EP2315854A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer probe - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer probe

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Publication number
EP2315854A1
EP2315854A1 EP09733308A EP09733308A EP2315854A1 EP 2315854 A1 EP2315854 A1 EP 2315854A1 EP 09733308 A EP09733308 A EP 09733308A EP 09733308 A EP09733308 A EP 09733308A EP 2315854 A1 EP2315854 A1 EP 2315854A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
subsets
primer pairs
sample
predetermined sequence
biological sample
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09733308A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Mann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beckman Coulter Inc
Original Assignee
Beckman Coulter Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beckman Coulter Inc filed Critical Beckman Coulter Inc
Publication of EP2315854A1 publication Critical patent/EP2315854A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for the quantitative determination of the number of at least one predetermined sequence in a biological sample, preferably in a single cell, and more particularly to a method for determining the absolute copy number of alleles per cell.
  • trisomy 18 Eras syndrome
  • trisomy 13 Patau syndrome
  • trisomy 21 Down's syndrome
  • the copy number of the corresponding chromosome is 18, 13 and 21 per cell, respectively, whereas healthy individuals have only two copies of the aforementioned chromosomes per cell.
  • the increase in copy number of the affected chromosome to severe developmental disorders. While carriers of trisomy 21 are drastically inhibited in their development and sometimes have severe malformations, carriers of trisomy 18 and trisomy 13 usually die within the first year of life.
  • Huntington's disease a progressive neurodegenerative disease characterized by abnormal, involuntary movements with increasing decay of mental and physical abilities, is said to be the cascading of more than 37 copies of a particular subject (CAG), with the predisposition to disease education increases with the number of repetitions of this motif in the genome.
  • CAG a particular subject
  • Further examples of unstable trinucleotide sequences in humans are Kennedy syndrome and spinocerebral ataxia-1.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • any fluorescence signal present indicates the presence of the sequence corresponding to the probe provided with the corresponding fluorescent label.
  • the intensity of the fluorescence may allow a limited inference to the number of sequence copies in the biological sample. If, on the other hand, no signal or only a signal lying below a defined threshold is obtained at the wavelength of one of the fluorescence-labeled probes used, it is possible to deduce the absence of the sequence corresponding to the corresponding probe in the biological sample.
  • Another fluorescence-based method is the CGH analysis (com- parative genomic hyb ⁇ dizatio ⁇ ).
  • CGH analysis CGH analysis
  • the nucleic acid of the sample to be analyzed is completely labeled with a dye 1.
  • the same amount of nucleic acid of a reference sample is with a dye 2 marked.
  • Both reaction mixtures are hybridized together on a sprouted metaphase chromosome set, wherein the sequences contained in both reaction mixtures compete for the binding sites on the spread chromosomes. Essentially, a ratio of dye 1 to dye 2 of 1: 1 will be established at all hybridization sites. If the sample to be analyzed contains amplified regions (more than the usual copy number of the reference), then dye 1 will predominate at this hybridization site.
  • a special variant is the array CGH, which hybridizes not to chromosomes but to immobilized sequences whose physical address is known in the genome.
  • Another known method for quantifying nucleic acid sequences is the real-time PCR method, in which a PCR (polymerase chain reaction or polymerase chain reaction) is performed with fluorescently labeled primers and the increase of the fluorescence signal is observed as a function of the number of cycles.
  • the threshold PCR cycle (also known as the threshold cycle) is assigned to the reaction time at which the fluorescence signal stands out significantly from the background fluorescence and the PCR product formation proceeds exponentially. This correlates with the initial copy number of the DNA sequence to be amplified. In this way, DNA samples can be analyzed according to the same with a DNA dilution series relatively quantify.
  • a disadvantage of this method is that the amount of starting material can not be arbitrarily reduced because with a few starting molecules, for example 10 to 100 copies, as starting material, the stochastic error due to the exponential amplification is very large, which no longer quantitative statements allows. Furthermore, this method also requires expensive and expensive equipment for measuring the fluorescence intensity.
  • a more recent method for the quantitative determination of a nucleic acid sequence is the QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), in which several PCRs are carried out in parallel using fluorescently labeled primers in a PCR approach and the fluorescently labeled PCR products are subsequently subjected to an automatic DNA PCR. Scanner laserdensito be metrically analyzed. In order to make a meaningful quantitative comparison between two side-by-side amplified PCR products, the two partial PCR reactions must proceed with equal efficiency and the fluorescence intensities of the reaction products at the time of exponential product amplification must be quantitatively analyzed. Other methods based on optically active-labeled probes, for example those using infrared-labeled probes, do not solve the problem either.
  • a method based on QF-PCR methodology for the detection of possible numerical aberrations of chromosomes 21, 18, 13, X and Y in amniotic fluid samples is described by Lucchini et al. in Scientific Information, September 2004.
  • This method is based on the in vitro PCR amplification of repetitive and polymorphic STR (short tandem repeats) sequences with fluorescently labeled primers. After completion of the PCR, the amplified PCR products using Capillary electrophoresis quantified. If chromosome-specific STR systems are used in these methods, it is possible to draw conclusions about the copy number of the corresponding chromosome from the number of different PCR products obtained.
  • this method does not allow any statement about the presence or absence of a trisomy, since this result is obtained both in the case of a monoallelic trisomy and in the case of a monoallelic disomy.
  • a method based on this technology for the detection of trisomy 13 is also disclosed in DE 101 02 687 A1.
  • this method also has the disadvantage that fluorescently labeled primers must be used.
  • the frequency distribution is determined by separately carrying out the same and under the same reaction conditions as that used for the biological sample to be examined at least one amplification reaction with at least two different reference samples, each having a known, mutually different copy number of the predetermined sequence, and then determining the number of different amplification products obtained per reference sample.
  • the object of the present invention is to provide a method for the quantitative determination of the number of one or more predetermined sequences in a biological sample, which is simple and inexpensive feasible, which also and especially with a small number of predetermined sequences present in the biological sample to be examined provides reliable results and which is feasible in particular with small amounts of starting material.
  • this object is achieved by a method for the quantitative determination of the number of at least one predetermined sequence in a biological sample, in particular for determining the absolute copy number of alleles per cell, which comprises the following steps:
  • fragmentation is understood to mean the division of nucleic acid molecules into at least two nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid fragments resulting from the fragmentation of each nucleic acid molecule therefore have a shorter molecule length than the starting molecules.
  • predetermined sequence in the context of the present invention is understood to mean any sequence which is encompassed by the nucleic acid contained in the biological sample.
  • the predetermined sequence may be a chromosome, a chromatid, a gene or a gene segment.
  • the nucleic acid contained in the sample provided in step a) is lysed between process step a) and process step b). This can be accomplished, for example, by adding lysozyme to the sample, heating the sample, or adding denaturing agents, such as urea, dithiothreitol (DTT), and the like, to the sample.
  • denaturing agents such as urea, dithiothreitol (DTT), and the like
  • the nucleic acid molecules contained in the biological sample are preferably used in fragmentation. fragmented into at least five nucleic acid fragments, wherein the fragmentation can be carried out for example by restriction hydrolysis, by shearing, by ultrasound or by DNase digestion.
  • the process parameters in the fragmentation for example the type of restriction enzyme used or the frequency and duration of the ultrasound, can be adjusted so that fragments having a desired length are obtained.
  • the absolute fluorescence intensity of PCR products is not determined and, as in the case of FISH and CGH, with the Fluorescence intensity of a control or reference sample compared, but it is only determined with how many subsets each of the same amplification products have been obtained.
  • fluorescence-marked primers do not have to be used in the method according to the invention.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence-labeled PCR products obtained does not have to be determined in a complex manner, but only evaluated if a fluorescence, if present above a defined threshold, is present in one of the fluorescent dyes used corresponding wavelength is present or not. Therefore, the inventive method is simple and inexpensive to perform without costly equipment for the quantitative detection of fluorescence.
  • a further advantage of the method according to the invention is its quick and easy implementation, because in comparison with the quantification method known from DE 10 2005 045 560 A1, only a comparatively small number of amplification reactions have to be carried out.
  • the method according to the invention is suitable both for the determination the relative number of at least one predetermined sequence in a biological sample as well as for the determination of the absolute number of at least one predetermined sequence in a biological sample.
  • the method according to the invention can be used to determine a trisomy in the context of in vitro fertilization (IVF) or in the context of the analysis of fetal cells from maternal blood.
  • the method according to the invention is also particularly suitable for the quantitative determination of the number of at least one predetermined sequence in a biological sample which contains only a small amount of nucleic acid, for example only a few cells.
  • the method according to the invention is carried out with a biological sample which contains as starting material only one cell, for example a human cell, such as a polar body, an animal cell or a plant cell, or with a suspended single cell.
  • the basic principle of the method according to the invention is based on the determination of the copy number of a predetermined nucleic acid sequence, such as the copy number of a chromosome, by fragmentation of the nucleic acid, dividing the fragmented sample into multiple subsets, performing a multiplex PCR with each of the subsets, wherein in The same primer pairs are used for each subset of multiplex PCR reactions before it is subsequently determined with which number of subsets the same in each case
  • a cell may contain zero, one or two copies of a predetermined sequence, for example, chromosome 21.
  • chromosome 21 When the cell is lysed in the cell suspension and the sample thus divided is divided into two subsets, in the case of monosomy, ie when the cell contains a copy of chromosome 21, chromosome 21 will be distributed to one of the two subsets. Thus, in this case, only one of the two subsets contains chromosome 21.
  • both subsets may each contain one copy of chromosome 21 or one of the subset may not contain a chromosome 21 and the other subset two
  • sequence to be determined ie chromosome 21
  • sequence to be determined is divided into 10 different partial sequences by fragmentation into several partial sequences, for example by restriction hydrolysis, the probability that in the case of disomy at least one pair of identical partial sequences is distributed over both partial amounts is nearly 100 %, whereas in the case of monosomy, each subsequence can be present in at most one of the two subsets.
  • nullisomy naturally, no partial sequence of chromosome 21 will be found in either of the two subsets.
  • each subsequence can be detected only in one of the two subsets, whereas in the case of disomy at least some of the subsequences of the chromosome 21 are present in both subsets and in the case Nullisomie in any of the subsets a partial sequence of chromosome 21 is present.
  • FIGS. 1 and 2 The above thought experiment is shown schematically in FIGS. 1 and 2 for the cases of monosomy and disomy.
  • FIG. 1 in the method according to the invention, a single cell symbolized in the top left by a circle in FIG. 1 is used, which contains a copy of the sequence to be quantified, in this case chromosome 21, which symbolizes the gray bar contained in the circle becomes.
