JPH02174679A - ヌクレオチド配列の増幅方法 - Google Patents

ヌクレオチド配列の増幅方法

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JPH02174679A
JPH02174679A JP1196447A JP19644789A JPH02174679A JP H02174679 A JPH02174679 A JP H02174679A JP 1196447 A JP1196447 A JP 1196447A JP 19644789 A JP19644789 A JP 19644789A JP H02174679 A JPH02174679 A JP H02174679A
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nucleic acid
vectorette
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target nucleic
dna
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Alexander Fred Markham
アレキサンダー・フレッド・マーカム
John Craig Smith
ジョン・クレイグ・スミス
Rashida Anwar
ラシダ・アンワー
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は核酸増幅のための方法と、それゆえキット（Ｋ
ｉｔ）に関する。そのような方法は、はんの一部だけ知
られている配列の増幅との関連において特に興味深く、
また長い核酸配列を速く効果的にシーケンスすることを
可能にする。この方法は、これまで未知のヌクレオタイ
ド配列をシーケンスするのに必要であった、組みかえＤ
ＮＡクローニング過程を避けている。そうすることによ
って、つの遺伝的位置の異なる対立遺伝子間の多様性が
、異なる個における特定の位置の対立遺伝子を同時的に
分析するのと同様に検索されることを許す。
ヌクレオタイドは個々のヌクレオタイド、または塩基対
Ｃ下部ではｂｐとも呼んでいるＤ、あるいは核酸鎖（ス
トランド）内−それぞれの鎖はｔｏ’ｂｐかそれ以上を
含むような−として存在できる０例えばヒトゲノムは約
３　ｘｌｏ’ｂｐ、一つの染色体は約１０’　ｘ　ＩＯ
’ｂｐを含むと考えられている。比較的短いヌクレオタ
イド配列をシーケンスする技術は何年もの間存在し、そ
の中にはマキサム−ギルバー）　（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ
　Ｇ１１ｂｅｒｔ）方も含まれていて、〔マキサム＾０
Ｍ、（Ｍａｘａ＋ＩＡ、Ｍ、）ギルバートＷ（Ｇｉｌｂ
ｅｒＬ）（１９７７）“ＤＮＡシーケンスの新方法”　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＤＮＡ　　Ｈ５６０−５６４と“塩基特異的科
学的切断による末端１１！識されたＩＩＮＡのシーケン
ス”酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎεｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）ｉ、　４９９〜５６０（１９８０）　
）そこでは例えば３２９などで端を放射性標識された一
本鎖ＤＮ＾が何回かの化学的切断過程（例えばジメチル
硫酸塩やヒドラジンなどで）を受け、（その過程は）あ
る種の核酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｃｌｅ）の片側に選択的
に切れ目を作る。得られた小片はアクリルアミドゲル電
気泳動によってサイズで分離されオートラジオグラフィ
ーで確認される。比較的短い核酸配列はまたサンガー（
Ｓａｎｇｅｒ）らの酵素的“ダイデオキシ”法で決定す
ることもでき、その方法では、例えば３２．で１種かそ
れ以上が放射性標識された４種のデオキシヌクレオサイ
ド−３リン酸存在下で、４種のグイデオキシヌクレオサ
イド３リイ酸の各々１つを低濃度で含むような４つの別
々なインキュベーションミックス内でＤＮＡポリメラー
ゼｌのフレノウ（Ｋｌｅｎｏ賀）断片か７７　ＤＮＡポ
リメラーゼまたはＴａｑ　ＤＮ＾ポリメラーゼが一本の
鎖の標的配列の相補配列を合成するのに使用される。こ
のようにそれぞれ共通の５′末端を持つが、塩基特異的
３′末端に対して長さの異なる切り縮められた放射性活
性のあるＤＮＡ分子の一郡が各反応で得られる。続く適
当なインキュベーションでそれぞれの混合液（ｍｉｘｔ
ｕｒｅ）のＤＮＡは変性され、（４種のｓ＋１ｘｔｕｒ
ｅは）隣りあって電気泳動さされ、オートラジオグラフ
ィーで一本１ｌＤＮＡの放射性活性のあるバンドが検出
される。その後標的のＤＮＡの配列（塩基配列）は、そ
のオートラジオグラフから直接読みとられる。さらにＥ
、１．ドウボン　デヌモアス＆カンパニー　　（１！、
Ｉ、ｎｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ　＆Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）　（ドエポン（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ））は最近、上
記に述べた“ダイデオキシ”法の修正を具体化した、Ｏ
Ｓ［、シーケンス用のオートメ化された装置を市場に出
している。この修正はケイ光染料で札をつけられた４種
のダイデオキシヌクレオサイド３リン酸最後部（ｔｅｒ
ｓｊｎａ！ｏｒ）の使用をともない、それぞれのグイデ
オキシ鎖、ターミネイターはアルゴンレザーで励起され
るとわずかに異なる波長の光を放射する〔サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ）宙、３３６（１９Ｂ？））　、　９−
ミネイターはそれらの放射スペクトうで見わけられるの
で４つのリイデオキヌクレオサイド３リン酸ターミネイ
ター全部を同じツボの中で使うことができる。それによ
ってできたＤＮＡ断片の混和液はポリアクリルアミドゲ
ルの一本のレーンで電気泳動をかけられる。そのあとゲ
ル上でそれぞれのバンドを終わらせているヌクレオチド
のアンデンティティーはその特徴的ケイ光放射で決定さ
れるので標的［ＩＮＡの配列は自動的に読まれる。
デュポンのＤＮＡシーケンサ−は至適条件下で１日に約
ｔｏ、ｏｏｏヌクレオチド確認できることが概算され、
熟練した働き手による修正なしの“ダイデオキシ”法で
見積もられた平均、１年で約ｓｏ、ｏｏ。
ヌクレオチドと対照をなす、これは比較的短いヌクレオ
チド配列決定でのスピードと効率の確固とした発展であ
る一方、比較的長い配列−例えばゲノムの塩基配列−の
決定において速度決定段階は俗に“染色体散歩（Ｗａｌ
ｋｉｎｓ）”として知られるステップに依拠する。“染
色体散歩”は例えば染色体のような、ファージャコスミ
ドや、イーストの人工染色体（ＹＡＣ）ベクターに入れ
るには大きすぎる区分のはしわたしのため重複する断片
をもつクローンの＃ＩＶｔ的分離を包合する技法である
。この技法はこのように、プローブが用意されてなかっ
たり、遺伝子やＤＮＡマーカーのような確認され、クロ
ーン化されている領域に接していることが知られている
ような、プローブの使用が特別（役立つわけ）ではない
、目的の領域の分離を許す、確認されている領域はゲノ
ムライブラリーをふるい落す（スクリーニング）ための
プローブとして使われ、相補的ヌクレオタイド配列を含
むいかなる断片ともハイブリダイズし、それ故それらは
重複したクローンを現す、そのような重複配列は５′側
でも３′側でもよい０重複したクローンを現していると
ｔｉｔ＋ｇされた断片は、こんどはそれ自身がゲノムラ
イブラリーを再ふるい落としするためのプローブとして
使用され、相補的核酸配列を含むどのような断片、即ち
それはさらに遠くの重複クローンを現すのだが、ともハ
イブリダイズするだろう、この過程をくりかえすことに
よってもともと確認された部分からどんどん遠い領域の
ヌクレオタイド配列が決定されやがて目的の部分に出逢
うだろう。
“染色体散歩”の技法は遺伝的異常のマーカーの発見か
ら、その異常のもとである特定の遺伝領域の発見までに
かかる時間を例とするように、いくつかの潜在的困難さ
を備っている。このように、例えばハンティングトン（
）Ｉｕｎｔｉｎｇｔｏｎ）無踏病（０４Ｓ１）（の遺伝
子）に連結した遺伝的マーカーは１９８３年に発見され
たが、しかし今日にいたるまでこの異常の原因となる特
定の遺伝領域は知られていない。
同様なコメントは他の多くの遺伝異常にもあてはまる。
“染色体散歩０の技法は特に、ゲノムＤＮ＾のクローニ
ングがまず要求されるという不利益をこうむっている。
多くの環境ではクローニングが不可能であるとか、ある
いは少なくとも非常に困難であると示されることもある
だろうし、そのような情況では“染色体散歩”は時間尚
早の終りに至る；Ａ、Ｒ，ワイマン（Ｗｙｍａｎ）とに
、Ｆ、ワードマン（Ｈｅｒ　ｔ＋ｗａｎ）、酵素学にお
ける方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏ
ｇｙ）、Ｖｏｌ　５２、分子クローニング技法の手びき
、Ｓ、Ｌ、ベルガ−（Ｂｅｒｇｅｒ）とＡ、Ｒ，キュメ
ル（Ｋｕｍｍｅ１）、アカデミツクプレス（ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　ｍ集音、サン２デイエゴ（Ｓａ
ｎ　Ｄｉｅｇｏ）、１９８７．　　ベージ１７３−１８
０゜更に重複したクローンを現わすと確認された断片の
分析はエノｌ二ニヱ旦エヱ（ｉｎｔｅｒ　ａｌｉａ）の
観点において複雑である。即ち、どのような１回のゲノ
ムライブラリーのスクリーニングでも見いだされるその
ような（重複を含む）断片の数と、その重複配列が５′
か３′の両方あるという事実がある。
染色体散歩に゛おける更に深刻な具体的問題は、ヒトあ
るいは他のゲノムで反復配列が広きにわたっておこって
いることである。このようにもし確認された部分がこの
ようなくり返し単位を含んでいるなら、ヒトゲノムのす
べてのそのような単位が重複クローンとして誤認される
であろう０分析はそれから極端に複雑になる。
更にまた“染色体散歩”で得られたどんな重複クローン
も、上記で述べたようにシーケンスされる時、確認され
た部分から得られた、１つのクローン化されたアリルよ
り導いた配列情報を作る。
種の個々のメンバー間の重要な遺伝的相違と、個の表現
型と彼らの関係の研究に関連して、もし１コ以上のアリ
ルが分析できて時間に性格づけもできるならそれは有意
義である。
当発明は、知られている配列の外側の特異的な場所で標
的ＤＮＡを切断し、得られた断片を増幅することにり上
に述べた困難さを少なくとも部分的に回避する方法の発
見に基づいており、クローニングの必要性を克服した。
このように当発明の１つの特徴により、プライマー伸長
による、未知の配列を含む核酸断片の増幅の方法が提示
されており、その方法は標的核酸断片を得るための標的
核酸切断を含んでいて、その核酸断片は開始プライマー
とハイブリダイズする既知の開始期１ｔｌＩ（プライミ
ング）領域核酸配列を含むと言われる断片の１つであっ
て、標的核酸断片／ベクトレット単位をベクトレットプ
ライマーとハイブリダイズする既知のベクトレットプラ
イミング領域を持つそれぞれの単位を連結させる（ライ
ゲーション）ことによって標的核酸断片から用意し、そ
の標的核酸断片／ヘクトレット単位を一緒にか又は連続
して適当なヌクレオサイド３リン酸と、ハイブリダイズ
する条件でヌクレオサイド３リン酸のポリメライゼーシ
ョンのための動力囚（エージェント）とで処理するのだ
か、ハイブリダイズする条件というのは、開始プライマ
ーの伸長産物が開始プライミング領域をもつ標的核酸／
ベクトレット単位の１本鎖に相補的に合成されていく、
というもので、その開始プライミング頭載がそこにしっ
かりと相補するよう選択された開始プライマーがハイブ
リダイズし、一方そのような開始プライミング領域を持
たない一本鎖標的核酸断片／ヘクトレット単位に相補的
に合成されるような伸長産物は存在しない。
もし望まれるなら上述の伸長産物は、ベクトレットプラ
イミング領域にしっかりと相補するよう選択されたベク
トレットプライマー存在下で増幅を受けられるだろう。
（的核酸断片／ベクトレット単位はかくして開始プライ
マーで処理されζもし、例えばサイキ（Ｓａｉｋｉ）ら
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０．４８７−４９
１（１９８７）、によって記述されたように開始プライ
マー伸長産物が増幅されるなら、ヘクトレットプライマ
ーの追加処理がなされる。もしベクトレットプライマー
が使われないなら、ハイブリダイズの条件と変性によっ
て開始プライマーの開始プライミング領域へのハイブリ
ダイゼーションとそれに続く、適当なヌクレオサイド３
リン酸とヌクレオサイド３リン酸のポリメライゼーショ
ンエージェントの存在下でのプライマー伸長によって算
術式あるいは線状（ｌｉｎｅａｒ）増幅が達成されるだ
ろう。
このプライミングの過程、即ちプライマー伸長と変性は
、望む増幅のレベルに到達するまで何度も適当な回数く
りかえせる。しかしながら、なるべくなら増幅は上記に
述べた、また以下で定義するＰＣＲ技法の使用によって
、開始とベクトレットの両プライマーの存在下でなされ
る。
当発明のさらなる特徴によると、未知の配列の核酸断片
をプライマー伸長によって増幅するためのキットが供給
され、そのキットは（以下のものを）含む： １）　標的核酸断片を得るために特定の力所で標的核酸
を切断する手段； ２）　　（１）で定義された標的核酸切断の手段の使用
によって得られた標的核酸断片に接着するのに適合する
ベクトレットで、それによって、使用する標的核酸断片
／ベクトレット単位を形成し、…■述のベクトレットは
ベクトレットプライマーとハイブリダイズするための、
既知の配列であるベクトレットプライミング領域を持つ
。
３）　各４種の異なるヌクレオサイド３リン酸；そして ４）　　（３）のヌクレオサイド３リン酸のポリメライ
ゼーションのためのエージェント。
ペクトレッドプライミング領域は、以下で定義されるよ
うに、標的核酸断片／ベクトレット単位のベクトレット
部分にあるかもしれないし、ないかもしれない。このよ
うに当発明キット内の（２）のベクトレットは、使用に
際して標的核酸／ペクトレフト単位がそのヘクトレット
部分にベクトレットプライミング領域を含むように形成
される限り、それ自身はベクトレットプライミング領域
を含まない。
このようにこれらの単位は、例えば、接着によって生成
された標的核酸断片／ペクトレフト単位のベクトレット
部分にベクトレットプライミング領域を持つか、あるい
は以下に書かれであるように開始プライマー伸長の結果
として単に引きおこされたベクトレットプライミング領
域を持つかのどちららかであろう。
望ましいことは、キットは、標的核酸断片／ベクトレン
ド単位のベクトレットプライミング領域にしっかり相補
的な核酸配列を持つベクトレットプライマーをさらに（
上記１−４に加えて）含む。
当発明のキット内のそのようなベクトレットプライマー
の存在は、標的核酸断片／ペクトレフト単位の増幅がＰ
ＣＲ技法（後で定義される）によって影響されるのを、
もし望むなら、可能にする。
キットは更に望ましいことに一連の“ネステソドベクト
レットブライマ−（後で定義される）もまた含むだろう
、そしてそれは例えばＩｌ、Ｂ、ガイレンシュティン（
Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎ）とＨ，エールリッヒ（Ｅｈｒ
ｌｉｃｈ）によってＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓ
ｃｊ、ＩＳＡ　８３７６５２−７６５６（１９８Ｂ＞に
述べられているように、必要である、あるいは望ましい
から、そして／あるいは増幅産物の直接のシーケンスの
ため、の２番目の増幅反応に使われるであろう、そのよ
うなベクトレットプライマーのすべてが、開始プライマ
ーのみを使用する線状増幅によって得られる、断片の遠
い方の一端のための直接シーケンスプライマーとしてか
なり利用価値があることがわかる。
調べられる標的核酸はたいていキットの使用者に独自の
ものなので、開始プライマーはたいていはキットにない
のだが、キット使用者によって用意されるだろう。
もし望まれるなら、しかしながら、この発明のキットは
さらに開始プライマーを、そしてまた、望まれるなら、
ネステッド開始プライマーを含むかもしれない。
この発明のキットはまた、都合よくこの発明の方法を行
うための緩衝液も含むかもしれなく、例えば反応混合液
の、カリウム、マグネシウム、そしてヌクレオサイド３
リン酸の濃度を変化させるための緩衝液の存在はこのキ
ットの独特な特徴になるかもしれない、これら後方（２
つ）の１１　ｄｉ液は、この発明の連続したサイクルの
至適条件を決定するのに望ましいかもしれない。
都合よ（キットは、標的核酸を各々特異的カ所で切断す
るのに１つ以上のａ複数の９手段を含む。
そのような複数の手段が存在する場合、得られた標的核
酸断片の各セットに関して標的核酸断片／ベクトレット
単位の生成を可能にするため、キットはふつう、そのよ
うな存在する各手段ごとに異なるベクトレットを含む、
この発明はこの適用に関して限界はないのだが、異なる
複数のベクトレットは都合よく１つのペクトレッドプラ
イマーに対する（共通の）相補的配列を持つ。このよう
な場合は１つのベクトレットプライマーが複数の（！的
核酸切断力所から増幅を行う。
このように望ましい（方向への）ｉｌ、体化においてこ
の発明のキットはさらに下記より１つかそれ以上の選ば
れたものを含むニー開始プライマーネステッドベクトレ
ットプライマー、ネステツド開始プライマー、シーケン
ス用プライマー、この発明の方法を遂行するための緩衝
液、そしてマグネシウム、カリウム、ヌクレオサイド３
リン酸の濃度をこえるための緩衝液。
この発明の更なる特徴によると、未知の配列を持つ核酸
断片のプライマー伸長による増幅のためにベクトレット
ライブラリーキットが供給されていて、そのキットは（
以下を）含む： １）　少なくとも１つのベクトレントライブラリー各ラ
イブラリーは、動物、植物、微生物の種の個体の核酸配
列から得られた標的核酸断片／ヘクトレフト単位のセン
トを含んでいる。
２）　標的核酸断片／ベクトレット単位の開始プライミ
ング領域にハイブリダイズする、開始ブうイマ−（ｌコ
かまたは複数）。
ベクトレットライブラリーキットはなるべく複数のベク
トレットライブラリーを含む。
標的核酸断片／ペクトレッド単位は、例えば望む種から
直接に、かあるいはそのような（望む）種から間接的に
、（即ち）プラスミド、ファージ、コスミドまたはイー
スト人工染色体（ＹＡＣ）ベクターでまずクローニング
したあと、作られるだろう。
用いられる動物、植物、微生物の種は、好んでヒトであ
るが、しかし細菌、ウィルス、イースト、寄生物のよう
な他の動物種、植物、または微生物であるかもしれない
、核酸配列は好んで染色体１）ＮＡであるが、選択され
た染色体かクローンでもよい。
用いられるペクトレッド単位は、単一切断方法から得た
ものと／あるいは、複数切断方法から得られた複数ベク
トレット単位のいずれかで、それは一緒にか又は別々に
１つのベクトレットライブラリーか複数のベクトレット
ライブラリー（以下で定義する）を構成する。
用いられる標的核酸断片はいくつかの異なる源から得る
ことができる。例えば標的核酸断片は、動物、植物、微
生物の種の１個体から、（あるいは）例えばそれらの種
の典型的ないくつかの個体から得られるだろう、Ｉｌ的
核酸断片はまた、与えられた遺伝的部位に異型接合性（
ｈｅ　ｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）であることが知られてい
るような、例えばのう飽性線維症（ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉ
ｂｒｏｓｉｓ）や他の遺伝性疾患をおこす部位など、単
独の個体から得られるであろう。
標的核酸断片はまた、与えられた遺伝的部位に正常な同
型接合性（ｈｏａｏｚｙｇｏｕｓ）であることが知られ
ているような、例えばのう飽性線維症や他の遺伝性疾患
など、単独の個体から得られるだろう。標的核酸断片は
また同じ表現型を持つ個体のグループα単独個体の反対
としてのＤからも得られるかもしれない。同じ表現型を
持つグループの各メンバーからの核酸または組織は、も
し望まれるなら、プールされるだろう０個からなる各グ
ループは少なくども２、そして便宜的に１（１０）０以
下、例えば５０５（１０）（の個体数）から成る。ベク
トレット単位は標的核酸断片と、ベクトレットライブラ
リーを形成するため別々にプールされ使用されるベクト
レット単位から作られる。その共通の表現型は、もし望
むなら、疾患又は疾患素因（即ち）遺伝する疾患の真性
キャリジ（ｃａｒｒ　ｉ　ａｇｅ−運ぶもの）が、その
疾患あるいは疾患誘因の形跡のない正常状態であろう。
当発明の手法を用いて得られるヌクレオタイド配列の比
較は、集団中の例えば所定の疾患又は疾患素因を１備え
た°どのような共通の遺伝的変化も確認する。これは、
詳しい分析の視野を、以前試みられたＲＦＬＰ技法を使
った方法を超えて（ｏｖｅｒ）上に（ａｂｕｖｅ）かな
り広げるということが認識される。
当発明のベクトレットライブラリーキットは好しいこと
に、ベクトレットプライマーと、便利にネステッド開始
プライマーからｌコかそれ以上の選択されたもの、ネス
テッドベクトレフトプライマー・とシーケンシングプラ
イマーを追加的に含む。
ベクトレットライブラリーキットはまた便利なことに４
つの異なるヌクレオサイド３リン酸各々と、ヌクレオサ
イド３リン酸のポリメライゼーションのための動力囚（
ａｇｓｎ　ｔ）を含むだろう、もし望むならベクトレッ
トライブラリーキットは更に発明を遂行するためのバッ
ファーを、そして／またはマグネシウム、カリウム、そ
してヌクレオサイド３リン酸の濃度を様々にしたバッフ
ァーを含むかもしれない、これら後のバッファーは、当
発明の手法の連続したサイクルのための至適条件を決定
するのに、望ましいかもしれない。
当発明は広い応用能力がある。このように例えば当発明
は、植物や動物、とくにヒト、における疾患の原因とな
る微生物のような特定の微生物に特徴的なヌクレオタイ
ド配列を確認するのに使用され、このような微生物には
例えば真菌（ｆｕｎｇｕｓ）、イースト１．細菌、ある
いはウィルス、さらにまた寄生虫ｑパラスモディウムｐ
ｌａｓｍｏｄｊｕｍ（（マラリャＤやトリパノゾー７　
ｔｒｙｐａｎｏｓｏｓｅ（Ｉねむり病りなどＤがある。
当発明の手法はまた、ある生物における薬剤、例えば抗
生物質、耐性の原因となるヌクレオタイド配列を確認す
るのに使用されるかもしれない、このように当発明は、
動物と植物における疾患診断用の探針（ｐｒｏｂｅ）産
生を可能にし、さらに加えて薬剤の、例えば抗生物質、
耐性の診断探針産生を可能にする。
当発明はまた例えば１）　ヌクレオタイド配列の変化、
例えば点変異、で植物、しかし特に動物、特にヒト、に
おける遺伝的障害の原因になるものを検出するのに（用
いられる）：２）　　ヌクレオタイド配列の変化、例え
ば欠失、で動物、特にヒトにおける新生物形成（ｎｅｏ
ｐｌａｓ　ｔｉｃ）疾患の原因となるものを検出するの
に（用いられる）；３）　　ヌクレオタイド配列の変化
で、植物、特に動物、特にヒトにおける疾患や障害の素
因の原因となるものを検出するのに；４）　　ヌクレオ
タイド配列の変化で、望ましい特徴、例えば植物におい
ての花の色、穀類の収穫率、又は除草剤耐性のような特
別な特徴の原因となるものを検出するのに用いられるだ
ろう。
当発明はまた動物学、例えばトランスジェニック（ｔｒ
ａｎｓｇｅｎ　ｉｃ）動物のモニターにも使われるだろ
−！１− その上更に、当発明は動物染色体、特にヒト染色体のシ
ーケンシングにおいて例えば特にヒトにおいて従来未知
の、インービボ（ｉｎ　ｖｉｒｏ）で産生可能なポリペ
プチドを確認することは特に興味深く、またそのペプチ
ドには例えば治療上の興味があるかもしれない、当発明
はまた薬剤学的（ｐｈａｒＩＩａｃｅｕＬｉｃａ１）タ
ンパク質の産生に関連して、例えば遺伝子や発現システ
ムの配列上の規制領域（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｒｅｇ
ｉｏｎ）など、興味深いかもしれない。
大きなゲノムをシーケンシングするような情況において
、例えばヒト染色体など、現在的に認められる主な限界
は、分離されたコスミドクローンの重複した“コンティ
グ（接触者）″を含んだ物理的地図を作ることである、
というのは広く受は入れられている。そのようなマツピ
ングプロジェクトのための現在的戦略は“我々の遺伝子
のマツピング（Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｏｕｒ　Ｇｅｎｅｓ）
　ニゲツムプロジェクト：どの（らい大きい、どのくら
い早い？”合衆国議会、技術査定部（Ｏｆｆｉｃｅ　ｏ
ｆ　ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｅｓ！ｍｅｎｔ）、ジ
ョンホブキング大学出版、バルチモア（Ｂａｌ　ｔｉｍ
ｏｒｅ）とロンドン（Ｋ　１９８８１１で再考されてい
る。更に進んだ詳細が“ヒトゲノムのマンピング：　Ｄ
ＮＡ断片のクローニングと順番づけのための実験的アプ
ローチ”ＲＭメイヤー（Ｍｙｅｒ）、生理学科（ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ）、カルフォルニア大学、サンフランシ
スコ校、ＵＳＡ、”我々の遺伝子のマツピング請負業者
（ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ）報告、Ｖｏｌ　　２、注文Ｎ
ｏ　ＰＢ８８−１６２８０５／Ａｓ国立技術情報サービ
ス（ＮａｔｃｏｎａｌＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）（（Ｎｌｌ５Ｄ　５８
８５Ｐｏｒｔ　Ｒｏｙａ！　Ｒｏａｄ　、　Ｓｐｒｉｎ
ｇｆｉｅｌｄ　、　Ｖ＾２２１６１．１１ｓＡ、からの
ＩＩｓ　ＯＴＡ援助下で手に入る（ａｖａｉｌａｂｌｅ
）、にのっている、ずっと小さな大ｕｉｗゲノムのマツ
ピングのアプローチがＣＬスミスら（＜　５ｃｉｅｎｃ
ｅ　、２３６．１４４８−１４５３１９８７　ＤとＹコ
ハラ（Ｋｏｈａｒａ）ら（［Ｃｅ１ｌ、利、４９５−５
０８．１９８７Ｄによって教えられている。
当発明はまた、例えばコスミドとＹＡＣ（（イースト人
工染色体（ｙｅａｓｔ　ａｒｔＨｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏ
ｍｏｓｏｍｅ）Ｄ内でのクローニングによって精製され
た大きなヌクレオタイド断片をシーケンスするのに用い
られるかもしれない、コスミドは例えば約４５ｋｂまで
のヌクレオタイド断片、をクローン化するのに使用でき
、ＶＡＣは平均サイズ３（１０）ｋｂ以上（１）ｌｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅａｒｃｈ　１？、３４２５
−３４３３α１９８９Ｄ　Ｒアナニド（Ａｎａｎｄ）ら
Ｄの断片をクローン化するのに用いられるだろう、その
ような大きなヌクレオタイド断片のシーケンシングへの
当発明の応用可能性は、非常に大きなヌクレオタイド配
列のす速いシーケンシングを可能にする。
当発明の特に有利な面は、この発明の手法を使っての配
列分析が、標的核酸のクローニングをともなわない、と
いうことである。実際これは、標的核酸サンプルに存在
するすべてのアリルが同時に分析されるであろう、とい
うことを意味する。
ヘテロ接合体の確認におけるこのアプローチのを利（な
所）は正常、変異のホモ接合体と同様、以前に説明され
ていて、（つまり）　ＰＣＲ産物の直接シーケンシング
が遺伝的疾患をおこすような変異α例えば点変異りの分
析に用いられているということである。αＮｕｃｔｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｇ、、１６．８２３３−８２．１３
（Ｉ　１９８８Ｄ　ＣＲニエートンらによるり１点変異
はヘテロ接合体では簡単に可視化できる、なぜなら２つ
の異なる塩基に対応する共−移動（ｃｏｍｉｇｒａｔｉ
ｎｇ）するバンドが“グイデオキシ”シーケンシングゲ
ルの２つのレーンに現われるからである。
以前は、このタイプの、ＰＣＲに基づいた配列分析のた
めの前条件（ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ）は、関心のあ
る領域の配列が、それ自体知られている方法によってあ
らかじめ決定される、ということであった。
これはＰＣＲプライマーが、関心のある領域の増幅とそ
れに続く、くり返しのシーケンシング用にデザインされ
ることを許す、当発明は、そのような分析が標的核酸断
片、その配列はすでに全部確立されている訳ではない、
を用いて着手されることを許す、当発明の手法を用いて
例えば個人からのヒト染色体ＤＮＡについて行われるシ
ーケンシングは、２倍体染色体（それぞれ）の間の多様
な相異の最大限の（Ｆｕｌ１）程度をあばく、もしその
個人が、与えられた遺伝的位置の未知の変異に対して真
性ヘテロ接合体であることが知れているなら、当発明の
手法による両方のアリルのシーケンシングＣなるべくな
ら同時的シーケンシングＤはそれ故観察される表現型の
原因かもしれない存在するすべての多様性（ｐｏｌｙ　
＋ｍｏｒｐｈｉｃ）塩基を避けることなくさらす０個の
多様性塩基変化の重要性は、同じ標的核酸配列を、知ら
れているホモ接合の正常体と変異体で　ａ他の真性ヘテ
ロ接合体と同様にＤ続いて研究することによって確めら
れるか又は反駁されるかするだろう、当発明は現在的な
ＲＦＬＰ（（制限断片長さ多様性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ
ｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ＩｅｎｇＬｈｐｏｌｙｓｏｒ
ｐｈｉｓ＋１）　Ｄ、（それは）染色体間の変化（ｖａ
ｒｉａｔｉｏｎ）の研究への基礎的アプローチ（である
が）、をこえるかなりの発展を現わしていることがさら
に確認される。その（ＲＦＬＰ）場合、制限エンドヌク
レアーゼ認識部位をひんばんに作るか壊すかする塩基変
化のみ検出される。　ＰＰＬＰでは結果とならない点変
異の、容易な分析技術がある（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
　Ｒｏｓ、、　１７　Ｎｏ７ペー　ジ２５０３−２５１
６（１９８９）ＣＲ二エニートンによる）。
当発明のさらに進んだ特色には多層発生的（ｐｏｌｙｇ
ｅｎｅｔｉｃ）又は多回性（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉ
ａ１）疾患の分析における有用性がある。このように、
例えば、ある遺伝的部位での特定の多様性変化が、アテ
ローム性動脈硬化症（ａＬｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ
）、高血圧（ｏｒ緊張冗進症ｈ　ｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏ
ｎ）、糖尿病、精神分裂などのような多回性多発生的（
ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌｐｏ　ｌ　ｙｇｅｎｅ　
ｔ　ｉｃ）疾患を発達させる素因を示すのかどうかを確
立するのは有利（＝好ましい結果）である。以前ＲＦＬ
Ｐ技術を使ってのこの問題へのアプローチの試みは一般
に不成功であることが証明された。このような研究は個
々の候補者の遺伝子プローブによる多数の労働−集中型
（ｌａｂｏｕｒ−１ｎＬｅｕｓｉｖｅ）サザンプロット
で展示される特定の多様性の試験に依存しており、（上
記の結果は）多分驚くべきことではない、このようにヒ
トゲノムにおける全体の多様性の範囲は、実際に疾患素
因に対する結びつき（ｌｉｎｋａｇｅ）を分析したとこ
ろ、事実消えてしまうほど小さいα　゛ヒト多層的疾患
への分子的アプローチ”を見よ、Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄ
ａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｐｏｓｉｕｍ１３０、ジ、７ウイリ
ー、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ　１９８７　Ｄｏ　当発明を
用いて、ある疾病、疾病素因、又は他の表現型を持つ、
多数の個人からの標的核酸を混ぜることが可能になった
。ベクトレットライブラリーは、後に定義するように、
そのようなプールされた標的核酸、例えばプールされた
ヒトゲノムＤＮＡ、から作製されてもよい、当発明はこ
のプールされたゲノムＤＮＡが発展したやり方でシーケ
ンスされるのを許す。一般の多様性は、単一のヘテロ接
合体を観察する（という）同じようなやり方で明らかに
なる。もう−度、組みかえＤＮＡのクローニングのいか
なる必要性もないということは、プールされた遺伝的材
料に存在するすべてのアリルが同時的に分析されるだろ
うことを意味している。プールに存在する個々のサンプ
ル数に制限はない。
当発明の手法を用いることはそれだけで遺伝型のコンセ
ンサスと多様性をあばく、ある疾病、疾病素因、あるい
は他の表現型を示さない個体からのプールされたゲノム
ＤＮＡの分析で得られた結果を、得られた似たような結
果と比較することは、その疾病又は表現型Ｃ又は逆説明
にその疾病又は表現型の欠落りにともなう多様性（ｐｏ
ｌｙｓ＊ｒｐｈｉｓｓ）が確認されるのを許す。分析は
、候補の遺伝子に近い、ヒトゲノムの小さな領域に限定
されない。この発明の手法を使ったこのタイプの分析は
、所定の開始プライマーを用いて得られる増幅産物と、
個人のプールされた集団の“正常°゛又はパ影響されて
いる“のいずれかからの標的核酸で作られた特定のへク
トレントライブラリーを結合することによってより容易
になるだろう、もし集団の間で、全く著しい多様性の違
いがあれば、増幅産物を混和し、変性させて再−アニー
リング（を行うこと）は、非相補的塩基対を持った２本
鎖増幅産物を生成している（ことになる）。そのような
非相補性は　αＲＧＨＲツトン（Ｃｏｔｔｏｎ）、ＮＲ
ロドリーグス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ）　、ＲＤキャンベ
ル（Ｃａｗｐｂｅｌ１）、ＰＮＡＳ。
４３９７−４４０１１９８８Ｄで説明されるように、０
！ＩＯ，又はハイドロオキシアミンのような試薬を用い
て明らかにできるであろう。この特許説明書を読む人を
助けるためここで用いられたいくつかの用語の語い集を
下に設定する。
用語“標的核酸“は核酸配列にあてはまり、般には染色
体ＤＮＡだが、例えばヒ）　ＤＮＡや細菌０１１へのよ
うな植物や動物の染色体ＤＮＡである。この発明の技法
において使用される、このような“標的核酸°”は普通
既知の部分α一般に小さな部分りと、−Ｓにずっと大き
な未知の配列部分を含む。
用語“標的核酸断片（ｔａｒｇｅｔ　ｎｕｃｌｅｉｃａ
ｃｉｄｆｒａｇｍｅｎｔ）”は、ここでは標的核酸を切
断（後に定義する）して得られた標的核酸の断片を意味
して使われている。用語′″標的核酸断片”は、それゆ
え制限エンドヌクレアーゼを使って得られたような断片
に限られない。さらに、そのような断片（−標的核酸断
片）は例えば既知配列部分と一般により大きい未知配列
部分を含むか、またはその断片は未知配列（だけ）から
なるかもしれない。
断片が未知の配列からなる場合は、切断と標的核酸断片
／ベクトレット単位の生成は後に述べられているように
