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Die
Erfindung betrifft ein Extraktionsverfahren zur Isolierung von Zielmolekülen
aus einer Probe unter Verwendung einer Molekülbibliothek.
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Die
selektive Extraktion von Molekülen ist für viele
Arbeitsgebiete in der Biochemie, Biologie und Medizin ein zentraler
und wichtiger Prozess. Zu diesen Arbeitsgebieten gehört
die Extraktion und Aufreinigung von Nukleinsäuren, Proteinen,
Zuckern und weiteren biochemischen funktionellen Molekülen.
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Auch
in der Genetik spielen biochemische Methoden zur Extraktion von
bestimmten Molekülen, Verbindungen oder Stoffklassen eine
wichtige Rolle. Besondere Bedeutung kommt dabei der Aufreinigung von
Nukleinsäuren, meist DNA und RNA, zu. Wesentliche Schritte
der Rekombinationstechnik setzen die Isolation und Reinigung von
bestimmten Nukleinsäuren, z. B. von Plasmid-DNA oder genomischer DNA,
voraus. Auch die Konstruktion von Gen-Bibliotheken aus messenger-RNA
(mRNA), die eine zentrale Bedeutung in der Gentechnik hat, ist auf
die Isolation einer gewünschten RNA-Population angewiesen.
Aus solchen Bibliotheken werden Gene oder Genfragmente "gefischt",
um sie weiter untersuchen oder manipulieren zu können.
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Biochemische,
biologische und medizinische Analyseverfahren lassen sich durch
Miniaturisierung und Parallelisierung in ihrer Effizienz und Aussagekraft
enorm steigern. Solche Miniaturisierungen betreffen z. B. die Analyse
von genetischem Material mit Hilfe von Hybridisierungsexperimenten
auf DNA-Mikroarrays. Durch Entwicklung von Mikroarrays aus geeigneten
DNA-Sonden als Rezeptoren lassen sich ganze Genome und Transkriptome
analysieren. Neben den recht weit verbreiteten DNA-Mikroarrays sind
auch Verfahren miniaturisiert und parallelisiert worden, die dem
Screening nach Molekülen mit besonderen Eigenschaften dienen,
z. B. Ribozymen. Weitere Beispiele für Rezeptoren auf Mikroarrays
sind Proteine und solche Moleküle, die in der Natur nicht
vorkommen, wie z. B. Peptidnukleinsäuren (PNA). Viele solcher
Assay-Formate werden unter der Rubrik Biochips zusammengefasst.
Alle diese Assay-Formate und Biochips sind potenziell für
die Isolation und Reinigung des Probenmaterials und die Probenvorbereitung
nutzbar.
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Mikroreaktionstechniken
können mit solchen Mikroarrays gekoppelt werden, um sowohl
bei Probenvorbereitung als auch bei Herstellung des eigentlichen
Arrays zu schnellen und effizienten Systemen zu kommen. Dies schließt
auch die Verwendung von mikrofluidischen Verfahren mit ein.
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Für
die biochemische Isolation von Nukleinsäuren stehen zahlreiche
Methoden zur Verfügung. Die Methoden erlauben zwar die
Isolation und gegebenenfalls auch Aufreinigung von RNA oder DNA über
ihre biophysikalischen Eigenschaften, sind dabei aber völlig
unspezifisch in Bezug auf die Sequenz des Nukleinsäurestranges.
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So
können aus Gesamt-RNA, die unterschiedliche Sorten RNA
enthält, mRNA-Moleküle relativ spezifisch isoliert
werden, indem man auf einer festen Phase, z. B. Latex-Beads, Magnet-Beads, Controlled
Pore Glass-Beads oder der Matrix einer Säule Poly-Thymidin
Stränge (poly-T Stränge) immobilisiert. Diese
Poly-T Stränge hybridisieren nach Zugabe von Gesamt-RNA
mit dem Poly-Adenin (poly-A) Schwanz von mRNA-Molekülen
und erlauben das Abtrennen der nichtgebundenen RNA-Moleküle.
Die mRNA-Moleküle werden dann isoliert, indem der Puffer
entsprechend so geändert wird, dass die Hybridisierung
zugunsten von Einzelsträngen aufgehoben wird. Die frei
werdenden mRNA-Moleküle kann man anschließend
eluieren.