  • This single cell is lysed in suspension (not shown) before the suspension is added a restriction enzyme, the chromosome 21 contained in the sample, as shown above in the middle and top right in Figure 1, in five defined partial sequences with each more distinctive Length fragmented.
  • the sample containing these five partial sequences as shown in the bottom left and in the middle of FIG. 1, is divided into two partial samples, each of the five partial sequences being distributed to one of the two partial quantities with a probability of 50% each.
  • the two short subsequences are contained in subset 1, while the three longer subsequences are contained in subset 1 Subset 2 are present.
  • the two subsets are then each 5 equal primer pairs added, of which each of the five primer pairs for each one of the previously generated by the fragmentation partial sequences of chromosome 21 is specific.
  • the 5 primer pairs are designed in such a way that each of the primer pairs produces a PCR product of different lengths in the subsequent PCR.
  • FIG. 2 the same procedure is schematically reproduced for the case of a biological sample containing two chromosomes 21 (disomy).
  • two copies of the five partial sequences of chromosome 21 are obtained in the fragmentation.
  • Each of these subsequences will have a 50% probability of being split into one of the two subsets so that the probability that the two copies of a subsequence are in a subset is 50% and the likelihood that each one of the subsequences will be 50% two copies of a subsequence are in one subset, whereas the other copy of the same subsequence is in the other subset, also 50%.
  • the probability that at least for one of the five different subsequences the two copies of the subsequence are distributed over two different subsets is therefore more than 95%.
  • one copy each is contained in subset 1 and one copy in subset 2
  • the two copies of the fifth subsequence are contained exclusively in subset 2.
  • the method steps a) to c) of the method according to the invention can be carried out under non-denaturing conditions, so that the predetermined sequence, if this is double-stranded DNA, is distributed in the form of double-stranded nucleic acid to the individual subsets.
  • To transfer nucleic acid to single-stranded nucleic acid because single-stranded nucleic acid as well as double-stranded nucleic acid can lead to a positive PCR result.
  • This denaturation can be carried out, for example, before or after the fragmentation according to process step b).
  • method step c there are twice as many copies of the fragmented predetermined sequence to be distributed to the partial quantities as in the biological starting sample, namely, in the case of disomy, for example, four single-stranded copies of the fragmented predetermined sequence, whereas in biological Original sample two double-stranded copies of the unfragmented predetermined sequence templates.
  • the method according to the invention is not limited, so that in principle both specific and unspecific primer pairs can be used.
  • the use of specific primer pairs is preferred because it allows the length of the PCR products to be tailored and ensures that only the genetic subsequences are amplified.
  • the at least two primer pairs added in method step d) is proposed to adapt the at least two primer pairs added in method step d) to amplify different non-overlapping partial sequences of the at least one predetermined sequence in an amplification reaction.
  • the restriction enzyme or the restriction enzymes are preferably selected so that they do not intersect in the sequence regions to be amplified. This can be ensured, for example, by first relatively rarely intersecting restriction enzymes being selected in the nucleic acid and then, depending on the specific interfaces, selecting the primers such that the restriction enzyme sites are not in the regions encompassed by the primer binding sites ,
  • An essential process step of the method according to the invention is that after performing the amplification reactions with the individual subsets, it is determined with how many subsets identical amplification products have been obtained in order to determine therefrom the number of predetermined sequences in the biological sample.
  • This determination with how many subsets identical amplification products have been obtained, naturally requires that the different amplification products are distinguished from one another, ie the number of different amplification products obtained per subset is determined.
  • electrophoresis for example by gel electrophoresis, such as polyacrylamide gel electrophoresis or agarose gel electrophoresis, or by capillary electrophoresis.
  • a fluorometric determination of the amplification products is possible.
  • step gi further to perform a method step gi), which comparing the in step f) for each subset determined amplification products with at least amplification products obtained from a control sample in an amplification reaction, wherein the amplification reaction carried out with the at least one control sample is carried out with the same primer pairs as in step d) and the control sample preferably contains a known number of the predetermined sequence.
  • fikationsretress such as a temporary failure of the thermocycler during the amplification reaction
  • the nullisomial case in which no bands are expected for the amplification reactions performed with the fragmented aliquots of the sample can be validated because in the event the expected bands for the control sample are obtained, an error in performing the amplification reaction is excluded can be.
  • the amplification reaction with the at least one control sample is preferably carried out in parallel with step e).
  • the method according to the invention may also comprise the additional method step g2), which comprises comparing the amplification products determined in step f) with a data set for each subset, the data record containing information relating to at least one Control sample in an amplification reaction using the different amplification products available in the primer pairs added in step d).
  • the statistical reliability of the result obtained with the method according to the invention is greater, the more primer pairs are used in the amplification reaction, preferably a multiplex PCR.
  • the experimental effort increases as the number of primer pairs used increases.
  • the statistical reliability of the result obtained with the method according to the invention is greater, in particular for larger copy numbers, the more subsets the fragmented sample is divided in method step c), whereas the experimental effort increases with increasing number of subsets prepared in step c).
  • the sample obtained in process step b) is subdivided in process step c) such that the produced at least two subsets have the same volume. Apart from the fact that this facilitates the implementation of method step c), this also facilitates later calculations of the result.
  • each of the reaction sites on the substrate has a central hydrophilic area which is surrounded on the outside by a first hydrophobic region, which in turn outside of a central hydrophilic Surrounded area, which is surrounded on the outside by a second hydrophobic area.
  • the central hydrophilic region is at least essentially circular and is surrounded on the outside by an at least substantially annular annular first hydrophobic region, which in turn is externally surrounded by an at least substantially circular ring-shaped central hydrophilic region is surrounded concentrically, which is surrounded on the outside by the second hydrophobic region.
  • the subsets of the fragmented sample must have the necessary DNA polymerase and optionally at least one compound selected from the group consisting of pH buffer substances, salts, water and further conventional PCR additives to set conditions suitable for the performance of the PCR.
  • the copy number of a predetermined sequence contained in the biological sample or preferably the copy number of a plurality of predetermined sequences contained in the biological sample can be determined.
  • the predetermined sequence (s) are chromosomes, such that the method according to the invention determines, in particular, the copy number of 1 to 23, more preferably 1 to 10 and most preferably 1 to 5, chromosomes present in the biological samples may.
  • the above-described method according to the invention for the quantitative determination of the number n of x predetermined sequence (s) in a biological sample comprises the following method steps:
  • Subsets f) determining the number of different amplification products obtained with the PCR reactions in step e) for the individual subsets and determining with how many of the z subsets identical amplification products have been obtained.
  • x is an integer between 1 and 23
  • y is an integer greater than or equal to 4, preferably from 5 to 20
  • z is an integer which is greater than or equal to 3 • x, preferably 5 • x to 25 ⁇ x and particularly preferably 8 • x to 15 • x.
  • the number n of the predetermined sequence (s) can be determined.
  • the number n of the predetermined sequence (s) can be determined.
  • the copy number is 0 (zero isomie) if no amplification product has ever been obtained with any of the subsets. If, on the other hand, at least two subsets of identical amplification products are obtained, the copy number is at least two and so on.
  • the number of primer pairs used in method step e) is selected so that the probability of a false negative result is a maximum of 5%. This can be ensured, for example, by the following statistical approach:
  • the probability of correctly determining the copy number depends on all of the following parameters:
  • An element may not be selected more than once (ie in the initial distribution of the sequence copies only a maximum of one sequence is assigned to a partial reaction). If one then sets the "desired" events (2) in relation to all possible events (1) one obtains the proportion of "desired” events and thus the probability of success of a correct statement of the method using the corresponding parameters.
  • a possible evaluation variant of the amplifications obtained would be, for example, the detection by means of fluorescent dyes, wherein in each case one fluorescent dye is selected for each fragment of different size. Since it is only interesting here whether products were amplified, but the amount of product is not of interest, it would be so easy to measure the fluorescence of the individual wavelengths with an end point determination without having to use a gel.
  • the inventive method is particularly suitable for the quantitative determination of the number n of at least one predetermined sequence in a biological sample, if the number n per predetermined sequence in the biological sample 0 to 100, preferably 0 to 10, particularly preferably 0 to 5 and especially preferably 0, 1, 2, 3 or 4.
  • the method according to the invention can advantageously be carried out in the context of a fitro-fertilization (IVF) or in the context of the analysis of fetal cells from maternal blood.
  • IVF fitro-fertilization
  • the method according to the invention was carried out separately with two biological samples in the form of a suspension containing each cell in order to determine the copy number of the chromosome 21 present in the two samples. While the first sample contained two cells, the second sample contained only one cell.
  • the two samples were lysed and with a mixture of restriction enzymes Xho I, Sac I and Pac at 37 0 C for 5 minutes hydrolyzed (Cek kit Advalytix Products or Olympus Life Science Research Europa GmbH). Subsequently, the obtained fragmented samples were each divided into four aliquots of equal volumes, after which each of the subsamples received 7 primer pairs was added. All seven primer pairs were for different subsequences or subsequences of chromosome 21, with all seven primer pairs selected so that each primer pair gives a different length PCR product. These samples were pipetted onto one reaction site each of a glass substrate.
  • FIG. 3 A photograph of the polyacrylamide gel is shown in FIG.
  • the numbers 1 to 4 designate the tracks for the individual subsets of the PCR reactions for the two samples used, while a length marker was applied in the left unmarked track.
  • the result is summarized in the two tables reproduced to the right of the photograph in FIG.
  • the first Line of the tables represents the individual tracks of the gel, that is, the subsets 1 to 4 corresponding tracks 1 to 4 for the first sample and the subsets 1 to 4 corresponding tracks 1 to 4 for the second sample.
  • the number of bands for the seven possible PCR products which have been obtained for each individual subset ie "O" or "1" is indicated in each column.
  • the first sample contained at least three copies of chromosome 21, whereas the second sample contained at least two copies of chromosome 21.

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Abstract

Ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe umfasst die Schritte: a) Bereitstellung einer Nukleinsäure enthaltenden biologischen Probe, b) Fragmentierung der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure, c) Aufteilen der in dem Schritt b) erhaltenen Probe in wenigstens zwei Teilmengen, d) Zugabe von jeweils wenigstens zwei Primerpaaren zu jeder der wenigstens zwei Teilmengen, wobei jeder der Teilmengen jeweils dieselben Primerpaare zugegeben werden, und wobei die einzelnen Primerpaare daran angepasst sind, in einer Amplifikationsreaktion jeweils unterschiedliche Teilsequenzen der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz zu amplifizieren, e) Durchführen einer Amplifikationsreaktion mit jeder der wenigstens zwei in dem Schritt d) erhaltenen Teilmengen, f) Bestimmen der Anzahl der mit den Amplifikationsreaktionen in dem Schritt e) für die einzelnen Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte und Bestimmen, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind.

