DE60014350T2

DE60014350T2 - Verfahren zur erkennung und/oder analyse, unter verwendung von primertechniken, von einfachen nukleotidpolymorphismen in restriktionsfragmenten speziell aus amplifizierten restriktionsfragmenten generiert durch aflp

Info

Publication number: DE60014350T2
Application number: DE60014350T
Authority: DE
Inventors: Tiemen Marius KUIPER; Hanneke Witsenboer
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-04-10
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: AU4150900A; DE60038109D1; CA2366374C; WO2000061800A2; EP1173612A2; DE60038109T2; WO2000061800A8; EP1173612B1; ATE386819T1; WO2000061801A3; AU773855B2; EP1175512A2; DE60014350D1; WO2000061801A2; EP1175512B1; CA2366365A1; ES2298139T3; AU4150800A; WO2000061800A3; US7169552B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen und eine Anordnung zur Verwendung in solch einem Verfahren.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Anordnung zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Einzelnukleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNP) in genomischer DNA oder einer Probe von Restriktionsfragmenten, die aus genomischer DNA stammen, wie z.B. AFLP-Fragmente.
Eine Anzahl von Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen sind bekannt. Allgemein umfassen diese Verfahren die Immobilisierung der zu analysierenden Sequenzen, z.B. durch Blotten; Hybridisierung der Sequenzen mit einer markierten DNA- oder RNA-Sonde; stringente Waschungen, um nicht-hybridisiertes Material zu entfernen; gefolgt vom Nachweis jener Sequenzen, die mit der Sonde hybridisiert haben.
Beispiele für Methoden, die für die Analyse von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, sind unter anderem in WO 98/59066 beschrieben, welches ein Verfahren zur Identifizierung von multiplen SNPs in einer Einzelreaktion beschreibt, das in Verbindung mit genomischen Bibliotheken oder mit restriktionsgeschnittenen PCR-Produkten verwendet werden kann. WO-A 990531 beschreibt verschiedene Verfahren, wie z.B. Einzelnukleotidverlängerung (single nucleotide extension) mit markierten Nukleotiden unter Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, die auf festen Anordnungen für DNA-Fingerabdrücke unter Verwendung von AFLP immobilisiert sind. WO 9617082 offenbart modifizierte AFLP-Assays zum Nachweis von genetischen Polymorphismen.
Solche Methoden werden manchmal nach vorheriger Amplifikation – wie z.B. durch PCR – der Anfangsnukleinsäuresequenzen, üblicherweise eine Mischung von Restriktionsfragmenten aus einer genomischen DNA, ausgeführt. Die resultierende Mischung von amplifizierten Fragmenten wird dann abgetrennt, z.B. auf der Basis von Unterschieden in Länge oder Molekulargewicht, wie z.B. durch Gelelektrophorese, und dann sichtbar gemacht, d.h. durch Blotten, gefolgt von Hybridisierung. Das resultierende Muster von Banden wird als DNA-Fingerabdruck bezeichnet.
Üblicherweise werden bei DNA-Fingerabdrücken Fingerabdrücke von nahe verwandten Spezies, Subspezies, Varietäten, Züchtungen, Rassen oder Individuen verglichen. Solche verwandten Fingerabdrücke können identisch oder sehr ähnlich sein, d.h. eine große Anzahl an korrespondierenden – und deshalb wenig informativen – Banden enthalten. Unterschiede zwischen zwei verwandten Fingerabdrücken werden als "DNA-Polymorphismen" bezeichnet. Diese sind DNA-Fragmente (d.h. Banden), die in oder für einen spezifischen Fingerabdruck einzigartig sind. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit von solchen polymorphen Banden, oder dem Muster derselben, kann als ein genetischer Marker verwendet werden, d.h. um eine spezifische Spezies, Subspezies, Varietät, Züchtung, Rasse oder Individuum zu identifizieren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von einem spezifischen, vererbbaren Merkmal, von einem Gen, festzustellen oder das Stadium einer Krankheit zu bestimmen.
Für eine weitere Erörterung und Definitionen von DNA-Fingerabdrücken, DNA-Typisierung, DNA-Polymorphismen, Genotypisierung, PCR und ähnlichen Methoden wird auf Erörterung des Standes der Technik in EP-0 534 858 A1 verwiesen.
Der Stand der Technik beschreibt auch Oligonukleotidanordnungen zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen oder Mischungen derselben, siehe z.B. WO 97/27317, WO 97/22720, WO 97/43450, EP 0 799 897 , EP 0 785 280 , WO 97/31256, WO 97/27317 und WO 98/08083.
WO 90/09455, WO 91/02087, WO 91/13075, WO 92/15712 und EP 0 123 513 beschreiben alle Methoden zum Nachweisen von Punktmutationen an einer vorbestimmten Stelle einer DNA-Sequenz (üblicherweise genomische DNA oder vollständige cDNA), die allgemein als "Minisequenzierung" bezeichnet werden. Insbesondere können solche Minisequenzierungsmethoden verwendet werden, um Unterschiede zwischen auf andere Weise verwandten oder sogar identischen DNAs an einer einzelnen, spezifischen Basenposition nachzuweisen. Solche Unterschiede werden auch als "Einzelnukleotidpolymorphismen" oder SNPs bezeichnet.
Die Minisequenzierung basiert auf Verlängerung eines Primers, der so mit einem Teil der DNA-Sequenz hybridisiert, daß das 3'-Ende des Primers unmittelbar benachbart zu der Punktmutation ist. Das so erhaltene Hybrid wird – üblicherweise in einem einzelnen "Ein-Röhrchen" Reaktionsschritt – mit einer Mischung in Berührung gebracht, die wenigstens ein nachweisbares Nukleotid enthält, unter Bedingungen, daß die Verlängerung des Primers mit dem nachweisbaren Nukleotid stattfindet, wenn das nachweisbare Nukleotid komplementär zu dem an der Stelle der Punktmutation vorhandenen Nukleotid ist, aber keine Verlängerung stattfindet, wenn das nachweisbare Nukleotid nicht dem an der Punktmutation vorhandenen Nukleotid entspricht, so daß Information über das an der Stelle der Punktmutation vorhandene Nukleotid bereitgestellt wird, je nachdem ob Verlängerung des Primers stattfindet oder nicht. (Alternativ dazu können 2-4 unterschiedlich markierte Nukleotide gleichzeitig verwendet werden, wobei die Verlängerung mit einem spezifisch markierten Nukleotid das Vorhandensein eines komplementären Nukleotids an der Mutationsstelle anzeigt). Neben der Bereitstellung von nachweisbarer Funktionalität werden das (die) nachweisbare(n) Nukleotid(e) und die bei der Minisequenzierung verwendeten Reaktionsmischungen/Bedingungen auch so gewählt, daß, nachdem das markierte Nukleotid an den Primer angefügt worden ist, keine weitere Verlängerung des Primers stattfindet ("Terminationsmischungen"). Z.B. können die kettenterminierenden Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (ddNTPs) oder Thionukleotide verwendet werden.
Das hierin beschriebene Verfahren unterscheidet sich von der Minisequenzierung wenigstens in den folgenden, nicht-limitierenden Ausführungsformen:

a) Minisequenzierung wird verwendet, um Punktmutationen (SNP) an einer spezifischen, bekannten Stelle im Genom, welche gewöhnlich durch PCR unter Verwendung eines Paars von flankierenden Primern amplifiziert wird, nachzuweisen/zu bestimmen und wird nicht verwendet, um die in (einer Mischung) von AFLP-Fragmenten vorhandenen SNP-Allele zu bestimmen.
b) Zum Teil als eine Konsequenz aus (a), bei der Minisequenzierung wird (amplifizierte) gesamtgenomische oder cDNA als Ausgangsmaterial verwendet, nicht eine Mischung von (amplifizierten) Restriktionsfragmenten;
c) Bei der Minisequenzierung werden üblicherweise nur ein oder höchstens eine kleine Anzahl von Mutationen gleichzeitig untersucht; bei der Erfindung werden üblicherweise eine Mischung von (amplifizierten) Restriktionsfragmenten auf das Vorhandensein von wenigstens 100 bis zu mehreren 1000 Markern gleichzeitig getestet;
d) Bei der Minisequenzierung ist es im allgemeinen schwierig, Templat-DNA in Multiplexform zu erzeugen;
e) Zum Teil als eine Konsequenz aus (c) und (d), bei der Minisequenzierung werden Anordnungen, die eine große Anzahl von unterschiedlichen Primern enthalten, nicht verwendet werden.

