な一般的ライブラリーペプチドのアミノ酸配列である( 図3A)。 配列番号12は、LPSエピトープライブラリーペプチドのアミノ酸配列である( 図5A)。 配列番号13は、図9に示される一本鎖ペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号14は、図9に示されるリニアZnFペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号15は、CP1ペプチドのアミノ酸配列である(KimおよびBerg、1993)。発明の詳細な説明 I.定義 用語「ペプチド」は、アミノ酸ベースのポリアミドの鎖を示す。鎖は、2アミ ノ酸から約50アミノ酸の長さで変化し得る。 用語「ポリペプチド」もまた、アミノ酸ベースのポリアミドの鎖を示す。鎖は 、2アミノ酸から100以上のアミノ酸の長さで変化し得る。約100アミノ酸よりも 長 い鎖は、代表的には「タンパク質」と呼ばれる。 他に指示がない限り、ペプチドおよびポリペプチドの配列は、アミノ末端から カルボキシル末端への順に示される。 本明細書で使用される用語「良好な媒体」は、代表的には約6と約8との間の pHおよび約50mMと約500mMとの間の塩濃度を有する生理学的に適合可能な水性溶 液を記載する。好ましくは、塩濃度は、約100mMと約200mMとの間である。緩衝液 Aとして示される良好な媒体の例は、以下の組成を有する:50mMリン酸カリウム 、100mM KCl、pH 7。同様に効果的な良好な媒体は、例えば、リン酸ナトリウム をリン酸カリウムにおよび/またはNaClをKClに置き換えることによって作製さ れ得る。 II.本発明の一般的概略 本発明は、組合わせペプチド、ペプトイド、またはポリペプチドライブラリー に関し、ここでライブラリーの異なるメンバー中で配列可変性の基礎になる可変 残基または配列はコンホメーション的に制限された、または半剛性の骨格上に存 在するかまたは含まれる。ライブラリーのメンバー中の配列可変性および構造一 致性のこの配列の組み合わせは、ライブラリーメンバーの基本構造が公知なので 、選択された巨大分子リガンドに対する高い親和性を有するライブラリーの個々 のメンバーに基づくペプチド模倣物の開発を促進する。 本発明の教示によれば、選択されたリガンドへの種々の配列組み合わせの構造 的に一致した提示に適した典型的な骨格構造は、安定化されたαヘリックスであ る。このヘリックスは、配列が「不変」位置(同じアミノ酸残基が特定のライブ ラリーの各メンバーに組み込まれる)、および「可変」位置(アミノ酸残基がラ イブラリーの多様性を達成するためにライブラリーの異なるメンバー中で変化さ れる)を含むペプチドまたはポリペプチドから構成される。 不変位置は、αヘリックスコンホメーションにおいてペプチドを維持または安 定化するために重要である。可変位置で用いられ得る多くの残基がαヘリックス コンホメーションにおいて脱安定化効果を有し得るので、このような安定化は、 本発明の重要な局面である。いくつかの方策が、αヘリックス中に骨格ペプチド を安定化するために使用され得る。1つは、ラクタム架橋のような共有結合の使 用により、そのペプチドが制限されていないαヘリックスを脱安定化する残基を 含む場合でさえも、αヘリックスを非常に安定に且つ効果的に好ましいコンホメ ーションにする様式で残基を連結することである。ラクタム架橋の形成に代表的 に用いられる残基は、GluからLysへの方向で、(i,i+4)の間隔での、Gluおよ びLys残基である。したがって、ラクタム架橋(単数または複数)によって安定化 されたペプチドは、好ましくはラクタム架橋の位置によって指示される「不変」 位置にこれらの残基を含む。 αヘリックスコンホメーションを安定化する他の手段は、コイルドコイルダイ マー骨格ともいわれる、αヘリックスコイルドコイルダイマーの形成による。コ イルドコイルダイマー骨格は、可変残基位置での変化にもかかわらず、基本構造 が組合わせライブラリーの異なるメンバー中で比較的一定のままである分子を構 成する。コイルドコイルダイマー骨格は、ペプチド間の接触の領域で、Ile、Leu 、またはValのような疎水性残基間の疎水性相互作用によって主として安定化さ れるが、他の残基は、以下に述べるように、ダイマー安定化/脱安定化において 重要な役割を演じ得る。 もちろん、前記の安定化アプローチの例は、ライブラリーがコイルドコイルダ イマー骨格を含み、それぞれが2つのポリペプチドから構成され、その1つまた は両方が順にラクタム架橋によって安定化されるように組み合わされ得る。ラク タム架橋およびコイルドコイル形成は組合わせライブラリーのαヘリックスメン バーに対する安定化手段の例であるが、可変位置を有するαヘリックスを安定化 するために有効な他の安定化手段も本発明の範囲内であると考えられることもま た理解される。 コイルドコイルダイマー骨格を構築する2つのポリペプチドは、骨格ポリペプ チドといわれることがある。骨格ポリペプチドは、代表的には、約15と約50との 間の残基を含む。コイルドコイルダイマー形成に関する論議において、これらは 本明細書中においてSP1(骨格ポリペプチド1)、およびSP2(骨格ポリペプチド 2)といわれることがある。ポリペプチドSP1およびSP2は、以下に詳細に記載の ように、ヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成することが望まれているかど うかに依存して、「不変」位置で同じセットの残基または異なるセットの残基を 有し得る。SP1およびSP2のダイマーは、本明細書中ではSP1〜SP2といわれること がある。SP1およびSP2がそれらのそれぞれの不変のアミノ酸位置に同じアミノ酸 残基を有する場合、骨格を構築する2つのペプチドがそれらの可変位置に異なる アミノ酸残基を有し得るとしても、得られるコイルドコイルダイマー骨格は、「 ホモダイマー」であるといわれる。SP1およびSP2がそれらのそれぞれの不変のア ミノ酸位置に異なるアミノ酸残基を有する場合、得られるコイルドコイルダイマ ー骨格は、「ヘテロダイマー」であるといわれる。ヘテロダイマーまたはホモダ イマーのいずれかの形成を助ける条件は以下に詳細に述べられる。 αヘリックスコイルドコイルコンホメーション中のペプチドは、各ペプチドの 不変位置での残基の同定によって決定される特徴的な様式で互いに可逆的に結合 する。αヘリックスの三次構造は、そのようなものなので一次配列中の7アミノ 酸残基がαヘリックスの約2ターンに対応する。したがって、αヘリックスコン ホメーションを生じる一次アミノ酸配列は、ヘプタドと呼ばれる、各7残基の単 位にそれぞれ分解され得る。骨格ポリペプチドは、並んだ一連のヘプタドから構 成される。ヘプタドの配列が特定の骨格ポリペプチドで繰り返される場合、ヘプ タドは「ヘプタドリピート」、または単に「リピート」といわれ得る。ヘプタド リピートは、規則的に繰り返すアミノ酸残基に対応する規則的に繰り返すヘプタ ド位置を、αヘリックスに沿って生じる。 コイルドコイル様式で相互作用するαヘリックスSP1およびSP2の状況では、各 ポリペプチドにおけるヘプタドの個々の位置は、文字(a〜g)によって同定さ れる。以下に述べるように、そのヘリックスは、各ヘリックス内のaおよびd位 置により規定される面に沿って互いに接触する。この接触領域は、コイルドコイ ルダイマー骨格の「内部」領域を含み、そして規則的に繰り返すアミノ酸残基( すなわち、ヘプタド位置aおよびdの残基)によって形成され、これは代表的に は疎水性残基であり、そして一般的にはコイルドコイルダイマー骨格を形成する ように設計された組合わせポリペプチド組成物中で「不変」である。 骨格ポリペプチドのそれぞれにおける残っているヘプタド位置(すなわち、位 置b、c、e、f、およびg)は、これらがコイルドコイルダイマー骨格の外部 に面する局面にあり、そしてコイルドコイルダイマー骨格が懸濁される溶媒と接 触しているので、「外部の」または「露出した」と考えられる。したがって、2 つのポリペプチドのそれぞれにおけるこれらの位置の規則的に繰り返すアミノ酸 残基は、コイルドコイルダイマー骨格の露出した領域を構成し、ここで、コイル ドコイルダイマーの2つの露出した領域は、それぞれ2つのポリペプチドの露出 した位置に対応する。外部のまたは露出した位置のそれぞれは、選択された安定 化策に依存して、可変または不変のいずれかであり得る。さらに、bのような特 定の外部位置は、また、これらを含むポリペプチドが、安定化したαヘリックス またはコイルドコイルコンホメーションを取り入れる場合、安定化策および可変 残基の所望の空間的配置に依存して、ポリペプチドの1つのヘプタドにおいて可 変であり得、且つ同じポリペプチドの他のヘプタドにおいて不変であり得る。 この骨格の露出した領域における可変位置でのアミノ酸改変は、組合わせポリ ペプチドライブラリーの異なる配列のポリペプチドメンバーを生じる。可変位置 の数に、および各可変位置を占有し得る異なる残基の数に依存して、このような ライブラリーは103を越える異なる配列のメンバーを有し得る。例えば、各ペプ チドが3つの可変位置を有し、そのそれぞれが19の異なるアミノ酸残基を含み得 る組合わせペプチドライブラリーは、193すなわち6859の異なる配列メンバーを 有する。 コイルドコイルダイマー骨格を用いる組合わせライブラリーは、ホモダイマー 骨格またはヘテロダイマー骨格のいずれかを含み得る。1つのペプチドプールが 作成されることが必要であるのみなので、ホモダイマーライブラリーは、合成す ることが幾分容易である。ヘテロダイマーライブラリーは、これが可変残基を含 む点で、「組合わせ」ポリペプチドである骨格ポリペプチド(例えば、SP1)の 1つとともに構築され得、そして配列中の位置のすべてが「不変」である点で、 「安定化している」ポリペプチドである他の骨格ポリペプチド(SP2)およびポ リペプチドの配列はコイルドコイルSP1〜SP2ダイマーの最大安定化を最適化する 。 SP1およびSP2は、溶液に曝される架橋セグメントによって連結され得、そして その配列中に可変位置を含み得る。このような架橋セグメントは、一方または両 方の骨格ポリペプチドで合成され得る(例えば、2つのポリペプチドおよび架橋 セグメントは、1つの連続的なポリペプチドとして合成され得る)か、またはSP 1およびSP2の末端を互いに結合するための合成に引き続いて化学的に付着され得 る。前記のようにポリペプチドに付着された架橋セグメントは、SP1〜SP2コイル ドコイルダイマーの形成によって、コンホメーション的に制限される。SP1、SP2 、および架橋セグメントが単一のポリペプチドである場合、そのポリペプチドは 、一方の骨格ポリペプチド(例えば、SP1)に対応するN-末端領域、他方の骨格 ポリペプチド(SP2)に対応するC-末端領域、および組合わせライブラリーの多 様性を生じるのに適切な可変位置を含む架橋セグメントに対応する中間の独特の 配列領域を有すると考えられ得る。2つの末端領域(すなわち、SP1およびSP2) は、互いに結合されて、安定なαヘリックスコイルドコイルダイマー構造を形成 し、独特の配列領域(架橋セグメント)の移動を制限する。 前記の組合わせライブラリーのいずれかが、選択された巨大分子リガンドと特 異的に相互作用し得るライブラリーの独特のメンバー(すなわち、特異的化合物 )を同定するためのスクリーニングに使用され得る。適切な巨大分子リガンドの 例としては、抗体、抗体フラグメント、レセプター、イオンチャンネル、酵素、 酵素基質などが挙げられる。このようなリガンドは、多くの方式でライブラリー の独特のメンバーに結合し得る。