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Probe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, vorzugsweise in einer Einzelzelle, und insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der absoluten Kopienzahl von Allelen pro Zelle.
In der molekularen Diagnostik gewinnen Verfahren zum Quantifizieren von Sequenzen, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen pro Zelle, eine immer bedeutendere RoI- Ie. Da eine Vielzahl von zum Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen von der normalen Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen im Genom verursacht werden, lassen sich durch eine Bestimmung der Kopienzahl bestimmter Chromosomen oder bestimmter Genabschnitte entsprechende Krankheiten schon im Frühstadium der Entwicklung zuver- lässig diagnostizieren.
Beispiele für zum Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, sind die Trisomie 18 (Edward's Syndrom), Trisomie 13 (Patau- Syndrom) sowie Trisomie 21 (Down-Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopien- zahl des betreffenden Chromosoms zu schwersten Entwicklungsstörungen. Während Träger der Trisomie 21 in ihrer Entwicklung drastisch gehemmt sind und teilweise schwere Fehlbildungen aufweisen, versterben die Träger der Trisomie 18 und Trisomie 13 meistens innerhalb des ersten Lebensjahres.
Neben Krankheiten, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl von Erkrankungen bekannt, welche auf einer veränderte Kopienzahl von Genen oder Genab- schnitten beruhen.
Ursache für die Huntington-Krankheit, einer progressiv verlaufenden neu- rodegenerativen Erkrankung gekennzeichnet durch abnormale, unwillkürliche Bewegungen bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperli- chen Fähigkeiten, soll die Hintereinanderschaltung von mehr als 37 Kopien eines bestimmten Motivs (CAG) sein, wobei die Prädisposition zur Krankheitsausbildung mit der Anzahl der Wiederholungen dieses Motivs im Genom zunimmt. Weitere Beispiele für instabile Trinukleotidsequenzen beim Menschen sind das Kennedy-Syndrom und die spinocerebrale Ata- xie-1.
Zudem ist bekannt, dass sich bestimmte Protoonkogene durch Genampli- fikation im Genom vervielfältigen können. Derartige Amplifikationen sind in dem Chromosomensatz oftmals als so genannte "double minutes" (D.M.) oder als " homogeneously staining regions" (HSR) zu erkennen. Aufgrund der enormen Erhöhung der Gen-Kopienzahl kann das zugehörige Protein in den Zellen in sehr großen Mengen produziert werden, was eine verstärkte Aktivierung der Zellproliferation - ohne Veränderung des Einzelgens an sich - ermöglicht. Insbesondere das myc-Protoonkogen soll von der Amplifikation besonders oft betroffen sein. Aufgrund des Bedarfs an Verfahren zur Quantifizierung von Sequenzkopien in einer biologischen Probe sind in der Vergangenheit eine Vielzahl entsprechender Verfahren vorgeschlagen worden.
Eines der grundlegenden Quantifizierungsverfahren, welches zumindest eine Aussage über die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und abhängig von der Verfahrensführung auch einen bedingten Rück- schluss auf die Kopienzahl der betreffenden Nukleinsäuresequenzen pro Zelle erlaubt, ist das so genannte FISH-Verfahren (fluorescence in situ hybridization) . Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende biologische Probe nach entsprechender Vorbehandlung, d.h. Denaturierung mit Formamid sowie Vorhybridisierung, mit einer oder mehreren verschiedenen Sonden, welche zuvor mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarb- Stoffen markiert wurden, unter Bedingungen inkubiert, welche eine
Hybridisierung der Sonden mit dazu homologen Sequenzen in der biologischen Probe ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden die Proben gewaschen, wobei unspezifische Hybridisierungssignale eliminiert werden. Abschließend werden die Fluoreszenzsignale des Präparats mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Jedes vorhandene Fluoreszenzsignal weist auf die Anwesenheit der der mit dem entsprechenden Fluoreszenz- marker versehenen Sonde entsprechenden Sequenz hin. Die Intensität der Fluoreszenz kann einen bedingten Rückschluss auf die Anzahl der Sequenzkopien in der biologischen Probe zulassen. Wird hingegen bei der Wellenlänge einer der eingesetzten fluoreszenzmarkierten Sonden kein Signal oder nur ein unterhalb eines definierten Schwellenwerts liegendes Signal erhalten, kann auf die Abwesenheit der zu der entsprechenden Sonde korrespondierenden Sequenz in der biologischen Probe geschlossen werden. Allerdings kann die Abwesenheit eines entsprechenden Fluores- zenzsignals auch darin begründet liegen, dass in der entsprechenden Bin- dungsstelle der nachzuweisenden Sequenz eine Mutation und/ oder Mikrodeletion stattgefunden hat, weswegen die Sonde unter den gewählten Hybridisierungsbedingungen nicht mehr an die vorbestimmte Sequenz bindet. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt darin, dass eine unerwünschte und zu falschen Ergebnissen führende Kreuz- hybridisierung niemals vollständig ausgeschlossen werden kann. Zudem ist dieses Verfahren vergleichsweise teuer, zum einen weil zwingend Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen, und zum anderen, weil es aufwändige Apparaturen, wie Fluoreszenzmikroskope, benötigt. Schließ- lieh hängt die Aussagekraft dieses Verfahrens in ganz erheblichem Maße von der Qualität der eingesetzten Sonden ab; zuverlässige Ergebnisse werden nur erhalten, wenn die Sonden mit einer Effektivität von mehr als 90 % an die dazu korrespondierenden Bindungsstellen hybridisieren, so dass nur noch 10% der Zielsequenzen unhybridisiert vorliegen und dem- zufolge nicht mehr amplifiziert werden. Daraus folgt, dass eine falsche Wahl der Sonden, aber auch inadäquate Hybridisierungsbedingungen zu einem falschen Ergebnis führen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass eine Mindestmenge an biologischer Probe eingesetzt werden muss, um überhaupt ein auswertbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Zudem darf die Sequenz eine minimale Länge nicht unterschreiten. Weiterhin ist es für ein valides Ergebnis notwendig, eine Vielzahl von Zellen zu analysieren, die einer Hybridisierung zugänglich waren. Aus diesem Grund ist die FISH-Analyse für die Einzelzelldiagnostik nicht adäquat. Darüber hinaus ist eine automatisierte Auswertung durch den Pathologen kaum möglich.
Ein anderes fluoreszenzbasierendes Verfahren ist die CGH-Analyse (com- paratiυe genomic hybήdizatioή). Bei diesem Verfahren wird die Nukleinsäure der zu analysierenden Probe komplett mit einem Farbstoff 1 mar- kiert. Die gleiche Menge an Nukleinsäuren einer Referenzprobe wird mit einem Farbstoff 2 markiert. Beide Reaktionsansätze werden gemeinsam auf einem gespreiteten Metaphasechromosomensatz hybridisiert, wobei die in beiden Reaktionsansätzen enthaltenen Sequenzen um die Bindungsstellen an den gespreiteten Chromosomen kompetieren. Im Wesent- liehen wird sich an allen Hybridisierungsstellen ein Verhältnis von Farbstoff 1 zu Farbstoff 2 von 1: 1 einstellen. Enthält die zu analysierende Probe amplifizierte Bereiche (mehr als die gewöhnliche Kopienzahl der Referenz), so wird der Farbstoff 1 an dieser Hybridisierungsstelle überwiegen. Im Fall einer Deletion in der zu untersuchenden Probe wird man nur den Farbstoff 2 an dieser Hybridisierungsstelle detektieren. Die Referenzmessung erlaubt eine relative Aussage über die Häufigkeit von Sequenzen in der zu analysierenden Probe. Allerdings ist auch dieses Verfahren, da absolute Fluoreszenzintensitäten gemessen werden müssen, aufwändig und teuer. Zudem erfordert auch dieses den Einsatz einer bestimmten, vergleichsweise hohen Ausgangsmenge.
Eine spezielle Variante ist die Array-CGH, in der nicht auf Chromosomen, sondern auf immobilisierte Sequenzen, deren physikalische Adresse im Genom bekannt ist, hybridisiert wird.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure- sequenzen ist die Real-Time-PCR-Methode, bei der eine PCR (polymerase chain reaction bzw. Polymerasekettenreaktion) mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt wird und die Zunahme des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zyklenzahl beobachtet wird. Der Schwellenwert- PCR-Zyklus (auch Threshold-Cycle) wird dem Reaktionszeitpunkt zugeordnet, bei dem sich das Fluoreszenzsignal signifikant von der Hintergrundfluoreszenz abhebt und die PCR-Produktbildung exponentiell verläuft. Dieser korreliert mit der Anfangskopienzahl der zu vermehrenden DNA-Sequenz. Auf diese Weise lassen sich DNA-Proben anhand des Ver- gleichs mit einer DNA- Verdünnungsreihe relativ quantifizieren. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Menge an Ausgangsmaterial nicht beliebig verkleinert werden kann, da mit wenigen Startmolekülen, beispielsweise 10 bis 100 Kopien, als Ausgangsmaterial der stochasti- sehe Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird, was keine quantitative Aussagen mehr zulässt. Des weiteren erfordert auch dieses Verfahren aufwändige und teure Apparaturen zur Messung der Fluoreszenzintensität.
Ein neueres Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure- sequenz ist die QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), bei der in einem PCR- Ansatz parallel mehrere PCR's unter Einsatz unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Primer durchgeführt werden und die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte anschließend mit einem automatischen DNA-Scanner laserdensito metrisch analysiert werden. Um einen aussagenkräftigen quantitativen Vergleich zwischen zwei nebeneinander amplifizierten PCR- Produkten treffen zu können, müssen die beiden PCR-Teilreaktionen mit gleicher Effizienz ablaufen und die Fluoreszenzintensitäten der Reaktionsprodukte zum Zeitpunkt der exponentiellen Produktamplifikation quanti- tativ analysiert werden. Auch andere auf optisch aktiv markierten Sonden basierende Verfahren, bspw. solche unter Einsatz von infrarotmarkierten Sonden, lösen das Problem nicht.
