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1. TECHNISCHES GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Bibliotheken aus an in separater
Phase vorliegende Syntheseträger gebundenen
synthetischen Testverbindungen. Insbesondere betrifft die Erfindung
Bibliotheken aus an in separater Phase vorliegende Syntheseträger gebundenen
synthetischen Testverbindungen, die auch codierende polymere Sequenzen
enthalten, welche für
die Struktur der synthetischen Testverbindung codieren. Die Festphasensyntheseträgerkügelchen
enthalten jeweils eine einzige Art synthetische Testverbindung sowie
eine einzige, einmalige und leicht bestimmbare codierende polymere
Sequenz, die für
die Struktur der synthetischen Testverbindung codiert. Dabei kann
die synthetische Testverbindung Grundgerüststrukturen mit Verknüpfungen,
wie beispielsweise Amid-, Harnstoff-, Carbamat- (d.h. Urethan-),
Ester-, Amino-, Sulfid-, Disulfid- oder Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verknüpfungen,
die beispielsweise Alkan- und Alkenverknüpfungen, oder einer beliebigen
Kombination daraus, aufweisen. Ebenso kann es sich bei der synthetischen
Testverbindung um molekulare Gerüste
handeln, wie beispielsweise Derivate monocyclischer oder bicyclischer
Kohlenhydrate, Steroide, Zucker, heterocyclische Strukturen, polyaromatische
Strukturen oder andere Strukturen, die als Gerüst fungieren können. Ebenso
betrifft die Erfindung Verfahren zur Synthese derartiger Bibliotheken
sowie die Verwendung derartiger Bibliotheken zur Identifizierung
und Charakterisierung von Molekülen
von Interesse aus der Bibliothek synthetischer Testverbindung.
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2. STAND DER TECHNIK
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Fast
alle biologischen Vorgänge,
einschließlich
Immunerkennung, zelluläre
Signalgebung und Kommunikation, Transkription und Translation, intrazelluläre Signalgebung
sowie enzymatische Katalyse, werden durch Ligandenerkennung und
-bindung reguliert. Daher besteht im Fachgebiet seit langem ein
Interesse an der Identifizierung von Molekülen, die sich wie folgt nutzen
lassen: zur Verwendung als Agonisten oder Antagonisten von Liganden,
wie beispielsweise Hormonen, Wachstumsfaktoren oder Neurotransmittern;
zur Induktion der B-Zellen-(antikörpervermittelten)
oder T-Zellen-(zellvermittelten) Immunität; zur Induktion der Katalyse chemischer
Reaktionen und zur Regulation der Genexpression auf der Transkriptions-
oder Translationsebene. Ein Hauptgrund für dieses Interesse besteht
in dem Wunsch einer direkten Verwendung dieser biologisch aktiven
Moleküle
als Arzneistoffe oder, falls notwendig, einer Umwandlung dieser
Moleküle
zu Derivaten, die als Arzneistoffe wirken können.
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Bei
vielen biologischen Liganden handelt es sich um Proteine oder Peptide.
Zu dieser Aufzählung
gehört
die Mehrzahl der Hormone, Wachstumsfaktoren, neuroaktiven Moleküle und Immunepitope.
Daher beinhalteten erste Ansätze
zur Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten rezeptor- oder enzymvermittelter
biologischer Aktivitäten
die Konstruktion und Synthese von Peptiden. Allerdings sind Peptide,
bei denen wünschenswerte
biologische Aktivitäten
festgestellt wurden, häufig
als Arzneistoffe ungeeignet. Um zu Arzneistoffen zu werden, müssen die
Peptide häufig
zu Derivaten oder Strukturanalogen, d.h. Peptidmimetika, umgewandelt
werden, welche im Gegensatz zu den meisten Peptiden zufrieden stellende
pharmakokinetische und Stabilitätseigenschaften
besitzen. Es sind viele Veröffentlichungen
schienen, die die Entwicklung medizinisch geeigneter oder vielversprechender
Peptidomimetika beschreiben; zu jüngeren Veröffentlichungen dieser Art gehören beispielsweise
Rudy Baum, in Chemical & Engineering
News, 18. Januar, 1993, Seite 33; Hirschmann, R. et al., J. Am.
Chem. Soc., 1992, 114, 9699-9701; Hirschmann, R. et al., J. Am.
Chem. Soc., 1992, 114, 9217-9218.
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Die
Entdeckung biologisch aktiver Verbindungen kann sich schwierig,
zeitraubend und äußerst kostenintensiv
erweisen. Ein Hauptproblem auf diesem Gebiet besteht in der Identifizierung
einer einzelnen chemischen Struktur aus einer großen Anzahl
möglicher
relevanter Strukturen, die die gewünschten Eigenschaften besitzt.
Wird bei dem Entdeckungsverfahren eine Abfolge von Strategien von
Strukturentwurf, Synthese und biologischem Testen eingesetzt, so
wird die Identifizierung einer wünschenswerten
chemischen Struktur äußerst arbeitsaufwendig.
Zur Umgehung dieser hohe Anforderungen stellenden Aufgabe lassen
sich Bibliotheken mit einer großen
Anzahl von Molekülen
verschiedener Strukturen herstellen. Idealerweise können solche
Bibliotheken schnell durchsucht und bewertet werden.
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Ein
Großteil
der Arbeit auf diesem Gebiet der Bibliothekssynthese und -suche
wurde mit Peptiden durchgeführt,
beispielsweise bei den Ansätzen
von Geysen (Geysen et al., Molecular Immunology, 1986, 23, 709-715;
Geysen et al., J. Immunologic Methods, 1987, 102, 259-274), Fodor
(Fodor et al., Science, 1991, 251, 767-773) und Houghten (Houghten
et al., Nature, 1991, 354, 84-86). Allerdings sind derartige Bibliotheken
hinsichtlich der Anzahl möglicher
Strukturvarianten, die hergestellt, getestet und in einem gegebenen
Experiment identifiziert werden können, beschränkt.
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Die
Erfindung echter Zufallsbibliotheken polymerer synthetischer Testverbindungen,
bei denen eine aus einer Kombination von Untereinheiten entstandene
einzelne Polymerspezies an einen einzelnen festen Träger gebunden
wird, bezeichnete einen Durchbruch bei der Entdeckung biologisch
aktiver Verbindungen, bei denen es sich um Peptide oder in ganz
wichtiger Weise um Peptidmimetika handelt (siehe die Anmeldung
WO-A-9200091 ).
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Nichtpeptidische
organische Verbindungen, wie beispielsweise Peptidmimetika, sind
häufig
in der Lage, Peptidliganden hinsichtlich der Affinität für einen
bestimmten Rezeptor oder ein bestimmtes Enzym zu übertreffen.
So beinhaltet die stärkste
jemals aufgezeichnete Bindung, nämlich
die von Biotin und Avidin, die Anlagerung einer nichtpeptidischen
organischen Struktur (Biotin) an ein Protein (Avidin). Eine wirksame
Strategie zur raschen Identifizierung hochaffiner biologischer Liganden
und damit letztendlich neuer und wichtiger Arzneistoffe erfordert
die schnelle Konstruktion und das schnelle Absuchen verschiedenartiger
Bibliotheken nichtpeptidischer Strukturen, die verschiedene Struktureinheiten
enthalten, die zur Realisierung einer oder mehrerer Arten von Wechselwirkungen
mit einem biologischen Akzeptor (z.B. einem Rezeptor oder Enzym)
in der Lage sind, wie beispielsweise Wasserstoffbrückenbindungen
Salzbrücken, π-Komplexierung,
hydrophobe Effekte usw. Allerdings stecken die Arbeiten an der Erzeugung
sowie der Absuche von nichtpeptidische Moleküle enthaltenden Bibliotheken
synthetischer Testverbindungen noch in ihren Anfängen. Ein Beispiel aus diesem
Gebiet ist die Arbeit von Ellman und Bunin an einer kombinatorischen
Synthese von Benzodiazepinen auf einem festen Träger (J. Am. Chem. Soc. 114,
10997, (1992); siehe Chemical and Engineering News, 18. Januar,
1993, Seite 33).
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Ein
bislang nicht gelöstes
Hauptproblem auf dem Gebiet der Erzeugung und Verwendung nichtpeptidischer
Bibliotheken besteht in der Aufklärung der Struktur von aus einer
Bibliothek ausgewählten
Molekülen, die
eine viel versprechende biologische Aktivität zeigen.
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Kürzlich wurde
von Brenner und Lerner (Brenner, S. und Lerner, R.A. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1992,
89, 5381-5383) ein Versuch zur Aufdeckung der Strukturen von aus
einer Bibliothek ausgewählten
Peptiden beschrieben, bei dem einmalige Nukleotidsequenzcodes, die
parallel zur Peptidbibliothek synthetisiert werden, verwendet werden.
Die Nukleotidsequenz des jeweils zum Peptid gehörenden Codes muss über die Polymerasekettenreaktion
(PCR) amplifizierbar sein. Allerdings sind die Nukleotidsynthesetechniken
nicht mit allen für
die Synthese vieler Arten von Molekülbibliotheken benötigten Synthesetechniken
kompatibel. Weiterhin wird dieser Ansatz auch durch die enge Nachbarschaft
von Nukleotid und synthetischer Testverbindung in der Bibliothek,
die zu Wechselwirkungen zwischen diesen Molekülen führen kann, wodurch die Bindung
des Liganden mit einem Zielrezeptor oder Enzym während des biologischen Tests
gestört
wird, eingeschränkt.
Die Nukleotidkomponente der Bibliothek kann auch auf verschiedene
andere Weisen während
biologischer Tests stören.
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Dower
et al. (
WO 93/06121 )
betrifft ein stochastisches Verfahren zur Synthese von Bibliotheken
aus Zufallsoligomeren. Die Zufallsoligomere werden dabei auf festen
Trägern
bzw. Partikeln synthetisiert, können jedoch
von diesen Trägern
abgespalten werden, um so eine lösliche
Bibliothek bereitzustellen. Die Oligomere setzen sich aus einer
Abfolge von Monomeren zusammen, wobei es sich bei den Monomeren
um beliebige Mitglieder des Satzes von Molekülen, die unter Bildung eines
Oligomers oder Polymers zusammengefügt werden können, d.h. Aminosäuren, Carbamate,
Sulfone, Sulfoxide, Nukleoside, Kohlenhydrate, Harnstoffe, Phosphonate,
Lipide, Ester, Kombinationen daraus und dergleichen, handelt. Zur
Identifizierung der Abfolge von Monomeren im Oligomer wird ein Identifizierungs-Tag
verwendet. Dabei kann das Identifizierungs-Tag irgendein erkennbares
Merkmal sein, das auf irgendeine Weise die benötigte Information trägt und die
auf dem Niveau eines oder einiger weniger festen Träger entziffert werden
kann. Die festen Träger
können
mit den Oligomeren und dem Identifizierungs-Tag mittels einem oder
mehrerer Linker-Moleküle
verbunden werden.
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Von
Kerr et al. (J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 2520-2531) wurde über die Synthese von Lösungsphasenbibliotheken
von Peptiden mit nichtnatürlichen
Aminosäureresten
parallel zu peptidcodierenden Strängen berichtet. Der Peptidligand
und sein codierender Strang sind in dieser Bibliothek kovalent miteinander
verbunden, was die paarweise Isolierung und Sequenzbestimmung der
synthetischen Testverbindung und ihres entsprechenden Codes gestattet.
Allerdings kann wie bei der von Brenner und Lerner, supra, beschriebenen
nukleinsäurecodierten
Bibliothek das codierende Peptid den Suchtest [„Screening Assay"] stören. Zudem
wird durch die Notwendigkeit zur Aufreinigung ausreichender Mengen
an Material aus der Bibliothek beim Affinitätsselektionsverfahren, um die
Sequenz der codierenden Peptide zu erhalten, die Synthese von Bibliotheken mit
mehr als einigen tausend Spezies ausgeschlossen.
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Somit
besteht im Fachgebiet ein Bedarf an neuen, allgemeinen und vielseitigen
Verfahren zur Erzeugung und Durchsuchung von Bibliotheken von Verbindungen,
die zu verschiedenen chemischen Klassen gehören. Ferner besteht ein Bedarf
an wirkungsvollen Verfahren zur Aufklärung der Strukturen von aus
der Bibliothek als Ergebnis der Suche ausgewählten Verbindungen, deren Strukturen
sich mit traditionellen Techniken, z.B. Edman-Abbau oder Massenspektrometrie,
allein nicht bestimmen lassen. Weiterhin besteht im Fachgebiet auch
noch ein Bedarf an einem molekularen Codierungssystem, das weder
die Suchtests stört
noch die Bindung der synthetischen Testverbindung über Nachbarschaftseffekte
beeinflusst.
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Die
Angabe bzw. Identifizierung der Literaturstellen im vorliegenden
Text soll nicht als Eingeständnis, dass
diese Literaturstellen als Stand der Technik der vorliegenden Erfindung
verfügbar
sind, verstanden werden.
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3. KURZE BESCHREIBUNG DER
ERFINDUNG
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Von
der Anmelderin wurde eine Bibliothek zur Identifizierung und Analyse
eines Liganden eines Akzeptors entdeckt. Die vorliegende Erfindung
richtet sich auf eine Bibliothek, die eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst,
an denen jeweils eine Testverbindung sowie ein oder mehrere codierende
Moleküle
gebunden ist bzw. sind. Dabei umfasst die Testverbindung eine Sequenz
von Untereinheiten und ist jeweils über einen spaltbaren Linker
an den Festphasenträger
gebunden.
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Die
codierenden Moleküle
sind über
einen nichtspaltbaren oder getrennt spaltbaren Linker an jeden Festphasenträger gebunden.
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Die
codierenden Moleküle
umfassen α-Aminosäuren. Weiterhin
unterscheidet sich jede Spezies codierendes Molekül von der
Spezies der Testverbindung, wird die Sequenz der Untereinheiten
der Testverbindung durch die Spezies von codierenden Molekülen codiert
und weisen die codierenden Moleküle
Untereinheiten auf, die in einem nichtsequenziellen Code angeordnet
und topologisch von der Testverbindung, die an den Träger gebunden
ist, getrennt sind, so dass sich das codierende Molekül im Inneren
des Trägers
befindet und sich die Testverbindung auf der Außenseite des Trägers befindet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Bibliothek zur Identifizierung
eines Liganden oder eines Akzeptors von Interesse, wobei die Bibliothek eine
Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst, an deren Oberfläche jeweils
ein Linker gebunden ist, der eine einzige Spezies einer Testverbindung
mit einer Sequenz von Untereinheiten umfasst, und wobei im Inneren
jedes Trägers
ein codierendes Molekül
gebunden ist, das die Sequenz von Untereinheiten der Testverbindung
codiert, wobei der Linker eine Bindung aufweist, die durch ein Enzym
spaltbar ist, das nicht eine Bindung des codierenden Moleküls spaltet
und wobei das codierende Molekül α-Aminosäuren umfasst.
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Ebenso
wird durch die vorliegende Erfindung eine Bibliothek zur Identifizierung
eines Liganden oder eines Akzeptors von Interesse bereitgestellt,
wobei die Bibliothek eine Vielzahl von separaten Festphasenträgern umfasst,
wobei auf der Oberfläche
jedes Trägers
ein Linker gebunden ist, der eine einzige Spezies einer Testverbindung
umfasst, die eine Sequenz von Untereinheiten umfasst, an die eine
erste Schutzgruppe gebunden ist, und wobei im Inneren jedes Trägers ein
codierendes Molekül
gebunden ist, das die Sequenz von Untereinheiten codiert und an
das eine zweite Schutzgruppe gebunden ist, wobei die erste Schutzgruppe
von der zweiten Schutzgruppe verschieden ist und wobei das codierende
Molekül α-Aminosäuren umfasst.
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Ebenso
befasst sich die vorliegende Erfindung mit Suchtests zur Suche nach
den Verbindungen, wie beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein,
Enzymaktivität,
Elektronentransportaktivität
und Photoaktivität,
um nur einige zu erwähnen.
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Feste
Träger,
die Verbindungen enthalten, welche die Aktivität von Interesse im Suchtest
demonstrieren, werden ausgewählt.
Die Struktur der Verbindung wird bestimmt, beispielsweise mittels
Massenspektrometrie, Kernmagnetresonanzspektrometrie oder anderen
spektrometrischen Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei der
Bibliothek um eine codierte Bibliothek, wobei in diesem Fall die
Struktur der Verbindung von der Sequenz des codierenden Moleküls codiert
wird, welche sich leicht bestimmen lässt.
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Durch
die Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich Leitverbindungen
für therapeutische oder
diagnostische Mittel bereitstellen. Insbesondere kann es sich bei
den Verbindungen selbst um geeignete Therapeutika oder Diagnostika
handeln. Die Verbindungen auf Trägern
in separater Phase können
auch für den
Elektronentransport, z.B. als Transistoren oder Halbleiter, geeignet
sein.
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4. KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1. Strategien zur Anbindung codierter
Bibliotheken einer synthetischen Testverbindung. Untereinheiten
der synthetischen Testverbindung sind als [NONSEQ] bezeichnet; das
codierende Molekül
ist durch A-B-C gekennzeichnet. (A) Die Testverbindung und das codierende
Molekül
lassen sich separat direkt oder über
einen Linker an den Träger
binden, und zwar mit einer statistischen Verteilung, die sich bezogen
auf die Massenwirkung und die innewohnende Reaktivität verändern lässt. (B)
Die synthetische Testverbindung und das codierende Molekül lassen
sich an den gleichen Linker auf dem Träger in separater Phase binden,
und zwar in einem definierten Molverhältnis. (C) Die synthetische
Testverbindung wird auf der Oberfläche und das codierende Molekül im Inneren
eines Trägers
in separater Phase, wie beispielsweise eines Harzkügelchens, gebunden.
Als Alternative kann sich bei (C) das codierende Molekül auf der
Oberfläche
und die Testverbindung im Inneren befinden.
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2. Drei Formen einer modellcodierten Bibliothek,
wobei es sich sowohl bei der „Test"-Verbindung (Ala-Phe-Val) als auch
beim codierenden Molekül
(Gly-Tyr- Leu) um
ein Peptid handelt. (A) Die „Test"-Verbindung wurde
unter Verwendung der Fmoc-Schutzgruppe und das codierende Molekül mit der
Boc-Schutzgruppe synthetisiert. Bei Fmoc und Boc handelt es sich
um orthogonale Schutzgruppen. (B) Die Fmoc-entschützte „Test"-Verbindung wurde
acetyliert, so dass lediglich das codierende Peptid mittels Edman-Abbau
sequenziert würde.
(C) Das codierende Peptid wurde mit Trifluoracetyl (TFA) blockiert,
was die Edman-Sequenzierung
der „Test"-Verbindung gestattete,
wonach TFA abgetrennt und das codierende Peptid sequenziert wurde.
Die Peptide wurden an das TantaGel (TG)-Harz über einen „Safety-Catch"-Amidlinker (SCAL;
Patek und Lebl, 1991, Tetrehedron Lett. 32:3891-3894) mit Lysinverzweigungen
gebunden.
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3.
Modellbibliotheken mit verzweigten Gerüsten, wobei verschiedene mögliche chemische
Verknüpfungsprozesse
dargestellt sind, einschließlich
der Umsetzung eines Amins mit einer Carbonsäure unter Bildung eines Amids;
der Umsetzung einer Carbonsäure
mit einem Amin unter Bildung eines Amids; der Umsetzung eines Thiols
mit einem Alkylhalogenid unter Bildung eines Sulfids.
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4. Modell der Wechselwirkung einer synthetischen
Testgerüstverbindung
mit einem Akzeptormolekül.
(A) Die am Gerüst
gebundenen funktionellen Gruppen besitzen die Freiheit, eine geeignete
Bindungskonformation einzunehmen. (B) Die funktionellen Gruppen
auf dem Gerüst
sind hinsichtlich der geeigneten Bindungskonformation eingeschränkt.
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5.
Strukturen einiger der Untereinheiten, die sich chemisch in Zufallsstrukturen
unter Ausbildung der Bibliotheken der synthetischen Testverbindung
chemisch verknüpfen
lassen.
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6.
Aus wiederholten Kondensationsreaktionen mit Boc- und Fmoc-blockierten
Untereinheiten gebildete cyclische Modelbibliothek.
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7.
Schema zur Herstellung einer Gerüstbibliothek
an TentaGel-Harz, wobei es sich bei dem Gerüst um Cyclopentan handelt.
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8.
Strukturen von zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Gerüstbibliothek
verwendeten Untereinheiten. Der Zwei-Buchstaben-Aminosäuredipeptid-Code für die Untereinheiten
ist jeweils unterhalb der entsprechenden Untereinheit angegeben.
Die Herstellung und Verwendung dieser Bibliothek ist in Abschnitt
9 unten beschrieben.
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5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft Bibliotheken synthetischer Testverbindungen,
die an Trägern
in separater Phase gebunden sind, wobei jeder Träger in separater Phase jeweils
eine einzige Spezies einer synthetischen Testverbindung enthält, sowie
Verfahren zur Synthese und Verwendung derartiger Bibliotheken. Dabei
bezieht sich der Begriff „Träger in separater
Phase" auf eine
Matrix, an die die synthetische Testverbindung gebunden werden kann
und die in einer Flüssigkeit
nicht löslich
ist oder mit einer Flüssigkeit
ein Zweiphasensystem bildet. Vorzugsweise handelt es sich bei der
separaten Phase um eine Festphase, obwohl separate Phasen, wie etwa Hydrogele
und Aerogele, auch in Betracht gezogen werden.
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Der
Begriff „Bibliothek
einer synthetischen Testverbindung", wie er hier verwendet wird, bezieht
sich auf Sammlungen synthetischer Testverbindungen auf Trägerpartikeln
in separater Phase, wobei die Trägerpartikel
in separater Phase jeweils eine einzige Strukturspezies der synthetischen
Testverbindung enthalten. Jeder Träger enthält viele Kopien der einzigen
Strukturspezies. So enthält
beispielsweise ein typischer Harzträger für die Festphasenpeptidsynthese
etwa 50-250 pmol Peptid. Die Strukturen der synthetischen Testverbindung
leiten sich von einer im Wesentlichen zufälligen chemischen Kombination
von „Untereinheiten" ab.
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Der
Begriff „synthetische
Testverbindung",
wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf kleine Moleküle, die
aus 2 bis 100 und stärker
bevorzugt 2-20 Untereinheiten mit einem oder ohne einem Gerüst bestehen.
In einer Ausführungsform
handelt es sich bei der synthetischen Testverbindung um ein aus
Untereinheiten, die über
solche Verknüpfungen
wie etwa Amid-, Harnstoff-, Ester-, Ether-, Carbamat-, Amin-, Sulfid-,
Disulfid-, Kohlenstoff-Kohlenstoff-Verknüpfungen, wie z.B. Alkan-, Alken-
und Alkinverknüpfungen,
und dergleichen, verknüpft
sind, gebildetes Polymer; insbesondere können zu der Verbindung, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Polycarbamat, Polyharnstoff, Polyamid, Polyester, Polyether
usw. oder eine beliebige Kombination daraus, wie ausführlich unten
beschrieben, gezählt
werden. In einer weiteren Ausführungsform
kann es sich bei einer synthetischen Testverbindung um ein zufällig funktionalisiertes
molekulares Gerüst
handeln, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Steroidstruktur,
heterocyclische Struktur, ein polyaromatischer Ring oder eine Kohlenhydratstruktur
und dergleichen, wie ausführlich
unten beschrieben.
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Der
Begriff „Untereinheit", wie er hier verwendet
wird, bezieht sich auf eine chemische Teilkomponente, womit die
synthetische Testverbindung über
die Verknüpfung
der chemischen Teilkomponenten mittels einer definierten Chemie
gebildet wird. So handelt es sich beispielsweise bei einer „Bibliothek
von Peptiden" um eine
Sammlung von Peptiden (der synthetischen Testverbindung), d.h. aus
2-100 α-Aminosäureresten
(den Untereinheiten) bestehenden Ketten, deren Sequenzen einen beliebigen
Aminosäurerest
enthalten, der einem anderen beliebigen Aminosäurerest vorangeht oder diesem
folgt. Eine „Bibliothek
von Steroidderivaten" ist
beispielsweise eine Sammlung von Steroidderivaten, die jeweils eine
funktionelle Gruppe aus einem Satz funktioneller Gruppen, den Untereinheiten,
an spezifischen Positionen des Steroidkerns tragen.
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Besonders
bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung codierte Bibliotheken
synthetischer Testverbindungen. Dabei bezieht sich der Begriff „codierte
Bibliothek", wie
er hier verwendet wird, auf eine Bibliothek, bei der jede unterschiedliche
Spezies der Verbindung auf jedem Träger in separater Phase mit
einem codierenden Molekül
gepaart ist, dessen Struktur leicht bestimmbar ist und eine einmalige
Struktur für
seinen gepaarten Partner in der Bibliothek codiert. In einer bevorzugten
Ausführungsform
einer codierten molekularen Bibliothek handelt es sich bei dem codierenden
Polymermolekül
um ein Peptid. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich
bei dem codierenden Polymermolekül
um ein Oligonukleotid.
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Zu
Ausführungsformen
von Bibliotheken gehören
beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die folgenden:
Bibliotheken,
bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyamide
handelt, d.h. die synthetische Testverbindung besteht aus Ketten
von 2-100 Aminosäuren, die über Amidbindungen
verknüpft
sind;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Polyester handelt, d.h. Ketten von 2-100 Hydroxysäuren, die über Esterbindungen
verknüpft
sind;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Polyether handelt, d.h. Ketten von 2- 100 Hydroxyalkoholen,
die über
Etherbindungen verknüpft
sind;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Polyharnstoffe handelt;
Bibliotheken, bei
denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyurethane
handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Polycarbonate handelt;
Bibliotheken, bei
denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polyamine
handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Polyalkane, Polyalkene oder Polyalkohole, einschließlich deren
Halogenderivate, handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei
der synthetischen Testverbindung um Polysulfide handelt;
Bibliotheken,
bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Polydisulfide
handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Polymere handelt, deren Strukturen zufällig angeordnete
Segmente aus zwei oder mehr der in den obigen Ausführungsformen
beschriebenen polymeren Strukturen enthalten;
Bibliotheken,
bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Derivate
einer Steroidstruktur handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich
bei der synthetischen Testverbindung um Derivate eines Zuckers,
wie z.B. β-D-Glukose, handelt;
Bibliotheken,
bei denen es sich bei der synthetischen Testverbindung um Derivate
einer heterocyclischen Struktur, wie beispielsweise Benzodiazepin,
handelt;
Bibliotheken, bei denen es sich bei der synthetischen
Testverbindung um Derivate einer Struktur handelt, die als Gerüst dienen
kann, an das eine Vielzahl von Strukturen, wie beispielsweise, ohne
jedoch darauf beschränkt
zu sein, Carbonsäuren,
Amine und Halogenderivate, auf definierte Weise gebunden werden
können;
Bibliotheken,
bei denen es sich bei den Molekülen
um chimäre
Strukturen handelt, die einen oder mehrere Sequenzen variabler Länge enthalten,
die chemisch über
aus einer oder mehreren Amiden, Estern, Ethern, Carbonsäureestern,
Sulfiden, Disulfiden, Alkenen und Aminen sowie einer oder mehreren
Strukturen, die als Gerüst
fungieren können,
wie beispielsweise einer Steroid-, einer Zucker-, einer aromatischen
oder polyaromatischen Struktur, ausgewählte Verbindungen verknüpft sind.
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Viele
verschiedene Untereinheiten der unterschiedlichen Klassen synthetischer
Testverbindungen sind im Handel von Lieferfirmen, wie beispielsweise
Sigma, Aldrich, ICI Chemicals usw., erhältlich. Als Alternative können Untereinheiten
synthetisch mit chemischen Standardsynthesetechniken hergestellt
werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei den oben aufgeführten Bibliotheken um codierte
Bibliotheken, bei denen jeder Träger
in separater Phase eine synthetische Testverbindung sowie eine für die Struktur
der synthetischen Testverbindung codierende polymere Sequenz enthält. Vorzugsweise
handelt es sich bei der codierenden polymeren Sequenz um ein Peptid.
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5.1 CODIERUNGSSTRATEGIEN
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Wie
oben angemerkt, handelt es sich in einem bevorzugten Aspekt bei
den erfindungsgemäßen Bibliotheken
um codierte Bibliotheken, bei denen die Sequenz eines codierenden
Moleküls
auf jedem Träger
jeweils der Struktur der synthetischen Testverbindung auf jedem
Träger
entspricht. Somit wird jede einmalige synthetische Testverbindungsstruktur
von einer einmaligen codierenden Molekülsequenz codiert. Wie oben angemerkt,
handelt es sich bei dem codierenden Molekül vorzugsweise um ein Peptid,
doch umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuren oder
eines beliebigen sequenzierbaren Polymers als codierende Sequenz.
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Das
Paradigma einer codierenden Sequenz ist der genetische Code, bei
dem Nukleotidtriplettsequenzen in einem Gen einer spezifischen Aminosäure in einem
von dem Gen codierten Protein entsprechen. Die Anordnung von Codons
in einem Gen entspricht der Sequenz von Aminosäuren in einem Protein. Somit
codiert das Gen für
das Protein.
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Nach
dieser Analogie lässt
sich die Codierung der Sequenz einer Bibliothek einer synthetischen
Testverbindung, wie beispielsweise eines Polyamids, dessen Sequenz
nicht mit herkömmlichen
Verfahren (z.B. Edman-Abbau) ermittelt werden kann, mit einem codierenden
Molekül
leicht unter Verwendung eines analogen Codes bewerkstelligen. Dabei
ist die Wahl des Codes rein willkürlich, einschließlich davon,
ob Einfach-, Zweifach- oder Dreifachkombinationen (oder höhere Kombinationen)
von Untereinheiten des codierenden Moleküls einer jeden Untereinheit
der synthetischen Testverbindung entsprechen.
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So
kann es sich beispielsweise bei dem codierenden Molekül um ein
Peptid handeln. In diesem Fall werden Codes, die aus einem oder
mehreren Aminosäureresten
bestehen, die sich leicht mit dem Edman-Abbau nachweisen lassen
und von denen man auch weiß,
dass sie in der Festphasenpeptidsynthese in wirksamer Weise kuppeln,
ohne dass sie einen Seitenkettenschutz benötigen, als ganz besonders geeignet
angesehen. Wird beispielsweise ein Triplettcode auf der Grundlage
der Aminosäuren
Leucin (Leu), Glycin (Gly), Alanin (Ala) und Phenylalanin (Phe)
(die alle keinen Seitenkettenschutz benötigen und während der Peptidsynthese auf
wirksame Weise kuppeln und weiterhin leicht durch Edman-Abbau nachweisbar
sind) verwendet, so können
mit geeigneten chemischen Reaktionen Bibliotheken synthetischer
Testverbindungen synthetisiert werden, die bis zu 64 strukturell
unterschiedliche Untereinheiten enthalten, wobei jede Untereinheit
mit einem einmaligen, die Tripletts von Leu, Gly, Ala bzw. Phe (wobei
jedes Triplett einer und tatsächlich
nur einer Untereinheit im Polyamid entspricht) enthaltenden Peptid
gepaart ist. Zu weiteren bevorzugten Aminosäuren, d.h. solchen, die keinen
Seitenkettenschutz benötigen,
gehören,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, Isoleucin, Valin, Cyclohexyl-L-alanin, Norleucin, Norvalin,
Prolin und dergleichen. Weniger bevorzugt sind Asparagin und Glutamin.
In einer weiteren Ausführungsform
kann jede der 20 natürlichen
Aminosäuren
für eine
spezifische Untereinheit codieren. Eine einzige codierende Sequenzuntereinheit
bzw. ein einziges Codon kann dabei für mehr als eine Untereinheit
der synthetischen Testverbindung codieren, wodurch sich ein degenerierter
Code ergibt, obwohl dies nicht notwendig ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt verschiedene Strategien bereit, um
die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass
in Screening-Tests eine aktive synthetische Testverbindung statt
der codierenden Moleküle
auf einem gegebenen Träger
erkannt wird, was im Abschnitt 5.3 unten erörtert wird.
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5.2 VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG EINER BIBLIOTHEK
SYNTHETISCHER TESTVERBINDUNGEN
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Wie
oben angegeben, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Erzeugung einer Bibliothek synthetischer Testverbindungen an
Trägern
in separater Phase. Vorzugsweise handelt es sich bei der Bibliothek
um eine, bei der jede synthetische Testverbindung mit einem einmaligen
codierenden Molekül,
z.B. einem Peptid, dessen Sequenz für die Struktur der am gleichen
Träger
gebundenen synthetischen Testverbindung codiert und leicht mit traditionellen
Analysetechniken, z.B. Edman-Abbau, bestimmt werden kann, gepaart
ist.
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Falls
es sich bei der synthetischen Testverbindung um funktionalisierte
molekulare Gerüste
handelt, so wird das Gerüst
oder eine Vorstufe zu dem Gerüst
vor dem Beginn der Synthese an den Festphasenträger gebunden.
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Die
Synthese von Bibliotheken synthetischer Testverbindungen umfasst
die Wiederholung der folgenden Schritte:
- (i)
Teilen des ausgewählten
Trägers
in eine Anzahl von Anteilen, die mindestens gleich der Anzahl an
zu verknüpfenden
unterschiedlichen Untereinheiten ist;
- (ii) Chemische Verknüpfung
einer und nur einer der Untereinheiten der synthetischen Testverbindung
mit einem und nur einem der Anteile des festen Trägers aus
Schritt (i), wobei vorzugsweise sichergestellt wird, dass. die die
chemische Verknüpfung
bildende Reaktion so vollständig
wie möglich
durchgeführt
wird;
- (iii) Gründliches
Mischen der Festträgeranteile,
die die wachsende synthetische Testverbindung enthalten;
- (iv) Wiederholung der Schritte (i) bis (iii), und zwar so viele
Male wie die Anzahl an Untereinheiten in jeder der synthetischen
Testverbindungen der gewünschten
Bibliothek, womit die synthetische Testverbindung wächst;
- (v) Abtrennen eventuell vorhandener Schutzgruppen, die während des
Zusammenbaus der synthetischen Testverbindung am festen Träger verwendet
wurden.
-
Vorzugsweise
wird ein codierendes Molekül
parallel mit der synthetischen Testverbindung synthetisiert. In
diesem Fall wird bzw. werden vor oder nach Verknüpfung der Untereinheit der
synthetischen Testverbindung mit dem Träger in Schritt (ii) eine Untereinheit
bzw. mehrere Untereinheiten des codierenden Moleküls, die
der hinzugefügten
Untereinheit der synthetischen Testverbindung entspricht bzw. entsprechen,
mit dem wachsenden codierenden Molekül so verknüpft, dass ein einmaliger Strukturcode
(siehe Abschnitt 5.1 oben), der der Struktur der wachsenden synthetischen
Testverbindung entspricht, auf jedem Träger erzeugt wird. Dabei ist
leicht ersichtlich, dass bei der Herstellung einer codierten Bibliothek
die Synthese der codierenden Untereinheit bzw. codierenden Untereinheiten
dem Mischungsschritt (iii) vorangehen muss.
-
Die
Wiederholung der Schritte (i)-(iii) (siehe Schritt (iv)) führt natürlicherweise
zum Wachstum der synthetischen Testverbindung und, falls das Verfahren
modifiziert wird, um die Synthese eines codierenden Moleküls mit einzubeziehen,
des codierenden Moleküls
parallel mit der Testverbindung. Dabei werden die Begriffe Testarm
und codierender Arm hier zur Bezeichnung der am Träger synthetisierten
synthetischen Testverbindung bzw. falls vorhanden, des am Träger synthetisierten
codierenden Moleküls
verwendet.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst die Veränderung aller Schritte der
obigen Verfahrensweise. So erhält
man beispielsweise eine andere, und gelegentlich wünschenswerte,
Bibliothek, falls Schritt (ii) so abgeändert wird, dass darin die
gleiche Polymeruntereinheit mit allen Anteilen des festen Trägers verknüpft wird.
In diesem Fall muss die Verlängerung
des codierenden Polymers in analoger Weise modifiziert werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
braucht, falls das gleiche Polymer am Testarm wie am codierenden Arm
verlängert
wird, der codierende Arm nicht über
den Punkt, der für
die Codierung einer nicht sequenzierbaren Untereinheit der synthetischen
Testverbindung benötigt
wird, hinaus verlängert
zu werden, solange die Geschichte der Synthese, z.B. die Anzahl
an Untereinheiten, bekannt ist.
-
In
einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird der zur Durchführung
der Synthese einer synthetischen Testverbindung, bei der es sich
um ein kurzes Polymer handelt, verwendete feste Träger mit
einer oder mehreren der Untereinheiten des Polymers vor seiner Verwendung
bei der Synthese einer Bibliothek derivatisiert.
-
In
einer Ausführungsform
werden genügend
Trägerpartikel
verwendet, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass alle
möglichen
Strukturen der synthetischen Testverbindung in der Bibliothek vorhanden sind.
Eine solche Bibliothek wird als „vollständige" Bibliothek bezeichnet. Zur Gewährleistung
einer hohen Wahrscheinlichkeit einer Repräsentation aller Strukturen
ist die Verwendung einer Reihe von Trägern im Überschuss, z.B. im fünffachen,
zwanzigfachen usw. Überschuss,
gemäß der Statistik,
wie beispielsweise der Poisson-Statistik, der Anzahl möglicher
Spezies von Verbindungen erforderlich. In einer weiteren Ausführungsform ist
vor allem dann, wenn die Anzahl möglicher Strukturen die Anzahl
an Trägern übersteigt,
nicht jede mögliche Struktur
in der Bibliothek repräsentiert.
Derartige „unvollständige" Bibliotheken sind
ebenso von sehr großem Nutzen.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
kann eine Bibliothek eine synthetische Testverbindung aufweisen, zu
deren Strukturen eine wünschenswerte,
als Ergebnis des Absuchens einer anderen vor Erzeugung der Bibliothek
oder am Ende der Erzeugung der Bibliothek hinzugefügten Bibliothek
gefundene polymere Sequenz gehört.