行われるだろう。そのような情況においては不特定（ｒ
ａｎｄｏｍ）な［ｌＮＡプローブが、“不特定゛開始プ
ライマーでの線状増幅か、ベクトレットプライマーに足
して不特定開始プライマーを用いた増幅によってずっと
大きな染色体断片から生成されるだろう、特別な増幅は
アト・ランダムな断片たちを生成し、それはＣｅ１ｌ　
５１．３１９−３３７（（１９８７ＤのＨドニスーケラ
−（ＨＤｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒ）らのように、精製し
、染色体地図作製に使うことができる。
用語“増幅（ａｓｐｌ　Ｈｉｃａｔｉｏｎ）″はここで
は非生物学的手段によってヌクレオタイド配列と／かそ
の相補配列を複数することをさすのに用いていて、それ
ゆえ標的核酸断片／ベクトレット単位の開始プライミン
グ領域にハイブリダイズするような開始プライマーのみ
を使っての増幅も含み、プライマー伸長は、ハイブリダ
イズする条件下で、適当なヌクオシサイド３リン酸とヌ
クレアーゼ３１Ｊン酸のポリメライゼーションのための
動力因（ａｇｅｎ　Ｌ）の存在において有効となる、こ
のようなプライマー伸長は続いての変性（ｄｅｖａｔｕ
ｒａｔｉｏｎ）があって、このプライミング（＝プライ
マーがハイブリダイズする過程）、プライマー伸長、そ
して変性の過程は増幅の望ましいレベルに達するまで何
回も適当な回数くり返される。用語“増幅”はまたポリ
メラーゼチェーン反応σＰＣＲＤ技法による複数も含み
、例えば５ｃｉｅｎｃｅ　２３９，４８７−４９１α１
９８７ＤにＲ１Ｋ９サイキ（Ｓａｉｋｉ）らによって、
またＵ、Ｓ、特許Ｎｏ５４．６８３．１９５と４，６８
３，２０２で述べられているように、開始プライマーと
、後に定義されるベクトレットプライマー、それとこれ
らの参考文献で述べられているような技法を言及するの
にここで使われているポリマレースチェーン反応技法ま
たはＰＣＲ技法の表現（ｅｘｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）を使
っている。
用ｇ！“非生物学的（ｎｏｎ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａ１）
″は、ここでは単に直接のクローニングと細菌コロニー
の増殖を除外するのに使われている。それゆえ増殖の用
語はここではＰＣＴ特許出版同８７１（１６２７０　（
また（ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　’ａ、　１
９８８年１０月）　、ＰＣＴ特許出版同８Ｂ／１０３１
５あるいはＰＣＴ特許出版−０８９１０１０５０で述べ
られているような増幅過程を含むために使われいること
が理解される。
用語“切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）　”はここでは核
酸の特定な部位での切断を言うのに用いられている。
このような切断は、！２諏配列と切断パターンそしてそ
れ故特定な部分でのＤＮＡ切断の特徴が知られているよ
うな制限エンドヌクレアーゼ、なるべくなら６ｂｐ切り
、を用いてうまく遂げられる。
この間点では与えられた標的核酸内のこれらの“特定な
部位（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｊｔｅｓ）”は、標的核酸
内の他の既知要素の位置に比べ、たいていはわからない
のだが、この特定部位の配列はそれらの切断パターンと
同様にわかる。かくして、得られる制限断片の両端配列
がわかる。従って例えば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ｐｌばこの配列を認識するニーそして示されているよう
にこのような配列を、示辷れている結合性末端（ｃｏｈ
ｅｓ　ｉ　ｖｅｅｎｄｓ）を持つ制限断片を金主ずるよ
うに切断する。結合性末端の配列はわかっているので、
後にのべられているような“標的核酸断片／ベクトレン
ト単位”の発現（ｅｘｐｒｅＳｓ　ｔｏｎ）に関連して
、この知識（＝＋＝切断末端がわかるということ）に基
づいて標的核酸断片／ベクトレット単位を産生ずること
が可能である。
制限エンドヌクレアーゼ以外で標的核酸を特定の力所で
切断する手段を用いることはできるが、制限エンドヌク
レアーゼの使用が好ましい、どのような便利な制限エン
ドヌクレアーゼも用いてよい。
個々の制限エンドヌクレアーゼの例は、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｉｒｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、配列増補、１６巻、１９
８８年ベージｒ２７１−ｒ３１３と“分子生物学におけ
る現在的プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｎｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）
”＋９８７−１９８８年オースベル（＾ｕｓｕｂｅ１）
Ｐ、Ｍ、　＋ブレンド（Ｂｒｅｎ　ｔ）　Ｒ，＋キング
ストン（にｉｎｇｓｔｏｎ）Ｒ，Ｅ、＋　モーア（？ｔ
ｏｏｒ）０．０．、スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｊ、Ａ、、セ
イドマン（Ｓｅｉｄｍａｎ）Ｊ、Ｇ、、ストルール（Ｓ
Ｌｒｕｈ１）Ｋ、Ｗ集、ＷｉｄｅｌｙＩｎｔｅｒｓｃｉ
ｅｎｃｅセクション３、表３．１−１に詳しくのせられ
ているものを含む、　ＥｃｏＲＩ　、旧ｎｄｌ［ｌ、Ｘ
ｂａ　１のような結合性末端を持つ断片を産生できる制
限エンドヌクレアーゼはその結合性末端が５′又は３′
余剰ぶらさがり（オーバーハング　ｏｖｅｒｈａｎｇ）
のどちらを持つかを考慮する必要がなく便利である。３
′か５′オ一バーハング結合末端のいずれかを持つ断片
を産生できる制限エンドヌクレアーゼを用いるのと同様
に、標的核酸断片／ベクトレット単位の産生はまた、断
端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）断片を産生ずる制限ヌクレア
ーゼと後で定義する適当な断端ベクトレットとの組みあ
わせて可能であるということも認識される。標準制限ヌ
クレアーゼ消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）以外で標的核酸
を特定力所で切断する手段は技術面で（ｉｎ　ｔｈｅ　
ａｒｔ）で知られており、例えばアダプター−プライマ
ーとクラス−■Ｓ制限酵素の使用αＳ、Ｃ，キム（ｋｉ
ｌ１）ら、５ｃｉｅｎｃｅ２４１．５０４−５（１６（
１９８８）　；　Ｗズイバルスキ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ
）、Ｇｅｎｅ　　４０１６９（１９８５）；＾Ｊボタヤ
ジス力（Ｐｏｄ−ｈａｊｓｋａ）と圓、ズイバルスキ、
Ｇｅｎｅ、４０．１７５（１９８５）　Ｄを様々な化学
的アプローチαＢ、Ｌ、アイバーソン（Ｉｖｅｒｓｏｎ
）とＰＢダーバン（Ｄｅｒｖａｎ）、Ｊ、　ａｓｅｒ、
Ｃｈｅ＋ｓ、Ｓｏｃ、＋１（１９）＋１２４１−１２４
３（１９８７）　；ＧＢドレイヤ−（Ｄｒｅｙｅｒ）と
Ｐ８ダーバン（Ｄｅｒｖａｎ）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　［ＩＳＡ＋８２．９６Ｂ（１９８５
）　；ＶＶバラツブ（Ｖｌａｓｓｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　ａｎｉｄＲｅｓ、、１４．４（１６５（１９８６
）；）１２モーサー（Ｍｏｓｅｔ）とＰ。
Ｂ、ダーバン、５ｃｉｅｎｃｅ、２３Ｂ　、６４５　（
１９８７）；　ＯＲコレ（Ｃｏｒｅｙ）とｐｃシュルツ
（Ｓｃｈｕｌｔｚ）、５ｃｉｅｎｉｅ　２３８．１４０
１　（１９８７）　；ＪＰスルカ（Ｓｌｕｋａ）ら、５
ｃｉｅｎｃｅ、　２３８．１９Ｂ？）Ｄと同様に含む。
その上、標的核酸断片を断端化（ｂｌｕｎＬ−ｅｎｄｅ
ｄ）することは可能であり、ＤＮＡポリメラーゼによる
、５′オ一バーハング結合性末端の埋め入れ／修復か、
３′と／か５′のオーバーハングを８１ヌクレアーゼに
よる一本鎖分解を使ってとり除くかいずれかで行われ、
それら（オーバーハング）が制限酵素分解によってかま
たは他のＣ即ち化学的り手段によって作られたかに無関
係である。それらすべての断端断片は、適当な断端ベク
トレットに付着することによって再び標的核酸断片／ペ
クトレフト単位に変えられるだろう。
ここで用いられている“開始プライミング領域（ｉｎｉ
Ｈａｔｉｎｇ　ｐｒｉｓｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）″とい
う表現は、切断された例えば制限酵素消化で、標的核酸
断片の一部分を意味し、それは既知のヌクレオタイド配
列で、開始プライマーともし望むならネステツド開始プ
ライマーａ後で定義されるＤ、例えば重複するネステン
ド開始プライマーが使用の際そこの部分にハイブリダイ
ズするだろう。一般に当発明の方法は、存在する標的核
酸断片のたった１つが開始プライミング領域を持つよう
な時を効となる０例外は、後で定義されるような複数の
異なるベクトレットライブラリーの混合使用であるかも
しれない。
ここで使われている“ベクトレットプライミング領域（
νｅｃｔｏｒｅｔｌｅ　ｐｒｉｍｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ
）″という表現は標的核酸断片／ベクトレント単位の一
部分を意味し、それはベクトレット自身によって定義さ
れるように既知のヌクレオタイド配列で、ヘクトレット
プライマーと、もし望むならネステッドヘクトレフトプ
ライマーＣ後で定義されるＤ、例えば重複すうネステッ
ド開始プライマーが使用の際そこにハイブリダイズする
だろう。ベクトレットプライミング領域は開始プライミ
ング領域を含むストランドに相補するストランドに存在
する。この観点において、ベクトレットプライマーとも
し望むならネステソドベクトレソトプライマーが使用の
際そこヘハイブリダイズするような“ベクトレットプラ
イミング領域“は、接着（Ｉ　ｉｇａｔｆｏｎ）によっ
てできた標的核酸断片／ベクトレット単位か、または開
始プライマーのプライマー伸長によってできた標的核酸
断片／ペクトレッド単位かのいずれかに、あるいは両者
に、存在しているだろう。
このように当発明の手法において使われるヘクトレット
プライマーともし望むならネステッドベクトレソトプラ
イマーは、ベクトレットプライミング領域にハイブリダ
イズすることをとおして選ばれるだろうということ、ま
たそれ（−ベクトレットプライミング領域）は、例えば
開始プライマーともし望むならネステンド開始プライマ
ーの、プライマー伸長まで作られることがないだろうと
いうことが認識される。これの帰結するところは、例え
ばベクトレット自体完全に自己相補の２重鎮ＤＮＡ断片
である必要はない、ということである。
ここで使われている用語“プライマー°゛はオリゴヌク
レオタイドをさし、精製された制限分解物（ｒｅｓｔｒ
ｉｃｔｉｏｎ　ｄｉｇｅｓｔ）内のように自然にできた
か又は合成的に産生されたかのいずれかで、核酸ストラ
ンドに相補する、プライマー伸長産物の合成が引きおこ
されるような条件下、即ち適切なヌクレオサイド３リン
酸と適切な緩衝液中ａ″緩衝液“はｐＨ、イオン強度、
補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を含むＤのＤＮＡポリマラ
ーゼのようなポリメライゼーションのためのエージェン
トの存在、そして適当な温度、におかれた時に合成の開
始地点としてふるまうことができるだろう。
プライマーは、伸長の最大効率のためなるべく一本鎖で
あるが、かわりに二本鎖であるかもしれない、もし二本
鎖ならば、プライマーは伸長産物をつくるのに使われる
前にまずストライドを分離する処理がされる。なるべく
プライマーはオリゴデオキシライボヌータレオタイド（
ｏｌ　ｉｇｏｄｅｏχｙｒｉｂ。
ｎｕｃ！ｅｏｔｉｄｅ）である、プライマーは、ポリメ
ライゼーションの試薬の存在下で伸長産物の合成を導火
する（ρｒ！ｍｅ）のに充分長くなければならない。
プライマーの正確な長さは温度、プライマーの出所（ｓ
ｏｕｒｓｅ）、そして使用方法を含む多くの要素に依有
する０例えば標的配列の複雑さ次第で、開始（プライマ
ー）とベクトレットプライマーは典型で１．５−３５ヌ
クレオタイド、多少の増減はあるにせよ、を含む、短い
プライマー分子は一般に鋳型と充分安定なハイブリッド
複合体を作るのにより低い温度を要求する。
用語“開始プライマー（ｉｎｉｔｉａｔｔｎｇ　ｐｒｉ
ｍｅｒ）　’はここでは、すでに定義されたような開始
プライミング領域とハイブリダイズする能力のあるプラ
イマーを言うために用いられている。例えばヒト染色体
ＯＮ＾全体から作られたベクトレント単位の使用におい
て“″開始プライマー伸長は、ヒト染色体に存在する、
たまたま開始プライミング領域と一敗するような配列へ
の不特定なハイブリダイズとプライミングを避けるため
１５４７ヌオクレタイド以上の長さが望しいたろう。
用語“ベクトレットプライマー”はここでは、標的核酸
断片／ベクトレット単位のベクトμ・ントプライミング
領域にハイブリダイズする能力のあるプライマーを言う
のに用いられている。“ベクトレットプライマー”は、
開始プライマー伸長産物に、その相補側と分離の後、ハ
イブリダイズできるようなヌクレオタイド配列を持ち、
そこでは開始プライマー伸長産物はベクトレットプライ
マーの伸長産物合成の鋳型として働いていて、それによ
って増幅を促進する。一般に当発明の方法はたった１つ
の標的核酸断片／ペクトレッド単位が開始プライミング
領域を持つ時に有効であり、その単位だけが増幅にかけ
られる。開始プライミング領域を持たないそれら標的核
酸断片／ベクトレット単位はＰＣＲ増幅ができない、な
ぜならベクトレットプライマー伸長産物生成は可能であ
る一方、開始プライミング領域がないので開始プライマ
ーはベクトレットプライマー伸長産物にハイブリダイズ
できず、かくしてＰＣＲ増幅は不可能となる。
使用の際にはベクトレットプライマー増幅産物の合成が
開始プライマー伸長産物の最初の合成に依有することが
望ましい。これは多数の非増幅性ベクトレットプライマ
ー伸長産物が生成され、反応混合液中の使えるヌクレオ
サイド３リン酸や他の補因子が、有害なくらい涸渇する
かもしれないのを避ける。
ここで用いられる用語“ネステイドブライマ−（ｎｅｓ
ｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）”は開始プライマーの５′末端
から３′方向に、またはベクトレットプライマーの５′
末端から３′方向に、あるいはそのような開始プライマ
ーとベクトレットプライマー両者の５′末端から３′方
向へ、１つかそれ以上の塩基対がおき変えられたプライ
マーを意味する。ネスティドプライマーやプライマーの
配列は既知の開始又はベクトレットプライミング領域に
相補的な配列から、あるいはそのような領域両者から必
ず選ばれなくてはならないいことが認識される。
用語“標的核酸断片／ベクトレット単位”　（またはこ
こでは“ペクトレフト単位”とも呼ばれている）はここ
ではヌクレオタイド配列を言うのに用いられていて、例
えばＤＮＡ配列で、標的核酸断片と、例えばＤＮＡ配列
で一本鎖の時に前で定義されたようなヘクトレットプラ
イマーにハイブリダイズできるような既知のヌクレオタ
イド配列の一部を含む。これについて、配列かへクトレ
ットプライマーの配列にしっかり相補する、既知のヌク
レオタイド配列の一部分が前述の単位に存在する効力に
よって、または開始プライマー伸長産物の、前述の単位
の一本鎖にもとづいた鋳型としてベクトレットプライマ
ーの配列にしっかり相補するヌクレオタイド配列を含む
能力の効果によって゛′標的核酸断片／ベクトレット単
位はベクトレットプライマーにハイブリダイズできるこ
とがｉｌｍされる。これについては“標的核酸断片／ヘ
クトレット単位”は−本のストランドではそれは少なく
ともベクトレットプライマーの部分では確実に同し配列
を持つものであることが認識される。
既知のヌクレオタイド配列の部分は、例えばＤＮＡ配列
、もし上記の要求、（つまり）−末鎖でベクトレットプ
ライマーとハイブリダイズする能力を満たすとすればい
かなる都合の良い出所（ｓｏｕｒｃｅ）から導いてもよ
い。このように例えばベクトレットはＤＮＡ合成機を使
って、標的核酸断片／ヘクトレット単位を得るために標
的核酸断片に接着（ｌｉｇａｔｅ）　して得られたペク
トレッドとは別に作られるかもしれない、このことにつ
いてはベクトレットは核酸断片への接着に都合よく適応
させられ、例えば標的核酸断片の結合性末端はベクトレ
ットの結合性末端とハイブリダイズして前で定義された
ようなペクトレッド単位を作り、また断端末端の標的核
酸断片は断端末端のベクトレットに接着して前で定義さ
れたようなベクトレット単位を作る。しかしながらベク
トレットが標的核酸断片との接着に先だって事前−生成
されることは、望ましくはあるのだが、必要ない、この
ように例えば先に述べられている単位は適切な場合、−
末鎖ＤＮＡの標的核酸断片への接着によって、（そして
）例えば結合性末端のオーバーハングを利用して最初の
一末鎖ＤＮ＾をそこへ固定しそれから２番目の一本鎖を
接着させて望む単位を作る。
当発明の１つの具体化において標的核酸断片／ベクトレ
ット単位は閉鎖ベクトレット部分を含む。
ここで用いられる用語′″閉鎖ベクトレット°゛とは標
的核酸断片／ベクトレット部分のへクトレットまたはベ
クトレット部分を言っていて、片方かまたは両方の自由
な末端塩基がヌクレオタイドがそこへ接着するのを防ぐ
ように、あるいは例えばハイブリダイズする条件のもと
ての適切なヌクレオサイド３リン酸とヌクレオサイド３
リン酸をポリメライゼーションする動力囚の存在下でプ
ライマー伸長を防ぐように変形した形をとっている。そ
のような変形はそれ自体知られており、例えばダイデオ
キシヌクレオサイド（ｄｉｄｅｏｘｙｈｕｃｌｅｏｓｉ
ｄｅ）の存在から（によって）構成されるだろう。この
ように例えば２本鎖閉鎖ベクトレットはダイデオキシア
デノシン（Ｋ　ｄｄＡＤのように３′末端ダイデオキシ
ヌクレオサイドを持つだろう。このような変形はまたラ
イボース（ｒｉｂｏｓｅ）のダイオール（ｄｉａ１）が
切断されたような、例えばペリオデイト（ｐｅｒｉ。
ｄａ　ｔｅ＞、ライポヌクレオサイド（ｒｉｂｏｎｕｃ
ｌｅｏｓｉｄｅ）を含むだろう。もう１つのやり方とし
ては例えば３′−デオキシアデノシン残基（のような）
３′−デオキシヌクレオサイドが、例えばコーダイセビ
ン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）　３リン酸とターミナルト
ランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｔｒａｎｓｆｅ
ｒａｓｅ）を用いてつけ加えられてもよい、更に他の方
法としては３′アミノ（ａｍｉｎｏ）又は３′−サイオ
（ｔｈ　ｉｏ）　ＩＩＪ能性が、すでにそれ自体知られ
ている方法で３′末端に化学的に導入されてもよい。
当発明の更なる具体化おいて、ペクトレッドあるいはペ
クトレッド部分は部分的にハイブリダイズされた２つの
１本鎖を含み、それらはベクトレットプライマー伸長が
そのようなベクトレットを使うことで影響されないよう
に非相補性の度合（ｄｅｇｒｅｃ）を持っている。
用語“ヌクレオサイド３リン酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）″はここではＤＮＡかｌ１
ＮＡいずれかに存在する、ヌクレオサイドの３リン酸を
言及するのに用いられ、それ故塩基としてアデニン（ａ
ｄｅｎ　１ｎｅ）、サイトシン（ｃｙＬｏｓｉｎｅ）、
グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、サイミン（ｔｈｙ＠１ｎ
ｅ）ウラシル（ｕｒａｃｉ１）と、デオキシライボース
（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）又はライボース（ｒｉｂ。
ｓｅ）の糖部を含む。一般にデオキシライポヌクレオサ
イドはＤＮＡポリメラーゼと結びついて用いられる。し
かしながら他の変形された塩基で、普通の塩基である、
アデニン、サイトシン、グアニン、サイミン、ウラシル
のうちの１つと塩基対を作れるようなものも用いられる
ことができるということが認識される。そのような変形
された塩基は例えば７−ジアザグアニン（ｄｅａｚａｇ
ｕａｎｉｎｅ）やハイポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔ
ｈｉｎｅ）を含む。
ここで用いられている用語“ヌクレオタイド（ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ）　’は［ｌＮへかＩＩＮ＾いずれにか存
在するヌクレオタイドを言っていて、それ故塩基として
アデニン、サイトシン、グアニン、サイミン、ウラシル
、デオキシライポース又はライポースの糖部を含む、し
かしながら他の変形された塩基で、梓通の塩基であるア
デニン、サイトシン、グアニン、サイミン、ウラシルと
塩基対を作れるものも、当発明で用いられている開始プ
ライマーとへクトレットプライマー内に使えることが認
識される。そのような変形塩基には例えば７−ジアザグ
アニン（ｄｅａｚａｇｎｅｎｉｎｅ）やハイポキサンチ
ン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）を含む。
ヌクレオサイド３リン酸のポリメライゼーションのため
の動力囚（エージェント）は、プライマー伸長産物の合
成を遂行する機能を持つ（なら）いかなる化合物、又は
系、酵素を含む、でもよい。
この目的に適した酵素は、例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＣリチャードソン（Ｒｉｃｈ
ａｒｄｓｏｎ）Ｃ，Ｃ，ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
２３９，２２２（１１９６４Ｄ　、大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼｌのフレノウ断片（にｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇ−ｍ
ｅｎ　Ｌ）　（Ｉジャコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）　
Ｈ、ら、Ｅｕｒ、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、４５．６２３−６２７ｆｆ　１９７４
Ｄ　Ｄ　、　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼαバネット（Ｐ
ａｎｅｔ）＾、ら、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ　１２
＋５０４５−５０５０　（１１９７３Ｄ　Ｄ　、　Ｔ７
　ＤＮＡ；Ｈ’Ｊ　）ラーセαタバー（Ｔａｂｏｒ）Ｓ
、とリチャードソンＣ，Ｃ，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４４７６７−４７７１α
１９８７Ｄ　Ｄその他年に入るＤＮＡポリメラーゼ、リ
バーストランスフリブテース（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、そして熱安定な酵素を含むそ
の他の酵素、（など）を含む。
ここで使われている用語“熱安定な酵素°゛は、比較的
熱に対して安定か又は熱耐性の酵素で、適当な方法にお
いてヌクレオタイドを結び合わせるのを触媒しＣ促進し
Ｄそれぞれの核酸ストランドに相補的なプライマー伸長
産物を作るものを言う。
一般に合成は各プライマーの３′末端で開始され鋳型ス
トランドに沿って５′方向へ進行し１合成が止まるまで
に普通は異なる長さの分子が産生される。当発明の情況
において合成はたいてい標的核酸切断部位によって決め
られた位置で終了し結果的に同じ長さの分子になる。し
かしながら、熱安定な酵素を含む酵素（頻）で、上で述
べたのと同様な過程を使って５′末端で合成を開始しも
う一方の方向へ進行するものがある。当発明の過程に用
いられる、好ましい熱安定な酵素は、サーマス・アクア
ティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から
抽出、精製され、（それは）分子間約８６（１０）０−
９（１０）（１０）ダルトンで、コーロッパ特許出版（
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＰａｔｅｎｔＰｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎ）　Ｎｏ、２３７．３６２　（１ヨ一ロツパ特許出版
Ｎｏ、　２５８．０１７も見よりに述べられている。サ
ーマス・アクアティカス株ＹＴＩはアメリカ・型培養収
集（ａｓｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１　Ｐａｒ−ｋｌａｗｎ
　Ｄｒｉｖｅ　、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、　Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ、　ＵＳＡがら＾ＴＣＣ２５，１０４として制
約なしで手に入れる。
すぐれた、あるいはより有利な性質を持つＤＮＡポリメ
ラーゼが、このタンパク質を発現するクローンの不特定
な変異によって得られるだろうことは明白である。−例
として、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼをコードする二本
鎖ＤＮＡの変異型（ｍｕｔａｔｅｄνｅｒｓｉｏｎ）を
得ることは明らかに好ましく、５′エキソヌクレアーゼ
活性の欠除、のようなすぐれた性質のタンパク質の発現
を結果するかもしれない。このような望ましい変異型を
獲得する技法はよく知られており、また平均的分子生物
学者の技術内にある。
用語“〜に相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｔｏ
）″はここではヌクレオタイドに関連して使われており
、ＤＮＡやＲＮ＾にとりこまれる時、もう一方の特異的
ヌクレオタイドと塩基対をつくるヌクレオタイドを意味
する。このようにデオキシアデノシン３リン酸はサイミ
ジン３リン酸に相補的であり、デオキシグアノシン３リ
ン酸はデオキシサイチジン３リン酸と相補的であり、一
方デオキシグアノシン３リン酸はサイミジン３リン酸に
相補的ではない、これに関連して、サイミジン３リン酸
とデオキシグアノシン３リン酸はある情況下で塩基対に
なるかもしれないが、この特定化の趣旨によるとそれら
は相補的であると見なされないということが認識される
。
ここのプライマーは、伸長されるか増幅される、各々特
定の配列の異なるストランドに“しっかりと゛°相補的
なものかどうかで選ばれる。このことはプライマーは、
それらの呼応するストランドにハイブリダイズする程充
分に相補的でなければならない、ということを意味する
。それであるから、プライマー配列は、それらの鋳型の
正確な配列を反映する、それが一般に好ましいのだが、
必要はない。
用語“ベクトレット　ライブラリー”はここでは標的核
酸断片／ベクトレット単位の複数性を言及するのに使っ
ており、標的核酸を、与えられた制限エンドヌクレアー
ゼについて標的核酸が含むすべての潜在切断部位で切断
して、標的核酸断片／ベクトレット単位を、標的核酸断
片の全混和がら、適切に適応させられたベクトレット部
分への接着のくりかえしくｃｙｃｌｅｓ）（Ｉそしても
し必要ならば、切断のくり返しくｒｅｐｅａｔ）　Ｄに
よって作った後で獲得される１通常与えられたベクトレ
ットライブラリーの中の１つのベクトレット単位だけが
関心（対象）の開始プラミング領域を含む。特定の６ｂ
ｐ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼ（ｒ６ｂρ切
断者（ｃｕｔｔｅｒ）　Ｄで切断されたヒト染色体ＤＮ
Ａの場合、結果的にできる標的核酸断片の平均サイズは
、１（１９）６ｂρで、標的核酸はそのような断片を約
１（１６生ずる。
つまり約１０’の標的核酸断片／ペタトレッド単位を含
むベクトレットライブラリーが６ｂｐ切断制限エンドヌ
クレアーゼによって切断されたヒト染色体ＤＮＡから得
られ、その全ヒトベクトレットライブラリーでそのよう
なベクトレット単位１つだけが開始プライマー、もし望
むならベクトレットプライマー、ハイブリダイズする条
件下での適当なヌクレオサイド３リン酸とヌクレオサイ
ド３リン酸のポリメライゼーションこのための動力図（
ａｇｅｎｔ）の存在中増幅を開始できる所定の開始プラ
イミング領域を含む。
異なるベクトレットライブラリーが同じ標的核酸から、
異なる制限エンドヌクレアーゼによる切断と適切に適応
させられたベクトレット部分の接着によって作られた標
的核酸断片／ベクトレット単位を生ずるだろう、もし望
むなら手に入る制限エンドヌクレアーゼ全部がこの過程
で使用されることができ、その限界内でベクトレット部
分は、標的核酸におけるすべての制限酵素認識部位で、
標的核酸に接着されることができる。この特徴は、理想
的にどんな与えられたヘクトレントライブラリーでも関
心（対象）の開始プライミング領域が１（１０）ｂｐか
それ以上ペクトレッド部分の付着点から離れている、と
いう程には必ずしも望ましいものではない、それはなぜ
なら、これ（１（１０）ｂｐ）より小さい開始プライマ
ー伸長産物あるいは開始プライマー／ベクトレットプラ
イマー増幅産物はこの発明の実践において、はとんど配
列情報を生み出さず、長いヌクレオタイド配列の効率良
いシーケンスにはほとんど価値がないようなものである
からだ、さらにそのような小さい産物のヌクレオタイド
配列はベクトレットライブラリーを使って得た産物内に
含まれてその中で開始プライマーはベクトレット部分付
着点より遠くにいる。複数の異なるベクトレットライブ
ラリーをある特定の開始プライマーと使うことは、伸長
又は増幅産物がシーケンス用に便利な長さであるような
ライブラリーの同定（ｉｄｅｎＬｉｆｉｃａＬｉｏｎ）
を許す０例えば特定のライブラリーから所定の開始プラ
イマーを用いて得られた約２（１０）ｂｐ、　４（１０
）ｂρ、　６（１０）ｂｐ、　８（１０）ｂρ、　ｔｏ
ｏｏｂｐなどの開始プライミング伸長（産物）あるいは
増幅産物を選ぶのは特に便利であるだろう。所定の開始
プライマーの対してそれらがたまたまおこったベクトレ
ットライブラリーからの、そのような（注；上記の長さ
のような）産物を、ペクトレッド又はネステッドベクト
レッドシーケンスプライマーと本来それ自体知られてい
る方法を用いてのシーケンスは、開始プライマーの３′
側の大きな領域に対する重複するシーケンスデークを生
ずるようなものである。複数のベクトレットライブラリ
ーの所定の開始プライマーを用いての分析ひとめぐり（
１ラウンドｏｎｅ　ｒｏａｎｄ）で生ずる配列データの
量は、単に実践において得られる開始プライマー伸長（
産物）や増幅産物のサイズによって、そして／あるいは
ａ開始プライマー領域からＤ複数のベクトレットライブ
ラリーにおいて表わされている、最も遠い制限エンドヌ
クレアーゼ部位までの距離によって限定されている。
当発明の方法の有利な具体化において、標的核酸断片／
ペクトレッド単位は接着によって標的核酸断片から作ら
れ、（その時）ベクトレットは標的核酸を標的核酸断片
をつ（るため切断するのに使われたのと同じ動力因によ
って、生成された標的核酸／ベクトレット単位から切り
出されないようなやり方で（行われる）、標的核酸が制
限エンドヌクレアーゼで切断されベクトレットへの接着
用の標的核酸断片を生じ、ベクトレットの配列が、言わ
れた制限エンドヌクレアーゼの制限エンドヌクレアーゼ
認識部位がその標的核酸断片／ベクトレット単位に欠け −ＧＡＡＴＴＣ−Ｇ　＋ＡＡＴＴＸ　−ＣＴＴＡＡＧ−
＋　　−ＣＴＴＡＡ　　Ｖ　−−Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ
標的核酸断片 ているように選ばれ、例えば上で説明されているＥｃｏ
Ｒｌの場合ＸはＣ以外のどんなヌクレオサイドで（もよ
＜）Ｙはその相補的ヌクレオサイドであること（注；上
記のすべてを指す）は特に好ましい。
当発明は、プライマー伸長産物や好ましいベクトレット
プライマー増幅産物の合成が、開始プライマー伸長産物
の最初の合成に依有するような時に有効であるだろう。
これは、例えば線状増幅によって、またはなるべく開始
プライマーの伸長産物に唯一ハイブリダイズできるベク
トレットプライマーの使用によって達成されるだろう、
このように、標的核酸断片／ベクトレット単位のベクト
レット部分は有利に最初と２番目のストランドを持つ２
本鎖部分を含み、最初のストライドはポリメライゼーシ
ョン閉鎖部位を持ち、２番目のストランドは、標的核酸
断片で開始プライミング６１域を持つストランドへ接着
されたもので、一本鎖部分を持っていて、（１番目）の
末端ポリメライゼーション閉鎖部分はハイブリダイズす
る条件下で、適当なヌクレオサイ１！３リン酸とヌクレ
オサイド３リン酸のポリメライゼーションのための動力
囚（エージェント）の存在において最初のストランドが
のびて２番目のストランドの一本鎖部分に相補を形成す
るのを防ぐのに効果がある。ベクトレットプライマーは
このように標的核酸断片／ベクトレット単位にハイブリ
ダイズできないが、開始プライマーの伸長産物へのハイ
ブリダイズは可能である。かくしてベクトレットプライ
マー伸長産物は開始プライマーの伸長産物の生成まで得
られず、通常に得られた伸長産物は、２番目のストラン
ドの一本鎖部分の既知のヌクレオタイド配列に相補的な
部分を含む、この都合の良い具体化（ｅｓｂｏｄ　ｉｍ
ｅｎ　ｔ）はあとで図６で説明されている。
ポリメライゼーション閉鎖部位は、プライマーからヌク
レオタイド配列が重合（ポリメライゼーション）して鋳
型ヌクレオタイド配列の相補鎖をヌクレオサイド３リン
酸のポリメライゼーション用動力囚（エージェント）、
例えばＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌［ＩＮＡポリメラー
ゼ■のフレノウ（Ｍｌｅｎｏｗ）断片、Ｔ７　ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのような、の
存在において、形成するのを防ぐのに効果的である。ポ
リメライゼーション閉鎖部分は、この目的用に知られて
いるいかなる便利なグループ、即ち例えばグイデオキシ
ヌクレオサイド又はコープイセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐ
ｉｎ）のような３′−デオキシヌクレオサイド、あるい
は３′−アミノ又は３″−サイオ（ｔｈ　ｉｏ）の作用
性（＝作用原子団、ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）など
適切な変形ヌクレオサイド、でもよい。
当発明の、更に特別好ましい具体化では標的核酸断片／
ペクトレフト単位のベクトレット部分は最初と２番目の
ストランドを持つ２本鎖部分を包合し、ペクトレッド部
分の２番目のストランドは、開始プライミング領域を含
む標的核酸断片の、その（＝開始プライミング領域を持
つ）ストランドに接着され、そして最初のストランドの
ヌクレオタイド配列、２番目ストランド、そしてペクト
レフトプライマーは、同じハイブリダイゼーションの条
件下でベクトレットプライマーが２番目ストランドの相
補鎖にハイブリダイズできて１番目にはできないような
方法で選択される。この具体化においてはポリメライゼ
ーション閉鎖部分の存在は必要がないことが認識される
