DD284053A5 - Ein verfahren zur verstaerkung von nucleotiden sequenzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Methode fuer die Amplifikation eines Nucleinsaeurefragments mit unbekannter Sequenz durch Primerextension, und Kits dafuer, die die schnelle und wirksame Sequenzierung langer Nucleotidsequenzen ermoeglichen. Die Methode umfaszt die Bildung von Targetnucleinsaeurefragment/Vektoretteeinheiten durch Spaltung von Targetnucleinsaeure und anschlieszende Ligation. Eines der Nucleinsaeurefragments enthaelt eine Initiierungsstartregion mit bekannter Sequenz fuer die Hybridisierung mit einem Initiierungsprimer, und Targetnucleinsaeurefragment/Vektoretteeinheiten enthalten eine Vektorettestartregion mit bekannter Sequenz fuer die Hybridisierung mit einem Vektoretteprimer. Die Amplifikation wird durch Primerextension eines Initiierungsprimers, der an die Initiierungsstartregion der Targetnucleinsaeurefragment/Vektoretteeinheit hybridisiert wird, bewirkt.{Amplifikation Nucleinsaeurefragment; Sequenz unbekannt; Primerextension; Sequenzierung Nucleotidsequenzen, schnell; Bildung Targetnucleinsaeurefragment/Vektoretteeinheiten; Spaltung Targetnucleinsaeure; Ligation}

Description

Methode für die Amplifikation eines Nucleineäurefragments mit unbekannter Sequenz durch Primerextension und Vekiorettebibliothakskit

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Methode für die Amplifikation von Nucleotidsequenzen und Kits dafür. Eine solche Methode ist von besonderem Interesse in bezug auf die Amplifikation von Sequenzen« von denen nur ein Teil bekannt ist, und ermöglicht die schnelle und wirksame Sequenzierung langer Nucleotidsequenzen. Die Methode vermeidet die bislang für die Sequenzierung unbekannter Nucleotidsequenzen notwendigen Klonierungsverfahren rekombinanter DNA. Dadurch gestattet sie sowohl den Nachweis von Polymorphismen zwischen Nucleotidsequenzen verschiedener Allele an einem Genort als auch die gleichzeitige Analyse von Allelen an einem bestimmten Ort in verschiedenen Individuen.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Nucleotide können als einzelne Nucleotide oder Basenpaare (nachstehend bp abgekürzt) oder in Strängen von Nucleotiden vorkommen, wobei jeder Strang bis zu 10 bp oder noch mehr enthält. Es wird zum Beispiel angenommen, daß das Humangenomungefähr 3 χ IO bp und ein einzelnes Chromosom ungefähr

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IO bis 10 bp enthält. Techniken für die Sequenzierung relativ kurzer Nucleotidsequenzen existieren seit vielen Oahren und schließen das Verfahren von Maxam und Gilbert/Maxam,

A.M. Gilbart, W. (1977) "A new method for sequencing DNA" (Ein neues Verfahren zur DNA-Sequenzierung)ι Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74, 560 - 564, und "Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical cleavages" (Sequenzierung endmarkierter DNA mit basenspezifischen chemischen Spaltungen), Methods in Enzymology 65, 499 - 560 (1980)/ ein, bei dem an einem Ende, mit z. B. P, radioaktiv markierte einzelsträngige DNA mehreren chemischen Spaltungsprotokollen (beispielsweise mit Dimethylsulfat oder Hydrazin) unterzogen wird, die selektiv an einer Seite eines bestimmten Nucleotide Brüche herbeiführen. Die gewonnenen Fragmente werden durch Elektrophorese auf Acrylamidgelen nach ihrer Größe getrennt und durch Autoradiografie identifiziert. Relativ kurze Nucleotidsequenzen können auch durch die enzymatische ^HDidesoxy"-Technik von Sanger et al./Proc. Natl. Acad. Sei., USA 74,

5463-7, (1977)/ bestimmt werden, bei der das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I oder T7-DNA-Polymerase oder Taq-DNA-Polymerase verwendet wird, um in Anwesenheit der vier Desoxynucleotidtriphosphate, von denen eines oder mehrere radioaktiv mar-

kiert sind, beispielsweise mit P, und in vier separaten Inkubationsgemischen, die eine niedrige Konzentration von jeweils einem der vier Didesoxynucleosidtriphosphate enthalten, eine komplementäre Kopie der einzelsträngigen Targetsequenz zu synthetisieren. Eine Population beschnittener (truncated) radioaktiver DNA-Moleküle, die je ein gemeinsames 5'-Enda haben, aber jeweils in der Länge zu einem basenspezifisciien 3'-Ende variieren, wird somit bei jeder Reaktion gewonnen. Nach angemessener Inkubation kann die DNA in jedem Gemisch denaturiert und nebeneinander der Elektrophorese unterzogen werden, und die radioaktiven Bande einzelsträngiger DNA können durch Autoradiograf ie nachgewiesen werden. Die Sequenz der Target-DNA wird dann direkt aus dem Autoradiogramm abgelesen. Außerdem hat die Firma E.I. Du Pont de Nemours & Company (DuPont) kürzlich ein automatisches Gerät zur Sequenzierung von DNA-Strängen suf den Markt gebracht, welches eine Modifikation der obengenannten "Didesoxy"-Technik verkörpert. Diese Modifikation umfaßt die Verwendung der vier mit Fluoreszenzfarbstoffen markierten Didesoxynucleotidtriphosphatterminatoren, wobei jeder Didesoxykettenterminator bei Anregung durch einen Argonlaser Licht einer etwas anderen Wellenlänge aussendet /Science, 238, 336 (1987)/. Alle vier Didesoxynucleosidtriphosphatterminatoren können im gleichen Gefäß eingesetzt werden, weil die Terminatoren durch ihre Emissionsspektren unterschieden werden können. Das entstehende Gemisch von DNA-Fragmenten kann in einer einzelnen Spur eines Polyacrylamidgels elektrophoretisiert werden. Die Sequenz der Target-DNA kann dann automatisch gelesen werden, da die Identität des jede Bande auf dem Gel terminierenden Nucleotids durch seine charakteristische fluoreszierende Emission bestimmt wird.

Es wird eingeschätzt, daß der DuPont-DNA-Sequenzierungsautomat in der Lage ist, etwa 10 000 Nucleotide täglich unter optimalen

Bedingungen zu identifizieren; dagegen identifiziert eine Fachkraft bei Anwendung der unmodifizierten manuellen "Didesoxy"- [ Technik schätzungsweise im durchschnitt etwa 50 000 Nucleotide i im Jahr. Während das eine wesentliche Verbessei ng hinsichtlich , Geschwindigkeit und Effektivität der Bestimmung relativ kurzer Nucleptidsequenzen ist, ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Be^ctimmung relativ langer Sequenzen, beispielsweise genomischer Sequenzen, von dem Schritt abhängig, der in ; der Umgangssprache als "Chromosom-Walking" bekannt ist. "Chromosom-Walking" ist ein Verfahren, das die sequentielle Isolierung von überlappende Fragmente tragenden Klonen zur überspannung eines Segments von beispielsweise einem Chromosom, das größer ist als es in einem Phagen- oder einem Cosmid- oder einem , YAC-(^east artificial chromosome)-Vektor getragen werden kann, umfaßt. Dieses Verfahren gestattet also die Isolierung eines interessierenden Locus, für den keine Sonde zur Verfügung steht, und ist dort von besonderem Nutzen, wo der interessierende Locus · bekanntlich mit einem Locus verbunden ist, der identifiziert und kloniert worden ist, wie z. B. ein Gen oder DNA-Marker. Der identifizierte Locus kann dann als Sonde zum Screenen einer genomischen Bibliothek eingesetzt werden und hybridisiert mit einem Fragment, das komplementäre Nucleotidsequenzen enthält und daher überlappende Klone darstellt.

Solche überlappenden Sequenzen können entweaer im 5'- oder 3'-Slnn vorliegen. Ein Fragment, das gemäß Identifizierung einen überlappenden Klon darstellt, kann dann selbst als Sonde zum Rescreenen der genomischen Bibliothek verwendet werden und mit allen Fragmenten hybridisieren, die komplementäre Nucleotidsequenzen enthalten, die somit weitere überlappende Klone darstellen. Durch Wiederholung dieses Prozesses können die Nucleotidsequenzen von Regionen, die sich immer weiter von dem ursprünglich identifizierten Locus entfernt befinden, bestimmt werden, bis schließlich der interessierende Locus getroffen wird. Die Technik des "Chromosom-Walking" bringt eine Reihe potentieller Schwierigkeiten mit sich. Ein Beispiel dafür ist die Zeit,

gemessen von der Entdeckung eines Markers für eine Erbkrankheit bis zur Entdeckung des spezifischen Genschadens, der für die Krankheit verantwortlich ist. So wurde beispielsweise im Jahre 1983 ein verbundener genetischer Marker für Huntingtonnche Chorea (D4S1) entdeckt, aber noch heute ist der für diese Krankheit verantwortliche spezifische Genschaden nicht bekannt. Ähnliches gilt für viele andere Erbkrankheiten.

Die Technik des "Chromosom-Walking" leidet besonders unter dem Nachteil, daß Klonierung von genomischer DNA eine Voraussetzung ist. Unter einer Reihe von Umständen kann sich die Klonierung als unmöglich oder zumindest als sehr schwierig erweisen, und in solchen Situationen kommt der "Chromosomen-Walk" zu einem vorzeitigen Ende; A. R. Wyman und K. F. Wertmari, in: Methods in Enzymology, Bd. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Leitfaden für molekulare Klonierungsverfahren), S. L. Berger und A. R. Kümmel, Hrsg. Academic Press, San Diego, 1987, S. 173 - 180.

Außerdem ist die Analyse der Fragmente, die gemäß Identifizierung überlappende Klone darstellen, unter anderem angesichts der Anzahl solcher Fragmente, die bei jedem Screenen der genomischen Bibliothek lokalisiert werden können, und dar Tatsache, daß die überlappenden Sequenzen entweder im 5'- oder 3'-Sinn vorliegen können, kompliziert.

Ein weiteres ernstliches praktisches Problem beim "Chromosom-Walking" ist das weit verbreitete Auftreten'von sich wiederholenden Sequenzen innerhalh der menschlichen und anderen Genome. Wenn der identifizierte Locus also seiche sich wiederholenden Elemente enthält, können alle solchen Elemente im Humangenom inkorrekt als überlappende Klone identifiziert werden. Die Analyse gestaltet sich dann äußerst kompliziert.

Außerdem erzeugen alle durch "Chromosom-Walking" gewonnenen überlappenden Klone, wenn sie gemäß vorstehender Beschreibung se-

quenziert wurden« eine Sequenzinformation, die von einem einzelnen klonierten Allel von dem identifiz.'.erten Locus abgeleitet wurde. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der wichtigen genetischen Unterschiede zwischen einzelnen Vertretern einer Species und ihrer Beziehung zum Phänotyp eines Individuums wäre es von Vorteil, wenn mehr als ein einzelnes Allel auf einmal analysiert und charakterisiert werden könnte.

Ziel der Erfindung

Durch die Erfindung wird eine gegenüber dem Stand der Technik weniger aufwendige und breit anwendbare Methode für die Amplifikation eines Nucleinsäurefragments mit unbekannter Sequenz durch Primerextension sowie dafür erforderliche Kits zur Verfügung gestellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Methode für die Amplifikation eines eine unbekannte Sequenz enthaltenden Nucleinsäurefragments, wobei vor allem die aufwendige Klonierung entfallen soll, bereitzustellen.

Die Erfindung basiert auf der Entdeckung einer Methode, die zumindest teilweise die obengenannten Schwierigkeiten beseitigt, indem mittels Spaltung von Target-DNA an spezifischen Stellen außerhalb bekannter Sequenzen gewonnene Fragmente ampliziert werden, wodurch die Notwendigkeit der Klonierung überwunden wird.

Erfindungsgemäß wird eine Methode für die Amplifikation eines eine unbekannte Sequenz enthaltenden Nucleinsäurefragments

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durch Primerextension zur Verfügung gestellt, welche das Spalten einer Targetnucleineäure zur Gewinnung von Targetnucleinsäurefragmenten, von denen ein Fragment eine Initiierungeetartregion mit bekannter Nucleotidsequenz für die Hybridisierung mit einem Initiierungsprimer enthält, das Herstellen von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten aus den Targetnucleins^urefragmenten durch Ligation jeder Einheit, die eine Vektorettestartregion bekannter Sequenz für die Hybridisierung mit einem Vektoretteprimer aufweist, und das Behandeln der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten, zusammen oder schrittweise, mit geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation der Nucleosic¹-triphosphate unter Hybridisierungsbedingungen umfaßt, so daß ein Extensionsprodukt eines Initiierungsprimers synthetisiert wird, das komplementär ist zu einer einzelsträngigen Targotnucleinsäure/Vektoretteeinheit mit einer Initiierungsstartregion, an die ein Initiierungsprimer hybridisiert ist, der so ausgewählt ist, daß er im wesentlichen zu der Initiierungsstartregion komplementär ist, während kein solches Extensionsprodukt synthetisiert wird, welches zu einzelsträngigen Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheiten, die keine solche Initiierungsstartregion aufwei-

sen, komplementär ist.

Auf Wunsch kann das Extensionsprodukt der Amplifikation in An-Wesenheit eines Vektoretteprimers unterzogen werden, der so aus- ! gewählt wird, daß er im wesentlichen zu der Vektorettestartre-

! gion komplementär ist.

'; Die Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheiten werden also j mit Initiierungsprimer und, wenn das Initiierungsprimer-Exten- ' sionsprodukt amplifiziert werden soll, wie es z. B. durch R.K. j Saiki et al. , Science 2_39, 487 - 491 (1987) beschrieben wird, j zusätzlich mit Vektoretteprimer behandelt. Wo kein Vektoretteprimer verwendet wird, kann arithmetische oder lineare Amplifikation (nachstehend als lineare Amplifikation angegeben) durch ι Hybridisierung des Initiierungsprimers an die Initiierungsstartregion und anschließende Primerextension in Anwesenheit von geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbe- ; dingungen und Denaturierung erzielt werden. Dieser Prozeß des _: Startens, der Primerextension und Denaturierung kann so oft wiederholt werden, wie es zur Erreichung des gewünschten Amplifikationsgrades angemessen ist. Vorzugsweise wird die Amplifikation jedoch in Anwesenheit von sowohl Initiierungs- als auch Vektoretteprimern unter Anwendung des PCR-Verfahrens, auf. das oben Bezug genommen wurde und das nachstehend definiert wird, bewirkt.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Kit für die Amplifikation eines Nucleinsäurefragments unbekannter Sequenz durch Primerextensiun zur Verfügung gestellt, der umfaßt:

] . Mittel z'ir Spaltung einer Targetnucleinsäure an einer spezifischen Stelle zur Gewinnung eines Targetnucleinsäurefragments;

2. eine Vektorette, die für die Ligation an ein Targetnucleinsäuref ragment angepaßt ist, das durch Einsatz der Mittel zum

Spalten einer Targetnucleinsäure gemäß Definition in (1) gewonnen wurde, um dadurch im Einsatz eine Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit zu bilden, wobei die Vektorette eine Vektorettestartregion bekannter Sequenz für die Hybridisierung mit einem Vektoretteprimer aufweist;

3. jedes der vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate; und

4. ein Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate von (3).

Eine Vektorettestartregion kann im ' ektoretteteil einer Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit, wie nachstehend definiert, vorhanden sein oder nicht vorhanden sein. So kann die Vektorette (2) im Kit der Erfindung selbst keine Vektorettestartregion enthalten, vorausgesetzt, daß bei Verwendung eine Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit gebildet wird, in der der Vektoretteteil eine Vektorettestartregion enthält. So können solche Einheiten zum Beispiel entweder eine Vektorettestartregion im Vektoretteteil der Targetnucleinsäurefragment/ Vektoretteeinheit aufweisen, die durch Ligation gebildet wurde, oder sie können eine Vektorettestartregion haben, die nur als Resultat von Primerextension eines Initiierungsprimers gemäß nachstehender Beschreibung entsteht. Bezugnahmen in der gesamtsn Beschreibung auf "Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit" (auch als "Vektoretteeinheit" bezeichnet), wie nachstehend definiert, sind in diesem Sinne zu verstehen.

Vorzugsweise enthält der Kit zusätzlich einen Vektoretteprimer mit einer Nucleotidsequenz, die im wesentlichen zu der Vektorettestartregion der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit komplementär ist. Die Anwesenheit eines solchen Vektoretteprimers in dem erfindungsgemäßen Kit gestattet die Ausführung der Amplifikation der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit durch PCR-Techniken (gemäß nachstehender Definition), wenn das gewünscht wird.

Der Kit kann noch besser eine Reihe ineinandergeschachtelter ("nested") Vektoretteprimer (gemäß nachstehender Definition) enthalten, die zu'n Beispiel, wo notwendig oder erwünscht, für sekundäre Amplifikationsreaktionen und/oder für die direkte Sequenzierung der Amplifikationsprodukte gemäß Beschreibung von U.B. Gyllenstein und H. Ehrlich in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 7652 - 7656 (1988) verwendet werden können. Es versteht sich, daß alle diese Vektoretteprimer gut als direkte Sequenzierungsprimer für die durch lineare Amplifikation unter alleiniger Verwendung eines Initiierungsprimers gewonnenen distalen Enden von Fragmenten nützlich sein können.

Da die zu untersuchende Targetnucleinsäure normalerweise dem Nutzer des Kits zur Verfugung steht, werden Initiierungsprimer normalerweise nicht im Kit vorhanden sein, sondecn können vom Nutzer des Kits hergestellt werden.

Wenn es allerdings gewünscht wird, kann der erfindungsgemäße Kit zusätzlich Initiierungsprimer und auf Wunsch auch ineinandergeschachtelte Initiierungsprimer enthalten.

Der erfindungsgemäße Kit kann vorteilhafterweise auch Puffer für die Ausführung der erfindungsgemäßen Methode enthalten, wobei ein besonderes Merkmal des Kits beispielsweise die Anwesenheit von Puffern zum Variieren der Kalium-, Magnesium- und Nucleosidtriphosphatkonzentrationen des Reaktionsgemisches ist. Diese letzgenannten Puffer können für die Bestimmung der optimalen Bedingungen für nachfolgende Zyklen der erfindungsgemäßen Methode wünschenswert sein.

Vorteilhafterweise kann der Kit mehr als ein Mittel, d. h. eine Vielzahl von Mitteln, zum Spalten von je einer Targetnucleinsäure an spezifischen Stellen umfassen. Wo eine Vielzahl solcher Mittel anwesend ist, umfaßt der Kit normalerweise für jedes dieser anwesenden Mittel eine andere Vektorette, um die Bildung von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten in bezug auf jede

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Gruppe von Targetnucleinsäurefragmenten, die gewonnen werden können, zu gestatten. Obwohl die Erfindung nicht auf diese Anwendung beschränkt ist, wird die Mehrheit der verschiedenen Vektoretten vorteilhafterweise zu einem Vektoretteprimer komplementäre Sequenzen teilen. In solchen Fällen wird ein einzelner Vektoretteprimer Amplifikation aus einer Vielzahl von Targetnucleinsäurespaltstellen ermöglichen.

Bei einer bevorzugten Ausführung enthält der erfindungsgemäße Kit also zusätzlich einen oder mehrere der unter den folgenden ausgewählten Bestandteile: einen oder mehrere Initiierungsprimer, ineinandergeschachtelte(n) Vektoretteprimer, ineinandergeschachtelte(n) Initiierungsprimer, Sequenzierungsprimer, Puffer für die Durchführung der erfindungsgemäOen Methode und Puffer zum Variieren der Magnesium-, Kalium- und Nucleosidtriphosphatkonzentrationen.

Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Vektorettebibliothekskit für die Amplifikation eines Nucleinsäurefragments unbekannter Sequenz durch Primerextension zur Verfügung gestellt, der umfaßt:

1. mindestens eine Vektorettebibliothek, wobei jede Bibliothek eine Gruppe von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten umfaßt, die von Nucleotidsequenzen eines einzelnen Vertreters einer Tier-, Pflanzen- oder Mikroorganismenspecies gewonnen wurde; und

2. einen oder mehrere Initiierungsprimer für die Hybridisierung an die Initiierungsstartregion der Targetnucleinsäurefragment/ Vektoretteeinheiten.

Der Vektorettebibliothekskit umfaßt vorzugsweise eine Vielzahl von Vektorettebibliotheken.

Die Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten können zum Beispiel entweder direkt aus den gewünschten Species oder indi-

rekt aus einer solchen Species nach anfänglicher Klonierung in Plasmid-, Phagen-, Cosmid- oder YAC-C^eaat artificial £hromosome)-Vektoren hergestellt werden. Bei der verwendeten Tier-, Pflanzen- oder Mikroorganismenspecies handelt es sich vorzugsweise um die Species Mensch, aber es kann auch jede andere Tierspecies sowie Pflanzen- oder Mikroorganismenspecies wie z. B. Bakterien, Viren , Hefe oder Parasiten verwendet werden. Die Nucleotidsequenzen stammen vorzugsweise von genomischer DNA, können aber auch von sortierten Chromosomen oder Klonen stammen.

Die verwendeten Vektoretteeinheiten können entweder durch eine Einfachspaltungsmethode und/oder multiple Vektoretteeinheiten können durch Mehrfachspaltungsmethoden abgeleitet werden; zusammen oder getrennt können sie eine Vektorettebibliothek oder eine Vielzahl von Vektorettebibliotheken (gemäß nachstehender Definition) bilden.

Die verwendeten Targetnucleinsäurefragmente können von einer Reihe unterschiedlicher Quellen abgeleitet werden. So können die Targetnucleinsäurefragmente zum Beispiel von einzelnen Individuen einsr Tier-, Pflanzen- oder Mikroorganisnuinspecies gewonnen werden, beispielsweise von für ihre Species typischen Individuen. Die Targetnucleinsäurefragmente können auch von einzelnen Individuen gewonnen werden, die bekanntlich für einen gegebenen Genort heterc*ygot sind, beispielsweise einen Ort, der Zystofibrose oder eine andere Erbkrankheit verursacht. Die Targetnucleinsäurefragmente können auch von einzelnen Individuen gewonnen werden, von denen bekannt ist, daß.sie für einen gegebenen Genort, zum Beispiel Zystofibrose oder eine andere Erbkrankheit homozygot sind. Die Targetnucleinsäurefragmente können auch von einzelnen Individuen gewonnen werden, von denen bekannt ist, daß sie für einen gegebenen Genort, zum Beispiel Zystofibrose oder eine andere Erbkrankheit, normale Homozygoten sind. Die Targetnucleinsäurefragmente können auch von Gruppen von Individuen (im Gegensatz zu Einzelindividuen) mit(einem) gemeinsamen Phänotyp(en) gewonnen werden. Die Nucleinsäure oder

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! j Gewebe von jedem Vertreter einer Gruppe, die einen Phänotyp j teilt, kann auf Wunsch gepoolt werden. Jede Gruppe von Indivi-

duen besteht aus mindestens zwei und vorteilhafterweise aus we-

j niger als 1000, beispielsweise aus 50 bis 500. Vektoretteeinhei-

ten können aus den Targetnucleinsäurefragmenten hergestellt werden, und die Vektoretteeinheiten können gepoolt oder separat zur Bildung von Vektorettebibliotheken verwendet werden. Der ge-

, meinsame Phänotyp kann auf Wunsch eine Krankheit oder Krankheits-

prädisposition, obligates Tragsi einer Erbkrankheit oder ein

! normaler Zustand ohne ein Zeichen der Krankheit oder Krankheits-

I prädisposition sein.

: Der Vergleich der mit der erfindungsgemäOen Methode gewonnenen

Nucleotidsequenzen identifiziert alle gemeinsamen genetischen

; Varianten in der Population, die beispielsweise mit einer gege-

; benen Krankheit oder Krankheitsprädisposition "assoziiert" sind.

' Man wird erkennen, daß das beträchtlich über den Umfang der

ι früher unter Einsatz der RFLP-Technologie versuchten detaillier-

ί ten Analyse hinausgeht.

Der erfindungsgemäOe Vektorettebibliothekskit enthält zusätzlich vorzugsweise Vektoretteprimer und vorteilhafterweise einen oder mehrere unter ineinandergeschachtelten Initiierungsprimern, ineinandergeschachtelten Vektoretteprimern und Sequenzierungsprimern ausgewählte Primer.

Der Vektorettebibliothekskit kann auch geeigneterweise jedes einzelne von vier unterschiedlichen Nucleosidtriphosphaten und ein Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate enthalten. Auf Wunsch kann der Vektorettebibliothekskit ferner Puffer für die Ausführung der Erfindung und/oder Puffer zum Variieren der Magnesium-, Kalium- und Nucleosidtriphosphatkonzentrationen enthalten. Diese letzteren Puffer können zum Bestimmen der optimalen Bedingungen für nachfolgende Zyklen des erfindungsgemäßen Verfahrens erwünscht sein.

Die Erfindung ist breit anwendbar. So kann die Erfindung zum Bei-

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spiel angewendet werden, um Nucleotidsequenzen zu identifizieren, die für einen speziellen Mikroorganismus charakteristisch sind, wie z. B. einen Mikroorganismus, der für eine Krankheit bei Pflanzen oder Tieren, insbesondere bei Menschen, verantwortlich ist. Solche Mikroorganismen sind zum Beispiel ein Pilz, eine Hefe, ein Bakterium oder ein Virus sowie ein Parasit (wie z. B. Plasmodium (Malaria) oder_#Trypanosom (Schlafkrankheit). Die erfindungsgemäße Methode kann auch angewendet werden, um Nucleotidsequenzen zu identifizieren, die für Arzneimittelresistenz, zum Beispiel Antibiotikijmresistenz bei einem gegebenen Organismus verantwortlich sind. So gestattet die Erfindung die Erzeugung von Sonden für die Diagnose von Krankheiten bei Tieren od',-L Pflanzen und ermöglicht außerdem die Produktion von Sonden für die Diagnose von Arzneimittelresistenz.

Die Erfindung kann beispielsweise auch angewendet werden, um nachzuweisen: 1. Nucleotidsequenzvariationen zum Beispiel Punktmutationen, die für Erbkrankheiten bei Pflanzen, aber speziell bei Tieren, insbesondere beim Menschen, verantwortlich sind; 2. Nuckleotidsequenzvariationen, zum Beispiel Deletionen, die für neoplastische Krankheiten bei Tieren, insbesondere beim Menschen, verantwortlich sind; 3. Nucleotidsequenzvariationen, die für Prädispositionen gegenüber Krankheiten oder Störungen bei Pflanzen, aber speziell bei Tieren, insbesondere beim Menschen, verantwortlich sind; und 4. Nucleotidsequenzvariationen, die für ein spezifisches Merkmal wie z. B. ein erwünschtes Merkmal, zum Beispiel bei Pflanzen Blütenfarbe, Ernteertrag oder Herbizidresistenz, verantwortlich sind.

Die Erfindung kann auch bei Tieruntersuchungen Anwendung finden, beispielsweise bei der Überwachung trarisgener Tiere. Außerdem ist die Erfindung von besonderem Interesse bei der Sequenzierung eines Tiergenoms, insbesondere des Humangenoms, beispielsweise zur Identifizierung bislang unbekannter Polypeptide, die in vivo, insbesondere im Menschen, produziert werden können und die beispielsweise von therapeutischem Interesse sein können.

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Die Erfindung kann auch bei der Erzeugung pharmazeutischer Proteine von Interesse sein, beispielsweise für die Sequenzierung von Regulationsregionen von Genen oder Expresaionssystemen.

In Zusammenhang mit der Sequenzierung großer Genome, zum Beispiel des Humangenoms, wird weithin akzeptiert, daß die allgemein wahrgenommene Hauptschranke die Anfertigung physischer Karten darstellt, die überlappende "contigs" isolierter Cosmidk.one umfassen. Die gegenwärtigen Strategien für solche Kartierungsprojekte wurden in "Mapping our Genes: Genome Projects: How Big, How Fast?" (Kartierung unserer Gene: Grnomprojekte: Wie groß, wie schnell?) Congress of the United Jtates, Office of Technology Assessment, The John Hopkins Lkiversity Press, Baltimore and London (1988) im Überblick dargestellt. Weitere Details sind enthalten in: "Mapping the Human Genome: Experimental Approaches for Cloning and Ordering DNA Fragments" (Kartierung des Humangenoms: Experimentelle Methoden für die Klonierung und Ordnung von DNA-Fragmenten", R. M. Myer, Department of Physiology, University of California, San Francisco, USA, in: "Mapping our Genes Contractor Reports, Bd. 2, Bestell-Nr. PB 88-162 805/AS, verfügbar unter dem Schutz der US OTA vom National Technical Information Service (NTIS) 5285 Port Royal Road, Springfield, VA22161, USA. Eine Methode zur Kartierung des viel kleineren E.CoIi-Genoms wird dargestellt bei C. L. Smith et al. (Science, 236, 1448 - 1453. 1987) und Y. Kohara et al. (Cell, J^, 495 - 508, 1987).

Die Erfindung wird zum Beispiel auch angewendet, um große Nucleotidfragmente zu sequenzieren, die durch Klonierung in Cosmiden und YACs (yeast artificial chromosomes) gereinigt wurden. Cosmide können verwendet werden, um Nucleotidfragmente von z. B. bis zu etwa 45 kb zu klonieren, und YACs können eingesetzt werden, um Fragmente mit einer durchschnittlichen Größe von über · 300 kb zu klonieren (Nucleic Acids Research 17, 3425 - 3433 (1989) R. Anand et al.). Die Anwendbarkeit der Erfindung für die Sequenzierung solcher großen Nucleotidfragmente gestattet die

15 schnelle Sequenzierung sehr großer Nucleotidsequenzen. '

Es ist ein besonders vorteilhafter Aspekt der Erfindung, daß ' die unter Anwendung der erfindungsgemäßen Methode ausgeführte Sequenzanalyse keine Klonierung der Targetnucleinsäure in sich schließt. In der Praxis bedeutet das, daß alle in der Targetnucleirisäureprobe vorhandenen Allele gleichzeitig analysiert werden können. Die Vorteile dieser Methode für die Identifizierung von Heterozygoten sowie homozygot Normalen und Mutanten ist früher beschrieben worden, wobei die direkte Sequenzierung von PCR-Produkten zur Analyse von Mutationen (z. B. Punktmutationen), die Erbkrankheiten verursachen, angewendet wurde. (Nucleic, Acids Res., 16, 8233 - 8243 (1988) von CR. Noewton et al.). Eine Punktmutation wird im Heterozygoten leicht sichtbar gemacht, weil zwei unterschiedliche Basen entsprechende komigrierende Bande in zwei Spuren von "Didesoxy"-Sequenzierungsgel erscheinen. Die Homozygoten (normal oder mutant) bei diesem Basenpaar zeigen eine einzelne Bande, die der einen oder anderen Base in dieser Position auf einem Sequenzierungsgel entspricht.

Früher bestand eine Voraussetzung für diese Art von Sequenzanalyse auf PCR-Basis darin, daß die Sequenz der Region von Interesse im voraus durch an sich bekannte Methoden bestimmt wurde. Das gestattet die Konstruktion von PCR-Primern für die Amplifikation und die nachfolgende sich wiederholende Sequenzierung der Region von Interesse. Die Erfindung gestattet es, eine solche Analyse mit Targetnucleinsaurefragmenten zu unternehmen, deren Sequenz nicht bereits vollkommen bestimmt ist. Sequenzierung unter Anwendung der Methode der Erfindung, beispielsweise an menschlicher genomischer DNA von einem Individuum zeigt das volle Ausmaß polymorpher Differenzen zwischen den diploiden Chromosomen. Ist von dem Individuum bekannt, daß es obligat heterozygot für eine unbekannte Mutation an einem gegebenen Genort ist, dann enthüllt die Sequenzierung beider Allele (vorzugsweise gleichzeitige Sequenzierung) nach der erfindungsgemäßen Methode unumgänglich alle vorhandenen polymcrphen Basen, die daher Ursachen eines beobach-

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teten Phänotyps sein könnten. Die Bedeutung individueller polymorpher Basenveränderungen kann durch nachfolgende Untersuchung der gleichen Targetnucleinsäuresequenzen in bekannten homozygoten Normalen oder Mutanten (sowie in anderen obligat Heterozygoten) bestätigt oder widerlegt werden. Man wird ferner erkennen, daß die Erfindung einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber jetzigen Methoden auf der Basis von RFLP (.restriction .fragment length £olymorphism - Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) für die Untersuchung von Variationen zwischen Chromosomen darstellt. In jenem Fall werden nur die Basenver£nderungen nachgewiesen, die eine Restriktionsendonucleaseerkennungsstelle selten schaffen oder zerstören. Es sind Techniken für die leichte Analyse von Punktmutationen, die nicht in einem RFLP resultieren, verfügbar (Nucleic Acids Res., 17 Nr. 7, S. 2503 - 2516 (1989) von C. R. Newton et al.).

Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist ihre Nützlichkeit bei der Analyse von polygenetischen oder viele Faktoren betreffenden Krankheiten. So wäre es zum Beispiel vorteilhaft festzustellen, ob bestimmte polymorphe Varianten an bestimmten Genorten eine Prädisposition für die Entwicklung von solchen viele Faktoren betreffenden polygenetischen Krankheiten wie Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes, Schizophrenie etc. anzeigen. Frühere Versuche zur Lösung dieses Problems unter Anwendung von RFLP-Techniken haben sich im allgemeinen als erfolglos erwiesen. Das ist wahrscheinlich nicht überraschend, da sich solche Studien auf die Untersuchung bestimmter Polymorphismen stützten, die auf einer großen Zahl arbeitsintensiver Southern-Blots mittels Gensonden einzelner Kandidaten beruhten. So war der Bereich des Gesamtpolymorphismus im Humangenom, der tatsächlich auf Verknüpfung mit Krankheitsprädisposition untersucht wurde, in Wirklichkeit verschwindend klein. (Siehe "Molecular Approaches to Human Polygenic Disease" (Molekulare Methoden für die polygene Krankheit beim Menschen), Ciba Foundation Symposium 130, John Wiley, Chichester, 1987). Mit der vorliegenden Erfindung wird es möglich, Targetnucleinsäuren von einer Reihe von Individuen

mit einer gegebenen Krankheit, Krankheitsprädisposition oder einem anderen Phänotyp zu mischen. Aus solchen gepoolten Targetnucleinsäuren, zum Beispiel gepoolter menschlicher genomischer DNA, können Vektorettebibliotheken gemäß nachstehender Definition konstruiert werden. Die Erfindung gestattet die prozessive Sequenzierung dieser gepoolten genorischen DNA. Gemeinsame Pol>morphismen werden ähnlich sichtbar wie bei den Beobachtungen mit einem einzelnen Heterozygocen. Wiederum bedeutet das Fehlen jeglicher Notwendigkeit der Klonierung rekombinanter DNA, daß alle im gepoolten genomischen Material vorhandenen Allele gleichzeitig analysiert werden können. Die Anzahl der im Pool vorhandenen Einzelproben ist nicht begrenzt. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Methode zeigt einfach einen Consensus hinsichtlich Genotyp plus Polymorphismus. Ein Vergleich der auf diese Weise erzielten Ergebnisse mit ähnlichen Ergebnissen von der Analyse gepoolter genomischer DNA von Individuen, die die gegebene Krankheit, Krankheitsprädisposition oder einen anderen Phänotyp nicht zeigen, gestattet die Identifizierung von PoIymorphismen, die mit der Krankheit oder dem Phänotyp Coder umgekehrt mit einem Fehlen der Krankheit oder des Phänotyps) assoziiert sind. Die Analyse ist nicht auf den kleinen Bereich des Humangenoms dicht bei Kandidatengenen begrenzt. Diese Art der Analyse unter Anwendung uer erfindungsgemäßen Methode läßt sich weiter erleichtern, indem die amplifizierten Produkte zusammengenommen werden, die mit einem gegebenen Initiierungsprimer und einer besonderen Vektorettebibliothek, die mit Targetnucleinsäure von entweder einer "normalen" oder einer "befallenen" gepoolten Population von Individuen hergestellt wurde, gewonnen wurden. Bestehen zwischen den Populationen tatsächlich offenkundige polymorphe Unterschiede, dann würde Mischen der amplifizierten Produkte, Denaturierung und Rehybridisierung (re-annealing) doppelsträngige Amplifikationsprodukte mit Basenpaaren mit fehlender Übereinstimmung erzeugen. Solche fehlenden Übereinstimmungen (mismatches) lassen sich unter Einsatz von Reagenzien wie QsO4 oder Hydroxylamin gemäß R.G.H. Cotton, N.R. Rodrigues und R.D. Campbell PNAS, 4397 - 4401, 1988, aufdecken.

Als Hilfe für den Leser folgt ein Glossar bestimmter, in dieser Beschreibung verwendeter Termini.

