DE19911130A1 - Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene - Google Patents
Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und GeneInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von chromosomalen Fragmenten, welche eine Rolle in der Entwicklung komplexer Phänotypen, wie multifaktorieller Krankheiten, spielen. Das Verfahren erlaubt den direkten Nachweis von DNA-Fragmenten, welche in den Genomen zweier verwandter Individuen durch Abstammung identisch sind. Weiter erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Selektion solcher DNA-Fragmente, welche spezifisch für einen bestimmten Phänotyp sind. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren erfindungsgemäße Verfahren die Identifikation von Genen in Regionen, welche für einen bestimmten Phänotyp mitverantwortlich sind.
Description
Eine der großen Herausforderungen der modernen Biologie und Medizin ist die
Aufklärung der molekulargenetischen Grundlagen, welche bei der Entwicklung
komplexer Phänotypen, wie sie multifaktorielle Krankheiten wie Diabetes,
Adipositas, Asthma etc. darstellen, eine Rolle spielen. Die Grundlagen für die
molekulargenetischen Untersuchungen dieser Krankheiten stammen weitestgehend
aus dem Erfahrungsschatz zur Identifizierung seltener, monogener Erkrankungen,
in denen ein klarer, kausaler Zusammenhang zwischen einer oder mehreren
Mutationen in einem bestimmten Gen und einem Krankheitsphänotyp vorliegen.
Dieser kausale Zusammenhang ist bei den weitverbreiteten Krankheiten, für die
oben einige Beispiele angeführt wurden, nicht mehr gegeben. Bei solchen
Krankheiten führen Veränderungen an vielen genetischen Loci zu einer
Prädisposition für einen bestimmten Krankheitsphänotyp, welcher häufig zu seiner
Ausprägung das Vorhandensein zusätzlicher nicht-genetischer Umweltfaktoren
voraussetzt.
Der heute existierende Ansatz solche DNA Regionen zu identifizieren, welche bei
der Krankheitsentwicklung eine Rolle spielen, basiert auf der Betrachtung
polymorpher, genetischer Marker und statistischen Analysen, welche nach einer
Korrelation zwischen bestimmten Markerallelen und einem Krankheitsphänotyp
suchen. Die meisten dieser Verfahren basieren auf dem Nachweis von Regionen
" identical-by-descent (IBD)" d. h. Regionen, welche bei zwei verwandten
Individuen mit dem gleichen Krankheitsphänotyp durch Abstammung identisch sind
und demnach eine gewisse, größer als zufällige, Wahrscheinlichkeit haben, an der
Expression des betrachteten Phänotyps beteiligt zu sein (Tran LD, Elston RC, Keats
BJB & Wilson AF. Sib-pair linkage program (SIBPAL) in S. A. G. E Statistical
Analysis of Genetic Epidemiology, Release 2.2 (Lousiana State University, New
Orleans, 1994. Haseman JK & Elston RC. The investigation of linkage between a
quantitative trait and a marker locus. Behav Genet 2, 3-19 (1972)). Dieses
Verfahren durchgeführt an vielen oft hunderten von Familien kann zum Nachweis
von chromosomalen an der Krankheit beteiligten genetischen Loci führen.
Der Nachweis solcher Regionen erfolgt normalerweise durch den Gebrauch
sogenannter Mikrosatellitenmarker. Diese hoch-polymorphen DNA Abschnitte,
welche durch eine Anzahl repetitiver, kurzer Sequenzabschnitte (z. B. CA, CAAT
etc.) gekennzeichnet sind, lassen sich leicht mit Hilfe der Polymerase Chain
Reaktion (PCR) und anschließenden Separationsverfahren über Polyacrylamidgele
nachweisen (C. Dib et al. A comprehensive genetic map of the human genome
based on 5,264 microsatellites. Nature (1996) 380: 152-154). Dies erfolgt heute
meist über ein semi-automatisiertes Verfahren in welchem die Oligonukleotide zur
PCR Amplifikation mit Fluorophoren markiert werden und dann von einem
automatischen Sequenziergerät nachgewiesen werden können. Vielfach wird ein
solches Experiment genomweit durchgeführt. Hierfür werden Marker in geeigneten
Abständen (normalerweise etwa 10 centi Morgan (cM)) über das gesamte Genom
verteilt selektioniert, durch PCR amplifiziert und die individuellen Allele wie oben
beschrieben nachgewiesen (Davies et al. A genomewide search for human type 1
diabetes susceptibility genes. Nature. (1994) 371: 130-6., Hager et al. A genome
wide screen for human obesity genes reveals a major susceptibility locus on
chromosome 10, Nature Genet 20: 304-308 (1998)).
Der Nachteil dieses Verfahrens liegt in der Komplexität der betrachteten
Phänotypen. Um eine ausreichende statistische Aussagekraft zu erhalten müssen
deswegen bei diesem Verfahren hunderte, oft auch tausende von Individuen getestet
werden. Der damit verbundene Aufwand ist enorm (Hodge S. E. Linkage analysis
versus association analysis: distinguishing between two models that explain disease
marker associations. Am J Hum Genet. (1993) 53 : 367-84, Lander E. & Kruglyak
L. Genetic dissection of complex traits: guidelines for interpreting and reporting
linkage results. Nature Genet 11: 241-247 (1995)). Darüberhinaus ist der materielle
Aufwand und die damit verbundenen Kosten hoch. Außerdem liefert dieses
Verfahren auch im besten Fall nur eine relativ geringe Auflösung der Region, in
welcher sich das Gen (bzw. die Gene) befinden; welche bei der
Krankheitsentwicklung eine Rolle spielen. Oft ist diese Region größer als 10 cM
(dies entspricht im Mittel etwa 10 Millionen Nukleobasen). Das eigentliche
Auffinden des Gens (der Gene) erfordert daher nachfolgende, langwierige
Klonierungsverfahren. Diese beinhalten das Erstellen einer physikalischen Karte
der Region (z. B. mit Hilfe artifizieller, bakterieller Chromosomen, BAC's) und
viele aufwendige und teure Sequenzierschritte.
Die oben beschriebenen Schwierigkeiten der klassischen Nachweismethode haben
in neuerer Zeit deswegen das Interesse an neuen Verfahren geweckt. Besonderes
Augenmerk fällt dabei auf eine Methode, welche als "Genomische Mismatch
Analyse" (Genomic Mismatch Scan, GMS) bezeichnet wird (Nelson S. et al.
