ES2228480T3 - Composiciones y procedimientos para analisis genetico. - Google Patents
Composiciones y procedimientos para analisis genetico.Info
- Publication number
- ES2228480T3 ES2228480T3 ES00912573T ES00912573T ES2228480T3 ES 2228480 T3 ES2228480 T3 ES 2228480T3 ES 00912573 T ES00912573 T ES 00912573T ES 00912573 T ES00912573 T ES 00912573T ES 2228480 T3 ES2228480 T3 ES 2228480T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fragments
- dna
- populations
- nucleic acid
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Procedimiento para la identificación (o aislamiento o separación) de fragmentos idénticos de ácido nucleicos de una mezcla de por lo menos dos poblaciones de ácido nucleico, que comprende: a) digerir por separado los ácidos nucleicos de dichas por lo menos dos poblaciones con por lo menos una enzima de restricción; b) ligar una secuencia adaptadora específica a los fragmentos de restricción; c) amplificar los fragmentos de restricción ligados a la secuencia adaptadora generados en a) y b) usando unos cebadores específicos para la secuencia adaptadora marcados de distinto modo; d) hibridar los productos de amplificación procedentes de las diferentes poblaciones de ácidos nucleicos entre sí; e) eliminar los homohíbridos basándose en el marcaje de los cebadores; e f) identificar (o aislar o separar) los fragmentos heterohíbridos idénticos, completamente emparejados.
Description
Composiciones y procedimientos para análisis
genético.
La presente invención se refiere al campo del
genoma y el análisis genético, más particularmente al mapeo genético
de caracteres cuantitativos y cualitativos complejos. Más
particularmente, la presente invención proporciona composiciones y
procedimientos para analizar la información genética procedente de
diferentes orígenes, con el fin de identificar genes o mutaciones
terapéuticos relevantes. La presente invención se refiere más
particularmente a composiciones y procedimientos para identificar
fragmentos de ADN idénticos procedentes de diferentes orígenes de
ADN. El procedimiento permite la separación de ADN perfectamente
emparejado de ADN imperfectamente emparejado o de ADN formado
mediante hibridación del mismo origen (por ejemplo, homohíbridos).
El procedimiento representa variantes alternativas y/o mejoradas del
Genomic Mismatch Scanning (rastreo genómico de emparejamientos
erróneos) (GMS), y proporciona mejoras significativas con respecto
al procedimiento de GMS, permitiendo trabajar con pequeñas
cantidades de partida de ADN, amplificación específica, menor coste
y menor número de etapas de reacción.
Un reto principal para la biología y la medicina
en la actualidad es la identificación de los genes que participan en
enfermedades humanas, complejas y comunes, como el asma, la diabetes
mellitus de tipo 2, la obesidad, etc. La identificación de tales
genes normalmente se lleva a cabo realizando estudios de ligamiento
y/o asociación en grandes muestras de pacientes o familias. Estos
estudios pueden realizarse utilizando una variedad de marcadores
genéticos (secuencias en el genoma que difieren entre individuos, es
decir, que son polimórficas). Los polimorfismos más extendidos
utilizados son los marcadores microsatélite que consisten en cortas
secuencias repetidas específicas o polimorfismos de un único
nucleótido (SNP) que difieren en sólo un nucleótido. Se han
desarrollado diferentes tecnologías de análisis para determinar el
genotipo de esos marcadores como, la electroforesis en gel, la
hibridación de ADN en formación ordenada, identificación utilizando
espectrometría de masas.
El principal objetivo de la genética es asociar
un fenotipo (es decir, una característica que se puede medir,
cualitativa o cuantitativa, de un organismo) a un gen o un número de
genes. Históricamente, existen dos enfoques genéticos que se aplican
para identificar los loci genéticos responsables de un fenotipo, los
estudios de asociación y los estudios de ligamiento en familias.
Cualquiera que sea el enfoque, los estudios genéticos se basan en
polimorfismos, es decir, diferencias de bases en la secuencia de ADN
entre dos individuos en el mismo locus genético. La existencia de
diferencias en la secuencia para el mismo locus genético se denomina
variación alélica. Se sabe desde hace mucho tiempo que diferentes
alelos de un gen pueden dar como resultado una expresión diferente
de un fenotipo dado.
El análisis de ligamiento ha sido el
procedimiento de elección para identificar los genes implicados en
muchas enfermedades, tanto monogénicas como multigénicas, pero en
las que sólo está implicado un gen para cada paciente. El análisis
de ligamiento sigue la herencia de alelos en una familia y trata de
ligar ciertos alelos a un fenotipo (por ejemplo, una enfermedad). En
otras palabras, se buscan alelos compartidos entre individuos con el
mismo fenotipo que sean idénticos por ascendencia (IBD), es decir,
que se deriven del mismo ancestro. Con el fin de ser razonablemente
potente en el análisis estadístico, los polimorfismos estudiados
tienen que cumplir varios criterios:
- alta heterocigosidad, es decir, existen muchos
alelos para un locus dado (esto aumenta la capacidad de
información);
- amplia representación del genoma;
- detectables con los procedimientos estándar de
laboratorio.
Un tipo de polimorfismos que cumple la mayoría de
estos criterios es un marcador microsatélite. Éstos son elementos de
secuencia repetidos de dos (por ejemplo, CA), tres o cuatro bases.
El número de repeticiones es variable para un locus dado, lo que da
como resultado un elevado número de alelos posibles, es decir, alta
heterocigosidad (70 - 90%). Están ampliamente distribuidos en el
genoma. En la actualidad se han identificado y mapeado casi 20.000
marcadores microsatélite (cobertura de aproximadamente 0,5 - 2
Mbases).
Los marcadores microsatélite son todavía los
marcadores genéticos de elección para los análisis de ligamiento. La
determinación del genotipo de esos marcadores se realiza
amplificando los alelos por PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) y separación por tamaños en una matriz de gel (gel en
placa o capilar). Para el estudio de enfermedades humanas complejas
normalmente se utilizan entre 400 y 600 marcadores microsatélite que
se distribuyen a distancias regulares en todo el genoma
(aproximadamente cada 10 a 15 megabases).
Las ventajas de los estudios de ligamento en
familias incluyen sistemas de marcadores establecidos y bien
mapeados (marcadores microsatélite); las herramientas de análisis
estadístico están relativamente bien desarrolladas; alta capacidad
de información; permiten el análisis paralelo de varios loci
implicados en un genotipo (metanálisis); unos mapas comparativos
bien desarrollados entre las especies.
Las desventajas de los estudios de ligamiento en
familias incluyen el aspecto económico (muchas PCR, el marcaje de
alelos requiere mucho personal, marcaje de marcador fluorescente);
es lento debido a que aunque pueden lograrse algunas uniones
múltiples, no es posible una alta paralelización (no hay chips de
ADN microsatélite), el poder estadístico es limitado para analizar
pequeños efectos; los resultados dependen de las frecuencias
alélicas y de la heterocigosidad; son necesarias amplias colecciones
familiares con individuos afectados (200 a 2000 individuos); las
regiones IBD normalmente se extienden en grandes regiones no
adecuadas para la clonación génica directa, a menudo entre 10 y 15
megabases (baja resolución).
Otro enfoque para el análisis genético se basa en
los estudios de asociación. Los estudios de ligamiento siguen alelos
en familias. Sin embargo, cada familia podría tener un alelo
diferente de un locus genético ligado al fenotipo de interés. Los
estudios de asociación, por el contrario, siguen la evolución de un
alelo dado en una población. La suposición subyacente es que en un
momento dado en la historia evolutiva, un polimorfismo llegó a
asociarse a un fenotipo porque:
a) es por sí mismo responsable de un cambio en el
fenotipo o;
b) está físicamente muy próximo a un
acontecimiento de este tipo y, por tanto, rara vez se separa del
elemento de secuencia causativo por recombinación (se dice que el
polimorfismo está en desequilibrio de ligamiento con el
acontecimiento causativo).
Ésta es una diferencia fundamental entre el
ligamiento y la asociación. Mientras que en un carácter adquirido
genéticamente debe haber ligamiento de una secuencia con el alelo
causativo si se puede realizar un experimento de ligamento
infinitamente denso, a priori no existe ningún motivo para
que pueda ser un único (o muy pocos)
\hbox{alelo(s)} causativo(s) en la
población (es decir, hay asociación). Esto presenta implicaciones
importantes para el análisis estadístico. Un ejemplo de ligamiento
sin asociación son muchas enfermedades monogénicas, por ejemplo, la
diabetes del joven que comienza en la madurez (MODY), en la que casi
cada familia lleva una mutación diferente en el mismo gen. El gen se
identificó mediante estudios de ligamiento. Los estudios de
asociación no habrían identificado el locus. Dado que los estudios
de asociación postulan la existencia de un alelo dado para un
carácter de interés, se desea que los marcadores para un estudio de
asociación sean simples. En consecuencia, los marcadores de elección
para estos estudios son polimorfismos de un único nucleótido (SNP).
Estos polimorfismos muestran un simple intercambio de bases en un
locus dado (es decir, son bi o rara vez trialélicos). Los estudios
de asociación pueden llevarse a cabo en muestras de población (casos
frente a controles) o en muestras de familias (padres y una
descendencia en la que los alelos transmitidos constituyen los
"casos" y los no transmitidos los "controles"). Las
ventajas principales de los estudios de asociación usando SNP
son:
- son relativamente fáciles de tipificar
(cualquier tecnología que permita la discriminación de una única
base, por ejemplo, chips de ADN, espectrometría de masas);
- los SNP son muy abundantes en el genoma humano
(una media de un SNP cada 300 a 1000 bases);
- la asociación permite definir un intervalo
genético relativamente bien delimitado (normalmente varias
kilobases).
