DE10106339A1 - Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden - Google Patents
Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten PolypeptidenInfo
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Abstract
Beschrieben wird ein Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden, die nach Kopplung an eine Trägermatrix direkt für ein Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen verwendet werden können.
Description
Die vorliegende Verbindung betrifft ein Verfahren zur
Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden,
die nach Kopplung an eine Trägermatrix direkt für ein
Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen verwendet
werden können.
Die Synthese von rekombinanten Polypeptiden und ihre Kopplung
an eine Trägermatrix zum Screenen von Kandidaten-Verbindungen
erfolgt bisher in zwei getrennten Verfahren, wobei die
Kopplung der Polypeptide an die Trägermatrix deren Isolierung
nach erfolgter Synthese voraussetzt. Diese Verfahren sind in
der Regel langwierig und wenig effektiv, da insbesondere bei
der Isolierung der Polypeptide eine große Menge dieser
verloren geht.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde,
ein Verfahren bereitzustellen, das die Nachteile der
bisherigen Verfahren nicht aufweist, d. h. eine schnelle und
effektive in vitro Synthese einer sehr hohen Anzahl
unterschiedlicher rekombinanter Polypeptide erlaubt,
vorzugsweise für ein darauffolgendes Screening von Kandidaten-
Verbindungen nach einer eventuell an ein so hergestelltes
Polypeptid bindenden Verbindung.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Bereitstellung
eines Verfahrens mit den in den Patentansprüchen
gekennzeichneten Merkmalen.
Das erfindungsgemäße, nachstehend beschriebene Verfahren
erlaubt die in vitro Synthese von mehr als 5.000 rekombinanten
Proteinen pro Tag. Mittels dieses Verfahrens ist es möglich,
daß die Interaktion zwischen Proteinen und deren potentiellen
Bindungspartnern in einem Hochdurchsatz-Expressionsverfahren
("High Throughput Expression" (HTE)) mit anschließendem
HighThroughput Screening vollautomatisch durchgeführt werden
kann. Mit Anpassung des erfindungsgemäßen Systems auf
Biochip-Basis lassen sich schließlich z. B. mehr als 600.000
Interaktionen zwischen rekombinanten "Drug-Targets" und
potentiellen Bindungspartnern pro Tag spezifisch analysieren.
Ausgehend von unterschiedlichen DNA-, RNA- oder
Proteinsequenzen werden via (RT-)PCR die erforderlichen
Genabschnitte ggf. revers transkribiert und amplifiziert.
Anschließend werden durch das erfindungsgemäße Verfahren die
abgeleiteten rekombinanten Proteine in vitro exprimiert und
auf eine Trägermatrix (z. B. Biochips) fixiert: Mühevolles und
zeitaufwendiges Klonieren entfällt. Zum Drug-Targetscreening
werden die gebundenen Proteine potentiellen Bindungspartnern
(Pharmazeutika etc.) ausgesetzt und anschließend ihre
Affinität zueinander gemessen. Die freien Interaktionspartner
können hierbei z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert
worden, wodurch eine sichere Aussage über die
Bindungsaffinität beider Partner durch vollautomatische,
spektroskopische Methoden gewährleistet ist. Einmal beladene
Biochips können auch wiederholt zum Drug-Targetscreening
eingesetzt werden.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden
und deren Kopplung an eine Trägermatrix, das durch folgende
Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Herstellung von DNA-Konstrukten, die folgende Abschnitte
aufweisen:
- 1. eine Promotorsequenz,
- 2. eine ein Affinitäts-Tag kodierende DNA-Sequenz, und
- 3. jeweils eine das gewünschte rekombinante Polypeptid kodierende DNA-Sequenz, wobei die Reihenfolge der Abschnitte in 5'-3'-Richtung (1), (2), (3) oder (1), (3), (2), vorzugsweise (1), (2), (3) ist;
- b) gekoppelte in vitro-Transkription und -Translation der DNA-Konstrukte von Schritt (a); und
- c) Kopplung der in Schritt (b) erhaltenen Polypeptide an eine Trägermatrix, die eine Affinität für das Affinitäts- Tag aufweist.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Kenntnis über die
jeweiligen Nukleinsäure- oder Proteinsequenzen. Dabei lassen
sich auch Teilsequenzen (z. B. Exon-Bereiche genomischer DNA)
für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
heranziehen. Entsprechend den Anforderungen sowie den
bereitgestellten biologischen Ausgangsmaterialien (Zellen,
Gewebe, Blut, gereinigte Nukleinsäuren, Proteine, Urin, Sputum
etc.) werden die spezifischen Gensequenzen durch geeignete
molekularbiologische Methoden (z. B. PCR, RT-PCR etc.)
vervielfältigt. Diese DNA-Amplifikate werden daraufhin durch
den Einsatz von RNA-Polymerasen in RNA umgeschrieben und
anschließend durch in vitro-Translation in Polypeptide
translatiert. Die erhaltenen Polypeptide können dann für
Interaktions- bzw. Aktivitätsanalysen herangezogen werden.
Zum Erhalt der für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten
Ausgangsmaterialien kann wie folgt vorgegangen werden:
- a) Verwendung genomischer DNA: Eine bestimmte genomische Sequenz, die aus einem gesamten Operon, verschiedenen Exon/Intron-Sequenzen oder einzelnen Exon-Bereichen (z. B. SNP("single nucleotide polymorphismus")-beinhaltenden Exons) bestehen, wird (z. B. als Datenfile) ermittelt. Entsprechend den Wünschen/Anforderungen werden die spezifischen Gensequenzen amplifiziert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Die hierfür erforderliche und speziesspezifische Matrize (genomische DNA) kann ebenfalls vom Auftraggeber als auch von anderen Quellen bereitgestellt werden.
- b) cDNA und mRNA: Hierbei werden ebenfalls die Sequenzdaten und ggf. die Matrize (z. B. PCR-Fragmente, Vektoren, synthetische Gene etc.) mit Angabe des zu bearbeitenden Genabschnittes vom Auftraggeber übermittelt. Die Matrize wird wiederum über PCR amplifiziert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt. Wird zum Beispiel nur die cDNA-Sequenz mitgeteilt, dann läßt sich die erforderliche cDNA über die Isolierung und reverse Transkription speziesspezifischer mRNA unter Einsatz der RT-PCR herstellen.