。この場合、ペクトレッドプライマーの配列は、ベクト
レットの２番目ストランドの、少なくとも一部の配列と
実質的に同じであることが更に認識される。この発明の
、この特に望ましい具体化は後に図６に関連して更に検
討される。
当発明の、更に好ましい具体化は、同じ単一の開始プラ
イマーを用いるための、複数の異なるベクトレットライ
ブラリーの作製を含み、各ベクトレットライブラリーは
標的核酸を異なる切断カ所で切断して作られ、接着によ
って標的核酸断片から標的核酸断片／ペクトレフト単位
を作りそれによって（ここで）言われているベクトレッ
トライブラリーを形成する；各ベクトレットライブラリ
ーを別々にあるいは一緒に、のいずれかでハイブリダイ
ズする条件下、適当なヌクレオサイド３リン酸とヌクレ
オサイド３リン酸のポリメライゼーション用、のエージ
ェントで処理し、それによって同じ単一の開始プライマ
ーの使用に基づいた複数の開始プライマー伸長産物を得
る。そのような伸長産物のサイズは、開始プライマーか
ら、特定の切断手段、例えば特定のライブラリーを作る
のに使った制限酵素（など）、のための最も近い３′地
点までの距離によって決定される。
もし望むなら１かそれ以上の（ここで）言われている開
始プライマー伸長産物が分離でき、そして／あるいはシ
ーケンスされかもしれない、または伸長産物の少なくと
も一部はシーケンスされうる。このように例えばこの具
体化は、望まれる、たいてい最も長い、開始プライミン
グ領域を含む、標的核酸断片を同定するのに便利に使わ
れ、そのため３′末端はこの望ましい具体化のような、
当発明の方法の更に進んだ使用のための新しい出発点を
与えるため前で説明されたように、ネステッドベクトレ
ットプライマーを用いて便利にシーケンスされる。前述
の最長標的核酸断片の３′末末端列はこのようにペクト
レッドライブラリーマルチ（ｍｕ！ｔｉｐｌｅ）開始プ
ライマー伸長産物形成のもうひとめぐり（ａｆｕｒｔｈ
ｅｒ　ｒｏｕｎｄ）や、最長標的核酸断片の同定とシー
ケンスのための新しい標的核酸断片の開始プライミング
領域になるだろう。
この発明の方法を用いて生み出された、新しい配列のデ
ータを基にして新しい開始プライミング領域を選ぶにあ
たり、標的核酸断片の３′末端では、そのような配列デ
ータは一般に人手可能なデータベース編集を用いて日常
的に既知の核酸配列（例えばＧｅｎｂａｎｋ　、　［！
ＭＢＬ）と比較し、提出されている新しい開始プライミ
ング領域が偶然どこからの、例えば関心の対象の染色体
ＤＮＡなど、の既知の核酸配列に極めて一致していると
いうのではないことを確かめられるだろう。これは明ら
かに、特定の標的核酸断片が例えばＡｌｕ配列のような
反復要素をたまたま含むような場合、最もおきやすい。
このような場合結果としてできる伸長産物の少なくとも
１つはさらに進んだ開始プライミング領域の選択のため
の非反復性／独自の３′末端を持つことを保障するよう
に複数のベクトレットライブラリーに所定の開始プライ
マーを用いてこの発明の方法を遂行するのが有利である
。
以前は知れていなかった１つの開始プライミング領域か
らもう１つへ、標的核酸、例えばヒト染色体ＤＮＡ、に
沿って１歩づつ前進していくのは標的核酸断片／ペタト
レッド単位α前で定義した“ベクトレットライブラリー
″Ｂの作製で用いられた様に、同じ制限エンドヌクレア
ーゼで別々に、完全に切断されたここで言われる標的核
酸のサンプルを使って便利にモニターされ、アガロース
ゲル電気泳動とサザンブロッテング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ
　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）が行われるだろう。はじめの開始
プライマーでそのように得られたフィルターのブロービ
ングは、標的核酸においてこのはじめの開始プライミン
グ領域にかこまれた様々な制限酵素認識部位からなるバ
ンドパターンを示す、当発明の方法を複数のベクトレッ
トライブラリーとこのはじめの開始プライマーで使用す
ることは、伸長産物の一連を生じ、それらの３′末端は
、質問になっているベクトレットライブラリーを生成す
るのに使われた制限酵素の認識部位に最も近い開始プラ
イミング領域に相対化した地点で定義される。このよう
にはしめの開始プライマーの３′側に対する制限部位の
地図が効果的に得られる。以前には知られていない配列
の、２番目に新しい開始プライミング領域を続いて選択
することによって、最初の開始プライミング領域へのつ
ながりが、２番目の新しい開始プライマーによる上記の
サザンブロノトフィルターの再プローブによって確立さ
れる。
得られるバンドのパターンは、問われている制限酵素の
どんな認識部位も最初と２番目の開始プライミング領域
の間にはないような場合、はじめの開始プライマーで得
られるものと同一である。問われている制限酵素の認識
部位が開始プライマー領域間にある場合、これは対応す
るペクトレッドライブラリーでより小さい伸長産物の外
観で判断でき、通常は異なるサイズの断片が２番目の開
始プライマーを用いたサザンプロットフィルターの再プ
ローブで観察される。この方法を何度もくり返すごとに
よって、標的核酸にそって１つの開始プライミング領域
からもう１つへの１歩１歩の前進の正確さと信鯨性が維
持され確実化するのである。
複数の開始プライマー伸長産物すべての３′末末端列は
、それ自体知られている方法によるシーケンシングで用
いるのと同じペクトレフトプライマーかネステッドベク
トレットプライマーを使って簡単に得られるだろう。こ
の方法で標的ＤＮＡ核酸の未知断片の全体配列は容易に
そして整然としたやり方で決定され、それは例えばＭ１
３“ショウトガン”クローニングを用いるのよりはるか
に便利である。これは開始プライマー伸長産物がサイズ
で順番づけられ、それゆえそれらの配列のもとの標的核
酸内での順番が明らかになるからである。
各開始プライマー伸長産物は、開始プライマーによって
決定された５′一端と、特定の切断手段、例えば制限部
、に最短の３′−地点によって決定された３′一端を持
ち、（これらは）特定のへクトレットライブラリーの合
成に使われる。
当発明に従った、望ましい具体化では、いくつかあるい
はすべての得られた開始プライマー伸長産物は、さらに
進む開始プライマーの配列を決定し、それによってさら
に進んだ開始プライマー伸長産物を、さらに進んだ開始
プライマーのプライマー伸長に基づいて得ることができ
るように、少なくとも所定の開始プライマーに遠い方の
末端はシーケンス（後の定義される）される。
当発明に従った、さらに望ましい具体化では、開始プラ
イマー伸長産物又はその一部はシーケンス（後に定義さ
れる）され、それによってここで言われている伸長産物
又はその一部の性格づけがなされる。
上に記述されているように当発明の１つの潜在的に重要
な応用には、以前に未確認の遺伝型、例えば遺伝的疾患
や障害の表現型の原因である遺伝的欠陥などの確認、あ
るいは以前に未確認の遺伝型、例えば疾患などの表現型
に対する疾病素質（ｐｒｅｄｊｉｐｏｓｉ　ｔｉｏｎ）
における誘因（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｙｆ　ａｃ　ｔ
ｏｒ）、または原因であるような遺伝的欠陥などの確認
、がある。
このように例えば遺伝的疾患又は障害のような遺伝型に
関連して、当発明の手法は遺伝型α即ち遺伝的欠陥りを
持たない核酸や調査されるべき遺伝型即ち遺伝的欠陥を
含む核酸に応用でき、遺伝的即ち遺伝的欠陥の確認は２
つの核酸サンプルをシーケンスすることによって作られ
る情報の比較により果たされる。このような比較は、例
えば、便利に自動スキャンでシーケンスゲルを比較する
など、単純に（ＦＪ単に）果たされる。これに関して、
もし検出、６ｍ　認される標的核酸サンプルの間の相異
を可能にするほど充分なデータが出たなら、特定の配列
はそれ自身は決定される必要がなく、そして用語“シー
ケンスする（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）”と“シーケンス
された（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）″は従ってここでは単に
特定のヌクレオタイド配列の決定だけでなく、特定のヌ
クレオタイド配列の決定なしで配列の相異を検出、確認
することも含んでいることが確認される。当発明の手法
を、例えば調整される遺伝的疾患や障害などの責任を負
うヘテロ接合体の標的核酸に応用するのは便利である０
問われている部位の正常と変異アリル両方がそのような
１個体に存在するのは必然であり、この発明の手法を用
いて確認された部位で１コ以上のヌクレオタイドが配列
に存在するようなものはその発現型、即ち変異によって
ひきおこされた疾患又は障害、の候補である。
上記に加えである遺伝型、即ち遺伝的欠陥が個体の表現
型、例えば若年性アテローム動脈硬化症（ｐｒｅｍａｔ
ｕｒｅ　ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉＳ）　、高血圧
（注：又は緊張元進症ｈｙｐｅｒｔｅｕｓｆｏｎ）、糖
尿病、癌などの素因を作るうろことが疑われている。例
えば、もしそのような遺伝的欠陥が確認されたなら、そ
のような“ハイ・リスク”患者は監視され、疾病のどの
ような開始にも早期に治療されることができる。当発明
の手法はこのような、素因を作る遺伝型の確認に応用で
きる。このように例えば当発明の手法は、一方で調査さ
れるべき表現型に影響された（＝疾患が現われている）
複数の個人の核酸に応用され、もう一方では前述の表現
型の形跡が現われていない複数の個人の核酸に応用され
、遺伝型の確認は核酸サンプルの配列比較で果たされる
だろう０便利なことに、調査される表現型によって疾患
の現われている複数の個人からの核酸はプールされ、当
発明手法にかけられ、同じように前述の表現型の形跡が
現われていない個人からの核酸もプールされ、当発明の
手法にかけられる。
この２つの集団同士の配列の相異を比較するのは、あら
ゆる素因となる遺伝型、もしあれば、の存在を確認する
ことになる。この技法の有利なところは、遺伝型の素因
を持つ個人が、それらがおこる頻度に無関係に、そして
全体の復雑さと表現型全体に幻する異なる遺伝的誘因の
数には無関係に確認されることを可能にしていることで
ある。このように、もし明らかに無関係な遺伝的欠陥の
組みあわせの存在が、調査される疾病の素質（ｐｒｅｄ
ｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）における誘発要因（ｃｏｎｔｒ
ｉｂｕｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ）の原因又は示すもと（
ｒｅｐｒｅｓｅｎ　ｔ）になっているなら、当発明の手
法はこれは確認することができる。
当発明のある具体化は、標的核酸断片で互いに接着でき
る末端を持つものを円形にすることを含み、既知ヌクレ
オタイド配列部分を含む標的核酸断片は、そのような既
知のヌクレオタイド配列あるいはその一部は開始プライ
マーのハイブリダイゼーション用の開始プライミング領
域として供給出来るのだか、開始プライマーを前述の開
始プライミング領域にハイブリダイズさせ、そのように
形成されたハイブリッドを、ハイブリダイズする条件下
で、適切なヌクレオサイド３リン酸とヌクレオサイド３
リン酸のポリメライゼーシゴン用エージェント存在のも
とにプライマー伸長させる。
例えばＰＣＲ用の正常なもの以外に互いに逆向きになっ
ている２つの開始プライマーが増幅の効果を上げるのに
使われるかもしれない。
これに関して標的核酸断片の円形化は接着による、標的
核酸断片／ベクトレット単位の作製とみなされ、このよ
うに例えばプライマー伸長は鋳型としての環状標的核酸
に基づいて行われるだろう。
しかしながらもし望むならば、環状標的核酸断片は切断
され、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｒ　ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ）νｏｌ　１６　ｐｐ　８１８６１９８
８に説明されているようにプライマー伸長が切断産物を
鋳型にして行われる、これは我々のｕｋ特許出願Ｎｏ、
８８１８０２０．３のあと公表されたもので、そこで（
＝特許出願）は優先協約（ｃｏｎｕｅｎｔｉｏｎ　ｐｒ
ｉｏｒｉｔｙ）が請求されている。
更にもし望むならその切断産物は接着によって標的核酸
断片／ペクトレノｉ・単位を作るのに使われ、開始プラ
イマー伸長が、得られた標的核酸断片／ベクトレット単
位を鋳型として行われる。そのような具体化のすべてが
当発明の射程内にある。
このように例えば形成された環状標的核酸断片は切断産
物を産生ずるため切断され、それは少なくとも既知のヌ
クレオタイド配列の一部を含み、そのような部分は開始
プライマーを用いたハイブリダイゼーションのための開
始プライミング領域として供給でき、その場合例えば環
状標的核酸断片は既知のヌクレオダイト配列領域内で切
断され、未知の配列ではさまれた末端に既知配列を持つ
線状分子を形成するだろう；それは既知のヌクレオタイ
ド配列の端で切断され一方の端に既知のヌクレオタイド
配列を、もう一方の端に既知の切断部位パターンを持つ
線状分子を形成し、ベクトレントへの接着を可能にする
だろう；あるいはより望しく、それは既知のヌクレオタ
イド配列の外側で切断され、既知のヌクレオタイド配列
を含み、少なくとも一端、通常は両端での既知の切断部
位パターンを持つ線状分子を形成し、一端又は両端を接
着しての標的核酸断片／ペクトレッド単位の形成を可能
にするだろう、このように当発明の望ましい具体化は、
互いに接着できる両端を持つ標的核酸断片を環状化する
ことを含み、その一部を含む標的核酸断片は開始プライ
マーを用いたハイブリダイゼーションの開始プライミン
グ領域とじて供給できる一環状標的核酸断片を既知ヌク
レオタイド配列の外側で切断し、既知ヌクレオタイド配
列を含み、少なくとも一端には接着のための既知切断部
位パターンを持つ線状分子を形成し、標的核酸断片／ベ
クトレット単位を形成する；前述の標的核酸断片／ベク
トレット単位を接着によって形成し、その標的核酸断片
／ベクトレント単位を、一緒にか又は断続的に、適切な
ヌクレオサイド３リン酸と、ヌクレオサイド３リン酸を
ポリメライゼーションするエージェントで、ハイブリダ
イズする条件下で処理する。
この、発明の望ましい具体化は、例えば最底ｌｋｈから
２０ｋｂの環状標的核酸断片との関係において興味深い
のだが、例えば約１（１０）ｋｂ　（らいの環状標的核
酸断片のような２０ｋｂから約１２０ｋｂのより大きな
標的核酸断片との関係において特別に興味深い、上限は
現実的考慮に依有し、かくして環状化できる標的核酸断
片の最大サイズに基づいている。
そのような環状化は既知の技法（ｐ、ｓ、コリンズＣｏ
１１ｉｎｓ（１９８８）ゲノム分析Ｇｅｎｏｓｅ　ａｎ
ａｌｙｓｉｓ　−アプローチの実ＶＡＡｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　（ｉ　Ｋ、デイビスＤａｖｉ
ｅｓ［集Ｄ　ｐ７３−９４．１ＲＬ出版Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ、　　オフスフオードｏｘｆｏｒｄｌによって果
たされ、例えば低濃度で接着を行う（など）、この望ま
しい具体化はこのように例えば制限酵素なるべくなら比
較的低い頻度で（例えば平均断片サイズがｔｏ−２０ｋ
ｂ　）切るＸｂａｌ　Ｉ　、にｐｎｌ　Ｉ　、　Ｂａｗ
ｌ目のような制限酵素、による染色体ＤＮＡの分解によ
って果たされる。断片はそれから自己接着して環を形成
する。この環はそれから制限酵素で切られるのだが、な
るべくひんばんに切る（例えば旧ｎｆ　Ｉ　）制限酵素
を用い、断片は対応する（例えば旧ｎｆ　ｌ　）へクト
レットに接着される。このように例えばもし既知のＸｂ
ａ１部位に隣り合う配列が手に入るなら、次の、多分遠
い、Ｘｂａ　１部位に隣り合う配列かへクトレット産物
の分析によって得ることができる。このようにして、一
連のジャンプが行われこの手法の追加の出発地点が供給
される。そのようなジャンプをする能力は、以前に説明
したようにＰＣＲ技法を超える大きな有利さを現わして
おり、これまでのところ開始ブライマ一部位から相当離
れた距離で、増幅されたヘクトレット産物を得ることが
可能である。このようにこの手法は、ルーチンでの使用
において５ｋｂ以上の標準ＰＣＲ産物を得る時に出会う
困難さによって限定されない。
第１図は例えば１（１０）ｋｂ以上の標的となる二本鎖
核酸の模式回であり、該配列は、例えば約２０ヌクレオ
チドの斜線で示した最初の５′側ヌクレオヂド以外は未
知である。未知の配列である、問題の部位Ｘが５′末端
から未知の距離の場所に示されている。平均して核酸を
４（１９）６ｂｐごとに切断することが期待される。　
Ｅｃｏｒなとの６ｂｐカツターを用いて標的核酸を制限
酵素処理した（第１　（ｂ）図参照）。
Ｅｃｏｒｌの認識配列はＧ　ＡＡＴＴＣであり、切断部
位を矢印で示した。したがって、ＥｃｏＲｒは標的核酸
を切断して粘着末端を生じさせる０次に標的核酸制限断
片の粘着末端を第１　（ｃ）で斜線で示したベクトレッ
トなどの適当なベクトレットに連結する。
ベクトレットは上述のようにいかなる適切な（亥酸配列
でもよいが、上述の制限断片の粘着末端との連結が確実
となるようなヌクレオチド配列パターンを５′末端に有
するものである。したがって、ＥｃｏＲＩを制限エンド
ヌクレアーゼとして用いた場合には制限断片の３′末端
およびベクトレットの５′末端は以下の配列を有するこ
とになる。
制限断片　５’−Ｇ　　　ＡＡＴＴＣ−３’ベクトレッ
ト３’−ＣＴＴＡＡ　　　Ｇ−５’ 連結反応に関係しない制限エンドヌクレアーゼ認識パタ
ーンのこの部分は、ベクトレット中で認識パターンが破
壊されるように変化することが望ましい、したがって標
的核酸を切断する目的で存在するいかなる制限エンドヌ
クレアーゼも制限断片／ベクトレットユニットがひとた
び形成されると切断不可能となる。用いた制限エンドヌ
クレアーゼがＥｃｏＲｌである場合には、ベクトレット
の５′末端は ５　’　ＡＡＴＴＡ　３　’あるいは５　’　ＡＡＴＴ
Ｔ　３　’あるいは５′八ＡＴＴＧＴ　　　　　　　　
　　　Ａ　　　　　　　　　　　Ｃであることが望まし
く、その場合には認識パターンのＣＣ部分力楠↑に変化
しているが、あるいはＣＧが該ＥｃｏＲＩ　Ｅ’ｌ識パ
ターン内に軒耳される０次に制限断片／ベクトレットユ
ニットをハイブリダイゼーション条件下（実施例１　（
ｄ）参照）で開始プライマーとベクトレットプライマー
と同時に、あるいは望ましくは段階的に（開始プライマ
ーを最初に加える）処理する。開始プライマーのみが既
知の配列を含む一つの標的制限断片の一部にハイブリダ
イズすることができる。（第１（ｄ）（ｉ）図参照）。
ベクトレットプライマーは開始プライマー（および第１
　（ｄ）図に示されるように、開始プライマーがハイブ
リダイズできる核酸鎖に相補的な核酸鎖）の伸長によっ
て形成される核酸鎖にハイブリダイズするように考案さ
れている。ベクトレットプライマーは存在する各制限断
片／ベクトレットユニットのベクトレ・ントプライミン
グ？■域にハイブリダイズするが（第１（ｄ）図（１１
）参照）、適当なヌクレオシド３リン酸およびヌクレオ
ンドボリメライゼーションのための試薬の存在下では、
開始プライマーがハイブリダイズして伸長される制限断
片／ベクトレットユニ７）についてのみ増幅が丘なわれ
る。ハイブリダイゼーション（１１）はハイブリダイゼ
ーション（１）、ヌクレオシド３リン酸とヌクレオシド
３リン酸のポリメライゼーションのための試薬およびそ
れに続く変性後にのみ行なうことが望ましいことは理解
されるであろう。これにより、ベクトレットプライマー
（１１）がハイブリダイズし、したがって複雑な混合液
中に存在する全ての標的核酸断片／ベクトレットユニッ
トとともに伸長産物を形成可能な場合に第１　（ｄ）図
から明かな一つの状態を回避することができる。したが
って、ベクトレットユニットをまず最初に開始プライマ
ーで処理し、つぎにベクトレットプライマーを上述の過
程の後に添加することが望ましい。
したがって、増幅された標的断片の同定およびもし望む
なら全断片の塩基配列を例えば上述の方法で決定するこ
とが可能である。しかしながら、もしも望むなら、新し
い開始プライマーをデザインするために増幅された標的
制限断片の３′末端のみの塩基配列が決定される必要が
ある。この新しい開始プライマーは、異なる制限酵素、
望ましくはやはり６ｂｐカツターで標的核酸を消化する
ことにより得られた新しい標的断片の増幅のために使用
され、本発明が繰り返される。このようにして標的核酸
は、クローニングの必要性なしに、定の向きに、常に５
′から３′の方向に、５′末端から塩基配列が決定され
る０本発明の方法を繰り返すことにより、上述の目的の
座位Ｘに迅速にたどりつき、塩基配列を決定することが
可能である。
第２図は本発明の態様の一つを示している。目的のＤＮ
Ａ配列を例えばＥｃｏＲＩで部分消化し、得られた制限
断片を第２（ａ）図で示したようにゲル電気泳動にかけ
る。電気泳動は矢印で示した方向に流れ、したがって高
分子量制限断片はゲルのトップの方に現れ、低分子量制
限断片はゲルのボトムの方に現われる。Ｘ軸は増加させ
る酵素の濃度の上昇、あるいはインキュベーションの延
長を示す。
あらかじめ決定したサイズ、例えば１０ｋｂ以下の制限
断片は捨て、高分子量の制限断片を次の過程に持ち越し
た。これらの高分子量制限断片は第２（ｂ）図に示され
るようなオーバーラツプした部分消化断片の混合物を構
成し、制限部位（１）で示した制限断片末端あるいはｂ
）で示した断片内に存在する。
全ての制限断片は同し一つの制限エンドヌクレアーゼ、
例えばＥｃｏＲＩで切断し、したがって各断片は消化を
行なうのに用いた制限エンドヌクレアーゼに特有の粘着
末端を有するようになる。わずかに最も末端の５′およ
び３′断片はこのような粘着末端を一つしか持たず、残
りの断片はそれぞれこのような粘着末端を二つづつ有す
る。制限エンドヌクレアーゼ認識配列が破壊された前述
のヘクトレッドを次にリガーゼの存在下で上述の標的制
限断片と混合し、ベクトレットを末端の箱として表して
いる第２（Ｃ）に例示したような産物の混合物を得る。
リガーゼの存在により標的制限断片とベクトレットの連
結反応が行なわれるだけでなく標的制限断片同士の連結
も行なわれることは理解されるであろう、したがって、
第２図の連結条件下では最初の標的核酸断片／ベクトレ
ットユニット中の断片Ａと断片８が元の標的ゲノム核酸
中では隣接していないが連結反応の間に例外的に１妄合
する可能性があることは理解されるであろう。つぎに、
連結反応産物を部分消化に用いた制限エンドヌクレアー
ゼ、例えばＥｃｏＲＩで完全に消化する。
完全消化産物は一般に、断片の各末端にベクトレットが
連結している二本鎖標的制限断片および、断片の一方の
末端にのみベクトレットを有する標的制限断片である。
ベクトレットをいずれの末端にも持たない第２（ｃ）図
の断片ＡおよびＢなどの、標的制限断片のバックグラウ
ンドとなる集団も存在する。前者の産物は、産物の総混
合物の少数部分を構成している。変性によってベクトレ
ットユニットの少量しか開始プライマーとハイブリダイ
ズすることができないが、産物混合物の相当量は、ベク
トレットの実質的な修飾が以下に述べるように行なわれ
ていなければベクトレットプライマーとハイブリダイズ
可能である。望みの制限断片の増幅は以上のように可能
であるが、ベクトレットプライマーとハイブリダイズ可
能なベクトレットユニットライブラリーの相当量は、相
当量のベクトレットプライマー、ヌクレオシド３リン酸
ポリメライゼーション試薬、（例えばＴａｑ　ＤＮＡポ
リメラーゼ）およびヌクレオシド３リン酸そのものを使
用することが必要となる。この困難は、少量の出発材料
を使用することによりある程度回避されるが、産物混合
物中の開始プライマーにハイブリダイズできる標的制限
断片／ベクトレットユニットの相対的な割合を選択的に
増加させることが有利であろう。
第２図に示されているヘクトレットユニントライブラリ
ーを構築するアプローチのための理論的根拠は以下のよ
うなものであるｍ　５ｂｐカツター酵素で完全に消化す
ると、平均サイズが４（１９）６ｂｐの断片の集団が得
られる。ベクトレットユニットをこの集団（全ヒトゲノ
ムＤＮＡ由来の場合約１（１６断片）に連結すると、各
末端にベクトレットユニットを持つ多数の断片が形成さ
れることが期待される。
これらの多くは制限部位のガウス分布を仮定すると４（
１９）６ｂρよりも相当に小さい。使用の際には、この
状況下のベクトレットプライマーは標準的なＰＣＲで双
方のプライマーとして働り、大量の疑似増幅産物が開始
プライマーから生じるあらゆる産物と同様に産生される
。上述の議論において、ベクトレットプライマー増幅産
物の合成が開始プライマーの伸長産物の最初の合成に依
有する方法が参考にされた。第２図の態様において、ベ
クトレットユニットそれ自体はへクトレットプライマー
とハイブリダイズし、ベクトレットプライマーからコピ
ーを開始する。各末端にベクトレット部分を有する標的
核酸断片からのＰＣＲ産物形成の上記の欠点は、全ての
このようなベクトレットユニ・７ト構造が標準的なＰＣ
Ｒが効率が悪く明確な産物が形成されないような距離（
例えば１Ｏｋｂ以上）で分離された二つの同一のベクト
レットを有するようなサイズ分画過程によって克服され
る。
第３図は上記の第２図に関して述べたようにして得られ
たベクトレットユニット産物混合物中の、開始プライマ
ーにハイブリダイズすることのできる制限断片の相対濃
度を増加させることを目的としたｗ４様の一つを示して
いる。第３（ａ）図の、（ｉ）開始プライミング領域（
１）およびベクトレット部分（斜線部）（２）を有する
制限断片であり、（ｉｉ　）は各末端に連結したベクト
レット部分（斜線部）（２）を有するが開始プライミン
グ領域を持たない制限断片であり、（ｉｎ　）は開始プ
ライミング領域を持たないが一つのベクトレット部分（
斜線部）（２）を有する制限断片である。この観点にお
いて、変性後（第３ｂ図参照）にＴａｑ　ＤＮＡポリメ
ラーゼなどのヌクレオシド３リン酸をポリメライズする
ための試薬およびヌクレオシド３リン酸の存在下で開始
プライマーのみで（３）処理する。この過程ではベクト
レットプライマーは使用しない。開始プライマーにハイ
ブリダイズすることができる標的制限断片／ベクトレッ
トユニットはこのように選択的に複製される（第３（ｃ
）図参照）１必要な開始プライミング領域を持たない断
片の複製は不可能である。このようにして得られた産物
混合物を５１ヌクレアーゼなどの一本鎖特異的エンドヌ
クレアーゼで処理する（第３（ｄ）図参照）、このエン
ドヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡ中の内部のホスホジエス
テル結合を切断し、その結果プラント末端を有する二本
鎖ＤＮＡが産生される。この過程により残有するバック
グラウンド断片よりも開始プライマーにハイブリダイズ
することのできる標的制限断片／ベクトレットユニット
の相対濃度を増加させる。
さらに望むならば、変性、ヌクレオシド３リン酸ポリメ
ライゼーションのための試薬とヌクレオシド３リン酸の
存在下での開始プライマーのみでの処理、それに続＜Ｓ
＋ヌクレアーゼなどの一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ
と得られた産物混合物を処理することからなる以上の過
程を、開始プライマーにハイブリダイズすることのでき
る標的制限断片／ベクトレットユニットの相対濃度が望
ましいあるいは必要であると思われる程度に上昇するま
で繰り返すらとができる。このようなベクトレット／ユ
ニットの濃度が残有するバックグラウンド断片と比較し
て十分に高いと思われる濃度に達したら、産物混合物を
さらにベクトレットプライマーで処理して米国特許第４
．６８３，１９５号および４．６８３．２０２号に記載
されている様に増幅を行なう。
上述の方法の欠点は、Ｓ１ヌクレアーゼが期待されるほ
ど一本鎖特異的ではない傾向があり、ある程度の二本鎖
［］ＮＡも分解されてしまうことである。
さらに、１回のみの開始プライマー伸長でＳｌヌクレア
ーゼ耐性の二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａが得られるので、第３図の
方法に関しては直線増幅は適当ではない。
第４図は、Ｓ１ヌクレアーゼを使用することを避けて、
目的の標的ＤＮＡ配列の完全制限エンドヌクレアーゼ消
化によって得られた産物混合物中に開始プライマーにハ
イブリダイズ可能な制限断片の相対濃度を増加させるこ
とを目的とした本発明のさらに別の態様を示したもので
ある１本態様の利点は、得られた断片の分画も、最初の
過程として必要とされたゲル電気泳動も不要なことであ
る。
ＥｃｏＲＩなどの制限エンドヌクレアーゼで目的のＤＮ
Ａ配列を完全に消化した後に、得られた断片をＤＮＡリ
ガーゼの存在下でブロッキングベクトレット（上で定義
）と処理し、第４（ａ）図に示したように産物の完全な
混合物を得る。断片Ａと断片Ｂは元のＤＮＡ配列中で隣
接している必要はないが、ＤＮＡリガーゼ反応中に例外
的に接触した可能性があることは理解されるであろう。
ブロッキングベクトレットは第４（ｂ）図に示したよう
な二本鎖オリゴヌクレオチド配列からなり、連結反応の
ために適合させた制限断片の粘着末端に対応する第一の
粘着末端を一方の末端に有し、しかし連結反応に関係の
ない制限エンドヌクレアーゼ認識部位の部分は、制限断
片／ベクトレットユニットがひとたび形成されると制限
断片を生じさせた制限エンドヌクレアーゼによって切断
されなくなるように制限部位を破壊するようにベクトレ
ット内で変化させる。ブロッキングベクトレットのもう
一方の末端はジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）などの３
′ジデオキシヌクレオシド、あるいは例えば３′デオキ
シヌクレオシドや他の既知の化学修飾剤などの、そこで
プライマー伸長が進まないような他の３′残基であるこ
とが望ましいブロッキング残基を有する末端を含む。第
４（ｂ）図に示すように、下側の鎖は上側の鎖とオーバ
ーラツプしている。
この鎖は自己連結（ｓｅｌｆ　ｌｉｇａｔｉｏｎ）の問
題を避けるためにリン酸化されていない残基で終結する
ことが望ましい。該領域（４）は、ベクトレットプライ
マーが開始プライマーの伸長産物とはハイブリダイズ可
能であるが３′を修飾したブロッキングヘクトレットの
伸長不能な上側の鎖とはハイブリダイズしないようなベ
クトレットプライマーと同し配列を有する。ブロッキン
グヘクトレットは結果としてハイブリダイズする二つの
分離した鎖として調製するのが便利である０例えば手動
で、あるいはＤＮ＾号世紀を用いて簡便に、第一の鎖と
第二の鎖を独立にそれぞれ調製し、第一の鎖は簡便には
ポリヌクレオチドキナーゼの使用などによって酵素的に
、化学的手段で５′末端がリン酸化し、ターミナルトラ
ンスフェラーゼは３′末端にジデオキシヌクレオチドあ
るいは他の修飾ヌクレオチドを節単に導入するために用
いられる。あるいは、既知の方法によって３′末端に他
のブロッキング成分（例えばアミン）を化学的に導入す
ゐこともできる。このように、第一の鎖と第二の鎖を調
製し、次にハイブリダイズさせて二本鎖ブロッキングヘ
クトレフトを形成させる。
第４（ａ）図に示されている、ＤＮＡリガーゼの存在下
でブロッキングベクトレットとの制限断片の処理後に得
られた産物混合物を、制限断片／ヘクトレフトユニット
の形成に先だって制限断片の作成に使用したものと同じ
制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、それによって
第４（ｃ）図に示される（ｉ）　、（ｉｉ）　、（ｉｉ
ｉ）のタイプの産物が得られる。制限断片／ベクトレッ
トユニット（ｉ）および（ｉｉ　）の混合物中に存在す
る制限断片（ｉｉ　）の相対濃度を減少させるために、
上述のサイクルを、例えば制限エンドヌクレアーゼ［！
ｃｏＲＩの使用に基づいて制限断片／ベクトレットユニ
ットのプールを形成するのに必要あるいは望ましいと思
われるまで繰り返すことができる。
第５図は（ｉ）で、切断した標的ＤＮＡに生じた末端と
相補的な４塩基突出（５′突出）とともに、アニールし
た１４塩基トツプオリゴヌクレオチドおよび４２塩基ボ
トムオリゴヌクレオチドからなるブロッキングベクトレ
ットを示している。Ｎｌ、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、お
よびＮ５’は以下の表１で定義する。
１４塩基オリゴヌクレオチドの３′末端をクレノー断片
、７７　ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ）、ある
いはＴａｑ　ＯＮ＾ポリメラーゼなどの既知のＤＮＡポ
リメラーゼの何れかを用いて５′→３′伸長がその末端
から起きないように修飾（Ｘ）する、該修飾塩基は、ジ
デオキシヌクレオシドあるいは３′デオキシヌクレオシ
ド（例えばコルデイセビン）を用いることができる。望
むならば、３′糖残基を既知の化学的方法で修飾するこ
とが可能である。
ボトム４２７−の３′末端塩基および１４塩基トツプオ
リゴヌクレオチド中の５位（５′末端から）の相補的な
塩基は、切断された標的ＤＮＡへのブロッキングヘクト
レットの連結に続いて得られたヘキサヌクレオチド（連
結部）が元のゲノムＤＮＡの切断に用いた制限エンドヌ
クレアーゼによって認識されないように選択される。こ
れは、全ての切断されたゲノムＤＮＡ断片がその末端に
プロンキングベクトレットが連結されたかを認識するの
に重要である。明らかに、連結産物は互いに再連結され
た切断されたゲノムＤＮＡ断片を含み、これらは第二の
連結反応においてブロッキングペクトレフトのための受
容末端を生成するために再度消化される。この消化と連
結サイクルは、全ての切断されたゲノムＤＮＡ断片がど
ちらかの末端にプロンキングベクトレットを持つことを
確実にするために１回以上、例えば３回から４回、操り
返す必要がある場合もある。各切断されたゲノムＤＮＡ
断片は、変性後に開始プライマー処理を行なった後に反
応混合液中のゲノムＤＮＡ断片のあらゆるブロックされ
ていない３′末端からのランダムプライミングを避ける
ため、どちらかの末端にブロッキングベクトレットを有
することが望ましい。
第５（ｉ）図に示されたブロンキングベクトレットは５
′突出が生じる制限エンドヌクレアーゼで切断した標的
ゲノムＤＮＡに適当である。３′突出を生じる制限エン
ドヌクレアーゼはわずかに修飾する必要がある。例えば
１４塩基トツプオリゴヌクレオチドは１０塩基トツプ鎖
によって置換される場合もあり（５′末端の４塩基突出
を失う）、４２塩基ボトムオリゴヌクレオチド鎖は３′
末端に余分な４塩基が付き、ゲノム標的ＤＮＡの切断に
用いた制限エンドヌクレアーゼによって産生される末端
に相補的な４６塩基ボトム鎖によって置換され得る。
第５（ｉｉ）Ｃ（ｌは、ヘクトレットプライマー伸長が
すぐには行なわれないような、ある程度の非相補性を持
つアニールさせた二つの一本鎖配列（５７塩基および５
３塩基オリゴヌクレオチド）からなる非相補性ベクトレ
ット部分を示している。非相補性ベクトレット部分はヌ
クレオシドの修飾を必要としない点を除いては、第５（
ｉ）図に関しての上記のＪ西論をそのまま当てはめるこ
とができる。
第６図は第５（ｉ）図のベクトレット部分に対する本発
明の通用を模式的に示したものである。標的ゲノムＤＮ
＾を単一の制限エンドヌクレアーゼで完全に消化して、
（ｉ）に示されるような断片を産生ずる。ブロッキング
ベクトレット部分（第５（１）図の５）をＤＮＡリガー
ゼの存在下で、全ての切断された標的ゲノムＤＮＡ断片
（ｉｉ　）の末端に連結する。
次に、変性後、例えばＴａｑポリメラーゼなどの存在下
で既知のヌクレオチド配列工およびＬのプライマーを用
いて増幅を行なう。
