In
biologischen Systemen wird die differentielle Transkription von
Genen sowie die damit einhergehende Produktion von Proteinen dazu
verwendet, um geänderten
externen Einflüssen
zu begegnen oder eine Differenzierung der Zelle zu einem geänderten
Phänotyp
herbeizuführen.
Darüber
hinaus treten in Zellen auch durch externe Einflüsse hervorgerufene Änderungen
in dem Genom auf, die zu einer Änderung
der Nukleotidfolge in der genomischen DNA und als Folge davon zur
Transkription veränderter
Proteine oder zu einer veränderten,
beispielsweise gesteigerten, Transkription der Gene selbst führen können. Derartige Änderungen
können
einen erheblichen Einfluss auf biologische Abläufe haben, wie die Entstehung
entarteter Zellen usw..
Gemäß herkömmlicher
molekularbiologischer Methoden wurde zur Erforschung derartiger Abläufe/Änderungen
normalerweise ein "1-Gen-l-Experiment
durchgeführt,
was die Erforschung der komplexen Abläufe und Zusammenhänge in der
Zelle jedoch nur unter erschwerten Bedingungen erlaubte.
In
den letzten Jahren wurden sogenannte Mikroarrays entwickelt, mit
deren Hilfe eine Vielzahl von Genen bzw. Transkripten in einer Zelle
gleichzeitig untersucht werden konnten. Ein Mikroarray besteht aus
einem normalerweise planaren Träger,
wie einem Glas- oder Silikon-Plättchen
oder einer Nylonmembran, auf dem/der auf vorbestimmten Stellen in einer
bestimmten Anordnung, einem Array, Sonden aufgetragen werden. Die
Grösse
dieser Stellen beträgt
normalerweise etwa 20-200 μm
so dass ein Träger
eine Vielzahl derartiger Stellen enthalten kann.
Derartige
Mikroarrays ermöglichen
eine schnelle und kostengünstige
Untersuchung beispielsweise der Genexpression und/oder genetischer Änderungen
in einer Probe. Das Verfahren läuft
dabei im wesentlich wie folgt ab. Geeignete Sonden-Nukleotide in
der Größenordnung
von etwa 500 bis 2000 Basen werden in einer vorbestimmten Anordnung
auf einem geeigneten Träger,
gewöhnlich
einem Glasplättchen,
immobilisiert. Anschließend
wird die zu untersuchende Probe mit dem Träger unter Bedingungen in Kontakt
gebracht, die eine Hybridisierung komplementärer Stränge erlaubt. Nicht-komplementäre Stränge, die
keine Hybridisierung mit den Sonden auf dem Träger eingehen, werden entfernt. Die
Bereiche auf dem Microarray, welche Nukleotid-Doppelstränge enthalten,
werden ermittelt und ermöglichen
einen Rückschluss
auf die Sequenz und die Menge der Nukleinsäure in der Ausgangsprobe.
Microarrays
werden beispielsweise in entsprechenden Verfahren zur Analyse des
Transkriptions-/Expressionsprofils von Zellen, also zur Erfassung
und Charakterisierung der Gesamtheit der von bestimmten Zellen exprimierten
mRNA-Sequenzen, eingesetzt (vgl. Lockhart et al., Nat. Biotechnol.
14 (1996), 1675-1680).
Ein
Problem derartiger Untersuchungen liegt zum Teil in der Reinheit
der zu untersuchenden Proben, wobei in einigen Fällen die zu untersuchenden Proben
mit Verunreinigungen versehen sind, die eine spezifische Hybridisierung
stören.
So können
insbesondere die zur Aufreinigung der mRNA verwendeten Chemikalien,
wie Phenol, oder auch die nachfolgende Markierungseffizienz der
RNA die Ergebnisse verfälschen.
Ein weiteres Problem besteht zudem darin, dass bestimmte Nukleotide
in den zu untersuchenden Proben nur in äußerst geringen Mengen vorhanden
sind, die mit herkömmlichen
Mikroarrays nur schwer, oder überhaupt
nicht mehr erfasst werden können.