Eine solche Bibliothek wird hergestellt, indem man einen die wünschenswerte
polymere Sequenz enthaltenden festen Träger synthetisiert und diesen
derivatisierten Träger
als festen Träger
für die
Synthese der neuen Bibliothek verwendet. Als Alternative kann ein
Teil der Bibliothek der synthetischen Testverbindung synthetisiert
werden, woran sich die Synthese der wünschenswerten Polymersequenz
als Erweiterung der Testverbindungen auf allen Trägern in
separater Phase folgt. Als Alternative kann die wünschenswerte
Sequenz diskontinuierlich und in der Zufallsbibliothek enthalten
sein.
-
5.3 ENTWICKLUNG UND VERWENDUNG VON SYNTHESETRÄGERN IN
SEPARATER PHASE UND LINKERN BEI SYNTHESEN CODIERTER MOLEKULARER
BIBLIOTHEKEN
-
5.3.1 BEI DER SYNTHESE EINER CODIERTEN
MOLEKULAREN BIBLIOTHEK GEEIGNETE TRÄGER UND LINKER
-
Ein
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneter Träger in separater
Phase ist durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet: (1)
Unlöslichkeit
in flüssigen
Phasen, die zur Synthese oder zur Suche verwendet werden; (2) Fähigkeit
zur Mobilität
in drei Dimensionen, unabhängig
von allen anderen Trägern; (3)
Vorliegen vieler Kopien jeder einzelnen synthetischen Testverbindung
und, falls vorhanden, der am Träger gebundenen
codierenden Sequenz; (4) Kompatibilität mit Suchtestbedingungen;
und (5) Inertheit gegenüber den
Reaktionsbedingungen für
die Synthese einer Testverbindung und die Synthese des codierenden
Moleküls.
Ein bevorzugter Träger
weist ebenso reaktive funktionelle Gruppen, wie beispielsweise Hydroxyl-,
Carboxyl-, Amino-, Thiolgruppen usw. zur Anbindung einer Untereinheit
auf, die eine Vorstufe zu jeder der synthetischen Testverbindung
und codierenden Moleküle
darstellt, oder zur Anbindung eines Linkers, der eine oder mehrere
reaktive Gruppen zur Anbindung des Monomers oder einer anderen Untereinheitsvorstufe
enthält.
-
Der
Träger
in separater Phase, wie er hier verwendet wird, ist nicht auf einen
bestimmten Typ von Träger
beschränkt.
Vielmehr stehen zahlreiche Träger
zur Verfügung,
die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. In einem bevorzugten
Aspekt handelt es sich bei dem Träger in separater Phase um einen
Festphasenträger,
obwohl die vorliegende Erfindung die Verwendung halbfester Stoffe,
wie beispielsweise Aerogele und Hydrogele, umfasst. Zu Festphasenträgern gehören Kieselgele,
Harze, derivatisierte Plastikfolien, Glaskügelchen, Baumwolle, Plastikkügelchen,
Aluminiumoxidgele, Polysaccharide, wie beispielsweise Sepharose
und dergleichen, usw. Ein geeigneter Festphasenträger kann
auf der Grundlage der gewünschten
Endverwendung und der Eignung für
verschiedene Synthesevorschriften ausgewählt werden. So können beispielsweise
bei der Polyamidsynthese als Festphasenträger Harze, wie beispielsweise
Polystyrol (z.B. PAM-Harz, bezogen von Bachem Inc., Peninsula Laboratories,
usw.), POLYHIPE®-Harz
(bezogen von Aminotech, Kanada), Polyamidharz (bezogen von Peninsula
Laboratories), Polystyrolharz mit aufgepfropftem Polyethylenglykol
(TentaGel®,
Rapp Polymer, Tubingen, Deutschland) oder Polydimethyl-Acrylamidharz
(bezogen von Milligen/Biosearch, Kalifornien) geeignet sein. In einer
bevorzugten Ausführungsform
für Peptid-
und andere Polyamidsynthesen ist als Festphasenträger Polydimethyl-Acrylamidharz
bevorzugt. Bevorzugte Festphasensyntheseträger für spezifische Synthesen sind
nachfolgend beschrieben. So lässt
sich beispielsweise in einem spezifischen Ausführungsmodell, siehe unten,
ein Träger,
wie er etwa in der Merrifield-Peptidsynthese
verwendet wird, nacheinander mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure, die über nachfolgende
Synthesezyklen unter Erhalt des „synthetische Testverbindung"-Polyamids verlängert wird,
und einer Ddz- oder Boc-geschützten
Aminosäure,
die unter Erhalt des codierenden Peptids verlängert wird, derivatisieren.
Andere hintereinander erfolgende Derivatisierungen sind nachfolgend
beschrieben. Somit wird jedes Harzkügelchen so funktionalisiert, dass
es sowohl die synthetische Testverbindung als auch die entsprechenden
codierenden Strukturen enthält, wobei
deren relative Mengen von den Reaktionsbedingungen zur Anbindung
der ersten Fmoc- bzw. Ddz- (oder Boc-) geschützten Aminosäuren abhängt. In
einer Variation dieses Ansatzes werden die synthetische Testverbindung
und codierenden Moleküle über Linker,
wie beispielsweise den unten beschriebenen, an den festen Träger gebunden.
-
Die
erfindungsgemäßen Träger können auch
Linker oder eine Anordnung von Linkern umfassen. Dabei bezieht sich
ein Linker, wie er hier verwendet wird, auf ein beliebiges Molekül, das eine
Kette von Atomen, z.B. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff usw.,
enthält
und zur Verknüpfung
der am Träger
zu synthetisierenden Moleküle
mit dem Träger
dient. Der Linker wird an den Träger üblicherweise über eine
kovalente Bindung gebunden, und zwar vor Beginn der Synthese am
Träger,
und stellt eine oder mehrere Stellen für die Anbindung von Vorstufen
der am Träger
zu synthetisierenden Moleküle
bereit. Zur Bindung der Vorstufen von zu synthetisierenden Molekülen an den
Festphasenträger lassen
sich verschiedene Linker einsetzen. Zu Linkern gehören beispielsweise
Aminobuttersäure,
Aminocapronsäure,
7-Aminoheptansäure,
8-Aminocaprylsäure, Lysin, Iminodiessigsäure, Polyoxyethylen,
Glutaminsäure
usw. In einer weiteren Ausführungsform
können
Linker zusätzlich
ein oder mehrere β-Alanine
oder andere Aminosäuren
als „Spacer" [Abstandhalter]
umfassen.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
wird der „Safety-Catchamidlinker" (SCAL) (siehe Patek,
M. und Lebl, M. 1991, Tetrahedron Letters 32:3891-3894; Internationale
Patentveröffentlichung
WO 92/18144 , veröffentlicht
am 29. Oktober 1992) am Träger
eingeführt.
-
Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Linkern können
selektiv spaltbare Linker eingesetzt werden, vorzugsweise zur Anbindung
des synthetischen Testverbindungsmoleküls. Ein Beispiel ist der von
Barany und Albericio (1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942) beschriebene
gegenüber
ultraviolettem Licht empfindliche Linker ONb. Weitere Beispiele
für photospaltbare
Linker finden sich bei Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer
et al. (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45) und Kreib-Cordonier
et al. (1990, in „Peptides – Chemistry,
Structure and Biology",
Rivier und Marschall, Hrsg., S. 895-897). Von Landen (1977, Methods
Enzym. 47:145-149) wurde wässrige
Ameisensäure
zur Spaltung von Asp-Pro-Bindungen verwendet; dieser Ansatz wurde
zur Charakterisierung von T-Zelldeterminanten in Verbindung mit
dem „Pin"-Syntheseverfahren nach Geysen verwendet
(Van der Zee et al., 1989, Eur. J. Immunol. 191:43-47). Zu weiteren
potenziellen Linkern, die unter basischen Bedingungen spaltbar sind,
gehören
solche, die auf p-(Hydroxymethyl)benzoesäure (Atherton
et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I:538-546) und Hydroxyessigsäure (Baleaux
et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28) beruhen. Von
Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33; Internationale Veröffentlichung
WO 90/09395 , veröffentlicht
am 23. August 1990) wird die Peptidspaltung über einen Diketopiperazinmechanismus
beschrieben. Bevorzugte Diketopiperazinverknüpfungen sind in der
US-Patentanmeldung mit der Seriennr.
07/919,454 , eingereicht am 24. Juli 1992, offenbart, die
hiermit durch Bezugnahme voll inhaltlich aufgenommen wird. Ebenso
können
enzymspaltbare Linker geeignet sein. Dabei kann ein Enzym einen
Linker, der eine von dem Enzym erkannte Sequenz umfasst, spezifisch
spalten. Somit können
geeignete Peptidsequenzen enthaltende Linker von einer Protease
und geeignete Nukleotidsequenzen enthaltende Linker von einer Endonuklease
gespalten werden. In bestimmten Fällen kann man einen Teil (z.B.
10-90%) der verfügbaren
funktionellen Harzgruppen mit einem spaltbaren Linker unter Verwendung
bestimmter Reaktionsbedingungen sowie die restlichen funktionellen
Harzgruppen mit einem Linker, der gegenüber den Spaltungsbedingungen
stabil ist, derivatisieren, so dass sichergestellt wird, dass nach
der Abspaltung genügend
Material auf dem Harz für
weitere Untersuchungen verbleibt. Diese Anordnung ist insbesondere
dann bevorzugt, wenn kein codierendes Molekül vorhanden ist. Kombinationen
von unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen spaltbaren Linkern
können
ebenso verwendet werden, um die selektive Abspaltung von Molekülen von
einem einzigen Festträgerkügelchen
zu gestatten.
-
Vorzugsweise
lässt sich
ein spaltbarer Linker zur Freisetzung der synthetischen Testverbindungen oder
eines Teils davon, zum Testen in einem Suchtest verwenden. In diesem
Fall wird die codierende Sequenz, falls vorhanden, über einen
nicht spaltbaren Linker an den Festphasenträger gebunden.
-
Ein
Ansatz zur Synthese codierter Bibliotheken beinhaltet die Verknüpfung der
Vorstufen der synthetischen Testverbindung und der codierenden Moleküle der Bibliothek
zusammen über
einen verzweigten Linker, der auch zur Verknüpfung beider Vorstufen mit
dem festen Träger
dient. Je nach der Struktur des Linkers kann eines der beiden Moleküle oder
können
beide Moleküle
vom festen Träger
zur weiteren Untersuchung abgelöst
werden. Ein Beispiel für
diesen Ansatz der Verankerung der synthetischen Testverbindung und
der codierenden Moleküle
besteht in der Verwendung von Lys(SCAL)-derivatisiertem TentaGel.
-
Ferner
kann ein Festphasenträger-Linker
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ein Molekül von Interesse
umfassen, das unter Erhalt einer molekularen Bibliothek weiter derivatisiert
werden kann. Das vorgebundene Molekül kann gemäß den hier beschriebenen Verfahren
ausgewählt
werden oder kann eine Struktur umfassen, von der man weiß, dass
sie die gewünschten
Eigenschaften verkörpert.
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung eines Arrays von Linkern,
die in einer von vielen Anordnungen am festen Träger gebunden sind. So kann
beispielsweise eine Lysincarboxylgruppe mit einem SCAL-Linker verknüpft werden,
der mit dem Festphasenträger
verknüpft
ist, womit ein mit einem Lysin-SCAL-Linker funktionalisierter Träger produziert
wird. In einer anderen Ausführungsform
lässt sich
ein Lysin mit dem Festphasenträger über einen
Polyethylenglykol-Linker verknüpfen.
Ein SCAL-Linker an einem festen Träger lässt sich auch mit einer Aminogruppe
eines Diamin-Linkers
verknüpfen,
während
die andere Aminogruppe direkt zur weiteren Kupplung verwendet werden
kann. In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein spaltbarer
Linker an eine der Aminogruppen eines mit einem Träger verknüpften Lysins
gebunden werden, während
die andere Aminogruppe ohne weitere Modifikation verwendet wird.
Spezifische Kupplungen an die einzelnen Aminogruppen eines Lysin-Linkers
lassen sich jeweils durch Verwendung orthogonaler Schutzgruppen
bewerkstelligen.
-
In
einer spezifischen Ausführungsform,
siehe unten, kann ein mit TentaGel verknüpfter SCAL mit Lysin acyliert
werden, dessen Aminogruppen mit Fmoc und Boc geschützt sind;
als Ergebnis erhält
man als Träger TentaGel
mit dem Linker Boc-Lys(Fmoc)-SCAL, der nacheinander entschützt werden
kann, so dass zwei einmalige Aminogruppen bereitgestellt werden,
die beispielsweise nach Acylierungen mit zwei unterschiedlichen Sätzen von
Aminosäuren
zu Ankern für
zwei Polyamide werden können.
Die Acylierung einer der Aminogruppen der Lysingruppierung des Linkers
mit Boc-Lys (Fmoc)
ergibt einen neuen Linker mit insgesamt drei potenziellen Aminoankern
(bei nacheinander erfolgter Entschützung), wobei die Acylierung
beider Aminogruppen des Linker-Lysins durch Boc-Lys (Fmoc) einen
neuen Linker mit insgesamt vier potenziellen Aminoankern bereitstellt.
-
5.3.2 TOPOLOGIE DER VERANKERUNG SYNTHETISCHER
TESTVERBINDUNGEN UND CODIERENDER MOLEKÜLE AUF OBERFLÄCHEN FESTER
TRÄGER
-
Verschiedene
Ansätze
zur topologischen Trennung der synthetischen Testverbindung und
der codierenden Moleküle
auf einem festen Träger
zur Erzeugung von Bibliotheken werden in Betracht gezogen.
-
Die
topologische Trennung der synthetischen Testverbindung und des codierenden
Moleküls
bezieht sich auf die räumliche
Trennung für
einen Träger.
So kann beispielsweise, falls es sich bei dem Träger um ein Harzkügelchen
handelt, die Trennung einer signifikanten Anzahl der Ligandenkandidatenmoleküle von einer signifikanten
Anzahl der codierenden Moleküle
zwischen der Oberfläche
und dem Inneren des Harzkügelchens
erfolgen. Vorzugsweise enthält
die Oberfläche
des Trägers
in erster Linie synthetische Testverbindungsmoleküle und nur
sehr wenige codierende Moleküle.
Besonders bevorzugt enthält
die Oberfläche
des Trägers mehr
als 90% synthetische Testverbindung. Noch stärker bevorzugt enthält die Oberfläche des
Trägers
mehr als 99% synthetische Testverbindungsmoleküle; am stärksten bevorzugt enthält sie mehr
als 99,9% synthetische Testverbindung. Der Vorteil einer solchen
Anordnung besteht darin, dass dadurch die Störung des codierenden Moleküls in einem
Bindungssuchtest (siehe Abschnitt 5.6, unten) in Grenzen gehalten
wird. Dabei ist es nicht notwendig, dass die topologische Fläche, die
die codierende Sequenz enthält,
d.h. das Innere eines Harzkügelchens,
frei von der synthetischen Testverbindung ist.
-
Im
oben genannten Beispiel wird das codierende Molekül im Inneren
des Trägerpartikels
segregiert. Ebenso wird in Betracht gezogen, dass das codierende
Molekül
zur Oberfläche
eines Trägerpartikels
oder zu einer Seite eines Trägerpartikels
segregiert werden kann.
-
Ein
allgemeiner Ansatz zur topologischen Trennung der synthetischen
Testverbindung von codierenden Molekülen beinhaltet die selektive
Derivatisierung reaktiver Stellen auf dem Träger, die auf der unterschiedlichen
Zugänglichkeit
der Kupplungsstellen für
Reagenzien und Lösungsmittel
beruht. So stellen beispielsweise das Innere des Kügelchens,
z.B. verschiedene Kanäle
und andere Höhlungen,
Bereiche mit geringer Zugänglichkeit
in einem Harzkügelchen
dar. Die Oberfläche
eines Harzkügelchens,
die mit den Molekülen
der Lösung,
in der das Kügelchen
suspendiert ist, in Kontakt steht, stellt einen Bereich mit relativ
hoher Zugänglichkeit
dar. Verfahren zur Realisierung der selektiven Verknüpfung von
Vorstufen codierender Moleküle
und synthetischer Testverbindungen mit einem geeigneten Festphasenträger umfassen,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, das Folgende.
- (i) Selektive Derivatisierung
von Oberflächen
fester Träger über kontrollierte
Photolyse: zwei Ansätze
können
verwendet werden. Bei einem wird ein funktionalisierter fester Träger mit
einer photospaltbaren Schutzgruppe, z.B. Nitroveratryloxycarbonyl
(Nvoc) geschützt
(Patchornik et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92:6333). Die Nvoc-derivatisierten Trägerpartikel
werden in einer Monolager-Formation auf einer geeigneten Oberfläche angeordnet.
Der Monolager wird unter Verwendung von Licht kontrollierter Intensität so photolysiert,
dass es sich bei der Zone des Kügelchens,
das am wahrscheinlichsten durch Licht entschützt wird, um denjenigen Bereich
des Kügelchens
handelt, der am stärksten
mit dem Licht in direktem Kontakt steht, d.h. die äußere Oberfläche des
Kügelchens.
Die erhaltenen teilentschützten
Kügelchen
werden gründlich gewaschen
und mit einer Vorstufe der synthetischen Testverbindung, die eine
lichtstabile Schutzgruppe enthält,
reagiert. Beispielsweise könnte
es sich im Fall der Synthese einer codierten Bibliothek von Polyamiden
bei dieser Vorstufe um eine Boc-geschützte Aminosäure handeln, die über weitere
Synthesezyklen zur synthetischen Polyamidtestverbindung umgewandelt
wird. Nach der Reaktion mit der Vorstufe der synthetischen Testverbindung
werden die Kügelchen
einer quantitativen Photolyse unterzogen, um die verbliebenen lichtempfindlichen
Schutzgruppen zu entfernen, womit funktionelle Gruppen in weniger
lichtzugänglichen
Umgebungen, z.B. im Inneren eines Harzkügelchens, freigelegt werden.
Nach dieser quantitativen Photolyse werden die Trägerpartikel
weiter mit einer orthogonal-geschützten Vorstufe
des codierenden Moleküls,
z.B. Fmoc-geschützter
Aminosäure,
derivatisiert. Das erhaltene Festträgerkügelchen enthält schließlich vorwiegend
auf der äußeren Oberfläche segregierte
synthetische Testverbindungen sowie im Inneren des Festphasenträgerkügelchens
lokalisierte codierende Moleküle.
Eine
alternative Photolysetechnik zur Segregierung codierender Moleküle und synthetischer
Testverbindungsmoleküle
auf einem Träger
beinhaltet die Derivatisierung des Trägers mit einem verzweigten
Linker, dessen einer Zweig photospaltbar ist, und die Bindung der
Vorstufe des codierenden Moleküls
an dem photoempfindlichen Zweig des Linkers. Nach Beendigung der
Synthese werden die Trägerkügelchen
in einer Monolayerformation angeordnet und wie oben beschrieben
photolysiert. Durch diese Photolyse werden Kügelchen bereitgestellt, die
Flecken mit synthetischen Testverbindungsmolekülen für die selektive Suche mit minimaler
Störung
durch die codierenden Moleküle
enthalten.
- (ii) Selektive Derivatisierung von Oberflächen fester Träger unter
Verwendung chemischer oder biochemischer Ansätze. Die Wirksamkeit dieser
chemischen und biochemischen Derivatisierungen hängt von der Fähigkeit
der exponierten funktionellen Gruppen auf der äußeren Oberfläche ab,
schneller als andere, im Inneren liegende Gruppen, die nicht exponiert
sind, zu reagieren. Beispielsweise konnte man beobachten, dass Antikörper nicht
an Peptidliganden im Inneren eines Festphasenträgerharzes binden können. Daher können unter
Verwendung von durch die Struktur des Trägers oder durch Modulation
des Aufquellens eines Kügelchens über die
Wahl des Reaktionslösungsmittels
aufgezwungenen Unterschieden in der sterischen Hinderung reaktive
Gruppen auf der Außenseite
des Kügelchens,
die für
Makromoleküle
oder bestimmte Reagenzien zugänglich
sind, selektiv in Bezug auf reaktive Gruppen im Inneren des Kügelchens
umgesetzt werden. Daher lassen sich die auf der Außenseite
des Kügelchens
liegenden reaktiven Gruppen für
die Synthese der synthetischen Testverbindung modifizieren, während innen
liegende reaktive Gruppen für
die Verlängerung
der codierenden Moleküle
oder sowohl der codierenden Moleküle als auch der synthetischen Testverbindung modifiziert
werden können.
Da die Anzahl reaktiver Gruppen im Inneren eines Harzkügelchens
wesentlich größer ist
als die Anzahl von Gruppen auf der äußeren Oberfläche, ist
die tatsächliche Anzahl
codierender Moleküle
sehr groß,
wodurch genügend
codierende Moleküle
für eine
genaue Sequenzanalyse und somit die Entschlüsselung der Struktur der synthetischen
Testverbindung bereitgestellt werden. Dabei werden verschiedene
chemische und biochemische Ansätze,
einschließlich
der folgenden, in Betracht gezogen:
- (a)Verwendung polymerer Entschützungsagenzien zur selektiven
Entschützung
von Teilen der Außenseite eines
geschützte
funktionelle Gruppen tragenden Festträgerkügelchens. Dabei werden die
entschützten funktionellen
Gruppen als Anker für
die synthetische Testverbindung verwendet. Die noch geschützten funktionellen
Gruppen werden anschließend
unter Verwendung eines nicht polymeren Entschützungsagenz entschützt und
als Anker für
die Anbindung der codierenden Moleküle verwendet. In einer spezifischen
Ausführungsform
beinhaltet dieses Verfahren die Verwendung von Enzymen zur selektiven
Aktivierung von auf der Außenseite
der Kügelchen
liegenden Gruppen, die mit einem geeigneten Enzymsubstrat derivatisiert
wurden. Aufgrund ihrer Größe sind
Enzyme vom Inneren des Kügelchens
ausgeschlossen. In einem Beispiel, siehe unten, wird ein Substrat
durch ein Enzym vollständig
von der Oberfläche
eines Harzkügelchens
entfernt, ohne dass dabei die Gesamtmenge an am Kügelchen,
d.h. der Innenseite des Kügelchens,
gebundenem Substrat in signifikanter Weise betroffen ist. Durch
die Abtrennung von Substrat wird eine reaktive Stelle auf dem Kügelchen
freigelegt und somit aktiviert. Die enzymmodifizierten Gruppen des festen
Trägers
werden zur Verankerung der synthetischen Testverbindung verwendet,
wobei diejenigen Gruppen, die keine Modifikation durchliefen, zur
Verankerung der Mehrzahl der codierenden Moleküle verwendet werden.
- (b)Verwendung einer polymeren Schutzgruppe zur selektiven Blockierung
exponierter ungeschützter
funktioneller Gruppen auf der Außenseite eines Trägerkügelchens.
Die ungeschützten
funktionellen Gruppen im Inneren des Trägers werden zur Verankerung
des codierenden Moleküls
verwendet. Die verbliebenen geschützten funktionellen Gruppen
werden dann entschützt
und als Anker für
die synthetische Testverbindung der Bibliothek verwendet. In einem
besonderen Beispiel, siehe unten, werden zugängliche funktionelle Gruppen
auf der Oberfläche
durch das Polymer Polyglutaminsäure
mit einem Molekulargewicht (MW) von 30 kD vollständig blockiert, ohne dass davon
die Gesamtmenge an am Kügelchen
gebundenem Peptid betroffen ist. Falls das zur Blockierung verwendete
Polymer über
seine α-Carboxylgruppe gebunden
ist, so kann durch einen nach Entschützung der x-Aminogruppe des
Polymers in einem einzigen Schritt durchgeführten Edman-Abbau eine Regeneration
der Oberflächenaminogruppen
erfolgen.
- (c)Erzeugung eines anderen Zustands im Innern des Kügelchens,
beispielsweise durch Gefrieren von Wasser im Inneren der Kügelchen
und anschließende
Umsetzung der Kügelchen
in einem organischen Lösungsmittel
bei geringer Temperatur, um das Wasser im gefrorenen Zustand zu
halten. Somit kann eine spezifische Reaktion auf der Oberfläche des
Kügelchens,
jedoch nicht in dessen Innern, erfolgen.
-
5.4 STRATEGIE ZUR DURCHFÜHRUNG SICH
ABWECHSELNDER SYNTHESEN DER CODIERENDEN MOLEKÜLE BZW. DER SYNTHETISCHEN TESTVERBINDUNGSMOLEKÜLE WÄHREND DER
ERZEUGUNG CODIERTER BIBLIOTHEKEN
-
Eine
wichtige Synthesearbeit während
der Synthese einer codierten Bibliothek beinhaltet die Verwendung
orthogonaler Schutzgruppen. Zur effizienten Synthese der codierenden
Moleküle
parallel zur Synthese der synthetischen Testverbindung der Bibliothek
auf dem gleichen Festträgerpartikel
müssen
die für
die Synthesen verwendeten Schutzgruppen jeweils orthogonal sein,
d.h. während
aller Synthesearbeiten an einem Molekül müssen die Schutzgruppen am anderen
Molekül
intakt bleiben.
-
Es
lassen sich mehrere orthogonale Kombinationen von Schutzgruppen
für die
Konstruktion der synthetischen Testverbindung und der codierenden
Moleküle
einer molekularen Bibliothek verwenden. Geeignete Schutzgruppen
sind bei Geiger und Konig, 1981, „The Peptides" (Gross und Meinhofer,
Hrsg.) S. 3-101, Academic Press: New York) beschrieben. Eine besonders
geeignete Kombination beinhaltet durch Base und Säure abspaltbare
Schutzgruppen. So können
beispielsweise bei der Synthese einer codierten Bibliothek von Polyamiden
die basenempfindliche Schutzgruppe Nα-[(9-Fluorenylmethyl)oxy]carbonyl
(Fmoc) zum Zusammenbau der synthetischen Testverbindungsmoleküle und die
säurelabile
Schutzgruppe Nα-[[2-(3,5-Dimethoxyphenyl)prop-2-yl]oxy]carbonyl
(Ddz) zum Zusammenbau der codierenden Peptidmoleküle verwendet
werden. Fmoc-Schutzgruppen und ihre Verwendung in der Peptidsynthese
sind bei Carpino und Han (1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409) und
Ddz-Schutzgruppen bei Voss und Birr (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.
1981, 362, 717-725)
beschrieben. Beide Arten von Schutzgruppen wurden traditionell zur
Blockierung der α-Aminogruppen
von α-Aminosäuren während der
Peptidsynthese eingesetzt; es können
jedoch auch andere geeignete Aminogruppen von diesen Gruppen während der
Synthese eines Polyamids geschützt
werden. Falls die Polyamide von Interesse Seitenketten mit reaktiven
funktionellen Gruppen enthalten, kann ein Schutz der reaktiven Gruppen
in Form von t-Butoxycarbonyl- (Boc) und t-Butyl (t-Bu)-Derivaten oder vorzugsweise
in Form der säurestabileren
Benzyl- und Benzyloxycarbonylderivate sinnvoll sein. Falls die reaktiven
Seitenkettengruppen unter Verwendung von Gruppen des t-Butyl-Typs
geschützt
werden, so kann das codierende Peptid unter Verwendung einer Schutzgruppe,
die säurelabiler
als Ddz ist, wie z.B. Nps (Zervas et al., 1963, J. Am. Chem. Soc.
85:3660) oder Trt (Zervas et al., 1956, J. Am. Chem. Soc. 78:1359),
synthetisiert werden.
-
Eine
alternative Kombination von orthogonalen Schutzgruppen bei der Synthese
einer codierten Bibliothek von Polyamiden beinhaltet die Verwendung
von Fmoc oder anderen basenlabilen Gruppen zum Zusammenbau der codierenden
Peptide, sowie Ddz oder anderer säurelabiler Gruppen zum Zusammenbau
der Ligandenbindungskandidaten.
-
Eine
alternative orthogonale Kombination von Schutzgruppen zur abwechselnden
und parallelen Synthese codierender Moleküle und der synthetischen Testverbindung
beinhaltet Trichlorethoxycarbonyl als Aminoschutzgruppe sowie Trichlorethyl
als Hydroxylschutzgruppe, die sich unter Verwendung eines Reduktionsmittels,
wie z.B. Zink in Essigsäure,
abtrennen lassen, zur Synthese von z.B. Polyestern in einer codierten
Bibliothek von Polyestern, sowie Boc und t-Bu oder eine andere säurespaltbare
Gruppe zur Synthese der codierenden Peptide. Wie zuvor können die
beiden Sätze
orthogonaler Schutzgruppen gegeneinander austauschbar sein, d.h.
Nα-Trichlorethoxycarbonyl-geschützte Aminosäuren werden
zur Herstellung der codierenden Peptide und Nα-Boc-geschützte Monomere
zur Herstellung der synthetischen Testverbindungspolyamide verwendet.
-
Eine
weitere geeignete Kombination orthogonaler Schutzgruppen beinhaltet
die Trimethylsilylethoxycarbonylgruppe, die mit Fluoridionen abgetrennt
werden kann, sowie eine hoch säureempfindliche
Schutzgruppe, wie z.B. Ddz oder Bpoc (2-Biphenyl-2-propoxycarbonyl).
Beide Arten von Schutzgruppen lassen sich für den N-Schutz während des
Zusammenbaus entweder des Polyamids, in einer Synthese einer codierten
Polyamidbibliothek, oder des codierenden Peptids verwenden.
-
Für die Synthese
der peptidcodierenden Moleküle
in bevorzugten codierten Bibliotheken werden allgemein bekannte
Techniken der Festphasenpeptidsynthese, einschließlich geeigneter
Schutzgruppenstrategien, verwendet. Der relevante veröffentlichte
Stand der Technik der Peptidsynthese ist ziemlich umfangreich und
umfasst unter anderem Stewart und Young, 1984, „Solid Phase Synthesis" 2. Ausgabe, Pierce
Chemical Co., Rockford Il; Bodanszky, Y. Klausner, und M. Ondetti „Peptide
Synthesis" 2. Ausgabe,
Wiley, New York, 1976; E. Gross und J. Meienhofer (Herausgeber) „The Peptides", Bd. 1, fortlaufende
Reihe, Academic Press, New York, 1979.
-
5.5 SPEZIFISCHE BIBLIOTHEKEN VON TESTVERBINDUNGEN
SOWIE VERFAHREN ZU DEREN SYNTHESE
-
Spezifische
Arten von Verknüpfungen
für die
in Abschnitt 5 aufgeführten
Bibliotheken werden nachfolgend ebenso wie synthetische Reaktionen,
die zur Erzeugung dieser Bibliotheken verwendet werden können, d.h.
Reaktionen, die zur Durchführung
von Schritt (ii) der allgemeinen Vorschrift zur Erzeugung von Bibliotheken
(siehe Abschnitt 5.2) verwendet werden können, beschrieben. Wie dem
Durchschnittsfachmann aus der vorangegangenen Diskussion und dem
folgenden beispielhaften Material leicht ersichtlich ist, lässt sich
zur Herstellung der erfindungsgemäßen Bibliotheken jede der zahlreichen,
in der Synthesechemie bekannten Kondensationsreaktionen verwenden,
die mit entsprechenden Schutzgruppen schrittweise ablaufen kann.
Die Liste von Untereinheiten, die zur Herstellung solcher Bibliotheken
verwendet werden können,
ist enorm; viele geeignete Reagenzien sind kommerziell erhältlich oder
lassen sich mit allgemein bekannten Vorschriften synthetisieren.
Eine Teilliste von Strukturen geeigneter Untereinheiten ist in 5 dargestellt.
Beispiele für
Synthesereaktionen sind in den folgenden Unterabschnitten und dem
Schema beschrieben.
-
Bei
den hier abgegebenen Schemen steht Z für eine beliebige Alkyl-, Aryl-,
Heteroalkyl- oder Heteroarylgruppe mit einer oder mehreren Gruppen,
einschließlich,
ohne darauf beschränkt
zu sein, H, -NH2, -OH, CO2H,
-CO2R, -CONHR und dergleichen. Dabei bedeutet
Alkyl einen gesättigten
oder ungesättigten C1-C20-Kohlenwasserstoff.
Aryl bedeutet einen aromatischen C5-C20-Kohlenwasserstoff.
P mit einem Kreis bezieht sich auf einen Träger in separater Phase, z.B.
ein Harzkügelchen.
P (ohne Kreis) bezieht sich auf eine Schutzgruppe. Die restlichen
Symbole besitzen ihre übliche
Bedeutung.
-
Diese
Strategien lassen sich zur Herstellung codierter Bibliotheken durch
Verwendung geeigneter orthogonaler Schutzgruppen, wie oben beschrieben,
einsetzen.
-
5.5.1 AMIDBINDUNGEN ENTHALTENDE BIBLIOTHEKEN
MIT ANDEREN UNTEREINHEITEN ALS α-AMINOSÄUREN
-
Verschiedene
Bibliotheken mit einer oder mehreren Amidbindungen, einschließlich Bibliotheken
von Polyamiden, deren Strukturen andere Aminosäuren als α- Aminosäuren enthalten, werden in Betracht
gezogen. Schema 1 zeigt eine Synthesestrategie für Polyamide: Schema
1
-
Ein
geeigneter fester Träger,
wie beispielsweise einer der in Abschnitt 5.2 beschriebenen Träger, wird mit
einem Carbonsäureanhydrid
in einem geeigneten Lösungsmittel
unter Erhalt eines Carbonsäureamidträgers gekuppelt.
Das geträgerte
Säureamid
wird weiter durch Aktivierung der Carboxylgruppe unter Verwendung
einer Verbindung, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart
von Hydroxybenzotriazol (HOBt), mit anschließender Kondensation mit einem
eine geschützte
Aminogruppe enthaltenden Diamin verlängert, wobei die Entschützung des
Kondensationsprodukts ein Diamid-Amin am festen Träger ergibt.
Die Wiederholung dieses Synthesezyklus, d.h. nacheinander erfolgende
Umsetzung mit einem Anhydrid, Kondensation mit einem einzelnen geschützten Diamin
und Entschützung,
führt zu
einem wachsenden Polyamid am festen Träger. Falls die vervollständigte Polyamidsequenz
Schutzgruppen enthält,
so wird sie ohne Ablösung vom
festen Träger
entschützt.
-
Ein
alternativer Syntheseansatz für
Polyamide beinhaltet die Modifikation der obigen Synthese durch Austausch
des Anhydrids gegen eine teilweise geschützte Dicarbonsäure, z.B.
einen geeigneten Dicarbonsäurehalbester.
Das erhaltene Esteramidharz wird entschützt und mit z.B. DCC/HOBt vor
der Kondensation mit dem Diamin aktiviert.
-
Zur
Synthese von synthetischen Testverbindungspolyamiden, deren Strukturen α-Aminosäuren enthalten,
wie z.B. Peptide und Peptidmimetika, können die bereits beschriebenen
Peptidsynthesetechniken verwendet werden.
-
In
einer Ausführungsform
kann als N-terminaler Rest der synthetischen Testpolyamide der Bibliothek Pyroglutamat
einbezogen werden.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
werden zum Einbau in eine synthetische Testpolyamidsequenz Untereinheiten gewählt, die
nützliche
chemische und strukturelle Eigenschaften verleihen. Insbesondere
sieht die vorliegende Erfindung die Herstellung von Bibliotheken
von Polyamiden vor, die besser definierte strukturelle Eigenschaften
als native Peptide aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform
kann eine Polyamidbibliothek erzeugt werden, die eine reduzierte
Peptidbindung enthält,
d.h. R1-CH2-NH-R2, worin R1 und R2 für
Aminosäurereste
oder -sequenzen stehen. Eine reduzierte Peptidbindung kann in Form
einer Dipeptiduntereinheit eingeführt werden. Ein solches Molekül wäre gegenüber Peptidbindungshydrolyse,
z.B. Proteaseaktivität,
resistent. Derartige Bibliotheken könnten Liganden mit einmaliger
Funktion und Aktivität
im Vergleich mit denen der entsprechenden nativen Peptide, wie beispielsweise
verlängerte
Halbwertzeiten in vivo aufgrund der Resistenz gegenüber metabolischem
Abbau oder Proteaseaktivität,
bereitstellen.
-
Ein
Polyamid mit erzwungener, cyclischer oder starrer Struktur kann
nach dem bereits beschriebenen Verfahren hergestellt werden, vorausgesetzt,
dass an wenigstens zwei Positionen in der Sequenz der gesamten synthetischen
Testverbindung Untereinheiten, z.B. Aminosäuren, eingefügt werden,
die zur Quervernetzung fähige
chemische funktionelle Gruppen bereitstellen, so dass nach Behandlung
zur Ausbildung einer Quervernetzung das Polyamid eine erzwungene
Struktur einnimmt, cyclisisert wird oder starr gemacht wird. Zu
zur Quervernetzung eines Peptids fähigen Aminosäuren gehören beispielsweise
Cystein zur Ausbildung von Disulfiden, Asparaginsäure zur
Ausbildung eines Lactons oder eines Lactams sowie ein Chelator,
wie z.B. γ-Carboxylglutaminsäure (Gla)
(im Handel z.B. von der Firma Bachem erhältlich) zur Chelatierung eines Übergangsmetalls
und Ausbildung einer Quervernetzung. Eine geschützte γ-Carboxylglutaminsäure kann
durch Abänderung
der von Zee-Cheng und Olson (1980, Biophys. Biochem. Res. Commun.
94:1128-1132) beschriebenen Synthese hergestellt werden. Eine Bibliothek,
in der die Polyamidsequenz wenigstens zwei zur Quervernetzung fähige Untereinheiten
umfasst, kann beispielsweise durch Oxidation von Cysteinresten unter
Ausbildung eines Disulfids oder Addition eines Metallions unter
Ausbildung eines Chelats behandelt werden, um das Peptid querzuvernetzen
und ein Peptid mit erzwungener, cyclischer oder starrer Struktur
zu bilden. Cyclische Motive sind ausführlich in der
US-Anmeldung mit der Seriennr. 07/717,454 ,
eingereicht am 19. Juni 1991, offenbart.