- c) Gensynthese: Im Falle bestimmter Gensequenzen, die weder aus biologischem Material isoliert noch aus Klonierungsstrategien erhalten werden können, lassen sich artifizielle Gene basierend auf bekannten Sequenzdaten synthetisieren. Dieses kann durch die Verwendung sequenzspezifischer, komplementärer sowie überlappender Oligonukleotide erreicht werden. Über PCR können dann diese Fragmente vervielfältigt und für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
- d) Herstellung von Hybriden: Durch geeignete Klonierungsverfahren oder Megaprime-PCR (siehe unten) können gemäß den entsprechenden Anforderungen beliebige cDNA-Fragmente, welche unterschiedliche Domänen diverser Proteine darstellen, miteinander verknüpft, amplifiziert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.
- e) Proteinsequenzen: Ausgehend von einem isolierten und ggf. bereitgestellten Protein wird dessen N-terminale Proteinsequenz durch Sequenzierung ermittelt und aus der erhaltenen Proteinsequenz werden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet sowie synthetisiert. Diese wiederum werden z. B. in Kombination mit poly(A)15-20 Oligonukleotiden für die RT-PCR aus den erforderlichen biologischen Ausgangsmaterialien (z. B. einem Gewebestück) eingesetzt. Sofern die Proteinsequenzen bereitgestellt werden können, entfällt die Proteinsequenzierung. Nach Erhalt des genspezifischen Amplifikates wird die daraus abgeleitete Proteinsequenz durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur
Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte verwendet
werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-
Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, in vivo-
Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)
beschrieben sind sowie die in den nachstehenden Beispielen
beschriebenen Verfahren. Geeignete Promotorsequenzen und
Affinitäts-Tags kodierende DNA-Sequenzen und geeignete
Vorgehensweisen, um diese gemäß den erwünschten Erfordernissen
zu verknüpfen, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Ebenfalls
bekannt sind dem Fachmann geeignete Systeme für die gekoppelte
in vitro Transkription/Translation der vorstehend
beschriebenen DNA-Konstrukte, wobei insbesondere auf die in
den nachstehenden Beispielen beschriebenen kommerziellen
Systeme bzw. Kits verwiesen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße
Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten
Proteinen außerdem dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-
Konstrukte zusätzlich noch folgende Abschnitte aufweisen: eine
5' zu der Promotorsequenz gelegene Mehrfachklonierungsstelle,
eine zwischen der ein Affinitäts-Tag kodierenden DNA-Sequenz
und der das gewünschte rekombinante Polypeptid kodierenden
DNA-Sequenz gelegene, einen Aminosäurelinker kodierende
Sequenz, und/oder eine 3' zu der das Polypeptid kodierenden
DNA-Sequenz gelegene, eine poly(dA) kodierende DNA-Sequenz,
wobei die Länge des von dieser DNA-Sequenz kodierten poly(dA)-
Schwanzes vorzugsweise 15 bis 50 dA beträgt, und die DNA-
Sequenz vorzugsweise auch eine Mehrfachklonierungsstelle
aufweist.
Da Voraussetzung für eine erfolgreiche Bindung des Polypetids
die Exposition des Affinitäts-Tag, z. B. des S-Peptids, in dem
das rekombinante Protein umgebende Medium ist, kann es in
manchen Fällen vorkommen, daß das Affinitäts-Tag in das
Proteininnere ragt, so daß keine Interaktion mit dem
entsprechenden Partner der Trägermatrix, z. B. dem S-Protein,
möglich ist. Dieses Problem kann durch einen Aminosäure-Linker
zwischen Affinitäts-Tag und rekombinantem Polypetid minimiert
werden. Vorzugsweise besteht der Aminosäure-Linker aus 5 bis
20 Glycin- und/oder Serin-Resten.
Vorzugsweise erfolgt die Herstellung der erfindungsgemäßen
DNA-Konstrukte über PCR, wobei z. B. gemäß den in dem
nachfolgenden Beispiel 1 beschriebenen Schemata vorgegangen
werden kann. Besonders bevorzugt erfolgt die Herstellung der
DNA-Konstrukte über Megaprime-PCR, die z. B. in den
nachfolgenden Beispielen von Barik und Galinsky, BioTechnigues
10 (1991), 489-490, beschrieben ist.
Für die Transkription der in dem erfindungsgemäßen Verfahren
verwendeten DNA-Konstrukte eignet sich jeder Promotor, der in
dem verwendeten Transkriptions/Translationssystem zu einer
starken Genexpression führt. Geeignete Promotoren sind dem
Fachmann bekannt. Besonders bevorzugt ist der T7, T3 oder SP6
Promotor, wobei auch andere Promotoren, wie der E. coli 530,
der SV40- oder der HCMV-Promotor, verwendet werden können.
Für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Affinitäts-Tags
und die entsprechenden Bindungspartner sowie Bedingungen für
die kovalente oder nicht-kovalente Kopplung des
Bindungspartners an eine Trägermatrix sind dem Fachmann
bekannt. Beispiele für geeignete Affinitätssysteme sind das
Strep-Tag-System, (Institut für Bioanalytik, Göttingen,
Deutschland), oder das T7-Tag-System, (Novagen, Madison, USA),
die als Bindungspartner ein Strep-Tag-Affinitätsprotein bzw.
einen T7-Tag-Antikörper enthalten. Vorzugsweise wird für das
erfindungsgemäße Verfahren das in den nachstehenden Beispielen
beschriebene S-Peptid/S-Protein-System verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum
Hochdurchsatz-Screening, das durch folgende Schritte
gekennzeichnet ist:
- a) Inkontaktbringen der gemäß der vorstehend beschriebenen Vorgehensweise erhaltenen, an eine Trägermatrix gebundenen Polypeptide mit einer oder mehreren Kandidaten-Verbindungen; und
- b) Bestimmung der Bindung einer Kandidaten-Verbindung an ein Polypeptid.
