WO2002059358A2 - Kit, verfahren und mikroarray zur ermittlung der prädisposition für osteoporose - Google Patents

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WO2002059358A2
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Stefanie WASCHÜTZA
Cengiz Tamak
Lutz Wehmeier
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Adnagen Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • Kit Procedure and microarray to determine predisposition to osteoporosis
  • the present invention relates to a kit, a method and a microarray for determining the predisposition to osteoporosis in humans.
  • Osteoporosis is a widespread disease of bone, in which a 1 steady decrease in bone mass occurs. Around 20% of all women carry a high genetic risk of developing osteoporosis, 45% have an increased risk and around 5% of the male population are affected. Osteoporosis is actually a "childhood disease" because the risk of developing an osteoporosis is significantly increased, above all, by insufficiently promoting the build-up of bones in adolescence, for example due to improper nutrition.
  • the balance of a constant building and dismantling of Bone tissue is the prerequisite for a permanently healthy bone structure, whereby the balance is shifted in favor of the bone-building process up to around the age of 35.
  • the bone structure is mediated by specialized cells (osteoblasts) that form the basic bone substance. Minerals such as calcium phosphate are embedded in this basic bone substance.
  • osteoclasts bone degradation is mediated by another type of specialized cells (osteoclasts), which dissolve the basic bone substance with the help of certain enzymes and remove the stored minerals by acidifying the milieu. If the individual maximum bone mass is reached, the balance normally shifts slowly in the direction of the bone-degrading process. In the clinical picture of osteoporosis, this process of breaking down the bones begins prematurely and accelerates, whereby women after menopause are particularly affected.
  • the calcium balance in the healthy organism ie an almost constant calcium concentration in the blood, is controlled hormonally.
  • the parathyroid gland releases parathyroid hormone in response to a decrease in calcium in the bloodstream. This hormone then stimulates the formation of the vitamin D 3 hormone in the kidney.
  • the release of the vitamin D 3 hormone again increases the enteral and renal calcium absorption, whereby the calcium concentration in the blood plasma rises again to the necessary level and thus ultimately enables the synthesis of bone tissue.
  • VDR vitamin D 3 receptor
  • both human alleles of the VDR gene are in an osteoporotic condition. About 20% of all women carry this particularly high genetic risk of developing osteoporosis at an early age of 65.
  • both VDR alleles are in the best possible condition for optimal bone density (approx. 35% of the female population), while the constellation "Bb” is a mixed form with a moderate predisposition to osteoporosis. This genetic makeup is found in around 45% of the female population.
  • kit according to claim 1 the microarray according to claim 19 and the method according to claim 23.
  • Advantageous developments of the kit, microarrays and method according to the invention are given in the respective dependent claims.
  • a molecular biological test method which uses any human tissue, in particular peripheral blood, as the starting material.
  • the genetic material (DNA) is isolated from this and then examined whether the gene for the vitamin D 3 receptor (VDR) at position 650 has guanine or adenine or contains the recognition sequence of the restriction endonuclease Mval269I.
  • VDR vitamin D 3 receptor
  • the knowledge is used that the restriction endonuclease Mval269I has a recognition sequence over the polymorphic region in the case of the b allele of the VDR. In the case of the B allele, this restriction endonuclease has no recognition sequence and therefore cannot cut the VDR gene.
  • the polymorphism of a section of DNA is examined which contains the recognition sequence of the restriction endonuclease Mval269I in the b allele form of the VDR gene.
  • This can advantageously be done by amplifying the sought DNA section with the primer pairs shown in claim 2 by means of PCR and then analyzing this fected area is carried out.
  • a restriction fragment analysis is suitable, the amplified DNA sections advantageously being subjected to digestion with the restriction endonuclease Mval269I.
  • the fragment pattern can now be analyzed in a conventional manner by means of gel electrophoresis.
  • the oligo- or nucleotides used as primers can also be labeled with fluorophores, so that the bands formed at 140 bp, 340 bp or 480 bp on the gel can be easily detected with fluorescence excitation.
  • An analysis using ABI-Genetic Analyzer TM from Applied Biosystems or corresponding devices is also possible with such fluorescence-labeled primer pairs.
  • the LightCycler TM technology can also be used.
  • the single strands become after the amplification of the searched DNA section.
  • the amplified DNA separated from one another and hybridized with the oligonucleotides mentioned in claim 5.
  • These two oligonucleotides are fluorescence-labeled, as described in claim 6, and bind to the single-stranded DNA in close spatial proximity to one another. In this state, a resonant fluorescence energy transfer is possible between the fluorescence markers of the two oligonucleotides.
  • the 3FAM TM 3-fluorescein
  • 5-LightCycler Red 640 TM 5-LC Red 640 TM
  • the 3FAM TM are excited, the excitation energy of the 3-FAM TM being transferred to 5-LC Red 640 TM due to the fluorescence energy transfer and fluorescence of the dye 5-LC Red-640 TM being observable.
  • this DNA hybridized with the two fluorescence-labeled oligonucleotides is heated so that the oligonucleotides detach from the single-stranded DNA again at certain temperatures.
  • this DNA is heated so that the oligonucleotides detach from the single-stranded DNA again at certain temperatures.
  • one of the oligonucleotides binds less stably to the single-stranded DNA and consequently detaches from this DNA at a lower temperature. Based on the melting temperature that is observed, a statement can now be made as to which of the alleles or whether both alleles of the VDR gene are present in the sample.
  • the detection of the alleles of the VDR gene can also be carried out using the microarray according to the invention, e.g. of a DNA chip, with the individual cells of the chip having oligonucleotides that hybridize specifically with sought-after sections of the alleles to be detected.
  • the detection can take place directly without amplification or only after amplification of the DNA section sought. In the same way, the detection can be carried out without or only after restriction digestion of the DNA or an amplified DNA segment thereof in shorter DNA segments.
  • every laboratory doctor and every medical laboratory, as well as every scientific laboratory that carries out such tests is provided with all of the coordinated substances, if necessary in a single diagnostic kit, or that all preparatory work for the laboratories is omitted and simple and how the polymorphism can be determined.
  • the primer oligonucleotides or the oligonucleotides of the microarray have already been tested, so that the main work in the development of corresponding oligonucleotides is omitted.
  • a conventional thermal cycler PCR device
  • a device for ' separating the individual amplified DNA fragments for example a gel electrophoresis unit or a capillary electrophoresis device, or one LightCycler TM from Röche Molecular Biochemicals.
  • a conventional capillary electrophoresis device is marketed, for example, by Perkin Elmer Biosystems TM under the name "PE ABI Pris Genetic Analyzer 310" TM.