-
Einige
einfache Aminosäuren,
die sich als Untereinheiten für
den Einbau in eine Bibliothek verwenden lassen, umfassen die folgenden
Verbindungen:
-
Nichtklassische
Aminosäuren
können
bei der Synthese von Polyamiden verwendet werden. Die folgenden
nichtklassischen Aminosäuren
können
in eine Polyamidbibliothek eingebaut werden, um bestimmte Konformationsmotive
einzuführen:
1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carboxylat (Kazmierski et al., 1991,
J. Am. Chem. Soc., 113:2275-2283); (2S,3S)-Methylphenylalanin, (2S,3R)-Methyl-phenylalanin,
(2R,3S)-Methylphenylalanin und (2R,3R)-Methylphenylalanin (Kazmierski
und Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); 2-Aminotetrahydronaphthalin-2-carbonsäure (Landis,
1989, Ph.D. Thesis, University of Arizona); Hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-carboxylat
(Miyake et al., 1984, J. Takeda Res. Labs., 43:53-76); β-Carbolin
(D und L) (Kazmierski, 1988, Ph.D. Thesis, University of Arizona);
HIC (Histidin-isochinolincarbonsäure)
(Zechel et al., 1991, Int. J. Pep. Protein Res., 38:131-138).
-
Die
folgenden Aminosäureanaloge
und Peptidomimetika können
in die Bibliothek einer synthetischen Testverbindung eingebaut werden,
um spezifische Sekundärstrukturen
zu induzieren oder zu begünstigen: LL-Acp
(LL-3-Amino-2-propenidon-6-carbonsäure), ein eine β-Schleife
induzierendes Dipeptidanalog (Kemp et al., 1985, J. Org. Chem.,
50:5834-5838); β-Faltblatt
induzierende Analoge (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:5081-5082); β-Schleifen
induzierende Analoge (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:5057-5060); α-Helix induzierende
Analoge (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:4935-4938); γ-Schleife
induzierende Analoge (Kemp et al., 1989, J. Org. Chem., 54:109:115)
sowie Analoge, die von den folgenden Literaturstellen bereitgestellt
werden: Nagai und Sato, 1985, Tetrahedron Lett., 26:647-650; DiMaio
et al., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans., S. 1687; ebenso ein Gly-Ala-Schleife-Analog
(Kahn et al., 1989, Tetrahedron Lett., 30:2317); Amidbindungsisostere
(Jones et al., 1988, Tetrahedron Lett., 29:3853-3856); Tetrazol
(Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soc., 110:5875-5880); DTC (Samanen
et al., 1990, Int. J. Protein Pep. Res., 35:501-509) sowie bei Olson
et al., 1990, J. Am. Chem. Soc., 112:323-333 und Garvey et al.,
1990, J. Org. Chem., 56:436 gelehrte Analoge.
-
Die
vorliegende Erfindung sieht ferner die Modifikation oder Derivatisierung
von synthetischen Testverbindungspolyamiden in einer Bibliothek,
wie beispielsweise in der
US-Anmeldung
mit der Seriennr. 07/717,454 , eingerichtet am 19 Juni 1991,
beschrieben, vor. Modifikationen von Peptiden sind dem Durchschnittsfachmann
allgemein bekannt und umfassen die Phosphorylierung, Sulfatierung,
Carboxymethylierung und Acylierung. Die Modifikationen können mit
chemischen oder enzymatischen Mitteln realisiert werden. Da derartige
Modifikationen zu nichtsequenzierbaren Peptiden führen können, ist
die Verwendung eines codierenden Moleküls in solchen Bibliotheken
bevorzugt.
-
In
einem weiteren Aspekt können
glykosylierte oder fettsäureacylierte
Peptidderivate hergestellt werden. Die Herstellung glykosylierter
oder fettsäureacylierter
Peptide ist im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z.B.
US-Anmeldung mit der Seriennr. 07/717,454 ).
-
Ebenso
können
Fettsäurepolyamidderivate
hergestellt werden. Dabei kann beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein,
eine freie Aminogruppe acyliert, z.B. myristoyliert werden. Diese
und weitere zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete
Peptid-Fettsäure-Konjugate
sind im Britischen Patent
GB-8809162.4 ,
Internationale Patentanmeldung
PCT/AU89/00166 ,
offenbart.
-
5.5.2 BIBLIOTHEKEN MIT CARBAMATBINDUNGEN
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst synthetische Testverbindungen, die
eine oder mehrere Carbamat (d.h. Polyurethan)-Bindungen enthalten,
einschließlich
Polycarbamate Zwei Strategien zur Bildung von Carbamaten sind im
Schema II dargestellt Schema
II
-
Zur
Synthese der beiden unterschiedlichen Arten von Carbamaten lassen
sich Kupplungen von Isocyanaten und Diolen oder Aminoalkoholen verwenden.
So wird beispielsweise ein geeignetes Harz, wie z.B. das für die Synthese
von Polyamiden oben verwendete funktionalisierte Harz, durch Umsetzung
mit Phosgen zum Isocyanat umgewandelt, woraufhin das Isocyanat mit
einem aminogeschützten
Aminoalkohol unter Erhalt des geschützten Carbamats gekuppelt wird.
Die Entschützung
des Harzurethans führt
zu einem Aminourethanharz, das zur Wiederholung des gleichen Synthesezyklus
verwendet wird, wobei ein Polyurethan entsteht, d.h. Umsetzung mit
Phosgen mit anschließender
Kupplung mit einem N-geschützten Aminoalkohol
und Entschützung
ergibt ein Aminodiurethanharz usw.
-
Eine
zweite Art von geträgertem
Carbamat wird durch Abänderung
der obigen Synthesevorschrift wie folgt erhalten. Das Ausgangsaminoharz
wird zum Isocyanat umgewandelt, das Isocyanat wird durch Umsetzung
mit teilweise geschütztem
Diol zu einem geschützten
Carbamat umgewandelt, das geschützte
Carbamatharz wird unter Erhalt eines Hydroxycarbamats entschützt, das
Hydroxycarbamat wird durch Umsetzung mit einem aminogeschützten Aminoalkylisocyanat
zu einem Aminodicarbamat umgewandelt, wonach die Entschützung erfolgt.
-
5.5.3 BIBLIOTHEKEN MIT HARNSTOFFBINDUNGEN
-
Eine
Strategie zur Synthese verschiedener Härnstoffbindungen enthaltender
Strukturen ist in Schema III dargestellt.
-
-
Ein
geeignetes, mit Isocyanatgruppen funktionalisiertes Harz, wie beispielsweise
das bei der Synthese der oben beschriebenen Carbamate verwendete
Harz, wird durch Umsetzung mit einem teilweise geschützten Diamin
und anschließender
Entschützung
zu einem Aminoharnstoff und das Aminoharnstoffharz unter Verwendung
von Phosgen zu einem Isocyanat umgewandelt. Das Isocyanatharnstoffharz
wird dann der gewünschten
Anzahl an den obigen, aus drei Schritten bestehenden Synthesezyklen
unterzogen, so dass Polyharnstoffe gebildet werden.
-
5.5.4 BIBLIOTHEKEN MIT ESTERBINDUNGEN
-
Eine
Strategie für
die Synthese von Bibliotheken mit Esterbindungen ist in Schema IV
dargestellt.
-
-
Ein
geeignetes Harz, wie beispielsweise das in der Festphasenpeptidsynthese
nach Merrifield verwendete Hydroxyalkylharz, in einem Lösungsmittel
zum Aufquellen, wie z.B. Methylenchlorid, wird mit einer in geeigneter
Weise geschützten
Hydroxycarbonsäure,
vorzugsweise in Gegenwart eines Kondensierungsmittels, wie z.B.
DCC, kondensiert, so dass nach Entschützung ein geträgerter Hydroxyester
erhalten wird, der unter Verwendung der gleichen Acylierungs-Entschützungszyklen
weiter verlängert
wird.
-
5.5.5 BIBLIOTHEKEN MIT AMINBINDUNGEN
-
Eine
Strategie zur Synthese von Aminen ist in Schema V dargestellt:
-
-
Ein
geeignetes Harz, wie beispielsweise das in der Amidsynthese oben
verwendete Harz, wird zu einem Nitroalkylaminharz über reduktive
Aminierung unter Verwendung eines Nitroaldehyds umgewandelt und weiter
zum primären
Amin reduziert, und zwar unter Verwendung einer der zahlreichen
bekannten Reaktionen zur Reduktion von Nitroalkaminen zu primären Aminen
(z.B. Reduktion mittels Lithiumaluminiumhydrid). Das auf dem Harz
vorliegende primäre
Amin wird durch Wiederholung der Abfolge reduktive Alkylierung-Reduktion unter
Erhalt des gewünschten
Polyamins verlängert.
-
Die
Reduktion eines Nitroalkylaminharzes im obigen Verfahren lässt sich
durch Austauschen des Nitroaldehyds der reduktiven Aminierung gegen
ein N-geschütztes Aminoaldehyd
und Abtrennen der Schutzgruppe des erhaltenen Produkts in einem
separaten Syntheseschritt vermeiden.
-
5.5.6 BIBLIOTHEKEN MIT SULFIDEN UND DISULFIDBINDUNGEN
-
Eine
Strategie zur Synthese verschiedener Polysulfid- und Polydisulfidstrukturen ist im Schema
VI dargestellt:
-
-
Ein
geeignetes Harz, z.B. ein in der Festphasenpeptidsynthese nach Merrifield
verwendetes Harz, wird funktionalisiert, so dass es freie Thiolgruppen
aufweist. Das Thiolharz wird mit einem geschützten Thioalkylhalogenid alkyliert
und das Produkt unter Erhalt eines Thioalkylharzsulfids entschützt. Die
geträgerte
Thioalkylsulfidokette wird weiter durch Wiederholung des Alkylierungs-Entschützungszyklus
verlängert,
so dass sich ein geträgertes
Polysulfid ergibt.
-
Mit
der obigen Synthese lassen sich geträgerte Disulfide erhalten, falls
das geschützte
Thioalkylhalogenid durch ein geschütztes Thioalkylchlorsulfenat
oder Thioalkylmethoxycarbonylsulfenat ersetzt wird.
-
5.5.7 BIBLIOTHEKEN MIT KOHLENSTOFF-KOHLENSTOFFBINDUNGEN
-
Verschiedene
Polyalkane, Polyalkene, Polyhalogenalkene und Polyole werden in
Betracht gezogen. Strategien zur Synthese solcher Bibliotheken sind
in Schema VII dargestellt:
-
-
Ein
geeignetes Harz wird mit Carbonylgruppen funktionalisiert (z.B.
durch kontrollierte Oxidation von Hydroxyalkylträgergruppen), mit einem Wittig-Reagens kondensiert,
das aus Triphenylphosphin und einem Halogenalkyldialkylacetal dargestellt
wird, und unter Erhalt eines eine ungesättigte Aldehydkette enthaltenden Harzes
entschützt.
Diese Kette kann zu einem Polyenaldehyd unter Verwendung der gleichen
Abfolge aus Wittig-Kondensation und Entschützung verlängert werden. Die Behandlung
des geträgerten
Polyens mit einem molekularen Halogen, wie beispielsweise Chlor
oder Brom, führt
zu einem Halogenalkan an einem Harz. Die Umwandlung dieser Halogenalkane
in ihre vollständig
dehalogenierten reduzierten Derivate durch Umsetzung mit Tributylzinnhydrid
oder einem elektropositiven Metall, wie z.B. Zink, in Gegenwart
einer schwachen Säure wird
ebenso in Betracht gezogen. Durch vorsichtige Behandlung des geträgerten Polyens
mit einem Oxidierungsmittel, z.B. Permanganat oder Periodat, erhält man Polyole.
Weitere Polyole können
produziert werden, indem man das Polyen einer Abfolge aus Hydroborierung
und Oxidation, einer Abfolge aus Epoxidierung (über eine Persäure, wie
z.B. m-Chlorperbenzoesäure) und
Hydrolyse oder einer Abfolge von Quecksilberacetat und alkalischem
Borhydrid aussetzt.
-
5.5.8 BIBLIOTHEKEN POLYCYCLISCHER VERBINDUNGEN
UND FUNKTIONALISIERTER POLYCYCLISCHER VERBINDUNGEN
-
Verschiedene
polycyclische und funktionalisierte polycyclische Verbindungen werden
in Betracht gezogen. Eine Strategie zur Synthese polycyclischer
und verwandter Strukturen ist in Schema VIII dargestellt, in dem
R1, R2 und R3 für
verschiedene substituierte Alkyl- oder Arylgruppen mit der oben
angegebenen Bedeutung stehen:
-
-
Schema
VIII zeigt die Darstellung eines gesättigten Kohlenwasserstoffs.
Als Alternative lassen sich auch ungesättigte Strukturen darstellen.
Ein geeignetes Harz, wie beispielsweise das oben beschriebene Carbonylharz,
wird zu einem Alkenharz, z.B. mittels einer Wittig-Kondensation,
umgewandelt und dieses Harz in einer percyclischen Umsetzung vom
Diels-Alder-Typ mit einem in geeigneter Weise aktivierten, z.B.
elektrophilen, Diendimethylacetal verwendet, so dass man nach Hydrolyse
der Acetalgruppe einen geträgerten
funktionalisierten Cyclohexenylaldehyd erhält. Diese geträgerte Struktur
lässt sich
weiter durch Wiederholung der Abfolge aus Wittig-Kondensation, Cycloaddition
und Entschützung
unter Erhalt eines geträgerten
Polycyclohexenaldehyds verlängern,
der wie folgt weiter funktionalisiert werden kann: (i) durch Halogenierung,
z.B. Bromierung oder Chlorierung, unter Erhalt eines Polyhalogencyclohexanylaldehyds,
(ii) durch Reduktion des Polyhalogencyclohexanylaldehyds, z.B. unter
Verwendung von Tributylzinnhydrid oder einem elektropositiven Metall
(z.B. Zn) und einer schwachen Säure,
wobei ein Polycyclohexanaldehyd oder -alkohol erhalten wird, und
(iii) durch kontrollierte Oxidation des Polycyclohexanaldehyds unter
Verwendung von Permanganat, einer Abfolge von Hydroborierung und
Oxidation, einer Abfolge von Epoxidierung und Hydrolyse oder einer
Abfolge von Epoxidierung und Reduktion (z.B. Epoxidierung mittels
m-Chlorperbenzoesäure
und anschließender
Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid), wobei ein funktionalisiertes
Polyol erhalten wird.
-
Ein
weiteres Beispiel für
eine cyclische Bibliothek ist in 6 dargestellt.
Diese Bibliothek wird durch Binden von Brompropionsäure an einen
Träger
und Binden von Boc-geschütztem
Cysteinmethylester an den Träger über Substitution
von Brom mit der Schwefelseitenkette unter Bildung einer Sulfidverknüpfung hergestellt.
Boc/Fmoc-geschützte
Diaminosäuren,
wie z.B. Diaminobuttersäure
oder Lysin, können
addiert werden. Die Entschützung
der einen Schutzgruppe gestattet die Substitution mit einer beliebigen
Carbonsäure.
Die Entschützung
der anderen Aminogruppe gestattet die Addition einer weiteren Diaminosäure. Diese
Schrittfolge wird so viele Male wie gewünscht wiederholt. Schließlich wird
die Methylestergruppe vom Cystein hydrolysiert, was die Umsetzung
mit einer entschützten
Aminogruppe unter Cyclisierung der Struktur gestattet.
-
5.5.9 BIBLIOTHEKEN POLYSUBSTITUIERTER
RINGSTRUKTUREN, DIE ALS GERÜST
DIENEN KÖNNEN
-
Verschiedene
polysubstituierte Strukturen, die als Gerüst dienen können, werden in Betracht gezogen. Eine
allgemeine Strategie zur Synthese einer solchen Struktur ist in
Schema IX dargestellt: SCHEMA
IX
-
Eine
allgemeine Strategie zur Herstellung eines spezifischen Typs von
Gerüstbibliotheken
ist in Schema X dargestellt:
-
-
Zu
geeigneten Gerüsten
gehören,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, Cyclopentan, Kemps Trisäure
(Kemp und Petrakis, 1981, J. Org. Chem. 46:5140-5143), ein durch
aufeinander folgende Kupplung von Diaminocarbonsäuren hergestelltes verzweigtes
Konstrukt, cyclische Matrizen, wie beispielsweise die von Mutter
et al. (1992, J. Am. Chem. Soc. 114-1463-1470) beschriebenen, Steroide, Benzodiazepine
und dergleichen.
-
Ein
Ansatz zur Bindung eines Derivats von cis-1,3,5- Cyclohexantricarbonsäure an ein Harz vom Merrifield-Typ
mit anschließender
Derivatisierung jeder der drei Carbonsäuren der Trisäure ist
in Abschnitt 9 unten als ein Beispiel für eine Synthese einer geträgerten polysubstituierten
Ringstruktur, die als Gerüst
dienen kann, beschrieben (siehe Schema XIV, unten).
-
Als
zweites Beispiel für
eine Synthese einer polysubstituierten Ringstruktur, die als Gerüst dienen kann,
ist der Zusammenbau und die Derivatisierung von 1,4-Benzodiazepinen
auf der Grundlage der veröffentlichten
Arbeit von Ellman und Bunin (Chemical & Engineering News, 18. Januar, 1993,
S. 33) nachfolgend angegeben. In einer spezifischen Ausführungsform
wird ein geeignetes Harz, wie etwa ein mit einem 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure-Linker
funktionalisiertes Harz vom Merrifield-Typ, mit einem 2-Amino-4'-hydroxybenzophenon,
dessen Aminogruppe mit der Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe
geschützt
ist, weiter funktionalisiert. Nach Abtrennen des Fmoc, Kupplung
des erhaltenen Anilins mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure unter
Erhalt eines Anilids, Abtrennen des Fmoc vom Anilid und Cyclisierung
wird ein geträgertes 1,4-Benzodiazepin
erhalten, das am Anilidstickstoff mit verschiedenen Elektrophilen
weiter alkyliert werden kann, so dass man verschiedene Benzodiazepinderivate
für die
weitere Untersuchung erhält.
-
Eine
der kleinsten möglichen
Ringstrukturen zur Verwendung als Gerüst ist der Cyclopentanring (7).
-
Codierte
Versionen der oben beschriebenen Bibliotheken von polysubstituierten
Ringstrukturen sind bevorzugte Ausführungsformen. Am stärksten bevorzugt
sind codierte Bibliotheken, bei denen es sich bei den codierenden
Molekülen
um Peptide handelt. Für
die Synthese der peptidcodierten Bibliotheken werden die allgemeine
Vorgehensweise in Abschnitt 5.1 sowie die in Abschnitten 5.2 und
5.3 umrissenen Synthesestrategien verwendet.
-
5.5.10 BIBLIOTHEKEN AUF DER GRUNDLAGE
VON AUS AMINOSÄUREN
KONSTRUIERTEN GERÜSTSTRUKTUREN
-
Eine
Gerüststruktur,
die einen größeren Konformationsraum
kartiert und bei der es sich um eine einfache verzweigte Anbindung
handelt, wird durch aufeinander folgende Kupplung von Diaminocarbonsäuren konstruiert
(siehe 3). Bei verschiedenen Arten
der einen ausgedehnten Raum kartierenden Gerüststrukturen handelt es sich
um flexible cyclische oder verzweigte Gerüststrukturen. Die Prinzipien
dieser Bibliotheken sind in 3 dargestellt.
Als Beispiel für
die Konstruktion einer Gerüstbibliothek
zeigen wir hier die Synthese einer verzweigten Bibliothek (Schema
XV, Abschnitt 9 unten).
-
5.6 VERFAHREN ZUM NACHWEIS UND ZUR IDENTIFIZIERUNG
VON LIGANDEN IN BIBLIOTHEKEN VON TESTVERBINDUNGEN
-
Zusätzlich zur
Bereitstellung von Bibliotheken vieler verschiedener chemischer
Strukturen als synthetische Testverbindung sowie Verfahren zu deren
Synthese umfasst die vorliegende Erfindung ferner Verfahren zur
Absuche der Testverbindungen einer Bibliothek, um Liganden in der
Bibliothek zu identifizieren, die eine biologische Aktivität von Interesse,
wie z.B. Bindung, Stimulierung, Hemmung, Toxizität, Geschmack usw. zeigen. Andere
Bibliotheken können
gemäß den unten
beschriebenen Verfahren nach Enzymaktivität, enzymhemmender Aktivität sowie
chemischen und physikalischen Eigenschaften von Interesse abgesucht
werden. Viele Suchtests sind im Fachgebiet allgemein bekannt; zahlreiche
Suchtests sind ebenso in der
US-Patentanmeldung mit
der Seriennr. 07/717,454 , eingereicht am 19. Juni 1991,
beschrieben).
-
Es
kann passieren, dass es sich bei den während einer ersten Suche entdeckten
Liganden nicht um die optimalen Liganden handelt. Tatsächlich ist
die Synthese einer zweiten Bibliothek auf der Grundlage der während der
ersten Suche ausgewählten
Liganden häufig
bevorzugt. Auf diese Weise kann man Liganden mit höherer Aktivität identifizieren.
-
5.6.1 BINDUNGSTESTS
-
Die
vorliegende Erfindung gestattet die Identifizierung synthetischer
Testverbindungen, die an Akzeptormoleküle binden. Dabei bezieht sich
der Begriff „Akzeptormolekül", wie er hier verwendet
wird, auf ein beliebiges Molekül,
das an einen Liganden bindet. Bei Akzeptormolekülen kann es sich um biologische
Makromoleküle,
wie etwa Antikörper,
Rezeptoren, Enzyme, Nukleinsäuren,
oder um kleinere Moleküle,
wie etwa bestimmte Kohlenhydrate, Lipide, organische Verbindungen,
die als Arzneistoffe dienen, Metalle usw., handeln.
-
Die
synthetische Testverbindung in erfindungsgemäßen Bibliotheken kann potenziell
mit vielen unterschiedlichen Akzeptormolekülen Wechselwirken. Durch Identifizierung
der jeweiligen Ligandenspezies, an die ein spezifisches Akzeptormolekül bindet,
wird es möglich,
die Ligandenspezies von Interesse physikalisch zu isolieren.
-
Da
während
eines jeden Such-/Nachweis-/Isolierungsschritts
nur eine geringe Anzahl Festträgerkügelchen
abgetrennt wird, verbleibt die Mehrzahl der Kügelchen im Kügelchenreservoir.
Daher kann die Bibliothek mehrere Male wieder verwendet werden.
Werden unterschiedliche Farb- oder Identifizierungsschemata für unterschiedliche
Akzeptormoleküle
(z.B. mit Fluoreszenzreportergruppen, wie z.B. Fluoreszein (grün), Texas
Red (rot), DAPI (blau) und BODIPI, die jeweils als Tag auf den Akzeptoren
vorliegen) sowie geeignete Exitationsfilter im Fluoreszensmikroskop
oder dem Fluoreszenzdetektor verwendet, so lassen sich unterschiedliche
Akzeptoren (Rezeptoren) zu einer Bibliothek hinzufügen und
gleichzeitig auswerten, so dass die schnelle Suche nach spezifischen
Zielen erleichtert wird. Durch diese Strategien werden nicht nur
die Kosten verringert, sondern auch die Anzahl der Akzeptormoleküle, die
abgesucht werden können,
erhöht.
-
Beim
erfindungsgemäßen Verfahren
wird ein Akzeptormolekül
von Interesse in einer Bibliothek eingeführt, worin es eine oder mehrere
Ligandenspezies in der Bibliothek erkennt und daran bindet. Dabei
findet sich jede Ligandenspezies, an die das Akzeptormolekül bindet,
jeweils auf einem einzelnen Festphasenträger wieder, so dass der Träger und
somit der Ligand sich leicht identifizieren und isolieren lässt.
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Der
gewünschte
Ligand kann mit allen dem Durchschnittsfachmann bekannten herkömmlichen
Mitteln isoliert werden, wobei die Erfindung hinsichtlich des Isolierungsverfahrens
nicht beschränkt
ist. So ist es beispielsweise, und ohne darauf beschränkt zu sein,
möglich,
eine Festträgerkügelchen-Ligandenkombination physikalisch
zu isolieren, die die stärkste
physikalisch-chemische Wechselwirkung mit dem spezifischen Akzeptormolekül zeigt.
Dabei wird in einer Ausführungsform
eine Lösung
spezifischer Akzeptormoleküle
zu einer Bibliothek gegeben, die 105 bis
107 Festphasenträgerkügelchen enthält. Das
Akzeptormolekül
wird mit den Kügelchen
hinreichend lange inkubiert, so dass eine Bindung stattfinden kann.
Anschließend
wird der Komplex des Akzeptormoleküls und des an das Trägerkügelchen
gebundenen Liganden isoliert. Weitere spezifische Ausführungsformen
sind in den folgenden Verfahren aufgeführt, die die Verwendung eines
monoklonalen Antikörpers
als lösliches
Akzeptormolekül
zur Bindung eines Liganden, bei dem es sich um ein Peptid handelt, beschreiben.
Dabei ist ersichtlich, dass sich diese Verfahren leicht an den Nachweis
der Bindung eines beliebigen Akzeptormoleküls anpassen lassen.
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Zusätzlich zur
Verwendung löslicher
Akzeptormoleküle
besteht in einer weiteren Ausführungsform
die Möglichkeit,
Liganden nachzuweisen, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, und
zwar unter Verwendung intakter Zellen. Die Verwendung intakter Zellen
ist dabei für
die Verwendung mit Rezeptoren, die aus mehreren Untereinheiten bestehen
oder labil sind, oder mit Rezeptoren, die eine funktionsfähige Lipiddomäne der Zellmembran
benötigen,
bevorzugt. Bei den bei dieser Technik verwendeten Zellen kann es
sich entweder um lebende oder fixierte Zellen handeln. Die Zellen
werden mit der Bibliothek inkubiert und binden an bestimmte Peptide
in der Bibliothek unter Ausbildung einer „Rosette" zwischen den Zielzellen und dem relevanten
Kügelchen-Peptid.
Die Rosette lässt
sich anschließend über differenzielle
Zentrifugation isolieren oder physikalisch unter einem Präparationsmikroskop
abtrennen.
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Als
Alternative kann man die Bibliothek unter Verwendung eines „Panning"-Verfahrens [etwa:
Abfahrverfahren] mit Zelllinien, wie beispielsweise (i) einer „Eltern"-Zelllinie, auf deren
Zelloberfläche
der Rezeptor von Interesse fehlt, und (ii) einer rezeptorpositiven
Zelllinie, z.B. einer Zelllinie, die durch Transfektion der Elternlinie
mit dem für
den Rezeptor von Interesse codierenden Gen abgeleitet ist, absuchen.
Es besteht dann die Möglichkeit,
die Bibliothek mit der folgenden Strategie abzusuchen:
(i)
Die Bibliothek wird zunächst
an ihren nichtspezifischen Kügelchen,
die an die Zellen ohne den Rezeptor binden, abgereichert, indem
ein Monolager der Elternzelllinie über die Standard-„Panning-Technik” eingeführt wird,
so dass rezeptorspezifische nichtbindende Kügelchen oder irrelevante nichtbindende
Kügelchen
verbleiben; (ii) die nichtbindenden Kügelchen, die sowohl rezeptorspezifische
als auch irrelevante Kügelchen
umfassen, werden abgetrennt und auf ein Monolager der rezeptorpositiven
Zelllinie aufgebracht, wobei das rezeptorspezifische Kügelchen
an die rezeptorpositive Zelllinie bindet; (iii) die verbleibenden
irrelevanten nichtbindenden Kügelchen
werden durch vorsichtiges Waschen und Dekantieren abgetrennt, und
(iv) das bzw. die rezeptorspezifische(n) Kügelchen wird bzw. werden mit
einem Mikromanipulator, wie etwa einer Mikropipette, abgetrennt.
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Als
Alternative zu Tests mit ganzen Zellen für membrangebundene Rezeptoren
oder Rezeptoren, die eine funktionsfähige Lipiddomäne der Zellmembran
benötigen,
lassen sich die Rezeptormoleküle
in Liposomen rekonstituieren, wo die Reportergruppe oder das Reporterenzym
gebunden werden kann.
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Die
vorangegangenen Beispiele beziehen sich auf die synthetische Testverbindung,
wobei alle in den obigen Abschnitten beschriebenen Verbindungen
bei der praktischen Durchführung
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. So kann ein Akzeptormolekül an eine
Verbindung aus einer Vielfalt von Polyamiden, Polyurethanen, Polyestern,
mehrfach funktionalisierten Strukturen, die als Gerüst fungieren,
usw. binden.
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In
einer Ausführungsform
kann das Akzeptormolekül
direkt markiert werden. In einer weiteren Ausführungsform kann ein markiertes
sekundäres
Reagenz zum Nachweis der Bindung eines Akzeptormoleküls an ein
einen Liganden von Interesse enthaltendes Festphasenträgerpartikel
verwendet werden. Die Bindung kann über die in-situ-Bildung eines
Chromophors mit einer Enzymmarkierung nachgewiesen werden. Zu geeigneten Enzymen
gehören,
ohne darauf beschränkt
zu sein, alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase. In einer weiteren Ausführungsform
kann ein Zweifarbentest unter Verwendung von zwei chromogenen Substraten
mit zwei Enzymmarkierungen auf unterschiedlichen Akzeptormolekülen von
Interesse eingesetzt werden. Dabei können mit einem Zweifarbentest
sowohl kreuzreaktive als auch einfachreaktive Liganden identifiziert werden.
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Zu
weiteren Markierungen für
die erfindungsgemäße Verwendung
zählen
gefärbte
Latexkügelchen, magnetische
Kügelchen,
Fluoreszenzmarkierungen (z.B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE),
Texas rot (TR), Rhodamin, freie oder chelatierte Salze der Lanthanidenreihe,
vor allem Eu3+, um nur einige wenige Fluorophore
zu nennen), Chemilumineszenzmoleküle, Radioisotope oder Markierungen
für die Abbildung
mittels Magnetresonanz. Zweifarbentests können mit zwei oder mehr gefärbten Latexkügelchen oder
Fluorophoren, die bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, durchgeführt werden.
Dabei können markierte
Kügelchen
manuell oder mit mechanischen Mitteln isoliert werden. Zu mechanischen
Mitteln gehören
das Fluoreszenz-aktivierte Sortieren, d.h. analog zu FACS, sowie
Mittel zur Abtrennung mittels Mikromanipulator.
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In
spezifischen, unten aufgeführten
Beispielen, werden Enzym-Chromogen-Markierungen und Fluoreszenzmarkierungen
(FITC-Markierungen) verwendet.
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Reaktive
Kügelchen
können
auf der Grundlage der Intensität
der Markierung, z.B. Farbintensität, Fluoreszenzintensität, magnetische
Stärke
oder Radioaktivität,
um nur einige wenige Kriterien zu nennen, isoliert werden. Die am
stärksten
markierten Kügelchen
können
ausgewählt
und der am Kügelchen
gebundene Ligand entweder direkt, z.B. durch Edman-Sequenzierung oder,
falls anwendbar, durch Massenspektrumanalyse, oder indirekt durch
Sequenzieren des dem Liganden von Interesse entsprechenden codierenden
Peptids strukturell charakterisiert werden. In einer weiteren Ausführungsform
kann eine willkürliche
Auswahl von Kügelchen
mit einer Markierungsstärke
oberhalb einer willkürlichen
Ausschlussgrenze ausgewählt
und der Strukturanalyse unterzogen werden. Dabei kann man zur Quantifizierung
der Farbintensität
potenziell die moderne Bildanalysemikroskopie verwenden und somit
die relative Affinität
des Liganden für
das Akzeptormolekül
vor der Strukturanalyse des Kügelchenliganden
präzise
definieren. Auf ähnliche
Weise lässt
sich die quantitative Immunfluoreszenzmikroskopie anwenden, falls
der Akzeptor mit einer Fluoreszenzmarkierung als Tag versehen ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform
werden eine gewisse Markierungsstärke zeigende Kügelchen für die Zusammensetzungsanalyse,
z.B. die Analyse der Aminosäurezusammensetzung
im Fall von Peptidliganden, ausgewählt. Anschließend kann
eine verfeinerte Bibliothek, die einen beschränkten Satz von in der Aminosäureanalyse
als wichtig identifizierten Aminosäureuntereinheiten umfasst,
hergestellt und abgesucht werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann der Ligand bzw. können
die Liganden mit der größten Bindungsaffinität identifiziert
werden, indem man das Akzeptormolekül von Interesse fortlaufend
verdünnt,
bis eine Bindung an lediglich einige wenige Festphasenträgerkügelchen
der Bibliothek nachgewiesen wird. Als Alternative kann die Stringenz
der Bindung mit dem Akzeptormolekül erhöht werden. Dem Fachmann wäre bewusst,
dass die Stringenz der Bindung durch (i) Erhöhen der Innenstärke der
Lösung,
(ii) Erhöhen
der Konzentration denaturierender Verbindungen, wie etwa Harnstoff,
(iii) Erhöhen
oder Absenken des pH-Werts der Testlösung, (iii) Verwendung eines
einwertigen Akzeptormoleküls,
(iv) Einschluss einer definierten Konzentration eines bekannten
Konkurrenzmoleküls
in das Reaktionsgemisch und (v) Verringern der Akzeptorkonzentration gesteigert
werden kann. Andere Mittel zur Veränderung von Lösungsbestandteilen
zur Veränderung
von Bindungswechselwirkungen sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
Liganden interessant sein, die eine Bindung mit geringer Affinität zeigen.
Diese können
ausgewählt
werden, indem man zunächst
alle hochaffinen Liganden abtrennt und anschließend die Bindung unter Bedingungen
geringer Stringenz oder niedrigerer Verdünnung nachweist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann ein Doppelmarkierungstest verwendet werden. Dabei kann die
erste Markierung zum Nachweis nichtspezifischer Bindung eines Akzeptormoleküls von Interesse
an Kügelchen
in Gegenwart von löslichen
Liganden verwendet werden. Markierte Kügelchen werden dann aus der
Bibliothek abgetrennt und der lösliche
Ligand entfernt. Anschließend
wird die spezifische Bindung des Akzeptormoleküls an die verbliebenen Kügelchen
nachgewiesen. Dabei kann man erwarten, dass Liganden auf solchen
Kügelchen
das Akzeptormolekül
an der gleichen Bindungsstelle wie der Ligand von Interesse binden und
somit den Liganden von Interesse imitieren. Der Doppelmarkierungstest
bietet den Vorteil, dass das Akzeptormolekül von Interesse nicht aufgereinigt
werden muss, da der erste Schritt des Tests die Abtrennung nichtspezifischer
positiv reagierender Kügelchen
gestattet. In einer bevorzugten Ausführungsform können fluoreszenzmarkierte
Akzeptormoleküle
als Sonde zum Absuchen einer synthetischen Testbibliothek, z.B.
unter Verwendung von FACS, eingesetzt werden.
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5.6.2 BIOAKTIVITÄTSTESTS
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Mit
der vorliegenden Erfindung werden ferner Tests für die biologische Aktivität eines
Ligandenkandidaten aus einer Bibliothek, die so behandelt wurde,
dass eventuell verbliebene toxische Moleküle aus der Synthese abgetrennt
wurden, beispielsweise durch Neutralisierung und ausgiebiges Waschen
mit Lösungsmittel, sterilem
Wasser und Kulturmedium, bereitgestellt. Zu den biologischen Aktivitäten, die
getestet werden können,
gehören
Toxizität
und Abtöten,
Stimulierung und Wachstumsförderung,
Signalweiterleitung, biochemische und biophysikalische Änderungen
sowie physiologische Änderungen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die synthetischen Testverbindungen der Bibliothek vom Festphasenträger, der
hier auch als „Kügelchen" („bead") bezeichnet wird,
selektiv abspaltbar. Vorzugsweise werden die synthetischen Testverbindungen
an den Träger
in separater Phase über
mehrere spaltbare Linker gebunden, um mehr als einen Freisetzungs-
und Suchtest zu gestatten. In einer Ausführungsform werden Kügelchen
so hergestellt, dass nur ein Teil der synthetischen Testverbindung
selektiv abspaltbar ist. Selektiv spaltbare Ligandenkanditaten,
Linker und Kügelchen
werden in Abschnitt 5.3.2 oben erörtert. Eine Bibliothek wird
mit einem Spaltungsmittel behandelt, so dass die Spaltung eines
Teils der synthetischen Testverbindung erfolgt. Zu Spaltungsmitteln
gehören
beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, UV-Licht, Säure, Base,
Enzym oder Katalysator. In einer Ausführungsform wird die Bibliothek
so behandelt, dass 10-90% der synthetischen Testverbindung freigesetzt
werden. In einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
werden 25-50% der synthetischen Testverbindung freigesetzt. Falls
alle synthetischen Testverbindungsmoleküle spaltbar sind, so lässt sich
eine nicht quantitative Spaltung durch Limitieren des Spaltungsmittels
erreichen. In einem Aspekt ist die Expositionszeit bzw. Intensität von UV-Licht
limitiert. In einer weiteren Ausführungsform ist die Konzentration
an Reagenz limitiert. Nach Behandlung zur Erreichung der Spaltung
kann die Bibliothek weiter behandelt werden, z.B. mittels Neutralisierung,
um sie mit dem gewünschten
Test biologisch kompatibel zu machen. In der Praxis wäre ein Durchschnittsfachmann
leicht in der Lage, entsprechende Spaltungsbedingungen für die teilweise
Abspaltung zu bestimmen, wenn alle synthetischen Testverbindungsmoleküle der Bibliothek über spaltbare
Linker oder Bindungen an die feste Phase gebunden sind. Ferner wäre dem Durchschnittsfachmann
verständlich,
dass die relative Konzentration an freigesetzter synthetischer Testverbindung
durch Variieren der Spaltungsbedingungen beeinflusst werden kann.
