DE10103308A1

DE10103308A1 - Kit, Verfahren und Mikroarray zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose

Info

Publication number: DE10103308A1
Application number: DE10103308A
Authority: DE
Inventors: Stefanie Waschuetza; Cengiz Tamak; Lutz Wehmeier
Original assignee: Adnagen GmbH
Current assignee: Alere Diagnostics GmbH
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2002-08-14
Also published as: WO2002059358A3; WO2002059358A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit, ein Verfahren und ein Mikroarray zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose. Dieser Nachweis erfolgt über einen Nachweis der allelischen Variabilität des Vitamin-D¶3¶-Rezeptors (VDR) durch Amplifikation geeigneter Abschnitte des VDR-Gens und anschließendem Nachweis von deren Variabilität beispielsweise mittels Restriktionsverdau und anschließender Analyse der erzeugten DNS-Fragmente.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Kit, ein Verfahren und ein Mikroarray zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose von Menschen.

Osteoporose ist eine weitverbreitete Knochenkrank heit, bei der eine stetige Abnahme der Knochenmasse stattfindet. Dabei tragen etwa 20% aller Frauen ein hohes genetisches Risiko für eine Osteoporose-Erkran kung, 45% haben ein erhöhtes Risiko und etwa 5% der männlichen Bevölkerung sind betroffen. Bei Osteoporo se handelt es sich eigentlich um eine "Kinderkrank heit", denn das Risiko für eine Osteoporose- Erkrankung wird vor allem durch die ungenügende För derung des Knochenaufbaus in der Jugend, verursacht z. B. durch falsche Ernährung, erheblich gesteigert.

Das Gleichgewicht eines ständigen Auf- und Abbaus von Knochengewebe ist die Voraussetzung für eine dauer haft gesunde Knochenstruktur, wobei bis etwa zum 35. Lebensjahr die Bilanz zugunsten des knochenaufbauen den Prozesses verschoben ist. Der Knochenaufbau wird durch spezialisierte Zellen vermittelt (Osteobla sten), die die Knochengrundsubstanz bilden. In diese Knochengrundsubstanz werden Mineralien wie Calcium phosphat eingelagert. Dagegen wird der Knochenabbau durch eine andere Sorte spezialisierter Zellen (Osteoklasten) vermittelt, die mit Hilfe bestimmter Enzyme die Knochengrundsubstanz auflösen und durch Ansäuerung des Milieus die eingelagerten Mineralien herauslösen. Wird die individuelle, maximale Knochen masse erreicht, so verschiebt sich die Bilanz norma lerweise langsam in Richtung des knochenabbauenden Prozesses. Beim Krankheitsbild der Osteoporose setzt dieser knochenabbauende Prozeß verfrüht und beschleu nigt ein, wobei vor allem Frauen nach der Menopause betroffen sind.

Der Calcium-Haushalt im gesunden Organismus, d. h. ei ne nahezu konstante Calciumkonzentration im Blut, wird hormonell gesteuert. Auf eine Erniedrigung des Calciumgehalts im Blutkreislauf wird mit der Aus schüttung des Parathormons durch die Nebenschilddrüse reagiert. Dieses Hormon stimuliert dann die Bildung des Vitamin-D₃-Hormons in der Niere. Die Ausschüttung des Vitamin-D₃-Hormons wiederum steigert die enterale und renale Calcium-Resorption, wodurch die Calcium konzentration im Blutplasma wieder auf das notwendige Maß ansteigt und somit letztlich die Synthese von Knochengewebe möglich wird.

Die Wirkung des Vitamin-D₃-Hormons auf die Calcium konzentration bzw. den Knochenstoffwechsel wird über den Vitamin-D₃-Rezeptor (VDR) vermittelt, so daß sich eine Veränderung dieses Rezeptors zwangsläufig auch auf den Knochenstoffwechsel auswirkt. Inzwischen konnte gezeigt werden, daß die genetische Konstella tion des Vitamin D₃-Rezeptors die Entwicklung der in dividuellen Knochenstruktur und damit die individuel le, genetisch-bedingte Osteoporose-Prädisposition in einem hohen Maß beeinflußt, wobei drei Risikogruppen unterschieden werden:
Bei einer Genausstattung "BB" liegen beide humanen Allele des VDR-Gens in einer Osteoporose-begünsti genden Zustandsform vor. Etwa 20% aller Frauen tra gen dieses besonders hohe genetische Risiko, bereits früh im Alter von 65 Jahren an Osteoporose zu erkran ken. Bei der Genausstattung "bb" liegen beide VDR- Allele in der bestmöglichen Zustandsform für eine op timale Knochendichte vor (ca. 35% der weiblichen Be völkerung), während die Konstellation "Bb" eine Mischform mit mittlerer Osteoporose-Prädisposition einnimmt. Diese Genausstattung findet sich bei etwa 45% der weiblichen Bevölkerung.