Genomic mismatch scanning, a new approach to genetic linkage scanning Nature
Genet 4: 11-18 (1993)). Dieses Verfahren zeichnet sich durch einige Besonderheiten
aus, welche die oben beschriebenen Nachteile der klassischen Methodik ausräumen.
Wie die klassische Methode beruht dieses Verfahren auf dem Umstand, daß
chromosomale Regionen, welche durch eine genetische Veränderung zur
Krankheitsprädisposition beitragen, bei zwei verwandten Individuen mit dem
gleichen Krankheitsphänotyp durch Abstammung identisch (IBD) sein sollten. Bei
zwei verwandten Individuen sind gewisse chromosomale Regionen IBD, da sie von
den gleichen genetischen Vorfahren stammen. Mit dem Verwandtschaftsgrad
nimmt auch der Anteil dieser Regionen ab, d. h. der Grad an Homologie der DNA
zwischen den Individuen verringert sich mit ihrem verwandtschaftlichen Abstand.
Dabei sollte aber eine Region, welche bei der Ausprägung eines
Krankheitsphänotyps eine Rolle spielt auch über abnehmende
Verwandschaftverhältnisse IBD erhalten bleiben. Im Mittel enthält die menschliche
DNA alle 100-1000 Basen eine polymorphe Stelle (Cooper D. N. et al. (1985) An
estimate of unique DNA sequence heterozygosity in the human genome. Hum Genet
69: 201-205). Nimmt man nun die DNA von zwei verwandten Individuen des
gleichen Phänotyps (z. B. Verwandte dritten, vierten oder fünften Grades) und
hybridisiert diese miteinander dann sollten nur wenige Regionen ihrer genomischen
DNA's 100% IBD sein (Zwei Kusinen haben im Mittel z. B. 1/16 ihrer DNA IBD).
Unter den homologen Fragmenten sollten sich aber solche Loci befinden, welche an
der Ausprägung des entsprechenden Phänotyps beteiligt sind.
Technisch wird diese Methode durchgeführt, indem man genomische DNA von
zwei verwandten Individuen durch Restriktionsenzyme in kleinere Fragmente
schneidet, mischt, durch Erhitzen denaturiert und dann re-naturieren läßt. Eine der
beiden DNA's wird dabei vor der Hybridisierung enzymatisch vollständig
methyliert. Das Ergebnis dieser Reaktion sind vollständig- und nicht-methylierte
Homohybride, sowie Heterohybride mit einem methylierten und einem
unmethylierten DNA Strang, welche den renaturierten DNA's beider Individuen
entsprechen. Die vollständig- bzw. nicht-methylierten, nicht informativen
Homohybride können durch geeignete spezifische Enzyme (z. B. Dpnl und Mbol)
abgebaut werden. Die verbleibenden Heterohybride bilden ein Gemisch aus
vollständig homologen Fragmenten und solchen, welche unterschiedliche
Basensequenzen aufweisen und daher "mismatches" beinhalten. Diese Mismatches
können durch geeignete Enzyme, wie z. B. das E. coli Reparaturenzym MutS,
erkannt und die mismatch enthaltende DNA eliminiert werden, so daß zuletzt nur die
vollständig homologen DNA Fragmente, welche IBD sind erhalten bleiben. Diese
können dann auf verschiedene Weise analysiert und charakterisiert werden. Ein
Enzymsystem, welches sich als besonders geeignet für dieses Verfahren erwiesen
hat ist das MutHLS mismatch Reparationssystem. Dies besteht aus drei
interagierenden Proteinen, MutS, welches Mismatches erkennt und an der Stelle des
Mismatches an die DNA bindet, MutL, welches an der DNA entlangfährt bis es eine
spezifische Erkennungssequenz (GATC) findet und MutH, welches hinter der
Erkennungssequenz einen Einzelstrangbruch erzeugt (Pang et al. The mutH, mut
mutS and uvrD genes of Salmonella typhimurium LT2. Cold Spring Harbor
Symposia on quantitative Biology (1884) 49: 597-602, Modrich et al. DNA
mismatch correction. Ann Rev Biochem (1987) 56: 435-466, Smith J and Modrich
P. (1996) Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repair proteins.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4374-4379. (Nelson S. et al. (1993) Genomic
mismatch scanning, a new approach to genetic linkage scanning Nature Genet 4: 11-
18. Cheung V. G. Nelson F. S. (1998) Genomic mismatch scanning identifies
human genomic DNA shared identical by descent Genomics 47: 1-6).
Der Vorteil von GMS gegenüber der klassischen Markeranalyse besteht auf zwei
Ebenen. Zum einen ist der Nachweis ein direkter bei dem keine aufwendigen
statistischen Analysen benötigt werden. Im Idealfall reichen zwei verwandte
Individuen gleichen Phänotyps einer Familie aus, um die Prozedur erfolgreich
durchzuführen. Damit ist der logistische und finanzielle Aufwand zur Sammlung
von Patientenmaterial erheblich verringert. Zum anderen werden bei der
Durchführung dieses Verfahrens durch die Restriktion handliche, definierte DNA
Fragmente erzeugt (z. B. werden bei einem Restriktionsenzym mit einer häufigen 4-
Basen Erkennungssequenz im Mittel Fragmente von 3000 Basen erzeugt). Diese
Fragmente lassen sich leicht analysieren und charakterisieren.
Derzeit lassen sich mit der GMS Methode genetische Loci für multifaktorielle
Phänotypen nicht nachweisen. Dies liegt zum einen an der komplexen Natur dieser
Phänotypen, welche kein klares den Mendelschen Gesetzen folgendes
Vererbungsmuster zeigen zum anderen an der Komplexität der notwendigen
molekularen Reaktionen selbst, wie z. B. der Komplexität der menschlichen DNA
und der Effizienz des eingesetzten Enzymsystems. So ist z. B. die notwendige
Separation der Mismatch enthaltenden Heterohybride an das Vorhandensein der
spezifischen Erkennungssequenz für MutL (GATC) gebunden. Dies bedeutet, daß
Fragmente, welche mismatches enthalten aber nicht diese Erkennungssequenz, nicht
eliminiert werden und erhöhen die falsch-positiv Rate des Experiments. Die
Komplexität der Krankheit erschwert ausserdem die Selektion der wirklich am
Phänotyp beteiligten Fragmente von solchen, welche IBD aber ohne phänotypische
Bedeutung sind.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende und zu lösende technische
Problem war demnach, ein effizientes und kostengünstiges Verfahren zur
Identifikation von IBD Loci für komplexe phänotypische Merkmale bereitzustellen,
welche diese Limitationen der GMS Anwendung ausräumen.