例えば、リガンドは、その分解産物が検出され 得る特異的な基質であり得、そしてライブラリースクリーニングは、基質を分解 する能力を有するライブラリーの独特のメンバーによる、このような分解産物の 検出を包含し得る。イオンチャンネルのようなイオンチャンネル型レセプター(i onotrophic receptor)の場合には、リガンドは、イオンチャンネルの孔であり得 、そしてスクリーニングは、ライブラリーの独特のメンバーによるチャンネルを 介するイオンの流れのブロックの検出を包含し得る。あるいは、リガンドは、ア ゴニスト、アンタゴニスト、あるいはレセプターまたはイオンチャンネル上のト キシン結合部位であり得、そしてそのスクリーニングは、チャンネルを介するイ オンの流れ(イオンチャンネル型レセプターの場合)、またはチャンネルもしく はレセプタータンパク質への高親和性結合のモニタリングを包含する。リガンド が抗体または抗体フラグメントである場合、スクリーニングは、抗体によって認 識されるエピトープを含むライブラリーのメンバーと、抗体または抗体フラグメ ン トとの間に形成される、免疫複合体の検出を包含し得る。 すべての場合において、先に概説されたスクリーニングは、前記のようなライ ブラリー組成物をリガンドと接触させ、そしてそのリガンドと特異的に相互作用 するライブラリーのメンバーを同定することを包含する。メンバーは、例えば、 位置スキャンニングフォーマットを使用することによって同定され得る(Pinill aら、1992;Wallaceら、1994)。このアプローチでは、5つの可変位置を有する ペプチドについて本明細書中では例示され、5つの異なるセットのサブライブラ リーが調製される。サブライブラリーのセットにおける可変位置は、O1X2X3X4X5 、X1O2X3X4X5、X1X2O3X4X5、X1X2X3O4X5、X1X2X3X4O5の形態をとる。特定のセッ トにおけるサブライブラリーはそれぞれ、1つの可変位置での異なる公知の残基 (Oi)、および残りの可変位置での可能な全ての組み合わせの残基(Xi)を含む 。5つの全セットにおける全ライブラリーをスクリーニングすることによって、 「高親和性」アミノ酸残基のサブセットが、各可変位置について同定され得る。 次いで、この制限されたサブセットは、ライブラリーの追加のセットを生成する ために使用され得、これは特異的高親和性メンバー、または選択された巨大分子 リガンドに結合する化合物を同定するために使用され得る。この同定プロセスを スピードアップおよび簡便化し得る改変を以下に詳述する。 III.コイルドコイル安定化−骨格ポリペプチドの特徴 αヘリックス組合わせペプチドまたはペプトイドライブラリーのコイルドコイ ル安定化に有用な2つの骨格ポリペプチド(SP1およびSP2)は、同一サイズでな い場合、それぞれ約15〜約50残基(2〜7ヘプタド)の長さの範囲で類似してい る。本明細書中に記載される骨格ポリペプチドの特定の例は、約20〜約30残基の 長さの範囲である。SP1およびSP2は、2つの別々のポリペプチド鎖から形成され 得るか、あるいは、単一のポリペプチド鎖から形成され得、ここでこの2つの骨 格ポリペプチドは、コイルドコイルヘテロダイマーへのSP1およびSP2の結合を実 質的に妨害しない架橋セグメントによって連結される。 ペプチドは、当業者に公知の種々の方法によって合成され得る。例えば、ABIM odel 430Aペプチド合成機が、Hodgesら(1988)によって以前記載されたように、 従来のt-Boc化学を用いて使用され得る。あるいは、これらは、実施例1に詳述 されるようなLabortec SP 640ペプチド合成機を使用して合成され得る。 合成後、ペプチドは、例えば、実施例1に詳述されるように、逆相高速液体ク ロマトグラフィー(RPC)および「SYNCHROPAK」RP-4カラムを使用して、当業者 に公知の多くの方法のいずれかによって精製される。 ペプチドの組成および純度は、実施例1に詳述されるように、Beckmanモデル6 300アミノ酸分析機でのアミノ酸組成マス分析および「BIOION-20」Nordicでの飛 行時間マススペクトロメトリー(time of flight mass spectroscopy)を使用する 分子量分析を含む、いくつかの方法によって確認され得る。 A.コイルドコイル形成 SP1およびSP2のダイマー化は、保存されたアミノ酸残基の反復されたヘプタド モチーフの存在によって生じる。各ヘプタドにおける個々の位置は、図1Aおよび 1Bに示すように、SP1については文字aからg、およびSP2についてはa’からg ’によって示される。SP2の位置(例えば、a’、g’)は、以下の骨格ポリペ プチドにおけるヘプタドの位置の一般的議論では(’)の記号なしに示されるこ とがある。 適切なヘプタドモチーフまたはリピートは、SP1およびSP2ポリペプチドを、許 容される条件下でダイマーのαヘリックスコイルドコイル構造に組み立てるよう に指示する(以下を参照のこと)。個々のαヘリックスペプチドは、各ヘプタド のaおよびd位置として規定される、それぞれの疎水性、または内部の面に沿っ て互いに接触する。 SP1およびSP2は、平行または逆平行のいずれかの形状でダイマーコイルドコイ ルヘリックス(コイルドコイルヘテロダイマー)に組み立てられ得る。平行形状 において、2つの骨格ポリペプチドヘリックスは、これらが同じ配向(アミノ末 端からカルボキシル末端)を有するように整列される。逆平行形状においては、 ヘリックスは、一方のヘリックスのアミノ末端が、他方のヘリックスのカルボキ シル末端と並ぶように配列され、そしてその逆もある。 2つの相互作用するαヘリックスのa〜g位置の相対配向の図を、図1Aおよび 1Bに示す。図1Aは、2つの骨格ポリペプチドの例、平行形状に配列されたEEおよ びKK(配列番号1および配列番号2)の最初の2つのターン(1ヘプタド)の真 っ向からの概略図を示す。図1Bは、逆平行形状に配列された同じ骨格ポリペプチ ドの真っ向からの概略図を示す。 図1Aおよび1Bにおいて、アミノ酸は円で囲まれそして1文字コードによって示 され、そして保存的アミノ酸位置は番号付けされそしてN-末端からC-末端への方 向を示す矢印の頭を有する線によって連結される。2つのヘリックス間の相互作 用は、矢印によって示される。ヘリックス間で交差する広い矢印は、隣接するヘ リックスのaとd位置との間の疎水性相互作用を示す。 隣接するヘリックスのeとgとの位置の間のイオン性相互作用は、ヘリックス の関連を上および下の曲がっている矢印として示される。ペプチドEE(配列番号 1)の位置eは、最初および最後のヘプタドにおいてはGln、および内部ヘプタ ドにおいてはGluである。この位置とのイオン性相互作用を示す(下の)曲がっ ている矢印は、破線で描かれて、イオン性相互作用がヘリックスの内部ヘプタド 間に存在するが、最初および最後、すなわち末端のヘプタド間にはないことを示 す。 ラクタム架橋は、各ヘリックス内のfとb位置との間の直角の線として示され る。 B.コイルドコイル安定性における疎水性相互作用 ヘリックス間の疎水性相互作用は、骨格ポリペプチドのaおよびd位置での疎 水性残基による。ヘリックスを接触して維持するために有効なこれらの位置の残 基には、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、ト リプトファン、チロシン、および前記のいずれかの誘導体が含まれる。SP1およ びSP2の長さに依存して、アラニン、システイン、セリン、トレオニン、アスパ ラギン、およびグルタミンを含む他の残基はまた、他が疎水性残基によって占有 される限り、いくつかのヘプタドにおいてaまたはd位置を占有し得る。 aおよびd位置を占有するための特定の残基の適切な選択は、本発明の重要な 局面である。例えば、一方の位置にIleおよび他方の位置にLeuを含むヘリックス 間の場合であるように、疎水性相互作用が強い場合、同様の電荷を有する残基が ホモダイマー形成を妨害するためのeおよびg位置に存在する場合でさえ、ヘリ ックスの重要な画分は、pH7でホモダイマーとして形成する(以下のC部を参照 のこと)。この相互作用は、組合わせホモダイマーライブラリーの構築に適切な ペプチドの例の構築に利用され、そして以下の図3Bおよび5Bに関して詳細に議論 される。 他方では、aおよびd位置の残基が、疎水性相互作用が非常に弱いように選択 される場合(例えば、両位置ともAla)、ヘリックスは、コイルドコイルダイマ ーを全く形成し得ない(図9における「一本鎖」ペプチドを参照のこと;配列番 号13)。ヘテロダイマー形成が望まれる場合、残基対は、好ましくは、pH7で 95%ヘテロダイマー形成を促進するように選択される。ヘテロダイマー対ホモダ イマー形成の程度は、例えば、実施例3に記載のように測定され得る。pH7での 95%ヘテロダイマー形成へ伝導する疎水性相互作用を生じる、aおよびd位置 での残基対の例は、一方の位置にLeuおよび他方の位置にValを含む。これらの残 基は、骨格ポリペプチドEE(配列番号1)およびKK(配列番号2)のaおよびd 位置に存在する。 C.コイルドコイル安定性におけるイオン性相互作用 αヘリックスのダイマーコイルドコイルコンホメーションは、図2A〜Eに示さ れるように、隣接するヘリックスのeおよびg位置での残基間のイオン性相互作 用によって安定化され得る。ダイマーの各ヘリックスが、ある位置(例えば、e) に正に荷電した残基を有し、そして他の位置(例えば、g)に負に荷電した残基を 有する場合、ホモダイマー形成が好ましい(図2A;図2Bにおけるヘテロダイマー と比較して)。しかし、各ヘリックスが両方の位置で同様に荷電した残基を有す る場合、次いで、2つの反対に荷電したヘリックスは、ホモダイマー(図2C、2E )を形成することとは対照的に、ヘテロダイマー(図2D)に会合する傾向がある 。 溶液中のSP1およびSP2のようなポリペプチドのコンホメーションは、溶液のCD スペクトルから決定され得る。これらのデータは、個々のペプチドそれ自体のコ ンホメーション(ランダムコイル対αヘリックス)についての情報、ならびにSP 1およびSP2のヘテロダイマー対ホモダイマーの相対量についての情報を提供する 。実施例2は、CDスペクトルを測定する1つの方法を詳述する。実施例3は、CD スペクトル測定が、どのように溶液中のペプチドのコンホメーションを評価する ために使用され得るかを詳述する。 図2に示す図において、2つのヘリックス間のイオン性相互作用は、SP1(EE ;配列番号1)上のeおよびg位置の負に荷電した(Glu)残基、およびSP2(KK ;配列番号2)上のeおよびg位置の正に荷電した(Lys)残基から生じる。し かし、ペプチドEE(配列番号1)の末端ヘプタドは、内部リピート中のその位置 には荷電したGluとは反対に、e位置には荷電していない残基(Gln)を有する。 したがって、EEのe位置に関連するイオン性相互作用は、内部(配列番号4)の 、そして末端(配列番号3)ではないリピートで生じる。 負に荷電した残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはその誘導体であ り得る。正に荷電した残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、またはその誘 導体であり得る。 ヘプタド中での他の位置間のイオン性相互作用はまた、ヘリックスの安定性に おいて著しい影響を及ぼし得る。例えば、両方の位置でのGlu残基は、イオン性 反発作用によるαヘリックスコンホメーションを脱安定化する傾向があるので、 EEペプチド(配列番号1)末端リピートの位置eは、Gluとは対照的に、Glnであ る(図1Aおよび1Bを参照のこと)。