Um
in diesen Fällen
eine bessere Signalstärke
zu erhalten, wurde vorgeschlagen das Ausgangsmaterial zu amplifizieren,
so dass auch bei geringen Mengen an ursprünglich vorhandenem Ausgangmaterial
eine Untersuchung ermöglich
wird. Ein diesbezüglich
eingeschlagener Weg bestand darin, aus dem RNA-Pool zuerst cDNA
herzustellen, wobei der für
diesen Zweck eingesetzte poly dT-Primer am 5'-Ende die Nukleotidfolge des T7-Promotors enthält. Nach
Bildung des Heteroduplexes und alkalischer Denaturierung wird der
zweite DNA-Strang unter Ausnutzung der Haarnadel-Struktur am 3'-Ende der cDNA als
Primer, synthetisiert und mittels Nuklease S1 zum linearen Doppelstrang
geöffnet.
Der DNA-Doppelstrang
dient anschliessend als Matrize für die T7-RNA-Polymerase. Die
so erhaltene RNA dient wiederum als Primer für cDNA-Synthese.
Diese
Vorgehensweise bringt jedoch den Nachteil mit sich, dass der gesamte
RNA-Pool amplifiziert wird, wobei Populationen von Ribonucleotiden bzw.
cDNA Molekülen
erzeugt werden, die ggf. nicht ihrem prozentualen Anteil in der
Ursprungspopulation entsprechen. Darüber hinaus werden Artefakte
erzeugt, die bei der weiteren Analyse stören.
Ein
Verfahren zum Nachweis von viralen Verunreinigungen in Wasserproben
wird von Regan, P. M. und Margolin, A. B. (Journal of Virological
Methods (1997) 64, pp. 65-72) beschrieben. Mittels magnetischer
beads wurde Polivirus-RNA isoliert und mit biotinylierten Oligonukleotidsonden
hybridisiert. Hybridisierte Sonden wurden anschließend amplifiziert
und nachgewiesen.
In
Armour, A. L. et al. (Nucleic Acids Research (2000) Vol. 28, No.
2, pp. 605-9) wird die Messung der Kopienzahl an bestimmten genetischen Loci über Hybridisierung
beschrieben. Hierzu wird die Test-DNA denaturiert, auf einem Filter
immobilisiert und mit einem Überschuss
an amplifizierbaren Sonden hybridisiert. Nach einem Waschschritt
werden die gebundenen Sonden amplifiziert und quantifiziert.
Ein
Verfahren zum Nachweis von bestimmten Organismen in einer Probe
wird in der WO 00/77260 beschrieben. Hierzu werden an charakteristische
Bereiche der genomischen DNA der nachzuweisenden Organismen spezifische
Sonden hybridisiert, selektiv amplifiziert und nachgewiesen.
Verfahren
zum Nachweis von Deletionen in einer Ziel-DNA, insbesondere von
einigen wenigen kB umfassenden Deletionen, werden von Sellner, L. N.
und Taylor, G. R. (Human mutation (2004) 23:413-9) beschrieben.
Diese Verfahren umfassen die Mulitplex-Amplifikation und Sondenhybridisierung (MAPH)
sowie die ligations-abhängige
Multiplex-Sondenamplifikation (MLPA), die beide auf einer Sequenz-spezifischen
Sondenhybridisierung an eine Ziel-DNA beruhen. Hybridisierte Sonden
werden amplifiziert und die erhalten PCR Produkte semi-quantitativ
nachgewiesen. Eine RT-MLPA wird beispielsweise von Eldering, E.
et al. (Nucleic Acids Research (2003) Vol. 31, No. 23, e153) beschrieben.
Das Verfahren wird hierbei zum Nachweis mehrer Translcripte aus
einer Probe eingesetzt und ermöglicht
das genaue Aufzeigen von Transkriptionsmustern.
Ein
alternatives Verfahren zur Signalamplifizierung besteht darin, dass
das Signal der Probe selbst verstärkt wird, beispielsweise mittels
enzymatischer Reaktionen.
Keines
der bekannten Verfahren führt
jedoch bis jetzt zufriedenstellend zu einer verlässlichen Sensitivität des Tests,
so dass auch Proben-Nukleotide, beispielsweise RNA-Moleküle, die
in der Probe nur in geringen Mengen vorhanden sind, auch quantitativ verlässlich bestimmt
werden können.
Eine
Aufgabe der vorliegende Erfindung besteht daher darin ein verbessertes
Verfahren zur Untersuchung von RNA-Populationen bereitzustellen, mit
dem der qualitative und quantitative Nachweis von RNA, das in der
Zelle nur in geringer Kopienanzahl vorhanden ist, möglich wird.
Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Verfahren zur Erfassung und Quantifizierung von RNA welches
die Schritte umfasst, (a) Bereitstellen eines RNA-Pools, (b) Zusetzen
mindestens eines ersten DNA-Moleküls zu dem RNA-Pool, das zu
einem ersten Bereich einer RNA von Interesse komplementär ist, und
eines zweiten DNA-Moleküls,
das zu einem zweiten Bereich der RNA, der verschieden ist von dem
ersten Bereich, komplementär
ist, unter Bedingungen, die ein Binden komplementärer Stränge ermöglichen,
(c) Isolieren von Heteroduplex-Molekülen, die
das zweite DNA-Molekül
aufweisen, und (d) Inkontaktbringen des isolierten Materials mit
einem Array, der an vorbestimmten Stellen Moleküle aufweist, an die das in
Schritt (c) mit-isolierte erste DNA-Molekül binden kann.
In
den Figuren zeigen,
1 schematisch
den Ablauf des Verfahrens bis zur Gewinnung der Detektor-Sonden;
2 schematisch
das Ergebnis einer Hybridisierung der Detektor-Sonden mit einem
Array; und
3 schematisch
den Ablauf des Verfahrens unter Verwendung von amplifizierbaren
Detektor-Sonden.
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein schnelles und äusserst
sensitives Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung
von RNA über
Mikroarrays durch Kopplung von sequenzspezifischer RNA-Aufreinigung
mit Mikroarray-Analyse.
Zur
Durchführung
des vorliegenden Verfahrens wird in einem ersten Schritt ein von
einer Zelle gelieferter RNA-Pool bereitgestellt. Dazu kann die in einer
Zelle enthaltene RNA direkt als solche verwendet werden, d.h. das
Zell-Lysat kann direkt eingesetzt werden, ohne dass die darin enthaltene
Gesamt-RNA oder mRNA spezifisch aufgereinigt werden müsste. Dies
hat insbesondere den Vorteil, dass beim Weglassen eines derartigen
Aufreinigungs schrittes keinerlei Verfälschungen, beispielsweise hinsichtlich
der Population einer bestimmten RNA-Spezies, insbesondere bei RNA-Spezies
mit einer geringen Kopien-Anzahl, auftreten können. Natürlich kann, wenn gewünscht, die
RNA gemäß herkömmlicher
Methoden isoliert bzw. aufgereinigt werden, beispielsweise wie in
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 3rd Edition (ISBN
0879695773) beschrieben ist.
Die
RNA wird in einem nächsten
Schritt mit mindestens einem ersten DNA-Molekül und weiter mit einem zweiten
DNA-Molekül
in Kontakt gebracht.
Das
erste, als "Detektor-Sonde" bezeichnete Nukleotid
weist eine Sequenz auf, die komplementär zu einem bestimmten ersten
Bereich eines RNA-Moleküls
von Interesse ist. Dieser erste Bereich ist im Allgemeinen der Bereich
der untersucht werden soll, beispielsweise auf eine Mutation in
der Nukleotidabfolge, oder ein Bereich, spezifisch für eine bestimmte RNA-Spezies, so dass
die Anwesenheit der RNA-Spezies bestimmt werden kann. Die Detektor-Sonde weist generell
eine Länge
zwischen etwa 20 und 1000 Nukleotiden auf, vorzugsweise zwischen
20 und 500, mehr bevorzugt zwischen etwa 30 bzw. 40, bzw. 50 und
200 Nukleotiden.
Das
zweite, als "Capture-Sonde" bezeichnete Nukleotid,
mit dem der RNA-Pool in Kontakt gebracht wird, weist eine Sequenz
auf, die zu einem zweiten Bereich einer RNA komplementär ist, welcher
von dem ersten Bereich, an den die Detektor-Sonde hybridisiert,
verschieden ist. Diese Sequenz kann einerseits poly-dT sein, so
dass die Capture-Sonden in dem Gesamt RNA-Pool nur an mRNA binden.
Alternativ und bevorzugt kann diese Sequenz auch komplementär zu einem
Bereich der bestimmten RNA von Interesse sein (d.h. der zu untersuchenden
RNA), der für
diese RNA, bzw. verwandte RNA-Moleküle (beispielsweise Transkripte
einer Genfamilie) im wesentlichen spezifisch ist. In diesem Falle
erfolgt die Hybridisierung der Capture-Sonde nur an die RNA von
Interesse bzw. die bestimmten Transkripte. Gewöhnlich weist die Capture-Sonde eine
Länge von
zwischen 40 und 200 Nukleotiden, bevorzugt zwischen 40 und 80 Nukleotiden
auf.