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Der
Informationsgehalt einer solchen Isolationsmatrix ist vergleichsweise gering,
da nur zwei Kategorien von Zielmolekülen unterschieden
werden können, nämlich mit oder ohne poly-A Schwanz.
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Im
Falle von Isolationsverfahren für Proteine verhält
es sich zumeist ähnlich. So werden Immunglobuline häufig
durch eine Isolationsmatrix in einer Säule mit immobilisiertem
Protein A (aus Staphylococcus aureus) isoliert (Brown et
al., Biochem. Soc. Transactions (England) 26 (1998), 249).
In anderen Versionen des Verfahrens werden Antikörper für
eines oder wenige Zielmoleküle an die Isolationsmatrix gebunden.
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Solche
Isolationsverfahren werden allgemein als Affinitätschromatographie
bezeichnet. Ein Nachteil dieser Verfahren besteht darin, dass keine parallele
selektive Isolation unterschiedlicher Zielmoleküle möglich
ist.
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US-Patent 6,013,440 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung einer Affinitätsmatrix, wobei
ein Satz unterschiedlicher Nukleinsäuresonden auf einem
festen Träger immobilisiert wird, um auf diese Weise Zielnukleinsäuren
einer noch unbekannten Sequenz aus einer Probe anzureichern. Neben
anderen Nachteilen ist hervorzuheben, dass das vorgeschlagene Verfahren
flächige Träger als Isolationsmatrix verwendet,
die nur eine ungünstige Elution erlauben. Auch mit diesem
Verfahren können somit die aus dem Stand der Technik bekannten
Nachteile nicht beseitigt werden.
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WO 03/031965 beschreibt
ein Verfahren und eine Vorrichtung, bei denen ein mikrofluidischer
Träger als Isolationsmatrix verwendet wird, der eine selektive
Isolation von bestimmten biochemischen funktionellen Molekülen
(Zielmolekülen), insbesondere eine sequenzspezifische parallele
Isolation mehrerer Spezies von Zielmolekülen, aus einem
Gemisch erlaubt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von
Zielmolekülen aus einer Probe unter Verwendung einer Molekülbibliothek,
bestehend aus freien Fänger-Rezeptoren, die spezifische Wechselwirkungen
mit den Zielmolekülen aufweisen. Das Verfahren umfasst
vorzugsweise eine parallele Isolierung von mehreren Zielmolekülen
unter Verwendung einer Bibliothek von mehreren unterschiedlichen
Fänger-Rezeptoren. Die Synthese der Molekülbibliothek
findet auf einem festen Träger, insbesondere auf einem
mikrofluidischen Täger statt. Vor Inkontaktbringen mit
der Probe werden die die Molekülbibliothek bildenden Fänger-Rezeptoren
vom Träger abgelöst, insbesondere durch chemische oder/und
physikalische Verfahren, oder abgeschrieben bzw. abkopiert, insbesondere
durch enzymatische Verfahren. Die Fänger-Rezeptoren werden
mit funktionellen Gruppen markiert und dann mit der Probe in Kontakt
gebracht, so dass eine Bindung der Zielmoleküle an die
für die Zielmoleküle spezifischen Fänger-Rezeptoren
erfolgen kann, und Komplexe der Zielmoleküle und der Fänger-Rezeptoren
entstehen. Die gebildeten Komplexe, die z. B. aus einem Fänger-Rezeptor
und einem Zielmolekül bestehen, werden anschließend
von übrigen Probenkomponenten abgetrennt, vorzugsweise
durch Immobilisierung an eine Festphase, z. B. über die
funktionelle Gruppe. Anschließend können die an
die Festphase gebundenen Zielmoleküle eluiert werden.
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Die
Funktionalität eines Zielmoleküls ist durch seine
Fähigkeit zur selektiven Bindung an einen für
das Zielmolekül spezifischen Fänger-Rezeptor,
vorzugsweise durch bioaffine Wechselwirkungen wie Hybridisierung,
Rezeptor-Ligand-Bindung, Antigen-Antikörper-Bindung, Saccharid-Lectin-Bindung etc.,
definiert.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Bereitstellung
eines Trägers mit einer Molekülbibliothek, d.
h. einen Array von selektiv bindenden Rezeptoren bzw. Fängersonden,
die zur Isolierung der Zielmoleküle geeignet sind. In einer
bevorzugten Ausführungsform erfolgt eine in situ Synthese
der Rezeptoren auf oder in dem Träger, vorzugsweise einem
mikrofluidischen Reaktionsträger. Diese Vorgehensweise
erlaubt bei Einsatz entsprechender Verfahren für die in
situ Synthese einen sehr hohen Informationsgehalt der Molekülbibliothek.
