JPH10509594A

JPH10509594A - 遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー

Info

Publication number: JPH10509594A
Application number: JP8517186A
Authority: JP
Inventors: モルガンテ，ミケレ; ボゲル，ジユリー・マリー
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-21
Publication date: 1998-09-22
Also published as: DE69507646D1; AR000215A1; AU4367496A; EP0804618B1; DE69507646T2; WO1996017082A3; ZA9510097B; AU704660B2; IL116135A0; EP0804618A2; NZ298236A; US5955276A; WO1996017082A2

Abstract

(57)【要約】多型を検出するためにゲノムをスクリーニングするための自己固定プライマーとして用いる複合ミクロサテライトを提供する。好ましい複合ミクロサテライトプライマーは、隣接するジヌクレオチド対が複合連結部を越えて同周期である共通のヌクレオチドを含む完全複合ジヌクレオチドプライマーである。有用な態様において、これらの同周期複合プライマーをＡＦＬＰアッセイの変形を含む他の既知のスクリーニングアッセイに適用した。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー発明の分野本発明は、ＤＮＡ配列多型の同定及び分析のための自己固定プライマーとしての完全複合の単純配列反復（ＳＳＲ）の使用に関する。より具体的には、植物及び動物ゲノムの両方における単純配列反復（ＳＳＲ）のどの一つの型も異なる型のＳＳＲに直接隣接してしばしば存在し、通常、両ＳＳＲにより共有される成分ヌクレオチドの一つが完全な周期性を有していることが述べられている。この所見により、反復間増幅及び増幅断片長多型アッセイを含むポリメラーゼ連鎖反応に基づいた多様（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）なゲノムアッセイの新しい変形において、自己固定プライマーを考案できるようになった。これらの方法の変形は、集合的に、ミクロサテライト多型座の選択的増幅（ＳＡＭＰＬ）と呼ばれている。発明の背景真核生物ゲノムの地図を作成できることは、遺伝病の診断、並びに植物育種及び法医学にとって必須の道具になってきている。あらゆる遺伝的連鎖地図の解明のために絶対必要なことは、ＤＮＡ配列の変異を同定できることである。表現型が同一の個体間の遺伝的（ＤＮＡ）多型が存在し、遺伝子地図作成のためのマーカーとして用いることができるという認識は、真核生物の連鎖地図を明らかにする技術において主要な前進を生み出した。遺伝的多型を同定するための技術は比較的少なく、現在までのところ、時間がかり多大な労力を要する。最も一般的な技術の一つは、制限酵素切断片長多型またはＲＦＬＰ（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３４２、３１４、（１９８０））と呼ばれる。ＲＦＬＰ技術を用いると、制限酵素分析からのＤＮＡバンディングパターンを区別することにより、ゲノムの単一または複数の点突然変異に基づく遺伝的マーカーを検出することができる。制限酵素はＤＮＡを特定の標的部位配列で切断するので、この部位内の点突然変異は認識部位の損失または獲得をもたらし、そのゲノム領域において異なった長さの制限フラグメントを生じる。ＤＮＡ断片の挿入、欠失、逆位により引き起こされる突然変異もまた、ＤＮＡ制限フラグメントの長さの変異をもたらす。遺伝子型間の異なる長さのゲノム制限フラグメントは、サザンブロット上で領域特異的プローブで検出することができる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３、（１９７５））。ゲノムＤＮＡは、典型的には、一般に好まれるほとんどあらゆる制限酵素で消化される。得られたフラグメントは電気泳動的に大きさを分離され、膜に移され、そして次にゲノムの特定の領域に対応するフラグメントを検出するために、適当に標識したプローブに対してハイブリダイズされる。ＲＦＬＰ遺伝的マーカーは、表現型的にサイレントの突然変異における遺伝的変異を検出することにおいて特に有用であり、非常に正確な診断用道具として使える。ＲＦＬＰ分析は、共優性の遺伝的マーカーの作成における有用な道具であるが、制限フラグメントを電気泳動的に分離する必要があるという難点があり、そして、有意の多型マーカーを検出できる比率を示す有効なバックグラウンドを達成するために、多大な最適化をしばしば必要とする。加えて、ＲＦＬＰ法は、実際の制限部位内に存在するＤＮＡ多型に依存する。ゲノムにおけるいかなる他の点突然変異も通常検出されないままである。このことは、本来低いレベルのＤＮＡ多型を有するゲノムをアッセイする時に、特に難しい問題である。このように、ＲＦＬＰの差異は、しばしば同定することが困難である。多型の遺伝的マーカーを同定する他の方法は、任意の配列の短いプライマーを用いるＤＮＡ増幅を用いる。これらのプライマーは、「無作為に増幅した多型ＤＮＡ」または「ＲＡＰＤ」プライマー、Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１８、６５３１（１９９０）及び米国特許第５，１２６，２３９号（また欧州特許０５４３４８４Ａ２号、国際公開第９２／０７０９５号、国際公開第９２／０７９４８号、国際公開第９２／１４８４４号、及び国際公開第９２／０３５６７号）と呼ばれている。ＲＡＰＤ法は、標準的な増幅バッファー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＴＴＰヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼのような耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、二本または一本鎖の非標的の任意のＤＮＡ配列を増幅する。プライマーのヌクレオチド配列は、典型的には、約９ないし１３塩基の長さで、５０及び８０％の間のＧ＋Ｃ組成で、パリンドローム配列を含まない。単一ヌクレオチドのようなゲノム間のわずかな違いもＲＡＰＤプライマーの結合／標的部位に影響を及ぼすことができ、ＰＣＲ産物を片方のゲノムから生じることができるがもう片方からは生じることができない。かかる時間がより少なく、より多くの情報を提供し、そして、容易に自動化に適応できることにおいて、遺伝的多型のＲＡＰＤ検出はＲＦＬＰより進んでいることを示す。しかしながら、ＲＡＰＤアッセイの使用は優性の多型のみを検出できる、すなわち、この方法では、集団における一つの遺伝子座の全ての対立遺伝子を同時に調べることができない点において制限される。それにもかかわらず、多型の検出のための感度のために、ＲＡＰＤ分析及びＲＡＰＤ／ＰＣＲ法に基づいた変形は、動物及び植物界の両方において種または近縁の属内の遺伝的変異を分析するために一般に好まれる方法となっている。遺伝的多型を同定しマッピングするためにより最近に導入された三番目の方法は、増幅断片長多型またはＡＦＬＰ（Ｍ．Ｚａｂｅａｕ、欧州特許第５３４，８５８号）と呼ばれる。ＡＦＬＰは、分析するゲノムＤＮＡを特異的に消化するために制限酵素を用いるという点においてＲＦＬＰに概念が類似する。これらの二つの方法の主要な違いは、アダプタープライマーとのＰＣＲ増幅のための標的部位として使われる特定の既知のアダプター配列を付加することにより、ＡＦＬＰにおいて生じた増幅制限フラグメントが修飾されることである。簡潔に言えば、単一または二つの制限酵素の組み合わせで、後者では「頻繁な」制限酵素を「稀な」制限酵素と組み合わせて用いて完全消化することにより、制限フラグメントをゲノムＤＮＡから生じる。これらの酵素の一つがテトラヌクレオチド認識部位を有し、他の酵素がヘキサヌクレオチド部位を有する時、最も望ましい結果が得られる。そのような二重酵素消化は、単一及び二つの酵素で消化されたゲノムＤＮＡフラグメントの混合物を生じる。次に、適度な長さ（１０−３０塩基）の合成オリゴヌクレオチドからなる二本鎖アダプターをこれらの制限フラグメトの末端に特異的に連結する。異なる制限部位に対応する個々のアダプターは全て、異なるＤＮＡ配列を保有する。これらのアダプターの一つで、通常、ヘキサヌクレオチド部位の制限酵素に対応しているものは、ビオチン部分を保有する。ビオチン−ストレプトアビジン捕獲方法論の応用は、全ての非ビオチン化制限フラグメント（両末端でヘキサヌクレオチド制限部位により境界づけられるもの）の選択的除去をもたらし、従って、その集団は片方または両末端でビオチン化アダプターを保有しているフラグメントに関して効果的に濃縮される。結果として、ＤＮＡフラグメント混合物はまた、各末端に異なる制限部位を有している非対称フラグメントに関して濃縮される。選択されたフラグメントは、アダプター／制限部位配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として働く。これらのアダプタープライマーはまた、ＤＮＡフラグメント上で制限部位に直接隣接するゲノム配列にアニールしそこから重合を開始する、１から１０までの任意のヌクレオチドを３’末端に含むことができる。この型のプールしたフラグメント鋳型及びアダプタープライマーを用いたＰＣＲ反応は、多数のゲノムフラグメントの共増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらす。制限部位またはその制限部位に直接隣接した１−１０ヌクレオチドの領域におけるゲノム間のいかなるＤＮＡ配列の違いも、生じるＰＣＲ産物において違いまたは多型（優性及び共優性）をもたらす。多数のフラグメントが同時に共増幅され、これらのいくつかの部分はゲノム間で多型である。多型をアッセイする四番目の方法は、大部分のゲノムにおいて見いだされるある反復ヌクレトチド配列から生じる高度な長さの変異を利用することに関している。全てではないにしても大部分の真核生物のゲノムは、単純配列反復（ＳＳＲ）、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、またはペンタヌクレオチド反復、及びミクロサテライトと様々に呼ばれる反復塩基配列で占められる。単純配列反復は、遺伝的マーカーとして有用であることが示されてきた（ＤＥ３８３４６３６Ａ、Ｊａｃｋｌｅ等；Ｗｅｂｅｒ等、ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ４４、３８８、（１９８９）；Ｌｉｔｔ等、ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ４、３９７、（１９８９））。Ｗｅｂｅｒ等（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１１、６９５、（１９９１））は、哺乳類のゲノムの比較分析及びマッピングのためにＳＳＲをうまく用い、いくつかのグループ（Ａｋｋａｙａ等、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１３２、１１３１（１９９２）、Ｍｏｒｇａｎｔｅ＆Ｏｌｉｖｉｅｒｉ、ＰｌａｎｔＪ３、１７５（１９９３）、Ｗｕ＆Ｔｒａｎｋｓｌｅｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１、２２５、（１９９３））は、植物ゲノムで同様な結果を示した。ＳＳＲ多型は少量のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲにより検出でき、ＲＡＰＤと異なり、共優性のマーカーを提供し、高度な遺伝的多型を検出できる（Ｗｅｂｅｒ、Ｊ．Ｌ．（１９９０）ＩｎＴｉｌｇｈｍａｎ、Ｓ．、Ｄａｖｅｓ、Ｋ．、（ｅｄｓ）「ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ第一巻：Ｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｐｉｎｇ」ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１５９−１８１頁）。ＳＳＲＰＣＲプライマーは、多型を検出するために非常に効果的であるけれども、これらの使用は様々な実用的な欠点がある。典型的には、これらの方法により生じるマーカーは、まず最初にゲノムライブラリーを構築し、このライブラリーを特定の反復配列のコア要素を表すプロブでスクリーニングし、陽性クローンを精製及びシークエンシングし、そして、各クローン化したＳＳＲ座に対して隣接している配列に特異的なプライマーを合成することにより得られる。次に、ゲノムＤＮＡを多型に関して選別するために増幅し、次いでゲノムのマッピングを行う。この全工程は、時間がかかり、高額で、技術的に過大の労力を要し、結果として、その応用において幾分制限されていた。少なくとも一つの方法がこれらの制限を回避するための試みとして開発され、特定のＳＳＲ座配列の演繹的な知識なしに、より直接的に多型のＳＳＲマーカーを使用することを可能にする。Ｚｉｅｔｋｉｅｗｃｚ等（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０、１７６、（１９９４））は、例えば、動物及び植物ゲノムにおいて隣接した（ＣＡ）_n反復間の長さの多型を検出するために、単一プライマーＰＣＲ増幅を用いることができることを示す。このアッセイに用いられたＰＣＲプライマーは、各々、２ないし４ヌクレオチドの既知または任意の配列が５’または３’に直接隣接している特定のＳＳＲ配列を含み、これらのアンカー配列は、ゲノム中のＳＳＲ配列に隣接する非ＳＳＲゲノム配列にアニールし、各付合するＳＳＲ座で単一の位置にプライマーを「固定」するために働く。隣接するＳＳＲ配列が反対向きでゲノム中で十分密接して配置している時生じる放射性標識したＳＳＲ−ＳＳＲ増幅産物は、ゲル電気泳動、続いてオートラジオグラフィーにより分析される。この方法は、ゲノムからＳＳＲをクローニング及びシークエンシングする必要を除き、単一座のＳＳＲに関して濃縮された多型バンディングパターンを示す。Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等は、この濃縮されたパターンを、ＳＳＲプライマーが同時に多数のＳＳＲ標的座にアニールしそこから重合を開始できる任意の配列アンカーの使用の結果であるとする。Ｚｅｔｋｉｅｗｉｃｚに類似する概念において、Ｗｕ等（ＮｕｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２、３２５７、（１９９４））は、任意配列のＲＡＰＤプライマーの存在下でミクロサテライト反復からなる放射性標識した５’固定プライマーを用いて非対称熱循環したＰＣＲによりゲノムＤＮＡを増幅する、多型を検出するための方法を教示する。Ｗｕ等の方法は、ミクロサテライト反復の多くの特徴を含む遺伝的マーカーを作成するために有用である。Ｗｕ等は、増幅のための複合のミクロサテライト反復プライマーの使用を開示していない。単純配列反復を幾通りかに分類できる。ヒト（ＣＡ）_nまたは（ＧＴ）_n反復を分類し、特性化することにおいて、Ｗｅｂｅｒ、Ｊ．Ｌ．（ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ第１巻、１５９、１９９０、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮＹ）は、少なくとも３つの型の（ＣＡ）_nＳＳＲ、すなわち、単純完全ＳＳＲ、単純不完全ＳＳＲ、及び複合ＳＳＲを定義する。各完全ＳＳＲは、反復内に中断のない単純（ＣＡ）_n横並び配列であると考えられる。不完全ＳＳＲは、反復の連続内に３つまでの非反復塩基の一つまたはそれより多い中断を有する反復配列として定義される。複合ＳＳＲは、一続きの異なる配列の短い横並び反復に隣接したまたは３ヌクレオチド以内のＣＡまたはＧＴ反復領域を有する配列として定義される。Ｗｅｂｅｒは、ヒトにおける完全配列反復は、ゲノムからクローン化された全（ｄＣ−ｄＡ）_n（ｄＧ −ｄＴ）_n配列の約６５％、不完全反復は約２５％、そして、複合反復は約１０％を構成することを示す。Ｗｅｂｅｒは、完全反復が最も長い非中断反復ブロックを含むので、最も有用な情報を提供するようであると理論化する。Ｗｅｂｅｒはまた、１２またはそれより多い非中断単位からなる反復は、より短い反復領域より一貫してより多型であることを教示する。不完全反復は、一般的により短い反復領域を含むので、多型の指標として有用性がより低いようである。複合反復は、一般的に、あまり特徴づけられておらず、それらの潜在的な有益性は明確には確立されていない。他者は、遺伝的連鎖地図を構築するために、完全、不完全、及び複合ＳＳＲ座内で検出できる多型を用いてきた。Ｂｕｃｈａｎａｎ等（ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ、４、２５８、（１９９３））は、絶対的な多型レベルに関して、ヒツジゲノム中の異なるＳＳＲ型の使用においてほとんど差がない、すなわち、完全、非完全、及び複合反復は、異なる頻度で（完全及び不完全単純ＳＳＲは複合より頻度が高い）ゲノム中に存在しているようであるけれども、類似したＢｏｔｓｔｅｉｎ等により定義された平均の多型情報量（ＰＩＣ）値（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、３２、３１４、（１９８０））を有することが見いだされたことを教示する。大西洋サケゲノムにおける（ＧＴ）_nＳＳＲの研究において、Ｓｌｅｔｔａｎ等（ＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ、２４、１９５、（１９９３））は、完全及び不完全単純ＳＳＲの両方を見つけたが、複合反復は何も見つからなかった。ウマゲノムの調査において、Ｅｌｌｅｇｒｅｎ等（ＡｎｉｍａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ、２３、１３３、（１９９３））は、完全または不完全単純反復を増幅するために考案したプライマーを用いて、ウマ遺伝子型間の（ＴＧ）_n及び（ＴＣ）_n反復に関する最も高いレベルの多型を検出し、すなわち、８つのクローン化した（ＧＴ）_n反復のうち２つは、構造において複合であることが同定された（一つは完全、一つは不完全）けれども、いずれもさらに特徴づけられなかった。Ｃｏｎｄｉｔ＆Ｈｕｂｂｅｌｌ（Ｇｅｎｏｍｅ３４、６６（１９９１））は、熱帯樹及びトウモロコシからの（ＡＣ）_n 及び（ＡＧ）_n反復を保有している大きいインサートのクローンを特徴づけることにおいて、一つの型の反復を保有しているインサートの１０−２０％は他の型も保有すること、及び多くの（ＡＣ）_n部位は他の二塩基反復も近接してまたはすぐ近くに有することを見いだした。最後に、Ｂｒｏｗｎｅ等（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２０、１４１、（１９９１））は、縮重した（ＣＡ）_nプライマーでのＤＮＡシークエンシングによりヒトゲノム中の（ＣＡ）_nＳＳＲ配列を特徴づける試みにおいて、（ＣＡ）_n反復の８８％がＣＡ反復の片方または両末端でＡＴ塩基を保有することを開示している。現在までのところ、文献における記録は、ゲノム中の複合ＳＳＲの出現率はゲノムの各型で変わるけれども、完全または不完全単純ＳＳＲ配列のいずれかの出現率より低いことを示す。それにもかかわらず、複合ＳＳＲ配列の情報量（ＰＩＣ値）は、一般的に高いことが示されてきた。加えて、これらの文献は、複合ＳＳＲ座を特異的に単離することにより遺伝的多型を検出することは通例かろうじて成功する、すなわち、個々の複合ＳＳＲ座を認識し従ってこれを特異的に単離するために考案されたプローブまたはプライマーを使用することは、より多数の単純ＳＳＲ配列の単離に比べると、多数の新しいＳＳＲマーカーを生じる効率が低いことを示す。しかしながら、出願人等は、予期せず、複合ＳＳＲ、特に（ＡＴ）_n反復を含んでいるものが、真核生物ゲノムにおいて非常に多型であること、及び本明細書において完全同周期（ｉｎ−ｐｈａｓｅ）複合ＳＳＲと名付けられた特定の型のＳＳＲに特異的にアニールするように考案されたオリゴヌクレオチドが、真核生物ゲノム間の多型の作成及び検出において特に有用であることを発見した。「完全」複合ＳＳＲは、各々がジ、トリ、テトラ、またはペンタヌクレオチド単位から構成されることができる２つの異なる反復配列が、２つの反復ブロック間で３個以下の介在する塩基を有して違いに非常に近くに位置するものである。完全複合反復の一つの種類は、２つの構成反復が介在する塩基なしに違いに直接接しているものである。さらに、間隔が反復連結部を越えてそして二つの反復ブロックの長さにわたって保存される共通ヌクレオチドを成分単純反復の両方が共有する場合、完全複合ＳＳＲを「同周期」であると分類することができる。例えば、同周期完全複合ＳＳＲ、（ＡＴ）_n（ＡＧ）_nは、この完全複合構造の両成分にわたってアデノシン塩基を「同周期」で保持する。出願人等は、（ｄＣ−ｄＡ）_n（ｄＴ−ｄＡ）_n のような同周期完全複合ＳＳＲ配列が、動物及び植物ゲノムの両方において豊富にあることを発見した。完全複合ＳＳＲ配列の各型の出現頻度は、種内並びに種間で変わるけれども、同周期である配列は、調べた全ての真核生物ゲノムにおいて十分に高頻度であり、そして、十分に分散及び高度に多型の両方であるようである。そのような直接隣接した同周期完全反復がまたがる連結部は、完全に予期できるといる所見に基づき、出願人等は、反復間増幅及び増幅断片長多型アッセイを含むポリメラーゼ連鎖反応に基づく多数ゲノムアッセイの新しい変形において、同周期複合配列を自己固定プライマーとして含んでいる合成オリゴヌクレオチドを用いる方法論を開発した。出願人等は、複合ＳＳＲプライマーの５’末端が、３’末端反復から起こるプライマー伸長のための非常に効率のよいアンカー塩基として働くことを見いだした。このプライマー伸長は、複合ＳＳＲ標的配列の内部から始まり、従って、標的ＳＳＲ座での異なる対立因子間の長さの変異は、得られる増幅産物において対応する長さの変異として検出できる。そのような増幅プライマーとしての完全複合ＳＳＲの使用は、高割合が多型（８０％までも高い）である多数の産物を生じる。出願人等は、本発明の方法が、共優性及び優性の両方の多数のゲノム多型の同時同定を非常に促進すると信じる。従って、本方法は、目的の遺伝的特質に連鎖した多型マーカーを同定することにおいて大きな利点を提供し、また、ゲノムフィンガープリンティング及び全ゲノム比較のための効率よく簡便な基盤技術を提供する。