Die Sequenzanalyse der beiden VDR-Allele (Nature 367 (1994), Seite 284, WO 94/03633) erbrachte, daß sie sich lediglich an einer einzigen, definierten Positi on voneinander unterscheiden. Liegt das Gen in der B- Form vor, so ist das Nukleotid an Position 650 Guanin (G), während es bei der b-Form ein Adenin (A) ist.

Herkömmliche Diagnostikverfahren, z. B. Knochendichte- Messungen zeigen den beginnenden und fortschreitenden Knochenabbau an, sind daher nur geeignete Methoden für Verlaufskontrollen. Die invasive Methode der Kno chenbiopsie ist experimentell aufwendig und kann den zeitlichen Beginn der Krankheit nur unpräzise fest stellen.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein molekularbio logisches Testverfahren anzugeben, mit dem eine Frü herkennung des genetisch bedingten Osteoporoserisikos auf einfache Art und Weise möglich ist.

Diese Aufgabe wird durch das Kit nach Anspruch 1, den Mikroarray nach Anspruch 19 sowie das Verfahren nach Anspruch 23 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Kits, Mikroarrays und Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gege ben.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein molekular biologisches Testverfahren entwickelt, das als Aus gangsmaterial beliebige menschliche Gewebe, insbeson dere peripheres Blut verwendet. Aus diesem wird das Erbmaterial (DNS) isoliert und anschließend unter sucht, ob das Gen für den Vitamin D₃-Rezeptor (VDR) an Position 650 Guanin oder Adenin aufweist bzw. die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Mva1269I enthält. Es wird also zu diagnostischen Zwecken die Erkenntnis genutzt, daß die Restriktions endonuklease Mva1269I im Falle des b-Allels des VDR eine Erkennungssequenz über den polymorphen Bereich besitzt. Im Falle des B-Allels besitzt diese Restrik tionsendonuklease keine Erkennungssequenz und kann daher das VDR-Gen nicht schneiden. Letztlich wird al so der Polymorphismus eines DNS-Abschnittes unter sucht, der in der b-Allelform des VDR-Gens die Erken nungssequenz der Restriktionsendonuklease Mva1269I enthält. Dies kann vorteilhafterweise erfolgen, indem der gesuchte DNS-Abschnitt mit den in Patentanspruch 2 dargestellten Primerpaaren mittels PCR amplifiziert wird und anschließend eine Untersuchung dieses amplifizierten Bereiches durchgeführt wird. Hierzu eignet sich zum einen eine Restriktionsfragmentanalyse, wo bei vorteilhafterweise die amplifizierten DNS-Ab schnitte einem Verdau mit der Restriktionsendonuklea se Mva1269I unterworfen werden. Dies führt im Falle des b-Allels zu zwei Fragmenten von ca. 140 Basen paaren und 340 Basenpaaren während im Falle des B- Allels das 480 Basenpaare große Amplifikat nicht fragmentiert wird.

Die Analyse des Fragmentmusters kann nun auf herkömm liche Weise mittels Gelelektrophorese erfolgen. Wei terhin können auch die als Primer verwendeten Oligo nukleotide mit Fluorophoren markiert sein, so daß auf dem Gel die entstehenden Banden bei 140 bp, 340 bp bzw. 480 bp leicht unter Fluoreszenzanregung erfaßt werden können. Auch eine Analyse mittels ABI-Genetic Analyzer™ der Firma Applied Biosystems oder entspre chenden Geräten ist mit derart fluoreszenzmarkierten Primerpaaren möglich.

Alternativ kann auch die LightCycler™-Technologie eingesetzt werden. Hierzu werden nach der Amplifika tion des gesuchten DNS-Abschnittes die Einzelstränge der amplifizierten DNS voneinander gelöst und mit den in Anspruch 5 genannten Oligonukleotiden hybridi siert. Diese beiden Oligonukleotide sind fluoreszenz markiert, wie in Anspruch 6 beschrieben, und binden in unmittelbar räumlicher Nähe zueinander an die ein zelsträngige DNS. In diesem Zustand ist zwischen den Fluoreszenzmarkern der beiden Oligonukleotide ein re sonanter Fluoreszenzenergietransfer möglich. Wird beispielsweise das eine Nukleotid mit dem Fluores zenzfarbstoff 3FAM™ (3-Fluorescein) und das andere Nukleotid mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5-LightCycler Red 640™ (5-LC Red 640™) markiert, so kann das 3FAM™ angeregt werden, wobei aufgrund des Fluoreszenzener gietransfers die Anregungsenergie des 3-FAM™ auf 5- LC Red 640™ übertragen wird und Fluoreszenz des Farbstoffes 5-LC Red 640™ beobachtbar ist.