Selektive Restriktionsfragment-Amplifikation oder AFLP, eine DNA-Fingerabdruckmethode, die keine vorhergehende Kenntnis der zu analysierenden Sequenz benötigt, wird in der Europäischen Patentanmeldung 0 534 858 von der Anmelderin beschrieben. Allgemein umfaßt diese Methode die Schritte:

(a) Verdau einer Nukleinsäure, insbesondere einer DNA, mit einer oder mehr spezifischen Restriktionsendonuklease(n), um die DNA in eine entsprechende Reihe von Restriktionsfragmenten zu spalten;
(b) Ligieren der so erhaltenen Restriktionsfragmente mit wenigstens einem doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotid-Adapter, dessen eines Ende kompatibel zu einem oder beiden Enden des Restriktionsfragmentes ist, um dadurch markierte Restriktionsfragmente der Anfangs-DNA herzustellen;
(c) In Berührung bringen der markierten Restriktionsfragmente unter hybridisierenden Bedingungen mit wenigstens einem Oligonukleotid-Primer;
(d) Amplifizieren des markierten Restriktionsfragmentes, das mit den Primern durch PCR oder eine ähnliche Methode hybridisiert ist, um eine weitere Verlängerung der hybridisierten Primer entlang der Restriktionsfragmente der Anfangs-DNA herbeizuführen, an die die Primer hybridisiert sind; und
(e) Identifizieren oder Gewinnen des so erhaltenen amplifizierten oder verlängerten DNA-Fragments.

Die so amplifizierten DNA-Fragmente können dann analysiert und/oder sichtbar gemacht werden, z.B. mittels Gelelektrophorese, um einen genetischen Fingerabdruck bereitzustellen, der Banden zeigt, die jenen Restriktionsfragmenten entsprechen, die mit dem Adapter verbunden worden sind, erkannt durch den Primer, und deshalb während des Ampilifizierungsschritts amplifiziert; die resultierenden Banden stellen Information über das spezifische Ristriktionsschnittstellenmuster der Anfangs-DNA bereit.
Für eine weitere Beschreibung von AFLP, dessen Vorteile, dessen Ausführungsformen sowie die Methoden, Enzyme, Adapter, Primer und weitere Bestandteile und darin verwendete Mittel, wird auf EP-A-0 534 858 und die gemeinsam anhängigen Europäischen Anmeldungen EP 976 835 und EP 974 672 , alle von der Anmelderin, verwiesen.
Auch werden in der nachfolgenden Beschreibung die in Abschnitt 5.1 von EP 0 534 858 angegebenen Definitionen verwendet werden, außer anders angegeben.
Durch Vergleichen von AFLP-Fingerabdrücken von verwandten Individuen können Banden, die einzigartig für jeden Fingerabdruck sind, identifiziert werden. Diese Polymorphismen, bezeichnet als "AFLP-Marker", können wieder verwendet werden, um eine spezifische Züchtung, Rasse, Varietät, Subspezies, Spezies oder ein Individuum zu identifizieren und/oder, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von einem spezifischen, geerbten Merkmal, Gen oder Krankheitsstadium festzustellen. Der Nachweis von solchen Markern ist jedoch nicht die Aufgabe der vorliegenden Anmeldung. Neben solchen "Marker-Fragmenten" enthält ein AFLP-Fingerabdruck im allgemeinen auch eine Anzahl von Banden, die gleich für die verglichenen Fingerabdrücke sind (d.h. nicht polymorph sind). Solche "konstanten" AFLP-Fragmente können deshalb nicht als ein Marker verwendet werden, z.B. basierend auf Mobilitätsunterschieden bei Gelelektrophorese. Nichtsdestotrotz können solche konstanten AFLP-Fragmente interne Sequenzvariationen, wie z.B. SNP, enthalten, welche durch Minisequenzierung nachgewiesen werden können. Insbesondere sind SNP, die in konstanten AFLP-Fragmenten lokalisiert sind, in diesem Zusammenhang von Interesse, weil beide SNP-Allele nachgewiesen werden können. Auf eine ähnliche Weise, aber abhängig vom Sequenzkontext, kann es durch Minisequenzierung möglich sein, Polymorphismen vom Insertions-Deletionstyp nachzuweisen, die in konstanten AFLP-Fragmenten lokalisiert sind, obwohl diese üblicherweise auch durch Gelelektrophorese nachgewiesen werden können.
So ist die vorliegende Erfindung allgemein auf ein Verfahren zum Nachweisen solcher SNP gerichtet, die in diesen entsprechenden (konstanten) AFLP-Banden, die auch als genetische Marker informativ sind, enthalten sind, welche deshalb diese nicht-polymorphen Banden ergeben, die gewöhnlich keine nützliche Information bereitstellen, wenn das übliche Nehmen von AFLP-Fingerabdrücken verwendet wird.
Insbesondere zielt die Erfindung darauf ab, solch ein Verfahren für den Nachweis von SNPs bereitzustellen, das von den allgemeinen Vorteilen der AFLP-Methoden profitiert, und insbesondere von dem Vorteil, das bei Verwendung der AFLP-Methodik Restriktionsfragmente effizient erzeugt werden können und für Nachweis/Analyse in Multiplexform bereitgestellt werden.
Trotz der von der AFLP-Methodik angebotenen Vorteile, leiden die vorstehend beschriebenen AFLP-Methoden jedoch immer noch unter dem Nachteil, daß die amplifizierten Fragmente getrennt (d.h. durch Gelelektrophorese) und sichtbar gemacht (d.h. durch Erzeugung eines Fingerabdrucks) werden müssen. Dies sind sehr arbeitsintensive und zeitraubende Verfahren, die ein spezielles Gerät benötigen, wie z.B. Elektrophorese- und Autoradiographieausstattung und durch die Auflösungskraft des verwendeten Gelsystems beschränkt sind. Folglich kann solch Nachweis durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein beschränkender Faktor für die enorme Multiplexkapazität der AFLP-Technologie für Hochdurchsatzmarkernachweis sein. Die Erfindung zielt darauf ab, diese Beschränkungen zu überwinden.
Somit ist eine der Hauptaufgaben der Erfindung, ein Verfahren zum Analysieren von Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, insbesondere zum Nachweisen von Nukleinsäuresequenzvariationen, wie z.B. SNP, durch die ein höherer Durchsatz verglichen mit der üblichen Minisequenzierung erreicht werden kann, und die insbesondere nicht länger die Verwendung von Gelelektrophorese benötigt und vorzugsweise die Verwendung von Autoradiographie und/oder radioaktiven Materialien vermeidet, und dadurch den Durchsatz verbessert.
Dies wird erreicht durch das Verfahren der Erfindung, das auf spezifischer Ausdehnung/Verlängerung einer Oligonukleotidsequenz (d.h. Primer) basiert, die komplementär ist zu (einem Teil von) dem nachzuweisenden Fragment, und unmittelbar 5'-stromaufwärts des SNP, das in diesen Fragment enthalten ist, lokalisiert ist, so daß die Ausdehnung des komplementären Oligonukleotids am 3'-Ende nur mit dem markierten ddNTP, das komplementär zu dem in dem Fragment enthaltenen SNP-Allel ist, stattfinden wird, und mit keinem anderen markierten ddNTP stattfinden wird. Somit wird (werden) das (die) Ausdehnungsprodukt(e) der Minisequenzierungreaktion anzeigend für den SNP-Genotyp an diesem Lokus sein.
Dieser auf Ausdehnung basierte Nachweis kann anstelle von Gelelektrophorese/Autoradiographie verwendet werden, z.B. zur Analyse von AFLP-Reaktionsmischungen, insbesondere zur routinemäßigen Hochdurchsatzgenotypisierung. Zu diesem Zweck stellt die Erfindung unter anderem auch eine Anordnung von Oligonukleotiden bereit, die verwendet werden kann, um eine AFLP-Reaktionsmischung gleichzeitig auf das Vorhandensein von mehreren (Einzelnukleotid) Polymorphismen zu testen, d.h. in einem einzigen Nachweisschritt.