Bei den Kandidaten-Verbindungen kann es sich um sehr
unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl natürlich
vorkommende als auch synthetische, organische und anorganische
Verbindungen, sowie Polymere (z. B. Oligopeptide, Polypeptide,
Oligonukleotide und Polynukleotide) sowie kleine Moleküle,
Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nukleotide und Nukleotid-
Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen (z. B.
Peptid-"Imitatoren", Nukleinsäureanaloge etc.) und zahlreiche
weitere Verbindungen.
Das Suchen nach geeigneten Verbindungen kann auch in großem
Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe
Anzahl von Kandidaten-Verbindungen in Substanzbibliotheken
gescreent wird, wobei die Substanzbibliotheken synthetische
oder natürliche Moleküle enthalten können. Somit ist in einer
bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
die Kandidaten-Verbindung Bestandteil einer
Substanzbibliothek.
Die grundsätzliche Vorgehensweise bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening ist in der
wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur
beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt. In diesem
Zusammenhang wird auch auf die nachfolgenden Beispiele
verwiesen. Beispielsweise kann eine große Anzahl von
möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test
gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld
von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle
1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben
und gleichzeitig getestet werden. Wenn eine Bindung entdeckt
wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100
aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden,
bis eine individuelle Verbindung identifiziert ist.
Jedenfalls können die Herstellung und das simultane Screenen
von großen Banken aus synthetischen Molekülen mittels gut
bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt
werden, siehe beispielsweise von Breemen, Anal. Chem. 69
(1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997),
145-167.
Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise
nützlichen Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten
als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können
aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise
den Spezies Pilze, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen,
Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die eine Bindung
anzeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls
analysiert werden. Siehe beispielsweise Turner, J.
Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh, Anticancer
Res. 15 (1995) 233-239.
Bevorzugte Kandidaten-Verbindungen sind SMDs, Peptide,
Hormone, Proteine und Nukleinsäuren.
Vorzugsweise tragen die Kandidaten-Verbindungen eine
nachweisbare Markierung, wobei es sich vorzugsweise um ein
Radioisotop, eine biolumineszente Verbindung, eine
chemilumineszente Verbindung, eine Fluoreszenz-Verbindung, ein
Metalchelat oder ein Enzym handelt.
Der Fachmann kennt Verfahren zum Nachweis einer
stattgefundenen Bindung der Kandidaten-Verbindung an das
rekombinante Polypeptid in Abhängigkeit der für die
Kandidaten-Verbindung gewählten Markierung. Bevorzugte
Verfahren zur Bestimmung der Bindung einer Kandidaten-
Verbindung sind radioaktive, fluoreszenzabhängige,
magnetische, spektroskopische, massenspektrometische,
biosensorische, photometrische Verfahren oder konfokale
Lasermikroskopie. Bedingungen zur Durchführung dieser
Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Geeignete Trägermatrizes sind dem Fachmann ebenfalls bekannt,
wobei als Trägermatrizes eine Mikrotiterplatte, ein
Glasobjektträger, ein Reaktionsgefäß, eine Membran, ein
Biochip (The Chipping Forecast 1999, Nature Genetics 21:
Supplement) oder eine Gelmatrix bevorzugt sind. Gelmatrizes
(z. B. Gelfiltrations- oder Ionenaustauscher-Matrizes) werden
z. B. verwendet, wenn die rekombinant hergestellten Polypeptide
von verunreinigenden Partikeln befreit werden müssen oder
falls diese in "batch"-Verfahren mit entsprechenden
Kandidaten-Verbindungen inkubiert werden sollen. Beispiele für
geeignete Gelmatrizes sind Streptavidin-gekoppelte
Säulenmaterialen (z. B. Sephadex™, DEAE etc., Pharmacia,
Freiburg, Deutschland) z. B. für die Bindung von biotinyliertem
S-Protein (Novagen, Madison, USA).
- A) Schematische Darstellung des genspezifischen PCR-Fragments (Fragment A). Das Fragment A wird durch die beiden Oligonukleotide um ca. 80 bis 100 Nukleotide verlängert. Der fett markierte Bereich stellt die genspezifische Sequenz der Oligonukleotide dar.
- B) Schematische Darstellung des genspezifischen 5'- Oligonukleotids (A). Der genspezifische Bereich ist kursiv und fett markiert. Der weiße Pfeil gibt die Syntheserichtung an. Das Initiationssignal "ATG" des spezifischen Gens befindet sich im ORF der vorgeschaltenen Linker-Sequenz.
- C) Schematische Darstellung des genspezifischen 3'- Oligonukleotids (A). Der genzspezifische Bereich ist kursiv und fett markiert. Die Sequenz dieses 3'-Oligonukleotids muß als Komplementärstrang dargestellt werden. Der graue Pfeil gibt die Syntheserichtung an. Das Stopcodon ist unterstrichen. Als translationsfördernde Sequenz ist ein poly(A)Schwanz von 15 Adeninen eingefügt.
- A) Schematische Darstellung des PCR-Fragments B. Die Länge des Fragments beträgt ca. 90 Nukleotide. Schraffierter Bereich: Mehrfachklonierungsstelle; grauer Bereich: Promotorsequenz für RNA-Polymerasen; schwarzer Bereich: S- Peptid-Sequenz; weißer Bereich: komplementäre Linker-Sequenz.
- B) Schematische Darstellung des 5'-Oligonukleotids (B) für Fragment B. Der 5'-S-Peptid-Bereich ist fett markiert. Die T7- Promotorsequenz ist unterstrichen. Der weiße Pfeil gibt die Syntheserichtung an.
- C) Schematische Darstellung des 3'-Oligonukleotids (B) von Fragment B. Der 5'-S-Peptid-Bereich ist fett markiert. Die Sequenz dieses 3'-Oligonukleotids muß als Komplementärstrang dargestellt werden. Der graue Pfeil gibt die Syntheserichtung an.