Zur Analyse des Polymorphismus wird nun diese mit den beiden fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden hybri disierte DNS erwärmt, so daß sich die Oligonukleotide bei bestimmten Temperaturen wieder von der einzel strängigen DNS lösen. Aufgrund der Punktmutation, die in der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonu klease Mva1269I enthalten ist, bindet jedoch in einem Falle eines der Oligonukleotide weniger stabil an die einzelsträngige DNS und löst sich folglich bei nied rigerer Temperatur von dieser DNS. Aufgrund der Schmelztemperatur, die beobachtet wird, läßt sich nun eine Aussage treffen, welches der Allele bzw. ob bei de Allele des VDR-Gens in der Probe vorhanden sind.

Die Erfassung der Allele des VDR-Gens kann auch mit tels des erfindungsgemäßen Mikroarrays, z. B. eines DNA-Chips, erfolgen, wobei die einzelnen Zellen des Chips Oligonukleotide aufweisen, die spezifisch mit gesuchten Abschnitten der nachzuweisenden Allele hy bridisieren. Zum Aufbau und dem Einsatz von DNS-Chips wird beispielhaft allgemein auf die EP 0 373 203 ver wiesen. Der Nachweis kann dabei ohne Amplifikation direkt oder auch erst nach Amplifikation des gesuch ten DNS-Abschnittes erfolgen. In gleicher Weise kann der Nachweis ohne oder erst nach Restriktionsverdau der DNS bzw. eines amplifizierten DNS-Abschnittes hiervon in kürzere DNS-Abschnitte durchgeführt wer den.

Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Diagnose-Kit, dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie dem erfindungsgemäßen Mikroarray ist es, daß jeder Laborarzt und jedes medizinische Labor sowie jedes wissenschaftli che Labor, das derartige Untersuchungen durchführt, sämtliche aufeinander abgestimmte Substanzen gegebe nenfalls in einem einzigen Diagnose-Kit, zur Verfü gung erhält bzw. daß jegliche Vorbereitungsarbeiten für die Labore entfallen und auf einfache Art und Weise der Polymorphismus bestimmt werden kann. Insbe sondere sind die Primer-Oligonukleotide bzw. die Oli gonukleotide des Mikroarrays bereits ausgetestet, so daß die Hauptarbeit bei der Entwicklung entsprechen der Oligonukleotide entfällt.

Damit ist es erstmals möglich, die Bestimmung des Po lymorphismus des VDR-Gens von einzelnen Patienten in großem Maßstabe und am jeweiligen Ort des Patienten auf einfache und kostengünstige Weise durchzuführen. Denn hierzu benötigt der einzelne Laborarzt bzw. das einzelne medizinische Labor lediglich noch einen er findungsgemäßen Mikroarray, einen herkömmlichen Ther mocycler (PCR-Gerät), ein Gerät zur Auftrennung der einzelnen amplifizierten DNS-Fragmente, beispielswei se eine Gelelektrophorese-Einheit oder ein Kapillare lektrophoresegerät, oder einen LightCycler™ der Fa. Roche Molecular Biochemicals sein. Ein herkömmliches Kapillarelektrophoresegerät wird beispielsweise von der Firma Perkin Elmer Biosystems™ unter dem Namen "PE ABI Prism Genetic Analyser 310''™ vertrieben. Ent sprechende Thermocycler für die Amplification der DNS werden beispielsweise von der Firma Applied Biosy stems™ unter dem Namen "GenAmp 2400''™ bzw. auch "Gen- Amp9600"™ vertrieben.

Zur leichteren Erfassung der amplifizierten DNS- Abschnitte kann jeweils mindestens eines der Oligonu kleotide eines Paares mit einem Fluorophor gekennzeichnet sein, so daß hierdurch auch eine automati sierte Auswertung anhand der spezifischen Fluores zenzemission der jeweiligen Fluorophore möglich ist.

Insgesamt wird durch das erfindungsgemäße Diagnose- Kit, Mikroarray bzw. Verfahren die Bestimmung des Po lymorphismus des VDR-Gens jedermann auf einfache, si chere und standardisierte Weise ermöglicht.

Erfindungsgemäß kann das Diagnose-Kit auch dahinge hend weitergebildet werden, daß dem Diagnose-Kit nicht nur Oligonukleotide für die Bestimmung eines einzelnen Enzymes sondern auch weitere Oligonukleo tidpaare für die Bestimmung weiterer Gene beigegeben werden. In gleicher Weise kann der erfindungsgemäße Mikroarray auch Felder vorsehen, die Oligonukleotide aufweisen, mit denen weitere Gene nachgewiesen werden können.