Für die Zwecke des Nachweises von solchen "internen SNPs", wie vorstehend beschrieben, stellt die Erfindung somit im allgemeinen die Hauptstärken der AFLP-Technologie bereit, dadurch, daß Fragmente zum Nachweis in Multiplexform ohne die Begrenzungen des Durchsatzes, die mit üblicher Gelelektrophorese/Autoradiographie verbunden sind, und ohne die Begrenzungen, die durch im allgemeinen verwendete Verfahren zur Amplifizierung von Templaten durch Minisequenzierung, basierend auf Amplifizierung von genomischer DNA oder cDNA, auftreten, erzeugt/bereitgestellt werden können.
Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Bestimmung der Genotypen von polymorphen Loci, amplifiziert in einer Mischung aus Restriktionsfragmenten, die unter Verwendung von AFLP amplifiziert worden sind, wobei eine Oligonukleotidsequenz verwendet wird, die im wesentlichen komplementär zu einem Teil eines Ziel-Restriktionsfragmentes ist, und benachbart (stromaufwärts) zu einem Polymorphismus lokalisiert ist, der ermittelt werden soll, wobei das Ziel-Restriktionsfragment ein Fragment ist, das dieselbe gelelektrophoretische Mobilität bei AFLP-Fingerabdrücken von wenigstens zwei verwandten Individuen aufweist, und wobei das Verfahren die Schritte umfaßt

a) In Berührung bringen der Mischung der Restriktionsfragmente mit der Oligonukleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, so daß, wenn das Ziel-Restriktionsfragment vorhanden ist, ein Hybrid zwischen dem Ziel-Restriktionsfragment und der Oligonukleotidsequenz gebildet wird, so daß das resultierende Hybrid wenigstens ein ungepaartes Nukleotid des Ziel-Restriktionsfragmentes direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz aufweist;
b) Zugeben von wenigstens einem markierten Nukleotid oder Nukleotid-Analogon zu der aus Schritt a) resultierenden Mischung, unter für die Verlängerung eines Oligonukleotids geeigneten Bedingungen; so daß, wenn ein Hybrid aus dem Ziel-Restriktionsfragment und dem Oligonukleotid vorhanden ist, und dieses wenigstens eine markierte Nukleotid oder Nukleotid-Analogon komplementär ist zu dem wenigstens einen ungepaarten Nukleotid dieses Ziel-Restriktionsfragmentes direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz, die Nukleotidsequenz mit dem markierten Nukleotid oder Nukleotid-Analogon verlängert wird;
c) Ermitteln der Gegenwart oder Abwesenheit von jeglichem/n Hybrid(en) mit (einem) hinzugefügten markierten Nukleotid(en) oder Nukleotid-Analogon(a), und/oder jeglicher Oligonukleotidsequenz mit (einem) hinzugefügten markierten Nukleotid(en) oder Nukleotid-Analogon(a).

Das Verfahren der Erfindung kann ferner einen oder mehr Schritte enthalten, in welchen das zwischen dem Ziel-Restriktionsfragment und der Oligonukleotidsequenz gebildete Hybrid von jeglichen nicht an eine Oligonukleotidsequenz hybridisierten Fragmenten sowie von jeglichen anderen unerwünschten Sequenzen oder Verbindungen abgetrennt wird. Solch ein Schritt kann nach Schritt a), nach Schritt b), oder beiden ausgeführt werden.
Außerdem wird es dem Fachmann klar sein, daß die Reihenfolge, in welcher die verschiedenen Verbindungen/Sequenzen (d.h. die Restriktionsfragmente, das Oligonukleotid und das markierte Nukleotid) in Schritten a) und b) zugesetzt/miteinander vermischt werden variiert werden kann, und solche Variationen in den Umfang der Erfindung und die Ansprüche fallen. Jedoch gibt die vorstehend beschriebene Reihenfolge die geeignetste Art zur Ausführung der Erfindung an.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung des in einem oder mehr Ziel-Restriktionsfragmenten in einer Mischung von Restriktionsfragmenten vorhandenen SNP-Genotyps, umfassend die Schritte:

a) In Berührung bringen der Mischung der Restriktionsfragmente mit wenigstens einer Oligonukleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die Oligonukleotidsequenz zu einem Teil eines Ziel-Restriktionsfragmentes komplementär ist, aber nicht zu irgendeinem anderen Restriktionsfragment in der Mischung, so daß das resultierende Hybrid wenigstens ein ungepaartes Nukleotid des Ziel-Restriktionsfragmentes direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz aufweist.
b) Verlängern der Oligonukleotidsequenz mit wenigstens einem markierten Nukleotid oder Nukleotid-Analogon, wobei wenigstens ein markiertes Nukleotid oder Nukleotid-Analogon komplementär zu dem wenigstens einen ungepaarten Nukleotid des Ziel-Restriktionsfragmentes direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz ist;
c) Ermitteln der Oligonukleotidsequenz mit dem (den) zugesetzten markierten Nukleotid(en) oder Nukleotid-Analogon(a).

Nochmals, dieses Verfahren kann ein oder zwei optionale Schritte zur Abtrennung der Ziel-Restriktionsfragmente, hybridisiert mit der Oligonukleotidsequenz von jeglichen nicht mit einer Oligonukleotidsequenz hybridisierten Restriktionsfragmenten enthalten; sowie von anderen unerwünschten Sequenzen und überschüssigen Reagenzien.
Während Schritt a) wird bei dem Verfahren der Erfindung die Mischung der Restriktionsfragmente üblicherweise gleichzeitig mit wenigstens 3, vorzugsweise wenigstens 10, bevorzugter wenigstens 50, am stärksten bevorzugt wenigstens 100 unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen in Berührung gebracht, wobei jede Oligonukleotidsequenz am stärksten bevorzugt nur für ein Ziel-Restriktionsfragment spezifisch ist, d.h. ein Restriktionsfragment, das einen (Einzelnukleotid) Polymorphismus enthält (oder wenigstens vermutlich enthält). Zu diesem Zweck werden bei dem Verfahren der Erfindung die verwendete(n) Oligonukleotidsequenz(en) vorzugsweise an einen festen Träger gebunden, bevorzugter so, daß sie eine Anordnung bilden, und solche Anordnungen bilden eine weitere Ausführungsform der Erfindung.
Mit "einem für ein Ziel-Restriktionsfragment spezifischen Oligonukleotid" ist gemeint, daß die Oligonukleotidsequenz im wesentlichen nur zu dem bestimmten Ziel-Restriktionsfragment komplementär ist, aber am stärksten bevorzugt im wesentlichen nicht zu jeglichem anderen Restriktionsfragment in der Mischung komplementär ist. Eine Oligonukleotidsequenz wird als "im wesentlichen komplementär zu" einem Ziel-Restriktionsfragment betrachtet, wenn sie einen hohen Grad an Sequenzhomologie mit dem entsprechenden Teil des Ziel-Restriktionsfragments (bestimmt auf der Grundlage der gesamten Länge der Oligonukleotidsequenz) aufweist, d.h. von wenigstens 90 %, vorzugsweise wenigstens 95 %, am stärksten bevorzugt wenigstens 99 %.
In der vorliegenden Beschreibung wird das Restriktionsfragment, das den Polymorphismus enthält, der ermittelt werden soll, als die "Ziel-Sequenz" bezeichnet.
