DE10106339A1 - Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden, die nach Kopplung an eine Trägermatrix direkt für ein Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen verwendet werden können.

Description

Die vorliegende Verbindung betrifft ein Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden, die nach Kopplung an eine Trägermatrix direkt für ein Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen verwendet werden können.

Die Synthese von rekombinanten Polypeptiden und ihre Kopplung an eine Trägermatrix zum Screenen von Kandidaten-Verbindungen erfolgt bisher in zwei getrennten Verfahren, wobei die Kopplung der Polypeptide an die Trägermatrix deren Isolierung nach erfolgter Synthese voraussetzt. Diese Verfahren sind in der Regel langwierig und wenig effektiv, da insbesondere bei der Isolierung der Polypeptide eine große Menge dieser verloren geht.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die Nachteile der bisherigen Verfahren nicht aufweist, d. h. eine schnelle und effektive in vitro Synthese einer sehr hohen Anzahl unterschiedlicher rekombinanter Polypeptide erlaubt, vorzugsweise für ein darauffolgendes Screening von Kandidaten- Verbindungen nach einer eventuell an ein so hergestelltes Polypeptid bindenden Verbindung.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung eines Verfahrens mit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Merkmalen.

Das erfindungsgemäße, nachstehend beschriebene Verfahren erlaubt die in vitro Synthese von mehr als 5.000 rekombinanten Proteinen pro Tag. Mittels dieses Verfahrens ist es möglich, daß die Interaktion zwischen Proteinen und deren potentiellen Bindungspartnern in einem Hochdurchsatz-Expressionsverfahren ("High Throughput Expression" (HTE)) mit anschließendem HighThroughput Screening vollautomatisch durchgeführt werden kann. Mit Anpassung des erfindungsgemäßen Systems auf Biochip-Basis lassen sich schließlich z. B. mehr als 600.000 Interaktionen zwischen rekombinanten "Drug-Targets" und potentiellen Bindungspartnern pro Tag spezifisch analysieren. Ausgehend von unterschiedlichen DNA-, RNA- oder Proteinsequenzen werden via (RT-)PCR die erforderlichen Genabschnitte ggf. revers transkribiert und amplifiziert. Anschließend werden durch das erfindungsgemäße Verfahren die abgeleiteten rekombinanten Proteine in vitro exprimiert und auf eine Trägermatrix (z. B. Biochips) fixiert: Mühevolles und zeitaufwendiges Klonieren entfällt. Zum Drug-Targetscreening werden die gebundenen Proteine potentiellen Bindungspartnern (Pharmazeutika etc.) ausgesetzt und anschließend ihre Affinität zueinander gemessen. Die freien Interaktionspartner können hierbei z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert worden, wodurch eine sichere Aussage über die Bindungsaffinität beider Partner durch vollautomatische, spektroskopische Methoden gewährleistet ist. Einmal beladene Biochips können auch wiederholt zum Drug-Targetscreening eingesetzt werden.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden und deren Kopplung an eine Trägermatrix, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Herstellung von DNA-Konstrukten, die folgende Abschnitte aufweisen:
  • 1. eine Promotorsequenz,
  • 2. eine ein Affinitäts-Tag kodierende DNA-Sequenz, und
  • 3. jeweils eine das gewünschte rekombinante Polypeptid kodierende DNA-Sequenz, wobei die Reihenfolge der Abschnitte in 5'-3'-Richtung (1), (2), (3) oder (1), (3), (2), vorzugsweise (1), (2), (3) ist;
• b) gekoppelte in vitro-Transkription und -Translation der DNA-Konstrukte von Schritt (a); und
• c) Kopplung der in Schritt (b) erhaltenen Polypeptide an eine Trägermatrix, die eine Affinität für das Affinitäts- Tag aufweist.

Voraussetzung für eine erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Kenntnis über die jeweiligen Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen. Dabei lassen sich auch Teilsequenzen (z. B. Exon-Bereiche genomischer DNA) für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens heranziehen. Entsprechend den Anforderungen sowie den bereitgestellten biologischen Ausgangsmaterialien (Zellen, Gewebe, Blut, gereinigte Nukleinsäuren, Proteine, Urin, Sputum etc.) werden die spezifischen Gensequenzen durch geeignete molekularbiologische Methoden (z. B. PCR, RT-PCR etc.) vervielfältigt. Diese DNA-Amplifikate werden daraufhin durch den Einsatz von RNA-Polymerasen in RNA umgeschrieben und anschließend durch in vitro-Translation in Polypeptide translatiert. Die erhaltenen Polypeptide können dann für Interaktions- bzw. Aktivitätsanalysen herangezogen werden.

Zum Erhalt der für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Ausgangsmaterialien kann wie folgt vorgegangen werden:

• a) Verwendung genomischer DNA: Eine bestimmte genomische Sequenz, die aus einem gesamten Operon, verschiedenen Exon/Intron-Sequenzen oder einzelnen Exon-Bereichen (z. B. SNP("single nucleotide polymorphismus")-beinhaltenden Exons) bestehen, wird (z. B. als Datenfile) ermittelt. Entsprechend den Wünschen/Anforderungen werden die spezifischen Gensequenzen amplifiziert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Die hierfür erforderliche und speziesspezifische Matrize (genomische DNA) kann ebenfalls vom Auftraggeber als auch von anderen Quellen bereitgestellt werden.
• b) cDNA und mRNA: Hierbei werden ebenfalls die Sequenzdaten und ggf. die Matrize (z. B. PCR-Fragmente, Vektoren, synthetische Gene etc.) mit Angabe des zu bearbeitenden Genabschnittes vom Auftraggeber übermittelt. Die Matrize wird wiederum über PCR amplifiziert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Wird zum Beispiel nur die cDNA-Sequenz mitgeteilt, dann läßt sich die erforderliche cDNA über die Isolierung und reverse Transkription speziesspezifischer mRNA unter Einsatz der RT-PCR herstellen.
• c) Gensynthese: Im Falle bestimmter Gensequenzen, die weder aus biologischem Material isoliert noch aus Klonierungsstrategien erhalten werden können, lassen sich artifizielle Gene basierend auf bekannten Sequenzdaten synthetisieren. Dieses kann durch die Verwendung sequenzspezifischer, komplementärer sowie überlappender Oligonukleotide erreicht werden. Über PCR können dann diese Fragmente vervielfältigt und für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
• d) Herstellung von Hybriden: Durch geeignete Klonierungsverfahren oder Megaprime-PCR (siehe unten) können gemäß den entsprechenden Anforderungen beliebige cDNA-Fragmente, welche unterschiedliche Domänen diverser Proteine darstellen, miteinander verknüpft, amplifiziert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.
• e) Proteinsequenzen: Ausgehend von einem isolierten und ggf. bereitgestellten Protein wird dessen N-terminale Proteinsequenz durch Sequenzierung ermittelt und aus der erhaltenen Proteinsequenz werden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet sowie synthetisiert. Diese wiederum werden z. B. in Kombination mit poly(A)_15-20 Oligonukleotiden für die RT-PCR aus den erforderlichen biologischen Ausgangsmaterialien (z. B. einem Gewebestück) eingesetzt. Sofern die Proteinsequenzen bereitgestellt werden können, entfällt die Proteinsequenzierung. Nach Erhalt des genspezifischen Amplifikates wird die daraus abgeleitete Proteinsequenz durch DNA-Sequenzierung verifiziert.

Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro- Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, in vivo- Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) beschrieben sind sowie die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren. Geeignete Promotorsequenzen und Affinitäts-Tags kodierende DNA-Sequenzen und geeignete Vorgehensweisen, um diese gemäß den erwünschten Erfordernissen zu verknüpfen, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Ebenfalls bekannt sind dem Fachmann geeignete Systeme für die gekoppelte in vitro Transkription/Translation der vorstehend beschriebenen DNA-Konstrukte, wobei insbesondere auf die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen kommerziellen Systeme bzw. Kits verwiesen wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Proteinen außerdem dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Konstrukte zusätzlich noch folgende Abschnitte aufweisen: eine 5' zu der Promotorsequenz gelegene Mehrfachklonierungsstelle, eine zwischen der ein Affinitäts-Tag kodierenden DNA-Sequenz und der das gewünschte rekombinante Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz gelegene, einen Aminosäurelinker kodierende Sequenz, und/oder eine 3' zu der das Polypeptid kodierenden DNA-Sequenz gelegene, eine poly(dA) kodierende DNA-Sequenz, wobei die Länge des von dieser DNA-Sequenz kodierten poly(dA)- Schwanzes vorzugsweise 15 bis 50 dA beträgt, und die DNA- Sequenz vorzugsweise auch eine Mehrfachklonierungsstelle aufweist.

Da Voraussetzung für eine erfolgreiche Bindung des Polypetids die Exposition des Affinitäts-Tag, z. B. des S-Peptids, in dem das rekombinante Protein umgebende Medium ist, kann es in manchen Fällen vorkommen, daß das Affinitäts-Tag in das Proteininnere ragt, so daß keine Interaktion mit dem entsprechenden Partner der Trägermatrix, z. B. dem S-Protein, möglich ist. Dieses Problem kann durch einen Aminosäure-Linker zwischen Affinitäts-Tag und rekombinantem Polypetid minimiert werden. Vorzugsweise besteht der Aminosäure-Linker aus 5 bis 20 Glycin- und/oder Serin-Resten.

Vorzugsweise erfolgt die Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte über PCR, wobei z. B. gemäß den in dem nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Schemata vorgegangen werden kann. Besonders bevorzugt erfolgt die Herstellung der DNA-Konstrukte über Megaprime-PCR, die z. B. in den nachfolgenden Beispielen von Barik und Galinsky, BioTechnigues 10 (1991), 489-490, beschrieben ist.

Für die Transkription der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten DNA-Konstrukte eignet sich jeder Promotor, der in dem verwendeten Transkriptions/Translationssystem zu einer starken Genexpression führt. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt. Besonders bevorzugt ist der T7, T3 oder SP6 Promotor, wobei auch andere Promotoren, wie der E. coli 530, der SV40- oder der HCMV-Promotor, verwendet werden können.

Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Affinitäts-Tags und die entsprechenden Bindungspartner sowie Bedingungen für die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung des Bindungspartners an eine Trägermatrix sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für geeignete Affinitätssysteme sind das Strep-Tag-System, (Institut für Bioanalytik, Göttingen, Deutschland), oder das T7-Tag-System, (Novagen, Madison, USA), die als Bindungspartner ein Strep-Tag-Affinitätsprotein bzw. einen T7-Tag-Antikörper enthalten. Vorzugsweise wird für das erfindungsgemäße Verfahren das in den nachstehenden Beispielen beschriebene S-Peptid/S-Protein-System verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Inkontaktbringen der gemäß der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhaltenen, an eine Trägermatrix gebundenen Polypeptide mit einer oder mehreren Kandidaten-Verbindungen; und
• b) Bestimmung der Bindung einer Kandidaten-Verbindung an ein Polypeptid.

Bei den Kandidaten-Verbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, organische und anorganische Verbindungen, sowie Polymere (z. B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonukleotide und Polynukleotide) sowie kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nukleotide und Nukleotid- Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z. B. Peptid-"Imitatoren", Nukleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche weitere Verbindungen.

Das Suchen nach geeigneten Verbindungen kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandidaten-Verbindungen in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbibliotheken synthetische oder natürliche Moleküle enthalten können. Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Kandidaten-Verbindung Bestandteil einer Substanzbibliothek.

Die grundsätzliche Vorgehensweise bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening ist in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt. In diesem Zusammenhang wird auch auf die nachfolgenden Beispiele verwiesen. Beispielsweise kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und gleichzeitig getestet werden. Wenn eine Bindung entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden, bis eine individuelle Verbindung identifiziert ist. Jedenfalls können die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise von Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167.

Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die eine Bindung anzeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden. Siehe beispielsweise Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh, Anticancer Res. 15 (1995) 233-239.

Bevorzugte Kandidaten-Verbindungen sind SMDs, Peptide, Hormone, Proteine und Nukleinsäuren.

Vorzugsweise tragen die Kandidaten-Verbindungen eine nachweisbare Markierung, wobei es sich vorzugsweise um ein Radioisotop, eine biolumineszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung, eine Fluoreszenz-Verbindung, ein Metalchelat oder ein Enzym handelt.

Der Fachmann kennt Verfahren zum Nachweis einer stattgefundenen Bindung der Kandidaten-Verbindung an das rekombinante Polypeptid in Abhängigkeit der für die Kandidaten-Verbindung gewählten Markierung. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Bindung einer Kandidaten- Verbindung sind radioaktive, fluoreszenzabhängige, magnetische, spektroskopische, massenspektrometische, biosensorische, photometrische Verfahren oder konfokale Lasermikroskopie. Bedingungen zur Durchführung dieser Verfahren sind dem Fachmann bekannt.

Geeignete Trägermatrizes sind dem Fachmann ebenfalls bekannt, wobei als Trägermatrizes eine Mikrotiterplatte, ein Glasobjektträger, ein Reaktionsgefäß, eine Membran, ein Biochip (The Chipping Forecast 1999, Nature Genetics 21: Supplement) oder eine Gelmatrix bevorzugt sind. Gelmatrizes (z. B. Gelfiltrations- oder Ionenaustauscher-Matrizes) werden z. B. verwendet, wenn die rekombinant hergestellten Polypeptide von verunreinigenden Partikeln befreit werden müssen oder falls diese in "batch"-Verfahren mit entsprechenden Kandidaten-Verbindungen inkubiert werden sollen. Beispiele für geeignete Gelmatrizes sind Streptavidin-gekoppelte Säulenmaterialen (z. B. Sephadex™, DEAE etc., Pharmacia, Freiburg, Deutschland) z. B. für die Bindung von biotinyliertem S-Protein (Novagen, Madison, USA).

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1 Amplifizierung des spezifischen Gens bzw. ORF

• A) Schematische Darstellung des genspezifischen PCR-Fragments (Fragment A). Das Fragment A wird durch die beiden Oligonukleotide um ca. 80 bis 100 Nukleotide verlängert. Der fett markierte Bereich stellt die genspezifische Sequenz der Oligonukleotide dar.
• B) Schematische Darstellung des genspezifischen 5'- Oligonukleotids (A). Der genspezifische Bereich ist kursiv und fett markiert. Der weiße Pfeil gibt die Syntheserichtung an. Das Initiationssignal "ATG" des spezifischen Gens befindet sich im ORF der vorgeschaltenen Linker-Sequenz.
• C) Schematische Darstellung des genspezifischen 3'- Oligonukleotids (A). Der genzspezifische Bereich ist kursiv und fett markiert. Die Sequenz dieses 3'-Oligonukleotids muß als Komplementärstrang dargestellt werden. Der graue Pfeil gibt die Syntheserichtung an. Das Stopcodon ist unterstrichen. Als translationsfördernde Sequenz ist ein poly(A)Schwanz von 15 Adeninen eingefügt.

Fig. 2 Amplifizierung des PCR-Fragments B

• A) Schematische Darstellung des PCR-Fragments B. Die Länge des Fragments beträgt ca. 90 Nukleotide. Schraffierter Bereich: Mehrfachklonierungsstelle; grauer Bereich: Promotorsequenz für RNA-Polymerasen; schwarzer Bereich: S- Peptid-Sequenz; weißer Bereich: komplementäre Linker-Sequenz.
• B) Schematische Darstellung des 5'-Oligonukleotids (B) für Fragment B. Der 5'-S-Peptid-Bereich ist fett markiert. Die T7- Promotorsequenz ist unterstrichen. Der weiße Pfeil gibt die Syntheserichtung an.
• C) Schematische Darstellung des 3'-Oligonukleotids (B) von Fragment B. Der 5'-S-Peptid-Bereich ist fett markiert. Die Sequenz dieses 3'-Oligonukleotids muß als Komplementärstrang dargestellt werden. Der graue Pfeil gibt die Syntheserichtung an.

Fig. 3 Schematische Darstellung der Hybridisierung zwischen dem ssDNA 3'-Bereich des Fragmentes B und dem ssDNA 5'-Bereich des Fragmentes A

Die Polymerase verlängert die 3'-Enden in Richtung des Fragment B- sowie Fragment A-Bereichs (graue Pfeile). MCS: Mehrfachklonierungsstelle; Prom: RNA-Promotor; SPS: S-Peptid- Sequenz; GSS-T: genspezifische Sequenz mit poly(dA)-Schwanz.

Fig. 4 Schematische Darstellung des Megaprime-Produkts

Die Länge des Megaprime-Produkts ist abhängig von der Länge des genspezifischen Fragments (GSS). Die Länge der vor- und hintergeschaltenen DNA-Sequenzen ist einheitlich. MCS: Mehrfachklonierungsstelle; Prom: RNA-Promotor; SPS: S-Peptid- Sequenz; Gly_(n): Glycin-Linker-Sequenz; poly (dA)_15-50: poly(dA)- Schwanz.

Fig. 5 Schematische Darstellung des in vitro translatierten Proteins

Die Länge des Gesamtproteins ist abhängig von der Länge der genspezifischen Proteinsequenz (GSPS). S-Peptid: S-Peptid- Sequenz; Gly_(n): Glycin-Linker-Sequenz; NH₂: Amino-terminales Proteinende; COOH: Carboxy-terminales Proteinende.