発明の要約本発明は、プライマーによる増幅を用いて各サンプルから核酸の断片を増幅し、違いを検出するためにこれらの増幅断片を比較することを含んでなり、改善が、該増幅において用いるプライマーの少なくとも一つが完全複合単純配列反復からなることを含んでなる、２つの別個の核酸サンプル間の多型を検出する改善法を提供する。好ましい態様において、複合プライマーは同周期である。最も好ましい態様において、本発明は、固定した配列のアダプターを連結した制限酵素消化したゲノムＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ増幅のために同周期完全複合ＳＳＲプライマー及び合成アダプタープライマーの組み合わせを用いた遺伝的多型を検出するための方法を提供する。本方法は、臨床遺伝的診断、（核酸組成におけるわずかな多型の変異を検出することが重要である）法医学の分野において、並びに動物及び植物の育種及び遺伝子マッピングの分野において特に有用である。特別な応用として、これらの方法は、ゲノムフィンガープリンティング、多型マーカーの同定（すなわち、表現型形質を「示している」）、及び生殖質比較のための優れた有用性を有する。図面の簡単な説明図１は、ＳＳＲ−アダプター増幅の概念図を示す。パネルａは、制限酵素の二重消化、アダプターの連結、及びＤＮＡ鋳型混合物を作成するためのビオチンーストレプトアビジン選択工程、並びに、複雑な鋳型ＤＮＡ混合物からの指数的なＳＳＲ−アダプター増幅のための特異的なＳＳＲプライマーの選択的な性質を表す。パネルｂは、この場合そうでなければ共通のＳＳＲプライマーにより増幅される鋳型フラグメントを区別するための一つの非縮重選択的ヌクレオチドを３’ 末端に含んでいるアダプタープライマーの選択的性質を表す。対角線に線影をつけた箱は、６塩基認識部位を有する制限酵素に対応するビオチン化アダプターを表し、黒い箱は、４塩基認識部位を有する酵素に対応する非ビオチン化アダプターを表す。ビオチン部分は濃い円により示される。垂直に縞のある箱は、ＰＣＲ増幅に用いたＳＳＲプライマーに符合する特定の型の単純ＳＳＲまたは複合ＳＳＲのいずれかを示す。矢印は、矢じりがプライマー伸長の方向を示しているＰＣＲプライマーを表し、すなわち実線／黒矢印がアダプターＰＣＲプライマーを示し、垂直に縞のある線影を付けた矢印は、鋳型フラグメント上に示したＳＳＲ配列に対応するプライマーを表す。ＳＳＲプライマーのみが、＊により示されるように、蛍光または放射性標識のいずれかで標識される。パネルｃは、二本鎖標的座の一本鎖を各々が表している２種類のプライマーのための標的部位として働くことのできる、ゲノム中の二本鎖の座（（ＡＴ）_x（ＡＧ）_y、ここで、ｘ＝１１．５及びｙ＝１０）として完全同周期複合ＳＳＲを表す。各種類内の個々のプライマーは、各構成反復の相対的な長さにより異なることができる。これらの２種類のプライマーは、反対方向（小さい矢印）にプライマー伸長を開始する。あらゆる場合において、プライマーは、標的の固定された部位にアニールし、プライマー伸長はＳＳＲ領域の内部から始まる。各場合において、ゲノム間の最も３’の反復におけるあらゆる長さの変異を、ＳＳＲ−アダプター増幅を用いた共優性の多型として検出できる。図２は、４つの異なるＧｌｙｃｉｎｅｍａｘまたはＧｌｙｃｉｎｅｓｏｊａ遺伝子型（Ｎ、ｍａｘＮ８５−２１７６；Ｎｏ、ｍａｘＮＯＩＲ−１；Ｗ、ｍａｘｗｏｌｖｅｒｉｎｅ；Ｓ、ｓｏｊａＰＩ８１７６２）から調製した、ＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ消化し、アダプター修飾し、ビオチン選択した鋳型ＤＮＡへのＳＳＲ−アダプター反応からの共増幅産物を比較する変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。５’末端に３塩基の縮重アンカーを含んでいる³³Ｐ−標識した単純ＳＳＲプライマー［ＨＢＨ（ＡＧ）_8.5、ＤＢＤ（ＡＣ）_7.5、ＨＶＨ（ＴＧ）_7.5）］を、３’末端に０（ＴａｑＡｄ．Ｆ）または１個（Ｔａｑ．ｐｒ６、Ｔａｑ．ｏｐｒ８）のいずれかの選択的ヌクレオチドを含んでいる非標識ＴａｑＩアダプタープライマーと組み合わせる。コールドスタート増幅は、定温（５８℃）またはタッチダウン（５９℃の最終温度）温度サイクル特性（それぞれ、左及び右のパネル）のいずれかを用いる。矢印は、共優性の多型らしいものを示す。図３ａ及び３ｂは、１５の異なるダイズの遺伝子型から調製した、ＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ消化し、アダプター修飾し、ビオチン選択した鋳型ＤＮＡへのＳＳＲ− アダプター反応からの共増幅産物を比較する変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。完全複合ＳＳＲ、（ＴＣ）_4.5（ＴＧ）_4.5、（ＣＴ）_7.5（ＡＴ）_3.5及び（ＣＡ）_7. ₅ （ＴＡ）_2.5［パネルａ］または（ＴＧ）_4.5（ＡＧ）_4.5及び（ＴＣ）_4.5（ＡＣ）_4.5［パネルｂ］に対応する³³Ｐ−標識したプライマーを、各々、タッチダウン（５６℃最終）温度サイクル特性を用いているコールドスタート増幅条件の下で、０（ＴａｑＡｄ．Ｆ）または１個（Ｔａｑ．ｐｒ８）のいずれかの３’選択的ヌクレオチドを含んでいる非標識ＴａｑＩアダプタープライマーと組み合わせる。各組において、レーン１、Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘｗｏｌｖｅｒｉｎｅ；レーン２、Ｇ．ｍａｘＮＯＩＲ−１；レーン３、Ｇ．ｍａｘＮ８５−２１７６１；レーン４、Ｇ．ｍａｘＨａｒｒｏｗ；レーン５、Ｇ．ｍａｘＣＮＳ；レーン６、Ｇ．ｍａｘＭａｎｃｈｕ：レーン７、Ｇ．ｍａｘＭａｎｄａｒｉｎ；レーン８、Ｇ．ｍａｘＭｕｋｄｅｎ；レーン９、Ｇ．ｍａｘＲｉｃｈｌａｎｄ；レーン１０、Ｇ．ｍａｘＲｏａｎｏｋｅ；レーン１１、Ｇ．ｍａｘＴｏｋｙｏ；レーン１２、Ｇ．ｍａｘＰＩ５４．６１０；レーン１３、Ｇ．ｍａｘＢｏｎｕｓ；レーン１４、Ｇ．ｓｏｊａＰＩ８１７６２；レーン１５、Ｇ．ｓｏｊａＰＩ４４０．９１３。産物の大きさの分布は、図２のものと類似している。（ＴＧ）_4.5（ＡＧ）_4.5＋Ｔａｑ．Ｐｒ８組のレーン９は、正しくない（非ダイズ）サンプルのミスローディングである。図４は、ＴａｑＩとＨｉｎｄIIIまたはＰｓｔＩのいずれかとの組み合わせ（それぞれ、Ｈ＋ＴまたはＰ＋Ｔ）での消化により調製した５つの異なるダイズの遺伝子型（レーン１、Ｇ．ｍａｘｗｏｌｖｅｒｉｎｅ；２、Ｇ．ｍａｘＮＯＩＲ−１；３、Ｇ．ｍａｘＮ８５−２１７６；４、Ｇ．ｍａｘＢｏｎｕｓ；５、Ｇ．ｓｏｊａＰＩ８１７６２）に行ったＳＳＲ−アダプター増幅からの共増幅産物を比較する変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。５６℃のタッチダウン温度サイクル特性を用いたコールドスタート増幅は、³³Ｐ−標識したＳＳＲプライマー、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を、示した非標識ＴａｑＩアダプタープライマー、ＴａｑＡｄ．ＦまたはＴａｑ．Ｐｒ８（それぞれ、０または１個の３’選択的ヌクレオチド）と組み合わせて用いた。Ｘは、ミスロード（正しくない）レーンを示す。図５ａは、Ｇ．ｓｏｊａＰＩ８１７６２及びＧ．ｍａｘＢｏｎｕｓ間の交配からの６６のＦ２子孫の多型の共増幅産物の分離を示している変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。完全複合ＳＳＲ、（ＣＡ）_7. ₅ （ＴＡ）_2.5に対応する³³Ｐ−標識したプライマーを３’選択的ヌクレオチドＴａｑ．ｐｒ６アダプタープライマーと組み合わせた。空白のレーンは、「失われたデータ」の結果である。この集団において分離する記録された多型のバンドを示す。Ｂ、ｂｏｎｕｓ親；Ｓ、ｓｏｊａＰＩ８１７６２親。図５ｂは、（表VI に含まれた）産物の各々の分離得点のＭＡＰＭＡＫＥＲ分析により決定された、パネルａに含まれる多型の分離している増幅産物の６つのマップ位置を示す。図６ａは、それぞれ、図３ａ及び４におけるものと同じ順序の遺伝子型の５（ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ、ＮＯＩＲ−１、Ｎ８５−２１７６、Ｂｏｎｕｓ、ＰＩ８１６５２）または１５のダイズ変種のいずれか、並びに６つの哺乳類個体（１つのラット、４つのヒト、１つのマウスＢＡＬＢ／Ｃ）からの鋳型ＤＮＡへの、Ｔａｑ．ＡｄＦまたはより選択的なＴａｑ．ｐｒ８アダプタープライマーのいずれかと組み合わせた完全複合ＳＳＲプライマー、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を用いた増幅を比較している変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。全てのビオチン選択した鋳型は、ＴａｑＩをＨｉｎｄIIIまたはＰｓｔＩのいずれかと組み合わせて用いて調製した。図６ｂは、ＰｓｔＩ＋ＴａｑＩ調製した鋳型ＤＮＡからの、（ＣＴ）_7.5（ＡＴ）₂及び（ＧＡ）_7.5（ＴＡ）₂完全複合ＳＳＲプライマーを用いた共増幅産物の同様の比較を表す。産物の大きさの分布は、パネルａのものと類似している。図６ｃは、Ｔａｑ．ｐｒ６プライマーと組み合わせた（ＣＡ）_7.5 （ＴＡ）_2.5を用いた、Ｚｅａｍａｙｓ（トウモロコシ）及びサケＤＮＡ鋳型のＴａｑＩ＋ＨｉｎｄIII調製した鋳型から生じたＳＳＲ−アダプター増幅産物を、ダイズＢｏｎｕｓ及びＰＩ８１７６２からのものと比較して示す。レーン１、Ｚ．ｍａｙｓＢ７３；レーン２及び３、別個のサケ由来；レーン４、Ｚ．ｍａｙｓＣＭ２７；レーン５、Ｚ．ｍａｙｓＴ２３２；レーン６、Ｚ．ｍａｙｓＤＥ８１１ＡＳＲ；レーン７、Ｚ．ｍａｙｓＬＨ１３２；レーン８− １０、Ｇ．ｍａｘＢｏｎｕｓｘＧ．ｓｏｊａＰＩ８１７６２交配からの２つのＦ２個体。産物の大きさの分布は、図６ａに示したものと類似している。図７は、０（Ｔａｑ．ＡｄＦ）または１個の特定（Ｔａｑ．ｐｒ５、．ｐｒ６、．ｐｒ７、．ｐｒ８）のいずれかの３’選択的ヌクレオチドを保有しているＴａｑＩアダプタープライマーと個々に組み合わせた（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を用いた、ＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ調製したダイズ鋳型（Ｓ、ＳｏｊａＰＩ８１７６２；Ｗ、Ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ；Ｂ、ｂｏｎｕｓ）からの共増幅産物を比較している変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを表す。図８は、３つの異なるＴａｑＩアダプタープライマー、Ｔａｑ．ＡｄＦ、Ｔａｑ．ｐｒ６、及びＴａｑ．ｐｒ８と別々に組み合わせた、完全複合ＳＳＲ二本鎖配列［（ＡＴ）_x（ＧＴ）_y：（ＣＡ）_x（ＴＡ）_y］の相補鎖を表しているＳＳＲプライマーを用いた、ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ及びＰＩ８１７６２ダイズ栽培変種からのＳＳＲ−アダプター増幅を比較している変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを表す。二本鎖複合ＳＳＲ配列の各鎖は、プライマー内の２つの成分反復の各々の相対的な長さにより異なる３つのプライマーにより表される。３つのより効率的な（ＣＡ）_x（ＴＡ）_yプライマー型に比べて、（ＡＴ）_8.5（ＧＴ）_2.5及び（ＡＴ）_6.5（ＧＴ）_4.5プライマーは、全く非効率的（増幅産物を何も生じなかった（データは示さない））で、（ＡＴ）_3.5（ＧＴ）_6.5プライマーは、適度にうまくいった（示す）。図９は、温度サイクルの開始のためにコールドスタート（左）及びホットスタート（右）法を用いた、ダイズ栽培変種、ボルベリン（ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ）及びＰＩ８１７６２からの共増幅産物を比較する変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを表す。両方法に対して、完全複合ＳＳＲプライマー、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を示したＴａｑＩアダプタープライマーの各々と組み合わせた。図１０ａは、もう一つのアダプタープライマーなしにまたはＴａｑ．ｐｒ８と組み合わせたＤＢＤ（ＡＣ）_6.5を用いて増幅した、ダイズ（Ｂ、Ｂｏｎｕｓ；Ｓ、ｓｏｊａ；ＰＩ８１７６２）及びトウモロコシ（ｂ、Ｂ７３；ｃ、ＣＭ３７）栽培変種からの共増幅産物を比較している変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを表す。これらの鋳型は、示したように、元のままの未消化ＤＮＡまたはＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ消化したＤＮＡ（Ｐ＋Ｔ）のいずれかの形態にある。図１０ｂは、ダイズボルベリン（Ｗ）及びＰＩ８１７６２（Ｓ）栽培変種からの未消化及びＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ消化しビオチン選択した鋳型ＤＮＡの両方からの（アダプタープライマーを用いない）単一プライマー増幅において、³³Ｐ−標識した５’固定単純ＳＳＲプライマー［ＤＢＤ（ＡＣ）_7.5及びＨＢＨ（ＡＧ）₈ _.5 ］または完全複合ＳＳＲプライマー［（ＡＴ）_3.5（ＡＧ）_7.5及び（ＡＴ）_3. ₅ （ＧＴ）_6.5］を用いて得られた増幅産物を比較している変性ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを表す。コールドスタート増幅は、定温（５８ ℃）または５６℃タッチダウンアニーリング特性のいずれかを用いた。図１１は、選択したＳＳＲ−アダプター増幅産物のクローニング及びシークエンシング、並びに特定された単一座マーカーへの転換の概念図である。標的ＳＳＲ反復を保有しているゲノム制限フラグメントは、制限部位特異的アダプター、Ａｄ_A及びＡｄ_Bにより両末端で境界づけられる。このフラグメントは、ＳＳＲプライマー及びアダプターの一つに対応するプライマーを用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として働く。この増幅産物を精製し、シークエンスし、座特異的隣接プライマー（ｌｓｆｐ−１）を考案する。次に、鋳型としてアダプターを修飾した制限フラグメント混合物を用いたＰＣＲ増幅のために、ｌｓｆｐ−１プライマーをもう一方のアダプターに対応するプライマーと組み合わせる。得られた特異的産物を、次に単離し、シークエンスし、ＳＳＲのもう片方の側の独特な隣接配列に対応するもう一つのプライマー（ｌｓｆｐ−２）を考案する。ｌｓｆｐ−１＋ｌｓｆｐ−２プライマー組は、このＳＳＲ座を特異的に特定し、この座でのＳＳＲ長多型を見えるようにするためにゲノムＤＮＡから直接増幅するために用いることができる。出願人等は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５及びＡｐｐｅｎｄｉｅｃｅｓＡ及びＢ（「ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列を含んでいる出願開示のための要件」）に従った８９の配列表を提供している。発明の詳細な説明本明細書に用いるように、以下の用語を請求及び明細書の解釈のために用いることができる。「単純配列反復（ＳＳＲ）」または「ミクロサテライト反復（ＭＳ）」または「短い横並び反復」または「ジヌクレオチド反復」または「トリヌクレオチド反復」または「テトラヌクレオチド反復」または「ミクロサテライト」または「単純配列長多型（ＳＳＬＰ）」という用語は全て、横並びに反復している２、３、４、または５ヌクレオチド単位からなるＤＮＡ領域をいう。ＳＳＲ領域は２反復単位と短くあり得るが、より頻繁には８−１０反復単位よりも多い。単純配列反復は、実質的に研究した全ての真核生物ゲノムに共通で、遺伝的多型の研究のための有用な道具として同定された。本明細書に用いられるＳＳＲ座またはＳＳＲ配列の分類は、ヒト（ＣＡ）_nジヌクレオチド反復の分類のためにＷｅｂｅｒ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ７、５２４（１９９０））により提案された定義に基づく（しかし同一ではない）。「単純ＳＳＲ」という用語は、ゲノム中でいかなる他の異なる単純ＳＳＲにも隣接しない、少なくとも３またはそれより多い同じ横並びに反復したジ、トリ、またはテトラヌクレオチド配列を含んでなる領域をいう。「隣接しない」は、どちらの側にも４ヌクレオチドより近くではないことを意味する。「複合ＳＳＲ」という用語は、隣接する２またはそれより多い異なる単純ＳＳＲ配列からなる領域をいう。「隣接する」は、異なる単純ＳＳＲが、３個またはそれ未満の連続した非反復ヌクレオチドにより互いに離されていることを意味する。「完全ＳＳＲ」という用語は、ＳＳＲ内のあらゆる単純反復単位が元のままで、非反復ヌクレオチドにより遮断されていない単純ＳＳＲをいう。「不完全ＳＳＲ」という用語は、成分反復単位の一つまたはそれより多くが、３または４個の連続した非反復ヌクレオチドによりＳＳＲ内で少なくとも一回遮断される単純ＳＳＲをいう。「完全複合ＳＳＲ」という用語は、２つの成分反復ＳＳＲ領域が元のままで非反復塩基により遮断されず、（すなわち、それらは完全なＳＳＲである）、そして、２つの完全ＳＳＲ領域が、介在ヌクレオチドなしに互いに直接隣接している複合ＳＳＲをいう。「同周期の」という用語は、両成分ＳＳＲ領域が、２つのＳＳＲ領域の連結部にわたって一定の間隔を保持する共通のヌクレオチドを共有する、完全複合ＳＳＲの潜在的な特徴をいう。「異周期の（ｏｕｔｏｆｐｈａｓｅ）」という用語は、１つのヌクレオチドが２つまたはそれより多い成分反復領域に共通であるが、その複合構造の連結部を越えて一定の間隔または周期性を保持しない、完全複合ＳＳＲの潜在的な特徴をいう。「多型」という用語は、２つまたはそれより多い異なるゲノムまたは個体間のＤＮＡ配列における違いをいう。そのような違いは、既知または標識したゲノム領域内で起こる時検出できる。「優性の多型」は、単一座での特定のＤＮＡ配列の有無としてのみ検出できるＤＮＡの違いである。優性の多型を検出するための方法は、一度にその座の一つの対立因子だけを検出することができ、検出できる対立因子に関するゲノムのホモ対ヘテロは区別されない。「共優性の多型」は、ヘテロの組み合わせにおける時でさえその座での多数の対立因子の各々を区別できる、ゲノム間の一つの座でのＤＮＡの違いである。電気泳動ゲル上で移動度の変異体として典型的に同定できる共優性の多型は、ヘテロ型において存在する時、付加的な親ではない遺伝子型を生じることができる。優性の多型はそれが示す形質と相引（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）である時マーカーとして最も有用であり、一方、共優性の多型は形質に相引または相反（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）である時等しく有用である。「タッチダウン増幅」または「タッチダウンＰＣＲ」という用語は、最初のいくつかのサイクルの間アニーリング温度を人為的に高く（または低く）始め、次に、最終的な望ましいアニーリング温度に達するまで特定の数の連続するサイクルの間一定量低下（または上昇）させる、ポリメラーゼチェインリアクションのための特定の温度サイクル特性をいう。多数のサイクル特性の残りのサイクルを、次に、この最終のタッチダウンアニーリング温度で行う。この方法を用いる温度サイクルは、遺伝子増幅の最初の段階の間の偽の非特異的プライミングを減少または阻止するために役立ち、正しい及び偽のアニーリング間の不均衡を自動的に最小限に抑える。「ホットスタート」及び「コールドスタート」という用語は、ＰＣＲ増幅反応のための温度サイクルを開始するための方法論の一般的な選択をいう。コールドスタート増幅において、全ての反応成分は、最初の変性工程の前に室温で同時にまとめられる。この方法は、望ましくない低温でのプライマーアニーリング及びプライマー伸長の結果生じる偽のプライミング及び非特異的な増幅の可能性を与える。それに反して、ホットスタート法は、そうでなければ全部そろった増幅反応から少なくとも一つの重要な成分を故意に除き、従って、（もし、プライマーを除くなら）プライマーアニーリングまたは（もしポリメラーゼまたはヌクレオチドを除くなら）伸長のいずれかを防ぐ。最初の高温変性を行った後、除いた成分を加え、温度サイクルを続ける。従って、ホットスタート増幅は、厳しくない温度での偽のプライマー伸長の結果生じる非特異的な産物の生産を減少または除去するために役立つ。「核酸」は、糖、リン酸、及びプリンまたはピリミジンのいずれかを含んでいるモノマー（ヌクレオチド）を含んでなる一本または二本鎖であることのできる分子をいう。バクテリア、下等真核生物、並びに高等動物及び植物において、「デオキシリボ核酸」（ＤＮＡ）は遺伝物質をいい、一方、「リボ核酸」（ＲＮＡ）はＤＮＡからタンパク質への情報の翻訳に関与する。「ゲノムＤＮＡ」または「標的ＤＮＡ」または「標的核酸」という用語は、互いに交換して使用でき、ＳＳＲ領域の存在に関する本発明の方法による増幅または複製及びそれに続く分析のために標的とされる核酸フラグメントをいう。ゲノムＤＮＡの出所は、典型的には、真核生物から単離される。ゲノムＤＮＡは、検出できるプライマー伸長産物を生じる適当なプライマーを用いた標準的な複製方法により増幅される。「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子中の特定のパリンドローム塩基配列を認識し、あらゆる標的部位における特定の塩基でのＤＮＡ分子の両鎖の切断を触媒する酵素である。「制限フラグメント」という用語は、制限酵素での切断により生じるＤＮＡ分子をいう。いかなる与えられたゲノムも、特定の制限酵素により別個の制限フラグメント組に消化することができる。制限酵素切断の結果生じるＤＮＡフラグメントは、ゲル電気泳動により分離でき、例えば、蛍光またはオートラジオグラフィーのいずれかにより検出できる。「制限酵素切断片長多型（ＲＦＬＰ）」という用語は、生物のゲノムＤＮＡの制限酵素消化により生じた制限フラグメントのパターンにおける違いに基づいて検出される、２つの近縁の生物のゲノムＤＮＡにおける違いをいう。例えば、制限酵素の標的部位中に多型を含むゲノムは、制限酵素によりその箇所で切断されない。または、一つのヌクレオチド配列の変異は、他の生物においては存在しない新しい標的部位を導入でき、その箇所でその制限酵素によりＤＮＡを切断されるようにする。