Allgemein wird eine Ziel-Sequenz dadurch charakterisiert, daß sie durch Schneiden einer Anfangs-DNA, üblicherweise einer genomischen DNA oder cDNA, mit wenigstens einem, aber üblicherweise mit zwei Restriktionsenzymen, von denen vorzugsweise wenigstens eines ein Restriktionsenzym für "häufig vorkommende Schnittstellen" und wenigstens eines ein Restriktionsenzym für "selten vorkommende Schnittstellen" ist, erhältlich ist/erhalten wird. (Im Fall von genomischer DNA dient das "Restriktionsenzym für häufig vorkommende Schnittstellen" dem Zweck, die Größe der Restriktionsfragmente auf einen Bereich von Größen zu reduzieren, die effizient amplifizierbar und auf eine Weise kompatibel mit der verwendeten Nachweismethode sind und das "Restriktionsenzym für selten vorkommende Schnittstellen" dient dem Zweck, die Gesamtzahl der erzeugten Fragmente zu kontrollieren. Für beide wird auf EP-A-0 534 858 und EP-A-0 721 987 von der Anmelderin verwiesen). Nicht-limitierende Beispiele von geeigneten Enzymen für häufig vorkommende Schnittstellen umfassen MseI und TaqI. Nicht-limitierende Beispiele von kommerziell erhältlichen Enzymen für selten vorkommende Schnittstellen umfassen PstI, HpaII, MspI, ClaI, HhaI, EcoRI, EcoRII, BstBI, HinPI, HinDIII, MaeII, BbvI, PvuII, XmaI, SmaI, NciI, AvaI, HaeII, SaII, XhoI, BstYI, BamHI, BglII und PvuII, von welchen PstI, HpaII, MspI, ClaI, EcoRI, EcoRII, BstBI, HinPI, HinDIIl, BamHI, BglII und MaeII bevorzugt sind.
Vorzugsweise ist die Ziel-Sequenz ein Restriktionsfragment wie es in einer Mischung von Restriktionsfragmenten vorhanden ist, bevorzugter ein amplifiziertes Restriktionsfragment wie es in einer Mischung von Restriktionsfragmenten und/oder amplifizierten Restriktionsfragmenten vorhanden ist.
Noch bevorzugter ist die Ziel-Sequenz ein Restriktionsfragment, das einem "konstanten" AFLP-Fragment (oder einem Teil desselben) entspricht, z.B. einem durch AFLP amplifizierten Restriktionsfragment wie es in einer Reaktionsmischung nach AI-Amplifizierung erhalten wird.
Die Oligonukleotidsequenz, die verwendet wird, um die Ziel-Sequenz zu ermitteln, wird nachfolgend als das "Nachweis-Oligonukleotid", die "Nachweis-Sequenz" oder der "Nachweis- Primer" bezeichnet, wobei die Ausdrücke als äquivalent betrachtet werden.
Jede Nachweis-Sequenz sollte wenigstens teilweise zu einer spezifischen Ziel-Sequenz komplementär sein, wie vorstehend definiert. Die Nachweis-Sequenz kann jegliche Nukleinsäure (d.h. DNA oder RNA) sein, ist aber vorzugsweise DNA. Die Nachweis-Sequenz wird allgemein eine Größe von etwa 10 bis 100 Basenpaaren haben, vorzugsweise etwa 20 bis 50 Basenpaare. Die Nachweis-Sequenzen können alle dieselbe Größe haben, oder unterschiedliche Größen. Wenn die Nachweis-Sequenzen wie nachfolgend beschrieben auf einer Anordnung immobilisiert sind, können sie außerdem auch einen "Anhang" – wie z.B. eine PolyT-Sequenz – für eine verbesserte Zugänglichkeit zu der Ziel-Sequenz enthalten.
Die Nachweis-Sequenz kann auf jegliche geeignete Weise erhalten werden. Z.B., wenn ein oder mehr konstante AFLP-Fragmente, enthaltend ein oder mehr Einzelnukleotid-Polymorphismen, in einem AFLP-Fingerabdruck eines spezifischen Satzes von (vorzugsweise verwandten) Individuen identifiziert worden sind, kann die Sequenz von jeder(m) Bande/Fragment auf eine an sich bekannte Weise bestimmt werden, und Nachweis-Sequenzen können synthetisiert werden, die komplementär zu irgendeinem Teil der Sequenz von jeder der konstanten Banden sind, d.h. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers oder irgendeiner anderen an sich bekannten Weise. Auch Festphasennukleinsäuresyntheseverfahren können verwendet werden, welche direkt in einer Anordnung mit den gewünschten Nachweis-Sequenzen resultieren können, wie nachfolgend beschrieben. Ferner kann die Nachweis-Sequenz unter Verwendung bekannter Verfahren der Gentechnologie erhalten werden, z.B. durch Primerverlängerung unter Verwendung der Ziel-Sequenz als Templat und/oder durch Verwendung von einem oder mehr Restriktionsenzymen, wahlweise unter Verwendung von Amplifizierung.
Auch kann die Nachweis-Sequenz ein oder mehr "alternative Nukleoside" enthalten, wie im Europäischen Patent 974672 der Anmelderin beschrieben, so daß die Nachweis-Sequenz ein "alternativer Primer", wie darin beschrieben, ist. Ähnlich kann in Schritt b) die Nachweis-Sequenz mit solch einem alternativen Nukleosid/Nukleotid, versehen mit einem Marker, verlängert werden. Beispiele hierfür umfassen die Basen Inosin (I) und Uracil (U), sowie dUTP und dITP, und diese sind in dem vorstehend erwähnten Ausdruck "markiertes Nukleotid-Analogon" umfaßt. Es sollte verstanden werden, daß die Gegenwart von solch alternativen Nukleosiden nicht verhindert, daß die Nachweis-Sequenz und die Ziel-Sequenz zueinander im wesentlichen komplementär sind, wie vorstehend definiert.
Wie vorstehend erwähnt, sind die Nachweis-Sequenzen vorzugsweise an einen festen Träger gebunden, bevorzugter so, daß sie eine Anordnung bilden. Solch eine Anordnung wird allgemein wenigstens 10, insbesondere wenigstens 100, bevorzugter wenigstens 1000 unterschiedliche Nachweis-Sequenzen umfassen. Für eine "hochdichte Anordnung" oder "Mikroanordnung" kann die Gesamtzahl der Nachweis-Sequenzen in dem Bereich von 1000–100000 pro cm² des Oberflächenbereichs sein.
Die Nachweis-Sequenzen werden allgemein an den Träger in solcher Weise gebunden werden, daß jede Nachweis-Sequenz an den Träger gebunden ist und einem spezifischen, bestimmten Teil des Trägers entspricht, so daß ein unabhängig nachweisbarer Bereich auf dem Träger gebildet wird, wie z.B. ein Fleck oder eine Bande. Dies macht es möglich, die Anordnung durch Abtasten (d.h. visuell oder auf andere Weise) der Bereiche, an die jede Nachweis-Sequenz (d.h. eine Sequenz, die einem Marker von Interesse entspricht) gebunden ist, zu "lesen". Für eine allgemeine Beschreibung von solchen Anordnungen wird auf die ebenfalls anhängige PCT-Anmeldung WO 00/61800 "Verfahren zur Analyse von AFLP-Reaktionsmischungen unter Verwendung von Primerverlängerungsverfahren", eingereicht am 10. April 2000, der Anmelderin verwiesen. In Schritt a) der Erfindung werden die eine oder mehr Nachweis-Sequenzen (oder die Anordnung der Nachweis-Sequenzen) mit der zu analysierenden Probe unter an sich bekannten Hybridisierungsbedingungen in Berührung gebracht (d.h. Mischung von Restriktionsfragmenten). Geeignete Hybridisierungsbedingungen (d.h. verwendete Puffer, Salzstärke, Temperatur, Dauer) können von einem Fachmann auf der Grundlage von Erfahrung oder wahlweise nach einigen vorläufigen Experimenten ausgewählt werden. Diese Bedingungen können variieren, abhängig von Faktoren, wie der Größe der Nachweis-Sequenzen, dem CG-Gehalt der Nachweis-Sequenzen und ob die Nachweis-Sequenz oder Ziel-Sequenz an eine Anordnung gebunden ist, wie nachfolgend beschrieben. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory manual, (1989) 2. Auflage Cold Spring Harbour, N.Y.; Berger und Kimmel, "Guide to Molecular Cloning Techniques", Methods in Enzymology", (1987), Band 152, Academic Press Inc., San Diegeo, CA; Young und Davis (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 1194; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 24, Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Thijssen, Hrsg., Elsevier, N.Y. (1993), sowie WO 97/43450, EP-A-O 799 897, WO 97/27317, WO 92/10092, WO 95/1195, WO 97/22720 und US-A-5,424,186 und umfassen allgemein Temperaturen zwischen 25–70°C, vorzugsweise 35–65°C, eine Dauer von zwischen einer Minute und 30 Stunden, vorzugsweise etwa 15 Minuten bis 2 Stunden, und die Verwendung eines geeigneten Puffers, wie z.B. einem Tris-Puffer. Die Hybridisierungsbedingungen werden vorzugsweise so gewählt, daß jede Nachweis-Sequenz nur ein Hybrid (Duplex) mit einer Ziel-Sequenz, zu der die Nachweis-Sequenz wie vorstehend definiert im wesentlichen komplementär ist, bilden wird, und andererseits kein Hybrid bilden wird.