Der Terminus "Target.iucleinsäurr;" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, im allgemeinen genomische DNA, zum Beispiel pflanzliche oder tierische genomische DNA wie menschliche DNA oder bakterielle DNA. Eine solche "Targetnucleinsäure^;l zum Einsatz bei der erfindungsgemä'ßen Methode umfaßt normalerweise einen Abschnitt (im allgemeinen einen kleinen Abschnitt) von bekannter Sequenz und im allgemeinen einen viel größeren Abschnitt von unbekannter Sequenz.

Der Terminus "Targetnucleinsäurefragment" bedeutet in dieser Beschreibung ein Fragment einer Taigetnucleinsäure, das durch Spaltung (wie nachstehend definiert) von Targetnucleinsäure gewonnen wurde. Der Terminus "Targetnucelinsäurefragment" ist deshalb nicht auf ein solches Fragment beschränkt, das durch die Verwendung einer Restriktionsendonuclease gewonnen wurde. Außerdem kann ein solches Fragment zum Beispiel einen Abschnitt mit bekannter Sequenz und im allgemeinen einen größeren Abschnitt mit unbekannter Sequenz umfassen, cder das Fragment kann von unbekannter Sequenz sein. Wo das Fragment von unbekannter Sequenz ist, können Spaltung und Erzeugung von Tragetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten gemäß nachstehender Beschreibung ausgeführt werden. Unter solchen Umständen können Zufalls-DNA-Sonden aus dem viel größeren genomischen Fragment durch lineare Amplifikation mit einem "Zufalls"-Initiierungsprimer oder Amplifikation mit einem Zuf alls-Initiieruncisprimer plus Vektoretteprimer erzeugt werden. Durch spezifische Amplifikation entstehen Fragmente in zufälliger Weise, die gereinigt und bei der genetischen Kartierung verwendet werden können, vgl.: Cell 51, 319 - 337 (1987) H. Donis-Keller et al.

Der Terminus "Amplifikation" bezieht sich hierin auf die Replikation einer Nucleotidsequenz und/oder ihre komplementäre Sequenz durch nichtbiologische Mittel und schließt somit Amplifi-

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kation unter Verwendung eines Initiierungsprimers allein ein, wobei sin solcher Primer an die Initiierungsstartregion einer Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit hybridisiert wird, i Primerextension in Anwesenheit von geeigneten Nucleotidtriphosphaten unter Hybridisierungsbedingungen und einem Agens für die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten bewirkt wird, sich Denaturierung an eine solche Primerextension anschlieOv, und dieser Prozeß von Starten, Primerextension und Denaturierung so oft wiederholt wird, wie es zur Erzielung eines gewünschten Amplifikationsgrades angemessen ist. Der Terminus "Amplifikation" umfaßt auch die Replikation durch Polymerasekettenreaktionstechniken (PCR-Techniken), wie sie beispielsweise von R.K. Saik.i et al. in Science ^39, 487 - 491 (1987) una in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben wurden, wobei ein Initiierungsprimer und ein Vektoretteprimer gemäß nachstehender Definition verwendet werden und die Expressionspolymerasekettenreaktionstechnik oder PCR-Technik, wie sie hier angewendet werden, sich auf solche Techniken beziehen, wie sie in diesen Referenzen beschrieben werden.

Der Terminus "nicht-biologisch" schließt hier nur Amplifikation durch direkte Klonierung und Vermehrung von Bakterienkolonien aus. Man wird also erkennen, daS der Terminus Amplifikation hierin solche Amplifikationsprozesse einschließt, wie sie in der PCT-Patentveröffentlichung WO 87/06270 (oder Biotechnology Bd. 6, Oktober 1988), PCT-Patentveröffentlichung WO 88/10315 oder PCT-Patentveröffentlichung WO 09/01050 beschrieben werden.

Der Terminus "Spalten" betrifft hierin die Spaltung einer Nucleinsäure an einer spezifischen Stelle. Eine solche Spaltung wird geeigneterweise unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease, vorzugsweise eines 6bp-Cutters, der eine bekannte Erkennungssequenz und ein bekanntes Spaltungsmuster und folglich das Merkmal aufweist, DNA an spezifischen Stellen zu spalten, bewirkt.

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In dieser Hinsicht wird die Position dieser "spezifischen Stellen" in einer gegebenen Targetnucleinsäure im Verhältnis zur j Position eines anderen bekannten Elementes in der Targetnuclein-; säure normalerweise nicht bekannt sein, aber die Sequenz der spezifischen Stellen wird ebenso bekannt sein wie ihre Spaltungsmuster. Folglich werden die terminalen Sequenzen der gewonnenen Restriktionsfragmente bekannt sein. So erkennt zum

j Beispiel die Restriktionsendonu :lease EcoRI die Sequenz:

-G|_AATTC- -G + AATTG-

TI G- ^y -CTTAA G-

und spaltet eine solche Sequenz wie angegeben, so daß Restriktionsfragmente mit den angegebenen kohäsiven Enden entstehen. Da die Sequenz des kohäsiven Endes bekannt ist, ist es möglich, auf der Basis dieser Kenntnis Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten gemäß nachstehender Beschreibung in bezug auf den Ausdruck "Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit" zu erzeugen. Mittel zur Spaltung einer Targetnucleinsäure an einer anderen spezifischen Stelle als einer Restriktionsendonuclease können eingesetzt werden, aber die Verwendung einer Restriktionsendonuclease wird bevorzugt. Jede passende Restriktionsendonuclease kann verwendet werden. Beispiele für einzelne Restriktionsendonucleasen schließen jene ein, die im einzelnen angegeben sind in:

Nucleic Acids Research, Sequences Supplement, Band 16, 1988, S. r271-r313, und in: Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988" (Laufende Protokolle der Molekularbiologie 1987-1988), herausgegeben von Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moor, D.D., Smith, J.A., Seidman, J.G und Struhl, K., Wiley Interscience, Section 3, Tabelle 3.1.1. Restriktionsendonucleasen, die in der LagR sind, Fragmente mit kohäsiven Enden zu erzeugen, wie z. B. EcoRI, Hind III und Xbal, sind geeignet, egal, ob die kohäsiven Enden 5'- oder 3'-Uberhänge haben. Es versteht sich auch, daß ebenso wie durch die Verwendung von Restriktionsendo-

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nucleasen, die in der Lage jind, Fragmente mit entweder einem überhängenden kohäsiven 3'- oder 5'-Ende zu erzeugen, die Produktion von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten auch unter Einsatz von Restriktionsendonucleasen möglich ist, die stumpfendige Fragmente in Verbindung mit geeigneten stumpfendigen Vektoretten gemäß nachstehender Definition erzeugen. Andere Mittel zur Spaltung einer Targetnucleinsäure bei (einer) spezifischen Stelle(n) als durch Standardrestriktionsendonucleasedigestion sind im Fachgebiet bekannt und schließen beispielsweise die Verwendung von Adapterprimern und Restriktionsenzymen der Klasse H-S (S.C. Kim et al., Science, 240, 504-506 (1988), W. Szybalski, Gene, 40, 169 (1985); A.J. Podhajska und W. Szybalski, Gene, 40, 175 (1985)) sowie verschiedene chemische Methoden ein (B.L. Iverson und P.B. Dervan, J. Amer. Chem. Soc., 109, 1241-1243 (1987); G.B. Dreyer und P.B. Dervan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 968 (1985); V.V. Vlassov et al., Nucleic Acids Res. , 14, 4065 (1986); H.E. Moser und P.B. Dervan, Science, 238, 645 (1987); D.R. Corey und P.G. Schultz, Science, 238, 1401 (1987); 3. P. Sluka et al., Science, 238, 1129 (1987)).

Außerdem ist es möglich, Targetnucleinsäurefragmente stumpfendig zu machen, und zwar entweder durch DNA-Polymerase vermittelte Einfüllung/Reparatur irgendwelcher überhängenden kohäsiven 5'-Enden oder durch Entfernung von 3'- und/oder 5'-Überhängen unter Verwendung von durch Sl-Nuclease vermittelter Einzelstrangdigestion j unabhängig davon, ob sie durch Restriktionsenzymdigestion oder andere (z. B. chemische) Mittel erzeugt werden. Alle diese stumpfendigen Fragmente können durch Anheftung der entsprechenden stumpfendigen Vektorette in Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheiten umgewandelt werden.

Der Ausdruck "Initiierungsstartregion" bedeutet, wie er hier verwendet wird, den Teil eines gespaltenen, zum Beispiel Restriktionsenzym-digerierten Targetnucleinsäurefragments, der eine bekannte Nucleotidsequenz aufweist und an den bei Verwendung ein Initiierungsprimer und, auf Wunsch, ineinandergeschach-

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telte(r) Initiierungsprimer (wie nachstehend definiert), zum Beispiel überlappende(r) ineinandergeschachtelte^) Initiierungsprimer hybridisieren kann (können). Im allgemeinen wird die erfindungsgemäße Methode so ausgeführt, daß nur eines der vorhandenen Targetnucleinsäurefragmente eine Initiierungsstartregion hat. Eine Ausnahme wäre die Verwendung eines Gemisches aus eij ner Vielzahl von verschiedenen Vektorettebibliotheken gemäß

i nachstehender Definition.

j Der Ausdruck "Vektorettestartregion"bedeutet hierin jenen Teil der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretceeinheit, der eine bekannte Nucleotidsequenz aufweist, wie es durch die Vektorette selbst definiert ist, und an den bei Verwendung der Vektoretteprimer und, auf Wunsch, ineinandergeschachtelte^]) Vektoretteprimer (gemäß nachfolgender Definition), zum Beispiel überlappende(r) ineinandergeschachtelte(r) Vektoretteprimer hybridisieren kann (können). Die Vektorettestartregion ist in dem Strarg komplementär zu dem Strang vorhanden, der die Initiierungsstartregion enthält. In dieser Hinsicht kann die "Vektorettestartregion", an die der Vektoretteprimer und, auf Wunsch, ineinandergeschachtelte^) Vektoretteprimer hybridisieren, entweder in der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit vorhanden sein, die durch Ligation hergestellt wurde, oder in einer Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheit , die durch Primerextension eines Initiierungsprimers hergestellt wurde, oder in beiden. Somit wird man erkennen, daß der Vektoretteprimer und, auf Wunsch, der (di e) ineinandergeschachtelte(r) Vektoretteprimer zum Einsatz bei der erfindungsgemäßen Methode für die Hybridisierung mit einer Vektorettestartregion ausgewählt werden können, die zum Beispiel erst im Anschluß an die Primerextension eines Vektoretteprimers und, auf Wunsch, ineinandergeschachtelten(r) Initiierungsprimers generiert werden kann. Eine Folge davon ist, daß beispielsweise die Vektorette selbst kein vollkommen selbstkomplementäres doppelsträngiges DNA-Fragment zu sein braucht.

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I j

J Der Terminus "Primer" bezieht sich hierin auf ein Oligonucleotid, j und zwar entweder ein natürlich vorkommendes wie in einem gerei-

j nigten Restriktionsdigest oder ein synthetisch erzeugtes, das in der Lage ist, als Initiierungspunkt der Synthese zu wirken, wenn j es unter Bedingungen gebracht wird, unter denen die Synthese j eines Primerextensionsproduktes, das zu einem Nucleinsäurestrang ¹ omplementär ist, induziert wird, d. h. in Anwesenheit geeigneter Nucleosidtriphosphate und eines Agens für die Polymerisation wie z. B. DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer ("Puffer" schließt pH, Ionenstärke, Kofaktoren etc. ein) und bei einer geeigneten Temperatur.

! Der Primer ist für maximale Wirksamkeit bei der Extension vorzugsweise einzelsträngig, kann aber wahlweise auch doppelsträngig sein. Ist der Primer doppelsträngig, wird er vor seiner Ver-Wendung zur Herstellung von Extensionsprodukten zuerst behandelt, um seine Stränge zu trennen. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß zum Starten der Synthese von Extensionsprodukten in Anwesenheit des Agens für die Polymerisation ausreichend lang sein. Die exakten Primerlängen sind von vielen Fktoren einschließlich Temperatur und Primerquelle und Verwendungsmethode abhängig. In Abhängigkeit von der Komplexität der Targetsequenz werden die Initiierungs- und Vektoretteprimer typischerweise 15 bis 35 Nucleotide enthalten, obwohl sie auch mehr oder weniger Nucleotide enthalten können. Kurze Primermoleküle erfordern im allgemeinen niedrigere Temperaturen zur Bildung ausreichend stabiler Hybridkomplexe mit der Matrize.

Der Terminus "Initiierungsprimer" bezieht sich hierin auf einen Primer, der zur Hybridisierung mit der Initiierungsstartregion gemäß vorstehender Definition fähig ist. Bei Verwendung beispielsweise mit Vektoretteeinheiten, die aus totaler menschlicher genomischer DNA hergestellt werden, kann es besser sein, wenn der "Initiierungsprimer" länger als 15 bis 17 Nucleotide ist, um zu vermeiden, daß zufälliges Hybridisieren oder Starten an im Humangenom vorhandenen Sequenzen erfolgt, die zufällig mit denen der

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Initiierungsstartregion überei.istimmen.

Der Terminus "Vektoretteprimer" bezieht sicn hierin auf einen Primer, der zur Hybridisierung an die Vektorettestartregion der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit fähig ist. Der "Vektoretteprimer" wird eine derartige Nucleotidsequenz aufweisen, daß er in der Lage ist, an ein Initiierungsprimerextensionsprodukt, nach Trennung von seinem Komplement, zu hybridisieren, wodurch das Initiierungsprimerextensionsprodukt als Matrize für die Synthese eines Extensionsproduktes des Vektoretteprimers dient und dabei die .Amplifikation erleichtert. Da die erfindungsgemäße Methode im allgemeinen so ausgeführt wird, daß nur eine der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten eine Initiierungsstartregion aufweist, wird nur diese Einheit der Amplifikation unterzogen. Jene Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten, die keine Initiierungsstartregion aufweisen, werden nicht zur PCR-Amplifikation in der Lage sein, da, wenn auch die Bildung eines Vektoretteprimerextensionsproduktes möglich sein kann, kein Initiierungsprimer in der Lage sein wird, an das Vektoretteprimerextensionsprodukt zu hybridisieren, weil keine Initiierungsstartregion vorhanden ist und somit keine PCR-Amplifikation möglich ist.

Im Einsatz wird es vorgezogen, wenn die Synthese von Vektoretteprimeramplifikationsprodukten von der anfänglichen Synthese eines Extensionsproduktes des Initiierungsprimers abhängig ist. Das vermeidet die Bildung großer Mengen nichtamplifizierbarer Vektoretteprimerextensionsprodukte, von denen erwartet werden kann, daß sie die verfügbaren Nucleosidtriphosphate oder andere Kofaktoren im Reaktionsgemisch nachteilig erschöpfen.

Der Terminus "ineinandergeschachtelter Primer" bedeutet hier einen Primer, der durch einen oder mehrere Basenpaare in der 3'-Richtung weg vom 5'-Terminus des Initiierungsprimers oder in der 3'-Richtung weg vom 5'-Terminus des Vektoretteprimers oder in der 3'-Richtung weg vom 5'-Terminus beider solcher Initiierungs- und

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Vektorettcprimer verschoben ist. Es versteht sich, daß die Sequenz ties oder der ineinandergeschachtelten Primer(s) notwendigerweise aus der Sequenz, die zu den bekannten Initiierungs- oder Vektorettestartregionen komplementär ist, oder aus diesen beiden Regionen ausgewählt wird.

Der Terminus "Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit" (hierin auch als "Vektoretteeinheit" bezeichnet) bezieht sich in dieser Beschreibung auf eine Nucleotidsequenz, zum Beispiel eine DNA-Sequenz, die ein Targetnucleinsäurefragment und einen Abschnitt mit bekannter Nucleotidsequenz, beispielsweise eine DNA-Sequenz, umfaßt, wobei der Abschnitt in einzelsträngiger Form zur Hybridisierung an einen Vektoretteprimer gemäß vorstehender Definition fähig ist. In dieser Hinsicht wird man verstehen, daß die "Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit"· zur Hybridisierung an einen Vektoretteprimer in der Lage sein kann, entweder aufgrund des Vorhandenseins eines Abschnitts mit bekannter Nucleotidsequenz in der obengenannten Einheit, wobei die Sequenz im wesentlichen zu der Sequenz ded Vektoretteprimers komplementär ist, oder aufgrund der Fähigkeit eines Initiierungsprimerextensionsproduktes - auf der Basis eines Stranges der obengenannten Einheit als Matrize - eine mit der Sequenz des Vektoretteprimers im wesentlichen komplementäre Nucleotidsequenz zu umfassen. Es versteht sich in diesem Zusammenhang, daß die "Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheit" so aussieht, daß sie in einem Strang mindestens teilweise im wesentlichen die gleiche Sequenz aufweist wie der Vektoretteprimer. Dieser Strang enthält auch die Initiierungsstartregion.

Der Abschnitt mit bekannter Nucleotidsequenz, zum Beispiel DNA-Sequenz, kann von jeder geeigneten Quelle abgeleitet werden, vorausgesetzt, daß er die obengenannte Forderung erfüllt, daß er in einzelsträngiger Form an den Vektoretteprimer hybridisierungsfähig ist. So kann die Vektorette zum Beispiel separat unter Verwendung eines DNA-Synthesisers hergestellt und die gewonnene Vektorette an das (die) Targetnucleinsäurefragment(e) ligiert

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werden, um die Targetnucleinsäurefragment/VektoretteeinheitCen) zu gewinnen. Insofern wird die Vektorette in geeigneter Weise für die Ligation an das (die) Nucleinsäurefragment(e) angepaßt, ; beispielsweise hybridisiert ein kohäsives Ende an dem (den) Targetnucleinsäurefragment(en) mit einem kohäsiven Ende an der Vektorette zur Bildung einer Vektoretteeinheit gemäß vorstehender Definition, oder ein stumpfendiges Targetnucleinsäurefragment kann zur Bildung einer Vektoretteeinheit gemäß vorstehender Definition an eine stumpfendige Vektorette ligiert werden. Es ist jedoch nicht rotwendig, daß die Vektorette vor der Ligation mit dem Targetnucleinsäurefragment vorgebildet wird, wenngleich das bevorzugt sein kann. So kann die obengenannte Einheit zum FJeispiel in einem entsprechenden Fall durch Ligation einer einzelsträngigen DNA an das Targetnucleinsäurefragment hergestellt werden, indem beispielsweise der Überhang des kohäsiven Endes be-, nutzt wird, um eine erste einzelsträngige DNA daran zu knüpfen, ^: und dann gestattet wird, daß eine zweite einzelsträngige DNA so ligiert wird, daß die erwünschte Einheit entsteht.

: Bei einem Ausführungsbeispiel der Erfindung enthält die Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheit einen blockierenden Vektoretteabschnitt. Der Terminus "blockierende Vektorette" bezieht sich hierin auf eine Vektorette oder den Vektoretteabschnitt einer Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit, in der eine oder beide freie terminale Basen in modifizierter Form vorliegen, um Ligation von Nucleotiden daran zu verhindern oder um Primerextension zu verhindern, zum Beispiel in Anwesenheit geeigneter Nucleosidtriphosphate und eines Mittels für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen. Solche Modifikationen sind an sich bekannt und können zum Beispiel in der Anwesenheit eines Didesoxynucleosids bestehen. So kann zum Beispiel die doppelsträngige blockierende Vektorette ein 3'-terminales Didesoxynucleosid wie Didesoxyadenosin (ddA) aufwsisen. Eine solche Modifikation kann auch Ribonucleoside einschließen, bei denen das Giol der Ribose gespalten ist, z. B. Periodat

Wahlweise kann ein 3' -Desoxynucleosid, beispielsweise ein 3'-De-

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so nucleosid, beispielsweise ein 3'-Desoxyadenosinrest am 3¹-Terminus angefügt werden, wobei z. B. Cordycepintriphosphat und j terminale Transferase verwendet werden. Als weitere Alternative j können, durch an sich bekannte Methoden, chemisch eine 3'-Amino-I oder 3'-Thiofunktionalität am 3'-Ende eingeführt werden.

' Bei einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt eine j Vektorette oder ein Vektoretteabschnitt zwei teilweise hybridisierte einzelsträngige Sequenzen, die einen solchen Grad an ι Nichtkomplementärität besitzen, daß die Vektorettepiimerextension nicht unter Einsatz einer solchen Vektorette bewirkt werden kann.

[ Ger Terminus "Nucleosidtriphosphat" bezieht sich hierin auf die

Triphosphate von Nucleosiden, die entweder in DNA'oder RNA vor-

' handen sind und daher Nucleoside einschließen, die Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil als Base umfassen, wobei die Zukkerkomponente Desoxyribose oder Ribose ist. Im allgemeinen werden

die Desoxyribonucleoside in Kombination mit einer DNA-Polymerase : verwendet. Es versteht sich jedoch, daß andere modifizierte Basen, die mit einer der herkömmlichen Basen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil zur Basenpaarung fähig sind, eingesetzt werden können. Solche modifizierten Basen schließen beispielsweise 7-Deazaguanin und Hypoxanthin ein.

Der Terminus "Nucleotid", wie er hierin verwendet wird, kann sich auf Nucleotide beziehen, die entweder in DNA oder RNA vorhanden sind und daher Nucleotide einschließen, die Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil als Base umfassen, wobei die Zuckerkomponente Desoxyribose oder Ribose ist. Es versteht sich jedoch, daß andere modifizierte Basen, die zur Basenpaarung mit einer der herkömmlichen Basen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil fähig sind, in dem bei der Erfindung eingesetzten Initiierungsprimer und Vsktoretteprimer verwendet werden können. Solche modifizierten Basen schließen beispielsweise 7-Deazaguanin und Hypoxanthin ein.

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Das Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate kann jede Verbindung oder jedes System sein, welches die Synthese von Primerextensionsprodukten einschließlich Enzymen bewirkt. Zu geeigneten Enzymen für diesen Zweck zählen zum Beispiel: E.coIi-DNA-Polymerase I (Richardson CC. et al., J. Biol. Chem. 239, 222 (1964)), Klenow-Fragment von E.coli-DNA-Polymerase I (Jacobsen, H. et al., Eur. J. Biochem. 45, 623-627 (1974)), T4-DNA-Polymerase (Panet, A. et al., Biochemistry 12, 5045-5050 (1973)), T7-DNA-Polymerase (Tabor, S. und Richardson CC, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 4767-4771 (1987)), andere verfügbare DNA-Polymerasen, Reverse Transkriptase und andere Enzyme einschließlich thermostabile Enzyme. Der Terminus "thermostabiles Enzym" bezieht sich entsprechend seiner Anwendung in dieser Beschreibung auf ein Enzym, das gegenüber Wärme relativ stabil ist und wärmebeständig ist und die Kombination der Nucleotide in der richtigen Weise katalysiert (erleichtert), damit die PrJmerextensionsprodukte, die zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär sind, gebildet werden. Im allgemeinen wird die Synthese em 3'-Ende iedes Primers initiiert und verläuft in der 5'-Richtung den Mafcrizenstrang entlang, bis die Synthese aufhört, wobei im allgemeinen Moleküle unterschiedlicher Länge erzeugt werden. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung endet die Synthese im allgemeinen an einer Position, die durch die Targetnucleinsäurespaltstelie bestimmt wird, und es entstehen Moleküle der gleichen Länge. Es können jedoch Enzyme, einschließlich thermostabile Enzyme auftreten, die die Synthese am 5'-Ende initiieren und in der anderen Richtung fortfahren, wobei ein ähnliches Verfahren angewendet wird, wie es oben beschrieben ist. Ein bevorzugtes thermostabiles Enzym, welches bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, wird aus Thermus aquatxjus extrahiert und gereinigt und hat eine relative Molekülmasse von etwa 86 000 bis 90 000 Dalton, wie in der EP-Veröffentlichung Nr. 237,362 beschrieben (siehe auch EP-Veröffentlichung Nr. 258,017). Thermus-aquaticus-Stamm YTl ist oh-ne Beschränkung von der American Type Culture Collection, J2301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA als ATCC 25,104 erhältlich.

Es leuchtet ein, daß DNA-Polvmerasen mit besseren oder vorteilhafteren Eigenschaften durch Zufallsmutation von diese Proteine exprimierenden Klonen gewonnen werden können. Es wäre beispielsweise offensichtlich günstiger, eine mutierte Version doppelsträngiger DNA zu erhalten, die Taq-DNA-Polymerase codiert, was die Expression eines Proteins mit besseren Eigenschaften, wie z. B. Fehlen von 5'-Exonucleaseaktivität, zur Folge hätte. Techniken zur Gewinnung solcher erwünschten mutierten Versionen sind bekannt und dem durchschnittlichen Molekularbiologen geläufig .

Der Terminus "komplementär" wird hier in bezug auf Nucleotide verwendet und bedeutet ein Nucleoti'J, das bei Einschluß in DNA oder RNA mit einem anderen spezifischen Nucleotid ein Basenpaar bildet. So ist Desoxyadenosintriphosphat komplementär zu Thymidintriphosphat und Desoxyguanosintriphosphat ist komplementär zu Desoxycytidintriphosphat, während Desoxyguanosintriphosphat nicht zu Thymidintriphosphat komplementär ist. Es versteht sich in diesem Zu3ammf?.ihang, daß Thymidintriphosphat und Desoxyguariosintriphosr^lidt zwar unter bestimmten Umständen Basenpaare bilden können, aber für die Zwecke dieser Beschreibung nicht als komplementär angesehen werden.

Die Primer werden hierin so ausgewählt, daß sie "im wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen zu extendierenden oder amplifizierenden Sequenz sind. Das bedeutet, daß die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren entsprechenden Strängen zu hybridisieren. Deshalb brauchen die Primersequenzen nicht die exakte Sequenz ihror Matrizen widerzuspiegeln, obgleich das normalerweise am besten wäre.

Der Terminus "Ve<torettebibliothek" wird hier verwendet, um auf die Vielzahl vor Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten B.ⁿzug zu nehmen, die nach Spalten einer Targetnucleinsäure an ;llen potentiellen Spaltstellen in bezug auf eine gegebene Re-

striktionsendonuclease, die die Targetnucleinsäure enthält, und ierstellen von Targetnucleinsäurefriigment/Vektoretteeinheiten aus dem Gesamtgemisch von Targetnucleinsäurefragmenten durch Zyklen von Ligation an einen in geeigneter Weise angepaßten Vektoretteabschnitt (und, falls erforderlich, wiederholte Spaltung) gewonnen werden. Im allgemeinen wird nur eine einzelne Vektoretteeinheit in einer gegebenen Vektorettebibliothek die Initiierungsstartregion von Interesse enthalten. Im Falle von menschlicher genomischer DNA, die mit einer eine spezifische 6-bp-Sequenz (ein 6-bp-Cutter) erkennenden Restriktionsendonuclease gespalten wird, betrage die durchschnittliche Größe der entstehenden Targetnucleinsäurefragmente 4096 bp, und die Targetnucleinsäure erzeugt ungefähr 10 solcher Fragmente. Folglich wird eine etwa 10 Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten enthaltende Vektorettebibliothek aus humaner genomischer, mit einer 6-Dp-Cutter-Restriktionsendonuclease gespaltener DNA gewonnen, und nur eine solche Vektoretteeinheit in der gesamten Human-Vektorettebibliothek wird eine gegebene Initiierungsstartregion enthalten, die zur Initiierung der Amplifikation in Anwesenheit eine Initiierungsprimers, auf Wunsch eines Vektoretteprimers, geeigneter Nucleosic'triphosphate und eines Agens für nie Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen in der Lage ist.

Verschiedene Vektorettebibliotheken können aus der gleichen Tai'getnucleinsäure durch Spaltung mit unterschiedlichen Restrikticnsendonucleasen und Ligation von entsprechend angepaßten Vektoretteabschnitten zur Erzeugung von Target'nucleinsäuref ragment/ Vektoretteeinheiten hergestellt werden. Alle verfügbaren Restriktionsendonucleasen können, wenn gewünscht, bei diesem Prozeß eingesetzt werden, und in Grenzen kann ein Vektoretteabschnitt an jeder Restriktionsenzymerkennungsstelle in der Targetnucleinsäure an Targetnucleinsäurefragmente ligiert werden. Dieses Merkmal ist nicht immer erwünscht, da im Idealfall die Initiierungsstartregion von Interesse in einer gegebenen Vektorettebibliothek durch 100 Basenpaare oder mehr von der Anheftungsstelle des

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Vektoretteabschnitts getrennt sein wird

Das kommt daher, weil Initiierungsprimerextensionsprodukte oder · Initiierungsprimer/Vektoretteprimeramplifikationsprodukte un- ; terhalb dieser Größe in e'er erfindungsgemäßen Praxis so geringe Sequenzinformationen erzeigen, daß sie von wenig Wert für die effiziente Sequenzierung langer Nucleotidsequenzen sind. Außerdem wird die Nucleotidseqcenz solcher kleinen Produkte in den Produkten enthalten sein, die unter Verwendung einer Vektorettebibliothek gewonnen wurden, in der der Iriitiierungsprimer weiter von der Vektoretteabschnittanheftungsstelle entfernt ist. Die Verwendung einer Vielzahl unterschiedlicher Vektorettebibliotheken mit rinem besonderen Initiierungsprimer gestattet die Identifizierung jener Bibliotheken, bei d.enen Extensions- oder Amplifikationsprodukte von angemessener Größe für die Sequenzierung sind. Beispielsweise kann es besonders günstig sein, Initiierungsprimerextensions- oder -amplifikationsprodukte von ungefähr 200 bp, 400 bp, 600 bp, 800 bp, 1000 bp usw. auszuwählen, die mit einem gegebenen Initiierungsprimer von speziellen Vektorettsbibliotheken gewonnen wurden. Die Sequenzierung solcher Produkte aus den Vektorettebibliotheken, in denen sie für einen gegebenen Initiierungsprimer vorkommen, unter Verwendung eines Vektorette- oder ineinandergeschachtelten Vektorettesequenzierungsprimers und an sich bekannten Methoden erzeugt wahrscheinlich überlappende Sequenzdaten für eine große Hegion an der 3'-Seite des Initiierungsprimers. Der Umfang der Sequenzdaten, die in einer Analyserunde von einer Vielzahl von Vektorettebibliotheken mit einem gegebenen Initiierungsprimer erzeugt werden, wird nur durch die Größe der Initiierungsprimerextensions- oder -amplifikationsprodukte, die in der Praxis gewonnen werden können, und/oder durch den Abstand (von der Initiierungsprimerregion) zur entferntesten, in der Vielzahl von Vektorettebibliotheken repräsentierten Restriktionsendonucleasestelle begrenzt.

In einem vorteilhaften Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen

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j Verfahrens werden die Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten aus Targetnucleinsäurefragmenten durch Ligation so hergestellt, daß die Vektorette nicht von der Targetnucleinsäure- | fragment/Vektoretteeinheit abgespalten werden kann, die durch das gleiche Agens gebildet wurde, das zur Spaltung der Targetnucleinsäure zur Gewinnung von Targetnucleinsäurefragmenten ver- wendet wurde. Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Targetnuc- ; leinsäure mit einer Restriktionsendonuclease gespalten wird, um ein Targetnucleinsäurefragment zur Ligation an eine Vektorette zu erhalten, wobei die Sequenz der Vektorette so ausgewählt wird, daß die Restriktionsendonucleaseerkennungssequenz der Restriktionsendonuclease in der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit nicht vorhanden ist, zum Beispiel im Fall des oben beschriebenen EcoRl,

-GAATTC -G + AATTX-

-CTTAAG > -CTTAA Y- " ^Vektarette

Targetnucleinsäurefragment

wo X jedes Nucleosid außer C ist und Y sein komplementäres Nucleosid ist.

Die Erfindung kann so ausgeführt werden, daß die Synthese von Primerextensionsprodukten oder vorzugsweise Vektoretteprimersamplifikationsprodukten von der anfänglichen Synthese eines Extensionsproduktes des Initiierungsprimers abhängig ist.

Das kann zum Beispiel durch lineare Amplifikation oder vorzugsweise durch den Einsatz eines Vektoretteprimers erzielt werden, der nur in der Lage ist, an das Extensionsprodukt des Initiierungsprimers zu hybridisieren. So umfaßt dar Vektoretteteil der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit einen doppelsträngigen Abschnitt mit einem ersten und einem zweiten Strang, wobei der erste Strang eine terminale Polymerisationsblockierkomponente aufweist und der zweite Strang, der an jenen Strang des Tar-

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getnucleinsäurefragments mit der Initiierungsstartregion ligiert ι ist, einen einzelsträngigen Abschnitt trägt, wobei die terminale j Polymerisationsblückierungskomponente so wirkt, daß Extension des ersten Stranges verhindert wird, um ein Komplement zu dem einzelsträngigen Abschnitt des zweiten Stranges in Anwesenheit ^: geeigneter Nucleosidtriphosphate und eines Agens für die PoIy-J merisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedin-' gungen zu bilden. Der Vektoretteprimer ist somit unfähig zur ; Hybridisierung an die Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteein-

heit, aber fähig zur Hybridisierung an das Extensionsprodukt des Initiierungsprimers. Also werden bis zur Erzeugung eines Exten- : sionsproduktes des Initiierungsprimers keine Vektoretteprimerextensionsprodukte gewonnen, wonach die gewonnenen Extensionsprodukte normalerweise einen Abschnitt einschließen, der komple- ; mentär zu der (den) bekannten Nucleotidsequenz(en)' des einzel- ^: strängigen Abschnitts des zweiten Stranges ist. Dieses vorteilhafte Ausführungsbeispiel wird in nachstehender Figur 6 veran- schaulicht.

Die Polymerisationsblockierkomponente verhindert erfolgreich die ; Polymerisation einer Nucleotidsequenz aus einem Primer zur Bildung des Komplements einer Matrizennucleotidsequenz in Anwesenheit eines Agens für die Polymerisation von Nucleotidtriphosphaten wie tiner DNA-Polymerse, zum Beispiel Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, T7-DNA-Polymerase oder Taq-DNA-Polymerase. Die Polymerisationsblockierkomponente kann jede geeignete Gruppe sein, die für diesen Zweck bekannt ist, wie zum Beispiel ein geeignetes modifiziertes Nucleosid, beispielsweise ein Didesoxynucleosid oder ein 3'-Desoxynucleosid wie Cordycepin oder eine 3'-Amino- oder eine 3¹-Thiofunktionali⁺?l.

Bei einem weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt der Vektoretteteil der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit einen doppelsträngigen Abschnitt mit einem ersten und zweiten Strang, wobei der zweite Strang des Vektoretteteils an jenen Strang des Targetnucleinsäurefragments ligiert

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ist, der die Initiierungsstartregion enthält, und die Nucleotidsequenz des ersten Stranges, zweiten Stranges und Vektoretteprimers so ausgewählt werden, daß der Vektoretteprimer zur Hybridisierung an das Komplement des zweiten Stranges, aber nicht an den ersten Strang unter den gleichen Hybridisierungsbedingungen in der Lage ist. Es versteht sich, daß die Anwesenheit einer Polymerisationsblockierkomponente bei diesem Ausführungsbeispiel nicht notwendig ist. Es versteht sich ferner, daß in diesem Fall die Sequenz des Vektoretteprimers im wesentlichen die gleiche sein wird wie die Sequenz mindestens eines Abschnitte des zweiten Stranges der Vektorette. Dieses besonders bevorzugte Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Figur 6 weiter diskutiert.

Ein weiteres bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt die Herstellung einer Vielzahl verschiedener Vektorettebibliotheken zum Einsatz mit dem gleichen einzelnen Initiierungsprimer, wobei jede Vektorettebibliothek hergestellt wird durch Spalten von Targetnucleinsäure an unterschiedlichen Spaltstellen und Gewinnen von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten aus den Targetnucleinsäurefragmenten durch Ligation,um dadurch die Vektorettebibliothek zu bilden; Behandeln jeder Vektorettebibliothek entweder separat ocjer zusammen mit geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens zur Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen, um auf diese weise eine Vielzahl Initiierungsprimerextensionsprodukte auf der Basis des Einsatzes des gleichen einzelnen Initiierungsprimers zu gewinnen.

Die Größe solcher Extensionsprodukte wird durch den Abstand vom Initiierungsprimer zur nächsten 3'-Stelle für die speziellen Spaltungsmittel, zum Beispiel das zur Konstruktion der speziellen Bibliothek verwendete Restriktionsenzym, bestimmt.

Auf Wunsch können eines oder mehrere der InitiierungsprimerextensionspiTodukte isoliert und/oder sequenziert werden, oder zumindest kann ein Teil des Extensionsproduktes sequenziert werden.

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So kann dieses Ausführungsbeispiel günstig zur Identifizierung eines gewünschten, normalerweise des längsten Tarqetnucleinsäurefragments, das eine Initiierungsstartregion enthält, angewendet werden, so daß das 3'-terminale Ende in geeigneter Weise mit einem ineinandergeschachtelten Vektoretteprimer gemäß vorstehender Beschreibung sequenziert werden kann, um einen neuen Startpunkt zum weiteren Einsatz der erfindungsgemäßen Methode wie dieses bevorzugten Ausführungsbeispiels zur Verfugung zu stellen.