Die jeweiligen Proben zur Erfassung der VDR-Allele können mittels handelsüblichen DNA-Isolierungskits (z. B. QIAamp DNA-Blood Kit™, Qiagen, Hilden) gewon nen werden. Als Ausgangsmaterial für die Extraktion der genomischen DNA können dabei Vollblut, Blutplas ma, Blutserum, Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Amnionflüssigkeit, kernhaltige Blutzellen wie bei spielsweise Lymphozyten, kultivierte Zellen, Gewebe oder auch forensisches Probenmaterial und dergleichen verwendet werden. Die extrahierte DNS dient dann als Template für die in den einzelnen Verfahren beschrie benen PCR-Reaktionen. Im folgenden werden einige Bei spiele erfindungsgemäßer Verfahren, hierzu verwendete Diagnose-Kits und dergleichen beschrieben.

Es zeigen:

Fig. 1 den Nachweis von PCR-Produkten über eine gelelektrophoretische Trennung;

Fig. 2 den Nachweis von PCR-Produkten über ABI- Fragmentanalyse;

Fig. 3 ein weiteres Beispiel für den Nachweis von PCR-Produkten über gelelektrophoretische Trennung;

Fig. 4 ein weiteres Beispiel für den Nachweis von PCR-Produkten über ABI-Fragmentanalyse; und

Fig. 5 den Nachweis eines Polymorphismus mittels LightCycler-Technologie.

Ein erster Kit ermöglicht die Bestimmung des Polymor phismus des VDR-Gens und enthält neben den Grundsub stanzen für eine PCR ein Primerpaar sowie die Re striktionsendonuklease Mva1269I in getrennten Behält nissen. Außerdem enthält es eine rekombinante Posi tivkontrolle des gesuchten Abschnittes des VDR-Gens. Mit diesem Kit wird nun das Verfahren folgendermaßen durchgeführt.

Zuerst wird DNA-Ausgangsmaterial über handelsübliche DNA-Isolierungskits (QIAamp DNA-Blood Kit, Qiagen, Hilden) isoliert. Als Ausgangsmaterial für die Ex traktion der genomischen DNA können u. a. Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Körperflüssigkeiten wie bei spielsweise Amnionflüssigkeit, kernhaltige Blutzellen wie beispielsweise Lymphozyten, kultivierte Zellen, Gewebe oder auch forensisches Probenmaterial verwen det werden. Die extrahierte DNA kann dann als Template für die im folgenden dargestellten Verfahren be schriebene PCR-Reaktion dienen.

In einem ersten Beispiel wurde zunächst eine Blutpro be von insgesamt drei Probanden verwendet. Es wurde aus diesem peripheren Blut über die genannten han delsüblichen Isolierungskits die genomische DNA ex trahiert. Diese DNA dient dann als Template für eine PCR-Reaktion bei der Amplifikate von 480 bp erzeugt werden, die den variablen Genbereich VDR-Allele bein halten. Da die variablen Allel-Bereiche zudem inner halb der Erkennungssequenz der Restriktionsendo nuclease Mva1269I lokalisiert sind, können durch eine anschließende RFLP-Analyse beide individuellen VDR- Allele typisiert werden. Der DNA-Verdau mit dem Enzym Mva1269I führt im Falle des "b"-Allels zu zwei Frag menten von ca. 140 bp und 340 bp. Im Gegensatz dazu wird das "B"-Allel aufgrund des singulären Nukleotid- Austausches innerhalb der Enzym-Erkennungsstelle nicht von Mva1269I fragmentiert. Demzufolge können sich in Abhängigkeit der individuellen VDR-Allelaus stattung die in Tabelle 1 gezeigten Fragmentmuster ergeben:

Tabelle 1

Als Primer wurden die in der folgenden Tabelle 2 dar gestellten Oligonukleotide verwendet, wobei beide Primer mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5'-6-FAM markiert waren. Die Größe des durch diese beiden Primer ampli fizierten DNS-Einzelstranges beträgt 480 Basenpaare.

Tabelle 2

Mit diesen Primern wurde eine Polymerasekettenreakti on durchgeführt mit den in der folgenden Tabelle 3 dargestellten Parametern.

Tabelle 3

Die PCR-Reaktionen wurden dabei auf einem PCR- Blockcycler PE 9700™ der Firma PE Applied Biosystems durchgeführt. Als Reaktionsansatz mit 25 µl Reak tionsvolumen wurde der in Tabelle 4 dargestellte Re aktionsansatz Verwendet.

Tabelle 4

Taq-Puffer bezeichnet dabei einen Taq DNA Polymerase Storage Buffer (Taq-Buffer B), der in wäßriger Lösung enthält: Tris-HCl 20 mM (pH = 8,0 bei 25°C), KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Glycerol 50% (v/v), Tween20 0,5% (v/v), Nonidet-P40 0,5% (v/v) und bei spielsweise von Promega Corp. (Cat.-No: M166B) ver trieben wird.