  • Appropriate thermal cyclers for amplification of the DNA are sold, for example, by Applied Biosystems TM under the name "GenAmp 2400" TM or "GenAmp9600" TM.
  • At least one of the oligonucleotides of a pair can be identified with a fluorophore.
  • FIG. 2 shows the detection of PCR products via ABI fragment analysis
  • FIG. 3 shows a further example for the detection of PCR products via gel electrophoretic separation
  • FIG. 4 shows another example for the detection of PCR products using ABI fragment analysis
  • a first kit enables the polymorphism of the VDR gene to be determined and, in addition to the basic substances for PCR, contains a pair of primers and the Mval269I restriction endonuclease in separate containers. It also contains a recombinant positive control of the desired section of the VDR gene.
  • DNA starting material is isolated using commercially available DNA isolation kits (QIAamp DNA-Blood Kit, Qiagen, Hilden).
  • Whole blood, blood plasma, blood serum, body fluids such as amniotic fluid, nucleated blood cells such as lymphocytes, cultured cells, tissue or forensic sample material can be used as starting material for the extraction of the genomic DNA.
  • the extracted DNA can then be used as Te te serve for the PCR reaction described below.
  • a blood sample from a total of three subjects was used.
  • the genomic DNA was extracted from this peripheral blood using the commercially available isolation kits mentioned.
  • This DNA serves as a template for a PCR reaction in which amplicons of 480 bp are generated which contain the variable gene region VDR alleles. Since the variable allele regions are also located within the recognition sequence of the restriction endonuclease Mval269I, both individual VDR alleles can be typed by a subsequent RFLP analysis. DNA digestion with the enzyme Mval269I leads to two fragments of approx. 140 bp and 340 bp in the case of the "b" allele. In contrast, the "B" allele is not fragmented by Mval269I due to the singular nucleotide exchange within the enzyme recognition site. As a result, depending on the individual VDR allele configuration, the fragment patterns shown in Table 1 can result:
  • the oligonucleotides shown in Table 2 below were used as primers, both primers being labeled with the fluorescent dye 5'-6-FAM.
  • the size of the DNA single strand amplified by these two primers is 480 base pairs.
  • the PCR reactions were carried out on a PCR block cycler PE 9700 TM from PE Applied Biosystems.
  • the reaction mixture shown in Table 4 was used as the reaction mixture with a 25 ⁇ l reaction volume.
  • the restriction mixture was incubated for 60 min at 37 ° C. and then analyzed using various methods.
  • agarose gel electrophoresis was carried out.
  • 15 ⁇ l of the respective reaction mixture were used per lane.
  • the documentation of the agarose gel electrophoresis is shown in FIG. 1.
  • lanes 2 and 11 each denote a 100 bp ladder and lanes 4, 5 and 6 the reaction batches of the three test persons mentioned immediately after carrying out PCR and before restriction cleavage.
  • Lanes 8, 9 and 10 show the corresponding samples here after restriction cleavage by Mval269l.
  • the test subject whose samples are shown in lanes 4 and 8, obviously contains two VDR genes, both of which contain the recognition sequence for the restriction endonuclease Mval269I. After the restriction digest in FIG. 8, only fragments with 140 base pairs and 340 base pairs can be seen. So there is genotypically the bb type with a low risk of osteoporosis. In the subject, whose samples are shown in lanes 5 and 9, after restriction digestion in lane 9 there are both bands at 140 base pairs and 340 base pairs and a band at 480 base pairs. It is genotypically a subject with two different alleles of the VDR gene (bB type).
  • FIG. 2E shows the analysis results after restriction digestion. It can be seen in FIG. 2E that this test subject has only restriction fragments 10 and 11, that is to say the bb type with a low risk of osteoporosis.
  • FIG. 2F it can be seen that not only restriction fragments with a length of 140 bp and 340 bp, designated as 10 and 11, occur in this sample, but also an uncut fragment at 480 bp (reference numerals 12, 12 ')
  • the bB genotype is therefore available. It can be seen in FIG. 2G that only uncut fragments 12, 12 'at 480 bp are present in this sample, and consequently the BB genotype with a high risk of osteoporosis is present.
  • FIGS. 3 and 4 show further examples of an analysis method carried out as above, the corresponding kits also being used here.
  • an H 2 0 control is plotted in lane 1, while one can be seen in lanes 2, 3 and 4, respectively - A sample with the genotypes bb, bB or BB is available.
  • Lane 5 again shows a 100 bp ladder.
  • Figure 4 shows the same samples, but after evaluation by ABI fragment analysis already with Mval269I restriction-digested samples. It can be seen that Figure 4A is a sample of a heterozygous bB type. In FIG. 4B it is a sample of a homozygous bb type and in FIG. 4C it is a sample of a homozygous BB type.
  • FIG. 4D again shows the control sample, which contained only H 2 0. The results obtained by gel electrophoresis thus fully correspond to those obtained by ABI fragment analysis.
  • VDR genotyping was carried out using direct real-time PCR detection.
  • VDR genotyping since the two VDR alleles "b" and “B” differ only in a single nucleotide, there is another modern method for VDR genotyping in addition to the "classic" PCR-RFLP analysis.
  • LightCycler TM technology Idaho Technologies Inc., Idaho
  • the individual VDR alleles are directly detected via a "real-time" PCR, so that a subsequent restriction cleavage can be dispensed with.
  • the time required for the PCR reaction can be drastically reduced using the innovative technology of the LightCycler TM (approx. 30 minutes in the LightCycler TM compared to 180 minutes in conventional block cyclers).
  • oligonucleotide In contrast to the conventional PCR approach in the block cycler, in addition to the "forward" (POSTLCOlf) and “reverse” (POSTLCOlr) PCR primers, two other oligonucleotides are used in the reaction batch, which are known as. "mutatuion probe” (POSTLChyb 01) and “anchor probe” (POSTLCanchOl).
  • the “mutation probe” spans the variable or polymorphic VDR-DNA region, but corresponds in its DNA sequence only to the "B” allele.
  • the “anchor probe” is located 5 bp "downstream" of the "mutation probe”.
  • the two oligonucleotides are labeled with fluorochromes, the "mutation probe” at their 3 'end with 3' -fluroescein (3FAM) and the “anchor probe” at their 5 'end with 5 « LightCycler Red 640 TM.
  • amplicons of 480 bp are generated using the "forward" and "reverse” primers, which contain the variable gene regions of the VDR alleles.
  • a so-called melting curve analysis is carried out. To do this, the generated PCR products are first denatured at 95 ° C.