Ein auf der QF-PCR-Methodik basierendes Verfahren zur Feststellung möglicher numerischer Aberrationen der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in Fruchtwasserproben ist von Lucchini et al. in Wissenschaftliche Informationen, September 2004 beschrieben worden. Dieses Verfahren basiert auf der in-vitro- PCR- Amplifikation von repetitiven und polymorphen STR (short tandem repeats) -Sequenzen mit fluoreszenzmarkierten Primern. Nach Abschluss der PCR werden die amplifizierten PCR-Produkte mittels Kapillarelektrophorese quantifiziert. Werden bei diesen Verfahren chromosomenspezifische STR-Systeme eingesetzt, so lassen sich aus der Anzahl der erhalten unterschiedlichen PCR-Produkte Rückschlüsse auf die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms schließen. Werden beispiels- weise bei der Reaktion mit einem chromosomspezifischen STR-System bei der Kapillarelektrophorese drei Peaks erhalten, wobei die Peakhöhen untereinander 1: 1 : 1 betragen, so enthält das untersuchte Individuum drei verschiedene Allele des entsprechenden Chromosoms (triallelische Trisomie). Werden hingegen bei dem Verfahren zwei Peaks erhalten, wobei das Verhältnis der Peaks untereinander 2: 1 beträgt, so weist das untersuchte Individuum pro Zelle zwei gleiche Allele des Chromosoms sowie ein anderes Allel des Chromosoms (diallelische Trisomie) auf. Im Fall, dass nur zwei Peaks mit identischer Peakhöhe erhalten werden, weist das Individuum zwei Allele auf, so dass keine Trisomie vorliegt (heterozygoter Fall). Allerdings lässt dieses Verfahren in dem Fall, dass lediglich ein Peak erhalten wird, keine Aussage über die An- oder Abwesenheit einer Trisomie zu, da dieses Ergebnis sowohl im Fall einer monoallelischen Trisomie als auch im Fall einer monoallelischen Disomie erhalten wird. Ein auf dieser Technologie beruhendes Verfahren zum Nachweis von Trisomie 13 wird auch in der DE 101 02 687 Al offenbart. Um auch zwischen einer monoallelischen Disomie und einer monoallelischen Trisomie unterscheiden zu können, wird bei diesem Verfahren vorgeschlagen, mit der PCR drei verschiedene, für das Chromosom 13 spezifische STR-DNA-Bereiche zu amplifizieren. Allerdings weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt werden müssen. Zudem erfordert es den Einsatz einer Mindestmenge an DNA, da andernfalls der stochastische Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird und keine quantitative Aussage für die diallelische Trisomie mehr möglich ist. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt schließlich darin, dass dieses nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit funktioniert, da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Verhältnis des Ausgangsmaterials sind. Des weiteren weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass die absolute Fluoreszenzintensität bestimmt werden muss.
Alle vorgenannten Verfahren basieren auf dem Einsatz von fluoreszenzmarkierten Primern und erfordern teure Apparaturen zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität. Zudem erfordern diese den Einsatz einer Mindestmenge an Ausgangsmaterial um zumindest einigermaßen zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
In der DE 10 2005 045 560 Al ist es vorgeschlagen worden, zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologen Sequenzen in einer biologi- sehen Probe mit einer definierten Menge einer biologischen Probe wenigstens eine Amplifikationsreaktion, welche daran angepasst ist, mehrere zueinander nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, durchzuführen, bevor die Anzahl der bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen unter- schiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt wird und die so bestimmte Anzahl mit wenigstens einer Häufigkeitsverteilung verglichen wird. Dabei wird die Häufigkeitsverteilung durch getrenntes, jeweils mehrmaliges Durchführen der gleichen und unter denselben Reaktionsbedingungen wie der für die zu untersuchenden biologischen Probe eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion mit wenigstens zwei verschiedenen Referenzproben, welche jeweils eine bekannte, voneinander verschiedene Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweisen, sowie anschließendes Bestimmen der pro Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten. Dieses Verfahren liefert gute Ergebnis- se, erfordert jedoch eine große Vielzahl an durchzuführenden PCR- Reaktionen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl einer oder mehrerer vorbestimmter Sequenzen in einer biologischen Probe bereitzustellen, welches einfach und kostengünstig durchführbar ist, welches auch und gerade bei einer geringen Anzahl an in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen vorbestimmten Sequenzen zuverlässige Ergebnisse liefert und welches insbe- sondere mit geringen Mengen an Ausgangsmaterial durchführbar ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Kopienzahl von Allelen pro Zelle, gelöst, welches die nachfolgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellung einer Nukleinsäure enthaltenden biologischen Probe, b) Fragmentierung der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure, c) Aufteilen der in dem Schritt b) erhaltenen Probe in wenigstens zwei Teilmengen, d) Zugabe von jeweils wenigstens zwei Primerpaaren zu jeder der wenigstens zwei Teilmengen, wobei jeder der Teilmengen jeweils dieselben Primerpaare zugegeben werden, und wobei die einzelnen Primerpaare daran angepasst sind, in einer Amplifikationsreakti- on jeweils unterschiedliche Teilsequenzen der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz zu amplifizieren, e) Durchführen einer Amplifikationsreaktion mit jeder der wenigstens zwei in dem Schritt d) erhaltenen Teilmengen, f) Bestimmen der Anzahl der mit den Amplifikationsreaktionen in dem Schritt e) für die einzelnen Teilmengen erhaltenen unter- schiedlichen Amplifikationsprodukte und Bestimmen, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind.
Unter dem Begriff Fragmentierung wird im Sinne der vorliegenden Erfϊn- düng die Zerteilung von Nukleinsäuremolekülen in jeweils wenigstens zwei Nukleinsäuremoleküle verstanden. Die durch die Fragmentierung aus jedem Nukleinsäuremolekül entstehenden Nukleinsäurefragmente weisen demnach eine kürzere Moleküllänge auf als die Ausgangsmoleküle.
Ferner wird unter dem Begriff vorbestimmte Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung jede beliebige Sequenz verstanden, welche von der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure umfasst wird. Insbesondere kann es sich bei der vorbestimmten Sequenz um ein Chromosom, um ein Chromatid, um ein Gen oder um einen Genabschnitt handeln.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die in der in dem Schritt a) bereitgestellten Probe enthaltene Nukleinsäure zwischen dem Verfahrensschritt a) und dem Verfahrensschritt b) lysiert. Dies kann beispielsweise durch die Zugabe von Lysozym zu der Probe, durch die Erhitzung der Probe oder durch die Zugabe von denaturierenden Agentien, wie beispielsweise Harnstoff, Dithiothreitol (DTT) und dergleichen, zu der Probe erreicht werden.
Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäuremoleküle bei der Fragmentie- rung in jeweils mindestens fünf Nukleinsäurefragmente fragmentiert, wobei die Fragmentierung beispielsweise durch Restriktionshydrolyse, durch Scherung, durch Ultraschall oder durch DNase- Verdau erfolgen kann. Die Verfahrensparameter bei der Fragmentierung, beispielsweise die Art des eingesetzten Restriktionsenzyms oder die Frequenz und Dauer des Ultraschalls, können dabei so eingestellt werden, dass Fragmente mit einer gewünschten Länge erhalten werden.
Im Unterschied zu den Verfahren nach dem Stand der Technik wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht, wie beispielsweise bei der quantitativen PCR, QF-PCR, FISH und CGH, die absolute Fluoreszenzintensität von PCR-Produkten bestimmt sowie wie im Fall der FISH und CGH mit der Fluoreszenzintensität einer Kontroll- bzw. Referenzprobe verglichen, sondern es wird lediglich bestimmt, mit wie vielen Teilmengen jeweils die gleichen Amplifikationsprodukte erhalten worden sind. Insofern müssen in dem erfindungsgemäßen Verfahren keine fluoreszenzmarkierten Primer eingesetzt werden. Sofern diese zur Detektion der Anzahl an erhaltenen verschiedenen PCR-Produkten dennoch eingesetzt werden, muss nicht aufwendig die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Fluoreszenzmarkierten PCR-Produkten bestimmt werden, sondern lediglich evaluiert werden, ob eine ggf. über einem definierten Schwellenwert liegende Fluoreszenz bei einer den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen entsprechenden Wellenlänge vorhanden ist oder nicht. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ohne kostenaufwändige Apparaturen zur quantitativen Detektion von Fluores- zenz einfach und kostengünstig durchzuführen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dessen schnelle und einfache Durchführbarkeit, weil bei diesem verglichen mit dem aus der DE 10 2005 045 560 Al bekannten Quantifizierungsverfahren nur eine vergleichsweise geringe Anzahl an Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden muss. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl für die Bestimmung der relativen Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe als auch für die Bestimmung der absoluten Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, um eine Trisomie in Rahmen einer in ^itro-Fertilisation (IVF) oder im Rahmen der Analyse fetaler Zellen aus maternalem Blut zu bestimmen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere auch zur quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, welche nur eine geringe Menge an Nukleinsäure, beispielsweise nur wenige Zellen, enthält. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einer biologischen Probe durchgeführt, welche als Ausgangsmaterial nur eine Zelle, beispielsweise eine humane Zelle, wie beispielsweise einen Polkörper, eine tierische Zelle oder eine Pflanzenzelle enthält, bzw. mit einer in Suspension gehaltenen Einzelzelle.
Das Grundprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf der Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz, wie beispielsweise der Kopienzahl eines Chromosoms, durch Fragmentierung der Nukleinsäure, Aufteilen der fragmentierten Probe in mehrere Teilmengen, Durchführen einer Multiplex-PCR mit jeder der Teilmengen, wobei in den mit den einzelnen Teilmengen durchgeführten Multiplex-PCR- Reaktionen jeweils die gleichen Primerpaare eingesetzt werden, bevor an- schließend bestimmt wird, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche
Amplifikationsprodukte erhalten worden sind. Aus diesem Vergleich kann dann mit der geforderten Sicherheit die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz bestimmt werden. Dies sei an dem folgenden Gedankenexperiment erläutert. Eine Zelle mag null, eine oder zwei Kopien einer vorbestimmten Sequenz, beispielsweise des Chromosoms 21, enthalten. Lysiert man die Zelle in der Zellsuspension und teilt die so erhaltene Probe in zwei Teilmengen auf, so wird sich das Chromosom 21 in dem Fall von Monosomie, d.h. wenn die Zelle eine Kopie des Chromosoms 21 enthält, auf eine der beiden Teilmengen verteilen. Mithin enthält in diesem Fall nur eine der beiden Teilmengen das Chromosom 21. Hingegen können in dem Fall der Disomie, d.h. wenn die Zelle zwei Chromosome 21 enthält, alle beiden Teilmengen jeweils eine Kopie des Chromosoms 21 enthalten oder kann eine der Teil- mengen kein Chromosom 21 enthalten und die andere Teilmenge zwei
Kopien des Chromosoms 21 enthalten. Enthält die Probe keine Kopie des Chromosoms 21 , wird sich dieses naturgemäß in keiner der beiden Teilmengen befinden.