Dieses technische Problem wird durch die Bereitstellung der in den
Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Das Verfahren dient zur Identifikation chromosomaler Regionen lED zwischen
Individuen mit dem gleichen komplexen Phänotyp (z. B. einer komplexen
Erkrankung). Für das Verfahren sind die folgenden Schritte durchzuführen. a)
Restriktion der DNA von mindestens zwei, verwandten Individuen, b) Ligation
spezifischer Adaptormoleküle an die Restriktionsfragmente, c) Amplifikation der
generierten Fragmente durch PCR, d) Methylierung der DNA einer der an der
Reaktion der beteiligten Individuen, e) Hybridisierung der Fragmente von jeweils
zwei Individuen und Abbau von renaturierten Homohybriden durch
methylabhängige bzw. methylinaktivierte Restriktionsendonukleasen (z. B. Dpn1
und Mbo l) und f) durch eine spezifische Enzymreaktion werden "Mismatches"
identifiziert und die entsprechenden Fragmente eliminiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die spezifische Amplifikation der zu
untersuchenden DNA's durch eine PCR Reaktion um so genügend
Ausgangsmaterial zu erhalten. Dies wird dem erfindungsmäßigen Verfahren
entsprechend durch Addition spezifischer Adaptormoleküle (Oligonukleotide
bekannter Sequenz) nach Restriktion der DNA erreicht. Diese Adaptormoleküle
haben den Vorteil, daß hierdurch nicht nur die Restriktionsfragmente gezielt
amplifiziert werden können, sondern, daß sich die Adaptorensequenzen so wählen
lassen, daß zusätzliche Informationen in die Fragmente eingebracht werden können,
wie die Erkennungssequenzen für die bei der Eliminierung der Homohybride zu
verwendenden Restriktionsendonukleasen. Weiter können die Adaptoren z. B. die
Erkennungssequenz für das MutHLS System integrieren, um so einen vollständigen
Abbau der Mismatch enthaltenden Fragmente zu erreichen. Andere
sequenzspezifische Elemente der Adaptoren sind z. B. Sequenzen für weitere
Restriktionsendonukleasen, welche die spätere Direktklonierung der Fragmente in
geeignete Vektoren (z. B. Plasmide) zulassen. Auch können solche Adaptoren mit
Molekülen wie z. B. Biotin markiert werden, welche eine Immobilisierung der
resultierenden PCR Fragmente an einer Festphase zulassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die direkte Amplifikation mit kurzen Oligonukleotiden unterschiedlicher
Sequenzzusammensetzung (Random Priming) erreicht. Dieses Verfahren läßt mit
einigen sequenzgegebenen Ausnahmen die gleichen Manipulationen zu wie die
Adaptoren Variante. Hier kann jedoch auf eine vorherige Restriktion der DNA
verzichtet werden.
Eine weitere bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert in
vorteilhafter Weise zytogenetische und molekulargenetische Verfahren, welche es
erlauben die Komplexität des GMS Verfahrens so herabzusetzen, daß dieses
Verfahren routinemäßig angewandt werden kann um chromosomale Regionen IBD,
auch solche welche an der Entwicklung komplexer Phänotypen beteiligt sind, zu
identifizieren.
Eine weitere Möglichkeit die Komplexität der durchzuführenden
Hybridisierungsreaktionen herabzusetzen kann durch die Vorselektion von
Chromosomen der zu untersuchenden Individuen erreicht werden. Dies kann
manuell unter einem Phasenkontrastmikroskop geschehen, indem von einem
Objektträger etwa 20-40 G-Band gefärbte Chromosomen mittels einer Glaspipette
entfernt und gesammelt werden. In einer weiteren Variante kann die Abtrennung der
Chromosomen automatisch über einen Zellsorter, welcher auch die Trennung der
Chromosomen erlaubt, erfolgen. Durch diese Trennung wird die nachfolgende
GMS Reaktion wesentlich vereinfacht und spezifischer. Diese
Chromosomenpräparation ist das Ausgangsmaterial für die oben beschriebenen
Verfahrensschritte.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
nach erfolgter PCR Amplifikation der Gesamt-DNA oder der
Chromosomenpräparation aus dem Gemisch der amplifizierten DNA Fragmente
repetitive Elemente weitgehend eliminiert. Diese Eliminierung kann z. B. über die
Schmelzcharakteristik der DNA Fragmente erreicht werden. Hierzu wird die DNA
durch Hitze denaturiert und unter stringenten Bedingungen (Puffersystem,
Temperatur) renaturiert. Repetitive Elemente zeigen eine größere vm~ bei der Re
naturierung als nicht-repetitive Elemente. Die Zeit, in der die meisten repetitiven aber
nicht die uni-Sequenzfragmente renaturiert haben, läßt sich experimentell ermitteln.
Die verbleibenden einzelsträngigen Unisequenzen können stabilisiert werden (z. B.
durch niedrige Temperatur). Diese Einzelstränge können dann von den
doppelsträngigen repetitiven Elementen z. B. durch Bindung an Hydroxylapatit oder
andere Einzelstrangspezifische Moleküle von der doppelsträngigen DNA getrennt
werden (Sedat J. W., Kelly R. B. & Sinsheimer R. L. (1967) Fractionation of nucleic
acid on benzoylated-naphtoylated DEAE cellulose. J Mol Biol 26: 537-540).
In einer weiteren bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens können
repetitive Elemente durch Absättigung mit kurzen Sonden der gängigen repetitiven
Sequenzen (Alu, Di-, Tri, Tetra nukleotidsequenzen) aus dem Gemisch entfernt
werden. Dazu können diese Sonden mit Molekülen markiert werden, welche die
Bindung an eine feste Matrix erlauben (z. B. Biotin).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu
dem die Heterohybride enthaltenen Gemisch nach erfolgter Amplifikation und
Abbau der Homohybride das Protein MutS zugegeben, um an die Mismatches zu
binden. Der Protein/DNA Komplex wird dann bei dieser bevorzugten
Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens direkt an eine
proteinbindende Oberfläche (z. B. PVDF-Membran, reversed phase Säule)
gebunden und so von der nicht-komplexierten DNA getrennt.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird der MutS Protein/DNA
Komplex an spezifische Antikörper gebunden und durch eine Immunopräzipitation
von der freien DNA getrennt. Die Antikörper werden in einer bevorzugten
Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens an eine Matrix innerhalb einer
Säule gebunden. Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die
an MutS gebundene DNA dann über diese Säule durch die Antikörperbindung von
den nicht MutS gebundenen, vollständig homologen DNA Fragmenten getrennt.