  • the "mutation probe” and the “anchor probe” are then hybridized to the generated 480 bp single-stranded DNA by lowering the temperature to 40 ° C. Due to the immediate vicinity of the two oligonucleotides on the VDR single-stranded DNA, the process of "fluorescence resonance energy transfer” can now take place.
  • the 3'-fluorescein dye of the "mutation probe” is first excited by the device.
  • the primers shown in Table 6 were used for this detection method, the first two primers being used to amplify the desired DNA section with the point mutation, while the two primers POSTLChybOl and POSTLCanchOl were used as hybridization samples.
  • kit according to the invention and its ingredients, as well as the method according to the invention that can be carried out by means of the kit and the array according to the invention have been used to develop a molecular biological test method with which an early detection of the genetic risk of osteoporosis is possible and, accordingly, a corresponding lifestyle is adopted prematurely can.
  • body tissues in particular peripheral blood, can be used as the starting material for this diagnostic method, from which the genetic material is isolated and then the genetic predisposition of the person concerned is specifically determined.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Diagnose-Kit, ein Verfahren und ein Mikroarray zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose. Dieser Nachweis erfolgt über einen Nachweis der allelischen Variabilität des Vitamin-D3-Rezeptors (VDR) durch Amplifikation geeigneter Abschnitte des VDR-Gens und anschließendem Nachweis von deren Variabilität beispielsweise mittels Restriktionsverdau und anschließender Analyse der erzeugten DNS-Fragmente.

Description

Kit, Verfahren und Mikroarray zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Kit, ein Verfahren und ein Mikroarray zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose von Menschen.
Osteoporose ist eine weitverbreitete Knochenkrankheit, bei der eine1 stetige Abnahme der Knochenmasse stattfindet. Dabei tragen etwa 20 % aller Frauen ein hohes genetisches Risiko für eine Osteoporose-Erkran- kung, 45 % haben ein erhöhtes Risiko und etwa 5 % der männlichen Bevölkerung sind betroffen. Bei Osteoporose handelt es sich eigentlich um eine "Kinderkrankheit", denn das Risiko für eine Osteoporose- Erkrankung wird vor allem durch die ungenügende Förderung des Knochenaufbaus in der Jugend, verursacht z.B. durch falsche Ernährung, erheblich gesteigert.
Das Gleichgewicht eines ständigen Auf- und Abbaus von Knochengewebe ist die Voraussetzung für eine dauerhaft gesunde Knochenstruktur, wobei bis etwa zum 35. Lebensjahr die Bilanz zugunsten des knochenaufbauenden Prozesses verschoben ist. Der Knochenaufbau wird durch spezialisierte Zellen vermittelt (Osteobla- sten) , die die Knochengrundsubstanz bilden. In diese Knochengrundsubstanz werden Mineralien wie Calcium- phosphat eingelagert. Dagegen wird der Knochenabbau durch eine andere Sorte spezialisierter Zellen (Osteoklasten) vermittelt, die mit Hilfe bestimmter Enzyme die Knochengrundsubstanz auflösen und durch Ansäuerung des Milieus die eingelagerten Mineralien herauslösen. Wird die individuelle, maximale Knochenmasse erreicht, so verschiebt sich die Bilanz normalerweise langsam in Richtung des knochenabbauenden Prozesses. Beim Krankheitsbild der Osteoporose setzt dieser knochenabbauende Prozeß verfrüht und beschleunigt ein, wobei vor allem Frauen nach der Menopause betroffen sind.
Der Calciu -Haushalt im gesunden Organismus, d.h. eine nahezu konstante Calciumkonzentration im Blut, wird hormoneil gesteuert. Auf eine Erniedrigung des Calciumgehalts im Blutkreislauf wird mit der Ausschüttung des Parathormons durch die Nebenschilddrüse reagiert. Dieses Hormon stimuliert dann die Bildung des Vitamin-D3-Hormons in der Niere. Die Ausschüttung des Vitamin-D3-Hormons wiederu steigert die enterale und renale Calciu -Resorption, wodurch die Calciumkonzentration im Blutplasma wieder auf das notwendige Maß ansteigt und somit letztlich die Synthese von Knochengewebe möglich wird.
Die Wirkung des Vitamin-D3-Hormons auf die Calciumkonzentration bzw. den Knochenstoffwechsel wird über den Vitamin-D3~Rezeptor (VDR) vermittelt, so daß sich eine Veränderung dieses Rezeptors zwangsläufig auch auf den Knochenstoffwechsel auswirkt. Inzwischen konnte gezeigt werden, daß die genetische Konstellation des Vitamin D3-Rezeptors die Entwicklung der individuellen Knochenstruktur und damit die individuelle, genetisch-bedingte Osteoporose-Prädisposition in einem hohen Maß beeinflußt, wobei drei Risikogruppen unterschieden werden:
Bei einer Genausstattung "BB" liegen beide humanen Allele des VDR-Gens in einer Osteoporose-begünsti- genden Zustandsform vor. Etwa 20 % aller Frauen tragen dieses besonders hohe genetische Risiko, bereits früh im Alter von 65 Jahren an Osteoporose zu erkranken. Bei der Genausstattung "bb" liegen beide VDR- Allele in der bestmöglichen Zustandsform für eine optimale Knochendichte vor (ca. 35 % der weiblichen Bevölkerung) , während die Konstellation "Bb" eine Mischform mit mittlerer Osteoporose-Prädisposition einnimmt. Diese Genausstattung findet sich bei etwa 45 % der weiblichen Bevölkerung.
Die Sequenzanalyse der beiden VDR-Allele (Nature 367 ,(1994), Seite 284, WO 94/03633) erbrachte, daß sie sich lediglich an einer einzigen, definierten Position voneinander unterscheiden. Liegt das Gen in der B- Form vor, so ist das Nukleotid an Position 650 Guanin (G) , während es bei der b-Form ein Adenin (A) ist.
Herkömmliche Diagnostikverfahren, z.B. Knochendichte- Messungen zeigen den beginnenden und fortschreitenden Knochenabbau an, sind daher nur geeignete Methoden für Verlaufskontrollen. Die invasive Methode der Kno- chenbiopsie ist experimentell aufwendig und kann den zeitlichen Beginn der Krankheit nur unpräzise feststellen. Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein molekularbiologisches Testverfahren anzugeben, mit dem eine Früherkennung des genetisch bedingten Osteoporoserisikos auf einfache Art und Weise möglich ist.