Fig. 6 (A) Schematische Darstellung der S-Protein-Kopplung an eine Trägermatrix

Der Linker zwischen S-Protein (schraffiert) und Trägermatrix ist als graue Welle gekennzeichnet.

(B) Schematische Darstellung des S-Protein/S-Peptid- Targetmolekül-Bindung

Das an die Trägermatrix (schwarzer Balken) gebundene S-Protein (schraffiert) bindet das S-Peptid (gepunktet) mit hoher Affinität, so daß das rekombinante Protein (GSP) ebenfalls an die Trägermatrix fixiert wird. Glycin-Linker: Schwarze Welle.

Fig. 7 (A) Nachweis spezifischer Interaktionen zwischen einem definierten Molekül und diversen in vitro translatierten Proteinen

1. Die mit dem rekombinanten Protein (jeder graue Punkt entspricht einem spezifischen Protein) beladenen Glasobjektträger werden 2. in einer geeigneten Objektträger-Waschschale überführt und mit den in Lösung befindlichen, z. B. fluoreszenzmarkierten Molekülen (schwarze Punkte) inkubiert. 3. Nach mehrmaligen Waschen werden die gebundenen Liganden z. B. durch Fluoreszenzanalyse detektiert und den jeweiligen in vitro translatierten Proteinen zugeordnet.

(B) Nachweis spezifischer Interaktionen mit verschiedenen Molekülen und diversen in vitro translatierten Proteinen

1. Es werden jeweils 24 Spots von vier verschiedenen rekombinanten Proteinen auf eine Glassobjektträgeroberfläche gespottet. 2. Pro horizontaler Ausrichtung werden unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Moleküle (schwarze und graue Sterne) präzise auf die entsprechenden Spots transferiert und unter geeigneten Bedingungen inkubiert. 3. Nach mehrmaligen Waschen werden die gebundenen Liganden durch Fluoreszenzanalyse detektiert und den jeweiligen in vitro translatierten Proteinen (in Triplikaten) zugeordnet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbaren DNA-Konstrukte über PCR (a) Amplifizierung des spezifischen Gens

Hierfür werden genspezifische 5'- und 3'-Oligonukleotide konstruiert, synthetisiert und anschließend in der (RT-)PCR unter Zusatz des erforderlichen biologischen Ausgangsmaterials eingesetzt. Das daraus resultierende spezifische Genfragment wird hier als 'Fragment A' bezeichnet (Fig. 1a). Das für die Herstellung des Fragments A verwendete 5'-Oligonukleotid (A) weist am 3'-Ende die genspezifische Sequenz auf (15-20 Nukleotide für das Zinkfingergen pAT133 (Müller et al., PNAS USA 88 (1991), 10079-10083; 5'-ATG CTC CAC CTT AGC-3') (Fig. 1b). Flußaufwärts dieser Sequenz wird eine "Linker-Sequenz" von 12-24 bp (z. B. 5'-GGG GGG GGG GGG GGG-3') angefügt, die nach der Translation ein Abfolge von 4-8 Glycin-Seitenketten bewirkt. Das für die Herstellung des Fragments A verwendetet 3'-Oligonukleotid (A) weist ebenfalls an seinem 3'-Ende die genspezifische Sequenz mit 15 bis 25 Nukleotiden auf (das Stopcodon CTA beinhaltende Ende des pAT133-Gens: 5'-CTA TTC ACT GGG TGG-3'), wobei das 5'-Ende des 3'-Oligonukleotids (A) zusätzlich eine Abfolge von translationsfördernden Sequenzen (z. B. poly (A)_10-50) beinhaltet (Fig. 1c).

Reaktionsbedingungen für die Amplifikation des genspezifischen Fragments A Materialien

Thermostabile DNA Polymerase (Hybaid GmbH, Heidelberg, Deutschland), (2 U/µl), 10 × Reaktionspuffer-Komplett (200 mM Tris-HCCl, pH 8,5, 160 mM (NH₄)₂ SO₄, 15 mM MgCl₂), 5'-Oligonukleotid (A) (50 pmol/µl), 3'-Oligonukleotid (A) (50 pmol/µl), dNTP-Mix (40 mM), genspezifische Matrize (Gesamtmenge 0.1-10 ng); z. B. pAT133 Plasmid, H₂O bidest., sterile Reaktionsgefäße (0.5 ml/0,2 ml)

Durchführung (Pipettierschema für 50 µl Endvolurnen): add 50 µl H₂O bidest.: 5,0 µl 10 × Reaktionspuffer-Komplett, 1,0 µl 5'-Oligonukleotid (A), 1,0 µl 3'-Oligonukleotid (A), xx µl Matrize, 2,0 µl dNTP-Mix, 0,5 µl Thermostabile DNA Polymerase

Durchführung (PCR-Programm; Fragment A): Schritt 1: 2 min/94°C, Schritt 2: 30 Sek/94°C, Schritt 3: 30 Sek/60°C, Schritt 4: pro 1000 bp 1 min bei 70-75°C, 30 Zyklen: Schritt 2-4; Schritt 5: 10 min bei 70-75°C.