Die Polymerase verlängert die 3'-Enden in Richtung des
Fragment B- sowie Fragment A-Bereichs (graue Pfeile). MCS:
Mehrfachklonierungsstelle; Prom: RNA-Promotor; SPS: S-Peptid-
Sequenz; GSS-T: genspezifische Sequenz mit poly(dA)-Schwanz.
Die Länge des Megaprime-Produkts ist abhängig von der Länge
des genspezifischen Fragments (GSS). Die Länge der vor- und
hintergeschaltenen DNA-Sequenzen ist einheitlich. MCS:
Mehrfachklonierungsstelle; Prom: RNA-Promotor; SPS: S-Peptid-
Sequenz; Gly(n): Glycin-Linker-Sequenz; poly (dA)15-50: poly(dA)-
Schwanz.
Die Länge des Gesamtproteins ist abhängig von der Länge der
genspezifischen Proteinsequenz (GSPS). S-Peptid: S-Peptid-
Sequenz; Gly(n): Glycin-Linker-Sequenz; NH2: Amino-terminales
Proteinende; COOH: Carboxy-terminales Proteinende.
Der Linker zwischen S-Protein (schraffiert) und Trägermatrix
ist als graue Welle gekennzeichnet.
Das an die Trägermatrix (schwarzer Balken) gebundene S-Protein
(schraffiert) bindet das S-Peptid (gepunktet) mit hoher
Affinität, so daß das rekombinante Protein (GSP) ebenfalls an
die Trägermatrix fixiert wird. Glycin-Linker: Schwarze Welle.
1. Die mit dem rekombinanten Protein (jeder graue Punkt
entspricht einem spezifischen Protein) beladenen
Glasobjektträger werden 2. in einer geeigneten
Objektträger-Waschschale überführt und mit den in Lösung
befindlichen, z. B. fluoreszenzmarkierten Molekülen (schwarze
Punkte) inkubiert. 3. Nach mehrmaligen Waschen werden die
gebundenen Liganden z. B. durch Fluoreszenzanalyse detektiert
und den jeweiligen in vitro translatierten Proteinen
zugeordnet.
1. Es werden jeweils 24 Spots von vier verschiedenen
rekombinanten Proteinen auf eine Glassobjektträgeroberfläche
gespottet. 2. Pro horizontaler Ausrichtung werden
unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Moleküle (schwarze und
graue Sterne) präzise auf die entsprechenden Spots
transferiert und unter geeigneten Bedingungen inkubiert. 3.
Nach mehrmaligen Waschen werden die gebundenen Liganden durch
Fluoreszenzanalyse detektiert und den jeweiligen in vitro
translatierten Proteinen (in Triplikaten) zugeordnet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Hierfür werden genspezifische 5'- und 3'-Oligonukleotide
konstruiert, synthetisiert und anschließend in der (RT-)PCR
unter Zusatz des erforderlichen biologischen Ausgangsmaterials
eingesetzt. Das daraus resultierende spezifische Genfragment
wird hier als 'Fragment A' bezeichnet (Fig. 1a). Das für die
Herstellung des Fragments A verwendete 5'-Oligonukleotid (A)
weist am 3'-Ende die genspezifische Sequenz auf (15-20
Nukleotide für das Zinkfingergen pAT133 (Müller et al., PNAS
USA 88 (1991), 10079-10083; 5'-ATG CTC CAC CTT AGC-3') (Fig.
1b). Flußaufwärts dieser Sequenz wird eine "Linker-Sequenz"
von 12-24 bp (z. B. 5'-GGG GGG GGG GGG GGG-3') angefügt, die
nach der Translation ein Abfolge von 4-8 Glycin-Seitenketten
bewirkt. Das für die Herstellung des Fragments A verwendetet
3'-Oligonukleotid (A) weist ebenfalls an seinem 3'-Ende die
genspezifische Sequenz mit 15 bis 25 Nukleotiden auf (das
Stopcodon CTA beinhaltende Ende des pAT133-Gens: 5'-CTA TTC
ACT GGG TGG-3'), wobei das 5'-Ende des 3'-Oligonukleotids (A)
zusätzlich eine Abfolge von translationsfördernden Sequenzen
(z. B. poly (A)10-50) beinhaltet (Fig. 1c).
Thermostabile DNA Polymerase (Hybaid GmbH, Heidelberg,
Deutschland), (2 U/µl), 10 × Reaktionspuffer-Komplett (200 mM
Tris-HCCl, pH 8,5, 160 mM (NH4)2 SO4, 15 mM MgCl2),
5'-Oligonukleotid (A) (50 pmol/µl), 3'-Oligonukleotid (A) (50 pmol/µl),
dNTP-Mix (40 mM), genspezifische Matrize
(Gesamtmenge 0.1-10 ng); z. B. pAT133 Plasmid, H2O bidest.,
sterile Reaktionsgefäße (0.5 ml/0,2 ml)
Durchführung (Pipettierschema für 50 µl Endvolurnen): add 50 µl
H2O bidest.: 5,0 µl 10 × Reaktionspuffer-Komplett, 1,0 µl
5'-Oligonukleotid (A), 1,0 µl 3'-Oligonukleotid (A), xx µl
Matrize, 2,0 µl dNTP-Mix, 0,5 µl Thermostabile DNA Polymerase
Durchführung (PCR-Programm; Fragment A): Schritt 1: 2 min/94°C,
Schritt 2: 30 Sek/94°C, Schritt 3: 30 Sek/60°C, Schritt 4:
pro 1000 bp 1 min bei 70-75°C, 30 Zyklen: Schritt 2-4;
Schritt 5: 10 min bei 70-75°C.
Parallel zum genspezifischen Fragment A wird ein weiteres
"PCR-Fragment B" amplifiziert, das die in Fig. 2a
dargestellten Sequenzen beinhaltet. Das für die PCR verwendete
5'-Oligonukleotid ist aus drei Sequenzelementen aufgebaut
(Fig. 2b): Am 5'-Ende sind verschiedene Schnittstellen für
Restriktionsenzyme enthalten (z. B. 5'-GGA TCC GAA TTC CCC GGG-
3'; für BamHI, EcoRI, SmaI etc.). Davon flußabwärts wird eine
Promotorsequenz starker viraler, bakterieller oder
eukaryotischer RNA-Polymerasen eingefügt (15-30 Nukleotide:
z. B. T7 RNA Pol Promotor: 5'-AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC
GA-3') und am 3'-Ende dieses 5'-Oligonukleotides (B) schließt
die 5'-Sequenz für das S-Peptid der bovinen RNase A aus dem
Rinderpankreas (Richards und Wyckoff, The Enzymes Vol. IV
(1971), 647-806, Academic Press) mit 21 Nukleotiden (z. B.