加えて、１つの生物のゲノム中のある制限酵素の２つの標的部位間で生じるヌクレオチドの挿入または欠失は、これらの標的部位間の距離を変える。従って、これらの２つの生物のＤＮＡを消化すると、異なる長さを有する制限フラグメントを生じ、ゲル電気泳動において異なるパターンを生じる。「連結」という用語は、２つの二本鎖ＤＮＡ分子がリン酸ジエステル結合により糖−リン酸バックボーンにおいて一緒に共有的に連結される、酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより触媒される酵素反応をいう。連結は、平滑（非突出）末端により各々境界づけられる２つのＤＮＡ分子間で起こることができ、並びに、２つのＤＮＡ分子が配列において相補的である一本鎖突出末端を含む場合にも起こることができる。一般的に、２つの二重らせんの両ＤＮＡ鎖は、各連結部でＤＮＡ分子の１つの遊離５’末端が５’−リン酸基を保有するように、一緒に共有的に連結される。末端の一つの化学的または酵素的修飾（例えば、５’リン酸の除去）により、二本鎖の一つの連結を妨げることもでき、その場合、共有結合は、２つのＤＮＡ分子の一つにおいてのみ生じる。「アダプター」という用語は、本明細書では、特に、限られた数の塩基対、例えば、１０ないし３０塩基対を含んでなる短い大部分が二本鎖のＤＮＡ分子をいう。アダプターは、目的のゲノム中の反復配列を故意に表さず、また互いに部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する２つの合成一本鎖オリゴヌクレオチドを含んでなる。適当なアニーリング条件の下で、これらの２つの相補的な合成オリゴヌクレオチドは、溶液中で部分的に二本鎖の構造を形成する。アダプター分子の末端の少なくとも一つは、制限フラグメントの消化末端に相補的で、特異的に連結されるように考案される。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、ＤＮＡフラグメントのコピーが、インビトロで基質ＤＮＡから合成される酵素反応をいう（米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号）。この反応は、基質ＤＮＡ中の標的部分に隣接しているヌクレオチド配列に各々相補的な一つまたはそれより多いオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、連続する一連の増幅のための鋳型として働く新たに合成されたＤＮＡ分子へのヌクレオチドの導入を触媒する。「ＤＮＡ増幅」または「核酸増幅」または「核酸複製」または「プライマー伸長」という用語は、基質ＤＮＡ分子のコピーである核酸分子の直線的または指数的複製をもたらす、当該技術分野において既知のあらゆる方法をいう。「プライマー」という用語は、ＤＮＡ鎖の複製のための開始点または部位として働くＤＮＡ断片をいう。プライマーは、通例、一本鎖で、標的または基質核酸の少なくとも一本鎖に相補的で、その標的配列を鋳型として用いてヌクレオチド重合またはプライマー伸長を導くように働く。プライマーは、ＰＣＲにおいて標的配列を「包囲する」ためにもう一つのプライマーと組み合わせて用いることができ、従って、「プライマー組」または「プライマー対」を形成する。一般的に、プライマーは、１２ないし４０ヌクレオチドの長さで、好ましくは、二次構造またはヘアピン配置を形成しないように考案される。プライマーの長さ、塩基配列、相補性、及び標的との相互作用の特別な要求は、発明の詳細な説明のプライマーの項において論じる。「プライマー」という用語は、そのようなものとして、基質ＤＮＡ分子のある領域に特異的に水素結合し、核酸複製またはプライマー伸長工程、すなわち、そのような工程は、例えば、ＰＣＲ、または多数よりむしろ単一のオリゴヌクレオチドイニシエーターを用いる他の酵素反応を含むことのできる、を開始するために働くことのできるあらゆる合成のまたは天然に生じるオリゴヌクレオチドを包含するために、本明細書において出願人等により用いられる。「アンカー」または「アンカー領域」または「アンカー部分」という用語は、特定の配列のＳＳＲに直接隣接するＤＮＡ配列とハイブリダイズするようにデザインされたプライマーの３−２０ヌクレオチドの領域をいう。プライマーのアンカー領域は、最も５’または３’末端のいずれかに存在することができ、特定のＳＳＲに対して隣接した位置で標的ＤＮＡ上にプライマーを固定するために働く。この固定は、各標的部位で固定されたヌクレオチドから起こるプライマー伸長をもたらす。アンカー配列は、故意または任意のいずれかのデザインの非縮重配列であることができ、あるいは完全または部分的に縮重した配列であることができる。後者は、ゲノム中の広範囲のＳＳＲ部位に隣接しているゲノムＤＮＡ配列にアニーリングすることができる。場合によっては、プライマーのアンカー部分は、レポーター分子、典型的には、放射性同位体、蛍光部分、または反応性リガンドで５’末端標識することができる。ＤＮＡ配列中の各位置で個々のヌクレオチドをいう時、「任意の」という用語の使用は、偏見のない手段、または、必然的にもしくは前もって決定された配列に固執してというよりむしろ見たところ偶然に基づきもしくは決定された選択をいう。「非縮重した」という用語は、ＤＮＡポリマー、通常、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中の直線状に並んでいるヌクレオチド内の一つの特定の位置または多数の特定の位置で単一の特定のヌクレオチドが存在することをいう。いかなる非縮重ヌクレオチドの位置も、例えば、与えられた鋳型の部位に対応することが既知である意図された塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれか）を保有することができ、または、前以て既知ではない標的部位に対応する任意に選択された塩基を保有することができる。「非縮重オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子内のあらゆるヌクレオチドの位置が非縮重であることを意味する。「縮重した」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中の一つの特定の位置で一つ以上の特定のヌクレオチド型が存在することをいう。特定のオリゴヌクレオチドは、縮重しているいくつかの位置、及び完全または部分的に縮重しているいくつかの位置からなることができる。「完全に縮重した」は、特定のヌクレオチドの位置で、４つの可能なヌクレオチド塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）の等しい混合物が存在することを示し、部分的に縮重したは、特定の位置で、４つの可能な塩基の２つまたは３つのみが存在することを示す。「縮重オリゴヌクレオチド」は、その中の少なくとも一つの位置に完全または部分的な縮重を持つものであり、すなわち、そのようなオリゴまたはポリヌクレオチドは、特定の非縮重ＤＮＡ分子の混合物であり、その各々は、直線状ヌクレオチド配列において特定された縮重塩基によって可能なヌクレオチド配列の単一の置換を表す。例えば、２つの完全な縮重位置を有するオリゴヌクレオチドは、（４）² ＝１６の異なる非縮重分子の混合物であり、４つの完全な縮重及び２つの部分的な縮重（３塩基）位置を有するオリゴヌクレオチドは、（４）³ｘ（３）²＝５７６の異なる非縮重分子の混合物を含んでなる。本明細書に用いる標準的な縮重コードは、ＮまたはＸＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴＢＧ、Ｃ、またはＴ（Ａを除いて何でも）ＤＡ、Ｇ、またはＴ（Ｃを除いて何でも）ＨＡ、Ｃ、またはＴ（Ｇを除いて何でも）ＶＡ、Ｃ、またはＧ（Ｔを除いて何でも）である。「レポーター」または「レポーター分子」という用語は、蛍光分子、放射性標識、光放出部分、または免疫反応性もしくはアフィニティー反応性リガンドを含むがこれらに制限されない、酵素的方法、免疫学的方法またはエネルギー放出により検出されることのできるあらゆる部分をいう。「結合対」という用語は、抗原／抗体またはハプテン／抗ハプテン系のような免疫型結合対の特異的な分子間認識の種類のあらゆるもの、また、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、相補的各酸断片、プロテインＡまたはＧ／免疫グロブリンのような非免疫型結合対、並びに、マレイミド及びハロアセチル誘導体を含むスルフヒドリル反応性基、及びイソチオシアナート、スクシンイミジルエステル、及びスルホニルハロゲン化物のようなアミン反応性基のような共有結合を形成する結合対の種類のあらゆるものも含む。本発明は、ＳＳＲ遺伝的マーカーの検出のための自己固定プライマーの考案及び使用について記述する。これらのプライマーを用いる一般的な多型検出方法は、ミクロサテライト多型座の選択的増幅（ＳＡＭＰＬ）と呼ばれる。プライマー考案の方法は、単一の型のヌクレオチドが直接隣接する構成反復の両方により共有され、反復の結合部を越えてそして反復の長さの全体にわたって「同周期」に維持されるジヌクレオチド反復から多くの複合ＳＳＲ配列がなるという所見に基づく。本発明は、従来の単一座ＳＳＲマーカーに固有の多くの利点（すなわち、高いレベルの多型及び高い共優性潜在性）を、多数ゲノムアッセイにより提供される付加的な利点及び簡便さと組み合わせる。従来の単一座ＳＳＲマーカーとのように、完全複合ＳＳＲ配列の自己固定ＰＣＲプライマーとしての使用は、ゲノム間の優性及び共優性の多型の検出を可能にする。しかしながら、従来のＳＳＲ分析と異なり、この方法は、個々のＳＳＲ座に隣接している特異的な配列の前もった知識を必要としない。従って、我々が記述するようなそのような複合ＳＳＲ配列をプライマーとして使用するために、多大な労力のかかるＳＳＲマーカーの発見または座の同定は必要ない。また、従来のＳＳＲマーカーでのように、複合ＳＳＲ配列の同周期の一組は、植物及び動物ゲノムの両方において非常に豊富で十分に分散し、並びに個々のゲノム間で非常に多型であるようである。それに反して、完全複合ＳＳＲ配列の「異周期」の一組は、かなり低い相対頻度でこれらの同じゲノム中に存在する。従って、非常に豊富な同周期完全複合ＳＳＲ配列が目的の座に密接に連鎖した新しい多型を同定できる可能性は、極めて高い。加えて、最も５’の反復が２つの反復の最も３’によるプライマー伸長のためのアンカーとして働き、従って、５’または３’隣接アンカーとしていかなる付加的な縮重または固定配列もこれらのプライマーに組み入れる必要を除くように、これらの複合ＳＳＲ配列を表すＰＣＲプライマーは自己を固定する。それ故、同じ複合ＳＳＲ配列を保有していると考えられ得るあらゆるゲノムの座は、これらの標的部位に符合している単一の複合ＳＳＲプライマーによる同時増幅のための標的部位として働くことが期待される。最後にそして最も好ましくは、これらのプライマーの使用は、いくつかの異なるゲノムアッセイの多用性及び有益性を増すためにこれらに組み込むことができる。例えば、増幅断片長多型アッセイ（ＡＦＬＰ；Ｚａｂｅａｕ、欧州特許第５３４，８５８号）の修正におけるこれらの完全同周期複合ＳＳＲプライマーの使用は、従来のＡＦＬＰ法に比べて、非常に近縁のゲノム間でさえ多型及び共優性である増幅産物の割合の増加をもたらす。ＡＦＬＰアッセイで得ることのできる増幅産物の数及び型の両方を調整できることと組み合わせて、これらの複合ＳＳＲプライマーの多用性は、複雑な植物及び動物ゲノムの多数の分析のために独特な組み合わせの利点を提供する。出願人等の修正したＡＦＬＰ発明を、図１に示す。ある出現頻度で完全同周期複合ＳＳＲ配列を保有しているゲノムＤＮＡ（Ｉ）を、単一の制限酵素または２つまたはそれより多い制限酵素の組み合わせで消化する。この図は、ヘキサヌクレオチド認識部位（線影をつけた箱）を有する一つの酵素及びテトラヌクレオチド部位（黒い箱）を有するもう一つの酵素の二つの酵素の組み合わせの使用を示す。特定の型（長さ）の認識部位を有する制限酵素の以下の組み合わせを含むがこれらに制限されない多数の制限酵素の他の組み合わせを選択することも、本発明の範囲内である。追加的な酵素の組み合わせ２酵素３酵素４＋４４＋４＋４５＋５５＋４＋４６＋６６＋４＋４４＋５５＋４＋５５＋６６＋４＋５４＋８６＋４＋６５＋８５＋５＋５５＋５＋６６＋６＋６全ての場合において、これらの多数の酵素消化は、対応する平滑または一本鎖突出末端の全ての組み合わせを有する制限フラグメントの混合物を生じる。加えて、全てが同じ平滑または一本鎖突出末端を共有しているフラグメントを生じるために単一の制限酵素を用いることは、本発明の範囲内である。一般的に、もし、酵素活性が、酵素部位内のＤＮＡメチレーションまたは他の非メンデル形態のＤＮＡ修飾により影響または阻害されないなら、４、５、６、または８塩基認識部位を有するあらゆる酵素が適当である。次に、アダプターＡはヘキサヌクレオチド部位の酵素により生じる一本鎖突出に特異的にアニールし、そして、アダプターＢはテトラヌクレオチド部位の酵素により残される突出に特異的にアニールする、二本鎖のアダプターＡ及びＢを構築する。アダプターＡ及びＢは、（表IIIにおいても記述される）標準的な方法を用いて、消化したＤＮＡ混合物中の全ての制限フラグメント（II）の適当な末端に同時に連結される。別の態様において、ゲノム制限フラグメントのより少ない組（III）の捕獲及び単離をさせる、（ビオチン−ストレプトアビジン対の一部として）ビオチンのような結合対の一つとアダプターＡまたはアダプターＢのいずれかを結合することができる。修飾したアダプターにより認識される特定の制限部位のゲノムの頻度により、次に選択されるゲノムフラグメントの割合が影響されるように、これらのアダプターのいずれかを修飾することができる。いかなる与えられた制限酵素の組み合わせに対しても、この濃縮方法は、例外なく、ゲノムからの制限フラグメントの総数のわずかな部分だけが次のＰＣＲ増幅のための鋳型として働くようにするが、しかしながら、この減少した複雑さは、次の工程における共増幅産物の適度な数を保証するために必要である。濃縮ゲノムフラグメントの異なる組を作成するための多数の組み合わせの制限酵素の使用により、全ゲノムを調べることができる。図１ａは、ビオチン化したヘキサヌクレオチド部位のアダプターを示す。代わりに、一対の非標識アダプタープライマーを用いて最終増幅の前に前増幅工程を行うことにより、ゲノムフラグメント混合物の複雑さを選択的に減少することができる。このプライマー対は、一つのアダプター配列に対応する一つのプライマー及びもう一つのアダプター配列に対応する二つ目のプライマーの２つの異なるプライマーを含んでなる。各プライマーは、その３’末端に一つの選択的なヌクレオチドを保有する。これらの＋１アダプタープライマーの各々の最も３ ’の位置は、４つのＤＮＡヌクレオチドのいかなる一つででも占めることができるので、各アダプターを４つの異なるプライマーにより表すことができる。さらに、各ゲノムから１６の異なる重複しないフラグメント組を作成するために、これらの＋１プライマーの４ｘ４＝１６の異なる組み合わせをあらゆるゲノムフラグメント混合物に対しても用いることができる。従って、前増幅は、ゲノムフラグメントの全混合物の一組を濃縮し、前増幅のために用いる特定のプライマーを変えることにより、単一の制限フラグメント混合物から異なる濃縮組を作成することができる。フラグメントの濃縮をどのようにして行おうとも、次に、一対のＰＣＲプライマーを標準的なプロトコルに従って合成する。ビオチンが介在するフラグメント濃縮法を用いる場合、一つのプライマーは、アダプターＢに特異的にアニールするように考案されたアダプタープライマーである。前増幅による濃縮に対しては、このプライマーは、２つのアダプターのいずれかに対応することができる。いずれの場合でも、このアダプタープライマーは、それらの３’末端に１−４個の無作為に選択したヌクレオチドを保有する。もう一つのプライマーは、一組のゲノムフラグメント上に存在する特定のＳＳＲ配列に特異的にアニールするように考案されたＳＳＲプライマーである。好ましい態様において、ＳＳＲプライマーは、典型的には、³²Ｐもしくは³³Ｐのような放射性ヌクレオチドまたは蛍光部分（＊）で５’末端標識される。もしＳＳＲプライマーが、好ましくはプライマーの長さにわたって「同周期」のままである一つのヌクレオチドを有して複合ＳＳＲにまたがる「完全複合」型であるなら、さらに特に好ましい。アダプタープライマー及び５’標識したＳＳＲプライマーの存在下での一組のアダプター修飾した制限フラグメントの指数的増幅は、ＳＳＲ配列を保有し、考案したアダプター配列が向かい合わせの末端に位置するあらゆる投入ゲノムフラグメントから標識されたプライマー伸長産物（IV）を生じる。この方法は、ゲノム間で高い割合が多型であることが期待される多数の共増幅産物を生じる。考案したＳＳＲ配列もしくは適当なアダプター末端のいずれかまたは両方を欠いているゲノムフラグメントは、指数的に増幅されず、従って検出されない（Ｖ）。一般法：プライマーの考案：全てのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＯｐｅｒｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡにより記述されるような固相ホスホルアミダイド化学を用いて合成する。全てのプライマーは、５’末端が非リン酸化されており、効率良い合成ならば未精製の形態において使用できる。しかしながら、最高のプライマーの特異性のためには、カラムクロマトグラフィーにより精製されたオリゴヌクレオチドが好ましい。全てのオリゴヌクレオチドプライマーを、５０ｍＭ塩（ＫＣｌまたはＮａＣｌ）中のＴ_mが３８℃及び４５℃の間であるように選択する（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、ＭａｃｉｎｔｏｓｈのＯｌｉｇｏｖ４．０３により用いられるアルゴリズムを用いて決定された）。出願人等の発明に関連していくつかの型のプライマーが用いられた。第一番目は、１５から２５までの長さのヌクレオチド及び４０％から６０％までのＧ＋Ｃで変わることのできる、（Ｚａｂｅａｕ欧州特許第５３４，８５８号において開示された）アダプタープライマーである。このプライマーは、その５’末端で始まり、試験される制限酵素消化した標的ＤＮＡに連結される二本鎖のアダプターの一本鎖の長さにわたり、そして相補的である。次に、このプライマーは、制限部位の全てまたは一部を含み、そして、その３’末端は、アダプターに隣接する標的ＤＮＡフラグメント内のヌクレオチドにアニールしそこから伸長を開始する任意の非縮重塩基を保有することができる。そのようなアダプタープライマーの配列は、鋳型の構築のために用いる特定のアダプター、及びプライマーの３’ 末端に位置する任意の選択的ヌクレオチドの数により変わることができる。各々、特定の制限酵素により生じた部位に特異的なアダプター及びアダプタープライマーの両方を含んでなるオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列及び特徴の例を表Ｉに示すが、これらに限定されるものではない。本発明内で用いられる２番目の型のプライマーは、その３’部分において、単純配列反復または構造が上に定義したように単純（単純ＳＳＲ）であるミクロサテライトに相当する。この単純ミクロサテライト領域は、モノ、ジ、トリ、テトラ、またはペンタヌクレオチドの横並びの反復であることができる。プライマーの５’の位置は、標的ゲノム中のミクロサテライトの近くにプライマーを固定するように働く、３ないし５個の完全または部分的に縮重したヌクレオチドを含む。このプライマーは、典型的には１６％から８０％までの［Ｇ＋Ｃ］量で、１０から６０までのヌクレオチドの長さで変わることができる。ほとんど全ての場合において、プライマーの伸長は、ＳＳＲ標的領域に対して固定された部位から開始することが期待されるので、ゲノム間のミクロサテライト座内の長さの多型をこれらのプライマーを用いて検出できることが期待される。これらに類似するプライマーは、Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ、Ｅ．等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０、１７６、（１９９４）により記述される。本発明内において独特に用いられる別の型のＳＳＲプライマーは、反復間または反復の各々内のいずれかにおいて介在するヌクレオチドなしにお互い直接隣接する２つの異なる完全ＳＳＲを含んでなる完全複合ＳＳＲプライマーである。完全複合ＳＳＲプライマーは、完全に自己を固定する、すなわち、プライマーの５ ’末端の単純ＳＳＲが、プライマー伸長が始まる隣接する３’ＳＳＲに対する効率よいアンカーとして働く（図１ｃ参照）。それ故、プライマー伸長が複合ＳＳＲ標的領域内の単一の固定された部位から始まることが意図される。プライマー伸長が生じる標的ＳＳＲの部分におけるゲノム間のいかなる長さの変異も、これらのゲノムから得られる増幅産物における長さの変異として見ることができるはずである。複合プライマー内の各成分ＳＳＲの相対的な長さは変わることができる。しかしながら、出願人等は、最もよいプライマーの固定及び標的の鋳型に対する最も高い特異性は、５’アンカーの長さが３’プライミング部位の長さに等しいまたはより長い時に生じることを見いだした。ジヌクレオチド反復に対しては、出願人等は、ＣＧ及びＧＣの組み合わせ（これらの長い領域は、真核生物ゲノムにおいて稀であると考えられる）を除いて、２つの隣接するジヌクレオチド配列の９０の異なる配列が可能であると理論上想定する。以下の式、［（４）（３）−２］ｘ［（４）（３）−２−１］＝９０、により概算されるように、最初の（最も５’の）成分反復は、その最初の位置に４つのヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）のどれでも持つことができ、その２番目の位置で３つの残りのヌクレオチドのいずれかにより続けられ、次に、この積から２つのＧＣ及びＣＧの組み合わせを引かなければならない。２番目の（最も３’の）ジヌクレオチドに対しては、同じ計算が行われるが、最初の成分２ヌクレオチド反復位置を占めている１つの組み合わせをさらに引く。これらの９０配列の全てを表IIに挙げる。しかしながら、８０だけが真の複合反復配列であり、これらの配列の１０は、実際には不完全単純反復（例えば、（ＣＴ）_n（ＴＣ）_n、（ＡＧ）_n（ＧＡ）_n等）である。同様の計算を、無作為のヌクレオチド配列により可能な異なるトリ、テトラ及びペンタヌクレオチドの組み合わせの数及び型を概算するために行うことができる。完全なジーンバンクＤＮＡ配列データベース（バージョン８４．０）を、ウイスコンシン大学ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ配列分析パッケージ（バージョン７．３）内のＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎｓ検索アルゴリズムを用いて検索した。