以上のように、第６（ｉｉｉ）図では、■は開始プライ
マーを表し、鎖１中のｌｐ（開始プライマー）と記した
領域と同じ、あるいは実質的に同じ配列を有する。工は
鎖２の開始プライミング領域（ＩＰＲ）にハイブリダイ
ズすることができる。開始プライミング令頁域（ＩＰＲ
）を含むｉ貞２は、ヘクトレントプライマー（νＰ）の
ヌクレオチド配列と同じ、あるいは少なくとも実質的に
同じヌクレオチド配列の部分も含んでいる。使用の際に
は、工のプライマー伸長によりプライマー１で表される
ベクトレットプライマー（ＶＰ）とのハイブリダイゼー
ションに適当なベクトレットプライミング領域（ＶＦＲ
）を含む鎖が生じる。鎖１はベクトレットプライミング
領域それ自身は含まず、ポリメライゼーションブロッキ
ング部分の存在によりプライマー伸長が行なわれず、鎖
２もベクトレットプライミング領域を持たないので、ベ
クトレットプライマー領域は開始プライマーのプライマ
ー伸長によって作成されるまではベクトレットプライマ
ーのプライマー伸長は行なわれない。
したがって、最初の増幅サイクルだけで、プライマー１
はブロッキングペクトレフト（１１）の４２塩基オリゴ
ヌクレオチドの末端まで延びる伸長産物を産生できるこ
とは理解されるであろう、プライマーＬは、それがハイ
ブリダイズして伸長産物を合成するための相補的な配列
が存在しないため、最初のサイクルでは不要である。プ
ライマー１の配列は第５（ｉ）図の４２塩基ボトムオリ
ゴヌクレオチドの５′末端から教えて塩基２から３１ま
で、および第５（ｉｉ）図の５３塩基ボトムオリゴヌク
レオチドに含まれる塩基１３から４２と正確に同じであ
る。
第二のサイクルおよびそれ以後（Ｖおよびｖｉ）では、
プライマーエはプライマー１の伸長産物にハイブリダイ
ズすることができ、この伸長産物（ｉｖ）の相補鎖合成
が行なわれる。このようにプライマー１は（ｊｉ）に示
されるようにいかなる連結産物にもハイブリダイズする
ことができない、プライマーＬは、必ず、問題となる領
域中の既知のヌクレオチド配列であるプライミングの完
全な伸長産物のみハイブリダイズすることができる。こ
のように、プライマー１、未知のヌクレオチド配列主、
およびプライマー１を含む増幅産物のみが産生される。
１のヌクレオチド配列はプライマー■およびＬをシーフ
ェンシングライマーとして用いて両方の末端から決定す
ることができる。あるいは“重なりあった（ｎｅｓ　ｔ
ｅｄ）　”シークエンシングブライマ−１′およびＬ′
を調製してもよい。これらはプライマー１の３′あるい
はプライマーＬの３′の配列、例えば第５（ｉ）図の４
２マーオリゴヌクレオチドの５′末端から２５塩基から
４２塩基までを含む。
第６図は、ベクトレット部分がポリメライゼーシッンブ
ロッキング部分を含む標的核酸断片／ヘクトレフトユニ
ットに関連した本発明の方法を示したものである。少な
くとも非相補的な領域をヘクトレット部分が含んでいれ
ば、上述の、および第５（ｉｉ）図の例に示されたもの
と同様の考察が適用される。すなわち、ａｔはＩＰとす
るされた領域と同じ、あるいは少なくとも実質的に同じ
配列を有する。開始プライマー（ＩＰ）は鎖２の開始プ
ライミング領域（ＩＰＲ）にハイブリダイズすることが
できる。ＩＰＲを含む鎖２ベクトレントプライマ−（Ｖ
ｆ’）のヌクレオチド配列と同じあるいは少なくとも実
質的に同じヌクレオチド配列部分も含むが、鎖２の該部
分は鎖ｌに故意に導入したある程度の非相補性によりｔ
ｌ　１の対応する部分にはハイブリダイズしない、した
がって、ＩＸ　１はへクトレントプライミング領域（Ｖ
ＦＲ）を含まず、さらに、鎖２がＶＰとは同しだが相補
的な配列すなわちＶＦＲでは向配列部分を含むために鎖
２にハイブリダイズできないため、ベクトレットプライ
マー（ＶＰ）は１ｆｆ　１にハイブリダイズすることが
できない。したがって、ベクトレットプライミング領域
（ＶＰＩＩ）が開始プライマー（ＩＰ）のプライマー伸
長によって生成されるまで、ベクトレットプライマー伸
長産物は形成されない。
続いて、異なるベクトレットライブラリーを構築する制
限断片／ベクトレントユニットの異なるプールを形成さ
せるために、異なる制限エンドヌクレアーゼおよびそれ
に対応して考案された異なるブロノキングベクトレノト
を用いて上述の過程を繰り返すことが望ましい。この過
程は、あらゆる望みの数の異なる制限エンドヌクレアー
ゼ（例えば１０から３０、便利には１５から２５、有利
には約２０）およびそれに対応して考案されたブロッキ
ングへクトレットに関して独立に繰り返し、同数の制限
断片／ベクトレットユニットを形成させる。つぎに、制
限／ベクトレットユニットの異なるライブラリーを混合
してこのようなハイブリッドの多重性ライブラリーを形
成させる。多重性ライブラリーをつぎにヌクレオシド３
リン酸とＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼなどのヌクレオシ
ド３リン酸のポリメライゼーションのための試薬の存在
下、ハイブリダイズ条件下で開始プライマーとともに処
理する。
米国特許筒４．６８３．１９５号および第４，４８３，
２０２号に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）に適した条件下でベクトレットプライマーを添加
することにより目的の領域のみが増幅され、該増幅され
た断片の塩基配列を決定することができ、したがって、
新しい開始プライマーをデザインする事が可能となり、
新しい開始プライマーを増幅の開始点として用いて上述
の過程を繰り返し、望むならばさらに目的の領域の塩基
配列を決定し、該過程を繰り返すことができる。
第７図はベクトレットライブラリーの使用の模式図を示
すことにより、上記のことを説明するものである。ゲノ
ムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全に
消化する。ＥｃｏＲＩ消化によって生じた４塩基突出に
相補的な４塩基突出を有するベクトレット部分を全ての
切断されたゲノムＤＮＡの末端に連結する。これをＥｃ
ｏＲｌベクトレットライブラリーと呼ぶ。ヘキサヌクレ
オチド配列を認識する例えば約１５から２０の制限エン
ドヌクレアーゼを用いて同様のライブラリーを構築する
。これらのライブラリーをプールし、増幅を行なうとあ
る程度のＰＣＲ産物が得られ、あるいは、より望ましく
はそれらを独立に分離して使用して各ライブラリーから
単一のＰＣＲ産物を産生ずる。
第７（ａ）図は既知のヌクレオチド配列（−）の目的の
座位の３′側の仮想的な制限酵素地図を示している。プ
ライマー１およびＬを用いてプールしたヘクトレットラ
イブラリーを増幅すると、（ｂ）に示ＬりＰＣＲ産物Ｚ
　ＳＺｌ、　Ｚ２、Ｚ３、およびＺ４が産生されるこれ
らのＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動すると、（
ｃ）に示したようなバンドのパターンが得られ、ここで
はＰＣＲ反応産物がプールした多重性ライブラリーでは
なく各ベクトレットライブラリー状で分離して泳動され
ている。ゲル上で可視化された最も大きいＰＣＲ産物（
この場合にはＺ４）をゲルから精製し、その３′末端の
ヌクレオチド配列をオリゴマーＬあるいは“重なった”
オリゴマーＬ′をシークエンジングプライマーとして用
いて決定することができる。Ｚ４の３′末端のこのヌク
レオチド配列をこの方法を用いたさらなるウオーキング
過程で使用する新しい開始プライマーエとして供給する
、あるいはその合成のために使用することができる。
第８図は逆ＰＣＲに対する本発明の応用を模式的に示し
ており、逆ＰＣＢはトリダリア（Ｔｒｉｇｌｉａ）、Ｔ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
Ｖｏｌ　１６．（１９８Ｂ）８１８６およびオックマン
（Ｏｃｈｓａｎ）、Ｈ他、ＧｅｎｅＬｉｃｓ　１２０；
６２１−６２３　（１９８８年１１月）に最近記載され
たものである。
望ましくは、Ｘｂａ　Ｉ　、　Ｋｐｎ　ＩあるいはＢａ
ｍＨＩなどの比較的希にしか切断しない（例えば、平均
断片サイズ１０〜２０ｋｂ）ような制限酵素でゲノムＤ
ＩＪＡを消化する。低濃度では断片は自己連結して環を
形成する。つづいて環を、望ましくは頻繁に切断する（
Ｈｉｎｆ　Ｉなど）制限酵素で切断し、断片を対応する
ペクトレッド、例えば旧ｎｆＴペタトレッドに連結する
。したがって例えば既知のＸｂａ　１部位に隣接した配
列が可能であれば、ベクトレットユニット産物の解析に
よって次のＸｂａ１部位に隣接した配列を得ることがで
きる。このようにして、本発明の方法のためのさらなる
開始点を供給する一連のジャンプを作ることができる０
例として平均断片サイズがｌθ〜２０ｋｂの場合につい
て述べたが、標的核酸を切断して例えば約１（１０）ｋ
ｂなどのさらに長い断片を与えるものが望ましい、この
ような断片は、例えばゲノムＤＮＡを非常に希にしか切
断しない＋ｌｏｔ　Ｉ　、　Ｂｓ５）Ｉｎ、および５ａ
ｌｌなどの制限酵素を使用することによって得られる。
第１１（＋　）図は、アガロースゲルの写真の上部であ
って、レーンｌと１１にはＨａｅ　ｍで切断したφｘ１
７４マーカー、レーン１２にはλ／Ｈｉｎｄ　ｍマーカ
、レーン２にはＰＣＲコントロール、レーン９には実施
例１および第９図に示されたオリゴヌクレオチド５８お
よび６１を用いて得られた増幅断片が示されている。
第１！（ｉｉ）図は、アガロースゲルの写真の下部であ
って、レーン１と１３にはλ／Ｈｉｎｄｌｎマーカーレ
ーン２および１２にはＨａｅ　ｍで切断したφｘ１７４
７−カー、レーン３にはＰＣＲコントロール、およびレ
ーンｌＯには実施例１　（第９図参照）のオリゴヌクレ
オチド５８および６１を用いて得られた増幅断片が示さ
れている。
第１Ｈｉｉｉ）図は、アガロースゲルの写真の下部であ
り、レーンｌと１１にはλ／Ｈｉｎｄ　ｍマーカー、レ
ーン６にはＨａｅｍで切断したφｘ１７４マーカー、レ
ーン２．３．４、および５には実施例５によって得られ
た増幅断片、レーン７．８．９、およびｌＯには実施例
７による増幅断片が示されている。
残りの図については以下の実施例の中で詳しく述べる。
以下に示すオリゴヌクレオチドを用いる、以下の方法及
び実施例を参考として本発明を以下に例示するが、これ
により制限されるものではなく、その以下に示した各ヌ
クレオチドは慣習的に５′から３′に読まれることとす
る。
オ　ゴヌクレオ　　　　イ　Ａ（５′末端の塩基配列が
４．５個異なった１４塩基のオリゴヌクレオチド群で、
したがって５′突出末端との使用に適している。突出し
た４塩基は５′突出末端を表し、５番目の塩基は制限酵
素の認識部位を消失させるために存在する）。
オ！ゴヌ　し　　　゛ ＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼ、ＸｂａｌまたはＮｈｅｌま
たは５ｐｅｌで消化された［ｌＮＡと共に用いる）オｌ
ゴヌクレオ　２ ＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで消化されたＤＮ
Ａと共に用いる。） 第１ゴヌクレオチ′３ Ｇ＾↑ＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ１または、Ｂｇｌ！
１またはＸｈｏｌまたはＢｃｌｌで消化されたＤＮＡと
共に用いる） 第１ゴヌ　レオ　゛ ＾ＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄｌｌ［で切断されたＤ
ＩＪ＾と共に用いる） 第１ゴヌクレオチ゛ ＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＳａｌ　ｒで切断された［１
ｌｌＡと共に用いる） オ車ゴヌ　レオ　　゛ ＣＧＣＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼ旧ｕｌまたはＢｓｄＩＩで切
断されたＤＮＡと共に用いる） オ嘗ゴヌ　レオチ゛７ ＧＴＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＡｓｐ７１８で切断されたＤ
ＮＡと共に用る） 第１ゴヌクレオチ１ ＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　Ｉで切断されたＤＮ
Ａと共に用いる） オＪｊＬ乙り」ゴＬ九上Ｊ− ＣＡＴＧＣＡＡＧにＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＮｅｏ　Ｉで切断された［１
ｌｌＡと共に用いる） 第１ゴヌ　レオ　′ ＧＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＮｏｔｌまたはＥａｇＩで切
断されたＤＮＡと共に用いる） 第１ゴヌクレオチ゛ ＣＣＧＧＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＢｓｐａ　１１またはＸｓａ
　ＩまたはＡｃｃ　ｍで切断された［ｌＮＡと共に用い
る）オｌゴヌ　レオ　゛ ＣＡＴＧＴ＾＾ＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＨＩまたはＮｃｏ　Ｉ
で切断されたＤＮＡと共に用いる） 第１ゴヌ　し　　　・ ＣＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧ （制限エンドヌクレアーゼＡｖｒ■またはＮｈｅ　Ｉま
たはＸｈｅ　Ｉで切断されたＤＮＡと共に用いる）オ　
ゴヌクレオ　　　　イブＢ（３′末端の塩基配列に多様
性のある４２塩基長のオリゴヌクレオチド群で、５′突
出末端との使用に適している）オ「ゴヌ　レオ　゛ ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧ＾＾
ＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴにのオリゴヌクレオ
チドはオリゴヌクレオチド１゜２．３．４．５．６．７
と供に使用される。
第１ゴヌクレオ　゛ ＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣ［；ＴＡＣＧＡＧＡ
ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧ（この核酸の配
列は３′末端のＣがＧに置換された以外は１４と同じで
ある）このオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド８
．９．１０と供に使用される。
第１ゴヌクレオチ゛ ＣＧＡＩＴＣＧ↑＾ＡＣＣＩ、ＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡ
ＡＴＣＧＣＴＩ、ＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴ（この核酸配
列は３′末端のＣが↑に置換された以外は１４と同じで
ある） 第１ゴヌクレオチ゛１７ ＣＧ＾＾ＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＡ
ＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡ（この核酸配列は
３′末端のＣがＡに置換された以外は１４と同じである
）このオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド１１，
１２．１３．１８　　（以下に示す）と供に使用される
。
オｉゴヌクレオ　８（１０マー） ＴＡＡＧＧＡＧＡＧＧ オリゴヌクレオチド１８はオリゴヌクレオチド１７とア
ニーリングする。これらはベクトレットユニットとして
、プラント末端を作ることができる制限酵素で消化した
ＤＮＡと使用するために考案された。
オリゴヌクレオチド１９とタイプＣシリーズのオリゴヌ
クレオチドは３′突出末端との使用に適してい第１ゴヌ
　レオ　　５（１０マー） ５’−ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　Ｇ−３’このオリゴヌ
クレオチドは以下で定義するオリゴヌクレオチド２０か
ら２５までと共に使用するようにつくられている。
オ　ゴヌクレオチ゛　　イブＣ（４６塩基の長さのオリ
ゴヌクレオチド群） 第１ゴヌ　レオチ′ ５’−ＣＧＡ　　ＡＴＣＧＴＡ　　ＡＣＣＧＴＴ　　Ｃ
０丁　ＡＣＣＡＧＡ　　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣ丁Ｃ
ＣＴＴＴ　　ＴＧＣ＾−３′（制限エンドヌクレアーゼ
Ｎ５ｉｌまたはＰｓＬＩで消化されたＤＮＡと共に用い
る） 第１ゴヌ　レオ　′ ５’−ＣＧ＾＾ＴＣＧＴＡ　ＡＣＣＧＴＴ　ＣＧＴ　Ａ
ＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴ
　ＡＧＣＴ−３’（制限エンドヌクレアーゼ５ｓｔｌま
たはＳａｃ　Ｉで消化されたＤＮＡと共に用いる） オ！ゴヌ　レオ　′２ ５’−ＣＧＡ　　ＡＴＣＧＴＡ　　ＡＣＣＧＴＴ　　Ｃ
ＧＴ　　ＡＣＧ　　ＡＧＡ　　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴ
ＣＴＣＣＴＴＴ　　ＣＡＴ　　Ｇ−３’（制限エンドヌ
クレアーゼＳｐｈ　Ｉで消化されたＤＮＡと共に用いる
） 第１ゴヌ　レオチ゛３ ５’−ＣＧＡ　　ＡＴＣＧＴＡ　　ＡＣＣＧＴＴ　　Ｃ
ＧＴ　　ＡＣＧ　　ＡＧＡ　　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴ
ＣＴＣＣＴＴＴ　ＧＡＴ　Ｃ−３’（制限エンドヌクレ
アーゼＫｐｎ　ｌで消化された口ＩＪＡと共に用いる） 第１ゴヌ　し　　　′４ ５’−ＣＧＡ　ＡＴＣＧＴＡ　ＡＣＣＧＴＴ　ＣＧＴ　
ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ
Ｔ　ＡＣＧ　Ｔ−３’（制限エンドヌクレアーゼＡａｔ
ｌｌで消化された［１ｌｉＡと共に用いる） オｌゴヌ　レオ　５ ５’−ＣＧ＾＾ＴＣＧＴＡ　ＡＣＣＧＴＴ　ＣＧＴ　Ａ
ＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴ
　ＧＧＣＣ−３’（制限エンドヌクレアーゼＡｐａ　ｌ
で消化されたＤＮＡと共に用いる） オ　　ゴヌ　　し　　　　　　　　イ　　Ｄこのタイプ
は、５′末端の４から５塩基の配列のみに多様性がある
５７塩基長のオリゴヌクレオチド群である。
主ユゴｕＬ＝オ」≦６詞 ＣＴＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＴＣＴＩ、
ＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡ
ＡＧＧＧＡＧＡＧ オリゴヌクレオチド４０　（以下に示す）および、Ｘｂ
ａ　Ｉ及びにｈａ！またはＳｐｅ　ｌで切断されたＤＮ
Ａと供に用いる。
第１ゴヌクレオチ゛２ ５’−ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ　Ａ
ＡＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ
−３’オリゴヌクレオチド４０とともに使用し、Ｅｃｏ
ＲＩで切断されるＤＮＡと供に用いる。
第１ゴヌ　レオ　゛ ５’−ＴＣＧＡＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　Ｇ（ｉＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ　Ａ
ＡＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ
−３’オリゴヌクレオチド４０とともに使用し、５ａｌ
ｒで切断されたＤＮＡと共に用いる。
第１ゴヌ　し　　゛ ５’−ＣＧＣＧＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣ
ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＣＧ　　Ａ
ＡＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡ
Ｇ−３’オリゴヌクレオチド４０とともに使用し、Ｂｓ
５Ｈ■または旧ｕｌで切断されたＤＮＡともに用いる。
オｉゴヌ　レオチ゛０ ５′−ＡＣＣＴＧ＾＾ＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣＴ
ＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　　ＡＧＧ　　Ａ
ＡＣＧＧＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　　ＧＧ＾
　ＧＡＧ−３’オリゴヌクレオチド４０とともに使用し
、旧ｎｄｎｌで切断されたＤＮＡと共に用いる。
第１ゴヌ　レオ　゛ ５’−ＧＡＴ　ＣＧ＾＾ＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣ
ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＡ
ＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ−
３’オリゴヌクレオチド４０とともに使用し、ＢａａＨ
Ｉ　。
Ｂｃｌ　１またはＢｇｌ■で切断されたＤＮＡと共に用
いる。
第１ゴヌ　し　　　′ ５’−ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ＾＾
ＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧオ
リゴヌクレオチド４０とともに使用し、Ａｃｅ　ＩＩＩ
またはＢｓｐＭＩＩで切断されたＤＮＡと共に用いる。
第１ゴヌ　レオ　３３ ５′−ＴＣＣＡＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣ
ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　　ＡＧＧ　　
ＡＡＣＧＧＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＧ、ＡＡＧ　　ＧＧＡ
　　ＧＡＧ−３’オリゴヌクレオチド４０とともに使用
し、＾ｐａＬ　Ｉで切断されたＤＮＡと共に用いる。
オＪ≦些仁Ｕオー丈ヱＵ ５′−丁ＣＧ　　ＡＴ＾　ＡＧＧ　　ＡＧＡ　　ＧＧＡ
　　ＣＧＣＴＧＴ　　ＣＴＧ　　ＴＣＧ　　ＡＡＧＧＴ
＾＾ＧＧ　ＡＡＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ、ＡＡＧ　Ｇ
ＧＡ　ＧＡＧ−３’オリゴヌクレオチド４１とともに使
用し、Ｘｈｏ　Ｉで切断されたＤＮＡと共に用いる。
第１ゴヌクレオ　゛。
５’　−ＧＧＣＣＴＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ　　
ＡＡＣＧＧＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＧ、ＡＡＧ　　ＧＧＡ
　　ＧＡＧ−３’オリゴヌクレオチド４１とともに使用
し、Ｅｇｌ　１またはＮｏＬＩ又はＸｓａ　ＩＩＩで切
断されたＤＮＡと共に用いる。
オｉゴヌクレオ　′ ５’−ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴｌｌ；Ｔ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ
　ＡＡＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ、ＡＡＧ　ＧＧＡ　Ｇ
ＡＧ−３’オリゴヌクレオチド４１とともに使用し、Ｂ
ｓｐｓ　ＩｔまたはＸｍａ　ＩＩまたはＡｃｃｌｆｆで
切断されたＤＩｒ＾と共に用いる。
第１ゴヌ　レオチ゛３７ ５’−ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＣＡＡ
ＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ、ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ−
３’オリゴヌクレオチド４１と共に使用し、ＢｓｐＨＩ
またはＮｃｏ　Ｉで切断されたＤＮＡと共に用いる。
オＩゴヌ　レオチ゛３８ ５’−ＣＴＡ　ＧＴＡＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣ
ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＡ
ＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ、ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ−
３’オリゴヌクレオチド４１とともに使用し、Ａｖｒ　
１１、ＮｈθＩまたはＸｂａ　Ｉで切断されたＩ）ＮＡ
と共に用いる。
第１ゴヌクレ　　゛ ５′−ＴＡＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣＴＧＴ　Ｃ
ＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＴＡＡＧＧ　ＡＡＣＧＧＡ　
ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ−３’オリゴ
ヌクレオチド４１とともに使用し、平滑末端をつくるこ
とのできる制限酵素により切断されるＤＮＡ　。
オ　ゴヌ　レオ　　　　イブＥ このタイプは３′末端残基に多様性がある５３塩基のオ
リゴヌクレオチド群である。
第１ゴヌクレオ　４０ ５’−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＴＣＧ　Ｔ
ＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＣ
Ｇ　　ＣＴＧ　　丁ＣＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　　ＴＣ−３
’オリゴヌクレオチド２６から３３とともに使用する。
第１ゴヌクレオ　４１ ５’　−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＴＣＧ　
ＴＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　　ＧＡＡ　　Ｔ
ＣＧ　　ＣＴＧ　　ＴＣＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　　ＴＡ−
３’オリゴヌクレオチド３４から３９とともに使用する
。
オ　ゴヌ　レオチ　　　イブＦ このタイプは５３塩基のオリゴヌクレオチドで、以下に
示すオリゴヌクレオチドタイプＧ（４３から４８）とと
もに使用し、３′突出末端ととも使用するものである。
第１ゴヌ　レオチ゛４ ５′−＾ＡＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＣＴＧＴ　Ｃ
ＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＴＡＡＧＧ　ＡＡＣＧＧＡ　
ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ−３’オ　ゴ
ヌ　レオ　　　　　　　Ｇ このタイプは、５７塩基のオリゴヌクレオチドで３′末
端の配列に４塩基に多様性がある。
第１ゴヌクレオ　４３ ５’−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　　ＣＴＣＧＡＡ　　ＴＣＧ
　　ＴＡＡ　　ＣＣＧ　　ＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　ＧＡＡ
　ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＴＣＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　Ｇ
Ｃ＾−３′オリゴヌクレオチド４２とともに使用し、Ｐ
ｓｔｌまたはＮ５ｉ１で切断されたＤＮＡと共に用いる
。
第１ゴヌクレオチ゛４ ５’　−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　　ＣＴＣＧ＾＾　ＴＣＣ
ＴＡＡ　　ＣＣＣＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　　ＧＡＡ　　Ｔ
ＣＧ　　ＣＴＧ　　ＴＣＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　　ＴＴＡ
　　ＣＣＴ−３′オリゴヌクレオチド４２とともに使用
し、５ｓｔｌまたはＳａｃ　Ｉで切断されたＤＮＡと共
に用いる。
オｉゴヌ　レオ　゛ ５’−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＴＣＧ　Ｔ
ＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＣ
Ｇ　　ＣＴＧ　　ＴＣＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　ＴＴＣＡＴ
Ｇ−３’オリゴヌクレオチド４２とともに使用し、Ｓｐ
ｈ　１で切断されたＤＮＡと共に用いる。
オ富ゴヌ　レオチ゛ ５’−ＣＴ（：　ＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＴＣＧ
↑＾Ａ　ＣＣＧ　ＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　ＧＡＡ　ＴＣＧ
　ＣＴＧ　ＴＣＣＴＣＴ　Ｃ１，Ｔ　ＴＴＧ　ＴＡＣ−
３’オリゴヌクレオチド４２とともに使用し、Ｎ９ｉ１
で切断されたＤＮＡと共に用いる。
１ゴヌ　レオチ゛ ５’−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＴＣＧ　Ｔ
ＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴＣＧＴ＾ＣＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＣ
Ｇ　　ＣＴＧ　　ＴＣＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　　ＴＴＡ　
　ＣＧＴ−３’オリゴヌクレオチド４２とともに使用し
、ＡａｔＩ［で切断されたＤＮＡと共に用いる。
第１ゴヌ　レオ　゛ ５’−ＣＴＣＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＴＣＧ　Ｔ
ＡＡ　ＣＣＧ　ＴＴＣＧＴＡＣＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＣ
Ｇ　　ＣＴＧ　　ＴＣＣＴＣＴ　　ＣＣＴ　　ＴＴＧ　
　ＧＣＣ−３’オリゴヌクレオチド４２と七もに使用し
、Ａｐａ　ｌで切断されたＤＮＡと共に用いる。
示された制限酵素は特定のオリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド対とともに用いるＤＮＡを切断するた
めに用いる。つまり、オリゴヌクレオチドｌは例えば、
Ｎｈｅ　ＩまたはＳｐｅ　ＩもしくはＸｂａ　ｒで切断
されるゲノムＤＮＡに使用される。
５′突出末端とともに用いる全てのオリゴヌクレオチド
（すなわちタイプＡ、Ｄ、Ｆ（４２）更に、オリゴヌク
レオチド１８．１９．３９）は、リン酸化されるのが望
ましい。
第１ゴヌ　レオ　゛　−７これらは他のベクターへのコ
ントラフシランに用いる。
第１ゴヌ　レオ　９ ５’−ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＧＧＴＡ　　ＡＧＧ　
　ＡＡＣＧＧＡ　　ＧＧＡ　　Ｇ−３’第１ゴヌクレオ
　゛ ５’−ＣＧＡ　ＡＴＣＧＴＡ　ＡＣＣＧＴＴ　ＣＧＴ　
ＡＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＴ
Ｃ−３’ 第１ゴヌクレオ　゛ ５′−ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＣＧＧＴＴ　ＡＣＧ　Ａ
ＡＣＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ
−３’Ｉゴヌ　レオ　　゛ ＡＡＴ　　ＴＧＡ　　ＡＧＧ　　ＡＧＡ　　ＧＧＡ　　
ＣＧＣＴＧＡ　　ＣＴＧ　　ＴＣＧ　　ＡＡＣＧＴＡＣ
ＧＣＡＴＡ　ＧＧＡ　ＧＴＣＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　
ＧＴＣＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＡＧＡＧ−３’ オクゴヌ　レオ　゛ ５’−ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡ
Ｇ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＣＧＣＴＧＴＣ丁Ｇ　　ＴＣＧ　
　ＡＡＧ　　ＧＴＡ　ＡＧＧ　　ＡＡＣＧＧＡ　　ＧＧ
Ａ−３’第１ゴヌ　レオ　゛ ５’−ＣＧ＾＾ＴＣＧＴＡ　ＡＣＣＧＴＴ　ＣＧＴ　Ａ
ＣＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＴＣ
ＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＴＣ−３’第１ゴヌ　し　　　′ ５′−ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＣＧＡ　ＣＧ
ＣＴＧＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＩＩＡＧＧＴＡ　　ＡＧＧ
　ＡＡＣＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　　ＡＡＧ　ＧＧＡ　
ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＧＧＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ−３’ オ寥ゴヌ　レオ　′ ５’−ＣＴＴ　　ＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴ　　ＣＴＣ
ＴＣＣＣＴＴ　　ＣＴＣＧＡＡＴＣＧ　　ＴＡＡ　　Ｃ
ＣＧ　　ＴＴＣＧＴＡ　　ＣＧＡ　　ＧＡＡ　　ＴＣＧ
　　ＣＴＧ　　ＴＣＣＴＣ丁ＣＣＴ　　ＴＣ−３’ 第１ゴヌクレオチ゛５７ ５′＝＾ＡＴ　ＴＧＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＣＡにＡ
　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＧ−３’１のベク　レー　ユニ・ オリゴヌクレオチド４９は、オリゴヌクレオチド５０と
アニールするべきである。
オリゴヌクレオチド５１．５２．５７は、オリゴヌクレ
オチド４０とアニールするとよい。
オリゴヌクレオチド５３は、オリゴヌクレオチド５４と
アニールするとよい。
オリゴヌクレオチド５５は、オリゴヌクレオチド５６と
アニールするとよい。
これらのオリゴヌクレオチドはＥｃｏＲ４で切断される
、染色体ＤＮＡとともに用いられる。
μｍ 塞　≧ 筒ｑ　　［Ｆ］ −。
礪　＝ 悟　　■ 表１において、）Ｉｔ、　ＮＺ、Ｎ３、Ｎ４は、標的核
酸断片と、対応する制限酵素部位に連結可能な粘着末端
を与える４つのヌクレオチドを示している。ヌクレオチ
ドＮ％及びＨ％ｌ　は制限酵素の認識形式を壊すために