Genomische DNA von drei verwandten Individuen, von denen zwei sich durch den
gleichen Phänotyp und das dritte durch die Abwesenheit dieses Phänotyps
auszeichnen, wird nach Standardmethoden (z. B. Phenol-Chloroform Extraktion)
extrahiert. Die DNA's werden getrennt mit einer relativ häufig schneidenden
Restriktionsendonuklease (z. B. Pst1) geschnitten. Zu diesen
Restriktionsfragmenten werden dann Adaptoren hinzupipettiert, welche für den
enstandenen Restriktionsüberhang komplementär sind und an die
Restriktionsfragmente ligiert. Die Sequenz der Adaptoren ist dabei so gewählt, daß
sie die folgenden Elemente enthalten: a) Erkennungssequenzen für methylabhängige
bzw. Methylinaktivierte Endonukleasen (z. B. Dpn1 und Nde1), b)
Erkennungssequenz für MutH und c) die Erkennungssequenz für eine
Restriktionsendonuklease (z. B. Kpn1), welche die Klonierung in einen
Plasmidvektor des Typs BlueScript zulassen. Nach erfolgter Hybridisierung und
Ligation der Adaptoren an die Restriktionsfragmente werden die Fragmente durch
Zugabe adaptorspezifischer, komplementärer Oligonukleotide durch PCR
amplifiziert.
Die Amplifikationsprodukte eines des an der Reaktion beteiligten Individuums mit
dem betrachteten Phänotyp wird dann mittels Dam Methylase an den Adenin Basen
methyliert. Danach werden jeweils die PCR Produkte dieses Individiums mit denen
der anderen beiden Individuen zusammenpipettiert. Durch Hitzedenaturierung und
anschließende Renaturierung der DNA Fragmente in einem speziellen
Reaktionspuffer werden Heteroduplexes aus der DNA der zwei verschiedenen
Individuen gebildet, welche auf einem der beiden DNA Stränge eine Methylierung
aufweisen (Casna et al. (1986) genomic analysis II, isolation of high molecular
weight heteroduplex DNA following methylase protectiori and formamide PERT
hybridization Nucleic Acids Res. 14: 7285-7303). Daneben entstehen, aus der
Hybridisation der DNA's der beiden Individuen untereinander vollständig
methylierte und nicht-methylierte Homohybride. Zu diesen Hybrid DNA's wird eine
methylabhängige Endonuklease (z. B. Dpn1) sowie eine methylinaktivierte
Endonuklease (z. B. Nde1) hinzugegeben. Durch das Einbringen der
Erkennungssequenzen für die beiden Enzyme in die Adaptoren wird ein
vollständiger Verdau der Homohybride gewährleistet. Die geschnittenen
Homohybridmoleküle werden dann durch eine Exonuklease (z. B. Exo3) weiter
abgebaut und durch Bindung an eine Einzelstrangspezifische Matrix (z. B. BNDC)
aus dem Gemisch entfernt.
Zu den verbliebenen Hybrid DNA Molekülen werden MutS, MutL und MutH
hinzupipettiert. MutS bindet an etwaige Mismatches innerhalb der DNA Fragmente
und propagiert die Bindung von MutL und Mutil was zum Schneiden der DNA an
der spezifischen Erkennungssequenz GATC führt. Da diese Sequenz als Teil des
Adaptormoleküls in die DNA eingeführt wurde, wird gewährleistet, daß alle
Mismatch enthaltenden DNA Fragmente geschnitten werden. Wie nach Restriktion
der Homohybride werden die Schnitte durch eine Exonuklease erweitert und über
ein einzelstrang-bindendes System (z. B. BNDC) aus dem Gemisch entfernt. Durch
dieses Verfahren wurde eine Anreicherung von absolut homologen IBD Fragmenten
erreicht.
Die Analyse der verbliebenen Fragmente wird über ihre direkte Klonierung in einen
Vektor (z. B. BlueScript) erreicht. Die nach der bakteriellen Amplifikation erhaltenen
Klone können z. B. der Direktsequenzierung zugeführt werden oder durch
Hybridisierung mit einem geordnetem cDNA Array auf kodierende Sequenzen hin
untersucht werden.
Ausgehend von Chromosomenpräparationen G-band gefärbter Mitosechromosomen
von drei verwandten Individuen, von denen zwei sich durch den gleichen Phänotyp
und das dritte durch die Abwesenheit dieses Phänotyps auszeichnen, werden von
jedem Individium 20-40 Exemplare eines jeden Chromosoms mittels einer
Glaspipette isoliert. Für jedes der 23 Chromosomenexemplare wird ein getrenntes
Gefäß (z. B. Eppendorf Reaktionsgefäß) bereitgestellt, in welches die 20-40
isolierten Chromosomen überführt werden.
Die so nach Chromosomen geordneten DNA's werden für jedes Individuum
getrennt mit einer relativ häufig schneidenden Restriktionsendonuklease (z. B. Pst1)
geschnitten. Zu diesen Restriktionsfragmenten werden dann Adaptoren
hinzupipettiert, welche für den enstandenen Restriktionsüberhang komplementär
sind und an die Restriktionsfragmente ligiert. Die Sequenz der Adaptoren ist dabei
so gewählt, daß sie die folgenden Elemente enthalten: a) Erkennungssequenzen für
Dpn1 und Nde1, b) Erkennungssequenz für MutH und c) die Erkennungssequenz
für eine Restriktionsendonuklease (z. B. Kpnl), welche die Klonierung in einen
Plasmidvektor des Typs BlueScript zulassen. Nach erfolgter Ligation der Adaptoren
werden die Fragmente durch Zugabe adaptorspezifischer, komplementärer
Oligonukleotide durch PCR ampliiiziert.