Im Fall von Nukleinsäuren als Zielmoleküle kann
ein geeignetes System für die in situ Synthese der entsprechenden Fängersonden
Tausende von definierten Sequenzen einer Molekülbibliothek
herstellen. Somit wird durch die Erfindung ein Weg eröffnet,
um gezielt Hunderte bis Tausende oder sogar Millionen von individuellen DNA-
oder RNA-Molekülen gezielt aus einem Gemisch zu isolieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren kann z. B. zum Einsatz
kommen in der akademischen Forschung, der Grundlagenforschung, der
industriellen Forschung, in der Qualitätskontrolle, in
der Pharmaforschung, in der Biotechnologie, in der klinischen Forschung,
in der klinischen Diagnostik, in Screening-Verfahren, in der patientenindividuellen
Diagnostik, in klinischen Studien, in der Forensik, für
genetische Tests, wie Elternschaftsbestimmungen, in der Tier- und
Pflanzenzucht oder im Umweltmonitoring.
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Ein
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Isolierung
von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellen eines Trägers mit
einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekülen,
die an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger
immobilisiert sind,
- (b) Ablösen der Fängermoleküle von
dem Träger,
- (c) Markieren der Fängermoleküle, wobei das Markieren
vor oder nach dem Ablösen der Fängermoleküle
gemäß Schritt (b) erfolgen kann,
- (d) Inkontaktbringen der markierten Fängermoleküle
mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält,
unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an
die markierten Fängermoleküle binden können,
- (e) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle
gebundenem Material aus der Probe und
- (f) Isolieren der Zielmoleküle.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung
von Zielmolekülen aus einer Probe, umfassend die Schritte:
- (a) Bereitstellen eines Trägers mit
einem Array von mehreren verschiedenen frei wählbaren Fängermolekül-Matrizen,
die an jeweils unterschiedlichen Positionen auf dem oder im Träger
immobilisiert sind,
- (b) Abschreiben der Fängermolekül-Matrizen,
um Fängermoleküle in freier Form zu erhalten,
- (c) Markieren der Fängermoleküle, wobei das Markieren
während oder nach dem Abschreiben gemäß Schritt
(b) erfolgen kann,
- (d) Inkontaktbringen der markierten Fängermoleküle
mit einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle enthält,
unter Bedingungen, bei denen Zielmoleküle spezifisch an
die markierten Fängermoleküle binden können,
- (e) Abtrennen von nicht an Fängermoleküle
gebundenem Material aus der Probe und
- (f) Isolieren der Zielmoleküle.
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Die
durch das erfindungsgemäße Verfahren isolierten
Zielmoleküle werden vorzugsweise aus biologischen Polymeren,
wie Nukleinsäuren, z. B. doppelsträngigen oder
einzelsträngigen DNA-Molekülen, z. B. genomischen
DNA-Molekülen oder cDNA-Molekülen, oder RNA-Molekülen,
Polypeptiden, wie etwa Proteinen, Glykoproteinen, Lipoproteinen,
Nukleoproteinen etc., Peptiden und Sacchariden ausgewählt.
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Bevorzugt
handelt es sich bei den Zielmolekülen um Nukleinsäuren
und die Fängermoleküle werden aus dazu komplementären
Hybridisierungssonden ausgewählt. Bei den Hybridisierungssonden kann
es sich ebenfalls um Nukleinsäuren, insbesondere DNA-Moleküle,
jedoch auch um Nukleinsäureanaloga, wie Peptidnukleinsäuren
(PNA), Locked-Nukleinsäuren (LNA) etc. handeln. Die Hybridisierungssonden
haben vorzugsweise eine Länge entsprechend 10–100
Nukleotiden und müssen nicht durchgängig aus Bausteinen
mit Basen bestehen, d. h. sie können beispielsweise auch
abasische Bausteine, Linker, Spacer etc. enthalten. Die Hybridisierungssonden
oder deren Komplemente können am 3'-Ende, 5'-Ende oder
dazwischen oder an mehreren Positionen am Träger gebunden
sein.