Wird nun die zu bestimmende Sequenz, also das Chromosom 21, durch Fragmentierung in mehrere Teilsequenzen, beispielsweise durch Restriktionshydrolyse in 10 verschiedene Teilsequenzen zerlegt, beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass sich im Fall der Disomie zumindest ein Paar von gleichen Teilsequenzen auf beide Teilmengen verteilt, nahezu 100 %, wohin- gegen im Fall der Monosomie wiederum jede Teilsequenz in maximal einer der beiden Teilmengen vorliegen kann. Im Fall der Nullisomie wird sich naturgemäß in keiner der beiden Teilmengen eine Teilsequenz des Chromosoms 21 befinden. Führt man nunmehr die Verfahrensschritte d) bis f) des erfindungsgemäßen Verfahrens durch, kann im Fall der Monosomie jede Teilsequenz nur in einer der beiden Teilmengen nachgewiesen werden, wohingegen im Fall der Disomie zumindest einige der Teilsequenzen des Chromosoms 21 in beiden Teilmengen vorliegen und im Fall der Nullisomie in keiner der Teilmengen eine Teilsequenz des Chromosoms 21 vorliegt. Mithin kann durch die Aufteilung der fragmentierten Probe in zwei Teilmengen und die anschließende Durchführung der Verfahrens- schritte d) bis f), sofern während der Verfahrensschritte a) bis c) unter nicht denaturierenden Bedingungen gearbeitet wird, also die DNA während dieser Verfahrensschritte doppelsträngig vorliegt, bei einer hinreichend großen Zahl von während des Verfahrensschritts d) zugesetzten Primerpaaren eindeutig entschieden werden, ob die Probe null, eine oder wenigstens zwei Kopien des Chromosoms 21 enthält. Durch eine Erhöhung der Anzahl an Teilmengen, in welche die fragmentierte Probe in dem Verfahrensschritt c) aufgeteilt wird, können auch die Fälle Nullisomie, Monosomie, Disomie, Trisomie etc. voneinander unterschieden werden, und zwar auch in dem Fall, dass die DNA vor der Aufteilung in die Teilmengen denaturiert wird, also in Einzelstränge überführt wird.
Das vorstehende Gedankenexperiment ist für die Fälle Monosomie und Disomie in den Figuren 1 und 2 schematisch dargestellt.
In der Figur 1 wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine in der Figur 1 oben links durch einen Kreis symbolisierte Einzelzelle eingesetzt, welche eine Kopie der zu quantifizierender Sequenz, in diesem Fall des Chromosoms 21 , enthält, welches durch den in dem Kreis enthaltenen grauen Balken symbolisiert wird. Diese Einzelzelle wird in Suspension lysiert (nicht dargestellt), bevor der Suspension ein Restriktionsenzym zugesetzt wird, welches das in der Probe enthaltene Chromosom 21 , wie oben in der Mitte und oben rechts in der Figur 1 dargestellt, in fünf definierte Teilsequenzen mit sich jeweils unterscheidender Länge fragmen- tiert. Anschließend wird die diese fünf Teilsequenzen enthaltende Probe, wie in der Figur 1 unten links und mittig dargestellt, in zwei Teilproben aufgeteilt, wobei sich jede der fünf Teilsequenzen mit einer Wahrscheinlichkeit von jeweils 50 % auf eine der beiden Teilmengen verteilt. In dem in der Figur 1 dargestellten Fall sind die beiden kurzen Teilsequenzen in der Teilmenge 1 enthalten, während die drei längeren Teilsequenzen in der Teilmenge 2 vorliegen. Den beiden Teilmengen werden anschließend jeweils 5 gleiche Primerpaare zugesetzt, von denen jedes der fünf Primerpaare für jeweils eine der zuvor durch die Fragmentierung erzeugten Teilsequenzen des Chromosoms 21 spezifisch ist. Dabei sind die 5 Primerpaa- re in dem in der Figur 1 dargestellten Fall so konzipiert, dass jedes der Primerpaare bei der nachfolgenden PCR ein unterschiedlich langes PCR- Produkt erzeugt. Dann wird mit den beiden Teilmengen sowie mit einer Kontrollprobe, welche ein Chromosom 21 enthält, jeweils eine PCR unter gleichen Bedingungen durchgeführt und anschließend wird jeweils eine Teilmenge aller drei PCR- Ansätze auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Wie dem in der Figur 1 , unten rechts schematisch dargestellten Gel zu entnehmen ist, werden bei der Kontrollprobe (K) 5 verschiedene Banden erhalten, wobei für die Teilmenge 1 (1) lediglich 2 und für die Teilmenge 2 (2) lediglich 3 Banden erhalten werden, wobei keine der für die Teilmenge 1 erhaltenen Banden die gleich Länge wie die für die Teilmenge 2 erhaltenen Banden aufweist. Daraus kann mit hoher Wahrscheinlichkeit geschlossen werden, dass in der Probe genau eine Kopie des Chromosoms 21 enthalten war. Durch eine Erhöhung der Anzahl an in den PCR-Reaktionen eingesetzten Primerpaaren von 5 auf beispielsweise 10 kann die statistische Sicherheit des erhaltenen Ergebnisses entsprechend erhöht werden.
In der Figur 2 wird das gleiche Verfahren für den Fall einer biologischen Probe, welche zwei Chromosomen 21 (Disomie) enthält, schematisch wie- dergegeben. In diesem Fall werden bei der Fragmentierung jeweils zwei Kopien der fünf Teilsequenzen des Chromosoms 21 erhalten. Jede dieser Teilsequenzen wird sich mit einer 50 %-igen Wahrscheinlichkeit auf eine der beiden Teilmengen verteilen, so dass die Wahrscheinlichkeit dafür, dass sich die beiden Kopien einer Teilsequenz in einer Teilmenge befinden, 50 % beträgt und die Wahrscheinlichkeit dafür, dass sich jeweils eine der beiden Kopien einer Teilsequenz in einer Teilmenge befindet, wohingegen die andere Kopie derselben Teilsequenz in der anderen Teilmenge vorliegt, ebenfalls 50 % beträgt. Die Wahrscheinlichkeit, dass sich zumindest für eine der fünf verschiedenen Teilsequenzen die beiden Kopien der Teilse- quenz auf zwei unterschiedliche Teilmengen verteilen, liegt mithin bei mehr als 95 %. In dem in der Figur 2 dargestellten Fall sind von den beiden Kopien von vier der Teilsequenzen jeweils eine Kopie in der Teilmenge 1 und jeweils eine Kopie in der Teilmenge 2 enthalten, wohingegen die beiden Kopien der fünften Teilsequenz ausschließlich in der Teilmenge 2 enthalten ist. Nach der Durchführung der PCR-Reaktionen ergibt sich demnach bei der gelelektrophoretischen Analyse, dass für die Teilmenge 1 (1) vier Banden erhalten werden, wohingegen für die Teilmenge 2 (2) und für die Kontrolle (K) fünf Banden erhalten werden. Mithin weisen die Teilmengen 1 und 2 jeweils vier gleiche PCR-Produkte auf, woraus sich ergibt, dass die Probe wenigstens zwei Chromosomen 21 enthielt. Die Fälle Monosomie und Nullisomie können aufgrund des Ergebnisses jedoch ausgeschlossen werden. Durch eine Erhöhung der Anzahl von Teilmengen, in welche die biologische Probe in dem Verfahrensschritt c) aufgeteilt wird, könnte auch die absolute Kopienzahl des Chromosoms 21 in der Probe bestimmt werden, also bestimmt werden, ob das Chromosom 21 in der Probe mit 2, 3, 4, 5 etc. Kopien vorliegt.
Grundsätzlich können die Verfahrensschritte a) bis c) des erfindungsgemäßen Verfahrens unter nicht denaturierenden Bedingungen durchge- führt werden, so dass die vorbestimmte Sequenz, sofern diese dop- pelsträngige DNA ist, in Form von doppelsträngiger Nukleinsäure auf die einzelnen Teilmengen verteilt wird. Alternativ dazu ist es jedoch auch möglich, die Nukleinsäure in der biologischen Probe vor der in dem Verfahrensschritt c) erfolgenden Aufteilung der fragmentierten Probe in we- nigstens zwei Teilmengen zu denaturieren, um vorhandene doppelsträngi- ge Nukleinsäure zu einzelsträngiger Nukleinsäure zu überführen, weil einzelsträngige Nukleinsäure gleichermaßen wie doppelsträngige Nukleinsäure zu einem positiven PCR-Ergebnis führen kann. Diese Denaturierung kann beispielsweise vor oder nach der Fragmentierung gemäß dem Ver- fahrensschritt b) durchgeführt werden. In diesem Fall liegen demnach in dem Verfahrensschritt c) doppelt so viele auf die Teilmengen zu verteilende Kopien der fragmentierten vorbestimmten Sequenz vor wie in der biologischen Ausgangsprobe, nämlich im Falle einer Disomie beispielsweise vier einzelsträngige Kopien der fragmentierten vorbestimmten Sequenz, wohin- gegen in der biologischen Ausgangsprobe zwei doppelsträngige Kopien der unfragmentierten vorbestimmten Sequenz vorlagen. Auch in dem Fall, dass die vorbestimmte Sequenz bereits in der Ausgangsprobe einzelsträn- gig vorliegt, beispielsweise als RNA, kann eine Denaturierung vor der Durchführung des Verfahrensschritts c) erfolgen, beispielsweise um vor der enzymatisch erfolgenden Fragmentierung Sekundärstrukturen der einzelsträngigen Nukleinsäuren aufzubrechen.
Bezüglich der Art der eingesetzten Primerpaare ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert, so dass grundsätzlich sowohl spezifische als auch unspezifische Primerpaare eingesetzt werden können. Allerdings ist der Einsatz spezifischer Primerpaare bevorzugt, weil damit die Länge der PCR-Produkte gezielt eingestellt werden kann und sichergestellt wird, dass nur die genetischen Teilsequenzen amplifiziert werden.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird es vorgeschlagen, die wenigstens zwei in dem Verfahrensschritt d) zugegebenen Primerpaare daran anzupassen, in einer Amplifikationsreaktion jeweils verschiedene, nicht überlappende Teilsequenzen der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz zu amplifizieren. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, die Fragmentierung in dem Verfahrensschritt b) derart durchzuführen und/ oder die in dem Verfahrensschritt d) zugegebenen Primerpaare derart auszuwählen, dass die durchschnittliche Länge der in dem Verfahrensschritt b) erhaltenen Nukleinsäurefragmente größer ist als die Länge der mit den in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaaren amplifizierbaren Teilsequenzen der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz.