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Da
die Kügelchen
der Bibliothek immobilisiert sind, bildet sich ein Konzentrationsgradient
eines bestimmten Liganden-Kandidaten aus. Dabei finden sich hohe
Konzentrationen an synthetischer Testverbindung in der Nähe des Kügelchens,
von dem sie freigesetzt wurde. Somit gestatten Hinweise auf die
biologische Aktivität
von Interesse in der Nähe
zu einem Kügelchen
die Identifizierung und Isolierung eines Kügelchens sowie die strukturelle
Charakterisierung durch Sequenzieren des der synthetischen Testverbindung
entsprechenden codierenden Moleküls
oder eine andere Technik. Die Identifizierung der synthetischen
Testverbindung ist möglich,
da nach der teilweisen Abspaltung für die Sequenzierung oder andere
Charakterisierung genug auf dem Kügelchen übrig bleibt. In einer weiteren
Ausführungsform
können
die Kügelchen
in Mikrotitervertiefungen aufgeteilt werden (z.B. 10 Kügelchen/Vertiefung),
wobei eine Fraktion des Liganden-Kandidaten freigesetzt und auf
biologische Aktivität
getestet werden kann, womit das potentielle Problem der Diffusion
wegfällt.
Unterschiedliche Teile der synthetischen Testverbindung können über unterschiedliche
spaltbare Linker für
nacheinander erfolgende Tests an einen Festphasenträger bzw.
ein Festphasenkügelchen
gebunden werden. Innerhalb dieser Beispiele bezieht sich der Begriff „Kügelchen" auf ein Trägerpartikel
in separater Phase.
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Ebenso
sind biologische Tests mit ungespaltener synthetischer Testverbindung
vorgesehen. Die biologische Aktivität von mit einer ganzen synthetischen
Testverbindung beschichteten Kügelchen
kann dann abgesucht werden. In einem Aspekt kann eine Bibliothek
in ein Tier eingeführt
werden. Kügelchen
von Interesse können
aus einem spezifischen Gewebe isoliert werden. Dabei können Kügelchen
isoliert werden, die nach oraler, nasaler oder kutaner Verabreichung
spezifisch absorbiert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform
sind derartige Kügelchen
magnetisch oder besitzen ein gewisses anderes identifizierendes
Merkmal und sind somit leicht aus dem Gewebe zu isolieren. In einer
weiteren Ausführungsform
kann der immobilisierte Ligand selbst biochemische Änderungen
mit entsprechenden Oberflächenrezeptoren
hervorrufen.
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Ferner
ist dem Durchschnittsfachmann bewusst, dass in einem biologischen
Test alle Zellen, die in Gewebekultur sowohl kurzzeitig als auch
langzeitig gehalten werden können,
verwendet werden können.
Dabei soll der Begriff „Zelle", wie er hier verwendet
wird, prokaryontische (z.B. bakterielle) und eukaryontische Zellen, Hefe,
Schimmel und Pilze umfassen. Es können Primärzellen oder in Kultur gehaltene
Linien verwendet werden. Weiterhin ist in der Anmeldung vorgesehen,
dass biologische Tests an Viren durch Infektion oder Transformation
von Zellen mit Virus durchgeführt
werden können.
So kann beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, die Fähigkeit
eines Liganden zur Hemmung lysogener Aktivität von λ-Bakteriophage getestet werden, indem
man transfizierte E. coli-Kolonien, die bei der Infektion keine
klaren Plaques bilden, identifiziert.
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Verfahren
der vorliegenden Erfindung zum Testen der Aktivität eines
synthetischen Testverbindungsmoleküls einer Bibliothek sind nicht
auf die vorstehenden Beispiele beschränkt; die Anmeldung sieht vor,
dass ein beliebiges Testsystem modifiziert werden kann, um die vorliegend
offenbarte Erfindung einzubauen. Dabei ist in der Anmeldung vorgesehen,
dass solche Systeme im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
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5.6.3 ENZYMMIMETIKA/ENZYMINHIBITOREN
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weitere Bibliotheken, die zur Katalyse
von Reaktionen fähig
sind, d.h. Enzymbibliotheken, Bibliotheken von Molekülen, die
als Koenzyme dienen, sowie Bibliotheken von Molekülen, die
Enzymreaktionen hemmen können.
Somit werden durch die Erfindung auch Verfahren bereitgestellt, die
zum Testen auf Enzym- oder Koenzymaktivität oder auf die Hemmung von
Enzymaktivität
verwendet werden können.
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Eine
Enzymaktivität
kann über
die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts beobachtet werden.
In einer besonderen Ausführungsform
katalysiert ein Enzym aus einer Enzymbibliothek die durch alkalische
Phosphatase katalysierte Reaktion, z.B. die Hydrolyse von 5-Brom-4-chlor-3-indoylphosphat
(BCIP), und bildet ein blaues, unlösliches Reaktionsprodukt auf
dem Festphasenträger
(siehe Beispiel 13 unten).
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann eine Zone mit einem beobachtbaren Produkt, z.B. Farbe oder Fluoreszenz,
in einer halbfesten Matrix ausgebildet werden. Eine Bibliothek wird
dabei in eine halbfeste Matrix, z.B. ein Agarosegel, schichtweise
eingetragen und mit einem chromogenen oder anderen Indikatorsubstrat versetzt.
Dort, wo ein Enzym- Kügelchen-Komplex
aus einer Enzymbibliothek die gewünschte Enzymaktivität zeigt,
bildet sich eine Zone mit Produkt. So kann beispielsweise, ohne
darauf beschränkt
zu sein, ein Molekül aus
einer Bibliothek, bei dem es sich um ein Analog von Meerrettich-Peroxidase handelt,
durch Zugabe einer Lösung
von Aminoantipyren (0,25 mg/ml; Kodak), Phenol (8 mg/ml) und H2O (0,005%) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0
identifiziert werden. Dabei bilden Kügelchen mit Enzymaktivität eine violette
Farbzone. In einer anderen Ausführungsform
können
Kügelchen
mit Proteaseaktivität
durch Zugabe der allgemein bekannten kolorimetrischen Proteasesubstrate
identifiziert werden.
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Koenzymaktivität kann beobachtet
werden, indem auf die von einem Koenzym vermittelte Enzymaktivität bei Fehlen
des natürlichen
oder gemeinen Koenzyms getestet wird.
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Enzymhemmende
Aktivität
lässt sich
mit einer teilweise freigesetzten synthetischen Testverbindung nachweisen.
Dabei wird in einem Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Bibliothek
in einer halbfesten Matrix, die ein Enzym enthält, schichtweise eingetragen.
Die Bibliothek wird zur teilweisen Freisetzung von Liganden-Kandidatenmolekülen behandelt.
Dort, wo das Molekül
die Enzymaktivität
hemmt, kann eine Zone ohne Produkt identifiziert werden. In einer
Ausführungsform
ist das Enzymsubstrat chromogen, wobei ein gefärbtes Produkt gebildet wird.
Somit würde
das Vorhandensein eines Enzyminhibitors eine Zone ohne Farbe ergeben.
In einer weiteren Ausführungsform
kann die Hemmung der Proteolyse von Hämoglobin oder eines Indikatorenzyms,
wie z.B. alkalischer Phosphatase, über das Vorhandensein einer
undurchsichtigen Zone in der halbfesten Matrix nachgewiesen werden.
Dies liegt daran, dass das Vorhandensein eines Proteolyseinhibitors
den Abbau des Hämoglobins
oder Indikatorenzyms verhindert.
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Dem
Durchschnittsfachmann ist allgemein bekannt, dass ein synthetisches
Testverbindungsmolekül, das
Enzymaktivität,
Koenzymaktivität
zeigt oder das Enzymaktivität
hemmt, ein Peptid, ein Peptidmimetikum, eines von verschiedenen
Polymeren oder eine der in Abschnitt 5 beschriebenen Verbindungen
sein kann. Von besonderem Interesse sind dabei die Polymere mit
erzwungener Struktur, einschließlich,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, cyclischer, bicyclischer oder tricyclischer Strukturen,
oder erzwungene Strukturen mit bestimmter Gerüststruktur, durch die eine
einmalige katalytische Bindungstasche oder Oberfläche erzeugt
werden kann.
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5.6.4 TOPOLOGISCHE SEGREGATION
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Die
Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zum Segregieren des codierenden
Moleküls
im Inneren des festen Trägers
sowie der Testverbindung auf der Außenseite, die für ein makromolekulares
Akzeptormolekül
von Interesse zugänglich
ist. Das Verfahren umfasst dabei die Schritte der Synthese eines
Linkers, bei dem es sich in der bevorzugten Ausführungsform um ein Peptid handelt.
Der Linker enthält
eine Sequenz, die sich mit einem leicht erhältlichen Enzym, wie beispielsweise
Chymotrypsin oder einer anderen Endopeptidase, hydrolysieren lässt. In
einer Ausführungsform
handelt es sich bei dem Enzym um Chymotrypsin und der Linker enthält ein Phenylalanin.
Nach der Synthese des Linkers liegt die Nα-Aminofunktion
geschützt
vor und der Träger
ist der Endopeptidase ausgesetzt. Die Endopeptidase wirkt dabei
nur auf Linker, die für
andere Makromoleküle,
wie etwa Akzeptoren, zugänglich
wären.
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Nach
der enzymatischen Hydrolyse des Peptidlinkers können die Testverbindung und
die codierenden Verbindungen unter Verwendung beliebiger orthogonaler
Schutzgruppen synthetisiert werden.
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5.7 VERFAHREN ZUR CHARAKTERISIERUNG EINER
SYNTHETISCHEN TESTVERBINDUNG AUS EINER BIBLIOTHEK
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Sobald
ein Träger
mit einem Liganden von Interesse nach einem der Verfahren in Abschnitt
5.6 oben ausgewählt
ist, wird durch die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Bestimmung
der Struktur des Liganden bereitgestellt.
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Dabei
gibt es zwei allgemeine Ansätze
zur Bestimmung der Struktur einer Testverbindung: die Struktur des
Polymers kann direkt mit herkömmlichen
Techniken, z.B. Edman-Abbau oder Massenspektrometrie, analysiert
werden; als Alternative kann ein zweites Molekül oder eine zweite Gruppe von
Molekülen
während
der Konstruktion der Bibliothek synthetisiert werden, so dass die
Struktur(en) der zweiten molekularen Spezies die Struktur der am
gleichen Träger
gebundenen Testverbindung eindeutig anzeigt (codiert). Mit dieser
zweiten Technik lässt
sich die Struktur von Polymeren, die selbst einer Sequenzierung
nicht zugänglich
sind, leicht bestimmen.
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Noch
eine weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst eine dritte Codierungstechnik mit
der Bezeichnung „fraktionelle
Codierung", die
sich von den vorhergehenden Ausführungsformen
dahingehend unterscheidet, dass kein eigenständiges, von der Testverbindung
verschiedenes codierendes Molekül vorliegt.
Die funktionelle Codierung wird dann verwendet, wenn spezifische
Untereinheiten der Testverbindung in der herkömmlichen Analyse nicht aufgelöst werden
können,
z.B. die D- und L-Stereoisomeren
einer Aminosäure.
Durch die fraktionelle Codierung wird ein Verfahren bereitgestellt,
wodurch sich die Untereinheiten unterscheiden lassen, indem man
eine geringe Menge einer anderen Untereinheit 1, die nicht anderweitig
bei der Konstruktion der Bibliothek genutzt wird, während der
Synthese der Bibliothek zumischt. Somit wird durch die fraktionelle
Codierung ein kleinerer, nachweisbarer Grad an Heterogenität der Testverbindung
des Trägers
bei Verwendung einer der beiden ununterscheidbaren Untereinheiten
erzeugt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein solcher Grad
an Heterogenität,
der typischerweise etwa 5% beträgt,
mit der Lehre der Anmeldung, dass nämlich auf jedem Träger nur
eine einzige Spezies einer Testverbindung vorliegen kann, vereinbar.
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5.7.1 CHARAKTERISIERUNG MITTELS EINES
EINZELNEN CODES UND MEHRERER AUFEINANDERFOLGENDER CODES
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der codierten molekularen Bibliotheken enthält der Träger in separater Phase mit
der synthetischen Testverbindung von Interesse auch ein Molekül, vorzugsweise
ein Peptid, dessen Sequenz für
die Struktur des Liganden codiert; z.B. wird durch die Bestimmung
der Sequenz des codierenden Peptids die Identität des Liganden enthüllt. Ein
bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Peptidsequenzierung ist
der Edman-Abbau. Dabei wird bei einem besonders bevorzugten Verfahren
der Applied Biosystems 477A Protein Sequencer eingesetzt. Die Aminosäuresequenz
von Peptiden lässt
sich auch entweder mit der FAB (Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopie
(FAB-MS) oder unter Verwendung anderer Analysetechniken bestimmen.
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Die
codierenden Peptide können
entweder in am festen Träger
gebundener Form oder in davon abgespaltener Form sequenziert werden.
Zur Abspaltung der Peptide werden die isolierten Kügelchen
mit herkömmlichen
Spaltungsmitteln, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind,
behandelt, um Peptide von Festphasenträgern zu trennen. Die Wahl des
ausgewählten
Spaltungsmittels hängt
dabei vom eingesetzten Festphasenträger ab.
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Als
Alternative besteht in einer weiteren Ausführungsform im Rahmen der Erfindung
die Möglichkeit, ein
einzelnes Festphasenträgerpartikel,
wie z.B. ein Kügelchen,
mit seiner an ihn gebundenen codierenden Peptidsequenz zu isolieren
und das Kügelchen
in ein Sequenziergerät
für die
Peptidsequenzierung einzuführen,
ohne vorher das codierende Peptid vom Kügelchen abzuspalten. Man schätzt, dass
ein einzelnes Harzkügelchen
mit einem Durchmesser von 100 μm
und mit 0,5 mEq/Gramm funktionalisierbaren Stellen ungefähr 100 pmol
Peptid enthält,
wenn die Hälfte
der Stellen zur Verknüpfung
codierender Peptide verwendet werden. Bei einem ähnlichen Grad an Substitution
mit codierenden Peptiden enthält
ein einzelnes PAM-Harzkügelchen mit
einem Durchmesser von 250 μm
und mit 0,5 mEq/Gramm Harz funktionalisierbaren Stellen ungefähr 1500 pmol
codierendes Peptid. Mit einem Peptidsequenziergerät des Standes
der Technik benötigt
man lediglich 5-10 pmol für
eine angemessene Sequenzierung. Daher kann bei einem Standard-PAM-Harz
ein einzelnes Kügelchen
mit einem Durchmesser von 100 μm
so beladen werden, dass es mehr als eine angemessene Menge codierendes
Peptid für
die Sequenzierung enthält.
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Neben
der Edman-Sequenzierung stellt die Massenspektrometrie mit schnellem
Innenbeschuss ein sehr leistungsfähiges Analysewerkzeug dar,
das häufig
auf wirksame Weise zur Analyse der Strukturen von Peptiden und verschiedener
anderer Moleküle
verwendet werden kann. Ebenso kann die Elektrospray-Hochleistungsmassenspektrometrie
bei der Strukturanalyse sehr nützlich
sein. Vorzugsweise wird die Massenspektrometrie zur Bestimmung der
Struktur eines codierenden Moleküls
wie in der
US-Patentanmeldung mit
der Seriennr. 07/939,811 , eingereicht am 3. September 1992,
beschrieben durchgeführt.
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Dem
Fachmann ist ersichtlich, dass die Anzahl an Untereinheitsspezies
an einer beliebigen Position der Testverbindung manchmal größer ist
als die Anzahl an zur Konstruktion des codierenden Polymers verwendeten
Monomeren. So lässt
sich beispielsweise ein codierendes Peptid mit einem begrenzten
Satz von Aminosäuren
konstruieren, die nach dem Edman-Abbau leicht unterschieden werden.
Unter diesen Umständen
kann das codierende Molekül
auch über
die Einführung
eines Gemisches von Aminosäuren
an einer gegebenen Position konstruiert werden. So kann beispielsweise
ein Singulett/Dublett-Code, d.h. mit einer bzw. zwei codierenden
Gruppierung(en) pro Position der Testverbindung, wobei das codierende
Polypeptid lediglich acht Aminosäuren
enthält,
für bis
zu 36 Untereinheiten codieren; ein Triplett/Dublett/Singulett-Code
mit der gleichen Anzahl an Gruppierungen codiert für 84 Untereinheiten
pro Position.
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Die
Analyse der Edman-Abbauprodukte solcher codierender Peptide zeigt
entweder ein bzw. zwei oder ein, zwei bzw. drei Aminosäuren an
jeder Position der codierenden Sequenz.
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5.7.2 CHARAKTERISIERUNG MITTELS EINES
NICHTSEQUENZIELLEN CODES
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Eine
alternative bevorzugte Ausführungsform
mit der Bezeichnung nichtsequenzielle Codierung berücksichtigt
das „Lesen" des codierenden
Moleküls
ohne eine Bestimmung der Sequenz seiner Untereinheiten. Sequenzielle
Codes sind von Natur aus mühsam
zu entschlüsseln.
Die Sequenzierung eines Moleküls
erfordert wiederholte Abbauschritte. Im Gegensatz dazu lässt sich
die Analyse der Zusammensetzung eines polymeren Moleküls über einen
einzigen Abbau und eine einzige Analyse der erhaltenen Untereinheiten
oder ihrer Derivate durchführen.
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Ferner
besteht der zeitaufwendigste Schritt, der für die Sequenzierung eines peptidcodierenden
Moleküls
erforderlich ist, in der chromatographischen Analyse eines jeden
der abgespaltenen Phenylthiohydantoine. Auch wenn die gesamte Information
in der einmaligen Retentionszeit des einzigen Elutionsspitzenwerts vorliegt,
so muss dennoch an den Produkten eines jeden schrittweisen Abbaus
jeweils ein getrennter Chromatographieschritt durchgeführt werden.
Somit wird die meiste Zeit der Gradientenanalyse durch das Warten
auf das Erscheinen des einzigen Spitzenwerts, der dem Rest an jener
Position entspricht, „verschwendet". Der Fortgang ist
eindeutig nicht so effizient wie möglich. Falls anstelle des sequenziellen
Edman-Abbaus mit anschließender
HPLC-Analyse die Möglichkeit
bestünde,
alle codierenden Untereinheiten gleichzeitig abzuspalten, zwischen
diesen in einem einzigen HPLC-Lauf
zu unterscheiden und anschließend
die Ergebnisse zur Bestimmung der Testverbindungsidentität zu entschlüsseln, so
könnte
der Vorgang stark beschleunigt werden.
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Für das Lesen
eines nichtsequenziellen Codes ist es lediglich erforderlich, zu
bestimmen, ob ein gegebenes Signal vorhanden ist oder nicht. Die
Auflösung
an der Grundlinie zweier Spitzenwerte, die sich um etwa 0,3 Minuten
in ihrer Retentionszeit unterscheiden, lässt sich unter Verwendung einer
Umkehrphasen-HPLC-Standardanalyse
mit Gradientenelution erreichen. Somit kann ein 45-Minuten-Gradient
zwischen 150 Verbindungen unterscheiden. Ein aus aus einer Gruppe
von 150 verschiedenen Codierungsgruppierungen ausgewählten Untereinheiten
bestehendes Codierungsmolekül
entspricht einer Binärzahl
mit 150 Stellen. Somit könnten
2150 oder etwa 1045 verschiedene
Spezies der Testverbindung auf diese Weise codiert werden. Somit
reichen nichtsequenzielle Codes leicht aus, sowohl die Sequenz als
auch die Identität
der Untereinheiten der Testverbindungen selbst der größten praktischen
Bibliotheken zu codieren.
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Ein
nichtsequenzieller Code lässt
sich wie folgt konstruieren. C000 bis C099 seien die Elemente des Satzes
aus 100 codierenden Gruppierungen, die für die Codierung der Struktur
einer Testverbindung mit bis zu 20, aus bis zu 32 unterschiedlichen
Untereinheiten, die hier mit S00-S31 bezeichnet werden, ausgewählten Resten,
verwendet werden. In diesem Schema wird die Identität des Rests
an der ersten Position durch das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit
der codierenden Elemente C000-C004 bestimmt; falls keine vorhanden sind,
so liegt S00 an der ersten Position der Testverbindung vor und,
falls alle vorhanden sind, so liegt S31 an Position 1 vor. Nachfolgende
Positionen werden von den Gruppierungen C005-C009, C010-C014 ... C095-C099
codiert. Dem Durchschnittsfachmann ist dabei ersichtlich, dass in
dem häufigen
Fall, bei dem Bibliotheken, die deutlich kleiner als die maximale
Codierungskapazität
eines 100-stelligen Codes sind, benötigt werden, die Treue des
Codes dadurch erhöht
werden kann, dass man entweder die Größe des Satzes codierender Moleküle verringert,
d.h. das Intervall zwischen Gruppierungen in der chromatographischen
Analyse erhöht,
oder indem man redundante Codierung verwendet; z.B. kann eine „Paritäts"-Gruppierung für jede codierte
Position in dem Code eingeführt
werden.
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Am
häufigsten
werden zwischen 4 und 8 codierende Gruppierungen, die zwischen 16
Untereinheiten und 128 Untdreinheiten plus einer Paritätsgruppierung
entsprechen, für
die Codierung jeder einzelnen Position in der Testverbindung benötigt.
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Die
codierenden Gruppierungen müssen
in der codierenden Struktur so angeordnet sein, dass dadurch ihre
gleichzeitige Abspaltung und Analyse gestattet wird.
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Eine
offensichtliche Möglichkeit
besteht in einer Totalhydrolyse mit anschließender selektiver Modifikation
und Analyse des Gemischs. In diesem Fall ist die Struktur der codierenden
Verbindung nicht wichtig. Codierende Gruppierungen können miteinander
verbunden oder an separate Zweige einer verzweigten Struktur oder
eine beliebige Kombination gebunden werden, so lange die Bindung
zu jeder Gruppierung hydrolysierbar ist. Allerdings könnte dieser
Ansatz durch das Vorhandensein von Hydrolyseprodukten von der Testverbindung
gefährdet
sein. Daher schien die Verwendung des von Edman, 1950, ACTA CHEM
SCAND, 4:283-293;
Edman, et al., 1967, EURO J BIOCHEM, 1:80-91 entwickelten sehr selektiven
Abbauverfahrens die optimale Wahl darzustellen.
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Beim
Edman-Abbau wird die N-terminale Aminosäure selektiv von der Peptidkette
abgespalten. Falls eine angemessene Anzahl von Aminosäuren und
Aminosäurederivaten,
die die oben definierten chromatographischen Erfordernisse erfüllen, identifiziert
werden könnten
und diese in Form einer codierenden Struktur in einer Anordnung,
die ihre gleichzeitige Abspaltung gestattet, synthetisiert würden, so
wäre es
möglich,
die Zusammensetzung einer nichtpeptidischen Struktur in nur einem
Zyklus aus Edman-Abbau und HPLC-Analyse zu analysieren.
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Die
Retentionszeit von Aminosäurephenylthiohydantoinen
an der Umkehrphase folgt der Lipophilizität der Seitenkette der Aminosäure. Somit
ist es für
die Konstruktion eines Satzes von Aminosäurederivaten mit den entsprechenden
Retentionszeiten lediglich notwendig, die Seitenkette der einzelnen
Aminosäuren
jeweils mit entsprechenden Unterschieden in der Lipophilizität zu konstruieren.
Ein einfacher Weg zur Erreichung der entsprechenden Unterschiede
besteht in der Substitution der funktionellen Gruppe der Seitenketten
trifunktioneller Aminosäuren
durch entsprechende Substituenten. Dementsprechend wurde von uns
der Effekt der Acylierung der Seitenkettenaminogruppe von Diaminocarbonsäuren – Diaminopropionsäure, Diaminobuttersäure, Ornithin
und Lysin – untersucht.
Alternative Sätze
codierender Gruppierungen, wie etwa Derivate von Dicarboxyaminosäuren und
SH-haltiger Aminosäuren,
sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Die oben beschriebene Gruppierung
ist nur dahingehend bevorzugt, dass sie sich von Personen, die leichten
Zugang zur Festphasenpeptidsynthese haben, zweckmäßig synthetisieren
lässt.
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Eine
Ausführungsform
zur Erreichung der gleichzeitigen Abspaltung codierender Gruppierungen
sieht vor, dass es sich bei allen codierenden Gruppierungen jeweils
um eine α-Aminosäure handelt,
die als N-terminale Aminosäure
gebunden ist, wobei ihre Aminogruppe frei vorliegt. Das Gerüst einer
solchen codierenden Struktur lässt
sich aus Diaminocarbonsäuren
(Daa), Dicarboxyaminosäuren
oder anderen trifunktionellen Untereinheiten konstruieren. Die Aminogruppen
dieser Aminosäuren
werden von den für
die Codierung verwendeten N-geschützten Aminosäuren acyliert.
Die Acylierung wird unter Verwendung eines Gemischs der als Code
für die
gegebene Untereinheit und deren Position in der Testverbindung definierten
Gruppierungen durchgeführt.
Wie im Schema XIC unten dargestellt ist, braucht die Positionschemie
der Umsetzungen der Diaminocarbonsäuren nicht angegeben zu werden.
Das Polymer und die codierenden Gruppierungen können an eine der beiden Aminogruppen
der Diaminosäuren,
die das codierende Molekülpolymer
bilden, gekuppelt werden.
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Im
Fall der in Beispiel 13 unten beschriebenen und dargestellten substituierten
Diaminocarbonsäuren waren
die Kupplungsreaktivitäten
von Seitenkettensubstitutionen unabhängig. Sollten allerdings andere
codierende Untereinheiten verwendet werden, so gibt es zwei Verfahren,
mit denen sich ein äquimolarer
Einbau der codierenden Gruppierungen erzielen lässt, obwohl diese signifikant
unterschiedlichen Reaktivitäten
aufweisen können,
z.B. Alanin und Isoleucin. Das erste Verfahren beruht auf dem Ausgleichen
der Unterschiede in der Reaktivität durch Verwendung einer höheren Konzentration
der langsamer reagierenden Aminosäure (z.B. Eichler J. & Houghten, R.,
1993, Biochemistry 32:11035; Rutter
US-Patent Nr. 5,010,175 ).
Als Alternative kann wiederholt eine subäquimolare Menge des Gemischs
eingesetzt werden, so dass, obwohl eine Gruppierung schneller reagieren
könnte,
genügend
Kupplungsstellen für
die langsamer reagierende Aminosäure
zur Kupplung übrig
blieben, bis nach genügend
Wiederholungen der Kupplungsreaktion alle reaktiven Stellen aufgebraucht
sind. Andrews et al., 1994, TECHNIQUES IN PROTEIN CHEMISTRY, 5:485-492.
-
Es
gibt mehrere Grundstrategien zur Konstruktion eines wie oben beschriebenen
codierenden Moleküls.
Zwei von diesen sind in Schema XIA dargestellt. Das erste beruht
auf der Verwendung der Alloc-Schutzgruppe (Loffet A. & Zhang H., 1993,
Int. Pep. & Prot.
Res. 42:346); (Stevens & Watanabe,
1950, J. Am. Chem. Soc. 72:725); (Guibe, F. & Saint M'Leux Y., 1981, Tet. Lett. 21:3591) zum
Aufbau der codierenden Struktur und der Fmoc- oder Fmoc-ähnlichen
Gruppe (Carpino & Han,
1972, J. Org. Chem., 37:3404) zum Schutz funktioneller Gruppen auf
der Testverbindung. In diesem Fall lässt sich die Boc-Gruppe als permanente
Schutzgruppe sowohl für
die Testverbindungssynthese als auch die Codierungssynthese verwenden.
Dabei ist es vorteilhaft, vorgeformte codierende Untereinheiten
der allgemeinen Form des in Schema XIA dargestellten „Block
A" zu verwenden.
Als Alternative wird eine weitere Orthogonalitätsstufe während der Synthese benötigt, falls
keine vorgeformten codierenden Untereinheiten verwendet werden.
Dies lässt
sich durch Verwendung von Alloc/Ddz-geschützten Diaminocarbonsäuren für den Aufbau
des codierenden Grundgerüsts
erreichen, da die Ddz-Gruppe durch 2% Trifluoressigsäure in Dichlormethan
selektiv abspaltbar ist (Birr C., et al., 1972, Liebigs Ann. Chem.,
763:162-73). Allerdings wird dieser Ansatz durch die Notwendigkeit,
unterschiedliche Kupplungsreaktivitäten der als Gemisch gebundenen
codierenden Aminosäuren
auszugleichen, kompliziert. Eine zweite Strategie beruht auf der
Verwendung einer Kombination aus Fmoc- und Boc-Gruppen für den zeitweisen
orthogonalen Schutz funktioneller Gruppen in der Testverbindung
und den codierenden Molekülen
sowie der Verwendung von Benzoxycarbonyl (Z) oder Z-ähnlichen
Gruppen für
einen permanenten Schutz. Die codierende Untereinheit kann während der
Synthese unter Verwendung von Fmoc/Dde- (oder Fmoc/Alloc oder Fmoc/Ddz-)
geschützten
Diaminocarbonsäuren
aufgebaut werden, da die Dde-Gruppe durch eine Lösung von Hydrazin in Dimethylformamid
abgespalten wird und unter zur Abtrennung der Boc- bzw. Fmoc-Gruppe
verwendeten Bedingungen stabil ist (Hone, N.D. et al., Poster 263
beim 22. Eur. Pept. Symp., Interlaken, Schweiz, September 1992).
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Ein
alternativer Ansatz für
die Codierung ist in Schema XIB dargestellt. In diesem Fall wird
ein Bruchteil der für
die Codierung zur Verfügung
stehenden Aminogruppen durch das codierende Gemisch acyliert, wobei die
verbleibenden Aminogruppen vor der Durchführung des nächsten Schritts der Randomisierung
erneut durch eine orthogonal abspaltbare Gruppe (z.B. Alloc) geschützt werden.
Bei diesem Schema ist es vorteilhaft, das codierende Gemisch vor
der Testverbindungsuntereinheit zu kuppeln, da die Entschützung von
Alloc auf der rekombinierten Stufe durchgeführt werden kann.
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Eine
dritte alternative Ausführungsform
wird im Schema XIC bereitgestellt. Bei diesem Schema brauchen die
codierenden Elemente nicht mit einer Grundgerüst-Diaminocarbonsäure vorgeformt werden, wie
in Schema XIA, noch muss eine repetitive Blockierung und Deblockierung
wie in Schema XIB vorhanden sein. Das Schema sieht eine Fmoc-geschützte Testverbindung
sowie ein Alloc-geschütztes
codierendes Molekül vor,
wobei die reaktiven Gruppen sowohl der codierenden als auch der
Testverbindung während
der Synthese mit Boc permanent geschützt sind. Das codierende Molekül wird durch
aufeinander folgende Schritte aus Entfernen des Alloc-Schutzes sowohl
von der Nα-
als auch der Nε-Funktionalität des Lysins,
Zugabe und Kupplung eines Gemischs der codierenden Elemente Boc-Caa11 und Boc-Caa12 jeweils
in einer Menge von 0,5 Äquivalent,
Zugabe und Kupplung von 1,0 Äquivalent
Alloc-Lys(Alloc) synthetisiert. Dabei ist zu beachten, dass in dieser
Ausführungsform
die codierenden Elemente, d.h. die Boc-Caa's,
entweder an das Nα und/oder das Nε irgendeines
bestimmten Lysins im Grundgerüst
des codierenden Moleküls
kuppeln können.
Trotzdem bewirkt weder die Stereochemie noch die Stöchiometrie
der Kupplung die Durchführbarkeit
der Ausführungsform,
da die Nα-
und Nε-Funktionalitäten von
Lysin für
alle erfindungsgemäßen Zwecke äquivalent
sind.
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Noch
eine weitere alternative Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Lesen eines nichtsequenziellen Codes durch
Massenspektrometrie. Dabei werden die codierenden Moleküle vom Festphasenträger durch
spezifische Spaltung eines Linkers freigesetzt. Die Moleküle können weiter
durch Elektro/Spray oder Innenbeschuss fragmentiert und die einzelnen
codierenden Gruppierungen über
ihre Molekulargewichte identifiziert werden.
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Dem
Fachmann ist ersichtlich, dass die Verwendung von Massenspektrometrie
zum Lesen eines nichtsequenziellen Codes impliziert, dass die codierenden
Gruppierungen mit den codierenden Molekülen über verschiedene andere chemische
Bindungen als die, die gegenüber
einem spezifischen Abbau empfindlich sind, wie beispielsweise Peptidbindungen,
verknüpft
sein können.
-
Es
folgen die Schemata XIA, XIB und XIC:
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5.7.3 NICHTCODIERTE BIBLIOTHEKEN
-
Zur
Analyse der Struktur von aus Bibliotheken, die keine codierenden
Moleküle
enthalten, ausgewählten
Liganden kann die zur Analyse der Struktur codierender Peptide (oben
beschrieben) verwendete Technik, falls anwendbar, eingesetzt werden.
Als Alternative lässt
sich die Massenspektrometrie, insbesondere unter Verwendung von
in der
US-Anmeldung mit der
Seriennr. 07/939,811 , eingereicht am 3. September 1992,
beschriebenen Techniken, oder andere Analysetechniken (Dünnschichtchromatographie,
HPLC, NMR, IR, Elementaranalyse und dergleichen) zur Bestimmung
der Struktur einer gemäß der vorliegenden
Erfindung ausgewählten
synthetischen Testverbindung verwenden.
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5.8 THERAPEUTISCHE UND DIAGNOSTISCHE MITTEL
AUS BIBLIOTHEKEN EINER synthetischen Testverbindung
-
Nach
der Bestimmung der Struktur eines ausgewählten Liganden kann eine große Menge
der Verbindung chemisch oder biologisch zur Bestätigung der Ergebnisse der Struktur
und Suchexperimente sowie anderer Untersuchungen synthetisiert werden.
Nachdem einmal eine molekulare Struktur von Interesse über Bibliothekssuche
und Strukturanalyse aktiver Liganden identifiziert wurde, werden
durch die vorliegende Erfindung Moleküle, die die molekulare Struktur
umfassen, für
die Verwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krankheiten
bereitgestellt. Dabei kann das durch die Suche identifizierte Molekül entweder
allein ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel bereitstellen
oder kann in ein größeres Molekül eingebaut
werden. Ein eine Struktur mit biologischer oder Bindungsaktivität umfassendes
Molekül
kann als „Effektormolekül" bezeichnet werden.
Ferner werden durch die Erfindung Bibliotheken zur Verwendung bei
verschiedenen Anwendungen bereitgestellt. Bei der „Effektor"-Funktion des Effektormoleküls kann
es sich um eine der hier beschriebenen oder im Fachgebiet bekannten
Funktionen handeln.
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Durch
das hier beschriebene Verfahren wird nicht nur ein neues Werkzeug
zur Suche nach spezifischen Liganden mit potenziellen diagnostischem
oder therapeutischem Wert, sondern auch wichtige Informationen über eine
Reihe von Liganden mit potenziell enorm unterschiedlicher Struktur,
die nichts desto weniger mit dem gleichen Akzeptormolekül Wechselwirken
können,
bereitgestellt. Die Integration derartiger Informationen mit der
Erstellung molekularer Modelle und modernen Rechnertechniken sorgt
wahrscheinlich für
ein neues grundlegendes Verständnis
von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen.
-
Die
erfindungsgemäßen therapeutischen
Mittel umfassen Effektormoleküle,
die an das biologisch aktive Zentrum von Cytokinen, Wachstumsfaktoren
oder Hormonstoffen binden und dadurch deren Wirkung verstärken oder
neutralisieren und die die Transkription und/oder Translation blockieren
oder verstärken.
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Zu
den erfindungsgemäßen therapeutischen
Mitteln gehören
beispielsweise Effektormoleküle,
die an einen Rezeptor von pharmakologischem Interesse, wie z.B.
Wachstumsfaktorrezeptoren, Neurotransmitterrezeptoren oder Hormonrezeptoren,
binden. Diese Effektormoleküle
können
entweder als Agonisten oder Antagonisten der Wirkung des natürlichen
Rezeptorliganden verwendet werden.
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Eine
weitere Anwendung von Effektormolekülen, die an Rezeptoren binden,
würde darin
bestehen, die Bindung zur Blockierung der Anbindung von Viren oder
Mikroben, die sich Zugang zu einer Zelle verschaffen, indem sie
an einen normalen zellulären
Rezeptor binden und dann ins Innere transportiert werden, zu verwenden.
Zu diesem Phänomen
zählen
beispielsweise die Bindung des menschlichen Immunschwächevirus
an den CD4-Rezeptor und des Herpes-Simplex-Virus an den Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptor.
Effektormoleküle,
die den Rezeptor belegen, könnten
als pharmakologische Mittel zur Blockierung einer viralen Infektion
von Zielzellen verwendet werden. Die Einwanderung von Parasiten
in Zellen könnte
auf ähnliche
Weise gehemmt werden, nachdem geeignete Effektormoleküle gemäß der vorliegenden
Erfindung identifiziert wurden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann ein Effektormolekül
mit einer Struktur, die an ein Akzeptormolekül von Interesse bindet, zum
Abzielen auf einen Arzneistoff oder ein Toxin verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Akzeptormolekül von Interesse um einen Rezeptor
oder ein Antigen, der bzw. das auf der Oberfläche einer Tumorzelle angetroffen
wird, einen Tierparasiten oder eine Mikrobe, z.B. ein Bakterium,
ein Virus, einen einzelligen Parasiten, einen einzelligen Krankheitserreger,
Pilz oder Schimmelpilz. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich
bei dem Zielstoff um einen intrazellulären Rezeptor.
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Darüber hinaus
besteht die Möglichkeit,
dass einige der Millionen von synthetischen Testverbindungsmolekülen im Reservoir
Strukturen mit biologischer Aktivität bereitstellen können. Man
kann dabei Moleküle isolieren,
die gegen Tumore, Tierparasiten oder Mikroben gerichtete Aktivitäten, z.B.
gegen Unkraut, Pflanzenparasiten, Pilze, Bakterien, einzellige Parasiten,
einzellige Krankheitserreger oder Viren gerichtete Aktivitäten, besitzen.
Darüber
hinaus können
einige dieser Liganden als Agonisten oder Antagonisten von Wachstumsfaktoren,
z.B. Erythropoetin, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor,
Tumorwachstumsfaktoren, um nur einige zu nennen, ebenso wie Hormone,
Neurotransmitter, Agonisten für
die Rezeptoren, Immunmodulatoren oder andere regulatorische Moleküle wirken.
-
Zu
den erfindungsgemäßen therapeutischen
Mitteln zählen
auch Effektormoleküle
mit einer Struktur, die eine hohe Affinität für Arzneistoffe bzw. Drogen,
z.B. Digoxin, Benzodiazepan, Heroin, Kokain oder Theophyllin, aufweist.