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Ein
anderes bevorzugtes Beispiel für Fängermoleküle
sind Peptide. Desweiteren können selbstverständlich
auch niedermolekulare Substanzbibliotheken als Rezeptoren eingesetzt
werden.
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Vorzugsweise
werden die auf dem Träger immobilisierten Fängermoleküle
bzw. Fängermolekül-Matrizen, z. B. die Hybridisierungssonden,
durch in situ Synthese, z. B. durch schrittweisen Aufbau aus Synthesebausteinen,
auf dem Träger erzeugt und sind damit frei wählbar.
Die Bausteine für diese in situ Synthese können
Monomere der betreffenden Stoffklasse sein, also im Fall von Nukleinsäuren
z. B. Nukleotidbausteine. Es kann sich aber auch um komplexere Bausteine
handeln, so z. B. Oligonukleotide oder Oligopeptide aus mehreren,
z. B. 2, 3, oder 4, Monomereinheiten.
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Die
für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete
Probe ist vorzugsweise eine komplexe Probe, d. h. die Zielmoleküle
müssen aus einer Vielzahl ähnlicher Molekülspezies
selektiv isoliert werden. Die Probe kann eine biologische Probe
sein, z. B. eine Probe aus einem biologischen Organismus, z. B.
aus einer Körperflüssigkeit, eine Probe aus einer
Zell- oder Mikroorganismenkultur etc. Weiterhin kann die Probe auch
aus synthetischen Quellen, z. B. aus einer Synthesevorrichtung,
stammen, oder ein Gemisch aus biologischem und synthetischem Material
sein. Auch die Verwendung aus vorgefertigten Molekülbibliotheken,
in denen spezifische Zielmoleküle vorhanden sein können,
ist möglich.
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Die
Probe kann vor dem Inkontaktbringen mit den Rezeptoren gegebenenfalls
prozessiert werden, z. B. durch enzymatische Reaktion wie Amplifikation, Restriktionsspaltung,
Markierung, Transkription, Translation, Fraktionierung, Vorreinigung
etc. Die zu isolierenden Zielmoleküle können somit
in markierter oder unmarkierter Form vorliegen.
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Der
die Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen
in immobilisierter Form enthaltende Array wird bevorzugt auf einem
strukturierten Träger, besonders bevorzugt an einem Träger
mit Kanälen, z. B. mit geschlossenen Kanälen,
bereitgestellt. Die Kanäle sind beispielsweise Mikrokanäle
mit einem Querschnitt von 10–10 000 μm. Beispiele
für geeignete Träger mit Kanälen sind
in
WO 00/13017 und
WO 00/13018 beschrieben.
Vorzugsweise wird ein Träger verwendet, der zumindest teilweise
im Bereich der Positionen mit den immobilisierten Fängermolekülen
bzw. Fängermolekül-Matrizen optisch transparent
oder/und elektrisch leitfähig ist. Alternativ können
jedoch auch andere Arten von Trägern, z. B. planare Träger
wie etwa Mikroskopslides, Verwendung finden, die eine Herstellung
definierter Molekülbibliotheken von Fängermolekülen
ermöglichen.
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Der
für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte
Träger enthält einen Array mit mehreren verschiedenen
Spezies von immobilisierten Fängermolekülen bzw.
Fängermolekül-Matrizen, z. B. mit mindestens 10,
vorzugsweise mindestens 100, besonders bevorzugt mindestens 1000
verschiedenen Spezies von Fängermolekülen bzw.
Fängermolekül-Matrizen. Die einzelnen immobilisierten
Spezies unterscheiden sich darin, dass sie eine unterschiedliche
Struktur, z. B. Nukleinsäuresequenz, aufweisen und gegebenenfalls – im
Falle von Fängermolekülen – unterschiedliche
Zielmoleküle binden und – im Falle von Fängermolekül-Matrizen – beim
Abschreiben unterschiedliche Fängermoleküle ergeben.
Die Fängermoleküle bzw. Fängermolekül-Matrizen
werden vorzugsweise in situ schrittweise durch orts- oder/und zeitspezifisches
Koppeln von Synthesebausteinen an den jeweils vorbestimmten Positionen
auf dem oder im Träger aufgebaut.