第一列に示した二本鎖配列の個々の鎖を、（全ての種を合わせた）全ジーンバンクデータベースまたは示した系統発生的分類を表しているそれぞれのサブデータベースのいずれかの対する問い合わせとして個々に用いた。（ＡＣ）_x（ＡＴ）_yのような各問い合わせに対して、ｘ及びｙをそれぞれ≧６であるように指示し、すなわち、データベース中のいかなるヒットも２つの成分ジヌクレオチド反復の各々の少なくとも６単位を保有することが要求される。最後の列は、（ＡＣ）_xまたは（ＡＧ）_y配列のいずれかを含んでいる小さいインサートとして単離された、クローン化ダイズＳＳＲ配列（未発表データ）の研究室内収集物内の各問い合わせに対して符合した数を示す。全ての８０複合２ヌクレオチド配列はゲノム中に存在し、対応するプライマーに対する標的として働く可能性を有するけれども、これらの隣接するジヌクレオチド反復の組み合わせの少数の組のみが、ＤＮＡ配列、データベース内に存在する複合ＳＳＲ間、並びに植物及び動物ゲノムからクローン化されシークエンスされたＳＳＲ間に適当な頻度で出現することが見られた（表II参照）。これら８０の全組み合わせの大部分は、真核生物ゲノムにおいて意外にも低い相対頻度で出現する。この高頻度の組におけるほとんど全ての複合反復は、２つの隣接する成分ジヌクレオチド反復が連結部及び全複合構造にわたって一定の周期間隔を保持する共通のヌクレオチドを共有する完全なヌクレオチド周期性を有する。これらの複合ＳＳＲ配列は、出願人等により「同周期」と呼ばれ、ｘ及びｙが独立して≧２で、０．５の倍数であることができる、（ＡＴ）_x（ＡＧ）_y、（ＡＣ）_x（ＴＣ）_y、及び（ＡＴ）_x（ＧＴ）_yのような反復を含む。８０の可能なジヌクレオチドの組み合わせのうち３２はこの同周期の分類に入り、これらを表IIに挙げる。残りの複合反復の全ては、「異周期」と呼ばれる。しかしながら、（ＣＧ及びＧＣを除いた）３２の個々の同周期複合配列は、１６の独特な非重複一本鎖配列だけを表す。この２倍の重複は、反復している同周期ヌクレオチドをコア配列中の一番目または二番目の塩基のいずれかとして位置する可能性から生じる（すなわち、個々のプライマーとして同一でないけれども、（ＡＣ）_x（ＡＴ）_y及び_y（ＣＡ）_x（ＴＡ）_yは同じ複合配列を表す）。加えて、これら１６の基本的な非重複配列は、８つだけの個々の二本鎖複合反復座の相補鎖を表す（表II参照）。言い換えれば、二本鎖ＤＮＡ中の座としての複合ジヌクレオチド反復を、全組の３２の可能な配列から、４つの異なる一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーのいずれによっても認識することができる。例えば、（ＡＴ）₆ （ＡＧ）₆は、４つの仮説に基づいたプライマー、（ＡＴ）_x（ＡＧ）_y、（ＴＡ）_x（ＧＡ）_y、（ＣＴ）_x（ＡＴ）_y、及び（ＴＣ）_x（ＴＡ）_y（ｘ、ｙ≦６で）の標的部位である。偶然にのみ、及び出所ゲノムにおいてヌクレオチドの偏りがないと仮定すると、８０の異なる完全複合ジヌクレオチド配列の各々は、ゲノム中において等しい頻度で出現することが期待される。しかしながら、上に述べたように、異周期の組に比べて同周期の組がより豊富にあることは、出願人等によりすでに発見された。さらに、同周期の複合配列の組み合わせのいくつかの成分反復の２つの可能な配列は、与えられたゲノムにおいて著しく異なる頻度で存在するようである。例えば、複合反復、（ＡＴ）≦₆（ＡＧ）≦₆は、その配列の相対物、（ＡＧ）≦₆（ＡＴ）≦₆より植物ゲノムにおいて少なくとも５倍より豊富にあるようであり、（ＡＣ）≦₆（ＡＧ）≦₆は、（ＡＧ）≦₆（ＡＣ）≦₆より霊長目ゲノムにおいてかなり豊富である。クローン化した配列のデータベースの系統的分析、並びに植物及び動物ゲノムの両方の経験的な調査の両方から、これらの少数の最も頻繁に出現する複合ジクレオチド反復は、出願人等により既知であり、従って完全に予測できる。この知識は、本発明を用いて適当な数のＳＳＲ−アダプター共増幅産物を生じるためにうまくいく、ほんのわずかな数の異なる複合ＳＳＲプライマーに減少するために役立つ。従って、ヌクレオチドの無作為な配列により可能である８０の全複合ジヌクレオチド配列の並びのうち、（ほとんど全てが同周期である）ほんのわずかだけが植物及び動物ゲノムにおいて測定できる頻度で存在し、それ故、これらの少数だけが、あらゆる与えられたゲノムにおいて存在する複合ＳＳＲ座の大部分を検出するために必要とされる。しかしながら、実験データは、これらの１６複合配列を表している特定のプライマーが、それぞれの標的座を認識し、そこからプライミングするのに等しく効果的ではないことを示す。プライマー効率におけるそのような違いは、プライマー内の各成分反復の相対的な位置（３’プライミングに対する５’固定）と組み合わさった、各成分反復の塩基組成（ＡＴの豊富さ）から生じると経験的に決定した。表IIはまた、共有されるヌクレオチドの間隔が保存されない（「異周期」と呼ばれる）、または２つの成分反復間に共有されるヌクレオチドがないジヌクレオチド配列も挙げる。後者の種類は、パリンドローム及び非パリンドロームの両方であるジヌクレオチドの組み合わせを含む。真核生物ゲノムにおいて同周期の配列ほどとても頻繁ではないけれども、異周期複合ＳＳＲ配列のいくつかは、それにもかかわらず大部分のゲノムにおいて存在するようである。従って、そのような異周期の反復に対応するプライマーもまた、ゲノム中のそれらの各々の標的座からのプライマー伸長の開始部位として働くことが期待される。プライマーヌクレオチドの周期性を特に示さない本発明の好ましい固定プライマーを、ジヌクレオチド反復に関して式Ｉ、式Ｉ５’-（ＸＹ）≦１５（ＮＭ）≦１５ -３’ 式中、Ｘ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｘ≠ＹＮ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｍ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｎ≠Ｍそして、式中ＸＹ≠ＭＮ本明細書において、これらは（ＸＹ）＃（ＮＭ）＃と省略して書かれる、により、及び３ヌクレオチド反復に関して式II、式II ５’-（ＸＹＺ）≦１０（ＬＭＰ）≦１０ -３’ 式中、Ｘ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｚ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ、そして、Ｘ、Ｙ、Ｚは同じ単一塩基ではない、式中、Ｍ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｐ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ、そして、Ｍ、Ｎ、Ｐは同じ単一塩基ではない、そして、式中ＸＹＺ≠ＮＭＰにより定義することができる。通例、式Ｉ及びIIのプライマーは、介在する非反復ヌクレオチドなしに互いに直接隣接する２つの異なる成分単純配列反復を含む１０−６０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドからなる。このオリゴヌクレオチドは、５’末端から、１５反復単位の長さまでの単純配列反復を含み、同じく１５反復単位の長さまでの２番目の単純配列反復がすぐ３’に続く。プライマーヌクレオチドが同周期であることを特に示す本発明の好ましい固定プライマーは、２ヌクレオチド反復に関して式III、式III この式は、式Ｉにより広く含まれる配列の組を記述する。５’-（ＸＹ）≦１５（ＸＺ）≦１５ -３’または５’-（ＹＸ）≦ １５（ＺＸ）≦１５ -３’ 式中、Ｘ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｚ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧしかし、式中、Ｙ≠Ｘ；Ｚ≠Ｘ；そして、Ｙ≠Ｚ本明細書において、これらは（ＸＹ）＃（ＸＺ）＃または（ＹＸ）＃（ＺＸ）＃と省略して書かれる、により定義される。典型的には、式IIIのオリゴヌクレオチドは、１０−６０ヌクレオチドの長さで、介在する非反復ヌクレオチドなしに互いに直接隣接する２つの異なる成分単純配列反復を含む。このオリゴヌクレオチドは、５’末端から、１５反復単位の長さまでの単純配列反復を含み、同じく１５反復単位の長さまでの２番目の単純配列反復がすぐ３’に続く。各反復は、各反復内の一番目または二番目の位置のいずれかを占め、両成分反復のにわたって一定の周期性で保持される共通のヌクレオチドを共有する。出願人等の発明の特に好ましい態様において、適当なアダプターで修飾された制限フラグメントＤＮＡを用いて、用いるプライマー対が、上記の第一番目の型（Ｚａｂｅａｕ欧州特許第５３４，８５８号；ＡＦＬＰプライマー）である一つのプライマーを含んでなり、第二プライマーが上記の出願人等の独特な完全複合ＳＳＲプライマーの一つである、多型を検出するためのＰＣＲ増幅を行う。当該技術部分野における技術の一つはまた、出願人等の独特な複合ＳＳＲプライマーを、例えば、非アダプタープライマー、固定された配列のプライマー、任意のプライマー、またはゲノム中の現在既知もしくは未知の分散した反復配列とハイブリダイズするかもしれないいかなるプライマーも含む様々な他のプライマー型とあわせて用いることもできることも認識する。本発明に特に適した例は、もう一つのプライマーが、ＲＡＰＤプライマー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８、６５３１、（１９９０））のような完全に任意の配列であるものである。ＲＡＰＤプライマーは、ゲノムＤＮＡの増幅から多型マーカーを作成するために用いられてきた。好ましくは、ＲＡＰＤプライマーのヌクレオチド配列は、約９ないし１０塩基の長さで、５０及び８０％の間のＧ＋Ｃ組成で、パリンドローム配列を含まない。ＲＡＰＤプライマーだけを用いた増幅は、典型的には、短いプライマー、及びゲノム上のいくつかの無作為に分布した座が増幅産物を生じる可能性を最大にする低いアニーリング温度を用いて行われる。ゲノム内のいかなる特定のＲＡＰＤ結合部位の出現率も比較的低いので、この方法論は、あらゆる特定のプライマーの組み合わせでの増幅に供するゲノムの量を制限するように働く。ＲＡＰＤ方法論の選択性は、次に適当な数の共増幅が起こる無作為に分布したゲノム領域の一組だけを濃縮するために、従来のＡＦＬＰ法におけるビオチン化アダプターの使用により提供される選択機能に類似した濃縮機能を果たすと考えられる。ゲノムＤＮＡの調製制限消化フラグメント本発明における増幅のために有用な標的ＤＮＡは、真核生物ゲノムＤＮＡのＴａｑＩ＋ＰｓｔＩまたはＴａｑＩ＋ＨｉｎｄIII消化から生じ、さらに特定のアダプター配列の連結により修飾した制限フラグメントを含んでなる。Ｍｕｒｒａｙ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ｍｕｒｒｙ等、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．、８、４３２１、１９８０）のＣＴＡＢ／クロロホルム抽出及びＣｓＣｌ／遠心法または尿素抽出ミニプレップ法（Ｃｈｅｎ等、ＴｈｅＭａｉｚｅＨａｎｄｂｏｏｋ、Ｍ．Ｆｒｅｅｌｉｎｇ及びＶ．Ｗａｌｂｏｔ、ｅｄｓ．、（１９９３）５２６ −５２７頁、ＮｅｗＹｏｒｋ）のいずれかを用いて、ゲノムＤＮＡをダイズ及びトウモロコシから単離した。哺乳類及びサケのゲノムＤＮＡは、市販されているもの（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ゲノムＤＮＡを完全制限酵素消化、それに続く部位特異的二本鎖アダプターの連結により増幅反応のために調製した。この型のアダプターの考案及び構築のための方法は、当該技術分野においてよく知られており、実施例は、Ｚａｂｅａｕ、欧州特許第５３４，８５８号により与えられる。もし、それぞれ４塩基及び６塩基の認識部位を有する２つの異なる制限酵素を標的ＤＮＡの調製のために用いるなら好ましい。適当な制限酵素の例はＴａｑＩ及びＰｓｔＩであるが、しかしながら、４−、５−、６−、または８塩基さえの認識部位を有するいかなる制限酵素もまた、それらの活性が標的部位ＤＮＡのメチル化または他の非メンデル機構の選択的なヌクレオチドの修飾により阻害されないなら、適当である。そのような制限酵素のいかなる組み合わせも、潜在的に適している。本発明に適した他の制限酵素は、ヘキサヌクレオチド部位酵素、ＥｃｏＲＩ、ＤｒａＩ、またはＢａｍＨＩ、テトラヌクレオチド部位酵素、Ｓａｕ３ＡＩ、ＭｂｏＩ、ＭｓｅＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、またはＡｌｕＩ、ペンタヌクレオチド部位酵素、ＨｉｎｆＩまたはＡｖａII、及びオクタヌクレオチド部位酵素、ＰｍｅＩ、ＰａｃＩ、またはＳｗａＩを含むことができるが、これらに制限されない。Ｚａｂｅａｕ（欧州特許第５３４，８５８号）により与えられるような標準的なプロトコルに従って、ゲノムＤＮＡをＴａｑＩのような一つ目の酵素で消化し、続いて、ＰｓｔＩのような二つ目の酵素でさらに消化する。各投入したゲノムＤＮＡから生じた消化物は、ＴａｑＩまたはＰｓｔＩ部位のいずれかが両末端に位置する対称なフラグメント、及びＴａｑＩ部位及びＰａｔＩ部位が各末端に位置する非対称なフラグメントの混合物である。アダプター二本鎖のアダプターを、各対の２つの部分的に相補的な一本鎖の成分オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより作成する（例を表Ｉに挙げる）。制限酵素はゲノムＤＮＡ分子を特定の部位で切断するので、まず最初に合成オリゴヌクレオチドアダプターを制限フラグメントのこれらの末端に連結し、従って、ＰＣＲ増幅において用いられるプライマーのためのアンカー塩基として働く２つの共通の隣接している標識を全ての制限フラグメントに与えることにより、制限フラグメントの増幅を達成することができる。典型的には、制限酵素は、両鎖の末端のヌクレオチドが塩基対をなしているような平滑末端をＤＮＡフラグメント上に生じるか、または２つの鎖の一つが短い（１−４ヌクレオチド）一本鎖伸長を与えるように突出している突出末端を生じる。平滑末端を有する制限フラグメントの場合、１つの平滑末端を有するアダプターを用いる。突出末端を有する制限酵素の場合、制限フラグメントの一本鎖伸長に相補的な一本鎖伸長を有するアダプターを用いる。その結果として、各型の制限部位末端は、符合する末端の相補性により特定のアダプターで特異的に認識される。加えて、各アダプター型の全長のＤＮＡ配列は、他のアダプター型のものと異なる（表Ｉ参照）。典型的には、用いるアダプターは、互いに部分的に相補的で、通常、約１０ないし３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、１２ないし２２ヌクレオチドの長さで、溶液中に一緒に混合すると二本鎖構造を形成する合成の一本鎖オリゴヌクレオチドを含んでなる。酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、特定のゲノムＤＮＡ源から生じた制限フラグメントの混合物中の個々のＤＮＡ分子の相補的な末端に、アダプターを共有的にそして特異的に連結する。制限フラグメントに対して大過剰のモル濃度のアダプターを用いることは、全ての制限フラグメントが両末端にアダプターを受け取ることを保証する。これらのアダプターは、通常、リン酸化されていない。これらの連結されたアダプターは、次に、アダプターＰＣＲプライマーのための鋳型として働く。本発明の一つの態様において、ゲノムから全ての制限フラグメントは、両末端に同じアダプターを保有し、そのアダプター配列に対応する単一のＰＣＲプライマーをこれらのフラグメントから同時に増幅するために用ぃることができる。いくつかの異なる制限フラグメントの同時増幅は、しばしば、多数ＰＣＲ増幅と称される。そのような場合、全ての制限フラグメントは同じアダプターが両末端に位置しているので、標識された制限フラグメントの混合物のプライマー伸長及びＰＣＲ増幅は、同時に全ての制限フラグメントを増幅することが明らかである。ＤＮＡを切断するために２つまたはそれより多い異なる制限酵素を用いた別の態様において、２つまたはそれより多い異なるアダプターを制限フラグメントの末端に連結する。この場合、各々特定のアダプターの配列に符合している２つの異なるＰＣＲプライマーを、一組の制限フラグメントからの指数的な増幅のために用いることができる。２つまたはそれより多い制限酵素を用いた一つの好ましい態様において、両アダプターは修飾されず、フラグメントの混合物は前増幅工程を用いて濃縮される。２つまたはそれより多い制限酵素を用いた別の好ましい態様において、制限酵素部位末端の一つに対応するアダプターをビオチン分子に共有的に連結する。ビオチン化した分子を単離するための標準的な方法を用いて、この考案は、制限フラグメントの複雑な混合物から、ビオチン化アダプターが片方または両末端に位置するものだけを選択することができる。２つの可能な選択工程の両方とも、制限フラグメントの出発混合物の複雑さを減少し、ＰＣＲ増幅前の濃縮工程を構成し、それにより、ある場合において、同じ部位の末端を有するフラグメントのバックグラウンドを減少する。さらに他の態様において、増幅プライマーの一つを、オートラジオグラフィーによりその産物を同定するために放射性標識することができ、または、産物の蛍光検出のために蛍光標識で修飾することができる。核酸の標識方法及び適当な標識は、当該技術分野においてよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ上記参照）。例えば、本発明に適した放射性同位体は、リン酸化条件の下で［γ−³³Ｐ］ＡＴＰからのリン酸基転移によりアダプターの一本鎖の５’末端に取り込まれる³³リン酸塩である。（表Ｉに挙げた）各対の２つの部分的に相補的な一本鎖成分オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、（ビオチン標識を有するまたはなしの）二本鎖のアダプターを作成する。例えば、適したアニーリング条件の下で一本鎖のＴａｑ．ＡｄＦ及びＴａｑ．ＡｄＲオリゴヌクレオチドを結合させることにより、二本鎖のＴａｑＩアダプター（Ｔａｑ−Ａｄ）を作る。ビオチン化した二本鎖のＰｓｔＩアダプター（ビオチン−ＰｓｔＩ−Ａｄ）を作成するために、一本鎖のオリゴヌクレオチド、ビオチン−Ｐｓｔ．ＡｄＦ及びＰｓｔ．ＡｄＲを同様に結合させた。もし、表Ｉに挙げたもの以外の制限酵素を用いるなら、その場合、与えられた制限部位半分の適当な突出一本鎖末端を保有するようにアダプターを考案しなければならない。好ましい態様において、各連結により生じた再構築部位を再消化できないように、各アダプターは、保有する制限部位の半分内（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ１／２−ｓｉｔｅ）に単一の塩基の変異を含む。それ故、適当なバッファー及び温度条件の下で、制限消化及び連結を同時に行うことができることを技術者は認識する。ＤＮＡ増幅核酸の増幅のための基本的なプロトコルは、当該技術分野においてよく知られているけれども、ＤＮＡフラグメントの最適な増幅及び多型産物の検出を達成するために、これらのプロトコルの著しい修正が必要であった。ＰＣＲプロトコルの温度サイクリングパラメーターにおける変化、プライマーの標識における変化、並びにプライマーの長さ及びヌクレオチド組成を含むいくつかの因子は、これらの増幅に著しく影響を及ぼすことが見いだされた。ＰＣＲにおける温度サイクリングの変化５’固定単純及び複合ＳＳＲプライマーの両方による増幅の効率を、定温またはタッチダウンアニーリング条件のいずれかを有する温度サイクリング特性を用いて、ダイズ、トウモロコシ、及び哺乳類の鋳型に試験した。増幅のために選択したいかなるプライマー対もだいたい同じ最適アニーリング温度を有するように、比較的狭い範囲内（５０ｍＭＮａまたはＫ塩中で３８−４５℃）にＴｍを持つようにこれらの増幅におけるアダプター及びＳＳＲプライマーの両方を考案した。３つの異なる一定のアニーリング温度、５２℃、５８℃、及び６０℃を、標準的なサイクルあたり３段階のプロトコルを用いて試験した。各試験からの結果は他のものと異なる（温度が高いほど、生じる産物はより少ない）けれども、大部分の標的座でのプライマー識別の効率は、これらの一定のアニーリング温度のいずれででも許容できないほど効率が悪いと見いだされたことは明らかである。これらの増幅からのあらゆる「産物」は、小さい集団のバンドにより表され、各集団内のこれらの産物は、２の倍数、すなわち各ジヌクレオチド反復の長さで異なる。しかしながら、タッチダウン温度サイクルプロトコル（Ｄｏｎ等、ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、１９、４００８（１９９１））を用いると、この「スタッター」結果及び潜在的な非特異的産物の形成を最小限にする。タッチダウン増幅において、アニーリング温度は、故意に高く始められ、次に、続くサイクルにおいて、所望する「タッチダウン」アニーリング温度まで段階的に低下される。いくつかのプライマーの組み合わせに対して、５９℃、５８℃、及び５６℃のタッチダウン温度を試験した。大部分のＳＳＲプライマーに対して、５６℃の最終タッチダウン条件が、最も多くの特異的な非スタッターバンドを生じた。従って、本発明の目的のためには、５６℃が最適の最終アニーリング温度であるタッチダウンプロトコルに従って核酸増幅を行う場合、最も好ましい。しかしながら、プライマーの実際の組成により、特定の増幅は、５５℃−６０℃の最終アニーリング温度を含むことができる。検討した温度サイクリングプロトコルにおける他の変化する要素は、増幅反応を開始する方法である。典型的なＰＣＲ増幅プロトコルは、コールドスタートで開始し、すなわち，ＤＮＡ増幅のために必要な全ての試薬が最初の変性工程の前に反応混合物中に存在する。それに反して、ホットスタートプロトコルは、一つの主要な反応成分、典型的には、プライマー、ヌクレオチド、またはポリメラーゼのいずれかを、反応の準備及び最初の変性の間混合物から除くことを要する。次に、この成分を変性後に加え、プライマー伸長を始めることができる。コールドスタートプロトコルは、厳しくない条件下で、必ずしも完全に符合しない鋳型部位及び標的座内の多数のずれた部位の両方にプライマーがアニールする可能性を与える。この方法は、しばしば、ゲル上に増幅産物のスタッター結果をもたらす。それに反して、ホットスタートプロトコルは、最初の変性の前の周囲の温度での正しくない鋳型部位への偽のプライマーアニーリングを防ぎ、ゲル上により明確ではっきり分かれた産物を生じる。そうでなければ同一の増幅反応を、コールドスタート及びホットスタートプロトコルを用いて行うと、ほとんどあらゆる５’固定単純ＳＳＲプライマーに対して、コールドスタートは、ゲル上に許容できないほど不明瞭な産物を生じた。