留意して選択したものである。例を示す：Ｎ’ｌｌ”１
１″％４ＮＳ Ｍゝ′をＩｔｃｏＲＩ制限部位として仮にＡＡＴＴＧと
示し、ＨｒＮｘ＋ｒｓＨ４ＮＳ Ｈ％Ｉを旧ｎｄｌｌｌ制限部位として仮にＡＧＣＴＧと
示す。
「、「、１１３、Ｎ４、Ｈ％、　Ｈ％′が上で述べたＥ
ｃｏＲＩ切断部位を表す場合、特異的なベクトレットユ
ニット１から１０は表２に記述されており、各々のオリ
ゴヌクレオチドは適当な同定番号によって表示されてい
る１表２のベクトレットユニット１１および１２におい
ては、Ｈｌ、　Ｈｌ、　ＮＳ、　Ｎ４、ＮＳ、　ＮＳお
よびＨＳｒは上述の旧ｎｄｌｌｌ制限酵素部位認識パタ
ーンを表し、各オリゴヌクレオチドは適当な同定番号に
よって表示されている。
■ローロ〜口ｃＱｗの口 ！りＩ／１！い！のりいり 礪 鳩ロ オ ゴヌ レオチ び６０ は全てのコン トラフシランに使用可能である。
第１ゴヌクレオチ゛５ はユニバーサルペクトレ ットプライマーである。
例 ３′ 刹 ５′ 第１ゴヌ　レオチ′５９ は−収約なシークエンシ ングベクターでネステッドヘクトレフトプライマーであ
る。
鎚 第１ゴヌ　レオチ゛６　はネステッドユニバーサルプラ
イマーである。
例（４０）　３’　ＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣ
ＴＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣＡＡ　−ＣＣＴＣＴ
ＣＣＴＧＴＣＧＣＴＡＡＧＡＧＣＡＴＧＣＴＴＧＣＣ＾
３′　　　　　　　　聾　　　　　　　５′短いオリゴ
ヌクレオチドは、１４マープラス４２マーでアニールす
る。長いオリゴヌクレオチドは、５７マ　プラス５３７
−でアニールする。タイプＡとタイプＤはそれぞれ短い
オリゴヌクレオチドと長いものが同等である。それゆえ
、１と２６は同じ突出部を持ち、同じ酵素Ｎｈｅ　ｒ　
、　Ｓｐｅ　ＩまたはＸｂａ　Ｉで切断された叶＾とと
もに使用される。同様に２と２７は両方とも！！ｃｏｉ
ｌ　１で切断されたＤＮＡとともに使用される。全く同
じことが、タイプＢとタイプＥの１．９に、タイプＦ　
（４２）とタイプＣとタイプＧに適用される。
各オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドのと
なりに示された制限酵素によって切断されたＤＮＡと連
結される。
タイプＡとタイプＢ（そしてタイプＤとタイプＥ）は５
′の突出端と使用する。オリゴヌクレオチド１９＋タイ
プＣ（そしてタイプＦ＋タイプＧ）は３′の突出端と使
用する。オリゴヌクレオチドｌから８はオリゴヌクレオ
チド１４と対である。
９から１３と１８はオリゴヌクレオチド１７と対である
。
１９はオリゴヌクレオチド２０から２５と対である。
２６から３３はオリゴヌクレオチド４０と対である。
３４から３９はオリゴヌクレオチド４１と対である。
タイプＦ　（４２）はタイプＧのオリゴヌクレオチド４
３から４８と対である。オリゴヌクレオチド７（及び３
２）は、Ｂｓｐｓ　ＩＩで制限されるＤＮＡに使用する
ためには、オリゴヌクレオチド１１（及び３６）と取り
換えることが可能である。
オリゴヌクレオチドｌから７はオリゴヌクレオチド１４
にアニールさせるためのものであることは理解されるで
あろう。
オリゴヌクレオチド８からｌＯはオリゴヌクレオチド１
５にアニーリングする。
オリゴヌクレオチド１１から１３はオリゴヌクレオチド
１７にアニーリングする。オリゴヌクレオチド１６を使
用することは必要ではない。
第１ゴヌ　レオチ゛５８ ＣＧＡＡＴＣＧτ＾ＡＣＣＧＴＴＣＧ丁ＡＣＧＡＧＡＡ
ＴＣＧＣＴ（以下に示す方法Ｉのステップ６で概略をの
べる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の“ユニバーサ
ルベクトレットプライマー”としての３０塩基のオリゴ
ヌクレオチドである） の　　　に　　　　　　　　　第１ゴヌ　レオｌ二Ｆ これらのオリゴヌクレオチドは、以下に詳細に示すオリ
ゴヌクレオチド６５を例外として、使用される制限酵素
にかかわらず、すべてのベクトレットライブラリーに使
用できる。
オ寥ゴヌ　レオ　６ ＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＭＴ（：Ａ
ＴＴＡＡＧ（アンチトリプシンα−１遺伝子の第５エク
ソンの３′オリゴヌクレオチド） νゴヌ　レオ　　６ ＾ＡＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣＴＣＡＣＴＣＣＣＧＧＧ
ＧＡＧＣＣ（ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺
伝子の第１エクソンの５′のオリゴヌクレオチド、その
変異はフェニルケトン尿症（Ｐ）［Ｕ）の原因となる）
嘗ゴヌ　レオ　　゛ ＾ＧＧＧＡＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＧＡＧＣＴ丁ＴＴＣ
ＡＡＴＧ丁（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡ
Ｈ）遺伝子の第９エクソンの３′のオリゴヌクレオチド
）第１ゴヌクレオ　ドロ４ ＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧ
ＡＧＧＴＧ（抗トリプシンα−１遺伝子の第３エクソン
の３′のオリゴヌクレオチド） 第１ゴヌクレオ　′６ ＾ＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
ＣＣＡＴＧ（伸張させたＭＩ３のリバースプライマー）
このオリゴヌクレオチドは、Ｍ１３ＯＮＡもしくはＰｕ
ｃブラスト［ｌＮＡのインサートを増幅させるためのＰ
ＣＩ＋プライマーの一つとして使用される。
Ｉゴヌ　レオ　　６ ５’−ＡＴＣＡＧＧ　　ＴＧＣＡＣＣＣＡＧ　　ＡＧＡ
　　ＧＧＣＡＡＧ　　ＧＣＣ−３’（フェニルアラニン
ヒドロキシラーゼ（ＰＡＲ）遺伝子の第９エクソンの３
′のオリゴヌクレオチド）去汰土 方法Ｉは次の６つのステップから成るニステップｌ−オ
リゴヌクレオチドタイプＡのリン酸化、次いで、リン酸
化されたオリゴヌクレオチドのゲルによる精製 ステップ２−ステシブｌでゲルにより精製されたリン酸
化されたオリゴヌクレオチドタイプＡの３′末端にｄｄ
＾残蟇を付ける ステップ３〜修飾したオリゴヌクレオチドタイプＡを対
応するオリゴヌクレオチドタイプＢとアニールする ステップ４−ＤＮＡの調製及び制限酵素による消化ステ
ップ５〜ステツプ４で切断して脱リン酸化したＤＮＡと
アニールしたオリゴヌクレオチドタイプＡとタイプＢの
連結 ステップ６〜ステツプ５の連結産物の増幅とｌ１ＣＲの
産物の検出と分析 各ステップにおける例を次に示す。
久至ヱ１土 使用した緩衝液及びそのｌｌｂ標準液を示す。
土ｄ　　×キ　−ゼ　°。
０．５Ｍ　）リス塩酸（ｐＨ７，６） ０、ＩＭ　　Ｉ’１ｇ１ｌＪｘ ５０ａ＋Ｍ　　ジチオトレイナール Ｉ−Ｎ　スペルミジン １　ｓＭ　　ＨＤＴＡ −２０°Ｃ保存 Ｕ　　アー゛　シン５′三１ン １０−Ｍ溶液のナトリウム塩（ファルマシア社）２（１
９）ガｏ１７ｐｌに水で希釈 一２０℃保存 土」　−ジオ　イ゛　− ａ）アデノシン５’　−［ｒ　”ＰＩ三リン酸〔アマジ
ャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）比活性　約６（１０）０
Ｃｉ／ｍｓ＋ｏｌｂ）デオキシアデノシン５′−１α３
１ｐ］三リン酸〔アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）
比活性　約３（１０）０Ｃｉ／ｍ５ｏｌ 上」　ホルム　ミ′トー。
８０％（ｖ／ν）脱イオン化ホルムアミド５０１ＩＭト
リスホウ酸　ｐＨ８，３ １ｍＭ　　ＥＯＴＡ Ｏ，ＩＸ（ｗ／ν）ブロムフェノールブルー０．１χ（
ｗ／ｖ）キシレンシアツールホルムアミドは、アンベル
リット ｆｔａ）ＭＢ−１樹脂（バイオ−ランド、Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）２ｇを加えて３０分間撹拌して脱イオン化した後、
ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　　１番フィルターで濾
過した。この緩衝液は暗所で保存した。
１−Ｍ　　　　Ｏア　　１　ル　　ミ　パ肖゛５（１０
）　ｍ分量（ｐｅｒ） アクリルアミド（ｉｔ気泳動用　１９０ｇ）ビス・アク
リルアミド（を気泳動用　１０ｇ）アクリルアミドは５
ｇのアンベルリット（＾ｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＭＢ−１樹
脂（バイオ・ランド）。
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を加えて３０分攪拌した後、ワット
マン０１ｈａＬ鋤ａｎ）フィルター１番を２枚使用して
濾過した。
この溶液は４℃、暗所で保存した。
土」　θ°　′　　アンモニウム 過硫酸アンモニウム〔シグマ、（Ｓｉｇｍａ）　を気泳
動用）Ｉｇを滅菌脱イオン水に熔がし、１０ｍにあわせ
た。この溶液を暗所に保存した。
土Ｊｕ　　＋ル々・　ス （２０％　アクリル７ミド、７Ｍ尿素）５０１１分量 ２１ｇ　　尿素 ２５ｄ　　４０％　アクリ／Ｌ／７ミド溶液（１，５）
２．５ｄ　　１０ＸＴＢ！！　（１，８）重合剤を加え
る直前に混ぜる ３（１０）ｐｌ　　１０％過硫酸アンモニウム４０８１
　　　丁εＭＥＤ 土、８Ｂシ（」「−１１分量 トリス　１（１９）ｇ ＥＤＴＡ　　　９．５ｇ ホウ酸　５５ｇ １Ｏ倍ＴＢＥｌｌＩ街液は用途に応じて水でＩＸまたは
０．５×に希釈した。
土」　巖ｌ丘人 ０．１Ｍ　　トリス塩＠　　ｐｆｆ７．７１０ｍＭ　　
）リエチラミン １　ｓＭ　　ＢＤＴＡ このＶ＆街液は４°Ｃに保有し、月に１度新しいものに
作りかえる。
、、Ｌ−１Ｌ　試［１（１０）絨分量 ５０−　エタノール ５０Ｊｄ　　滅菌脱イオン水 次の試薬を１．５−ザルシュテッド（Ｓａｒｓｔｅｄｔ
）チューブの中で混和した。
オリゴヌクレオチドタイプＡ　　　１（１０）ｐｍ１（
１０）ｐ×キナーゼ緩衝液（１，１）　　　　　５．１
−アデノシン５′−三リン酸（１，２）　　９．５ａｊ
（１９０ｐｓｏ１）アデノシン５’−［ｙ”ＰＩ三リン
酸（１，３）　５ｐｌ　＜１０ｐｍｏ１）Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼＥｉＣｏｌｉ　Ｂ　（アマジャム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）　）　４０単位ＨｔＯを５０ｐｌにな
るよう加えた。オリゴヌクレオチドとＡＴＰ分子の比率
は１；２とした。オリゴヌクレオチドのリン酸化は３７
°Ｃで１時間行った。ホルムアミドサンプル緩衝液（１
，４）　２０ｐｌを加えて、２０％アクリルアミド７Ｍ
尿素変性ゲルにのせる前に酵素溶液を９０″Ｃの水槽で
１０分間変性させた。
活性化された（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴヌクレオチドの
ゲルによる精製を行なった。変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎ
ｇ）ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により、リ
ン酸化されたオリゴヌクレオチドをＭ、Ｊ、Ｇａ１ｔ［
、「オリゴヌクレオチド合成実用的アプローチ」中の１
１ｕ　Ｒ，外著の「合成オリゴヌクレオチド類の精製及
び配列解析（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ）　
Ｊ　（ＩＲＬブレス発行）に記載されているように精製
した。
Ｃ）カームに この最終段階の精製には、ＮｅＮ５ｏｒｂ”　（デュポ
ン（ＤｕＦｏｎ　ｔ）核酸精製カートリッジを使用した
。
１）　カラムの前平衡化処理 カラムをクランプスタンドに立てた。カートリッジの内
壁は２ｄのＩＩＰＬｃ用メタノールでリンスした。これ
によりカラムヘット上にゆるいバンキングのものを洗い
落した。
エアータイトシールで包まれたカートリッジの最上部に
アダプターをしっかりとはめこんだ、デスボザブルブラ
スチックシリンジを空気を満たし、アダプターに取り付
けた、一定のおだやかな圧力をかけて、メタノールをカ
ートリッジの中へ通らせた（流速　１滴／２秒）、同時
に２ｄの緩衝液Ａ　（１，９）を通してカラムの準備を
した。
２）試料の充填 オリゴヌクレオチドを含む２ｐｌの水にトリエチルアミ
ン２．８μｌを加えた。これをカラムペットの上にシリ
ンジと針を使用して直接加えた。試料はＣ（１）のとき
と同じように空気を満たしたシリンジを使って、カラム
を通過させた。
３）　試料の洗浄 ３ｐｌの緩衝液Ａ　（１，９）をシリンジと針を使用し
てカラムに加えた。これもＣ（１）と同じようにおだや
かな力でカラムを通過させた。
４）１ｍの試薬Ｂ（１，１０）をカラムの上にのせたそ
のＤＮＡはＣ（１）と同じように空気を満たしたシリン
ジを使いおだやかな力でカラムペットがら流出した。流
出したＤＮＡは１．５ｍザルシュテッドチューブに集め
、そして真空を負荷した遠心機中で乾燥させた（ＵＮＩ
ＶＡＰ：ユニサイエンス社）。
乾燥した、精製されたオリゴヌクレオチドは必要なとき
に再懸濁した。
久之ヱプＩ 次の緩衝液とその他の標準液を使用した：２、Ｌｌ、４
Ｍ　　カコジル酸ナトリウム塩酸でｐｉａ，５に調製 一２０℃で保存した。
２、Ｌ　　５−Ｍ　　塩化第１コバルト２０℃で保存し
た。
ＬＬ　１ｍＭ　ジチオトレイトール −２０°Ｃで保存した。
訃　デオキシアデノシン５′−三リン酸凍結乾燥ナトリ
ウム塩（ベーリンガー、マンハイム社、　Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｓ＋）水で希釈して１０５
Ｍを保存溶液用とし、そして１ｍＭを実験溶液用とする
。
ＬＬＯ，５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０ ステツプｌで述べたように、オリゴヌクレオチドタイプ
Ａをリン酸化し、リン酸化されたものを精製した。８０
％の回収率で、リン酸化され（ｋｉｎａ−ｓｅｄ）、タ
ーミナルトランスフェラーゼ反応に使用できる、オリゴ
ヌクレオチド８（１９）ＩＩＯＩを得た。
リン酸化しくｋｉｎａｓｅｄ）　、精製したオリゴヌク
レオチドＩ　ＲＱｐｍｏｌを４８ｉ１１の滅菌脱イオン
水に再懸濁した。
リン酸化したオリゴヌクレオチドに次のものを加えた。
　　（４８ｐ７のオリゴヌクレオチド（８０ｐｍｏ１）
１　ｐｌ　　１　＋ｓＭ　　ｄｄＡＴＰ（Ｉｎ　５ｏｆ
）　（２，４）ＬＯｐｌ　　１．４Ｍ　　カコジル酸（
２，１）１０βｌ　　　１＋ｓＭ　　　ＤＴ？　　（２
，３）２（ｈｌ　　５鴎Ｈ塩化第１コバルト（２，２）
５ＩＩＩｄｄＡＴＰ（α−”Ｐ）　（１５ｐｗｏ１）（
１，３ｂ）６ｔｉｌ　　ターミナルトランスフェラーゼ
（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ）　ＴｄＴの
１５０単位） 反応液は３１’Ｃで１時間保温し、次に４バの０．５ｈ
ＥＤＴＡを加えて、反応を停止した。
２０％アクリルアミド７ｈ尿素変性ゲルに試料をのせる
前に、４０〆のホルムアミド試料緩衝液を加えて（１，
４）　、９０°Ｃの水浴で１０分間保温することにより
試料を変性させた。
ゲルの電気泳動はステップ１で述べたように行った。
ここで、１５マーのオリゴヌクレオチドタイプＡのバン
ドをステップ１で述べたように切り出し、そして精製し
た。最終回収率は５０ｐａ＋ｏｌと見積もられた。これ
を０．２ｐ＋ｗｏ！／ｐＺの４度になるように、２５０
μｌの滅菌脱イオン水に再懸濁する。
次の溶液を必要とした。
３ＬＬ１０×アニール緩衝液 １（１０）ｍＭ　　）リス塩酸（ρ）１８．０）１（１
０）ｍＭ　　Ｍｇ（Ｊｘ 次のものを１．５ｍスクリューキャップザルシュテッド
（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）チューブで混和した。
２５ｐｍｏｌｓの修飾したタイプＡオリゴヌクレオチド
（ステップ１と２を経て得られた） ２５ｐｍｏｌのタイプＢオリゴヌクレオチド５ｐｌ　　
ＩＯＸアニール緩衝液（３，１）そして水を加えて５０
ｔｔｌとした。
もし、タイプＡオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチ
ド１．２．３．４の中から選ぶときは・これらに適当な
（ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ）タイツ“Ｂオリゴヌクレオチ
ドは１．オリゴヌクレオチド１４である。
エツベンドルフチューブを沸騰している水浴に１いた。
（小さなビーカーが便利である）５分後、ビーカーの水
を２時間以上かけてゆっくりと室温に戻した。最後にチ
ューブの内容物を１０秒間遠心し、チューブの底に集め
た。濃度０．５ｐｓｏｌ／μｌのアニールしたオリゴヌ
クレオチドは連結に使うことができる。
１、ヒトゲノムＤＮＡ　　ｌ ＤＮＡ　ｌｊｌ製と細胞増殖中のシチジン残基のメチル
化を防ぐために、培地に０．１■／Ｉｄの５−アザシチ
ジンを加えた。
２、ヒトゲノムＤＮＡ　ＩＮ（ゲノムＤＮＡは、リンパ
芽球細胞から調製した） 次の逓」■良査１υＬした。
’＝ｌ−１ｙ１１０１五辰 １１（１０）ＩＩトリス塩酸　ｐＨ７，５１０抛門　ｎ
ｇｃ！。
ｌＯ鋤ｈジチオトレイトール ４２　　■し已Ｆ塩ｌｕ１辰 １（１０）ａ＋Ｍ　　トリス塩酸　ｐＨ７，５１（１０
）鵬Ｍ　　阿ｇＣＪｇ ５（１０）ｓＭ　　ＮａＣＪ １０ｍＭ　ジチオトレイトール １Ｊ−■ｙｊ１１１黴直 ５（１０）ａ＋Ｍ　　）リス塩酸　ｐＨ７，５１（１０
）ｎＭ　　　Ｍｇ（Ｊ。
１（１０）ｍＭ　　Ｎａ（Ｊ ｌＯ鋤ｎジチオトレイトール ！Ｌ、Ｌ　１更汐粒ｍｌＵ」［１液 １（１０）曙ｉ　トリス塩酸　ｐｏａ、。
５〇−台　　ＭｇｌＪｚ １（１０）０ｎＭ　　Ｎａ　Ｃｊ １０ｍＭ　２−メルカプトエタノール 虹５　１０ｘ玉舷艶目１直液 １（１０）■Ｈトリス塩酸　ｐｌ＋７．５１（１０）１
Ｍ　　　ＭｇＣｌ　！ ５（１０）ｍＭ　　ＭｇＣｌ ４６　　ｕｉｌｉ欣 ｌＯＩａＭトリス塩酸　ｐＨ７，５ １、ａ＋Ｍ　　　ＲＤＴＡ ＬＬ　　ガロース量　コ　　゛ １５％（−／ν）フィコール４（１０）０．０５％（ｗ
／ｖ）ブロモフェノールブルー０．０５％（ｗ／ν）キ
シレンシアツール試料緩衝液はＩＸＴＢＢで調製した（
１．８）Ｕ　　利Ｘ汀り援１撒 ５（１０）ｍＭ　　）リス塩＃　　ｐＨ８，０１ｍＭ　
　　［！ＤＴＡ （ｉ）次の条件は、特異的な制限エンドヌクレアーゼに
よるゲノムＤＮＡの切断のために使用したものである。
５０１１ｇのＤＮＡ ２Ｑ＃１の適当な１０×制限緩衝液 ５０単位の希望する制限エンドヌクレアーゼ反応液の最
終量を２（１０）ｐ！に合わせた。
３７°Ｃ’ｔ’２時間消化した。　　４　ｐｌ（Ｄｏ、
５Ｍ　ＥＤＴＡ（２，５）を加えて反応を停止した後、
試料を７０℃で１０分間加熱した。
（ｉｉ）１■の試料を完全に消化されたことを確かめる
ためにアガロースゲルで電気泳動して確認した。
アガロース　ル　′。
ゲルは１×のｔａ［！（ｔ、８）ｆｉ衝液液中０．７χ
（ｗ／Ｖ）のアガロース（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）でつくり、電気泳動用の同じ濃度のＴＢ［ｌ
緩衝液に浸しておいた。試料をゲルの穴にのせる前に、
１１５量のアガロース試料緩衝液（４，７）を加えた。
電気泳動の後、ゲルは１尾／−のエチジウムプロミドを
含んだ脱イオン水に１０分間浸すことによって染色され
た。そのＤＮＡは、トランスイルミネータ（マクロビニ
−（Ｍａｃｒｏｖｕｅ）、ＬＫＢ社）を使用し、３０２
量ｍで観察した。
（ｉｉ　）　（ａ）　　消化された叶＾はフェノール抽
出により精製された： 等量の緩衝化再蒸留フェノール（８１２１社、ＴＥ（４
゜６）で緩衝化された核酸用フェノール）を制限酵素で
消化されたＤＮＡに加えて、その混合物を３０秒間ポル
テックスした。遠心を５分間すると、生じた白い乳液状
態から２層に分かれた。水層を新しいチューブに移した
。水層に残ったフェノールは、等量のフェノール：クロ
ロホルム；イソアミルアルコール（２５：２４：１）に
よる最初の抽出の後、等量のクロロホルム：イソアミル
アルコール（２４；１）で除かれた。
［有］）　ＤＮＡは最後にエタノール沈殿により精製し
た。
最終濃度が３（１０）１１Ｍの酢酸ナトリウムとなるよ
うに、３Ｍの酢酸ナトリウムを１／１０量［ＩＮＡ溶液
に加えた。９５％のエタノールを２．５倍量加えて、−
８０°Ｃで３０分間放置した後、遠心して、ＤＮＡを沈
殿した。
（マイクロ遠心器で１２．ＯＯＯｒｐｍ　、５分間］、
沈殿したＤＮＡを８０％（Ｖ／ｖ）の冷エタノールで洗
った後、真空下で乾燥させた。　ＤＮＡは必要時に緩衝
液に熔かした。
（ｉｖ　）　　　　　　　たＤＮへの　Ｉン切断したＤ
ＮＡを自己連結を防ぐため脱リン酸化した。制限酵素で
切断し、精製したＤ１１八を１７５μｌの滅菌脱イオン
水に溶かした。
このＤＮＡにカロえるもの ５μｌの子牛　小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（ベーリ
ンガーマンハイム社、（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎ
ｈｅｊｍ）　　（１単位／　１１　）２０ｐＺａ）ＩＯ
ＸＣＩＰ　緩衝液（４，８）試料を３７°Ｃで６０分間
保温した。４ｔｒｌの０．５？ｌ　Ｉ！ＩＩＴＡを加え
た後脱リン化されたＤＮＡは、上の（ｉｎ　）　（ａ）
及び（ｕｉ　）　（ｂ）で述べたように、フェノール抽
出とエタノー沈殿で精製した。最終的なりＮＡの沈殿は
ｌ屑／　ｕｌの濃度になるように、５０ｐｌのＴｌ！＄
１ｉｌｉ液（４，６）に溶かした。
２（１０）ａ＋Ｍ　　ｌ−リス塩酸　ｐＨ１，４１（１
０）ｍＭ　　　Ｍｇ（Ｊｚ １（１０）ｍＭ　　　ロＴＴ １０＋Ｍ　　　ＡＴＰ 次のものを１．５ｍのザルシュテｙ　ト（Ｓａｒｓｔｅ
ｄｔ）チューブの内でｌ昆和した 切断されたゲノムＤＮＡａ，４ｐ鵬０１）　　　　１０
眉アニールしたオリゴヌクレオチド　　ｌｌｐｍｏｌｅ
ステップ３より １０×連結緩衝液　　　　　　　　　　１０ａｌＴ４　
ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンノλイム社、（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｌｍ）　　２単位滅菌
脱イオン水で１（１０）μｌにした。
連結反応液は４°Ｃに１晩放置した。連結の効率を連結
産物０，５％をゲル電気泳動することによって確めた。
−手順の詳細はステップ４（ｉｉ）参照。
連結産物は次にステップ４　（ｉｉ）で述べたように、
フェノール抽出とエタノール沈殿によって精製した。最
終ＤＮ＾沈殴沈殿ｌ１ｇ／ｐｌの濃度になるように、９
．５１の↑［！緩衝液（４，６）に溶かした。
囚１１プ旦 スー・ブ５の゛　七　　の１　鼓 次の緩衝液及び他の標準液を使用した。
ＦＬｌ　　ｌｙ１■ＯＬ１に ５（１０）麟ＭＸＣ７ １（１０）ｓ＋Ｍ　　ｌ−リス塩酸　ＰＨ８，３１５＋
＊Ｍ　　ＨｇＣ１ｚ Ｏ０１χ　ゼラチン ２０゛Ｃで保存 ＬＬ　区え上土上上 ｌＯ×保存液 ２ｍＭ　　ｄＡＴＰ ２ｍＭ　　ｄＴＴＰ ２＋＋＋Ｍ　　　ｄＧ丁Ｐ ２ｍＭ　　　ｄＣ丁Ｐ −２０°Ｃに保存 、Ｌ３−　エエズヱニ左二 Ｈａｅ　ｍで切断したバタテリオファージφＸ１７４　
；塩基対で表した各バンドの大きさは： １３５３、ｔ０７８．８７２．６０３．３１０．２８１
．２７１．２３４．１９４．１１Ｂ及び７２゜ 次のものはｔ、ｓＭｌねじ口５ａｒｉｔｓｄｔチューブ
の中で混和した。
Ｉｎのステップ５からの連結産物。
１（１０）１（１０）ｐ　のオリゴヌクレオチド５８１
（１０）ｐ■ｏ１　のオリゴヌクレオチド６１または６
２または６３ １０．７　１０Ｘ増幅緩衝液（６，１）１０ｐｌ　　１
０ｘ保存ヌクレオチド溶液滅菌脱イオン水で１（１０）
）−に合わせる。
そのチューブを沸騰水槽中に５分間放置した。
Ｔａｑポリメラーゼ（アニグリアン社、（＾ｎｇｌｉａ
ｎ））を１×増幅緩衝液（６，１）で１単位／Ｉに希釈
した。
２ｐ１の希釈した酵素を上の煮沸した、反応混合液に加
えて混和した。内容物をマイクロ遠心器で５秒間まわし
て底におとした０次に５０ｐ！のライトミネラルオイル
（シグマ社（Ｓ１ｇｓ＋ａ））を反応混合液の上に重層
した。（以下の反応中の蒸発を防ぐため） チューブを次の水浴に置いた： １）６０°Ｃ２分間 ２）７２゛Ｃ３分間 ３）９１°Ｃ２分間 ステップ１）、２）、３）を３９回繰返した。チューブ
を６２゛Ｃの水槽で２分間置き、次に７２°Ｃで８分間
保温した。増幅が終了した時に内容物を下にまわし落し
てミネラルオイルをピペットで除いた。
Ｌ５ｔｔｌの増幅産物を、ステップ４（ｉｉ）で述べた
ようにアガロースゲル電気泳動で分析した。増幅産物の
大きさを測定するために、）ｌａｅ　ＩＩＩによって切
断されたφχ１７４（６，３）を増幅された試料のとな
りに流した。
方法１ 方法口は次のステップから成る： ■、オリゴヌクレオチドタイプＡの３′末端にｄｄＡ残
基を付け、続いて３′末端が標識されたものをゲル精製
した。
２．３′末端が４ｊＡ議されたオリゴヌクレオチドタイ
プＡのリン酸化、続いて取り込まれなかったヌクレオチ
ドの分離。
３、修飾されたオリゴヌクレオチドタイプＡを、対応す
るオリゴヌクレオチドタイプＢとアニールする。
４、ゲノム口Ｎ＾の切断。
５．７二−ルされたオリゴヌクレオチドＡ＋Ｂと切断さ
れたＤＮＡとの連結。
６、連結産物の増幅。ＰＣＲ産物の検出と分析。
上のステップ群は例えば次のように行なわれる：久之ヱ
１上 実験の詳細は方ｉ１のステップ２と全く同じである。
スｊシｆｆｌ オリゴヌクレオチドは、方法１のステップｌで述べたよ
うにリン酸化する。リン酸化されたオリゴヌクレオチド
は、方法ＩのステップＩ（ｉｉ）Ｃで詳細を示したよう
にカラムを通して直接精製する。試料をカラムにのせる
前に、トリエチルアミンの代りに２（１０）μ！の緩衝
液Ａ（１，９）を反応液に加える。
スミ１１１か血■は、方法Ｉと全く同じである。
次のステップ群が含まれる： ■、１４マーのオリゴヌクレオチドタイプＡのリン酸化
と、それに続くリン酸化された分子種のゲル精製 ２、リン酸化されたオリゴヌクレオチドの３′末端−・
のｄｄＡ残基の負荷とそれに続くゲル精製３、オリゴヌ
クレオチドタイプＡと対応するオリゴヌクレオチドタイ
プＢのアニール ４、ＤＮＡの制限酵素による消化 ５．７二−ルされたオリゴヌクレオチドＡ＋Ｂと制限酵
素で切断されたＤＮＡとの連結 ６、何もついていない３′末端へのジデオキシヌクレオ
チドの付加 ７、連結産物の増幅。増幅産物の検出と解析。
このようなステップは例えば次のように行われるニ ステップ上からｊは方法Ｉの詳細と全く同じである。
ステヱプエ ステップ５からの精製された連結産物を３０μｌの滅菌
脱イオン水に熔かす。
ＤＮＡに次のものを加えるニー ５ｔｒｌのｌＯ×増幅緩衝液（６，１＞１５ｐ■０１の
適当なジデオキシヌクレオチド１単位のＴａｑポリメラ
ーゼ（Ａｎｇｌｉａｎ社）水を加えて５０ｐ！にする。
反応混合液を３７°Ｃで３０分間保温する。
ＤＮＡを方法■、ステップ４（ｉｉｉ）で述べたように
、フェノール抽出し、エタノール沈殿して精製する。
ＤＮＡ沈殿を１ｐｇ／μ！の濃度になるように、５０ｔ
ｒｌのＴＥ！１衝液（４，６）で溶かす。
２ｊ＝乙プｊ−は　方法Ｉのステップ６と同じ方法Ｎ 方法■のステップ６が方法■のステップ５と６の間に挿
入される以外は、方法■と全く同じである。
方ユｎ 方法Ｖは以下のステップ群を含む； １．５７マーのタイプＤオリゴヌクレオチドのリン酸化
と、それに続く取り込まれなかったヌクレオチドからの
分前 ２、リン酸化された、例えばリン酸化されたタイプＤオ
リゴヌクレオチドとそれに適したタイプＥオリゴヌクレ
オチドのアニール それに続けて、前の方法１−ＩＶのステップ４このよう
なステップ群は例えば次のように行われる １、オリゴヌクレオチドは方法１１ステツプ１で述べた
ようにリン酸化する。精製は方法Ｉ、ステンブＩ（ｉｉ
）Ｃで述べたように、ＮｅＮ５ｏｒｂ”カラムを通して
行う。
２、アニールは方法Ｉの詳細と同しように。
前のステップ４は前に詳細をのべた（方法■及び■）。
方法■ 方法■は次のステップ群を含む； １、タイプＡの１４マーオリゴヌクレオチド、（または
オリゴヌクレオチド１８、または１９、または３９、ま
たはタイプＦ　（４２）またはタイプＤのとれかのリン
酸化と、それに続くリン酸化された分子種のゲル精製 ２．リン酸化されたオリゴヌクレオチド１８．１９また
はタイプＤと対応する適当なオリゴヌクレオチドタイプ
Ｂ（またはタイプＣ）またはタイプＥ１またはタイプＧ
とのアニール ３、ゲノムＯＮＡの制限酵素消化 ４．７二−ルされたオリゴヌクレオチド群と消化された
ＤＮＡの連結。
５、上のステップからの連結産物の制限酵素による消化
。
６、アニールしたオリゴヌクレオチドとステップ（５）
での産物をさらに連結。
７、ステップ（５）、（６）の繰返し。
８、ステップａ）の産物の最後の制限酵素による消化。
９、ステップ（８）からの産物の３′末端へのデオキシ
ヌクレオチド三リン酸の付加。
１０、ステップ（９）の産物の増幅、増幅産物の検出と
解析。
このようなステップ群は例えば次のように行われるニ ス孟ｌブ土 方法１のステップ１に述べたものと同様。
回天上１１ このステップは方法■のステップ３で述べたものと同様
。
例；− オリゴヌクレオチド１から７は１４とアニールされる。
オリゴヌクレオチド１１から１３及び１８は１７とアニ
ールされる。
オリゴヌクレオチド２０から２５は１９とアニールされ
る。
オリゴヌクレオチド２６から３２は４０とアニールされ
る。
オリゴヌクレオチド２４から３９は４１とアニールされ
る。
オリゴヌクレオチド４３から４８は４２とアニールされ
る。
２＆ｊ！ムプ」− このステップは方法１の４（ｉ）、４　（ｉｉ　）と４
（ｉｉ）と同じであるが、制限酵素で切断されたＤＮＡ
は脱リン酸化されていない。
２（１０）ｍＭ　　）リス塩酸　ｐＨ７，４１（１０）
−一　　Ｍ、Ｃ／。
１（１０）５Ｍ　　　ＯＴＴ １０ｓＭ　　＾ＴＰ （ｉ）切断されたＤＮＡの１■中の粘着末端のｐｍｏ　
Ｉの計算は方法１のステップ５で説明したのと同様であ
る。
（ｉｉ　）　Ｍ払 次のものは１．５ａｅ　５ａｒｓｔｅｄｔチユーブの中
で混和する： 切断されたゲノムＤＮＡ　７．４ｐｍｏｌ（１０丙）ス
テップ２でアニールされたオリゴヌクレオチド　　　　
　ｌｌｐｍｏｌ １０×連結緩衝液（４，１）　１０μ！７４　ＯＮ＾リ
ガーゼ（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　
２単位滅菌脱イオン水で体積を１ｏｈｆにする。
連結反応液は４°Ｃに一晩放置した。
連結の効率を連結産物の５％をゲル電気泳動することに
より確めた一手順の詳細は方法Ｉのステップ４（ｉｉ）
を参照。
連結産物は方法Ｉのステップ４　（ｉｉｉ　）で述べた
ように、フェノール抽出とエタノール沈殿によって精製
した。
ス至１プエ このステップは上のステップ３と同じである。
ス主Ｊ このステップは、ＤＮＡをアニールしたオリゴヌクレオ
チドを等モル濃度使っている点を除いて上のステップ４
と同じである。
例　７．４ｐ＊ｏｌ　のＤＮＡ ７．４ｐｍｏｌ　のアニールされたオリゴヌクレオチド 久天ヱ１ユ 上のステップ５と６を繰返す。
、ステップ」− 上のステップ５と同じ ２（１０）１ＩＭトリス塩酸　ｐＨ７，５１（１０）ｓ
Ｍ　　ＭｇＣｆｚ ２５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ ｇ、ＬｄＮＴＰ−ｄＡＴＰ ｌ麟Ｍ　　ｄＴＴＰ １　ｍＭ　　ｄＧＴＰ ｌ　ｎＭ　　ｄＣＴＰ 滅菌脱イオン水で調製した。
ｍ　　韮紅ム １１Ｍ　　ｄｄＡＴＰ 滅菌脱イオン水で調製した。
（ｉ）ステップ８の産物の３′末端へのｄｄＡ残基の付
加 次のものは１．５ａｄ　５ａｒｓｔｅｄｔチユーブの中
で混和した ４　ｕｇの上のステップ８からのＤＮＡ２０ｔｒｌの５
　ＸＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（９，１）２０ｐ
！のｄＮＴＰ　−ｄＡＴＰ（９，２）２０μ！のｄｄＡ
ＴＰ（９，３） ５単位の７７　ＤＮＡポリメラーゼ（シークエネース）
滅菌脱イオン水で体積を１（１０）ｐＺに合わせた。
そのチューブを３７゛Ｃで３０分間保温した０次に酵素
は７０゛Ｃで１０分間保温することにより変性した。
次にそのＤＮＡは前に述べているように、フェノール抽
出とエタノール沈殿を行って精製した。
λ±１プ刊 このステップは方法Ｉのステップ６と同じであるか、増
幅を温度順回機（例えばＴｅｃｈｎｅ　ｐｒｏｇｒａｍ
ａｂｌｅ　Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋ　ＰＨＣ−１）で行うこ
ともできる。
この方法■において、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼのジデオキ
シヌクレオチドに特異的な予期せぬエキソヌクレアーゼ
活性による、３′末端のｄｄＡ残基の損失を妨ぐために
ジデオキシアデノシン５′−三リン酸をＴＶ　ＤＮＡポ
リメラーゼ（シークエネース）の存在下で、連結された
オリゴヌクレオチドの３′末端に反応させることは好ま
しい。
方法■ 方法■は、方法■のステップ１を省略することを例外と
して方法■と同じである。更にこの方法ではゲル精製の
実施もないが、連結の効率はアガロースゲル電気泳動と
エチジウムプロミド染色で確認できる。
方法■ 方法■は方法■のステップ９を省略することを例外とし
て方法■と同じである。この方法で使ねれるオリゴヌク
レオチドは例えば次のとおりである ２６から３２は４０とアニールする ２６から３９は４１とアニールする ４３から４８は４２とアニールする 方法■ 方法■は以下のステップ群から成る。
１、リン酸化 ２．７二−リング ３、ＤＮＡの制限酵素による消化 ４．７二−ルされたオリゴヌクレオチドと切断されたＤ
ＮＡとの連結（例えば２５°Ｃで）５、制限酵素による
切断／連結 ６、ステップ５からの産物の増幅と増幅産物の検出と解
析。
上のステップ群は、例えば、方法■の対応するステップ
群について述べられているように行われる。
１抜Ｘ 方法Ｘのステップ１．２及び３は、方法■のステップ１
２及び３と同じである。方法Ｘのステップ４（ｉ）も方
法■のステップ４（：）と同じであるがステップ４（ｉ
ｉ）の例は次のように行われる：４（ｉｉ）ｊｌ慧 次のものは０．５ｄの５ａｒｓｔｅｄｔチユーブの中で
混合した。
制限酵素で切断された７３Ｂ？　ＤＮＡ　０．７４ｐｍ
ｏｌｅｓ（１ｇ）アニールされたオリゴヌクレオチド１
．６５Ｐ■ｏｌｅｓ１０×連結緩衝液（４，１）　　　
　　　　　ＩＩＩＺ１０ＸＡＴＰ　　（４，２）　　　
　　　　　　　　　　　１ｐｌＴ４　ＯＮＡリガーゼ（
ヘーリンガーマンハイム社）１　　ｕｎｉｔ Ｈ，Ｏで　　　　　　　　　１０ｔｈｌになるように連
結反応液は２５“Ｃに（Ｔｅｃｈｎｅ　Ｄｒｉ旧ｏｃｋ
の内で）１２０分間放置した。
次に連結反応液はＤＮＡ濃度が１０ｎｇ／μｌに水で希
釈され、そして以前に示した方法８のステップ１０に述
べたように、増幅反応を受けた。
方法Ｘ± 方法×１は、方法Ｘと次にあげること以外は同じである
ニー 方１しく■ 方法Ｘ■は、ステップ４（ｉｉ）で連結反応液を２５゛
Ｃで２時間のかわりに４°Ｃで一晩放置する以外は方法
Ｘと同じである。
最後に連結産物を水でＤＮＡｆｉ度１０ｎｇ／ｐｉにな
るように希釈した。
方法１ｍ 方法Ｘ■は、４°Ｃ−晩の連結反応した後、連結産物を
適当な制限エンドヌクレアーゼ消化することを除いて、
方法ＸＨと同しである。
この反応は次のものにより行なわれた：ＩＯμｌの連結
反応液に加えるもの ２ｕｌの適当なエンドヌクレアーゼのためのｊｌｄｊ液
（３，ｌ参照） ２単位の制限エンドヌクレアーゼ（ヘーリンガーマンハ
イム社） ２５°Ｃ１１２０分間の連結反応の後、連結産物は次の