Derartige Moleküle
lassen sich als Gegenmittel für Überdosen
solcher Arzneistoffe bzw. Drogen verwenden. In ähnlicher Weise gehören zu therapeutischen
Mitteln Effektormoleküle,
die an kleine Moleküle
oder Metallionen, einschließlich
Schwermetallen, binden. Moleküle
mit hoher Affinität für Bilirubin
sind für die
Behandlung von Neugeborenen mit Hyperbilirubinämie geeignet.
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Die
vorliegende Erfindung sieht allgemein die Bereitstellung von Verfahren
zur Identifizierung von Molekülen
für die
Therapie von Krankheiten oder Erkrankungen, wie beispielsweise den
im Product Category Index of The Physicians Desk Reference (PDR,
1993, 47. Ausgabe, Medical Economics Data: Oradell, NJ, S. 201-202)
aufgeführt
sind, vor. So kann beispielsweise ein Effektormoleküle mit Aktivität gegen
Krebs und Parasiten, mit Antikoagulanzaktivität, mit Aktivität als Antagonist
von Antikoagulanzien, als Antidiabetikum, als Anticonvulsivum, als
Antidepressivum, als Antidiarrhoikum, als Antidot, als Antigonadotropin,
als Antihistamin, als Antihypertonikum, als entzündungshemmendes Mittel, als
gegen Nausea wirkendes Mittel, als gegen Migräne wirkendes Mittel, als gegen
Morbus Parkinson wirkendes Mittel, als gegen Blutplättchen gerichtetes
Mittel, als Mittel gegen Juckreiz, als Antipsychotikum, als Antipyretikum,
als Antitoxin (z.B. Antivenin), als Bronchodilatans, als Vasodilatans,
als Chelator, als Verhütungsmittel,
als Muskelrelaxans, als Mittel gegen Glaukom oder als Sedativum
identifiziert werden.
-
Die
erfindungsgemäßen therapeutischen
Mittel können
auch entsprechende pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe,
Verdünnungsmittel
und Adjuvanzien enthalten. Bei solchen pharmazeutischen Trägerstoffen
kann es sich um sterile Flüssigkeiten,
wie z.B. Wasser und Öle,
einschließlich
den aus Petroleum, Tieren, Pflanzen stammenden Ölen oder synthetischer Öle, wie
z.B. Erdnussöl,
Sojaöl,
Mineralöl,
Sesamöl
und dergleichen handeln. Dabei ist Wasser als Trägerstoff bevorzugt, wenn die
pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Als flüssige Trägerstoffe
können
auch Kochsalzlösungen
und wässrige
Dextrose- und Glyzerinlösungen
eingesetzt werden, insbesondere für injizierbare Lösungen.
Zu pharmazeutischen Hilfsstoffen zählen Stärke, Glukose, Laktose, Saccharose,
Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselgel, Magnesiumcarbonat,
Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glyzerinmonostearat, Talkum, Natriumchlorid,
Magermilch in getrockneter Form, Glyzerin, Propylen, Glykol, Wasser,
Ethanol und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können die
Form von Lösungen,
Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen
mit kontinuierlicher Freisetzung und dergleichen einnehmen. Geeignete
pharmazeutische Trägerstoffe sind
in „Remington's Pharmaceutical
Sciences" von E.W.
Martin beschrieben. Derartige Zusammensetzungen enthalten eine wirksame
therapeutische Menge des Wirkstoffs zusammen mit einer geeigneten
Menge an Trägerstoff,
um so die Form für
die korrekte Verabreichung an den Patienten bereitzustellen. Zwar
handelt es sich bei der intravenösen
Injektion um eine sehr wirksame Form der Verabreichung, doch können auch
andere Arten eingesetzt werden, beispielsweise mittels Injektion
oder über
orale, nasale oder parenterale Verabreichung.
-
Ein
eine gemäß der vorliegenden
Erfindung bestimmte Struktur umfassendes Molekül kann auch zur Bildung diagnostischer
Mittel verwendet werden. Das diagnostische Mittel kann auch ein
Molekül
sein, das eine oder mehrere als Ergebnis der Bibliothekssuche identifizierte
Strukturen, z.B. mehr als eine Polyamidsequenz oder Polyalkansequenz,
umfasst. Darüber
hinaus kann das diagnostische Mittel einen der oben für die therapeutischen
Mittel beschriebenen Trägerstoffe
enthalten.
-
Der
Begriff „diagnostisches
Mittel", wie er
hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Mittel, das zum Nachweis
von Leiden wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein,
Krebs, wie z.B. T- oder B-Zellenlymphom, sowie Infektionskrankheiten,
wie oben angegeben, verwendet werden kann. Dabei wird der Begriff Nachweis
im weitesten Sinne verwendet, so dass er die Indikation des Bestehens
eines Leidens, die Lokalisierung des von dem Leiden betroffenen
Körperteils
oder die Indikation der Schwere des Leidens umfasst. Sc könnte beispielsweise
ein Peptid-Meerrettich-Immunperoxidase-Komplex
oder ein verwandtes immunhistochemisches Mittel zum Nachweis und
zur Quantifizierung spezifischer Rezeptor- oder Antikörpermoleküle in Geweben,
Serum oder Körperflüssigkeiten
verwendet werden. Diagnostische/Mittel können zur Verwendung sowohl
in vitro als auch in vivo geeignet sein. Insbesondere werden durch
die vorliegende Erfindung geeignete diagnostische Reagenzien zur
Verwendung in Immuntests, Southern- oder Northern-Hydridisierung
und in-situ-Assays
bereitgestellt.
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Darüber hinaus
kann das diagnostische Mittel einen oder mehrere Marker, wie z.B.,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, Radioisotop-, Fluoreszenz-Tags, paramagnetische Substanzen
oder andere, die Abbildung verbessernde Stoffe, enthalten. Dem Durchschnittsfachmann
wäre die
Bandbreite an Markern und Verfahren geläufig, so dass er sie in das
Mittel zur Bildung diagnostischer Mittel einbauen würde.
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Die
therapeutischen Mittel und diagnostischen Mittel der vorliegenden
Erfindung können
für die
Behandlung und/oder Diagnose von Tieren und stärker bevorzugt Säugern, einschließlich Menschen,
Hunden, Katzen, Pferden, Rindern, Schweinen, Meerschweinchen, Mäusen und
Ratten, verwendet werden. Therapeutische oder diagnostische Mittel
können
auch zur Behandlung und/oder Diagnose von Pflanzenkrankheiten verwendet
werden.
-
Die
einer Therapie oder Diagnose mit gemäß der vorliegenden Erfindung
entdeckten Molekülen
zugänglichen
Krankheiten und Leiden sind genauso vielfältig und breit gefächert wie
die Permutationen der Strukturen in einer Bibliothek.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können
mit geringer Affinität
bindende Kügelchen
ausgewählt
und eine limitierte Bibliothek auf der Grundlage der Strukturen
der Liganden auf dem Kügelchen
hergestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann ein spezieller
niedrigaffiner oder hochaffiner Träger, der einen oder einige
wenige von den von der Erfindung bereitgestellten Millionen synthetischen
Testverbindungen identifizierten Liganden umfasst, bei chromatographischen
Trennungen eingesetzt werden.
-
Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, bei denen es sich
ausschließlich
um Beispiele für die
Erfindung handeln soll, näher
erklärt.
-
6. BEISPIEL: EINE CODIERTE MODELLBIBLIOTHEK
-
Im
vorliegenden Beispiel wird gezeigt, dass zwei Moleküle, nämlich eine „synthetische
Testverbindung" und
ein „codierendes
Molekül", gleichzeitig auf
einem einzigen Harzkügelchen
hergestellt werden können.
Weiterhin lässt
sich eine Bibliothek solcher Verbindungen herstellen, wobei jedes
Harzkügelchen
in der Bibliothek eine einzelne Spezies der „synthetischen Testverbindung" sowie eine einzelne
Spezies des „codierenden
Moleküls" enthält. In diesem
Beispiel liegen sie in einem molaren Verhältnis von 2:1 vor. Die Sequenz des „codierenden
Moleküls" entspricht der Sequenz
der „synthetischen
Testverbindungen".
-
Für dieses
Modellsystem handelt es sich sowohl bei der „synthetischen Testverbindung" als auch dem „codierenden
Molekül" um Peptide. Dabei
wurde die parallele Synthese des Testpeptids und des codierenden Peptids
unter Verwendung der orthogonalen Blockierungsgruppen Boc und Fmoc
durchgeführt.
-
6.1 MATERIAL UND METHODEN
-
Die
Festphasensynthese wurde manuell in Polypropylenspritzen, wie von
Krchnak und Vagner (1990, Peptide Res. 3:102-193) beschrieben durchgeführt. Synthesen
wurden an mit einem SCAL-Stiel (Patek und Lebl, 1991, Tetrahedron
Lett. 32:3891-3894) (Safety-Catch-Amidlinker)
oder mit einem entsprechenden Linker modifiziertem TentaGel (TG)
(Rapp Polymere, Tübingen,
Deutschland, 130 oder 80 μm,
0,23 mmol/g) durchgeführt.
Die Abspaltungen der Fmoc-Schutzgruppen erfolgten mit 50% Piperidin/DMF über einen
Zeitraum von 1 × 10
min. Die Boc-Schutzgruppe wurde mit 30% TFA/DCM mit 3% Anisol 20
min. abgespalten. Für
die Neutralisierung nach der Boc-Abspaltung wurde eine Lösung von
DIEA/DCM (10%) verwendet. Für
die Aktivierung sowohl von Nα-Fmoc- als auch Boc-Aminosäuren wurde
ein Gemisch aus BOP/HOBt/DIEA (1:1:2 Äq.) in DMF verwendet. Die Vollständigkeit
der einzelnen Kondensationsreaktionen (1,5-40 Std.) wurde jeweils
mit dem Ninhydrintest oder bei Kupplung an sekundäre Aminogruppen
mit dem Chloraniltest überprüft. Die
Kupplungsvorschrift beinhaltete das Waschen mit DMF (6-8 mal) (mit
anschließendem
Waschen mit DCM bei Boc-geschützten
Aminosäuren)
zwischen der Kupplung und der Entschützung sowie zwischen der Entschützung und der
Kupplung. Die Reduktion des SCAL-Linkers wurde über 2 Stunden mit 20% (EtO)2P(S)SH in DMPU durchgeführt. Die endgültige Spaltung
erfolgte mit einem Gemisch aus 95% TFA und 5% Wasser.
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Es
wurden Lösungsmittel
im handelsüblichen
Reinheitsgrad ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Geschützte Aminosäuren wurden
von Bachem (Torrance, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY) oder
Propeptide (Vert-le-Petit, Frankreich) bezogen.
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6.2 ERGEBNISSE
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6.2.1 SYNTHESE DER MODELLBIBLIOTHEK UND
ENTSCHÜTZUNG
BEIDER SCHUTZGRUPPEN
-
Boc-Lys(Fmoc)-OH
wurde als erste Aminosäure
an SCAL-TG gekuppelt, die Nε-Fmoc-Gruppe
entschützt
und Fmoc-Lys(Fmoc)-OH
an die Seitenkette des ersten Lysins gekuppelt. Die Nα- und Nε-Fmoc-Gruppen
des Lysins wurden abgespalten und das Harz in drei Teile geteilt.
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH bzw. Fmoc-Val-OH wurden jeweils an jeden
Anteil des Harzes gekuppelt. Entsprechende Boc-Aminosäuren (Gly, Tyr
und Leu-Boc-Tyr-OH
wurde mit einer nichtgeschützten
Hydroxylgruppe verwendet) wurden im nächsten Schritt an die α-Aminogruppe des Lysins
nach Boc-Entschützung
gekuppelt, während
der „Fmoc-Zweig" geschützt blieb.
Nach Beendigung der Boc-Aminosäurekondensationen
wurden alle drei Anteile des Harzes miteinander vereinigt und der „Fmoc-Zweig" entschützt. Die
folgende Randomisierung wurde genauso wie die erste nach Aufteilen
des Harzes in die drei gleichen Anteile durchgeführt. Nach der Randomisierung
von drei Positionen (Kupplung von drei unterschiedlichen Aminosäuren in
jeder Position) wurde das Harz zur nachfolgenden Analyse in getrennte
Portionen geteilt.
-
Zwei
zufällig
ausgewählte
vollständig
entschützte
Kügelchen
wurden separaten Sequenzanalysen unterzogen. Dabei fanden sich in
allen drei Zyklen korrekte „komplementäre" Aminosäuren im
erwarteten Verhältnis
von 2:1. Ergebnisse (Werte in pmol): 1. Kügelchen: 1. Zyklus: V 251,
L 146, 2. Zyklus: V 244, L 147, 3. Zyklus: V 245, L 119; 2. Kügelchen:
1. Zyklus: A 102, G 39, 2. Zyklus: V 121, L 59, 3. Zyklus: F 125,
Y 50.
-
Ein
Teil des Harzes (etwa 100 mg) wurde mit 20% Diethyldithiophosphat
in DMPU (2 × 1
h Schütteln) versetzt,
um den SCAL-Stiel zu reduzieren. Das Gemisch von Peptiden wurde
vom reduzierten SCAL 1 h mit TFA/H2O (95:5)
abgespalten. Das abgespaltene Gemisch wurde im Vakuum eingeengt
und mit Et2O gefällt. Der Niederschlag wurde
durch Zentrifugation gesammelt und getrocknet. Das Peptidgemisch
wurde in 0,1% TFA/H2O gelöst und mittels
HPLC analysiert. Die erwarteten 27 Spitzenwerte wurden mit einem
langsamen Gradienten von 0-50%
Acetonitril und 0,1% TFA über
200 min. eluiert. Es wurden mehrere zusätzliche kleinere Spitzen identifiziert,
deren Bildung auf die Verwendung von Tyrosin mit ungeschützter Seitenkette
während
der Synthese zurückgeführt wurde.
Da die Gefahr des Ausschlusses (oder wenigstens der Abnahme des
Gehalts) einiger Sequenzen durch die Etherfällung bestand, wurde bei der
zweiten Spaltung des Gemisches dieser Schritt umgangen. Das Spaltungsgemisch
aus TFA und Wasser wurde mit zusätzlichem
Wasser verdünnt,
eingeengt und im Vakuum zentrifugiert und lyophilisiert. Die HPLC-Auswertung des Gemischs
zeigte eine etwa äquimolare
Repräsentation
aller erwarteten Spitzenwerte.
-
6.2.2 ENTSCHÜTZUNG DER N-TERMINALEN FMOC-GRUPPE
UND ACETYLIERUNG DES „FMOC-ZWEIGS"
-
An
die Entschützung
der Fmoc-Gruppe schloss sich die Acetylierung freier N-terminaler
Aminogruppen an. Die Acetylierung wurde mit einer Lösung von
0,3 M N-Acetylimidazol
in DMF 20 min. durchgeführt
(Ninhydrintest negativ). Die N-terminalen Boc-Gruppen auf dem anderen
Zweig wurden nach der Acetylierung entschützt. Drei willkürlich gewählte Kügelchen
wurden sequenziert und ergaben die folgenden abgelesenen Werte (in
pmol): 1. Zyklus: Y 213, (Kügelchen
1), G 161 (Kügelchen
2), Y 201 (Kügelchen
3), 2. Zyklus: L 165 (1), Y 166 (2), Y 205 (3), 3. Zyklus: Y 188
(1), L 128 (2), G 162 (3). Die abgelesenen Werte waren durch die
im acetylierten Arm vorliegenden Aminosäuren nicht kontaminiert.
-
Ein
Teil der acetylierten Kügelchen
(etwa 100 mg) wurde wie oben beschrieben behandelt (Fällung des Gemischs
mit Ethylether und/oder Eindampfen des Spaltungsgemischs und Lyophilisierung),
um den Stiel zu reduzieren und die acetylierten Peptide abzuspalten.
Durch HPLC-Analyse unter den gleichen Bedingungen konnte gezeigt
werden, dass während
der Etherfällung
ein beträchtlicher
Anteil der Bibliothek aufgrund ihrer Löslichkeit in Ether verloren
ging. Die eingeengte und lyophilisierte Probe ergab die gleiche
Anzahl an Spitzenwerten mit ungefähr dem gleichen Muster wie
im Fall der entschützten
Bibliothek, obwohl die Retentionszeiten aufgrund der Acetylierung
des Fmoc-„Zweigs" zu höheren Werten
hin verschoben waren.
-
6.2.3 AUSTAUSCH DER BOC-SCHUTZGRUPPE GEGEN
DIE TFA-GRUPPE
-
Die
Boc-Gruppe am N-Terminus wurde gegen die Trifluoracetylgruppe ausgetauscht,
um ein schrittweises Sequenzierexperiment zu gestatten. Zunächst wurde
dabei die N-terminale Boc-Gruppe von einer Harzprobe (50 mg) abgespalten,
während
der „Fmoc-Zweig" geschützt blieb.
Die freien Aminogruppen wurden mit Trifluoracetyl durch Versetzen
mit 10 Äquivalenten
(0,14 mmol, 21 μl)
Trifluoressigsäureanhydrid
in Dichlormethan (0,5 ml) in Gegenwart von DIEA (0,16 mmol, 28 μl) geschützt. Die
Umsetzung war nach 1 h beendet (Ninhydrintest negativ). Nach der
Trifluoracetylierung wurde die Fmoc-Gruppe auf dem anderen Zweig
abgetrennt und drei Kügelchen
wurden der Sequenzierung unterzogen. Die Sequenz des Fmoc-Zweigs wurde bestimmt.
Nach Sequenzierung des FmocZweigs wurde das sequenzierte Kügelchen
aus dem Sequenziergerät genommen
und mit einer Lösung
von 0,2 M NaOH versetzt (3 h, 20°C),
getrocknet und weiteren drei Sequenzierungszyklen unterzogen. Die
entsprechenden, von der Sequenzierung des Fmoc-Zweigs her vorhergesagten
Sequenzen des Boc-Zweigs wurden erhalten. 1. Kügelchen (Werte in pmol): 1.
F (735), 2. V (643), 3. A (837); nach TFA-Abtrennung: 1. Y (207),
2. L (187), 3. G (76), Sequenz FVA/YLG; 2. Kügelchen: 1. A (215), 2. A (230),
3. F (193); nach TFA-Abtrennung: 1. G (88), 2. G (86), 2. Y (80),
Sequenz AAF/GGY; 3. Kügelchen: 1.
F (63), 2. F (67), 3. V (41); nach TFA-Abtrennung: 1. Y (15), 2.
Y (12), 3. L (4), Sequenz FFV/YYL.
-
6.2.4 ABSPALTUNG EINES PEPTIDS VON EINEM
KÜGELCHEN
-
Mehrere
Kügelchen
aus Harz mit vollständig
entschützten
Sequenzen am reduzierten SCAL-Stiel wurden getrennt in kleine Glasfläschchen
gegeben und über
Nacht mit 30 μl
reiner TFA versetzt. Es wurden Portionen von jeweils 3 μl entnommen
und mit H2O auf ein Gesamtvolumen von 20 μl verdünnt und
mittels HPLC an einem Microbore-HPLC-Gerät (Michrom
Apparatus) (Gradient von 5-60% Acetonitril in 0,1% TFA in Wasser über 20 min.)
analysiert. Durch Berechnungen auf der Grundlage des mittleren Extinktionskoeffizienten
von Peptiden bei 215 nm konnte gezeigt werden, dass etwa 100-200
pmol Peptid von einem Polymerkügelchen freigesetzt
wurden.
-
6.3 DISKUSSION
-
Die
codierte Modellbibliothek ist in 2 dargestellt.
Das synthetische Testverbindungspeptid und das codierende Peptid
sind über
einen sich verzweigenden Linker an den Festphasenträger gebunden.
Im Allgemeinen kann es sich bei der synthetischen Testverbindung
um eine Verbindung handeln, die keinen Edman-Abbau durchläuft, womit
die Sequenzangaben von der codierenden Sequenz für die Strukturbestimmung der
Testverbindung sorgen. Die einzelnen Untereinheiten der synthetischen
Testverbindung sind jeweils eindeutig mit einer Aminosäure im codierenden
Arm in positionsspezifischer Weise assoziiert, was die Strukturanalyse
gestattet.
-
Es
gibt mehrer Ansätze
zum Aufbau der codierenden Sequenz. Eine Verfahrensweise (1A) verwendet eine statistische Verteilung beider
Strukturen auf dem Polymerkügelchen.
In diesem Fall lassen sich alle möglichen Verhältnisse
erzielen, und die Möglichkeit
der Erzeugung eines kooperativen Effekts beider Sequenzen kann minimiert
werden. Bei der zweiten Verfahrensweise (1B)
werden sowohl die Such- als auch die codierende Struktur auf der
am festen Träger
hängenden
verzweigten Struktur, die beispielsweise von einer Diaminocarbonsäure (Lysin)
realisiert ist, aufgebaut. Beide „Sequenzen" liegen in einem definierten Molverhältnis sowie
einer definierten speziellen Anordnung vor, die für das Akzeptormolekül, nach
dem gesucht wird, zugänglich
ist. Bei denjenigen Anwendungen, bei denen die Freisetzung des gesuchten
Peptids in die Lösung
verwendet wird, spielt die Lokalisierung der Suchverbindung bzw.
codierenden Verbindung auf dem Kügelchen
keine Rolle, da aufgrund der Verwendung unterschiedlicher Linker
die codierende Sequenz nie in die Lösung freigesetzt wird.
-
Um
die chemische Synthese der synthetischen Testverbindung und der
codierenden Sequenzen überzeugend
zu demonstrieren, wurde ein einfaches Schema verfolgt. Eine „synthetische
Testverbindung" wurde aus
A, F und V aufgebaut. Diese Aminosäuren wurden mit G, Y bzw. L
in der „codierenden" Sequenz codiert. Die
synthetische Testverbindung wurde auf „Test"-Zweigen aufgebaut, d.h. beide Aminogruppen
von Lysin, gebunden an eine weitere Lysinseitenkette, unter Verwendung
von Fmoc-Chemie (siehe 2). Das Harz
Wurde in drei Teile geteilt und Nα-Fmoc-geschützte Aminosäuren wurden
auf den Testzweigen gekuppelt und im geschützten Zustand belassen. Die
entsprechenden Nα-Boc-(codierenden)
Aminosäuren
wurden auf den codierenden Zweig gekuppelt. Der gesamte Harzträger wurde
vermischt und wiederum in drei Teile geteilt. Die Entschützung der
Nα-Fmoc-Gruppe
und Kupplung der nächsten
Nα-Fmoc-Aminosäure wurde
in Gegenwart eines Boc-Schutzes auf dem anderen Zweig durchgeführt. Die
Boc-Schutzgruppe ist unter diesen Bedingungen stabil. Im nächsten Schritt
wurde die Nα-Boc-Gruppe
abgespalten und die der am Testzweig gekuppelten Fmoc-Aminosäure entsprechende
Nα-Boc-Aminosäure in den
einzelnen Reaktionen jeweils auf dem codierenden Zweig gekuppelt.
Das Verfahren aus Mischen, Spalten und getrennter Kupplung von Fmoc-
und Boc-Aminosäuren
wurde noch einmal wiederholt. Die Synthese wurde an einem SCAL-Stiel durchgeführt, der
unter den Bedingungen sowohl der Boc- als auch der Fmoc-Strategie
stabil ist. Dieser Stiel lässt
sich allerdings unter relativ milden acidolytischen Bedingungen
nach Reduktion seiner Sulfoxidgruppierungen abspalten (Patek und Lebl,
1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-3894).
-
Die
Sequenzierung von auf diese Weise präparierten Kügelchen zeigte ein Molverhältnis von
2:1 von Such- zu codierender Sequenz und die entsprechende Übereinstimmung
bestimmter Aminosäuren
(2A). Unter Verwendung einer Portion von Kügelchen
wurde die „Such"-Sequenz acetyliert
und eine reine Sequenz von der „codierenden" Sequenz abgelesen
(2B). Unter Verwendung einer anderen Portion von
Kügelchen wurde
die „codierende" Sequenz von einer
Trifluoracetylgruppe blockiert, die Sequenzierung des „Such"-Zweigs durchgeführt, die
Trifluoracetylgruppe von den sequenzierten Kügelchen abgespalten und die Sequenz
des „codierenden" Peptids bestimmt,
wodurch die Ergebnisse von der Sequenzierung des „Such"-Peptids bestätigt wurden
(2C).
-
Um
zu verifizieren, dass die Synthesestrategie das vorhergesagte äquimolare
Verhältnis
einer definierten Anzahl von Strukturen erzeugt, wurde die in einer
Portion repräsentierte „Minibibliothek" vom Träger abgespalten.
Mittels Umkehrphasen-HPLC wurde das Vorhandensein 27 unterschiedlicher
Peptide bestätigt. Die
als Spuren identifizierten Spitzenwerte wurden gesammelt und der
Sequenzanalyse unterzogen, wodurch die Reinheit eines jeden Peptids
sowie seine Zusammensetzung bestätigt
wurden. Ebenso wurde die Abspaltung von Peptiden von den Einzelkügelchen
durchgeführt,
wobei die Möglichkeit
der Analyse von von nur einem Kügelchen
freigesetzten Peptiden bestätigt
wurde.
-
7. BEISPIEL: VON EINER PEPTIDSTRUKTUR
CODIERTE NICHTPEPTID-BIBLIOTHEKEN
-
In
diesem Beispiel wird gezeigt, dass ein codierendes Peptidmolekül eindeutig
für eine
nichtpeptidische Testverbindung codieren kann, wenn beide parallel
auf einem einzigen Kügelchen
synthetisiert werden. In diesem Beispiel wurden die Untereinheiten
der Testverbindung so gewählt,
dass jede Verbindung ein einzigartiges Molekulargewicht aufweist.
Durch Vergleichen des beobachteten Molekulargewichts der Testverbindung
mit der Sequenz des codierenden Peptids wird gezeigt, dass ein codierendes
Peptid für
eine einzige Testverbindung codiert.
-
7.1 MATERIAL UND METHODEN
-
Die
Kupplungen der Aminosäuren
wurden nach einem manuellen Verfahren unter Verwendung einer Standardvorschrift
bei Raumtemperatur durchgeführt;
geschützte
Aminosäure
(3 Aq.) in DMF wurde mit DIC (3 Äq.)
oder DIC und HOBt (jeweils 3 Äq.)
mit dem Harz gemischt, wobei auf die Kupplung analytische Tests folgten.
Dort, wo angegeben, wurden symmetrische Anhydride verwendet.
-
Die
zur Herstellung der nicht-Peptid-Bibliothek verwendeten Untereinheiten
sind in Schema XII dargestellt:
-
-
Fmoc-SCAL-Linker
und Boc-Lys(Fmoc) wurden zunächst
unter Verwendung von DIC und HOBt an das Harz (TentaGel S NH2, 1 g) gekuppelt. Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe
wurde Fmoc-Trp gekuppelt und die neue Fmoc-Gruppe entschützt. Das
Peptidharz wurde in drei gleiche Teile geteilt, und drei unterschiedliche Bromsäuren (jeweils
eine pro Reaktionsgefäß, jeweils
3 Äq.)
wurden durch Verwendung von DIC in DMF (3 Äq.) gekuppelt. Bei den drei
Säuren
handelte es sich um α-Bromessigsäure, α-Bromvaleriansäure und
Bromtoluolsäure.
Die Kupplung der letzten Säure
wurde aufgrund ihrer geringen Reaktivität wiederholt, wobei jeweils
ein sechsfacher Überschuss
der Säure
und von DIC verwendet wurde. Der Boc-Schutz der α-Aminogruppe von Lys wurde mit
TFA abgetrennt, und die ersten Boc-geschützten Aminosäuren der
codierenden Sequenz (Gly, Ala, Leu) wurden durch DIC gekuppelt.
Die codierenden Aminosäuren
wurden dabei nach dem Molekulargewicht der nicht-Peptid-Bausteine
gewählt,
so dass der leichteste Baustein (in diesem Fall Bromessigsäure) von
Gly, der schwerste (Bromtoluolsäure)
von Leu und der mittlere (α-Bromvaleriansäure) von
Ala codiert wurde.
-
Die
drei Harzteile wurden miteinander vereinigt, gründlich mit DCM gewaschen und
als Vorbereitung für
die Kupplung der nächsten
codierenden Aminosäuren
durch TFA/DCM entschützt.
Nach der Entschützung wurde
das Harz wiederum in drei Teile geteilt. Die Kupplungen der Boc-geschützten Aminosäuren (wiederum Gly,
Ala und Leu) wurden wie üblich
mittels DIC durchgeführt.
Nach der Kupplung der Aminosäuren
des codierenden Peptids wurden die nicht-Peptidyl-Untereinheiten
zugegeben. Zwei Teile des Harzes wurden mit 2 M Lösungen von
Aminen (Benzylamin und 1-Amino-4-methylpiperazin) in DMF über Nacht
versetzt. Der dritte Teil wurde mit einer Lösung von 2 M Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethylthiol
versetzt, und die Fmoc-Gruppe wurde nach Beendigung der Reaktion
abgetrennt. Die Codierung der Amine beruhte wiederum auf ihren Molekulargewichten.
-
Das
Harz wurde wiederum vereinigt, gemischt und in drei Teile für die letzten
Kupplungen geteilt. Carbonsäuren
(Cyclohexylessigsäure,
Phenyloxyessigsäure
und 4-Pyridylthioessigsäure)
wurden an die erhaltenen (primären
und sekundären)
Amine mittels DIC gekuppelt und die Kupplungsreaktionen zweimal
wiederholt, wobei vorgeformte symmetrische Anhydride in einem 3-5fachen Überschuss
eingesetzt wurden. Nachdem ein Chloraniltest ein negatives Ergebnis
ergab, wurden die drei Harzansätze
getrennt mit TFA versetzt, neutralisiert, und die letzten codierenden
Boc-geschützten
Aminosäuren
wurden unter Verwendung von DIC und HOBt gekuppelt. Die Codierung
der letzten Carbonsäuren
beruhte auf dem gleichen Schema wie zuvor. Schließlich wurde
das gesamte Harz vereinigt.
-
FAB
(Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopiemessungen wurden am ZAB
EQ-Spektrometer (VG Analytical Ltd, Manchester, UK) durchgeführt. 1H-NMR-Spektren wurden mit einem General
Electric QE 300-Gerät
gewonnen. Die Sequenzierung mittels Edman-Abbau wurde am Proteinsequenziergerät ABI 4778 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) und einem Porton PI 3010-Gerät (Porton
Instruments, Tarzana, CA) durchgeführt. Sowohl die analytische
als auch die präparative
HPLC wurden am System 625 LC von Waters mit einem Waters 490E Programmable
Multiwavelength Detector unter Verwendung von Vydac Peptide und Protein
C18 analytischen (0,46 × 250
mm, 5 μm,
1 ml/min.) bzw. präparativen
(10 × 250
mm, 10 μm,
3 ml/min.) Säulen
durchgeführt.
Die Analysen von von einem einzigen Kügelchen freigesetzten Gemischen
wurden am Ultrafast Microprotein Analyzer (Michrom BioResources,
Pleasanton, CA) unter Verwendung einer Reliasil C18-Säule (5 μm, 300 A, 1 × 150 mm) durchgeführt. Alle
Spektren sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (δ) mit entweder
CDCl3 oder CD3SOCD3 als Lösungsmittel
angegeben. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden am HP 8452A Diode-Array-Spektrophotometer
von Hewlett Packard unter Verwendung einer 1-cm-Quarzcuvette aufgezeichnet.
Die Aminosäureanalysen
wurden am System D-500 (Durrum Corp., Palo Alto, CA) durchgeführt.
-
7.2 ERGEBNISSE
-
7.2.1 SYNTHESE VON ZWEI FORMEN CODIERTER
BIBLIOTHEK
-
Mit
diesem allgemeinen Ansatz wurden zwei Formate für die Bibliotheken komplettiert.
Der einzige Unterschied zwischen diesen beiden Formaten besteht
in der Lokalisierung des SCAL-Linkers, wie in Schema XIII gezeigt.
-
-
ERSATZBLATT (REGEL 26)
-
Die
erste Bibliothek (A) enthielt den SCAL-Linker am N-ε von Lys,
der direkt am Harz gebunden war, wodurch bei allen Verbindungen
dieser Bibliothek die letzte Aminosäure Trp-Amid war. In dieser
Bibliothek verblieben codierende Peptide nach der Spaltung auf den
Harzkügelchen.
In der zweiten Bibliothek (B) wurde der SCAL-Linker an das Harz
gebunden, wobei die letzte Aminosäure in allen Verbindungen Lys
war. Die von dieser Bibliothek freigesetzten Verbindungen enthielten
jeweils die synthetische Verbindung und Peptid mit codierender Sequenz.
-
Die
zur Konstruktion der synthetischen Testverbindung verwendeten nicht-Aminosäure-Bausteine
sind oben in Schema XII dargestellt. Diese Bausteine wurden zur
Bildung von Testverbindungen mit einzigartigem Molekulargewicht
gewählt.
Die Testverbindungen, Molekulargewichte und codierenden Sequenzen
sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
Kombination
von bei der Konstruktion einer Nichtpeptid-Modellbibliothek verwendeten Bausteinen |
M.W. |
Kombination | ohne
Codierung | mit
Codierung* | codierende
Sequenz |
167 | 444,6 | 743,9 | GGG |
168 | 454,5 | 767,9 | AGG |
169 | 471,6 | 827,0 | LGG |
147 | 474,6 | 787,9 | GAG |
148 | 484,5 | 811,9 | AAG |
149 | 501,6 | 871,1 | LAG |
157 | 482,6 | 838,0 | GLG |
158 | 492,6 | 862,0 | ALG |
159 | 509,6 | 921,2 | LLG |
|
267 | 486,7 | 800,0 | GGA |
268 | 496,6 | 824,0 | AGA |
269 | 513,7 | 883,1 | LGA |
247 | 516,7 | 844,1 | GAA |
248 | 526,6 | 868,0 | AAA |
249 | 543,7 | 927,2 | LAA |
257 | 524,7 | 894,1 | GLA |
258 | 534,7 | 918,1 | ALA |
259 | 551,7 | 977,3 | LLA |
|
367 | 520,7 | 876,1 | GGL |
368 | 530,6 | 900,1 | AGL |
369 | 547,7 | 959,2 | LGL |
347 | 550,7 | 920,1 | GAL |
348 | 560,6 | 944,1 | AAL |
349 | 577,7 | 1003,3 | LAL |
357 | 558,7 | 970,2 | GLL |
358 | 568,7 | 994,2 | ALL |
359 | 585,7 | 1053,3 | LLL |
- * M.W. der die Testverbindung und das codierende
Peptid enthaltenden verzweigten Verbindung
-
Kügelchen
aus der ersten Bibliothek (Schema XIII, obere Reihe) wurden mit
Reduktionsmittel versetzt und einzelne Kügelchen für getrennte Spaltung und Sequenzanalysen
aufgenommen. Fünf
Kügelchen
wurden untersucht. Nach Abspaltung des nicht-Peptid-Teils wurden
die Kügelchen
erfolgreich sequenziert (siehe Tabelle 2), wobei die Struktur der
nicht-Peptid-Verbindung
abgeleitet werden konnte. Die abgespalteten Verbindungen enthaltende
Lösungen
wurden am Mikro-HPLC-System
analysiert. Tabelle 2
Auf willkürlich ausgewählten Kügelchen
aus einer Bibliothek von nicht-Peptid-Strukturen enthaltene Strukturen |
| nachgewiesene
Aminosäure
(pmol) |
Kügelchen Nr. | Untereinheitkombination | M.W.
(m/z) | 1.
Zyklus | 2.
Zyklus | 3.
Zyklus |
1 | 149 | 501,6 | L
(50) | A
(55) | G
(72) |
2 | 169 | 471,6 | L
(34) | G
(31) | G
(29) |
3 | 258 | 534,7 | A(101) | L
(83) | A
(98) |
4 | 147 | 474,6 | G
(45) | A
(41) | G
(25) |
5 | 157 | 444,6 | G
(39) | G
(30) | G
(22) |
-
Eine
Probe (800 mg) der zweiten Bibliothek (Schema XIII, untere Reihe)
wurde mit 95% TFA nach Reduktion des SCAL-Linkers versetzt, gefriergetrocknet,
in Wasser gelöst
und auf einer halbpräparativen HPLC-Säule in 44 Spitzenwerte unter
Verwendung eines Gradienten von 0-60% Acetonitril in 0,1% TFA in Wasser über einen
Zeitraum von 200 min. getrennt. Die Fraktionen wurden lyophilisiert
und mehrere Spitzenwerte mittels FAB-MS analysiert und sequenziert,
um die Entsprechung zwischen der von der codierenden Aminosäuresequenz
vorhergesagten Struktur und dem Molekulargewicht des Konstrukts
aufzuzeigen. Es folgen Beispiele von Spitzenwerten, die für die weitere
Analyse zufällig
gewählt
wurden: Spitze 4: RT 25,31 min, Sequenzierung: 1. Leu (364 pmol),
2. Gly (139), 3. Gly (422); FAB MS – 827,0 (Bausteinkombination
169); Spitze 8: RT 28,69 min, Sequenzierung: 1. Gly (261), 2. Leu
(176), 3. Ala (225); FAB MS – 770,2
(Bausteinkombination 257 ohne Baustein 7); Spitze 13: RT 31,47 min,
Sequenzierung: 1. Leu (792), 2. Leu (551), 3. Gly (128); FAB MS – 921,0
(Bausteinkombination 159); Spitze 14: RT 32,27 min, Sequenzierung:
1. Leu (7930), 2. Gly (1810), 3. Ala (1763); FAB MS – 883,0
(Bausteinkombination 269); Spitze 15: RT 32,77 min, Sequenzierung: 1.
Leu (784), 2. Ala (447), 3. Ala (360); FAB MS – 776,2 (Bausteinkombination
249 ohne Baustein 9); Spitze 16: RT 33,16 min, Sequenzierung: 1.
Leu (1286), 2. Ala (918), 3. Ala (688); FAB MS – 776,2 (Bausteinkombination
249 ohne Baustein 9); Spitze 17: RT 33,51 min, Sequenzierung: 1.