5'-ATG GAA ACT GCA GCA GCC AAG-3') an. Das Intitiationssignal
ATG eröffnet den ORF des gesamten Fusionsproduktes. Das
3'-Oligonucleotid (B) für die PCR des Fragmentes B weist an
seinem 5'-Ende die komplementäre Sequenz (5'-CCC CCC CCC CCC
CCC-3') der Linker-Sequenz des genspezifischen 5'-
Oligonukleotides (siehe Fig. 1b) auf. Flußabwärts werden die
letzten 15-30 Nukleotide (z. B. 5'-GTC CAT GAG CTG CCG CTC AAA
CTT-3') des S-Peptid 3'-Endes repräsentiert (Fig. 2c). Das
Stopcodon "TGA" wird durch GAC (komplementär = CTG)
ausgetauscht, damit der ORF erhalten bleibt.
Thermostabile DNA Polymerase (2 U/µl), 10 ×
Reaktionspuffer-Komplett, 5'-Oligonukleotid (B) (50 µmol/µl),
3'-Oligonukleotid (B) (50 µmol/µl), dNTP-Mix (40 mM), RNase A
Matrize (Schmidt et al., Biochemistry 25(20), 1986, 5955-5961;
1245825 (GenBank)) (Gesamtmenge 1 ng/µ), H2O bidest., sterile
Reaktionsgefäße (0.5 ml/0,2 ml)
Durchführung (Pipettierschema für 50 µl Endvolumen): add 50 µl
H2O bidest.: 5,0 µl 10 × Reaktionspuffer-Komplett, 1,0 µl
5'-Oligonukleotid (B), 1,0 µl 3'-Oligonukleotid (B), 1 µl
RNase A Matrize, 2,0 µl dNTP-Mix, 0,5 µl Thermostabile DNA
Polymerase
Durchführung (PCR-Programm; Fragment B): Schritt 1: 2 min/94°C,
Schritt 2: 30 Sek/94°C, Schritt 3: 30 Sek/60°C,
Schritt 4: 30 Sek bei 70-75°C, 30 Zyklen: Schritt 2-4;
Schritt 5: 1 min bei 70-75°C.
Falls als Ausgangsmaterial Gesamt-RNA oder mRNA für das
genspezifische Fragment A herangezogen werden muß, dann werden
die Oligonukleotide (A) wie folgt in der RT-PCR eingesetzt.
0,5 ml sterile Reaktionsgefäße, 5 × RT-Puffer (250 mM Bicin (pH
8,2), 425 mM KAc, 40% Glycerin), MnAc2 (25 mM), H2O bidest.
(DEPC-behandelt), dNTP-Mix (40 mM), Tth DNA Polymerase (Hybaid
GmbH, Heidelberg, Deutschland) (2 U/µl), 5'-Oligonukleotid
(A) (50 µmol/µl), 3'-Oligonukleotid (A) (50 µmol/µl),
poly(dA)15-20 (50 pmol/µl); Gesamt-RNA oder mRNA (Gesamtmenge
0,1-1,0 µg).
Durchführung (Pipettierschema für 50 µl Endvolumen): add 50 µl
H2O bidest.: 10 µl 5 × RT-Puffer, 1,0 µl 5'-Oligonukleotid (A),
1,0 µl 3'-Oligonukleotid (A) und/oder, 1,0 µl poly (dA)15-20,
xx µl Matrize, 2,0 µl dNTP-Mix, 5,0 µl MnAc2, 1,0 µl Tth DNA
Polymerase.
Durchführung (RT-PCR-Programm/Fragment A): 1. Schritt: 6 min
70°C, 2. Schritt: 5 min/48 bzw. 58°C (in Abhängigkeit des
3'-Oligonukleotides), 3. Schritt: 30 min/60°C, 4. Schritt 2 min/94°C,
5. Schritt: 30 sec/94°C, 6. Schritt: 30 sec/
58°C, 7. Schritt: 1 min/68°C; 30 Zyklen: Schritte 5-7, 8.
Schritt: 10 min/68°C.
Die Reinigung der PCR-Fragmente erfolgt nach Standard-Methoden
(Silica-Beads, Spin-Preps) entsprechend den Herstellerangaben.
Die gereinigten Fragmente A und B werden daraufhin für die
Megaprime-PCR eingesetzt.
Durch die sog. Megaprime PCR (Barik und Galinsky,
BioTechniques 10 (1991), 489-490) lassen sich überlappende
DNA-Fragmente direkt während der PCR-Zyklen miteinander
ligieren. Die denaturierten DNA-Einzelstränge dienen dabei als
Primer und binden die komplementäre Sequenz des
Überlappungspartners. Das 3'-Oligonukleotid (B) und das
5'-Oligonukleotid (A) weisen eine komplementäre Sequenz
("Linker-Sequenz") auf, so daß nach Denaturierung der beiden
Fragmente eine Hybridisierung zwischen den komplementären
Enden des Fragmentes A und B stattfinden kann. Die
hybridisierten Einzelstränge können nun als "Megaprimer"
fungieren, so daß die Polymerase die freien 3'-Enden dieser
Stränge elongiert (Fig. 3). Damit eine exponentielle
Amplifikation gewährleistet ist, werden dem PCR-Ansatz sowohl
das 5'-Oligonukleotid (B) als auch das 3'-Oligonukleotid (A)
hinzupipettiert.
0,5 ml sterile Reaktionsgefäße, 10 × Reaktionspuffer-Komplett
(500 mM Tris-HCl (pH 8,1), 140 mM (NH4)2SO4, 17,5 mM MgCl2),.