Sofern die Fragmentierung durch Restriktionshydrolyse erfolgt, wird das Restriktionsenzym bzw. werden die Restriktionsenzyme vorzugsweise so ausgewählt, dass diese nicht in den zu amplifizierenden Sequenzbereichen schneiden. Dies kann beispielsweise dadurch gewährleistet werden, dass zunächst in der Nukleinsäure vergleichsweise selten schneidende Restrik- tionsenzyme ausgewählt werden und dann in Abhängigkeit von den konkreten Schnittstellen die Primer so ausgewählt werden, dass die Schnittstellen der Restriktionsenzyme nicht in den von den Primerbindungsstel- len umfassten Bereichen liegen.
Ein wesentlicher Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass nach der Durchführung der Amplifikationsreaktionen mit den einzelnen Teilmengen bestimmt wird, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind, um daraus die Anzahl der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe zu bestimmen. Diese Bestimmung, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind, setzt naturgemäß voraus, dass die unterschiedlichen Amplifikationsprodukte voneinander unterschieden werden, also die Anzahl der pro Teilmenge erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt wird. Dies wird vorzugsweise durch Elektrophorese, beispielsweise durch Gelektrophorese, wie Polyacrylamid- gelelektrophorese oder Agarosegelelektrophorese, oder durch Kapillarelektrophorese, durchgeführt. Alternativ dazu ist auch eine fluorometrische Bestimmung der Amplifikationsprodukte möglich.
Um bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung den Arbeitsaufwand bei der Elektrophorese, insbesondere, wenn Polyacrylamid- gelelektrophorese oder Agarosegelelektrophorese eingesetzt wird, zu erleichtern und um die Dauer der Elektrophorese zu verringern, wird es in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die in dem Ver- fahrensschritt d) zugegebenen Primerpaare so auszuwählen, dass sich alle der mit den einzelnen Primerpaaren amplifizierbaren unterschiedlichen Teilsequenzen in ihrer Länge um jeweils wenigstens 10 Basenpaare, bevorzugt um wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt um wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 100 Basenpaare unterscheiden. Auf diese Weise werden keine besonderen Anforderungen an die Trennleistung bei der Gelelektrophorese gestellt.
Um die Zuverlässigkeit des Ergebnisses des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen, ist es gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form der vorliegenden Erfindung vorgesehen, ferner einen Verfahrensschritt gi) durchzuführen, welcher das Vergleichen der in dem Verfahrensschritt f) für jede Teilmenge bestimmten Amplifikationsprodukte mit den mit wenigstens einer Kontrollprobe bei einer Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikationsprodukten, wobei die mit der wenigstens einen Kontrollprobe durchgeführte Amplifikationsreaktion mit denselben Primerpaaren wie in dem Schritt d) durchgeführt wird und die Kontrollprobe vorzugsweise eine bekannte Anzahl der vorbestimmten Sequenz enthält, umfasst. Auf diese Weise können anhand des Vergleichs des mit der Kontrollprobe erhaltenen Bandenmusters mit dem für die Kontrollprobe er- warteten Bandenmusters etwaige Fehler bei der Durchführung der Ampli- fikationsreaktion, wie beispielsweise ein temporärer Ausfall des Thermo- cyclers während der Amplifikationsreaktion, erkannt werden. So kann beispielsweise der Fall Nullisomie, bei dem für die mit den fragmentierten Teilmengen der Probe durchgeführten Amplifikationsreaktionen keine Banden erwartet werden, validiert werden, weil in dem Fall, dass für die Kontrollprobe die erwarteten Banden erhalten werden, ein Fehler bei der Durchführung der Amplifikationsreaktion ausgeschlossen werden kann.
Aus diesem Grund wird die Amplifikationsreaktion mit der wenigstens einen Kontrollprobe vorzugsweise parallel zu dem Schritt e) durchgeführt.
Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren anstelle des Verfahrensschritt gi) auch den zusätzlichen Verfahrensschritt g2) umfassen, welcher ein Vergleichen der in dem Schritt f) für jede Teilmenge bestimmten Amplifikationsprodukte mit einem Datensatz umfasst, wobei der Datensatz Informationen zu den mit wenigstens einer Kontrollprobe bei einer Amplifikationsreaktion unter Einsatz der in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaaren erhältlichen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten umfasst.
Grundsätzlich gilt, dass die statistische Sicherheit des mit dem erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Ergebnisses umso größer ist, desto mehr Primerpaare in der Amplifikationsreaktion, vorzugsweise einer MuI- tiplex-PCR, eingesetzt werden. Allerdings steigt mit zunehmender Anzahl der eingesetzten Primerpaare der experimentelle Aufwand. Als Kompro- miss zwischen diesen beiden gegenläufigen Tendenzen ist es bevorzugt, in dem Verfahrensschritt d) jeder der Teilmengen, pro zu bestimmender vorbestimmter Sequenz, jeweils 2 bis 50, bevorzugt 5 bis 25, besonders bevorzugt 8 bis 15, ganz besonders bevorzugt 10 bis 15 und höchst bevor- zugt 12 Primerpaare zugegeben. Auch für die Anzahl der in dem Verfahrensschritt c) erstellten Teilmengen gilt, dass, insbesondere für größere Kopienzahlen, die statistische Sicherheit des mit dem erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Ergebnisses umso größer ist, in desto mehr Teilmengen die fragmentierte Probe in dem Verfahrensschritt c) aufgeteilt wird, wohingegen der experimentelle Aufwand mit zunehmender Anzahl an in dem Verfahrensschritt c) erstellten Teilmengen zunimmt. Als Kompromiss zwischen diesen beiden gegenläufigen Tendenzen ist es bevorzugt, die fragmentierte Probe in dem Verfah- rensschritt c) in wenigstens 3 Teilmengen, vorzugsweise in wenigstens 4 Teilmengen und besonders bevorzugt in 5 bis 20 Teilmengen aufzuteilen. Vorzugsweise wird die in dem Verfahrensschritt b) erhaltene Probe in dem Verfahrensschritt c) so aufgeteilt, dass die hergestellten wenigstens zwei Teilmengen das gleiche Volumen aufweisen. Abgesehen davon, dass dies die Durchführung des Verfahrensschritt c) erleichtert, erleichtert dies auch spätere Berechnungen des Ergebnisses.
Um den apparativen und manuellen Aufwand möglichst gering zu halten, wird es in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die Amplifikationsreaktionen in dem Verfahrensschritt e) für alle Teilmengen parallel auf einem beispielsweise aus Glas bestehenden Substrat durchzuführen, wobei die einzelnen Teilmengen oder Teilproben dieser Teilmengen auf jeweils einer Reaktionsstelle des Substrats positioniert werden. Um eine feste Haftung der einzelnen Teilmengen bzw. Teilproben auf dem Substrat, insbesondere auch nach dem Überschichten mit dem nachfolgenden Öltropfen, zu gewährleisten, ist es gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass jede der Reaktionsstellen auf dem Substrat einen zentralen hydrophilen Bereich umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist.
Gute Ergebnisse werden bei dieser Ausführungsform insbesondere dann erhalten, wenn der zentrale hydrophile Bereich zumindest im Wesentlichen kreisrund ist und dieser außenseitig von einem zumindest im Wesentlichen kreisringförmig ausgebildeten ersten hydrophoben Bereich konzentrisch umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem zumindest im Wesentlichen kreisringförmig ausgestalteten mittleren hydrophilen Bereich konzentrisch umgeben ist, der außenseitig von dem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist.
Selbstverständlich müssen den Teilmengen der fragmentierten Probe vor der Durchführung der Amplifikationsreaktionen gemäß dem Verfahrens- schritt e) die notwendige D NA- Polymerase und ggf. wenigstens eine aus der aus pH-Puffersubstanzen, Salzen, Wasser und weiteren üblichen PCR- Zusatzstoffen bestehenden Gruppe ausgewählte Verbindung zur Einstellung von für die Durchführung der PCR geeigneten Bedingungen zugegeben werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Kopienzahl einer in der biologischen Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenz oder vorzugsweise die Kopienzahl mehrerer in der biologischen Probe enthaltenen vorbestimmten Sequenzen bestimmt werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der bzw. den vorbestimmten Sequenzen um Chromosomen, so dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere die Kopienzahl von in der biologischen Proben vorliegenden 1 bis 23, besonders bevorzugt von 1 bis 10 und ganz besonders bevorzugt von 1 bis 5 Chromosomen bestimmt werden kann. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl n von x vorbestimmten Se- quenz(en) in einer biologischen Probe die nachfolgenden Verfahrensschrit- te:
a) Bereitstellung einer DNA enthaltenden biologischen Probe, b) Fragmentierung der in der biologischen Probe enthaltenen DNA, c) Aufteilen der in dem Schritt b) erhaltenen Probe in y Teilmengen, d) Zugabe von jeweils z Primerpaaren zu jeder der y Teilmengen, wobei jeder der Teilmengen jeweils dieselben Primerpaare zugegeben werden, und wobei die einzelnen Primerpaare daran angepasst sind, in einer PCR jeweils unterschiedliche Teilsequenzen der x vorbestimmten Sequenz(en) zu amplifizieren, e) Durchführen einer PCR mit jeder der y in dem Schritt d) erhaltenen
Teilmengen, f) Bestimmen der Anzahl der mit den PCR-Reaktionen in dem Schritt e) für die einzelnen Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Ampli- fikationsprodukte und Bestimmen, mit wie vielen der z Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind.
Vorzugsweise ist x eine ganze Zahl zwischen 1 und 23, ist y eine ganze Zahl von größer gleich 4, bevorzugt von 5 bis 20, und ist z eine ganze Zahl, welche größer gleich 3 • x, vorzugsweise 5 • x bis 25 ■ x und beson- ders bevorzugt 8 • x bis 15 • x ist.