しかし、多くの脱安定化効果が、ラクタム架 橋のような安定化共有結合修飾を導入することによって克服され得る(以下のE 部で議論される)。 D.コイルドコイル形成に好ましい条件 繰り返しのヘプタドから構成され、そして前記A〜C部に示される指針に従っ て設計された骨格ポリペプチドは、I部で規定された、良好な媒体中でコイルド コイルダイマーを容易に形成する。αヘリックスコイルドコイルヘテロダイマー 形成の程度は、例えば、実施例3に記載のような、CDスペクトルから決定され得 る。 コイルドコイルダイマーは、良好な媒体の所定のpHおよび塩の範囲外の条件下 で形成し得るが、いくつかの分子相互作用およびヘテロダイマー対ホモダイマー 複合体の相対的安定性は、前記の特徴とは異なり得る。例えば、ヘテロダイマー を安定化する傾向のあるeとg位置との間のイオン性相互作用は、例えば、酸性 pHでのGlu側鎖のプロトン化、または例えば、塩基性pHでのLys側鎖の脱プロトン 化による低または高pH値で破壊し得る。 コイルドコイルヘテロダイマー形成における低および高pH値の前記の効果は、 塩濃度を上昇させることによって克服され得、これは安定化するイオン性引力を 中和し、または脱安定化するイオン性反発作用を抑制し得る。ある塩は、イオン 性相互作用を中和することにより大きな効果を有する。例えば、KKペプチド(配 列番号2)の場合には、1M以上の濃度のClO4 -アニオンが最大αヘリックス構造 を誘導するために必要とされる(実施例2に詳述されるように行われるCD測定に よって決定されるように)が、それに対し3M以上の濃度のCl-イオンが、同じ効 果に必要とされる。また低および高pHでのコイルドコイル形成における高塩の効 果は、ヘリックス内イオン性引力がヘリックス形成に必須ではなく、むしろ、コ イルドコイルがヘテロダイマー対ホモダイマーとして形成する傾向があるかどう かを制御することを示す。 E.骨格ポリペプチドにおけるヘプタド改変 前記A、B、およびC部は、代表的には、良好な媒体中でαヘリックスコイル ドコイル構造を形成するそれらのペプチドを生じる骨格ポリペプチドのヘプタド における特定の(例えば、不変の)位置に、どのアミノ酸残基が含まれ得るか、 およびどのアミノ酸残基が好ましいかについての指針を示す。この部は、前記の A〜C部に示される指針に従う配列を有するどのようなヘプタドが、骨格ポリペ プチド内に配列され得るかのいくつかの例を記載する。 本発明の骨格ポリペプチドは、それぞれ、2〜多数(例えば、7)のヘプタド (すなわち、4〜多数、例えば14のヘリックスターン)を含み得る。これらのヘ プタドのそれぞれの不変位置の特定の残基はすべて同じであり得るか、またはこ れらは異なり得る。特に、最初および最後のヘプタド、または末端リピートの不 変位置の残基は、内部または中間のヘプタドまたはリピートの不変位置の残基と は異なり得る。さらに、内部リピートの不変位置の残基は、例えば、可変残基の 選択された位置に依存して、互いに異なり得る。例えば、EEおよびKKペプチド両 方の末端リピートは、αヘリックスコンホメーションを安定化するためのラクタ ム架橋を形成するように設計された残基を組み込む。 以下に詳述するように、ペプチドのいくつかのヘプタド(単数または複数)にお いて不変である位置は、同じペプチドの他のヘプタド(単数または複数)において は可変であると考えられ得る。同様に、αヘリックスコイルドコイルヘテロダイ マー対における2つの骨格ポリペプチド間の顕著な相互作用が、各ペプチドにお ける隣接する「相補的」ヘプタド間にあるので、各ヘプタド内の不変残基が第2 の骨格ポリペプチドの相補的ヘプタドにおける不変残基と都合よく相互作用する 限りは、骨格ポリペプチド内のヘプタドにおける不変残基の一次配列は変化し得 る。 F.骨格ポリペプチドの共有結合修飾 骨格ポリペプチド配列は、コイルドコイルダイマー内で各骨格ポリペプチドの αヘリックスコンホメーションをさらに安定化するように設計された残基を含み 得る。例えば、ペプチドEEおよびKKは、末端リピートのbおよびf位置に、それ ぞれ、グルタミン酸およびリジン残基を有する。これらの残基は、実施例4に詳 述される適切な条件下で反応して、図1に概略されるようなラクタム架橋を形成 し得る。このような架橋の意義は、実施例5に関連して以下に論じる。 IV.可変残基の配置 本発明のライブラリーを含む骨格ポリペプチドにおける可変残基の位置は、骨 格の性質および用いられる安定化方策のタイプに依存する。しかし、すべての場 合において、可変位置は、骨格ポリペプチドが溶液中にある場合、溶媒に露出さ れる。例えば、コイルドコイルダイマーから構成されるライブラリーの場合、ア ミノ酸改変は、ダイマーの露出した領域で(すなわち、αヘリックスヘプタドの 位置e、b、f、c、またはgで)生じる。これは、図1Aに示されるような、コ イルドコイルダイマーのヘリックスホイール表示から認識され得る。アミノ酸変 化の位置は、「可変」残基と呼ばれる、一方残りの位置は「不変」残基と呼ばれ る。 コイルドコイルダイマーから構成されるライブラリーの構築に有用なペプチド の例を、図3Aに示す。ペプチド配列(配列番号11)は、アミノ酸残基が1つのラ イブラリーメンバーから次へ変化する5つの位置を含み、そしてαヘリックスコ ンホメーションにおいて約3.5のターンを形成する。位置は、図3AにおいてX1、X2 、X3、X4、およびX5として同定され、そしてペプチド配列中で、それぞれ、位 置10、11、13、14、および17に位置する。可変位置の数(Xiのi)がペプチド配 列中の残基の位置に必ずしも対応しないことに留意すること。ペプチドはまた、 2つのラクタム架橋を含み、GluとLys残基との間の配列の下の線によって示され る。図3Bは、図3Aにおける配列(配列番号11)を有する2つのペプチドの会合に よって形成されるコイルドコイルホモダイマーのヘリックスホイール表示を示す 。この表示は、最初のコイルのみとは対照的に、全体の配列が示されること以外 は、図1Aに示されるものと類似している。残基の相対的位置、ならびにラクタム 架橋の配置が示される。またαヘリックスのaとd位置との間の疎水性相互作用 が示され、そしてeとg位置との間のイオン性相互作用を安定化する。図3Bから 認識され得るように、可変アミノ酸位置(X1、X2、X3、X4、およびX5)は、コイ ルドコイルダイマーの露出した部分にすべて位置づけられる。 図4は、図3Aに示される配列(配列番号11)から予測されたαヘリックスのヘ リックスネット表示を示す。ヘリックスネットは、縦に切断されて平らに置いた 場合のαヘリックスの側面図であり、そしてαヘリックスにおける特定の残基の 2次元空間的配置を可視化するのに有用である。ヘプタド位置を、図の上部に沿 って示す。ヘリックスの露出した部分(ヘリックスがコイルドコイルダイマーに おいて互いに対になっていた場合)は、図中のヘプタド位置の残りから、それぞ れヘプタド位置dおよびaを別々にする2つの垂線間にある。 5つの可変位置(X1、X2、X3、X4、およびX5)が、ペプチドがαヘリックスに 組み立てられるかまたはコイルドコイル形状において他のαヘリックスと対にな る場合、これらがクラスターを形成するように配置されることが、図4から理解 さ れ得る。可変位置は、同様の多くの他の形状で生じ得る。例えば、コイルドコイ ルダイマー骨格に関して、これらは隣接する残基位置で生じ得、そして一方のポ リペプチド(例えば、SP1)に対応するが、必ずしも他方のポリペプチド(SP2) で必要ではない、ダイマー骨格の露出領域内で生じ得る。これらはまた、単一の αヘリックスターン、単一のヘプタド(2つのヘリックスターン;例えば、図3B および4におけるX1、X2、X3、X4の位置を参照のこと)内で、または2より多い ヘリックスターンにおいて、すべて生じ得る。本発明の他の実施態様では、可変 位置はコイルドコイルダイマーの両方のポリペプチドに位置づけられ得、特定の 組合わせダイマーが、例えば、2以上の空間的に異なるが関連の結合部位を有す るレセプターに結合することを可能にする。 プロリンを除くすべての天然に存在するアミノ酸、ならびに多くの合成アミノ 酸は、可変位置に組み込まれ得る。アミノ酸は、標準および非標準および誘導体 化したL-およびD-アミノ酸、非アミド結合によってカップリングしたアミノ酸( ポリペプトイドを形成する)などを含み得る。非天然アミノ酸として、2-アミノ 酪酸(Abu)、シクロヘキシルアラニン(Cha)、ノルロイシン(NIe)、ノルバ リン(Nva)、オルニチン(Orn)、ホモフェニルアラニン(Hph)、4-クロロフ ェニルアラニン(Fcl)、4-ニトロフェニルアラニン(Fno)、およびフェニルグ リシン(Phg)が挙げられるが、これらに限定されない。 残りの残基は、好ましくは、前記のように、αヘリックスおよび/またはコイ ルドコイルダイマーの安定化を促進するように選択される。例えば、ラクタム架 橋は、安定化のためにαヘリックスの末端に組み込まれ得る。コイルドコイルダ イマー骨格については、疎水性残基が、aおよびd位置に配置され、そしてホモ ダイマーまたはヘテロダイマーを安定化するために選択された荷電残基は、eお よびg位置に配置され得る。 V.ラクタム架橋によるαヘリックスペプチドの安定化 本発明の組合わせライブラリーのペプチドまたはポリペプチドメンバーは、得 られる組合わせライブラリーがコンホメーション的に均一であるように安定化さ れる。コンホメーション的に均一のライブラリーを生じるために効果的な安定化 を達成する1つの方法は、特にペプチドがαヘリックスコンホメーションをその ペプチドに適用させる配列を有する場合、前記のように、個々のペプチドにラク タム架橋を(Lys残基とGlu残基との間に)組み込むことである。 本発明の支持で行われそして以下の実施例5に詳述される実験は、このような ラクタム架橋の選択的組み込みによって達成され得るαヘリックスの安定化を証 明する。例えば、データは、(i,i+3)から(i,i+4)までのラクタム架橋におい て進行するヘリックス含量に著しい差があることを示す。両方ともヘリックスの 同じ面にあるべきであるが、(i,i+3)ラクタムは、(i,i+4)ラクタムであるほ ど、ライブラリーペプチドの例におけるヘリックス含量を安定化するために有効 ではなかった。 骨格ポリペプチドのヘリックス含量はまた、(i,i+4)ラクタム結合の配向に 依存することが見いだされた。LysからGluへ配向したラクタム架橋は、代表的に は、そのリニアなホモログよりもヘリックスが少なかった。他方では、GluからL ysへのラクタムは、そのリニアな対合物よりもヘリックスが多く、そして本発明 の方法および組成物において好ましいと考えられる。 何らかの特定のメカニズムによって結合されることは望まれないが、この配向 の効果が、GluおよびLys側鎖の長さの差によるものであり得、配向が逆にされる 場合、異なる環境にあるラクタム架橋のカルボキシル基を生じることが意図され る。本発明の支持で行われたモデリング研究は、KEラクタムについて、ラクタム 結合のカルボニル酸素の近位性は、ithペプチド結合(Lys-Ala)のカルボニル 酸素のファンデルワールス接触距離内に入ること、および良好な条件で見られる ランダム構造がこの分裂の相互作用を軽減することを示唆する。 実施例5に示されそして先にまとめられた結果は、ペプチドのヘリックス含量 を誘導および安定化することにおけるラクタム位置および配向の効果を証明し、 そしてコンホメーション的に制限された組合わせライブラリーのペプチドメンバ ーにおいてαヘリックスコンホメーションを安定化する方法としてのラクタム架 橋の価値を支持する。 