ホットスタートを用いると、よりはっきりした産物を生じた。それに反して、複合ＳＳＲプライマーを用いると、コールド及びホットスタート法の間で、産物の解像度はより一致することが見いだされた。産物の解像度における潜在的な欠点にもかかわらず、コールドスタート増幅は、特に多数のサンプルを処理する時に行うことがより容易で、そして、ゲノム間の多型として識別することのできる増幅産物を生じるのに十分であることが決まって見いだされた。それ故、コールドスタートプロトコルにおいて、産物の解像度におけるわずかな増加は、反応準備のよりより優れた迅速さ及び簡便さの代わりに犠牲にされる。５’固定単純ＳＳＲプライマーを用いる場合、ホットスタートが好ましいが、大部分の複合ＳＳＲプライマーを含んでいる増幅反応に対しては、コールドスタートが適当で十分である。プライマー標識の選択デュープレックスＤＮＡ分子の相補鎖は、通常、変性ポリアクリルアミドゲル上のわずかに異なる位置に独立して分かれる。もし、ＤＮＡデュープレックスの両鎖を放射能標識すると、その場合、オートラジオグラフィーは各増幅産物の各鎖を表している別個のバンドを示す。変性ポリアクリルアミドゲル上の各増幅反応産物に対する単一のバンドのみの解像は、各産物の一つの鎖のみを標識することを必要とする。これを達成するために、増幅反応のために用いるあらゆる与えられた対における２つのプライマーの一つだけを標識しなければならない。³³Ｐの像は、通例、オートラジオグラフィー上でより明瞭であるけれども、³² Ｐまたは³³Ｐのいずれかを放射性標識として用いることができる。代わりには、様々な異なる蛍光をプライマーに取り込むことができ、得られた産物を、次に、蛍光検出系を用いて検出できる。アダプタープライマーの代わりの標識と比べて、ＳＳＲプライマーを放射性標識する影響を調べた。全てのプロトコルの変形において、アダプタープライマーを放射性標識すると著しいバックグラウンドを生じた。通例、ゲル上のレーンは少数のはっきりしたバンドを含んでいたが、あらゆる場合における主要な結果は、レーンの全長に沿って分布した産物のスメアーであった。それに反して、増幅反応においてＳＳＲプライマーのみを標識すると、それらの産物はオートラジオグラフ上でずっと明瞭で、いかなる著しいレーンのバックグラウンドも付随しなかった。この違いは、おそらく、大部分の鋳型フラグメント上の非常に豊富にあるアダプター標的部位（標識プライマーでの直線的増幅さえ、全体で著しいバックグラウンドをもたらす）から生じる。それに反して、標識したＳＳＲプライマーは、鋳型混合物中にはるかに少ない標的部位を有し、そして、大部分は生産的、指数的な増幅の一部となる。従って、ＳＳＲプライマーのみの５’標識が好ましく、放射性または蛍光標識のいずれかでの標識に適用される。ＳＳＲ及びアダプタープライマーの考案における変形ＳＳＲ−アダプター増幅反応、従って得られる産物中の可変性は、上記の反応及び温度サイクルの設定条件からだけでなく、これらの増幅に用いるプライマーの考案における微細なものからも生じる。いったん、特定の複合ＳＳＲをこのアッセイのための標的座配列として選択しても、その場合、まだ、以下のプライマー考案の規準：ａ）アダプタープライマー上の３’伸長ヌクレオチドの数及び塩基組成ｂ）複合ＳＳＲプライマーを含んでなる２つの成分単純反復の相対的な長さｃ）一本鎖プライマーに対応するように選択された二本鎖複合ＳＳＲ座の特定の鎖（すなわち、プライマーの方向性）ｄ）特定のゲノムのための制限酵素及びＳＳＲ標的の選択のいずれでも一つを変えることにより、部分的または全体的のいずれかに異なる増幅産物の組を制御することができる。ａ）アダプタープライマーの長さゲノムＤＮＡの制限末端に連結した合成アダプターの一つの配列に対応するアダプター増幅プライマーは、その３’末端に様々な数の任意の配列のヌクレオチド（０ないし１０）を保有することができる。プライ’ー上のこれらの不定の３ ’ヌクレオチドは、アダプター及び制限部位に直接隣接し、あらゆる特定のゲノム制限フラグメント上で配列が前もって知られていない配列に特異的にアニールする。鋳型混合物中の全ての可能なフラグメントの一組のみに対する各々のそのようなプライマーの認識は、増幅反応において卓越した特異性を与える（Ｚａｂｅａｕ、欧州特許第５３４、８５８号）。数個の最も３’のヌクレオチドにおける違いを除いてさもなければ配列において同一のそのようなプライマーは、完全に重複しない増幅産物の組を増幅し、より対立遺伝子特異的増幅プライマーのように機能する（Ｎｅｗｔｏｎ等、（１９８９）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ１７：２５０３；Ｋｗｏｋ等、（１９９０）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：９９９；Ｗｕ等、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２７５７）。しかしながら、重要な違いは、これらのアダプタープライマーの使用は、増幅されるゲノムの座の前もった配列の知識が必要でなく、各プライマーは、鋳型ＤＮＡ混合物中の多数の標的部位を選択的に共に認識することである。一般的に、不定の３’伸長が長くなるにつれて、プライマーはより選択的または制限的になる。この３’伸長は、潜在的な標的部位の総数のうちの一組のみにプライマーのアニーリングを制限し、従って、共増幅産物の真の数において減少をもたらす、任意の非縮重または部分的に縮重した塩基を含む。３’伸長への各非縮重ヌクレオチドの付加は、仮定的に４倍大きい鋳型識別をもたらす。加えて、最も３’の塩基位置の異なる単一ヌクレオチドは、さもなければ同一のプライマーに独特な鋳型特異性を与える。従って、与えられたＳＳＲプライマーと対をなす時、アダプタープライマー上の３’選択的ヌクレオチドの数及び組成の両方を変えることは、同じ鋳型から個々の部分的または完全のいずれかに重複しない増幅産物の組を生じるのに十分である。特定の増幅のためにどの３’伸長を用いるかの選択は大部分は偶然の問題であるが、それでも大いに、標的ゲノム中の相対的なヌクレオチドの頻度及びもう一つのプライミング部位として働く特定のＳＳＲのゲノムにおける豊富さによる。ｂ）複合ＳＳＲプライマーを含んでなる２つの成分単純反復の相対的な長さゲノム中のあらゆる単純及び複合ＳＳＲ座は、個々の鎖がヌクレオチドの異なる配列を保有する二本鎖構造である。複合反復のコアのジヌクレオチドがパリンドローム（例えば、（ＣＡ）_x（ＴＧ）_yまたは（ＡＧ）_x（ＣＴ）_y）でないなら、特定のＳＳＲ座で一つの鎖に特異的にアニールすることのできる一本鎖プライマーは、反対側の鎖にアニールしない。同周期複合ＳＳＲどれもパリンドロームではなく、９０の可能なジヌクレオチド配列の８つだけがそのようなパリンドロームを示す。それ故、全ての同周期及び大部分の異周期ＳＳＲプライマーは、極性のある一方向に各ゲノムの標的座からプライマーを伸長し、いかなる複合ＳＳＲ座も４つのプライマーの種類のいずれかにより認識され増幅されることができる。例えば、複合同周期ＳＳＲ座、は、４つの異なる基本的なプライマーの種類、５’-（ＡＣ）_x（ＡＴ）_y-３’、５’-（ＣＡ）_x（ＴＡ）_y-３’、５’-（ＡＴ）_x（ＧＴ）_y-３’、及び５’-（ＴＡ）_x（ＴＧ）_y-３’、により認識することができ、各々の最も５’の反復は、プライマーを鋳型に固定するために主に働き、最も３’の反復は、プライマー伸長機能を果たす（図１ｃ参照）。これらの４つの基本的なプライマーの種類の各々は、プライマー内の２つの成分反復の長さにより全て異なる、広範囲の個々のプライマーを含むことができる。これらの成分反復の長さにおける変化は、プライマーの有効性及び再現できる増幅の正確さに大きな影響を有する。一般的に、３’プライミング反復（ｙの値）対する５’固定反復（すなわち、上のｘの値）が長くなるにつれて、増幅におけるプライマーの特異性及びプライミング効率はよりよくなる。加えて、短い３ ’反復を有するプライマーだけが、非常に短い下流の反復を含んでいる複合ＳＳＲ座からの増幅を与える。ｃ）一本鎖複合ＳＳＲプライマーの極性二本鎖複合ＳＳＲ座のどちらの鎖をプライマーとして用いるかの選択は、ＳＳＲ−アダプター増幅反応の成功を決定するために極めて重要である。標準的な条件の下で効率よく生じる増幅産物をもたらす（ＡＴ）を含んでいるプライマーの唯一の型は、（ＡＴ）_n配列が非常に短く（１．５−３反復単位）、そして、それが３’プライマー伸長末端として位置するものであることに気をつけなければならない。５’末端でのいかなる長さの（ＡＴ）_n反復も、アンカーとして全く非効率的で、複雑なゲノム鋳型混合物からほとんどまたは全く増幅をもたらさない。ｄ）制限部位の頻度、ヌクレオチドの偏り、ＳＳＲの頻度、及びプライマー考案の考慮すべき要件ＤｙｎａｌＩｎｃ．、（ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）により提供されるような常時性のビーズのようなストレプトアビジンまたはアビジンを被覆した支持体を用いて、各消化／連結混合物からビオチン化したアダプターを保有している連結産物を選択することができる。この選択されたＤＮＡは、次の増幅のためにビーズからさらに精製する必要はない。２つの制限酵素を用い、ヘキサヌクレオチド部位を有する制限酵素に対応するアダプターのみをビオチン化した一つの態様において、選択されたＤＮＡは、一つもしくはもう一つの制限部位だけが位置する、または異なる部位が各末端に位置するフラグメントの混合物である。例えば、ＴａｑＩ及びＰｓｔＩを用いる場合、ＰｓｔＩアダプターのみをビオチン化する。ビオチン選択の後、ＴａｑＩ−ＰｓｔＩ及びＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントは、それぞれ、３０：１のおおよその割合で、濃縮さらたフラグメント混合物中に存在すると予測される。全てのＴａｑＩ− ＴａｑＩフラグメントは効率よく除かれる。そのような計算のための方法は、当該技術分野において熟練した者にとって明らかであり、例えば、各ヌクレオチドの頻度が特定のゲノムに対して既知であるなら、予測できる割合で消化混合物中に対称及び非対称の制限フラグメントが存在する。一般的に、以下の仮定に由来する計算をすることをできる。第一に、各制限酵素の認識部位は、その部位におけるヌクレオチドの数及びゲノムのヌクレオチド組成の関数である異なる絶対頻度でゲノム中に存在する。第二に、相対頻度の合計（ｐ＋ｑ）はいつも１に等しいので、これらの絶対頻度は、相対頻度、ｐ及びｑに変換することができる。（ゲノム中の等しいヌクレオチド頻度及び無作為なヌクレオチド分布を考慮すると）、例えば、最後に、これらの部位により境界づけられる制限フラグメントの相対頻度は、単に、各フラグメント型に対する相対部位頻度の積である。従って、フラグメント相対頻度ＴａｑＩ−ＴａｑＩｐ²＝０．８８６２ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩｑ²＝０．００３５ＴａｑＩ−ＰｓｔＩ及びＰｓｔＩ−ＴａｑＩ２ｐｑ＝０．１１０９それ故、この態様において、４及び６塩基対認識部位を有する制限酵素を用い、ヌクレオチドの偏りがないと仮定すると、ビオチン選択したＤＮＡフラグメントは、ゲノムの１１．１％のみを表す。異なる部位頻度を有する異なる制限酵素は、選択されたフラグメントの混合物において表されるゲノムのより大きいまたはより小さい割合をもたらす。いくつかの制限酵素の組み合わせを用いることは、ただ単一の酵素の組み合わせよりもゲノムのよりよい適用範囲を保証する。選択したＤＮＡフラグメントを、アダプターの一つに対応するプライマー（ビオチン選択しなかったもの）及び特定の５’固定単純または複合ＳＳＲ配列に対するプライマーの各々一つを用いたポリメラーゼチェインリアクション増幅のためのプールした鋳型混合物として用いることができる。当該技術分野におい熟練した者は、アダプタープライマー及び反対向きのＳＳＲプライマーの間に指数的な増幅が起こる時のみ、いかなる単一のゲノム鋳型フラグメントからも検出できる産物が生じることを認識する（図１ａ参照）。ＳＳＲ及びアダプター配列は単一コピー部位ではないので、多数の増幅産物が各鋳型ＤＮＡ混合物から期待される。各増幅反応の複合的な割合（共増幅された産物の数）は、特定のＳＳＲ配列の絶対的なゲノムコピー数により影響され、単純ＳＳＲプライマーの５ ’アンカーの縮重のレベルまたはアダプタープライマーの３’末端の非縮重選択的ヌクレオチドの数及び質のいずれかを変えることにより、与えられたＳＳＲに対して実験的に調整することができる。例えば、ゲノム中の全ての４つのヌクレオチドに対して等しい頻度を仮定すると、アダプタープライマーの３’末端に各連続する非縮重ヌクレオチドを付加することは、与えられた鋳型混合物から共増幅される産物の数において４倍の減少をもたらす（図１ｂ参照）。それ故、３’ 末端に０個の選択的ヌクレオチドを保有するアダプタープライマー（例えば、Ｔａｑ．ＡｄＦ；表Ｉ参照）は、単一の非縮重３’ヌクレオチドを有するプライマー（例えば、Ｔａｑ．ｐｒ６、その３’伸長は−Ａである）より、４倍多くの鋳型を共増幅する。同様に、このプライマーは、２個の選択的ヌクレオチドを保有しているプライマーより４倍多くの鋳型を共増幅するなどである。一般的に、アダプタープライマーの選択性の程度は、式、１／４²ⁿ、式中、ｎ＝選択的塩基の数を用いて概算できる。簡便であるけれども、この単純化した計算は、ゲノムまたはゲノムフラグメントを生じるために用いた制限酵素の認識部位のいずれもの塩基組成を考慮していないことに注意しなければならない。１．ビーズで選択したまたは前増幅した混合物中の大部分のＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲに用いるアダプタープライマーに対応するアダプターにより一方の末端が境界づけられているはずであるけれども、これらのフラグメントの一組だけが、特定のＳＳＲプライマーに相補的な内部の単純配列反復領域を保有することが期待される。従って、増幅産物は、プライマー特異的なアダプターにより隣接されているだけでなく、ＳＳＲプライマーに符合している内部反復配列も含む標的分子の組からのみ生じ、検出される。異なる反復に対する絶対頻度は種内で大きく変わることができ、大部分の植物ゲノムに対しては正確には知られていないことに気をつけなければならない。予備的な研究は、ダイズにおいて、（ＡＴ）_nは、（ＣＴ）_nより少なくとも２倍豊富であり、（ＣＴ）_nは、代わって（ＣＡ）_nより幾分より頻度が高いようであることを示す（Ｍｏｒｇａｎｔｅ＆Ｏｌｉｖｉｅｒｉ、ＰｌａｎｔＪ３．１７５（１９９２）；Ａｋｋａｙａ等、（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３２：１１３１）。一般的に、２０塩基より長い一つのＳＳＲは、哺乳類における６ｋｂの数値に比べて、植物ゲノムにおいては２３−２９ｋｂごとに一つ存在することが概算される（Ｗａｎｇ等、Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ：８８、１（１９９４）；Ｍｏｒｇａｎｔｅ＆Ｏｌｉｖｉｅｒｉ、ＰｌａｎｔＪ（１９９３）；Ｂｅｃｋｍａｎｎ＆ＷｅｂｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ１２、６２７（１９９２））。しかしながら、複合ＳＳＲ配列の頻度は、文献において記録されていない。単純ＳＳＲプライマー上の完全に縮重した５’アンカーは、特定のＳＳＲ配列を保有するゲノム中のあらゆる座から伸長を開始するはずである。アンカーに導入された非縮重のいかなる程度も、ゲノムの標的部位の可能な数、それ故、増幅されるフラグメントの数を減少する。ヌクレオチドの偏りのないゲノムにおいて、共増幅される産物の複雑さは、非縮重ヌクレオチドを付与されるあらゆるアンカー位置に対して４倍減少される。（各標的ＳＳＲ座が、プライマーによる完全なハイブリダイゼーションをさせる十分な長さを有するなら）、各自己固定複合ＳＳＲプライマーは、ビオチン選択したフラグメント混合物中のあらゆる符合する複合ＳＳＲ座にアニールし、そこから伸長を開始することが期待される。表現型が同類の個体間の多型の検出異なる鋳型（すなわち、異なるゲノム）間の共増幅されたフラグメントの個々のゲルバンディングパターンの違いは、出所ゲノム間の多型を示す。複合ＳＳＲプライマーのいずれででも生じた増幅産物は、多型及び非多型のフラグメントの混合物である。検出される多型の大部分が優性である従来のＡＦＬＰ反応（欧州特許第０５３４８５８号）に比べて、出願人等の複合ＳＳＲ−アダプター複合増幅法は、共優性の多型のより多い割合を生じる。この方法により生じる増幅産物の多くは、近縁の株間で非多型であるけれども、多型産物の割合は、より遠縁の系統間で増加する。一般的に、ＳＳＲ−アダプター複合増幅を用いて種内並びに種間からの個体の間でゲノムの多型を検出でき、比較されるゲノム間の進化的距離が大きいほど、より多くの多型が期待される。優性及び共優性の多型の両方を検出できる。いずれの場合においても、この方法によって明らかにされる多型は、可能な原因、１）与えられたゲノム領域を境界づける片方または両方の制限部位が、一つのゲノムにおいて欠けている（ＲＦＬＰに類似しているが、本明細書では異なる方法により検出される）。これは、ゲノム間の優性または共優性の違いのいずれかとして見ることができる。２）共通の制限部位により境界づけられるゲノムフラグメント内に、挿入または欠失の違いがゲノム間に存在する（いずれかの対立因子フラグメントに対して、増幅の距離があまり大きすぎないなら、これは共優性の多型として見ることができるはずである）。３）ゲノム間の単純配列反復における長さの違いが、通例、反復単位の倍数で長さが異なる共優性の多型増幅産物をもたらすことができる。４）対立因子特異的増幅に類似したように、アダプタープライマーの３’選択的部分が異なる鋳型間を区別できるように、制限部位に直接隣接する領域にゲノム間で単一の塩基の違いが存在する。の一つまたはこれらの組み合わせのいずれからでも生じることができる。多型の全てのこれらの原因のために、この型の複合増幅アッセイの座当たりの基準の情報量は、非常に高い。情報を提供する（すなわち、多型を検出することのできる）一つの座のヌクレオチド位置の最小数に関して、簡単な概算をすることができる。４及び６塩基制限酵素で消化した鋳型に対して、４（４塩基制限部位内）＋６（６塩基制限部位内）＋０ないし１０（アダプター特異的制限部位に直接隣接する配列）＋０ないし３０（ゲノム間の長さの変異をアッセイすることのできるＳＳＲ内のヌクレオチドの数）＝増幅した座あたり１０ないし５０ヌクレオチドが、個々のゲノム間で多型を生じるために有益であることができる。この計算の最初の３つの因子は、ゲノム間の単一のヌクレオチドの変異（例えば、置換）から生じ、一方、計算の４番目の因子は、反復長の変異から生じる。全ゲノム中に分布した小さい挿入及び欠失は、これ並びに他のゲノムアッセイにおける長さの変異の検出に寄与することができるけれども、各ＳＳＲ標的座での反復長の変異が非常に増加して見込まれることは、産物中に検出できる長さの多型の「バックグラウンド以上」のレベルをもたらす。それに比べて、ＲＦＬＰの情報量は８−１２であり、ＲＡＰＤは１６−１８であり、標準的なＡＦＬＰアッセイは、通例１０−１５ヌクレオチドである。さらに、従来のＡＦＬＰ及びＲＡＰＤ技術に比べて、このＳＳＲ−アダプター増幅法によりアッセイすることのできる多型のより大きな割合は、ゲノム間の共優性の違いとして検出できる。このＳＳＲ−アダプター、またはＳＡＭＰＬ増幅法を用いて検出されるＳＳＲを基にした多型は、より一般的で簡便な単一座ＳＳＲマーカーに転換することができる。例えば、ゲノム間の何百または何千の可能な多型を迅速に選別するために多数の方法を用いる場合、及び、次に、より大きくより多い処理量規模またはこれらの特定の座で多型をより迅速にアイソトープを用いずに調べるためのいずれかでこれらの多型の選択した組を続いてアッセイすることが望ましい場合、この転換を行うことができる。この転換工程は、所望するバンドをＳＡＭＰＬゲルから切り出し、次にシークエンスすることを必要とする。ＳＳＲに隣接している独特な配列に由来するヌクレオチド配列から、ＳＳＲに隣接し、ＳＳＲに向かって反対向きである、「座特異的」プライマーを考案することができる。この独特なプライマーを、次に、一般的なアダプタープライマーと対にして、元のフラグメント混合物から増幅するために用いることができる。得られるアダプターから独特なプライマーまでのＰＣＲ産物を、次に、ＳＳＲのもう一方の独特な隣接している配列を見つけるためにシークエンスすることができ、二番目の座特異的プライマーを考案することができる。最後に、２つの反対向きの座特異的隣接プライマーを、標的ゲノム中の所望するＳＳＲ座にまたがる領域を増幅するための対として用いることができる。実施例材料及び方法以下の実施例において用いた制限酵素、リガーゼ、及びポリメラーゼは、ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）またはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から入手した。ダイズ栽培変種、Ｂｏｎｕｓ及びｓｏｊａＰＩ８１７６２の出所は、ＴｈｅｏｄｏｒｅＨｙｍｏｗｉｔｚ、イリノイ大学である。Ｇ．ｍａｘ栽培変種、ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ、ＮＯＩＲ−１、Ｎ８５−２１７６、Ｈａｒｒｏｗ、ＣＮＳ、Ｍａｎｃｈｕ、Ｍａｎｄａｒｉｎ、Ｍｕｋｄｅｎ、Ｒｉｃｈｌａｎｄ、Ｒｏａｎｏｋｅ、Ｔｏｋｙｏ、及びＰＩ５４−６０、並びにＧ．ｓｏｊａ継承（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）ＰＩ４４０−９１３を含んでいる全ての他のダイズ系統は、ＵＳＤＡＳｏｙｂｅａｎＧｅｒｍｐｌａｓｍＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、イリノイ大学（農学部、ＴｕｒｎｅｒＨａｌｌ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ）から入手した。Ｚ．ｍａｙｓの同系交配栽培変種、Ｂ７３及びＭｏ１７、並びに選良系統、ＬＨ８２、ＬＨ１１９、及びＬＨ２０４の出所は、Ｈｏｌｄｅｎ’ｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｅｅｄｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒｇ、ＩＡであった。Ｚ．ｍａｙｓの同系交配栽培変種、ＣＭ３７の出所は、ＢｅｎｊａｍｉｎＢｕｒｒ、ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕｐｔｏｎ、ＮＹであった。ＡＥＣ２７２及びＡＳＫＣ２８Ｚ．ｍａｙｓ系統は、ＤｅｎｔｏｎＡｌｅｘａｎｄｅｒ博士、イリノイ大学から入手した。