Wie insbesondere in dem vorstehenden Gedankenexperiment detailliert dargelegt, kann aus der Anzahl, mit wie vielen der z Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind, die Anzahl n der vorbestimmten Sequenz(en) bestimmt werden. Für den einfachen Fall von vier Teilmengen (y=4) und 8 eingesetzten Primerpaaren (z=8) bedeutet beispielsweise, wenn vor dem Verfahrensschritt c) keine Denaturierung der DNA in Einzelstrang-DNA vorgenommen wurde, das Ergebnis, dass mit keiner der Teilmengen gleiche Amplifikationsprodukte erhalten wur- den, sondern die einzelnen Amplifikationsprodukte jeweils in nur einer Teilmenge vorkommen, dass die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe 1 (Monosomie) beträgt. Hingegen beträgt die Kopienzahl 0 (Nullisomie), wenn mit keiner der Teilmengen überhaupt ein Amplifikationsprodukt erhalten worden ist. Werden hingegen für wenigs- tens zwei Teilmengen gleiche Amplifikationsprodukte erhalten, beträgt die Kopienzahl mindestens zwei und so weiter.
Vorzugsweise wird die Anzahl der in dem Verfahrensschritt e) eingesetzten Primerpaare so gewählt, dass die Wahrscheinlichkeit für ein falsch negati- ves Ergebnis bei maximal 5 % liegt. Dies kann beispielsweise durch den nachfolgend wiedergegebenen statistischen Ansatz gewährleistet werden:
Mittels der nachfolgend beschriebenen Methode soll beispielsweise die Aussage ermöglicht werden, wie viele Kopien eines bestimmten Chromo- soms in einer Probe vorhanden sind.
Die Wahrscheinlichkeit der richtigen Bestimmung der Kopienzahl hängt hierbei vor allen von folgenden Parametern ab:
- k = tatsächlich vorhandene Kopien
- N = Anzahl der Teilreaktionen
(Multiplexgrad = Anzahl der untersuchten verschieden langen
Banden pro Teilreaktion)
(Anzahl der untersuchten Zellen) . Folgende statistische Überlegungen verdeutlichen die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer korrekten Kopienzahl-Bestimmung:
1) Bestimmung aller möglichen Kombinationen bei der Aufteilung der vorhandenen Sequenzkopien auf die Teilreaktionen:
Kombinationen mit Wiederholung Aerwünscht = (N + k - l)!/ (N - l)! * k!
Prinzipiell gelten hierbei folgende Voraussetzungen:
a) Alle Elemente (= Teilreaktion, z.B. 1 bis 8) unterscheiden sich voneinander. b) Es werden einige Elemente ausgewählt (eine Teilreaktion mit Sequenzkopie gilt als "ausgewählt"). c) Ein Element kann mehrmals ausgewählt werden (d.h. es können bei der anfänglichen Verteilung mehrere Sequenzkopien einer bestimmten Teilreaktion zugeteilt werden).
2) Bestimmung der möglichen Kombinationen bei der Aufteilung der vor- handenen Sequenzkopien auf die Teilreaktionen, bei denen jeweils nur eine Kopie pro Teilreaktion vorliegt:
Kombinationen mit Wiederholung Agesamt = N! / (N - k)! * k!
Prinzipiell gelten hierbei folgende Voraussetzungen:
a) und b) wie oben. c) Ein Element darf nicht mehrmals ausgewählt werden (d.h. bei der anfänglichen Verteilung der Sequenzkopien wird nur maximal eine Sequenz einer Teilreaktion zugeteilt). Setzt man nun die "erwünschten" Ereignisse (2) ins Verhältnis zu allen möglichen Ereignissen (1) erhält man den Anteil der "erwünschten" Ereignisse und damit die Erfolgswahrscheinlichkeit einer richtigen Aussage der Methode bei Verwendung der entsprechenden Parameter.
Wahrscheinlichkeit P(richtige Aussage) = Aerwünscht/ Agesamt = (N - 1)! * N! /(N + k - 1)! * (N - k)!
Beispiel:
- k = 4
- N = 8
- Multiplexgrad = Anzahl der untersuchten verschieden langen Banden pro Teilreaktion).
Wahrscheinlichkeit für den erfolgreichen Nachweis aller 4 vorhandenen Sequenzkopien
= Aenvünscht/ Agesamt = ((8 - 1)! * 8!) / ((8 + 4 - 1) !* (8 - 4)!) = (7! * 8!) / (11! * 4!) = 0,2121.
Die Wahrscheinlichkeit, eine unrichtige Aussage zu treffen, liegt damit bei 1- 0,2121 = 0,7878. Dies gilt, wenn nur ein PCR-Produkt pro Teilmenge analysiert wird.
Wenn man allerdings mehrere PCR-Produkte pro Teilmenge analysiert (Multiplex - PCR), erhält man die Gesamtwahrscheinlichkeit durch Multiplikation der Einzelwahrscheinlichkeiten. Also z.B. für eine 3-Plex: P(Nachweis aller Banden) = 0,7878 * 0,7878 * 0,7878. Man kommt zu folgender Tabelle, abhängig vom Multiplex-Grad.
Bei einem Multiplex- Grad von 13 erreicht man hier also eine Fehlerwahr- scheinlichkeit von weniger gleich 5 %.
Da aber z.B. beim Nachweis von Chromosomen nach deren Denaturierung immer 2n Einzelstränge vorliegen, kann man bei der statistischen Aussage folgendermaßen vorgehen.
P(Erfolgreicher Nachweis von n Chromosomen) = P(erfolgreicher Nachweis von genau 2n Chromatiden) + P(erfolgreicher Nachweis von genau (2n - 1) Chromatiden). So kann man aus dem Nachweis von 1 oder 2 Amplifikaten auf die Anwesenheit von einem Chromosom (= 2 Chromatiden) rückschließen, aus dem Nachweis von 3 oder 4 Amplifikaten auf die Anwesenheit von 2 Chromosomen ( = 4 Chromatiden), aus dem Nachweis von 5 oder 6 Amplifikaten auf die Anwesenheit von 3 Chromosomen ( = 6 Chromatiden) schließen usw.
P(Nachweis von genau 2n Chromatiden) + P(Nachweis von genau (2n - 1) Chromatiden) = = (N - 1)! * N! /(N + k - 1)! * (N - k)! + (N!/ko!*k1!*k2!*...*kn!)/ ((N+ k - 1)!/(N- l)!*k!) wobei gilt:
Ko = Anzahl der Reaktionsgefäße, in denen keine Sequenzkopie vorliegt, K1 = Anzahl der Reaktionsgefäße, in denen genau 1 Sequenzkopie vorliegt, K2 = Anzahl der Reaktionsgefäße, in denen genau 2 Sequenzkopien vorliegen etc.
Im Falle des Nachweises von 2n- 1 Chromatiden liegen in einer der Teilre- aktionen 2 Sequenzkopien vor und in allen anderen, wenn überhaupt, nur
1 Sequenzkopie: somit gilt hier:
Ko = N-k+ l
K1 = k-2
K2 = 1
Also lautet die Formel:
P(Nachweis von genau 2n Chromatiden) + P(Nachweis von genau (2n - 1) Chromatiden) =
= ((N - 1)! * N!) /((N + k - 1)! * (N - k)l) + (N!/ (N-k+ 1)!* (k-2)!) / ((N+ k - l)!/(N- l)!*k!)
Beispiel: - k = 4
- N = 8
Wahrscheinlichkeit für den erfolgreichen Nachweis aller 4 vorhandenen Sequenzkopien = ((8 - 1)! * 8!) /((8 + 4 - 1)! * (8 - 4)!) + (8!/ (8-4+1)!* (4-2)!) / ((8+ 4 - 1)1/(8-1)1*4!) = 0,212 + 0,509 = 0,721
Die Wahrscheinlichkeit, eine unrichtige Aussage zu treffen liegt, damit bei 1 - 0,721 = 0,278. Dies gilt, wenn nur ein PCR Produkt pro Teilmenge analysiert wird.
Wenn mal allerdings mehrere PCR-Produkte pro Teilmenge analysiert (Multiplex - PCR), erhält man die Gesamtwahrscheinlichkeit durch Multiplikation der Einzelwahrscheinlichkeiten. Also z.B. für eine 3-Plex: P(Nachweis aller Banden) = 0,278 * 0,278 * 0,278 = 0,021.
Man kommt, abhängig von dem Multiplex-Grad, zu folgender Tabelle.
Hier erreicht man bereits bei einem Multiplex-Grad 3 eine Fehlerwahrscheinlichkeit von weniger gleich 5 %.
Eine mögliche Auswertevariante der erzielten Amplifikationen wäre z.B. der Nachweis mittels Fluoreszenzfarbstoffen, wobei für jedes Fragment unterschiedlicher Größe jeweils ein Fluoreszenzfarbstoff gewählt wird. Da hier nur interessant ist, ob Produkte amplifiziert wurden, die Menge an Produkt dagegen nicht interessiert, könnte so einfach mit einer Endpunktbestimmung die Fluoreszenz der einzelnen Wellenlängen gemessen werden, ohne dass ein Gel benutzt werden muss. Mithin eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Anzahl n wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, wenn die Anzahl n pro vorbestimmter Sequenz in der biologischen Probe 0 bis 100, vorzugsweise 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5 und ganz besonders bevorzugt 0, 1, 2, 3 oder 4 beträgt.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren mit Vorteil im Rahmen einer in fitro-Fertilisation (IVF) oder im Rahmen der Analyse fetaler Zellen aus maternalem Blut durchgeführt werden.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand eines beispielhaften, die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränkenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel
Mit zwei, jeweils Zellen enthaltenden biologischen Proben in Form einer Suspension wurde getrennt voneinander das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt, um die in den beiden Proben vorliegende Kopienzahl des Chromosoms 21 zu bestimmen. Während die erste Probe zwei Zellen enthielt, enthielt die zweite Probe lediglich eine Zelle.
Hierzu wurden die beiden Proben jeweils lysiert und mit einer Mischung aus den Restriktionsenzymen Xho I, Sac I und Pacl bei 37 0C für 5 Minuten hydrolysiert (Cek-Kit, Advalytix Products bzw. Olympus Life Science Research Europa GmbH). Anschließend wurden die erhaltenen fragmentierten Proben jeweils in vier Teilmengen gleicher Volumina aufgeteilt, wonach jeder der erhaltenen Teilmengen 7 Primerpaare zugegeben wurde. Alle sieben Primerpaare waren für jeweils unterschiedliche Teilsequenzen bzw. Subsequenzen des Chromosoms 21 spezifisch, wobei alle sieben Primerpaare so ausgewählt wurden, dass jedes Primerpaar ein unterschiedlich langes PCR-Produkt ergibt. Diese Probenansätze wurden auf jeweils eine Reaktionsstelle eines Glassubstrats pipettiert.