VI.組合わせライブラリーのサブユニット組成物 本発明の組合わせライブラリーは、ホモダイマー、ヘテロダイマー、またはモ ノマーから構成され得る。用語「ホモダイマー」は、本発明の組合わせライブラ リー組成物のメンバーに適用される場合、たとえこれらが可変位置で異なる残基 を有し得るとしても、配列中の不変位置に同じ残基を有するペプチドから構成さ れるダイマーを意味すると理解される。例えば、図3A、3B、および4に示すペプ チドの一般的形態を有するペプチドのダイマーから構成されるライブラリーは、 「ホモダイマー」のライブラリーであると考えられる。ホモダイマーライブラリ ーは、ペプチドの1つのプールのみが合成を成し遂げるために必要なので、より 簡単な合成ストラテジーを包含する。 用語「ヘテロダイマー」は、組合わせライブラリーのメンバーに適用される場 合、異なるクラスからのそれぞれの2つのペプチドから構成されダイマーを意味 することが理解される。1つのクラスからのペプチドは、不変位置で1セットの 残基を有し得、そして他のクラスからのペプチドは、不変位置で異なるセットの 残基を有し得る。ホモダイマー形成対ヘテロダイマー形成、およびその反対(例 えば、eとgとの位置の間のイオン性相互作用)を行う条件を同定する前記のス トラテジーは、本発明のライブラリーの構築に使用されるペプチドの設計に適用 され得る。特に、適切な不変残基を有するペプチドのクラスは、混合によって2 つのクラスのペプチド間のヘテロダイマーが優先的に形成されるように調製され 得る。このようなアプローチは、例えば、レセプターが2つの空間的に離れた結 合部位を有することが公知であり、そのそれぞれが異なる公知の特徴を有する場 合、有用であり得る。2つのプール、または組合わせペプチドのクラスが調製さ れ得、ここで、可変部位での組み込みのために各プールで用いた特異的残基の位 置づけおよび同定が、2つの部位のうちの1つの特徴に適合可能であるように選 択される。これは、例えば、2つのαヘリックス間の可変残基の位置づけの差、 または2つのプールにおける可変位置で使用されるアミノ酸の一般的タイプの差 を包含し得る。 ヘテロダイマーライブラリーはまた、ライブラリーダイマーを形成する骨格ペ プチドの1つのみが可変残基を有し、そして他の骨格ペプチドが構造安定化剤と してのみ作用するコンフィギュレーションで用いられ得る。このアプローチにお いて、「安定化」ペプチドは、コイルドコイルヘテロダイマー骨格の安定性を最 大にするために最適化されたアミノ酸の配列を含むように設計され得る。 上述のコイルドコイルダイマーライブラリーの他に、本発明はまた、アミノ酸 残基改変の領域を有するαヘリックスペプチドモノマーを含む組合わせライブラ リーを包含する。モノマーは、例えば、ラクタム架橋を使用してαヘリックスコ ンホメーションで安定化され得る。コイルドコイルを形成するように設計された ペプチドとは逆に、αヘリックスモノマーライブラリー用に設計されたペプチド は、代表的には、αヘリックスヘプタドの位置aおよびdにIle,Leu、およびVa lのような疎水性残基を使用しない。むしろ、これらは、Alaのようなより小さく 疎水性の少ない側鎖を有する残基を用いる(図9、配列番号13を参照のこと)。 同様に、モノマーライブラリーにおける使用のためのペプチドは、位置eおよび gで荷電した残基から必ずしも利益を受けない。モノマーαヘリックス組合わせ ライブラリーのためのモデルとして適切なαヘリックスペプチドの例を、以下に 示しそして論じる。 VII.ライブラリーの合成 本発明に有用なタイプの組合わせライブラリーは、種々の溶液相または固相法 によって形成され得、ここではサブユニットが成長するオリゴマーに段階的に付 加される。本発明のライブラリーを含むペプチドは、代表的には、その末端に不 変残基を含むので、特定のライブラリープール中のすべてのペプチドは、代表的 には、各カップリング工程で不変位置に付加される独特のアミノ酸残基とともに 、単一のバッチとして合成を開始する。合成が、付加されるべき次の残基が可変 位置にある点に達する場合、その可変位置に所望されるアミノ酸を含むアミノ酸 の混合物は、合成混合物に付加される(Houghtenら、1991)。選択された可変位 置に所望の改変を有する所望のペプチドが合成されるまで、合成が行われる。 種々の合成ストラテジーが、ライブラリーを使用するスクリーニングにおいて 所望の活性を有する特異的配列のペプチドの同定を容易にするために用いられ得 る。例えば、アミノ酸の低減した複雑性のセットは、活性種を同定するために実 際にスクリーニングされねばならないプールの数を低減させるために、可変位置 での合成に用いられ得る。 1つの合成ストラテジーにおいて、組合わせライブラリーの2つ以上のセット が合成される。各セットにおいて、1つ以上の選択された「可変」残基位置は、 選択された位置のそれぞれにおける実質的にすべての可能な異なる残基の1つを 有し、そして残りの1つ以上の「可変」残基位置は、異なる残基の実質的にすべ ての可能な組み合わせを含む。 例示の目的で、1つのこのようなライブラリー組成物が、許容された残基が標 準的な20個の L-アミノ酸(プロリンを除く)のいくつかまたはすべてを含む、 6つの可変残基を含む組成物に関して記載される。さらに、ライブラリーは、可 変残基に関してのみ記載され、本発明での使用に適切なαヘリックスペプチドで は、これらの可変残基がすべて代表的には互いに隣接するわけではなく、むしろ 不変残基によって互いに分離され得ることが理解される。 図10A〜10Cは、6つの可変残基の一般的な配列を示し、ここで残基を含むペプ チドは2つのライブラリーのセットを含む。図10Aにおける配列は、可変位置1 〜6に6つの残基「X」を含む。図10Bに示される最初のライブラリーセットは 、O1、O2、およびO3によって示される、最初の3つの可変位置のそれぞれを、19 個の可能な天然に存在するアミノ酸残基(プロリンを数えない)のそれぞれで満 たすことによって形成される。次いで、O1O2O3順列のそれぞれは、セット中に1 つのライブラリーを形成し、各ライブラリー中の残りの可変位置X4、X5、および X6は、好ましくは、可変位置4〜6に配置された異なる残基のすべてまたは実質 的にすべての組み合わせを含む。 このライブラリーセットの代表的メンバーの可変残基の配列を図11Aに示す。 ここで、各ライブラリーは、順列AAA、AAR、ARA、VVVなどのような最初の3つの 可変位置における6,859の可能な3つの残基の順列の1つを含む。最後の3つの 可変位置、すなわち、これらの6,859ライブラリーのそれぞれにおける可変位置 4〜6は、好ましくは、異なる残基の6,859の組み合わせのすべてまたは実質的 にすべてを含む。すなわち、セット中の各ライブラリーは、可変位置1〜3での 残基の公知の配列、および可変位置4〜6での配列の組合わせライブラリーを含 む。 組成物中のライブラリーの第2のセットを図10Cに示す。このセットの各ライ ブラリーは、O4、O5、およびO6によって示される最後の3つの可変位置のそれぞ れを、可能な残基のそれぞれで満たすことによって形成され、各ライブラリー中 の残りの可変位置X1、X2、およびX3は、好ましくは、可変位置1〜3に配置され る異なる残基のすべてまたは実質的にすべての組み合わせを含む。 このライブラリーセットの代表的メンバーの可変残基の配列を図11Bに示し、 ここで、各ライブラリーは、順列AAA、AAR、ARA、VVVなどのような最後の3つの 可変位置における6,859の可能な3つの残基の順列の1つを含む。最初の3つの 可変位置、すなわち、これらの6,859ライブラリーのそれぞれにおける可変位置 1〜3は、好ましくは、異なる残基の6,859の組み合わせのすべてまたは実質的 にすべてを含む。すなわち、セット中の各ライブラリーは、可変位置4〜6での 残基の公知の配列、および可変位置1〜3での配列の組合わせライブラリーを含 む。 2つのライブラリーセットは、互いに相補的であり、これらは、位置1〜3お よび4〜6での公知の残基順列のそれぞれについての組合わせライブラリーを含 む。 前記の方法における合成および選択手順は、可変位置で「代表的」アミノ酸を 用いることによって簡単にされ得る。このような代表的アミノ酸は、代表的には 、アミノ酸の物理化学的特性に基づいて、アミノ酸の通常分類される群のほとん どすべての代表である約8〜12個のアミノ酸を含む。これらの特性には、サイズ 、疎水性、電荷、および/または側鎖がアミノ酸に与える構造形成特性が挙げら れる。代表的アミノ酸のこのような低減したセットを使用して生成したライブラ リーは、低減した組合わせペプチドライブラリー、すなわちRCPLという。 物理化学的特性によるアミノ酸の1つの認識された群分けは、群(a)Ala、小さ く荷電していない側鎖を示す;(b)GluおよびAsp、負に荷電したアミノ酸を示す ;(c)Phe、Tyr、およびTrp、芳香族基を有する側鎖を示す;(d)Gly、非常に小さ い側鎖および高自由度の骨格コンホメーションを与えるものを示す;(e)Ileおよ びVal、β分枝状疎水性側鎖を示す;(f)Lys、His、およびArg、正に荷電したア ミノ酸を示す;(g)Leu、Met、およびCys、大きな疎水性側鎖および硫黄含有側 鎖を示す;(h)Pro、二次構造および特にターンにおいて強い影響を有する側鎖を 示す;(i)GlnおよびAsn、アミド含有側鎖を示す;および(j)SerおよびThr、ヒド ロキシル含有側鎖を示す、を含む。 本発明の組合わせライブラリーでの使用に適切なアミノ酸の「代表的」セット の1つの例は、9つのアミノ酸:群(a)からのAla(A);群(b)からのGlu(E);群(c )からのPhe(F);群(d)からのGly(G);群(e)からのIle(I);群(f)からのLys(K); 群(g)からのLeu(L);群(i)からのGln(Q);および群(J)からのSer(S)を含む。プ ロリンは捩れをヘリックスに導入することによってαヘリックスを脱安定化する ので、群(h)からのPro(P)は含まれない。 理解され得るように、この群のアミノ酸は、図10A〜Cおよび11A〜Bに関して記 載される3つの位置のライブラリーセット中のライブラリーの数を、6,859から7 29(9×9×9)まで減少させ、そして同様に、各組合わせライブラリー中の組み 合わせの数を6,859から729に減少させる。すなわち、各セットにおける729ライ ブラリーのそれぞれは、現在、最初のライブラリーセットについては可変位置4 〜6に、および第2のライブラリーセットについては可変位置1〜3に、729の 異なる配列のみを含む。 前記のアプローチにおける改変が用いられ得る。例えば、可変残基の合計の数 が6である場合、前記のように、組成物は、単一のライブラリーセット内の順列 を生じる残基の対で、3つのライブラリーセットに分けられ得る。したがって、 19アミノ酸残基が各可変位置で使用された場合、最初のセットの各ライブラリー は、順列AA、AR、RA、およびVVなどのような、最初の2つの可変位置において36 1の可能な2つの残基の順列の1つを含む。最後の4つの可変位置、すなわち、 これらの361ライブラリーのそれぞれにおける可変位置3〜6は、好ましくは、 可変位置3〜6に異なる残基の130,321の組み合わせのすべてまたは実質的にす べてを含む。すなわち、セット中の各ライブラリーは、可変位置1および2に残 基の公知の配列、および可変位置3〜6に配列の組合わせライブラリーを含む。 第2および第3のセットが対応して形成される。