Diese Aufgabe wird durch das Kit nach Anspruch 1, den Mikroarray nach Anspruch 19 sowie das Verfahren nach Anspruch 23 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Kits, Mikroarrays und Verfahrens werden in den jeweiligen abhängigen Ansprüchen gegeben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ein molekularbiologisches Testverfahren entwickelt, das als Ausgangsmaterial beliebige menschliche Gewebe, insbesondere peripheres Blut verwendet. Aus diesem wird das Erbmaterial (DNS) isoliert und anschließend untersucht, ob das Gen für den Vitamin D3-Rezeptor (VDR) an Position 650 Guanin oder Adenin aufweist bzw. die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease Mval269I enthält. Es wird also zu diagnostischen Zwecken die Erkenntnis genutzt, daß die Restriktionsendonuklease Mval269I im Falle des b-Allels des VDR eine Erkennungssequenz über den polymorphen Bereich besitzt. Im Falle des B-Allels besitzt diese Restriktionsendonuklease keine Erkennungssequenz und kann daher das VDR-Gen nicht schneiden. Letztlich wird also der Polymorphismus eines DNS-Abschnittes untersucht, der in der b-Allelform des VDR-Gens die Erken- nungssequenz der Restriktionsendonuklease Mval269I enthält. Dies kann vorteilhafterweise erfolgen, indem der gesuchte DNS-Abschnitt mit den in Patentanspruch 2 dargestellten Primerpaaren mittels PCR amplifiziert wird und anschließend eine Untersuchung dieses ampli- fizierten Bereiches durchgeführt wird. Hierzu eignet sich zum einen eine Restriktionsfragmentanalyse, wobei vorteilhafterweise die amplifizierten DNS-Abschnitte einem Verdau mit der Restriktionsendonuklease Mval269I unterworfen werden. Dies führt im Falle des b-Allels zu zwei Fragmenten von ca. 140 Basenpaaren und 340 Basenpaaren während im Falle des B- Allels das 480 Basenpaare große Amplifikat nicht fragmentiert wird.
Die Analyse des Fragmentmusters kann nun auf herkömmliche Weise mittels Gelelektrophorese erfolgen. Weiterhin können auch die als Primer verwendeten Oligo- , nukleotide mit Fluorophoren markiert sein, so daß auf dem Gel die entstehenden Banden bei 140 bp, 340 bp bzw. 480 bp leicht unter Fluoreszenzanregung erfaßt werden können. Auch eine Analyse mittels ABI-Genetic Analyzer™ der Firma Applied Biosystems oder entsprechenden Geräten ist mit derart fluoreszenzmarkierten Primerpaaren möglich.
Alternativ kann auch die LightCycler™-Technologie eingesetzt werden. Hierzu werden nach der Amplifika- tion des gesuchten DNS-Abschnittes die Einzelstränge . der amplifizierten DNS voneinander gelöst und mit den in Anspruch 5 genannten Oligonukleotiden hybridisiert. Diese beiden Oligonukleotide sind fluoreszenzmarkiert, wie in Anspruch 6 beschrieben, und binden in unmittelbar räumlicher Nähe zueinander an die ein- zelsträngige DNS. In diesem Zustand ist zwischen den Fluoreszenzmarkern der beiden Oligonukleotide ein re- sonanter Fluoreszenzenergietransfer möglich. Wird beispielsweise das eine Nukleotid mit dem Fluoreszenzfarbstoff 3FAM™ (3-Fluorescein) und das andere Nukleotid mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5-LightCycler Red 640™ (5-LC Red 640™) markiert, so kann das 3FAM™ angeregt werden, wobei aufgrund des Fluoreszenzenergietransfers die Anregungsenergie des 3-FAM™ auf 5- LC Red 640™ übertragen wird und Fluoreszenz des Farbstoffes 5-LC Red- 640™ beobachtbar ist.
Zur Analyse des Polymorphismus wird nun diese mit den beiden fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden hybridisierte DNS erwärmt, so daß sich die Oligonukleotide bei bestimmten Temperaturen wieder von der einzel- strängigen DNS lösen. Aufgrund der Punktmutation, die in der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Mval269I enthalten ist, bindet jedoch in einem Falle eines der Oligonukleotide weniger stabil an die einzelsträngige DNS und löst sich folglich bei niedrigerer Temperatur von dieser DNS. Aufgrund der Schmelztemperatur, die beobachtet wird, läßt sich nun eine Aussage treffen, welches der Allele bzw. ob beide Allele des VDR-Gens in der Probe vorhanden sind.
Die Erfassung der Allele des VDR-Gens kann auch mittels des erfindungsgemäßen Mikroarrays, z.B. eines DNA-Chips, erfolgen, wobei die einzelnen Zellen des Chips Oligonukleotide aufweisen, die spezifisch mit gesuchten Abschnitten der nachzuweisenden Allele hybridisieren. Zum Aufbau und dem Einsatz von DNS-Chips wird beispielhaft allgemein auf die EP 0 373 203 verwiesen. Der Nachweis kann dabei ohne Amplifikation direkt oder auch erst nach Amplifikation des gesuchten DNS-Abschnittes erfolgen. In gleicher Weise kann der Nachweis ohne oder erst nach Restriktionsverdau • der DNS bzw. eines amplifizierten DNS-Abschnittes hiervon in kürzere DNS-Abschnitte durchgeführt werden.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Diagnose-Kit, dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie- dem erfindungs- gemäßen Mikroarray ist es, daß jeder Laborarzt und jedes medizinische Labor sowie jedes wissenschaftliche Labor, das derartige Untersuchungen durchführt, sämtliche aufeinander abgestimmte Substanzen gegebenenfalls in einem einzigen Diagnose-Kit, zur Verfügung erhält bzw. daß jegliche Vorbereitungsarbeiten für die Labore entfallen und auf einfache Art und Weise der Polymorphismus bestimmt werden kann. Insbesondere sind die Primer-Oligonukleotide bzw. die Oligonukleotide des Mikroarrays bereits ausgetestet, so daß die Hauptarbeit bei der Entwicklung entsprechender Oligonukleotide entfällt.