H2O bidest., dNTP-Mix (40 mM), Taq/Pwo DNA Polymerase Mix
(Hybaid GmbH, Heidelberg, Deutschland) (2,5 U/µl),
5'-Oligonukleotid (B) (50 µmol/µl), 3'-Oligonukleotid (A) (50 pmol/µl),
Fragment A (ca. 100 ng/µl), Fragment B (ca. 100 ng/µl).
Durchführung (Pipettierschema für 100 µl Endvolumen): 10 µl 10
× Reaktionspuffer-Komplett, 76 µl H2O bidest., 2,0 µl
5'-Oligonukleotid B, 3,0 µl 3'-Oligonukleotid A, 3,0 µl
Fragment A, 3,0 µl Fragment B, 2,0 µl dNTP-Mix, 1,0 µl Taq/Pwo
DNA Polymerase Mix.
Durchführung (PCR-Programm): 1. Schritt: 2 min/94°C, 2.
Schritt: 30 sec/94°C, 3. Schritt: 2 min/48°C, 4. Schritt:
1 min/68°C; 25 Zyklen: Schritte 2-4, 5. Schritt: 10 min
/68°C, 6. Schritt: 4°C/t = ∞.
Das erhaltene Fragment kann direkt für die kombinierte in
vitro-Transkription/Translation eingesetzt werden.
Hierzu wird das in Beispiel 1 hergestellte Fragment verwendet.
Es werden (a) die eukaryotischen (Retikulozytenlysat oder
Weizenkeimlysat) oder bakteriellen "TNT™ Coupled"
Tranksription/Translation-Systeme der Fa. Promega, Mannheim,
Deutschland verwendet.
"96/384well"-Mikrotiterplatten, Megaprime-PCR-Fragment aus
Beispiel 1, "TNT-Coupled" Transkriptions/Translations-System,
TNT-Reaktionspuffer, TNT RNA Polymerase, Aminosäuregemisch
inkl. [35S]markierte Aminosäuren (Promega, Mannheim,
Deutschland), RNAsin Inhibitor (Promega, Mannheim,
Deutschland) (40 U/µl), H2O bidest. (DEPC-behandelt, Nuklease
frei).
Die Durchführung wird entsprechend den Herstellerangaben an
die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderlichen Volumina
(ca. 5-20 µl) angepaßt.
Pipettierschema für 10 µl Endvolumen in "384well"-
Mikrotiterplatten: xx µl TNT Lysat, 0,4 µl TNT
Reaktionspuffer, 0,2 µl TNT RNA Polymerase, 0,2 µl Aminosäure-
Gemisch, 0.8 µl [35S]markierte Aminosäure (1000 Ci/mmol,
10 mCi/ml), 0,2 µl RNasin Inhibitor, xx µl Megaprime-PCR
Fragment (0,1 bis 0,5 µg), add 10.0 µl H2O bidest.
Die einzelnen Komponenten (außer dem Megaprime-PCR Fragment)
werden als Mastermix pipettiert und in die entsprechenden
Mikrotiternäpfchen vorgelegt. Die Zugabe des Megaprime-PCR
Fragmentes erfolgt direkt in die Mikrotiternäpfchen. Die
Reaktion wird für 30-120 min bei 30°C durchgeführt.
In Kombination mit den oben beschriebenen Amplifikationen (bei
Verwendung von 20-30 "384well" PCR-Blöcken) sowie der
darauffolgenden zellfreien Proteinexpression (in 10-15
"384well" Mikrotiterplatten) lassen sich mehr als 5.000
unterschiedliche Proteine innerhalb von 24 Stunden
exprimieren. Nach der in vitro Translation werden ca. 20-50 ng
rekombinantes Protein in 10 µl Reaktionsvolumen erhalten. Alle
Proteine weisen dann die in Fig. 5 gezeigten
Aminosäuresequenzen auf.
Die aus Beispiel 2 erhaltenen Proteine werden darauffolgend an
die erforderlichen Trägermatrizes gebunden. Als Trägermatrix
lassen sich entsprechend vorbehandelte Materialien verwenden,
wobei vorzugsweise "384well"-Polystyrol- oder
Polypropylen-Mikrotiterplatten bzw. Glasobjektträger verwendet
werden.
Damit die rekombinanten Proteine mit hoher Affinität an eine
geeignete Trägermatrix gekoppelt werden können, wird die
hochaffine Interaktion zwischen einer trunkierten Form (104
Aminosäuren) der bovinen, pankreatischen RNase A (= S-Protein
(Kim und Raines, Protein Sci. 2 (1993), 348-356; Richard und
Wyckoff (1971), In: The Enzymes, Vol IV (Boyer, P. D. Ed.), p.
647-806, Academic Press, NY, USA)) und dem 15 Aminosäuren
langen S-Peptid ausgenutzt. Das S-Peptid entspricht den ersten
15 Aminosäuren (MKETAAAKFERQHMDS) der RNase A, wobei das
S-Protein eine Dissoziationskonstante von Kd = 10-9 M aufweist.
Das entspricht einer hochaffinen Bindungsaktivität, die z. B.
durch monoklonale Antikörper ebenfalls repräsentiert wird.
Im ersten Schritt wird das S-Protein an die einzusetzende
Trägermatrix nicht-kovalent gebunden, wobei (a)
Mikrotiterplatten und (b) Glasobjekträger verwendet werden.
Anschließend erfolgt die Kopplung der rekombinanten Proteine
über das S-Peptid an die so vorbehandelten Träger.
(a) Kopplung der rekombinanten Proteine an Mikrotiterplatten
Kommerziell erhältliche "96/384well"-Streptavidin-gekoppelte
Mikrotiterplatten (aus Polystyrol oder Polypropylen; Steffens
Analytik, Freiburg, Deutschland) werden für die Bindung von
biotinyliertem S-Protein (Novagen, Madison, USA) gemäß
Herstellerangaben (Novagen Corporation, Technical Bulletin TB
143) eingesetzt. Auf diese Weise werden die S-Proteine mit
sehr hoher Affinität (Kd = 10-14 M) an die Mikrotiterplatten
gekoppelt. Bei Verwendung von zwölf "384well"-
Mikrotiterplatten lassen sich bis zu 5.000 verschiedene in
vitro translatierte Proteine koppeln und z. B. für das
Hochdurchsatz-Screening unter Hinzugabe von potentiellen
Interaktionspartnern (SMDs (Small Molecule Drugs), Peptide,
Nukleinsäuren, Proteine etc.) einsetzen.