Las desventajas son:
- las asociaciones sólo pueden detectarse a
resoluciones muy altas (debe seleccionarse un alto número poco
apropiado de SNP, probablemente > 100.000);
- dado que no puede postularse a priori
que existe la asociación, deben corregirse las reglas estadísticas
para la aplicación de múltiples pruebas, es decir, el resultado para
cada SNP adicional probado. El resultado es un umbral alto poco
adecuado para la asociación positiva, cuando se prueban miles de
marcadores o, en otras palabras, una inflación de resultados de
falsos positivos en niveles de significación nominal. Son necesarias
nuevas herramientas estadísticas;
- las pruebas de asociación normalmente se llevan
a cabo como pruebas dos por dos (es decir, los polimorfismos en un
locus dado se prueban frente a un fenotipo). Los metanálisis son
difíciles, si no imposibles, de llevar a cabo para miles de
marcadores;
- al igual que el análisis de ligamiento, el de
asociación está influido por la frecuencia alélica;
- todavía no existen mapas genéticos integrados
para los SNP;
- son necesarias grandes colecciones de
muestras;
- la tecnología actual es demasiado cara para
determinar el genotipo de miles de muestras para miles de SNP (PCR,
costes de tecnología de chip, instrumentación) y la discriminación
todavía no es lo suficientemente fidedigna (por ejemplo, chip
Affymetrix de SNP).
En consecuencia, se necesitan procedimientos de
análisis genético mejorados o alternativos que superen los
inconvenientes de estas tecnologías de la técnica anterior. A este
respecto, la tecnología ideal de determinación del genotipo sería
capaz de buscar tanto el ligamiento como la asociación y, al mismo
tiempo, evitar las desventajas de estos procedimientos. Debería ser
fidedigna, permitir un amplio análisis del genoma, ser capaz de
limitar los loci ligados al fenotipo a pequeños intervalos, y
ser sencillo de realizar y analizar y ser barata.
Un procedimiento denominado rastreo genómico de
emparejamientos erróneos ("GMS") parece cumplir con la mayoría
de estos requisitos. El rastreo genómico de emparejamientos erróneos
se desarrolló en la "comunidad de reparación de emparejamientos
erróneos" que tenía poco que ver con la comunidad de ligamiento
humano que trataba de hallar los genes implicados en los caracteres
humanos. Más particularmente, en 1993, Nelson SF et al.
(Genomic mismatch scanning: A new approach to genetic linkage
mapping. Am J Hum Genet. 61: 111-119 (1993))
describieron un procedimiento que permitía la detección y la
cuantificación de la relación entre diferentes cepas de levaduras.
El procedimiento consiste en mezclar el ADN procedente de diferentes
cepas de levaduras y destruir todo lo que no sea idéntico utilizando
un conjunto de enzimas de reparación de emparejamientos erróneos.
Aparte de en la comunidad de investigación que trabajaba en la
reparación de emparejamientos erróneos, el artículo no tuvo mayor
impacto. Sin embargo, parecía lógico que esta tecnología también
podría aplicarse para detectar regiones idénticas en seres humanos.
A este respecto, Linda McAllister et al., publicaron en 1998
un artículo de prueba de principio
("proof-of-principle") en el
que describían la identificación de un locus de enfermedad humana en
el cromosoma 11 usando GMS (Linda McAllister, Lolita Penland y
Patrick O. Brown. Enrichment of loci identical by descent
between pairs of mouse or human genomes by genomic mismatch
scanning, Genomics 47:7-11 (1998)).
Brevemente, el procedimiento está constituido por
las etapas siguientes:
- restricción del ADN de dos individuos;
- marcaje de uno de los ADN mediante
metilación;
- mezclado de los dos ADN creando así una mezcla
de heterodúplex entre los dos ADN, que están hemimetilados, y
homodúplex del ADN original derivados mediante renaturalización de
cada ADN de los individuos consigo mismo. Dado que el ADN de un
individuo estaba completamente metilado y el otro no metilado, los
homodúplex resultantes están también metilados o no metilados;
- los homodúplex no informativos se eliminan
mediante varias etapas enzimáticas que incluyen enzimas de
restricción que sólo digieren el ADN completamente metilado o completamente no metilado y una digestión final del ADN mediante la nucleasa Exo III.
restricción que sólo digieren el ADN completamente metilado o completamente no metilado y una digestión final del ADN mediante la nucleasa Exo III.
- los heterodúplex restantes que se formaron
entre los ADN de los dos individuos estaban constituidos por unos
pocos fragmentos que son idénticos en un 100% en su composición de
secuencia (los fragmentos de interés) y los que, debido a la
heterogeneidad entre los individuos, muestran diferencias en la
secuencia (es decir, las bases presentan emparejamientos erróneos en
esos sitios);
- los fragmentos de ADN con emparejamientos
erróneos se eliminan usando un sistema de reparación enzimático de
emparejamientos erróneos de ADN que está constituido por tres
proteínas (mut S, mut H, mut L) que reconocen
estos emparejamientos erróneos y cortan las cadenas de ADN en una
secuencia de reconocimiento específica (GATC);
- los heterohíbridos de ADN restantes idénticos
en un 100% pueden identificarse entonces mediante amplificación
específica por PCR, en la que se marca la presencia o ausencia de un
producto de amplificación.
Las ventajas del procedimiento con respecto a los
estudios clásicos de ligamiento y asociación son:
- el procedimiento permite la detección
inequívoca de fragmentos IBD entre individuos, ya que no depende de
las frecuencias alélicas ni de la heterocigosidad del marcador;
- el procedimiento no está limitado por la
utilización de marcadores polimórficos. Puede usarse cualquier
secuencia para marcar, siempre que se disponga de cierta información
sobre la secuencia y el mapeo;
- no es necesaria la discriminación alélica. La
señal de detección es digital (es decir, la presencia o ausencia de
un fragmento);
- el procedimiento de detección puede graduarse
hasta cualquier densidad;
- debido a la detección inequívoca de IBD y a la
independencia de la frecuencia alélica, han de seleccionarse menos
individuos (por ejemplo, 100 pares de hermanos dan el mismo poder
para detectar regiones de ligamiento que 400 - 600 pares de hermanos
en el análisis de ligamiento clásico).
Sin embargo, la metodología clásica de GMS
presenta algunas desventajas que dificultan su utilización como una
herramienta habitual para la selección genética:
- la cantidad de ADN para un único experimento es
grande debido a la pérdida de material durante todo el
procedimiento. Normalmente, son necesarios 5 \mug de ADN.
Dependiendo del procedimiento de extracción, esto constituye a
menudo más de la mitad del ADN disponible en una colección;
- la metilación de uno de los ADN no resulta
eficaz al 100%, es decir, algunos de los heterodúplex no pueden
distinguirse y se pierden y algunos de los homodúplex del ADN
"metilado" de los individuos en realidad estará hemimetilado
tras la etapa de hibridación y, por tanto, da como resultado una
señal de fondo en el nivel de detección (ya que el ADN de un
individuo es a priori idéntico en un 100% consigo mismo);
- dado que la digestión con la nucleasa
exo III desempeña un papel principal en la tecnología, sólo
pueden utilizarse enzimas de restricción que creen extremos 3'
cohesivos para la digestión inicial del ADN (normalmente se
emplea
Pst I). Estas enzimas son poco frecuentes y limitan la elección para la restricción del ADN y, por tanto, la constitución de los fragmentos creados;
Pst I). Estas enzimas son poco frecuentes y limitan la elección para la restricción del ADN y, por tanto, la constitución de los fragmentos creados;
- el reconocimiento eficaz de secuencias de ADN
no idénticas, con emparejamientos erróneos por el sistema
mut SHL se basa en la presencia de la secuencia de reconocimiento GATC en un fragmento dado. La ausencia de la secuencia da como resultado una señal de fondo debido al ADN con emparejamientos erróneos no eliminado;
mut SHL se basa en la presencia de la secuencia de reconocimiento GATC en un fragmento dado. La ausencia de la secuencia da como resultado una señal de fondo debido al ADN con emparejamientos erróneos no eliminado;
- el marcaje de uno de los ADN por metilación
permite sólo una comparación dos por dos entre los diferentes
ADN.
Smith et al. (PNAS 93 (1996) 4374) se
refieren a un procedimiento de detección de mutaciones en fragmentos
de ácido nucleico amplificados por PCR. El documento WO89/12695 se
refiere a un procedimiento de aislamiento de ácidos nucleicos que
son característicos de dos poblaciones de ácidos nucleicos. El
documento WO93/22462 se refiere a un kit que comprende una proteína
de unión a ácido nucleico.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de
técnicas de análisis genético y compuestos que resulten más
convenientes, fáciles de realizar, fidedignos y aplicables a
poblaciones más amplias de material genético
La presente invención proporciona ahora nuevos
procedimientos de análisis genético que superan los inconvenientes
de la técnica de GMS de la técnica anterior. En las realizaciones
específicas, la invención describe variantes alternativas y/o
mejoradas basadas en el concepto de GMS que salvan la mayoría de las
desventajas del enfoque clásico mencionado anteriormente.
Más particularmente, se proporciona un
procedimiento que permite la identificación de secuencias idénticas
de ADN procedente de diferentes orígenes a partir de una pequeña
cantidad inicial de ADN genómico.