Die Sequenz des 3'-terminalen Endes des obengenannten längsten Targetnucleinsäurefragments kann somit die Initiierungsstartregion eines neuen Targetnucleinsäurefragments für eine weitere Runde dar Bildung von Vektorettebibliothek-Mehrfachinitiierungsprimerextensionsprodukten, Identifizierung des längsten Targetnucleinsäuref ragments und Sequenzierung sein.

Bei der Wahl einer neuen Initiierungsstartregion auf der Basis neuer, unter Anwendung der erfindungsgemäßen Methode generierter Sequenzdaten, und zwar am 3'-terminalen Ende eines Targetnucleinsäuref ragments , können solche Sequenzdaten in der Regel mit den öffentlich verfügbaren Datensammlungen bekannter Nucleinsäuresequenz (zum Beispiel Genbank, EMBL) verglichen werden, um zu gewährleisten, daß eine vorgeschlagene neue Initiierungsstartregion nicht zufällig genau mit einer bekannten Nucleinsäuresequenz irgendwo in beispielsweise der genomische,n DNA von Interesse übereinstimmt. Das tritt offensichtlich höchstwahrscheinlich in jenen Fällen ein, wo das 3'-terminale Ende eines bestimmten Targetnucleinsäurefragments sich wiederholende Elemente wie zum Beispiel Alu-Sequenzen umfaßt. In solchen Fällen ist es von Vorteil, die erfindungsgemäße Methode an einer Vielzahl von Vektorettebibliotheken mit einem gegebenen Initiierungsprimer auszuführen, um zu garantieren, daß mindestens eines der entstehenden Extensionspi-odukte ein nichtrepetitives/einzigartiges 3'-terminales Ende für die Auswahl einer weiteren Initiierungsstartregion hat.

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Das schrittweise Voranschreiten von einer vorher unbekannten Initiierungsatartregion zu einer anderen längs einer Targetnucleinsäure, zum Beispiel menschlicher genomischer DMA, kann in geeigneter Form überwacht werden, indem Proben der Targetnucleinsäure verwendet werden, die separat bis zur Vollständigkeit mit den gleichen Restriktionsendonucleasen gespalten werden, wie sie bei der Herstellung von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten ("Vektorettebibliotheken gemäß vorstehender Definition) eingesetzt wurden, und der Agarosegelelektrophorese und Sothern-Blotting unterzogen werden. Die Untersuchung der so hergestellten Filter mit einem ersten Initiierungsprimer zeigt ein Muster von Banden in Übereinstimmung mit den verschiedenen Restriktionsenzymerkennungsstellen, die diese erste Initiierungsstartregion in der Targetnucleinsäure umgeben. Die Anwendung der erfindungsgemäOen Methode mit einer Vielzahl von Vektorettebibliotheken und diesem ersten Initiierungsprimer erzeugt eine Reihe von Extensionsprodukten, bei denen alle 3' -terminalen Enden jeweils durch die Position im Verhältnis zur Initiierungsstartregion der nächsten Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym, das zur Erzeugung der betreffenden Vektorettebibliothek verwendet wurde, definiert werden. So entsteht effektiv eine Karte der Restriktionsstellen zur 3'-Seite eines ersten Initiierungsprimers. Nach anschließender Auswahl einer zweiten neuen Initiierungsstartregion mit vorher unbekannter Sequenz erfolgt die Verbindung mit der ersten Initiierungsstartregion durch erneute Untersuchung der obigen Southern-Blot-Filter mit dem zweiten neuartigen Initiierungsprimer. Das er¹ :ltene Bandenmuster wird identisch sein mit demjenigen, welches mit dem ersten Initiierungsprimer in jenen Fällen gewonnen wurde, wo keine Erkennungsstelle für das betreffende Restriktionsenzym zwischen der ersten und zweiten Initiierungsstartregion liegt. In jenen Fällen, wo eine Erkennungsstelle für das betreffende Restriktionsenzym zwischen den Initiierungsstartregionen, gemäß Beurteilung nach dem Erscheinen von kleineren Extensionsprodukten in der entsprechenden Vektorettebibliothek, auftritt, wird normalerwei-

se bei erneuter Untersuchung der Southern-Blot-Filter mit dem zweiten Initiierungsprimer ein Fragment mit unterschiedlicher Gröüe beobachtet werden. Durch Wiederholung dieses Verfahrens werden Folgerichtigkeit, Genauigkeit und Zuverlässigkeit des schrittweisen Voranschreitens von einer Initiierungsstartregion zu einer anderen längs der Targetnucleinsäure aufrechterhalten und gewährleistet.

Es versteht sich, daß sich die Sequenz der 3'-terminalen Enden all der vielen Initiierungsprimerextensionsprodukte leicht ermitteln läßt, wenn der gleiche Vektoretteprimer oder ineinandergeschachtelte Vektoretteprimer für die Sequenzierung nach an sich bekannten Methoden verwendut werden. Auf diese Weise kann die gesamte Sequenz eines unbekannten Abschnitts von Target-QNA-Nucleinsäure leicht und systematisch und mit viel größerer Angemessenheit als beispielsweise mit der M13 "Shot-gun-Klonierung" bestimmt werden. Das ist darauf zurückzuführen, daß die Initiierungsprimerextensionsprodukte nach ihrer Größe geordnet werden können und daher die Anordnung ihrer Sequenzen in der ursprünglichen Targetnucleinsäure sichtbar wird. Jedes Initiierungsprimerextensionsprodukt hat eine 5'-Extremität, die durch den Initiierungsprimer bestimmt wird, und eine 3'-Extremität, die durch die nächste 3'-Stelle für das .spezielle Spaltungsmittel, zum Beispiel Restriktionsenzym, das bei der Synthese der bestimmten Vektorettebibliothek verwendet wurde, bestimmt wird.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird (werden) irgendeines oder alle der gewonnenen Initiierungsprimerextensionsprodukte zumindest an dem (den) Ende(n), die distal zu einem gegebenen Initiierungsprimer liegen, sequenziert (wie nachstehend definiert), um die Sequenz eines weiteren Initiierungsprimers zu bestimmen, um dadurch weitere Initiierungsprimerextensionsprodukte auf der Basis von Primerextension des weiteren Initiierungsprimers zu gewinnen.

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Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein Initiierungsprimerextensionsprodukt oder ein Teil davon sequenziert (wie nachstehend definiert), um dadurch dati Extensionsprodukt oder einen Teil davon zu charakterisieren.

Wie oben beschrieben, ist eine überaus wichtige Anwendung der Erfindung die Identifizierung eines vorher nichtidentifizierten Genotyps, beispielsweise eines Genschadens, der für einen Phänotyp, z. B. eine Erbkrankheit oder eine Störung, verantwortlich ist, oder die Identifizierung eines vorher nichtidentifizierten Genotyps, zum Beispiel eines Genschadens, der für die Prädisposition für einen Phänotyp, zum Beispiel eine Krankheit, verantwortlich oder ein dazu beitragender Faktor ist.

So kann die erfindungsgemäße Methode zum Beispiel in bezug auf einen Genotyp wie eine Erbkrankheit oder Störung für Nucleinsäure angewendet werden, die den Genotyp nicht enthält (z. B. Genschäden) und für Nucleinsäure, die den Genotyp enthält, z. B. zu untersuchende Genschäden, wobei die Identifizierung des Genotyps, z. B. Genschaden, durch Vergleich der durch Sequenzierung der zwei Nucleinsäureproben erzeugten Informationen erfolgt. Ein solcher Vergleich könnte zum Beispiel auf einfache Weise durch Vergleichen der Sequenzierungsgele, geeigneterweise durch automatisches Scanning, erfolgen. Es versteht sich in dieser Hinsicht, daß die spezifischen Sequenzen nicht an sich bestimmt zu werden brauchen, vorausgesetzt, daß genügend Daten erzeugt werden, um den Nachweis oder die Iuentifizierung eines Unterschiedes oder von Unterschieden zwischen den Targetnucleinsäureprohen zu ermöglichen, und die Termini "Sequenzierung" und "sequenziert" sollen demzufolge hierin nicht nur die spezifische Nucleotidsequenzbestimmung einsch ießen, sondern auch den Nachweis und die Identifizierung von Sequenzunterschieden ohne spezifische Nucleotidsequenzbestimmung. Es ist angemessen, die erfindungsgemäße Methode für die Targetnucleinsäure eines obligaten Heterozygoten, beispielsweise für die zu untersuchende

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Erbkrankheit oder Störung anzuwenden. Notwendigerweise werden sowohl ein normales als auch ein mutiertes Allel für den betreffenden Genort in einem solchen Individuum vorhanden sein, und jene mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Stellen, wo mehr als ein einzelnes Nucleotid beim Sequenzieren vorhanden ist, sind Kandidaten für den Phänotyp, z. B. Krankheit oder Störung, die Mutation verursacht.

Außerdem wird vermutet, daß bestimmte Genotypen, z. B. Genschäden, Individuen für Phänotypen, z. B. Krankheiten wie prämature Arteriosklerose, Hypertonie, Diabetes und Krebs prädisponieren können. Wenn solche Genschäden zum Beispiel identifiziert werden könnten, dann könnten solche Risikop°.tienten überwacht und jeder Ansatz der Krankheit in einem frühen Stadium behandelt werden. Die erfindungsgemäße Methode kann für die Identifizierung solcher prädisponierenden Genotypen angewendet werden. So kann die erfindungsgemäße Methode auf der einen Seite für die Nucleinsäure einer Vielzahl von Individuen angewendet werden, die mit einem zu untersuchenden Phänotyp behaftet sind, und auf der anderen Seite für die Nucleinsäure einer Vielzahl von Individuen, die kein Anzeichen für den Phänotyp zeigen, wobei die Identifizierung eines Genotyps durch Vergleich der Sequenzen der Nucleinsäureproben erfolgt. Geeigneterweise wird Nucleinsäure von der Vielzahl von Individuen, die mit dem zu untersuchenden Phänotyp behaftet sind, gepoolt und dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen, und ähnlich wird Nucleinsäure von den Individuen, die kein Anzeichen des Phänotyps zeigen, gepoolt und dem erfindungsgemäßen Verfahren unterzogen. Der Vergleich der Sequenzunterschiede zwischen den beiden Pools identifiziert das Vorhandensein eines prädisponierenden Genotyps, sofern einer oder mehrere anwesend sind. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, daß sie die Identifizierung des individuellen prädisponierenden Genotyps unabhängig von der Häufigkeit seines Vorkommens und unabhängig von der Gesamtkompliziertheit und der Anzahl der unterschiedlichen, zu dem Gesamtgenotyp beitragenden Genfaktcren ermöglicht. Wenn also die Anwesenheit einer Kombination

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von offensichtlich nicht in Beziehung stehenden Genschäden für die Prädisposition für eine zu untersuchende Krankheit verantwortlich ist oder einen dazu beitragenden Faktor bildet, dann ist die erfindungsgemäße Methode dazu in der Lage, das zu identifizieren .

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt die Zirkularisierung eines Targetnucleinsäurefragments mit Termini, die zur Ligation aneinander fähig sind, wobei das Targetnucleinsäurefragment einen Abschnitt mit bekannter Nucleotidsequenz enthält, wobei die bekannte Nucleotidsequenz oder der Abschnitt davon als Initiierungsstartregion für die Hybridisiening mit einem Initiierungsprimer dienen kann, einen Initiierungsprimer an die Initiierungsstartregion hybridisieren kann und die so gebildete Hybride der Primerextension in Anwesenheit von angemessenen Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation aer Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen unterziehen kann. Zum Beispiel können zwei Initiierungsprimer, die im entgegengesetzten Sinn zueinander orientiert sind als es für PCR normal ist, verwendet werden, um Amplifikation zu bewirken.

In dieser Hinsicht kann Zirkularisierung des Targetnucleinsäurefragments als die Herstellung der Targethucleinsäurefragment/ VektoretReinheit durch Ligation angesehen werden, und daher kann zum Beispiel Primerextension auf der Basis de? zirkularisierten Targetnucleinsä;jrefragments als Matrize erfolgen. Auf Wunsch kann das zirkularisierte Targetnucleinsäurefragment jedoch gespalten werden, und Primerextension kann auf der Basis des Spaltprodukts als Matrize erfolgen, wie es beschrieben wird in: Nucleic Acids Research, Bd. 16, S. 8186, 1988, veröffentlicht nach der UK-Patentanmeldung Nr. 8818020.3, für die Verbandspriorität beansprucht wird. Ferner kann das Spaltprodukt auf Wunsch verwendet werden, um eine Targetnucleinsäurefragnient/ Vektoretteeinheit durch Ligation herzustellen, und Initiierungsprimerextension kann auf der Basis der so gewonnenen Target · nucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit als Matrize erfolgen.

j Alle diese Ausführungsbeispiele liegen im Geltungsbereich der Erfindung.

So kann zum Beispiel das gebildete zirkularisierte Targetnuoleinsäurefragment gespalten werden, um ein Spaltprodukt zu ge-

; winnen, das mindestens einen Abschnitt mit bekannter Nucleotidsequen'z enthält, wobei dieser Abschnitt als Initiierungsstartregion für die Hybridisierung mit einem Initiierungsprimer dienen kann, in welchem Fall beispielsweise das zirkularisierte Targetnucleinsäurefragment innerhalb der Region mit bekannter

: Nucleotidsequenz gespalten werden kann, um ein lineares Molekül mit bekannter Sequenz zu bilden, das an seinen Termini unbekannte Sequenz flankiert; es kann an einem Terminus mit bekannter Nucleotidssquenz gespalten werden, um ein lineares Mo-

: lekül mit einer bekannten Nucleotidsequenz an ein'em Terminus

; und einem bekannten Spaltstellenmuster am anderen Terminus zu bilden, um es für die Ligation an eine Vektorette fähig zu machen; oder noch besser kann es außerhalb der bekannten Nucleotidsequenz gespalten werden, um ein lineares Molekül zu bilden, welches die bekannte Nucleotidsequenz enthält und ein bekanntes Spaltstellenmuster an mindestens einem Terminus, normalerweise beiden Termini aufweist, wodurch es möglich wird, den Terminus oder die Termini zu ligieren, um eine Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit zu bilden. So umfaßt ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung die Zirkularisierung eines Targetnucleinsäurefragments mit Termini, die zur Ligation aneinander fähig sind, wobei das Targetnucleinsäurefragment einen Abschnitt aufweist, der als Initiierungsstartregion für die Hybridisierung mit einem Initiierungsprimer dienen kann; die Spaltung des zirkularisierten Targetnucleinsäurefragments außerhalb der bekannten Nucleotidsequenz zur Bildung eines linearen Moleküls, das die bekannte Nucleotidsequenz enthält und ein bekanntes Spaltstellenmuster an mindestens einem Terminus für die Ligation zur Bildung einer Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit aufweist; Bilden der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit durch Ligation und Behandeln der Targetnuclein-

söurefragment/Vektoretteeinheit zusammen oder nacheinander mit geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen.

Dieses bevorzugte Ausführungsbeispiel der Erfindung ist von Interesse in bezug auf zirkularisierte Targetnucleinsäurefragmente von beispielsweise mindestens 1 kb bis etwa 20 kb, aber es kann von besonderem Interesse in bezug auf größere zirkularisierte Targetnucleinsäurefragmente von zum Beispiel 20 kb bis etwa 120 kb wie zirkularisierte Targetnucleinsäurefragmente von etwa 100 kb sein. Die obere Größengrenze ist von praktischen Erwägungen abhängig und basiert daher auf der maximalen Größe von Targetnucleinsäurefragmenten, die zirkularisiert werden können. Eine solche Zirkularisierung kann durch bekannte Techniken erfolgen /F.S. Collins (1908) Genome Analysis - A practical approach (Genomanalyse - eine praktische Methode) (Editor K. Davies) p73-94, IRL Publishers, Oxford/, zum Beispiel durch Herbeiführung, von Ligation bei niedriger Konzentration. Dieses bevorzugte Ausführungsbeispiel kann zum Beispiel ausgeführt werden, indem genomische DNA mit einem Restriktionsenzym digeriert wird, und zwar vorzugsweise mit einem Restriktionsenzym, das relativ selten schneidet (z. B. durchschnittliche Fragmentgröße 10 - 20 kb) wie Xbal, Kpnl oder BamHI. Die Fragmente können dann zur Bildung von Ringen selbstligiert werden. Die Ringe können danach mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden, vorzugsweise mit einem Restriktionsenzym, das häufig schneidet (zum Beispiel Hinfl), und die Fragmente können an eine entsprechende (zum Beispiel Hinfl) Vektorette ligiert werden. So kann beispielsweise, wenn die einer bekannten Xbal-Stelle benachbarte Sequenz zur Verfügung steht, die Sequenz, die der nächsten, möglicherweise entfernten Xbal-Stelle benachbart ist, durch Analyse des Vektoretteproduktes gewonnen werden. Auf diese Weise kann eine Reihe von Sprüngen ausgeführt werden, vorausgesetzt, daß zusätzliche Startpunkte für die Methode vorhanden sind. Es versteht sich, daß die Fähigkeit zur Ausführung solcher Sprünge einen beträchtlichen

- 43 - 2 UO 5

Vorteil gegenüber den PCR-Technlken, wie vorstehend beschrieben, darstellt, da es möglich sein kann, amplifizierte Vektoretteprodukte in einem beträchtlichen Abstand von der Stelle des Initiierungsprimers zu erhalten. Somit ist die Methode nicht durch die Schwierigkeit begrenzt, die gewöhnlich bei der Herstellung von Standard-PCR-Produkten von mehr als etwa 5 kb auftritt.

Aueführungsbeispiele

Die Erfindung soll nachstehend zu ihrem noch besseren Verständnis anhand von Beispielen mit Bezug auf die dazugehörigen Zeichnungen beschrieben werden. In den Zeichnungen zeigen:

Figur l(a) eine doppelsträngige Targetnucleinsäure, Figur l(b) die restringierte Targetnucleinsäure, Figur l(c) die durch Ligation der Targetnucleinsäurerestriktionsfragmente und der Vektorette gewonnenen Targetnucleinsäurefragmentt/Vektoretteeinheiten, und Figur l(d) die Hybridisierung von (i) Initiierungeprimer und (ii) Vektoretteprimer mit den Targetnucleinsäuref ragmen t/Vek to ret teeinhei ten.

Figur 2 ein Ausführungsbeispiel der Erfindung; Figur 2(a) die bildliche Darstellung von Restriktionsfragmenten, die durch teilweise Digerierung von genomischer DNA gewonnen wurden und der Gelelektrophorese unterzogen wurden. Figur 2(b) das Gemisch unterschiedlicher Typen von Fragmenten mit hoher relativer Molekülmasse, die für die weitere Verarbeitung entsprechend der Große ausgewählt wurden. Figur 2(c) das Gemisch von Produkten, die nach Ligation zur Bildung von Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheiten gewonnen wurden.

- 43a -

Figur 3 ein Ausführungsbeispiel der Erfindung« bei dem versucht wird« die relative Konzentration von Restriktionsfragmenten« die zur Hybridisierung an den Initiierungsprimer fähig sind, zu erhöhen*

Figur 4, ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung« bei dem der Einsatz von Sl-Nuclease vermieden und versucht wird« die re-

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j lative Konzentration von Restr.Mctionsf ragmenten, die zur Hybridisierung sowohl an den Initiierungsprimer als auch den Vektoretteprimer fähig sind, zu erhöhen, Figur 4(a) das Gemisch von Produkten, die nach der Behandlung der Restriktionsfragmente, die durch komplette Digerierung der Target-DNA-Sequenz von Interesse erzeugt wurden, mit blockierender Vektorette in Anwesenheit von DNA-Ligase gewonnen werden könnten. Figur 4(b) eine blockierende Vektorette zum Einsatz bei der Erfindung nach Digerierung mit dem Restriktionsenzym Eco Rl und Figur 4(c) die Produkte, die durch komplette Digerierung des in Figur 4(a) gezeigten Produktgemisches gewonnen wurden.

Figur 5 zwei unterschiedliche Vektoretteabschnitte zum Einsatz bei der erfindungsgemäßen Methode, wobei Vektoretteabschnitt (i) eine blockierende doppelsträngige Vektorette ist, die einen kurzen oberen (5') Strang mit einer zur blockierenden Polymerisation fähigen 3'-terminalen Gruppe und einen unteren (3¹) Strang aufweist, der den Schwanz bildet, wobei die 3'-terminale Gruppe des oberen (5¹) Stranges zur blockierenden Polymerisation in Anwesenheit von Nucleosidtriphosphaten und eines Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen in der Lage ist; Vektoretteabschnitt (ii) ist doppelsträngig, weist aber einen Grad von Nichtkomplementärität zwischen den Strängen auf.

Figur 6 eine schematische Darstellung der Anwendung der Erfindung auf Vektoretteabschnitte von Figur 5.

Figur 7 eine schematische Darstellung der Verwendung von Vektorettebibliotheken.

Figur 8 die schematische Anwendung der Erfindung auf die ^mplifikation von zirkularisierten Targetnucleinsäurefragmenten.

Figur 9 die Amplifikation eines Teils des ©£· -1 Antitrypsingens unter Einsatz der Oligonucleotide 58 und 61 (Schritt 6 in Me-

j 45

j thode I) und einer Xbal-Vektoretteeinheit/Bibliothek.

S Figur 10 die Restriktionskarte des Plasmids B3 (pUC8 mit einem

• 440bp-Insert an der EcoRI-Stelle).

j Figur 11 (i) und (ii) Photographien eines Agarosegels, welche j die in .den nachstehenden Beispielen 1, 5 und 7 gewonnenen ampli-

• fizierten Fragmente zeigen.

j Figur 12 eine Sequenz aus dem Phenylalaninhydroxylasegen, das

Exon 9 flankiert, und die entsprechenden Bindepositionen für die j Oligonucleotide 58, 63, 66 und 59.

! Figur 13 einen Teil einer Photographic eines Agarosegels, die das nach Beispiel 8 gewonnene amplifizierte Produkt zeigt.

Figur 14 eine Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 9 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 15 eine Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 10 amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 16 eine. Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 11 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 17 eine Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 12 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 18 eine Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 13 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 19 eine Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 14 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 20 eine Photographie eines Agarosegels, die die nach Beispiel 15 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

j !

j j Figur 21 ein Autoradiogramm eines Sequenzierungsgels, das die ; j Sequenz der in Beispiel 16 erzeugten Produkte zeigt.

- i

, Figur 22 die Nucleotidsequenzdateny die aus den in Beispiel beschriebenen Produkten generiert wurden.

j Figur 23 eine Sektion des Phenylalaninhydroxylasegens, das Exon

ι 1 flankiert, und die entsprechenden Positionen der Oligonucleo-

^f tide 58, 62 und 67 sowie die bei der Konstruktion der Vektoret-

' teeinheit verwendete EcoRI-Restriktionsstelle.

j Figur 24

(a) eine Photographic eines Agarosegels, welche das nach Bei- ; spiel 17 gewonnene primäre Amplifikationsprodukt zeigt; ι (b) eine Photographie eines Agarosegels, welche die nach Bei- ; spiel 17 gewonnenen sekundären Amplifikationsprod'ukte zeigt.

Figur 25 die Nucleotidsequenzdaten, die von den in Beispiel 17 ; beschriebenen Produkten generiert wurden.

25(a) die mit Oligonucleotid 62 gelesene Sequenz (s. nachstehende Definition), Figur 25(b) die mit Oligonucleotid 67 gelesene Sequenz (s. nachstehende Definition) und Figur 25(c) die mit den Oligonucleotiden 62 und 67 gelesene Gesamtsequenz.

Figur 26 eine Sektion des <£-1 Antitrypsingens, das Exon 5 flankiert, und die entsprechenden Positionen der Oligonucleotide 58, 60, 68, 69 und 70 sowie die EcoRI-Restriktionsstelle für Hybridisierung (annealing) und Ligation der-Vektorette.

Figur 27

(a) eine Photographie eines Agarosegels, welche das nach Beispiel J.3 gewonnene primäre Amplif ikationsprodukt zeigt;

(b) eine Photographie eines Agarosegels, die das nach Beispiel 18 gewonnene sekundäre Amplifikaticnsprodukt zeigt;

(c) ein Autqradiogramm eines Nylonfilters, von dem in Figur 27(b) gezeigten Gel geblottet und mit einer oC -1 Antitrypsin-

' sonde untersucht.

Figur 28 die Nucleotidsequeni· von 05, ein anonymes Fragment an Chromosom 7 des Humangenom s, wobei die relativen Positionen der Oligonucleotide 71 und 72 angegeben werden.

Figur 29 eine Restriktionskarte der Region, die 05 enthält. Die entsprechenden Positionen der Oligonucleotide 71 und 72 werden angegeben. Die Positionen der gemäß Beispiel 19 synthetisierten Produkte werden ebenfalls gezeigt.

Figur 30 eine Photographic eines Agarosegels, die die gemäß Beispiel 19 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 31 die Nucleotidsequenz, die von dem Bcl-1-Produkt generiert wurde, das entsprechend der Beschreibung in Beispiel 19 gewonnen wurde. Die Position der aus den Restriktionsenzymdigests vorhergesagten Hind-III-und Hae-III-Stellen wird ebenfalls gezeigt. Die Position von Oligonucleotid 73, das als Initiierungsprimer in nachfolgenden Zyklen von Vektoretteeinheitamplifikation verwendet würde, wird ebenfalls angegeben.

Figur 32 eine Photographic eines Agarosegels, die die nach Beispiel 20 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 33 die Nucleotidsequenz, die aus dem EcoRl-Produkt generiert wurde, das gemäß Beschreibung in Beispiel 20 gewonnen wurde.

Figur 34 eine Photographic eines Agarnsegels, die die Fragmente zeigt, die nach Digerierung mit Restriktionsenzymen des EcoRl-Produktes, das gemäß der Beschreibung in Beispiel 20 gewonnen wurde, hergestellt wurden.

Figur 35 eine Photograph!.? eines Agarosegels, die die gemäß Beispiel 21 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

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Figur 36

(a) eine Restriktionskarte einer Sektion einer Hind Ill/Cosmid-Vektorettebibliothek, die die Positionen der Oligonucleotide 58, 76 und 77 anzeigt;

(b) eine Photographic eii.es Agarosegels, die die gemäß Beispiel 22 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur 37

(a) eine Restriktionskarte eines Segments von an eine EcoRl-Vektorette ligierter Target-genomischer .GNA. Die Positionen der Oligonucleotide 27, 76, 78 und 79 sind angegeben.

(b) eine Restriktionskarte eines Segments von an eine EcoRl-Vektorette ligierter Target-genomischer DNA. Die Position der Oligonucleotide 78, 79 und 84 sind angegeben.

(c) ein Segment des Phenylalaninhydroxylasegen-Exons 9, das an eine modifizierte EcoRl-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 63 und 79 sind angegeben.

(d) eine Restriktioriskarte des Segments von Target-genomischer DNA (Beschreibung in 37(c) oben), die an eine modifizierte EcoRl-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 76, 79 und 80 sowie 81 sind angegeben.

(e) eine Restriktionskarte eines Segments von Target-genomischer DNA (Beschreibung in 37(b) oben), die an eine modifizierte EcoRl-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 79, 80, 81 und 84 sind angegeben.

(f) ein Segment des Phenylalaninhydroxylasegen-Exons 9, das an eine modifizierte EcoRl-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 63, 79, 80 und 81 sind angegeben.

(g) eine Restriktionskarte eines Segments von Target-genomischer DNA, die an eine modifizierte Hind-III-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 76, 78 und 79 sind angegeben .

(h)eine Restriktionskarte eines Segments von Target-genomischer DNA, die an eine modifizierte Hind-III-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 76, 79, 81 und 82 sind angegeben .

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(i) eine Restriktionskarte eines Segments von Target-genomi- ; scher DNA, die an eine modifizierte Hind-III-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 76, 79, 81 und 83 sind angegeben.

Figur 38 eine Photographic eines Agarosegels, welche die amplifizierten Produkte zeigt, die nach den Beispielen 23 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) und (i) gewonnen wurden.

Figur 39

(a) eine Restriktionskarte der Target-genomischen DNA-Sequenz, die die durch Sonde KM19 nachgewiesene polymorphe Pst-1-Stelle enthält. Die polymorphe Pst-1-Stelle ist durch ein Sternchen gekennzeichnet.

(b) die Bildung ringförmiger Produkte durch Ligation von Fragmenten von Pst-1-gespaltenen Target-genomischer DNA.

(c) die Konstruktion von Hind-III-Vektoretteeinheit-Bibliotheken durch Ligation von Oligonucleotiden an durch Hind III gespaltene Pst-1-Ringe.

Figur 40 eine Photographie eines Agarosegels, die die gemäß Beispiel 24 gewonnenen amplifizierten Produkte zeigt.

Figur l(a) zeigt schematisch eine doppelsträngige Targetnucleinsäure von beispielsweise 100 kb oder mehr, deren Sequenz mit Ausnahme der anfänglichen 5'-Nucleotide (schraffiert dargestellt) z. B. etwa 20 Nucleotide, unbekannt ist.

Ein Ort von Interesse, X, mit unbekannter Sequenz wird in einem unbekannten Abstand vom 5'-Ende gezeigt. Die Targetnucleinsäure wird der Restriktion (siehe Figur Kb)) unterzogen, wobei ein 6-bp-Cutter wie EcoRI eingesetzt wird, von dem zu erwarten ist, daß er eine Nucleinsäure im Durchschnitt aller 4096 bp spaltet. Die Erkennungssequenz für EcoRI ist GAATTC, die Spaltstelle wird durch den Pfeil angegeben

EcoRI spaltet also die Targetriucleinsäure, wobei kohäsive Enden

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entstehen. Das kohäsive Ende der Targetnucleinsäurerestriktionsfragmente wird dann an eine entsprechende Vektorette ligiert, wie es in Figur l(c) dargestellt ist, wobei die Vektorette schraffiert ist. Die Vektorette kann von jeder geeigneten Nucleotidsequenz sein, wie oben beschrieben, wird aber an ihrem 5'-Ende ein Nucleotidsequenzmuster aufweisen, das mit der Gewährleistung der Ligation mit den kohäsiven Enden der oben aufgeführten Restriktionsfragmente vereinbar ist. Wenn also EcoRI als die Restriktionsendonuclease verwendet wird, werden das 3'-Ende der Restriktionsfragmente und das 5'-Ende der Vektorette die folgenden Sequenzen haben:

Restriktions- 5¹- G AATTC - 3¹ Vektorette fragmente 3' - CTTAA G - 5¹

Vorzugsweise wird der Teil des Restriktionsendonucleaseerkennungsmusters, der nicht an der Ligation beteiligt ist, in der Vektorette verändert, um das Erkennungsmuster zu zerstören. Somit ist jede zum Spalten der Targetnucleinsäure anwesende Restriktionsendonuclease unfähig, die einmal gebildeten Restriktionsfragment/Vektoretteeinheiten zu spalten. Wo es sich bei der verwendeten Restriktionsendonuclease um EcoRI handelt, ist daher das 5'-terminale Ende der Vektorette vorzugweise

5¹ AATTA 3^T oder 5¹AATTT 3¹ oder 5¹ AATTG 3' TAC

wobei der CG-Abschnitt des Erkennungsmusters in AT verändert wird oder CG zu dem im EcoRI-Erkennungsmuster transponiert wird. Die Restriktionsfragment/Vektoretteeinheiten werden dann zusam.nen oder vorzugsweise nacheinander mit Initiierungsprimer und Vektoretteprimer (wobei der Initiierungsprimer zuerst zugefügt wird) unter Hybridisierungsbedingungen behandelt (siehe figur Kd)). Der Initiierungsprimer kann nur an den Teil des einen Targetrestriktionsfragmentes hybridisieren, der eine bekannte Sequenz enthält (siehe Figur l(d) (i)). Der Vektoretxeprimer ist so kon-

51 I

struiert, daß er an den Nucleinsäurestrang hybridisiert, der ; durch Extension des Initiierungsprimers gebildet wird (und, wie ; in Figur l(d) gezeigt, den Nucleinsäurestrang, der zu dem Nucleinsäurestrang komplementär ist, an den der Initiierungspri- ^: mer hybridisieren kann). Der Vektoretteprimer hybridisiert an die Vektorettestartregion jeder vorhandenen Restriktionsfragment/Vektoretteeinheit (siehe Figur l(d) (ii), aber in Anwesenheit von geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate erfolgt die Amplifikation nur hinsichtlich der Restriktionsfragment/Vektoretteeinheit, an die der Initiierungsprimer hybridisiert, dann erweitert wurde. Es versteht sich, daß vorzugsweise die Hybridisierung (ii) nur bei Einsatz nach der Hybridisierung (i), Extension in Anwesenheit von Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate und nachfolgende Denaturierung erfolgt. Das verhindert eine aus Figur l(d) hervorgehende Situation, wo zu sehen ist, daß der Vektoretteprimer (ii) hybridisiert an und daher in der Lage ist, ein Extensionsprodukt zu bilden mit jeder Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit, die in dem komplexen Gemisch vorhanden ist. Es ist daher vorzuziehen, zuerst die Vektoretteeinheit mit dem Initiierungsprimer zu behandeln und dann, nach den oben im Detail aufgeführten Schritten, den Vektoretteprimer hinzufügen.

Es wird daher möglich sein, das amplifizierte Targetfragment, und auf Wunsch das ganze Fragment, beispielsweise durch oben beschriebene Techniken zu identifizieren. Wenn gewünscht, braucht jedoch nur das 3'-Ende des amplifizierten Targetrestriktionsfragments sequenziert zu werden, so daß ein'neuer Initiierungsprimer konstruiert werden kann. Dieser neue Initiierungsprimer kann dann eingesetzt werden, um Amplifikation eines neuen Targetrestriktionsfragments zu erzielen, das durch Digestion der Targetnucleinsäure mit einer anderen Restriktionsendonuclease, vorzugsweise auch einem 6-bp-Cutter, gewonnen wurde, und das erfindungsgemäße Verfahren kann wiederholt werden. Auf diese Weise kann eine Targetnucleinsäure vom 5'-Ende sequenziert werden,

52 i

ohne daß die Notwendigkeit zur Klonierung besteht und wobei die Sequenzierungsrichtung konstant und konsequent in die 5'- bis 3'-Richtung verläuft. Durch Wiederholung der erfindungsgemäßen Methode ist es daher möglich, den obengenannten Locus X von Interesse schnell zu erreichen und zu sequenzieren.

Figur 2 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die interessierende DNA-Sequenz wird partieller Digestion beispielsweise mit EcoRI unterzogen, und die gewonnenen Restriktionsfragmente werden Gelelektrophorese, wie in Figur 2(a) dargestellt, unterzogen. Die Elektrophorese verläuft in die durch den Pfeil angegebene Richtung, und folglich erscheinen Fragmente mit hoher relativer Molekülmasse zum oberen Ende des Gels zu, während die Rustriktionsfragmente mit niedrigeur relativer Molekülmasse zum unteren Ende des Gels zu erscheinen..