Leu (298), 2. Leu (280), 3. Ala (202); FAB MS – 826,2 (Bausteinkombination
259 ohne Baustein 9); Spitze 19: RT 34,80 min, Sequenzierung: 1.
Leu (641), 2. Gly (412), 3. Ala (460); FAB MS – 883,1. (Bausteinkombination
269); Spitze 20: RT 36,66 min, Sequenzierung: 1. Leu (150), 2. Leu
(119), 3. Leu (80); FAB MS – 902,2
(Bausteinkombination 359 ohne Baustein 9); Spitze 26: RT 41,77 min,
Sequenzierung: 1. Gly (39), 2. Gly (38), 3. Gly (23); FAB MS – 744,1
(Bausteinkombination 167); Spitze 31: RT 48,86 min, Sequenzierung:
1. Ala (180), 2. Gly (98), 3. Ala (106); FAB MS – 824,0 (Bausteinkombination
268); Spitze 32: RT 49,46 min, Sequenzierung: 1. Leu (234), 2. Leu
(320), 3. Ala (277); FAB MS – 826,1
(Bausteinkombination 259 ohne Baustein 9); Spitze 33: RT 50,70 min,
Sequenzierung: 1. Gly (152), 2. Gly (120), 3. Ala (94); FAB MS – 800,1
(Bausteinkombination 267).
-
7.2.2 SYNTHESE REPRÄSENTATIVER VERBINDUNGEN AUS
DER NICHT-PEPTID-BIBLIOTHEK
-
Ein
Bestandteil der ersten Bibliothek (A), Verbindung I:
wurde an 0,23 g Knorr-Harz
(0,5 mÄq./g)
synthetisiert. Fmoc-Trp wurde zunächst nach der allgemeinen Vorschrift
unter Verwendung von DIC und HOBt gekuppelt. Nach Entschützung der
Aminogruppe wurde α-Bromessigsäure (50
mg) unter Verwendung von DIC (50 μl)
in DMF (0,5 ml) gekuppelt. Benzylamin (100 μl) wurde in 0,5 ml DMSO gelöst und Bromharz
mit dieser Lösung über Nacht
versetzt. Die letzte Carbonsäure,
4-Pyridylthioessigsäure
(80 mg), wurde in 0,85 ml DMPT gelöst und mit DIC (80 μl) und HOBt
(80 mg) voraktiviert und 10 Stunden an Aminoharz gekuppelt. Die
Kupplung wurde zur Aktivierung mit PyBrop und DIEA wiederholt. Die
Abspaltung der Verbindung I wurde in 95% TFA erreicht. Nach der
Abspaltung wurde TFA im Vakuum verdampft und der Rest in 30% wässrigem
Acetonitril gelöst
und lyophilisiert. Das nach dem Trocknen erhaltene Produkt wurde
wieder in reinem Acetonitril gelöst
und mit Ether gefällt.
Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, wobei ein fast weißer Niederschlag
erhalten wurde. Das Produkt zeigte zwei Spitzenwerte bei der Umkehrphasen
(RP [Reverse Phase])-HPLC. Der zweite Spitzenwert ergab das erwartete
Massenspektrum der Verbindung I. Die Ausbeute an Bestandteil I nach
Aufreinigung an halbpräparativer
RP-HPLC betrug 18 mg. Formel: C
27H
27N
5O
3S,
MS erwartet 501,6, MS gefunden – 502,2
(M + H)
+.
1H NMR-Daten
(DMSO-d6): 10,804 d (1H, N
inH); B. 49 d
(2H, Pyridyl C
2H und C
6H);
8,35 d (1H, NH); 7,62 d (2H, Pyridyl C
3H
und C
5H); 6,9-7,7 mm (Bzl und Trp aromatische
Protonen); 4,59 m (1H, Trp C
αH); 3,75-4,65 m (aliphatische
Protonen); 3,19 dd und 2,91 dd (2H, Trp C
βH).
-
Ein
zweiter Bestandteil der ersten Bibliothek (Schema XII, A), Verbindung
II:
wurde nach dem gleichen Schema
wie Verbindung I synthetisiert, wobei als Untereinheiten α-Bromvaleriansäure (40 μl), 4-Methylaminopiperazin
(100 μl)
und Cyclohexylessigsäure
(80 mg) verwendet wurden. Formel: C
29H
44N
6O
3,
MS erwartet – 524,7,
MS gefunden – 525,3
(M + H)
+ 558,2 (M + Na)
+ und
573,2 (M + K)
+.
-
Der
dritte Bestandteil der ersten Bibliothek (A), Verbindung III:
wurde
nach ähnlichem
Schema wie Verbindung I synthetisiert, wobei als Bausteine α-Bromtoluolsäure (120 mg),
Fluorenylmethyloxycarbonylaminoethylmercaptan (280 mg) (Entschützung nach
Kupplung mit Piperidin/DMF) und Phenoxyessigsäure (80 mg). Formel: C
29H
30N
4O
4S, MS erwartet 530,6, MS gefunden – 553,0
(M + Na)
+.
-
7.3 DISKUSSION
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Dieses
Beispiel zeigt die Fähigkeit
zur Konstruktion von nicht-Peptid-Strukturen parallel zur codierenden
Sequenz. Der Unterschied in den Bibliotheken bestand in der Platzierung
des SCAL-Linkers, was die selektive Spaltung des Produkts gestattete.
Im ersten Fall (Schema XIII, obere Reihe) führt die Spaltung des Linkers
zur Freisetzung der nicht-Peptid-Verbindung X3-X2-X1-Trp (Trp ist zum Zweck der spektroskopischen
Beobachtung angebunden), die über
eine Lysingruppierung mit ihrer codierenden peptidischen Struktur
verbunden ist. Die Spaltung des Linkers im zweiten Fall (Schema
XIII, untere Reihe) führt
zur Freisetzung der nicht-Peptid-Verbindung X3-X2-X1-Trp ohne irgendein
gebundenes codierendes Peptid. Die Konstruktion der nicht-Peptid-Verbindung
beinhaltete (i) die Bindung von α-Brom-substituierter
Carbonsäure
oder Brommethylbenzoesäure
an die verfügbare
Aminogruppe am festen Träger,
(ii) Alkylierung einer Amino- (Zuckerman et al., 1992, J. Am. Chem.
Soc. 114:10646-10647) oder Thiolgruppe eines Amins oder N-geschützten Aminomercaptans
und (iii) Acylierung einer erzeugten Aminogruppe durch ein Carbonsäurederivat.
Für dieses
Experiment wurden die Bausteine so ausgewählt, dass dadurch die Zuordnung
der Struktur der konstruierten Suchmoleküle allein auf dem Molekulargewicht
des Konstrukts beruht (siehe Tabelle I). Der Einführung jedes
nicht natürlichen
Bausteins in die Suchstruktur folgte (bzw. ging voraus) die Kupplung
einer codierenden Aminosäure an
den anderen Arm des Moleküls.
Für die
Codierung wurden von uns lediglich Glycin, Alanin und Leucin verwendet
(diese Aminosäuren
codierten daher bei jedem Schritt der Randomisierung für ein anderes
Strukturelement). Die Zuordnung dieser Aminosäuren zu dem jeweiligen Strukturelement
ist in Schema IX angegeben. Die Alkylierung von in diesem Experiment
verwendeten Aminen oder Thiol durch an die Polymermatrix gebundene
2-Brompentansäure
führt zur
Erzeugung von Verbindungen mit einem chiralen Zentrum, wodurch die
Anzahl der Strukturkombinationen 36 statt 27 beträgt. Allerdings
werden nur 27 verschiedene Arten von Kügelchen erzeugt (mit Suchsequenzen
von unterschiedlichem Molekulargewicht), von denen 9 ein Gemisch
von diastereoisomeren Verbindungen enthalten. Zur Vereinfachung
der Analyse der Gemische und um die Fähigkeit zur Durchführung dieser
Art von Synthese am polymeren Träger
aufzuzeigen, wurden drei der möglichen Strukturen
als Einzelverbindungen neu synthetisiert, wobei die gleiche Chemie
und der gleiche Polymerträger wie
bei der Synthese der Modellbibliothek verwendet wurden.
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Die
erzeugten Gemische wurden vom Träger
nach Reduktion des SCAL-Linkers abgespalten und mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert.
Die erhaltene Anzahl von Spitzenwerten entspricht ungefähr der vorhergesagten
Anzahl 36. Einzelne Spitzenwerte vom ersten Bibliothekstyp wurden
gesammelt. Ein Teil jeder gesammelt Fraktion wurde dem Edman-Abbau
unterzogen und ein Teil wurde durch Massenspektroskopie analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen
die Korrelation der Sequenzbestimmung mit der Molekulargewichtsbestimmung
mittels Massenspektroskopie, wodurch die Realisierbarkeit des Prinzips
der Codierung mittels Peptidsequenz bestätigt wird (Tabelle 2).
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Eine
alternative Analyse wurde an zufällig
ausgewählten
Kügelchen
aus der zweiten Bibliothek durchgeführt. Einzelne Kügelchen
wurden dabei mit einem Reduktionsmittel versetzt, um den SCAL-Linker
labil zu machen, und die nicht-Peptid-Struktur wurde durch ein TFA/Wasser-Gemisch
gespalten. Nach dieser Behandlung wurden die Kügelchen erfolgreich sequenziert
(siehe Tabelle 2), und die Struktur der nicht-Peptid-Verbindung konnte
abgeleitet werden. Die abgespaltenen Verbindungen wurden an einem
Mikro-HPLC-System analysiert.
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8. BEISPIEL: BIBLIOTHEK: XXXX-Lys(XXXX)-Lys(ZZ)-βAla-Gly-βAla-Gly-TG
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Im
vorliegenden Beispiel wird die Verwendung eines codierenden Peptids
zur Codierung eines nichtsequenzierbaren Teils eines Peptids gleichzeitig
mit dem sequenzierbaren Teil des Testverbindungspeptids demonstriert.
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8.1 MATERIAL UND METHODEN
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8.1.1 SYNTHESE DER BIBLIOTHEK
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Die
Bibliothek wurde nach der folgenden Vorschrift synthetisiert. 1.
Kupplung von Fmoc-Lys(Boc) an H-βAla-Gly-βAla-Gly-TG;
2. Fmoc-Spaltung; 3. Kupplung von Fmoc-Lys(Fmoc); 4. Boc-Abspaltung;
5. Nach Aufteilung des Harzes in neun Teile wurden die folgenden
Ddz-geschützten Aminosäuren in
getrennten Reaktionen gekuppelt: A, D, I, K, M, N, S, T, V; 6. Fmoc-Spaltung;
7. Kupplung von neun Fmoc-geschützten
Aminosäuren:
Y, G, F, L, H, P, Q, R, E (Y wurde an denjenigen Teil des Harzes
gekuppelt, an den bereits A gebunden war, usw.); 8. Harz vereinigt
und Ddz abgespalten; 9. Wiederholung der Schritte 5-7; 10. Fmoc-Abspaltung;
11. Kupplung von neun Fmoc-geschützten
Aminosäuren:
Y, G, F, L, H, P, Q, R, E; 12. Wiederholung der Schritte 10-11;
13. Fmoc-Abspaltung;
14. Seitenkettenschutzgruppen und Ddz durch Gemisch K abgetrennt
(King et al., 1990, Int. J. Pep. Protein Res. 36:255-266).
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Ein
Kügelchen
wurde 4 Zyklen Edman-Abbau unterzogen: 1. Zyklus: Arg (64), Ile
(67); 2. Zyklus: Gly (45), Thr (14); 3. Zyklus: Phe (42); 4. Zyklus.
Arg (35). Ile war für
die Kupplung Ddz-geschützt
und fand sich im ersten Zyklus. Es codierte für Phe, das im dritten Zyklus
nachgewiesen wurde. Im zweiten Zyklus wurde Thr als diejenige Aminosäure, die
in Ddz-geschützter
Form gekuppelt worden war, nachgewiesen. Entsprechend wurde Arg,
das von Thr codiert wurde, im vierten Zyklus der Sequenzierung gefunden.
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8.1.2 VORSCHRIFT ZUM ABSUCHEN DER BIBLIOTHEK
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Die
Peptidbibliothek wurde gemäß veröffentlichten
Verfahrensweisen abgesucht (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15).
Die Peptidkügelchen
wurden zunächst
mit doppelt destilliertem Wasser zur Abtrennung des DMF gemischt.
Nach ausgiebigem Waschen mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM
Na2HPO4, 1,4 mM
KH2PO4, pH 7,2)
wurden die Kügelchen
mit 0,05% Gelatine (w/v) beschichtet, um eine eventuelle nichtspezifische
Bindung zu blockieren. Die Kügelchen
wurden dann mit einer 1:100.000 verdünnten Lösung von 2 mg/ml Streptavidin-alkalische
Phosphatase 2 mg/ml (Pierce; Rockford, IL) in 2 × PBS/Tween/Gelatine (2 × PBS, 0,1%
Tween-20 (v/v) und 0,05% Gelatine (w/v)) inkubiert. Anschließend wurden
die Kügelchen gründlich mit
TBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 25 mM Tris-Base, pH 7,4) gewaschen
und mit dem Standardsubstrat 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat versetzt. Die Kügelchen
wurden dann zusammen mit dem Substrat auf Petrischalen zur Farbentwicklung überführt. Nach
30 Minuten bis 1 Stunde wurden die gefärbten Kügelchen gesammelt, und zwar
mit Hilfe einer Mikropipette, mit 6 M Guanidinhydrochlorid, pH 1,0,
gewaschen und wie beschrieben der Sequenzierung unterzogen.
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Die
verbliebene Bibliothek aus farblosen Kügelchen wurde dann mit 8 M
Guanidinhydrochlorid, pH 2,0, wiederaufbereitet, gründlich mit
PBS gewaschen und mit 60 pM biotinyliertem anti-β-Endorphin (Klon 3-E 7, Boehringer
Mannheim) über
Nacht in 2 × PBS/Tween/Gelatine
inkubiert. Nach gründlichem
Waschen wurde Streptavidin-alkalische Phosphatase zugegeben. Eine
Stunde später
wurden die Kügelchen
gewaschen, mit Substrat versetzt, woraufhin die Farbentwicklung
wie oben beschrieben erfolgte. Die gefärbten Kügelchen wurden dann physikalisch
isoliert und der Sequenzierung unterzogen. Bei diesen beiden Experimenten
wurden lediglich die dunkelsten Kügelchen sequenziert.
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8.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
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In
den Abschnitten 6 und 7 oben wird gezeigt, dass eine „Testverbindung" von einer „codierenden" Peptidsequenz codiert
werden kann. Dieses Prinzip lässt
sich auch zur Bestimmung der Struktur von Peptiden, die eine nichtsequenzierbare
Komponente innerhalb ihrer Peptidkette enthalten, verwenden. In
diesem Fall muss nur für
die am Carboxylterminus des Moleküls nach dem nichtsequenzierbaren
Teil lokalisierten Aminosäurereste
codiert werden. Von uns wurde eine Bibliothek konstruiert, die diese
Situation nachahmt, obwohl die „Testverbindung" tatsächlich keine
nichtsequenzierbare Komponente enthält. Die Struktur der Bibliothek
ist in Schema XIV angegeben.
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Die
Aminosäurereste
X
4 und X
3 im „Testverbindungs"-Arm werden von keinem
Gegenstück
im „codierenden" Arm codiert. Die
Aminosäuren
Z
1 und Z
2 codieren
für den
Rest X
1 und X
2 und
liegen mit einer halb so hohen Konzentration wie die Aminosäuren in
der „Test"-Sequenz vor. Die
Struktur des Peptids von Interesse lässt sich mit zwei Zyklen Edman-Abbau
aufdecken. Die in größerer Menge
nachgewiesene Aminosäure
ist der Rest von Position 1 oder 2 der „Test"-Sequenz. Bei der in geringerer Menge
nachgewiesenen Aminosäure handelt
es sich um den für
Position 4 oder 3 dieser Sequenz codierenden Rest. Bei der codierenden
Aminosäure
kann es sich um die gleiche handeln, für die sie codiert, oder sie
kann von dieser verschieden sein. Der codierende Satz und der Suchsatz
der Aminosäuren,
die in diesem Beispiel verwendet wurden, sind in Schema XIV angegeben. Tabelle 3
Ergebnisse
der Sequenzierung |
1.
Zyklus | 2.
Zyklus | abgeleitete
Sequenz | Ziel |
Y,D | G,I | YGGF | anti-β-Endorphin |
Y,N | G,I | YGPF | anti-β-Endorphin |
Y,D | G,K | YGGL
(3×) | anti-β-Endorphin |
H,S | P,I | HPQF
(5×) | Streptavidin |
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Die
Synthese der Bibliothek wurde unter Verwendung einer Kombination
aus drei Aminoschutzgruppen durchgeführt. Ein zeitweiliger Schutz
der α-Aminogruppe
in der „Such"-Sequenz wurde von
der Fmoc-Gruppe bereitgestellt, die durch Piperidin in Dimethylformamid
abgespalten werden kann. Ein zeitweiser Schutz der „codierenden" Sequenz wurde durch
Verwendung der Ddz-Gruppe
(Birr et al., 1972, Liebig's
Ann. Chem. 763:162-173),
die mit verdünnter
Trifluoressigsäure
(2%) abgespalten werden kann, erreicht. Die funktionellen Seitenkettengruppen
wurden durch Schutzgruppen vom tert.-Butyl-Typ geschützt, die
mit Trifluoressigsäure
höherer
Konzentration (50%) abgespalten werden können. Ein Zyklus der Randomisierung
mit Sequenz-Tagging bestand aus (i) der Aufteilung des Harzes auf
die Anzahl Reaktionsgefäße, die
der Anzahl der in diesem Schritt randomisierten Aminosäuren entspricht,
(ii) Kupplung Fmoc-geschützter
Aminosäuren
(Y, G, F, L, H, P, Q, R, E), (iii) Waschen, Abspaltung der Ddz-Gruppe
und Neutralisierung, (iv) Kupplung der entsprechenden Ddz-geschützten Aminosäuren (A,
D, I, K, M, N, S, T, V), (v) Mischen des festen Trägers und
Entschützung
der Fmoc-Gruppe.
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Diese
Bibliothek wurde bei der Suche gegen zwei Modellziele, nämlich monoklonaler
anti-β-Endorphin-Antikörper und
Streptavidin, verwendet. Positive Kügelchen wurden dabei mittels
Standardfärbetechnik (Lam
und Lebl, 1992, Immunomethods, 1:11-15; Lam et al., 1991, Nature
354:82-85) identifiziert, wobei die bei dieser Suche identifizierten
Kügelchen
(jeweils 5 pro Ziel) dann zwei Zyklen Edman-Abbau unterzogen wurden.
Die Ergebnisse der zwei Zyklen Edman-Abbau sind in Tabelle 3 angegeben.
Wie man sieht, ergaben Streptavidin-positive Kügelchen in allen Fällen H (X1) und S (Z1) (für Q, X3 codierend) im ersten Zyklus und P (X2) und I (Z2) (für F, X4 codierend) im zweiten Zyklus. Daher ließ sich die
Sequenz des Sucharms HPQF leicht entschlüsseln. Bei der anti-β-Endorphin-Suche identifizierte
Kügelchen
ergaben unterschiedlichere Ergebnisse. Neben Y (X1)
und D (Z1) (für G, X3 codierend)
wurde auch N (Z1) (für P, X3 codierend)
im ersten Zyklus gefunden, wobei G (X2)
und I (Z2) (für F, X4 codierend)
und K (Z2) (für L, X4 codierend)
im zweiten Zyklus gefunden wurden. Daher ließen sich die Sequenzen YGGL
(3×),
YGGF und YGPF aus diesen Daten konstruieren. Die Sequenzen sind
mit den bereits früher
erhaltenen Daten vereinbar (Lam und Lebl, unten; Lam et al., 1991,
unten; Lam et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett., 3:419-429).
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Diese
Experimente zeigen eindeutig, dass Peptide zur Codierung anderer
Strukturen, die teilweise oder vollständig unsequenzierbar sind,
verwendet werden können.
Diese Technologie besitzt aufgrund ihrer breiten Anwendbarkeit auf
die Untersuchung von molekularen Liganden-Akzeptor-Wechselwirkungen
und auf die Entwicklung von Arzneistoffen große Signifikanz. Codierte Bibliotheken öffnen die
Tür zur
Anwendung breiter paralleler Ansätze
zur Wirkstoffsynthese und zum Durchsuchen von nicht-Peptid-Bibliotheken.
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9. BEISPIEL: BIBLIOTHEKEN VON NICHT-PEPTID-STRUKTUREN
AUF DER GRUNDLAGE DER FESTPHASENPEPTIDSYNTHESECHEMIE
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Im
vorliegenden Beispiel wird die Einfachheit der Synthese von Peptidstrukturen
mit der bei Verwendung alternativer Untereinheiten neben den Standardaminosäuren verfügbaren Vielfältigkeit
kombiniert. Die einfachsten Untereinheiten für die Konstruktion der Bibliothek
werden in Abschnitt 5.5.9 oben erörtert.
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Die
Synthese der vorliegenden Bibliothek beinhaltet die Verwendung trifunktioneller
Aminosäuren
und die Modifikation einer Seitenkette zur Erzielung der strukturellen
Vielfältigkeit.
Dabei stellen Aminosäuren
wie etwa Diaminobuttersäure,
Asparaginsäure,
Cystin und/oder Iminodiessigsäure
die kleinsten Untereinheiten dar, an deren Seitenketten Carbonsäuren, Amine,
Isocyanate oder Halogenide (aliphatisch, aromatisch, heterocyclisch)
gebunden werden können.
Diese Aminosäuren
können
selbst als Gerüst
für die
weitere Derivatisierung dienen.
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Zur
Erreichung einer angemessenen Bindung an einen Akzeptor (z.B. Rezeptor,
Antikörper,
Enzym, Nukleinsäure
usw.) muss die entsprechende räumliche
Anordnung der wechselwirkenden Strukturen realisiert werden. Die
lineare Präsentation
von Aminosäureseitenketten
in Peptidbibliotheken dürfte
dabei kein optimales Format für
die Auswahl der am besten bindenden Strukturen darstellen. Die optimale
Strategie zur Präsentation
der wechselwirkenden Strukturen dürfte ihre Platzierung auf einem
molekularen Gerüst
sein, wodurch der entsprechende Konformationsraum kartiert würde. Die
Beziehungen der gleichen einzelnen Bausteine untereinander in der
Gerüststrukturanordnung
lassen sich durch Verwendung unterschiedlicher Gerüststrukturen ebenso
wie unterschiedlicher Seitenketten variieren.
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9.1 MATERIAL UND METHODEN
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9.1.1 GERÄTE
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FAB
(Fast Atom Bombardment)-Massenspektroskopiemessungen wurden am ZAB
EQ-Spektrometer (VG Analytical Ltd, Manchester, UK) durchgeführt. 1H-NMR-Spektren wurden mit einem General
Electric (Fullerton, CA)-QE
300-Gerät
gewonnen. Die Sequenzierung mittels Edman-Abbau wurde am Proteinsequenziergerät ABI 4778
(Applied Biosystems Foster City, CA) und einem Porton PI 3010-Gerät (Porton
Instruments, Tarzana, CA) durchgeführt. Sowohl die analytische
als auch die präparative
HPLC wurden am System 625 LC von Waters mit einem Waters 490E Programmable
Multiwavelength Detector unter Verwendung von Vydac Peptide und
Protein C18 analytischen (4,6 × 250
mm, 5 μm,
1 ml/min.) bzw. präparativen
(10 × 250
mm, 10 μm,
3 ml/min.) Säulen
durchgeführt.
Die Analysen von von einem einzigen Kügelchen freigesetzten Gemischen
wurden am Ultrafast Microprotein Analyzer (Michrom BioResources,
Pleasanton, CA) unter Verwendung einer Reliasil C18-Säule (5 μM, 300 A, 1 × 150 mm) durchgeführt. Alle
Spektren sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan (δ) mit entweder
CDCl3 oder CD3SOCD3 als Lösungsmittel
angegeben. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden am HP 8452A Diode-Array-Spektrophotometer
von Hewlett Packard unter Verwendung einer 1-cm-Quarzcuvette aufgezeichnet.
Die Aminosäureanalysen
wurden am System D-500 (Durrum Corp., Palo Alto, CA) durchgeführt.
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9.1.2. VERFAHRENSWEISEN
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Die
Festphasensynthese wurde manuell in Polypropylenspritzen, wie von
Krchnak und Vagner (1990, Peptide Res. 3:182-193) beschrieben durchgeführt. Synthesen
wurden an mit einem SCAL-Stiel (Patek und Lebl, 1991, Tetrahedron
Lett. 32:3891-3894) (Safety-Catch-Amidlinker)
oder mit einem entsprechenden Linker modifiziertem TentaGel S NH2 (TG)-Harz (Rapp Polymere, Tübingen,
Deutschland, 130 oder 80 μm,
0,23 mmol/g) durchgeführt.
Die Abspaltungen der Fmoc-Schutzgruppen erfolgten mit 50% Piperidin/DMF über einen
Zeitraum von 1 × 10
min., TFA-Gruppen durch wiederholte Behandlung (3 × 1 min.
+ 90 min.) mit 10% Piperidin/Wasser. Npys-Gruppen wurden mit einer Lösung von
0,3 M HCl in Dioxan 5 + 30 min. abgetrennt, die Aloc-Gruppe mit
(Ph3P)4Pd in DMF/AcOH/N-Me-Morpholin
(10:2:1) und Boc-Gruppen wurden mit 30% TFA/DCM mit 3% Anisol 20
min. abgespalten. Für
die Neutralisierung nach der Boc-Abspaltung wurde eine Lösung von
DIEA/DCM (10%) verwendet. Für
die Aktivierung sowohl von Nα-Fmoc-
als auch Boc-Aminosäuren wurde
ein Gemisch aus BOP/HOBt/DIEA (1:1:2 Äq.) in DMF verwendet. Die Vollständigkeit
der einzelnen Kondensationsreaktionen (1,5-40 Std.) wurde jeweils
mit dem Ninhydrintest oder bei Kupplung an sekundäre Aminogruppen
dem Chloraniltest überprüft. Die
Kupplungsvorschrift beinhaltete das Waschen mit DMF (6-8 mal) (mit anschließendem Waschen
mit DCM bei Boc-geschützten Aminosäuren) zwischen
der Kupplung und der Entschützung
sowie zwischen der Entschützung
und der Kupplung. Die Reduktion des SCAL-Linkers wurde über 2 Stunden
mit 20% (EtO)2P(S)SH in DMPU durchgeführt. Die
endgültige
Spaltung erfolgte mit einem Gemisch aus 95% TFA und 5% Wasser.
-
9.1.3 REAGENZIEN
-
Es
wurden Lösungsmittel
im handelsüblichen
Reinheitsgrad ohne weitere Aufreinigung eingesetzt. Geschützte Aminosäuren wurden
von Bachem (Torrance, CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY) oder
Propeptide Vert-le-Petit, Frankreich) bezogen. Amine und Carbonsäuren wurden
von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen.
-
9.1.4 SYNTHESE EINER NICHTPEPTIDISCHEN
BIBLIOTHEK AN NICHTPEPTIDISCHEN GERÜSTSTRUKTUREN
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Mono-tert.-butyloxycarbonylethylendiamin.
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Diese
Verbindung wurde wie bereits beschrieben dargestellt (Krapcho et
al., 1990, Synthetic Commun. 20:2559-2564). Kurz gesagt wurde dabei
eine Lösung
von tert.-Butyldicarbonat
(5,0 g, 0,023 mol) in Dioxan (50 ml) langsam zu Ethylendiamin (11,0
ml, 0,165 mol) in Dioxan (60 ml) gegeben. Nach 24 Stunden Rühren wurde
das Lösungsmittel
abgezogen und der Rückstand
in Wasser (80 ml) gelöst,
unlösliches
Nebenprodukt abfiltriert und das Filtrat mit Dichlormethan (3 × 100 ml)
extrahiert. Nach Abziehen des Lösungsmittels
wurde das Produkt aus einem Lösungsmittelgemisch
aus Diethylether-Petrolether oder Essigester-Petrolether kristallisiert.
Ausbeute: 2,6 g (71%). NMR (300 MHz, DMSO-d6,
25°C) d:
1,39 (s, 9H, tBu), 2,83 (m, 2H, CaH2), 3,16 (q, 2H, CbH2), 6,93 (t, 1H, NH), 7,77 (br, 2H, NH2). Fp. 75°C.
-
N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin.
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Eine
Lösung
von Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (31,0 g, 0,092 mol) in Acetonitril
(300,0 ml) wurde langsam zu mono-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin (10,0
g, 0,063 mol), gelöst
in 10% aq. Na2CO3 (250
ml), gegeben. Acetonitril wurde abgezogen und das Produkt mit Essigester
extrahiert, die organische Phase über Na2CO3 getrocknet, eingeengt und das Produkt durch
Zugabe von Petrolether auskristallisieren gelassen. Das Produkt
wurde auf einem Filter gesammelt und mit Petrolether gewaschen.
Ausbeute: 20,0 g (84%). DC mit Petrolether – Diethylether 88:12 Rf 0,64. NMR (300 MHz, DMSO-d6,
25°C) d:
1,37 (s, 9H, tBu), 2,99 (m, 4H, CH2CH2), 4,20-4,29 (m, 3H, Fmoc OCH2CH–), 6,76
(t, 1H, NH), 7,25 (t, 1H, NH), 7,33-7,89 (m, 8H, Fmoc). Fp. 146-148°C.
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mono-N-Fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin-trifluoracetat.
-
N-tert.-Butyloxycarbonyl-N'-fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin
(20,0 g, 0,052 mol) wurde mit Trifluoressigsäure und Anisol in Dichlormethan
(10:10:1) 1 Stunde bei Raumtemperatur versetzt. Nach Einengen bis
zur Trockne wurde das Rohprodukt aus einem Lösungsmittelgemisch von Essigester-N-hexan
kristallisiert. Ausbeute: 15,0 g (73%). NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C)
d: 2,85 (m, 2H, CaH2),
3,22 (m, 2H, CbH2), 4,23-4,36
(m, 3H, Fmoc OCH2CH–), 7,37 (m, 1H, NH), 7,34-7,89
(m, 8H, Fmoc), 7,77 (br, 2H, NH2). Fp. 128-129°C.
-
cis,cis-1,3,5-Trimethylcyclohexan-5-carbonsäure-1,3-dicarbonsäureanhydrid
(1).
-
Verbindung
(1) wurde wie beschrieben dargetellt (Askew et al., 1989, J. Am.
Chem. Soc., 111:1082-1090). Kurz gesagt wurde dabei cis,cis-1,3,5-Trimethylcyclohexan-1,3,5-tricarbonsäure (1,0
g, 0,004 mol) in Xylol (50 ml) unter Stickstoff 19 h am Rückfluss
erhitzt, und zwar unter Verwendung eines Firestone-Ventils und einer
Dean-Stark-Falle. Die erhaltene Lösung wurde im Vakuum eingeengt
und das Produkt kristallisieren gelassen. Nach Sammeln auf einem
Filter wurde das Produkt im Vakuum 1 h bei 70°C getrocknet. Ausbeute: 0,78
g (82%). NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C) d: 1,10
(s, 3H, CH3), 1,16 (s, 6H, 2CH3),
1,33, 2,39 (d, d, 4H, 2CH2), 1,33, 2,15
(d, d, 2H, CH2), 12,60 (s, 1H, COOH). Fp.
252-253°C,
Lit. (32) Fp. 252-254°C.
-
5-(N-tert.-Butyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-cis,cis-1,3,5-trimethylcyclohexan-1,3-dicarbonsäure (2).
-
Das
Säureanhydrid
(1) (0,5 g, 0,002 mol) wurde in DMF (4 ml) gelöst und mit in DMF (4 ml) gelöstem Mono-tert.-butyloxycarbonylethylendiamin
(0,33 g, 0,002 mol) unter Stickstoff versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde
etwa 5 Stunden (Verfolgen mit DC) gerührt und das DMF anschließend abgezogen.
Das Produkt wurde aus einem Lösungsmittelgemisch
von Essigester-Petrolether
kristallisiert. Ausbeute: 0,38 g (47%). NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C)
d: 1,08 (s, 3H, CH3), 1,13 (s, 6H, 2CH3), 1,34 (s, 9H, tBu), 1,07, 2,51 (d, d,
4H, 2CH2), 2,43 (d, 2H, CH2),
2,96 (m, 4H, 2CH2), 6,70 (t, 1 h, NH), 7,71
(t, 1H, NH), 12,10 (s, 1H, COOH). Fp. 161-164°C.
-
5-(N-tert.-Butyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-cis,cis-1,3,5-trimethylcyclohexan-1,3-dicarbonsäureanhydrid
(3).
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Dicyclohexylcarbodiimid
(0,55 g, 0,002 mol) wurde unter Stickstoff zu der Lösung von
Disäure
(2) (1,0 g, 0,0025 mol) in DCM (70 ml) gegeben. Nach 4 stündigem Rühren wurde
der Reaktionsansatz eingeengt und Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.
Das Filtrat wurde bis. zur Trockne eingeengt und der Rückstand
aus einem Lösungsmittelgemisch
von Essigester-Petrolether
kristallisiert und im Exsikkator (KOH, P2O5) im Vakuum getrocknet. Ausbeute 0,9 g (95%).
-
5-(N-tert.-Butyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-3-(N-fluorenylmethyloxycarbonylaminoethylcarboxamid)-cis,cis-1,3,5-trimethylcyclohexan-1-carbonsäure (4).
-
Das
Anhydrid (3) (0,85 g, 0,002 mol) wurde in DMF (10 ml) gelöst und mit
einer Lösung
von Mono-N-fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamintrifluoracetat
(0,88 g, 0,002 mol) in DMF (15 ml) in Gegenwart von Triethylamin
(auf pH 8,5 eingestellt) unter Stickstoff versetzt. Der Reaktionsansatz
wurde 4 Stunden gerührt
(Verfolgen mit DC) und danach zur Trockne eingeengt. Das Rohprodukt
wurde einer Flash-Chromatographie (Silica Gel Merck 60, 230-400
mesh) im Lösungsmittelsystem
DCM-MeOH 25:1 unterzogen. Reines Produkt enthaltende Fraktionen
wurden vereinigt, zur Trockne eingeengt und das Produkt wurde aus
einem Lösungsmittelgemisch
von Essigester-Petrolether
kristallisiert. Ausbeute: 0,32 g (24%). NMR (300 MHz, DMSO-d6, 25°C)
d: 1,08 (s, 6H, 2CH3), 1,14 (s, 3H, CH3), 1,35 (s, 9H, tBu), 4,25 (m, 3H, Fmoc
OCH2CH–),
6,86 (t, 1H, NH), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc). Fp. 118-121.
-
Nichtpeptidische Bibliothek
an nichtpeptidischer Gerüststruktur.
-
Die
Verbindung (4) wurde als Gerüststruktur
für eine
nichtpeptidische Bibliothek verwendet. An TentaGel S NH
2 (0,4
g, Substitution 0,21 mÄquiv.
NH
2/g) wurde eine Festphasensynthese nach
der folgenden Vorschrift durchgeführt:
Schritt
Reagenz | Zeit |
1 | 5%
DIEA/DMF | 2 × 5 min. |
2 | DMF-Waschschritt | 10 × 2 min. |
3 | Fmoc-Lys(Boc)/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
4 | Wiederholung
von Schritt 2 | |
5 | DCM | 10 × 2 mm. |
6 | TFA/DCM/Anisol | 1 × 30 min. |
7 | Wiederholung
von Schritt 5 | |
8 | 5%
DIEA/DCM | 3 × 2 min. |
9 | Wiederholung
von Schritt 2 | |
10 | Harz
wurde in 20 Portionen eingeteilt und die unten angegebenen Säuren gekuppelt.
Dabei wurden Anhydride als solche verwendet und andere Carbonsäuren unter
Verwendung des BOP-Reagenz gekuppelt.
Pivalinsäure
Phenylessigsäure
Diphenylessigsäure
1-Adamantanessigsäure
Z-Gly
ClZ-β-Ala
ClZ-Aminocapronsäure
diBoc-Guanidinessigsäure
diBoc-ε-Guanidinpentansäure
Succinamidsäure
Furan-2-carbonsäure
p-Hydroxybenzoesäure
Isonicotinsäure
4-Phenylbuttersäure
Essigsäureanhydrid
n-Buttersäureanhydrid
n-Capronsäureanhydrid
Benzoesäureanhydrid
Bernsteinsäureanhydrid
Glutarsäureanhydrid | |
11 | Wiederholung
von Schritt 2 | |
12 | 50%
Piperidin/DMF | 10
min. |
13 | Wiederholung
von Schritt 2 | |
14a | Verbindung
4/DIC/HOBt | 30
min. (Voraktivierung) |
14b | Produkt
aus Schritt 14a | bis
Kaiser Test negativ ist |
15 | Wiederholung
von Schritt 11-13 | |
16 | Harz
in 20 Portionen geteilt und die in Schritt 10 definierten Säuren gekuppelt.
Anhydride wurden als solche verwendet, und andere Carbonsäuren wurden
zunächst
durch ein DIC/HOBt-Gemisch
voraktiviert. | |
17 | DMF-Waschschritt | 10 × 2 min. |
18 | DCM | 3 × 2 min. |
19 | TFA/DCM/Anisol | 1 × 30 min. |
25 | DCM | 5 × 2 min. |
26 | 5%
DIEA/DCM | 3 × 2 min. |
27 | DMF-Waschschritt | 4 × 2 min. |
28 | Harz
in 20 Portionen geteilt und die in Schritt 10 definierten Säuren gekuppelt.