(b) Amulifizierung des PCR-Fragments B

Parallel zum genspezifischen Fragment A wird ein weiteres "PCR-Fragment B" amplifiziert, das die in Fig. 2a dargestellten Sequenzen beinhaltet. Das für die PCR verwendete 5'-Oligonukleotid ist aus drei Sequenzelementen aufgebaut (Fig. 2b): Am 5'-Ende sind verschiedene Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthalten (z. B. 5'-GGA TCC GAA TTC CCC GGG- 3'; für BamHI, EcoRI, SmaI etc.). Davon flußabwärts wird eine Promotorsequenz starker viraler, bakterieller oder eukaryotischer RNA-Polymerasen eingefügt (15-30 Nukleotide: z. B. T7 RNA Pol Promotor: 5'-AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GA-3') und am 3'-Ende dieses 5'-Oligonukleotides (B) schließt die 5'-Sequenz für das S-Peptid der bovinen RNase A aus dem Rinderpankreas (Richards und Wyckoff, The Enzymes Vol. IV (1971), 647-806, Academic Press) mit 21 Nukleotiden (z. B. 5'-ATG GAA ACT GCA GCA GCC AAG-3') an. Das Intitiationssignal ATG eröffnet den ORF des gesamten Fusionsproduktes. Das 3'-Oligonucleotid (B) für die PCR des Fragmentes B weist an seinem 5'-Ende die komplementäre Sequenz (5'-CCC CCC CCC CCC CCC-3') der Linker-Sequenz des genspezifischen 5'- Oligonukleotides (siehe Fig. 1b) auf. Flußabwärts werden die letzten 15-30 Nukleotide (z. B. 5'-GTC CAT GAG CTG CCG CTC AAA CTT-3') des S-Peptid 3'-Endes repräsentiert (Fig. 2c). Das Stopcodon "TGA" wird durch GAC (komplementär = CTG) ausgetauscht, damit der ORF erhalten bleibt.

Reaktionsbedingungen für die Amplifikation des genspezifischen Fragments B Materialien

Thermostabile DNA Polymerase (2 U/µl), 10 × Reaktionspuffer-Komplett, 5'-Oligonukleotid (B) (50 µmol/µl), 3'-Oligonukleotid (B) (50 µmol/µl), dNTP-Mix (40 mM), RNase A Matrize (Schmidt et al., Biochemistry 25(20), 1986, 5955-5961; 1245825 (GenBank)) (Gesamtmenge 1 ng/µ), H₂O bidest., sterile Reaktionsgefäße (0.5 ml/0,2 ml)

Durchführung (Pipettierschema für 50 µl Endvolumen): add 50 µl H₂O bidest.: 5,0 µl 10 × Reaktionspuffer-Komplett, 1,0 µl 5'-Oligonukleotid (B), 1,0 µl 3'-Oligonukleotid (B), 1 µl RNase A Matrize, 2,0 µl dNTP-Mix, 0,5 µl Thermostabile DNA Polymerase

Durchführung (PCR-Programm; Fragment B): Schritt 1: 2 min/94°C, Schritt 2: 30 Sek/94°C, Schritt 3: 30 Sek/60°C, Schritt 4: 30 Sek bei 70-75°C, 30 Zyklen: Schritt 2-4; Schritt 5: 1 min bei 70-75°C.

(c) RT-PCR (optional)

Falls als Ausgangsmaterial Gesamt-RNA oder mRNA für das genspezifische Fragment A herangezogen werden muß, dann werden die Oligonukleotide (A) wie folgt in der RT-PCR eingesetzt.

Materialien

0,5 ml sterile Reaktionsgefäße, 5 × RT-Puffer (250 mM Bicin (pH 8,2), 425 mM KAc, 40% Glycerin), MnAc₂ (25 mM), H₂O bidest. (DEPC-behandelt), dNTP-Mix (40 mM), Tth DNA Polymerase (Hybaid GmbH, Heidelberg, Deutschland) (2 U/µl), 5'-Oligonukleotid (A) (50 µmol/µl), 3'-Oligonukleotid (A) (50 µmol/µl), poly(dA)_15-20 (50 pmol/µl); Gesamt-RNA oder mRNA (Gesamtmenge 0,1-1,0 µg).

Durchführung (Pipettierschema für 50 µl Endvolumen): add 50 µl H₂O bidest.: 10 µl 5 × RT-Puffer, 1,0 µl 5'-Oligonukleotid (A), 1,0 µl 3'-Oligonukleotid (A) und/oder, 1,0 µl poly (dA)_15-20, xx µl Matrize, 2,0 µl dNTP-Mix, 5,0 µl MnAc₂, 1,0 µl Tth DNA Polymerase.

Durchführung (RT-PCR-Programm/Fragment A): 1. Schritt: 6 min 70°C, 2. Schritt: 5 min/48 bzw. 58°C (in Abhängigkeit des 3'-Oligonukleotides), 3. Schritt: 30 min/60°C, 4. Schritt 2 min/94°C, 5. Schritt: 30 sec/94°C, 6. Schritt: 30 sec/­ 58°C, 7. Schritt: 1 min/68°C; 30 Zyklen: Schritte 5-7, 8. Schritt: 10 min/68°C.

(d) Reinigung der PCR-Produkte

Die Reinigung der PCR-Fragmente erfolgt nach Standard-Methoden (Silica-Beads, Spin-Preps) entsprechend den Herstellerangaben. Die gereinigten Fragmente A und B werden daraufhin für die Megaprime-PCR eingesetzt.

(e) Megaprime-PCR

Durch die sog. Megaprime PCR (Barik und Galinsky, BioTechniques 10 (1991), 489-490) lassen sich überlappende DNA-Fragmente direkt während der PCR-Zyklen miteinander ligieren. Die denaturierten DNA-Einzelstränge dienen dabei als Primer und binden die komplementäre Sequenz des Überlappungspartners. Das 3'-Oligonukleotid (B) und das 5'-Oligonukleotid (A) weisen eine komplementäre Sequenz ("Linker-Sequenz") auf, so daß nach Denaturierung der beiden Fragmente eine Hybridisierung zwischen den komplementären Enden des Fragmentes A und B stattfinden kann. Die hybridisierten Einzelstränge können nun als "Megaprimer" fungieren, so daß die Polymerase die freien 3'-Enden dieser Stränge elongiert (Fig. 3). Damit eine exponentielle Amplifikation gewährleistet ist, werden dem PCR-Ansatz sowohl das 5'-Oligonukleotid (B) als auch das 3'-Oligonukleotid (A) hinzupipettiert.