Die X-Achse stellt eine steigende Konzentration von Restriktionsenzym oder verlängerte Inkubation dar. Restriktionsfragmente von weniger als einer vorbestimmten Größe, zum Beispiel 10 kb, werden als unbrauchbar ausgesondert, und die Restriktionsfragmente mit der höheren relativen Molekülmasee werden zum nächsten Stadium überführt. Diese Restriktionsfraymente mit der höheren relativen Moleküliiiasse stellen ein Gemisch überlappender partieller Digestionsfragmente, wie in Figur 2(1d) gezeigt, dar,.wobei die Restriktionsstellen an einem Restriktionsfragmentterminus mit (1-) oder innerhalb des Fragments mit (_v) gekennzeichnet sind. Alle Restriktionsfragmente sind dann mit der gleichen einzelnen Restriktionsendonuclease, zum Beispiel EcoRI, geschnitten, und folglich hat dann jedes einzelne Restriktionsfragment kohäsive Enden, die für die zur Herbeiführung der Digestion eingesetzte Restriktionsendonuclease charakteristisch sind. Nur die extremen 5'- und 3'-Fragmente werden ein einzelnes derartiges kohäsives Ende besitzen, während die verbleibenden Fragmente je zwei solche kohäsiven Enden haben werden. Eine Vektorette gemäß vorstehender Definition, bei der die Restriktionsendonucleaseerkennungssequenz zerstört worden ist, kann dann mit

2 6405 j

53

den obengenannten Targetrestriktionsfragmenten in Anwesenheit einer Ligase gemischt werden, um ein Produktgemisch, wie in Figur 2(c) als Beispiel dargestellt, zu gewinnen, wobei die Vektorette als terminale Box dargestellt ist. Es versteht sich, daO die Anwesenheit von Ligase nicht nur die Herbeiführung von Ligation der Targetrestriktionsfragmente mit der Vektorette ermöglicht, sondern auch Ligation der Targetrestriktionsfragmente selbst. Man wird deshalb einsehen, daß es unter den Bedingungen von Ligation in Figur 2 nicht unwahrscheinlich ist, daß die Segmente A und B in den anfänglichen Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten in der ursprünglichen Targetgenomischen Nucleinsäure nicht benachbart sind, sondern während der Ligation anomal zusammengekommen sind. Die Ligationsprodukte werden dann kompletter Digerierung mit der Restriktionsendo- ^! nuclease unterzogen, die verwendet wurde, um die partielle Digestion zu bewirken, zum Beispiel EcoRI. Die Produkte vollständiger Digestion werden im allgemeinen doppelsträngige Targetrestriktionsfragmente sein, die eine Vektorette aufweisen, die an jedem Ende des Fragments ligiert ist, un^rJ Targetrestriktionsfragmente mit einer Vektorette an nur einem Ende des Fragments. Es wird eine Hintergrundpopulation von Targetrestriktionsfragmenten, beispielsweise Fragmente A und B in Figur 2(c), geben, die keine Vektorette an einem der Enden haben. Die erstgenannten Produkte werden einen geringeren Anteil des gesamten Produktgemisches darstellen. Bei Denaturierung wird nur eine Spur von Produktvektoretteeinheiten in der Lage sein, mit dem Initiierungsprimer zu hybridisieren, aber ein sehr wesentlicher Prozentsatz des Produktgemisches wird zur Hybridisierung mit dem Vektoretteprimer in der Lage sein, wenn nicht eine wesentliche Modifikation der Vektorette erfolgt, wie nachstehend beschrieben. Die Amplifikation des gewünschten Restriktionsfragments wird daher möglich sein, aber der wesentliche Prozentsatz der Vektoretteeiheitsbibliothek, der zur Hybridisierung mit dem Vektoretteprimer fähig ist, kann die Notwendigkeit zur Folge haben, wesentliche Mengen des Vektoretteprimers, des Agens für die Polymerisation der Nucleosidtrphosphate (z. B. Taq-DNA-Polymerase)

54 j

"Γ'"" und der Nucleosidtriphosphate selbst zu verwenden. Diese Schwie-^; rigkeit kann in gewissem Maße durch die Verwendung kleiner Mengen Ausgangsmaterial aus dem Wege geräumt werden, aber es wäre von Vorteil, den relativen Anteil der Targetrestriktionsfragment/Vektoretteeinheiten, die zur Hybridisierung an den Intitiierungsprimer in dem Produktgemisch fähig sind, selektiv zu erhöhen.

i Das Prinzip für das Herangehen an den Aufbau einer Vektorette- ! einheitbibliothek gemäß Darstellung in Figur 2 ist folgendermaj Ben. Die vollständige Digestion mit einem 6-bp-Schneidenzym er-

j zeugt eine Population von Fragmenten mit einer mittleren Größe

; von 4096 bp. Es wäre zu erwarten, daß die Ligation von Vekto- :

{ retteeinheiten an diese Population (ungefähr 10 Fragmente von

j totaler menschlicher genomischer DNA) viele Fragmente mit einer

; Vektoretteemheit an jedem Ende erzeugt. Viele davon werden er-

; heblich kleiner sein als t'096 bp, geht man von der Gauss-Vertei-

i lung von Restriktionsstellen aus. Im Einsatz könnte ein Vekto-

j retteprimer unter diesen Umständen wie beide Primer in einem

j Standard-PCR wirken. Große Mengen unechter Amplif ikations'produkte würden entstehen sowie ein von einem Initiierungsprimer her-

rührendes Produkt. Bei der vorstehenden Diskussion wurde auf Methoden Bezug genommen, bei denen die Synthese von Vektorette-

; primeramplifikationsprodukten von der anfänglichen Synthese ei- : nes Extensionsproduktes des Initiierungsprimers abhängig ist. Bei dem Ausführungsbeispiel von Figur 2 kann die Vektoretteeinheit selbst mit dem Vektoretteprimer hybridisieren und Kopieren

von dem Vektoretteprimer initiieren. Der obige Naci teil von PCR-Produktbildung aus Targetnucleinsäurefragmeriten mit Vektoretteabsch:iitten an jedem Ende wird durch einen Größenfraktionierungsschritt überwunden, so daß bei allen solchen Vektoretteeinheitskonstrukten 2 identische Vektoretten vorhanden sind, die durch einen derartigen Abstand (z. B. größer als 10 kb) getrennt

: sind, daß Standard-PCR so unwirksam ist, daß kein signifikantes

Produkt entsteht.

2 8*053

55

Figur 3 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel, bei dem versucht wird, die relative Konzentration von Restrikfcionsfragnenten zu erhöhen, die zur Hybridisierung an den Initiierungsprimer in dem Vektoretteeinheitsproduktgemisch, das gemäß der obigen Beschreibung in bezug auf Figur 2 gewonnen wurde, fähig sind. In Figur 3 (a) ist (i) ein Restriktionsfragment, das eine Initiierungsstartregion (1) enthält und einen VeKtoretteabschnitt (schraffiert) (2) aufweist, (ii) ein Restriktionsfragment mit einem Vektoretteabschnitt (ashraffiert) (2), der an jedem Ende ligiert ist, aber ohne Initiierungsstartregion und (iii) ein Restriktionsfragment ohne Initiierungsstartregion, aber mit einem einzelnen Vektoretteabschnitt (schraffiert) (2). In dieser Hinsicht wird das Produktgemisch nach Denaturierung (siehe Figur 3 b) nur mit Initiierungsprimer (3) behandelt, und zwar in Anwesenheit eines Agens für die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten wie Tag-DNA-Polymerase und Nucleosidtriphosphaten. In diesem Stadium wird kein Vektoretteprimer verwendet. Die zur Hybridisierung an den Initiierungsprimer fähigen Targetrestriktionsfragment/Vektoretteeinheiten werden somit selektiv repliziert (siehe Figur 3 (c)); dabei ist ohne die notwendige Initiierungsstartregion keine Replikation von Fragmenten möglich. Das so gewonnene Produktgemisch wird dann der Behandlung mit einer einzelsträngigen spezifischen Endonuclease wie Sl-Nuclease (siehe Figur 3 (d)) unterzogen. Diese Endonuclease spaltet die" internen Phosphodiesterbindungen in einzelsträngiger DNA auf, was die Produktion von stumpfendiger doppelsträngiger DNA zur Folge hat. Dieser Prozeß erhöht die relative Konzentration der Targetrestriktionsfragment/Vektoretteeinheiten, die zur Hybridisierung an den Initiierungsprimer fähig sind, über die verbleibenden Hintergrundfragmente. Außerdem kann auf Wunsch dieser Prozeßschritte von Denaturierung, Behandlung mit Initiierungsprimer nur in Anwesenheit eines Agens für die Polymerisierung von Nucleosidtriphosphaten und Nucleosidtriphosphaten mit anschließender Behandlung des gewonnenen Produktgemisches mit einer einzelsträngigen spezifischen Endonuclease wie Sl-Nuclease so oft wiederholt werden, wie es für wünschenswert oder notwendig

56

erachtet wird, um die relative Konzentration der Targetrestriktionsfragment/Vektoretteeinheiten, die zur Hybridisierung an den Initiierungsprimer fähig sind, zu erhöhen. Wenn die Konzentration solcher Vektoretteeinheiten im Verhältnis zu den verbleibenden Hintergrundfragmenten als ausreichend hoch angesehen wird, dann kann das Produktgamisch zusätzlich mit Vektoretteprimer behandelt werden, um Amplifikation zu bewirken, wie es in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,202 beschrieben ist.

Ein Nachteil der oben beschriebenen Technik besteht darin, daß Sl-Nuclease nicht dazu tendiert, so einzelstrangspezifisch zu sein, wie es erwünscht sein könnte und somit auch etwa doppelsträngige DNA abgebaut werden kann.

Außerdem wäre lineare Amplifikation in bezug auf die Technik in Figur 3 nicht angemessen, weil nur eine einzelne Runde von Initiierungsprimerextension S-1-Nuclfiase-resistente doppelsträngige DNA liefern würde.

Figur 4 veranschaulicht ein weiteres erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel, bei dem die Verwendung von Sl-Nuclease vermieden wird und versucht wird, die relative Konzentration von Restriktionsfragmenten zu erhöhen, die zur Hybridisierung an den Initiierungsprimer in dem Produktgemisch in. der Lage sind, das durch komplette Restriktionsendonucleasedigestion der interessierenden DNA-Sequenz gewonnen wurde. Der Vorteil dieses Ausführungsbeispiels besteht darin, daß keine Fraktionierung der gewonnenen Fragmente notwendig ist und auch keine Gelelektrophorese als Anfangsschritt erforderlich ist. Nach vollständiger Digestion der interessierenden DNA-Sequenz mit einer Restriktionsendonuclease wie EcoRI werden die gewonnenen Fragmente mit einer blockierenden Vektorette (wie v_orstehend definiert) in Anwesenheit einer DNA-Ligase behandelt, um ein komplettes Gemisch von Produkten zu gewinnen, vgl. Figur 4(a). Es versteht sich, daß die Fragmente A und B in der ursprünglichen DNA-Sequenz nicht unbedingt benachbart sind, sondern in der DNA-Ligasereaktion anomal verbun- ;

2 β 4 0 5

I den worden sein können. Die blockierende Vektorette besteht aus

j einer doppelsträngigen Oligonucleotidsequenz, wie in Figur 4(b)

! gezeigt, mit einem ersten kohäsiven Ende an einem ihrer Enden,

j das für die Ligation an die entsprechenden kohäsiven Enden der

ι Restriktionsfragmente angepaßt ist, worin aber der Te.ll der Re-

• striktionsendonucleaseerkennungsstelle, der nicht an der Liga-

j tion teilnimmt, in der Vektore.tte verändert wird, um die Erken-

! nungsstelle zu zerstören, so daß die einmal gebildete Restrik-

I tionsfragment/Vektoretteeinheit nicht durch die Restriktions-

j enodnuclea>e gespalten werden kann, was zu Restriktionsfragmen-

' ten führen würde. Das andere Ende der blockierenden Vektorette

j umfaßt einen Terminus mit einem blockierenden Rest, der vorzugs-

I weise ein 3' -Didesoxynucleosid wie Didesoxyadenosin (ddA) sein

ι könnte, oder irgendein anderer 3'-Rest, so daß Primerextension

ι dort nicht vuranschreiten kann, zum Beispiel ein 3'-Desoxynu-

i cleosid oder eine andere an sich bekannte chemische Modifika-

I tion. Der untere Strang überlappt den oberen Strang, wie in Fi-

) gur 4(b) gezeigt. Dieser Strang endet vorzugsweise in einem

j nichtphosphorylierten Rest, um Probleme von Selbstligation zu j vermeiden. Die Region (4) besitzt die gleiche Sequenz wie der

¹ Vektoretteprimer, so daß der Vektoretteprimer in der Lage ist, mit dem Extensionsprodukt eines Initiierungsprimers zu hybridi-

j sieren, aber nicht mit dem nichtextendierbaren oberen Strang der 3'-modifizierten blockierenden Vektorette. Die blockierende Vektorette wird geeigneterweise als zwei separate Stränge hergestellt, die nacheinander hybridisiert werden. Der erste und der zweite Strang werden jeweils separat hergestellt, beispielsweise manuell, oder geeigneterweise unter Einsatz eines DNA-Synthesisers, wobei der erste Strang durch chemische"Mittel 5'-phosphoryliert wird, geeigneterweise enzymatisch, z. B. durch die Verwendung von Polynucleotidkinase, und eine terminale Transferase geeigneterweise verwendet wird, um ein 3'-terminales Didesoxynucleotid oder andere modifizierte Mucleotide einzuführen. Wahl-

weise können andere blockierende Komponenten (zum Beispiel Amino) chemisch am 3'-Ende durch an sich bekannte Methoden eingeführt werden.

50

Den so hergestellten ersten und zweiten Strang läßt man dann i hybridisieren, um die doppelsträngige blockierende Vektorette zu bilden.

Das in Figur 4(a) gezeigte und im Anschluß an die Behandlung der Restriktionsfragmente mit blockierender Vektorette in Anwesenheit von DNA-Ligase gewonnene Produktgemisch wird vollständiger Digestion mit der gleichen Restriktionsendonuclease unterzogen, die zur Schaffung der Restrikt onsfragmente vor der Bildung der Restriktionsfragment/Vektoretteeinheiten verwendet wurde, wodurch die Produktarten (i), (ii) und (iii), wie in Figur 4(c) gezeigt, gewonnen.werden. Zur Reduzierung der relativen Konzentration von Restriktionsfragmenten (iii), die in dem Gemisch von Restriktionsfragment/Vektoretteeinheiten (i) und (ii) vorhanden sind, kann der oben aufgeführte Zyklus so viele Male wiederholt werden, wie es zur Bildung eines Pools von Restriktionsfragment/Vektoretteeinheiten, zum Beispiel auf der Basis der Verwendung der Restriktionsendonuclease EjoRI, als notwendig oder erwünscht erachtet wird.

Figur 5 zeigt in (i) eine blockierende Vektorette, die aus einem 14-Basen-Topoligonucleotid und einem 42-Basen-Bottomoligonucleotid besteht, die zusammen mit den vier Basenüberhangen (ein 5'-Uberhang) hybridisiert (annealed) sind, die zu den in der gespaltenen Target-DNA erzeugten Enden komplementär sind.

1 2 3 4 5 5' N , N , N , N , N und N entsprechen der Definition in der nachstehenden Tabelle 1. Das 3'-Ende des 14-Basen-Oligonucleotids wird so modifiziert (X), daß 5'—> 3'-Extension von jenem Ende nicht unter Verwendung einer der bekannten DNA-Polymerasen, z. B. Klenow-Fragment, T7-DNA-Polymerase (Sequenase) oder Taq-DNA-Polymerase durchgeführt werden kann. Diese modifizierte Base kann ein Didesoxynucleosid oder ein 3'-Desoxynucleosid (z. B. Cordycepin) sein. Der 3'-Zuckerrest kann auf Wunsch durch alle an sich bekannten chemischen Methoden modifiziert-werden.

59 I

Die 3'-terminale Base des Bottom-42-mers und die komplementäre ; Base an Position 5 (vom 5'-Ende) im 14-Basen-Topoligonucleotid ^: werden so gewählt, daO nach Ligation der blockierenden Vekto- ' rette an die gespaltene Target-DNA das entstehende Hexanucleotid (an der Ligationsstelle) durch die ursprünglich zur Spaltung der genomischen DNA verwendete Restriktionsendonuclease nicht .erkannt wird. Das ist von Bedeutung, wenn gewährleistet wird, daß jedes Fragment gespaltener genomischer DNA eine blokkierende Vektorette aufweist, die an seine Enden ligiert ist.

Es ist klar, daß die Ligationsprodukte aneinander religierte Fragmente gespaltener genomischer DNA enthalten, und diese werden wieder digeriert, um in einer zweiten l.igationsreaktion empfangende Enden für die blockierende Vektorette zu erzeugen. Dieser Restriktions- und Ligationszyklus muß möglicherweise mehr als einmal wiederholt werden, beispielsweise drei- bis viermal, um zu gewährleisten, daß jedes Fragment gespaltener genomischer DNA an jedem Ende eine blockierende Vektorette hat. Es wird : bevorzugt, daß jedes Fragment gespaltener genomischer DNA an jedem Ende eine blockierende Vektorette aufweist, um zu verhindern, daß zufälliges Starten von irgendwelchen nichtblockierten 3'-Enden von Genom-DNA-Fragmenten im Reaktionsgemisch nach Denaturierung und Behandlung mit einem Initiierungsprimer erfolgt.

Die in Figur 5(i) gezeigte blockierende Vektorette ist für Target-genomische DNA geeignet, die mit Restriktionsendonucleasen gespalten wurde, die 5'-Überhänge erzeugen. Für Restriktionsendonucleasen, die einen 3'-Uberhang erzeugen, müßte die blockierende Vektorette leicht modifiziert werden. So könnte zum Beispiel das 14-Basen-Topoligonucleotid durch einen 10-Basen-Topstrang (dem der 4-Basen-Überhang am 5'-Ende fehit) ersetzt werden, und der 42-Basen-Bottomoligonucleotidstrang könnte durch einen 46-Easen-Bottomstrang ersetzt werden, wobei sich die 4 Extrabasen am 3'-Ende befinden und komplementär zu den Enden sind, die durch die Restriktionsendonuclease erzeugt wurden, die zum Spalten der genomischen Target-DNA verwendet wurde.

60

j Figur 5 (ii) zeigt einen nichtkomplementären Vektoretteabschnitt,

j der aus zwei hybridisierten (annealed) einzelsträngigen Sequen-

J zen (einem 57-Basen- und einem 53-Basen-Oligonucleotid) besteht, [

j die einen derartigen Grad an Nichtkomplementärität besitzen, daß

! die Vektoretteprimerextension nicht sofort stattfinden kann.

j Die obige Diskussion in bezug auf die blockierende Vektorette

j von Figur 5 (i) gilt exakt für den nichtkomplementären Vektoret-

i teabschnitt, mit der Ausnahme, daß der nichtkomplementäre Vek-

¹ torctteabschnitt keine modifizierten Nucleoside zu besitzen

j braucht.

j Figur 6 zeigt eine schematische Darstellung der Anwendung der

! Erfindung auf die Vektoretteabschnitte von Figur 5 (i). Genomi-

! sehe Target-DNA wird bis zur Vollständigkeit mit einer einzelnen

j Restriktionsendonuclease digeriert, um Fragmente, wie in (i) ge-

; zeigt, zu erzeugen. Die Blockiervektoretteabschnittc /5 in Figur

5(i)/ werden in Anwesenheit von DNA-Ligase an die Enden jedes

\ Fragments gespaltener genomischer Target-DNA ligiert. Amplifi-

i kation erfolgt dann nach Denaturierung unter Verwendung der Pr.i-·

I mer mit bekannter Nucleotidsequenz 21 und γ_ in Anwesenheit von

' z. B. Taq-Polymerase.

So stellt 21 in Figur 6 (iii) den In'itiierungsprimer dar und besitzt die gleiche oder zumindest im wesentlichen die gleiche Sequenz wie die in Strang 1 mit IP markierte Ktgion (IP = Initiierungsprimer); 21 ist in der Lage, in Strang 2 an die Initiierungsstartregion (IPR = initiating £riming jcegion) zu hybridisieren. Strang 2, der die Initiierungsstartregion (IfR) enthält, hat auch einen Nucleotidsequenzabschnitt, der gleich oder im wesentlichen gleich ist wie die Nucleotidsequenz des Vektoretteprimers (VP). Im Einsatz liefert die Primerextension von 21 einen Strang, : der eine Vektorettestartregion (VPR = vectorette £riming region) enthält, die zur Hybridisierung mit dem durch den Primer y dargestellten Vektoretteprimer (VP) geeignet ist. Da Strang 1 selbst keine Vektorettestartregion enthält und aufgrund des Vorhandenseins der Polymerisationsblockierkomponente nicht der Primerex-

61 \

tension unterzogen werden kann und Strang 2 auch keine Vektorettestartregion aufweist, kann keine Primerextersion eines Vektoretteprimers erfolgen, bis durch Primerextension des Initiierungsprimers eine Vektorettestartrecjion geschaffen worden ist.

Es versteht sich daher, daß beim ersten Amplifikationszyklus nur der Primer £ ein Extensionsprodukt erzeugen kann, welches sich bis zum Ende des 42-Basen-Oligonucleo-l.ids der blockierenden Vektorette (iii) erstreckt. Der Primer y ist im ersten Zyklus redundant, weil für ihn keine komplementäre Sequenz zu: Hybridisierung und zur Erzeugung von Extensionsprodukten vorhanden ist. Die Sequenz von Primer y_ ist genau die gleiche wie Basen 2 bis 31 vom 5'-Ende des 42-Basen-Bottomoligonuoleotids in Figur 5 (i) und Basen 13 bis einschließlich 42. des 53-Basen-Bottomoligonucleotids in Figur 5 (ii). Im zweiten Zyklus und danach (v und vi) kann der Primer χ an das Extensionsprodukt von Primer χ hybridisieren, und die komplementäre Synthese dieses extendierten Produktes (iv) kann weitergehen. Somit kann Primer £ nicht an irgendeines der in (iii) gezeigten Ligationsprodukte hybridisieren. Er kann nur an ein im wesentlichen vollständig extendiertes Produkt von Primer χ hybridisieren, wobei es sich um die bekannte Nucleotidsequenz an dem Genort von Interesse handelt. So wird nur ein Amplifikotionsprodukt, das Primer 21, die unbekannte Nucleotidsequenz z: und Primer χ enthält, erzeugt. Die Nucleotidsequenz von z_ kann von beiden Enden unter Verwendung der Primer x^ und ^ als Sequenzierungsprimer bestimmt werden. Wahlweise können ineinandergeschachtelte (nested) Sequenzierungsprimer χ/ und j/' hergestellt werden. Diese enthalten Sequenz 3¹ von Primer χ. -der 3¹ von Primer χ, zum Beispiel die Basen 25 bis 42 vom 5'-Ende des 42-mtr-Dligonucleotids in Figur

Figur 6 veranschaulicht die erfindungsgemäße Methode durch Bezugnahme auf eine Targenucleinsäurefragme it/Vektoretteeinheit, ; bei der der Vektoretteabschnitt eine Polymerisationsblockier- _; ί komponente enthält. Ähnliche Erwägungen gelten dort, wo der ' Vektoretteabschnitt mindestens eine Region Nichtkomplementärität gemäß vorstehender Beschreibung und Darstellung als Beispiel in Figur 5 (ii) umfaßt. Somit wird Strang 1 die gleiche oder mindestens im wesentlichen die gleiche Sequenz besitzen, wie die mit IP markierte Region. Ein Initiierungsprimer (IP) wird in der Lage sein, an die Initiierungsstartregion (IPR) ir Strang zu hybridisieren. Strang 2, der IPR enthält, hat auch einen Nucleotidsequenzabschnitt, der der Nucleotidsequenz des Vektoretteprimers (VP) gleicht oder mindestens im wesentlichen gleicht, ; aber dieser Abschnitt von Strang 2 hybridisiert nicht an den · entsprechenden Abschnitt von Strang 1, ur>ri zwar aufgrund des Grades an Nichtkomplementärität, der absichtlich in Strang 1 eingeführt wurde. Der Vektoretteprimer (VP) kann also nicht an Strang 1 hybridisieren, weil Strang 1 keine Vektorettestartregion (VPR) enthält, und er kann auch nicht an Strang 2 hybridisieren, weil Strang 2 einen Sequenzabschnitt enthält, der VP gleicht, aber keine komplementäre Sequenz oder VPR. Somit können keine Vektoretteprimerextensionsprodukte gebildet werden, ehe nicht eine Vektorettestartregion (VPR) durch Primerextension des Initiierungsprimers (IP) geschaffen worden ist.

Der oben beschriebene Prozeß wird dann vorzugsweise unter Verwendung einer anderen Restriktiunsendonuclease und anderer entsprechend konstruierter blockierende¹? Vektorette wiederholt, um einen anderen Pool von Restriktio.isfragment/Vektoretteeinheiten zu bilden, der eine andere Vektorettebibliothek darstellt.

Dieser Prozeß kann separat für jede gewünschte Zahl verschiedener Restriktionsendonucleasen (z. B. 10 bis 30, geeigneterweise 15 bis 25, vorteilhafterweise etwa 20) und entsprechend ; konstruierte blockierende Vektoretten wiederholt werden, um

63

eine Vielzahl von Bibliotheken solcher Hybriden zu bilden. Gie

j Vielzahl von Bibliotheken kann dann unter Hybridisierungsbedin-

gungen in Anwesenheit von Nucleosidtriphosphaten und einem Agens

i für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate wie Taq-DNA-

I Polymerase mit einem Initiierungsprimer behandelt werden. Der

! Zuatz von Vektoretteprimer unter den für Polymerasekettenreak-

.. j tion (PCR = £olymerase £hain Reaction) geeigneten Bedingungen

^: gemäß Beschreibung in den US-Patenten Nr. 4,683,195 und 4,683,

i hat Amplifikatiop lediglich der interessierenden Loci zur Folge, und

! solche amplifizierten Fragmente können der Sequenzierung unter-

j zogen werden, wodurch die Konstruktion eines neuen Initlierungs-

I primers unü die Wiederholung des obengenannten Verfahrens ermög-

j licht wird, wobei der neue Intiierungsprimer als Ausgangspunkt

I für die Amplifikation und, auf Wunsch, Sequenzierung einer wei-

i teren Region von Interesse verwendet wird, wobei die Verfahrens-

, weise auf Wunsch wiederholt wird.

Figur 7 veranschaulicht, was oben gesagt wurde, indem eine sehe- · matische Darstellung der Verwendung von Vektorettebibliotheken i gegeben wird. Genomische DNA wird bis zur Vollständigkeit mit ¹ der Restriktionsendonuclease EcoRl digeriert. Vektoretteabschnit-t te mit 4 Basenüberhängen, die zu den 4 durch EcoRl-Spaltung erzeugten Basenüberhängen komplementär sind, werden an die Enden jedes Fragments gespaltener genomischer DNA ligiert. Das nennt man eine EcoRl-Vektorettebibliothek. Ähnliche Bibliotheken werden unter Verwendung von beispielsweise etwa 15 bis 20 Restriktionsendonucleasen, die Hexanucleotidsequenzen erkennen, kon-. struiert. Wenn diese Bibliotheken gepoolt un.d der Amplif ikation ; unterzogen werden, kann eine Reihe von PCR-Produkten gewonnen werden, oder sie können noch besser individuell und separat verwendet werden, um von jeder Bibliothek ein yinzelnes PGR-Produkt zu erzeugen.

; Figur 7 (a) zeigt eine hypothetische Restriktionskarte für die 3'-Seite eines interessierenden Lccus mit bekannter Nucleotidsenoenz (w). Bei Amplifikation von gepoolten Vektorettebiblio-

64

theken unter Einsatz der Primer 21 und _y_ werden die in (b) gezeigten PCR-Produkte Z, Zl, Z2, Z3 und Z4 prodziert. Elektrophorese dieser PCR-Produkte auf einem Agarosegel würde das in (c) gezeigte Bandenmuster erzeugen, wo die PCR-Reaktionen eher separat mit jeder Vektorettebibliothek als mit einer gepoolten Vielzahl von Bibliotheken ablaufen. Gas größte auf dem Gel sichtbar gemachte PCR-Produkt (in diesem Fall Z4) kann gel-gereinigt werden, und seine 3'-Ende-Nucleotidsequenz kann unter Verwendung von Oligomer _v_ oder von einem ineinandergeschachtelten Oligomer χ¹ als Sequenzierungsprimer bestimmt werden. Diese Nucleotidsequenz am 3'-Ende von Z4 könnte dann, bei weiteren "waling" Schritten unter Anwendung dieser Methode, dienen als oder verwendet werden für die Synthese eines neuen Initiierungsprimers x.·

Figur 8 zeigt die schematische Anwendung der Erfindung für die inverse PCR. Die inverse PCR wurde letztlich beschrieben bei Triglia, T. et al., Nucleic Acids Research, Band 16, 1988, S. 8186, und von Ochmann, H. et al., Genetics 120; 621-623 (November 1988).

Genomische DNA wird mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das vorzugsweise relativ selten schneidet (z. B. durchschnittliche Fragmentgröße 10 bis 20 kb) wie Xbal, Kpnl oder BamHI. Die Fragmente mit niedriger Konzentration werden zur Bildung von Ringen selbstligiert. Die Ringe werden dann mit einem Restriktionsenzym geschnitten, das vorzugsweise häufig schneidet (wie Hinfl), und die Fragmente werden an eine entsprechende Vektorette ligiert, z. B. eine HinfI-Vektorette. Wenn also beispielsweise die einer bekannten Xba-Stelle benachbarte Sequenz zur Verfügung steht, kann die der nächsten Xba-Stelle benachbarte Sequenz durch Analyse des Vektoretteeinheitsproduktes ermittelt werden. Auf die- :>e Weise könnte eine Reihe von Sprüngen erfolgen, die zusätzliche Startpunkte für das erfindungsgemäße Verfahren liefern würden. Zwar wurde oben als Beispiel eine durchschnittliche Fragmentgröße von 10 bis 20 kb angeführt, es wäre aber noch besser,

65 ^;

die Targetnucleinsäure so zu spalten, daß noch größere Fragmen- j te von beispielsweise etwa 100 kh entstehen. Solche Fragmente ι könne.ι z. B. durch den Einsatz von Restriktionsenzymen gewonnen : werden, die genomische DNA sehr selten schneiden wie Notl, Bss-HII und Sal I.

rigur ll(i) ist eine Photographie eines Agarosegels, die in den Spuren 1 und 11 den mit Haelll gespaltenen Marker 0x174, in Spur 12 den Marker X/HindIII, in Spur 2 eine PCR-Kontrolle und in Spur 9 das amplifizierte Fragment zeigt, das unter Verwendung der Oligonucleotide 58 und 61 in Beispiel 1 und gemäß Darstellung in Figur 9 gewonnen wurde.

Figur ll(ii) ist der obere Abschnitt einer Photographie eines Agarosegels, der den Marker X/HindIII in den Spuren 1 und 13, den mit Haelll gespaltenen Marker 0x174 in den Spuren 2 und 12, eine PCR-Kontrolle in Spur 3 und das unter Verwendung der Oligonucleotide 58 und 61 in Beispiel 1 (siehe Figur 9) gewonnene amplifizierte Fragment in Spur 10 zeigt.

Figur ll(iii) ist der untere Abschnitt einer Photographie eines Agarosegels, der den Marker J\ /Hindllll in den Spuren 1 und 11, den mit Haelll gespaltenen Marker 0x174 in Spur 6, das gemäß Beispiel 5 gewonnene amplifizierte Fragment in den Spuren 2, 3, 4 und 5 und das gemäß Beispiel 7 gewonnene amplifizierte Fragment in den Spuren 7, 8, 9 und 10 zeigt.

Die verbleibenden Figuren werden in den nachstehenden Beispielen im Detail behandelt.

Die Erfindung soll nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Methoden und Beispiele näher veranschaulicht, aber nicht eingeschränkt werden, wobei die im folgenden einzeln aufgeführten Oligodesoxynucleotide verwendet wurden, wobei jede angegebene Nucleotidsequenz im herkömmlichen 5'—j3'-Sinn zu lesen ist:-

66 :

Oligonucleotid Typ A (eine Gruppe von 14 Basen langen Oligonuc- ]

leotiden mit 4 oder 5 Endbasen am 5'-Ende mit variierende Se-

! quenz und daher' geeignet zur Verwendung mit 5'-Überhängen. Die ;

j 4 Endbasen stellen den 5'-Uberhang dar, während die fünfte End- >

base vorhanden ist, um die Restriktionsenzymerkennungsstelle

zu zerstören).

Speziell wurden verwendet:

Oligonucleotid 1

CTAGGAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Xba I oder Nhel oder Spei digeriert wurde)

Oligonucleotid 2

AATTGAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease EcoRI digeriert wurde)

Oligonucleotid 3

GATCGAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit den Restxiktionsendonucleasen BamHJ. oder BgI II oder Xho II oder Bei I digeriert wurde)

Oligonucleotid 4

AGCTGAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Hind III gespalten wurde)

Oligonucleotid 5

TCGAGAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease ' Sal I gespalten wurde)

j

67

Oligonucleotid 6

CGCGGAAGGAGAGG

j (zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease MIuI oder Bss HII gespalten wurde)

Oligonucleotid 7

GTACGAAGGAGAGG

j (zur Verwendung mit Restriktionsendonuclease-Asp718-gespaltener DNA)

Oligonucleotid 8

j TCGACAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Xhol gespalten wurde)

Oligonucleotid 9

CATGCAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Ncol gespalten wurde)

Oligonucleotid 10

GGCCCAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Not I oder Eag I gespalten wurde)

Oligonucleotid 11

CCGGTAAGGAGAGG

(zur Verwendung mit DNA, die mit den Restriktionsendonucleasen Bspm II oder Xma I oder Acc III gespalten wurde)

Oligonucleotid 12

CATGTAAGGAGAGG (zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease

68 BspHI oder Nco I digeriert wurde)

Oligonucleotid 13

CTAGTAAGGAGAGG

ι (zur Verwendung mit DNA, die mit den Restri!<tionsendonucleasen Avr II, Nhe I oder Xba I digeriert wuroe)

Qligonucleotid Typ B (eine Gruppe von 42 Basen langen Oligonucleotiden, bei denen die Z '-Endbase eine variierende Sequenz hat; j die Oligonucleotide eignen sich zur Verwendung mit 5'-Uberhän- ! gen).

j Speziell wurden verwendet:

j Qligonucleotid 14

! CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTC

: Dieses Oligonucleotid ist mit den Oligonucleotiden 1, 2, 3, 4, '. j 5, 6 und 7 zu verwenden.

: Qligonucleotid 15

\ CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTG

; (Die Nucleotidsequenz ist die gleiche wie bei 14, mit dem Unterschied, daß der 3'-terminale Rest C durch G ersetzt wird). Dieses Qligonucleotid ist mit den Oligonucleotiden 8, 9 und 10 zu verwenden.

Oligonucleotid 16

CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTT

(Die Nucleotidsequenz ist die gleiche wie bei 14, mit dem Unterschied, daß der 3'-terminale Rest C durch T ersetzt wird).

Oligonucleotid 17

CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTA (Die Nucleotidsequenz ist die gleiche wie bei 14, mit dem Unter-

69 ;

schied, daß der 3'-terminale Rest C durch A ersetzt wird). Die- ; ses Oligonucleotid ist mit dem Oligonucleotiden 11, 12, 13 und . 18 (nachstehend definiert) zu verwenden. i

i Oligonucleotid 18 (lumer) TAAGGAGAGG

j Oligonucleotid 18 wird an Oligonucleotid 17 hybridisiert. Sie ι sind zur Verwendung als Vektoretteeinheit mit DNA konstruiert, die mit einer zur Schaffung stumpfer Enden fähigen Restriktionsendonuclease digeriert wurde).

Die Oligonucleotide 19 und Oligonucleotide der Serie Typ C sind

zum Einsatz mit 3'-Überhängen geeignet:

* Oligünucleotid 19 (lOmer)

5¹- AAA GGA GAG G-3¹

Dieses Oligonucleotid ist zur Verwendung mit den Oligonucleotiden 20 bis 25 gemäß nachstehender Definition konstruiert.

; Oligonucleotid Typ C (eine Gruppe von 46 Basen langen Oligonucleotiden)

' Oligonucleotid 20

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT TGC A-3¹

(zur Verwendung mit DNA, die mit den Restriktionsendonucleasen Nsi I oder Pst I digeriert wurde)

Oli.qonucleotid 21

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT AGC T-3¹

; (zur Verwendung mit DNA, die mit den Restriktionsendonucleasen Sst I oder Sac I digeriert wurde)

70

Oligonucleotid 22

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT CAT G-3¹

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Sph I digeriert wurde)

i Oligonucleotid 23

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT GTA C-3¹

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Kpn I digeriert wurde)

Oligonucleotid 24

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT ACG T-3'

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Aat II digeriert wurde)

Oligonucleotid 25

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT GGC C-3¹

(zur Verwendung mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease Apa I digeriert wurde)

Oligonucleotid Typ D

Das ist eine Gruppe von 57 Basen langen Oligonucleotiden mit nur 4 bis 5 Basen am 5'-Ende, deren Sequenz variiert.

Oligonucleotid 26

CT/* GGAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAAGGGAGAG

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 (nachstehend definiert) und mit Xbal, Nhe I oder Spe I digerierter DNA.

71

Oligonucleotid 27

5'- AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit EcoRI gespaltener DNA.

j Oligonucleotid 28

5'-TCGAGA AGG AUA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA

j GAG AAG GGA GAG-3¹

j Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit Sal I gespaltener

I DNA.

j Oligonucleotid 29

j 5'-CGC GGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA j GAG AAG GGA GAG-3'

> Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit Bss HII oder MIu I

> gespaltener DNA.

' Oligonucleotid 30

j 5'-AGC TGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit Hind III gespaltener DNA.

Oligonucleotid 31

5'-GAT CGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA ; GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit Bam HI, Bc II oder BgI II gespaltener DNA.

j Oligonucleotid 32

5'-CCG GGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA : GAG AAG GGA GAG

; Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit Apa LI gespaltener

72 DNA.

j :

Oligonucleotid 33

5'-TGC AGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 40 und mit Apa LI gespaltener j DNA. · j j Oligonucleotid 34

j 5'-TCG ATA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA j GAG AAG GGA GAG-3¹

j Zur Verwendung mit Oligonucleotid 41 und mit Xho I gespaltenrr ! DNA.

I Oligonucleotid 35

! 5'-GGC CTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA ! GAG AAG GGA GAG-3¹

i Zur Verwendung mit Oligonucleotd 41 und mit Eag I oder Not I j oder Xma III gespaltener DNA.

Oligonucleotid 36

i 5¹CCG GTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 41 und mit Bspm II oder Xma I oder Acc III gespaltener DNA.

: Oiigonucleotid 37

5'-CAT GTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA ; GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 41 und mit Bsp HI oder Nco I gespaltener DNA.