Damit ist es erstmals möglich, die Bestimmung des Polymorphismus des VDR-Gens von einzelnen Patienten in großem Maßstabe und am jeweiligen Ort des Patienten auf einfache und kostengünstige Weise durchzuführen. Denn hierzu benötigt der einzelne Laborarzt bzw. das einzelne medizinische Labor lediglich noch einen erfindungsgemäßen Mikroarray, einen herkömmlichen Thermocycler (PCR-Gerät) , ein Gerät zur' Auftrennung der einzelnen amplifizierten DNS-Fragmente, beispielsweise eine Gelelektrophorese-Einheit oder ein Kapillarelektrophoresegerät, oder einen LightCycler™ der Fa. Röche Molecular Biochemicals sein. Ein herkömmliches Kapillarelektrophoresegerät wird beispielsweise von der Firma Perkin Eimer Biosystems™ unter dem Namen "PE ABI Pris Genetic Analyser 310"™ ertrieben. Entsprechende Thermocycler für die Amplification der DNS werden beispielsweise von der Firma Applied Biosystems™ unter dem Namen "GenAmp 2400"™ bzw. auch "Gen- Amp9600"™ vertrieben.
Zur leichteren Erfassung der amplifizierten DNS- Abschnitte kann jeweils mindestens eines der Oligonukleotide eines Paares mit einem Fluorophor gekenn- ö cn Ö "-3 < o cn t? ' 3 P Pϊ ö ! J £ s: rt Φ P tr M Ω « N cn N
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Es zeigen:
Figur 1 den Nachweis von PCR-Produkten über eine gelelektrophoretische Trennung;
Figur 2 den Nachweis von PCR-Produkten über ABI- Fragmentanalyse;
Figur 3 ein weiteres Beispiel für den Nachweis von PCR-Produkten über gelelektrophoretische Trennung;
Figur 4 ein weiteres Beispiel für den Nachweis von PCR-Produkten über ABI-Fragmentanalyse; und
Figur 5 den Nachweis eines Polymorphismus mittels LightCycler-Technologie .
Ein erster Kit ermöglicht die Bestimmung des Polymorphismus des VDR-Gens und enthält neben den Grundsubstanzen für eine PCR ein Primerpaar sowie die Restriktionsendonuklease Mval269I in getrennten Behältnissen. Außerdem enthält es eine rekombinante Positivkontrolle des gesuchten Abschnittes des VDR-Gens. Mit diesem Kit wird nun das Verfahren folgendermaßen durchgeführt .
Zuerst wird DNA-Ausgangsmaterial über handelsübliche DNA-Isolierungskits (QIAamp DNA-Blood Kit, Qiagen, Hilden) isoliert. Als Ausgahgsmaterial für die Extraktion der genomischen DNA können u.a. Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Amnionflüssigkeit, kernhaltige Blutzellen wie beispielsweise Lymphozyten, kultivierte Zellen, Gewebe oder auch forensisches Probenmaterial verwendet werden. Die extrahierte DNA kann dann als Te pla- te für die im folgenden dargestellten Verfahren beschriebene PCR-Reaktion dienen.
In einem ersten Beispiel wurde zunächst eine Blutprobe von insgesamt drei Probanden verwendet. Es wurde aus diesem peripheren Blut über die genannten handelsüblichen Isolierungskits die genomische DNA ex- ' trahiert. Diese DNA dient dann als Template für eine PCR-Reaktion bei der Amplifikate von 480 bp erzeugt werden, die den variablen Genbereich VDR-Allele beinhalten. Da die variablen Allel-Bereiche zudem innerhalb der Erkennungssequenz der Restriktionsendo- nuclease Mval269I lokalisiert sind, können durch eine anschließende RFLP-Analyse beide individuellen VDR- Allele typisiert werden. Der DNA-Verdau mit dem Enzym Mval269I führt im Falle des "b"-Allels zu zwei Fragmenten von ca. 140 bp und 340 bp. Im Gegensatz dazu wird das "B"-Allel aufgrund des singulären Nukleotid- Austausches innerhalb der Enzym-Erkennungsstelle nicht von Mval269I fragmentiert. Demzufolge können sich in Abhängigkeit der individuellen VDR-Allelaus- stattung die in Tabelle 1 gezeigten Fragmentmuster ergeben:
Figure imgf000011_0001
Tabelle 1
Als Primer wurden die in der folgenden Tabelle 2 dargestellten Oligonukleotide verwendet, wobei beide Primer mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5'-6-FAM markiert waren. Die Größe des durch diese beiden Primer amplifizierten DNS-Einzelstranges beträgt 480 Basenpaare.
Figure imgf000012_0001
Tabelle 2
Mit diesen Primern wurde eine Polymerasekettenreakti- on durchgeführt mit den in der folgenden Tabelle 3 dargestellten Parametern.
Figure imgf000012_0002
Tabelle 3
Die PCR-Reaktionen wurden dabei auf einem PCR- Blockcycler PE 9700™ der Firma PE Applied Biosystems durchgeführt. Als Reaktionsansatz mit 25 μl Reaktionsvolumen wurde der in Tabelle 4 dargestellte Reaktionsansatz verwendet.
Figure imgf000012_0003
Tabelle 4 Taq-Puffer bezeichnet dabei einen Taq DNA Polymerase Storage Buffer (Taq-Buffer B) , der in wäßriger Lösung enthält: Tris-HCl 20 mM (pH=8,0 bei 25 °C) , KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Glycerol 50 % (v/v), Tween20 0,5 % (v/v), Nonidet-P40 0,5 % (v/v) und beispielsweise von Promega Corp. (Cat.-No: M166B) vertrieben wird.
Mit den so erzeugten amplifizierten DNS-Abschnitten wurde eine RFLP-Analyse durchgeführt. Hierzu wurden die Amplifikate mit dem Restriktionsenzym Mval269I in den bereits verwendeten PCR-Reaktionsgefäßen und PCR- Geräten inkubiert. Hierzu wurde ein Reaktionsansatz von 30 μl Volumen gemäß der nachfolgenden Tabelle 5 verwendet .
Figure imgf000013_0001
Tabelle 5
Der Restriktiohsansatz wurde für 60 min bei 37 °C inkubiert und anschließend über verschiedene Verfahren analysiert.
Zum einen wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Für die Agarose-Gelelektrophorese wurden pro Spur 15 μl des jeweiligen Reaktionsansatzes verwendet. Die Dokumentation der Agarose-Gelelektrophorese ist in Figur 1 dargestellt. In Figur 1 bezeichnen die Spuren 2 und 11 jeweils eine 100-bp-Leiter und die Spuren 4, 5 und 6 die Reaktionsansätze der oben genannten drei Probanden unmittelbar nach Durchführen der PCR und vor der Restriktionsspaltung. Die Spuren 8, 9 und 10 zeigen die entsprechenden Proben jedoch hier nach Restriktionsspaltung durch Mval269l.
Bei sämtlichen Proben in Spuren 4 bis 6 findet sich lediglich das amplifizierte Fragment mit einer Länge von 480 bp.