Mit den so erzeugten amplifizierten DNS-Abschnitten wurde eine RFLP-Analyse durchgeführt. Hierzu wurden die Amplifikate mit dem Restriktionsenzym Mva1269I in den bereits verwendeten PCR-Reaktionsgefäßen und PCR- Geräten inkubiert. Hierzu wurde ein Reaktionsansatz von 30 µl Volumen gemäß der nachfolgenden Tabelle 5 verwendet.

Tabelle 5

Der Restriktionsansatz wurde für 60 min bei 37°C in kubiert und anschließend über verschiedene Verfahren analysiert.

Zum einen wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durch geführt. Für die Agarose-Gelelektrophorese wurden pro Spur 15 µl des jeweiligen Reaktionsansatzes verwen det. Die Dokumentation der Agarose-Gelelektrophorese ist in Fig. 1 dargestellt. In Fig. 1 bezeichnen die Spuren 2 und 11 jeweils eine 100-bp-Leiter und die Spuren 4, 5 und 6 die Reaktionsansätze der oben ge nannten drei Probanden unmittelbar nach Durchführen der PCR und vor der Restriktionsspaltung. Die Spuren 8, 9 und 10 zeigen die entsprechenden Proben jedoch hier nach Restriktionsspaltung durch Mva1269I.

Bei sämtlichen Proben in Spuren 4 bis 6 findet sich lediglich das amplifizierte Fragment mit einer Länge von 480 bp.

Es ist unmittelbar zu erkennen, daß der Proband, des sen Proben in den Spuren 4 und 8 dargestellt sind, offensichtlich zwei VDR-Gene enthält, die beide die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Mva1269I enthalten. Es sind daher nach dem Restrikti onsverdau in Fig. 8 lediglich noch Fragmente mit 140 Basenpaaren und 340 Basenpaaren zu erkennen. Es liegt also genotypisch der bb-Typ mit geringem Osteoporose risiko vor. Bei dem Probanden, dessen Proben in den Spuren 5 und 9 dargestellt sind, liegen nach Restrik tionsverdau in Spur 9 sowohl Banden bei 140 Basenpaa ren und 340 Basenpaaren vor als auch eine Bande bei 480 Basenpaaren. Es handelt sich also genotypisch um einen Probanden mit zwei verschiedenen Allelen des VDR-Gens (bB-Typ). Bei dem Probanden, dessen Proben in den Spuren 6 und 10 dargestellt sind, liegt offen sichtlich ein homozygoter BB-Typ mit hohem Osteoporo serisiko vor, da keine Restriktionsfragmente bei 340 Basenpaaren und 140 Basenpaaren zu erkennen sind, sondern lediglich ungespaltene Bruchstücke bei 480 Basenpaaren.

Zum zweiten werden dieselben Proben mittels ABI-Frag mentanalyse ausgewertet. Für die ABI-Fragmentanalyse wurden dabei jeweils 1 µl des Reaktionsansatzes ver wendet. Diese ist in Fig. 2 dargestellt. Dabei zei gen die Fig. 2A, 2B und 2C das Analyseergebnis der Proben, die vor dem Restriktionsverdau analysiert wurden. Die Fig. 2E, 2F und 2G zeigen die Ergeb nisse nach dem Restriktionsverdau der entsprechenden Probanden. Die Fig. 2D und 2H sind Kontrollmessun gen, bei denen lediglich H₂O als Probe eingesetzt wurde. Es ist klar zu erkennen, daß alle drei Proban den vor dem Restriktionsverdau mit 12, 12' bezeichne te Fragmente von etwa 480 Basenpaaren Länge aufwei sen.

Grund für das Auftreten zweier Banden 12, 12' bei ca. 480 bp ist, daß das Wanderungsverhalten der beiden Einzelstränge der amplifizierten DNS aufgrund der se quenzbedingten Faltung bzw. Konformation geringfügig unterschiedlich ist.

Die Fig. 2E bis 2G zeigen die Analyseergebnisse nach dem Restriktionsverdau. In Fig. 2E ist zu erkennen, daß dieser Proband lediglich Restriktionsfragmente 10 und 11 aufweist, also der bB-Typ mit geringem Osteo poroserisiko vorliegt. In Fig. 2F ist zu erkennen, daß bei dieser Probe nicht nur Restriktionsfragmente mit 140 bp und 340 bp Länge, mit 10 und 11 bezeich net, auftreten, sondern auch ein ungeschnittenes Fragment bei 480 bp (Bezugszeichen 12, 12').

Es liegt folglich der bD-Genotyp vor. In Fig. 2G ist zu erkennen, daß bei dieser Probe ausschließlich un geschnittene Fragmente 12, 12' bei 480 bp vorliegen, folglich der BB-Genotyp mit hohem Osteoporoserisiko gegeben ist.