73 Oligonucleotid 38

5'-CTA GTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleoti'·· 41 und mit Avr II, Nhel oder Xba I gespaltener DNA.

Oligonucleotid 39

5'-TA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 41 und DNA, die mit einer zur Schaffung stumpfer Enden fähigen Restriktionsendonuclease gespalten wurde.

Oligonucleotid Typ E

Das ist eine Gruppe vxn 53 Basen langen Oligonucleotiden mit einem variierenden 3'-terminalen Rest.

Oligonucleotid 40

5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TC-3'

Zur Verwendung mit den Oligonucleotiden 26 bis 33.

Oligonucleotid 41

5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TA-3¹

Zur Verwendung mit den Oligonucleotirien 34 bis 39.

Oligonucleotid Typ F

Hierbei handelt es sich um ein 53 Basen langes Oligonucleotid zur Verwendung mit der Gruppe von Oligonucleotiden von Typ G (43 bis 48) gemäß nachstehender Definition und zur Verwendung mit 3'-Überhängen.

2 8 40

74 Oligonucleotid 42 :

5'-AAAGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3¹

Oligonucleotid Typ G

Das ist eine Gruppe von 57 Basen langen Oliqonucleotiden mit 4 Basen am 3'-Ende mit variierender Sequenz.

Oligonucleotid 43

5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TTT GCA-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 42 und mit Pst I oder Nsi I gespaltener DNA.

Oligonucleotid 44

5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TTA GCT-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 42 und mit ;ist I oder Sac I gespaltener DNA.

Oligonucleotid 45

5'- CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TTC ATG-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 42 und mit Sph I gespaltener DNA.

Olinonucleotid 46

5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TTG TAC-3¹

Zur Verwendung mit Oligonucleotid 42 und mit Kpn I gespaltener DNA.

75 Qlicjonucleotid 47

5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC j TCT CCT TTA CGT-3¹ i

j Zur Verwendung mit Oligonucleotid 42 und mit Aat II gespaltener DNA.

j Oligonucleotid 48

j 5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC

! TCT CCT TTG GCC-3¹

j Zur Verwendung mit Oligonucleotid 42 und mit Apa I gespaltener

I DNA.

I Die angeführten Restriktionsendonucleasen sind zum Spalten der j DNA zum Einsatz mit dem speziellen Oligonucleotid oder Oligonu-

• cleotidpaar zu verwenden. So ist Oligonucleotid 1 beispielsweise : mit genomischer DNA zu verwenden, die mit Nhe I oder Spe I oder I Xba I gespalten wurde.

; Alle Oligonucleotide zum Einsatz mit 5'-Überhängen (d. h. Typ A, D und F (42)) und doe Oligonucleotide 18, 19 und 39 werden vorzugsweise phosphoryliert.

Oligonucleotide 49 - 57

Sie werden bei der Konstruktion alternativer Vektoretteeinheiten eingesetzt.

Oligonucleotid 49

5'-AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA G-3¹

: Oligonucleotid 50

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCu TTC-3¹

76 ^;

Oligonucleotid 51 ,

5'-AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGT CAG AGG ACG GTT ACG AAC GTA

GGA CAG AAG GGA GAG-3^{1 ;}

Oligonucleotid 52

AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGA CTG TCG AAC GTA CGG ATA GGA GTC GAG

j AAG GGA GTC GAG AAG GGA GAG-3¹

I Oligonucleotid 53

5'-AAT TGA AGG AGA GGA GAG AAG GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA-3¹

Oligonucleotid 54

5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT TCC CTT CTC TCC TCT CCI TC-3¹

Oligonucleotid 55

5'-AAT TGA AGG AGA GGA CGC IGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG AAA GAG GAA GGG AAG-3¹

Oligonucleotid 56

5'-CTT CCC TTC CTC TTT CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TC-3¹

Oligonucleotid 57

5'-AAT TGA AGG AGA GGC AGA AGG GAG AG-3¹

Alternative Vektoretteeinheiten

Oligonucleotid 49 sollte an Oligonucleotid 50 hybridisiert werden. Oligonucleotide 51, 52, und 57 sollten an Oligonucleotid hybridisiert werden.

77

Qligunucleotid 53 sollte an Oligonucleotid 54 hybridisiert werden. Oligonucleotid 55 sollte an Oligonucleotid 56 hybridisiert werden. Diese Oligonucleotide würden mit genomischer DNA verwendet werden, die mit EcoRl gespalten wurde.

-Tab« lie 1-

Vektoretteeinheiten

1. 5' N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACG JAGGAG

I I I Il IM M M I I Il I ! I I I I I I

· ν⁵ 'ttcctctcctgtcgctaagagcatgcttgccaatgctaagc

12/30 komplementär

2. 5' N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGACGCTGTCAGAGCACGGTTACGAACGTAGGACAGAAGGGAGAG

I MMIIMIM I I I I I IMMMMII N⁵¹TTCCTCTCCTGTCGCTAACAGCATGCrTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTC

5-/30 komplementär

3- 5¹ N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGACGCTGACTGTCGAACGTACGGATAGGAGTCGAGAAGGGAGAG

I I I Il I I I I Il I M I III III I I I I Il M I I III IM I I I I I I N⁵¹TTCCTCTCCTCTCGCTMGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCtCTC

20/30 komplementär

· 5' N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGAGAGAAGGGACGCTGTCTGTCGAÄGGTAAGCAACCGAGGA

I M I M M I III M I M I I I M I II I III N⁵¹TTCCTCTCCTCTCrTCCCTTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGC

9/30 komplementär

5. 5' N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACCGAGGAGAGAAGGGAGAGAAAGAGGAAGG

I MIIMIMM I I III I I I Il Il I I I I I I I M I I M M I I M I Il I N⁵¹TTCCTCTCCTGTCGCTAACAGCATGCTTCCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTCrITCTCCTTCC

13/30.komplementär

6. 5· N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAZ-GGAACGGAGGAGAGAAGGGaGAG

I I I I Il I IiI I I : I I I 1 I 1 I I I I I I ll I I I M I Il N^{5 1}TTCCTCTCCTGTCGCt JLGAGCATGCrrTGCCAATGCTAAGCTCrrCCCTCTC

13/30 komplementär

7. 5¹ N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGCAGAAGGGAGAG

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I N⁵'TTCCTCTCC TCTTCCCTCTC

* I ,-T

8. . 5¹ N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGG

I I I Il M I M

N⁵'TTOCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGC

9. 5' N¹N²N³N⁴N⁵ AAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGCAGAGAAGGGAGAG

I IMIIIIIMI I.I I I MIMIMIMM

NS'TTCCrrCTCCTCGCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCCTCTTCCCTCTC GGCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTaGTGGCC 5' 79

¹O- ⁵' N¹N²N³N⁴N⁵ GCGGCCGCCATCCTAATTCTOTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT

I MIMIIMIIM I I M. I II

. N5' CGCCGGCGGTAGGCGGCCxGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCCCTCTTCA

fok I-Spaltstelle g^gcctgcgtagcaccggccgtagtcgcc 5·

fok I-Erkennungsstelle

11. 5' N¹N²N³N⁴N⁵ GCGGCCGCCATCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT

I I I I I I I I I I Il I I I III IMIIIII N5' CGCCGGCGGTAGGCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCCCTCTTGA Fok I-Spaltstelle GCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCC 5^r 79 ~

Fok I-Erkennungsstelle

12. 5' N¹N²N³N⁴N⁵ GCGGCCGCCATCC-Nh₂

I I I M I I I I I M I N5'CGCCGGCGGTAGGCGGCCrGCCTAGCACCGCCCGTAGTGGCCCTCTTGA

Fok I-Spaltstelle gcggcctgcgtagcaccgcccgtagtgccc 5^f

Eok I-Erkennungsstelle *°

In Tabelle 1 stellen N , N , N und N vier Nucleotide dar, die ; kohäsive Enden zur Verfügung stellen, die zur Ligation an eine , entsprechende Restriktionsstelle auf einem Targetnucleinsäure- ' fragment fähig sind. Die Nucleotide N und N werden bewußt so ausgewählt, daß das Restriktionsstellen-Erkennungsmuster zerstört wird. Zum Beispiel:

i N¹N²N³N⁴N⁵ kann darstellen AATTG

j N⁵' C

j in bezug auf die EcoRI-Restriktionsstelle, und

i N¹N²N³N⁴N⁵ kann darstellen AGCTG

in bezug auf die Hind III-Restriktionsstelle.

Wo N¹, N², N³, N⁴, N⁵ und N⁵' das obengenannte EcoRI-Restriktionsstellen-Erkennungsmuster darstellen, werden die spezifischen Vektoretteeinheiten 1 bis 10 nachstehend in Tabelle 2 einzeln aufgeführt, wobei jedes Oligonucleotid durch s°ine entsprechende Identifikationsnummer markiert wird. In den Vektoretteeinheiten 11 und 12 von Tabelle 2 stellen N , N , N , N ,

5 5' N und N das obengenannte Hind III-Restriktionsstellen-Erkennungsmuster dar, und jedes Oligonucleotid wird durch seine entsprechende Identifikationsnummer markiert.

Tabelle 2 Spezifische Veketoretteeinheiten

1. 49 5¹ AATTGAAGGAGAGGACSCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAG

1!MMIIIIMI I IMIIIIM I I 3' CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGC

2. 51 5' AATTGAAGGAGAGGACGCTGTCAGAGGACGGTTACGAACGTAGGACAGAAGGGAGAG

IMIMMIIMI I I I 1 I MIIIMIII CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATG CTTGCCAA X CTAAG CTCTTCC CTCTC

3. 52 5* AATTGAAGGAGAGGACGCTGACTGTCGAACGTACGGATAGGAGTCGAGAAGGGAGAG

I I Il I M Il I ! I I M III Ml MM Il 1 I Il M I M I M I M I CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAG CTCITCCCTCTC

4. 53 5' AATTGAAGGAGAGGAGAGAAGGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGA

I I I M M M I I I I I I I I I M I I I Il I MI CTTCCTCTCCTCTCTTCCCTTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGC

5. 55 5' AATTGAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGCTAAGGAACGGAGGAGAGAAGGGAGAGAAAGAGGAAGG

IMMIMIIMI I < Il I I I Il Il I I I I I Il I Il .Mil I I I I IUM CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATCCTTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTCTTTCTCCTTCC

AATTOAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAAGGGAGAG I I I I I I I I I I I I I I I I ! I I I I I Il I I I I I I I I I Ml

CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTC

AATTGAAGGAGAGGCAGAAGGGAGAG ¹IIIIIIIM Il I M I I I I I

CTTCCTCTCC TCTTCCCTCTC I >

AATTGAAGGAGAGG I I I M I Il I I CTTCCTCTCCI¹GTCGCTAAg AGCiLTGCTTGCCAATGCTAAGC

AATTGAAGGAGAGGACGCT&TCTGTCGAAGGTAACGAACGGAGGACAGAAGGGAGAG I I I III I I I I I I I I I I MMIMIIIII

CTTCCTCrrcCrrcGCGGCCTGCGTAGCACCCGCCGTAGTGGCCTCTTC 5' GCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCC 5· 79

10. 80 5' AATTGGCGGCCGCCATCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT

I Il I I I Il I I III I I III I Il Mill CCGCCGGCGGTAGGCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCCCTCTTGA -5'

-Fokl-Spaltstelle GCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCC 5^f

Jok I-Erkennungsstelle

11. 82 5* AATTGGCGGCCGCOTCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT

I III I III »I III I I Ml IMIMII CCGCCGGCGGTAGGCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCCCTCTTGA 5^f Fok I-Spaltstelle GCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCC 5' F-ok I-Erkennunnsstelle

12. 83 5« AGCTGGCGGCCGCCATCC-NH2

MIMMIMMM

CCGCCGGCGGTAGGCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAgrGGCCCTCTTGA F-Ok I-Spa It stelle GCGGCCTGCGTAGCACCGGCCGTAGTGGCC

Fok I-Erkennungsstelle f⁰

Die Qiigonucleotide 58, 59 und 60 können mit allen Konstrukten verwendet werden.

Oligonucleotid 58 ist ein universeller Vektoretteprimer.

z. B. :

(40) CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTC 3· ι; 111111! 1111111111111111111!ι 5'

TCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGC 3¹ 58 5'

Oligonucleotid 59 ist ein universeller Sequenzierungsprimer und ein ineinandergeschachtelter Vektoretteprimer.

z. B. :

(40) CTTCCTCTCCTGTCGCTA

I I I I I I I I I I I I I I I

₃·, TTCCTCTCCTGTCGC 5'

59

Oligonucleotid 60 ist ein ineinandergeschachtelter universeller Vektoretteprimer.

z. B. :

(40) 3¹ CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAA—

CCTCTCCTGTCG CTAAGAGCATG CTTGCCA 3' 60 5¹

Kurze 01igonucleotj.de sind die 14mer + 42mer hybridisierten. Lange 01igonucleotide sind die 57mer + 53mer hybridisierten.

Typ A und Typ 0 sind äquivalente kurze bzw. lange Oligonucleotide.

Deshalb haben 1 und 26 den gleicnen Überhang und sind beide mit DNA zu verwenden, die mit Nhe I, Spe I oder Xba I gespalten wurde. Ähnlich sind 2 un'J 27 beide mit DNA zu verwenden, die mit EcoRI gespalten wurde.

Genau das gleiche gilt für Typ B und Typ E, 19 und Typ F (42)

sowie Typ C und Typ G.

Jedes Oligonucleotid ist an DNA zu ligieren, die mit der Restriktionsendonuclease gespalten wurde, die am nächsten zu dem Oligonucleotid angegeben ist. Die Typen A und B (und Typ D und Typ E) sind zur Verwendung mit 5'-Überhängen vorgesehen.

Die Oligonucleotide 19 + Typ C (und Typ F + Typ G) sind zur

Verwendung n.it 3' -Überhängen vorgesehen.

Die Oligonucleotide 1 bis 8 werden mit Oligonucleotid 14 ge

paart.

Die Oligonucleotide 9 bis 13 und 18 werden mit Oligonucleotid 17 gepaart.

Oligonucleotid 19 wird mit den Oligonucleotiden 20 bis 25 gepaart.

Die Oligonucleotide 26 bis 33 werden mit Oligonucleotid 40 gepaart.

Die Oligonucl .ctide 34 bis 39 werden mit Oligonucleotid 41 gepaart.

Typ F (42) wird mit Typ-G-Oligoviucleotiden 43 bis 48 gepaart. Oligonucleotid 7 (und 32) kann durch Oligonucleotid 11 (urd 36) zur Verwendung mit Bspm Il-restringierter DNA ersetzt werden.

Es versteht sich, daß die Oligonucleotide 1 bis 7 zum Hybridisieren an Oligonucleotid 14 vorhanden sind. "Die Oligonucleotide 8 bis 10 sind zum Hybridisieren an Oligonucleotid 15 da. Die Oligonucleotide 11 bis 13 sind zum Hybridisieren an Oligonucleotid 17 vorhanden. Die Verwendung von Oligonucleotid 16 kann sich als unnötig erweisen.

87 Oligonucleotid 58 :

CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCT '

(ein 30 Basen langes Oligonucleotid, das als "Universalvektoretteprimer" in der in Schritt 6 von nachstehender Methode I aufgeführten Polymerasekettenreaktion (PCR) vorgesehen st).

In den nachstehenden Beispielen verwendete zusätzliche Oligonucleotide

j Diese Oligonucleotide können mit jeder Vektorettebibliothek ! verwendet werden, und zwar unabhängig von der eingesetzten Restriktionsendopuclease und mit Ausnahme von Oligonucleotid 65,

siehe nachstehende detaillierte Aufstellung:

Oligonucleotid 61

GAGACTiGGTATTTTGTTCAATCATTAAG

(ein 3'-Oligonucleotid von Exon V des ^£-1 Antitrypsingens)

Oligonucleotid 62

AAAAGCCAGAGACCTCACTCCCGGGGAGCC

(ein 5'-Oligonucleotid von Exon 1 des menschlichen Phenylalaninhydroxylasegens, dessen Mutationen Phenylketonurie (PKU) verursachen) .

Oligonucleotid 63

AGGGACTTACTGTGGCGAGCTTTTCAATGT

(ein 3¹-Oligonucleotid von Exon 9 des Phenylalaninhydroxylasegens (PAH-Gens))

OligonuclRotid 64

GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTG (ein 3'-01igonucleotid von Exon III des «C 1-Antitrypsingens)

88 ^;

Oligonucleotid 65 !

AATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG

(ein verlängerter M13-Reverse-Primer)

Dieser ist als einer der PCR-Primer für die Amplifikation von

Inserts entweder in M13-DNA oder pUC-Plasmid-DNA zu verwenden. ! j ; Oligonucleotid 66

j 5'-ATC AGG TGC ACC CAG AGA GGC AAG GCC-3¹

! (ein 3'-Oligoni-Jleotid von Exon 9 des Phenylalaninhydroxylasegens (PAH-Gens))

; Methode I

j Sie umfaßt die folgenden sechs Schritte:

\ Schritt 1 - Phosphorylierung von Oligonucleotid Typ A, anschlie- · j pend Gelreinigung der phosphorylierten Species.

Schritt 2 - Addition eines ddA-Rests an das 3'-Ende des phos- ! phorylierten Oligonucleotids Typ A von Schritt 1 mit anschließender Gelreinigung.

Schritt 3 - Hybridisierung des modifizierten Oligonucleotids Typ A an das entsprechende Oligonucleotid Typ B.

Schritt 4 - DNA-Herstellung und Restriktionsdigestion.

Schritt 3 - Ligation der hybridisierten Oligonucleotide Typ A und Typ B an die gespaltene dephosphorylierte DNA von Schritt

Schritt ο - Amplifikation der Ligationsprodukte von Schritt 5 und Nachweis und Analyse der PCR-Produkte.

Solche Schritte können zum Beispiel folgendermaßen ausgeführt werden:

89

Schritt 1

Folgende Puffer und andere Standardlösungen wurden verwendet:

1.1 IQX Kinasepuffer

0,5 M Tris-HCl (pH 7,6) 0,1 M MgCl₂

50 mM Dithiothreitol 1 mM Spermidin

1 mM EDTA

aufbewahrt bei - 20 ⁰C.

1.2 Adenosin-5'-triphosphat

Natriumsalz als 10-mM-Lösung (Pharmacia) Verdünnt mit Wasser auf 20 pMol/μΙ, aufbewahrt bei - 20 ⁰C.

32

a) Adenosin-5'-/JT P/triphosphat (Amersham)

61

32

b) Didesoxyadenosin-5'-ItO P/triphosphat (Amersham)

1.3 Radioisotope

a) Adenosin-

Spezifische Aktivität etwa 6000 Ci/mmol.

• 32

b) Didesoxyadenosin-5'-/»6 P/triphospha

Spezifische Aktivität etwa 3Ί00 Ci/mmol.

1.4 Formamidprobenpuffer

80 % (Vol./Vol.) deionisiertes Formamid 50 mM Tris-borat, pH 8,3 1 mM EDTA

0,1 % (Masse/Vol.) Bromphen-lblau 0,1 % (Masse/Vol.) Xylencyanol

Das Formamid wurde durch 30minütiges Rühren mit 2 g Amberlit-MB-1-Harz (Bio-Rad) und Abfiltrieren unter Einsatz eines Whatman-Filters der Nummer 1 deionisiert,

Der Puffer wurde im Dunkeln aufbewahrt.

1. 5 40 %iges Vorrats-Acrylamid

pro 500 ml;

Acrylamid (elektrophoretische Qualität 190 g) Bisacrylamid (elektrophoretische Qualität 10 g)

90 ;

Das Acrylamid wurde 30 Minuten mit 5 g Amberlit-MB- -1-Harz (Bio-Rad) gerührt und unter Verwendung von zwei Platten Whatman-Filter Nummer 1 filtriert. i Die Vorratslösung wurde im Dunkeln bei 40 ⁰C aufbewahrt.

1.6 10%iges Ammoniumpersulfat

j 1 g Ammoniumpersulfat (Sigma, Elektrophoresequalität)

' " wurde gelöst und mit sterilem deionisiertem Wasser I auf 10 ml aufgefüllt. Es wurde im Dunkeln aufbewahrt.

j 1.7 0.5X Gelmischung

j (20 % Acrylamid, 7 M Harnstoff)

j pro 50 ml:

j 21 g Harnstoff

j 25 ml 40 %iges Vorrats-Acrylamid (1,5)

! 2,5 ml 10 χ TBE (1,8)

j Unmittelbar vor der Verwendung sind polymerisierende Agenzien

; zuzusetzen:

j 300 μΐ 10 %iges Ammoniumpersulfat (1,6)

j 40 μΐ TEMED

; JLJ₁ IPX TBE pro Liter: \ Tris 109 g

: EDTA 9,5 g

, Borsäure 55 g

1OX TBE-Puffer wurde, wenn erforderlich, in Wasser I auf 1- oder 0,5fache Stärke verdünnt.

1.9 Puffer A j 0,1 M Tris-HCl, pH 7,7

10 mM Triethylamin 1 mM EDTA Der Puffer wurde bei 4 ⁰C aufbewahrt und einmal im

. Monat frisch hergestellt.

i 1.10 Reagens B pro 100 ml: 50 ml Ethanol 50 ml steriles deionisiertes Wasser

91 j

Phosphorylierung des 14mer Qligonucleotids Typ A i

Folgendes wurde in einem 1,5 ml Sarstedt-Röhrchen gemischt:

Oligonucleotid Typ A 100 pmol

1OX Kinasepuffer (1,1) 5 μΐ

Adenosin-5'-triphosphat (1,2) 9,5 μΐ (190 pmol) Adenosin-5'-/₍f³²P/triphosphat (1.3) 5 μΐ ( 10 pmol) T4-Polynucleotidkinase E.coli B (Amersham) 40 Einheiten H₂O auf 50 μΐ.

Das Verhältnis von Oligonucleotiden zu ATP-Molekülen wurde bei 1:2 gehalten.

Die Phosphorylierung der Oligonucleotide erfolgte durch 60 Mij nuten lange Inkubation bei 37 C.

! 20 μΐ des Formamidprobenpuffers (1.4) wurden zugesetzt, und die ί Enzymprobe wurde 10 Minuten in einem 90 °C-Wasserbad denaturiert, i bevor sie auf ein 20 % Acrylamid/7M Harnstoff-Denaturierungsgel ] gebracht wurde.

j Es erfolgte Gelreinigung der kinasierten (kinased) Oligonucleoi tide. Phosphorylierte Oligonucleotide wurden durch Elektrophore-

se auf denaturierenden Polyacrylamidgelen gemäß der Beschreibung : durch Wu R. et al. "Purification and sequence analysis of syn-

: thütic oligonucleotides" (Reinigung und Sequenzanalyse von synthetischen Oligonucleotiden) in Oligonucleotide Synthesis - a practical approach, herausgegeben von M. 3. Gait, IRL Press,

I gereinigt.

I c) Endreinigung durch eine Säule

NeNsorb -(DuPont)-Nucleinsäure-Reinigungspatronen wurden für

diesen Endreinigungsschritt eingesetzt.

; 1) Prä-äguilibrierung der Säule

' Die Säule wurde an einem Klemmständer befestigt. Das Innere der ¹ Patrone wurde mit 2 ml Methanol von HPLC-Qualität gewaschen. ^; Dadurch wurde jegliches lose Packungsmaterial auf das Säulenbett zurückgespult.

Der Adapter wurde fest in das obere Ende der Patrone gepreßt, so daß ein luftdichter Verschluß entstand. Eine Einwegplastspritze wurde mit Luft gefüllt und am Adapter befestigt. Mit konstantem sanftem Druck wurde das gesamte Methanol durch die Patrone gedruckt (Durchflußgeschwindigkeit: 1 Tropfen in 2 Sekunden). Auf die gleiche Weise wurde die Säule 'gestartet', indem -2 ml Puffer A (1.9) hindurchgeleitet wurden.

2) Probenaufgabe

2,8 μΐ Triethylamin wurden den 2 ml Wasser zugesetzt, die das Oligonucleotid enthielten. Das Ganze wurde dann unter Verwendung einer Spritze und einer Nadel direkt oben auf das Säulenbett gegeben. Die Probe wurde unter Einsatz einer mit Luft gefüllten Spritze, wie in C(I), durch die Säule geleitet.

3) Probenwäsche

3 ml Puffer A (1.9) wurden unter Einsatz einer Spritze und Nadel auf die Säule gegeben und wie in C(I) durch die Säule gedrückt.

4) 1 ml Reagens B(I.10) wurde oben auf die Säule gegeben. Die DNA wurde durch sanften Druck unter Verwendung einer mit Luft gefüllten Spritze, wie in C(I), von dem Säulenbett eluiert. Das ablaufende Medium wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gesammelt und in einer Zentrifuge, an die ein Vakuum angelegt war (UNIVAP, Uniscience) zur Trocknung eingfidampft.

Das getrocknete, gereinigte Oligonucleotid wurde, wenn erforderlich, resuspendiert.

Schritt 2

Folgende Puffer und andere Standardlösungen wurden verwendet:

2.1 1,4 M Natriumcacodylat pH 7,5 mit HCl

Aufbewahrung bei - 20 C.

I	2	.2
;
	2	J»
	2	.4

93

5 mM Cobaltdichlorid

Aufbewahrung bei - 20 ⁰C.

1 mM Dithiothreitol

Aufbewahrung bei -2O⁰C.

Didesoxyadenosin-5'-triphosphat-lyophilisiertes

Natriumsalz.

(Boehringer Mannheim)

Verdünnt auf 10 mM Vorratslösung in H₂O

und 1 mM Arbeitslösung in H₂O

2.5 0,5 M EDTA, pH 8,0

Addition eines Didesoxyadenosinrests am 3'-Ende des OligonucleoticE Typ A

Oligonucleotid Typ A wurde phosphoryliert, und die phosphorylier- . te Species wurde, wie in Schritt 1 beschrieben, gereinigt. Mit einer Rückgewinnung von 80 H werden 80 pmol Oligonucleotid kinasiert und stehen für die Terminale-Transferase-Reaktion zur Verfügung.

Die 80 pmol kinasiertes und gereinigtes Oligonucleotid I wurden in 48 μΐ sterilem deionisiertem Wasser resuspendiert. Folgendes wurde zu dem kinasierten Oligonucleotid hinzugegeben:

(48 μΐ Oligonucleotid (80 pmol)

μΐ 1 mM ddATP (1 nmol) (2.4)

μΐ 1,4 M Cacodylsäure (2.1)

μΐ 1 mM DTT (2.3)

μΐ 5 mM Cobaltdichlorid (2.2)

μΐ ddATP ( ³²P) Ü5 pmol) (1.3b)

μΐ Terminale Transferase

(150 Einheiten Boehringer TdT)

Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 31 ⁰C inkubiert, und die Reaktion wurde dann durch den Zusatz von 4 μΐ 0,5 M EDTA beendet.

94 '

40 μΐ des Formamidprobenpuffers wurden zugesetzt (1.4), und die _; Probe wurde durch lOminütiges Inkubieren in einem Wasserbad von 90 ⁰C vor dem Aufgeben auf ein 20 % Acrylamid/7 M Harnstoff-

Denaturierungsgel denaturiert.

Gie Gelelektrophorese entsprach genau der Beschreibung in Schritt

Die nunmehr ISmer-Oligonucleotid-Typ Α-Bande wurde ausgeschnit-S ten und genau entsprechend der Beschreibung in Schritt 1 gereinigt. Die endgültige Rückgewinnung wird auf 50 pmol geschätzt.

Diese werden in 250 μΐ sterilem deionisiertem Wasser resuspenj diert, so daß sich eine Konzentration von 0,2 pmol/μΐ ergibt.

j Schritt 3

j Hybridisierung (annealing) des modifizierten Oligonucleotids

I Typ A an das entsprechende Oligonucleotid Typ B

Die folgende Lösung war erforderlich. I 3.1 10 χ Hybridisierungspuffer j 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)

100 mM MgCl₂

Folgendes wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen mit Schraubkappe gemischt:

25 pmol modifiziertes Oligonucleotid vom Typ A (gewonnen über Schritt 1 und 2)

25 pmol Oligonucleotid Typ B 5 μΐ 10 χ Hybridisierungspuffer (3.1)

und H₂O auf 50 μΐ.

Wenn das Oligunucleotid von Typ A unter den Oligonucleotiden 1, 2, 3 oder 4 ausgewählt wird, dann ist ein geeignetes Oligonucleotid vom Typ B dafür (1-4) das Oligonucleotid 14. Das Eppendorf-Röhrchen wurde in ein siedendes Wasserbad (passen- ' derweise ein kleines Becherglas) gelegt. Nach 5 Minuten ließ man das Wasser in dem Becherglas langsam über einen Zeitraum von 2 Stunden auf Raumtemperatur abkühlen. Schließlich wurde der Inhalt

95

des Röhrchens durch 10 Sekunden langes Zentrifugieren am Boden gesammelt. Das hybridisierte Oligonucleotid, mit einer Konzentration von 0,5 pmol/μΐ ist fertig zum Einsatz bei Ligationen.

Schritt 4

DNA-Herstellung und Restriktion j Folgende DNA-Proben wurden verwendet:

j 1. Menschliche genomische DNA I

j 2. Menschliche genomische DNA II (Genomische DNA, hergestellt ! aus Lymphoblastoidzellen), bei der dem Kulturmedium 0,1 mg/ml I 5-Azacytidin zugesetzt worden war, um Methylierung an den Cy-

tidinresten während Replikation von DNA und Zellwachstum zu ver-' hindern.

Folgende Puffer wurden verwendet:

I 4.1 IQx salzarmer Puffer

j 100 mM Tris-HCl, pH 7,5

j 100 mM MgCl₂

j 10 mM Dithioerythritül

' 4.2 IQx Puffer mit mittlerem Salzgehalt

; 100 mM Tris-HCl, pH 7,5

: 100 mM MgCl₂

500 mM NaCl

10 mM Dithioerythritol

4. 3 IQx salzreicher Puffer

500 mM Tris-HCl, pH 7,5

100 mM MgCl₂

1000 mM NaCl

10 mM Ditnioerythritol

44.4 IQx BamHl-Puffer

100 mM Tris-HCl, pH 8,0 50 mM MgCl₂

: 1000 mM NaCl

10 mM 2-Mercaptoethanol.

96 ;

4.5 IQx EcoRI-Puffgr | 100 mM Tris-KCl, pH 7,5

100 mM MgCl₂ [

500 mM NaCl

4.6 TE-Puffer

10 mM Tris-HCl, pH 7,5 1 mM EDTA

4.7 Agaroseprobenpuffer < 15 % (Masse/Vol.) Ficoll 400 i 0,05 % (Masse/Vol.) Bromphenolblau

1 0,05 % (Masse/Vol.) Xylencyanol

j Der Probenpuffer wurde in IX TBE-Puffer (1.8) aufgefüllt. -

_t

i ·

j LJL IPX CIP-Puffer ^;

500 mM Tris-HCl, p!l 8,0 ;

1 mM EGTA

(i) Die folgenden Bedingungen wurden zum Spalten der genomischen DNA mit spezifischen Restriktionsendonucleasen angewendet:

50 μβ DNA

20 μΐ des geeigneten 1OX Restriktionspuffers.

50 Einheiten der gewünschten R«striktionsendonuclease. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches wurde auf 200μ1

eingestellt.

Digestion erfolgte 2 Stunden bei 37 C. Die Reaktion wurde durch den Zusatz von 4 μΐ 0,5 M EDTA (2.5) und Erwärmen der Probe über einen Zeitraum von 10 Minuten auf 70 ⁰C beendet, (ii) 1 pg der Probe wurde durch Agarosegelelektrophorese kontrolliert, jm komplette Digestion sicherzustellen.

Agarosegelelektrophorese

Die Gele wurden aus 0,7 % (Masse/Vol.) Agarose (Pharmacia) in IX TBE-Puffer (1.8) hergestellt und zur Elektrophorese in TBE-Puffer der gleichen Stärke getaucht. Ein Fünftel des Agarosegel-

97

puffervolumens (4.7) wurde zu der Probe gegeben, bevor sie in die Vertiefungen des Gels gegeben wurde. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 10 Minuten lang durch Eintauchen in deionisiertes Wasser mit einem Gehalt von 1 Mg/ml Ethidiumbromid angefärbt. Die DNA wurde unter Einsatz eines Transilluminators (Macrovue-LKB) sichtbar gemacht.

(iii) (a) Die digerierte DNA wurde durch Phenclextraktion gereinigt:

Ein gleiches Volumen gepufferten redestillierten Phenols (BRL, Phenol mit Nucleinsäurequalität, mit TE gepuffert (4.6)) wurde zu der restringierten DNA hinzugegeben, und aas Gemisch wurde 30 Sekunden wirb.jlbehandelt. Die entsteinende weiße Emulsion wurde durch 5iiiinütiges Zentrifugieren in zwei Phasen getrennt. Die wäßrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen übertragen. Alles rgetliche Phenol wurde, nachdem die wäßrige Schicht zuerst mit Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) - ein gleiches Volumen - extrahiert worden war/ mit einem gleichen Volumen von Chloroform : Isoamylalcohol (24 : 1) entfernt.

(b) Die DNA wurde schließlich durch Ethanolprazipitation gereinigt: 1/10 Volumen von 3M Natriumacetat wurde zu der DNA-Lösung hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 300 mM Natfiumacetat zu erhalten. Die DNA wurde durch den Zusatz von 2,5 Volumen 95 %iges Ethanol und anschließendes 30minütiges Stehen bei - 80 C und nachfolgende Zentrifugierung (Mikrozentrifuge, 5 Minuten lang, 12 000 U/min) präzipitiert. Die pelletierte DNA wurde mit 80 % (Vol./Vol.) kaltem Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wurde bei Anforderung in Puffer gelöst.

(iν) Dephosphorylierung der gespaltenen DNA

Die gespaltene DNA wurde zur Verhinderung von Selbstligation de-

phosphoryliert.

Die restringierte und gereinigte DNA wurde in 175 μΐ sterilem

deionisierten Wasser gelöst.

Zu dieser DNA wurden hinzugegeben:

98

5 μΐ Kalbsdarmphosphatase (CIP)

(Boehringer Mannheim) (1 Einheit/μΐ) 20 μΐ 1OX ClP-Puffer (4.8)

Die Probe wurde 60 Minuten lang bei 37 ⁰C inkubiert. 4 μΐ 0,5 M EDTA wurden zugesetzt, und die dephosphorylierte DNA wurde durch Phenolextraktion und Ethanolprazxpitation gemäß Beschreibung in (iii) (a) und (iii) (b) oben gereinigt. Das fertige DNA-Pellet wurde in 50 μΐ TE-Puffer (4.6) gelöst, so daß eine Konzentration von 1 μg/μl entstand.

Schritt 5

Ligation der hybridisierten (annealed) Oligonucleotide I & II

an die gespaltene dephosphorylierte DNA

Folgende Puffer wurden verwendet:

IQX Ligationspuffer

200 mM Tris-HCl, pH 7,4

100 mM MgCl₂

100 mM DTT

10 mM ATP

Folgendes wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt.-Röhrchen gemischt:

Gespaltene genomische DNA (7,4 pmol)

Hybridisierte Oligonucleotide von Schritt 3 1OX Ligationspuffer T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) Sterilisiertes deionisiertes Wasser, auf 100 μΐ zu bringen

10 μg

11 pmol

10 μΐ

2 Einheiten um das Volumen

Das Ligationsgemisch wurde über Nacht bei 4 C stehen gelassen. Die Effizienz der Ligation wurde durch Gelelektrophorese von 5 % der Ligationsprodukte eingeschätzt - siehe Schritt 4 (ii) bezüglich Einzelheiten der Verfahrensweise.

99

Die Ligationsprodukte wurden dann durch Phenolextraktion und _;

Ethanolprazipitation gemäß der Beschreibung in Schritt 4 (iii) \

gereinigt. Das fertige DNA-Pellet wurde in 9,5 μΐ TE-Puffer

(4.6) gelöst, um eine Konzentration von 1 pg/μΐ zu erhalten. ''

J Schritt 6

j Amplifikation der Ligationsprodukte von Schritt

j Folgende Puffer und andere Standardlösungen wurden verwendet.

6.1 IQX Amplifikationspuffer

500 mM KCl

100 mM Tris-HCl, pH 8,3

15 mM MgCl₂ '.

0,1 % Gelatine Aufbewahrung bei - 20 ⁰C

6.2 Nucleotide 1OX Vorrat 2 mM dATP 2 mM dTTP

2 mM dGTP 2 mM dCTP Aufbewahrung bei - 20 ⁰C

6.3 Größenmarker

Mit Haelll gespaltener Bakteriophage 0X174.

Die Größe der Bande in Basenpaaren ist:

1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 und 72.

Folgendes wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt: 1 pg der Ligationsprodukte von Schritt 5

100 pmol Oligonucleotid 58 100 pmol Oligonucleotid 61 oder 62 oder 63 10 μΐ 1OX Amplifikationspuffer (6.1) 10 μΐ 1OX Vorratsnucleotide.