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An
einer vorbestimmten Position kann nur eine einzige Fängermolekül-Spezies
bzw. Fängermolekül-Matrizenspezies oder ein Gemisch
von mehreren verschiedenen Fängermolekül-Spezies
bzw. Fängermolekül-Matrizenspezies immobilisiert
oder synthetisiert werden. Beispielsweise kann man Gemische von
Spezies verwenden, die für das gleiche zu isolierende Zielmolekül
spezifisch sind, z. B. ein Satz von verschiedenen Hybridisierungssonden
für die Isolierung einer einzigen bestimmten Ziel-Nukleinsäure.
Alternativ können die Fängermoleküle
auch extern synthetisiert und anschließend auf dem Träger immobilisiert
werden, z. B. durch Spotting.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger
in einer Vorrichtung integriert, umfassend eine programmierbare
Lichtquellenmatrix, eine Detektormatrix, einen vorzugsweise zwischen
Lichtquellen- und Detektormatrix angeordneten Träger sowie
Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Träger und zur Ableitung
von Fluids aus dem Träger. Die programmierbare Lichtquellen-
bzw. Belichtungsmatrix kann eine Reflexionsmatrix, eine Lichtventilmatrix,
z. B. eine LCD-Matrix oder eine selbstemittierende Belichtungsmatrix,
sein. Derartige Lichtmatrices sind in
WO00/13017 und
WO00/13018 offenbart. Die Detektormatrix
kann gegebenenfalls im Trägerkörper integriert
sein.
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Der
in situ Aufbau von Fängermolekülen auf dem Träger
kann fluidchemische Schritte, photochemische Schritte, elektrochemische
Schritte oder Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Schritte
umfassen. Ein Beispiel für eine elektrochemische Synthese
von Fängermolekülen auf einem Träger
ist in
DE 101 20 633.1 beschrieben.
Ein Beispiel für ein Hybridverfahren, umfassend die Kombination
von fluidchemischen Schritten und photochemischen Schritten, ist
in
DE 101 22 357.9 beschrieben.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur
Herstellung von mehrere Bibliotheken von Fängermolekülen
auf einem einzigen Träger. So kann sich nach der Ablösung
von Fängermolekülen bzw. nach dem Abschreiben
von Fängermolekül-Matrizen ein weiterer Synthese-Ablösungs-
bzw. Abschreib-Zyklus anschließen. Auf diese Weise lassen sich
mit einem Träger auch sehr unterschiedliche Molekülspezies,
wie mRNA-Moleküle oder DNA-Sequenzen, isolieren. Darüber
hinaus ist eine Umstellung auf neue Zielmoleküle mit einem
einzigen Träger möglich. Das Verfahren ist gut
automatisierbar und kann mit weiteren nachfolgenden Prozessierungsschritten,
wie einer Amplifikationsreaktion, z. B. unter Verwendung eines PCR-Thermocyclers,
einer Detektion oder einer in vitro Translation kombiniert werden.
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In
einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden die Fängermoleküle, die spezifisch
an die Zielmoleküle binden können, direkt auf
dem Träger bereitgestellt. In dieser Ausführungsform
der Erfindung sind die Fängermoleküle über
eine spaltbare Bindung an den Träger gekoppelt, so dass
ein Ablösen der Fängermoleküle vom Träger
beispielsweise durch photochemische oder/und fluidchemische Schritte
folgen kann. Hierzu werden vorzugsweise photolabile oder/und chemisch labile,
z. B. durch Säuren, Basen oder/und Reduktion spaltbare
Bindungen zwischen dem Fängermolekül und dem Träger
vorgesehen. Vor oder nach dem Ablösen vom Träger
werden die Fängermoleküle markiert. Dies erfolgt
vorzugsweise durch Einführung von einer oder mehreren funktionellen
Gruppen. Diese funktionellen Gruppen können beispielsweise
während der Synthese in Form von funktionalisierten Synthesebausteinen
oder/und nach der Synthese (auf dem Träger oder nach dem
Ablösen) durch Reaktion des Fängermoleküls
mit geeigneten funktionellen Gruppen eingeführt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Träger
mit immobilisierten Fängermolekül-Matrizen bereitgestellt.