第3のライブラリーセットは、 互いに相補的であり、これらは、可変位置(1、2)、(3、4)、および(5 、6)に公知の残基の順列それぞれについての組合わせライブラリーを含む。 実施例によって、最初の2つの可変位置が公知であり、そして残りの4つの可 変位置が組合わせである、6つの可変位置を有する100組合わせペプチドライブ ラリーのライブラリーセットを(9つの代表的アミノ酸のみを使用して)調製す るために、81の異なる反応ウェル中に樹脂を分布し、そして樹脂上に形成された 最初の2つの可変残基においてアミノ酸の81の異なる順列を形成する。その後、 各可変残基において、各反応ウェルは、9つの異なる残基の混合物と段階的に反 応し、81ライブラリーのそれぞれにおける第3の可変位置で可能な残基のそれぞ れを効果的に配置する。次いで、すべてのアミノ酸の混合物を含むこの後者の反 応は、所望のライブラリーのセットを形成するために、第4、第5、および第6 の可変残基位置について繰り返される。一般的反応化学は、標準的方法に従い得 る(例えば、HolmおよびMldal;Meldalら)。 第3および第4の可変位置に公知の残基位置を有する第2のライブラリーセッ トは、最初にアミノ酸混合物との第1および第2のカップリング反応を1つの容 器中で行うこと、100の別々のウェル中で、各ウェル中の2つの残基の異なる公 知の組み合わせと第3および第4のカップリング反応を行うこと、および別々の ウェル中であるが再度アミノ酸混合物との第5および第6の反応によって、同様 に形成される。第5および第6の可変位置でのアミノ酸の公知の順列を有する最 終ライブラリーセットは、1つの容器中でのアミノ酸混合物との最初の4つの可 変位置付加、および別々のウェル中での最終的な2つの付加を行うことによって 、同様に形成される。 VIII.高親和性ペプチドを選択する方法 この項は、前記のような組合わせライブラリー組成物を用いる、選択された巨 大分子リガンドと特異的に相互作用し得るペプチド化合物を生成する方法を記載 する。この方法において、ライブラリーセット中の各ライブラリーは、巨大分子 レセプターのような選択されたリガンドと特異的に相互作用する能力についてス クリーニングされる。この反応は、代表的には、リガンドと、スクリーニングさ れるライブラリー中の1つ以上の分子との間の、結合複合体の形成によって測定 されるような、結合反応である。 リガンドは、目的の任意の生物学的レセプターであり、すなわち、正常な生理 学的環境においてレセプターの機能化に影響を及ぼすために、レセプターに特異 的に結合する化合物を同定することが所望されるものである。例えば、レセプタ ーは酵素であり得、ここで化合物は、酵素の活性部位に結合し得るか、さもなけ れば正常基質に対して酵素の作用を阻害または影響を及ぼし得る。 1つの実施態様では、レセプターは、イオンチャンネルまたは他の輸送レセプ タータンパク質、あるいはホルモンまたは他の細胞エフェクターについてのレセ プター部位、あるいは、病原性細菌またはウイルスの細胞表面への結合のための レセプター部位のような細胞レセプタータンパク質であり得る。レセプタータン パク質は、単離した細胞と、培養細胞と、組織から単離した生物学的膜粒子と、 レセプターを組換えによって生成するために形質転換された細胞と、または単離 された細胞レセプターと会合し得る。このタイプのレセプタータンパク質、およ び種々の形態で発現または単離されたレセプタータンパク質は、文献に記載され ている。 関連の実施態様では、レセプターは、抗体または抗体フラグメントであり、こ こでは、抗体に特異的におよび高親和性で結合する「人工的」エピトープを同定 することが所望される。 図12A〜12Cは、本発明の方法を実施する際の、組合わせライブラリーをスクリ ーニングするための1つの方法を例示する。この方法では、組合わせライブラリ ーは、溶液相でスクリーニングされる。図12Aは、テストする方法に使用される マイクロタイタープレートの2つのウェル40、42を示す。ウェル40のようなプレ ートにおける各ウェルは、テストされる組合わせライブラリーの1つを含み、こ こで各ライブラリーは、選択された可変位置における公知の残基を有するペプチ ドから作成され、そして前記のように、これは残りの可変位置において組合わせ である。ウェル40におけるライブラリーは、ペプチド46のようなペプチドから構 成され、そしてウェル42においてはペプチド48のようなペプチドから構成される 。 各ライブラリーは、低モル濃度のリガンド、この実施例においては50で示され るような抗体とともにプレインキュベートする。抗体は、ウェル40中のライブラ リーでは52で示されるような1つ以上のペプチド種と免疫反応性であるが、ウェ ル42中のライブラリーでは免疫反応性はない。 次いで、各ライブラリーからの反応混合物は、第2のプレート上の新しいウェ ルに、ウェル当たり1ライブラリーで添加される。図12Bに示すように、プレー ト58中のウェル54、56のような第2のウェルは、それぞれ60で示されるような抗 原分子でコートされる。これらの抗原はまた、レセプター抗体と免疫反応性であ る。添加されたライブラリーは、レセプター抗体分子と表面結合した抗原との間 で免疫複合体形成する条件下で表面結合した抗原と反応させる。図12Bから理解 され得るように、抗体−ペプチド免疫複合体の形成は、ウェル表面への抗体結合 を防ぐ(ウェル54)。逆に、このような複合体形成の不在下では、抗体は最大レ ベルでウェル表面に結合する(ウェル56)。 この結合工程の後、ウェルを洗浄して、結合していない材料を除去し、そして 図12Cにおいて62で示されるようなリポーター標識した抗体と反応する。図12Cに おけるウェル56のような、結合したレセプター抗体を含むウェルにおいて、リポ ーター標識した抗体は、示されたように、レセプター抗体によってウェル表面に 結合される。結合していない抗体を除去するためにウェルを洗浄後、ウェルを結 合したリポーターの存在について分析する。この方法によって選択されるセット における1または複数のライブラリーは、結合したリポーターの低レベルまたは 不在を示すものである。まさに記載されたスクリーニング工程は、ライブラリー セットのそれぞれについて繰り返される。各セットについて、レセプターへの高 親和性結合を示す1つ以上のライブラリーが同定される。 このようにライブラリーペプチドにおける可変位置のすべてについて高親和性 残基が同定された場合、次の工程は、可変位置に高親和性残基を含むペプチドの 順列ライブラリーを構築することである。次いで、順列ライブラリーの各メンバ ーを、ライブラリーにおける最も高い親和性のペプチドを同定するためにテスト する。これは、例えば、標準的方法に従って、レセプターに対して各ライブラリ ーペプチドの結合親和性を決定することによって行われ得る。 以下の実施例6は、本発明のポリペプチドダイマー組成物の、Shigella flexn eriのリポ多糖(LPS)に対するモノクローナルIgAに対する抗体との相互作用を 測定するためのスクリーニングを詳述する。ペプチド組成物を、図5A、5B、およ び6に示す。図5Aは、ペプチド配列(配列番号12)を示す。ペプチドは、図3Aに 示す「一般的」ペプチドに基づき、それぞれH、F、V、Q、およびHを含む可 変位置X1、X2、X3、X4、およびX5を有する。図5Bは、図5Aにおける配列(配列番 号12)を有する2つのペプチドの会合によって形成されるコイルドコイルホモダ イマーのヘリックスホイール(wheel)表示を示す。図6は、図5Aに示す配列(配 列番号12)から予測されるαヘリックスのヘリックスネット(net)表示を示す。 図5Aおよび5Bに示されるラクタム架橋を含むペプチド配列番号12を使用して作 製したコイルドコイルヘテロダイマー、同一のペプチドを含むがラクタム架橋を 含まない組成物、ダイマーを形成しない同様のコントロールペプチド(配列番号 13、図9)、および抗体によって認識されるエピトープに対応する配列を有する より短いリニアペプチド(配列番号14、図9)を、抗LPS IgA抗体に対する親和 性について、図12A〜Cに関して記載されるのと同様な様式で、競合ELISAアッセ イでテストした(実施例6)。実験の結果を、以下の表3および4にまとめ、そ して図7にペプチド濃度の関数としてプロットする。 前記の実験は、ラクタム架橋および/またはコイルドコイルダイマー形成によ って安定化されるαヘリックスが、レセプターまたは酵素のような選択された巨 大分子リガンドと特異的に相互作用するアミノ酸側鎖のセットの提示のために有 効な骨格を構成することを証明する。 前記のように、本発明のライブラリー組成物は、種々のインビトロアッセイお よびインビボアッセイを含む、種々の異なるスクリーニングで使用され得る。バ イオアッセイは、イオンチャンネルおよび膜会合レセプターのような、細胞膜と 会合したリガンドへの結合を検出するために特に適切である。膜会合レセプター およびイオンチャンネルに関するスクリーニングについて、コンホメーション的 に制限されていないペプチドオリゴマーを含む組合わせライブラリーに対して、 本発明の方法および組成物を使用することのいくつかの有利点を、以下に詳述す る。 IX.適用 前記の本発明の種々の局面および実施態様は、組合わせ選択方法(すなわち、 組合わせライブラリーを用いるスクリーニング)を、選択可能な配列について構 造誘導テンプレートの理論的設計と組み合わせることの有利点を証明する。所定 の構造を有するペプチドから構成される本発明の組合わせライブラリーは、選択 誘導したペプチド疑似設計を可能にする。これによって、ペプチドファーマコホ アについてのコンホメーション的モデルは、直接スクリーニングから誘導される 。したがって、適切な非ペプチド性骨格の設計がペプチド骨格を置き換える。 さらに、本発明は、組み立てられたファルマコホアのライブラリーのパネルの 設計および合成を可能にし、それぞれは、規定される構造によって特徴づけられ 、そして大きな形状の空間を集約的に探求する。このようなライブラリーから選 択された各リガンドは、ペプチド疑似物の設計における最後の工程を開始するた めに必要な情報を直接もたらす。パネルの系統的なスクリーニングは、さらに、 より狭い形状の空間にわたる二次ライブラリーの合成を可能にする。 本発明の方法および組成物は、高親和性リガンドが探索されるレセプターの結 合部位が、2つ以上の空間的に分離されたドメインから構成される場合に、さら なる有利点を有する。代表的には、このようなレセプターは、少なくとも20アミ ノ酸残基を有するポリペプチドと相互作用することが公知である。このような結 合部位は、普通の組合わせライブラリーで代表的に見られるような短いオリゴマ ー種によって十分に結合/活性化され得ないが、結合部位は、本明細書に記載さ れるような幾分かさばったより堅固な種によって活性化され得る。このような結 合部位の例には、種々のレセプターおよびイオンチャンネル上の種々のトキシン 結合部位が含まれる。このような部位についての高親和性リガンドを形成するト キシンは、代表的には、比較的堅固な構造、およびレセプターへの結合に重要な 2つ以上の領域を有するより大きな分子である。多くのこのようなトキシンは、 ジスルフィドまたは他の共有架橋によってコンホメーション的に制限されるペプ チドトキシンである。例えば、Pacific cone shellは、ω-コノトキシンを含む 多くのイオンチャンネル指向性トキシンを含み(Oliveraら、1985)、これは、 ピコモル濃度で不可逆的にいくつかのカルシウムチャンネルをブロックする(Mc Cleskyら、1987;AosakiおよびKasai、1989;Plummerら、1989)。 