2340

100

Das Volumen wurde mit destilliertem deionisiertem Wasser auf _; 100 μΐ aufgefüllt. ;

Das Röhrchen wurde für 5 Minuten in ein siedendes Wasserbad gelegt. Taq-Polymerase (Anglian) wurde in IX A;nplifikationspuffer ! (6.1) auf 1 Einheit/μΐ verdünnt.

j 2 μΐ des verdünnten Enzyms wurden zu dem obigen gesiedeten Reak-

; tionsgemisch hinzugegeben und gemischt. Der Inhalt wurde in ei-

ner Mikrozentrifuge 5 Sekunden in Richtung Boden geschleudert.

\ 50 μΐ leichtes Mineralöl (Sigma) wurde anschließend auf das

j Reaktionsgemisch gegeben (um während der folgenden Reaktionen

I Verdampfung zu verhindern).

! Das Röhrchen wurde in ein Wasserbad gelegt von:

j 1) 60 ⁰C für 2 Minuten I 2) 72 ⁰C für 3 Minuten I 3) 91 ⁰C für 2 Minuten

: Die Schritte 1), 2) und 3) wurden dann 39mal wiederholt. Dos \ Röhrchen wurde danach 2 Minuten lang in das Wasserbad von 60 ⁰C ; gelegt, woran sich Inkubation bei 72 ⁰C über einen Zeitraum von 8 Minuten anschloß. Am Ende der Amplifikation wurde der Inhalt Richtung Boden geschleudert und das Mineralöl abpipettiert.

15 μΐ der amplifizierten Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese entsprechend der Beschreibung in Schritt 4 (ii) analysiert. Zur Einschätzung der Größe der amplifizierten Produkte wurde mit Hae III (6.3) gespaltener 0X174 neben der amplifizierten Probe elektrophoretisiert.

Methode II Methode II umfaßt folgende Schritte:

1. Addition eines ddA-Rests an das 3'-Ende von Oligonucleotid Typ A mit anschließender Gelreinigung der 3'-end-markierten Species.

2 8 4 O 5

101 ;

2. Phosphorylierung des 3'-end-markierten Oligonucleotids Typ A mit anschließender Separation von nichteingebauten Nucleotiden. ;

3. Hybridisierung des modifizierten Oligonucleotids T/p A an das entsprechende Oligonucleotid Typ B.

4. Spaltung der genomischen DNA.

5. Ligation der hybridisierten Oligonucleotide A + B an die gespaltene DNA.

6. Amplifikation der Ligationsprodukte. Nachweis und Analyse der PCR-Produkte.

Die obigen Schritte können zum Beispiel wie folgt ausgeführt werden:

Schritt I

Die experimentellen Details sind genau die gleichen wie bei

Schritt 2 von Methode I.

Schritt 2

Das Oligonucleotid wird gemäß derBeschreibung in Schritt. I von Methode I phosphoryliert. Das phosphorylierte Oligonucleotid wird direkt durch eine Säule gereinigt, wie es in Schritt I (ii)C von Methode I im einzelnen beschrieben wurde. Bevor die Probe auf die Säule gebracht wird, werden dem Reaktionsgemisch anstelle von Triethylamin 200 μΐ Puffer A (1.9) zugesetzt.

Schritte 3-6 sind genau die gleichen wie bei Methode I.

Methode III

Sie umfaßt die folgenden Schritte:

: 1. Phosphorylierung der 14mer Oligonucleotids Typ A mit anschlie-

Gender Gelreinigung der phosphorylierten Species.

2. Addition eines ddA-Rests an das 3'-Ende des kinasierten Oligonucleotids mit anschließender Gelreinigung.

3. Hybridisierung des Oligonucleotids Typ A an das entsprechende Oligonucleotid Typ B.

4. Restriktion der DNA.

5. Ligation der hybridisierten Oligonucleotide A + B an die restringierte DNA.

6. Addition eines Didesoxynucleotids an freie 3'-Enden.

7. Amplifikation der Ligationsprodukte. Nachweis 'und Analyse der Amplifikationsprodukte.

Solche Schritte können zum Beispiel wie folgt ausgeführt werden: Die Schritte 1 bis 5 entsprechen genau den Details in Methode I

Schritt 6

Die gereinigten Ligationsprodukte von Schritt 5 werden in 30 μΐ destilliertem deionisierten Wasser gelöst. Zu der DNA wird folgendes hinzugegeben:

5 μΐ 1Ox Amplifikationspuffer (6.1) 15 pmol des geeigneten Didesoxynucleotids 1 Einheit Taq-Polymerase (Anglian) Wasserzusatz, um das Volumen auf 50 μΐ zu bringen.

Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Die DNA wird durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gemäß der Beschreibung in Methode I, Schritt 4 (iii), gereinigt. Das DNA-Pellet wird in 50 μΐ TE-Puffer (4.6) gelöst, um eine

2 8 4 0 5

103 Konzentration von 1 Mg/μΐ zu erhalten.

Schritt 7 entspricht Schritt 6 von Methode I.

Methode IV

Genau wie Methode II, mit dem Unterschied, daß Schritt 6 von Me- ; thode III zwischen den Schritten 5 und 6 von Methode II einge- ; schoben wird.

j Methode V

Methode V umfaßt die folgenden Schritte: ;

; 1. Phosphorylierung des 57mer Oligonucleotids vom Typ D mit an- j schließender Separation desselben von nichteingebautem Nucleotid.

; 2. Hybridisierung des phosphorylierten, zum Beispiel kinasierten I Oligonucleotids vom Typ D, an das entsprechende Oligonucleotid : vom Typ E. Es folgen die Schritte 4 ff. von den Methoden I-IV. Solche Schritte können beispielsweise wie folgt ausgeführt werden 1. Das Oligonucleotid wird phosphoryliert, wie es in Methode I, Schritt I, beschrieben ist. Die Reinigung* erfolgt durch eine

NeNsorl (ii)C.

TM NeNsorb -Säule gemäß der Beschreibung in Methode I, Schritt I

2. Die Hybridisierung erfolgt, wie im einzelnen in Methode I aufgeführt, üie Schritte von 4 an aufwärts erfolgen wie vorstehend aufgeführt (Methoden I und ΪΙΙ).

Methode VI Methode VI umfaßt die folgenden Schritte:

1. Phosphorylierung des 14mer Oligonucleotids vom Typ A (oder Oligonucleotide 18 oder 19 oder 39 oder Typ F (42) oder Typ D)

104 ;

mit anschließender Gelreinigung der phosphorylierten Species.

2. Hybridisierung des phosphorylierten Oligonucleotids z. B. 18, 19 oder Typ D an das entsprechende geeignete Oligonucleotid Typ B (oder Typ C) oder Typ E oder Typ C.

3. Restriktionsenzymdigestion der genomischen GNA.

4. Ligation der hybridisierten Qligonucleotide an die restringierte DNA.

j 5. Restriktion der Ligationsprodukte vom obigen Schritt.

ι ^;

6. Ligation weiterer hybridisierter Oligonucleotide an Produkte

von Schritt (5).

7. Wiederholung von Schritt (5) und (6).

8. Endrestriktion von Produkten von Schritt (7).

9. Addition eines Didesoxynucleotidtriphosphats an das 3'-Ende ^: der Produkte von Schritt (8).

10. Amplifikation der Produkte von Schritt (9). Nachweis und Analyse der amplifizierten Produkte.

Solche Schritte können zum Beispiel wie folgt ausgeführt werden: Schritt 1

I — —

Wie in Schritt 1 von Methode I beschrieben.

Schritt 2

Dieser Schritt entspricht der Beschreibung in Schritt 3 von Methode I

Zum Beispiel: Die Oligonucleotide 1 bis 7 werden an 14 hybridisiert.

!O₅ ²»40:

Die Oligonucleotide 11 bis 13 und 18 werden an 17 hybridisiert.

Die Oligonucleotide 20 bis 25 werden an 19 hybridisiert.

Die Oligonucleotide 26 bis 32 werden an 40 hybridisiert.

Die Oligonucleotide 24 bis 39 werden an 41 hybridisiert.

Die Oligonucleotide 43 bis 48 werden an 42 hybridisiert.

Schritt 3 ι Dieser Schritt ist der gleiche wie Schritt 4(i), 4(ii) und j 4(iii) von Methode I, aber restringierte DNA wird nicht dephos-

I phoryliert.

j Schritt 4

Ligation der hybridisierten Oligonucleotide an die gespaltenen

ι

DNA-Puffer und andere Standardlösungen:

4.1. IQx Ligationspuffer

200 mM Tris-HCl, pH 7,4

100 mM MgCl₂

100 mM DTT 10 mM ATP

(i) Die Berechnung von pmol klebriger Enden in 1 pg gespaltener DNA entspricht den Ausführungen in Schritt 5 von Methode I. (ii) Ligationen

Folgendes wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt: Gespaltene genomische DNA, 7,4 pmol (10 pg) Hybridisierte Oligonucleotide von Schritt 2 11 pmol 1Ox Ligationspuffer (4.1) 10 μΐ

T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) 2 Einheiten

Sterilisiertes deionisiertes Wasser, um das Volumen zu bringen auf 100 μΐ

Das Ligationsgemisch wurde über Nacht bei 4 C stehen gelassen. Die Effizienz der Ligation wurde durch Gelelektrophorese von 5% der Ligationsprodukte eingeschätzt - siehe Schritt 4(ii) von Methode I bezüglich VerfahrensdetaiIs.

Die Ligationsprodukte wurden durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gemäß der Beschreibung in Abschnitt 4(iii) oder Methode I gereinigt.

Schritt 5 Dieser Schritt ist der gleiche wie Schritt 3 oben.

Schritt 6

Dieser Schritt ist der gleiche wie Schritt 4 oben, mit dem Unterschied, daß äquimolare Konzentrationen von DNA und hybridisierten Oligonucleotiden verwendet werden. Zum Beispiel:

7,4 pmol DNA

7,4 pmol hybridisierte Oligonucleotide

Schritt 7 Wiederholung von Schritt 5 und 6 oben.

Schritt 8 Wie Schritt 5 oben.

Schritt 9

Puffer und andere Standardlösungen

T7-DNA-Polymerase-Puffer (5x) 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 100 mM MgCl₂ 250 mM NaCl

dNTP-dATP

1 mM dTTP

1 mM dGTP

1 mM dCTP

aufgefüllt mit sterilisiertem deionisierten Wasser.

ddATP

1 mM ddATP

aufgefüllt mit sterilisiertem deionisierten Wasser.

2 βΤό 5

107

(i) Addition eines ddA-Rests an 3'-Enden von Produkten von

Schritt 8:

Folgendes wurde in einem 1,5-ml -Sarstedt-Röhrchen gemischt:

4 pg DNA von Schritt oben ί 20 μΐ von 5x T7-DNA-Polymerase-Puffer (9.1) ' 20 μΐ dNTP-dATP )9.2)

20 μΐ ddATP (9.3) !

5 Einheiten T7-DNA-Polymerase (Sequenase)

Das Volumen wurde mit destilliertem deionisierten Wasser auf 1OU μΐ aufgefüllt.

Dos Röhrchen wurde 30 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Das Enzym wurde dann durch 10 Minuten lange Inkubation bei 70 ⁰C denaturiert. Die DNA wurde dann durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation gemäß vorstehender Beschreibung gereinigt. ^ ·

Schritt 10

Dieser Schritt ist der gleiche wie Schritt 6 von Methode I, oder die Amplifikation kann auf einer Temperatur-Kreislauf-Maschine (temperature cycling machine), ζ. B. Techne Programmable Dri-

Block PHC-I, durchgeführt werden.

Es versteht sich, daß bei dieser Methode VI Didesoxyadenosin-5'-triphosphat mit den 3'-Enden der ligierten Oligonucleotide in Anwesenheit von T7-DNA-Polymerase (Sequenase) umgesetzt wird, um jeglichen Verlust von 3'-terminalen ddA-Resten als Folge einer unerwarteten Exonucleaseaktivität der für Didescxynucleo-

tide spezifischen T4-DNA-Ligase zu ersetzen.

Methode VII

Methode VII ist die gleiche wie Methode VI, mit dem Unterschied, daß Schritt 1 von Methode VI weggelassen wird. Außerdem erfolgt bei dieser Methode keine Gelreinigung, aber die Effizienz der Ligation kann durch Agarosegelelektrophorese und Anfärben mit Etiiidiumbromid kontrolliert werden.

108

Methode VIII

Methode VIII ist die gleiche wie Methode VII, mit dem Unterschied, daß Schritt 9 ausgelassen wird. Die bei dieser Methode verwendeten Qligonucleotide sind z. B. wie folgt:

26 bis 32 hybridisiert an 40 36 bis-39 hybridisiert an 41 43 bis 48 hybridisiert an 42

Methode IX

Methode IX umfaßt die folgenden Schritte:

1. Phosphorylierung

2. Hybridisierung

3. Restriktion von DNA

4. Ligation (zum Beispiel bei 25 ⁰C) von hybridisierten Oligonucleotidsn an gespaltene DNA

5. Restrikticn/Ligation

6. Amplifikation der Produkte von Schritt 5 und Nachweis und Analyse der Amplifikationsprodukte.

Die obigen Schritte können beispielsweise so ausgeführt werden, wie es im Zusammenhang mit den entsprechenden Schritten in Methode VI beschrieben wurde.

Methode X

Die Schritte 1, 2 und 3 Methode X sind die gleichen wie die Schritte 1, 2 und 3 von Methode VIII, Schritt 4(i) von Methode X ist ebenfalls der gleiche wie Schritt 4(i) von Methode VIII, aber Schritt 4(ii) wird wie folgt ausgeführt:

4(ii) Ligation

Folgendes wurde in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

Restringierte 7387-DNA 0,74 pmol

Hybridisierte (annealed) Qligonucleotide 1,65 pmol 1Ox Ligationspuffer (4.1) 1 μΐ

109 :

1Ox ATP (4.2) 1 μΐ

T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) 1 Einheit

H₂O auf 10 μΐ

Das Ligationsgemisch wurde 120 Minuten bei 25 ⁰C (im Techne ; Dr.i-Block) belassen.

Das Ligationsgemisch wurde dann in Wasser auf eine DNA-Konzen- ·. j tration von 10 ng/μΐ verdünnt und der Amplifikationsreaktion gemäO der Beschreibung in Schritt 10 von vorstehender Methode

VIII unterzogen.

Methode XI <

Methode XI entspricht mit folgenden Ausnahmen der Methode X: ι Nach der 120minütigen Ligationsreaktion bei 25 ⁰C werden die Li- :

gationsprodukte mit der Restriktionsendonuclease digeriert, und

zwar durch Zusatz von:

2 μΐ Puffer für die entsprechende Restriktionsendonuclease

(siehe 3.1) 2 Einheiten Restriktionsnuclease H₂O auf 20 μΐ

und Inkubation bei 37 ⁰C über einen Zeitraum von 60 Minuten.

Die Probe wurde dann in H₂O auf eine DNA-Konzentration von 10 ng/

μΐ verdünnt.

Methode XII

Methode XII ist die gleiche wie Methode X, mit dem Unterschied, daß in Schritt 4 (ii) das Ligationsgemisch über Nacht bei 4 C stehen gelassen wird anstatt 2 Stunden bei 25 ⁰C

Schließlich wird das Ligationsgemisch in Wasser auf eine DNA-Konzentration von 10 ng/μΐ verdünnt.

Methode XIII

Methode XIII ist die gleiche wie Methode XII, mit dem Unterschied, daß nach der Ligationsreaktion über Nacht bei 4 ⁰C die Ligationsprodukte mit der entsprechenden Restriktionsendonuclea- \ se digeriert werden. Das geschieht durch: ;

2 β 4 0 5 3

110 ;

Zusatz von i

2 μΐ Puffer für die entsprechende Endonuclease (siehe 3.1) \

2 Einheiten Restriktionsendonuclease (Boehringer Mannheim) ^:

zu dem Ligationsgemisch von 10 μΐ

und H₂O auf 20 μΐ j sowie Inkubation bei 37 ⁰C über einen Zeitraum von 60 Minuten.

Die Probe wird dann in t^O auf eine DNA-Konzentration von '; 10 ng/μΐ verdünnt.

Beispiel 1

Es wurden die Oligonucleotide 1 und 14 nach der Beschreibung j in den Schritten 1 und 2 der obigen Methode I hergestellt. Die- ^: se Oligonucleotide zum Einsatz bei Methode I wurden nach der I Beschreibung im obigen Schritt 3 hybridisiert (annealed). ; Menschliche genomische DNA II wurde hergestellt und entspre- ^ chend der Beschreibung in Schritt 4 von Methode I gespalten

Mit Restriktionsendonuclease Xba 1 gespaltene und dephosphory- _: lierte (wie im obigen Schritt 4 im einzelnen ausgeführt) menschliche genomische DNA II wurde mit den hybridisierten Oligonucleotiden 1 und 14 ligiert, wie es oben in Schritt (5) beschrieben wurde.

Dann erfolgte die Amplifikation an den L'igationsprodukten

Figur ll(i), gemäß vorstehender Beschreibung, zeigt den mit Hae III gespaltenen Marker 0X174 in den Spuren 1 und 11, den Marker λ Hind III in Spur 12, eine Amplifikationskontrolle in Spur 2 und das mit den Oligonucleotiden 58 und 61 gewonnene amplifizierte Fragment, das erwartungsgemäß eine Länge von 800 bp aufweist .

Figur ll(ii) zeigt auch den Marker λ Hind III in den Spuren 1 und 13, den mit Hae III gespaltenen Marker 0X174 in den Spuren 2 und 12, eine Amplifikationskontrolle in Spur 3 und das unter Verwendung der Oligonucleotide 58 und 61 gewonnene amplifizierte, Fragment in Spur 10.

in ;

Beispiel 2 :

Verwendung der Oligonucleotide 1 und 14 mit DNA, die mit der ί Restriktionsendonuclease Xba I gespalten wurde. !

a) Oligonucleotid 1 (100 pmol) wurde phosphoryliert, und die kinasierte Species wurde gereinigt, wie es in Schritt 1 von Methode I beschrieben ist. \

b) Das kinasierte Oligonucleotid 1 wurde mit terminaler Transfe- rase behandelt (terminal transferased), um einen Didesoxyade- ^! nosinrest an das 3'.-Ende des Oligonucleotids zu fügen. Das ent- ! stehende 15mer Oligonucleotid 1 (+ ddA am 3'-Ende) wurde gerei- I nigt, wie es in Schritt 2 von Methode I im einzelnen ausgeführt !

ist. j

c) Oligonucleotid 1 wurde an Oligonucleotid 14 hybridisiert.

d) Menschliche genomische DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease Xba I gespalten und dephosphoryliert, wie es in Methode I im einzelnen ausgeführt wurde.

e) Die hybridisierten (annealed) Oligonucleotide 1 und 14 wurden an mit Xba I restringierte menschliche genomische DNA II ligiert - siehe Methode I bezüglich Details. * .

f) Die Amplifikation wurde an den Ligationsprodukten unter Einsatz der Oligonucleotide 58 und 61 ausgeführt. Das erwartete amplifizierte Produkt weist in diesem Fall ungefähr 800 bp auf.

Beispiel 3

Verwendung der Oligonucleotide 2 und 14 mit DNA, die mit der Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten wurde.

a) Das Oligonucleotid 2 wurde phosphoryliert und ein ddA-Rest, gemäß der obigen Beschreibung in Beispiel (2), an das 3'-Ende i gefügt. Dieses modifizierte Oligonucleotid wurde dann an Oligo- ;

nucleotid 14 hybridisiert.

b) Genomische DNA I wurde wit der Restriktionsendonuclease ! EcoRI gespalten und, wie in Methode I beschrieben, dephosphory- I liert.

c) Die hybridisierten Oligonucleotide 2+14 wurden dann an mit i EcoRI gespaltene genomische ΠΝΑ I ligiert. j

d) Amplifikation erfolgte an den Ligationsprodukten unter Verwendung von:

(i) Oligonucleotid 58 und 62.

Das erwartete Produkt weist etwa 220 bp auf. (ii) Oligonucleotid 58 und 63.

Das erwartete Produkt weist etwa 560 bp auf..

Beispiel 4

i Verwendung der Oligonucleotide 3 und 14 mit DNA, die mit der j Restriktionsendonuclease BamHI gespalten wurde.

! a) Das Oligonucleotid 3 wurde phosphoryliert und ein ddA-Nucleo- \ tid an das 3'-Ende gefügt, wie es oben in Beispiel 1 beschrie-

ben wurde.

b) Dieses präparierte Oligonucleotid wurde dann an Oligonucleo-. tid 14 hybridisiert (annealed).

'; c) Genomische DNA I wurde mit der Restriktionsenc jnuclease BamHI gespalten und gemäß Beschreibung in Methode I dephosphoryliert.

I d) Die hybridisierten Oligonucleotide 3 und 14 wurden dann an ! mit BamHI gespaltene genomische DNA I ligiert (siehe Methode I ; bezüglich Details).

; e) Alle freien 3'-Enden in den Ligationsprodukten wurden dann

nach dem in Schritt 6 von Methode 3 beschriebenen Verfahren mit ; ' einem ddG-Rest blockiert.

113 '

f) Schließlich wurde Amplifikation an diesen Produkten unter Einsatz der Oligonucleotide 58 und 63 ausgeführt. j

Das erwartete Produkt weist etwa 200 bp auf. ^!

Beispiel 5

Verwendung der Oligonucleotide 3 und 14 mit DNA, die mit der

Restri-ktionsendonuclease BamHI gespalten wurde.

a) Oligonucleotid 3 wurde hergestellt und gemäß obiger Beschreibung in Beispiel (4) an Oligonucleotid 14 hybridisiert (annea- ; led). :

b) pUC8 mit Gehalt an einer 440bp-Insert-Plasmid-DNA (siehe B3, \ Figur 10) wurde bis zur Vollständigkeit mit der Restriktions- ! endonuclease BamHI digeriert und, wie im einzelnern in Methode I ausgeführt, dephosphoryliert.

c) Die Oligonucleotide 3 und 14 wurden an mit BamHI gespaltene B3-Plasmid-DNA hybridisiert.

d) Ein ddG-Rest wurde, wie in Beispiel 4 angegeben, an freie 3'-Enden geheftet. Es erfolgte Amplifikation an den Ligationsprodukten unter Einsatz der Oligonucleotide 58 und 65. Vorstehend beschriebene Figur ll(i.ii) zeigt dfe Marker Hind III in den Spuren 1 und 11, den mit Hae III gespaltenen Marker 0X174 in Spur 6 und das nach Beispiel 5 gewonnene amplifizierte Fragment in den Spuren 2, 3, 4 und 5. Wie erwartet ist das Produkt etwa 440 bp lang.

Beispiel 6

Verwendung der Oligonucleotide 26 und 40 mit DNA, die mit der

Restriktionserdonuclease Xbal gespalten wurde.

a) Oligonucleotid 26 wurde phosphoryliert und die kinasierte Species gereinigt, wie es in Methode V beschrieben ist.

b) Das kinasierte Oligonucleotid 26 wurde unter den in Schritt 3 von Methode I beschriebenen Bedingungen an Oligonucleotid 40 hybridisiert (annealed).

c) Menschliche genomische DNAII wurde mit Xba I restringiert und, wie in Schritt 4 von Methode I ausgeführt, desphosphoryliert., ;

d) Die hybridisierten Oligonucleotide 26 und 40 wurden dann

an mit der Restriktionsendonuclease Xbal gespaltene genomische ^; DNA II ligiert (siehe Schritt 5 von Methode I bezüglich Details).

e) Alle freien 3'-Enden in den Ligationsprodukten wurden unter _: Anwendung der in Schritt 6 von Methode III beschriebenen Ver- '. fahrensweise mit einem ddA-Rest blockiert. ;

f) Die Amplifikation erfolgte an den Ligationsprodukten mit:

(i) den Oligonucleotiden 58 und 61.

Das erwartete Produkt ist etwa 800 bp lang, (ii)den Oligonucleotiden 58 und 64.

Das erwartete Produkt ist etwa 760 bp lang.

Beispiel 7

Verwendung der Oligonucleotide 27 und 4Q mit DNA, die mit der

Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten wurde.

a) Oligonucleotid 27 wurde phosphoryliert, gereinigt und an Oligonucleotid 40 hybridisiert, wie es oben in Beispiel 5 beschrieben wurde.

b) Genomische DNA I wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten und desphosphoryliert, wie es in Schritt 4 von Methode I im einzelnen ausgeführt ist.

c) Die hybridisierten Oligonucleotide 27 und 40 wurden dann an mit EcoRI gespaltene genomische DNA I ligiert (siehe Schritt 5 von Methode 1 bezüglich Details).

d) Alle freien 3'-Enden in den Ligationsprodukten wurden, wie

in Schritt 6 von Methode III beschrieben, mit ddA-Rest blockiert,

e) Die Amplifikation erfolgte an den Ligationsprodukten unter ^: Verwendung von:

(i) Oligonucleotid 58 und 62.

Das erwartete Produkt ist etwa 220 bp lang, (ii) Oligonucleotid 58 und 63. j Das erwartate Produkt ist 560 bp lang.

j Vorstehend beschriebene Figur ll(iii) zeigt den Marker Hind j III in den Spuren 1 und 11, den mit Hae III gespaltenen Marker _:

j 0X174 in Spur 6 und die nach Beispiel 7 gewonnenen amplifizier-

ten Fragmente in den Spuren 7, 8, 9 und 10. ;

i ·

I Beispiel R

J Eine EcoRI-Vektorettebibliothek wurde gemäß Methode VI konstru- ^! iert, und Vektoretteeinheit 6 (Oligonucleotid 27, 40) wurde zu-

sammen mit DNA der Zellinie 7387 verwendet.

] Die Amplifikationsreaktion wurde an 10 ng der konstruierten Bi- . bliothek ausgeführt, um die in Figur 12 dargestellte Sequenz zu amplifizieren.

Amplifikationsbedingungen

Folgendes wurde in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

; 10 ng konstruierte EcoRI-Vektorettebibliothek 100 pmol 58 100 pmol 63

100 pm (Endkonzentration) dNTPs (siehe Ml.7 gemäß nachstehender Definition)

Das Volumen wurde mit sterilem doppelt destilliertem H₇O auf 100 pm eingestellt. 50 μΐ leichtes Mineralöl (Sigma) wurden vorsichtig über das Reaktionsgemisch gegeben, um Verdampfung zu

116 j

ι :

verhindern. Dao Röhrchen wurde dann in einen Techne Dri-Block ; gegeben, der auf 96 ⁰C eingestellt war. Man ließ die DNA 10 Mi- I nuten bei 96 ⁰C denaturieren. Danach ließ man den Block auf 90 ⁰C abkühlen. Zwei Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) wurden I dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die folgenden Temperaturen und Zeiten wurden zur Amplifizierung der Sequenz zwischen den Oligonucleotiden 58 und 63 angewendet: <

91	O	2	Minuten
62	O	2	Minuten
72	O	2	Minuten

Es wurden 40 Zyklen durchgeführt. Beim abschließenden Zyklus wurde die Temperatur des Blocks 9,9 Minuten bei 72 ⁰C gehalten, dann ließ man sie im Verlaufe einer Stunde auf Raumtemperatur

abkühlen.

15 μΐ des Amplifikationsreaktionsgemisches wurden durch Agaro-

segelelektrophorese analysiert.

Das Resultat ist in Figur 13 dargestellt. Sie zeigt das gemäß diesem Beispiel gewonnene Amplifikationsprodukt in Spur 1 und den mit Hae III gespaltenen Marker 0X174 in spur 2. Das Amplifikationsprodukt besitzt die erwartete Größe (ca. 600tp).

Beispiel 9

Dieses Beispiel wurde nach Methode IX wie folgt ausgeführt:

Schritt 1

Phosphorylierung des "Top"-Qlinonucleotids

Oligonucleotid 49, 51, 52, 53, 55, 27, 57 und 2. Puffer und andere Standardlösungen

1.1 IQx Kinasepuffer

0,5 M Tris-HCl (pH 7,6) 0,1 M MgCl₂ 50 mM Dithiothreitol 1 mM Spermidin

117 j

1 mM EDTA j

Aufbewahrung bei -20 ⁰C. _;

j 1.2 Adenosin-5'-triphosphat ! Von Pharmacia gekauftes Natriumsalz als 10-mM-Lösung. Verdünnt in Wasser auf 20 pmol/μΐ.

Aufbewahrung bei -20 ⁰C. i

Verfahrensweise

Folgendes wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

Oligonucleotid 10 pmol :

1Ox Kinasepuffer (1.1) 1 μΐ ;

ATP (1.2) 1 μΐ (20 pmol) '

T4-Polynucleotidkinase 5 Einheiten ι

(Amersham) !

H₂ 0 auf 10 μΐ :

Das Molverhältnis der Oligonucleotide zu ATP wurde bei 1:2 gehalten. Die Phosphorylierung der Oligonucleotide erfolgte durch 60minütige Inkubation bei 37 ⁰C.

Am Ende dieser Periode wurde die T4-Polynucleotidkinase durch lOminütige Inkubation bei 90 ⁰C inaktiviert. Die Röhrchen wurden dann 10 Sekunden in einer Mikrozentrifuge geschleudert, um das gesamte Kondensat zu sammeln.

Die phosphorylierten Species werden bei dieser Methode nicht gelgereinigt.

Schritt 2

Hybridisierung (annealing) des phosphorylierten 'Top'-Oligo-

nucleotids an das entsprechende 'Bottom'-Oligonucleotid

Erforderliche Lösung:

2.1 IQx Hybridisierungspuffer 100 mM Tris-hCl (pH 8,0) 100 mM MgCl₂

118 '

Folgendes wurde in einem 1,5-ml-Sarstedt-Röhrchen mit Schraub- ;

kappe gemischt:

10 pmol (in 10 μΐ) phosphoryliertes 'Top'-Oligo-

nucleptid von Schritt 1

10 pmol des entsprechenden 'Bottom¹- ligonucleotids

2 μΐ 1Ox Hybridisierungspuffer (2.1)

H₂O auf 20 μΐ

Das Röhrchen wurde in ein siedendes Wasserbad gelegt. Nach 5 Minuten wurde die Erhitzung unterbrochen, und man ließ das Wasserbad über einen Zeitraum von etwa 2 Stunden langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Schließlich wurde der Inhalt des Röhrchens am Boden durch lOminütiges Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge gesammelt. Die hybridisierten Oligonucleotide mit einer Konzentration von 0,5 pmol/μΐ sind dann zum Einsatz bei Ligationen bereit.

Die Vektoretteeinheiten 1-8 entsprachen der Definition in vorstehender Tabelle 1.

Schritt 3 Herstellung von DNA

Es wurde DNA der Zellinie 7387 verwendet. Erforderliche Puffer:

3.1 IQx EcoRI-Puffer

100 mM Tris-HCl, pH 7,5 100 mM MgCl₂ 500 mM NaCl

3.2 TE-Puffer

10 mM Tris-HCl, pH 7,5 1 mM EDTA

! 3.3 Agaroseprobenpuffer

15 % (Masse/Vol.) Ficoll 400

119 I

0,05 % (Masse/Vol.) BromphenoJblau !

0,05 % (Masse/Vol.) Xylencyanol Der Probenpuffer wurde in lx^rBE-Puffer aufgefüllt (siehe 3.4 unten). !

3.4 lOx-TBE-Puffe.:; pro Liter:

Tris 109 g

EDTA 9,5 j

Borsäure 55 g

1Ox TBE-Puffer wurde, wenn erforderlich, in Wasser

auf lfache oder 0,5fache Stärke verdünnt.

(i) Die folgenden Bedingungen wurden zum Spalten von INA der Zellinie 7387 mit der Restriktionsendonuclease EcoRI angewendet: !

40 μg genomis-,ii<? DNA von 7387 _:

40 μΐ 1OX Ecof.'I-Puffer (3.1)

80 Einheiten der Restriktionsendonuclease EcoRI

(von Boehringer Mannheim)

H₂O auf 400 μΐ

Die Digestion erfolgte 2 Stunden bei 37 ⁰C. Die Reaktion wurde durch lOminütiytjo Halten ier Probe bei 70 ⁰C durchgeführt.

(ii) 5 μΐ der Probe wurden durch Agarosegelelektrophorese kontrolliert, um vollständige Digestion zu gewährleisten.

Agarosegelelektrophorese

Die Gele wurden aus 0,7 % (Masse/Vol.) Agarose (Pharmacia) in IX TBE-Puffer (3.4) hergestellt und in TBE-Puffer der gleichen Stärke für die Elektrophorese getaucht. Bevor die Proben in die Vertiefungen des Gels gegeben wurden, wurde ein Fünftel des Agaroseprobenpuffervolumens (3.3) zu d^r Probe (5 μΐ) gegeben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 10 Minuten angefärbt, indem es in deionisiertes Wasser mit Gehall: von 1 pg/ml Ethidiumbromid getaucht wurde. Die DNA wurde bei 302 nm unter Verwendung eines Transilluminators (Chromato-Vue-C-63-Transillumina-

2 8 4 O 5

tor) sichtbar gemacht.

(iii) (a) f,'ie digerierte DNA' wurde durc'.i Phenolextraktion gerei-: nigt: i

Ein gleiches Volumen gepuffertes redestilliertes Phenol (BRL, ÜNA-Qualität mit TE-Puffer, 3.2) wurde zu der restringierten DNA gegeben, und das Gemisch wurde 30 Sekunden wirbelbehandelt. : Die gebildete weiße Emulsion durch 5 Minuten lange Mikrozentcifugierung in zwei Phasen getrennt. Die wäßrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen transferiert. Alles restliche Phenol wurde entfernt, indem die wäßrige Schicht zuerst mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1) ein gleiches Volumen - und dann mit einem gleichen Volumen Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) extrahiert wurde.

(b) Die DNA wurde schließlich durch Ethanolpräzipitation gereinigt:

Zu der DNA-Lösung wurden 3 M Natriumacetat gegeben, damit eine Endkonzentration von 300 mM Natriumacetat entstand. Die DNA wurde durch den Zusatz von 2,5 Volumen 95 %iges Ethanol und 30miniitiges Abkühlen bfci -80 ⁰C präzipitiert, woran sich Zentrifugieren anschloß (Mikrozentrifuge, 5 Minuten, 12 000 U/min). Die pelletierte DNA wurde mit 80 % (Vol./Vol.) kaltem Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wurde in de.n TE-Puffer (3.2) gelöst, um eine Konzentration von 0,5 pg/1 zu erhalten.

Schritt 4

Ligation der hybridisierten Oligonucxeotide an die gespaltene DNA Puffer und andere Standardlösungen IQx Ligationspuffer

200 mM Tris-HCl, pH 7,4

100 mM MgCl₂

100 mM DTT

IQxATP 10 mM ATP

4,3 0,5 M NaCl

Die Berechnung der pmol klebriger Enden in 1 μg gespaltener DNA wurde in 4.1(i) von Methode I dargestellt.

Ligationen

Folgendes wurde in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

Gespaltene 7387-DNA	1,48	pmol (2 pg)
Hybridisierte Oligonucleotide	3	pmol
(von Schritt 2)
1Ox Ligationspuffer (4.1)	2	μΐ
1Ox ATP (4.2)	2	Ml
T4-DNA-Ligase (Boehringer
Mannheim)	2	Einheiten
H0O Endvolumen auf	20	μΐ '

Das Ligationsgemisch wurde 120 Minuten bei 25 ⁰C stehen gelassen. Dann wurde NaCl (4.3) bis zu einer Endkonzentration von 50 mM zu dem Ligationsgemisch hinzugegeben. Alle Fragmente genomischer DNA, die an andere Fragmente genomischer DNA ligiert waren, wurden durch den Zusatz von 2 Einheiten EcoRl (Boehringer Mannheim) und 30minütige Inkubation der Probe bei 37 ⁰C erneut geschnitten. Vektoretteeinheiten wurden dann durch Zusatz von:

ATP auf 1 mM Konzentration (4.2)

1,5 pmol hybridisierte Oligonucleotide 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim)

und lstündige Inkubation bei 25 ⁰C an diese erneut geschnittenen Fragmente genomischer DNA ligiert. Nach dem Neuschneiden der DNA mit EcoRI bei 37 ⁰C im Verlaufe von 3i striktionsendonuclease nicht inaktiviert.

DNA mit EcoRI bei 37 ⁰C im Verlaufe von 30 Minuten wird die Re-

Deshalb werden während der zweiten und letzten 60minütigen Ligation bei 25 ⁰C alle Fragmente genomischer DNA, die an andere Fragmente genomischer DNA ligieren, wahrscheinlich in der glei-

122 !

chen Reaktion neu gespalten, so daß am Ende dieser Restriktions/; Ligationsreaktion im Prinzip 100 h der Fragmente genomischer DNA die Vektoretteeinheiten an beiden Enden haben. Ligation der Vektoretveeinheit, um genomische DNA zu schneiden, inaktiviert jene spezielle Restriktionsstelle

Die DNA (Reaktionsgemisch) wurde dann auf 10 ng/μΐ verdünnt.