添加により制限エンドヌクレアーゼにより消化される； ２ｕｌの適切な制限エンドヌクレアーゼ用の緩衝液（３
，ｌを参照） ２単位の制限エンドヌクレアーゼ １（２０で２０μｌにする そして３７°Ｃで６０分間保温する。
次に試料は１０ｎｇ／μ１ＯＤＮＡａ度にＦｌ、Ｏで希
釈された。
ＨＪを加えて２μｌにする そして３７゛Ｃで６０分間、保温する。
試料はその後、ＤＮＡ　７１７４度１０ｎｇ／μｌにな
るように希釈された。
１１１例」− オリゴヌクレオチド１およびオリゴヌクレオチド１４は
、上述の方法■の第１段階および第２段階で記載された
ようにして調製された。方法１で用いられるこれらのオ
リゴヌクレオチドは、上述の第３段階で記載されるよう
にアニールされた。ヒトゲノムＤＮ＾■は、方法Ｉの第
４段階に記載されるように調製および切断された。制限
酵素Ｘｂａ　１で切断され、（上述の第４段階に詳述さ
れているように）脱リン酸化されたヒトゲノムＤＮＡ　
ＩＩは、上述の第５段階に記載されていることとまさに
同じようにしてアニールされたオリゴヌクレオチド１お
よびオリゴヌクレオチド１４とライゲーションされた。
次いで、増幅がこのライゲーション産物について行なわ
れた。
上文中で述べられたように、第１１（ｉ）図は、レーン
１および１１にｔｌａｅｌ［で切断したφＸ１７４７−
カーと、レーン１２にλ旧ｎｄｍマーカーならびに、レ
ーン２には増幅の対照を、そしてオリゴヌクレオチド５
日および６１を用いて得られた増幅断片を示している。
この増幅された断片は予想されたように８（１０）塩基
対長である。
第１１（ｉｉ）図も、レーンｌと１３にλ旧ｎｄｌｌｌ
？−カーを示し、レーン２と１２にＨａｅ　ＩＩで切断
したφχ１７４マーカーならびに、レーン３に増幅の対
照およびレーン１０にはオリゴヌクレオチド５８と６１
を用いて得た増幅断片を示している。
ス崖ｍ オリゴヌクレオチド１と１４を、制限酵素Ｘｂａ　１で
切断したＤＮＡとともに使用。
ａ）　オリゴヌクレオチドｌ　（１（１０）ｐｍｏｌｅ
ｓ）を、方法■の第１段階に記載されたようにしてリン
酸化し、リン酸化されたオリゴヌクレオチドを精製した
。
ｂ）　リン酸化されたオリゴヌクレオチド１は、オリゴ
ヌクレオチドの３′末端にジデオキシアデノンン残基を
付加するために、ターミナル・トランスフェラーゼで処
理した。その結果得られた１５量体のオリゴヌクレオチ
ド１（＋３’端のｄｄＡ）を、方法■の第２段階で述べ
られるようにして精製した。
Ｃ）　オリゴヌクレオチドｌを、オリゴヌクレオチド１
４にハイブリダイズした。
ｄ）　ヒト・ゲノムＤＮＡ　Ｉｔを制限酸素Ｘｂａ　Ｉ
で切断し、方法Ｉで詳細に述べたように脱リン酸化した
。
ｅ）　アニールしたオリゴヌクレオチド１および１４を
χｂａｌで切断したヒト・ゲノムＤＮＡ　ＩＩにライゲ
ーションしたｍ−詳細は方法１を参照。
ｆ）　増幅は、オリゴヌクレオチド刹およびｕ２を用い
たライゲーション産物について行なった。この場合予想
される増幅産物は約８（１０）塩基対である。
実施班ユ オリゴヌクレオチドＩおよび■と制限酵素ＥｃｏＲＩで
切断したＤＮＡを使用。
ａ）実施例（２）で述べたように、オリゴヌクレオチド
２をリン酸化し、その３′末端にｄｄＡ残基を付加した
。次に、この修飾されたオリゴヌクレオチドをオリゴヌ
クレオチド１４にアニールした。
ｂ）　方法！に述べられているように、ゲノムＤＮＡＩ
を制限酵素［！ｃｏＲＩで切断し、脱リン酸化した。
Ｃ）　次に、アニールしたオリゴヌクレオチモ■を、Ｅ
ｃｏＲ１で切断したゲノム［ｌＮＡ　Ｉとライゲーショ
ンさせた。
ｄ）増幅は、 （ｉ）オリゴヌクレオチド皿および姪。
予想される産物は、約２２０塩基対である。
（ｉｉ）オリゴヌクレオチド皿および雌。
予想される産物は、約５６０塩基対である。
を用いたライゲーション産物について行なわれた。
遺」１井土 オリゴヌクレオチド主および口と制限酵素Ｂａ曽ＨＩで
切断したＤＮＡを使用。
ａ）実施例１で述べたように、オリゴヌクレオチドｌを
リン酸化し、その３′末端にｄｄＡ残基を付加した。
ｂ）　このように調製したオリゴヌクレオチドをオリゴ
ヌクレオチド１４にアニールした。
Ｃ）　方法１に述べられているように、ゲノム０ＮＡＩ
を制限酵素Ｂａ＋＊ｌＩ　Ｉで切断し、脱リン酸化した
。
ｄ）　アニールしたオリゴヌクレオチド１および■を、
次にＢａｗｌ　Ｉで切断したゲノム［ｌＮＡ　Ｉとライ
ゲージタンした（詳細は方法■を参照）。
ｅ）　次いで、ライゲーション産物の全ての３′末端を
、方法主の第６段階に記載された方法を用いて堕虹残基
で保護した。
ｆ）　最後に、増幅をオリゴヌクレオチド皿および鑓を
用いてこれらの産物について行なった。
予想される産物は約２（１０）塩基対である。
１１■ｌ− オリゴヌクレオチド主および■と制限酵素Ｂａ鳳ＨＩで
切断したＤＮＡを使用。
ａ）実施例（４）で上述したようにして、オリゴヌクレ
オチド３を調製し、オリゴヌクレオチド１４にアニール
した。
ｂ）　　４４０塩基対の挿入断片（第１Ｏ図、超参照）
を含むρυＣ８プラスミドＤＮＡは、方法Ｉに詳述され
ているようにして制限酵素Ｂａｇ）ｌ　Ｉで完全に消化
し、脱リン酸化した。
Ｃ）　オリゴヌクレオチド１と口をＢａｍＨＩで切断し
たＢ３プラスミドＤＮＡとアニールした。
ｄ）実施例４に詳述されるようにして、ｄｄＧ残基を３
′遊離末端に連結した。増幅は、オリゴヌクレオチド５
８と６５を用いたライゲーション産物について行なった
。上文に記載した第１１（ｉｉｉ）図は、レーン１およ
び１１にλ旧ｎｄｌ［ｌマーカーと、レーン６に１Ｉａ
ｅＩ［［で切断したφｘ１７４マーカーおよびレーン２
．　３．　４および５に実施例５にしたがって得られた
増幅された断片を示している。予想されたように、産物
は４４０塩基長である。
災隻班ｌ オリゴヌクレオチド２６と４０を、制限酵素Ｘｂａ　１
で切断したＤＮＡとともに使用。
ａ）　オリゴヌクレオチド２６を、方法Ｖに記載された
ようにしてリン酸化し、リン酸化されたオリゴヌクレオ
チドを精製した。
ｂ）　リン酸化したオリゴヌクレオチド２６を方法Ｉの
第３段階に記載されている条件下でオリゴヌクレオチド
並とアニールした。
Ｃ）　ヒト・ゲノムＩ）ＮＡ　ＩｔをＸｂａ　ｌで切断
し、方法１の第４段階に記載されるようにして脱リン酸
化した。
ｄ）　次に、アニールしたオリゴヌクレオチド２Ｇと４
０を制限酵素Ｘｂａ　Ｉで切断したゲノムＤＮＡ　ＩＩ
とライゲーションした（詳細は方法Ｉの第５段階を参照
）。
ｅ）　ライゲーション産物中の全ての３′末端を、方法
３の第６段階に記載された方法を用いて皿［残基で保護
した。
ｆ）　増幅は、 （ｉ）オリゴヌクレオチド匣と虹 予想される産物は、８（１０）塩基対 （１１）オリゴヌクレオチド兆と且 予想される産物は、７６０塩基対 を用いて、このライゲーション産物について行なった。
ユ」１外エ オリゴヌクレオチドｒおよび利と制限酵素［１ｃｏＲＩ
で切断したＤＮＡを使用。
ａ）　オリゴヌクレオチド近は、実施例５に記載される
ようにして、リン酸化、精製およびオリゴヌクレオチド
４０にアニーリングされた。
ｂ）　ゲノムＤＮＡ　Ｉは、方法ｌの第４段階に詳述さ
れるようにして、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、脱リン
酸化した。
Ｃ）　次に、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＵ
と並を、ＥｃｏＲｌで切断したゲノム［ｌＮＡ　Ｉにラ
イゲーションした（詳細は、方法Ｉの第５段階を参照）
。
ｄ）　ライゲーション産物の全ての３′末端を、方法■
の第６段階に記載された方法を用いてｄｄ＾残基で保護
した。
ｅ）　増幅は、 （ｉ）オリゴヌクレオチド皿および婬 予恐される産物は、２２０塩基対、 （１１）オリゴヌクレオチド兆および競予想される産物
は、５６０塩基対、 を用いたライゲージ５ン産物について行なわれた。
前文中で述べられたように、第１１（ｉｉｉ）図は、レ
ーン１と１１にλ旧ｎｄＩＯマーカー、レーン６にｌ１
ａｅｆｌで切断したφＸ１７４マーカー、およびレーン
７．８．９ＩＯに実施例７にしたがって得られた増幅断
片を示している。
ス五〇１１ ＥｃｏＲＩベクトレットライブラリーは、方法切にした
がって構築し、ベクトレットユニット６（オリゴヌクレ
オチド２７と４０）は、７３８７細胞系列ＤＮＡととも
に用いた。
増幅反応は、第１２図に示された配列を増幅するために
、構築されたライブラリーｌｏｎｇについて行なわれた
。
増１眩口Ｆ庄 以下は、０．５ｄ容のザルシュタット試験管中で混合さ
れた： Ｌｏｎｇの構築されたＨｃｏＲＩベクトレットライブラ
リー １（１０）ｐ１（１０）ｐの５８ １（１０）ｐｍｏ　ｌ　ｅの６３ １（１０）−（終濃度）のｄＮＴＰｓ　（後文中で定義
されるものと同様にＭｌ、７を参照）容量は、滅菌した
２回蒸留水で１（１０）−に調整した。蒸発を防ぐため
、５０ｐ！の軽鉱油（シグマ）を穏やかに混合液の上に
重層した０次に、この試験管を９６゛Ｃのテクネ・ドラ
イブロンクに置いた。このＤＮ＾を９６°Ｃで１０分間
変性させた。その後、このブロックを９０°Ｃになるま
で放冷した。この反応液に２ユニツトのＴａｑポリメラ
ーゼ（セタス）を添加した。オリゴヌクレオチド５８と
６３の間の配列を増幅するために、下記の温度と時間が
用いられた。
９１°Ｃで２分間 ６２°Ｃで２分間 ７２°Ｃで２分間 これを４０サイクル行なった。最終サイクルの際、ブロ
ックの温度を７２”Ｃで９．９分間保ち、その後、１時
間以上かけて室温になるまで放冷した。増幅反応混合液
のうち１５μノをアガロースゲル電気泳動で分析した。
この結果は、本性にしたがって得られた増幅産物をレー
ン１に、１ＩａｅＩ［ｌで切断したφｘ１７４マーカー
をレーン２に示す第１３図に示されている。この増幅産
物は、予想されたサイズ（約６（１０）塩基対）である
。
１上１ 本実施例は、方法■にしたがい、以下のようにして行な
われた。
オリゴヌクレオチド４９．５１．５３．５５．２７．５
７および２゜ ０．５ｈ ０．１− ５０（至）Ｈ ｓＭ １ｍＭ Ｔｒｉｓ、Ｈ（ＩＩ（ｐＨ７，６） ＭｇｆＪ。
ジチオスレイトール スペルミジン ＥＤＴＡ ２０’Ｃで保存。
ＬＬ　アデノシン５′−三リン酸 １０５Ｍ？ｇ液としてファルマシア社から販売されてい
るナトリウム塩 水で２０ｐｍｏＩｅ／　ｐｌに希釈 −２０℃で保存 以下は、■、５−容のザルシュタット試験管中で混合さ
れた。
オリゴヌクレオチド　　　　　１０ｐｍｏｌｅｓ１０Ｘ
キナーゼ緩衝液（１，１）　　　　ｉｐ！ＡＴＰ　　　
　　　　　（１，２）　　　１　ｔＩ！（２０ｐ＊ｏｌ
ｅｓ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ　５ユニツト（ア
マシ中ム社） Ｈ２Ｏで１０ｔｒｌに調整。
ＡＴＰに対するオリゴヌクレオチドのモル比は１：２に
保たれた。オリゴヌクレオチドのリン酸化は、３７℃で
６０分間保温することにより行なわれた。保温終了時に
、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを９０°Ｃで１０分間
保温することで不活性化した６次に、この試験管を微量
遠心機で１０秒間遠心して、Ｊ縮物をすべて回収した６
本法では、リン酸化されたものをゲルで精製しない。
必要とされる溶液： ＬＬ　ｌＯ×アニーリング緩衝液 １（１０）５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−）１ｃｆ　（ｐ）１８．
０）１（１０）ｍＭ　　　　’ＡｇＣ１ｔ以下は、１．
５ｄ容のネジロザルシュタット試験管中で混合された。
１０ｐｓｏｌｅｓ　（１０μＺ中で）の第１段階で得ら
れた、リン酸化された“上部　オリゴヌクレオチド １０ｐｓｏｌｅｓの対応する“底部°オリゴヌクレオチ
ド ２μｌのＩＯＸアニーリング緩衝ｇＬ（２，１））１２
０で２０ｐｌに調整。
この試験管は、沸騰水浴中に置かれた。５分後、加熱を
止め、２時間以上かけてこの水浴を室温まで放冷した。
Ｈ後にこの試験管の内容を、微量遠心機で１０秒間遠心
して底に集めた。０．５ρ５ｏｌｅｓ／ｐｌの４度であ
る、アニールされたオリゴヌクレオチドは、次に、直ち
にライゲーションに■いることが出来る。ベクトレント
ユニントは、前文中の第１表で定義された。
細胞系列７３８７　ＯＮ＾が用いられた。
必要とされる緩衝液； 月−削凶り皿り榎ＷＬ １（１０）ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＺ　　ｐ）１７．５
１（１０）麟Ｍ　　　　ＭｇＣ１゜５（１０）ｓ＋Ｍ　
　Ｎａ（Ｊ ３．２　　ＬＬ！ｌ衡櫃 ｌｈＭ　　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐｌ！７．５１　ｌ
１Ｍ　　　ＥＤＴＡ ［［アガロースｉ　゛　′−゛ ｌ５χ（＠／ｖ）　　フィコール４（１０）０．０５χ
（Ｗ／ν）ブロモフェニル・ブルー０．０５χ（Ｗ／ν
）キシレン・シアツール試料緩衝液は、ｌ　ＸＴＢＥ緩
衝液（下記３．４）中で作製した。
１　１０ＸＴＢＥ　Ｉ衝？＆、：ｘリットル当り；Ｔｒ
ｉｓ　　　　　１（１９）ｇ ＥＤＴ４　　　９．５ｇ ホウ酸　　５５ｇ １ｏ　ｘ　ＴＢＥ緩衝液は、必要に応じ、水で１×ある
いは０．５×に希釈した。
（ｉ）制限酵素ＥｃｏＲＩによる７３８７細胞系列ＤＩ
ＩＡの切断には、以下の条件が用いられた。
４０席の７３８７ゲノム１ｌｌＮＡ ４０ｐ！の１０　Ｘ　［！ｃｏＲＩ緩衝液（３，１）８
０ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ（ベーリンガー・マン
ハイム社より） ＨＮＯで４（１０）ｔｔｌに調整 切断は３７°Ｃで２時間行なった６反応は、７０°Ｃで
１０分間試料を加熱することにより停止させた。
（ｉｉ　）試料のうち、５μｌを完全な切断を確認する
ためにアガロースゲル電気泳動により検定した。
アガロ−友ｆ火且気水軌 ゲルは、ｌ　ＸＴＢＥ　ＩＩ衝液液中、０．７χ（ｗ／
ｖ）アガロースで作り（３゜４）、電気泳動のために同
感度のＴＢＥ緩衝液に浸した。試料をゲルのウェルにの
せる前に、この試料（５ｔｒ！　）に対して、５倍のア
ガロース試料緩衝液（３，３）を加えた。電気泳動後、
ゲルを、！ｘ／ｄの臭化エチジウムを含む脱イオン水に
浸して１０分間染色した。ＤＮＡは、トランスイルミネ
ーター（クロマト・ビュー　Ｃ−６３トランスイルミネ
ーター）を用いて３２０Ｍｍで視覚化した。
（ｉｉｉ　）　！ａ）　　切断したＤＮＡは、フェノー
ル抽出で精製した： 再蒸留し、緩衝化したフェノール（Ｂｌ？Ｌ　ＤＮＡグ
レード　ＴＥ−３，２緩衝化フエノール）を等量切断し
たＤＮＡに対し加え、３０分間ポルテックスで混合した
。形成された白色乳濁液を微量遠心を５分間行なって２
層に分離した。水層を新しい試験管に移した。残留する
フェノールは、はじめにこの水層ヲ等量のフェノール：
クロロホルム；イソアミルアルコール（２５：２４：１
）で抽出し、次に、等量のクロロホルム：イソアミルア
ルコール（２４：　１）で抽出することにより除去した
。
（ｂｌ　　ＯＮＡは、最終的にエタノール沈澱により精
製された； ＤＮＡ　ｉＩ液に対し、３Ｍの酢酸ナトリウムを、終濃
度３（１０）ａＭとなるように添加した。　ＤＮＡは、
２，５倍容の９５％エタノールを加え、−８０°Ｃで３
０分間冷却し、遠心（微量遠心機で５分間、１２．（１
０）０ｒｐｍ）することにより沈澱させた。ベレント状
の０１４＾を８０１（Ｖ／Ｖ）の冷エタノールで洗い、
真空乾燥した０ＤＮＡは、０．５μｌ／ｉの終濃度とな
るように、ＴＥ緩衝液（３，２）に溶解した。
４ＪＩＩＸ−イ　゛−シリンＩｔ　ａｔｉｏｎＴｒｉｓ
−ＨＣｆ　　ｐＨ７，４ ２（１０）ｓ団 １０〇−６ （１０）５Ｍ ４．２　　１０×ＡＴＰ ＩＯ顧ＭＡ丁Ｐ ＭｇｃＩ。
［ＩＴＴ １Ｊ〜 ０．５Ｍ　　　　Ｎａ（Ｊ 切断されたＤＮＡ　１眉中の粘着端のｐｍｏｌｅ数の計
算は、方法ｌの４．Ｈｉ）に説明されたものを用いた。
旦Ａ泣〉凸とＬＺ 以下は、０．５威容のザルシュタット試験管中で混合さ
れた： 切断した７３８７　ＤＮＡ　　　　　１．４８ｐｍｏｌ
ｅｓ（２ｇ）アニーリングした オリゴヌクレオチド（第２段階より）　　３ｐ纜ｏ１ｅ
ｓ１０ｘライゲ−’ｙ−ｒンＩＪｉ街液（４，１）　　
　　２ｔｔ１１０ＸＡＴＰ（４，２）　　　　　　　　
　　　　　２　ｐノ↑４　　ＤＮパライゲース （へＩＪンガー・マンハイム）　　２ユニツト１１．０
で終容１１２０μｌに調整。
ライゲーション混合液は、２５“Ｃで１２０分間放置し
た０次に、ＮａＣ！（４，３）を終濃度５０ｍＭとなる
ようにライゲーション混合液に添加した。他のゲノムＤ
ＮＡ断片にライゲーションしてしまったようなゲノムＤ
ＮＡ断片は、２単位のＥｃｏＲｌ（ベーリンガー・マン
ハイム）を添加し、この試料を３７°Ｃで３０分間保温
することによりすべて再切断された。
次に、ベクトレットユニットは、 ＡＴＰを１ｍＭの濃度に（４，２） １．５ｐＰａｏｌｅｓのアニーリングしたオリゴヌクレ
オチド １ユニツトの７４　ＤＮＡライゲース（ベーリンガー・
マンハイム） を添加し、２５°Ｃで１時間保温することにより、これ
らの再切断したゲノムＤＮＡ断片にライゲーションされ
た。ＥｃｏＲＩにより３７°Ｃで３０分間ＤＮＡを切断
した後、この制限酵素を不活性化しない。
したがって、２５°Ｃで６０分間行なう２番目および最
後のライゲーションの間には、他のゲノムＤＮＡ断片に
ライゲーションしているどのようなゲノムＤＮＡ断片も
、おそらくは同し反応で再切断され、そのため、この制
限酵素切断／ライゲーション反応の終了時には、実質的
に１（１０）χのゲノムＤＮＡ断片が両端にベクトレッ
トユニットを持つだろう。切断されたゲノムＤＮ＾にベ
クトレットユニットをライゲーションすることにより、
この特定の制限酵素切断部位が不活性化される。このＤ
ＮＡ（反応混合液）を次に、１０ｎｇ／ｐ７に希釈した
。
ＥｃｏＲｌへクトレットライブラリーは、不法およびベ
クトレットユニットｌから８を７３８７細胞系列［ＩＮ
Ａとともに用いることによって構築された。
上述のライゲーションからベクトレットユニットを除い
た対照ＥｃｏＲＩライブラリーも構築された。
（ベクトレ・ントユニント１−８およびＤＮＡをカロえ
ないベクトレット対照ライブラリーに対して）構築され
たライブラリーのそれぞれｌＯｎｇを増幅に用いた。第
１２図に示された配列は、オリゴヌクレオチド５３と６
３をアンブリマーとして用いて増幅され、用いられた増
幅条件は、実施例８に記載した。増幅産物のうち１５μ
！をアガロースゲル電気泳動で分析した。その結果は第
１４図に示されている。基質ＤＮＡがライゲーション混
合液でベクトレットを入れずに構築したライブラリー由
来である場合を除いて、予想されたサイズ（約６（１０
）塩基対）の産物は全ての反応において生産されている
。（上のアンブリマーの１つの）オリゴヌクレオチドの
配列かへクトレットユニノト中にあるため、これは予想
されたことである。これらの結果は、ベクトレットユニ
ットのデザインは、ヘクトレッドユニットといずれの目
的とするゲノム配列（すなわち、上のヌクレオチド６３
）との間のヌクレオチド配列の増幅に関して、何ら有意
な影響を与えないことを示している。
以下に説明するようにして得られた産物を示す写真上臭
化エチジウム染色をしたゲルを示す結果は、第１４図に
示されている。
１　、７３８７　ＤＮＡで構築したライブラリー　十　
ベクトレットユニット１ ２、７３８７　ＤＮＡで横築したライブラリー　＋　ベ
クトレットユニット２ ３　、７３８７　ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　
ベクトレットユニット３ ４．７３８７ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベク
トレットユニット４ ５　、７３８７　ＤＮＡで構築したライブラリー　十　
ベクトレットユニット５ ６．７３８７　ＤＮＡで構築したライブラリー　４−　
ベクトレットユニット６ ７　、７３８７　ＤＮＡで構築したライブラリー　十　
ベクトレットユニット７ ８、ベクトレットを含まない、７３８７　ＤＮＡで構築
したライブラリー ９、φＸ１７４１１ａｅ！ＩｔマーカーｌＯ１φＸ１７
４１１ａｅ［［ｌマーカー１．１．７３８７　ＤＮＡで
構築したライブラリー　＋　ベクトレットユニット８ 予想されたサイズの産物が、各々の場合で得られ実Ｕ刊 この実施例は、前文中で述べられた方法Ｘにしたがって
行なわれた。［１ｃｏＲ１ペクトレッドライフラリ−は
、末法およびここで定義されたベクトレットユニットｌ
から７と、７３８７細胞系列［ＩＮＡを用いて構築され
た。上述のライゲーションからベクトレットユニットを
除いた、対照となるＥｃｏＲＩライブラリーも構築され
た。
ベク　し　　−イブ−１−への　−の （ベクトμ・ントユニント１−７およびＤＮＡを力■え
ないヘクトレット対照ライブラリーに対して）構築され
たライブラリーのそれぞれＩＯｎｇを増幅に用いた。
実施例８に示された配列は、オリゴヌクレオチド５３と
６３をアンブリマーとして用いて増幅された。
実施例８に記載した増幅条件を用いた。増幅産物のうち
１５ｐｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
その結果は第１５図に示されている。基質　ＤＮＡがラ
イゲーション混合液中でベクトレットを入れずに構築し
たライブラリー由来である場合を除いて、予想されたサ
イズ（約６（１０）塩基対）の産物は全ての反応におい
て生産されている。（上のアンブリマーの１つの）オリ
ゴヌクレオチド５８の配列がベクトレットユニット中に
あるため、これは予想されたことである。第１５図に示
した写真のレーンは、以下の通りである。
１、φχ１７４１１ａｅ［ｌｌマーカー２、ＤＮＡで構
築したライブラリー　十　ヘクトレフトユニット１ ３、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット２ ４、ＤＮＡで構築したライブラリーｓ＋　ベクトレット
ユニット３ ５、ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレット
ユニット４ ６、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット５ ７、ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレット
ユニット６ ８、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット７ ９、ベクトレットを含まない、７３８７　ＤＮＡで構築
したライブラリー １０、φＸ１７４１１ａｅｌ［ｌマーカー予想された結
果が各々のライブラリーから得られた。これらの結果は
、ベクトレットユニットのデザインは、ベクトレットユ
ニットといずれの目的とするゲノム配列（すなわち、上
のヌクレオチド６３）との間のヌクレオチド配列の増幅
に関して、何ら有意な影響を与えないことを示している
。
尖施銖■ この実施例は、前文中で述べられた方法ＸＩにしたがっ
て行なわれた。１ｉｃｏＲＩベクトレットライブラリー
は、末法およびここで定義されたベクトレットユニット
ｌから７と、７３８７細胞系列ＤＮＡを用いて構築され
た。上述のライゲーションからベクトレットユニットを
除いた、対照となるＥｃｏＲＩライブラリーも構築され
た。
ベク　し　　−　　−！−への　　の （ベクトレットユニット１−７およびＤＮＡを加えない
ベクトレット対照ライブラリーに対して）構築されたラ
イブラリーのそれぞれｌｏｎｇをポリメラーゼ連鎖反応
に用いた。実施例１に示された配列は・オリゴヌクレオ
チド５３と６３をアンブリマーとして用いて増幅された
。実施例８に記載した増幅条件を用いた。増幅産物のう
ち１５ｐ１をアガロースゲル電気泳動で分析した。その
結果は第１６図に示されている。基質ＤＮＡがライゲー
ション混合液中でヘクトレットを入れずに構築したライ
ブラリー由来である場合を除いて、予想されたサイズ（
約６（１０）塩基対）の産物は全ての反応において生産
されている。（上のアンブリマーの１つの）オリゴヌク
レオチド５８の配列がベクトレットユニット中にあるた
め、これは予想されたことである。第１６図に示した写
真のレーンは、以下の通りである。
１、φＸ１７４１１ａｅｌマーカー ２　　ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレッ
トユニット１ ３、Ｄ）ＩＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレン
トユニット２ ４、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　、クトレノト
ユニント３ ５　　ＯＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレッ
トユニット４ ６、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット５ ７、ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレット
ユニット６ ８、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット７ ９、ベクトレットを含まない、７３８７　ＤＮＡで半簿
築したライブラリー １０、φＸ１７４　Ｈａｅｌ！Ｉマーカーこれらの結果
は、ベクトレットユニットのデザインは、ベクトレット
ユニットといずれの目的とするゲノム配列（すなわち、
上のヌクレオチド６３）との間のヌクレオチド配列の増
幅に関して、何ら有意な影響を与えないことを示してい
る。
尖施拠肥 この実施例は、前文中で述べられた方法Ｘ■にしたがっ
て行なわれた。１ｉｃｏＲＩへクトレットライブラリー
は、本性およびここで定義されたベクトレットユニット
ｌから７と、７３８７細胞系列ＤＮＡを用いて構築され
た。上述のライゲーションからベクトレットユニットを
除いた、対照となるＥｃｏＲ１ライブラリーも構築され
た。
ヘク　し　　−イブ゛−１／−、の　　の（ベクトレッ
トユニット−７およびＤＮＡを加えないベクトレット対
照ライブラリーに対して）構築されたう・イブラリ−の
それぞれ１０ｎｇをポリメラーゼ連鎖反応に用いた。実
施例１に示された配列は、オリゴヌクレオチド５３と６
３をアンブリマーとして用いて増幅された。実施例日に
記載した増幅条件を用いた。増幅産物のうち１５μｌを
アガロースゲル電気泳動で分析した。その結果は第１７
図に示されている。基質ＤＮＡがライゲージクン混合液
中でヘクトレットを入れずに構築したライブラリー由来
である場合を除いて、予想されたサイズ（約６（１０）
塩基対）の産物は全ての反応において生産されている。
（上のアンブリマーの１つの）オリゴヌクレオチド５Ｂ
の配列かへクトレントユニット中にあるため、これは予
想されたことである。第１７図に示した写真のレーンは
、以下の通りである。
１、φＸ１７４　Ｈａｅ　ｍマーカー ２、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット１ ３、ＤＮＡで構築したライブラリー　士　ベクトレット
ユニット２ ４、ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレット
ユニット３ ５、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット４ ６、ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレット
ユニット５ ７゜ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ペタトレンド
ユニット６ ８、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット７ ９、ベクトレットを含まない、７３８７　ＤＮＡで横築
したライブラリー １０、φＸ１７４１１ａｅｌ［！　マーカーこれらの結
果は、ベクトレットユニットのデザインは、ベクトレッ
トユニットといずれの目的とするゲノム配列（すなわち
、上のヌクレオチド６３）との間のヌクレオチド配列の
増幅に関シて、何う有意な影響を与えないことを示して
いる。
実、嵐開封 この実施例は、前文中で述べられた方法Ｘ■にしたがっ
て行なわれた。　ＥｃｏＲｌヘクトレットライブラリー
は、本性およびここで定義されたベクトレットユニット
１から７と、７３８７細胞系列ＤＮＡを用いて構築され
た。上述のライゲーションからベクトレットユニットを
除いた、対照となるＥｃｏＲＩライブラリーも構築され
た。
ヘ　　し・　−イブ−１−への　　の （ベクトレットユニット１−７およびＤＮＡを加えない
ベクトレット対照ライブラリーに対して）構築されたラ
イブラリーのそれぞれＩＯｎｇをポリメラーゼ連鎖反応
に用いた。実施例１に示された配列は、オリゴヌクレオ
チド５３と６３をアンブリマーとじて用いて増幅された
。実施例８に記載したＰｌ？Ｃ条件を用いた。増幅産物
のうち１５トをアガロースゲル電気泳動で分析した。そ
の結果は第１８図に示されている。基］ＤＩｉＡがライ
ゲーション混合液中でペクトレフトを入れずに構築した
ライブラリー由来である場合を除いて、予愁されたサイ
ズ（約６（１０）塩基対）の産物は全ての反応において
生産されている。（上のアンブリマーの１つの）オリゴ
ヌクレオチド５８の配列か−・クトレノトユニント中に
あるため、これは予セされたことである。第１８図に示
した写真のレーンは、以下の通りである。
１、φＸＬ７４　Ｈａｅ■マーカー ２、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット１ ３、ＤＮＡで構築したライブラリー　十　ベクトレット
ユニット２ ４、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット３ ５、ＤＮＡで横築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット４ ６、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ヘクトレット
ユニ・ント５ ７、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトμ・ン
トユニント６ ８、ＤＮＡで構築したライブラリー　＋　ベクトレット
ユニット７ ９、ヘクトレットを含まない、７３８７　ＤＮＡで構築
したライブラリー １０、φχ１７４　Ｈａｅｍマーカー これらの結果は、ベクトレットユニットのデザインは、
ベクトレットユニットといずれの目的とするゲノム配列
（すなわち、上のヌクレオチド６３）との間のヌクレオ
チド配列の増幅に関して、何ら有意な影響を与えないこ
とを示している。
実施Ｕ ７３８７細胞系列ＤＩＪＡ　とへクトレットユニソト８
を次のようにして用いることにより、５つの異なる［！
ｃｏＲＩベクトレットライブラリーを構築した。
０）（ａ）　　あるライブラリーは方法■を用いて構築
された。
（ｂ）あるライブラリーは方法Ｘを用いて構築された。
（Ｃ）　　あるライブラリーは方法×１を用いて構築さ
れた。
（ｄ）　　あるライブラリーは方法Ｘ■を用いて構築さ
れた。
ｔｅｌ　　あるライブラリーは方法Ｘ■を用いて構築さ
れた。
（２）増幅に先立ち、上記の（１）で横築されたライブ
ラリーに、３′−末端保護反応をおこなった。
２（１０）ｍＭ　　　Ｔｒｉｓ−ｆｌｃｌ、　　ｐＨ７
，５１（１０）ｍＭ　　　Ｍｇ　Ｃ１！２５０５Ｍ　　
　ＮａＣ！ ｍ　　健工Ｐコーｄ＾ＴＰ ｌ　ｍＭ　　　　ｄＴＴＰ ｌ　ｍＭ　　　　ｄＧＴＰ ｌｍＭ　　　　ｄＣＴＰ 蒸留した脱イオン水で調製する。
７．２．３　　　ｄｄＡＴＰ 渾留した脱イオン水で調製した１ｍＭ　ｄｄＡＴＰ上述
の（りからの産物の３′−末端へのｄｄＡの付加。
以下は、０．５　ｄ容のザルシュタット試験管中で混合
された： 上述の第（１１段階からの［ｌＮＡ　０．５μ！４μｌ
の５　ＸＴ７　ＯＮＡポリメラーゼ１１衝液ａ，２，１
）２ｕｌのｄＮＴＰｓ−ｄＡＴＰ溶液ａ，２，２）２ｐ
ｌのｄｄＡＴＰ溶液＜７．２．３） １ユニツトの丁７　ＤＮＡポリメラーゼ（シークエネー
ス） 水で２０ｔｒｌに調整。
この試験管を３０分間、３７°Ｃに保った。次に、７０
°Ｃで１０分間保温することによって酵素を変性させた
。
その後、全ての試料中のＤＮＡの濃度は１０ｎｇ／ｐ７
に希釈された。
ヘク　し　　−イブーＩ−への　　の 構築された５つのライブラリーのそれぞれｌＯｎｇをポ
リメラーゼ連鎖反応に用いた。実施例８に示された配列
は、オリゴヌクレオチド５３と６３をアンブリマーとし
て用いて増幅された。実施例８に記載した増幅条件を用
いた。増幅産物のうち１５μｌをアガロースゲル電気泳
動で分析した。その結果は第１９図に示されている。第
１９図に示した写真のレーンは、以下の通りである。
１、φＸ１７４１１ａｅｌ［ｌマーカー２、７３８７　
ＤＮＡからの増幅産物　土　方法■のベクトレットユニ
ット８＋３’末端保護 ３．７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　土　方法Ｘのへ
クトレノトユニット８＋３’末端保護 ４　、７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　＋　方法ＸＩ
のベクトレットユニッ）８＋３’末端保護 ５、７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　＋　方法ＸＨの
ベクトレットユニット８＋３′末端保護 ６　、７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　土　方法Ｘ■
のベクトレットユニット８＋３′末端保護 いずれの産物も予想されたサイズである。
叉隻拠■ ７３８７細胞系列口ＨＡとへクトレットユニット８を用
いることにより、５つの異なるεｃｏＲＩベクトレット
ライブラリーを構築した。
（ａ）　　あるライブラリーは方法■を用いて構築され
た。
（ｂ）　　あるライブラリーは方法Ｘを用いて構築され
た。
（Ｃ）　　あるライブラリーは方法Ｘ！を用いて構築さ
れた。
（ｄ）　　あるライブラリーは方法Ｘ■を用いて構築さ
れた。
（ｅ）　　あるライブラリーは方法Ｘｍを用いて構築さ
れた。
但し、オリゴヌクレオチド２はリン酸化されていないも
のであった。ライブラリー（ｂ）から（ｅ）は、方法■
からＸＨに記載されるようにして調製した。
ライブラリー（ハ）、（Ｃ）、（ｄ）、（ｅ）およびラ
イブラリー（ａ）の一部は、遊離の３′−末端を保護す
るためにｄｄＡＴＰとＴＶ　ＤＮＡポリメラーゼ（シー
クエネース）で処理した。条件は、実施例１４に記載さ
れたものを用いた。増幅は、これらのライブラリーの全
てについて行なった。第１２図に示された配列は、オリ
ゴヌクレオチド６３と５８を用いて増幅した。実施例Ｉ
８に記載した条件を用いた。増幅産物のうち１５ｐＺを
アガロースゲル電気泳動（１，４２ｗ／ｖゲル）で分析
した。その結果は第２０図に示されている。第２０図に
示した写真のレーンは、以下の通りである：１　、７３
８７　ＤＮＡからの増幅産物　士　方法■のベクトレッ
トユニット８ （オリゴヌクレオチド２はリン酸化されていない）２、
７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　＋　方法■のベクト
レットユニット８＋３′末端保護 （オリゴヌクレオチド２はリン酸化されていない）３、
７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　士　方法Ｘのへクト
レットユニット８＋３′末端保護 （オリゴヌクレオチド２はリン酸化されていない）４　
、７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　土　方法ＸＩのベ
クトレットユニット８＋３′末端保護 （オリゴヌクレオチド２はリン酸化されていない）５　
、７３８７　ＤＮＡからの増幅産物　士　方法Ｘ■のベ