Die in Beispiel 2 erhaltenen rekombinanten Proteine (5-20 µl
Translationsansatz) werden ohne vorherige Reinigung direkt in
die entsprechenden Mikrotiternäpfchen der vorbereiteten
Mikrotiterplatten pipettiert.
Material: in vitro Translationsansatz (5-20 µl),
Streptavidin/S-Protein-gekoppelte Mikrotiterplatte,
PBST-Puffer, Glycerin
Durchführung: 5-20 µl des in vitro-Transkriptions/Transla
tions-Ansatzes werden in ein Mikrotiternäpfchen überführt,
danach erfolgt eine Inkubation für 6-20 min bei 4-30°C. Es
erfolgt die Entfernung des Überstandes und zweimaliges Waschen
der gebundenen Proteine mit jeweils 10-20 µl PBS. Schließlich
werden 10-20 µl PBS inkl. 50% Glycerin zugegeben. Die Lagerung
erfolgt bei -20°C.
(b) Kopplung der rekombinanten Proteine an Glasobjektträger
Kommerziell erhältliche "96/384well" Streptavidin-gekoppelte
Glasobjektträger (Interactiva GmbH, Ulm, Deutschland) werden
für die Bindung von biotinyliertem S-Protein (Novagen,
Madison, USA) nach Herstellerangaben eingesetzt. Auf diese
Weise werden die S-Proteine mit sehr hoher Affinität (siehe
(a)) an die Glasobjektträger gekoppelt, und diese "Biochips"
können ebenfalls wie unter (a) erwähnt für das Hochdurchsatz-
Screening herangezogen werden, wobei aber die eingesetzten
Volumina und Substanzmengen deutlich minimiert werden.
Die rekombinanten Proteine (0,2-1,0 µl Translationsansatz)
werden ohne vorherige Reinigung direkt in die entsprechenden
Mikrotiternäpfchen der vorbereiteten Mikrotiterplatten
pipettiert.
Material: in vitro Translationsansatz (0,2-1,0 µl),
Streptavidin/S-Protein-gekoppelte Glasobjektträger,
PSS-Puffer: Phosphate Buffered Saline (150 mM NaCl), Glycerin,
Objektträger-Waschschälchen, Feuchtkammer.
Durchführung: 0,2 µl (bei 384well) oder 1,0 µl (bei 96well)
des in vitro Translationsansatzes werden auf ein
Objektträgerspot überführt, danach erfolgt eine Inkubation für
5-20 min bei 4-30°C. Schließlich erfolgt das Entfernen des
Überstandes durch 2 × Waschen der gebunden Proteine mit jeweils
2-5 ml PBS. Die Lagerung der Objektträger erfolgt in einer
Feuchtkammer bei 40°C bis zum Screening.
Die in vitro translatierten Proteine wurden nach Fixierung an
die Trägermatrizes (Beispiel 3) zum Screenen potentieller
Interaktionspartner herangezogen. Die Variabilität in dem
erfindungsgemäßen Screening-System ist dadurch gegeben, daß
eine große Anzahl unterschiedlicher Proteine oder Mutanten pro
Glasobjektträgerfläche/Mikrotiterplatte aufgetragen werden
können, und daß der Objektträger mit nur einem zu
untersuchenden Molekül, z. B. in einem
Objektträger-Waschschälchen inkubiert wird (Fig. 7A).
Andererseits lassen sich diverse zu untersuchenden Moleküle
mit Hilfe von Pipettier- oder Spotting-Robotern auf die
unterschiedlichen Proteinspots/Wells der Glasobjektträger bzw.
Mikrotiternäpfchen transferieren (Fig. 7B).
Beispielhaft für eine Interaktionsanalyse zwischen einem gemäß
Beispiel 2 in vitro translatierten sowie gemäß Beispiel 3
lokal fixierten Protein und einem freien markierten Liganden
wurde das Zinkfingerprotein des pAT133-Gens und dessen
Bindungspartner (dsDNA Sequenz. 5'-GGGGCGGGG-3') herangezogen.
Bisher wurden solche Interaktionen mit Hilfe von Zeit- und
kostenaufwendigen Gelretardations- (Gelshift; Ausubel et al.,
(1993), Curr. Protocols in Mol Biol. Vol. 2, Greene Publ.
Assoc., Inc. J. Wiley & Sons, NY, USA) sowie Footprint-Analysen
(Schmitz und Galsa, Nucl. Acids. Res. 6 (1978), 111)
durchgeführt.
"384well"-Mikrotiterplatte mit gebundenem in vitro
translatierten Protein (Zinkfingerprotein AT133), Cy3-
markierte dsDNA (5'--GGGGCGGGG-3') (Eurogentec, Liege,
Belgien)(2 pmol/µl), nichtmarkierte Kompetitor-DNA:
poly(dI-dC)Ipoly(dI-dC) (Eurogentec, Liege, Belgien)
(2 pmol/µl), 5 × Gelshift-Bindungspuffer: 50 mM Tris-HCl (pH
7.5), 5 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 20%
Glycerin, H2O, bidest.
Zuerst wurden die Mastermixes (1 × Gelshift-Bindungspuffer)
hergestellt, danach pro Vertiefung der "384well"-Platte 10 µl
Mastermix pipettiert. Hierzu wurden nichtmarkierte Competitor-
DNA im fünffachen molaren Überschuss zur erwarteten
Proteinmenge hinzupipettiert, danach wurde 5-10 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde jeweils ein
fünffacher molarer Überschuß zur erwarteten Proteinmenge Cy3-
markierte dsDNA hinzugeben und es wurde 5-10 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde entnommen und
zweimal mit 1 × Gelshift-Bindungspuffer gewaschen.