Es ist unmittelbar zu erkennen, daß der Proband, dessen Proben in den Spuren 4 und 8 dargestellt sind, offensichtlich zwei VDR-Gene enthält, die beide die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Mval269I enthalten. Es sind daher nach dem Restrikti- onsverdau in Figur 8 lediglich noch Fragmente mit 140 Basenpaaren und 340 Basenpaaren zu erkennen. Es liegt also genotypisch der bb-Typ mit geringem Osteoporose- risiko vor. Bei dem Probanden, dessen Proben in den Spuren 5 und 9 dargestellt sind, liegen nach Restrik- tionsverdau in Spur 9 sowohl Banden bei 140 Basenpaaren und 340 Basenpaaren vor als auch eine Bande bei 480 Basenpaaren. Es handelt sich also genotypisch um einen Probanden mit zwei verschiedenen Allelen des VDR-Gens (bB-Typ) . Bei dem Probanden, dessen Proben in den Spuren 6 und 10 dargestellt sind, liegt offensichtlich ein homozygoter BB-Typ mit hohem Osteoporo- serisiko vor, da keine Restriktionsfragmente bei 340 Basenpaaren und 140 Basenpaaren zu erkennen sind, sondern lediglich ungespaltene Bruchstücke bei 480 Basenpaaren.
Zum zweiten werden dieselben Proben mittels ABI-Frag- mentanalyse ausgewertet. Für die ABI-Fragmentanalyse wurden dabei jeweils 1 μl des Reaktionsansatzes verwendet. Diese ist in Figur 2 dargestellt. Dabei zeigen die Figuren 2A, 2B und 2C das Analyseergebnis der Proben, die vor dem Restriktionsverdau analysiert wurden. Die Figuren 2E, 2F und 2G zeigen die Ergebnisse nach dem Restriktionsverdau der entsprechenden Probanden. Die Figuren 2D und 2H sind Kontrollmessungen, bei denen lediglich H20 als Probe eingesetzt wurde. Es ist klar zu erkennen, daß alle drei Probanden vor dem Restriktionsverdau mit 12, 12' bezeichnete Fragmente von etwa 480 Basenpaaren Länge aufweisen.
Grund für das Auftreten zweier Banden 12, 12' bei ca. 480 bp ist, daß das Wanderungsverhalten der beiden Einzelstränge der amplifizierten DNS aufgrund der sequenzbedingten Faltung bzw. Konformation geringfügig unterschiedlich ist.
Die Fign. 2E bis 2G zeigen die Analyseergebnisse nach dem Restriktionsverdau. In Figur 2E ist zu erkennen, daß dieser Proband lediglich Restriktionsfragmente 10 und 11 aufweist, also der bb-Typ mit geringem Osteo- poroserisiko vorliegt. In Figur 2F ist zu erkennen, daß bei dieser Probe nicht nur Restriktionsfragmente mit 140 bp und 340 bp Länge, mit 10 und 11 bezeichnet, auftreten, sondern auch ein ungeschnittenes Fragment bei 480 bp (Bezugszeichen 12, 12') ■
Es liegt folglich der bB-Genotyp vor. In Figur 2G ist zu erkennen, daß bei dieser Probe ausschließlich ungeschnittene Fragmente 12, 12' bei 480 bp vorliegen, folglich der BB-Genotyp mit hohem Osteoporoserisiko gegeben ist.
Die Figuren 3 und 4 zeigen weitere Beispiele für ein wie oben durchgeführtes Analyseverfahren, wobei auch hier die entsprechenden Kits zum Einsatz kamen. In Figur 3 ist in Spur 1 eine H20-Kontrolle aufgetragen, während ersichtlich in Spur 2, 3 bzw. 4 jeweils eine - Probe mit den Genotypen bb, bB bzw. BB vorliegt. Spur 5 zeigt wiederum eine 100 bp-Leiter. Figur 4 zeigt dieselben Proben, jedoch nach Auswertung durch ABI- Fragmentanalyse bereits mit Mval269I restriktionsver- dauter Proben. Es ist zu erkennen, daß es sich in Figur 4A um eine Probe eines heterozygoten bB-Typs handelt. In Figur 4B handelt es sich um die Probe eines homozygoten bb-Types und in Figur 4C um die Probe eines homozygoten BB-Types. Figur 4D zeigt wiederum die Kontrollprobe, die lediglich H20 enthielt. Die Ergebnisse, die durch Gelelektrophorese erhalten werden, entsprechen also vollständig denjenigen Ergebnissen, die durch ABI-Fragmentanalyse erhalten werden.
Als weiteres Nachweisverfahren wurde eine VDR-Geno- typisierung mittels eines direkten Echtzeit PCR- Nachweises durchgeführt.
Da sich die beiden VDR-Allele "b" und "B" lediglich in einem einzelnen Nukleotid unterscheiden ergibt sich neben der "klassischen" PCR-RFLP-Analytik eine weitere moderne Methodik zur VDR-Genotypisierung. Unter Verwendung der sog. LightCycler™-Technologie (Idaho Technologies Inc., Idaho) erfolgt dabei der direkte Nachweis der einzelnen VDR-Allele über eine "Echtzeit"-PCR, so daß auf eine nachfolgende Restriktionsspaltung verzichtet werden kann. Zudem kann der Zeitbedarf der PCR-Reaktion durch die innovative Technik des LightCyclers™ drastisch reduziert werden (ca. 30 Minuten im LightCycler™ im Vergleich zu 180 Minuten in herkömmlichen Blockcyclern) .