Die chromosomenspezifischen Amplifikationsprodukte eines der beiden Individuen
mit dem betrachteten Phänotyp wird dann mittels Dam Methylase an den Adenin
Basen methyliert. Danach werden jeweils die PCR Produkte dieses Individiums
immer getrennt nach Chromosomen mit denen der anderen beiden Individuen
zusammenpipettiert d. h. bei der Hybridisierung von drei Individuen werden 46
(2 × 23 Chromosomen) unabhängige Hybridisierungsreaktionen vorgenommen.
Durch Hitzedenaturierung und anschließender Renaturierung der DNA Fragmente in
einem speziellen Reaktionspuffer werden Heteroduplexes aus der DNA der zwei
verschiedenen Individuen gebildet, welche auf einem der beiden DNA Stränge eine
Methylierung aufweisen (Casna et al. (1986) Genomic analysis II, isolation of high
molecular weight heteroduplex DNA following methylase protection and formamide
PERT hybridization Nucleic Acids Res. 14: 7285-7303). Daneben entstehen aus der
Hybridsiaflon der DNA's der beiden Individuen untereinander vollständig
methylierte und nicht-methylierte Homohybride. Zu diesen Hybrid DNA's wird die
methylabhängige Endonuklease Dpn1, sowie die methylinaktivierte Endonuklease
Nde1 hinzugegeben. Durch das Einbringen der Erkennungssequenzen für die
beiden Enzyme in die Adaptoren wird so ein vollständiger Verdau der Homohybride
gewährleistet. Die geschnittenen Homohybridmoleküle werden dann durch eine
Exonuklease (z. B. Exo3) weiter abgebaut und durch Bindung an eine
einzelstrangspezifische Matrix (z. B. BNDC) aus dem Gemisch entfernt.
Zu den verbliebenen Hybrid DNA Molekülen werden MutS, MutL und Mutil
hinzupipettiert. MutS bindet an etwaige Mismatches innerhalb der DNA Fragmente
und propagiert die Bindung von MutL und MutH, was zum Schneiden der DNA an
der spezifischen Erkennungssequenz GATC führt. Da diese Sequenz als Teil des
Adaptormoleküls in die DNA eingeführt wurde, wird gewährleistet, daß alle
Mismatch enthaltenden DNA Fragmente geschnitten werden. Wie nach Restriktion
der Homohybride werden die Schnitte durch eine Exonuklease erweitert und über
BNDC aus dem Gemisch entfernt. Durch dieses Verfahren wird eine Anreicherung
von absolut homologen IBD Fragmenten erreicht.
Die Analyse der verbliebenen Fragmente wird über ihre direkte Klonierung in einen
Vektor (z. B. BlueScript) erreicht. Die nach der bakteriellen Amplifikation erhaltenen
Klone können z. B. der Direktsequenzierung zugeführt werden oder durch
Hybridisierung mit einem geordnetem cDNA Array auf kodierende Sequenzen hin
untersucht werden.
Genomische DNA von drei verwandten Individuen, von denen zwei sich durch den
gleichen Phänotyp und das dritte durch die Abwesenheit dieses Phänotyps
auszeichnen, wird nach Standardmethoden (z. B. Phenol-Chloroform Extraktion)
extrahiert. Die DNA's werden getrennt mit einer relativ häufig schneidenden
Restriktionsendonuklease (z. B. Pst1) geschnitten. Zu diesen
Restriktionsfragmenten werden dann Adaptoren hinzupipettiert, welche für den
enstandenen Restriktionsüberhang komplementär sind und an die
Restriktionsfragmente ligiert. Die Sequenz der Adaptoren ist dabei so gewählt, daß
sie die folgenden Elemente enthalten: a) Erkennungssequenzen für Dpn1 und Nde1,
b) Erkennungssequenz für MutH und c) die Erkennungssequenz für eine
Restriktionsendonuklease (z. B. Kpn1), welche die Klonierung in einen
Plasmidvektor (z. B. BlueScript) zulassen. Nach erfolgten Ligation der Adaptoren
werden die Fragmente durch Zugabe adaptorspezifischer, komplementärer
Oligonukleotide durch PCR amplifiziert.
Die Amplifikationsprodukte eines der beiden Individuen mit dem betrachteten
Phänotyp wird dann mittels Dam Methylase an den Adenin Basen methyliert.
Danach werden jeweils die PCR Produkte dieses Individiums mit denen der anderen
beiden Individuen zusammenpipettiert. Durch Hitzedenaturierung und anschließende
Renaturierung der DNA Fragmente in einem speziellen Reaktionspuffer werden
Heteroduplexes aus der DNA der zwei verschiedenen Individuen gebildet, welche
auf einem der beiden DNA Stränge eine Methylierung aufweisen (Casna et al.
(1986) genomic analysis II, isolation of high molecular weight heteroduplex DNA
following methylase protection and formamide PERT hybridization Nucleic Acids
Res. 14: 7285-7303). Daneben entstehen aus der Hybridsiation der DNA's der
beiden Individuen untereinander vollständig methylierte und nicht-methylierte
Homohybride. Zu diesen Hybrid DNA's wird die methylabhängige Endonuklease
Dpn1, sowie die methylinaktivierte Endonuklease Nde1 hinzugegeben. Durch das
Einbringen der Erkennungssequenzen für die beiden Enzyme in die Adaptoren wird
so ein vollständiger Verdau der Homohybride gewährleistet. Die geschnittenen
Homohybridmoleküle werden dann durch eine Exonuklease (z. B. Exo3) weiter
abgebaut und durch Bindung an eine einzelstrangspezifische Matrix (z. B. BNDC)
aus dem Gemisch entfernt.
Zu den verbliebenen Heterohybriden wird MutS hinzupipettiert, welches an
"mismatch" enthaltende Fragmente bindet. Über eine Säule, in welcher der
DNA/Protein Komplex nicht aber die freie DNA an eine Matrix gebunden wird,
wird die "mismatch" enthaltende DNA, gebunden an das mismatch erkennende
Protein, aus dem Gemisch entfernt.
Die Analyse der verbliebenen Fragmente wird über ihre direkte Klonierung in einen
Vektor (z. B. BlueScript) erreicht. Die nach der bakteriellen Amplifikation erhaltenen
Klone können z. B. der Direktsequenzierung zugeführt werden oder durch
Hybridisierung mit einem geordnetem cDNA oder Mikrosatelliten Array auf
kodierende Sequenzen hin untersucht werden.