Reaktionsbedingungen für die Megaprime PCR Materialien

0,5 ml sterile Reaktionsgefäße, 10 × Reaktionspuffer-Komplett (500 mM Tris-HCl (pH 8,1), 140 mM (NH₄)₂SO₄, 17,5 mM MgCl₂),. H₂O bidest., dNTP-Mix (40 mM), Taq/Pwo DNA Polymerase Mix (Hybaid GmbH, Heidelberg, Deutschland) (2,5 U/µl), 5'-Oligonukleotid (B) (50 µmol/µl), 3'-Oligonukleotid (A) (50 pmol/µl), Fragment A (ca. 100 ng/µl), Fragment B (ca. 100 ng/µl).

Durchführung (Pipettierschema für 100 µl Endvolumen): 10 µl 10 × Reaktionspuffer-Komplett, 76 µl H₂O bidest., 2,0 µl 5'-Oligonukleotid B, 3,0 µl 3'-Oligonukleotid A, 3,0 µl Fragment A, 3,0 µl Fragment B, 2,0 µl dNTP-Mix, 1,0 µl Taq/Pwo DNA Polymerase Mix.

Durchführung (PCR-Programm): 1. Schritt: 2 min/94°C, 2. Schritt: 30 sec/94°C, 3. Schritt: 2 min/48°C, 4. Schritt: 1 min/68°C; 25 Zyklen: Schritte 2-4, 5. Schritt: 10 min­ /68°C, 6. Schritt: 4°C/t = ∞.

Das erhaltene Fragment kann direkt für die kombinierte in vitro-Transkription/Translation eingesetzt werden.

Beispiel 2 Zellfreie in vitro-Transkription/Translation

Hierzu wird das in Beispiel 1 hergestellte Fragment verwendet. Es werden (a) die eukaryotischen (Retikulozytenlysat oder Weizenkeimlysat) oder bakteriellen "TNT™ Coupled" Tranksription/Translation-Systeme der Fa. Promega, Mannheim, Deutschland verwendet.

Durchführung der Reaktion Materialien

"96/384well"-Mikrotiterplatten, Megaprime-PCR-Fragment aus Beispiel 1, "TNT-Coupled" Transkriptions/Translations-System, TNT-Reaktionspuffer, TNT RNA Polymerase, Aminosäuregemisch inkl. [³⁵S]markierte Aminosäuren (Promega, Mannheim, Deutschland), RNAsin Inhibitor (Promega, Mannheim, Deutschland) (40 U/µl), H₂O bidest. (DEPC-behandelt, Nuklease­ frei).

Die Durchführung wird entsprechend den Herstellerangaben an die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderlichen Volumina (ca. 5-20 µl) angepaßt.

Pipettierschema für 10 µl Endvolumen in "384well"- Mikrotiterplatten: xx µl TNT Lysat, 0,4 µl TNT Reaktionspuffer, 0,2 µl TNT RNA Polymerase, 0,2 µl Aminosäure- Gemisch, 0.8 µl [³⁵S]markierte Aminosäure (1000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 0,2 µl RNasin Inhibitor, xx µl Megaprime-PCR Fragment (0,1 bis 0,5 µg), add 10.0 µl H₂O bidest.

Die einzelnen Komponenten (außer dem Megaprime-PCR Fragment) werden als Mastermix pipettiert und in die entsprechenden Mikrotiternäpfchen vorgelegt. Die Zugabe des Megaprime-PCR Fragmentes erfolgt direkt in die Mikrotiternäpfchen. Die Reaktion wird für 30-120 min bei 30°C durchgeführt.

In Kombination mit den oben beschriebenen Amplifikationen (bei Verwendung von 20-30 "384well" PCR-Blöcken) sowie der darauffolgenden zellfreien Proteinexpression (in 10-15 "384well" Mikrotiterplatten) lassen sich mehr als 5.000 unterschiedliche Proteine innerhalb von 24 Stunden exprimieren. Nach der in vitro Translation werden ca. 20-50 ng rekombinantes Protein in 10 µl Reaktionsvolumen erhalten. Alle Proteine weisen dann die in Fig. 5 gezeigten Aminosäuresequenzen auf.

Beispiel 3 Bindung der rekombinanten Proteine über das Affinitäts-Tag an eine Trägermatrix

Die aus Beispiel 2 erhaltenen Proteine werden darauffolgend an die erforderlichen Trägermatrizes gebunden. Als Trägermatrix lassen sich entsprechend vorbehandelte Materialien verwenden, wobei vorzugsweise "384well"-Polystyrol- oder Polypropylen-Mikrotiterplatten bzw. Glasobjektträger verwendet werden.

Damit die rekombinanten Proteine mit hoher Affinität an eine geeignete Trägermatrix gekoppelt werden können, wird die hochaffine Interaktion zwischen einer trunkierten Form (104 Aminosäuren) der bovinen, pankreatischen RNase A (= S-Protein (Kim und Raines, Protein Sci. 2 (1993), 348-356; Richard und Wyckoff (1971), In: The Enzymes, Vol IV (Boyer, P. D. Ed.), p. 647-806, Academic Press, NY, USA)) und dem 15 Aminosäuren langen S-Peptid ausgenutzt. Das S-Peptid entspricht den ersten 15 Aminosäuren (MKETAAAKFERQHMDS) der RNase A, wobei das S-Protein eine Dissoziationskonstante von K_d = 10^-9 M aufweist. Das entspricht einer hochaffinen Bindungsaktivität, die z. B. durch monoklonale Antikörper ebenfalls repräsentiert wird.

Im ersten Schritt wird das S-Protein an die einzusetzende Trägermatrix nicht-kovalent gebunden, wobei (a) Mikrotiterplatten und (b) Glasobjekträger verwendet werden. Anschließend erfolgt die Kopplung der rekombinanten Proteine über das S-Peptid an die so vorbehandelten Träger.