Die
Capture-Sonde weist neben einem an die RNA bindenden Bereich weiter
einen zweiten Bereich auf, mit dem eine spezifische Isolierung der Capture-Sonde
aus einem Gemisch ermöglicht
bzw. erleichtert wird. Dieser Bereich kann jede Gruppe eines Bindungssystems
sein, wie beispielsweise eine bestimmte Nukleotidsequenz (zu der
als Bindungspartner eine dazu komplementäre Nukleinsäure vorgesehen wird), oder
ein anderes Molekül,
wie beispielsweise Biotin, Digoxigenin, Dinitrophenol, oder ähnliche.
Die
Detektor-Sonde und Capture-Sonde werden nun mit dem RNA-Pool unter
Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Hybridisierung komplementärer Stränge ermöglichen.
Dabei wird die Detektor-Sonde spezifisch an die RNA von Interesse
binden, d.h. an den dazu komplementären Bereich der RNA, während die
Capture-Sonde in Abhängigkeit von
deren Sequenz entweder an alle mRNAs binden wird (bei Verwendung
einer poly-dT Sequenz), oder an RNA einer Genfamilie, die im wesentlichen
eine im wesentlichen identische Sequenz aufweisen (bei Verwendung
einer Sequenz, die für
eine Genfamilie einheitlich ist), oder an die spezifische RNA von
Interesse (bei Verwendung einer für die bestimmte RNA von Interesse
spezifischen Sequenz).
Das
so erhaltene Gemisch, das freie RNA (an die keine der eingesetzten
DNA-Moleküle
gebunden hat), freie Detektor- und Capture-Sonden, sowie Heteroduplexe
von RNA + Detektor-Sonde + Capture-Sonde und von RNA + Capture-Sonde
enthält, wird
nun mit einem Mittel in Kontakt gebracht, welches die spezifische
Gewinnung bzw. Isolierung der Capture-Sonden, und mit diesen auch
die damit hybridisierten RNA-Moleküle, ermöglicht.
Diese
Gewinnung wird über
den in der Capture-Sonde enthaltenen zweiten Bereich ermöglicht. Wenn
die Capture-Sonde als zweiten Bereich eine Nukleotidsequenz aufweist,
dann kann als das Mittel ein an einen Träger immobilisiertes, zu der
Nukleotidsequenz komplementäres
DNA-Molekül
eingesetzt werden. Als Träger
kann jedes geeignete Material eingesetzt werden, an das Nukleinsäuren gebunden werden
können,
beispielsweise Microbeads (die mit dem Gemisch in Kontakt gebracht
werden), oder eine Säule
(über die
das Gemisch geleitet wird). Andere geeignete Träger sind beispielsweise Nylon-Membranen
oder modifizierte Glas und Kunststoff-Oberflächen.
Alternativ
kann der zweite Bereich des zweiten Nukleotids auch durch eine Gruppe/ein
Molekül ausgestaltet
sein, für
das ein geeigneter Bindungspartner existiert, der auf einem Träger, wie
oben beispielhaft aufgeführt,
gebunden werden kann. Beispiele hierfür sind generell Antigene, bzw.
Haptene wie z.B. Dinitrophenol oder Digoxigenin (mit einem Antikörper als
auf dem Träger
gebundener Bindungspartner), oder Biotin (mit Streptavidin oder
Avidin als auf dem Träger
gebundenen Bindungspartner).
Nicht
gebundenes Material, d.h. alle Moleküle, die keine Capture-Sonde
aufweisen (RNA, an die keine Capture-Sonde gebunden hat; freie Detektor-Sonde)
wird entfernt, beispielsweise durch Waschen der Trägers unter
Entfernung des nicht an den Träger über einen
Bindungspartner gebundenen Materials oder durch Gewinnen der Mikrobeads
und Waschen derselben, so dass in dem so erhaltenen Gemisch nur
noch die Capture-Sonde und in Abhängigkeit von der gewählten Sequenz
der Capture Sonde, Heteroduplexe zwischen der Capture-Sonde und RNA
(beispielsweise mRNA also solche, oder RNA einer Genfamilie), sowie
Heteroduplexe, die die Capture-Sonde und die Detektor-Sonde sowie
die entsprechende RNA von Interesse aufweisen, enthalten sind. Wie
oben erläutert
ist es insbesondere dann, wenn eine hohe Spezifizität gewünscht ist
vorteilhaft, wenn die Capture-Sonde zu einem Bereich der RNA von
Interesse komplementär
ist, so dass in dem Gewinnungs-/Isolierungsschritt im wesentlichen
nur RNA mit-isoliert wird, an die auch eine Capture-Sonde gebunden
hat.