Anhydride wurden als solche verwendet, und andere Carbonsäuren wurden
zunächst
durch ein DIC/HOBt-Gemisch
voraktiviert. | |
29 | DMF-Waschschritt | 10 × 2 min. |
30 | DCM-Waschschritt | 3 × 2 min. |
31 | TFA/TFMSA/TA | 30
min. |
32 | DCM-Waschschritt | 3 × 2 min. |
33 | DMF-Waschschritt | 5 × 2 min. |
-
9.1.5 VERZWEIGTE BIBLIOTHEK AN TENTAGEL
-
TentaGel
S NH
2 (5 g, 0,23 mmol/g, Kügelchengröße: 130 μm) wurde
in DMF vorgequollen und die verzweigte Bibliothek gemäß der folgenden
Vorschrift aufgebaut: (1) Kupplung von SCAL-Linker; (2) Entschützung von
Fmoc; (3) Kupplung von Fmoc-Lys(Tfa); (4) Entschützung von Fmoc; (5) Kupplung
von Fmoc-β-Ala; (6)
Entschützung
von Fmoc; (7) Kupplung von Fmoc-Lys(Boc); (8) Entschützung von
Fmoc; (9) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(10) Entschützung
von Boc; (11) Erste Randomisierung; (12) Entschützung von Fmoc; (13) zweite Randomisierung;
(14) Entschützung
von Tfa; (15) Kupplung von Fmoc-Lys(Tfa); (16) Entschützung von
Fmoc; (17) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(18) Entschützung
von Fmoc; (19) dritte Randomisierung; (20) Entschützung von
Tfa; (21) vierte Randomisierung; (22) Entschützung von Seitenketten. Bei
jeder Randomisierung wurden die folgenden Säuren gekuppelt: Essigsäure, n-Buttersäure, Pivalinsäure, n-Capronsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Phenylbuttersäure, Diphenylessigsäure, 1-Adamantanessigsäure, Bersteinsäure, Glutarsäure, Glycin, β-Alanin,
epsilon-Amino-n-capronsäure,
Guanidinessigsäure,
gamma-Guanidinbuttersäure,
Succinamidsäure,
p-Hydoxybenzoesäure,
Furan-2-carbonsäure
und Isonicotinsäure.
Diese Untereinheiten sowie die entsprechenden, jeweils dafür codierenden
Aminosäuren
sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Die Aminosäuren wurden,
wenn im Handel erhältlich,
wie Anhydride gekuppelt (10 Äq.
Anhydrid, 1,2 Äq.
DIEA) oder 20 min. voraktiviert (Säure 12 Äq., DIC 10 Äq., HOBt 10 Äq.). Aufgrund
ihrer sehr schlechten Löslichkeit
in DMF wurden Guanidinsäuren
(12 Äq.)
in DMF mit HOBt und LiCl gelöst
und durch DIC aktiviert. Allerdings wurde in einem Kontrollexperiment
unter diesen Bedingungen nur ca. 70 bis 80% Kupplung beobachtet.
Nach Beendigung der Synthese wurde die Bibliothek mit TFA (3×), DCM
(5×),
DMF (5×),
DMF/0,1% HCl (1:1) (3×)
und 0,02% HCl gewaschen. Tabelle 4
Schutz,
Aktivierung und Codierungsschema für Säuren |
Säure | Schutz | Aktivierung | codiert
durch |
Essigsäure | | Anhydr. | Ala |
n-Buttersäure | | Anhydr. | Asn |
Pivalinsäure | | Anhydr. | Asp |
n-Capronsäure | | Anhydr. | Glu |
Benzoesäure | | Anhydr. | Gln |
Phenylessigsäure | | DIC,
HOBt | Gly |
4-Phenylbuttersäure | | DIC,
HOBt | His |
Diphenylessigsäure | | DIC,
HOBt | Ile |
1-Adamantanessigsäure | | DIC,
HOBt | Leu |
Bernsteinsäure | | Anhydr. | Lys |
Glutarsäure | | Anhydr. | Met |
Glycin | Boc | DIC,
HOBt | Orn |
beta-Alanin | Boc | DIC,
HOBt | Phe |
ε-Amino-n-capronsäure | Boc | DIC,
HOBt | Pro |
Guanidinessigsäure | diBoc | DIC,
HOBt | Ser |
γ-Guanidinpentansäure | diBoc | DIC,
HOBt | Thr |
Succinamidsäure | | DIC,
HOBt | Trp |
p-Hydroxybenzoesäure | | DIC,
HOBt | Tyr |
Furan-2-carbonsäure | | DIC,
HOBt | Val |
Isonicotinsäure | | DIC,
HOBt1 | Nva |
-
9.1.6 VERZWEIGTE CODIERTE BIBLIOTHEK AN
TENTAGEL
-
TentaGel
S NH2 (5 g, 0,23 mmol/g, Kügelchengröße: 130 μm) wurde
in DMF vorgequollen und die verzweigte Bibliothek mit codierender
Sequenz nach der folgenden Vorschrift aufgebaut: (1) Kupplung von Fmoc-Lys(Ddz-Gly);
(2) Entschützung
von Fmoc; (3) Kupplung von Fmoc-Lys(Tfa); (4) Entschützung von Fmoc;
(5) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(6) Entschützung
von Fmoc; (7) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (8) Entschützung von
Fmoc; (9) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(10) Entschützung
von Fmoc; (11) erste Randomisierung; (12) Entschützung von Ddz getrennt in jedem
Reaktionsgefäß; (13)
Kupplung von Fmoc-geschützter
codierender Aminosäure;
(14) Entschützung
von Npys; (15) zweite Randomisierung; (16) Entschützung von
Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (17) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender
Aminosäure;
(18) Entschützung
von Fmoc vom codierenden Arm; (19) Kupplung von Ddz-Phe; (20) Entschützung von
Tfa; (21) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (22) Entschützung von
Fmoc; (23) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(24) Entschützung
von Fmoc; (25) dritte Randomisierung; (26) Entschützung von
Ddz getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (27) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender
Aminosäure;
(28) Entschützung
von Npys; (29) vierte Randomisierung; (30) Entschützung von
Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (31) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender
Aminosäure;
(32) Entschützung
von Fmoc; (33) Entschützung
von Seitenketten. Die Bibliothek wurde mit TFA (3×), DCM
(5×),
DMF (5×),
DMF/0,1% HCl (1:1) (3×)
und 0,02% HCl gewaschen.
-
9.1.7 VERZWEIGTE BIBLIOTHEK MIT CODIERUNG
AN FAST FLOW SEPHAROSE (FFS)
-
Um
eine engere Verteilung der Teilchengröße (Kügelchengröße 85-125 μm) zu erhalten, wurde FFS gesiebt
und dann für
die Peptidsynthese in ein Reaktionsgefäß gegeben und 10 mal mit DMF
gewaschen. Fmoc-Gly (2,97 g) in DMF wurde durch DIC (1,57 ml) und
HOBt (1,35 g) aktiviert und zu 10 ml FFS gegeben. Die Umsetzung
wurde durch 0,25 g Dimethylaminopyridin katalysiert und die Suspension über Nacht
geschüttelt.
Fmoc-Gly-FFS wurde 10 mal mit DMF gewaschen, Fmoc abgespalten, das
Harz mit DMF gewaschen und die Substitution gemäß der Absorption der Entschützungslösung bei
302 nm berechnet. Die Substitution betrug typischerweise 0,1 mmol/ml.
Anschließend
wurde das Gemisch aus Fmoc-β-Ala
und Boc-β-Ala
(Molverhältnis
3:1) durch DIC und HOBt aktiviert und an Gly-FFS im dreifachen molaren Überschuss
gekuppelt. FFS wurde 10 mal mit DMF gewaschen, die Fmoc-Gruppen
wurden abgetrennt und die freien Aminogruppen 10 min. mit Ac2O/Py (1:1) acetyliert. Nach 10 maligem Waschen
mit DMF und DCM wurde Boc durch TFA/DCM/Anisol (45:45:10) über 5 +
30 min. abgetrennt, FFS mit DCM (10 mal) gewaschen, mit 2% DIEA/DCM
(3 mal 1 min.) neutralisiert und 10 mal mit DMF gewaschen.
-
Die
verzweigte Bibliothek mit codierender Sequenz wurde nach der folgenden
Vorschrift aufgebaut: (1) Kupplung von Fmoc-Lys(Ddz-Gly); (2) Entschützung von
Fmoc; (3) Kupplung von Fmoc-Lys(Alloc); (4) Entschützung von
Fmoc; (5) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(6) Entschützung
von Fmoc; (7) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (8) Entschützung von
Fmoc; (9) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(10) Entschützung
von Fmoc; (11) erste Randomisierung; (12) Entschützung von Ddz getrennt in jedem
Reaktionsgefäß; (13)
Kupplung von Fmoc-geschützter
codierender Aminosäure;
(14) Entschützung
von Npys; (15) zweite Randomisierung; (16) Entschützung von
Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (17) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender Aminosäure; (18)
Entschützung
von Fmoc vom codierenden Arm; (19) Kupplung von Ddz-Phe; (20) Entschützung von
Alloc; (21) Kupplung von Fmoc-Lys(Npys); (22) Entschützung von
Fmoc; (23) Kupplung von Fmoc-β-Ala;
(24) Entschützung
von Fmoc; (25) dritte Randomisierung; (26) Entschützung von
Ddz getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (27) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender
Aminosäure;
(28) Entschützung
von Npys; (29) vierte Randomisierung; (30) Entschützung von
Fmoc getrennt in jedem Reaktionsgefäß; (31) Kupplung von Fmoc-geschützter codierender
Aminosäure;
(32) Entschützung
von Fmoc; (33) Entschützung
von Seitenketten. Die Bibliothek wurde mit TFA (3×), DCM
(5×),
DMF (5×),
DMF/0,1% HCl (1:1) (3×)
und 0,02% HCl gewaschen.
-
9.1.8 BIBLIOTHEK GEMISCHTER PEPTID- UND
NICHTPEPTIDUNTEREINHEITEN
-
Die
Bibliothek wurde an TentaGel S NH2, 90 μm (Rapp Polymere,
Deutschland) (2 g, Substitution 0,25 mmol/g, 0,5 mmol) synthetisiert.
Dabei wurde zunächst
die für
alle Sequenzen identische Sequenz Gly-βAla-Gly-βAla-Gly-Lys(Tfa)-TG unter Verwendung eines Überschusses
(5 Äq.)
an aktivierten Fmoc-Aminosäuren (DIC/HOBt-Aktivierung) synthetisiert.
Nach der N-terminalen Fmoc-Entschützung wurde
das Harz in 9 Portionen im Verhältnis
17:8:5:1:1:1:1:1:1 (36 Teile, 0,014 mmol pro Teil) geteilt. Die
Strukturen der in dieser Bibliothek verwendeten Untereinheiten sind
in 8 dargestellt, und zwar zusammen mit dem Aminosäuredipeptidcode
für jede
der Untereinheiten. Die jeweils zu den einzelnen Portionen gegebenen
Untereinheiten sind in Klammern angegeben. Diese Portionen wurden
weiter wie folgt behandelt:
17-Teile-Portion (X2 =
1-17): Fmoc-Dab(Boc)-OH wurde gekuppelt (5 Äq. Überschuss), die Boc-Seitenkettenschutzgruppe
durch TFA/DCM/Anisol (50:50:2, 15 min.) abgetrennt, und diese Portion
wurde nach den Waschschritten in 17 Teile geteilt. Die entsprechenden
Säuren
wurden an die freie Seitenkettenaminogruppe über Standard-DIC/HOBt-Aktivierung gekuppelt.
8-Teile-Portion
(X1 = 18-25): Fmoc-Asp(OBut)-OH
wurde gekuppelt (5 Äq. Überschuss),
die But-Seitenkettenschutzgruppe
durch TFA/DCM/Anisol (50:50:2, 15 min) abgetrennt, und nach den
Waschschritten wurde diese Portion in 8 Teile geteilt. Die entsprechenden
Amine wurden an die Seitenketten gemäß der unten beschriebenen Verfahrensweise
gekuppelt.
5-Teile-Portion (X2 = 30-34):
Eine Lösung
von Fmoc-IDA-Anhydrid (10 Äq.,
0,7 mmol in 2 ml DMF) wurde zum Harz gegeben und 30 min. geschüttelt. Dieser
Vorgang wurde noch einmal wiederholt, das Harz mit DMF gewaschen
und in 5 Teile geteilt. Die Amine wurden gemäß der folgenden Vorgehensweise
gekuppelt.
-
Es
folgt die allgemeine Vorgehensweise zur Kupplung von Aminen in der
Seitenkette, die für
die Verknüpfung
der Strukturen 18-25 und 30-34 verwendet wird: die harzgebundenen
Carboxygruppen (0,014 mmol pro Teil) wurden durch ein Gemisch von
DIC/HOBt (10 Äq.)
in 0,4 ml DMF 30 min. aktiviert. Dieses Gemisch wurde ohne Waschen
abgetrennt, wonach 30 Äq.
des entsprechenden Amins in 0,2 ml DMF zugegeben wurden. Im Fall
von p-Toluidin wurde für
die Neutralisierung des Hydrochlorids eine äquimolare Menge DIEA zugegeben.
Das Harz wurde 1 Stunde geschüttelt
und mit DMF gewaschen.
1-Teil-(Einzel-)Portionen (X3 = 26-29, 35, 36): Die N-Fmoc-geschützten Monoamide der Iminodiessigsäure (für Strukturen
26-29) (10 Äq.,
0,014 mmol pro Teil) sowie Fmoc-Cys(Bzl)-OH bzw. Fmoc-D-Pen(Bzl)-OH
(5 Äq., 0,07
mmol) wurden über
DIC/HOBt-Aktivierung an die Einzelportionen gekuppelt.
Weitere
Vorgehensweisen für
alle 36 Portionen: Die N-terminale
Fmoc-Gruppe wurde durch Piperidin/DMF abgespalten. Boc-Gly-OH wurde
an die Untereinheiten 1-25,
35, 36 über
DIC/HOBt-Aktivierung (5 Äq.,
0,07 mmol pro Teil) gekuppelt. Die Untereinheiten 26-34 wurden mit
symmetrischem Anhydrid von Boc-Gly-OH (10 Äq., 0,12 mmol pro Teil) in
DMF über
Nacht umgesetzt.
Codierungsverfahren: Abspaltung der Lys(Tfa)-Schutzgruppe (identisch
für alle
36 Teile): Das Harz wurde mit Wasser gewaschen und mit 20% Piperidin/H2O (zweimal, 10 + 30 min.) versetzt. Die
Harze wurden dann mit Wasser und DMF gewaschen. Anschließend wurde
das Tag für
alle Sequenzen mit der Fmoc-Strategie (DIC/HOBt-Aktivierung, 10 Äq., 0,14
mmol pro Teil) ohne Abspaltung der N-terminalen Fmoc-Schutzgruppe des
Tag synthetisiert. Die codierenden Sequenzen für das Tag sind in 8 dargestellt.
Anschließend
wurden alle 36 Portionen gesammelt, gemischt und in zwei Portionen
geteilt. Boc-Gly wurde nach der Boc-Gruppen-Entschützung in der Hauptkette ausschließlich an
eine Hälfte
gekuppelt. Beide Portionen wurden dann gemischt, die Boc-Schutzgruppe
abgetrennt und das Harz in 13 Portionen geteilt. Fmoc-Tyr(But)-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(But)-O, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH,
Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Ser(But)-OH, Fmoc-Glu(OBut)-OH, Fmoc-Asp(OBut)-OH
und Fmoc-Gln-OH (10 Äq.,
0,38 mmol) wurden über
DIC/HOBt-Aktivierung an diese 13 Portionen gekuppelt. Seitenkettenentschützung: Die
Boc- und But-Seitenkettenschutzgruppen wurden durch
TFA/DCM/Anisol (50:50:2) abgespalten (Kontaktzeit: 15 min.), wobei
die Trt-Gruppe durch das gleiche Gemisch mit Zugabe von einem Tropfen 1Pr3SiH 15 min. abgespalten
wurde. Die Pmc-Gruppe
wurde durch Gemisch K 1 Stunde abgespalten. Nach den Wasch- und
Neutralisierungsschritten (DCM, 7% DIEA/DCM, DMF) und alle 13 Portions
gesammelt und die N-terminale
Fmoc-Gruppe abgespalten. Anschließend wurde die Bibliothek mit
DMF gewaschen und in 0,1% wässrige
HCL überführt.
-
9.1.9 SUCHVORSCHRIFT FÜR DIE BIBLIOTHEK
-
Die
Peptidbibliothek wurde gemäß der veröffentlichten
Verfahrensweise (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods 1:11-15) durchsucht.
Dabei wurden die Peptidkügelchen
zunächst
mit doppelt destilliertem Wasser gemischt, um das DMF abzutrennen.
Nach ausgiebigem Waschen mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM
Na2HPO4, 1,4 mM
KH2PO4, pH 7,2)
wurden die Kügelchen
mit 0,05% Gelatine (w/v) beschichtet, um jede nichtspezifische Bindung
zu blockieren. Die Kügelchen
wurden dann mit 60 pM biotinuiertem Anti-β-Endorphin-Antikörper (Klon
3-E7, Boehringer Mannheim) in 2 × PBS/Tween/Gelatine über Nacht
inkubiert. Nach gründlichem
Waschen wurde Streptavidin-alkalische
Phosphatase zugegeben. 1 Stunde später wurden die Kügelchen
gewaschen, mit Substrat versetzt, und die Farbentwicklung erfolgte
wie oben beschrieben. Anschließend
wurden die gefärbten
Kügelchen
physikalisch isoliert und der Sequenzierung unterzogen.
-
9.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
-
Eine
alternative nichtpeptidische Gerüststruktur
beruht auf der Verwendung von Kemps Trisäure (Kemp und Petrakis, 1981,
J. Org. Chem. 46:5140-5143) (Schema XV).
-
-
In
dieser Struktur werden die drei Carboxylgruppen in die triaxiale
Konfirmation gezwungen. Anhydridsäure 1 wurde mit einem Dehydratisierungsverfahren
(Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090) unter Verwendung
einer Dean-Stark-Falle unter Stickstoff dargestellt. Dieses Säureanhydrid
wurde mittels nukleophilem Angriff durch Mono-tert-butyloxycarbonylethylendiamin
geöffnet,
wobei die Amiddisäure
2 erhalten wurde. Das gleiche Dehydratisierungsverfahren kann bei
dieser Amiddisäure
nicht angewandt werden, und zwar wegen der Instabilität der Boc-Schutzgruppe
unter diesen Bedingungen. Eine milde Alternative zur Darstellung
des Amidanhydrids 3, die der Peptidchemie eigen ist, bestand in
der Verwendung des allgemeinen Dicyclohexylcarbodiimidverfahrens
in Methylenchlorid. Das Amidanhydrid 3 wurde anschließend mit Fluorenylmethyloxycarbonylethylendiamin
zur entsprechenden Diamidsäure
4 geöffnet.
Einfach geschützte Ethylendiamine
wurden dargestellt, indem von Boc-Ethylendiamin ausgegangen wurde,
das durch Bocylierung von Ethylendiamin unter Verwendung von Dicarbonsäure-tert-butylester
dargestellt wurde (Krapcho et al., 1990, Synthesis Commun. 20:2559-2564).
Mono-Boc-ethylendiamin wurde als solches verwendet und diente ebenso
als Ausgangsverbindung für
die Darstellung von Monofluorenylmethyloxycarbonylethylendiamintrifluoracetat über N-Boc-N'-Fmoc-Ethylendiamin.
-
Die
Diamidsäure
4 kann entweder für
die Synthese der die dritte Kette mit orthogonaler Schutzgruppe (Ddz,
Alloc) und Carboxylfunktion tragenden Gerüststruktur oder selbst als
Gerüst
verwendet werden, vorausgesetzt, dass die dritte Randomisierung
separat durchgeführt
wird. Die Verwendung von 1 als Gerüststruktur wurde zur Synthese
der vollständig
nichtpeptidischen Bibliothek gewählt.
Die erste Randomisierung wurde dabei an der Lysinseitenkette durchgeführt, obwohl
für diesen
Zweck alle trifunktionalen Aminosäuren verwendet werden können, und
die zweite und dritte Randomisierung wurden an der Gerüststruktur
durchgeführt.
Unter Verwendung dieser Gerüststruktur
mit erzwungener Konformation wurde eine mit 20 verschiedenen Carbonsäuren randomisierte
Nichtpeptidbibliothek aufgebaut.
-
Bei
einer einen größeren Konformationsraum
kartierenden Gerüststruktur
handelt es sich um eine durch aufeinanderfolgende Kupplung von Diaminocarbonsäuren konstruierte
einfache verzweigte angebundene Struktur. Verschiedene Typen des
weiten Gerüststrukturkartierungsraums
stellen flexible cyclische oder verzweigte Gerüststrukturen dar. Die Grundlagen
dieser Bibliotheken sind allgemein in 4 dargestellt.
-
Schema
XVI zeigt ein spezifisches Beispiel für eine solche Bibliothek:
-
-
Die
Synthese dieser Gerüststruktur
erforderte die Verwendung von vier unabhängigen (orthogonalen) Schutzgruppen.
Dabei wurde von uns die Verwendung der Trifluoracetylgruppe getestet,
die in den 50er Jahren in die Peptidchemie eingeführt wurde
(Schallenbert und Calvin, 1955, J. Am. Chem. Soc. 77:2779), jedoch aufgrund
der für
ihre Entschützung
benötigten
harschen Bedingungen ebenso wie aufgrund ihrer. Unwirksamkeit als
Schutz gegen Razemisierung bei Verwendung als α-Aminogruppenschutz nicht verwendet würde. Wir stellten
fest, dass diese Gruppe während
der Fmoc-Entschützung
unter Verwendung von 50% Piperidin in Dimethylformamid nicht abgespalten
wird, jedoch durch 1 bis 2 h Kontakt mit Piperidinlösung (20%)
in Wasser vollständig
abgespalten wird, wobei allerdings auch die Fmoc-Gruppe abgespalten
wird. Die bei der Konstruktion dieser Bibliothek verwendete Strategie
wird aus Schema XV ersichtlich.
-
Untereinheiten,
bei denen es sich nicht um Aminosäuren handelt, können mit
Standardaminosäuren kombiniert
werden. Wir konnten zeigen, dass dieser Ansatz zu sinnvollen Bindungsstrukturen
führen
kann, indem wir die Minibibliothek aus 936 Mitgliedern konstruierten,
die in Position 1 randomisierte ausgewählte Aminosäuren, in Position 2 und 3 ein
oder zwei Glycine und in Position 4 einen Satz aromatischer, an
die β-Carboxylgruppe von
Asparaginsäure
oder Seitenketten-modifizierte
Iminodicarbonsäure
gekuppelter aromatischer Amine oder an die Seitenkette von Diaminobuttersäure gekuppelte
aromatische Säuren,
oder an die Seitenkette von schwefelhaltigen Aminosäuren (Cystein
und Penicillamin) gekuppelte Benzylhalogenide aufweisen. Die Struktur
der Bibliothek ist in Schema XVII gezeigt: Schema
XVII
- Gesamtzahl an Permutationen: 936
-
Position
4, die die Nichtaminosäure-Untereinheit
enthält,
kann während
der Sequenzierung Probleme bereiten, weshalb diese Position codiert
wurde. Da bei der Randomisierung mehr als 20 Bausteine verwendet wurden,
wurde eine Dublettaminosäuren-Codierungs strategie
verwendet (8). Um Komplikationen bei der Strukturbestimmung
zu vermeiden, überlappen
die für
die Codierung verwendeten Aminosäuren
nicht mit dem für
die Randomisierung der Position 1 verwendeten Satz und der Aminosäure in Position
2. Unter Verwendung eines Dublettcodons aus sechs Aminosäuren könnten bis
zu 36 unterschiedliche Bausteine codiert werden.
-
Diese
Minibibliothek wurde gegen ein Modellsystem, nämlich monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper, abgesucht.
Positiv reagierende Kügelchen
wurden drei Zyklen Edman-Abbau unterzogen, wobei die von den erhaltenen
Daten abgeleiteten wechselwirkenden Strukturen in Schema XVII angegeben
sind. Die Struktur des natürlichen
Liganden für
den monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper ist
ebenso in Schema XVIII dargestellt:
-
-
Verbindungen,
die auf der Grundlage der Bindung mit dem monoklonalen Anti-β-Endorphin-Antikörper ausgewählt wurden,
wurden in an die Kügelchen
gebundener Form sowie in freier Form synthetisiert und ihre Bindungsaffinitäten bestimmt.
An Kügelchen
gebundene Sequenzen zeigten spezifische Bindung (mit Leucin-Enkephalin kompetierbar).
Wie man sieht (Schema XVIII), erfordert die Bindung an den Antikörper zwei aromatische
Gruppen im passenden Abstand. Die diese beiden aromatischen Gruppen
verbindende Struktur ist trotzdem für die Bindungsaffinität sehr wichtig.
-
10. BEISPIEL: SELEKTIVE AKTIVIERUNG FUNKTIONELLER
GRUPPEN AUF DER OBERFLÄCHE
EINES HARZKÜGELCHENS
-
Im
vorliegenden Beispiel wird die Herstellung eines Festphasenträgerpartikels
mit einer Partikel"oberfläche", die vom "Inneren" des Trägers physikalisch
getrennt ist, sowie die Synthese der Suchstruktur auf der Oberfläche und
des codierenden Moleküls
im Inneren des Kügelchens
beschrieben. In diesem Sinne sollte man die Oberfläche als
denjenigen Teil des Kügelchens
verstehen, der für
das makromolekulare Akzeptormolekül zugänglich ist. Bei einem Akzeptormolekül mit extrem
hohem Molekulargewicht entspricht die verfügbare Oberfläche des
Kügelchens
ungefähr
dem auf der Grundlage der Abmessungen des Kügelchens berechneten Oberflächenbereich.
Als Alternative lässt
sich bei Akzeptormolekülen
mit geringem Molekulargewicht der Oberflächenbereich mit verschiedenen
Verfahren unter Nutzung des Eindringens in ein Material (einschließlich der
inneren Oberfläche
aller Poren im Polymerkügelchen)
bestimmen. Verständlicherweise
werden eventuelle Unterschiede zwischen der Oberfläche und
dem Inneren des Polymerpartikels von Akzeptormolekülen, die
das Polymernetzwerk frei durchdringen können, nicht erkannt. Die verfügbare Oberfläche des
Partikels umfasst ebenso eine dynamische Komponente.
-
10.1 MATERIAL UND METHODEN
-
10.1.1 ENTFERNEN DES OBERFLÄCHENGEHALTS
DES PEPTIDS VOM FESTPHASENKÜGELCHEN
-
Modellpeptide
(YGGFL, LHPQF, LHPQYG) wurden an TentaGel AM (Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland,
0,21 mmol/g), mit dem daran gebundenen Linker β-Ala-Gly-β-Ala-Gly synthetisiert. Die
Synthese wurde mit der Standard-Festphasentechnik
unter Nutzung von Fmoc-geschützten
Aminosäuren
und von Diisopropylcarbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol
als Kupplungsreagenz durchgeführt.
Die Peptide wurden in zwei Schritten unter Verwendung von Trifluoressigsäure mit "Scavenger"-Molekülen (Ethandithiol, Wasser und
Thioanisol) sowie Piperidin (20%) in Dimethylformamid entschützt. Die
Kügelchen
wurden sorgfältig
gewaschen und in 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer mit pH 7,7 überführt. Nach
Zugabe von Chymotrypsin (1 mg) wurde die Suspension 20 Stunden bei
37°C geschüttelt. Die
gleiche Behandlung wurde noch zweimal für jeweils 4 Stunden wiederholt.
Durch Sequenzierung willkürlich
ausgewählter
Kügelchen
aus jeder Gruppe wurde gezeigt, dass der Peptidgehalt auf den Kügelchen
sich nicht signifikant änderte.
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10.1.2 SYNTHESE UNTERSCHIEDLICHER PEPTIDE
AUF DER OBERFLÄCHE
UND IM INNEREN DES POLYMERKÜGELCHENS
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TentaGel
AM-Harz (0,21 mmol/g, 1 g) wurde durch Ankondensation von Boc-Phe
modifiziert. Das Harz wurde gewaschen und in 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer,
pH 7,7, überführt. Die
Chymotrypsinbehandlung wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben
durchgeführt.
Nach vorsichtigem Waschen mit dem gleichen Puffer und Wasser wurde
das Harz mit Dimethylformamid gewaschen, und für die Synthese der YGGFL-Sequenz
wurde das Standard-Festphasensyntheseschema
unter Verwendung von Fmoc-Schutzgruppen und
Diisopropylcarbodiimid sowie N-Hydroxybenzotriazol
als Kupplungsreagenz verwendet. Nach der Kupplung von Fmoc-Tyr(But)
im letzten Kupplungsschritt wurde die Fmoc-Gruppe nicht abgetrennt
und das Harz mit 50% Trifluoressigsäure in Dichlormethan versetzt.
In den nächsten
Syntheseschritten wurden Bocgeschützte Aminosäuren eingesetzt. Die Kupplung
wurde mit dem gleichen Reagenz wie oben durchgeführt, die Boc-Gruppe nach jedem
Schritt durch 50% Trifluoressigsäure
abgetrennt und die protonierte Aminogruppe durch Behandlung mit
Diisopropylethylaminlösung
in Dimethylformamid (5%) für
die Kupplung verfügbar
gemacht. Die Peptide wurden in zwei Schritten unter Verwendung von
Trifluoressigsäure
mit Scavenger-Molekülen (Ethandithiol,
Wasser und Thioanisol) sowie Piperidin (20%) in Dimethylformamid
entschützt.
Die Kügelchen
wurden vorsichtig gewaschen und für die Anfärbung mit Anti-β-Endorphin
wie bereits beschrieben vorbereitet. Die Färbung der Kügelchen war von der Färbung der
lediglich die YGGFL-Sequenz enthaltenen Kügelchen nicht zu unterscheiden.
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10.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
-
Zur
selektiven Abspaltung eines Peptids von der Oberfläche eines
Kügelchens
wurde ein Enzym verwendet. Die Testsequenzen YGGFL und LHPQFYG wurden
hergestellt und mit Chymotrypsin inkubiert und die Reaktivität der Kügelchen
wurde getestet.
-
Die
behandelten Kügelchen
wurden auf Bindung an Anti-β-Endorphin
und Streptavidin getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5
Bindung
der Kügelchen
nach Behandlung mit Chymotrypsin |
|
Peptid
an Kügelchen | Bindung
an Antikörper | Streptavidin |
| kein
CT | +
CT | kein CT | +
CT |
YGGFL | 3+ | - | - | - |
LHPQF | - | - | 3+ | 2+ |
LHPQFYG | - | - | 3+ | - |
-
Kügelchen
mit YGGFL gingen die Bindungsaktivität an Anti-β-Endorphin-Antikörrer vollständig verloren
(Tabelle 5). Ebenso gingen den Kügelchen
mit LHPQF-YG die Aktivität
mit Streptavidin vollständig
verloren. Allerdings war die Abnahme der Gesamtmenge an LHPQF-YG
bzw. YGGFL minimal, was auf keine Auswirkung auf das Innere des
Kügelchens
hindeutet. In diesem Fall wurde der YG-Linker verwendet, da es sich bei
LHFQF um ein schlechtes Substrat für Chymotrypsin handelte. Der
Edman-Abbau zeigte, dass sich der Peptidgehalt auf den Kügelchen
nicht signifikant änderte.
-
Aufgrund
dieser vorläufigen
Ergebnisse wurde Chymotrypsin als selektives Entschützungsreagenz verwendet.
Ein einfaches Substrat für
Chymotrypsin, Boc-Phe,
wurde an allen verfügbaren
Aminogruppen des festen Trägers
synthetisiert. Die Inkubation dieses modifizierten Harzes unter
verschiedenen Bedingungen führte
zur Freisetzung ungefähr
der gleichen Menge an Boc-Phe: 1,1%. Die entschützte Aminogruppe wurde für die Synthese
von YGGFL unter Verwendung der Fmoc-Strategie verwendet. Der Synthese
folgte die quantitative Messung der Fmoc-Freisetzung, wobei die
abgelesenen Werte bestätigten,
dass ungefähr
1% der verfügbaren
Aminogruppen für
die Synthese verwendet wurden. Die Boc-Schutzgruppe wurde von den auf jedem Kügelchen
verbliebenen Aminogruppen durch TFA abgespalten und die Sequenz
LHPQF unter Verwendung der Boc-Synthese zusammengebaut. Alle Schutzgruppen
wurden abgetrennt, und die Tests zeigten eine positive Reaktion
sowohl mit Anti-β-Endorphin
als auch Streptavidin.
-
Willkürlich ausgewählte Kügelchen
wurden dem Edman-Abbau unterzogen, wobei die folgenden Ergebnisse
erhalten wurden (Werte in pmol): 1. Zyklus: L 114, Y < 1; 2. Zyklus: H
86, G < 1; 3. Zyklus:
P 94, G < 1; 4.
Zyklus: Q 78, F 4 (Vorschau); 5. Zyklus: F 73, L < 1. Die Analyse
des Edman-Abbaus zeigte, dass die Sequenz LHPQF auf einem Niveau
von 100-120 pmol pro Zyklus vorlag und der Gehalt an für die YGGFL-Sequenz
erwarteten Aminosäure
vernachlässigbar
war. Dies bedeutet, dass YGGFL zwar im Großteil des Kügelchens nicht vorhanden ist,
jedoch auf der Oberfläche
des Kügelchens
für die
Wechselwirkung mit dem relevanten Akzeptor zur Verfügung steht.
-
LHPQF
ist auch noch für
die Wechselwirkung mit Streptavidin verfügbar. Dies liegt wahrscheinlich
am geringeren Molekulargewicht von Streptavidin, was dessen Eindringen
ins Innere des Polymerkügelchens
gestattet.
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10.3 DISKUSSION
-
Durch
das vorliegende Beispiel wird eindeutig gezeigt, dass ein Enzym
die Oberfläche,
jedoch nicht das Innere, eines Harzkügelchens selektiv entschützen kann.
In diesem Fall verlief die Chymotrypsinspaltung der Sequenz LHPQFYG
effizient. Die Bindung des für
LHPQF spezifischen Streptavidins wurde vollständig aufgehoben.
-
Anschließende Experimente
mit einem Boc-Phe-Substrat derivatisierten Kügelchen zeigte, dass sich zwei
unterschiedliche Peptide auf einem Kügelchen synthetisieren lassen,
wobei das eine Peptid hauptsächlich
zur Oberfläche
und das andere Peptid hauptsächlich
zum Inneren segregiert wird.
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11. BEISPIEL: BEVORZUGTE BLOCKIERUNG DER
FREIEN AMINOGRUPPEN AUF DER OBERFLÄCHE EINES TENTAGELKÜGELCHENS
-
Durch
das vorliegende Beispiel wird die Durchführbarkeit der Blockierung der
Oberfläche
eines Harzkügelchens,
während
die funktionellen Gruppen im Inneren des Kügelchens für die Reaktion und Synthese
einer Verbindung, beispielsweise eines codierenden Moleküls, frei
bleiben, demonstriert.
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11.1 MATERIALE UND METHODEN
-
TentaGel-Amid
AM-Harz (0,3 mÄq./g
Substitution) wurde mehrere Stunden in H2O
hydratisiert und mit 0,1 M 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES)-Puffer,
pH 5,7, gewaschen. Verschiedene Mengen (0 bis 10 mg) Polyglutaminsäure (Mr
30 000, Sigma Chemical) wurden jeweils zu den 0,2 ml abgesetzten
Kügelchen gegeben.
Anschließend
wurde jedes Röhrchen
mit 60 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl (EDC)
versetzt. Die Reaktionsansätze
wurden über
Nacht leicht geschüttelt.
Die Kügelchen
wurden anschließend
in doppelt destilliertem (dd) H2O gewaschen,
und jede Probe wurde mit jeweils 0,24 mmol Ethanolamin plus 60 mg
EDC in MES-Puffer versetzt. Nach 4 Stunden leichtem Schütteln wurde
das Harz ausgiebig mit dd H2O gewaschen.
Anschließend
wurde das Harz zur Trockne lyophilisiert. Das behandelte Harz wurde
in Dimethylformamid (DMF) gequollen. Mittels Fmoc-Chemie wurde das
Peptid YGGFLGGG auf jeder der behandelten Harzproben unter Verwendung
von Standardtechniken synthetisiert. Die N-terminale Fmoc-Gruppe
sowie die Seitenkettenschutzgruppen wurden mit Piperidin und Trifluoressigsäure wie
beschrieben (Lam et al., 1991, Nature, 354:82-84) abgetrennt. Nach
der Neutralisierung mit Diisopropylethylamin (DIEA) wurden die Harzkügelchen
ausgiebig gewaschen und für
die Anfärbung
mit Anti-β-Endorphin
wie in Abschnitt 10 oben beschrieben vorbereitet.
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11.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
-
Die
Fähigkeit
zur Blockierung funktioneller Gruppen auf einem Harzkügelchen
mit Polyglutaminsäure war
zur Menge an verwendeter Polyglutaminsäure direkt proportional (Tabelle
6). Signifikanterweise wurde das Polyglutaminsäure-blockierte Harz nur schwach
gefärbt,
was darauf schließen
lässt,
dass die meisten der Oberflächenaminogruppen
vor der Synthese des YGGFLGGG-Peptids blockiert waren. Noch wichtiger
war jedoch, dass die Menge an Peptid sowohol im blockierten als
auch im unblockierten Harz etwa gleich war (Tabelle 7), was darauf
hindeutet, dass die Blockierung durch Polyglutaminsäure lediglich
auf der Oberfläche
des Kügelchens
stattfand und dass die im Inneren der Kügelchen vorhandenen freien
Aminogruppen für
die nachfolgende Peptidsynthese intakt blieben. Tabelle 6
Halbquantitative
Anfärbung
von Peptidkügelchen |
Ausmaß der Blockierung:
Polyglutaminsäure
mg pro 0,2 ml Harz | Markierung
mit Biotinyl-Anti-β-Endorphin
und danach mit Streptavidin-AP | Markierung
mit Streptavidin-AP allein |
0 | 3+ | - |
0,016 | 3+ | - |
0,08 | 2+ | - |
0,04 | 1+ | - |
2,0 | 1+ | - |
10 | Spur | - |
Tabelle 7
Mikrosequenzierung |
pmol Aminosäure (10
Kügelchen/Experiment)* |
| Y | G | G | F | L | G | G | G |
Polyglutaminsäure (10 mg) | I | 609 | 615 | 692 | 665 | 579 | 657 | 675 | 655 |
II | 996 | 885 | 839 | 772 | 696 | 522 | 550 | 506 |
Ohne Blockierung | I | 876 | 752 | 752 | 774 | 680 | 733 | 707 | 717 |
II | 519 | 534 | 332 | 559 | 471 | 540 | 550 | 335 |
-
Zusätzliche
Experimente beinhalteten die reversible Kupplung von Polymer, an
das Boc-Glu über
seine α-Carboxylgruppe gebunden
war. Nach der Kupplung dieses modifizierten Polymers an die Kügelchenoberfläche und
der entsprechenden Modifikation der "inneren" Aminogruppe wurde die Boc-Gruppe von
der Glutaminsäure
abgespalten. Anschließend
wurden die Kügelchen
einem Zyklus Edman-Abbau unterzogen, wodurch Aminogruppen, die durch
das Glutaminsäure-Polymerreagenz
geschützt
worden waren, regeneriert wurden. Unterschiedliche Peptide wurden
an getrennten Teilen des Kügelchens,
d.h. auf der Oberfläche
und im Inneren synthetisiert.