Auf diesem Träger werden durch Abschreiben der Matrizen
vorzugsweise mittels enzymatischer Methoden die Fängermoleküle in
freier Form hergestellt, beispielsweise durch enzymatische Elongation
von Primer-Molekülen, die an Teilsequenzen der Matrizen
binden, z. B. hybridisieren, oder mittels anderer Methoden, wie
etwa in
WO 2005/051970 beschrieben,
deren Offenbarung hiermit zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht
wird. In dieser Ausführungsform sind die Fängermolekül-Matrizen
vorzugsweise Nukleinsäuren und die Fängermoleküle
hierzu komplementäre Nukleinsäuremoleküle.
Die Einführung von Markierungsgruppen in die Fängermoleküle
kann während der Herstellung, z. B. während der
enzymatischen Synthese, beispielsweise durch Verwendung von mit funktionellen
Gruppen derivatisierten Primer-Molekülen und/oder Synthesebausteinen,
oder nach dem Herstellen der Fängermoleküle durch
Derivatisierung mit geeigneten reaktiven funktionellen Gruppen erfolgen.
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Nach
dem Eluieren der Fängermoleküle von dem Träger
kann auch eine Amplifikation der aus den Fänger-Rezeptoren
bestehenden Molekülbibliothek erfolgen. Vorzugsweise wird
hierzu ein verzerrungsfreies Amplifikationsverfahren verwendet,
bei dem die ursprüngliche Zusammensetzung der Molekülbibliothek
gewahrt bleibt. Ein Beispiel hierfür ist die Emulsions-PCR.
In dieser Ausführungsform können die zur Markierung
vorgesehenen funktionellen Gruppen beispielsweise durch Verwendung
markierter Amplifikationsprimer oder markierter Nukleosidtriphosphat-Derivate
eingeführt werden.
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Die
funktionellen Gruppen, mit denen die Fängermoleküle
im erfindungsgemäßen Verfahren markiert werden,
sind vorzugsweise Festphasenbindungsgruppen, d. h. Gruppen, die
an eine geeignete Festphase, z. B. an einen weiteren Träger
wie oben angegeben, eine Mikrotiterplatte, eine Säule oder partikuläre
Festphasen wie Kugeln, gebunden werden können. Vorzugsweise
wird als funktionelle Gruppe ein erster Parter eines bioaffinen
Bindepaares verwendet, der mit hoher Affinität und Spezifität mit
dem komplementären zweiten Partner des Bindepaares reagieren
kann. Beispiele für geeignete Paare von Bindepartnern sind
Antigen bzw. Hapten/Antikörper, Biotin/Streptavidin, Zucker/Lectin,
Ligand/Rezeptor etc. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die funktionelle Gruppe Biotin und die komplementäre
Gruppe der Festphase Streptavidin oder Avidin. Selbstverständlich
können anstelle von Biotin auch mit Streptavidin bzw. Avidin
bindefähige Biotinderivate verwendet werden.
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Durch
Immobilisierung von funktionalisierten Fängermolekülen
können im erfindungsgemäßen Verfahren
die an die Fängermoleküle gebundenen Zielmoleküle
von anderen Probenkomponenten, beispielsweise von nicht mit den
Fängermolekülen bindefähigen Komponenten
der Probe, abgetrennt werden. Die Immobilisierung der Fängermoleküle
auf der Festphase kann ortsunspezifisch, aber auch – bei Verwendung
unterschiedlicher funktionalisierter Gruppen – auch ortsspezifisch
erfolgen, z. B. auf verschiedenen Partikeln oder an verschiedenen
räumlichen Bereichen einer gemeinsamen Festphase.
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In
einer Ausführungsform der Erfindung werden mehrere Subfraktionen
der zur Isolierung der Zielmoleküle verwendeten Molekülbibliothek
von Fängermolekülen hergestellt. Diese Subfraktionen, die
vorzugsweise mit verschiedenen Spezies oder Gruppen von Zielmolekülen
bindefähig sind, können auf einem Träger
räumlich getrennt von anderen Subfraktionen hergestellt
und räumlich oder/und zeitlich von anderen Subfraktionen
vom Träger abgelöst bzw. abgeschrieben/abkopiert
werden. Alternativ können Subfraktionen der Molekülbibliothek
auch auf mehreren Trägern jeweils separat hergestellt werden.
Gegebenenfalls können verschiedene Subfraktionen der Molekülbibliothek
auch mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen markiert werden.