Ein wichtiges Gebiet der modernen Tierzucht ist die Optimierung bestimmter,
quantitativer Merkmale von landwirtschaftlichen Nutztieren (z. B. Rindern,
Schweinen, Schafen). Auch hier kann das vorgestellte erfindungsgemäße Verfahren
vorteilhaft angewandt werden. Das folgende Beispiel zeigt eine mögliche
Anwendung bei der Qualitätsoptimierung für Milch in der Käseverarbeitung.
Ein wichtiges quantitatives Merkmal bei der Auswahl von Milch für die
Verarbeitung zu Käse ist der Caseingehalt. Je höher dieser liegt desto größer ist die
Käseausbeute. Bei der Anwendung von GMS wird genomische DNA von
mindestens zwei verwandten Tieren, ausgezeichnet durch einen
überdurchschittlichen Caseingehalt der Milch, nach Standardmethoden (z. B. Phenol-
Chloroform) extrahiert und mit einer häufig schneidenden Restriktionsendonuklease
(z. B. Pst1) verdaut. Zu diesen Restriktionsfragmenten werden dann Adaptoren
hinzupipettiert, welche für den enstandenen Restriktionsüberhang komplementär
sind und mittels Hybridisierung und Zugabe einer Ligase an die Restriktions
fragmente ligiert werden. Die Sequenz der Adaptoren ist dabei so gewählt, daß sie
mindestens die folgenden Sequenzelemente enthalten: a) Erkennungssequenzen für
methylabhängige bzw. Methylinaktivierte Endonukleasen (z. B. Dpn1 und Nde1)
und b) Erkennungssequenz für den MutLH Komplex. Nach erfolgter Ligation der
Adaptoren werden die DNA Fragmente durch Zugabe' adaptorspezifischer,
komplementärer Oligonukleotide durch PCR amplifiziert.
Die Amplifikationsprodukte der DNA eines der beiden Tiere, welches hohe
caseinhaltige Milch gibt, wird dann mittels Dam Methylase an den Adenin Basen
methyliert. Danach werden jeweils die PCR Produkte dieses Tieres mit denen des
anderen Tieres zusammenpipettiert. Durch Hitzedenaturierung und anschließende
Renaturierung der DNA Fragmente in einem speziellen Reaktionspuffer werden
Heteroduplexes aus der DNA der zwei verschiedenen Individuen gebildet, welche
auf einem der beiden DNA Stränge eine Methylierung aufweisen (Casna et al.
(1986) genomic analysis II, isolation of high molecular weight heteroduplex DNA
following methylase protection and formamide PERT hybridization Nucleic Acids
Res. 14: 7285-7303). Daneben entstehen aus der Hybridisation der DNA's der
beiden Individuen untereinander vollständig methylierte und nicht-methylierte
Homohybride. Zu diesen Hybrid DNA's wird eine methyläbhängige Endonuklease
(z. B. Dpn1), sowie eine methylinaktivierte Endonuklease (z. B.: Nde1)
hinzugegeben. Durch das Einbringen der Erkennungssequenzen für die beiden
Enzyme in die Adaptoren wird ein vollständiger Verdau der Homohybride
gewährleistet. Die geschnittenen Homohybridmoleküle werden dann durch eine
Exonuklease (z. B. Exo3) weiter abgebaut und durch Bindung an eine
einzelstrangspezifische Matrix (z. B. BNDC) aus dem Gemisch entfernt. Zu den
verbliebenen Hybrid DNA Molekülen werden MutS, MutL und MutH
hinzupipettiert. MutS bindet an etwaige Mismatches innerhalb der DNA Fragmente
und propagiert die Bindung von MutL und MutH, was zum Schneiden der DNA an
der spezifischen Erkennungssequenz GATC führt. Da diese Sequenz als Teil des
Adaptormoleküls in die DNA eingeführt wurde, wird gewährleistet, daß alle
Mismatch enthaltenden DNA Fragmente geschnitten werden. Wie nach Restriktion
der Homohybride werden die Schnitte durch eine Exonuklease erweitert und über
BNDC aus dem Gemisch entfernt. Durch dieses Verfahren wird eine Anreicherung
von absolut homologen IBD Fragmenten erreicht unter denen sich auch die Loci
befinden, welche für die Caseinproduktion verantwortlich sind. Diese können durch
Bindung z. B. an ein cDNA Array identifiziert werden.
Genomische DNA von drei verwandten Individuen, von denen zwei sich durch den
gleichen Krankheitsphänotyp und das dritte durch die Abwesenheit dieses
Phänotyps auszeichnen, wird nach Standardmethoden (z. B. Phenol-Chloroform
Extraktion) extrahiert. Die DNA's werden getrennt mit einer relativ häufig
schneidenden Restriktionsendonuklease (z. B. Pst1) geschnitten. Zu diesen
Restriktionsfragmenten werden dann Adaptoren hinzupipettiert, welche für den
enstandenen Restriktionsüberhang komplementär sind und an die
Restriktionsfragmente ligiert. Die Sequenz der Adaptoren ist dabei so gewählt, daß
sie mindestens die folgenden Elemente enthalten: a) Erkennungssequenzen für
methylabhängige bzw. Methylinaktivierte Endonukleasen (z. B. Dpn1 und Nde1), b)
Erkennungssequenz für den MutLH Komplex und c) eine chemische Aktivität (z. B.
Radioaktivität, Fluorophor), welche den Nachweis der Fragmente erlaubt. Nach
erfolgter Hybridisierung und Ligation der Adaptoren an die Restriktionsfragmente
werden die Fragmente durch Zugabe adaptorspezifischer, komplementärer
Oligonukleotide durch PCR amplifiziert.
Die Amplifikationsprodukte eines der Individuen mit dem betrachteten
Krankheitsphänotyp wird dann mittels Dam Methylase an den Adenin Basen
methyliert. Danach werden jeweils getrennt die PCR Produkte dieses Individuums
mit denen der anderen beiden Individuen zusammenpipettiert. Durch
Hitzedenaturierung und anschließende Renaturierung der DNA Fragmente in einem
speziellen Reaktionspuffer werden Heteroduplexes aus der DNA der zwei
verschiedenen Individuen gebildet, welche auf einem der beiden DNA Stränge eine
Methylierung aufweisen (Casna et al. (1986) genomic analysis II, isolation of high
molecular weight heteroduplex DNA following methylase proteetion and formamide
PERT hybridization Nucleic Acids Res. 14: 7285-7303). Daneben entstehen aus der
Hybridisation der DNA's der beiden Individuen untereinander vollständig
methylierte und nicht-methylierte Homohybride. Zu diesen Hybrid DNA's wird eine
methylabhängige Endonuklease (z. B. Dpn1), sowie eine methylinaktivierte
Endonuklease (z. B. Nde1) hinzugegeben. Durch das Einbringen der
Erkennungssequenzen für die beiden Enzyme in die Adaptoren wird so ein
vollständiger Verdau der Homohybride gewährleistet. Die geschnittenen
Homohybridmoleküle werden dann durch eine Exonuklease (z. B. Exo3) Weiter
abgebaut und durch Bindung an eine einzelstrangspezifische Matrix (z. B. BNDC)
aus dem Gemisch entfernt.