Insbesondere sind jene an sich für Primerverlängerung bekannten Hybridisierungsbedingungen bevorzugt, wie z.B. die bei den Minisequenzierungsverfahren verwendeten Primerverlängerungsbedingungen, d.h. wie beschrieben in WO 90/09455, WO 91/02087, WO 91/13075, WO 92/15712 und EP 0 123 513 . Dies hat den Vorteil, daß sowohl vorstehender Schritt a) als auch Schritt b) unter denselben "Primerverlängerungsbedingungen" ausgeführt werden können, d.h. in einer Einzelreaktion unter Verwendung desselben Puffers usw., wahlweise bei wiederholten Temperaturzyklen.
Wenn die Mischung der Restriktionsfragmente mit einer Nachweis-Sequenz in Berührung gebracht wird, und eine Ziel-Sequenz für die Nachweis-Sequenz vorhanden ist, wird ein Hybrid zwischen der Ziel-Sequenz und der Nachweis-Sequenz gebildet werden. Das Hybrid sollte so sein – d.h. die Nachweis-Sequenz sollte entworfen sein, um komplementär zu der Ziel-Sequenz zu sein –, so daß es wenigstens ein ungepaartes Nukleotid der Ziel-Sequenz direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Nachweis-Sequenz gibt, so daß in Schritt b) die Nachweis-Sequenz verlängert wird, z.B. mit vorzugsweise höchstens 5, vorzugsweise wenigstens höchstens 3 und am stärksten bevorzugt nur einem Nukleotid.
Während Schritt b) des Verfahrens der Erfindung wird die wenigstens eine Position, die dem (den) ungepaarten Nukleotid(en) in der Ziel-Sequenz entspricht, mit wenigstens einem Nukleotid mittels Verlängerung der Nachweis-Sequenz "aufgefüllt", wobei die Ziel-Sequenz als ein Templat für eine Verlängerungsreaktion dient. Falls die Ziel-Sequenz, die der spezifischen Nachweis-Sequenz entspricht, nicht vorhanden ist, wird deshalb kein Hybrid gebildet werden, und die Nachweis-Sequenz wird nicht verlängert werden, wodurch gezeigt wird, daß die (Allel-Variante der) Ziel-Sequenz in der Anfangsmischung nicht vorhanden war.
Vorzugsweise werden die Nukleotide in Schritt b) zur Verlängerung der Nachweis-Sequenz Nukleotide oder Nukleotid-Analoga, die in einer an sich bekannten Weise nachgewiesen werden können, z.B. mittels eines nachweisbaren Markers, verwendet, und solch ein Nukleotid wird als ein "nachweisbares Nukleotid" bezeichnet. Für eine weitere Beschreibung von solch "nachweisbaren Nukleotiden" wird wiederum auf die ebenfalls anhängige PCT-Anmeldung WO 00/61800 "Verfahren zur Analyse von AFLP-Reaktionsmischungen unter Verwendung von Primerverlängerungsverfahren", eingereicht am 10. April 2000, der Anmelderin verwiesen.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthält die in Schritt b) zur Verlängerung der Nachweis-Sequenz verwendete Mischung nur ein (Art von) nachweisbares Nukleotid, d.h. ein oder mehr nachweisbare Nukleotide, die komplementär zu nur einem von A, T, C oder G sind. Unter diesen Bedingungen werden nur jene Ziel-Sequenzen, die 1) erfolgreich mit der Nachweis-Sequenz hybridisieren können; und 2) in ihrer Sequenz, an einer Position, die direkt benachbart zu dem Teil der Sequenz ist, die mit der Nachweis-Sequenz hybridisiert, ein zu dem nachweisbaren Nukleotid komplementäres Nukleotid aufweisen, zu einer Verlängerung der Nachweis-Sequenz mit dem nachweisbaren Nukleotid führen und dadurch zu einem positiven Signal, das für das Vorhandensein der entsprechenden Allel-Variante der Ziel-Sequenz in der zu analysierenden Mischung bezeichnend ist. In einer anderen Ausführungsform wird die in Schritt b) zur Verlängerung der Nachweis-Sequenz verwendete Mischung zwei, drei oder vier unterschiedliche nachweisbare Nukleotide enthalten. Mit "unterschiedlich nachweisbarem Nukleotid" ist gemeint, daß jedes nachweisbare Nukleotid zu einem unterschiedlichen ungepaarten Nukleotid A, T, G oder C in der Ziel-Sequenz komplementär ist, und jedes nachweisbare Nukleotid auf eine solche Weise markiert ist, daß es von dem (den) anderem(n) nachweisbare(n) Nukleotid(en), vorhanden in der Verlängerungsreaktion und/oder der verlängerten Nachweis-Sequenz, unterschieden werden kann – d.h. Verwendung einer geeigneten Nachweismethode – so daß die Verlängerung der Nachweis-Sequenz mit einem spezifischen nachweisbaren Nukleotid ein Anzeichen für das Vorhandensein eines spezifischen Nukleotids an der entsprechenden Position der Ziel-Sequenz sein kann.
Die Bedingungen für die Verlängerung der Nachweis-Sequenz mit dem nachweisbaren Nukleotid können alle an sich für die Verlängerung eines Oligonukleotids oder eines an ein Nukleinsäuretemplat hybridisierten Primers umfassen, z.B. wie im Stand der Technik für Minisequenzierung beschrieben, wie z.B. in WO 90/09455, WO 91/02087, WO 91/13075, WO 92/15712 und/oder EP 0 123 513 . Diese umfassen die Verwendung einer Polymerase, wie z.B. E.coli DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, DNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4, Taq DNA-Polymerase und AMV-Transcriptase, in einem geeigneten Puffer, wie z.B. einem wäßrigen Puffer, enthaltend Mg-Salze, bei einer Temperatur von 28°C, vorzugsweise 30–70°C.
Wahlweise können nach der Hybridisierung von Schritt a) und/oder nach der Verlängerungsreaktion von Schritt b) jegliche nicht an eine Nachweis-Sequenz hybridisierten Restriktionsfragmente sowie jegliche anderen unerwünschten Sequenzen, Verbindungen oder Überschußreagenzien entfernt werden, z.B. durch Waschen der Anordnung.
Nachdem die Nachweis-Sequenz in den Ziel-Sequenz/Nachweis-Sequenz-Duplexen mit dem nachweisbaren Nukleotid ("DN") verlängert worden ist, wird die resultierende Mischung analysiert, um unter Verwendung eines geeigneten Nachweisverfahrens zu bestimmen, welche Nachweis-Sequenz mit einem DN verlängert worden ist. Diese Analyse kann durchgeführt werden während die Nachweis-Sequenz(en) noch an die entsprechende(n) Ziel-Sequenz(en) hybridisiert ist (sind), oder die Ziel-Sequenz en) kann von der (den) Nachweis-Sequenz en) in einem getrennten Schritt, der dem Nachweis und der Analyse vorangeht, entfernt/abgetrennt werden.
Für eine allgemeinere Beschreibung der Verfahren/Methodik, die die Verwendung von Ziel-Sequenzen, Nachweis-Sequenzen, nachweisbaren Nukleotiden, Anordnungen usw. umfassen, wie sie hierin vorstehend für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird wiederum auf die ebenfalls anhängige PCT-Anmeldung WO 00/61800 "Verfahren zur Analyse AFLP-Reaktionsmischungen unter Verwendung von Primerverlängerungsverfahren", eingereicht am 10. April 2000, der Anmelderin verwiesen, und insbesondere auf 9 derselben.