５つの異なるヒト由来、並びにサケ及びマウスＢＡＢＬ／ｃからのゲノムＤＮＡは、市販されているもの（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯまたはＣｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。制限消化、連結、プライマーの５’末端リン酸化標識、及びＰＣＲ増幅に用いた試薬、バッファー、及びプロトコルを以下表IIIに示す。ゲノム鋳型ＤＮＡ混合物の調製ＣＴＡＢ／クロロホルム抽出及びＣｓＣｌ／遠心法（Ｍｕｒｒｙ等、ＮｕｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、８、４３２１、１９８０）を用いてダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）栽培変種から、そして、尿素抽出ミニプレップ法（Ｃｈｅｎ等、ＴｈｅＭａｉｚｅＨａｎｄｂｏｏｋ中、Ｍ．Ｆｒｅｅｌｉｎｇ及びＶ．Ｗａｌｂｏｔ、ｅｄｓ．、（１９９３）５２６−５２７頁ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いてトウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）から、ゲノムＤＮＡを単離した。Ｚａｂｅａｕにより記述されたもの（欧州特許第５３４，８５８号）に類似したように、完全制限酵素消化、及びそれに続くまたはそれと一緒に行う部位特異的二本鎖アダプターの連結により、精製したゲノムＤＮＡを増幅反応のために調製した。以下の実施例に用いる制限酵素の組み合わせは、ＴａｑＩ＋ＰｓｔＩまたはＴａｑＩ＋ＨｉｎｄIII（それぞれ、テトラ及びヘキサヌクレオチド認識部位を有する酵素の組み合わせ）のいずれかであった。１及び２．５μｇの間の高分子量ゲノムＤＮＡを、１０ｍＭトリス酢酸塩、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢酸カリウム、５ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．５を含んでいるバッファー中で、５０μｌ容量中５ｕｎｉｔｓ／μｇのＴａｑＩで６５℃で約３時間消化し、次に、同じバッファー中で、５ｕｎｉｔｓ／μｇのＰｓｔＩまたはＨｉｎｄIIIで３７℃で３時間さらに消化した（表III）。各投入ゲノムＤＮＡから生じた消化産物は、両末端をＴａｑＩまたはＰｓｔＩ（もしくはＨｉｎｄIII）部位のいずれかで境界づけられた対称フラグメント、及びＴａｑＩ及びヘキサヌクレオチド部位の両方で境界づけられた非対称フラグメントの混合物であった。同モル量の各対の２つの部分的に相補的な一本鎖成分オリゴヌクレオチドをゆっくりとアニーリングすることにより、二本鎖アダプターを作成した（表III参照）。Ｔａｑ．ＡｄＦ及びＴａｑ．ＡｄＲ一本鎖オリゴヌクレオチドの各々５０００ｐｍｏｌを水と最終容量１００μＬに合わせることにより、５０ｐｍｏｌｅ／μＬの二本鎖ＴａｑＩアダプター（Ｔａｑ−Ａｄ）を作った。５ｐｍｏｌｅ／ μｌのＰｓｔＩ及びＨｉｎｄIIIアダプター（ビオチン−ＰｓｔＩ−Ａｄまたはビオチン−Ｈｉｎｄ−Ａｄ）に対しては、１００μｌの最終容量中で各々の対応する一本鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれ５００ｐｍｏｌｅを合わせた。二本鎖分子を作成するために、全ての混合物を順次低下している温度、すなわち、６５ ℃で１５分間、３７℃で１５分間、室温で１５分間、次に最後に４℃でインキュベートした。この項は、ＳＳＲ−アダプター増幅の前のゲノムフラグメント混合物を濃縮するためにビオチン−ストレプトアビジン選択を用いる方法を記述する。１ｕｎｉｔＴ４ＤＮＡリガーゼ、０．２ｍＭＡＴＰ、及び各々長さに沿って異なる合成ＤＮＡ配列を保有し、一方の末端でゲノムフラグメント上の一本鎖テトラヌクレオチドまたはヘキサヌクレオチド突出にそれぞれ相補的な二つの二本鎖アダプター、Ｔａｑ−Ａｄ（５０ｐｍｏｌｅ）及びビオチン−ＰｓｔＩ−Ａｄまたはビオチン−ＨｉｎｄIII−Ａｄ（５ｐｍｏｌｅ）を含んでいる１０μＬの混合物を、各完全二重消化物に加えた（表III）。これらのアダプター連結反応物を、３７℃で３時間インキュベートした。各アダプターは、各連結により生じる再構築された部位を再消化できないように、それが保有する制限部位の半分内に単一塩基の変異を含んだ。それ故、用いる全ての酵素の活性が共通の最適反応温度を共有するなら、制限酵素消化及び連結を同時に行うことができる。少なくとも一方の末端にビオチン化ＰｓｔＩアダプターを全て保有している連結産物の組を、ストレプトアビジンを被覆した常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、ＬａｋｅＳｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）を用いて各消化／連結混合物から選択した。各選択に対して、２００μＬＳＴＥＸ（１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．０）中で一回洗浄し、次に１５０μＬＳＴＥＸ中に懸濁した１０μＬのビーズを各連結反応に加え、この混合物を穏やかに揺り動かしている台の上で室温で一時間インキュベートした。次に、ＤＮＡが吸着したビーズを、磁気ラック支持体を用いて各混合物から選択し、すなわち、上清を吸引して除き、ビーズを２００μ ＬＳＴＥＸ中に再懸濁した。４追加サイクルのビーズの選択、洗浄、及び吸引を行った。最終的な懸濁物を新しい管に移し、この最終サイクルにおいて選択されたＤＮＡが吸着したビーズを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（１μｇの投入ＤＮＡに対しては１００μＬ、または２−２．５μｇの投入ＤＮＡに対しては２００μＬ）中に再懸濁した。ビーズからさらに精製する必要のない、この選択したＤＮＡは、それぞれ、約３０：１の割合で存在する、ＴａｑＩ−ＰｓｔＩ（または、ＴａｑＩ−ＨｉｎｄIII）及びＰｓｔＩ −ＰｓｔＩ（または、ＨｉｎｄIII−ＨｉｎｄIII）フラグメントの混合物であった。選択したＤＮＡを、ＴａｑＩアダプタープライマー及び単純配列反復（ＳＳＲ）プライマーの各々一つを用いるポリメラーゼチェインリアクション増幅のためのプールした鋳型として用いた。最終的なＰＣＲ増幅の前に制限フラグメント混合物を濃縮するための代わりの方法としては、両方の制限部位特異的なアダプターをビオチン修飾するかまたは修飾しないかのいずれかであることができる。制限フラグメントへのアダプターの連結後、全混合物を、各々、一対の個々のアダプタープライマーを用いる１６までの個々の増幅反応に供する。各対の一つのプライマーはアダプター配列の一つに対応し、もう一つのプライマーはもう一つのアダプター配列に対応する。各場合において、増幅プライマーは、その最も３’末端に単一の無作為に選択したヌクレオチドを保有する。各プライマー対は、元のゲノムフラグメント混合物の約１／１６組を特異的に増幅する。共通の制限フラグメント集団に由来する前増幅産物の混合物のいずれかまたは全ては、次に、ＳＳＲプライマー及び２つの隣接するアダプターのいずれかを表すプライマーの間での次の増幅のための濃縮された鋳型として働くことができる。この場合、このアダプタープライマーは、典型的に、前増幅アダプタープライマー上に用いた一つのヌクレオチドに完全に符合している制限部位に最も近いヌクレオチドと共に、２、３、またはそれより多い任意の３’ヌクレオチドを保有する。実施例１ダイズ栽培変種間の多型を検出するための複合ＳＳＲ−アダプター増幅における５’固定単純ＳＳＲプライマーを用いた増幅実施例１は、アダプター標識した制限フラグメントの増幅及びそれに続くダイズ栽培変種間の遺伝的多型の検出のための、縮重ヌクレオチドが５’末端に位置する単純ＳＳＲ配列に対応するプライマーの使用について記述する。これらの増幅に用いるアダプタープライマーを表Ｉに示す。本明細書において５’固定単純ＳＳＲプライマーと呼ばれるＳＳＲプライマーを表IVに挙げる。Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ株、ＮＯＩＲ−１、Ｎ８５−２１７６及びｗｏｌｖｅｒｉｎｅ、並びにＧｌｙｃｉｎｅｓｏｊａ栽培変種ＰＩ８１７６２からのアダプター修飾し、ビオチン選択したゲノムＤＮＡを、材料及び方法において記述したように調製した。３０μＬ反応において５０マイクロキュリーの［γ−³³Ｐ］ＡＴＰ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を１５０ｎｇのプライマー及び５ｕｎｉｔｓのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを合わせることにより、ＳＳＲプライマーを³³Ｐで５’末端標識した（表III）。３７℃で１時間のインキュベーション後、（５ｎｇのプライマーを含んでいる）この標識したプライマー混合物の１μＬ量を各増幅反応において直接使用した。全ての増幅反応をコールドスタート開始により同時に行い、一連の反応混合物を用いて室温で一緒に準備した。全ての反応に共通な４つの成分を含んでいるマスター混合物は、（反応当たり）２．０μＬの１０ｘＰＥＣバッファー、０．８μＬの４つ全てのｄＮＴＰｓ（各５ｍＭ）、１３．０μＬのＨ₂Ｏ、及び０．１μＬ（０．５ｕｎｉｔｓ）のＡｍｐｌｉｔａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＲｏｃｈｅ）からなった（表III並びに材料及び方法参照）。次に、個々の完全なプライマー混合物を作るために、このマスター混合物の一部を適当なプライマーに加え、すなわち、各最終増幅反応に対して、１５．９ μＬのマスター混合物を０．６μＬの非標識ＴａｑＩアダプタープライマー（ストックは、５０ｎｇ／μＬ）、０．５μＬの非標識ＳＳＲプライマー、及び１．０μＬ（５ｎｇ／μＬで）の³³Ｐ標識したＳＳＲプライマーと合わせた。適当なビオチン−ストレプトアビジン選択した鋳型ＤＮＡ（各２μＬ）を０．２ｍＬの微量増幅管（ＲｏｂｂｉｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）に分配し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ９６００マルチウェルプレートの個々のウェルに配置した。次に、１８μＬの適当な完全プライマー混合物を加え、全ての反応物を２０μＬの最終容量にした。この反応成分の最終配合を迅速に終え、一定の５８℃のアニーリングまたは５８℃のタッチダウン温度サイクリングプロトコル、タッチダウンアニーリング変性：９４℃、３分１サイクル：９４℃、３０秒６５℃、３０秒７２℃、１分１１サイクル：９４℃、３０秒最初のサイクルは、６４．４℃、３０秒、次に、サイクル当たり０．６℃ずつ次の１０サイクルの間最終の５８．４℃まで下げる７２℃、１分２３サイクル：９４℃、３０秒５８℃、３０秒７２℃、１分定温アニーリング変性：９４℃、３分３５サイクル：９４℃、３０秒５８℃、３０秒７２℃、１分のいずれかを用いて、できるだけ遅延することなく増幅反応をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６００温度サイクラーで開始した。終了した増幅反応物を、等量のホルムアミドストップ溶液（９８％脱イオン化したホルムアミド、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール）で希釈し、９４℃まで３分間加熱し、次に、氷上ですばやく冷却した。最初に５５Ｗで３０分間、同じトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中で前泳動した４．５％または６％の変性３０ｘ４０ｘ０．４ｃｍポリアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素、４．５％アクリルアミド：Ｎ−，Ｎ’− メチレンビスアクリルアミド［１９：１］、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、８０ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）上に、各２．５μＬをすぐに添加した。この添加したサンプルを、（〜１４００−１５００Ｖ、３５−４０ｍＡに対応する）５５Ｗで２時間電気泳動し、次に、ゲルをクロマトグラフィー紙に移し、８０℃で２時間真空乾燥し、−７０℃で２ないし７日間、増感紙と共にＨｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはＢｉｏｍａｘ（Ｋｏｄａｋ）Ｘ線フィルムに感光させた。図２は、５’固定単純ＳＳＲプライマー、ＤＢＤ（ＡＣ）_7.5、（ＨＢＨ）ＡＧ_8.5、及びＨＶＨ（ＴＧ）_7.5を用いた増幅産物の比較を示す。全ての場合において、ＳＳＲプライマーを³³Ｐ標識し、それぞれ０及び１個の３’選択的ヌクレオチドを保有する２つの異なるＴａｑＩアダプタープライマー、Ｔａｑ．ＡｄＦ及びＴａｑ．ｐｒ６（表Ｉ参照）の各々と組み合わせて用いた。パネルａは、定温温度サイクリングを用いて生じた増幅産物を示し、パネルｂは、タッチダウンプロトコルからの産物を示す。全てを表IVに挙げる、いくつかの異なる５’固定単純ＳＳＲプライマーを試験した。一般的に、全てのそのような単純ＳＳＲ−アダプター増幅は、適当な数の共増幅産物を生じるためにアダプタープライマーの３’末端に０−２ヌクレオチドの伸長を必要とすることが見いだされた。アニーリング温度にかかわらず、定温アニーリングプロトコルは、試験したほとんど全てのプライマーの組み合わせに対して非常にスメアーし不明瞭なバンドをゲル上に生じた。５６℃から５８−５９℃にアニーリング温度を上げると、いくぶん少ないスメアーを生じ（図２ａ）、すなわち、個々の座の産物は、通例、識別できる。しかしながら、これらの産物は、はっきりと大きさが分かれておらず、その代わりに、ゲル上に高度の「スタッター」を示した。試験した最も高い定温アニーリング温度、６０℃は、いくつかのプライマーの組み合わせに対して比較的少数のバンドを生じ、他のものに対してはバンドを生じなかった（データは示さない）。これらの結果は、アニーリング温度が温度サイクリングを通して一定に保持される時、大部分の標的座でのプライマー識別の効率が比較的効率が悪いことを示す。プライマーはアニールするが標的座内での多数の位置でか（スタッター結果を生じている）、または産物を生じるように安定にアニールしないかのいずれかである。あらゆるプライマー対に対する最適の一定アニーリング温度は、結局、実験的に決定しなければなれないけれども、この温度サイクリング法を用いると、それども不均一の大きさの増幅産物が生じると思われる。それに反して、タッチダウン条件（Ｄｏｎ．等、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．、１９、４００８、（１９９１））を用いた温度サイクリングは、非常に効率のよい標的座識別をもたらし、増幅におけるプライマーのいずれかによる偽のプライミングを最小限にするまたは排除するために考案される。タッチダウン増幅において、アニーリング温度は、故意に高く始められ、次に、連続するサイクルにおいて段階的に所望する「タッチダウン」アニーリング温度まで下げられる。５９℃及び５６℃の両方のタッチダウン温度を試験した。大部分のＳＳＲプライマーに対して、この範囲の最終タッチダウン温度は、ゲル上に多数の比較的明瞭なバンドを生じるのに最適であり（５８℃のタッチダウン反応から生じる産物の例に関しては図２ｂを参照、他のデータは示さない）、これらのバンドは、実験から実験で再現性があった。異なる鋳型（すなわち、異なるゲノム）間で共増幅されたフラグメントにおける個々のバンディングパターンの違いは、出所ゲノム間の多型を示す。この方法により生じた増幅産物の大部分は、２つの近縁のＧ．ｍａｘ株、ＮＯＩＲ−１及びＮ８５−２１７６間で非多型であるようであるが、しかしながら、より遠縁のＧ．ｍａｘ、ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ及びＧ．ｓｏｊａＰＩ８１７６２栽培変種間ではより多数の多型産物が見られる。加えて、いくつかの多型は、優性であるようであり（一つのゲノムから増幅されたバンドで、しかし、他のゲノムからは明らかな対応するバンドがない）、少数は、潜在的に共優性である（各ゲノムから増幅された類似しているが同一の大きさではないバンド）。この分析は、このアッセイを調整し特別に作ることができる２つの重要な特徴を示す。第一に、共通のゲノム鋳型組に対して用いる時、２つの異なる５’固定単純ＳＳＲプライマー、ＨＢＨ（ＡＧ）_8.5及びＤＢＤ（ＡＣ）_7.5は、完全に異なる増幅パターンを生じた。これらのパターンが明らかに異なる増幅産物組を示すことは、ゲノムからの異なる制限フラグメント組が異なるＳＳＲ標的部位を保有しているようであるという考え（図１参照）と一致する。ゲル上の各バンドは、ＴａｑＩ部位に対して反対向きの特定のＳＳＲ配列間の生産的な増幅の結果である。ダイズゲノムにおける全ての型のＳＳＲ配列間の比較的大きい間隔の概算（Ｗａｎｇ等、Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ、８８、１（１９９４）；Ｍｏｒｇａｎｔｅ＆Ｏｌｉｖｉｅｒｉ、ＰｌａｎｔＪ．３、１７５（１９９３））を考慮すると、この実施例においてＨＢＨ（ＡＧ）_8.5及びＤＢＤ（ＡＣ）_7.5プライマーから生じたＳＳＲ−ＴａｑＩ部位産物が、共通にあらゆるゲノム座にまたがるとは思われない。この実施例において示される第二の特徴は、いかなる選択されたＳＳＲプライマーに対しても、アダプタープライマー上の３’選択的ヌクレオチドの数が少ないほど、共増幅バンドの数が多くなるということである。一般的に、アダプタープライマーのｎ＝０のものを用いて生じる産物の混合物は、ｎ＝１プライマーに対するものよりより複雑であり、そして、この産物の混合物は、ｎ＝２プライマーに対するものよりより複雑であるなどということが期待される。この実施例において、ＴａｑＩアダプタープライマー、０個の３’選択的ヌクレオチドを保有しているＴａｑ．ＡｄＦは、１個の選択的ヌクレオチドを保有しているプライマー（Ｔａｑ．ｐｒ６［ｎ＝１＝Ａ］またはＴａｑ．ｐｒ８［ｎ＝１＝ｃ］に比べて、与えられたＳＳＲプライマーと対にした時、首尾一貫して、より多数の標識された反応産物を生じた。理論的には、ｎ＝０からｎ＝１への３’伸長の長さにおける増加は増幅フラグメントの数を４倍減少するはずであるけれども、実際には、主として高度な全体のスメアー及び５’固定単純ＳＳＲプライマー由来の産物の低い解像度のために、真の違いを定量することは困難である。しかしながら、明らかに、最も高いレベルのバックグラウンドと共に最も多数のバンドをＴａｑ．ＡｄＦで増幅した反応を表しているレーンにおいて見ることができる。第三に、一定のアニーリング温度の使用に比べて、タッチダウン条件を用いる温度サイクリング条件は、通例、レーン内のスメアーを減少するのに役立ち、通例、より明瞭な産物のバンドを生み出す。しかしながら、これらのより明瞭なバンドにはまだ、レーン（ゲノム）間の多型の正確な比較を妨げる高度なスタッターが伴う。一般的に、ゲノムの多型は、種内並びに種間からの個体間で検出することができ、すなわち、比較するゲノム間の進化的距離が大きいほど、より多くの多型が期待される。優性及び共優性の多型の両方が現れる。しかしながら、特別な反応温度サイクリング条件が何であろうとも、ＳＳＲ−アダプター増幅における５’ 固定単純ＳＳＲプライマーの使用は、新しい多型を同定するために理想的ではない。タッチダウン温度サイクリングまたはホットスタート開始（示さない）におけるように、アニーリング条件を注意深く最適化する時でさえ、個々の共増幅産物はゲル上にかなりスメアーして不明瞭に分かれる。オートラジオグラフィー像上で明らかな高度なスタッターは、従来のＡＦＬＰ（Ｚａｂｅａｕ欧州特許第５３４，８５８号）を用いて得ることのできるバンドの明瞭さを相殺し、全てではないが大部分の顕著な多型の正確な同定を妨げる。実施例２ダイズ栽培変種間の多型を検出するための複合ＳＳＲ−アダプター増幅における完全複合ＳＳＲプライマーを用いた増幅実施例２は、多数の増幅産物間の多型の解像度を改善し、多型のレベルを上げる手段としての、実施例１において論じたものと類似するＳＳＲ−アダプター増幅法における完全複合ＳＳＲプライマーの使用を示す。これらの増幅のために用いた個々の複合ＳＳＲプライマーの全てを表Ｖに挙げる。これらの複合ＳＳＲ配列の大部分は、複合ＳＳＲを含んでなる２ヌクレオチド反復の一つを含むことがハイブリダイゼーションにより示された、シークエンスされたダイズゲノムクローン（Ｍ．Ｍｏｒｇａｎｔｅ及びＣ．Ａｎｄｒｅ、未発表）上、または公のＤＮＡ配列データベース（例えば、ジーンバンク；表II参照）に登録された、クローン化した植物及び動物の配列上のいずれかに存在する。Ｇ．ｍａｘ栽培変種、ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ、ＮＯＩＲ−１、Ｎ８５−２１７６、Ｈａｒｒｏｗ、ＣＮＳ、Ｍａｎｃｈｕ、Ｍａｎｄａｒｉｎ、Ｍｕｋｄｅｎ、Ｒｉｃｈｌａｎｄ、Ｒｏａｎｏｋｅ、Ｔｏｋｙｏ、ＰＩ５４−６０、及びＢｏｎｕｓ、並びにＧ．ｓｏｊａ継承（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ）ＰＩ８１７６２及びＰＩ４４０．９１３から、本質的に実施例１において記述したようにＤＮＡ鋳型を作成した。ＴａｑＩ＋ＰｓｔＩまたはＴａｑＩ＋ＨｉｎｄIIIのいずれかでの二重消化、二本鎖ＴａｑＩ−Ａｄ及びビオチン−ＰｓｔＩ−Ａｄ（またはビオチン− ＨｎｄIII−Ａｄ）アダプターの連結、及び少なくとも一つのビオチン化ＰｓｔＩまたはＨｉｎｄIII末端を保有しているフラグメントの選択後、全て実施例１において記述されるように、一連の反応混合物及びコールドスタート設定を用いて増幅反応を行った。全ての場合において、複合ＳＳＲプライマーのみを、［γ −³³Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端標識した。５６℃の最終アニーリング温度のタッチダウン特性を用いて、増幅をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ９６００温度サイクラー上で行った。変性：９４℃、３分１サイクル：９４℃、３０秒６５℃、３０秒７２℃、１分１１サイクル：９４℃、３０秒最初のサイクルは、６４．３℃、３０秒、次に、サイクル当たり０．７℃ずつ次の１０サイクルの間最終の５６℃まで下げる７２℃、１分２３サイクル：９４℃、３０秒５６℃、３０秒７２℃、１分本質的に実施例１において記述したように、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中６％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動後、−７０℃でＫｏｄａｋＢｉｏｍａｘＸ線フィルムに増感紙で増幅して感光させた後、オートラジオグラフィーにより共増幅された産物を視覚化した。