Beispielsweise kann eine erste Subfraktion von Fängermolekülen
mit Biotin markiert werden und an Streptavidin- bzw. Avidin-beschichtete
Festphase binden. Eine andere Subfraktion kann wiederum mit einem Antigen
oder Hapten markiert werden und an eine mit dem entsprechenden gegen
das Antigen oder Hapten gerichteten Antikörper beschichteten
Festphase binden.
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Das
Isolieren der Zielmoleküle umfasst vorzugsweise eine Elution
der Zielmoleküle von der Festphase unter Bedingungen, bei
denen die Bindung des Zielmoleküls an das Fängermolekül
gelöst wird, aber das Fängermolekül weiter
an der Festphase gebunden bleibt.
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Die
Elution der auf der Festphase immobilisierten Zielmoleküle
kann in einem einzigen Schritt erfolgen. Andererseits kann jedoch
eine orts- oder/und zeitspezifische Elution erfolgen, wobei einzelne
Zielmoleküle oder einzelne Gruppen von Zielmolekülen
zunächst in einem ersten Schritt von der Festphase eluiert
werden und die Elution weiterer Zielmoleküle oder Gruppen
von Zielmolekülen in einem oder mehreren nachfolgenden
Schritten erfolgt.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
erfolgt die Elution mittels einer Temperaturänderung, z.
B. einer Temperaturerhöhung, die zu einer Denaturierung
von Nukleinsäure-Doppelsträngen führt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren kann auch für
die Isolierung von Proteinen und anderen Molekülen, insbesondere
DNA-bindenden Molekülen, eingesetzt werden, wenn als Fängermoleküle
geeignete Fängersonden ausgewählt werden. In einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform können daher DNA-bindende
Proteine mit Hilfe von DNA-Fängersonden, die als Doppel-
oder Einzelstrang vorliegen können, isoliert werden. In
noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können
auch Peptidfängersonden für die Isolierung von
Proteinen oder DNA-Molekülen verwendet werden. In noch
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Fängersonden
Nukleinsäuren mit speziellen Bindungseigenschaften verwendet,
z. B. Aptamere oder Ribozyme.
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Die
isolierten Zielmoleküle können direkt oder indirekt
für diagnostische oder therapeutische Zwecke eingesetzt
werden. Weiterhin kann das extrahierte Material in Nachfolgereaktionen
eingesetzt werden. So können aus extrahierten Nukleinsäuren Proteine
oder Peptide, z. B. durch Transfer in geeignete Vektoren (Klonierung),
oder in geeignete Zielzellen (Transformation bzw. Transfektion)
oder durch in vitro Translation, insbesondere Isolierung von mRNA-Zielmolekülen,
erzeugt werden.
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Im
Folgenden ist der schematische Ablauf einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens am Beispiel von Nukleinsäuren als Zielmolekülen
erläutert:
- 1. Ermittlung von Daten
zu den Sequenzen der Zielmoleküle, die aus der Probe extrahiert
werden sollen, z. B. Gene aus einem Modellorganismus, der gerade
untersucht wird;
- 2. Ermittlung von geeigneten Fängersonden, die komplementär
zu Bereichen in den ausgewählten Genen sind, bevorzugt
mit Hilfe eines Computers;
- 3. Vorbereitung der zu untersuchenden Probe, z. B. durch Isolation
der Nukleinsäuremoleküle aus einem Organismus;
- 4. Bereitstellen eines Geräts zur in situ Synthese von
entsprechenden Fängersonden in oder auf einem mikrofluidischen
Reaktionsträger oder einem anderen geeigneten Träger;
- 5. Einspeisen der ermittelten Fängersonden-Sequenz
in eine Synthese-Steuerungseinheit, die mit dem Träger
integriert sein kann;
- 6. Synthetisieren der ausgewählten Fängersonden-Sequenzen
in oder auf dem Träger (siehe 1A);
- 7. Ablösen der auf dem mikrofluidischen Träger synthetisierten
Fängersonden und Elution vom Träger (siehe 1B).
Alternativ kann die Gewinnung der Molekülbibliothek auch über
eine Kopierreaktion von Fängersonden-Matrizen erfolgen. Dies
kann z. B. enzymatisch über eine Polymerase-Reaktion erfolgen.