Im Unterschied zum herkömmlichen PCR-Ansatz im Block- Cycler werden neben den "forward" (POSTLCOlf) und "reverse" (POSTLCOlr) PCR-Primern zwei weitere Oligonukleotide im Reaktionsansatz verwendet, die als sog. "mutatuion probe" (POSTLChyb 01) und "anchor probe" (POSTLCanchOl) bezeichnet werden. Die "mutation probe" umspannt den variablen bzw. polymorphen VDR-DNA- Bereich, entspricht in ihrer DNA-Sequenz jedoch nur dem "B"-Allel. Die "anchor probe" ist 5 bp "stromabwärts" der "mutation probe" lokalisiert. Die beiden Oligonukleotide sind mit Fluorochromen markiert, die "mutation probe" an ihrem 3 ' -Ende mit 3 ' -Fluroescein (3FAM) und die "anchor probe" an ihrem 5 ' -Ende mit 5«-LightCycler Red 640™. Im Verlauf der LightCycler- PCR-Reaktion werden mittels der "forward"- und "re- verse"-Primer Amplifikate von 480 bp erzeugt, die die variablen Genbereiche der VDR-Allele beinhalten. Nach Beendigung des letzten PCR-Zyklus wird dann eine sog. Schmelzkurven-Analyse durchgeführt. Dafür werden zunächst die erzeugten PCR-Produkte bei 95 °C denatu- iert. Im Anschluß erfolgt durch eine Temperaturerniedrigung auf 40 °C die Hybridisierung der "mutation probe" und der "anchor probe" an die erzeugte 480 bp- Einzelstrang-DNS . Durch die unmittelbare Nachbarschaft der beiden Oligonukleotide auf der VDR-Einzel- strang-DNA kann nun der Vorgang des sog. "Fluores- cence Resonance Energy Transfer" ablaufen. Dabei wird zunächst der 3'-Fluorescein-Farbstoff der "mutation probe" durch das Gerät angeregt. Durch die vom 3'- Fluorescein emittierte Strahlung kommt es dann zur Anregung des 5' -LightCycler Red-Farbstoffs der "anchor probe" und in der Folge zur Emission einer roten Fluoreszenz, die durch einen Detektor im Gerät gemessen wird (FRET-Effekt) . Bei einer Temperatur von 40 °C kann die "mutation probe" sowohl an "b"- als auch an "B"-DNA-Amplifikate hybridisieren, doch die Basenfehlpaarung im Falle des "b"-Allels führt zu einer Destabilisierung des entsprechenden DNA-Hybrids im Vergleich zur "B"-Allel-Hybridisierung. Dieser Effekt äußert sich im weiteren Verlauf der Schmelzkur- ven-Analyse, wo eine kontinuierliche Erhöhung der Temperatur von 45 °C auf 95 °C in 0,2 °C-Schritten erfolgt. Nach jeder Temperaturerhöhung wird die verbliebene Fluoreszenz-Emission gemessen. Während die "mutation probe" im Falle des b-Allels bereits bei etwa 54 °C vom erzeugten VDR-Einzelstrang-Amplifikat abfällt bzw. "abschmilzt" ist dieser Effekt beim "B"- Allel erst ab ca. 62 °C zu beobachten. Ein Abfallen/Abschmelzen der "mutation probe" ist mit dem Aufheben des FRET-Effekts verbunden, so daß keinerlei Fluoreszenz mehr detektiert werden kann. Nach Abschluß der Schmelzkurven-Analyse wird dessen Resultat graphisch dargestellt (1. negative Ableitung der Fluoreszenz in Abhängigkeit der Temperatur) . Dabei ergibt sich beim Genotyp "bb" lediglich ein Fluores- zenz-Peak bei 54 °C, während die "BB"-Anordnung nur zu einem entsprechenden Peak bei 62 °C führt.
Für dieses Nachweisverfahren wurden nun die in der vorliegenden Tabelle 6 dargestellten Primer verwendet, wobei die ersten beiden Primer zur Amplifikation des gewünschten DNA-Abschnittes mit der Punktmutation verwendet wurden, während die beiden Primer POSTLChybOl und POSTLCanchOl als Hybridisierungspro- ben verwendet wurden.
Figure imgf000018_0001
Tabelle 6 Die PCR wurde dabei, wie bereits oben dargestellt, nun jedoch mit den folgenden in Tabelle 7 dargestellten Parametern durchgeführt.
Figure imgf000019_0001
Tabelle 7
Sämtliche PCR-Reaktionen wurden auf einem LightCy- cler™-Gerät der Firma Röche Molecular Biochemical mit einem Reaktionsansatz von 20 μl, wie in Tabelle dargestellt, durchgeführt.
Figure imgf000019_0002
Tabelle 8 Als PCR-Te plate wurde zunächst Kontrollblut von 2 Probanden verwendet, aus denen die genomische DNS wie oben beschrieben extrahiert wurde. Figur 5 zeigt nun die Schmelzkurven in erster Ableitung für die beiden Probanden. Es ist zu erkennen, daß bei Kurve 1 in Figur 5 die erste negative Ableitung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur lediglich bei ca. 54 °C ein Maximum aufweist. Es handelt sich hier also um eine Probe mit dem homozygoten bb-Typ. Kurve 2 in Figur 5 zeigt die erste negative Ableitung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Temperatur für einen weiteren Probanden. In diesem Falle zeigen sich zwei Maxima bei ca. 54 °C und 62 °C. Dies weist darauf hin, daß die Probe dieses Probanden vom heterozygoten bB-Genotyp ist.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß durch das erfindungsgemäße Kit und seine Inhaltstoffe sowie durch das mittels dem Kit erfindungsgemäß durchführbare Verfahren und die erfindungsgemäßen Array ein molekularbiologisches Testverfahren entwickelt wurde, mit dem eine Früherkennung des genetisch bedingten Osteoporoserisikos möglich ist und demzufolge eine entsprechender Lebenswandel vorzeitig eingeschlagen werden kann. Als Ausgangsmaterial für dieses Diagnoseverfahren -können verschiedenste Körpergewebe, insbesondere auch peripheres Blut dienen, aus dem das Erbmaterial isoliert und anschließend gezielt die genetische Prädisposition der jeweiligen Person erfaßt wird.
-[Klicken und ext oingobon-j-

Claims

Patentansprüche
Kit zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose eines Menschen mit mindestens einem Paar Oligonukleotide (Reverseprimer, Forwardprimer) , wobei die beiden Oligonukleotide eines Paares als Primer zur Amplifikation mittels Poly- merasekettenreaktion jeweils eines der beiden komplementären Stränge eines gesuchten DNS-Abschnittes des menschlichen Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor (VDR) geeignet sind, und wobei der gesuchte DNS-Abschnitt das Nukleotid 650 des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor umfaßt.
Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der gesuchte DNS-Abschnitt in einer Allelform des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease Mval269I enthält.
Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eines der beiden folgenden Paare Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen aufweist:
AGGAGCCCATCTCCATTCCTTGAGCCTCCA und TGGTTTGCAGAGCCCCTGTGGTGTGTGGAC bzw.
CTTGAGCCTCCAGTCCAGGAA und TACTTTGCTGGTTTGCAGAGC .
4. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der beiden Oligonukleotide mit einem Fluorophor markiert ist.
5. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Paar Oligonukleotide mit den folgenden Sequenzen enthält: S'-GGCCTGCACATTCCCAATA-S1 und 5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3' .
6. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Oligonukleotide mit den Sequenzen
5?-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' und 5 ' -AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3 ' mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind, zwischen denen resonanter Fluoreszenzenergietransfer möglich ist.
7. Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' an seinem 3 ' -Ende mit 3'-
Fluoreszein (3FAM) und das Oligonukleotid mit der Sequenz
5 ' -AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3 ' an seinem 5" -Ende mit 5'-LightCycler Red 640 (5'-LC
Red 640) markiert ist.
8. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die Restriktionsendonuklease Mval269I enthält.
9. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die zur Durchführung einer Po- lymerasekettenreaktion erforderlichen Substanzen enthält.
10. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als zur Durchführung einer Po- lymerasekettenreaktion erforderliche Substanzen eine Pufferlösung, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotid- Triphosphate, sowie eine hitzestabile Polymerase enthält.
11. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß es als hitzestabile Polymerase eine Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq- Polymerase) enthält.
12. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als Positivkontrolle eine DNS- Probe mit dem gesuchten DNS-Abschnitt enthält.
13. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin eine Anleitung zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion, eine Anleitung zur Durchführung einer Fragmentanalyse enthält.
14. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Anleitung zur Durchführung eines Restriktionsverdaus mit anschließender Gelelektrophorese enthält.
15. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Schema zur Auswertung der erhaltenen Meßergebnisse enthält.
16. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Mikroarray (DNS-Chip) enthält, wobei der Mikroarray eine Anzahl Zellen (Felder) aufweist und in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid angeordnet ist, das mit einem der Allele des gesuchten DNS-AbSchnitts hybridisiert.
17. Kit nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle des Mikroarrays ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist und die Sequenz des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids unterscheidet.
18. Kit nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen Allelen des gesuchten DNS- Abschnitts hybridisieren.
19. Mikroarray, beispielsweise DNS-Chip, mit einer Anordnung von mehreren voneinander getrennten Zellen
(Feldern) , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß in mindestens einer Zelle ein Oligonukleotid an- geordnet ist, das mit einem DNS-Abschnitt des menschlichen Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor hybridisiert, wobei der DNS-Abschnitt das Nukleotid 650 des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor umfaßt.
20. Mikroarray nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der gesuchte DNS-Abschnitt in einer Allelform des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease Mval269I enthält.
21. Mikroarray nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens einer weiteren Zelle ein weiteres Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die Sequenz -des Oligonukleotids, das in der mindestens einen Zelle angeordnet ist, sich von der Sequenz des weiteren Oligonukleotids unterscheidet.
22. Mikroarray nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in mindestens zwei Zellen jeweils ein Oligonukleotid angeordnet ist, wobei die in verschiedenen Zellen angeordneten Oligonukleotide jeweils mit verschiedenen Allelen des gesuchten DNS-Abschnitts hybridisieren.
23. Verfahren zur Ermittlung der Prädisposition für Osteoporose eines Menschen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß das Nukleotid 650 des Gens für den Vitamin-D3-
Rezeptor erfaßt wird.
24. • Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein oder Fehlen einer Erkennungssequenz für das Enzym Mval269I in zumindest einem der Gene für den Vitamin-D3-Rezeptor erfaßt wird.
25. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Prädisposition für Osteoporose in zunehmender Reihenfolge bb < bB < BB bestimmt wird, wobei b für ein Gen des Vitamin-D3- Rezeptors mit einer Mval269I-Erkennungssequenz und B für ein Gen des Vitamin-D3-Rezeptors ohne Mval269I- Erkennungssequenz steht.
26. Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der DNS-Abschnitt des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor, der möglicherweise die Mval269I-Erkennungssequenz enthält, durch Polymerasekettenreaktion vervielfältigt wird.
27. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerasekettenreaktion mit mindestens einem der beiden folgenden Paare Oligonukleotide durchgeführt wird, die die folgenden Sequenzen aufweisen:
AGGAGCCCATCTCCATTCCTTGAGCCTCCA und TGGTTTGCAGAGCCCCTGTGGTGTGTGGAC bzw. CTTGAGCCTCCAGTCCAGGAA und TACTTTGCTGGTTTGCAGAGC .
28. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Paar Oligonukleotide verwendet wird, bei dem eines oder beide der Oligonukleotide mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist bzw. sind.
29. Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die vervielfältigte DNS durch geeignete Restriktionsenzyme verdaut und anhand der erzeugten DNS-Bruchstücke die allelische Variabilität des Gens für den Vitamin-D3-Rezeptor erfaßt wird.
30. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die vervielfältigte DNS mit der Restriktionsendonuklease Mval269I verdaut wird.
31. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die durch den Verdau erzeugten DNS-Fragmente bezüglich ihrer Länge aufgetrennt werden.
32. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die durch den Verdau erzeugten DNS-Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt werden.
33. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die von den aufgetrennten Fragmenten emittierte Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte DNS geschmolzen und mit zwei weiteren Oligonukleotiden hybridisiert wird, wobei beide weitere Oligonukleotide mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind und eines der weiteren Oligonukleotide (mutation probe) mit einem Sequenzabschnitt der einzelsträngigen amplifizierten DNS hybridisiert, der den für die allelische Variabilität verantwortlichen polymorphen Bereich des Vit- amin-D3-Rezeptors einschließt, und das andere weitere Oligonukleotid (anchor probe) derart benachbart zu dem ersten Oligonukleotid mit der DNS hybridisiert, daß zwischen den jeweiligen Fluorophoren benachbarter weiterer Oligonukleotide ein resonanter Fluoreszenzenergietransfer möglich ist und anschließend die Temperatur der hybridisierten DNS bestimmt wird, bei der die Fluoreszenzemission der DNS abnimmt .
35. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Paar weiterer Oligonukleotide folgende Sequenzen enthält:
5 ' -GGCCTGCACATTCCCAATA-3 ' und 5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3' .
36. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid mit der Sequenz
5'-GGCCTGCACATTCCCAATA-3' an seinem 3 ' -Ende mit 3'- Fluoreszein (3FAM) und das Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-AGGCTCTGCTCTTGCGTGAACTG-p-3' an seinem 5 ' -Ende mit 5'-LightCycler Red 640 (5T-LC Red 640) markiert ist.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß die zu amplifizierende DNS aus Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Körperflüssigkeiten wie Amnionflüssigkeit, kernhaltigen Blutzellen wie z.B. Lymphozyten, kultivierten Zellen, Körpergewebe oder forensisches Probematerial in herkömmlicher Weise isoliert wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die zu amplifizierende DNS aus Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Körperflüssigkeiten wie Amnionflüssigkeit, kernhaltigen Blutzellen wie z.B. Lymphozyten, kultivierten Zellen, Körpergewebe oder forensisches Probenmaterial in herkömmlicher Weise isoliert wird.
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Citations (3)

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