Anschließend werden
die in dem so erhaltenen Gemisch vorhandenen, und an RNA gebundene Detektor-Sonden
freigesetzt, was durch Denaturierung der Heteroduplex-Stränge erfolgen
kann, oder alternativ durch chemische Behandlung, beispielsweise
mit schwach alkalischer Lösung,
oder enzymatische Behandlung, beispielsweise durch Umsetzung mit
RNA abbauenden Enzymen, wie RNAse.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
weisen die Detektor-Sonden an deren 5'- und 3'-Ende, d.h. benachbart zu dem Bereich,
der zu einer bestimmten RNA-Sequenz komplementär ist, zwei weitere Bereiche
auf, die eine Amplifizierung der Detektor-Sonde ermöglichen.
Derartige
Bereiche können
Nukleotidsequenzen sein, die als Primerbindungsstellen in einem nachfolgenden
Amplifizierungsschritt über
PCR dienen können.
Derartige Nukleotidsequenzen weisen gewöhnlich eine Sequenz und Länge auf,
die mit einer Hybridisierung mit der für die RNA-Sequenz von Interesse
spezifischen Sequenz nicht nachteilig interferiert, normalerweise
eine Länge
von etwa 10 bis 25 Nukleotide, vorzugsweise von etwa 12 bis etwa
18. Alternativ können
diese zwei Bereich auch die Nukleotidabfolge des T3 oder T7 Promotors
aufweisen zur linearen Amplifikation durch in vitro-Transkription.
Die
Detektor-Sonden, die ein genaues 1:1 Abbild der RNA von Interesse
darstellen, werden entweder direkt mit einem Array in Kontakt gebracht oder
zuvor mit den dafür
vorgesehenen Mitteln amplifiziert. Diesbezüglich siehe beispielsweise
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 3rd Edition (ISBN
0879695773). Zum Nachweis der Bindung der Detektor-Sonde an den
Array kann diese in bereits vorab markierter Form in Schritt 7)
eingesetzt werden oder vor Inkontaktbringen mit dem Array markiert werden.
Dies erfolgt insbesondere bei einer optional durchgeführten Amplifizierungsreaktion,
bei der ein nachweisbarer Marker zugesetzt werden kann, wie beispielsweise
ein radioaktiv oder mit Fluoreszenzfarbstoff verbundenes Nukleotid.
Alternativ können die
ggf. amplifizierte Detekor-Sonden auch indirekt vermittelt über Marker
wie beispielsweise Biotin oder Digoxigenin oder Dinitrophenol verbundene
Nukleotide markiert werden und anschließend über an Streptavidin, bzw. spezifische
Antikörper
gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe sichtbar gemacht werden.
Der
Array, gegen den die Detektor-Sonden ggf. nach einem Amplifizierungsschritt
hybridisiert werden, weist an vorbestimmten Stellen bestimmte Moleküle auf,
an die die Detektor-Sonden
binden können.
Der Array ist herkömmlicherweise
auf einem Träger
aufgebracht, wie beispielsweise Glas, Silikon-Träger, Siliziumdioxid, Metall,
polymere Substanzen/Kunststoffe oder Gemische davon und kann die
Form von Plättchen,
Scheiben Gelschichten und/oder Kügelchen
aufweisen.
Die
Moleküle
auf dem Array sind gewöhnlich Nukleotide
mit unterschiedlicher Sequenz, können jedoch
auch ein Bindungspartner in einem System sein, beispielsweise Antigen- Antikörper, wobei
sich ein Bindungspartner an der Detektorsonde und der andere auf
dem Array befindet. In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich auf
dem Träger
in einer bekannten Anordnung, dem Array, Oligo- bzw. Polynukleotide
mit unterschiedlichen Sequenzen. Die Detektor-Sonde wird nun an
der Stelle des Arrays binden, auf dem sich eine komplementäre Nukleotidsequenz
befindet.