Dann wurde zu jeder Probe jeweils 1 μl einer PCR-Mischung, welche 0,5 μm 2x Multiplex PCR Master Mix (Qiagen GmbH, Hilden), 0,005 μl Bromphenolblau (0, 1 %), 0,06 μl 5x Q-Solution (Qiagen GmbH, Hilden) und 0,39 μl Wasser enthielt, zugegeben. Abschließend wurden die einzel- nen Reaktionsansätze mit 5 μl Sealing Solution (Advalytix AG, München) bedeckt und mit dem nachfolgenden Temperaturprofil einer PCR unterzogen:
- 10 Minuten bei 94 0C, - 35 Zyklen mit
94 0C für 30 Sekunden, 63 0C für 60 Sekunden und 72 0C für 60 Sekunden, sowie
- 10 Minuten bei 72 0C.
Anschließend wurde jeweils eine Teilmenge jeder der 8 PCR-Produkte in eine Tasche eines Polyacrylamidgels pipetiert, elektrophoretisch aufgetrennt und nach Silberfärbung detektiert.
Eine Photographie des Polyacrylamidgels ist in der Figur 3 wiedergegeben. In der Figur 3 bezeichnen die Zahlen 1 bis 4 die Spuren für die einzelnen Teilmengen der PCR-Reaktionen jeweils für die beiden eingesetzten Proben, während in der linken unbeschrifteten Spur ein Längenmarker aufgetragen wurde. Das Ergebnis ist in den beiden in der Figur 3 rechts neben der Photographie wiedergegebenen Tabellen zusammengefasst. Die erste Zeile der Tabellen gibt die einzelnen Spuren des Gels wieder, also die den Teilmengen 1 bis 4 entsprechenden Spuren 1 bis 4 für die erste Probe und die den Teilmengen 1 bis 4 entsprechenden Spuren 1 bis 4 für die zweite Probe. Darunter ist in jeder Spalte die Anzahl der Banden für die sieben möglichen PCR-Produkte angegeben, welche für jede einzelne Teilmenge erhalten worden sind, also "O" oder "1".
Wie sich der Figur 3 entnehmen lässt, wurden für die erste Probe, deren PCR-Produkte für die einzelnen Teilmengen in den linken vier Spuren des Polyacrylamidgels aufgetragen wurden, maximal in drei der vier Teilmengen gleiche PCR-Produkte erhalten, wohingegen für die zweite Probe, deren PCR-Produkte für die einzelnen Teilmengen in den rechten vier Spuren des Polyacrylamidgels aufgetragen wurden, maximal in zwei der vier Teilmengen gleiche PCR-Produkte erhalten worden sind.
Daraus ergibt sich, dass die erste Probe wenigstens drei Kopien des Chromosoms 21 enthielt, wohingegen die zweite Probe wenigstens zwei Kopien des Chromosoms 21 enthielt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der absoluten Kopienzahl von Allelen pro Zelle, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellung einer Nukleinsäure enthaltenden biologischen Probe, b) Fragmentierung der in der biologischen Probe enthaltenen Nukleinsäure, c) Aufteilen der in dem Schritt b) erhaltenen Probe in wenigstens zwei Teilmengen, d) Zugabe von jeweils wenigstens zwei Primerpaaren zu jeder der wenigstens zwei Teilmengen, wobei jeder der Teilmengen jeweils dieselben Primerpaare zugegeben werden, und wobei die einzelnen Primerpaare daran angepasst sind, in einer Amplifikationsreaktion jeweils unterschiedliche Teilsequen- zen der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz zu amplifi- zieren, e) Durchführen einer Amplifikationsreaktion mit jeder der wenigstens zwei in dem Schritt d) erhaltenen Teilmengen, f) Bestimmen der Anzahl der mit den Amplifikationsreaktionen in dem Schritt e) für die einzelnen Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte und Bestimmen, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine vorbestimmte Sequenz ein Chromosom, ein
Chromatid, ein Gen oder ein Genabschnitt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Einzelzelle oder eine in Suspension gehaltene Einzelzelle ist, wobei die Einzelzelle vorzugsweise eine humane Zelle, eine tierische Zelle oder eine PΩanzenzelle, besonders bevor- zugt ein Polkörper, ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmentierung der in der biologischen Probe enthaltenen Nuk- leinsäure in dem Schritt b) durch Restriktionshydrolyse, durch
Scherung, durch Ultraschall oder durch DNase-Verdau durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure doppelsträngige DNA ist und diese nach dem Schritt a) und vor dem Schritt c) zu Einzelsträngen denaturiert wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaare jeweils für Teilsequenzen der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz spezifische Primerpaare sind.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens 2 in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaare daran angepasst sind, in einer Amplifikationsreaktion jeweils verschiedene, nicht überlappende Teilsequenzen der wenigstens einen vorbe- stimmten Sequenz zu amplifizieren.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fragmentierung in dem Schritt b) derart durchgeführt wird und/ oder die in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaare derart ausgewählt werden, dass die durchschnittliche Länge der in dem Schritt b) erhaltenen Nukleinsäurefragmente größer ist als die Länge der mit den in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaaren amplifi- zierbaren Teilsequenzen der wenigstens einen vorbestimmten Se- quenz.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaare so ausgewählt wer- den, dass sich alle der mit den einzelnen Primerpaaren amplifϊzier- baren unterschiedlichen Teilsequenzen in ihrer Länge um jeweils wenigstens 10 Basenpaare, bevorzugt um wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt um wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 100 Basenpaare unterscheiden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Schritt f) bestimmte Anzahl der für die einzelnen Teilmengen erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte und/oder die Bestimmung, mit wie vielen Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind, durch Gelektrophore- se oder durch Kapillarelektrophorese erfolgt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses ferner den Schritt gi) Vergleichen der in dem Schritt f) für jede Teilmenge bestimmten Amplifikationsprodukte mit den mit wenigstens einer Kontrollprobe bei einer Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikationsprodukten, wobei die mit der wenigstens einen Kontrollprobe durchgeführte Amplifikationsreaktion mit denselben
Primerpaaren wie in dem Schritt d) durchgeführt wird, umfasst.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationsreaktion mit der wenigstens einen Kontrollprobe parallel zu dem Schritt e) durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass dieses ferner den Schritt g2) Vergleichen der in dem Schritt f) für jede Teilmenge bestimmten Amplifikationsprodukte mit einem Datensatz umfasst, wobei der Datensatz Informationen zu den mit wenigstens einer Kontrollprobe bei einer Amplifikationsreaktion unter Einsatz der in dem Schritt d) zugegebenen Primerpaaren erhältli- chen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten umfasst.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt d) jeder der Teilmengen, pro zu bestimmender vorbe- stimmter Sequenz, jeweils 2 bis 50, bevorzugt 5 bis 25, besonders bevorzugt 8 bis 15, ganz besonders bevorzugt 10 bis 15 und höchst bevorzugt 12 Primerpaare zugegeben werden.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in dem Schritt b) erhaltene Probe in dem Schritt c) in wenigstens 3 Teilmengen, vorzugsweise in wenigstens 4 Teilmengen und besonders bevorzugt in 5 bis 20 Teilmengen aufgeteilt wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationsreaktionen in dem Schritt e) für alle Teilmengen parallel auf einem Substrat aus beispielsweise Glas durchgeführt werden, wobei die einzelnen Teilmengen oder Teilproben dieser Teilmengen auf jeweils einer Reaktionsstelle des Substrats positioniert werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass jede der Reaktionsstellen auf dem Substrat einen zentralen hydrophilen Bereich umfasst, der außenseitig von einem ersten hydrophoben Bereich umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem mittleren hydrophilen Bereich umgeben ist, der außenseitig von einem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der zentrale hydrophile Bereich zumindest im Wesentlichen kreisrund ist, welcher außenseitig von einem zumindest im Wesentlichen kreisringförmig ausgebildeten ersten hydrophoben Bereich konzen- trisch umgeben ist, der wiederum außenseitig von einem zumindest im Wesentlichen kreisringförmig ausgestalteten mittleren hydrophilen Bereich konzentrisch umgeben ist, der außenseitig von dem zweiten hydrophoben Bereich umgeben ist.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die in der biologischen Proben vorliegende Kopienzahl von 1 bis 23, bevorzugt von 1 bis 10 und besonders bevorzugt von 1 bis 5 Chro- mosomen bestimmt wird.
20. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl n von x vorbestimmten Sequenz(en) in einer biologischen Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfassend die Schritte:
a) Bereitstellung einer DNA enthaltenden biologischen Probe, b) Fragmentierung der in der biologischen Probe enthaltenen DNA, c) Aufteilen der in dem Schritt b) erhaltenen Probe in y Teil- mengen, d) Zugabe von jeweils z Primerpaaren zu jeder der y Teilmengen, wobei jeder der Teilmengen jeweils dieselben Primerpaare zugegeben werden, und wobei die einzelnen Primerpaare daran angepasst sind, in einer PCR jeweils unterschiedliche Teilsequenzen der x vorbestimmten Sequenz(en) zu amplifi- zieren, e) Durchführen einer PCR mit jeder der y in dem Schritt d) erhaltenen Teilmengen, f) Bestimmen der Anzahl der mit den PCR-Reaktionen in dem Schritt e) für die einzelnen Teilmengen erhaltenen unter- schiedlichen Amplifikationsprodukte und Bestimmen, mit wie vielen der z Teilmengen jeweils gleiche Amplifikationsprodukte erhalten worden sind.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass x eine ganze Zahl zwischen 1 und 23 ist, y eine ganze Zahl von größer gleich 4, bevorzugt von 5 bis 20, ist und z eine ganze Zahl ist, welche größer gleich 3 ■ x, vorzugsweise 5 • x bis 25 • x und besonders bevorzugt 8 ■ x bis 15 • x ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass aus der Anzahl, mit wie vielen der z Teilmengen jeweils gleiche
Amplifikationsprodukte erhalten worden sind, die Anzahl n der vorbestimmten Sequenz(en) bestimmt wird.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende Anzahl n pro vorbestimmter Sequenzen in der biologischen Probe 0 bis 100, vorzugsweise 0 bis 10, besonders bevorzugt 0 bis 5 und ganz besonders bevorzugt 0, 1, 2, 3 oder 4 beträgt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses im Rahmen einer in mfro-Fertilisation (IVF) oder im Rahmen der Analyse fetaler Zellen aus maternalem Blut durchgeführt wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in der in dem Schritt a) bereitgestellten Probe enthaltene Nukleinsäure zwischen dem Verfahrensschritt a) und dem Verfahrens- schritt b) lysiert wird.
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