表Ｖに挙げた複合ＳＳＲプライマーの全てを、異なるダイズ栽培変種間の多型を検出するためのこのプロトコルにおいて用いた。用いた全てのプライマーは、成分ヌクレオチドの一つが２つの隣接するジヌクレオチド反復にわたって「同周期」である完全複合ＳＳＲ配列を表す。意外にも、表Ｖに挙げたプライマーの全てが産物を生じるのに等しく効果的であるとは限らず、クローン化した配列編纂（表II）に基づいて同程度の多型であることが予測される場合でさえ、全ての生じた産物がそうであるとは限らなかった。ダイズゲノムから最も多数の共増幅フラグメントを生じる複合プライマーは、（ＣＡ）ｘ（ＴＡ）ｙ（式中、ｘ及びｙは０．５の倍数であるが、各々≧１）である。図３ａは、（０個の３’ 選択的ヌクレオチドを含んでいる）Ｔａｑ．ＡｄＦ及び（１個の３’ヌクレオチド、−Ｃ）Ｔａｑ．ｐｒ８と組み合わせて用いた、このプライマーの（ＣＡ）_7. ₅ （ＴＡ）_2.5バージョンからの増幅産物を示す。ＴａｑＩプライマーが完全に非選択的である時でさえ、比較的少数のフラグメントのみを増幅する複合配列プライマー（ＴＣ）_4.5（ＴＧ）_4.5及び（ＣＴ）_7.5（ＡＴ）_3.5からの産物も図３ａに示す。（ＣＴ）_x（ＡＴ）_y配列は、単離したダイズクローン上の複合反復の二番目に豊富な種類であるようなので（表II参照）、この結果は意外であった。プライマーとして、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5及び（ＣＴ）_7.5（ＡＴ）_3.5は、主として、それらの３’−（ＡＴ）_y反復の長さにおいて異なる。さもなければ同一の増幅反応におけるこれらの２つプライマーの異なる効率は、主に、「導く」３ ’−（ＡＴ）_y配列の長さの結果であるかもしれない。それに反して、（ＴＣ）₄ _.5 （ＴＧ）_4.5から生じる非常に少数の増幅産物は、おそらく、ダイズゲノム中のこの複合反復の低いコピー数（表II参照）の結果である。図３ｂに示されるのは、各々、同じ２つのＴａｑＩアダプター特異的プライマーと組み合わせて（ＴＧ）_4.5（ＡＧ）_4.5及び（ＴＣ）_4.5（ＡＣ）_4.5を用いて生じた産物である。これらの２つの複合ＳＳＲ配列の各々により、中間的な数の産物が増幅される。完全複合ＳＳＲプライマーのいずれででも生じる増幅産物は、多型及び非多型のフラグメントの混合物である。例えば、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5プライマーからの産物のいくつかは、試験した全ての１５の異なるＧ．ｍａｘ及びＧ．ｓｏｊａの遺伝子型間で完全に非多型であるが、しかしながら、産物の多くは、これらのゲノム間で優性または共優性のいずれかの多型を示す。Ｔａｑ．ＡｄＦ（ｎ＝０）またはＴａｑ．ｐｒ８（ｎ＝１＝ｃ）のいずれかと組み合わせて（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を用いて増幅された産物を、図３ａから分類した。この増幅産物の組は、ダイズゲノムにおける（ＣＡ）≧_7.5（ＴＡ）≧_2.5座の全体を表していない。ＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ二重消化した鋳型フラグメントのビオチン選択した組内で、このＳＳＲがＴａｑＩ部位の増幅できる距離内にありＴａｑＩ部位に反対向きであり、そして、他のＴａｑＩ部位がＳＳＲのもう片側、ＳＳＲ及び「選択できる」ＰｓｔＩ部位の間にない（ＣＡ）≧_7.5（ＴＡ）≧_2.5ゲノム座のみに増幅は限られた（図１参照）。ゲノム中の残りの（ＣＡ）≧_7.5（ＴＡ）≧_2.5座は、異なる制限酵素の組を用いて構築した鋳型ＤＮＡから増幅することができる。図４は、２つの制限酵素の１つだけを変えた時（選択できる酵素部位として、ＰｓｔＩをＨｉｎｄIIIに代える）、増幅フラグメントのパターンがＰｓｔＩ＋ＴａｑＩで生じたものと著しく異なることを示す。それ故、制限酵素の異なる組み合わせで制限された鋳型を生じ、並びに、各鋳型調製物を多数の異なる複合ＳＳＲ及びアダプタープライマーの組み合わせの組でアッセイすることにより、あらゆる与えられたゲノム中の多型ＳＳＲ座の総数のより大きな割合を検出することができるはずである。５’固定単純ＳＳＲプライマーを用いたＳＳＲ−アダプター増幅により生じた増幅産物の低い解像度（実施例１参照）に比べて、複合ＳＳＲプライマーの代用は、かなり高いレベルの産物の解像度を与える。各バンド／産物には、はるかに少ないスタッターが伴い、これ実施例３遺伝子地図作成のための複合ＳＳＲ−アダプター反応における完全複合ＳＳＲプライマーを用いた増幅図３は、遺伝的マーカーを作成するためのＳＳＲ−アダプター増幅法の使用を示す。Ｇ．ｍａｘ、Ｂｏｎｕｓ及びＧ．ｓｏｊａ、ＰＩ８１７６２間で検出された多型のバンドが遺伝的に継承され得るかどうかを決定するために、そして、これらの多型が遺伝子地図作成のための有用性を有し得るかどうかを決定するために、これらの株間の多型産物を記録し、ダイズゲノムに位置づけた。（Ｔ．Ｈｙｍｏｗｉｔｚ、イリノイ大学からの）ｂｏｎｕｓ及びｓｏｊａ親に関する交配からのＦ₂世代での６６個体から、ゲノム鋳型ＤＮＡを材料及び方法において記述したように作成した。この実施例には、ＴａｑＩ及びＨｉｎｄIII 制限酵素を鋳型ＤＮＡの二重消化のために用いた。消化、アダプターの連結、及びそれに続くストレプトアビジン−ビオチン選択を、材料及び方法において記述したように行った。（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5複合ＳＳＲプライマー（表Ｖ）を、［γ−³³Ｐ］ＡＴＰを用いて５’末端標識し、次に、親及びＦ₂鋳型上の複合増幅のためにＴａｑ．ｐｒ６アダプタープライマー（表Ｉ）と組み合わせて用いた。これらの増幅は、実施例２において詳述したコールドスタート、５６℃のタッチダウン温度サイクリングプロトコルを用いた。増幅産物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上で分け、次に乾燥し、ＫｏｄａｋＢｉｏｍａｘＸ線フィルムに感光させた。これらの産物のオートラジオグラフを図５ａに示す。少なくとも１５の増幅産物が親の鋳型間で明確に多型であり、Ｆ₂個体間でメンデル分離を示した。これらの大部分は、優性の多型として分離し、各々が、Ｆ₂子孫において３：１または１：２：１のメンデル比率で単に偶然だけで分離した可能性は、一貫して５％未満であった。各多型産物の親の遺伝を、６６のＦ₂個体の各々に対して決定し、これらの多型の１３に対する記録を表VIに示す。この特異的プライマーの組み合わせで、より明確な多型のバンドの大部分が優性のマーカーとして分離するようであり、すなわち、少数の多型のみが共優性的に分離するようである。しかしながら、他の特異的プライマーの組み合わせで、共優性の分離の出現率はしばしばより高い。ホモ接合体は、時々、ヘテロ接合体から区別することができない点において、大部分の共優性の多型は、記録するにはより問題が多い。それ故、この増幅からの多型の各々を優性のデフォールト想定で記録し、真の共優性の場合を以下のマッピングで示す。これらのバンドをダイズゲノムに位置づけるために、これらの遺伝記録を、ダイズゲノムに以前に位置づけられた６００ＲＦＬＰ及び単一座ＳＳＲマーカー（Ｊ．Ａ．Ｒａｆａｌｓｋｉ及びＳ．Ｖ．Ｔｉｎｇｅｙ、ＧｅｎｅｔｉｃＭａｐｓ：ＬｏｃｕｓＭａｐｓｏｆＣｏｍｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅｓ．第６版中、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９３）のものと相関させた。この標準的な遺伝子地図（データは示さない）は、この実施例において用いられたものと同じＦ₂集団における多数のＲＦＬＰマーカーの分離パターンの分析から、標準的なＲＦＬＰ方法論により構築された（標準的なＲＦＬＰマッピング技術に関しては、本明細書に参考文献が含まれる、Ｔ．Ｈｅｌｅｎｔｊａｒｉｓ等、１９８６、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、７２、７６１を参照）。遺伝子マッピング分析のための原則は、ゲノム中で互いに近くに位置するマーカーはＦ₂子孫において一緒に遺伝され、一方、遠く離れて位置するマーカーはより低い頻度で共に遺伝されるということである。次に、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ用に出願人等により修正されたコンピューター分離分析プログラム、ＭａｐＭａｋｅｒ（Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ等、１９８７Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１、１７４）を用いて、分離の分析及びマーカーの地図の位置を計算した。これらの結果は、Ｆ2子孫間で約３：１の優性の分離比または１：２：１の共優性の分離比を有するほとんど全ての多型の増幅産物をダイズゲノムに位置づけることができることを示した。このことは、表VIからの６つの多型が全て様々な連鎖群上の別個の部位に位置する図５ｂにおいて示される。全体で、この単一のプライマーの組み合わせから位置づけられた１５の多型は、１０の異なる連鎖群間に分布し、すなわち、いくつかの場合において、２つまたはそれより多い多型は同じ連鎖群上の連鎖した部位に集まる。観察したデータから、図５ｂ中の多型の各々がこれらの位置に単に偶然集まる可能性は、１０^3.29中１から１０^16.88中１まで異なり、これらの地図の位置の信憑性を示している。この実施例は、本発明のＳＳＲ−アダプター複合増幅により明らかにされた多型が遺伝的マーカーとしての有用性を有することを示す。ＰＩ８１７６２及びＢｏｎｕｓダイズ系統間の交配から分離している６６のＦ₂ 個体の各々から、ＤＮＡを単離し、鋳型を作成した。示したマーカー座の各々での各個体の遺伝子型は、以下のように決定し、すなわち、「Ａ」または「Ｂ」の記録は、それぞれ、その座がＰＩ８１７６２またはＢｏｎｕｓ親から遺伝されたことを示す。Ｈの記録は、その座がＰＩ８１７６２及びＢｏｎｕｓの両方から遺伝されたことを示す。「ａ」の記録は、その座がＰＩ８１７６２からのみ遺伝された、または、Ｂｏｎｕｓ及びＰＩ８１７６２の両方から遺伝されたことを示す。「ｂ」の記録は、その座がＢｏｎｕｓからのみ遺伝された、または、Ｂｏｎｕｓ及びＰＩ８１７６２の両方から遺伝されたことを示す。「ｍ」の記録は、欠けているデータを示す。実施例４他の植物及び動物ゲノムにおける多型を検出するための複合ＳＳＲ−アダプター反応における完全複合ＳＳＲプライマーを用いた増幅実施例４は、トウモロコシ、サケ、ヒト、及びマウスを含む他の非ダイズゲノムからのゲノムＤＮＡの増幅のための完全複合ＳＳＲプライマーの使用を示す。尿素抽出ミニプレップ法（Ｃｈｅｎ等、ＴｈｅＭａｉｚｅＨａｎｄｂｏｏｋ中、Ｍ．Ｆｒｅｅｌｉｎｇ及びＶ．Ｗａｌｂｏｔ、ｅｄｓ．、（１９９３）５２６−５２７頁、ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いて、Ｚ．ｍａｙｓ同系交配の栽培変種、Ｂ７３、Ｍｏｌ７、ＡＳＫＣ２８、ＬＨ８２、ＬＨ１１９、ＬＨ２０４、ＡＥＣ２７２、及びＣＭ３７からゲノムＤＮＡを単離した。５つの異なるヒト由来、並びにサケ及びマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）からのゲノムＤＮＡを、市販されているもの（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）ＭＯまたはＣｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏＣＡ）から購入した。実施例１及び２において記述したように、全てのこれらのＤＮＡをＴａｑＩ＋ＰｓｔＩまたはＴａｑＩ＋ＨｉｎｄIIIのいずれかで二重消化し、これらの制限フラグメントをこれらの制限部位に特異的なアダプターに連結し、そして、ビオチン−ストレプトアビジン選択を行った。いくつかの個々の完全複合ＳＳＲプライマー（³³Ｐ−標識した）を、各プライマーを０または１個の３’選択的ヌクレオチドを保有している個々のＴａｑＩアダプタープライマーと組み合わせて用いて、実施例２において記述したように増幅反応を行った。増幅をコールドスタート、５６℃の最終タッチダウン温度サイクリング条件を用いて行い、標識された産物を６％変性ポリアクリルアミドゲル上で分けた。これらの植物及び哺乳類のゲノムからの増幅産物の例を図６、パネルａ、ｂ、及びｃに示す。試験した全てのゲノムにおいて、どの特定の複合ＳＳＲ及びＴａｑＩアダプタープライマーの組み合わせもはっきり識別できる増幅産物の組（フィンガープリント）を生じた。一般に、どの２つのフィンガープリントも類似する程度は、それらの個体間の進化的距離の関数である。これらのＳＳＲ−アダプター増幅産物のフィンガープリントは、異なり得る２つの成分、すなわち、フラグメントの絶対数及びそれらのゲル上での集合的なパターンを有する。第一に、与えられたＳＳＲプライマーは、一つの種において、他の種と比べて完全に異なる相対数の増幅産物を生じることができ、そのプライマーにより増幅された複合ＳＳＲ座が、他のものと比べて一つの系統発生群において完全に異なるコピー数で存在することができることを示している。例えば、複合反復、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を用いた共増幅フラグメントの数は、ダイズまたはドウモロコシにおけるよりも哺乳類ゲノムにおいてはるかに多いようであり（少なくとも、２−５倍）（図６参照）、哺乳類がより多数の（ＣＡ）≧_7.5（ＴＡ）≧_2.5標的座を含むことを示している。この関係は、ダイズまたはトウモロコシゲノムに対して哺乳類においてより高く概算された（ＣＡ）_n反復の頻度（Ｗａｎｇ等、Ｔｈｅｏｒ．ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ：８８、１（１９９４）；Ｍｏｒｇａｎｔｅ＆Ｏｌｉｖｉｅｒｉ、ＰｌａｎｔＪ（１９９３）；Ｂｅｃｋｍａｎｎ＆ＷｅｂｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ１２、６２７（１９９２））と一致する。第二に、限られた系統発生群内（種または属）で、通例、個体間の増幅産物のパターンは類似し、異なるが近縁のゲノムにおいて制限部位及びＳＳＲ座が全体的に保存されていることを示している。一つのゲノムにおいて与えられた増幅フラグメントに寄与する特定の制限部位またはＳＳＲ座が、同じ種の他のゲノムに比べて塩基置換、挿入／欠失、または反復長の違いを保有する時はいつでも、個体間の多型を検出する。進化的距離が同じ属を越えて広がる個体間の増幅産物のパターンにおいて実質的に類似点は明らかでなく、比較する２つのゲノムがより分岐しているほど、これらが共通の座を共有することがより起こりそうもないという一般に認められた考えに一致する。増幅フラグメントの組は、例えば、マウスまたはラットに比べてヒトからの個々のゲノム間で全く異なり、増幅パターン（及びおそらく増幅産物の組）は、ダイズ及び哺乳類間、またはダイズ及びトウモロコシ間でさえ何の類似点も共有しないようである。実施例５異なる増幅産物組を生じるために、プライマー構造及び温度サイクリング条件を変えることの効果ＳＳＲ−アダプター増幅反応における、それ故、得られる産物における可変性は、上記の反応及び温度サイクル設定条件だけでなく、これらの増幅に用いるプライマーの考案及び温度サイクリングパラメーターにおける微妙な違いからも生じる。いったん、特定の複合ＳＳＲをこのアッセイのための標的座配列として選択しても、以下のプライマー考案規準、すなわち、１）アダプタープライマー上の３’伸長ヌクレオチドの数及び組成、２）複合ＳＳＲプライマーを含んでなる２つの成分単純反復の相対的な長さ、３）一本鎖プライマーに対応するように選択した二本鎖複合ＳＳＲ座の特定の鎖（すなわち、ＳＳＲプライマーの方向性）のいずれでも一つを変えることにより、部分的または完全のいずれかに異なる増幅産物組を生じることができる。加えて、特定の増幅により生じるデータの特質は、温度サイクリングを開始する方法により影響される。１．アダプタープライマーの考案ゲノムＤＮＡの制限末端に連結された合成アダプターに対応するこのプライマーは、その３’末端に様々な数（０ないし１０）及び任意の配列のヌクレオチドを保有することができる。Ｚａｂｅａｕにより記述された（欧州特許第５３４，８５８号）ように、プライマー上のこれらの様々な３’ヌクレオチドはゲノムＤＮＡフラグメント上のアダプター及び制限部位に直接隣接した「未知の」配列に特異的にアニールし、鋳型混合物中の全ての可能なフラグメントの一組のみの各々による認識は、増幅反応における卓越した特異性を与える。数個の最も３’のヌクレオチドを除いて配列においてそうでなければ同一であるそのようなプライマーは、全く重複していない増幅産物組を増幅することができるので、これらの使用が増幅されるゲノム座の前もった配列の知識を必要せず、各プライマーが鋳型ＤＮＡ混合物における多数の標的部位を選択的に共に認識することを除いて、これらは大いに対立遺伝子特異的増幅プライマー（Ｎｅｗｔｏｎ等、（１９８９）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ１７：２５０３；Ｋｗｏｋ等、（１９９０）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：９９９；Ｗｕ等、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２７５７）のように機能する。一般的に、３’伸長が長くなるほど、プライマーはより選択的になり、すなわち、様々な３’伸長がより長く作られるにつれて、アダプタープライマーはより少数の可能なゲノム標的部位を認識するようにより制限されるようになり、より少ない真の数の共増幅産物をもたらす。３’伸長への各非縮重ヌクレオチドの付加は、約４倍大きい鋳型識別をもたらす。加えて、最も３’の塩基の位置で異なる単一ヌクレオチドは、そうでなければ同一のプライマーに対して独特な鋳型特異性を与える。これらの原理を図７に示した実施例により表す。³³Ｐ標識した完全複合ＳＳＲプライマー、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を、実施例２において記述した実験条件を用いて、いくつかのダイズ栽培変種のゲノムから特異的な産物を生じるためのＳＳＲ−アダプター増幅のために用いた。このＳＳＲプライマーを、最も３’のヌクレオチドの位置でのみ全て異なるいくつかの異なるＴａｑＩアダプタープライマー（表Ｉ参照）、の各々と対にした。最も短い３’伸長（０ヌクレオチド）を有するＴａｑＩアダプタープライマー、Ｔａｑ．ＡｄＦは、全く非選択的で、最も多数の産物を生じ、最も長い伸長を有するプライマー（Ｔａｑ．ｐｒ９）は最も選択的で、最も少ない増幅産物を生じた。３’伸長として一つのヌクレオチドを保有しているプライマーの全て４つは、ほどん同じ数の産物を増幅したが、しかしながら、これらの４つのプライマーの各々からの産物の組は、他の３つからの組と比べて独特である。Ｔａｑ．ＡｄＦを用いて増幅されたバンドの複雑なパターンは、実際、全ての４つの一塩基伸長プライマーの合成である。すなわち、これらの４つのプライマーの各々により生じるパターンは、０塩基伸長プライマーにより増幅されるパターンの約１／４組である。従って、アダプタープライマー上の３’選択的ヌクレオチドの数及び組成の両方を変えることは、与えられたＳＳＲプライマーと対にした時に、同じ鋳型から個々の部分的または完全のいずれかに重複していない増幅産物の組を生じるのに十分である。どの３’伸長を用いるかの選択は、主に、標的ゲノム中の相対的なヌクレオチドの頻度及び他のプライミング部位として働く特定のＳＳＲのゲノム中での豊富さによる。２．複合ＳＳＲプライマーを含んでなる２つの成分単純反復の相対的な長さゲノム中のあらゆる単純及びほとんど全ての複合ＳＳＲ座は、個々の鎖がヌクレオチドの異なる配列を保有する二本鎖構造である。ＳＳＲ座で一つの鎖に特異的にアニールすることのできる一本鎖プライマーは、（９つの特定のパリンドローム複合ＳＳＲ配列の組み合わせを除いて、表II参照）反対の鎖にアニールしない。それ故、与えられたＳＳＲプライマーは、各ゲノム標的座から極性の一方向にプライマーを伸長し、どの複合ＳＳＲ座も４つの異なるプライマーの種類のいずれかが認識し、そこから伸長を開始することができる。加えて、これらの４つの基本的なプライマーの種類の各々は、プライマー内の２つの成分反復の長さにより全て異なる広範囲の個々のプライマーを含むことができる。これらの成分反復の長さにおける違いは、プライマーの効率及び再現性のある増幅の正確さに大きく影響し、すなわち、一般的に、３’プライミング反復に対する５’アンカー反復が長いほど、増幅におけるプライマーの特異性及びプライミング効率がよりよい。２つの成分反復の長さにより各々他と異なっている多数の別個のプライマーを、４つの異なる複合ＳＳＲ配列、（ＣＴ）_x（ＡＴ）_y、（ＡＴ）_x（ＡＧ）_y、（ＣＡ）_x（ＴＡ）_y、（ＡＴ）_x（ＧＴ）_y（すなわち、ｘ及びｙの値は、特定のＳＳＲ型に対して変わる）に対して試験した。図８は、３つの異なる（ＣＡ）_x（ＴＡ）_yプライマー、（ＣＡ）_4.5（ＴＡ）_7.5、（ＣＡ）_6.5（ＴＡ）_4.5、及び（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5、並びに３つの異なる（ＡＴ）_x（ＧＴ）_yプライマー、（ＡＴ）_3.5（ＧＴ）_6.5、（ＡＴ）_8.5（ＧＴ）_2.5、及び（ＡＴ）_6.5（ＧＴ）₄ _.5 を用いた試験の結果を示す。これらのプライマーの全て５つは、３８−４２℃ の範囲のＴｍを有することが計算された。各々を、実施例２において記述したように、³³Ｐで５’標識し、ビオチン選択したダイズ鋳型ＤＮＡ、ＰＩ８１７６２及びｗｏｌｖｅｒｉｎｅを用いた増幅反応において、３つの異なるＴａｑＩプライマー（Ｔａｑ．ＡｄＦ、Ｔａｑ．ｐｒ６、及びＴａｑ．ｐｒ８）と個々に対にした。（ＡＴ）_x（ＧＴ）_yプライマーはいずれもあまり効率よく作動せず、（ＡＴ）_3.5（ＧＴ）_6.5は少なくともいくつかの産物を生じたけれども、一方、他の２つの（ＡＴ）_x（ＧＴ）_yプライマーバージョンは、なんらかの増幅産物を生じることに完全に失敗した。それに反して、全ての３つの（ＣＡ）_x（ＴＡ）_yプライマーは、増幅フラグメントの数はこれらのプライマー間で異なるけれども、産物を生じることができた。これらの結果は、５’固定反復が長く、３’プライマー伸長反復が短いほど、より多くの増幅産物を生じることを示す。