EcoRI-Vektoretteeinheiten wurden unter Anwendung dieser Methode? und der Vektoretteeinheiten 1 bis 8 zusammen mit DNA der ZeIl-

I j i linie 7387 konstruiert.

Es wurde auch eine Kontroll-EcoRI-Bibliothek konstruiert, wo die Vektoretteeinheiten aus den oben beschriebenen Ligationen ausgelassen wurden.

Schritt 5

Auf die Vektorettebibliotheken angewendete Amplifikation

:

10 ng von jeder der konstruierten Bibliotheken (für die Vektoretr teeinheiten 1-8 und die Kontrollbibliothek von DNA ohne Vektoretten wurden der Amplifikation unterzogen. Die in Figur 12 gezeigte Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleotide 58 und 63 als Amplimer amplifiziert, und die Amplifikationsbedingungen waren wie in Beispiel 8 beschrieben. 15*μ1 des Amplifikationsproduktes wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.

Das Ergebnis ist wie in Figur 14 dargestellt. Das Produkt der erwarteten Größe (ca. 600 bp) wurde bei allen. Reaktionen erzeugt, ausgenommen dort, wo die Substrat-DNA von der Bibliothek stammt, die ohne Vektoretten im Ligationsgemisch konstruiert wurde. Das entspricht der Erwartung, weil die Sequenz des Oligonucleotids (einer der obigsn Amplimer) sich innerhalb der Vektoretteeinheiten befindet.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Konstruktion der Vektoretteeinheiten keinen signifikanten Einfluß auf die Amplifikation der Nucleotidsequenz zwischen den Vektoretteeinheiten und einer ge-

123

wünschten genomischen Sequenz hat (d. h. Oligonucleotid 63 j oben).

Die Ergebnisse sind in Figur 14 dargestellt. Sie ist eine Photo-i graphie von einem mit Ethidiumbromid angefärbten Gel, welches die gewonnenen Produkte zeigt, die nachstehend aufgeführt sind:

1. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 1 konstruierte Bibliothek

2. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 2 konstruierte Bibliothek

3. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 3 konstruierte Bibliothek

4. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 4 konstruierte Bibliothek

5. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 5 konstruierte Bibliothek ;

6. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 6 konstruierte Bibliothek ,;

7. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 7 konstruierte Bibliothek

8. mit 7387-DNA ohne Vektoretten konstruierte Bibliothek !

9. 0X174 Haelll-Marker ' ί

10. 0X174 Haelll-Marker j

11. mit 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8" konstruierte Bibliothek

j In jedem Fall wird das Produkt mit der erwarteten Größe gewonnen.

j Beispiel 10

Dieses Beispiel wurde nach Methode X entsprechend vorstehender Beschreibung durchgeführt.

Es wurden EcoRI-Vektorettebibliotheken unter Anwendung dieser Methode und mit den Vektoretteeinheiten 1 bis 7 gemäß hierin gegebener Definition und mit DNA der Zellinie 7387 konstruiert. Es wurde auch eine Kontroll-EcoRI-Bibliothek konstruiert, wo die Vektoretteeinheiten aus den oben beschriebenen Ligationen ausgelassen wurden.

Auf die Vektorettebibliotheken angewendete Amplifikation

10 ng von jeder der konstruierten Bibliotheken (für die Vekto- ;

retteeinheiten 1 bis 7 und die Kontrollbibliothek von DNA ohne ]

Vektoretten) wurden der Amplifikation unterzogen. Die in Bei- '

φ iel 8 gezeigte Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleo- ^;

tide 58 und 63 als Amplimer amplifiziert. Die in Beispiel 8 be- ;

2 0 4 O 5^

124 j schriebenen Ampliiikationsbedingungen wurden angewendet. :

15 μΐ des Produktes wurden durch Agarosegelelektrophorese ana- · lysiert. i

Das Resultat ist wie in Figur 15 dargestellt. Das Produkt der erwarteten Größe (ca. 600 bp) wurde bei allen Reaktionen erzeugt, ausgenommen dort, wo die Substrat-DNA von der Bibliothek stammt, die ohne Vektoretten im Ligationsgemisch konstruiert wurde. Das entspricht der Erwartung, weil sich die Sequenz von Oligonucleo-j tid 58 (einer der obigen Amplimer) innerhalb der Vektoretteeinheiten befindet.

Die Spuren der in Figur 15 gezeigten Photographic sind wie folgt: - i

1. 0X174 Haelll-Marker

2. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + ; Vektoretteeinheit 1

3. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 2

4. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 3

5. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 4

6. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 5

7. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 6

6. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA +

Vektoretteeinheit 7 9. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA ohne

Vektoretten i 10. 0X174 Haelll-Marker.

! Für jede Bibliothek wird das erwartete Resultat erzielt.

: Diese Ergebnisse zeigen, daß die Konstruktion der Vektoretteein-' ' heiton keinen signifikanten Einfluß auf die Amplifikation der

28ΊΟ S3

125 !

Nucleotidsequenz zwischen den Vektoretteeinheiten und einer ge- : wünschten genomischen Sequenz hat (d. h. Oligonucleotid 63 oben)..

Beispiel 11 ^;

Dieses Beispiel wurde nach Methode XI entsprechend vorstehender Beschreibung durchgeführt.

Es wur.den EcoRI-Vektorettebibliotheken unter Anwendung dieser Methode und mit den Vektoretteeinheiten 1 bis 7 und DNA der Zellinie 7387 konstruiert.

Es wurde auch eine Kontroll-EcoRI-Bibliothek konstruiert, wo die Vektoretteeinheiten aus den oben beschriebenen Ligationen ausgelassen wurden.

Auf die Vektorettebibliotheken angewendete Amplifdkation :

10 ng von jeder der konstruierten Bibliotheken (für die Vektoretteeinheiten 1 bis 7 und die Kontrollbibliothek von DNA ohne ; Vektoretten) wurden der Polymerasekettenreaktion unterzogen. Die in Beispiel 1 gezeigte Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleotide 58 und 63 als Amplimer amplifiziert. Die in Beispiel 8 beschriebenen Amplifikationsbedingungen wurden angewendet.

15 μΐ des Produktes wurden durch Agarosecjelelektrophorese analysiert.

Das Ergebnis ist wie in Figur 16 dargestellt. Das Produkt mit der erwarteten Größe (ca. 600 bp) wurde bei allen Reaktion erzeugt, ausgenommen dort, wo die Substrat-DNA von der Bibliothek stammt, die ohne Vektoretten im Ligationsgemisch konstruiert wurde. Das entspricht der Erwartung, weil die Sequenz von Oligonucleotid 58 (einer der obigen Amplinier) sich innerhalb der Vektoretteeinheiten befindet

Die Spuren der in Figur 16 gezeigten Photographic sind wie folgt:

1. 0X174 Haelll-Marker

2. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 1

"j""'. 3. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + ! j j Vektoretteeinheit 2 ^;

4. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-GNA + Vektoretteeinheit 3

5. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 4

j 6. Aroplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA +

j Vuktoretteeinheit 5

j 7. Amplifikationsprodukt; von der Bibliothek von 7387- DNA +

i Vektoretteeinheit 6

j 8. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA +

Vektoretteeinheit 7 !

9. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA ohne ,

Vektoretten 10. 0X174 Haelll-Marker.

^! Die Ergebnisse zeigen, daO die Konstruktion der Vektoretteneinj heiten keinen signifikanten nachteiligen Einfluß auf die Ampli-

! fikation der Nucleotidsequenz zwischen den Vektoretteeinheiten j und einer gewünschten genomischen Sequenz hat (d. h. Oligonuc- ^! leotid 63 oben).

Beispiel 12

j Dieses Beispiel wurde nach Methode XII entsprechend vorstehen- ; der Beschreibung durchgeführt.

Es wurden EcoRI-Vektorettebibliotheken unter Anwendung dieser ι Methode und mit den Vektoretteeinheiten 1 bis 7 und DNA der ! Zellinie 7387 konstruiert. Es wurde auch eine Kontroll-EcoRI- ; Bibliothek konstruiert, wo die Vektoretteeinheiten aus den oben

beschriebenen Ligationen ausgelassen wurden.

ί Auf die Vektorettehibliotheken angewendete Amplifikation

j 10 ng von jeder der konstruierten Bibliotheken (für die Vekto-

I retteeinheiten 1 bis 7 und die Kontrollbibliothek von DNA ohne :

j Vektoretten) wurden der Amplifikation unterzogen. Die in Bei- ;

i spiel 1 gezeigte Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleo-

2 84 0 5i

tide 5B und 63 als Amplimer amplifiziert. Die in Beispiel 8 be- ] \ schriebenen Amplifikationsbedingungen wurden angewendet.

15 μΐ des Amplifikationsproriuktes wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.

Das Ergebnis ist wie in Figur 17 dargestellt. Das Produkt mit

der erwarteten Größe (ca. 600 bp) wurde bei allen Reaktionen . erzeugt, ausgenommen dort, wo die Substrat-DNA von der Kontroll-S bibliothek stammt, die ohne Vektoretten im Ligationsgemisch j konstruiert wurde. Das entspricht den Erwartungen, weil die Sej quenz von Oligonucleotid 58 (einer der obigen Amplimer) sich

innerhalb der Vektoretteeinheiten befindet.

Die Spuren der in Figur 17 gezeigten Photographic sind wie folgt?

1. 0X174 Haelll-Marker

2. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von.7387-DNA + Vektoretteeinheit 1

3. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 2

4. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektorstteeinheit 3

5. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 4

6. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 5

7. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 6

8. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 7

9. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA ohne Vektoretten

10. 0X174 Haelll-Marker

Diese Resultate zeigen, daß die Konstruktion der Vektoretteeinheiten keinen signifikanten Einfluß auf die Amplifikation der Nucleotidsequenz zwischen den Vektorelteeinheiten und einer gewünschten genomischen Sequenz hat (d. h. Oligonucleotid 63 oben).

1 84 Ö 5|3

128 j

Beispiel 13 ^;

Dieses Beispiel wurde nach Methode XIII entsprechend vorstehen- ^: der Beschreibung durchgeführt. ;

Es wurden EcoRI-Vektorettebibliotheken unter Anwendung dieser Methode und mit den Vektoretteeinheiten 1 bis 7 und DNA der Zellinie 7387 konstruiert.

Es wurde auch eine Kontroll-EcoRI-Bibliothek konstruiert, wo die Vektoretteeinheiten aus der Ligationsreaktion ausgelassen wurden. ;

Auf die Vektorettebibliotheken angewendete Amplifikation

10 ng von jeder der konstruierten Bibliotheken (für die Vektoretteeinheiten 1 bis 7 und die Kontrollbibliothek von DNA ohne Vektoretten) wurden der Amplifikation unterzogen. Die in Beispiel 1 gezeigte Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleo-' tide 58 und 63 als Amplimer amplifiziert. Die in Beispiel 8 beschriebenen PCR-Bedingungen wurden angewendet. _:

15 μΐ des Amplifikationsproduktes wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.

Das Resultat ist wie in Figur 18 dargestellt. Das Produkt der erwarteten Größe (600 bp) wurde bei allen Reaktionen erzeugt, ausgenommen dort, wo die Substrat-DNA von der Bibliothek stammt, die ohne Vektoretten im Ligationsgemisch-konstruiert wurde. Das entspricht der Erwartung, weil die Sequenz von Oligonucleotid 58 (einer der obigen Amplimer) sich innerhalb der Vektoretteeinheiten befindet. \

Die Spuren der in Figur 18 gezeigten Photographie sind wie folgt:

1. 0X174 Haelll-Marker

2. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 1

3. Amplifikationsprodukt von'der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 2

4. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 3

5. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 4 ;

129 ;

6. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + i Vektoretteeinheit 5 i

7. Arnplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 6

8. Amplifikationsprodukt von der Bibliothek von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 7

9. Amnlifikationsprodukt von r'ar Bibliothek von 7387-DNA ohne Vektoretten

10. 0X174 Haelll-Marker

Diese Ergebnisse zeigen, dai3 die Konstruktion der Vektoretteeinheiten keinen signifikanten Einfluß auf die Amplifikation der Nucleotidsequenz zwischen den Vektoretteeinheiten und einer gewünschten genomischen Sequenz hat (jiehn Oligonucleotid 63

ι ι

! oben).

I · ^!

j Beispiel 14

j Es wurden fünf verschiedene EcoRI-Vektorettebibliotheken auf ' I folgende Weise unter Verwendung von DNA der Zellinie 7387 und j Vektoretteeinheit 8 konstruiert:

(a) Eine Bibliothek wurde nach Methode IX konstruiert.

(b) Eine Bibliothek wurde nach Methode X konstruiert.

(c) Eine Bibliothek wurde nach Methode X-I konstruiert.

(d) Eine Bibliothek wurde nach Methode XII konstruiert.

(e) Eine Bibliothek wurde nach Methode XIII konstruiert.

Vor der Amplifikation wurden die in (1) oben konstruierten Bi bliotheken einer 3'-Endblockierreaktion unterzogen:

Puffer und andere Standardlösungen

7.2.1. T7-DNA-Polymerase-Puffer 5^

200 mM Tris-HCl pH 7,5 100 mM MgCl₂ 250 mM NaCl

2 8 4 Ö 5 3

7.2.2. dNTPs-dATP

1 mM dTTP 1 mM dGTP 1 mM dCTP

aufgefüllt mit sterilisiertem deionisierten

Wasser.

-! 7.2.3.' ddATP

1 mM ddATP, aufgefüllt mit sterilisiertem deionisierten Wasser.

Addition eines ddA-Rests an 3'-Enden von Produkten von (1) oben. Folgendes wurde in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt!

0,5 μΐ DNA von Schritt (1) oben ί

I 4 μΐ 5x T7-DNA-Polymerase-Puffer (7.2.1.) ;

j 2 μΐ dNTPs-dATP-Lösung (7.2.2.)

ί 2 μΐ ddATP-Lösung (7.2.3.) .

j 1 Einheit T7-DNA-Polymerase (Sequenase) :

j H₉O auf 20 μΐ

) Das Röhrchen wurde 30 Minuten lang bei 37 ⁰C gehalten. Das Enzym'

i wurde dann durch lOminütige Inkubation bei 70 ⁰C denaturiert.

j Die Konzentration von DNA in allen Proben wurde dann in Wasser

i auf 10 ng/μΐ verdünnt.

Auf die Vektorettebibliotheken angewendete Amplifikation

10 ng von jeder der fünf konstruierten Bibliotheken wurden der ; Polymerasekettenreaktion unterzogen. Die in Beispiel 8 gezeigte J Sequenz wurde unter Verwendung der Oligonucleotide 58 und 63 J als Amplimer amplifiziert. Die Amplifikationsbedingungen von

Beispiel 8 wurden angewendet.

15 μΐ des Amplifikationsproduktes wurden durch Agarosegelelektro-

phorese analysiert.

Das Resultat ist wie in Figur 19 dargestellt.

Die Spuren des in Figur 19 gezeigten Autoradiogramms sind wie

folgt: !

IM

1. 0X174 Haelll-Marker j

2. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, Methode IX + 3'-Endblockierung

3. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8. Methode X + 3¹-Endblockierung

4. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoietteeinheit 8, Meth'ode XI + 3 ' -Endblockierung

5. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, j Methode XII + 3 '-Endblockierung

j 6. Amplifikationsprodukt von 7387-ONA + Vektoretteeinheit 8, j Methode XIII + 3 '-Endblockierung

j Alle Produkte haben die erwartete Größe.

, Beispiel 15

! Es wurden 5 verschiedene EcoRI-Vektorettebibliotheken unter Ver- ! Wendung von DNA der Zellinie 7387 und Vektoretteeinheit 8 kon-I struiert.

i (a) Eine Bibliothek wurde nach Methode IX konstruiert.

j (b) Eine Bibliothek wurde nach Methode X konstruiert.

! (c) Eine Bibliothek wurde nach Methode XI konstruiert.

(d) Eine Bibliothek wurde nach Methode XII konstruiert.

(e) Eine Bibliothek wurde nach Methode XIII konstruiert.

^: Der Unterschied bestand darin, daß Oligonucleotid 2 nichtphos-

ί phoryliert war.

: Die Bibliotheken (b) bis (e) wurden hergestellt, wie es für die Methoden IX bis XII beschrieben worden ist. '

ι Die Bibliotheken (b), (c), (d), (e) und eine Aliquote von Bibliothek (a) wurden mit ddATP und T7-DNA-Polymerass (Sequenase)

: behandelt, um freie 3'-Enden zu blockieren. Die Bedingungen wa-

\ ren, wie in Beispiel 14 beschrieben. ·,

: Die Amplifikation wurde an all diesen Bibliotheken ausgeführt.

: Die in Figur 12 gezeigte Sequenz wurde unter Verwendung der Oli-

. gonucleotide 63 und 58 amplifiziert. Die in Beispiel 8 beschrie- ;

: benen Bedingungen wurden angewendet.

15 μΐ des Amplifikatlonsproduktes wurden durch Agarosegelelek-

trophorese (1,4 H (Masse/Vol.)Gel) analysiert.

Das erzielte Resultat war wie in Figur 20 dargestellt.

Die Spuren der in Figur 20 gezeigten Photographic sind wie

folgt:

1. Amplif ikationsprodukt von 7387-DNA + VeI'toretteeinheit 8, ; Methode IX + 3 '-Endblockierurig

(Oligonucleotid 2 nichtphosphoryliert)

2. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, Methode IX + 3'-Endblockierung.

(Oligonucleotid 2 nichtphosphoryliert)

3. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, Methode X + 3'-Endblcnkierung.

(Oligonucleotid 2 nichtphosphoryliert)

4. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, : Methode XII + 3 '-Endblockierung

(Oligonucleotid 2 nichtphosphoryliert)

5. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, Methode XII + 3 '-Endblockierung

(Oligonucleotid 2 nichtphosphoryliert)

6. Amplifikationsprodukt von 7387-DNA + Vektoretteeinheit 8, Methode XIII + 3 '-Endblockierung

(Oligonucleotid nichtphosphoryliert)

7. 0X174 Haelll-Marker

Alle Produkte haben die erwartete Größe.

Beispiel 16

Dieses Baispiel wurde ausgeführt, um zu zeigen, daß das in Figuren 13 - 20 gezeigte Produkt ein Produkt der 01igonucleoti.de 58 und 63 (siehe Beispiel 8) und nicht ein Produkt von einem der Amplimer ist.

Für jede Amplifikation wurden 10 ng von jeder der folgenden Vektorettebibliotheken verwendet:

133 I

Eine Bibliothek, die unter Verwendung von 7787-DNA und den Vek- : toretteeinheiten 1 bis 8 in Methode VII hergestellt wurde. Eine Bibliothek, die unter Verwendung von 7387-DNA und Vektoretteeinheit 8 nach Methode VII + 3'-Endblockierung (bezüglich Details siehe Beispiel 14) hergestellt wurde. Eine Bibliothek, die unter Verwendung von 7387-DNA und Vektoretteeinheit 8 (Ib Oligonucleotid nichtphosphoryliert) nach Methode VII + 3'-Endb.lnckierung hergestellt wurde (bezüglich Details siehe Beispiel 1:5)

j Eine Bibliothek, die unter Verwendung von 7387-DNA ohne Vektoj rette nach Methode VII hergestellt wurde.

Um zu zeigen, daß die in Boispiel 8 aus den mit den Vektorettej einheiten 1 bis 8 konstruierten Bibliotheken hergestellten Pro- ; ί dükte alle identisch waren und die richtige Sequenz hatten, wur- ! den die in Figur 16 (Produkte 2 bis 8) gezeigten £mplifikations- ! produkte und das in Spur 11 von Figur 14 gezeigte Produkt unter

: Einsatz der Oligonucleotide 59 und 66 sequenziert.

Figur 21 zeigt eine Photokopie des von der Sequenzierung der j Produkte 2 bis 8 von Figur 16 mit Oligonucleotid 66 erzeugten

: Autoradiogramms.

] Das Autoradiogramm zeigt auch die Sequenzierung von Teilen von ; Intron 8 und Exon 9 des Phenylalaninhydroxylasegens (Phenylketo-

nurie - PKU) als Kontrolle. Die Amplifikationsprodukte 2 bis 8 ; erscheinen von links nach rechts (wie in Figur 16 gezeigt) und ^! sind alle identisch. Die Spurfolge ist CGTA.

Figur 22 zeigt die Nucleotidsequenzdaten, die von den in Beispiel 16 beschriebenen Produkten stammen.

Die Basen 1 bis 16 sind am 3'-Ende der veröffentlichten PKU-Intron-8-Sequenz. Die Basen 17 bis 452 bilden neue PKU-Intron-8- -Sequenzdaten, die nach der erfindungsgemäßen Methode bestimmt wurden.

Beispiel 17

Das Produkt mit ca. 220 bp von Beispiel 7(i), Bahn (c), Spuren 7, 8, 9, 10, 11 wurde unter Verwendung der Oligonucleotide 62 und 67 sequenziert.

So wurde das 220-bp-Produkt von Beispiel 7(i)

1) in 3-Schritt-Zyklen amplifiziert, und zwar: a) 60 ⁰C, 2 Minuten, b) Ti ⁰C, 3 Minuten, und c) 91 ⁰C, 2 Minuten, ausgeführt wurden 40 Zyklen (Verwendung von 0,5 pg DNA)/100 μΐ Beladung/Bahn (siehe Figur 24a)

2) und das Produkt von (1) oben wurde dann gelgereinigt und in 2-Schritt-Zyklen reamplifiziert, und zwar: a) 60 ⁰C, <?· Minuten, und b) 91 ⁰C, 2 Mini-ten. Es wurden 40 Zyklen durchgeführt (siehe Figur 24b).

Die Positionen der Oligonucleotide 58, 62 und 67 sind in Ficjur 23 dargestellt. In Figur 25 ist die in (a) angegebene Sequenz die mit Oligonucleotid 62 gelesene Sequenz, die in (b) angegebene Sequenz ist die mit Oligonucleotid 67 gelesene Sequenz. In (a) und (b) ist die unterstrichene Sequenz die mit Oligonucleotid 62 und 67 gelesene Komplementäre/reverse Sequenz. Die gesamte .5' 3'-Sequenz ist in Figur 25(c; gezeigt, worin:

die Positionen 2-31 die 5'-3'-Sequenz von Oligonucleotid 62 zeigen,

die Positionen 75 - 104 die reverse komolementäre Sequenz von Oligonucleotid 67 zeigen,

die Positionen 95 - 104 (durch eine durchgehende Linie über der Sequenz gekennzeichnet) die ersten 10 Basen der veröffentlichten Intron-Sequenz sind (siehe Biochemistry 1985 lk_ S. 556-561 Kwok et al.),

die Positionen 2 bis 104 mit der veröffentlichten Sequenz für PKU Exon I und Teilen der Intronsequenzen übereinstimmen, die Positionen 105 aufwärts die neuen Sequenzdaten für PKU Intron 1 darstellen.

"" "" ' 2 8 4 Ö 5

Beispiel IB

Exon V des alpha-Antitrypsingens wurde der erfindungsgemäßen Methode (siehe Figur 26) unterzogen, wobei folgende Oligonucleotide eingesetzt wurden:

58 (Universalvektoretteprimer), 60 (Universalvektorettenucleotide, ineinandergeschachtelt), 68 (Exon V 5¹), 69 (Exon V 5', ineinandergeschachtelt) und 70 (Exon V 3'). ^]

Die Vektorettebibliothek wurde hergestellt mit mit EcoRI ge- ,

schnittener genomischer DNA mit hybridisierten (annealed) Vek- \ j toretteoligonucleotiden (87/40 entsprechend der Definition in

dieser Beschreibung) und ligiert. \

I Die Amplifikation erfolgte folgendermaßen: :

I 100 ng Vektorettebibliothek-DNA ;

Oligonucleotide 58 + 68 (100 pmol)

10 |il Puffer : 500 mM KCL

J 100 μΜ dNTP's 100 mM MgCl₂

j 2 Einheiten Taq-Polymerase 14 mM MgCl₂

j Auffüllung des Volumens auf 100 μΐ 0,1 % Gelatine

j mit doppelt destilliertem Wasser

j Anfänglicher Denaturierungsschritt 93 C, 10 Minuten lang

! 39 Zyklen von 93 ⁰C, 2 Minuten

; 65 ⁰C, 2 Minuten

: 72 ⁰C, 8 Minuten

\ Abschließender Zyklus: 72 ⁰C, 10 Minuten lang

Das Ergebnis wird in Figur 27(a) in Spur 4 gezeigt. Spur 3 zeigt: j eine Kontrollamplifikationsreaktion mit den Oligonucleotiden 68

I und 70 zur Erzeugung eines Produktes mit ca. 200 bp.

i Die primäre Amplifikationsrunde ergab eine Substanz ('smear')

j von etwa der erwarteten Größe. Das primäre Reaktionsgemisch wur-

I de dann wie folgt verdünnt.

! 1 μΐ des Produktes von Spur 4 in Figur 27(a) wurde mit ddH₉0

; (d. h. 10 Verdünnung)

auf 1 ml aufgefüllt. ;

136 j

1 μΐ davon wurde bei anschließenden PC-Reaktionen verwendet ; (gesamt = 100 μΐ) (d. h. Gesamtverdünnung = 10 ) und unter Einsatz einer Reihe von Primerpaaren wie folgt reamp-· lifiziert: :

Zweite PCR (mit ineinandergeschachtelten Oligonucleotiden)

1 μΐ Produkt von Spur 4 in Figur 27(a) (10³)DNA 100 pmol niigonucleotide 60 + 69

10 μΐ 1OX Puffer 1OX: 500 mM KCl

100 μm dNTP's 100 mM Tris pH 8,3

2 Einheiten Taq-Polymerase 10 mM MgCl₂

0,1 % Gelatine

Auffüllung des Volumens auf 100 μΐ mit doppelt destilliertem Wasser. Reaktionsbedingungen:

Anfänglicher Denaturierungsschritt—)95 ⁰C, 10 Minuten lang

Das sekundäre Amplifikationsprodukt wird als 3,0-kb-Produkt in den Spuren 1, 2 und 3 von Figur 27(b) gezeigt. Figur 27(b) ist eine Photographie eines Agarosegels, welches das Produkt der sekundären Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 60 und 69 zeigt:

Spur 1 das 3,0-kb-Produkt der sekundären Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 60 und 69,

Spur 2 das 3,0-kb-Produkt der sekundären Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 60 und 69,

Spur 3 das 3,0-kb-Produkt der sekundären Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 60 und 69,

Spur 4 den mit Hae III gespaltenen Marker 0X174 und den mit Hind III gespaltenen Marker*^.

Das Gel wurde auf eine Nylonmembran geblottet und mit einer <-l Antitrypsinsonde untersucht. Es wurde eine einzelne Bande der richtigen Größe (3,0 kb) beobachtet und in Figur 27(c) gezeigt.

Figur 27(c) ist ein Autoradiogramm eines Nylonfilters (geblottet von dem in Figur 27(c) gezeigten Gel), der mit einer««£-l Anti-

137 !

trypsinsonde untersucht worden war. Die Position von DNA-Mar- j kern wird gezeigt. ',

Spur 1 ist das 3,0-kb-Produkt sekundärer Amplifikation zwischen ; den Oligonucleotiden 60 und 69. |

Spur 2 ist das 3,0-kb-Produkt sekundärer Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 60 und 69.

Spur 3 ist das 3,0-kb-Produkt sekundärer Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 60 und 69.

Beispiel 19

D5 ist eine anonyme genomische Sequenz, die als ein 474-bp-XbaI-EcoRI-Fragment kloniert worden ist. Die Sequenz von D5 wurde durch Standardmethoden bestimmt (Newton et al., Nucleic Acids Research 16, 8233-8243, 1988) und wird in Figur 25 gezeigt. Es wurden zwei Oligonucleotidprimer, nämlich 71, 72, synthetisiert.

71 5' AAGTTTGAGCATAGGAAAAGTTCTGTGCCC

72 5' AGTTCTGTGCCCAAAATTGCATCCAAG

j Die Position der Oligonucleotide 71, 72 ist in Figur 29 angegeben.

Genomische DNA wurde von der Lymphoblastoidzellinie, GM 7387, (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) isoliert, und AIi- '. quoten (20 pg) wurden mit den folgenden Restriktionsenzymen, ; nämlich Dra I, Bei I, Hind III und Hae III, digeriert. Es.wurden ; dann Vektorettebibliotheken nach Methode X hergestellt.

Die primären Amplifikationen wurden an Aliquoten jeder Bibliothek gemäß nachfolgender Beschreibung durchgeführt. Folgendes wurde in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

! 10 ng konstruierte Vektorettebibliothek ! 100 pmol Oligonucleotid 58 100 pmol Oligonucleotid 71 100 pm dNTPs

2 ff 4 0 5

10 μΐ lOX-Puffer 1OX Puffer ist:

500 mM KCl 100 mM Tris-HCl,

pH 8,3 10 mM MgCl 0,1 % Gelatine

Das Volumen wurde mit sterilem doppelt destilliertem Wasser auf 100 μΐ eingestellt. 50 μΐ leichtes Mineralöl (Sigma) wurde vorsichtig übsr das Reaktionsgemisch pipettiert, um Verdampfung zu verhindern.

Das Röhrchen wurde dann auf 96 C erhitzt (in einem Techne Pro-

I Q

grammable Dri-Block PHC-I, der auf 96 C äquilibriert worden

. war). Man ließ die DNA 10 Minuten bei 96 ⁰C denaturieren. Den

! Block ließ man auf 90 ⁰C abkühlen. Zwei Einheiten Taq-Polymera-

se (Cetus) wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben. Die

^; folgenden Temperaturen und Zeiten wurden angewendet, um die Se-

< quenz zwischen den Oligonucleotiden 58 und 71 zu amplifizieren.

92	0C	2	Minuten
65	0C	2	Minuten
72	0C	5	Minuten

Es wurden 40 Zyklen durchgeführt. Während des abschließenden Zyklus wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 72 ⁰C gehalten. Aliquoten (15 μΐ) wurden von den Reaktionsgemischen abgenommen. Farbstoffgemisch (5 μΐ) wurde zugesetzt, und die Proben wurden auf 1,4 %igen Agarosegelen analysiert.

Farbstoffgemisch 155 (Masse/Vol.) Ficoll 400

(Dye Loading Mix) 0,05 h (Masse/Vol.) Bromphenolblau

0,05 % (Masse/Vol.) Xylencyanol

Gelöst in IX TBE

Eine sekundäre Amplifikation wurde an Aliquoten der primären Reaktionsgemische durchgeführt. Eine Aliquote des primären Reaktionsgemisches (2 μΐ) wurde mit Wasser auf 400 μΐ verdünnt.

139 j

Eine Aliquote des verdünnten Materials (2 μΐ) wurde in ein 0,5- ' ml-Sarsted-Röhrchen gebracht. :

Folgendes wurde ebenfalls in das Röhrchen gegeben: '

100 pmol Oligonucleotid 60

100 pmol Oligonucleotid 72

100 μΜ dNTPs

10 μΐ lOX-Puffer _:

10X-Puffer ist:

" 500 mM KCl

100 mM Tris-HCl, pH 8,3 10 mM MgCl 0,1 % Gelatine :

Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf lOO μΐ eingestellt. 50 μΐ leichtes Mineralöl (Sigma) wurde vorsichtig über das Reaktionsgemisch pipettiert, um Verdampfung zu verhindern. Dann wurde das Röhrchen auf 90 ⁰C erwärmt (im Techne Programmable Dri-Block PHC-I, der auf 96 ⁰C äquilibriert worden war). Man ließ die DNA 10 Minuten bei 96 ⁰C denaturieren. Den Block ließ man auf 90 ⁰C abkühlen. Zwei Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die folgenden Temperaturen und Zeiten wurden angewendet, um die Sequenz zwischen den Oligonucleotiden 60.und 72 zu nmplifizie— ren:

92	0C	2	Minuten
65	0C	2	Minuten
72	0C	5	Minuten

Es wurden 37 Zyklen durchgeführt. Während des abschließenden Zyklus wurde das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei 72 ⁰C gehalten Aliquoten (15 μΐ) wurden von den Reaktionsgemischen abgenommen. Farbstoffgemisch (Dye Loading Mix) (5 μΐ) wurde zugesetzt, und die Proben wurden auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert.

140

Farbstoffgemisch: 15 % (Masse/Vol.) Ficoll 400 (Dye Loading Mix) 0,05 % Bromphenolblau

0,05 % Xylencyanol

Gelöst in Ix TBE

Die Bibliotheken (Hae III, Hind III, BcI I, Dra I) ergaben bestimmte Produkte im Größenbereich von 0,4 bis 1,5 kb (Figur 30). Aus der beobachteten Größe der Produkte konnte eine provisorische Restriktionskarte erstellt werden (Figur 31). Die Produkte wurden weiter durch Restriktionsdigests analysiert. Authentische Produkte sollten gespalten werden, um die Fragmente der vorhergesagten Größe zu gewinnen. So könnte das 0,82-kb-Bcl I-Produkt durch Hind III gespalten werden, um ein Produkt von 0,78 kb zu gewinnen, und könnte auch durch Hind III gespalten werden, um ein Fragment von 0,75 kb zu gewinnen. Die Analyse des 0,82-kb-BclI-Produktes durch Hind III und Hae III wird in Figur 30 gezeigt. Die vorausgesagten Produkte wurden festgestellt, und ! das Bcll-Produkt wurde dann für die Sequenzanalyse eluiert.

I So ist in Figur 30 das aus der Amplifikation einer Haelll-Vektorettebibliothek resultierende Produkt in Spur 2 gezeigt, das aus ider Amplifikation einer Hindlll-Vektorettebibliothek resultie-' rende Produkt ist in Spur 3 gezeigt, das aus der Amplifikation i einer Bcll-Vektorettebibliothek resultierende Produkt ist in I Spur 4 gezeigt, und das aus der Amplif ikation einer Dral-Vekto-I rettebibliothek resultierende Produkt ist in Spur 5 zu sehen, i Spur 7 zeigt die nach der Digestion des Bcll-Produktes mit dem 1 Restriktionsenzym Hae III gewonnenen Fragmente. Spur 8 zeigt die ;nach Digestion des Bcll-Produktes mit dem Restriktionsenzym Hind 'ill gewonnenen Fragmente. Spur 9 zeigt das Bcll-Produkt, die Spujren 1 und 6 enthalten 1-kb-Marker (BRL).

iRestriktionsdigestanalyse von Vektoretteprodukten: 16 μΐ Amplifikationsreaktionsgemisch j 2 μΐ 10 X Restriktionspuffer

: 2 μΐ Restriktionsenzym

j Die Probe wurde 1 stunde bei 37 ⁰C inkubiert. 5 μΐ Farbstoffgeimisch (Dye Loading Mix) wurden der Probe zugesetzt, und die Pro-

141 I

dukte wurden auf 1,4 %igem Agarosegel analysiert. Sequenzierung

Das Bcll-Produkt wurde aus dem Agarosegel eluiert und unter Verwendung von Oligonucleotid 59 und Standardmethodologie sequenziert (Newton et al., Nucleic Acids Research 16, 8233-824.5, 1988) Die Sequenz wird in Figur 31 veranschaulicht. Ein weiterer.¹ Primer (73) wurde aus dieser Sequenz konstruiert und in nachfolgenden !Schritten verwendet.