Die Analyse der Anordnung kann auf eine an sich bekannte Weise ausgeführt werden, einschließlich optischer Methoden, Spektroskopie, chemischer Methoden, biochemischer Methoden, photochemischer Methoden, elektrischer Methoden, lichtstreuender Methoden, colorimetrischer Methoden, radiographischer Methoden, usw., abhängig von dem Marker in den nachweisbaren Nukleotiden. Geeignete Methoden sind z.B. beschrieben in WO 97/27317, WO 97/22720, WO 97/43450, EP 0 799 897 , WO 97/31256, WO 97/27317 und WO 98/08083. Z.B. kann die Anordnung visuell untersucht werden oder durch (Konfokale) Mikroskopie; durch Spektroskopie; unter Verwendung von photographischen Filmen, elektronischen Detektoren oder einer CCD-Kamera; durch colorimetrische oder (bio)chemische Untersuchung; oder durch irgendein anderes geeignetes Verfahren, für die wiederum auf WO 97/27317, WO 97/22720, WO 97/43450, EP 0 799 897 , WO 97/31256, WO 97/27317 und WO 98/08083 verwiesen wird. Automatisierte Abtastausrüstung, die auf solchen Methoden basiert, kann auch verwendet werden.
Allgemein wird das nachgewiesene Signal ein Anzeichen für das (nachweisbare) Nukleotid sein, mit dem die Nachweis- Sequenz verlängert worden ist, welche wiederum bezeichnend für die in der Ziel-Sequenz vorhandene(n) Base(n) – z.B. in dem Hybrid aus der Ziel-Sequenz und der Nachweis-Sequenz – direkt benachbart dem 3'-Ende der Nachweis-Sequenz sein wird. Somit gestattet das Verfahren der Erfindung auf diese Weise nicht nur den Nachweis von (jeglichen) SNPs in der Ziel-Sequenz – z.B. direkt benachbart zu der Nachweis-Sequenz – sondern macht es möglich, zu bestimmen, welche spezifische Base an dem Locus der SNP in der Ziel-Sequenz vorhanden ist.
Wahlweise kann die relative Intensität oder absolute Größe eines durch ein nachweisbares Nukleotid an einer spezifischen Stelle der Anordnung erzeugten Signals als ein relatives Anzeichen oder ein absolutes Maß für die Menge der entsprechenden Allel-Variante des in der Originalprobe vorhandenen Ziel-Sequenz-Fragments verwendet werden, z.B. wie in WO 98/08083 beschrieben.
Die Anordnung der Erfindung kann als eine Ausstattung mit Einzelteilen, umfassend die Anordnung und andere Bestandteile zur Verwendung mit der Anordnung, wie z.B. Hybridisierungspuffer, Verlängerungspuffer, Polymerase, markierte Nukleotide, Behälter/Verpackung und Handbücher sowie Bestandteile für an sich bekannte AFLP-Kits bequem bereitgestellt werden. Die Anordnung der Erfindung kann sogar in der Form einer in der Hand gehaltenen Vorrichtung sein, wie z.B. einem Meßstab.
Prinzipiell können Verfahren und Anordnungen der Erfindung angewandt werden für, und können verwendet werden für, jeglichen Zweck, für den ein SNP verwendet und/oder identifiziert werden kann. Dies umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf, alle im Fachgebiet für SNPs an sich bekannten, beschriebenen Verwendungen, wie z.B. Ermittlung von (SNP-)Allelen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Ergebnisse und/oder Daten, die durch Analyse einer Mischung von Restriktionsfragmenten mit dem Verfahren der Erfindung erhältlich sind. Diese Ergebnisse oder Daten können z.B. in der Form eines Bildes, einer Punktebewertung, digitaler oder analoger Daten oder in anderer geeigneter Form sein, und können wahlweise auf einem geeigneten Datenträger gespeichert werden, einschließlich Papier, photographischem Film, Computerplatte mit Dateien, einer Datenbank usw. Diese Daten können sein, wie direkt aus der Analyse oder Bewertung der Anordnung erhalten, oder können weiter verarbeitet worden sein.
Die Erfindung wird nun mittels des folgenden, nicht-limitierenden, experimentellen Teils weiter erläutert werden, sowie durch die enthaltenen Figuren, welche zeigen:
1: Screenen nach Y-Fragmenten und Y-Polymorphismen unter Verwendung von 5 männlichen Pools beziehungsweise einem weiblichen Pool. Die verwendeten Primerkombinationen, um die Fingerabdrücke zu erzeugen, sind über den Tafeln angegeben. Y-Fragmente sind mit Pfeilen angegeben.
2: Fingerabdrücke von 48 männlichen Individuen, erzeugt mit Primerkombination E48T46. Das 330 bp Y-polymorphe Fragment ist angegeben. Auch die unterschiedlichen Populationen, aus denen die Individuen stammen, sind angegeben (Bosnisch: Bahnen B 1-12, Saamisch: Bahnen L 13-22, Panayisch (Philippinen): Bahnen X 23-32, Mansisch: Bahnen M 33-42, Somalisch: Bahnen S 43–48).
Experimenteller Teil
Beispiel 1:
Die Gesamtaufgabe der Erfindung ist, ein Hochdurchsatz DNA-Markersystem für die Genkartierung und die Gen-Diagnostik zu entwickeln, und dessen Nützlichkeit für die genetische Analyse von Humanpupulationen als einen Auftakt zur Kartierung von komplexen Krankheiten zu demonstrieren.
Für die Zwecke zukünftiger molekularer Diagnostik wird die Bestrebung sein, viele Datenpunkte mit geringen Kosten zu erzeugen. Dies wird nur möglich sein, indem Verfahren verwendet werden, die den kostspieligen und zeitraubenden Gelelektrophoreseschritt nicht brauchen. Die Strategie, Serien von für die Mutation bestimmten Oligonukleotiden, die an einen festen Träger gebunden sind, zu verwenden, sollte die gleichzeitige Ermittlung von Hunderten bis Tausenden von Punktmutationen gestatten, wodurch ein umfassender genetischer Fingerabdruck eines Individuums erzeugt wird. Gegenwärtige Schätzungen für die Kosten von solchen in Masse produzierten Chips sind im zweistelligen Dollarbereich, einem moderaten Preis für Routinediagnostikzwecke bei Menschen. Obwohl die Ermittlung von vielen Punktmutationen auf einem Chipformat für eine relativ kleine Anzahl von SNPs (< 200) möglich ist, müssen für eine größere Anzahl von Markern eine Reihe von Problemen gelöst werden.

1. Es ist gegenwärtig unklar, wie Ziel-Moleküle für die Chip-Analyse auf eine effiziente Weise amplifiziert werden sollten.
2. Oligos auf einem Chip zur Hybridisierung an eine komplexe Mischung von Ziel-Sequenzen stellen ein Problem für die Sequenz-spezifische Hybridisierung dar. Dies kann nur durch die Verwendung von mehreren Oligos abgestellt werden, um jede mögliche polymorphe Stelle zu verifizieren. Dies beschränkt die Kapazität des Systems. Außerdem machen es die Sequenz-abhängigen Hybridisierungseffizienzen notwendig, in der Lage zu sein, die Hybridisierung über einen weiten dynamischen Bereich zu ermitteln.

In diesem Beispiel streben wir an, eine bessere Alternative zur Ermittlung von SNPs in einem Mikrochipformat zu entwerfen. AFLP gestattet die selektive Amplifizierung von großen Restriktionsfragmentsätzen. Augenblicklich ist die AFLP-Technologie die effizienteste erhältliche PCR-Methode, nämlich fähig zur quantitativen Amplifizierung ganzer Genome. Deshalb ist das AFLP-Verfahren die perfekte Technologie, die es ermöglicht, jegliche Zahl von Templaten für die SNP-Analyse herzustellen. Um die Probleme mit der geringen Spezifität des Hybridisierungsassays abzumildern, bietet die in dem Minisequenzierungassay verwendete Einzelnukleotid-Primerverlängerungsreaktion aufgrund der inhärenten Spezifität der DNA-Polymerasen eine überlegene Technologie an.