(a) Kopplung der rekombinanten Proteine an Mikrotiterplatten Kommerziell erhältliche "96/384well"-Streptavidin-gekoppelte Mikrotiterplatten (aus Polystyrol oder Polypropylen; Steffens Analytik, Freiburg, Deutschland) werden für die Bindung von biotinyliertem S-Protein (Novagen, Madison, USA) gemäß Herstellerangaben (Novagen Corporation, Technical Bulletin TB 143) eingesetzt. Auf diese Weise werden die S-Proteine mit sehr hoher Affinität (K_d = 10^-14 M) an die Mikrotiterplatten gekoppelt. Bei Verwendung von zwölf "384well"- Mikrotiterplatten lassen sich bis zu 5.000 verschiedene in vitro translatierte Proteine koppeln und z. B. für das Hochdurchsatz-Screening unter Hinzugabe von potentiellen Interaktionspartnern (SMDs (Small Molecule Drugs), Peptide, Nukleinsäuren, Proteine etc.) einsetzen.

Die in Beispiel 2 erhaltenen rekombinanten Proteine (5-20 µl Translationsansatz) werden ohne vorherige Reinigung direkt in die entsprechenden Mikrotiternäpfchen der vorbereiteten Mikrotiterplatten pipettiert.

Material: in vitro Translationsansatz (5-20 µl), Streptavidin/S-Protein-gekoppelte Mikrotiterplatte, PBST-Puffer, Glycerin

Durchführung: 5-20 µl des in vitro-Transkriptions/Transla­ tions-Ansatzes werden in ein Mikrotiternäpfchen überführt, danach erfolgt eine Inkubation für 6-20 min bei 4-30°C. Es erfolgt die Entfernung des Überstandes und zweimaliges Waschen der gebundenen Proteine mit jeweils 10-20 µl PBS. Schließlich werden 10-20 µl PBS inkl. 50% Glycerin zugegeben. Die Lagerung erfolgt bei -20°C.

(b) Kopplung der rekombinanten Proteine an Glasobjektträger Kommerziell erhältliche "96/384well" Streptavidin-gekoppelte Glasobjektträger (Interactiva GmbH, Ulm, Deutschland) werden für die Bindung von biotinyliertem S-Protein (Novagen, Madison, USA) nach Herstellerangaben eingesetzt. Auf diese Weise werden die S-Proteine mit sehr hoher Affinität (siehe (a)) an die Glasobjektträger gekoppelt, und diese "Biochips" können ebenfalls wie unter (a) erwähnt für das Hochdurchsatz- Screening herangezogen werden, wobei aber die eingesetzten Volumina und Substanzmengen deutlich minimiert werden.

Die rekombinanten Proteine (0,2-1,0 µl Translationsansatz) werden ohne vorherige Reinigung direkt in die entsprechenden Mikrotiternäpfchen der vorbereiteten Mikrotiterplatten pipettiert.

Material: in vitro Translationsansatz (0,2-1,0 µl), Streptavidin/S-Protein-gekoppelte Glasobjektträger, PSS-Puffer: Phosphate Buffered Saline (150 mM NaCl), Glycerin, Objektträger-Waschschälchen, Feuchtkammer.

Durchführung: 0,2 µl (bei 384well) oder 1,0 µl (bei 96well) des in vitro Translationsansatzes werden auf ein Objektträgerspot überführt, danach erfolgt eine Inkubation für 5-20 min bei 4-30°C. Schließlich erfolgt das Entfernen des Überstandes durch 2 × Waschen der gebunden Proteine mit jeweils 2-5 ml PBS. Die Lagerung der Objektträger erfolgt in einer Feuchtkammer bei 40°C bis zum Screening.

Beispiel 4 Interaktionsanalysen der an den Träger gekoppelten Proteine

Die in vitro translatierten Proteine wurden nach Fixierung an die Trägermatrizes (Beispiel 3) zum Screenen potentieller Interaktionspartner herangezogen. Die Variabilität in dem erfindungsgemäßen Screening-System ist dadurch gegeben, daß eine große Anzahl unterschiedlicher Proteine oder Mutanten pro Glasobjektträgerfläche/Mikrotiterplatte aufgetragen werden können, und daß der Objektträger mit nur einem zu untersuchenden Molekül, z. B. in einem Objektträger-Waschschälchen inkubiert wird (Fig. 7A). Andererseits lassen sich diverse zu untersuchenden Moleküle mit Hilfe von Pipettier- oder Spotting-Robotern auf die unterschiedlichen Proteinspots/Wells der Glasobjektträger bzw. Mikrotiternäpfchen transferieren (Fig. 7B).

(a) Bindung von Nukleinsäuren

Beispielhaft für eine Interaktionsanalyse zwischen einem gemäß Beispiel 2 in vitro translatierten sowie gemäß Beispiel 3 lokal fixierten Protein und einem freien markierten Liganden wurde das Zinkfingerprotein des pAT133-Gens und dessen Bindungspartner (dsDNA Sequenz. 5'-GGGGCGGGG-3') herangezogen. Bisher wurden solche Interaktionen mit Hilfe von Zeit- und kostenaufwendigen Gelretardations- (Gelshift; Ausubel et al., (1993), Curr. Protocols in Mol Biol. Vol. 2, Greene Publ. Assoc., Inc. J. Wiley & Sons, NY, USA) sowie Footprint-Analysen (Schmitz und Galsa, Nucl. Acids. Res. 6 (1978), 111) durchgeführt.

Material

"384well"-Mikrotiterplatte mit gebundenem in vitro translatierten Protein (Zinkfingerprotein AT133), Cy3- markierte dsDNA (5'--GGGGCGGGG-3') (Eurogentec, Liege, Belgien)(2 pmol/µl), nichtmarkierte Kompetitor-DNA: poly(dI-dC)Ipoly(dI-dC) (Eurogentec, Liege, Belgien) (2 pmol/µl), 5 × Gelshift-Bindungspuffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 20% Glycerin, H₂O, bidest.