También se proporciona un procedimiento para
amplificar los ácidos nucleicos procedentes de diferentes
poblaciones con un cebador que comprende un marcador específico para
cada población.
También se proporciona un procedimiento para
identificar las regiones de ADN genómico que son relevantes para
estados patológicos o un carácter particular.
También se proporciona un procedimiento para
preparar moléculas de ácido nucleico heterohíbrido a partir de dos o
más poblaciones de ácidos nucleicos, que comprende una etapa de
amplificación de cada población de ácidos nucleicos antes de una
etapa de hibridación, comprendiendo preferiblemente la amplificación
acoplar una molécula adaptadora a cada ácido nucleico en las
poblaciones, más preferiblemente en ambos extremos del mismo, y
realizar una amplificación utilizando un cebador que comprende por
lo menos una región de secuencia que es complementaria a una región
de secuencia de la molécula adaptadora.
Un aspecto particular de la presente invención
radica más específicamente en un procedimiento de separación de
fragmentos idénticos de ADN de mezclas complejas de al menos dos
poblaciones de ácidos nucleicos (procedentes de diferentes
orígenes), que comprende hibridar por lo menos las dos poblaciones y
separar los heterohíbridos idénticos formados, en el que las
poblaciones de ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos
amplificados.
Más particularmente, un objetivo de la presente
invención radica en un procedimiento para la identificación (o
aislamiento o separación) de fragmentos idénticos de ácido nucleico
de una mezcla de al menos dos poblaciones de ácidos nucleicos
procedentes de diferentes orígenes, que comprende: a) digerir por
separado los ácidos nucleicos de dichas a por lo menos dos
poblaciones con al menos una enzima de restricción; b) ligar las
secuencias adaptadoras específicas a los fragmentos de restricción;
c) amplificar los fragmentos de restricción ligados a las secuencias
adaptadoras generados en a) y b) usando cebadores específicos para
la secuencia adaptadora; d) hibridar los productos de amplificación
procedentes de las diferentes poblaciones de ácidos nucleicos entre
sí; e) identificar (o aislar o separar) los fragmentos
heterohíbridos idénticos, completamente emparejados.
Este procedimiento resulta ventajoso puesto que
permite la amplificación del ADN (es decir, la utilización de
pequeñas cantidades de material de partida) y la selección de
heterodúplex sin metilación antes de la selección de reparación de
emparejamientos erróneos (es decir, sin limitación con respecto a
las enzimas de restricción).
También se proporciona un procedimiento para
identificar las regiones de ADN que resultan relevantes para los
estados patológicos o para un carácter particular, que comprende
hibridar al menos dos poblaciones de ácidos nucleicos procedentes de
diferentes orígenes que presentan un carácter o patología
particular, y separar los heterohíbridos idénticos formados que
contienen regiones de ADN que son relevantes para dichos estados
patológicos o un carácter particular, en el que las poblaciones de
ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos amplificados y/o
preseleccionados.
Otros aspectos de la presente invención radican
en composiciones, kits y ensayos de diagnóstico.
Tal como se indicó anteriormente, la presente
invención proporciona un procedimiento para la identificación (o
aislamiento o separación) de fragmentos idénticos de ácido nucleico
de una mezcla de al menos dos poblaciones de ácidos nucleicos, que
comprende: a) digerir por separado los ácidos nucleicos de dichas al
menos dos poblaciones con al menos una enzima de restricción; b)
ligar una secuencia adaptadora específica a los fragmentos de
restricción; c) amplificar los fragmentos de restricción ligados a
las secuencias adaptadoras generados en a) y b) usando un cebador
específico para la secuencia adaptadora; d) hibridar los productos
de amplificación procedentes de las diferentes poblaciones de ácidos
nucleicos entre sí; e) identificar (o aislar o separar) los
fragmentos heterohíbridos idénticos, completamente emparejados.
La invención puede usarse para analizar diversas
poblaciones de ácidos nucleicos, especialmente con el objetivo de
identificar (o separar) regiones idénticas presentes en las mismas.
Normalmente, las poblaciones de ácidos nucleicos son ADN genómico,
en particular ADN genómico de mamífero, tal como ADN genómico
humano. En una realización preferida, las poblaciones de ácidos
nucleicos son ADN genómico humano procedente de diferentes sujetos
que comparten un carácter de interés, en particular un fenotipo o
patología. En esta realización, el procedimiento de la presente
invención se dirige a identificar los marcadores genéticos de la
patología, o los genes (mutaciones) implicados en o responsables de
la patología.
Las poblaciones de ácidos nucleicos también
pueden ser ADN genómico procedente de otras especies de mamíferos,
tales como las especies bovina, ovina, canina, ovejas, cabras, y
similares. En particular, el ADN genómico puede prepararse a partir
de animales (de la misma especie) que comparten un carácter
particular (alta producción de carne, alta producción de leche,
etc.).
Las poblaciones de ácidos nucleicos también
pueden ser ADN genómico procedente de otros orígenes, incluyendo
procariotas (bacterias, microorganismos patógenos, etc.), eucariotas
inferiores (levaduras, etc.), plantas, virus, y similares.
Aunque la población de ácidos nucleicos puede
comprender el ADN genómico total de una célula (o tejido u
organismo), o una librería genómica completa, por ejemplo, debe
observarse que también podría realizarse una criba o una selección
de los ácidos nucleicos de partida. En particular, la población de
ácidos nucleicos puede ser un cromosoma aislado (o grupo de
cromosomas).
En la realización de la presente invención,
pueden usarse dos o más poblaciones de ácidos nucleicos, que
proceden de diferentes orígenes. En las realizaciones preferidas, se
utilizan de 2 a 10 poblaciones de ácidos nucleicos.
En la primera etapa (opcional), las poblaciones
de ácidos nucleicos se digieren por separado para proporcionar
fragmentos de restricción. El término "por separado" indica que
cada población se somete individualmente a la digestión, es decir,
sin mezclarse entre sí. Pueden utilizarse una o varias enzimas de
restricción. Preferiblemente, se usa(n) la(s)
misma(s) enzima(s) de restricción para cada población
de ácidos nucleicos. La(s) enzima(s) de restricción
pueden elegirse según consideraciones prácticas, tales como el
tamaño de los fragmentos generados, la especificidad por las
especies de ADN, la actividad enzimática, la facilidad de
utilización, etc. En una realización preferida, la enzima de
restricción proporciona, como media, fragmentos de restricción de
longitud media, más particularmente fragmentos de entre 2 y 10
kilobases (kb). Dichas enzimas de restricción incluyen por ejemplo
enzimas de sitio de reconocimiento de seis bases como Apa I
(\sim 2 kb), Bam HI (\sim 5 kb), Bgl I + II
(\sim 3 kb), Hind III (\sim 4 kb), Nar I (\sim 4
kb), Sma I
(\sim 4 kb) o Xba I (\sim 5 kb).
(\sim 4 kb) o Xba I (\sim 5 kb).
En una realización específica, se usa una única
enzima de restricción que proporciona, como media, fragmentos de
restricción de entre 2 y 10 kilobases.
En una realización particular, los fragmentos de
restricción pueden seleccionarse antes de la etapa posterior de
ligamiento y/o amplificación. En particular, los fragmentos de
restricción pueden seleccionarse por tamaños para permitir una
amplificación uniforme de todos los fragmentos. La selección por
tamaños puede realizarse en un gel o mediante cualquier otra
técnica. En un gel de agarosa, los fragmentos de restricción se
separan por tamaños en un campo eléctrico junto a un patrón de
tamaños para su orientación. Los fragmentos en el intervalo de
tamaños preferido pueden separarse del gel y extraerse de la agarosa
usando procedimientos estándar (por ejemplo, kit de extracción de
gel Quiaex II, Quiagen AG, Alemania). La separación por tamaños
también puede lograrse utilizando la separación en columna con un
material de tamizado como poliacrilamida, Sephadex, etc.
Además, los fragmentos de restricción pueden
clonarse en cualquier vector adecuado, antes de la etapa de
amplificación. El vector puede ser cualquier plásmido, fago, virus,
cósmido, cromosoma artificial (YAC, BAC), etc. En particular, los
fragmentos de restricción pueden clonarse de una manera específica
de secuencia y cromosoma. En una realización particular, el
procedimiento comprende así (i) digerir por separado las poblaciones
de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN genómico procedente de por lo
menos dos orígenes diferentes) y (ii) clonar (ciertos) fragmentos de
restricción en un vector, de una manera específica de secuencia y
cromosoma (por ejemplo, mediante recombinación homóloga). Esta etapa
de clonación puede utilizarse para seleccionar ciertos fragmentos
para el análisis adicional, sin analizar la totalidad de la
población de ADN.
Otro aspecto particular de la presente invención
radica en la utilización de moléculas adaptadoras que facilitan la
amplificación específica de los ácidos nucleicos y el tratamiento
específico de las muestras para aumentar la selectividad del
procedimiento de identificación.