A. Material und Methoden
DNA-Proben aus Humanpopulation; von jeder Population waren 10 männliche und 10 weibliche Proben vorhanden.
Bosnisch (Muslime, Tuzla)
Saamisch (Lovozero, Rußland)
Panayisch (Fluß-Ob, Sibirien)
Mansisch (Fluß-Ob, Sibirien)
Somalisch (Somalia, Afrika)
B. Oligosynthese
Oligonukleotide wurden gemäß den Standardverfahren synthetisiert, oder von MWG-Biotech GmbH (Deutschland) erworben.
C. AFLP-Analyse von humaner DNA
AFLP-Template wurden gemäß Standardverfahren (Vos et al. 1995) hergestellt, unter Verwendung der Enzymkombination EcoRI und TaqI. Die AFLP-Reaktionen wurden eingeleitet durch Präamplifizierungen mit einem selektiven Nukleosid auf jedem Primer. AFLP-Reaktionen wurden mit Primerkombinationen mit 3 selektiven Nukleosiden auf jedem Primer durchgeführt.
Zur Amplifizierung der Fragmente, die Y-chromosomale SNPs enthalten, wurde eine angepaßte AFLP-Versuchsvorschrift verwendet, die nur ein Restriktionsenzym (MseI) für die Templatherstellung verwendet. AFLP-Primer-Sequenzen (5'-3'):
D. AFLP-Analyse von Pflanzen-DNA
AFLP-Template wurden gemäß dem Standardverfahren (Vos et al. 1995) hergestellt, unter Verwendung der Enzymkombination EcoRI und MseI. AFLP-Reaktionen wurden eingeleitet durch Präamplifizierungen mit einem selektiven Nukleosid auf jedem Primer. AFLP-Reaktionen wurden mit Primerkombinationen mit 2 oder 3 selektiven Nukleosiden auf jedem Primer durchgeführt.
E. Sequenzanalyse
AFLP-Fragmente wurden aus einem getrockneten Polyacrylamidgel ausgeschnitten, reamplifiziert mit derselben Primerkombination, die verwendet worden war, um den Fingerabdruck zu erzeugen, und entweder direkt unter Verwendung von AFLP-Primern sequenziert, oder in Plasmid pCR2.1-TOPO (TOPO TA Klonierungskit, Invitrogen) kloniert und unter Verwendung von M13 forward- und reverse-Primern sequenziert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung des von Perkin-Elmer erworbenen Farbstoff-Terminator Sequenzier-Kits durchgeführt und wurden auf einem ABI 377 Sequencer analysiert.
Minisequenzierung von ss DNA wurde gemäß Syvänen et al. (1990, 1993) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. AFLP-Reaktionen wurden unter Verwendung von einem biotinylierten Primer und einem Standard-Primer durchgeführt und biotinylierte AFLP-Produkte wurden auf magnetischen Kügelchen mit Streptavidin-Überzug (Dynal) gesammelt. Anschließend wurde Minisequenzierung durchgeführt an entweder 1) dem biotinylierten Strang, der nach Denaturierung mit NaOH an den Kügelchen gebunden blieb oder 2) dem nicht-biotinylierten Strang, der von dem biotinylierten Strang durch Kochen und abpipettieren des Überstandes abgetrennt werden konnte. Danach wurde eine weitere Reinigung des Überstandes durchgeführt, indem alkalische Phosphatase von Krabben und Exonuklease I zugesetzt wurden, um jegliche(n) zurückgebliebenen Primer und dNTPs loszuwerden (Chen et al. 1997).
Die Minisequenzierungreaktion an dem biotinylierten Strang wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, 50 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 0,02% Tween-20, 2 μl von 5 μM Nachweis-Primer, 0,3 μl ³³P-markiertem ddNTP (Amersham), komplementär zu dem zu ermittelnden Nukleotid, 1 Unit Thermosequenase und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 μl ausgeführt. Die Reaktion wurde für 10 Minuten bei 50°C inkubiert, die Kügelchen wurden gewaschen und die Produkte der Minisequenzierung wurden von den Kügelchen durch Denaturierung in Formamidfarbstoff bei 94°C freigesetzt, auf Whatman-Papier getropft und für 16 Stunden auf Fuji Phosphorimage-Schirmen entwickelt. Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphorimage Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan) visualisiert.
Die Minisequenzierungreaktion an dem nicht-biotinylierten Strang wurde durchgeführt 1) auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben, jedoch wurde ein biotinylierter Nachweis-Primer verwendet: ds Produkte wurden auf magnetischen Kügelchen mit Straptavidin-Überzug (Dynal) gesammelt, die Kügelchen wurden gewaschen, auf Filter getropft und für 16 Stunden auf Fuji Phosphorimage-Schirmen entwickelt. Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphorimage Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan) visualisiert; 2) Minisequenzierungreaktionen wurden auf Glasobjektträgern mit daran gebundenen Primern durchgeführt. Die Objektträger wurden gewaschen und für 16 Stunden auf Fuji Phosphorimage-Schirmen entwickelt. Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphorimage Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan) visualisiert.
Minisequenzierung an ds DNA wurde gemäß Syvänen et al. (1900, 1993) mit den folgenden Anpassungen durchgeführt. AFLP-Reaktionen wurden durchgeführt und mit alkalischer Phosphatase von Krabben und Exonuklease I behandelt, um jegliche(n) zurückgebliebenen Primer und dNTPs loszuwerden (Chen et al. 1997). Anschließend wurde Minisequenzierung in 10 mM Tris-HCl, pH 9,5, 50 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 0,02% Tween-20, 2 μl von 5 μM Biotin-markiertem Nachweisprimer, 0,3 μl ³³P-markiertem ddNTP (Amersham), komplementär zu dem zu ermittelnden Nukleotid, 5 μl 2 μM ddNTPs, 1 Unit Thermosequenase durchgeführt. Das PCR-Profil bestand aus 35 Zyklen: 15 Min. 95°C, 30 Min. 58°C (Chen et al. 1997). Die Produkte der Minisequenzierung wurden auf magnetischen Kügelchen mit Streptavidin-Überzug (Dynal) gesammelt, die Kügelchen wurden gewaschen, auf Whatman-Papier getropft und für 16 Stunden auf Fuji Phosphorimage-Schirmen entwickelt. Muster wurden unter Verwendung eines Fuji BAS-2000 Phosphorimage Analysesystems (Fuji Photo Film Company Ltd, Japan) visualisiert.
Die Beschichtung der Glasobjektträger und die Bindung der Aminoprimer wurde wie von Guo et al. (1994) beschrieben durchgeführt. 1 μl von Primern wurde manuell getropft.
F. Ergebnisse: Verwendung von AFLP für die Ermittlung von Y-Polymorphismen.
Proben humaner DNA wurden entweder zu männlichen oder weiblichen Pools zusammengefaßt: für das Screenen der spezifisch männlichen Fragmente wurden so viele unterschiedliche männliche und weibliche Proben wie möglich in einem Pool gesammelt. Für das Screenen nach Y-Polymorphismen wurden 3 unterschiedliche männliche Pools mit zusammengefaßten DNAs von nur 1 oder 2 unterschiedlichen Populationen hergestellt, um in der Lage zu sein, quantitative Unterschiede in der Zahl, der in einem Pool vorhandenen Allele zu ermitteln.