-
Die
vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang durch die hier beschriebenen
spezifischen Ausführungsformen
nicht beschränkt.
Tatsächlich
werden dem Fachmann aus der vorangegangenen Beschreibung und den
beigefügten
Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu
den hier beschriebenen ersichtlich. Dabei ist vorgesehen, dass derartige
Modifikationen unter den Schutzumfang der anhängigen Ansprüche fallen.
-
Vorliegend
sind verschiedene Veröffentlichungen
zitiert, deren Offenbarungen hiermit durch Bezugnahme voll inhaltlich
aufgenommen sind.
-
12. BEISPIEL: ZUR KONSTRUKTION NICHTPEPTIDISCHER
BIBLIOTHEKEN GEEIGNETE UNTEREINHEITEN
-
Die
Konstruktion nichtpeptidischer Bibliotheken erfordert die Auswahl
von für
die Einbeziehung in die Festphasensynthese geeigneten Untereinheiten.
Das vorliegende Beispiel beschäftigt
sich mit der Auswahl von für
drei unterschiedliche chemische Methoden geeigneten Untereinheiten.
-
12.1 ACYLIERUNG EINER PRIMÄREN AMINOGRUPPE
-
Experimentelle
Vorschrift: 1 mmol Säure
wurde in 2 ml DMF gelöst,
mit 0,5 mmol DIC (1 mmol im Fall von Dicarbonsäuren) versetzt und mit ungefähr 100 mg
Trp-RAM-TG über
Nacht umgesetzt. Die Vollständigkeit
der Umsetzung wurde mit dem Kaiser-Test beurteilt. Anschließend wurde
das Harz mit DMF und DCM gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde
durch einstündigen
Kontakt mit 1 ml 95% TFA, 5% Wasser gespalten. Danach wurde der
Reaktionsansatz mit 5 ml Wasser verdünnt und mittels HPLC und MS
analysiert.
-
Für ihre Akzeptanz
war erforderlich, dass die Produkte das erwartete M.W. (Molekulargewicht)
besitzen und der Gehalt des Hauptprodukts in einem Rohgemisch mehr
als 80% der Gesamtfläche
unterhalb der Kurve des HPLC-Chromatograms
beträgt
und dass das Hauptprodukt das erwartete Molekulargewicht aufweist.
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Tests von 33 Säuren dargestellt.
Von den 33 wurden 7 als zur Verwendung ungeeignet zurückgewiesen.
Zwei weitere Verbindungen, 4-Hydroxybenzoesäure und 4-Hydroxyphenylessigsäure, waren
mit der Monosynthese unter Verwendung von Tryptophan inkompatibel,
doch stellte sich heraus, dass sie in anderen Modellexperimenten
unter Verwendung der Nα-Aminogruppe von Lysin (Fmoc) verwendbar
waren.
-
-
-
12.2 NUKLEOPHILE VERDRÄNGUNG VON HALOGEN DURCH AMINE
-
Experimentelle
Vorschrift: Bromessigsäure
(5facher molarer Überschuss)
wurde über
symmetrische Anhydride 10 min. an TG130 gekuppelt und dann unter
Verwendung des gleichen Verfahrens noch mal 10 min. gekuppelt. Das
Testamin wurde unter Verwendung einer 1 M-Lösung in DMSO über Nacht
gekuppelt. Nach einem geeigneten Waschschritt wurde Fmoc-Gly eine
Stunde gekuppelt (HOBt, DIC), die Fmoc-Gruppe abgetrennt und die
Fmoc-Freisetzung
berechnet sowie mit einer theoretischen Freisetzung von 45 μmol/ml verglichen.
In einem zweiten Satz von Experimenten wurden die Reinheit und Identität von Produkten über die
Synthese der Modellverbindungen R-NH-CH2-CO-Gly-Trp-RAM-TG
getestet, die nach einer ähnlichen
Vorschrift synthetisiert und vom Harz mit 1 ml 95% TFA, 5% Wasser
1 Stunde abgespalten und danach zur Durchführung von analytischer HPLC
und MS mit etwa 5 ml Wasser verdünnt
wurden.
-
Insgesamt
wurden 33 Amine getestet, von denen sich bei 21 herausstellte, dass
sie für
die Einbeziehung in die Festphasensynthese akzeptierbar sind. Die
Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nachfolgend angegeben.
-
-
-
12.3 REDUKTIVE ALKYLIERUNG
-
12.3.1 VERALLGEMEINERTE VERFAHREN
-
Experimentelle
Vorschrift: Ein 20facher molarer Überschuss der Testaldehyde
wurde zu etwa 100 mg H-Gly-RAM-TG (Exp. A) oder H-βAla-Gly-Trp-RAM-TG
(Exp. B), vorgequollen in 1 ml MeOH-DCM-AcOH 40:10:1, gegeben, wonach
man die Reaktion über
Nacht ablaufen ließ.
Das Harz wurde mit 1% AcOH in DMF gewaschen und dann nochmals mit
einem 20fachen molaren Überschuss
des Testaldehyds über
Nacht in Kontakt gebracht. Danach wurde das Harz mit MeOH-DCM-AcOH
40:10:1 gewaschen und 1 ml dieses Ansatzes mit einem 20fachen molaren Überschuss
NaBH3CN versetzt und über Nacht reagieren gelassen.
Das Harz wurde anschließend
mit DMF/1% AcOH gewaschen und mit einem zweiten 20fachen molaren Überschuss NaBh3CN für
eine Reaktion über
Nacht versetzt. Nach dem Waschen wurden alle Proben mit Fmoc-Gly
acyliert. Im Exp. A wurde das Produkt nach Abtrennen des Fmoc mit
Fmoc-Trp acyliert. Anschließend
wurde das Harz zur Abtrennung des Fmoc behandelt, mit DMF und DCM
gewaschen, getrocknet und das Produkt anschließend mit 1 ml 95% TFA, 5% Wasser
1 Stunde abgespalten. Nach Verdünnung
mit etwa 5 ml Wasser wurden analytische HPLC und MS durchgeführt.
-
Insgesamt
wurden 31 Testaldehyde getestet, um deren Eignung für die Einbeziehung
in die Festphasensynthese zu bestimmen. Die in Tabelle 10 angegebenen
Ergebnisse deuten an, dass 19 von diesen akzeptierbar waren.
-
-
-
12.3.2 SPEZIFISCHE VERFAHREN
-
Im
Folgenden sind Verfahrensweisen angegeben, die sich spezifisch für die hinzuzufügende Untereinheit
eignen.
-
Die
Sequenz β-Ala-Gly-Trp
wurde an RAM-TG (Subst. 0,2 mmol/g) konstruiert. Die terminale Aminogruppe
wurde dann unter Verwendung des reduktiven Aminierungsverfahrens
mit einem Satz aliphatischer, aromatischer und heterocyclischer
Aldehyde alkyliert. Die N-alkylierten
Peptide wurden vom Harz mit 95% TFA – 5% H2O
abgespalten und die Reinheit sowie das korrekte Molekulargewicht
der erhaltenen Verbindungen unter Verwendung von HPLC und Massenspektroskopie
bestätigt.
-
Verfahren 1
-
- Lösungsmittelgemisch
1 Dichlormethan-Methanol-Essigsäure
80:20:1
- Lösungsmittelgemisch
2 Dimethylformamid-Essigsäure
100:1
-
Bildung
der Schiff-Base: 50 mg H-β-Ala-Gly-Trp-TentaGel
S RAM, 3× mit
Lösungsmittelgemisch
1 gewaschen, wurden mit 200 μl
dieses Gemischs sowie 0,2 mmol Aldehyd versetzt. Das Harz wurde
2 Stunden geschüttelt,
dann 3× mit
Lösungsmittelgemisch
2 gewaschen. Danach wurden weitere 0,2 mmol Aldehyd zusammen mit
200 μl Lösungsmittelgemisch
2 zugegeben, und nach 2 Stunden Schütteln wurde das Harz 3× mit Lösungsmittelgemisch
2 und 3× mit
Lösungsmittelgemisch
1 gewaschen.
-
Reduktion
der Schiff-Base: Ein gewaschenes Peptidharz wurde mit 200 μl Lösungsmittelgemisch
1 und 200 μl
einer Lösung
von 1 M NaBH3CN Dimethylformamid versetzt.
Das Harz wurde 2 Stunden geschüttelt,
anschließend
mit Lösungsmittelgemisch
2 gewaschen und die Reduktion in diesem Gemisch mit 200 μl einer Lösung von
1 M NaBH3CN in DMF nochmals 2 Stunden wiederholt.
Das Harz wurde dann mit DMF und DCM gewaschen, getrocknet und das
Peptid mit TFA-5% H2O gespalten.
-
Vorschrift 1
-
- Waschen 3× mit
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch
2
Waschen 3× mit
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 200 μl
1 M NaBH3CN in DMF
Schütteln, 2
h
Waschen 3× mit
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
1 M NaBH3CN in DMF
Schütteln, 2
h.
-
Verfahrensweise 2
-
Die
Bildung der Schiff-Base folgt Verfahrensweise A. Die Reduktion der
Schiff-Base folgt Verfahrensweise A, mit dem Unterschied, dass während der
beiden Reduktionsschritte 0,01 mmol Aldehyd zusammen mit dem Reduktionsmittel
zugegeben wurde.
-
Vorschrift 2
-
Waschen
3× mit
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 0,2 mmol Aldehyd
Schütteln, 2 h
Waschen 3× mit Lösungsmittelgemisch
2
waschen 3× mit
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
1
Zugabe von 200 μl
1 M NaBH3CN in DMF
Zugabe von 0,01
mmol Aldehyd
Schütteln,
2 h
Waschen 3× mit
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
1 M NaBH3CN in DMF
Zugabe von 0,01
mmol Aldehyd
Schütteln,
2 h
-
Verfahrensweise 3 (Ein-Topf-Reaktion)
-
50
mg mit Lösungsmittellgemisch
2 gewaschenes Peptidharz wurden mit 200 μl dieses Gemischs sowie 0,05
mmol Aldehyd versetzt. Nach 1 Stunde Schütteln wurden 50 μl einer Lösung von
1 M NaBH3 in DMF zugegeben, und man ließ das Harz
2 Stunden schütteln.
Anschließend
wurden weitere 50 μl
Reduktionsreagenz zugegeben, und nach 2 Stunden Schütteln wurde
der dritte Teil (50 μl)
der Lösung
von 1 M NaBH3CN in DMF zugegeben. Das Harz
wurde über
Nacht geschüttelt
und anschließend
wie oben aufgearbeitet.
-
Vorschrift 3
-
- Waschen 3× mit
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 200 μl
Lösungsmittelgemisch
2
Zugabe von 0,05 mmol Aldehyd
Schütteln, 1 h
Zugabe von
50 μl 1
M NaBH3CN in DMF
Schütteln, 2
h
Zugabe von 50 μl
1 M NaBH3CN in DMF
Schütteln, 2
h
Zugabe von 50 μl
1 M NaBH3CN
Schütteln über Nacht
-
Tabelle
11 Reduktive Aminierungng |
Aldehyd
(M.W.) |
Vorschrift |
MS
(MH+) |
Benzaldehyd
(421,2) |
1 |
OK
(422,2) |
2-Hydroxybenzaldehyd
(437,2) |
1 |
OK
(438,2) |
4-Hydroxybenzaldehyd
(437,2) |
1 |
OK
(438,2) |
4-Hydroxybenzaldehyd
(451,2) |
3 |
OK
(438,2) |
3-Methyoxy-4-hydroxybenzaldehyd
(467,2) |
1 |
OK
(468,2) |
4-Nitrobenzaldehyd
(466,3) |
1 |
OK
(467,3) |
2-Naphtaldehyd
(471,3) |
1 |
OK
(472,3) |
3-Phenoxybenzaldehyd
(513,3) |
1 |
OK
(514,3) |
4-Phenylbenzaldehyd
(497,3) |
1 |
OK
(498,3) |
2-Tolualdehyd
(435,2) |
1 |
OK
(436,2) |
2-Trifluormethylbenzaldehyd
(489,3) |
2 |
OK
(490,3) |
1,3,5-Trimethoxybenzaldehyd
(511,3) |
1 |
OK
(512,3) |
Cyclohexancarboxaldehyd
(427,2) |
2 |
OK
(428,2) |
2-Ethylbutyraldehyd
(415,2) |
2 |
OK
(416,2) |
2-Methylbutyraldehyd
(401,2) |
2 |
OK
(402,2) |
2-Methylpropionaldehyd
(387,2) |
2 |
OK
(388,2) |
2-Methyvaleraldehyd
(415,2) |
2 |
OK
(416,2) |
Trimethylacetaldehyd
(401,2) |
2 |
OK
(402,2) |
Chinolin-4-carboxaldehyd
(472,3) |
3 |
OK
(402,2) |
Thiophen-2-carboxaldehyd
(427,2) |
3 |
OK
(428,2) |
-
13. BEISPIEL: NICHTSEQUENZIELLE CODIERUNG
EINER BIBLIOTHEK
-
Wir
testeten die nichtsequenzielle Codierung unter Verwendung sowohl
einer Modelltestverbindung als auch durch Konstruktion einer nichtpeptidischen
Bibliothek.
-
13.1 GERÄTE, MATERIAL UND VERFAHRENSWEISEN
-
Gerätschaft:
Sowohl analytische als auch präparative
HPLC wurde am modularen Hitachi-System unter Verwendung von Vydac
(0,46 × 250
mm, 5 μm,
Fließgeschwindigkeit
1 ml/min.) bzw. Vydac (10 × 250
mm, 10 μl,
Fließgeschwindigkeit
3 ml/min.) C-18-Säulen
durchgeführt.
-
Material:
Falls nicht anders angegeben, wurden Lösungsmittel mit handelsüblichem
Reinheitsgrad ohne weitere Aufreinigung verwendet. TentaGel(TG)-Harz
(0,21 mmol/g) wurde von Rapp-Polymere (Tübingen) bezogen. Geschützte Aminosäuren wurden
von Bachem (Torrance, Kalifornien), Advanced ChemTech (Louisville,
Kentucky) oder Propeptide (Vert-le-Petit, Frankreich) erhalten.
-
Mehr
als 100 codierende Untereinheiten wurden am Festphasenträger synthetisiert.
Dabei wurden als Grundbausteine Lysin, Ornithin, Diaminobuttersäure und
Diaminopropionsäure
verwendet. Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Orn(Boc), Fmoc-Dab(Boc) und Boc-Dap(Fmoc)
wurden zunächst
mit den üblichen
DIC/HOBt-Verfahren an Amino-TentaGel
(0,21 mmol/g) gekuppelt. Nach Entfernen des Seitenkettenschutzes
wurden modifizierende Carbonsäuren
an die ungeschützten
Seitenketten unter Verwendung des DIC/HOBt-Verfahrens, symmetrische
Anhydride oder Acylchloride gekuppelt. Alle neu synthetisierten
codierenden Aminosäuren
wurden vollständig
entschützt
und einem Edman-Abbau im Proteinsequenziergerät Applied Biosystems ABI 477A
unterzogen. Die Retentionszeiten neuer PTH-AS wurden unter Verwendung
des Analysegeräts
Applied Biosystems ABI 120A mit einer PTH-222 Brownlee-Säule (PTH C-18, 5 Micron, 220 × 2,1 mm)
bestimmt. HPLC-Puffer:
A – 0,01
M NaOAc, B – Acetonitril;
Gradient: 0,0-0,4 min. – 8%
B, 0,4-38,0 min. – 8-60%
B, 38,0-40,0 min. – 60-90%
B; Fließgeschwindigkeit
230 μl/min.
Die Spitzenwerte wurden bei 269 nm nachgewiesen. In Tabelle 14 sind
die einzelnen codierenden Untereinheiten aufgeführt sowie das Nummerierungssystem,
mit dem sie hier bezeichnet werden, angegeben.
-
13.2 SYNTHESE VON MODELLSEQUENZEN
-
Bei
den hergestellten Testverbindungssequenzen handelt es sich um Tyr-Gly-Ala-Phe
und Phe-Gly-Ala-Phe, codiert durch Dubletts von Aminosäuren (siehe
Schema XIC), sowie Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu und Phe(Cl)-Gly-Gly-Phe-Leu
(codiert durch die Codierung nach Schema XIB). Diese Sequenzen wurden
ausgewählt,
da Tyr-Gly-Ala-Phe unter Verwendung eines Anti-β-Endorphin-Antikörpers als
Akzeptormolekül
nachgewiesen werden kann, wobei es sich bei Phe-Gly-Ala-Phe um eine
Negativkontrolle handelt. Zudem könnten die Treue und Codierung
durch direkte Sequenzierung der Testpeptide bestätigt werden.
-
13.2.1 MATERIAL UND METHODEN
-
Der
Zweck der Synthese der Modellpeptide bestand nicht in einer Demonstration
eines Verfahrens zur Bibliothekssynthese, sondern eher der Treue
der Codierung. Daher wurde die Synthese nicht in aufeinanderfolgenden
Schritten von Kupplung der Test-AS-Untereinheit
und danach eines Paars codierender Untereinheiten, sondern stattdessen
unter Verwendung des nachfolgend• beschriebenen
zweckmäßigeren
Schemas durchgeführt.
Der Polymerträger
(TentaGel, 100 mg, 0,21 mmol/g, 90 um mittlere Teilchengröße), an
den zuvor die Sequenz Boc-Ala-Gly-Val-Phe-bAla-Gly-bAla-Gly synthetisiert
wurde und der einer Chymotrypsinbehandlung zur Unterscheidung der
Oberfläche
vom Inneren durch Abspaltung von Phe unterzogen worden war (7 mg
Chymotrypsin in 30 ml 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,6, in 0,1 M CaCl2, 14 h bei 37°C), wurde in Dimethylformamid (DMF)
gequollen (Quellvolumen 0,5 ml), in zwei Polypropylenspritzen mit
daran angebrachten Polypropylenfritten (Krchnak & Vagner, 1990, J. Pept. Res., 3:182-193)
aufgeteilt, wonach Fmoc-Phe (3 Äquivalente
in Bezug auf alle theoretisch verfügbaren Aminogruppen) durch
Diisopropylcarbodiimid (DIC) (3 Äquivalente)
in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol (HOBT) (3 Äquivalente)
in DMF gekuppelt wurde. Nach dem Verschwinden der Blaufärbung (Krchnak
et al., 1988 Coll. Czech. Chem. Commun., 53:2542) wurde das Harz
gewaschen (5× DMF)
und die Fmoc-Gruppe durch Behandlung mit 50% Piperidin in DMF (10
min.) abgetrennt. Nach Waschen mit DMF (5×) und 2% HOBT in DMF (1×) wurde
die nächste
Aminosäure
gekuppelt. Auf diese Weise wurden Alanin, Glycin und Tyrosin an
das Harz in der ersten Spritze und Alanin, Glycin und Phenylalanin
an das Harz in der zweiten Spritze gebunden. Die Fmoc-Gruppe wurde
wie oben abgetrennt und das Harz nach Waschen mit DMF mit der Lösung (0,4
M) von 2-Chlorbenzyloxycarbonylsuccinimid in DMF über Nacht
behandelt (wobei nach 3 h ein Äquivalent
Diisopropylethylamin zugegeben wurde). Die Boc-Gruppe wurde mit
50% Trifluoressigsäure
(TFA) in DCM abgespalten (1 plus 20 min.). Nach dem Waschen mit
DCM (3×)
und DMF (4×)
wurde das Harz durch Waschen mit 10% Diisopropylethylamin in DMF
neutralisiert, mit DMF (3×)
gewaschen und Fmoc-Lys(Dde) (3 Äq.)
durch die Wirkungsweise von DIC und HOBT (jeweils 3 Äq.) in DMF
gekuppelt (2 h). Das Harz wurde mit DMF (5×) gewaschen und die Fmoc-Gruppe
durch 50% Piperidin in DMF (20 min.) abgespalten und das Harz mit
DMF (3×)
gewaschen. Das Gemisch der für
Phenylalanin in Position 4 der Testverbindungsstruktur codierenden
Aminosäuren
(Boc-Sar und Boc-Asp(OBzl) in einem Molverhältnis von 1:1 (was ihre relativ
gleichwertige Kupplungsreaktivität,
die zuvor experimentell bestimmt worden war, widerspiegelt) wurde
unter Verwendung von DIC und HOBT (jeweils 3 Äq.) gekuppelt. Die Reaktion
wurde mit dem Bromphenolblauverfahren verfolgt. Das Harz wurde mit
DMF (5×)
gewaschen und die Dde-Gruppe durch 2% Hydrazinhydrat in DMF (10
min.) entschützt.
Das Harz wurde mit DMF (5×),
2% HOBT in DMF gewaschen, und Fmoc-Lys(Dde) gekuppelt und die Fmoc-Gruppe
abgetrennt. Der Vorgang der Kupplung von Gemischen von Boc-Aminosäuren und
Fmoc-Lys(Dde) wurde zweimal wiederholt (Kupplung der codierenden
Untereinheitsgemische von Ile und Val (2:1) und Lys(ClZ) und Glu(OBzl)
(1,5:1)), und nach Entschützung
der Dde-Gruppe wurde
Boc-Lys(Fmoc) in beiden Spritzen an das Harz gekuppelt. Die Fmoc-Gruppe
wurde wie oben entschützt,
und nach Waschen mit DMF (5×)
wurde das Gemisch aus Buttersäure-
und Propionsäureanhydriden
(1:1 in Gegenwart eines Äquivalents
Triethylamin) zur Acylierung der freien Aminogruppe in der ersten
Spritze verwendet und das Gemisch aus 4-Phenylbuttersäure und
3-Phenylpropionsäure an das
Harz in der zweiten Spritze über
die Wirkung von DIC und HOBT gekuppelt. Anschließend wurde das Harz durch Applikation
des Gemischs aus TFA (82,5%), p-Kresol (5%), Thioanisol (5%), Wasser
(5%) und Ethandithiol (2,5%) (Gemisch K, (King, D. et al., 1990,
Int. J. Pep. Prot. Res., 36:255-266)) 2 h entschützt und mit DMF (4×) und 0,1%
HCl in Wasser (5×)
gewaschen.
-
13.2.2 MIT CODIERUNG KONSTRUIERTE MODELLVERBINDUNGEN
YGAF UND FGAF
-
Die
beiden Modelpeptide wurden auf der Oberfläche eines "rasierten" ("shaved") Polyoxyethylen-gepfropften
Polystyrolfestphasenträgers
(TentaGel) synthetisiert. Die codierenden Moleküle wurden im Inneren des TentaGel-Trägers synthetisiert,
womit sie in der Lage waren, an den Anti-β-Endorphin-Antikörper zu
binden. Die unterschiedlich selektive Bindung der positiven Kontrolltestverbindung
wurde unter Verwendung der Testverbindung/des Kügelchenkonstrukts jeweils für sich allein
oder als Gemisch beider Sequenzen oder nach Zugabe einer geringen
Anzahl spezifischer Kügelchen
zu einer Bibliothek von Verbindungen validiert.
-
Ein
nichtsequenzieller Code wurde auf einem Polylysingrundgerüst konstruiert.
-
Der
Code war wie folgt:
Schritt | Untereinheit | Codierende
Gruppierung |
4 | Phe | Butyryllysin,
Proprionyllysin |
4 | Tyr | φ-Butyryllysin, φ-Propionyllysin |
3 | Gly | Glu,
Lys |
2 | Ala | Val,
Ile |
1 | Phe | Asp,
Sar |
-
Die
positiven Träger
wurden nach Kontakt mit dem Anti-β-Endorphin-Antikörper ausgewählt. Durch
einen Zyklus Edman-Abbau wurden die positiven Kügelchen als YGAF identifiziert,
und zwar aufgrund der Freisetzung der φ-Butyryllysin-, φ-Propionyllysin-Derivate.
Da die Testverbindungssequenz nur auf der Oberfläche des Kügelchens vorhanden war und
diese Menge etwa 2% der Gesamtmenge von am Kügelchen gebundenen Molekülen ausmachte,
war das Signal des im ersten Zyklus (in dem alle codierenden Aminosäureuntereinheiten
ebenso gespalten wurden) nachgewiesenen Tyrosins äußerst gering.
Zur Bestätigung
davon, dass tatsächlich
die korrekten Kügelchen
nachgewiesen worden waren, wurde die Sequenzierung mit 30 vereinigten Kügelchen
zur Amplifikation des Signals wiederholt. In diesem Fall zeigten
vier Zyklen Sequenzierung direkt die YGAF-Testverbindungssequenz.
-
13.3 SYNTHESE DER AUF DIAMINOBENZOESÄURE RUHENDEN
BIBLIOTHEK MIT DIGITALER CODIERUNG
-
Eine
auf der Diaminobenzoesäure
beruhende Bibliothek wurde synthetisiert und mit einem nichtsequenziellen
Code codiert. Das Syntheseschema für diese Bibliothek ist im nachfolgenden
Schema angegeben. Eine Liste der im ersten Kupplungsschritt verwendeten
Aminosäuren
und der in den Kupplungsschritten 2 und 3 verwendeten Säuren bis
zu den Aminogruppen des Diaminobenzoesäuregerüsts ist in Tabellen 12 bzw.
13 angegeben. In den beiden Tabellen sind auch jeweils die jeder
Speziesuntereinheit der Testverbindung entsprechenden codierenden
Gruppierungen angegeben. Die codierenden Gruppierungen in Tabelle
13 sind dabei durch zweistellige Nummern, z.B. 3/1 bezeichnet, deren chemische
Bedeutungen in Tabelle 14 definiert sind.
-
Die
Sequenzierung mehrerer willkürlich
gewählter
Kügelchen
dieser Bibliothek bestätigt
die Möglichkeit
der einstufigen Entschlüsselung
durch Edman-Abbau.
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13.3.1 MATERIAL UND METHODEN
-
Die
Synthese wurde an TentaGel-Harz (90 μm, 0,2 mmol/g) durchgeführt. Fmoc-Entschützung: 50% Piperidin
in DMF, 10 min. Waschen mit DMF (6 mal), alle Waschlösungen sammeln,
Messen der Absorption bei 302 nm, Fmoc-Freisetzung berechnen.
-
Alloc-Entschützung: Waschen
mit 3× DMF
(jeweils 2 min.) und Zugabe des Gemischs von DMF/AcOH/NMM (5 ml,
1 ml, 0,5 ml) und Einblasen unter Argon (15 Minuten). Zugabe von
150 mg Tetrakis(triphenylphosphin)palladium und Einblasen von Argon
(3 Stunden). 3× Waschen
mit DMF. 5× Waschen
mit DCM.
-
Dde-Entschützung: Das
gewaschene Peptidharz wurde mit einer 3%igen Lösung von Hydrazin in DMF 5
min. und 30 min. behandelt, wonach sich ein DMF-Waschschritt anschloss.
-
Ddz-Entschützung: Das
Peptidharz wurde mit DMF und danach mit DCM gewaschen und 2× mit 3% TFA
in DCM jeweils 5 min. vorbehandelt. Die dritte Behandlung mit 3%
TFA/DCM wird 30 min. durchgeführt. Nach
gründlichem
Waschen mit DCM folgt die Neutralisierung durch 5% DIEA in DCM und
das Waschen mit DCM und DMF.
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Npys-Entschützung: das
gewaschene Peptidharz wurde mit 0,3 M HCL in Dioxan 5 min. und anschließend 30
min. behandelt. Das entschützte
Peptidharz wurde mit Dioxan und DCM gewaschen, mit 5% DIEA in DCM
neutralisiert und mit DCM und DMF gewaschen.
-
Kupplung
der Aminosäuren:
Dreifachen molaren Überschuss
geschützter
Aminosäure
durch BOP (Molverhältnis
1:1) in DMF aktivieren. Vollständigkeit
der Kondensationsreaktionen (1,5–40 h) jeweils durch Ninhydrintest
bzw. durch Chloraniltest bei Kupplung an sekundäre Aminogruppen überprüfen.
-
Seitenkettenentschützung: Dreimal
Waschen mit DCM und Entschützen
unter Verwendung von Gemisch K (82,5% TFA, 5% p-Kresol, 5% Thioanisol,
5% Wasser, 2,5% Ethandithiol) 5 + 120 min.
-
Letzte
Waschschritte: reines TFA (3×),
DCM (5×),
DMF (10×),
DMF/0,1% HCl (5×),
0,1% HCl (3×)
und 0,01% HCl (4×).
-
13.3.2 SYNTHESE DER BIBLIOTHEK
-
Synthese:
TentaGel S NH
2 (10 g) wurde in DMF vorgequollen
und 5 mal mit DMF gewaschen und danach der Festphasensynthese unter
Verwendung der folgenden Vorschrift, die schematisch dargestellt
ist, unterzogen:
Schritt | Reagenz |
1 | 5%
DIEA/DMF | 2 × 5 min. |
2 | DMF-Waschschritt | 10 × 2 min. |
3 | Fmoc-Lys(Dde)/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
4 | 50%
Piperidin/DMF | 10
min. |
5 | Fmoc-Lys(Alloc)/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
6 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
7 | Boc-Gly/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
8 | Pd-Katalysator | |
9 | Wiederholung
von Schritt 7 | |
10 | Fmoc-Gly/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
11 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
12 | Fmoc-β-Ala/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
13 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
14 | Wiederholung
von Schritt 10 | |
15 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
16 | Wiederholung
von Schritt 12 | |
17 | TFA/DCM | |
18 | Randomisierung
und Code 1 (Tabelle 3) Aminosäuren/BOP | |
19 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
20 | Ddz-Gly/BOP | |
21 | 3%
Hydrazin/DMF | |
22 | Fmoc-Lys(Dde)/BOP | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
23 | Chlorameisensäure allylester | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
24 | 3%
TFA/DCM | |
25 | Fmoc-Aminosäure R1/BOP
(Tabelle 3) | |
26 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
27 | Gerüst I/TBTU | Bis
Ninhydrintest negativ ist |
28 | Pd-Katalysator | |
29 | Randomisierung
+ Code 2 (Tabelle 4)/BOP | |
30 | HCl/Dioxan | |
31 | 47
Säuren
R 2 (Tabelle 4)/sym. Anhydride | |
32 | Wiederholung
von Schritt 4 | |
33 | Randomiserung
+ Code 3 | |
34 | 50
Säuren
R 3 (Tabelle 4)/sym. Anhydride | |
35 | Wiederholung
von Schritt 21 | |
36 | Code
3 (Tabelle 4)/BOP | |
37 | Gemisch
K | |
38 | Letzter
Waschschritt | |
-
Die
geschützte
Bibliothek wurde in DMA/0,3% HOBt, die entschützte Bibliothek in 0,01% wässriger HCl
gelagert. Schema
5 Schema
der Synthese einer Diaminobenzoesäure (DABA)-Bibliothek mit digitalem Code
-
-
Durchsuchen der durch Bar-Code
codierten Bibliothek
-
Die
Bibliothek wurde gemäß einer
veröffentlichten
Verfahrensweise (Lam und Lebl, 1992, Immunomethods, 1:11-15) durchsucht.
Dabei wurden die Kügelchen
der Bibliothek zunächst
mit stufenweise größeren Mengen
an doppelt destilliertem Wasser gemischt. Nach ausgiebigem Waschen
mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 Na
2HPO
4, 1,4 mM KH
2PO
4, pH 7,2) mit 0,1% Tween-20 wurden die Kügelchen
in 0,05% Gelatine (w/v) zur Blockierung jeglicher nichtspezifischer
Bindung inkubiert. Anschließend
wurden die Kügelchen
mit 60 pM biotinyliertem Anti-β-Endorphin
(Klon 3-E 7, Boehringer Mannheim) in 2 × PBS/Tween/Gelatine über Nacht inkubiert.
Nach gründlichem
Waschen wurde Streptavidin-alkalische Phosphatase zugegeben. Eine
Stunde später
wurden die Kügelchen
gewaschen und mit dem Standardsubstrat für alkalische Phosphatase, 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat,
versetzt. Die Kügelchen
wurden dann zusammen mit dem Substrat in Petrischalen zur Farbentwicklung überführt. Nach
30 Minuten bis 1 Stunde wurden die positiv gefärbten Kügelchen mit einer Mikropipette
gesammelt, mit 6 M Guanidinhydrochlorid, pH 1,0, gewaschen und der
Sequenzierung des Bar-Codes unterzogen. Tabelle 12 Für
die Codierung von Block R1 verwendete Aminosäuredubletts R1 = 29 Aminosäuren
Aminosäure | Code-Elemente |
Gly | Ala
Phe |
Ala | Ala
Ile |
Dap | Aib
Val |
Pro | Aib
Phe |
Val | Aib
Ile |
Pipecolinsäure | Val
Phe |
Leu | Val
Ile |
Asn | Phe
Ile |
Asp | Asn
Gln |
Orn | Asn
Gly |
Gln | Asn
Ala |
Glu | Asn
Aib |
2-Pyridyl-Ala | Asn
Val |
Chg | Asn
Phe |
Phe | Asn
Ile |
Cha | Gln
Gly |
Arg | Gln
Ala |
Citrulin | Gln
Aib |
Tetrahydroisochinolincarbonsäure | Gln
Val |
homoPhe | Gln
Phe |
N-Me-Gly | Gln
Ile |
Phe
(p-F) | Gly
Ala |
Phe(p-Cl) | Gly
Aib |
Trp | Gly
Val |
Phe(p-NO2) | Gly
Phe |
Ala(1-Naph) | Gly
Ile |
3,4-Dichlor-Phe | Ala
Aib |
Lys(TFA) | Ala
Val |
Phe(p-Bz) | Ala
Phe |
- Aib = Aminoisobuttersäure
-
14. BEISPIEL: MOLEKULARE GERÜSTE
-
In
Schema XIX sind die chemischen Strukturen von 19 Verbindungen angegeben,
die zur Konstruktion von Testverbindungen verwendet werden können. Das
Schema bezeichnet dabei die Stelle der Bindung der Untereinheiten
der Testverbindungen mit R
n. Schema
XIX:
-
In
Tabelle 15 unten finden sich Anleitungen hinsichtlich der Arten
von Untereinheiten und der Chemie ihrer Bindung an das molekulare
Gerüst.
Gerüst Nr. | Untereinheiten | Chemie
der Kupplung |
1.
Aminosäure-aldehyd/ Organometal | Aminosäure Homoserinaldehydalkyl-arylmetall | CO-NH-Kupplung
Ausbildung einer C-C-Bindung |
2.
Diketopiperazin | Aminosäuren N-Alkylaminosäuren | CO-NH-Kupplung
Reduktive Aminierung |
3.
Substituiertes Thioprolin | Aminosäuren Cystein
Aminosäurealdehyd
Alkyl- oder Arylsäuren | CO-NH-Kupplung
Reduktive Aminierung |
4.
Substituiertes Triazin | Aminosäure Trichlortriazin
Alkyl- oder Arylamine | CO-NH-Kupplung
Reduktive Aminierung |
5.
Substituiertes Thioprolindioxid | Aminosäuren N-Alkylaminosäuren Cystein
Aldehyd, Keton | CO-NH-Kupplung
Bildung von Thioaminal Oxidation C-Alkylierung |
6.
Acyliertes Polyethylendiamin | Aminosäuren Glycinal
Alkyl- oder Arylsäuren | CO-NH-Kupplung
Reduktive Aminierung |
7.
Benzoltricarbonsäure | Aminosäuren N-Alkylaminosäuren 1,
2, 4-Benzoltricarboxylsäure | CO-NH-Kupplung |
8.
2-S-Alkyl(aryl)isoindol | Subst.
Phthalanhydrid Alkyl- oder Arylamine Alkyl- oder Arylmercaptane | Isoindolsyntese |
9.
Cyclopentan | N-Alkylaminosäuren Primäre oder sekundäre Amine
Cyclopentantricarbonsäure | CO-NH-Kupplung |
10.
Diacyldialkyldiaminosäure | Aminosäuren Aldehyde
Alkyl- oder Arylsäuren | CO-NI-Kupplung
Reduktive Aminierung |
11.
Erweiterte Kemps-Trisäure | Aminosäuren Kemps-Trisäure und
geschützte
Diamine | CO-NH-Kupplung |
12.
Kemps-Trisäure | Aminosäuren Kemps-Trisäure Alkyl-
oder Arylsäuren | CO-NH-Kupplung |
13.
Alkylacylaminosäure | Aminosäuren Aldehyde
Alkyl- oder Arylsäuren | CO-NH-Kupplung |
14.
Diaminobenzoesäure | Aminosäuren 3,5-Diaminobenzoesäure Alkyl-
oder Arylsäuren | CO-NH-Kupplung |
15.
Steroid | Steroidgerüst Aldehyde | Reduktive
Aminierung CO-NH-Kupplung |
16.
Bis-iminodiessigsäure | Glycin
t-Butylbromacetatt Alkyl- oder Arylamine | |
17.
N-Alkylierte Iminodiessigsäure | Diaminobutanon-säure t-Butylbromacetat Alkyl-
oder Arylamine | CO-NH-Kupplung
N-Alkylierung |
18. α,β,γ-Peptidomimetikum | Diaminosäure Alkyl-
oder Arylsäuren | CO-N-Kupplung |
19.
N-substituiertes Glycinpeptidomimetikum | Aminosäuren Aldehyde | CO-NH-Kupplung
Reduktive Aminierung |