以下の実施例は例示であり、決して本発明を限定することを意図しない。 材料および方法 A.略号 AcCN、アセトニトリル;BOP、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジ メチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート;CD、円二色性;2-Cl Z、2-クロロベンジルオキシカルボニル;Fmoc、9-フルオレニルメチルオキシカ ルボニル;GRH、成長ホルモン放出因子;HFIP、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイ ソプロパノール;HF、フッ化水素酸;HBTU、2-(1H-ベンゾトリアゾリル)-1,1,3, 3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;HOBt、1-ヒドロキシベ ンゾトリアゾール;NMM、N-メチルモルホリン;NMP、N-メチルピロリジノン;OB zl、ベンジル;OFm、9-フルオレニルメチル;RPC、逆相クロマトグラフィー;TF A、トリフルオロ酢酸;TFE、2,2,2-トリフルオロエタノール。 実施例1 ペプチド合成、精製、および分析 Laborec SP 640ペプチド合成機(Bubendorf、Switzerland)でのベンズヒドリ ルアミン-ヒドロクロリド樹脂を使用する固相ペプチド合成によって、ペプチド を合成した。すべてのアミノ酸を、それぞれ2-ClZおよびOBzl誘導体として保護 されたリジンおよびグルタミン酸側鎖機能性と共に、N-α-t-ブチルオキシカル ボニル保護した。ラクタム形成に関連するグルタミン酸およびリジン残基の側鎖 を、それぞれOFmおよびFmoc誘導体として保護した。5分の活性化時間でNMP中5 倍過剰のHBTU/HOBt/アミノ酸/NMM(1:1:1:1.5)を使用するカップリングプロト コルを用いる。いくつかのペプチドでは、ラクタム架橋を実施例4に記載のよう に組み込んだ。 ペプチドを、−5℃〜0℃で1時間、10%アニソールおよび2%1,2-エタンジ チオールを含むフッ化水素酸(HF;10ml/g樹脂)との反応によって樹脂から切断 した。粗還元したペプチドを、「SYNCHROPAK」RP-4調製用C4カラム(250×21.2 mm内径、6.5μm粒子サイズ、300Å孔サイズ;SynChrom、Lafayette、IN)で0. 1%B/分の直線ABグラジエントおよび5ml/分での逆相高速液体クロマトグラ フィー(RPC)によって精製し、ここで溶媒Aは水中の0.05%トリフルオロ酢酸 (TFA)であり、そして溶媒Bはアセトニトリル中の0.05%TFAであった。 アミノ酸分析について、精製したペプチドを、160℃にて1時間、吸引され封 されたチューブ中で、0.1%フェノールを含む6NHClで加水分解した。アミノ酸 分析を、Beckmanモデル6300アミノ酸分析機(Beckman、San Ramon、CA)で行っ た。還元したペプチドの正確な一次イオン分子量を、「BIOION-20」Nordicマス スペクトロメーター(Uppsala、Sweden)のプラズマ脱離飛程時間型マススペク トロスコピーによって確認した。 実施例2 円二色性測定 円二色性(CD)スペクトルを、Jasco DP-500Nデータプロセッサーおよびキュベ ットの温度の制御のためのLauda(モデルRMS)水浴(Brinkmann Instruments、R exdale、Ontario、Canada)を装着したJasco J-500C分光旋光計(Jasco、Easton 、MD)で、20℃にて記録した。一定のN2気流を用いた。計器を、再結晶したd-1 0-(+)-樟脳スルホン酸の水性溶液で290nmで日常的にキャリブレーションした。 モル扁平率は、平均残基モル扁平率([θ]、deg・cm2・dmol-1)として報告さ れ、そして以下の等式から算出される: [θ]=θobs×mrw/10×l×c ここでθobsは、度単位で測定された扁平率であり、mrwは平均残基分子量(アミ ノ酸残基の数で割ったペプチドの分子量)であり、cはミリリットル当たりのグ ラム単位のペプチド濃度であり、そしてlはセンチメートル単位のセルの光学的 経路長である。 CDスペクトルは、250〜190nmの0.1nm間隔でのデータを集めることによって得 られた4回のスキャンの平均であった。ペプチド濃度を、アミノ酸分析によって 決定した。pHを室温で測定した。 実施例3 ヘテロダイマー対ホモダイマー形成 2つのペプチド、EE(配列番号1)およびKK(配列番号2)を、実施例1およ び4に記載のように合成した。第1のサブユニットペプチド(EE;配列番号1) と第2のサブユニットペプチド(KK;配列番号2)との種々の割合のペプチド混 合物のCDスペクトルを、実施例2に記載のように測定して、ヘテロダイマー対ホ モダイマー形成の程度を決定した。 ペプチドを、0.1M KClおよび50mMリン酸カリウム緩衝液、pH7(反応緩衝液) を含む溶液中に20℃にて懸濁した。総ペプチド濃度(EE濃度およびKK濃度の合計 )は、すべての測定について196μMであった。 データは、ペプチドの割合が0:100から50:50まで変化するにつれて、ペプチド 混合物のコンホメーションが、ランダムコイル構造からαヘリックス構造へ変化 することを示す。EEおよびKKペプチドの等モル混合物は、220nmにて−31.000deg ・cm2・dmol-1の平均残基扁平率で220および208nmで2重の最小値を示し、これ は約100%αヘリックス構造に対応し(Hodgesら、1990)、ホモ鎖コイルドコイ ルを脱安定化するヘリックス間イオン性反発作用が、ヘテロ鎖コイルドコイルの 形成に対しての推進力を提供することを示唆する。 これらの結果は、ペプチドEEおよびKKの混合物がヘテロ鎖コイルドコイルを形 成することを示す。 実施例4 ラクタム架橋の生成 ラクタム架橋を含むペプチドを、実施例1に記載のように合成した。5等量の 2-(1H-ベンゾトリアゾール-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフル オロホスフェート(HBTU)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、および Bocアミノ酸と、7.5等量のN-メチルモルホリン(NMM)とのN-メチルピロリドン (NMP)中での二重カップリングを、各サイクルに利用した。各サイクルの間中 、Boc基を、塩化メチレン(DCM)中の50%トリフルオロ酢酸(TFA)で除去した 。 リジンおよびグルタミン酸残基の側鎖に関する環化(ラクタム架橋)を、NMP 中の20%ピペリジンでの所望の側鎖の脱保護、次いで5%HFIPを含むNMP中の5 倍過剰のHBTU/HOBt/NMMでの環化によって、樹脂上で形成した(Felixら、1988) 。鎖内反応を促進するために、置換レベルを、樹脂1グラム当たり0.15mmolアミ ノ基にまたはそれより低く維持した。置換レベルを、Meienhoferら(1979)の方 法に従って分光学的に決定した。 両ペプチドEE(配列番号1)およびKK(配列番号2)についてのリジン35およ び7のε-アミノ基およびグルタミン酸31および3のγ-カルボキシル基を、それ ぞれFmocおよびOFm基で保護した。これにより、NMP中3等量のHBTU、HOBL、およ び4.5等量のNMMでの固相環化前に、20%ピペリジンでこれらの残基の選択的脱保 護が可能になる。図2に示す、ペプチドEEのC-末端ヘプタドの合成を、環化手順 を概説するために用いる。他のラクタム架橋を同様に調製した。 A.BocLys(Fmoc)- ベンズヒドリルアミン樹脂の調製(Labortec SP 640ペプチ ド合成機) ベンズヒドリルアミン樹脂(3.0g、0.74meq/g樹脂、2.2meq)を、各30mLのDCM 、メタノール(MeOH)、DCM、DCM中の5%ジイソプロピルエチルアミン(DIEA) (×2)、DCM、およびNMP(×2)で洗浄した。BocLys(Fmoc)(1.14g、2.4mmol )、HBTU(0.91g、2.4mmol)、HOBt(0.37g、2.4mmol)を、NMP(15mL)に溶解 し、これにNMM(0.51mL、3.63mmol)を添加し、そして溶液を5分間予め活性化 した。この溶液を、膨潤した樹脂に添加し、そして5分間撹拌した。得られたBo cLys(Fmoc)樹脂を、NMP(2×1分)およびDCM(3×1分)で洗浄した。 B.C- およびN-末端ヘプタドの調製 脱保護(DCM中50%TFA、1×20分)および中和(DCM中5%DIEA、2×2分) 後、樹脂をDCM(2×1分)およびNMP(3×1分)で洗浄した。次のアミノ酸、 およびC-末端ヘプタドのすべての次に続くアミノ酸、およびそれに続くN-末端ヘ プタドのアミノ酸を、以下のプロトコルに従って二重カップリングした。 Bocアミノ酸(5等量)、HBTU(5等量)、HOBt(5等量)を、NMP(15mL)に 溶解し、これにNMM(7.5等量)を添加し、そして溶液を5分間予め活性化した。 この溶液を、反応容器に加え、そして30分間穏やかに撹拌した。合成の1サイク ルは以下の操作からなった(樹脂1グラム当たり10mLの溶媒):1)DCM中50%TF A(1×1分);2)DCM中50%TFA(1×20分);3)DCM(3×1分);4)DCM中 5%DIEA(2×2分);5)DCM(1×1分);6)NMP(3×1分);7)カップ リング(30分);8)NMP(3×1分);9)カップリング(30分);10)NMP(2 ×1分);11)DCM(3×1分)。 C.リジン−グルタミン酸側鎖環化 Boc-Ileの添加後、リジンのFmoc基およびグルタミン酸のOFm基の選択的脱保護 を、DCM中20%ピペリジン(1×20分)で行い、そして樹脂をその後DCM(2×1 分)およびNMP(3×1分)で洗浄した。環化を以下のプロトコルを使用して行 った。 HBTU(3等量)、HOBT(3等量)、およびNMM(4.5等量)を、NMPに溶解し、 これに0.5mLのヘキサフルオロイソプロパノールを添加した。溶液を反応容器に 加え、穏やかに8時間撹拌した。反応の進行を、定量的ニンヒドリンテスト(Sa rinら、1981)によってモニターした。代表的には、97%を越えるカップリング 効率を達成するために、3つのカップリングを必要とした。樹脂を、DCM中25mL の5%DIEA中の10等量の無水酢酸で1時間アセチル化し、そしてDCM、MeOH、DCM 、およびNMP(×2)で洗浄した。以下の工程を各環化に用いた:1)DCM中20% ピペリジン(1×1分);2)DCM中20%ピペリジン(1×20分);3)DCM(2× 1分);4)NMP(3×1分);5)カップリング(8時間);6)NMP(2×1分 );7)DCM(1×1分);8)DCM中5%DIEA(1×1分);9)DCM(1×1分) ;10)NMP(2×1分);11)カップリング(3時間);12)工程6〜10を反復 ;13)カップリング(1時間)。 実施例5 溶液中のペプチドのヘリックス含量に対するラクタム架橋の効果 種々の位置にラクタム架橋を含む一連のペプチドを、実施例1に詳述のように 設計および合成した。ペプチドの配列を、以下の表1におよび配列表に提供する 。表1はまた、ラクタム架橋の位置づけおよびペプチド名を示す。 ラクタム架橋の命名は、ペプチドのN-末端から関連する2つの残基の配列を1 文字コードで含み、これは架橋の配向およびiからi+3へまたはiからi+4へのい ずれかとしての架橋タイプを与える。