Das
bei dieser Hybridisierung erhaltene Muster auf dem Array, sowie
die Stärke
des Signal ist ein Zeichen des qualitativen sowie auch des quantitativen
Vorhandenseins eines Transkripts in der Zelle.
Das
Verfahren eignet sich insbesondere zur Untersuchung der differentiellen
Transkription von RNA, beispielsweise als Antwort auf eine externe, geänderte Umweltbedingung,
beispielsweise Inkontaktbringen einer Zelle mit einem chemischen
Agens, oder Entwicklungsphasen in einer Zelle. Alternativ kann das
Verfahren auch zur quantitativen Bestimmung alternativ gespleisster
RNA-Produkte oder einfach zur Analyse von Mutationen in bestimmten
Transkripten eingesetzt werden.
Ein
Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens liegt insbesondere darin,
dass es nicht von dem Vorhandensein einer im wesentlichen vollständigen RNA,
d.h. RNA-Molekülen
in voller Länge,
abhängig ist,
sondern auch bei teilweise abgebauter RNA erfolgreich zum Einsatz
kommen kann. Wichtig für
das vorliegende Verfahren ist, dass der Bereich, an den die Detektor-Sonde
und die Capture Sonde bindet im wesentlichen intakt ist, was auch
bei teilweise abgebauter RNA der Fall sein kann.
In
einer alternativen Ausführungsform
können
in dem ersten Schritt mehrere, beispielsweise 2 Detektor-Sonden
eingesetzt werden, die alle für
die RNA von Interesse spezifisch sind. Eine Detektor-Sonde ist dabei
für einen
Bereich der RNA von Interesse spezifisch, beispielsweise einen Bereich,
der eine Mutation enthält
oder nicht, während
die zweite Amplisonde an einen anderen Bereich der RNA von Interesse
bindet. In dem Schritt der Hybridisierung gegen den Array müssen, im
Falle der Bindung der ersten Detektor-Sonde an den die mögliche Mutation enthaltenden
Bereich, für
beide Positionen auf dem Array die gleiche Signalstärke erhalten
werden, so dass die zweite Detektor-Sonde als Positiv-Kontrolle und interner
Marker dienen kann. Alternativ können natürlich mehr
als eine Detektor-Sonde dem ursprünglichen RNA-Pool zugesetzt
werden, um mehrere Untersuchungen hinsichtlich unterschiedlicher RNA-Spezies
gleichzeitig durchzuführen,
beispielsweise eine Detektor-Sonde spezifisch für eine Mutation in einem Transkript
und eine Detektor-Sonde
für das
nicht-mutierte Transkript. Um in Fällen des Einsatzes von mehr
als einer Detektor-Sonde eine noch verbesserte Unterscheidungsmöglichkeit
zu bieten, können
die Detektor-Sonden unterschiedlich, beispielsweise mit unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen, markiert sein.
Das
vorliegende Verfahren ist hochspezifisch, da einerseits die mindestens
eine Detektor-Sonde
sowie zusätzlich
ggf. auch die Capture-Sonde spezifisch sind für die bestimmte RNA von Interesse.
So werden, wenn die Detektor-Sonde spezifisch ist für die RNA
von Interesse in einem ggf. nachfolgenden Amplifizierungsschritt
nur dann eine grössere
Menge an DNA erhalten, wenn die Detektor-Sonde an die RNA von Interesse
gebunden hat und über
die Bindung der Capture-Sonde in die weiteren Verfahrensschritte
mitgezogen wurden. Wurde weiter die Capture-Sonde derart gewählt, dass
diese ebenfalls für
die RNA von Interesse spezifisch ist, dann wird bereits in dem ersten
Schritt eine Selektionierung auf die RNA von Interesse eingeschlossen.
Ein
weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens besteht auch darin
dass die Hybridisierungskinetik auf den Arrays aufgrund der vorbekannten
Länge der
Proben, d.h. die Länge
der Detektorsonde, stark verbessert ist. Aufgrund Fehlen der entsprechenden
Transkripte kann keine unspezifische Hybridisierung längerer Transkripte/Proben
an die an den Träger
in einem Array gebundenen Sonden auftreten, die die Ergebnisse verfälschen könnten.
Das
Beispiel erläutert
die Erfindung ohne sie zu begrenzen.