96 EcoRI/TaqI Primer-Kombinationen wurden verwendet, um nach spezifisch männlichen Fragmente zu screenen; mit 12 von diesen EcoRI/TaqI Primer-Kombinationen wurden spezifisch männliche Fragmente ermittelt (Tabelle 1, 1). Eine Anzahl von spezifisch männlichen Fragmenten, isoliert aus AFLP-Fingerabdrücken aus Pools, wurde direkt sequenziert, um nach spezifisch männlichen Polymorphismen zwischen Pools und innerhalb der Pools zu suchen: Für Y-Polymorphismen innerhalb der Pools wurden unklare Sequenzdaten erwartet. Dieser Ansatz war nicht erfolgreich, da es schwer war, aus Chromosom Y stammende Fragmente zu isolieren, die nicht mit anderen AFLP-Fragmenten kontaminiert waren, und deshalb wurde sowieso unklare Sequenzinformation erhalten. Als eine alternative Strategie wurden spezifisch männliche Fragmente, isoliert aus AFLP-Fingerabdrücken von Pools, kloniert, und 18 Klone pro Fragment wurden sequenziert. Die Sequenzen wurden verglichen, um SNPs zu suchen. Dies wurde für 3 spezifisch männliche Fragmente durchgeführt. Auf einem oder beiden Wegen sequenzierte Y-Fragmente sind angegeben (Tabelle 1). Ein vermuteter SNP in einem Y-Fragment von 330 bp, erzeugt mit Primer-Kombination E48T46, wurde auf diese Weise ermittelt (Tabelle 2). Durch Nehmen von Fingerabdrücken der männlichen und weiblichen Individuen mit dieser Primer-Kombination wurde auch ein AFLP-Polymorphismus für dieses Fragment ermittelt (2). Es gab keine weiblichen Individuen, von denen dieses Fragment amplifiziert wurde. Der AFLP-Polymorphismus war innerhalb aller 5 Gruppen der männlichen Individuen vorhanden, jedoch wurde in vielen Fällen das Fragment schlecht amplifiziert und war schwer zu bewerten.
Tabelle 1: Primer-Kombinationen, die AFLP-Fragmente, stammend aus Chromosom Y, ermitteln. Die Größe der Chromosom Y-Fragmente ist in Basenpaaren angegeben. Chromosom Y-Fragmente, sequenziert in Pools oder sequenziert als Klone, sind angegeben.
Tabelle 2: Das vermutete SNP in Fragment E48T46-330 wie durch Sequenzierung von 18 Zufallsklonen, die dieses Fragment enthalten, bestimmt; das SNP ist an Position 97 von der TaqI-Schnittstelle des AFLP-Fragments lokalisiert.
88-GGAATGGAGTGGATTCCAAT-107(5'-3')
88-GGAATGGAGAGGATTCCAAT-107(5'-3')
G. Folgerungen
Der Polymorphismusgrad in dem humanen Chromosom Y ist extrem gering. AFLP ist eine effiziente Weise, um nach spezifisch männlichen AFLP-Fragmenten und AFLP-Polymorphismen zu screenen. Die Sequenzierung von spezifisch männlichen AFLP-Fragmenten in Pools, um SNPs zu ermitteln, war nicht erfolgreich. Die Sequenzierung von klonierten, spezifisch männlichen AFLP-Fragmenten resultierte in der Ermittlung eines vermuteten SNP, jedoch ist dieser Ansatz sehr ineffizient.
H. Ermittlung von AFLP-Markern durch Minisequenzierung
Minisequenzierung wurde als ein Verfahren zur Ermittlung von AFLP-Fragmenten erforscht. Minisequenzierung unter Verwendung von AFLP-Templat kann als ein nicht-Zufallsverfahren zur SNP-Ermittlung durch Verwendung von vorbestimmter Sequenzinformation angewandt werden. Durch das Verfahren der Erfindung, unter Verwendung von internen AFLP-Primern, kann Minisequenzierung auch angewandt werden, um SNPs zu ermitteln. Voraussetzung ist, daß wenigsten 2 Allele bekannt sind, was bei AFLP, das hauptsächlich dominante Marker erzeugt, oft nicht der Fall ist.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Genotypen von polymorphen Loci, amplifiziert in einer Mischung von Restriktionsfragmenten, die unter Verwendung von AFLP amplifiziert worden sind, wobei eine Oligonukleotidsequenz verwendet wird, die im Wesentlichen komplementär zu einem Teil eines Ziel-Restriktionsfragments ist, und benachbart (stromaufwärts) zu einem Polymorphismus lokalisiert ist, der ermittelt werden soll, wobei das Ziel-Restriktionsfragment ein Fragment ist, das dieselbe gelelektrophoretische Mobilität bei AFLP-Fingerabdrücken von wenigstens zwei verwandten Individuen aufweist, und wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) In Berührung bringen der Mischung der Restriktionsfragmente mit der Oligonukleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen, so dass, wenn das Ziel-Restriktionsfragment vorhanden ist, ein Hybrid zwischen dem Ziel-Restriktionsfragment und der Oligonukleotidsequenz gebildet wird, so dass das resultierende Hybrid wenigstens ein ungepaartes Nukleotid des Ziel-Restriktionsfragments direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz aufweist; b) Zugeben von wenigstens einem markierten Nukleotid oder Nukleotid-Analogon zu der aus Schritt a) resultierenden Mischung, unter für die Verlängerung eines Oligonukleotids geeigneten Bedingungen; so dass, wenn ein Hybrid aus dem Ziel-Restriktionsfragment und dem Oligonukleotid vorhanden ist, und dieses wenigstens eine markierte Nukleotid oder Nukleotid-Analogon komplementär ist zu dem wenigstens einen ungepaarten Nukleotid dieses Ziel-Restriktionsfragments direkt benachbart zu dem 3'-Ende der Oligonukleotidsequenz, die Nukleotidsequenz mit dem markierten Nukleotid oder Nukleotid-Analogon verlängert wird; c) Ermitteln der Gegenwart oder Abwesenheit von jeglichem/n Hybrid en) mit (einem) hinzugefügten markierten Nukleotid(en) oder Nukleotid-Analogon(a), und/oder jeglicher Oligonukleotidsequenz mit (einem) hinzugefügten markierten Nukleotid(en) oder Nukleotid-Analogon(a).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt b) ausgeführt wird, indem das Hybrid aus der Ziel-Nukleinsäuresequenz und der Oligonukleotidsequenz, unter Bedingungen zur Verlängerung der Oligonukletidsequenz, mit einer Reaktionsmischung in Berührung gebracht wird, die wenigstens zwei unterschiedlich markierte Nukleotide oder Nukleotid-Analoga umfasst, die komplementär zu nur zwei aus A, T, C oder G sind, so dass, nach der Verlängerung der Oligonukleotidsequenz, die Gegenwart eines spezifisch markierten Nukleotids oder Nukleotid-Oligonukleotidsequenz, die Gegenwart eines spezifisch markierten Nukleotids oder Nukleotid-Analogons in der verlängerten Oligonukleotidsequenz ein Anzeichen für die Gegenwart von A, T, C oder G an der entsprechenden Position des Ziel-Restriktionsfragments ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Reaktionsmischung wenigstens drei unterschiedlich markierte Nukleotide oder Nukleotid-Analoga umfasst, die komplementär zu nur drei aus A, T, C oder G sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Reaktionsmischung wenigstens vier unterschiedlich markierte Nukleotide oder Nukleotid-Analoga umfasst, die komplementär zu nur vier aus A, T, C oder G sind.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei während Schritt b) das wenigstens eine markierte Nukleotid oder Nukleotid-Analogon so ist, dass die Verlängerung der Oligonukleotidsequenz abgebrochen wird, nachdem die Oligonukleotidsequenz mit dem wenigstens einen markierten Nukleotid oder Nukleotid-Analogon verlängert worden ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei während Schritt b) die Oligonukleotidsequenz durch ein einzelnes markiertes Nukleotid oder Nukleotid-Analogon verlängert wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oligonukleotidsequenzen auf einem festen Träger immobilisiert werden, vorzugsweise in der Form einer Anordnung.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mischung der Restriktionsfragmente erhältlich ist, indem eine Anfangs-DNA mit wenigstens einem Restriktionsenzym gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine Anfangs-DNA durch wenigstens zwei Restriktionsenzyme gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei eine Anfangs-DNA durch wenigstens ein Restriktionsenzym für selten vorkommende Schnittstellen und wenigstens ein Restriktionsenzym für häufig vorkommende Schnittstellen gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei auf die Spaltung der Anfangs-DNA die Adapter-Ligation und Amplifikation (von Teilmengen von) der Adapter-ligierten Restriktionsfragmente folgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieselben Oligonukleotid-Verlängerungsbedingungen für die Hybridisierung aus Schritt a) und für die Oligonukleotid-Verlängerung aus Schritt b) verwendet werden.