クトレットユニット８　」〜　３′末端保護（オリゴヌ
クレオチド２はリン酸化されていない）６、７３８７　
ＤＮＡからの増幅産物　＋　方法ｘｍのベクトレットユ
ニット８＋３′末端保護 （オリゴヌクレオチド２はリン酸化されていない）７、
φＸ１７４　Ｈａｅ■マーカー いずれの産物も予想されたサイズである。
側■Ｉ旦 本実施例は、第１３図−第２０図中に示された約６（１
０）塩基対の産物がオリゴヌクレオチド５８と６３（実
施例８を参照）の産物であり、アンブリマー１つの産物
ではないことを示すために行なわれた。
以下のベクトレットライブラリーの各々のうち、１０ｎ
ｇが各々の増幅に用いられ。
７３Ｂ？　ＤＮＡおよび、方法■のベクトレットユニッ
トＬＬを用いて調製したライブラリー ７３８７　ＤＮＡおよび、方法■と３′末端保護を用い
たベクトレットユニット８を用いて調製したライブラリ
ー（詳細は実施例１４を参照）。
７３８７　ＤＮＡおよび、方法■と３′末端保護を用い
たベクトレットユニット８（リン酸化されていない１ｂ
オリゴヌクレオチド）を用いて調製したライブラリー（
詳細は実施例１５を参照）。
方法■を用いた、ベクトレットを除＜　７３８７　ＤＮ
Ａを用いて調製したライブラリー ベクトレットユニット１−８を用いて調製したライブラ
リーから、実施例８において生産された産物のいずれも
同一のものであり、正しい配列を有していることを示す
ために、第１６図に示された増幅産物（産物２−８）と
第１４のレーン１１に示された産物について、オリゴヌ
クレオチド５９と６６を用いて配列決定がなされた。
第２１図は第１６図からの産物２−８を、オリゴヌクレ
オチド６６を用いた配列決定してｊ斗られたオートラジ
オグラフを複写したものを示している。
このオートラジオグラフは、対照として、フェニルアラ
ニン・ヒドロキシラーゼ遺伝子（フェニルケトン尿症−
ＰＫＵ　）のイントロン８とエクソン９の一部に関する
配列法よも示している。増幅産物２−８は、（第１６図
に示されているように）左から右に表わされており、い
ずれも同一である。レーンの順番は、ＣＧＴＡである。
第２２図は、実施例１６で述べられている産物から得ら
れたヌクレオチド配列のデータを示している。
塩基１から１６は、発表されているＰＫＵのイントロン
８の配列の３′末に存在する。塩基１７と４５２は、本
発明の方法にしたがって決定された新たなＰＫυイント
ロン８の配列データを構成している。
１施舅Ｕ 実施例７（ｉ）、トラック（Ｃ）のレーン７．８，９．
１０．１１の約２２０塩基対の産物は、オリゴヌクレオ
チド６２と６７を用いて配列が決定された。
したがって、実施例７（ｉ）の２２０塩基対の産物は、
１）３段階ノサイクル、ａ）６０°Ｃ，２分、ｂ）７２
°ｃ９３分、およびｃ）９１’Ｃ，２分で、トランクあ
たり１（１０）μｌをロードし、（０，５ａｇ　ＤＮＡ
を使用して）４０サイクル行なって増幅しく第２４ａ図
を参照）、２）　上述の（１）由来の産物を、次にゲル
を用いて精製し、２段階のサイクル、ａ）６０’Ｃ，４
分、ｂ）９１°Ｃ９２分を４０サイクル行なうことによ
り再び増幅した（第２４ｂ図参照）。
オリゴヌクレオチド５８．６２および６７の位置は、第
２３図に示されている。第２５図において、（ａ）の配
列は、オリゴヌクレオチド６２を用いて読んだ配列であ
り、（ｂ）の配列は、オリゴヌクレオチド６７を用いて
読んだ配列である。（ａ）および（ｂ）において、下線
を付した配列は、オリゴヌクレオチド６２と６７を用い
て読んだ相補／逆方向の配列である。５′から３′への
全長の配列は、第２５　（Ｃ）図に示されており、ここ
で、 位置２−３１は、オリゴヌクレオチド６２の５’−３’
の配列を読んでいる。
位１１ｆ７５−１０４は、オリゴヌクレオチド６７の逆
方向の相補的配列を読んでいる。
位置９５−１０４は（配列の上に実線で示されている）
、発表されているイントロンの配列のうちのはじめの１
０塩基である（Ｂｉｏｃｈｅ−ｊｓｔｒｙ　１９８５２
４　ｐ５５６−５６１、フォークらを参照）。
位ｒｆ１２−１０４は、ＰＫＵのエクソンＩに対して発
表されている配列とイントロンの配列の一部に一致して
いる。
位置１０５以降は、ＰＫＵイントロン１に対する新たな
配列データである。
道１外団 アルファ・アンチトリプシン遺伝子のエクソンＶが、以
下のオリゴヌクレオチドを用いることにより、本発明の
不法（第２６図を参照）に用いられた： ５８（ユニバーサル・ベクトレット・プライマー）、６
０（ユニバーサル・ベクトレットを組み込んだオリゴヌ
クレオチド）　、６８　（エクソンＶ　５’　）　、６
９（組み込まれたエクソンＶ５’）、および７０（ｘク
ソンＶ３’）。
ベクターライブラリーは、アニーリングしたベクトレッ
トオリゴヌクレオチド（ここで定義されているものとし
ては８７／４０）をもっ［１ｃｏＲｌで切断したゲノム
ＤＮＡで作製され、ライゲーションされた。
増幅は、以下のようにして行なわれた：＋（１０）ｎｇ
のベクターライブラリーを以下の増幅の第１回目に用い
た： １１（１０）ｎのヘクターライブラリーＤＮＡオリゴヌ
クレオチド５８＋６８（１（１０）ｐｎ＋ｏｌｅｓ）１
０ｔｒ！緩衝液：　１（１０）ｍＭ　ＫＣＺ１（１０）
／７Ｍ　ｄＮＴＰ’ｓ　　　　　　　　　　　１（１０
）ｍＭ　ＭｇＣｆｚ２ユニットのＴａｑポリメラーゼ　
　　１４５Ｍ　　’ＭｇＣ１ｔｏ、１χゼラチン ２回蒸留水で１（１０）ｐＺに容量を調整。
反応条件： 初期変性段階→９３°Ｃで１０分間 ９３゛Ｃで２分間 ６５°Ｃで２分間 ７２℃で８分間を３９サイクル 最終サイクル＝７２°Ｃで１０分間 この結果は、第２７（８１図のレーン４に示されている
。レーン３は、オリゴヌクレオチド６８と７０を用いた
対照増幅反応を示１１、約２（１０）塩基対の産物を生
ずる。
初期の回の増幅では、予慾されるサイズの付近にスミア
−が見られる９次に、初期反応混合液を以下のように希
釈し： 第２７（ａ）図のレーン４の産物１μＺをｄｄＨｚｏで
ｌｌ１ｄｌに希釈　（すなわち、１０’希釈） コａ）ｌｐ／ｆ次ａ）ＰＣＲニ用いた（総量＝１（１０
）ｐ７）（すなわち、総希釈率・１０５） そして、以下の範囲のプライマーを用いて再び増幅した
： ｌ何ｆｉ　（＆１１み込まれたオリゴヌクレオチドを含
む） 第２７（ａ）図のレーン４の産物１　ｐｌ　　（１０”
）　ＤＮＡ１０ＤＮＡ１（１０）ｐオリゴヌクレオチド
６０　＋　６９１０ｐｌ　　１０ｘ緩衝液　　　１０ｘ
緩ｉＪｉ液：　５０ｈ＋Ｍ　ＫＫＣｌｌｏｏ（ｔ　　ｄ
ＮＴＰ’ｓ　　　　　　　　　１１（１０）ｔａ　Ｔｒ
ｉｓ　ｐＨ８゜３２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ　　
ＩＯＮＭ　ＭｇＣｆｇＯ，ＬＸゼラチ ７２回蒸留水で１（１０）μｌに容量を調整。
反応条件： 初期変性段階→９５°Ｃで１０分間 第２回目の増幅産物は、第２７（ｂ）図のレーンＬ２お
よび３で３．０ｋｂの産物として示されている。
第２７（ｂ１図は、オリゴヌクレオチド６０と６９の間
の第２回目の増幅の産物を示すアガロースゲルの写真で
ある。
レーン１　オリゴヌクレオチド６０と６９の間の第２回
目の増幅による３、０ｋｂの産物 ２　オリゴヌクレオチド６０と６９の間の第２回目の増
幅による３、０ｋｂの産物 ３　オリゴヌクレオチド６０と６９の間の第２回目の増
幅による３、０ｋｂの産物 ４　　Ｈａｅｍで切断したφχ１７４マーカーと１１ｉ
ｎｄｌｌｌで切断したλマーカーゲルは、ナイロン膜く
にプロットされ、α−１すなわち、トリプシンに対する
プローブを用いた。
正しいサイズ（３，０ｋｂ）の単一なバンドが観察され
、これは第２７（Ｃ）図に示されている。
第２７　（Ｃ１図は、α−１すなわち、トリプシンに対
するプローブを用いたナイロンフィルター（第２７（ｂ
）図に示されたゲルからプロットされたもの）のオート
ラジオグラフである。　ＤＮＡマーカーの位置が示され
ている。
レーンｌ　オリゴヌクレオチド６０と６９の間の第２回
目の増１；Ｍによる３、Ｏｋｂの産物２　オリゴヌクレ
オチド６０と６９の間の第２回目の増幅による３、０ｋ
ｂの産物 ３　オリゴヌクレオチド６０と６９の間の第２回目の増
幅による３、０ｋｂの産物 夫隻例■ Ｄ５は、４７４塩基対のＸｂａ　Ｉ　−［１ｃｏＲ＋断
片としてクローンされた、特徴付けのされていないゲノ
ム配列である。Ｄ５配列は、ＭＡ準的な方法にュートン
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１
６．８２３３−８２４３１９８８）によって決定され、
第２９図に示されている。
２種類のオリゴヌクレオチドプライマー７１．７２が合
成された。
７１　５’　ＡＡＧＴＴＴＧＡＧＣＡＴＡＧＧＡＡＡＡ
ＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＣ７２５’　ＡＧＴＴＣＴＧＴＧ
ＣＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＣ＾＾Ｇオリゴヌクレオ
チド７１．７２の位置は、第２９図に示されている。ゲ
ノムＤＮ＾は、リンパ芽細胞系列、ＧＭ７３８７、（Ｎ
１０ＭＳヒユーマン・ジェネティック・ミュータント・
セル・レポジトリイ（ＩｌｕＩｌａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
　ＭｕＬａｒ＋ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）
　）から単離され、この内の一部（２０■）を以下の酵
素で切断した；Ｇｒａ　ｌ　ｒ　Ｂｃｌ　Ｉ　、１Ｉｉ
ｎｄｌ［ｌおよびｌ１ａｅ［ｌ。次に、ヘクトレットラ
イブラリーを方法Ｘにしたがって調製した。
初期の増幅は、以下に述べるようにして、各々のライブ
ラリーの一部について行なった。
以下は、０．５ｍρ容のザルシュタット試験管中で混合
された： １０μｇの構築されたベクトレットライブラリー１（１
０）ｐ１（１０）ｐのオリゴヌクレオチド５８１（１０
）ｐａ＋ｏｌｅのオリゴヌクレオチド７！１（１０）−
のｄＮＴＰｓ１０ｐＺの１０×緩衝液　１０ｘ緩衝液は
、５（１０）ｄ　ＫＣｌ１（１０）ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｉ
ＩＣＺ　　ｐＨ８，３１０ｇ＋Ｍ　Ｍｇ（Ｊ Ｏ１１χゼラチン 容量は、滅菌し、２回蒸留した水で１（１０）ｐＺに調
製した。蒸発を防ぐため、５０μｌの軽鉱油（シグマ）
を穏やかに混合液の上に重層した。次に、この試験管を
９６°Ｃに熱した（９６°Ｃで平衡化したテクネ・プロ
グラマブル・ドライブロックＰＩＩＣ−１中）。このＤ
ＮＡを９６゛Ｃで１０分間変性させた。その後、このブ
ロック９０°Ｃになるまで放冷した。この反応混合ン夜
に２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セタス）を添加し
た。以下の温度および時間を、オリゴヌクレオチド５８
と７１の間の配列を増幅するために用いた。
９２°Ｃで２分間 ６５°Ｃで２分間 ７２℃で５分間 これを４０サイクル行なった。最終サイクルの際、反応
混合液を７２°Ｃで１０分間保った。この反応混合液か
ら一部（１５μりを分取した。ロード用色素混合液（５
μりを添加し、試料を１．４χのアガロースゲルで分析
した。
ロード用色素混合液　１５χ（ｗ／ｖ）　　フィコール
４（１０）０．０５χ（ｖｒ／ｖ）ブロモフェノール・
ブルー〇。０５χ（Ｗ／Ｖ）キシレン・シアツールｌ　
ＸＴＢＥに溶解 第２回目の増幅を初期反応混合液の一部に対して行なっ
た。初期反応混合液の一部（２μりを水で４（１０）　
ｐｌに希釈した。この希釈物の一部（２ｕｌ　）を０．
５−容のザルシュタット試験管に入れた。
以下のものも、この試験管に加えた。
ＪＯＯｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド６０Ｌｏｏｐｈ
ｏｌｅのオリゴヌクレオチド７２１（１０）　ｎのｄＮ
ＴＰｓ １０ｐｌのｌＯ×緩衝液 １０Ｘ緩衝液は、５０（ｌｓＭ　　ＫＣｆｌｏｏｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　Ｈ（Ｊ　　ｐＨ８，３１Ｑａ＋Ｍ　　Ｍｇ
Ｃ／ｚ Ｏ，１χ　ゼラチン 容量は、滅菌し、２回蒸留した水で１（１０）．１に調
製した。蒸発を防ぐため、５０ｐｌの軽鉱油（シグマ）
を穏やかに混合液の上に重層した６次に、この試験管を
９６°Ｃに熱した（９６°Ｃで平衡化したテクネ・プロ
グラマブル・ドライブロックＰＩＩＣ〜１中）、このＤ
ＮＡを９６゛Ｃで１０分間変性させた。その後、このブ
ロツクを９０°Ｃになるまで放冷した。この反応混合液
に２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セタス）を添加し
た。以下の温度および時間を、オリゴヌクレオチド６０
と７２の間の配列を増幅するために用いた。
９２°Ｃで２分間 ６５℃で２分間 ７２°Ｃで５分間 これを３７サイクル行なった。最終サイクルの際、反応
混合液を７２°Ｃで１０分間保った。この反応混合液か
ら一部（１５ｐ／）を分取した。ロード用色素混合液（
５μりを添加し、試料を１．４χのアガロースゲルで分
析した。
ロード用色素混合液　１５χ（１４／ｖ）　　フィコー
ル４（１０）０．０５χ（ｗ／ｖ）ブロモフェノール・
ブルー〇、０５χ（Ｗ／ν）キシレン・シアツールＩＸ
ＴＢＨに溶解 このライブラリー（Ｉｌａｅｌ［Ｉ、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ、
Ｂｃｌ　Ｉ、Ｄｒａ　Ｉ）は、０．４−１．５ｋｂの範
囲のサイズの異なる産物を与えた（第３０図）、観察さ
れた産物のサイズがら、暫定的な制限酵素地図を作るこ
と力咄来た（第３１図）、この産物は、制限酵素による
切断でさらに分析された。本物の産物であれば、切断さ
れて予想されたサイズの断片を与えるはずである。した
がって、０．８２ｋｂのＢｃｌｌ産物は、１ＩｉｎｄＩ
［ｌで切断されて０．７８ｋｂの産物を与え、またＨａ
ｅ　Ｉｌｌによっても切断を受けて０．７５ｋｂの断片
を与えることが出来た。
０．８２ｋｂのＢｃｌ　Ｉ産物のｔｌｉｎｄｌ！Ｉおよ
びｔｌａｅｎ［による分析は、第３０図に示されている
。予想される産物が観察され、次にＢｃｌ　Ｉ産物は、
配列分析のために溶出された。
したがって、第３０図では、１ＩａｅｎＩペクトレツト
ライブラリーの増幅の結果得られる産物がレーン２に示
され、旧ｎｄｌｌｌベクトレットライブラリーの増幅の
結果生ずる産物はレーン３に示され、またｆｌｃｌ　１
ペクトレツトライブラリーの増幅の結果生ずる産物はレ
ーン４に示され、さらに、叶ａｌベクトレットライブラ
リーの増幅の結果生ずる産物はレーン５に示されている
。レーン７は、Ｂｅｔ　１産物を制限酵素１１ａｅｎｌ
により切断した後に得られる断片を示している。レーン
８は、Ｂｅ１ｌ産物を制限酵素旧ｎｃｌ［［ｌにより切
断した後に得られる断片を示している。レーン９は、８
ｃｌ　Ｉ産物を示し、レーン１と６は、ＩｋｂのｆｌＮ
Ａマーカー（ＢＩ？Ｌ）を含んでいる。
ヘクトレット産物の制限酵素切断による分析１６ｕ／　
　増幅反応混合液 ２μ！１０×制限酵素緩衝液 ２ｐｌ　　制限酵素 試料は、３７゛Ｃで１時間保温した。ロード用色素混合
液を試料に５μ！添加し、産物を１．４χのアガロース
ゲルで分析した。
配列決定 ［１ｃｌ　Ｉ産物をアガロースゲルから溶出し、オリゴ
ヌクレオチド５９を用いて、標準的な方法で配列決定を
行なったにュートンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｒｄｓＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　＋、６．８２３３−８２４３１９８８
）。この配列は、第３１図に示されている。さらにもう
１つのプライマー　ａ３）がこの配列からデザインされ
、次のウオーキングに用いられた。
７３　５’　ＧＧＣＣＴＴＴＧＡＮＮＡＡＧＡＧＡＡＧ
ＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＧ配列を検定することで、本発明
の末法にしたがってウオーキングを行なうことによって
予想された）１ａｅ　［［［および旧ｎｄｌ［１部位の
存在が確証される。
血清型Ｌ１２のクラミジア・トラコマティスをシクロヘ
キシミドで処理したＭｃＣｏｙ細胞中で成育させた。基
本小体は、１（１９）基本小体の収量で、グリセロール
−酒石酸濃度勾配により精製した。　ＤＮＡは、プロチ
ェースに／ＳＯ５およびフェノール／クロロホルムで処
理して抽出し、エタノール沈澱で回収した。９０ｍｇの
ＤｌｆＡが回収されたが、うち９（１０）ｎｇはクラミ
ジアＯＮ＾であると推定され、残りはＭｃＣｏｙ細胞由
来のマウス［ＩＮＡだった。
ＤＮＡ（５ｌ１ｇは、５０ｎｇのクラミジアＤＮＡに相
当する）は、ＥｃｏＲＩあるいはＢａｎ１ｌ　Ｉで切断
した。ヘクトレットライブラリーは適当なオリゴヌクレ
オチド（２７，、４０，ＢｃｏＲｌ　、　３１．４０．
　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　）を用い、方法Ｘにしたがって調製
した。このライブラリーを終審１１（１０）μ！にした
。２種のオリゴヌクレオチドプライマーが、クラミジア
Ｌ２のＭＯＭＰ　（主要外膜タンパク質）のコンセンサ
ス配列に基づいて合成された（ステファンスらＪ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１６９．３８１９３８８５１９
８７）。
７４　　５’　　ＣＴＧＣＴＣＡＣＧＴＡＡＡＴＧＣＡ
ＣＡＡＴＴＣＣＧ７５　　５’　　ＡＡＣＣＧＡＧＡＧ
ＣＡＡＡＡＧＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣ増幅 以下は、０．５威容のザルシュタット試験管中で混合さ
れた。
１０ｕｌ　　ヘクトレフトライブラリー２０ｔｒｌ　　
５Ｘ緩衝液 ５　×本１　衝ンＬ３３５ｎ＋Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１１ｃ
／　　　ｐＨ８，５８３１１Ｍ　Ｎｌｌ４ＳＯ４ １ｌＭ−ｇｃ１ ５０ｆｆｉＭ　　２−メルカプトエタノール０．８＋ａ
ｇ／ｄ　　ウシ血清７Ａ左ン１（１０）ｐ１（１０）ｐ
　　オリゴヌクレオチド５８１（１０）ρｔａｏｌｅ　
　オリゴヌクレオチド７１２（１０）　ｎ　　　ｄＮＴ
Ｐｓ容量は、滅菌し、２回蒸留した水で１（１０）ｐＺ
に調製した。蒸発を防ぐため、５０ｔｒｌの軽鉱油（シ
グマ）を穏やかに混合液の上に重層した。次に、この試
験管を９６°Ｃに熱した（９６’Ｃで平衡化したテクネ
・プログラマブル・ドライブロックＰＩＩＣ−１中）。
このＤＮＡを９６゛Ｃで１０分間変性させた。その後、
このブロックを９０°Ｃになるまで放冷した。この反応
混合液に２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セタス）を
添加した。以下の温度および時間を、オリゴヌクレオチ
ド６０と７２の間の配列を増幅するために用いた。
９２゛Ｃで０．７分間 ６５°Ｃで０．７分間 これを４０サイクル行なった０反応液の１０％をアガロ
ースゲルによる分析のために分取した。この結果は、第
３２図に示されており、ここで、レーン１は、ｔｌａｅ
ｌ［ｌで切断したφＸ１７４マーカーを示し、 レーン２は、１ｏｕｔのＥｃｏＲＩライブラリーを用い
たオリゴヌクレオチド５８と７４の間の増幅産物を示し
、レーン３は、ｌｐｌの！！ｃｏＲＩライブラリーを用
いたオリゴヌクレオチド５８と７４の間の増幅産物を示
す。
オリゴヌクレオチド５８と７４を用いたＦ！ｃｏＲＩラ
イブラリーの増幅からの産物を精製した。産物の非対称
的増幅（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　Ｖｏｌ　　８５ページ７６５２−７６５６．
１０月　１９８８　ｔｌ、Ｂ、ギＬ／　７　’／　ユタ
インと１１．エーリッヒ）は、５０ｐ１！ｏｌｅのオリ
ゴヌクレオチド７４およびオリゴヌクレオチド５８を用
いて上述のように３５サイクル行なった。増幅産物を、
（モレキュラー・クローニングーーア・ラボラトリ−・
マニュアル：マニアティスＴ、フリッシュＥ、Ｆ、、サ
ムプルツクＪ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−１９８２に述べられているようにして）Ｇ５０
スパンカラムで精製し、実施例１７に記載のようにして
オリゴヌクレオチド５９を用いて配列決定した。その配
列は、第３Ａ図に示されている。Ｈｉｎｆ　［あるいは
Ｃｌａ　Ｉを用いて行なったＰＣＲ産物の一部の切断は
、これらの制限酵素切断部位の存在を確証するものであ
る（第３４図）。第３４図に示した写真レーンは、以下
の通りである：レーン１　１６Ｘ１７４　Ｈａｅｍ　Ｄ
ＮＡ７−カー２　Ｃ１ａＴで切断した［！ｃｏＲＩ産物
３　　ＥｃｏＲ１産物 ４　　Ｈｉｎｆｌで切断したＥｃｏＲＩ産物５　φχ１
７４　Ｈａｅｍ　ＤＮ＾マーカー以下は、０．５　ｄ熔
のザルシュタ、ト試験管中で混合された。
１０ｐｌ　　ＢａｍＨｌベクトレットライブラリー２０
μ！　５×緩衝液（実施例２ｏで定義されている）１（
１０）ｐＩＩｌｏｌｅ　　オリゴヌクレオチド７５２（
１０）　ｔｔｓ　　　ｄＮＴＰｓ容量は、滅菌し、２回
蒸留した水で１（１０）ｐＺに調製した。蒸発を防ぐた
め、５０μ！の軽鉱油（シグマ）を穏やかに混合液の上
に重層した。次に、この試験管を９６°Ｃに熱した（９
６°Ｃで平衡化したテクネ・プログラマブル・ドライブ
ロックＰＨＣ−１中）。このＤＮＡを９６°Ｃで１０分
間変性させた。その後、このブロックを９０°Ｃになる
まで放冷した。この反応混合液に２ユニツトのＴａｑポ
リメラーゼ（セタス）を添加した。以下の温度および時
間を、オリゴヌクレオナト７５とＢａｍ＋ＨＩサイトの
間の配列の増幅に用いた。
９３°Ｃで０．７分間 ６５℃で０．７分間 ７２°Ｃで１．５分間 これを４０サイクル行なった６次に反応混合液にｌｏ。
ρ−ｏｌｅのオリゴヌクレオチド５８および２ユニント
のＴａｑポリメラーゼを添加し、上述のようにして、増
幅をさらに２０サイクル続けた０反応混合液の一部をア
ガロースゲル電気泳動で分析した（第３５図）。
Ｂａｍ１ｌ　Ｉライブラリーを上述の反応条件下でオリ
ゴヌクレオチド７５と５８を用いて増幅する付加的反応
を行なった。反応混合液の一部をアガロースゲル電気泳
動で分析した（第３５図）。
第３５図では： レーン１は、１ｌａｅ［Ｉ［で切断したφＸ１７４マー
カーを示し、 レーン２は、オリゴヌクレオチド７５を用いたＢａｍ１
ｌ　ｌペタトレシトライブラリーの直線的 増幅産物を示し、 レーン３は、オリゴヌクレオチド５８と７５を用いた２
回目の２０サイクルの増幅から得ら れた産物を示し、 レーン４は、オリゴヌクレオチド５８と７５を用いた２
回目の３５サイクルの増幅から得ら れた産物を示し、 レーン５は、オリゴヌクレオチド５８と７５を用いた２
回目の４０サイクルの増幅から得ら れた産物を示している。
実４１４彫ス ヒトゲノムライブラリーは、発表されている方法にした
がって、コスミドベクターｐＣｏｓＥＭＢＬ２を用いて
構築された（Ｐ［！Ｒリトル（１９８７）　ＤＮＡクロ
ーニングーーア・プラクティカル・アプローチＶｏｌ［
１ｐ１９−４２　ＤＭ　　グローベル編）。ライブラリ
ーは、プローブにＭ１９（Ｋエステイビリら（１９８７
）　Ｎａｔｕｒｅ３６２、８４０−８４５）に対するハ
イブリダイゼーションによって検索した。いくつかの陽
性のクローンが同定され、４０ｋｂの挿入断片の中にに
旧９を含むクローン４．１７が選択された。コスミｌ’
４．１７を旧ｎｄｍで切断し、方法Ｘにしたがってベク
トレットライブラリーを調製した。
２種のオリゴヌクレオチドプライマー７６．７７が合成
された。
７６　５’　ＧにＡＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴ＾＾
ＣＡＧＴＧＴＡＧＣＣ７７５’　ＧＣＴＧＣＡＴＣＡＴ
ＡＴＡＡＧＴＴＧＣにれらのプライマーの位置は、第３
６　（ａ）図中に示されている。下記のようにして、ラ
イブラリーの一部についてＰｃｔ？増幅を行なった。以
下は、０，５戚容のザルシュタット試験管中で混合され
た：０、１ｐｇのコスミド・ヘクトレットライブラリー
（１０）ｐ１（１０）ｐのオリゴヌクレオチド５８１（
１０）ρ■ｏｌｅのオリゴヌクレオチド７６１（１０）
μＨのｄＮＴＰｓ１０ｐ！のｉｏｘ緩衝液 １０Ｘ緩衝液は、５（１０）＊Ｍ　　ＫＣｆｌｏｏｓＭ
　　Ｔｒｉｓ　ｔｌ（Ｊ　　ｐＨ８，３１ｈ＋Ｍ　　阿
ｇｃｌ。
０．１χ　ゼラチン ２回目の反応には、０，５ｄ容のザルシュタット試験管
中に以下を含んだものを用意した。
０、　ｌｐｇのコスミド・ヘクトレットライブラリー１
（１０）ρ５ｏｌｅのオリゴヌクレオチド５８１（１０
）ρｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド７７１（１０）　ｕ
　ＭのｄＮＴＰｓ１０ｐｌの１０×緩衝液 容量は、滅菌し、２回蒸溜した水で１（１０）．Ｚに調
整した。蒸発を防ぐため、５０ｐ７の軽鉱油（シグマ）
を穏やかに混合液の上に重層した０次に、この試験管を
９６゛Ｃに熱した（９６’Ｃで平衡化したテクネ・プロ
グラマブル・ドライブロックＰＨＣ−１中）、このＤＮ
Ａを９６°Ｃで１０分間変性させた。その後、このブロ
ックを９０°Ｃになるまで放冷した。この反応混合液に
２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セタス）を添加した
。以下の温度および時間を、オリゴヌクレオチド５８と
７６および５８と７７の間の配列を増幅するために用い
た。
９２゛Ｃで２分間 ６５°Ｃで２分間 ７２℃で５分間 これを４０サイクル行なった。最終サイクルの際、反応
混合液を７２°Ｃで１０分間保った。
この反応混合液から一部（１５μりを分取した。
ロード用色素混合液（５ｕｌ　）を添加し、試料を１．
４％のアガロースゲルで分析した。
ロード用色素混合液 １５χ（−／ν）　　フィコール４（１０）０．０５χ
（＠／ν）　ブロモフェノール・ブルー〇、０５χ（Ｈ
／ｖ）　　キシレン・シアツールＩＸＴＲＨに溶解 この結果は、第３６　（ｂＪ図に示されている。
レーン１　φＸ１７４１１ａｅ［Ｉ　ＤＮ＾マーカー２
２３０塩基対の産物（オリゴヌクレオチド５８、オリゴ
ヌクレオチド７８） ３　１２（１０）塩基対の産物（オリゴヌクレオチド５
８、オリゴヌクレオチド７７）４　φＸ１７４１１ａｅ
ｌ［ｌ　ＤＮＡマーカー実ＪＬｆ彫は 以下のオリゴヌクレオチドが合成された。
７８　５’　　ＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＧＧＴＧＡ
ＴＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴ
ＣＣＴＣ？ＣＣＴＴＣｐＢＩｉ３２２プラスミドのテト
ラサイクリン耐性化遺伝子のヌクレオチド残基３８５−
４１４を表わす配列を含む、修飾されたＥ型オリゴヌク
レオチド（Ｔマニアナイス、Ｆ、Ｆフリッシュ、Ｊサム
プルツク（１９８２＞モレキュラー・クローニングアー
ア・ラボラトリ−・マニュアルｐ４７９−５０３）、　
Ｄ型オリゴヌクレオチドとともに用いられる。
７９　５’　ＣＣＧＧＴＧＩＩＴＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧ
ＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧｐＢＲ３２２プラスミドのテ
トラサイクリン耐性化遺伝子のヌクレオチド残基３８５
−４１４を表わす配列を含む、修飾されたユニバーサル
・ヘクトレットプライマー（Ｔマニアナイス、ＥＦフリ
ッシュ、Ｊサムプルツク（１９８２）モレキュラー・ク
ローニングア・ラボラトリ−・マニュアルｐ４７９−５
０３）。後文中で述べるオリゴヌクレオチド７８および
オリゴヌクレオチド８０／８１．８２／８１ならびに８
３／８１　とともに用いられる。
８０　５’　ＡＡＴＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴ
ＡＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＧＡ
ＧＧＡＧＡＧＡＡＣＴＢｃｏＲｌ粘着末端、ＮｏＬＩ認
識部位およびＰｏｋ　Ｉ認識部位を含む修飾されたＤ型
オリゴヌクレオチド。
オリゴヌクレオチド８１とともに用いる。
８１５′　＾ＧＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＧＡＴＣＣＣＧＧ
ＣＣＡＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＧＡＴＧＧＣＧＧ
ＣＣＧＣＣ 修飾されたＥ型オリゴヌクレオチド。
８２　　５’　　ＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣ
ＣＴＡＡＴＴＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧ
ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣ↑ １１ｉｎｄｌ［ｌ粘着末端、Ｎｏｔｌ認識部位およびＦ
ｏｋ　Ｉ　８２識部位を含む修飾されたＤ型オリゴヌク
レオチド。
オリゴヌクレオチド８１とともに用いる。
８３　５’　ＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣ−
）ｉｌ＋□アミノへキシル修飾による３′末端の保護を
した旧ｎｄ［Ｉｌ粘着末端を含む、修飾されたＡ型オリ
ゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド８１とともに用い
る。
８４　５’　ＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＴＴＴＧ＾
＾ＣＴＡＧＣＫＭ１９領域のＥｃｏＲｌサイトに隣接す
るプライマー以下の増幅の各々に適した制限酵素地図が
第３７図に示されており、そこでは、 （ａ）は、［１ｃｏＲｌヘクトレットにライゲーション
したゲノムＤＮＡの一部分の制限酵素地図を示している
。
オリゴヌクレオチド２７．７６．７８および７９の位置
が示しである。
（ｂｌは、ＥｃｏＲｌヘクトレットにライゲーションし
たゲノムＤＮＡの一部分の制限酵素地図を示している。
オリゴヌクレオチド７８．７９および８４の位置が示し
である。
（Ｃ）は、ＥｃｏＲｌヘクトレットにライゲーションし
たフェニルアラニン・ヒドロキシレース遺伝子のエクソ
ン９の一部分を示している。オリゴヌクレオチド６３お
よび７９の位置が示しである。
（ｄ）は、修飾されたＥｃｏＲｌヘクトレットにライゲ
ーションしたゲノムＤＮＡの一部分（上の３７　（ａ）
に述べられている）制限酵素地図を示している。オリゴ
ヌクレオチド７６．７９．８０および８１の位置が示し
である。
（ｅｌは、修飾されたＥｃｏＲｌヘクトレットにライゲ
ーションしたゲノムＤＮＡの一部分（上の３７　（”）
　ニ述へられている）の制限酵素地図を示している。オ
リゴヌクレオチド７９．８０．８１および８４の位置が
示しである。
Ｉｎは、修飾されたＢｃｏＲｌヘクトレットにライゲー
ションしたフェニルアラニン・ヒドロキシレース遺伝子
のエクソン９の一部分を示している。オリゴヌクレオチ
ド６３．７９．８０および８１の位置が示しである。
（ｇ）は、修飾された旧ｎｄｎｌヘクトレットにライゲ
ーションしたゲノムＤＮＡの一部分の制限酵素地図を示
している。オリゴヌクレオチド７６．７Ｂ、８０および
８１の位置が示しである。
（５）は、修飾された旧ｎｄｌ［ｌベクトレットにライ
ゲーションしたゲノムＤＮ＾の一部分の制限酵素地図を
示している。オリゴスクレオチド７８．７９．８１およ
び８２の位置が示しである。
（ｉ）は、修飾されたｌ１ｉｎｄｌｌｌヘクトレツトに
ライゲーションしたゲノムＤＮＡの一部分の制限酵素地
図を示している。オリゴヌクレオチド７８．７６．７９
．８１および８２の位置が示しである。
（ａ）　　［！ｃｏＲＩへクトレットライブラリーは、
方法Ｘにしたがって、ＥｃｏＲｌで切断したゲノムＤＮ
Ａ　（細胞系列７３８７）および、オリゴヌクレオチド
２７と７９から調製された。ライブラリーの一部（ｌｎ
ｇ）をオリゴヌクレオチド７６および７９で増幅した。
増幅は、実施例８に述べられているようにして行なった
。
反応混合液の一部（１５、ｉ　）を１．４χのアガロー
スで分析した。その結果は第３８図に示されている。
レーンｌ　φＸ１７４　Ｈａｅｌ［ｌ　ＤＮＡ７−カー
２　オリゴヌクレオチド７６と７９の間の増幅の結果生
じた、８７０塩基対の産物 ［有］）前出の実施例に述べられたＥｃｏＲｌベクトレ
ットライブラリーの一部（ｌｎｇ）は、オリゴヌクレオ
チド７９と８４を用いて増幅された。増幅は、実施例８
に述べられているようにして行なった０反応混合液の一
部（１５ｐｌ　）を１．４χのアガロースゲルで分析し
た。その結果は第３８図に示されている。
レーン３　オリゴヌクレオチド７９と８４の間の増幅の
結果生じた、５２０塩基対の産物 （Ｃ）　　前出の実施例に述べられたＥｃｏｌｌ　ｌベ
クトレットライブラリーの一部（ｌｏｇ）は、オリゴヌ
クレオチド６３と７９を用いて増幅された。増幅は、実
施例８に述べられているようにして行なった。反応混合
ｆｉ＜の一部（１５ｐ／）を１．４χのアガロースゲル
で分析した。その結果は第３８図に示されている。
レーン４　オリゴヌクレオチド６３と７９の間の増幅の
結果生じた、６（１０）塩基対の産物（ｃ１）　　Ｅｃ
ｏＲＩベクトレットライブラリーは、方法Ｘにしたがっ
て、［１ｃｏＲＩで切断したゲノムＤＮ＾（細胞系列７
３８７　）および、オリゴヌクレオチド８０と８１から
調製された。ライブラリーの一部（ｌｏｇ）をオリゴヌ
クレオチド７６および７９で増幅した。増幅は、実施例
８に述べられているようにして行なった。
反応混合液の一部（１５ｐＺ）を１，４χのアガロース
ゲルで分析した。その結果は第３８図に示されている。
レーン５　オリゴヌクレオチド７６と７９の間の増幅の
結果生じた、８７０塩基対の産物 （ｅ）　　前出の（４）に述べられたライブラリーの一
部は、オリゴヌクレオチド７９と８４を用いて増幅され
た。
増幅は、実施例８に述べられているようにして行なった
０反応混合液の一部（１５ｐＺ）を１，４χのアガロー
スゲルで分析した。その結果は第３８図に示されている
。
レーン６　オリゴヌクレオチド７９と８４の間の増幅の
結果生じた、５２０塩基対の産物 （ｆ）　　前出の（４）に述べられたライブラリーの一
部は、オリゴヌクレオチド６３と７９を用いて増幅され
た。
増幅は、実施例８に述べられているようにして行なった
。反応混合液の一部（１５，ｕりを１．４χのアガロー
スゲルで分析した。その結果は第３８図に示されている
。
レーン７　オリゴヌクレオチド６３と７９の間の増幅の
結果生じた、６（１０）塩基対の産物（ｇ）　　旧ｎｄ
ｎｌベクトレットライブラリーは、方法Ｘにしたがって
、Ｂｉｎｄｌ［［で切断したゲノムＤＮＡ　　（ａｔ胞
系列７３８７）および、オリゴヌクレオチド３０と８１
から調製された。ライブラリーの一部（ｌｏｇ）をオリ
ゴヌクレオチド７６および７９で増幅した。増幅は、実
施例８に述べられているようにして行なった。
反応混合液の一部（１５ｐ／）を１．４χのアガロース
ゲルで分析した。その結果は第３８図に示されている。
レーン８　オリゴヌクレオチド７６と７９の間の増幅の
結果生じた、２３０塩基対の産物 （５）ｌｌｉｎｄｌ［ｌベクトレットライブラリーは、
方法×にしたがって、ＥｃｏＲＩで切断したゲノムＤＮ
＾　（細胞系列７３８７）および、オリゴヌクレオチド
８２と８１から調製された。ライブラリーの一部（ｌｎ
ｇ）をオリゴヌクレオチド７６および７９で増幅した。
増幅は、実施例８に述べられているようにして行なった
。
反応混合液の一部（１５ｐＺ）を１．４χのアガロース
ゲルで分析した。その結果は第３８図に示されている。
レーン９　オリゴヌクレオチド７６と７９の間の増幅の