Zu den verbliebenen Hybrid DNA Molekülen werden MutS, MutL und MutH
hinzupipettiert. MutS bindet an etwaige Mismatches innerhalb der DNA Fragmente
und propagiert die Bindung von MutL und MutH was zum Schneiden der DNA an
der spezifischen Erkennungssequenz GATC führt. Da diese Sequenz als Teil des
Adaptormoleküls in die DNA eingeführt wurde, wird gewährleistet, daß alle
Mismatch enthaltenden DNA Fragmente geschnitten werden. Wie nach Restriktion
der Homohybride werden die Schnitte durch eine Exonuklease erweitert und über
BNDC aus dem Gemisch entfernt. Durch dieses Verfahren wurde eine
Anreicherung von absolut homologen IBD Fragmenten erreicht.
Auf einer festen Oberfläche (z. B. einem komerziell erhältlichen Glaschip oder in
einer Mikrotiterplatte mittels kovalenter Bindung) werden spezifische
Oligonukleotide (oder zur Erhöhung der Spezifität Peptidnukleinsäuren (PNA's))
für eine definierte Anzahl von Mikrosatelliten gebunden. Gegen dieses DNA array
werden die verbliebenen Produkte aus der GMS Reaktion hybridisiert. Nach
entsprechenden Waschschritten sind nach diesem Vorgang solche GMS Produkte an
den chip gebunden, welche homologe Bereiche zu den
mikrosatellitenmarkerspezifischen Oligonukleotiden aufweisen. Diese können durch
die in die Adaptorsequenz eingebrachte chemische Aktivität nachgewiesen werden.
Der Vergleich der Hybridisierungsexperimente zwischen dem krank-kranken und
krank-gesunden Paar, wird dabei zur Identifikation krankheitsrelevanter Fragmente
genutzt.
Claims (11)
1. Verfahren zur Identifikation von chromosomalen Regionen "identical by
descent" zwischen Individuen mit gleichen quantitativen oder qualitativen
phänotypischen Merkmalen, ausgezeichnet dadurch; daß folgende
Verfahrensschritte ausgeführt werden:
a) die DNA von mindestens zwei, verwandten Individuen durch Restriktionsendonukleasen geschnitten werden, b) spezifische Adaptormoleküle, ausgezeichnet durch die Einführung von Sequenzen, welche den Erkennungssequenzen einer methyl-abhängigen Restriktionsendonuklease (z. B. Dpn1) und eines methylinaktivierten Restriktionsenzyms, sowie der Erkennungs sequenz für z. B. MutL entsprechen, an die Restriktionsfragmente ligiert werden, c) die generierten Fragmente durch eine PCR amplifiziert werden, d) die DNA eines der an der Reaktion beteiligten Individuen methyliert wird, e) Heteroduplexes aus den Amplifikationsprodukten zweier Individuen gebildet werden, f) renaturierte Homohybriden durch methylabhängige bzw. methylinaktivierte Restriktionsendonukleasen abgebaut werden, g) durch eine spezifische Reaküön ein "mismatch" erkennendes Protein an die DNA gebunden und dadurch entfernt wird h) und die übriggebliebene DNA-Fragmente, die für die untersuchten Phänotypen charakteristischen IBD-DNAs enthält.
a) die DNA von mindestens zwei, verwandten Individuen durch Restriktionsendonukleasen geschnitten werden, b) spezifische Adaptormoleküle, ausgezeichnet durch die Einführung von Sequenzen, welche den Erkennungssequenzen einer methyl-abhängigen Restriktionsendonuklease (z. B. Dpn1) und eines methylinaktivierten Restriktionsenzyms, sowie der Erkennungs sequenz für z. B. MutL entsprechen, an die Restriktionsfragmente ligiert werden, c) die generierten Fragmente durch eine PCR amplifiziert werden, d) die DNA eines der an der Reaktion beteiligten Individuen methyliert wird, e) Heteroduplexes aus den Amplifikationsprodukten zweier Individuen gebildet werden, f) renaturierte Homohybriden durch methylabhängige bzw. methylinaktivierte Restriktionsendonukleasen abgebaut werden, g) durch eine spezifische Reaküön ein "mismatch" erkennendes Protein an die DNA gebunden und dadurch entfernt wird h) und die übriggebliebene DNA-Fragmente, die für die untersuchten Phänotypen charakteristischen IBD-DNAs enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch ausgezeichnet, daß es sich bei der in a)
geschnittenen DNA um sortierte Chromosomen handelt, welche in jeweils
getrennten Reaktionsgefäßen weiterbehandelt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch ausgezeichnet, daß in die in
Verfahrensschritt b) eingesetzten Adaptormoleküle eine Restriktionsschnittstelle zum
direktklonieren der amplifizierten Produkte enthalten.
4. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch ausgezeichnet, daß das "mismatch"
bindende Enzym in g) MutS ist.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1.-4. dadurch ausgezeichnet, daß nach der
Bindung von MutS an die DNA diese durch Zugabe von MutL und MutH
geschnitten wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch ausgezeichnet, daß anstelle der in b)
beschriebenen Adaptormoleküle ein "random priming" mit kurzen
Oligonukleotiden durchgeführt wird, welche die spezifischen Erkennungssequenzen
tragen und eine Amplifikation ohne vorherige Ligation erlauben.
7. Verfahren nach Anspruch 1. bei dem die in b) hergestellten Adaptormoleküle
mit einer chemischen Funktion versehen werden, welche die Bindung an eine
Oberfläche zuläßt.
8. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch ausgezeichnet, daß nach der nach
Anspruch 4. erfolgten Bindung von MutS an die mismatch enthaltenden DNA's
diese Protein/DNA Hybride über eine Festphase, welche die spezifische Bindung
des Proteins erlaubt, aus der Reaktion entfernt werden.