Las moléculas adaptadoras resultan
preferiblemente fragmentos cortos de ADN de doble cadena (u
oligonucleótidos) con composición de secuencia conocida. Más
preferiblemente, las moléculas adaptadoras son moléculas de ADN de
doble cadena de entre 5 y 100 bases de longitud, incluso más
preferiblemente de entre 5 y 50 pares de bases de longitud. Las
moléculas adaptadoras permiten la introducción de características de
secuencia que mejoran enormemente el procedimiento de análisis
genético. Más particularmente, la introducción de esas moléculas
adaptadoras presenta las ventajas siguientes:
- el ADN puede amplificarse por PCR antes del
procedimiento de análisis genético (por ejemplo, GMS), lo que
permite partir de menos material (100 a 500 ng). Solo es necesario
una amplificación por experimento, usando una única secuencia
cebadora, lo que hace que este procedimiento sea barato;
- la secuencia adaptadora se diseña
preferiblemente para que incluya la secuencia de reconocimiento de
mut HL (GATC), lo que permite que todos los fragmentos de
emparejamiento erróneo se eliminen de la mezcla, aumentando así la
selectividad y reduciendo la señal de fondo;
- la molécula adaptadora también puede comprender
un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que crea
extremos 3' cohesivos, tal como Aat III.
En una realización preferida, la molécula
adaptadora es un oligonucleótido de 5 a 100 pares de bases de
longitud (de doble cadena) que comprende al menos un motivo
GATC.
Las moléculas adaptadoras pueden prepararse según
técnicas convencionales (síntesis artificial) y ligarse a fragmentos
de restricción (o a la población de ácidos nucleicos, en las que no
se realiza etapa de restricción), mediante procedimientos
convencionales (usando por ejemplo una enzima ligasa, tal como T4
ligasa). El procedimiento de la presente invención comprende
preferiblemente el ligamiento de todos los ácidos nucleicos en las
diversas poblaciones a la misma molécula adaptadora. Más
preferiblemente, el ligamiento de la molécula adaptadora da como
resultado fragmentos de ADN que llevan una secuencia adaptadora en
ambos extremos.
La amplificación de los ácidos nucleicos (o
fragmentos de restricción) puede llevarse a cabo mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según las técnicas
convencionales. Preferiblemente, la amplificación se lleva a cabo
mediante la reacción en cadena de la polimerasa que utiliza una ADN
polimerasa de gran intervalo y alta fidelidad. Ejemplos de tales
polimerasas incluyen Pfx polimerasa (Life Technologies) y
Z-Taq polimerasa (TaKaRa). Pueden llevarse a
cabo varios ciclos de amplificación, más particularmente desde 25
hasta 40.
Otra ventaja de la presente invención radica en
la utilización de cebadores particulares para la reacción de
amplificación. Los cebadores resultan preferiblemente
complementarios a al menos parte de la molécula adaptadora. Los
cebadores pueden ser cualquier oligonucleótido, preferiblemente que
presente de 5 a 30 bases, incluso más preferiblemente 5 a 20 bases.
La parte del cebador que es complementaria a la (parte de la)
molécula adaptadora debería comprender preferiblemente por lo menos
5, más preferiblemente al menos 10 bases, para garantizar la
selectividad suficiente. Los cebadores pueden producirse por el
experto en la materia según las técnicas convencionales conocidas en
la técnica (preferiblemente síntesis artificial de ácidos
nucleicos).
En una realización preferida, los cebadores están
marcados, lo que proporciona ventajas adicionales al presente
procedimiento. En particular, la introducción de cebadores marcados
para la amplificación (PCR) permite distinguir las diferentes
poblaciones de ADN que están mezcladas. En efecto, el cebador
utilizado para amplificar cada población de ácidos nucleicos puede
mostrar un marcador diferente, tal como secuencias 5' únicas
diferentes (o algunos pueden estar marcados y algunos no), lo que
permite distinguir los productos amplificados procedentes de cada
origen. Esto evita la necesidad de cualquier etapa de metilación. En
consecuencia, no son necesarias enzimas de restricción específicas
de metilación y puede obtenerse una disminución significativa del
coste por experimento. Además, la utilización de cebadores marcados
permite llevar a cabo más que comparaciones por parejas (varios
individuos incluidos en una reacción, es decir, más de dos
poblaciones de ácidos nucleicos). Esto puede utilizarse para
aumentar la resolución del procedimiento (se detectan regiones IBD
más pequeñas). Esta característica es especialmente útil cuando se
busca la asociación alélica.
Además, los cebadores pueden diseñarse de una
forma que permita que la nucleasa exo III ataque a los
homodúplex formados con la hibridación entre las poblaciones de
ácidos nucleicos, pero no a los heterodúplex. En consecuencia, los
extremos de restricción no desempeñan ningún papel en la elección de
la enzima de restricción para la digestión de las poblaciones de
ácidos nucleicos. Por tanto, las enzimas pueden escogerse según
consideraciones prácticas (tamaño de los fragmentos generados,
especificidad por las especies de ADN, actividad enzimática y
facilidad de utilización).
Los cebadores pueden marcarse (i) añadiendo una
secuencia 5' única a cada cebador, (ii) añadiendo una actividad
química al cebador que proporcione medios para distinguir entre los
productos de amplificación procedentes de diferentes orígenes de ADN
y (iii) añadiendo nucleótidos modificados en el cebador, lo que
permite distinguir entre los productos de amplificación procedentes
de diferentes orígenes de ADN. La técnica de marcaje preferida
comprende la introducción de una secuencia 5' única a cada conjunto
de cebadores.
La identificación (o aislamiento o separación) de
los fragmentos heterohíbridos idénticos, completamente emparejados,
puede llevarse a cabo de varias formas. Preferiblemente, la
identificación comprende las siguientes etapas: (i) separar
homohíbridos de heterohíbridos; (ii) (identificar y) eliminar
heterohíbridos con emparejamientos erróneos, e (iii) identificar (o
aislar o separar) los fragmentos heterohíbridos idénticos.
Los heterohíbridos pueden separarse de los
homohíbridos basándose en el marcaje de cebadores, tal como se ha
descrito anteriormente. En particular, la separación puede llevarse
a cabo basándose en la utilización de cebadores con una secuencia en
el extremo 5' única para cada población de ácidos nucleicos. Según
esta realización, los homohíbridos sólo serán de extremos romos, es
decir, comprenden extremos de ADN perfectamente emparejados (la
secuencia en el extremo 5' única del cebador específico). En
consecuencia, todos los homohíbridos pueden eliminarse mediante
tratamiento del producto de hibridación con una enzima que digiere
específicamente fragmentos de ADN de doble cadena de extremos romos,
tal como Exo III. El tratamiento con Exo III da como
resultado la formación de cadenas sencillas, que pueden eliminarse
mediante diversos procedimientos, tales como mediante la unión a una
matriz específica para cadena sencilla.
A este respecto, en una realización específica,
el procedimiento de la presente invención comprende a) amplificar
por separado los fragmentos de restricción procedentes de diferentes
orígenes utilizando un cebador con una secuencia 5' única para cada
origen de ADN; b) mezclar los productos de amplificación procedentes
de dichos orígenes diferentes que llevan extremos 5' únicos; c)
desnaturalizar e hibridar de nuevo dichos ADN; d) digerir los ADN
perfectamente emparejados (de extremos romos) (homodúplex) mediante
Exo III y e) eliminar las cadenas sencillas creadas por
Exo III mediante la unión a una matriz específica para cadena
sencilla.
La separación de los homodúplex de ADN de los
heterodúplex de ADN también puede realizarse basándose en la
metilación de una de las dos preparaciones de ácidos nucleicos (o
fragmentos de restricción). Aunque no se prefiere, esta realización
puede llevarse a cabo ventajosamente cuando el cebador de
amplificación o la molécula adaptadora comprende un sitio de
reconocimiento de una enzima que crea extremos 3' cohesivos (tal
como Aat III). De hecho, en esta realización, las poblaciones
de ácidos nucleicos pueden digerirse con cualquier tipo de enzima
de
restricción.
restricción.
Los heterohíbridos con emparejamientos erróneos
pueden eliminarse preferiblemente con enzimas de reparación de
emparejamientos erróneos. En particular, la distinción entre (o
eliminación o separación de) fragmentos de ácidos nucleicos con
emparejamientos erróneos y perfectamente emparejados puede llevarse
a cabo utilizando las enzimas de reparación de emparejamientos
erróneos mutS, mutL y/o mutH, o derivados u
homólogos de las mismas. Los derivados incluyen fragmentos o
variantes de las proteínas Mut, es decir, cualquier
polipéptido o fragmento derivado de las mismas y que conserva la
actividad biológica de la proteína. Los derivados preferidos
conservan por lo menos el 80% de la estructura primaria de la
proteína Mut. Los homólogos incluyen proteínas que muestran
el mismo tipo de actividad enzimática en otros sistemas biológicos
(levaduras, plantas, etc.).
En particular, los fragmentos de ácidos nucleicos
con emparejamientos erróneos pueden eliminarse mediante (i)
incubación de la mezcla de hibridación con MutS (que se une a
los emparejamientos erróneos) y puesta en contacto del producto
resultante con un material de unión a MutS (por ejemplo,
soporte, perla, columna, etc.).
Los fragmentos de ácidos nucleicos con
emparejamientos erróneos también pueden eliminarse incubando la
mezcla de hibridación con MutS, MutL y MutH, lo
que da como resultado una escisión específica de los híbridos con
emparejamientos erróneos y la posterior formación de extremos romos,
que pueden eliminarse mediante tratamiento con enzimas particulares
(tales como Exo III) y la eliminación del ADN de cadena
sencilla formado.