Hierbei resultiert das Komplement der trägergebundenen
Molekülbibliothek;
- 8. Amplifikation und Markierung der Fängersonden, Synthese
doppelsträngiger, markierter Moleküle (siehe 1C);
- 9. Mischung der markierten Fängersonden und der Probe
(beispielsweise fragmentierte genomische DNA), so dass eine Bindung
zwischen Zielmolekülen und Fängersonden (Hybridisierung) bei
geeigneten Pufferbedingungen und geeigneter Temperatur erfolgen
kann (siehe 1D und E);
- 10. Immobilisierung der Fängersonden/Zielmolekül-Komplexe über
die im Fängermolekül enthaltene Modifikation (z.
B. Biotin) an ein spezifisches Trägermaterial (wie z. B.
beschichtete magnetische Kugeln, beschichtete Mikrotiterplatten
oder ein geeignetes Säulenmaterial, z. B. Strepavidin-beschichtet)
(siehe 1F);
- 11. Entfernen ungebundener bzw. unspezifisch gebundener Komponenten über
geeignete Pufferbedingungen und geeignete Temperatur;
- 12. Ablösen und Auffangen der zu isolierenden/extrahierenden
Nukleinsäurefragmente vom Träger über
geeignete Reagenzien und geeignete Temperaturen (siehe 1G);
- 13. Weitere Verwendung der selektiv extrahierten Nukleinsäuren,
z. B. in einer Sequenzierung, PCR, Klonierung, Mikroarray-Experimente.
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Gegebenenfalls
kann die zu untersuchende Probe vorbehandelt werden, um bestimmte
Komponenten aus einer ein Zielmolekül oder ein Zielmolekül-Gemisch
enthaltenden Probe selektiv zu entfernen. Störende Komponenten
können entfernt werden, z. B. repetitive Elemente oder
Telomersequenzen bei Analyse von Genfragmenten; Herausfiltern von
bestimmten Genen (z. B. Housekeeping Genes) bei Transkriptionsanalysen;
Protein- oder Proteinklassen, die die Proteomanalyse von (seltenen)
Proteinen stören. So können bekannte Komponenten durch
Bindung an für diese störenden Komplementen spezifische
(„negative") Fängermoleküle abgefangen
und nur noch erwünschte, z. B. bekannte oder unbekannte,
Zielmoleküle eluiert werden. Das führt zu einer
Aufkonzentration erwünschter Nukleinsäuren oder
Proteine oder anderer erwünschter Biomoleküle.
Diese Vorbehandlung kann beispielsweise durch ein Verfahren erfolgen,
umfassend die Schritte:
- (i) Bereitstellen eines
weiteren Trägers mit einem Array von mehreren verschiedenen
Fängermolekülen, die auf jeweils unterschiedlichen
Positionen auf dem oder im Träger immobilisiert sind, und
- (ii) Leiten einer Probe, die zu isolierende Zielmoleküle
enthält, durch oder über den Träger unter Bedingungen,
bei denen störende Komponenten aus einer Probe spezifisch
an die auf dem Träger immobilisierten Fängermolekül
binden können.
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Durch
diese Vorgehensweise werden störende Komponenten abgereichert,
so dass nachfolgende Analyse der gewünschten Moleküle
mit höherer Präzision durchgeführt werden
können. Weiterhin wird eine Aufkonzentrierung der gewünschten
Zielmoleküle der zu untersuchenden Probe erreicht und störende
Moleküle, z. B. mehrere Spezies parallel, können
gezielt aus dem Molekülgemisch entfernt werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst schließlich auch eine Ausführungsform
betreffend ein Verfahren zur Isolierung von Zielmolekülen
aus einer Probe, wobei mindestens ein Verfahrenszyklus, bei dem
die Zielmoleküle an immobilisierte Fängermoleküle
auf einem Träger binden, wie in
WO 03/031965 beschrieben und mindestens
einen Verfahrenszyklus, bei dem die Zielmoleküle an freie
markierte Fängermoleküle binden, kombiniert werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - US 6013440 [0011]
- - WO 03/031965 [0012, 0045]
- - WO 00/13017 [0025, 0028]
- - WO 00/13018 [0025, 0028]
- - DE 10120633 [0029]
- - DE 10122357 [0029]
- - WO 2005/051970 [0032]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Brown et al.,
Biochem. Soc. Transactions (England) 26 (1998), 249 [0009]