様々な成分反復長を保有している（ＣＴ）_x（ＡＴ）_y及び（ＡＴ）_x （ＡＧ）_yプライマーで行った同様の実験（示さない）から、これと同じ結論を引き出した。３．一本鎖複合ＳＳＲプライマーの極性二本鎖複合ＳＳＲ座のどちらの鎖をプライマーとして用いるかの選択は、ＳＳＲ−アダプター増幅反応の成功を決定するために極めて重要であり得る。いくつかの複合ＳＳＲに対して、プライマー上の成分反復の相対的な長さにかかわらず、二本鎖ＳＳＲの一つの鎖が効率よいプライマーとして働くことが見いだされ、一方、反対側の鎖は全く失敗した。この違いは、（ＡＴ）_n反復を含んでいる複合ＳＳＲに対して最も極端で、すなわち、（実施例２において記述された）標準的な条件の下で効率よく生じた増幅産物をもたらす（ＡＴ）_nを含んでいるプライマーの唯一の型は、（ＡＴ）_n配列が非常に短く（１．５−３反復単位）、３ ’プライマー伸長末端として位置するものである。図８は、例えば、同じ複合ＳＳＲの相補鎖を表す（ＡＴ）_x（ＧＴ）_yプライマーに対する（ＣＡ）_x（ＴＡ）_yプライマーの優れた効率を示す。たとえ全てのプライマーの計算されたＴ_m値がほとんど同じであっても、試験した（ＡＴ）_x（ＧＴ）_yプライマーの全て３つは、増幅産物を生じるのに極めて効率が悪かった（２つは失敗であった）。プライマー効率におけるこの違いは、プライマー内の（ＡＴ）_n領域の配置における違いから生じるようである。Ａ及びＴヌクレオチドは、塩基対形成中に弱い水素結合を示し、（ＡＴ）_n領域を含んでいるオリゴヌクレオチドは、鋳型に対する弱いアニーリングと競合する自己相補性のアーティファクトをしばしば有する。それ故、プライマーの５’末端の（ＡＴ）_n領域は鋳型に対してプライマーを固定するために不十分に働き、一方、３’末端での短い（ＡＴ）_nは、プライマーの上流の非（ＡＴ）_n部分により、よく固定されるようである。（ＡＴ）_n反復のない複合ＳＳＲに対応するプライマーは、２つの成分反復の相対的な順序によりかなり少ない影響しか受けない。例えば、２つの相補的なプライマー組、（ＴＣ）_4.5（ＡＣ）_4.5対（ＴＧ）_4.5（ＡＧ）_4.5（図３参照）及び（ＣＡ）_4.5（ＧＡ）_4.5対（ＴＣ）_4.5（ＡＣ）_4.5（示さない）における個々のプライマーは、ほとんど等しい効率で増幅産物を生じるようである。４．温度サイクリング開始の方法先の実施例において記述した反応設定プロトコルは、本質的にコールドスタートで、厳重でない条件の下で、必ずしも完全に符合しない鋳型の部位及び標的座内の多数のずれた部位（後者は、ゲル上に増幅産物のスタッター結果をもたらす）の両方にプライマーがアニールする可能性を与える。それにもかかわらず、この簡単な反応設定プロトコルは、決まって、ゲノム間の多型として識別することのできる増幅産物を生じるのに十分であった。実際、複合ＳＳＲプライマーからのコールドスタート反応産物は、首尾一貫して、全く明瞭ではっきりしていたが、しかしながら、５’固定単純ＳＳＲプライマー由来の比較できる産物は、通例、同じ明瞭さ及び鮮明さを欠いていた（図２及び３を比較）。両方の型のＳＳＲプライマーに対するこの不明瞭さ及び個々の産物の不均質性の多くは、温度サイクリングにホットスタート開始を使用することにより除くことができる。ホットスタートプロトコル（Ｃｈｏｕ等、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０、１７１７、１９９２）は、最初の変性の前の正しくない鋳型部位への偽のプライマーアニーリングを防ぎ、ゲル上でより明瞭ではっきり分かれた産物を生じる。実施例１及び２において記述したコールドスタート法、及び２つの異なるホットスタート開始法も用いて、そうでなければ同一の増幅反応を行った。ホットスタートの一つの型に対して、ＳＳＲプライマー（５’末端標識及び非標識バージョンの両方）を完全なプライマー混合物から除くことを除いて、材料及び方法において記述したように各増幅反応の全ての成分を合わせた。反応チューブをふたし（１８．５μＬ反応容量）、温度サイクリングの最初の変性工程を行った（９４℃、３分）。次に、１．５μＬの適当な（１．０μＬの５ｎｇ／μＬ³³Ｐ標識に加えて０．５μＬの５０ｎｇ／μＬ非標識）ＳＳＲプライマーを各反応物に加える間、反応物を８０℃で保持した。次に、一定の５８℃のアニーリング温度またはタッチダウン（５６℃または５８℃の最終）温度サイクリングプロトコルのいずれかを用いて、指数的な増幅を開始した。二番目のホットスタート法に対しては、１０ｘバッファー、ＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰｓ、Ｈ₂Ｏ、及びプライマー（合計５．４μＬ）の混合物をまずＡｍｐｌｉｗａｘと共に加熱し、冷却し、次に、鋳型ＤＮＡ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲバッファー、及びＨ₂Ｏからなる二つ目の混合物（１４．６μＬ）を再凝固したワックス層の上面に加える（各々の最終濃度は、標準的なコールドスタート増幅におけるものと対等である）ことを除いて、本質的に製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）により記述されたようにＡｍｐｌｉｗａｘＰＣＲ−５０を用いた。次に、実施例２において詳述したタッチダウンアニーリングプロトコルを用いて、温度サイクリングを開始した。図２−８に示した増幅は全て、コールドスタートプロトコルを用いた。しかしながら、２つの開始方法の直接的な比較を図９に示す。３つの異なるＴａｑＩアダプタープライマー（Ｔａｑ．ＡｄＦ、Ｔａｑ．ｐｒ６、Ｔａｑ．ｐｒ８）と対にした完全複合ＳＳＲプライマー、（ＣＡ）_7.5（ＴＡ）_2.5を用いた２組の増幅を、実施例２において記述した条件（５６℃の最終タッチダウン温度）を用いて行い、すなわち、一組は、標準的なコールドスタートで開始し、もう一組は、上記の一番目のホットスタートプロトコルで開始した。これらの結果は、ゲノム間の多型としてそれにもかかわらず識別できる産物を生じるために、コールドスタートは十分であるけれども、最も少ない量のスタッターで最も明瞭なバンドを生じるためには、ホットスタートの方が優れていることを示す。一般的に、ホットスタートは、試験したほとんどあらゆるＳＳＲプライマーに対して、ゲル上に最も明瞭な産物のバンドを生じた。５’固定単純ＳＳＲプライマーを使用した時、これらのプロトコル間の最も極端な違いが見られた。実際、５’固定単純ＳＳＲプライマーを用いたコールドスタートは、しばしば、容認できないほどスメアーし不鮮明な産物のバンドをもたらした。（５’アンカーとして長い領域の（ＡＴ）_nを有する）いくつかのＳＳＲプライマーは、ホットスタート条件の下でいかなる産物も生じることに失敗したけれども、通例、複合ＳＳＲプライマーに対してはこれらの違いはより微妙である。実施例６多型を検出するためのＳＳＲ間増幅用完全複合ＳＳＲプライマーを用いた増幅実施例６は、遺伝的多型の生成及び検出のための単一プライマー増幅における完全同周期複合ＳＳＲプライマーの使用を示す。最も５’末端に３個の縮重塩基を含んでいる単純ＳＳＲ配列は、ゲノム中の隣接するＳＳＲ配列間の増幅のための効率よいプライマーとして働くことが以前示されている（Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０、１７６、（１９９４））。同様に、複合ＳＳＲ配列に対応するプライマーも、単一プライマーＰＣＲ増幅においてＳＳＲ間増幅産物を生じるために有用で極めて効率がよい。通例、同周期の配列を有し、ゲノム中の最も豊富な複合ＳＳＲに対応する（表II参照）、ＳＳＲ−アダプター増幅において最も効率的な同じ複合ＳＳＲプライマーはまた、ＳＳＲ間増幅産物を生じるのにも最も効果的である。図１０は、（実施例１及び２において記述した）３つの異なるコールドスタート温度サイクリングプロトコル、すなわち、５８℃一定、５８℃のタッチダウン、及び５６℃のタッチダウンから、５’固定単純ＳＳＲプライマー及び複合ＳＳＲプライマーの両方を用いて得られた単一プライマー増幅産物を示す。材料及び方法において記述したように、ＳＳＲプライマーを［γ−³³Ｐ］ＡＴＰで５’末端標識した。２０ｎｇの未消化ゲノムＤＮＡまたは標準的な量の消化しビオチン選択したアダプター修飾鋳型ＤＮＡのいずれかを、（５ｎｇの標識したプライマーを２５ｎｇの非標識プライマーと合わせた）複合ＳＳＲプライマー及び先の実施例において記述した増幅反応の他の非プライマー成分と合わせた。アダプタープライマーは加えなかった。ホットスタートから生じた産物はゲル上でより明瞭でそしてよりよく分かれたけれども、ホットスタート（示さない）及びコールドスタート条件の両方を用いてこれらの反応を行った。図１０のパネルａは、示した３つの温度サイクリング特性で生じた、５’固定単純ＳＳＲプライマー、ＤＢＤ（ＡＣ）_7.5を用いたダイズ（Ｂｏｎｕｓ及びＰＩ８１７６２）並びにトウモロコシ（Ｂ７３及びＣＭ３７）栽培変種の未消化ゲノムＤＮＡからの産物の比較を示す。パネルｂは、ダイズｗｏｌｖｅｒｉｎｅ及びＰＩ８１７６２からの未消化及びＴａｑＩ＋ＰｓｔＩ消化しビオチン選択した鋳型ＤＮＡの両方から、５’固定単純ＳＳＲプライマー、ＤＢＤ（ＡＣ）_7. ₅ 及びＨＢＨ（ＡＧ）_8.5並びに完全複合ＳＳＲプライマー、（ＡＴ）_3.5（ＡＧ）_7.5及び（ＡＴ）_3.5（ＧＴ）_6.5を用いて得られた増幅産物の比較を示す。２つの異なる温度サイクリング法を示したように用いた。未消化ＤＮＡ鋳型は、消化した鋳型よりより多数の増幅産物を生じた。消化してアダプターを連結した鋳型を用いた反応物は、実施例１及び２において記述したＳＳＲ−アダプター増幅のための単一プライマーコントロールとして使い、すなわち、これらの消化したＤＮＡ鋳型から単一ＳＳＲプライマーにより比較的少数のフラグメントが増幅され、ＳＳＲ −アダプター反応において見られる増幅産物の大部分は、各消化したＤＮＡフラグメント上のＳＳＲ配列及び隣接するアダプター配列の両方の存在によることを示している。見ることのできる少数の単一プライマーの産物は、単一ＤＮＡフラグメント内の真のＳＳＲ間増幅またはおそらく何らかのフラグメント間対合のいずれかから生じることができる。これらの結果は、複合並びに単純ＳＳＲプライマーがトウモロコシ及びダイズゲノムからＳＳＲ間増幅産物を生じることができることを示す。個々のＳＳＲプライマーから生じた多数の産物は、非多型及び多型のフラグメントの混合物である。遺伝子型間の多型のバンドは、ゲノム中の隣接するＳＳＲ配列間または内の長さの違いを示し、すなわち、これらのフラグメントは、ゲノムの同定、フィンガープリント分析、またはマーカー援助選択のための潜在的なマーカーである。実施例７ＳＳＲ−アダプターバンド多型の単一座ＳＳＲマーカーへの転換いったん、ＳＳＲ−アダプター増幅（またはＳＡＭＰＬ）法を用いて申し分のないＳＳＲが見いだされると、しばしば、種の次の分析のためにこの単一のＳＳＲまたはほんの少数のＳＳＲのみに集中すること、及びより直接の非放射性の単一座法を用いてこれらの少数のＳＳＲでの変異を調べることが望ましくあり得る。ＳＡＭＬゲルからのバンドの単一座マーカーへの転換を成し遂げるために、このバンドをまず、乾燥したゲルから切り出す（図１１参照）。１００μＬのＨ₂ Ｏ中９５℃で１５分加熱することにより、バンドからＤＮＡを溶出させる。１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより残渣を沈殿させ、０．１容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、０．０２５容量の２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン、及び２．５容量のエタノールを加えて、−７０℃で３０分インキュベートし、次に１２０００ｒｐｍで１０分遠心分離することにより、上清中のＤＮＡを沈殿させた。この沈殿したＤＮＡを、７０％エタノール中で一回洗浄し、空気乾燥し、次に、１０μＬのＨ₂Ｏ中に再懸濁する。次に、このＤＮＡの１μＬを、（各々、１．５ｎｇ／μＬの最終濃度、すなわち、元の増幅のために用いたプライマー対にちょうど対応する）ＳＳＲプライマー及びアダプタープライマーが各々非標識であることを除いて、実施例２において記述したような条件を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として用いる（図１１参照）。これらの再増幅産物を、Ｑｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）ＰＣＲフラグメント精製キットを用いて精製し、精製されたＤＮＡフラグメントを、適当なＴ−ベクター（例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローン化しベクタープライマーを用いてインサートをシークエンスするか、またはシークエンシングプライマーとしてアダプタープライマーを用いて、サブクローニングせずに直接シークエンスする。いずれの場合においても、増幅フラグメントのＤＮＡ配列を得、一番目の座特異的隣接プライマー（ｌｓｆｐ−１）を考案することができる。このプライマーは、増幅フラグメントのＳＳＲに隣接する独特な配列に対応し、ＳＳＲに向かってその３’末端が向いている（図１１）。次に、標的ＳＳＲにまたがる増幅のために、ｌｓｆｐ−１プライマーを、制限フラグメント鋳型の最初の調製のために用いた二番目のアダプターに対応するプライマーと対にする。放射性標識したｌｓｆｐ−１プライマーで非特異的なバックグラウンドが減少するけれども、この増幅をｌｓｆｐ−１プライマーを放射性標識してまたはせずに行うことができる。特異的に増幅したアダプター−ｌｓｆｐ−１バンドをゲルから切り出し、上記のようにシークエンスした。得られたＳＳＲのもう片方の隣接する領域のＤＮＡ配列から、次に、二番目の座特異的隣接プライマー、ｌｓｆｐ−２を考案する。このプライマーの３’末端は、ｌｓｆｐ−１に反対向きで、ＳＳＲに対して向いている。最後に、ｌｓｆｐ−１及びｌｓｆｐ−２ユニークプライマーを対にし、制限フラグメント化したＤＮＡ鋳型混合物または非制限ゲノムＤＮＡ鋳型のいずれかを用いたＰＣＲ増幅のために用いる。このプライマー対の使用は、標的ＳＳＲにまたがる座特異的マーカーを生じる。しかしながら、このＳＳＲでの反復長変異は、今、こららの特異的な隣接領域プライマーを用いて、いかなる未消化ゲノムからも迅速及び非放射性で検出することはできない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．プライマーによる増幅を用いて各サンプルから核酸の断片を増幅し、差異を検出するために該増幅断片を比較することを含んでなり、改善が、該増幅において用いられるプライマーの少なくとも一つが完全複合単純配列反復からなることを含んでなる、２つの別個の核酸サンプル間の多型を検出する改善法。２．該完全複合単純配列反復プライマーが、式Ｉ、５’（ＸＹ）_n（ＮＭ）_n ３’ Ｉ式中、ｎは、独立して２−１５；Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｍは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；ただし、Ｘ≠Ｙ；Ｎ≠Ｍ；そしてＸＹ≠ＮＭにより記述される請求の範囲１に記載の方法。３．式中、ｎが独立して４ないし８である請求の範囲１に記載の方法。４．該完全複合単純配列反復プライマーが、式II、５’（ＸＹＺ）_m（ＬＭＰ）_m ３’ II 式中、ｍは、独立して２−１０；Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｚは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｍは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｐは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；ただし、Ｘ、Ｙ、及びＺは、全て同じではなく；Ｌ、Ｍ、及びＰは、全て同じではなく；そしてＸＹＺ≠ＮＭＰにより記述される請求の範囲１に記載の方法。５．ｍが、独立して２ないし４である請求の範囲４に記載の方法。６．該完全複合単純配列反復プライマーが同周期で、式IIIまたはIV、５’（ＸＹ）_n（ＸＺ）_n ３’ III ５’（ＹＸ）_n（ＺＸ）_n ３’ IV 式中、ｎは、独立して２−１５；Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｚは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；ただし、Ｙ≠Ｘ；Ｚ≠Ｘ；そしてＹ≠Ｚにより記述される請求の範囲１に記載の方法。７．ｎが、独立して４ないし８である請求の範囲６に記載の方法。８．５’の反復ジヌクレオチドのｎの値が３’の反復ジヌクレオチドのｎの値より大きい請求の範囲６に記載の方法。９．該同周期完全複合単純配列反復プライマーが、５’（ＡＣ）_n（ＡＴ）_n３’ （ＣＡ）_n（ＴＡ）_n （ＡＴ）_n（ＧＴ）_n （ＴＡ）_n（ＴＧ）_n （ＴＡ）_n（ＣＡ）_n （ＡＴ）_n（ＡＣ）_n （ＴＧ）_n（ＴＡ）_n （ＧＴ）_n（ＡＴ）_n （ＴＡ）_n（ＧＡ）_n （ＡＴ）_n（ＡＧ）_n （ＴＣ）_n（ＴＡ）_n （ＣＴ）_n（ＡＴ）_n （ＡＣ）_n（ＡＧ）_n （ＣＡ）_n（ＧＡ）_n （ＣＴ）_n（ＧＴ）_n （ＴＣ）_n（ＴＧ）_n （ＴＧ）_n（ＡＧ）_n （ＧＴ）_n（ＧＡ）_n （ＣＴ）_n（ＣＡ）_n （ＴＣ）_n（ＡＣ）_n （ＡＧ）_n（ＴＧ）_n （ＧＡ）_n（ＧＴ）_n （ＣＡ）_n（ＣＴ）_n ５’（ＡＣ）_n（ＴＣ）_n３’ 式中、ｎは独立して２ないし１５である、からなる群から選択される請求の範囲６に記載の方法。１０．該プライマーによる増幅を完全複合単純配列反復からなる単一プライマーを用いて行う請求の範囲１に記載の方法。１１．該完全複合単純反復が同周期である請求の範囲１に記載の方法。１２．ａ−ｄの工程、すなわち、ａ）核酸を少なくとも１つの制限酵素で切断して制限フラグメントを生じ、ｂ）工程ａ）の制限フラグメントの末端にアダプター断片を連結し、ｃ）増幅プライマーが、完全複合単純配列反復からなる第一プライマー及び工程ｂ）のアダプター断片に相補的な配列を含んでなる第二プライマーを含んでなる、プライマーによる増幅を用いて工程ｂ）のフラグメントを増幅し、そして、ｄ）各核酸サンプルからの工程ｃ）の増幅核酸産物を違いを検出するために比較する、に従って各核酸サンプルを別々に処理することを含んでなる、核酸の２つのサンプル間の多型を検出するための方法。１３．工程ｃ）において該第一プライマーが同周期である完全複合単純配列反復からなる請求の範囲１２に記載の方法。１４．工程ｃ）において該第二プライマーがさらに３’末端に１から１０までの任意のヌクレオチドを含んでなる請求の範囲１２に記載の方法。１５．工程ａ）で該核酸を消化するために、サンプル核酸上のテトラヌクレオチド部位を認識する一つの制限酵素及びサンプル核酸上のヘキサヌクレオチド部位を認識するもう一つの制限酵素の２つの異なる制限酵素を用い、そしてさらに、工程ｂ）で２つの異なるアダプター断片を工程ａ）で生じた制限フラグメントに連結する請求の範囲１２に記載の方法。１６．工程ｂ）で２つのアダプター断片の一つが結合対の一つを保有する請求の範囲１５に記載の方法。１７．該結合対の一つがビオチンである請求の範囲１６に記載の方法。１８．工程ｂ）の後に行われる付加的な工程、ｂ）（ｉ）結合対の一つを保有する工程ｂ）のフラグメントを結合対の一つを保有しない工程ｂ）のフラグメントから分離し、そして、さらに工程ｃ）で結合対の一つを保有する工程ｂ）（ｉ）でのフラグメントだけを工程ｃ）に従って増幅する、をさらに含んでなる請求の範囲１６に記載の方法。１９．工程ｃ）で該第一プライマーがレポーター分子を保有する請求の範囲１２に記載の方法。２０．該レポーターが³²Ｐまたは³³Ｐである請求の範囲１９に記載の方法。２１．工程ｃ）で該増幅をタッチダウン温度サイクリングプロトコルを用いて行う請求の範囲１２に記載の方法。２２．工程ｃ）で該増幅をホットスタートプロトコルを用いて開始する請求の範囲１２に記載の方法。２３．該同周期完全複合単純配列反復が、５’（ＡＣ）_n（ＡＴ）_n３’ （ＣＡ）_n（ＴＡ）_n （ＡＴ）_n（ＧＴ）_n （ＴＡ）_n（ＴＧ）_n （ＴＡ）_n（ＣＡ）_n （ＡＴ）_n（ＡＣ）_n （ＴＧ）_n（ＴＡ）_n （ＧＴ）_n（ＡＴ）_n （ＴＡ）_n（ＧＡ）_n （ＡＴ）_n（ＡＧ）_n （ＴＣ）_n（ＴＡ）_n （ＣＴ）_n（ＡＴ）_n （ＡＣ）_n（ＡＧ）_n （ＣＡ）_n（ＧＡ）_n （ＣＴ）_n（ＧＴ）_n （ＴＣ）_n（ＴＧ）_n （ＴＧ）_n（ＡＧ）_n （ＧＴ）_n（ＧＡ）_n （ＣＴ）_n（ＣＡ）_n （ＣＡ）_n（ＣＴ）_n （ＡＧ）_n（ＴＧ）_n （ＧＡ）_n（ＣＴ）_n （ＣＡ）_n（ＣＴ）_n ５’（ＡＣ）_n（ＴＣ）_n３’ 式中、ｎは独立して２ないし１５である、からなる群から選択される請求の範囲１３に記載の方法。２４．５’の反復ジヌクレオチドのｎの値が３’の反復ジヌクレオチドのｎの値より大きい請求の範囲２３に記載の方法。２５．ａ−ｄの工程、すなわち、ａ）核酸を少なくとも１つの制限酵素で切断して制限フラグメントを生じ、ｂ）工程ａ）の制限フラグメントの末端にアダプター断片を連結し、ｃ）増幅プライマーが、３’末端で単純配列反復領域及び５’末端で縮重ヌクレオチド領域からなる第一プライマー、並びに工程ｂ）のアダプター断片に相補的な配列を含んでなる第二プライマーを含んでなる、プライマーによる増幅を用いて工程ｂ）のフラグメントを増幅し、そして、ｄ）各核酸サンプルからの工程ｃ）の増幅核酸産物を、違いを検出するために比較する、に従って各核酸サンプルを別々に処理することを含んでなる、核酸の２つのサンプル間の多型を検出するための方法。２６．工程ｃ）で該第一プライマーが、式Ｖ、５’（縮重ヌクレオチド）_r（ＸＹ）_n３’ Ｖ式中、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ；Ｘ≠Ｙ；ｒは、２ないし６；そしてｎは、２ないし１５により記述される請求の範囲２５に記載の方法。２７．工程ｃ）で該第一プライマーが、式VI、５’（縮重ヌクレオチド）_r（ＸＹＺ）_m３’ VI 式中、Ｘは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ、Ｙは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ、Ｚは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧ、Ｘ、Ｙ、及びＺは、全て同じではなく、ｒは、２ないし６であり、そしてｍは、２ないし１０である、により記述される請求の範囲２５に記載の方法。