En una realización más específica, el
procedimiento comprende:
- digerir por separado los ADN genómicos
procedentes de al menos dos orígenes diferentes con una enzima de
restricción;
- ligar una molécula adaptadora a esos fragmentos
genómicos de restricción;
- amplificar los fragmentos de restricción
ligados a las moléculas adaptadoras (preferiblemente mediante la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), usando cebadores
marcados específicos para la molécula adaptadora;
- hibridar los productos de amplificación (por
ejemplo, PCR) procedentes de las diferentes orígenes de ADN entre
sí;
- separar los homodúplex de los heterodúplex;
- identificar y eliminar los heterohíbridos con
emparejamientos erróneos utilizando las proteínas mut SHL;
- identificar los fragmentos de los heterodúplex
idénticos en un 100%.
Tal como se indicó anteriormente, los cebadores
presentan una secuencia que es complementaria a por lo menos una
parte de la secuencia adaptadora. Además, preferiblemente están
marcados, proporcionando así medios para distinguir entre los
productos de amplificación procedentes de diferentes orígenes de
ADN.
En otro aspecto, la invención radica en un
procedimiento de análisis genético que comprende: a) digerir ADN
procedente de diferentes orígenes que comparten un carácter de
interés común, carácter que se sospecha que se basa en el mismo
cambio genético, con una enzima que, como media, proporciona
fragmentos de ADN de longitud media (por ejemplo, fragmentos de
entre 2 y 10 kilobases); b) ligar moléculas adaptadoras específicas
a esos fragmentos de restricción (estas moléculas adaptadoras
proporcionan medios para introducir una secuencia conocida y medios
para la selección posterior en la reacción); c) marcar por lo menos
uno de los ADN procedente de dichos orígenes diferentes con un
procedimiento que permite distinguir los ADN procedentes de
diferentes orígenes entre sí; d) amplificar los fragmentos de
restricción así preparados mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR); e) mezclar los ADN procedentes de diferentes
orígenes y formación de heterodúplex entre las cadenas de ADN
procedentes de estos orígenes; f) eliminar los homodúplex formados
por la renaturalización de dos cadenas de ADN procedentes del mismo
origen; g) eliminar los heterodúplex que presentan bases con
emparejamientos erróneos; h) detectar e identificar las secuencias
de ADN resultantes idénticas en un 100%.
Tal como se mencionó anteriormente, en una
realización preferida de la invención, la molécula adaptadora
incluye características de secuencia específicas: a) el sitio de
reconocimiento para mut HL (GATC), b) un sitio de
reconocimiento para una enzima de restricción que crea extremos 3'
cohesivos (por ejemplo, aat III).
En otra realización específica de la presente
invención, uno de los ADN que toman parte en el procedimiento se
metila tras la digestión y el ligamiento de la molécula adaptadora,
preferiblemente mediante la utilización de la metilasa dam. Los ADN
procedentes de diferentes orígenes se amplifican entonces por
separado mediante PCR utilizando cebadores de oligonucleótido
específicos para la molécula adaptadora. Los productos de
amplificación resultantes se digieren con una enzima de restricción
que crea extremos 3' cohesivos (al menos 2 sitios/fragmentos
introducidos en la molécula adaptadora) para proteger los fragmentos
de la digestión con exo III. Los fragmentos de ADN procedentes de
dos orígenes diferentes se mezclan entonces y se forman heterodúplex
hemimetilados entre las cadenas de ADN mediante desnaturalización
por calor y renaturalización en condiciones rigurosas (Casna et
al. (1986) Genomic analysis II, isolation of high molecular
weight heteroduplex DNA following methylase protection and formamide
PERT hybridization. Nucleic Acids Res. 14:
7285-7303). Los homodúplex no metilados y
completamente metilados se cortan mediante enzimas de restricción
sensibles a la metilación. Los fragmentos cortados se someten
entonces a digestión adicional mediante la exonuclasa exo III
y las regiones de cadena sencilla resultantes se eliminan de la
mezcla de reacción utilizando alguna matriz específica para cadena
sencilla conocida por los expertos en la materia (por ejemplo,
perlas de BND-celulosa (dietilaminoetanol benzoilado
y naftoilado - celulosa). Los heterodúplex restantes son una mezcla
de fragmentos que están emparejados en un 100% y los que presentan
emparejamientos erróneos en las pares de bases del ADN (debido a la
diferencia entre los individuos). Los fragmentos de ADN que
presentan secuencias de ADN con emparejamientos erróneos se
reconocen y se cortan mediante la adición de las proteínas mut SHL
que reparan emparejamientos erróneos a la mezcla de reacción. Los
fragmentos que se cortaron se someten a digestión adicional por la
exonucleasa exo III y las cadenas sencillas se eliminan tal
como se describió anteriormente.
En una realización preferida de la invención, el
procedimiento se caracteriza por las etapas siguientes: a) digerir
ADN procedente de al menos dos orígenes diferentes con una enzima de
restricción; b) ligar moléculas adaptadoras específicas a los
fragmentos de restricción; c) amplificar por separado los fragmentos
de restricción procedentes de los diferentes orígenes utilizando un
cebador con un marcador diferente (por ejemplo, un extremo 5' único)
para cada ADN de dichos orígenes; d) mezclar los productos de
amplificación procedentes de diferentes orígenes que llevan un
marcador único (por ejemplo, un extremo 5' único); e) desnaturalizar
e hibridar de nuevo dichos ADN procedentes de diferentes orígenes;
f) digerir los ADN perfectamente emparejados (de extremos romos)
(homodúplex) mediante la exonucleasa exo III; g) eliminar las
cadenas sencillas creadas por exo III mediante la unión a una
matriz específica para cadena sencilla; h) reconocer y formar
muescas (nicking) de los heterodúplex con emparejamientos erróneos
añadiendo las proteínas mut SHL a la mezcla de reacción; i) digerir
con exo III los ADN con muescas; j) eliminar las cadenas
sencillas creadas por exo III mediante la unión a una matriz
específica para cadena sencilla; k) detectar e identificar las
secuencias emparejadas en un 100% restantes en la mezcla de
reacción.
Los fragmentos de ADN idénticos identificados (o
separados o aislados) pueden analizarse adicionalmente para
determinar un gen, mutación, y similares. Más particularmente, los
fragmentos pueden analizarse mediante secuenciación. También pueden
analizarse mediante hibridación con matriz(s) de ADN
ordenada(s) o perlas codificadas que llevan secuencias de ADN
específicas.
La invención también se refiere a kits que pueden
utilizarse para realizar las técnicas de análisis genético descritas
anteriormente. En particular, la invención radica en un kit adecuado
para el análisis genético tal como se describió anteriormente, que
comprende una molécula adaptadora de doble cadena, un cebador
marcado específico y, opcionalmente, ADN control y enzimas. Los kits
de la presente invención pueden comprender adicionalmente medios
para la detección de los fragmentos de ADN seleccionados,
preferiblemente una matriz de ADN ordenada o perlas codificadas que
contienen secuencias específicas de ADN.
La invención también puede utilizarse para
identificar genes o mutaciones implicadas en patologías, tales como
patologías complejas (obesidad, asma, enfermedades cardiovasculares,
trastornos del SNC, etc.). La invención es ampliamente aplicable a
los análisis de cualquier material genético, especialmente con el
objetivo de identificar (o seleccionar) regiones idénticas de ADN
presentes en dos (o más) poblaciones diferentes de ácidos
nucleicos.
Los aspectos y ventajas adicionales de la
presente invención se describirán en la siguiente sección
experimental, que debe considerarse como ilustrativa y no
limitativa.
Se extrae ADN genómico procedente de por lo menos
dos individuos emparentados, con el mismo fenotipo de enfermedad,
mediante procedimientos estándar, por ejemplo, extracción con
fenol-cloroformo. Los ADN se cortan por separado con
una enzima de restricción (por ejemplo, Bam HI) para crear
fragmentos de restricción con un tamaño medio de aproximadamente 4
kilobases. A estos fragmentos de restricción se añade una disolución
que contiene oligonucleótidos (moléculas adaptadoras) cortos de
doble cadena. Las moléculas adaptadoras presentan extremos de
secuencia complementaria a las secuencias del sitio de restricción
para permitir el ligamiento. Las moléculas adaptadoras se ligan
entonces a los fragmentos de restricción de los ADN genómicos
utilizando una ligasa común (por ejemplo, T4 ligasa). La secuencia
de las moléculas adaptadoras se ha elegido de manera que: a) la
secuencia incluye el sitio de reconocimiento para mut HL, b)
los dímeros de la molécula adaptadora formados mediante el
ligamiento entre sí de dos moléculas adaptadoras son complementarios
entre sí y no compiten por los cebadores con los productos de
ligamiento genómico durante la PCR. Los fragmentos que llevan la
molécula adaptadora se amplifican entonces por PCR, por separado
para cada individuo, usando cebadores que son complementarios a una
parte de la secuencia adaptadora y que llevan extremos 5' únicos.
Tras varias rondas de amplificación, los productos de PCR de los
diferentes individuos difieren en sus extremos unos con respecto a
otros. Los productos de amplificación se mezclan entonces, se
desnaturalizan por calor y se permite que vuelvan a hibridar usando
condiciones de hibridación rigurosas (Casna et al. (1986)
Genomic analysis II, isolation of high molecular weight heteroduplex
DNA following methylase protection and formamide PERT hybridization.