結果生じた、２３０塩基対の産物 （ｌ　　ＩＩｔｎｄｌ［ｌベクトレットライブラリーは
、方法Ｘにしたがって、ＥｃｏＲｌで切断したゲノムＤ
ＮＡ　　（細胞系列７３Ｂ？）および、オリゴヌクレオ
チド８３と８１から調製された。ライブラリーの一部（
ｌｎｇ）をオリゴヌクレオチド７６および７９で増幅し
た。増幅は、実施例８に述べられているようにして行な
った。
反応混合液の一部（１５ｐＺ）を１．４χのアガロース
ゲルで分析した。その結果は第３８図に示されている。
レーン９　オリゴヌクレオチド７６と７９の間の増幅の
結果体した、２３０塩基対の産物 レーン１０　　φＸ１７４１１ａｅｌｌｌ　ＤＮＡマー
カー支施阻ハ 以下のオリゴヌクレオチドが合成された二８５　５’　
ＡＴＴＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＴＧＴＴＴ
ＴＧＴＣＡ８６　５’　ＡＧＣＣＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧ
ＧＧＣＡＴＡＡＴＣＴＣ８７５’　ＴＣＡＣ↑＾ＣＣＡ
ＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＧＣ８８５’
　ＣＣＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧ
ＴＡＡＧＧＴＤＮＡは、細胞系列７３Ｂ２　（ＫＭ１９
　Ｐｓｔ　Ｉ多形性に対し、杓のハブロタイブを持つこ
とがあらかじめ示されている）から抽出され、Ｐｓｔｌ
で切断さた。ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムで抽
出した後、エタノール沈澱で回収した（第３９　（８１
図を参照）。
サーキュー１ゼーシッン 以下は、０．５ｄ容のザルシュタント試験管中で混合さ
れた； １１（１０）ｎ　　ＰｓＬ　Ｉにより切断した７３８２
　ＤＩＩＡｌｏｔｒｌ　　ＩＯＸライゲージ目ン緩衝液
Ｌｏａｆ　　　１０ｍＭ　　ＡＴＰＯ，５，Ｉ　　Ｔ４
　　ＤＮＡ　リガーゼ（ベーリンガー・マンハイム　８
ユニツト／　ｕｌ　） 容ｆｌ・滅菌し、２回蒸溜した水で１（１０）ｐ７に調
整し、２５゛Ｃで２時間保温した。５つの同じ反応を行
ない、２５°Ｃで２時間保温した後、貯蔵した。
貯蔵した混合液をフェノール・クロロホルムで抽出し、
ＤＮＡをエタノール沈澱により回収した。ＤＮＡのベレ
ットを１（１０）ｐ７の水に溶解し、充填済みカラム（
Ｇ−５０セフアデツクス・ニック・カラム、ファルマシ
ア社）で精製した。ＤＮＡを４（１０）ｔｒｌの水で溶
出した。この溶液を凍結乾燥し、終濃度５０ｎｇ／ｐＺ
となるように水（９ｔｔｌ　）に再び溶解した。この溶
液１ｐ！を水で５０ｐ！に希釈した（第３９ら）図参照
）。
２ｐｌ　　Ｐｓｔｌサークルズ（１（１０）ｎｇ）０．
５ｕｌ　　ＩＯＸ緩街液 １．５ｄ　　Ｈよ０ １ｔ！７　　Ｈｉｎｄｎｌ　（２ニー’−７ト）この反
応混合液を３０分間３７°Ｃに保温した。
旦土ゲニ之１ノ 以下のものを制限酵素による切断物に添加した。
ｌｐｌ　　１０ｘ緩衝液 １　ｐｉ　　１０ｍＭ　ＡＴＰ ＩＩＪｌ　　アニーリングした オリゴヌクレオチド８１と８２（０，２５ｐｍ＋ｏｌｅ
）あるいは８１と８３（０，２５ｐ＋ｍｏｌｅ）１　ａ
ｌ　　ライゲース（２ユニツト）０．５１　　ｔｏｘ旧
１ｄｏｌ緩衝液 この混合液を３０分間３７°Ｃで保温した。
アニーリングしたオリゴヌクレオチド（８１／８２ある
いは８１／８３０．２５ｐｍｏｌｅ）を添加し、この反
応液を３７°Ｃでさらに１時間保温した６次に、反応混
合液の容量を水で１０ｈＺに調整した（第３９（Ｃ）図
を参照）。
ｌ、以下は、０．５＃ｆｉ容のザルシュタット試験管中
で混合された： Ｐｓｔｌサークルズ　（５ｎｇ） オリゴヌクレオチド８５　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）オ
リゴヌクレオチド８６　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）１０
ｐｌ　　ｌ０ＸＰＣＲ緩衝液１（１０）　ａ　Ｍ　　ｄ
ＮＴＰｓ ２ユニン）　　Ｔａｑポリメラーゼ（セタス）容量は、
水で１（１０）μｌに調整し、増幅は実施例８に述べら
れているようにして行なった。予想された７１０塩基対
の産物が得られ、これは、サークルズが形成されていた
ことを確証するものである。この結果は、第４０図に示
されている。
レーン１　φＸ１７４　Ｈａｅｍ　ＤＮＡマーカー２　
オリゴヌクレオチド８５と８６の間の増幅の結果体じた
、７１０塩基対の産物 ２、以下は、０，５ｄ容のザルシュタット試験管中で混
合された： １０ｎｇのＰｓロサークルー旧ｎｄＩＩＩベクトレット
−オリゴヌクレオチド　８１／８２ オリゴヌクレオチド８５　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）オ
リゴヌクレオチド７９　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）１０
ｔｒｌ　　１０　Ｘ　ＰＣＲ緩衝液１（１０）　、ｌ／
　Ｍ　　ｄＮＴＰｓ２ユニット　Ｔａｑポリメラーゼ（
セタス）容量は、水で１（１０）μ！に調整し、増幅は
実施例日に述べられているようにして行なった。
予想された７２０塩基対の産物が得られた。この結果は
、第４０図に示されている。
レーン３　オリゴヌクレオチド８５と７９の間の増幅の
結果生した、７２０塩基対の産物 ３、上述の（２）に記載の増幅反応混合液を１０７の率
で希釈した。希釈した混合液１μｌを０．５ｄ容のザル
シュタントＥＭ管にとった。
以下を、ザルシュタフト試験管に加えた。
オリゴヌクレオチド７９　（ｌｏｏｐｓ＋ｏｌｅ）オリ
ゴヌクレオチド８８　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）１０μ
ｍ　　１０ＸＰｃＲ１１衝液１（１０）　ｐ　Ｍ　　ｄ
ＮＴＰｓ ２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セタス）容量は、水
で１（１０）μｌに調整し、増幅は実施例８に述べられ
ているようにして行なった。予想された５（１０）塩基
対の産物が得られた。この結果は、第４０図に示されて
いる。
レーン４　オリゴヌクレオチド７９と８８の間の増幅の
結果生した、５（１０）塩基対の産物４、前出の（３）
からの増幅産物をＰｓｔｌで切断した。
予想された産物（３４０塩基対、１６０塩基対）が得ら
れた。この結果は、第４０図に示されている。
レーン５　　ＰＣＲ産物（レーン４）をＰｓｔｌで切断
した結果生じた産物、３４ｏ塩基対 と１６０塩基対の産物が得られる。
５、以下を、０．５−容のザルシュタフト試験管に加え
た。
１０ｎｇのＰｓｔｌサークル−１１ｉｎｄｌＩｌヘクト
レツトオリゴヌクレオチド　８３／８２ オリゴヌクレオチド８５　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）オ
リゴヌクレオチド７９　（ｌｏｏｐａ＋ｏ！ｅ）ＬＯｐ
ｌ　　１０　ｘ　ｐｃＲ１１衝液１（１０）　ｕ　Ｍ　
　ｄＮＴＰｓ ２ユニツト　Ｔａｑポリメラーゼ（セタス）容量は、水
で１（１０）ｐ／に調整し、増幅は実施例８に述べられ
ているようにして行なった。予想された７２０塩基対の
産物が得られた。この結果は、第４０図に示されている
。
レーン６　オリゴヌクレオチド７９と８５の間の増幅の
結果生じた、７２０塩基対の産物 ６、上述の（５）に記載の増幅反応混合液を１０’の率
で希釈した。希釈した混合液１　ｐｚを０．５１１１ｉ
！容のザルシュタラ］・試験管にとった。以下ものも、
ザルシュタ・、／ト試験管に加えた。
オリゴヌクレオチド７９　（１（１０）ｐｍｏｌｅ）オ
リゴヌクレオチド８８　（１（１０）ρ−ｏｌｅ）１０
ｐ１のｘｏｘｐｃｐｌｉ街液１（１０）　ＩＩ　Ｍ　　
ｄＮＴＰｓ ２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セクス）容量は、水
で１（１０）μＩに調整し、増幅は実施例８に述べられ
ているようにして行なった。予想された５（１０）塩基
対の産物が得られた。この結果は、第４０図に示されて
いる。
レーン７　オリゴヌクレオナト７９と８８の間の増幅の
結果生じた、５（１０）塩基対の産物７、前出の（６）
からの増幅産物をＰｓｔｌで切断した。
予想された産物（３４０塩基対、１６０塩基対）が得ら
れた。この結果は、第４０図に示されている。
レーン８　　ＰＣＲ産物（レーン６）をＰｓｔｌで切断
した結果生じた産物。３４０塩基対と １６０塩基対の産物が得られる。
８、上述の（３）に記載の増幅反応混合液を１０’の率
で希釈した。希釈した混合液１μ！を０．５ｄ容のザル
シュタフト試験管にとった。以下を、ザルシュタフト試
験管に加えた。
オリゴヌクレオチド７９　（１（１０）ｐａｏｌｅ）オ
リゴヌクレオチド８５　（ｌｏＯｐｍｏｌｅ）１０ｔｔ
ｌの１０　Ｘ　ＰＣＲ緩街液１（１０）　ｕ　Ｍ　　ｄ
ＮＴＰｓ ２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（セタス）容量は、滅
菌し、２回蒸留した水で１（１０）ｐＺに調整し、増幅
は実施例１に述べられているようにして行なった。予想
された７２０塩基対の産物が得られた。この結果は、第
４０図に示されている。
レーン９　オリゴヌクレオチド７９と８５の間の増幅の
結果生じた、７２０塩基対の産物 ９、前出の（８）からの増幅産物をＰｓｔｌで切断した
。
予想された産物（３７０塩基対、３５０塩基対）。
レーン１０　　ＰＣＲ産物（レーン６）をＰｓｔｌで切
断した結果生じた産物。３４０塩基対と １６０塩基対の産物が得られる。
レーン１１　　φＸ１７４１１ａｅｌ［Ｉ　ＤＮＡ？−
カー第４０図に示したアガローゼ（ａｇａｒｏｓｅ）ゲ
ルのレーン３からのサンプルを沈澱し新しいアガローゼ
ゲル上にロード（ｌｏａｄ）　シた。その写真を第４１
図として示した。第４１図の写真のレーンは次のとおり
である。
レーンｌ　φＸ１７４　Ｈａｅ［［Ｉ　ＤＮＡ７−カー
レーン２　第４０図のサンプル型レーン３レーン３　φ
Ｘ１７４　ＨａｅＩ［Ｉ　ＤＮ＾マーカーレーン４　第
４０図のレーン９からの増幅実施例２５ 脱リン酸工程（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａＬｉｏｎ　
５Ｌｅｐ）を行わなかった外は実施例３，４，５．６及
び７を繰返した。
結果は第４２図に示した。同図において、アガローゼゲ
ルの写真のレーンは下記のとおりである。
レーン１　φＸ１７４　Ｈａｅｍ　ＯＮ＾マーカーレー
ン２　実施例３（１）の増幅生産物レーン３　実施例３
（ｉｉ）の増幅生産物レーン４　実施例４の増幅生産物 レーン５　実施例５の増幅生産物 レーン６　実施例６（ｉｉ）の増幅生産物レーン７　実
施例７（ｉ）の増幅生産物レーン８　このレーンは無視 レーン９　φＸ１７４１１ａｅ［［ｌ　ＤＮＡ７−カー
【図面の簡単な説明】
第１　（８１図は標的二本鎖核酸を示し、第１（ｂ）図
は制限酵素で切断した標的核酸を示し、第１（Ｃ）図は
標的核酸の制限断片とへクトレットとの連結によって得
られた標的核酸断片／ベクトレットを示し、第１（ｄ）
図は（ｉ）開始プライマー、および（ｉｉ　）へクトレ
ットプライマーと標的核酸断片／ベクトレットユニット
とのハイプリダイゼーシ式ンを示している。 第２図は本発明の態様の一つを示している；第２（ａ）
図はゲノムＤＮＡの部分消化によって得られた制限断片
をゲル電気泳動にかけて視覚化したものを示し、第２し
）図はさらなる操作のために選択された異なる型の高分
子量断片長の混合物を示している。第２（Ｃ）図はそれ
に続く連結反応で標的核酸断片／ベクトレットユニット
を形成させることにより得られた産物の混合物を示して
いる。 第３図は開始プライマーにハイブリダイズすることので
きる制限断片の相対濃度を増加させることを求める本発
明の態様の一つを示したものである。 第４図はＳ１ヌクレアーゼの使用を避け、開始プライマ
ーおよびベクトレットプライマーの双方にハイブリダイ
ズ可能な制限断片の相対４度を増加させることを求める
本発明のさらなる態様を示したものであり、第４（ａ）
図はＤＮＡ　リガーゼの存在下でブロッキングペクトレ
フトを有する目的の標的ＤＮＡ配列の完全消化によって
産生された制限断片を処理して得られる産物の混合物を
示したものである。第４（ｂ）図は制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化後の本発明で使用するブロッキングベクトレット
を示しており、第４（Ｃ）図は第４（ａ）図で示した産
物の混合物を完全に消化して得られた産物を示す。 第５図は本発明で用いた二つの異なるベクトレット部分
を示しており、ヘクトレ・７ト部分（１）はブロッキン
グポリメライゼーション可能な３′末端群を有する短い
トップ（５’）鎖およびテイルを形成するボトム（３’
）鎖を有する二本鎖ブロッキングベクトレットであり、
二亥トップ（５’Ｈ１の３′末端群はヌクレオシド３リ
ン酸とヌクレオシド３リン酸ポリメライゼーションのた
めの試薬の存在下、ハイブリダイゼーション条件下でブ
ロンキングポリメライゼーションを行なうことができ；
ベクトレット部分（１１）は二本鎖であるが鎖の間にあ
る程度の非相補性を有するものである。 第６図は第５図のベクトレット部分に対する本発明の応
用を模式的に示したものである。 第７図はへクトレソトライブラリーの使用の模式図であ
る。 第８図は環状化した標的核酸断片の増幅に対する本発明
の応用を模式的に示したものである。 第９図はオリゴヌクレオチド５８と６１（方法１の過程
６）およびＸｂａ　Ｉベクトレットユニット／ライブラ
リーを用いたα−１アンチトリプシン遺伝子の一部の増
幅を示している。 第１０図はプラスミド８３　（［！ｃｏＲ１部位に４４
０ｂｐのインサートを有するρ１Ｉｃ８　）の制限酵素
地図を示ず６第１１図（ｉ）および（１１）は実施例１
、実施例５、および実施例７で得られた増幅された断片
を示すアガロースゲルの写真である。 第１２図はエクソン９に隣接したフェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ遺伝子由来の配列と、オリゴヌクレオチド
５８．６３．６６、および５９が結合する相対位置を示
す。 第１３図は実施例日によって得られた増幅産物を示すア
ガロースゲルの写真の一部を示している。 第１４図は実施例９によって得られた増幅産物を示すア
ガロースゲルの写真である。 第１５図は実施例１０によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第１６図は実施例１１によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第１７図は実施例１２によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第１８図は実施例１３によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第１９図は実施例１４によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第２０図は実施例１５によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第２１図は実施例１６で生成された産物の塩基配列を示
すシーフェンスゲルのオートラジオグラフを示す。 第２２図は実施例１６に述べられた産物から得られたヌ
クレオチド配列データを示したものである。 第２３図はエクソン１に隣接したフェニルアラニンヒド
ロキシラーゼ遺伝子の一部を示し、オリゴヌクレオチド
５８．６２、および６７の相対位１およびベクトレット
ユニット構築に用いたＥｃｏＲ１部位を指示している。 第２４（ａｊ図は実施例１７により得られた一次増幅産
物を示すアガロースゲルの写真であり：第２４（ｂ１図
は実施例１７により得られた二次増幅産物を示すアガロ
ースゲルの写真であり；第２５　（８１図はオリゴヌク
レオチド６２を用いて読んだ塩基配列であり、第２５（
ｂ）図はオリゴヌクレオチド６７を用いて読んだ塩基配
列であり、第２５　（Ｃ）図はオリゴヌクレオチド６２
および６７を用いて読んだ全体の塩基配列を示している
。 第２６図はエクソン■に隣接したα−ｌアンチトリプシ
ン遺伝子の一部を示しており、オリゴヌクレオチド５８
．６０．６Ｂ、６９．７０の相対位置およびベクトレン
トのアニーリングと連結反応のためのＥｃｏＲｌ制限部
位も示している。 第２７（８１図は実施例１８により得られた一次増幅産
物を示すアガロースゲルの写真であり；第２７世）図は
実施例１８により得られた二次増幅産物を示すアガロー
スゲルの写真であり；第２７　（Ｃ）図は第２７（ｂ）
図で示されたゲルからブロッティングし、α−１アンチ
トリプシンプローブをプローブとして用いたナイロンフ
ィルターのオートラジオグラフである。 第２８図はヒトゲノムの第７染色体上の特性のない断片
であるＤ５のヌクレオチド配列を示し、オリゴヌクレオ
チド７１および７２の相対位置を示している。 第２９図はＤ５を含む領域の制限酵素地図を示している
。オリゴヌクレオチド７１および７２の相対位置が示さ
れている。実施例１９にしたがって合成された産物の位
置も示されている。 第３０図は実施例１９により得られた増幅産物示すアガ
ロースゲルの写真である。 第３１図は実施例１９に記述されたようにして得られた
Ｂｃｌ　ｌ産物から得られたヌクレオチド配列を示して
いる。制限酵素消化から予測された旧ｎｄｌｌ！および
ｌｌａｅｌｌｌ部位の位置が示されている。ベクトレッ
トユニット増幅の連続サイクルで開始プライマーとして
使用されるオリゴヌクレオチド７３の位置も示されてい
る。 第３２図は実施例２０により得られた増幅産物を示すア
ガロースゲルの写真である。 第３３図は実施例２０で述べられているようにして得ら
れたＥｃｏＲｌ産物から得られたヌクレオチド配列を未
している。 第３４図は実施例２０に述べられたようにして得られた
ＥｃｏＲＩ産物の、制限酵素消化後に得られた断片を示
すアガロースゲルの写真である。 第３５図は実施例２１によって得られた増幅産物を示す
アガロースゲルの写真である。 第３６　（８１図は１Ｉｉｎｄ［［／コスミドベクトレ
ットライブラリーの一部の制限酵素地図であり、オリゴ
ヌクレオチド５８．７６および７７の位置が示されてい
る。 第３６（ｂ）図は実施例２２により得られた増幅産物を
示すアガロースゲルの写真である。 第３７　（ａ）図はＥｃｏＲｌペタトレッドに連結した
標的ゲノムＤＮＡの一部の制限酵素地図である。オリゴ
ヌクレオチド２７．７６．７Ｂ、および７９の位置が示
されている。 第３７（ｂ）図はＥｃｏＲｌペタトレッドに連結した標
的ゲノム１）ＮＡの一部の制限酵素地図である。オリゴ
ヌクレオチド７８．７９、および８４の位置が示されて
いる。 第３７（Ｃ）図はＥｃｏＲｌペタトレッドに連結したフ
ェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子エクソン９の断
片を示している。オリゴヌクレオチド６３および７９の
位置が示されている。 第３７（ｄ１図は修飾したＥｃｏＲｌペタトレッドに連
結した標的ゲノムＤＮ＾断片（上記３７　（Ｃ１に記述
）の制限酵素地図である。オリゴヌクレオチド７６．７
９．８０、および８１の位置が示されている。 第３７（ｅ）図は修飾したＥｃｏＲｌペタトレッドに連
結した標的ゲノムＤＮＡ断片（上記３７（ｂ）に記述）
の制限酵素地図である。オリゴヌクレオチド７９．８０
．８１、および８４の位置が示されている。 第３７（ｆ１図は修飾したＥｃｏＲｌペタトレッドに連
結したフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子エクソ
ン９の断片を示している。オリゴヌクレオチド６３．７
９．８０および８１の位置が示されている。 第３７（＠図は修飾した旧ｎｄｌ［ｌペタトレッドに連
結した標的ゲノムＤＮＡ断片の制限酵素地回である。 オリゴヌクレオチド７６．７８、および７９の位置が示
されている。 第３７（員は修飾した旧ｎｄｌ［ｌペタトレッドに連結
した標的ゲノムＤＮＡ断片の制限酵素地図である。オリ
ゴヌクレオチド７６．７９．８１および８２の位置が示
されている。 第３７（ｉ１図は修飾した旧ｎｄｔｌ［ベクトレットに
連結した標的ゲノムＤＮＡ断片の制限酵素地図である。 オリゴヌクレオチド７６．７９．８１および８３の位置
が示されている。 第３８図は実施例２３　（ａ）、（ｂ）、（Ｃ１、（ｄ
）、（ｅ）、（ｆ）、（湯、（５）、および（ｉ）によ
って得られた増幅産物を示すアガロースゲルの写真であ
る。 第３９（ａ）図はプローブＫＭ１９によって検出された
ポリモルフイックＰｓｔ１部位を含む標的ゲノムＤＩＩ
Ａ配列の制限酵素地図である。ポリモルフイックＰｓｔ
１部位は星印で示されている。 第３９（ｂ１図はＰｓｔｌで切断された標的ゲノムＤＮ
Ａ断片の連結による環状産物の生成を示している。 第３９　（Ｃ）図はオリゴヌクレオチドを旧ｎｄｌｌで
切断したＰｓｔｌ環状産物に連結することによる旧ｎｄ
Ｉ［ベクトレットユニットライブラリーの構築を示して
いる。 第４０図は実施例２４によって得られた増幅生産物を示
すアガロースゲルの写真である。 第４１図は第４０図のレーン３がらのサンプルをとり沈
澱、新しいアガａ−スゲルにロード（ｌｏａｄ）　サせ
て得たアガロースゲルの写真を示す。 第４２図は、実施例２５により得た増幅生産物を示すア
ガロースゲルの写真である。 （外３名） 図＝の１′争Ｓ（内容に変更ｚしン （ｂ〕　− ｍ＝＝Ｉ＝− ５−３′ ３′５′ （ｃ） （＋１） ｌ　ｉｉｉ　１ Ｆｔ’ｇ、５゜ １）プ０．７へシデベクトし１．ト ５’　　Ｎ）Ｎ２８３Ｎ’Ｎ’　　晶ＧＧＡＧＡＧＣＸ
　３’３、　　　Ｎ５゜ １１〉非相調１灼ペク←レント ５＋　　Ｎ”Ｎ”ＮｉＮ’Ｎｓ　　ムＡＣＧＡＣＡＧＧ
ＡＣ３’　　Ｎ５’　ＴＴＣＣＴＣＴＣｃＴＣａＡｃＡ
ＡａｃｃＡｃｋｃ　３’ ＣＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣ５ ｉｔ ＋ 一ズ“の　Ｘｂａ＠シ信）１九４し丁；ル１し・・１１
１０（ｂ） ＠＋ｒ＋ｄ　ＩＣＥ （Ｃ） ｉ２．１４５６’７Ｂ９＋０１１１２ １２３４５．６ ６　’／　８９　＋　ｉｉ ’、２３４５６′７８９ ］Ｑ　＋ｉ 〜・７５・ 〜・１６・ １２３７．５６７８９１０ １４ｂ６ ７：／々、２４゜ １ｋＮｃｃＴＧｃＡｃＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡｃＡｃｃＡ
ｒｒｃｃｃＣＴＡＣＡＧＣＡ丁ＡＴＡＡＡＡ丁丁＾Ｔ：
１５１ＴＡＴＣＡＣＴＴＧＡＣ？ＧＴＴＡＴＣＣＡＣＴ
ＣＣＴｃｎ７ＡＡＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣ’ＴＣ丁ＣＡＧ
ＧＡＧ２０１ＣＡＣＣｒＡＡＧＧＧＴＡＧ入人ＴＡＧＧ
ＡＡＣＴＧＧＣＡＣ’ｒＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧｔＪｃ
ＡＫｃｃＴＴ２５５、ＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＴＧ
ＧＡＧＡ丁ＧＣＡＣＴＧＧＡＧ丁ＣＴＧＧＧＴＣ丁ＴＣ
ＧＡＡＡＧＴＡＧＣＣ３０１ＡＴＧＴＴｒＧＡＭＧＧＣ
ＣＡＧｍ’ＴＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧ’ｒＡ（ＴＣ
ＴＣＡＴ’ＴＳＣＡ丁ＣＴＧ３５１ｃｃＡｃｃｃｉＣ人
ムＡＴＴＴＣＴｒＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＡＣＡｃｃＣＴ
ｃｃｔｒｒｒ丁ＡにＣＴＴＴＧＴＴ＾ＧＡＴＣＣＴＣｉ
ＴＡＣＡＣＡＴＡＡ人ＡＧＧＡＣＡＡＧＣＴｆ：ＡＡＣ
ＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＡＣＴ丁ＡＡＣ１０１ＡＴＧ＆
ＡＧＣＣＴＴＴ？ＡＴＴｒＴｒＡＡｃ入＾人人ＡＡＡＴ
ＧＣＣＣＴＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＡ７ｕ１５１　
　　ＴＴＡＧ＋刀ＴＣＡＧ　　ＡπにυμＡＧＣσＧ＝
τＣ５　ｔ　’、’ｊ　２ ′２３ １２　　’：（１４も １．２　ｚ −２３０ｂｐ− −２３０’ｏｐ −２３０ｂｐ ２’３ｏ　ｂｐ ７０　ｂｐ Ｉソ ５２０ｂρ ：１！仏４工つツノ９ ７０ｂｐ １　２　３１＋　　５６　　’／　　８１ｉＪ　　ＩＦ
ｔ’ｇ、３９ ＋２５０　ｂｐ Ｈ２ Ｚｌよ Ｆｉｇ　、３９゜

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）プライマー伸長によって未知の配列を含む核酸断
    片の増幅法であって、該増幅法は、それぞれの断片が開
    始プライマーとのハイブリダイゼーションのための既知
    のヌクレオチド配列である開始プライミング領域を含む
    、標的核酸断片が得られるように標的核酸を切断するこ
    と、各ユニットがベクトレットプライマーとのハイブリ
    ダイゼーションのための既知配列であるベクトレットプ
    ライミング領域を有する標的核酸断片／ベクトレットユ
    ニットを標的核酸断片から連結（リゲーション）によっ
    て調製すること、および適当なヌクレオシド３ホスフェ
    ートおよびヌクレオシド３ホスフェートのポリメライゼ
    ーションのための試薬で一緒に、あるいは連続的に、ハ
    イブリダイズ条件下で標的核酸断片／ベクトレットユニ
    ットを処理することからなり、その際開始プライミング
    領域に実質的に相補的に成るように選択した開始プライ
    マーがハイブリダイズする開始プライミング領域を有す
    る一本鎖（ストランド）標的核酸／ベクトレットユニッ
    トに相補的に開始プライマーの伸長産物が合成されるが
    、開始プライミング領域を持たない一本鎖（ストランド
    ）標的核酸断片／ベクトレットユニットに相補的な伸長
    産物は合成されないような増幅法。 （２）プライマーが、ベクトレットプライミング領域に
    実質的に相補的となるように選択されたベクトレットプ
    ライマーの存在下で伸長産物が増幅される、請求項第１
    項記載の方法。 （３）ベクトレットプライマー増幅産物の合成が開始プ
    ライマーの伸長産物の最初の合成に依存する、請求項第
    ２項記載の方法。 （４）標的核酸断片／ベクトレットユニットのベクトレ
    ット部分が第１鎖および第２鎖を有する二本鎖部分から
    なり、ベクトレット部分の第２鎖が開始プライミング領
    域を含む標的核酸断片の該鎖に連結（リゲート）され、
    ベクトレットプライマーが第２鎖の相補鎖にハイブリダ
    イズできるが同じハイブリダイゼーション条件下で第１
    鎖にハイブリダイズできないように第１鎖、第２鎖、お
    よびベクトレットプライマーのヌクレオチド配列が選択
    されている、請求項第３項記載の方法。 （５）標的核酸断片／ベクトレットユニットのベクトレ
    ット部分が第１鎖と第２鎖を有する二本鎖部分からなり
    、該第１鎖が末端ポリメライゼーションブロッキング部
    分を有し、使用の際に開始プライミング領域を含む標的
    核酸断片の該鎖に連結（リゲート）される第２鎖が一本
    鎖部分を有し、末端ポリメライゼーションブロッキング
    部分がハイブリダイズ条件下で適当なヌクレオシド３ホ
    スフェートおよびヌクレオシド３ホスフェートのポリメ
    ライゼーションのための試薬の存在下で第２鎖の該一本
    鎖部分に対する相補鎖を形成する第１鎖の伸長を阻害す
    るのに効果的である、請求項第３項記載の方法。 （６）同じ単一の開始プライマーとともに使用するため
    に異なるベクトレットライブラリーを複数調製し、各ベ
    クトレットライブラリーは異なる切断部位で標的核酸を
    切断して調製した核酸断片を連結して得た標的核酸断片
    ／ベクトレットユニットからなり；各ベクトレットライ
    ブラリーをハイブリダイズ条件下で適当なヌクレオシド
    ３ホスフェートおよびヌクレオシド３ホスフェートのポ
    リメライゼーションのための試薬で独立に、あるいは一
    緒に処理し、それによって同じ単一の開始プライマーの
    使用に基づいて複数の開始プライマー伸長産物を得る、
    請求項第１項から第５項までのいずれかに記載の方法。 ａ）互いに連結可能な末端を有する核酸を環状化し、核
    酸酸は開始プライマーとハイブリダイゼーションするた
    めの開始プライミング領域として働くことが可能な領域
    を含むものであり；該環状化した核酸を既知のヌクレオ
    チド配列の外側で切断して既知のヌクレオチド配列を含
    みかつ標的核酸断片／ベクトレットユニットを形成させ
    る連結反応のための少なくとも一つの末端において既知
    の切断部位パターンを有する直鎖状分子を形成させ；連
    結により該標的核酸断片／ベクトレットユニットを形成
    させ、ハイブリダイズ条件下で開始プライマー、適当な
    ヌクレオシド３ホスフェート、およびヌクレオシド３ホ
    スフェートのポリメライゼーションのための試薬で一緒
    にあるいは連続的に処理する、請求項第１項あるいは第
    ２項記載の方法。 （８）該標的核酸断片／ベクトレットユニットを開始プ
    ライマー、ベクトレットプライマー、適当なヌクレオシ
    ド３ホスフェートおよびヌクレオシド３ホスフェートの
    ポリメライゼーションのための試薬で一緒にあるいは連
    続的に処理する、請求項第７項記載の方法。 （９）該標的核酸断片／ベクトレットユニットを標的核
    酸断片から、標的核酸断片を得るために該標的核酸を切
    断するのに用いたのと同じ試薬によって該ベクトレット
    がそれから得られた標的核酸断片／ベクトレットユニッ
    トから切断できないように連結することによって、調製
    する、請求項第１項から第８項までのいずれかに記載の
    方法。 （１０）標的核酸が制限エンドヌクレアーゼで切断され
    てベクトレットへの連結のための標的核酸断片を生じ、
    該制限エンドヌクレアーゼの制限エンドヌクレアーゼ認
    識配列が標的核酸断片／ベクトレットユニットに存在し
    ないように該ベクトレットの配列が選択される、請求項
    第９項記載の方法。 （１１）さらなる開始プライマーの配列を決定するため
    に、得られたいかなるあるいは全ての開始プライマー伸
    長産物が、少なくとも与えられた開始プライマーから離
    れた末端において配列（塩基配列が決定）され、それに
    よってさらなる開始プライマーのプライマー伸長に基づ
    くさらなる開始プライマー伸長産物が得られる、請求項
    第１項から第１０項までのいずれかに記載の方法。 （１２）開始プライマー伸長産物あるいはその一部が配
    列（塩基配列が決定）され、それによって該伸長産物あ
    るいはその一部が特性ずけられる、請求項第１項から第
    １１項までのいずれかに記載の方法。 （１３）遺伝子型を含む核酸配列をそのような遺伝子型
    を含まない核酸配列と比較して、それによってある表現
    型の原因となる遺伝子型を同定する、ある表現型の原因
    となる遺伝子型を同定するための請求項第１１項あるい
    は第１２項記載の方法。 （１４）ある表現型に対して真正のヘテロ二倍体から単
    独の核酸試料を使用して比較を行なう、請求項第１３項
    記載の方法。 （１５）検査されるべき表現型に冒されている複数の個
    体由来の核酸配列を、検査されるべき表現型の証拠が存
    在しない複数の個体由来の核酸配列と比較し、それによ
    って検査されるべき表現型が存在する場合に該表現型に
    対する素因の原因となるあるいは寄与する遺伝子型を同
    定する、ある表現型が存在する場合に該表現型に対する
    素因の原因となるあるいは寄与する遺伝子型を同定する
    ための請求項第１１項あるいは第１２項記載の方法。 （１６）１）検査されるべき表現型によって冒されてい
    る複数の個体由来の核酸プール；と２）検査されるべき
    表現型の証拠が存在しない複数の個体由来の核酸プール
    ；との配列の違いを比較する、請求項第１５項記載の方
    法。 （１７）プライマー伸長によって未知の配列の核酸断片
    を増幅するためのキッドであって、 １）標的核酸を特異的な部位で切断して標的核酸断片を
    得る手段； ２）１）で定義された標的核酸を切断する手段を用いて
    得た標的核酸断片に連結するために適合させたベクトレ
    ットであって、それによって標的核酸断片／ベクトレッ
    トユニットが使用時に形成され、該ベクトレットがベク
    トレットプライマーとハイブリダイゼーションするため
    の既知の配列であるベクトレットプライミング領域を有
    する該ベクトレット； ３）４種の各々異なるヌクレオシド３ホスフェート； ４）３）のヌクレオシド３ホスフェートのポリメライゼ
    ーションのための試薬； からなるキット。 （１８）ベクトレットプライマーおよび、必要ならば少
    なくとも一つの重なりあった（ｎｅｓｔｅｄ）プライマ
    ーをさらに含み、該プライマーが標的核酸断片／ベクト
    レットユニットのベクトレットプライミング領域に実質
    的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項第１７
    項記載のキット。 （１９）標的核酸断片への連結に適合するベクトレット
    が第１鎖と第２鎖を有する二本鎖部分からなり、ベクト
    レットの第２鎖が開始プライミング領域を含む核酸断片
    の該鎖への連結に適合し、使用の際にベクトレットプラ
    イマーが第２鎖の相補鎖にハイブリダイズ可能であるが
    同じハイブリダイゼーション条件下で第１鎖にはハイブ
    リダイズしないように第１鎖および第２鎖の核酸配列が
    選択されている、請求項第１７項あるいは第１８項記載
    のキット。 （２０）プライマー伸長による未知の配列の核酸断片の
    増幅のためのベクトレットライブラリーキットであって
    、該キットが、 １）各ライブラリーがある種の動物、植物あるいは微生
    物の個体のヌクレオチド配列由来の一組の標的核酸断片
    ／ベクトレットユニットからなる、少なくとも一つのベ
    クトレットライブラリー；２）標的核酸断片／ベクトレ
    ットユニットの開始プライミング領域にハイブリダイゼ
    ーションするための開始プライマー（群） からなるもの。 （２１）ある表現型に対する素因の原因となる、あるい
    は寄与する遺伝子型の解析のためのキットであって、標
    的核酸断片／ベクトレットユニットの紐が、 １）検査されるべき表現型によって冒されている複数の
    個体由来の標的核酸断片／ベクトレットユニットのプー
    ル；および ２）検査されるべき表現型の証拠を示さない複数の個体
    由来の標的核酸断片／ベクトレットユニットのプール からなる、請求項第２０項記載のキット。
JP1196447A 1988-07-28 1989-07-28 ヌクレオチド配列の増幅方法 Pending JPH02174679A (ja)

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GB888818020A GB8818020D0 (en) 1988-07-28 1988-07-28 Method for amplification of nucleotide sequences
GB8818020.3 1988-07-28

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