Die Fig. 3 und 4 zeigen weitere Beispiele für ein wie oben durchgeführtes Analyseverfahren, wobei auch hier die entsprechenden Kits zum Einsatz kamen. In Fig. 3 ist in Spur 1 eine H₂O-Kontrolle aufgetragen, während ersichtlich in Spur 2, 3 bzw. 4 jeweils eine Probe mit den Genotypen bb, bB bzw. BB vorliegt. Spur 5 zeigt wiederum eine 100 bp-Leiter. Fig. 4 zeigt dieselben Proben, jedoch nach Auswertung durch ABI- Fragmentanalyse bereits mit Mva1269I restriktionsver dauter Proben. Es ist zu erkennen, daß es sich in Fig. 4A um eine Probe eines heterozygoten bB-Typs han delt. In Fig. 4B handelt es sich um die Probe eines homozygoten bb-Types und in Fig. 4C um die Probe ei nes homozygoten BB-Types. Fig. 4D zeigt wiederum die Kontrollprobe, die lediglich H₂O enthielt. Die Ergeb nisse, die durch Gelelektrophorese erhalten werden, entsprechen also vollständig denjenigen Ergebnissen, die durch ABI-Fragmentanalyse erhalten werden.

Als weiteres Nachweisverfahren wurde eine VDR-Geno typisierung mittels eines direkten Echtzeit PCR- Nachweises durchgeführt.

Da sich die beiden VDR-Allele "b" und "B" lediglich in einem einzelnen Nukleotid unterscheiden ergibt sich neben der "klassischen" PCR-RFLP-Analytik eine weitere moderne Methodik zur VDR-Genotypisierung. Un ter Verwendung der sog. LightCycler™-Technologie (Idaho Technologies Inc., Idaho) erfolgt dabei der direkte Nachweis der einzelnen VDR-Allele über eine "Echtzeit"-PCR, so daß auf eine nachfolgende Re striktionsspaltung verzichtet werden kann. Zudem kann der Zeitbedarf der PCR-Reaktion durch die innovative Technik des LightCyclers™ drastisch reduziert werden (ca. 30 Minuten im LightCycler™ im Vergleich zu 180 Minuten in herkömmlichen Blockcyclern).

Im Unterschied zum herkömmlichen PCR-Ansatz im Block- Cycler werden neben den "forward" (POSTLC01f) und "reverse" (POSTLC01r) PCR-Primern zwei weitere Oligo nukleotide im Reaktionsansatz verwendet, die als sog. "mutatuion probe" (POSTLChyb 01) und "anchor probe" (POSTLCanch01) bezeichnet werden. Die "mutation pro be" umspannt den variablen bzw. polymorphen VDR-DNA- Bereich, entspricht in ihrer DNA-Sequenz jedoch nur dem "B"-Allel. Die "anchor probe" ist 5 bp "stromab wärts" der "mutation probe" lokalisiert. Die beiden Oligonukleotide sind mit Fluorochromen markiert, die "mutation probe" an ihrem 3'-Ende mit 3'-Fluroescein (3FAM) und die "anchor probe" an ihrem 5'-Ende mit 5'-LightCycler Red 640™. Im Verlauf der LightCycler- PCR-Reaktion werden mittels der "forward"- und "re verse"-Primer Amplifikate von 480 bp erzeugt, die die variablen Genbereiche der VDR-Allele beinhalten. Nach Beendigung des letzten PCR-Zyklus wird dann eine sog. Schmelzkurven-Analyse durchgeführt. Dafür werden zu nächst die erzeugten PCR-Produkte bei 95°C denatu iert. Im Anschluß erfolgt durch eine Temperaturer niedrigung auf 40°C die Hybridisierung der "mutation probe" und der "anchor probe" an die erzeugte 480 bp- Einzelstrang-DNS. Durch die unmittelbare Nachbar schaft der beiden Oligonukleotide auf der VDR-Einzel strang-DNA kann nun der Vorgang des sog. "Fluores cence Resonance Energy Transfer" ablaufen. Dabei wird zunächst der 3'-Fluorescein-Farbstoff der "mutation probe" durch das Gerät angeregt. Durch die vom 3'- Fluorescein emittierte Strahlung kommt es dann zur Anregung des 5'-LightCycler Red-Farbstoffs der "an chor probe" und in der Folge zur Emission einer roten Fluoreszenz, die durch einen Detektor im Gerät gemes sen wird (FRET-Effekt). Bei einer Temperatur von 40°C kann die "mutation probe" sowohl an "b"- als auch an "B"-DNA-Amplifikate hybridisieren, doch die Basenfehlpaarung im Falle des "b"-Allels führt zu ei ner Destabilisierung des entsprechenden DNA-Hybrids im Vergleich zur "B"-Allel-Hybridisierung. Dieser Ef fekt äußert sich im weiteren Verlauf der Schmelzkurven-Analyse, wo eine kontinuierliche Erhöhung der Temperatur von 45°C auf 95°C in 0,2°C-Schritten erfolgt. Nach jeder Temperaturerhöhung wird die ver bliebene Fluoreszenz-Emission gemessen. Während die "mutation probe" im Falle des b-Allels bereits bei etwa 54°C vom erzeugten VDR-Einzelstrang-Amplifikat abfällt bzw. "abschmilzt" ist dieser Effekt beim "B"- Allel erst ab ca. 62°C zu beobachten. Ein Abfal len/Abschmelzen der "mutation probe" ist mit dem Auf heben des FRET-Effekts verbunden, so daß keinerlei Fluoreszenz mehr detektiert werden kann. Nach Ab schluß der Schmelzkurven-Analyse wird dessen Resultat graphisch dargestellt (1. negative Ableitung der Fluoreszenz in Abhängigkeit der Temperatur). Dabei ergibt sich beim Genotyp "bb" lediglich ein Fluores zenz-Peak bei 54°C, während die "BB"-Anordnung nur zu einem entsprechenden Peak bei 62°C führt.