73 5' GGCCTTTGANNAAGAGAAGAGTCAAGGATG

j Die Untersuchung der Sequenz bestätigt das Vorhandensein dur

jHaelll- und HindllT-Stellen, die durch Schritte entsprechend der

I erfindungsgemäßen Methode vorausgesagt wurden.

j Beispiel 20

j Untersuchung des Chlamydia-Genoms mit der erfindungs.qemäOen

I Methode

IChlamydia-trachomatis-Serotyp L2 wurde in mit Cycloheximid beihandelten McCoy-Zellen gezüchtet. Elementarkörper wurden auf GIy-

:cerol-Tartrat-Gradienten gereinigt, wobei sich 10 Elementarkörper ergaben. DNA wurde durch Behandlung mit Proteinase K/SDS, Phenol/Chloroform behandelt und durch Ethanolpräzipitation.rück- ;gewonnen. Es wurden 90 mg DNA rückgewonnen, wovon 900 ng als ίChlamydien-DNA eingeschätzt wurden und der Rest von den McCoy-I Zellen abgeleitete Mäuse-DNA war.

j DNA (5 pg, die äquivalent waren zu 50 ng Chlamydien-DNA) wurde

entweder mit EcoRI oder BanHI digeriert. Vektorettebibliotheken wurden unter Verwendung der geeigneten Oligonucleotide (27, 40, IEcoRI, 31, 40, BamHI) nach Methode X hergestellt. Die Bibliothe- ;ken wurden auf ein Endvolumen von 100 μΐ aufgefüllt.

j Zwei Oligonucleotidprimer wurden auf der Basis der Conseniius- ^!Sequenz von MOMP (Major Outer Membrane Protein) von Chlamydia L2

142 I

synthetisiert. (Stephens et al., 3 Bacteriology 169, 3879-3885, I 1! 7). :

74 5¹ CTGCTCACGTAAATGCACAATTCCG

75 5¹ AACCGAGAGCAAAAGCCATATTGGC

Amplification

Folgendes wurde.· in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

j 10 μΐ EcoRI-Vektorettebibliothek

j 20 μΐ 5Χ Puffer

j 5X Puffer = 335 Tris-HCl, pH 8,5 ^! 83 mM NH₄SO₄

j 10 mM MgCl

! 50 mM 2-Mercaptoethanol

[ 0,8 mg/ml Rinderserumalbumih

I 100 pmol Oligonucleotid 58

! 100 pmol Oligonucleotid 74

200 μΜ dNTPs

Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf

100 μΐ eingestellt. 50 μΐ leichtes Mineralöl (Sigma) wurden vorsichtig über das Reaktionsgemisch pipettiert, um Verdampfung zu

verhindern. Das Röhrchen wurde dann auf 96 ⁰C erhitzt (im Techne . Programmable Dri-Block PHC-I, der auf 96 '⁰C äquilibriert worden war). Man ließ die DNA 10 Minuten bei 96 ⁰C denaturieren. Dann 'ließ man den Block auf 90 C abkühlen. Dem Reaktionsgemisch wurden zwei Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) zugesetzt. Die folgenden Temperaturen und Zeiten wurden angewendet, um die Sequenz zwischen den Oligonucleotiden 60 und 72 zu amplifizieren:

92	0C	0	,7	Minuten
65	0C	0	,7	Minuten
72	0C	1	Minute

Es wurden 40 Zyklen durchgeführt. 10 % des Reaktionsgemisches wurden für die Analyse auf Agarosegel entnommen. Die Resultate sind in Figur 32 gezeigt, worin Spur 1 den mit Hae^wHI gespaltenen Marker 0X174 zeigt.

143

Spur 2 zeigt das Produkt der Amplifikation zwischen den Oligo-

nucleotiden 58 und 7Λ unter Verwendung von 10 μΐ einer EcoRI-

j Bibliothek.

j Spur 3 zeigt das Produkt der Amplifikation zwischen den Oligo-

j nucleotiden 58 und 74 unter Verwendung von 1 μΐ einer EcoRI-

I Bibliothek.

i Das Produkt aus der Amplifikation einer EcoRI-Biblioihek mit den ! O.i.igonucleotiden 58 und 74 wurde gereinigt. Asymmetrische Arcpli-I fikation (Proc. Natl. Aca(|. Sei. USA Td. 85, S. 7652-/656, Oktoj ber 1988, U.B. Gyllenstein und H. Ehrlich) des Produktes erfolg- ! te mit 50 pmol Oligonucleotid 74 und Oligonucleotid 58 in 35 Zyk- ; len gemäß obiger Beschreibung. Das amplifizierte Produkt wurde j auf einer GSO-Schleudersäule (G50 spun column) (wie beschrieben ^; in: Molecular Cloning - A laboratory manual (Molekulares Klonieren - Ein Laborhandbuch)j Maniatis, Γ., Fritsch, E.F., Sambrock, , 3., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) gereinigt und mit Oligonucleotid 59, wie in Beispiel 17 beschrieben, sequenziert. Die Sequenz wird in Figur 3A gezeigt. Die Digestion einer Aliquote des PCR-Produktes entweder mit Hinf I oder CIa I bestätigt die Anwesenheit dieser Restriktionsstellen (Figur 34). In Figur 34 sind die Spuren der Photographie die folgenden:

: Spur 1 0X174 Haelll-DNA-Marker

Spur 2 mit CIa I digeriertes EcöRI-Produkt \ Spur 3 EcoRI-Produkt '. Spur 4 mit Hinf I digeriertes EcoRI-Produkt I Spur 5 0X174 Haelll-DNA-Marker

Beispiel 21 Auf das Chlamydia-Genom angewendete lineare Amplifikation

I Folgendes wurde in win 0,5-ml-Sarstedt-Röhrohen gebracht:

; 10 μΐ BamHI-Vektorettebibliothek

20 μΐ 5X Puffer (in Beispiel 20 definiert)

100 pmol Oligonucleotid 75

200 pm dNTPs

144 ι

Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf ; 100 μΐ eingestellt. 50 μΐ leichtes Mineralöl (Sigma) wurde vorsichtig über das Reaktionsgemlsch pipettiert, um Verdampfung i zu verhindern. !

Dann wurde das Röhrchen auf 96 ⁰C erhitzt (im Techne Programmable Dri-Block PHC-I, der auf 96 ⁰C äquilibriert worden war). Man ließ die DNA"10 Minuten bei 96 ⁰C denaturieren. Man ließ den Block auf 90 ⁰C abkühlen. ι Zwei Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) wurden dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die folgenden Temperaturen und Zeiten wurden angewendet, um die Sequenz zwischen den Oligonucleotiden 75 und der BamHI-Stelle zu amplifizieren:

93	0C	0	,7	Minuten
65	0C	0	,7	Minuten
72	0C	1	,5	Minuten.

j Es wurden 40 Zyklen ausgeführt. 100 pmol Oligonucleotid 58 und zwei Einheiten Taq-Polymerase wurden dann dem Reaktionsgemisch !zugesetzt, und die Amplifikation wurde für weitere 20 Zyklen !gemäß obiger Beschreibung fortgesetzt. Eine Aliquote Reaktions-I gemisch wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert (Figur J35).

j Es wurde eine zusätzliche Reaktion ausgeführt, bei der eine Bam-HI-Bibliothek unter Einsatz der Oligonucleotide 75 und 58 unter den oben beschriebenen Reaktionsbtdingungen amplifizieit wurde.

Eine Aliquote des Reaktionsgemisches wurde durch Agarosegelelek- !trophorese (Figur 35) analysiert

In Figur 35 zeigt:

!Spur 1 den mit Mae III gespaltenen Marker 0X174, Spur 2 das Produkt der linearen Amplifikation einer BamHI-Vekto- ;rettööibliothek unter Einsatz des Oligonucleotids 75, I Spur 3 das aus 20 Zyklen sekundärer Amplifikation mit den Oiigojnucleotiden 58 und 75 resultierende Produkt,

j Spur 4 das aus 35 Zyklen sekundärer Amplifikation mit den Oligo

.nucleotiden 58 und 75 resultierende Produkt,

•Spur 5 das aus 40 Zyklen primärer Amplifikation mit den Oligo-

^:. nucleotiden 58 und 75 resultierende Produkt.

145 I

Beispiel 22

Eine Humangenombibliothek wurde unter Verwendung des Cosmidvek- ; tors ρ Cos EMBL2 nach den veröffentlichten Verfahrensweisen kon- ' struiert (PFR Little (1987) in: DNA cloning - A practical approach (DNA-Klonierung - eine praktische Methode), Band III, 5. 19-42, herausgegeben von DM Glover). Die Bibliothek wurde durch Hybridisierung an Sonde KM19 gescreent (X. Estivill et al. (1987) Nature 326, 840 - 845). Mehrere positive Klone wurden identifiziert, und es wurde ein Klon 4.17 selektioniert, der die KM19-Sequenz in einem 40-kb-Insert enthielt.

Cosmid 4.17 wurde mit Hind III digeriert, und eine Vektorettebibliothek wurde nach Methode X hergestellt. '

Es wurden zwei Oligonucleotidprimer, 76, 77, synthetisiert: ;

76 5' GGAAGGCCTTCAAAATTAACAGTGTAGCC

77 5 GCTGCATCATATAAGTTGCC

Die Positionen dieser Primer sind in Figur 36(a) gezeigt

PCR-Amplifikation wurde an Aliquoten der Bibliothek gemäß nachstehender Beschreibung ausgeführt

Folgendes wurde in einem 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gemischt:

0,1 pg Cosmidvektorettebibliothek 100 pmol Oligonucleotid 58 100 pmol Oligonucleotid 76 100 μΜ dNTPs 10 μΐ 1Ox Puffer 1Ox Puffer ist:· 500 mM KCl

100 mM Tris-HCl,

pH 8,3 10 mM MgCl₂ 0,1 % Gelatine

Es wurde eine zweite Reaktion mit folgendem Inhalt eines 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen durchgeführt: i

	pg	Cosmidvektorettebibliothek	50
	pmol	Oligonucleotid	77
	pmol	Oligonucleotid
	μΜ	dNTPs
	Ml	10x Puffer
ο,ι
100
100
100
10

2 8405

H6

I Das Volumen der Reaktionsgemische wurde mit sterilem doppelt de-] stilliettem Wasser auf 100 μΐ eingestellt. 50 μΐ leichtes Minerali öl (Sigma) wurden vorsichtig über das Reaktionsgemisch pipettiert, ! um Verdampfung zu verhindertn. Dann wurden die Röhrchen in einen j Thermal Cycler (Techne Programmalbe Dri-Block PHC-I) gelegt, der

jauf 96 ⁰C äquilibriert worden war. Man ließ den Block auf 96 ⁰C

{abkühlen. Dem Reaktionsgemisch wurden zwei Einheiten Taq-Polyme- , j rase (Cetus) zugesetzt. Die folgenden Temperaturen und Zeiten iwurden angewendet, um die Sequenzen zwischen den Oligonucleotiden j 58 und 76 und zwischen 58 und 77 zu amplifizieren:' |

92	0C	2	Minuten
65	0C	2	Minuten
72	0C	5	Minuten

I Es wurden 40 Zyklen durchgeführt. Während des ab .schließenden Zyklus wurde das Reaktionsgeinisch 10 Minuten lang bei 72 ⁰C gehalten.

Aliquoten. (15 μΐ) wurdejn von den Reaktion.sgemischen abgenommen. Farbstoffgemisch (Dye Loading Mix) (5 μΐ) wurde zugesetzt, und die Proben wurden auf 1,4 %igen Agarosegelen analysiert.

:Farbstoffgemisch: 15 % (Masse/Vol.) Ficoll 400 (Dye Loading Mix) 0,05 % (Masse/Vol.) Bromphenolblau

0,05 H (Masse/Vol.) Xylencyannl Gelöst in 1 χ TBE

.Die Ergebnisse sind in Figur 36(b) gezeigt.

,Spur 1 0X174 Haelll-DNA-Marker

!Spur 2 230-bp-Produkt (Oligonucleotid 58, Oligonucleotid 78) 'Spur 3 1200-bp-Produkt (Oligonucleotid 58, Oligonucleotid 77)

!Spur 4 0X174 Haelll-DNA-Marker

2 8 4 O 5|3

147 '

Beispiel 23 j

Die folgenden Oligonucleotide wurden synthetisiert. !

78 5¹ CTCTCCCTTCTCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGGTCCTCTCCTTC

Ein modifiziertes Oligonucleotid vom Typ E, das eine Sequenz enthält, die die Nucleotidreste 385 - 414 des Tetracyclinresistenzgens von Plasmid pBR322 darstellt (T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrock (1982) Molecular Cloning - A laboratory manual (Molekulares Klonieren - Ein Laborhandbuch) S. 479 - 503). Zur Verwendung in Verbindung mit Oligonucleotiden vom Typ D.

79 5¹ CCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCG

Ein modifizierter Universalvektoretteprimer, der die Nucleotid- ; reste 385-414 des Tetracyclinresistenzgens von Plasmid pBR322 (T. Maniatis et al. Molecular Cloning - A laboratory manual (Molekulares Klonieren - Ein Laborhandbuch, S. 479 - 503) darstellt. Zur Verwendung mit Oligonucleotid 78 und Oligonucleotiden 80/81, 82/81 und 83/81 gemäß nachstehender Beschreibung.

80 5¹ AATTGGCGGCCGCCATCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT

Ein modifiziertes Oligonucleotid vom Typ D mit einem kohäsiven EcoRi-Ende, einer Not I-Erkennungsstelle und einer Fok I-Erkennungsstelle. Zur Verwendung mit Oligonucleotid 81.

81 5' AGTTCTCCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGGATGGCGGCCGCC iEin modifiziertes Oligonucleotid vom Typ E.

'82 5' AGCTGGCGGCCGCCATCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT

Ein modifiziertes Oligonucleotid vom Typ D mit einem kohäsiven Hindlll-Ende, einer Not I-Erkennungsstelle und einer Fok-I-Erikennungsstelle. Zur Verwendung mit Oligonucleotid 81.

'83 5' AGCTGGCGGCCGCCATCC -NH₂

Ein modifiziertes Oligonucleotid vom Ty A, das ein kohäsives Hind-

284 05

148

III-Ende mit einer den 3'-Terminus blockierenden Aminohexylmodifikation enthält. Zur Verwendung mit Gligonucleotid 81.

84 5¹ GGCTCAACAGTCAGTTTGAACTAGC

Ein einer EcoRI-Stelle in der KM19-Region benachbarter Primer.

Restriktionskarten, die für jede der folgenden Amplifikationen geeignet sind, sind in Figur 37 dargestellt. Es zeigen

a) eine Restriktionskarte eines Segments genomischer DNA, die an eine EcoRI-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 27, 76, 78 und 79 sind angegeben.

b) eine Restriktionskarte eines Segments genomischer DNA, das an eine EcoRI-Vektorette ligiert ist. Die Positionen der Oligonucleotide 78, 79 und 84 sind angegeben.

c) ein Segment des an eine EcoRI-Vektorette li'gierten Phenylalaninhydroxylasegen-Exons 9. Die Positionen der Oligonucleotide 63 und 79 sind angegeben.

d) eine Restriktionskarte des an eine modifizierte EcoRI-Vektorette ligierten Segments genomischer DNA (in 37(a) oben beschrieben). Die Positionen der Oligünucleotide 76, 79, 80 und 81 sind angegeben.

e) eine Restriktionskcirte eines an eine modifizierte EcoRI-Vektorette ligierten Segments genomischer DNA (in 37(b) oben beschrieben). Die Positionen der Oligonucleotide 79, 80, 81 und 84 sind angegeben.

f) ein Segment des an eine modifizierte EcoRI-Vektorette ligierten Exons 9 des Phenylalaninhydroxylasegens. Die Positionen der Oligonucleotide 63, 79, 80 und 81 sind angegeben.

g) eine Restriktionskarte eines an eine modifizierte Hindlll-Vektorettebibliothek ligierten Segments genomischer DNA. Die Positionen der Oligonucleotide 76, 78 und 79 sind angegeben.

h) eine Restriktionskarte eines an eine modifizierte Hindlll-.Vektorettebibliothek ligierten Segments genomischer DNA. Die Pojsitionen der Oligonucleotide 78, 79, 81 und 82 sind angegeben.

i) eine Restriktionskarte eines an eine modifizierte Hindlll- ;Vektorettebibliothek ligierten Segments genomischer DNA. Die Po-

149 :

sitionen der Oligonucleotide 76, 79, 81 und 83 sind angegeben.

(a) Eine EcoRI-Vektorettebibliothek wurde nach Methode X aus ' EcoRI-digerierter genomischer DNA (Zellinie 7387) und den Oligonucleotiden 27 und 79 hergestellt. Eine Aliquote der Bibliothek (1 ng) wurde mit den Oligonucleotiden 76 und 79 amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches (15 μΐ) wurde auf einem 1,4 %igem Agarosegel analysiert. Die Resultate sind in Figur 38 gezeigt:

Spur 1 0X174 Haelll-DNA-Marker

Spur 2 870-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den

Oligonucleotiden 76 und 79 resultiert.

ί (b) Eine Aliquote (1 ng) der in dem vorhergehenden.Beispiel beschriebenen EcoRI-Vektorettebibliothek wurde mit den Oligonucleo-J tiden 79 und 84 amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte nach der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches (15 μΐ) wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Das Resultat ist in Figur 38 gezeigt.

Spur 3 520-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 79 und 84 resultiert.

(c) Eine Aliquote (1 ng) der ip den vorhergehenden Beispielen beschriebenen EcoRI-Vektorettebibliothek wurde mit den Oligonucleotiden 63 und 79 amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte gemäß der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches (15 μΐ) wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Das Resultat ist in Figur 38 gezeigt.

Spur 4 600-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 63 und 79 resultiert.

(d) Es wurde eine EcoRI-Vektorettebibliothek nach Methode X aus : EcoRI-digerierter DNA (Zellinie 7387) und den Oligonucleotiden ι- :80 und 81 hergestellt. Eine Aliquote der Bibliothek (1 ng) wurde mit den Oligonucleotiden 76 und 79 amplifiziert. Die Amplifika-

~ ~ " " 2 8 4 O 5!3

150 ;

tion erfolgte entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8. Eine i Aliquote des Reaktionsgemische (15 μΐ) wurde auf 1,4 %igem ; Agarosegel analysiert. Die Resultate sind in Figur 38 gezeigt.

Spur 870-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 76 und 79 resultiert.

(e) Eine Aliquote der in (4) oben beschriebenen Bibliothek wurde j mit den Oligonucleotiden 79, 84 amplifiziert. Die Amplifikation

j erfolgte entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8. Eine AIiquote des Reaktionsgemisches wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Das Resultat ist in Figur 38 gezeigt.

Spur 6 520-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 79 und 84 resultiert.

(f) Eine Aliquote der in (4) oben beschriebenen Bibliothek wurde mit den Oligonucleotiden 63 und 79 amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Das Resultat ist in Figur 38 gezeigt.

Spur 7 600-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 63 und 79 resultiert.

(g) Es wurde eine Hindlll-Vektorettebiblitithek nach Methode X aus Hindlll-digerierter genomischer DNA (Zellinie 7387) und den Oligonucleotiden 30 und 81 hergestellt. Eine Aliquote der Bibliothek (1 ng) wurde mit den Oligonucleotiden 76 und 79 amplifiziert. Die Ampiifikation erfolgte nach der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches (15 μΐ) wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Das Resultat ist in Figur 38 gezeigt.

•Spur 8 230-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den

;Oligonucleotiden 76 und 79 resultiert.

j ;

i(h) Es wurde eine Iiindlll-Vektorettebibliothek nach Methode X aus Hindlll-digerierter genomischer DNA (Zellinie 7387) und den

151

Oligonucleotiden 82 und 81 hergestellt. Eine Aliquote der Bibliothek (1 ng) wurde mit den Oligonucleotiden 76 und 79 amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte nach der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches (15 μΐ) wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Die Resultate sind in Figur 38 gezeigt.

Spur 9 230-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 76 und 79 resultiert.

(i) Es wurde eine Hindlll-Vektorettebibliothek nach Methode X aus Hindlll-digerierter genomischer DNA (Zellinie 7387) und den Oligonucleotiden 83 und 81 hergestellt. Eine Aliquote der Bibliothek (1 ng) wurde mit den Oligonucleotiden 76 und 79 amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8. Eine Aliquote des Reaktionsgemisches (15 μΐ) wurde auf einem 1,4 %igen Agarosegel analysiert. Die Resultate sind in Figur 38 gezeigt.

Spur 9 230-bp-Produkt, das aus der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 76 und 79 resultiert.

Spur 10 0X174 Haelll-DNA-Marker. Beispiel 24

Die folgenden Oligonucleotide wurden synthetisiert:

85 5¹ ATTCTGTCCAGGAAACTTTGTGTTTTGTCA

86 5' AGCCGAAGACAAAGGGCATAATCTC

87 5¹ TCACTACCAGCTTTCCCCCACTTCCCTGGC

88 5¹ CCCTAAATTAGTCTCAGCTCCAGGTAAGGT

DNA wurde aus Zellinie 7382. (von der vorstehend gezeigt wurde, daß sie den ++Haplotyp für den KM19-Pstl-Polymorphismus enthält) extrahiert und mit Pstl digeriert. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform wurde DNA durch Ethanolpräzipitation rückgewonnen (siehe Figur 39(a)).

..J

840531

151 a

Zirkularisierung

Folgendes wurde in ein 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gegeben:

10 ng Pstl-digeriertes 7382-DNA

10 μΐ 1OX Ligationspuffer

10 μΐ 10 mM ATP

0,5 μΐ . T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim, 8 Einheiten/μΐ)

~ ~~ - - · 2 8 4 rs 3

152 I

"j Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf ^; 100 μΐ eingestellt und 2 Stunden bei 25 ⁰C inkubiert. Es wurden , 5 identische Reaktionen durchgeführt und nach 2 Stunden bei 25 ⁰C ; gepoolt. Das gepoolte Gemisch wurde mit Phenol/Chloroform extra- ; hiert, und DNA wurde durch Ethanolpräzipitation rückgewonnen. Das DNA-Pellet wurde in 100 μΐ Wasser gelöst und durch Gelfiltrationen a.uf vorgepackten Säulen gereinigt ( G 50-Sephadex-Nick- !Säulen, Pharmacia). Die DNA wurde in 400 μΐ Wasser eluiert. Die (Lösung wurde lyophilisiert und in Wasser (9 μΐ) erneut gelöst, ium eine Endkonzentration von 50 ng/μΐ zu erhalten. 1 μΐ dieser jLösung wurde mit Wasser auf 50 μΐ verdünnt (siehe Figur 39(b)).

!Konstruktion der Vektorettebibliothek

Hindlll-Digestion

2 μΐ Pstl-Kreise (100 ng)

0,5 pi 1OX Puffer

1,5 μΐ H₂O

1 μΐ HindIII (2 Einheiten)

Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Ligation

Folgendes wurde dem Restriktionsdigest zugesetzt:

1 μΐ 1OX Puffer

1 μΐ 10 mM ATP

i 1 μΐ Hybridisierte Oligonucleotide 81 und 82

' (0,25 pmol) oder 81 unJ 83 (0,25 pmol)

: 1 μΐ Ligase (2 Einheiten)

0,5 μΐ 1OX Hindlll-Puffer

;Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37 ⁰C inkubiert. Hybridisierte Oligonucleotide (81/f«2 oder 81/83 0,25 ιmol) wurden zugesetzt, jund die Reaktion wurde eine weitere Stunde bei 37 ⁰C inkubiert. Das Volumen des Reaktionsgemisches wurde dann mit Wasser auf 100 !μΐ eingestellt (siehe Figur 39(c)).

153

1. Folgendes wurde in ein 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gegeben

(5 ng) (100 pmol) (100 pmol)

Pstl-Kreise Oligonucleotid 85 Oligonucleotid 86 10 μΐ 1OX PCR-Puffer 100 μΜ -dNTPs )2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus)

Das Volumen wurde mit Wasser auf 100 μΐ eingestellt, und die jAmplifikation wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8 durchgeführt.Das vorausgesagte 710-bp-Produkt wurde gewonnen und bestätigte, daß sich Kreise gebildet hatten. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

jSpur 1 0X174 Haelll-DNA-Marker

JSpur 2 710-bp-Produkt der Amplifikation zwischen den Oligonucleo-

j tiden 85 und 86.

j2. Folgendes wurde in ein 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gegeben:

? 10 ng Pstl-kreis-Hindlll-Vektorette-Oligo.iucleotid 81/82 jOligopucleotid 85 (100 pmol) Oligonucleotid 79 (100 pmol) JlO μΐ 10 χ PCR-Puffer |l00 μΜ dNTPs ;2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus)

Das Volumen wurde mit Wasser auf 100 μΐ eingestellt, und die Amplifikation erfolgte entsprechend der Beschreibung in Beispiel Q. Das vorausgesagte 720-bp-Produkt wurde gewonnen. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

jSpur 3 720-bp-Produkt der Amplifikation zwischen Oligonucleotid J85 und 79.

13. Das in (2) oben beschriebene Amplifikationsreaktionsgemisch wurde durch einen Faktor von 10 verdünnt. 1 μΐ des verdünnten

154

Gemisches wurde in ein 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchsn gebracht. Folgendes wurde ebenfalls in das Sarstedt-Röhrchen gegeben:

Oligcnucleotid 79 (100 pmol) Oligonucleotid 88 (100 pmol) 10 μΐ 1OX PCR-Puffer 100 p;i dNTPs

2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus)

Das Volumen wurde auf 100 μΐ eingestellt, und die Amplification erfolgte entsprechend der Besenreibung in Beispiel 8. Das vorausgesagte 500-bp-Produkt wurde gewonnen. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

Spur 4 500-bp-Produkt der Amplifikation zwischen den Oligonucleotiden 79, 88. ,

4. Das Amplifikationsprodukt von (3) oben wurde mit Pstl digeriert. Die vorausgesagten Produkte (340 bp, 160 bp) wurden gewonnen. Das Resultat ist in Figur 40 gezeigt.

Spur 5 Von der Digestion des PCR-Produktes (Spur 4) mit Pstl resultierende Produkte. Es werden Produkte mit 340 bp und 160 bp gewonnen.

5. Folgendes wurde in ein 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gegeben:

10 ng Pstl-Kreis-Hindlll-Vektorette-Oligonucleotid 83/82 Oligonucleotid 85 (100 pmol) Oligonucleotid 79 (100 pmol) 10 μΐ 1OX PCR-Puffer 100 μΜ dNTPs •2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus).

j Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf

100 μΐ eingestellt, und die Amplifikation erfolgte entsprechend

der Beschreibung in Beispiel 8. Das vorausgesagte 720-bp-Produkt wurde gewonnen. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

Spur 6 720-bp-Produkt der Amplifikation zwischen Oligonucleo- ;

tid 79 und 85. I

6. Das in (5) oben beschriebene Amplifikationsreaktionsgemisch f wurde durch einen Faktor von 10 verdünnt. 1 μΐ des verdünnten Gemisches wurde in ein 0,5 ml Sarstedt-Röhrchen gebracht. Folgendes wurde ebenfalls in das Sarstedt-Röhrchen gegeben:

IOligonucleotid 79 (100 pmol) Oligonucleotid 88 (100 pmol) 10 μΐ 1OX PCR-Puffer 100 μΜ dNTPs 2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus)

Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf 100 μΐ eingestellt, und die Amplifikation wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8 durchgeführt. Das vorausgesagte 500-bp-Produkt wurde gewonnen. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

Spur 7 500^-bp-Produkt der Amplfikation zwischen Oligonucleotid 79, 88.

7. Das Amplifikationsprodukt von (6) oben wurde mit Pstl digeriert. Die vorausgesagten Produkte (340 bp, 160 bp) wurden gewonnen. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

Spur 8 Produkte, die von der Digestion von PCR-Produkt (Spur 6) mit Pstl resultieren. Produkte von 340 bp und 160 bp werden gewonnen.

8. Das in (3) oben beschriebene Amplifikationsreaktionsgemisch wurde durch einen Faktor von 10 verdünnt. 1 μΐ des verdünnten Gemisches wurde in ein 0,5-ml-Sarstedt-Röhrchen gegeben. Folgen-

[des wurde dann in das Sarstedt-Röhrchen gebracht:

J ·~ lOligonucleotiri 79 u jOligonucleotid 85

156

10 μΐ 1OX PCR-Puffer 100 μΜ dNTPs

2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus)

Das Volumen wurde mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser auf 100 μΐ eingestellt, und die Amplifikation wurde entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt. Das vorausgesagte 720-bp-Produkt wurde gewonnen. Die Resultate sind in Figur 40 gezeigt.

Spur 9 720-bp-Produkt der Amplifikation zwichen Oligonucleotid ι

79, 85.

9. Das Amplifikationsprodukt von (8) oben wurde mit Pstl digeriert.

Die vorausgesagten Produkte (370 bp, 350 bp) wurden gewonnen.

Spur 10 Produkte, die von der Digestion von PCR-Produkt (Spur 9) mit Pstl resultieren. |

Produkte von 370 bp und 350 bp wurden gewonnen. j

Spur 11 0X174 Haelll-DNA-Marker. !

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Claims (2)

157 Patentansprüche;

1) einen Pool von Targetnucleineäurefragment/Vektoretteeinheiten von einer Vielzahl von durch einen zu untersuchenden Phänotyp befallenen Individuen und

1) mindestens eine Vektoretteblbliothek, wobei jede Bibliothek eine Gruppe von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten umfaßt, die von Nucleotidsequenzen eines einzelnen Vertreters einer Tier-, Pflanzen- oder Mikroorganismenspecies gewonnen wurden, und

2) einen oder mehrere Initiierungsprimer für die Hybridisierung an eine Initilerungssta^tregion der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten.

18. Kit nach Anspruch 17 für die Analyse eines für eine Predisposition für einen gegebenen Phänotyp verantwortlichen oder dazu beitragenden Genotyps, dadurch gekennzeichnet, daß

die Gruppe von Targetnucleineäurefragment/Vektoretteeinheiten umfaßtt

1. Methode für die Amplif ikation eines Nucleinsäuref ragmen *:s, das eine unbekannte Sequenz aufweist, durch Primerextension, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt:

das Spalten einer Targetnucleinsäure zur Gewinnung von Targetnucleinsäurefragmenten, wobei eines der Fragmente eine Initiierungsstartregion mit bekannter Sequenz für die Hybridisierung mit einem Initiierungsprimer enthält; das Herstellen von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten aus den Targetnucleinsäurefragmenten durch Ligation jeder Einheit mit einer Vektorettestartregion bekannter Sequenz für die Hybridisierung mit einem Vektoretteprimer; und Behandeln der Targetnucleinsäurefragment/ Vektoretteeinheiten zusammen und nacheinander mit geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem ^gens für die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten unter Hybridisierungsbedingungen, so daß ein Extensionsprodukt eines Initiierungsprimers komplementär zu einer einzelsträngigen Targetnucleinsäure/Vektoretteeinheit synthetisiert wird, die eine Initiierungsstartregion aufweist, an die ein Initiierungsprimer hybridisiert wird, der so ausgewählt wird, daß er im wesentlichen komplementär zu der Initiierungsstartregion ist, während kein derartiges Extensionsprodukt synthetisiert wird, das komplementär zu e^inzelsträngigen Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten ist, die keine solche Initiierungsstartregion haben.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Extensionsprodukt der Amplifikation in Anwesenheit eines Vektoretteprimers unterzogen wird, der so ausgewählt wird, daß er im wesentlichen komplementär zu einer Vektorettestartregion ist.

3. Methode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese von Vektoretteprimeramplifikationsprodukten von der anfänglichen Synthese eines Extensionsproduktes des Initiierungsprimers abhängig ist.

158

4. Methode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektoretteabschnitt der Targetnucleinsäurefragment/Ve! toretteeinheit einen doppelsträngigen Abschnitt mit einem ersten und zweiten Strang umfaßt, wobei der zweite Strang des Vektoretteabschnitts an jenen Strang des Targetnucleinsäurefragments ligiert ist, der I die Initiierungsstartregion enthält, und die Nucleotidsequenz ; des ersten Stranges, zweiten Stranges und Vektoretteprimers so ^! ausgewählt werden, daß der Vektoretteprimer unter den gleichen

Hybridisierungsbedingungen zur Hybridisierung an das Komplement • des zweiten Stranges, aber nicht an den ersten Strang in der La-'ge ist.

:5. Methode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Vek- \ toretteabschnitt der Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteein-, heit einen doppelsträngigen Abschnitt mit einem ersten und zweiten Strang umfaßt, wobei der erste Strar.g eine terminale Polymerisat ionsblockierkomponente aufweist und der zweite Strang, der im Einsatz an jenen Strang des Targetnucleinsäurefragments ligiert wird, der die Initiierungsstartregion enthält, einen einzelsträngigen Abschnitt trägt, wobei die terminale Polymerisationsblockierkomponente dahingehend w~rkt, die Extension des ersten Stranges zur Bildung eines Komplements zu dem einzelsträngigen Abschnitt des zweiten Stranges in Anwesenheit geeigneter Nucleosidtriphosphate und eines Agens für-die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen zu verhindern .

6. Methode nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von unterschiedlichen Vektorettebiblio+heken zum Einsatz mit dem gleichen einzelnen Initiierungsprimer hergestellt wird, wobei jede Vektorettebibliothek Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheiten umfaßt, die durch Ligation von Nucleinsäurefrojmenten gewonnen werden, die hergestellt werden durch:Spalten von Targetnucleinsäure an unterschiedlichen Spaltstellen; Behandeln jeder Vektorettebibliothek, entweder separat oder zusammen, mit geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation von Nucleosidtriphosphaten un-

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159

ter Hybridisierungsbedingungen, um dadurch eine Vielzahl von Initiierungsprimerextensionsprodukten auf der Basis des Einsatzes 'eines einzelnen Initiierungsprimers zu gewinnen.

7. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ;eine Nucleinsäure, die zur Ligation aneinander fähige Termini !aufweist., zirkularisiert wird, wobei die Nucleinsäure einen Abschnitt aufweist, der in der Lage ist, als eine Initiierungsstartregion für die Hybridisierung mit einem Initiierungsprimer zu 'dienen; die zirkularisierte Nucleinsäure außerhalb der bekannten !Nucleotidsequenz gespalten wird, um ein lineares Molekül zu bil-Iden, das die bekannte Nucleotidsequenz enthält und an mindestens !einem Terminus ein bekanntes Spaltstellenmuster für die Ligation ^;zur Bildung einer Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit !aufweist; die Targetnucleinsäurefragment/Vektorette.einheit durch ligation gebildet wird und die Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheit zusammen oder nacheinander mit Initiierungsprimer, geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die Polymerisation der Nucleosidtriphosphate unter Hybridisierungsbedingungen behandelt wird.

8. Methode nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Targetnucleinsäuref ragment/Vektoretteeinheit zusammen oder nachein- /· lander mit Initiierungsprimer, Vektorettepr-imer, geeigneten Nucleosidtriphosphaten und einem Agens für die /olymerisation der Nucleosidtriphodphate behandelt wird.

9. Methode nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Targetnucelinsäurefragment/Vektoretteeinheiten aus Targetnucleinsäurefragmenten durch Ligation hergestellt werden, so daß die Vektorette von den daraus gewonnenen Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten nicht durch das gleiche Agens abgespalten werden kann, das zur Spaltung der Targetnucleinsäure zur Gewinnung der Targetnucleinsäurefragmente verwendet worden ist.

10. Methode nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Targetnucleinsäure mit einer Restriktionsendonuclease gespalten wird,

2 84 ΰ 5 3

160

um ein Targetnucleinsä'urefragment für die Ligation an eine Vek- \ torette zu gewinnen, wobei die Sequenz der Vektorette so ausge- \ wählt wird, daß die Restriktionsendonucleaseerkennungssequenz ! der Restriktionsendonuclease in der Tarpetnucleinsäurefragment/ IVektoretteeinheit abwesend ist.

ill. Methode nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gelkennzeichnet, daß eines oder alle der gewonnenen Initiierungs- !primerextensionsprodukte mindestens an dem (den) Ende(n) sequenziert wird (werden), das (die) distal zu einem gegebenen Ini- ^:tiierungsprimer ist (sind), um die Sequenz eines weiteren Ini- ;tiierungsprimers zu bestimmen, um dadurch weitere Initiierungsi primerextensionsprodukte auf der Basis von Primerextension des !weiteren Initiierungsprimers zu gewinnen.

*

12. Methode nach einem aer vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet ,daß ein Initiierungsprimerextensionsprodukt oder ein Teil davon sequenziert wird, um dadurch das Extensionsprodukt oder einen Teil davon zu charakterisieren.

13. Methode nach Anspruch 11 oder 12 für die Identifizierung eines für einen gegebenen Phänotyp verantwortlichen Genotyps, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der den Genotyp enthaltenden Nucleinsäure mit der Sequenz von Nucleinsäure verglichen wird, die keinen solchen Genotyp enthält, um dadurch den für einen gegebenen Phänotyp verantwortlichen Genotyp zu identifizieren .

14. Methode nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Vergleich durch die Verwendung einer Einzelprobe von Nucleinsäure von einer für einen gegebenen Phänotyp obligaten Heterozygoten ausgeführt wird.

15. Methode nach Anspruch 11 oder 12 für die Identifizierung eines Genotyps, der für eine Prädisposition für einen gegebenen Phänotyp, sofern vorhanden, verantwortlich ist oder dazu beiträgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuresequenzen von

einer Vielzahl von durch den zu untersuchenden Phänotyp befallenen Individuen mit den Nucleinsäureseq-jenzen von einer Vielzahl von Individuen verglichen werden, boi denen kein Zeichen für den zu untersuchenden Phänotyp vorhanden ist, um dadurch einen Genotyp zu identifizieren, der für eine Piädlsposifclon für einen zu untersuchenden Phänotyp, sofern vorhanden, verantwortlich ist oder dazu beiträgt.

16. Methode nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzunterschiede zwischen 1) einem Pool von Nucleinsäuren von einer Vielzahl von durch einen zu untersuchenden Phänotyp befallenen Individuen und 2) einem Pool von Nucleinsäuren von einer Vielzahl von Individuen, die kein Zeichen des zu untersuchenden Phenotype zeigen, verglichen werden.

17. Vektorettebibliothekskit für die Amplifikation eines Nucleins£urefragments mit unbekannter Sequenz durch Primerextension, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

2) einen Pool von Targetnucleinsäurefragment/Vektoretteeinheiten von einer Vielzahl von Individuen, die kein Zeichen
des zu untersuchenden Phänotyps zeigen.