2つの架橋を有するペプチドは、配列の前 の数字2によって示される。ラクタム架橋のないペプチドは、ペプチド番号の前 にlinearとして示される。 ラクタム架橋の命名は、ペプチドのN-末端から関連する2つの残基の配列を1 文字コードで含み、これは架橋の配向およびiからi+3へまたはiからi+4へのい ずれかとしての架橋タイプを与える。2つの架橋を有するペプチドは、配列の前 の数字2によって示される。ラクタム架橋のないペプチドは、ペプチド番号の後 にlinearとして示される。 ラクタム架橋を、N-またはC-末端で、あるいは(i,i+3)または(i,i+4)の間 隔で、ペプチドの中間でグルタミン酸およびリジンの側鎖間に組み込んだ。(i, i+n)命名法は、架橋がペプチド配列中に形成される残基間の相対位置をいう。 例えば、位置7のLysと位置10のGluとの間に形成されたラクタム架橋は、(i,i+3 )架橋であり、一方、位置6のLysと位置10のGluとの間に形成された架橋は、(i ,i+4)架橋である。αヘリックス(1ターン当たり3.6残基)の反復性の性質は、 (i,i+3)または(i,i+4)に間隔を開けた残基間に形成されたラクタム架橋がヘ リックスの同じ面に向くことを指示する。配列変化がラクタム架橋の種々の配向 (Glu-Lys対Lys-Glu)を研究するために作成される場合に、リニアホモログをコ ントロールとして合成した。 すべてのペプチドは14残基長であり、そして同数の酸性および塩基性アミノ酸 を含んでいた。グルタミン酸残基はN-末端付近に、およびリジン残基はC-末端付 近に位置し、その結果ヘリックス双極子とこれらの電荷を有する側鎖の相互作用 が、現実に誘引性であり、そしてヘリックス性を増強する(Shoemakerら、1985 、1987)。さらに、この疎水性面によるペプチドダイマー化を促進しそしてヘリ ックス含量を増加させるために、IleおよびLeu残基を、3,4疎水性リピートに配 列し、ここでそれらは、2本鎖αヘリックスコイルドコイルの特徴であるabc defgを示す繰り返しのヘプタドの位置aおよびdを占領した。位置aについ てはIleを、そして位置dについてはLeuを選択して、ペプチドダイマーの最大安 定性を提供した。好ましくないヘリックス−双極子相互作用を避けるために、N- およびC-末端を、それぞれアセチルおよびカルボキサミド機能性でキャップした (Shoemakerら、1985、1987)。 ペプチドのヘリックス含量を、実施例2に詳述のように、遠紫外CDスペクトル を使用して測定した。スペクトルを、いずれの濃度依存的影響も避けるために、 750μM±30μMのペプチド濃度で測定した。実験の結果を、以下の表2にまとめ る。 a222nmでのペプチドの算出されたモル扁平率。b Δ[θ]222は、良好な緩衝液中の222nmでの扁平率と50%TFE中の扁平率との間の 差である。c Δ[θ]222は、リニアペプチドの222nmでの扁平率と同じ配列のラクタムペプチ ドの扁平率との間の差である。d %ヘリックス含量を、予測されたモル扁平率によって割った観察された[θ]222 値の割合から算出した。予測されたモル扁平率(XnH)を、ヘリックスの無限 大長(X∞H)について−37400の[θ]222値を使用して、等式XnH= X∞H( 1−k/n)から算出した。nは14に等しく、そして波長依存定数kは2.50に等 しい(Chenら、1974)。e 良好な媒体中でヘリックス構造を誘導するための最も好ましいラクタム架橋の 位置付けを示す。 良好な条件(50mM KH2PO4、100mM KCl、pH7)下で、ペプチドKE(i,i+3)お よびKE(i,i+4)は、そのリニア5ホモログと比較した場合、ヘリックス含量の 著しい減少を示した。リニアペプチドは約61%ヘリックスであったが、KE(i,i+ 3)およびK-E(i,i+4)は、Chenら(1974)の方法によって算出すると、12およ び29%のヘリックス含量を含んでいた。ペプチドKE(i,i+3)は、198nmでのCD測 定における極小値によって特徴づけられるような著しいランダム構造を含んでい た(Chenら、1972)。50%トリフルオロエタノール(TFE)では、溶媒はヘリッ クス傾向を有するペプチドにおけるヘリックス形成を促進することが公知であり (GoodmanおよびListowsky、1962;Goodmanら、1971;Lehrmanら、1990;Sonnic hsenら、1992)、ペプチドKE(i,i+3)は64%ヘリックスであった。しかし、同 一条件下、リニア5およびKE(i,i+4)はそれぞれ98%および92%ヘリックスで あり、そして192nmでの極大値(>60000)および208および220nmでの極小値によ って特徴づけられた。 ペプチドEK(i,i+4)は、ペプチドKE(i,i+4)よりも、良好な条件においてか なりヘリックスであった(71%対29%)。ヘリックス性におけるこの増加は、配 列効果単独によるものではなかった。両方のペプチドとも50%TFE中で同様のヘ リックス含量(>90%ヘリックス性)を有したので、ペプチドKE(i,i+4)にお けるラクタム架橋の配向(Lys〜Glu)は、ラクタムカルボニルとヘリックスの主 鎖原子との間の脱安定化相互作用を有するようである。EK(i,i+4)ラクタム( −10100)(Δ[θ]222(リニア−ラクタム)、表2)によって与えられたヘリッ クス安定化の量は、KE(i,i+4)ラクタム(−9600)から得られるヘリックス脱 安定化の量の程度に匹敵する。 N-およびC-末端に位置するラクタムを有するペプチドのCDスペクトルは、ペプ チド2EK(i,i+3)が、ペプチドKE(i,i+3)と同様のCDプロフィル、および同じ 量のヘリックス含量(12%、表2)を有することを示した。しかし、50%TFEに よって誘導されたヘリックス構造の量は、KE(i,i+3)と比較してペプチド2EK( i,i+3)については著しく少なかった(6100対16250のΔ[θ]222)。これらの結 果は、良好な媒体中で(i,i+3)ラクタムのヘリックス構造を誘導する能力が限 定されることを示唆する。 同様に、ペプチド2KE(i,i+4)およびペプチド(i,i+4)は、良好な条件下でほ ぼ同一のCDスペクトルおよびヘリックス含量(それぞれ27%および29%)を有し 、 そして50%TFEの存在下ではヘリックス含量は90%を超えて増加する(表2)。 良好な条件では、2KE(i,i+4)についての極小値は、202から201nmにわずかに移 動しており、これは、[θ]222値のわずかな低下がランダム構造の増加の結果で あることを示唆する。しかし、ペプチドの末端の2つのGlu-Lys(i,i+4)ラクタ ムは、1つのペプチド2EK(i,i+4)を生じ、これは良好な条件下99%ヘリックス であった。このペプチドは、192nmでの極大値(82000)ならびに209nm(−27700 )および221nm(−30350)での極小値によって特徴づけられた。TFEの添加で、 −30350から−32150への[θ]222値のわずかな増加があった。ペプチドは、良好 な媒体中で本質的に完全にヘリックスなので、TFE中で観察された増加は、ヘリ ックス構造よりもむしろTFE中のラクタム架橋したペプチドの吸収特性と関係が あり得る。 良好な条件下および50%TFEの存在下での2EK(i,i+4)およびそのリニア対応 物のCDスペクトルは、適切に位置しおよび配向したラクタム架橋によって生じる ヘリックス含量の著しい増加を示す。2つの(i,i+4)ラクタムによって誘導さ れるヘリックス含量の増加(11750)は、リニアペプチドについて50%TFEによっ て誘導されるヘリックス性とほぼ同一(11400)であり、これは、ヘリックス構 造を与えることにおけるラクタム架橋の効率を示す。2EK(i,i+4)スペクトルの 他の特徴は、良好な条件(1.10)から50%TFE(0.97)になることにおける[θ]2 22 /[θ]208比の変化であった。さらに、222nmでの平均残基モル扁平率は、ダイ マー化を指示する濃度依存性を示した。ペプチドは、6000μM〜250μMの濃度範 囲にわたって95%より大きなヘリックスのままであった。リニアペプチド5は、 全体の範囲(6000μM〜25μM)にわたり濃度依存性を示した。 ペプチドリニア10を合成して、ラクタム形成に付随して増加した疎水性が、ヘ リックス含量を増加する役割を演じるかどうかを決定した。グルタミン酸をグル タミンに置換し、そしてリジンのε-アミノ基をアセチル化して、環化を制限し ない、代表的にはラクタム架橋に付随する疎水性を与えた。良好な条件下で、こ のペプチドは、約10%ヘリックス含量を有するランダム構造の実質的な量を有し た(表2)。50%TFEにおいて、ヘリックス含量は46%に増加し、これはラクタ ム架橋の形成における疎水性変化がペプチド2EK(i,i+4)のヘリックス含量を安 定化する効果がほとんどまたは全くないことを示唆した。2EK塩架橋を有するリ ニア5ペプチドは、良好な条件で61%ヘリックス含量および50%TFE中で98%α ヘリックスを有した(表2)。これらの結果は、リニア5に存在し、リニア10に 存在しない2つの塩架橋が、ヘリックスにかなりの安定性を与えることを示唆す る。 25%TFEの存在下での熱変性を、種々の(i,i+4)ラクタムの安定化効果を決定 するために行った。ヘリックス傾向を有するペプチドにおけるαヘリックス形成 を促進することの他に、TFEが、ペプチドおよびタンパク質における3次および 4次相互作用を破壊することが示されている(Sonnichsenら、1992、Lauら、198 4)。したがって、TFEの存在下での熱変性は、一本鎖αヘリックスの安定性の尺 度であるべきである。 すべての5つのペプチドのCDスペクトルは、202nmにイソ二色性点を示し、ち ょうど2つのコンホメーションの存在に一致した(Padmanabhanら、1990;Engel ら、1991)。すべてのペプチドは、5℃にてTFEの存在下で本質的に同じヘリッ クス含量を有したが、ヘリックス含量における差は、温度が上昇するにつれて観 察される。ペプチドの安定性は、一般的に、良好な条件下でヘリックス含量に従 った。最小の安定なペプチドはKEペプチドであり、2KE(i,i+4)はK-E(i,i+4) よりも実質的にあまり安定でなく、そして両方ともリニアの非環化ペプチドより もあまり安定でなく、これは、付加的脱安定化相互作用がKEラクタムペプチドに 関連したことを示す。 他方では、EKラクタムペプチドは、リニアペプチドよりも実質的により安定で あった。良好な条件下で2つのラクタムがαヘリックス含量を促進することにお いて1つのラクタムよりも効果的であったとしても、ペプチドEK(i,i+4)は2EK (i,i+4)よりも安定であった。80℃にて、両方のペプチドは、元のαヘリック ス含量の70%より多くを保持していた。ペプチド2EK(i,i+4)におけるαヘリッ クス含量の増加は、おそらく、所望のコンホメーションにペプチドを固定して、 末端効果を打ち消す末端ラクタム架橋から生じた。GCN4のコイルドコイル領域の ペプチドの結晶構造では、N-およびC-末端は、αヘリックスコンホメーションか らはずれ、そしてほぐれた(fray)(O'Sheaら、1991)。同様の結果を、Zhouら (1992)によるコイルドコイルモデルの分子動力学的シミュレーションから得た 。ほんの14残基のペプチドについて、このようにほぐれることは、ペプチドのα ヘリックス含量を減少する重要な役割を演じることを意図される。