Für dieses Nachweisverfahren wurden nun die in der vorliegenden Tabelle 6 dargestellten Primer verwen det, wobei die ersten beiden Primer zur Amplifikation des gewünschten DNA-Abschnittes mit der Punktmutation verwendet wurden, während die beiden Primer POSTLChyb01 und POSTLCanch01 als Hybridisierungspro ben verwendet wurden.

Tabelle 6

Die PCR wurde dabei, wie bereits oben dargestellt, nun jedoch mit den folgenden in Tabelle 7 dargestell ten Parametern durchgeführt.

Tabelle 7

Sämtliche PCR-Reaktionen wurden auf einem LightCy cler™-Gerät der Firma Roche Molecular Biochemical mit einem Reaktionsansatz von 20 µl, wie in Tabelle 8 dargestellt, durchgeführt.

Tabelle 8

Als PCR-Template wurde zunächst Kontrollblut von 2 Probanden verwendet, aus denen die genomische DNS wie oben beschrieben extrahiert wurde. Fig. 5 zeigt nun die Schmelzkurven in erster Ableitung für die beiden Probanden. Es ist zu erkennen, daß bei Kurve 1 in Fig. 5 die erste negative Ableitung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur lediglich bei ca. 54 °C ein Maximum aufweist. Es handelt sich hier also um eine Probe mit dem homozygoten bb-Typ. Kurve 2 in Fig. 5 zeigt die erste negative Ableitung der Fluores zenz in Abhängigkeit von der Temperatur für einen weiteren Probanden. In diesem Falle zeigen sich zwei Maxima bei ca. 54°C und 62°C. Dies weist darauf hin, daß die Probe dieses Probanden vom heterozygoten bB-Genotyp ist.

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß durch das erfindungsgemäße Kit und seine Inhaltstoffe sowie durch das mittels dem Kit erfindungsgemäß durchführ bare Verfahren und die erfindungsgemäßen Array ein molekularbiologisches Testverfahren entwickelt wurde, mit dem eine Früherkennung des genetisch bedingten Osteoporoserisikos möglich ist und demzufolge eine entsprechender Lebenswandel vorzeitig eingeschlagen werden kann. Als Ausgangsmaterial für dieses Diagno severfahren können verschiedenste Körpergewebe, ins besondere auch peripheres Blut dienen, aus dem das Erbmaterial isoliert und anschließend gezielt die ge netische Prädisposition der jeweiligen Person erfaßt wird.

Claims

1. Kit zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose eines Menschen mit
mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer), wobei die beiden Oligonukleotide ei nes Paares als Primer zur Amplifikation mittels Poly merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komple mentären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes des menschlichen Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor (VDR) geeignet sind, und
wobei der gesuchte DNS-Abschnitt das Nukleotid 650 des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor umfaßt.

2. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der gesuchte DNS-Abschnitt in ei ner Allelform des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease Mva1269I enthält.

3. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eines der beiden folgenden Paare Oligonukleotide mit den folgenden Se quenzen aufweist:
AGGAGCCCATCTCCATTCCTTGAGCCTCCA und
TGGTTTGCAGAGCCCCTGTGGTGTGTGGAC
bzw.
CTTGAGCCTCCAGTCCAGGAA und
TACTTTGCTGGTTTGCAGAGC.

4. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der beiden Oligo nukleotide mit einem Fluorophor markiert ist.

5. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Paar Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält:
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' und
5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3'.

6. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide mit den Sequenzen
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' und
5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3'
mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, zwi schen denen resonanter Fluoreszenzenergietransfer möglich ist.

7. Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' an seinem 3'-Ende mit 3'- Fluoreszein (3FAM) und
das Oligonukleotid mit der Sequenz
5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3'
an seinem 5'-Ende mit 5'-LightCycler Red 640 (5'-LC Red 640) markiert ist.

8. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die Restriktionsendonuklease Mva1269I enthält.

9. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Po lymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen ent hält.

10. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Po lymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid- Triphosphate, sowie eine hitzestabile Polymerase ent hält.

11. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq- Polymerase) enthält.

12. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS- Probe mit dem gesuchten DNS-Abschnitt enthält.

13. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion, eine An leitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse ent hält.

14. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchfüh rung eines Restriktionsverdaus mit anschließender Gelelektrophorese enthält.

15. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.

16. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Mikroarray eine Anzahl Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem der Al lele des gesuchten DNS-Abschnitts hybridisiert.

17. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zel le des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid ange ordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids unter scheidet.

18. Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen Allelen des gesuchten DNS- Abschnitts hybridisieren.

19. Mikroarray, beispielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren voneinander getrennten Zellen (Feldern), dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt des mensch lichen Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor hybridisiert, wobei der DNS-Abschnitt das Nukleotid 650 des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor umfaßt.

20. Mikroarray nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der gesuchte DNS-Abschnitt in ei ner Allelform des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease Mva1269I enthält.

21. Mikroarray nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle ein weiteres Oligonukleotid an geordnet ist, wobei die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids un terscheidet.

22. Mikroarray nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen Allelen des gesuchten DNS-Abschnitts hybridisieren.

23. Verfahren zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose eines Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleotid 650 des Gens für den Vitamin-D3- Rezeptor erfaßt wird.

24. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein oder Fehlen ei ner Erkennungssequenz für das Enzym Mva1269I in zu mindest einem der Gene für den Vitamin-D3-Rezeptor erfaßt wird.

25. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Prädispo sition für Osteoporose in zunehmender Reihenfolge
bb < bB < BB
bestimmt wird, wobei b für ein Gen des Vitamin-D3- Rezeptors mit einer Mva1269I-Erkennungssequenz und B für ein Gen des Vitamin-D3-Rezeptors ohne Mva1269I- Erkennungssequenz steht.

26. Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, daß der DNS-Abschnitt des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor, der möglicher weise die Mva1269I-Erkennungssequenz enthält, durch Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.

27. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerasekettenreaktion mit mindestens einem der beiden folgenden Paare Oligonu kleotide durchgeführt wird, die die folgenden Sequen zen aufweisen:
AGGAGCCCATCTCCATTCCTTGAGCCTCCA und
TGGTTTGCAGAGCCCCTGTGGTGTGTGGAC
bzw.
CTTGAGCCTCCAGTCCAGGAA und
TACTTTGCTGGTTTGCAGAGC.

28. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Paar Oli gonukleotide verwendet wird, bei dem eines oder beide der Oligonukleotide mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist bzw. sind.

29. Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, daß die vervielfältigte DNS durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten DNS-Bruchstücke die allelische Variabilität des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor er faßt wird.

30. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die vervielfältigte DNS mit der Restriktionsendonuklease Mva1269I verdaut wird.

31. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die durch den Verdau erzeugten DNS-Fragmente bezüglich ihrer Länge aufgetrennt werden.

32. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die durch den Verdau erzeugten DNS-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt werden.

33. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die von den aufgetrennten Fragmenten emittierte Fluoreszenzstrah lung erfaßt wird.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte DNS geschmolzen und mit zwei weiteren Oligonukleotiden hybridisiert wird, wobei beide weitere Oligonukleotide mit ver schiedenen Fluorophoren markiert sind und eines der weiteren Oligonukleotide (mutation probe) mit einem Sequenzabschnitt der einzelsträngigen amplifizierten DNS hybridisiert, der den für die allelische Variabi lität verantwortlichen polymorphen Bereich des Vit amin-D3-Rezeptors einschließt, und das andere weitere Oligonukleotid (anchor probe) derart benachbart zu dem ersten Oligonukleotid mit der DNS hybridisiert, daß zwischen den jeweiligen Fluorophoren benachbarter weiterer Oligonukleotide ein resonanter Fluoreszenz energietransfer möglich ist und anschließend die Temperatur der hybridisierten DNS bestimmt wird, bei der die Fluoreszenzemission der DNS abnimmt.

35. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Paar weiterer Oligonukleotide folgende Sequenzen enthält:
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' und
5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3'.

36. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Se quenz
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' an seinem 3'-Ende mit 3'- Fluoreszein (3FAM) und
das Oligonukleotid mit der Sequenz
5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3' an seinem 5'-Ende mit
5'-LightCycler Red 640 (5'-LC Red 640) markiert ist.

37. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß die zu amplifizierende DNS aus Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Körperflüssigkeiten wie Amnionflüssigkeit, kernhaltigen Blutzellen wie z. B. Lymphozyten, kultivierten Zellen, Körpergewebe oder forensisches Probematerial in herkömmlicher Wei se isoliert wird.