Nucleic Acids Res. 14: 7285-7303). Esto da como
resultado la formación de heterodúplex a partir de los ADN
procedentes de diferentes orígenes (individuos) con extremos
ahorquillados (de cadena sencilla) debido a la no complementariedad
de las secuencias de cebador. Además, se forman homodúplex mediante
la renaturalización entre las cadenas de un individuo consigo
mismas. Estos homodúplex presentan extremos romos. A esta mezcla se
añade una disolución que contiene exonucleasa exo III (o una
exonucleasa equivalente específica para extremos romos o acoplados
en 3'). La exonucleasa digiere los homodúplex de extremos romos,
pero no los heterodúplex con sus extremos 3' que sobresalen, lo que
crea grandes segmentos de cadena sencilla ("gap") en los
fragmentos de homodúplex. Estos pueden eliminarse de la mezcla de
reacción mediante la unión a una matriz específica para cadena
sencilla (por ejemplo, perlas de BND-celulosa). Los
heterodúplex restantes comprenden una reunión de fragmentos
idénticos en un 100% y fragmentos con emparejamientos erróneos en
sus pares de bases (fragmentos no IBD). Se añade a la mezcla una
disolución que contiene las enzimas de reparación de emparejamientos
erróneos mut SHL, dando como resultado la formación de muescas en
los heterodúplex con emparejamientos erróneos en un sitio de
reconocimiento específico (GATC). Estas muescas se digieren
adicionalmente añadiendo exonucleasa exo III (o una
exonucleasa equivalente específica para extremos romos o acoplados
en 3') a la mezcla de reacción, lo que crea grandes segmentos de
cadena sencilla en los fragmentos de homodúplex. Estos pueden
eliminarse de la mezcla de reacción mediante su unión a una matriz
específica para cadena sencilla (por ejemplo, perlas de
BND-celulosa). Los fragmentos restantes en la mezcla
de reacción constituyen una reunión de híbridos de ADN idénticos en
un 100% formados entre los ADN procedentes de diferentes individuos
que comprenden los loci responsables del fenotipo de la
enfermedad. Estos fragmentos pueden detectarse e identificarse (por
ejemplo, mediante hibridación a una matriz de ADN que representa el
genoma humano completo). La comparación de las señales de varios
experimentos en diferentes familias con el mismo fenotipo de
enfermedad permite la identificación de las regiones asociadas a la
enfermedad (haplotipo genómico específico de la enfermedad).
Un objetivo en la cría animal agrícola moderna es
la selección a favor o en contra a ciertos fenotipos de carácter
cuantitativo (por ejemplo, masa muscular, cantidad de leche,
concentración de caseína en la leche para la producción de queso
etc.). Los mecanismos genéticos que conducen a un carácter a menudo
son complejos, estando implicados varios loci. Estos loci
pueden identificarse usando el procedimiento de la invención. En
este ejemplo, se corta ADN genómico procedente de diferentes
animales que concuerdan para un carácter de interés (por ejemplo,
concentración de caseína en la leche superior a la media) utilizando
una endonucleasa de restricción que produce fragmentos en promedio
de aproximadamente 4 kilobases (por ejemplo, Bam HI). A estos
fragmentos de restricción se añade una disolución que contiene
oligonucleótidos (moléculas adaptadoras) cortos de doble cadena. Las
moléculas adaptadoras presentan extremos de secuencia complementaria
a las secuencias del sitio de restricción para permitir el
ligamiento. Las moléculas adaptadoras se ligan entonces a los
fragmentos de restricción de los ADN genómicos utilizando una ligasa
común (por ejemplo, T4 ligasa). La secuencia de las moléculas
adaptadoras se ha elegido de manera que: a) la secuencia incluye el
sitio de reconocimiento para mut HL, b) los dímeros de la
molécula adaptadora formados mediante el ligamiento entre sí de dos
moléculas adaptadoras son complementarios entre sí y no compiten por
los cebadores con los productos de ligamiento genómico durante la
PCR. Los fragmentos que llevan la molécula adaptadora se amplifican
entonces por PCR, por separado para cada individuo, usando cebadores
que son complementarios a una parte de la secuencia adaptadora
aunque llevan extremos 5' únicos. Tras varias rondas de
amplificación, los productos de PCR de los ADN procedentes de
diferentes animales difieren en sus extremos unos con respecto a
otros. Los productos de amplificación se mezclan entonces, se
desnaturalizan por calor y se permite que vuelvan a hibridar usando
condiciones de hibridación rigurosas (Casna et al. (1986)
Genomic analysis II, isolation of high molecular weight heteroduplex
DNA following methylase protection and formamide PERT hybridization.
Nucleic Acids Res. 14: 7285-7303). Esto da como
resultado la formación de heterodúplex entre los ADN procedentes de
diferentes animales, con extremos ahorquillados (de cadena sencilla)
debido a la no complementariedad de las secuencias de cebador.
Además, se forman homodúplex mediante la renaturalización entre las
cadenas de un individuo consigo mismas. Estos homodúplex presentan
extremos romos. A esta mezcla se añade una disolución que contiene
exonucleasa exo III (o una exonucleasa equivalente específica para
extremos romos o acoplados en 3'). La exonucleasa digiere los
homodúplex de extremos romos, pero no los heterodúplex con sus
extremos 3' que sobresalen, lo que crea grandes segmentos de cadena
sencilla en los fragmentos de homodúplex. Estos pueden eliminarse de
la mezcla de reacción mediante la unión a una matriz específica para
cadena sencilla (por ejemplo, perlas de
BND-celulosa). Los heterodúplex restantes comprenden
una reunión de fragmentos idénticos en un 100% y fragmentos con
emparejamientos erróneos en sus pares de bases (fragmentos no IBD).
Se añade a la mezcla una disolución que contiene las enzimas de
reparación de emparejamientos erróneos mut SHL, dando como resultado
la formación de muescas en los heterodúplex con emparejamientos
erróneos en un sitio de reconocimiento específico (GATC). Estas
muescas se digieren adicionalmente añadiendo la exonucleasa
exo III (o una exonucleasa equivalente específica para
extremos romos o acoplados en 3') a la mezcla de reacción, lo que
crea grandes segmentos de cadena sencilla en los fragmentos de
homodúplex. Estos pueden eliminarse de la mezcla de reacción
mediante su unión a una matriz específica para cadena sencilla (por
ejemplo, perlas de BND-celulosa). Los fragmentos
restantes en la mezcla de reacción constituyen una reunión de
híbridos de ADN idénticos en un 100% formados entre los ADN
procedentes de diferentes animales que comprenden los loci
responsables del carácter cuantitativo de interés. Estos fragmentos
pueden hibridarse frente a una matriz que contiene una selección
representativa de secuencias que cubren el genoma completo del
animal. Dado que en este caso pueden usarse animales no emparentados
para identificar los QTL, las regiones IBD deben ser pequeñas, es
decir, debe ser necesario un número muy limitado de experimentos
(sólo uno en el mejor caso) para identificar los genes responsables
del carácter. La introducción de un animal control discordante para
el carácter de interés puede mejorar adicionalmente la resolución
del sistema.
Dependiendo de la complejidad y la heterogeneidad
de un fenotipo de enfermedad, la definición de locus tras un
experimento de GMS, tal como se describe en el ejemplo 1, puede
variar entre varias kilobases y algunas megabases. En este último
caso deben llevarse a cabo experimentos adicionales para disminuir
el intervalo genético en el que se localiza el gen de la enfermedad.
El procedimiento inventivo también puede usarse para el mapeo fino
del (de los)
\hbox{gen(es)} de interés. Se extrae
ADN procedente de diferentes individuos no emparentados que se ha
demostrado que estaban asociados con los mismos loci de
enfermedad y se digiere mediante una endonucleasa de restricción
adecuada (por ejemplo, enzima de corte con sitio de reconocimiento
de 4 bases) para producir fragmentos de longitud bien definida. A
estos fragmentos de restricción se añade una disolución que contiene
oligonucleótidos (moléculas adaptadoras) cortos de doble cadena. Las
moléculas adaptadoras presentan extremos de secuencia complementaria
a las secuencias del sitio de restricción para permitir el
ligamiento. Las moléculas adaptadoras se ligan entonces a los
fragmentos de restricción de los ADN genómicos utilizando una ligasa
común (por ejemplo, T4 ligasa). La secuencia de las moléculas
adaptadoras se ha elegido de manera que: a) la secuencia incluye el
sitio de reconocimiento para mut HL, b) los dímeros de la
molécula adaptadora formados mediante el ligamiento entre sí de dos
moléculas adaptadoras son complementarios entre sí y no compiten por
los cebadores con los productos de ligamiento genómico durante la
PCR. Los fragmentos que llevan la molécula adaptadora se amplifican
entonces por PCR, por separado para cada individuo, usando cebadores
que son complementarios a una parte de la secuencia adaptadora y que
llevan extremos 5' únicos. Tras varias rondas de amplificación, los
productos de PCR de los diferentes individuos difieren en sus
extremos unos con respecto a otros. Los productos de amplificación
se mezclan entonces, se desnaturalizan por calor y se permite que
vuelvan a hibridar usando condiciones de hibridación rigurosas
(Casna et al. (1986) Genomic analysis II, isolation of high
molecular weight heteroduplex DNA following methylase protection and
formamide PERT hybridization. Nucleic Acids Res. 14:
7285-7303). Dependiendo de las restricciones para la
selección de los extremos 5' únicos para los cebadores, pueden
mezclarse los productos de amplificación de varios individuos,
mejorándose la resolución. La mezcla de los fragmentos de PCR da
como resultado la formación de heterodúplex a partir de los ADN
procedentes de diferentes orígenes (individuos) con extremos
ahorquillados (de cadena sencilla) debido a la no complementariedad
de las secuencias de cebador. Además, se forman homodúplex mediante
la renaturalización entre las cadenas de un individuo consigo
mismas. Estos homodúplex presentan extremos romos. A esta mezcla se
añade una disolución que contiene exonucleasa exo III (o una
exonucleasa equivalente específica para extremos romos o acoplados
en 3'). La exonucleasa digiere los homodúplex de extremos romos,
pero no los heterodúplex con sus extremos 3' que sobresalen, lo que
crea grandes segmentos de cadena sencilla en los fragmentos de
homodúplex. Estos pueden eliminarse de la mezcla de reacción
mediante la unión a una matriz específica para cadena sencilla (por
ejemplo, perlas de BND-celulosa). Los heterodúplex
restantes comprenden una reunión de fragmentos idénticos en un 100%
y fragmentos con emparejamientos erróneos en sus pares de bases. Se
añade a la mezcla una disolución que contiene las enzimas de
reparación de emparejamientos erróneos mut SHL, dando como resultado
la formación de muescas en los heterodúplex con emparejamientos
erróneos en un sitio de reconocimiento específico (GATC). Estas
muescas se digieren adicionalmente añadiendo exonucleasa exo III (o
una exonucleasa equivalente específica para extremos romos o
acoplados en 3') a la mezcla de reacción, lo que crea grandes
segmentos de cadena sencilla en los fragmentos de homodúplex. Estos
pueden eliminarse de la mezcla de reacción mediante su unión a una
matriz específica para cadena sencilla (por ejemplo, perlas de
BND-celulosa). Los fragmentos restantes en la mezcla
de reacción constituyen una reunión de pequeños híbridos de ADN,
idénticos en un 100%, formados entre los ADN procedentes de
diferentes individuos que comprenden los loci responsables
del fenotipo de la enfermedad. Puesto que prácticamente no hay
regiones IBD entre estos individuos, sólo deben ser idénticos un
número muy pequeño de fragmentos relativamente cortos (esto es
básicamente una forma muy eficaz de buscar asociación alélica).