ペプチドEK( i,i+4)は、ほぐれた末端を有することが期待され、そしてこれは良好な条件に おけるのより少ない量のαヘリックス含量を説明し得る。 図8のデータは、ペプチド2EK(i,i+4)、EK(i,i+4)、およびリニア5のす べてがペプチド濃度に対してヘリックス含量の依存性を示したことを示し、これ は、ダイマー化が、ラクタム架橋および塩架橋の他に、ヘリックス含量を安定化 することに重要な役割を演じることを示唆する。ラクタム架橋によって与えられ る安定性の程度は、これらの濃度依存性曲線からひらめき得る(図8)。リニア 5および2EK(i,i+4)は、疎水性界面に同一の配列および同一の残基を有するの で、任意の濃度でのヘリックス含量の差は、Glu-Lys塩架橋よりも大きな程度に ヘリックス構造を増強するラクタム架橋によるものである。 実施例6 競合ELISAアッセイ 配列番号12、配列番号13、および配列番号14として示されるペプチドの、IgAC 5(Shigella flexneriのリポ多糖(LPS)と反応するモノクローナルIgA抗体)へ の結合を、以下のような標準的方法を使用する酵素結合イムノソルベントアッセ イ(ELISA)によって測定した。ペプチド(配列番号12(ラクタム架橋を含むま たは含まない)、配列番号13、または配列番号14のいずれか)(80μl)およびI gAC5(約0.5μg/ml)を、Tris緩衝化生理食塩水(TBS)中で1時間室温にてイン キュベートした。得られるペプチド−抗体複合体を、ポリスチレン96ウェルマイ クロプレート(Nunc-Immunoplate「MAXISORP」、Fisher Scientific、Pittsburg h、PA)(TBS中ウサギ抗CP1抗血清の1:20000希釈物の100μlで一晩コートされ、 そしてTBS中0.8%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックし、次いで室温で1時間 インキュベートされた)に100μlの前記溶液を添加することによって検出した。 抗CP1抗血清を、配列番号15として与えられる配列を有するCP1合成ペプチドでの 免疫によって産生した(KimおよびBerg、1993;Krizekら、1991)。 洗浄後、結合したペプチド−抗体複合体を、アルカリホスファターゼ結合ヤギ 抗マウスIgAα鎖(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO;TBS+0.8%BSA中1:500 0希釈、100μl/ウェル)とp-ニトロフェニルホスフェート(Sigma 104錠剤;0.5 mM MgCl2を含む10%ジエタノールアミン,pH9.8中1mg/ml、100μl/ウェル)との 20℃での引き続いてのインキュベーションによって検出した。発色を、Titertek 「MULTISKAN PLUS」MK-IIマイクロプレートリーダー(Flow Lab,Inc.,McLean, VA)で405nmでの吸光度を測定することによって定量した。 以下の表3のデータは、ラクタム架橋を含むおよび含まないペプチドコイルド コイル(CC;配列番号12)についてのペプチド濃度の関数としての抗体結合の% 阻害、ならびにリニアZnFペプチド(配列番号14)による%阻害を示す。データ は、ラクタム架橋によって安定化されたコンホメーション的に制限されたコイル ドコイルペプチドが、ラクタム架橋によって安定化されない同じペプチドよりも 抗LPS抗体への結合により効果的であることを証明し、これは、少なくともこの 特定の相互作用については、ペプチドをコンホメーション的に制限することが、 選択されたレセプターに結合するコイルドコイルヘテロダイマーの能力を改良す ることを示す。データはさらに、コンセンサス抗体結合残基を含むより短い制限 されないペプチド(図9)が、架橋されたまたは架橋されていないいずれかのコ イルドコイル(配列番号12)ペプチドよりも、抗体を結合することにあまり効果 的でないことを証明する。 以下の表4に示すデータは、非ダイマー化αヘリックス(シングルヘリックス ;一本鎖;配列番号13)を形成するように設計された、コンセンサス抗体結合残 基を含むラクタム架橋したペプチドがまた、抗体結合残基の選択されたセットの 提示についての骨格として効果的であること、およびこのコンホメーション的に 制限されたペプチドが、より短いリニア抗体結合コンセンサス配列ペプチド(リ ニアZnF;配列番号14)よりも、抗体を結合することに、より効果的であること を証明する。表4に示されるペプチド濃度値により、(架橋していない)コイル ドコイルペプチドがモノマーとしてのままであると考えられる。 本発明は、特定の方法および実施例に関して記載されているが、種々の改変お よび変更が本発明から逸脱することなく行われ得ることが理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホッジーズ,ロバート エス. カナダ国 アルバータ ティー6ダブリュ ー 1ジー4,エドモントン,サスカッチ ュワン ドライブ 9045 【要約の続き】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.異なる配列のポリペプチドメンバーの組合わせライブラリーであって、該ラ イブラリーの各メンバーが、 (a) αヘリックスコイルドコイルダイマー骨格を形成するための互いに結合し た第1および第2のポリペプチドであって、これは(i)両方のポリペプチドにお いてアミノ酸残基を規則的に繰り返すことによって形成される内部領域、および (ii)個々の第1および第2のポリペプチドにおいてそれぞれアミノ酸残基を規則 的に繰り返すことによって形成される第1および第2の露出した領域によって特 徴づけられ、ここで該骨格が、該骨格の内部領域におけるサブユニット間の疎水 性相互作用によって安定化される、ポリペプチド、および (b) 該ポリペプチドの少なくとも1つの露出した領域におけるアミノ酸残基の 独特の改変、 を含む、ライブラリー。 2.少なくとも103メンバーを含み、そしてアミノ酸改変が、前記少なくとも1 つのポリペプチドの前記露出した領域内の少なくとも3つの異なる残基位置に生 じる、請求項1に記載のライブラリー。 3.アミノ酸改変が、前記少なくとも1つのポリペプチドの露出した領域内の隣 接する残基位置で生じる、請求項1または2に記載のライブラリー。 4.アミノ酸改変が、前記少なくとも1つのポリペプチドにおいて2つの隣接す るαヘリックスターンの露出した領域内の残基位置で生じる、請求項1〜3のい ずれかに記載のライブラリー。 5.アミノ酸改変が、各ポリペプチドの露出した領域内の少なくとも2つの異な る残基位置の全体で生じる、請求項1〜4のいずれかに記載のライブラリー。 6.請求項1〜5のいずれかに記載のライブラリーであって、前記第1のポリペ プチドが、前記第2のポリペプチドの隣接末端に該第1のポリペプチドの末端を 連結する末端架橋セグメントを含み、前記第1の露出した領域が該架橋セグメン トをさらに含み、そしてアミノ酸改変が該架橋セグメント内に生じる、ライブラ リー。 7.各ポリペプチドが少なくとも4つのヘリックスターンを含む、請求項1〜6 のいずれかに記載のライブラリー。 8.少なくとも1つのポリペプチドが、ラクタム架橋によってαヘリックスコン ホメーションに安定化される、請求項1〜7のいずれかに記載のライブラリー。 9.請求項1〜8のいずれかに記載のライブラリーであって、前記露出した領域 中にアミノ酸残基の独特の改変が、天然に存在するアミノ酸に関連する基本的物 理化学的特性を示すが、これらの天然に存在するアミノ酸の多くが排除される、 代表的アミノ酸を使用して成し遂げられる、ライブラリー。 10.請求項9に記載のライブラリーであって、前記代表的アミノ酸が、(a)Ala 、(b)GluおよびAsp、(c)Phe、Tyr、およびTrp、(d)Gly、(e)IleおよびVal、(f)L ys、His、およびArg、(g)Leu、Met、およびCys、(h)GlnおよびAsn、および(i)Se rおよびThrからなる群のそれぞれからの少なくとも1つを含む、ライブラリー。 11.異なる配列のポリペプチドメンバーの組合わせライブラリーであって、該 ライブラリーの各メンバーが、 中間の独特の配列領域によって接合されるN-およびC-末端領域を有するポリペ プチドであって、ここで該2つの末端領域が、安定なαヘリックスコイルドコイ ルダイマー構造を形成するために互いに結合され、そのため、該独特の配列領域 の移動を抑制する、ポリペプチド、 を含む、組合わせライブラリー。 12.請求項11に記載のライブラリーであって、少なくとも103メンバーを含 み、そしてアミノ酸改変が、前記ポリペプチドの独特の配列領域内の少なくとも 3つの異なる残基位置に生じる、ライブラリー。 13.前記2つの末端領域が、それぞれ、少なくとも4つのヘリックスターンを 含む、請求項11または12に記載のライブラリー。 14.少なくとも1つの末端領域が、ラクタム架橋によってαヘリックスコンホ メーションで安定化される、請求項11〜13のいずれかに記載のライブラリー 。 15.請求項11〜14のいずれかに記載のライブラリーであって、前記ポリペ プチドが、天然に存在するアミノ酸に関連する基本的物理化学的特性を示すが、 これらの天然に存在するアミノ酸の多くが排除される、代表的アミノ酸から合成 される、ライブラリー。 16.請求項15に記載のライブラリーであって、前記代表的アミノ酸が、(a)A la、(b)GluおよびAsp、(c)Phe、Tyr、およびTrp、(d)Gly、(e)IleおよびVal、(f )Lys、His、およびArg、(g)Leu、Met、およびCys、(h)GlnおよびAsn、ならびに( i)SerおよびThrからなる群のそれぞれからの少なくとも1つを含む、ライブラリ ー。 17.異なる配列のペプチドメンバーの組合わせライブラリーであって、該ライ ブラリーの各メンバーが、アミノ酸残基の配列を含むαヘリックスポリペプチド を含み、該ポリペプチドが (i)15と50残基との間の長さであり、 (ii)隣接していない残基を連結する少なくとも1つのラクタム架橋によって安 定化され、そして (iii)該配列中の少なくとも3つの位置にアミノ酸残基の独特の改変を有する 、 組合わせライブラリー。 18.選択された巨大分子リガンドと特異的に相互作用し得る化合物を同定する 方法であって、 (a) 多数の異なる配列のポリペプチドメンバーを含む請求項1〜17のいずれ かに記載のライブラリー組成物を、該リガンドと接触させる工程、および (b) 該リガンドと特異的に相互作用するライブラリーメンバーを同定する工程 、 を包含する、方法。 19.前記ライブラリーメンバーが、前記少なくとも1つのポリペプチド中の少 なくとも2つの隣接するヘリックスターンの露出した領域にアミノ酸改変を含む 、請求項18に記載の方法。 20.請求項18または19に記載の方法であって、前記巨大分子リガンドが、 少なくとも20アミノ酸残基を有するポリペプチドと相互作用することが公知であ るレセプターであり、そして前記ライブラリーメンバーが、両方のポリペプチド の露出した領域内にアミノ酸改変を含む、方法。 21.前記巨大分子リガンドが抗体である、請求項18または19に記載の方法 。 22.前記選択された巨大分子リガンドが、酵素によって、検出可能な産物に酵 素的変換し得る基質であり、そして前記同定する工程が、このような産物を検出 する工程を含む、請求項18または19に記載の方法。
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