Durchführung

Zuerst wurden die Mastermixes (1 × Gelshift-Bindungspuffer) hergestellt, danach pro Vertiefung der "384well"-Platte 10 µl Mastermix pipettiert. Hierzu wurden nichtmarkierte Competitor- DNA im fünffachen molaren Überschuss zur erwarteten Proteinmenge hinzupipettiert, danach wurde 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde jeweils ein fünffacher molarer Überschuß zur erwarteten Proteinmenge Cy3- markierte dsDNA hinzugeben und es wurde 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde entnommen und zweimal mit 1 × Gelshift-Bindungspuffer gewaschen. Darauffolgend wurde das Ganze in 10 µl 1 × Gelshift-Bindungspuffer belassen, mit Hilfe eines Mikrotiterplatten Fluoreszenzlesegerätes ausgewertet und die Bindung zwischen dem Zinkfingerprotein und seinem Bindungspartner nachgewiesen.

(b) Bindung von Small Molecule Drugs (SMD)

Für das Auffinden von potentiellen Medikamenten gegen oder für bestimmte Proteine im Hochdurchsatzverfahren lassen sich die gemäß Beispiel 2 in vitro translatierten und gemäß Beispiel 3 an die Trägermatrix gebundenen Proteine ebenfalls einsetzen. Es wurde die humane Phenylalanin-Hydroxylase verwendet, die eine natürliche Affinität zu L-Phenylalanin besitzt. Bei Parkinson-Patienten verursacht eine Punktmutation (SNP) eine reduzierte Affinität zu dieser Aminosäure, so daß die Bildung von L-DOPA unterbunden wird (Knappskog et al., Hum. Mutat. 8 (1996), 236-246. Die Interaktion zwischen L-Phenylalanin und der humanen Phenylalanin-Hydroxylase wurde mehrfach mit in vitro translatierten Proteinen demonstriert (Knappsog et al., Hum. Mutat 8 (1996), 236-246; Lüdecke et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996), 1023-1028. Bezüglich der vorliegend verwendeten Phenylalanin-Hydroxylase wurde das vorstehende pAT 133-Gen verwendet, bei dem die Sequenz ab dem ATG durch die PAH- Sequenz aus Lüdecke et al. ersetzt wurde.

Material

in vitro Translationsansatz (0,2-1,0 µl), gemäß Beispiel 3 vorbehandelte Glasobjektträger, fluoreszenzmarkiertes L-Phenylalanin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) in PBS (100 µM, 200 µM und 300 µm Lösungen), PBS-Puffer: Phosphate Buffered Saline (150 mM NaCl), Objektträger-Waschschälchen, Feuchtkammer.

Durchführung

Der Objektträger wurde in PBS vorinkubiert und anschließend die überschüssige Flüssigkeit durch Abtropfen und vorsichtiges Abwischen entfernt. Danach erfolgte das überführen von 0,2 µl (bei "384well"-Platten) oder 1,0 µl (bei "96well"-Platten) der L-Phenylalanin-Lösung (50 µM-500 µM) auf einen entsprechenden Objektträgerspot. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei Raumtemperatur. Danach wurde der Objektträger zweimal in PBS gewaschen. Schließlich wurde die überschüssige Flüssigkeit durch Abtropfen und vorsichtiges Abwischen entfernt. Die Analyse gebundener L-Phenylalanin-Moleküle erfolgte durch Glassobjektträger-Fluoreszenzlesegeräte (Chipleader, Virtek Inc., Waterloo, Kanada).

Claims (11)

1. Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden und deren Kopplung an eine Trägermatrix, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Herstellung von DNA-Konstrukten, die folgende Abschnitte aufweisen:
  • 1. eine Promotorsequenz,
  • 2. eine ein Affinitäts-Tag kodierende DNA-Sequenz, und
  • 3. jeweils eine das gewünschte rekombinante Polypeptid kodierende DNA-Sequenz, wobei die Reihenfolge der Abschnitte in 5'-3'-Richtung (1), (2), (3) oder (1), (3), (2) ist;
• b) gekoppelte in vitro-Transkription und -Translation der DNA-Konstrukte von Schritt (a); und
• c) Kopplung der in Schritt (b) erhaltenen Polypeptide an eine Trägermatrix, die eine Affinität für das Affinitäts-Tag aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Konstrukte zusätzlich noch folgende Abschnitte aufweisen: eine 5' zu der Promotorsequenz gelegene Mehrfachklonierungsstelle, eine zwischen (2) und (3) gelegene, einen Aminosäurelinker kodierende DNA-Sequenz, und/oder eine 3' zu (3) gelegene poly(dA) kodierende DNA- Sequenz, mit einer Mehrfachklonierungsstelle.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Konstrukte in Schritt (a) über PCR erhalten werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Promotorsequenz (1) eine T7, T3 SP6, E. Coli S30, SV40 oder HCMV Promotorsequenz ist. 1

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Affinitäts-Tag ein His-Tag, T7-Tag, Strep-Tag, myc-Tag oder eine S-Peptid-Sequenz ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die einen Aminosäurelinker kodierende DNA-Sequenz eine 5 bis 20 Glycin- und/oder Serin-Reste kodierende Sequenz ist.

7. Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

• a) Inkontaktbringen der in Schritt (c) der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen, an eine Trägermatrix gebundenen Polypeptide mit einer oder mehreren Kandidaten- Verbindungen; und
• b) Bestimmung der Bindung einer Kandidaten-Verbindung an ein Polypeptid.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kandidaten- Verbindung(en) eine nachweisbare Markierung tragen.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Bestimmung der Bindung einer Kandidaten-Verbindung über ein radioaktives, fluoreszenzabhängiges, magnetisches, spektroskopisches, massenspektrometisches, biosensorisches, photometrisches Verfahren oder konfokale Lasermikroskopie erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix eine Mikrotiterplatte, ein Glasobjektträger, ein Reaktionsgefäß, ein Biochip, eine Membran oder eine Gelmatrix ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Kandidaten-Verbindung ein SMD, Peptid, Hormon, Protein oder eine Nukleinsäure ist.