Puede utilizarse una matriz de secuencias de ADN específica de locus
denso para detectar e identificar secuencias dentro de la reunión de
ADN idénticos. Dado que se conocen las secuencias de la matriz,
pueden usarse para secuenciar directamente los fragmentos
procedentes del procedimiento de GMS para identificar marcos de
lectura abiertos (ORF) y los genes de interés.
Se extrae ADN genómico procedente de al menos dos
individuos emparentados, con el mismo fenotipo de enfermedad,
mediante procedimientos estándar, por ejemplo, extracción con
fenol-cloroformo. Los ADN se cortan por separado con
una enzima de restricción (por ejemplo, Bam HI) para crear
fragmentos de restricción con un tamaño medio de aproximadamente 4
kilobases. A estos fragmentos de restricción se añade una disolución
que contiene oligonucleótidos (moléculas adaptadoras) cortos de
doble cadena. Las moléculas adaptadoras presentan extremos de
secuencia complementaria a las secuencias del sitio de restricción
para permitir el ligamiento. Las moléculas adaptadoras se ligan
entonces a los fragmentos de restricción de los ADN genómicos
utilizando una ligasa común (por ejemplo, T4 ligasa). La secuencia
de las moléculas adaptadoras se ha elegido de manera que: a) la
secuencia incluye el sitio de reconocimiento para mut HL, b)
los dímeros de la molécula adaptadora formados mediante el
ligamiento entre sí de dos moléculas adaptadoras son complementarios
entre sí y no compiten por los cebadores con los productos de
ligamiento genómico durante la PCR. Los fragmentos que llevan la
molécula adaptadora se amplifican entonces por PCR, por separado
para cada individuo, usando cebadores que son complementarios a una
parte de la secuencia adaptadora y que llevan extremos 5' únicos.
Tras varias rondas de amplificación, los productos de PCR de los
diferentes individuos difieren en sus extremos entre sí. Los
productos de amplificación se mezclan entonces, se desnaturalizan
por calor y se permite que vuelvan a hibridar usando condiciones de
hibridación rigurosas (Casna et al. (1986) Genomic analysis
II, isolation of high molecular weight heteroduplex DNA following
methylase protection and formamide PERT hybridization. Nucleic Acids
Res. 14: 7285-7303). Esto da como resultado la
formación de heterodúplex a partir de los ADN procedentes de
diferentes orígenes (individuos) con extremos ahorquillados (de
cadena sencilla) debido a la no complementariedad de las secuencias
de cebador. Además, se forman homodúplex mediante la
renaturalización entre las cadenas de un individuo consigo mismas.
Estos homodúplex presentan extremos romos. A esta mezcla se añade
una disolución que contiene exonucleasa exo III (o una
exonucleasa equivalente específica para extremos romos o acoplados
en 3'). La exonucleasa digiere los homodúplex de extremos romos,
pero no los heterodúplex con sus extremos 3' que sobresalen, lo que
crea grandes segmentos de cadena sencilla en los fragmentos de
homodúplex. Estos pueden eliminarse de la mezcla de reacción
mediante la unión a una matriz específica para cadena sencilla (por
ejemplo, perlas de BND-celulosa). Los heterodúplex
restantes comprenden una reunión de fragmentos idénticos en un 100%
y fragmentos con emparejamientos erróneos en sus pares de bases
(fragmentos no IBD). Se añade a la mezcla de reacción una disolución
que contiene la proteína de reparación de emparejamientos erróneos
mut S. Mut S se une al ADN con emparejamientos
erróneos en el sitio del emparejamiento erróneo. El complejo
proteína/ADN se elimina a continuación de la mezcla de reacción
mediante la unión específica de mut S a una matriz (por ejemplo, una
columna que lleva anticuerpos, membrana de unión a proteínas). Este
procedimiento omite las etapas de formación de muescas por
mut LH y la segunda digestión con exo III, así como la
necesidad de una matriz de unión a cadenas sencillas para eliminar
los productos que resultan de la digestión con exonucleasa. Los
fragmentos restantes de heterodúplex de ADN idénticos pueden
detectarse e identificarse tal como se señala en el ejemplo 1.
Claims (17)
1. Procedimiento para la identificación (o
aislamiento o separación) de fragmentos idénticos de ácido nucleicos
de una mezcla de por lo menos dos poblaciones de ácido nucleico, que
comprende: a) digerir por separado los ácidos nucleicos de dichas
por lo menos dos poblaciones con por lo menos una enzima de
restricción; b) ligar una secuencia adaptadora específica a los
fragmentos de restricción; c) amplificar los fragmentos de
restricción ligados a la secuencia adaptadora generados en a) y b)
usando unos cebadores específicos para la secuencia adaptadora
marcados de distinto modo; d) hibridar los productos de
amplificación procedentes de las diferentes poblaciones de ácidos
nucleicos entre sí; e) eliminar los homohíbridos basándose en el
marcaje de los cebadores; e f) identificar (o aislar o separar) los
fragmentos heterohíbridos idénticos, completamente emparejados.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que las poblaciones de ácidos nucleicos son poblaciones de ADN
genómico, preferentemente poblaciones de ADN genómico humano, más
preferentemente procedente de sujetos diferentes que presentan una
característica de interés común.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que las poblaciones de ácido nucleico comprenden unos
cromosoma(s) seleccionado(s).
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que se utilizan de dos a diez
poblaciones de ácidos nucleicos procedentes de diferentes
orígenes.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que los fragmentos de restricción
se seleccionan por tamaño antes de la reacción de amplificación.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se clonan parte o todos los
fragmentos de restricción en un vector antes de la reacción de
amplificación.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia adaptadora comprende
un sitio de reconocimiento para mut HL.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el
que la molécula adaptadora es un fragmento de ADN de doble cadena
comprendido entre 5 y 100 bases de longitud que comprende por lo
menos un motivo GATC.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la amplificación es una reacción
en cadena de la polimerasa (PCR).
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el cebador es complementario a por
lo menos una parte de la secuencia de la molécula adaptadora.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el cebador se marca, preferentemente (i) añadiendo una
secuencia 5' única a cada cebador, (ii) añadiendo una actividad
química al cebador que proporcione unos medios para distinguir entre
los productos de amplificación procedentes de diferentes poblaciones
de ácidos nucleicos o (iii) añadiendo nucleótidos modificados en el
cebador lo que permite distinguir entre los productos de
amplificación procedentes de las diferentes poblaciones de ácidos
nucleicos.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la identificación de los
heterohíbridos emparejados comprende (i) separar los homodúplex de
los heterodúplex; (ii) (identificar y) eliminar los heterohíbridos
con emparejamientos erróneos, e (iii) identificar (o aislar o
separar) los fragmentos heterohíbridos idénticos.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, que
comprende a) amplificar por separado los fragmentos de restricción
utilizando un cebador con una secuencia 5' única para cada población
de ácidos nucleicos; b) mezclar los productos de amplificación
procedentes de dichas poblaciones diferentes de ácidos nucleicos que
llevan extremos 5' únicos; c) desnaturalizar e hibridar de nuevo
dichos ácidos nucleicos; d) digerir los ADN perfectamente
emparejados (de extremos romos) (homodúplex) mediante Exo III
y e) eliminar las cadenas sencillas creadas por Exo III,
preferentemente mediante la unión a una matriz específica para
cadena sencilla.
14. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que los heterohíbridos se separan de los homohíbridos basándose
en la metilación de una de las dos preparaciones de ácidos nucleicos
(o fragmentos de restricción).
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que los heterohíbridos con emparejamientos erróneos se eliminan
con enzimas de reparación de emparejamientos erróneos.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que los fragmentos de ácidos nucleicos con emparejamientos
erróneos se eliminan mediante (i) la incubación de la mezcla de
hibridación con MutS y (ii) puesta en contacto del producto
resultante con un material de unión a MutS.
17. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que los fragmentos de ácidos nucleicos con emparejamientos
erróneos se eliminan incubando la mezcla de hibridación con
MutS, MutL y MutH, dando como resultado una
escisión específica de los híbridos con emparejamientos
erróneos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19911130 | 1999-03-12 | ||
| DE19911130A DE19911130A1 (de) | 1999-03-12 | 1999-03-12 | Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2228480T3 true ES2228480T3 (es) | 2005-04-16 |
Family
ID=7900789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00912573T Expired - Lifetime ES2228480T3 (es) | 1999-03-12 | 2000-03-09 | Composiciones y procedimientos para analisis genetico. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6887666B1 (es) |
| EP (1) | EP1179088B1 (es) |
| JP (1) | JP2002537855A (es) |
| AT (1) | ATE277199T1 (es) |
| CA (1) | CA2366107C (es) |
| DE (2) | DE19911130A1 (es) |
| DK (1) | DK1179088T3 (es) |
| ES (1) | ES2228480T3 (es) |
| IL (2) | IL145141A0 (es) |
| PT (1) | PT1179088E (es) |
| WO (1) | WO2000053802A1 (es) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1147219A1 (en) * | 1999-02-05 | 2001-10-24 | Amersham Pharmacia Biotech UK Limited | Analysis method |
| US7166432B2 (en) * | 1999-03-12 | 2007-01-23 | Integragen | Compositions and methods for genetic analysis |
| DE10017675A1 (de) * | 2000-04-08 | 2001-12-06 | Qtl Ag Ges Zur Erforschung Kom | Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genomfragmenten mit Kopplungsungleichgewicht |
| US20040014056A1 (en) * | 2000-05-02 | 2004-01-22 | Jorg Hager | Identification of genetic markers |
| US7032817B2 (en) * | 2000-06-23 | 2006-04-25 | Arthur Blank & Company, Inc. | Transaction card with shaped edge |
| AU2002223591A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-15 | Axaron Bioscience Ag | Method for mutational analysis |
| EE200100112A (et) * | 2001-02-23 | 2002-10-15 | Tartu Ülikool | Meetod DNA järjestuste variatsioonide leidmiseks |
| EP1293576A1 (en) * | 2001-09-18 | 2003-03-19 | Integragen | Compositions and methods to identify haplotypes |
| FR2856410B1 (fr) * | 2003-06-20 | 2007-06-15 | Integragen Sa | Methodes de preparation de puces genetiques et utilisations |
| EP1727912A2 (en) * | 2004-03-24 | 2006-12-06 | Integragen | Human obesity susceptibility genes encoding peptide hormones and uses thereof |
| EP1815018B1 (en) * | 2004-11-23 | 2009-07-15 | Integragen | Human obesity susceptibility gene encoding a member of the neurexin family and uses thereof |
| JP2008532499A (ja) * | 2005-02-28 | 2008-08-21 | アンテグラジャン | 神経伝達物質輸送体をコードするヒトの自閉症感受性遺伝子及びその使用 |
| CA2601311A1 (en) * | 2005-03-24 | 2006-09-28 | Integragen | Human autism susceptibility gene encoding a transmembrane protein and uses thereof |
| CN102925561B (zh) | 2005-06-23 | 2015-09-09 | 科因股份有限公司 | 用于多态性的高通量鉴定和检测的策略 |
| US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
| ATE453728T1 (de) | 2005-09-29 | 2010-01-15 | Keygene Nv | Screening mutagenisierter populationen mit hohem durchsatz |
| WO2007073165A1 (en) | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Keygene N.V. | Method for high-throughput aflp-based polymorphism detection |
| ES2645661T3 (es) | 2006-04-04 | 2017-12-07 | Keygene N.V. | Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basada en fragmentos de restricción |
| US20080228700A1 (en) | 2007-03-16 | 2008-09-18 | Expanse Networks, Inc. | Attribute Combination Discovery |
| EP3276526A1 (en) | 2008-12-31 | 2018-01-31 | 23Andme, Inc. | Finding relatives in a database |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6107023A (en) * | 1988-06-17 | 2000-08-22 | Genelabs Technologies, Inc. | DNA amplification and subtraction techniques |
| US5556750A (en) * | 1989-05-12 | 1996-09-17 | Duke University | Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems |
| WO1993022457A1 (en) * | 1992-04-24 | 1993-11-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Screening for genetic variation |
| US5376526A (en) * | 1992-05-06 | 1994-12-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genomic mismatch scanning |
| FR2709761B1 (fr) | 1993-09-10 | 1995-11-24 | Pasteur Institut | Procédé de détection de molécules contenant des mésappariements nucléotidiques et de localisation de ces mésappariements, et application à la détection de substitutions ou de délétions de bases . |
| US6027877A (en) | 1993-11-04 | 2000-02-22 | Gene Check, Inc. | Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, purification of amplified DNA samples and allele identification |
| EP0804618B1 (en) * | 1994-11-28 | 1999-01-27 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms |
| SE9500341D0 (sv) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | Ulf Landegren | Method for detecting DNA sequence variations |
| WO1996041002A2 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Genzyme Corporation | Methods for the identification of genetic modification of dna involving dna sequencing and positional cloning |
| GB9724480D0 (en) | 1997-11-19 | 1998-01-14 | Hexagen Technology Limited | Screening process |
| US6287825B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-09-11 | Molecular Staging Inc. | Methods for reducing the complexity of DNA sequences |
| US6150112A (en) * | 1998-09-18 | 2000-11-21 | Yale University | Methods for identifying DNA sequences for use in comparison of DNA samples by their lack of polymorphism using Y shape adaptors |
| EP1147219A1 (en) * | 1999-02-05 | 2001-10-24 | Amersham Pharmacia Biotech UK Limited | Analysis method |
| US6524794B1 (en) * | 1999-10-29 | 2003-02-25 | Decode Genetics Ehf. | Identical-by-descent fragment enrichment |
-
1999
- 1999-03-12 DE DE19911130A patent/DE19911130A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-03-09 AT AT00912573T patent/ATE277199T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-09 PT PT00912573T patent/PT1179088E/pt unknown
- 2000-03-09 ES ES00912573T patent/ES2228480T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-09 EP EP20000912573 patent/EP1179088B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-09 DE DE60014067T patent/DE60014067T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-09 JP JP2000603423A patent/JP2002537855A/ja active Pending
- 2000-03-09 IL IL14514100A patent/IL145141A0/xx active IP Right Grant
- 2000-03-09 WO PCT/EP2000/002053 patent/WO2000053802A1/en active IP Right Grant
- 2000-03-09 US US09/936,299 patent/US6887666B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-09 DK DK00912573T patent/DK1179088T3/da active
- 2000-03-09 CA CA 2366107 patent/CA2366107C/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-08-27 IL IL145141A patent/IL145141A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60014067T2 (de) | 2005-01-20 |
| CA2366107C (en) | 2010-02-16 |
| PT1179088E (pt) | 2004-12-31 |
| US6887666B1 (en) | 2005-05-03 |
| DE60014067D1 (de) | 2004-10-28 |
| EP1179088A1 (en) | 2002-02-13 |
| DE19911130A1 (de) | 2000-09-21 |
| IL145141A0 (en) | 2002-06-30 |
| JP2002537855A (ja) | 2002-11-12 |
| DK1179088T3 (da) | 2005-01-24 |
| WO2000053802A1 (en) | 2000-09-14 |
| ATE277199T1 (de) | 2004-10-15 |
| IL145141A (en) | 2007-07-24 |
| EP1179088B1 (en) | 2004-09-22 |
| CA2366107A1 (en) | 2000-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2228480T3 (es) | Composiciones y procedimientos para analisis genetico. | |
| ES2393318T3 (es) | Estrategias para la identificación y detección de alto rendimiento de polimorfismos | |
| ES2357549T3 (es) | Estrategias para la identificación y detección de alto rendimiento de polimorfismos. | |
| EP0534858B1 (en) | Selective restriction fragment amplification : a general method for DNA fingerprinting | |
| US5710028A (en) | Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor | |
| US7935488B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| JPH09508527A (ja) | リガーゼ／ポリメラーゼ媒体された単一ヌクレオチド多型のジェネティックビットアナリシスおよび遺伝子解析におけるその使用 | |
| FI112093B (fi) | Menetelmä ja testipakkaus geneettisen identiteetin osoittamiseksi | |
| EP0648222B1 (en) | Methods of single nucleotide primer extension to detect specific alleles and kits therefor | |
| US20240309434A1 (en) | Targeted rare allele crispr enrichment | |
| CA1313633C (en) | Purification of polymorphic components of complex genomes | |
| EP0298656A1 (en) | Polynucleotide probes | |
| US7572583B2 (en) | Selective restriction fragment amplification: fingerprinting | |
| Spanakis et al. | The molecular basis of genetic variation: mutation detection methodologies and limitations | |
| US7166432B2 (en) | Compositions and methods for genetic analysis | |
| Cotton | Detection of mutations in DNA | |
| AU699308B2 (en) | Microsatellite sequences for canine genotyping | |
| Nikali et al. | Infantile onset spinocerebellar ataxia represents an allelic disease distinct from other hereditary ataxias | |
| Hussein et al. | Evaluation of seven microsatellite loci in Simmental cattle | |
| McDonough | Molecular biology and reproduction | |
| IL106199A (en) | Method of single nucleotide prime extension to detect specific alleles and kit therefor |