Darauffolgend wurde das Ganze in 10 µl 1 ×
Gelshift-Bindungspuffer belassen, mit Hilfe eines
Mikrotiterplatten Fluoreszenzlesegerätes ausgewertet und die
Bindung zwischen dem Zinkfingerprotein und seinem
Bindungspartner nachgewiesen.
Für das Auffinden von potentiellen Medikamenten gegen oder für
bestimmte Proteine im Hochdurchsatzverfahren lassen sich die
gemäß Beispiel 2 in vitro translatierten und gemäß Beispiel 3
an die Trägermatrix gebundenen Proteine ebenfalls einsetzen.
Es wurde die humane Phenylalanin-Hydroxylase verwendet, die
eine natürliche Affinität zu L-Phenylalanin besitzt. Bei
Parkinson-Patienten verursacht eine Punktmutation (SNP) eine
reduzierte Affinität zu dieser Aminosäure, so daß die Bildung
von L-DOPA unterbunden wird (Knappskog et al., Hum. Mutat. 8
(1996), 236-246. Die Interaktion zwischen L-Phenylalanin und
der humanen Phenylalanin-Hydroxylase wurde mehrfach mit in
vitro translatierten Proteinen demonstriert (Knappsog et al.,
Hum. Mutat 8 (1996), 236-246; Lüdecke et al., Hum. Mol. Genet.
5 (1996), 1023-1028. Bezüglich der vorliegend verwendeten
Phenylalanin-Hydroxylase wurde das vorstehende pAT 133-Gen
verwendet, bei dem die Sequenz ab dem ATG durch die PAH-
Sequenz aus Lüdecke et al. ersetzt wurde.
in vitro Translationsansatz (0,2-1,0 µl), gemäß Beispiel 3
vorbehandelte Glasobjektträger, fluoreszenzmarkiertes
L-Phenylalanin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) in PBS
(100 µM, 200 µM und 300 µm Lösungen), PBS-Puffer: Phosphate
Buffered Saline (150 mM NaCl), Objektträger-Waschschälchen,
Feuchtkammer.
Der Objektträger wurde in PBS vorinkubiert und anschließend
die überschüssige Flüssigkeit durch Abtropfen und vorsichtiges
Abwischen entfernt. Danach erfolgte das überführen von 0,2 µl
(bei "384well"-Platten) oder 1,0 µl (bei "96well"-Platten) der
L-Phenylalanin-Lösung (50 µM-500 µM) auf einen entsprechenden
Objektträgerspot. Die Inkubation erfolgte für 30 min bei
Raumtemperatur. Danach wurde der Objektträger zweimal in PBS
gewaschen. Schließlich wurde die überschüssige Flüssigkeit
durch Abtropfen und vorsichtiges Abwischen entfernt. Die
Analyse gebundener L-Phenylalanin-Moleküle erfolgte durch
Glassobjektträger-Fluoreszenzlesegeräte (Chipleader, Virtek
Inc., Waterloo, Kanada).
Claims (11)
1. Verfahren zur Hochdurchsatz-Direktsynthese von
rekombinanten Polypeptiden und deren Kopplung an eine
Trägermatrix, das durch folgende Schritte gekennzeichnet
ist:
- a) Herstellung von DNA-Konstrukten, die folgende
Abschnitte aufweisen:
- 1. eine Promotorsequenz,
- 2. eine ein Affinitäts-Tag kodierende DNA-Sequenz, und
- 3. jeweils eine das gewünschte rekombinante Polypeptid kodierende DNA-Sequenz, wobei die Reihenfolge der Abschnitte in 5'-3'-Richtung (1), (2), (3) oder (1), (3), (2) ist;
- b) gekoppelte in vitro-Transkription und -Translation der DNA-Konstrukte von Schritt (a); und
- c) Kopplung der in Schritt (b) erhaltenen Polypeptide an eine Trägermatrix, die eine Affinität für das Affinitäts-Tag aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA-Konstrukte zusätzlich noch folgende Abschnitte
aufweisen: eine 5' zu der Promotorsequenz gelegene
Mehrfachklonierungsstelle, eine zwischen (2) und (3)
gelegene, einen Aminosäurelinker kodierende DNA-Sequenz,
und/oder eine 3' zu (3) gelegene poly(dA) kodierende DNA-
Sequenz, mit einer Mehrfachklonierungsstelle.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die DNA-Konstrukte in Schritt (a) über PCR erhalten
werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die
Promotorsequenz (1) eine T7, T3 SP6, E. Coli S30, SV40
oder HCMV Promotorsequenz ist. 1
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das
Affinitäts-Tag ein His-Tag, T7-Tag, Strep-Tag, myc-Tag
oder eine S-Peptid-Sequenz ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei die
einen Aminosäurelinker kodierende DNA-Sequenz eine 5 bis
20 Glycin- und/oder Serin-Reste kodierende Sequenz ist.
7. Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening, das durch folgende
Schritte gekennzeichnet ist:
- a) Inkontaktbringen der in Schritt (c) der Ansprüche 1 bis 6 erhaltenen, an eine Trägermatrix gebundenen Polypeptide mit einer oder mehreren Kandidaten- Verbindungen; und
- b) Bestimmung der Bindung einer Kandidaten-Verbindung an ein Polypeptid.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kandidaten-
Verbindung(en) eine nachweisbare Markierung tragen.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Bestimmung
der Bindung einer Kandidaten-Verbindung über ein
radioaktives, fluoreszenzabhängiges, magnetisches,
spektroskopisches, massenspektrometisches,
biosensorisches, photometrisches Verfahren oder konfokale
Lasermikroskopie erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Trägermatrix eine
Mikrotiterplatte, ein Glasobjektträger, ein
Reaktionsgefäß, ein Biochip, eine Membran oder eine
Gelmatrix ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Kandidaten-Verbindung ein SMD,
Peptid, Hormon, Protein oder eine Nukleinsäure ist.
Priority Applications (3)
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DE2001106339 DE10106339A1 (de) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden |
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