9. Kit für das Verfahren nach den Ansprüchen 1.-8., bestehend aus der
Kontroll-DNA von 3 verschiedenen Individuen zur Positivkontrolle,
Restriktionsendonukleasen um einen spezifischen Verdau durchzuführen,
spezifische Adaptoren mit den in 1. Ausgeführten Sequenzspezifikationen, um
die IBD Fragmente zu identifizieren.
10. Kit für das Verfahren nach den Ansprüchen 1.-9. einen DNA-chip zur
Identifikation der IBD Fragmente enthaltend.
11. Kit für das Verfahren nach Anspruch 10., dadurch ausgezeichnet, dass
die Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA-chip den Primersequenzen
bekannter Mikrosatellitenmarker entsprechen.
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001083813A1 (en) * | 2000-05-02 | 2001-11-08 | Centre National De La Recherche Scientifique | Identification of genetic markers |
WO2002029095A1 (de) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Axaron Bioscience Ag | Verfahren zur mutationsanalyse |
EP1293576A1 (de) * | 2001-09-18 | 2003-03-19 | Integragen | Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis von Haplotypen |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002535999A (ja) * | 1999-02-05 | 2002-10-29 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | ゲノム分析方法 |
US7166432B2 (en) * | 1999-03-12 | 2007-01-23 | Integragen | Compositions and methods for genetic analysis |
DE10017675A1 (de) * | 2000-04-08 | 2001-12-06 | Qtl Ag Ges Zur Erforschung Kom | Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht |
US7032817B2 (en) * | 2000-06-23 | 2006-04-25 | Arthur Blank & Company, Inc. | Transaction card with shaped edge |
EE200100112A (et) * | 2001-02-23 | 2002-10-15 | Tartu Ülikool | Meetod DNA järjestuste variatsioonide leidmiseks |
FR2856410B1 (fr) * | 2003-06-20 | 2007-06-15 | Integragen Sa | Methodes de preparation de puces genetiques et utilisations |
CA2560242A1 (en) * | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Integragen | Human obesity susceptibility genes encoding peptide hormones and uses thereof |
US20090208482A1 (en) * | 2004-11-23 | 2009-08-20 | Anne Philippi | Human obesity susceptibility gene encoding a member of the neurexin family and uses thereof |
US20080213765A1 (en) * | 2005-02-28 | 2008-09-04 | Integragen | Human Autism Susceptibility Genes Encoding a Neurotransmitter Transporter and Uses Thereof |
DE602006017045D1 (de) * | 2005-03-24 | 2010-11-04 | Integragen Sa | Ein transmembranprotein kodierendes humanes autismus-suszeptibilitätsgen und dessen verwendung |
EP2302070B1 (de) | 2005-06-23 | 2012-08-22 | Keygene N.V. | Strategien für eine hohe Durchsatzidentifikation und Erkennung von Polymorphismen |
US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
ES2338459T5 (es) | 2005-09-29 | 2014-02-24 | Keygene N.V. | Exploración de alto rendimiento de poblaciones mutagenizadas |
EP2363504A1 (de) | 2005-12-22 | 2011-09-07 | Keygene N.V. | Auf AFLP basierendes Hochdurchsatzverfahren zur Polymorphismuserkennung |
US20090253581A1 (en) | 2006-04-04 | 2009-10-08 | Keygene N.V. | High Throughput Detection of Molecular Markers Based on AFLP and High Throughput Sequencing |
US20080228700A1 (en) | 2007-03-16 | 2008-09-18 | Expanse Networks, Inc. | Attribute Combination Discovery |
EP3276526A1 (de) | 2008-12-31 | 2018-01-31 | 23Andme, Inc. | Suche nach verwandten in einer datenbank |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6107023A (en) * | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
US5556750A (en) | 1989-05-12 | 1996-09-17 | Duke University | Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems |
US5750335A (en) | 1992-04-24 | 1998-05-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Screening for genetic variation |
US5376526A (en) | 1992-05-06 | 1994-12-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genomic mismatch scanning |
FR2709761B1 (fr) | 1993-09-10 | 1995-11-24 | Pasteur Institut | Procédé de détection de molécules contenant des mésappariements nucléotidiques et de localisation de ces mésappariements, et application à la détection de substitutions ou de délétions de bases . |
US6027877A (en) * | 1993-11-04 | 2000-02-22 | Gene Check, Inc. | Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, purification of amplified DNA samples and allele identification |
JPH10509594A (ja) * | 1994-11-28 | 1998-09-22 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー |
SE9500341D0 (sv) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | Ulf Landegren | Method for detecting DNA sequence variations |
JPH11506937A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-06-22 | ジェンザイム・コーポレーション | Dnaの配列決定およびポジショナルクローニングを含む、dnaの遺伝子的修飾を特定する方法 |
GB9724480D0 (en) | 1997-11-19 | 1998-01-14 | Hexagen Technology Limited | Screening process |
US6150112A (en) * | 1998-09-18 | 2000-11-21 | Yale University | Methods for identifying DNA sequences for use in comparison of DNA samples by their lack of polymorphism using Y shape adaptors |
US6287825B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-09-11 | Molecular Staging Inc. | Methods for reducing the complexity of DNA sequences |
JP2002535999A (ja) * | 1999-02-05 | 2002-10-29 | アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド | ゲノム分析方法 |
US6524794B1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-02-25 | Decode Genetics Ehf. | Identical-by-descent fragment enrichment |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Enrichment for Loci identical-by-descent between pairs of mouse or human genomes by genomic mis- match scanning. Mcallister,L. et al. (1998) 47:7- 11 * |
Katalog 98/99 der Firma Clontech, Palo Alto, Cali-fornia, USA, S.29 (1998) * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001083813A1 (en) * | 2000-05-02 | 2001-11-08 | Centre National De La Recherche Scientifique | Identification of genetic markers |
WO2002029095A1 (de) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Axaron Bioscience Ag | Verfahren zur mutationsanalyse |
EP1293576A1 (de) * | 2001-09-18 | 2003-03-19 | Integragen | Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis von Haplotypen |
WO2003025221A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-03-27 | Integragen | Compositions and methods to identify haplotypes |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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---|---|---|
DE19911130A1 (de) | Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene | |
DE69230873T3 (de) | Selektive Restriktionsfragmentenamplifikation: generelles Verfahren für DNS-Fingerprinting | |
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